26.9.2019   

HR

Službeni list Europske unije

L 247/1


UREDBA KOMISIJE (EU) 2019/1390

оd 31. srpnja 2019.

o izmjeni Priloga Uredbi (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku

(Tekst značajan za EGP)

EUROPSKA KOMISIJA,

uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,

uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća od 18. prosinca 2006. o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i Direktive Vijeća 76/769/EEZ i direktiva Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ (1), a posebno njezin članak 13. stavak 2.,

budući da:

(1)

Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 (2) sadržava ispitne metode za potrebe određivanja fizikalno-kemijskih svojstava, toksičnosti i ekotoksičnosti kemikalija koje treba primijeniti za potrebe Uredbe (EZ) br. 1907/2006.

(2)

Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj (OECD) razvija usklađene i na međunarodnoj razini dogovorene smjernice za ispitivanje kemikalija u regulatorne svrhe. OECD redovito izdaje nove i revidirane smjernice za ispitivanje uzimajući u obzir znanstveni napredak u tom području.

(3)

Kako bi se uzeo u obzir tehnički napredak i, kad je god moguće, u skladu s člankom 13. stavkom 2. Uredbe (EZ) br. 1907/2006 smanjio broj životinja koje se koriste u eksperimentalne svrhe, nakon donošenja odgovarajućih smjernica OECD-a za ispitivanje trebalo bi utvrditi dvije nove ispitne metode za procjenu ekotoksičnosti i devet novih ispitnih metoda za utvrđivanje toksičnosti za ljudsko zdravlje te bi sedam ispitnih metoda trebalo ažurirati. Jedanaest od tih ispitnih metoda odnose se na in vitro ispitivanja nadraživanja/nagrizanja kože i oka, izazivanje osjetljivosti kože, genotoksičnost i endokrine učinke. S dionicima je provedeno savjetovanje o predloženoj izmjeni.

(4)

Uredbu (EZ) br. 440/2008 trebalo bi stoga na odgovarajući način izmijeniti.

(5)

Mjere predviđene ovom Uredbom u skladu su s mišljenjem odbora uspostavljenog na temelju članka 133. Uredbe (EZ) br. 1907/2006,

DONIJELA JE OVU UREDBU:

Članak 1.

Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se u skladu s Prilogom ovoj Uredbi.

Članak 2.

Ova Uredba stupa na snagu dvadesetog dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.

Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.

Sastavljeno u Bruxellesu 31. srpnja 2019.

Za Komisiju

Predsjednik

Jean-Claude JUNCKER


(1)  SL L 396, 30.12.2006., str. 1.

(2)  Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 od 30. svibnja 2008. o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) (SL L 142, 31.5.2008., str. 1.).


PRILOG

Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se kako slijedi:

(1)

u dijelu B poglavlje B.4. zamjenjuje se sljedećim:

„B.4.   AKUTNO NADRAŽIVANJE/NAGRIZANJE KOŽE

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 404 (TG) (2015.). Smjernice OECD-a za ispitivanje kemikalija periodički se preispituju kako bi se osiguralo da odražavaju najbolje dostupne znanstvene spoznaje. Kod preispitivanja Smjernice OECD-a za ispitivanje 404 posebna je pozornost posvećena mogućim poboljšanjima u vezi s dobrobiti životinja i procjeni svih postojećih informacija o ispitivanoj kemikaliji kako bi se izbjegla nepotrebna ispitivanja na laboratorijskim životinjama. Ažurirana verzija Smjernice OECD-a za ispitivanje 404 (izvorno donesena 1981., revidirana 1992., 2002. i 2015.) uključuje upućivanje na Smjernice o integriranim pristupima ispitivanju i procjeni (IATA) za nadraživanje/nagrizanje kože (1.), u kojima se predlaže modularan pristup ispitivanju nadraživanja i nagrizanja kože. U IATA-i je opisano nekoliko modula u kojima se grupiraju izvori informacija i alati za analizu te i. pružaju se smjernice o tome kako integrirati i upotrijebiti postojeće podatke o ispitivanju i podatke koji se dobivaju bez ispitivanja za procjenu potencijala kemikalija da uzrokuju nadraživanje i nagrizanje kože te ii. predlaže se pristup kad je potrebno daljnje ispitivanje (1.). Osim toga, u toj se smjernici, prema potrebi, kod početnog ispitivanja in vivo preporučuje postupna, a ne istodobna primjena triju ispitnih krpica (patch test) na životinju.

2.

Definicije za nadraživanje i nagrizanje kože utvrđene su u Dodatku ovoj ispitnoj metodi.

POČETNA RAZMATRANJA

3.

Kako bi se osigurala pouzdanost znanstvenih rezultata i dobrobit životinja, in vivo ispitivanje ne bi trebalo započeti sve dok se analizom snage dokaza ne ocijene svi raspoloživi podaci koji su relevantni za moguće nagrizajuće/nadražujuće djelovanje ispitivane kemikalije na kožu, kako je navedeno u Smjernicama o integriranim pristupima ispitivanju i procjeni za nagrizanje i nadraživanje kože, tj. u trima dijelovima tih smjernica i njihovim odgovarajućim modulima (1.). Ukratko, u dijelu 1. postojeći se podaci razmatraju u sedam modula kojima su obuhvaćeni podaci dobiveni ispitivanjima na ljudima, podaci dobiveni metodom in vivo, podaci dobiveni metodom in vitro, podaci o fizikalno-kemijskim svojstvima (npr. pH-vrijednost, osobito jaka kiselost ili lužnatost) i metode koje ne uključuju ispitivanje. U dijelu 2. provodi se analiza snage dokaza. Ako analiza snage dokaza i dalje nije jednoznačna, trebao bi se provesti dio 3. s dodatnim ispitivanjem, pri čemu se počinje s in vitro metodama, a in vivo ispitivanja koriste se kao posljednja opcija. Ta bi analiza stoga trebala smanjiti potrebu za in vivo ispitivanjem nagrizajućeg/nadražujućeg djelovanja ispitivanih kemikalija na kožu za koje u pogledu te dvije krajnje točke već postoji dovoljno dokaza na temelju drugih istraživanja.

NAČELO IN VIVO ISPITIVANJA

4.

Jedna doza ispitivane kemikalije nanosi se na kožu pokusne životinje; netretirani dijelovi kože ispitne životinje služe za kontrolu. Stupanj nadraženosti/nagriženosti očitava se i bilježi u određenim vremenskim intervalima i zatim se dodatno opisuje kako bi se mogla napraviti kompletna ocjena učinaka. Istraživanje treba trajati dovoljno dugo da bude moguće ocijeniti jesu li uočeni učinci reverzibilni ili ireverzibilni.

5.

Životinje koje pokazuju stalne znakove jakog stresa i/ili boli u bilo kojoj fazi ispitivanja treba humano usmrtiti te ispitivanu kemikaliju s tim u skladu ocijeniti. Kriteriji za donošenje odluke o humanom usmrćivanju životinja koje su na umoru i koje jako pate navedeni su u zasebnom dokumentu sa smjernicama (2.).

PRIPREME ZA IN VIVO ISPITIVANJE

Odabir životinjske vrste

6.

Kao pokusne životinje preporučuje se upotrijebiti albino kuniće, i to zdrave, mlade odrasle primjerke. U slučaju da se koristi neka druga životinjska vrsta, treba navesti razloge za to.

Priprema životinja

7.

Otprilike 24 sata prije ispitivanja životinjama se s leđnog dijela trupa uklanja dlaka šišanjem neposredno uz kožu. Pritom treba paziti da se koža ne ošteti te treba koristiti samo životinje sa zdravom, netaknutom kožom.

8.

Kod nekih su sojeva kunića određeni dijelovi kože prekriveni vrlo gustom dlakom, što je posebno izraženo u određeno doba godine. Na takvima se gusto obraslim dijelovima kože ispitivanja ne bi smjela obavljati.

Uvjeti smještaja i hranjenja

9.

Životinje treba smjestiti pojedinačno. Kad su u pitanju kunići, temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 20 °C (±3 °C). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 % te je poželjno da ne prijeđe 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Rasvjeta bi trebala biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Kad je riječ o hranjenju, može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograničene količine vode za piće.

ISPITNI POSTUPAK

Primjena ispitivane kemikalije

10.

Ispitivanu kemikaliju treba nanijeti na malu površinu (približno 6 cm2) kože i prekriti gazenom krpicom koju treba pričvrstiti nenadražujućom ljepljivom trakom. U slučajevima kad izravno nanošenje nije moguće (npr. tekućine ili neke paste) ispitivanu kemikaliju prvo treba nanijeti na gazenu krpicu koja se zatim stavlja na kožu. Krpicu treba držati labavo u kontaktu s kožom s pomoću odgovarajućeg poluokluzivnog obloga tijekom cijelog razdoblja izlaganja. Ako se ispitivana kemikalija nanosi na krpicu, na kožu je treba pričvrstiti na takav način da se ostvari dobar kontakt između kemikalije i kože te da kemikalija bude jednoliko raspoređena po koži. Životinju treba spriječiti da dosegne krpicu te da kemikaliju unese u organizam gutanjem ili udisanjem.

11.

Tekuće ispitivane kemikalije obično se koriste nerazrijeđene. Kad se ispituju krute tvari (koje mogu biti usitnjene u prah ako se smatra potrebnim), ispitivanu kemikaliju treba navlažiti najmanjom mogućom količinom vode (ili, prema potrebi, nekim drugim odgovarajućim nosačem) koja je dovoljna da omogući dobar kontakt s kožom. Kad se koriste drugi nosači, a ne voda, potencijalni utjecaj nosača na nadraženost kože izazvanu ispitivanom kemikalijom treba biti minimalan ili nikakav.

12.

Na kraju razdoblja izlaganja, koje obično traje četiri sata, ostatke ispitivane kemikalije po mogućnosti treba ukloniti vodom ili odgovarajućim otapalom, ne mijenjajući nastao odgovor ili integritet površinskog sloja kože (epiderme).

Visina doze

13.

Na pripremljeni dio kože nanosi se doza od 0,5 ml tvari u tekućem obliku ili 0,5 g u krutom obliku ili u obliku paste.

Početno ispitivanje (ispitivanje nadražujućih/nagrizajućih svojstava in vivo na jednoj životinji)

14.

Ako se na temelju analize snage dokaza ili prethodnog in vitro ispitivanja utvrdi da je ispitivana kemikalija korozivna, nadražujuća ili nerazvrstana, daljnje in vivo ispitivanje obično nije potrebno. Međutim, u slučajevima u kojima se smatra da su potrebni dodatni podaci provodi se in vivo ispitivanje u kojem se prvo upotrebljava jedna životinja i primjenjuje se sljedeći pristup. Na kožu jedne životinje u slijedu se stavljaju najviše tri krpice. Prva se krpica uklanja nakon tri minute. Ako se na koži ne uoči jaka reakcija, na drugo se mjesto stavlja druga krpica koja se uklanja nakon jednog sata. Ako se na temelju opažanja u ovoj fazi može zaključiti da ne bi bilo nehumano produžiti izlaganje, stavlja se treća krpica koja se uklanja nakon četiri sata i utvrđuje stupanj odgovora.

15.

Ako se nakon bilo kojeg od tri izlaganja u nizu opazi nagrizajuće djelovanje, ispitivanje se odmah prekida. Ako se nakon uklanjanja posljednje krpice ne uoči nagrizajuće djelovanje, životinja se opaža 14 dana, osim u slučaju da do nagrizanja dođe ranije.

16.

U slučajevima kad se ne očekuje da će ispitivana kemikalija uzrokovati nagrizanje, ali da može biti nadražujuća, treba na jednu životinju staviti jednu krpicu i držati je četiri sata.

Potvrdni test (ispitivanje nadraživanja kože in vivo na dodatnim životinjama)

17.

Ako se tijekom početnog ispitivanja ne opazi nagrizajući učinak, nadražujući ili negativan odgovor treba potvrditi ispitivanjem na najviše dvije dodatne životinje, od kojih na svaku treba primijeniti po jednu krpicu u trajanju od četiri sata. Ako se tijekom početnog ispitivanja opazi nadražujući učinak, potvrdno se ispitivanje može izvesti sekvencijski ili istodobnim izlaganjem dviju dodatnih životinja. U iznimnim slučajevima kod kojih se početno ispitivanje ne provodi, može se tretirati dvije ili tri životinje jednom krpicom koja se nakon četiri sata uklanja. Ako pri korištenju dviju životinja obje pokažu isti odgovor, daljnje ispitivanje nije potrebno. U suprotnom, ispitivanju se podvrgava i treća životinja. Dvosmislene odgovore ponekad treba ocijeniti ispitivanjem na dodatnim životinjama.

Razdoblje opažanja

18.

Opažanje treba trajati dovoljno dugo da se u potpunosti može utvrditi reverzibilnost uočenih učinaka. Međutim, pokus treba prekinuti u bilo kojem trenutku ako životinja pokazuje trajne znakove jake boli ili stresa. Da bi se utvrdila reverzibilnost učinaka, životinje treba opažati do 14 dana nakon uklanjanja krpica. Ako se reverzibilnost utvrdi prije isteka 14 dana, pokus odmah treba prekinuti.

Klinička opažanja i stupnjevanje reakcija na koži

19.

Sve životinje treba pregledati kako bi se vidjelo pokazuju li znakove crvenila kože (eritema) ili oteklina (edema) i to nakon 60 minuta, a zatim nakon 24, 48 i 72 sata po skidanju krpice. Za početno ispitivanje na jednoj životinji mjesto ispitivanja pregledava se i odmah nakon uklanjanja krpice. Stupanj reakcije na koži utvrđuje se i bilježi prema stupnjevima opisanim u tablici u nastavku. Ako se na koži pojavi oštećenje koje se nakon 72 sata ne može definirati kao nadraženost ili nagriženost, možda će za utvrđivanje reverzibilnosti učinaka biti potrebno opažanje u trajanju od 14 dana. Uz opažanja povezana s nadraženosti kože treba detaljno opisati i zabilježiti sve lokalne toksične učinke, kao što je isušivanje kože, i sve sustavne štetne učinke (npr. klinički znakovi toksičnosti i promjene u tjelesnoj masi). U slučaju dvosmislenih odgovora trebalo bi razmotriti mogućnost histopatološkog pregleda.

20.

Stupnjevanje odgovora na koži po svojoj je prirodi subjektivno. Da bi se poboljšala usklađenost u stupnjevanju odgovora na koži te da bi se u tom smislu pomoglo ispitnim laboratorijima i onima koji obavljaju opažanja i tumače rezultate, osoblje koje obavlja ta opažanja treba proći odgovarajuće osposobljavanje za primjenu sustava ocjenjivanja (vidjeti tablicu u nastavku). Od pomoći bi mogao biti ilustrirani priručnik za utvrđivanje stupnja nadraženosti i drugih lezija kože (3.).

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

21.

Rezultate istraživanja, koji obuhvaćaju sve stavke iz stavka 24., treba rezimirati u obliku tablice u konačnom izvješću o ispitivanju.

Ocjena rezultata

22.

Pokazatelje nadraženosti kože treba ocijeniti ovisno o vrsti i stupnju lezija te o njihovoj reverzibilnosti ili ireverzibilnosti. Pojedinačni rezultati ne predstavljaju apsolutni standard za nadražujuća svojstva određenog ispitnog materijala, s obzirom na to da se ocjenjuju i drugi njegovi učinci. Umjesto toga, na pojedinačne rezultate treba gledati kao na referentne vrijednosti koje se ocjenjuju u kombinaciji sa svim ostalim opažanjima iz istraživanja.

23.

Kod ocjenjivanja nadraženosti kože treba uzeti u obzir reverzibilnost lezija. Ako reakcije kao što su alopecija (ograničena površina), hiperkeratoza, hiperplazija i perutanje ostanu prisutne do kraja 14-dnevnog razdoblja opažanja, ispitivanu kemikaliju treba smatrati nadražujućom.

Izvješće o ispitivanju

24.

Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće informacije:

 

Razlozi za ispitivanje in vivo:

analiza snage dokaza postojećih podataka dobivenih prethodnim ispitivanjima, uključujući rezultate dobivene primjenom strategije sekvencijskog ispitivanja,

opis relevantnih podataka dobivenih ranijim ispitivanjima,

podaci dobiveni u svakoj fazi primijenjene strategije ispitivanja,

opis obavljenih in vitro ispitivanja, uključujući pojedinosti o postupcima i rezultate dobivene ispitivanjem ispitivanih/referentnih tvari,

analiza snage dokaza radi provođenja istraživanja in vivo.

 

Ispitivana kemikalija:

tvar s jednim sastojkom: kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv, CAS broj, SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula, čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi, itd.,

tvar s više sastojaka, smjesa i tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvodi ili biološki materijali (UVCB): opis (koliko je to moguće) kemijskog identiteta (vidjeti gore), kvantitativnog udjela i relevantnih fizikalno-kemijskih svojstava sastojaka,

fizički izgled, topljivost u vodi i druga relevantna fizikalno-kemijska svojstva,

izvor, broj serije, ako su dostupni,

tretiranje ispitivane kemikalije/kontrolne tvari prije ispitivanja, ako je primjenljivo (npr. grijanje, mljevenje),

stabilnost ispitivane kemikalije, rok uporabe ili datum za ponovnu analizu ako je poznat,

uvjeti skladištenja.

 

Nosač:

identifikacijska oznaka, koncentracija (prema potrebi), upotrijebljeni volumen,

obrazloženje za odabir nosača.

 

Ispitne životinje:

upotrijebljena vrsta/soj, razlozi za upotrebu drugih životinja umjesto albino kunića,

broj životinja svakog spola,

tjelesna masa pojedinačnih životinja na početku i na kraju ispitivanja,

dob na početku istraživanja,

podrijetlo životinja, uvjeti smještaja, prehrana itd.

 

Ispitni uvjeti:

tehnika pripremanja mjesta na koje će se staviti krpica,

pojedinosti o upotrijebljenim materijalima i tehnici stavljanja krpice,

pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije, nanošenju i uklanjanju.

 

Rezultati:

tablični prikaz stupnjeva nadražujućeg/nagrizajućeg odgovora za svaku životinju u svakoj vremenskoj točki u kojoj se provodi opažanje,

opis svih uočenih lezija,

detaljni opis vrste i stupnja uočene nadraženosti ili nagrizanja i svi histopatološki nalazi,

opis drugih štetnih lokalnih (npr. isušivanje kože) i sustavnih učinaka koji se javljaju pored nadraživanja i nagrizanja kože.

 

Rasprava o rezultatima

 

Zaključci

LITERATURA

1.

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

2.

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, studeni 1998.

3.

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

Tablica

Utvrđivanje Stupnja Reakcije na Koži

Nema eritema…

0

Lagano izraženi eritemi (jedva uočljivi)…

1

Dobro definirani eritemi…

2

Srednje do jako izraženi eritemi…

3

Jako izraženi eritemi (tamno crvenilo, poput boje govedine) uz stvaranje eshara koji sprečavaju utvrđivanje stupnja eritema…

4

Najviši mogući stupanj: 4

Nema edema…

0

Vrlo lagani edemi (jedva uočljivi)…

1

Lagani edemi (rubovi površine izdignuti i jasno definirani)…

2

Srednji edemi (izdignuti približno 1 mm)…

3

Jaki edemi (izdignuti više od 1 mm i šire se izvan površine izlaganja)…

4

Najviši mogući stupanj: 4

U slučaju dvosmislenih odgovora može se obaviti histopatološki pregled.

Dodatak

DEFINICIJE

Kemikalija je tvar ili smjesa.

Nadraživanje kože je uzrokovanje reverzibilnog oštećenja kože nakon primjene ispitivane kemikalije u trajanju do najviše četiri sata.

Nagrizanje kože je uzrokovanje ireverzibilnog oštećenja kože, odnosno vidljive nekroze koja kroz epidermu prodire u dermu nakon što je ispitivana kemikalija primjenjivana u trajanju do najviše četiri sata. Nagrizanje je obično popraćeno čirevima, krvarenjem, krvavim krastama, a do kraja razdoblja promatranja od 14 dana i promjenom boje zbog izbjeljivanja kože, potpunim gubitkom dlake na zahvaćenim dijelovima te ožiljcima. Za ocjenjivanje sumnjivih lezija treba razmotriti mogućnost histopatoloških pretraga.

Ispitivana kemikalija je svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.;

(2)

u dijelu B poglavlje B.17. zamjenjuje se sljedećim:

„B.17.    IN VITRO ISPITIVANJA GENSKIH MUTACIJA STANICA SISAVACA UPOTREBOM GENA HPRT I XPRT

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara smjernici OECD-a za ispitivanje 476 (2016.). Ispitne metode periodično se preispituju uzimajući u obzir znanstveni napredak, promjene regulatornih potreba i dobrobit životinja. U trenutačnoj revidiranoj verziji ispitne metode B.17. uzima se u obzir gotovo 30 godina iskustva s ovim ispitivanjem te je ona rezultat razvoja posebne nove metode namijenjene in vitro ispitivanjima genskih mutacija stanica sisavaca upotrebom gena za timidin kinazu. Ispitna metoda B.17. dio je niza ispitnih metoda u području genetske toksikologije. OECD je sastavio dokument u kojem se daju sažete informacije o ispitivanju u području genetske toksikologije te pregled novijih promjena smjernica OECD-a za ispitivanje genotoksičnosti (1.).

2.

Svrha je in vitro ispitivanja genskih mutacija stanica sisavaca otkrivanje genskih mutacija induciranih kemikalijama. Stanične linije koje se upotrebljavaju u tim ispitivanjima mjere napredne mutacije na reporterskim genima, točnije na genu za endogenu hipoksantin-gvanin-fosforibozil-transferazu (Hprt kod stanica glodavaca, HPRT kod ljudskih stanica; u ovoj se ispitnoj metodi zajednički nazivaju gen Hprt i HPRT test) i transgenu za ksantin-gvanin-fosforibozil-transferazu (gpt) (dalje u tekstu „XPRT test”). Testovi mutacija HPRT i XPRT otkrivaju različite spektre genetskih pojava. Uz mutacije otkrivene HPRT testom (npr. supstitucije baznih parova, pomaci okvira očitavanja, manje delecije i insercije), autosomalna lokacija transgena gpt može omogućiti otkrivanje mutacija koje su rezultat velikih delecija i moguće mitotske rekombinacije koja nije otkrivena HPRT testom jer se gen Hprt nalazi na X-kromosomu (2., 3., 4., 5., 6. i 7.). XPRT se trenutačno upotrebljava manje nego HPRT test u regulatorne svrhe.

3.

Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1.

POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA

4.

Ispitivanja koja se obavljaju in vitro obično zahtijevaju primjenu egzogenog izvora metaboličke aktivacije. Egzogenim sustavom metaboličke aktivacije ne oponašaju se u cijelosti in vivo uvjeti.

5.

Trebalo bi voditi računa o tome da se izbjegnu uvjeti koji bi doveli do lažno pozitivnih rezultata (odnosno moguće interakcije s ispitnim sustavom) koji nisu uzrokovani izravnom interakcijom ispitivanih kemikalija i genetskog materijala stanice; takvi uvjeti uključuju promjene pH-vrijednosti ili osmolalnosti (8., 9. i 10.), interakciju s komponentama medija (11. i 12.) ili prekomjerne razine citotoksičnosti (13.). Citotoksičnost koja premašuje preporučene najviše razine citotoksičnosti, kako su definirane u stavku 19., smatra se prekomjernom za HPRT test.

6.

Prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se te, ako se mogu, zašto se njome mogu dobiti primjereni rezultati za tu svrhu. Ta razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese.

NAČELO ISPITIVANJA

7.

Mutirane stanice kod kojih nema aktivnosti enzima Hprt u HPRT testu ili aktivnosti enzima xprt u XPRT testu otporne su na citostatske učinke purin analognog 6-tiogvanina (TG). Stanice koje sadržavaju dosta Hprta (u HPRT testu) ili gpta (u XPRT testu) osjetljive su na TG, što uzrokuje inhibiciju staničnog metabolizma i sprečava daljnju diobu stanica. Tako se mutirane stanice uz prisutnost TG-a mogu razmnožavati, a normalne stanice koje sadržavaju enzim Hprt (u HPRT testu) ili gpt (u XPRT testu) ne mogu.

8.

Stanice u suspenziji ili jednoslojnim kulturama izlažu se u odgovarajućem trajanju ispitivanoj kemikaliji (od tri sata do šest sati), s egzogenim izvorom metaboličke aktivacije i bez njega (vidjeti stavak 14.), te se zatim supkultiviraju da bi se utvrdila citotoksičnost i omogućila fenotipska ekspresija prije selekcije mutanata (14., 15., 16. i 17.). Citotoksičnost se utvrđuje relativnom stopom preživljavanja, tj. učinkovitošću kloniranja koja se mjeri odmah nakon tretiranja i prilagođava za mogući gubitak stanica tijekom tretiranja u usporedbi s negativnom kontrolom (stavak 18. i Dodatak 2.). Tretirane se kulture drže u mediju za rast tijekom dovoljno dugog vremenskog razdoblja koje je karakteristično za svaki tip stanice, kako bi se omogućila gotovo optimalna fenotipska ekspresija induciranih mutacija (obično najmanje 7–9 dana). Nakon fenotipske ekspresije utvrđuje se učestalost pojave mutanata nasađivanjem poznatog broja stanica u medij koji sadržava selektivni agens za otkrivanje kolonija mutanata, a u medij bez selektivnog agensa za određivanje učinkovitosti kloniranja (vijabilnost). Nakon odgovarajućeg razdoblja inkubacije kolonije se prebroje. Učestalost pojave mutanata računa se na temelju broja kolonija mutanata koji se ispravlja učinkovitošću kloniranja u trenutku selekcije mutanata.

OPIS METODE

Pripreme

Stanice

9.

Vrste stanica koje se koriste u testovima HPRT i XPRT trebale bi imati dokazanu osjetljivost na kemijske mutagene, visoku učinkovitost kloniranja, stabilan kariotip i stabilnu učestalost pojave spontanih mutanata. Stanice koje se najčešće upotrebljavaju za HPRT test uključuju linije stanica kineskog hrčka CHO, CHL i V79, stanice limfoma miša L5178Y te stanice ljudskih limfoblastoidnih stanica TK6 (18. i 19.). Za XPRT test upotrebljavaju se stanice AS52 dobivene od stanica CHO koje sadržavaju transgen gpt ( i kod kojih je izbrisan gen Hprt) (20. i 21.); HPRT test ne može se provesti na stanicama AS52 jer je izbrisan gen hprt. Uporaba drugih staničnih linija trebala bi se opravdati i validirati.

10.

Rutinski bi trebalo provjeravati stabilnost modalnog broja kromosoma staničnih linija te odsustvo kontaminacije mikoplazmom (22. i 23.), a stanice ne bi trebalo upotrebljavati ako su kontaminirane ili ako je promijenjen modalni broj kromosoma. Treba utvrditi uobičajeno trajanje staničnog ciklusa koje se upotrebljava u ispitnom laboratoriju i ono treba biti u skladu s objavljenim značajkama stanica. Trebalo bi provjeriti i učestalost pojave spontanih mutanata u glavnoj zalihi stanica te zalihu ne bi trebalo upotrebljavati ako učestalost pojave mutanata nije prihvatljiva.

11.

Prije upotrebe u ovom ispitivanju iz kultura će možda trebati odstraniti mutirane stanice koje već postoje, npr. uzgojem u HAT mediju za HPRT test i MPS mediju za XPRT test (5. i 24.) (vidjeti Dodatak 1.). Te pročišćene stanice mogu se krioprezervirati i zatim odmrznuti za uporabu kao radni uzorci. Radni uzorak koji se odmrzne može se upotrebljavati za ispitivanje nakon što se dosegne normalno vrijeme dupliciranja. Pri provedbi XPRT testa za rutinsku kulturu stanica AS52 trebali bi se primjenjivati uvjeti kojima se osigurava održavanje transgena gpt (20.).

Uvjeti koje moraju zadovoljavati podloge i kulture

12.

Za održavanje kultura trebalo bi primjenjivati prikladne uvjete za medije za uzgoj kulture i uvjete inkubacije (posude za kulture, vlažne atmosferske uvjete od 5 % CO2 i temperaturu inkubacije od 37 °C). Stanične kulture uvijek bi se trebale održavati u uvjetima kojima se osigurava da one rastu u logaritamskoj fazi. Posebno je važno odabrati uvjete medija i kultura kojima se osiguravaju optimalni rast stanica tijekom razdoblja ekspresije i optimalna učinkovitost kloniranja kako mutiranih tako i nemutiranih stanica.

Priprema kultura

13.

Stanične linije razmnožavaju se iz matičnih kultura te se nasađuju u medij za uzgoj kulture takvom gustoćom da stanice u suspenziji ili jednoslojnoj kulturi nastave eksponencijalno rasti tijekom razdoblja tretiranja i ekspresije (npr. treba izbjegavati konfluenciju kod stanica koje rastu kao jednoslojna kultura).

Metabolička aktivacija

14.

Kod uporabe stanica s neodgovarajućom endogenom sposobnošću metabolizma trebalo bi upotrebljavati egzogene sustave metaboličkog djelovanja. Sustav koji se najčešće upotrebljava i automatski preporučuje, osim ako je drukčije opravdano, jest postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom (S9), pripravljena od jetre glodavaca (obično štakora), koja je bila tretirana sredstvima za enzimsku indukciju, kao što je Aroclor 1254 (25., 26., 27. i 28.), ili mješavinom fenobarbitala i β-naftoflavona (29., 30., 31. i 32.). Upotreba navedene smjese nije u suprotnosti sa Stockholmskom konvencijom o postojanim organskim onečišćujućim tvarima (33.) i dokazano je da je za indukciju oksidaza s miješanom funkcijom jednako učinkovita kao Aroclor 1254 (29. i 31.). Frakcija S9 obično se upotrebljava u koncentracijama u rasponu od 1 do 2 % (v/v), ali može se povećati na 10 % (v/v) u konačnom ispitnom mediju. Na odabir vrste i koncentracije upotrijebljenog egzogenog sustava metaboličke aktivacije ili metaboličkog pokretača može utjecati kategorija tvari koje se ispituju (34., 35. i 36.).

Priprema ispitivane kemikalije

15.

Krute ispitivane kemikalije trebalo bi pripremiti u prikladnim otapalima i prema potrebi razrijediti prije tretiranja stanica (vidjeti stavak 16.). Tekuće ispitivane kemikalije mogu se dodati izravno u ispitni sustav i/ili razrijediti prije tretiranja ispitnog sustava. Plinovite ili hlapljive ispitivane kemikalije trebalo bi ispitivati nakon što se prikladno izmijene standardni protokoli, kao što je tretiranje u hermetički zatvorenim posudama za kulture (37. i 38.). Ispitivanu kemikaliju potrebno je pripremiti neposredno prije tretiranja, osim ako je prema podacima o stabilnosti prihvatljivo skladištenje.

ISPITNI UVJETI

Otapala

16.

Otapalo bi trebalo odabrati tako da se optimizira topljivost ispitivanih kemikalija bez negativnih učinaka na provedbu ispitivanja, kao što su npr. promjena rasta stanica, učinak na integritet ispitivane kemikalije, reagiranje s posudama za kulture ili oštećenje sustava metaboličke aktivacije. Preporučuje se da se, kad je god moguće, prvo uzme u obzir upotreba vodenog otapala (ili medija za uzgoj kulture). Uobičajena su otapala, na primjer, voda i dimetil sulfoksid. Općenito, organska otapala ne bi trebala prelaziti 1 % (v/v), a vodena otapala (fiziološka otopina ili voda) ne bi trebala prelaziti 10 % (v/v) u mediju za završno tretiranje. Ako se upotrebljavaju neuobičajena otapala (npr. etanol ili aceton), potrebno je opravdati njihovu uporabu podacima iz kojih se vidi da su ta otapala kompatibilna s ispitivanim kemikalijama i ispitnim sustavom te da ne djeluju genotoksično pri upotrijebljenoj koncentraciji. Ako ne postoje ti popratni podaci, važno je dodati netretirane kontrole (vidjeti Dodatak 1.) kako bi se dokazalo da odabrano otapalo ne inducira štetne ili mutagene učinke.

Mjerenje citotoksičnosti i odabir koncentracija izlaganja

17.

Pri utvrđivanju najviše koncentracije ispitivane kemikalije trebalo bi izbjegavati koncentracije koje imaju sposobnost izazivanja lažno pozitivnih odgovora, kao što su koncentracije koje izazivaju prekomjernu citotoksičnost (vidjeti stavak 20.), taloženje u mediju za uzgoj kulture (vidjeti stavak 21.) ili znatne promjene pH-vrijednosti ili osmolalnosti (vidjeti stavak 5.). Ako ispitivana kemikalija u trenutku dodavanja uzrokuje znatnu promjenu pH-vrijednosti medija, pH-vrijednost može se prilagoditi puferiranjem medija za završno tretiranje kako bi se izbjegli lažno pozitivni rezultati te održali primjereni uvjeti za uzgoj kulture.

18.

Odabir koncentracije temelji se na citotoksičnosti i drugim razmatranjima (vidjeti stavke 20.–22.). Iako ocjena citotoksičnosti u početnom ispitivanju može biti korisna za bolje određivanje koncentracija koje će se upotrebljavati u glavnom pokusu, početno ispitivanje nije potrebno. Čak i ako se provodi početna ocjena citotoksičnosti, i dalje je obvezno mjerenje citotoksičnosti za svaku kulturu u glavnom pokusu. Citotoksičnost bi se trebala ocjenjivati primjenom relativne stope preživljavanja, tj. učinkovitošću kloniranja stanica koje se nasade odmah nakon tretiranja, prilagođeno za mogući gubitak stanica tijekom tretiranja, na temelju broja stanica, u usporedbi s prilagođenom učinkovitošću kloniranja u negativnim kontrolama (kojima se dodjeljuje stopa preživljavanja od 100 %) (formulu vidjeti u Dodatku 2.).

19.

Potrebno je ocijeniti najmanje četiri ispitne koncentracije (ne uključujući kontrolu s otapalom i pozitivnu kontrolu) koje ispunjavaju kriterije prihvatljivosti (odgovarajuća citotoksičnost, broj stanica itd.). Iako se preporučuje upotreba usporednih kultura, za svaku se ispitivanu koncentraciju može upotrijebiti samo jedna tretirana kultura ili više njezinih ponovljenih uzoraka. Rezultati dobiveni iz više neovisnih ponovljenih kultura pri određenoj koncentraciji trebali bi se navoditi odvojeno, ali mogu se objediniti radi analize podataka (17.). Za ispitivane kemikalije koje pokazuju malu ili nikakvu citotoksičnost uglavnom će biti prikladne približno dvostruke ili trostruke koncentracije. Ako se pojavi citotoksičnost, odabranim bi ispitnim koncentracijama trebalo obuhvatiti raspon od koncentracije koja uzrokuje citotoksičnost do koncentracija pri kojima je citotoksičnost umjerena, niska ili nepostojeća. Mnoge ispitivane kemikalije imaju oštre krivulje odgovora na koncentraciju te će za obuhvaćanje cijelog raspona citotoksičnosti ili podrobno istraživanje odnosa koncentracije i odgovora možda biti potrebno upotrijebiti bliže raspoređene koncentracije i više od četiri koncentracije, posebno u situacijama u kojima je potrebno ponavljanje pokusa (vidjeti stavak 43.). Upotreba više od četiri koncentracije može biti osobito važna kad se upotrebljava jedna kultura.

20.

Ako se maksimalna koncentracija temelji na citotoksičnosti, najvećom koncentracijom trebala bi se nastojati ostvariti relativna stopa preživljavanja od 20 do 10 %. Trebalo bi s oprezom tumačiti pozitivne rezultate koji se nalaze samo pri relativnoj stopi preživljavanja od 10 % ili manjoj (stavak 43.).

21.

Za slabo topljive ispitivane kemikalije koje nisu citotoksične pri koncentracijama nižima od najniže koncentracije pri kojoj kemikalija nije topljiva najviša bi analizirana koncentracija trebala dovesti do zamućenosti ili taloga vidljivog golim okom ili inverznim mikroskopom na kraju tretiranja ispitivanom kemikalijom. Čak i ako se citotoksičnost pojavi iznad najniže netopljive koncentracije, preporučuje se ispitivanje pri samo jednoj koncentraciji koja dovodi do zamućenja ili s vidljivim talogom jer lažni učinci mogu biti posljedica taloga. Pri koncentraciji zbog koje nastaje talog potrebno je osigurati da taj talog ne utječe na izvođenje ispitivanja. Može biti korisno odrediti topljivost u mediju za uzgoj kulture prije izvođenja pokusa.

22.

Ako nisu zapaženi talog ili ograničavajuća citotoksičnost, najviša ispitna koncentracija trebala bi odgovarati najnižoj od sljedećih vrijednosti: 10 mM, 2 mg/ml ili 2 μl/ml (39. i 40.). Ako sastav ispitivane kemikalije nije definiran, npr. ako je riječ o tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složenim reakcijskim proizvodima ili biološkim materijalima (tj. kemijskim tvarima nepoznatog ili promjenjivog sastava ili UVCB tvarima) (41.), proizvodima ekstrahiranima iz okoliša itd., možda će trebati povećati najvišu koncentraciju (npr. 5 mg/ml), u odsustvu dovoljne citotoksičnosti, kako bi se povećala koncentracija svakog sastojka. Međutim, trebalo bi napomenuti da ti zahtjevi mogu biti drukčiji za farmaceutske proizvode namijenjene ljudima (42.).

Kontrole

23.

Kod svakog uvjeta pokusa potrebno je uključiti istodobne negativne kontrole (vidjeti stavak 16.) koje se sastoje samo od otapala u mediju za tretiranje i koje su tretirane na isti način kao kulture za tretiranje.

24.

Istodobne pozitivne kontrole potrebne su za dokazivanje sposobnosti laboratorija za određivanje mutagena u uvjetima upotrijebljenog protokola ispitivanja i učinkovitosti egzogenog sustava metaboličke aktivacije ako je primjenjivo. Primjeri pozitivnih kontrola navedeni su u tablici 1. u nastavku. Ako je to opravdano, mogu se koristiti alternativne tvari za pozitivnu kontrolu. S obzirom na to da je in vitro ispitivanje genotoksičnosti na stanicama sisavaca u dostatnoj mjeri standardizirano, ispitivanja u kojima se upotrebljavaju tretiranja s egzogenom metaboličkom aktivacijom i bez nje mogu se provoditi upotrebom samo pozitivnih kontrola koje zahtijevaju metaboličku aktivaciju. U tom će slučaju taj jedan odgovor pozitivne kontrole dokazati djelovanje sustava metaboličke aktivacije i osjetljivost ispitnog sustava. Svaku pozitivnu kontrolu trebalo bi primijeniti pri jednoj ili više koncentracija za koje se očekuje da će dovesti do ponovljivih i zamjetnih povećanja u odnosu na pozadinu kako bi se dokazala osjetljivost ispitnog sustava, a odgovor ne bi trebala dovesti u pitanje citotoksičnost koja prelazi granične vrijednosti utvrđene u ispitnoj metodi (vidjeti stavak 20).

Tablica 1.

Referentne tvari preporučene za ocjenu osposobljenosti laboratorija i za odabir pozitivnih kontrola

Stanje metaboličke aktivacije

Lokus

Tvar i CAS br.

Odsutnost egzogene metaboličke aktivacije

Hprt

Etil metansulfonat [CAS br. 62-50-0] Etil nitrozoureja [CAS br. 759-73-9] 4-nitrokinolin-1-oksid [CAS br. 56-57-5]

 

xprt

Streptonigrin [CAS br. 3930-19-6] Mitomicin C [CAS br. 50-07-7]

Prisutnost egzogene metaboličke aktivacije

Hprt

3-metilkolantren [CAS br. 56-49-5] 7,12-dimetilbenzantracen [CAS br. 57-97-6] Benzo[a]piren [CAS br. 50-32-8]

 

xprt

Benzo[a]piren [CAS br. 50-32-8]

POSTUPAK

Tretiranje ispitivanom kemikalijom

25.

Stanice koje se razmnožavaju tretiraju se ispitivanom kemikalijom uz prisutnost i odsutnost sustava metaboličke aktivacije. Izlaganje treba trajati odgovarajuće vrijeme (obično je primjereno od tri do šest sati).

26.

Minimalni broj stanica koje se koriste za svaku ispitnu kulturu (kontrolnu i tretiranu) u svakoj fazi ispitivanja trebao bi se temeljiti na učestalosti pojave spontanih mutanata. Opća je smjernica tretirati i pasažirati dovoljno stanica kako bi se održalo deset spontanih mutacija u svakoj kulturi u svim fazama ispitivanja (17.). Učestalost pojave spontanih mutanata općenito iznosi od 5 do 20 × 10-6. Kako bi se postigla učestalost pojave spontanih mutanata od 5 × 10-6 i kako bi se održao dovoljan broj spontanih mutacija (10 ili više) čak i za kulture koje se tretiraju pri koncentracijama koje uzrokuju 90-postotnu citotoksičnost tijekom tretiranja (relativna stopa preživljavanja od 10 %), bilo bi potrebno tretirati najmanje 20 × 106 stanica. Osim toga, mora se kultivirati dovoljan broj stanica (ali nikad manje od dva milijuna) tijekom razdoblja ekspresije i nasaditi radi selekcije mutanata (17.).

Vrijeme fenotipske ekspresije i mjerenje učestalosti pojave mutanata

27.

Nakon razdoblja tretiranja stanice se kultiviraju kako bi se omogućila ekspresija fenotipa mutanata. Obično je dovoljno od sedam do devet dana da bi se omogućila gotovo optimalna fenotipska ekspresija novoinduciranih mutanata Hprta i xprta (43. i 44.). Tijekom tog razdoblja stanice se moraju redovno supkultivirati kako bi se održao eksponencijalni rast. Nakon fenotipske ekspresije stanice se ponovno nasađuju u medij sa selektivnim agensom (6-tiogvanin) odnosno bez njega kako bi se utvrdili broj mutanata odnosno učinkovitost kloniranja u trenutku selekcije. To nasađivanje može se provesti upotrebom zdjelica za jednoslojne kulture ili ploče s mikrojažicama za stanice u suspenziji. Za selekciju mutanata stanice bi trebalo nasaditi pri gustoći kojom se osigurava optimalna regeneracija mutanata (tj. izbjegava se metabolička suradnja) (17.). Ploče se inkubiraju tijekom odgovarajućeg vremenskog razdoblja za optimalan rast kolonije (npr. od sedam do 12 dana) i kolonije se prebrojavaju. Učestalost pojave mutanata računa se na temelju broja kolonija mutanata koji se ispravlja učinkovitošću kloniranja u trenutku selekcije mutanata (formule vidjeti u Dodatku 2.).

Osposobljenost laboratorija

28.

Kako bi steklo dovoljno iskustva u izvođenju ispitivanja prije njegove rutinske primjene, laboratorij treba izvesti niz pokusa s referentnim pozitivnim tvarima koje djeluju putem različitih mehanizama (najmanje jedna aktivna s metaboličkom aktivacijom i jedna aktivna bez metaboličke aktivacije, odabrana s popisa tvari iz tablice 1.) te s različitim negativnim kontrolama (upotrebom različitih otapala/nosača). Odgovori pozitivnih i negativnih kontrola trebali bi biti u skladu s literaturom. To se ne primjenjuje na laboratorije koji već imaju iskustva, tj. one koji imaju bazu podataka o prijašnjim ispitivanjima kako je utvrđeno u stavcima od 30. do 33.

29.

Odabir tvari za pozitivnu kontrolu (vidjeti tablicu 1. u stavku 25.) trebao bi se ispitati u odsutnosti i prisutnosti metaboličke aktivacije kako bi se dokazala osposobljenost za otkrivanje mutagenih kemikalija, za utvrđivanje učinkovitosti sustava metaboličke aktivacije i za dokazivanje primjerenosti uvjeta za rast stanica tijekom tretiranja, fenotipske ekspresije i selekcije mutanata te postupaka ocjenjivanja. Potrebno je izabrati raspon koncentracija odabranih tvari pri kojima će doći do ponovljivih povećanja u odnosu na pozadinske vrijednosti, koja su povezana s koncentracijom, kako bi se dokazala osjetljivost i dinamički raspon ispitnog sustava.

Podaci o prijašnjim kontrolama

30.

Laboratorij bi trebao utvrditi:

raspon i distribuciju prijašnjih pozitivnih kontrola,

raspon i distribuciju prijašnjih negativnih kontrola (netretirane kulture, kontrole s otapalom).

31.

Pri prvom prikupljanju podataka za distribuciju prijašnjih negativnih kontrola istodobne negativne kontrole trebale bi biti u skladu s objavljenim podacima o kontrolama (22.). Kako se budu dodavali novi eksperimentalni podaci o distribuciji kontrola, istodobne negativne kontrole trebale bi u idealnom slučaju biti unutar kontrolnih granica od 95 % te distribucije (17., 45. i 46.).

32.

Baza podataka o prijašnjim negativnim kontrolama laboratorija trebala bi u početku obuhvaćati najmanje deset pokusa, ali bilo bi poželjno da se sastoji od najmanje 20 pokusa provedenih u usporedivim pokusnim uvjetima. Laboratoriji bi trebali primjenjivati metode za kontrolu kvalitete, kao što su kontrolni dijagrami (npr. C-dijagrami ili X-stupčasti dijagrami (47.)), kako bi utvrdili koliko su promjenjivi njihovi podaci o pozitivnim i negativnim kontrolama te dokazali da je u njihovu laboratoriju metodologija „pod kontrolom” (46.). Daljnje preporuke o tome kako uspostaviti i upotrebljavati prijašnje podatke (npr. kriteriji za uključivanje podataka u prijašnje podatke i njihovo izuzimanje iz tih podataka te kriteriji prihvatljivosti za određeni pokus) nalaze se u literaturi (45.).

33.

Podaci o negativnim kontrolama trebali bi se sastojati od podataka o učestalosti pojave mutanata u jednoj kulturi ili, po mogućnosti, u ponovljenim kulturama kako je opisano u stavku 23. Istodobne negativne kontrole u idealnom bi slučaju trebale biti unutar kontrolnih granica od 95 % distribucije prijašnjih podataka o negativnim kontrolama koji se nalaze u bazi podataka laboratorija (17., 45. i 46.). Ako se podaci o istodobnim negativnim kontrolama nalaze izvan kontrolnih granica od 95 %, mogu biti prihvatljivi za uključenje u distribuciju prijašnjih kontrola pod uvjetom da ti podaci nisu ekstremne netipične vrijednosti te da postoje dokazi o tome da je ispitni sustav „pod kontrolom” (vidjeti prethodno navedeno) i da nema tehničke ili ljudske pogreške.

34.

Svaku izmjenu pokusnog protokola trebalo bi razmotriti s obzirom na to je li u skladu s postojećim bazama podataka laboratorija o prijašnjim kontrolama. Svaka veća nesukladnost trebala bi dovesti do uspostave nove baze podataka o prijašnjim kontrolama.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Predstavljanje rezultata

35.

Predstavljanje rezultata trebalo bi uključivati sve podatke koji su potrebni za izračun citotoksičnosti (izraženo kao relativna stopa preživljavanja). Podaci za tretirane i kontrolne kulture trebali bi uključivati broj stanica na kraju tretiranja, broj stanica nasađenih odmah nakon tretiranja i brojeve kolonija (ili broj jažica bez kolonija za metodu s mikrojažicama). Relativna stopa preživljavanja za svaku kulturu trebala bi se izraziti kao postotak u odnosu na istodobnu kontrolu s otapalom (definicije potražiti u Dodatku 1.).

36.

Predstavljanje rezultata trebalo bi uključivati i sve podatke koji su potrebni za izračun učestalosti pojave mutanata. Podaci za tretirane i kontrolne kulture trebali bi uključivati: (1) broj stanica nasađenih sa selektivnim agensom i bez njega (kad se stanice nasađuju radi selekcije mutanata) i (2) broj izbrojanih kolonija (ili broj jažica bez kolonija za metodu s mikrojažicama) na pločama sa selektivnim agensom i bez njega. Učestalost pojave mutanata računa se na temelju broja kolonija mutanata (na pločama sa selektivnim agensom) koji se ispravlja učinkovitošću kloniranja (s ploča bez selektivnog agensa). Učestalost pojave mutanata trebala bi se izraziti kao broj mutiranih stanica po milijunu vijabilnih stanica (definicije potražiti u Dodatku 1.).

37.

Potrebno je navesti podatke o pojedinačnim kulturama. Osim toga, sve je podatke potrebno sažeto prikazati u obliku tablice.

Kriteriji prihvatljivosti

38.

Prihvatljivost ispitivanja temelji se na sljedećim kriterijima:

smatra se da je istodobnu negativnu kontrolu prihvatljivo dodati u bazu podataka o prijašnjim negativnim kontrolama laboratorija kako je opisano u stavku 33.,

istodobne pozitivne kontrole (vidjeti stavak 24.) trebale bi inducirati odgovore koji su u skladu s odgovorima generiranima u bazi podataka o prijašnjim pozitivnim kontrolama i dovesti do statistički značajnog povećanja u odnosu na istodobnu negativnu kontrolu,

ispitana su dva pokusna uvjeta (tj. s metaboličkom aktivacijom i bez nje) osim ako je jedan doveo do pozitivnog rezultata (vidjeti stavak 25.),

odgovarajući broj stanica i koncentracija prikladan je za analizu (stavci 25., 26. i 19.),

kriteriji za odabir najviše koncentracije u skladu su s kriterijima opisanima u stavcima 20., 21. i 22.

Ocjenjivanje i tumačenje rezultata

39.

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno pozitivnom ako u bilo kojem od ispitanih pokusnih uvjeta:

najmanje pri jednoj ispitnoj koncentraciji zapaženo je statistički značajno povećanje u odnosu na istodobnu negativnu kontrolu,

odgovarajući test trenda pokazuje da je povećanje povezano s koncentracijom,

bilo koji od rezultata je izvan distribucije podataka o prijašnjim negativnim kontrolama (npr. kontrolne granice od 95 % prema Poissonovoj distribuciji; vidjeti stavak 33.).

Kad su ispunjeni svi ti uvjeti, smatra se da ispitivana kemikalija može inducirati genske mutacije u uzgojenim stanicama sisavaca u tom sustavu ispitivanja. Preporuke za najprikladnije statističke metode nalaze se u literaturi (46. i 48.).

40.

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno negativnom ako u svim ispitanim pokusnim uvjetima:

ni pri jednoj ispitnoj koncentraciji nije zapaženo statistički značajno povećanje u odnosu na istodobnu negativnu kontrolu,

odgovarajući test trenda pokazuje da nema povećanja povezanog s koncentracijom,

svi su rezultati u okviru distribucije podataka o prijašnjim negativnim kontrolama (npr. kontrolne granice od 95 % prema Poissonovoj distribuciji; vidjeti stavak 33.).

Tad se smatra da ispitivana kemikalija ne može inducirati genske mutacije u uzgojenim stanicama sisavaca u tom sustavu ispitivanja.

41.

Jasan pozitivan ili negativan odgovor nije potrebno provjeravati.

42.

Ako odgovor nije ni jasno pozitivan ni jasno negativan kako je prethodno opisano ili kako bi se pridonijelo utvrđivanju biološke relevantnosti rezultata, podatke bi trebalo ocjenjivati na temelju stručne prosudbe i/ili daljnjih istraživanja. Moglo bi biti korisno ponoviti pokus, eventualno u izmijenjenim pokusnim uvjetima (npr. razmak između koncentracija, drugi uvjeti metaboličke aktivacije (tj. koncentracija S9 ili podrijetlo S9)).

43.

U rijetkim slučajevima, čak i nakon dodatnih istraživanja, skup podataka neće omogućiti donošenje zaključka o tome je li rezultat pozitivan ili negativan. Stoga bi se trebalo zaključiti da je odgovor na ispitivanu kemikaliju dvosmislen (tumači se da je jednako vjerojatno da je pozitivan ili negativan).

Izvješće o ispitivanju

44.

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:

 

Ispitivana kemikalija:

izvor, broj serije, rok uporabe, ako su dostupni,

stabilnost ispitivane kemikalije, ako je poznata,

topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu, ako su poznate,

izmjerene vrijednosti za pH, osmolalnost i taloženje u mediju za uzgoj kulture u koji je dodana ispitivana kemikalija, prema potrebi.

 

Tvar s jednim sastojkom:

fizički izgled, topljivost u vodi i druga relevantna fizikalno-kemijska svojstva,

kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv, CAS broj, SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula, čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd.

 

Tvari s više sastojaka, UVCB tvari i smjese:

opis (koliko je to moguće) kemijskog identiteta (vidjeti gore), kvantitativnog udjela i relevantnih fizikalno-kemijskih svojstava sastojaka.

 

Otapalo:

obrazloženje odabira otapala,

postotak otapala u konačnom mediju za uzgoj kulture.

 

Stanice:

 

Za laboratorijske glavne kulture:

vrsta, izvor staničnih linija,

broj pasaža, ako je dostupan, i povijest laboratorija,

kariotipna svojstva i/ili modalni broj kromosoma,

metode održavanja staničnih kultura,

odsustvo mikoplazme,

vremena udvostručivanja stanica.

 

Ispitni uvjeti:

obrazloženje za odabir koncentracija i broja kultura, uključujući npr. podatke o citotoksičnosti i ograničenja topljivosti,

sastav medija, koncentracija CO2, razina vlažnosti,

koncentracija ispitivane kemikalije izražena kao konačna koncentracija u mediju za uzgoj kulture (npr. μg ili mg/ml ili mM medija za uzgoj kulture),

koncentracija (i/ili volumen) otapala i ispitivane kemikalije koji su dodani mediju za uzgoj kulture,

temperatura inkubacije,

vrijeme inkubacije,

trajanje tretiranja,

gustoća stanica za vrijeme tretiranja,

vrsta i sastav sustava metaboličke aktivacije (izvor S9, metoda pripreme mješavine S9, koncentracija ili volumen mješavine S9 i S9 u konačnom mediju za uzgoj kulture, kontrole kvalitete S9), tvari pozitivne i negativne kontrole, konačne koncentracije za svaki uvjet tretiranja,

duljina razdoblja ekspresije (uključujući broj nasađenih stanica te režim uzgoja supkultura i dodavanja hranjivih tvari, ako je primjereno),

identitet selektivnog agensa i njegova koncentracija,

kriteriji prihvatljivosti ispitivanja,

metode korištene za utvrđivanje broja vijabilnih i mutiranih stanica,

metode mjerenja citotoksičnosti,

sve dodatne informacije koje se odnose na citotoksičnost i upotrijebljenu metodu,

trajanje inkubacije nakon nasađivanja,

kriteriji prema kojima se istraživanje smatra pozitivnim, negativnim ili dvosmislenim,

metode upotrijebljene za određivanje pH-vrijednosti, osmolalnosti i taloženja.

 

Rezultati:

broj tretiranih stanica i broj supkultiviranih stanica za svaku kulturu,

mjerenja citotoksičnosti i druga opažanja, ako postoje,

znakovi taloženja i vrijeme utvrđivanja,

broj stanica nasađenih na selektivni i neselektivni medij,

broj kolonija u neselektivnom mediju i broj otpornih kolonija u selektivnom mediju te povezana učestalost pojave mutanata,

odnos koncentracije i odgovora, ako je moguće,

podaci o istodobnim negativnim kontrolama (s otapalom) i pozitivnim kontrolama (koncentracije i otapala),

podaci o prijašnjim negativnim kontrolama (s otapalom) i prijašnjim pozitivnim kontrolama, zajedno s rasponima, srednjim vrijednostima i standardnim devijacijama, interval pouzdanosti (npr. 95 %) te broj podataka,

statističke analize (za pojedinačne kulture i objedinjena ponavljanja ako je primjereno) i p-vrijednosti, ako postoje.

 

Rasprava o rezultatima

 

Zaključak

LITERATURA

1.

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Pariz.

2.

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

3.

Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., SAD, 61, 1306.–1312.

4.

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394.–403.

5.

Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121.–128.

6.

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235.–239.

7.

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17.–36.

8.

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147.–204.

9.

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297.–305.

10.

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789.–886.

11.

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439.–452.

12.

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177.–183.

13.

Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 584, 1.–256.

14.

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O’Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135.–141.

15.

Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9.–17.

16.

Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133.–147.

17.

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. U: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), Cambridge University Press, str. 66.–101.

18.

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193.–214.

19.

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165.–175.

20.

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411.–1415.

21.

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616.–9620.

22.

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Rukopis u pripremi).

23.

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261.–287.

24.

Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299.–305.

25.

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83.–90.

26.

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365.–373.

27.

Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347.–364.

28.

Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

29.

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175.–177.

30.

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. U: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, str. 85.–88.

31.

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55.–65.

32.

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51.–59.

33.

UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Dostupno na: [http://www.pops.int.html].

34.

Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147.–156.

35.

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7.–18.

36.

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7.–18.

37.

Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. U: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, str. 91.–103.

38.

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen., 5, 795.–801.

39.

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Na zahtjev dostupno kod Organizacije za gospodarsku suradnju i razvoj.

40.

Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36.–43.

41.

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

42.

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Dostupno na: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

43.

O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109.–118.

44.

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121–8.

45.

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87.–90.

46.

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Pariz.

47.

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. U: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, str. 141.–154.

48.

Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

Dodatak 1.

DEFINICIJE

Mutageni supstitucije baznih parova: kemikalije koje uzrokuju supstituciju baznih parova u DNK-u.

Kemikalija: tvar ili smjesa.

Učinkovitost kloniranja: postotak stanica nasađenih pri malenoj gustoći koje mogu narasti u koloniju koja se može prebrojiti.

Koncentracije: znači konačne koncentracije ispitivane kemikalije u mediju za uzgoj kulture.

Citotoksičnost: za testove obuhvaćene ovom ispitnom metodom citotoksičnost se definira kao smanjenje relativne stope preživljavanja tretiranih stanica u odnosu na negativnu kontrolu (vidjeti poseban stavak).

Napredna mutacija: genska mutacija od roditeljskog tipa u mutantni oblik, koja uzrokuje promjenu ili gubitak enzimskog djelovanja ili funkcije kodiranog proteina.

Mutageni pomaka okvira očitavanja (frameshift mutageni): kemikalije koje uzrokuju adiciju ili deleciju jednog baznog para ili više njih u molekuli DNK.

Genotoksičnost: opći izraz kojim su obuhvaćene sve vrste oštećenja DNK ili kromosoma uključujući lomove DNK, adukte, premještanja, mutacije, aberacije kromosoma i aneuploidiju. Ne dovode sve vrste genotoksičnih učinaka do mutacija ili trajnog oštećenja kromosoma.

HAT medij: medij koji sadržava hipoksantin, aminopterin i timidin, koji se koristi za odstranjivanje Hprt mutanata.

Mitotska rekombinacija: rekombinacija između homolognih kromatida koja može dovesti do indukcije lomova oba lanca DNK ili gubitka heterozigotnosti, a do koje dolazi tijekom mitoze.

MPA medij: medij koji sadržava ksantin, adenin, timidin, aminopterin i mikofenolnu kiselinu, koji se koristi za odstranjivanje Xprt mutanata.

Mutagen: uzrokuje nasljednu promjenu slijeda (sljedova) parova baza DNK u genima ili strukture kromosoma (kromosomske aberacije).

Učestalost pojave mutanata (MF): broj uočenih mutantnih kolonija podijeljen brojem stanica nasađenih u selektivni medij, koji se ispravlja učinkovitošću kloniranja (ili vijabilnosti) u trenutku selekcije.

Vrijeme fenotipske ekspresije: vrijeme nakon tretiranja tijekom kojeg se genetske modifikacije fiksiraju unutar genoma i postojeći genski produkti odstranjuju do te mjere da se mijenja fenotipsko svojstvo.

Relativna stopa preživljavanja (RS): relativna stopa preživljavanja upotrebljava se kao mjera citotoksičnosti povezane s tretiranjem. Relativna stopa preživljavanja je učinkovitost kloniranja stanica koje se nasade odmah nakon tretiranja, prilagođeno za mogući gubitak stanica tijekom tretiranja, u usporedbi s učinkovitošću kloniranja u negativnim kontrolama (kojima se dodjeljuje stopa preživljavanja od 100 %).

Frakcije jetre S9: supernatant homogenata jetre centrifugiran na 9 000 g, tj. ekstrakt sirove jetre.

Mješavina S9: mješavina frakcije jetre S9 i kofaktora potrebnih za djelovanje metaboličkih enzima.

Kontrola s otapalom: opći izraz za označivanje kontrolnih kultura kojima je dodano jedino otapalo koje je upotrijebljeno za otapanje ispitivane kemikalije.

Ispitivana kemikalija: svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.

Netretirana kontrola: kulture koje nisu ni s čim tretirane (tj. ni ispitivanom kemikalijom ni otapalom), ali se obrađuju istodobno i na isti način kao kulture tretirane ispitivanom kemikalijom.

UVCB: kemijske tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvodi i biološki materijali.

Dodatak 2.

FORMULE ZA PROCJENU CITOTOKSIČNOSTI I UČESTALOSTI POJAVE MUTANATA

Citotoksičnost se ocjenjuje relativnom stopom preživljavanja, tj. učinkovitošću kloniranja stanica koje se nasade odmah nakon tretiranja, prilagođeno za mogući gubitak stanica tijekom tretiranja, u usporedbi s prilagođenom učinkovitošću kloniranja u negativnim kontrolama (kojima se dodjeljuje stopa preživljavanja od 100 %) (vidjeti formulu za relativnu stopu preživljavanja u nastavku).

Prilagođena učinkovitost kloniranja za kulturu tretiranu ispitivanom kemikalijom računa se na sljedeći način:

Formula

Relativna stopa preživljavanja za kulturu tretiranu ispitivanom kemikalijom računa se na sljedeći način:

Formula

Učestalost pojave mutanata je učinkovitost kloniranja kolonija mutanata u selektivnom mediju podijeljeno učinkovitošću kloniranja u neselektivnom mediju koja se mjeri za istu kulturu u trenutku selekcije.

Formula

Kad se za učinkovitost kloniranja upotrebljavaju ploče:

CE (učinkovitost kloniranja) = broj kolonija / broj nasađenih stanica.

Kad se za učinkovitost kloniranja upotrebljavaju ploče s mikrojažicama:

broj kolonija po jažici na pločama s mikrojažicama slijedi Poissonovu distribuciju,

učinkovitost kloniranja = -LnP(0) / broj nasađenih stanica po jažici,

pri čemu je -LnP(0) vjerojatan broj praznih jažica od jažica u koje su nasađene stanice i dobiva se sljedećom formulom:

LnP(0) = -Ln (broj praznih jažica / broj jažica u koje su nasađene stanice);

(3)

u dijelu B poglavlje B.22. zamjenjuje se sljedećim:

„B.22.   ISPITIVANJE DOMINANTNIH LETALNIH GENA NA GLODAVCIMA

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 478 (2016.). Ispitne metode periodično se preispituju uzimajući u obzir znanstveni napredak, promjene regulatornih potreba i razmatranja o dobrobiti životinja. U ovoj izmijenjenoj verziji ispitne metode uzima se u obzir više od trideset godina iskustva s tim ispitivanjem i mogućnost integriranja ili kombiniranja tog ispitivanja s drugim ispitivanjima toksičnosti kao što su razvojne studije ili studije reproduktivne toksičnosti ili genotoksičnosti; međutim, zbog njegovih ograničenja i upotrebe velikog broja životinja, ovo ispitivanje nije namijenjeno za upotrebu kao primarna metoda, već kao dodatna ispitna metoda koja se može upotrebljavati samo ako ne postoji alternativa za regulatorne zahtjeve. Kombiniranjem ispitivanja toksičnosti stvara se mogućnost da se u ispitivanjima toksičnosti ne upotrijebi mnogo životinja. OECD je sastavio dokument u kojem se daju sažete informacije o ispitivanju u području genetske toksikologije te pregled novijih promjena smjernica OECD-a za ispitivanje genotoksičnosti (1.).

2.

Svrha je ispitivanja dominantnih letalnih gena ispitati uzrokuju li kemikalije mutacije koje su posljedica kromosomskih aberacija zametnih stanica. Osim toga, ispitivanje dominantnih letalnih gena relevantano je za ocjenu genotoksičnosti jer, iako se mogu razlikovati među vrstama, faktori in vivo metabolizma, farmakokinetika i procesi popravka DNK aktivni su i pridonose odgovorima. Indukcija mutacije dominantnih letalnih gena nakon izlaganja ispitivanoj kemikaliji ukazuje na činjenicu da je kemikalija djelovala na zametno tkivo ispitne životinje.

3.

Mutacije dominantnih letalnih gena uzrokuju embrionalnu ili fetalnu smrt. Indukcija mutacije dominantnih letalnih gena nakon izlaganja ispitivanoj kemikaliji ukazuje na činjenicu da je kemikalija djelovala na zametne stanice ispitne životinje.

4.

Test dominantnih letalnih gena koristan je kao potvrda pozitivnih rezultata ispitivanja u kojima se upotrebljavaju somatske in vivo krajnje točke te je relevantna krajnja točka za predviđanje rizika po ljude i rizika od genetskih bolesti koje se prenose zametnom lozom. Međutim, za taj je test potrebno mnogo životinja i sati rada; stoga je i vrlo skup te dugo traje. Budući da je spontana učestalost mutacija dominantnih letalnih gena prilično velika, osjetljivost testa za otkrivanje malih povećanja učestalosti mutacija općenito je ograničena.

5.

Definicije ključnih pojmova utvrđene su u Dodatku 1.

POČETNA RAZMATRANJA

6.

Ispitivanje se najčešće provodi na miševima (2., 3. i 4.), ali u određenim slučajevima mogu biti primjerene i druge vrste, kao što su štakori (5., 6., 7. i 8.), ako je to znanstveno opravdano. Dominantni letalni geni obično su rezultat velikih kromosomskih aberacija (strukturnih i numeričkih abnormalnosti) (9., 10. i 11.), ali ne mogu se isključiti genske mutacije. Mutacija dominantnih letalnih gena je mutacija do koje dolazi u zametnoj stanici automatski ili se fiksira nakon oplodnje u ranoj fazi embrija, a ne uzrokuje disfunkciju gamete, ali je smrtonosna za oplođeno jajašce ili embrij u razvoju.

7.

Svaki se mužjak u odgovarajućim vremenskim intervalima uzastopno pari sa ženkama koje se prethodno nisu parile. Broj parenja nakon tretiranja ovisi o krajnjoj svrsi istraživanja dominantnih letalnih gena (stavak 23.) i trebao bi osigurati da se sve faze sazrijevanja zametnih stanica mužjaka ocijene u pogledu dominantnih letalnih gena (12.).

8.

Ako postoje dokazi da ispitivana kemikalija ili njezini metaboliti neće dospjeti do sjemenika, ovaj oblik ispitivanja nije prikladan.

NAČELO ISPITIVANJA

9.

Obično se mužjaci izlažu ispitivanoj kemikaliji prikladnim načinom izlaganja te se pare s netretiranim ženkama koje se prethodno nisu parile. Različite vrste zametnih stanica mogu se ispitati primjenom uzastopnih intervala parenja. Nakon parenja ženke se nakon odgovarajućeg razdoblja eutanaziraju i njihove se maternice pregledavaju kako bi se utvrdio broj implantata te živih i mrtvih embrija. Dominantno letalno djelovanje ispitivane kemikalije utvrđuje se usporedbom živih implantata po ženki u tretiranoj skupini sa živim implantatima po ženki u kontrolnoj skupini s nosačem/otapalom. Povećanje broja mrtvih implantata po ženki u tretiranoj skupini u odnosu na broj mrtvih implantata po ženki u kontrolnoj skupini odražava postimplantacijski gubitak induciran ispitivanom kemikalijom. Postimplantacijski gubitak računa se utvrđivanjem omjera mrtvih implantata u odnosu na njihov ukupan broj u tretiranoj skupini u usporedbi s omjerom mrtvih implantata u odnosu na njihov ukupan broj u kontrolnoj skupini. Predimplantacijski gubitak može se procijeniti usporedbom broja žutih tijela umanjenog za ukupan broj implantata ili ukupnog broja implantata po ženki u tretiranoj i kontrolnoj skupini.

PROVJERA OSPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

10.

Osposobljenost za provedbu ovog ispitivanja trebalo bi utvrditi dokazivanjem sposobnosti reproduciranja učestalosti pojave mutacija dominantnih letalnih gena na temelju objavljenih podataka (npr. 13., 14., 15., 16., 17. i 18.) s tvarima za pozitivnu kontrolu (uključujući slabe odgovore) kao što su one navedene u tablici 1., i kontrolama s nosačem te postizanja učestalosti u negativnim kontrolama koje su u skladu s prihvatljivim rasponom podataka (vidjeti prethodna upućivanja) ili distribucijom prijašnjih kontrola laboratorija, ako su dostupni.

OPIS METODE

Pripreme

Odabir životinjske vrste

11.

Trebalo bi upotrebljavati zdrave, spolno zrele životinje sojeva koji se obično upotrebljavaju u laboratorijskim istraživanjima. Obično se upotrebljavaju miševi, iako i štakori mogu biti prikladan odabir. Moguća je uporaba bilo koje druge prikladne vrste sisavaca ako je to znanstveno opravdano u izvješću.

Uvjeti smještaja i hranjenja životinja

12.

U slučaju glodavaca, temperatura prostorije u kojoj se drže životinje trebala bi biti 22 °C (±3 °C). Iako bi u idealnim okolnostima relativna vlažnost trebala biti 50–60 %, ona bi trebala biti najmanje 40 %, a poželjno je da ne prelazi 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Rasvjeta bi trebala biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana uz neograničenu količinu vode za piće. Kad se ispitivana kemikalija primjenjuje ovim načinom izlaganja, na izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovarajuća primjesa ispitivane kemikalije. Prije tretiranja ili parenja glodavce bi trebalo držati u malim skupinama (najviše pet) istog spola ako se ne očekuje ili ne opazi agresivno ponašanje, po mogućnosti u čvrstim kavezima s primjereno obogaćenim okolišem. Ako je to znanstveno opravdano, životinje se mogu držati u zasebnim nastambama.

Priprema životinja

13.

Zdrave, spolno zrele mužjake i ženke nasumce se raspoređuje u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Pojedinačne životinje označuju se na jedinstven način upotrebom humane, najmanje invazivne metode (npr. prstenovanjem, stavljanjem oznaka, mikročipiranjem ili biometrijskom identifikacijom, ali ne rezanjem prsta i uha) i prilagođavaju laboratorijskim uvjetima najmanje pet dana. Kaveze bi trebalo rasporediti tako da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Trebalo bi izbjegavati unakrsnu kontaminaciju pozitivnom kontrolom i ispitivanom kemikalijom. Na početku istraživanja razlike u tjelesnoj masi životinja trebale bi biti minimalne i ne bi trebale prelaziti ±20 % srednje vrijednosti mase svakog spola.

Priprema doza

14.

Prije nego što se doza daje životinjama, krute ispitivane tvari po potrebi treba otopiti ili suspendirati u odgovarajućim otapalima ili nosačima ili dodati hrani ili vodi za piće. Tekuće ispitivane kemikalije mogu se dozirati izravno ili razrijediti prije doziranja. Za potrebe inhaliranja, ispitivane kemikalije mogu se primijeniti u obliku plina, pare ili krutog/tekućeg aerosola, ovisno o njihovim fizikalno-kemijskim svojstvima. Ako prema podacima o stabilnosti skladištenje nije prihvatljivo i ako nisu utvrđeni prikladni uvjeti skladištenja, preparate ispitivane kemikalije trebalo bi upotrebljavati svježe.

Ispitni uvjeti

Otapalo/nosač

15.

Pri upotrijebljenom volumenu doze otapalo/nosač ne smije imati toksične učinke i ne smije postojati sumnja da bi mogao kemijski reagirati s ispitivanom tvari. Ako se upotrebljavaju otapala/nosači koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje trebalo bi potkrijepiti referentnim podacima kojima se dokazuje njihova usklađenost. Kad je god moguće, preporučuje se najprije razmotriti mogućnost primjene vodenog otapala/nosača. Primjeri uobičajeno korištenih usklađenih otapala/nosača uključuju vodu, fiziološku otopinu, otopinu metil-celuloze, otopinu natrijeve soli karboksimetilne celuloze, maslinovo ulje i kukuruzno ulje.

Pozitivne kontrole

16.

Uvijek bi se trebale upotrebljavati životinje istodobnih pozitivnih kontrola, osim ako je laboratorij dokazao osposobljenost za provedbu ispitivanja te je u nedavnoj prošlosti rutinski upotrebljavao ispitivanje (npr. u posljednjih pet godina). Međutim, životinje pozitivnih kontrola nije potrebno tretirati istim putem izlaganja kao životinje koje primaju ispitivanu kemikaliju ili uzimati uzorke u svim intervalima parenja. Za tvari za pozitivnu kontrolu trebalo bi biti poznato da proizvode dominantne letalne gene u uvjetima koji se upotrebljavaju za ispitivanje. Izuzimajući tretiranje, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati jednako kao sa životinjama u tretiranim skupinama.

17.

Doze tvari za pozitivnu kontrolu trebale bi se odabrati tako da proizvode slabe ili umjerene učinke kojima se kritički procjenjuju uspješnost i osjetljivost ispitivanja, ali da dosljedno dovode do pozitivnih dominantno letalnih učinaka. Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu i primjerene doze navedeni su u tablici 1.

Tablica 1.

Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu

Tvar [CAS br.]

(referentni br.)

Raspon učinkovitih doza (mg/kg)

(vrsta glodavca)

Trajanje primjene (u danima)

Trietilenmelamin [51-18-3] (15.)

0,25 (miševi)

1

Ciklofosfamid [50-18-0] (19.)

50–150 (miševi)

5

Ciklofosfamid [50-18-0] (5.)

25–100 (štakori)

1

Etil metansulfonat [62-50-0] (13.)

100–300 (miševi)

5

Monomerni akrilamid [79-06-1] (17.)

50 (miševi)

5

Klorambucil [305-03-3] (14.)

25 (miševi)

1

Negativne kontrole

18.

Životinje negativne kontrole, koje se tretiraju samo s otapalom ili nosačem i koje su osim toga tretirane na jednak način kao i skupine za tretiranje, trebale bi biti uključene u svako vrijeme uzorkovanja (20.). Ako ne postoje prijašnji ili objavljeni kontrolni podaci kojima se dokazuje da odabrano otapalo ili nosač ne inducira dominantne letalne gene ili druge štetne učinke, netretirane kontrolne životinje također bi trebale biti uključene u svako vrijeme uzorkovanja kako bi se utvrdila prihvatljivost kontrole s nosačem.

POSTUPAK

Broj životinja

19.

Svaki se mužjak u odgovarajućim unaprijed utvrđenim vremenskim intervalima (npr. u tjednim intervalima, stavci 21. i 23.) uzastopno pari, po mogućnosti s jednom ženkom koja se prethodno nije parila. Broj mužjaka po skupini treba unaprijed utvrditi kako bi bio dovoljan (u kombinaciji s brojem parenih ženki u svakom intervalu parenja) za osiguravanje statističke snage potrebne kako bi se otkrilo barem udvostručenje učestalosti pojave dominantnih letalnih gena (stavak 44.)

20.

Broj ženki po intervalu parenja isto treba unaprijed utvrditi izračunima statističke snage kako bi se omogućilo otkrivanje barem udvostručenja učestalosti pojave dominantnih letalnih gena (tj. dovoljan broj gravidnih ženki kako bi se ukupno dobilo najmanje 400 implantata) (20., 21., 22. i 23.) i tako da se očekuje najmanje jedan mrtvi implantat po jedinici analize (tj. skupini parenja po dozi) (24.).

Razdoblje primjene i intervali parenja

21.

Broj intervala parenja koji slijedi nakon tretiranja određen je režimom tretiranja i trebao bi osigurati ocjenjivanje svih faza sazrijevanja zametnih stanica mužjaka u pogledu induciranja dominantnih letalnih gena (12. i 25.). Kod jednog tretiranja u kojem se primjenjuje do pet dnevnih doza trebalo bi provesti osam (miševi) ili deset (štakori) parenja u tjednim intervalima nakon posljednjeg tretiranja. Kod primjene više doza broj intervala parenja može se smanjiti razmjerno produljenju razdoblja primjene, ali tako da se zadrži cilj ocjenjivanja svih faza spermatogeneze (npr. kod miševa su nakon 28-dnevnog izlaganja dovoljna samo četiri tjedna parenja kako bi se ocijenile sve faze spermatogeneze). Svi režimi tretiranja i parenja trebali bi biti znanstveno opravdani.

22.

Ženke bi trebale ostati s mužjacima barem tijekom jednog ciklusa estrusa (npr. kod miševa i štakora jedan tjedan obuhvaća jedan ciklus estrusa). Ženke koje se nisu parile tijekom jednotjednog intervala mogu se upotrijebiti za sljedeći interval parenja. Ili dok ne dođe do parenja, što se utvrđuje na temelju prisutnosti sperme u vagini ili na temelju prisutnosti vaginalnog čepa.

23.

Izlaganje i režim parenja koji se primjenjuju ovise o krajnjoj svrsi istraživanja dominantne letalnosti. Ako je cilj utvrditi inducira li određena kemikalija mutacije dominantnih letalnih gena automatski, tad bi prihvatljiva metoda bila izlaganje cijelog ciklusa spermatogeneze (npr. sedam tjedana kod miševa, 5–7 tretiranja tjedno) i jedno parenje na kraju ciklusa. Međutim, ako je cilj utvrditi vrstu zametnih stanica osjetljivu na induciranje dominantnih letalnih gena, prednost se daje jednom ili petodnevnom izlaganju nakon kojeg slijedi tjedno parenje.

Visine doza

24.

Ako se provodi preliminarno istraživanje za određivanje raspona jer još nisu dostupni prikladni podaci koji bi pomogli u odabiru doza, trebalo bi ga provesti u istom laboratoriju primjenom iste vrste, soja, spola i režima tretiranja kao i u glavnom istraživanju (26.). Istraživanjem bi se trebala odrediti maksimalna podnošljiva doza (MTD), koja je definirana kao najviša doza koja će se podnijeti bez dokaza o toksičnosti ograničene istraživanjem, povezane s trajanjem istraživanja (na primjer, neuobičajeno ponašanje ili reakcije, manji gubitak tjelesne mase ili hematopoetska sustavna citotoksičnost), isključujući smrt ili dokaze o boli, patnji ili stresu zbog kojih se zahtijeva humana eutanazija (27.).

25.

Maksimalna podnošljiva doza ne smije negativno utjecati ni na uspjeh parenja (21.).

26.

Ispitivane kemikalije s posebnim biološkim djelovanjem u slabim netoksičnim dozama (kao što su hormoni i mitogeni) i kemikalije koje pokazuju zasićenost toksikokinetičkih svojstava mogu se izuzeti iz kriterija u pogledu određivanja doza i trebale bi se procjenjivati od slučaja do slučaja.

27.

Kako bi se dobile informacije o odgovoru na dozu, potpuno istraživanje trebalo bi uključivati negativnu kontrolnu skupinu i minimalno tri visine doze pri čemu je svaka uglavnom dvostruko veća od prethodne, ali najviše četverostruko. Ako ispitivana kemikalija u istraživanju za određivanje raspona ili na temelju postojećih podataka ne izaziva toksičnost, najviša doza za jednu primjenu trebala bi biti 2 000 mg/kg tjelesne mase. Međutim, ako ispitivana kemikalija uzrokuje toksičnost, MTD bi trebao biti najviša primijenjena doza i poželjno je da se primijenjenim visinama doze obuhvati raspon od maksimalne doze do doze koja izaziva malu toksičnost ili ne izaziva toksičnost. Za netoksične kemikalije granična doza za razdoblje primjene od 14 dana ili više iznosi 1 000 mg/kg tjelesne mase dnevno, a za razdoblja primjene kraća od 14 dana granična doza iznosi 2 000 mg/kg tjelesne mase dnevno.

Primjena doza

28.

Pri planiranju testa u obzir bi trebalo uzeti očekivani način izlaganja kod ljudi. Stoga se, ako je to opravdano, mogu odabrati načini izlaganja kao što su unos s hranom, unos s vodom za piće, potkožna primjena, intravenozna primjena, lokalna primjena, inhalacija, oralna primjena (oralna intubacija) ili implantacija. U svakom slučaju, način izlaganja trebalo bi odabrati tako da se osigura prikladno izlaganje ciljnog tkiva. Intraperitonealna injekcija obično se ne preporučuje jer nije način izlaganja namijenjen ljudima i trebalo bi je upotrebljavati samo uz posebno znanstveno opravdanje. Ako se ispitivana kemikalija dodaje hrani ili vodi za piće, posebno u slučaju primjene jedne doze, trebalo bi voditi računa o tome da se osigura dostatno vrijeme od unosa hrane i vode do parenja kako bi se omogućilo otkrivanje učinaka (stavak 31.). Maksimalni volumen tekućine koji se odjednom može primijeniti oralnom intubacijom ili injekcijom ovisi o veličini ispitne životinje. Taj volumen obično ne bi trebao biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim u slučaju vodenih otopina kod kojih je dopušteno upotrijebiti maksimalno 2 ml/100 g. Primjene većih volumena od navedenog (ako je dopušteno zakonodavstvom o dobrobiti životinja) treba opravdati. Variranje ispitnih volumena treba svesti na minimum podešavanjem koncentracije kako bi se kod svih visina doza osigurao stalni volumen u odnosu na tjelesnu masu.

Opažanja

29.

Najmanje jednom dnevno treba provoditi opća klinička opažanja o ispitnim životinjama i zabilježiti kliničke znakove, po mogućnosti svaki dan u isto vrijeme ili vremena, vodeći računa o razdoblju najvećeg intenziteta očekivanih učinaka nakon doziranja. Najmanje dvaput dnevno tijekom razdoblja primjene doze, kod svih životinja treba provjeriti ima li slučajeva morbiditeta ili smrtnosti. Sve bi životinje trebalo izvagati na početku istraživanja i najmanje jednom tjedno tijekom istraživanja s ponovljenim dozama te prilikom eutanazije. Unos hrane treba mjeriti najmanje jednom tjedno. Ako se ispitivana kemikalija daje s vodom za piće, unos vode trebalo bi mjeriti pri svakoj promjeni vode i najmanje jednom tjedno. Životinje koje pokazuju nesmrtonosne pokazatelje prekomjerne toksičnosti trebalo bi eutanazirati prije dovršetka razdoblja ispitivanja (27.).

Prikupljanje i obrada tkiva

30.

Ženke se eutanaziraju u drugoj polovini gravidnosti, na 13. dan gestacije kod miševa i 14.–15. dan kod štakora. Maternice se pregledavaju s obzirom na dominantno letalne učinke kako bi se utvrdio broj implantata, živih i mrtvih embrija te žutih tijela.

31.

Rog maternice i jajnici izlažu se kako bi se prebrojala žuta tijela, a fetusi se uklanjaju, broje i važu. Trebalo bi oprezno pregledati maternice kako bi se otkrile resorpcije koje mogu prikriti živi fetusi i kako bi se osiguralo da se nabroje sve resorpcije. Bilježi se fetalna smrtnost. Bilježi se i broj uspješno oplođenih ženki i ukupan broj implantacija, predimplantacijskih gubitaka i postimplantacijska smrtnost (uključujući rane i kasne resorpcije). Osim toga, vidljivi fetusi mogu se čuvati u Bouinovu fiksativu najmanje dva tjedna, nakon čega slijedi pregled kojim se utvrđuju velike vanjske deformacije (28.) kako bi se dobile dodatne informacije o reproduktivnim i razvojnim učincima ispitnog agensa.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Obrada rezultata

32.

Podatke treba prikazati u obliku tablice iz koje se može vidjeti broj mužjaka koji su se parili, broj gravidnih ženki i broj negravidnih ženki. Rezultate svakog parenja, uključujući identifikacijsku oznaku svakog mužjaka i ženke, treba bilježiti pojedinačno. Za svaku ženku trebalo bi navesti interval parenja, visinu doze za tretirane mužjake i broj živih i mrtvih implantata.

33.

Postimplantacijski gubitak računa se utvrđivanjem omjera mrtvih implantata u odnosu na njihov ukupan broj iz tretirane skupine u usporedbi s omjerom mrtvih implantata u odnosu na njihov ukupan broj iz kontrolne skupine s nosačem/otapalom.

34.

Predimplantacijski gubitak računa se kao razlika između broja žutih tijela i broja implantata ili kao smanjenje prosječnog broja implantata po ženki u usporedbi s parenjima u kontrolnoj skupini. Ako su procijenjeni gubici prije implantacije, treba ih zabilježiti.

35.

Čimbenik dominantne letalnosti procjenjuje se kao: (broj postimplantacijskih smrti / ukupan broj implantacija po ženki) × 100.

36.

Treba izvijestiti o podacima o toksičnosti i kliničkim znakovima (u skladu sa stavkom 29.).

Kriteriji prihvatljivosti

37.

Prihvatljivost ispitivanja utvrđuje se na temelju sljedećih kriterija.

Istodobna negativna kontrola u skladu je s objavljenim normama za podatke o prijašnjim negativnim kontrolama i podacima laboratorija o prijašnjim kontrolama, ako su dostupni (vidjeti stavke 10. i 18.).

Istodobne pozitivne kontrole induciraju odgovore koji su u skladu s objavljenim normama za podatke o prijašnjim pozitivnim kontrolama ili bazom podataka laboratorija o prijašnjim pozitivnim kontrolama, ako je dostupno, i dovode do statistički značajnog povećanja u usporedbi s negativnom kontrolom (vidjeti stavke 17. i 18.).

Analiziran je odgovarajući ukupan broj implantata i doza (stavak 20.).

Kriteriji za odabir najviše doze u skladu su s kriterijima opisanima u stavcima 24. i 27.

Ocjenjivanje i tumačenje rezultata

38.

Treba analizirati barem tri skupine tretirane dozom da bi se prikupilo dovoljno podataka za analizu doze i odgovora.

39.

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno pozitivnom:

ako najmanje jedna od ispitnih doza pokazuje statistički značajno povećanje u usporedbi s istodobnom negativnom kontrolom,

ako je povećanje povezano s dozom u najmanje jednom pokusnom uvjetu (npr. tjedni interval parenja) kad se ocjenjuje odgovarajućim testom, i

ako je bilo koji od rezultata izvan prihvatljivog raspona podataka o negativnim kontrolama ili distribucije podataka laboratorija o prijašnjim negativnim kontrolama (npr. kontrolne granice od 95 % prema Poissonovoj distribuciji), ako su dostupni.

Tad se smatra da ispitivana kemikalija može inducirati mutacije dominantnih letalnih gena u zametnim stanicama ispitnih životinja. Preporuke za najprikladnije statističke metode opisane su u stavku 44.; drugi preporučeni statistički pristupi mogu se pronaći i u literaturi (20., 21., 22., 24. i 29.). Upotrijebljena statistička ispitivanja trebala bi kao pokusnu jedinicu uzimati životinju.

40.

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno negativnom:

ako ni pri jednoj ispitnoj dozi nije zapaženo statistički značajno povećanje u odnosu na istodobnu negativnu kontrolu,

ako ni u jednom pokusnom uvjetu nema povećanja povezanog s dozom, i

ako su svi rezultati unutar prihvatljivog raspona podataka o negativnim kontrolama ili podataka o prijašnjim negativnim kontrolama laboratorija (npr. kontrolne granice od 95 % prema Poissonovoj distribuciji), ako su dostupni.

Tad se smatra da ispitivana kemikalija ne može inducirati mutacije dominantnih letalnih gena u zametnim stanicama ispitnih životinja.

41.

Jasan pozitivan ili negativan odgovor nije potrebno provjeriti.

42.

Ako odgovor nije jasno negativan ili pozitivan i kako bi se pomoglo utvrditi biološku relevantnost rezultata (npr. slabo ili granično povećanje), podatke bi trebalo ocjenjivati na temelju stručne prosudbe i/ili daljnjih istraživanja uz upotrebu postojećih eksperimentalnih podataka, kao što su razmatranja o tome je li pozitivan rezultat izvan prihvatljivog raspona podataka o negativnim kontrolama ili podataka laboratorija o prijašnjim negativnim kontrolama (30.).

43.

U rijetkim slučajevima, čak i nakon dodatnih istraživanja, skup podataka neće omogućiti donošenje zaključka o tome je li rezultat pozitivan ili negativan te će se stoga zaključiti da je dvosmislen.

44.

Upotrijebljena statistička ispitivanja trebala bi kao pokusnu jedinicu uzimati mužjaka. Iako je moguće da podaci o broju (npr. broj implantata po ženki) mogu odgovarati Poissonovoj distribuciji i/ili da udjeli (npr. udio mrtvih implantata) mogu biti binomno distribuirani, ti su podaci često previše raspršeni (31.). U skladu s tim, u statističkoj analizi prvo bi se trebao primijeniti test za veću ili manju raspršenost upotrebom testa varijance kao što je Cochranov test binomne varijance (32.) ili Taroneov C(α) test za binomnu veću raspršenost (31. i 33.). Ako se ne otkrije odstupanje od binomne raspršenosti, trendovi udjela u svim visinama doza mogu se ispitati upotrebom Cochran-Armitageova testa trenda (34.), a usporedba u parovima s kontrolnom skupinom može se ispitati upotrebom Fisherova egzaktnog testa (35.). Isto tako, ako se ne otkrije odstupanje od Poissonove raspršenosti, trendovi u brojevima mogu se ispitati upotrebom Poissonove regresije (36.), a usporedba u parovima s kontrolnom skupinom može se ispitati u kontekstu Poissonova modela upotrebom kontrasta u parovima (36.). Ako se otkrije znatno veća ili manja raspršenost, preporučuju se neparametarske metode (23. i 31.). One obuhvaćaju testove koji se temelje na rangovima, kao što su Jonckheere-Terpstraov test trenda (37.) i Mann-Whitneyjevi testovi (38.) za usporedbu u parovima s kontrolnom skupinom s nosačem/otapalom te testovi permutacija, ponovnog uzorkovanja i samonadopunjavanja (bootstrap) za trendove i usporedbe u parovima s kontrolnom skupinom (31. i 39.).

45.

Pozitivni test dominantnih letalnih gena pruža dokaze o genotoksičnosti ispitivane kemikalije u zametnim stanicama tretiranog mužjaka ispitne vrste.

46.

Pri procjeni biološke važnosti odgovora kao orijentacija mogu poslužiti razmatranje o tome jesu li uočene vrijednosti unutar ili izvan raspona prijašnjih kontrola (40.).

Izvješće o ispitivanju

47.

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije.

Sažetak

 

Ispitivana kemikalija:

izvor, broj serije, rok uporabe, ako su dostupni,

stabilnost ispitivane kemikalije, ako je poznata,

topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu, ako su poznate,

izmjerene vrijednosti za pH, osmolalnost i taloženje u mediju za uzgoj kulture u koji je dodana ispitivana kemikalija, prema potrebi.

 

Tvar s jednim sastojkom:

fizički izgled, topljivost u vodi i druga relevantna fizikalno-kemijska svojstva,

kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv, CAS broj, SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula, čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd.

 

Tvari s više sastojaka, UVCB tvari i smjese:

opis (koliko je to moguće) kemijskog identiteta (vidjeti gore), kvantitativnog udjela i relevantnih fizikalno-kemijskih svojstava sastojaka.

 

Priprema ispitivane kemikalije:

obrazloženje za odabir nosača,

topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu/nosaču, ako su poznate,

priprema formulacija koje se unose s hranom, vodom za piće ili udisanjem,

analitička određivanja formulacija (npr. stabilnost, homogenost, nominalne koncentracije), ako se provode.

 

Ispitne životinje:

vrsta/soj te obrazloženje tog odabira,

broj, dob i spol životinja,

podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd.,

metoda jedinstvenog identificiranja životinja,

za kratkotrajna istraživanja: pojedinačna tjelesna masa mužjaka na početku i na kraju ispitivanja; za istraživanja dulja od tjedan dana: pojedinačna tjelesna masa tijekom istraživanja i unos hrane. Trebalo bi uključiti raspon tjelesne mase, srednju vrijednost i standardno odstupanje za svaku skupinu.

 

Ispitni uvjeti:

podaci o pozitivnim i negativnim kontrolama (nosač/otapalo),

podaci iz istraživanja za određivanje raspona,

obrazloženje odabira visine doze,

pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije,

pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,

obrazloženje odabira načina primjene,

metode mjerenja toksičnosti životinje, uključujući, ako je dostupno, histopatološke ili hematološke analize i učestalost kojom su obavljeni promatranje i vaganje životinje,

metode kojima se provjerava je li ispitivana kemikalija dospjela u ciljno tkivo ili krvotok, ako se dobiju negativni rezultati,

stvarna doza (mg/kg tjelesne mase/dan) izračunata na temelju koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće (ppm) i unosa hrane/vode, ako je primjenjivo,

pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,

pojedinosti o obogaćivanju okoliša u kavezu,

detaljan opis režima tretiranja i uzorkovanja te obrazloženje tih odabira,

metoda analgezije,

metoda eutanazije,

postupak izdvajanja i očuvanja tkiva,

izvor i serijski brojevi sve opreme i reagensa (ako je primjenjivo),

metode prebrojavanja dominantnih letalnih gena,

režim parenja,

metode korištene da bi se utvrdilo da je došlo do parenja,

vrijeme eutanazije,

kriteriji za ocjenjivanje dominantno letalnih učinaka, uključujući žuta tijela, implantacije, resorpcije i predimplantacijske gubitke, žive implantate i mrtve implantate.

 

Rezultati:

stanje životinje prije i tijekom razdoblja ispitivanja, uključujući znakove toksičnosti,

tjelesna masa mužjaka tijekom razdoblja tretiranja i parenja,

broj parenih ženki,

odnos doze i odgovora, ako je to moguće,

podaci o istodobnim i prijašnjim negativnim kontrolama s rasponima, srednjim vrijednostima i standardnim odstupanjima,

podaci o istodobnim pozitivnim kontrolama,

tablični podaci za svaku ženku (majku), uključujući: broj žutih tijela po ženki; broj implantacija po ženki; broj resorpcija i predimplantacijskih gubitaka po ženki; broj živih implantata po ženki; broj mrtvih implantata po ženki; težine fetusa,

prethodno navedeni podaci sažeti za svako razdoblje parenja i dozu, s učestalostima pojave mutacija dominantnih letalnih gena,

primijenjene statističke analize i metode.

 

Rasprava o rezultatima.

 

Zaključak.

LITERATURA

1.

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Pariz.

2.

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) str. 235.–334., Elsevier, Amsterdam.

3.

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group „Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173.–185.

4.

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159.–167.

5.

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267.–270.

6.

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77.–74.

7.

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325.–329.

8.

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80.–85.

9.

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239.–249.

10.

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616.–624.

11.

Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112.–129.

12.

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169.–172.

13.

Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21.–27.

14.

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167.–180.

15.

Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371.–378.

16.

James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303.–314.

17.

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35.–40.

18.

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143.–156.

19.

Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, str. 129.–156.

20.

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19.–30.

21.

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313.–318.

22.

Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124.–141.

23.

Haseman J.K. and Soares E.R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277.–288.

24.

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353.–360.

25.

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417.–429.

26.

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313.–319.

27.

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

28.

Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291.–306.

29.

Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

30.

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87.–90.

31.

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35.–58.

32.

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10:103. 417.–451.

33.

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585.–590.

34.

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. U Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), str. 334.–336. John Wiley and Sons, New York.

35.

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

36.

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, poglavlja 14. i 17. McGraw-Hill, Boston.

37.

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133.–145.

38.

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York.

39.

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

40.

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Dodatak 1.

DEFINICIJE

Kemikalija: tvar ili smjesa

Žuto tijelo (tijela): struktura koja luči hormone i koja nastaje na jajniku na mjestu folikula koji je ispustio jajašce. Broj žutih tijela u jajnicima odgovara broju jajašaca koja su ovulirala.

Mutacija dominantnih letalnih gena: mutacija do koje dolazi u zametnoj stanici ili koja se fiksira nakon oplodnje, a uzrokuje embrionalnu ili fetalnu smrt.

Stopa plodnosti: broj parenih gravidnih ženki u odnosu na broj parenih ženki.

Interval parenja: vrijeme od kraja izlaganja do parenja tretiranih mužjaka. Kontrolom tog intervala mogu se procijeniti kemijski učinci na različite vrste zametnih stanica. Kod miševa koji se pare tijekom 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. i 8. tjedna nakon kraja izlaganja mjere se učinci na spermu, kondenzirane spermatide, okrugle spermatide, spermatocite u fazi pahitena, rane spermatocite, diferencirane spermatogonije, diferencirajuće spermatogonije i matične spermatogonije.

Predimplantacijski gubitak: razlika između broja implantata i broja žutih tijela. Može se procijeniti i usporedbom ukupnog broja implantata po ženki u tretiranoj i kontrolnoj skupini.

Predimplantacijski gubitak: omjer mrtvih implantata u tretiranoj skupini u usporedbi s omjerom mrtvih implantata u odnosu na njihov ukupan broj u kontrolnoj skupini.

Ispitivana kemikalija: svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.

UVCB: kemijske tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvodi i biološki materijali.

Dodatak 2.

TIJEK SPERMATOGENEZE U SISAVACA

Image 1

Slika 1.: Usporedba trajanja (u danima) razvoja muških zametnih stanica u miševa, štakora i ljudi. Do popravka DNK ne dolazi tijekom razdoblja koja su osjenčana.

Gore je prikazan shematski prikaz spermatogeneze u miševa, štakora i ljudi (preuzeto iz Adler, 1996.). Nediferencirane spermatogonije uključuju: spermatogonije tipa As, Apr i Aal (Hess i de Franca, 2008.). As se smatra pravom matičnom stanicom; stoga od posljednje injekcije ispitivane kemikalije do parenja mora proći najmanje 49 dana (kod miševa) kako bi se procijenili učinci na zametne stanice.

Referentni dokumenti

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169.–172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. U: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1.–15.

(4)

u dijelu B poglavlje B.23. zamjenjuje se sljedećim:

„B.23.   ISPITIVANJE KROMOSOMSKIH ABERACIJA U SPERMATOGONIJAMA SISAVACA

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 483 (2016.). Ispitne metode periodično se preispituju uzimajući u obzir znanstveni napredak, promjene regulatornih potreba i razmatranja o dobrobiti životinja. U ovoj izmijenjenoj verziji ispitne metode uzimaju se u obzir godine iskustva s tim testom i mogućnost integriranja ili kombiniranja tog ispitivanja s drugim studijama toksičnosti ili genotoksičnosti. Kombiniranjem studija toksičnosti može se smanjiti broj životinja koje se upotrebljavaju u ispitivanjima toksičnosti. Ova je ispitna metoda dio niza ispitnih metoda u području genetske toksikologije. OECD je sastavio dokument u kojem se daju sažete informacije o ispitivanju u području genetske toksikologije te pregled novijih promjena smjernica OECD-a za ispitivanje genotoksičnosti (1.).

2.

Svrha je in vivo testa kromosomskih aberacija u spermatogonijama sisavaca utvrditi kemikalije koje uzrokuju strukturne kromosomske aberacije u spermatogonijskim stanicama sisavaca (2., 3. i 4.). Osim toga, ovo je ispitivanje relevantno za ocjenu genotoksičnosti jer, iako se mogu razlikovati među vrstama, faktori in vivo metabolizma, farmakokinetika i procesi popravka DNK aktivni su i pridonose odgovorima. Ova ispitna metoda nije namijenjena mjerenju numeričkih abnormalnosti; test se ne upotrebljava rutinski u tu svrhu.

3.

Ovim se ispitivanjem mjere strukturne kromosomske aberacije (i kromosomskog i kromatidnog tipa) u spermatogonijskim zametnim stanicama u fazi diobe te se stoga očekuje da se tim ispitivanjem može predvidjeti indukcija nasljednih mutacija u tim zametnim stanicama.

4.

Definicije ključnih pojmova utvrđene su u Dodatku.

POČETNA RAZMATRANJA

5.

U ovom ispitivanju obično se upotrebljavaju glodavci, ali i druge vrste mogu biti prikladne u određenim slučajevima, ako je to znanstveno opravdano. Standardni citogenetski preparati sjemenika glodavaca daju mitotske (spermatogonije) i mejotske (spermatocit) metafaze. Mitotske i mejotske metafaze utvrđuju se na temelju morfologije kromosoma (4.). Ovim se in vivo citogenetskim testom otkrivaju strukturne kromosomske aberacije pri spermatogonijskoj mitozi. Druge ciljne stanice nisu predmet ove ispitne metode.

6.

Kako bi se moglo otkriti aberacije kromatidnog tipa u spermatogonijskim stanicama, treba ispitati prvu mitotsku diobu stanica nakon tretiranja, prije nego što se te aberacije pretvore u aberacije kromosomskog tipa u kasnijim staničnim diobama. Dodatne informacije o tretiranim spermatocitima mogu se dobiti analizom strukturnih kromosomskih aberacija kod kromosoma tijekom mejoze u dijakinezi-metafazi I i metafazi II.

7.

U sjemeniku se nalaze brojne generacije spermatogonija (5.) i te različite vrste zametnih stanica mogu biti različito osjetljive na tretiranje kemikalijama. Prema tome, uočene aberacije predstavljaju skupnu reakciju tretiranih populacija spermatogonijskih stanica. Većinu mitotskih stanica u preparatima sjemenika čine spermatogonije tipa B, koje imaju stanični ciklus od približno 26 sati (3.).

8.

Ako postoje dokazi da ispitivana kemikalija ili njezini metaboliti neće dospjeti do sjemenika, ovaj oblik ispitivanja nije prikladan.

NAČELO ISPITNE METODE

9.

Obično se životinje izlažu ispitivanoj kemikaliji prikladnim načinom izlaganja i eutanaziraju u odgovarajućim trenucima nakon tretiranja. Prije eutanazije životinje se tretiraju agensom za zaustavljanje metafaze (npr. kolhicinom ili Colcemidom®). Nakon toga naprave se i oboje kromosomski preparati zametnih stanica te se analizom utvrđuje je li došlo do kromosomskih aberacija metafaznih stanica.

PROVJERA OSPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

10.

Osposobljenost za provedbu ovog testa trebalo bi utvrditi dokazivanjem sposobnosti reproduciranja očekivanih rezultata za učestalost pojave kromosomske aberacije kod spermatogonija s tvarima za pozitivnu kontrolu (uključujući slabe odgovore), kao što su one navedene u tablici 1., te postizanja učestalosti u negativnim kontrolama koje su u skladu s prihvatljivim rasponom podataka o kontrolama u objavljenoj literaturi (npr. 2., 3., 6., 7., 8., 9. i 10.) ili distribucijom prijašnjih kontrola laboratorija, ako su dostupni.

OPIS METODE

Pripreme

Odabir životinjske vrste

11.

Trebalo bi upotrebljavati zdrave, mlade odrasle životinje sojeva koji se obično upotrebljavaju u laboratorijskim istraživanjima. Obično se upotrebljavaju mužjaci miševa; međutim, mogu se upotrebljavati mužjaci drugih prikladnih vrsta sisavaca ako za to postoji znanstveno opravdanje i ako se time omogućuje da se ispitivanje provodi zajedno s drugom ispitnom metodom. U izvješću bi trebalo navesti znanstveno opravdanje za uporabu drugih vrsta osim glodavaca.

Uvjeti smještaja i hranjenja životinja

12.

U slučaju glodavaca, temperatura prostorije u kojoj se drže životinje trebala bi biti 22 °C (±3 °C). Iako bi u idealnim okolnostima relativna vlažnost trebala biti 50–60 %, ona bi trebala biti najmanje 40 %, a poželjno je da ne prelazi 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Rasvjeta bi trebala biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana uz neograničenu količinu vode za piće. Kad se ispitivana kemikalija primjenjuje ovim načinom izlaganja, na izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovarajuća primjesa ispitivane kemikalije. Glodavci bi trebali biti smješteni u malim skupinama (ne više od pet po kavezu) ako se ne očekuje agresivno ponašanje, po mogućnosti u kavezima s čvrstim podom i uz prikladno obogaćivanje okoliša. Ako je to znanstveno opravdano, životinje se mogu držati u zasebnim nastambama.

Priprema životinja

13.

Obično se upotrebljavaju zdravi mladi odrasli mužjaci (stari 8–12 tjedana na početku tretiranja) te se nasumce raspoređuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Pojedinačne životinje označuju se na jedinstven način upotrebom humane, najmanje invazivne metode (npr. prstenovanjem, stavljanjem oznaka, mikročipiranjem ili biometrijskom identifikacijom, ali ne rezanjem uha ili prsta) i prilagođavaju laboratorijskim uvjetima najmanje pet dana. Kaveze bi trebalo rasporediti tako da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Trebalo bi izbjegavati unakrsnu kontaminaciju pozitivnom kontrolom i ispitivanom kemikalijom. Na početku istraživanja variranje tjelesne mase pojedinačnih životinja treba biti što manje i ne smije prelaziti ±20 %.

Priprema doza

14.

Prije nego što se doza daje životinjama, krute ispitivane tvari po potrebi treba otopiti ili suspendirati u odgovarajućim otapalima ili nosačima ili dodati hrani ili vodi za piće. Tekuće ispitivane kemikalije mogu se dozirati izravno ili razrijediti prije doziranja. Za potrebe inhaliranja, ispitivane kemikalije mogu se primijeniti u obliku plina, pare ili krutog/tekućeg aerosola, ovisno o njihovim fizikalno-kemijskim svojstvima. Ako prema podacima o stabilnosti skladištenje nije prihvatljivo i ako nisu utvrđeni prikladni uvjeti skladištenja, preparate ispitivane kemikalije trebalo bi upotrebljavati svježe.

Ispitni uvjeti – otapalo/nosač

15.

Pri visinama doza koje se primjenjuju otapalo/nosač ne smije imati toksične učinke i ne smije postojati sumnja da bi mogao kemijski reagirati s ispitivanim kemikalijama. Ako se upotrebljavaju otapala/nosači koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje trebalo bi potkrijepiti referentnim podacima kojima se dokazuje njihova usklađenost. Kad je god moguće, preporučuje se najprije razmotriti mogućnost primjene vodenog otapala/nosača. Primjeri uobičajeno korištenih usklađenih otapala/nosača uključuju vodu, fiziološku otopinu, otopinu metil-celuloze, otopinu natrijeve soli karboksimetilne celuloze, maslinovo ulje i kukuruzno ulje. Ako ne postoje prijašnji ili objavljeni podaci o kontrolama kojima se dokazuje da odabranim atipičnim otapalom/nosačem nisu inducirane strukturne kromosomske aberacije ili drugi štetni učinci, trebalo bi provesti početno istraživanje kako bi se utvrdila prihvatljivost kontrole s otapalom/nosačem.

Pozitivne kontrole

16.

Uvijek bi se trebale upotrebljavati životinje istodobnih pozitivnih kontrola, osim ako je laboratorij dokazao osposobljenost za provedbu ispitivanja te je u nedavnoj prošlosti rutinski upotrebljavao ispitivanje (npr. u posljednjih pet godina). Ako nije uključena istodobna pozitivna kontrolna skupina, u svaki pokus trebalo bi uključiti kontrole ocjenjivanja (fiksirana i nebojena predmetna stakalca). One se mogu dobiti uključivanjem u ocjenjivanje istraživanja prikladnih referentnih uzoraka koji su dobiveni i pohranjeni iz zasebnog pokusa s pozitivnom kontrolom koji se provodi periodično (npr. svakih šest do 18 mjeseci) u laboratoriju u kojem se provodi ispitivanje; na primjer, tijekom ispitivanja osposobljenosti laboratorija i redovito nakon toga, ako je potrebno.

17.

Tvari za pozitivnu kontrolu trebale bi pouzdano izazvati zamjetno povećanje učestalosti stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama iznad spontanih razina. Doze pozitivnih kontrola trebalo bi odabrati tako da učinci budu jasni, ali da analitičar ne može odmah vidjeti identitet kodiranih uzoraka. Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu navedeni su u tablici 1.

Tablica 1.

Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu

Tvari [CAS br.] (referentni br.)

Ciklofosfamid (monohidrat) [CAS br. 50-18-0 (CAS br. 6055-19-2)] (9.)

Cikloheksilamin [CAS br. 108-91-8] (7.)

Mitomicin C [CAS br. 50-07-7] (6.)

Monomerni akrilamid [CAS 79-06-1] (10.)

Trietilenmelamin [CAS 51-18-3] (8.)

Negativne kontrole

18.

Životinje negativne kontrole, koje se tretiraju samo s otapalom ili nosačem, a inače se tretiraju jednako kao skupine za tretiranje, trebale bi biti uključene u svako vrijeme uzorkovanja. Ako ne postoje prijašnji ili objavljeni kontrolni podaci kojima se dokazuje da odabrano otapalo ili nosač ne inducira nikakve kromosomske aberacije ili druge štetne učinke, i netretirane kontrolne životinje trebale bi biti uključene u svako vrijeme uzorkovanja kako bi se utvrdila prihvatljivost kontrole s nosačem.

POSTUPAK

Broj životinja

19.

Na početku istraživanja trebalo bi utvrditi veličine skupina kako bi se po skupini osiguralo minimalno pet mužjaka. Taj se broj životinja smatra dovoljnim za dobivanje primjerene statističke snage (tj. općenito se može otkriti barem udvostručenje učestalosti pojave kromosomske aberacije kad je razina negativne kontrole 1,0 % ili veća s 80-postotnom vjerojatnošću pri razini značajnosti od 0,05) (3. i 11.). Kao smjernica za uobičajene maksimalne zahtjeve u pogledu životinja, za istraživanje s dva vremena uzorkovanja, s tri skupine koje primaju dozu i istodobnom negativnom kontrolnom skupinom plus pozitivnom kontrolnom skupinom (pri čemu se svaka skupina sastoji od pet životinja) bilo bi potrebno 45 životinja.

Režim tretiranja

20.

Ispitivane kemikalije obično se primjenjuju jednom (tj. kao jednokratno tretiranje); mogu se primjenjivati i drugi režimi doziranja uz uvjet da su znanstveno opravdani.

21.

Kod skupine na koju se primjenjuje najviša doza uzorci se uzimaju dvaput nakon tretiranja. Budući da vrijeme potrebno za apsorpciju i metabolizam ispitivane kemikalije ili kemikalija, kao i njezino djelovanje na kinetiku staničnog ciklusa, mogu utjecati na optimalno vrijeme za otkrivanje kromosomskih aberacija, jedno se uzorkovanje obavlja ranije, a jedno kasnije, približno 24 sata i 48 sati nakon tretiranja. Kod ostalih doza ranije uzorke treba uzeti 24 sata nakon tretiranja (manje od trajanja staničnog ciklusa spermatogonija tipa B ili jednako tom trajanju, čime se poboljšava vjerojatnost ocjene prve metafaze nakon tretiranja), osim ako je poznato da je neko drugo vrijeme uzorkovanja primjerenije i opravdano.

22.

Uzorci se mogu uzeti i u neko drugo vrijeme. Na primjer, u slučaju kemikalija koje imaju učinke neovisne o S-fazi, uzorkovanja može biti primjereno obaviti ranije (tj. u razdoblju kraćem od 24 sata).

23.

Može se upotrijebiti režim ponovljenih doza tretiranja, na primjer, zajedno s ispitivanjem na drugoj krajnjoj točki kod koje se upotrebljava razdoblje primjene od 28 dana (npr. ispitna metoda B.58.); međutim, bile bi potrebne dodatne skupine životinja kako bi se uzela u obzir različita vremena uzorkovanja. U skladu s tim, primjerenost tog režima treba znanstveno opravdati od slučaja do slučaja.

24.

Prije eutanazije životinjama se intraperitonealno ubrizgava odgovarajuća doza kemikalije za zaustavljanje metafaze (npr. Colcemid® ili kolhicin). Zatim se nakon odgovarajućeg vremenskog intervala životinje podvrgavaju uzorkovanju. Za miševe i štakore taj interval iznosi približno 3–5 sati.

Visine doza

25.

Ako se provodi preliminarno istraživanje za određivanje raspona doza jer još nisu dostupni prikladni podaci koji bi pomogli u odabiru doza, trebalo bi ga provesti u istom laboratoriju primjenom iste vrste, soja i režima tretiranja kao i u glavnom istraživanju, u skladu s preporukama za provođenje istraživanja za određivanje raspona doza (12.). Tim bi se istraživanjem trebala odrediti maksimalna podnošljiva doza (MTD), koja se definira kao doza koja inducira blage toksične učinke povezane s trajanjem istraživanja (na primjer, neuobičajeno ponašanje ili reakcije, manji gubitak tjelesne mase ili hematopoetska sustavna citotoksičnost), ali ne inducira smrt ili znakove boli, patnje ili stresa zbog kojih bi životinju trebalo eutanazirati (13.).

26.

Najviša se doza može definirati i kao doza pri kojoj se javljaju određeni znakovi toksičnosti u spermatogonijskim stanicama (npr. smanjenje omjera spermatogonijskih mitoza u odnosu na prvu i drugu mejotsku metafazu). Navedeno smanjenje ne bi smjelo prelaziti 50 %.

27.

Ispitivane kemikalije s posebnim biološkim djelovanjem u slabim netoksičnim dozama (kao što su hormoni i mitogeni) i kemikalije koje pokazuju zasićenost toksikokinetičkih svojstava mogu se izuzeti iz kriterija u pogledu određivanja doza i trebale bi se procjenjivati od slučaja do slučaja.

28.

Kako bi se dobile informacije o odgovoru na dozu, potpuno istraživanje trebalo bi uključivati negativnu kontrolnu skupinu (stavak 18.) i minimalno tri visine doze pri čemu je svaka uglavnom dvostruko veća od prethodne, ali najviše četverostruko. Ako ispitivana kemikalija u istraživanju za određivanje raspona ili na temelju postojećih podataka ne izaziva toksičnost, najviša doza za jednu primjenu trebala bi biti 2 000 mg/kg tjelesne mase. Međutim, ako ispitivana kemikalija uzrokuje toksičnost, MTD bi trebao biti najviša primijenjena doza i poželjno je da se primijenjenim visinama doze obuhvati raspon od maksimalne doze do doze koja izaziva malu toksičnost ili ne izaziva toksičnost. Ako je toksičnost ciljnog tkiva (tj. sjemenika) zapažena pri svim ispitanim visinama doza, preporučuje se daljnje istraživanje pri netoksičnim dozama. Za istraživanja čiji je cilj potpunije opisati kvantitativne informacije o odgovoru na dozu mogu biti potrebne dodatne skupine koje primaju dozu. Za određene vrste ispitivanih kemikalija (npr. za farmaceutske proizvode namijenjene ljudima) obuhvaćene posebnim zahtjevima ta se ograničenja mogu razlikovati. Ako ispitivana kemikalija uzrokuje toksičnost, trebala bi se odabrati granična doza i dvije manje doze (kako je prethodno opisano). Granična doza za razdoblje primjene od 14 dana ili više iznosi 1 000 mg/kg tjelesne mase dnevno, a za razdoblja primjene kraća od 14 dana granična doza iznosi 2 000 mg/kg tjelesne mase dnevno.

Primjena doza

29.

Pri planiranju testa u obzir bi trebalo uzeti očekivani način izlaganja ljudi. Stoga se, ako je to opravdano, mogu odabrati načini izlaganja kao što su unos s hranom, unos s vodom za piće, lokalna primjena potkožno, intravenozna primjena, oralna primjena (oralna intubacija), udisanje ili implantacija. U svakom bi slučaju odabrani put trebao biti takav da se osigura odgovarajuća izloženost ciljnog tkiva. Intraperitonealna injekcija obično se ne preporučuje, osim ako je znanstveno opravdana, jer obično nije fiziološki odgovarajući put izlaganja ljudi. Ako se ispitivana kemikalija dodaje hrani ili vodi za piće, posebno u slučaju primjene jedne doze, trebalo bi voditi računa o tome da se osigura dostatno vrijeme od unosa hrane i vode do uzorkovanja kako bi se omogućilo otkrivanje učinaka (vidjeti stavak 33.). Maksimalni volumen tekućine koji se odjednom može primijeniti oralnom intubacijom ili injekcijom ovisi o veličini ispitne životinje. Taj volumen obično ne bi trebao biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim u slučaju vodenih otopina kod kojih je dopušteno upotrijebiti maksimalno 2 ml/100 g tjelesne mase. Primjene većih volumena od navedenog (ako je dopušteno zakonodavstvom o dobrobiti životinja) treba opravdati. Variranje ispitnih volumena treba svesti na minimum podešavanjem koncentracije kako bi se kod svih visina doza osigurao stalni volumen u odnosu na tjelesnu masu.

Opažanja

30.

Najmanje jednom dnevno treba provoditi opća klinička opažanja o ispitnim životinjama i zabilježiti kliničke znakove, po mogućnosti svaki dan u isto vrijeme ili vremena, vodeći računa o razdoblju najvećeg intenziteta očekivanih učinaka nakon doziranja. Najmanje dvaput dnevno kod svih životinja treba provjeriti ima li slučajeva morbiditeta ili smrtnosti. Sve životinje trebalo bi izvagati na početku istraživanja, najmanje jednom tjedno tijekom istraživanja s ponovljenim dozama, i prilikom eutanazije. U istraživanjima koja traju najmanje tjedan dana trebalo bi najmanje jednom tjedno mjeriti unos hrane. Ako se ispitivana kemikalija daje s vodom za piće, trebalo bi mjeriti unos vode pri svakoj promjeni vode i najmanje jednom tjedno. Životinje koje pokazuju nesmrtonosne pokazatelje prekomjerne toksičnosti trebalo bi eutanazirati prije dovršetka razdoblja ispitivanja (13.).

Kromosomski pripravak

31.

Odmah po eutanaziji životinje napravi se suspenzija zametnih stanica iz jednog ili oba sjemenika, koja se izlaže hipotoničkoj otopini i fiksira primjenom utvrđenih protokola (npr. 2., 14. i 15.). Zatim se stanice razmažu po mikroskopskom stakalcu i oboje (16. i 17.). Sva bi stakalca trebalo kodirati tako da analitičar ne zna njihov identitet.

Analiza

32.

Za svaku životinju treba pregledati najmanje 200 dobro raširenih metafaza (3. i 11.). Ako je učestalost u prijašnjim negativnim kontrolama < 1 %, trebalo bi pregledati više od 200 stanica po životinji kako bi se povećala statistička snaga (3.). Trebale bi se upotrebljavati metode bojenja koje omogućuju utvrđivanje centromera.

33.

Aberacije kromosomskog i kromatidnog tipa trebalo bi zabilježiti odvojeno i klasificirati prema podtipovima (lomovi, zamjene). Prekide bi trebalo zabilježiti, ali ne i uzimati u obzir, prilikom utvrđivanja inducira li kemikalija znatna povećanja učestalosti stanica s kromosomskim aberacijama. U postupcima koji se primjenjuju u laboratoriju trebalo bi osigurati da analizu kromosomskih aberacija provode dobro osposobljeni analitičari. Uzimajući u obzir da postupci pripreme predmetnih stakalaca često za posljedicu imaju lom jednog dijela metafaza uz posljedični gubitak kromosoma, stanice koje se pregledavaju trebale bi stoga sadržavati broj centromera koji nije manji od 2n± 2, pri čemu je n haploidan broj kromosoma za tu vrstu.

34.

Iako je svrha ovog ispitivanja otkrivanje strukturnih kromosomskih aberacija, važno je zabilježiti učestalost poliploidnih stanica i stanica s endoredupliciranim kromosomima ako se opaze te pojave (vidjeti stavak 44.).

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Obrada rezultata

35.

Podatke o pojedinačnim životinjama trebalo bi prikazati u tabličnom obliku. Za svaku životinju treba odrediti broj stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama i broj kromosomskih aberacija po stanici. Aberacije kromatidnog i kromosomskog tipa, klasificirane prema podtipovima (lomovi, zamjene), trebalo bi navesti odvojeno, s njihovim brojem i učestalošću za pokusne i kontrolne skupine. Prekidi se bilježe zasebno. Iako se bilježi učestalost kromosomskih prekida, ona se općenito ne uključuje u analizu ukupne učestalosti strukturnih kromosomskih aberacija. Postotak poliploidnih stanica i stanica s endoredupliciranim kromosomima bilježi se ako su zapažene takve stanice.

36.

Treba izvijestiti o podacima o toksičnosti i kliničkim znakovima (u skladu sa stavkom 30.).

Kriteriji prihvatljivosti

37.

Prihvatljivost ispitivanja utvrđuje se na temelju sljedećih kriterija.

Istodobna negativna kontrola u skladu je s objavljenim normama za podatke o negativnim kontrolama iz prijašnjih istraživanja, kod kojih se obično očekuje > 0 % i ≤ 1,5 % stanica s kromosomskim aberacijama, i podacima o prijašnjim kontrolama laboratorija, ako su dostupni (vidjeti stavke 10. i 18.).

Istodobne pozitivne kontrole induciraju odgovore koji su u skladu s objavljenim normama za podatke o prijašnjim pozitivnim kontrolama ili bazom podataka laboratorija o prijašnjim podacima o pozitivnoj kontroli, ako je dostupna, i dovode do statistički značajnog povećanja u usporedbi s negativnom kontrolom (vidjeti stavke 17. i 18.).

Analiziran je odgovarajući broj stanica i doza (vidjeti stavke 28. i 32.).

Kriteriji za odabir najviše doze u skladu su s kriterijima opisanima u stavcima 25. i 26.

38.

Ako se promatraju i mitoza i mejoza, omjer spermatogonijskih mitoza u odnosu na prvu i drugu mejotsku metafazu treba utvrditi kao mjerilo citotoksičnosti za sve tretirane životinje i životinje negativne kontrole, na ukupnom uzorku od 100 stanica u fazi diobe po životinji. Ako se promatra samo mitoza, potrebno je utvrditi mitotski indeks u barem 1 000 stanica za svaku životinju.

Ocjenjivanje i tumačenje rezultata

39.

Treba analizirati barem tri skupine tretirane dozom da bi se prikupili odgovarajući podaci za analizu doze i odgovora.

40.

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno pozitivnom:

ako najmanje jedna od ispitnih doza pokazuje statistički značajno povećanje u usporedbi s istodobnom negativnom kontrolom,

ako je u najmanje jednom vremenu uzorkovanja to povećanje povezano s dozom, te

ako je bilo koji od rezultata izvan prihvatljivog raspona podataka o negativnim kontrolama ili distribucije podataka o prijašnjim negativnim kontrolama laboratorija (npr. kontrolne granice od 95 % prema Poissonovoj distribuciji), ako su dostupni.

Tad se smatra da ispitivana kemikalija može inducirati kromosomske aberacije spermatogonijskih stanica ispitnih životinja. Preporuke o najprikladnijim statističkim metodama dostupne su i u literaturi (11. i 18.). Upotrijebljena statistička ispitivanja trebala bi kao pokusnu jedinicu uzimati životinju.

41.

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno negativnom:

ako ni pri jednoj ispitnoj dozi nije zapaženo statistički značajno povećanje u odnosu na istodobnu negativnu kontrolu,

ako ni u jednom pokusnom uvjetu nema povećanja povezanog s dozom, te

ako su svi rezultati unutar prihvatljivog raspona podataka o negativnim kontrolama ili podataka o prijašnjim negativnim kontrolama laboratorija (npr. kontrolne granice od 95 % prema Poissonovoj distribuciji), ako su dostupni.

Tad se smatra da ispitivana kemikalija ne može inducirati kromosomske aberacije spermatogonijskih stanica ispitnih životinja. Preporuke o najprikladnijim statističkim metodama dostupne su i u literaturi (11. i 18.). Negativan rezultat ne isključuje mogućnost da kemikalija može inducirati kromosomske aberacije u kasnijim fazama razvoja koje se ne istražuju, ili genske mutacije.

42.

Jasan pozitivan ili jasan negativan odgovor nije potrebno provjeriti.

43.

Ako odgovor nije jasno negativan ili pozitivan i kako bi se pomoglo utvrditi biološku relevantnost rezultata (npr. slabo ili granično povećanje), podatke bi trebalo ocjenjivati na temelju stručne prosudbe i/ili daljnjih istraživanja uz upotrebu postojećih eksperimentalnih podataka, kao što su razmatranja o tome je li pozitivan rezultat izvan prihvatljivog raspona podataka o negativnim kontrolama ili podataka laboratorija o prijašnjim negativnim kontrolama (19.).

44.

U rijetkim slučajevima, čak i nakon dodatnih istraživanja, skup podataka neće omogućiti donošenje zaključka o tome je li rezultat pozitivan ili negativan te će se stoga zaključiti da je dvosmislen.

45.

Povećanje broja poliploidnih stanica može značiti da ispitivana kemikalija može inhibirati mitotske procese i inducirati numeričke kromosomske aberacije (20.). Povećanje broja stanica s endoredupliciranim kromosomima može značiti da ispitivana kemikalija može inhibirati progresiju staničnog ciklusa (21. i 22.), a to je drugačiji mehanizam induciranja numeričkih kromosomskih promjena od inhibiranja mitotskih procesa (vidjeti stavak 2.). Stoga bi učestalost poliploidnih stanica i stanica s endoredupliciranim kromosomima trebalo zabilježiti odvojeno.

Izvješće o ispitivanju

46.

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:

 

Sažetak.

 

Ispitivana kemikalija:

izvor, broj serije, rok uporabe, ako su dostupni,

stabilnost ispitivane kemikalije, ako je poznata,

topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu, ako su poznate,

izmjerene vrijednosti za pH, osmolalnost i taloženje u mediju za uzgoj kulture u koji je dodana ispitivana kemikalija, prema potrebi.

 

Tvar s jednim sastojkom:

fizički izgled, topljivost u vodi i druga relevantna fizikalno-kemijska svojstva,

kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv, CAS broj, SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula, čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd.

 

Tvari s više sastojaka, UVCB tvari i smjese:

opis (koliko je to moguće) kemijskog identiteta (vidjeti gore), kvantitativnog udjela i relevantnih fizikalno-kemijskih svojstava sastojaka.

 

Priprema ispitivane kemikalije:

obrazloženje za odabir nosača,

topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu/nosaču,

priprema formulacija koje se unose s hranom, vodom za piće ili udisanjem,

analitička određivanja formulacija (npr. stabilnost, homogenost, nominalne koncentracije ako se provode.

 

Ispitne životinje:

vrsta/soj te obrazloženje njihove uporabe,

broj i dob životinja,

podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd.,

metoda jedinstvenog identificiranja životinja,

za kratkotrajna istraživanja: pojedinačna tjelesna masa životinja na početku i na kraju ispitivanja; za istraživanja dulja od tjedan dana: pojedinačna tjelesna masa tijekom istraživanja i unos hrane. Trebalo bi uključiti raspon tjelesne mase, srednju vrijednost i standardno odstupanje za svaku skupinu.

 

Ispitni uvjeti:

podaci o pozitivnim i negativnim kontrolama (nosač/otapalo),

podaci iz istraživanja o utvrđivanju raspona, ako je provedeno,

obrazloženje odabira visine doze,

obrazloženje odabira načina primjene,

pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije,

pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,

obrazloženje za vremena usmrćivanja životinja,

metode mjerenja toksičnosti životinje, uključujući, ako je dostupno, histopatološke ili hematološke analize i učestalost kojom su obavljeni promatranje i vaganje životinje,

metode kojima se provjerava je li ispitivana kemikalija dospjela u ciljno tkivo ili krvotok, ako se dobiju negativni rezultati,

stvarna doza (mg/kg tjelesne mase/dan) izračunata na temelju koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće (ppm) i unosa hrane/vode, ako je primjenjivo,

pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,

detaljan opis režima tretiranja i uzorkovanja te obrazloženje tih odabira,

metoda eutanazije,

metoda analgezije (ako se primjenjuje),

postupci izdvajanja tkiva,

naziv (identifikacijska oznaka) kemikalije za zaustavljanje metafaze, njezina koncentracija i trajanje primjene,

metode pripreme predmetnih stakalaca,

kriteriji za ocjenu aberacija,

broj analiziranih stanica po životinji,

kriteriji prema kojima se istraživanje smatra pozitivnim, negativnim ili dvosmislenim.

 

Rezultati:

stanje životinje prije i tijekom razdoblja ispitivanja, uključujući znakove toksičnosti,

mase tijela i organa prije usmrćivanja (ako se primjenjuje više tretiranja, mase tijela izmjerene tijekom režima tretiranja),

znakovi toksičnosti,

mitotski indeks,

omjer spermatogonijskih mitotskih stanica u odnosu na prvu i drugu mejotsku metafazu, ili drugi dokaz izloženosti ciljnom tkivu,

vrsta i broj aberacija, navedeni za svaku životinju zasebno,

ukupan broj aberacija po skupini sa srednjim vrijednostima i standardnim odstupanjima,

broj stanica s aberacijama po skupini sa srednjim vrijednostima i standardnim odstupanjima,

odnos doze i odgovora, ako je to moguće,

primijenjene statističke analize i metode,

podaci o istodobnim negativnim kontrolama,

podaci o prijašnjim negativnim kontrolama, zajedno s rasponima, srednjim vrijednostima, standardnim devijacijama i intervalom pouzdanosti od 95 % (ako je dostupan) ili objavljeni podaci o prijašnjim negativnim kontrolama koji se upotrebljavaju za prihvatljivost rezultata ispitivanja,

podaci o istodobnim pozitivnim kontrolama,

promjene ploidije ako su zapažene, uključujući učestalost poliploidnih i/ili endoredupliciranih stanica.

 

Rasprava o rezultatima

 

Zaključak

LITERATURA

1.

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Pariz.

2.

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. U: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, str. 275.–306.

3.

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313.–318.

4.

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167.–189.

5.

Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. U: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, str. 1.–15.

6.

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368.–379. Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. U: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, str. 477.–484.

7.

Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472.–474.

8.

Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371.–375.

9.

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135.–140.

10.

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313.–324.

11.

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19.–30.

12.

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313.–319.

13.

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

14.

Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207.–209.

15.

Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291.–294.

16.

Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289.–294.

17.

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, U: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 115.–141.

18.

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays U: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 184.–232.

19.

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87.–90.

20.

Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29.–46.

21.

Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362.–1364.

22.

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403.–413.

Dodatak

DEFINICIJE

Aneuploidija: svako odstupanje od uobičajenog diploidnog (ili haploidnog) broja kromosoma za jedan kromosom ili više njih, ali ne za cijelu skupinu ili skupine kromosoma (poliploidija).

Centromera: područje ili područja kromosoma s kojima su tijekom stanične diobe povezane niti diobenog vretena, čime se omogućuje uredno kretanje kromosoma kćeri prema polovima stanica kćeri.

Kemikalija: tvar ili smjesa.

Raznolikost kromosoma: raznolikost oblika kromosoma (npr. metacentrični, akrocentrični itd.) i njihovih veličina.

Aberacija kromatidnog tipa: strukturno oštećenje kromosoma izraženo kao lom pojedinačnih kromatida ili lom i ponovno spajanje kromatida.

Aberacija kromosomskog tipa: strukturno oštećenje kromosoma izraženo kao lom ili lom i ponovno spajanje obiju kromatida na istom mjestu.

Klastogen: svaka kemikalija koja uzrokuje strukturne kromosomske aberacije u populacijama stanica ili organizama.

Prekid: akromatska lezija manja od širine jedne kromatide i s minimalnim otklonom kromatida.

Genotoksičnost: opći izraz kojim su obuhvaćene sve vrste oštećenja DNK ili kromosoma uključujući lomove, delecije, adukte, modifikacije i povezivanje nukleotida, premještanja, mutacije, aberacije kromosoma i aneuploidiju. Ne dovode sve vrste genotoksičnih učinaka do mutacija ili trajnog oštećenja kromosoma.

Mitotski indeks: omjer stanica u metafazi podijeljen s ukupnim brojem stanica zapaženih u populaciji stanica; pokazatelj stupnja proliferacije te populacije.

Mitoza: dioba stanične jezgre koja je obično podijeljena na profazu, prometafazu, metafazu, anafazu i telofazu.

Mutagen: uzrokuje nasljednu promjenu slijeda (sljedova) parova baza DNK u genima ili strukture kromosoma (kromosomske aberacije).

Numerička abnormalnost: promjena u broju kromosoma u odnosu na normalni broj koji je karakterističan za korištene životinje.

Poliploidija: višekratnik haploidnog broja kromosoma (n) osim diploidnog broja (tj. 3n, 4n itd.).

Strukturna aberacija: promjena u strukturi kromosoma koja se može otkriti mikroskopskim pregledom diobe stanica u metafazi, zapažena kao delecije i fragmenti, zamjene.

Ispitivana kemikalija: svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.

UVCB: kemijske tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvodi i biološki materijali.;

(5)

u dijelu B poglavlje B.40. zamjenjuje se sljedećim:

„B.40.   NAGRIZANJE KOŽE IN VITRO: ISPITNA METODA TRANSKUTANOG ELEKTRIČNOG OTPORA (TER)

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 430 (2015.). Nagrizanje kože odnosi se na izazivanje ireverzibilnog oštećenja kože koje se manifestira kao vidljiva nekroza koja kroz epidermu prodire u dermu nakon primjene ispitivane kemikalije [kako je utvrđeno Globalno usklađenim sustavom razvrstavanja i označivanja kemikalija (GHS) Ujedinjenih naroda (UN) (1.) i Uredbom (EZ) br. 1272/2008 o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa (CLP) (1) Europske unije]. Ova ažurirana ispitna metoda B.40. pruža in vitro postupak kojim se omogućuje utvrđivanje nagrizajućih i nenagrizajućih tvari i smjesa u skladu s UN GHS-om (1.) i CLP-om.

2.

Procjena nagrizajućeg djelovanja na kožu obično je obuhvaćala primjenu laboratorijskih životinja (ispitna metoda B.4., ekvivalentna Smjernici OECD-a za ispitivanje 404 koja je izvorno donesena 1981. i revidirana 1992., 2002. i 2015.) (2.). Uz sadašnju ispitnu metodu B.40., validirane su i donesene druge ispitne metode in vitro za ispitivanje potencijala kemikalija da uzrokuju nagrizanje kože, kao što su ispitna metoda B.40.bis (ekvivalentna Smjernici OECD-a za ispitivanje 431) (3.) i ispitna metoda B.65. (ekvivalentna Smjernici OECD-a za ispitivanje 435) (4.), kojima se mogu utvrditi i potkategorije korozivnih kemikalija ako je potrebno. Doneseno je nekoliko validiranih ispitnih metoda in vitro, kao što je ispitna metoda B.46. (ekvivalentna Smjernici OECD-a za ispitivanje 439 (5.), koje treba upotrebljavati za ispitivanje nadraženosti kože. U Smjernicama OECD-a o integriranim pristupima ispitivanju i procjeni (IATA) za nagrizanje i nadraživanje kože opisano je nekoliko modula u kojima se grupiraju različiti izvori informacija i alati za analizu te se pružaju smjernice o i. načinu integriranja i uporabe postojećih podataka o ispitivanju i podataka koji se dobivaju bez ispitivanja za procjenu potencijala kemikalija da uzrokuju nadraživanje i nagrizanje kože te ii. predlaganju pristupa kad je potrebno daljnje ispitivanje (6.).

3.

Ova se ispitna metoda bavi konačnim učinkom nagrizanja kože na zdravlje ljudi. Temelji se na ispitnoj metodi transkutanog električnog otpora (TER) na koži štakora kod koje se upotrebljavaju diskovi kože kako bi se identificirale nagrizajuće tvari prema njihovoj sposobnosti da dovedu do gubitka integriteta i funkcije barijere normalnog stratum corneum. Odgovarajuća smjernica OECD-a za ispitivanje izvorno je donesena 2004. i ažurirana je 2015. kako bi se odnosila na smjernice o IATA-i.

4.

Kako bi se u regulatorne svrhe ocijenilo in vitro ispitivanje nagrizanja kože provedene su predvalidacijske studije (7.) nakon čega je slijedila službena validacijska studija ispitne metode TER-a na koži štakora za procjenu nagrizanja kože (8., 9., 10. i 11.). Rezultati tih studija doveli su do preporuke da bi se ispitna metoda TER-a (imenovana validiranom referentnom metodom) mogla upotrebljavati u regulatorne svrhe za procjenu in vivo nagrizajućeg djelovanja na kožu (12., 13. i 14.).

5.

Prije nego što se predložena slična ili izmijenjena ispitna metoda TER-a in vitro za nagrizanje kože, koja nije validirana referentna metoda, može upotrijebiti u regulatorne svrhe, trebalo bi utvrditi njezinu pouzdanost, relevantnost (točnost) i ograničenja za njezinu predloženu uporabu kako bi se osigurala njezina sličnost s validiranom referentnom metodom, u skladu sa zahtjevima izvedbe (15.). OECD-ovo uzajamno prihvaćanje podataka jamčit će se samo nakon što se svaka predložena nova ili ažurirana ispitna metoda koja je u skladu sa zahtjevima izvedbe pregleda i uključi u odgovarajuću smjernicu OECD-a za ispitivanje.

DEFINICIJE

6.

Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku.

POČETNA RAZMATRANJA

7.

Validacijskom studijom (10.) i drugim objavljenim studijama (16. i 17.) utvrđeno je da se ispitnom metodom TER-a na koži štakora mogu razlikovati poznate tvari s nagrizajućim djelovanjem na kožu od tvari koje na kožu ne djeluju nagrizajuće uz ukupnu osjetljivost od 94 % (51/54) i specifičnost od 71 % (48/68) za bazu podataka od 122 tvari.

8.

Ova se ispitna metoda bavi nagrizanjem kože in vitro. Omogućuje identifikaciju ispitivanih kemikalija koje ne djeluju nagrizajuće i onih koje djeluju nagrizajuće u skladu s UN GHS-om ili CLP-om. Ograničenje ove ispitne metode, kako je pokazano validacijskim studijama (8., 9., 10. i 11.), jest to što ne omogućuje daljnje razvrstavanje nagrizajućih tvari i smjesa u skladu s UN GHS-om ili CLP-om. Primjenjivim regulatornim okvirom utvrdit će se način upotrebe ove ispitne metode. Iako se ovom ispitnom metodom ne dobivaju primjerene informacije o nadraživanju kože, trebalo bi napomenuti da se ispitna metoda B.46. posebno bavi učinkom koji nadraživanje kože in vitro ima na zdravlje (5.). Za potpunu evaluaciju lokalnih učinaka na kožu nakon jednostrukog dermalnog izlaganja potrebno je proučiti Smjernice OECD-a o IATA-i (6.).

9.

Tijekom validacijske studije na kojoj se temelji ova ispitna metoda ispitan je širok raspon kemikalija koje uglavnom čine tvari, a empirijskom bazom podataka validacijske studije bilo je obuhvaćeno 60 tvari koje su obuhvaćale širok raspon kemijskih razreda (8. i 9.). Na temelju svih podataka koji su dostupni, ispitna metoda primjenjiva je na širok raspon kemijskih razreda i agregatnih stanja, uključujući tekućine, polukrute i krute tvari te voskove. Međutim, budući da za posebna agregatna stanja nisu lako raspoložive ispitivane stavke s odgovarajućim referentnim podacima, trebalo bi napomenuti da je tijekom validacije procijenjen relativno malen broj voskova i nagrizajućih krutih tvari. Tekućine mogu biti vodene i bezvodne; krute tvari mogu biti topljive ili netopljive u vodi. U slučajevima u kojima se može dokazati da se ispitna metoda ne može primijeniti za ispitivanje specifične kategorije tvari, tu ispitnu metodu ne bi trebalo upotrebljavati za tu specifičnu kategoriju tvari. Osim toga, pretpostavlja se da se ova ispitna metoda može primijeniti na smjese kao proširenje njezine primjenjivosti na tvari. Međutim, budući da smjese obuhvaćaju široki spektar kategorija i sastava te da su trenutačno dostupne samo ograničene informacije o ispitivanju smjesa, u slučajevima u kojima se može dokazati da se ispitna metoda ne može primijeniti za ispitivanje specifične kategorije smjesa (npr. primjenom strategije koju su predložili Eskes i dr., 2012.) (18.), ispitnu metodu ne bi trebalo upotrebljavati za tu specifičnu kategoriju smjesa. Prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se te, ako se mogu, zašto se njome mogu dobiti primjereni rezultati za tu svrhu. Ta razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese. Plinovi i aerosoli još nisu ocijenjeni u validacijskim studijama (8. i 9.). Iako je moguće da se oni mogu ispitati upotrebom ispitne metode TER-a, trenutačnom ispitnom metodom nije omogućeno ispitivanje plinova i aerosola.

NAČELO ISPITIVANJA

10.

Ispitivana kemikalija primjenjuje se u trajanju do 24 sata na epidermalne površine diskova kože u dvodijelnom ispitnom sustavu u kojem diskovi kože djeluju kao pregrada između dva odjeljka. Diskovi kože uzeti su od humano usmrćenih štakora u dobi od 28 do 30 dana. Nagrizajuće kemikalije identificirane su prema sposobnosti da dovedu do gubitka integriteta i funkcije barijere normalnog stratum corneum, što se mjeri kao smanjenje TER vrijednosti ispod razine praga (16.) (vidjeti stavak 32.). Za TER vrijednosti za kožu štakora, vrijednost praga u iznosu od 5 kΩ odabrana je na temelju mnogobrojnih podataka za širok raspon tvari kod kojih je velika većina vrijednosti jasno bila ili znatno iznad (često > 10 kΩ), ili znatno ispod (često < 3 kΩ) te vrijednosti (16.). Općenito, ispitivane kemikalije koje na životinje ne djeluju nagrizajuće, već su nadražujuće ili nenadražujuće, ne smanjuju TER ispod te vrijednosti praga. Nadalje, uporaba drugih preparata kože ili druge opreme može modificirati vrijednost praga, što znači da je potrebna dodatna validacija.

11.

U ispitni postupak ugrađena je i faza vezanja boje kojom se potvrđuju pozitivni rezultati za TER u vrijednostima od približno 5 kΩ. Postupkom vezanja boje određuje se može li se povećanje ionske permeabilnosti pripisati fizičkom uništenju stratum corneum. Pokazalo se da se TER metodom uz primjenu kože štakora može predvidjeti nagrizajuće djelovanje in vivo kod kunića koji su procjenjivani ispitnom metodom B.4. (2.).

DOKAZIVANJE OSPOSOBLJENOSTI

12.

Prije rutinske upotrebe ispitne metode TER-a na koži štakora koja je u skladu s ovom ispitnom metodom laboratoriji bi trebali dokazati tehničku osposobljenost pravilnim utvrđivanjem kategorije dvanaest tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti koje su preporučene u tablici 1. U slučajevima u kojima nije dostupna navedena tvar ili ako je to opravdano, može se upotrijebiti druga tvar za koju su dostupni primjereni referentni in vivo i in vitro podaci (npr. s popisa referentnih kemikalija (16.)) pod uvjetom da se primjenjuju isti kriteriji za odabir kao oni opisani u tablici 1.

Tablica 1.

Popis tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti  (2)

Tvar

CAS br.

Kemijski razred (3)

Kat. sustava UN GHS-a ili CLP-a na temelju in vivo rezultata (4)

Kat. VRM-a na temelju in vitro rezultata

Agregatno stanje

pH (5)

Tvari koje djeluju nagrizajuće in vivo

N,N’-dimetil dipropilentriamin

10563-29-8

organska baza

1.A

6 × C

Tekuće

8,3

1,2-diaminopropan

78-90-0

organska baza

1.A

6 × C

Tekuće

8,3

Sumporna kiselina (10 %)

7664-93-9

anorganska kiselina

(1.A/)1.B/1.C

5 × C 1 × NC

Tekuće

1,2

Kalijev hidroksid (10 % aq.)

1310-58-3

anorganska baza

(1.A/)1.B/1.C

6 × C

Tekuće

13,2

Oktanska (kaprilna) kiselina

124-07-2

organska kiselina

2.B/1.C

4 × C 2 × NC

Tekuće

3,6

2-tert-butilfenol

88-18-6

fenol

2.B/1.C

4 × C 2 × NC

Tekuće

3,9

Tvari koje ne djeluju nagrizajuće in vivo

Izostearinska kiselina

2724-58-5

organska kiselina

NC

6 × NC

Tekuće

3,6

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

organska baza

NC

6 × NC

Kruto

5,5

Fenetil bromid

103-63-9

elektrofil

NC

6 × NC

Tekuće

3,6

4-(metiltio)-benzaldehid

3446-89-7

elektrofil

NC

6 × NC

Tekuće

6,8

1,9-dekadien

1647-16-1

neutralne organske kemikalije

NC

6 × NC

Tekuće

3,9

Tetrakloretilen

127-18-4

neutralne organske kemikalije

NC

6 × NC

Tekuće

4,5

Kratice: aq. = vodena otopina; CAS br. = registarski broj Službe za podatke o kemijskim tvarima; VRM = validirana referentna metoda; C = nagrizajuće; NC = nije nagrizajuće.

POSTUPAK

13.

Dostupni su standardni operativni postupci za ispitne metode TER-a na koži štakora za ispitivanje nagrizanja kože (19). Ispitne metode TER-a na koži štakora obuhvaćene ovom ispitnom metodom trebale bi biti u skladu sa sljedećim uvjetima.

Životinje

14.

Trebali bi se upotrebljavati štakori jer je osjetljivost njihove kože na tvari u ovoj ispitnoj metodi prethodno dokazana (12.) te je jedini izvor kože koji je službeno validiran (8. i 9.). Dob (u kojoj se koža prikuplja) i soj štakora posebno su važni kako bi se osiguralo da folikuli dlake budu u latentnoj fazi prije početka rasta odraslih dlaka.

15.

Dlaka na leđima i bokovima mladih, približno 22 dana starih mužjaka ili ženki štakora (soja Wistar ili nekog usporedivog soja) pažljivo se ukloni malim škarama. Životinje se zatim operu nježnim brisanjem, a ošišana se površina umoči u antibiotsku otopinu (koja sadržava, primjerice, streptomicin, penicilin, kloramfenikol i amfotericin u koncentracijama koje su učinkovite u inhibiciji rasta bakterija). Životinje se ponovno operu antibioticima trećeg ili četvrtog dana nakon prvog pranja i koriste u roku od tri dana nakon drugog pranja, kad se stratum corneum oporavi od odstranjivanja dlake.

Priprema diskova kože

16.

Životinje se humano usmrte kad su stare 28–30 dana; ta je dob veoma važna. Sa svake životinje odstrani se bočna koža na leđima s koje se opreznim ljuštenjem oguli prekomjerna potkožna mast. Odstrane se diskovi kože, u promjeru svaki približno 20 mm. Prije uporabe diskova koža se može skladištiti ako se pokaže da su podaci za pozitivnu i negativnu kontrolu istovjetni podacima dobivenima sa svježom kožom.

17.

Po jedan disk stavi se preko jednog kraja teflonske (politetrafluoretilenske) cijevi, osiguravajući da je epidermalna površina u dodiru s cijevi. Gumeni O-prsten pritisne se preko ruba cijevi kako bi se učvrstila koža, a višak tkiva se odreže. Gumeni O-prsten zatim se dužinom ruba teflonske cijevi oprezno zabrtvi petrolejskim gelom. Cijev se uvede u prihvatnu komoru koja sadržava otopinu MgSO4 (154 mM) u kojoj je pridržava opružna štipaljka (slika 1.). Disk kože treba potpuno potopiti u otopinu MgSO4. Od kože jednog štakora može se dobiti čak 10–15 diskova kože. Dimenzije cijevi i O-prstena prikazane su na slici 2.

18.

Prije početka ispitivanja mjeri se TER na dva kožna diska kao postupak kojim se kontrolira kvaliteta kože svake životinje. Kako bi se preostali diskovi te kože mogli koristiti u ispitnoj metodi, oba kontrolna diska moraju dati vrijednosti električnog otpora veće od 10 kΩ. Ako je vrijednost otpora manja od 10 kΩ, preostale diskove te kože treba baciti.

Primjena ispitivane kemikalije i kontrolnih tvari

19.

Za svaki ciklus (pokus) treba koristiti istodobne pozitivne i negativne kontrole kako bi se osigurala odgovarajuća uspješnost pokusnog modela. Za svaki ciklus (pokus) treba koristiti diskove kože jedne životinje. Kao ispitivane kemikalije pozitivne i negativne kontrole predlažu se 10 M klorovodična kiselina odnosno destilirana voda.

20.

Tekuće ispitivane kemikalije (150 μl) primjenjuju se ravnomjerno na epidermalnu površinu unutar cijevi. Kod ispitivanja krutih materijala, dovoljna količina krute tvari primjenjuje se ravnomjerno na disk kako bi se osigurala pokrivenost cijele epiderme. Na krutu tvar dodaje se deionizirana voda (150 μl) i cijev se pažljivo protrese. Za postizanje maksimalnog dodira s kožom, krute tvari možda treba zagrijati na 30 °C kako bi se ispitivana tvar rastopila ili omekšala ili samljeti kako bi se dobio zrnati materijal ili prah.

21.

Za svako ispitivanje i kontrolnu kemikaliju koriste se tri diska kože u svakom ciklusu ispitivanja (pokusu). Ispitivane kemikalije primjenjuju se 24 sata na temperaturi 20–23 °C. Ispitivana kemikalija uklanja se ispiranjem pod mlazom vode iz slavine čija temperatura nije viša od sobne temperature sve dok se ne odstrani sav materijal.

Mjerenja transkutanog električnog otpora (TER)

22.

Impedancija kože mjeri se kao transkutani električni otpor (TER) upotrebom Wheatstoneova mjernog mosta na niskonaponsku izmjeničnu struju (18.). Opće su specifikacije mosta radni napon 1–3 volta, izmjenična struja sinusnog ili pravokutnog oblika 50–1 000 Hz i mjerno područje od najmanje 0,1–30 kΩ. Mjerni most koji je korišten u validacijskoj studiji mjerio je induktivitet, kapacitivnost i otpor do vrijednosti 2 000 H, 2 000 μF odnosno 2 MΩ, kod frekvencija od 100 Hz ili 1 kHz, primjenom serijskih ili paralelnih vrijednosti. U svrhu testa otkrivanja nagrizajućeg djelovanja, mjerenja transkutanog električnog otpora bilježe se pri frekvenciji od 100 Hz primjenom serijskih vrijednosti. Prije mjerenja električnog otpora, površinska napetost kože smanjuje se dodavanjem dovoljnog volumena 70-postotnog etanola koji se nanosi na epidermu. Nakon nekoliko sekundi etanol se uklanja iz cijevi, a tkivo se hidratizira dodavanjem 3 ml otopine MgSO4 (154 mM). Elektrode mjernog mosta postavljaju se na obje strane diska kože kako bi se izmjerio otpor u kΩ/disk kože (slika 1.). Dimenzije elektrode i duljina elektrode izložene ispod krokodilskih štipaljki prikazane su na slici 2. Štipaljka na unutarnjoj elektrodi za vrijeme mjerenja otpora stoji na vrhu teflonske cijevi kako bi se osiguralo da u otopinu MgSO4 bude uronjena stalno ista duljina elektrode. Vanjska elektroda postavlja se unutar komore na način da stoji na dnu komore. Razmak između opružne štipaljke i dna teflonske cijevi održava se nepromjenjivim (slika 2.) jer ta udaljenost utječe na dobivene vrijednosti otpora. Zbog toga, razmak između unutarnje elektrode i diska kože treba biti nepromjenjiv i minimalan (1–2 mm).

23.

Ako je izmjerena vrijednost otpora veća od 20 kΩ, to može biti posljedica preostalog sloja ispitivane kemikalije na epidermalnoj površini diska kože. Ponovno treba pokušati ukloniti taj sloj, primjerice, tako da se teflonska cijev zatvori pritiskom prsta zaštićenog rukavicom i protrese približno deset sekundi; otopina MgSO4 baca se i mjerenje otpora ponavlja se s novom otopinom MgSO4.

24.

Svojstva i dimenzije ispitnog uređaja i primijenjen ispitni postupak mogu utjecati na dobivene vrijednosti transkutanog električnog otpora. Prag od 5 kΩ za nagrizajuće djelovanje određen je iz podataka dobivenih konkretnim uređajem i postupkom opisanim u ovoj ispitnoj metodi. Ako se ispitni uvjeti izmijene ili se primijeni drukčiji uređaj, mogu vrijediti drugačiji pragovi i kontrolne vrijednosti. Stoga je potrebno kalibrirati metodologiju i vrijednosti praga otpora ispitivanjem niza tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti odabranih među tvarima koje su korištene u validacijskoj studiji (8. i 9.) ili kemikalijama koje su iz kemijski sličnih razreda kao tvari koje se istražuju. Niz odgovarajućih tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti utvrđen je u tablici 1.

Metode vezanja boje

25.

Izlaganje određenih nenagrizajućih materijala može rezultirati smanjenjem otpora na vrijednost ispod praga od 5 kΩ koja dopušta prolazak iona kroz stratum corneum, čime se električni otpor smanjuje (9.). Na primjer, neutralne organske tvari i tvari koje imaju površinski aktivna svojstva (uključujući deterdžente, emulgatore i druge površinski aktivne tvari) mogu iz kože odstraniti lipide i time povećati propusnost barijere za ione. Znači, ako su vrijednosti TER-a koje proizvode te kemikalije manje od 5 kΩ ili približno 5 kΩ bez vidljivog oštećenja diskova kože, na kontrolnom i tretiranom tkivu treba provesti procjenu penetracije boje kako bi se odredilo jesu li te dobivene vrijednosti TER rezultat povećane propusnosti kože ili nagrizanja kože (7. i 9.). Ako se radi o nagrizajućem djelovanju, odnosno o pucanju stratum corneum, boja sulforodamin B, kad se nanese na površinu kože, brzo prodire i boji potkožno tkivo. Ta konkretna boja stabilna je na širok raspon tvari i na nju ne utječe postupak ekstrakcije opisan u nastavku.

Primjena i odstranjivanje boje sulforodamina B

26.

Nakon procjene vrijednosti TER, magnezijev sulfat evakuira se iz cijevi i koža se pažljivo pregleda s obzirom na vidljiva oštećenja. Ako nema očitih velikih oštećenja (npr. perforacija), 150 μl 10-postotne (w/v) otopine boje sulforodamina B (Acid Red 52; C.I. 45100; CAS broj 3520-42-1) u destiliranoj vodi primjenjuje se na epidermalnu površinu svakog diska kože tijekom dva sata. Zatim se ti diskovi kože približno deset sekundi ispiru vodom iz slavine čija temperatura nije viša od sobne temperature kako bi se time uklonio višak boje ili nevezana boja. Svaki disk kože oprezno se skine s teflonske cijevi i stavi u tikvicu (npr. tikvicu od 20 ml za scintilaciju) koja sadržava deioniziranu vodu (8 ml). Tikvice se nježno tresu pet minuta kako bi se odstranila eventualna preostala nevezana boja. Zatim se ponavlja postupak ispiranja, nakon kojega se diskovi kože skidaju i stavljaju u tikvice koje sadržavaju 5 ml 30-postotnog (w/v) natrijevog dodecil-sulfata (SDS) u destiliranoj vodi i ostave se inkubirati preko noći na 60 °C.

27.

Nakon inkubacije, svaki disk kože skida se i baca, a preostala otopina centrifugira se osam minuta na 21 °C (relativna centrifugalna sila ~175 × g). Uzorak od 1 ml supernatanta razrijedi se u omjeru 1:5 (v/v) [tj. 1 ml + 4 ml] s 30-postotnim (w/v) natrijevim dodecil-sulfatom (SDS) u destiliranoj vodi. Optička gustoća (OD) otopine mjeri se na 565 nm.

Izračun sadržaja boje

28.

Sadržaj boje sulforodamin B po disku računa se iz vrijednosti optičke gustoće (OD) (9.) (koeficijent molarne ekstinkcije sulforodamina B na 565 nm = 8,7 × l04; molekulska masa = 580). Sadržaj boje određuje se za svaki disk kože primjenom odgovarajuće kalibracijske krivulje, zatim se za ponovljene pokuse izračunava srednja vrijednost sadržaja boje.

Kriteriji prihvatljivosti

29.

Srednji rezultati TER vrijednosti prihvatljivi su ako su vrijednosti istodobne pozitivne i negativne kontrole unutar prihvatljivih raspona za predmetnu laboratorijsku metodu ispitivanja. Prihvatljivi rasponi otpora za metodologiju i uređaj iz prethodnog teksta navedeni su u sljedećoj tablici:

Kontrola

Tvar

Raspon otpora (kΩ)

Pozitivna

10 M klorovodična kiselina

0,5–1,0

Negativna

Destilirana voda

10–25

30.

Srednji rezultati vezanja boje prihvatljivi su pod uvjetom da su vrijednosti istodobne kontrole unutar prihvatljivih raspona za predmetnu metodu. Predloženi prihvatljivi rasponi sadržaja boje za kontrolne tvari za metodologiju i uređaj iz prethodnog teksta navedeni su u sljedećoj tablici:

Kontrola

Tvar

Raspon sadržaja boje (μg/disku)

Pozitivna

10 M klorovodična kiselina

40–100

Negativna

Destilirana voda

15–35

Tumačenje rezultata

31.

Granična vrijednost TER-a koja služi za razlikovanje nagrizajućih od nenagrizajućih ispitivanih kemikalija utvrđena je tijekom optimizacije ispitne metode, ispitana tijekom predvalidacijske faze i potvrđena u službenoj validacijskoj studiji.

32.

Model predviđanja za ispitnu metodu TER-a na koži štakora za ispitivanje nagrizanja kože (9. i 19.), povezan sa sustavom razvrstavanja UN GHS-om ili CLP-om naveden je u nastavku.

Ispitivana kemikalija ne smatra se nagrizajućom za kožu:

i)

ako je srednja vrijednost TER-a postignuta za ispitivanu kemikaliju veća od (>) 5 kΩ; ili

ii)

ako je srednja vrijednost TER-a postignuta za ispitivanu kemikaliju manja od ili jednaka (≤) 5 kΩ; i

ako diskovi kože ne pokazuju vidljivo oštećenje (npr. perforaciju), i

ako je srednja vrijednost sadržaja boje diska manja od (<) srednje vrijednosti sadržaja boje diska iz istodobne pozitivne kontrole s 10 M HCl (vidjeti stavak 30. za vrijednosti pozitivne kontrole).

Ispitivana kemikalija smatra se nagrizajućom za kožu:

i)

ako je srednja vrijednost TER-a postignuta za ispitivanu kemikaliju manja od ili jednaka (≤) 5 kΩ i ako su diskovi kože vidljivo oštećeni (npr. perforirani); ili

ii)

ako je srednja vrijednost TER-a postignuta za ispitivanu kemikaliju manja od ili jednaka (≤) 5 kΩ i:

ako diskovi kože ne pokazuju vidljivo oštećenje (npr. perforaciju), ali

srednja vrijednost sadržaja boje diska veća je ili jednaka (≥) srednjoj vrijednosti sadržaja boje diska iz istodobne pozitivne kontrole s 10 M HCl (vidjeti stavak 30. za vrijednosti pozitivne kontrole).

33.

Ciklus ispitivanja (pokus) koji obuhvaća najmanje tri ponovljena diska kože trebao bi biti dovoljan za ispitivanu kemikaliju ako je razvrstavanje nedvosmisleno. Međutim, u slučajevima graničnih rezultata, kao što su neusklađena ponovljena mjerenja i/ili srednja vrijednost TER-a od 5 ± 0,5 kΩ, trebalo bi razmotriti drugi neovisni ciklus ispitivanja (pokus), a i treći ciklus u slučaju neusklađenih rezultata između prva dva ciklusa ispitivanja (pokusa).

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Podaci

34.

Po mogućnosti, vrijednosti otpora (kΩ) i vrijednosti sadržaja boje (μg/disku) za ispitivanu kemikaliju te za pozitivne i negativne kontrole treba zabilježiti u tabličnom obliku, uključujući podatke za svaki pojedinačni ponovljeni disk u svakom ciklusu ispitivanja (pokusu) i srednje vrijednosti ± standardno odstupanje. Treba zabilježiti sve ponovljene pokuse. Uočeno oštećenje na diskovima kože trebalo bi zabilježiti za svaku ispitivanu kemikaliju.

Izvješće o ispitivanju

35.

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:

 

Ispitivana kemikalija i kontrolne tvari:

tvar s jednim sastojkom: kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv, CAS broj, SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula, čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd.,

tvar s više sastojaka, UVCB tvar i smjesa: opis (koliko je to moguće) kemijskog identiteta (vidjeti gore), kvantitativnog udjela i relevantnih fizikalno-kemijskih svojstava sastojaka,

fizički izgled, topljivost u vodi i druga relevantna fizikalno-kemijska svojstva,

izvor, broj serije, ako su dostupni,

tretiranje ispitivane kemikalije/kontrolne tvari prije ispitivanja, ako je primjenljivo (npr. grijanje, mljevenje),

stabilnost ispitivane kemikalije, rok uporabe ili datum za ponovnu analizu ako je poznat,

uvjeti skladištenja.

 

Ispitne životinje:

soj i spol koji je upotrijebljen,

dob životinja kad su upotrijebljene kao donorske životinje,

podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd.,

pojedinosti o preparatu kože.

 

Ispitni uvjeti:

kalibracijske krivulje za ispitni uređaj,

kalibracijske krivulje za provođenje testa vezanja boje, pojas koji se upotrebljava za mjerenje optičke gustoće (OD) i raspon linearnosti OD-a uređaja za mjerenje (npr. spektrofotometra), ako je primjereno,

pojedinosti o ispitnom postupku upotrijebljenom za mjerenja TER-a,

pojedinosti o ispitnom postupku za procjenu vezivanja boje, ako je primjereno,

upotrijebljene ispitne doze, trajanje razdoblja izlaganja i temperature izlaganja,

pojedinosti o postupku ispiranja upotrijebljenom nakon razdoblja izlaganja,

broj ponovljenih diskova kože upotrijebljenih po ispitivanoj kemikaliji i kontrolama (pozitivna i negativna kontrola),

opis svih izmjena ispitnog postupka,

upućivanje na prijašnje podatke za predmetni model. To bi, među ostalim, trebalo uključivati:

i)

prihvatljivost vrijednosti TER-a pozitivnih i negativnih kontrola (u kΩ) u odnosu na raspone otpora pozitivnih i negativnih kontrola;

ii)

prihvatljivost vrijednosti sadržaja boje pozitivnih i negativnih kontrola (u μg/disku) u odnosu na raspone sadržaja boje pozitivnih i negativnih kontrola;

iii)

prihvatljivost rezultata ispitivanja u odnosu na prijašnju varijabilnost među ponovljenim diskovima kože,

opis primijenjenih kriterija za odlučivanje/modela predviđanja.

 

Rezultati:

tablični podaci iz testova za utvrđivanje vrijednosti TER-a i vezivanja boje (ako je primjereno) za pojedinačne ispitivane kemikalije i kontrole, za svaki ciklus ispitivanja (pokus) i svaki ponovljeni disk kože (pojedinačne životinje i pojedinačni uzorci kože), srednje vrijednosti, standardne devijacije (SD) i koeficijenti varijacije (CV),

opis svih uočenih učinaka,

utvrđeno razvrstavanje, s upućivanjem na primijenjeni model predviđanja/kriterije odlučivanja.

 

Rasprava o rezultatima

 

Zaključci

LITERATURA

1.

Ujedinjeni narodi (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York i Ženeva, 2013. Dostupno na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

2.

Poglavlje B.4. ovog Priloga, Akutno nadraživanje/nagrizanje kože.

3.

Poglavlje B.40.bis ovog Priloga, Model kože in vitro.

4.

Poglavlje B.65. ovog Priloga, In vitro ispitna metoda s membranskom barijerom.

5.

Poglavlje B.46. ovog Priloga, Nadraživanje kože in vitro: ispitna metoda na modelu rekonstruirane ljudske epiderme.

6.

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

7.

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219.–255.

8.

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471.–482.

9.

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic. In Vitro 12, 483.–524.

10.

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129.–147.

11.

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, SAD.

12.

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), izdao ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3. travnja 1998.

13.

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275.–280.

14.

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, SAD.

15.

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

16.

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507.–512.

17.

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191.–194.

18.

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol. Pharmacol. 62, 393.–403.

19.

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

20.

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 34), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

Slika 1.

Ređaj za Test Transkutanog Električnog Otpora (TER) na Koži Štakora

Image 2

Slika 2.

Dimenzije Upotrijebljene Teflonske (Politetrafluoretilenske – PTFE) I Prihvatne Cijevi i Elektroda

Image 3

Kritički faktori uređaja prikazanog na gornjoj slici:

unutarnji promjer teflonske (PTFE) cijevi,

duljina elektroda u odnosu na teflonsku i prihvatnu cijev; duljina bi trebala biti takva da elektrode ne dodiruju disk kože i da je elektrode pri standardnoj duljini u dodiru s otopinom MgSO4,

količina otopine MgSO4 u prihvatnoj cijevi trebala bi omogućiti dubinu tekućine u odnosu na razinu u teflonskoj cijevi, kako je prikazano na slici 1.,

disk kože treba biti dobro pričvršćen na teflonsku cijev, kako bi izmjereni električni otpor vjerno odražavao svojstva kože.

Dodatak

DEFINICIJE

Točnost : stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. Ona je mjerilo učinkovitosti ispitne metode i jedan od aspekata relevantnosti. Pojam je često međusobno zamjenjiv s pojmom „podudarnost” u smislu udjela točnih ishoda ispitne metode (20.).

C : nagrizajuće.

Kemikalija : tvar ili smjesa.

Podudarnost : mjerilo učinkovitosti ispitne metode za ispitne metode koje daju kategorijski rezultat i jedan je od aspekata relevantnosti. Pojam je ponekad međusobno zamjenjiv s pojmom točnosti i definira se kao udio svih ispitanih kemikalija koje su pravilno razvrstane kao pozitivne ili negativne. Podudarnost u velikoj mjeri ovisi o prisutnosti pozitivnih rezultata u vrstama ispitivane kemikalije (20.).

GHS (Globalno usklađeni sustav razvrstavanja i označivanja kemikalija (UN)) : sustav za razvrstavanje kemikalija (tvari i smjesa) prema standardiziranim vrstama i stupnjevima fizičkih opasnosti te opasnosti za zdravlje i okoliš, kojim su obuhvaćena odgovarajuća komunikacijska sredstva kao što su piktogrami, oznake opasnosti, oznake upozorenja, oznake obavijesti i sigurnosno-tehnički listovi, kojima se prenose informacije o njihovim štetnim učincima u cilju zaštite ljudi (uključujući poslodavce, radnike, prijevoznike, potrošače i interventno osoblje) i okoliša (1.).

IATA : integrirani pristup ispitivanju i procjeni.

Smjesa : smjesa ili otopina koja se sastoji od dviju ili više tvari.

Tvar s jednim sastojkom : tvar, definirana količinskim sastavom, u kojoj je jedan glavni sastojak prisutan u koncentraciji od najmanje 80 % (w/w).

Tvar s više sastojaka : tvar, definirana količinskim sastavom, u kojoj je više od jednog glavnog sastojka prisutno u koncentraciji od 10 % (w/w) ili većoj te manjoj od 80 % (w/w). Tvar s više sastojaka rezultat je procesa proizvodnje. Smjesa i tvar s više sastojaka razlikuju se po tome što se smjesa dobiva miješanjem dviju ili više tvari bez kemijske reakcije. Tvar s više sastojaka rezultat je kemijske reakcije.

NC : nije nagrizajuće.

OD : optička gustoća.

PC : pozitivna kontrola; ponovljeni uzorak koji sadržava sve komponente ispitnog sustava i tretiran je s tvari za koju je poznato da inducira pozitivan odgovor. Kako bi se osigurala mogućnost procjene varijabilnosti odgovora pozitivne kontrole tijekom vremena, pozitivan odgovor ne bi smio biti presnažan.

Zahtjevi izvedbe (PS) : zahtjevi koji se temelje na validiranoj ispitnoj metodi i pružaju temelj za ocjenjivanje usporedivosti predložene, funkcionalno i mehanicistički slične, ispitne metode. Uključuju: i. ključne elemente ispitne metode; ii. minimalni popis referentnih kemikalija odabranih među kemikalijama koje se upotrebljavaju za dokazivanje prihvatljive učinkovitosti validirane ispitne metode; te iii. slične razine pouzdanosti i točnosti, utemeljene na rezultatima dobivenim za validiranu ispitnu metodu, koje se prilikom ocjenjivanja trebaju dokazati predloženom ispitnom metodom koristeći minimalni popis referentnih kemikalija.

Relevantnost : opis odnosa između ispitne metode i istraživanog učinka te je li ispitivanje prikladno i korisno za određenu svrhu. Pokazuje u kojoj se mjeri ispitnom metodom točno mjeri ili predviđa istraživani biološki učinak. Relevantnost uključuje razmatranje o točnosti (podudarnosti) ispitne metode (20.).

Pouzdanost : pokazuje u kojoj se mjeri ispitna metoda može obnovljivo primijeniti unutar jednog laboratorija i između više laboratorija tijekom vremena uz primjenu istog protokola. Ocjenjuje se izračunavanjem obnovljivosti unutar jednog laboratorija i između više laboratorija (20.).

Osjetljivost : udio svih pozitivnih/aktivnih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom ispitne metode. To je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (20.).

Nagrizanje kože in vivo : uzrokovanje ireverzibilnog oštećenja kože, točnije, vidljive nekroze koja kroz epidermu prodire u dermu nakon što je ispitivana kemikalija primjenjivana u trajanju do najviše četiri sata. Za nagrizanje kože tipična je pojava čireva, krvarenja, krvavih krasta te, do kraja opažanja od 14 dana, gubitak boje kože zbog nestajanja pigmenta, cijele površine zahvaćene alopecijom (gubitak dlake) i ožiljci. Za ocjenjivanje sumnjivih lezija treba razmotriti mogućnost histopatoloških pretraga.

Specifičnost : udio svih negativnih/neaktivnih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom ispitne metode. To je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (20.).

Tvar : kemijski element i njegovi spojevi u prirodnom stanju ili dobiveni proizvodnim postupkom, što uključuje i aditive koji su nužni za održavanje stabilnosti proizvoda te nečistoće koje proizlaze iz primijenjenoga postupka, ali isključuje otapala koja se mogu izdvojiti bez utjecaja na stabilnost tvari ili promjene njezina sastava.

Ciklus (ispitivanja) : jedna ispitivana kemikalija koja se istodobno ispituje na najmanje tri ponovljena diska kože.

Ispitivana kemikalija : svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.

Transkutani električni otpor (TER) : mjera električne impedancije kože, izražena kao vrijednost otpora u kiloomima. Jednostavna, robusna metoda za procjenu funkcije barijere bilježenjem prolazaka iona kroz kožu primjenom Wheatstoneova mosta.

UVCB : tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvodi ili biološki materijali.;

(6)

u dijelu B poglavlje B.40.bis zamjenjuje se sljedećim:

„B.40.bis   NAGRIZANJE KOŽE IN VITRO: ISPITNA METODA NA MODELU REKONSTRUIRANE LJUDSKE EPIDERME (RhE)

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 431 (2016.). Nagrizanje kože odnosi se na izazivanje ireverzibilnog oštećenja kože koje se manifestira kao vidljiva nekroza koja kroz epidermu prodire u dermu nakon primjene ispitivane kemikalije [kako je utvrđeno Globalno usklađenim sustavom razvrstavanja i označivanja kemikalija (GHS) Ujedinjenih naroda (UN) (1.) i Uredbom (EZ) br. 1272/2008 o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa (CLP) (6) Europske unije]. Ova ažurirana ispitna metoda B.40.bis pruža in vitro postupak kojim se omogućuje utvrđivanje nagrizajućih i nenagrizajućih tvari i smjesa u skladu s UN GHS-om i CLP-om. Omogućuje i djelomično daljnje razvrstavanje nagrizajućih tvari.

2.

Procjena potencijala kemikalija da uzrokuju nagrizanje kože obično je uključivala upotrebu laboratorijskih životinja (ispitna metoda B.4., ekvivalentna Smjernici OECD-a za ispitivanje 404; izvorno donesena 1981. i revidirana 1992., 2002. i 2015.) (2.). Uz sadašnju ispitnu metodu B.40.bis validirane su i donesene još dvije ispitne metode in vitro za ispitivanje potencijala kemikalija da uzrokuju nagrizanje kože – ispitna metoda B.40. (ekvivalentna Smjernici OECD-a za ispitivanje 430) (3.) i ispitna metoda B.65. (ekvivalentna Smjernici OECD-a za ispitivanje 435) (4.). Nadalje, donesena je ispitna metoda in vitro B.46. (ekvivalentna Smjernici OECD-a za ispitivanje 439) (5.) za ispitivanje potencijala nadraživanja kože. U Smjernicama OECD-a o integriranim pristupima ispitivanju i procjeni (IATA) za nagrizanje i nadraživanje kože opisano je nekoliko modula u kojima se grupiraju izvori informacija i alati za analizu te se pružaju smjernice o i. načinu integriranja i uporabe postojećih podataka o ispitivanju i podataka koji se dobivaju bez ispitivanja za procjenu potencijala kemikalija da uzrokuju nadraživanje i nagrizanje kože te ii. predlaganju pristupa kad je potrebno daljnje ispitivanje (6.).

3.

Ova se ispitna metoda bavi konačnim učinkom nagrizanja kože na zdravlje ljudi. U njoj se upotrebljava rekonstruirana ljudska epiderma (RhE) (dobivena iz ljudskih netransformiranih epidermalnih keratinocita) koja vjerno oponaša histološka, morfološka, biokemijska i fiziološka svojstva gornjih slojeva ljudske kože, tj. epiderme. Odgovarajuća smjernica OECD-a za ispitivanje izvorno je donesena 2004. i ažurirana 2013. kako bi se uključile dodatne ispitne metode u kojima se upotrebljavaju modeli RhE-a i mogućnost upotrebe metoda koje podržavaju daljnje razvrstavanje nagrizajućih kemikalija, a 2015. je ažurirana radi upućivanja na smjernice o IATA-i i uvođenja alternativnog postupka za mjerenje vijabilnosti.

4.

Ova ispitna metoda obuhvaća četiri validirana komercijalno dostupna modela RhE-a. Predvalidacijske studije (7.), nakon kojih je slijedila službena validacijska studija za procjenu nagrizanja kože (8., 9. i 10.), provedene su (11. i 12.) za dva ta komercijalno dostupna ispitna modela – standardni model EpiSkin™ i test nagrizajućeg djelovanja na kožu EpiDerm™ (EPI-200) (dalje u tekstu „Validirane referentne metode – VRM-ovi”). Ishod tih studija doveo je do preporuke da bi se dvije prethodno navedene validirane referentne metode mogle upotrebljavati u regulatorne svrhe za razlikovanje nagrizajućih tvari (C) od nenagrizajućih tvari (NC) i da bi se EpiSkin™ osim toga mogao upotrebljavati za daljnje razvrstavanje nagrizajućih tvari (13., 14. i 15.). Druga dva komercijalno dostupna ispitna modela RhE za utvrđivanje nagrizanja kože in vitro pokazala su rezultate slične validiranoj referentnoj metodi EpiDerm™ u skladu s validacijom na temelju zahtjeva izvedbe (16., 17. i 18.). To su SkinEthic™ RHE (7) i epiCS® (prethodni naziv EST-1000) te se i oni mogu upotrebljavati u regulatorne svrhe za razlikovanje nagrizajućih tvari od nenagrizajućih tvari (19. i 20.). Postvalidacijskim studijama koje su proveli proizvođači modela RhE od 2012. do 2014. s poboljšanim protokolom u kojem su ispravljene interferencije neodređene redukcije MTT-a koje uzrokuju ispitivane kemikalije poboljšana je učinkovitost razlikovanja nagrizajućih i nenagrizajućih tvari, ali i daljnjeg razvrstavanja nagrizajućih tvari (21. i 22.). Provedene su daljnje statističke analize postvalidacijskih podataka s modelima EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE i EpiCS® kako bi se identificirali alternativni modeli predviđanja koji poboljšavaju prediktivnu sposobnost daljnjeg razvrstavanja (23.).

5.

Prije nego što se predložena slična ili izmijenjena ispitna metoda RhE in vitro za nagrizanje kože, koja nije validirana referentna metoda, može upotrijebiti u regulatorne svrhe, trebalo bi utvrditi njezinu pouzdanost, relevantnost (točnost) i ograničenja za njezinu predloženu uporabu kako bi se osigurala njezina sličnost s validiranom referentnom metodom, u skladu sa zahtjevima izvedbe (24.) utvrđenima u skladu s načelima Smjernice OECD-a br. 34 (25.). Uzajamno prihvaćanje podataka jamčit će se samo nakon što se svaka predložena nova ili ažurirana ispitna metoda koja je u skladu sa zahtjevima izvedbe pregleda i uključi u odgovarajuću smjernicu za ispitivanje. Ispitni modeli uključeni u tu smjernicu za ispitivanje mogu se upotrijebiti za ispunjavanje zahtjeva zemalja u pogledu rezultata ispitivanja ispitne metode in vitro za nagrizanje kože, uz ostvarivanje koristi od uzajamnog prihvaćanja podataka.

DEFINICIJE

6.

Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1.

POČETNA RAZMATRANJA

7.

Ova ispitna metoda omogućuje utvrđivanje nagrizajućih i nenagrizajućih tvari i smjesa u skladu s UN GHS-om i CLP-om. Ovom se ispitnom metodom podržava daljnje razvrstavanje nagrizajućih tvari i smjesa na neobaveznu potkategoriju 1.A, u skladu s UN GHS-om (1.), te kombinaciju potkategorija 1.B i 1.C (21., 22. i 23.). Ograničenje je ove metode to što ne omogućuje razlikovanje potkategorije 1.B i potkategorije 1.C s nagrizajućim djelovanjem na kožu u skladu s UN GHS-om i CLP-om zbog ograničenog skupa poznatih kemikalija iz potkategorije 1.C s nagrizajućim djelovanjem in vivo. Ispitnim modelima EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE i epiCS® mogu se odrediti daljnje potkategorije (tj. 1.A naspram 1.B i 1.C naspram NC).

8.

Širok raspon kemikalija, koje uglavnom čine pojedinačne tvari, ispitan je u validaciji kojom se podupiru ispitni modeli uključeni u ovu ispitnu metodu kada se upotrebljavaju za utvrđivanje nagrizajućih i nenagrizajućih kemikalija; empirijska baza podataka validacijske studije uključivala je 60 kemikalija koje su obuhvaćale širok raspon kemijskih razreda (8., 9. i 10.). Subjekti koji su razvili ispitnu metodu proveli su ispitivanje radi dokazivanja osjetljivosti, specifičnosti, točnosti i obnovljivosti unutar laboratorija testa za daljnje razvrstavanje, a rezultate je pregledao OECD (21., 22. i 23.). Na temelju svih podataka koji su dostupni, ispitna metoda primjenjiva je na širok raspon kemijskih razreda i agregatnih stanja, uključujući tekućine, polukrute i krute tvari te voskove. Tekućine mogu biti vodene i bezvodne; krute tvari mogu biti topljive ili netopljive u vodi. Krute tvari prije primjene treba samljeti u sitni prah kad je god moguće; nije potrebno nikakvo drugo prethodno tretiranje uzorka. U slučajevima u kojima se može dokazati da se ispitni modeli uključeni u ispitnu metodu ne mogu primijeniti za ispitivanje specifične kategorije ispitivanih kemikalija, te modele ne bi trebalo upotrebljavati za tu specifičnu kategoriju ispitivanih kemikalija. Osim toga, pretpostavlja se da se ova ispitna metoda može primijeniti na smjese kao proširenje njezine primjenjivosti na tvari. Međutim, budući da smjese obuhvaćaju široki spektar kategorija i sastava te da su trenutačno dostupne samo ograničene informacije o ispitivanju smjesa, u slučajevima u kojima se može dokazati da se ispitna metoda ne može primijeniti za ispitivanje specifične kategorije smjesa (npr. primjenom strategije predložene u 26.), ispitnu metodu ne bi trebalo upotrebljavati za tu specifičnu kategoriju smjesa. Prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se te, ako se mogu, zašto se njome mogu dobiti primjereni rezultati za tu svrhu. Ta razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese. Plinovi i aerosoli još nisu ocijenjeni u validacijskim studijama (8., 9. i 10.). Iako je moguće da se oni mogu ispitati upotrebom tehnologije RhE, trenutačnom ispitnom metodom nije omogućeno ispitivanje plinova i aerosola.

9.

Ispitivane kemikalije koje apsorbiraju svjetlost u istom rasponu kao i MTT formazan i ispitivane kemikalije koje mogu izravno reducirati vitalnu boju MTT (na MTT formazan) mogu ometati mjerenje vijabilnosti tkiva te se kod njih trebaju upotrebljavati prilagođene kontrole za ispravke. Vrsta prilagođenih kontrola koja može biti potrebna mijenjat će se ovisno o vrsti interferencije koju proizvodi ispitivana kemikalija i postupku koji se upotrebljava za mjerenje MTT formazana (vidjeti stavke 25.–31.).

10.

Iako se ovom ispitnom metodom ne dobivaju primjerene informacije o nadraživanju kože, trebalo bi napomenuti da se ispitna metoda B.46. posebno bavi učinkom nadraženosti kože na zdravlje in vitro i temelji se na istom ispitnom sustavu RhE uz upotrebu drugog protokola (5.). Za potpunu evaluaciju lokalnih učinaka na kožu nakon jednostrukog dermalnog izlaganja potrebno je proučiti Smjernice OECD-a o integriranim pristupima ispitivanju i procjeni (6.). Taj pristup IATA obuhvaća provođenje in vitro ispitivanja za dokazivanje nagrizajućeg (kako je opisano u ovoj ispitnoj metodi) i nadražujućeg djelovanja na kožu prije eventualnog provođenja ispitivanja na živim životinjama. Podrazumijeva se da upotreba ljudske kože podliježe nacionalnim i međunarodnim etičkim pitanjima i uvjetima.

NAČELO ISPITIVANJA

11.

Ispitivana se kemikalija lokalno nanosi na trodimenzionalni model RhE, koji čine netransformirani ljudski epidermalni keratinociti uzgojeni u svrhu dobivanja višeslojnog, visoko izdiferenciranog modela ljudske epiderme. Sastoji se od organiziranih bazalnih, trnastih i zrnatih slojeva te višeslojnog rožnatog sloja (stratum corneum) koji između stanica sadržava lamelarne masne slojeve koji predstavljaju glavne razrede lipida analogne onima koji se susreću in vivo.

12.

Ispitna metoda RhE temelji se na pretpostavci da nagrizajuće kemikalije mogu penetrirati kroz stratum corneum putem difuzije ili erozije te su citotoksične za stanice ispod tog sloja. Vijabilnost stanica mjeri se enzimskom konverzijom vitalne boje MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plavo tetrazolijev bromid; CAS broj 298-93-1] u sol plavog formazana koja se kvantitativno mjeri nakon ekstrakcije iz tkiva (27.). Nagrizajuće kemikalije prepoznaju se po tome što smanjuju vijabilnost stanica ispod definiranih pragova (vidjeti stavke 35. i 36.). Pokazalo se da se ispitnom metodom za utvrđivanje nagrizanja kože koja se temelji na modelu RhE može predvidjeti nagrizajuće djelovanje na kožu in vivo koje je procijenjeno kod kunića u skladu s ispitnom metodom B.4. (2.).

DOKAZIVANJE OSPOSOBLJENOSTI

13.

Prije rutinske primjene bilo kojeg od četiriju validiranih ispitnih modela RhE koji su u skladu s ovom ispitnom metodom laboratoriji bi trebali dokazati tehničku osposobljenost pravilnim utvrđivanjem kategorije dvanaest tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti koje su navedene u tablici 1. U slučaju upotrebe metode za daljnje razvrstavanje trebalo bi dokazati i pravilno daljnje razvrstavanje. U slučajevima u kojima nije dostupna navedena tvar ili ako je to opravdano, može se upotrijebiti druga tvar za koju su dostupni primjereni referentni in vivo i in vitro podaci (npr. s popisa referentnih kemikalija (24.)) pod uvjetom da se primjenjuju isti kriteriji za odabir kao oni opisani u tablici 1.

Tablica 1.

Popis tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti  (8)

Tvar

CAS br.

Kemijski razred (9)

Kat. sustava UN GHS-a ili CLP-a na temelju in vivo rezultata (10)

Kat. VRM-a na temelju in vitro rezultata (11)

Redukcija MTT-a (12)

Agregatno stanje

Tvari koje djeluju nagrizajuće in vivo iz potkategorije 1.A

Bromoctena kiselina

79-08-3

Organska kiselina

1.A

(3) 1.A

S

Borov trifluorid dihidrat

13319-75-0

Anorganska kiselina

1.A

(3) 1.A

L

Fenol

108-95-2

Fenol

1.A

(3) 1.A

S

Dikloracetil klorid

79-36-7

Elektrofil

1.A

(3) 1.A

L

Kombinacija tvari koje djeluju nagrizajuće in vivo iz potkategorija 1.B i 1.C

Monohidrat glioksilne kiseline

563-96-2

Organska kiselina

1.B i 1.C

(3) 1.B i 1.C

S

Mliječna kiselina

598-82-3

Organska kiselina

1.B i 1.C

(3) 1.B i 1.C

L

Etanolamin

141-43-5

Organska baza

1.B

(3) 1.B i 1.C

Y

Viskozno

Klorovodična kiselina (14,4 %)

7647-01-0

Anorganska kiselina

1.B i 1.C

(3) 1.B i 1.C

L

Tvari koje ne djeluju nagrizajuće in vivo

Fenetil bromid

103-63-9

Elektrofil

NC

(3) NC

Y

L

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Organska baza

NC

(3) NC

S

4-(metiltio)-benzaldehid

3446-89-7

Elektrofil

NC

(3) NC

Y

L

Laurinska kiselina

143-07-7

Organska kiselina

NC

(3) NC

S

Kratice: CAS br. = registarski broj Službe za podatke o kemijskim tvarima; VRM = validirana referentna metoda; NC = nije nagrizajuće; Y = da; S = kruto; L = tekuće

14.

U okviru dokazivanja osposobljenosti preporučuje se da korisnik po primitku provjeri svojstva barijere tkiva u skladu sa specifikacijama proizvođača modela RhE. To je posebno važno ako se tkiva šalju na velike udaljenosti/tijekom dugih vremenskih razdoblja. Nakon što se metoda uspješno uspostavi i nakon što se dokaže osposobljenost u pogledu njezine uporabe, takva rutinska provjera neće biti potrebna. Međutim, kod rutinske uporabe ispitne metode preporučuje se daljnje ocjenjivanje svojstava barijere u pravilnim vremenskim intervalima.

POSTUPAK

15.

U nastavku se nalazi opći opis elemenata i postupaka u vezi s metodom na temelju rekonstruirane ljudske epiderme za potrebe ocjenjivanja nadraživanja kože obuhvaćenih ovom ispitnom metodom. Modeli RhE koji su podržani kao znanstveno valjani za upotrebu u ovoj ispitnoj metodi, tj. modeli EpiSkin™ (standardni model), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE i epiCS® (16., 17., 19., 28., 29., 30., 31., 32. i 33.) mogu se nabaviti iz komercijalnih izvora. Dostupni su standardni operativni postupci za ta četiri modela RhE (34., 35., 36. i 37.), a glavni elementi ispitne metode sažeti su u Dodatku 2. Preporučuje se da se pri provedbi i upotrebi jednog od tih modela u laboratoriju prouči relevantni standardni operativni postupak. Ispitivanje s četiri ispitna modela RhE obuhvaćena ovom ispitnom metodom trebalo bi biti u skladu sa sljedećim:

ELEMENTI ISPITNE METODE RHE

Opći uvjeti

16.

Za rekonstruiranje epitela treba koristiti netransformirane ljudske keratinocite. Ispod funkcionalnog rožnatog sloja (stratum corneum) nalaze se višestruki slojevi vijabilnih epitelnih stanica (bazalni sloj, trnasti sloj, zrnati sloj). I sam rožnati sloj višeslojan je te sadržava esencijalni profil lipida kao čvrstu funkcionalnu barijeru koja je sposobna zaustaviti brzi prodor citotoksičnih referentnih kemikalija, npr. natrijev dodecil-sulfat (SDS) ili Triton X-100. Funkciju barijere trebalo bi dokazati i može se ocijeniti određivanjem koncentracije pri kojoj referentna kemikalija smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC50) nakon fiksnog vremena izlaganja ili određivanjem vremena izlaganja koje je potrebno da se vijabilnost stanica smanji za 50 % (ET50) nakon primjene referentne kemikalije u unaprijed određenoj fiksnoj koncentraciji (vidjeti stavak 18.). Model RhE mora biti dovoljno nepropustan da spriječi prolazak materijala oko rožnatog sloja do vijabilnog tkiva jer bi to dovelo do lošeg modeliranja izlaganja kože. Model RhE ne smije biti onečišćen bakterijama, virusima, mikoplazmama ili gljivicama.

Funkcionalni uvjeti

Vijabilnost

17.

Za kvantifikaciju vijabilnosti tkiva upotrebljava se MTT test (27.). Vijabilne stanice modela tkiva RhE reduciraju vitalnu boju MTT u talog plavog MTT formazana koji se zatim ekstrahira iz tkiva izopropanolom (ili sličnim otapalom). Optička gustoća (OD) samog ekstrakcijskog otapala treba biti dovoljno mala tj. OD < 0,1. Ekstrahirani MTT formazan može se kvantificirati upotrebom mjerenja standardne apsorbancije (OD) ili postupkom HPLC/UPLC spektrofotometrije (38.). Korisnici modela RhE trebali bi osigurati da svaka šarža modela RhE koji se upotrebljava ispunjava utvrđene kriterije za negativnu kontrolu. Raspon prihvatljivosti (gornja i donja granica) za vrijednosti optičke gustoće negativne kontrole trebao bi utvrditi subjekt koji je razvio model RhE ili dobavljač tog modela. Rasponi prihvatljivosti za vrijednosti optičke gustoće negativne kontrole za četiri validirana ispitna modela RhE uključena u ovu ispitnu metodu navedeni su u tablici 2. Korisnik HPLC/UPLC spektrofotometrije trebao bi upotrebljavati raspone optičke gustoće negativne kontrole navedene u tablici 2. kao kriterij prihvatljivosti za negativnu kontrolu. Potrebno je dokumentirati da su tkiva obrađena negativnom kontrolom stabilna u kulturi (tj. daju slična mjerenja optičke gustoće) za vrijeme trajanja izlaganja.

Tablica 2.

Rasponi prihvatljivosti vrijednosti optičke gustoće negativne kontrole za kontrolu kvalitete šarži

 

Donja granica prihvatljivosti

Gornja granica prihvatljivosti

EpiSkin™ (standardna metoda)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Funkcija barijere

18.

Rožnati sloj sa svojim sastavom lipida trebao bi biti sposoban zaustaviti brzi prodor određenih citotoksičnih referentnih kemikalija (npr. SDS ili Triton X-100), procijenjeno na temelju IC50 ili ET50 (tablica 3.). Subjekt koji je razvio model RhE ili njegov prodavatelj trebao bi pri dostavi tkiva krajnjem korisniku dokazati funkciju barijere svake šarže modela RhE koji se upotrebljava (vidjeti stavak 21.).

Morfologija

19.

U izvedbi histološkog pregleda modela RhE mora se dokazati da je struktura slična višeslojnoj strukturi ljudske epiderme koja sadržava bazalni sloj, trnasti sloj, zrnati sloj i rožnati sloj te pokazuje profil lipida sličan profilu lipida ljudske epiderme. Subjekt koji je razvio model RhE ili njegov prodavatelj trebao bi pri dostavi tkiva krajnjem korisniku dostaviti histološko ispitivanje svake šarže modela RhE koji se upotrebljava kojim se dokazuje odgovarajuća morfologija tkiva (vidjeti stavak 21.).

Obnovljivost

20.

Korisnici ispitnih metoda trebali bi dokazati obnovljivost ispitnih metoda tijekom vremena primjenom pozitivnih i negativnih kontrola. Nadalje, ispitna metoda trebala bi se upotrebljavati samo ako subjekt koji je razvio model RhE ili dobavljač dostavi podatke kojima se dokazuje obnovljivost tijekom vremena primjenom kemikalija koje djeluju nagrizajuće i onih koje ne djeluju nagrizajuće, npr. s popisa tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti (tablica 1.). U slučaju upotrebe ispitne metode za daljnje razvrstavanje trebalo bi dokazati i obnovljivost u pogledu potkategorija.

Kontrola kvalitete (KK)

21.

Model RhE trebao bi se upotrebljavati samo ako subjekt koji ga je razvio ili dobavljač dokaže da svaka šarža upotrijebljenog modela RhE ispunjava definirane kriterije za odobrenje proizvoda, među kojima su najvažniji oni za vijabilnost (stavak 17.), funkciju barijere (stavak 18.) i morfologiju (stavak 19.). Ti se podaci trebaju dostaviti korisnicima ispitne metode tako da ih mogu uključiti u izvješće o ispitivanju. Za pouzdano predviđanje nagrizajućeg razvrstavanja prihvatljivi su isključivo rezultati dobiveni sa šaržama tkiva koje ispunjavaju kontrolu kvalitete. Raspon prihvatljivosti (gornja i donja granica) za IC50 ili ET50 utvrđuje subjekt koji je razvio model RhE ili dobavljač tog modela. Rasponi prihvatljivosti za četiri validirana ispitna modela navedeni su u tablici 3.

Tablica 3.

Kriteriji za kontrolu kvalitete šarže

 

Donja granica prihvatljivosti

Gornja granica prihvatljivosti

EpiSkin™ (standardna metoda) (18-satno tretiranje SDS-om) (33.)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34.)

ET50 = 4,0 sati

ET50 = 8,7 sati

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35.)

ET50 = 4,0 sati

ET50 = 10,0 sati

epiCS® (1 % Triton X-100) (36.)

ET50 = 2,0 sati

ET50 = 7,0 sati

Primjena ispitivane kemikalije i kontrolnih kemikalija

22.

Za svaku ispitnu kemikaliju i kontrole trebala bi se upotrijebiti barem dva ponovljena tkiva za svako vrijeme izlaganja. I kod tekućina i kemikalija u krutom stanju treba primijeniti dovoljnu količinu ispitivane kemikalije kako bi se ravnomjerno pokrila površina epiderme tako da se izbjegne beskonačna doza, tj. trebalo bi upotrijebiti najmanje 70 μl/cm2 ili 30 mg/cm2 kemikalije. Ovisno o modelima, površinu epiderme trebalo bi navlažiti deioniziranom ili destiliranom vodom prije primjene kemikalija u krutom stanju kako bi se poboljšao kontakt ispitivane kemikalije s površinom epiderme (34., 35., 36. i 37.). Kad je god moguće, kemikalije u krutom stanju treba ispitivati u obliku sitnog praha. Metodu primjene treba prilagoditi ispitivanoj kemikaliji (vidjeti npr. upućivanja (34.–37.). Na kraju razdoblja izlaganja ispitivanu kemikaliju treba pažljivo oprati s epiderme vodenom puferskom otopinom ili 0,9-postotnom NaCl. Ovisno o tome koji se od četiri validirana ispitna modela RhE upotrebljava, upotrebljavaju se dva ili tri razdoblja izlaganja po ispitivanoj kemikaliji (za sva četiri valjana modela RhE: 3 min. i 1 sat; za EpiSkin™ dodatno vrijeme izlaganja od četiri sata). Ovisno o tome koji se ispitni model RhE upotrebljava i razdoblju izlaganja koje se procjenjuje, temperatura inkubacije tijekom izlaganja može varirati od sobne temperature do 37 °C.

23.

U svakom bi se ciklusu trebale upotrebljavati istodobne negativne i pozitivne kontrole kako bi se dokazalo da su vijabilnost (s negativnim kontrolama), funkcija barijere i posljedična osjetljivost tkiva (s pozitivnim kontrolama) unutar prihvatljivog raspona utvrđenog na temelju rezultata prijašnjih ispitivanja. Kao kemikalija pozitivne kontrole predlaže se ledena octena kiselina ili 8N KOH, ovisno o modelu RhE koji se upotrebljava. Trebalo bi napomenuti da 8N KOH izravno reducira MTT pa će možda biti potrebne prilagođene kontrole kako je opisano u stavcima 25. i 26. Kao negativna kontrolna tvar predlaže se 0,9-postotna NaCl (w/v) ili voda.

Mjerenja vijabilnosti stanica

24.

MTT test je kvantitativni test koji bi se trebao upotrebljavati za mjerenje vijabilnosti stanica na temelju ove ispitne metode (27.). Uzorak tkiva stavlja se u otopinu MTT odgovarajuće koncentracije (0,3 ili 1 mg/ml) i ostavi u njoj tri sata. Nataloženi plavi formazan zatim se ekstrahira iz tkiva s pomoću otapala (npr. izopropanol, kiseli izopropanol) i koncentracija formazana mjeri se određivanjem vrijednosti OD na 570 nm uz pojas propuštanja do najviše ±30 nm ili postupkom HPLC/UPLC spektrofotometrije (vidjeti stavke 30. i 31.) (38.).

25.

Ispitivane kemikalije mogu ometati MTT test izravnom redukcijom MTT-a u plavi formazan i/ili interferencijom s bojom ako ispitivana kemikalija apsorbira, prirodno ili zbog postupaka tretiranja, u istom rasponu optičke gustoće formazana (570 ± 30 nm, uglavnom plave i ljubičaste kemikalije). Treba upotrijebiti dodatne kontrole kako bi se utvrdila i ispravila moguća interferencija do koje dovode te ispitivane kemikalije, kao što su kontrola nespecifične redukcije MTT-a (NSMTT) i kontrola nespecifične boje (NSC) (vidjeti stavke od 26. do 30.). To je osobito važno kada se određena ispitivana kemikalija ne ispere u potpunosti s tkiva ili prodre u epidermu te je stoga prisutna u tkivima pri provođenju MTT testa vijabilnosti. Podroban opis načina na koji se ispravljaju izravna redukcija MTT-a i interferencija bojila dostupan je u standardnim operativnim postupcima za ispitne modele (34., 35., 36. i 37.).

26.

Kako bi se identificirale tvari koje izravno reduciraju MTT, svaku bi ispitivanu kemikaliju trebalo dodati u svježe pripremljeni medij MTT (34., 35., 36. i 37.). Ako smjesa MTT-a koja sadržava ispitivanu kemikaliju postane plava/ljubičasta, pretpostavlja se da ispitivana kemikalija izravno reducira MTT i treba se provesti daljnja funkcionalna provjera nevijabilne epiderme, neovisno o upotrebi mjerenja standardne apsorbancije (OD) ili postupka HPLC/UPLC spektrofotometrije. U toj dodatnoj funkcionalnoj provjeri upotrebljavaju se mrtva tkiva kod kojih je prisutna samo preostala metabolička aktivnost, ali koja apsorbiraju sličnu količinu ispitivane kemikalije kao vijabilna tkiva. Svaka kemikalija koja reducira MTT primjenjuje se na barem dva ponovljena mrtva tkiva po vremenu izlaganja, koja se podvrgavaju cijelom ispitivanju nagrizanja kože. Prava vijabilnost tkiva zatim se računa kao postotak vijabilnosti tkiva koji se dobiva iz živih tkiva izloženih tvari koja reducira MTT umanjenom za postotak nespecifične redukcije MTT-a dobivene s mrtvim tkivima izloženima istoj tvari koja reducira MTT, izračunano u odnosu na negativnu kontrolu koja se provodi istodobno kad i ispitivanje koje se ispravlja (%NSMTT).

27.

Kako bi se identificirala potencijalna interferencija obojenih ispitivanih kemikalija ili ispitivanih kemikalija koje se oboje u dodiru s vodom ili izopropanolom te kako bi se odlučilo jesu li potrebne dodatne kontrole, trebalo bi provesti spektralnu analizu ispitivane kemikalije u vodi (okoliš tijekom izlaganja) i/ili izopropanolu (otopina za ekstrahiranje). Ako ispitivana kemikalija u vodi i/ili izopropanolu apsorbira svjetlost u rasponu od 570 ± 30 nm, trebalo bi provesti daljnje kontrole bojila ili bi, kao alternativu, trebalo primijeniti postupak HPLC/UPLC spektrofotometrije; u potonjem slučaju te kontrole nisu potrebne (vidjeti stavke 30. i 31.). Pri provedbi mjerenja standardne apsorbancije (OD) svaka interferirajuća obojena ispitivana kemikalija primjenjuje se na najmanje dva ponovljena uzorka vijabilnog tkiva po vremenu izlaganja, koji se podvrgavaju cijelom ispitivanju nagrizanja kože, ali se u koraku inkubacije MTT-a inkubiraju medijem, a ne otopinom MTT-a, kako bi nastala kontrola nespecifične boje (NSCliving). Kontrolu NSCliving treba provoditi istodobno po vremenu izlaganja po obojenoj ispitivanoj kemikaliji (u svakom ciklusu) zbog svojstvene biološke varijabilnosti živih tkiva. Prava vijabilnost tkiva zatim se računa kao postotak vijabilnosti tkiva koji se dobiva iz živih tkiva izloženih interferirajućoj ispitivanoj kemikaliji i inkubiranih otopinom MTT-a, umanjeno za postotak nespecifične boje dobiven sa živim tkivima izloženima interferirajućoj ispitivanoj kemikaliji i inkubiranima medijem bez MTT-a, što se provodi istodobno kad i ispitivanje koje se ispravlja (%NSCliving).

28.

Za ispitivane kemikalije za koje se utvrdi da uzrokuju i izravnu redukciju MTT-a (vidjeti stavak 26.) i interferenciju s bojom (vidjeti stavak 27.) pri mjerenju standardne apsorbancije (OD) bit će potreban i treći skup kontrola, uz kontrole NSMTT i NSCliving opisane u prethodnim stavcima. To je obično slučaj kod tamno obojenih ispitivanih kemikalija koje ometaju MTT test (npr. plave, ljubičaste ili crne kemikalije) jer njihova intrinzična boja sprečava procjenu njihove sposobnosti da izravno reduciraju MTT, kako je opisano u stavku 26. Te se ispitivane kemikalije mogu vezati i na živa i na mrtva tkiva te se stoga kontrolom NSMTT može ispraviti ne samo potencijalna izravna redukcija MTT-a ispitivanom kemikalijom, već i interferencija s bojom koja je posljedica vezanja ispitivane kemikalije na mrtva tkiva. To bi moglo dovesti do dvostrukog ispravka za interferenciju s bojom jer se kontrolom NSCliving već ispravlja interferencija s bojom koja je posljedica vezanja ispitivane kemikalije na živa tkiva. Kako bi se izbjegao mogući dvostruki ispravak za interferenciju s bojom, treba provesti treću kontrolu za nespecifičnu boju u mrtvim tkivima (NSCkilled). U toj dodatnoj kontroli ispitivana kemikalija primjenjuje se na najmanje dva ponovljena uzorka mrtvog tkiva po vremenu izlaganja, koja se podvrgavaju cijelom postupku ispitivanja, ali se u koraku inkubacije MTT-a inkubiraju medijem, a ne otopinom MTT-a. Dovoljna je jedna kontrola NSCkilled po ispitivanoj kemikaliji neovisno o broju provedenih neovisnih ispitivanja/ciklusa, ali treba je provoditi istodobno s kontrolom NSMTT i, ako je moguće, s istom šaržom tkiva. Prava vijabilnost tkiva zatim se računa kao postotak vijabilnosti tkiva koji se dobiva iz živih tkiva izloženih ispitivanoj kemikaliji umanjeno za %NSMTT i %NSCliving te uvećano za postotak nespecifične boje dobiven s mrtvim tkivima izloženima interferirajućoj ispitivanoj kemikaliji i inkubiranima medijem bez MTT-a, izračunano u odnosu na negativnu kontrolu koja se provodi istodobno kad i ispitivanje koje se ispravlja (%NSCkilled).

29.

Važno je napomenuti da nespecifična redukcija MTT-a i nespecifična interferencija s bojom mogu povećati očitanja ekstrakta tkiva izvan raspona linearnosti spektrofotometra. Na temelju toga svaki bi laboratorij prije početka ispitivanja ispitivanih kemikalija u regulatorne svrhe trebao utvrditi raspon linearnosti svojeg spektrofotometra s MTT formazanom (CAS # 57360-69-7) iz komercijalnog izvora. Točnije, mjerenje standardne apsorbancije (OD) upotrebom spektrofotometra primjereno je za procjenu tvari koje izravno reduciraju MTT i ispitivanih kemikalija koje interferiraju s bojom ako je optička gustoća ektrakata tkiva dobivena ispitivanom kemikalijom bez ikakvih ispravaka za izravnu redukciju MTT-a i/ili interferenciju s bojom unutar linearnog raspona spektrofotometra ili ako je neispravljenim postotkom vijabilnosti dobivenim ispitivanom kemikalijom ona već utvrđena kao nagrizajuća (vidjeti stavke 35. i 36.). Ipak, rezultate za ispitivane kemikalije koji daju %NSMTT i/ili %NSCliVing > 50 % negativne kontrole trebalo bi oprezno tumačiti.

30.

Kod obojenih ispitivanih kemikalija koje nisu kompatibilne s mjerenjem standardne apsorbancije (OD) zbog prejake interferencije s MTT testom, za mjerenje MTT formazana može se upotrijebiti alternativni postupak HPLC/UPLC spektrofotometrije (vidjeti stavak 31.) (37.). Sustav HPLC/UPLC spektrofotometrije omogućuje izdvajanje MTT formazana iz ispitivane kemikalije prije njegove kvantifikacije (38.). Zato pri upotrebi HPLC/UPLC spektrofotometrije nikad nisu potrebne kontrole NSCliVing ili NSCkilled, neovisno o kemikaliji koja se ispituje. Kontrole NSMTT ipak bi se trebale upotrijebiti ako se sumnja u to da ispitivana kemikalija izravno reducira MTT ili ima boju koja sprečava procjenu sposobnosti izravne redukcije MTT-a (kako je opisano u stavku 26.). Ako se za mjerenje MTT formazana upotrebljava HPLC/UPLC spektrofotometrija, postotak vijabilnosti tkiva računa se kao postotak površine pika MTT formazana dobiven sa živim tkivima izloženima ispitivanoj kemikaliji u odnosu na pik MTT formazana dobiven s istodobnom negativnom kontrolom. Za ispitivane kemikalije koje mogu izravno reducirati MTT prava vijabilnost tkiva računa se kao postotak vijabilnosti tkiva dobiven sa živim tkivima izloženima ispitivanoj kemikaliji umanjen za %NSMTT. Naposljetku, treba napomenuti da se ne mogu procijeniti tvari koje izravno reduciraju MTT i koje ujedno mogu i interferirati s bojom, koje se zadržavaju u tkivima nakon tretiranja i reduciraju MTT toliko jako da dovode do optičke gustoće (upotrebom standardnog mjerenja optičke gustoće) ili površina pika (upotrebom UPLC/HPLC spektrofotometrije) ispitivanih ekstrakata tkiva koji su izvan raspona linearnosti spektrofotometra, iako do toga dolazi samo u iznimno rijetkim slučajevima.

31.

HPLC/UPLC spektrofotometrija može se upotrebljavati i sa svim vrstama ispitivanih kemikalija (obojenima, neobojenima, koje reduciraju MTT i koje ga ne reduciraju) za mjerenje MTT formazana (38.). Zbog raznolikosti sustava HPLC/UPLC spektrofotometrije, kvalifikaciju sustava HPLC/UPLC spektrofotometrije trebalo bi dokazati prije njegove upotrebe za kvantificiranje MTT formazana iz ekstrakata tkiva tako da sustav ispuni kriterije prihvatljivosti za skup standardnih parametara kvalifikacije u skladu s parametrima opisanima u smjernicama američke Uprave za hranu i lijekove o validaciji bioanalitičkih metoda namijenjenih industriji (38. i 39.). Ti ključni parametri i njihovi kriteriji prihvatljivosti prikazani su u Dodatku 4. Kad se ispune kriteriji prihvatljivosti definirani u Dodatku 4., smatra se da je sustav HPLC/UPLC spektrofotometrije kvalificiran i spreman za mjerenje MTT formazana u pokusnim uvjetima opisanima u ovoj ispitnoj metodi.

Kriteriji prihvatljivosti

32.

Za svaku ispitnu metodu u kojoj se upotrebljavaju valjani modeli RhE, tkiva tretirana negativnom kontrolom trebala bi pokazivati optičku gustoću koja odražava kvalitetu tkiva, kako je opisano u tablici 2., i ne bi trebala biti ispod prethodno utvrđenih granica. Tkiva tretirana pozitivnom kontrolom, tj. ledenom octenom kiselinom ili 8N KOH, trebala bi odražavati sposobnost tkiva da odgovore na nagrizajuću kemikaliju u uvjetima ispitnog modela (vidjeti Dodatak 2.). Varijabilnost između ponovljenih uzoraka tkiva ispitivane kemikalije i/ili kontrolnih kemikalija trebala bi biti unutar prihvaćenih ograničenja za svaki zahtjev valjanog modela RhE (vidjeti Dodatak 2.) (npr. razlika u vijabilnosti između sva ponovljena uzorka tkiva ne bi trebala biti veća od 30 %). Ako negativna ili pozitivna kontrola uključena u ciklus bude izvan prihvaćenih raspona, smatra se da ciklus ne ispunjava zahtjeve i treba ga ponoviti. Ako je varijabilnost ispitivanih kemikalija izvan definiranih raspona, trebalo bi ponoviti ispitivanje.

Tumačenje rezultata i model predviđanja

33.

Vrijednosti optičke gustoće za svaku ispitivanu kemikaliju trebalo bi koristiti za izračun postotka vijabilnosti u odnosu na negativnu kontrolu, koja je određena kao 100 %. U slučaju upotrebe HPLC/UPLC spektrofotometrije postotak vijabilnosti tkiva računa se kao postotak površine pika MTT formazana dobiven sa živim tkivima izloženima ispitivanoj kemikaliji u odnosu na pik MTT formazana dobiven s istodobnom negativnom kontrolom. Granične vrijednosti vijabilnosti stanica, izražene postotkom, koje služe za razlikovanje nagrizajućih od nenagrizajućih ispitivanih kemikalija (ili za razlikovanje različitih potkategorija nagrizajućeg djelovanja) navedene su u nastavku u stavcima 35. i 36. za svaki ispitni model obuhvaćen ovom ispitnom metodom i trebale bi se upotrebljavati za tumačenje rezultata.

34.

Jedan ciklus ispitivanja koji obuhvaća najmanje dva ponovljena uzorka tkiva trebao bi biti dovoljan za ispitivanu kemikaliju ako je dobiveno razvrstavanje nedvosmisleno. Međutim, u slučajevima graničnih rezultata, kao što su neusklađena ponovljena mjerenja, može se razmotriti drugi ciklus, a i treći ciklus u slučaju neusklađenih rezultata između prva dva ciklusa.

35.

Model predviđanja za ispitni model EpiSkin™ za ispitivanje nagrizanja kože (9., 34. i 22.), povezan sa sustavom razvrstavanja UN GHS-om ili CLP-om, prikazan je u tablici 4.

Tablica 4.

Model predviđanja za EpiSkin™

Vijabilnost mjerena u točkama vremena izlaganja (t = 3, 60 i 240 minuta)

Predviđanje koje treba razmotriti

< 35 % nakon 3 min. izlaganja

Nagrizajuće:

Neobavezna potkategorija 1.A (*1)

≥ 35 % nakon 3 min. izlaganja I

< 35 % nakon 60 min. izlaganja

ILI

≥ 35 % nakon 60 min. izlaganja I

< 35 % nakon 240 minuta izlaganja

Nagrizajuće:

Kombinacija neobaveznih potkategorija 1.B i 1.C

≥ 35 % nakon 240 min. izlaganja

Nije nagrizajuće

36.

Modeli predviđanja za ispitne modele EpiDerm™ SCT (10., 23. i 35.), SkinEthic™ RHE (17., 18., 23. i 36.) i epiCS® (16., 23. i 37.) za ispitivanje nagrizanja kože povezani sa sustavom razvrstavanja UN GHS-om ili CLP-om prikazani su u tablici 5.:

Tablica 5.

EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE i epiCS®

Vijabilnost mjerena u točkama vremena izlaganja (t = 3 i 60 minuta)

Predviđanje koje treba razmotriti

KORAK 1 za EpiDerm™ SCT, za SkinEthic™ RHE i epiCS®

< 50 % nakon 3 min. izlaganja

Nagrizajuće

≥ 50 % nakon 3 min. izlaganja I< 15 % nakon 60 min. izlaganja

Nagrizajuće

≥ 50 % nakon 3 min. izlaganja I≥ 15 % nakon 60 min. izlaganja

Nije nagrizajuće

KORAK 2 za EpiDerm™ SCT – za tvari/smjese identificirane kao nagrizajuće u koraku 1

< 25 % nakon 3 min. izlaganja

Neobavezna potkategorija 1.A*

≥ 25 % nakon 3 min. izlaganja

Kombinacija neobaveznih potkategorija 1.B i 1.C

KORAK 2 za SkinEthic™ RHE – za tvari/smjese identificirane kao nagrizajuće u koraku 1

< 18 % nakon 3 min. izlaganja

Neobavezna potkategorija 1.A*

≥ 18 % nakon 3 min. izlaganja

Kombinacija neobaveznih potkategorija 1.B i 1.C

KORAK 2 za epiCS® – za tvari/smjese identificirane kao nagrizajuće u koraku 1

< 15 % nakon 3 min. izlaganja

Neobavezna potkategorija 1.A*

≥ 15 % nakon 3 min. izlaganja

Kombinacija neobaveznih potkategorija 1.B i 1.C

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Podaci

37.

Podatke pojedinačnih ponavljanja uzoraka tkiva u svakom ispitivanju (npr. vrijednosti OD i izračunani postotak vijabilnosti stanica za svaku ispitivanu kemikaliju, zajedno s razvrstavanjem) treba prikazati u tabličnom obliku, uključujući eventualne podatke iz ponovljenih pokusa. Osim toga, treba navesti srednje vrijednosti i raspone vijabilnosti te koeficijente varijacije između ponovljenih uzoraka tkiva za svako ispitivanje. Za svaku ispitanu kemikaliju treba navesti zapažene interakcije tvari koje reduciraju MTT ili obojenih ispitivanih kemikalija s MTT reagensom.

Izvješće o ispitivanju

38.

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:

 

Ispitivana kemikalija i kontrolne kemikalije:

tvar s jednim sastojkom: kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv, CAS broj, SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula, čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd.,

tvar s više sastojaka, UVCB tvar i smjesa: opis (koliko je to moguće) kemijskog identiteta (vidjeti gore), kvantitativnog udjela i relevantnih fizikalno-kemijskih svojstava sastojaka,

fizički izgled, topljivost u vodi i bilo koja druga relevantna fizikalno-kemijska svojstva,

izvor, broj serije, ako su dostupni,

tretiranje ispitivanih kemikalija/kontrolne tvari prije ispitivanja, ako je primjenljivo (npr. grijanje, mljevenje),

stabilnost ispitivane kemikalije, rok uporabe ili datum za ponovnu analizu ako je poznat,

uvjeti skladištenja.

 

Model RhE i protokol koji se upotrebljavaju te obrazloženje odabira (ako je primjenjivo)

 

Ispitni uvjeti:

model RhE koji se upotrebljava (uključujući broj šarže),

informacije o kalibraciji mjernog uređaja (npr. spektrofotometar), valna duljina i pojas propuštanja (ako je primjenjivo) koji se upotrebljavaju za kvantifikaciju MTT formazana te raspon linearnosti mjernog uređaja,

opis metode koja se upotrebljava za kvantifikaciju MTT formazana,

opis kvalifikacije sustava HPLC/UPLC spektrofotometrije, ako je primjenjivo,

potpune popratne informacije o konkretnom upotrijebljenom modelu RhE, uključujući njegove radne značajke. To bi, među ostalim, trebalo uključivati:

i)

vijabilnost;

ii)

funkciju barijere;

iii)

morfologiju;

iv)

obnovljivost i prediktivnu sposobnost;

v)

kontrole kvalitete modela,

upućivanje na prijašnje podatke za predmetni model. To bi, među ostalim, trebalo uključivati prihvatljivost podataka o kontroli kvalitete s upućivanjem na prijašnje podatke o šarži,

dokazivanje osposobljenosti za izvođenje ispitne metode prije rutinske upotrebe ispitivanjem tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti.

 

Ispitni postupak:

pojedinosti o upotrijebljenom ispitnom postupku (uključujući postupke ispiranja upotrijebljene nakon razdoblja izlaganja),

doze upotrijebljenih ispitivanih kemikalija i kontrolnih kemikalija,

trajanje razdoblja izlaganja i temperature izlaganja,

oznake kontrola koje se koriste za tvari koje izravno reduciraju MTT i/ili ispitivane kemikalije za bojenje, ako je primjenjivo,

broj ponavljanja uzoraka tkiva upotrijebljenih po ispitivanoj kemikaliji i kontrolama (pozitivna kontrola, negativna kontrola te NSMTT, NSCliving i NSCkilled, ako je primjenjivo) po vremenu izlaganja,

opis primijenjenih kriterija za odlučivanje/modela predviđanja na temelju upotrijebljenog RhE modela,

opis mogućih izmjena ispitne metode (uključujući postupke ispiranja).

 

Kriteriji prihvatljivosti ciklusa i ispitivanja:

srednje vrijednosti i rasponi prihvatljivosti pozitivnih i negativnih kontrola na temelju prijašnjih podataka,

prihvatljiva varijabilnost između ponovljenih uzoraka tkiva za pozitivne i negativne kontrole,

prihvatljiva varijabilnost između ponovljenih uzoraka tkiva za ispitivanu kemikaliju.

 

Rezultati:

tablični prikaz podataka za pojedinačne ispitivane kemikalije i kontrole, za svako razdoblje izlaganja, svaki ciklus i svako ponovljeno mjerenje, uključujući optičku gustoću ili površinu pika MTT formazana, postotak vijabilnosti tkiva, srednji postotak vijabilnosti tkiva, razlike između ponovljenih uzoraka, standardne devijacije i/ili koeficijente varijacije, ako je primjenjivo,

ako je primjenjivo, rezultati kontrola upotrijebljenih za tvari koje izravno reduciraju MTT i/ili ispitivane kemikalije za bojenje, uključujući optičku gustoću ili površinu pika MTT formazana, %NSMTT, %NSCliving, %NSCkilled, razlike između ponovljenih uzoraka tkiva, standardne devijacije i/ili koeficijente varijacije (ako je primjenjivo) te konačni točni postotak vijabilnosti tkiva,

rezultati dobiveni s ispitivanom kemikalijom/kemikalijama i kontrolnim kemikalijama u odnosu na utvrđene kriterije prihvatljivosti za ciklus i ispitivanje,

opis drugih uočenih učinaka,

utvrđeno razvrstavanje, s upućivanjem na primijenjeni model predviđanja/kriterije odlučivanja.

 

Rasprava o rezultatima

 

Zaključci

LITERATURA

1.

UN (2013). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth Revised Edition, UN New York i Ženeva. Dostupno na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

2.

Poglavlje B.4. ovog Priloga, Akutno nadraživanje/nagrizanje kože.

3.

Poglavlje B.40. ovog Priloga, Nagrizanje kože in vitro.

4.

Poglavlje B.65. ovog Priloga, In vitro ispitna metoda s membranskom barijerom.

5.

Poglavlje B.46. ovog Priloga, Nadraživanje kože in vitro: ispitna metoda na modelu rekonstruirane ljudske epiderme.

6.

OECD (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment of Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

7.

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23:219.–255.

8.

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 12:471.–482.

9.

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhutter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol.in Vitro 12:483.–524.

10.

Liebsch M., Traue D., Barrabas C., Spielmann H., Uphill P., Wilkins S., Wiemann C., Kaufmann T., Remmele M. and Holzhütter H. G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing, ATLA 28: 371.–401.

11.

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H. et Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops, ATLA 23:129.–147.

12.

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, SAD.

13.

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, SAD.

14.

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), izdao ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3. travnja 1998.

15.

EC-ECVAM (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, izdao ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC14), 21. ožujka 2000.

16.

Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S., Losse J., Thomas D., Siefken W., Ahr H.J., Vohr H.W. and Fuchs H.W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000)-A New Reconstructed Epidermis for In Vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol. In Vitro 19: 925.–929.

17.

Kandárová H., Liebsch M., Spielmann,H., Genschow E., Schmidt E., Traue D., Guest R., Whittingham A., Warren N, Gamer A.O., Remmele M., Kaufmann T., Wittmer E., De Wever B., and Rosdy M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In Vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol. In Vitro 20: 547.–559.

18.

Tornier C., Roquet M. and Fraissinette A.B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0,5 cm2 Tissue Sample. Toxicol. In Vitro 24: 1379.–1385.

19.

EC-ECVAM (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, izdao ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC25), 17 studenoga 2006.

20.

EC-ECVAM (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000, izdao ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 12. lipnja 2009.

21.

OECD (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 190). Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

22.

Alépée N., Grandidier M.H., and Cotovio J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. In Vitro 28:131.–145.

23.

Desprez B., Barroso J., Griesinger C., Kandárová H., Alépée N., and Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. In Vitro 29:2055.–2080.

24.

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion in Relation to OECD TG 431. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 219). Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

25.

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz.

26.

Eskes C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 62:393.–403.

27.

Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65:55.–63.

28.

Tinois E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In Vitro. U: In Vitro Skin Toxicology. Rougier A., Goldberg A.M and Maibach H.I. (Eds): 133.–140.

29.

Cannon C. L., Neal P.J., Southee J.A., Kubilus J. and Klausner M. (1994), New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol. in Vitro 8:889.–891.

30.

Ponec M., Boelsma E, Weerheim A, Mulder A, Bouwstra J and Mommaas M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Inter. J. Pharmaceu. 203:211.–225.

31.

Tinois E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M. and Thivolet J. (1991). In Vitro and Post - Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193:310.–319.

32.

Parenteau N.L., Bilbo P, Nolte CJ, Mason VS and Rosenberg M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotech. 9:163.–171.

33.

Wilkins L.M., Watson SR, Prosky SJ, Meunier SF and Parenteau N.L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotech. Bioeng. 43/8:747.–756.

34.

EpiSkin™ SOP (December 2011). INVITTOX Protocol (No 118). EpiSkin™ Skin Corrosivity Test.

35.

EpiDerm™ SOP (February 2012). Version MK-24-007-0024 Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT), for Use with MatTek Corporation’s Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm.

36.

SkinEthic™ RHE SOP (January 2012). INVITTOX Protocol SkinEthic™ Skin Corrosivity Test.

37.

EpiCS® SOP (January 2012). Version 4.1 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Epidermal Skin Test 1000 (epiCS®) CellSystems.

38.

Alépée N., Barroso J., De Smedt A., De Wever B., Hibatallah J., Klaric M., Mewes K.R., Millet M., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Templier M., and McNamee P. Use of HPLC/UPLC- spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)- based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29: 741.–761.

39.

US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. (svibanj 2001.). Dostupno na: [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

Dodatak 1.

DEFINICIJE

Točnost : stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. Ona je mjerilo učinkovitosti ispitne metode i jedan od aspekata relevantnosti. Pojam je često međusobno zamjenjiv s pojmom „podudarnost” u smislu udjela točnih ishoda ispitne metode (25.).

Vijabilnost stanica : parametar za mjerenje ukupne aktivnosti populacije stanica, npr. sposobnost staničnih mitohondrijskih dehidrogenaza da reduciraju vitalnu boju MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plavo), koji, ovisno o krajnjoj točki koja se mjeri i planu ispitivanja, korelira s ukupnim brojem i/ili vitalnošću živih stanica.

Kemikalija : tvar ili smjesa.

Podudarnost : mjerilo učinkovitosti ispitne metode za ispitne metode koje daju kategorijski rezultat i jedan je od aspekata relevantnosti. Pojam je ponekad međusobno zamjenjiv s pojmom točnosti i definira se kao udio svih ispitanih kemikalija koje su pravilno razvrstane kao pozitivne ili negativne. Podudarnost u velikoj mjeri ovisi o prisutnosti pozitivnih rezultata u vrstama ispitivane kemikalije (25.).

ET50 : može se procijeniti utvrđivanjem vremena izlaganja potrebnog za smanjenje vijabilnosti stanica za 50 % nakon primjene referentne kemikalije u određenoj, fiksnoj koncentraciji; vidjeti i IC50.

GHS (Globalno usklađeni sustav razvrstavanja i označivanja kemikalija) : sustav za razvrstavanje kemikalija (tvari i smjesa) prema standardiziranim vrstama i stupnjevima fizičkih opasnosti te opasnosti za zdravlje i okoliš, kojim su obuhvaćena odgovarajuća komunikacijska sredstva kao što su piktogrami, oznake opasnosti, oznake upozorenja, oznake obavijesti i sigurnosno-tehnički listovi, kojima se prenose informacije o njihovim štetnim učincima u cilju zaštite ljudi (uključujući poslodavce, radnike, prijevoznike, potrošače i interventno osoblje) i okoliša (1.).

HPLC : tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti.

IATA : integrirani pristup ispitivanju i procjeni.

IC50 : može se procijeniti utvrđivanjem koncentracije pri kojoj referentna kemikalija smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC50) nakon fiksnog vremena izlaganja; vidjeti i ET50.

Beskonačna doza : količina ispitivane kemikalije primijenjena na epidermu koja je veća od količine potrebne da bi se potpuno i ravnomjerno pokrila površina epiderme.

Smjesa : smjesa ili otopina koja se sastoji od dviju ili više tvari koje u njoj ne reagiraju.

Tvar s jednim sastojkom : tvar, definirana količinskim sastavom, u kojoj je jedan glavni sastojak prisutan u koncentraciji od najmanje 80 % (w/w).

MTT : 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid; tiazolil plavo tetrazolijev bromid.

Tvar s više sastojaka : tvar, definirana količinskim sastavom, u kojoj je više od jednog glavnog sastojka prisutno u koncentraciji većoj od 10 % (w/w) te manjoj od 80 % (w/w). Tvar s više sastojaka rezultat je procesa proizvodnje. Smjesa i tvar s više sastojaka razlikuju se po tome što se smjesa dobiva miješanjem dviju ili više tvari bez kemijske reakcije. Tvar s više sastojaka rezultat je kemijske reakcije.

NC : nije nagrizajuće.

Kontrola NSCkilled : kontrola nespecifične boje u mrtvim tkivima.

Kontrola NSCliving : kontrola nespecifične boje u živim tkivima.

NSMTT : nespecifična redukcija MTT-a.

OD : optička gustoća.

PC : pozitivna kontrola; ponovljeni uzorak koji sadržava sve komponente ispitnog sustava i tretiran je kemikalijom za koju je poznato da inducira pozitivan odgovor. Kako bi se osigurala mogućnost procjene varijabilnosti odgovora pozitivne kontrole tijekom vremena, pozitivan odgovor ne bi smio biti presnažan.

Zahtjevi izvedbe (PS) : zahtjevi koji se temelje na validiranoj ispitnoj metodi i pružaju temelj za ocjenjivanje usporedivosti predložene, funkcionalno i mehanicistički slične, ispitne metode. Uključuju: i. ključne elemente ispitne metode; ii. minimalni popis referentnih kemikalija odabranih među kemikalijama koje se upotrebljavaju za dokazivanje prihvatljive učinkovitosti validirane ispitne metode; te iii. slične razine pouzdanosti i točnosti, utemeljene na rezultatima dobivenim za validiranu ispitnu metodu, koje se prilikom ocjenjivanja trebaju dokazati predloženom ispitnom metodom koristeći minimalni popis referentnih kemikalija (25.).

Relevantnost : opis odnosa između ispitne metode i istraživanog učinka te je li ispitivanje prikladno i korisno za određenu svrhu. Pokazuje u kojoj se mjeri ispitnom metodom točno mjeri ili predviđa istraživani biološki učinak. Relevantnost uključuje razmatranje o točnosti (podudarnosti) ispitne metode (25.).

Pouzdanost : pokazuje u kojoj se mjeri ispitna metoda može obnovljivo primijeniti unutar jednog laboratorija i između više laboratorija tijekom vremena uz primjenu istog protokola. Ocjenjuje se izračunavanjem obnovljivosti unutar jednog laboratorija i između više laboratorija (25.).

Ciklus : ciklus se sastoji od jedne ispitivane kemikalije ili više njih, koje se ispituju istodobno s negativnom i pozitivnom kontrolom.

Osjetljivost : udio svih pozitivnih/aktivnih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom ispitne metode. To je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (25.).

Nagrizanje kože in vivo : uzrokovanje ireverzibilnog oštećenja kože, točnije, vidljive nekroze koja kroz epidermu prodire u dermu nakon što je ispitivana kemikalija primjenjivana u trajanju do najviše četiri sata. Za nagrizanje kože tipična je pojava čireva, krvarenja, krvavih krasta te, do kraja opažanja od 14 dana, gubitak boje kože zbog nestajanja pigmenta, cijele površine zahvaćene alopecijom (gubitak dlake) i ožiljci. Za ocjenjivanje sumnjivih lezija treba razmotriti mogućnost histopatoloških pretraga.

Specifičnost : udio svih negativnih/neaktivnih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom ispitne metode. To je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (25.).

Tvar : kemijski element i njegovi spojevi u prirodnome stanju ili dobiveni proizvodnim postupkom, što uključuje i aditive koji su nužni za održavanje stabilnosti proizvoda te nečistoće koje proizlaze iz primijenjenoga postupka, ali isključuje otapala koja se mogu izdvojiti bez utjecaja na stabilnost tvari ili promjene njezina sastava.

Ispitivana kemikalija : svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.

UPLC : tekućinska kromatografija iznimno visoke djelotvornosti.

UVCB : tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvodi i biološki materijali.

Dodatak 2.

GLAVNI ELEMENTI ISPITNIH MODELA RHE KOJI SU VALIDIRANI ZA ISPITIVANJE NAGRIZANJA KOŽE

Elementi ispitnog modela

EpiSkinTM

EpiDermTM SCT

SkinEthicTM RHE

epiCS®

Površina modela

0,38 cm2

0,63 cm2

0,5 cm2

0,6 cm2

Broj ponavljanja uzoraka tkiva

Najmanje dva po vremenu izlaganja

2–3 po vremenu izlaganja

Najmanje dva po vremenu izlaganja

Najmanje dva po vremenu izlaganja

Doze za tretiranje i primjena

Tekućine i viskozne kemikalije: 50 μl ± 3 μl (131,6 μl/cm2)

Krute tvari: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 μl ± 5 μl otopine NaCl (9 g/l)

Voskovi/ljepljive tvari: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) s najlonskom mrežom

Tekućine: 50 μl (79,4 μl/cm2) s najlonskom mrežom ili bez nje

Kompatibilnost ispitivane kemikalije s najlonskom mrežom prije ispitivanja

Polukrute tvari: 50 μl (79,4 μl/cm2)

Krute tvari: 25 μl H2O (ili po potrebi više) + 25 mg (39,7 mg/cm2)

Voskovi: ravni komad nalik disku promjera otprilike 8 mm koji se stavlja na tkivo navlaženo s 15 μl H2O.

Tekućine i viskozne kemikalije: 40 μl ± 3 μl (80 μl/cm2) s najlonskom mrežom

Kompatibilnost ispitivane kemikalije s najlonskom mrežom prije ispitivanja

Krute tvari: 20 μl ± 2 μl H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2)

Voskovi/ljepljive tvari: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) s najlonskom mrežom

Tekućine: 50 μl (83,3 μl/cm2) s najlonskom mrežom

Kompatibilnost ispitivane kemikalije s najlonskom mrežom prije ispitivanja

Polukrute tvari: 50 μl (83,3 μl/cm2)

Krute tvari: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 μl H2O (ili po potrebi više)

Voskovi: ravni komad nalik kolačiću promjera otprilike 8 mm koji se stavlja na tkivo navlaženo s 15 μl H2O

Prethodna provjera izravne redukcije MTT-a

50 μl (tekućine) ili 20 mg (krute tvari)+ 2 ml MTT

0,3 mg/ml otopine za 180 ± 5 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

→ ako otopina postane plava/ljubičasta, treba provesti prilagođene kontrole usmrćivanjem vodom

50 μl (tekućine) ili 25 mg (krute tvari)+ 1 ml MTT

1 mg/ml otopine za 60 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

→ ako otopina postane plava/ljubičasta, treba provesti prilagođene kontrole usmrćivanjem zamrzavanjem

40 μl (tekućine) ili 20 mg (krute tvari)+ 1 ml MTT

1 mg/ml otopine za 180 ± 15 min na 37 °C, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

→ ako otopina postane plava/ljubičasta, treba provesti prilagođene kontrole usmrćivanjem zamrzavanjem

50 μl (tekućine) ili 25 mg (krute tvari)+ 1 ml MTT

1 mg/ml otopine za 60 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

→ ako otopina postane plava/ljubičasta, treba provesti prilagođene kontrole usmrćivanjem zamrzavanjem

Prethodna provjera za interferenciju s bojom

10 μl (tekućine) ili 10 mg (krute tvari) + 90 μl H2O miješano 15 min na sobnoj temperaturi

→ ako otopina postane obojena, trebalo bi provesti prilagođene kontrole na živom tkivu

50 μl (tekućine) ili 25 mg (krute tvari) + 300 μl H2O za 60 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

→ ako otopina postane obojena, trebalo bi provesti prilagođene kontrole na živom tkivu

40 μl (tekućine) ili 20 mg (krute tvari) + 300 μl H2O miješano 60 min na sobnoj temperaturi

→ ako je ispitivana kemikalija obojena, trebalo bi provesti prilagođene kontrole na živom tkivu

50 μl (tekućine) ili 25 mg (krute tvari) + 300 μl H2O za 60 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

→ ako otopina postane obojena, trebalo bi provesti prilagođene kontrole na živom tkivu

Vrijeme i temperatura izloženosti

3 min, 60 min (± 5 min) i 240 min (± 10 min)

U ventiliranim ormarima Sobna temperatura (18–28 oC)

3 min na sobnoj temperaturi i 60 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

3 min na sobnoj temperaturi i 60 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

3 min na sobnoj temperaturi i 60 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

Ispiranje

25 ml 1 x PBS (2 ml/odbacivanje)

20 puta uz stalan lagani tok 1 x PBS-a

20 puta uz stalan lagani tok 1 x PBS-a

20 puta uz stalan lagani tok 1 x PBS-a

Negativna kontrola

50 μl otopine NaCl (9 g/l)

Ispituje se sa svakim vremenom izlaganja

50 μl H2O

Ispituje se sa svakim vremenom izlaganja

40 μl H2O

Ispituje se sa svakim vremenom izlaganja

50 μl H2O

Ispituje se sa svakim vremenom izlaganja

Pozitivna kontrola

50 μl ledene octene kiseline

Ispituje se samo četiri sata

50 μl 8N KOH

Ispituje se sa svakim vremenom izlaganja

40 μl 8N KOH

Ispituje se samo 1 sat

50 μl 8N KOH

Ispituje se sa svakim vremenom izlaganja

Otopina MTT-a

2 ml 0,3 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

Vrijeme i temperatura inkubacije MTT-a

180 min (± 15 min) na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

180 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

180 min (±15 min) na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

180 min na 37 oC, 5 % CO2, relativna vlažnost od 95 %

Ekstrakcijsko otapalo

500 μl zakiseljenog izopropanola

(0,04 N HCl u izopropanolu)

(potpuno uronjeno izolirano tkivo)

2 ml izopropanola

(ekstrakcija s vrha i dna umetka)

1,5 ml izopropanola

(ekstrakcija s vrha i dna umetka)

2 ml izopropanola

(ekstrakcija s vrha i dna umetka)

Vrijeme i temperatura ekstrakcije

Preko noći na sobnoj temperaturi, zaštićeno od svjetla

Preko noći bez protresanja na sobnoj temperaturi ili 120 min uz protresanje (~ 120 rpm) na sobnoj temperaturi

Preko noći bez protresanja na sobnoj temperaturi ili 120 min uz protresanje (~ 120 rpm) na sobnoj temperaturi

Preko noći bez protresanja na sobnoj temperaturi ili 120 min uz protresanje (~ 120 rpm) na sobnoj temperaturi

Očitavanje optičke gustoće

570 nm (545–595 nm) bez referentnog filtra

570 nm (ili 540 nm) bez referentnog filtra

570 nm (540–600 nm) bez referentnog filtra

540–570 nm bez referentnog filtra

Kontrola kvalitete tkiva

18-satno tretiranje SDS-om

1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,0 mg/ml

Tretiranje s 1 % Triton X-100

4,08 sati ≤ ET50 ≤ 8,7 sati

Tretiranje s 1 % Triton X-100

4,0 sati ≤ ET50 ≤ 10,0 sati

Tretiranje s 1 % Triton X-100

2,0 sati ≤ ET50 ≤ 7,0 sati

Kriteriji prihvatljivosti

1.

Srednja optička gustoća ponovljenih uzoraka tkiva tretiranih negativnom kontrolom (NaCl) trebala bi biti ≥ 0,6 i ≤ 1,5 za svako vrijeme izlaganja.

2.

Srednja vijabilnost ponovljenih uzoraka tkiva izloženih pozitivnoj kontroli (ledena octena kiselina) na četiri sata, izražena kao postotak negativne kontrole, trebala bi biti ≤ 20 %.

3.

U rasponu vijabilnosti 20–100 % i za optičku gustoću ≥ 0,3, razlika u vijabilnosti između dva ponovljena uzorka tkiva ne bi trebala biti veća od 30 %.

1.

Srednja optička gustoća ponovljenih uzoraka tkiva tretiranih negativnom kontrolom (H2O) trebala bi biti ≥ 0,8 i ≤ 2,8 za svako vrijeme izlaganja.

2.

Srednja vijabilnost ponovljenih uzoraka tkiva izloženih pozitivnoj kontroli (8N KOH) na 1 sat, izražena kao postotak negativne kontrole, trebala bi biti < 15 %.

3.

U rasponu vijabilnosti 20–100 % koeficijent varijacije između ponovljenih uzoraka tkiva trebao bi biti ≤ 30 %.

1.

Srednja optička gustoća ponovljenih uzoraka tkiva tretiranih negativnom kontrolom (H2O) trebala bi biti ≥ 0,8 i ≤ 3,0 za svako vrijeme izlaganja.

2.

Srednja vijabilnost ponovljenih uzoraka tkiva izloženih pozitivnoj kontroli (8N KOH) na jedan sat (i četiri sata ako je primjenjivo), izražena kao postotak negativne kontrole, trebala bi biti < 15 %.

3.

U rasponu vijabilnosti 20–100 % i za optičku gustoću ≥ 0,3, razlika u vijabilnosti između dva ponovljena uzorka tkiva ne bi trebala biti veća od 30 %.

1.

Srednja optička gustoća ponovljenih uzoraka tkiva tretiranih negativnom kontrolom (H2O) trebala bi biti ≥ 0,8 i ≤ 2,8 za svako vrijeme izlaganja.

2.

Srednja vijabilnost ponovljenih uzoraka tkiva izloženih pozitivnoj kontroli (8N KOH) na 1 sat, izražena kao postotak negativne kontrole, trebala bi biti < 20 %.

3.

U rasponu vijabilnosti 20–100 % i za optičku gustoću ≥ 0,3, razlika u vijabilnosti između dva ponovljena uzorka tkiva ne bi trebala biti veća od 30 %.

Dodatak 3.

UČINKOVITOST ISPITNIH MODELA ZA DALJNJE RAZVRSTAVANJE

U tablici u nastavku navedena je učinkovitost četiriju ispitnih modela izračunana na temelju skupa od 80 kemikalija koje su ispitala četiri subjekta koja su razvila testove. Izračune je provelo tajništvo OECD-a, a pregledala ih je i potvrdila stručna podskupina (21. i 23.).

Ispitnim modelima EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™ i epiCS® mogu se odrediti daljnje potkategorije (tj. 1.A naspram 1.B i 1.C naspram NC).

Učinkovitost, stope prestrogog i preblagog razvrstavanja te točnost (prediktivna sposobnost) četiriju ispitnih modela na temelju skupa od 80 kemikalija koje su ispitane u dva ili tri ciklusa u svakom ispitnom modelu:

STATISTIČKI PODACI O PREDVIĐANJIMA DOBIVENI NA CIJELOM SKUPU KEMIKALIJA

(n = 80 kemikalija ispitivanih u dva neovisna ciklusa za epiCS® ili tri neovisna ciklusa za EpiDerm™ SCT, EpiSkin™ i SkinEthic™ RHE, tj. 159 (*2) odnosno 240 razvrstavanja)

 

EpiSkin™

EpiDerm TM

SkinEthic™

epiCS®

Prestroga razvrstavanja:

 

 

 

 

1.B i 1.C prestrogo razvrstani kao 1.A

21,50 %

29,0 %

31,2 %

32,8 %

NC prestrogo razvrstan kao 1.B i 1.C

20,7 %

23,4 %

27,0 %

28,4 %

NC prestrogo razvrstan kao 1.A

0,00 %

2,7 %

0,0 %

0,00 %

Ispr. prestrogog razvrstavanja

20,7 %

26,1 %

27,0 %

28,4 %

Opća stopa prestrogog razvrstavanja (sve kategorije)

17,9 %

23,3 %

24,5 %

25,8 %

Preblaga razvrstavanja:

 

 

 

 

1.A preblago razvrstan kao 1.B i 1.C

16,7 %

16,7 %

16,7 %

12,5 %