31999L0076

A Bizottság 1999/76/EK irányelve

(1999. július 23.)

a takarmányokban lévő lazalocid-nátrium meghatározására szolgáló közösségi analitikai módszer létrehozásáról

(EGT vonatkozású szöveg)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a legutóbb Ausztria, Finnország és Svédország csatlakozási okmányával módosított, a takarmányok hatósági ellen- őrzésénél alkalmazandó közösségi mintavételi és analitikai módszerek bevezetéséről szóló, 1970. július 20-i 70/373/EGK bizottsági irányelvre [1] és különösen annak 2. cikkére,

(1) mivel a 70/373/EGK irányelv előírja, hogy a takarmányok hatósági ellenőrzését, amelynek célja a takarmányok minőségére és összetételére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezésekből eredő követelmények betartásának ellenőrzése, közösségi mintavételi és analitikai módszerek alkalmazásával kell végrehajtani;

(2) mivel a legutóbb az 1999. április 26-i 866/1999/EK bizottsági rendelettel [2] módosított, a takarmány-adalékanyagokról szóló, 1970. november 23-i 70/524/EGK bizottsági irányelv [3] előírja, hogy a lazalocid-nátrium-tartalmat fel kell tüntetni a címkézésen, amennyiben az említett anyagot az előkeverékekhez és a takarmányokhoz keverik;

(3) mivel ezen anyagok ellenőrzésére közösségi analitikai módszereket kell meghatározni;

(4) mivel az ebben az irányelvben előírt intézkedések összhangban vannak a Takarmányok Állandó Bizottsága véleményével,

ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:

1. cikk

A tagállamok előírják, hogy a takarmányok és az előkeverékek lazalocid-tartalmának hatósági ellenőrzése céljából végzett analitikai vizsgálatokat a mellékletében meghatározott módszerrel kell végrehajtani.

2. cikk

A tagállamok legkésőbb 2000. január 31-ig hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot.

Ezeket az intézkedéseket 2000. február 1-jétől alkalmazzák.

Amikor a tagállamok elfogadják ezeket az intézkedéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre, vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg.

3. cikk

Ez az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő 20. napon lép hatályba.

4. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 1999. július 23-án.

a Bizottság részéről

Franz Fischler

a Bizottság tagja

[1] HL L 170., 1970.8.3., 2. o.

[2] HL L 108., 1999.4.27., 20. o.

[3] HL L 270., 1970.12.14., 1. o.

--------------------------------------------------

MELLÉKLET

A LAZALOCID-NÁTRIUM MEGHATÁROZÁSA

A Streptomyces lasaliensis által termelt poliéter-monokarboxilsav nátriumsója

1. Cél és alkalmazási terület

A módszer a takarmányok és az előkeverékek lazalocid-nátrium-tartalmának meghatározására szolgál. A kimutatási határérték 5 mg/kg, a mérési határérték 30 mg/kg.

2. Vizsgálati alapelv

A lazalocid-nátriumot a mintából savas metil-alkohollal extraháljuk, majd fordított fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC), spektrofotometriás detektor segítségével határozzuk meg.

3. Reagensek

3.1. Kálium-dihidrogén-foszfát (KH2PO4)

3.2. Ortofoszforsav, w = 85 %

3.3. Ortofoszforsav oldat, σ = 20 %

Hígítsunk fel vízzel 23,5 ml ortofoszforsavat (3.2.) 100 ml-re.

3.4. 6-metil-2-heptilamin (1,5-dimetil-hexilamin), w = 99 %

3.5. Metil-alkohol, HPLC minőségű

3.6. Sósav, ρ20 1,19 μg/ml

3.7. Foszfátpuffer-oldat, c = 0,01 mol/l

Oldjunk fel 1,36 g KH2PO4-ot (3.1.) 500 ml vízben (3.11.), adjunk hozzá 3,5 ml ortofoszforsavat (3.2.) és 10,0 ml 6-metil-2-heptilamint (3.4.). Állítsuk be a pH-t 4,0-re ortofoszforsav-oldattal (3.3.), és hígítsuk fel vízzel 1000 ml-re (3.11.).

3.8. Savas metil-alkohol

Öntsünk 5,0 ml sósavat (3.6.) egy 1000 ml-es mérőlombikba, töltsük fel jelig metil-alkohollal (3.5.) és keverjük össze. Az oldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.

3.9. A HPLC mobil fázis, foszfátpuffer-metil-alkohol-oldat, 5 + 95 (V + V)

Keverjünk össze 5 ml foszfátpuffer-oldatot (3.7.) 95 ml metil-alkohollal (3.5.).

3.10. Lazalocid-nátrium garantált tisztaságú standard anyag, C34H53O8Na (a poliéter-monokarboxilsav nátriumsója, amelyet a Streptomyces lasaliensis termel), E763

3.10.1. Lazalocid-nátrium standard törzsoldat, 500 μg/ml

Mérjünk be 0,1 mg-os pontossággal 50 mg lazalocid-nátriumot (3.10.) egy 100 ml-es mérőlombikba, oldjuk fel savas metil-alkoholban (3.8.), töltsük fel jelig ugyanezzel az oldószerrel, és keverjük össze. Ezt az oldatot használat előtt frissen kell elkészíteni.

3.10.2. Lazalocid-nátrium standard törzsoldat, 50 μg/ml

Pipettázzunk 10,0 ml standard törzsoldatot (3.10.1.) egy 100 ml-es mérőlombikba, töltsük fel jelig savas metil-alkohollal (3.8.), és keverjük össze. Az oldatot használat előtt frissen kell elkészíteni.

3.10.3. Kalibráló oldatok

50 ml-es mérőlombikokba öntsünk 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, illetve 10.0 ml standard közbenső oldatot (3.10.2.). Öntsük fel jelig savas metil-alkohollal (3.8.), és keverjük össze. Ezek az oldatok egyenként 1.0, 2.0, 4.0, 5.0 és 10.0 μg/ml lazalocid-nátriumnak felelnek meg. Ezeket az oldatokat felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.

3.11. Víz, HPLC minőségű

4. Eszközök

4.1. Ultrahangos fürdő (vagy vízfürdős rázógép), hőmérséklet-szabályozóval

4.2. Membránszűrők, 0,45 μm

4.3. HPLC berendezés injektáló rendszerrel, 20 μl-nyi injektálási lehetőséggel.

4.3.1. Folyadékkromatográfiás oszlop 125 mm · 4 mm, fordított fázisú C18, 5 μm-es töltet vagy ezzel egyenértékű

4.3.2. Spektrofluoriméter, változtatható gerjesztési és emissziós hullámhossz-szabályozással

5. A vizsgálat módja

5.1. Általános megjegyzések

5.1.1. Vakpróba-takarmány

Vakpróba-takarmány analizálásával végezzünk visszanyerési próbát (5.1.2.) annak ellenőrzésére, hogy sem lazalocid-nátrium, sem egyéb interferáló anyag nincs jelen. A vakpróba-takarmány a mintához hasonló típusú legyen, és benne lazalocid-nátrium vagy más interferáló anyag ne legyen kimutatható.

5.1.2. Visszanyerési próba

Végezzünk visszanyerési próbát egy olyan vakpróba-takarmány analizálásával, amelyet a mintában jelenlévőhöz hasonló mennyiségű lazalocid-nátriummal dúsítottak. 100 mg/kg-os szintre történő dúsításhoz öntsünk 10,0 ml standard törzsoldatot (3.10.1.) egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba, és pároljuk be az oldatot kb. 0,5 ml-re. Adjunk hozzá 50 g vakpróba-takarmányt, keverjük össze alaposan, és hagyjuk 10 percig állni, majd újra keverjük többször össze, mielőtt folytatnánk a műveletet az extrahálással (5.2.).

Amennyiben a mintához hasonló típusú vakpróba-takarmány nem áll rendelkezésre (lásd 5.1.1.), a visszanyerési próbát a standard addíciós módszerrel is el lehet végezni. Ebben az esetben az analizálandó mintát a mintában már meglévővel megegyező mennyiségű lazalocid-nátriummal dúsítjuk. Ezt a mintát a nem dúsított mintával együtt analizáljuk, a visszanyerést kivonással számoljuk ki.

5.2. Extrahálás

5.2.1. Takarmányok

Mérjünk be 0,01 g-os pontossággal 5–10 g mintát egy dugós, 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba. Pipettával adjunk hozzá 100,0 ml savas metil-alkoholt (3.8.). Dugaszoljuk le lazán, és keverjük, míg diszperziót nem kapunk. Helyezzük a lombikot körülbelül 40 °C-os ultrahangos fürdőbe (4.1.) 20 percre, majd vegyük ki és hűtsük le szobahőmérsékletre. Hagyjuk állni kb. 1 óráig, amíg a szuszpendált anyag leülepszik, majd egy 0,45 μm-es membránszűrőn (4.2.) szűrjünk egy aliquot részt egy megfelelő edénybe. Folytassuk a műveletet a HPLC-meghatározással (5.3.).

5.2.2. Előkeverékek

Mérjünk be 0,001 g-os pontossággal 2 g őröletlen előkeveréket egy 250 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá 100,0 ml savas metil-alkoholt (3.8.) és keverjük, amíg diszperziót nem kapunk. Helyezzük a mérőlombikot tartalmával együtt kb. 40 °C-os ultrahangos fürdőbe (4.1.) 20 percre, majd vegyük ki és hűtsük le szobahőmérsékletre. Hígítsuk jelig savas metil-alkohollal (3.8.), és alaposan keverjük össze. Hagyjuk állni kb. 1 óráig, amíg a szuszpendált anyag leülepszik, majd egy 0,45 μm-es membránszűrőn (4.2.) szűrjünk át egy aliquot részt. Hígítsuk a tiszta filtrátum megfelelő mennyiségét savas metil-alkohollal (3.8.), hogy így kb. 4 μg/ml lazalocid-nátriumot tartalmazó végső vizsgálati oldatot kepjunk. Folytassuk a műveletet a HPLC-meghatározással (5.3.).

5.3. HPLC-meghatározás

5.3.1. Paraméterek

A következő paraméterek iránymutatásul szolgálnak; más paraméterek is alkalmazhatók, feltéve hogy egyenértékű eredményeket adnak:

Folyadékkromatográfiás oszlop (4.3.1.): | 125 mm · 4 mm, fordított fázisú C18, 5 μm-es töltet vagy ezzel egyenértékű |

Mobil fázis (3.9.): | Foszfátpuffer-oldat (3.7.) és metil-alkohol (3.5.) keveréke, 5 + 95 (V + V) |

Áramlási sebesség: | 1,2 ml/perc |

Detektálási hullámhosszok:

–Gerjesztési: | 310 nm |

–Emissziós: | 419 nm |

Befecskendezett mennyiség: | 20 μl |

Ellenőrizzük a kromatográfiás rendszer stabilitását 4,0 μg/ml-es koncentrációjú kalibráló oldat többszöri befecskendezésével (3.10.3.), amelyet állandó csúcsmagasságok (vagy teröletek) és retenciós idők eléréséig folytassunk.

5.3.2. Kalibrációs görbe

Fecskendezzük be többször az egyes kalibráló oldatokat (3.10.3.), és határozzuk meg az egyes koncentrációk átlag csúcsmagasságait (területeit). Készítsük el a kalibrációs görbét úgy, hogy az átlag csúcsmagasságokat (területeket) az ordinátán, a μg/ml-ben kifejezett megfelelő koncentrációkat az abszcisszán ábrázoljuk.

5.3.3. Mintaoldat

Fecskendezzük be többször az 5.2.1. vagy 5.2.2. pont szerint nyert mintakivonatokat, ugyanakkora mennyiséget használva, mint a kalibráló oldatok esetén, és határozzuk meg a lazalocid-nátrium-csúcsok átlag csúcsmagasságait (területeit).

6. Az eredmények kiszámítása

A mintaoldat (5.3.3.) befecskendezése után kapott átlag csúcsmagasságokból (területekből), a kalibrációs görbe alapján határozzuk meg a lazalocid-nátrium koncentrációját μg/ml-ben.

6.1. Takarmányok

A minta lazalocid-nátrium-tartalma, w (mg/kg) a következő képlet szerint adható meg:

w =

β · V

ahol:

β = a mintaoldat (5.2.1.) μg/ml-ben kifejezett lazalocid-nátrium koncentrációja

V1 = a mintakivonat, 5.2.1. pont szerint ml-ben megadott (= 100) térfogata

m = a vizsgálati mennyiség g-ban kifejezett tömege

6.2. Előkeverékek

A minta lazalocid-nátrium-tartalma, w (mg/kg) a következő képlet szerint adható meg:

w =

β · V

· f

ahol:

β = a mintaoldat (5.2.2.) μg/ml-ben megadott lazalocid-nátrium koncentrációja

V2 = a mintakivonat 5.2.2. pont szerint ml-ben megadott (= 250) térfogata

f = az 5.2.2. pont szerinti hígítási tényező

7. Az eredmények validálása

7.1. Azonosság

A spektro-fluorimetrián alapuló módszerek kevésbé érzékenyek az interferenciára, mint azok az eljárások, amelyek során UV detektort használnak. Az analizált anyag azonossága párhuzamos kromatografiával ellen- őrizhető.

7.1.1. Párhuzamos kromatográfia

Egy mintakivonatot (5.2.1. vagy 5.2.2.) megfelelő mennyiségű kalibráló oldat (3.10.3.) hozzáadásával dúsítunk. A hozzáadott lazalocid-nátrium mennyisége közel azonos legyen a mintaoldatban található lazalocid-nátrium mennyiségével. A hozzáadott lazalocid-nátrium mennyiségét és a kivonat hígulását tekintve csak a lazalocid-nátrium csúcsmagassága növekedhet. A csúcsszélesség a magasság felénél nem haladhatja meg a nem dúsított mintakivonat eredeti csúcsszélességének ± 10 %-át.

7.2. Ismételhetőség

Az ugyanazon a mintán elvégzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

- a magasabb érték 15 %-át, 30–100 mg/kg közötti lazalocid-nátrium-tartalom esetén,

- a 15 mg/kg értéket, a 100–200 mg/kg közötti lazalocid-nátrium-tartalom esetén,

- a magasabb érték 7,5 %-át, a 200 mg/kg-nál nagyobb lazalocid-nátrium-tartalom esetén.

7.3. Visszanyerés

A dúsított (vakpróba) takarmányminta esetében a visszanyerés foka legalább 80 %-os legyen. A dúsított előkeverék-minták esetében a visszanyerés foka legalább 90 %-os legyen.

8. Kollaborációs vizsgálat eredményei

Kollaborációs vizsgálat [1] keretében 12 laboratórium 2 előkeveréket (1. és 2. minta) és 5 takarmányt (3–7. minta) analizáltak. Minden egyes mintán kettős analízist végeztek. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza:

L = a laboratóriumok száma

n = az egyedi értékek száma

Sr = az ismételhetőség szórása

SR = a reprodukálhatóság szórása

CVr = az ismételhetőség variációs koefficiense %

CVR = a reprodukálhatóság variációs koefficiense %

| 1. minta Csirke előkeverék | 2. minta Pulyka előkeverék | 3. minta Pulyka pellet | 4. minta Csirke derce | 5. minta Pulyka takarmány | 6. minta Baromfi A-takarmány | 7. minta Baromfi B-takarmány |

L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |

N | 23 | 23 | 23 | 23 | 23 | 23 | 23 |

Átlag (mg/kg) | 5050 | 16200 | 76,5 | 78,4 | 92,9 | 48,3 | 32,6 |

sr (mg/kg) | 107 | 408 | 1,71 | 2,23 | 2,27 | 1,93 | 1,75 |

Cvr ( %) | 2,12 | 2,52 | 2,24 | 2,84 | 2,44 | 4,00 | 5,37 |

sR (mg/kg) | 286 | 883 | 3,85 | 7,32 | 5,29 | 3,47 | 3,49 |

CVR ( %) | 5,66 | 5,45 | 5,03 | 9,34 | 5,69 | 7,18 | 10,70 |

Névleges tartalom (mg/kg) | 5000 | 16000 | 80 | 105 | 120 | 50 | 35 |

[1] Analyst, 1995., 120., 2175–2180. o.

--------------------------------------------------