02009R0152 — HU — 16.11.2020 — 007.001

Ez a dokumentum kizárólag tájékoztató jellegű és nem vált ki joghatást. Az EU intézményei semmiféle felelősséget nem vállalnak a tartalmáért. A jogi aktusoknak – ideértve azok bevezető hivatkozásait és preambulumbekezdéseit is – az Európai Unió Hivatalos Lapjában közzétett és az EUR-Lex portálon megtalálható változatai tekintendők hitelesnek. Az említett hivatalos szövegváltozatok közvetlenül elérhetők az ebben a dokumentumban elhelyezett linkeken keresztül

Módosította:

Helyesbítette:

▼B

A BIZOTTSÁG 152/2009/EK RENDELETE

(2009. január 27.)

a takarmányok hatósági ellenőrzése során alkalmazott mintavételi és vizsgálati módszerek megállapításáról

(EGT-vonatkozású szöveg)

▼M3

1. cikk

A takarmányok hatósági ellenőrzésére, különös tekintettel az alkotóelemek, többek között a géntechnológiával módosított szervezeteket (GMO-kat) tartalmazó, azokból álló, illetve azokból előállított anyagok, az 1831/2003/EK rendelet ( 1 ) szerinti takarmány-adalékanyagok és a 2002/32/EK európai parlamenti és tanácsi irányelv ( 2 ) szerinti nemkívánatos anyagok meghatározására szolgáló mintavételezést az I. mellékletben meghatározott módszereknek megfelelően kell elvégezni.

Az I. mellékletben foglalt mintavételi módszer alkalmazandó a takarmányoknál előforduló peszticid-szermaradványok 2005. február 23-i 396/2005/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet ( 3 ) szerinti meghatározására irányuló ellenőrzés, valamint a 619/2011/EU rendeletnek való megfelelés ellenőrzése során.

▼B

2. cikk

Az analitikai vizsgálat céljára szolgáló minták előkészítését és az eredmények megadását a II. mellékletben előírt módszerek szerint kell végrehajtani.

3. cikk

A takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló analitikai vizsgálatokat a III. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmány-alapanyagok és ►C1  takarmánykeverékek ◄ összetételének ellenőrzésére), a IV. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmányokban lévő engedélyezett adalékanyagok szintjének ellenőrzésére), az V. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmányokban lévő nemkívánatos anyagok ellenőrzésére) és a VI. mellékletben (A takarmányok hatósági ellenőrzése során az állati eredetű alkotóelemek meghatározására szolgáló analitikai módszerek) előírt módszerek szerint kell végrehajtani.

4. cikk

►C1  A baromfitakarmány-keverék ◄ energiaértékét a VII. mellékletnek megfelelően kell kiszámítani.

5. cikk

Megerősítés céljából a VIII. mellékletben a már nem engedélyezett adalékanyagok takarmányokban való illegális jelenlétének ellenőrzésére előírt analitikai módszereket kell használni.

6. cikk

A 71/250/EGK, a 71/393/EGK, a 72/199/EGK, a 73/46/EGK, a 76/371/EGK, a 76/372/EGK, a 78/633/EGK, a 81/715/EGK, a 84/425/EGK, a 86/174/EGK, a 93/70/EGK, a 93/117/EK, a 98/64/EK, az 1999/27/EK, az 1999/76/EK, a 2000/45/EK, a 2002/70/EK és a 2003/126/EK irányelv hatályát veszti.

A hatályon kívül helyezett irányelvekre történő hivatkozásokat az e rendeletre történő hivatkozásoknak kell tekinteni, és a IX. mellékletben található megfelelési táblázatokkal összhangban kell értelmezni.

7. cikk

Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba.

Ezt a rendeletet 2009. augusztus 26-tól kell alkalmazni.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.

▼M3

I. MELLÉKLET

MINTAVÉTELI MÓDSZEREK

1.   CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

A takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló mintavételezést az alábbiakban leírt módszerek szerint kell elvégezni. Az így nyert mintákat a mintavételi tételek reprezentatív részének kell tekinteni.

A reprezentatív mintavétel célja kisebb mennyiséget venni a tételből oly módon, hogy e mennyiség bármely jellemző tulajdonságának meghatározásával az adott tulajdonságot illetően a teljes tételre érvényes középértéket kapjunk. A mintavételezés során a tétel különböző részeiből ismételten elemi mintákat kell venni. Ezen elemi mintákat össze kell keverni annak érdekében, hogy az így nyert átlagolt mintából reprezentatív osztással reprezentatív végső mintákat lehessen kialakítani.

Ha a mintavételre kerülő takarmányadagok szemrevételezés alapján minőségi eltérést mutatnak a takarmány ugyanazon tételének többi részéhez képest, a szóban forgó adagokat el kell különíteni és altételként kell kezelni őket. Amennyiben a takarmányt nem lehet különálló altételekre osztani, azt egyetlen tételként kell mintavételezni. Ebben az esetben erről a tényről említést kell tenni a mintavételi jegyzőkönyvben.

Ha az e rendelet előírásai alapján mintavételezett takarmányról megállapítják, hogy nem felel meg az uniós követelményeknek, továbbá az egy azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel részét képezi, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

2.   FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

3.   ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK

4.   BERENDEZÉS

5.   AZ ELEMI MINTÁK SZÁMÁRA VONATKOZÓ MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEK

5.1.    A takarmányban egyenletesen eloszló anyagok és termékek ellenőrzése kapcsán az elemi mintákra vonatkozó mennyiségi követelmények

5.1.1.    Ömlesztett szilárd takarmány

5.1.2.    Ömlesztett folyékony takarmány

5.1.3.    Kiszerelt takarmány

A (szilárd és folyékony) takarmányt zsákokba, göngyölegekbe, dobozokba, hordókba stb. lehet csomagolni, amelyek a táblázatban egységek néven szerepelnek. A nagy egységek (≥ 500 kg vagy liter) esetében a mintavételezésnek az ömlesztett takarmányokra érvényes előírásokkal összhangban kell történnie (lásd: az 5.1.1. és az 5.1.2. pont).

5.1.4.    Takarmánytömbök és nyalósók

A 25 egységből álló mintavételi tételenként legalább egy, legfeljebb 4 tömböt vagy nyalósót kell mintaként venni.

Az egyenként 1 kg-ot meg nem haladó tömegű tömbök és nyalósók esetében az elemi mintának egy tömbnek vagy egy nyalósónak kell lennie.

5.1.5.    Szálastakarmány/zöldtakarmány

5.2.    A takarmányban egyenetlenül eloszló anyagok és termékek ellenőrzése kapcsán az elemi mintákra vonatkozó mennyiségi követelmények

Az elemi minták számára vonatkozóan itt ismertetett követelményeket az alábbi esetekben kell alkalmazni:

Amennyiben az ellenőrzést végző hatóságnak erős a gyanúja, hogy ez az egyenetlen eloszlás valamely alkotóelem, illetve az összetett takarmányban található valamely anyag okozta keresztszennyeződés nyomán is fellép, az alábbi táblázatban feltüntetett mennyiségi követelményeket lehet alkalmazni.

5.3.    Az igen nagyméretű tételek esetében az elemi mintákra vonatkozó mennyiségi követelmények

A nagyméretű mintavételi tételek (> 500 tonna) esetében az elemi minták szükséges száma = 40 elemi minta + √tonna a takarmányban egyenletesen eloszló anyagok és termékek ellenőrzése esetén, vagy 100 elemi minta + √tonna a takarmányban feltételezhetően egyenetlenül eloszló anyagok és termékek ellenőrzése esetén.

6.   AZ ÁTLAGOLT MINTÁRA VONATKOZÓ MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEK

7.   A VÉGSŐ MINTÁKRA VONATKOZÓ MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEK

Végső minták

Legalább egy végső minta elemzése szükséges. Az analizálásra szolgáló végső minta nem lehet kisebb a következőknél:

8.   IGEN NAGYMÉRETŰ TÉTELEK, ILLETVE OLY MÓDON TÁROLT VAGY SZÁLLÍTOTT TÉTELEK MINTAVÉTELEZÉSE, AMELY NEM TESZI LEHETŐVÉ A MINTAVÉTELEZÉSÉT A TÉTEL EGÉSZÉBEN

8.1.    Általános elvek

Amennyiben egy tétel szállítási vagy tárolási módja nem teszi lehetővé, hogy elemi mintákat vegyünk a tétel valamennyi részéből, a mintavételezésre lehetőleg akkor kell sort keríteni, amikor a tétel mozgásban van.

Takarmányok tárolására szolgáló nagyméretű raktárak esetében a raktárak üzemeltetőit ösztönözni kell olyan berendezések felszerelésére, amelyek segítségével (automatikusan) mintát lehet venni az ott tárolt teljes tételből.

Az e 8. fejezetben meghatározott mintavételi eljárások alkalmazása esetén a takarmányipari vállalkozó vagy annak képviselője tisztában van a mintavételi eljárással. Ha a takarmányipari vállalkozó vagy annak képviselője kétségbe vonja a mintavételi eljárást, lehetővé kell tennie az illetékes hatóság számára, hogy a vállalkozó saját költségén a tétel minden részéből mintát tudjon venni.

8.2.    Hajóval szállított nagy tételek

8.2.1.    A hajóval szállított nagy tételek dinamikus mintavételezése

A hajóval szállított nagy tételek mintavételezésére lehetőleg akkor kell sort keríteni, amikor az mozgásban van (dinamikus mintavételezés).

A mintavételezést rakterenként (fizikailag elkülöníthető egységenként) kell végezni. A rakterek kiürítése azonban egymás után, részlegesen történik, ezért a kezdeti fizikai elkülönítés a tárolólétesítménybe történő áthelyezést követően már nem áll fenn. A mintavételezést ennek megfelelően vagy a kezdeti fizikai elkülönítés, vagy a tárolólétesítménybe történő áthelyezést követő elkülönítés függvényében lehet elvégezni.

A hajó rakterének kiürítése néhány napot is igénybe vehet. A mintavételezést rendszerint a kiürítés teljes időtartama alatt, szabályos időközönként kell végezni. Hatósági ellenőr jelenléte azonban nem mindig lehetséges vagy célszerű a teljes kiürítési művelet alatt. A mintavételezést tehát a tétel egy részén (mintavételi tétel) is el lehet végezni. Az elemi minták számának meghatározása a mintavételi tétel méretének figyelembevételével történik.

Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

Abban az esetben is, ha a hatósági mintát automata mintavevő segítségével veszik, indokolt az ellenőr jelenléte. Amennyiben azonban az automatikus mintavételezés előre beállított paraméterekkel történik, és a csalás bármely formáját megelőzendő a mintákat pecséttel ellátott tárolóedényekbe gyűjtik, az ellenőrnek kizárólag a mintavételezés megkezdésekor és befejezésekor, valamint akkor kell jelen lennie, amikor a tárolóedényeket cserélni kell.

8.2.2.    A hajóval szállított nagy tételek statikus mintavételezése

Statikus mintavételezés esetén a felülről hozzáférhető tárolók (silók) tekintetében előírt eljárást kell alkalmazni (lásd: 8.4.1. pont).

A mintavételezést a tétel/raktér hozzáférhető részén (felülről) kell elvégezni. Az elemi minták számának meghatározása a mintavételi tétel méretének figyelembevételével történik. Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

8.3.    A raktárakban tárolt nagy tételek mintavételezése

A mintavételezést a tétel hozzáférhető részén kell elvégezni. Az elemi minták számának meghatározása a mintavételi tétel méretének figyelembevételével történik. Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

8.4.    A raktározási létesítmények (silók) mintavételezése

8.4.1.    A felülről (könnyen) hozzáférhető silók mintavételezése

A mintavételezést a tétel hozzáférhető részén kell elvégezni. Az elemi minták számának meghatározása a mintavételi tétel méretének figyelembevételével történik. Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

8.4.2.    A felülről nem hozzáférhető (zárt) silók mintavételezése

8.4.2.1.    Felülről nem hozzáférhető (zárt), 100 tonnát meghaladó kapacitású silók

Az ilyen típusú silókban tárolt takarmányból nem lehet statikusan mintát venni. Ezért amennyiben el kell végezni a silóban tárolt takarmány mintavételezését, továbbá nincs lehetőség a tétel mozgatására, meg kell állapodni a létesítmény üzemeltetőjével, hogy az értesíteni fogja az ellenőrt a siló kiürítésének időpontjáról annak érdekében, hogy mintát lehessen venni a mozgásban lévő takarmányból.

8.4.2.2.    Felülről nem hozzáférhető (zárt), legfeljebb 100 tonna kapacitású silók

A mintavételi eljárás 50–100 kg közötti mennyiségben a takarmány tartályba történő engedéséből és e mennyiség megmintázásából áll. Az átlagolt minta mérete a teljes tételnek, az elemi minták száma pedig a silóból mintavételezési céllal a tartályba engedett takarmány mennyiségének felel meg. Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

8.5.    Nagyméretű zárt tartályokban tárolt ömlesztett takarmány mintavételezése

Az ilyen típusú tételekből sokszor csak a tartályból történő eltávolítás során lehet mintát venni. Bizonyos esetekben erre nincs lehetőség a behozatal vagy az ellenőrzés helyén, ezért a mintavételezésre a tartály kiürítésekor kell sort keríteni.

9.   A MINTAVÉTELRE, A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSÉRE ÉS CSOMAGOLÁSÁRA VONATKOZÓ UTASÍTÁSOK

9.1.    Általános megjegyzések

A mintákat indokolatlan késedelem nélkül kell vételezni és előkészíteni, mindvégig ügyelve a szükséges óvintézkedések betartására, amelyek biztosítják azt, hogy a termék ne változzon meg, illetve ne szennyeződjön. A mintákkal közvetlenül érintkező eszközöknek, felületeknek és tartályoknak tisztáknak és szárazaknak kell lenniük.

9.2.    Elemi minták

A teljes mintavételi tételből véletlenszerűen, körülbelül egyforma nagyságú elemi mintákat kell venni.

Az elemi minta minimális tömege 100 gramm, illetve 25 gramm a kis fajlagos tömegű szálastakarmányok és zöldtakarmányok esetében.

Amennyiben a 8. fejezetben meghatározott mintavételi eljárásra vonatkozó szabályok alapján kevesebb mint 40 elemi mintát kell venni, az elemi minták méretét az átlagolt minta előírt méretének függvényében kell meghatározni (lásd: 6. fejezet).

Kiszerelt takarmány kis tételeinek mintavételezésekor – amikor is a mennyiségi követelmények szerint korlátozott számú elemi mintát kell venni – az elemi minta egy olyan eredeti egység tartalma, amelynek tartalma nem haladja meg az 1 kg-ot vagy az 1 litert.

Kis egységű (pl.: < 250 g) kiszerelt takarmány mintavételezésekor az elemi minta mérete az egység méretéről függ.

9.2.1.    Ömlesztett takarmány

Adott esetben, a mintavételi tétel mozgatása közben (berakodáskor, illetve kirakodáskor) is végre lehet hajtani a mintavételt.

9.2.2.    Kiszerelt takarmány

Miután a mintavétel elvégzésére az 5. fejezet szerint kiválasztottuk az előírt számú egységet, minden egység tartalmának egy részét szúrcsap vagy lapát segítségével ki kell venni. Ha szükséges, az egységek egyenkénti kiürítése után is le lehet venni a mintákat.

9.2.3.    Homogén vagy homogenizálható folyékony vagy félfolyékony takarmányok

Miután a mintavétel elvégzésére az 5. fejezet szerint kiválasztottuk az előírt számú egységet, az egységek tartalmát szükség esetén homogenizálni kell, és minden egyes egységből ki kell venni egy bizonyos mennyiséget.

Az elemi mintákat a tartályok kiürítésekor is lehet vételezni.

9.2.4.    Nem homogenizálható, folyékony vagy félfolyékony takarmányok

Miután a mintavétel elvégzésére az 5. fejezet szerint kiválasztottuk az előírt számú egységet, a különböző rétegekből kell a mintákat levenni.

A tartályok tartalmának kiürítésekor is lehet mintákat venni, ám ebben az esetben az első frakciókat el kell önteni.

A minta összesített űrtartalmának mindkét esetben legalább 10 liternek kell lennie.

9.2.5.    Takarmánytömbök és nyalósók

Miután a mintavétel elvégzésére az 5. fejezet szerint kiválasztottuk a kívánt számú blokkot vagy tömböt, minden blokk vagy tömb egy részét lehet venni. Nem homogén blokk vagy tömb gyanúja esetén a teljes blokkot vagy tömböt fel lehet mintaként használni.

Az egyenként 1 kg-ot meg nem haladó tömegű blokkok és tömbök esetében az elemi minta egy blokk vagy egy tömb.

9.3.    Átlagolt minták elkészítése

Az átlagolt minta kialakítása érdekében az elemi mintákat össze kell keverni.

9.4.    Végső minták elkészítése

Az átlagolt mintában lévő anyagot gondosan össze kell keverni ( 4 ).

9.5.    A minta csomagolása

A tartályokat, illetve csomagokat le kell pecsételni és címkével kell ellátni oly módon, hogy a pecsét felsértése nélkül ne lehessen kinyitni azokat. A pecsétnek magában kell foglalnia a teljes címkét.

9.6.    A minták laboratóriumba történő küldése

A mintát – a vegyelemző számára szükséges információkkal együtt – indokolatlan késedelem nélkül el kell küldeni az arra a kijelölt vizsgálati laboratóriumba.

10.   MINTAVÉTELI JEGYZŐKÖNYV

Minden egyes mintáról jegyzőkönyvet kell vezetni, amely lehetővé teszi az egyes mintavételi tételek és azok méretének egyértelmű azonosítását.

Jegyzőkönyvbe kell foglalni az e rendeletben meghatározott mintavételi eljárástól történő bármely eltérést.

A jegyzőkönyvet elérhetővé kell tenni a hatósági ellenőrző laboratórium, továbbá a takarmányipari vállalkozó és/vagy a takarmányipari vállalkozó által kijelölt laboratórium számára.

II. MELLÉKLET

A TAKARMÁNYVIZSGÁLATI MÓDSZEREKRE VONATKOZÓ ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK

A.   MINTÁK ANALITIKAI VIZSGÁLATRA TÖRTÉNŐ ELŐKÉSZÍTÉSE

1.    Cél

Az alábbiakban leírt eljárások az I. mellékletben megállapított rendelkezéseknek megfelelő mintavételezés után, az ellenőrző laboratóriumoknak megküldött minták analitikai vizsgálat céljából történő előkészítésére vonatkoznak.

A laboratóriumi mintákat oly módon kell előkészíteni, hogy a vizsgálati módszerekben előírt kimért mennyiségek homogének és a végső mintákra jellemzőek legyenek.

2.    Óvintézkedések

A követendő mintaelőkészítési eljárás függ az alkalmazandó vizsgálati módszertől és az ellenőrizendő alkotóelemektől, illetve anyagoktól. Ezért elsőrendű fontosságú annak biztosítása, hogy a követett minta-előkészítési eljárás megfeleljen az alkalmazott vizsgálati módszernek, valamint az ellenőrizendő alkotóelemeknek, illetve anyagoknak.

Minden szükséges műveletet oly módon kell elvégezni, hogy minimális legyen a minta beszennyeződésének és összetétele megváltozásának lehetősége.

Az őrlést, keverést és rostálást haladéktalanul végre kell hajtani azért, hogy a minta a lehető legrövidebb ideig érintkezzen a levegővel és a fénnyel. Kerülni kell az olyan daráló- és őrlőgépek használatát, amelyek a mintát érzékelhetően felmelegítik.

A különösen hőérzékeny takarmányok esetében a kézi őrlés alkalmazása javasolt. Figyelmet kell fordítani annak biztosítására is, hogy az eszköz maga ne lehessen szennyeződés forrása.

Ha az előkészítést nem lehet a minta nedvességtartalmának jelentős megváltozása nélkül elvégezni, akkor a nedvességtartalmat az előkészítés előtt és után is meg kell határozni a III. melléklet A. részében meghatározott módszer szerint.

3.    Az eljárás

3.1.    Általános eljárás

A vizsgálati aliquotot a végső mintából kell venni. Az átlós negyedeléssel történő mintavétel nem ajánlott, mivel magas eloszlási hibát tartalmazó vizsgálati aliquotokat eredményezhet.

3.1.1.    Előkészítés nélkül őrölhető takarmányok

3.1.2.    Szárítás után őrölhető takarmányok

3.1.3.    Folyékony vagy félfolyékony takarmányok

3.1.4.    Egyéb takarmányok

3.2.    A szemrevételezéses vagy mikroszkópos vizsgálat, illetve a teljes egészében homogenizált átlagolt minta esetében alkalmazandó külön eljárás

4.    A minták tárolása

A mintákat olyan hőmérsékleten kell tárolni, amely összetételüket nem változtatja meg. A vitaminok vagy fényre különösen érzékeny anyagok vizsgálatára szánt mintákat a fény esetleges hátrányos hatását kizáró feltételek mellett kell tárolni.

B.   A VIZSGÁLATI MÓDSZEREK SORÁN HASZNÁLT REAGENSEKRE ÉS ESZKÖZÖKRE VONATKOZÓ RENDELKEZÉSEK

C.   A VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ALKALMAZÁSA ÉS AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

1.    Extrahálási eljárás

Számos módszer külön extrahálási eljárást határoz meg. Főszabályként a módszerben említettől eltérő extrahálási eljárást is lehet követni, feltéve, hogy az alkalmazott extrahálási eljárás hatékonysága a vizsgált mátrix tekintetében bizonyítottan egyenértékű a módszerben említett eljárás extrahálási hatékonyságával.

2.    Tisztítási eljárás

Számos módszer külön tisztítási eljárást határoz meg. Főszabályként a módszerben említettől eltérő tisztítási eljárást is lehet követni, feltéve, hogy az alkalmazott tisztítási eljárás a vizsgált mátrix tekintetében bizonyítottan a módszerben említett eljárással egyenértékű vizsgálati eredményt ad.

3.    Meghatározások száma

Nemkívánatos anyagok vizsgálata esetében, ha az első meghatározás eredménye jelentősen (> 50 %) alacsonyabb, mint a megengedett határérték, nincs szükség további meghatározásokra, feltéve, hogy a megfelelő minőségügyi eljárásokat alkalmazzák. Eltérő esetben párhuzamos vizsgálatra (második meghatározásra) van szükség ahhoz, hogy kizárjuk a minták belső keresztszennyeződésének, valamint esetleges összecserélődésének veszélyét. A mérési bizonytalanságot is figyelembe véve, a két meghatározás számtani középértéke szolgál a megfelelőség ellenőrzésére.

Valamely anyag vagy összetevő feltüntetett mennyiségére végzett vizsgálat esetében, ha az első meghatározás eredménye igazolja a feltüntetett mennyiséget, azaz az vizsgálati eredmény a feltüntetett tartalom elfogadható szórási tartományába esik, nincs szükség további meghatározásokra, feltéve, hogy a megfelelő minőségügyi eljárásokat alkalmazzák. Ettől eltérő esetben párhuzamos vizsgálatra (második meghatározásra) van szükség ahhoz, hogy kizárjuk a minták belső keresztszennyeződésének, valamint esetleges összecserélődésének veszélyét. A mérési bizonytalanságot is figyelembe véve, a két meghatározás számtani középértéke szolgál a megfelelőség ellenőrzésére.

Néhány esetben az elfogadható szórási tartományról jogszabályok rendelkeznek, mint például a takarmányok forgalomba hozataláról és felhasználásáról, az 1831/2003/EK rendelet módosításáról, valamint a 79/373/EGK tanácsi irányelv, a 80/511/EGK bizottsági irányelv, a 82/471/EGK, 83/228/EGK, 93/74/EGK, 93/113/EK és 96/25/EK tanácsi irányelv és a 2004/217/EK bizottsági határozat hatályon kívül helyezéséről szóló, 2009. július 13-i 767/2009/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet ( 7 ).

4.    Az alkalmazott vizsgálati módszer jegyzőkönyvi feltüntetése

A vizsgálati jegyzőkönyvben fel kell tüntetni az alkalmazott vizsgálati módszert.

5.    Az vizsgálati eredmények jegyzőkönyvi feltüntetése

A vizsgálati eredményt a vizsgálati módszerben meghatározott módon és megfelelő helyiérték-számmal kell kifejezni, és ha szükséges, akkor a végső minta előkészítés előtti nedvességtartalmára kell korrigálni.

6.    Mérési bizonytalanság és visszanyerési arány nemkívánatos anyagok vizsgálata esetében

A 2002/32/EK irányelv szerinti nemkívánatos anyagok tekintetében valamely takarmányozásra szánt termék akkor minősül meg nem felelőnek a megengedett határérték szempontjából, ha úgy ítélik meg, hogy a 12 %-os nedvességtartalmú takarmányra vonatkoztatott vizsgálati eredmény – figyelembe véve a kiterjesztett mérési bizonytalanságot és a visszanyerési korrekciót – meghaladja a megengedett határértéket. A megfelelés megállapítására a mért koncentrációt alkalmazzák a visszanyerés alapján végzett korrekció, valamint a kiterjesztett mérési bizonytalanság kivonása után. Ezt az eljárást csak olyan esetekben lehet alkalmazni, amikor a vizsgálati módszer lehetővé teszi a mérési bizonytalanság becslését és a visszanyerési korrekciót (pl. mikroszkópos elemzésnél nem lehetséges).

A vizsgálati eredményt a következők szerint kell a jegyzőkönyvben feltüntetni (amennyiben az alkalmazott vizsgálati módszer lehetővé teszi a mérési bizonytalanság és a visszanyerés becslését):

Ha azonban a vizsgálat eredménye jelentősen (> 50 %) alacsonyabb, mint a megengedett határérték, és feltéve, hogy megfelelő minőségi eljárásokat alkalmaznak és az analízis célja kizárólag a jogszabályi rendelkezéseknek való megfelelés ellenőrzése, a vizsgálati eredményeket fel lehet tüntetni a jegyzőkönyvben a visszanyerési korrekció nélkül, és ezekben az esetekben el lehet hagyni a visszanyerés arányának és a mérési bizonytalanságnak jegyzőkönyvi feltüntetését.

▼B

III. MELLÉKLET

ANALITIKAI MÓDSZEREK A TAKARMÁNY-ALAPANYAGOK ÉS ►C1  TAKARMÁNYKEVERÉKEK ◄ ÖSSZETÉTELÉNEK ELLENŐRZÉSÉRE

A.   A NEDVESSÉGTARTALOM MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok nedvességtartalmának meghatározását. Illóanyagokat (mint például szerves savakat) tartalmazó takarmányok esetében figyelembe kell venni, hogy a nedvességtartalommal együtt jelentős mennyiségű illóanyag meghatározása történik.

Nem vonatkozik a tejtermékek mint takarmány-alapanyagok analízisére, az ásványi anyagok és a túlnyomórészt ásványi anyagokból álló keverékek analízisére, az állati és növényi zsírok és olajok és olajos magvak és olajtartalmú gyümölcsök analízisére.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát, a takarmány jellege szerint, meghatározott körülmények között szárítjuk. A tömegveszteséget méréssel határozzuk meg. Amennyiben magas nedvességtartalmú, szilárd takarmányokkal dolgozunk, előzetes szárítást kell végezni.

3.   Eszközök

4.   A vizsgálat módja

4.1.   Előkészítés

4.1.1.    A 4.1.2. és a 4.1.3. pont alatt nem szereplő takarmányok

Vegyünk legalább 50 g-ot a mintából. Szükség esetén aprítsuk fel vagy oszlassuk el úgy, hogy a nedvességtartalma egyenletes legyen (lásd 6. pont).

4.1.2.    Gabona- és darafélék

Vegyünk legalább 50 g-ot a mintából. Őröljük le úgy, hogy a kapott részecskék legalább 50 %-a átjusson egy 0,5 mm-es szembőségű szitán, és ne maradjon vissza 10 %-nál több egy kerek szemű, 1 mm-es szembőségű szitán.

4.1.3.    Folyékony vagy kenőcsös állagú takarmányok, túlnyomórészt olajokból és zsírokból álló takarmányok

Mérjünk ki 25 g mintát 10 mg pontossággal, adjunk hozzá megfelelő mennyiségű vízmentes homokot, 10 mg pontossággal kimérve, és keverjük addig, amíg homogén masszát nem kapunk.

4.2.   Szárítás

4.2.1.    ►C3  4.2.1. A 4.2.2. és a 4.2.3. pont alatt nem szereplő takarmányok

Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 1 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 103 oC-ra előmelegített szárítószekrénybe. Annak megakadályozása érdekében, hogy a szárítószekrény hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a szárítószekrénybe. Hagyjuk száradni négy órán át attól az időponttól számítva, amikor a szárítószekrény hőfoka újból elérte a 103 oC-ot. Helyezzük vissza a tartályra a fedelet, a tartályt vegyük ki a szárítószekrényből, hagyjuk hűlni 30–45 percig az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg pontossággal.

Túlnyomórészt olajokból és zsírokból álló takarmányok esetén szárítsuk további 30 percen át 130 oC-on a szárítószekrényben. A két mérés különbsége nem haladhatja meg a nedvességtartalom 0,1 %-át. ◄

▼C3

4.2.2.    Gabonafélék, liszt, darafélék és derce

Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 0,5 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g aprított mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 130 oC-ra előmelegített szárítószekrénybe. Annak megakadályozása érdekében, hogy a szárítószekrény hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a szárítószekrénybe. Hagyjuk száradni két órán át attól az időponttól számítva, amikor a szárítószekrény hőfoka újból elérte a 130 oC-ot. Helyezzük vissza a tartályra a fedelet, a tartályt vegyük ki a szárítószekrényből, hagyjuk hűlni 30–45 percig az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg pontossággal.

▼B

▼C3

Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 0,5 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 80–85 oC-ra előmelegített vákuum szárítószekrénybe (3.5.). Annak megakadályozása érdekében, hogy a szárítószekrény hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a szárítószekrénybe.

Emeljük a nyomást 100 torr-ra, és hagyjuk a mintát száradni ezen a nyomáson négy órán át száraz, forró levegő áramoltatásával vagy szárítóanyag (20 mintához kb. 300 g) felhasználásával. Utóbbi esetben a kívánt nyomás elérésekor kapcsoljuk le a vákuumszivattyút. A szárítási időt attól a pillanattól kell számítani, amikor a szárítószekrény hőmérséklete visszaáll 80–85 oC-ra. Óvatosan állítsuk vissza a szárítószekrényben a légköri nyomást. Nyissuk ki a szárítószekrényt, azonnal helyezzük vissza a tartály fedelét, vegyük ki a tartályt a szárítószekrényből, hagyjuk hűlni 30–45 percen át az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg-os pontossággal. Szárítsuk további 30 percen át a vákuum szárítószekrényben 80–85 oC-on, és mérjük le újra. A két mérés különbsége nem haladhatja meg a nedvességtartalom 0,1 %-át.

▼B

4.3.   Előszárítás

4.3.1.    A 4.3.2. pont alatt nem szereplő takarmányok

A magas nedvességtartalmú szilárd takarmányokat, amelyek nehezen apríthatók fel, előszárításnak kell alávetni az alábbiak szerint:

Mérjünk le 50 g-ot az aprítatlan mintából 10 mg pontossággal (a préselt vagy agglomerált mintákat kissé fel is lazíthatjuk, ha szükséges) egy megfelelő tartályba (pl. 20×12 cm-es, 0,5 cm-es peremmel ellátott alumíniumtálca). ►C3  Hagyjuk száradni 60–70 oC-os szárítószekrényben, amíg a nedvességtartalom 8–12 % körüli értékre csökken. Vegyük ki a szárítószekrényből, hagyjuk fedél nélkül hűlni a laboratóriumban egy órán át, és mérjük le 10 mg pontossággal. ◄ Ezután aprítsuk fel azonnal a 4.1.1. pontban feltüntetett módon, és szárítsuk a 4.2.1. vagy a 4.2.3. pontban feltüntetett módon, a takarmány jellege szerint.

4.3.2.    Gabonafélék

A 17 %-nál magasabb nedvességtartalmú gabonaféléket előszárításnak kell alávetni az alábbiak szerint:

Mérjünk le 50 g-ot az aprítatlan gabonából 10 mg pontossággal egy megfelelő tartályba (pl. 20×12 cm-es, 0,5 cm-es peremmel ellátott alumíniumtálca). ►C3  Hagyjuk száradni 5–7 percen át 130 oC-os szárítószekrényben. Vegyük ki a szárítószekrényben, hagyjuk fedél nélkül hűlni a laboratóriumban két órán át, és mérjük le 10 mg pontossággal. ◄ Őröljük meg azonnal a 4.1.2. pontban feltüntetett módon, és szárítsuk a 4.2.2. pontban feltüntetett módon.

5.   Az eredmények kiszámítása

A minta százalékosan kifejezett nedvességtartalmát (X) az alábbi képletek segítségével számítjuk ki:

5.1.   Szárítás előszárítás nélkül

ahol:

5.2.   Szárítás előszárítással

ahol:

5.3.   Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán elvégzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg a nedvességtartalom abszolút értékének 0,2 %-át.

6.   Észrevételek

Ha az aprítás szükségesnek bizonyul, és úgy tűnik, hogy ez befolyásolja a termék nedvességtartalmát, a takarmány-alkotóelemek analízisének eredményét az eredeti minta nedvességtartalmának megfelelően korrigálni kell.

B.   AZ ÁLLATI ÉS NÖVÉNYI ZSÍROK ÉS OLAJOK NEDESSÉGTARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi az állati és növényi zsírok és olajok víz- és illóanyag-tartalmának meghatározását.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát 103 oC-on, a tömegállandóság eléréséig szárítjuk (két egymást követő mérés közötti tömegveszteségnek 1 mg-nál kevesebbnek kell lennie). A tömegveszteséget méréssel határozzuk meg.

3.   Eszközök

4.   A vizsgálat módja

Mérjünk ki mg pontossággal 20 g homogenizált mintát a hőmérőt (3.2.) tartalmazó száraz, lemért edénybe (3.1.). A hőmérővel folyamatosan kevergetve hevítsük a homokfürdőn vagy a főzőlapon (3.3.) úgy, hogy a hőmérséklet körülbelül hét perc alatt érje el a 90 oC-ot.

Csökkentsük a hőt, ügyelve az edény aljáról felszálló buborékok gyakoriságára. A hőmérséklet nem haladhatja meg a 105 oC-ot. Folytassuk az edény alján lévő anyag keverését, amíg a buborékképződés le nem áll.

A teljes kiszárítás érdekében hevítsük az edényt néhányszor 103 ± 2 oC-ra, miközben két hevítés között 93 oC-ra hűtjük tartalmát. Ezután hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni az exszikkátorban (3.4.), és mérjük le. Ismételjük addig a műveletet, amíg a két egymást követő mérés közötti tömegveszteség már nem haladja meg a 2 mg-ot.

5.   Az eredmények kiszámítása

A mintára vonatkoztatott, százalékosan kifejezett nedvességtartalmat (X) a következő képlettel lehet kiszámítani:

ahol:

A 0,05 %-nál kisebb eredményeket a „0,05 %-nál kisebb” megnevezéssel kell feljegyezni.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán elvégzett két párhuzamos meghatározás eredményeként kapott nedvességtartalmak eltérésének abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,05 %-ot.

C.   A NYERSFEHÉRJE-TARTALOM MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

E módszer lehetővé teszi a takarmányok nyersfehérje-tartalmának meghatározását a Kjeldahl-módszer szerint meghatározott nitrogéntartalom alapján.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát katalizátor jelenlétében kénsavval roncsoljuk. A savas oldatot nátrium-hidroxid-oldattal lúgosítjuk. Az ammóniát lepároljuk, és ismert mennyiségű kénsavban vesszük fel, amelynek feleslegét nátrium-hidroxid standardoldatával titráljuk.

Alternatív megoldásként a felszabadult ammóniát bőséges bórsavoldatba desztilláljuk, majd sósav- vagy kénsavoldattal titráljuk.

3.   Reagensek

Kolorimetriás végpont-meghatározás alkalmazásakor a metilvörös és a brómkrezol indikátort a bórsavas oldathoz kell adni. Ha 1 liter bórsavas oldatot készítünk, a térfogat kiigazítása előtt 7 ml metilvörösindikátor-oldatot (3.16.) és 10 ml brómkrezol-zöld oldatot (3.17.) kell hozzáadni.

A használt víztől függően a bórsavas oldat pH-ja tételenként változhat. Pozitív vakpróbához gyakorta szükség lehet kis mennyiségű lúg hozzáadására.

4.   Eszközök

A Kjeldahl-eljárás szerinti roncsolás, desztillálás és titrálás elvégzésére alkalmas készülék.

5.   A vizsgálat módja

5.1.   Roncsolás

Mérjünk ki 0,001 g pontossággal 1 g mintát, és helyezzük be a roncsoló lombikjába. Adjunk hozzá 15 g kálium-szulfátot (3.1.), megfelelő mennyiségű katalizátort (3.2.) (0,3 –0,4 g réz(II)-oxidot vagy 0,9 –1,2 g réz(II)-szulfát-pentahidrátot), 25 ml kénsavat (3.4.) és szükség szerint néhány szemcse horzsakövet (3.12.), majd keverjük össze.

Először mérsékelten hevítsük a lombikot, szükség esetén időnként keverjük meg annak tartalmát, egészen addig, amíg a massza karbonizálódik és a hab eltűnik; ezt követően erősebben hevítsük, amíg a folyadék erős forrásba nem jön. A hevítés akkor megfelelő, ha a forrásban levő sav a lombik falán lecsapódik. Kerüljük a lombik oldalának túlhevítését és azt, hogy ahhoz szerves részecskék tapadjanak.

Amikor az oldat feltisztult és világoszöld színűvé vált, folytassuk a forralást további két órán át, majd hagyjuk lehűlni az oldatot.

5.2.   Lepárlás

Óvatosan adjunk hozzá annyi vizet, amennyi a szulfátok teljes feloldódásához elegendő. Engedjük lehűlni, majd szükség szerint adjunk hozzá néhány szemcsényi cinket (3.3.). Folytassuk az 5.2.1. vagy az 5.2.2. pont szerint.

5.2.1.    Lepárlás kénsavba

A lepárlókészülék gyűjtőlombikjába mérjünk be pontosan 25 ml kénsavat (3.5. vagy 3.7.), a feltételezett nitrogéntartalomtól függően. Adjunk hozzá néhány csepp metilvörösindikátort (3.8.).

Kapcsoljuk össze a Kjeldahl-lombikot a lepárlókészülék hűtőjével, és legalább 1 cm mélyen merítsük be a hűtő végét a gyűjtőlombikban lévő folyadékba (lásd a 8.3. észrevételt). Lassan, ammóniaveszteség nélkül öntsünk 100 ml nátrium-hidroxid oldatot (3.9.) a Kjeldahl-lombikba (lásd a 8.1. észrevételt). Hevítsük a lombikot az ammónia lepárlódásáig.

5.2.2.    Lepárlás bórsavba

Amennyiben a párlat ammóniatartalmának titrálását manuálisan végezzük, az alább megadott eljárást kell alkalmazni. Amennyiben a lepárlóegység teljesen automatikusan a párlat ammóniatartalmát is titrálja, kövessük a gyártó utasításait a lepárlóegység működtetése tekintetében.

Tegyünk a hűtő kifolyójához 25–30 ml bórsavas oldatot (3.18.) tartalmazó gyűjtőlombikot úgy, hogy az adagolócső a bórsavas oldat szintje alatt legyen. Állítsuk be a lepárlóegységet 50 ml nátrium-hidroxid oldat (3.9.) adagolására. A lepárlóegységet a gyártó utasításainak megfelelően működtessük, és pároljuk le a nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával felszabadult ammóniát. Gyűjtsük össze a párlatot a bórsavas fogadóoldatban. A párlat mennyisége (a gőzlepárlás ideje) a minta nitrogéntartalmától függ. Kövessük a gyártó utasításait.

5.3.   Titrálás

Folytassuk az 5.3.1. vagy a 5.3.2. pont szerint.

5.3.1.    Kénsav

A gyűjtőlombikban levő kénsavfelesleget a végpont eléréséig titráljuk nátrium-hidroxid oldattal (3.10. vagy 3.11.) az alkalmazott kénsav-koncentrációtól függően.

5.3.2.    Bórsav

A gyűjtőlombik tartalmát a normál sósavmérőoldattal (3.19.) vagy normál kénsavmérőoldattal (3.6.) titráljuk büretta segítségével, és olvassuk le a használt párlat mennyiségét.

Kolorimetriás végpont-meghatározás alkalmazásakor a végpont elérése akkor történik, amikor a rózsaszín első jele megjelenik a tartalomban. Becsüljük meg a büretta eredményét 0,05 ml pontossággal. Egy megvilágított mágneses keverőlemez vagy fotometrikus detektor segíthet a végpont megjelenítésében.

Ez történhet automatikusan automata titrálóval felszerelt gőzlepárló használatával.

Kövessük a gyártó utasításait az adott lepárló vagy lepárló/titráló működtetésekor.

5.4.   Vakpróba

A reagensek nitrogénmentességének igazolására végezzünk vakpróbát (roncsolás, lepárlás és titrálás) a minta helyett 1 g szacharózt (3.14.) használva.

6.   Az eredmények kiszámítása

A számításokat a 6.1. vagy a 6.2. pont szerint végezzük.

6.1.   Számítás az 5.3.1. pont szerinti titrálás esetén

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

6.2.   Számítás az 5.3.2. pont szerinti titrálás esetén

6.2.1.    Sósavas titrálás

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

6.2.2.    Kénsavas titrálás

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

7.   A módszer validálása

7.1.   Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

7.2.   Pontosság

Végezzük el az analízist (roncsolás, lepárlás és titrálás) 1,5 –2,0 g acetaniliden (3.13.) 1 g szacharóz (3.14.) jelenlétében; 1 g acetanilid 14,80 ml kénsavat (3.5.) fogyaszt. A visszanyerés mértékének legalább 99 %-osnak kell lennie.

8.   Észrevételek

D.   A KARBAMID MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányokban lévő karbamid szintjének meghatározását.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát vízben szuszpendáljuk egy derítőszerrel. A szuszpenziót leszűrjük. A szűrlet karbamidtartalmát, 4-dimetil-amino-benzaldehid (4-DMAB) hozzáadása után, az optikai sűrűség 420 nm-es hullámhosszon való megmérésével határozzuk meg.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A minta elemzése

Mérjünk ki a mintából 2 g-ot mg-nyi pontossággal, és 1 g aktív szénnel (3.4.) együtt helyezzük egy 500 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá 400 ml vizet és 5 ml Carrez I. oldatot (3.2.), keverjük kb. 30 másodpercig, majd adjunk hozzá 5 ml Carrez II. oldatot (3.3.). Keverjük a forgódobon harminc percig. Töltsük térfogatra vízzel, rázzuk fel, és szűrjük le.

Vegyünk el 5 ml-t az áttetsző, színtelen szűrletekből, öntsük csiszolt üvegdugóval ellátott kémcsövekbe, adjunk hozzájuk 5 ml 4-DMAB oldatot (3.1.), és keverjük fel. Helyezzük a kémcsöveket vízfürdőbe 20 oC-on (+/- 4 oC). Tizenöt perc elteltével a spektrofotométer segítségével, 420 nm-en mérjük meg a mintaoldat optikai sűrűségét, és ezt hasonlítsuk össze a vakpróbához a reagensekből készített oldattal.

5.2.   Kalibrációs görbe

Vegyünk el a karbamid oldatból (3.5.) 1, 2, 4, 5 és 10 ml-t, öntsük 100 ml-es mérőlombikokba, és töltsük fel őket térfogatra vízzel. Vegyünk el 5 ml-t minden egyes oldatból, és mindegyikhez adjunk 5 ml 4-DMAB oldatot (3.1.), homogenizáljuk, és a fentiek szerint mérjük meg az optikai sűrűséget összehasonlítva az 5 ml 4-DMAB oldatot és 5 ml vizet tartalmazó karbamidmentes kontrolloldattal. Szerkesszük meg a kalibrációs görbét.

6.   Az eredmények kiszámítása

A kalibrációs görbe segítségével határozzuk meg a mintában lévő karbamidmennyiséget.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

7.   Észrevételek

E.   AZ ILLÓ NITROGÉNBÁZISOK MEGHATÁROZÁSA

I.   MIKRODIFFÚZIÓVAL

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok ammóniában kifejezett illó nitrogénbázis-tartalmának meghatározását.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát vízzel extraháljuk, majd az oldatot derítjük és szűrjük. Az illó nitrogénbázisokat mikrodiffúzióval, kálium-karbonát oldat használatával kiszorítjuk, bórsavas oldatban fogjuk fel, és kénsavval titráljuk.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

Mérjünk le 10 g mintát 1 mg pontossággal és tegyük egy 100 ml vizet tartalmazó 200 ml-es mérőlombikba. Keverjük a keverőgépben 30 percen át. Adjunk hozzá 50 ml triklór-ecetsavas oldatot (3.1.), töltsük fel térfogatra vízzel, rázzuk össze alaposan, majd szűrjük át hajtogatott szűrőn.

Pipettázzunk 1 ml bórsavas oldatot (3.3.) a Conway-küvetta középső részébe és 1 ml mintaszűrletet a küvetta koronarészébe. Fedjük le részlegesen a bezsírozott fedéllel. Tegyünk 1 ml telített kálium-karbonát oldatot (3.4.) gyorsan a küvetta koronarészébe, majd zárjuk le légmentesen a küvettát a fedéllel. Forgassuk el a küvettát óvatosan a vízszintes síkban úgy, hogy a két reagens összekeveredjen. Hagyjuk inkubálódni legalább négy órán át szobahőmérsékleten vagy egy órán át 40 oC-on.

Mikrobüretta (4.3.) segítségével titráljuk az illó bázisokat a bórsavoldatban kénsavval (3.5.).

Végezzünk vakpróbát ugyanezzel az eljárással, de az analizálandó minta hozzáadása nélkül.

6.   Az eredmények kiszámítása

1 ml 0,01 mól/liter koncentrációjú H2SO4 0,34 mg ammóniának felel meg.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg:

7.   Észrevételek

Ha a minta ammóniatartalma meghaladja a 0,6 %-ot, az eredeti szűrletet hígítani kell.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   DESZTILLÁLÁSSAL

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a karbamidot gyakorlatilag nem tartalmazó halliszt ammóniában kifejezett illó nitrogénbázis-tartalmának meghatározását. Csak 0,25 %-nál alacsonyabb ammóniatartalom esetén alkalmazható.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát vízzel extraháljuk, majd az oldatot derítjük és szűrjük. Az illó nitrogénbázist forrásponton szorítjuk ki magnézium-oxid hozzáadásával, és meghatározott mennyiségű kénsavban fogjuk fel, amelynek feleslegét nátrium-hidroxid oldattal titráljuk vissza.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

Mérjünk le 10 g mintát 1 mg pontossággal, és tegyük egy 100 ml vizet tartalmazó 200 ml-es mérőlombikba. Keverjük a keverőgépben 30 percen át. Adjunk hozzá 50 ml triklór-ecetsavas oldatot (3.1.), töltsük fel térfogatra vízzel, rázzuk össze alaposan, majd szűrjük át hajtogatott szűrőn.

Vegyünk a tiszta szűrletből elegendő mennyiséget, hogy a feltételezett illó nitrogénbázis-tartalmat meg tudjuk határozni (100 ml mennyiség rendszerint megfelel a célnak). Hígítsuk fel 200 ml-re, és adjunk hozzá 2 g magnézium-oxidot (3.2.), valamint néhány csepp habzásgátló emulziót (3.3.). Az oldatnak lakmuszpapírral mérve lúgos kémhatásúnak kell lennie; ha nem az, adjunk hozzá egy kevés magnézium-oxidot (3.2.). Folytassuk a nyersfehérje meghatározására az 5.2. vagy 5.3. pontban ismertetett módszer szerint (e melléklet C. része).

Végezzünk vakpróbát ugyanezzel az eljárással, de az analizálandó minta hozzáadása nélkül.

6.   Az eredmények kiszámítása

1 ml 0,05 mól/liter koncentrációjú H2SO41,7 mg ammóniának felel meg.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg relatív értékben az ammóniatartalom 10 %-át.

F.   AZ AMINOSAVAK MEGHATÁROZÁSA (A TRIPTOFÁN KIVÉTELÉVEL)

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer a takarmányok szabad (szintetikus és természetes) és összes (peptidhez kötött és szabad) aminosav-tartalmának meghatározását teszi lehetővé, aminosav-analizátort használatával. A módszer a következő aminosavakra alkalmazható: cisztein, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aszparaginsav, glutaminsav, glicin, hisztidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, prolin, szerin, tirozin és valin.

A módszer nem tesz különbséget az aminosav sói között, és nem különbözteti meg az aminosavak D és L formáit. A módszer nem érvényes triptofán vagy az aminosavak hidroxi analógjainak meghatározására.

2.   Vizsgálati alapelv

2.1.   Szabad aminosavak

A szabad aminosavakat híg sósavval extraháljuk. Az együtt extrahált nitrogéntartalmú makromolekulákat szulfoszalicilsavval csapatjuk ki, és szűréssel távolítjuk el. A szűrt oldat kémhatását pH = 2,20 értékre állítjuk be. Az aminosavakat ioncserés kromatográfiával választjuk szét, és ninhidrines reakcióval, 570 nm-en végzett fotometriás detektálással határozzuk meg.

2.2.   Összes aminosav

A választott eljárás függ a vizsgált aminosavaktól. A ciszteint és a metionint a hidrolízis előtt ciszteinsavvá, illetve metionin-szulfonná kell oxidálni. A tirozint az oxidálatlan minták hidrolizátumaiból kell meghatározni. Az (1) bekezdésben felsorolt összes többi aminosav akár oxidált, akár oxidálatlan mintából meghatározható.

Az oxidálást 0 oC-on végezzük perhangyasav/fenol keverékével. A oxidálószer-felesleget nátrium-diszulfittal bontjuk le. Az oxidált vagy oxidálatlan mintát sósavval (3.20.) hidrolizáljuk 23 órán keresztül. A hidrolizátum kémhatását pH = 2,20 értékre állítjuk be. Az aminosavakat ioncserés kromatográfiával választjuk szét, és ninhidrines reakcióval, 570 nm-en (prolin esetében 440 nm-en) végzett fotometriás detektálással határozzuk meg.

3.   Reagensek

Kétszer desztillált vizet vagy ezzel egyenértékű minőségű vizet kell használni (vezetőképessége < 10 μS).

Oldjunk fel 300 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

Oldjunk fel 40 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

Elegyítsünk 889 g hangyasavat (3.2.) 111 g vízzel és adjunk hozzá 4,73 g fenolt (3.3.).

Adjunk egy g fenolt (3.3.) 492 ml HCl-hez (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 l-re.

Oldjunk fel 60 g 5-szulfo-szalicilsavat (3.6.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

Elegyítsünk 0,5 ml hidrogén peroxidot (3.1.) 4,5 ml hangyasav-fenol oldattal (3.19.) egy kis főzőpohárban. Inkubáljuk 20–30 oC-on egy órán át a perhangyasav keletkezéséhez, majd hűtsük le jeges vízfürdőben (15 percig), mielőtt a mintához adnánk.

Figyelem: Kerüljük a bőrrel való érintkezést, és viseljünk védőruházatot.

Oldjunk fel 19,61 g nátrium-citrátot (3.8.), 5 ml tiodiglikolt (3.9.), 1 g fenolt (3.3.) és 16,50 ml HCl-t (3.7.) megközelítőleg 800 ml vízben. Állítsuk be a pH-t 2,20 -re. Töltsük fel vízzel 1 literre.

c = 2,5 μmól/l, mindegyik sósavban.

Kereskedelmi forgalomban kapható.

1 literes mérőlombikban citrátpufferban (3.24.) oldjunk fel 0,2115 g ciszteinsavat (3.16.2.) és 0,2265 g metionin szulfont (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig citrátpufferrel. Legfeljebb 12 hónapig tároljuk 5 oC alatt. Nem használjuk ezt az oldatot, ha a standard törzsoldat (3.27.1.) tartalmaz ciszteinsavat és metionin szulfont.

Mérőlombikban oldjunk fel 0,6560 g norleucint (3.13.) citrátpufferben (3.24.), majd az oldatot töltsük fel 250 ml-re citrátpufferrel. Legfeljebb 6 hónapig tároljuk 5 oC alatt.

Öntsük át a teljes mennyiséget egy 50 ml-es mérőlombikba, töltsük fel jelig citrátpufferrel (3.24.), és keverjük össze.

Legfeljebb 3 hónapig tároljuk 5 oC alatt.

Lásd még az Észrevételek 9.1. pontját.

Legfeljebb 3 hónapig tároljuk 5 oC alatt.

4.   Eszközök

A kolonna szulfonált polisztirol gyantával van töltve, amely képes az aminosavak egymástól és más ninhidrin-pozitív anyagoktól való elválasztására. A puffer és ninhidrin vonal áramlását ±0,5 %-os áramlási stabilitású szivattyúk biztosítják a standard kalibrálás és a minta analízisének időszakában.

Néhány aminosav-analizátornál olyan hidrolízises eljárások is alkalmazhatók, amelyekben a hidrolizátum nátriumkoncentrációja k = 0,8 mól/l, és amelyek tartalmazzák az oxidációs lépésből származó valamennyi hangyasavmaradékot. Más analizátorok nem biztosítanak megfelelő elválasztást bizonyos aminosavak esetében, ha a hidrolizátum feleslegben tartalmaz hangyasavat, és/vagy magas benne a nátrium-ion koncentráció. Ebben az esetben a sav térfogatát a hidrolízis után és a pH-beállítás előtt mintegy 5 ml-re való bepárlással csökkentjük. A bepárlást vákuum alatt és maximum 40 oC-on kell végezni.

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A minta előkészítése

A mintát úgy őröljük meg, hogy átjusson egy 0,5 mm-es szitán. Őrlés előtt a nagy nedvességtartalmú mintákat vagy légszáraz állapotba kell hozni 50 oC-nál nem magasabb hőmérsékleten, vagy liofilizálni kell azokat. A nagy zsírtartalmú mintákat őrlés előtt petroléterrel (3.12.) extrahálni kell.

5.2.   A szabad aminosavak meghatározása takarmányokban és előkeverékekben

Az előkészített mintából (5.1.) megfelelő mennyiséget (1–5 g) mérjünk be 0,2 mg pontossággal egy Erlenmeyer-lombikba, és adjunk hozzá 100,0 ml extraháló keveréket (3.21.). Rázassuk a keveréket 60 percig mechanikus rázógép vagy mágneses keverő segítségével (4.8.). Hagyjuk leülepedni az üledéket, és a felülúszó oldatból pipettázzunk 10,0 ml-t egy 100 ml-es főzőpohárba.

Keverés közben adjunk hozzá 5,0 ml szulfoszalicilsavat (3.22.), és folytassuk a keverést mágneses keverő segítségével 5 percig. A felülúszó folyadékot szűrjük le, vagy centrifugáljuk a csapadék leválasztása céljából. A kapott oldat 10,0 ml-ét tegyük egy 100 ml-es főzőpohárba, és állítsuk be a pH-t 2,20 -ra nátrium-hidroxid-oldattal (3.18.), majd töltsük át egy megfelelő térfogatú mérőlombikba citrát-puffer segítségével (3.24.), és a lombikot töltsük fel jelig a pufferoldattal (3.24.).

Ha belső standardot használunk, adjunk 1,00 ml belső standardot (3.27.3.) minden 100 ml végső oldathoz, és a lombikot töltsük fel jelig a pufferoldattal (3.24.).

Folytassuk a műveletet a kromatográfiával, az 5.4. pont szerint.

Ha a kivonatok vizsgálatára nem ugyanazon a napon kerül sor, akkor azokat 5 oC alatt kell tárolni.

5.3.   Összes aminosav meghatározása

5.3.1.    Oxidáció

0,2 mg pontossággal mérjünk ki 0,1 –1 g-ot az előkészített mintából (5.1.):

A kimért mintamennyiségnek hozzávetőlegesen 10 mg nitrogéntartalommal és legfeljebb 100 mg nedvességtartalommal kell rendelkeznie.

Helyezzük a lombikot/palackot jeges vízfürdőbe, és hűtsük le 0 oC-ra, adjunk hozzá 5 ml oxidációs keveréket (3.23.), és keverjük össze egy hajlított végű üvegspatulával. Zárjuk le légmentesen a spatulát is magában foglaló lombikot/palackot, tegyük a lezárt tartályt tartalmazó jeges vízfürdőt 0 oC-os hűtőszekrénybe, és hagyjuk állni 16 órán keresztül. 16 óra múlva vegyük ki a hűtőszekrényből, és a feleslegben lévő oxidáló reagenst 0,84 g nátrium-diszulfit (3.4.) adagolásával bontsuk le.

Folytassuk a műveletet az 5.3.2.1. pont szerint.

5.3.2.    Hidrolízis

5.3.2.1.    Az oxidált minták hidrolízise

Az 5.3.1. pont szerint elkészített oxidált mintához adjunk 25 ml hidrolíziskeveréket (3.20.), ügyelve arra, hogy lemossuk az edény falára és a spatulára tapadt mintamaradékot.

Az alkalmazott hidrolízis-eljárástól függően az 5.3.2.3. vagy az 5.2.3.4. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.2.    A nem oxidált minta hidrolízise

Mérjünk be egy 100 ml-es vagy egy 250 ml-es gömblombikba (4.1.) vagy egy 100 ml-es csavaros fedelű palackba (4.2.) 0,1 –1 g-ot az előkészített mintából (5.1.) 0,2 mg pontossággal. A mintából bemért adagnak hozzávetőlegesen 10 mg nitrogéntartalommal kell rendelkeznie. Óvatosan adjunk hozzá 25 ml hidrolíziskeveréket (3.20.), és keverjük őket össze. Az 5.3.2.3. vagy az 5.3.2.4. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.3.    Nyitott hidrolízis

Tegyünk 3 üveggyöngyöt a lombikban lévő keverékbe (ami az 5.3.2.1. vagy az 5.3.2.2. pont szerint készült), és forraljuk folyamatos buborékolás mellett, reflux alatt, 23 órán keresztül. Amikor a hidrolízis befejeződött, mossuk ki a hűtőt 5 ml citrát-pufferrel (3.24.). Vegyük le a lombikot, és hűtsük le jeges vízfürdőben.

Az 5.3.3. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.4.    Zárt hidrolízis

▼C3

Tegyük az 5.3.2.1. vagy az 5.3.2.2. pont szerint elkészített keveréket tartalmazó palackot egy 110 oC-os szárítószekrénybe (4.3.). A (gázfejlődésnek tulajdonítható) nyomás kialakulásának megelőzése és a robbanás elkerülése érdekében az első órában helyezzük a csavaros fedelet az edény nyílására. Ne zárjuk le az edényt a fedővel. Egy óra elteltével zárjuk le az edényt a fedővel, és hagyjuk a szárítószekrényben (4.3.) 23 órán keresztül. Amikor a hidrolízis befejeződött, vegyük ki az edényt a szárítószekrényből, óvatosan nyissuk fel a palack fedelét, és tegyük a palackot jeges vízfürdőbe. Hagyjuk lehűlni.

▼B

A pH beállításához alkalmazott eljárástól függően (5.3.3.) a palack tartalmát teljes egészében vigyük át egy 250 ml-es főzőpohárba vagy egy 250 ml-es gömblombikba citrát-puffer segítségével (3.24.).

Az 5.3.3. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.3.    A pH beállítása

Az aminosav-analizátor (4.9.) nátriummal szembeni tűrőképességétől függően az 5.3.3.1. vagy az 5.3.3.2. pont szerint végezzük el a pH beállítását.

5.3.3.1.    Alacsony nátriumkoncentrációt igénylő kromatográfiás rendszerek (4.9.) esetén:

Tanácsos belső standard törzsoldatot (3.27.3.) használni alacsony nátriumkoncentrációt igénylő aminosav-analizátorok alkalmazása esetén (amikor a sav térfogatát csökkenteni kell).

Ebben az esetben bepárlás előtt adjunk 2,00 ml belső standard törzsoldatot (3.27.3.) a hidrolizátumhoz.

Adjunk 2 csepp 1-oktanolt (3.15.) az 5.3.2.3. vagy az 5.2.3.4. pont szerint nyert hidrolizátumhoz.

Rotációs bepárló segítségével (4.7.) csökkentsük a térfogatot 5–10 ml-re vákuum alatt, 40 oC-on. Ha a térfogat véletlenül 5 ml alá csökken, akkor a hidrolizátumot ki kell önteni, és az analízist újra kell kezdeni.

Nátrium-hidroxid-oldattal (3.18.) állítsuk be a pH-t 2,20 -re, és az 5.3.4. ponttal folytassuk a műveletet.

5.3.3.2.    Minden más típusú aminosav-analizátor (4.9.) esetén:

Az 5.3.2.3. vagy az 5.3.2.4. pont szerint kapott hidrolizátumokat részlegesen semlegesítsük úgy, hogy keverés közben óvatosan hozzáadunk 17 ml nátrium-hidroxid-oldatot (3.17.), mialatt a hőmérsékletet 40 oC alatt tartjuk.

Szobahőmérsékleten állítsuk be a pH-t 2,20 -re a 3.17. pont alatti nátrium-hidroxid-oldattal és végül a 3.18. pont alatti nátrium-hidroxid-oldattal. Folytassuk a műveletet az 5.3.4. pont szerint.

5.3.4.    Mintaoldat a kromatográfiához

A beállított pH-jú hidrolizátumot (5.3.3.1. vagy 5.3.3.2.) maradék nélkül, citrát-pufferrel vigyük át egy 200 ml-es mérőlombikba, és töltsük fel jelig a pufferrel (3.24.).

Ha még nem használtunk belső standardot, adjunk hozzá 2,00 ml belső standardot (3.27.3.), és töltsük fel jelig citrát-pufferrel (3.24.). Keverjük össze alaposan.

Folytassuk a műveletet a kromatográfiával (5.4.).

Ha a mintaoldatok vizsgálatára nem ugyanazon a napon kerül sor, 5 oC alatt kell őket tárolni.

5.4.   Kromatográfia

Kromatográfiás vizsgálat előtt a kivonatot (5.2.) vagy a hidrolizátumot (5.3.4.) állítsuk be szobahőmérsékletre. Rázzuk fel a keveréket, és szűrjünk át megfelelő mennyiséget egy 0,2 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kapott tiszta oldatot vessük alá ioncserés kromatográfiának aminosav-analizátor segítségével (4.9.).

Az injektálást lehet kézzel vagy automatikusan végezni. Ügyeljünk arra, hogy – ± 0,5 %-os eltéréssel – azonos mennyiségű oldatot tegyünk az oszlopra a standardok és minták analíziséhez, kivéve, amikor belső standardot használunk, valamint, hogy a nátrium-aminosav arányok, amennyire csak lehet, megegyezzenek a standardban és a mintában.

A kalibrálás gyakorisága általában a ninhidrin reagens és az analitikai rendszer stabilitásától függ. A standardot vagy a mintát citrát-pufferrel (3.24.) hígítjuk annak érdekében, hogy a standard csúcsterülete a minta aminosav csúcsterületének 30–200 %-a legyen.

Az aminosavak kromatográfiás vizsgálata az alkalmazott analizátor és a használt gyanta típusától függően némiképp eltérhet. A választott rendszernek képesnek kell lennie arra, hogy az aminosavakat elválassza egymástól és a ninhidrin-pozitív anyagoktól. A működési tartományban a kromatográfiás rendszer reakciójának egyenesen arányosnak kell lennie a kolonnára felvitt aminosavak mennyiségével.

A kromatográfiás lépésnél az alábbiakban említett csúcs-mélyponti arányt alkalmazzuk, amikor (a meghatározandó aminosavak vonatkozásában) ekvimoláris oldatot analizálunk. Az ekvimoláris oldatnak az aminosav-analizátor rendszerrel (4.9.). pontosan mérhető aminosavak maximális mennyiségének legalább 30 %-át tartalmaznia kell.

A treonin-szerin szétválasztásánál a kromatogramon a két egymást átfedő aminosav közül a kisebb csúcs-mélyponti aránya ne haladja meg a 2:10 értéket (ha csak cisztein, metionin, treonin és lizin meghatározásáról van szó, a szomszédos csúcsok nem megfelelő elválása hátrányosan befolyásolja a meghatározást). Minden más aminosav esetében a szétválasztásnak jobbnak kell lennie, mint 1:10.

A rendszernek el kell tudnia választani a lizint a „mesterséges lizin képződményektől” és az ornitintől.

6.   Az eredmények kiszámítása

Minden aminosavra megmérjük a minta és a standard csúcsterületét, és kiszámítjuk a minta egy kg-jában lévő aminosav g-ban kifejezett mennyiségét (X).

Ha belső standardot használunk, szorozzuk meg

-vel.

Mind a cisztin, mind a cisztein mint cisztein-sav kerül meghatározásra az oxidált minta hidrolizátumaiban, de cisztinként kerül kiszámításra (C6H12N2O4S2, MW 240,30 g/mól), ha MW 120,15 g/mólt (= 0,5 × 240,30 g/mól) használunk.

A metionin metionin-szulfonként kerül meghatározásra az oxidált minta hidrolizátumaiban, de metioninként kerül kiszámításra a metionin molekulatömegének (MW = 149,21 g/mol) használatával.

A hozzáadott szabad metionin extrahálás után metioninként kerül meghatározásra, és a számításhoz ugyanezt a molekulatömeget (M) használjuk.

7.   A módszer értékelése

A módszert nemzetközi összehasonlító vizsgálat során ellenőrizték, amelyet 1990-ben végeztek négy különböző takarmány (kevert sertéstáp, brojlertápkeverék, fehérjekoncentrátum, előkeverék) felhasználásával. A szélsőértékek kizárásával kapott átlagértékeket és standard szórásokat az ebben a pontban található táblázatok mutatják be:

7.1.   Ismételhetőség

A fent említett összehasonlító vizsgálat ismételhetőségét „laboratóriumon belüli szórásként” kifejezve az alábbi táblázatok mutatják:

7.2.   Reprodukálhatóság

A fent említett összehasonlító vizsgálatra vonatkozóan, a különböző laboratóriumok közötti szórásértékeket az alábbi táblázat adja meg:

8.   Referenciaanyagok használata

A módszer helyes alkalmazását lehetőség szerint hitelesített referenciaanyagokon végzett ismételt mérésekkel kell ellenőrizni. Hitelesített aminosav-kalibrálóoldattal végzett kalibrálás javasolt.

9.   Észrevételek

A berendezés lineáris reakciójának tartományát valamennyi aminosavra ellenőrizni kell.

A standardoldatot citrát-pufferrel hígítjuk, hogy a csúcsterületek a tartomány közepére essenek.

G.   A TRIPTOFÁN MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

A módszer a takarmányokban található összes és a szabad triptofán meghatározására szolgál. Nem különbözteti meg a D- és az L-formákat.

2.   Vizsgálati alapelv

Az összes triptofán meghatározásához a mintát alkalikus körülmények között, telített bárium-hidroxid-oldattal hidrolizáljuk, majd 110 oC-ra hevítjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 20 órán át. Hidrolízis után belső standardot adunk hozzá.

A szabad triptofán meghatározásához a mintát enyhén savas körülmények között extraháljuk belső standard jelenlétében.

A hidrolizátumban vagy a kivonatban található triptofánt és a belső standardot HPLC-módszerrel, fluoreszcens detektálással határozzuk meg.

3.   Reagensek

Oldjunk fel 40,0 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel (3.1.) töltsük fel 1 literre.

Vegyünk 492 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

Vegyünk 82 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

Vegyünk 8,2 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

Vegyünk 34 ml ortofoszforsavat (3.6.), és vízzel (3.1.) töltsük fel 1 literre.

Egy 500 ml-es mérőlombikban oldjunk fel 0,2553 g triptofánt (3.2.) sósavban (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig sósavval (3.13.). Tároljuk –18 oC-on maximum négy hétig.

Egy 500 ml-es mérőlombikban oldjunk fel 0,2728 g α-metil-triptofánt (3.3.) sósavban (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig sósavval (3.13.). Tároljuk –18 oC-on maximum négy hétig.

Vegyünk 2,00 ml-t a triptofán koncentrált oldatából (3.15.) és 2,00 ml-t a koncentrált belső standard (α-metil-triptofán) oldatból (3.16.). Oldjuk fel vízben (3.1.) és metil-alkoholban (3.8.) a kész hidrolizátuméval körülbelül azonos térfogatra és körülbelül azonos metil-alkohol koncentrációra (10–30 %).

Az oldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.

Készítés során közvetlen napfényhatástól óvjuk.

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A minták elkészítése

Őröljük meg a mintát annyira, hogy az átjusson egy 0,5 mm-es szemméretű szitán. Őrlés előtt a nagy nedvességtartalmú mintákat vagy légszáraz állapotba kell hozni 50 oC-nál nem magasabb hőmérsékleten, vagy liofilizálni kell azokat. A nagy zsírtartalmú mintákat őrlés előtt petroléterrel (3.9.) extrahálni kell.

5.2.   A szabad triptofán (kivonat) meghatározása

1 mg-os pontossággal mérjünk be az elkészített mintából (5.1.) megfelelő mennyiséget (1–5 g) egy Erlenmeyer-lombikba. Adjunk hozzá 100,0 ml sósavat, k = 0,1 mól/l (3.13.) és 5,00 ml koncentrált belső standardoldatot (3.16.). Rázzuk vagy keverjük 60 percen át mechanikus rázógépen vagy mágneses keverőn (4.7.). Engedjük a zagyot leülepedni, majd pipettázzunk a felülúszó oldatból 10,0 ml-t főzőpohárba. Adjunk hozzá 5 ml ortofoszforsavat (3.14.). Nátrium-hidroxiddal (3.10.) állítsuk a pH-t 3,0 -ra. Adjunk hozzá annyi metil-alkoholt (3.8.), hogy a végtérfogatra számított metil-alkohol-koncentráció 10 és 30 % között legyen. Vigyük át megfelelő űrtartalmú mérőlombikba, és vízzel hígítsuk a kromatográfiához szükséges térfogatra (körülbelül a kalibráló standardoldat (3.17.) térfogatával megegyező térfogatra).

A HPLC oszlopra való felvitel előtt szűrjük át az oldat néhány ml-ét 0,45 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kromatográfiát az 5.4. bekezdés szerint végezzük.

A standardoldatot és a kivonatokat óvjuk a közvetlen napfényhatástól. Ha a kivonatokat nem lehet a készítés napján analizálni, azok 5 oC-on legfeljebb három napig tárolhatók.

5.3.   Az összes triptofán (hidrolizátum) meghatározása

Az elkészített mintából (5.1.) mérjünk be 0,2 mg-os pontossággal 0,1 –1 g-ot a polipropilén lombikba (4.4.). A kimért mintamennyiség nitrogéntartalmának kb. 10 mg-nak kell lennie. Adjunk hozzá 8,4 g bárium-hidroxid-oktahidrátot (3.4.) és 10 ml vizet. Keverjük össze kémcsőkeverővel (4.8.) vagy mágneses keverőn (4.7.). A teflonbevonatú mágnest hagyjuk a keverékben. Mossuk le 4 ml vízzel az edény falát. Helyezzük rá a csavaros zárókupakot, és lazán zárjuk le a lombikot. Helyezzük autoklávba (4.6.) forró vízzel, és gőzöljük 30–60 percig. Zárjuk be az autoklávot, és autoklávozzuk 110 (±2) oC hőmérsékleten 20 órán át.

Az autokláv kinyitása előtt csökkentsük a hőmérsékletet kevéssel 100 oC alá. A Ba(OH)2 .0,8 H2O kikristályosodásának elkerülése érdekében adjunk a meleg keverékhez 30 ml, szobahőmérsékletű vizet. Óvatosan rázzuk vagy keverjük össze. Adjunk hozzá 2,00 ml koncentrált belső standard (α-metil-triptofán) oldatot (3.16.). Hűtsük az edényeket víz- vagy jégfürdőben 15 percen át.

Ezután adjunk hozzá 5 ml ortofoszforsavat (3.14.). Tartsuk az edényt a hűtőfürdőben, és keverés közben semlegesítsük az oldatot sósavval (3.11.), majd állítsuk a pH-t 3,0 -ra sósavval (3.12.). Adjunk hozzá annyi metil-alkoholt, hogy a végtérfogatra számított metil-alkohol-koncentráció 10 és 30 % között legyen. Vigyük át megfelelő űrtartalmú mérőlombikba, és vízzel hígítsuk a kromatográfiához szükséges térfogatra (például 100 ml-re). Ügyeljünk, hogy a metil-alkohol hozzáadása ne okozzon kicsapódást.

A HPLC oszlopra való felvitel előtt szűrjük át az oldat néhány ml-ét 0,45 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kromatográfiát az 5.4. bekezdés szerint végezzük.

A standardoldatot és a kivonatokat óvjuk a közvetlen napfényhatástól. Ha a hidrolizátumokat nem lehet a készítés napján analizálni, azok 5 oC-on legfeljebb három napig tárolhatók.

5.4.   Meghatározás HPLC-vel

Az izokratikus elúcióra vonatkozó következő paraméterek útmutatásul szolgálnak; más paraméterek is alkalmazhatók, feltéve, hogy ezzel egyenértékű eredményeket adnak (lásd még az Észrevételek 9.1. és 9.2. pontját).

6.   Az eredmények kiszámítása

100 g mintában lévő triptofán grammban kifejezett mennyiségét (X) az alábbiak szerint számítjuk.

7.   Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a magasabb érték 10 %-át.

8.   A körvizsgálat eredményei

Közösségi körvizsgálatra került sor (negyedik körvizsgálat), amelynek során három mintát vizsgáltak meg a hidrolízis módszerének hitelesítése céljából, 12 laboratóriumban. Mindegyik mintát többször (5) analizálták. Az eredmények a következő táblázatban szerepelnek:

Egy másik közösségi körvizsgálatot is végeztek (harmadik körvizsgálat), amelynek során két mintát vizsgáltak meg a szabad triptofán kivonására használt módszer hitelesítése céljából, 13 laboratóriumban. Mindegyik mintát többször (5) analizálták. Az eredmények a következő táblázatban szerepelnek:

Egy további közösségi körvizsgálatot is végeztek, amelynek során négy mintát vizsgáltak meg a triptofán hidrolízisére használt módszer hitelesítése céljából, hét laboratóriumban. Az eredmények az alábbi táblázatban szerepelnek. Mindegyik mintát többször (5) analizálták.

9.   Észrevételek

Izokratikus elúció, majd grádiens oszlopon történő tisztítás:

A kromatográfiás rendszernek a működési tartományban lineáris választ kell adnia. A lineáris választ a belső standard állandó (a normális) koncentrációjával és a triptofán változó koncentrációival kell mérni. Fontos, hogy mind a triptofán-, mind a belső standard csúcsok nagysága a HPLC/fluoreszcens rendszer lineáris tartományába essen. Ha a triptofán- és/vagy a belső standard csúcs(ok) túl kicsi(k) vagy túl nagy(ok), az analízist meg kell ismételni más mintamérettel és/vagy más végtérfogattal.

Állás hatására a bárium-hidroxid egyre nehezebben oldódik. Ennek következtében a HPLC-meghatározáshoz használt oldat zavaros lesz, ami alacsony triptofánértékeket eredményezhet.

H.   NYERSOLAJOK ÉS ZSÍROK MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer az állati takarmányokban lévő nyersolajok és zsírok meghatározására szolgál. Nem vonatkozik az olajos magvakra és olajtartalmú gyümölcsökre.

A továbbiakban leírt két módszer használata a takarmány jellegétől és összetételétől, valamint az analitikai vizsgálat céljától függ.

1.1.   A. eljárás – Közvetlenül extrahálható nyersolajok és zsírok

Ez a módszer a növényi eredetű takarmány-alapanyagok esetében alkalmazható, kivéve azokat, amelyek a B. módszer tárgykörébe esnek.

1.2.   B. eljárás – Összes nyersolaj és zsír

Ez a módszer az állati eredetű takarmány-alapanyagok és minden ►C1  takarmánykeverék ◄ esetében alkalmazható. Mindazon anyagokra alkalmazandó, amelyekből az olajok és a zsírok teljesen nem extrahálhatók előzetes hidrolízis nélkül (pl. sikér, élesztő, burgonyafehérjék és extrudálás, a pelyhesítés és a melegítés révén készített termékek).

1.3.   Az eredmények értelmezése

Mindazon esetekben, amikor magasabb eredményt kapunk a B. eljárással, mint az A. eljárással, a B. eljárással kapott eredményt tekintsük a helyes értéknek.

2.   Vizsgálati alapelv

2.1.   A. módszer

A mintát petroléterrel extraháljuk. Az oldószert bepároljuk, a maradékanyagot megszárítjuk, és megmérjük.

2.2.   B. módszer

A mintát melegítés közben sósavval kezeljük. A keveréket lehűtjük, és leszűrjük. A maradékanyagot kimossuk, megszárítjuk és a meghatározást az A. módszer szerint végezzük el.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A. módszer (lásd 8.1. pont)

1 mg pontossággal mérjünk ki 5 g mintát, töltsük át egy extraháló tégelybe (4.2.), és fedjük be egy zsírmentes gyapotvattatamponnal.

Tegyük az extraháló tégelyt az extrahálókészülékbe (4.1.), és extraháljuk hat órán keresztül petroléterrel (3.1.). A petroléter-kivonatot egy horzsakődarabokat ( 9 ) tartalmazó, száraz, lemért lombikba gyűjtsük.

Pároljuk be az oldószert. A lombikot másfél órán át tartsuk a ►C3  szárítószekrényben ◄ (4.3.), hogy a maradékanyag megszáradjon. Hagyjuk kihűlni egy exszikkátorban, és mérjük meg a tömegét. Ismét szárítsuk 30 percig annak biztosítása érdekében, hogy az olajok és zsírok tömege stabilizálódjon (a tömegveszteség a két egymást követő mérés között legfeljebb 1 mg lehet).

5.2.   B. módszer

1 mg pontossággal mérjünk ki 2,5 g mintát (lásd 8.2. pont), tegyük egy 400 ml-es főzőpohárba vagy egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba, adjunk hozzá 100 ml sósavat (3.3.) és horzsakődarabokat. Fedjük le a főzőpoharat egy óraüveggel, vagy csatlakoztassunk az Erlenmeyer-lombikhoz egy visszafolyós hűtőt. Lassú lángon vagy főzőlapon enyhén forraljuk fel, és tartsuk így egy órán keresztül. Ne hagyjuk, hogy az anyag odatapadjon az edény falához.

Hűtsük le, és adjunk hozzá annyi szűrési segédanyagot (3.4.), amely elég ahhoz, hogy megakadályozza a szűrés folyamán keletkező olaj- vagy zsírveszteséget. Szűrjük át egy nedvesített, zsírmentes, kettős szűrőpapíron. Addig mossuk hideg vízzel a maradékanyagot, amíg semleges szűrletet nem kapunk. Ellenőrizzük, hogy a szűrlet nem tartalmaz olajat vagy zsírokat. Ezek jelenléte azt jelzi, hogy a mintát a hidrolízis előtt petroléterrel extrahálni kell az A. módszer szerint.

Tegyük a maradékanyagot tartalmazó kettős szűrőpapírt egy óraüvegre, és szárítsuk a ►C3  légkeveréses szárítószekrényben ◄ (4.3.) másfél órán keresztül, 100 oC ± 3 oC-on.

Tegyük a száraz maradékanyagot tartalmazó kettős szűrőpapírt egy extrahálótégelybe (4.2.), és fedjük le egy zsírmentes üvegvatta tamponnal. Helyezzük az extrahálótégelyt egy extrahálókészülékbe (4.1.), és folytassuk a műveletet az 5.1. pont második és harmadik bekezdése szerint.

6.   Az eredmény kifejezése

A maradékanyag tömegét a minta százalékában fejezzük ki.

7.   Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán, ugyanazon analitikus által végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

8.   Észrevételek

1 mg pontossággal mérjünk ki 20 g mintát, és keverjük össze 10 g vagy annál több vízmentes nátriumszulfáttal (3.2.). Extraháljuk petroléterrel (3.1.) az 5.1. pont szerint. A kapott kivonatot töltsük fel petroléterrel (3.1.) 500 ml-re, és keverjük össze. Helyezzünk 50 ml oldatot egy horzsakődarabokat tartalmazó, száraz, lemért kis lombikba. Pároljuk be az oldószert, szárítsuk, majd az 5.1 pont utolsó bekezdésében leírtak szerint járjunk el.

Távolítsuk el az oldószert az extrahálótégelyben hagyott maradékanyagból, aprítsuk fel a maradékanyagot 1 mm-es finomságúra, tegyük vissza az extrahálótégelybe (ne adjunk hozzá nátriumszulfátot), és az 5.1. pont második és harmadik bekezdésében leírtak szerint folytassuk a műveletet.

Az olaj- és zsírtartalmat a minta százalékában számítsuk ki a következő képlet segítségével:

(10m1 + m2) × 5

ahol:

I.   A NYERSROST MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányokban előforduló, hagyományosan nyersrostnak nevezett, savas és lúgos közegben oldhatatlan, zsírmentes szerves anyagok meghatározását.

2.   Vizsgálati alapelv

A szükség esetén zsírtalanított mintát többször egymás után meghatározott koncentrációjú kénsav és kálium-hidroxid forrásban lévő oldataival kezeljük. A maradékot zsugorított üvegszűrővel szűréssel elválasztjuk, kimossuk, megszárítjuk, lemérjük és 475–500 oC-on elhamvasztjuk. A hamvasztásból eredő tömegveszteség megegyezik a vizsgálati minta nyersrosttartalmával.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

Mérjünk ki 1 mg-os pontossággal 1 g-ot az előkészített mintából, és helyezzük a szűrőtégelybe (4.2.) (lásd az Észrevételek 8.1., 8.2. és 8.3. pontját), majd adjunk hozzá 1 g szűrési segédanyagot (3.3.).

Állítsuk össze a fűtőegységet (4.1.) és a szűrőtégelyt (4.2.), majd csatlakoztassuk a hengert (4.3.) a szűrőtégelyhez. Öntsünk 150 ml forrásban lévő kénsavat (3.1.) az összeállított hengerbe és tégelybe, és szükség esetén adjunk hozzá néhány csepp habzásgátló anyagot (3.2.).

5 ± 2 perc alatt hozzuk forrásba a folyadékot, és forraljuk erőteljesen pontosan 30 percig.

Nyissuk meg az ürítőpipa csapját (4.1.), vákuum alatt szűrjük át a kénsavat a szűrőtégelyen, és mossuk a maradékot egymást követően háromszor, 30 ml-es forróvízadagokkal, ügyelve arra, hogy a maradékot minden mosás után szárazra szűrjük.

Zárjuk el a kivezető csapot, és öntsünk 150 ml forrásban lévő kálium-hidroxid oldatot (3.7.) az összeállított hengerbe és tégelybe, majd adjunk hozzá néhány csepp habzásgátló anyagot (3.2.). 5 ± 2 perc alatt hozzuk forrásba a folyadékot, és forraljuk erőteljesen pontosan 30 percig. Szűrjük, és ismételjük meg a kénsavas lépésnél alkalmazott mosási műveletet.

Az utolsó mosás és szárítás után szereljük le a tégelyt, és tartalmával együtt csatlakoztassuk a hideg extrahálóegységhez (4.6.). Vákuumot használva mossuk a tégelyben lévő maradékot háromszor egymás után 25 ml-es acetonadagokkal (3.4.), ügyelve arra, hogy a maradékot minden mosás után szárazra szűrjük.

Szárítsuk a tégelyt tömegállandóságig a ►C3  szárítószekrényben ◄ 130 oC-on. Az egyes szárítások után hűtsük le exszikkátorban, és gyorsan mérjük le. Helyezzük a tégelyt a tokos kemencébe, és 475–500 oC-on hamvasszuk tömegállandóságig (a tömegveszteségnek két egymást követő mérés között 1 mg-nál kisebbnek kell lennie) legalább 30 percen át.

A mérés előtt minden hevítés után hűtsük a tégelyt először a kemencében, majd az exszikkátorban.

Végezzünk vakpróbát minta nélkül. A hamvasztásból adódó tömegveszteség nem haladhatja meg a 4 mg-ot.

6.   Az eredmények kiszámítása

A minta százalékosan kifejezett nyersrosttartalma az alábbi képlettel adható meg:

ahol:

7.   Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

8.   Észrevételek

J.   A CUKOR MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

A módszer lehetővé teszi a redukálócukor és az invertálás utáni összes cukor glükózban vagy, adott esetben, 0,95 -os tényezővel konvertálva, szacharózban kifejezett szintjének meghatározását. A módszer ►C1  takarmánykeverékek ◄ esetében alkalmazható. Egyéb takarmányokra különleges módszerek vonatkoznak. Adott esetben, a laktózt külön meg kell mérni, és figyelembe kell venni az eredmények kiszámításánál.

2.   Vizsgálati alapelv

A cukrot hígított etanolban extraháljuk; az oldatot Carrez I. és II. oldattal derítjük. Az etanol kizárása után az invertálás előtti és utáni mennyiség Luff–Schoorl-módszerrel kerül meghatározásra.

3.   Reagensek

Óvatosan kevergetve öntsük a citromsavoldatot (3.8.2.) a nátrium-karbonát-oldatba (3.8.3.). Adjuk hozzá a réz-szulfát oldatot (3.8.1.), és öntsük fel 1 literig vízzel. Hagyjuk másnapig ülepedni, majd szűrjük.

Ellenőrizzük az így kapott reagens koncentrációját (0,05 mól/liter koncentrációjú Cu; 1 mól/liter koncentrációjú Na2CO3), lásd az (5.4.) pont utolsó bekezdését. Az oldat pH-értékének körülbelül 9,4 -nek kell lenni.

4.   Eszközök

Billenődobos keverőgép: kb. 35–40 fordulatszám/perc teljesítménnyel.

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A minta extrahálása

Mérjünk ki mg-os pontossággal 2,5 g-ot a mintából, és helyezzük egy 250 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá 200 ml etanolt (3.1.), és keverjük a keverőgépen egy órán keresztül. Adjunk hozzá 5 ml Carrez I. oldatot (3.2.), és kevergessük körülbelül 30 másodpercig. Adjunk hozzá 5 ml Carrez II. oldatot (3.3.), és kevergessük egy percig. Töltsük fel térfogatra etanollal (3.1.), homogenizáljuk, és szűrjük. Vegyünk el 200 ml-t a szűrletből, és az etanol nagy részének eltávolítása céljából pároljuk térfogatának kb. felére. Helyezzük a bepárlás utáni maradékot mennyiségileg egy 200 ml-es mérőlombikba meleg vízzel, hűtsük, töltsük fel térfogatra vízzel, homogenizáljuk, és szükség esetén szűrjük. Ezen oldatot használjuk a redukálócukor és invertálás utáni összes cukor mennyiségének meghatározására.

5.2.   A redukálócukor meghatározása

Pipetta segítségével vegyünk fel legfeljebb 25 ml oldatot, amely 60 mg-nál kevesebb, glükózban kifejezett redukálócukrot tartalmaz. Szükség esetén töltsük fel az oldatot desztillált vízzel 25 ml-re, és határozzuk meg redukálócukor-tartalmát a Luff–Schoorl-módszerrel. Az eredményt a minta glükóztartalmára vonatkoztatva, százalékosan fejezzük ki.

5.3.   Az invertálás utáni összes cukor meghatározása

Pipetta segítségével vegyünk fel az oldatból 50 ml-t, és öntsük át egy 100 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá néhány csepp metilnarancsoldatot (3.4.), majd óvatosan és folyamatos kevergetés közben, adjunk hozzá sósavat (3.5.), amíg a folyadék határozottan vörössé nem válik. Adjunk hozzá 15 ml sósavat (3.6.), merítsük a lombikot gyorsan forró vízfürdőbe, és tartsuk ott harminc percen keresztül. Hűtsük le gyorsan kb. 20 oC-ra, és adjunk hozzá 15 ml nátrium-hidroxid-oldatot (3.7.). Töltsük fel vízzel 100 ml-re, és homogenizáljuk. Vegyünk el legfeljebb 25 ml oldatot, amely 60 mg-nál kevesebb, glükózban kifejezett redukálócukrot tartalmaz. Szükség esetén töltsük fel az oldatot desztillált vízzel 25 ml-re, és határozzuk meg redukálócukor-tartalmát a Luff–Schoorl-módszerrel. Az eredményt a glükózra vagy, adott esetben, 0,95 -os tényezővel szorozva a szacharózra vonatkoztatva, százalékosan fejezzük ki.

5.4.   Titrálás a Luff–Schoorl-módszerrel

Pipetta segítségével vegyünk fel 25 ml Luff–Schoorl-reagenst (3.8.), és helyezzük át egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba; adjunk hozzá pontosan 25 ml-t a derített cukoroldatból. Adjunk hozzá kétszemcsényi habkövet (3.13.), hevítsük közepes méretű, szabad lángon, közben kézzel kevergessük, és kb. két perc alatt forraljuk fel a folyadékot. Az Erlenmeyer-lombikot azonnal helyezzük egy 6 cm átmérőjű lyukkal ellátott azbesztes dróthálóra, amely alatt előzőleg lángot gyújtunk. A lángot úgy kell szabályoznunk, hogy az Erlenmeyer-lombiknak csak az alját melegítse. Illesszünk egy visszafolyós hűtőt az Erlenmeyer-lombikhoz. Forraljuk pontosan tíz percig. Hűtsük le azonnal hideg vízben, és kb. öt perc elteltével a következők szerint titráljuk:

Adjunk hozzá 10 ml kálium-jodid-oldatot (3.12.), és közvetlenül ezután (a bőséges habképződés veszélye miatt óvatosan) adjunk hozzá 25 ml kénsavat (3.11.). Titráljuk nátrium-tioszulfát-oldattal (3.9.), amíg fakósárga színt nem kapunk, adjuk hozzá a keményítő-indikátort (3.10.), és fejezzük be a titrálást.

Forralás nélkül, 10 ml kálium-jodid-oldat (3.12.) és 25 ml kénsav (3.11.) hozzáadása után végezzük el ugyanezt a titrálást egy pontosan kimért, 25 ml Luff–Schoorl-reagenst (3.8.) és 25 ml vizet tartalmazó keveréken.

6.   Az eredmények kiszámítása

A táblázat segítségével határozzuk meg a glükóz mennyiségét mg-ban, amely a két titrálás eredménye közti különbségnek felel meg 0,1 mól/liter koncentrációjú nátrium-tioszulfát mg-jában kifejezve. Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

7.   Különleges vizsgálati módok

Homogenizáljuk és szűrjük. Vonjuk ki az etanolt az 5.1. pontban leírtak szerint. Ha nincs jelen dextrinált keményítő, töltsük fel térfogatra desztillált vízzel.

8.   Észrevételek

A jelen lévő cukormennyiség meghatározása mindkét esetben a Luff–Schoorl-módszerrel történik, és a glükóz mg-ban kerül kiszámításra. Az egyik értéket kivonjuk a másikból, és az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

Példa

A kiválasztott két mennyiség az egyes meghatározások esetében 250 mg-os mintának felel meg.

Az első esetben 44,2 mg glükóznak megfelelő, 17 ml 0,1 mól/liter koncentrációjú nátrium-tioszulfát oldat fogyott; a második esetben 11 ml, amely 27,6 mg glükóznak felel meg.

A különbség 16,6 mg glükóz.

Ezért a glükózra átszámított (laktóz nélküli) redukálócukor-tartalom a következő

K.   LAKTÓZ MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a 0,5 %-nál magasabb laktóztartalmú takarmányok laktózszintjének meghatározását.

2.   Vizsgálati alapelv

A cukrokat vízben oldjuk. Az oldatot Saccharomyces cerevisiae élesztővel erjesztjük, amely a laktózt érintetlenül hagyja. Derítés és szűrés után a szűrlet laktóztartalmát Luff–Schoorl-módszerrel határozzuk meg.

3.   Reagensek

Óvatosan kevergetve öntsük a citromsavoldatot (3.4.2.) a nátrium-karbonát-oldatba (3.4.3.). Adjuk hozzá a réz-szulfát-oldatot (3.4.1.), és töltsük fel egy 1 l-re vízzel. Hagyjuk másnapig ülepedni, majd szűrjük. Ellenőrizzük az így kapott reagens koncentrációját (0,05 mól/liter Cu; 1 mól/liter Na2CO3). Az oldat pH-értékének körülbelül 9,4 -nek kell lenni.

4.   Eszközök

38–40 oC-ra beállított, hőfokszabályzóval ellátott vízfürdő.

5.   A vizsgálat módja

Mérjünk ki a mintából 1 g-ot mg-os pontossággal, és ezt a részmintát helyezzük egy 100 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá 25–30 ml vizet. Helyezzük a lombikot harminc percre forrásban lévő vízfürdőbe, majd hűtsük le kb. 35 oC-ra. Adjunk hozzá 5 ml élesztő-szuszpenziót (3.1.), és homogenizáljuk. Hagyjuk a lombikot két órán keresztül, 38–40 oC-on állni a vízfürdőben. Hűtsük le kb. 20 oC-ra.

Adjunk hozzá 2,5 ml Carrez I. oldatot (3.2.), és kevergessük harminc másodpercig, majd adjunk hozzá 2,5 ml Carrez II. oldatot (3.3.), és újra kevergessük harminc másodpercig. Töltsük fel vízzel 100 ml-re, keverjük össze, és szűrjük. Pipetta segítségével vegyünk fel a szűrletből egy részt, amely nem haladja meg a 25 ml-t, és amely lehetőleg 40–80 mg laktózt tartalmaz, és helyezzük át egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba. Amennyiben szükséges, töltsük fel 25 ml-re vízzel.

Végezzünk vakpróbát ugyanilyen módon 5 ml élesztő oldattal (3.1.). A laktóztartalmat a Luff–Schoorl-módszer szerint, a következőképpen határozzuk meg: adjunk az oldathoz pontosan 25 ml Luff–Schoorl-reagenst (3.4.) és kétszemcsényi habkövet (3.5.). Közepes méretű, szabad lángon történő melegítés közben kézzel kevergessük, és kb. két perc alatt forraljuk fel a folyadékot. Az Erlenmeyer-lombikot azonnal helyezzük egy 6 cm átmérőjű lyukkal ellátott azbesztes dróthálóra, amely alatt előzőleg lángot gyújtunk. A lángot úgy kell szabályoznunk, hogy az Erlenmeyer-lombiknak csak az alját melegítse. Illesszünk egy visszafolyós hűtőt az Erlenmeyer-lombikhoz. Forraljuk pontosan tíz percig. Hűtsük le azonnal hideg vízben, és kb. öt perc elteltével a következők szerint titráljuk:

Adjunk hozzá 10 ml kálium-jodid-oldatot (3.6.), és rögtön utána (a bőséges habképződés veszélye miatt óvatosan) adjunk hozzá 25 ml kénsavat (3.7.). Titráljuk nátrium-tioszulfát-oldattal (3.8.) amíg fakósárga színt nem kapunk, adjuk hozzá a keményítő-indikátort (3.9.), és fejezzük be a titrálást.

Forralás nélkül, 10 ml kálium-jodid-oldat (3.6.) és 25 ml kénsav (3.7.) hozzáadása után végezzük el ugyanezt a titrálást egy pontosan kimért, 25 ml Luff–Schoorl-reagenst (3.4.) és 25 ml vizet tartalmazó keveréken.

6.   Az eredmények kiszámítása

A csatolt táblázat segítségével határozzuk meg a laktóz mennyiségét mg-ban, amely a két titrálás eredménye közti különbségnek felel meg, 0,1 mól/liter koncentrációjú nátrium-tioszulfát ml-ében kifejezve.

A dehidratált laktózra vonatkozó eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

7.   Észrevételek

A 40 %-nál több erjeszthető cukrot tartalmazó termékek esetében 5 ml-nél nagyobb mennyiségű élesztő-szuszpenziót (3.1.) használjunk.

L.   A KEMÉNYÍTŐ MEGHATÁROZÁSA

POLARIMETRIÁS MÓDSZER

1.   Cél és alkalmazási terület

E módszer lehetővé teszi a keményítő és a nagy molekulasúlyú keményítő-bomlástermékek takarmányokban jelen lévő szintjének meghatározását a feltüntetett energiaérték (a VII. melléklet rendelkezései) és a 96/25/EK tanácsi irányelv ( 10 ) betartásának ellenőrzése céljából.

2.   Vizsgálati alapelv

A módszer két meghatározásból áll. Az első meghatározás során a mintát híg sósavval kezeljük. Tisztítás és szűrés után az oldat optikai forgatóképességét polarimetriával mérjük.

A második meghatározás során a mintát 40 %-os etanollal extraháljuk. A szűrlet sósavval való savanyítása, tisztítása és szűrése után az optikai forgatóképességet ugyanúgy mérjük, mint az első meghatározás esetében.

A minta keményítőtartalmát úgy kapjuk meg, hogy a két mért érték különbségét megszorozzuk egy ismert együtthatóval.

3.   Reagensek

A koncentrációt 0,1 mól/liter koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldattal végzett titrálással kell ellenőrizni, 94 %-os (v/v) etanolban oldott 0,1 % (w/v) metilvörös jelenlétében. 10 ml semlegesítéséhez 30,94 ml 0,1 mól/liter koncentrációjú NaOH szükséges.

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A minta előkészítése

Őröljük a mintát olyan finomságúra, hogy az teljes egészében átjusson egy 0,5 mm szemméretű, kerek szemű szitán.

5.2.   A teljes optikai forgatóképesség (P vagy S) meghatározása (lásd az Észrevételek 7.1. pontját)

Mérjünk ki a megőrölt mintából mg pontossággal 2,5 g-ot, és helyezzük azt egy 100 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá 25 ml sósavat (3.2.), rázzuk össze a vizsgálati minta egyenletes eloszlásának biztosítása céljából, és adjunk hozzá további 25 ml sósavat (3.2.). Merítsük a lombikot forrásban levő vízfürdőbe, az első három percben erőteljesen és folyamatosan rázogassuk a csomóképződés megakadályozása céljából. A vízfürdőben elegendő víznek kell lennie ahhoz, hogy a fürdő a lombik behelyezésekor forrásponton maradjon. A lombikot rázogatás közben nem szabad kivenni a vízfürdőből. Pontosan 15 perc elteltével vegyük ki a lombikot a vízfürdőből, adjunk hozzá 30 ml hideg vizet, és azonnal hűtsük le 20o-ra.

Adjunk hozzá 5 ml-t a Carrez I. oldatból (3.3.), és rázogassuk kb. harminc másodpercen át. Ezt követően adjunk hozzá 5 ml-t a Carrez II. oldatból (3.4.), és ismét rázzuk kb. harminc másodpercen át. Töltsük fel vízzel térfogatra, keverjük össze és szűrjük meg. Ha a szűrlet nem teljesen tiszta (ami ritkán fordul elő), nagyobb mennyiségű (pl. 10 ml) Carrez I. és II. oldat hozzáadásával ismételjük meg a meghatározást.

Egy 200 mm-es csőben a polariméterrel vagy a szachariméterrel mérjük meg az oldat optikai forgatóképességét.

5.3.   A 40 %-os etanolban oldható anyagok optikai forgatóképességének (P′ vagy S′) meghatározása

Mérjünk ki a mintából mg pontossággal 5 g-ot, helyezzük egy 100 ml-es mérőlombikba, és adjunk hozzá mintegy 80 ml etanolt (3.5.) (lásd az Észrevételek 7.2. pontját). Hagyjuk a lombikot állni szobahőmérsékleten 1 órán át; ezalatt hatszor erőteljesen rázzuk össze, hogy a vizsgálati minta alaposan összekeveredjen az etanollal. Töltsük fel térfogatra etanollal (3.5.), keverjük össze és szűrjük meg.

A szűrletből pipettázzunk 50 ml-t (= 2,5 g minta) egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba, adjunk hozzá 2,1 ml sósavat (3.1.), és erősen rázzuk össze. Csatlakoztassunk visszafolyós hűtőt az Erlenmeyer-lombikhoz, és merítsük az utóbbit forrásban levő vízfürdőbe. Pontosan 15 perc elteltével vegyük ki az Erlenmeyer-lombikot a vízfürdőből, öntsük át annak tartalmát egy 100 ml-es mérőlombikba, öblítsük kis mennyiségű hideg vízzel, majd hűtsük le 20 oC-ra.

Derítsük Carrez I. oldattal (3.3.) és Carrez II. oldattal (3.4.), vízzel töltsük fel térfogatra, keverjük össze, szűrjük át, majd mérjük meg az optikai forgatóképességét az 5.2. pont második és harmadik bekezdésében ismertetett módon.

6.   Az eredmények kiszámítása

A keményítőtartalmat ( %) a következőképpen számítjuk ki:

6.1.   Mérés polariméterrel

6.2.   Mérés szachariméterrel

6.3.   Ismételhetőség

Az ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége 40 %-nál alacsonyabb keményítőtartalom esetén, abszolút értékben nem lehet több mint 0,4 , 40 %-os vagy annál nagyobb keményítőtartalom esetén pedig nem haladhatja meg az 1 %-os relatív értéket.

7.   Észrevételek

M.   NYERSHAMU MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

A módszer lehetővé teszi a takarmányok nyershamutartalmának meghatározását.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát 550 oC-on hamvasztjuk; a maradékanyagot megmérjük.

3.   Reagensek

20 %-os (w/v) ammónium-nitrát-oldat.

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

Mérjünk ki a mintából 5 g-ot mg-os pontossággal (2,5 g-ot a duzzadóképes anyagból származó termékek esetében), és helyezzük egy hamvasztótégelybe, amelyet előzetesen 550 oC-ra hevítettük, majd lehűtöttük és táráztunk. Helyezzük a tégelyt a főzőlapra, és fokozatosan addig hevítsük, amíg az anyag el nem szenesedik. Hamvasszuk az 5.1. vagy az 5.2. pont szerint.

6.   Az eredmények kiszámítása

A maradék tömegét a táratömeg kivonásával számoljuk ki.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

7.   Észrevételek

N.   SÓSAVBAN OLDHATATLAN HAMU MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

A módszer lehetővé teszi a takarmányokban lévő sósavban oldhatatlan ásványi anyagok szintjének meghatározását. A minta jellegétől függően két módszer alkalmazható.

2.   Vizsgálati alapelv

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A. módszer

Hamvasszuk a mintát a nyershamu meghatározásánál ismertetett módszer szerint. Annak az analízisnek a során kapott hamut is használhatjuk.

75 ml sósav (3.1.) felhasználásával helyezzük a hamut egy 250–400 ml-es főzőpohárba. Lassan forraljuk, és tartsuk forrásban óvatosan tizenöt percig. Szűrjük át a meleg oldatot egy hamumentes szűrőpapíron, és mossuk a maradékot meleg vízzel mindaddig, amíg a savreakció már nem észlelhető. Szárítsuk ki a maradékot tartalmazó szűrőt, és hamvasszuk egy tárázott tégelyben legalább 550 oC és legfeljebb 700 oC hőmérsékleten. Hűtsük le egy szárítóban, és mérjük meg.

5.2.   B. módszer

Mérjünk le a mintából 5 g-ot mg-nyi pontossággal, és helyezzük egy 250–400 ml-es főzőpohárba. Adjunk hozzá egymást követően 25 ml vizet és 25 ml sósavat (3.1.), keverjük össze, és várjunk a pezsgés elállásáig. Adjunk hozzá még 50 ml sósavat (3.1.). Várjunk az esetleges gázkibocsátás megszűnéséig, majd helyezzük a főzőpoharat forró vízfürdőbe, és tartsuk ott harminc percig vagy szükség esetén tovább, az esetlegesen jelen lévő összes keményítő teljes hidrolízise érdekében. Még meleg állapotban szűrjük át egy hamumentes szűrőn, és mossuk a szűrőt 50 ml meleg vízben (lásd: 7. Észrevételek). Helyezzük a maradékanyagot tartalmazó szűrőt hamvasztótégelybe, szárítsuk ki, és hamvasszuk legalább 550 oC és legfeljebb 700 oC hőmérsékleten. 75 ml sósav (3.1.) felhasználásával helyezzük a hamut egy 250–400 ml-es főzőpohárba; kövessük az 5.1. pont második albekezdésében leírtakat.

6.   Az eredmények kiszámítása

A maradék tömegét a táratömeg kivonásával számoljuk ki. Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

7.   Észrevételek

Ha a szűrés problémásnak bizonyul, kezdjük újra az analízist úgy, hogy az 50 ml sósavat (3.1.) 50 ml 20 %-os triklór-ecetsavval (3.2.) helyettesítjük, és a szűrőt 1 %-os meleg triklór-ecetsavban oldatban (3.3.) mossuk.

O.   KARBONÁTOK MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a karbonátok hagyományosan kalcium-karbonátban kifejezett mennyiségének meghatározását a legtöbb takarmányban.

Bizonyos esetekben (például a vas-karbonát esetében) speciális módszert kell alkalmazni.

2.   Vizsgálati alapelv

A karbonátokat sósavban bontjuk szét; a kibocsátott szén-dioxidot egy kalibrált csőben gyűjtjük össze, és térfogatát ismert mennyiségű kalcium-karbonát által azonos körülmények között kibocsátott mennyiséggel hasonlítjuk össze.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

Scheibler–Dietrich-készülék (lásd az ábrát) vagy annak megfelelő készülék.

5.   A vizsgálat módja

A minta karbonáttartalmától függően mérjünk ki egy részmintát az alábbiak szerint:

Helyezzük a részmintát a készülék speciális lombikjába (4), amelyet 10 ml sósavat (3.1.) tartalmazó, törhetetlen anyagból készült, kisméretű csővel szereltek fel, és kapcsoljuk a lombikot a készülékhez. Fordítsuk el a háromfázisú csapot (5), hogy a cső (1) a külső résszel kapcsolódjon. A színezett kénsavval (3.3.) töltött és a kalibrált csőhöz (1) kapcsolt mozgatható cső (2) segítségével igazítsuk a folyadék szintjét a nulla jelhez. Az (1) és a (3) cső összekapcsolásához fordítsuk el a csapot (5), és ellenőrizzük, hogy a szint nullán áll-e.

A lombik (4) megdöntésével folyassunk lassan sósavat (3.1.) a részmintára. A (2) cső leengedésével egyenlítsük ki a nyomást. Rázzuk a (4) lombikot egészen addig, amíg a szén-dioxid-kibocsátás teljesen meg nem szűnik.

Az (1) és a (2) csőben lévő folyadék egyenlő szintre igazításával állítsuk vissza a nyomást. Néhány perc múlva, amikor a gáz mennyisége állandósul, olvassuk le az eredményt.

Végezzünk ellenőrző vizsgálatot ugyanilyen körülmények között 0,5 g kalcium-karbonáton (3.2.).

6.   Az eredmények kiszámítása

A kalcium-karbonátként kifejezett karbonáttartalmát az alábbi képlet segítségével számítjuk ki:

ahol:

7.   Észrevételek

P.   AZ ÖSSZES FOSZFOR MEGHATÁROZÁSA

FOTOMETRIÁS ELJÁRÁSSAL

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok összes foszfortartalmának meghatározását. Különösen alkalmas az alacsony foszfortartalmú termékek elemzésére. Bizonyos esetekben (foszforban gazdag termékeknél) gravimetriás módszert használhatunk.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát száraz égetéssel (szerves takarmányok esetén) vagy savas feltárással (ásványi vegyületek és folyékony takarmányok esetén) mineralizáljuk, és savas oldatba helyezzük. Az oldatot molibdén-vanadát reagenssel kezeljük. Az így keletkező sárga oldat optikai sűrűségét 430 nm-nél mérjük egy spektrofotométeren.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   Oldatkészítés

A minta jellege szerint készítsünk oldatot az 5.1.1. vagy az 5.1.2. pontban leírtak szerint.

5.1.1.    Általános módszer

Mérjünk le kb. 1 g-ot vagy valamivel többet a mintából, 1 mg pontossággal. Tegyük a vizsgálati mintát egy Kjeldahl-lombikba és adjunk hozzá 20 ml kénsavat (3.5.), rázzuk össze, hogy az anyag teljesen telítődjön a savval és ne tapadjon semmi a lombik oldalára, hevítsük és tartsuk forrásponton 10 percen át. Hagyjuk kissé lehűlni, adjunk hozzá 2 ml salétromsavat (3.4.), lassan hevítsük, majd hagyjuk újra kissé lehűlni, ezt követően adjunk hozzá kevés salétromsavat (3.4.), és forraljuk fel újra. Addig ismételjük ezt a műveletet, amíg színtelen oldatot nem kapunk. Hagyjuk hűlni, adjunk hozzá egy kevés vizet, majd dekantáljuk a folyadékot egy 500 ml-es mérőlombikba, és öblítsük ki a Kjeldahl-lombikot forró vízzel. Hagyjuk hűlni, töltsük fel vízzel térfogatra, homogenizáljuk, és szűrjük.

5.1.2.    Szerves anyagokat tartalmazó, kalcium- és magnézium-dihidrogén-foszfátoktól mentes minták

Mérjünk kb. 2,5 g-ot a mintából 1 mg pontossággal egy hamvasztótégelybe. Keverjük össze a vizsgálati mintát 1 g kalcium-karbonáttal (3.1.), amíg teljesen egyneművé nem válik. Hamvasszuk a kemencében 550 oC-on, amíg fehér vagy szürke hamut nem kapunk (egy kis szénmaradvány nem számít). Tegyük a hamut egy 250 ml-es főzőpohárba. Adjunk hozzá 20 ml vizet és sósavat (3.2.), amíg a pezsgés meg nem szűnik. Adjunk hozzá még 10 ml sósavat (3.2.). Tegyük a főzőpoharat homokfürdőbe és hagyjuk teljesen elpárologni, hogy a kvarc szárazzá és oldhatatlanná váljon. Oldjuk fel a maradékot 10 ml salétromsavban (3.3.), és forraljuk a homokfürdőben vagy főzőlapon 5 percen át anélkül, hogy teljesen beszárítanánk. Dekantáljuk a folyadékot egy 500 ml-es mérőlombikba, majd öblítsük ki a főzőpoharat néhányszor forró vízzel. Hagyjuk hűlni, töltsük fel vízzel térfogatra, homogenizáljuk, és szűrjük.

5.2.   Elszíneződés kialakulása és az optikai sűrűség mérése

Hígítsuk az 5.1.1. vagy az 5.1.2. pont szerint nyert szűrlet aliquot részét úgy, hogy 40 μg/ml-nél nem nagyobb foszforkoncentrációt kapjunk. Tegyünk 10 ml-t ebből az oldatból kémcsőbe (4.6.), és adjunk hozzá 10 ml molibdén-vanadát reagenst (3.6.). Homogenizáljuk és hagyjuk állni legalább 10 percen át 20 oC-on. Mérjük meg az optikai sűrűséget 430 nm-nél spektrofotométeren egy olyan oldattal szemben, amelyet úgy nyertünk, hogy 10 ml molibdén-vanadát reagenst (3.6.) adtunk 10 ml vízhez.

5.3.   Kalibrációs görbe

A standardoldatból (3.7.) készítsünk egyenként 5, 10, 20, 30 és 40 μg/ml foszfort tartalmazó oldatokat. Vegyünk 10 ml-t ezekből az oldatokból, és adjunk hozzá mindegyikhez 10 ml molibdén-vanadát reagenst (3.6.). Homogenizáljuk és hagyjuk állni legalább 10 percen át 20 oC-on. Mérjük meg az optikai sűrűséget az 5.2. pontban leírt módon. Szerkesszük meg a kalibrációs görbét úgy, hogy az optikai sűrűséget a megfelelő foszformennyiség függvényében ábrázoljuk. A 0 és 40 μg/ml közötti koncentrációk esetében a görbe lineáris lesz.

6.   Az eredmények kiszámítása

A vizsgálati minta foszfortartalmát a kalibrációs görbe segítségével határozzuk meg.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg:

Q.   KLORIDOKBÓL SZÁRMAZÓ KLÓR MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a vízben oldható kloridokban található, hagyományosan nátrium-kloridban kifejezett klór mennyiségének meghatározását. A módszer minden takarmány esetében alkalmazható.

2.   Vizsgálati alapelv

A kloridokat vízben oldjuk. Ha a termék szerves anyagot tartalmaz, tisztítjuk. Az oldatot salétromsavval enyhén savasítjuk, és a kloridokat ezüst-klorid formájában csapjuk ki ezüst-nitrát-oldat felhasználásával. Az ezüst-nitrát felesleget ammónium-tiocianát oldattal, a Volhard-módszer szerint titráljuk.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

Billenődobos keverőgép: kb. 35–40 fordulatszám/perc teljesítménnyel.

5.   A vizsgálat módja

5.1.   Oldatkészítés

A minta jellegétől függően készítsünk oldatot az 5.1.1., az 5.1.2. vagy az 5.1.3. pontban foglaltak szerint.

Ezzel egy időben végezzünk vakpróbát az analizálandó minta kihagyásával.

5.1.1.    Szerves anyagtól mentes minták

Mg-os pontossággal mérjünk le a mintából legfeljebb 10 g-ot, amely legfeljebb 3 g klórt tartalmaz kloridok formájában. 400 ml vízzel helyezzük egy 500 ml-es mérőlombikba kb. 20 oC-on. Keverjük harminc percig a keverőgépen, töltsük fel térfogatra, homogenizáljuk, és szűrjük.

5.1.2.    Szerves anyagot tartalmazó minták, az 5.1.3. pontban felsorolt termékek kivételével

Mérjünk le a mintából 5 g-ot mg-os pontossággal, és 1 g aktív szénnel együtt helyezzük egy 500 ml-es mérőhengerbe. Adjunk hozzá 400 ml, körülbelül 20 oC-os vizet és 5 ml Carrez I. oldatot (3.7.), keverjük 30 másodpercig, majd adjunk hozzá 5 ml Carrez II. oldatot (3.8.). Keverjük harminc percig a keverőgépen, töltsük fel térfogatra, homogenizáljuk, és szűrjük.

5.1.3.    Főzött takarmányok, lenpogácsák és lenliszt, lenlisztben gazdag termékek, valamint más, nyákban és kolloid anyagokban (például dextrinált keményítőben) gazdag termékek

Készítsük el az oldatot az 5.1.2. pontban foglaltak szerint, de ne szűrjük. Dekantáljuk (ha szükséges, centrifugáljuk), vegyünk el 100 ml-t a felülúszó folyadékból, és öntsük át egy 200 ml-es mérőlombikba. Keverjük össze acetonnal (3.6.), és töltsük fel térfogatra ezzel az oldószerrel, homogenizáljuk, és szűrjük.

5.2.   Titrálás

Pipettázzunk egy Erlenmeyer-lombikba 25–100 ml-t (a feltételezett klórtartalom szerint) a szűrletből, amelyet az 5.1.1., az 5.1.2. vagy az 5.1.3. pontban foglaltak szerint nyertünk. Az aliquot rész nem tartalmazhat 150 mg-nál több klórt (Cl). Szükség szerint hígítsuk vízzel, legalább 50 ml-ig, adjunk hozzá 5 ml salétromsavat (3.4.), 20 ml telített ammónium-vasszulfát-oldatot (3.3.) és két csepp ammónium-tiocianát-oldatot (3.1.) egy nulla jelig töltött büretta segítségével. Büretta segítségével helyezzük át az ezüst-nitrát oldatot (3.2.) úgy, hogy 5 ml-nyi többletet kapjunk. Adjunk hozzá 5 ml dietilétert (3.5.), és rázzuk fel erősen, a csapadék koagulálásáig. Titráljuk az ezüst-nitrát többletet az ammónium-tiocianát oldattal (3.1.), amíg egy percen át tartó vörösesbarna színárnyalatot nem kapunk.

6.   Az eredmények kiszámítása

A nátriumklorid százalékában kifejezett klór mennyiségét (X) a következő képlet segítségével számíthatjuk ki:

ahol:

Ha a vakpróba azt jelzi, hogy 0,1 mól/liter koncentrációjú ezüst-nitrát oldat került felhasználásra, vonjuk ki ezt az értéket a (V1 – V2) mennyiségből.

7.   Észrevételek

IV. MELLÉKLET

ANALITIKAI MÓDSZEREK A TAKARMÁNYOKBAN LÉVŐ ENGEDÉLYEZETT ADALÉKANYAGOK SZINTJÉNEK ELLENŐRZÉSÉRE

A.   AZ A-VITAMIN MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok és előkeverékek A-vitamin- (retinol-) tartalmának meghatározását. Az A-vitamin magában foglalja az ezzel a módszerrel meghatározásra kerülő all-transz-retinyl alkoholt és annak cisz-izomerjeit. Az A-vitamin-tartalmat nemzetközi egység (NE)/kg-ban fejezzük ki. Egy NE 0,300 μg all-transz-A-vitamin-alkohol, 0,344 μg all-transz-A-vitamin-acetát vagy 0,550 μg all-transz-A-vitamin-palmitát aktivitásának felel meg.

A meghatározási határ 2 000 NE A-vitamin/kg.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát etanolos kálium-hidroxid oldattal hidrolizáljuk, és az A-vitamint petroléterrel extraháljuk. Az oldószert bepárlással eltávolítjuk, a maradékot metanolban oldjuk, és – szükség esetén – a kívánt koncentrációra hígítjuk. Az A-vitamin-tartalmat fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadék-kromatográfiával (RP-HPLC) határozzuk meg, UV- vagy fluoreszcens detektor alkalmazásával. A kromatográfiás paramétereket úgy válasszuk meg, hogy az all-transz-A-vitamin-alkohol és annak cisz-izomerjei ne váljanak szét.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A minta előkészítése

Ügyelve a hőképződés elkerülésére, őröljük a mintát annyira, hogy az átjusson egy 1 mm-es szemnagyságú szitán. Az őrlést közvetlenül a súlymérés és a szappanosítás előtt kell végezni, különben A-vitamin-veszteség léphet fel.

5.2.   Szappanosítás

Az A-vitamin-tartalomtól függően mérjünk be 1 mg pontossággal 2–25 g mintát egy 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikba (4.2.1.). Keverés közben adjunk hozzá egymást követően 130 ml etanolt (3.1.), körülbelül 100 mg BHT-t (3.13.), 2 ml nátrium-aszkorbát-oldatot (3.5.) és 2 ml nátrium-szulfid-oldatot (3.6.). Illesszünk a lombikhoz hűtőt (4.3.), és merítsük mágneses keverővel felszerelt vízfürdőbe (4.7.). Hevítsük forrásig a lombik tartalmát, majd hagyjuk visszacsepegni öt percig. Ezután a hűtőn (4.3.) át adjunk hozzá 25 ml kálium-hidroxid-oldatot (3.4.), és hagyjuk visszacsepegni újabb 25 percig, lassú nitrogénáramban történő keverés közben. Ezt követően kb. 20 ml vízzel öblítsük a hűtőt, és hűtsük le a lombik tartalmát szobahőmérsékletűre.

5.3.   Extrahálás

250 ml vízzel történő átöblítéssel dekantáljuk a szappanosítási oldatot teljes mennyiségében egy 1 000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.) vagy az extrahálókészülékbe (4.8.). Öblítsük a szappanosításhoz használt lombikot egymást követően 25 ml etanollal (3.1.) és 100 ml petroléterrel (3.2.), majd az öblítő oldószereket töltsük a választótölcsérbe vagy az extrahálókészülékbe. Az egyesített oldatokban a víz és az etanol aránya körülbelül 2:1 legyen. Rázassuk erőteljesen két percig, majd két percen át hagyjuk ülepedni.

5.3.1.    Extrahálás választótölcsérrel (4.2.3.)

Amikor a rétegek már elkülönültek (lásd az Észrevételek 7.3. pontját), vigyük át a petroléterréteget egy másik választótölcsérbe (4.2.3.). Az extrahálást ismételjük meg kétszer 100 ml petroléterrel (3.2.), kétszer pedig 50 ml petroléterrel (3.2.).

Az egyesített kivonatokat a választótölcsérben mossuk kétszer 100-100 ml vízadaggal, lassú keverés közben (az emulzióképződés megakadályozása céljából), majd többszöri rázatás közben további 100 ml-es vízadagokkal egészen addig, amíg a víz, fenolftaleinoldat (3.7.) hozzáadását követően színtelen nem marad (négyszeri mosás rendszerint elegendő). A szuszpendált víz eltávolítása céljából, a mosott kivonatot szűrjük át a fázisok elkülönítésére szolgáló száraz, redős szűrőpapíron (4.4.) egy 500 ml-es mérőlombikba (4.2.2.). A választótölcsért és a szűrőt öblítsük 50 ml petroléterrel (3.2.), töltsük fel jelig petroléterrel (3.2.), és a tartalmát alaposan keverjük össze.

5.3.2.    Extrahálás extrahálókészülékkel (4.8.)

Amikor a rétegek szétváltak (lásd az Észrevételek 7.3. pontját), helyezzük az üveghenger (4.8.1.) dugója helyére a csiszolt üvegfeltétet (4.8.2.), és helyezzük az állítható cső U alakú, alsó végét úgy, hogy az éppen a rétegek találkozási felülete felett legyen. Egy nitrogénvezetékből nyomást gyakorolva az oldalcsőre, vigyük át a felső petroléterréteget egy 1 000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.). Mérjünk 100 ml petrolétert (3.2.) az üveghengerbe, helyezzük vissza a dugót, és alaposan rázzuk össze. Hagyjuk szétválni a rétegeket, majd a felső réteget vigyük át a választótölcsérbe az előbbiekben ismertetett módon. Ismételjük meg az extrahálási műveletet további 100 ml petroléterrel (3.2.), majd kétszer 50 ml petroléterrel (3.2.), és vigyük át a petroléterrétegeket a választótölcsérbe.

Mossuk az egyesített petroléterkivonatokat az 5.3.1. pontban leírt módon, majd folytassuk a műveletet az ott leírtak szerint

5.4.   A mintaoldat elkészítése a HPLC-hez

Pipettázzuk a petroléteroldat aliquot részét (5.3.1. vagy 5.3.2.) egy 250 ml-es, körte alakú lombikba (4.2.4.). Az oldószert pároljuk még éppen nedves állapotúra a rotációs bepárlókészüléken (4.1.), csökkentett nyomáson legfeljebb 40 oC-os vízfürdőben. Nitrogén (3.10.) bejuttatásával állítsuk vissza az atmoszferikus nyomást, és vegyük le a lombikot a rotációs bepárlókészülékről. Nitrogén beáramoltatásával (3.10.) távolítsuk el a maradék oldószert, és a maradékot azonnal oldjuk fel ismert térfogatú (10–100 ml) metil-alkoholban (3.3.) (az A-vitamin koncentrációjának 5 NE/ml és 30 NE/ml között kell lennie).

5.5.   Meghatározás HPLC-vel

Az A-vitamin elválasztása fordított fázisú C18 oszlopon (4.5.1.) történik, koncentrációját pedig UV-detektor (325 nm) vagy fluoreszcens detektor (gerjesztés: 325 nm, emisszió: 475 nm) (4.5.2.) segítségével mérjük.

Fecskendezzünk be az 5.4. lépés szerint nyert metil-alkoholos oldatból egy aliquot részt (pl. 20 μl), és eluáljuk a mozgófázissal (3.9.). Ugyanabból a mintaoldatból többszöri befecskendezés után számítsuk ki a mintaoldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságot (területet), valamint a kalibrálóoldatból (5.6.2.) többszöri befecskendezés után számítsuk ki a kalibrálóoldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságokat (területeket).

HPLC paraméterek

A következő paraméterek útmutatásul szolgálnak; ettől eltérő paraméterek is alkalmazhatók, feltéve, hogy ezzel egyenértékű eredményeket adnak.

5.6.   Kalibrálás

5.6.1.    A standard munkaoldatok elkészítése

Pipettázzunk az A-vitamin-acetát törzsoldatból (3.11.1.) 20 ml-t vagy az A-vitamin-palmitát törzsoldatból (3.12.1.) 20 ml-t egy 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikba (4.2.1.), és hidrolizáljuk az 5.2. pontban leírt módon, de BHT hozzáadása nélkül. Ezt követően extraháljuk petroléterrel (3.2.) az 5.3. pont szerint, és töltsük fel 500 ml-re petroléterrel (3.2.). Ebből a kivonatból 100 ml-t pároljunk még éppen nedves állapotig a rotációs bepárlókészüléken (lásd 5.4.), nitrogénáramoltatással távolítsuk el a maradék oldószert (3.10.), majd oldjuk a maradékot 10,0 ml metil-alkoholban (3.3.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 560 NE A-vitamin/ml. A pontos A-vitamin-tartalmat az 5.6.3.3. pont szerint kell meghatározni. A standard munkaoldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.

Ebből a standard munkaoldatból 2,0 ml-t pipettázzunk egy 20 ml-es mérőlombikba, majd töltsük azt fel jelig metil-alkohollal (3.3.), és keverjük össze. E hígított standard munkaoldat névleges koncentrációja 56 NE A-vitamin/ml.

5.6.2.    A kalibrálóoldatok és a kalibrációs görbe elkészítése

A hígított standard munkaoldatból vigyünk át 1,0 , 2,0 , 5,0 és 10,0 ml-t 20 ml-es mérőlombikokba, töltsük fel a lombikokat jelig metil-alkohollal (3.3.), és keverjük össze a tartalmukat. Ezeknek az oldatoknak a névleges koncentrációja 2,8 , 5,6 , 14,0 és 28,0 NE A-vitamin/ml.

Minden kalibrálóoldatból fecskendezzünk be 20 μl-t több alkalommal, és határozzuk meg az átlagos csúcsmagasságokat (területeket). Figyelembe véve az UV-ellenőrzés (5.6.3.3.) eredményeit, az átlagos csúcsmagasságok (területek) alapján szerkesszük meg a kalibrációs görbét.

5.6.3.    A standardoldatok UV hitelesítése

5.6.3.1.    A-vitamin-acetát törzsoldat

Pipettázzunk az A-vitamin-acetát törzsoldatból (3.11.1.) 2,0 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba (4.2.2.), és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 56 NE A-vitamin/ml. Ebből a hígított A-vitamin-acetát oldatból pipettázzunk 3,0 ml-t egy 25 ml-es mérőlombikba, és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 6,72 NE A-vitamin/ml. Mérjük meg ennek az oldatnak az UV-spektrumát spektrofotométeren (4.6.) 2-propanollal (3.8.) szemben, 300 nm és 400 nm között. Az extinkció maximális értékének 325 nm és 327 nm között kell lennie.

Az A-vitamin-tartalom kiszámítása:

A-vitamin NE/ml = E326 × 19,0

(

az A-vitamin-acetát esetében = 1 530 , 326 nm-nél 2- propanolban)

5.6.3.2.    A-vitamin-palmitát törzsoldat

Pipettázzunk az A-vitamin-palmitát törzsoldatból (3.12.1.) 2,0 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba (4.2.2.), és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 56 NE A-vitamin/ml. Ebből a hígított A-vitamin-palmitát oldatból pipettázzunk 3,0 ml-t egy 25 ml-es mérőlombikba, és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 6,72 NE A-vitamin/ml. Mérjük meg ennek az oldatnak az UV-spektrumát spektrofotométeren (4.6.) 2-propanollal (3.8.) szemben, 300 nm és 400 nm között. Az extinkció maximális értékének 325 nm és 327 nm között kell lennie.

Az A-vitamin-tartalom kiszámítása:

A-vitamin NE/ml = E326 × 19,0

(

az A-vitamin-palmitát esetében = 957, 326 nm-nél 2- propanolban)

5.6.3.3.    A-vitamin standard munkaoldat

Pipettázzunk az 5.6.1. pont szerint elkészített, hígítatlan A-vitamin standard munkaoldatból 3,0 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba (4.2.2.), és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ebből az oldatból pipettázzunk 5,0 ml-t egy 25 ml-es mérőlombikba, és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 6,72 NE A-vitamin/ml. Mérjük meg ennek az oldatnak az UV-spektrumát spektrofotométeren (4.6.) 2-propanollal (3.8.) szemben, 300 nm és 400 nm között. Az extinkció maximális értékének 325 nm és 327 nm között kell lennie.

Az A-vitamin-tartalom kiszámítása:

A-vitamin NE/ml = E325 × 18,3

(

az A-vitamin-alkohol esetében = 1 821 , 325 nm-nél 2- propanolban)

6.   Az eredmények kiszámítása

A mintaoldat A-vitamin csúcsainak átlagos magasságából (területéből) határozzuk meg a mintaoldat koncentrációját NE/ml-ben, a kalibrációs görbét (5.6.2.) használva.

Az A-vitamin-tartalmat (w) NE/kg mintában a következő képlet adja:

[NE/kg]

ahol:

7.   Észrevételek

Annak ellenőrzése érdekében, hogy a használt analitikai módszer megbízható eredményt ad-e az adott mátrixon (tejpótló), visszanyerési próbát kell végezni egy további vizsgálati adagon. Ha a visszanyerés 80 % alatti, az analízis eredményét korrigálni kell a visszanyeréssel.

8.   Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a magasabb érték 15 %-át.

9.   A körvizsgálat eredményei ( 11 )

B.   AZ E-VITAMIN MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer a takarmányokban és az előkeverékekben lévő E-vitamin meghatározására szolgál. Az E-vitamin-tartalmat mg DL-α-tokoferol-acetát/kg-ban fejezzük ki. Egy mg DL-α-tokoferol-acetát 0,91 mg DL-α-tokoferolnak (E-vitaminnak) felel meg.

A meghatározási határ 2 mg E-vitamin/kg. Ez a meghatározási határ csak fluoreszcens detektorral érhető el. UV-detektorral a meghatározási határ 10 mg/kg.

2.   Vizsgálati alapelv

A mintát etanolos kálium-hidroxid oldattal hidrolizáljuk, és az E-vitamint petroléterrel extraháljuk. Az oldószert bepárlással eltávolítjuk, a maradékot metanolban oldjuk, és – szükség esetén – a kívánt koncentrációra hígítjuk. Az E-vitamin-tartalmat fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadék-kromatográfiával (RP-HPLC) határozzuk meg, fluoreszcens vagy UV-detektor alkalmazásával.

3.   Reagensek

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   A minta előkészítése

Ügyelve a hőképződés elkerülésére, őröljük a mintát annyira, hogy az átjusson egy 1 mm-es szemnagyságú szitán. Az őrlést közvetlenül a súlymérés és a szappanosítás előtt kell végezni, különben E-vitamin-veszteség léphet fel.

5.2.   Szappanosítás

Az E-vitamin-tartalomtól függően mérjünk be 0,01 g pontossággal 2–25 g mintát egy 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikba (4.2.1.). Keverés közben adjunk hozzá egymást követően 130 ml etanolt (3.1.), körülbelül 100 mg BHT-t (3,12 .), 2 ml nátrium-aszkorbát-oldatot (3.5.) és 2 ml nátrium-szulfid-oldatot (3.6.). Illesszük a lombikhoz a hűtőt (4.3.), és merítsük a mágneses keverővel felszerelt vízfürdőbe (4.7.). Hevítsük forrásig a lombik tartalmát, majd hagyjuk visszacsepegni öt percig. Ezután a hűtőn keresztül (4.3.) adjunk hozzá 25 ml kálium-hidroxid-oldatot (3.4.), és hagyjuk visszacsepegni újabb 25 percig, lassú nitrogénáramban történő keverés közben. Ezt követően kb. 20 ml vízzel öblítsük a hűtőt, és hűtsük le a lombik tartalmát szobahőmérsékletűre.

5.3.   Extrahálás

250 ml vízzel történő átöblítéssel dekantáljuk a szappanosítási oldatot teljes mennyiségében egy 1 000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.) vagy az extrahálókészülékbe (4.8.). Öblítsük a szappanosításhoz használt lombikot egymást követően 25 ml etanollal (3.1.) és 100 ml petroléterrel (3.2.), majd az öblítő oldószereket töltsük a választótölcsérbe vagy az extrahálókészülékbe. Az egyesített oldatokban a víz és az etanol aránya körülbelül 2:1 legyen. Rázassuk erőteljesen két percig, majd két percen át hagyjuk ülepedni.

5.3.1.    Extrahálás választótölcsérrel (4.2.3.)

Amikor a rétegek már elkülönültek (lásd az Észrevételek 7.3. pontját), vigyük át a petroléterréteget egy másik választótölcsérbe (4.2.3.). Az extrahálást ismételjük meg kétszer 100 ml petroléterrel (3.2.), kétszer pedig 50 ml petroléterrel (3.2.).

Az egyesített kivonatokat a választótölcsérben mossuk kétszer 100–100 ml vízadaggal, lassú keverés közben (az emulzióképződés megakadályozása céljából), majd többszöri rázatás közben további 100 ml-es vízadagokkal egészen addig, amíg a víz, fenolftaleinoldat (3.7.) hozzáadását követően színtelen nem marad (négyszeri mosás rendszerint elegendő). A szuszpendált víz eltávolítása céljából, a mosott kivonatot szűrjük át a fázisok elkülönítésére szolgáló száraz, redős szűrőpapíron (4.4.) egy 500 ml-es mérőlombikba (4.2.2.). A választótölcsért és a szűrőt öblítsük 50 ml petroléterrel (3.2.), töltsük fel jelig petroléterrel (3.2.), és a tartalmát alaposan keverjük össze.

5.3.2.    Extrahálás extrahálókészülékkel (4.8.)

Amikor a rétegek szétváltak (lásd az Észrevételek 7.3. pontját), helyezzük az üveghenger (4.8.1.) dugója helyére a csiszolt üvegfeltétet (4.8.2.), és helyezzük az állítható cső U alakú, alsó végét úgy, hogy az éppen a rétegek találkozási felülete felett legyen. Egy nitrogénvezetékből nyomást gyakorolva az oldalcsőre, vigyük át a felső petroléterréteget egy 1 000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.). Mérjünk 100 ml petrolétert (3.2.) az üveghengerbe, helyezzük vissza dugót, és alaposan rázzuk össze. Hagyjuk szétválni a rétegeket, majd a felső réteget vigyük át a választótölcsérbe az előbbiekben ismertetett módon. Ismételjük meg az extrahálási műveletet további 100 ml petroléterrel (3.2.), majd kétszer 50 ml petroléterrel (3.2.), és vigyük át a petroléterrétegeket a választótölcsérbe.

Mossuk az egyesített petroléterkivonatokat az 5.3.1. pontban leírt módon, majd folytassuk a műveletet az ott leírtak szerint.

5.4.   A mintaoldat elkészítése a HPLC-hez

Pipettázzuk a petroléteroldat aliquot részét (5.3.1. vagy 5.3.2.) egy 250 ml-es, körte alakú lombikba (4.2.4.). Az oldószert pároljuk még éppen nedves állapotúra a rotációs bepárlókészüléken (4.1.), csökkentett nyomáson legfeljebb 40 oC-os vízfürdőben. Nitrogén (3,9 .) bejuttatásával állítsuk vissza az atmoszferikus nyomást, és vegyük le a lombikot a rotációs bepárlókészülékről. Nitrogénáram (3.9.) segítségével távolítsuk el a maradék oldószert, és a maradékot azonnal oldjuk fel ismert térfogatú (10–100 ml) metil-alkoholban (3.3.) (a DL-α-tokoferol koncentrációjának 5 μg/ml és 30 μg/ml között kell lennie).

5.5.   Meghatározás HPLC-vel

Az E-vitamin elválasztása fordított fázisú C18 oszlopon (4.5.1.) történik, koncentrációját fluoreszcens detektor (gerjesztés: 295 nm, emisszió: 330 nm) vagy UV-detektor (292 nm) (4.5.2.) segítségével mérjük.

Fecskendezzünk be az 5.4. lépés szerint nyert metil-alkoholos oldatból egy aliquot részt (pl. 20 μl), és eluáljuk a mozgófázissal (3.8.). Ugyanabból a mintaoldatból többször befecskendezve számítsuk ki a mintaoldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságokat (területeket), valamint a kalibrálóoldatokból (5.6.2.) többször befecskendezve a kalibrálóoldatokhoz tartozó átlagos csúcsmagasságokat (területeket).

HPLC paraméterek

A következő paraméterek útmutatásul szolgálnak; ettől eltérő paraméterek is alkalmazhatók, feltéve, hogy ezzel egyenértékű eredményeket adnak.

5.6.   Kalibrálás (DL-α-tokoferol-acetát vagy DL-α-tokoferol)

5.6.1.    DL-α-tokoferol-acetát standard

5.6.1.1.    A standard munkaoldat elkészítése

Pipettázzunk a DL-α-tokoferol-acetát törzsoldatból (3.10.1.) 25 ml-t egy 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikba (4.2.1.), és hidrolizáljuk az 5.2. pontban leírt módon. Ezt követően extraháljuk petroléterrel (3.2.) az 5.3. pont szerint, és töltsük fel 500 ml-re petroléterrel. Ebből a kivonatból 25 ml-t pároljunk még éppen nedves állapotig a rotációs bepárlókészüléken (lásd 5.4.), nitrogénáramoltatással távolítsuk el a maradék oldószert (3.9.), majd oldjuk a maradékot 25,0 ml metil-alkoholban (3.3.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 45,5 μg DL-α-tokoferol/ml, ami egyenértékű 50 μg DL-α-tokoferol-acetát/ml-rel. A standard munkaoldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.

5.6.1.2.    A kalibrálóoldatok és a kalibrációs görbe elkészítése

A standard munkaoldatból vigyünk át 1,0 , 2,0 , 4,0 és 10,0 ml-t 20 ml-es mérőlombikokba, töltsük fel a lombikokat jelig metil-alkohollal (3.3.), és keverjük össze a tartalmukat. Ezeknek az oldatoknak a névleges koncentrációja 2,5 , 5,0 , 10,0 és 25,0 μg/ml DL-α-tokoferol-acetát, azaz 2,28 , 4,55 , 9,10 μg/ml és 22,8 μg/ml DL-α-tokoferol.

Minden kalibrálóoldatból fecskendezzünk be 20 μl-t több alkalommal, és határozzuk meg az átlagos csúcsmagasságokat (területeket). Az átlagos csúcsmagasságok (területek) alapján szerkesszük meg a kalibrációs görbét.

5.6.1.3.    A DL-α-tokoferol-acetát törzsoldat (3.10.1.) UV hitelesítése

Etanollal hígítsuk a DL-α-tokoferol-acetát törzsoldat (3.10.1.) 5,0 ml-ét 25,0 ml-re, majd mérjük meg ennek az oldatnak az UV-spektrumát spektrofotométeren (4.6.) etanollal (3.1.) szemben, 250 nm és 320 nm között.

Az abszorbancia maximális értéke 284 nm kell, hogy legyen:

= 43,6 284 nm-nél etanolban

Ennél a hígításnál 0,84 és 0,88 közötti extinkciós értéket kell kapni.

5.6.2.    DL-α-tokoferol standard

5.6.2.1.    A standard munkaoldat elkészítése

Pipettázzunk a DL-α-tokoferol törzsoldatból (3.11.1.) 2 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba, oldjuk fel metil-alkoholban (3.3.), és töltsük fel jelig metil-alkohollal. Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 40 μg DL-α-tokoferol/ml, ami egyenértékű 44,0 μg DL-α-tokoferol-acetát/ml-rel. A standard munkaoldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.

5.6.2.2.    A kalibrálóoldatok és a kalibrációs görbe elkészítése

A standard munkaoldatból vigyünk át 1,0 , 2,0 , 4,0 és 10,0 ml-t 20 ml-es mérőlombikokba, töltsük fel a lombikokat jelig metil-alkohollal (3.3.), és keverjük össze a tartalmukat. Ezeknek az oldatoknak a névleges koncentrációja 2,0 , 4,0 , 8,0 és 20,0 μg/ml DL-α-tokoferol, azaz 2,20 , 4,40 , 8,79 μg/ml és 22,0 μg/ml DL-α-tokoferol-acetát.

Minden kalibrálóoldatból fecskendezzünk be 20 μl-t több alkalommal, és határozzuk meg az átlagos csúcsmagasságokat (területeket). Az átlagos csúcsmagasságok (területek) alapján szerkesszük meg a kalibrációs görbét.

5.6.2.3.    A DL-α-tokoferol törzsoldat (3.11.1.) UV hitelesítése

Etanollal hígítsuk a DL-α-tokoferol törzsoldat (3.11.1.) 2,0 ml-ét 25,0 ml-re, majd mérjük meg ennek az oldatnak az UV-spektrumát spektrofotométeren (4.6.) etanollal (3.1.) szemben, 250 nm és 320 nm között. Az abszorbancia maximális értéke 292 nm kell, hogy legyen:

= 75,8 292 nm-nél etanolban

Ennél a hígításnál 0,6 -os extinkciós értéket kell kapni.

6.   Az eredmények kiszámítása

A mintaoldat E-vitamin-csúcsainak átlagos magasságából (területéből) a kalibrációs görbét (5.6.1.2. vagy 5.6.2.2.) használva határozzuk meg a mintaoldat koncentrációját μg/ml-ben (a-tokoferol-acetátban számolva).

Az E-vitamin-tartalmat (w) mg/kg mintában kifejezve a következő képlet adja:

[mg/kg]

ahol:

7.   Észrevételek

8.   Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a magasabb érték 15 %-át.

9.   A körvizsgálat eredményei ( 12 )

C.   A VAS, RÉZ, MANGÁN ÉS CINK NYOMELEMEK MEGHATÁROZÁSA

1.   Cél és alkalmazási terület

A módszer lehetővé teszi a vas, réz, mangán és cink nyomelemek takarmányokban történő meghatározását. A meghatározás méréshatárai a következők:

2.   Vizsgálati alapelv

Az esetleg jelen lévő szerves anyag roncsolása után a mintát sósavban oldjuk. A vas, réz, mangán és cink nyomelemeket megfelelő hígítás után atomabszorpciós spektrometriával határozzuk meg.

3.   Reagensek

Előzetes megjegyzések

A reagensek és az analitikai oldatok elkészítéséhez használt víznek a meghatározás alá eső kationoktól mentesnek kell lennie, amelyet vagy boroszilikát üveg, illetve kvarc lepárlókészülékben történő kétszeres desztillálással, vagy ioncserélő gyantával végzett kétszeres kezeléssel érhetünk el.

A reagenseknek legalább analitikai tisztaságúaknak kell lenniük. A meghatározandó elemektől való mentességet vakpróbával kell ellenőrizni. Szükség esetén a reagenseket tovább kell deríteni.

Az alább leírásra kerülő standardoldatok helyett használhatunk olyan kereskedelmi forgalomban lévő standardoldatokat is, amelyek garantált minőségűek, és ezt felhasználásuk előtt le is ellenőrizték.

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja ( 13 )

5.1.   Szerves anyagot tartalmazó minták

5.1.1.    Hamvasztás és az oldatok előkészítése az analízisre ( 14 )

Vízzel nedvesítsük meg a hamut, és tegyük egy 250 ml-es főzőpohárba. Mossuk a tégelyt kb. 5 ml sósavval (3.1.), amit aztán lassan és óvatosan öntsünk a főzőpohárba (a CO2-képződés miatt heves reakció léphet fel). Adjuk hozzá cseppenként a sósavat (3.1.) addig kevergetve, amíg a pezsgés meg nem szűnik. Párologtassuk el belőle a nedvességet, időnként üvegbottal megkeverve.

Ezután adjunk a maradékanyaghoz 15 ml, 6 mól/liter koncentrációjú sósavat (3.2.), majd kb. 120 ml vizet. Keverjük meg az üvegbottal, amit a főzőpohárban hagyunk, és fedjük be a főzőpoharat egy kémlelőüveggel. Lassan forraljuk és tartsuk forrásponton addig, amíg a hamu feloldódása befejeződik. Szűrjük le hamumentes szűrőpapíron, és vegyük fel a szűrletet egy 250 ml-es mérőlombikban. Mossuk a főzőpoharat és a szűrőt 5 ml, forró, 6 mól/liter koncentrációjú sósavval (3.2.) és kétszer forrásban lévő vízzel. Töltsük fel a mérőlombikot jelig vízzel (a HCl-koncentráció kb. 0,5 mól/liter).

Megjegyzések:

5.1.2.    Spektrofotometriás meghatározás

5.1.2.1.    A kalibrálóoldatok elkészítése

Minden egyes meghatározandó elemhez készítsünk a 3.7.1., 3.8.1., 3.9.1. és 3.10.1. pontban megadott standard munkaoldatokból egy kalibrálóoldat-sorozatot, úgy, hogy minden egyes kalibrálóoldatnak a HCl-koncentrációja kb. 0,5 mól/liter és (vas, mangán és cink esetében) a lantán-klorid koncentrációja 0,1 %-os (w/v) lantánnal egyenértékű legyen.

A kiválasztott nyomelem-koncentrációknak az alkalmazott spektrofotométer érzékenységi tartományán belül kell lenniük. Az alábbi táblázatok példákon keresztül mutatják a kalibrálóoldat-sorozatok egy mintasorozatát; az alkalmazott spektrofotométer típusától és érzékenységi tartományától függően, adott esetben más koncentrációkat kell kiválasztani.

Vas

Réz

Mangán

Cink

5.1.2.2.    Az oldat előkészítése az analízisre

A réz meghatározásához az 5.1.1. pont szerint elkészített oldatot általában közvetlenül fel lehet használni. Ha mégis korrigálni kell koncentrációját a kalibrálóoldat-sorozaton belül, egy aliquot részt pipettázzunk egy 100 ml-es mérőlombikba, és töltsük fel jelig 0,5 mól/liter koncentrációjú sósavval (3.3.).

A vas, mangán és cink meghatározásához pipettázzunk egy aliquot részt az 5.1.1. pont szerint elkészített oldatból egy 100 ml-es mérőlombikba, adjunk hozzá 10 ml lantán-klorid oldatot (3.11.), és töltsük fel jelig 0,5 mól/liter koncentrációjú sósavval (3.3.) (lásd még az Észrevételek 8. pontját).

5.1.2.3.    Vakpróba

A vakpróba során a módszer összes meghatározott lépését el kell végezni, azzal a különbséggel, hogy a mintaanyagot elhagyjuk. A „0” kalibrálóoldatot nem szabad vakoldatként használni.

5.1.2.4.    Az atomabszorpció mérése

Mérjük meg a kalibrálóoldatok és az analizálandó oldat atomabszorpcióját oxidáló, levegő-acetilén láng alkalmazásával, a következő hullámhosszokon:

Minden mérést négyszer végezzünk el.

5.2.   Ásványi takarmányok

Ha a minta nem tartalmaz szerves anyagot, az előzetes hamvasztás szükségtelen. Folytassuk a műveletet az 5.1.1.1. pont második bekezdésétől. A fluorsavval végzett bepárlás elhagyható.

6.   Az eredmények kiszámítása

Egy kalibrációs görbe segítségével számoljuk ki az analizálandó oldat nyomelem-koncentrációját, az eredményt a minta kilogrammonkénti nyomelemtartalmára vonatkoztatva, milligrammban adjuk meg (ppm).

7.   Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán, ugyanazon analitikus által végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg a:

8.   Észrevétel

Nagy mennyiségű foszfát jelenléte interferenciát okozhat a vassal, mangánnal és cinkkel. Az intereferenciát lantán-klorid oldat (3.11.) hozzáadásával kell korrigálni. Ha azonban a mintában a Ca + Mg / P súlyaránya > 2, elhagyható a lantán-klorid oldatnak a vizsgálandó oldathoz és a kalibrálóoldatokhoz való hozzáadása.

D.   A HALOFUGINON MEGHATÁROZÁSA

DL-transz-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]-quinazolin-4-(3H)-egy hidrobromid

1.   Cél és alkalmazási terület

A módszer a halofuginon takarmányokban történő meghatározására szolgál. A meghatározás határértéke 1 mg/kg.

2.   Vizsgálati alapelv

Forró vízzel történt kezelés után a halofuginont szabad bázis formában etilén-acetátba extraháljuk, ezt követően pedig hidroklorid formában vizes savoldatba partícionáljuk. A kivonatot ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk. A halofuginontartalom meghatározását fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerrel és UV-detektor alkalmazásával végezzük.

3.   Reagensek

Mérjünk be egy 500 ml-es mérőlombikba 0,1 mg pontossággal 50 mg halofuginont (3.6.), oldjuk fel ammónium-acetát pufferoldatban (3.18.), töltsük fel a lombikot jelig a pufferoldattal, majd keverjük el. Ezen oldat 5 oC hőmérsékleten és sötétben tárolva három héten át stabil marad.

100 ml-es mérőlombikokba adagoljunk 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 és 6,0 ml standard törzsoldatot (3.6.1.). A mozgófázissal (3.21.) töltsük fel jelig, és keverjük el. Ezen oldatok halofuginon-koncentrációja 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 , illetve 6,0 μg/ml lesz. Az oldatokat használat előtt frissen kell elkészíteni.

Oldjunk fel 50 g nátrium-karbonátot (3.11.) vízben, hígítsuk fel 1 literre, és adjunk hozzá nátrium-kloridot (3.12.), amíg az oldat telített nem lesz.

10 ml HCl-t (3.7.) hígítsunk vízzel egy literre.

Oldjunk fel 19,3 g ammónium-acetátot (3.3.) és 30 ml ecetsavat (3.5.) vízben (3.14.), és hígítsuk 1 literre.

Megfelelő mennyiségű Amberlite-et (3.2.) mossunk addig vízzel, amíg az összes kloridiont el nem távolítottuk, mindezt ezüst-nitrátnak (3.20.) az elöntött vizes fázishoz való hozzáadásával ellenőrizhetjük. Ezután mossuk ki a gyantát 50 ml metil-alkoholban (3.8.), öntsük le a metil-alkoholt, és a gyantát friss metil-alkohol alatt tároljuk.

Oldjunk fel 0,17 g ezüst-nitrátot (3.9.) 10 ml vízben.

Keverjünk el 500 ml acetonitrilt (3.1.) 300 ml ammónium-acetát pufferoldattal (3.18.) és 1 200 ml vízzel (3.14.). Az oldat pH-ját ecetsavval (3.5.) állítsuk be 4,3 -ra. Szűrjük át egy 0,22 μm-es szűrőn (4.8.) és gázmentesítsük az oldatot (pl. 10 percig tartó ultrahangos kezeléssel). Az oldat egy hónapon át stabil marad, ha zárt edényben, sötétben tároljuk.

4.   Eszközök

5.   A vizsgálat módja

5.1.   Általános szabályok

5.2.   Extrahálás

Egy 200 ml-es centrifugacsőbe 0,1 g-os pontossággal mérjünk ki 10 g-ot az előkészített mintából, adjunk hozzá 0,5 g nátrium-aszkorbátot (3.10.), 0,5 g EDTA-oldatot (3.13.) és 20 ml vizet, majd keverjük össze. A csövet helyezzük öt percre 80 oC-os vízfürdőbe. Miután visszahűlt szobahőmérsékletre, adjunk hozzá 20 ml nátrium-karbonát oldatot (3.15.), és keverjük össze. Közvetlenül ezután adjunk hozzá 100 ml etil-acetátot (3.4.), és kézzel erősen rázzuk 15 másodpercen keresztül. Ezután tegyük a csövet három percig az ultrahangos fürdőbe (4.1.), és lazítsuk meg a dugóját. Centrifugáljuk két percen át, majd dekantáljuk az etil-acetát fázist egy üvegszálas szűrőn (4.6.) keresztül egy 500 ml-es választótölcsérbe. Ismételjük meg az extrahálást a mintán egy második 100 ml-es etil-acetát adaggal. Mossuk az elegyített kivonatot 50 ml nátrium-kloriddal telített nátrium-karbonát oldattal (3.16.) egy percen keresztül, és a vizes fázist öntsük el.

A szerves réteget 1 percen keresztül 50 ml sósavval (3.17.) extraháljuk. Az alsó savas réteget eresszük le egy 250 ml-es választótölcsérbe. A szerves réteget ismételten extraháljuk másfél percen keresztül további 50 ml sósavval, és elegyítsük az első kivonattal. Mossuk az elegyített savas kivonatokat úgy, hogy megközelítőleg tíz másodpercig locsoljuk 10 ml etil-acetáttal (3.4.).

A vizes réteget teljes mennyiségben vigyük át egy 250 ml-es gömblombikba, és öntsük el a szerves fázist. A rotációs, vékonyfilmes bepárlókészülékkel (4.2.) párologtassuk el az összes visszamaradó etil-acetátot a savas oldatból. A vízfürdő hőmérséklete nem haladhatja meg a 40 oC-ot. Körülbelül 25 mbar vákuumban 38 oC-on az összes visszamaradt etil-acetát öt perc alatt elpárolog.

5.3.   Tisztítás

5.3.1.    Az Amberlite-oszlop előkészítése

Minden mintakivonat számára külön XAD-2 oszlopot készítünk. Vigyünk át metil-alkohollal (3.8.) 10 g előkészített Amberlite-et (3.19.) egy üvegoszlopba (4.5.). A gyantaágy tetejére tegyünk egy kis üvegvatta dugót. Eresszük le az oszlopról a metil-alkoholt, és 100 ml vízzel mossuk el a gyantát, de állítsuk meg az átfolyást, amikor a folyadék elérte a gyantaágy tetejét. Használat előtt, 10 percig engedjük, hogy az oszlop egyensúlyba kerüljön. Soha ne hagyjuk az oszlopot kiszáradni.

5.3.2.    A minta tisztítása

A kivonatot (5.2.) teljes mennyiségben vigyük át az előkészített Amberlite-oszlop (5.3.1.) tetejére, eluáljuk, majd az eluátumot öntsük el. Az eluálás sebessége nem lehet több, mint 20 ml/perc. Öblítsük el a gömblombikot 20 ml sósavval (3.17.), és ezt használjuk a gyantaoszlop elmosásához is. Légbefúvással távolítsunk el minden savoldat-maradékot. A mosóoldatot öntsük el. Adjunk 100 ml metil-alkoholt (3.8.) az oszlopra, és engedjünk 5–10 ml-t eluálódni, miközben az eluátumot egy 250 ml-es gömblombikban fogjuk fel. Tíz percig hagyjuk, hogy a maradék metil-alkohol egyensúlyba kerüljön a műgyantával, majd folytassuk az eluálást maximum 20 ml/perc sebességen, miközben az eluátumot ugyanabban a gömblombikban fogjuk fel. A metil-alkoholt a rotációs, vékonyfilmes bepárlókészüléken párologtassuk el (4.2.), a vízfürdő hőmérséklete nem haladhatja meg a 40 oC-ot. A maradékot a mozgófázis (3.21.) segítségével teljes mennyiségben vigyük át egy 10 ml-es mérőlombikba. Mozgófázissal töltsük fel jelig, és keverjük el. Egy aliquot részt szűrjünk át membránszűrőn (4.7.) Ezt az oldatot tegyük el a HPLC-meghatározáshoz (5.4.).

5.4.   HPLC-meghatározás

5.4.1.    Paraméterek

A következő vizsgálati feltételek útmutatásként szolgálnak, egyéb feltételek is használhatók, feltéve, hogy ezzel egyenértékű eredményeket adnak.

Folyadékkromatográfiás oszlop (4.4.1.)

HPLC mozgófázis (3.21.)

Átáramlási sebesség: 1,5 –2 ml/perc

Kimutatási hullámhossz: 243 nm

Befecskendezett mennyiség: 40–100 μl.

Ellenőrizzük a kromatográfiás rendszer stabilitását oly módon, hogy 3,0 μg/ml koncentrációjú kalibrálóoldatot (3.6.2.) fecskendezünk be többször, amíg a csúcsmagasságok (vagy területek) és a retenciós idők állandóvá nem válnak.

5.4.2.    Kalibrációs görbe

Fecskendezzük be többször egymás után az egyes kalibrálóoldatokat (3.6.2.), és mérjük meg az egyes koncentrációkhoz tartozó csúcsok magasságát (területét). Szerkesszünk kalibrációs görbét úgy, hogy a kalibrálóoldatok átlagos csúcsmagasságait vagy területeit az ordinátatengelyen, a hozzájuk tartozó, μg/ml-ben kifejezett koncentrációkat pedig az abszcisszán ábrázoljuk.

5.4.3.    Mintaoldat

Ugyanolyan mennyiségű oldatot használva, mint amennyit a kalibrálóoldatoknál használtunk, fecskendezzük be a mintakivonatot (5.3.2.) egymás után többször, és határozzuk meg a halofuginoncsúcsok átlagos magasságát (területét).

6.   Az eredmények kiszámítása

A mintaoldat halofuginoncsúcsainak átlagos magasságát (területét) a kalibrációs görbével (5.4.2.) egybevetve határozzuk meg a mintaoldat koncentrációját μg/ml-ben.

A minta (mg/kg-ban kifejezett) w halofuginontartalmát az alábbi képlet segítségével kapjuk meg:

ahol:

7.   Az eredmények validálása

7.1.   Azonosítás

Az analizált anyag azonosítása párhuzamos kromatográfiával vagy diódasoros detektor használatával erősíthető meg, amely során a mintakivonat és a 6,0 μg/ml-es kalibrálóoldat (3.6.2.) spektrumát hasonlítjuk össze.

7.1.1.    Párhuzamos kromatográfia

A mintakivonatot megfelelő mennyiségű kalibrálóoldattal (3.6.2.) dúsítjuk. A hozzáadott halofuginon mennyiségének a mintakivonatban található halofuginon becsült mennyiségével közel azonosnak kell lennie.

A hozzáadott mennyiséget és a kivonat hígítását figyelembe véve, csak a halofuginoncsúcs emelkedhet. A csúcs szélességének a legnagyobb magasság felénél az eredeti szélesség ± 10 %-on belül kell lennie.

7.1.2.    Diódasoros detektálás

Az eredményeket a következő kritériumok szerint értékeljük:

Amennyiben ezen kritériumok valamelyike nem teljesül, az analizált anyag jelenléte nem bizonyított.

7.2.   Ismételhetőség

Két azonos mintán végzett párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség 3 mg/kg halofuginontartalomig nem lehet több, mint 0,5 mg/kg.

7.3.   Visszanyerés

A dúsított takarmányvakminta esetében legalább 80 %-os visszanyerési arányt kell elérni.

8.   A körvizsgálat eredményei

Egy körvizsgálat ( 15 ) során három mintát analizáltak nyolc laboratóriumban.