1.1.

„Prag za pokretanje postupka” znači količina dotične tvari kako je utvrđeno u Prilogu Preporuci 2013/711/EU zbog koje se pokreću istrage za otkrivanje izvora te tvari u slučajevima kada su otkrivene povećane količine te tvari.

1.2.

„Orijentacijske metode” znači metode upotrijebljene za odabir onih uzoraka s količinama PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova koje prelaze najveće dopuštene količine ili pragove za pokretanje postupka. Njima se omogućuje troškovno učinkovita velika propusnost uzoraka i tako povećava mogućnost za otkrivanje novih slučajeva kada velika izloženost može dovesti do rizika za zdravlje potrošača. Orijentacijske metode temelje se na bioanalitičkim ili GC/MS metodama. Rezultati iz uzoraka koji prelaze cut-off vrijednost utvrđenu za provjeru sukladnosti s najvećom dopuštenom količinom provjeravaju se potpunom ponovljenom analizom originalnog uzorka upotrebom potvrdne metode.

1.3.

„Potvrdne metode” znači metode koje osiguravaju potpune ili dopunske informacije kojima se omogućuju nedvosmisleno otkrivanje i kvantificiranje najveće dopuštene količine PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova, ili u slučaju potrebe, praga za pokretanje postupka. Pri takvim metodama koriste se plinska kromatografija/masena spektrometrija visoke razlučivosti (GC-HRMS) ili plinska kromatografija/tandem masena spektrometrija (GC-MS/MS).

1.4.

„Bioanalitičke metode” znači metode koje se temelje na biološkim načelima, npr. stanične bioanalize, receptorski ili imunološki testovi. Te metode ne daju rezultate na razini kongenera već samo navode (1) vrijednosti TEQ izražene u bioanalitičkim ekvivalentima (BEQ), s obzirom na to da svi spojevi prisutni u izolatu uzorka koji proizvedu odgovor pri ispitivanju možda ne ispunjavaju sve zahtjeve načela TEQ.

1.5.

„Iskorištenje dobiveno bioanalizom” znači količina BEQ izračunana iz kalibracijske krivulje za TCDD ili PCB 126, korigirane za vrijednost slijepe probe i zatim podijeljene s vrijednošću TEQ određenom potvrdnom metodom. Ta metoda pokušava korigirati faktore kao što su gubitak PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih spojeva tijekom ekstrakcije i čišćenja, koekstrakcijski spojevi koji povećavaju ili smanjuju odgovor (agonistički i antagonistički učinci), kvaliteta prilagodbe krivulje ili razlike između vrijednosti TEF i REP. Iskorištenje dobiveno bioanalizom izračunava se iz odgovarajućih referentnih uzoraka koji imaju reprezentativno raspoređene kongenere oko najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka.

1.6.

„Dvostruka analiza” znači odvojena analiza predmetnih analita upotrebom drugog alikvota istog homogeniziranog uzorka.

1.7.

„Prihvaćena posebna granica kvantifikacije (2) pojedinog kongenera u uzorku” znači najmanji udio analita koji se može izmjeriti s razumnom statističkom sigurnošću, koji ispunjuje kriterije identifikacije kako su opisani u međunarodno priznatim normama, na primjer u normi EN 16215:2012 („Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC/HRMS and of indicator PCBs by GC/HRMS”) i/ili u metodama EPA 1613 i 1668 kako su revidirane.

Granica kvantifikacije pojedinog kongenera može se odrediti na sljedeći način:

1.8.

„Gornji” znači pojam koji zahtijeva primjenu granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera.

1.9.

„Donji” znači pojam koji zahtijeva primjenu nule za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera.

1.10.

„Srednji” znači pojam koji zahtijeva primjenu polovice granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera.

1.11.

„Serija” znači točno određena količina hrane isporučena jednokratno i za koju nadležna osoba može odrediti da posjeduje zajedničke karakteristike kao što su podrijetlo, vrsta, vrsta pakiranja, osoba koja je pakirala, pošiljatelj ili oznake. U slučaju kada se radi o ribi i ribljim proizvodima i veličina ribe mora biti usporediva. U slučaju kada veličina i/ili masa ribe nije usporediva u istoj pošiljci, pošiljka se može smatrati serijom, ali se tada uzorkovanje mora obaviti prema posebnom postupku.

1.12.

„Podserija” znači određeni dio velike serije na kojoj se provodi uzorkovanje. Svaka podserija mora biti fizički odvojena i prepoznatljiva.

1.13.

„Pojedinačni uzorak” znači količina materijala uzetoga s jednoga mjesta iz serije, odnosno podserije.

1.14.

„Skupni uzorak” znači zbroj svih pojedinačnih uzoraka uzetih iz serije, odnosno podserije.

1.15.

„Laboratorijski uzorak” znači reprezentativni dio/količina skupnog uzorka namijenjen laboratorijskoj analizi.

BEQ

bioanalitički ekvivalenti

GC

plinska kromatografija

HRMS

masena spektrometrija visoke razlučivosti

LRMS

masena spektrometrija niske razlučivosti

MS/MS

tandem masena spektrometrija

PCB

poliklorirani bifenil

PCB-ovi koji nisu slični dioksinima

PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 i PCB 180

PCDD

poliklorirani dibenzo-p-dioksini

PCDF

poliklorirani dibenzofurani

QC

kontrola kvalitete

REP

relativna učinkovitost

TEF

faktor ekvivalentne toksičnosti

TEQ

toksični ekvivalenti

TCDD

2,3,7,8-tetraklorodibenzo-p-dioksin

U

proširena mjerna nesigurnost

—

Ako serija koja se uzorkuje sadržava sitnu ribu (riba čija je pojedinačna masa manja od oko 1 kg), kao pojedinačni uzorak za tvorbu skupnog uzorka uzima se cijela riba. Kada tako dobiveni skupni uzorak teži više od 3 kg, pojedinačni uzorci mogu se uzeti od sredine ribe, ako svaki takav uzorak, od riba koje čine skupni uzorak, teži najmanje 100 grama. Cijeli dio na koji se primjenjuju najveće dopuštene količine koristi se za homogenizaciju uzorka.

Sredina ribe je i njezino težište. Ono se najčešće nalazi kod leđne peraje (ako je riba ima), odnosno na pola puta između otvora za škrge i anusa.

—

Ako serija koju se uzorkuje sadržava veće ribe (svaka riba je teža od oko 1 kg), pojedinačni se uzorak sastoji od središnjega dijela ribe. Svaki pojedinačni uzorak teži najmanje 100 g.

Kod riba srednje veličine (od oko 1 do 6 kg) pojedinačni uzorak se odreže u srednjem dijelu ribe koji se proteže od kralježnice do trbuha.

Kod vrlo velikih riba (npr. > približno 6 kg), uzima se pojedinačni uzorak s desne strane (gledano sprijeda) dorzo-lateralnog (odozgo i sa strane) dijela mišića iz sredine ribe. Ako bi tako uzeti uzorak sredine ribe prouzrokovao veliki trošak, može se smatrati dovoljnim uzimanje triju pojedinačnih uzoraka, od kojih svaki ima najmanje 350 grama bez obzira na veličinu serije, ili alternativno jednaki dio mišićnog mesa u blizini repa ribe i dio mišićnog mesa u blizini glave iste ribe mogu se uzeti kao pojedinačni uzorak koji će biti reprezentativan za određivanje dioksina u cijeloj ribi.

—

Za pripremu uzorka primjenjuju se odredbe iz točke III.3.

—

Kada prevladava određeni razred ili kategorija veličine ili mase (oko 80 % serije i više), uzorak se uzima od riba čija veličina ili masa prevladava. Ovakav se uzorak smatra reprezentativnim za cijelu seriju.

—

Ako ne prevladava ni jedan određeni razred ili kategorija veličine ili mase, mora se osigurati da su ribe odabrane za uzorak reprezentativne za seriju. Posebne smjernice za takve slučajeve navedene su u smjernicama za uzorkovanje cijelih riba različite veličine i/ili mase „Guidance document on sampling of whole fishes of different size and/or weight” (2).

—

provedene orijentacijskom metodom s udjelom lažno sukladnih rezultata manjim od 5 % upućuje na to da količina ne prelazi odgovarajuće najveće dopuštene količine PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova kako je utvrđeno u Uredbi (EZ) br. 1881/2006;

—

provedene potvrdnom metodom ne prelazi odgovarajuće najveće dopuštene količine PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova kako je utvrđeno u Uredbi (EZ) br. 1881/2006 uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost (5).

—

Mjere za sprečavanje uzajamne kontaminacije moraju se poduzeti u svakoj fazi uzorkovanja i analize.

—

Uzorci se moraju čuvati i prevoziti u spremnicima od stakla, aluminija, polipropilena ili polietilena koji su primjereni za čuvanje i ne utječu na količine PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u uzorcima. Tragovi papirne prašine moraju se ukloniti iz spremnika za uzorke.

—

Skladištenje i prijevoz moraju biti provedeni tako da se očuva cjelovitost uzorka hrane.

—

Gdje je to relevantno, svaki laboratorijski uzorak treba sitno samljeti i dobro promiješati koristeći postupak kojim se dokazano postiže potpuna homogenizacija (npr. prosijavanjem samljevenog uzorka kroz sito otvora 1 mm); ako je sadržaj vlage u uzorku previsok, uzorak se prije mljevenja mora osušiti.

—

Kontrola reagensa, staklenog pribora i opreme zbog mogućeg utjecaja na rezultate izražene u TEQ ili BEQ od opće je važnosti.

—

Slijepu probu treba analizirati provodeći cijeli analitički postupak, ali bez uzorka.

—

Za bioanalitičke metode vrlo je važno da su sav stakleni pribor i otapala koji se koriste u analizi ispitani da ne sadržavaju spojeve koji utječu na otkrivanje ciljnih spojeva u radnom rasponu. Stakleni pribor treba isprati otapalima ili/i grijati na temperaturama koje su primjerene za otklanjanje tragova PCDD/PCDF-ova, dioksinima sličnih spojeva te interferirajućih spojeva s njihove površine.

—

Količina uzorka za ekstrakciju mora biti dovoljna da se ispune zahtjevi u pogledu dovoljno niskog radnog raspona uključujući koncentracije na razini najveće dopuštene količine ili pragova za pokretanje postupka.

—

Posebni postupci pripreme uzorka koji se koriste za dotične proizvode moraju slijediti međunarodno priznate smjernice.

—

Kod ribe treba ukloniti kožu jer su najveće dopuštene količine propisane za mišić bez kože. Međutim potrebno je pažljivo i potpuno sastrugati cjelokupno mišićno i masno tkivo koje se nalazi s unutarnje strane kože i dodati ih u uzorak koji se analizira.

—

U skladu s odredbama Uredbe (EZ) br. 882/2004, laboratorije akreditiraju priznata tijela koja rade u skladu sa smjernicom ISO 58 kako bi se osiguralo da primjenjuju analitičko osiguranje kvalitete. Laboratoriji se akreditiraju prema normi EN ISO/IEC 17025. Načela kako su opisana u tehničkim smjernicama za procjenu mjerne nesigurnosti i granica kvantifikacije za analizu PCDD/PCDF-ova i PCB-ova poštuju se ako je primjenjivo (1).

—

Sposobnost laboratorija dokazuje se kontinuiranim uspješnim sudjelovanjem u međulaboratorijskim studijama za određivanje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u relevantnim matricama hrane i rasponima koncentracija.

—

Laboratoriji koji provode orijentacijske metode pri rutinskim kontrolama uzoraka moraju uspostaviti blisku suradnju s laboratorijima koji provode potvrdne metode zbog kontrole kvalitete, i zbog potvrde analitičkih rezultata sumnjivih uzoraka.

—

Za PCDD/PCDF-ove osjetljivost određivanja mora biti u gornjem femtogramskom (10– 15 g) rasponu zbog iznimno visoke toksičnosti nekih od ovih spojeva. Za većinu PCB kongenera dovoljna je granica kvantifikacije u nanogramskom (10– 9 g) rasponu. Međutim za mjerenje toksičnijih kongenera dioksinima sličnih PCB-ova (posebno ne-orto supstituiranih kongenera) donji dio radnog raspona mora doseći donje pikogramsko područje (10– 12 g).

—

Potrebno je razlikovati između PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova i mnogobrojnih drugih, istodobno ekstrahiranih i vjerojatno interferirajućih spojeva, prisutnih u koncentracijama koje su nekoliko redova veličine veće od koncentracija predmetnih analita. Kod metoda plinske kromatografije/masene spektrometrije (GC-MS) nužno je razlikovati između različitih kongenera, npr. između toksičnih (npr. sedamnaest 2,3,7,8-supstituiranih PCDD/PCDF-ova i dvanaest dioksinima sličnih PCB-ova) i drugih kongenera.

—

Bioanalitičke metode moraju moći otkriti ciljne spojeve kao zbroj PCDD/PCDF-ova i/ili dioksinima sličnih PCB-ova. Čišćenje uzorka ima za cilj uklanjanje spojeva koji uzrokuju lažnu nesukladnost rezultata ili spojeva koji mogu smanjiti odgovor i prouzročiti lažno sukladne rezultate.

—

Kod metoda GC-MS određivanje treba osigurati valjanu procjenu prave koncentracije u uzorku. Visoka točnost (točnost mjerenja: podudarnost između rezultata mjerenja i stvarne ili prihvaćene vrijednosti mjerenoga) potrebna je da bi se izbjeglo odbijanje rezultata analize uzorka na temelju slabe pouzdanosti utvrđene razine TEQ. Točnost se izražava kao istinitost (razlika između izmjerene srednje vrijednosti za analit u certificiranome materijalu i njegove certificirane vrijednosti, izražene kao postotak ove vrijednosti) i preciznost (RSDR relativna standardna devijacija izračunana iz rezultata dobivenih u uvjetima ponovljivosti).

—

Kod bioanalitičkih metoda potrebno je odrediti očito iskorištenje pri biološkim testovima.

—

Laboratoriji moraju dokazati učinkovitost izvedbe metode u određenom rasponu najveće dopuštene količine, npr. 0,5 ×, 1 × i 2 × većom količinom od najveće dopuštene količine, s prihvatljivim koeficijentom varijacije ponovljene analize tijekom validacijskog postupka i/ili rutinske analize.

—

Redovite slijepe probe i pokusi s dodavanjem ili analize kontrolnih uzoraka (ako je dostupan, poželjan je certificirani referentni materijal) provode se kao mjere unutarnje kontrole kvalitete. Dijagrami kontrole kvalitete (QC) za slijepe probe, pokuse s dodavanjem ili analize kontrolnih uzoraka bilježe se i provjeravaju kako bi se osiguralo da je provedba analiza u skladu sa zahtjevima.

—

Za bioanalitičku orijentacijsku metodu, određivanje LOQ nije nužno potrebno, ali je potrebno dokazati da metoda može razlikovati slijepu vrijednost od cut-off vrijednosti. Pri određivanju vrijednosti BEQ određuje se prag izvještavanja zbog postupanja s uzorcima koji daju odgovor ispod te razine. Za prag izvještavanja potrebno je dokazati da se razlikuje najmanje za tri puta od postupka sa slijepim uzorcima s odgovorom ispod radnog raspona. Stoga ga se izračunava na temelju uzoraka koji sadrže ciljne spojeve blizu najniže zahtijevane količine, a ne iz omjera između signala i šuma ili slijepe probe.

—

Granica kvantifikacije (LOQ) za potvrdnu metodu mora biti približno jedna petina najveće dopuštene količine.

—

Za pouzdane rezultate potvrdnih ili orijentacijskih metoda moraju biti ispunjeni sljedeći kriteriji u rasponu najveće dopuštene količine za TEQ vrijednosti odnosno BEQ vrijednosti, koje se određuju kao ukupna vrijednost TEQ ili ukupna vrijednost BEQ (kao zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova), ili odvojeno za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove.

—

Mogu se koristiti GC-MS metode i bioanalitičke metode. Za GC-MS metode primjenjuju se zahtjevi utvrđeni u točki 6. Za stanične bioanalitičke metode primjenjuju se posebni zahtjevi utvrđeni u točki 7.

—

Laboratoriji koji provode orijentacijske metode za rutinsku kontrolu uzoraka moraju uspostaviti blisku suradnju s laboratorijima koji provode potvrdnu metodu.

—

Tijekom rutinske analize potrebno je provesti provjeru mogućnosti orijentacijske metode pomoću kontrole analitičke kvalitete i stalnog vrednovanja metoda. Kontinuirano se mora provoditi program za kontrolu sukladnih rezultata.

—

Provjera mogućeg smanjenja staničnog odgovora i citotoksičnosti.

20 % izolata uzoraka mjeri se u rutinskom orijentacijskom pregledu bez dodane tvari TCDD i s njom, koja odgovara najvećoj dopuštenoj količini ili pragu za pokretanje postupka kako bi se provjerilo je li odgovor možda smanjen zbog interferirajućih supstanci prisutnih u izolatu uzorka. Izmjerena koncentracija uzorka s dodatkom uspoređuje se sa zbrojem koncentracija izolata bez dodatka i koncentracije za dodavanje. Ako je ta izmjerena koncentracija za više od 25 % manja od izračunane (zbirne) koncentracije, to ukazuje na moguće smanjenje signala i dotični rezultat treba podvrgnuti potvrdnoj analizi. Rezultati se prate na dijagramima kontrole kvalitete.

—

Kontrola kvalitete sukladnih uzoraka

Otprilike od 2 % do 10 % sukladnih uzoraka, ovisno o matrici uzorka i laboratorijskim iskustvima, bit će potvrđeno.

—

Određivanje učestalosti lažno sukladnih rezultata na temelju podataka kontrole kvalitete

Određuje se učestalost lažno sukladnih rezultata dobivenih orijentacijskim metodama analize uzoraka ispod i iznad najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Stvarna učestalost lažno sukladnih rezultata mora biti ispod 5 %.

Nakon što je najmanje 20 potvrđenih rezultata po matrici/skupini matrica dostupno iz kontrole kvalitete sukladnih uzoraka, donose se zaključci o učestalosti lažno sukladnih rezultata iz te baze podataka. Rezultati uzoraka analizirani prstenastim probama ili tijekom incidenata kontaminacije koji pokrivaju raspon koncentracije do npr. 2 × najveće dopuštene količine, mogu se uključiti i u minimum od 20 rezultata za procjenu učestalosti lažno sukladnih rezultata. Uzorci moraju uključivati najčešće uzorke kongenera koji predstavljaju različite izvore.

Iako su orijentacijske metode usmjerene prvenstveno na otkrivanje uzoraka koji prelaze prag za pokretanje postupka, kriterij za određivanje lažno sukladnih rezultata jest najveća dopuštena količina, uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost potvrdne metode.

—

Mogući nesukladni rezultati iz orijentacijske metode moraju se uvijek provjeriti cijelom ponovljenom analizom na originalnom uzorku potvrdnom metodom. Ti se uzorci mogu koristiti i za procjenu učestalosti lažno nesukladnih rezultata. Kod orijentacijskih metoda učestalost lažnih nesukladnih rezultata dio je rezultata za koje je potvrđeno da su sukladni potvrdnom analizom, dok je prethodnom orijentacijskom metodom analize za uzorak izražena sumnja da nije sukladan. Međutim, procjena prednosti orijentacijske metode temelji se na usporedbi lažno nesukladnih rezultata s ukupnim brojem pregledanih uzoraka. Ta učestalost mora biti dovoljno niska da je uporaba orijentacijske metode korisna.

—

Bioanalitičke metode moraju barem u uvjetima validacije valjano pokazati količinu TEQ, izračunanu i izraženu kao BEQ.

—

I kod bioanalitičkih metoda provedenih u uvjetima ponovljivosti, interna laboratorijska ponovljivost RSDr je uobičajeno manja nego ponovljivost RSDR.

—

Razlika između gornje i donje granice ne smije biti veća od 20 % da bi se potvrdilo prelaženje najveće dopuštene količine ili u slučaju potrebe prelaženja praga za pokretanje postupka.

—

Dodavanje 13C-označenih 2,3,7,8-klor-supstituiranih unutarnjih standarda za PCDD/PCDF-ove i 13C-označenih unutarnjih standarda za dioksinima slične PCB-ove potrebno je provesti na samom početku analitičke metode, na primjer prije ekstrakcije, kako bi se vrednovao analitički postupak. Mora se dodati najmanje po jedan kongener za sve tetra do okta-klorirane homologne skupine za PCDD/PCDF-ove i najmanje po jedan kongener za svaku homolognu skupinu za dioksinima slične PCB-ove (odnosno najmanje po jedan kongener za svaki izabrani ion u spektrometriji masa koja se koristi za praćenje PCDD/PCDF-ova odnosno dioksinima sličnih PCB-ova). U slučaju potvrdnih metoda koristi se svih 17 13C-označenih 2,3,7,8-supstituiranih unutarnjih standarda za PCDD/PCDF-ove i svih 12 13C-označenih unutarnjih standarda za dioksinima slične PCB-ove.

—

Relativne faktore odgovora treba utvrditi i za one kongenere za koje se ne dodaje ni jedan 13C-označen analog, tako što će se koristiti odgovarajuće kalibracijske otopine.

—

Za hranu biljnog i životinjskoga podrijetla koja sadržava manje od 10 % masti, interni se standardi obavezno dodaju prije ekstrakcije. Za hranu životinjskoga podrijetla u kojoj je udio masti veći od 10 %, interni se standardi mogu dodati prije ili poslije ekstrakcije masti. Mora se provesti odgovarajuće vrednovanje učinkovitosti ekstrakcije, što ovisi o fazi kada se dodaju interni standardi te o tome iskazuju li se rezultati na osnovi proizvoda ili masti.

—

Prije GC-MS analize treba dodati 1 ili 2 (surogat) standarda radi provjere iskorištenja

—

Potrebno je kontrolirati iskorištenje. Za potvrdne metode, iskorištenje pojedinačnih internih standarda mora biti u rasponu između 60 % i 120 %. Manje ili veće iskorištenje za pojedinačne kongenere, a posebno za neke hepta- i okta-klorirane dibenzo-p-dioksine i dibenzofurane, prihvatljivo je pod uvjetom da je njihov doprinos TEQ vrijednosti manji od 10 % ukupne TEQ vrijednosti (dobivene na temelju zbroja PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova). Za orijentacijske metode GC-MS iskorištenje mora biti u rasponu između 30 % i 140 %.

—

Odvajanje PCDD/PCDF-ova od interferirajućih kloriranih spojeva kao što su PCB-ovi koji nisu slični dioksinima i klorirani difenil eteri provodi se pomoću odgovarajućih kromatografskih tehnika (najbolje s pomoću kolone s florisilom, aluminijevim oksidom i/ili aktivnim ugljenom).

—

Razdvajanje izomera plinskom kromatografijom mora biti zadovoljavajuće (< 25 % od vrha do vrha između 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Raspon kalibracijske krivulje mora obuhvaćati relevantni raspon najvećih dopuštenih količina ili pragova za pokretanje postupka.

—

Za GC-HRMS:

—

Za GC-MS/MS:

—

Kada se koncentracije izračunavaju iz kalibracijske krivulje za TCDD, vrijednosti na gornjem kraju krivulje pokazuju velike varijacije (visok koeficijent varijacije (CV)). Radni raspon je raspon u kojem je CV manji od 15 %. Donji dio radnog raspona (prag izvještavanja) mora se dalje odrediti u znatno većoj mjeri (najmanje tri puta više) od postupka slijepe probe. Gornji dio radnog raspona obično predstavlja vrijednost EC70 (70 % najveće učinkovite koncentracije), ali je niži ako je CV u tom rasponu veći od 15 %. Radni raspon se određuje tijekom validacije. Cut-off vrijednosti (vidjeti točku 7.3.) moraju biti unutar radnog raspona.

—

Standardne otopine i izolati uzoraka ispituju se trostrukom ili barem dvostrukom analizom. Kad se upotrebljavaju dvostruke analize, standardne otopine ili izolati kontrolnih uzoraka ispitani u četiri do šest udubina raspoređenih po pločici pokazuju odgovor ili koncentraciju (moguće samo u radnom rasponu) na temelju CV < 15 %.

—

Razine u uzorcima se mogu procijeniti usporedbom odgovora na ispitivanje s kalibracijskom krivuljom TCDD (ili PCB 126 ili standardna mješavina PCDD/PCDF-ova/dioksinima sličnih PCB-ova) za izračun BEQ vrijednosti u izolatu i kasnije u uzorku.

—

Kalibracijska krivulja sadržava osam do 12 koncentracija (barem dvostruko) s dovoljno koncentracija u donjem dijelu krivulje (radni raspon). Posebnu pažnju treba obratiti na kvalitetu prilagodbe krivulje u radnom rasponu. Tako R2 vrijednost ima malu ili nikakvu korist u procjeni ispravnosti prilagodbe pri nelinearnoj regresiji. Bolja prilagodba postići će se smanjivanjem razlike između izračunatih i primijećenih vrijednosti u radnom rasponu krivulje (npr. smanjivanjem zbroja kvadrata rezidua).

—

Procijenjena vrijednost u izolatu uzorka se zatim korigira za vrijednost BEQ, izračunanu za slijepi uzorak matrice ili otapala (kako bi se uzele u obzir nečistoće iz upotrijebljenih otapala i kemikalija) i za očito iskorištenje (izračunano iz vrijednosti BEQ odgovarajućih referentnih uzoraka s reprezentativnim uzorcima kongenera u području najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka). Za korekciju iskorištenja, očito iskorištenje mora uvijek biti unutar zahtijevanog raspona (vidjeti točku 7.1.4.). Referentni uzorci koji se koriste za korekciju iskorištenja moraju biti sukladni zahtjevima iz točke 7.2.

—

Referentni uzorci predstavljaju uzorke matrica, uzorke kongenera i raspone koncentracija za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove oko najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka.

—

Uz svaku seriju uzoraka koja se ispituje mora se uključiti jedna slijepa proba ili po mogućnosti slijepa matrica i jedan referentni uzorak s najvećom dopuštenom količinom ili na pragu za pokretanje postupka. Ovi uzorci se moraju ekstrahirati i analizirati istodobno u istovjetnim uvjetima. Referentni uzorak mora pokazati izrazito veći odgovor od slijepog uzorka, čime se osigurava primjerenost testa. Ti se uzorci mogu koristiti za korekciju slijepe probe i iskorištenja.

—

Referentni uzorci koji se odabiru za korekciju iskorištenja su reprezentativni za pokusne uzorke, što znači da uzorci kongenera ne uzrokuju preniske procjene vrijednosti.

—

Dodatnim referentnim uzorcima kojima su količine 0,5 x i 2 x veće od najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka mogu se uključiti za dokazivanje ispravnosti ispitivanja u rasponu propisanih količina za kontrolu najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Ako se kombiniraju, ovi uzorci se mogu koristiti za izračun vrijednosti BEQ u pokusnim uzorcima (vidjeti točku 7.1.2.2.).

BEQDL

BEQ koji odgovara odlučujućoj granici potvrdne metode, koja je najveća dopuštena količina uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost

sy,x

standardna devijacija rezidua

t α,f = m – 2

student faktor (α = 5 %, f = slobodni stupnjevi, jednostrani)

m

ukupan broj kalibracijskih točaka (indeks j)

n

broj ponavljanja na svakoj razini

xi

koncentracija uzorka (u TEQ) kalibracijske točke i određena potvrdnom metodom

srednja vrijednost koncentracija (u TEQ) svih kalibriranih uzoraka

i

=

indeks za kalibracijsku točku i

SDR

standardna devijacija rezultata bioanalitičkih testova pri BEQDL, izmjereno u uvjetima unutarnje laboratorijske ponovljivosti

1.

iz donjeg raspona 95 % intervala predviđanja pri odlučujućoj granici potvrdne metode,

2.

iz višestrukih analiza uzoraka (n≥ 6) kontaminiranih na odlučujućoj granici potvrdne metode kao donja krajnja točka distribucije (na slici prikazana s krivuljom u obliku zvona) pri odgovarajućoj srednjoj BEQ vrijednosti.

—

S obzirom na to da se u bioanalitičkim metodama ne mogu koristiti interni standardi, moraju se provoditi ispitivanja ponovljivosti kako bi se dobili podaci o standardnoj devijaciji unutar i između serija ispitivanja. Ponovljivost mora biti manja od 20 %, a interna laboratorijska ponovljivost manja od 25 %. To se temelji na razinama izračunatim u BEQ nakon korekcije za vrijednost slijepe probe i za iskorištenja.

—

U postupku validacije mora se dokazati da test pravi razliku između slijepe probe i razine na cut-off vrijednosti omogućavajući identifikaciju uzoraka iznad odgovarajuće cut-off vrijednosti (vidjeti točku 7.1.2.).

—

Moraju se utvrditi ciljni spojevi, moguće interferencije i najveće prihvatljive količine za slijepe probe.

—

Postotak standardne devijacije u odgovoru ili koncentraciji izračunan iz odgovora (moguće samo u radnom rasponu) pri trostrukom određivanju izolata uzorka ne smije biti iznad 15 %.

—

Nekorigirani rezultati referentnih uzoraka izraženi u BEQ (vrijednost slijepe probe i pri najvećoj dopuštenoj količini ili pragu za pokretanje postupka) koriste se za ocjenu izvedivosti bioanalitičke metode kroz kontinuirano vremensko razdoblje.

—

Dijagrami kontrole kvalitete (QC) za postupke sa slijepim uzorcima i svaka vrsta referentnog uzorka bilježe se i provjeravaju kako bi se osiguralo da je izvedivost analiza u skladu sa zahtjevima, a posebno za postupak sa slijepim uzorcima u pogledu zahtijevane najmanje razlike do donjeg dijela radnog raspona i za referentne uzorke u pogledu unutar laboratorijske obnovljivosti. Postupke sa slijepim uzorcima potrebno je dobro kontrolirati kako bi se izbjegli lažno sukladni rezultati kada se oduzimaju.

—

Rezultati analiza potvrdnim metodama sumnjivih uzoraka i 2 do 10 % sukladnih uzoraka (najmanje 20 uzoraka po matrici) prikupljaju se i koriste za procjenu izvedivosti orijentacijske metode i odnosa između BEQ-ova i TEQ-ova. Ova baza podataka može se koristiti za ponovljenu evaluaciju cut-off vrijednosti koje se primjenjuju na rutinske uzorke za validirane matrice.

—

Uspješna izvedivost metode može se dokazati i prstenastim probama. Rezultati uzoraka analiziranih prstenastim probama koje uključuju raspon koncentracija od npr. 2 × najveće dopuštene količine, mogu također biti uključeni u procjenu učestalosti lažno sukladnih rezultata, ako laboratorij može dokazati uspješnu izvedivost. Uzorci moraju uključivati najčešće uzorke kongenera koji predstavljaju različite izvore.

—

Tijekom incidenata se mogu ponovo procijeniti cut-off vrijednosti uzimajući u obzir posebne uzorke matrica i kongenera koji se pojavljuju u tom incidentu.

—

Analitički rezultati moraju sadržavati količine pojedinačnih PCDD/PCDF-ova i kongenera dioksinima sličnih PCB-ova, a o vrijednostima se izvještava kao o donjima, gornjima ili srednjima kako bi se u izvješće uključilo što više podataka o rezultatima i na taj način omogućilo tumačenje rezultata prema posebnim zahtjevima.

—

U izvješću je potrebno uključiti i metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova, dioksinima sličnih PCB-ova i masti. Udio masti u uzorku određuje se i iskazuje za matrice hrane s najvećim dopuštenim količinama izraženima na temelju masti i s očekivanom koncentracijom masti u rasponu od 0 – 2 % (u skladu s postojećim zakonodavstvom). Za druge uzorke određivanje udjela masti je neobavezno.

—

Iskorištenja pojedinih internih standarda moraju biti navedena u slučaju da su izvan raspona navedenog u točki 6.2., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najveće dopuštene količine (u tom slučaju iskorištenja za jednu ili dvije dvostruke analize), a u drugim slučajevima na zahtjev.

—

S obzirom da proširenu mjernu nesigurnost treba uzeti u obzir pri odluci o sukladnosti uzorka, potrebno je navesti i taj parametar. Stoga se analitički rezultati prikazuju kao x +/- U, pri čemu je x analitički rezultat, a U je proširena mjerna nesigurnost koristeći faktor pokrivanja 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od približno 95 %. U slučaju kada se PCDD/PCDF-ovi i dioksinima slični PCB-ovi određuju odvojeno, tada se zbroj procijenjene proširene nesigurnosti za pojedinačne analitičke rezultate PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova koristi za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova.

—

Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine u Uredbi (EZ) br. 1881/2006.

—

Rezultat orijentacijske metode izražava se kao sukladan ili se za njega sumnja da je nesukladan („sumnjiv”).

—

Osim toga, okvirni rezultat za PCDD/PCDF-ove i/ili dioksinima slične PCB-ove može se izraziti u BEQ (ne TEQ) (vidjeti točku 1.). Za uzorke s odgovorom ispod granice izvještavanja navodi se da su ispod granice izvještavanja. Za uzorke s odgovorom iznad radnog raspona navodi se da prelaze radni raspon i odgovarajuća količina do gornjeg dijela radnog raspona navodi se u BEQ.

—

Za svaku vrstu uzorka matrice u izvješću se mora navesti najveća dopuštena količina ili prag za pokretanje postupka na kojima se procjena temelji.

—

U izvješću se mora navesti vrsta ispitivanja koje se koristi, osnovno načelo ispitivanja i vrsta kalibracije.

—

U izvješću je potrebno uključiti i metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova, dioksinima sličnih PCB-ova i masti. Udio masti u uzorku određuje se i iskazuje za matrice hrane s najvećim dopuštenim količinama izraženima na temelju masti i s očekivanom koncentracijom masti u rasponu od 0 – 2 % (u skladu s postojećim zakonodavstvom). Za druge uzorke određivanje udjela masti je neobavezno.

—

U slučaju uzoraka za koje se sumnja da nisu sukladni, izvješće treba uključivati napomenu o postupku koji treba poduzeti. Koncentracija PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u tim uzorcima s povišenim razinama mora se odrediti/potvrditi potvrdnom metodom.

—

Nesukladni rezultati navode se samo iz potvrdne analize.

—

Rezultat orijentacijske metode izražava se kao sukladan ili se za njega sumnja da je nesukladan („sumnjiv”).

—

Za svaku vrstu uzorka matrice u izvješću se mora navesti najveća dopuštena količina ili prag za pokretanje postupka na kojima se procjena temelji.

—

Osim toga mogu se navesti količine za pojedine PCDD/PCDF-ove i/ili dioksinima slične PCB kongenere te TEQ vrijednosti izražene kao donje, gornje i srednje. Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se (barem) na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine utvrđene u Uredbi (EZ) br. 1881/2006.

—

Iskorištenja pojedinih internih standarda moraju biti dostupna u slučaju da su izvan raspona navedenog u točki 6.2., a u drugim slučajevima na zahtjev.

—

U izvješću se navodi primjenjena GC-MS metoda.

—

U izvješće je potrebno uključiti i metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova, dioksinima sličnih PCB-ova i masti. Udio masti u uzorku određuje se i iskazuje za matrice hrane s najvećim dopuštenim količinama izraženima na temelju masti i s očekivanom koncentracijom masti u rasponu od 0 – 2 % (u skladu s postojećim zakonodavstvom). Za druge uzorke određivanje udjela masti je neobavezno.

—

U slučaju uzoraka za koje se sumnja da nisu sukladni, izvješće treba uključivati napomenu o postupku koji treba poduzeti. Koncentracija PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u tim uzorcima s povišenim razinama mora se odrediti/potvrditi potvrdnom metodom.

—

O nesukladnosti se može odlučiti samo nakon potvrdne analize.

—

Relativno retencijsko vrijeme u odnosu na interne standarde ili referentne standarde (prihvaćena devijacija od +/– 0,25 %).

—

Plinsko kromatografsko odvajanje PCB-ova koji nisu slični dioksinima (od interferirajućih tvari, posebno ko-eluiranih PCB-ova, a posebno ako su uzorci u rasponu zakonski dozvoljenih granica i nesukladnost se mora potvrditi (1)).

—

Za tehnike GC-MS:

—

Za GC-ECD:

Potvrda rezultata koji prelaze dopušteno najveću dopuštenu količinu s dva stupca GC sa stacionarnim fazama različitog polariteta.

—

Korištenje primjerenih internih standarda s fizikalno-kemijskim svojstvima koji odgovaraju predmetnim analitima.

—

Dodavanje internih standarda:

—

Zahtjevi za metode u kojima se koristi svih šest izotopski označenih kongenera PCB-ova koji nisu slični dioksinima:

—

Zahtjevi za metode u kojima se ne koristi svih šest izotopski označenih internih standarda ili se koriste drugi interni standardi:

—

Iskorištenje neoznačenih kongenera provjerava se analizom uzoraka s dodatkom ili kontrolnih uzoraka s koncentracijama u rasponu najveće dopuštene količine. Prihvatljivo iskorištenje za te kongenere je između 60 i 120 %.

—

Analitički rezultati sadržavaju količine pojedinačnih kongenera PCB-ova koji nisu slični dioksinima i zbroj PCB-ova koji nisu slični dioksinima i koji se navode kao donji, gornji ili srednji kako bi se u izvješće uključilo što više informacija o rezultatima i na taj način omogućilo tumačenje rezultata u skladu s posebnim zahtjevima.

—

U izvješće je potrebno uključiti i metodu koja se koristi za ekstrakciju PCB-ova i masti. Udio masti u uzorku određuje se i iskazuje za matrice hrane s najvećim dopuštenim količinama izraženima na temelju masti i s očekivanom koncentracijom masti u rasponu od 0 – 2 % (u skladu s postojećim zakonodavstvom). Za druge uzorke određivanje udjela masti je neobavezno.

—

Iskorištenja pojedinih internih standarda moraju biti navedena u slučaju da su izvan raspona navedenog u točki 6., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najvećih dopuštenih količina, a u drugim slučajevima na zahtjev.

—

S obzirom da proširenu mjernu nesigurnost treba uzeti u obzir pri odluci o sukladnosti uzorka, potrebno je navesti i taj parametar. Stoga se analitički rezultati prikazuju kao x +/– U, pri čemu je x analitički rezultat, a U je proširena mjerna nesigurnost koristeći faktor pokrivanja 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od približno 95 %.

—

Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine utvrđene u Uredbi (EZ) br. 1881/2006.