1.3.2016   

HU

Az Európai Unió Hivatalos Lapja

L 54/1


A BIZOTTSÁG (EU) 2016/266 RENDELETE

(2015. december 7.)

a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendeletnek a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról

(EGT-vonatkozású szöveg)

AZ EURÓPAI BIZOTTSÁG,

tekintettel az Európai Unió működéséről szóló szerződésre,

tekintettel a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezéséről szóló, 2006. december 18-i 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendeletre (1) és különösen annak 13. cikke (2) bekezdésére,

mivel:

(1)

A 440/2008/EK bizottsági rendelet (2) az 1907/2006/EK rendelettel összefüggésben történő alkalmazás céljából vizsgálati módszereket határoz meg a vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságainak, toxicitásának és ökotoxicitásának meghatározására.

(2)

A 440/2008/EK rendeletet az OECD által a közelmúltban a műszaki fejlődésre való tekintettel elfogadott új és átdolgozott vizsgálati módszerek beépítése, valamint – a 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelvnek (3) megfelelően – a kísérleti célokra felhasznált állatok számának csökkentése érdekében módosítani kell. A Bizottság e rendelet tervezetéről konzultált az érdekeltekkel.

(3)

A módosítás húsz vizsgálati módszert tartalmaz: egy új módszer egy fizikai-kémiai jellemző mérésére szolgál, tizenegy új és három átdolgozott módszer az ökotoxicitás értékelését támogatja, míg öt új módszer a vegyi anyagok környezeti sorsának és viselkedésének meghatározását segíti.

(4)

A 440/2008/EK rendeletet ezért megfelelően módosítani kell.

(5)

Az e rendeletben előírt intézkedések összhangban vannak az 1907/2006/EK rendelet 133. cikke alapján létrehozott bizottság véleményével,

ELFOGADTA EZT A RENDELETET:

1. cikk

A 440/2008/EK rendelet melléklete e rendelet mellékletének megfelelően módosul.

2. cikk

Ez a rendelet Az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő harmadik napon lép hatályba.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.

Kelt Brüsszelben, 2015. december 7-én.

a Bizottság részéről

az elnök

Jean-Claude JUNCKER


(1)  HL L 396., 2006.12.30., 1. o.

(2)  A Bizottság 2008. május 30-i 440/2008/EK rendelete a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról (HL L 142., 2008.5.31., 1. o.).

(3)  Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről (HL L 276., 2010.10.20., 33. o.).


MELLÉKLET

A 440/2008/EK rendelet melléklete a következőképpen módosul:

1.

A melléklet az A. rész előtt a következő szöveggel egészül ki:

„Megjegyzés:

Ha egy vizsgálati módszer leírása nem utal egyértelműen a módszernek a több összetevőből álló anyagok, az ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyagok (UVCB), illetőleg a keverékek vizsgálatára való alkalmazhatóságára, akkor azt megelőzően, hogy a vizsgálati módszert egy több összetevőből álló anyag, UVCB vagy keverék vizsgálatára alkalmaznánk, meg kell fontolni, hogy a módszer a tervezett szabályozási cél szempontjából megfelelő-e.

Ha a vizsgálati módszert több összetevőből álló anyag, UVCB vagy keverék vizsgálatára alkalmazzuk, akkor – például az összetevők kémiai azonosító adatainak, mennyiségi előfordulásának és releváns jellemzőinek megadásával – a lehetőségekhez mérten elegendő információt kell szolgáltatni az összetételről.”

2.

A melléklet a következő A.24. fejezettel egészül ki:

A.24.   MEGOSZLÁSI HÁNYADOS (N-OKTANOL/VÍZ), NAGY TELJESÍTMÉNYŰ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS (HPLC) MÓDSZER

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 117. vizsgálati iránymutatásában (2004) leírt módszerrel.

1.

A megoszlási hányados (P) egy két, egymással nem elegyedő oldószerből álló, kétfázisú rendszerben feloldott anyag egyensúlyi koncentrációinak aránya. N-oktanol és víz esetében:

Formula

Mivel a megoszlási hányados két koncentráció hányadosa, dimenziótlan, és rendszerint 10-es alapú logaritmusával adják meg.

2.

A Pow az egyik legfontosabb paraméter a vegyi anyagok környezetben bekövetkező sorsának tanulmányozása során. Erősen szignifikáns kapcsolatot mutattak ki az anyagok nem ionizált formájának Pow értéke és a halakban való biológiai felhalmozódása között. Azt is kimutatták, hogy a Pow hasznos paraméter a talajon és az üledékeken végbemenő adszorpció előrejelzésére, valamint kvantitatív szerkezet–hatás összefüggések megállapítására a biológiai hatások széles köre esetében.

3.

Az erre a vizsgálati módszerre vonatkozó eredeti javaslat C.V. Eadsforth és P. Moser cikkén (1) alapult. A vizsgálati módszer kidolgozását és az OECD laboratóriumok közötti összehasonlító vizsgálatát a Németországi Szövetségi Köztársaság Umweltbundesamt nevű intézménye koordinálta 1986 folyamán (2).

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

4.

A – 2 és + 4 közötti (esetenként akár 5 és afeletti) tartományban található log Pow értékeket (1) a lombikrázásos módszerrel (e melléklet A.8. fejezete, OECD 107. vizsgálati iránymutatás) lehet kísérleti úton meghatározni. A HPLC-módszer a 0–6 közötti tartományban található log Pow értékeket fedi le (1)(2)(3)(4)(5). E módszer esetében a Pow becslésére lehet szükség a megfelelő referenciaanyagok hozzárendelése, illetve a vizsgálat által generált adatokból levont következtetések alátámasztása érdekében. A számítási módszereket a vizsgálati módszer függelékében röviden bemutatjuk. A HPLC-üzemmód izokratikus.

5.

A Pow értékek a környezeti feltételektől függenek, például a hőmérséklettől, a pH-értéktől, az ionerősségtől stb. Ezeket a Pow adatok helyes értelmezése érdekében a kísérlet során meg kell határozni. Ionizálható anyagok esetében más módszerek (pl. az ionizált anyagoknál alkalmazható pH metrikus módszerről szóló OECD-iránymutatás-tervezet (6)) is elérhetővé válhatnak, amelyeket alternatív módszerként lehet használni. Bár az említett OECD-iránymutatás-tervezet alkalmas lehet a Pow meghatározására ionizálható anyagok esetében, egyes esetekben célszerűbb egy bizonyos, környezetvédelmi szempontból releváns pH-értéken (lásd a 9. pontot) a HPLC-módszert használni.

A MÓDSZER ELVE

6.

A fordított fázisú HPLC-t olyan, kereskedelmi forgalomban kapható szilárd fázissal megtöltött analitikai oszlopokon végezzük, amely kémiailag kovasavhoz kötött hosszú szénhidrogénláncokat (például C8, C18) tartalmaz.

7.

Az ilyen oszlopra injektált vegyi anyag elválasztja a mozgó oldószer fázist a szénhidrogén álló fázistól, miközben azt a mozgó fázis végigszállítja az oszlopon keresztül. Az anyagok a szénhidrogén–víz megoszlási hányadosuk arányában maradnak vissza: a hidrofil anyagok eluálódnak először, a lipofil anyagok pedig utoljára. A retenciós időt a k kapacitástényező fejezi ki, amely a következő egyenletből adódik:

Formula

ahol tR a vizsgált anyag retenciós ideje, t0 pedig a holtidő, azaz az egy oldószer-molekulának az oszlopon történő áthaladásához átlagosan szükséges idő. Kvantitatív analitikai módszerek nem szükségesek, csak a retenciós időket kell meghatározni.

8.

Egy vizsgált anyag oktanol/víz megoszlási hányadosát úgy lehet kiszámítani, hogy kísérleti úton meghatározzuk a k kapacitástényezőjét, majd a kapacitástényezőt beillesztjük a következő egyenletbe:

Formula

ahol

a, b

=

lineáris regressziós együtthatók.

A fenti egyenletet úgy kapjuk, hogy lineáris regressziót alkalmazunk a referenciaanyagok oktanol/víz megoszlási hányadosainak logaritmusára a referenciaanyagok kapacitástényezői logaritmusának függvényében

9.

A fordított fázisú HPLC-módszer lehetővé teszi a 0 és 6 közötti log Pow tartományban található megoszlási hányadosok becslését, de kivételes esetekben ki lehet terjeszteni, hogy lefedje a 6 és 10 közötti log Pow tartományt is. Ehhez a mozgó fázis módosítására lehet szükség (3). A módszer nem alkalmazható erős savak és lúgok, komplex fémvegyületek, az eluenssel reakcióba lépő anyagok és felületaktív anyagok esetében. Ionizálható anyagokon nemionos formájukban (szabad sav vagy szabad bázis) csak megfelelő puffer használata mellett lehet méréseket végezni, amelynek pH-értéke szabad sav esetében a pKa alatt, szabad bázis esetében a pKa felett van. Emellett az ionizálható anyagok tesztelésére szolgáló pH-metrikus módszer (6) is elérhetővé válhat, és alternatív módszerként lehet majd használható (6). Ha a log Pow érték környezeti veszélyességi besorolás vagy környezeti kockázatértékelés céljából kerül meghatározására, a vizsgálatot a természeti környezet szempontjából releváns, azaz az 5,0 és 9 közötti pH-tartományban kell elvégezni.

10.

Egyes esetekben a szennyeződések megnehezíthetik az eredmények értelmezését a csúcsok hozzárendelésének bizonytalansága miatt. Az olyan keverékek esetében, amelyek egy feloldatlan sávot adnak, a log Pow felső és alsó határát, valamint az egyes log Pow csúcsok terület %-át kell meghatározni. A homológokból álló keverékek esetében a súlyozott átlagos log Pow értéket is meg kell állapítani (7), amelyet az egyes Pow értékek és a megfelelő terület %-értékek alapján kell kiszámítani (8). A számításban minden olyan csúcsot figyelembe kell venni, amelynek területe 5 % vagy annál nagyobb mértékben járul hozzá az összes csúcs alatti területhez (9):

Formula

A log Pow súlyozott átlaga csak homológokból (pl. alkánsorozat) álló anyagok vagy keverékek (pl. tallolajok) esetében érvényes. A keverékek esetében érdemi mérési eredményeket lehet kapni, feltéve, hogy a használt analitikai detektor a keverékben található összes anyaggal szemben azonos érzékenységet mutat, és megfelelően fel lehet őket oldani.

A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

11.

Az anyag disszociációs állandóját, szerkezeti képletét és a mozgó fázisban való oldhatóságát a módszer alkalmazása előtt meg kell ismerni. Ezenkívül a hidrolízisre vonatkozó információk is hasznosak lehetnek.

MINŐSÉGI KRITÉRIUMOK

12.

A mérés megbízhatóságának növelésére két meghatározást kell végezni.

Megismételhetőség: Az azonos körülmények között elvégzett és ugyanazokat a referenciaanyagokat használó megismételt mérésekből származó log Pow értékeknek a ± 0,1 log egység tartományba kell esniük.

Reprodukálhatóság: Ha a méréseket különböző referenciaanyagokkal ismétlik meg, az eredmények eltérhetnek. A log k és log Pow közötti összefüggés R korrelációs együtthatója egy adott sorozat vizsgálati anyag esetében jellemzően 0,9 körül van, amely log Pow ± 0,5 log egység oktanol/víz megoszlási együtthatónak felel meg.

13.

A laboratóriumok közötti összehasonlító vizsgálat kimutatta, hogy a HPLC-módszerrel a lombikrázásos értékekhez képest ± 0,5 egységen belüli log Pow értékek nyerhetők (2). A szakirodalomban további összehasonlítások találhatók (4)(5)(10)(11)(12). A szerkezetileg rokon referenciaanyagokon alapuló korrelációs diagramok adják a legpontosabb eredményeket (13).

REFERENCIAANYAGOK

14.

Annak érdekében, hogy egy anyag mért k kapacitástényezőjét a saját Pow értékével korrelációba lehessen hozni, egy legalább 6 pontot felhasználó kalibrációs görbét kell kialakítani (lásd a 24. pontot). A felhasználó feladata a megfelelő referenciaanyagok kiválasztása. A referenciaanyagoknak általában olyan log Pow értékekkel kell rendelkezniük, amelyek magukban foglalják a vizsgálati anyag log Pow értékét, azaz legalább egy referenciaanyagnak a vizsgált anyagénál magasabb, egy másiknak pedig a vizsgált anyagénál alacsonyabb Pow értékkel kell rendelkeznie. Extrapoláció csak kivételes esetekben alkalmazható. Célszerű, hogy ezek a referenciaanyagok a vizsgált anyaggal szerkezetileg rokon anyagok legyenek. A kalibráció során használt referenciaanyagok log Pow értékeinek megbízható kísérleti adatokon kell alapulniuk. A magas (általában több mint 4) log Pow értékű anyagoknál azonban számított értékek is használhatók, kivéve, ha megbízható kísérleti adatok állnak rendelkezésre. Extrapolált értékek használata esetén határértéket kell megadni.

15.

Számos vegyianyag-csoport esetében a log Pow értékekről terjedelmes jegyzékek állnak rendelkezésre (14)(15). Amennyiben a szerkezetileg rokon anyagok megoszlási hányadosairól nem állnak rendelkezésre adatok, más referenciaanyagokkal végzett, általánosabb kalibrálás is használható. Az ajánlott referenciaanyagok és azok Pow értékei az 1. táblázatban találhatók. Ionizálható anyagok esetében a megadott értékek a nem ionizált formára vonatkoznak. Az értékek elfogadhatóságát és minőségét a laboratóriumok közötti összehasonlító vizsgálat során ellenőrizték.

1. táblázat

Ajánlott referenciaanyagok

 

CAS-szám

Referenciaanyag megnevezése

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanon

(metil-etil-keton)

0,3

 

2

1122-54-9

4-acetil-piridin

0,5

 

3

62-53-3

Anilin

0,9

 

4

103-84-4

Acetanilid

1,0

 

5

100-51-6

Benzil-alkohol

1,1

 

6

150-76-5

4-metoxi-fenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Fenoxi-ecetsav

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Benzonitril

1,6

 

11

140-29-4

Fenil-acetonitril

1,6

 

12

589-18-4

4-metilbenzil-alkohol

1,6

 

13

98-86-2

Acetofenon

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-nitrobenzoesav

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-klóranilin

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitro-benzol

1,9

 

18

104-54-1

Fahéjalkohol

(Fahéjsav-alkohol)

1,9

 

19

65-85-0

Benzoesav

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-krezol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(transz)

Fahéjsav

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4.44 (transz)

22

100-66-3

Anizol

2,1

 

23

93-58-3

Metil-benzoát

2,1

 

24

71-43-2

Benzol

2,1

 

25

99-04-7

3-metilbenzoesav

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-klórfenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Triklór-etilén

2,4

 

28

1912-24-9

Atrazin

2,6

 

29

93-89-0

Etil-benzoát

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-diklórbenzonitril

2,6

 

31

535-80-8

3-klórbenzoesav

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Toluol

2,7

 

33

90-15-3

1-naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-diklóranilin

2,8

 

35

108-90-7

Klórbenzol

2,8

 

36

1746-13-0

Allil-fenil-éter

2,9

 

37

108-86-1

Brómbenzol

3,0

 

38

100-41-4

Etil-benzol

3,2

 

39

119-61-9

Benzofenon

3,2

 

40

92-69-3

4-fenilfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Timol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-diklór-benzol

3,4

 

43

122-39-4

Difenil-amin

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftalin

3,6

 

45

93-99-2

Fenil-benzoát

3,6

 

46

98-82-8

Izopropilbenzol

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-triklórfenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenil

4,0

 

49

120-51-4

Benzil-benzoát

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-szek-butilfenol

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-triklór-benzol

4,2

 

52

143-07-7

Dodekánsav

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenil-éter

4,2

 

54

85-01-8

Fenantrén

4,5

 

55

104-51-8

n-butilbenzol

4,6

 

56

103-29-7

Dibenzil

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenilpiridin

4,9

 

58

206-44-0

Fluorantén

5,1

 

59

603-34-9

Trifenil-amin

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

A MÓDSZER LEÍRÁSA

A megoszlási hányados előzetes becslése

16.

Ha szükséges, a vizsgált anyag megoszlási hányadosát meg is lehet becsülni, lehetőleg egy számítási módszer használatával (lásd a függeléket), vagy adott esetben a vizsgált anyag tiszta oldószerekben való oldhatósági aránya segítségével.

Készülékek

17.

Egy alacsony pulzálású szivattyúval és alkalmas detektáló rendszerrel felszerelt folyékony fázisú kromatográfra van szükség. A 210 nm hullámhosszot használó UV-detektor vagy az RI detektor a legkülönbözőbb kémiai csoportok esetében alkalmazható. A poláros csoportok jelenléte az álló fázisban nagymértékben ronthatja a HPLC-oszlop teljesítményét. Ezért az álló fázisnak minimális százalékban szabad csak poláros csoportokat tartalmaznia (16). Kereskedelmi forgalomban kapható mikroszemcsés, fordított fázisú töltetek vagy előre töltött oszlopok is használhatók. Az injektáló rendszer és az analitikai oszlop közé védőoszlop helyezhető el.

Mozgó fázis

18.

Használjunk HPLC-minőségű metanolt és desztillált vagy ionmentesített vizet az eluáló oldószer készítésére, amelyet használat előtt gáztalanítsunk. Izokratikus elúciót célszerű alkalmazni. A metanol/víz arányt úgy állítsuk be, hogy az eluáló oldószer legalább 25 % vizet tartalmazzon. Általában a 3:1 (térfogat/térfogat) arányú metanol-víz keverék alkalmas log P = 6 anyagok 1 órán belüli eluálásához 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Ha az anyag log P-je 6-nál magasabb, szükségessé válhat az elúciós idő lerövidítése (a referenciaanyagoknál is) a mobil fázis polaritásának vagy az oszlop hosszúságának csökkentésével.

19.

A vizsgálati anyagnak és a referenciaanyagoknak a kimutathatósághoz elegendő koncentrációban oldhatónak kell lenniük a mozgó fázisban. Adalékok csak kivételes esetekben adhatók a metanol-víz elegyhez, mivel megváltoztatják az oszlop tulajdonságait. Ezekben az esetekben igazolni kell, hogy az adalékok nem befolyásolják a vizsgált anyag és a referenciaanyagok retenciós idejét. Ha a metanol-víz keverék nem megfelelő, más szerves oldószer-víz keverékek is használhatók, pl. etanol-víz, acetonitril-víz vagy izopropil-alkohol (2-propanol)-víz.

20.

Az eluáló folyadék pH-ja döntő fontosságú ionizálható anyagok esetében. Ennek az oszlop üzemi pH-tartományán belül kell elhelyezkednie, amely rendszerint 2 és 8 között van. Ajánlatos a pufferolás. El kell kerülni a só kicsapódását és az oszlop minőségromlását, amely bizonyos szerves fázis/puffer keverékek esetében következhet be. Általában nem ajánlatos kovasav alapú álló fázisú HPLC-berendezéssel 8-as pH-érték felett méréseket végezni, mivel a lúgos mobil fázis használata gyors romlást okozhat az oszlop teljesítményében.

Oldott anyagok

21.

A vizsgált anyagnak és referenciaanyagoknak kellően tisztának kell lenniük ahhoz, hogy a kromatogramon megjelenő csúcsokat hozzá lehessen rendelni a megfelelő anyagokhoz. A vizsgálatra vagy kalibrálásra szánt anyagokat, amennyiben lehetséges, a mozgó fázisban kell feloldani. A vizsgált anyag és a referenciaanyagok feloldásához a mozgó fázistól eltérő oldószer alkalmazása esetén az injektálás előtti végső hígításhoz a mozgó fázist kell használni.

Vizsgálati körülmények

22.

A mérések során a hőmérsékletnek nem szabad ±1 °C-nál nagyobb értékkel változnia.

A to holtidő meghatározása

23.

A t0 holtidőt kromatográffal nem késleltetett szerves anyagok (például tiokarbamid vagy formamid) alkalmazásával mérhetjük. Pontosabb holtidőt származtathatunk a mért retenciós időkből vagy egy körülbelül héttagú homológ sorból (például n-alkil-metil-ketonok) (17). A tR (nC + 1) retenciós időket a tR (nC) függvényében ábrázoljuk, ahol nC a szénatomok száma. Egy egyenes vonalat kapunk, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, ahol A, amely a k(nC + 1)/k(nC) függvényt képviseli, állandó. A t0 holtidőt az (1 – A)t0 és az A meredekségének metszéspontjából kapjuk meg.

Regressziós egyenlet

24.

A következő lépés a log k és a log P korrelációjának ábrázolása olyan megfelelő referenciaanyagok esetében, amelyek log P értékei a vizsgált anyag esetében várható log P érték közelében helyezkednek el. A gyakorlatban 6–10 referenciaanyagot injektálunk be egyidejűleg. A retenciós időket lehetőleg a detektáló rendszerhez kapcsolt regisztráló integrátoron határozzuk meg. A kapacitástényezők megfelelő logaritmusait (log k) a log P függvényében ábrázoljuk. A regressziós egyenletet rendszeres időközönként, naponta legalább egyszer határozzuk meg, azért, hogy felismerjük az esetleges változásokat az oszlop viselkedésében.

A VIZSGÁLT ANYAG POW ÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA

25.

A vizsgálandó anyagot a legkisebb kimutatható mennyiségben fecskendezzük be. A retenciós időt kétszer határozzuk meg. A vizsgálandó anyag megoszlási hányadosa a számított kapacitástényezőnek a kalibrációs görbén történő interpolációjával kapható meg. Nagyon kicsi és nagyon nagy megoszlási hányadosok esetében extrapoláció szükséges. Ilyen esetekben különös figyelmet kell fordítani a regressziós egyenes konfidenciahatáraira. Ha a minta retenciós ideje a standardok esetében kapott retenciós idők tartományán kívül található, határértéket kell megadni.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Vizsgálati jegyzőkönyv

26.

A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia:

ha történt ilyen, a megoszlási hányados előzetes becslését, a becsült értékeket és az alkalmazott módszert; ha számítási módszert alkalmaztunk, annak teljes leírását, beleértve az adatbázis megnevezését és a fragmentumok kiválasztására vonatkozó részletes információkat is,

a vizsgált és a referenciaanyagokat: tisztaságukat, szerkezeti képletüket és CAS-számukat,

a berendezések és a működési körülmények ismertetését: az analitikai oszlop, valamint a védőoszlop leírását,

a mozgó fázist, a detektálásra szolgáló eszközöket, a hőmérsékletet, a pH-t,

az elúciós profilokat (kromatogramok),

a holtidőt és mérésének módját,

a kalibrálás során használt referenciaanyagok regressziós adatait és a szakirodalomban közölt log Pow értékeit,

az illesztett regressziós egyenesre vonatkozó részleteket (a log k a log Pow függvényében) és az egyenes korrelációs együtthatóját, beleértve a megbízhatósági intervallumokat is,

a vizsgált anyag átlagos retenciós adatait és interpolált log Pow értékét,

keverékek esetén: az elúciós profil kromatogramot a jelzett határértékekkel,

a log Pow csúcs terület %-ához viszonyított log Pow értékeket,

a regressziós egyenes felhasználásával készített számítást,

a számított súlyozott átlagos log Pow értékeket, ha szükséges.

IRODALOM

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). »Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995«, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Függelék

A POW számítási módszerei

BEVEZETÉS

1.

Ez a függelék rövid bevezetést nyújt a Pow számításába. További információk a tankönyvekben találhatók (1) (2).

2.

A Pow számított értékei használhatók:

annak eldöntésére, hogy a kísérleti módszerek közül melyik a megfelelő: a lombikrázásos módszer – 2-től 4-ig terjedő log Pow értékek esetén, illetve a HPLC-módszer 0-tól 6-ig terjedő log Pow értékek esetén;

a HPLC-eljárásokhoz megfelelő vizsgálati körülmények kiválasztásához (például referenciaanyagok, metanol/víz arány);

a kísérleti módszerekkel kapott értékek megbízhatóságának ellenőrzésére;

becsült érték meghatározásához, azokban az esetekben, amikor a kísérleti módszerek nem alkalmazhatók.

A számítási módszerek alapelve

3.

Az itt javasolt számítási módszerek a molekulának olyan elemekre való elméleti lebomlásán alapulnak, amelyekről megbízható log Pow értékek állnak rendelkezésre. A log Pow a fragmentumértékek és az intramolekuláris kölcsönhatásokra vonatkozó korrekciós kifejezések összegzésével számítható ki. A fragmentumkonstansok és korrekciós kifejezések jegyzékei rendelkezésre állnak (1) (2) (3) (4) (5) (6). Néhányat közülük rendszeresen frissítenek (3).

A számított értékek megbízhatósága

4.

Általánosságban elmondható, hogy a számítási módszerek megbízhatósága a vizsgált anyag összetettségének növekedésével csökken. Kis molekulasúlyú és egy vagy két funkciós csoportú, egyszerű molekulák esetében a különböző fragmentálási módszerek eredményei és a mért érték között 0,1–0,3 log Pow eltérés várható. A hibahatár a használt fragmentumkonstansok megbízhatóságától, az intramolekuláris kölcsönhatások (például hidrogénkötések) felismerhetőségétől és a korrekciós kifejezések helyes használatától függ. Ionizálható vegyületek esetében figyelembe kell venni a töltést és az ionizáció mértékét (10).

A Fujita–Hansch-féle π-módszer

5.

Az eredetileg Fujita és munkatársai (7) által bevezetett π hidrofób helyettesítő konstanst a következőképpen definiálták:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

ahol PhX egy aromás származék, PhH pedig a kiindulási anyag.

pl.

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

A π-módszer elsősorban aromás anyagokra alkalmazható. Nagy számú szubstituens π értéke áll rendelkezésre (4) (5).

A Rekker-féle módszer

6.

Rekker-féle módszer szerint (8) a log Pow érték kiszámítása a következőképpen történik:

Formula

ahol ai egy adott fragmentum molekulában való előfordulásának száma és fi a fragmentum log Pow értékének növekménye. Az interakciós tényezők egyetlen Cm konstans (egy úgynevezett »mágikus konstans«) egész számú többszöröseként fejezhetők ki. Az fi és a Cm fragmentumkonstansokat egy 825 anyag 1 054 kísérleti Pow értékét tartalmazó jegyzékből határozták meg többszörös regresszióanalízis segítségével (6) (8). A interakciós tényezők meghatározását a megadott szabályoknak megfelelően kell végezni (6) (8) (9).

A Hansch–Leo-féle módszer

7.

A Hansch–Leo-féle módszer (4) szerint a log Pow érték a következő összefüggésből számítható ki:

Formula

ahol fi egy fragmentumkonstans, Fj egy korrekciós kifejezés (faktor), ai és bj pedig az ezeknek megfelelő előfordulási gyakoriság. Az atomos és csoportfragmentálási értékek jegyzékét és az Fj korrekciós kifejezések jegyzékét kísérleti Pow értékekből határozták meg a fokozatos megközelítés módszerével. A korrekciós kifejezéseket több különböző osztályba sorolták be (1) (4). Olyan speciális szoftvercsomagokat fejlesztettek ki, amelyek az összes szabályt és korrekciós kifejezést figyelembe veszik (3).

ÖSSZETETT MÓDSZER

8.

Az összetett molekulák log Pow értékének számítása lényegesen javítható, ha a molekula olyan nagyobb szerkezeti elemekre bontható, amelyek tekintetében rendelkezésre állnak megbízható log Pow értékek táblázatokból (3) (4) vagy korábban elvégzett mérésekből. Ezek a fragmentumok (például heterociklusok, antrakinon, azobenzol) ezután kombinálhatók a Hansch-féle π értékekkel, vagy a Rekker- vagy Leo-féle fragmentumkonstansokkal.

Megjegyzések

i.

A számítási módszerek csak a szükséges korrekciós tényezők figyelembevételével alkalmazhatók részben vagy teljesen ionizált anyagok esetében.

ii.

Amennyiben intramolekuláris hidrogénkötések létezése feltételezhető, az eredményhez hozzá kell adni a megfelelő korrekciós kifejezéseket (körülbelül +0,6 és +1,0 közötti log Pow egység) (1). Az ilyen kötések jelenlétét a molekula sztereomodelljei vagy spektroszkópikus adatai jelezhetik.

iii.

Amennyiben több tautomeralak lehetséges, a legvalószínűbb alakot kell használni számítási alapként.

iv.

A fragmentumkonstansok jegyzékeinek módosításait gondosan figyelemmel kell kísérni.

A SZÁMÍTÁSI ÓDSZEREKKEL KAPCSOLATOS IRODALOM

(1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, Kalifornia 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3)

(4)

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R.A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

3.

A C.3. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

C.3.   SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLAT, ÉDESVÍZI ALGÁK ÉS CIANOBAKTÉRIUMOK

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 201. vizsgálati iránymutatásában (2006, a melléklet 2011-ben korrigálva) leírt módszerrel. Megállapították, hogy a vizsgálati módszert további fajokra is ki kell terjeszteni és frissíteni kell, hogy eleget tegyen a vegyületekkel szemben támasztott kockázatértékelési és besorolási követelményeknek. A módszer átdolgozása a kiterjedt gyakorlati tapasztalatok, az algákra ható toxicitás vizsgálatának területén végbement tudományos fejlődés és a módszer eredeti elfogadása óta folyamatban lévő széles körű hatósági alkalmazás tapasztalatai alapján történt.

2.

Az alkalmazott fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

A VIZSGÁLAT ELVE

3.

A vizsgálat célja egy adott vegyi anyag által az édesvízi mikroalgákra és/vagy cianobaktériumokra gyakorolt hatás meghatározása. A vizsgált vegyi anyagnak exponenciálisan szaporodó organizmusokat teszünk ki egyszeres (batch) tenyészetekben, szokásosan 72 órán keresztül. A viszonylag rövid vizsgálati időtartam ellenére több generációra kiterjedő hatások vizsgálhatók.

4.

A rendszerben fellépő válasz a szaporodás visszaesése a vizsgált vegyi anyag különböző koncentrációinak kitett algatenyészetekben (kísérleti egységek). A választ a koncentráció függvényében értékeljük, összehasonlítva a szaporodást az párhuzamos, nem kezelt kontrolltenyészetekben észlelt szaporodással. A toxikus hatásra adott válasz teljes kibontahozásához (optimális érzékenység) a tenyészetek számára – megfelelő tápkörülmények és folyamatos világítás mellett – lehetővé kell tenni a korlátlan exponenciális szaporodást elegendően hosszú ideig ahhoz, hogy mérni lehessen a fajlagos szaporodási sebesség csökkenését.

5.

A szaporodás és a szaporodásgátlás mennyiségi meghatározásához az alga élőanyagtömegét mérjük az idő függvényében. Az élőanyag mennyisége definíció szerint száraz tömeg/térfogat, pl. mg alga/liter tápoldat. A száraz tömeg mérése azonban bonyolult, ezért helyettesítő paraméterek használatosak. Ezek közül a sejtszám a leggyakrabban használt paraméter. További helyettesítő paraméterek lehetnek a sejttérfogat, a fluoreszcencia, az optikai sűrűség stb. A mért helyettesítő paraméterek és az élőanyagtömeg közötti átszámítási tényezőt ismerni kell.

6.

A kísérlet végpontja a szaporodás gátlása, az élőanyagtömeg expozíciós idő alatti növekedésének logaritmikusaként kifejezve (átlagos fajlagos szaporodási sebesség). A kísérleti oldatsorozattal mért átlagos fajlagos szaporodási sebességekből meg kell határozni azt a koncentrációt, amely a szaporodási sebességet adott x %-os (pl. 50 %-os) mértékben gátolja, és azt ErCx-ként (pl. ErC50) kell kifejezni.

7.

Az eljárás másik hatásváltozója a szaporulat, amelyre bizonyos országok esetében a jogszabályi követelmények teljesítéséhez lehet szükség. A szaporulat definíció szerint az expozíciós idő végén és az expozíciós idő kezdetén meglévő élőanyag tömegének különbsége. A vizsgálati oldatok tekintetében egyenként kiszámított szaporulatok alapján meghatározzuk azt az EyCx (például EyC50) koncentrációt, amely egy adott x %-os (például 50 %-os) növekedésgátlást idéz elő.

8.

Statisztikai eljárással meghatározható továbbá az észlelhető hatást okozó legkisebb koncentráció (LOEC) és az észlelhető hatást még nem okozó koncentráció (NOEC) értéke is.

A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

9.

A kísérleti körülmények kialakításához hasznosak lehetnek egyes információk a vizsgált vegyi anyagról, mint pl. szerkezeti képlet, tisztaság, fényérzékenység, stabilitás a kísérleti körülmények között, fényabszorpciós tulajdonságok, pKa és az átalakulási vizsgálatok eredményei, beleértve a biológiai lebonthatóságot vízben.

10.

A vízben való oldhatóságot, az oktanol-víz megoszlási hányadost (Pow) és a vizsgált vegyi anyag gőznyomását ismerni kell, valamint rendelkezésre kell állnia egy, a kísérleti oldatban jelen lévő vegyi anyag mennyiségi meghatározására alkalmas validált módszernek, dokumentált visszanyerési hatékonysággal és kimutatási határral.

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

11.

A vizsgálat érvényességéhez a következő kritériumoknak kell teljesülniük:

A kontrolltenyészetekben a élőanyag mennyiségének exponenciálisan kell növekednie, legalább 16-szorosára a 72-órás kísérleti idő alatt. Ez 0,92 nap– 1-es fajlagos szaporodási sebességnek felel meg. A leggyakrabban használt fajoknál a szaporodási sebesség rendszerint jelentősen nagyobb ennél (lásd a 2. függeléket). Ez a kritérium az 2. függelékben felsoroltaknál lassabban szaporodó fajok alkalmazása esetében nem feltétlenül teljesül. Ebben az esetben a kísérleti időt meg kell hosszabbítani, hogy legalább 16-szoros szaporodást kapjunk a kontrolltenyészetekben úgy, hogy a szaporodás mindvégig exponenciális marad a kísérlet ideje alatt. A kísérlet ideje lerövidíthető (de legalább 48 órának kell lennie), hogy a korlátlan exponenciális szaporodás a kísérlet alatt végig fennálljon, feltéve hogy megmarad a legalább 16-szoros szaporodás.

A szakaszonkénti (0–1., 1–2. és 2–3. nap a 72 órás kísérletnél) fajlagos szaporodási sebesség átlagos variációs együtthatója a kontrolltenyészeteknél (lásd a »variációs együttható«-t az 1. függelékben) nem haladhatja meg a 35 %-ot. A szakaszonkénti fajlagos szaporodási sebesség kiszámítására vonatkozóan lásd a 49. pontot. Ez a kritérium a kontroll ismétlésekre számított variációs együttható átlagértékére vonatkozik.

Az átlagos fajlagos szaporodási sebesség variációs együtthatója a kísérleti idő alatt a kontroll ismétlésekben semmikor sem haladhatja meg a 7 %-ot a Pseudokirchneriella subcapitata fajjal és Desmodesmus subspicatus fajjal folytatott vizsgálatokban. A többi, kevésbé gyakran vizsgált faj esetében ez az érték nem lehet nagyobb 10 %-nál.

REFERENCIA-VEGYIANYAGOK

12.

A vizsgálati eljárás referencia-vegyianyag(ok), mint például a nemzetközi körvizsgálatban (1) alkalmazott 3,5-diklór-fenol segítségével ellenőrizhető. A kálium-dikromát szintén használható referencia-vegyianyagként, zöldalgák esetében. Tanácsos legalább kétszer egy évben tesztelni a referencia-vegyianyagot.

A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA

13.

Ez a vizsgálati módszer legegyszerűbben olyan vízoldható vegyi anyagokra használható, amelyek a vizsgálati körülmények között valószínűleg a vízben maradnak. Az illékony, erősen adszorbeálódó, színes, vízben rosszul oldódó, esetleg a tápoldatban lévő tápanyagok vagy ásványi anyagok felvételére hatással lévő vegyi anyagok esetében szükség lehet a leírt módszer bizonyos módosítására (pl. zárt rendszer, a vizsgálathoz használt edények kondicionálása). Néhány megfelelő módosításhoz útmutatás található a (2), (3) és (4) szakirodalmi hivatkozásban.

A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA

Készülékek

14.

A vizsgálathoz használt edények és minden más, a vizsgálati oldatokkal közvetlenül érintkező más felszerelések üvegből vagy más, kémiailag közömbös anyagból készüljenek. Alaposan át kell mosni őket, biztosítandó, hogy szerves vagy szervetlen szennyezések ne befolyásolhassák az algák szaporodását, vagy a tápoldat összetételét.

15.

A vizsgálathoz használt edények általában olyan méretű üveglombikok legyenek, amelyek a vizsgálat során végzett mérésekhez képesek megfelelő térfogatú tenyészetet befogadni, és biztosítják a kívánt mértékű CO2-átadást a környezeti levegőből (lásd a 30. pontot). Figyelni kell arra, hogy a folyadéktérfogat elegendő legyen az analitikai meghatározások elvégzéséhez (lásd a 37. pontot).

16.

Szükséges lehet továbbá néhány vagy az összes az alábbi eszközök közül:

Tenyésztőberendezés: tenyésztőszekrény vagy -fülke ajánlott, amelyekben a választott inkubációs hőmérsékletet ±2 °C pontossággal tartható.

Fénymérő berendezés: fontos megjegyezni, hogy a fényerő mérési módszere, és főleg az érzékelő (kollektor) típusa hatással lehet a mért értékre. A mérésekhez gömb alakú (4 π) érzékelő (amely a mérési sík alatti és feletti bármely szögből érkező közvetlen és visszavert fényre reagál), vagy félgömb alakú (2 π) érzékelő (amely a mérési sík feletti bármely szögből érkező fényre reagál) használata preferált.

Az alga élőanyagtömegének meghatározására alkalmas berendezés. Az sejtszámlálás, amely az alga élőanyagtömeg mérésére leggyakrabban használt helyettesítő módszer, elvégezhető elektronikus részecskeszámláló, számlálókamrával ellátott mikroszkóp, vagy áramlásos citométer segítségével. Más helyettesítő paraméterek mérhetők áramlásos citométerrel, fluoriméterrel, spektrofotométerrel vagy koloriméterrel. Célszerű kiszámítani a sejtszám és a száraz tömeg közötti átszámítási tényezőt. Spektrofotométer használata esetén szükséges lehet legalább 4 cm fényúttal rendelkező küvetták használatára, hogy a módszer kis élőanyag-koncentrációknál is használható méréseket szolgáltasson.

A vizsgálathoz használt organizmusok

17.

A nem kitapadó mikroalgák és cianobaktériumok több faja használható. A 2. függelékben felsorolt törzsekről már bizonyították, hogy megfelelően használhatók ennek a vizsgálati módszernek az eljárásai során.

18.

Más faj használata esetén a törzset és/vagy az eredetet dokumentálni kell. Igazolni kell, hogy a vizsgálathoz kiválasztott alga exponenciális szaporodása a kísérlet ideje alatt mindvégig fennmarad az adott körülmények között.

Tápoldat

19.

Két választható tápoldat, az OECD-tápoldat és az AAP-tápoldat ajánlott. Ezeknek a tápoldatoknak az összetétele a 3. függelékben látható. Figyelembe kell venni, hogy a két tápoldat kiindulási pH-értéke és pufferkapacitása (a pH-növekedés szabályozása) eltérő. Ennek megfelelően az alkalmazott tápoldattól függően a vizsgálati eredmények különbözőek lehetnek, kiváltképp ionizáló vegyi anyagok vizsgálata során.

20.

Bizonyos célokhoz (pl. fémek és kelátképző szerek vizsgálatakor, vagy ha a kísérlet különböző pH-értékeken történik) a tápoldat módosítására lehet szükség. A módosított tápoldat használatát részletesen ismertetni és indokolni kell (3)(4).

Kiindulási élőanyag-koncentráció

21.

A kiindulási élőanyagnak minden vizsgált tenyészetben ugyanannyinak és megfelelően kevésnek kell lennie, hogy exponenciálisan növekedhessen végig az expozíciós idő alatt, a tápanyagok elfogyásának veszélye nélkül. A kiindulási élőanyag mennyisége nem lépheti túl a 0,5 mg száraz tömeg/l értéket. Az alábbi kiindulási sejtkoncentrációk ajánlottak:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 x 103 – 104 sejt/ml

Desmodesmus subspicatus

2–5 x 103 sejt/ml

Navicula pelliculosa

104 sejt/ml

Anabaena flos-aquae

104 sejt/ml

Synechococcus leopoliensis

5 x 104 – 105 sejt/ml

A vizsgált vegyi anyag koncentrációi

22.

Az a koncentrációtartomány, amelyben a hatások valószínűleg fellépnek, koncentrációtartomány-meghatározási vizsgálatok eredményei alapján állapítható meg. A végleges meghatározó vizsgálathoz legalább öt, egy 3,2-nél nem nagyobb kvóciensű mértani sorozat szerinti koncentrációt kell kiválasztani. Olyan vegyi anyagok esetében, ahol a koncentráció-válasz görbe lapos, nagyobb kvóciens használata lehet indokolt. A koncentrációsorozatnak lehetőleg az algaszaporodási sebesség 5–75 %-os gátlását okozó tartományt kell lefednie.

Ismétlések és kontrolltenyészetek

23.

A vizsgálatot úgy kell megtervezni, hogy minden vizsgált koncentrációra három ismétlést tartalmazzon. Ha az NOEC meghatározása nem követelmény, a vizsgálat ettől eltérő lehet úgy, hogy a koncentrációk száma nagyobb lesz, az egy koncentrációhoz tartozó ismétlések száma pedig kisebb. A kontroll ismétlések számának legalább háromnak kell lennie, és ideálisan kétszer annyinak, mint az egyes vizsgált koncentrációkhoz tartozó ismétlések száma.

24.

Külön oldatsorozatot lehet készíteni a vizsgált vegyi anyag koncentrációinak analitikai meghatározásához (lásd a 36. és 38. pontot).

25.

Ha a vizsgált vegyi anyag oldhatóvá tételéhez oldószert kell használni, akkor a vizsgálatnak további kontrolltenyészeteket is tartalmaznia kell, amelyekben az oldószernek ugyanabban a koncentrációban kell jelen lennie, mint a vizsgált tenyészetekben.

Az oltótenyészet elkészítése

26.

A tápoldattal 2–4 nappal a kísérlet kezdete előtt oltótenyészetet kell készíteni, hogy a vizsgált algák hozzászokjanak a kísérleti körülményekhez, és hogy exponenciális szaporodási fázisban legyenek a kísérleti oldatok beoltásakor. Az alga élőanyag-mennyiségét úgy kell beállítani, hogy a kísérlet kezdetéig az exponenciális szaporodás érvényesüljön az oltótenyészetben. Az oltótenyészetet a kísérleti tenyészetekkel megegyező körülmények között kell inkubálni. Mérni kell az élőanyag mennyiségének növekedését az oltótenyészetben, ellenőrizendő, hogy a vizsgált törzsnek az adott tenyésztési körülmények közötti szaporodása a megfelelő tartományon belül marad-e. Az algatenyésztési eljárás egy példája a 4. függelékben található. Elkerülendő a kísérlet alatt az egyidejű sejtosztódást, szükség lehet esetleg az oltótenyészet egy második szaporítási lépésére is.

A kísérleti oldatok elkészítése

27.

Minden kísérleti oldatnak azonos koncentrációban kell tartalmaznia a tápoldatot és a vizsgált algák kiindulási élőanyagtömegét. A kiválasztott koncentrációjú kísérleti oldatokat rendszerint a vizsgált vegyi anyag törzsoldatának, a tápoldatnak és az oltótenyészetnek az összekeverésével kell előállítani. A törzsoldatokat általában a vizsgált vegyi anyagnak a kísérleti oldattal való feloldásával kell elkészíteni.

28.

Oldószerek (pl. aceton, tercier butilalkohol és dimetil-formamid) használhatók hordozóanyagként a vízben rosszul oldódó vegyi anyagoknak a kísérleti oldatba juttatásához (2)(3). Az oldószer-koncentráció nem haladhatja meg a 100 μl/l-t, és az oldószert a kísérletsorozatban használt minden tenyészethez (beleértve a kontrolltenyészeteket is) azonos koncentrációban hozzá kell adni.

Inkubáció

29.

A kísérleti lombikokat légáteresztő dugóval kell lezárni. A lombikokat rázás után a tenyésztőberendezésbe kell helyezni. A kísérlet folyamán az algáknak lebegniük kell, és elő kell segíteni a CO2-átadást. Ebből a célból folyamatos rázást vagy keverést kell alkalmazni. A tenyészeteket 21 és 24 °C közötti hőmérséklet-tartományban kell tartani ± 2 °C eltérésen belül szabályozva. Az 2. függelékben nem szereplő fajok, pl. a trópusi fajok esetében magasabb hőmérséklet lehet megfelelő, feltéve hogy az érvényességi kritériumok teljesülnek. Ajánlott a lombikok véletlenszerű elrendezése majd naponkénti áthelyezése az inkubátorban.

30.

A vizsgálat során a kontrolltenyészet tápoldatának pH-értéke nem növekedhet 1,5-nél nagyobb mértékben. Fémek, és a kísérlet pH-ja körüli értéken részlegesen disszociáló vegyi anyagok esetében szükséges lehet a pH-eltolódás korlátozása a reprodukálható és jól definiált eredmények érdekében. A 0,5 pH-egységnél kisebb eltolódás biztosítása technikailag kivitelezhető és a környezeti levegőből az oldatba történő CO2-bevitel megfelelő sebességének biztosításával, például a rázás intenzitásának növelésével lehet megvalósítani. Másik lehetőség a CO2-igény csökkentése a kiindulási élőanyag mennyiségének vagy a kísérlet időtartamának csökkentésével.

31.

A felületnek, ahol a tenyészetek inkubálása történik, folytonos egyenletes fluoreszcens megvilágítást (pl. »hideg-fehér« vagy »nappali« fény) kell kapnia. Az alga- és cianobaktériumtörzsek fényigénye eltérő. A fényerőt úgy kell megválasztani, hogy az megfeleljen a vizsgált organizmusnak. A javasolt zöldalga-fajokra a kísérleti oldatok szintjén a fényerőt a 60–120 μE·m– 2 · s– 1 tartományból kell kiválasztani, a megfelelő érzékelővel a fotoszintetikusan hatékony, 400–700 nm-es hullámhossz-tartományban mérve. Néhány faj, főként az Anabaena flos-aquae jól növekszik kisebb fényerő mellett, és a nagyobb fényerő károsíthatja. Ezekre a fajokra a 40–60 μE·m– 2 · s– 1 tartományba eső átlagos fényerőt kell választani. (A luxban kalibrált fénymérő berendezéseknél a hideg fehér fényre megadott 4 440–8 880 luxos tartomány felel meg az ajánlott 60–120 μE·m– 2 · s– 1-es fényerőnek). Az inkubációs területen az átlagos fényerő±15 %-ának megfelelő fényerőt kell fenntartani.

A vizsgálat időtartama

32.

A kísérlet hossza szokásos esetben 72 óra. Használható azonban rövidebb vagy hosszabb kísérleti időtartam is, feltéve, hogy a 11. pontban előírt összes érvényességi kritérium teljesül.

Mérések és analitikai vizsgálatok

33.

Az alga élőanyag-mennyiségét a kísérlet ideje alatt minden lombikban legalább naponta meg kell határozni. Ha a mérések a kísérleti oldatból pipettával vett kis térfogatú mintákkal történnek, ezeket a mintákat nem kell visszajuttatni a lombikba.

34.

Az élőanyag mennyiségének mérése mikroszkópos manuális sejtszámlálással vagy elektronikus részecskeszámlálással (sejtszámlálás és/vagy élőanyag térfogata) történik. Alternatív eljárások, pl. áramlásos citometria, in vitro vagy in vivo klorofillfluoreszcencia (5)(6), vagy az optikai sűrűség mérése is használható, ha igazolni lehet az élőanyagtömeggel fennálló kielégítő korrelációt az élőanyagtömegnek a kísérletben előforduló tartományában.

35.

Az oldatok pH-ját a kísérlet kezdetén és végén meg kell mérni.

36.

Amennyiben az alkalmazott koncentrációtartományban a vizsgált vegyi anyag meghatározásához rendelkezésre áll analitikai módszer, akkor a kísérleti oldatokat elemezni kell a kiindulási koncentrációk ellenőrzése, illetve annak ellenőrzése céljából, hogy a kísérletben használandó koncentrációk mindvégig fennállnak-e a kísérlet során.

37.

Elegendő lehet a vizsgált vegyi anyag egy alsó és felső koncentráció-határértékének, valamint a várható EC50 érték körüli koncentrációjának a mérése a kísérlet kezdetén és végén, ha valószínű, hogy a kísérlet során a koncentráció kevesebb mint 20 %-kal tér el a névleges értéktől. Ha nem valószínű, hogy a koncentrációk a névleges érték 80–120 %-án belül maradnak, ajánlott az összes kísérleti koncentráció mérése a kísérlet kezdetén és végén. Illékony, instabil és erősen adszorbeálódó vegyi anyagoknál további mintavétel ajánlott 24 óránként végzendő elemzéshez a kísérlet folyamán mindvégig, hogy az anyagveszteség még jobban meghatározható legyen. Ilyen vegyi anyagoknál további ismétlésekre lehet szükség. A vizsgált vegyi anyag koncentrációjának meghatározását minden esetben elegendő csak egyetlen ismétlés lombikjából elvégezni az egyes kísérleti koncentrációkra (vagy a lombikok ismétlésenként egyesített tartalmán).

38.

A kifejezetten a vizsgálat folyamán előálló kísérleti koncentrációk méréséhez készített oldatokat a kísérlethez használtakkal megegyező módon kell kezelni, azaz ezeket is be kell oltatni algával és a kísérleti körülményekkel azonos körülmények között inkubálni kell. Ha az oldott vegyi anyag koncentrációját kell mérni, szükséges lehet az algák eltávolítása az oldatból. Az elválasztást lehetőleg az algák kiülepedéséhez elegendő, de kis fordulatszámú centrifugálással kell végezni.

39.

Ha kimutatható, hogy a vizsgált vegyi anyag koncentrációját a vizsgálat időtartama alatt sikerült a névleges vagy a mért kezdeti koncentráció ± 20 %-os környezetében tartani, akkor az eredmények a névleges vagy mért kezdeti értékek alapján elemezhetők. Ha a névleges vagy a mért kezdeti koncentrációtól való eltérés nem maradt belül a ±20 % tartományon, akkor az eredményeket a kísérlet alatti koncentrációk mértani átlaga, vagy a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának csökkenését leíró modellek alapján kell elemezni (3)(7).

40.

Az algaszaporodás gátlásának vizsgálata dinamikusabb vizsgálati rendszer, mint a legtöbb hasonló, a vízi toxicitást mérő rövid időtartamú vizsgálat. Ennek következtében a tényleges kísérleti koncentrációkat esetleg nehezen lehet meghatározni, főleg kis koncentrációk esetén, és ha a vizsgált vegyi anyag abszorbeálódik. Ilyen esetekben az, ha a vizsgált vegyi anyag a növekvő élőanyagban való adszorpciója miatti eltűnik az oldatból, nem jelenti azt, hogy eltávozott a vizsgált rendszerből. A kísérlet eredményeinek elemzése során ellenőrizni kell, hogy a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a vizsgálat során történő csökkenése együtt jár-e a szaporodásgátlás csökkenésével. Ha ez a helyzet áll fenn, mérlegelni lehet egy olyan megfelelő modell alkalmazását, amely leírja a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának csökkenését (7). Ha ez nem áll fenn, akkor az eredmények elemzését megfelelő lehet a kiindulási (névleges vagy mért) koncentrációkra alapozni.

Egyéb észrevételek

41.

Az oltótenyészet normális és egészséges fenotípusának ellenőrzésére, illetve a kísérlet végén az algák esetleges abnormális fenotípusának (ami lehet a vizsgált vegyi anyag hatása) megállapítására mikroszkópos vizsgálatokat célszerű végezni.

Határérték-vizsgálat

42.

Bizonyos körülmények között, például amikor egy előzetes vizsgálat azt jelzi, hogy a vizsgált vegyi anyagnak nincs toxikus hatása 100 mg/l koncentrációig, vagy a kísérleti oldatban való oldhatósága határáig (amelyik a kettő közül kisebb), határérték-vizsgálat végezhető, amely egy kontrollcsoport és egy kezelt csoport (100 mg/l-es vagy az oldhatósági határral megegyező koncentrációval) szaporodási viselkedésének összehasonlítását jelenti. A vizsgálat során fokozottan ajánlatos elemezni az expozíció koncentrációját. A határérték-vizsgálatra érvényes az összes korábban leírt kísérleti körülmény és érvényességi kritérium, kivéve, hogy a kezelt ismétlések számának legalább hatnak kell lennie. A kontroll- és a kezelt csoport hatásváltozóit az átlagok összevetésére használható statisztikai analízissel (pl. Student-féle t-próba) lehet elemezni. Ha a két csoport szórásnégyzetei nem egyenlőek, akkor egyenlőtlen szórásnégyzetekre korrigált t-próbát kell végezni.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

A szaporodási görbék szerkesztése

43.

A kísérleti lombikokban lévő élőanyag mennyiségét ki lehet fejezni a mérésre használt helyettesítő paraméter (pl. sejtszám, fluoreszcencia) mértékegységében is.

44.

Táblázatba kell foglalni a vizsgált tenyészetekben és a kontrolltenyészetekben a becsült élőanyag-koncentrációkat, a vizsgált anyag koncentrációival és a legalább egész órákra kerekített mérési időpontokkal együtt, és ezek alapján kell megszerkeszteni a szaporodási görbéket. Ebben az első szakaszban használható akár logaritmikus, akár lineáris skála, a logaritmikus skála azonban kötelező, és általában jobban megjeleníti a kísérleti időszak alatt a szaporodási viselkedésben bekövetkező eltéréseket. Megjegyzendő, hogy logaritmikus ábrázolás esetén az exponenciális szaporodás egyenes vonalat ad, és a vonal meredeksége adja meg a fajlagos szaporodási sebességet.

45.

A görbék segítségével meg kell vizsgálni, hogy a kontrolltenyészetek a vizsgálat során mindvégig exponenciálisan szaporodtak-e, a várt sebességgel. Kritikusan meg kell vizsgálni minden adatpontot és a görbék lefutását, valamint ellenőrizni kell az adatsorokat és eljárásokat a lehetséges hibák tekintetében. Főleg azokat az adatok igényelnek ellenőrzést, melyeknél az eltérés valószínűleg szisztematikus hibából ered. Ha nyilvánvaló, hogy eljárási hiba történt, illetve ennek nagy a valószínűsége, akkor az adott adatpontot érvénytelenként meg kell jelölni, és ki kell zárni a további statisztikai elemzésből. (Ha a két vagy három ismétlésből az egyik lombik algakoncentrációja nulla, az azt jelezheti, hogy a lombik nem megfelelően lett beoltva, vagy megtisztítva). Az érvénytelenként elvetett adatpontoknál az elvetést egyértelműen indokolni kell a mérési jegyzőkönyvben. Csak eljárási hiba (ritka) lehet elfogadható indok, egyszerű pontatlanság nem. Az érvénytelen adatpontok azonosítására szolgáló statisztikai módszerek csak korlátozottan használhatóak az ilyen típusú problémákra, és nem helyettesítik a szakértői megítélést. Az érvénytelen adatpontokat (ilyenként megjelölve) célszerű megtartani az adatpontok között, feltüntetve azokat a későbbi grafikus vagy táblázatos megjelenítések során.

Hatásváltozók

46.

A vizsgálat célja a vizsgált vegyi anyag által az alga szaporodására gyakorolt hatás meghatározása. Ez a vizsgálati módszer két hatásváltozót tartalmaz, mert a különböző jogrendszerek preferenciái és szabályozási igényei eltérőek. Hogy a vizsgálati eredmények valamennyi jogrendszerben elfogadhatók legyenek, a hatást mindkét alábbi hatásváltozó alapján meg kell határozni.

a)    Átlagos fajlagos szaporodási sebesség : ez a hatásváltozó az élőanyag tömegének a kísérlet alatt bekövetkező logaritmikus növekedése alapján számítható, egy napra vetítve.

b)    Szaporulat : ez a hatásváltozó a kísérlet végén mérhető élőanyagtömeg mínusz a kiindulási élőanyagtömeg.

47.

Megjegyzendő, hogy a két hatásváltozó alapján számított toxicitásértékek nem hasonlíthatók egymáshoz, és a vizsgálatok eredményeinek felhasználása során erre a különbségre tekintettel kell lenni. A jelen vizsgálati módszerben előírt vizsgálati körülmények betartása mellett a két számítási eljárás matematikai háttere következtében az átlagos fajlagos növekedési sebességen alapuló ECx értékek (ErCx) általában nagyobbra adódnak, mint a szaporulaton alapuló ECx értékek (EyCx). Ezt az eltérést nem szabad úgy értelmezni, hogy egyik hatásváltozó érzékenyebb lenne a másiknál; egyszerűen arról van szó, hogy a két érték matematikailag mást jelent. Az átlagos fajlagos szaporodási sebesség koncepciója az algák korlátozás nélküli tenyészetekben történő általános exponenciális szaporodási sémáján alapszik, ahol a toxicitás mértéke a szaporodási sebességre gyakorolt hatások alapján becsülhető, függetlenül a kontrolltenyészet fajlagos szaporodási sebességének abszolút értékétől, a koncentráció-válasz görbe meredekségétől, vagy a kísérlet időtartamától. A szaporulatból származtatott eredmények ezzel szemben mindezektől a változóktól is függnek. Az EyCx függ az egyes vizsgálatokban használt algafajok fajlagos szaporodási sebességétől és a legnagyobb fajlagos szaporodási sebességétől, ami a fajok, sőt még különböző algatörzsek között is eltérő lehet. Ez a hatásváltozó nem használható az algafajok, de még a különböző törzsek mérgező anyagokkal szembeni érzékenységének összehasonlítására sem. Bár tudományos szempontból a toxikus hatást indokoltabb az átlagos fajlagos növekedési sebességből meghatározni, ez a vizsgálati módszer a szaporulaton alapuló toxicitásszámítást is tartalmazza, mert egyes országok hatályos jogszabályi követelményei ezt is szükségessé teszik.

Átlagos szaporodási sebesség

48.

Az adott időszakra vonatkozó átlagos fajlagos szaporodási sebesség az egyes kontrolltenyészetekre és kezelt tenyészetekre az élőanyag mennyiségének logaritmikus növekedéseként számítható ki a következő egyenletből [1]:

Formula

[1],

ahol:

μi – j

az átlagos fajlagos szaporodási sebesség i-től j időpontig;

Xi

az élőanyag mennyisége i időpontban;

Xj

az élőanyag mennyisége j időpontban.

Minden kezelt és kontrollcsoportra ki kell számítani egy átlagot a szaporodási sebességre, valamint meg kell becsülni a szórásnégyzetet.

49.

Az átlagos fajlagos szaporodási sebességet ki kell számolni a teljes kísérleti időszakra (általában 0–3. nap), kezdeti értékként a névlegesen beoltott élőanyagot, nem pedig a mért kezdeti értéket használva, mert ilyen módon általában nagyobb pontosság érhető el. Ha az élőanyag mérésére használt mérőeszköz lehetővé teszi az oltó élőanyag kis mennyiségének megfelelően pontos meghatározását (pl. áramlásos citométer), akkor használható a mért kezdeti élőanyag-koncentráció. A szakaszonkénti szaporodási sebességet is meg kell állapítani a vizsgálat minden egyes napjára vonatkozóan (0–1., 1–2. és 2–3. nap), ugyanúgy számítva, mint a fajlagos szaporodási sebességet, és meg kell vizsgálni, hogy a kontrolltenyészet szaporodási sebessége állandó marad-e (lásd az érvényességi kritériumokat a 11. pontban). Az első napon kapott, a teljes átlagos fajlagos szaporodási sebességnél szignifikánsan kisebb fajlagos szaporodási sebesség késési (lag) fázist jelez. Míg a késési (lag) fázis az előtenyészet megfelelő adagolásával minimalizálható és gyakorlatilag kiküszöbölhető a kontrolltenyészetekben, addig a vizsgált anyagnak kitett tenyészetekben a késési (lag) fázis a kezdeti toxicitás-stressz utáni helyreállást, vagy pedig a vizsgált vegyi anyagnak az expozíció elején történő elveszése (beleértve az élőanyagba történő szorpciót) miatti kisebb gátló hatást jelezhet. Ebből következően a szakaszonkénti szaporodási sebesség használható a vizsgált vegyi anyagnak a kísérlet során mutatott hatásainak az értékeléséhez. Ha a szakaszonkénti növekedési sebesség és az átlagos növekedési sebesség között nagy különbséget tapasztalunk, az azt jelenti, hogy a növekedés mintája erősen eltér az állandó kitevőjű exponenciális növekedéstől és különösen ajánlott a növekedési görbék részletes vizsgálata.

50.

A szaporodási sebesség százalékos gátlása az egyes kezelt ismétlésekre vonatkozóan az alábbi egyenletből számítható ki [2]:

Formula

[2],

ahol:

%Ir

=

az átlagos szaporodási sebesség százalékos gátlása;

μC

=

az átlagos szaporodási sebesség átlaga (μ) a kontrollcsoportban;

μT

=

az átlagos szaporodási sebesség a kezelt ismétlésben.

51.

Ha a kísérleti oldatok oldószer felhasználásával készülnek, oldószer nélküli kontrolltenyészetek helyett oldószeres kontrolltenyészeteket kell használni a százalékos gátlás számításakor.

Szaporulat

52.

A szaporulatot az egyes kontrolltenyészetekre és kezelt tenyészetekre úgy kell kiszámítani, hogy a kísérlet végén mért élőanyagtömegből kivonjuk a kiindulási élőanyagtömeget. Minden egyes vizsgálati koncentráció és kontrollcsoport esetén kiszámítjuk a szaporulat középértékét és tapasztalati szórásnégyzetét. Az egyes kezelt ismétlések vonatkozásában a szaporulatra vonatkozó százalékos gátlás ( % Iy) az alábbiak szerint számítható ki:

Formula

[3]

ahol:

% Iy

=

a százalékos szaporulatgátlás;

YC

=

a szaporulat átlaga a kontrollcsoportban;

YT

=

a szaporulat értéke a kezelt ismétlésekben.

A koncentráció-válasz görbe szerkesztése

53.

A százalékos szaporodásgátlást ábrázolni kell a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának (logaritmus) függvényében, és alaposan meg kell vizsgálni a görbét, figyelmen kívül hagyva azokat az adatpontokat, amelyek az első szakaszban érvénytelenként lettek megjelölve. Egy egyenest kell illeszteni az adatpontokra kézzel vagy számítógépes interpolációval, ami első benyomást ad a koncentráció és a válasz összefüggéseiről, majd ezután kifinomultabb módszert, lehetőleg számítógépes statisztikai módszert kell használni. Az adatok tervezett felhasználásának, minőségének (pontosságának) és mennyiségének, valamint a rendelkezésre álló adatelemző eszközök függvényében lehet úgy dönteni (és néha jól meg lehet indokolni), hogy ezen a szinten befejeződik az adatelemzés és a meghatározó értékek, azaz az EC50 és az EC10 (és/vagy EC20) egyszerűen leolvashatók a kézzel illesztett görbéről (lásd még alább a stimulációs hatásokról szóló pontot). A következők indokolhatják a statisztikai módszer mellőzését:

Az adatok nem megfelelőek ahhoz, hogy számítógépes módszerrel további, még megbízhatóbb eredmény szülessen, mint a szakértői megítéléssel – ilyen esetekben néhány számítógépes program nem is képes megbízható megoldást adni (az iteráció nem konvergál stb.).

A stimulációs szaporodási viselkedés nem kezelhető pontosan a rendelkezésre álló számítógépes programokkal (lásd alább).

Statisztikai eljárások

54.

A statisztikai számítások célja, hogy regressziószámítással kvantitatív koncentráció-válasz összefüggést állítsunk elő. Lehetőség van arra, hogy a hatásadatok – például probit-, logit- vagy Weibull-modell (8) szerinti – linearizációs transzformálását követően súlyozott lineáris regressziót végezzünk, de előnyösebb inkább nemlineáris regressziót alkalmazni, mert ez jobban kezeli az adatok elkerülhetetlen irregularitását és a sima eloszlástól való eltérést. A nulla és a teljes gátlás környezetében az irregularitást a transzformáció felnagyíthatja, ami a számítás szempontjából előnytelen (8). Meg kell jegyezni, hogy a transzformációval kapott probit, logit vagy Weibull egységeket használó szabványos elemzési módszerek kvantált adatok (pl. halálozás vagy túlélés) használatára vannak tervezve, és a szaporodási adatokkal vagy az élőanyagra vonatkozó adatokkal való alkalmazásukhoz módosítani kell őket. Az ECx-értékek folytonos adatokból való számítására alkalmas módszereket a (9), (10) és (11) irodalom ismertet. A nem lineáris regresszió használatáról a 5. függelékben található részletesebb információ.

55.

Az ECx értékek pontbecsléseinek kiszámításához a koncentráció-válasz összefüggést kell használni minden elemzendő hatásváltozóra. Ha lehetséges, meg kell határozni az egyes becslések 95 %-os konfidenciahatárát. A hatásadatok regressziós modellhez illeszkedésének jóságát grafikus vagy statisztikai módszerrel kell megállapítani. A regressziószámítást az egyes vizsgálati edényeken nyert értékekkel, nem pedig a vizsgálati csoportok középértékével kell elvégezni. Ha azonban a nem lineáris görbeillesztés bonyolult vagy nem sikerül az adatok túl nagy szórása miatt, a problémát meg lehet kerülni a csoportátlagok regresszióanalízésével, ami egy gyakorlati mód a feltehető érvénytelen adatpontok hatásának csökkentésére. Ennek a lehetőségnek a használatát a szokásos eljárástól való eltérésként fel kell tüntetni a mérési jegyzőkönyvben, hivatkozva arra, hogy a görbeillesztések az egyedi ismétléseknél kapott adatokkal nem adtak jó eredményt.

56.

Ha a rendelkezésre álló regressziós modellek/módszerek nem alkalmasak a konkrét adatok elemzésére, az EC50-re vonatkozó becsléseket és a konfidenciahatárokat »bootstrap« technikával együtt alkalmazott lineáris interpolációval (13) is előállíthatjuk.

57.

Az LOEC és ennélfogva az NOEC becsléséhez is, illetve a vizsgált vegyi anyag által a szaporodási sebességre gyakorolt hatásnak a becsléséhez szórásnégyzet-elemzési (ANOVA) eljárások segítségével össze kell hasonlítani a kezelt csoport átlagait. Az egyes koncentrációkhoz tartozó középértékeket ezután alkalmasan megválasztott többszörös összehasonlító módszerrel vagy trendpróbával a kontrollcsoporton nyert középértékhez hasonlítjuk. A Dunnett- vagy a Williams-féle módszer használható lehet erre a célra (12)(14)(15)(16)(17). Lényeges ellenőrizni, hogy fennáll-e az ANOVA-nak a szórásnégyzetek homogenitására vonatkozó feltevése. Ezt az ellenőrzést grafikusan vagy formális próbával (17) végezhetjük. A Levene- és Bartlett-féle próbák megfelelőek ehhez. Ha a szórásnégyzet homogenitásának követelménye nem teljesül, az néha az adatok logaritmikus transzformációjával korrigálható. Ha a szórásnégyzetek heterogenitása túlságosan szélsőségesnek bizonyul, és transzformációval nem javítható, akkor célszerű megfontolni például a lépésenkénti Jonkheere-trendpróba alkalmazását. Az NOEC meghatározásához további útmutatást ad a (11) irodalom.

58.

Az újabb keletű tudományos eredmények az NOEC-koncepció elhagyásának ajánlásához és az ECx regresszión alapuló pontbecsléssel történő meghatározásával való helyettesítéséhez vezettek. Ehhez az algavizsgálathoz még nem állapítottak meg megfelelő x értéket. A 10–20 %-os tartomány azonban megfelelőnek tűnik (a választott hatásváltozótól függően), és célszerű mind az EC10-et, mind az EC20-at megadni a mérési jegyzőkönyvben.

Szaporodásstimuláció

59.

Kis koncentrációk mellett néha szaporodásstimuláció (negatív gátlás) figyelhető meg. Ezt vagy a hormesis (kétfázisú reagálás) jelensége (»toxikus anyag által kiváltott stimuláció«), vagy a vizsgált anyaggal együtt az alkalmazott ásványi sókat tartalmazó tápoldatba került szaporodásserkentő tényezők okozhatják. Megjegyzendő, hogy a szervetlen tápanyagok hozzáadásának nem lehet semmilyen közvetlen hatása, mert a kísérleti oldatnak a kísérlet folyamán végig feleslegben kell tartalmaznia a tápanyagot. Kis dózisú stimuláció gyakran figyelmen kívül hagyható az EC50 kiszámítása során, hacsak mértéke nem rendkívül nagy. Ha azonban rendkívül nagy mértékű, vagy pedig kis x értékre kell ECx-et számítani, akkor speciális eljárásokra lehet szükség. Lehetőség szerint kerülni kell a stimulációs hatások törlését az adatelemzésből, és ha a rendelkezésre álló görbeillesztő szoftver nem képes kezelni a kisebb mértékű stimulációkat, akkor visszatevéses mintavétellel (»bootstrap« módszer) együtt alkalmazott lineáris interpoláció használható. Ha a stimuláció rendkívül nagy, akkor mérlegelni lehet hormesismodell alkalmazását (18).

Nem toxikus növekedésgátlás

60.

A fényt abszorbeáló anyagok a szaporodási sebesség csökkenését okozhatják, hiszen az árnyékolás csökkenti a kapott fény mennyiségét. Az ilyen jellegű fizikai hatásokat a kísérleti körülmények módosításával el kell választani a toxikus hatásoktól, és az előbbit külön kell dokumentálni. Útmutatás a (2) és (3) szakirodalmi hivatkozásban található.

VIZSGÁLATI JEGYZŐKÖNYV

61.

A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

 

Vizsgált vegyi anyag:

fizikai jelleg és a vonatkozó fizikai és kémiai tulajdonságok, beleértve a vízoldhatósági határértéket is,

kémiai azonosító adatok (pl. CAS-szám), tisztaság (szennyeződések).

 

A vizsgálathoz felhasznált faj:

a törzs, a szállító vagy az eredet, és az alkalmazott tenyésztési körülmények.

 

Vizsgálati körülmények:

a vizsgálat megkezdésének időpontja és időtartama;

a kísérlet kivitelezésének leírása: kísérleti eszközök, a tenyészetek mennyisége, az élőanyag sűrűsége a vizsgálat kezdetén;

a tápoldat összetétele;

kísérleti koncentrációk és ismétlések (pl. ismétlések száma, kísérleti koncentrációk száma és az alkalmazott mértani sor);

a kísérleti oldatok készítésének leírása, beleértve az oldószerek használatát stb.

tenyésztőkészülék;

fényerő és -minőség (fényforrás, homogenitás);

hőmérséklet;

kísérleti koncentrációk: a névleges kísérleti koncentrációk és a lombikokban lévő vizsgált vegyi anyag koncentrációjának meghatározására szolgáló analízisek eredménye. A vizsgálati mátrixra vonatkozóan a mérési jegyzőkönyvben fel kell tüntetni a módszer visszanyerési hatékonyságát és a mennyiségi meghatározás határértékét;

minden eltérés ettől a vizsgálati módszertől;

az élőanyag tömegének meghatározási módszere, valamint a mért paraméter és a száraz tömeg közötti korreláció bizonyítéka;

 

Eredmények:

pH-értékek minden kezelés kezdetén és végén;

az élőanyag tömege minden lombikban és minden mérési pontban, valamint az élőanyag mérésének módszere;

szaporodási görbék (az élőanyag mennyiségének ábrázolása az idő függvényében);

hatásváltozók számított értéke minden kezelt ismétlésre, továbbá az ismétlések középértéke és szórásnégyzete;

a koncentráció-válasz összefüggés grafikus ábrázolása;

toxicitásbecslés a hatásváltozókra, pl. EC50, EC10, EC20 és a kapcsolódó konfidenciaintervallumok. Az LOEC és az NOEC, ha ezek kiszámítása megtörtént, és a meghatározásukhoz használt statisztikai módszerek;

ANOVA alkalmazása esetén a hatás kimutatásának mérethatára (például a legkisebb szignifikáns különbség);

a vizsgálatok során észlelt esetleges növekedésserkentés;

bármilyen más észlelt hatás, például az algák morfológiai változása;

az eredmények szöveges elemzése, beleértve az e vizsgálati módszertől való eltérések vizsgálat kimenetelére gyakorolt hatását.

IRODALOM

(1)

Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (1993). ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (1998). ISO/DIS 14442 Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(4)

Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1. függelék

Fogalommeghatározások

E vizsgálati módszerben az alábbi definíciók és rövidítések használatosak:

Élőanyag : egy populációban jelen lévő élő anyag száraz tömege egy adott mennyiségben kifejezve; pl. mg alga/liter vizsgálati oldat. Általában az »élőanyag« tömegként van definiálva, de ebben a vizsgálatban a szó »tömeg/térfogat«-ot jelent. Szintén ebben a vizsgálatban az élőanyag tömege helyett jellemzően sejtszám, fluoreszcencia stb. mérése történik, és az »élőanyag« kifejezés használata így ezekre a helyettesítő mérőszámokra is utal.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Variációs együttható (CV): egy paraméter változékonyságának dimenzió nélküli mérőszáma; definíció szerint a szórás és az átlag aránya. Ezt százalékos formában is ki lehet fejezni. A kontroll ismétlésekben az átlagos fajlagos szaporodási sebesség átlagos variációs együtthatóját az alábbiak szerint lehet kiszámítani:

1.

Ki kell számítani az átlagos fajlagos szaporodási sebesség %-os variációs együtthatóját a naponkénti/szakaszonkénti szaporodási sebességekből a megfelelő ismétlésekre;

2.

Ki kell számítani az 1. pontban kiszámított összes érték átlagát, ami megadja a kontroll ismétlésekben a naponkénti/szakaszonkénti átlagos fajlagos szaporodási sebesség átlagos variációs együtthatóját.

ECx : a vizsgálati oldatban oldott vizsgált vegyi anyag olyan koncentrációja, ami meghatározott expozíciós idő alatt (ha eltér a teljes vagy szokásos kísérleti időtartamtól, akkor pontosan meg kell adni) a vizsgált organizmus x %-os (pl. 50 %) szaporodásgátlását eredményezi. Hogy egyértelmű legyen, hogy az EC értékét a növekedési sebességből vagy a szaporulatból nyertük-e, növekedési sebesség esetén »ErC«-t, szaporulat esetén pedig »EyC«-t írunk.

Tápoldat : az a teljes mesterséges tenyésztő közeg, amelyben a vizsgált algák a vizsgált vegyi anyag jelenlétében szaporodnak. A vizsgált vegyi anyag általában oldott formában van jelen a vizsgálati oldatban.

Növekedési sebesség (átlagos fajlagos növekedési sebesség): az élőanyagtömeg logaritmikus növekedése az expozíciós idő alatt.

Észlelhető hatást okozó legkisebb koncentráció (LOEC) : az a legkisebb vizsgált koncentráció, amely mellett adott expozíciós idő alatt a vegyi anyag statisztikailag szignifikáns mértékben (p < 0,05) csökkenti a növekedést a kontrolltenyészethez képest. Az LOEC felett ugyanakkor minden koncentrációnak legalább akkora káros hatást kell eredményeznie, mint amelyet az LOEC okoz. Ha ez a két feltétel nem elégíthető ki, az LOEC (és így az NOEC) megválasztását részletesen indokolni kell.

Észlelhető hatást még nem okozó koncentráció (NOEC) : az a vizsgált koncentráció, amely közvetlenül az LOEC alatt helyezkedik el.

Hatásváltozó : a toxikus hatás becslésére használt változó, amely különböző számítási módokkal az élőanyag leírására szolgáló bármelyik mért paraméterből levezethető. Ebben a vizsgálati módszerben a hatásváltozók a szaporodási sebesség, illetve a szaporulat, amelyek közvetlenül az élőanyag mérésével, vagy pedig az említett helyettesítő mérőszámok valamelyikének mérésével kaphatók meg.

Fajlagos szaporodási sebesség : egy mérési paraméter (ebben a vizsgálati módszerben az élőanyag mennyiségének változása) természetes alapú logaritmusainak különbségéből és a változáshoz tartozó időtartamból képzett hányadosként definiált hatásváltozó.

Vizsgált vegyi anyag : az e vizsgálati módszerrel vizsgált bármely anyag vagy keverék.

Szaporulat : az élőanyag vizsgálat alatti mennyiségi növekedésének a kifejezésére használt mérési változó értéke; az expozíciós idő végén mért változóérték mínusz az expozíciós idő kezdetén mért változóérték.

2. függelék

A vizsgálathoz bizonyítottan alkalmas törzsek

Zöldalgák

 

Pseudokirchneriella subcapitata, (régebbi elnevezéssel Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (régebbi elnevezéssel Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG

Kovamoszatok

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Cianobaktériumok

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

A törzsek eredete

Az ajánlott törzsek egyfajú algatenyészetként beszerezhetőek az alábbi törzsgyűjteményekből (ábécésorrendben):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

Egyesült Államok

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

Egyesült Királyság

 

SAG: Sammlung von Algenkulturen

Albrecht-von-Haller-Institut

Universität Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

NÉMETORSZÁG

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

Egyesült Államok

A javasolt fajok fenotípusa és jellemzői

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Jellemzők

Hajlott, csavart egyedi sejtek

Ovális, főként egyedi sejtek

Pálcák

Ovális sejtekből álló fonalak

Pálcák

Méret (hossz x szélesség) μm

8 – 14 × 2 – 3

7 – 15 × 3 – 12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Sejttérfogat (μm3/sejt)

40 – 60 (2)

60 – 80 (2)

40 – 50 (2)

30 – 40 (2)

2,5 (3)

Sejt száraz tömege (mg/sejt)

2 – 3 × 10– 8

3 – 4 × 10– 8

3 – 4 × 10– 8

1 – 2 × 10– 8

2 – 3 × 10– 9

Szaporodási sebesség (4) (nap– 1)

1,5 – 1,7

1,2 – 1,5

1,4

1,1 – 1,4

= 2,0 – 2,4

Egyedi ajánlások a vizsgálathoz ajánlott fajok tenyésztésére és kezelésére

Pseudokirchneriella subcapitata és Desmodesmus subspicatus

Ezeket a zöldalgákat általában könnyű fenntartani különféle tápoldatokban. A megfelelő tápoldatról a tenyészetgyűjteményektől szerezhető be információ. A sejtek általában különállóak, és a sejtsűrűség könnyen mérhető elektronikus részecskeszámlálóval vagy mikroszkóppal.

Anabaena flos-aquae

Törzstenyészet fenntartására számos tápoldat használható. Különösen fontos, hogy megújításkor elkerüljük az egyszeres (batch) tenyészet túlfutását az exponenciális fázison, mert azután már nehéz helyreállítani a tenyészetet.

Az Anabaena flos-aquae fonaltelepekben fejlődik. Ezek mérete a tenyésztési körülményekkel változik. Mikroszkópos vagy elektronikus részecskeszámlálóval végzett élőanyag-meghatározáshoz fontos lehet ezeknek a telepeknek a szétoszlatása.

Részminták ultrahangos kezelése használható a láncok szétoszlatására, hogy csökkenjen a sejtszámlálás változékonysága. A fonalak rövidebb szakaszokra töréséhez szükségesnél hosszabb ultrahangos kezelés roncsolhatja a sejteket. Az ultrahangos kezelés intenzitásának és hosszának minden kezelésnél azonosnak kell lennie.

A változékonyság kompenzálásának elősegítése céljából elegendően nagy számú mezőben kell a számlálást végezni a hemocitométerben (legalább 400 sejt). Ez növeli a mikroszkópos sűrűségmeghatározás megbízhatóságát.

Elektronikus részecskeszámláló használható az Anabaena teljes sejttérfogatának meghatározásához, a sejtfonalak óvatos ultrahangos széttörése után. Az ultrahang energiáját úgy kell beállítani, hogy elkerüljük a sejtek roncsolását.

Örvénykeverő (vortex) segítségével vagy hasonló alkalmas módszerrel biztosítani kell, hogy a lombikok beoltására alkalmazott algaszuszpenzió megfelelően el legyen keverve és homogén legyen.

A lombikokat kb. 150/perc fordulatszámú körpályás, vagy lengőmozgású rázóasztalra kell helyezni. Más megoldásként szakaszosan keverés is használható az Anabaena összetapadási hajlamának csökkentésére. Ha összetapadás történik, ügyelni kell arra, hogy az élőanyag-mérésekhez szükséges minták reprezentatívak legyenek. Az összetapadt algák szétválasztásához erőteljes keverés lehet szükséges a mintavétel előtt.

Synechococcus leopoliensis

Törzstenyészet fenntartására számos tápoldat használható. A megfelelő tápoldatról a tenyészetgyűjteményektől szerezhető be információ.

A Synechococcus leopoliensis különálló pálca alakú sejtek formájában szaporodik. A sejtek nagyon kicsik, ami megnehezíti az élőanyag-meghatározáshoz szükséges mikroszkópos sejtszámlálást. Jól használhatók a kb. 1 μm méretű részecskék számlására alkalmas elektronikus részecskeszámlálók. In vitro fluorometriai mérések szintén alkalmazhatóak.

Navicula pelliculosa

Törzstenyészet fenntartására számos tápoldat használható. A megfelelő tápoldatról a tenyészetgyűjteményektől szerezhető be információ. Figyelni kell arra, hogy a tápoldatban lennie kell szilikátnak.

A Navicula pelliculosa bizonyos körülmények között telepeket hozhat létre. A lipidtermelés következtében az algasejtek néha hajlamosak rétegekben összegyűlni a felszínen. Ilyen körülmények között az élőanyag mennyiségének meghatározásához leveendő minták esetében speciális intézkedések szükségesek ahhoz, hogy a minták reprezentatívak legyenek. Erőteljes rázás, pl. örvénykeverő használata lehet szükséges.

3. függelék

Tápoldatok

A következő két tápoldat egyike használható:

OECD-tápoldat: Az OECD 201. vizsgálati iránymutatásában használt eredeti tápoldat, megfelel az ISO 8692-nek is.

Az USA Környezetvédelmi Hatóságának (EPA) AAP-tápoldata, megfelel az ASTM-nek is.

Ezeknek a tápoldatoknak az elkészítése során laboratóriumi reagenseket vagy analitikai tisztaságú vegyszereket, és ionmentesített vizet kell használni.

Az AAP-tápoldat (USA EPA) és az OECD 201. vizsgálati iránymutatásában használt tápoldat összetétele.

Összetevő

AAP

OECD

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 ·6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2·2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4·7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3·6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA·2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2·4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2·6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4·2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2·2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

Az EDTA-vas mólarány kissé nagyobb 1-nél. Ez megakadályozza a vas kicsapódását, és ugyanakkor a kelátképződés a nehézfém-ionokkal a lehető legkisebb lesz.

A Navicula pelliculosa kovamoszattal végzett vizsgálat során mindkét tápoldathoz Na3SiO3·9H20-t kell adni úgy, hogy a koncentráció 1,4 mg Si/l legyen.

A tápoldat pH-ját akkor kell mérni, amikor egyensúly van az oldat karbonáttartalma és a környezeti levegőben lévő CO2 parciális nyomása között. Közelítő összefüggés a 25 °C-on mért pH és a moláris bikarbonátkoncentráció között:

pHeq = 11,30 + log[HCO3]

15 mg NaHCO3/l-rel pHeq = 7,5 (EPA-tápoldat), és 50 mg NaHCO3/l-rel pHeq = 8,1 (OECD-tápoldat).

A kísérleti oldatok elemi összetétele

Elemek

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Az OECD-tápoldat elkészítése

Tápanyag

Koncentráció a törzsoldatban

1.

törzsoldat: makrotápanyagok

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

2. törzsoldat:

vas

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

3. törzsoldat:

nyomelemek

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

4. törzsoldat:

bikarbonát

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 ·9H20

 

A törzsoldatokat membránszűréssel (átlagos pórusátmérő 0,2 μm ) vagy autoklávban (120 °C, 15 perc) sterilizálni kell. Az oldatokat 4 °C-on, sötét helyen kell tárolni.

A 2. és 4. törzsoldatokat nem szabad autoklávban kezelni, hanem membránszűréssel kell őket sterilizálni.

Készítsük el a tápoldatot az 1–4. törzsoldatokból vett megfelelő térfogatok és víz összekeverésével:

 

Adjunk kb. 500 ml sterilizált vízhez:

 

10 ml-t az 1. törzsoldatból

 

1 ml-t az 2. törzsoldatból

 

1 ml-t az 3. törzsoldatból

 

1 ml-t az 4. törzsoldatból

 

Töltsük fel az oldatot 1 000 ml-re sterilizált vízzel.

Várjuk meg, hogy a tápoldat egyensúlyba kerüljön a környezetben lévő CO2-vel, szükség esetén buborékoltassunk át az oldaton steril, szűrt levegőt néhány órán keresztül.

Az EPA-tápoldat elkészítése

1.

Adjunk a 2.1–2.7. pontban felsorolt törzsoldatok mindegyikéből 1-1 ml-t kb. 900 ml ionmentesített vagy desztillált vízhez, majd hígítsuk fel 1 literre.

2.

A makrotápanyagok törzsoldatainak készítéséhez oldjuk fel az alábbiakat 500 ml ionmentesített vagy desztillált vízben. A 2.1., a 2.2., a 2.3. és a 2.4. pontban szereplő reagensek egyesíthetők egy törzsoldatba.

2.1

NaNO3

12,750 g.

2.2

MgCl2·6H2O

6,082 g.

2.3

CaCl2·2H2O

2,205 g.

2.4

Mikrotápanyagok törzsoldata (lásd a 3. pontot).

2.5

MgSO4·7H2O

7,350 g.

2.6

K2HPO4

0,522 g.

2.7

NaHCO3

7,500 g.

2.8

Na2SiO3·9H2O

Lásd az 1. megjegyzést.

1. megjegyzés: Csak kovamoszatfajokhoz alkalmazandó. Beadható közvetlenül (202,4 mg) vagy törzsoldat formájában úgy, hogy 20 mg/l Si legyen a tápoldatban a végkoncentráció.

3.

A mikrotápanyagok törzsoldatának elkészítéséhez oldjuk fel az alábbiakat 500 ml ionmentesített vagy desztillált vízben:

3.1

H3BO3

92,760 mg.

3.2

MnCl2·4H2O

207,690 mg.

3.3

ZnCl2

1,635 mg.

3.4

FeCl3·6H2O

79,880 mg.

3.5

CoCl2·6H2O

0,714 mg.

3.6

Na2MoO4·2H2O

3,630 mg.

3.7

CuCl2·2H2O

0,006 mg.

3.8

Na2EDTA·2H2O

150,000 mg. [Dinátrium-(etiléndinitrilo)tetraacetát].

3.9

Na2SiO4·9H2O

0,005 mg Lásd a 2. megjegyzést.

2. megjegyzés: Csak kovamoszatfajok törzstenyészetének tápoldatában alkalmazandó.

4.

Állítsa be a pH-t 7,5 ± 0,1 értékre 0,1 N vagy 1,0 N NaOH-dal vagy HCl-dal.

5.

Szűrje a tápközeget steril edénybe, vagy 0,22 μm-os membránszűrőn, ha részecskeszámlálót használ, vagy 0,45 μm-os szűrőn, ha nem részecskeszámlálót használ.

6.

Felhasználásig tárolja a tápoldatot sötét helyen, kb. 4 °C-on.

4. függelék

Példa algatenyésztési eljárására

Általános megjegyzések

Az alábbiakban ismertetett eljárások alapján végzett tenyésztés célja a toxicitásvizsgálatokhoz használható algatenyészetek létrehozása.

Az algatenyészetek bakteriális fertőződésének elkerülése érdekében megfelelő módszereket kell használni. Tiszta (axenikus) tenyészetek kívánatosak lehetnek, de egyfajú algatenyészeteket kell létrehozni és felhasználni.

Minden beavatkozást steril körülmények között kell végezni, elkerülendő a baktériumokkal, vagy más algákkal történő szennyeződést.

Eszközök és anyagok

Lásd a vizsgálati módszer alatt: Eszközök.

Eljárások algatenyészetek előállításához

Tápoldatok készítése:

A tápoldat minden tápsóját tömény törzsoldatként készítik, és sötét hideg helyen tárolják. Ezeket az oldatokat szűréssel vagy autoklávban sterilizálni kell.

A tápoldat a megfelelő mennyiségű törzsoldat desztillált vízhez való hozzáadásával készül, ügyelve arra, hogy ne történjen befertőződés. Szilárd táptalajhoz 0,8 % agart kell adni.

Törzstenyészet:

A törzstenyészetek kis algatenyészetek, amelyeket rendszeresen friss táptalajba kell oltani azért, hogy kezdeti vizsgált anyagként szolgáljanak. Ha nem használnak rendszeresen tenyészeteket, akkor azokat ferde agarra kell széleszteni. E tenyészeteket minden két hónapban legalább egyszer friss médiumba kell oltani.

A törzstenyészeteket a megfelelő tápoldatot tartalmazó kúpos lombikokban (körülbelül 100 ml-es űrtartalommal) kell szaporítani. Amikor az algákat 20 °C hőmérsékleten inkubálják folyamatos megvilágítás mellett, hetenkénti átoltás szükséges.

Az átoltás során bizonyos mennyiségű »régi« tenyészetet kell átvinni steril pipettákkal egy friss tápfolyadékot tartalmazó lombikba úgy, hogy a gyorsan növekvő fajták esetében a kezdeti koncentráció körülbelül a régi tenyészetnek a századrésze legyen.

Valamely fajta növekedési rátája a növekedési görbe segítségével határozható meg. Ha ez ismert, meghatározható az a sűrűség, amelynek elérésekor a tenyészetet át kell oltani. Ezt azelőtt kell végrehajtani, mielőtt a tenyészet eléri az elpusztulási fázist.

Előtenyészet:

Az előtenyészetnek megfelelő mennyiségű algát kell termelnie, amiket a vizsgált kultúráknál oltóanyagként lehet alkalmazni. Az előtenyészetet a kísérleti körülmények között inkubáljuk és akkor használjuk fel, amikor még exponenciálisan szaporodó fázisban van, szokásosan 2–4 napos inkubációs időszakot követően. Azon algatenyészeteket, amelyek deformálódtak vagy abnormális sejteket tartalmaznak, ki kell dobni.

5. függelék

Adatelemzés nemlineáris regresszióval

Általános szempontok

Az algaszaporodási és más mikrobiológiai szaporodási vizsgálatokban a válasz – az élőanyag növekedése – természeténél fogva folyamatos, azaz metrikus változó. Folyamatsebesség, ha a szaporodási sebességet használjuk, illetve annak idő szerinti integrálja, ha az élőanyag tömegét választjuk. Mindkettő olyan nem kezelt, kontrollismétlésekben fellépő, megfelelő válasz átlagához van viszonyítva, amelyek maximálisan reagáltak az adott körülményekre – az algás vizsgálatoknál ezek közül meghatározó tényező a fény és a hőmérséklet. A rendszer statisztikai eloszlású, azaz homogén, és az élőanyag kontiniumnak tekinthető, nem pedig önálló sejteknek. Ilyen rendszereknél a jellemző válasz szórásnégyzet-eloszlása kizárólag a kísérleti tényezőktől (amelyeket jellemzően a log/normál vagy a normál hibaeloszlás ír le) függ. Ezzel szemben, a jellemző biológiai kísérletek kvantált adatokkal szolgálnak, amelyeknél az önálló organizmusok tűréséről (ami jellemzően binomiális eloszlású) gyakran feltételezik, hogy az a meghatározó komponens a szórásnégyzetben. A kontrollmintában fellépő hatások ekkor nullával, vagy a háttérszinttel egyenlőek.

Egyszerű esetben a normált vagy relatív válasz, r, monoton csökken 1-től (nulla gátlás) 0-ig (100 százalékos gátlás). Megjegyzendő, hogy minden hatással együtt jár egy belső hiba, és hogy a megjelenő negatív gátlások csak véletlen hiba eredményeként számolhatók.

Regressziószámítás

Minták

A regresszióanalízis célja, hogy egy matematikai regressziós függvény – Y=f(C), vagy még gyakrabban F(Z), ahol Z = log C – formájában mennyiségileg leírja a koncentráció-válasz görbét. A függvény inverze, a C = f– 1 (Y), segítségével kiszámíthatók az ECx értékek, köztük az EC50, EC10 és EC20, valamint ezekre a 95 %-os megbízhatósághoz tartozó határok. Több egyszerű matematikai függvény bizonyítottan jól leírja az algákkal végzett szaporodásgátlási vizsgálatokban kapott koncentráció-válasz összefüggéseket. Ilyen függvény például a logisztikai egyenlet, az aszimmetrikus Weibull-egyenlet, és a log/normál eloszlási függvény, amelyek mind szigmoid görbék, melyek aszimptotikusan közelítenek 0-hoz, ha C → 0- hoz, illetve 1-hez, ha C → a végtelenhez.

Újabban ajánlott a folytonos küszöbérték-függvényre alapuló modellek (mint pl. a Kooijman-modell a »populációnövekedés gátlására«, Kooijman és mtsai, 1996) használata, akár az aszimptotikus modellek alternatívájaként. Ez a modell feltételezi, hogy egy adott küszöbérték, EC0+, alatt a koncentrációknak nincs hatása, és ennek a küszöbértéknek a meghatározása a koncentráció-válasz görbe egy, a kezdőpontban nem differenciálható egyszerű folyamatos függvény segítségével történő extrapolációjával és a koncentrációtengely metszésével történik.

Megjegyzendő, hogy az analízis lehet a legkisebb négyzetek összegének módszere (állandó szórásnégyzetet feltételezve), vagy a súlyozott legkisebb négyzetek módszere, ha a szórásnégyzet heterogenitása kompenzálva van.

Eljárás

Az eljárás vázlatosan a következő: Választani kell egy megfelelő függvényt, az Y = f(C) – t, és nem lineáris regresszióval rá kell illeszteni az adatpontokra. Lehetőség szerint az egyes lombikokból származó méréseket használjuk, ne pedig az ismétlések átlagait, hogy a lehető legtöbb információt nyerjük ki az adatokból. Ha viszont a szórásnégyzet értéke nagy, akkor a gyakorlati tapasztalatok azt mutatják, hogy az ismétlések átlagai szilárdabb matematikai becslést eredményezhetnek, amelyet csak kevéssé befolyásolnak az adatokban meglévő véletlen hibák, mint a minden egyes megtartott adatpont használata.

Az illesztett görbe és a mért adatok megszerkesztése után meg kell vizsgálni, hogy a görbe illeszkedése megfelelő-e. A különbségek elemzése különösen hasznos eszköz lehet erre a célra. Ha a koncentráció-válasz pontokra való illesztéshez választott függvény nem írja le jól a teljes görbét, vagy annak egy adott, alapvetően fontos részét – mint például a kis koncentrációknál jelentkező hatásokat –, akkor egy másik illesztési megoldást kell választani, a szimmetrikus helyett például aszimmetrikus görbét, mint pl. a Weibull-függvényt. Negatív gátlás esetén probléma lehet például a logaritmikus/normál eloszlási függvénnyel, ekkor szintén egy másik regressziófüggvényt kell használni. Az ilyen negatív értékek nullával vagy kis pozitív számmal történő helyettesítése nem ajánlott, mert torzítja a hibaeloszlást. Célravezetőbb lehet másik illesztést használni az érintett szakaszokra – például arra, ahol a szaporodásgátlás kismértékű –, egy adott EClowx érték meghatározása céljából. Az illesztési egyenletből ki kell számítani (inverz számítással, C = f– 1 (Y)) az ECx jellemző pontértékeit, és a mérési jegyzőkönyvben meg kell adni legalább az EC50-re és egy vagy két EClowx-re kapott értékeket. A gyakorlati tapasztalat azt mutatja, hogy az algás vizsgálatok pontossága általában elfogadhatóan pontos becslést tesz lehetővé 10 %-os gátlási szinten, ha van elég adatpont – kivéve, ha zavaró tényezőként stimuláció fordul elő kis koncentrációknál. Az EC20-becslés pontossága gyakran lényegesen jobb, mint az EC10-é, mert az EC20 rendszerint a koncentráció-válasz görbe középső, közelítőleg lineáris szakaszára esik. A szaporodásstimuláció miatt néha nehéz az EC10-et értelmezni. Összefoglalva, noha az EC10 általában kielégítő pontossággal meghatározható, mindig ajánlott az EC20 feltüntetése is a mérési jegyzőkönyvben.

Súlyozó tényezők

A tapasztalati szórásnégyzet általában nem állandó, és rendszerint tartalmaz egy proporcionális tagot, ezért előnyős rutinszerűen súlyozott regressziót végezni. Az ilyen analízishez használt súlyozó tényezők általában fordítottan arányosak a szórásnégyzettel:

Wi = 1/Var(ri)

Sok regresszióelemző programban lehetőség van a súlyozott regresszióanalízisre úgy, hogy a súlyozó tényezők egy táblázatban vannak felsorolva. Kényelmi szempontból a súlyozó tényezőket célszerű normálni, megszorozva őket n/Σ wi-vel (ahol n az adatpontok száma), hogy az összegük egyenlő legyen 1-gyel.

A hatásváltozók normálása

A kontrollmintával kapott hatások átlagával történő normálás elvi problémákat vet fel és meglehetősen bonyolult szórásnégyzet-szerkezethez vezethet. Ha a szaporodásgátlás százalékos meghatározásához a kapott hatásértékeket elosztjuk a kontrollmintával kapott hatások átlagával, további hibát viszünk be, amit a kontrollminta átlagának hibája okoz. Ha ez a hiba nem elhanyagolhatóan kicsi, akkor a regresszióhoz és a megbízhatósági határokhoz használt súlyozó tényezőket korrigálni kell a kontrollminták kovarianciájával (Draper és Smith, 1981). Megjegyzendő, hogy nagyon fontos a kontrollmintákkal kapott hatásértékek becsült átlagának a pontossága, hogy a lehető legkisebb legyen a relatív válasz általános szórásnégyzete. Ez a szórásnégyzet a következő:

(az i alsó index az i-dik koncentrációkat, a 0 alsó index pedig a kontrollmintákat jelöli)

Yi = Relatív hatás = ri/r0 = 1 – I = f (Ci)

Var(Y i) = Var ( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0) szórásnégyzettel

és mivel (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 and (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2

normál eloszlású adatoknál és mi és m0 ismétlésekkel: Var(ri ) = σ2/mi

a relatív hatás, Yi, teljes szórásnégyzete így a következő:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 ·mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

A kontrollminták átlagának hibája fordítottan arányos az átlagolt kontroll ismétlések számának négyzetgyökével, és néha indokolt lehet régebbi adatok is felhasználni és így nagymértékben csökkenteni a hibát. Más megoldásként mellőzhető az adatok normálása és az illesztést az abszolút hatásértékekre kell elvégezni, beleértve a kontrollminta hatásadatait is, de ekkor újabb paraméterként be kell vezetni a kontrollminta hatásértékét, amelyre nem lineáris regresszióval el kell végezni az illesztést. A szokásos 2-paraméteres regresszióegyenlet esetén ehhez a módszerhez 3 paraméter illesztése szükséges, és így több adatpontot igényel, mint az előre beállított kontrollminta-válasz segítségével normált adatokon végzett nem lineáris regresszió.

Inverz konfidenciaintervallumok

A nem lineáris regresszió konfidenciaintervallumainak inverz becsléssel történő kiszámítása meglehetősen bonyolult és a szokásos statisztikai számítógépes programcsomagokban ez a lehetőség nem is áll rendelkezésre. A körülbelüli megbízhatósági határok megkaphatók szokásos nem lineáris regressziós programmal, a paraméterek megváltoztatásával (Bruce és Versteeg, 1992), ami a matematikai egyenletnek az átírását jelenti a kívánt pontbecslésekkel, pl. az EC10-zel és az EC50-nel mint megbecsülendő paraméterekkel. (Legyen a függvény I = f (α, β, koncentráció) és a definiáló egyenletek, f (α, β, EC10) = 0,1 és f (α, β, EC50) = 0,5 felhasználásával helyettesítsük be az f (α, β, koncentráció) függvényt egy ekvivalens g (EC10, EC50, koncentráció) függvénnyel.

Közvetlenebb számítás (Andersen és mtsai, 1998) végezhető az eredeti egyenlet megtartásával és az ri és r0 átlagok körüli Taylor-sorfejtés felhasználásával.

Újabban a visszatevéses mintavételes (bootstrap) módszerek váltak népszerűvé. Ezek a módszerek mért adatokat, és véletlenszám-generátor által irányított gyakori mintavételt használnak a tapasztalati szórásnégyzet eloszlásának becslésére.

HIVATKOZÁSOK

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R..D. and Versteeg,, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

4.

A C.11. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

C.11.   ELEVENISZAP LÉGZÉSGÁTLÓ HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA (SZÉN ÉS AMMÓNIUM OXIDÁCIÓJA)

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 209. vizsgálati iránymutatásában (2010) leírt módszerrel. Ez a vizsgálati módszer egy olyan módszert ír le, amellyel úgy mutatható ki valamely vegyi anyag hatása az eleveniszapból származó mikroorganizmusok (főként baktériumok) működésére, hogy meghatározott körülmények között a vizsgált vegyi anyag különböző koncentrációinak jelenlétében mérik a légzés sebességét (szén és ammónium oxidációja). A vizsgálati módszer az ETAD (a festékanyag gyártóipar ökológiai és toxikológiai egyesülete) vizsgálatán (1) (2), az OECD korábbi 209. vizsgálati iránymutatásán (3) és a módosított ISO 8192 szabványon (4) alapul. A vizsgálat célja, hogy gyors szűrést tegyen lehetővé a vegyi anyagok azon hatásának értékelésére, amelyet a szennyvízkezelő telepek eleveniszapos biológiai (aerob) szakaszában közreműködő mikroorganizmusokra gyakorolnak. A vizsgálati eredmények a vizsgált vegyi anyagok biológiai lebonthatósági vizsgálatok során használandó megfelelő, nem gátló koncentrációinak indikátoraként is szolgálhatnak (például e melléklet C.4. A–F, C.9., C.10., C12. és C29. fejezetei, az OECD 302C. vizsgálati iránymutatása). Ebben az esetben a vizsgálatot – a koncentrációtartomány-meghatározási vagy határérték-vizsgálathoz hasonlóan (lásd a 39. pontot) – szűrővizsgálatként is lehet végezni, kizárólag a teljes légzést figyelembe véve. Ezt az információt azonban óvatosan kell kezelni a gyors biológiai lebonthatósági tesztek esetében (e melléklet C.4. A–F és C.29. fejezetei), amelyeknél az oltóanyag koncentrációja lényegesen alacsonyabb, mint az e vizsgálati módszerben használt koncentráció. Sőt, a gátlásnak az ebben a légzési vizsgálatban megfigyelt hiánya nem jelent automatikusan nem gátló feltételeket az e melléklet C.4. A–F és C.29. fejezetében tárgyalt gyors biológiai lebonthatósági vizsgálatban.

2.

Összességében úgy tűnik, hogy a légzésgátlási vizsgálatot első megjelenése óta sikerrel alkalmazzák, de néhány alkalommal hamis eredményeket jelentettek, pl. (2) (4) (5). A koncentrációval összefüggő légzési görbék néha kétfázisúak, a dózis-válasz görbék eltorzultak és az EC50-értékek váratlanul alacsonyak voltak (5). A vizsgálatok azt mutatták, hogy ilyen eredmények akkor adódnak, ha a vizsgálatban használt eleveniszap jelentős mértékben nitrifikál, és a vizsgált vegyi anyag nagyobb hatást gyakorol az ammónium oxidációjára, mint az általános heterotróf oxidációra. Ezért ezeket a hamis eredményeket úgy lehet leküzdeni, ha a nitrifikáció egy specifikus inhibitora segítségével további vizsgálatokat végeznek. Ha az oxigénfelvételi arányokat egy ilyen inhibitor, pl. N-allil-tiokarbamid (ATU) jelenlétében és anélkül mérik, külön kiszámítható a teljes, a heterotróf és a nitrifikációs oxigénfelvételi arány (4) (7) (8). Így meg lehet határozni a vizsgált vegyi anyagnak a két folyamatra gyakorolt gátló hatásait, és a szerves szén oxidáció (heterotróf) és az ammónium-oxidáció (nitrifikáció) EC50-értéke a szokásos módon számítható. Meg kell jegyezni, hogy bizonyos ritka esetekben az N-allil-tiokarbamid gátló hatása részlegesen vagy teljesen semlegesítődhet a vizsgált vegyi anyagokkal vagy a tápoldat-kiegészítőkkel, pl. Cu++-ionokkal történő komplexképződés eredményeként (6). A Cu++-ionok elengedhetetlenek a Nitrosomonas baktériumok esetében, de nagyobb koncentrációban toxikusak.

3.

A szennyvíz aerob kezelése során történő nitrifikáció, amely a nitrogénvegyületek szennyvizekből – a gáz halmazállapotú termékek denitrifikációja által – történő eltávolításának egy szükséges lépése, egyre sürgetőbbé vált, különösen az európai országokban; az EU most alacsonyabb határértéket határozott meg a befogadó vizekbe kibocsátott kezelt szennyvizek nitrogénkoncentrációja tekintetében (5).

4.

A legtöbb esetben a szerves szén oxidációs folyamataira gyakorolt hatás értékelésére szolgáló módszer önmagában elegendő. Ugyanakkor bizonyos esetekben kizárólag a nitrifikációra gyakorolt hatás vizsgálatára, vagy külön-külön a nitrifikációra és a szerves szén oxidációjára gyakorolt hatás vizsgálatára van szükség az eredmények értelmezése és a hatások megértése érdekében.

A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

5.

Szintetikus szennyvízzel táplált eleveniszap-minták légzési sebességét mérik egy oxigén-elektródot tartalmazó zárt cellában, háromórás érintkezési időt követően. A reális expozíciós forgatókönyv mérlegelése alapján hosszabb érintkezési időre lehet szükség. Ha a vizsgált vegyi anyag gyorsan lebomlik, pl. abiotikusan hidrolízis útján, vagy illékony, és a koncentrációját nem lehet megfelelően fenntartani, rövidebb expozíciós időt (pl. 30 perc) lehet használni. Az egyes eleveniszap-sorozatok érzékenységét az expozíció napján megfelelő referencia-vegyianyaggal ellenőrizni kell. A vizsgálatot általában a vizsgált vegyi anyag ECx-értékének (pl. EC50) és/vagy az észlelhető hatást még nem okozó koncentrációnak (NOEC) a meghatározásához használják.

6.

Az oxigénfelvétel mértékének N-allil-tiokarbamid – az ammónium első szintű nitrifikáló baktériumok által nitritté történő oxidációjának specifikus inhibitora – távollétében és jelenlétében történő mérésével a szerves szenet oxidáló mikroorganizmusok oxigénfelvételének gátlását az ammóniumot oxidáló mikroorganizmusok oxigénfelvételének gátlásától elkülönítve is ki lehet fejezni. Ebben az esetben az oxigénfelvétel sebességének százalékos gátlását úgy számítják ki, hogy az oxigénfelvételnek a vizsgált vegyi anyag jelenlétében mutatott sebességét a specifikus inhibitor, az N-allil-tiokarbamid jelenlétében és távollétében egyaránt összehasonlítják a vizsgált vegyi anyagot nem tartalmazó megfelelő kontrollok átlagos oxigénfelvételi sebességével.

7.

Az abiotikus folyamatokból származó oxigénfelvételt úgy lehet kimutatni, hogy a vizsgált vegyi anyagból, szintetikus szennyvíz tápoldatból és vízből álló, eleveniszapot nem tartalmazó keverékben meghatározzák az oxigénfelvételi sebességet.

A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

8.

A vizsgált vegyi anyag azonosítóját (lehetőleg CAS-számát), nevét (IUPAC), tisztaságát, vízben való oldhatóságát, gőznyomását, illékonyságát és adszorpciós jellemzőit ismerni kell ahhoz, hogy az eredményeket megfelelően értelmezni lehessen. Normális esetben az illékony vegyi anyagokat nem lehet megfelelően vizsgálni, kivéve, ha külön óvintézkedések tesznek (lásd a 21. pontot).

A VIZSGÁLATI MÓDSZER ALKALMAZHATÓSÁGA

9.

A vizsgálati módszer vízben oldható, gyengén oldható és illékony vegyi anyagok esetében alkalmazható. Korlátozott oldhatóságú vegyi anyagok esetében azonban előfordulhat, hogy nem mindig lehet megkapni az EC50-értéket, illékony vegyi anyagok esetében pedig érvényes eredményeket csak akkor lehet kapni, ha a vizsgált vegyi anyag nagyobbik része (mondjuk > 80 %) a reakcióelegyben marad az expozíciós periódus(ok) végén. További alátámasztó analitikai adatokat kell benyújtani az ECx koncentráció pontosítása céljából, ha a vizsgált anyag stabilitását vagy volatilitását bizonytalanság övezi.

REFERENCIA-VEGYIANYAGOK

10.

A referencia-vegyianyagokat rendszeres időközönként meg kell vizsgálni a vizsgálati módszer és vizsgálati feltételek megbízhatóságának ellenőrzése érdekében, illetve az expozíció napján ellenőrizni kell a mikrobiális oltóanyagként használt eleveniszap egyes tételeinek érzékenységét. A 3,5-diklór-fenol (3,5-DCP) ajánlott referencia gátló vegyi anyagként, mivel a légzés ismert inhibitora és számos gátlási/toxicitási vizsgálatban használják (4). A réz(II)-szulfát-pentahidrát szintén használható a teljes légzés referencia gátló vegyi anyagaként (9). Az N-metil-anilin a nitrifikáció specifikus referencia-inhibitoraként használható (4).

ÉRVÉNYESSÉGI KRITÉRIUMOK ÉS REPRODUKÁLHATÓSÁG

11.

A vak (vizsgált vegyi anyag vagy referencia-vegyianyag nélküli) kontrollok oxigénfelvételének sebessége nem lehet kevesebb, mint 20 mg oxigén per egy gramm eleveniszap (lebegő szilárd anyagok száraz tömege) óránként. Amennyiben a sebesség alacsonyabb, a vizsgálatot mosott eleveniszappal vagy más forrásból származó iszappal meg kell ismételni. A kontroll ismétlések oxigénfelvételi sebességének variációs együtthatója nem haladhatja meg a 30 %-ot a meghatárzozó vizsgálat végén.

12.

Az ISO által 2004-ben szervezett és háztartási szennyvízből származó eleveniszap felhasználásával végzett nemzetközi körvizsgálatban (4) a 3,5-DCP EC50-értékét a 2–25 mg/l közötti tartományban találták a teljes légzés szempontjából, az 5–40 mg/l tartományban a heterotróf légzés szempontjából, és a 0,1–10 mg/l tartományban a nitrifikációs légzés szempontjából. Ha a 3,5-DCP EC50-értéke nem a várt tartományban helyezkedik el, a vizsgálatot más forrásból származó eleveniszappal meg kell ismételni. A réz(II)-szulfát-pentahidrát EC50-értékének az 53–155 mg/l tartományban kell elhelyezkednie a teljes légzés szempontjából (9).

A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA

Vizsgálati edények és készülékek

13.

A szokásos laboratóriumi berendezéseket, illetve a következő eszközöket kell használni:

a)

Vizsgálati edények – például 1 000 ml-es főzőpoharak az 500 ml reakcióelegy részére (lásd az 5. eszközt az 1. ábrán);

b)

Az oldott oxigén koncentrációjának mérésére szolgáló cella és mellékletei; egy megfelelő oxigén-elektród; egy zárt cella, amely felső üres tér nélkül tartalmazza a mintát, illetve egy érzékelő (pl. a 7., 8. és 9. eszköz a 2. függelék 1. ábráján); alternatív megoldásként egy BOD-palack is használható, amely esetében az oxigén-elektródot egy alkalmas hüvely adapter rögzíti a palack nyakában (lásd a 3. függelék 2. ábráját). Az oxigén-elektród beillesztésekor bekövetkező folyadékvesztés elkerülése érdekében célszerű először egy tölcsért vagy üvegcsövet behelyezni a hüvelybe, vagy kifelé hajló peremű edényt használni. Mindkét esetben mágneses keverőt vagy alternatív keverési módszert, pl. önkeverő szondát kell használni;

c)

Semleges anyaggal bevont mágneses keverők és követők, amelyek a mérőkamrában és/vagy a vizsgálati edényekben használhatók;

d)

Levegőztető berendezés: ha szükséges, sűrített levegőt kell megfelelő szűrőn a por és az olaj eltávolítása, illetve vizet tartalmazó mosó palackokon a levegő nedvesítése érdekében keresztülvezetni. Az edények tartalmát Pasteur-pipettával vagy más, vegyi anyagokat nem adszorbeáló levegőztető eszközzel levegőztetni kell. 150–250 rpm sebességgel üzemeltetett körpályás rázógépet lehet használni például 2 000 ml kapacitású lombikokkal, hogy kielégítsék az iszap oxigénigényét és leküzdjék az olyan vegyi anyagokkal kapcsolatos nehézségeket, amelyek túlzott mennyiségű habot termelnek, illékonyak és ezért elvesznek, vagy nehezen diszpergálhatók, ha levegőöblítéssel levegőztetik őket. A vizsgálati rendszer jellemzően több folyamatosan levegőztetett és egymást követően (pl. kb. 10–15 perces időközönként) létrehozott, majd szekvenciális módon analizált főzőpohárból áll. A levegőztetést és a keverékek oxigénfogyasztási sebességének mérését egtyidejűleg lehetővé tevő validált műszerek is használhatók;

e)

pH-mérő;

f)

Centrifuga, általános asztali centrifuga iszap részére, amely 10 000 m/s2 centrifugális gyorsulásra képes.

Reagensek

14.

Az egész eljárás során analitikai tisztaságú reagenseket kell használni.

Víz

15.

Kevesebb, mint 1 mg/l DOC-t tartalmazó desztillált vagy ionmentesített vizet kell használni, kivéve, ha klórmentes csapvíz van megadva.

Mesterséges szennyvíz tápszer

16.

A közeget úgy kell elkészíteni, hogy az alábbi összetevőket tartalmazza a megadott mennyiségben:

pepton

16 g

húskívonat (vagy hasonló növényi kivonat)

11 g

karbamid

3 g

nátrium-klorid (NaCl)

0,7 g

kalcium-klorid-dihidrát (CaC12, 2H2O)

0,4 g

magnézium-szulfát-heptahidrát (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

vízmentes kálium-monohidrogén-foszfát (K2HPO4)

2,8 g

desztillált vagy ionmentesített vízzel 1 literre feltöltve

 

17.

7,5 (± 0,5) pH-jú oldatot kell kapnunk. Ha az elkészített közeget nem használjuk fel azonnal, sötét helyen 0–4 °C közötti hőmérsékleten legfeljebb egy hétig, vagy olyan körülmények között lehet tárolni, amelyek nem okoznak változást a közeg összetételében. Meg kell jegyezni, hogy ez a szintetikus szennyvíz »A szintetikus detergensekben használt felületaktív anyagok biológiai lebonthatóságának meghatározásához javasolt módszer« című OECD technikai jelentésben (1976. június 11.) megadott recept százszoros koncentrátuma, dikálium-hidrogén-foszfáttal kiegészítve.

18.

Alternatív megoldásként a közeg komponenseit a tárolás előtt egyedileg is sterilizálni lehet, vagy a peptont és a húskivonatot röviddel a vizsgálat elvégzése előtt is hozzá lehet adni. Használat előtt a közeget alaposan meg kell keverni, és ha szükséges, a pH-t 7,5 ± 0,5 értékre kell beállítani.

Vizsgált vegyi anyag

19.

A vízben könnyen oldódó vizsgált anyagok esetében törzsoldatot kell készíteni, de csak a maximális vízoldhatóság mértékéig (csapadék nem fogadható el). A vízben rosszul oldódó anyagokat, a különböző vízoldhatóságú összetevőkből álló keverékeket és az adszorbens anyagokat közvetlenül a vizsgálati edényekbe kell mérni. Ezekben az esetekben törzsoldatok használata is alternatíva lehet, ha a vizsgált vegyi anyagok oldott koncentrációit analitikailag meghatározzák a vizsgálati edényekben (az eleveniszap hozzáadása előtt). Ha vízben oldódó frakciókat (WAF) készítenek, a vizsgált vegyi anyagok oldott koncentrációinak a vizsgálati edényekben történő analitikai meghatározása is elengedhetetlen. A szerves oldószerek vagy diszpergálószerek/emulgeálószerek oldhatóság javítása céljából történő használata kerülendő. A törzsoldatok ultrahangos keverése és a szuszpenziók előkeverése – pl. az éjszaka folyamán – akkor lehetséges, ha elegendő információ áll rendelkezésre a vizsgált vegyi anyag ilyen körülmények között mutatott stabilitása vonatkozásában.

20.

A vizsgált vegyi anyag káros hatással lehet a vizsgálati rendszer pH-jára. A vizsgált vegyi anyaggal kezelt keverékek pH-ját a vizsgálat felállítása előtt – egy előzetes vizsgálat keretében – meg kell határozni annak megállapítása céljából, hogy a fő vizsgálat előtt szükség lesz-e a pH kiigazítására, illetve ismét meg kell határozni a fő vizsgálat napján. A vizsgált vegyi anyag vizes oldatait/szuszpenzióit az oltóanyag hozzáadása előtt semlegesíteni kell, ha szükséges. Mivel azonban a semlegesítés megváltoztathatja a vegyi anyag kémiai tulajdonságait, a vizsgálat céljaitól függően további vizsgálatokat is lehet végezni annak értékelése érdekben, hogy a vizsgált vegyi anyag milyen hatást gyakorol az iszapra a pH beállítása nélkül.

21.

Az illékony vegyi anyagok toxikus hatásai – különösen az olyan vizsgálatokban, amelyben a levegőt buborékoltatnak át a rendszeren – változó hatásszinteket eredményezhetnek az expozíciós idő alatt bekövetkező anyagveszteség miatt. Az ilyen anyagokkal óvatosan kell eljárni, és el kell végezni az anyagot tartalmazó kontrollkeverékek anyagspecifikus elemzését, módosítva a levegőztetést.

Referencia-vegyianyag

22.

Ha 3,5-diklór-fenolt használnak referencia-vegyianyagként, akkor 1,00 g 3,5-diklór-fenolt 1 000 ml vízben feloldva törzsoldatot kell készíteni (15). Meleg vizet és/vagy ultrahangos keverést kell használni az oldódás gyorsítása érdekében, és az oldatot akkor kell feltölteni a megfelelő térfogatra, ha szobahőmérsékletre hűlt. Ugyanakkor azonban biztosítani kell, hogy a referencia-vegyianyag szerkezetileg ne módosuljon. Az oldat pH-ját ellenőrizni kell és szükség esetén NaOH-dal vagy H2SO4-val pH 7-8 értékre ki kell igazítani.

23.

Ha réz(II)-szulfát-pentahidrátot használnak referencia-vegyianyagként, akkor 58 mg/l, 100 mg/l és 180 mg/l (1,8-szeres) koncentrációt használnak. Az anyagot közvetlenül a vizsgálati edényekbe mérlegelik (29–50–90 mg 500 ml teljes térfogathoz). Ezt azután 234 ml autoklávozott csapvízzel feloldják. A réz(II)-szulfát-pentahidrát könnyen oldódik. A vizsgálat kezdetekor 16 ml szintetikus szennyvizet és 250 ml eleveniszapot adnak hozzá.

A nitrifikáció specifikus inhibitora

24.

2,32 g/l koncentrációjú N-allil-tiokarbamid (ATU) törzsoldatot kell készíteni. Ebből a törzsoldatból 2,5 ml hozzáadása az 500 ml végső térfogatú inkubációs elegyhez 11,6 mg ATU/l (10– 4mol/l) végső koncentrációt eredményez, amely köztudottan elegendő ahhoz (4), hogy 100 %-ban gátolja a nitrifikációt az 1,5 g/l lebegő szilárd anyagot tartalmazó nitrifikáló eleveniszapban.

Abiotikus kontroll

25.

Bizonyos ritkán előforduló helyzetekben egy erős redukáló tulajdonságú vizsgált vegyi anyag mérhető abiotikus oxigénfogyasztást okozhat. Ilyen esetekben abiotikus kontrollokra van szükség, hogy meg lehessen különböztetni a vizsgált vegyi anyag abiotikus oxigénfelvételét és a mikrobiális légzést. Abiotikus kontrollokat az oltóanyag vizsgálati keverékekből való kihagyásával lehet előállítani. Oltóanyag nélküli abiotikus kontrollokat lehet akkor is bevonni, ha alátámasztó analitikai méréseket végeznek a vizsgálat expozíciós szakaszában elért koncentráció meghatározására, pl. amikor vízben rosszul oldódó vegyi anyagok törzsoldatait különböző vízoldhatóságú összetevőkkel használják. Meghatározott esetekben sterilizált oltóanyagmal készített abiotikus kontrollra lehet szükség (pl. autoklávban vagy sterilizáló toxikus anyagok hozzáadásával). Néhány vegyi anyag csak akkor termel vagy fogyaszt oxigént, ha a felület elég nagy a reakcióhoz, akkor is, ha általában sokkal magasabb hőmérsékletre vagy nyomásra van szükség ehhez. E tekintetben különös figyelmet kell fordítani a peroxi-vegyületekre. A sterilizált oltóanyag nagy felületet biztosít.

Oltóanyag

26.

Általános használatra az eleveniszapot a levegőztető medence kilépési pontján kell gyűjteni, vagy a kifolyó közelében a tartályból, egy túlnyomórészt háztartási szennyvizet fogadó jól működő szennyvíztisztító telepről. A vizsgálat céljától függően egyéb megfelelő típusú vagy forrásból származó eleveniszap is használható (pl. a laboratóriumban termesztett iszap), ha a szuszpendált szilárd anyag koncentrációja 2–4 g/l. A különböző szennyvízkezelő telepekről származó iszapok azonban más jellegzetességeket és érzékenységet mutathatnak.

27.

Az iszapot begyűjtött állapotában is lehet használni, de a durva részecskéket el kell távolítani, vagy rövid (pl. 5–15 perces) ülepítéssel és a finomabb szilárd anyagokat tartalmazó felső réteg dekantálásával vagy szitálással (pl. 1 mm2 lyukmérettel). Alternatív megoldásként az iszapot turmixgépben kb. 15 másodpercig vagy hosszabb ideig homogenizálni lehet, de óvatosságra van szükség az nyírási erők és a hőmérsékletváltozás miatt, amelyek a hosszú ideig tartó keverés során előfordulhatnak.

28.

Az iszap mosására gyakran szükség van, például ha az endogén légzés alacsony. Az iszapot először egy ideig centrifugálni kell, pl. 10 percen át kb. 10 000 m/s2 centrifugális gyorsuláson, hogy tiszta felülúszót és a szennyvíz szilárd anyagaiból álló üledéket kapjunk. A felülúszó folyadékot el kell távolítani és az iszapot rázatás közben újra kell szuszpendálni klórmentes csapvízben, majd a mosóvizet újbóli centrifugálás és leöntés útján el kell távolítani. A mosási és centrifugálási folyamatot szükség esetén meg kell ismételni. Az ismert térfogatú újraszuszpendált iszap száraz tömegét meg kell határozni, és az iszapot a folyadék eltávolításával be kell töményíteni vagy további kell hígítani klórmentes csapvízzel az iszap kívánt szilárdanyag-koncentrációjának (3 g/l) eléréséig. Az eleveniszapot folyamatosan levegőztetni kell (pl. 2 l/perc) a vizsgálati hőmérsékleten, és lehetőség szerint a gyűjtés napján fel kell használni. Ha ez nem lehetséges, az iszapot naponta táplálni kell szintetikus szennyvíz tápszerrel (50 ml szintetikus szennyvíz tápszer/l eleveniszap) további két napig. Az iszapot ezután fel kell használni a vizsgálathoz és az eredményeket érvényesnek kell tekinteni, feltéve, hogy nem történt jelentős változás az aktivitásában, amelyet az endogén heterotróf és nitrifikációs légzési sebesség alapján kell értékelni.

29.

Nehézségek merülhetnek fel, ha olyan mértékű habképződés lép fel az inkubáció alatt, amelynek következtében a hab és a rajta található szilárd iszaprészecskék eltávoznak a levegőztető edényekből. Esetenként a habzás egyszerűen a szintetikus szennyvíz jelenlétéből ered, de a habzással számolni kell, ha a vizsgált vegyi anyag felületaktív vagy felületaktív anyagot tartalmaz. Az iszap szilárd anyagainak a vizsgálati keverékből való elvesztése mesterségesen lecsökkentett légzési sebességet eredményez, amely tévesen gátlás eredményeként is értelmezhető. Ezen túlmenően, egy felületaktív anyag oldatának levegőztetése a felületaktív anyagot a habrétegben koncentrálja; a hab elvesztése a vizsgálati rendszerből csökkenti az expozíciós koncentrációkat. A habzás egyszerű mechanikai módszerekkel is kontrollálható (pl. alkalmi manuális keverés egy üvegbot segítségével), vagy úgy, hogy felületaktív anyagtól mentes szilikonemulzió habzásgátló szert adnak hozzá és/vagy alkalmazzák a lombikrázásos levegőztető módszert. Ha a probléma a szintetikus szennyvíz jelenlétéhez társul, módosítani kell a szennyvíz összetételét egy habzásgátló reagens pl. 50 μl/l. mennyiségben történő hozzáadásával. Ha a habzást a vizsgált vegyi anyag okozza, a csökkentéséhez szükséges mennyiséget a maximális vizsgált koncentráción kell meghatározni, majd minden egyes levegőztető edényt azonos módon kell kezelni (beleértve például a vak kontrollokat és a referencia edényeket is, ahol nincs hab). Ha habzásgátló anyagokat használnak, az nem léphet kölcsönhatásba az oltóanyagmal és/vagy a vizsgált vegyi anyaggal.

VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

30.

Három különböző oxigénfelvétel gátlását lehet meghatározni: teljes, csak heterotróf és nitrifikáció okozta oxigénfelvétel. Normális esetben elegendő a teljes oxigénfelvétel gátlásának mérése. A szerves szén oxidációjából eredő heterotróf oxigénfelvételre, illetve az ammónium oxidációjából eredő oxigénfelvételre gyakorolt hatások bemutatására akkor van szükség, ha egy adott vegyi anyaggal kapcsolatban specifikus igény merül fel két ilyen különböző végpont iránt vagy (adott esetben) a teljes oxigénfelvétel gátlásáról készült atípusos dózis-válasz görbéket kell megmagyarázni.

Vizsgálati körülmények

31.

A vizsgálatot a 20 ± 2 °C hőmérsékleti tartományban kell elvégezni.

Vizsgálati keverékek

32.

Vizsgálati keverékeket (FT az 1. táblázat szerint) kell készíteni vízből, szintetikus szennyvíz tápszerből és a vizsgált vegyi anyagból úgy, hogy azok a vizsgált vegyi anyag különböző névleges koncentrációit tartalmazzák (térfogatokat és összetevőket tartalmazó példáért lásd az 1. táblázatot). A pH-t 7,5 ± 0,5 értékre kell beállítani, ha szükséges; a keverékeket vízzel fel kell hígítani és az oltóanyagot hozzá kell adni úgy, hogy az edényekben azonos végső térfogatok legyenek és meg lehessen kezdeni a levegőztetést.

Referencia keverékek

33.

A vizsgált vegyi anyag helyett referencia vegyi anyagot, például 3,5-diklór-fenolt tartalmazó keverékeket (FR) kell készíteni a vizsgálati keverékekkel megegyező módon.

Blank (»vak«) kontrollok

34.

Vak kontrollokat (FB) kell készíteni az expozíciós idő elején és végén azokban a vizsgálatokban, amelyekben a vizsgálati főzőpoharak egymás után időközönként vannak beállítva. Az olyan berendezések használatával végzett vizsgálatokban, amelyek lehetővé teszik az oxigénfogyasztás egyidejű mérését, legalább két vak kontrollt kell minden egyidejű vizsgálatra kerülő tételbe bevonni. A vak kontrollok megegyező térfogatú eleveniszapot és szintetikus közeget tartalmaznak, de nem tartalmazzák a vizsgált vegyi anyagot vagy a referencia-vegyianyagot. Ezeket a vizsgált és referencia keverékekkel megegyező térfogatra kell hígítani vízzel.

Abiotikus kontroll

35.

Szükség esetén, például ha a vizsgált vegyi anyagról ismert vagy feltételezik, hogy erős redukáló tulajdonsággal rendelkezik, egy FA keveréket kell készíteni az abiotikus oxigénfogyasztás mérése céljából. A keveréknek a vizsgált keverékekkel megegyező mennyiségű vizsgált vegyi anyagot és szintetikus szennyvíz tápszert kell tartalmaznia és azzal megegyező térfogatúnak kell lennie, de eleveniszapot nem tartalmazhat.

Általános eljárás és mérések

36.

A vizsgálati keverékeket, a referencia keverékeket, valamint a vak és abiotikus kontrollokat a vizsgálati hőmérsékleten, kényszerített levegőztetés körülményei között (0,5–1 l/perc) inkubálják, hogy az oldott oxigén koncentrációja a 60–70 %-os telítettség felett maradjon, illetve hogy az iszappelyheket szuszpenzióban tartsák. A kultúrák keverése is szükséges, hogy az iszappelyheket szuszpenzióban lehessen tartani. Az inkubáció kezdetének azt a pillanatot tekintik, amikor az eleveniszap-oltóanyag először lép érintkezésbe a végső keverék többi alkotóelemével. Az inkubálás végén, az általában 3 órában meghatározott expozíciós idő eltelte után mintákat vesznek, hogy az e célra tervezett cellában (3. függelék 2. ábra) vagy egy teljesen teletöltött BOD-palackban megmérjék az oldott oxigén koncentrációjának csökkenését. Az inkubáció megkezdésének módja az oxigénfogyasztás mérésére használt berendezés kapacitásától is függ. Ha például csak egyetlen oxigénszondából áll, a méréseket egyedileg végzik el. Ebben az esetben a szintetikus szennyvízzel végzett vizsgálathoz szükséges különböző keverékeket el kell készíteni, de az oltóanyagot vissza kell tartani, és az iszap szükséges mennyiségeit kell hozzáadni a sorozat egyes edényeihez. Az inkubációkat kényelmes időközönként, pl. 10–15 percenként kell elkezdeni. Más esetben a mérési rendszer több szondából is állhat, ami több egyidejű mérést tesz lehetővé; ebben az esetben az oltóanyagot egyidőben is hozzá lehet adni a megfelelő edénycsoportokhoz.

37.

Az eleveniszap koncentrációja minden vizsgált, referencia és vak keverékben (de nem abiotikus kontrollban) névlegesen 1,5 g/l szuszpendált szilárd anyag. Az oxigénfogyasztást a 3 órás expozíció után kell megmérni. További 30 perces expozíciós méréseket kell végezni szükség esetén az 5. pontban leírt módon.

Az iszap nitrifikációs potenciálja

38.

Annak eldöntésére, hogy az iszap nitrifikál-e, és ha igen, milyen ütemben, a vak kontrollnak megfelelő keverékeket (FB) és további »kontroll« keverékeket (FN) kell készíteni, amelyek 11,6 mg/l N-allil-tiokarbamidot is tartalmaznak. A keverékeket levegőztetni és 20° ± 2 °C-on 3 órán át inkubálni kell. Ezután meg kell mérni az oxigénfelvétel sebességét, és ki kell számítani a nitrifikáció miatti oxigénfelvétel mértékét.

A vizsgálat megtervezése

Dózisbehatároló vizsgálat

39.

Szükség esetén előzetes vizsgálatot kell végezni, hogy megbecsüljék a vizsgált vegyi anyagnak az oxigénfogyasztás gátlásának meghatározására szolgáló meghatározó vizsgálathoz szükséges koncentrációját. Az oxigénfogyasztás vizsgált vegyi anyag által okozott gátlásának előzetes vizsgálatban megfigyelt hiánya azt jelezheti, hogy a meghatározó vizsgálatra nincs szükség, de a vizsgálatba be kell vonni az előzetes vizsgálatban vizsgált legmagasabb koncentráció (jellemzően 1 000 mg/l, de függ az adatokra vonatkozó követelménytől) háromszorosát.

1. táblázat

Példák az előzetes vizsgálatban használt keverékekre

Reagens

Eredeti koncentráció

A vizsgált vegyi anyag törzsoldata

10 g/l

A szintetikus közeg törzsoldata

Lásd a 16. pontot

Eleveniszap törzsszuszpenzió

3 g/l szuszpendált szilárd anyag

A keverékek összetevői

Adagolás a vizsgálati edényekbe (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

A vizsgált vegyi anyag törzsoldata (ml)

(19–21. pont)

0,5

5

50

0

50

A szintetikus szennyvíz tápszer törzsoldata (ml)

(16. pont)

16

16

16

16

16

Eleveniszap-szuszpenzió (ml)

(26–29. bekezdés)

250

250

250

250

0

Víz

(15. pont)

233,5

229

184

234

434

A keverékek összes térfogata (ml)

500

500

500

500

500

Koncentrációk a keverékben

 

 

 

 

 

Vizsgálati szuszpenzió (mg/l)

Eleveniszap

10

10

1 000

0

1 000

(szuszpendált szilárd anyagok) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

A vizsgálatot a vizsgált vegyi anyag legalább három koncentrációjával (például 10 mg/l, 100 mg/l és 1 000 mg/l) és egy vak kontrollal kell elvégezni, illetve szükség esetén a vizsgált vegyi anyag legmagasabb koncentrációját tartalmazó legalább három abiotikus kontrollal (példaként lásd az 1. táblázatot). Ideális esetben a legalacsonyabb koncentráció nem lehet hatással a oxigénfogyasztásra. Ki kell számítani az oxigénfelvétel sebességét és, ha lényeges, a nitrifikáció sebességét; ezt követően pedig ki kell számítani a százalékos gátlást. A vizsgálat céljától függően az is lehetséges, hogy egyszerűen meghatározzák a határérték koncentráció (pl. 1 000 mg/l) toxicitását. Ha ezen a koncentráción nem lép fel statisztikailag szignifikáns toxikus hatás, nincs szükség magasabb vagy alacsonyabb koncentrációkon végzett további vizsgálatokra. Meg kell jegyezni, hogy a vízben rosszul oldódó anyagokat, a különböző vízoldhatóságú komponensek keverékekeit és az adszorbeáló anyagokat közvetlenül kell bemérni a kísérleti edényekbe. Ebben az esetben a vizsgált anyag törzsoldata számára fenntartott térfogatot hígító vízre kell cserélni.

Meghatározó vizsgálat

A teljes oxigénfelvétel gátlása

41.

A vizsgálatot az előzetes vizsgálatból levezethető koncentrációtartományban kell elvégezni. A NOEC és az ECx (pl. EC50) megállapítása érdekében a legtöbb esetben hat kontroll, egy mértani sorozatot alkotó öt kezelési koncentráció, illetve öt ismétlés ajánlott. Az abiotikus kontrollt nem kell megismételni, ha nem volt oxigénfelvétel az előzetes vizsgálat során, de ha jelentős mértékű felvétel történik, abiotikus kontrollokat kell alkalmazni a vizsgált vegyi anyag minden egyes koncentrációjához. Az iszap érzékenységét a 3,5-diklór-fenol referencia-vegyianyag alkalmazásával kell ellenőrizni. Az iszap érzékenységét minden vizsgálati sorozat esetében ellenőrizni kell, hiszen az érzékenység köztudottan fluktuál. Minden esetben mintákat vesznek a kísérleti edényből 3 óra elteltével, és ezen felül 30 perc múlva, ha szükséges, hogy megmérjék az oxigénfelvétel sebességét az oxigén-elektróda cellában. Az összegyűjtött adatokból kiszámítják a kontroll és vizsgálati keverékek specifikus légzési sebességét; a százalékos gátlást ezt követően az alábbi 7. egyenletből vezetik le.

A heterotróf légzés és a nitrifikáció gátlásának megkülönböztetése

42.

A nitrifikáció specifikus inhibitorának (ATU) használata lehetővé teszi, hogy közvetlenül értékeljék a vizsgált vegyi anyagoknak a heterotróf oxidációt gátló hatását, és az oxigénfelvétel ATU jelenlétében mért sebességét kivonva a teljes felvételi sebességből (ATU nincs jelen) ki lehet kiszámítani a nitrifikáció sebességére gyakorolt hatást. Két sorozat reakciókeveréket kell készíteni a 41. pontban leírt ECx vagy NOEC vizsgálat elrendezés szerint, de emellett ATU-t kell hozzáadni az egyik sorozat minden egyes keverékéhez 11,6 mg/l végső koncentrációban, amelyről kimutatták, hogy teljes mértékben gátolja a legfeljebb 3 000 mg/l szuszpendált szilárd anyag koncentrációjú iszap nitrifikációját (4). Az oxigénfelvétel sebességét az expozíciós idő eltelte után kell mérni; ezek a közvetlen értékek csak a heterotróf légzést reprezentálják, és az ezek és a hozzájuk tartozó teljes légzési sebességek különbsége reprezentálja a nitrifikációt. A gátlás különböző mértékeit ezt követően számítják ki.

Mérések

43.

Az expozíciós idő(k) eltelte után az első levegőztető edényből át kell transzferálni egy mintát az oxigén-elektród cellába (2. függelék 1. ábra), és az oldott oxigén koncentrációját azonnal meg kell mérni. Ha több elektródát tartalmazó rendszer áll rendelkezésre, akkor a mérések végezhetők egyidejűleg is. A keverés (bevont mágnes útján) alapvető fontosságú és ugyanolyan sebességen kell történnie, mint amelyet az elektróda kalibrálásakor alkalmaztak. Ez biztosítja, hogy a szonda minimális késéssel válaszoljon a változó oxigén koncentrációkra, és ez teszi lehetővé a rendszeres és reprodukálható oxigénmérések végzését a mérőedényben. Általában az egyes oxigén-elektródák önkeverő szondarendszere megfelelő. A cellát a mérések között vízzel ki kell öblíteni. Alternatív megoldásként a mintát egy mágneses keverővel ellátott BOD-palack megtöltésére is lehet használni (3. függelék 2. ábra). Egy hüvely adapterrel ellátott oxigénszondát kell ezután beilleszteni a palack nyakába, és a mágneses keverőt el kell indítani. Mindkét esetben folyamatosan kell mérni és regisztrálni az oldott oxigén koncentrációját egy adott ideig, rendszerint 5–10 percig, vagy amíg az oxigénkoncentráció 2 mg/l alá nem csökken. Az elektródát el kell távolítani, a keveréket pedig vissza kell juttatni a levegőztető edénybe és folytatni kell levegőztetést és a keverést, ha hosszabb expozíciós időszakok utáni mérésekre is szükség van.

A vizsgált vegyi anyag koncentrációjának ellenőrzése

44.

Bizonyos esetekben szükség lehet arra, hogy megmérjék a vizsgált vegyi anyag koncentrációját a vizsgálati edényben. Meg kell jegyezni, hogy ha

vízben rosszul oldódó anyagokból,

különböző vízoldhatóságú összetevők keverékéből, vagy

vízben jól oldódó anyagokból, de ahol a törzsoldat koncentrációja a közel van a maximális vízoldhatósághoz,

készített törzsoldatokat használnak, az oldott frakció ismeretlen, és a vizsgált vegyi anyagnak a vizsgálati edénybe transzferált valódi koncentrációja nem ismert. Az expozíció jellemzése érdekében szükség van a vizsgált vegyi anyag vizsgálati edényben elért koncentrációjának analitikus becslésére. Az egyszerűség kedvéért az analitikus becslést az oltóanyag hozzáadása előtt kell elvégezni. Annak a ténynek köszönhetően, hogy csak oldott frakciók kerülnek át a vizsgálati edényekbe, a mért koncentrációk nagyon alacsonyak lehetnek.

45.

Az időigényes és drága analízisek elkerülése érdekében ajánlott a vizsgált vegyi anyagot egyszerűen közvetlenül a vizsgálati edényekbe bemérni, és a későbbi számítások során a kezdeti bemért névleges koncentrációra hivatkozni. A vizsgált vegyi anyag oldott, nem oldott vagy adszorbeált frakciói közötti különbségtételre nincs szükség, mert ezek a frakciók valós körülmények között, a szennyvízkezelő üzemben is megjelennek, és a frakciók a szennyvíz összetételétől függően eltérőek lehetnek. A vizsgálati módszer célja a nem gátló koncentráció reális becslése, és nem alkalmas annak részletes vizsgálatára, hogy mely frakciók járulnak hozzá az eleveniszapban található organizmusok gátlásához. Végezetül az adszorbens anyagokat is közvetlenül a vizsgálati edényekbe kell bemérni, és az edényeket az adszorpció okozta veszteségek minimalizálása érdekében szilanizálni kell.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az oxigénfelvételi sebességek kiszámítása

46.

Az oxigénfelvételi sebességet az átlagos mért értékekből kell kiszámítani, pl. az oxigénkoncentrációt az idő függvényében ábrázoló grafikonok lineáris részéből, a számításokat a 2,0 mg/l és 7,0 mg/l közötti oxigénkoncentrációkra korlátozva, mivel a magasabb és az alacsonyabb koncentrációk maguk is befolyásolhatják a fogyasztás sebességét. Az ezen értékek alatti vagy feletti koncentrációsávokba történő kiterjesztés alkalmanként elkerülhetetlen és szükséges, például, ha a légzés erősen elnyomott, és ennek következtében nagyon lassú, vagy ha egy adott eleveniszap nagyon gyorsan lélegzik. Ez elfogadható, feltéve, hogy az oxigénfelvételi grafikon kiterjesztett szakaszai egyenesek és a gradiensei nem változnak, miközben áthaladnak a 2,0 mg/l vagy a 7,0 mg/l O2-határokon. A grafikon ívelt szakaszai azt jelzik, hogy a mérési rendszer stabilizálódik, vagy a felvételi sebesség változik, és ezeket nem szabad a légzés sebességének kiszámításához használni. Az oxigénfelvétel sebességét milligramm per liter per óra (mg/lh) vagy milligramm per gramm száraz iszap per óra (mg/gh) mértékegységben kell megadni. Az oxigénfogyasztás mértékét (R, mg/lh mértékegységben) a felvett oxigéncsökkenési grafikon lineáris részéből lehet kiszámítani vagy interpolálni az 1. egyenlet szerint:

R = (Q1 – Q2)/Δt x 60

(1)

ahol:

Q1

oxigénkoncentráció a lineáris fázis kiválasztott szakaszának elején (mg/l);

Q2

oxigénkoncentráció a lineáris fázis kiválasztott szakaszának végén (mg/l);

Δt

időintervallum a két mérés között (perc).

47.

A fajlagos légzési sebességet (Rs) az iszap egy gramm száraz tömege által óránként elfogyasztott oxigén mennyiségében (mg/gh) fejezik ki a 2. egyenlet szerint:

Rs = R/SS

(2)

ahol SS a szuszpendált szilárd anyag koncentrációja a vizsgálati keverékben (g/l).

48.

Az R különböző kombinálható indexei a következők:

S

specifikus sebesség

T

teljes légzés sebessége

N

nitrifikációs légzés miatti sebesség

H

heterotróf légzés miatti sebesség

A

abiotikus folyamatok miatti sebesség

B

sebesség a vak vizsgálatok alapján (átlag)

A nitrifikáció miatti oxigénfelvétel sebességének kiszámítása

49.

A teljes légzés (RT), a nitrifikációs légzés (RN), és a heterotróf légzés (RH) közötti összefüggést a 3. egyenlet adja meg:

RN = RT – RH

(3)

ahol:

RN

a nitrifikáció miatti oxigénfelvétel sebessége (mg/lh);

RT

a vak kontroll oxigénfelvételének mért sebessége (ATU nélkül; FB) (mg/lh).

RH

a vak kontroll oxigénfelvételének mért sebessége hozzáadott ATU-val (FN) (mg/lh).

50.

Ez az összefüggés a vakértékekre (RNB, RTB, RHB), az abiotikus kontrollokra (RNA, RTA, RHA) és a vizsgált vegyi anyagokkal végzett vizsgálatokra (RNS, RTS, RHS) (mg/gh) érvényes. A specifikus légzési sebesség kiszámítása:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Ha az előzetes vizsgálat során az RN nem szignifikáns (pl. az RT < 5 %-a a vak kontrollokban), abból kell kiindulni, hogy a heterotróf oxigénfelvétel megegyezik a teljes felvétellel, és hogy nitrifikáció nem zajlik. Alternatív eleveniszap forrásra lenne szükség, ha a vizsgálatoknak figyelembe kellene venniük a heterotróf és nitrifikáló mikroorganizmusokra gyakorolt hatásokat. Meghatározó vizsgálatot végeznek, ha nyomott oxigénfelvételi sebességre utaló bizonyítékok adódnak a vizsgálati vegyi anyag különböző koncentrációival.

A százalékos gátlás kiszámítása

52.

A teljes oxigénfogyasztás százalékos gátlását (IT) a vizsgált vegyi anyag egyes koncentrációinál a 7. egyenlet adja meg:

IT = [1 –(RT – RTA)/RTB] x 100 %

(7)

53.

Hasonlóképpen, a heterotróf oxigénfelvétel százalékos gátlását (IH) a vizsgált vegyi anyag egyes koncentrációinál a 8. egyenlet adja meg:

IH = [1-(RH -RHA)/RHB] x 100 %

(8)

54.

Végezetül, az oxigénfelvétel nitrifikáció miatti gátlását (IN) az egyes koncentrációknál a 9. egyenlet adja meg:

IN = [1 –(RT – RH)/(RTB –RHB)] x 100 %

(9)

55.

Az oxigénfelvétel százalékos gátlását a vizsgált vegyi anyag koncentrációja logaritmusának függvényében kell ábrázolni (gátlási görbe, lásd a 4. függelék 3. ábráját). A gátlási görbét minden egyes 3 órás levegőztetési periódus esetében felrajzolják, illetve kiegészítésképpen 30 perc után is. A vizsgált vegyi anyag azon koncentrációját, amely az oxigén felvételét 50 %-kal gátolja (EC50), a grafikonból kell kiszámítani vagy interpolálni. Ha megfelelő adatok állnak rendelkezésre, az EC50 95 %-os megbízhatósági határait, a görbe lejtését, a gátlás kezdetét jelölő megfelelő értékeket (például EC10 vagy EC20), és a gátlási tartomány a végét (például EC80 vagy EC90) ki lehet számítani vagy interpolálni lehet.

56.

Meg kell jegyezni, hogy tekintettel az eredmények gyakran megfigyelt variabilitására, sok esetben elegendő lehet az eredményeket nagyságrendileg kifejezni, például:

EC50

<1 mg/l

EC50

1-10 mg/l

EC50

10-100 mg/l

EC50

> 100mg/l

Az eredmények értelmezése

ECx

57.

Az ECx-értékeket, beleértve a hozzájuk tartozó alsó és felső 95 %-os megbízhatósági határokat, megfelelő statisztikai módszerekkel számítják ki (pl. probit analízis, logisztikai vagy Weibull funkció, vágott Spearman-Karber módszer vagy egyszerű interpoláció (11)). Az ECx-értéket úgy kapják meg, hogy a kapott egyenletbe beillesztenek egy értéket, amely megfelel a kontroll átlaga x %-ának. Az EC50 vagy bármely más ECx kiszámításához a kezelésenkénti átlagokat (x) regressziós elemzésnek kell alávetni.

A NOEC becslése

58.

Ha a statisztikai elemzés célja a NOEC meghatározása, edényenkénti statisztikákra (az egyes edények ismétlésnek minősülnek) van szükség. Az Aktuális megközelítések a ökotoxicitási adatok statisztikai elemzésében: alkalmazási útmutató című OECD-dokumentum szerinti megfelelő statisztikai módszereket kell alkalmazni (11). Általában a vizsgált vegyi anyag káros hatásait a kontrollal összehasonlítva egyoldali (kisebb) hipotézisvizsgálattal (p ≤ 0,05) vizsgálják.

Vizsgálati jegyzőkönyv

59.

A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

 

Vizsgált vegyi anyag

közös név, kémiai név, CAS-szám, tisztaság;

a vizsgált vegyi anyag fizikai-kémiai tulajdonságai (pl. log Kow, vízoldhatóság, gőznyomás, Henry-állandó (H), valamint a vizsgált anyag sorsára vonatkozó esetleges információk, pl. eleveniszapos adszorpció);

 

Kísérleti rendszer

forrás, a szennyvíztisztító telep működésének feltételei és a kapott befolyó anyag, koncentráció, az eleveniszap előkezelése és fenntartása;

 

Vizsgálati körülmények

vizsgálati hőmérséklet, pH a vizsgálat alatt és az expozíció időtartama, fázis(ok);

 

Eredmények

a kontrollok fajlagos oxigénfogyasztása (mg O2/(g iszap × h);

mért adatok, gátlási görbe (görbék), az EC50 számítási módszere;

EC50, és ha lehetséges, a 95 %-os megbízhatósági határok, esetleg EC20, EC80; esetleg NOEC és az alkalmazott statisztikai módszerek, ha az EC50-et nem lehet meghatározni;

a teljes, és ha szükséges, a heterotróf és a nitrifikációs gátlás eredményei;

a fizikai-kémiai kontroll abiotikus oxigénfelvétele (ha van);

a referencia-vegyianyag neve és az ezzel a vegyi anyaggal kapott eredmények;

minden megfigyelés és minden eltérés a vizsgálati módszertől, amely az eredményeket befolyásolhatta.

IRODALOM

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Vízminőség. Az eleveniszap oxigénfogyasztás-gátlásának vizsgálata szén- és ammóniumoxidációval, Nemzetközi Szabványügyi Szervezet.

(5)

Bealing, D. J. (2003). ISO/TC147/WGI/N.183 dokumentum, Nemzetközi Szabványügyi Szervezet.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Vízminőség. Útmutató a vízben rosszul oldódó szerves vegyületek előkészítésére és kezelésére azok vizes közegben való biológiai lebonthatóságának értékeléséhez, Nemzetközi Szabványügyi Szervezet.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1. függelék

Fogalommeghatározások

E vizsgálati módszerben a következő fogalommeghatározások alkalmazandók:

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

ECX (hatáskoncentráció x % hatás eléréséhez) : az a koncentráció, amely valamely hatás x %-át okozza a vizsgálati szervezetekben egy adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva. Például az EC50 az a becsült koncentráció, amely a vizsgálat valamilyen végpontja tekintetében a kitett populáció 50 %-ában okoz hatást a meghatározott expozíciós idő alatt.

NOEC (észlelhető hatást még nem okozó koncentráció) : a vizsgált vegyi anyag azon koncentrációja, amelyen nem figyelhető meg hatás. Ebben a vizsgálatban a NOEC-nek megfelelő koncentrációnak nincs statisztikailag szignifikáns hatása (p < 0,05) az adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva.

Vizsgált vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszerrel vizsgált anyag vagy keverék.

2. függelék

1. ábra:   Példa mérőegységre

Image

Jelmagyarázat

1

eleveniszap

2

szintetikus közeg

3

vizsgált vegyi anyag

4

levegő

5

keverőedény

6

mágneses keverő

7

oxigénmérő cella

8

oxigén-elektród

9

oxigénmérő műszer

10

felvevő

3. függelék

2. ábra:   Példa mérőegységre, BOD-palackkal

Image

Jelmagyarázat

1

Vizsgálati edény

2

oxigénelektród

3

oxigénmérő műszer

4. függelék

3. ábra:   Példa gátlási görbére

Image

Jelmagyarázat

X

a 3,5-diklór-fenol koncentrációja (mg/l)

Y

gátlás ( %)

Image

a heterotróf légzés gátlása nitrifikáló iszap használata esetén

Image

a nitrifikáció gátlása nitrifikáló iszap használata esetén

5.

A C.26. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

C.26   A LEMNA-FAJOK NÖVEKEDÉSGÁTLÁSI VIZSGÁLATA

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 221. vizsgálati iránymutatásában (2006) leírt módszerrel. Ez a vizsgálati módszer a különböző vegyi anyagok által a Lemna (békalencse) nemzetséghez tartozó édesvízi növényekre kifejtett toxikus hatás meghatározására szolgál. A módszer meglévő módszereken (1)(2)(3)(4)(5)(6) alapul, de azoktól több kulcsfontosságú kérdés tekintetében, a legfrissebb kutatási eredmények és szakmai egyeztetések figyelembevétele érdekében eltér. A vizsgálati módszer validálása nemzetközi körvizsgálattal (7) történt.

2.

A vizsgálati módszer Lemna gibba és Lemna minor felhasználásával végzendő toxicitási vizsgálatot ír le; mindkét fajon számos vizsgálatot végeztek, és a fent említett szabványosított vizsgálatok is ezekre vonatkoznak. A Lemna nemzetség rendszertana nehezen leírható, amit tovább bonyolít a létező fenotípusok nagy száma. Bár a Lemna nemzetségben a genetikai eltérések a toxikus anyagokkal szembeni viselkedés változatosságát eredményezhetik, erről a változóról egyelőre kevés adat áll rendelkezésre ahhoz, hogy az ismertetendő eljárás keretében konkrét klón használatát ajánlhassunk. Megjegyzendő, hogy a vizsgálat nem steril körülmények között zajlik, de az eljárás egyes szakaszaiban erőfeszítéseket kell tenni annak érdekében, hogy más élő szervezetek zavaró hatása a lehető legkisebb legyen.

3.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a vizsgálati oldat cseréjével végzett (félstatikus és állandó áramlású) és a vizsgálati oldat cseréje nélkül végzett (statikus) vizsgálatokat. A vizsgálat céljától és a jogszabályi követelményektől függően a félstatikus és az átfolyásos vizsgálat alkalmazását például az oldatból gyorsan eltávozó (illékony, fény hatására lebomló, kicsapódó vagy biológiailag lebomló) vegyi anyagok esetén érdemes megfontolni. További iránymutatást a (8) irodalom tartalmaz.

4.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

A VIZSGÁLAT ELVE

5.

Exponenciálisan növekedő, a Lemna nemzetséghez tartozó növénytenyészeteket monokultúraként hét napig növekedni hagyunk a vizsgált vegyi anyag különböző koncentrációinak jelenlétében. A vizsgálat célja: a vizsgálat időtartama alatt a vizsgált vegyi anyag vegetatív növekedésre gyakorolt hatásának számszerű kifejezése alkalmasan megválasztott mérési változók értékelése alapján. Elsődleges mérési változóként a levélszám szolgál. Emellett legalább még egy mérési változót (a levelek összterületét, a száraz tömeget vagy a nedves tömeget) is mérni kell, mert bizonyos vegyi anyagok más mérési változókat sokkal inkább befolyásolnak, mint a levélszámot. A vizsgált vegyi anyag hatásainak számszerű kifejezése érdekében a vizsgálati oldatban bekövetkező növekedést összehasonlítjuk a kontrolltenyészetben bekövetkező növekedéssel, és meghatározzuk azt az ECx (például EC50) koncentrációt, amely egy adott x %-os (például 50 %-os) növekedésgátlást idéz elő.

6.

A vizsgálat végpontjaként a növekedésgátlás szolgál, amelyet a mérési változóban az expozíciós idő alatt bekövetkező logaritmikus növekedéssel (az átlagos fajlagos növekedési sebességgel) fejezünk ki. A kísérleti oldatsorozattal mért átlagos fajlagos szaporodási sebességekből meg kell határozni azt a koncentrációt, amely a szaporodási sebességet adott x %-os (pl. 50 %-os) mértékben gátolja, és azt ErCx-ként (pl. ErC50) kell kifejezni.

7.

Az eljárás másik hatásváltozója a szaporulat, amelyre bizonyos országok esetében a jogszabályi követelmények teljesítéséhez lehet szükség. A szaporulat a mérési változóknak az expozíciós idő végén érvényes értéke és az expozíciós idő kezdetén érvényes értéke közötti különbséget jelenti. A vizsgálati oldatok tekintetében egyenként kiszámított szaporulatok alapján meghatározzuk azt az EyCx (például EyC50) koncentrációt, amely egy adott x %-os (például 50 %-os) növekedésgátlást idéz elő.

8.

Statisztikai eljárással meghatározható továbbá az észlelhető hatást okozó legkisebb koncentráció (LOEC) és az észlelhető hatást még nem okozó koncentráció (NOEC) értéke is.

A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

9.

Rendelkezésre kell állnia egy olyan analitikai eljárásnak, amellyel a vizsgálati oldatban lévő vegyi anyag mennyisége kellő pontossággal meghatározható.

10.

A vizsgálati körülmények rögzítése érdekében célszerű lehet tájékozódni többek között a vizsgált anyag szerkezeti képletéről, tisztaságáról, vízben való oldhatóságáról, vízben és fény hatására tanúsított stabilitásáról, pKa és Kow értékéről, gőznyomásáról és biológiai lebonthatóságáról. A vízben való oldhatóságból és a gőznyomásból meghatározható a Henry-állandó, amely megmutatja, mennyire kell arra számítani, hogy a vizsgálat során a vizsgált vegyi anyag jelentős mennyiségben eltávozik. Ennek alapján eldönthető, kell-e külön gondoskodni az így adódó veszteségek ellensúlyozásáról. Ha a vizsgált vegyi anyag oldhatóságára és stabilitására vonatkozó információk bizonytalanok, célszerű ezeket a vizsgálat körülményei, azaz a vizsgálati oldat, hőmérséklet és fényviszonyok mellett meghatározni.

11.

Ha különösen fontos a vizsgálati oldat pH-értékének szabályozása, például könnyen hidrolizálódó fémek vagy egyéb vegyi anyagok vizsgálata esetén, akkor ajánlatos a vizsgálati oldatot pufferrel kiegészíteni (lásd a 21. pontot). A (8) irodalom további iránymutatást ad olyan vegyi anyagok vizsgálatához, amelyek fizikai-kémiai jellegzetességeiknél fogva nehezen vizsgálhatók.

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

12.

A vizsgálat akkor érvényes, ha a kontrolltenyészetben a levélszám megkettőződési ideje 2,5 napnál (60 óránál) kisebb, ami hét nap alatt körülbelül hétszeres növekedést, illetve 0,275 1/nap átlagos fajlagos növekedési sebességet jelent. A jelen módszerben ismertetett vizsgálati oldat és vizsgálati körülmények alkalmazása esetén ez a feltétel statikus vizsgálattal kielégíthető (5). Várható, hogy a feltétel félstatikus és állandó áramlású vizsgálat esetén is kielégíthető. A megkettőződési idő számítását a 49. pont ismerteti.

REFERENCIA-VEGYIANYAG

13.

A vizsgálati eljárás referencia-vegyianyag(ok), mint például a nemzetközi körvizsgálatban (7) alkalmazott 3,5-diklór-fenol segítségével ellenőrizhető. Referencia-vegyianyaggal legalább évente kétszer (ha ennél ritkábban végzünk vizsgálatot, akkor a vizsgált vegyi anyag toxicitásának meghatározásával párhuzamosan mindig) ajánlott vizsgálatot végezni.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Készülékek

14.

Minden, a vizsgálati oldattal érintkező eszköz üvegből vagy más, kémiailag semleges anyagból legyen. A tenyésztés és a vizsgálat céljára felhasznált üvegeszközök sterilek legyenek, és meg kell őket tisztítani minden olyan kémiai szennyeződéstől, amely a vizsgálati oldatba bemosódhatna. A vizsgálati edények legyenek kellően szélesek ahhoz, hogy a kontrolltenyészetekben a különböző telepek levelei a vizsgálat végéig átfedésmentesen növekedhessenek. Nem jelent problémát, ha a gyökér az edény alját éri, de ajánlatos legalább 20 mm mélységű és legalább 100 ml térfogatú vizsgálati edényeket alkalmazni. Ha ezek a feltételek teljesülnek, a vizsgálati edények megválasztása nem kritikus. A korábbiakban a kellő méretű üveg főzőpoharak, kristályosító tégelyek és üveg Petri-csészék egyaránt alkalmasnak bizonyultak. A vizsgálati edényeket a párolgás és a véletlen szennyeződések megakadályozása érdekében le kell fedni oly módon, hogy a levegő cserélődhessen. A vizsgálati edény, különösen pedig a fedő lehetőleg ne keltsen árnyékot vagy okozza a fény spektrális jellemzőinek módosulását.

15.

A tenyészeteket és a vizsgálati edényeket ne tartsuk együtt. A legjobb megoldás, ha külön környezeti növesztőkamrákat, inkubátorokat vagy helyiségeket veszünk igénybe. A fényviszonyok és a hőmérsékletek szabályozhatók legyenek, és állandó szinten kell őket tartani (lásd a 35-36. pontot).

Vizsgált szervezet

16.

A vizsgálat során Lemna gibba vagy Lemna minor egyedeket kell használni. A toxicitási vizsgálatokhoz korábban már felhasznált békalencsefajok rövid leírását az 2. függelék adja meg. A növényanyag törzsgyűjteményből, más laboratóriumból vagy a terepről nyerhető. A terepről származó növényanyag tenyészetét felhasználás előtt legalább nyolc hétig a vizsgálat során alkalmazandóval megegyező tápoldatban kell tartani. A tenyészet kialakításához a növényanyagot nyilvánvaló szennyeződéstől mentes helyszínről kell begyűjteni. A más laboratóriumból vagy törzsgyűjteményből származó növényanyagot legalább három hétig kell hasonló körülmények között tartani. A mérési jegyzőkönyvben mindig rögzíteni kell a növényanyag eredetét és a vizsgálathoz felhasznált fajt és klónt (ha ismert).

17.

Olyan monokultúrát használjunk, amelyet más élő szervezetek, például algák vagy egysejtűek szemmel érzékelhető módon nem szennyeznek. Az egészséges L. minor növények kettő–öt levélből állnak, míg a L. gibba egészséges telepei akár hét levelet is tartalmazhatnak.

18.

A vizsgálat során felhasznált növények minősége és egységessége jelentősen befolyásolja a vizsgálat eredményeit, ezért megválasztásuk során kellő gondossággal kell eljárni. Fiatal, gyorsan növekvő, látható sérüléstől és fakulástól (klorózistól) mentes egyedeket kell felhasználni. A jó minőségű tenyészetet az jellemzi, hogy nagy arányban tartalmaz legalább két levélből álló telepeket. A sok egyedülálló levél kedvezőtlen környezeti körülményekre, például tápanyaghiányra utal, ezért ilyen tenyészetekből vett egyedeket nem szabad a vizsgálatban felhasználni.

Tenyésztés

19.

Az átoltás gyakoriságának csökkentése érdekében (például ha egy ideig előreláthatóan nem végzünk Lemna-vizsgálatokat) a tenyészet csökkentett fényviszonyok mellett és hőmérsékleten (4–10 °C) tartható. A tenyésztés körülményeit részletesen a 3. függelék ismerteti. Ha olyan nyilvánvaló jeleket figyelünk meg, amelyek algák vagy más élő szervezetek okozta szennyeződésre utalnak, akkor a Lemna-levelek egy részét felületi sterilizálásnak kell alávetni, majd másik oldatba kell áthelyezni (lásd a 3. függeléket). Ebben az esetben a fennmaradó szennyezett kultúrát meg kell semmisíteni.

20.

A vizsgálatok előtt legalább hét nappal elegendő mennyiségű telepet csíramentesen friss, steril oldatba kell áthelyezni, majd hét–tíz napon át a vizsgálatnak megfelelő körülmények között tartani.

Vizsgálati oldat

21.

Lemna minor és Lemna gibba esetén eltérő oldatot ajánlott alkalmazni az alábbiak szerint. Kellő körültekintéssel meg kell fontolni pH-puffer alkalmazását a vizsgálati oldatban (MOPS (4-morfolinpropánszulfonsav, CAS-szám: 1132-61-5 a L. minor és NaHCO3 a L. gibba vizsgálati oldatában), ha gyanítható, hogy az oldat reakcióba léphet a vizsgált anyaggal és befolyásolhatja a toxikus hatást. Az érvényességi kritériumok betartása mellett Steinberg-féle tápoldat (9) is alkalmazható.

22.

A L. minor tenyésztése és vizsgálata során a svéd szabvány (SIS) szerinti Lemna-tápoldat módosított változatát ajánlott alkalmazni. E tápoldat összetételét a 4. függelék ismerteti.

23.

A L. gibba tenyésztése és vizsgálata során a 4. függelék szerinti 20X–AAP tápoldatot ajánlott alkalmazni.

24.

A 4. függelék szerinti Steinberg-féle tápoldat ugyancsak alkalmas L. minor esetén, és az érvényességi kritériumok betartása mellett L. gibba esetén is alkalmazható.

Vizsgálati oldatok

25.

A vizsgálati oldatokat általában törzsoldat hígításával állítjuk elő. A vizsgált vegyi anyag törzsoldatait általában úgy készítjük, hogy a vegyi anyagot tápoldatban feloldjuk.

26.

A vizsgált vegyi anyag legnagyobb vizsgálati koncentrációja általában ne haladja meg a vegyi anyag vizsgálati körülmények között érvényes vízben való oldhatóságát. Megjegyzendő azonban, hogy a Lemna nemzetség egyedei a víz felszínén úsznak, ezért olyan vegyi anyagok hatásának is ki lehetnek téve, amelyek jellemzően a víz és a levegő határfelületén fordulnak elő (például vízben nehezen oldódó vagy víztaszító vegyi anyagok, felületaktív vegyi anyagok). Ilyenkor az expozíció nem a vizsgálati oldatban lévő anyag következtében áll elő, és a vizsgálati koncentráció a vizsgált vegyi anyag jellemzőitől függően meghaladhatja a vízben való oldhatóságot. Vízben kismértékben oldódó vizsgált vegyi anyag esetén szükséges lehet szerves oldó- vagy diszpergálószer alkalmazásával nagy koncentrációjú törzsoldatot vagy -diszperziót készíteni annak érdekében, hogy könnyebb legyen a vizsgált vegyi anyagból a pontos mennyiséget a vizsgálati oldathoz adagolni, és könnyebben végbemenjen az oldódás vagy a diszperzióképződés. Ilyen anyag alkalmazását lehetőség szerint kerülni kell. A segédoldószer vagy -diszpergálószer alkalmazása nem járhat fitotoxikus hatással. A széles körben alkalmazott oldószerek közül például az aceton vagy a dimetil-formamid 100 μl/l koncentrációig nem okoz fitotoxikus hatást. Az esetleg alkalmazott oldó- vagy diszpergálószer végső koncentrációja – amelyet a mérési jegyzőkönyvben rögzíteni kell – a lehető legkisebb legyen (≤ 100 μl/l), és az oldó- vagy diszpergálószert a vizsgálathoz és a kontrolltenyészet esetében azonos koncentrációban kell alkalmazni. A (8) irodalom bővebb iránymutatást ad a diszpergálószerekre vonatkozóan.

Vizsgálati csoportok és kontrollcsoportok

27.

A vizsgált vegyi anyag Lemna-fajokra gyakorolt toxikus hatásának előzetes ismerete alapján, amely származhat például koncentrációtartomány-meghatározási vizsgálatból, megválaszthatók az alkalmas vizsgálati koncentrációk. A végleges toxicitási vizsgálatnak általában öt, egymással mértani sorozatot alkotó vizsgálati koncentrációra kell kiterjednie. A koncentrációk sorozatának hányadosa általában ne legyen 3,2-nél nagyobb, de lapos koncentráció-válasz görbe esetén ennél nagyobb érték lehet indokolt. Ötnél kevesebb koncentráció alkalmazását indokolni kell. Minden koncentrációval legalább három ismétlést kell megvizsgálni.

28.

A vizsgálati koncentrációk tartományának kijelölése során (akár a koncentrációtartomány-meghatározási vizsgálatot, akár a végleges vizsgálatot megelőzően) a következőket célszerű megfontolni:

ECx meghatározása esetén a kellő konfidenciaszint biztosítása érdekében a vizsgálati koncentrációknak közre kell fogniuk az ECx értékét. Ha például az EC50 értéket kívánjuk meghatározni, akkor a legnagyobb vizsgálati koncentrációnak nagyobbnak kell lennie EC50-nél. Ha az EC50 kívül esik a vizsgálati koncentrációk tartományán, akkor a kiadódó konfidenciaintervallumok szélesek lesznek, és előfordulhat, hogy nem végezhető el a modell statisztikai illesztése.

LOEC és/vagy NOEC meghatározása esetén a legkisebb vizsgálati koncentráció legyen elegendően kicsiny ahhoz, hogy a növekedési sebesség ne legyen jelentősen kisebb, mint a kontrollcsoportban. A legnagyobb koncentráció ugyanakkor legyen elegendően nagy ahhoz, hogy a növekedési sebesség jelentősen kisebb legyen, mint a kontrollcsoportban. Ha ez nem teljesül, a vizsgálatot más koncentrációtartománnyal meg kell ismételni (kivéve akkor, ha a legnagyobb koncentráció megegyezik az oldhatósági határral vagy az előírt maximális határkoncentrációval, például 100 mg/l-rel).

29.

Az egyes vizsgálatok mellett kontrolltenyészeteket is kell vizsgálni a vizsgálati edényekével megegyező táptalaj, levél- és telepszám, környezeti körülmények és eljárások alkalmazásával, de a vizsgált vegyi anyag nélkül. Segédoldószer vagy -diszpergálószer alkalmazása esetén egy további kontrolltenyészet is szükséges, amelyben az oldó- vagy diszpergálószer azonos koncentrációban van jelen, mint a vizsgálati edényekben. Legalább a koncentrációnként alkalmazott edényszámmal megegyező, ideális esetben kétszer annyi ismétlést (illetőleg szükség szerint oldószeres edényt) kell alkalmazni.

30.

Ha nem kívánjuk meghatározni az NOEC értékét, a vizsgálati terv módosítható oly módon, hogy több koncentrációt, de koncentrációnként kevesebb ismétlést tartalmazzon. A kontroll ismétlések száma azonban ilyenkor is legalább három legyen.

Expozíció

31.

Kettő–négy látható levélből álló telepeket a kiindulási tenyészetből csíramentesen a kísérleti edényekbe helyezünk, véletlenszerűen elosztva. A kísérleti edényekbe egyenként összesen 9–12 levél kerüljön. Minden kísérleti edényben azonos számú levél és telep legyen. A módszer alkalmazása és a körvizsgálat során szerzett tapasztalatok azt mutatják, hogy a készítmények közötti, a növekedési sebesség alapján meghatározott növekedésgátlás 4–7 %-os értékének (a szaporulat alapján meghatározott növekedésgátlás 10–15 %-os értékének) megfelelő nagyságú növekedéskülönbség kimutatásához elegendő, ha készítményenként három ismétlést és edényenként 9–12 kiindulási levelet alkalmaznak (7).

32.

Az inkubátorban a kísérleti edényeket véletlenszerű elrendezésben kell elhelyezni annak érdekében, hogy a fényerő és a hőmérséklet térbeli változatossága minél kisebb hatást gyakoroljon a vizsgálatokra. A megfigyelések végzésekor (vagy gyakrabban) az edényeket véletlenszerűen vagy blokkonkénti kiosztási terv alapján át kell rendezni.

33.

Ha az előzetesen elvégzett stabilitásvizsgálatok azt jelzik, hogy a vizsgált anyag koncentrációja a vizsgálat időtartama (7 nap) alatt nem tartható fenn (azaz a mért koncentráció a kezdeti mért koncentráció 80 %-a alá csökken), akkor félstatikus vizsgálatot ajánlatos végezni. Ennek keretében a telepeket a vizsgálat során legalább két alkalommal (a 3. és az 5. napon) friss vizsgálati és kontrolloldatokba kell helyezni. A friss oldatba helyezés gyakorisága a vizsgált vegyi anyag stabilitásától függ; nagymértékben instabil vagy illékony vegyi anyagok esetén a közel állandó koncentráció fenntartása gyakoribb oldatcserét igényelhet. Bizonyos esetekben állandó áramlású vizsgálatot célszerű végezni (8)(10).

34.

Ez az eljárás nem tartalmazza a levélre történő felvitellel (permetezéssel) megvalósuló expozíciót; erről lásd a (11) irodalmat.

Inkubációs körülmények

35.

Folyamatos meleg- vagy hidegfehér fluoreszcens megvilágítást alkalmazzunk oly módon, hogy a fotoszintetikusan aktív sugárzásban (400–700 nm), a fényforrástól a Lemna-levelekkel megegyező távolságban lévő pontokban mért fényerő a 85–135 μE/m2s tartományban előzetesen felvett értéknek feleljen meg (ez 6 500–10 000 lux értéket jelent). A vizsgálat területén a fényerő az előzetesen felvett értéktől legfeljebb ± 15 %-kal térhet el. A fényerő érzékelésére és mérésére szolgáló módszer, különösen pedig a fényérzékelő befolyásolja a mért értéket. A gömbérzékelők (amelyek a mérési sík alatt és felett tetszőleges irányból érkező fény mérésére alkalmasak) és a »koszinuszos« érzékelők (amelyek csak a mérési sík felett tetszőleges irányból érkező fény mérésére alkalmasak) előnyben részesítendők az egytengelyű érzékelőkkel szemben, mert a jelen módszerben előírt többpontos fényforrás esetén nagyobb értékeket szolgáltatnak.

36.

A vizsgálati edényekben a hőmérséklet 24 ± 2 °C legyen. A vizsgálat során a kontrolltenyészet tápoldatának pH-értéke nem növekedhet 1,5-nél nagyobb mértékben. Az 1,5-nél nagyobb eltérés ugyanakkor nem teszi érvénytelenné a vizsgálatot, ha kimutatható, hogy az érvényességi feltételek teljesülnek. A pH-érték eltolódása egyes különleges esetekben, például instabil vegyi anyag vagy fém vizsgálata esetén fokozott körültekintést tesz szükségessé. További iránymutatást a (8) irodalom tartalmaz.

Időtartam

37.

A vizsgálat a növények vizsgálati edényekbe helyezése után 7 nappal fejeződik be.

Mérések és analitikai vizsgálatok

38.

A vizsgálat kezdetén meg kell számlálni a vizsgálati edényekben lévő leveleket, és az értéket fel kell jegyezni a mérési jegyzőkönyvben; a számlálás során ügyelni kell arra, hogy a kiálló, vizuálisan elkülönülő leveleket vegyük figyelembe. A szabályszerűnek vagy rendellenesnek tűnő levelek számát a vizsgálat kezdetén, az expozíció időtartama alatt legalább háromnaponta (azaz a hét nap során legalább kétszer), valamint a vizsgálat végén kell meghatározni. Fel kell jegyezni a növények fejlődésében beálló változásokat, például a levélméret vagy a megjelenés változásait, a nekrózisra, a klorózisra vagy a púposságra utaló jeleket, a telepek felbomlását vagy az úszóképesség megszűnését, a gyökerek hosszának vagy megjelenésének megváltozását. Fel kell továbbá jegyezni a vizsgálati oldat jellegzetességeit (például oldatlan anyag jelenléte, algaképződés a vizsgálati edényben) is.

39.

A vizsgálat során a levélszám mellett a vizsgált vegyi anyagnak a következő mérési változók közül legalább egy továbbira gyakorolt hatását is meg kell határozni:

i.

a levelek összterülete,

ii.

száraz tömeg,

iii.

nedves tömeg.

40.

A levelek összterülete azért előnyös mérési változó, mert a vizsgálat kezdetén, folyamán és végén minden vizsgálati és kontrolltenyészetre külön-külön meghatározható. A száraz és a nedves tömeget a vizsgálat elején a vizsgálatban alkalmazandó kiindulási tenyészet szempontjából reprezentatív mintán, majd a vizsgálat végén az egyes vizsgálati és kontrolltenyészetek növényanyagán kell meghatározni. Ha a levélterületet nem mérjük, a száraz tömeg mérését előnyben kell részesíteni a nedves tömeg mérésével szemben.

41.

A levelek összterülete, a száraz tömeg és a nedves tömeg a következőképpen határozható meg:

i.

A levelek összterülete: A telepekben előforduló levelek összterülete meghatározható képelemzés segítségével. Videokamerával (például az edényt világító testre helyezve) rögzíthetők a vizsgálati edény és a növények körvonalai, majd a kiadódó kép digitalizálható. Ismert területű síkidomokhoz hasonlítva meghatározható a vizsgálati edényekben lévő levelek összterülete. Kellő gondossággal ki kell küszöbölni a vizsgálati edény pereme miatti zavarás hatását. Másik, munkaigényesebb lehetőség, ha a vizsgálati edényeket és a növényeket lefényképezzük, a kiadódó körvonalak mentén kivágjuk az alakokat, majd levélterület-elemzővel vagy milliméterpapíron meghatározzuk a levélterületet. Egyéb technikák (például a papírból kivágott terület egységnyi területű idomokhoz hasonlítása a tömegek összevetése alapján) ugyancsak megoldást jelenthetnek.

ii.

Száraz tömeg: A telepeket összegyűjtjük a vizsgálati edényekből, desztillált vagy ionmentesített vízzel leöblítjük őket, leitatjuk a felesleges vizet, és a telepeket 60 °C-on tömegállandóságig hevítjük. A kapcsolódó gyökereket nem távolítjuk el. A száraz tömeget legalább 0,1 mg pontossággal kell kifejezni.

iii.

Nedves tömeg: A telepeket előzetesen megmért tömegű, kerek aljukon kis (1 mm-es) lyukakkal ellátott polisztirol (vagy más kémiailag semleges anyagból készült) csövekbe helyezzük. A csöveket ezt követően 3 000 1/perc fordulatszámon, szobahőmérsékleten 10 percig centrifugáljuk. Megmérjük a most már szárított telepeket tartalmazó csövek tömegét, és a nedves tömeget az üres csövek tömegének levonásával nyerjük.

A mérések és az analitikai vizsgálatok gyakorisága

42.

Statikus vizsgálat esetén a vizsgálat elején és végén megmérjük az egyes készítmények pH-értékét. Félstatikus vizsgálat esetén a pH-értéket minden oldatcsere alkalmával meghatározzuk mind a friss, mind az elhasznált oldaton.

43.

A fényerőt a növesztőkamrában, az inkubátorban vagy a vizsgálati helyiségben a fényforrástól a Lemna-levelekkel megegyező távolságban elhelyezkedő pontokban mérjük. Fényerőt a vizsgálat során legalább egyszer kell mérni. A növesztőkamrában, az inkubátorban vagy a vizsgálati helyiségben azonos körülmények között külön erre a célra tartott edényben legalább naponta mérjük a tápoldat hőmérsékletét.

44.

A vizsgálat során alkalmas időközönként meg kell határozni a vizsgált vegyi anyag koncentrációját. Statikus vizsgálat esetén a koncentrációt legalább a vizsgálat elején és végén kell meghatározni.

45.

Félstatikus vizsgálat esetén, ha a vizsgált vegyi anyag koncentrációja várhatóan nem marad a névleges koncentráció ± 20 %-os környezetében, akkor minden friss vizsgálati oldatot elkészítésekor, továbbá minden lecserélt oldatot analitikai vizsgálatnak kell alávetni (lásd a 33. pontot). Olyan vizsgálatok esetén ugyanakkor, amelyekben a vizsgált vegyi anyag mért kezdeti koncentrációja ugyan nem a névleges koncentráció ±20 %-os környezetében van, de adatokkal kellően bizonyítható, hogy a kezdeti koncentrációk megismételhetők és stabilak (azaz a kezdeti koncentráció 80–120 %-os környezetében vannak), akkor az analitikai vizsgálatokat elegendő csak a legkisebb és a legnagyobb vizsgálati koncentráción elvégezni. Az oldatcsere előtt a vizsgált vegyi anyag koncentrációját minden esetben elegendő vizsgálati koncentrációnként egy ismétlésen (vagy az edények ismétlésenként egyesített tartalmán) elvégezni.

46.

Állandó áramlású vizsgálat esetén a félstatikus vizsgálathoz hasonló rendben, így a vizsgálat elején, felénél és végén kell mintákat venni, de ilyenkor nincs értelme az »elhasznált« oldat vizsgálatának. Átfolyásos vizsgálat esetén naponta ellenőrizni kell az oldószer és a vizsgált vegyi anyag vagy a vizsgált vegyi anyag törzsoldata adagolási sebességét.

47.

Ha kimutatható, hogy a vizsgált vegyi anyag koncentrációját a vizsgálat időtartama alatt sikerült a névleges vagy a mért kezdeti koncentráció ± 20 %-os környezetében tartani, akkor az eredmények a névleges vagy mért kezdeti értékek alapján elemezhetők. Ha a névleges vagy a mért kezdeti koncentrációtól való eltérés meghaladja a ± 20 %-ot, akkor az eredményeket az expozíció idején érvényes koncentrációértékek mértani középértéke vagy a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának csökkenését leíró modellek alapján kell elemezni (8).

Határérték-vizsgálat

48.

Bizonyos körülmények között, például amikor egy előzetes vizsgálat azt jelzi, hogy a vizsgált vegyi anyagnak nincs toxikus hatása 100 mg/l koncentrációig, vagy a kísérleti oldatban való oldhatósága határáig (amelyik a kettő közül kisebb), határérték-vizsgálat végezhető, amely egy kontrollcsoport és egy kezelt csoport (100 mg/l-es vagy az oldhatósági határral megegyező koncentrációval) szaporodási viselkedésének összehasonlítását jelenti. A vizsgálat során fokozottan ajánlatos elemezni az expozíció koncentrációját. A határérték-vizsgálat során biztosítani kell valamennyi fent leírt vizsgálati körülmény fennállását és érvényességi feltétel teljesülését azzal az eltéréssel, hogy kétszer annyi kezelt ismétlést kell vizsgálni. A kontrollcsoportban és az expozíciónak kitett csoportban tapasztalt növekedés olyan statisztikai próbával (például a Student-féle t-próbával) elemezhető, amely a középértékek összehasonlításán alapul.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Megkettőződési idő

49.

A vizsgálat során a levélszám megkettőződéséhez szükséges Td idő meghatározásához és az erre vonatkozó érvényességi feltétel (lásd a 12. pontot) ellenőrzéséhez a kontrolltenyészetek adataira a következő összefüggést kell alkalmazni:

Td = ln 2/μ

ahol μ az 54–55. pont szerint meghatározott átlagos fajlagos növekedési sebesség.

Hatásváltozók

50.

A vizsgálat célja annak meghatározása, milyen hatást gyakorol a vizsgált vegyi anyag a Lemna-telepek vegetatív növekedésére. Ez a vizsgálati módszer két hatásváltozót tartalmaz, mert a különböző jogrendszerek preferenciái és szabályozási igényei eltérőek. Hogy a vizsgálati eredmények valamennyi jogrendszerben elfogadhatók legyenek, a hatást mindkét alábbi hatásváltozó alapján meg kell határozni.

a)

Átlagos fajlagos növekedési sebesség: ezt a hatásváltozót a levélszám logaritmusának, valamint egy további mért paraméter (a levelek összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) logaritmusának napi változása alapján számítjuk a kontrolltenyészetek és az egyes expozíciónak kitett tenyészetek figyelembevételével. Ezt a mennyiséget relatív növekedési sebességnek is nevezik (12);

b)

Szaporulat: ezt a hatásváltozót a levélszám, valamint egy további mért paraméter (a levelek összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) értékének változása alapján számítjuk a kontrolltenyészetek és az egyes expozíciónak kitett tenyészetek figyelembevételével.

51.

Megjegyzendő, hogy a két hatásváltozó alapján számított toxicitásértékek nem hasonlíthatók egymáshoz, és a vizsgálatok eredményeinek felhasználása során erre a különbségre tekintettel kell lenni. A jelen vizsgálati módszerben előírt vizsgálati körülmények betartása mellett a két számítási eljárás matematikai háttere következtében az átlagos fajlagos növekedési sebességen alapuló ECx értékek (ErCx) általában nagyobbra adódnak, mint a szaporulaton alapuló ECx értékek (EyCx). Ezt az eltérést nem szabad úgy értelmezni, hogy egyik hatásváltozó érzékenyebb lenne a másiknál; egyszerűen arról van szó, hogy a két érték matematikailag mást jelent. Az átlagos fajlagos növekedési sebesség a békalencse korlátozatlan tenyészetekben tanúsított általános exponenciális növekedési mintáján alapul, és a toxicitást a növekedési sebességre kifejtett hatás alapján, a kontrolltenyészetekben tapasztalható növekedési sebesség abszolút nagyságától, a koncentráció-válasz görbe meredekségétől és a vizsgálat időtartamától függetlenül becsli. A szaporulatból származtatott eredmények ezzel szemben mindezektől a változóktól is függnek. Az EyCx függ az egyes vizsgálatokban használt békalencsefajok fajlagos szaporodási sebességétől és a legnagyobb fajlagos növekedési sebességétől, ami a fajok, sőt még különböző klónok között is eltérő lehet. Ez a hatásváltozó nem alkalmas az egyes békalencsefajok vagy klónok toxikus hatással szembeni érzékenységében fennálló különbségek megítélésére. Bár tudományos szempontból a toxikus hatást indokoltabb az átlagos fajlagos növekedési sebességből meghatározni, ez a vizsgálati módszer a szaporulaton alapuló toxicitásszámítást is tartalmazza, mert egyes jogrendszerek hatályos jogszabályi követelményei ezt is szükségessé teszik.

52.

A toxicitást a levélszám és egy további mérési változó (a levelek összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) alapján is meg kell határozni, mert bizonyos vegyi anyagok egy másik mérési változót sokkal erősebben befolyásolhatnak, mint a levélszámot. Ez a hatás nem volna kimutatható, ha csak a levélszámból indulnánk ki.

53.

A levélszám, valamint a többi feljegyzett mérési változó (a levelek összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) értékét az egyes mérések alkalmával a vegyi anyag koncentrációértékei szerint táblázatba kell rendezni. A további adatelemzés, azaz az LOEC, az NOEC vagy az ECx meghatározása során az ismétlések külön-külön vett adataiból, nem pedig az egyes kezelési csoportok középértékéből kell kiindulni.

Átlagos fajlagos növekedési sebesség

54.

Az adott időszakhoz tartozó átlagos fajlagos növekedési sebességet a növekedést leíró változók (levélszám, valamint egy további mérési változó: a levelek összterülete, száraz tömeg vagy nedves tömeg) logaritmusának növekedéseként számítjuk a vizsgálati és a kontrolltenyészetek minden egyes példányára külön-külön, a következő összefüggés szerint:

Formula

ahol:

:

μi – j

:

az átlagos fajlagos növekedési sebesség az »i«-től a »j« időpillanatig

:

Ni

:

a mérési változó értéke a vizsgálati vagy a kontrolltenyészetben az »i« időpillanatban

:

Nj

:

a mérési változó értéke a vizsgálati vagy a kontrolltenyészetben a »j« időpillanatban

:

t

:

az »i«-től »j«-ig terjedő időtartam

Minden kezelt és kontrollcsoportra ki kell számítani egy átlagot a szaporodási sebességre, valamint meg kell becsülni a szórásnégyzetet.

55.

Az átlagos fajlagos növekedési sebességet a vizsgálat teljes időtartamára (tehát úgy, hogy a fenti összefüggésben »i« a vizsgálat kezdetét, »j« a vizsgálat végét jelöli) kell meghatározni. Minden egyes vizsgálati koncentrációra és kontrollcsoportra meg kell határozni az átlagos fajlagos növekedési sebesség középértékét és tapasztalati szórásnégyzetét. Emellett (például a növekedési görbék logaritmikus transzformáltjának szemügyre vételével) becslést kell adni a növekedési sebesség szakaszonkénti értékére is annak érdekében, hogy megítélhető legyen a vizsgált vegyi anyag által az expozíciós időszak folyamán kifejtett hatás. Ha a szakaszonkénti növekedési sebesség és az átlagos növekedési sebesség között nagy különbséget tapasztalunk, az azt jelenti, hogy a növekedés mintája erősen eltér az állandó kitevőjű exponenciális növekedéstől és különösen ajánlott a növekedési görbék részletes vizsgálata. Ilyenkor a biztonság javára járunk el, ha az összehasonlítást a legnagyobb gátlás időszakában a vizsgált tenyészetekben és az ugyanebben az időszakban a kontrolltenyészetekben tapasztalt fajlagos növekedési sebesség között végezzük.

56.

A növekedési sebesség (Ir) százalékos gátlását ezután vizsgálati koncentrációnként (kezelési csoportonként) a következő összefüggésből kell meghatározni:

Formula

ahol:

:

% Ir

:

az átlagos fajlagos növekedési sebesség százalékos gátlása

:

μC

:

a μ középértéke a kontrollcsoportban

:

μT

:

a μ középértéke a vizsgált csoportban

Szaporulat

57.

A szaporulatra gyakorolt hatást vizsgálati edényenként, két mérési változó: a levélszám és egy további mérési változó (a levelek összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) vizsgálat kezdetén és vizsgálat végén mért értékéből számítjuk. A száraz tömeg és a nedves tömeg esetében a kezdeti élőanyagtömeget a vizsgálati edények tartalmának összeállításához (lásd a 20. pontot) használt tételből származó levelekből vett mintán határozzuk meg. Minden egyes vizsgálati koncentráció és kontrollcsoport esetén kiszámítjuk a szaporulat középértékét és tapasztalati szórásnégyzetét. Az egyes kezelési csoportok vonatkozásában a szaporulatra vonatkozó átlagos százalékos gátlás (% Iy) az alábbiak szerint számítható ki:

Formula

ahol:

:

% Iy

:

a szaporulat százalékos csökkenése

:

bC

:

az élőanyagtömeg végső értéke és kiindulási értéke közötti különbség a kontrollcsoportban

:

bT

:

az élőanyagtömeg végső értéke és kiindulási értéke közötti különbség a vizsgált csoportban

A koncentráció-válasz görbék elkészítése

58.

El kell készíteni a hatásváltozóhoz tartozó átlagos százalékos gátlás értékét (az 56., illetve az 57. pontban bemutatottak szerint számított Ir vagy Iy értéket) a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának logaritmusa függvényében ábrázoló koncentráció-válasz görbéket.

Az ECx becslése

59.

Az ECx (például EC50) becslését mind az átlagos fajlagos növekedési sebesség (ErCx), mind a szaporulat (EyCx) alapján el kell végezni, amelyeket viszont a levélszámból és egy további mérési változóból (levelek összterülete, száraz tömeg vagy nedves tömeg) egyaránt ki kell számítani. Ez azért szükséges, mert egyes vizsgált vegyi anyagok a levélszámra és a második mérési változóra eltérő hatást gyakorolnak. Ennek megfelelően tehát minden x gátlási szinthez négy ECx toxicitási paramétert állítunk elő: ErCx (levélszám); ErCx (levelek összterülete, száraz tömeg vagy nedves tömeg); EyCx (levélszám); and EyCx (levelek összterülete, száraz tömeg vagy nedves tömeg).

Statisztikai eljárások

60.

A statisztikai számítások célja, hogy regressziószámítással kvantitatív koncentráció-válasz összefüggést állítsunk elő. Lehetőség van arra, hogy a hatásadatok – például probit-, logit- vagy Weibull-modell (13) szerinti – linearizációs transzformálását követően súlyozott lineáris regressziót végezzünk, de előnyösebb inkább nemlineáris regressziót alkalmazni, mert ez jobban kezeli az adatok elkerülhetetlen irregularitását és a sima eloszlástól való eltérést. A nulla és a teljes gátlás környezetében az irregularitást a transzformáció felnagyíthatja, ami a számítás szempontjából előnytelen (13). Megjegyzendő, hogy a probit-, logit- vagy Weibull-transzformáltat alkalmazó szokásos számítási módszerek elsősorban kvantált (például mortalitási vagy túlélési) adatok feldolgozására alkalmasak, így módosítást igényelnek, ha a növekedési sebességre vagy a szaporulatra kívánjuk őket alkalmazni. Az ECx-értékek folytonos adatokból való számítására alkalmas módszereket a (14), (15) és (16) irodalom ismertet.

61.

Az ECx értékek pontbecsléseinek kiszámításához a koncentráció-válasz összefüggést kell használni minden elemzendő hatásváltozóra. Ha lehetséges, meg kell határozni az egyes becslések 95 %-os konfidenciahatárát. A hatásadatok regressziós modellhez illeszkedésének jóságát grafikus vagy statisztikai módszerrel kell megállapítani. A regressziószámítást az egyes vizsgálati edényeken nyert értékekkel, nem pedig a vizsgálati csoportok középértékével kell elvégezni.

62.

Ha a rendelkezésre álló regressziós modellek/módszerek nem alkalmasak a konkrét adatok elemzésére, az EC50-re vonatkozó becsléseket és a konfidenciahatárokat »bootstrap« módszerrel együtt alkalmazott lineáris interpolációval (17) is előállíthatjuk.

63.

Az LOEC, és így az NOEC becsült értékének előállítása érdekében varianciaanalízis (ANOVA) segítségével összevetjük az egyes készítményekhez tartozó középértékeket. Az egyes koncentrációkhoz tartozó középértékeket ezután alkalmasan megválasztott többszörös összehasonlító módszerrel vagy trendpróbával a kontrollcsoporton nyert középértékhez hasonlítjuk. Hasznos lehet a Dunnett- és a Williams-próba alkalmazása (18)(19)(20)(21). Lényeges ellenőrizni, hogy fennáll-e az ANOVA-nak a szórásnégyzetek homogenitására vonatkozó feltevése. Ezt az ellenőrzést grafikusan vagy formális próbával (22) végezhetjük. A Levene- és Bartlett-féle próbák megfelelőek ehhez. A szórásnégyzetek homogenitására vonatkozó feltevés nem teljesülése gyakran kiküszöbölhető az adatok logaritmikus transzformálásával. Ha a szórásnégyzetek heterogenitása túlságosan szélsőségesnek bizonyul, és transzformációval nem javítható, akkor célszerű megfontolni például a lépésenkénti Jonkheere-trendpróba alkalmazását. Az NOEC meghatározásához további útmutatást ad a (16) irodalom.

64.

Az újabb keletű tudományos eredmények az NOEC-koncepció elhagyásának ajánlásához és az ECx regresszión alapuló pontbecsléssel történő meghatározásával való helyettesítéséhez vezettek. Ehhez a Lemna-vizsgálathoz még nem állapítottak meg megfelelő x értéket. A 10–20 %-os tartomány azonban megfelelőnek tűnik (a választott hatásváltozótól függően), és célszerű mind az EC10-et, mind az EC20-at megadni a mérési jegyzőkönyvben.

Jelentéstétel

65.

A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

 

Vizsgált vegyi anyag:

fizikai jelleg és fizikokémiai tulajdonságok, vízben való oldhatósági határ;

kémiai azonosító adatok (pl. CAS-szám), tisztaság (szennyeződések).

 

A vizsgálathoz felhasznált faj:

tudományos név, klón (ha ismert) és eredet.

 

Vizsgálati körülmények:

alkalmazott vizsgálati eljárás (statikus, félstatikus vagy állandó áramlású);

a vizsgálat megkezdésének időpontja és időtartama;

vizsgálati oldat;

a kísérleti terv ismertetése: vizsgálati edények és fedők, oldattérfogatok, telep- és levélszámok vizsgálati edényenként a vizsgálat megkezdésekor;

vizsgált koncentrációk (szükség szerint névleges és mért értékek) és az ismétlések száma koncentrációnként;

a törzs- és a vizsgálati oldatok elkészítésének módszere, az esetleg alkalmazott oldó- vagy diszpergálószer;

hőmérséklet a vizsgálat folyamán;

fényforrás, a fény ereje és homogenitása;

a vizsgálati és a kontrolloldatok pH-értékei;

a vizsgált vegyi anyag koncentrációi és az analízis módszere a megfelelő minőségellenőrzési adatokkal együtt (az érvényesség vizsgálata, a szórás vagy az analízis konfidenciahatára);

a levélszám és a további mérési változók (száraz tömeg, nedves tömeg vagy levélterület) meghatározásának módszere;

a jelen vizsgálati módszertől való esetleges eltérések.

 

Eredmények:

nyers mérési adatok: levélszám és a további mérési változók minden egyes vizsgálati és kontrolltenyészetben minden adatfelvételkor és analízis alkalmával;

az egyes mérési változók középértékei és szórásai;

növekedési görbék minden egyes koncentrációra (logaritmikusan transzformált mérési változókkal ajánlott megadni, lásd az 55. pontot);

megkettőződési idő, illetve növekedési sebesség a kontrolltenyészetben, a levélszám alapján;

hatásváltozók számított értéke kezelési ismétlésenként, továbbá ismétlésenként a középérték és a szórásnégyzet;

a koncentráció-válasz összefüggés grafikus formában;

a hatásváltozók toxikus végpontjainak becslése, pl. EC50, EC10, EC20 és a kapcsolódó konfidenciaintervallumok. Ha kiszámítottuk, az LOEC és/vagy az NOEC értéke, továbbá a számításhoz alkalmazott statisztikai módszer;

ANOVA alkalmazása esetén a hatás kimutatásának mérethatára (például a legkisebb szignifikáns különbség);

a vizsgálatok során észlelt esetleges növekedésserkentés;

fitotoxicitásra utaló esetleges látható jelek, valamint a vizsgálati oldatokkal kapcsolatos észrevételek;

az eredmények szöveges elemzése, beleértve az e vizsgálati módszertől való eltérések vizsgálat kimenetelére gyakorolt hatását.

IRODALOM

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., »Public draft«. EPA 712-C-96-156. 8pp.

(3)

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

(4)

SSI – Svéd Szabványügyi Intézet. (1995). Vízminőség. A növekedésgátlás meghatározása (7-d) Lemna minor, békalencse. SS 02 82 13. 15pp. (svéd nyelven).

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – 120 pp.

(6)

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(9)

Nemzetközi Szabványügyi Szervezet. ISO/DIS 20079 Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. EPA-600/3–77 108. 1977. szeptember.

(11)

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 – 359.

(12)

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

(13)

Christensen, E.R.,, Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.

(14)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

(15)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

(16)

OECD. (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs.

(17)

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096–1121.

(19)

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482–491.

(20)

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

(21)

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.

(22)

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1. függelék

Fogalommeghatározások

E vizsgálati módszerben az alábbi definíciók és rövidítések használatosak:

Élőanyagtömeg : a populációban lévő élő anyag száraz tömege. A vizsgálat során az élőanyagtömeg helyett jellemzően helyettesítő mennyiségeket, például levélszámot vagy levélterületet mérünk, és ezekre a helyettesítő mennyiségekre is »élőanyagtömegként« hivatkozunk.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Klorózis : a levélszövet sárgulása.

Klón : egy adott egyedből ivartalan szaporodással létrejövő szervezet vagy sejt. Az azonos klónhoz tartozó egyedek tehát genetikai szempontból azonosak.

Telep : egymáshoz kapcsolódó anya- és leánylevelek (általában 2–4) összessége. Néha növénynek is nevezik.

ECx : a vizsgálati oldatban feloldott vizsgált vegyi anyag azon koncentrációja, amely adott expozíciós idő alatt a Lemna növekedésének x %-os (például 50 %-os) csökkenését okozza (az expozíciós időt külön meg kell adni, ha eltér a vizsgálat rendes vagy teljes időtartamától). Hogy egyértelmű legyen, hogy az EC értékét a növekedési sebességből vagy a szaporulatból nyertük-e, növekedési sebesség esetén »ErC«-t, szaporulat esetén »EyC«-t írunk, majd ezt követően megadjuk a mérési változót, például: ErC (levélszám).

Állandó áramlású vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek során a vizsgálati oldatot folyamatosan cseréljük.

Levél : a békalencse növény egyetlen különálló, »levélszerű« struktúrája. Ez a szaporodásra képes legkisebb egység (egyed).

Púposság : púpos vagy duzzadt megjelenést mutató levelek.

Növekedés : a vizsgálat ideje alatt a mérési változóban (például a levélszámban, a száraz tömegben, a nedves tömegben vagy a levélterületben) bekövetkező növekedés.

Növekedési sebesség (átlagos fajlagos növekedési sebesség): az élőanyagtömeg logaritmikus növekedése az expozíciós idő alatt.

Észlelhető hatást okozó legkisebb koncentráció (LOEC) : az a legkisebb vizsgált koncentráció, amely mellett adott expozíciós idő alatt a vegyi anyag statisztikailag szignifikáns mértékben (p < 0,05) csökkenti a növekedést a kontrolltenyészethez képest. Az LOEC felett ugyanakkor minden koncentrációnak legalább akkora káros hatást kell eredményeznie, mint amelyet az LOEC okoz. Ha ez a két feltétel nem elégíthető ki, az LOEC (és így az NOEC) megválasztását részletesen indokolni kell.

Mérési változók : minden olyan változó, amelyet a vizsgálat végpontjának egy vagy több különböző hatásváltozó segítségével történő kifejezése érdekében mérünk. Ebben az eljárásban mérési változó a levélszám, a levélterület, a nedves tömeg és a száraz tömeg.

Monokultúra : egyetlen növényfajból álló tenyészet.

Nekrózis : elhalt (például fehér vagy vízzel átitatott) levélszövet.

Észlelhető hatást még nem okozó koncentráció (NOEC) : az a vizsgált koncentráció, amely közvetlenül az LOEC alatt helyezkedik el.

Fenotípus : az élőlény észlelhető, génjei és a környezet kölcsönhatása által meghatározott jellemzői.

Hatásváltozók : a toxikus hatás becslésére szolgáló, az élőanyagtömeget leíró mérési változókból különböző számítási módszerekkel származtatott változók. Ebben az vizsgálati módszerben hatásváltozó a növekedési sebesség és a szaporulat, amelyeket a levélszámból, a levélterületből, a nedves tömegből és a száraz tömegből mint mérési változókból származtatunk.

Félstatikus (oldatcserés) vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek során a vizsgálati oldatot bizonyos időközönként lecseréljük.

Statikus vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek során a vizsgálati oldatot nem cseréljük le.

Vizsgált vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszerrel vizsgált anyag vagy keverék.

A vizsgálat végpontja : az az általános jellemző, amelyre a vizsgálat irányul, és amely a vizsgált vegyi anyag hatására a kontrolltenyészethez képest megváltozik. Ebben az vizsgálati módszerben a vizsgálat végpontja a növekedésgátlás, amely különböző, egy vagy több mérési változóból származtatott hatásváltozók segítségével fejezhető ki.

Vizsgálati oldat : az a teljes, szintetikus tápoldat, amelyben a vizsgált növények a vizsgált vegyi anyag jelenlétében növekednek. A vizsgált vegyi anyag általában oldott formában van jelen a vizsgálati oldatban.

Szaporulat : az élőanyagtömeget leíró mérési változó értéke az expozíciós idő végén, mínusz ugyanezen változó értéke az expozíciós idő kezdetén.

2. függelék

A Lemna nemzetség leírása

A Lemna nemzetséghez tartozó, békalencseként közismert vízinövények a Lemnaceae családba tartoznak, amelynek négy nemzetsége számos világszerte elterjedt fajt felölel. Különböző megjelenésüket és rendszertanukat a szakirodalom kimerítően ismerteti (1)(2). A Lemna gibba és a L. minor a mérsékelt éghajlati övezet jellegzetes képviselői; a toxicitási vizsgálatokban többnyire ezeket alkalmazzák. Mindkét fajnak úszó vagy alámerülő, korong alakú levelei és nagyon vékony, az egyes levelek alsó felszínének közepéről eredő gyökerei vannak. A Lemna-fajok többnyire nem virágzanak, a szaporodás érdekében a növények vegetatív úton új leveleket hoznak létre (3). Az idősebb növényekhez képest a fiatalabbak általában halványabbak, rövidebb gyökereik vannak és két-három, különböző méretű levélből állnak. A Lemna-növények kis mérete, egyszerű struktúrája, ivartalan szaporodása és rövid generációs ideje a nemzetség fajait különösen alkalmassá teszi laboratóriumi vizsgálatokra (4)(5).

Mivel az egyes fajok előreláthatóan eltérő mértékben lesznek érzékenyek a különböző behatásokra, az érzékenységet kizárólag fajon belül szabad összehasonlítani.

Példák a vizsgálatokban korábban már alkalmazott Lemna-fajokra: Fajonkénti szakirodalmi hivatkozások

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., »Public draft«. EPA 712-C-96-156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Svéd Szabványügyi Intézet (SIS). (1995). Vízminőség. A növekedésgátlás meghatározása (7-d) Lemna minor, békalencse. SS 02 82 13. 15pp. (svéd nyelven).

 

Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., »Public draft«. EPA 712-C-96-156. 8pp.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

A Lemna-fajok beszerzési forrásai

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2

Telefon: +1-416-978-3641

Fax +1-416-978-5878

e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

Amerikai Egyesült Államok

phone 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

STOCKHOLM

SVÉDORSZÁG

Telefon: +46 8 674 7240

Fax (+46) 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin Tel.

Németország

e-mail: lemna@uba.de

SZAKIRODALOM

(1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

3. függelék

A törzstenyészet fenntartása

A törzstenyészetek alacsony hőmérsékleteken (4–10 oC) hosszabb ideig átoltás nélkül is fenntarthatók. A Lemna tápoldata megegyezhet a vizsgálatok során alkalmazottal, de a törzstenyészetek más, tápanyagokban gazdag oldatban is tarthatók.

Időről időre néhány fiatal, világoszöld növényt csíramentes eljárással friss tápoldatot tartalmazó növesztőedénybe helyezünk. A javasolt hűvösebb körülmények között elegendő lehet akár háromhavonta is átoltást végezni.

Kémiailag tiszta (savval lemosott) és steril üveg növesztőedényeket alkalmazzunk, és a kezelés során biztosítsunk csíramentes körülményeket. A törzskultúra (például algával vagy gombákkal történő) fertőződése esetén meg kell kísérelni a szennyező organizmusok eltávolítását. Algák és a legtöbb más szennyező organizmus esetén ez felületi fertőtlenítéssel valósítható meg. A fertőződött növényanyagból mintát veszünk, és a gyökereket levágjuk. A növényeket ezután tiszta vízben intenzíven megrázzuk, majd 30 másodperc és 5 perc közötti időtartamra 0,5 térfogatszázalékos nátrium-hipoklorit-oldatba merítjük. A növényanyagot ezután steril vízben átöblítjük, majd több részletben friss tápoldatot tartalmazó növesztőedényekbe helyezzük. A kezelés eredményeképpen számos levél elhal, különösen hosszabb expozíciós idő esetén, de a fennmaradók közül néhány általában fertőzésmentes lesz. Ez a tenyészet a későbbiekben újabbak leoltására használható fel.

4. függelék

Tápoldatok

L. minor és L. gibba esetén eltérő tápoldatot ajánlott alkalmazni. L. minor esetén a svéd szabvány (SIS) szerinti tápoldat módosított változatát, míg L. gibba esetén a 20X–AAP tápoldatot javasoljuk. Az alábbiakban megadjuk minkét tápoldat összetételét. Ezeknek a tápoldatoknak az elkészítése során laboratóriumi reagenseket vagy analitikai tisztaságú vegyszereket, és ionmentesített vizet kell használni.

Svéd szabvány (SIS) szerinti Lemna-tápoldat

Az I–V. törzsoldatot autoklávozással (120 °C, 15 perc) vagy membránszűréssel (körülbelül 0,2 μm pórusméret) sterilizáljuk.

A VI. (és szükség esetén a VII.) törzsoldatot kizárólag membránszűréssel sterilizáljuk, autoklávozás nem alkalmazható.

A steril törzsoldatokat hideg, sötét helyen tároljuk. Az I–V. törzsoldatot hat hónap elteltével ki kell önteni, míg a VI. (és szükség esetén a VII.) törzsoldat eltarthatósági ideje egy hónap.

Törzsoldat száma

Anyag

Koncentráció a törzsoldatban

(g/l)

Koncentráció a kész tápoldatban

(mg/·l)

Kész tápoldat

 

 

 

 

Elemek

Koncentráció

(mg/·l)

I.

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II.

MgSO4. 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III.

CaCl2. 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV.

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V.

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2. 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4. 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4. 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4. 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2. 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI.

FeCl3. 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

-

-

VII.

MOPS (puffer)

490

490

-

-

Egy liter SIS szerinti tápoldat elkészítéséhez 900 ml ionmentesített vízhez a következőket adagoljuk:

10 ml az I. törzsoldatból

5 ml a II. törzsoldatból

5 ml a III. törzsoldatból

5 ml a IV. törzsoldatból

1 ml az V. törzsoldatból

5 ml a VI. törzsoldatból

1 ml a VII. törzsoldatból (ha szükséges)

Megjegyzés: A VII. törzsoldatot (MOPS puffer) bizonyos vizsgált vegyi anyagok esetében kell alkalmazni (lásd a 11.pontot).

A pH-értéket 0,1 vagy 1 mol HCl vagy NaOH hozzáadásával 6,5 ± 0,2 értékre állítjuk, majd a térfogatot ionmentesített víz hozzáadásával egy literre kiegészítjük.

20X–AAP tápoldat

A törzsoldatokat steril desztillált vagy ionmentesített vízzel készítjük.

A steril törzsoldatokat hűvös, sötét helyen tároljuk. Ilyen körülmények között eltarthatósági idejük legalább 6–8 hét.

A 20X–AAP tápoldat előállításához öt, tápanyagokat tartalmazó törzsoldatot (A1., A2., A3., B. és C.) készítünk reagens minőségű vegyületek felhasználásával. A tápoldat előállításához kb. 850 ml ionmentesített vízhez 20 ml-t adunk minden törzsoldatból. A pH-értéket 0,1 vagy 1 mol HCl vagy NaOH hozzáadásával 7,5 ± 0,1 értékre állítjuk, majd a térfogatot ionmentesített víz hozzáadásával egy literre kiegészítjük. Ezután a tápoldatot egy kb. 0,2 μm pórusméretű membránszűrőn át steril edénybe szűrjük.

A vizsgálatok céljára szánt tápoldatot egy-két nappal a felhasználás előtt kell elkészíteni annak érdekében, hogy pH-értékük stabilizálódhasson. A tápoldat pH-értékét felhasználás előtt ellenőrizni kell, és szükség esetén 0,1 vagy 1 mol HCl vagy NaOH hozzáadásával a fentieknek megfelelően újra be kell állítani.

Törzsoldat száma

Anyag

Koncentráció a törzsoldatban

(g/ߦl) (7)

Koncentráció a kész tápoldatban

(mg/ߦl) (7)

Kész tápoldat

 

 

 

 

Elemek

Koncentráció

(mg/ߦl) (7)

A1.

NaNO3

26

510

Na;N

190;84

MgCl2.6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2.2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2.

MgSO4.7H2O

15

290

S

38,22

A3.

K2HPO4.3H2.O

1,4

30

K;P

9,4;3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2.4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3.6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA.2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2.6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4.2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2.2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na;C

220; 43

STEINBERG-féle tápoldat (az ISO 20079 szerint)

Koncentrációk és törzsoldatok

A módosított Steinberg-féle tápoldatot az ISO 20079 kizárólag Lemna minor esetére írja elő (mert a szabvány csak Lemna minor alkalmazását engedélyezi), de korábbi vizsgálatok Lemna gibba esetén is kedvező eredményekre vezettek.

A tápoldat készítése során reagens vagy analitikai tisztaságú anyagokat és ionmentesített vizet kell alkalmazni.

A tápoldatot elkészíthetjük törzsoldatokból vagy a tízszeres töménységű oldatból, amely maximális oldatkoncentrációt tesz lehetővé kicsapódás nélkül.

1. táblázat

pH-stabilizált (Altenburger szerint módosított) STEINBERG-féle tápoldat

Összetevő

Tápoldat

Makroelemek

móltömeg

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroelemek

móltömeg

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

Dinátrium-EDTA-dihidrát

372,24

1 500,00

4,03


2. táblázat

Törzsoldatok (Makroelemek)

1.

Makroelemek (50-szeres töménységű)

g/l

1. törzsoldat:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

2. törzsoldat:

MgSO4 · 7H2O

5,00

3. törzsoldat:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


3. táblázat

Törzsoldatok (Mikroelemek)

2.

Mikroelemek (1 000-szeres töménységű)

mg/l

4. törzsoldat:

H3BO3

120,0

5. törzsoldat:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

6. törzsoldat:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

7. törzsoldat:

MnCl2 · 4H2O

180,0

8. törzsoldat:

FeCl3 · 6H2O

760,00

Dinátrium-EDTA-dihidrát

1 500,00

A 2. és 3., illetve külön a 4–7. törzsoldat egyesíthető (a kívánt koncentrációk figyelembevételével).

A hosszabb eltarthatóság érdekében kezeljük a törzsoldatokat autoklávban 121 °C-on 20 percig, vagy végezzünk membránszűréses (0,2 μm) sterilizálást. A 8. törzsoldat esetében fokozottan ajánlott membránszűréses (0,2 μm) sterilizálást végezni.

A végleges koncentrációjú (módosított) STEINBERG-féle tápoldat elkészítése

A kicsapódás elkerülése érdekében mintegy 900 ml ionmentesített vízhez adjunk az 1., 2. és 3. törzsoldatból (lásd a 2. táblázatot) egyaránt 20 ml-t.

Az oldathoz adjunk a 4., 5., 6., 7. és 8. törzsoldatból (lásd a 3. táblázatot) egyaránt 1,0 ml-t.

A pH-érték 5,5 ± 0,2 legyen (ezt az értéket minél kevesebb NaOH-oldat vagy HCl hozzáadásával állítsuk be).

Víz hozzáadásával egészítsük ki az oldat térfogatát 1 000 ml-re.

Ha a törzsoldatok sterilizáltak és megfelelő minőségű vizet alkalmazunk, akkor további sterilizálás nem szükséges. Ha a végleges tápoldatot sterilizáljuk, a 8. törzsoldatot az autoklávozás (121 °C-on 20 percig) után kell hozzáadni.

A 10-szeres töménységű (módosított) STEINBERG-féle tápoldat elkészítése ideiglenes tárolásra

A kicsapódás elkerülése érdekében mintegy 30 ml vízhez adjunk az 1., 2. és 3. törzsoldatból (lásd a 2. táblázatot) egyaránt 20 ml-t.

Az oldathoz adjunk a 4., 5., 6., 7. és 8. törzsoldatból (lásd a 3. táblázatot) egyaránt 1,0 ml-t. Víz hozzáadásával egészítsük ki az oldat térfogatát 100 ml-re.

Ha a törzsoldatok sterilizáltak és megfelelő minőségű vizet alkalmazunk, akkor további sterilizálás nem szükséges. Ha a végleges tápoldatot sterilizáljuk, a 8. törzsoldatot az autoklávozás (121 °C-on 20 percig) után kell hozzáadni.

A (végleges koncentrációjú) tápoldat pH-értéke 5,5±0,2 legyen.

6.

A melléklet a következő C.31–C.46. fejezettel egészül ki:

C.31.   SZÁRAZFÖLDI NÖVÉNYEK VIZSGÁLATA: CSÍRÁZÁS ÉS CSÍRANÖVEKEDÉS

BEVEZETÉS

1.

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 208. vizsgálati iránymutatásában (2006) leírt módszerrel. A vizsgálati módszereket a tudományos fejlődés és a szabályozási célra történő használatra való alkalmazhatóság alapján rendszeresen felülvizsgálják. E frissített vizsgálati módszer célja, hogy megvizsgálja a vegyi anyagoknak a csírázásra és a csíranövekedésre gyakorolt potenciális hatásait. A vizsgálat nem terjed ki a szaporodásra (azaz a magképzésre, a virág kialakulására, a gyümölcs érésére) gyakorolt krónikus hatásokra. Az expozíció feltételeit és a vizsgálandó vegyi anyag tulajdonságait meg kell fontolni a megfelelő vizsgálati módszerek használatának biztosítása érdekében (például fémek/fémvegyületek vizsgálatakor a pH és a kapcsolódó ellenionok hatásait mérlegelni kell) (1). Ez a vizsgálati módszer nem foglalkozik a vegyi anyagok gőzeinek kitett növényekkel. A vizsgálati módszer általános vegyi anyagok, biocidek és növényvédő szerek (más néven peszticidek) tesztelésére alkalmazható. Meglévő módszerek alapján fejlesztették ki (2) (3) (4) (5) (6) (7). A növények vizsgálatára vonatkozó egyéb hivatkozásokat is figyelembe vettek (8) (9) (10). A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

A VIZSGÁLAT ELVE

2.

A vizsgálat a vizsgált vegyi anyagnak a magasabb rendű növények csírázására és korai növekedésére gyakorolt hatásait értékeli a talajon (vagy más alkalmas talajmátrixon) keresztül történő expozíciót követően. A magokat érintkezésbe helyezzük a vizsgált vegyi anyaggal kezelt talajjal, és a hatásokokat rendszerint 14–21 nap elteltével értékeljük, miután a csíranövények 50 %-a megjelent a kontrollcsoportban. A mért végpontok a csírázás vizuális értékelése, a hajtás száraz tömege (alternatívaként a friss hajtások tömege), és bizonyos esetekben a hajtás magassága, valamint a különböző növényi részeken látható káros hatások értékelése. A méréseket és megfigyeléseket összevetjük a kezeletlen kontroll növényekkel.

3.

Az expozíció várható útvonalától függően a vizsgált vegyi anyagot el kell keverni a talajba (vagy esetleg a mesterséges talajmátrixba), vagy szét kell oszlatni a talaj felületén, ami megfelelően képviseli az adott vegyi anyagnak való expozíció potenciális útvonalát. A talajba való elkeverést ömlesztett talaj kezelésével végezhetjük. Az alkalmazást követően a talajt áthelyezzük a cserépbe, majd az adott növényfaj magjait ültetjük a talajba. A felületi alkalmazást a cserepes talajon végezzük, amelybe már beültettük a magokat. A vizsgálati egységeket (kontroll és kezelt talaj plusz magok) ezután megfelelő, a növények csírázását/növekedését támogató körülmények közé helyezzük.

4.

A vizsgálatot a vizsgálat célja szerint el lehet végezni a dózis-válasz görbe meghatározása érdekében, vagy pedig egyetlen koncentráció/arány alkalmazásával határérték vizsgálatként. Ha az egyetlen koncentráció/arány vizsgálatának eredményei meghaladnak egy bizonyos toxicitási szintet (például hogy x %-nál nagyobb mértékű hatás figyelhető-e meg), akkor dózisbehatároló vizsgálatot kell végezni a toxicitás felső és alsó határértékeinek meghatározása céljából, amelyet egy több koncentrációban/arányban elvégzett vizsgálatnak kell követnie a dózis-válasz görbe felvétele céljából. Megfelelő statisztikai elemzést kell használni az érdeklődésre számot tartó legérzékenyebb paraméter(ek) ECx hatékony koncentrációjának vagy ERX hatékony alkalmazási arányának (pl. EC25, ER25, EC50, ER50) megállapításához. Továbbá, az észlelhető hatást még nem okozó koncentrációt (NOEC) és az észlelhető hatást okozó legkisebb koncentrációt (LOEC) is ki lehet számítani ebben a vizsgálatban.

A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK

5.

Az alábbi információ hasznos a vegyi anyag várható expozícós útvonalának azonosításához és a vizsgálat tervezéséhez: szerkezeti képlet, tisztaság, vízben való oldhatóság, szerves oldószerekben való oldhatóság, 1-oktanol-víz megoszlási hányados, talaj szorpciós viselkedés, gőznyomás, kémiai stabilitás vízben és fényben, illetve biológiai lebonthatóság.

A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE

6.

A vizsgálat érvényességéhez az alábbi teljesítménykritériumoknak kell teljesülniük a kontrollcsoport(ok)ban:

a magoknak legalább 70 %-a kicsírázott;

a csíranövények nem mutatják fitotoxikus hatások látható jeleit (pl. klorózis, elhalás, hervadás, levél- és szárdeformációk) és a növények csak az adott fajnál szokásos növekedési és morfológiái változatosságot mutatják;

az átlagos túlélési arány a kikelt kontroll-csíranövények esetében legalább 90 % a vizsgálat időtartama alatt;

egy adott faj környezeti feltételei megegyeznek és a táptalaj ugyanakkora mennyiségű talajmátrixot, támogató közeget vagy ugyanabból a forrásból származó táptalajt tartalmaz.

REFERENCIA-VEGYIANYAG

7.

A referencia-vegyianyagot rendszeres időközönként ellenőrizni lehet annak igazolása céljából, hogy a vizsgálat elvégzése, az adott kísérleti növények által adott válasz és a vizsgálati feltételek nem változtak jelentősen az idő múlásával. Alternatív megoldásként a kontrollok élőanyagtömegének vagy növekedésének korábbi mérési eredményeit lehet felhasználni a vizsgálati rendszer adott laboratóriumban történő értékelésére, amely a laboratóriumon belüli minőségellenőrzési intézkedésként szolgálhat.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Természetes talaj – Mesterséges táptalaj

8.

A növényeket cserépben lehet nevelni homokos vályog, agyagos homok, vagy homokos agyagos vályog használatával, amely legfeljebb 1,5 százalék szerves szént tartalmaz (kb. 3 százalék szerves anyag). A legfeljebb 1,5 százalék szerves szént tartalmazó kereskedelmi virágföldek vagy szintetikus talajkeverékek is használhatók. Agyagos talajok nem használhatók, ha a vizsgált vegyi anyagról közismert, hogy nagy az agyaghoz való affinitása. A terepről származó talajt a homogenizálás és a durva részecskék eltávolítása érdekében 2 mm lyukátmérőjű szitán meg kell szitálni. A végső előkészített talaj típusát és textúráját, százalékos szerves szén tartalmát, pH-ját, sótartalmát és elektronikus vezetőképességét meg kell adni a jelentésben. A talajt be kell sorolni a standard osztályozási rendszer szerint (11). A talajt pasztőrözni vagy hőkezelni lehet a talajkórokozók hatásának csökkentése érdekében.

9.

A természetes talaj az eltérő fizikai/kémiai tulajdonságok és mikrobiális populációk miatt megnehezítheti az eredmények értelmezését és növelheti a változékonyságot. Ezek a változók megváltoztatják a nedvességmegtartó képességet, a kémiai megkötő képességet, az átszellőzést, valamint a tápanyag- és nyomelemtartalmat. E fizikai tényezők változékonysága mellett a kémiai tulajdonságok – például a pH és a redox potenciál – is változékonyak lehetnek, ami hatással lehet a vizsgált vegyi anyag biológiai hozzáférhetőségére (12) (13) (14).

10.

A mesterséges táptalajokat jellemzően nem használják a növényvédő szerek vizsgálatánál, de hasznosak lehetnek az általános vegyi anyagok vizsgálatának céljára, vagy ha arra van szükség, hogy minimálisra csökkentsük a természetes talajok variabilitását és jobban összehasonlíthatóak legyenek a vizsgálati eredmények. A táptalajoknak inert anyagokból kell állniuk, amelyek minimalizálják a vizsgált vegyi anyaggal, az oldószer hordozóanyaggal, vagy mindkettővel való kölcsönhatást. A savval mosott kvarchomokot, az ásványgyapotot és az üveggyöngyöket (pl. a 0,35-0,85 mm átmérőjű gyöngyöket) alkalmas inert anyagoknak találták, amelyek minimális mértékben nyelik el a vizsgált vegyi anyagot (15), és biztosítják, hogy a csíranövények a vegyi anyagot a gyökereiken keresztül maximális mértékben fel tudják venni. Az alkalmatlan táptalajok közé tartoznak a vermikulit, a perlit és az egyéb erősen nedvszívó anyagok. A növények számára tápanyagokat kell biztosítani annak érdekében, hogy a növényekre ne gyakoroljon stresszhatást a tápanyaghiány, és ahol lehetséges, ezt kémiai elemzés vagy a kontroll növények vizuális értékelése útján ellenőrizni kell.

A vizsgált fajok kiválasztásának kritériumai

11.

A kiválasztott fajoknak meglehetősen széleskörűnek kell lenniük, pl. a növényvilágon belüli rendszertani diverzitás, az elterjedtség, az előfordulási gyakoriság, az életciklus fajspecifikus jellemzői és a természetbeli előfordulás földrajzi területe tekintetében, hogy széles választartományt adjanak (8) (10) (16 ) (17) (18) (19) (20). A lehetséges vizsgálati fajok következő jellemzőit kell figyelembe venni a kiválasztás során:

a fajoknak egységes méretű magokkal kell rendelkezniük, amelyek a megbízható standard vetőmag forrás(ok)ból könnyen hozzáférhetőek, és konzisztens, megbízható és egyenletes csírázást, valamint a csíranövény egyenletes növekedését mutatják;

a növények alkalmasak a laboratóriumban végzett vizsgálatok céljára, illetve megbízható és reprodukálható eredményeket adnak a vizsgálati létesítményen belül és azok között;

a vizsgált fajok érzékenységének összhangban kell lennie a vegyi anyagnak kitett környezetben található növények által adott válaszokkal;

a fajokat bizonyos mértékig már használták korábbi toxicitási vizsgálatok során, és az alkalmazásuk során szerzett tapasztalatok – például gyomirtó biológiai vizsgálatokban, nehézfém szűrővizsgálatokban, sótartalommal kapcsolatos vagy ásványi stressz vizsgálatokban, illetve allelopátia vizsgálatokban – azt mutatják, hogy sokféle stresszorral szemben mutatnak érzékenységet;

összhangban vannak a vizsgálati módszer növekedési feltételeivel;

megfelelnek a vizsgálat érvényességi követelményeinek.

Néhány korábban gyakran használt fajt a 2. függelék sorol fel, a potenciális nem terményfajok pedig a 3. függelékben találhatók.

12.

A vizsgálandó fajok száma függ a vonatkozó jogszabályi követelményektől, ezért ezt a vizsgálati módszer nem határozza meg.

A vizsgált vegyi anyag bevitele

13.

A vegyi anyagot egy megfelelő hordozóban (pl. víz, aceton, etanol, polietilén-glikol, gumiarábikum, homok) kell bevinni. Hatóanyagokat és különböző segédanyagokat tartalmazó keverékeket (formulázott termékeket vagy készítményeket) is lehet vizsgálni.

Bevitel a talajba/mesterséges táptalajba

14.

A vízben oldható vagy vízben szuszpendált vegyi anyagokat vízhez adjuk, majd az oldatot egy megfelelő keverőberendezés segítségével összekeverjük a talajjal. Ez a fajta vizsgálat akkor lehet megfelelő, ha a vegyi anyagnak való kitettség a talajon vagy a talaj pórusaiban lévő vízen keresztül történik, és felmerül a gyökereken át történő felvétel lehetősége. A talaj vízmegtartó képességét a vizsgált vegyi anyag hozzáadásával nem szabad túllépni. A hozzáadott víz térfogatának meg kell egyeznie minden egyes kísérleti koncentráció esetében, de annak mértékét korlátozni kell, hogy a talaj agglomerátumok csomósodása megakadályozható legyen.

15.

A vízben kevésbé oldódó vegyi anyagokat egy alkalmas illékony oldószerben (pl. aceton, etanol) fel kell oldani, és homokkal el kell keverni. Az oldószert ezután légáram használatával, a homok állandó kevergetése közben eltávolítjuk a homokból. A kezelt homokot összekeverjük a kísérleti talajjal. Létre kell hozni egy második kontroll mintát is, amely csak homokot és oldószert kap. Egyenlő mennyiségű homokot – a bekevert és eltávolított oldószerrel – kell adni minden kezelési szinthez és a második kontrollhoz. Szilárd, oldhatatlan vizsgált vegyi anyagok esetében a vegyi anyagot egy alkalmas keverő berendezés segítségével összekeverjük száraz talajjal. A továbbiakban a talajt hozzáadjuk a cserepekhez, és azonnal magokat vetünk bele.

16.

Amikor talaj helyett mesterséges táptalajt használunk, a vízben oldható vegyi anyagokat közvetlenül a vizsgálat megkezdése előtt oldjuk fel a tápoldatban. A vízben oldhatatlan, de vízben oldószer hordozó segítségével szuszpendálható vegyi anyagokat a hordozóanyaggal együtt kell hozzáadni a tápoldathoz. A vízben nem oldódó vegyi anyagokat, amelyek esetében nem áll rendelkezésre nem-toxikus vízoldékony hordozó, egy megfelelő illékony oldószerben kell feloldani. Az oldatot összekeverjük homokkal vagy üveggyöngyökkel, behelyezzük egy forgó vákuum berendezésbe és elpárologtatjuk, így a vegyi anyag egyenletes bevonatot fog képezni a homokon vagy a gyöngyökön. A cserepek feltöltése előtt a gyöngyök egy lemért részét ugyanazzal a szerves oldószerrel extrahálni, majd a vegyi anyagra analizálni kell.

Felületi alkalmazás

17.

Növényvédő termékek esetében a vizsgált vegyi anyag bevitelére gyakran alkalmazzák a talaj felületének a vizsgálati oldattal való permetezését. A vizsgálatok során használt berendezéseknek, beleértve a vizsgált vegyi anyag elkészítésére és bevitelére használt berendezéseket, olyan elrendezésűnek és kapacitásúnak kell lenniük, hogy a berendezéseket használó vizsgálatokat a legpontosabb módon lehessen elvégezni és reprodukálható lefedettséget adjanak. A lefedettség egyenletes legyen a talaj egész felületén. Ügyelni kell arra, hogy elkerüljék annak lehetőségét, hogy a vegyi anyagokat a berendezések adszorbeálják vagy azokkal reakcióba lépjenek (pl. műanyag csövek és lipofil vegyi anyagok, vagy acél alkatrészek és elemek). A vizsgált vegyi anyagot rápermetezzük a talaj felületére, utánozva a permetezőtartályból történő tipikus alkalmazást. A permettérfogatoknak általában a normál mezőgazdasági gyakorlatnak megfelelő tartományban kell lenniük, és a térfogatokat (víz mennyisége stb.) meg kell adni a jegyzőkönyvben. Olyan fúvókatípust kell kiválasztani, amely egyenletes lefedettséget biztosít a talaj felszínén. Ha oldószereket és hordozókat alkalmazunk, egy kontroll növényekből álló második csoportot is ki kell alakítani, amely kizárólag oldószert/hordozóanyagot kap. Ez nem szükséges készítményként vizsgált növényvédelmi termékek esetében.

A vizsgált vegyi anyag koncentrációjának/arányának ellenőrzése

18.

A koncentrációkat vagy az alkalmazás mértékét megfelelő analitikai ellenőrzéssel meg kell erősíteni. Oldható vegyi anyagok esetében valamennyi koncentráció/arány ellenőrzése megerősíthető a vizsgálat során alkalmazott legmagasabb koncentrációjú vizsgálati oldat elemzése révén a rákövetkező hígításra vonatkozó dokumentációval és kalibrált beviteli berendezésekkel (pl. kalibrált analitikai üvegáru, permetező berendezések kalibrálása). Oldhatatlan vegyi anyagok esetében az összetett anyag ellenőrzését a vizsgált vegyi anyagnak a talajhoz adott tömegével kell biztosítani. Ha demonstrálni kell a homogenitást, a talaj elemzésére lehet szükség.

AZ ELJÁRÁS

A vizsgálat megtervezése

19.

Azonos fajba tartozó magokat ültetünk el cserepekben. A cserepenként elültetett magok száma a fajtól, a cserép méretétől és a vizsgálat időtartamától függ. A edényenkénti növények számának megfelelő növekedési feltételeket kell biztosítania, és el kell kerülni túlzsúfoltságot a vizsgálat időtartama alatt. A maximális tőszám 3–10 mag/100 cm2 körül van a magok méretétől függően. Például 1–2 kukorica, szójabab, paradicsom, uborka, vagy cukorrépa növény ajánlott egy 15 cm-es tartályban; három repce vagy hüvelyes növény ajánlott egy 15 cm-es tartályban; és 5–10 hagyma, búza, vagy más apró mag ajánlott egy 15 cm-es tartályban. A magok és az ismétlések száma (az ismétlés edényként van meghatározva, ezért az azonos edényben található növények nem jelentenek ismétlést) elegendő kell legyen az optimális statisztikai elemzéshez (21). Meg kell jegyezni, hogy a változékonyság nagyobb lesz az olyan vizsgált fajok esetében, ahol kevesebb nagy magot használunk edényenként (ismétlésenként), összehasonlítva azokkal a vizsgált fajokkal, ahol nagyobb számú kis magot lehet használni edényenként. Edényenként azonos számú mag ültetésével ez a változékonyság minimalizálható.

20.

Kontrollcsoportokat kell használni annak igazolására, hogy a megfigyelt hatások összefüggenek a vizsgált vegyi anyagnak való kitettséggel, illetve kizárólag annak tulajdoníthatók. A megfelelő kontrollcsoportnak minden tekintetben azonosnak kell lennie a vizsgált csoporttal, kivéve a vizsgált vegyi anyagnak való kitettséget. Egy adott vizsgálaton belül valamennyi kísérleti növénynek, beleértve a kontrollokat is, azonos forrásból kell származnia. A torzítások megelőzése érdekében a vizsgálati és kontroll edények véletlen besorolására van szükség.

21.

Az inszekticiddel vagy fungiciddel bevont magokat (azaz a »kikészített« magokat) kerülni kell. Bizonyos nem szisztémás kontakt fungicidek (pl. kaptán, thiram) használatát azonban egyes szabályozó hatóságok engedélyezik (22). Ha a magok által hordozott kórokozók jelenléte aggodalomra adhat okot, a magokat rövid ideig gyenge 5 %-os hipoklorit-oldatba lehet mártani, majd alaposan át kell öblíteni folyó vízzel és meg kell szárítani. Az egyéb növényvédőszerekkel végzett javító kezelés nem engedélyezett.

Vizsgálati körülmények

22.

A vizsgálati feltételeknek meg kell közelíteniük a vizsgált fajok és fajták normális növekedéséhez szükséges feltételeket (a vizsgálati feltételek példáit lásd a 4. függelékben). A fejlődő növényeket a jó kertészeti gyakorlatnak megfelelően ellenőrzött környezetű kamarákban, fitotronokban, vagy üvegházakban kell tartani. Növesztő létesítmények használata esetén ez a gyakorlat rendszerint magában foglalja a hőmérséklet, a páratartalom, a széndioxid-koncentráció, a fény (fényerő, hullámhossz, fotoszintetikusan aktív sugárzás) és a megvilágitási időszak, az öntözőeszközök, stb. ellenőrzését és megfelelően rendszeres (pl. naponta történő) feljegyzését a növények megfelelő fejlődésének biztosítása érdekében, amelyet a kiválasztott fajba tartozó kontroll növények alapján ítélnek meg. Az üvegházi hőmérsékletet a szellőztetés és a fűtő és/vagy hűtő rendszerek segítségével kell kontrollálni. Üvegházban történő vizsgálat esetén általában az alábbi feltételek ajánlottak:

hőmérséklet: 22 °C ± 10 °C;

nedvesség: 70 % ± 25 %;

megvilágítási időszak: minimum 16 óra fény;

fényerő: 350 ± 50 μE/m2/s. A kevesebb fényt igénylő fajok kivételével 400-700 nm hullámhosszú kiegészítő világításra lehet szükség, ha a fényerő 200 μE/m2/s alá csökken.

A környezeti feltételeket a vizsgálat során nyomon kell követni és jegyzőkönyvezni kell. A növényeket nem porózus műanyag vagy mázas edényekben kell nevelni, az edény alatt elhelyezett tálcával vagy csészealjjal. Az edényeket rendszeresen át lehet helyezni a vizsgálati feltételek tekintetében a növesztő létesítményen belül fennálló különbségek miatt kialakuló és a növények növekedésében megmutatkozó variabilitás minimalizálása érdekében. Az edényeknek elég nagynak kell lenniük ahhoz, hogy lehetővé tegyék a normális növekedést.

23.

A talajt tápanyagokkal lehet egészíteni, hogy fenntartsuk a növények jó életképességét. A kiegészítő tápanyagok iránti igényt és azok időzítését a kontroll növények megfigyelése alapján lehet megítélni. Ajánlott a vizsgálati edények alsó öntözése (pl. üvegszálból készült kanóc használatával). Kezdetben azonban felső öntözést is lehet használni a magok csírázásának ösztönzése céljából, illetve a talaj felületén történő kezelés esetén, mivel megkönnyíti a vegyi anyag bejutását a talajba.

24.

A specifikus növekedési feltételeknek megfelelőnek kell lenniük a vizsgált faj és a vizsgált vegyi anyag számára. A kontroll és a kezelt növényeket azonos környezeti feltételek között kell tartani, megfelelő intézkedéseket kell azonban tenni a vizsgált vegyi anyaggal történő keresztexpozíció (pl. illékony vegyi anyagok) megakadályozására a különböző kezelési csoportok között, illetve a kezelési csoportok és a kontrollok között.

Egyetlen koncentrációban/arányban történő vizsgálat

25.

Egy vegyi anyag egyetlen koncentrációval vagy aránnyal történő vizsgálatának lefolytatásához megfelelő koncentráció/arány (kihívás/határérték) meghatározása érdekében számos tényezőt kell figyelembe venni. Általános vegyi anyagok esetében ezek közé tartoznak a vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságai. Növényvédő szerek esetében a vizsgált vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságait és felhasználási formáit, maximális koncentrációját vagy kiszórt mennyiségét, a szezononkénti alkalmazások számát és/vagy a vizsgált vegyi anyag perzisztenciáját figyelembe kell venni. Annak meghatározására, hogy egy általános vegyi anyag rendelkezik-e fitotoxikus tulajdonságokkal, a vegyi anyagot legfeljebb 1 000 mg/kg száraz talaj szinten kell vizsgálni.

Dózisbehatároló vizsgálat

26.

Ha szükséges, dózisbehatároló vizsgálatot lehet végezni, hogy útmutatást nyújtson arra vonatkozóan, milyen koncentrációkat/arányokat kell vizsgálni a meghatározó dózis-válasz vizsgálatban. A dózisbehatároló vizsgálathoz a vizsgálati koncentrációknak/arányoknak nagy léptékkel kell emelkedniük (pl. 0,1, 1,0, 10, 100 és 1 000 mg/kg száraz talaj). A növényvédő szerek esetében a koncentrációknak/arányoknak az ajánlott vagy maximális koncentráción, illetve kiszórt mennyiségen kell alapulniuk, pl. az ajánlott/maximális koncentráció vagy a kiszórt mennyiség 1/100, 1/10, 1/1 része.

Több koncentrációban/arányban történő vizsgálat

27.

A több koncentrációban/arányban történő vizsgálat célja a dózis-válasz összefüggés megállapítása és a csírázás ECx vagy ERX értékének, illetve az élőanyagtömegnek és/vagy a látható hatásoknak a nem kitett kontrollokhoz viszonyított meghatározása, a szabályozó hatóságok követelményei szerint.

28.

A koncentrációk és arányok számának és elhelyezkedésének elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy megbízható dózis-válasz összefüggést és regressziós egyenletet generáljanak, és becslést adjanak az ECx vagy az ERx értékére. A kiválasztott koncentrációknak/arányoknak körbe kell venniük a meghatározandó ECx vagy ERx értéket. Például, ha az EC50 értékre van szükség, akkor olyan arányokat kell vizsgálni, amelyek 20–80 %-os hatást eredményeznek. Az ennek eléréséhez ajánlott kísérleti koncentrációk/arányok száma legalább öt egy mértani sorozatban, plusz a kezeletlen kontroll, és az egyes koncentrációkat/arányokat egymástól elválasztó kvóciens értéke legfeljebb három lehet. Minden egyes kezelt és kontroll csoport esetében az ismétlések száma legalább négy legyen, a magok számának pedig legalább 20-nak kell lennie. Az alacsony csírázási arányú vagy változó növekedésű növények esetében több ismétlésre lehet szükség a vizsgálat statisztikai erejének növelése érdekében. Ha nagyobb számú kísérleti koncentrációt/arányt használnak, az ismétlések száma csökkenthető. Ha a NOEC értékét kívánják becsülni, több ismétlésre lehet szükség a kívánt statisztikai erő eléréséhez (23).

Megfigyelések

29.

A megfigyelési időszak alatt, azaz a kontroll növények (adott esetben az oldószer kontrollok is) 50 %-ának kicsírázása után 14-21 napig a növényeket gyakran megfigyelik (legalább hetente, vagy ha lehetséges, naponta), hogy ellenőrizzék a csírázást, a látható fitotoxicitást és a mortalitást. A vizsgálat végén fel kell jegyezni a túlélő növények csírázási százalékát és élőanyagtömegét, valamint a növény különböző részein látható káros hatásokat. Utóbbiak közé tartoznak a csíranövények megjelenésében mutatkozó rendellenességek, a fejlődésben való visszamaradás, a klorózis, az elszíneződés, a mortalitás, és a növény fejlődésére gyakorolt hatások. A végső élőanyagtömeget a túlélő növények hajtásainak átlagos száraz tömege segítségével lehet mérni, amelyhez a hajtásokat a talaj felszínén kell levágni és 60 °C-on tömegállandóságig szárítani. Alternatív módszerként a végső élőanyagtömeget a hajtások friss tömegének segítségével is mérni lehet. A hajtások magassága egy másik végpont lehet, ha a szabályozó hatóságok megkövetelik. A látható sérülések tekintetében egységes pontozási rendszert kell használni a megfigyelhető toxikus válaszok értékelésére. A minőségi és mennyiségi vizuális értékelés elvégzésére vonatkozó példák a (23) és (24) szakirodalmi hivatkozásban találhatók.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Statisztikai elemzés

Egyetlen koncentráció/arány vizsgálata

30.

Az egyes növényfajok adatait megfelelő statisztikai módszerrel kell elemezni (21). A vizsgált koncentráció/arány hatásának szintjét, vagy az adott hatás elérésének hiányát a vizsgált koncentrációban/arányban (pl. <x % hatást figyeltek meg y koncentráció vagy arány esetén) jegyzőkönyvezni kell.

Több koncentráció/arány vizsgálata

31.

A dózis-válasz kapcsolatot egy regressziós egyenlet formájában állapítják meg. Különböző modellek használhatók: például a csírázás ECx vagy ERx értéke (pl. EC25, ER25, EC50, ER50) és a megbízhatósági határok – mint kvantális adatok – becslésére a logit, probit, Weibull, Spearman-Karber, vágott Spearman-Karber módszerek, stb. lehetnek megfelelőek. A csíranövények növekedése (tömeg és a magasság), mint folyamatos végpont esetében az ECx vagy ERx értéket és a megbízhatósági határokat megfelelő regressziós elemzés (pl. Bruce-Versteeg nem lineáris regressziós elemzés (25)) segítségével lehet megbecsülni. Ahol csak lehetséges, a legérzékenyebb fajok esetében az R2 legyen 0,7 vagy magasabb, és az alkalmazott vizsgálati koncentrációknak/arányoknak a 20–80 %-os hatások tartományát kell felölelniük. Ha a NOEC értékét kívánják becsülni, az erős statisztikai vizsgálatok alkalmazását kell előnyben részesíteni, és ezeket az adatok eloszlása alapján kell kiválasztani (21) (26).

Vizsgálati jegyzőkönyv

32.

A vizsgálati jegyzőkönyvnek be kell mutatnia a vizsgálatok eredményeit, valamint a vizsgálati feltételek részletes leírását, az eredmények alapos megvitatását, az adatok elemzését, és az abból levont következtetéseket. Egy táblázatos összefoglalót és az eredmények kivonatát is el kell készíteni. A jelentés kötelező elemei a következők:

 

Vizsgált vegyi anyag:

kémiai azonosító adatok, a vizsgált vegyi anyag lényeges tulajdonságai (pl. log Pow, vízoldhatóság, gőznyomás, illetve a környezetben bekövetkező sorsra és viselkedésre vonatkozó információk, ha rendelkezésre állnak);

a vizsgálati oldat elkészítésére és a vizsgált koncentrációk ellenőrzésére vonatkozó információk a 18. pontban meghatározottak szerint.

 

A vizsgálathoz felhasznált faj:

a vizsgált szervezetre vonatkozó információk: faj/fajta, növénycsalád, tudományos és közönséges név, a mag eredete és története a lehető legrészletesebben (azaz a szállító neve, csírázási százalék, mag méretkategória, tételszám, gyűjtés éve vagy vegetációs időszaka, csírázási minősítés dátuma), életképesség, stb.;

a vizsgált egy- és kétszikű fajok száma;

a faj kiválasztásának indoklása;

a mag tárolásának, kezelésének és fenntartásának leírása.

 

Vizsgálati körülmények:

vizsgálati berendezés (pl. növesztőkamra, fitotron és üvegház);

a vizsgálati rendszer leírása (pl. edényméretek, az edény anyaga és a talaj mennyisége);

a talaj jellemzői (textúra vagy a talaj típusa: a talaj részecskeeloszlása és osztályozása, fizikai és kémiai tulajdonságai, beleértve a szerves anyagok százalékos arányát, a szerves szén százalékos arányát és a pH-t);

a talaj/táptalaj (pl. talaj, mesterséges talaj, homok és egyéb) előkészítése a vizsgálat előtt;

a tápközeg leírása, ha használnak ilyet;

a vizsgált vegyi anyag alkalmazása: a felhasználás módjának leírása, a berendezés leírása, az expozíciós arányok és mennyiségek, beleértve a vegyi anyag ellenőrzését, a kalibrációs módszer leírása és az alkalmazása során tapasztalt környezeti feltételek leírása;

növekedési feltételek: fényerő (pl. PAR: fotoszintetikusan aktív sugárzás), megvilágítási időszak, maximum és minimum hőmérséklet, az öntözés ütemezése és módja, trágyázás;

a magok száma edényenként, a növények száma dózisonként, az ismétlések (edények) száma expozíciós arányonként;

a kontrollok típusa és száma (negatív és/vagy pozitív kontrollok, oldószer kontroll, ha van);

a vizsgálat időtartama.

 

Eredmények:

az összes végpontot, a vizsgálati koncentrációt/arányt és fajt tartalmazó táblázat minden ismétlés esetében;

a csírázó növények száma és százalékos aránya a kontrollcsoporthoz viszonyítva;

a növények élőanyagtömegének mérési eredményei (a hajtások száraz tömege vagy nedves tömege) a kontrollok százalékában;

a növényi hajtások magassága a kontrollok százalékában, ha mérik;

a vizsgált vegyi anyag által okozott látható sérülések százalékos aránya és a látható sérülések kvalitatív és kvantitatív leírása (klorózis, nekrózis, hervadás, levél- és szárdeformáció, valamint a hatások hiánya), a kontroll növényekkel összehasonlítva;

a látható sérülések megítéléséhez használt értékelő rendszer leírása, ha készült vizuális értékelés;

egy arányt tartalmazó vizsgálatok esetében a károsodás százalékos arányát kell jegyzőkönyvezni;

az ECx vagy ERx (pl. EC50, ER50, EC25, ER25) értékek és a kapcsolódó megbízhatósági határok. Ha regressziós elemzést végeznek, biztosítani kell a standard hibát a regressziós egyenlethez, valamint a standard hibát az egyéni paraméterek becsléséhez (pl. emelkedés, metszés);

a NOEC (és LOEC) érték, ha kiszámították;

a statisztikai eljárások és feltételezések leírása;

ezen adatok és a vizsgált faj dózis-válasz összefüggésének grafikus bemutatása.

Az e vizsgálati módszerben leírt eljárásoktól való eltérések és a vizsgálat során bekövetkezett valamennyi szokatlan esemény.

IRODALOM

(1)

Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193.

(2)

Nemzetközi Szabványügyi Szervezet. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth.

(3)

Nemzetközi Szabványügyi Szervezet. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants.

(4)

American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests.

(5)

U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1.

(6)

US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:

850.4000: Background – Non-target Plant Testing;

850.4025: Target Area Phytotoxicity;

850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence);

850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test;

850.4225: Seedling Emergence, Tier II;

850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.

(7)

AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines.

(8)

Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada.

(9)

Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48.

(10)

Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada.

(11)

Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

(12)

Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206.

(13)

Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575.

(14)

Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250.

(15)

U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC.

(16)

McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174

(17)

Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369.

(18)

Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271.

(19)

Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271.

(20)

Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541.

(21)

OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(22)

Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63.

(23)

Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389.

(24)

Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23.

(25)

Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1492.

(26)

E melléklet C.33. fejezete: Földigiliszták szaporodásának vizsgálata (Eisenia fetida/Eisenia andrei).

1. függelék

Fogalommeghatározások

Hatóanyag (a.i.), (vagy aktív anyag (a.s.)) : egy specifikus biológiai hatás (pl. rovarirtás, növénybetegségek elleni védekezés, gyomirtás a kezelt területen) elérése céljából tervezett anyag, más néven technikai minőségű hatóanyag, aktív anyag.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Növényvédő szerek (CPP vagy PPP) vagy peszticidek : adott biológiai aktivitással rendelkező anyagok, amelyeket szándékosan használnak a termés kártevőktől (pl. gombás betegségek, rovarok és versengő növények) való megóvása érdekében.

ECx, x %-os hatáskoncentráció vagy ERx, x %-os hatásarány : az a koncentráció vagy arány, amely x %-os nemkívánatos változást vagy módosulást eredményez a vizsgált végpontban a kontrollhoz viszonyítva (pl. a csírázás, a hajtástömeg, vagy a megmaradó növények végső számának 25 %-os vagy 50 %-os csökkenése, illetve a látható károsodás 25 %-os vagy 50 %-os növekedése EC25/ER25-nek vagy EC50/ER50-nek minősül).

Csírázás : a koleoptil vagy a sziklevél megjelenése a talaj felülete felett.

Készítmény : a kereskedelemben kapható formulázott termék, amely az aktív anyagot (hatóanyagot) tartalmazza, más néven végső készítmény (8) vagy tipikus végfelhasználói termék (typical end-use product, TEP).

LOEC (észlelhető hatást okozó legkisebb koncentráció) : a vizsgált vegyi anyag azon legalacsonyabb koncentrációja, amelynek alkalmazása esetén hatás volt megfigyelhető. Ebben a vizsgálatban a LOEC-nek megfelelő koncentrációnak nincs statisztikailag szignifikáns hatása (p < 0,05) az adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva, és magasabb, mint a NOEC-érték.

Nem célzott növények : Azok a növények, amelyek kívül esnek a célnövény területén. A növényvédő szerek esetében ez általában a kezelt területen kívüli növényeket jelenti.

NOEC (észlelhető hatást még nem okozó koncentráció) : a vizsgált vegyi anyag azon legmagasabb koncentrációja, amelyen hatás nem volt megfigyelhető. Ebben a vizsgálatban a NOEC-nek megfelelő koncentrációnak nincs statisztikailag szignifikáns hatása (p < 0,05) az adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva.

Fitotoxicitás : A növények normális megjelenési mintájától és növekedésétől egy adott vegyi anyag hatására kialakuló káros eltérések (méréses és vizuális értékelés alapján).

Ismétlés : az a vizsgálati egység, amely megtestesíti a kontrollcsoportot és/vagy a kezelési csoportot. Ezekben a vizsgálatokban az edényt definiálják ismétlésként.

Vizuális értékelés : A látható károsodás értékelése a növény állásának, életerejének, fejlődési rendellenességeinek, klorózisának, nekrózisának, és általános megjelenésének megfigyelése alapján, a kontrollal összehasonlítva.

Vizsgált vegyi anyag : Az e vizsgálati módszerrel vizsgált bármely anyag vagy keverék.

2. függelék

A növények vizsgálata során történelmileg használt fajok jegyzéke

Család

Faj

Közismert név

DICOTYLEDONAE

Apiaceae (Umbelliferae)

Daucus carota

Sárgarépa

Asteraceae (Compositae)

Helianthus annuus

Napraforgó

Asteraceae (Compositae)

Lactuca sativa

Saláta

Brassicaceae (Cruciferae)

Sinapis alba

Fehér mustár

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica campestris var. chinensis

Kínai kel

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica napus

Olajrepce

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica oleracea var. capitata

Káposzta

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica rapa

Tarlórépa

Brassicaceae (Cruciferae)

Lepidium sativum

Kerti zsázsa

Brassicaceae (Cruciferae)

Raphanus sativus

Retek

Chenopodiaceae

Beta vulgaris

Cukorrépa

Cucurbitaceae

Cucumis sativus

Uborka

Fabaceae (Leguminosae)

Glycine max (G. soja)

Szójabab

Fabaceae (Leguminosae)

Phaseolus aureus

Mungóbab

Fabaceae (Leguminosae)

Phaseolus vulgaris

Törpe bab, zöldbab, kerti bab

Fabaceae (Leguminosae)

Pisum sativum

Borsó

Fabaceae (Leguminosae)

Trigonella foenum- graecum

Görögszéna

Fabaceae (Leguminosae)

Lotus corniculatus

Szarvaskerep

Fabaceae (Leguminosae)

Trifolium pratense

Vöröshere

Fabaceae (Leguminosae)

Vicia sativa

Bükköny

Linaceae

Linum usitatissimum

Len

Polygonaceae

Fagopyrum esculentum

Hajdina

Solanaceae

Solanum lycopersicon

Paradicsom

MONOCOTYLEDONAE

Liliaceae (Amarylladaceae)

Allium cepa

Vöröshagyma

Poaceae (Gramineae)

Avena sativa

Zab

Poaceae (Gramineae)

Hordeum vulgare

Árpa

Poaceae (Gramineae)

Lolium perenne

Évelő perje

Poaceae (Gramineae)

Oryza sativa

Rizs

Poaceae (Gramineae)

Secale cereale

Rozs

Poaceae (Gramineae)

Sorghum bicolor

Cirokmag, shattercane

Poaceae (Gramineae)

Triticum aestivum

Búza

Poaceae (Gramineae)

Zea mays

Kukorica

3. függelék

A lehetséges nem terményfajok jegyzéke

OECD potenciális fajok növényi toxicitás vizsgálatára.

Megjegyzés: Az alábbi táblázat 52 nem terményfajról tartalmaz információt (az egyes tételekhez kapcsolódó hivatkozások zárójelben vannak megadva). A megadott csírázási arányok a publikált szakirodalomból származnak és csak általános útmutatóként szolgálnak. Az egyéni tapasztalatok a mag beszerzési forrásától és egyéb tényezőktől függően változhatnak.

CSALÁD Faj botanikai neve

(közismert magyar név)

Élettartam (9) és előfordulási hely

Mag tömege

(mg)

Csírázás vagy növekedés megvilágítási időszaka (10)

Ültetési mélység

(mm) (11)

Csírázási idő

(nap) (12)

Különleges kezelések (13)

Toxicitási vizsgálat (14)

Mag beszerzési források (15)

Egyéb hivatkozások (16)

APIACEAE

Torilis japónica

(bojtorjános tüskemag)

А, В bolygatott területek, sövények, legelők (16, 19)

1,7–1,9 (14, 19)

L = D (14)

0

(1, 19)

5 (50 %) (19)

hideg sztratifikáció (7, 14, 18, 19) érlelésre lehet szükség (19) csírázást a sötétség gátolja (1, 19) különleges kezelést nem igényel (5)

POST (5)

 

 

ASTERACEAE

Bellis perennis

(angol százszorszép)

Ρ

rétek, szántók, gyepek (16, 19)

0,09–0,17 (4, 19)

L = D (14)

0

(4)

3 (50 %) (19)

11 (100 %) (18)

a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (18, 19) különleges kezelést nem igényel (4, 14)

POST (4)

A, D, F

7

Centaurea cyanus

(búzavirág)

A

mezők, utak mente, nyílt élőhelyek (16)

4,1–4,9 (4, 14)

L = D (14)

0–3 (2, 4, 14)

14–21 (100 %) (14)

különleges kezelést nem igényel (2, 4)

POST (2,4)

A, D, E, F

7

Centaurea nigra

(fekete imola)

Ρ

mezők, utak mente, nyílt élőhelyek (16, 19)

2,4–2,6 (14, 19)

L = D (14)

0 (19)

3 (50 %) (19)

4 (97 %) (18)

érlelésre lehet szükség (18, 19) csírázást a sötétség gátolja (19) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 26)

POST (5, 22, 26)

A

 

Inula helenium

(örménygyökér)

Ρ

nedves, zavart helyek

(16)

1–1,3 (4, 14, 29)

 

0

(4, 29)

 

különleges kezelést nem igényel (4)

POST (4)

A, F

 

Leontodon hispidus

(közönséges oroszlánfog)

Ρ

mezők, utak mente, bolygatott területek (16, 19)

0,85-1,2 (14, 19)

L = D (14)

0 (19)

4 (50 %) (19)

7 (80 %) (18)

a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (17, 18, 19) különleges kezelést nem igényel (5, 23)

POST (5, 22, 23)

 

 

Rudbeckia hirta

(borzas kúpvirág)

Β, Ρ zavart

(16)

0,3 (4, 14)

L = D (14)

0

(4, 33)

< 10 (100 %) (33)

különleges kezelést nem igényel

(4