az Ostreid herpeszvírus 1 μvar (OsHV-1 μvar) észlelésével kapcsolatban a Crassostrea gigas fajba tartozó osztrigák megnövekedett arányú elhullása elleni védekezésre irányuló intézkedések tekintetében a 2006/88/EK tanácsi irányelv végrehajtásáról

tekintettel a tenyésztett víziállatokra és az azokból származó termékekre vonatkozó állat-egészségügyi követelményekről és a víziállatokban előforduló egyes betegségek megelőzéséről és az azok elleni védekezésről szóló, 2006. október 24-i 2006/88/EK tanácsi irányelvre (1) és különösen annak 41. cikke (3) bekezdésére és 61. cikke (3) bekezdésére,

E rendelet alkalmazásában az OsHV-1 μvar az Ostreid herpeszvírus-1 (OsHV-1) azon genotípusát jelenti, amelyben a részleges szekvenciaadatok alapján az OsHV-1-gyel összehasonlítva a genom 4-es nyitott leolvasó keretében 12 bázispár szisztematikus hiánya mutatkozik (GenBank # AY509253).

(1) Amennyiben a Crassostrea gigas fajba tartozó osztrigák („Crassostrea gigas osztrigák”) megnövekedett arányú elhullását észlelik, az illetékes hatóságok:

(2) Amennyiben az (1) bekezdés b) pontjában említett vizsgálatok kimutatják az OsHV-1 μvar jelenlétét, az illetékes hatóság elszigetelési területet hoz létre. E terület meghatározása eseti vizsgálat alapján történik, figyelemmel az I. melléklet C. részében meghatározott, a betegség terjedési kockázatát befolyásoló tényezőkre.

(3) A tagállamok szükségtelen késedelem nélkül értesítik a Bizottságot és a többi tagállamot az első, 2010-ben a területükön létrehozott elszigetelési területről.

Forgalombahozatali követelmények a 2. cikkben említett elszigetelési területekről származó Crassostrea gigas osztrigákkal kapcsolatban

(1) A 2. cikk (2) bekezdésével összhangban létrehozott elszigetelési területekről származó Crassostrea gigas osztrigák nem szállíthatók el az érintett területről.

(2) Az (1) bekezdéstől eltérően a Crassostrea gigas osztrigaszállítmányok elszállíthatók az elszigetelési területről, amenynyiben:

(3) A (2) bekezdés a) és b) pontjában említett, tenyésztési vagy átmosási területekre szánt szállítmányokat állatorvosi bizonyítványnak kell kísérnie, amelyet a jelen rendelet II. mellékletében megállapított mintával és az 1251/2008/EK rendelet V. mellékletében megállapított magyarázó megjegyzésekkel összhangban állítottak ki.

Az illetékes hatóság feloldhatja a 2. cikk (2) bekezdésével összhangban létrehozott elszigetelési területtel és a 3. cikkben megállapított forgalombahozatali korlátozásokkal kapcsolatban megállapított védekezési intézkedéseket, amennyiben 15 nap különbséggel elvégzett két egymást követő vizsgálatot, melyek a nagyarányú elhullás megszűnését mutatják.

Forgalombahozatali követelmények a Crassostrea gigas osztrigáknak az OsHV-1 μvarral összefüggésben megnövekedett arányú elhullása miatt védekezési intézkedéseknek alávetett szállítmányokból származó Crassostrea gigas osztrigák tekintetében

(1) A Crassostrea gigas osztrigáknak az OsHV-1 μvarral összefüggésben megnövekedett arányú elhullása miatt 2009-ben vagy 2010-ben elszigetelési intézkedésnek alávetett szállítmányból származó Crassostrea gigas osztrigák/osztrigákat:

(2) Az (1) bekezdés a) pontjának i. alpontja szerinti, az OsHV-1 μvar korai észlelésére irányuló program megfelel az alábbi követelményeknek:

(3) Az (1) bekezdést az Élelmiszerlánc- és Állat-egészségügyi Állandó Bizottság azon ülését követő egy hét elteltével kell alkalmazni, amelyen az (1) bekezdés a) pontjának i. alpontjában említett programot benyújtották.

(1) A tagállamok elérhetővé teszik a Bizottság és a többi tagállam számára:

(2) Az (1) bekezdés értelmében nyújtott információt naprakészen kell tartani, és elérhetővé kell tenni a 2009/177/EK határozat 10. cikkével összhangban létrehozott internetalapú információs oldalakon.

Legkésőbb 2010. október 1-jéig a tagállamok jelentést nyújtanak be a Bizottságnak az 5. cikk (2) bekezdésével összhangban bejelentett programokról.

A jelentéshez a 2009/177/EK határozat VI. mellékletében található minta formanyomtatványt kell használni.

Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő napon lép hatályba.

I. MELLÉKLET

A. RÉSZ

Mintavétel

1. Mintavétel a 2. cikk alkalmazásában

A 2. cikk szerinti mintáknak legalább tizenkét Crassostrea gigas osztriga példányból kell állniuk. A mintavétel céljára gyenge, nyitott vagy frissen elhullott (nem bomló) példányokat kell begyűjteni abból a területi egységből, ahol az elhullást megfigyelték.

2. Mintavétel a 3. cikk (2) bekezdésének b) pontja, az 5. cikk (1) bekezdésének b) pontja és az 5. cikk (2) bekezdésének alkalmazásában

A 3. cikk (2) bekezdésének b) pontja céljából történő mintavétel az alábbiakból áll:

i.	lárvák esetében szállítmányonként legalább öt 50 mg-os készlet, amelyek a megtermékenyítést követő negyedik és nyolcadik nap között begyűjtött egész állatokat tartalmaznak, beleértve a héjat is;

ii.	6 mm-esnél rövidebb ikrák esetében szállítmányonként harminc 300 mg-os készlet, amelyek egész állatokat tartalmaznak, beleértve a héjat is;

iii.	6 mm-esnél nagyobb osztrigák esetében szállítmányonként 150 példány.

Az állatok kiválasztásánál a mintának a szállítmány minden részét arányosan képviselni kell. Ha gyenge, tátogó vagy frissen elhullott (bomlásnak még nem indult) állatok is előfordulnak, akkor elsősorban azokat kell kiválasztani.

A mintavétel az 5. cikk (2) bekezdés alkalmazásában mintavételi pontonként legalább százötven Crassostrea gigas példányt jelent. A tagállamban vagy a területi egységen lévő minden, a programban érintett gazdaságból vagy puhatestű-tenyésztési területről mintát kell venni.

A mintavétel az 5. cikk (1) bekezdése b) pontjának alkalmazásában területi egységenként legalább százötven Crassostrea gigas osztrigát jelent.

Az állatok kiválasztásánál az alábbi követelményeket kell figyelembe venni:

—	Ha gyenge, tátogó vagy frissen elhullott (bomlásnak még nem indult) állatok is előfordulnak, akkor elsősorban azokat kell kiválasztani. Ha ilyenek nincsenek, akkor 12 hónaposnál fiatalabb, egészséges puhatestűeket is ki kell választani.

—	Olyan gazdaságokban történő mintavétel esetében, ahol egynél több vízforrást használnak a tenyésztéshez, a mintában szerepelnie kell minden vízforrásból származó állatnak oly módon, hogy a gazdaság minden része arányosan legyen képviselve.

—

Puhatestű-tenyésztési területeken történő mintavétel esetében megfelelő számú, de legalább három mintavételi pontról származó állatoknak kell szerepelniük a mintavételben oly módon, hogy a puhatestű-tenyésztési terület minden része arányosan legyen képviselve, ideértve a jelenlevő természetes szaporodási területeket is. A mintavételi pontok kiválasztásánál az alábbi fő szempontokat kell figyelembe venni: Az OsHV-1 μvar korábbi észlelése a területen, vízáramlások, állománysűrűség, batimetria és a terület irányítási gyakorlata.

Az 5. cikk (2) bekezdése szerinti mintavételt az évnek abban a szakában kell végrehajtani, amikor az ismeretek szerint az OsHV-1 μvar a leginkább elterjedt az adott tagállamban vagy a területi egységen. Amennyiben erről nem áll rendelkezésre adat, a mintavételt közvetlenül azután az időszak után kell végrehajtani, amikor a vízhőmérséklet eléri a 16 °C fokot, vagy az év azon szakában, amikor a vízhőmérséklet általában eléri az éves legmagasabb szintet.

Az 5. cikk (1) bekezdésének b) pontja szerinti mintavételt lehetőleg a c) pontban meghatározott időszakban kell kivitelezni. Amennyiben a mintavételre máskor kerül sor, a mintavétel céljából begyűjtött osztrigákat a c) pontban meghatározottakkal azonos körülmények között kell tartani a vizsgálat előtt az OsHV-1 μvar észleléséhez megfelelően hosszú ideig.

B. RÉSZ

Az OsHV-1 μvar észlelésének diagnosztikai módszerei

1. Alkalmazási kör

A jelen eljárás az OsHV-1 μvar jelenlétének észlelésére és azonosítására használt polimeráz láncreakción (a továbbiakban: PCR) alapuló standard diagnosztikai módszereket magyarázza meg. Az eljárás lehetővé teszi az OsHV-1 és az OsHV-1 μvar közötti különbségtételt.

Ha a reakció feltételeinek optimalizálása, illetve saját felszerelésük és a feltételek sajátosságai miatt szükséges, a laboratóriumok módosításokat eszközölhetnek a jelen mellékletben leírt módszereken, feltéve, hogy bizonyíthatóan ugyanakkora marad azok érzékenysége és a specificitása.

2. Fogalommeghatározás

Az OsHV-1 μvar fogalmát a jelen rendelet 1. cikke határozza meg.

3. Felszerelés és környezetei feltételek

Az OsHV-1 μvar észlelésére és azonosítására használt PCR-hez az alábbi, a PCR-vizsgálatokhoz klasszikusan használt felszerelésekre és feltételekre van szükség:

—	egy zárt, a PCR-keverék elkészítésekor a potenciális szennyezéseket elpusztító, UV sugárzó rendszerrel felszerelt fülkére,

—	két teljes pipettakészletre (2 μl; 20 μl; 200 μl és 1 000 μl), amelyekből az első a DNS-extrakciójára, a második a PCR-keverék elkészítésére szolgál,

—	három különböző pipettára: egy pipettára (2 μl) a PCR-keverékben a minták elválasztásához, egy pipettára (20 μl) a EB mintavételhez és egy pipettára (20 μl) a PCR-végtermékek agarózgélekbe vezetéséhez,

—	szűrőpipettacsúcsokra (2 μl; 20 μl; 200 μl and 1 000 μl) a DNS extrakciójához, a PCR-keverék elkészítéséhez és a minta szétválasztásához,

—	pipettacsúcsokra (20 μl) a EB begyűjtéséhez és az amplifikáció végtermékeinek az agarózgélbe töltéséhez,

—	egy PCR-készülékre az amplifikáláshoz,

—	horizontális elektroforézis rendszerre a PCR-termékek elektroforéziséhez,

—	UV-asztalra a PCR-termékek megfigyeléséhez az agarózgélben történő elektroforézist követően,

—	a gélekről képeket készítő rendszerre.

A laboránsnak az alább leírt valamennyi lépés során laborköpenyt és valamilyen kesztyűt kell viselnie. A köpenyt és a kesztyűket lehetőleg minden fő lépés után cserélni kell, melyek a következőek: DNS-extrakció, a PRC keverék elkészítése, a minta szétválasztása, amplifikáció, gélbe töltés.

Ajánlott ezeket a lépéseket különböző helyiségekben elvégezni. Különösképpen fontos az amplifikációt és a gélbe töltést/elektroforézist külön helyiségben végezni, mint a DNS-extrakciót, a PCR-keverék elkészítését és a DNS-szétválasztást.

4. Az eljárás

4.1. A minta előkészítése

A DNS-extrakció céljára élő vagy frissen kimúlt (nem bomló) osztrigákat használunk, amelyeket előzetesen le lehet fagyasztani.

A minták méretüktől függően különbözőképpen kerülnek feldolgozásra:

a)	lárvák esetében az egész állatokat (héjjal együtt) tartalmazó 50 mg-os készletekhez hozzá kell adni 200 μl desztillált vizet, össze kell törni őket, majd 1 000 g-n centrifugálni 1 percig;

b)	6 mm-es vagy annál kisebb fiatal példányok esetében az egész állatokat (héjjal együtt) tartalmazó 300 mg-os készletekhez hozzá kell adni 1 200 μl desztillált vizet, össze kell törni őket, majd 1 000 g-n centrifugálni 1 percig;

c)	a 6 mm és 15 mm közötti állatok esetében minden példány lágy szöveteit egyedileg kell összetörni;

d)	a 15 mm-esnél hosszabb állatok esetében le kell választani a kopoltyúk és a köpeny darabjait.

DNS-extrakció az QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) használatával, a szövetteszt protokoll-előírásai szerint történik.

A minta további előkészítése az alábbi sorrendben történik:

1.	Helyezzük az a) vagy b) pont szerinti, a víz felszínén maradó mintából 100 μl-t, vagy a c) és d) pont szerinti mintaszövetekből 10–50 mg-ot egy 1,5 ml-es mikrocentrifuga csőbe, és adjunk hozzá 180 μl ATL puffert.

Adjunk hozzá 20 μl K proteinázt, vortexeljük, majd inkubáljuk 56 °C-on, amíg a szövet teljesen feloldódik (egy éjszaka alatt). A minta szétoszlatása érdekében az inkubálás alatt időnként vortexeljük. Röviden centrifugáljuk az 1,5 ml-es mikrocentrifuga csövet annak érdekében, hogy eltávolítsuk a fedőről a cseppeket.

3.	Adjunk a mintához 200 μl AL puffert, keverjük össze pulzáló vortexeléssel 15 másodpercig, majd inkubáljuk 70 °C-on 10 percig. Röviden centrifugáljuk az 1,5 ml-es mikrocentrifuga csövet annak érdekében, hogy eltávolítsuk a fedőről a cseppeket.

4.	Adjunk a mintához 200 μl (96–100 %-os) etanolt, majd 15 másodpercig pulzálva vortexeljük. Röviden centrifugáljuk az 1,5 ml-es mikrocentrifuga csövet annak érdekében, hogy eltávolítsuk a fedőről a cseppeket.

A negyedik lépésben elkészített keveréket óvatosan helyezzük bele a QIAamp Spin Column-ba (a 2 ml-es gyűjtőcsőben) a szegély megnedvesítése nélkül. Zárjuk le a fedelet, és centrifugáljunk 10 000 rpm-en 1 percig. Tegyük a QIAamp Spin Column-ot egy tiszta 2 ml-es gyűjtőcsőbe (a készlet tartalmazza), és tegyük félre a filtrátumot tartalmazó csövet.

Óvatosan nyissuk ki a QIAamp Spin Column-ot, és adjunk hozzá 500 μl AW1 puffert a szegély megnedvesítése nélkül. Zárjuk le a fedelet, és centrifugáljunk 10 000 rpm-en 1 percig. Tegyük a QIAamp Spin Column egy tiszta 2 ml-es gyűjtőcsőbe (a készlet tartalmazza), majd tegyük félre a gyűjtőcsövet a filtrátummal.

7.	Óvatosan nyissuk ki a QIAamp Spin Column-ot, és adjunk hozzá 500 μl AW2 puffert a szegély megnedvesítése nélkül. Zárjuk le a fedelet, és centrifugáljunk teljes sebességen (14 000 rpm) három percig.

8.	(Választás szerint) Helyezzük a QIAamp Spin Column-ot egy új 2 ml-es gyűjtőcsőbe (a készlet nem tartalmazza), és tegyük félre a filtrátumot tartalmazó gyűjtőcsövet. Centrifugáljunk teljes sebességen (14 000 rpm) egy percig.

Helyezzük a QIAamp Spin Column-ot egy tiszta 1,5 ml-es mikrocentrifuga csőbe (a készlet nem tartalmazza), és tegyük félre a filtrátumot tartalmazó gyűjtőcsövet. Óvatosan nyissuk ki a QIAamp Spin Column-ot, és adjunk hozzá 100 μl desztillált vizet. Inkubáljuk szobahőmérsékleten 5 percig, majd centrifugáljuk 10 000 rpm-en egy percig.

10.	Ellenőrizzük a DNS-extrakció minőségét és hatékonyságát (például a OD [260 nm] spektrofotométeres vagy az elektroforézis utáni agarózgélben történő mérésével).

11.	Készítsünk híg oldatot a mintából annak érdekében, hogy a végső DNS-koncentráció 50–100 ng/μl legyen.

12.	A DNS-oldatokat 4 °C-on kell tartani a PCR-elemzés elvégzéséig.

Más kereskedelmi forgalomban használható készletek is használhatók a DNS-extrakcióhoz, feltéve, hogy bizonyítottan hasonló eredményekhez vezetnek.

4.2. Polimeráz láncreakció (PCR)

4.2.1. Reagensek

—	10 X puffer (Taq DNS polimerázzal együtt)

—	MgCl2 (DNS polimerázzal együtt) (25 mM)

—	Taq DNS polimeráz (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl

—	A dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix-et (20 mM) tízszeresen hígítani kell (2 mM-re) használat előtt

—	d H2O (DNS- és RNS-mentes desztillált H2O)

4.2.2. Primerek

A következő primereket (1) kell használni:

CF (10 μM)

CR (10 μM)

4.2.3. PCR-keverék

A PCR-keverék minden csőben:

	Csövenkénti mennyiség	Végső koncentráció
Puffer (10 X)	5 μl	1 X
MgCl2 (25 mM)	5 μl	2,5 mM
dNTP (2 mM)	5 μl	0,2 mM
CF (10 μM)	1 μl	0,2 μM
CR (10 μM)	1 μl	0,2 μM
Taq polimeráz (5 U/μl)	0,5 μl	2,5 U
dH2O	31,5 μl

—	A PCR-keverékből adagoljunk 49 μl-t minden PCR-csőbe

—	Adjunk hozzá 1 μl extraktált DNS-t (50–100 ng/μl) minden csőhöz

4.2.4. Tesztek

Kétfajta tesztet használunk:

—	A negatív tesztek dH2O-t tartalmaznak (1 μl 49 μl-nyi PCR-keverék után). A potenciális reaktív szennyeződés vagy munkakörnyezet észlelésére irányulnak. Minden 10 mintához, vagy minden mintaköteghez egy negatív tesztet kell mellékelni.

—	A pozitív tesztek az OsHV-1 CF-CR célgenom részét tartalmazó plazmikus DNS-t tartalmaznak. A PCR-reakció hatékonyságának ellenőrzésére irányulnak. Minden PCR-elemzéshez egy pozitív tesztet kell mellékelni. A pozitív tesztek a közösségi referencialaboratóriumból szerezhetők be.

4.2.5. Amplifikáció

Az amplifikációs ciklusokat PCR-készülékben végezzük.

—	Kezdeti denaturáció: 2 perc 94 °C-on

—	Amplifikáció: 35 ciklus (1 perc 94 °C-on, 1 perc 50 °C-on és 1 perc 72 °C-on)

—	Végső elongáció: 2 perc 72 °C-on

4.3. Elektroforézis

4.3.1. Reagensek

—

50 X TAE (megvásárolható közvetlenül felhasználásra készen):

—	Trisz bázis (40 mM) 242 g

—	Jégecet (40 mM) 57,1 ml

—	Na2EDTA.2H2O (1 mM) 18,61 g

—	dH2O 1 literhez

—	Állítsuk be az oldat pH-ját 8-asra

—	2,5 % agarózgél a 1 X TAE-ban Adjunk hozzá etídium-bromidot (0,5 μg/ml) a gél lehűtése után.

—

Kék töltőfesték:

—	0,25 % kék bromofenol

—	Cyanol xylene FF 0,25 %

—	40 % szacharóz

—	Tartsuk 4 °C-on.

—	Használjunk hatszoros hígítást (2 μl kék töltőpuffer 10 μl PCR-termékhez).

—	Molekulasúly-indikátor: SmartLadder SF (Eurogentec): közvetlenül felhasználható molekulasúly-indikátor, amely 9 szabályosan elhelyezkedő sávot tartalmaz 100 és 1 000 bp között.

4.3.2. Az agarózgél elkészítése

1.	Mérjünk ki 2,5 g agarózt, adjunk hozzá 100 ml 1 X TAE-t, és melegítsük a keveréket addig, amíg megolvad.

2.	Az oldat kihűtése után adjunk hozzá etídium-bromidot (5 μl-t 100 ml agarózgélhez), töltsük az oldatot az öntőformába, és helyezzük bele a fésűt a zsebek előállításához.

3.	Miután a gél polimerizálódik, távolítsuk el a fésűket, és helyezzük a gélt olyan vízszintes elektroforézis rendszerbe, amely elegendő 1X TAE-t tartalmaz ahhoz, hogy lefedje az agarózgélt.

4.	10 μl PCR-terméket vegyítsünk el 2 μl kék festékkel (6X), majd helyezzük be a zsebekbe.

5.	Az egyik zsebbe a molekulasúly-indikátort (5 μl) helyezzük.

6.	A gél méretétől és vastagságától függően 50–150 volt feszültséget vezetünk bele 30 perc és 1 óra közötti időtartamra.

7.	Vizsgáljuk meg a gélt UV fényben.

4.4. Értelmezés

Az OsHV-1 μvar jelenlétét a mintában egy megfelelő méretű (OsHV-1 esetében a szokásos 173 bp helyett 157 bp) sáv mutatja a 2,5 %-os agarózgélen. Minden negatív tesztnek negatívnak, és minden pozitív tesztnek pozitívnak kell bizonyulnia.

C. RÉSZ

Az elszigetelési terület meghatározása

Az elszigetelési terület 2. cikk (2) bekezdése szerinti meghatározásánál a betegség terjedésének kockázatát befolyásoló alábbi tényezőket kell figyelembe venni:

a)	a fertőzött puhatestű-tenyésztési területen vagy gazdaságban a puhatestűek száma, aránya és eloszlása;

b)	a szomszédos puhatestű-tenyésztési területek vagy gazdaságok távolsága és sűrűsége;

c)	a feldolgozólétesítményektől való távolság, a kapcsolatban lévő gazdaságok vagy puhatestű-tenyésztési területek;

d)	a gazdaságokban vagy puhatestű-tenyésztési területeken fellelhető fajok;

e)	az érintett és a szomszédos gazdaságokban és puhatestű-tenyésztési területeken alkalmazott gazdálkodási módszerek; valamint

f)	hidrodinamikai feltételek és más azonosított, járványügyi jelentőségű tényezők.

(1) Az említett primerek, illetve azok leírásai beszerezhetőek a puhatestűek betegségeivel foglalkozó közösségi referencialaboratóriumtól (LGP-Ifremer, av de Mus de Loup, 17390 La Tremblade, Franciaország).