o propisivanju metoda analize i ispitivanja toplinski obrađenog mlijeka za izravnu prehranu ljudi

uzimajući u obzir Direktivu Vijeća 85/397/EEZ od 5. kolovoza 1985. o zdravstvenim problemima ljudi i životinja koji utječu na trgovinu termički obrađenim mlijekom unutar Zajednice (1), a posebno njezin članak 11. stavak 6.,

budući da, prema članku 11. stavku 6. Direktive 85/397/EEZ, Vijeće treba propisati detaljne odredbe za preglede koji su predviđeni člankom 11. stavkom 2.; budući da je svrha tih pregleda, koje će provesti objekti pod nadzorom i odgovornošću službenog tijela i uz povremene inspekcije službenog tijela, osigurati udovoljavanje zahtjevima iz Direktive 85/397/EEZ, a naročito onih koji su propisani njezinim člankom 3. stavkom A točkom 3.;

budući da propisivanje postupaka za preglede uključuje određivanje metoda koje će se koristiti pri njihovoj provedbi,

budući da se moraju propisati metode za određivanje ukupnog udjela suhih tvari, masti, bezmasnih suhih tvari, ukupnog udjela dušika, bjelančevina i gustoće toplinski obrađenog mlijeka namijenjenog izravnoj prehrani ljudi;

budući da iz tehničkih razloga treba prvo propisati referentne metode analize i ispitivanja kako bi se osiguralo zadovoljenje normi propisanih člankom 3. stavkom A točkom 3. Direktive 85/397/EEZ; budući da je naročito važno napraviti studiju uvjeta pod kojima se koriste redovne metode analize i ispitivanja; budući da se, dok su rezultati te studije još nepoznati, nadležna tijela moraju pobrinuti da se koriste odgovarajuće redovne metode kako bi se osiguralo zadovoljenje navedenih normi;

budući da je za određivanje gore navedenih metoda naročito potrebno odrediti analitičke postupke i utvrditi kriterije pouzdanosti kako bi se osiguralo jedinstveno tumačenje rezultata,

Provedba referentnih metoda analiza i ispitivanja, određivanje kriterija pouzdanosti i sakupljanje uzoraka provodi se u skladu s pravilima navedenima u Prilogu I.

Sastavljeno u Bruxellesu 14. studenoga 1992.

Za Vijeće

Predsjednik

J. GUMMER

Opisane su opće odredbe u pogledu reagensa, opreme, izražavanja rezultata, preciznosti i izvještaja o ispitivanju. Nadležna tijela država članica i laboratoriji zaduženi za provedbu uzorkovanja i ispitivanja mlijeka moraju poštovati ove odredbe.

2.1.1. Kada se spominje vodu za potrebe otapanja, razrjeđivanja ili ispiranja, koristi se destilirana voda, deionizirana voda ili demineralizirana voda najmanje jednake čistoće, osim ako nije drukčije navedeno.

2.1.2. Kada se spominje „otapanje” ili „razrjeđivanje” bez dodatnih navoda, podrazumijeva se „otapanje u vodi” ili „razrjeđivanje vodom”.

Sve kemijske tvari koje se koriste moraju imati priznatu analitičku čistoću osim ako nije drukčije navedeno.

Popisi opreme za različite referentne metode sadrže samo pribor za posebnu upotrebu i pribor koji zahtijeva posebnu specifikaciju.

Osim ako je drukčije navedeno, rezultati navedeni u izvještaju o ispitivanju (6) su srednja aritmetička vrijednost dobivena dvama ispitivanjima koja zadovolje kriterij ponovljivosti (5.1.1.) naveden za tu metodu. Ako kriterij ponovljivosti nije zadovoljen, ispitivanje mora biti ponovljeno, ako je to moguće, ili rezultat proglašen nevažećim.

Kriteriji preciznosti koji su zadani u svakoj metodi definirani su kako slijedi:

5.1.1. Ponovljivost (r) je vrijednost ispod koje se nalazi apsolutna razlika između dvaju pojedinačnih rezultata ispitivanja dobivena primjenom istog postupka na jednakom materijalu za ispitivanje, pod istim uvjetima (isti analitičar, ista oprema, isti laboratorij i kratki vremenski interval).

5.1.2. Obnovljivost (R) je vrijednost ispod koje se nalazi apsolutna razlika između dvaju pojedinačnih rezultata ispitivanja dobivena primjenom istog postupka na jednakom materijalu za ispitivanje, pod različitim uvjetima (drugi analitičar, druga oprema, drugi laboratoriji, i/ili drugo vrijeme).

5.1.3. Osim ako je navedeno drukčije navedeno za svaku pojedinu metodu vrijednosti kriterija ponovljivosti i obnovljivosti svakog postupka predstavljaju intervale s razinom pouzdanosti od 95 % u skladu s ISO 5725: 2. izdanje, 1986.

5.1.4. Potrebna međulaboratorijska testiranja i studije treba planirati i provoditi u skladu s međunarodnim smjernicama.

U izvještaju o ispitivanju navode se korištena metoda analize i dobiveni rezultati. Osim toga, on sadrži sve pojedinosti o postupku koje nisu određene metodom analize ili su izborne, kao i sve druge okolnosti koje su mogle utjecati na dobivene rezultate. Izvještaj o ispitivanju pruža sve potrebne informacije za potpunu identifikaciju uzorka.

Ovim postupkom određuje se referentna metoda uzorkovanja, prijevoza i skladištenja uzoraka toplinski obrađenog mlijeka.

Uzorkovanje toplinski obrađenog mlijeka u spremnicima itd. provodi stručna osoba koja je prošla odgovarajuću obuku prije uzorkovanja mlijeka.

Ako je to potrebno, nadležna tijela ili laboratorij koji provodi ispitivanje podučavaju osoblje koje provodi uzorkovanje o tehnikama uzorkovanja kako bi se osiguralo da uzorak bude reprezentativan i u skladu s cijelom serijom.

Ako je to potrebno, nadležna tijela ili laboratorij koji provodi ispitivanje podučavaju osoblje koje provodi uzorkovanje o označivanju uzorka kako bi se osigurao nedvojbeni identitet uzorka.

Oprema za uzorkovanje izrađena je od nehrđajućeg čelika ili drugog odgovarajućeg materijala primjerene čvrstoće i oblika koji odgovara njezinoj namjeni (miješanje, uzorkovanje itd.). Stapovi i miješalice za miješanje tekućine u spremnicima moraju imati dovoljno prostora za odgovarajuće miješanje proizvoda, a da ne uzrokuju nastajanje užeglog okusa. Žlica mora imati čvrstu ručku dostatne dužine kako bi se omogućilo uzorkovanje na bilo kojoj dubini u spremniku. Kapacitet žlice ne smije biti manji od 50 ml.

Spremnici za uzorke i poklopci trebali bi biti od stakla, odgovarajućih metala ili plastike.

Materijali od kojih je izrađena oprema za uzorkovanje (uključujući spremnike i poklopce) ne smiju uzrokovati nikakve promjene na uzorcima koje bi mogle utjecati na rezultate ispitivanja. Sve površine opreme za uzorkovanje i spremnika za uzorke moraju biti čiste i suhe, glatke i bez pukotina, i rubovi im moraju biti zaobljeni.

Bez obzira na ispitivanja koja treba provesti, mlijeko treba potpuno promiješati prije uzorkovanja, i to ručno ili strojno.

Volumen uzorka odgovara zahtjevima ispitivanja. Kapacitet korištenih spremnika za uzorke je takav da su gotovo u potpunosti ispunjeni uzorkom, i da se time omogući odgovarajuće miješanje sadržaja prije ispitivanja, i izbjegne bućkanje tijekom transporta.

U slučaju kada se količina mlijeka iz koje se trebaju uzeti uzorci nalazi u više spremnika, treba uzeti reprezentativnu količinu iz svakog spremnika i zabilježiti na koju količinu mlijeka se odnosi koji uzorak. Osim ako uzorke iz svakog spremnika treba zasebno ispitati, promiješajte udjele ovih reprezentativnih količina u omjerima proporcionalnima količini koja se nalazi u spremnicima iz kojih je uzet uzorak. Uzorak(-e) iz tih skupnih razmjernih količina uzmite nakon miješanja.

4.2.2. Uzorkovanje iz velikih posuda – skladišni, željeznički i cestovni spremnici

Savjetuje se korištenje strojne miješalice (4.2.2.2.) za miješanje sadržaja velikih posuda ili skladišnih, željezničkih i cestovnih spremnika.

Vrijeme miješanja odgovara vremenskom razdoblju u kojem je mlijeko mirovalo. Potrebno je dokazati da učinkovitost postupka miješanja koji se primijeni pod bilo kojim okolnostima odgovara potrebama predviđene analize; kriterij učinkovitosti miješanja naročito utječe na sličnost rezultata analize provedene na uzorcima uzetima ili iz različitih dijelova pošiljke, ili iz ispusta spremnika u razmacima tijekom pražnjenja. Postupak miješanja mlijeka (neobrađenog ili punomasnog mlijeka) smatrat će se učinkovitim ako razlika u količini masti koju sadrže dva uzroka uzeta pod ovim uvjetima iznosi manje od 0,1 %.

U velikoj posudi s ispustom za izlijevanje na dnu može na točki izlijevanja postojati manja količina mlijeka koja nije reprezentativna za cjelokupni sadržaj čak ni nakon miješanja. Stoga je bolje uzimati uzorke kroz gornji otvor. Ako se uzorci uzimaju na ispustu za izlijevanje, pustite dovoljnu količinu mlijeka da proteče kako bi osigurali reprezentativnost uzoraka u odnosu na cjelinu.

4.2.2.2. Miješanje sadržaja velikih posuda ili skladišnih, željezničkih i cestovnih spremnika može se provesti na sljedeće načine:

4.3. Uzorkovanje toplinski obrađenog mlijeka za izravnu prehranu ljudi u maloprodajnoj ambalaži

Uzorci toplinski obrađenog mlijeka za izravnu prehranu ljudi u maloprodajnoj ambalaži moraju biti u originalnom pakiranju. Ako je to moguće, uzorci moraju biti uzeti iz stroja za pakiranje ili hladnjače u objektu za preradu što je prije moguće nakon prerade (za pasterizirano mlijeko na dan prerade).

Uzorci se uzimaju iz svake vrste toplinski obrađenog mlijeka (pasteriziranog, UHT obrađenog i steriliziranog) i to u broju koji odgovara ispitivanjima koja će se vršiti i u skladu s uputama koje je propisao laboratorij koji provodi ispitivanja ili drugo nadležno tijelo.

Uzorak treba biti označen identifikacijskim kodom tako da se može odmah identificirati prema uputama laboratorija koji provodi ispitivanja ili drugog nadležnog tijela.

Laboratorij koji provodi ispitivanja je dužan u dogovoru s nadležnim državnim tijelima pripremiti upute vezane za uvjete čuvanja (kemijske, temperaturne), prijevoza, skladištenja i vremenskih razdoblja između uzorkovanja i analize mlijeka prema vrsti mlijeka i postupku analize koja se koristi.

Ovim postupkom propisuje se referentna metoda za određivanje udjela ukupne suhe tvari u mlijeku.

Udio ukupne suhe tvari: je masa koja ostane po završetku točno određenog postupka sušenja, a izražena je kao maseni udio.

Isparavanje vode iz ispitivanog uzorka na temperaturi od 102 ± 2 °C u sušioniku.

4.2. Eksikator, s učinkovitim sredstvom za sušenje (npr. svježe osušeni silika-gel s pokazateljem udjela vode).

4.3. Sušionik, ventiliran, s temperaturom održavanom na 102 ± 2 °C na cijelom radnom prostoru.

4.4. Posude s ravnim dnom, visine 20 do 25 mm, promjera 50 do 75 mm, i od odgovarajućeg materijala, zajedno s poklopcima koji dobro prianjaju i lako se uklanjaju.

Uzorak mlijeka zagrijati na temperaturu između 20 i 25 °C. Temeljito promiješati kako bi se osigurala ravnomjerna distribucija masti u cijelom uzorku. Izbjegavati previše snažno miješanje da ne bi došlo do pjenjenja mlijeka ili bućkanja masti. Ako se pokaže da je teško raspršiti sloj vrhnja, polako zagrijati na temperaturu između 25 i 40 °C i pažljivim miješanjem umiješati sve vrhnje sa stjenke spremnika. Brzo ohladiti uzorak na 20—25 °C.

Po želji, može se koristiti homogenizator kao pomagalo pri raspršivanju masti.

Ne može se očekivati dobivanje točnih rezultata ako uzorak sadrži odvojenu tekuću mast ili vidljive odvojene bijele čestice nepravilnog oblika koje prianjaju uza stjenke spremnika.

Zagrijavati posudu (4.4.) i poklopac tako da se stave u sušionik (4.3.) jedno pokraj drugog, na temperaturi održavanoj na 102 ± 2 °C, najmanje 30 minuta. Staviti poklopac na posudu i odmah ju premjestiti u eksikator (4.2.), a zatim pustiti da se ohladi na sobnu temperaturu (odnosno najmanje 30 minuta) i izmjeriti s točnošću od 0,1 mg.

Odmah izmjeriti, s točnošću od 0,1 mg, 3 do 5 g pripremljenog uzorka za ispitivanje (5.) i staviti u pripremljenu posudu (6.1.).

6.3.1. Predsušiti posudu 30 minuta grijući je na vrućoj vodenoj kupelji (4.5.).

6.3.2. Zagrijavati posudu, s poklopcem pored nje, u sušioniku (4.3.) dva sata na konstantnoj temperaturi od 102 ± 2 °C. Staviti poklopac na posudu i izvaditi ju iz sušionika.

6.3.3. Ostaviti ju da se u eksikatoru (4.2.) ohladi na sobnu temperaturu (odnosno najmanje 30 minuta) i izmjeriti s točnošću od 0,1 mg.

6.3.4. Ponovno zagrijati posudu, s poklopcem pored nje, u sušioniku jedan sat. Staviti poklopac na posudu i izvaditi ju iz sušionika. Pustiti je da se u eksikatoru ohladi najmanje 30 minuta i izmjeriti s točnošću od 0,1 mg.

6.3.5. Ponoviti postupak opisan u točki 6.3.4. dok razlika u masi između dva uzastopna mjerenja ne prelazi 0,5 mg. Zabilježite najnižu masu.

Ovim postupkom određuje se referentna metoda određivanja udjela masti u sirovom mlijeku i punomasnom mlijeku, djelomično obranom mlijeku i obranom mlijeku.

Udio masti u mlijeku: je sva tvar određena točno naznačenom metodom. Izražava se kao maseni udio.

Otopina amonijaka i etanola ispitivanog uzorka ekstrahira se pomoću dietiletera i petroleja, otapala koje se uklanja destilacijom ili isparavanjem, a potom se određuje masa ekstrahirane tvari topive u petroleju. (Ovaj postupak je poznat kao Röse-Gottliebova metoda).

Svi reagensi moraju biti priznate analitičke čistoće i ne smiju ostavljati znatne taloge pri slijepoj probi.

Kako bi se provjerila kvaliteta reagensa, provodi se određivanje opisano u točki 6.3. Koristite praznu tikvicu, čašu ili metalnu posudu (5.8.) za mjerenje, pripremljene u skladu s točkom 6.4., kao taru (kako bi se omogućilo ispravljanje učinka promjena u atmosferskim prilikama na rezultate mjerenja). Ako talog, ispravljen za očitu promjenu mase tare prelazi 2,5 mg, odvojeno se određuje talog otapala isparavanjem 100 ml dietiletera (4.4.) i 100 ml petroleja (4.5.), tim redoslijedom. Također koristiti taru za mjerenje. Kada je talog veći od 2,5 mg, pročistiti otapalo destilacijom ili ga zamijeniti.

4.1. Otopina amonijaka, koja sadrži otprilike 25 % (m/m) NH3. Može se koristiti i otopina amonijaka veće koncentracije (pogledajte 6.5.1. i A.1.5.1.).

4.2. Etanol, najmanje 94 % (v/v). Etanol razgrađen metanolom može se koristiti ako je sigurno da to ne utječe na rezultate određivanja.

Napomena: Korištenje ove otopine, koja omogućava da se lakše vidi granica između sloja otapala i vodenog sloja, nije obvezno (pogledajte 6.5.2.). Mogu se koristiti i druge vodene otopine u boji ako ne utječu na rezultate određivanja.

4.4. Dietileter bez peroksida koji ne sadrži više od 2 mg/kg antioksidansa, i zadovoljava zahtjeve slijepe probe (6.3.).

4.6. Smjesa otapala, pripravljeno netom prije korištenja miješanjem jednakih volumena dietiletera (4.4.) i petroleja (4.5.).

Upozorenje: Budući da određivanje uključuje korištenje hlapljivih i zapaljivih otapala, sva korištena električna oprema mora biti u skladu sa zakonima koji se odnose na korištenje tih otapala.

5.2. Centrifuga, u kojoj se mogu vrtjeti tikvice ili epruvete za ekstrakciju masti (5.6.) rotacijskom frekvencijom od 500 do 600 okretaja u minuti–1 kako bi se proizvelo gravitacijsko polje od 80 do 90 g na vanjskim krajevima tikvica ili epruveta.

5.3. Destilator ili instrument za isparavanje, kako bi se omogućilo destiliranje otapala i etanola iz tikvica ili isparavanje iz čaša i posuda (pogledajte 6.5.12. i 6.5.15.) na temperaturi koja ne prelazi 100 °C.

5.4. Sušionik, koji se zagrijava električnim putem, s potpuno otvorenim ventilacijskim otvorom(-ima), i u kojem se temperatura može održavati na 102 ± 2 °C na cijelom radnom prostoru. Sušionik bi trebao biti opremljen odgovarajućim termometrom.

Napomena: Moguće je koristiti i epruvete za ekstrakciju sifonom ili nastavcima boce štrcaljke, ali u tom slučaju je postupak drugačiji te je naveden u Dodatku.

Tikvice (ili epruvete) moraju imati čepove od brušenog stakla, kvalitetnog pluta ili drugog materijala na koji ne djeluju reagensi koji se koriste. Čepove od pluta treba ekstrahirati dietileterom (4.4.), namakati u vodi na 60 °C ili više najmanje 15 minuta, a nakon toga ostaviti da se ohlade u vodi kako bi ostali zasićeni pri korištenju.

5.7. Stalak, za držanje tikvica (ili epruveta) za ekstrakciju masti (pogledajte 5.6.).

5.8. Boca štrcaljka, za korištenje smjese otapala (4.6.). Ne smije se koristiti plastična boca štrcaljka.

5.9. Posude za sakupljanje masti, npr. tikvice za vrenje (s ravnim dnom), ili Erlenmeyerove tikvice kapaciteta 125 – 250 ml ili metalne posude. Ako se koriste metalne posude, najbolje je da su od nehrđajućeg čelika, s ravnim dnom, po mogućnosti s noscem, i trebaju biti promjera 80 do 100 mm i visine oko 50 mm.

5.10. Pomagala za vrenje, bez masti, od neporoznog porculana ili silicij-karbida ili staklenih kuglica (neobvezno u slučaju metalnih posuda).

Napomena: Druga mogućnost koja je opisana u Dodatku je korištenje epruveta za ekstrakciju masti sa sifonom ili nastavcima boce štrcaljke (pogledajte napomenu pod 5.6.).

Prilagoditi temperaturu laboratorijskog uzorka na otprilike 35—40 °C 15 minuta, i to pomoću vodene kupelji ako je potrebno. Temeljito, ali lagano promiješati uzorak stalnim preokretanjem boce s uzorkom tako da ne nastane pjenjenje ili bućkanje, i brzo ohladiti na otprilike 20 °C.

Promiješati uzorak za ispitivanje (6.1.) polaganim preokretanjem boce tri ili četiri puta i odmah izvagati, s točnošću od 1 mg, 10 do 11 g uzorka za ispitivanje, izravno ili na temelju razlike, i prenijeti ga u tikvicu za ekstrakciju (5.6.).

Ispitivani uzorak mora u cijelosti biti u donjem (manjem) dijelu tikvice za ekstrakciju.

Provesti slijepu probu istodobno s određivanjem, i to korištenjem istog postupka i istog reagensa, ali tako da umjesto ispitivanog uzorka stavimo 10 do 11 ml vode.

Promjena prave mase posude za sakupljanje masti, ispravljena za ukupnu promjenu mase kontrolne posude ne smije prelaziti 2,5 mg.

Osušiti posudu (5.9.) zajedno s nekoliko pomagala za vrenje (5.10.) kako bi potakli lagano vrenje tijekom narednog uklanjanja otapala u sušioniku (5.4.) u trajanju od jedan sat. Ostaviti posudu da se ohladi (ne u eksikatoru, ali zaštititi od prašine) na temperaturu prostorije za mjerenje (staklene posude pustiti da se hlade najmanje jedan sat, metalne posude najmanje 30 minuta). Koristiti kliješta za stavljanje posude na vagu i provoditi mjerenje s točnošću od 0,1 mg te pri tome izbjegavati promjene temperature.

6.5.1. Dodati 2 ml otopine amonijaka (4.1.) ili odgovarajući volumen otopine amonijaka veće koncentracije i temeljito promiješati s ispitivanim uzorkom u manjem dijelu tikvice. Nakon što se doda amonijak, provesti određivanje bez odlaganja.

6.5.2. Dodati 10 ml etanola (4.2.) i lagano, ali temeljito promiješati dopuštajući da sadržaj tikvice teče naprijed i nazad između njezina dva dijela; izbjegavati da tekućina dođe preblizu vratu tikvice. Prema želji dodati dvije kapi otopine kongo crvenila ili krezol crvenila (4.3.).

6.5.3. Dodati 25 ml dietiletera (4.4.), zatvoriti tikvicu čepom od pluta zasićenim vodom ili zatvaračem smočenim vodom (pogledajte 5.6.) i tresti tikvicu umjerenom jačinom (kako bi izbjegli stvaranje postojanih emulzija) jednu minutu s tikvicom u vodoravnom položaju, tako da manji dio stoji prema gore. Povremeno dopustiti da se tekućina iz većeg dijela pretoči u manji dio. Prema potrebi ohladiti tikvicu u tekućoj vodi, a zatim pažljivo ukloniti čep od pluta ili drugi zatvarač i pomoću boce štrcaljke (5.8.) isprati njega i vrat tikvice s malo smjese otapala (4.6.) tako da isprani sadržaj uđe u tikvicu.

6.5.4. Dodati 25 ml petroleja (4.5.), zatvoriti tikvicu ponovno namočenim čepom od pluta ili drugim zatvaračem (ponovno smočiti uranjanjem u vodu) i lagano tresti tikvicu 30 sekundi kako je opisano u točki 6.5.3.

6.5.5. Centrifugirati zatvorenu tikvicu 1 do 5 minuta rotacijskom frekvencijom od 500 do 600 okretaja u minuti-1 (5.2.). Ako centrifuga nije na raspolaganju (pogledajte napomenu uz 5.2.) ostaviti zatvorenu tikvicu da stoji na stalku (5.7.) najmanje 30 minuta dok se gornji sloj jasno i vidljivo ne odvoji od vodenog sloja. Prema potrebi ohladiti tikvicu pod tekućom vodom.

6.5.6. Pažljivo ukloniti pluteni čep ili drugi zatvarač i isprati njega i unutarnju stranu vrata tikvice s malo smjese otapala (4.6.) tako da isprani sadržaj uđe u tikvicu.

Ako se granica nalazi ispod kraja vrata tikvice, podignite ga malo iznad te razine lagano ulijevajući vodu niz stjenku tikvice tako da se olakša prelijevanje otapala.

6.5.7. Držeći tikvicu za ekstrakciju za manji dio, pažljivo preliti najveću moguću količinu gornjeg sloja u pripremljene posude za sakupljanje masti (6.4.) koje sadrže nekoliko pomagala za vrenje (5.10.) u slučaju tikvica (po izboru s metalnim posudama), izbjegavajući izlijevanje vodenog sloja.

6.5.8. Isprati vanjsku stranu vrata tikvice za ekstrakciju s malo smjese otapala (4.6.), sakupljajući isprani sadržaj u posudu za sakupljanje masti i pazeći da se smjesa otapala ne prolije preko vanjskog dijela tikvice za ekstrakciju.

Prema želji se otapalo ili dio otapala mogu ukloniti iz posude destilacijom ili isparavanjem kako je opisano u točki 6.5.12.

6.5.9. Dodati 5 ml etanola (4.2.) sadržaju tikvice za ekstrakciju, pri tome koristeći etanol za ispiranje unutrašnjosti vrata tikvice, i izmiješati kako je opisano u točki 6.5.2.

6.5.10. Provesti drugu ekstrakciju ponavljanjem radnji opisanih u točkama 6.5.3. do 6.5.8., ali koristeći samo 15 ml dietiletera (4.4.) i 15 ml petroleja (4.5.); koristiti eter za ispiranje unutrašnjosti vrata tikvice za ekstrakciju. Prema potrebi podignuti granicu na sredinu vrata tikvice kako bi se omogućilo da konačno izlijevanje otapala bude što potpunije.

6.5.11. Provesti treću ekstrakciju daljnjim ponavljanjem radnji opisanih u točkama 6.5.3. do 6.5.8., ali koristeći samo 15 ml dietil etera (4.4.) i 15 ml petroleja (4.5.); koristite eter za ispiranje unutrašnjosti vrata tikvice za ekstrakciju. Prema potrebi podignuti granicu na sredinu vrata tikvice kako bi omogućili da konačno izlijevanje otapala bude što potpunije.

6.5.12. Otapala (uključujući etanol) iz tikvice ukloniti što potpunije postupkom destilacije, ili iz čaše ili posude isparavanjem (5.3.), ispirući unutrašnjost vrata tikvice s malo miješanog otapala (4.6.) prije započinjanja destilacije.

6.5.13. Grijati posudu za sakupljanje masti (s tikvicom pored nje kako bi para otapala isparila) jedan sat u sušioniku (5.4.). Ukloniti posudu za sakupljanje masti iz sušionika, ostaviti da se ohladi (ne u eksikatoru, ali zaštititi od prašine) na temperaturu prostorije za mjerenje (staklene posude neka stoje najmanje sat vremena, a metalne posude najmanje 30 minuta) i izvršite mjerenje s točnošću od 0,1 mg.

Ne brisati posudu neposredno prije mjerenja. Staviti posudu na vagu korištenjem kliješta i naročito izbjegavati promjene temperature.

6.5.14. Ponavljati radnje opisane u točki 6.5.13. dok se masa posude za sakupljanje masti ne smanji za 0,5 mg ili manje ili poveća, između dva uzastopna mjerenja. Zabilježiti najmanju izmjerenu masu posude za sakupljanje masti i ekstrahirane tvari.

6.5.15. Dodati 25 ml petroleja u posudu za sakupljanje masti kako bi provjerili je li ekstrahirana tvar u potpunosti topiva. Lagano zagrijati i miješati otapalo dok se sva mast ne otopi.

Ako je ekstrahirana tvar u potpunosti topiva u petroleju, uzima se da je masa masti razlika između konačne mase posude koja sadrži ekstrahiranu tvar (6.5.14.) i početne mase (6.4.).

6.5.16. Ako je ekstrahirana tvar u potpunosti topiva u petroleju, ili u slučaju sumnje, u potpunosti ekstrahirajte mast iz posude ponavljanim ispiranjem toplim petrolejem.

Pustiti sve tragove netopljive tvari da se slegnu i pažljivo izliti petrolej bez da se ukloni netopljiva tvar. Ponoviti ovaj postupak još tri puta korištenjem petroleja za ispiranje unutrašnjosti vrata posude.

Na kraju isperite vanjski dio vrha posude smjesom otapala tako da se otapalo ne proširi preko vanjske strane posude. Ukloniti paru petroleja iz posude jednosatnim zagrijavanjem posude u sušioniku, pustiti da se ohladi i izmjeriti kako je opisano u točkama 6.5.13. i 6.5.14.

Uzmite da je masa masti razlika mase određene u točki 6.5.14. i ove konačne mase.

Ovim postupkom opisuje se referentna metoda za određivanje ukupnog udjela bezmasne suhe tvari u toplinski obrađenom mlijeku.

Udio ukupne suhe tvari (pogledajte odjeljak I.) umanjen za udio masti (pogledajte odjeljak II.).

Ovim postupkom opisuje se referentna metoda za određivanje udjela ukupnog dušika u sirovom mlijeku i punomasnom mlijeku, djelomično obranom mlijeku i obranom mlijeku.

Udio ukupnog dušika u mlijeku je udio dušika, izražen kao maseni udio, kako je određeno točno opisanom Kjeldahlovom metodom.

Izmjerenu količinu uzorka mlijeka tretira se koncentriranom sumpornom kiselinom i kalij-sulfatom i bakar(II)-sulfatom kao katalizatorom, kako bi se dušik iz organskih spojeva pretvorio u amonij-sulfat. Amonijak se oslobađa dodavanjem otopine natrij-hidroksida, a zatim se destilira i apsorbira u otopinu borne kiseline. To se titrira kiselom otopinom.

4.2. Otopina bakar-sulfata. Otopiti 5,0 g bakar(II)-sulfata pentahidrata (CuSO4, 5H2O) u vodi i razvodniti do 100 ml (na 20 °C) u odmjernoj tikvici.

Napomena: može se koristiti i otopina natrij-hidroksida manje koncentracije, npr.: 40 % (m/m) 572 g/l, 20 °C; ili 30 % (m/m) 399 g/l, 20 °C.

4.5. Otopina borne kiseline. Otopiti 40 g borne kiseline (H3BO3) u jednoj litri vruće vode, ostaviti da se ohladi i spremiti u bocu od borosilikatnog stakla.

4.6. Indikatorska otopina. Otopite 0,01 g crvenog metila, 0,02 g plavog bromtimola i 0,06 g zelenog bromkrezola u 100 ml etanola. Spremiti otopinu u smeđu zatvorenu bocu, na hladno i tamno mjesto.

c (½ H2SO4) ili c (HCl) = 0,1 mol/l standardizirana s točnošću od 0,0001 mol/l.

4.9. Amonijeva sol, čista, kao što su amonij-oksalat (NH4)2C2O4, H2O ili amonij-sulfat (NH4)2SO4.

4.10. Triptofan (C11H12N2O2), fenacetin (C10H7CH2CONH2) ili lizin mono- ili dihidroklorid (C6H14N2O2 · HCl ili C6H14N2O2 · 2HCl).

Napomena: čistoća reagensa u točkama 4.9. i 4.10. trebala bi biti veća od stupnja „analitičke čistoće”. Ako je na raspolaganju, trebala bi se koristiti certificirana otopina amonijeve soli (4.9.).

5.2. Odgovarajuća pomagala za vrenje, npr. staklene kuglice promjera oko 5 mm, Hengarove granule, kamen plavac.

5.5. Digestor u nagnutom položaju (oko 45 °), s električnim grijačima ili plinskim plamenicima koji ne zagrijavaju tikvicu iznad razine njezinog sadržaja, sa sustavom za ekstrahiranje dima.

5.6. Destilator, napravljen od borosilikatnog stakla, na koji se može spojiti Kjeldahlovu tikvicu (5.1.), i koji se sastoji od učinkovite glave štrcaljke povezane s učinkovitim hladilom s ravnom unutarnjom cijevi i odvodnom cijevi povezanom s njegovim donjim završetkom; povezne cijevi i zatvarač(-i) moraju dobro prianjati i po mogućnosti biti od neoprenske gume.

5.9. Bireta kapaciteta 50 ml, graduirana na 0,1 ml, s maksimalnom mogućnošću pogreške ± 0,05 ml.

6.1. Dodajte pomagala za vrenje (5.2.) (npr. tri staklene kuglice) u Kjeldahlovu tikvicu (5.1.), 15 g kalij-sulfata (4.1.), 1,0 ml otopine bakar-sulfata (4.2.), otprilike 5 g uzorka mlijeka (izmjerenog s točnošću od 0,001 g) i 25 ml sumporne kiseline (4.3.). Koristiti kiselinu za ispiranje otopine bakar-sulfata, kalij-sulfata ili mlijeka na vratu tikvice, i lagano promiješati sadržaj tikvice.

Napomena: Budući da organska tvar troši sumpornu kiselinu tijekom vrenja, za digestiju umjesto 25 ml koristite 30 ml H2SO4 (4.3.) ako mlijeko sadrži više od 5,0 % (m/m) masti. Isto bi trebalo učiniti i u slijepoj probi.

6.2. Zagrijati svaku Kjeldahlovu tikvicu na digestoru (5.5.), u početku vrlo polako tako da crna pjena ostane unutar trbušastog dijela tikvice. Kada prestane početno pjenjenje i pojavi se obilna bijela para, snažno prokuhati (kisela para će se kondenzirati kada dođe na pola puta do vrha vrata tikvice) dok ne nestanu sve crne čestice i dok sadržaj tikvice ne bude jasno blijede plavo-zelene boje. Tada lagano kuhajte najmanje 1,5 sat. Primite na znanje sljedeće:

6.3. Kada se Kjeldahlove tikvice u potpunosti ohlade, dodati 300 ml vode (pogledajte napomenu) u svaku tako da se pažljivo ispere vrat tikvice, i temeljito promiješati sadržaj pazeći na to da se kristali koji su se odvojili otope. Dodati pomagala za vrenje (5.2.) kako bi se osiguralo jednolično vrenje. Zatim u svaku tikvicu dodati 70 ml otopine natrij-hidroksida (4.4.) (pogledajte napomenu) lagano ulijevajući otopinu kroz nakošeni vrat tikvice da se stvori donji sloj u trbušastom dijelu; ne močiti vrh vrata otopinom natrij-hidroksida.

Napomena: Nužno je da zajednički volumen vode i otopine natrij-hidroksida iznosi 370 ml kako bi se omogućilo sakupljanje oko 150 ml destilata upravo prije nego što uslijedi neujednačeno vrenje („bubnjanje”) (6.4). Stoga, ako se doda veći odgovarajući volumen otopine natrij-hidroksida koncentracije manje od 47 % (m/m), volumen dodane vode smanjit će se prema tome. Na primjer, ako se doda 85 ml od 40 % (m/m) ili 125 ml od 30 % (m/m) otopine natrij-hidroksida, volumen dodane vode iznosit će 285 ml ili 245 ml, tim redoslijedom.

6.4. Odmah spojite svaku Kjeldahlovu tikvicu na destilator (5.6.). Pobrinuti se da vrh odvodne cijevi hladila bude uronjen u 50 ml borne kiseline (4.5.) zajedno s 0,20 ml (5 – 6 kapi) indikatorske otopine (4.6.) u čunjastoj tikvici (5.8.). Zavrtite sadržaj svake Kjeldahlove tikvice kako bi ga temeljito promiješali i zakuhali, ali u početku lagano kako bi spriječili pretjerano pjenjenje. Nakon što se sakupi 100 do 125 ml destilata, spuštati svaku čunjastu tikvicu dok se vršak odvodne cijevi hladila ne nađe na otprilike 40 mm iznad oznake za 200 ml. Nastaviti sa svakom pojedinačnom destilacijom dok ne počne neujednačeno vrenje („bubnjanje”), a zatim odmah prestati sa zagrijavanjem. Odvojiti sve Kjeldahlove tikvice i isprati vrh odvodnih cijevi hladila pomoću malo vode, sakupljajući isprani sadržaj u čunjastu tikvicu. Primite na znanje sljedeće zahtjeve:

6.5. Titrirati svaki destilat sa standardnom volumetrijskom otopinom (4.7.) dok pH ne bude 4,6 ± 0,1, i pri tome koristiti pH-metar i po želji automatsku biretu. Dodavanje indikatora pomaže pri provjeravanju pravilnog tijeka titracije. Očitati vrijednosti na bireti s točnošću od 0,01 ml pomoću povećala (5.10.) izbjegavajući greške vezane za menisk.

Titriranje se može provesti samo s indikatorom. Potrebno je titrirati dok boja destilata ne postane jednaka boji prethodno pripremljene otopine od 150 ml vode u koju je dodano 50 ml otopine borne kiseline i 0,20 ml indikatora sadržanog u čunjastoj tikvici (5.8.).

6.6. Provesti slijepu probu u skladu s točkama 6.1. do 6.5., i umjesto uzorka mlijeka za postupak uzmite 5 ml destilirane vode i otprilike 0,1 g saharoze (4.8.).

Napomena: Za titraciju slijepog destilata potreban je samo jako mali volumen standardne volumetrijske otopine (4.7.).

6.7. Redovito provjeravajte ispravnost postupka korištenjem dva rekuperacijska pokusa prateći postupak opisan u točkama 6.1. do 6.5.

6.7.1. Provjeriti dolazi li do gubitka dušika zbog pretjeranog zagrijavanja ili mehaničkih curenja tijekom destilacije, i to korištenjem ispitivanog uzorka od 0,15 g amonij-oksalata ili sulfata (4.9.) izmjerenog s točnošću od 0,001 g i 0,1 g saharoze (4.8.).

Niži ili viši rezultati ukazuju na propuste u postupku i/ili netočne koncentracije standardnih otopina (4.7.).

6.7.2. Provjeriti je li postupak razgradnje dovoljan za oslobađanje cjelokupnog proteinskog dušika korištenjem ispitivanog uzorka od 0,20 g čistog triptofana, 0,35 g fenacetina ili 0,20 g lizin hidroklorida (4.10.). Sva mjerenja trebala bi biti provedena s točnošću od 0,001 g. Najmanje 98 – 99 % dušika trebalo bi biti rekuperirano.

Pri radu s koncentriranom sumpornom kiselinom i natrij-hidroksidom i kada rukujete Kjeldahlovim tikvicama, uvijek nosite laboratorijsku kutu, zaštitne naočale i rukavice otporne na kiselinu.

Nikad ne ostavljajte Kjeldahlove tikvice bez nadzora tijekom destilacije. Zbog potencijalne opasnosti odmah zaustavite destilaciju ako sadržaj tikvice „bubnja” prejako. Ako je struja isključena više od dvije do tri minute, spustite tikvicu za sakupljanje tako da destilacijski vršak bude izvan tekućine.

Izračunajte udio dušika (WN), izraženo u gramima dušika na 100 g proizvoda sljedećom formulom:

9.1. Koristiti opremu za digestiju s cilindričnim tikvicama, umjesto digestora i Kjeldahlovih tikvica opisanih u točkama 5.5. i 5.1. U tom slučaju svaki uređaj treba zasebno provjeriti kako bi se utvrdile potencijalne nepravilnosti (6.7.).

9.2. Koristiti parnu destilaciju umjesto izravnog zagrijavanja tikvica (6.4.). Kada instrument ne dopušta korištenje destilirane vode, treba obratiti pažnju na to sadrži li voda hlapljive kiseline ili lužine.

9.3. Ispitivani uzorak od 1 g mlijeka (semi-makro Kjeldahl) može se koristiti umjesto 5 g (6.1.) ako:

Napomena: Korištenje jedne ili više od ovih mogućnosti prihvatljivo je samo ako su vrijednost ponovljivosti (8.2.1.) i rezultati dvaju ispitivanja točnosti (6.7.) u skladu s uvjetima propisanima ovom metodom.

Ovim postupkom opisuje se referentna metoda za određivanje udjela bjelančevina u toplinski obrađenom mlijeku (članak 3. stavak A3. Direktive 85/397/EEZ).

Udio proteina: je vrijednost koja se dobije množenjem udjela ukupnog dušika, izraženog kao maseni udio, određenog u skladu s metodom opisanom u odjeljku IV. stavku 3., s odgovarajućim faktorom (3.).

Udio bjelančevina u mlijeku kao maseni udio = 6,38 x udio ukupnog dušika N u mlijeku %.

Ovim postupkom opisuje se referentna metoda određivanja specifične mase sirovog mlijeka i punomasnog mlijeka, djelomično obranog mlijeka i obranog mlijeka na 20 °C.

Specifična masa mlijeka je omjer mase određenog volumena mlijeka na 20 °C i mase istog volumena vode na 20 °C.

Specifični gravitacijski hidrometar je instrument koji se sastoji od staklenog plovka koji je u svom donjem dijelu širok i težak. Cilindrična staklena cjevčica je spojena na gornji kraj plovka te je usporedna s njim; gornji dio cjevčice je zatvoren.

Stakleni plovak sadrži teret (olovo, živa itd.) namijenjen prilagođavanju mase hidrometra. Cjevčica ima skalu od 1,025 do 1,035 g/ml.

Hidrometar bi trebalo provjeriti piknometrijskom metodom, korištenjem piknometra kapaciteta oko 100 ml koji je opremljen termometrom za mjerenje preciznosti.

5.1. Promiješati uzorak preokretanjem kako bi se raspršila mast i staviti ga u vodenu kupelj (4.4.). Pustiti da uzorak dosegne temperaturu od 40 °C i održavati tu temperaturu pet minuta. Temeljito promiješati laganim preokretanjem kako bi bili sigurni da se mast ravnomjerno rasporedila. Ohladiti na 20 °C u drugoj vodenoj kupelji (4.3.).

5.2. Temeljito promiješati uzorak laganim preokretanjem kako bi se izbjegao ulazak zraka. Uliti mlijeko u cilindar (4.2.) koji se mora držati nagnutim kako bi izbjegli stvaranje pjene ili balončića. Koristiti dostatnu količinu uzorka mlijeka kako bi bili sigurni da će se dio preliti iz cilindra kada se u uzorak uroni hidrometar (4.1.). Pažljivo spustiti hidrometar u mlijeko i pustite ga da slobodno pluta dok ne postigne ravnotežu. Cilindar treba položiti okomito. Hidrometar treba biti namješten u sredini stupca tekućine i ne bi trebao dodirivati stranice cilindra.

5.4. Odmah nakon što se izvrši očitavanje na hidrometru staviti termometar (4.5.) u uzorak i očitati temperaturu s točnošću od 0,5 °C. Temperatura ne smije odstupati više od ± 2 °C od ± 20 °C.

6.1. Ako temperatura uzorka mlijeka ne iznosi točno 20 °C pri mjerenju specifične mase, onda se dobiveni rezultat mora ispraviti dodavanjem određenoj specifičnoj masi 0,0002 za svaki stupanj celzija iznad 20 °C ili oduzimanjem 0,0002 za svaki stupanj celzija ispod 20 °C. Ovaj ispravak vrijedi samo ako temperatura uzorka mlijeka odstupa do 5 °C od 20 °C.

Metoda izračuna i formula: specifična masa uzorka izražava se u g/ml obranog mlijeka na 20 °C u skladu sa sljedećom formulom:

ALTERNATIVNI POSTUPAK KOJI UKLJUČUJE KORIŠTENJE EPRUVETA ZA EKSTRAKCIJU MASTI SA SIFONOM ILI NASTAVKOM BOCE ŠTRCALJKE

Postupiti kako je navedeno pod 6.2., ali pri tome koristiti epruvete za ekstrakciju masti (pogledajte 5.6.).

A.1.5.1. Dodati 2 ml otopine amonijaka (4.1.), ili jednaki volumen otopine amonijaka veće koncentracije, i temeljito promiješati s prethodno pripremljenim ispitivanim uzorkom na dnu epruvete. Nakon dodavanja amonijaka, provedite određivanje bez odgađanja.

A.1.5.2. Dodati 10 ml etanola (4.2.) i lagano, ali temeljito promiješati na dnu epruvete. Po želji dodati dvije kapi otopine kongo crvenila ili krezol crvenila (4.3.).

A.1.5.3. Dodati 25 ml dietiletera (4.4.), zatvoriti epruvetu plutenim čepom zasićenim vodom ili zatvaračem natopljenim vodom (5.6.), i snažnije tresti epruvetu, ali ne previše snažno (kako bi se izbjeglo nastajanje postojanih emulzija), i stalno je preokretati jednu minutu. Ako je to potrebno, ohladiti epruvetu u tekućoj vodi, a zatim pažljivo odstraniti pluteni čep ili drugi zatvarač i isprati čep i vrat epruvete s malo smjese otapala (4.6.) korištenjem boce štrcaljke (5.8.) tako da isprani sadržaj uđe u epruvetu.

A.1.5.4. Dodati 25 ml petroleja (4.5.), zatvoriti epruvetu s ponovno natopljenim plutenim čepom ili drugim zatvaračem (ponovno ga natopiti uranjanjem u vodu) i lagano tresti epruvetu 30 sekundi kako je opisano u točki A.1.5.3.

A.1.5.5. Centrifugirati zatvorenu epruvetu jednu do pet minuta s rotacijskom frekvencijom od 500 do 600 okretaja u minuti-1 (5.2.). Ako centrifuga nije na raspolaganju (pogledajte napomenu pod 5.2.), pustiti zatvorenu epruvetu da stoji u stalku (5.7.) najmanje 30 minuta, dok gornji sloj ne postane bistar i jasno odvojen od vodenog sloja. Prema potrebi ohladiti epruvetu pod tekućom vodom.

A.1.5.6. Pažljivo odstraniti pluteni čep ili drugi zatvarač i isprati čep i vrat epruvete s malo smjese otapala tako da isprani sadržaj uđe u epruvetu.

A.1.5.7. Umetnuti sifonski nastavak ili nastavak boce štrcaljke u epruvetu i gurnuti prema dolje dugi unutarnji krak nastavka dok dovod ne bude otprilike 3 mm iznad granice između slojeva. Unutarnji krak nastavka treba biti paralelan s osi epruvete za ekstrakciju.

Pažljivo preliti gornji sloj iz epruvete u pripremljenu posudu za sakupljanje masti (6.4.) koja sadrži nekoliko pomagala za vrenje (5.10.) u slučaju tikvica (neobavezno s metalnim posudama), izbjegavajući da pri tome prenesete dio vodenog sloja. Isperite odvod nastavka s malo smjese otapala, sakupljajući isprani sadržaj u posudu za sakupljanje masti.

A.1.5.8. Otpustiti nastavak iz vrata epruvete, lagano podignuti nastavak i isprati donji dio njegovog duljeg unutarnjeg kraka s malo smjese otapala. Spustiti i ponovno umetnuti nastavak pa prenijeti isprani sadržaj u posudu za sakupljanje masti.

Isprati odvod nastavka s malo smjese otapala, sakupljajući isprani sadržaj u posudi. Po želji se otapalo ili dio otapala mogu ukloniti iz posude destilacijom ili isparavanjem, kako je opisano u točki 6.5.12.

A.1.5.9. Ponovno otpustiti nastavak iz vrata, polako podignuti nastavak i dodati 5 ml etanola sadržaju epruvete, koristeći etanol za ispiranje dugog unutarnjeg kraka nastavka; promiješati kako je opisano u točki A.1.5.2.

A.1.5.10. Provesti drugu ekstrakciju ponavljanjem postupka opisanog u točkama A.1.5.3. do A.1.5.8., ali pri tome koristiti samo 15 ml dietiletera (4.4.) i 15 ml petroleja (4.5.). Upotrijebiti eter za ispiranje dugog unutarnjeg kraka nastavka dok se uklanja nastavak iz epruvete nakon prethodne ekstrakcije.

A.1.5.11. Provesti treću ekstrakciju ponovnim ponavljanjem postupka opisanog u točkama A.1.5.3. do A.1.5.8., koristeći 15 ml dietiletera i 15 ml petroleja i ispirući dugi unutarnji krak nastavka u skladu s točkom A.15.10.

WT	=	ukupni udio suhe tvari u g na 100 g,
m0	=	masa posude i poklopca (pogledajte 6.1.), u gramima,
m1	=	masa posude, poklopca i ispitivanog uzorka (pogledajte 6.2.), u gramima,
m2	=	masa posude, poklopca i suhog uzorka za ispitivanje (pogledajte 6.3.5.), u gramima.

F	=	udio masti,
m0	=	masa ispitivanog uzorka (6.2.), u gramima,
m1	=	masa posude za sakupljanje masti i ekstrahirane tvari određene u točki 6.5.14., u gramima,
m2	=	masa pripremljene posude za sakupljanje masti ili, u slučaju netopivih tvari, posude za sakupljanje masti i netopivog taloga određenog u točki 6.5.16., u gramima,
m3	=	masa posude za sakupljanje masti korištene u slijepoj probi (6.3.) i sav ekstrahirani materijal određen u točki 6.5.14., u gramima,
m4	=	masa pripremljene posude za sakupljanje masti (pogledati 6.4.) korištene u slijepoj probi (6.3.) ili, u slučaju netopive tvari, posude za sakupljanje masti i netopivog taloga određenog u točki 6.5.16., u gramima.

WN	=	udio dušika,
V	=	volumen standardne volumetrijske otopine kiseline korištene pri određivanju, u mililitrima,
V0	=	volumen standardne volumetrijske otopine kiseline korištene u slijepoj probi u mililitrima,
c	=	koncentracija, izražena u molima po litri standardne volumetrijske otopine kiseline (4.7.),
m	=	masa ispitivanog uzorka u gramima.

mv	=	specifična masa uzorka očitana na hidrometru (5.4.) u g/l
MG	=	udio masti u uzorku u g/l
0,92	=	gustoća masti.