1.3.2016   

HR

Službeni list Europske unije

L 54/1


UREDBA KOMISIJE (EU) 2016/266

od 7. prosinca 2015.

o izmjeni Uredbe (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku

(Tekst značajan za EGP)

EUROPSKA KOMISIJA,

uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,

uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća od 18. prosinca 2006. o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i Direktive Vijeća 76/769/EEZ i direktiva Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ (1), a posebno njezin članak 13. stavak 2.,

budući da:

(1)

Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 (2) sadržava ispitne metode za određivanje fizikalno-kemijskih svojstava, toksičnosti i ekotoksičnosti tvari koje se primjenjuju za potrebe Uredbe (EZ) br. 1907/2006.

(2)

Uredbu (EZ) br. 440/2008 potrebno je ažurirati kako bi obuhvatila nove i ažurirane metode ispitivanja koje je nedavno donijela Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj (OECD), odnosno kako bi se u obzir uzeo tehnički napredak te kako bi se osiguralo smanjenje broja životinja koje se upotrebljavaju u pokusne svrhe, u skladu s Direktivom 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća (3). Savjetovanje sa zainteresiranim stranama o tom nacrtu već je provedeno.

(3)

Prilagodbom je obuhvaćeno 20 metoda ispitivanja: jedna nova metoda za određivanje fizikalno-kemijskog svojstva, jedanaest novih ispitnih metoda te tri ažurirane ispitne metode za procjenu ekotoksičnosti, kao i pet novih ispitnih metoda za procjenu životnog ciklusa i ponašanja u okolišu.

(4)

Uredbu (EZ) br. 440/2008 treba stoga na odgovarajući način izmijeniti.

(5)

Mjere predviđene ovom Uredbom u skladu su s mišljenjem Odbora uspostavljenog na temelju članka 133. Uredbe (EZ) br. 1907/2006,

DONIJELA JE OVU UREDBU:

Članak 1.

Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se u skladu s Prilogom ovoj Uredbi.

Članak 2.

Ova Uredba stupa na snagu trećeg dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.

Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.

Sastavljeno u Bruxellesu 7. prosinca 2015.

Za Komisiju

Predsjednik

Jean-Claude JUNCKER


(1)  SL L 396, 30.12.2006, str. 1.

(2)  Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 od 30. svibnja 2008. o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) (SL L 142, 31.5.2008., str. 1.).

(3)  Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe, SL L 276, 20.10.2010., str. 33.


PRILOG

Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se kako slijedi:

1.

Na početku Priloga, prije dijela A, umeće se napomena:

„Napomena:

Prije nego što se bilo koja od sljedećih ispitnih metoda primijeni za ispitivanje složene smjese (MCS), smjese nepoznatog ili promjenjivog sastava, kompleksnog reakcijskog produkta ili biološkog materijala (UVCB) ili smjese te ako njezina primjenjivost za ispitivanje MCS-a, UVCB-a ili smjesa nije navedena u odgovarajućoj metodi testiranja, potrebno je razmotriti je li metoda prikladna za predviđenu regulatornu svrhu.

Ako se ispitna metoda primjenjuje za ispitivanje MCS-a, UVCB-a ili smjese, na raspolaganju bi trebalo biti što više informacija o sastavu smjese, npr. o kemijskom identitetu njezinih sastojaka, njihovoj količinskoj zastupljenosti i relevantnim svojstvima.”

2.

Dodaje se poglavlje A.24.:

A.24.   KOEFICIJENT RAZDJELJENJA (N-OKTANOL/VODA), METODA VISOKOUČINKOVITE TEKUĆINSKE KROMATOGRAFIJE (HPLC)

UVOD

Ova ispitna metoda odgovara smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 117 (2004.).

1.

Koeficijent razdjeljenja (P) definira se kao omjer uravnoteženih koncentracija otopljene tvari u dvofaznom sustavu koji obuhvaća dva otapala koja uglavnom nije moguće miješati. U slučaju n-oktanola i vode:

Formula

Budući da je koeficijent razdjeljenja količnik dviju koncentracija, nema dimenzija i najčešće se navodi kao logaritam s bazom 10.

2.

Pow je ključni parametar u studijama o ostanku kemijskih tvari u okolišu. Utvrđeno je da postoji vrlo značajan odnos između vrijednosti Pow neioniziranog oblika tvari i njihove bioakumulacije u ribama. Isto je tako utvrđeno da je Pow koristan parametar u predviđanju adsorpcije na tlo i sedimente te za utvrđivanje kvantitativnih odnosa strukture i aktivnosti za široki raspon bioloških učinaka.

3.

Izvorni prijedlog ove ispitne metode temeljio se na članku C. V. Eadsfortha i P. Mosera (1). Tijekom 1986. Savezni ured za okoliš (Umweltbundesamt) Savezne Republike Njemačke koordinirao je razvoj ispitne metode i OECD-ovo međulaboratorijsko poredbeno ispitivanje (2).

POČETNA RAZMATRANJA

4.

Vrijednosti log Pow u rasponu od –2 do 4 (povremeno do 5 i više) (1) mogu se odrediti pokusom primjenom metode protresanja tikvice (poglavlje A.8. ovog Priloga, OECD-ova smjernica za ispitivanje 107). Metoda HPLC obuhvaća vrijednosti log Pow u rasponu od 0 do 6 (1) (2) (3) (4) (5). U okviru te metode može biti nužno procijeniti vrijednosti Pow kako bi se dodijelile prikladne referentne tvari i potkrijepili svi zaključci temeljeni na podacima dobivenima ispitivanjem. O metodama izračuna ukratko se govori u Dodatku ovoj ispitnoj metodi. Metoda HPLC ima izokratičan način djelovanja.

5.

Vrijednosti Pow ovise o okolišnim uvjetima, kao što su temperatura, pH, ionska jakost itd., koji moraju biti utvrđeni u pokusu radi ispravnog tumačenja podataka o vrijednostima Pow. Druga metoda, koja bi se mogla primijeniti kao alternativna (npr. nacrt OECD-ove smjernice o pH-metrijskoj metodi za ionizirajuće tvari (6)), može postati dostupna za ionizirajuće tvari. Iako navedeni nacrt OECD-ove smjernice može biti prikladan za određivanje vrijednosti Pow za ionizirajuće tvari, u nekim je slučajevima primjerenije primijeniti metodu HPLC pri pH-vrijednosti koja je relevantna za okoliš (vidjeti stavak 9.).

NAČELO METODE

6.

HPLC obrnutih faza provodi se na analitičkim kolonama koje su napunjene komercijalno dostupnom krutom fazom koja sadržava duge lance ugljikovodika (npr. C8, C18), kemijski vezane na silicijev dioksid.

7.

Kemikalija ubrizgana u takvu kolonu prenosi se duž kolone mobilnom fazom te se razdjeljuje između mobilne faze otapala i stacionarne faze ugljikovodika. Tvari se zadržavaju proporcionalno svojem koeficijentu razdjeljenja ugljikovodik/voda, pri čemu hidrofilne tvari eluiraju prve, a lipofilne posljednje. Vrijeme zadržavanja opisuje se faktorom kapaciteta k, koji se izražava kao:

Formula

gdje je tR vrijeme zadržavanja ispitivane tvari, a t0 mrtvo vrijeme, tj. prosječno vrijeme koje je molekuli otapala potrebno za prolaz kroz kolonu. Ne zahtijevaju se kvantitativne analitičke metode i potrebno je samo odrediti vremena zadržavanja.

8.

Koeficijent razdjeljenja ispitivane tvari između oktanola i vode može se izračunati tako da se pokusom odredi njezin faktor kapaciteta k, koji se potom uvrštava u sljedeću jednadžbu:

Formula

gdje su

a, b

=

koeficijenti linearne regresije.

Navedena jednadžba može se dobiti linearnom regresijom logaritma koeficijenata razdjeljenja referentnih tvari između oktanola i vode u donosu na logaritam faktora kapaciteta referentnih tvari.

9.

Metoda HPLC obrnutih faza omogućuje procjenu koeficijenata razdjeljenja u području log Pow od 0 do 6, ali se u iznimnim slučajevima to područje može proširiti tako da obuhvaća i vrijednosti log Pow u rasponu od 6 do 10. To može zahtijevati modificiranje mobilne faze (3). Metoda nije primjenjiva na jake kiseline i baze, metalne komplekse, tvari koje reagiraju s eluensom ili površinski aktivna sredstva. Mjerenja se mogu provoditi na ionizirajućim tvarima kad su u neioniziranom obliku (slobodne kiseline ili slobodne baze) jedino primjenom odgovarajućeg pufera čija je pH-vrijednost manja od vrijednosti pKa ako je riječ o slobodnoj kiselini ili je veća od pKa vrijednosti ako je riječ o slobodnoj bazi. Alternativno, može postati dostupna pH-metrijska metoda za ispitivanje ionizirajućih tvari (6) koja bi se mogla primijeniti kao alternativna metoda (6). Ako se vrijednost log Pow određuje za primjenu u klasifikaciji opasnosti za okoliš ili u procjeni rizika za okoliš, ispitivanje treba provesti u rasponu pH-vrijednosti relevantnom za prirodni okoliš, tj. za pH-vrijednosti od 5,0 do 9.

10.

U nekim slučajevima nečistoće mogu otežati tumačenje rezultata jer nije moguće sa sigurnošću odrediti pikove. Za smjese koje daju nerazlučeni pojas treba navesti gornju i donju granicu vrijednosti log Pow te postotak površine svakog pika vrijednosti log Pow. Za smjese koje se sastoje od skupine homologa treba navesti i ponderirani prosječni log Pow (7), izračunan na temelju pojedinačnih vrijednosti Pow i odgovarajućih postotaka površine (8). Pri izračunu treba uzeti u obzir sve pikove koji čine 5 % ili više ukupne površine svih pikova (9):

Formula

Ponderirana prosječna vrijednost log Pow valjana je jedino za tvari ili smjese (npr. talova ulja) koje se sastoje od homologa (npr. niza alkana). Mjerenjem smjesa mogu se dobiti smisleni rezultati pod uvjetom da je upotrijebljeni analitički detektor jednako osjetljiv na sve tvari u smjesi i da se može razlučiti. na odgovarajući način

INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI

11.

Prije primjene metode moraju biti poznati konstanta disocijacije, strukturna formula i topljivost u mobilnoj fazi. Osim toga, bile bi korisne i informacije o hidrolizi.

KRITERIJI KVALITETE

12.

Da bi se povećala pouzdanost mjerenja, moraju se provoditi dvostruka određivanja.

Ponovljivost: Vrijednost log Pow dobivena ponavljanim mjerenjima provedenima u identičnim uvjetima s istom skupinom referentnih tvari mora biti u području ± 0,1 logaritamskih jedinica.

Obnovljivost: Ako se mjerenja ponavljaju s drukčijom skupinom referentnih tvari, rezultati se mogu razlikovati. Koeficijent korelacije R za odnos između vrijednosti log k i vrijednosti log Pow za skupinu ispitivanih tvari obično iznosi oko 0,9, što odgovara koeficijentima razdjeljenja oktanol/voda za log Pow ± 0,5 logaritamskih jedinica.

13.

Međulaboratorijsko poredbeno ispitivanje pokazalo je da se metodom HPLC mogu dobiti vrijednosti log Pow koje su unutar ± 0,5 jedinica vrijednosti dobivenih metodom protresanja u tikvici (2). Ostale se usporedbe mogu pronaći u literaturi (4) (5) (10) (11) (12). Najtočnije rezultate pružaju korelacijski grafovi koji se temelje na strukturno srodnim referentnim tvarima (13).

REFERENTNE TVARI

14.

Radi postavljanja korelacije između izmjerenog faktora kapaciteta k neke tvari i njezine vrijednosti Pow, potrebno je uspostaviti kalibracijsku krivulju s pomoću najmanje šest točaka (vidjeti stavak 24.). Odgovarajuće referentne tvari odabire korisnik. Referentne tvari obično moraju imati vrijednosti log Pow koje obuhvaćaju log Pow ispitivane tvari, tj. najmanje jedna referentna tvar mora imati vrijednost Pow veću od vrijednosti Pow ispitivane tvari, a vrijednost Pow druge tvari mora biti manja od vrijednosti Pow ispitivane tvari. Ekstrapolaciju bi trebalo primjenjivati samo u iznimnim slučajevima. Poželjno je da referentne tvari budu strukturno srodne s ispitivanom tvari. Vrijednosti log Pow referentnih tvari koje se upotrebljavaju za kalibraciju moraju se temeljiti na pouzdanim pokusnim podacima. Međutim, za tvari koje imaju visoki log Pow (obično veći od 4) mogu se upotrebljavati izračunane vrijednosti, osim ako su dostupni pouzdani pokusni podaci. Ako se upotrebljavaju ekstrapolirane vrijednosti, treba navesti graničnu vrijednost.

15.

Dostupni su iscrpni popisi vrijednosti log Pow za mnoge skupine kemikalija (14)(15). Ako podaci o koeficijentima razdjeljenja strukturno srodnih tvari nisu dostupni, može se primijeniti općenitija kalibracija utvrđena s drugim referentnim tvarima. Preporučene referentne tvari i njihove vrijednosti Pow navedene su u tablici 1. Kod ionizirajućih tvari navedene se vrijednosti primjenjuje na njihov neionizirani oblik. Vjerodostojnost i kvaliteta vrijednosti provjereni su međulaboratorijskim poredbenim ispitivanjem.

Tablica 1.

Preporučene referentne tvari

 

Broj CAS

Referentna tvar

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanon

(Metil etil keton)

0,3

 

2

1122-54-9

4-acetilpiridin

0,5

 

3

62-53-3

Anilin

0,9

 

4

103-84-4

Acetanilid

1,0

 

5

100-51-6

Benzil-alkohol

1,1

 

6

150-76-5

4-metoksifenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Fenoksiocetna kiselina

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Benzonitril

1,6

 

11

140-29-4

Fenilacetonitril

1,6

 

12

589-18-4

4-metilbenzil alkohol

1,6

 

13

98-86-2

Acetofenon

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-nitrobenzojeva kiselina

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-kloranilin

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobenzen

1,9

 

18

104-54-1

Cinamil alkohol

(Cinaminski alkohol)

1,9

 

19

65-85-0

Benzojeva kiselina

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-krezol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Cimetova kiselina

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anisol

2,1

 

23

93-58-3

Metil benzoat

2,1

 

24

71-43-2

Benzen

2,1

 

25

99-04-7

3-metilbenzojeva kiselina

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-klorofenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

trikloroetilen

2,4

 

28

1912-24-9

Atrazin

2,6

 

29

93-89-0

Etil benzoat

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-diklorobenzonitril

2,6

 

31

535-80-8

3-klorobenzojeva kiselina

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Toluen

2,7

 

33

90-15-3

1-naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dikloroanilin

2,8

 

35

108-90-7

Klorobenzen

2,8

 

36

1746-13-0

Alil-fenil-eter

2,9

 

37

108-86-1

Bromobenzen

3,0

 

38

100-41-4

Etilbenzen

3,2

 

39

119-61-9

Benzofenon

3,2

 

40

92-69-3

4-fenilfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Timol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-diklorbenzen

3,4

 

43

122-39-4

Difenilamin

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftalen

3,6

 

45

93-99-2

Fenil benzoat

3,6

 

46

98-82-8

Izopropilbenzen

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-triklorofenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenil

4,0

 

49

120-51-4

Benzil benzoat

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sek-butilfenol

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-triklorobenzen

4,2

 

52

143-07-7

Dodekanska kiselina

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenil eter

4,2

 

54

85-01-8

Fenantren

4,5

 

55

104-51-8

n-butilbenzen

4,6

 

56

103-29-7

Dibenzil

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenilpiridin

4,9

 

58

206-44-0

Fluoranten

5,1

 

59

603-34-9

Trifenilamin

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

OPIS METODE

Preliminarna procjena koeficijenta razdjeljenja

16.

Ako je potrebno, koeficijent razdjeljenja ispitivane tvari može se procijeniti, i to po mogućnosti metodom izračuna (vidjeti Dodatak) ili, kad je to primjereno, primjenom omjera topljivosti ispitivane tvari u čistim otapalima.

Aparatura

17.

Potreban je tekućinski kromatograf opremljen pumpom niske pulsacije i prikladnim sustavom za detektiranje. UV detektor s valnom duljinom detekcije od 210 nm ili RI detektor primjenjivi su za široki spektar kemijskih skupina. Prisutnost polarnih skupina u stacionarnoj fazi može ozbiljno ugroziti rad kolone HPLC-a. Stoga bi stacionarna faza trebala sadržavati minimalni postotak polarnih skupina (16). Mogu se upotrebljavati trgovačka pakiranja mikročestica inverzne faze ili gotove kolone. Između sustava za ubrizgavanje i analitičke kolone može se postaviti pretkolona.

Mobilna faza

18.

Za pripremu eluacijskog otapala, koje se prije uporabe otplinjava, upotrebljava se metanol HPLC čistoće i destilirana ili deionizirana voda. Treba primijeniti izokratičku eluaciju. Treba upotrijebiti omjere metanola i vode s minimalnim udjelom vode od 25 %. Obično je omjer mješavine metanola i vode 3: 1 (v/v) zadovoljavajući za eluiranje tvari s vrijednošću log P 6 unutar jednog sata kod brzine protoka od 1 ml/min. Za tvari čiji je log P veći od 6 možda će trebati skratiti vrijeme eluiranja (i vrijeme eluiranja referentnih tvari) smanjivanjem polariteta mobilne faze ili duljine kolone.

19.

Ispitivana tvar i referentne tvari trebale bi biti topljive u mobilnoj fazi u koncentracijama koje su dovoljne za njihovu detekciju. S mješavinom metanola i vode smiju se upotrebljavati aditivi, ali samo u iznimnim slučajevima, jer aditivi mijenjaju svojstva kolone. U tim se slučajevima mora potvrditi da nema utjecaja na vrijeme zadržavanja ispitivane tvari i referentnih tvari. Ako mješavina metanola i vode nije prikladna, mogu se upotrebljavati mješavine drugih organskih otapala i vode, npr. etanola i vode, acetonitrila i vode ili izopropil alkohola (2-propanola) i vode.

20.

pH eluensa od kritične je važnosti za ionizirajuće tvari. pH-vrijednost mora biti u radnom području pH-vrijednosti kolone, obično između 2 i 8. Preporučuje se puferiranje. Treba paziti da ne dođe do taloženja soli i propadanja kolone, što se događa kod nekih smjesa organske faze i pufera. Kod stacionarnih faza koje se temelje na silicijevu dioksidu s pH-vrijednošću iznad 8 ne preporučuje se mjerenje kromatografijom HPLC, jer upotreba alkalne mobilne faze može brzo uzrokovati slabije funkcioniranje kolone.

Otopljene tvari

21.

Ispitivane i referentne tvari moraju biti dovoljno čiste kako bi se na kromatogramima mogli odrediti pikovi odgovarajućih tvari. Tvari koje se upotrebljavaju za ispitivanje ili u svrhu kalibracije otapaju se po mogućnosti u mobilnoj fazi. Ako se za otapanje ispitivanih i referentnih tvari upotrebljava neko drugo otapalo, a ne mobilna faza, mobilnu fazu treba upotrijebiti za konačno razrjeđivanje prije ubrizgavanja.

Uvjeti ispitivanja

22.

Za vrijeme mjerenja temperatura ne bi smjela varirati za više od ± 1 °C.

Određivanje mrtvog vremena to

23.

Mrtvo vrijeme t0 može se izmjeriti uporabom nezadržanih organskih tvari (npr. tiouree ili formamida). Preciznije mrtvo vrijeme može se odrediti iz izmjerenih vremena zadržavanja ili seta od približno sedam članova homolognog niza (npr. n-alkil metil ketona) (17). Vremena zadržavanja tR (nC + 1) ucrtavaju se kao funkcija vremena tR (nC), gdje je nC broj atoma ugljika. Dobiva se pravac tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, gdje je A, koji predstavlja k(nC + 1)/k(nC), konstanta. Mrtvo vrijeme t0 dobiva se iz sjecišta (1 – A)t0 i nagiba A.

Regresijska jednadžba

24.

Sljedeći je korak konstruiranje korelacijske krivulje vrijednosti log k u odnosu na log P za odgovarajuće referentne tvari s vrijednostima log P koje su u blizini vrijednosti koja se očekuje za ispitivanu tvar. U praksi se istodobno ubrizgava od 6 do 10 referentnih tvari. Određuju se vremena zadržavanja, poželjno na integratoru za bilježenje rezultata spojenom na sustav za detekciju. Odgovarajući logaritmi faktora kapaciteta, log k, ucrtavaju se kao funkcija vrijednosti log P. Regresijska jednadžba izvodi se u redovitim razmacima, najmanje jednom dnevno, kako bi se mogle uzeti u obzir moguće promjene u funkcioniranju kolone.

ODREĐIVANJE VRIJEDNOSTI POW ISPITIVANE TVARI

25.

Ispitivana tvar ubrizgava se u najmanjim količinama koje se mogu detektirati. Vrijeme zadržavanja određuje se dva puta. Koeficijent razdjeljenja ispitivane tvari dobiva se interpolacijom izračunanog faktora kapaciteta na kalibracijski graf. Za vrlo male i vrlo velike koeficijente razdjeljenja nužna je ekstrapolacija. U tim slučajevima treba posebno voditi računa o granicama pouzdanosti linije regresije. Ako je vrijeme zadržavanja uzorka izvan raspona vremena zadržavanja dobivenih za standarde, potrebno je navesti graničnu vrijednost.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Izvješće o ispitivanju

26.

U izvješću mora biti navedeno sljedeće:

prethodna procjena koeficijenta razdjeljenja, ako je provedena, procijenjene vrijednosti i primijenjena metoda; ako je primijenjena metoda izračuna, njezin puni opis, uključujući identifikaciju baze podataka i detaljne informacije o izboru fragmenata,

ispitivane i referentne tvari: čistoća, strukturna formula i broj CAS,

opis opreme i radnih uvjeta: analitička kolona, pretkolona,

mobilna faza, sustav detekcije, temperaturno područje, pH,

profili eluiranja (kromatogrami),

mrtvo vrijeme i način na koji je mjereno,

podaci o zadržavanju i vrijednosti log Pow koje se za referentne tvari upotrijebljene u kalibraciji spominju u literaturi,

podaci o prilagođenom regresijskom pravcu (log k u odnosu na log Pow) i koeficijent korelacije pravca uključujući intervale pouzdanosti,

podaci o prosječnom zadržavanju i interpolirana vrijednost log Pow za ispitivanu tvar,

u slučaju smjesa: kromatogram profila eluiranja s navedenim vrijednostima pragova,

vrijednosti log Pow u odnosu na postotak površine pika log Pow,

izračun s pomoću regresijskog pravca,

izračunane ponderirane prosječne vrijednosti log Pow, prema potrebi.

LITERATURA

(1)

C. V. Eadsforth i P. Moser. (1983.) Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss i H. J. Poremski. (1988.) Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C. V. Eadsforth. (1986.) Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt i R. Fuerer (1981.) Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981.) Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000.) Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995.) ‚Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995’, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez i C. C. Karman. (1999.) An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke i K. Bansal. (1998.) Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, str. 529 – 537.

(10)

L. O. Renberg, S. G. Sundstroem i K. Sundh-Nygård. (1980.) Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W. E. Hammers, G. J. Meurs i C. L. De-Ligny. (1982.) Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J. E. Haky i A. M. Young. (1984.) Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa i E. Masuhara. (1981.) Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch i A. J. Leo. (1979.) Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A. J. Leo, dir. (1982.) Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979.) The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G. E. Berendsen, P. J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony i J. Inczédy. (1980.) On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Dodatak

Metode izračuna vrijednosti POW

UVOD

1.

U ovom se dodatku navodi kratak uvod u izračunavanje vrijednosti Pow. Za više informacija upućujemo na priručnike (1) (2).

2.

Izračunane vrijednosti Pow upotrebljavaju se za:

donošenje odluke o tome koju eksperimentalnu metodu primijeniti: metodu protresanja tikvice za log Pow između – 2 i 4 i metodu HPLC za log Pow između 0 i 6,

odabir uvjeta koji će se primijeniti pri metodi HPLC (referentne tvari, omjer metanol/voda),

provjeru vjerodostojnosti vrijednosti dobivenih eksperimentalnim metodama,

davanje procjene ako se eksperimentalne metode ne mogu primijeniti.

Načelo metoda izračuna

3.

Metode izračuna koje se ovdje predlažu temelje se na teoretskoj fragmentaciji molekule na odgovarajuće podstrukture za koje su prirasti vrijednosti log Pow poznati. Log Pow se dobiva zbrajanjem vrijednosti fragmenata i korektivnih članova za intramolekulske interakcije. Popisi konstanti fragmenata i korektivnih članova mogu se pronaći u literaturi (1) (2) (3) (4) (5) (6). Neki od njih redovito se ažuriraju (3).

Pouzdanost izračunanih vrijednosti

4.

Općenito, što je složenija tvar koji se proučava, pouzdanost metoda izračuna je manja. Kad je riječ o jednostavnim molekulama male molekulske težine i molekulama koje sadržavaju jednu ili dvije funkcionalne skupine, između rezultata različitih metoda fragmentacije i izmjerenih vrijednosti može se očekivati odstupanje od 0,1 do 0,3 log Pow jedinica. Granica dopuštenih pogrešaka ovisit će o pouzdanosti primijenjenih konstanti fragmenata, mogućnosti prepoznavanja intramolekulskih interakcija (npr. vodikovih veza) i pravilnoj primjeni korektivnih članova. Kod ionizirajućih tvari moraju se uzeti u obzir naboj i stupanj ionizacije (10).

Fujita-Hanschova π-metoda

5.

Konstanta hidrofobnog supstituenta, π, koju su izvorno uveli Fujita i ostali (7) definira se kao:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

gdje je PhX aromatski derivat, a PhH izvorna tvar.

npr.

πCl

=log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

π-metoda u prvom je redu od interesa za aromatske tvari. π-vrijednosti za veliki broj supstituenata mogu se pronaći u literaturi (4) (5).

Rekkerova metoda

6.

Primjenom Rekkerove metode (8) vrijednost log Pow izračunava se kao:

Formula

gdje je ai broj pojavljivanja određenog fragmenta u molekuli, a fi je prirast log Pow fragmenta. Članovi interakcije mogu se izraziti kao integralni višekratnik samo jedne konstante Cm (takozvane ‚magične konstante’). Konstante fragmenata fi i Cm određene iz popisa koji sadržava 1 054 eksperimentalne vrijednosti Pow za 825 tvari primjenom višestruke regresijske analize (6) (8). Određivanje interakcijskih članova provodi se u skladu s utvrđenim pravilima (6) (8) (9).

Hansch-Leova metoda

7.

Primjenom Hanschove i Leove metode (4) vrijednost log Pow izračunava se kao:

Formula

gdje je fi konstanta fragmenta, Fj korektivni član (faktor), a ai i bj odgovarajuća učestalost pojavljivanja. Popisi atomskih i grupnih fragmentiranih vrijednosti te korektivnih članova Fj dobiveni su metodom pokušaja i pogreške te izvedeni iz eksperimentalnih vrijednosti Pow. Korektivni članovi svrstani su u nekoliko različitih klasa (1) (4). Razvijeni su softverski paketi kako bi se uzela u obzir sva pravila i korektivni članovi (3).

KOMBINIRANA METODA

8.

Izračunavanje vrijednosti log Pow složenih molekula moguće je znatno poboljšati ako se molekula rasiječe na veće podstrukture za koje su pouzdane vrijednosti log Pow dostupne bilo iz tablica (3) (4) ili iz postojećih mjerenja. Takve fragmente (npr. heterocikli, antrakinon, azobenzen) tada je moguće kombinirati s Hanschovim π-vrijednostima ili s Rekkerovim i Leovim konstantama fragmenata.

Napomene

i.

Metode izračuna mogu se primijeniti na djelomično ili potpuno ionizirane tvari samo ako se uzmu u obzir potrebni korektivni faktori.

ii.

Ako se može pretpostaviti prisutnost intramolekulskih vodikovih veza, obvezatno treba dodati odgovarajuće korektivne članove (približno +0,6 do +1,0 log Pow jedinica) (1). Pokazatelji prisutnosti tih veza mogu se dobiti stereomodelima ili spektroskopskim podacima.

iii.

Ako je moguće više tautomernih oblika, izračun se mora temeljiti na najvjerojatnijem obliku.

iv.

Treba pažljivo pratiti revizije popisa konstanti fragmenata.

LITERATURA O METODAMA IZRAČUNA

(1)

W. J. Lyman, W. F. Reehl i D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982.)

(2)

W. J. Dunn, J. H. Block i R. S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986.)

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

C. Hansch i A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979.)

(5)

A. J. Leo, C. Hansch i D. Elkins. (1971.) Partition coefficients and their uses. Chemical Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979.) The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa i Corwin Hansch (1964.) A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977.)

(9)

C. V. Eadsforth i P. Moser. (1983.) Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R. A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, str. 225, American Chemical Society, Washington, D. C. (1984.)

3.

Poglavlje C.3 zamjenjuje se sljedećim:

C.3.   TEST INHIBICIJE RASTA SLATKOVODNIH ALGI I CIJANOBAKTERIJA

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 201 (2006., prilog ispravljen 2011.). Bilo je utvrđeno da je ispitnu metodu potrebno proširiti kako bi se uključile još neke vrste i ispunili zahtjevi ocjenjivanja opasnosti i razvrstavanja kemikalija. Revizija je provedena na temelju širokog praktičnog iskustva, znanstvenog napretka u području toksikoloških istraživanja s algama i široke regulatorne primjene koja je uslijedila nakon njezina donošenja.

2.

Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1.

NAČELO ISPITIVANJA

3.

Svrha je ispitivanja odrediti učinke kemikalije na rast slatkovodnih mikroalgi i/ili cijanobakterija. Eksponencijalno rastući ispitni organizmi izlažu se ispitivanoj kemikaliji u šaržnim kulturama, u pravilu tijekom 72 sata. Unatoč relativno kratkom trajanju ispitivanja, mogu se ocijeniti učinci na nekoliko generacija.

4.

Odgovor sustava sastoji se u smanjenju rasta niza kultura algi (ispitnih jedinica) koje su izložene različitim koncentracijama ispitivane kemikalije. Odgovor se ocjenjuje kao funkcija koncentracije izlaganja u odnosu na prosječni rast ponavljanih, neizloženih kontrolnih kultura. Da bi se u punoj mjeri izrazila reakcija sustava na toksične učinke (optimalna osjetljivost), kulturama treba prije mjerenja smanjenja specifične brzine rasta ostaviti dovoljno vremena da postignu neograničeni eksponencijalni rast, uz dovoljno nutrijenata i neprekidno osvjetljenje.

5.

Rast i inhibicija rasta kvantificiraju se mjerenjima biomase algi u ovisnosti o vremenu. Biomasa algi definirana je kao suha masa po volumenu, npr. mg algi / l ispitne otopine. Ipak, suhu je masu teško mjeriti pa se stoga primjenjuju zamjenski parametri. Od zamjenskih parametara najčešće se upotrebljava broj stanica. Ostali su zamjenski parametri volumen stanica, fluorescencija, optička gustoća itd. Mora biti poznat faktor pretvorbe za prevođenje izmjerenih zamjenskih parametara u biomasu.

6.

Krajnja je točka ispitivanja inhibicija rasta, izražena kao logaritamsko povećanje biomase (prosječna specifična brzina rasta) u razdoblju izlaganja. Iz prosječnih specifičnih brzina rasta zabilježenih u nizu ispitnih otopina određuje se koncentracija koja izaziva određeno x-postotno smanjenje brzine rasta (npr. 50 %), koja se izražava kao ErCx (npr. ErC50).

7.

U ovoj se ispitnoj metodi upotrebljava i prirast kao dodatna varijabla odgovora koja je potrebna da bi se ispunili određeni regulatorni zahtjevi u nekim državama. Prirast se definira kao biomasa na kraju razdoblja izlaganja umanjena za biomasu na početku razdoblja izlaganja. Iz prirasta zabilježenog u nizu ispitnih otopina izračunava se koncentracija koja izaziva određeno x-postotno smanjenje prirasta (npr. 50 %), koja se izražava kao EyCx (npr. EyC50).

8.

Osim toga, može se statistički odrediti najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC) i najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC).

INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI

9.

Za određivanje ispitnih uvjeta korisno je imati informacije o ispitivanoj kemikaliji kao što su strukturna formula, čistoća, stabilnost na svjetlosti, stabilnost u uvjetima ispitivanja, svojstva apsorpcije svjetlosti, pKa i rezultati istraživanja pretvorbe, uključujući biorazgradivost u vodi.

10.

Treba biti poznata topljivost u vodi, koeficijent razdjeljenja oktanol/voda (Pow) i tlak pare ispitivane kemikalije te biti raspoloživa validirana metoda za kvantifikaciju kemikalije u ispitnim otopinama s dokumentiranim iskorištenjem i granicom detekcije.

VALJANOST ISPITIVANJA

11.

Da bi ispitivanje bilo valjano, mora ispuniti sljedeće kriterije:

Biomasa u kontrolnim kulturama mora se eksponencijalno povećati barem za faktor 16 u razdoblju ispitivanja od 72 sata. To odgovara specifičnoj brzini rasta od 0,92 dan– 1. Kod vrsta koje se najčešće upotrebljavaju brzina rasta uglavnom je znatno viša (vidjeti Dodatak 2.). Ovaj kriterij možda neće biti zadovoljen ako se upotrebljavaju vrste koje rastu sporije od onih koje su navedene u Dodatku 2. U tom slučaju razdoblje ispitivanja treba produžiti koliko je potrebno da se u kontrolnim kulturama dobije barem šesnaesterostruki rast, uz eksponencijalni rast tijekom cjelokupnog razdoblja ispitivanja. Razdoblje ispitivanja može se skratiti na najmanje 48 sati da bi se održao neograničeni eksponencijalni rast tijekom ispitivanja, pod uvjetom da je postignut minimalni faktor povećanja 16.

Srednji koeficijent varijacije etapnih specifičnih brzina rasta (dani 0 – 1, 1 – 2, 2 – 3, za ispitivanje koje traje 72 sata) u kontrolnim kulturama (vidjeti Dodatak 1. pod ‚koeficijent varijacije’) ne smije biti viši od 35 %. Za izračunavanje etapne specifične brzine rasta vidjeti stavak 49. Ovaj kriterij vrijedi za srednju vrijednost koeficijenata varijacije izračunanih za ponavljanja kontrolnih kultura.

Kod ispitivanja s vrstama Pseudokirchneriella subcapitata i Desmodesmus subspicatus koeficijent varijacije prosječnih specifičnih brzina rasta u ponavljanjima s kontrolnim kulturama tijekom ukupnog razdoblja ispitivanja ne smije biti viši od 7 %. Kod ostalih ispitnih vrsta koje se rjeđe upotrebljavaju ta vrijednost ne smije biti viša od 10 %.

REFERENTNA KEMIKALIJA

12.

Jedna ili više referentnih kemikalija, kao što je 3,5-diklorfenol koji je upotrijebljen u međulaboratorijskom ispitivanju usporedivosti (1), mogu se ispitati radi provjere postupka. Kao referentna kemikalija za zelene alge može se upotrijebiti i kalijev dikromat. Poželjno je da se referentna kemikalija ispita najmanje dvaput godišnje.

PRIMJENJIVOST TESTA

13.

Ova se ispitna metoda najlakše primjenjuje kod kemikalija topljivih u vodi za koje se može pretpostaviti da će u ispitnim uvjetima ostati u vodi. Opisani postupak ponekad je potrebno izmijeniti (npr. zatvoreni sustav, kondicioniranje ispitnih posuda) kad se ispituju kemikalije koje su hlapljive, vrlo adsorptivne, obojene, slabo topljive u vodi ili kemikalije koje mogu utjecati na raspoloživost nutrijenata ili minerala u ispitnom mediju. Smjernice za neke izmjene mogu se pronaći u literaturi pod (2), (3) i (4).

OPIS ISPITNE METODE

Aparatura

14.

Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u dodir s ispitnim otopinama moraju biti u cijelosti izrađeni od stakla ili drugog kemijski inertnog materijala. Aparaturu je potrebno temeljito oprati kako organski i anorganski onečišćivači ne bi utjecali na rast algi ili na sastav ispitnih otopina.

15.

Ispitne su posude u pravilu staklene tikvice dovoljnih dimenzija da se osigura potreban volumen kulture za mjerenja tijekom ispitivanja i dovoljan prijenos mase CO2 iz atmosfere (vidjeti stavak 30.). Valja napomenuti da volumen tekućine mora biti dovoljan za analitička određivanja (vidjeti stavak 37.).

16.

Osim toga, potrebna je sljedeća oprema (djelomično ili u cijelosti):

Inkubator za uzgoj: preporučuje se ormar ili komora u kojoj se može održavati odabrana temperatura inkubacije na ± 2 °C.

Instrumenti za mjerenje svjetlosti: važno je napomenuti da metoda mjerenja intenziteta svjetlosti, a posebno vrsta prijamnika (senzora), može utjecati na izmjerenu vrijednost. Mjerenja po mogućnosti treba provoditi s pomoću sferičnog (4 π) prijamnika (koji reagira na izravnu i reflektiranu svjetlost iz svih kutova iznad i ispod mjerne ravnine) ili prijamnika 2 π (koji reagira na svjetlost iz svih kutova iznad mjerne ravnine).

Aparatura za određivanje biomase algi. Broj stanica, najčešće upotrebljavani zamjenski parametar za biomasu algi, može se odrediti s pomoću elektroničkog brojača čestica, mikroskopa s komorom za brojenje ili protočnog citometra. Ostali se zamjenski parametri za biomasu mogu mjeriti s pomoću protočnog citometra, fluorimetra, spektrofotometra i kolorimetra. Korisno je izračunati faktor pretvorbe broja stanica u masu suhe tvari. Da bi se kod mjerenja spektrofotometrom dobile upotrebljive mjerne vrijednosti pri niskim koncentracijama biomase, ponekad je potrebno upotrijebiti kivete s putom svjetlosti od najmanje 4 cm.

Ispitni organizmi

17.

Može se upotrijebiti nekoliko vrsta slobodnoplivajućih mikroalgi i cijanobakterija. Za sojeve navedene u Dodatku 2. dokazano je da su prikladni za ispitni postupak iz ove ispitne metode.

18.

Ako se upotrebljavaju druge vrste, treba navesti soj i/ili podrijetlo. Treba se uvjeriti da se eksponencijalni rast odabranih ispitnih algi može održati tijekom cjelokupnog razdoblja ispitivanja u odgovarajućim ispitnim uvjetima.

Uzgojni medij

19.

Preporučuju se dva alternativna uzgojna medija, OECD i AAP. Sastav tih medija prikazan je u Dodatku 3. Valja napomenuti da ta dva medija imaju različitu početnu pH-vrijednost i puferski kapacitet (za regulaciju povećanja pH-vrijednosti). Stoga se kod ispitivanja mogu dobiti različiti rezultati ovisno o mediju koji se upotrebljava, posebno kad se ispituju ionizirajuće kemikalije.

20.

U određenim je slučajevima potrebno izmijeniti uzgojni medij, npr. kad se ispituju metali i kelatna sredstva ili kad se ispitivanje provodi s različitim pH-vrijednostima. Uporabu izmijenjenog medija treba detaljno opisati i obrazložiti (3) (4).

Početna koncentracija biomase

21.

Početna biomasa mora biti jednaka u svim ispitnim kulturama i mora biti dovoljno niska da se može postići eksponencijalni rast tijekom čitavog razdoblja inkubacije bez bojazni da bi se mogle iscrpiti zalihe nutrijenata. Početna biomasa ne smije biti viša od 0,5 mg/l suhe mase. Preporučuju se sljedeće početne koncentracije stanica:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103 – 104 stanica/ml

Desmodesmus subspicatus

2 – 5 × 103 stanica/ml

Navicula pelliculosa

104 stanica/ml

Anabaena flos-aquae

104 stanica/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 stanica/ml

Koncentracije ispitivane kemikalije

22.

Raspon koncentracija u kojemu se mogu očekivati učinci može se odrediti na temelju rezultata ispitivanja za određivanje raspona. Za konačno, glavno ispitivanje treba odabrati najmanje pet koncentracija raspoređenih u geometrijskom nizu uz faktor do najviše 3,2. Kod ispitivanih kemikalija čija je krivulja koncentracija-odgovor ravna ponekad je opravdano upotrebljavati viši faktor. Niz koncentracija trebao bi po mogućnosti obuhvatiti područje u kojemu se javlja inhibicija rasta algi od 5 do 75 %.

Ponavljanja i kontrole

23.

U planu ispitivanja treba predvidjeti po tri ponavljanja pri svakoj ispitnoj koncentraciji. Ako nije potrebno odrediti NOEC, plan ispitivanja može se promijeniti tako da se poveća broj koncentracija i smanji broj ponavljanja po koncentraciji. Broj kontrolnih ponavljanja mora biti najmanje tri, a u idealnom slučaju dvostruko veći od broja ponavljanja za svaku ispitnu koncentraciju.

24.

Za analitička određivanja koncentracija ispitivane kemikalije može se pripremiti zaseban niz ispitnih otopina (vidjeti stavke 36. i 38.).

25.

Ako se za otapanje ispitivane kemikalije upotrebljava otapalo, potrebno je predvidjeti dodatne kontrole koje sadržavaju istu koncentraciju otapala kao ispitne kulture.

Priprema kulture inokuluma

26.

Kulturu inokuluma u ispitnom mediju treba pripremiti dva do četiri dana prije početka ispitivanja, kako bi se ispitne alge prilagodile uvjetima ispitivanja i bile u fazi eksponencijalnog rasta u trenutku kad se primjenjuju za inokulaciju ispitnih otopina. Biomasu algi treba prilagoditi tako da kultura inokuluma može eksponencijalno rasti do početka ispitivanja. Kulturu inokuluma potrebno je inkubirati u istim uvjetima kao ispitne kulture. Mjerenjem povećanja biomase u kulturi inokuluma treba se uvjeriti da je rast u granicama normale za ispitivani soj u uvjetima uzgoja. Primjer postupka uzgoja kulture algi opisan je u Dodatku 4. Ponekad može biti potrebno provesti još jedan korak razmnožavanja kulture inokuluma da bi se izbjegla istodobna dijeljenja stanica za vrijeme ispitivanja.

Priprema ispitnih otopina

27.

Sve ispitne otopine moraju sadržavati istu koncentraciju uzgojnog medija i istu početnu biomasu ispitnih algi. Ispitne otopine odabranih koncentracija uglavnom se pripremaju miješanjem radne otopine ispitivane kemikalije s uzgojnim medijem i kulturom inokuluma. Radne otopine u pravilu se pripremaju otapanjem kemikalije u ispitnom mediju.

28.

Ako je ispitivana kemikalija slabo topljiva u vodi, kao nosači za dodavanje kemikalije u ispitni medij mogu se upotrebljavati otapala, npr. aceton, t-butil alkohol i dimetilformamid (2) (3). Koncentracija otapala ne smije biti viša od 100 μm/l i mora biti jednaka u svim kulturama u ispitnom nizu (uključujući kontrole).

Inkubacija

29.

Ispitne se posude začepe zrakopropusnim čepovima. Posude se protresu i stave u inkubator za uzgoj. Alge se tijekom ispitivanja moraju držati u suspenziji i mora se omogućiti prijenos CO2. To se postiže stalnim tresenjem ili miješanjem. Kulture treba držati na temperaturi između 21 i 24 °C, uz toleranciju ± 2 °C. Kod vrsta koje nisu navedene u Dodatku 2., npr. tropskih vrsta, mogu biti primjerene više temperature, pod uvjetom da se mogu ispuniti kriteriji valjanosti. Preporučuje se da se tikvice nasumično rasporede u inkubatoru i svakodnevno razmještaju.

30.

pH-vrijednost kontrolnog medija tijekom ispitivanja ne smije se povećati za više od 1,5 jedinica. Kod metala i kemikalija koji djelomično ioniziraju pri pH-vrijednosti koja je približna ispitnoj pH-vrijednosti ponekad je nužno ograničiti pomak pH-vrijednosti kako bi se dobili obnovljivi i dobro definirani rezultati. Pomak od < 0,5 pH jedinica tehnički je izvediv i može se postići osiguravanjem odgovarajućeg prijenosa mase CO2 iz okolnog zraka u ispitnu otopinu, npr. povećanjem brzine tresenja. Druga je mogućnost da se smanji potrošnja CO2 smanjenjem početne biomase ili trajanja ispitivanja.

31.

Površina na kojoj se kulture inkubiraju mora primati neprekidno i ravnomjerno fluorescentno svjetlo, npr. hladno bijelo ili dnevno svjetlo. Različiti sojevi algi i cijanobakterija imaju različite potrebe za svjetlošću. Intenzitet svjetlosti potrebno je prilagoditi ispitnim organizmima. Intenzitet svjetlosti na razini ispitnih otopina za preporučene vrste zelenih algi treba odabrati unutar područja od 60 do 120 · μE m– 2 s– 1, mjereno u fotosintetički učinkovitom spektralnom području od 400 do 700 nm primjenom odgovarajućeg prijamnika. Neke vrste, posebno Anabena flos-aquae, dobro rastu na svjetlosti slabijeg intenziteta i jaka ih svjetlost može oštetiti. Kod tih vrsta treba odabrati prosječni intenzitet svjetlosti u području od 40 do 60 μE m– 2 s– 1. (Kod instrumenata za mjerenje intenziteta svjetlosti baždarenih u luksima područje od 4 440 do 8 880 luksa za hladno bijelo svjetlo približno odgovara preporučenom intenzitetu svjetlosti od 60 do 120 μE m– 2 s– 1). Intenzitet svjetlosti treba održavati unutar ±15 % prosječnog intenziteta svjetlosti na inkubacijskom području.

Trajanje ispitivanja

32.

Ispitivanje u pravilu traje 72 sata. Ipak, ispitivanje može trajati i duže ili kraće, pod uvjetom da su zadovoljeni svi kriteriji valjanosti iz stavka 11.

Mjerenja i analitička određivanja

33.

Biomasa algi u svakoj tikvici određuje se najmanje jedanput dnevno tijekom ispitivanja. Ako se mjerenja provode na malom volumenu pipetiranom iz ispitne otopine, izvađenu otopinu nije potrebno nadomjestiti.

34.

Mjerenje biomase provodi se ručnim brojenjem stanica pod mikroskopom ili elektroničkim brojačem čestica (za broj stanica i/ili biovolumen). Mogu se primjenjivati i alternativne tehnike, npr. protočna citometrija, flourescencija klorofila in vitro ili in vivo (5) (6) ili optička gustoća, pod uvjetom da se može dokazati zadovoljavajuća korelacija s biomasom unutar područja biomasa koje se javljaju u ispitivanju.

35.

pH-vrijednost otopina potrebno je izmjeriti na početku i na kraju ispitivanja.

36.

Ako je raspoloživ analitički postupak za određivanje ispitivane kemikalije u rasponu koncentracija koje se upotrebljavaju u ispitivanju, ispitne otopine potrebno je analizirati kako bi se provjerile početne koncentracije i ujednačenost koncentracija izloženosti tijekom ispitivanja.

37.

Ponekad je dovoljno analizirati koncentraciju ispitivane kemikalije u jednoj niskoj i jednoj visokoj ispitnoj koncentraciji na početku i na kraju ispitivanja te koncentraciju oko očekivane vrijednosti EC50 ako se očekuje da će koncentracije izloženosti tijekom ispitivanja odstupati manje od 20 % od nazivnih vrijednosti. Ako nije vjerojatno da će koncentracije ostati unutar 80 do 120 % nazivne vrijednosti, preporučuje se analiza svih ispitnih koncentracija na početku i na kraju ispitivanja. U slučaju hlapljivih, nestabilnih i vrlo adsorptivnih ispitivanih kemikalija preporučuje se da se tijekom razdoblja izloženosti obave dodatna uzorkovanja za analizu u razmacima od 24 sata kako bi se mogao bolje odrediti gubitak ispitivane kemikalije. Kod takvih kemikalija mogu biti potrebna dodatna ponavljanja. U svakom slučaju, koncentraciju ispitivane kemikalije treba određivati samo na jednoj posudi u svakoj ispitnoj koncentraciji (ili na združenom sadržaju posuda ponavljanja).

38.

S ispitnim medijima koji su posebno pripremljeni za analizu koncentracija izlaganja tijekom ispitivanja treba postupati jednako kao s medijima na kojima se provodi ispitivanje, tj. treba ih inokulirati algama i inkubirati u jednakim uvjetima. Ponekad je za analizu koncentracije otopljene ispitivane kemikalije potrebno odvojiti alge od medija. Odvajanje se po mogućnosti provodi laganim centrifugiranjem gdje je g-sila tek tolika da se postigne taloženje algi.

39.

Ako je moguće dokazati da se koncentracija ispitivane kemikalije tijekom ukupnog trajanja ispitivanja na zadovoljavajući način održava u granicama ± 20 % nazivne ili izmjerene početne koncentracije, analiza rezultata može se temeljiti na nazivnim ili izmjerenim početnim vrijednostima. Ako odstupanje od nazivne ili izmjerene početne koncentracije nije unutar područja od ± 20 %, analiza rezultata mora se temeljiti na srednjoj geometrijskoj koncentraciji tijekom izlaganja ili modelima koji opisuju opadanje koncentracije ispitivane kemikalije (20) (8).

40.

Test inhibicije rasta algi dinamičniji je ispitni sustav nego što je to većina testova kratkotrajne toksičnosti u vodi. Stoga je ponekad teško odrediti stvarne koncentracije izlaganja, što posebno vrijedi za ispitivanja adsorptivnih kemikalija u niskim koncentracijama. U tom slučaju nestanak ispitivane kemikalije iz otopine adsorpcijom na rastuću biomasu algi ne znači gubitak kemikalije iz ispitnog sustava. Kod analize rezultata ispitivanja treba provjeriti je li smanjenje koncentracije ispitivane kemikalije tijekom ispitivanja praćeno smanjenjem inhibicija rasta. Ako je to slučaj, može se razmotriti primjena prikladnog modela koji opisuje opadanje koncentracije ispitivane kemikalije (7). U protivnom će možda biti primjereno provesti analizu rezultata na temelju početnih (nazivnih ili izmjerenih) koncentracija.

Ostala opažanja

41.

Mikroskopskim pregledom trebalo bi se uvjeriti u normalan i zdrav izgled kulture inokuluma te uočiti eventualne promjene u izgledu algi (one koje mogu biti posljedica izlaganja ispitivanoj kemikaliji) na kraju ispitivanja.

Granično ispitivanje

42.

U određenim okolnostima, npr. kad preliminarno ispitivanje ukazuje na to da ispitivana kemikalija nema toksično djelovanje pri koncentraciji do 100 mg/l ili do granice topljivosti u ispitnom mediju (ovisno o tomu što je manje), može se provesti granično ispitivanje za usporedbu odgovora kontrolne skupine s jednom ispitnom skupinom (100 mg/l ili koncentracija koja odgovara granici topljivosti). Preporučuje se da se uz granično ispitivanje svakako napravi analiza koncentracije izloženosti. Za granično ispitivanje vrijede svi prethodno opisani ispitni uvjeti i kriteriji valjanosti, s time da broj ponavljanja u ispitnoj skupini ne smije biti manji od šest. Varijable odgovora u kontrolnoj i ispitnoj skupini mogu se analizirati statističkim testom za usporedbu srednjih vrijednosti, npr. Studentovim t-testom. Ako su varijance dviju skupina nejednake, potrebno je provesti prilagođeni t-test za nejednake varijance.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Grafički prikaz krivulja rasta

43.

Biomasa u ispitnim posudama može se izraziti u jedinicama mjerenog zamjenskog parametra (npr. broj stanica, fluorescencija).

44.

Da bi se dobio grafički prikaz krivulja rasta, potrebno je izraditi tablicu procijenjenih koncentracija biomase u ispitnim i kontrolnim kulturama, zajedno s koncentracijama ispitivanog materijala, koje se bilježe s razlučljivošću od najmanje jednog cijelog sata, i vremenima mjerenja. U ovoj prvoj fazi mogu biti korisne i logaritamske i linearne skale; međutim, logaritamske su skale obvezatne i općenito daju bolji prikaz promjena uzorka rasta u razdoblju ispitivanja. Valja napomenuti da kad se eksponencijalni rast prikaže na logaritamskoj skali kao rezultat se dobiva pravac, a nagib pravca pokazuje specifičnu brzinu rasta.

45.

Na grafičkim prikazima treba provjeriti rastu li kontrolne kulture tijekom ispitivanja eksponencijalno i očekivanom brzinom. Treba kritički preispitati sve točke podataka i izgled grafova te provjeriti sirove podatke i postupke kako bi se utvrdile eventualne pogreške. Potrebno je posebno provjeriti one točke podataka kod kojih se čini da su odstupanja posljedica sustavne pogreške. Ako je očito i/ili vrlo vjerojatno da je riječ o pogreškama u postupku, odgovarajuću točku treba označiti kao stršeću vrijednost i isključiti iz kasnije statističke analize. (Nulta koncentracija algi u jednoj od dvije ili tri posude ponavljanja može ukazivati na to da posuda nije pravilno inokulirana ili da nije bila dobro očišćena.) U izvješću o ispitivanju treba jasno navesti zašto je određena točka odbačena kao stršeća vrijednost. Prihvatljivi su razlozi samo (rijetke) pogreške u postupku, ali ne i loša preciznost. Statistički postupci za utvrđivanje stršećih vrijednosti imaju kod ove vrste problema ograničenu primjenu i ne mogu zamijeniti stručnu prosudbu. Stršeće vrijednosti (koje su označene kao takve) treba po mogućnosti zadržati među točkama podataka u kasnijim grafičkim ili tabličnim prikazima podataka.

Varijable odgovora

46.

Svrha je ispitivanja utvrditi učinke ispitivane kemikalije na rast algi. U ovoj su ispitnoj metodi opisane dvije varijable odgovora, budući da različite jurisdikcije imaju različite preferencije i regulatorne zahtjeve. Da bi rezultati ispitivanja bili prihvatljivi u svim jurisdikcijama, učinke treba ocijeniti primjenom obiju varijabli odgovora opisanih u nastavku pod točkama (a) i (b).

(a)    Prosječna specifična brzina rasta : ova se varijabla odgovora izračunava na temelju logaritamskog povećanja biomase u razdoblju ispitivanja, izraženog po danu

(b)    Prirast : ova varijabla odgovora predstavlja biomasu na kraju ispitivanja umanjenu za početnu biomasu.

47.

Valja napomenuti da vrijednosti toksičnosti izračunane primjenom tih dviju varijabli odgovora nisu usporedive i tu razliku treba uzeti u obzir kod uporabe rezultata ispitivanja. Ako su ispoštovani ispitni uvjeti ove metode, vrijednosti ECx na temelju prosječne specifične brzine rasta (ErCx) općenito su više od rezultata na temelju prirasta (EyCx) zbog razlike u matematičkoj osnovi tih dvaju pristupa. To ne treba tumačiti kao razliku u osjetljivosti dviju varijabli odgovora, nego jednostavno prihvatiti da su te vrijednosti matematički različite. Pojam prosječne specifične brzine rasta temelji se na općenitom obrascu eksponencijalnog rasta algi u neograničenim kulturama, gdje se toksičnost procjenjuje na temelju učinaka na brzinu rasta neovisno o apsolutnoj vrijednosti specifične brzine rasta u kontrolnoj skupini, nagibu krivulje koncentracija-odgovor i trajanju ispitivanja. Za razliku od toga, rezultati koji se temelje na varijabli odgovora ‚prirast’ ovise o svim tim drugim varijablama. EyCx ovisi o specifičnoj brzini rasta vrsta algi upotrijebljenih u svakom ispitivanju i o maksimalnoj specifičnoj brzini rasta, koja se može razlikovati između vrsta, pa čak i između sojeva algi. Ovu varijablu odgovora ne treba upotrebljavati za usporedbu osjetljivosti na toksine među vrstama algi, pa čak ni među sojevima algi. Iako se, sa znanstvenog stajališta, procjeni toksičnosti na temelju prosječne specifične brzine rasta daje prednost, u ovu su ispitnu metodu uključene i procjene toksičnosti na temelju prirasta kako bi se zadovoljili trenutačni regulatorni zahtjevi u nekim državama.

Prosječna brzina rasta

48.

Prosječna specifična brzina rasta u određenom razdoblju izračunava se kao logaritamsko povećanje biomase za svaku kontrolnu i ispitnu posudu primjenom sljedeće jednadžbe:

Formula

[1],

gdje je:

μi-j

:

prosječna specifična brzina rasta od vremena i do vremena j;

Xi

:

biomasa u vremenu i;

Xj

:

biomasa u vremenu j

Za svaku ispitnu i kontrolnu skupinu treba izračunati srednju vrijednost brzine rasta s procjenom varijance.

49.

Izračuna se prosječna specifična brzina rasta za ukupno vrijeme ispitivanja (obično dana 0 – 3); pritom se umjesto izmjerene početne vrijednosti kao početna vrijednost uzima nazivna inokulirana biomasa, jer se na taj način u pravilu postiže veća preciznost. Ako oprema koja se upotrebljava za mjerenje biomase dopušta dovoljno precizno određivanje male biomase inokuluma (npr. protočni citometar), može se upotrijebiti izmjerena početna koncentracija biomase. Isto tako, treba odrediti etapnu brzinu rasta, koja se izračunava kao specifična brzina rasta za svaki dan ispitivanja (dani 0 – 1, 1 – 2 i 2 – 3), te provjeriti je li kontrolna brzina rasta stalna (vidjeti kriterije valjanosti, stavak 11.). Ako je specifična brzina rasta prvoga dana znatno niža od ukupne prosječne specifične brzine rasta, to može ukazivati na fazu prilagodbe. Dok se faza prilagodbe u kontrolnim kulturama može smanjiti i gotovo eliminirati pravilnim razmnožavanjem pretkulture, faza prilagodbe kod izloženih kultura može biti znak oporavka nakon prvobitnog toksičnog šoka ili smanjenog izlaganja zbog gubitka ispitivane kemikalije (uključujući sorpciju na biomasu algi) nakon početnog izlaganja. Stoga se može ocijeniti etapna brzina rasta kako bi se ocijenili učinci ispitivane kemikalije koji se javljaju tijekom razdoblja izlaganja. Značajne razlike između etapne brzine rasta i prosječne brzine rasta ukazuju na odstupanje od stalnog eksponencijalnog rasta i zahtijevaju temeljito preispitivanje krivulja rasta.

50.

Postotak inhibicije brzine rasta za pojedina ponavljanja u ispitnim skupinama izračunava se pomoću sljedeće jednadžbe [2]:

Formula

[2],

gdje je:

%Ir

=

postotak inhibicije prosječne specifične brzine rasta;

μC

=

srednja vrijednost prosječne specifične brzine rasta (μ) u kontrolnoj skupini;

μT

=

prosječna specifična brzina rasta ponavljanja u ispitnoj skupini.

51.

Ako se za pripremu ispitnih otopina upotrebljavaju otapala, za izračun postotka inhibicije treba upotrebljavati kontrole s otapalom, a ne bez otapala.

Prirast

52.

Prirast se izračunava kao biomasa na kraju ispitivanja umanjena za početnu biomasu za svaku kontrolnu i ispitnu posudu. Za svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu treba izračunati srednju vrijednost prirasta s procjenama varijance. Postotak inhibicije prirasta ( % Iy) za pojedina ponavljanja u ispitnoj skupini može se izračunati na sljedeći način:

Formula

[3]

gdje je:

% Iy

=

postotak inhibicije prirasta;

YC

=

srednja vrijednost prirasta u kontrolnoj skupini;

YT

=

vrijednost prirasta ponavljanja u ispitnoj skupini.

Grafički prikaz krivulje koncentracija-odgovor

53.

Napravi se grafički prikaz postotka inhibicije u odnosu na logaritam koncentracije ispitivane kemikalije i dobiveni se graf detaljno pregleda, zanemarujući sve točke podataka koje su u prvoj fazi izdvojene kao stršeće vrijednosti. Točkama podataka prostim okom ili računalnom interpolacijom prilagodi se glatka krivulja kako bi se dobio prvi dojam o odnosu koncentracija-odgovor te se potom nastavlja detaljnijom metodom, po mogućnosti računalnom statističkom metodom. Ovisno o predviđenoj uporabi podataka, kvaliteti (preciznosti) i količini podataka te raspoloživosti alata za analizu podataka, može se donijeti odluka (koja je u određenim slučajevima posve opravdana) da se u ovoj fazi prekine analiza podataka i jednostavno očitaju ključne vrijednosti EC50 i EC10 (i/ili EC20) s krivulje podešene prostim okom (vidjeti i odjeljak u nastavku o stimulirajućim učincima). Neki su od valjanih razloga za neupotrebu statističke metode:

s obzirom na raspoložive podatke, računalnim se metodama ne mogu dobiti pouzdaniji rezultati od onih koji se mogu dobiti stručnom prosudbom – može se dogoditi da neki računalni programi uopće ne daju nikakvo pouzdano rješenje (iteracije ne konvergiraju itd.),

raspoloživi računalni programi nisu prikladni za obradu učinaka stimulacije rasta (vidjeti u nastavku).

Statistički postupci

54.

Cilj je dobiti kvantitativni odnos koncentracija-odgovor regresijskom analizom. Ako se provede linearizacijska pretvorba podataka odgovora – npr. u jedinice probit, logit ili Weibullova modela (8) – može se provesti ponderirana linearna regresija; ipak, prednost se daje postupcima nelinearne regresije koji se bolje nose s neizbježnim nepravilnostima podataka i odstupanjima od pravilnih razdioba. S približavanjem nultoj ili potpunoj inhibiciji te se nepravilnosti mogu pretvorbom i dodatno povećati te tako otežati analizu (8). Valja napomenuti da su standardne metode analize za vrijednosti dobivene pretvorbom (probit, logit ili Weibull) namijenjene kvantalnim podacima (npr. smrtnost ili preživljavanje) i moraju se prilagoditi da bi se mogle primijeniti na podatke o rastu ili biomasi. Konkretni postupci za određivanje vrijednosti ECx iz kontinuiranih podataka mogu se pronaći u literaturi pod (9) (10) i (11). Primjena nelinearne regresijske analize podrobnije je opisana u Dodatku 5.

55.

Za svaku varijablu odgovora koja se analizira potrebno je izračunati procjene točaka za vrijednosti ECx na temelju odnosa koncentracija-odgovor. Po mogućnosti, za sve procjene treba odrediti granice pouzdanosti 95 %. Valjanost podudaranja podataka odgovora s regresijskim modelom procjenjuje se grafički ili statistički. Regresijsku analizu potrebno je provesti na temelju pojedinačnih odgovora u ponavljanjima, a ne na temelju srednjih vrijednosti ispitnih skupina. Ipak, ako je nelinearno prilagođavanje krivulje teško ili nemoguće zbog velike raspršenosti podataka, problem se može zaobići provođenjem regresije na srednjim vrijednostima po skupinama kao praktičnim načinom smanjenja utjecaja mogućih stršećih vrijednosti. Ako se primjenjuje ova opcija, to treba navesti u izvješću o ispitivanju kao odstupanje od uobičajenog postupka uz napomenu da prilagođavanje krivulje pojedinačnim ponavljanjima nije dalo dobar rezultat.

56.

Ako raspoloživi regresijski modeli/metode nisu prikladni za podatke, procjene EC50 i granice pouzdanosti mogu se dobiti i linearnom interpolacijom sa samonadopunjavanjem (‚bootstrapping’) (13).

57.

Za procjenu LOEC-a, a time i NOEC-a, u vezi s učincima ispitivane kemikalije na brzinu rasta potrebno je usporediti srednje vrijednosti obrada primjenom tehnika analize varijance (ANOVA). Zatim srednju vrijednost za svaku koncentraciju treba usporediti s kontrolnom srednjom vrijednošću primjenom odgovarajuće metode višestruke usporedbe ili testa trenda. Ovdje može biti koristan Dunnettov ili Williamsov test (12) (14) (15) (16) (17). Potrebno je provjeriti vrijedi li pretpostavka homogenosti varijanci ANOVA-e. To se može učiniti grafički ili formalnim testom (17). Prikladni su Leveneov i Bartlettov test. Ako pretpostavka homogenosti varijanci nije zadovoljena, to se ponekad može ispraviti logaritamskom pretvorbom podataka. Ako je heterogenost varijance prevelika da bi se mogla ispraviti pretvorbom, trebalo bi razmotriti mogućnost analize metodama kao što su Jonckheereovi testovi trenda postupnim snižavanjem. Dodatne smjernice za određivanje NOEC-a mogu se pronaći u literaturi (11).

58.

Novije znanstvene spoznaje rezultirale su preporukom da se pojam NOEC-a napusti i zamijeni procjenama točaka ECx dobivenih regresijom. Za ovaj test s algama nije utvrđena određena vrijednost x. Čini se da je primjereno područje od 10 do 20 % (ovisno o odabranoj varijabli odgovora), a poželjno je da se navedu obje vrijednosti, EC10 i EC20.

Stimulacija rasta

59.

Ponekad se pri niskim koncentracijama može zapaziti stimulacija rasta (negativna inhibicija). To može biti posljedica hormeze (toksička stimulacija) ili unošenja stimulirajućih faktora rasta s ispitivanim materijalom u upotrijebljeni minimalni medij. Dodavanje anorganskih nutrijenata ne bi smjelo imati nikakav izravan utjecaj budući da ispitni medij tijekom ispitivanja mora stalno sadržavati višak nutrijenata. Stimulacija pri niskim dozama u pravilu se može zanemariti kod izračunavanja EC50, osim ako je ekstremno visoka. U slučaju ekstremne stimulacije, ili kad je potrebno izračunati ECx za niske vrijednosti x, ponekad je potrebno primijeniti posebne postupke. Pojave stimulacije rasta potrebno je kad je god to moguće uključiti u analizu podataka, a ako raspoloživi softver za prilagođavanje krivulje ne može prihvatiti male vrijednosti stimulacije, može se primijeniti linearna interpolacija sa samonadopunjavanjem (‚bootstrapping’). U slučaju ekstremne stimulacije može se razmotriti primjena modela hormeze (18).

Netoksična inhibicija rasta

60.

Ispitivani materijali koji apsorbiraju svjetlost mogu izazvati smanjenje brzine rasta stvaranjem sjene, koja smanjuje raspoloživu količinu svjetlosti. Ove i druge slične fizikalne učinke treba odvojiti od toksičnih učinaka izmjenom ispitnih uvjeta i treba ih posebno navesti u izvješću o ispitivanju. Smjernice se mogu pronaći u literaturi pod (2) i (3).

IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

61.

Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće:

 

Ispitivana kemikalija:

fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva, uključujući granicu topljivosti u vodi,

podaci za identifikaciju kemikalije (npr. CAS broj), uključujući čistoću (nečistoće).

 

Ispitne vrste:

soj, dobavljač odnosno izvor i primijenjeni uvjeti uzgoja.

 

Uvjeti ispitivanja:

datum početka ispitivanja i trajanje,

plan ispitivanja: ispitne posude, volumeni kulture, gustoća biomase na početku ispitivanja,

sastav medija,

ispitne koncentracije i ponavljanja (npr. broj ponavljanja, broj ispitnih koncentracija i primijenjena geometrijska progresija),

opis pripreme ispitnih otopina, uključujući primjenu otapala itd.,

inkubator za uzgoj:

intenzitet i kvaliteta svjetlosti (izvor, homogenost),

temperatura,

ispitane koncentracije: nazivne ispitne koncentracije i rezultati analiza za određivanje koncentracije ispitivane kemikalije u ispitnim posudama; potrebno je navesti iskorištenje metode i granicu kvantifikacije u ispitnom matriksu,

sva odstupanja od ove ispitne metode,

metoda određivanja biomase i dokaz korelacije između izmjerenog parametra i suhe mase.

 

Rezultati:

pH-vrijednosti na početku i kraju ispitivanja u svim obradama,

biomasa za svaku tikvicu u svakoj mjernoj točki i metoda mjerenja biomase,

krivulje rasta (grafički prikaz biomase u ovisnosti o vremenu),

izračunane varijable odgovora za svako ponavljanje u ispitnim skupinama, uključujući srednje vrijednosti i koeficijent varijacije ponavljanja,

grafički prikaz odnosa koncentracije i učinka,

procjene toksičnosti za varijable odgovora, npr. EC50, EC10, EC20 i odgovarajući intervali pouzdanosti; ako se izračunavaju, LOEC i NOEC te statističke metode koje su upotrijebljene za njihovo određivanje,

Ako je upotrijebljena ANOVA, veličina učinka koja se može utvrditi (npr. najmanja značajna razlika),

eventualna stimulacija rasta u bilo kojoj obradi,

svi ostali zapaženi učinci, npr. morfološke promjene algi,

rasprava o rezultatima, uključujući i svaki utjecaj na ishod ispitivanja koji proizlazi iz odstupanja od ove ispitne metode.

LITERATURA

(1)

International Organisation for Standardisation (1993.) ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998.) ISO/DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000.) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, br. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998.) ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. i Nyholm, N. (1997.) A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525 – 2531.

(6)

Slovacey, R. E. i Hanna, P. J. (1997.) In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S. L., Roland, M. G. E., Stauber, J. L. i Batley, G. E. (2003.) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073 – 2079.

(8)

Christensen, E. R., Nyholm, N. (1984.) Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713 – 718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P. S., Kusk, K. O. i Christensen, E. R. (1992.) Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157 – 167.

(10)

Bruce, R. D. i Versteeg, D. J. (1992.) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485 – 1494.

(11)

OECD (2006.) Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C. W. (1955.) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King, T. J. (1988.) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C. W. (1964.) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482 – 491.

(15)

Williams, D. A. (1971.) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103 – 117.

(16)

Williams, D. A. (1972.) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519 – 531.

(17)

Draper, N. R. i Smith, H. (1981.) Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. i Cousens, R. (1989.) An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93 – 96.

Dodatak 1.

Definicije

Za potrebe ove ispitne metode upotrebljavaju se sljedeće definicije i kratice:

 

Biomasa je suha masa žive tvari u populaciji izražena u odnosu na dani volumen; npr. mg algi / l l ispitne tekućine. ‚Biomasa’ se obično definira kao masa, ali se u ovom testu ta riječ odnosi na masu po volumenu. Osim toga, u ovom se testu u pravilu mjere i zamjenski parametri biomase kao što su broj stanica, fluorescencija itd. pa se izraz ‚biomasa’ odnosi i na te zamjenske mjere.

 

Kemikalija znači tvar ili smjesa.

 

Koeficijent varijacije je bezdimenzionalna mjera varijabilnosti parametra, definirana kao omjer standardne devijacije i srednje vrijednosti. Može se izraziti i kao postotak. Srednji koeficijent varijacije prosječne specifične brzine rasta u ponavljanjima kontrolnih kultura izračunava se na sljedeći način:

1.

Izračuna se postotak koeficijenta varijacije (KV) prosječne specifične brzine rasta iz dnevnih/etapnih brzina rasta za odgovarajuće ponavljanje.

2.

Izračuna se srednja vrijednost svih izračunanih vrijednosti iz točke 1. kako bi se dobio srednji koeficijent varijacije dnevne/etapne specifične brzine rasta u ponavljanjima kontrolnih kultura.

 

ECx je koncentracija ispitivane kemikalije otopljene u ispitnom mediju koja rezultira x-postotnim (npr. 50 %) smanjenjem rasta ispitnog organizma unutar navedenoga razdoblja izlaganja (koje je potrebno izričito navesti ako odstupa od punog ili uobičajenog trajanja ispitivanja). Da bi se nedvosmisleno pokazalo je li vrijednost EC dobivena iz brzine rasta ili iz prirasta, za brzinu rasta upotrebljava se simbol ‚ErC’, a za prirast simbol ‚EyC’.

 

Uzgojni medij je kompletna sintetička hranjiva podloga u kojoj ispitne alge rastu kad se izlože ispitivanoj tvari. Ispitivana se kemikalija obično otapa u ispitnom mediju.

 

Brzina rasta (prosječna specifična brzina rasta) je logaritamsko povećanje biomase tijekom razdoblja izlaganja.

 

Najniža koncentracija s vidljivim učinkom (engl. Lowest Observed Effect Concentration, LOEC) najniža je ispitana koncentracija kod koje je uočeno da kemikalija ima statistički značajan usporavajući učinak na rast (pri p < 0,05) u usporedbi s kontrolom u određenom razdoblju izlaganja. Ipak, sve ispitne koncentracije iznad LOEC-a moraju imati jednak ili veći štetan učinak od onoga koji je zabilježen pri LOEC-u. Ako se ova dva uvjeta ne mogu zadovoljiti, potrebno je detaljno objasniti kako je odabran LOEC (a prema tomu i NOEC).

 

Najviša koncentracija bez vidljivog učinka (engl. No Observed Effect Concentration, NOEC) ispitna je koncentracija neposredno ispod LOEC-a.

 

Varijabla odgovora je varijabla za procjenu toksičnosti izvedena iz bilo kojeg izmjerenog parametra koji opisuje biomasu primjenom različitih računskih metoda. Kod ove su ispitne metode stope rasta i prirast varijable odgovora dobivene izravnim mjerenjem biomase ili bilo kojeg navedenog zamjenskog parametra.

 

Specifična brzina rasta je varijabla odgovora definirana kao kvocijent razlike prirodnih logaritama promatranog parametra (kod ove je ispitne metode to biomasa) i odgovarajućeg vremenskog razdoblja.

 

Ispitivana kemikalija je svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.

 

Prirast je vrijednost mjerne varijable na kraju razdoblja izlaganja umanjena za vrijednost mjerne varijable na početku razdoblja izlaganja, kojom se izražava povećanje biomase tijekom ispitivanja.

Dodatak 2.

Sojevi koji su se pokazali prikladnima za ispitivanje

Zelene alge

 

Pseudokirchneriella subcapitata (ranije poznata kao Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (ranije poznata kao Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG

Dijatomeje

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Cijanobakterije

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Izvori sojeva

Preporučeni sojevi raspoloživi su u kulturama jedne vrste algi iz sljedećih zbirki (abecednim redom):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

SAD

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

UK

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

University of Göttingen

Nikolausberger Weg 18

3703 Göttingen

NJEMAČKA

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

SAD

Izgled i svojstva preporučenih vrsta

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Izgled

Zakrivljene, uvijene pojedinačne stanice

Duguljaste, većinom pojedinačne stanice

Štapićaste

Lanci duguljastih stanica

Štapićaste

Veličina (D × Š) μm

8 – 14 × 2 – 3

7 – 15 × 3 – 12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Volumen stanica (μm3/stanica)

40 – 60 (2)

60 – 80 (2)

40 – 50 (2)

30 – 40 (2)

2,5 (3)

Suha masa stanica (mg/stanica)

2 – 3 × 10– 8

3 – 4 × 10– 8

3 – 4 × 10– 8

1 – 2 × 10– 8

2 – 3 × 10– 9

Brzina rasta (4) (dan– 1)

1,5 – 1,7

1,2 – 1,5

1,4

1,1 – 1,4

2,0 × 2,4

Posebne preporuke za uzgoj i rukovanje preporučenim ispitnim vrstama

Pseudokirchneriella subcapitata i Desmodesmus subspicatus

Ove je zelene alge općenito lako održavati u različitim medijima kulture. Informacije o prikladnim medijima mogu se dobiti u zbirkama kultura. U pravilu je riječ o pojedinačnim stanicama i mjerenja gustoće stanica mogu se jednostavno obaviti s pomoću elektroničkog brojača čestica ili mikroskopa.

Anabaena flos-aquae

Za držanje radne kulture mogu se upotrebljavati različiti uzgojni mediji. Osobito je važno ne dopustiti da šaržna kultura kod obnavljanja ne prođe logaritamsku fazu rasta, jer je tada regeneracija teška.

Anabaena flos-aquae tvori nakupine isprepletenih lanaca stanica. Veličina nakupina može biti različita, ovisno o uzgojnim uvjetima. Te je nakupine ponekad potrebno razbiti ako se biomasa određuje brojenjem pod mikroskopom ili elektroničkim brojačem čestica.

Da bi se smanjila varijabilnost rezultata brojenja, lanci se mogu razbiti ultrazvučnom obradom poduzoraka. Ultrazvučna obrada ne smije trajati duže nego što je potrebno da se lanci razbiju na kraće lance, jer se u protivnom stanice mogu uništiti. Intenzitet i trajanje ultrazvučne obrade moraju biti jednaki kod svih uzoraka.

Na hemocitometru treba izbrojiti dovoljan broj polja (najmanje 400 stanica) da bi se mogla ispraviti odstupanja. Time se poboljšava pouzdanost mikroskopskih određivanja gustoće.

Nakon što se lanci stanica razbiju pažljivom ultrazvučnom obradom, za određivanje ukupnog volumena stanica Anabaena može se upotrijebiti elektronički brojač čestica. Ultrazvučnu energiju potrebno je prilagoditi tako da se izbjegne oštećenje stanica.

Da bi se dobila dobro izmiješana i homogena suspenzija algi za inokulaciju ispitnih posuda, potrebno je upotrijebiti vortex miješalicu ili sličnu prikladnu metodu.

Ispitne posude potrebno je staviti na orbitalnu ili linearnu tresilicu na oko 150 okretaja u minuti. Drugi je način da se smanji tendencija tvorbe gruda kod Anabaena periodično mućkanje. Kod pojave gruda treba paziti da se za mjerenje biomase dobiju reprezentativni uzorci. Ponekad je prije uzorkovanja potrebno snažno protresti posude da bi se razbile grude algi.

Synechococcus leopoliensis

Za držanje radne kulture mogu se upotrebljavati različiti uzgojni mediji. Informacije o prikladnim medijima mogu se dobiti u zbirkama kultura.

Synechococcus leopoliensis raste u obliku pojedinačnih štapićastih stanica. Stanice su vrlo malene, što otežava mjerenje biomase brojenjem pod mikroskopom. Ovdje mogu pomoći elektronički brojači čestica opremljeni za brojenje čestica do veličine od oko 1 μm. Osim toga, mogu se primijeniti i fluorometrijska mjerenja in vitro.

Navicula pelliculosa

Za držanje radne kulture mogu se upotrebljavati različiti uzgojni mediji. Informacije o prikladnim medijima mogu se dobiti u zbirkama kultura. Medij mora sadržavati silikat.

Navicula pelliculosa može u određenim uvjetima rasta stvarati nakupine. Stanice algi ponekad se nakupljaju u površinskoj emulziji zbog tvorbe lipida. U tom se slučaju kod uzimanja poduzoraka za određivanje biomase moraju poduzeti posebne mjere kako bi se dobili reprezentativni uzorci. Ponekad je nužno i snažno protresanje, npr. uz pomoć vortex miješalice.

Dodatak 3.

Uzgojni mediji

Može se upotrijebiti jedan od sljedećih dvaju uzgojnih medija:

Medij OECD: izvorni medij OECD TG 201, također u skladu s normom ISO 8692,

US. EPA medij AAP, također u skladu s normom ASTM.

Kod pripreme tih medija potrebno je upotrijebiti reagencijski ili analitički čiste kemikalije i deioniziranu vodu.

Sastav medija AAP (US. EPA) i medija OECD TG 201

Sastojak

AAP

OECD

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

Molarni omjer EDTA – željezo nešto je veći od jedan. Time se sprječava taloženje željeza i istovremeno smanjuje kelatiranje iona teških metala.

Kod ispitivanja s dijatomejom Navicula pelliculosa oba medija treba nadopuniti s Na2SiO3 · 9H20 tako da se dobije koncentracija od 1,4 mg Si/l.

pH-vrijednost medija određuje se kad se uspostavi ravnoteža između karbonatnog sustava medija i parcijalnog tlaka CO2 u atmosferskom zraku. Približni odnos između pH na 25 °C i molarne koncentracije bikarbonata proizlazi iz sljedeće formule:

pHeq = 11.30 + log[HCO3]

S 15 mg NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (medij US EPA), a s 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (medij OECD).

Udjeli elemenata u ispitnim medijima

Element

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Priprema medija OECD

Nutrijent

Koncentracija u radnoj otopini

Radna otopina 1:

makronutrijenti

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Radna otopina 2:

željezo

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Radna otopina 3:

elementi u tragovima

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Radna otopina 4:

bikarbonat

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Radne se otopine steriliziraju membranskom filtracijom (srednji promjer pora 0,2 μm) ili obradom u autoklavu (120 °C, 15 min). Otopine se pohrane u mraku na temperaturi od 4 °C.

Radne otopine 2 i 4 ne steriliziraju se u autoklavu, nego membranskom filtracijom.

Uzgojni medij priprema se dodavanjem odgovarajućeg volumena radnih otopina 1 do 4 u vodu.

 

U 500 ml sterilizirane vode doda se:

 

10 ml radne otopine 1

 

1 ml radne otopine 2

 

1 ml radne otopine 3

 

1 ml radne otopine 4

 

Nadopuni se steriliziranom vodom do 1 000 ml.

Zatim treba ostaviti dovoljno vremena za uspostavu ravnoteže između medija i atmosferskog CO2, prema potrebi upuhivanjem sterilnog filtriranog zraka u trajanju od nekoliko sati.

Priprema medija US EPA

1.

U približno 900 ml deionizirane ili destilirane vode doda se po 1 ml radnih otopina 2.1. – 2.7. i razrijedi do jedne litre.

2.

Radne otopine s makronutrijentima pripreme se otapanjem sljedećih količina tvari u 500 ml deionizirane ili destilirane vode. Reagensi 2.1., 2.2., 2.3. i 2.4. mogu se združiti u jednu radnu otopinu.

2.1.

NaNO3

12,750 g;

2.2.

MgCl2 · 6H2O

6,082 g;

2.3.

CaCl2 · 2H2O

2,205 g;

2.4.

Radna otopina s mikronutrijentima (vidjeti 3);

2.5.

MgSO4 · 7H2O

7,350 g;

2.6.

K2HPO4

0,522 g;

2.7.

NaHCO3

7,500 g;

2.8.

Na2SiO3 · 9H2O

vidjeti napomenu 1.

Napomena 1.: Upotrijebiti samo kod ispitivanja s dijatomejama. Može se dodati izravno (202,4 mg) ili putem radne otopine tako da se dobije konačna koncentracija 20 mg/l Si u mediju.

3.

Radna otopina s mikronutrijentima priprema se otapanjem sljedećih količina tvari u 500 ml deionizirane ili destilirane vode:

3.1.

H3BO3

92,760 mg;

3.2.

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg;

3.3.

ZnCl2

1,635 mg;

3.4.

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg;

3.5.

CoCl2·6H2O

0,714 mg;

3.6.

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg;

3.7.

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg;

3.8.

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg [dinatrijev (etilendinitrilo) tetraacetat];

3.9.

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg (vidjeti napomenu 2.).

Napomena 2.: Upotrijebiti samo u mediju za radne kulture s dijatomejama.

4.

Prilagoditi pH-vrijednost na 7,5 ± 0,1 s pomoću 0,1 N ili 1,0 N NaOH ili HCl.

5.

Medij se profiltrira u sterilnu posudu kroz membranski filtar od 0,22 μm ako će se upotrijebiti brojač čestica ili kroz membranski filtar od 0,45 μm ako se neće upotrijebiti brojač čestica.

6.

Medij je do uporabe potrebno pohraniti u mraku na temperaturi od približno 4 °C.

Dodatak 4.

Primjer postupka za uzgoj kulture algi

Opće napomene

Uzgoj kultura u skladu s ovim postupkom provodi se radi dobivanja kultura algi za toksikološka ispitivanja.

Potrebno je primijeniti prikladne metode kako bi se osiguralo da kulture algi ne budu inficirane bakterijama. Iako aksenične kulture mogu biti poželjne, svakako se moraju uspostaviti i upotrijebiti kulture koje sadržavaju samo jednu vrstu algi.

Sve postupke treba provoditi u sterilnim uvjetima kako bi se izbjeglo onečišćenje bakterijama i drugim algama.

Oprema i materijali

Vidjeti: Ispitna metoda: Aparatura.

Postupci za dobivanje kultura algi

Priprema hranjivih otopina (medija):

Sve se hranjive soli medija pripremaju kao koncentrirane radne otopine i čuvaju na tamnom i hladnom mjestu. Otopine se steriliziraju filtracijom ili obradom u autoklavu.

Medij se priprema dodavanjem ispravne količine radne otopine u sterilnu destiliranu vodu, pazeći da ne dođe do infekcije. Kod krutih medija treba dodati 0,8 % agara.

Radna kultura:

Radne kulture su male kulture algi koje se redovito prenose u svježi medij i upotrebljavaju kao polazni ispitni materijal. Ako se kulture ne upotrebljavaju redovito, nanose se na kosi agar u epruvetama. Kulture se prenose u svježi medij najmanje jedanput u dva mjeseca.

Radne se kulture uzgajaju u stožastim tikvicama koje sadržavaju odgovarajući medij (oko 100 ml). Kad se alge inkubiraju na 20 °C uz neprekidno osvjetljenje, potrebno je tjedno prenošenje.

Kod prenošenja se određena količina ‚stare’ kulture prenese sterilnim pipetama u tikvicu sa svježim medijem tako da kod brzorastućih vrsta početna koncentracija bude oko 100 puta niža nego u staroj kulturi.

Brzina rasta vrste može se odrediti iz krivulje rasta. Ako je ona poznata, moguće je procijeniti gustoću pri kojoj je kulturu potrebno prenijeti u novi medij. To se mora učiniti prije nego što kultura dosegne fazu odumiranja.

Pretkultura:

Pretkultura je namijenjena dobivanju količine algi primjerene za inokulaciju ispitnih kultura. Pretkultura se inkubira u uvjetima ispitivanja i upotrebljava se dok još eksponencijalno raste, obično nakon razdoblja inkubacije od dva do četiri dana. Kulture algi koje sadržavaju deformirane ili abnormalne stanice potrebno je odbaciti.

Dodatak 5.

Analiza podataka nelinearnom regresijom

Opća razmatranja

Kod testova s algama i drugih testova mikrobnog rasta – rasta biomase – odgovor je po svojoj prirodi kontinuirana ili metrička varijabla – brzina procesa, ako se upotrebljava brzina rasta, i njezin vremenski integral, ako je odabrana biomasa. Oba se parametra stavljaju u odnos prema odgovarajućem srednjem odgovoru ponavljanja neizloženih kontrola koje najjače reagiraju na dane uvjete; u testu s algama glavni su čimbenici svjetlost i temperatura. Sustav je podijeljen ili homogen, a biomasa se može promatrati kao kontinuum bez razmatranja pojedinačnih stanica. Razdioba varijance za odgovore kakvi se javljaju kod ovakvih sustava ovisi isključivo o pokusnim čimbenicima (koji se obično opisuju putem lognormalnih ili normalnih razdioba pogreške). To je u suprotnosti s tipičnim odgovorima kod biopokusa s kvantalnim podacima, gdje se tolerancija (u pravilu s binomnom razdiobom) pojedinačnih organizama često smatra dominantnom komponentom varijance. Ovdje su odgovori kontrola nula ili na razini osnovne vrijednosti.

U najjednostavnijem slučaju normirani odnosno relativni odgovor r jednoliko opada od 1 (nulta inhibicija) do 0 (stopostotna inhibicija). Valja napomenuti da su svi odgovori povezani s pogreškom te da se očite negativne inhibicije mogu izračunati samo kao rezultat slučajne pogreške.

Regresijska analiza

Modeli

Cilj je regresijske analize kvantitativno opisati krivulju koncentracija-odgovor u obliku matematičke regresijske funkcije Y = f (C) ili češće F (Z), gdje je Z = log C. Inverzna funkcija C = f– 1 (Y) omogućuje izračunavanje vrijednosti ECx, uključujući EC50, EC10 i EC20 te njihovih granica pouzdanosti od 95 %. Pokazalo se da nekoliko jednostavnih matematičkih funkcija uspješno opisuju odnose koncentracija-odgovor koji se dobivaju u testovima inhibicije rasta algi. Te funkcije obuhvaćaju npr. logističku jednadžbu, nesimetričnu Weibullovu jednadžbu i funkciju lognormalne razdiobe, koje sve predstavljaju sigmoidne krivulje koje se asimptotski približavaju nuli kod C → 0 i vrijednosti 1 kod C → beskonačno.

Primjena modela neprekinute funkcije s pragom (npr. Kooijmanov model ‚inhibicije rasta populacije’ (Kooijman i sur., 1996.) u zadnje se vrijeme predlaže kao alternativa asimptotskim modelima. Ovaj model polazi od pretpostavke da nema nikakvih učinaka pri koncentracijama ispod određenoga praga EC0+ koji se procjenjuje ekstrapolacijom odnosa koncentracija-odgovor sa sjecištem u osi koncentracije primjenom jednostavne neprekinute funkcije koja nije diferencijabilna u polaznoj točki.

Valja napomenuti da se analiza može provesti jednostavnim minimiziranjem zbrojeva rezidualnih kvadrata (uz pretpostavku stalne varijance) ili ponderiranih kvadrata, ako se ispravlja heterogenost varijance.

Postupak

Postupak se može ukratko opisati na način opisan u nastavku. Odabere se odgovarajuća funkcijska jednadžba, Y = f (C), i prilagodi podacima nelinearnom regresijom. Poželjno je da se umjesto srednjih vrijednosti ponavljanja upotrebljavaju mjerenja pojedinačnih tikvica kako bi se iz podataka izvuklo što je moguće više informacija. Međutim, ako je varijanca visoka, praktična iskustva pokazuju da srednje vrijednosti ponavljanja mogu dati pouzdaniju matematičku procjenu uz manji utjecaj sustavnih pogrešaka podataka nego što je to slučaj kad se zadrže pojedinačne točke podataka.

Napravi se grafički prikaz prilagođene krivulje i izmjerenih podataka te se provjeri je li krivulja ispravno prilagođena. Ovdje se posebno korisnom može pokazati analiza reziduala. Ako funkcionalni odnos koji je odabran za prilagođavanje krivulje koncentracija-odgovor dobro ne opisuje čitavu krivulju ili neki njezin bitan dio, npr. odgovor pri niskoj koncentraciji, za prilagođavanje krivulje treba odabrati neku drugu opciju – npr. nesimetričnu krivulju Weibullove funkcije umjesto simetrične. Negativne inhibicije mogu predstavljati problem npr. kod funkcije lognormalne razdiobe te zahtijevati da se upotrijebi i alternativna regresijska funkcija. Nije preporučljivo da se tim negativnim vrijednostima dodijeli vrijednost nula ili mala pozitivna vrijednost jer se time iskrivljuje razdioba pogrešaka. Ponekad je primjereno napraviti zasebno prilagođavanje određenih dijelova krivulje, npr. dijela krivulje s niskom inhibicijom, kako bi se dobila procjena vrijednosti EClowx. Iz prilagođene jednadžbe izračunaju se (‚inverznom procjenom’ C = f– 1 (Y)), karakteristične procjene točaka ECx i dokumentira barem EC50 i jedna ili dvije procjene EClow x. Iskustva s praktičnim ispitivanjima pokazuju da je test s algama dovoljno precizan da se u pravilu može dobiti dovoljno točna procjena kod inhibicije od 10 % pod uvjetom da su točke podataka dostatne – osim ako se pri niskim koncentracijama javlja stimulacija rasta kao zbunjujući faktor. Preciznost procjene EC20 često je znatno veća od EC10 jer je EC20 obično smješten u približno linearnom dijelu središnje krivulje koncentracija-odgovor. Ponekad se EC10 teško tumači zbog stimulacije rasta. Prema tomu, iako se EC10 u pravilu može dobiti s dovoljnom točnošću, preporučuje se da se uz njega uvijek navede i EC20.

Ponderi

Varijanca pokusa općenito nije stalna i obično uključuje proporcionalnu komponentu te je stoga uvijek dobro rutinski provesti ponderiranu regresiju. Kod takve analize obično se uzima da su ponderi obrnuto proporcionalni varijanci:

Wi = 1/Var(ri)

Brojni regresijski programi nude mogućnost ponderirane regresijske analize primjenom pondera koji su navedeni u tablici. Ponderi se radi jednostavnosti normiraju množenjem s n/Σ wi (n je broj točaka podataka) tako da njihov zbroj bude 1.

Normalizacija odgovora

Normalizacijom s pomoću srednjeg odgovora kontrola javljaju se neki temeljni problemi i dobiva se prilično komplicirana struktura varijance. Dijeljenjem odgovora sa srednjim odgovorom kontrola da bi se dobio postotak inhibicije uvodi se dodatna pogreška koja proizlazi iz pogreške srednje kontrolne vrijednosti. Osim kad je ta pogreška zanemarivo mala, ponderi regresije i granice pouzdanosti moraju se ispraviti za kovarijancu s kontrolom (Draper i Smith, 1981). Valja napomenuti da je važno postići visoku preciznost procjene srednje vrijednosti kontrolnih odgovora kako bi se smanjila ukupna varijanca relativnog odgovora. Ta se varijanca može opisati ovako:

(indeks i odnosi se na razinu koncentracije i, a indeks 0 na kontrole)

Yi = relativni odgovor = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

s varijancom Var(Y i) = Var ( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

i budući da je (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 i (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2

uz normalnu razdiobu podataka i ponavljanja mi i m0: Var(ri ) = σ2/mi

ukupna varijanca relativnog odgovora Yi prema tomu postaje:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

Pogreška srednje kontrolne vrijednosti obrnuto je proporcionalna kvadratnom korijenu broja prosječnih kontrolnih ponavljanja i stoga je ponekad opravdano uključiti podatke iz ranijih ispitivanja, čime se može znatno smanjiti pogreška. Druga je mogućnost da se umjesto normalizacije podataka i prilagođavanja apsolutnih odgovora, uključujući podatke o kontrolnim odgovorima, kontrolni odgovor uvede kao dodatni parametar koji se prilagođava linearnom regresijom. Ova metoda uz uobičajenu regresijsku jednadžbu s dva parametra zahtijeva prilagođavanje triju parametara, tako da je potrebno više točaka podataka nego što je to slučaj kod nelinearne regresije podataka normaliziranih uporabom unaprijed definiranog kontrolnog odgovora.

Obrnuti intervali pouzdanosti

Izračunavanje intervala pouzdanosti nelinearne regresije inverznom procjenom prilično je složeno i ne predstavlja standardnu opciju u uobičajenim statističkim računalnim programskim paketima. Približne granice pouzdanosti mogu se dobiti standardnim programima nelinearne regresije s reparametrizacijom (Bruce i Versteeg, 1992.), pri čemu se matematička jednadžba mora preraditi tako da se na mjesto parametara za procjenu uvrste željene procjene točaka, npr. EC10 i EC50. (Ako je funkcija I = f (α, β, koncentracija), f (α, β, koncentracija) zamijeni se istovjetnom funkcijom g (EC10, EC50, koncentracija) uporabom definicijskih odnosa f (α, β, EC10) = 0,1 i f (α, β, EC50) = 0,5.)

Izravniji izračun (Andersen i sur., 1998.) dobije se ako se zadrži izvorna jednadžba i upotrijebi Taylorov razvoj oko srednjih vrijednosti ri i r0.

U posljednje su vrijeme postale popularne metode samonadopunjavanja (‚boot strap’ metode). Te metode uključuju procjenu empirijske razdiobe varijance na temelju izmjerenih podataka i učestalog uzorkovanja primjenom generatora slučajnih brojeva.

IZVORI

Kooijman, S. A. L. M.; Hanstveit, A. O.; Nyholm, N. (1996.): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625 – 1632.

Draper, N. R. i Smith, H. (1981.). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R. D. i Versteeg, D. J. (1992.) A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem.11, 1485 – 1494.

Andersen, J. S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. i Nyholm, N. (1998.) Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405 – 420.

4.

Poglavlje C.11 zamjenjuje se sljedećim:

C.11.   AKTIVNI MULJ, TEST INHIBICIJE DISANJA (OKSIDACIJA UGLJIKA I AMONIJAKA)

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 209 (2010.). Ovom se ispitnom metodom opisuje način određivanja učinaka kemikalije na mikroorganizme iz aktivnog mulja (uglavnom bakterije) mjerenjem njihove stope disanja (oksidacije ugljika i/ili amonijaka) u definiranim uvjetima u prisutnosti različitih koncentracija ispitivane kemikalije. Ova se ispitna metoda temelji na testu ETAD-a (engl. Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing industry – Ekološko i toksikološko udruženje industrijskih proizvođača bojila) (1) (2), na prethodnoj smjernici TG 209 OECD-a (3) postojećem poglavlju C.11 ovog Priloga (3) i na revidiranoj normi ISO 8192 (4). Svrha je ispitivanja osigurati brzu orijentacijsku metodu za procjenu učinaka kemikalija na mikroorganizme iz aktivnog mulja tijekom biološke (aerobne) faze obrade otpadnih voda u postrojenjima za pročišćavanje. Rezultati ispitivanja mogu poslužiti i kao pokazatelj prikladnih neinhibitornih koncentracija ispitivanih kemikalija koje će se upotrebljavati u ispitivanjima biorazgradivosti (na primjer, poglavlja C.4 A – F, C.9, C.10, C12 i C.29 ovog Priloga, OECD TG302C). U tom se slučaju ispitivanje može provesti kao test probira, slično kao test za određivanje raspona ili granični test (vidjeti stavak 39.), uzimajući u obzir samo sveukupno disanje. Međutim, te podatke treba pažljivo uzimati u obzir za testove lake biorazgradivosti (poglavlja C.4 A – F i C.29 ovog Priloga) za koje je koncentracija inokuluma znatno niža od one koja se upotrebljava u ovoj ispitnoj metodi. Zapravo, odsutnost inhibicije u ovom testu disanja ne znači automatski postojanje neinhibitornih uvjeta u testu lake biorazgradivosti iz poglavlja C.4 A – F ili C.29 ovog Priloga.

2.

Iako se općenito čini da se test inhibicije disanja uspješno primjenjuje od kada je prvi put objavljen, u nekim su slučajevima zabilježeni netočni rezultati, npr. (2) (4) i (5). Tako su u nekim slučajevima krivulje disanja koje su povezane s koncentracijom dvofazne, grafički prikazi doza-odgovor iskrivljeni i vrijednosti EC50 neočekivano niske (5). Istraživanja su pokazala da se takvi rezultati dobiju kada dolazi do znatne nitrifikacije aktivnog mulja koji se upotrebljava u ispitivanju i kada ispitivana kemikalija ima veći učinak na oksidaciju amonijaka nego na opću heterotrofnu oksidaciju. Stoga se ti netočni rezultati mogu ispraviti dodatnim ispitivanjem uporabom specifičnog inhibitora nitrifikacije. Mjerenjem brzina potrošnje kisika u prisutnosti i odsutnosti takvog inhibitora, npr. N-aliltiouree (ATU), mogu se odvojeno izračunati brzina ukupne potrošnje kisika, heterotrofne potrošnje kisika i potrošnje kisika nitrifikacijom (4) (7) (8). Tako se mogu odrediti inhibitorni učinci ispitivane kemikalije na oba procesa te se na uobičajen način mogu izračunati vrijednosti EC50 za oksidaciju organskog ugljika (heterotrofnu) i za oksidaciju amonijaka (nitrifikaciju). Valja napomenuti da u nekim rijetkim slučajevima inhibitorni učinak N-aliltiouree može biti djelomično ili u cijelosti poništen zbog stvaranja kompleksa s ispitivanim kemikalijama ili dodacima mediju, npr. s ionima Cu++ (6). Ioni Cu++ ključni su za Nitrosomonas, ali su toksični pri većim koncentracijama.

3.

Nitrifikacija kod aerobne obrade otpadnih voda, kao nužan korak u postupku uklanjanja dušikovih spojeva iz otpadnih voda denitrifikacijom do plinovitih oblika, postala je prijeko potrebna, posebno u europskim državama; EU je sada odredio niže granice za koncentraciju dušika u pročišćenim otpadnim vodama koje se ispuštaju u prihvatne vode (5).

4.

U većini slučajeva dostatna je metoda koja se sastoji od procjene učinka samo na procese oksidacije organskog ugljika. Međutim, u nekim je slučajevima za tumačenje rezultata i razumijevanje učinaka potrebno ispitati učinak samo na nitrifikaciju, ili zasebno na nitrifikaciju i na oksidaciju organskog ugljika.

NAČELO ISPITNE METODE

5.

Stope disanja uzoraka aktivnog mulja hranjenog sintetičkim otpadnim vodama mjere se u zatvorenoj ćeliji s kisikovom elektrodom nakon vremena kontakta od tri sata. Ovisno o stvarnom scenariju izloženosti, može biti primjeren i dulji kontakt. Ako se ispitivana kemikalija brzo razgrađuje, npr. abiotički hidrolizom, ili je hlapljiva te joj se koncentracija ne može održati na odgovarajući način, može se primijeniti i kraće vrijeme izloženosti, npr. 30 minuta. Odgovarajućom referentnom kemikalijom potrebno je provjeriti osjetljivost svake šarže aktivnog mulja na dan izloženosti. Ispitivanje se obično primjenjuje za određivanje vrijednosti ECx (npr. EC50) ispitivane kemikalije i/ili najviše koncentracije bez vidljivog učinka (NOEC).

6.

Inhibicija potrošnje kisika mikroorganizama koji oksidiraju organski ugljik može se izraziti odvojeno od inhibicije potrošnje kisika mikroorganizama koji oksidiraju amonijak, i to mjerenjem brzine potrošnje kisika u odsutnosti i u prisutnosti N-aliltiouree, specifičnog inhibitora oksidacije amonijaka u nitrite koju u prvoj fazi provode nitrificirajuće bakterije. U tom slučaju postotak inhibicije brzine potrošnje kisika izračunava se tako da se brzina potrošnje kisika u prisutnosti ispitivane kemikalije usporedi sa srednjom brzinom potrošnje kisika odgovarajućih kontrola koje ne sadržavaju ispitivanu kemikaliju u prisutnosti i u odsutnosti specifičnog inhibitora, N-aliltiouree.

7.

Određivanjem brzine potrošnje kisika u mješavinama koje sadržavaju ispitivanu kemikaliju, vodu i sintetičku otpadnu vodu, bez aktivnog mulja, može se otkriti svaka potrošnja kisika koja proizlazi iz abiotičkih procesa.

INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI

8.

Trebali bi biti poznati identifikacijski podaci (poželjno je da to bude CAS broj), naziv (IUPAC), čistoća, topljivost u vodi, tlak para, hlapljivost i adsorpcijska svojstva ispitivane kemikalije, kako bi se omogućilo ispravno tumačenje rezultata. Obično se hlapljive kemikalije ne mogu primjereno ispitivati ako se ne poduzmu posebne mjere opreza (vidjeti stavak 21.).

PRIMJENJIVOST ISPITNE METODE

9.

Ova se ispitna metoda može primijeniti na kemikalije topljive u vodi, slabo topljive kemikalije i hlapljive kemikalije. Međutim, možda neće uvijek biti moguće dobiti vrijednosti EC50 s kemikalijama ograničene topljivosti, a valjani rezultati s hlapljivim kemikalijama mogu se dobiti jedino pod uvjetom da veliki dio (na primjer > 80 %) ispitivane kemikalije ostane u reakcijskoj smjesi na kraju razdoblja izloženosti. Potrebno je dostaviti dodatne analitičke podatke radi bolje procjene vrijednosti koncentracije ECx ako postoji ikakva nesigurnost u pogledu stabilnosti ili hlapljivosti ispitivane kemikalije.

REFERENTNE KEMIKALIJE

10.

Referentne kemikalije potrebno je periodično ispitivati kako bi se osiguralo da ispitna metoda i uvjeti ispitivanja budu pouzdani te kako bi se provjerila osjetljivost svake šarže aktiviranog mulja koje se upotrebljava kao mikrobni inokulum na dan izloženosti. Kemikalija 3,5-diklorfenol (3,5-DCP) preporučuje se kao referentna inhibitorna kemikalija jer je poznati inhibitor disanja i upotrebljava se u mnogim vrstama testova inhibicije/toksičnosti (4). Kao referentna kemikalija za inhibiciju ukupnog disanja može se upotrijebiti i bakrov (II) sulfat pentahidrat (9). Kao specifični referentni inhibitor nitrifikacije može se upotrijebiti N-metilanilin (4).

KRITERIJI VALJANOSTI I OBNOVLJIVOST

11.

Brzina potrošnje kisika slijepih proba (bez ispitivane kemikalije ili referentne kemikalije) ne bi smjela biti manja od 20 mg kisika po gramu aktivnog mulja (suha masa suspendirane krute tvari) u jednom satu. Ako je brzina manja, test je potrebno ponoviti s ispranim aktivnim muljem ili s muljem iz drugog izvora Koeficijent varijacije brzine potrošnje kisika u kontrolnim ponavljanjima ne bi smio biti veći od 30 % na kraju konačnog testa.

12.

Međunarodnim prstenastim testom koji je 2004. organizirao ISO (4) i pri kojemu je upotrijebljen aktivni mulj iz komunalnih otpadnih voda utvrđeno je da se EC50 za 3,5-DCP kreće u rasponu od 2 mg/l do 25 mg/l za ukupno disanje, od 5 mg/l do 40 mg/l za heterotrofno disanje i od 0,1 mg/l do 10 mg/l za disanje povezano s nitrifikacijom. Ako EC50 za 3,5-DCP nije u očekivanom rasponu, test treba ponoviti s aktivnim muljem iz drugog izvora. EC50 za bakrov (II) sulfat pentahidrat mora biti u rasponu od 53 do 155 mg/l za ukupno disanje (9).

OPIS ISPITNE METODE

Ispitne posude i aparatura

13.

Potrebno je upotrebljavati uobičajenu laboratorijsku opremu te sljedeće:

(a)

ispitne posude – na primjer laboratorijske čaše od 1 000 ml za držanje 500 ml reakcijske smjese (vidjeti 5 na slici 1.);

(b)

ćeliju i dodatke za mjerenje koncentracije otopljenog kisika; odgovarajuću kisikovu elektrodu; zatvorenu ćeliju u kojoj se uzorak može držati bez slobodnog prostora iznad njega i zapisivač (npr. 7, 8 i 9 na slici 1. u Dodatku 2.); druga je mogućnost uporaba boce BPK s odgovarajućim cijevnim adaptorom za pričvršćivanje kisikove elektrode za grlo boce (vidjeti sliku 2. u Dodatku 3.). Kako bi se spriječio gubitak tekućine zbog prelijevanja tijekom umetanja kisikove elektrode, preporučljivo je prvo umetnuti lijevak ili staklenu cjevčicu ili upotrijebiti posude s izvijenim rubovima. U oba je slučaja potrebno upotrijebiti magnetsku miješalicu ili neku drugu metodu miješanja, npr. samomiješajuću sondu;

(c)

magnetske miješalice i magnetske štapiće obložene inertnim materijalom, za uporabu u mjernoj komori i/ili u ispitnim posudama;

(d)

uređaj za dozračivanje: komprimirani zrak potrebno je prema potrebi propustiti kroz odgovarajući filtar kako bi se uklonila prašina i ulje te kroz boce za ispiranje koje sadržavaju vodu kako bi se zrak ovlažio. Sadržaj posuda potrebno je dozračivati s pomoću staklenih konusnih pipeta ili drugih naprava za dozračivanje koje ne izazivaju adsorpciju kemikalija. Može se upotrijebiti orbitalna tresilica s brzinom tresenja između 150 i 250 rpm, s tikvicama kapaciteta npr. 2 000 ml, kako bi se zadovoljila potreba mulja za kisikom te nadvladale poteškoće kod kemikalija koje stvaraju veliku pjenu, hlapljive su i stoga se gube ili teško dispergiraju kad se dozračuju propuhivanjem zraka. Ispitni se sustav obično sastoji od određenog broj laboratorijskih čaša koje se neprekidno dozračuju u utvrđenim vremenskim razmacima (npr. u razmacima od 10 do 15 minuta) te se potom sekvencijski analiziraju. Mogu se upotrijebiti i validirani instrumenti koji omogućuju istodobno dozračivanje i mjerenje brzine potrošnje kisika u smjesama;

(e)

pH-metar;

(f)

centrifugu, klasičnu stolnu centrifugu za mulj koja može postići 10 000 m/s2.

Reagensi

14.

Tijekom cijelog testa potrebno je upotrebljavati reagense analitičke čistoće.

Voda

15.

Potrebno je upotrebljavati destiliranu ili deioniziranu vodu koja sadržava manje od 1 mg/l DOC-a, osim ako se nalaže uporaba vode iz slavine koja ne sadržava klor.

Sintetička otpadna voda

16.

Medij se pripremi tako da sadržava sljedeće sastojke u navedenim količinama:

pepton

16 g

mesni ekstrakt (ili usporedivi biljni ekstrakt)

11 g

ureu

3 g

natrijev klorid (NaCl)

0,7 g

kalcijev klorid dihidrat (CaC12, 2H2O)

0,4 g

magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

bezvodni kalijev monohidrogenfosfat (K2HPO4)

2, 8 g

destiliranu ili deioniziranu vodu do 1l

 

17.

pH ove otopine mora biti 7,5 ± 0,5. Ako se pripremljeni medij ne upotrijebi odmah, treba ga čuvati u mraku na temperaturi od 0 °C do 4 °C najviše tjedan dana ili u uvjetima koji neće promijeniti njegov sastav. Valja napomenuti da je ova sintetička otpadna voda stostruki koncentrat vode opisane u tehničkom izvješću OECD-a ‚Predložena metoda za određivanje biorazgradivosti surfaktanata koji se upotrebljavaju u sintetičkim deterdžentima’ od 11. lipnja 1976. s dodatkom dikalijevog hidrogenfosfata.

18.

Druga je mogućnost da se sastojci medija pojedinačno steriliziraju prije skladištenja ili da se pepton i mesni ekstrakt dodaju neposredno prije ispitivanja. Prije uporabe medij je potrebno temeljito promiješati i njegov pH prema potrebi prilagoditi na pH 7,5 ± 0,5.

Ispitivana kemikalija

19.

Radna se otopina priprema za ispitivane tvari koje su lako topljive u vodi, i to samo do maksimalne topljivosti u vodi (taloženje nije prihvatljivo). Tvari koje se slabo otapaju u vodi, smjese čiji sastojci imaju različitu topljivost u vodi i adsorptivne tvari potrebno je odmjeriti izravno u ispitne posude. U tim slučajevima uporaba radnih otopina može biti valjana opcija ako se otopljene koncentracije ispitivanih kemikalija analitički određuju u ispitnim posudama (prije dodavanja aktivnog mulja). Analitičko određivanje otopljenih koncentracija ispitivanih kemikalija u ispitnim posudama ključno je i u slučaju kad se pripremaju frakcije WAF (engl. water accommodated fractions, WAF). Treba izbjegavati uporabu organskih otapala, dispergenata/emulgatora za pospješivanje topljivosti. Obrada radnih otopina i suspenzija ultrazvukom, npr. preko noći, moguća je ako postoje odgovarajući podaci koji govore o stabilnosti ispitivane kemikalije u takvim uvjetima.

20.

Ispitivana kemikalija može štetno utjecati na pH unutar ispitnog sustava. Prije postavljanja testa potrebno je provesti preliminarni pokus za određivanje pH-vrijednosti smjese kojoj je dodana ispitivana kemikalija kako bi se utvrdilo hoće li trebati prilagoditi pH prije glavnog testa i ponovno na dan glavnog testa. Vodene otopine / suspenzije ispitivane kemikalije treba prema potrebi neutralizirati prije dodavanja inokuluma. Međutim, s obzirom na to da neutralizacija može promijeniti kemijska svojstva kemikalije, mogu se provesti dodatna ispitivanja, ovisno o svrsi istraživanja, kako bi se procijenio učinak ispitivane kemikalije na mulj bez prilagođavanja pH-vrijednosti.

21.

Toksični učinci hlapljivih kemikalija, posebno u testovima u kojima se kroz sustav upuhuju mjehurići zraka, mogu biti različitog intenziteta zbog gubitka tvari tijekom razdoblja izloženosti. Kod takvih je tvari potreban oprez, što znači da je kontrolne smjese koje sadržavaju predmetnu tvar potrebno podvrgnuti analizi specifičnoj za tu tvar te prilagoditi režim dozračivanja.

Referentna kemikalija

22.

Ako se kao referentna kemikalija upotrebljava 3,5-diklofenol, treba pripremiti otopinu od 1,00 g 3,5-diklofenola u 1 000 ml vode (15). Treba primijeniti toplu vodu i/ili ultrazvuk kako bi se ubrzalo otapanje i kako bi otopina dobila konačan volumen nakon što se ohladi na sobnu temperaturu. Međutim, treba osigurati da struktura referentne kemikalija ostane nepromijenjena. Treba provjeriti pH otopine i prema potrebi ga prilagoditi s NaOH ili H2SO4 na pH 7 – 8.

23.

Ako se kao referentna kemikalija upotrebljava bakrov (II) sulfat pentahidrat, upotrebljavaju se koncentracije od 58 mg/l, 100 mg/l i 180 mg/l (faktor 1,8). Tvar je potrebno odvagati izravno u ispitne posude (29 – 50 – 90 mg za 500 ml ukupnog volumena). Potom se otapa s 234 ml vode iz slavine sterilizirane u autoklavu. Bakrov (II) sulfat pentahidrat lako se otapa. Kad započne test, dodaje se 16 ml sintetičke otpadne vode i 250 ml aktivnog mulja.

Specifični inhibitor nitrifikacije

24.

Treba pripremiti radnu otopinu N-aliltiouree (ATU) u koncentraciji od 2,32 g/l. Dodavanjem 2,5 ml te radne otopine u inkubacijsku smjesu konačnog volumena 500 ml dobije se konačna koncentracija od 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), za koju je poznato da je dovoljna (4) za izazivanje 100-postotne inhibicije nitrifikacije u nitrificirajućem aktivnom mulju koji sadržava 1,5 g/l suspendirane krute tvari.

Abiotička kontrola

25.

U nekim rijetkim uvjetima ispitivana kemikalija s jakim reducirajućim svojstvima može uzrokovati mjerljivu abiotičku potrošnju kisika. U tim su slučajevima potrebne abiotičke kontrole kako bi se mogla razlikovati abiotička potrošnja kisika ispitivane kemikalije i mikrobno disanje. Abiotičke kontrole mogu se pripremiti izostavljanjem inokuluma iz ispitne smjese. Isto tako, abiotičke kontrole bez inokuluma mogu se uključiti i pri dodatnim analitičkim mjerenjima koja se provode radi određivanja koncentracije postignute tijekom ispitne faze izloženosti, npr. kad se upotrebljavaju radne otopine kemikalija koje su slabo topljive u vodi s komponentama različite topljivosti u vodi. U nekim posebnim slučajevima možda će biti potrebno pripremiti abiotičku kontrolu sa steriliziranim inokulumom (npr. obradom u autoklavu ili dodavanjem sterilizirajućih toksikanata). Neke kemikalije mogu proizvoditi ili trošiti kisik jedino ako je površina dovoljno velika za reakciju, čak i ako im je za to obično potrebna mnogo veća temperatura ili tlak. U tom pogledu posebnu pozornost treba posvetiti peroksi-tvarima. Sterilizirani inokulum predstavlja veliku površinu.

Inokulum

26.

Za opću je uporabu aktivni mulj potrebno prikupiti na izlazu iz aeracijskog bazena ili u blizini izlaza iz aeracijskog bazena ispravnog postrojenja za pročišćavanje koje pretežno pročišćava komunalne otpadne vode. Ovisno o svrsi ispitivanja, mogu se upotrebljavati i druge odgovarajuće vrste ili izvori aktivnog mulja, npr. mulj uzgojen u laboratoriju, s odgovarajućom koncentracijom suspendirane krute tvari od 2 g/l do 4 g/l. Međutim, muljevi iz različitih postrojenja za pročišćavanje vjerojatno će imati različita svojstva i različitu osjetljivost.

27.

Mulj se može upotrijebiti onakav kakav je sakupljen, ali se grube čestice moraju ukloniti kratkim taloženjem, npr. pet do 15 minuta, i pretakanjem gornjeg sloja koji sadržava finije čestice ili prosijavanjem (npr. kroz sito veličine otvora 1 mm2 ). Druga je mogućnost da se mulj homogenizira u miješalici oko 15 sekundi ili dulje, pri čemu je potreban oprez u pogledu smičnih sila i promjene temperature do koje može doći pri dugotrajnom miješanju.

28.

Često je potrebno oprati mulj, npr. ako je stopa endogenog disanja niska. Mulj je prvo potrebno centrifugirati dovoljno dugo da nastane jasan supernatant i talog krute tvari mulja, npr. deset minuta brzinom od oko 10 000 m/s2. Tekući supernatant treba ukloniti te mulj ponovno suspendirati tresenjem u vodi iz slavine koja ne sadržava klor; vodu za pranje potom treba ponovno centrifugirati i odbaciti te je time ukloniti. Ako je potrebno, postupak centrifugiranja i pranja može se ponoviti. Treba odrediti suhu masu poznatog volumena resuspendiranog mulja te mulj koncentrirati uklanjanjem tekuće frakcije ili dodatnim razrjeđivanjem u vodi iz slavine koja ne sadržava klor da se dobije potrebna koncentracija suhe tvari mulja od 3 g/l. Aktivni mulj treba neprestano dozračivati (npr. brzinom od 2 l/min) na ispitnoj temperaturi i, ako je moguće, upotrijebiti na dan skupljanja. Ako to nije moguće, mulj je potrebno još dva dana svakodnevno hraniti sintetičkom otpadnom vodom (50 ml sintetičke otpadne vode / l l aktivnog mulja). Mulj se potom upotrebljava za ispitivanje i rezultati se prihvaćaju kao valjani pod uvjetom da se aktivnost mulja nije značajno promijenila, što se procjenjuje brzinom endogenog heterotrofnog disanja i brzinom disanja povezanog s nitrifikacijom.

29.

Poteškoće se mogu javiti ako tijekom inkubacije dođe do tolikog pjenjenja da pjena i krute tvari nošene njome izlaze iz posuda za dozračivanje. Ponekad je pjenjenje jednostavno posljedica prisutnosti sintetičke otpadne vode pa ga treba predvidjeti ako je ispitivana kemikalija površinski aktivna tvar ili sadržava površinski aktivnu tvar. Gubitak krute tvari mulja iz ispitivanih smjesa dovest će do umjetno sniženih stopa disanja koje bi se mogle pogrešno tumačiti kao učinak inhibicije. Osim toga, dozračivanje otopine površinski aktivne tvari dovodi do skupljanja površinski aktivne tvari u sloju pjene; gubitak pjene iz ispitnog sustava imat će za posljedicu smanjenje koncentracija izlaganja. Pjenjenje se može kontrolirati jednostavnim mehaničkim metodama (npr. povremenim ručnim miješanjem s pomoću staklenog štapića) ili dodavanjem sredstva protiv pjenjenja u obliku silikonske emulzije koja ne sadržava površinski aktivne tvari i/ili primjenom metode dozračivanja protresanjem u tikvici. Ako je problem povezan s prisutnošću sintetičke otpadne vode, treba promijeniti sastav otpadne vode dodavanjem reagensa protiv pjenjenja u količini od npr. 50 μl/l. Ako je ispitivana kemikalija ta koja uzrokuje pjenjenje, količinu potrebnu za smanjenje pjene treba odrediti pri maksimalnoj ispitivanoj koncentraciji i potom svaku pojedinačnu posudu za dozračivanje treba tretirati istom količinom (uključujući i one kod kojih nema pjene, npr. slijepe probe i referentne posude). Ako se upotrebljavaju sredstva protiv pjenjenja, ne smije postojati interakcija s inokulumom i/ili ispitivanom kemikalijom.

POSTUPAK ISPITIVANJA

30.

Može se odrediti inhibicija triju različitih vrsta potrošnje kisika, i to ukupne potrošnje, samo heterotrofne i one do koje dolazi zbog nitrifikacije. Obično je dovoljno izmjeriti inhibiciju ukupne potrošnje kisika. Učinke na heterotrofnu potrošnju kisika koja je povezana s oksidacijom organskog ugljika i onu koja nastaje zbog oksidacije amonijaka potrebno je odrediti ako se za određenu kemikaliju posebno zahtijeva određivanje tih dviju odvojenih krajnjih točaka ili (neobvezatno) kako bi se objasnile atipične krivulje doza-odgovor dobivene mjerenjem inhibicije ukupne potrošnje kisika.

Uvjeti ispitivanja

31.

Ispitivanje je potrebno provoditi na temperaturi od 20 ± 2 °C.

Ispitne smjese

32.

Ispitne smjese (FT kao u tablici 1.) koje sadržavaju vodu, sintetičku otpadnu vodu i ispitivanu kemikaliju treba pripremiti tako da se dobiju različite nazivne koncentracije ispitivane kemikalije (u tablici 1. vidjeti primjere volumena sastojaka). Prema potrebi, pH bi trebalo prilagoditi na 7,5 ± 0,5; smjese treba razrijediti vodom te dodati inokulum tako da se dobiju jednaki konačni volumeni u posudama i da se započne s dozračivanjem.

Referentne smjese

33.

Smjese (FR) treba pripremiti na isti način kao i ispitne smjese, s tim da se ispitivana kemikalija zamijeni referentnom kemikalijom, npr. 3,5-diklorfenolom.

Slijepe probe

34.

Kod ispitivanja u kojima se ispitne čaše pripremaju jedna poslije druge u određenim vremenskim razmacima, slijepe probe (FB) treba pripremiti na početku i na kraju razdoblja izlaganja. U ispitivanjima koja se provode s pomoću opreme koja omogućuje istodobna mjerenja različitih potrošnja kisika u svaku seriju istodobne analize treba uključiti najmanje dvije slijepe probe. Slijepe probe sadržavaju jednak volumen aktivnog mulja i sintetičkog medija, ali ne sadržavaju ispitivanu ili referentnu kemikaliju. Treba ih razrijediti vodom do istog volumena kao i ispitne i referentne smjese.

Abiotička kontrola

35.

Ako je potrebno, primjerice ako je poznato ili se sumnja da ispitivana kemikalija ima jaka reducirajuća svojstva, treba pripremiti smjesu FA za mjerenje abiotičke potrošnje kisika. Smjesa mora imati iste količine ispitivane kemikalije i sintetičke otpadne vode te isti volumen kao ispitivane smjese, ali ne smije sadržavati aktivni mulj.

Opći postupci i mjerenja

36.

Ispitne smjese, referentne smjese, slijepe probe i abiotičke kontrole inkubiraju se na ispitnoj temperaturi u uvjetima prisilnog dozračivanja (0,5 do 1 l/min) tako da se koncentracija otopljenog kisika održi iznad 60 do 70 % zasićenosti te da se pahulje mulja zadrže u suspenziji. Da bi se pahulje mulja zadržale u suspenziji, potrebno je isto tako promiješati kulture. Smatra se da inkubacija započinje u trenutku kada inokulum od aktivnog mulja dođe u dodir s ostalim sastojcima konačne smjese. Na kraju inkubacije, to jest nakon vremena izloženosti koje se obično utvrđuje na tri sata, uzimaju se uzorci kako bi se izmjerila brzina smanjenja koncentracije otopljenog kisika u ćeliji predviđenoj za tu svrhu (slika 2. u Dodatku 3.) ili u potpuno napunjenoj boci BPK. Način započinjanja inkubacija ovisi i o kapacitetu opreme koja se upotrebljava za mjerenje stope potrošnje kisika. Na primjer, ako oprema uključuje samo jednu sondu za mjerenje kisika, mjerenja se provode pojedinačno. U tom slučaju različite smjese potrebne za ispitivanje treba pripremiti sa sintetičkom otpadnom vodom bez dodavanja inokuluma te potom u svaku posudu serije treba dodati potrebnu količinu mulja. Inkubacije treba započinjati jednu za drugom, u prikladnim vremenskim razmacima od npr. 10 do 15 minuta. Alternativno, sustav mjerenja može se sastojati od više sondi koje omogućuju više istodobnih mjerenja; u tom se slučaju inokulum može istodobno dodati u odgovarajuće skupine posuda.

37.

Nazivna koncentracija aktivnog mulja u svim ispitnim smjesama, referentnim smjesama i smjesama za slijepu probu (ali ne za abiotičku kontrolu) iznosi 1,5 g suspendirane krute tvari po litri. Potrošnju kisika treba izmjeriti nakon tri sata izloženosti. Prema potrebi treba provesti dodatna mjerenja nakon 30-minutne izloženosti, i to kako je opisano u stavku 5.

Nitrifikacijski potencijal mulja

38.

Da bi se odredilo dolazi li do nitrifikacije mulja te, ako dolazi, kojom brzinom, treba pripremiti smjese (FB) kao kod slijepe probe i dodatne ‚kontrolne’ smjese (FN) koje sadržavaju i N-aliltioureu u količini od 11,6 mg/l. Smjese treba dozračiti i inkubirati na 20° ± 2 °C tri sata. Potom treba izmjeriti brzine potrošnje kisika te izračunati brzinu potrošnje kisika zbog nitrifikacije.

Plan ispitivanja

Ispitivanje za određivanje raspona

39.

Kada je to potrebno, provodi se preliminarno ispitivanje kako bi se procijenio raspon koncentracija ispitivane kemikalije koje će se upotrebljavati u glavnom ispitivanju za određivanje inhibicije potrošnje kisika. Alternativno, odsutnost inhibicije potrošnje kisika ispitivane kemikalije u preliminarnom ispitivanju može ukazati na to da nije potrebno provoditi glavno ispitivanje, ali moraju biti uključena tri ponavljanja s najvećom ispitivanom koncentracijom iz preliminarnog ispitivanja (obično 1 000 mg/l, ali ta vrijednost ovisi o zahtijevanim podacima).

Tablica 1.

Primjeri smjesa za preliminarno ispitivanje

Reagens

Izvorna koncentracija

Radna otopina ispitivane kemikalije

10 g/l

Radna otopina sintetičkog medija

Vidjeti stavak 16.

Radna suspenzija aktivnog mulja

3 g suspendirane krute tvari po litri

Komponente smjese

Doziranje u ispitne posude (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Radna otopina ispitivane kemikalije (ml)

(stavci od 19. do 21.)

0,5

5

50

0

50

Radna otopina sintetičke otpadne vode (ml)

(stavak 16.)

16

16

16

16

16

Suspenzija aktivnog mulja (ml)

(stavci od 26. do 29.)

250

250

250

250

0

Voda

(stavak 15.)

233,5

229

184

234

434

Ukupni volumen smjese (ml)

500

500

500

500

500

Koncentracija u smjesi

 

 

 

 

 

Ispitna suspenzija (mg/l)

Aktivni mulj

10

10

1 000

0

1 000

(suspendirana kruta tvar (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Ispitivanje je potrebno provesti s najmanje tri koncentracije ispitivane kemikalije, na primjer, 10 mg/l, 100 mg/l i 1 000 mg/l sa slijepom probom i, ako je potrebno, s najmanje tri abiotičke kontrole s najvećim koncentracijama ispitivane kemikalije (kao primjer vidjeti tablicu 1.). U idealnom slučaju najniža koncentracija ne smije utjecati na potrošnju kisika. Treba izračunati brzine potrošnje kisika i brzinu nitrifikacije, prema potrebi; potom se izračunava postotak inhibicije. Ovisno o svrsi ispitivanja, moguće je jednostavno odrediti toksičnost granične koncentracije, npr. 1 000 mg/l. Ako se pri toj koncentraciji ne javlja statistički značajan učinak, nije potrebno daljnje ispitivanje s višim ili nižim koncentracijama. Valja napomenuti da tvari koje se slabo otapaju u vodi, smjese čiji sastojci imaju različitu topljivost u vodi i adsorptivne tvari treba odvagati izravno u ispitne posude. U tom slučaju volumen rezerviran za radnu otopinu ispitne tvari treba zamijeniti vodom za razrjeđivanje.

Glavno ispitivanje

Inhibicija ukupne potrošnje kisika

41.

Za ispitivanje treba upotrijebiti raspon koncentracija određen preliminarnim ispitivanjem. Da bi se dobili NOEC i ECx (npr. EC50), u većini slučajeva preporučuje se šest kontrola i pet ispitnih koncentracija raspoređenih u geometrijskom nizu, s pet ponavljanja. Abiotičku kontrolu nije potrebno ponavljati ako u preliminarnom testu nije bilo potrošnje kisika; međutim, u slučaju značajne potrošnje kisika abiotičke kontrole treba uključiti za svaku koncentraciju ispitivane kemikalije. Osjetljivost mulja treba provjeriti uporabom referentne kemikalije, 3,5-diklorfenola. Osjetljivost mulja treba provjeriti za svaki ispitni niz jer je poznato da osjetljivost nije postojana. U svakom slučaju, uzorci se uzimaju iz ispitnih posuda nakon tri sata, i prema potrebi nakon dodatnih 30 minuta, kako bi se izmjerila brzina potrošnje kisika u ćeliji s kisikovom elektrodom. Iz prikupljenih podataka izračunavaju se specifične stope disanja kontrolnih i ispitnih smjesa; potom se prema jednadžbi 7. navedenoj u nastavku izračunava postotak inhibicije.

Razlikovanje inhibicije heterotrofnog disanja od nitrifikacije

42.

Uporaba specifičnog inhibitora nitrifikacije, ATU-a, omogućuje izravnu procjenu inhibitornih učinaka ispitivanih kemikalija na heterotrofnu oksidaciju te se oduzimanjem brzine potrošnje kisika u prisutnosti ATU-a od brzine ukupne potrošnje (kad nije prisutan ATU) mogu izračunati učinci na stopu nitrifikacije. Treba pripremiti dva seta reakcijskih smjesa prema planovima ispitivanja za ECx ili NOEC opisanima u stavku 41., s tim da u svaku smjesu jednog seta treba k tome dodati ATU u konačnoj koncentraciji od 11,6 mg/l, za koju je dokazano da u potpunosti inhibira nitrifikaciju u mulju koji sadržava koncentracije suspendirane krute tvari do 3 000 mg/l (4). Brzinu potrošnje kisika treba izmjeriti nakon razdoblja izloženosti; te izravne vrijednosti predstavljaju samo heterotrofno disanje, a razlika između tih vrijednosti i odgovarajuće stope ukupnog disanja predstavlja nitrifikaciju. Potom se izračunavaju različiti stupnjevi inhibicije.

Mjerenja

43.

Nakon razdoblja izloženosti uzorak iz prve posude za dozračivanje treba prenijeti u ćeliju opremljenu kisikovom elektrodom (slika 1. u Dodatku 2.) i treba odmah izmjeriti koncentraciju otopljenog kisika. Ako je na raspolaganju sustav s više elektroda, mjerenja se mogu izvršiti istodobno. Ključno je da miješanje (s pomoću obloženog magneta) bude istom brzinom kao što je ona koja je primijenjena pri kalibraciji elektrode, kako bi se osiguralo da sonda reagira s najmanjim mogućim zakašnjenjem na promjene koncentracije kisika te kako bi se omogućila redovita i ponovljiva mjerenja kisika u mjernoj posudi. Obično je prikladan sustav kisikove elektrode koji se sastoji od samomiješajuće sonde. Ćeliju je između mjerenja potrebno isprati vodom. Druga je mogućnost da se uzorak stavi u bocu BPK (slika 2. u Dodatku 3.) postavljenu na magnetsku miješalicu. Potom se u grlo boce umetne kisikova sonda s cijevnim adapterom te se pokrene magnetska miješalica. U oba slučaja koncentraciju otopljenog kisika treba neprestano mjeriti i bilježiti u razdoblju od obično pet do deset minuta ili dok koncentracija kisika ne padne ispod 2 mg/l. Elektroda se potom uklanja i smjesa se vraća u posudu za dozračivanje, u kojoj se nastavlja s dozračivanjem i miješanjem ako je potrebno mjerenje nakon duljih razdoblja izloženosti.

Provjera koncentracije ispitivane kemikalije

44.

Za neke je svrhe ponekad potrebno izmjeriti koncentraciju ispitivane kemikalije u ispitnim posudama. Valja napomenuti da ako se upotrebljavaju radne otopine:

tvari koje se slabo otapaju u vodi,

smjesa čiji sastojci imaju različitu topljivost u vodi ili

tvari koje se dobro otapaju u vodi, ali je koncentraciju radne otopine blizu maksimalne topljivosti u vodi,

otopljena frakcija nije poznata te je nepoznata i stvarna koncentracija ispitivane kemikalije prenesene u ispitne posude. Kako bi se odredila svojstva izloženosti, potrebno je analitički procijeniti koncentracije ispitivane kemikalije u ispitnim posudama. Radi jednostavnosti, analitičku procjenu treba izvršiti prije dodavanja inokuluma. Zbog činjenice da se u ispitne posude prenose samo otopljene frakcije, izmjerene koncentracije mogu biti vrlo niske.

45.

Da bi se izbjegle dugotrajne i skupe analize, preporučuje se jednostavno odmjeriti ispitivanu kemikaliju izravno u ispitne posude te se u kasnijim izračunima oslanjati na ponderiranu početnu nazivnu koncentraciju. Nije potrebno razlikovanje između otopljenih, neotopljenih i adsorbiranih frakcija, jer se u stvarnim uvjetima sve te frakcije slično javljaju u postrojenju za pročišćavanje otpadnih voda i mogu varirati ovisno o sastavu otpadne vode. Cilj je ove ispitne metode realno procijeniti neinhibitornu koncentraciju i nije prikladna za detaljno istraživanje o tome koje frakcije pridonose inhibiciji organizama u aktivnom mulju. Naposljetku, i tvari koje imaju adsorpcijska svojstva treba odmjeriti izravno u ispitne posude; posude moraju biti silanizirane kako bi se gubitak adsorpcijom sveo na najmanju moguću mjeru.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Izračun brzina potrošnje kisika

46.

Brzinu potrošnje kisika treba izračunati iz srednje vrijednosti izmjerenih veličina, npr. iz linearnog dijela grafa koji prikazuje koncentraciju kisika u odnosu na vrijeme, pri čemu se izračun ograničava na koncentracije kisika između 2,0 mg/l i 7,0 mg/l, jer više i niže koncentracije same po sebi mogu utjecati na brzinu potrošnje. Ponekad je neizbježno i potrebno upotrijebiti vrijednosti koncentracije koje su ispod ili iznad navedenih granica, na primjer kada je disanje jako suprimirano i stoga vrlo sporo ili ako određeni aktivni mulj diše vrlo brzo. To je prihvatljivo pod uvjetom da su predmetni dijelovi grafa potrošnje linearni i da se njihovi gradijenti ne mijenjanju dok prolaze kroz granične vrijednosti od 2,0 mg/l ili 7,0 mg/l O2. Svi nelinearni dijelovi grafa ukazuju na to da se sustav mjerenja stabilizira ili da se brzina potrošnje mijenja te ih se ne smije upotrijebiti za izračun brzina potrošnje. Brzinu potrošnje kisika treba izraziti u miligramima po litri po satu (mg/lh) ili miligramima po gramu suhog mulja po satu (mg/gh). Brzina potrošnje kisika, R, u mg/lh, može se izračunati ili interpolirati iz linearnog dijela zabilježenog grafa smanjenja kisika prema jednadžbi (1):

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1),

gdje je:

Q1

=

koncentracija kisika na početku odabranog linearnog dijela grafa (mg/l);

Q2

=

koncentracija kisika na kraju odabranog linearnog dijela grafa (mg/l);

Δt

=

vremenski interval između tih dvaju mjerenja (min).

47.

Specifična stopa disanja (Rs) iskazuje se kao količina kisika potrošenog po gramu suhe mase mulja po satu (mg/gh) prema jednadžbi (2):

Rs = R/SS

(2),

gdje je SS koncentracija suspendirane krute tvari u ispitnoj smjesi (g/l).

48.

Mogu se kombinirati sljedeći pokazatelji za R:

S

specifična stopa,

T

stopa ukupnog disanja,

N

stopa disanja povezanog s nitrifikacijom,

H

stopa heterotrofnog disanja,

A

stopa povezana s abiotičkim procesima,

B

stopa na temelju slijepih proba (srednja).

Izračun brzine potrošnje kisika zbog nitrifikacije

49.

Odnos između ukupnog disanja (RT), disanja povezanog s nitrifikacijom (RN) i heterotrofnog disanja (RH) prikazan je jednadžbom (3):

RN = RT – RH

(3),

gdje je:

RN

=

brzina potrošnje kisika zbog nitrifikacije (mg/lh);

RT

=

izmjerena brzina potrošnje kisika kod slijepe probe (bez ATU-a; FB) (mg/lh);

RH

=

izmjerena brzina potrošnje kisika kod slijepe probe kojoj je dodan ATU (FN) (mg/lh).

50.

Navedeni odnos vrijedi za vrijednosti slijepih proba (RNB, RTB, RHB), abiotičke kontrole (RNA, RTA, RHA) i pokuse s ispitivanim kemikalijama (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Specifične stope disanja izračunavaju se iz:

RNS = RN/SS

(4),

RTS = RT/SS

(5),

RHS = RH/SS

(6).

51.

Ako je u preliminarnom testu RN značajan (npr. < 5 % RT-a slijepih proba), može se pretpostaviti da je heterotrofna potrošnja kisika jednaka ukupnoj potrošnji i da nema nitrifikacije. Ako je ispitivanjima potrebno razmotriti učinke na heterotrofne i nitrificirajuće mikroorganizme, potreban je drugi izvor aktivnog mulja. Glavno se ispitivanje provodi ako postoje dokazi o supresiji brzina potrošnje kisika ovisno o koncentracijama ispitivane kemikalije.

Izračun postotka inhibicije

52.

Postotak inhibicije, IT, ukupne potrošnje kisika pri svakoj koncentraciji ispitivane kemikalije prikazan je jednadžbom (7):

IT = [1 – (RT – RTA) / RTB] × 100 %

(7).

53.

Isto tako, postotak inhibicije heterotrofne potrošnje kisika, IH, pri svakoj koncentraciji ispitivane kemikalije prikazan je jednadžbom (8):

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] / 100 %

(8).

54.

Konačno, inhibicija potrošnje kisika zbog nitrifikacije, IN, pri svakoj koncentraciji prikazana je jednadžbom (9):

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9).

55.

Postotak inhibicije potrošnje kisika potrebno je grafički prikazati u odnosu prema logaritmu koncentracije ispitivane kemikalije (krivulja inhibicije, vidjeti sliku 3. u Dodatku 4.). Krivulje inhibicije grafički se prikazuju za svako razdoblje dozračivanja od tri sata ili dodatno nakon 30 minuta. Koncentraciju ispitivane kemikalije koja inhibira potrošnju kisika za 50 % (EC50) treba izračunati ili interpolirati iz grafa. Ako su na raspolaganju odgovarajući podaci, mogu se izračunati ili interpolirati 95-postotne granice pouzdanosti za EC50, nagib krivulje te odgovarajuće vrijednosti koje označuju početak inhibicije (na primjer EC10 ili EC20) i kraj inhibicije (na primjer EC80 ili EC90).

56.

Valja napomenuti da zbog često uočavane varijabilnosti rezultata u mnogim slučajevima može biti dovoljno iskazati rezultate prema redu veličine, na primjer:

EC50

< 1 mg/l,

EC50

1 mg/l do 10 mg/l,

EC50

10 mg/l do 100 mg/l,

EC50

> 100 mg/l.

Tumačenje rezultata

ECx

57.

Vrijednosti ECx te njihove niže i više 95-postotne granice pouzdanosti za parametar izračunavaju se odgovarajućim statističkim metodama (npr. probit-analizom, logističkom ili Weibullovom funkcijom, modificiranom Spearman-Karberovom metodom ili jednostavnom interpolacijom (11)). ECx se dobiva tako da se u dobivenu jednadžbu uvrsti vrijednost koja odgovara x % kontrolne srednje vrijednosti. Da bi se izračunao EC50 ili bilo koji drugi ECx, srednje vrijednosti izračunane za svaki tretman (x) potrebno je podvrgnuti regresijskoj analizi.

Procjena NOEC-a

58.

Ako se za određivanje NOEC-a namjerava primijeniti statistička analiza, potrebni su statistički podaci za svaku posudu (pojedinačne posude smatraju se ponavljanjima). Treba primijeniti odgovarajuće statističke metode u skladu s OECD-ovim dokumentom ‚Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application’ (11). Općenito, štetni učinci ispitivane kemikalije u usporedbi s kontrolom istražuju se jednosmjernim testiranjem hipoteza za p ≤ 0,05.

Izvješće o ispitivanju

59.

Izvješće o ispitivanju mora obuhvaćati sljedeće podatke:

 

Ispitivana kemikalija

uobičajeni naziv, kemijski naziv, CAS broj, čistoća,

fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije (npr. log Kow, topljivost u vodi, tlak pare, Henryjeva konstanta (H) i moguće informacije o sudbini ispitivane kemikalije, npr. adsorpciji na aktivni mulj);

 

Sustav ispitivanja

izvor, uvjeti rada postrojenja za pročišćavanje otpadnih voda i ulazna voda koju prima, koncentracija, prethodna obrada i održavanje aktivnog mulja;

 

Uvjeti ispitivanja

ispitna temperatura, pH tijekom ispitivanja i trajanje faze (faza) ispitivanja;

 

Rezultati

specifična potrošnja kisika kod kontrola (mg O2/(g mulja × h),

svi izmjereni podaci, krivulja (krivulje) inhibicije i metoda izračuna EC50,

EC50 i, po mogućnosti, 95-postotne granice pouzdanosti, po mogućnosti EC20, EC80; po mogućnosti NOEC i primijenjene statističke metode ako se EC50 ne može odrediti,

rezultati za ukupnu inhibiciju i, ako je primjereno, za heterotrofnu inhibiciju te inhibiciju povezanu s nitrifikacijom,

abiotička potrošnja kisika u fizikalno-kemijskoj kontroli (ako je primijenjena),

naziv referentne kemikalije i rezultati dobiveni s tom kemikalijom,

sva zapažanja i odstupanja od standardnog postupka koja su mogla utjecati na rezultat.

LITERATURA

(1)

Brown, D., Hitz, H. R. i Schäfer, L. (1981.) The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245 – 261.

(2)

King, E. F. i Painter H. A. (1986.). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27 – 39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality – Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003.) Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H. A, Jones, K. (1963.) The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471 – 483.

(7)

Painter, H. A. (1986.) Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976.) Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. i Noack, U. (2004.) The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556 – 1557.

(10)

ISO (1995.) ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006.) Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Pariz.

Dodatak 1.

Definicije

Za potrebe ove ispitne metode primjenjuju se sljedeće definicije.

 

Kemikalija znači tvar ili smjesa.

 

ECx (koncentracija s učinkom od x %) je koncentracija koja izaziva x-postotni učinak na ispitne organizme u određenom razdoblju izloženosti, u usporedbi s kontrolom. Na primjer, EC50 je koncentracija za koju se procjenjuje da proizvodi učinak na ispitivani parametar kod 50 % izložene populacije u definiranom razdoblju izloženosti.

 

NOEC (najviša koncentracija bez vidljivog učinka) koncentracija je ispitivane kemikalije kod koje nije uočen nikakav učinak. Kod ovog ispitivanja koncentracija koja odgovara NOEC-u nema statistički značajan učinak (p < 0,05) unutar određenog razdoblja izloženosti u usporedbi s kontrolom.

 

Ispitivana kemikalija znači sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom metodom.

Dodatak 2.

Slika 1.   Primjeri naprave za mjerenje

Image

Legenda

1

aktivni mulj

2

sintetički medij

3

ispitivana kemikalija

4

zrak

5

posuda za miješanje

6

magnetska miješalica

7

ćelija za mjerenje kisika

8

kisikova elektroda

9

instrument za mjerenje kisika

10

zapisivač

Dodatak 3.

Slika 2.   Primjer naprave za mjerenje s bocom BPK

Image

Legenda

1

ispitna posuda

2

kisikova elektroda

3

instrument za mjerenje kisika

Dodatak 4.

Slika 3.   Primjer krivulja inhibicije

Image

Legenda

X

koncentracija 3,5-diklofenola (mg/l)

Y

inhibicija ( %)

Image

inhibicija heterotrofnog disanja kod nitrificirajućeg mulja

Image

inhibicija nitrifikacije kod nitrificirajućeg mulja

5.

Poglavlje C.26. zamjenjuje se sljedećim:

C.26.   TEST INHIBICIJE RASTA VRSTA LEMNA

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 221 (2006.). Ova je ispitna metoda namijenjena ocjenjivanju toksičnosti kemikalija za slatkovodne biljke roda Lemna (vodena leća). Temelji se na postojećim metodama (1) (2) (3) (4) (5) (6), ali uključuje neke izmjene tih metoda u svjetlu posljednjih istraživanja i savjetovanja o nizu ključnih pitanja. Ova je ispitna metoda validirana međunarodnim prstenastim testom (7).

2.

U ovoj su ispitnoj metodi opisana toksikološka ispitivanja s vrstama Lemna gibba i Lemna minor koje su do sada već znatno proučavane i predmet su navedenih normi. Taksonomija Lemna spp. složena je zbog velikog broja različitih fenotipa. Iako se u odgovoru na toksično djelovanje kod vrsta Lemna može javiti određena genetska varijabilnost, trenutačno nema dovoljno podataka o tom izvoru varijabilnosti da bi se mogao preporučiti neki određeni klon za ovu ispitnu metodu. Valja napomenuti da se ispitivanje ne provodi aksenično, ali se u pojedinim fazama ispitnog postupka poduzimaju koraci kako bi se onečišćenje drugim organizmima svelo na najmanju moguću mjeru.

3.

Opisani su detalji ispitivanja s obnavljanjem (polustatičko i protočno) i bez obnavljanja (statičko) ispitne otopine. Ovisno o ciljevima ispitivanja i regulatornim zahtjevima, preporučuje se da se ispita mogućnost primjene polustatičkih i protočnih metoda, npr. kod kemikalija koje se brzo gube iz otopine zbog isparavanja, fotokemijske razgradnje, taloženja ili biorazgradnje. Dodatne smjernice mogu se pronaći u literaturi (8).

4.

Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1.

NAČELO ISPITIVANJA

5.

Eksponencijalno rastuće biljne kulture roda Lemna puste se da rastu kao monokulture u različitim koncentracijama ispitivane kemikalije u razdoblju od sedam dana. Cilj je ispitivanja kvantificirati učinke kemikalije na vegetativni rast tijekom toga razdoblja ocjenjivanjem odabranih mjernih varijabli. Broj listova primarna je mjerna varijabla. Osim toga, mjeri se barem još jedna mjerna varijabla (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa), budući da neke kemikalije znatno više utječu na neke druge mjerne varijable nego na broj listova. Da bi se kvantificirali učinci kemikalije, rast u ispitnim otopinama uspoređuje se s rastom u kontrolama i određuje koncentracija koja izaziva određeni postotak (x %) inhibicije rasta (npr. 50 %), koja se izražava kao ECx (npr. EC50).

6.

Krajnja je točka ispitivanja inhibicija rasta koja se izražava kao logaritamsko povećanje mjerne varijable (prosječna specifična brzina rasta) u razdoblju izlaganja. Iz prosječnih specifičnih brzina rasta zabilježenih u nizu ispitnih otopina određuje se koncentracija koja izaziva određeni postotak (x %) inhibicije brzine rasta (npr. 50 %) koja se izražava kao ErCx (npr. ErC50).

7.

U ovoj se ispitnoj metodi upotrebljava i prirast kao dodatna varijabla odgovora koja je potrebna da bi se ispunili određeni regulatorni zahtjevi u nekim državama. Definiran je kao razlika između mjernih varijabli na kraju razdoblja izlaganja i mjernih varijabli na početku razdoblja izlaganja. Iz prirasta zabilježenog u nizu ispitnih otopina izračunava se koncentracija koja izaziva određeni postotak (x %) inhibicije prirasta (npr. 50 %), koja se izražava kao EyCx (npr. EyC50).

8.

Osim toga, može se statistički odrediti najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC) i najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC).

INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI

9.

Mora biti raspoloživa analitička metoda odgovarajuće osjetljivosti za kvantifikaciju kemikalije u ispitnom mediju.

10.

Za određivanje ispitnih uvjeta korisno je imati informacije o ispitivanoj kemikaliji kao što su strukturna formula, čistoća, topljivost u vodi, stabilnost u vodi i na svjetlosti, pKa, Kow, tlak pare i biorazgradivost. Topljivost u vodi i tlak pare mogu se upotrijebiti za izračunavanje konstante Henryjeva zakona, iz koje se može zaključiti treba li u razdoblju ispitivanja očekivati značajne gubitke ispitivane kemikalije. Na taj se način prema potrebi mogu poduzeti određene mjere za nadzor tih gubitaka. Ako su informacije o topljivosti i stabilnosti ispitivane kemikalije nesigurne, preporučuje se da se topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije ocijene u uvjetima ispitivanja, tj. u uzgojnom mediju te pri temperaturi i režimu rasvjete koji će se upotrebljavati tijekom ispitivanja.

11.

U slučajevima kad je nadziranje pH-vrijednosti ispitnog medija posebno važno, npr. kod ispitivanja metala ili kemikalija koje su hidrolitički nestabilne, preporučuje se dodavanje pufera u uzgojni medij (vidjeti stavak 21.). Dodatne smjernice za ispitivanje kemikalija čija fizikalno-kemijska svojstva otežavaju ispitivanje nalaze se u literaturi pod (8).

VALJANOST ISPITIVANJA

12.

Da bi ispitivanje bilo valjano, vrijeme potrebno da se broj listova u kontrolnom uzorku udvostruči mora biti kraće od 2,5 dana (60 sati), što približno odgovara sedmerostrukom povećanju u sedam dana i prosječnoj specifičnoj brzini rasta od 0,275 d– 1. Uz medije i ispitne uvjete opisane u metodi taj se kriterij može zadovoljiti primjenom statičkog režima ispitivanja (5). Također se očekuje da će se taj kriterij moći ispuniti u polustatičkim i protočnim uvjetima ispitivanja. Izračunavanje vremena potrebnog za udvostručenje prikazano je u stavku 49.

REFERENTNA KEMIKALIJA

13.

Jedna ili više referentnih kemikalija, kao što je 3,5-diklorfenol koji je upotrijebljen u međulaboratorijskom ispitivanju (7), mogu se ispitati radi provjere postupka ispitivanja. Preporučljivo je da se referentna kemikalija ispita barem dvaput godišnje ili, ako se ispitivanje provodi rjeđe, istovremeno s određivanjem toksičnosti ispitivane kemikalije.

OPIS METODE

Aparatura

14.

Sva oprema koja dolazi u dodir s ispitnim medijima mora biti izrađena od stakla ili drugog kemijski inertnog materijala. Staklena oprema koja se upotrebljava za uzgoj i ispitivanje mora biti sterilna i potrebno ju je očistiti od kemijskih onečišćivača koji bi mogli dospjeti u ispitni medij. Ispitne posude moraju biti dovoljno široke da listovi različitih kolonija u kontrolnim posudama mogu rasti tako da na kraju ispitivanja ne dođe do preklapanja među listovima. Ne smeta ako korijenje dodiruje dno ispitne posude, ali preporučuje se da sve posude imaju dubinu od najmanje 20 mm i volumen od najmanje 100 ml. Vrsta ispitnih posuda nije važna sve dok su ti zahtjevi ispunjeni. Prikladnima su se pokazale staklene čaše, zdjelice za kristalizaciju i staklene Petrijeve zdjelice odgovarajućih dimenzija. Ispitne posude treba prekriti kako bi se smanjilo isparavanje i slučajna onečišćenja, ali pritom treba omogućiti nužan protok zraka. Ispitne posude, a posebno poklopci, ne smiju stvarati sjenu niti izazivati promjene u spektralnim svojstvima svjetlosti.

15.

Kulture i ispitne posude ne smiju se držati zajedno. To je najlakše postići ako se upotrijebe odvojene uzgojne komore, inkubatori ili prostorije. Osvjetljenje i temperaturu treba nadzirati i održavati na stalnoj razini (vidjeti stavke 35. i 36.).

Ispitni organizam

16.

Organizmi koji se upotrebljavaju za ovo ispitivanje su Lemna gibba ili Lemna minor. Kratak opis vrsta vodenih leća koje se upotrebljavaju u toksikološkim ispitivanjima nalazi se u Dodatku 2. Biljni se materijal može nabaviti u zbirkama kultura, od drugog laboratorija ili se može prikupiti na terenu. Ako se materijal prikuplja na terenu, biljke treba držati u kulturi u mediju kakav će se upotrebljavati u ispitivanju najmanje osam tjedana prije uporabe. Mjesta na kojima se prikupljaju polazne kulture ne smiju biti onečišćena očitim izvorima onečišćenja. Ako se kulture nabavljaju od drugog laboratorija ili iz zbirke kultura, treba ih držati u sličnim uvjetima najmanje tri tjedna. Izvor biljnog materijala te vrstu i klon (ako je poznat) koji se upotrebljavaju kod ispitivanja treba svaki puta dokumentirati.

17.

Primjenjuju se monokulture kod kojih nisu prisutna vidljiva onečišćenja drugim organizmima kao što su alge i praživotinje. Zdrave biljke L. minor sastoje se od kolonija koje sadržavaju između dva i pet listova, dok zdrave kolonije L. gibba mogu imati i do sedam listova.

18.

Biljke treba pažljivo odabrati jer kakvoća i jednolikost biljaka koje se upotrebljavaju u ispitivanju imaju značajan utjecaj na rezultate ispitivanja. Treba upotrijebiti mlade brzorastuće biljke bez vidljivih oštećenja i promjena boje (kloroza). Osobina je kvalitetnih kultura visok udio kolonija koje sadržavaju najmanje dva lista. Velik broj kolonija s jednim listom ukazuje na okolišni stres, npr. ograničene nutrijente, pa se biljni materijal iz takvih kultura ne bi smio upotrebljavati za ispitivanja.

Uzgoj kulture

19.

Da bi se smanjili zahtjevi održavanja (npr. kad određeno vrijeme nisu planirana ispitivanja s vodenom lećom), kulture se mogu držati pod smanjenim osvjetljenjem i na nižoj temperaturi (od 4 do 10 °C). Informacije o uzgoju nalaze se u Dodatku 3. U slučaju očitih znakova onečišćenja algama i drugim organizmima, poduzorak listova Lemna treba podvrgnuti površinskoj sterilizaciji i prenijeti ga u svježi medij (vidjeti Dodatak 3.). U tom slučaju ostatak onečišćene kulture treba baciti.

20.

Najmanje sedam dana prije ispitivanja dovoljno kolonija treba aseptički prenijeti u svježi sterilni medij i uzgajati sedam do deset dana u uvjetima ispitivanja.

Ispitni medij

21.

Za vrste Lemna minor i Lemna gibba preporučuju se različiti mediji, kako je opisano u nastavku. Treba dobro razmisliti prije nego što se u ispitni medij doda pH pufer (MOPS (4-morfolinpropan-sulfonska kiselina, CAS br. 1132-61-2) u medij za L. minor i NaHCO3 u medij za L. gibba) ako se sumnja da bi pufer mogao reagirati s ispitivanom kemikalijom i utjecati na očitovanje njezinih toksičnih svojstava. Prihvatljiv je i medij Steinberg (9) pod uvjetom da su zadovoljeni kriteriji valjanosti.

22.

Za uzgoj kulture i ispitivanje s L. minor preporučuje se izmijenjena varijanta uzgojnog medija Lemna prema švedskoj normi (SIS). Sastav tog medija naveden je u Dodatku 4.

23.

Uzgojni medij 20X – AAP, kako je opisan u Dodatku 4., preporučuje se za uzgoj kulture i ispitivanja s L. gibba.

24.

Medij Steinberg koji je opisan u Dodatku 4. također je prikladan za L. minor, ali se može upotrijebiti i za L. gibba pod uvjetom da su zadovoljeni kriteriji valjanosti.

Ispitne otopine

25.

Ispitne se otopine obično pripremaju razrjeđivanjem radne otopine. Radne otopine ispitivane kemikalije u pravilu se pripremaju otapanjem kemikalije u uzgojnom mediju.

26.

Najviša ispitna koncentracija ispitivane kemikalije u pravilu ne smije biti viša od topljivosti kemikalije u vodi u ispitnim uvjetima. Ipak, valja napomenuti da Lemna spp. plutaju na površini i mogu biti izložene kemikalijama koje se skupljaju u sučelju voda-zrak (npr. tvari koje su slabo topljive u vodi, hidrofobne kemikalije ili površinski aktivne kemikalije). U tim su uvjetima organizmi izloženi materijalu koji se nalazi izvan otopine i ispitne koncentracije mogu, ovisno o svojstvima ispitivane kemikalije, biti više od topljivosti u vodi. Kod ispitivanih kemikalija niske topljivosti u vodi ponekad je potrebno pripremiti koncentriranu radnu otopinu ili disperziju kemikalije upotrebljavajući organsko otapalo ili dispergent kako bi se olakšalo dodavanje točnih količina ispitivane kemikalije u ispitni medij i ubrzalo njezino dispergiranje i otapanje. U svakom slučaju, treba nastojati izbjeći primjenu takvih materijala kad god je to moguće. Upotrijebljena pomoćna otapala odnosno dispergenti ne bi smjeli imati fitotoksično djelovanje. Primjeri su otapala u širokoj uporabi koja nemaju fitotoksično djelovanje u koncentracijama do 100 μl/l aceton i dimetilformamid. Ako se upotrebljava otapalo ili dispergent, treba navesti njegovu konačnu koncentraciju, koju u svakom slučaju treba svesti na najmanju moguću mjeru (≤ 100 μl/l) i voditi računa o tome da sve obrade i kontrole sadrže istu koncentraciju otapala odnosno dispergenta.. Dodatne smjernice o uporabi dispergenata navedene su u literaturi pod (8).

Ispitne i kontrolne skupine

27.

Prethodna saznanja o toksičnosti ispitivane kemikalije za vodenu leću, npr. na temelju ispitivanja za određivanje raspona, mogu pomoći u odabiru prikladnih ispitnih koncentracija. Kod glavnog ispitivanja toksičnosti u pravilu je potrebno najmanje pet ispitnih koncentracija raspoređenih u geometrijskom nizu. Ispitne se koncentracije po mogućnosti ne bi smjele razlikovati za faktor viši od 3,2, ali može se upotrijebiti i viša vrijednost ako je krivulja koncentracija-odgovor ravna. Ako se upotrebljava manje od pet koncentracija, treba dati obrazloženje. Pri svakoj su koncentraciji potrebna najmanje tri ponavljanja.

28.

Kod određivanja raspona ispitnih koncentracija (za ispitivanje za određivanje raspona i/ili glavno ispitivanje toksičnosti) treba uzeti u obzir sljedeće:

da bi se kod određivanja ECx osigurala potrebna razina pouzdanosti, vrijednost ECx mora se nalaziti između najviše i najniže ispitne koncentracije. Primjerice, ako se procjenjuje EC50, najviša ispitna koncentracija mora biti viša od EC50. Ako se vrijednost EC50 nalazi izvan raspona ispitnih koncentracija, pripadajući intervali pouzdanosti bit će veliki i možda neće biti moguće ispravno ocijeniti statističku prikladnost modela.

Ako je cilj procijeniti LOEC/NOEC, najniža ispitna koncentracija mora biti dovoljno niska da rast ne bude značajno niži od rasta u kontrolnoj skupini. Isto tako, najviša ispitna koncentracija mora biti dovoljno visoka da rast bude značajno niži nego u kontrolnoj skupini. Ako to nije slučaj, ispitivanje je potrebno ponoviti s drugim rasponom koncentracija (osim ako je najviša koncentracija na granici topljivosti ili jednaka maksimalnoj predviđenoj graničnoj koncentraciji, npr. 100 mg/l).

29.

Svako ispitivanje uključuje kontrole s istim hranjivim medijem, istim brojem listova i kolonija, okolnim uvjetima te postupcima kao kod ispitnih posuda, ali bez ispitivane kemikalije. Ako se upotrebljava pomoćno otapalo ili dispergent, potrebna je dodatna kontrola koja sadržava istu koncentraciju otapala/dispergenta kao posude s ispitivanom kemikalijom. Broj ponavljanja kontrolnih posuda (i posuda s otapalom, ako se upotrebljava) mora biti barem jednak broju posuda upotrijebljenih za svaku ispitnu koncentraciju, a po mogućnosti i dvostruko veći.

30.

Ako nije potrebno odrediti NOEC, plan ispitivanja može se izmijeniti tako da se poveća broj koncentracija i smanji broj ponavljanja po koncentraciji. Ipak, broj kontrolnih ponavljanja mora biti najmanje tri.

Izlaganje

31.

Kolonije koje se sastoje od dva do četiri vidljiva lista prenesu se iz kulture inokuluma i nasumce raspodijele po ispitnim posudama u aseptičnim uvjetima. Svaka ispitna posuda mora sadržavati ukupno devet do 12 listova. Broj listova i kolonija mora biti jednak u svim ispitnim posudama. Iskustva s ovom metodom i podaci iz međulaboratorijskog ispitivanja pokazuju da je dovoljno upotrijebiti tri ponavljanja po obradi, od kojih svako u početku sadržava devet do 12 listova, da se između obrada utvrde razlike u rastu na razini inhibicije od približno 4 do 7 %, izračunano na temelju brzine rasta (10 do 15 % izračunano na temelju prirasta) (7).

32.

Ispitne posude treba nasumce rasporediti po inkubatoru kako bi se smanjio utjecaj prostornih razlika u svjetlosti i temperaturi. Osim toga, kod promatranja treba primijeniti blokni raspored ili slučajno razmještanje posuda (ili češće razmještanje).

33.

Ako preliminarno ispitivanje stabilnosti pokaže da se koncentracija ispitivane kemikalije ne može održati (tj. izmjerena koncentracija padne ispod 80 % izmjerene početne koncentracije) tijekom razdoblja ispitivanja (sedam dana), preporučuje se polustatički ispitni režim. U tom slučaju kolonije treba izložiti svježe pripremljenim ispitnim i kontrolnim otopinama najmanje dvaput tijekom ispitivanja (npr. trećeg i petog dana). Učestalost izlaganja svježem mediju ovisit će o stabilnosti ispitivane kemikalije; u slučaju vrlo nestabilnih i hlapljivih kemikalija potrebno je češće izlaganje da bi se održale približno stalne koncentracije. U određenim okolnostima može biti potrebna primjena protočnog postupka (8) (10).

34.

Ova ispitna metoda ne uključuje scenarij izlaganja kod folijarne primjene (raspršivanje); umjesto toga, vidjeti (11).

Uvjeti inkubacije

35.

Potrebna je neprekidna toplo ili hladno bijela fluorescentna rasvjeta čiji intenzitet treba odabrati unutar područja od 85 do 135 μE · m– 2s– 1, mjereno u području fotosintetički aktivnog zračenja (400 – 700 nm) u točkama koje su na istoj udaljenosti od izvora svjetlosti kao i listovi Lemna (što odgovara 6 500 – 10 000 lx). Odstupanja od odabranog intenziteta svjetlosti u ispitnom prostoru ne smiju biti viša od ± 15 %. Metoda detekcije i mjerenja svjetlosti, posebno vrsta senzora, utječu na izmjerenu vrijednost. Sferičnim senzorima (koji reagiraju na svjetlost iz svih kutova iznad i ispod mjerne ravnine) i ‚kosinusnim’ senzorima (koji reagiraju na svjetlost iz svih kutova iznad mjerne ravnine) daje se prednost u odnosu na usmjerene senzore jer daju više mjerne vrijednosti kod višetočkastog izvora svjetlosti kakav je ovdje opisan.

36.

Temperatura u ispitnim posudama mora biti 24 ± 2 °C. pH-vrijednost kontrolnog medija tijekom ispitivanja ne smije se povećati za više od 1,5 jedinica. Ipak, odstupanje za više od 1,5 jedinica ne dovodi u pitanje valjanost ispitivanja ako se može dokazati da su zadovoljeni kriteriji valjanosti. Pomak pH-vrijednosti ipak u nekim posebnim slučajevima zahtijeva povećanu pozornost, npr. kad se ispituju nestabilne kemikalije ili metali. Za dodatne smjernice vidjeti (8).

Trajanje

37.

Ispitivanje se prekida sedam dana nakon što se biljke prenesu u ispitne posude.

Mjerenja i analitička određivanja

38.

Na početku ispitivanja izbroje se listovi u ispitnim posudama i zabilježi se broj listova, pazeći da se uzmu u obzir svi istureni, jasno vidljivi listovi. Broj listova normalnog i promijenjenog izgleda određuje se na početku ispitivanja, najmanje jedanput svaka tri dana u razdoblju izlaganja (tj. najmanje dva puta u razdoblju od sedam dana) i po završetku ispitivanja. Treba zabilježiti sve promjene u razvoju biljaka, npr. promjene u veličini listova ili izgledu, naznake nekroze, kloroze ili nabrekline, raspadanje kolonija ili gubitak sposobnosti plivanja te promjene dužine i izgleda korijenja. Također treba zabilježiti značajna svojstva ispitnog medija (npr. prisutnost neotopljenog materijala, rast algi u ispitnoj posudi).

39.

Osim određivanja broja listova tijekom ispitivanja, ocjenjuju se i učinci ispitivane kemikalije na jednu (ili više) sljedećih mjernih varijabli:

i.

ukupnu lisnu površinu;

ii.

suhu masu;

iii.

svježu masu.

40.

Ukupna lisna površina ima prednost u tome da se može odrediti za svaku ispitnu i kontrolnu posudu na početku, za vrijeme i na kraju ispitivanja. Suhu odnosno svježu masu treba odrediti na početku ispitivanja, i to na uzorku kulture inokuluma koja je reprezentativna za materijal upotrijebljen na početku ispitivanja, te na kraju ispitivanja na biljnom materijalu iz svake ispitne i kontrolne posude. Ako se ne mjeri lisna površina, suhoj se masi daje prednost u odnosu na svježu masu.

41.

Ukupna lisna površina, suha masa i svježa masa mogu se odrediti na sljedeći način:

i.

Ukupna lisna površina: Ukupna lisna površina svih kolonija može se odrediti slikovnom analizom. Obris ispitne posude i biljaka snimi se videokamerom (npr. posuda se položi na UV-lampu) i dobivena se slika digitalizira. Ukupna lisna površina u ispitnoj posudi može se zatim odrediti kalibracijom s plošnim oblicima poznate površine. Pritom treba voditi računa o tome da se isključi utjecaj ruba ispitne posude. Drugi je, nešto zamorniji postupak da se ispitne posude i biljke fotokopiraju te se dobiveni obris kolonija izreže i površina se odredi uz pomoć analizatora lisne površine ili milimetarskog papira. Mogu biti prikladne i druge tehnike (npr. omjer papirne mase između površine obrisa kolonija i jedinične površine).

ii.

Suha masa: Sve se kolonije izvade iz ispitnih posuda i isperu destiliranom ili deioniziranom vodom. Višak vode upije se papirom i kolonije suše na 60 °C dok se ne postigne stalna masa. Treba uključiti sve ostatke korijenja. Suhu masu treba izraziti s točnošću od najmanje 0,1 mg.

iii.

Svježa masa: Sve se kolonije prenesu u prethodno izvagane polistirenske epruvete (ili epruvete od drugog inertnog materijala) koje u zaobljenom dnu imaju sitne rupice (1 mm). Epruvete se zatim deset minuta centrifugiraju na 3 000 o/min pri sobnoj temperaturi. Epruvete, koje sada sadržavaju osušene kolonije, ponovno se izvažu i izračuna se svježa masa oduzimanjem mase prazne epruvete.

Učestalost mjerenja i analitičkih određivanja

42.

Ako se primjenjuje statički postupak, pH-vrijednost treba izmjeriti u svakoj obradi na početku i na kraju ispitivanja. U slučaju polustatičkog postupka pH treba izmjeriti u svakoj šarži ‚svježe’ ispitne otopine prije svakog obnavljanja te u odgovarajućim ‚potrošenim’ otopinama.

43.

Intenzitet svjetlosti treba izmjeriti u uzgojnoj komori, inkubatoru odnosno prostoriji u točkama koje su na istoj udaljenosti od izvora svjetlosti kao i listovi vodene leće. Mjerenja se provode najmanje jedanput tijekom ispitivanja. Najmanje jedanput dnevno treba bilježiti temperaturu medija u jednoj zamjenskoj (‚surogat’) posudi koja se drži u istim uvjetima u uzgojnoj komori, inkubatoru odnosno prostoriji.

44.

Koncentracije ispitivane kemikalije određuju se u prikladnim razmacima tijekom ispitivanja. Kod statičkog se ispitivanja koncentracije moraju odrediti barem na početku i na kraju ispitivanja.

45.

U slučaju polustatičkih ispitivanja kod kojih se ne očekuje da će koncentracija ispitivane kemikalije ostati u granicama ± 20 % nazivne koncentracije potrebno je analizirati sve svježe pripremljene ispitne otopine i zatim ponoviti analizu kod svakog obnavljanja (vidjeti stavak 33.). Ipak, kod ispitivanja u kojima izmjerena početna koncentracija ispitivane kemikalije nije u granicama ± 20 % nazivne koncentracije, ali ima dovoljno dokaza da su početne koncentracije ponovljive i stabilne (tj. unutar područja od 80 do 120 % početne koncentracije), kemijska se određivanja mogu provoditi samo na najvišoj i najnižoj ispitnoj koncentraciji. U svakom slučaju, određivanje koncentracija ispitivane kemikalije prije obnavljanja treba provesti samo na jednoj posudi u svakoj ispitnoj koncentraciji (ili na združenom sadržaju posuda ponavljanja).

46.

Ako se primjenjuje protočni postupak, može se primijeniti sličan režim uzorkovanja poput onoga koji je opisan za polustatička ispitivanja, uključujući analizu na početku, u sredini i na kraju ispitivanja, ali u tom slučaju nije primjereno mjerenje ‚potrošenih’ otopina. Kod ovakvih ispitivanja treba svakodnevno provjeravati brzinu protoka vode za razrjeđivanje i ispitivane kemikalije odnosno radne otopine ispitivane kemikalije.

47.

Ako postoje dokazi da se koncentracija ispitivane kemikalije tijekom ukupnog trajanja ispitivanja na zadovoljavajući način održava u granicama ± 20 % nazivne ili izmjerene početne koncentracije, analiza rezultata može se temeljiti na nazivnim ili izmjerenim početnim vrijednostima. Ako je odstupanje od nazivne ili izmjerene početne koncentracije veće od ± 20 %, analiza rezultata mora se temeljiti na srednjoj geometrijskoj koncentraciji tijekom izlaganja ili modelima koji opisuju opadanje koncentracije ispitivane kemikalije (8).

Granično ispitivanje

48.

U određenim okolnostima, npr. kad preliminarno ispitivanje ukazuje na to da ispitivana kemikalija nema toksično djelovanje u koncentraciji do 100 mg/l ili do granice topljivosti u ispitnom mediju (ovisno o tomu što je manje), može se provesti granično ispitivanje za usporedbu odgovora kontrolne skupine s jednom ispitnom skupinom (100 mg/l ili koncentracija koja odgovara granici topljivosti). Preporučuje se da se uz granično ispitivanje svakako napravi analiza koncentracije izloženosti. Za granično ispitivanje vrijede svi navedeni ispitni uvjeti i kriteriji valjanosti, s time da je potrebno udvostručiti broj ponavljanja u ispitnoj skupini. Rast u kontrolnoj i ispitnoj skupini može se analizirati statističkim testom za usporedbu srednjih vrijednosti, npr. Studentovim t-testom.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Vrijeme udvostručenja

49.

Da bi se odredilo vrijeme koje je potrebno da se broj listova udvostruči (Td) i utvrdilo ispunjuje li istraživanje ovaj kriterij valjanosti (stavak 12.), dobivene podatke za kontrolne posude treba uvrstiti u sljedeću formulu:

Td = ln 2/μ

gdje je μ prosječna specifična brzina rasta određena onako kako je opisano u stavcima 54. i 55.

Varijable odgovora

50.

Svrha je ispitivanja odrediti učinke ispitivane kemikalije na vegetativni rast vrsta roda Lemna. U ovoj su ispitnoj metodi opisane dvije varijable odgovora, budući da različite jurisdikcije imaju različite preferencije i regulatorne zahtjeve. Da bi rezultati ispitivanja bili prihvatljivi u svim jurisdikcijama, učinke treba ocijeniti primjenom obiju varijabli odgovora opisanih u nastavku pod točkama (a) i (b).

(a)

Prosječna specifična brzina rasta: ova se varijabla odgovora izračunava na temelju promjena logaritama broja listova i osim toga na temelju promjena logaritama nekog drugog mjernog parametra (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) u vremenu (izraženo po danu) u kontrolama i svim ispitnim skupinama. Ponekad se naziva i relativnom brzinom rasta (12).

(b)

Prirast: ova se varijabla odgovora izračunava na temelju promjena broja listova i osim toga na temelju promjena nekog drugog mjernog parametra (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) u kontrolama i svim ispitnim skupinama do kraja ispitivanja.

51.

Valja napomenuti da vrijednosti toksičnosti izračunane primjenom tih dviju varijabli odgovora nisu usporedive i tu razliku treba uzeti u obzir kod primjene rezultata ispitivanja. Ako su ispoštovani ispitni uvjeti ove metode, vrijednosti ECx na temelju prosječne specifične brzine rasta (ErCx) općenito su više od rezultata na temelju prirasta (EyCx) zbog razlike u matematičkoj osnovi tih dvaju pristupa. To ne treba tumačiti kao razliku u osjetljivosti dviju varijabli odgovora, nego naprosto prihvatiti da su te vrijednosti matematički različite. Pojam prosječne specifične brzine rasta temelji se na općenitom obrascu eksponencijalnog rasta vodene leće u neograničenim kulturama, gdje se toksičnost procjenjuje na temelju učinaka na brzinu rasta neovisno o apsolutnoj vrijednosti specifične brzine rasta u kontrolnoj skupini, nagibu krivulje koncentracija-odgovor ili trajanju ispitivanja. Za razliku od toga, rezultati koji se temelje na varijabli odgovora ‚prirast’ ovise o svim tim drugim varijablama. EyCx ovisi o specifičnoj brzini rasta vrsta vodene leće koje se upotrebljavaju u ispitivanju i o maksimalnoj specifičnoj brzini rasta, koja se može razlikovati među vrstama, pa čak i različitim klonovima. Ovu varijablu odgovora ne treba upotrebljavati za usporedbu osjetljivosti na toksine među vrstama vodene leće, pa čak ni među klonovima. Iako se, sa znanstvenog stajališta, procjeni toksičnosti na temelju prosječne specifične brzine rasta daje prednost, u ovu su ispitnu metodu uključene i procjene na temelju prirasta kako bi se zadovoljili trenutačni regulatorni zahtjevi u nekim jurisdikcijama.

52.

Procjene toksičnosti treba temeljiti na broju listova i jednoj dodatnoj mjernoj varijabli (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa), jer neke kemikalije mogu znatno više utjecati na neke druge mjerne varijable nego na broj listova. Taj bi utjecaj ostao neotkriven kad bi se samo računao broj listova.

53.

Broj listova, kao i sve druge dokumentirane mjerne varijable, tj. ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa, treba uvrstiti u tablicu zajedno s koncentracijama ispitivane kemikalije pri svakom mjerenju. Kasnija analiza podataka, npr. za procjenu vrijednosti LOEC, NOEC ili ECx, mora se temeljiti na vrijednostima pojedinačnih ponavljanja, a ne na izračunanim srednjim vrijednostima po ispitnim skupinama.

Prosječna specifična brzina rasta

54.

Prosječna specifična brzina rasta za određeno razdoblje izračunava se kao logaritamsko povećanje varijabli rasta – broj listova i još jedna mjerna varijabla (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) – primjenom formule u nastavku za svako ponavljanje u kontrolama i obradama:

Formula

gdje je:

:

μi-j

:

prosječna specifična brzina rasta od vremena i do j,

:

Ni

:

mjerna varijabla u ispitnoj ili kontrolnoj posudi u vremenu i,

:

Nj

:

mjerna varijabla u ispitnoj ili kontrolnoj posudi u vremenu j,

:

t

:

vremensko razdoblje od i do j.

Za svaku ispitnu i kontrolnu skupinu treba izračunati srednju vrijednost brzine rasta s procjenom varijance.

55.

Prosječnu specifičnu brzinu rasta treba izračunati za čitavo razdoblje ispitivanja (vrijeme ‚i’ u gornjoj formuli početak je ispitivanja, a vrijeme ‚j’ je kraj ispitivanja). Izračuna se srednja vrijednost prosječne specifične brzine rasta s procjenom varijance za svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu. Osim toga, odredi se etapna brzina rasta kako bi se ocijenili učinci ispitivane kemikalije koji se javljaju tijekom razdoblja izlaganja (npr. pregledom logaritamski transformiranih krivulja rasta). Značajne razlike između etapne brzine rasta i prosječne brzine rasta ukazuju na odstupanje od stalnog eksponencijalnog rasta i u tom slučaju treba temeljito preispitati krivulju rasta. Konzervativniji pristup u ovakvim bi slučajevima bio usporediti specifične brzine rasta obrađenih kultura u razdoblju maksimalne inhibicije sa specifičnim brzinama rasta kontrolnih kultura tijekom istog razdoblja.

56.

Postotak inhibicije brzine rasta (Ir) tada se može izračunati za svaku ispitnu koncentraciju (ispitnu skupinu) prema sljedećoj formuli:

Formula

gdje je:

:

% Ir

:

postotak inhibicije prosječne specifične brzine rasta,

:

μC

:

srednja vrijednost μ u kontroli,

:

μT

:

srednja vrijednost μ u ispitnoj skupini.

Prirast

57.

Učinci na prirast određuju se na temelju dviju mjernih varijabli, broja listova i još jedne mjerne varijable (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) u svakoj ispitnoj posudi na početku i na kraju ispitivanja. Početna biomasa za suhu i svježu masu određuje se na temelju uzorka listova uzetog iz iste šarže koja je upotrijebljena za inokulaciju ispitnih posuda (vidjeti stavak 20.). Za svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu treba izračunati srednju vrijednost prirasta s procjenama varijance. Srednji postotak inhibicije prirasta ( % Iy) za svaku ispitnu skupinu može se izračunati na sljedeći način:

Formula

gdje je:

:

% Iy

:

postotak smanjenja prirasta,

:

bC

:

konačna biomasa umanjena za početnu biomasu kontrolne skupine,

:

bT

:

konačna biomasa umanjena za početnu biomasu ispitne skupine.

Prikaz krivulja koncentracija-odgovor

58.

Treba prikazati krivulje koncentracija-odgovor iz kojih je vidljiv odnos srednjeg postotka inhibicije varijable odgovora (Ir ili Iy izračunanih kako je navedeno u stavcima 56. ili 57.) i logaritamske koncentracije ispitivane kemikalije.

Procjena vrijednosti ECx

59.

ECx (npr. EC50) treba procijeniti i na temelju prosječne specifične brzine rasta (ErCx) i na temelju prirasta (EyCx), pri čemu se svaka od tih vrijednosti mora temeljiti na broju listova i još jednoj mjernoj varijabli (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa). To je stoga što neke ispitivane kemikalije ne utječu jednako na broj listova i na druge mjerne varijable. Traženi parametri toksičnosti stoga su četiri vrijednosti ECx za svaku izračunanu razinu inhibicije x: ErCx (broj listova); ErCx (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa); EyCx (broj listova) i EyCx (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa).

Statistički postupci

60.

Cilj je dobiti kvantitativni odnos koncentracija-odgovor regresijskom analizom. Ako se provede linearizacijska pretvorba podataka odgovora, npr. u jedinice probit, logit ili Weibullova modela (13), može se provesti ponderirana linearna regresija; ipak, prednost se daje postupcima nelinearne regresije koji se bolje nose s neizbježnim nepravilnostima podataka i odstupanjima od pravilnih razdioba. S približavanjem nultoj ili potpunoj inhibiciji te se nepravilnosti pretvorbom mogu i dodatno povećati te tako otežati analizu (13). Valja napomenuti da su standardne metode analize za vrijednosti dobivene pretvorbom (probit, logit ili Weibull) namijenjene kvantalnim podacima (npr. smrtnost ili preživljavanje) i moraju se posebno prilagoditi da bi se mogle primijeniti na podatke o brzini rasta i prirastu. Konkretni postupci za određivanje vrijednosti ECx iz kontinuiranih podataka mogu se pronaći u literaturi pod (14) (15) i (16).

61.

Za svaku varijablu odgovora koja se analizira potrebno je izračunati procjene točaka za vrijednosti ECx na temelju odnosa koncentracija-odgovor. Po mogućnosti, za sve procjene treba odrediti granice pouzdanosti 95 %. Valjanost podudaranja podataka odgovora s regresijskim modelom procjenjuje se grafički ili statistički. Regresijsku analizu treba provesti na temelju pojedinačnih odgovora u ponavljanjima, a ne na temelju srednjih vrijednosti ispitnih skupina.

62.

Ako raspoloživi regresijski modeli/metode nisu prikladni za podatke, procjene EC50 i granice pouzdanosti mogu se dobiti i linearnom interpolacijom sa samonadopunjavanjem (‚bootstrapping’) (17).

63.

Za procjenu LOEC-a, a time i NOEC-a, potrebno je usporediti srednje vrijednosti obrada primjenom tehnika analize varijance (ANOVA). Zatim srednju vrijednost za svaku koncentraciju treba usporediti s kontrolnom srednjom vrijednošću primjenom odgovarajuće metode višestruke usporedbe ili testa trenda. Ovdje može biti koristan Dunnettov ili Williamsov test (18) (19) (20) (21). Treba provjeriti vrijedi li pretpostavka homogenosti varijanci ANOVA-e. To se može učiniti grafički ili formalnim testom (22). Prikladni su Leveneov ili Bartlettov test. Ako pretpostavka homogenosti varijanci nije zadovoljena, to se ponekad može ispraviti logaritamskom pretvorbom podataka. Ako je heterogenost varijance prevelika da bi se mogla ispraviti pretvorbom, treba razmotriti mogućnost analize metodama kao što su Jonckheereovi testovi trenda postupnim snižavanjem. Dodatne smjernice za određivanje NOEC-a mogu se pronaći u literaturi (16).

64.

Novije znanstvene spoznaje rezultirale su preporukom da se pojam NOEC-a napusti i zamijeni procjenama točaka ECx dobivenih regresijom. Za ovaj test Lemna spp. nije utvrđena određena vrijednost x. Ipak, čini se da je primjereno područje od 10 do 20 % (ovisno o odabranoj varijabli odgovora), a poželjno je da se navedu obje vrijednosti, EC10 i EC20.

Izvješćivanje

65.

Izvješće o ispitivanju mora obuhvaćati sljedeće:

 

Ispitivana kemikalija:

fizikalno stanje i fizikalno-kemijska svojstva, uključujući granicu topljivosti u vodi,

podaci za identifikaciju kemikalije (npr. CAS broj), uključujući čistoću (nečistoće).

 

Ispitne vrste:

znanstveni naziv, klon (ako je poznat) i izvor.

 

Uvjeti ispitivanja:

primijenjeni ispitni postupak (statički, polustatički ili protočni),

datum početka ispitivanja i trajanje,

ispitni medij,

plan pokusa: ispitne posude i pokrovi, volumeni otopina, broj kolonija i listova po ispitnoj posudi na početku ispitivanja,

ispitne koncentracije (nazivne ili izmjerene, ovisno o slučaju) i broj ponavljanja po koncentraciji,

način pripreme radnih i ispitnih otopina, uključujući eventualnu uporabu otapala ili dispergenata,

temperatura tijekom ispitivanja,

izvor svjetlosti, intenzitet svjetlosti i homogenost,

pH-vrijednosti ispitnih i kontrolnih medija,

koncentracije ispitivane kemikalije i analitička metoda s odgovarajućim podacima za ocjenu kakvoće (validacijska istraživanja, standardne devijacije ili granice pouzdanosti analiza),

metode određivanja broja listova i drugih mjernih varijabli, npr. suhe mase, svježe mase ili lisne površine,

eventualna odstupanja od ispitne metode.

 

Rezultati:

sirovi podaci: broj listova i druge mjerne varijable u svakoj ispitnoj i kontrolnoj posudi kod svakog promatranja i analize,

srednje vrijednosti i standardne devijacije za svaku mjernu varijablu,

krivulje rasta za svaku koncentraciju (preporučljivo s logaritamski transformiranom mjernom varijablom, vidjeti odjeljak 55.),

vrijeme udvostručenja / brzina rasta u kontroli na temelju broja listova,

izračunane varijable odgovora za svako ponavljanje u ispitnim skupinama, uključujući srednje vrijednosti i koeficijente varijacije ponavljanja,

grafički prikaz odnosa koncentracija/učinak,

procjene krajnjih točaka toksičnosti za varijable odgovora, npr. EC50, EC10, EC20 i pripadajući intervali pouzdanosti. LOEC i/ili NOEC, ako su izračunati, i statističke metode koje su upotrijebljene za njihovo određivanje,

ako se primjenjuje ANOVA, veličina učinka koja se može utvrditi (npr. najmanja značajna razlika),

eventualna stimulacija rasta u bilo kojoj obradi,

svi vidljivi znakovi fitotoksičnosti i zapažanja u ispitnim otopinama,

rasprava o rezultatima, uključujući i svaki utjecaj na rezultate ispitivanja nastao zbog odstupanja od ove ispitne metode.

LITERATURA

(1)

ASTM International. (2003.) Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (ponovno odobreno 1998.). str. 733. – 742. U: Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996.) OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft’. EPA 712-C-96-156. str. 8.

(3)

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996.) XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. str. 10.

(4)

SSI –Swedish Standards Institute. (1995.) Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. str. 15. (na švedskom).

(5)

Environment Canada. (1999.) Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – str. 120.

(6)

Environment Canada. (1993.) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims I., Whitehouse P. i Lacey R. (1999.) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

(8)

OECD (2000.) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(9)

International Organisation for Standardisation. ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge C. T. (1977.) A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. Rujan 1977.

(11)

Lockhart, W. L., Billeck, B. N. i Baron, C. L. (1989.) Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 – 359.

(12)

Huebert, D. B. i Shay, J. M. (1993.) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481 – 483.

(13)

Christensen, E.R.,, Nyholm, N. (1984.): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713 – 718.

(14)

Nyholm, N. Sørensen, P. S., Kusk, K. O. i Christensen, E. R. (1992.): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157 – 167.

(15)

Bruce, R. D. i Versteeg, D. J. (1992.) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485 – 1494.

(16)

OECD. (2006.) Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(17)

Norberg-King, T. J. (1988.) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C. W. (1955.) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096 – 1121.

(19)

Dunnett, C. W. (1964.) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482 – 491.

(20)

Williams, D. A. (1971.) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103 – 117.

(21)

Williams, D. A. (1972.) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519 – 531.

(22)

Brain, P. i Cousens, R. (1989.) An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93 – 96.

Dodatak 1.

Definicije

Za potrebe ove ispitne metode primjenjuju se sljedeće definicije i skraćenice:

 

Biomasa je suha masa žive tvari u populaciji. U ovoj se metodi u pravilu mjere zamjenski parametri biomase kao što je broj listova ili lisna površina pa se izraz ‚biomasa’ odnosi i na te zamjenske mjere.

 

Kemikalija znači tvar ili smjesa.

 

Kloroza je žućenje lisnog tkiva.

 

Klon je organizam ili stanica nastala od jedne jedinke nespolnim razmnožavanjem. Prema tomu, jedinke potekle od istog klona genetski su istovjetne.

 

Kolonija znači svi listovi majke i kćeri (obično dva do četiri) koji su međusobno spojeni. Ponekad se naziva i biljkom.

 

ECx je koncentracija ispitivane kemikalije otopljene u ispitnom mediju koja rezultira x-postotnim (npr. 50 %) smanjenjem rasta Lemna unutar određenog razdoblja izlaganja (koje treba izričito navesti ako je različito od punog odnosno uobičajenog trajanja ispitivanja). Da bi se nedvosmisleno pokazalo je li vrijednost EC dobivena iz brzine rasta ili iz prirasta, za brzinu rasta upotrebljava se simbol ‚ErC’, a za prirast simbol ‚EyC’, iza čega se navodi mjerna varijabla, npr. ErC (broj listova).

 

Protočno ispitivanje je ispitivanje u kojem se ispitne otopine stalno zamjenjuju.

 

List je zasebna/pojedinačna ‚listasta’ struktura vodene leće. To je najmanja reproduktivno sposobna jedinica, odnosno jedinka.

 

Nabreklina su grbavi ili nabrekli listovi.

 

Rast je povećanje mjerne varijable, npr. broja listova, suhe mase, mokre mase ili lisne površine, u razdoblju ispitivanja.

 

Brzina rasta (prosječna specifična brzina rasta) logaritamsko je povećanje biomase tijekom razdoblja izlaganja.

 

Najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC) najniža je ispitana koncentracija kemikalije kod koje je uočen statistički značajan usporavajući učinak na rast (pri p < 0,05) u usporedbi s kontrolom u određenom razdoblju izlaganja. Ipak, sve ispitne koncentracije iznad LOEC-a moraju imati jednak ili veći štetan učinak od onoga koji je zabilježen pri LOEC-u. Ako se ova dva uvjeta ne mogu zadovoljiti, treba navesti detaljno obrazloženje za odabir LOEC-a (a time i NOEC-a).

 

Mjerna varijabla je bilo koja varijabla koja se mjeri kako bi se izrazila krajnja točka ispitivanja primjenom jedne ili više varijabli odgovora. Mjerne su varijable kod ove metode broj listova, lisna površina, svježa masa i suha masa.

 

Monokultura je kultura koja sadržava jednu biljnu vrstu.

 

Nekroza je mrtvo (tj. bijelo ili vodom natopljeno) lisno tkivo.

 

Najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC) ispitna je koncentracija neposredno ispod LOEC-a.

 

Fenotip su vidljive značajke organizma određene interakcijom njegovih gena i okoliša.

 

Varijabla odgovora je varijabla za procjenu toksičnosti izvedena iz bilo koje mjerene varijable koja opisuje biomasu primjenom različitih računskih metoda. Kod ove su metode brzine rasta i prirast varijable odgovora izvedene iz mjernih varijabli kao što su broj listova, lisna površina, svježa masa i suha masa.

 

Polustatičko ispitivanje (ispitivanje s obnavljanjem) je ispitivanje u kojemu se ispitna otopina zamjenjuje periodički, u određenim razmacima, tijekom ispitivanja.

 

Statičko ispitivanje ispitna je metoda kod koje se ispitna otopina ne obnavlja tijekom ispitivanja.

 

Ispitivana kemikalija je svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.

 

Krajnja točka ispitivanja je opći faktor koji se mijenja u odnosu na kontrolu zbog djelovanja ispitivane kemikalije kao cilj ispitivanja. Kod ove je ispitne metode krajnja točka ispitivanja inhibicija rasta koja se može izraziti različitim varijablama odgovora koje se temelje na jednoj ili više mjernih varijabli.

 

Ispitni medij cjelokupni je sintetički uzgojni medij u kojem ispitne biljke rastu kad se izlože ispitivanoj kemikaliji. Ispitivana se kemikalija u pravilu otapa u ispitnom mediju.

 

Prirast je vrijednost mjerne varijable kojom se izražava razlika između biomase na kraju razdoblja izlaganja i mjerne varijable na početku razdoblja izlaganja.

Dodatak 2.

Opis Lemna spp.

Vodena biljka poznata pod nazivom vodena leća, Lemna spp., pripada porodici Lemnaceae, u koju se ubrajaju različite vrste diljem svijeta koje su podijeljene u četiri roda. Njihov izgled i taksonomija iscrpno su opisani (1) (2). Vrste Lemna gibba i L. minor reprezentativne su vrste umjerenih pojasa i vrlo se često upotrebljavaju u toksikološkim ispitivanjima. Obje vrste imaju plivajuću ili uronjenu diskoidnu stabljiku (list) i vrlo tanak korijen koji izbija iz sredine naličja lista. Lemna spp. rijetko daju cvjetove, a biljke se vegetativno razmnožavaju stvaranjem novih listova (3). Mlađe su biljke uglavnom bljeđe od starijih biljaka, imaju kraće korijenje i sastoje se od dva do tri lista različite veličine. Biljke iz ovog roda vrlo su pogodne za laboratorijsko ispitivanje zahvaljujući maloj veličini, jednostavnoj građi, nespolnom razmnožavanju i kratkom generacijskom vremenu (4) (5).

Zbog vjerojatnih razlika u osjetljivosti među vrstama, valjane su samo usporedbe osjetljivosti unutar iste vrste.

Primjeri vrsta Lemna upotrijebljenih u ispitivanjima: referentni popis

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996.) The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925.) The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935 – 941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996.) OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft’. EPA 712-C-96-156. str. 8.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996.) XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995.) Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. str. 15. (na švedskom)

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003.) Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (ponovno odobreno 1998). str. 733. – 742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996.) OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft’. EPA 712-C-96-156. str. 8.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981.) Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981.) Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993.) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T. C., Czyrska, H. (1975.) Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Izvori vrsta Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2

Tel.: +1-416-978-3641

Faks: +1-416-978-5878

e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

Sjedinjene Američke Države

Tel.: 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

STOCKHOLM

ŠVEDSKA

Tel.: +46 8 674 7240

Faks: +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

Njemačka

e-mail: lemna@uba.de

LITERATURA

(1)

Hillman, W. S. (1961.) The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2)

Landolt, E. (1986.) Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3)

Björndahl, G. (1982.) Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986.) Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

(5)

Wang, W. (1990.) Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

Dodatak 3.

Održavanje radne kulture

Radne se kulture na nižoj temperaturi (4 –10 °C) mogu duže vrijeme držati bez presađivanja. Kao uzgojni medij za radne kulture Lemna može se upotrijebiti medij koji se upotrebljava u ispitivanju, ali moguće je upotrijebiti i druge medije bogate nutrijentima.

Određeni broj mladih svijetlozelenih biljaka povremeno se premješta u nove uzgojne posude sa svježim medijem primjenom aseptičkih postupaka. U hladnijim uvjetima, kakvi se ovdje preporučuju, presađivanje se može provoditi u razmacima do tri mjeseca.

Upotrebljavaju se kemijski čiste (očišćene kiselinom) i sterilne staklene uzgojne posude, a kod rukovanja se primjenjuju aseptički postupci. Ako dođe do onečišćenja radne kulture npr. algama ili gljivicama, treba poduzeti potrebne mjere za uklanjanje onečišćujućih organizama. U slučaju algi i većine drugih onečišćujućih organizama to se može postići površinskom sterilizacijom. Uzme se uzorak onečišćenog biljnog materijala i odreže se korijenje. Materijal se zatim snažno protrese u čistoj vodi i uroni u 0,5-postotnu (v/v) otopinu natrijeva hipoklorita na između 30 sekundi i pet minuta. Biljni se materijal zatim ispere sterilnom vodom i prenese u više šarži u uzgojne posude koje sadržavaju svježi uzgojni medij. U ovom će postupku mnogi listovi uginuti, posebno kod dužeg vremena izlaganja, ali bi barem neki od preživjelih trebali biti čisti. Oni se zatim ponovno mogu upotrijebiti za inokuliranje novih kultura.

Dodatak 4.

Mediji

Za vrste L. minor i L. gibba preporučuju se različiti uzgojni mediji. Za L. minor preporučuje se prilagođena varijanta medija prema švedskoj normi (SIS), a za L. gibba medij 20X AAP. Sastav tih dvaju medija naveden je u nastavku. Kod pripreme tih medija treba upotrijebiti reagens odnosno analitički čiste kemikalije i deioniziranu vodu.

Uzgojni medij Lemna prema švedskoj normi (SIS)

Radne otopine od I. do V. steriliziraju se obradom u autoklavu (120 °C, 15 minuta) ili membranskom filtracijom (veličina pora oko 0,2 μm).

Otopina VI. (i fakultativno VII.) sterilizira se isključivo membranskom filtracijom; ne smije se obrađivati u autoklavu.

Sterilne radne otopine treba čuvati na hladnom i mračnom mjestu. Radne otopine od I. do V. treba baciti nakon šest mjeseci, dok otopina VI. (i fakultativno VII.) ima rok uporabe jedan mjesec.

Radna otopina br.

Tvar

Koncentracija u radnoj otopini

(g/l)

Koncentracija u pripremljenom mediju

(mg/ߦl)

Pripremljeni medij

 

 

 

 

Element

Koncentracija

(mg/ߦl)

I.

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II.

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III.

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV.

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V.

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI.

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII.

MOPS (pufer)

490

490

Da bi se dobila jedna litra medija SIS, u 900 ml deionizirane vode dodaje se:

10 ml radne otopine I.

5 ml radne otopine II.

5 ml radne otopine III.

5 ml radne otopine IV.

1 ml radne otopine V.

5 ml radne otopine VI.

1 ml radne otopine VII. (fakultativno).

Napomena: Za ispitivanje nekih kemikalija može biti potrebna i radna otopina VII. (pufer MOPS) (vidjeti stavak 11.).

pH-vrijednost prilagodi se na 6,5 ± 0,2 s pomoću 0,1 ili 1 mol HCl ili NaOH i nadopuni deioniziranom vodom do volumena od jedne litre.

Uzgojni medij 20X AAP

Radne otopine pripremaju se u sterilnoj destiliranoj ili deioniziranoj vodi.

Sterilne radne otopine treba čuvati na hladnom i mračnom mjestu. U tim će uvjetima radne otopine imati rok uporabe najmanje šest do osam tjedana.

Za medij 20X – AAP priprema se pet radnih otopina s nutrijentima (A1, A2, A3, B i C) uporabom reagencijski čistih kemikalija. Uzgojni medij dobije se tako da se u približno 850 ml deionizirane vode doda po 20 ml svake od radnih otopina s nutrijentima. pH-vrijednost prilagodi se na 7,5 ± 0,1 s pomoću 0,1 ili 1 mol HCl ili NaOH i nadopuni deioniziranom vodom do volumena od jedne litre. Zatim se medij profiltrira u sterilnu posudu kroz membranski filtar 0,2 μm (približno).

Uzgojni medij za ispitivanje treba pripremiti jedan do dva dana prije uporabe kako bi se stabilizirala pH-vrijednost. pH-vrijednost uzgojnog medija treba provjeriti prije uporabe i prema potrebi prilagoditi dodavanjem 0,1 ili 1 mol NaOH ili HCl na način opisan ranije u tekstu.

Radna otopina br.

Tvar

Koncentracija u radnoj otopini

(g/ߦl) (7)

Koncentracija u pripremljenom mediju

(mg/ߦl) (7)

Pripremljeni medij

 

 

 

 

Element

Koncentracija

(mg/ߦl) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na; N

190; 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2.O

1,4

30

K; P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na; N

220; 43

Medij STEINBERG (prema ISO 20079)

Koncentracije i radne otopine

Prilagođeni medij Steinberg u ISO 20079 predviđen je samo za Lemna minor (budući da je ondje jedino i dopuštena Lemna minor), ali ispitivanja su pokazala da se i s vrstom Lemna gibba mogu postići dobri rezultati.

Kod pripreme medija treba upotrijebiti reagencijski odnosno analitički čiste kemikalije i deioniziranu vodu.

Hranjivi se medij priprema iz radnih otopina ili deseterostruko koncentriranog medija kako bi se dobila najviša koncentracija medija koja se može postići bez taloženja.

Tablica 1.

pH-stabilizirani medij STEINBERG (modificiran prema Altenburgeru)

Sastojak

Hranjivi medij

Makroelementi

molarna masa

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroelementi

molarna masa

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA dinatrijev dihidrat

372,24

1 500,00

4,03


Tablica 2.

Radne otopine (makroelementi)

1.

Makroelementi (pedeseterostruko koncentrirani)

g/l

Radna otopina 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Radna otopina 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Radna otopina 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Tablica 3.

Radne otopine (mikroelementi)

2.

Makroelementi (tisućostruko koncentrirani)

mg/l

Radna otopina 4:

H3BO3

120,0

Radna otopina 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Radna otopina 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Radna otopina 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Radna otopina 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA dinatrijev dihidrat

1 500,00

Radne otopine 2 i 3 mogu se objediniti, kao i radne otopine od 4 do 7 (uzimajući u obzir tražene koncentracije).

Za duži rok uporabe radne otopine potrebno je obraditi u autoklavu 20 minuta na temperaturi od 121 °C ili provesti sterilnu filtraciju (0,2 μm). Za radnu otopinu 8 u svakom se slučaju preporučuje sterilna filtracija (0,2 μm).

Priprema konačne koncentracije (modificiranog) medija STEINBERG

Potrebno je dodati 20 ml radnih otopina 1, 2 i 3 (vidjeti tablicu 2.) u oko 900 ml deionizirane vode kako bi se izbjeglo taloženje.

Doda se 1,0 ml radnih otopina 4, 5, 6, 7 i 8 (vidjeti tablicu 3.).

pH-vrijednost mora biti 5,5 +/– 0,2 (prilagoditi dodavanjem minimalnog volumena otopine NaOH ili HCl).

Nadopuni se vodom do 1 000 ml.

Ako su radne otopine sterilizirane i upotrebljava se prikladna voda, nije potrebna dodatna sterilizacija. Ako se sterilizacija provodi na konačnom mediju, radnu otopinu 8 treba dodati nakon obrade u autoklavu (20 minuta na 121 °C).

Priprema deseterostruko koncentriranog (modificiranog) medija STEINBER za međuskladištenje

Potrebno je dodati 20 ml radnih otopina 1, 2 i 3 (vidjeti tablicu 2.) u oko 30 ml vode kako bi se izbjeglo taloženje.

Doda se 1,0 ml radnih otopina 4, 5, 6, 7 i 8 (vidjeti tablicu 3.). Nadopuni se vodom do 100 ml.

Ako su radne otopine sterilizirane i upotrebljava se prikladna voda, nije potrebna dodatna sterilizacija. Ako se sterilizacija provodi na konačnom mediju, radnu otopinu 8 treba dodati nakon obrade u autoklavu (20 minuta na 121 °C).

pH-vrijednost medija (konačna koncentracija) mora biti 5,5 ± 0,2.

6.

Dodaju se sljedeća poglavlja od C.31. do C.46.:

C.31.   TEST NA KOPNENOM BILJU: ISPITIVANJE NICANJA I RASTA KLIJANACA

UVOD

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 208 (2006.). Ispitne se metode periodički preispituju u svjetlu znanstvenoga napretka i primjenjivosti za regulatorne svrhe. Ova ažurirana ispitna metoda namijenjena je ocjenjivanju mogućih učinaka kemikalija na nicanje i rast klijanaca. Kao takva ne obuhvaća kronične učinke ili učinke na razmnožavanje (tj. zametanje sjemena, formiranje cvjetova i sazrijevanje plodova). Kako bi se osigurao odabir primjerenih ispitnih metoda, mora se voditi računa o uvjetima izloženosti i svojstvima kemikalije koja će se ispitivati (npr. kada se ispituju metali/spojevi metala, treba voditi računa o učincima pH-vrijednosti i pripadajućim protuionima) (1). Ovom se ispitnom metodom ne ispituje bilje izloženo parama kemikalija. Ispitna se metoda može primijeniti za ispitivanje kemikalija u općoj uporabi, biocida i proizvoda za zaštitu usjeva (poznatih i kao sredstva za zaštitu bilja ili pesticidi). Razvijena je na temelju postojećih metoda (2) (3) (4) (5) (6) (7). Razmotrena je i ostala literatura koja se odnosi na ispitivanje bilja (8) (9) (10). Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1.

NAČELO ISPITIVANJA

2.

Ispitivanjem se ocjenjuju učinci na nicanje klijanaca i rani rast viših biljaka nakon izloženosti ispitivanoj kemikaliji u tlu (ili drugoj prikladnoj matrici tla). Sjeme se stavi u dodir sa zemljom koja je tretirana ispitivanom kemikalijom čiji se učinci ocjenjuju obično nakon 14 do 21 dana nakon što nikne 50 % klijanaca u kontrolnoj skupini. Krajnje točke koje se mjere jesu vizualna procjena nicanja klijanaca, masa suhe tvari izdanka (alternativno masa svježe tvari izdanka) i u određenim slučajevima visina izdanka, kao i procjena vidljivih štetnih učinaka na različite dijelove biljke. Ta se mjerenja i zapažanja uspoređuju s onima kod netretiranih kontrolnih biljaka.

3.

Ovisno o očekivanom putu izlaganja, ispitivana se kemikalija unosi u zemlju (ili eventualno u matricu umjetne zemlje) ili se primjenjuje na površinu zemlje, što pravilno predstavlja mogući put izlaganja kemikaliji. Kemikalija se unosi u zemlju tretiranjem zemlje u rasulu. Nakon primjene kemikalije zemlja se premješta u uzgojne posude, u koje se potom sije sjeme određene biljne vrste. Kod površinske primjene kemikalija se primjenjuje na zemlju u posudama u koju je već posijano sjeme. Ispitne jedinice (kontrole i tretirana zemlja plus sjeme) potom se stavljaju u odgovarajuće uvjete kako bi se potaknulo klijanje/rast biljaka.

4.

Ispitivanje se može provesti kako bi se odredila krivulja doza-odgovor ili kao granični test sa samo jednom koncentracijom / dozom primjene u skladu s ciljem studije. Ako rezultati dobiveni ispitivanjem sa samo jednom koncentracijom / dozom primjene premašuju određenu razinu toksičnosti (npr. uoče li se učinci veći od x %), provodi se ispitivanje za određivanje raspona kako bi se odredile gornja i donja granica toksičnosti, nakon čega se provodi ispitivanje s više koncentracija / doza primjene kako bi se dobila krivulja doza-odgovor. Odgovarajućom statističkom analizom izračunava se učinkovita koncentracija ECx ili učinkovita doza primjene ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) za najosjetljiviji parametar ili najosjetljivije parametre koji se ispituju. Osim toga, ovim se ispitivanjem može izračunati najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC) i najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC).

INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI

5.

Sljedeće su informacije korisne za utvrđivanje očekivanog puta izloženosti kemikaliji i za planiranje ispitivanja: strukturna formula, čistoća, topljivost u vodi, topljivost u organskim otapalima, koeficijent razdjeljenja 1-oktanol/voda, sorpcijsko ponašanje u tlu, tlak para, kemijska stabilnost u vodi i na svjetlosti te biorazgradivost.

VALJANOST ISPITIVANJA

6.

Da bi ispitivanje bilo valjano, kontrole moraju zadovoljavati sljedeće kriterije uspješnosti:

nicanje klijanaca iznosi najmanje 70 %,

klijanci ne pokazuju vidljive fitotoksične učinke (npr. klorozu, nekrozu, uvenuće, deformacije lista i stabljike) i biljke pokazuju uobičajene varijacije u rastu i morfologiji za predmetnu vrstu,

srednja stopa preživljavanja izniklih kontrolnih klijanaca iznosi najmanje 90 % tijekom trajanja istraživanja,

okolišni su uvjeti za određenu vrstu identični, a uzgojni mediji sadržavaju istu količinu matrice tla, pomoćnih medija ili supstrata iz istog izvora.

REFERENTNA KEMIKALIJA

7.

Ispitivanjem referentne kemikalije u redovitim vremenskim razmacima može se provjeriti jesu li se provođenje ispitivanja i odgovor određenih ispitnih biljaka te uvjeti ispitivanja značajno promijenili tijekom vremena. Alternativno se mogu upotrijebiti prijašnja mjerenja biomase ili rasta kontrola kako bi se ocijenila uspješnost ispitnih sustava u pojedinim laboratorijima, a mogu poslužiti i za kontrolu kvalitete unutar laboratorija.

OPIS METODE

Prirodno tlo – umjetni supstrat

8.

Biljke se mogu uzgajati u posudama s pjeskovitom ilovačom, ilovastim pijeskom ili pjeskovito glinastom ilovačom koja sadržava do 1,5 % organskog ugljika (oko 3 % organske tvari). Može se upotrijebiti i komercijalna zemlja za lončanice ili sintetička mješavina zemlje koja sadržava do 1,5 % organskog ugljika. Ne smije se upotrijebiti glinovita zemlja ako je poznato da ispitivana kemikalija ima visoki afinitet za gline. Zemlju s polja treba prosijati na veličinu čestica 2 mm kako bi se homogenizirala i kako bi se uklonile grube čestice. Treba dokumentirati vrstu i teksturu, postotak organskog ugljika, pH te udio soli koji se mjeri kao električna vodljivost konačne pripremljene zemlje. Zemlju treba klasificirati prema standardnoj klasifikacijskoj shemi (11). Zemlja se može pasterizirati ili toplinski obraditi kako bi se smanjio učinak patogena iz tla.

9.

Uporaba prirodne zemlje može otežati tumačenje rezultata i povećati varijabilnost zbog varirajućih fizikalno-kemijskih svojstava i mikrobnih populacija. Te varijable mogu pak izmijeniti sposobnost zadržavanja vlažnosti, sposobnost vezanja kemikalija, dotok zraka te udio hranjivih sastojaka i elemenata u tragovima. Osim varijacija u navedenim fizikalnim faktorima, postojat će i varijacije u kemijskim svojstvima, kao što su pH-vrijednost i redoks-potencijal, koja mogu utjecati na bioraspoloživost ispitivane kemikalije (12) (13) (14).

10.

Umjetni se supstrati u pravilu ne upotrebljavaju za ispitivanje sredstava za zaštitu bilja, ali se mogu upotrijebiti za ispitivanje kemikalija u općoj uporabi ili kad se želi smanjiti varijabilnost prirodnih tala i povećati usporedivost rezultata ispitivanja. Upotrijebljeni se supstrati moraju sastojati od inertnih materijala koji u najvećoj mogućoj mjeri smanjuju interakciju s ispitivanom kemikalijom, nosačem otapala ili jednim i drugim. Pokazalo se da su kremeni pijesak ispran kiselinom, mineralna vuna i staklena zrnca (npr. promjera od 0,35 do 0,85 mm) prikladni inertni materijali koji minimalno apsorbiraju ispitivanu kemikaliju (15), čime se osigurava maksimalna dostupnost kemikalije klijancu putem korijena. Vermikulit, perlit i ostali jaki apsorbenti nisu prikladni supstrati. Potrebno je osigurati nutrijente za rast bilja kako bi se spriječio stres biljaka zbog nutritivnog deficita, koji gdje je moguće treba procijeniti kemijskom analizom ili vizualnim pregledom kontrolnih biljaka.

Kriteriji za odabir ispitnih vrsta

11.

Kako bi se dobio niz odgovora, raspon odabranih vrsta mora biti prilično širok, npr. u smislu njihove taksonomske raznolikosti u carstvu biljaka, njihove rasprostranjenosti, brojnosti, značajki životnog ciklusa koje su specifične za vrstu te područja prirodnog rasta (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Pri odabiru potrebno je uzeti u obzir sljedeća svojstva mogućih ispitnih vrsta:

vrsta ima ujednačeno sjeme koje se može nabaviti iz pouzdanih izvora standardnog sjemena i koje klija redovito, pouzdano i ujednačeno te daje klijance ujednačenog rasta,

biljka se može ispitivati u laboratoriju i može dati pouzdane i obnovljive rezultate, kako unutar istog, tako i u različitim objektima u kojima se provodi ispitivanje,

osjetljivost ispitivane vrste mora biti u skladu s reakcijama biljaka koje se mogu pronaći u okolišu izloženom kemikaliji,

vrsta je u određenoj mjeri već bila upotrebljavana u prethodnim ispitivanjima toksičnosti i njezino ponašanje u primjerice biološkim ispitivanjima (biotestovima) herbicida, testovima probira na teške metale, testovima na salinitetni ili mineralni stres ili u istraživanjima alelopatije ukazuje na postojanje velikog broja stresora,

spojiva je s uvjetima rasta koji su predviđeni ispitnom metodom,

ispunjuje kriterije valjanosti ispitivanja.

Neke od vrsta koje su se najviše upotrebljavale u dosadašnjim ispitivanjima navedene su u Dodatku 2., a moguće nepoljoprivredne vrste navedene su u Dodatku 3.

12.

Broj vrsta koje će se ispitivati ovisi o odgovarajućim regulatornim zahtjevima pa taj broj nije određen u ovoj ispitnoj metodi.

Primjena ispitivane kemikalije

13.

Kemikaliju treba primijeniti u odgovarajućem nosaču (npr. vodi, acetonu, etanolu, polietilen glikolu, gumi arabici ili pijesku). Mogu se ispitivati i mješavine (formulirani proizvodi ili formulacije) koje sadržavaju aktivne sastojke i različita pomoćna sredstva.

Unošenje u tlo / umjetni supstrat

14.

Kemikalije koje su topljive ili suspendirane u vodi mogu se dodati u vodu, a otopina se potom pomiješa sa zemljom odgovarajućim uređajem za miješanje. Ova vrsta testa može biti primjerena ako do izlaganja kemikaliji dolazi kroz tlo ili pornu vodu i postoji rizik od njezina unošenja putem korijena. Dodavanjem ispitivane kemikalije ne smije se premašiti kapacitet tla za vodu. Količina dodane vode mora biti ista za svaku ispitnu koncentraciju, ali mora biti ograničena kako bi se spriječilo stvaranje grudastih nakupina zemlje.

15.

Kemikalije niske topljivosti u vodi treba otopiti u odgovarajućem hlapljivom otapalu (npr. acetonu, etanolu) te pomiješati s pijeskom. Otapalo se potom može ukloniti iz pijeska mlazom zraka uz stalno miješanje pijeska. Tretirani se pijesak pomiješa s pokusnom zemljom. Priprema se druga kontrola koja se sastoji samo od pijeska i otapala. Svim razinama tretmana i drugoj kontroli dodaju se jednake količine pijeska u koji je otapalo bilo umiješano i potom uklonjeno. U slučaju krutih, netopljivih ispitnih kemikalija u odgovarajućem se uređaju za miješanje pomiješaju suha zemlja i kemikalija. Potom se zemlja dodaje u uzgojne posude i odmah se sije sjeme.

16.

Kada se umjesto zemlje upotrebljava umjetni supstrat, kemikalije topljive u vodi mogu se otopiti u hranjivoj otopini netom prije početka ispitivanja. Kemikalije koje nisu topljive u vodi, ali se mogu suspendirati u vodi uporabom nosača otapala, treba u hranjivu otopinu dodati s nosačem. Kemikalije netopljive u vodi za koje ne postoji netoksični nosač topljiv u vodi potrebno je otopiti u odgovarajućem hlapljivom otapalu. Otopina se pomiješa s pijeskom ili staklenim kuglicama, stavi u okretni vakuumski isparivač gdje isprava, nakon čega na pijesku ili kuglicama ostaje ujednačen sloj kemikalije. Odmjereni dio kuglica ekstrahira se istim organskim otapalom te se odredi količina kemikalije prije punjenja uzgojnih posuda.

Površinska primjena

17.

U slučaju sredstava za zaštitu bilja ispitivana se kemikalija često primjenjuje raspršivanjem ispitne otopine po površini tla. Sva oprema koja se upotrebljava za provođenje ispitivanja, uključujući opremu za pripremanje i primjenu ispitivane kemikalije, mora biti takve izrade i kapaciteta da omogući ispravno provođenje ispitivanja uz obnovljivu pokrivenost. Pokrivenost mora biti ujednačena na svim površinama tla. Potrebno je voditi brigu o tome da se izbjegne mogućnost adsorpcije kemikalija na opremu ili njihove reakcije s opremom (npr. plastične cijevi i lipofilne kemikalije ili čelični dijelovi i elementi). Ispitivana se kemikalija raspršuje po površini tla simuliranjem tipične primjene s pomoću prskalice. Količine koje se raspršuju općenito moraju biti u rasponu količina koje se upotrebljavaju u uobičajenoj poljoprivrednoj praksi i treba ih zabilježiti (količina vode itd.). Treba odabrati takvu vrstu mlaznice koja će osigurati ujednačenu pokrivenost površine tla. Ako se primjenjuju otapala i nosači, treba uspostaviti još jednu skupinu kontrolnih biljaka koje će primati samo otapalo/nosač. To nije potrebno za sredstva za zaštitu bilja koja se ispituju kao formulacije.

Verifikacija koncentracije / doze primjene ispitivane kemikalije

18.

Odgovarajućom analitičkom verifikacijom moraju se potvrditi koncentracije / doze primjene. Za topljive se kemikalije verifikacija svih ispitnih koncentracija / doza primjene može potvrditi analizom ispitne otopine najveće koncentracije, s dokumentacijom o naknadnom razrjeđenju i uporabi kalibrirane opreme za primjenu (npr. kalibrirane analitičke staklene posude i kalibriranje opreme za primjenu škropiva). Za netopljive se kemikalije verifikacija mora poduprijeti masama ispitne kemikalije dodane tlu. Ako je potrebno dokazati homogenost, može biti potrebna analiza tla.

POSTUPAK

Plan ispitivanja

19.

Sjeme iste vrste posije se u uzgojne posude. Broj sjemenki posijanih u pojedinoj posudi ovisit će o vrsti, veličini posude i trajanju ispitivanja. Broj biljaka po posudi mora biti takav da omogući primjerene uvjete rasta i spriječi preveliku gustoću za vrijeme trajanja ispitivanja. Maksimalna gustoća sjemena iznosi oko tri do deset sjemenki na 100 cm2, ovisno o veličini sjemena. Na primjer, preporučuju se jedna do dvije biljke kukuruza, soje, rajčice, krastavca ili šećerne repe po posudi od 15 cm, tri biljke repe ili graška po posudi od 15 cm te pet do deset sjemenki luka, pšenice ili drugog sitnog sjemena po posudi od 15 cm. Broj sjemenki i ponavljanja (ponavljanje se definira kao jedna uzgojna posuda pa biljke u istoj posudi nisu ponavljanje) mora biti takav da osigura optimalnu statističku analizu (21). Valja napomenuti da će varijabilnost biti veća kod ispitnih vrsta za koje se upotrebljava manji broj velikih sjemenki po posudi (ponavljanju) u usporedbi s ispitnim vrstama kod kojih je moguće upotrijebiti veći broj manjih sjemenki po posudi. Sijanjem jednakog broja sjemenki u svaku posudu ta se varijabilnost može smanjiti.

20.

Kontrolne se skupine upotrebljavaju kako bi se osiguralo da se uočeni učinci povezuju isključivo s izloženošću ispitivanoj kemikaliji ili da se pripisuju isključivo toj izloženosti. Odgovarajuća kontrolna skupina mora u svakom pogledu biti identična ispitnoj skupini, osim izloženosti ispitivanoj kemikaliji. Unutar određenog ispitivanja sve ispitne biljke, uključujući kontrole, moraju biti iz istog izvora. Kako bi se izbjegla pristranost, ispitne i kontrolne uzgojne posude potrebno je odrediti slučajnim odabirom.

21.

Treba izbjegavati sjeme tretirano insekticidom ili fungicidom (tj. ‚obloženo’ sjeme). Međutim, neka regulatorna tijela dopuštaju primjenu određenih nesistemičnih kontaktnih fungicida (npr. kaptana i tirama) (22). Ako postoji zabrinutost zbog patogena koji se prenose sjemenjem, sjeme se može kratko namakati u slaboj petpostotnoj otopini hipoklorita i potom temeljito isprati tekućom vodom te osušiti. Nije dopušteno nikakvo kurativno tretiranje drugim sredstvom za zaštitu bilja.

Uvjeti ispitivanja

22.

Uvjeti ispitivanja moraju biti približni uvjetima koji su potrebni za normalan rast ispitivanih vrsta i sorti (u Dodatku 4. navedeni su primjeri uvjeta ispitivanja). Iznikle biljke potrebno je održavati u skladu s dobrom hortikulturnom praksom u kontroliranim uvjetima u komorama, fitotronima ili staklenicima. Ako se upotrebljavaju objekti za rast, ta praksa obično uključuje kontrolu i primjereno često (npr. dnevno) bilježenje temperature, vlažnosti, koncentracije ugljičnog dioksida, svjetlosti (intenzitet, valna duljina, fotosintetički aktivno zračenje) te razdoblja svjetlosti, načina zalijevanja itd. kako bi se osigurao dobar rast biljaka koji se ocjenjuje promatranjem kontrolnih biljaka odabranih vrsta. Temperature u stakleniku potrebno je kontrolirati sustavima ventilacije, grijanja i/ili hlađenja. Za ispitivanja u staklenicima općenito se preporučuju sljedeći uvjeti:

temperatura: 22 °C ± 10 °C;

vlaga: 70 % ± 25 %;

fotoperiod: najmanje 16 sati svjetlosti;

intenzitet svjetlosti: 350 ± 50 μE/m2/s. Ako intenzitet padne ispod 200 μE/m2/s, valne duljine 400 – 700 nm, možda će biti potrebno dodatno osvjetljenje, osim za određene vrste čije su potrebe za svjetlošću manje.

Tijekom trajanja ispitivanja treba pratiti i bilježiti okolišne uvjete. Biljke je potrebno uzgajati u neporoznim plastičnim ili glaziranim posudama postavljenima na podložak ili tanjurić. Posude se mogu periodično premještati kako bi se smanjila varijabilnost rasta biljaka (zbog razlika u uvjetima ispitivanja unutar objekta za uzgoj). Posude moraju biti dovoljno velike da omoguće normalan rast.

23.

Hranjive tvari tla mogu se prema potrebi dopuniti kako bi se održao dobar vigor biljaka. Potreba za dodatnim hranjivim tvarima i vrijeme njihova dodavanja mogu se procijeniti promatranjem kontrolnih biljaka. Preporučuje se zalijevati ispitne posude odozdo (npr. uporabom vrpci od staklenih vlakana). Međutim, prvo zalijevanje može biti površinsko kako bi se potaknulo klijanje sjemena i, kad je riječ o sredstvu koje se primjenjuje po površini tla, kako bi se olakšalo prodiranje kemikalije u tlo.

24.

Specifični uvjeti rasta moraju biti primjereni za ispitnu vrstu i ispitivanu kemikaliju. Kontrolne i tretirane biljke moraju se držati u istim okolišnim uvjetima, ali treba poduzeti odgovarajuće mjere za sprječavanje unakrsne izloženosti (npr. zbog hlapljivih kemikalija) među različitim tretmanima, kao i izloženosti kontrola ispitivanoj kemikaliji.

Ispitivanje s jednom koncentracijom / dozom primjene

25.

Pri određivanju odgovarajuće koncentracije / doze primjene kemikalije koja će se upotrijebiti u testu s jednom koncentracijom ili dozom primjene (test izazova / granični test) mora se uzeti u obzir više faktora. Kad je riječ o kemikalijama u općoj uporabi, ti faktori uključuju njihova fizikalno-kemijska svojstva. Kad je riječ o sredstvima za zaštitu bilja, potrebno je uzeti u obzir fizikalno-kemijska svojstva i obrazac uporabe ispitivane kemikalije, njezinu maksimalnu koncentraciju ili dozu primjene, broj primjena po sezoni i/ili njezinu postojanost. Da bi se odredilo ima li kemikalija u općoj uporabi fitotoksična svojstva, može biti primjereno ispitati maksimalnu količinu od 1 000 mg/kg suhog tla.

Ispitivanje za određivanje raspona

26.

Prema potrebi može se provesti ispitivanje za određivanje raspona kako bi se dobile smjernice o tome koje bi koncentracije / doze primjene trebalo ispitati u glavnom istraživanju odnosa između doze i odgovora. Kod ispitivanja za određivanje raspona potrebno je odabrati ispitne koncentracije / doze primjene sa širokim intervalima (npr. 0,1, 1,0, 10, 100 i 1 000 mg/kg suhog tla). Ako je riječ o sredstvima za zaštitu bilja, koncentracije / doze primjene mogu se temeljiti na preporučenoj ili maksimalnoj koncentraciji odnosno dozi primjene, npr. 1/100, 1/10, 1/1 preporučene/maksimalne koncentracije ili doze primjene.

Ispitivanje s više koncentracija / doza primjene

27.

Svrha je ispitivanja s više koncentracija / doza primjene utvrditi odnos između doze i odgovora te odrediti vrijednost ECx ili ERx za nicanje, biomasu i/ili vizualne učinke u usporedbi s neizloženim kontrolama, kako to zahtijevaju regulatorna tijela.

28.

Broj i interval između koncentracija ili doza primjene moraju biti dovoljni da se može pouzdano utvrditi odnos između doze i odgovora i regresijska jednadžba te procijeniti vrijednost ECx. ili ERx.. Odabrane koncentracije / doze primjene moraju obuhvaćati vrijednosti ECx ili ERx koje je potrebno odrediti. Na primjer, ako se traži vrijednost EC50, poželjno je provesti ispitivanje s dozama primjene koje proizvode 20-postotni do 80-postotni učinak. Da bi se to postiglo, preporučuje se najmanje pet ispitnih koncentracija / doza primjene u geometrijskom nizu, plus netretirana kontrola, s faktorom ne većim od tri. Za svaku ispitnu i kontrolnu skupinu potrebna su najmanje četiri ponavljanja, a ukupan broj sjemenki mora iznositi najmanje 20. Za određene biljke koje imaju nizak stupanj klijavosti ili promjenjive značajke rasta ponekad je potrebno više ponavljanja kako bi se povećala statistička snaga ispitivanja. Ako se upotrebljava veći broj ispitnih koncentracija / doza primjene, broj ponavljanja može se smanjiti. Ako treba odrediti NOEC, možda će biti potrebno više ponavljanja kako bi se postigla željena statistička snaga (23).

Promatranja

29.

Razdoblje promatranja, tj. 14 do 21 dan nakon što nikne 50 % kontrolnih biljaka (i kontrola s otapalom, ako je primjenjivo), biljke se učestalo promatraju (najmanje jednom tjedno, a po mogućnosti svakodnevno) kako bi se provjerilo njihovo nicanje te ima li vidljivih znakova fitotoksičnosti i slučajeva uginuća. Na kraju ispitivanja treba zabilježiti izmjereni postotak nicanja te biomasu preživjelih biljaka, kao i štetne učinke vidljive na različitim dijelovima biljke. Štetni učinci uključuju anomalije u izgledu izniklih klijanaca, zakržljali rast, promjenu boje, uginuće te učinke na razvoj biljke. Konačna se biomasa može izmjeriti primjenom konačne prosječne mase suhe tvari izdanka preživjelih biljaka, i to tako da se izdanci uberu pri površini tla te suše do stalne mase na temperaturi od 60 °C. Alternativno, konačna se biomasa može izmjeriti na temelju mase svježe tvari. Druga krajnja točka može biti visina izdanka, ako to zahtijevaju regulatorna tijela. Za ocjenjivanje uočenih toksičnih odgovora potrebno je primjenjivati ujednačeni sustav ocjenjivanja. Praktični primjeri kvalitativnih i kvantitativnih vizualnih ocjenjivanja navedeni su u literaturi (23) (24).

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Statistička analiza

Ispitivanje s jednom koncentracijom / dozom primjene

30.

Primjerenom statističkom metodom potrebno je analizirati podatke za svaku biljnu vrstu (21). Potrebno je izvijestiti o razini učinka pri ispitnoj koncentraciji / dozi primjene ili o nepostizanju određenog učinka pri ispitnoj koncentraciji / dozi primjene (npr. < x % učinka uočenog pri koncentraciji / dozi primjene y)

Ispitivanje s više koncentracija / doza primjene

31.

Odnos između doze i odgovora utvrđuje se regresijskom jednadžbom. Mogu se upotrijebiti različiti modeli: na primjer, za procjenu vrijednosti ECx ili ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) i njihovih granica pouzdanosti za nicanje, u obliku kvantalnih podataka, mogu biti prikladni modeli logit, probit i Weibull te Spearman-Karberova metoda i modificirana Spearman-Karberova metoda. Za rast klijanaca (masa i visina) kao stalnih krajnjih točaka, ECx ili ERx i njihove granice pouzdanosti mogu se procijeniti primjenom odgovarajuće regresijske analize (npr. Bruce-Versteegove nelinearne regresijske analize (25)). Kad je god moguće, vrijednost R2 trebala bi iznositi 0,7 ili više za najosjetljivije vrste, a upotrijebljene ispitne koncentracije / doze primjene moraju obuhvaćati 20 % do 80 % učinaka. Ako je potrebno procijeniti NOEC, poželjno je primijeniti snažne statističke testove koje treba odabrati na temelju distribucije podataka (21) (26).

Izvješće o ispitivanju

32.

U izvješću o ispitivanju potrebno je navesti rezultate ispitivanja te detaljan opis uvjeta ispitivanja, iscrpnu raspravu o rezultatima, analizu podataka i zaključke izvučene iz analize. Potrebno je navesti sažetak u obliku tablice i sintezu rezultata. Izvješće mora sadržavati sljedeće:

 

Ispitivana kemikalija:

podaci za identifikaciju kemikalije, relevantna svojstva ispitivane kemikalije (npr. log Pow, topljivost u vodi, tlak para te podaci o sudbini i ponašanju u okolišu, ako su dostupni),

pojedinosti o pripremi ispitne otopine i verifikaciji ispitnih koncentracija, kako je navedeno u stavku 18.

 

Ispitne vrste:

pojedinosti o ispitnom organizmu: vrsta/sorta, biljne porodice, znanstveni i uobičajeni nazivi, izvor i povijest sjemena što je moguće detaljnije (tj. ime dobavljača, postotak klijavosti, kategorija veličine sjemena, broj serije ili partije, sjemena godina ili vegetacijsko razdoblje u kojemu je prikupljeno, datum ocjenjivanja klijavosti), vitalnost itd.,

broj ispitanih vrsta jednosupnica i dvosupnica,

razlozi za odabir vrsta,

opis skladištenja, tretiranja i održavanja sjemena.

 

Uvjeti ispitivanja:

objekt u kojemu se provelo ispitivanje (npr. uzgojna komora, fitotron i staklenik),

opis ispitnog sustava (npr. dimenzije uzgojnih posuda, materijal od kojeg su napravljene uzgojne posude te količine zemlje),

svojstva zemlje (tekstura ili vrsta zemlje: distribucija i klasifikacija čestica zemlje, fizikalna i kemijska svojstva, uključujući postotak organske tvari, postotak organskog ugljika i pH);

priprema zemlje/supstrata (npr. tlo, umjetno tlo, pijesak i ostalo) prije ispitivanja,

opis hranjivog medija, ako je upotrijebljen,

primjena ispitivane kemikalije: opis metode primjene, opis opreme, doza izloženosti i količina, uključujući kemijski provjeru, opis metode umjeravanja i opis okolišnih uvjeta tijekom primjene,

uvjeti rasta: intenzitet svjetlosti (npr. PAR, fotosintetički aktivno zračenje), fotoperiod, najviše/najniže temperature, raspored i metoda zalijevanja, gnojenje,

broj sjemenki po uzgojnoj posudi, broj biljaka po dozi, broj ponavljanja (uzgojnih posuda) po dozi izloženosti,

vrsta i broj kontrola (negativne i/ili pozitivne kontrole te kontrola s otapalom, ako je upotrijebljena),

trajanje ispitivanja.

 

Rezultati:

tablica svih krajnjih točaka za svako ponavljanje, ispitnu koncentraciju / stupanj i vrstu,

broj i postotak izniklih klijanaca u usporedbi s kontrolama,

mjerenja biomase biljaka (suha ili svježa masa izdanaka) izražena kao postotak kontrola,

visine izdanaka biljaka izražene kao postotak kontrola, ako su izmjerene,

postotak vidljivih oštećenja te kvalitativan i kvantitativan opis vidljivih oštećenja (kloroza, nekroza, uvenuće, deformacije lista i stabljike, kao i svako nepostojanje učinaka) koje je uzrokovala ispitna kemikalija, u usporedbi s kontrolnim biljkama,

opis ljestvice ocjenjivanja primijenjene za procjenu vidljivih oštećenja, ako se izvješćuje o vizualnom ocjenjivanju,

za ispitivanja s jednom dozom primjene treba navesti postotak oštećenja,

vrijednosti ECx ili ERx (npr. EC50, ER50, EC25, ER25) i pripadajuće granice pouzdanosti. Ako se provodi regresijska analiza, navodi se standardna pogreška za regresijsku jednadžbu te standardna pogreška za procjenu pojedinačnih parametara (npr. nagiba, sjecišta),

vrijednosti NOEC (i LOEC) ako su izračunane,

opis primijenjenih statističkih postupaka i pretpostavki,

grafički prikaz navedenih podataka i odnosa između doze i odgovora ispitnih vrsta.

Odstupanja od postupaka opisanih u ovoj ispitnoj metodi i sve neuobičajene pojave tijekom ispitivanja.

LITERATURA

(1)

Schrader G., Metge K. i Bahadir M. (1998.) Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189 – 193.

(2)

International Organisation of Standards. (1993.) ISO 11269-1. Soil Quality – Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth.

(3)

International Organisation of Standards. (1995.) ISO 11269-2. Soil Quality – Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants.

(4)

American Standard for Testing Material (ASTM). (2002.) E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests.

(5)

US EPA. (1982.) FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1.

(6)

US EPA. (1996.) OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:

850.4000: Background – Non-target Plant Testing;

850.4025: Target Area Phytotoxicity;

850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence);

850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test;

850.4225: Seedling Emergence, Tier II;

850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.

(7)

AFNOR, X31-201. (1982.) Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993.) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines.

(8)

Boutin, C., Freemark, K. E. i Keddy, C. J. (1993.) Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No. 145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada.

(9)

Forster, R., Heimbach, U., Kula, C. i Zwerger, P. (1997.) Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No. 48.

(10)

Hale, B., Hall, J. C., Solomon, K. i Stephenson, G. (1994.) A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada.

(11)

Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985.) i Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962.)

(12)

Audus, L. J. (1964.) Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L. J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, poglavlje 5., str. 163. – 206.

(13)

Beall, M. L., Jr. i Nash, R. G. (1969.) Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575.

(14)

Beetsman, G. D., Kenney, D. R. i Chesters, G. (1969.) Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250.

(15)

U. S. Food and Drug Administration (FDA). (1987.) Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, str. 14, FDA, Washington, DC.

(16)

McKelvey, R. A., Wright, J. P., Honegger, J. L. i Warren, L. W. (2002.) A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174

(17)

Boutin, C.; Elmegaard, N. i Kjær, C. (2004.) Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349 – 369.

(18)

Boutin, C. i Rogers, C. A. (2000.) Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol. 9(4):255-271.

(19)

Boutin, C. i Harper, J. L. (1991.) A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271.

(20)

Boutin, C., Lee, H. B., Peart, T. E., Batchelor, S. P. i Maguire, R. J.. (2000.) Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532 – 2541.

(21)

OECD (2006.) Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(22)

Hatzios, K. K. i Penner, D. (1985.) Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63.

(23)

Hamill, P. B., Marriage, P. B. i Friesen, G. (1977.) A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389.

(24)

Frans, R. E. i Talbert, R. E. (1992.) Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2. izdanje, Southern weed Science Society, Auburn, 15 – 23.

(25)

Bruce, R. D. i Versteeg, D. J. (1992.) A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485 – 1492.

(26)

Poglavlje C.33. ovog Priloga: Test reproduktivne toksičnosti na gujavicama (Eisenia fetida/Eisenia andrei).

Dodatak 1.

Definicije

 

Aktivni sastojak (a. s.) (ili aktivna tvar (a. t.)): materijal namijenjen postizanju posebnog biološkog učinka (npr. suzbijanje kukaca, suzbijanje bolesti bilja, suzbijanje korova na području tretiranja), poznat i kao tehnički aktivni sastojak ili tehnička aktivna tvar.

 

Kemikalija znači tvar ili smjesa.

 

Proizvodi za zaštitu usjeva (PZU) ili sredstva za zaštitu bilja (SZB) ili pesticidi: materijali koji imaju specifično biološko djelovanje i namjerno se primjenjuju radi zaštite usjeva od nametnika (npr. gljivičnih bolesti, kukaca i kompetitivnih biljaka).

 

ECx. koncentracija s x-postotnim učinkom ili ERx. doza s x-postotnim učinkom: koncentracija ili doza koja dovodi do x-postotne neželjene promjene u ispitnoj krajnjoj točki koja se mjeri u odnosu na kontrolu (npr. 25-postotno ili 50-postotno smanjenje broja izniklih klijanaca, mase izdanaka, konačnog broja prisutnih biljaka ili 25-postotno ili 50-postotno povećanje vidljivih oštećenja daje EC25/ER25 odnosno EC50/ER50).

 

Nicanje: pojava koleoptila ili kotiledona iznad površine tla.

 

Formulacija: komercijalno formulirano sredstvo koje sadržava aktivnu tvar (aktivni sastojak), poznato i kao konačni pripravak (8) ili tipični proizvod za krajnju uporabu (eng. typical end-use product (TEP)).

 

LOEC (najniža koncentracija s vidljivim učinkom): najniža koncentracija ispitivane kemikalije pri kojoj je uočen učinak. U ovom ispitivanju koncentracija koja odgovara LOEC-u ima statistički značajan učinak (p < 0,05) unutar zadanog razdoblja izloženosti u usporedbi s kontrolom i veća je od vrijednosti NOEC-a.

 

Biljke koje ne pripadaju ciljanoj skupini: biljke izvan područja na kojemu se nalaze ciljane biljke. Kad je riječ o sredstvima za zaštitu bilja, to se obično odnosi na biljke izvan područja na kojemu se provodi tretiranje.

 

NOEC (najviša koncentracija bez vidljivog učinka): najviša koncentracija ispitivane kemikalije pri kojoj nije uočen nikakav učinak. U ovom ispitivanju koncentracija koja odgovara NOEC-u nema statistički značajan učinak (p < 0,05) unutar zadanog razdoblja izloženosti u usporedbi s kontrolom.

 

Fitotoksičnost: štetna odstupanja (prema izmjerenim vrijednostima ili vizualnoj procjeni) od normalnog izgleda i načina rasta biljaka koja se javljaju kao reakcija na određenu kemikaliju.

 

Ponavljanje: pokusna jedinica koja predstavlja kontrolnu skupinu i/ili skupinu koja se tretira. U ovom se ispitivanju uzgojna posuda definira kao ponavljanje.

 

Vizualna procjena: ocjenjivanje vidljivih oštećenja na temelju promatranja sklopa i vigora biljaka, deformacija, kloroze, nekroze i cjelokupnog izgleda u usporedbi s kontrolom.

 

Ispitivana kemikalija: bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.

Dodatak 2.

Popis vrsta koje se obično upotrebljavaju u ispitivanjima na biljkama

Porodica

Vrsta

Uobičajeni nazivi

DICOTYLEDONAE

Apiaceae (Umbelliferae)

Daucus carota

Mrkva

Asteraceae (Compositae)

Helianthus annuus

Suncokret

Asteraceae (Compositae)

Lactuca sativa

Zelena salata

Brassicaceae (Cruciferae)

Sinapis alba

Gorušica bijela

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica campestris var. chinensis

Kineski kupus

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica napus

Uljana repica

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica oleracea var. capitata

Kupus

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica rapa

Postrna repa

Brassicaceae (Cruciferae)

Lepidium sativum

Vrtni borovnjak

Brassicaceae (Cruciferae)

Raphanus sativus

Rotkvica

Chenopodiaceae

Beta vulgaris

Šećerna repa

Cucurbitaceae

Cucumis sativus

Krastavac

Fabaceae (Leguminosae)

Glycine max (G. soja)

Soja za zrno

Fabaceae (Leguminosae)

Phaseolus aureus

Mungo grah

Fabaceae (Leguminosae)

Phaseolus vulgaris

Grah

Fabaceae (Leguminosae)

Pisum sativum

Grašak

Fabaceae (Leguminosae)

Trigonella foenum-graecum

Piskavica (grčka djetelina)

Fabaceae (Leguminosae)

Lotus corniculatus

Smiljkita roškasta

Fabaceae (Leguminosae)

Trifolium pratense

Djetelina crvena

Fabaceae (Leguminosae)

Vicia sativa

Grahorica jara

Linaceae

Linum usitatissimum

Lan

Polygonaceae

Fagopyrum esculentum

Heljda

Solanaceae

Solanum lycopersicon

Rajčica

MONOCOTYLEDONAE

Liliaceae (Amarylladaceae)

Allium cepa

Luk

Poaceae (Gramineae)

Avena sativa

Zob

Poaceae (Gramineae)

Hordeum vulgare

Ječam

Poaceae (Gramineae)

Lolium perenne

Ljulj engleski

Poaceae (Gramineae)

Oryza sativa

Riža

Poaceae (Gramineae)

Secale cereale

Raž

Poaceae (Gramineae)

Sorghum bicolor

Stočni sirak

Poaceae (Gramineae)

Triticum aestivum

Pšenica

Poaceae (Gramineae)

Zea mays

Kukuruz

Dodatak 3.

Popis mogućih nepoljoprivrednih vrsta

Vrste koje je prema OECD-u moguće upotrebljavati za ispitivanje toksičnosti za bilje

Napomena: U sljedećoj su tablici navedeni podaci za 52 nepoljoprivredne vrste (kod svakog je unosa u zagradama navedeno upućivanje na literaturu). Navedene stope nicanja uzete su iz objavljene literature i služe samo za opću orijentaciju. Pojedinačno iskustvo može varirati ovisno o izvoru sjemena i drugim faktorima.

PORODICA Botanički naziv vrste

(Uobičajeni hrvatski naziv)

Životni vijek (9) i stanište

Težina sjemena

(mg)

Fotoperiod za klijanje ili rast (10)

Dubina sadnje

(mm) (11)

Vrijeme potrebno za klijanje

(u danima) (12)

Posebna obrada (13)

Test toksičnosti (14)

Dobavljači sjemena (15)

Ostala upućivanja (16)

APIACEAE

Torilis japónica

(kimljen divlji)

J, D poremećena područja, živice, pašnjaci (16, 19)

1,7 – 1,9 (14, 19)

L = D (14)

0

(1, 19)

5 (50 %) (19)

hladna stratifikacija (7, 14, 18, 19), može biti potrebno dozrijevanje (19), klijanje inhibirano tamom (1, 19), nikakva posebna obrada (5)

POST (5)

 

 

ASTERACEAE

Bellis perennis

(tratinčica)

V

travnjaci, oranice, ledine (16, 19)

0,09 – 0,17 (4, 19)

L = D (14)

0

(4)

3 (50 %) (19)

11 (100 %) (18)

zračenje ne utječe na klijanje (18, 19), nikakva posebna obrada (4, 14)

POST (4)

A, D, F

7

Centaurea cyanus

(različak)

J

polja, uz ceste, otvorena staništa (16)

4,1 – 4,9 (4, 14)

L = D (14)

0 – 3 (2, 4, 14)

14 – 21 (100 %) (14)

nikakva posebna obrada (2, 4)

POST (2,4)

A, D, E, F

7

Centaurea nigra

(crna zečina)

V

polja, uz ceste, otvorena staništa (16, 19)

2,4 – 2,6 (14, 19)

L = D (14)

0 (19)

3 (50 %) (19)

4 (97 %) (18)

može biti potrebno dozrijevanje (18, 19), klijanje inhibirano tamom (19), nikakva posebna obrada (5, 14, 26)

POST (5, 22, 26)

A

 

Inula helenium

(pravi oman)

V

vlažna, poremećena mjesta

(16)

1 – 1,3 (4, 14, 29)

 

0

(4, 29)

 

nikakva posebna obrada (4)

POST (4)

A, F

 

Leontodon hispidus

(lavlji zub)

V

polja, uz ceste, poremećena područja (16, 19)

0,85 – 1,2 (14, 19)

L = D (14)

0 (19)

4 (50 %) (19)

7 (80 %) (18)

klijanje inhibirano tamom (17, 18, 19), nikakva posebna obrada (5, 23)

POST (5, 22, 23)

 

 

Rudbeckia hirta

(crnooka pupavica)

D, V poremećena područja

(16)

0,3 (4, 14)

L = D (14)

0

(4, 33)

< 10 (100 %) (33)

nikakva posebna obrada

(4, 14, 33)

POST (4, 33)

C, D, E, F

 

Solidago canadensis