‚I.’

:

područje na kojem je prisutnost GSE-a kod domaćeg goveda procijenjena kao malo vjerojatna, u svrhu izvoza u Europsku Zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascima certifikata BOV-X i BOV-Y.

‚II.’

:

područje kojem je priznat status područja službeno slobodnog od tuberkuloze, u svrhu izvoza u Europsku zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata BOV-X.

‚III.’

:

područje kojem je priznat status područja službeno slobodnog od bruceloze, u svrhu izvoza u Europsku zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata BOV-X.

‚IV.a’

:

područje kojem je priznat status područja službeno slobodnog od enzootske leukoze goveda (ELG-a), u svrhu izvoza u Europsku zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata BOV-X.

‚IV.b’

:

područje s odobrenim gospodarstvima, kojima je priznat status područja službeno slobodnih od enzootske leukoze goveda (ELG-a), u svrhu izvoza u Europsku zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata BOV-X.

‚V.’

:

područje kojem je priznat status područja službeno slobodnog od bruceloze, u svrhu izvoza u Europsku zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata OVI-X.

‚VI.’

:

Zemljopisna ograničenja:

U slučaju Bugarske oznake državnog područja BG-1, životinje koje su certificirane u skladu s primjercima veterinarskih certifikata BOV-X, BOV-Y, RUM, OVI-X i OVI-Y mogu se uvoziti samo u one dijelove državnog područja države članice koji su navedeni u Prilogu II. Odluci 2001/138/EZ od 9. veljače 2001., ako navedena država članica to dopusti.

‚VII.’

:

područje kojem je priznat status područja službeno slobodnog od tuberkuloze, u svrhu izvoza u Europsku zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata RUM.

‚VIII.’

:

područje kojem je priznat status područja službeno slobodnog od bruceloze, u svrhu izvoza u Europsku zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata RUM.

‚IX.’

:

područje kojem je priznat status područja službeno slobodnog od bolesti Aujeszkoga, u svrhu izvoza u Europsku zajednicu životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata POR-X.

‚BOV-X’

:

Obrazac veterinarskog certifikata za domaća goveda (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalis i njihove križance), namijenjene za uzgoj i/ili tov nakon uvoza

‚BOV-Y’

:

Obrazac veterinarskog certifikata za domaća goveda (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalis i njihove križance), namijenjene za neposredno klanje nakon uvoza

‚OVI-X’

:

Obrazac veterinarskog certifikata za domaće ovce (Ovis aries) i koze (Capra hircus), namijenjene za uzgoj i/ili tov nakon uvoza

‚OVI-Y’

:

Obrazac veterinarskog certifikata za domaće ovce (Ovis aries) i koze (Capra hircus), namijenjene za neposredno klanje nakon uvoza

‚POR-X’

:

Obrazac veterinarskog certifikata za domaće svinje (Sus scrofa), namijenjene za rasplod i/ili tov nakon uvoza

‚POR-Y’

:

Obrazac veterinarskog certifikata za domaće svinje (Sus scrofa), namijenjene za neposredno klanje nakon uvoza

‚RUM’

:

Obrazac veterinarskog certifikata za nedomaće životinje, osim svinja (Suidae)

‚SUI’

:

Obrazac veterinarskog certifikata za nedomaće svinje (Suidae).

‚A’

:

jamstva koja se odnose na testove vezane uz bolest plavog jezika i epizootsku hemoragijsku bolest kod životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata BOV-X (točka 10.8.a), OVI-X (točka 10.6.a) i RUM (točka 10.7.a)

‚B’

:

jamstva koja se odnose na testove vezane uz vezikularnu enterovirusnu bolest svinja i klasičnu svinjsku kugu kod životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata POR-X (točka 10.4.a) i SUI (točka 10.4.a)

‚C’

:

jamstva koja se odnose na testove za utvrđivanje bruceloze kod životinja koje su certificirane u skladu s obrascem certifikata POR-X (točka 10.4.a) i SUI (točka 10.4.a)

(a)

Veterinarske certifikate mora pripremiti zemlje izvoznice na temelju obrazaca iz dijela 2. Priloga I. u skladu s oblikom i strukturom uzorka za predmetne životinje. Moraju sadržavati, istim redoslijedom kao u obrascu certifikata, potvrde koje se zahtijevaju za svaku treću zemlju i, ovisno o slučaju, ona dopunska jamstva koja se zahtijevaju za treću zemlju izvoznicu ili njezin dio.

Ako odredišna država članica Europske zajednice tako zahtijeva, potrebno je za predmetne životinje izvornom obrascu veterinarskog certifikata priložiti dodatne uvjete certifikacije.

(b)

Potrebno je pripremiti zaseban i jedinstven certifikat za životinje koje se izvoze iz jedinstvenog područja iz 2. i 3. stupca dijela 1. Priloga I., koje se šalju na isto odredište i prevoze istim željezničkim vagonom, kamionom, zrakoplovom ili brodom.

(c)

Izvornik svakog certifikata mora se sastojati od jednog lista papira, s obje strane, ili ako se zahtijeva više teksta, mora biti sastavljen na takav način da su sve potrebne stranice dio nedjeljive cjeline.

(d)

Certifikat se sastavlja na barem jednom službenom jeziku države članice Europske zajednice, u kojoj će se izvršiti pregled na graničnoj postaji i jeziku odredišne države članice. Međutim, navedene države članice mogu, umjesto svojeg jezika, dopustiti upotrebu drugog jezika Zajednice kojem se, prema potrebi, prilaže službeni prijevod.

(e)

Ako se zbog označivanja dijelova pošiljke (popis u točki 8.2. obrasca certifikata) certifikatu prilože dodatne stranice, te se stranice smatraju sastavnim dijelom izvornog certifikata, ako je svaka stranica ovjerena potpisom i pečatom službenog veterinara koji obavlja certifikaciju.

(f)

Ako se certifikat, uključujući i dodatne popise iz točke (e), sastoji od više od jedne stranice, svaka stranica mora biti obrojčena – (broj stranice) od (ukupnog broja stranica) – na dnu te označena brojem oznake certifikata kojeg joj je dodijelilo nadležno tijelo na vrhu.

(g)

Službeni veterinar mora ispuniti i potpisati izvornik certifikata 24 sata prije utovara pošiljke za izvoz u Zajednicu. U tu svrhu nadležna tijela zemlje izvoznice osiguravaju poštovanje načela certifikacije, jednaka onima iz Direktive Vijeća 96/93/EZ.

Boja potpisa mora se razlikovati od boje tiska. Jednako se pravilo primjenjuje na pečate, osim reljefnih i vodenih pečata.

(h)

Izvornik certifikata mora pratiti pošiljku do prispijeća na graničnu inspekcijsku postaju Europske zajednice.

(i)

Certifikat vrijedi deset dana od datuma izdavanja.

U slučaju prijevoza brodom rok se produljuje za vrijeme trajanja putovanja. U tu se svrhu veterinarskom certifikatu prilaže izvorni obrazac izjave zapovjednika broda, sastavljen u skladu s dodatkom u dijelu 3. Priloga I. ovoj Odluci.

(j)

Životinje se ne smiju prevoziti skupa s drugim životinjama koje nisu namijenjene Europskoj zajednici ili su lošijeg zdravstvenog stanja.

(k)

Tijekom prijevoza u Europsku zajednicu životinje se ne smiju istovarivati na područje zemlje ili dijela zemlje koja nije odobrena za uvoz navedenih životinja u Zajednicu.

I.

Moraju biti pod nadzorom službenog veterinara.

II.

Svaki se sabirni centar mora nalaziti u središtu područja promjera od 20 km u kojem, prema službenim nalazima, nije bilo pojave slinavke i šapa 30 dana prije uporabe kao odobreni centri.

III.

Prije svake uporabe kao sabirni centri, moraju biti očišćeni i dezinficirani sredstvom za dezinfekciju, koje zemlja izvoznica službeno odobrava kao učinkovito u nadzoru bolesti, iz gore navedenog uvjeta II.

IV.

Uzimajući u obzir njihove mogućnosti za smještaj životinja, moraju imati (a) prostor predviđen isključivo za tu namjenu; (b) odgovarajuće objekte koji se lako mogu čistiti i dezinficirati, za utovar, istovar te primjerene nastambe za životinje, u skladu sa standardima, za napajanje i hranjenje životinja i za svu potrebnu zdravstvenu skrb; (c) odgovarajuće prostore za veterinarske inspekcijske preglede i izolaciju životinja; (d) odgovarajuću opremu za čišćenje i dezinficiranje prostorija i kamiona; (e) odgovarajuće skladišne prostorije za krmu, stelju i gnoj; (f) odgovarajuće sustave za skupljanje i odstranjivanje otpadne vode; (g) ured za službenog veterinara.

V.

Tijekom djelovanja na raspolaganju mora biti dovoljno veterinara za izvršavanje svih zadaća.

VI.

Smiju primati samo pojedinačno označene životinje kako bi se zajamčila sljedivost. U tu svrhu vlasnik ili osoba koja vodi centar mora pri primanju životinja osigurati da su životinje pravilno označene te da su popraćene zdravstvenim dokumentima ili certifikatima u skladu s predmetnom životinjskom vrstom ili kategorijom. Nadalje, navedena osoba mora zabilježiti u registru ili bazi podataka i tri godine čuvati ime vlasnika, podrijetlo, datum upisa i ispisa, broj i identifikacijske oznake životinje ili registracijski broj stada podrijetla te njihovo odredište i registracijski broj prijevoznika i registracijski broj kamiona koji dovozi životinje u objekt te ih odvozi iz njega.

VII.

Sve životinje koje prolaze kroz centar moraju ispunjavati zdravstvene uvjete utvrđene za uvoz odgovarajuće kategorije životinja u Europsku zajednicu.

VIII.

Životinje namijenjene izvozu u Europsku zajednicu koje prolaze kroz sabirni centar moraju u roku šest dana od dolaska biti utovarene i poslane izravno na granicu zemlje izvoznice: (a) pritom ne smiju doći u dodir s papkarima, osim onih koji ispunjavaju zdravstvene uvjete utvrđene za uvoz odgovarajuće kategorije životinja u Europsku zajednicu; (b) moraju biti razdvojene u pošiljkama tako da ni jedna pošiljka istodobno ne sadrži životinje za uzgoj ili proizvodnju i životinje za neposredno klanje; (c) prevoziti se u prijevoznim sredstvima ili spremnicima koji su najprije očišćeni i dezinficirani sredstvom za dezinfekciju koje je službeno odobrilo kao učinkovito u nadzoru bolesti, iz gore navedenog uvjeta II., te koji su izrađeni tako da fekalije, mokraća, stelja ili stočna hrana ne mogu istjecati ili ispadati tijekom prijevoza.

IX.

Ako uvjeti za izvoz životinja u Zajednicu zahtijevaju testiranje životinja u određenom razdoblju prije utovara, to razdoblje mora uključivati svako razdoblje boravka u sabirnom centru, do šest dana, nakon dolaska životinja u odobrene centre.

X.

Zemlja izvoznica imenuje navedene odobrene centre koji su odobreni za životinje za uzgoj i proizvodnju i one odobrene centre koji su odobreni za životinje namijenjene klanju, te obavještava Komisiju i središnja nadležna tijela država članica o nazivima i adresama takvih prostorija te o njihovom redovitom osuvremenjivanju.

XI.

Zemlja izvoznica utvrđuje postupak za službeni nadzor odobrenih centara i osigurava provođenje tog nadzora.

XII.

Centri moraju biti redovito nadzirani kako bi se provjerilo jesu li zahtjevi za odobrenje i dalje ispunjeni. U slučaju neispunjavanja zahtjeva i privremenog ukidanja odobrenja, odobrenje se može obnoviti samo ako nadležno tijelo utvrdi kako centar u potpunosti ispunjava sve gore navedene odredbe.

Kompetitivna ELISA s pomoću monoklonskog protutijela 3-17-A3 može utvrditi protutijela na sve poznate serotipove virusa bolesti plavog jezika (BTV).

Načelo testa je prekid reakcije između antigena virusa bolesti plavog jezika (BTV) i grupno specifičnog monoklonskog protutijela (3-17-A3) dodavanjem pretraživanog seruma. Protutijela protiv BTV-a, prisutna u serumu, prekidaju reaktivnost monoklonskog protutijela (Mab) i uzrokuju smanjenje očekivanog obojenja nakon dodavanja enzimom označenog protu-mišjeg protutijela kromogena/supstrata. Serumi se mogu testirati u jednom razrjeđenju 1:5 (spot test – Dodatak 1.) ili se mogu titrirati (titracija seruma – Dodatak 2.), kako bi se dobili konačni titri razrijeđenih seruma. Vrijednosti inhibicije iznad 50 % mogu se smatrati pozitivnima.

1.

Odgovarajuće mikrotitarske pločice/plitice za test ELISA.

2.

Antigen: dostupan u obliku ekstrahiranog koncentrata koji se priprema kao što je opisano dalje u tekstu te pohranjuje pri temperaturama – 20 °C ili – 70 °C.

3.

Blokirajući pufer: fosfatni pufer (PBS), koji sadrži 0,3 % BTV negativnoga goveđeg seruma (odraslih goveda), 0,1 % (v/v) Tween-20 (dostupan kao sirup polioksietilen sorbitan monolaurat) u PBS.

4.

Monoklonsko protutijelo: 3-17-A3 (dostupno kao supernatant kulture tkiva hibridoma), usmjereno na grupno specifični polipeptid VP7, čuvano pri temperaturi od –20 °C ili suho zamrznuto te prije uporabe razrijeđeno u omjeru 1:100 s puferom za zaustavljanje reakcije.

5.

Konjugat: protu-mišji globulin pitomog zeca (adsorbiran ili ispran), konjugiran na peroksidazu hrena i čuvan u tamnom prostoru na 4 °C.

6.

Kromogen i supstrat: orto-fenildiamin (kromogen OPD) s konačnom koncentracijom 0,4 mg/ml u sterilnoj destiliranoj vodi. Vodikov peroksid (30 % w/v supstrat) 0,05 % v/v dodan neposredno prije uporabe (5 ml H2O2 na 10 ml OPD). (S OPD-om postupajte pažljivo – nosite gumene rukavice – moguće mutagene tvari).

7.

1 molarna sulfatna kiselina: 26,6 ml dodamo u 473,4 ml destilirane vode. (Zapamtite: uvijek dodajte kiselinu u vodu, a nikada vodu u kiselinu.)

8.

Rotacijska tresilica.

9.

Čitač mikroploča testa ELISA (test se može očitati vizualno).

Kontrola konjugata (Cc)

:

Jažice 1.A i 1.B predstavljaju slijepu kontrolu koja se sastoji od antigena BTV i konjugata. Može se koristiti za namještanje čitača ELISA.

Kontrola Mab (Cm)

:

Stupci 1. i 2. redovi G i H predstavljaju kontrolu s monoklonskim protutijelom i sadržavaju antigen protiv BTV-a, monoklonsko protutijelo i konjugat. Obojenje je najintenzivnije u navedenim jažicama. Srednja vrijednost očitavanja optičke gustoće te kontrole predstavlja vrijednost inhibicije 0 %.

Pozitivna kontrola (C++, C–)

:

Stupci 1. i 2. redovi C-D-E-F. Navedene jažice sadrže antigen protiv BTV-a, snažno pozitivan i slabo pozitivan antiserum protiv BTV-a, Mab i konjugat.

Negativna kontrola (C–)

:

Jažice 2.A i 2.B su negativne kontrole, koje sadrže antigen protiv BTV-a, negativni antiserum protiv BTV-a, Mab i konjugat.

Pretraživani serumi

:

Za opsežna serološka istraživanja i brze testove prosijavanja, kako bi se serumi se mogu pretraživati u jednom razrjeđenju 1:5 (Dodatak 1.). 10 seruma može se pretraživati u rasponu od 1:5 do 1:640 (Dodatak 2.). Na taj se način može približno utvrditi titar protutijela u pretraživanom serumu.

1.

Razrijedimo antigen protiv BTV-a na predtitriranu koncentraciju u PBS (fosfatni pufer), stavimo ga nakratko u sonikator, kako bi se nagomilani virus raspršio (ako sonikator nije na raspolaganju, snažno pipetiramo) i dodamo 50 ml u sve jažice na pliticu ELISA. Stresemo lijevu i desnu stranu plitice kako bi se antigen ravnomjerno raspršio.

2.

Inkubiramo pri temperaturi od 37 °C 60 minuta na rotacijskoj tresilici. Isperemo plitice tri puta, prelijevajući i prazneći jažice nesterilnim PBS-om (fosfatnim puferom) te ih stavimo na upijajući papir kako bi se osušile.

3.

Kontrolne jažice: dodamo 100 ml blokirajućeg pufera u jažice Cc. Dodamo 50 ml pozitivnog i negativnog kontrolnog seruma, pri razrjeđenju 1:5 (10 ml seruma + 40 ml blokirajućeg pufera), u odgovarajuću jažicu C-, C+ i C++. Dodamo 50 ml blokirajućeg pufera u kontrolne jažice Mab.

Metoda točkaste titracije: Svaki pretraživani serum, razrijeđen 1:5 u blokirajućem puferu, dodamo kako bi se udvostručile jažice u stupcima 3. do 12. (10 ml seruma + 40 ml blokirajućeg pufera)

ili

Metoda titracije seruma: pripremimo serije dvostrukog razrjeđenja svakog pretraživanog uzorka (1:5 do 1:640) u blokirajućem puferu u osam jažica svakog pojedinog stupca od 3. do 12.

4.

Nakon dodavanja pretraživanih seruma odmah razrijedimo Mab 1:100 u blokirajućem puferu te dodamo 50 ml u sve jažice na plitici, osim za slijepu kontrolu.

5.

Inkubiramo 60 minuta na 37 °C na rotacijskoj tresilici. Isperemo tri puta PBS-om i osušimo.

6.

Razrijedimo kunićji anti-mišji koncentrat na 1:5 000 u blokirajućem puferu i dodamo 50 ml u svaku jažicu na plitici.

7.

Inkubiramo 60 minuta na 37 °C na rotacijskoj tresilici. Isperemo tri puta PBS-om i osušimo.

8.

Otopimo OPD i netom prije upotrebe dodamo 5 μl 30-postotnog vodikovog peroksida u svakih 10 ml OPD-a. Dodamo 50 μl u svaku rupicu na mikroploči. Pričekamo približno 10 minuta da se jamice oboje i zaustavimo reakciju s 1 M sumporne kiseline (50 μl na rupicu). Moraju se obojiti kontrolne jažice Mab i one jažice u kojima su serumi bez antitijela protiv BTV-a.

9.

Mikroploče pregledamo vizualno ili spektrofotometričnim čitačem i zapišemo rezultate.

1.

40 – 60 Rouxouvih stanica protočne stanične linije BHK-21 triput isperemo s Eagle's Medium bez seruma te ih inficiramo virusom bolesti plavog jezika, serotip 1 Eagle's Medium bez seruma.

2.

Inkubiramo na 37 °C i svaki dan provjerimo citopatski učinak (CPE).

3.

Kada su citopatski učinci (CPE) dovršeni u 90 do 100 % u svakoj Rouxovoj stanici protočne stanične linije BHK-21, pokupimo virus otresajući sve stanice priljubljene uz staklo.

4.

Centrifugiramo pri 2 000 do 3 000 okr./min. kako bismo peletirali stanice.

5.

Odbacimo supernatant i pripremimo novu suspenziju stanica u približno 30 ml PBS-a koji sadrži 1 % ‚Sarkosyla’ i 2 ml fenilmetilsulfonil flourida (lizni pufer). Pri tom stanice mogu stvoriti gel te se može dodati više liznog pufera kako bi se taj učinak smanjio. (Napomena: fenilmetilsulfonil flourid je štetan – postupati krajnje oprezno).

6.

60 sekundi razbijamo stanice ultrazvučnom sondom amplitude od 30 mikrona.

7.

Centrifugiramo 10 minuta pri brzini od 10 000 okretaja u minuti.

8.

Supernatant pohranimo na temperaturi od + 4 °C i pripremimo novu suspenziju preostalog staničnog peleta u 10 do 20 ml liznog pufera.

9.

Triput obradimo u sonikatoru i pročistimo te na svakom stupnju pohranimo supernatant.

10.

Pripremimo skupni uzorak supernatanta te ga centrifugiramo u Beckmannovoj centrifugi (s 30 ml epruvetama i rotorom SW 28) pri 24 000 okr./min. (100 000 g) 120 minuta, pri temperaturi od + 4 °C, na 5 milititarskoj podlozi 40-postotne otopine saharoze (w/v u PBS).

11.

Odstranimo supernatant, temeljito isperemo epruvete i pripremimo novu suspenziju peleta u PBS s pomoću sonikatora. Pohranimo antigen u jednakim dijelovima na temperaturi od – 20 °C.

1.

Antigen protiv BTV-a razrijeđen u PBS u omjeru 1:20 titriramo duž mikrotitarskih plitica u serijama dvostrukog razrjeđenja (50 ml po jažici) s pomoću višekanalne pipete.

2.

Inkubiramo jedan sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

3.

Isperemo plitice tri puta PBS-om.

4.

Dodamo 50 ml monoklonskog protutijela 3-17-A3 (razrijeđenog u omjeru 1/100) u svaku jažicu na mikrotitarskoj plitici.

5.

Inkubiramo jedan sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

6.

Isperemo plitice tri puta PBS-om.

7.

U svaku jažicu mikrotitarske plitice dodamo 50 ml kunićjeg anti-mišjeg globulina, konjugiranog na peroksidazu iz hrena, razrijeđenog na predtitranu optimalnu koncentraciju.

8.

Inkubiramo jedan sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

9.

Dodamo supstrat i kromogen, kao što je gore opisano. Prekinemo reakciju nakon 10 minuta dodavanjem 1 molarne sulfatne kiseline (50 ml po jažici).

Postupak

:

1 %-tnu agarozu, pripremljenu u boratu ili puferu natrijevog barbitola, pH 8,5 do 9,0, nalijemo u Petrijevu zdjelicu do visine od najmanje 3,0 mm. U agar urežemo testni uzorak od sedam potpuno suhih jažica, svaka promjera 5,0 mm. Uzorak se sastoji od jedne središnje jažice i šest jažica oko nje u krugu s promjerom 3 cm. Središnju jažicu punimo standardnim antigenom. Rubne jažice 2, 4 i 6 napunimo poznatim pozitivnim serumom, jažice 1, 3 i 5 napunimo pretraživanim serumima. Sustav inkubiramo do 72 sata na sobnoj temperaturi u zatvorenoj vlažnoj prostoriji.

Tumačenje

:

Pretraživani je serum pozitivan ako s antigenom oblikuje tanku specifičnu precipitirajuću crtu te ako ima potpuno jednaku crtu s kontrolnim serumom. Pretraživani je serum negativan ako se ne oblikuje specifična crta s antigenom te ako se crta kontrolnog seruma ne zakrivi. Petrijeve zdjelice pregledavamo na tamnoj podlozi, pri neizravnom osvjetljenju.

Postupak

:

1 %-tnu agarozu pripremljenu u boratu ili puferu natrijevog barbitola, pH 8,5 do 9,0 nalijemo u Petrijevu zdjelicu do visine od najmanje 3,0 mm. U agar urežemo testni uzorak od sedam potpuno suhih jažica, svaka promjera 5,0 mm. Uzorak se sastoji od jedne središnje jažice i šest jažica oko nje u krugu s promjerom od 3 cm. Središnju jažicu punimo standardnim antigenom. Rubne jažice 2, 4 i 6 napunimo poznatim pozitivnim serumom, jažice 1, 3 i 5 napunimo pretraživanim serumima. Sustav inkubiramo do 72 sata na sobnoj temperaturi u zatvorenoj vlažnoj prostoriji.

Tumačenje

:

Pretraživani je serum pozitivan ako s antigenom oblikuje tanku specifičnu precipitirajuću crtu te ako ima potpuno jednaku crtu s kontrolnim serumom. Pretraživani je serum negativan ako se ne oblikuje specifična crta s antigenom te ako se crta kontrolnog seruma ne zakrivi. Petrijeve zdjelice pregledavamo na tamnoj podlozi, pri neizravnom osvjetljenju.

Serum

:

Sve serume inaktiviramo 30 minuta prije uporabe na temperaturi od 56 °C.

Postupak

:

Za test serumske neutralizacije na mikrotitarskim pločama, pri kojem se virus neprekidno mijenja, koristimo staničnu liniju MDBK ili druge prijemljive stanice. Colorado, Oxford ili neki drugi referentni soj virusa koristimo pri 100 TCID50 na 0,025 ml; inaktivirane nerazrijeđene uzorke seruma pomiješamo s jednakom količinom (0,025 ml) suspenzije virusa. Mješavine virus/serum inkubiramo 24 sata na temperaturi od 37 °C na mikrotitarskim pločama prije nego li im dodamo stanice MDBK. Stanice upotrebljavamo u koncentraciji koja osigurava oblikovanje potpune jednoslojne stanične kulture nakon 24 sata.

Kontrola

:

i. test zaraznosti (infektivnosti) virusa, ii. kontrola toksičnosti seruma, iii. kontrole neinokuliranih staničnih kultura, iv. referentni protuserumi.

Tumačenje

:

Rezultate testa serumske neutralizacije i titar virusa upotrijebljenog u testu, očitamo nakon tri do šest dana inkubacije pri temperaturi 37 °C. Titri seruma smatraju se negativnima ako pri razrjeđenju 1:2 (nerazrijeđeni serum) ne dođe do neutralizacijske reakcije.

Reagensi

:

Prije uzorkovanja pripravimo transportni medij. Po 2 ml medija raspoređuje se u onoliko spremnika koliko ima životinja koje ćemo uzorkovati. Spremnici moraju biti otporni na zamrzavanje na krutom CO2 ili tekućem dušiku. Uzorke ezofagealnog/faringalnog sputuma prikupljamo korištenjem posebne sonde, pod nazivom probang. Za prikupljanje uzorka faringoezofagealna sonda (probang) provuče se kroz usta, preko hrpta jezika, nadolje u gornji dio jednjaka. Površinski epitel gornjeg dijela jednjaka ostružemo lateralno i dorzalno. Potom izvadimo sondu, po mogućnosti nakon što životinja proguta. Posudica (grabilica sonde) mora biti puna i sadržavati mješavinu sluzi, sline, ezofagealne tekućine i staničnih ostataka. Potrebno je pripaziti da svaki uzorak sadrži nešto vidljivog staničnog tkiva. Potrebno je izbjegavati grubo postupanje koje uzrokuje krvarenje. Uzorci nekih životinja mogu biti kontaminirani ruminalnim sadržajima (sadržajem iz buraga). Takve uzorke potrebno je baciti i usta životinje isprati vodom ili po mogućnosti fiziološkom otopinom prije ponovnog uzorkovanja.

Priprema uzoraka

:

Provjerimo kvalitetu svakog uzorka prikupljenog faringoezofagealnom sondom, i 2 ml uzorka s jednakom količinom transportnog medija ulijemo u spremnik otporan na zamrzavanje. Spremnike čvrsto zatvorimo, zapečatimo, dezinficiramo i označimo naljepnicom. Uzorke držimo na hladnom (+ 4 °C) i pregledamo nakon tri do četiri sata ili ih do pregleda držimo zamrznute na suhom ledu (- 69 °C) ili u tekućem dušiku. Prije uzorkovanja svake sljedeće životinje sondu dezinficiramo i tri puta isperemo čistom vodom.

Testiranje na FMD virus

:

Uzorke ucijepimo u primarne kulture iz stanica goveđe štitnjače uporabom najmanje triju epruveta po uzorku. Mogu se upotrijebiti druge prijemljive stanice, na primjer primarne stanice goveđih ili svinjskih bubrega, ali je potrebno imati na umu da su one manje osjetljive na neke tipove FMD virusa. Epruvete inkubiramo na 37 °C na rotacijskoj tresilici i svaki dan za 48 sati provjeravamo prisutnost citopatskog učinka (CPE). Ako je negativan, provedemo slijepi prijenos kulture na nove kulture i ponovno provjerimo učinak za 48 sati. Potrebno je potvrditi specifičnost svakog CPE-a.

1.

0,08M fosfatni pufer, pH 7,2 s 0,01 % goveđeg serumskog albumina, 0,002 % fenol crvenog bojila i antibiotika.

2.

Medij za kulturu tkiva (npr. Eagle's MEM) s 0,04M pufera Hepes, 0,01 % goveđeg serumskog albumina i antibiotika, pH 7,2.

3.

Transportnom mediju dodamo antibiotike (na ml konačne otopine), npr. penicilin 1 000 IJ, neomicin sulfat 100 IJ, polimiksin B sulfat 50 IE, mikostatin 100 IJ.

Reagensi

:

Standardni antigen protiv FMDV-a pripremimo u staničnim kulturama ili na stanicama goveđeg jezika i pohranimo ga na – 70 °C ili manje ili na – 20 °C nakon dodatka 50 % glicerola. To je standardni antigen. FMDV je u tim uvjetima stabilan i titar tijekom višemjesečnog razdoblja malo varira.

Postupak

:

Test provodimo na graduiranim mikropločama s ravnim dnom za kulturu tkiva, koristeći prijemljive stanice kao što su na primjer IB-RS-2, BHK-21 ili stanice telećih bubrega. Serume za testiranje razrijedimo u omjeru 1:4 u mediju stanične kulture bez seruma, s dodatkom 100 IJ/ml neomicina ili drugih odgovarajućih antibiotika. Serume inaktiviramo pri 56 °C 30 minuta i s količinama po 0,05 ml pripremimo na mikropločama dvostruke serije uporabom petlji za razrjeđivanje s po 0,05 ml. U svaku jažicu dodamo pretitrani virus, također razrijeđen u mediju stanične kulture bez seruma, koji sadrži 100 TCID50 na 0,05 ml. Nakon inkubacije na 37 °C jedan sat, kako bi se omogućila neutralizacija, u svaku jažicu dodamo po 0,05 ml suspenzije stanica s po 0,5 do 1,0 × 106 stanica na 1 ml u mediju stanične kulture, koji sadrži serum bez protutijela protiv FMD i zapečatimo ploče. Ploče inkubiramo na 37 °C. Jednoslojne ploče obično konfluiraju u 24 sata. Nakon 48 sata CPE je obično dovoljno izražen da je test moguće mikroskopski očitati. Tada se može napraviti konačno mikroskopsko očitavanje ili se mikroploče fiksiraju i oboje za makroskopsko očitavanje, na primjer s 10-postotnom otopinom formola u 0,05- postotnome metilenskom plavilu.

Kontrole

:

Kontrole pri svakom testu uključuju homologni antiserum s poznatim titrom, staničnu kontrolu, kontrolu toksičnosti seruma, kontrolu medija i titraciju virusa iz koje izračunamo stvarnu količinu virusa pri testiranju.

Tumačenje

:

Jažice s jasno izraženim CPE smatraju se zaraženim a neutralizacijski se titri izražavaju kao recipročne vrijednosti konačne otopine seruma, prisutnog u mješavini serum/virus na 50 % krajnje točke, ocijenjene po Spearman-Karberevoj metodi. (Karber, G., 1931, Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmokologie, 162, 480). Testovi se smatraju valjanim kada je stvarna količina virusa korištenog po jažici na testu između 101,5 i 102,5 TCID50, i ako je titar referentnog seruma unutar dvostruke vrijednosti njegova očekivanog titra, procijenjeno po prethodnim titracijama. Ako su kontrole izvan ovih granica, test je potrebno ponoviti. Konačni titar 1:11 ili manje smatra se negativnim.

1.

Mikroploče ELISA prekrijemo s 50 μl kunićjeg antiseruma i ostavimo preko noći u vlažnoj komori na sobnoj temperaturi.

2.

Pedeset mikrolitara duplicirane dvojne serije svakog testiranog seruma, počevši s 1:4, priredimo na višejažičnim mikropločama (pločama s više jažica) s dnom u obliku slova U (nosive ploče). Pedeset mikrolitara konstantne doze antigena dodamo u svaku jažicu i pustimo da mješavina odstoji preko noći na 4 °C. Dodatkom antigena razrijedimo početno razrijeđeni serum na 1:8.

3.

Mikroploče ELISA pet puta isperemo s PBST.

4.

Pedeset mikrolitara mješavine serum/antigen prenesemo s nosivih ploča na mikroploče ELISA prekrivene kunićjim serumom i inkubiramo ih na 37 °C jedan sat na rotacijskoj tresilici.

5.

Nakon ispiranja u svaku jažicu dodamo po 50 μl antiseruma od zamoraca protiv antigena u skladu s točkom 4. Mikroploče inkubiramo na 37 °C jedan sat na rotacijskoj tresilici.

6.

Mikroploče isperemo i u svaku jažicu dodamo po 50 μl kunićjeg anti-zamoračkog imunoglobulina, konjugiranog na peroksidazi hrena (HRP). Mikroploče inkubiramo na 37 °C jedan sat na rotacijskoj tresilici.

7.

Mikroploče isperemo i u svaku jažicu dodamo po 50 μl ortofenilen-diamina s 0,05 % H2O2 (30 %) w/v

8.

Reakciju zaustavljamo nakon 15 minuta s 1,25M H2SO4.

Kontrole

:

Za svaki upotrijebljeni antigen, 40 jažica bez seruma, ali koje sadrže antigen razrijeđen u PBST. Duplicirana dvojna otopina serije homolognoga goveđeg antiseruma. Duplicirana dvojna otopina serije negativnoga goveđeg seruma.

Tumačenje

:

Titri antitijela izraženi su kao konačna otopina testiranih seruma, koje dosižu 50 % srednje vrijednosti OD zabilježene u jažicama s kontrolama virusa bez testiranog seruma. Vrijednosti titra iznad 1:40 smatraju se pozitivnim.

Reference

:

Hamblin C, Barnett ITR i Hedger RS (1986.) ‚A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA.’Journal of Immunological Methods, 93, 115 to 121.11.

Serum

:

Prije upotrebe sve serume inaktiviramo 30 minuta na 56 °C.

Postupak

:

Za test serumske neutralizacije na mikropločama, pri kojima virus konstantno varira, upotrijebimo staničnu liniju Vero ili druge stanične linije. Virus Aujeszkyjeve bolesti upotrijebimo pri 100 TCID50 na 0,025 ml; inaktivirane nerazrijeđene uzorke seruma pomiješamo s jednakom količinom (0,025 ml) suspenzije virusa. Mješavine virus/serum inkubiramo dva sata na 37 °C na mikropločama prije nego što im dodamo odgovarajuće stanice. Stanice upotrijebimo na koncentraciji koja nakon 24 sata tvori potpunu jednoslojnu staničnu kulturu.

Kontrole

:

i. provjera infektivnosti virusa, ii. kontrola toksičnosti seruma, iii. kontrola nenacijepljenih staničnih kultura, iv. referentni antiserumi.

Tumačenje

:

Rezultate testa serumske neutralizacije i titar virusa upotrijebljenog u testu bilježimo nakon tri do sedam dana inkubacije na 37 °C. Titri seruma, manji od 1:2 (nerazrijeđeni serum) smatraju se negativnim.

Serum

:

Prije upotrebe sve serume inaktiviramo 30 minuta na 56 °C.

Postupak

:

Za test serumske neutralizacije na mikropločama, pri kojem virus konstantno varira, upotrijebimo staničnu liniju A72 (stanice psećeg tumora) ili druge osjetljive stanične linije. Virus TGE upotrebljava se na 100 TCID50 na 0,025 ml; inaktivirani nerazrijeđeni uzorci seruma miješaju se s istom količinom (0,025 ml) suspenzije virusa. Mješavine virus/serum inkubiraju se 30 do 60 minuta na 37 °C na mikropločama prije nego što im dodamo odgovarajuće stanice. Stanice upotrijebimo u koncentraciji koja osigurava postupnu jednoslojnu staničnu kulturu nakon 24 sata. Svaka stanica dobiva 0,1 ml stanične suspenzije.

Kontrole

:

i. provjera infektivnosti virusa, ii. kontrola toksičnosti seruma, iii. kontrola nenacijepljenih staničnih kultura, iv. referentni antiserumi.

Tumačenje

:

Rezultate testa serumske neutralizacije i titra virusa, upotrijebljenog u testu, bilježimo nakon tri do pet dana inkubacije na 37 °C. Titri seruma manji od 1:2 (konačna otopina) smatraju se negativnim. Ako su nerazrijeđeni uzorci seruma toksični za kulture tkiva, ti se serumi mogu razrijediti na 1:2 prije upotrebe u testu. To će biti jednako 1:4 konačne otopine seruma. U tim se slučajevima titri seruma manji od 1:4 (konačna otopina) smatraju negativnim.

„1”

:

Geografska i vremenska ograničenja

„2”

:

Ograničenja za pojedine kategorije

Nije dopušten za iznutrice (osim ošita i žvačnih mišića goveda).

„BOV”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso domaćih goveda (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalis i njihovih križanaca)

„POR”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso domaćih svinja (Sus scrofa)

„OVI”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso domaćih ovaca (Ovis aries) i koza (Capra hircus)

„EQU”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso domaćih kopitara (Equus caballus, Equus asinus i njihovih križanaca)

„RUF”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso uzgojenih nedomaćih životinja, osim divljih svinja i kopitara

„RUW”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso divljih nedomaćih životinja, osim divljih svinja i kopitara

„SUF”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso uzgojenih nedomaćih svinja

„SUW”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso nedomaćih divljih svinja

„EQW”

:

Obrazac veterinarskog certifikata za svježe meso divljih nedomaćih kopitara

„A”

:

jamstva glede kondicioniranja, mjerenja pH i iskoštavanja svježeg mesa, osim iznutrica, certificiranog u skladu s obrascima certifikata BOV (točka 10.6.), OVI (točka 10.6.), RUF (točka 10.7.) i RUW (točka 10.4.)

„B”

:

jamstva glede kondicioniranih obrezanih iznutrica, kako je opisano u obrascu veterinarskog certifikata BOV (točka 10.6.)

„C”

:

jamstva glede laboratorijskih testova za klasičnu svinjsku kugu na trupovima, od kojih je dobiveno svježe meso, certificirano u skladu s obrascem veterinarskog certifikata SUW (točka 10.3.a)

„D”

:

jamstva glede hranjenja pomijama na gospodarstvu(-ima) podrijetla životinja od kojih je dobiveno sveže meso, certificirano u skladu s obrascem veterinarskog certifikata POR (točka 10.3.(d))

„E”

:

jamstva glede testova na tuberkulozu na životinjama od kojih je dobiveno svježe meso certificirano u skladu s obrascem veterinarskog certifikata BOV (točka 10.4.(d))

„F”

:

jamstva glede kondicioniranja i iskoštavanja svježeg mesa, osim iznutrica, certificirano u skladu s obrascem veterinarske potvrde BOV (točka 10.6.), OVI (točka 10.6.), RUF (točka 10.7.) i RUW (točka 10.4.)

(a)

Veterinarske certifikate izdaje zemlja izvoznica na temelju obrazaca svjedodžbe iz dijela 2. Priloga II., u skladu s formatom obrasca koje odgovara tom mesu. Moraju sadržavati, brojčanim redoslijedom kao u obrascu certifikata, potvrde koje se zahtijevaju za svaku treću zemlju i, ako je to primjereno, posebna jamstva koja se zahtijevaju za treću zemlju izvoznicu ili njezin dio.

(b)

Poseban i jedinstveni certifikat potrebno je osigurati za meso koje se izvozi iz jednog područja iz stupca 2 i 3 dijela 1. Priloga II., koje se šalje na istu destinaciju i prevozi se istim željezničkim vagonom, kamionom, zrakoplovom ili brodom.

(c)

Izvornik svakog certifikata mora biti izrađen na jednom listu papira, obostrano, ili, kad je potrebno više teksta, mora biti izrađen tako, da su sve potrebne stranice dio jedne integralne cjeline koja se ne može dijeliti.

(d)

Certifikat se izrađuje na najmanje jednom službenom jeziku države članice EU, u kojoj će se provesti inspekcijski pregled na graničnoj inspekcijskoj postaji i jeziku odredišne države članice EU-a. Države članice mogu, međutim, prema potrebi dozvoliti upotrebu drugih jezika, popraćenih službenim prijevodom.

(e)

Ako su zbog identifikacije pojedinih dijelova pošiljke (iz točke 8.3. obrasca certifikata) svjedodžbi priložene dodatne stranice, te stranice se također moraju smatrati sastavnim dijelom izvornika, ako je svaka stranica označena potpisom i pečatom službenog veterinara koji obavlja certifikaciju.

(f)

Ako certifikat, koja uključuje dodatne popise iz točke (e), sadrži više od jedne stranice, svaka strana mora biti obrojčena – (broj stranice) od (ukupnog broja stranica) – na dnu i označena oznakom certifikata, koju je označio nadležni organ u vrhu certifikata.

(g)

Izvornik mora ispuniti i potpisati službeni veterinar. Pritom će nadležna tijela države izvoznice osigurati da se poštuju načela certificiranja jednakovrijedna onima propisanim Direktivom Vijeća 96/93/EZ.

Potpis mora biti druge boje od tiska. Jednako pravilo važi za pečate, osim reljefnih ili vodenih pečata.

(h)

Izvornik mora pratiti pošiljku do prispijeća na graničnu inspekcijsku postaju EU-a.