o prikupljanju uzoraka i donošenju određenih detaljnih pravila u vezi s fizičkim pregledom rezanih dijelova govedine bez kostiju koji se kvalificiraju za povrat izvoznih naknada

uzimajući u obzir Uredbu Vijeća (EZ) br. 1254/1999 od 17. svibnja 1999. o zajedničkoj organizaciji tržišta govedinom i teletinom (1), kako je zadnje izmijenjena Uredbom Komisije (EZ) br. 2345/2001 (2), a posebno njezin članak 33. stavak 12.,

uzimajući u obzir Uredbu Vijeća (EEZ) br. 386/90 od 12. veljače 1990. o praćenju provedenom u vrijeme izvoza poljoprivrednih proizvoda koji primaju povrat sredstava ili druge iznose (3), kako je izmijenjena Uredbom (EZ) br. 163/94 (4), a posebno njezin članak 6.,

1. Ova se Uredba primjenjuje u slučaju fizičkih pregleda, prirode i svojstava proizvoda u smislu članka 2. točke (a) Uredbe (EEZ) br. 386/90 u pogledu:

2. Opis proizvoda koji se spominju u stavku 1. je onaj sadržan u nomenklaturi poljoprivrednih proizvoda za povrat izvoznih naknada izložen u odjeljku 5. Priloga I. Uredbi (EEZ) br. 3846/87.

1. U svrhu fizičkih pregleda, uzorci se sastoje od dvije pune kartonske kutije uzete iz dva različita dijela pošiljke. Prva je kutija namijenjena tijelima odgovornim za preglede, dok se druga drži u pričuvi pod nadzorom carinskih tijela.

2. Količina proizvoda obuhvaćena jednom od sljedećih deklaracija za koju se smatra da čini pošiljku:

U svrhu provjere udovoljavanja obvezi koja se spominje u članku 1. stavku 1. točki (a), carinska tijela provjeravaju da je svaki rezani dio u prvoj kutiji uzorka koji se spominje u članku 2. pojedinačno zapakiran i da svako pakiranje sadrži samo jedan rezani dio. Ako to nije slučaj, isti se nadzor provodi i na drugoj kutiji.

Ako, gledajući zajedno dvije kutije, najviše jedan rezani dio nije pojedinačno pakiran ili jedno pakiranje sadrži više od jednog rezanog dijela, a udovoljeno je svim ostalim uvjetima u smislu povrata sredstava, pošiljka se neće smatrati nepravilnom. Ako nisu uočeni ti uvjeti, smatrat će se da je nastala nepravilnost.

Ako se ustanovi nepravilnost, povrat sredstava koji se može platiti u odnosu na pošiljku izračunava se na temelju ispravljene težine. Ispravljena težina postiže se smanjenjem deklarirane neto težine za postotak koji odgovara težini rezanih dijelova koji ne udovoljavaju u odnosu na ukupnu neto težinu uzorka.

U svrhu pregleda uvjeta u pogledu podrijetla koji se spominje u članku 1. stavku 1. točki (b), uzorak za analizu sastoji se od jednog ili dva rezana dijela nasumično sakupljenih iz prve kutije uzorka koji se spominje u članku 2. Ako analiza pokaže da je prisutno neko drugo meso osim govedine od odraslih muških goveda, ne odobrava se povrat sredstava.

Ne dovodeći u pitanje daljnje preglede na koje se odlučuje ako se posumnja na nepravilnost, pregledi se provode nasumično obuhvaćajući sve izvoze na najmanje jednoj trećini izvoza odabranih za fizički nadzor.

U svrhu pregleda udovoljavanja uvjetu koji se spominje u članku 1. stavku 1. točki (c), čitav sadržaj prve kutije uzorka koji se spominje u članku 2. melje se u homogenu mješavinu. Ako je sadržaj nemasnog mesa ispod propisanog minimuma, sadržaj druge kutije pregledava se na isti način. Ako je prosjek dviju kutija ispod prosjeka propisanog sadržaja nemasnog mesa, ne odobrava se bilo kakav povrat sredstava.

U skladu s člankom 68. i ne dovodeći u pitanje članak 78. Uredbe Vijeća (EEZ) br. 2913/92 (13), uzorci se sakupljaju i pregledavaju, kako je predviđeno ovom Uredbom, u vrijeme prihvaćenih i provjerenih deklaracija, kako je navedeno u članku 2. stavku 2.

Odnosi se na izvoz obuhvaćen deklaracijom, kako je navedeno u članku 2. stavku 2., obuhvaćenim s učinkom od 1. srpnja 2002.

PRILOG

ANALIZA PODRIJETLA ODREĐENIH REZANIH DIJELOVA GOVEDINE BEZ KOSTIJU OD ODRASLIH MUŠKIH GOVEDA

Metodologija koja se primjenjuje za određivanje spola kod govedine

Metodologija koja se treba primijeniti temelji se na lančanoj reakciji polimerazom (PCR) i podrazumijeva uzorkovanje, ekstrakciju DNA, PCR i gel elektroforezu.

1. Uzorkovanje i poduzorkovanje

Poduzorak se izrezuje iz središnjeg dijela (unutrašnjeg) dotičnog komada mesa, korištenjem sterilnog (*) noža (skalpela i slično). Taj se uzorak melje pomoću mikro-usitnjivača ili izrezuje u manje komade kako bi se osigurala razumna učinkovitost ekstrakcije.

Uzorci se moraju pripremiti na različitoj radnoj površini od one koja se rabi za izvođenje PCR-a. Rukovanje materijalom mora se odvijati u okolini koja se lako čisti, po mogućnosti na čistom laboratorijskom stolu, kako bi se osiguralo da se ne dogodi unakrižno onečišćenje drugim uzorcima.

Sterilni (*) noževi, skalpeli ili sličan alat treba se koristiti prilikom pripreme uzorka mesa.

2. Ekstrakcija i purifikacija DNA

Ekstrakcija i purifikacija DNA se provodi ili korištenjem konvencionalnih postupaka (1) kitova koji su spremni za uporabu (temeljenih na principu: otapanje uzorka mesa u puferu lize koji sadrži surfaktante, detergente i proteinazu K, primjena otopljenog uzorka na DNA-vezujuću smolu, odstranjivanje spojeva koji nisu DNA ponavljanim ispiranjima, te na kraju razrjeđenjem purificirane DNA u vodi ili slabo slanom puferu), ili ekstrakcijom DNA u otopini natrij hidroksida (2).

Preporučuje se kontrola uspješne ekstrakcije provođenjem elektroforeze u gelu, no nije obvezna.

Aspekt validacije: za svaku seriju uzoraka koji se trebaju ekstrahirati, usporedno se izvodi jedna kontrola ekstrakcije (tj. nemesna) radi dokazivanja valjanosti primijenjenog postupka.

3. Lančana reakcija polimerazom (PCR)

Princip: princip PCR-a je postupak u tri koraka (denaturacija, cijepanje početnica, produživanje) koji se mora ponoviti nekih 25 do 40 puta (broj „ciklusa” u metodi). Reagensi (reakcijski pufer, MgCl2, deoksinukleotidi, početnice, termostabilna DNA polimeraza, sterilna voda) miješaju se zajedno prema razrađenoj metodi, što tvori tzv. „mastermix”. Namjenske pipete koriste se za pripravu mastermixa. Taj mastermix se potom dodaje na DNA predložak (ekstrahiranu DNA). Reakcija se provodi u aparatu „thermo-cycler”. Nakon dovršetka, produkti PCR-a analiziraju se gel elektroforezom ili se pohranjuju na 4 °C ili na – 20 °C.

Preporučena metoda (3) koja bi se trebala primijeniti, u odnosu na predložak, mora ili pojačavati sekvencu unutar lokusa amelogenina (homolognoga gena) ili unutar područja ZFX/Y (alel-specifičan PCR).

Specifične početnice za te dvije različite metode su:

Amelogenin prema naprijed: 5′-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3′

Reverzni amelogenin: 5′-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3′

(Ennis, S., and Gallagher, T.F. (1994) Anim. Genet. 25: 425-427)

Amelogenin prema naprijed: 5′-AAATTCTCTCACAGTCCAAG-3′

Reverzni amelogenin: 5′-CAACAGGTAATTTTCCTTTAG-3′

(Chen, C.M., Hu, C.L., Wang, C.H., Hung, C.M., Wu, H.K., Choo, K.B., and Cheng, W.T.K. (1999) Mol. Reprod. Dev. 54, 209-214)

ZFX (alel-specifičan), prema naprijed: 5′-GACAGCTGAACAAGTGTTACTG-3′

Reverzni ZFX (alel-specifičan): 5′-AATGTCACACTTGAATCGCATC-3′

ZFY (alel-specifičan), prema naprijed: 5′-GAAGGCCTTCGAATGTGATAAC-3′

Reverzni ZFY (alel-specifičan): 5′-CTGACAAAAGGTGGCGATTTCA-3′

(Kirkpatrick, B.W., and Monson, R.L. (1993) J. Reprod. Fertil. 98: 335-340)

ZFX prema naprijed: 5′-AGCTGAACAAGGGTTACTG-3′

ZFY prema naprijed: 5′-CAAGCTTACCAGCAAGTCA-3′

Reverzni ZFX/Y: 5′-CCAGTATGGATTCGCATGT-3′

(Zinovieva, N., Palma, G., Müller, M., and Brem G. (1995) Theriogenology 43: 265)

PCR mastermixi moraju se prirediti na čistom laboratorijskom stolu koji se nakon rada dekontaminira korištenjem detergenata i UV svjetla.

—

Razvoj metode: mogu se zatražiti moguće izmjene objavljenih metoda, poput točnog sastava mastermixa (npr. koncentracija MgCl2, koncentracija početnica), količina korištenog predloška DNA, te prilagođen temperaturni program (temperature, vremena stajanja). Pojava nespecifičnih produkata umnažanja vodi optimizaciji (npr. temperatura cijepanja, koncentracija MgCl2, koncentracija početnica itd.) radi jamstva točnosti rezultata.

—

Aspekti validacije: metoda koja će se primijeniti u rutinskoj analizi treba biti primjereno validirana. Analiza slijedećih kontrola mora biti uključena u set uzoraka: kontrola ekstrakcije (bezmesna), negativna PCR kontrola, te referentni uzorci (goveđe meso podrijetlom od mužjaka i ženke, ali i jedan uzorak mesa koji nije goveđe meso). Štoviše, primjenjuje se revalidacija ako se promjene ključne komponente u postupku, poput DNA polimeraze (različiti dobavljač ili proizvod) ili početnice (nova serija).

—	Dobra laboratorijska praksa smatra se neprocjenjivom poput čišćenja i dekontaminacije radne površine i upotrijebljenih instrumenata, razrjeđivanje početnica, namjenska uporaba pipeta itd.

4. Analiza umnožaka gel elektroforezom

Dobiveni fragmenti PCR-a (umnošci) trebaju se analizirati gel elektroforezom. Primjenjivi su ili agarozni gelovi koji se boje s etidij bromidom ili poliakrilamidni gelovi koji se boje sa srebrom nakon elektroforetskog odvajanja. Potrebno je na gelu upotrijebiti primjereni marker molekulske težine kako bi se odredila približna veličina dobivenih umnožaka.

5. Dokumentacija

Dobiveni rezultati trebaju se primjereno dokumentirati (slika gela, opis rezultata, bilježenje bilo kakvih neočekivanih rezultata).

(*) Nezagađene s DNA

(1) Kako je opisano u: Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (eds) in: Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989).

(2) Kako je opisano u: Elphinestone, J.G., Hennessey, J., Wilson, J.K., and Stead, D.E. (1996) Bulletin OEPP/EPPO 26, 663-678.

(3) PCR metode osim one koja je preporučena podložne su odobrenju službeno određenog referentnog laboratorija.