1.1.

„Prag za pokretanje postupka” znači količina dotične tvari kako je utvrđeno u Prilogu Preporuci 2013/711/EU koja zahtijeva istragu za otkrivanje izvora te tvari u slučajevima kada su otkrivene povećane količine te tvari.

1.2.

„Orijentacijske metode” znači metode upotrijebljene za odabir onih uzoraka s razinama PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a koje prelaze najveće dopuštene količine ili pragove za pokretanje postupka. One omogućavaju troškovno učinkovitu veliku propusnost uzoraka i tako povećavaju mogućnost za otkrivanje novih incidenata s velikom izloženosti i rizicima za zdravlje potrošača. Orijentacijske metode temelje se na bioanalitičkim i GC/MS metodama. Rezultati iz uzoraka koji prelaze cut-off vrijednost za provjeru sukladnosti s najvećom dopuštenom količinom provjeravaju se punom ponovljenom analizom originalnog uzorka potvrdnom metodom.

1.3.

„Potvrdne metode” znači metode koje osiguravaju potpune ili dopunske informacije koje omogućavaju nedvosmisleno otkrivanje i kvantificiranje najveće dopuštene količine PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a, ili u slučaju potrebe, praga za pokretanje postupka. Pri takvim metodama koriste se plinska kromatografija i masena spektrometrija visoke razlučivosti (GC-HRMS) ili plinska kromatografija i tandem masena spektrometrija (GC-MS/MS).

1.4.

„Bioanalitičke metode” znači metode koje se temelje na biološkim načelima, kao što su stanične bioanalize, receptorski ili imunološki testovi. Te metode ne daju rezultate na razini kongenera već samo navode (2) vrijednosti TEQ izražene u bioanalitičkim ekvivalentima (BEQ), s obzirom da svi spojevi prisutni u izolatu uzorka koji proizvedu odgovor pri ispitivanju možda ne ispunjavaju sve zahtjeve načela TEQ.

1.5.

„Iskorištenje dobiveno bioanalizom” znači BEQ količina izračunana iz TCDD ili PCB 126 kalibracijske krivulje, korigirane za vrijednost slijepe probe i zatim podijeljene s vrijednošću TEQ određenom potvrdnom metodom. Ta metoda pokušava korigirati faktore kao što su gubitak PCDD/PCDF i dioksinu sličnih spojeva tijekom ekstrakcije i čišćenja, koekstrakcijski spojevi koji povećavaju ili smanjuju odgovor (agonistički i antagonistički učinci), kvaliteta prilagodbe krivulje ili razlike između vrijednosti TEF i REP. Iskorištenje dobiveno bioanalizom izračunava se iz odgovarajućih referentnih uzoraka koji imaju reprezentativno raspoređene kongenere oko najviše dopuštene razine ili praga za pokretanje postupka.

1.6.

„Semikvantitativne metode” znači metode koje pokazuju približnu koncentraciju analita, a numerički rezultat ne ispunjava zahtjeve kvantitativnih metoda.

1.7.

„Prihvaćena granica kvantifikacije pojedinoga kongenera u uzorku” znači najmanji udio analita koji se može izmjeriti s razumnom statističkom sigurnošću, koji ispunjava kriterije identifikacije kako su opisani u međunarodno priznatim normama, na primjer u normi EN 16215:2012 (Hrana za životinje – određivanje dioksina i dioksinu sličnih PCB-a s pomoću GC/HRMS i PCB indikatora s pomoću GC/HRMS) i/ili u metodama EPA 1613 i 1668 kako su revidirane.

Granica kvantifikacije pojedinoga kongenera može se odrediti kao:

1.8.

„Gornji” znači pojam koji zahtijeva primjenu granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvanitificiranog kongenera.

1.9.

„Donji” znači pojam koji zahtijeva primjenu nule za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera.

1.10.

„Srednji” znači pojam koji zahtijeva primjenu polovice granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera.

1.11.

„Serija” znači točno određena količina hrane isporučena jednokratno i za koju nadležni inspektor može odrediti da posjeduje zajedničke karakteristike kao što su podrijetlo, vrsta, vrste pakiranja, osobu koja je pakirala, pošiljatelja ili oznake. U slučaju kada se radi o ribi i ribljim proizvodima i veličina ribe mora biti usporediva. U slučaju kada veličina i/ili masa ribe nije usporediva u istoj pošiljci, pošiljka se može smatrati serijom, ali se tada uzorkovanje mora obaviti prema posebnom postupku.

1.12.

„Podserija” znači određeni dio velike serije na kojoj se provodi uzorkovanje. Svaka podserija mora biti fizički odvojena i prepoznatljiva.

1.13.

„Pojedinačni uzorak” znači količina materijala uzetoga s jednoga mjesta iz serije, odnosno podserije.

1.14.

„Skupni uzorak” znači zbroj svih pojedinačnih uzoraka uzetih iz serije, odnosno podserije.

1.15.

„Laboratorijski uzorak” znači reprezentativni dio/količina skupnog uzorka namijenjen laboratorijskoj analizi.

BEQ

bioanalitički ekvivalenti

GC

plinska kromatografija

HRMS

masena spektrometrija visoke razlučivosti

LRMS

masena spektrometrija niske razlučivosti

MS/MS

tandem masena spektrometrija

PCB

poliklorirani bifenili

PCDD

poliklorirani dibenzo-p-dioksini

PCDF

poliklorirani dibenzofurani

QC

kontrola kvalitete

REP

relativna učinkovitost

TEF

faktori ekvivalentne toksičnosti

TEQ

toksični ekvivalenti

TCDD

tetraklorodibenzodioksin

U

proširena mjerna nesigurnost

—

U slučaju da serija koja se uzorkuje sadržava sitnu ribu (riba čija je pojedinačna masa manja od 1 kg), kao pojedinačni uzorak za tvorbu skupnog uzorka uzima se cijela riba. Kada bi tako dobiveni skupni uzorak težio više od 3 kg, pojedinačni uzorci mogu biti uzeti od sredine ribe, ako svaki takav uzorak, od riba koje čine skupni uzorak, teži najmanje 100 grama. Cijeli dio na koji se primjenjuju najveće dopuštene količine koristi se za homogenizaciju uzorka.

Sredina ribe je i njezino težište. Ono se najčešće nalazi kod leđne peraje (ako ju riba ima), odnosno na pola puta između otvora za škrge i anusa.

—

Kada serija koju se uzorkuje sadrži veće ribe (svaka riba je teža od 1 kg), pojedinačni se uzorak sastoji od središnjega dijela ribe. Svaki pojedinačni uzorak teži najmanje 100 g.

Kod riba srednje veličine (od oko 1 do 6 kg) pojedinačni uzorak se odreže u srednjem dijelu ribe koji se proteže od kralježnice do trbuha.

Kod velike ribe (npr. teže od 6 kg), uzima se pojedinačni uzorak s desne strane (gledano sprijeda) dorzo-lateralnog (odozgo i sa strane) dijela mišića iz sredine ribe. U slučaju kada bi tako uzeti uzorak izazvao veliki trošak, može se smatrati dovoljnim uzimanje triju pojedinačnih uzoraka od kojih svaki ima najmanje 350 grama bez obzira na veličinu serije ili alternativno jednaki dio mišićnog mesa u blizini repa ribe i dio mišićnog mesa u blizini glave iste ribe mogu se uzeti kao pojedinačni uzorak koji će biti reprezentativan za određivanje dioksina u cijeloj ribi.

—

Za pripremu uzorka primjenjuju se odredbe iz točke III.3.

—

Kada prevladava određena kategorija, veličina ili masa (oko 80 % serije i više), uzorak se uzima od riba čija veličina ili masa prevladava. Ovakav se uzorak smatra reprezentativnim za cijelu seriju.

—

Kada ne prevladava određena kategorija, veličina ili masa, mora se osigurati da se za uzorkovanje izaberu ribe koje su reprezentativne za cijelu pošiljku. Posebne upute za ove slučajeve nalaze se u „Smjernicama za uzorkovanje cijelih riba različitih veličina i/ili mase” (1).

—

izračunom proširene nesigurnosti, koristeći faktor pokrivanja 2, čime se dobiva pouzdanost od oko 95 %. Serija odnosno podserija nije sukladna ako je izmjerena vrijednost umanjena za mjernu nesigurnost (U) iznad utvrđene najviše dopuštene količine,

—

postavljanjem granične količine (CCα) u skladu s odredbama Odluke Komisije 2002/657/EZ (točka 3.1.2.5. Priloga I. toj Odluci – primjer tvari s određenom dozvoljenom količinom). Serija ili podserija je nesukladna ako je izmjerena vrijednost jednaka ili iznad CCα.

—

provedene orijentacijskom metodom s udjelom lažno sukladnih rezultata manjim od 5 % ukazuje da razina ne prelazi dotične najveće dopuštene količine PCDD/PCDF-a i zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a kako je propisano u Uredbi (EZ) br. 1881/2006;

—

provedene potvrdnom metodom ne prelazi dotične najveće dopuštene količine PCDD/PCDF-a i zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a kako je propisano u Uredbi (EZ) br. 1881/2006 uzimajući u obzir mjernu nesigurnost.

—

izračunom proširene nesigurnosti, koristeći faktor pokrivanja 2, čime se dobiva pouzdanost od oko 95 %. Serija odnosno podserija nije sukladna ako je izmjerena vrijednost umanjena za mjernu nesigurnost (U) iznad utvrđene najviše dopuštene količine. U slučaju kada se odvojeno određuju PCDD/PCDF i dioksinu slični PCB-i, tada se koristi zbroj procijenjenih proširenih nesigurnosti za svaki rezultat analize PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a zasebno, kako bi se dobio zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a,

—

postavljanjem granične količine (CCα) u skladu s odredbama Odluke 2002/657/EZ (točka 3.1.2.5. Priloga I. toj Odluci – primjer tvari s određenom dozvoljenom količinom. Serija ili podserija nije sukladna ako je izmjerena vrijednost jednaka ili iznad CCα.

(a)

Orijentacijske metode

Cilj orijentacijskih metoda je odabir onih uzoraka s razinama PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a koje prelaze najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Orijentacijske metode trebale bi omogućiti troškovno učinkovitu veliku propusnost uzoraka i tako povećati mogućnost za otkrivanje novih incidenata s velikom izloženosti i rizicima za zdravlje potrošača. Osmišljene su tako da se njima izbjegavaju lažno sukladni rezultati. One mogu uključivati bioanalitičke metode i GC/MS metode.

Orijentacijske metode uspoređuju analitički rezultat s cut-off vrijednošću, navodeći odluku da ili ne u pogledu mogućeg prelaženja najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Koncentracija PCDD/PCDF-a i zbroj PCDD/F-a i dioksinu sličnih PCB-a u uzorcima za koje se sumnja da su nesukladni s najvećom dopuštenom količinom mora biti određena/potvrđena potvrdnom metodom.

Osim toga, orijentacijske metode mogu pokazati razine PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a prisutne u uzorku. U slučaju primjene bioanalitičkih orijentacijskih metoda rezultat se izražava kao bioanalitički ekvivalenti (BEQ), dok se u slučaju primjene fizikalno-kemijskih GC-MS metoda izražava kao toksični ekvivalenti (TEQ). Numerički navedeni rezultati orijentacijskih metoda prikladni su za dokazivanje sukladnosti ili sumnje na nesukladnost ili prelaženja praga za pokretanje postupka i pokazuju raspon razina u slučaju daljnjeg praćenja s pomoću potvrdnih metoda. Oni nisu prikladni u svrhe kao što su ocjena količina prisutnosti, procjena unosa, praćenje vremenskih kretanja kod količina ili ponovljena ocjena pragova za pokretanje postupka i najveće dopuštene količine.

(b)

Potvrdne metode

Potvrdne metode omogućuju nedvosmisleno određivanje količine PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a u uzorku i osiguravaju punu informaciju na temelju kongenera. Stoga te metode omogućuju kontrolu najvećih dopuštenih količina i pragova za pokretanje postupka uključujući potvrdu rezultata dobivenih orijentacijskim metodama. Osim toga rezultati se mogu koristiti u druge svrhe kao što su određivanje niskih količina prisutnosti kod praćenja hrane, praćenje vremenskih kretanja, procjena izloženosti populacije i stvaranje baze podataka zbog moguće ponovne ocjene pragova za pokretanje postupka i najvećih dopuštenih količina. One su važne i za određivanje uzoraka kongenera kako bi se ustanovio izvor moguće kontaminacije. Pri takvim metodama koristi se GC-HRMS. Za potvrđivanje sukladnosti ili nesukladnosti s najvećom dopuštenom količinom može se koristiti i GC-MS/MS.

—

Mjere za sprečavanja uzajamnog zagađenja moraju se poduzeti u svakom stupnju uzorkovanja i analize.

—

Uzorci se moraju čuvati i prevoziti u spremnicima od stakla, aluminija, polipropilena ili polietilena koji su primjereni za čuvanje i ne utječu na sadržaj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a u uzorcima. Tragovi papirne prašine moraju se ukloniti iz spremnika.

—

Skladištenje i prijevoz moraju biti provedeni tako da se očuva cjelovitost uzorka hrane.

—

Gdje je to primjenjivo, svaki laboratorijski uzorak treba sitno samljeti i dobro promiješati koristeći postupak kojim se postiže potpuna homogenizacija (npr. prosijavanjem samljevenog uzorka kroz sito otvora 1 mm); ako je sadržaj vlage u uzorku previsok, uzorak se prije mljevenja mora osušiti.

—

Kontrola reagensa, staklovine i opreme zbog mogućeg utjecaja na rezultate izražene u TEQ ili BEQ od opće je važnosti.

—

Slijepu probu treba analizirati, provodeći cijeli analitički postupak ali bez uzorka.

—

Za bioanalitičke metode vrlo je važno da su sva staklovina i otapala koji se koriste u analizi ispitani da su slobodni od spojeva koji interferiraju s otkrivanjem ciljnih spojeva u radnom rasponu. Staklovinu treba isprati otapalima ili/i grijati na temperaturama koje su primjerene za otklanjanje tragova PCDD/PCDF-a, dioksinu sličnih spojeva te interferirajućih spojeva s njezine površine.

—

Masa uzorka za ekstrakciju mora biti dovoljna da se zadovolje zahtjevi u pogledu dovoljno niskog radnog raspona uključujući koncentracije na razini najveće dopuštene količine ili pragu za pokretanje postupka.

—

Posebni postupci pripreme uzorka koji se koriste za dotične proizvode moraju slijediti međunarodno priznate smjernice.

—

Kod ribe treba ukloniti kožu jer su najviše dopuštene količine propisane za mišić bez kože. Međutim potrebno je pažljivo i potpuno sastrugati cjelokupno mišićno i masno tkivo koje se nalazi s unutarnje strane kože i dodati ih u uzorak koji se analizira.

—

U skladu s odredbama Uredbe (EZ) br. 882/2004 Europskog parlamenta i Vijeća (1), laboratorije akreditiraju priznata tijela koja rade u skladu sa zahtjevima ISO Guide 58 kako bi se osiguralo da primjenjuju analitičko osiguranje kvalitete. Laboratoriji se akreditiraju prema normi EN ISO/IEC 17025.

—

Sposobnost laboratorija dokazuje se kontinuiranim uspješnim sudjelovanjem u međulaboratorijskim studijama za određivanje PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a u relevantnim matricama hrane i rasponima koncentracija.

—

Laboratoriji koji provode orijentacijske metode pri rutinskim kontrolama uzoraka moraju uspostaviti usku suradnju s laboratorijima koji provode potvrdne metode zbog kontrole kvalitete, i zbog potvrde analitičkih rezultata sumnjivih uzoraka.

—

Za PCDD/PCDF, osjetljivost određivanja mora biti na razini pikograma (10-15 g) zbog visoke toksičnosti nekih od ovih spojeva. Za većinu PCB kongenera dovoljna je osjetljivost u području nanograma (10-9 g). Međutim za mjerenje toksičnijih kongenera dioksinu sličnih PCB-a (posebno ne-orto supstituiranih kongenera) donji dio radnog raspona mora doseći donje pikogramsko područje (10-12 g).

—

Potrebno je razlikovati između PCDD-a, PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a i mnogobrojnih drugih, istodobno ekstrahiranih i vjerojatno interferirajućih spojeva, prisutnih u koncentracijama koje su nekoliko redova veličine veće od koncentracija predmetnih analita. Kod metoda plinske kromatografije/masene spektrometrije (GC-MS), nužno je razlikovati između različitih kongenera, npr. između toksičnih (npr. 17 2,3,7,8-supstituiranih PCDD/PCDF i 12 dioksinu sličnih PCB-a) i drugih kongenera.

—

Bioanalitičke metode moraju moći otkriti ciljne spojeve kao zbroj PCDD/PCDF-a i/ili dioksinu sličnih PCB-a. Čišćenje uzorka ima za cilj uklanjanje spojeva koji uzrokuju lažnu nesukladnost rezultata ili spojeva koji mogu smanjiti odgovor i prouzročiti lažno sukladne rezultate.

—

Kod metoda GC/MS određivanje treba osigurati valjanu procjenu prave koncentracije u uzorku. Visoka točnost (točnost mjerenja: podudarnost između rezultata mjerenja i stvarne ili prihvaćene referentne vrijednosti mjerenoga) potrebna je da bi se izbjeglo odbijanje rezultata analize uzorka na temelju nepouzdane procjene rezultata TEQ-a. Točnost se izražava kao istinitost (razlika između izmjerene srednje vrijednosti za analit u certificiranome materijalu i njegove certificirane vrijednosti, izražene kao postotak ove vrijednosti) i preciznost (RSDR relativna standardna devijacija izračunana iz rezultata dobivenih u uvjetima obnovljivosti).

—

Kod bionalitičkih metoda potrebno je odrediti očito iskorištenje pri biološkim testovima.

—

Laboratoriji moraju dokazati učinkovitost izvedbe metode u određenom rasponu najveće dopuštene količine, npr. 0,5 ×, 1 × i 2 × većom količinom od najveće dopuštene količine, s prihvatljivom relativnom standardnom devijacijom ponovljene analize tijekom validacijskog postupka i/ili rutinske analize.

—

Redovite slijepe probe i pokusi s dodavanjem ili analize kontrolnih uzoraka (ako je dostupan, poželjan je certificirani referentni materijal) provode se kao mjere unutarnje kontrole kvalitete. Dijagrami kontrole kvalitete (QC) za slijepe probe, pokuse s dodavanjem ili analize kontrolnih uzoraka, bilježe se i provjeravaju kako bi se osiguralo da je provedba analiza u skladu sa zahtjevima.

—

Za bioanalitičku orijentacijsku metodu, određivanje LOQ nije nužno potrebno, ali je potrebno dokazati da metoda može razlikovati slijepu vrijednost od cut-off vrijednosti. Pri određivanju vrijednosti BEQ određuje se prag izvještavanja zbog postupanja s uzorcima koji daju odgovor ispod te razine. Za prag izvještavanja potrebno je dokazati da se razlikuje najmanje za tri puta od postupka sa slijepim uzorcima s odgovorom ispod radnog raspona. Stoga ga se izračunava na temelju uzoraka koji sadrže ciljne spojeve blizu najniže zahtijevane razine, a ne iz omjera između signala i šuma ili slijepe probe.

—

Granica određivanja (LOQ) za potvrdnu metodu mora biti približno jedna petina najveće dopuštene količine.

—

Za pouzdane rezultate potvrdnih ili orijentacijskih metoda moraju biti ispunjeni sljedeći kriteriji u rasponu najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka, za TEQ vrijednosti odnosno BEQ vrijednosti, koje se određuju kao ukupna vrijednost TEQ (kao zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a), ili odvojeno za PCDD/PCDF i dioksinu slične PCB-e.

—

Mogu se koristiti GC/MS metode analize i bioanalitičke metode. Za GC/MS metode primjenjuju se zahtjevi utvrđeni u točki 6. ovog Priloga. Za stanične bioanalitičke metode primjenjuju se posebni zahtjevi utvrđeni u točki 7. ovog Priloga.

—

Laboratoriji koji provode orijentacijske metode za rutinsku kontrolu uzoraka moraju uspostaviti usku suradnju s laboratorijima koji provode potvrdnu metodu.

—

Tijekom rutinske analize potrebno je provesti provjeru mogućnosti orijentacijske metode pomoću kontrole analitičke kvalitete i stalnog vrednovanja metoda. Kontinuirano se mora provoditi program za kontrolu sukladnih rezultata.

—

Provjera mogućeg smanjenja staničnog odgovora i citotoksičnosti

20 % izolata uzoraka mjeri se u rutinskom orijentacijskom pregledu bez i s dodanim 2,3,7,8-TCDD koji odgovara najvećoj dopuštenoj količini ili pragu za pokretanje postupka kako bi se provjerilo je li odgovor možda smanjen zbog interferirajućih supstanci prisutnih u izolatu uzorka. Izmjerena koncentracija uzorka s dodatkom usporedi se sa zbrojem koncentracija izolata bez dodatka i koncentracije za dodavanje. Ako je ta izmjerena koncentracija za više od 25 % manja od izračunane (zbirne) koncentracije, to ukazuje na moguće smanjenje signala i dotični rezultat treba podvrgnuti potvrdnoj analizi. Rezultati se prate na dijagramima kontrole kvalitete.

—

Kontrola kvalitete sukladnih uzoraka

Otprilike od 2 % do 10 % sukladnih uzoraka, ovisno o matrici uzorka i laboratorijskim iskustvima, bit će potvrđeno.

—

Određivanje učestalosti lažno sukladnih rezultata na temelju podataka QC

Određuje se učestalost lažno sukladnih rezultata dobivenih orijentacijskim metodama analize uzoraka ispod i iznad najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Stvarna učestalost lažno sukladnih rezultata mora biti ispod 5 %.

Nakon što je najmanje 20 potvrđenih rezultata po matrici/skupini matrica dostupno iz kontrole kvalitete sukladnih uzoraka, donose se zaključci o učestalosti lažno sukladnih rezultata iz te baze podataka. Rezultati uzoraka analizirani prstenastim probama ili tijekom incidenata kontaminacije koji pokrivaju raspon koncentracije do npr. 2 × najveće dopuštene količine (NDK), mogu se uključiti i u minimum od 20 rezultata za procjenu učestalosti lažno sukladnih rezultata. Uzorci moraju uključivati najčešće uzorke kongenera koji predstavljaju različite izvore.

Iako su orijentacijske metode usmjerene prvenstveno na otkrivanje uzoraka koji prelaze prag za pokretanje postupka, kriterij za određivanje lažno sukladnih rezultata je najveća dopuštena količina, uzimajući u obzir mjernu nesigurnost potvrdne metode.

—

Mogući nesukladni rezultati iz orijentacijske metode moraju se uvijek provjeriti cijelom ponovljenom analizom na originalnom uzorku potvrdnom metodom. Ti se uzorci mogu koristiti i za procjenu učestalosti lažno nesukladnih rezultata. Kod orijentacijskih metoda učestalost „lažnih nesukladnih rezultata” je dio rezultata za koje je potvrđeno da su sukladni potvrdnom analizom, dok je prethodnom orijentacijskom metodom analize za uzorak izražena sumnja da nije sukladan. Međutim, procjena prednosti orijentacijske metode temelji se na usporedbi lažno nesukladnih rezultata s ukupnim brojem pregledanih uzoraka. Ta učestalost mora biti dovoljno niska da je uporaba orijentacijske metode korisna.

—

Bioanalitičke metode moraju barem u uvjetima validacije valjano pokazati količinu TEQ, izračunanu i izraženu kao BEQ.

—

Ikod bioanalitičkih metoda provedenih u uvjetima ponovljivosti, interna laboratorijska ponovljivost RSDr je uobičajeno manja nego obnovljivost RSDR.

—

Razlika između gornje i donje granice ne smije biti veća od 20 % da bi se potvrdilo prelaženje najveće dopuštene količine ili u slučaju potrebe prelaženja praga za pokretanje postupka.

—

Dodavanje (1)C-označenih 2,3,7,8- klor supstituiranih unutarnjih standarda za PCDF/F i (1)C-označenih unutarnjih standarda za dioksinu slične PCB-e je potrebno provesti na samom početku metode analize, na primjer prije ekstrakcije kako bi se vrednovao analitički postupak. Najmanje se mora dodati po jedan kongener za sve tetra do okta-klorirane homologne skupine za PCDD/PCDF i najmanje po jedan kongener za sve homologne skupine za dioksinima slične PCB-e (odnosno najmanje po jedan kongener za svaki izabrani ion u spektrometriji masa koja se koristi za praćenje PCDD/PCDF-a odnosno dioksinima sličnih PCB-a). U slučaju potvrdnih metoda koristi se svih 17 (1)C-označenih 2,3,7,8-klor supstituiranih unutarnjih standarda za PCDD/PCDF-e i svih 12 (1)C-označenih unutarnjih standarda za dioksinu slične PCB-e.

—

Relativne faktore odgovora treba utvrditi i za one kongenere za koje se ne dodaje ni jedan (1)C-označen analog, tako što će se koristiti odgovarajuće kalibracijske otopine.

—

Za hranu biljnog i životinjskoga podrijetla koja sadrži manje od 10 % masti, unutarnji se standardi obavezno dodaju prije ekstrakcije. Za hranu životinjskoga podrijetla u kojoj je udio masti veći od 10 %, unutarnji se standardi mogu dodati prije ili poslije ekstrakcije masti. Mora se provesti odgovarajuće vrednovanje učinkovitosti ekstrakcije, što ovisi o tome dodaje li se unutarnji standard prije ili nakon ekstrakcije masti, te o tome iskazuju li se rezultati na udio masti u uzorku ili na cijeli uzorak.

—

Prije GC/MS analize treba dodati 1 ili 2 (surogat) standarda radi provjere iskorištenja

—

Potrebno je kontrolirati iskorištenje. Za potvrdne metode, iskorištenje pojedinačnih unutarnjih standarda mora biti u rasponu između 60 % i 120 %. Manje ili veće iskorištenje za pojedinačne kongenere, a posebno za neke hepta- i okta-klorirane dibenzo-p-dioksine i dibenzofurane, je prihvatljivo pod uvjetom da je njihov doprinos TEQ vrijednosti manji od 10 % ukupne TEQ vrijednosti (dobivene na temelju zbroja PCDD/PCDF-a i dioksinima sličnih PCB-a). Za orijentacijske metode GC/MS iskorištenje mora biti u rasponu između 30 % i 140 %.

—

Odvajanje PCDD/PCDF-a od interferirajućih kloriranih spojeva kao što su PCB-i koji nisu slični dioksinu i klorirani difenil eteri se provodi pomoću odgovarajućih kromatografskih tehnika (najbolje pomoću kolone s florisilom, aluminijevim oksidom i/ili aktivnim ugljenom).

—

Razdvajanje izomera plinskom kromatografijom mora biti zadovoljavajuće (< 25 % od vrha do vrha između 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Raspon kalibracijske krivulje mora obuhvaćati relevantni raspon najvećih dopuštenih količina ili pragova za pokretanje postupka.

—

Za GC-HRMS:

—

Za GC-MS/MS:

—

Kada se koncentracije izračunavaju iz kalibracijske krivulje za TCDD, vrijednosti na donjem i gornjem kraju krivulje pokazuju veliku razliku (visok koeficijent varijacije (CV)). Radni raspon je raspon u kojem je CV manji od 15 %. Donji dio radnog raspona (prag izvještavanja) mora se dalje odrediti u znatno većoj mjeri (najmanje tri puta više) od postupka slijepe probe. Gornji dio radnog raspona obično predstavlja vrijednost EC70 (70 % najveće učinkovite koncentracije), ali je niži ako je CV u tom rasponu veći od 15 %. Radni raspon se određuje tijekom validacije. Cut-off vrijednosti (7.3.) moraju biti dobro unutar radnog raspona.

—

Standardne otopine i izolati uzoraka se ispituju barem dvostrukom analizom Kad se koriste dvostruke analize, standardne otopine ili izolati kontrolnih uzoraka ispitani u 4 do 6 bunarčića raspoređenih po pločici pokazuju odgovor ili koncentraciju (moguće samo u radnom rasponu) na temelju CV < 15 %.

—

Razine u uzorcima se mogu procijeniti usporedbom odgovora na ispitivanje s kalibracijskom krivuljom TCDD (ili PCB 126 ili standardna mješavina PCDD/PCDF-a/dioksinu sličnih PCB-a) za izračun BEQ vrijednosti u izolatu i kasnije u uzorku.

—

Kalibracijska krivulja sadrži 8 do 12 koncentracija (barem dvostruko) s dovoljno koncentracija u donjem dijelu krivulje (radni raspon). Posebnu pažnju treba obratiti na kvalitetu prilagodbe krivulje u radnom rasponu. Tako R2 vrijednost ima malu ili nikakvu korist u procjeni ispravnosti prilagodbe pri nelinearnoj regresiji. Bolja prilagodba postići će se smanjivanjem razlike između izračunatih i primijećenih vrijednosti u radnom rasponu krivulje (npr. smanjivanjem zbroja kvadrata rezidua).

—

Procijenjena vrijednost u izolatu uzorka se zatim korigira za vrijednost BEQ, izračunanu za slijepi uzorak matrice/otapala (kako bi se uzele u obzir nečistoće iz upotrijebljenih otapala i kemikalija) i za očito iskorištenje (izračunano iz vrijednosti BEQ odgovarajućih referentnih uzoraka s reprezentativnim uzorcima kongenera u području najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka). Za korekciju iskorištenja, očito iskorištenje mora uvijek biti unutar zahtijevanog raspona (vidjeti točku 7.1.4.). Referentni uzorci koji se koriste za korekciju iskorištenja moraju biti sukladni zahtjevima iz točke 7.2.

—

Referentni uzorci predstavljaju uzorke matrica, uzorke kongenera i raspone koncentracija za PCDD/PCDF i dioksinu slične PCB-e oko najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka.

—

Uz svaku seriju uzoraka koja se ispituje mora se uključiti jedna slijepa proba ili po mogućnosti slijepa matrica i jedan referentni uzorak s najvećom dopuštenom količinom ili na pragu za pokretanje postupka. Ovi uzorci se moraju ekstrahirati i analizirati istodobno u istovjetnim uvjetima. Referentni uzorak mora pokazati izrazito veći odgovor od slijepog uzorka, što osigurava ispravnost testa. Ti se uzorci mogu koristiti za korekciju slijepe probe i iskorištenja.

—

Referentni uzorci koji se odabiru za korekciju iskorištenja su reprezentativni za pokusne uzorke, što znači da uzorci kongenera ne uzrokuju preniske procjene vrijednosti.

—

Dodatnim referentnim uzorcima kojima su količine 0,5 i 2 puta veće od najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka mogu se uključiti za dokazivanje ispravnosti ispitivanja u rasponu propisanih količina za kontrolu najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Ako se kombiniraju, ovi uzorci se mogu koristiti za izračun vrijednosti BEQ u pokusnim uzorcima (7.1.2.2).

BEQDL

BEQ što odgovara odlučujućoj granici potvrdne metode, koja je najveća dopuštena količina uzimajući u obzir mjernu nesigurnost

sy,x

standardna devijacija rezidua

t α,f=m-2

student faktor (α = 5 %, f = slobodni stupnjevi, jednostrani)

m

ukupan broj kalibracijskih točaka (indeks j)

n

broj ponavljanja na svakoj razini

xi

koncentracija uzorka (u TEQ) kalibracijske točke i određena potvrdnom metodom

srednja vrijednost koncentracija (u TEQ) svih kalibriranih uzoraka

Qxx

=

i

=

indeks za kalibracijsku točku i

SDR

standardna devijacija rezultata bioanalitičkih testova pri BEQDL, izmjereno u uvjetima unutarnje laboratorijske obnovljivosti

1.

iz donjeg raspona 95 % intervala predviđanja pri odlučujućoj granici potvrdne metode,

2.

iz višestrukih analiza uzoraka (n ≥ 6) kontaminiranih na odlučujućoj granici potvrdne metode kao donja krajnja točka distribucije (na slici prikazana s krivuljom u obliku zvona) pri odgovarajućoj srednjoj BEQ vrijednosti.

—

S obzirom da se u bioanalitičkim metodama ne mogu koristiti unutarnji standardi, moraju se provoditi ispitivanja ponovljivosti kako bi se dobili podaci o standardnoj devijaciji unutar i između serija ispitivanja. Ponovljivost mora biti manja od 20 %, a interna laboratorijska obnovljivost manja od 25 %. To se temelji na razinama izračunatih u BEQ nakon korekcije za vrijednost slijepe probe i za iskorištenja.

—

U postupku validacije potrebno je dokazati da test pravi razliku između slijepe probe i razine na cut-off vrijednosti omogućavajući identifikaciju uzoraka iznad odgovarajuće cut-off vrijednosti (vidjeti 7.1.2.).

—

Moraju se utvrditi ciljni spojevi, moguće interferencije i najveće prihvatljive količine za slijepe probe.

—

Postotak standardne devijacije u odgovoru ili koncentraciji izračunan iz odgovora (moguće samo u radnom rasponu) pri trostrukom određivanju izolata uzorka ne smije biti iznad 15 %.

—

Nekorigirani rezultati referentnih uzoraka izraženi u BEQ (vrijednost slijepe probe i pri najvećoj dopuštenoj količini ili pragu za pokretanje postupka) koriste se za ocjenu izvedivosti bioanalitičke metode kroz kontinuirano vremensko razdoblje.

—

Dijagrami kontrole kvalitete (QC) za postupke sa slijepim uzorcima i svaka vrsta referentnog uzorka bilježe se i provjeravaju kako bi se osiguralo da je izvedivost analiza u skladu sa zahtjevima, a posebno za postupak sa slijepim uzorcima u pogledu zahtijevane najmanje razlike do donjeg dijela radnog raspona i za referentne uzorke u pogledu unutar laboratorijske obnovljivosti. Postupke sa slijepim uzorcima potrebno je dobro kontrolirati kako bi se izbjegli lažno sukladni rezultati kada se oduzimaju.

—

Rezultati analiza potvrdnim metodama sumnjivih uzoraka i 2 do 10 % sukladnih uzoraka (najmanje 20 uzoraka po matrici) sakuplja se i koristi za procjenu izvedivosti orijentacijske metode i odnosa između BEQ i TEQ. Ova baza podataka može se koristiti za ponovljenu evaluaciju cut-off vrijednosti koje se primjenjuju na rutinske uzorke za validirane matrice.

—

Uspješna izvedivost metode može se također dokazati prstenastim probama. Rezultati uzoraka analiziranih prstenastim probama koje uključuju raspon koncentracija od npr. 2 × najveće dopuštene količine, mogu također biti uključeni u procjenu učestalosti lažno sukladnih rezultata, ako laboratorij može dokazati uspješnu izvedivost. Uzroci uključuju najčešće uzorke kongenera, koji predstavljaju različite izvore.

—

Tijekom incidenata se mogu ponovo procijeniti cut-off vrijednosti uzimajući u obzir posebne uzorke matrica i kongenera koji se pojavljuju u tom incidentu.

—

U onoj mjeri u kojoj to analitički postupak dopušta, analitički rezultati moraju sadržavati količine pojedinačnih PCDD/PCDF-a i kongenera dioksinu sličnih PCB-a i treba ih definirati kao donje, gornje ili srednje kako bi se u izviješće uključilo što više podataka o rezultatima i na taj način omogućilo tumačenje rezultata prema posebnim zahtjevima.

—

U izvješće je potrebno uključiti i metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-a, dioksinu sličnih PCB-a i masti. Udio masti u uzorku određuje se i iskazuje za uzorke hrane s najvećim dopuštenim količinama određenim na temelju masti i očekivanom koncentracijom masti u rasponu od 0 – 2 % (u skladu s postojećim zakonodavstvom), za druge uzorke je određivanje udjela masti neobavezno.

—

Iskorištenja pojedinih unutarnjih standarda moraju biti navedena u slučaju da su izvan raspona navedenog u točki 6.2., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najveće dopuštene količine (u tom slučaju iskorištenja za jednu ili dvije dvostruke analize), a u drugim slučajevima na zahtjev.

—

S obzirom da mjernu nesigurnost treba uzeti u obzir pri odluci o sukladnosti uzorka, potrebno je navesti i taj parametar. Stoga se rezultati analize prikazuju kao x +/- U, gdje je x rezultat analize, a U je proširena mjerna nesigurnost koristeći faktor pokrivanja 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od 95 %. Određuju li se odvojeno PCDD/PCDF-i i dioksinu slični PCB-i, tada se zbroj procijenjene proširene nesigurnosti za pojedinačne rezultate analiza PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a koristi za zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a.

—

Ako se uzima u obzir mjerna nesigurnost primjenom CCα (kako je opisano u Prilogu II. točki IV.2.), tada se mora navesti i taj parametar.

—

Rezultati se moraju iskazati u istim mjernim jedinicama i zaokružiti (barem) na jednak broj decimalnih mjesta kao naveće dopuštene količine, kako je određeno u Uredbi (EZ) br. 1881/2006.

—

Rezultat orijentacijske metode se izražava kao sukladan ili se za njega sumnja da je nesukladan („sumnjiv”).

—

Osim toga, rezultat za PCDD/PCDF-e i/ili dioksinu slične PCB-e može se izraziti u bioanalitičkim ekvivalentima (ne TEQ) (vidjeti Prilog III. točku 1.). Za uzorke s odgovorom ispod granice izvještavanja navodi se da su ispod granice izvještavanja.

—

Za svaku vrstu uzorka matrice u izvješću se mora navesti najveća dopuštena količina ili prag za pokretanje postupka na kojoj se procjena temelji.

—

U izvješću se mora navesti vrsta ispitivanja koje se koristi, osnovno načelo ispitivanja i vrsta kalibracije.

—

U izvješću je potrebno uključiti i metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-a, dioksinu sličnih PCB-a i masti. Udio masti u uzorku se određuje i iskazuje za uzorke hrane s najvećim dopuštenim količinama ili pragovima za pokretanje postupka određenim na temelju masti i očekivanom koncentracijom masti u rasponu od 0 – 2 % (u skladu s postojećim zakonodavstvom), za druge uzorke je određivanje udjela masti neobavezno.

—

U slučaju uzoraka za koje se sumnja da nisu sukladni, izvješće treba uključivati napomenu o postupku koji treba poduzeti. Koncentracija PCDD/PCDF-a i zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a u tim uzorcima s povišenim razinama mora se odrediti/potvrditi potvrdnom metodom.

—

Relativno retencijsko vrijeme u odnosu na unutarnje standarde ili referentne standarde (prihvaćena devijacija od +/- 0,25 %).

—

Plinsko kromatografsko odvajanje svih šest indikatorskih PCB-a (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 i PCB 180) od interferirajućih tvari, posebno ko-eluiranih PCB-a, a posebno ako su uzorci u rasponu zakonski dozvoljenih granica i nesukladnost se mora potvrditi.

[Kongeneri za koje je često ustanovljeno da ko-eluiraju su npr. PCB 28/31, PCB 52/69 i PCB 138/163/164. Za GC/MS moraju se uzeti u obzir i moguće interferencije fragmenata viših kloriranih kongenera.]

—

Za tehnike GC-MS:

—

Za GC-ECD:

Potvrda rezultata koji prelaze dopušteno odstupanje s dva stupca GC sa stacionarnim fazama različitog polariteta.

—

Korištenje primjerenih unutarnjih standarda s fizikalno-kemijskim svojstvima koji odgovaraju predmetnim analitima.

—

Dodavanje unutarnjih standarda:

—

Zahtjevi za metode u kojima se koristi svih šest indikatorskih kongenera PCB-a označenih izotopima:

—

Zahtjevi za metode u kojima se ne koristi svih šest izotopski označenih unutarnjih standarda ili se koriste drugi unutarnji standardi:

—

Iskorištenje neoznačenih kongenera provjerava se analizom uzoraka s dodatkom ili kontrolnih uzoraka s koncentracijama u rasponu najveće dopuštene količine. Prihvatljivo iskorištenje za te kongenere je između 70 i 120 %.

—

U onoj mjeri u kojoj to analitički postupak dopušta, analitički rezultati moraju sadržavati količine pojedinačnih PCB kongenera i treba ih definirati kao donje, gornje ili srednje kako bi se u izviješće uključilo što više podataka o rezultatima i na taj način omogućilo tumačenje rezultata prema posebnim zahtjevima.

—

U izvješće je potrebno uključiti i metodu koja se koristi za ekstrakciju PCB-a i masti. Udio masti u uzorku se određuje i iskazuje za uzorke hrane s najvećim dopuštenim količinama određenim na temelju masti i očekivanom koncentracijom masti u rasponu od 0 – 2 % (u skladu s važećim zakonodavstvom), za druge uzorke je određivanje udjela masti neobavezno.

—

Iskorištenja pojedinih unutarnjih standarda moraju biti navedena u slučaju da su izvan raspona navedenog u točki 6., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najvećih dopuštenih količina, a u drugim slučajevima na zahtjev.

—

S obzirom da mjernu nesigurnost treba uzeti u obzir pri odluci o sukladnosti uzorka, taj je parametar također potrebno navesti. Stoga se rezultati analize prikazuju kao x +/- U, gdje je x rezultat analize, a U je proširena mjerna nesigurnost koristeći faktor pokrivanja 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od 95 %.

—

Ako se uzima u obzir mjerna nesigurnost primjenom CCα (kako je opisano u Prilogu II. točki IV.1.) tada se mora navesti i taj parametar.

—

Rezultati se moraju iskazati u istim mjernim jedinicama i zaokružiti (barem) na jednak broj decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine, kako je određeno u Uredbi (EZ) br. 1881/2006.