Hivatalos Lap L 156 , 25/06/2003 o. 0061 - 0073
A Bizottság határozata (2003. június 13.) a lazacok fertőző vérszegénységének (ISA) gyanúját vagy megerősítését követően a körzetek kialakítására és a hatósági megfigyelésre vonatkozó kritériumok megállapításáról (az értesítés a C(2003) 1831. számú dokumentummal történt) (EGT vonatkozású szöveg) (2003/466/EK) AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA, tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre, tekintettel a legutóbb a 806/2003/EK rendelettel [1] módosított, a tenyésztett víziállatok és az akvakultúra-termékek forgalomba hozatalára irányadó állat-egészségügyi feltételekről szóló, 1991. január 28-i 91/67/EGK tanácsi irányelvre [2], és különösen annak 15. cikkére, tekintettel a legutóbb a 2001/288/EK bizottsági határozattal [3] módosított, az egyes halbetegségek elleni védekezés céljából közösségi minimumintézkedések bevezetéséről szóló, 1993. június 24-i 93/53/EK tanácsi irányelvre [4], és különösen annak 5. cikke (2) bekezdésére, valamint 6. cikkére, mivel: (1) A 93/53/EGK irányelv előírja, hogy az I. és II. listán szereplő (a 91/67/EGK irányelv A. mellékletében említett) betegségek jelenlétére vonatkozó mintavételt és laboratóriumi vizsgálatot a 91/67/EGK irányelv 15. cikkével összhangban megállapított eljárások alkalmazásával kell elvégezni. (2) A II. listán szereplő halbetegségek, a pisztrángok vírusos vérfertőzése (VHS), valamint a pisztrángfélék fertőző vérképzőszervi elhalása (IHN) kimutatására és megerősítésére szolgáló mintavételi terveket és diagnosztikai eljárásokat a 2001/183/EK bizottsági határozat [5] állapítja meg. (3) A 93/53/EGK irányelv 5. cikkének (2) bekezdése, valamint 6. cikke szerint valamennyi gazdaságot, amely egy lazacok fertőző vérszegénysége (ISA) vírusával való fertőzöttségre gyanús vagy megerősítetten azzal fertőzött gazdasággal azonos vízgyűjtő területen vagy part menti övezetben található, hatósági megfigyelés alá kell helyezni. Meg kell határozni a körzetek kialakítására és a hatósági megfigyelésre vonatkozó kritériumokat. (4) Az ISA kimutatására és megerősítésére szolgáló mintavételi tervek és diagnosztikai eljárások meghatározása, valamint az ISA gyanúját vagy megerősítését követően a körzetek kialakítására és a hatósági megfigyelésre vonatkozó kritériumok megállapítása érdekében hal-egészségügyi és laboratóriumi szakértőkkel konzultáltak. Ezen túlmenően figyelembe kell venni a Nemzetközi Állatjárványügyi Hivatal (OIE) Víziállat-betegségek diagnosztikai kézikönyvének aktuális kiadásában az ISA diagnózisára vonatkozóan megállapított iránymutatásokat is. (5) Megfelelő időt kell biztosítani ezen új követelmények végrehajtásához. (6) Az e határozatban előírt intézkedések összhangban vannak az Élelmiszerlánc- és Állat-egészségügyi Állandó Bizottság véleményével, ELFOGADTA EZT A HATÁROZATOT: 1. cikk A lazacok fertőző vérszegénysége (ISA) kimutatására és megerősítésére szolgáló mintavételi terveket és diagnosztikai eljárásokat, valamint az ISA gyanúját vagy megerősítését követően a körzetek kialakítására és a hatósági megfigyelésre vonatkozó kritériumokat e határozat melléklete állapítja meg. 2. cikk Ezt a határozatot 2003. október 23-tól kell alkalmazni. 3. cikk Ennek a határozatnak a tagállamok a címzettjei. Kelt Brüsszelben, 2003. június 13-án. a Bizottság részéről David Byrne a Bizottság tagja [1] HL L 122., 2003.5.16., 1. o. [2] HL L 46., 1991.2.19., 1. o. [3] HL L 99., 2001.4.10., 11. o. [4] HL L 175., 1993.7.19., 23. o. [5] HL L 67., 2001.3.9., 65. o. -------------------------------------------------- MELLÉKLET Mintavételi tervek és diagnosztikai eljárások a lazacok fertőző vérszegénysége (ISA) kimutatására és megerősítésére, valamint az ISA gyanúját vagy megerősítését követően a körzetek kialakítására és a hatósági megfigyelésre vonatkozó kritériumok BEVEZETÉS ÉS FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK E melléklet: a) előírja az ISA jelenlétének kimutatását vagy megerősítését szolgáló mintavételi tervekre és diagnosztikai eljárásokra vonatkozó iránymutatásokat és minimumkövetelményeket; b) integrálja a 91/67/EGK irányelvben és a 93/53/EGK irányelvben megállapított rendelkezéseket és fogalommeghatározásokat; c) megállapítja az ISA megfelelő diagnózisára, ellenőrzésére és megfigyelésére vonatkozó rendelkezéseket az ISA gyanúja vagy megerősítése esetén; d) mind az ISA ellenőrzéséért felelős hatóságoknak, mind az e betegséggel kapcsolatos vizsgálatokat végző laboratóriumi személyzetnek szól. A hangsúly a mintavételi eljárásokon, a laboratóriumi vizsgálatok elvein és alkalmazásán, ezek eredményeinek értékelésén, valamint a laboratóriumi technikák részletes leírásán van. Megfelelő esetben azonban a laboratóriumok módosíthatják az e mellékletben leírt vizsgálatokat, illetve más vizsgálatokat is használhatnak, feltéve, hogy ezek azonos vagy fokozottabb érzékenysége és specifikussága bizonyítható. Megállapítja továbbá az ISA gyanúját vagy megerősítését követően a körzetek kialakítására és a hatósági megfigyelésre vonatkozó kritériumokat. E melléklet alkalmazásában a következő kiegészítő meghatározásokat kell alkalmazni. "Vízgyűjtő terület": a vízfolyások forrásától a torkolatig terjedő teljes vízgyűjtő terület, vagy a vízgyűjtő terület egy része a vízfolyás forrásától egy természetes vagy mesterséges gátig, amely megakadályozza a halak folyásirányban történő vándorlását. "Part menti övezet": a part vagy a nyílt tenger egy része, illetve egy földrajzilag pontosan körülhatárolható torkolat, amely egy homogén hidrodinamikai rendszerből vagy ilyen rendszerek sorozatából áll. Az I. rész megállapítja az ISA diagnózisának és megerősítésének általános elveit és kritériumait, valamint az ISA gyanúját vagy megerősítését követően a körzetek kialakítására és a hatósági megfigyelésre vonatkozó kritériumokat. A II. rész megállapítja az ISA jelenlétének kimutatása céljából elvégzendő vizsgálatokat és mintavételt. A III. rész megállapítja a virológiai vizsgálatok során alkalmazandó módszereket. A IV. rész ismerteti a mintáknak az ISA kimutatására szolgáló RT-PCR vizsgálatára vonatkozó eljárást. Az V. rész ismerteti a veselenyomatoknak az ISA-ra vonatkozó IFAT (indirekt fluoreszcens antitest teszt) vizsgálata során használatos vizsgálati tervet. A VI. rész tartalmazza a szövettani metodológiát. A VII. rész felsorolja a használt betűszavakat és rövidítéseket. I. Az ISA diagnózisára, valamint a körzetek kialakítására, egyes ellenőrzési intézkedésekre és a hatósági megfigyelésre vonatkozó kritériumok I.1. Az ISA diagnózisára vonatkozó általános elvek E melléklet 1.2. része ismerteti azon megalapozott okokat, amelyek alapján a halak ISAV-val való fertőzöttségének gyanúja felmerülhet. A tagállamok biztosítják, hogy amennyiben egy gazdaságban a halak ISAV-val való fertőzöttségének gyanúja merül fel, a betegség jelenlétét megerősítő vagy kizáró hivatalos vizsgálatot az e melléklet III.-VI. részében megállapított ellenőrzések és klinikai vizsgálatok, valamint mintavételi és mintaválogatási, illetve laboratóriumi vizsgálati módszerek alkalmazásával a lehető legrövidebb idő alatt elvégezzék. Az ISA jelenlétének hivatalos megerősítéséhez az e melléklet I.3. részében megállapított három kritérium-csoport egyikének teljesülnie kell. I.2. Az ISA-val való fertőzöttség gyanúja I.2.1. Az ISA jelenlétének gyanúja áll fenn, amennyiben a következő kritériumok legalább egyike teljesül: a) az ISA-nak megfelelő post mortem leletek jelenléte, a betegség klinikai tüneteinek jelentkezésével vagy anélkül. A post mortem leleteknek és a klinikai tüneteknek összhangban kell állniuk az OIE Víziállat-betegségek diagnosztikai kézikönyvének aktuális kiadásában megállapítottakkal; b) az ISA izolációja és azonosítása a gazdaságban található bármely hal egyedi mintájából származó sejttenyészetben, a III. részben leírtaknak megfelelően; c) két független laboratóriumi teszt, például RT-PCR (IV. rész) és IFAT (V. rész) alapján megalapozott bizonyíték az ISAV jelenlétére; d) élő halak átszállítása olyan gazdaságba, ahol okkal feltételezhető, hogy a halak átszállításakor az ISAV jelen volt; e) amennyiben egy vizsgálat egyéb lényeges járványügyi kapcsolatot tár fel ISA-val való fertőzöttségre gyanús vagy megerősítetten ISA-val fertőzött gazdaságokkal. I.2.2. Az ISA gyanúja kizárható, ha a hat hónapon keresztül folytatott, havonta legalább egy klinikai ellenőrzést magukba foglaló vizsgálatok az ISA jelenlétére vonatkozóan nem tárnak fel további jelentős bizonyítékot. I.3. Az ISA megerősítése Az ISA jelenlétét megerősítettnek kell tekinteni, ha az a), b) vagy c) pontban meghatározott kritériumok teljesülnek: a) az OIE Víziállat-betegségek diagnosztikai kézikönyvének aktuális kiadásával összhangban az ISA-nak megfelelő klinikai tüneteket és post mortem leleteket figyeltek meg, ideértve az elhullott, gyenge vagy rendellenesen viselkedő halakat, a vérszegénység tüneteit, valamint más post mortem leleteket és kórbonctani elváltozásokat, és az ISAV-ot a következő módszerek közül eggyel vagy többel kimutatták: i. az ISA izolációja és kimutatása a gazdaságban található bármely hal legalább egy mintájából származó sejttenyészetben, a III. részben leírtaknak megfelelően, ii. az ISAV kimutatása RT-PCR vizsgálattal, a IV. részben leírt módszerekkel, iii. az ISAV kimutatása szövetekben vagy szövetpreparátumokban, ISAV elleni specifikus antitestekkel (pl. veselenyomatokon végzett IFAT, az V. részben leírtaknak megfelelően); b) az ISAV izolálása és kimutatása a gazdaságban található egy vagy több halból vett, különböző alkalmak során vizsgált két mintából, a III. részben leírt módszert alkalmazva; c) az ISAV izolálása és kimutatása a gazdaságban található bármely halból vett legalább egy mintában a III. részben leírt módszert alkalmazva, a gazdaságban található bármely halból származó szövetpreparátumokban az ISAV jelenlétének RT-PCR (IV. rész) vagy IFAT (V. rész) módszerrel végzett alátámasztó bizonyításával. I.4. Az ISA gyanúját és megerősítését követően az ellenőrzési és hatósági megfigyelési körzetek létrehozásának és visszavonásának kritériumai I.4.1. A kockázatalapú hatósági megfigyelési program kialakítása céljából a hivatalosan ISA-val való fertőzöttségre gyanús vagy hivatalosan megerősítetten ISA-val fertőzött gazdaság környékén a tagállamok megfelelő ellenőrzési és megfigyelési körzeteket jelölnek ki. I.4.2. A kijelölendő körzeteket a betegség továbbterjedése veszélyének eseti elemzése alapján kell meghatározni. A járványügyi helyzettel összhangban az érintett vízgyűjtő területet vagy part menti övezetet: - ellenőrzési körzetként kell meghatározni, vagy - kiterjedt vízgyűjtő területek vagy part menti övezetek esetén egy ellenőrzési és egy megfigyelési körzetre lehet felosztani, amennyiben ez nem veszélyezteti az ISA terjedésének megelőzését. Szükség szerint továbbá a vízgyűjtő területen vagy part menti övezeten kívül kiegészítő megfigyelési körzeteket lehet létrehozni. I.4.3. A fenti körzetek létrehozásakor fő tényezőként azokat kell figyelembe venni, amelyek a betegség tenyésztett vagy vadon élő halak körében való terjedésének kockázatát befolyásolják, azaz: az elhullott halak száma, aránya és eloszlása az ISAV-val való fertőzöttségre gyanús vagy megerősítetten ISAV-val fertőzött gazdaságban; a mortalitás okai az érintett gazdaságban; a szomszédos gazdaságok távolsága és azok sűrűsége; az érintett gazdasággal kapcsolatban álló gazdaságok; a gazdaságban jelen levő fajok; az érintett, valamint a szomszédos gazdaságokban alkalmazott irányítási rendszer; a 93/53/EGK irányelv 5. cikkének (2) bekezdésével és 8. cikkével összhangban végzett járványügyi vizsgálatok keretében azonosított hidrodinamikai feltételek és más, járványügyi jelentőséggel bíró tényezők. I.4.4. A körzetek kialakítására a következő minimumkritériumok vonatkoznak. I.4.4.1. A tagállam a megerősítetten ISAV-val fertőzött gazdaság közvetlen környezetében "ellenőrzési körzetet" hoz létre, a következő kritériumoknak megfelelően: - part menti övezetekben: legalább az árapály-övezet szélességének megfelelő vagy legalább 5 km sugarú kör területe, melynek közepe a megerősítetten ISAV-val fertőzött gazdaság, vagy egy ennek megfelelő terület, amelyet a vonatkozó hidrodinamikai vagy járványügyi adatoknak megfelelően kell meghatározni, vagy - belvízi területeken: a megerősítetten ISA-val fertőzött gazdaság teljes vízgyűjtő területe; kiterjedt vízgyűjtő területeken a tagállam korlátozhatja a körzet kiterjesztését a vízgyűjtő terület részeire, feltéve, hogy ez nem veszélyezteti az ISA terjedésének megelőzését. I.4.4.2. Az ISA jelenlétének gyanúja esetén "ideiglenes ellenőrzési körzet"-et kell létrehozni, az ellenőrzési körzetre megállapítottakkal megegyező kritériumok alapján. I.4.4.3. Olyan területeken, ahol a kevésbé intenzív megfigyelés is elégségesnek mutatkozik, a tagállam az ellenőrzési körzeten kívül szükség szerint "megfigyelési körzetet" hoz létre, a következő kritériumoknak megfelelően: - part menti övezetekben: az egymást átfedő árapály-övezetekből álló ellenőrzési körzetet körülvevő terület, az ellenőrzési körzetet körülvevő és az ellenőrzési körzet központjától számított 10 km sugarú körben található terület, vagy egy ennek megfelelő terület, amelyet a vonatkozó hidrodinamikai vagy járványügyi adatoknak megfelelően kell meghatározni, vagy - belvízi területeken: amennyiben szükséges, a kijelölt ellenőrzési körzeten kívül eső kiterjesztett terület. I.5. A gazdaságok pihentetése és a kijelölt körzetek visszavonása I.5.1. A tagállam illetékes hatósága biztosítja, hogy a halak eltávolítását és a szükség szerinti fertőtlenítést követően az ellenőrzési körzeten belül található valamennyi gazdaságot megfelelő időn keresztül pihentessék. A megerősítetten ISA-val fertőzött gazdaságok esetén a pihentetési időszak hossza nem lehet rövidebb hat hónapnál. Az ellenőrzési körzetben levő többi gazdaság esetén a pihentetési időszak hosszát eseti kockázatelemzés alapján az illetékes hatóság állapítja meg. Ha az ellenőrzési körzetben található valamennyi gazdaságot kiürítették, legalább hathetes párhuzamos pihentetési időszakot kell alkalmazni. Az illetékes hatóság ezen felül dönthet a kijelölt megfigyelési körzetekben található gazdaságok pihentetéséről. I.5.2. Az ellenőrzési körzeteket a körzetben található valamennyi gazdaság kiürítéséig, szükség szerint a fertőtlenítésig, valamint az I.5.1. pontnak megfelelően elvégzett pihentetésig nem lehet visszavonni és újratelepíteni. A körzet újratelepítését követően az ellenőrzési körzetet az I.4.4.3. pontban megállapítottaknak megfelelően megfigyelési körzetté kell alakítani. I.5.3. Az ideiglenes ellenőrzési körzeteket az ISA gyanújának az I.2.2. rész szerinti kizárásáig nem lehet visszavonni. A fertőzés gyanújának az I.3 rész szerinti megerősítése esetében az ideiglenes ellenőrzési körzetet ellenőrzési körzetté kell alakítani. I.5.4. A megfigyelési körzeteket az ellenőrzési körzetek visszavonását követően két évig nem lehet visszavonni. I.6. Hatósági megfigyelés az ISA gyanújának megállapítását vagy megerősítését követően I.6.1. A 93/53/EGK irányelv 5. cikkének (2) bekezdésére és 6. cikkére tekintettel, és annak érdekében, hogy az ISA gyanúját vagy megerősítését követően meghatározzák a betegség eloszlását és alakulását egy gazdaságban, az illetékes hatóság, vagy az illetékes hatósággal konzultálva és annak ellenőrzése alatt a minősített halegészségügyi szolgálat a kijelölt körzetekben található valamennyi gazdaságban kockázat-alapú hatósági megfigyelési programot hajt végre. I.6.2. Egy ilyen hatósági megfigyelési program végrehajtása érdekében az illetékes hatóságnak – szükség esetén egy helyszíni ellenőrzés révén – valamennyi gazdaságot azonosítania kell a kijelölt körzeteken belül, és hatósági felmérést kell végeznie a gazdaságokban tartott valamennyi halfajról, a halak kategóriájáról és számáról, beleértve a mortalitási adatokat is. I.6.3. A kezdeti hatósági felmérést követően az ideiglenesen kijelölt ellenőrzési körzetekben levő azon gazdaságoknak, amelyek atlanti-óceáni lazacot (Salmo salar) vagy bármely más olyan fajt tartanak, amelyek az OIE Víziállat-egészségügyi Kódexének aktuális kiadása szerint az ISA-ra fogékonyak, vagy annak potenciális hordozói, 14 naponként jelentést kell tenniük az illetékes hatóságoknak a mortalitásról. A megnövekedett mortalitásról naponta és ketrecenként kell jelentést tenni. Az illetékes hatóság a jelentősen megnövekedett mortalitás minden esetét kivizsgálja a gazdaságban. Amennyiben a gyanú beigazolódik, a kijelölt ellenőrzési körzetben levő valamennyi gazdaságnak hetente jelentést kell tennie az illetékes hatóságnak a mortalitásról, napi és ketrecenkénti bontásban. A megfigyelési körzetben levő gazdaságoknak 14 naponként kell jelentést tenni az illetékes hatóságnak a mortalitásról. A kijelölt körzeteken belül továbbá az év folyamán rendszeres vizsgálatokat kell végezni az 1. táblázatban megadott gyakorisággal. Ha azonban az időjárási feltételek következtében az év egy része folyamán az ilyen vizsgálat lehetetlenné válik, a tagállamok a készenléti tervben más vizsgálati gyakoriságot is megállapíthatnak. 1. táblázat Hatósági megfigyelési program Gazdaság elhelyezkedése | A vizsgálatok minimális száma évente | A vizsgálatok minimális száma évente az ellenőrzési körzet visszavonása után | Ellenőrzési körzet | 12 | | Megfigyelési körzet | 6 | 6 | Ideiglenes ellenőrzési körzet | 6 | | A megfigyelési programot a körzetek visszavonásáig kell végezni. I.6.4. A vizsgálatokat, valamint a minták kiválasztását, vételét, előkészítését és szállítását a II.1.–II.4. részben meghatározottak szerint kell végrehajtani. A minták vizsgálatát a III.-VI. résznek megfelelően kell elvégezni. II. Vizsgálat és mintavétel II.1. Minták vizsgálata, kiválasztása és vétele olyan gazdaságokban, ahol az ISA jelenléte gyanítható II.1.1. Az I.6. részben ismertetett hatósági megfigyelési program keretében végzett rendszeres vizsgálatok folyamán, valamint az ISA-val való fertőzöttségre gyanús gazdaságokban minden berendezési tárgyat (ketrecek, tartályok vagy medencék) meg kell vizsgálni az elhullott, gyenge vagy rendellenesen viselkedő halak jelenlétére vonatkozóan. Amennyiben lehetséges, a frissen elhullott (nem bomló) és a gyenge vagy rendellenesen viselkedő halakat meg kell vizsgálni az OIE Víziállat-betegségek diagnosztikai kézikönyvének aktuális kiadásában leírt, az ISA-ra jellemző klinikai tünetek vagy post mortem leletek tekintetében. II.1.2. Ha az ISA-ra utaló friss klinikai tünetek figyelhetők meg, vagy ha egy ellenőrnek, illetve állatorvosnak bármely más oka van azt feltételezni, hogy a halak fertőzöttek lehetnek, legalább 10 halból kell mintát venni. Amennyiben lehetséges, a mintának frissen elhullott, gyenge vagy rendellenesen viselkedő halakból kell állnia. Amennyiben a klinikailag érintett halak száma nem elegendő, a mintát olyan ketrecekből, tartályokból és medencékből válogatott egészséges halakkal kell kiegészíteni, amelyekben a legnagyobb arányú mortalitás jelentkezik vagy a legtöbb klinikai tüneteket mutató hal található. II.1.3. Amennyiben frissen elhullott halakat, vagy gyenge, vagy rendellenesen viselkedő halakat figyelnek meg, de a klinikai tünetek és a post mortem leletek nem az ISA-ra utalnak, a mintavétel nem kötelező, bár az ellenőr vagy az állatorvos szabad mérlegelése szerint a differenciáldiagnózis felállításához végezhető ilyen mintavétel. II.1.4. Ha vadon élő halak esetében gyanítható az ISA-val való fertőzöttség, a tagállamok biztosítják a megfelelő minták vételét, valamint a minták II.–VI. részben megállapított megfelelő klinikai és laboratóriumi módszerek alkalmazásával végzett vizsgálatát az ISA jelenlétének kizárása vagy megerősítése, valamint annak felmérése érdekében, hogy a betegség előfordulása jelentős veszélyt jelent-e a tenyésztett halak számára. II.2. A halakból származó minták előkészítése II.2.1. A szövettani vizsgálatra szánt minták csak a betegség jelenlétére utaló klinikai tüneteket vagy post mortem leleteket mutató, frissen leölt halakból vehetők. Mintát kell venni bármilyen külső vagy belső sérülésből, valamint szike segítségével minden esetben mintát kell venni az egyes halak májából, középveséjéből, szívéből és lépéből, amelyeket 8–10 térfogatszázalékos pufferolt formalinos sóoldatba kell helyezni. A fixálóanyag szövethez viszonyított arányának a szövet kielégítő tartósításának biztosítása érdekében legalább 20:1-nek kell lennie. II.2.2. A mintául szolgáló összes halból szövetet kell venni virológiai vizsgálathoz. Az igazolás céljára dupla mintákat kell venni. Steril eszközt használva darabokat kell venni a hal májából, fejveséjéből, szívéből és lépéből, és ezeket 9 ml szállítóoldatot, azaz antibiotikumos sejttenyésztő közeget tartalmazó műanyag csőbe kell helyezni. A 12,5 μg ml-1 fungizon, 200 IU ml-1 polymixin B és 200 μg ml-1 kanamycin kombinációja megfelelő, de más bizonyított hatékonyságú kombináció is használható. Egy szállítófolyadékot tartalmazó csőbe legfeljebb 5 halból vett szövet tehető, ez egy összevont mintát jelent. Egy mintában a szövetek tömegének 1,0 ± 0,5 g-nak kell lennie. II.2.3. IFAT vizsgálatra veselenyomatok csak frissen leölt halakból vehetők, azaz a halál beálltától számított két órán belül. Steril eszközöket használva egy darabot kell venni a hal középveséjéből. A szövetet nedvszívó papírba kell törölni, hogy a fölösleges vér felszívódjon, utána pedig többször egy poli-L-lizinnel bevont üveglemezhez kell nyomni. Az egyes lenyomatoknak közel kell lenniük egymáshoz, de nem fedhetik át egymást, így egységes folyamatos sejtréteg jön létre. E vizsgálat szempontjából a vér és a szöveti folyadék nem mérvadó anyag. El kell kerülni, hogy a vesedarab a nedvszívó papíron maradjon és "lecsepegjen", mivel ez vér alvadását okozhatja, ennek nyomán pedig nagy mennyiségű szérumfehérje rakódhat a tárgylemezre. A lenyomatot levegőn kell megszárítani, utána pedig hűvös és száraz helyen kell tárolni, ha nem fixálják azonnal. A mintavételt követően a lenyomatokat 72 órán belül fixálni kell. Ennek alternatívájaként a lenyomatok a levegőn való szárítást követően lefagyaszthatók, és a fixálás előtt –20 °C hőmérsékleten egy hónapig tárolhatók. II.2.4. A vérszegénység jeleit mutató halak elkábíthatók, ezt követően pedig azonnal heparinos vérminták vehetők hematológiai vizsgálatra, például a hematokrit mérésére. II.2.5. A mintául szolgáló összes halból szövetet kell venni az RT-PCR elemzéshez. Steril eszközt használva egy darabot kell venni a hal fej- vagy középveséjéből és 1 ml, igazolt hatékonyságú RNS-tartósító folyadékot tartalmazó mikrofuga-csőbe kell helyezni. Egy tárolóoldatot tartalmazó csőbe legfeljebb öt halból származó szövet helyezhető, amely egy összevont mintát jelent. Egy mintában a szövetek tömegének körülbelül 0,5 g-nak kell lennie. Ha a halak az előírt súlyú minta vételéhez túl kicsik, vese, szív, lép, máj, vagy vakbél darabok vehetők – ilyen sorrendben – a 0,5 g eléréséig. II.3. A halakból származó minták szállítása II.3.1. A vérmintákat és a halak virológiai vizsgálatra vagy RT-PCR elemzésre szánt szöveteit tartalmazó csöveket szigetelt tartályokba kell helyezni (például vastag falú polisztirol-dobozokba), elegendő jéggel vagy jégakkuval ahhoz, hogy a laboratóriumig történő szállítás során a minták hűtése biztosítható legyen. A fagyasztást el kell kerülni, és érkezéskor a szállító dobozban még jégnek kell lennie, vagy egy vagy több jégakkunak még részben vagy teljesen fagyottnak kell lennie. Kivételes körülmények között az RT-PCR minták és a virológiai vizsgálatra szánt minták gyorsfagyaszthatók, és –20 °C vagy az alatti hőmérsékleten a laboratóriumba szállíthatók. II.3.2. Az IFAT-hoz készített tárgylemezeket tárgylemez-tartóban, elegendő mennyiségű szárítószerrel kell szállítani, hogy azokat a fentieknek megfelelően szárazon és hűvösen lehessen tartani. II.3.3. Ha a halszöveteket fixálószerben szállítják szövettani vizsgálatra, ezeket szivárgásmentes csövekben kell szállítani, ütésálló tartályokban, például vastag falú polisztirol dobozokban. II.3.4. A virológiai vizsgálatot a lehető leghamarabb és legkésőbb 72 órával a mintavétel után meg kell kezdeni, kivéve, ha a mintákat lefagyasztották. Az igazoló elemzésekre szolgáló mintákat a laboratóriumba történő megérkezésüket követően –20 °C vagy az alatti hőmérsékleten kell tárolni. II.3.5. Egész halak is szállíthatók a laboratóriumba, ha a II.3.1. pontban leírt hőmérsékleti követelmények a szállítás során teljesíthetők. Az egész halakat nedvszívó papírba kell csomagolni, és műanyag zsákban, a fentieknek megfelelően hűtve kell szállítani. II.3.6. Élő halak is szállíthatók, de csak a hatósági szolgálat felügyelete alatt. II.3.7. Az RT-PCR elemzés céljaira RNAlater-ben tartósított szövetek esetében az RNS kivonását a különböző hőmérsékleten tárolt minták esetében meghatározott időn belül el kell végezni. Ezek az időtartamok az alábbiak: –37 °C | egy nap | –25 °C | egy hét | –4 °C | egy hónap | –20 °C | nincs korlátozás | II.3.8. Valamennyi csomagolást és címkézést a hatályos nemzeti és nemzetközi szállítási előírásokkal összhangban kell végezni. II.4. Kiegészítő diagnosztikai anyag gyűjtése A diagnosztikai laboratórium beleegyezésével kiegészítő vizsgálatok céljára más halszöveteket is lehet gyűjteni és előkészíteni. III. Virológiai vizsgálat III.1. A minták előkészítése III.1.1. Ha olyan gyakorlati nehézségek merülnek fel, amelyek lehetetlenné teszik, hogy a szövetminták begyűjtését követő 72 órán belül beoltsák a sejteket, a szövetek –80 °C-on legfeljebb 28 napra lefagyaszthatók. A szöveteket a vizsgálat előtt csak egyszer lehet lefagyasztani és felolvasztani. III.1.2. Minden mintát (szállítóoldatban tárolt szövetelegyet) emésztéssel, keverőgép vagy mozsár és mozsártörő használatával teljesen homogenizálni kell, majd és 0–6 °C között 2000–4000 x g értéken 15 percig centrifugálni kell, a felülúszót le kell szűrni (0,45 μm), és az IPNV endemikus szerotípusai elleni antiszérumokból összeállított, megfelelően hígított ugyanilyen térfogatú eleggyel inkubálni kell. Az antiszérum titerének legalább 1:2000-nek kell lennie az 50 %-os plakk-neutralizációs tesztben. A keveréket egy óráig kell inkubálni 15 °C-on. Ez adja az inokulumot. Az inokulumnak az IPN-vírus (olyan vírus, amely Európa egyes részein a halminták 50 %-ában előfordul) elleni antiszérummal végzett kezelése az IPN-vírus által előidézett CPE kialakulásának megelőzését célozza a beoltott sejttenyészetekben. Ez csökkenti a virológiai vizsgálat időtartamát, valamint azon esetek számát, amikor a CPE előfordulását az ISAV-ra utaló esetleges jelzésként kellene értékelni. Ha a minták IPN-től mentesnek tekintett termelési egységekből származnak, az inokulumnak az IPN -vírus antiszérumával végzett kezelését el lehet hagyni. III.2. A sejttenyészetek beoltása III.2.1. SHK-1 sejteket (80 passzálás vagy kevesebb) vagy TO-sejteket kell növeszteni L-15 tápoldatban, amely 5 % szarvasmarha magzati szérumot, 2 térfogatszázalék 200 mM L-glutamint és 0,08 térfogatszázalék 50 mM 2-merkaptoetanolt tartalmaz, 12 vagy 24 lyukú tálcákon. Más, igazolt hatékonyságú és érzékenységű sejtvonalak is használhatók az ISAV izolálására, figyelembe véve a törzsek változékonyságát és a különböző törzsek azon képességét, hogy különböző sejtvonalakban szaporodjanak. Az antiszérummal kezelt szervszuszpenziót fiatal, aktívan növekvő sejttenyészetekbe kell oltani úgy, hogy a szövet anyagának végső hígítása a tápoldatban 1:1000 legyen. Minden szervszuszpenzióból 40 μl inoculumot kell a 2 ml tápoldatot tartalmazó lyukba adagolni. A keresztfertőződés kockázatának minimalizálása érdekében ajánlott külön 12 vagy 24 lyukú tálcák használata a különböző halgazdaságokból származó mintákhoz. III.2.2. Egy tálcát beoltatlanul kell hagyni, amely negatív kontrollként fog szolgálni. Pozitív kontrollként egy külön tálcát be kell oltani az ISAV referencia-izolátumával, a következők szerint. Száz μl ISAV-törzspreparátumot (minimális titer: 10 TCID50 ml-1) be kell oltani az első lyukba, és jól el kell keverni. Ezen anyag adott mennyiségét át kell vinni az elsőből a második lyukba, hogy 1:10 hígítást adjon, és jól el kell keverni. Ezt a műveletet az egész tálcán meg kell ismételni, hogy hat 10-szeres hígítás keletkezzen. A törzs ISAV –80 °C-on legalább két évig tárolható, de a felolvasztást követően három napon belül fel kell használni. Megjegyzés: ügyelni kell a vizsgálati tálcák pozitív kontrollal való keresztfertőződésének megakadályozására. E kockázat elkerülése érdekében a pozitív kontrollokat a vizsgálati tálcáktól elkülönítve kell elkészíteni és kezelni. III.2.3. A mintákat 14 ± 2 °C -on kell inkubálni legfeljebb 15 napig. III.3. Mikroszkópos vizsgálat Mikroszkóp használatával az inkubálást követő 5–7. és 12–14. napon a sejttenyészeteket kétszer meg kell vizsgálni a CPE tekintetében. Ha bármelyik elegy CPE-t mutat, a vírus-azonosítási eljárásokat azonnal meg kell kezdeni (III.6). Ha a 14. napon sem figyelhető meg CPE, hemadszorpciós tesztet kell végezni (III.4). III.4. Hemadszorpció Az ISAV sejtkultúrában történő szaporítása nem mindig eredményez CPE-t. Ezért minden lyukat az alábbiakban leírt hemadszorpciós próbának kell alávetni, vagy ennek alternatívájaként minden lyukat a II.6.1. pontban leírt IF-próbának kell alávetni. III.4.1. A sejttenyésztő tápoldatot minden lyukból – beleértve a pozitív és negatív kontrollokat is – ki kell venni, és felcímkézett steril csövekbe kell helyezni. Minden lyukhoz ötszáz μl 0,2 térfogatszázalékos mosott nyúl vagy ló vörösvértest-szuszpenziót, vagy 0,05 térfogatszázalékos mosott szivárványos pisztráng vagy atlanti-óceáni lazac vörösvértest-szuszpenziót kell adni, és szobahőmérsékleten 45 percig kell inkubálni. A vörösvértesteket el kell távolítani és minden lyukat kétszer át kell mosni L-15 tápoldattal. Mikroszkóp alatt minden lyukat meg kell vizsgálni. III.4.2. Az SHK-1 vagy TO-sejtek felületére tapadó vörösvértest-csoportok az ortomixovírussal történt valószínű fertőződést jeleznek. Ha a hemadszorpciós próba pozitív, azonnal el kell végezni a vírus-azonosítási vizsgálatot (III.6). III.5. Másodlagos tenyészet vagy passzálás III.5.1. A másodlagos tenyészetet a 13–15. nap között kell létrehozni. Kettőszázhuszonöt μl tenyészetből származó felülúszót 12 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiba friss, aktívan növekvő SHK-1 sejtekhez kell adni, majd 14 ± 2 °C-on 18 napig kell inkubálni. A sejttenyészeteket mikroszkóp alatt CPE tekintetében kétszer meg kell vizsgálni, az inkubációt követő 5–7. és a 14–18. nap között. Ha bármely elegy CPE-t mutat, a vírus-azonosítási eljárást azonnal meg kell kezdeni (III.6). Ha a 14–18. napig nem figyelhető meg CPE, hemadszorpciós tesztet kell végezni (III.4.). III.5.2. Ha citotoxicitás alakul ki az inkubálás első hét napjában, már ebben a stádiumban létrehozható a másodlagos tenyészet, és a sejteket 14–18 napon át inkubálni kell, majd újra létre kell hozni a másodlagos tenyészetet, amelyet azután 14–18 napig ismét inkubálni kell. Ha a citotoxicitás hét nap után alakul ki, másodlagos tenyészetet egyszer kell készíteni és a sejteket az első beoltástól számított 28–36 napos teljes inkubációs idő eléréséig kell inkubálni. III.5.3. Ha bakteriális fertőzés alakul ki az elsődleges tenyészetben, a tesztet ismét el kell készíteni a –80 °C-on tárolt szövet-homogenizátum felhasználásával. A beoltást megelőzően a szövet-homogenizátumot 4000 × g értéken, 30 percig, 0–6 °C között centrifugálni kell, és a felülúszót 0,22 μm-es szűrőn kell átszűrni. Ha a bakteriális fertőzés a másodlagos tenyészet kialakítása során lép fel, a felülúszót 0,22 μm-es szűrőn kell átszűrni, friss sejtekre kel oltani, és további 14–18 napig inkubálni kell. III.6. Vírus-azonosítási vizsgálatok Ha bármely szakaszban CPE jelei mutatkoznak, vagy ha egy hemadszorpciós próba pozitív, vírus-azonosítást kell végezni. Az ISAV azonosításának választható módszerei az IF (III.6.1) és az RT-PCR (IV. rész). Ha úgy tűnik, hogy más vírusok is jelen lehetnek, ajánlott kiegészítő vírus-azonosítási vizsgálatok elvégzése. Ha e próbák egy héten belül sem teszik lehetővé a vírus pontos azonosítását, a felülúszót azonnali azonosítás céljából a nemzeti referencia-laboratóriumba vagy az EU halbetegségekkel foglalkozó referencia-laboratóriumába kell küldeni. III.6.1. IF III.6.1.1. SHK-1 sejteket (80 passzálás vagy kevesebb) vagy TO-sejteket kell növeszteni L-15 tápoldatban, amely 5 % szarvasmarha magzati szérumot, 2 térfogatszázalék 200 mM L-glutamint és 0,08 térfogatszázalék 50 mM 2-merkaptoetanolt tartalmaz, 24 vagy 96 lyukú tálcákon, amelyet akkor lehet felhasználni, ha az 50 %-ot meghaladó benőttséget elérték. Más, igazolt hatékonyságú sejtvonalak vagy tápoldatok is használhatók. Kettőszázhuszonöt μl vélelmezetten vírusfertőzött tenyészetből származó felülúszót kell bevinni két lyukba, össze kell keverni, és 225 μl-t át kell vinni két másik lyukba, azaz 1:5 arányú hígítást kell készíteni. Két további lyukat beoltatlanul kell hagyni, amelyek kontrollként szolgálnak. Az egyes halgazdaságokból származó mintákat külön tálcákon kell kezelni, csakúgy, mint a víruskontrollt. A víruskontrollt az ISAV referencia-izolátumának felhasználásával kell létrehozni. III.6.1.2. A tálcákat 14 ± 2 °C-on inkubálni kell és mikroszkóppal legfeljebb hét napig kell vizsgálni. Ha korai CPE-t állapítható meg, vagy ha hét napon belül nem figyelhető meg CPE, a következő lépés a fixálás. A lyukakat ekkor PBS-sel át kell mosni, és 80 %-os acetonban, szobahőmérsékleten, 20 percig végzett inkubálással kell fixálni. A tálcákat levegőn meg kell szárítani, és azonnal meg kell festeni, vagy megfestés előtt 0–6 °C között legfeljebb 24 óráig kell tárolni. III.6.1.3. Párhuzamos lyukakat meg kell festeni ISAV 3H6F8 monoklonális ellenanyaggal, vagy más, igazoltan hatékony és specifikus monoklonális ellenanyaggal, hígítani kell PBS-sel és 37 ± 4 °C-on 30 percig inkubálni kell. A monoklonális ellenanyagot el kell távolítani, és a tálcákat 0,05 % Tween 20-at tartalmazó PBS-sel háromszor át kell mosni. PBS-sel hígított anti-egér IgG FITC konjugátumot kell adni minden lyukhoz, és 37 ± 4 °C-on 30 percig inkubálni kell. Megjegyzés: a monoklonális ellenanyag és az FITC-konjugátum különböző tételeinek hígítását minden laboratóriumban optimalizálni kell. Az ellenanyagot el kell távolítani és a tálcákat 0,05 % Tween 20-at tartalmazó PBS-sel háromszor át kell mosni. III.6.1.4. A lyukakat haladéktalanul meg kell vizsgálni az FITC gerjesztéséhez megfelelő szűrővel felszerelt, fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatra előkészített inverz mikroszkóppal. A próbát pozitívnak kell tekinteni, ha fluoreszcens sejtek figyelhetők meg. Ahhoz, hogy a próba érvényes legyen, a pozitív kontrolloknak pozitív, a negatívaknak negatív eredményt kell adniuk. IV. A minták vizsgálata RT-PCR módszerrel IV.1. Ez a szakasz az ISAV genom 8-as szegmense egy részének PCR-amplifikációjához szükséges olyan eljárásokat írja le, amelyeket a halakból származó szöveteken, vagy az ISAV-tenyészetben lehet végrehajtani IV.1.1. Az RNS kivonása a) Az RNAlater-t minden mintából el kell távolítani. 1 ml DEPC-vel kezelt dH2O-t kell adni minden csőhöz, és a csöveket 0–6 °C között, 13000 rpm fordulaton, öt percig kell centrifugálni. b) A felülúszót minden mintából el kell távolítani, és 800 μl TRIzol-t (Invitrogen), vagy más, ugyanilyen vagy nagyobb hatékonyságú reagenst kell adni minden mintához és a megfelelő kontrollanyagot tartalmazó (400 μl dH2O vagy meghatározott kórokozóktól mentes halakból származó vesehomogenizátum) kontrollcsőhöz. Szükség esetén a szöveteket ismételt pipettázással szét kell választani. A csöveket szobahőmérsékleten 5 percig inkubálni kell. Minden csőhöz 160 μl kloroformot kell adni, és a csöveket 3 percig erőteljesen rázni kell, azután pedig 0–6 °C között, 13000 rpm fordulaton, 15 percig centrifugálni kell. c) A vizes felső réteget el kell távolítani egy 500 μl izopropanolt tartalmazó, 1,5 ml-es felcímkézett mikrofuga-csőbe, és a csöveket szobahőmérsékleten 10 percig inkubálni kell, majd 0–6 °C között, 6500 rpm fordulaton, 15 percig centrifugálni kell. d) A felülúszót el kell távolítani és 1 ml 75 %-os etanolt kell adni az RNS-pellethez. A csöveket ezután 0–6 °C között, 6500 rpm fordulaton, öt percig centrifugálni kell. e) A felülúszót el kell távolítani és a csöveket körülbelül 3 percig nyitva kell hagyni, hogy a visszamaradt etanol elpárologjon. 15 μl DEPC-vel kezelt dH2O-t kell hozzáadni, a pellet reszuszpendálása érdekében, és szükség esetén rövid ideig vortexelni kell. f) Az RNS-koncentráció és a minták tisztaságának kiszámításához spektrofotométert kell használni. Az optikai sűrűséget 260 és 280 nm-en kell mérni. g) Az azonnal (még azon a napon) felhasználandó RNS 0–6 °C között ideiglenesen tárolható. Az azonnal fel nem használt RNS-t –80 °C-on kell tárolni. IV.1.2. RT a) Két μg RNS-t fel kell oldani DEPC-vel kezelt dH2O-ban, 1,5 ml-es mikrofuga-csövekben. Ha a minta RNS-tartalma annyira alacsony, hogy nem lehet 2 μg mennyiséget felhasználni az RT-reakcióban, az RNS lehető legnagyobb mennyiségét kell használni. A hígított RNS-t 55–60 °C között 10 percig kell inkubálni. b) Az RNS-t tartalmazó csöveket ezután jégre kell helyezni és RT-reagenseket kell hozzájuk adni, hogy a 20 μl össztérfogatban a következő végső koncentrációkat kapjuk: 1 x pufferoldat, 1 mM dNTP, 100 ng random hexamer, 20 U RNáz-inhibitor és 200 U MMLV-RT. c) A csöveket 37 °C-on 1 óráig inkubálni kell. d) A cDNA-t 0–6 °C között kell tárolni, amíg szükség lesz rá, és a PCR-hez a lehető leghamarabb fel kell használni. IV.1.3. PCR a) Öt μl cDNA-t kell 45 μl PCR-keverékhez adni, hogy a következő végső koncentrációkat kapjuk: 1 x pufferoldat, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM minden dNTP-ből, 25 pmol minden primerből és 1 U Taq-polimeráz. A primerek: ISA+ (5'-GGC-TAT-CTA-CCA-TGA-ACG-AAT-C-3') (forward primer) és ISA- (5'-GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC-3') (reverz primer). A kivonási, RT és PCR fázisokhoz negatív kontrollokat is be kell állítani. b) A csöveket thermocycler-be kell helyezni és 5 percre kell programozni 94 °C-on, amelyet 94 °C-on 35 egyperces, majd 55 °C egy egyperces és 72 °C egy egyperces ciklusnak, végül 72 °C-on egy 5 perces inkubálásnak kell követnie. c) A PCR eredményeit a minták, valamint az RT és PCR fázisokból származó negatív kontrollok mentén elhelyezett méretbeosztással ellátott, etidium-bromiddal festett 2 %-os agarózgélen végzett elektroforézist követően kell értékelni. Egyetlen 155 bp PCR-terméket az ISAV-RNS jelenléte jelének kell tekinteni. Azokat a mintákat, amelyek egy további terméket (310 bp) is tartalmaznak, szintén ISAV-RNS-t tartalmazónak kell tekinteni. Azok a minták, amelyek többféle PCR-terméket adnak – ideértve legalább egy, körülbelül 155 bp-ből állót – ISAV-RNS-t tartalmazhatnak. Ezeket DNS-próbákkal vagy nukleotid-szekvenálással tovább lehet vizsgálni. IV.1.4. Az ISAV-izolálásának igazolása PCR-vizsgálattal szövettenyészetben Ha az SHK-1 sejtekben a szövetminták virológiai vizsgálata során teljes CPE alakul ki, 400 μl felülúszót el kell távolítani a lyukból és steril 1,5 ml-es csőbe kell helyezni. Az RNS-t a III.1 pont szerint ki kell vonni a mintából és RT-PCR-vizsgálatot kell végezni. Ha teljes CPE-t nem mutató tenyészeteket használnak, a felülúszót el kell távolítani, a sejteket le kell kaparni a lyuk vagy lombik felszínéről és steril 1,5 ml-es csőbe kell helyezni az RNS kivonása és az RT-PCR céljára. IV.1.5. A PCR-termékek igazolása DNS-szondával a) A 155 bp PCR-termék specifikusságát oligonukleotiddal végzett szondázás segítségével lehet értékelni, amely a PCR-termék egy régiójával hibridizál, a primereken belül. A PCR-termékeket 1 %-os agarózgélen, a méretbeosztás mentén és a pozitív kontroll, valamint az RT és PCR fázisokból származó negatív kontrollok mellett elektroforézisnek kell alávetni. b) A DNS-t Southern-blottolással fel kell vinni egy membránra és a megjelölt oligonukleotidot (5'-CGGGAGTTGATCAGACATGCACTGAAGGTG-3') a megfelelő prehibridizációs lépéseket követően a membránnal inkubálni kell. c) A nem kötődő és nem specifikusan kötődő szondákat le kell mosni a membránról és a kötött szondákat láthatóvá kell tenni. d) A 155 bp fragmenthez (és a 310 bp fragmenthez, ha jelen van) kötődő szondákat a PCR specifikussága bizonyítékának kell tekinteni és ez arra utal, hogy az ISAV-RNS a mintában jelen volt. IV.1.6. A PCR-termékek nukleotid szekvenálása A PCR-specifikusságát a 155 bp PCR-termék nukleotid-szekvenciájának vizsgálatával is lehet értékelni. a) A PCR-terméket meg kell tisztítani az agaróz-géltől vagy -oldattól. b) A fragmentet a PCR során alkalmazottakkal megegyező primerekkel kell szekvenálni, vagy vektorprimerekkel, ha azt a szekvenálás előtt egy vektorba klónozták. c) A nukleotid-szekvenciát össze kell hasonlítani az ISAV 8-as szegmensével, amely az EMBL nukleotid-szekvencia adatbázisában hozzáférhető (hozzáférési számok: Y10404, AJ012285, AJ242016). d) Az ISAV 8-as szegmensének megfelelő szekvencia jelenléte bizonyítékul szolgál arra, hogy a minta ISAV-RNS-t tartalmazott. V. A veselenyomatok vizsgálata IFAT -tal V.1. A következő vizsgálati terv a veselenyomatok IFAT-tal végzett vizsgálatához készült V.2. A lenyomatok előkészítése és megfestése V.2.1. A tárgylemezeket acetonban vagy metanol/aceton-keverékben (1:1) három percig kell fixálni, majd levegőn meg kell szárítani. A festés előtt mindegyik tárgylemezt meg kell vizsgálni és a tárgylemezek megfelelő régióit ImmEdgeTM tollal vagy hasonló eszközzel körül kell rajzolni és levegőn meg kell szárítani. A tárgylemezeket ezt követően blokkoló oldatba kell helyezni (6 % fölözött tej 0,2 % Tween 20-at tartalmazó PBS-ben) és enyhe rázogatás mellett szobahőmérsékleten 30 percig kell inkubálni. A tárgylemezeket le kell csepegtetni és vízszintesen tárgylemez-tároló dobozba kell helyezni, amely a párás környezet biztosítása érdekében nedves papírvattát tartalmaz. V.2.2. Minden lenyomatot ISAV 3H6F8 monoklonális ellenanyagból (vagy más bizonyított specifikusságú és hatékonyságú ellenanyagból) készült oldattal kell befedni, a tárgylemez-dobozt be kell zárni és rázogatás mellett szobahőmérsékleten 60 percig kell inkubálni. Az ellenanyagot rendszerint 1:10-től 1:100-ig terjedő arányban 1 %-os fölözött tejben kell oldani, de a tényleges hígítást az egyes tételek esetében kell meghatározni. A tárgylemezeket háromszor két percig kell 0,1 % Tween 20-at tartalmazó PBS-ben mosni. A lenyomatokat 1 %-os fölözött tejben 1:1000 arányban hígított kecskében termelt anti-egér FITC konjugátummal kell befedni és nedves környezetben, szobahőmérsékleten 60 percig kell inkubálni. A tárgylemezeket háromszor két percig kell 0,1 % Tween 20-at tartalmazó PBS-ben mosni. A tárgylemezeket CITIFLUORTM-oldattal (500 μl CITIFLUORTM 1,5 ml 0,1 térfogatszázalékos Tween 20-at tartalmazó PBS-sel elegyítve) vagy más megfelelő fedőoldattal 10 percre be kell fedni. A tárgylemezeket háromszor két percig kell 0,1 % 20-at tartalmazó PBS-ben mosni. Ha kontrasztfestésre is szükség van, a lenyomatokat 0,1 %-os Tween 20-at tartalmazó PBS-ben oldott propidium-jodiddal (0,01 mg/ml) kell befedni és szobahőmérsékleten 3 percig kell inkubálni. A tárgylemezeket háromszor két percig kell 0,1 % Tween 20-at tartalmazó PBS-ben mosni. A tárgylemezeket le kell csepegtetni és CITIFLUORTM-ba vagy más megfelelő fedőoldatba kell ágyazni. A tárgylemezeket a mikroszkópos vizsgálat előtt sötét helyen, 4 °C hőmérsékleten kell tárolni. V.3. Fluoreszcens mikroszkóppal végzett vizsgálat A tárgylemezeket epifluoreszcens megvilágításra alkalmas mikroszkóppal kell vizsgálni, olyan szűrő alkalmazásával, amely gerjeszti az FITC-t és az ezáltal jellegzetes zöld fluoreszcenciát bocsát ki. Az ImmEdgeTM tollal megjelölt régiókban minden mezőt meg kell vizsgálni 10x vagy 20x objektív alatt és a gyanús területeket (amelyek zöld fluoreszcenciát mutatnak) 40x tárgylencse alatt fáziskontraszt/fluoreszcens megvilágítás mellett tovább kell vizsgálni annak megállapítása érdekében, hogy a fluoreszkáló festés a sejtekhez kötődik. A gyanús területek koordinátáit fel kell jegyezni, hogy később egy második vizsgáló a fluoreszcencia természetét megerősíthesse. Az első vizsgáló által végzett vizsgálatot követően a pozitív vagy gyanús tárgylemezeket egy második vizsgálónak újból meg kell vizsgálnia és az eredményeket meg kell erősítenie. V.4. Kontrollok V.4.1. Az IFAT céljából megfestett tárgylemezek minden tételének háromféle kontrollt kell magában foglalnia: - nem fertőzött atlanti-óceáni lazacból származó veselenyomat (negatív kontroll), - nem fertőzött SHK-1 sejttenyészet vagy más fogékony sejttenyészet (negatív kontroll), - ISAV-val fertőzött SHK-1 sejttenyészet vagy más fogékony sejttenyészet (pozitív kontroll). V.4.2. Ha rendelkezésre áll, kiegészítő pozitív kontrollként ajánlott az ISAV-val fertőzött atlanti-óceáni lazacból származó veselenyomat. V.4.3. Ha bármelyik negatív kontrollal pozitív eredmény adódik, a próbát az abban a tételben levő valamennyi tárgylemez szempontjából érvénytelennek kell tekinteni. Ha a vizsgálat a tételben szereplő valamennyi tárgylemez esetében – a pozitív kontrollt is beleértve – negatív, a vizsgálatot a tételben levő valamennyi tárgylemez szempontjából érvénytelennek kell tekinteni. Ha a kontrollok hibája egy tárgylemez-tétel érvénytelenségét eredményezi, a tárgylemezeket meg kell semmisíteni és a másolati lenyomatok felhasználásával új vizsgálatot kell végezni. V.5. Egyéb szövetek vizsgálata Ez a technika halakból származó más szöveteken is alkalmazható, mint például a máj, a lép és a szív, feltéve, hogy megfelelő mennyiségű endothel sejtet, leukocitát és limfocitát lehet a tárgylemezre felvinni. A festési eljárás minden szövet esetében ugyanaz, bár egyes szöveteknél előnyös lehet a propidium-jodiddal végzett festés elhagyása, és a lenyomatban található sejttípusok meghatározásához ilyenkor a fáziskontraszt megvilágításra kell támaszkodni. VI. SZÖVETTAN Paraffinba ágyazott darabokat 5 μm vastagságúra kell vágni, majd azokat hematoxilin és eozin használatával meg kell festeni. Az ISA-hoz kapcsolódó szövettani változások leírása az OIE Víziállat-betegségek diagnosztikai kézikönyvének legutóbbi kiadásában szerepel. VII. Betűszavak és rövidítések cDNA | Komplementer dezoxi-ribonukleinsav | CPE | Citopatogén hatás | DEPC | Dietil-pirokarbonát | dNTP | Dezoxinukleotid-trifoszfát | FITC | Fluoreszcein-izotiocianát | IF | Immunfluoreszcencia | IFAT | Indirekt fluoreszcens antitest teszt | OIE | Nemzetközi Állatjárványügyi Hivatal | IPN(V) | Fertőző hasnyálmirigy-elhalás (vírus) | ISA(V) | Lazacok fertőző vérszegénysége (vírus) | PBS | Foszfátpuffer-oldat | RNA | Ribonukleinsav | RT-(PCR) | Reverz transzkriptáz (polimeráz láncreakció) | SHK-1 | Lazac fejvese-sejtek | TCID50 | Szövettenyészet fertőző dózis az 50 %-os végpontnál | --------------------------------------------------