«B.53.   ÉTUDE DE NEUROTOXICITE POUR LE DEVELOPPEMENT

INTRODUCTION

1.   La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice pour les essais de produits chimiques no 426 (2007) de l'OCDE. En juin 1995, à Copenhague, un groupe de travail de l'OCDE sur la toxicité pour la reproduction et le développement a débattu de la pertinence d'une actualisation des lignes directrices de l'OCDE existantes sur la toxicité pour la reproduction et le développement, et de l'élaboration de nouvelles lignes directrices sur des effets qui ne sont pas actuellement couverts (1). Le groupe de travail a recommandé la rédaction d'une ligne directrice concernant la neurotoxicité pour le développement, fondée sur une ligne directrice de l'Agence des États-Unis pour la protection de l'environnement (US EPA), révisée depuis (2). Une seconde réunion de consultation s'est tenue en juin 1996 à Copenhague avec pour objet de livrer au secrétariat des informations sur l'avant-projet d'une nouvelle ligne directrice sur la neurotoxicité pour le développement, notamment concernant des éléments majeurs tels que des précisions sur le choix de l'espèce animale, la période d'administration, la durée de l'essai, les effets à évaluer et les critères d'évaluation des résultats. L'US EPA a publié une ligne directrice sur l'évaluation des risques neurotoxiques en 1998 (3). Une consultation d'experts de l'OCDE et un atelier de travail de l'Institut des sciences du risque ISLI se sont tenus parallèlement en octobre 2000, tandis qu'une consultation d'experts a eu lieu à Tokyo en 2005. Ces rencontres avaient dans leur ensemble pour objectif de débattre de questions scientifiques et techniques relatives à l'actuelle ligne directrice, et les recommandations qui en ont résulté (4) (5) (6) (7) ont été prises en compte lors de l'élaboration de la présente méthode d'essai. Les documents d'orientation no 43 “Reproductive Toxicity Testing and Assessment” (8) et no 20 “Neurotoxicity testing” (9) contiennent d'autres informations sur la mise en œuvre, l'interprétation et la terminologie relatives à cette méthode d'essai.

REMARQUES PRÉLIMINAIRES

2.   De nombreuses substances chimiques sont connues pour entraîner des effets neurotoxiques sur le développement chez l'homme et chez d'autres espèces (10) (11) (12) (13). Il est parfois nécessaire de déterminer la neurotoxicité potentielle pour le développement d'une substance chimique et d'estimer et d'évaluer ses caractéristiques toxiques. Les études de neurotoxicité pour le développement ont pour objectif de produire des résultats relatifs aux effets fonctionnels et morphologiques potentiels exercés sur le système nerveux en développement de la progéniture après exposition in utero et aux premiers stades de la vie, notamment des caractérisations par des courbes de réponse à la dose.

3.   Une étude de neurotoxicité pour le développement peut être menée isolément, ou intégrée dans une étude de toxicité pour la reproduction et/ou de neurotoxicité chez l'adulte [par exemple méthodes d'essai B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)], ou encore annexée à une étude de toxicité pour le développement prénatal [par exemple méthode d'essai B.31 (17)]. Si l'étude est intégrée dans une autre étude ou annexée, il est impératif de maintenir l'intégrité des deux types d'études. Tous les essais doivent être conformes à la législation en vigueur et aux lignes directrices gouvernementales et institutionnelles applicables concernant l'utilisation des animaux de laboratoire à des fins de recherche (par exemple 18).

4.   Le laboratoire qui mène l'essai doit tenir compte de toutes les informations disponibles sur la substance d'essai avant de procéder à l'étude. Il s'agit notamment d'informations sur l'identité et la structure de la substance chimique, sur ses propriétés physico-chimiques, sur les résultats de tout autre essai de toxicité in vitro ou in vivo réalisé sur la substance, sur les données toxicologiques relatives à d'autres substances chimiques apparentées, ainsi que sur la ou les utilisations prévues de la substance. Ces renseignements sont nécessaires pour convaincre toutes les parties intéressées de l'intérêt de l'essai pour la protection de la santé humaine, et ils seront utiles pour déterminer la dose initiale appropriée.

PRINCIPE DE L'ESSAI

5.   La substance d'essai est administrée aux animaux pendant les périodes de gestation et de lactation. Les mères sont testées pour évaluer les effets sur les femelles gravides et allaitantes, avec pour objectif additionnel l'acquisition d'informations comparatives (entre mère et progéniture). La neurotoxicité est évaluée sur des descendants sélectionnés au hasard dans les portées. L'évaluation comprend des observations destinées à détecter des anomalies neurologiques macroscopiques et comportementales, notamment l'examen du développement physique, de l'ontogénie comportementale, de l'activité motrice, des fonctions motrices et sensorielles, et de l'apprentissage et de la mémoire, ainsi que l'évaluation pondérale du cerveau et de la neuropathologie au cours du développement postnatal et à l'âge adulte.

6.   Lorsque la méthode d'essai est mise en œuvre dans le cadre d'une étude séparée, il est possible d'appliquer sur des animaux surnuméraires disponibles dans chaque groupe des protocoles spécifiques d'étude du neurocomportement, de neuropathologie, de neurochimie ou d'électrophysiologie susceptibles de compléter les résultats obtenus par les examens recommandés par la présente méthode d'essai (16) (19) (20) (21). Ces protocoles présentent un intérêt particulier lorsque l'observation empirique, les effets escomptés ou le mécanisme ou le mode d'action évoquent un type spécifique de neurotoxicité. Ces protocoles supplémentaires peuvent être appliqués aux mères aussi bien qu'aux petits. Il est également possible de recourir à d'autres protocoles ex vivo ou in vitro, sous réserve qu'ils n'altèrent pas l'intégrité des protocoles in vivo.

PRÉPARATIONS EN VUE DE L'ESSAI

Sélection de l'espèce animale

7.   L'espèce animale expérimentale privilégiée est le rat; d'autres espèces peuvent être utilisées, s'il y a lieu. Toutefois, il convient de noter que le nombre de jours de gestation et de développement postnatal spécifiés dans cette méthode d'essai correspond à des souches de rats couramment utilisées, et que des durées comparables devront être choisies dans le cas de l'utilisation d'une autre espèce ou d'une souche inhabituelle. L'emploi d'une autre espèce sera justifié par des données toxicologiques, pharmacocinétiques, et/ou d'une autre nature. La légitimation du choix doit s'appuyer sur des évaluations neurocomportementales et neuropathologiques postnatales déjà disponibles, spécifiques de l'espèce. Lorsqu'un essai antérieur a produit des résultats préoccupants, il convient de se pencher sur l'espèce ou la souche utilisée pour cet essai. Les différentes souches de rat se caractérisent par des performances dissemblables et il convient donc de fournir les preuves démontrant que la souche sélectionnée présente une fécondité et une réactivité adéquates. La fiabilité et la sensibilité de la détection de la neurotoxicité pour le développement sur les autres espèces devront être documentées.

Conditions d'hébergement et d'alimentation

8.   La température du local abritant les animaux expérimentaux doit être de 22 ± 3 °C. L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et, de préférence, elle n'excédera pas 70 %, sauf pendant le nettoyage du local, mais il faut s'efforcer de la maintenir à 50-60 %. L'éclairage doit être artificiel, avec une alternance de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité. Il est possible d'inverser le cycle d'éclairage avant l'accouplement et pendant la durée de l'étude, afin de procéder aux évaluations des effets fonctionnels et comportementaux pendant la période d'obscurité (sous lumière rouge), c'est-à-dire pendant la période d'activité normale des animaux (22). Toute modification du cycle lumière-obscurité doit inclure une période d'acclimatation suffisante pour l'adaptation des animaux aux nouvelles conditions. L'alimentation correspond à des régimes de laboratoire conventionnels avec accès illimité à l'eau de boisson. Il y a lieu de consigner la nature des aliments et de l'eau et d'analyser ceux-ci pour détecter la présence de contaminants.

9.   Les animaux peuvent être logés individuellement ou réunis dans des cages en petits groupes du même sexe. L'accouplement doit avoir lieu dans des cages adaptées à cet usage. Dès confirmation de la copulation ou avant le 15e jour de gestation, les animaux fécondés doivent être placés individuellement dans des cages de mise bas ou de maternité. Cet équipement doit être aménagé pour réduire au minimum les éventuels effets de placement en cage. Les femelles fécondées disposeront de matériaux de nidification adéquats et bien définis aux abords de la mise bas. Il est notoire qu'une manipulation ou un stress superflu pendant la gestation peut provoquer des effets indésirables, notamment un avortement ou un développement fœtal ou postnatal perturbé. Afin de se prémunir contre une mortalité fœtale due à des facteurs non liés au traitement, il convient de manipuler avec soin les animaux pendant la gestation, et d'éviter tout stress exercé par des facteurs externes tels qu'un bruit excessif.

Préparation des animaux

10.   Il faut utiliser des animaux sains, acclimatés aux conditions de laboratoire et n'ayant préalablement subi aucun traitement expérimental, à moins que l'étude ne soit incorporée dans une autre étude (voir paragraphe 3). Les animaux expérimentaux doivent être caractérisés en termes d'espèce, de souche, de source, de sexe, de poids et d'âge. Chaque animal doit être affecté et marqué d'un numéro d'identification individuel. Il convient de maintenir autant que possible une uniformité de poids et d'âge des animaux, dans tous les groupes de l'essai, et de se trouver dans la gamme de valeurs normales de l'espèce et de la souche étudiées. À chaque niveau de dose, il faut utiliser des animaux femelles nullipares adultes jeunes. Les individus d'une même fratrie ne peuvent pas être accouplés, et des précautions doivent être prises dans ce sens. Le jour de gestation (JG) 0 est le jour auquel on observe un bouchon vaginal et/ou des spermatozoïdes. Les animaux à gestation datée acquis auprès d'un fournisseur disposeront d'une période d'acclimatation adéquate (par exemple 2-3 jours). Les femelles fécondées doivent être affectées sans biais aux groupes témoin et de traitement et, dès que possible, uniformément réparties dans les groupes (par exemple il est recommandé d'employer un protocole aléatoire stratifié pour uniformiser la répartition entre tous les groupes, notamment fondé sur le poids corporel). Les femelles inséminées par le même mâle doivent être également réparties dans les groupes.

PROTOCOLE

Nombre et sexe des animaux

11.   Chaque groupe traité et témoin doit contenir un nombre suffisant de femelles gravides exposées à la substance d'essai afin de garantir l'obtention d'un nombre adéquat de descendants pour évaluer la neurotoxicité. Un nombre total de 20 portées est recommandé pour chaque niveau de dose. Il est possible d'utiliser des modèles d'administration avec répétition des expériences et groupes échelonnés sous réserve que le nombre total de portées par groupe soit adéquat, et que des modèles statistiques appropriés soient utilisés pour tenir compte des expériences identiques.

12.   Au jour 4 après la naissance (JAN 4) ou avant (le jour de la mise bas est JAN 0), la taille de chaque portée doit être ajustée en éliminant les petits en excès par sélection aléatoire pour que toutes les portées soient de taille identique (23). La taille de la portée ne doit pas dépasser la taille de portée moyenne pour la souche de rongeur utilisée (8-12). Les nombres de petits mâles et femelles doivent être aussi proches que possible de l'égalité. Il ne convient pas de procéder à une élimination sélective des petits basée, par exemple, sur le poids corporel. Après standardisation des portées (restriction) et avant toute analyse des effets fonctionnels, chaque petit sur lequel on a programmé des essais présevrage ou postsevrage doit être identifié individuellement par une méthode humaine adéquate d'identification des petits (par exemple 24).

Affectation des animaux aux essais fonctionnels et comportementaux, aux mesures de poids du cerveau et aux évaluations neuropathologiques

13.   La méthode d'essai admet des approches diverses quant à la répartition des animaux exposés in utero et via l'allaitement dans les différents essais fonctionnels et comportementaux, à la détermination de la maturité sexuelle et du poids du cerveau et à l'évaluation neuropathologique (25). Il est possible d'ajouter d'autres essais sur la fonction neurocomportementale (par exemple comportement social), ou des essais de neurochimie ou de neuropathologie, au cas par cas, à condition que l'intégrité des essais initiaux requis ne soit pas compromise.

14.   Les petits sont sélectionnés dans chaque groupe de dose et affectés à une évaluation d'effet au JAN 4 ou après. La sélection des petits doit permettre, dans la mesure du possible, une représentation équilibrée des deux sexes de chaque portée, pour chaque groupe de dose, dans tous les essais. Dans le test d'activité motrice, il convient d'analyser la même paire de petits mâle et femelle à tous les âges de présevrage (voir paragraphe 35). Pour tous les autres essais, on peut affecter des paires identiques ou différentes d'animaux mâles et femelles aux différents essais comportementaux. Pour l'étude de la fonction cognitive, il peut s'avérer nécessaire d'affecter des petits différents aux essais sur animaux immatures et sur animaux adultes, afin d'éviter toute confusion entre les effets de l'âge et les effets d'un entraînement antérieur pour ces mesures (26) (27). Au moment du sevrage (JAN 21), les petits qui ne sont pas sélectionnés pour des tests peuvent être sacrifiés humainement. Toute modification de la répartition des petits doit être consignée. L'unité statistique de la mesure est la portée (ou la mère) et non le petit.

15.   Il existe différentes façons de répartir les petits dans les examens présevrage et postsevrage, les essais cognitifs, les examens pathologiques, etc. (un modèle général est proposé à la figure 1 et des exemples de répartition sont présentés dans l'appendice 1). Il est recommandé d'employer les nombres minimaux suivants d'animaux dans chaque groupe de dose pour les examens présevrage et postsevrage:

Observations cliniques et poids corporel	Tous les animaux
Observations cliniques detaillées	20/sexe (1/sexe/portée)
Poids du cerveau (postfixation) JAN 11-22	10/sexe (1/portée)
Poids du cerveau (non fixé) ~JAN 70	10/sexe (1/portée)
Neuropathologie (fixation par immersion ou perfusion) JAN 11-22	10/sexe (1/portée)
Neuropathologie (fixation par perfusion) JAN ~70	10/sexe (1/portée)
Maturité sexuelle	20/sexe (1/sexe/portée)
Autres marqueurs du développement (facultatif)	Tous les animaux
Ontogénie comportementale	20/sexe (1/sexe/portée)
Activité motrice	20/sexe (1/sexe/portée)
Fonction motrice et sensorielle	20/sexe (1/sexe/portée)
Apprentissage et mémoire	10/sexe (1) (1/portée)

Dosage

16.   On doit utiliser au moins trois niveaux de doses différents et un groupe témoin en parallèle. Les niveaux de dose doivent être espacés de façon à produire une gradation des effets toxiques. Si elle n'est pas limitée par les propriétés physico-chimiques ou biologiques de la substance d'essai, la dose la plus élevée doit être choisie en vue d'induire une certaine toxicité pour la mère [par exemple signes cliniques, diminution du gain de poids corporel (pas plus de 10 %) et/ou preuve de toxicité limitée par la dose dans un organe cible]. La dose élevée ne doit pas dépasser 1 000 mg/kg/jour de poids corporel, sauf exception, par exemple, si l'exposition humaine prévue indique qu'il est nécessaire d'utiliser une dose plus élevée. Il est également possible de mener des études pilotes ou des études préliminaires de détermination d'un ordre de grandeur afin de définir la dose la plus élevée qu'il faut utiliser pour produire une toxicité minimale pour la mère. Lorsque la substance d'essai s'est révélée toxique sur le plan du développement dans une étude standard de toxicité pour le développement ou dans une étude pilote, la dose la plus élevée doit être la dose maximale qui n'induit pas de toxicité excessive pour la descendance, ni de mort in utero ou néonatale, ni de malformations, qui empêcherait une évaluation significative de la neurotoxicité. La dose la plus faible ne doit produire aucun signe de toxicité pour la mère ni de toxicité pour le développement, notamment de neurotoxicité. Il convient de sélectionner une séquence de doses décroissantes en vue de mettre en évidence une relation dose-effet et une concentration sans effet nocif observé (CSENO), ou des doses proches de la limite de détection permettant de déterminer un niveau de référence. Les intervalles optimaux au sein d'une séquence de doses décroissantes sont souvent d'un facteur de 2 à 4 et l'adjonction d'un quatrième groupe de dose est souvent préférable à l'administration de doses très espacées (par exemple par un facteur de plus de 10).

17.   Il convient de choisir des niveaux de dose en considérant toutes les données existantes sur la toxicité ainsi que d'autres informations sur le métabolisme et la toxicocinétique de la substance d'essai ou de composés apparentés. Ces informations contribueront également à justifier l'échelle des doses. Il faut envisager l'administration directe aux petits en se fondant sur des informations relatives à l'exposition et à la pharmacocinétique (28) (29). Il faudra soigneusement évaluer les avantages et les inconvénients avant la mise en œuvre d'études d'administration directe (30).

18.   Le groupe témoin étudié en parallèle doit être un groupe témoin fictivement traité ou un groupe témoin traité par le véhicule, lorsqu'un véhicule est utilisé pour administrer la substance d'essai. Tous les groupes doivent recevoir le même volume de substance d'essai ou de véhicule, rapporté au poids corporel. Lorsqu'un véhicule ou un autre adjuvant est utilisé pour faciliter l'administration, il convient de tenir compte des caractéristiques suivantes: effets sur l'absorption, la distribution, le métabolisme, ou la rétention de la substance d'essai; effets sur les propriétés chimiques de la substance d'essai susceptibles de modifier ses caractéristiques toxiques; effets sur la consommation d'aliments ou d'eau ou l'état nutritionnel des animaux. Le véhicule ne doit provoquer aucun effet susceptible d'interférer avec l'interprétation de l'étude et ne doit induire aucune toxicité sur le plan neurocomportemental, ni exercer d'effets sur la reproduction ou le développement. Dans le cas de l'utilisation de nouveaux véhicules, il convient d'inclure dans l'étude, outre le groupe véhicule témoin, un groupe témoin fictivement traité. Les animaux inclus dans le ou les groupes témoins doivent être manipulés exactement comme les animaux des groupes d'essai.

Administration des doses

19.   La substance d'essai ou le véhicule doivent être administrés par la voie la plus représentative de l'exposition humaine potentielle, en fondant le choix sur des informations disponibles sur le métabolisme et la distribution dans les animaux expérimentaux. La voie d'administration sera généralement orale (par exemple gavage, aliments ou eau de boisson), mais il est possible d'utiliser d'autres voies (par exemple voie cutanée, inhalation), justifiées par des caractéristiques particulières ou des voies d'exposition de l'homme envisagées ou connues [d'autres informations sont fournies dans le document d'orientation no 43 (8)]. Il convient de motiver le choix de la voie d'administration. La substance d'essai doit être administrée tous les jours à peu près au même moment.

20.   La dose administrée à chaque animal dépend normalement de la mesure la plus récente du poids corporel du sujet. Toutefois, les doses devront être ajustées avec précaution dans le dernier tiers de la gestation. Si une toxicité excessive est observée sur les mères traitées, elles seront humainement sacrifiées.

21.   La substance d'essai ou le véhicule doivent être administrés au minimum quotidiennement aux femelles fécondées à partir du moment de l'implantation (JG 6) et jusqu'à la fin de la lactation (JAN 21), de façon à exposer les petits à la substance d'essai pendant le développement neurologique prénatal et postnatal. L'âge au début de l'administration et la durée et la fréquence des administrations peuvent être ajustés, s'il est démontré qu'un autre modèle expérimental correspond mieux aux expositions de l'homme. Les durées d'administration doivent être adaptées aux autres espèces de façon à garantir une exposition pendant toutes les périodes précoces du développement du cerveau (c'est-à-dire équivalentes à la croissance cérébrale humaine prénatale et postnatale précoce). Il est possible de commencer l'administration au début de la gestation (JG 0), mais il convient d'envisager que la substance d'essai puisse entraîner une perte préimplantatoire. Le choix d'une administration à partir du JG 6 permettrait d'écarter ce risque, mais les stades du développement compris entre JG 0 et 6 ne seraient alors pas traités. Il est impossible de commencer l'administration à JG 0 sur des animaux à accouplement daté acquis par le laboratoire, et JG 6 semble par conséquent un bon compromis de jour de départ. Le laboratoire d'essai prendra soin d'ajuster le régime posologique conformément aux informations pertinentes dont il dispose sur les effets de la substance d'essai, avant l'expérience, et conformément à des considérations logistiques, notamment par le prolongement de l'administration après le sevrage. Il est préférable d'interrompre l'administration le jour de la parturition chez les animaux qui n'ont pas mis bas tous leurs descendants. On estime en général que les petits sont exposés par l'intermédiaire du lait maternel; toutefois, l'administration directe aux petits doit être envisagée dans les cas d'absence de preuve d'une exposition continue de la progéniture. Ces preuves peuvent être tirées, par exemple, d'informations pharmacocinétiques, de toxicité sur la progéniture ou de modification des marqueurs biologiques (28).

OBSERVATIONS

Observations sur les mères

22.   Toutes les mères doivent faire l'objet d'une observation attentive au moins une fois par jour, afin de constater leur état de santé et de relever la morbidité et la mortalité.

23.   Pendant les périodes de traitement et d'observation, des examens cliniques plus détaillés sont périodiquement menés (au moins deux fois pendant la période d'administration au cours de la gestation et deux fois pendant la période d'administration au cours de la lactation), en employant au moins dix mères par dose. Les animaux doivent être observés à l'extérieur de leur cage d'habitation, par des techniciens formés ignorant le traitement des animaux, et suivant des protocoles normalisés visant à limiter autant que possible les biais liés au stress des animaux, à l'observateur, et à optimiser la reproductibilité interobservateurs. Dans la mesure du possible, il est préférable que toutes les observations d'une étude donnée soient réalisées par le même technicien.

24.   La présence de signes observés doit être consignée. Autant que possible, leur ampleur doit également être notée. Les observations cliniques incluront, sans s'y limiter, des modifications de l'état de la peau, de la fourrure, des yeux, des muqueuses, la présence de sécrétions, et l'activité autonome (par exemple larmoiement, horripilation, taille des pupilles, mode de respiration inhabituel, et/ou respiration par la bouche, et tous signes inhabituels de miction ou défécation).

25.   Il faut également noter toutes les réactions inhabituelles dans la position du corps, le niveau d'activité (par exemple augmentation ou diminution de l'exploration de la zone standard) et la coordination des mouvements. Les modifications de la marche (par exemple marche en canard, ataxie), de la posture (par exemple dos rond) et de la réactivité à la manipulation, à la pose ou à d'autres stimuli environnementaux, ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques, de convulsions, de tremblements, de stéréotypies (par exemple toilettage excessif, mouvements inhabituels de la tête, déplacements répétés en cercle), de comportements étranges (par exemple morsures ou léchage excessif, automutilation, marche à reculons, vocalisation), ou d'agression doivent être enregistrés.

26.   Les signes de toxicité doivent être enregistrés, notamment le jour de leur apparition, le moment de la journée, leur degré et leur durée.

27.   Les animaux sont pesés au moment de l'administration au moins une fois par semaine pendant toute l'étude, ou le jour de la mise bas ou à un moment proche de ce jour et à JAN 21 (sevrage). Dans les études par gavage, les mères doivent être pesées au moins deux fois par semaine. Les doses sont ajustées au moment de chaque pesée, s'il y a lieu. La consommation d'aliments est mesurée une fois par semaine au moins pendant la gestation et la lactation. La consommation d'eau doit être mesurée au moins une fois par semaine si les animaux sont exposés par l'eau de boisson.

Observations sur la progéniture

28.   Tous les petits doivent être attentivement examinés au moins quotidiennement pour détecter les signes de toxicité et déterminer la morbidité et la mortalité.

29.   Pendant les périodes de traitement et d'observation, des examens cliniques plus détaillés des descendants doivent être réalisés. La progéniture (au moins un petit/sexe/portée) doit être observée par des techniciens formés ignorant le traitement des animaux, suivant des protocoles normalisés visant à réduire au minimum les biais et à optimiser la reproductibilité interobservateurs. Dans la mesure du possible, il est préférable que les observations soient réalisées par le même technicien. On contrôlera au minimum les effets décrits dans les paragraphes 24 et 25, s'ils s'appliquent au stade du développement étudié.

30.   Tous les signes de toxicité sur la progéniture doivent être consignés, notamment le jour de leur apparition, le moment de la journée, leur degré et leur durée.

Marqueurs physiques et développementaux

31.   Les modifications des marqueurs du développement antérieurs au sevrage (par exemple dépliement du pavillon de l'oreille, ouverture des yeux, poussée des incisives) sont étroitement corrélées au poids corporel (30) (31). Le poids corporel est donc souvent le meilleur indicateur du développement physique. Il est par conséquent recommandé de mesurer les marqueurs de développement uniquement lorsque les indices préalables suggèrent que ces données fourniront de nouvelles informations. Le calendrier d'évaluation de ces paramètres est indiqué dans le tableau 1. En se fondant sur les effets anticipés et les résultats des mesures initiales, il peut être judicieux d'ajouter d'autres dates d'examen ou de réaliser les mesures à d'autres stades du développement.

32.   Il est préférable d'utiliser l'âge postcoïtal plutôt que l'âge postnatal pour évaluer le développement physique (33). Si l'essai est réalisé le jour du sevrage, il est recommandé d'examiner les petits avant sevrage effectif pour éviter toute confusion avec l'effet du stress associé au sevrage. De surcroît, on ne procédera à aucun examen postsevrage des petits au cours des deux jours qui suivent cet événement.

Tableau 1

Calendrier d'évaluation des marqueurs physiques et développementaux, et des effets fonctionnels/comportementaux  (2)

Âges Effets	Présevrage (3)	Adolescence (3)	Jeunes adultes (3)
Marqueurs physiques et développementaux
Poids corporel et observations cliniques	hebdomadaire (4)	au moins toutes les deux semaines	au moins toutes les deux semaines
Poids du cerveau	JAN 22 (5)		à la fin
Neuropathologie	JAN 22 (5)		à la fin
Maturité sexuelle	—	en temps opportun	—
Autres marqueurs du développement (6)	s'il y a lieu	—	—
Effets fonctionnels/comportementaux
Ontogénie comportementale	au moins deux mesures
Activité motrice (y compris accoutumance)	1-3 fois (7)	—	une fois
Fonction motrice et sensorielle	—	une fois	une fois
Apprentissage et mémoire	—	une fois	une fois

33.   Les petits vivants doivent être comptés et sexés, par exemple, par examen visuel ou mesure de la distance ano-génitale (34) (35), et chaque petit d'une portée doit être pesé individuellement à la naissance ou peu après, puis au moins une fois par semaine pendant l'allaitement, et au moins toutes les deux semaines par la suite. Pour évaluer la maturité sexuelle, il faut déterminer l'âge et la masse corporelle de l'animal à l'apparition de la perméabilité vaginale (36) ou de la séparation prépuciale (37) sur au moins un mâle et une femelle par portée.

Ontogénie comportementale

34.   L'ontogénie des comportements sélectionnés doit être mesurée sur au moins un petit/sexe/portée pendant la période d'âge appropriée, et sur les mêmes petits à toutes les dates d'essai pour tous les comportements évalués. Il convient d'espacer uniformément les dates de mesure sur cette période, afin de déterminer si la modification de l'ontogénie de ce comportement est normale ou liée au traitement (38). Quelques exemples de comportements susceptibles de donner lieu à une évaluation de l'ontogénie sont les suivants: réflexe de redressement, géotaxie négative et activité motrice (38) (39) (40).

Activité motrice

35.   L'activité motrice doit être suivie (41) (42) (43) (44) (45) pendant la période préalable au sevrage et à l'âge adulte. La mise en œuvre de l'essai au moment du sevrage est décrite au paragraphe 32. La longueur de la session d'essai doit permettre de démontrer l'accoutumance intrasession des témoins non traités. Il est vivement recommandé d'utiliser l'activité motrice pour évaluer l'ontogénie comportementale. Dans un essai d'ontogénie comportementale, il faut utiliser les mêmes animaux dans toutes les sessions d'essai préalables au sevrage. Les observations doivent être suffisamment fréquentes pour permettre d'évaluer l'ontogénie de l'accoutumance intrasession (44). À cet effet, l'essai peut demander trois examens ou davantage avant le sevrage, jour du sevrage compris (par exemple JAN 13, 17, 21). Il convient également d'analyser les mêmes animaux, ou des animaux de la fratrie, à l'âge adulte vers la fin de l'étude (par exemple à JAN 60-70). Si nécessaire, des dates d'essai peuvent être ajoutées. L'activité motrice doit être contrôlée par un appareil d'enregistrement automatique capable de détecter aussi bien des augmentations que des diminutions d'activité (c'est-à-dire que l'activité de base mesurée par le dispositif ne doit pas être trop modérée, ce qui empêcherait la détection des diminutions d'activité, ni trop élevée, ce qui empêcherait la détection d'augmentations). Tous les appareils seront testés par des protocoles standard afin de garantir, dans la mesure du possible, la reproductibilité entre appareils et entre dates de mesure. Il conviendra d'équilibrer au mieux les groupes de traitement affectés à chaque appareil. Chaque animal doit être testé individuellement. Il faut répartir les groupes d'évaluation de l'essai sur la journée pour tenir compte des rythmes d'activité circadiens. On s'attachera particulièrement à réduire au minimum les variations affectant les conditions de l'essai et à éviter de les rattacher systématiquement au traitement. Les variables susceptibles d'affecter de nombreuses mesures du comportement, notamment l'activité motrice, comprennent l'intensité du bruit, les dimensions et la forme de la cage de l'essai, la température, l'humidité relative, les conditions de luminosité, les odeurs, l'utilisation de la cage d'habitation pour les tests ou d'une nouvelle cage d'essai et les distractions dues à l'environnement.

Fonction motrice et sensorielle

36.   Les fonctions motrices et sensorielles doivent être étudiées en détail au moins une fois pendant la période de l'adolescence et une fois à l'âge jeune adulte (par exemple JAN 60-70). Pour procéder aux essais au moment du sevrage, se reporter au paragraphe 32. Il convient de mener les expériences en nombre suffisant pour garantir un échantillonnage quantitatif approprié des modalités sensorielles (par exemple somato-sensorielle, vestibulaire) et des fonctions motrices (par exemple force, coordination). La réponse à la poussée (46), le réflexe de redressement (47) (48), l'accoutumance au sursaut auditif (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54), et les potentiels évoqués (55) comptent parmi les exemples de tests des fonctions motrices et sensorielles.

Essais d'apprentissage et de mémoire

37.   Un essai d'apprentissage associatif et de mémoire doit être mené après le sevrage (par exemple 25 ± 2 jours) et chez les jeunes adultes (JAN 60 et plus). Pour ce qui est de l'essai au moment du sevrage, on se reportera au paragraphe 32. Il est possible d'utiliser des essais identiques ou différents aux deux stades de développement. Le choix du ou des essais d'apprentissage et de mémoire chez les rats sevrés et adultes reste relativement libre, mais les tests doivent satisfaire deux critères. Tout d'abord, l'apprentissage doit être évalué soit comme un changement au cours de plusieurs tests ou sessions répétées d'apprentissage, ou bien, dans des essais mettant en œuvre un seul test, par référence à une condition expérimentale qui contrôle les effets non associatifs de l'entraînement. De plus, le ou les essais doivent inclure une mesure de la mémoire (à court terme ou à long terme) en plus de l'apprentissage initial (acquisition), mais cette mesure de mémoire n'a pas lieu d'être rapportée si une mesure d'acquisition n'a pas été obtenue dans le même essai. Dans le cas où le ou les essais d'apprentissage et de mémoire démontrent un effet de la substance d'essai, il convient d'envisager l'utilisation d'autres tests visant à éliminer toute interprétation fondée sur des altérations des capacités sensorielles, de motivation et/ou motrices. Outre ces deux critères, il est recommandé de choisir l'essai d'apprentissage et de mémoire en tenant compte de sa sensibilité démontrée à la classe de la substance chimique à l'étude, dans la mesure où cette information est disponible dans la littérature. Si elle ne l'est pas, la liste ci-dessous propose des tests qui peuvent être réalisés pour satisfaire aux critères mentionnés plus haut dans ce paragraphe: test d'évitement passif (43) (56) (57), appariement retardé de la position pour le rat adulte (58) et pour le rat avant sevrage (59), conditionnement olfactif (43) (60), labyrinthe d'eau de Morris (61) (62) (63), labyrinthe de Biel ou de Cincinnati (64) (65), labyrinthe à bras radiaux (66), labyrinthe en T (43), acquisition et rétention d'un comportement programmé (26) (67) (68). D'autres essais décrits dans la littérature s'appliquent aux rats sevrés (26) (27) et adultes (19) (20).

Autopsie

38.   Les mères peuvent être euthanasiées après sevrage de leur progéniture.

39.   L'évaluation neuropathologique des descendants sera menée sur des tissus prélevés sur des animaux humainement sacrifiés au JAN 22 ou plus tôt dans l'étude, entre JAN 11 et JAN 22, et également à la fin de l'étude. Les tissus cérébraux doivent être examinés sur les petits sacrifiés jusqu'au JAN 22; sur les animaux sacrifiés à la fin de l'étude, on évaluera les tissus du système nerveux central (SNC) et du système nerveux périphérique (SNP). Les tissus des animaux sacrifiés au JAN 22 ou plus tôt peuvent être fixés par immersion ou perfusion. Ceux des animaux tués à la fin de l'étude doivent être fixés par perfusion. Tous les aspects de la préparation des échantillons de tissus, depuis la perfusion des animaux jusqu'à la dissection des échantillons de tissus, au traitement des tissus et à la coloration des lames, devront respecter un plan expérimental contrebalancé tel que chaque lot contienne des échantillons représentatifs de chaque groupe de dose. Le document d'orientation no 20 de l'OCDE (9) contient des informations supplémentaires sur la neuropathologie [voir également (103)].

Traitement des échantillons de tissus

40.   Toutes les anomalies macroscopiques évidentes au moment de l'autopsie doivent être consignées. Les échantillons de tissus prélevés doivent représenter les principales régions du système nerveux. Les échantillons sont conservés dans un fixateur approprié et traités en suivant des protocoles histologiques publiés normalisés (69) (70) (71) (103). L'inclusion dans la paraffine est acceptée pour les tissus du SNC et du SNP, mais l'utilisation d'osmium lors de la postfixation, associée à des inclusions dans une résine époxy, convient parfois mieux lorsqu'un degré plus élevé de résolution est requis (par exemple pour les nerfs périphériques, en cas de suspicion d'une neuropathie périphérique ou pour une analyse morphométrique des nerfs périphériques). Les tissus cérébraux prélevés à des fins d'analyse morphométrique doivent être inclus dans un milieu approprié, simultanément pour toutes les doses, afin d'éviter les artefacts de rétrécissement parfois associés à un stockage prolongé dans le fixateur (6).

Examen neuropathologique

41.   L'examen qualitatif a les objectifs suivants:

i)	repérer les régions du système nerveux présentant des indices d'altérations neuropathologiques;

ii)	recenser les types d'altérations neuropathologiques provoqués par l'exposition à la substance d'essai, et

iii)	évaluer la gravité des altérations neuropathologiques.

Des coupes histologiques représentatives des échantillons de tissus doivent être examinées au microscope par un pathologiste de formation adéquate afin de détecter des altérations neuropathologiques. Toutes les altérations détectées seront caractérisées par un degré de gravité subjectif. Une coloration hématoxyline et éosine suffisent souvent pour évaluer les coupes de cerveau des animaux humainement sacrifiés à JAN 22 ou plus tôt. Toutefois, une coloration de la myéline (par exemple fast blue luxol/violet de crésyl) et une coloration à l'argent (par exemple colorations de Bielschowsky ou de Bodians) sont recommandées pour les coupes de tissus du SNC et du SNP prélevés sur les animaux sacrifiés à la fin de l'étude. Le pathologiste appréciera, en s'appuyant sur son expérience professionnelle et sur la nature des altérations observées, s'il convient d'utiliser d'autres colorations afin de repérer et de caractériser des types d'altérations particuliers [par exemple protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) ou histochimie de la lectine pour estimer les altérations gliales et microgliales (72), fluoro-jade pour détecter les nécroses (73) (74), ou coloration à l'argent spécifique de la dégénérescence neurale (75)].

42.   Il convient d'effectuer une évaluation morphométrique (quantitative), car ces données peuvent contribuer à détecter un effet lié au traitement et sont utiles à l'interprétation des différences liées au traitement au niveau du poids du cerveau ou de la morphologie (76) (77). Des échantillons de tissu nerveux sont prélevés et préparés en vue d'une évaluation morphométrique. Il faut inclure, par exemple, des mesures linéaires ou surfaciques de régions spécifiques du cerveau (78). De telles mesures se pratiquent sur des coupes homologues soigneusement sélectionnées grâce à des repères microscopiques fiables (6). La stéréologie peut permettre d'identifier des effets liés au traitement sur des paramètres tels que le volume ou le nombre de cellules spécifiques de régions neuroanatomiques (79) (80) (81) (82) (83) (84).

43.   On recherchera par l'examen des cerveaux tous les indices d'altérations neuropathologiques associés au traitement, sur des échantillons adéquats prélevés dans les principales régions du cerveau [par exemple bulbes olfactifs, cortex cérébral, hippocampe, noyaux basaux, thalamus, hypothalamus, mésencéphale (tectum, calotte, pédoncules cérébraux), pont, bulbe rachidien, cervelet], en s'efforçant de procéder à un examen exhaustif. Il est important que les coupes soient prélevées dans le même plan sur tous les animaux. Sur les adultes humainement sacrifiés à la fin de l'étude, il faut prélever des sections représentatives de la moelle épinière et du SNP. Les zones étudiées doivent comprendre l'œil avec le nerf optique et la rétine, la moelle épinière au niveau des renflements cervicaux et lombaires, les fibres de la chaîne dorsale et ventrale, le nerf sciatique proximal, le nerf tibial proximal (au niveau du genou), et les ramifications du nerf tibial au niveau des muscles du mollet. La moelle épinière et les nerfs périphériques doivent être représentés par des sections transversales et longitudinales.

44.   L'évaluation neuropathologique doit comprendre un examen permettant de détecter des indices de dommages affectant le développement du système nerveux (6) (85) (86) (87) (88) (89), en plus des altérations cellulaires (par exemple vacuolisation neuronale, dégénérescence, nécrose) et des modifications tissulaires (par exemple gliose, infiltration leucocytaire, formation de kystes). À cet égard, il est important de distinguer les effets liés au traitement des événements normaux du développement qui surviennent habituellement au stade correspondant au moment du sacrifice (90). Quelques exemples d'altérations significatives, indicatrices d'effets préjudiciables au développement sont cités ci-dessous:

—	modification des dimensions ou de la forme des bulbes olfactifs, des hémisphères cérébraux ou du cervelet au niveau macroscopique,

—

modification des dimensions relatives des diverses régions du cerveau, notamment augmentations ou diminutions de la taille des régions s'expliquant par une perte ou une persistance de populations normalement transitoires de cellules ou de projections axoniques (par exemple couche germinale externe du cervelet, corps calleux),

—

modifications de la prolifération, de la migration, et de la différentiation, révélées par des zones d'apoptose ou nécrose excessives, de populations groupées ou dispersées de neurones ectopiques, désorientés ou malformés ou d'altérations des dimensions relatives des diverses couches de structures corticales,

—	modifications des modèles de myélinisation, notamment réduction de la taille globale ou modification de la coloration des structures myélinisées,

—	signe d'hydrocéphalie, en particulier grossissement des ventricules, sténose de l'aqueduc de Sylvius et amincissement des hémisphères cérébraux.

Analyse de la relation dose-réponse des altérations neuropathologiques

45.   Le protocole suivant est recommandé pour les analyses neuropathologiques qualitatives et quantitatives. Il s'agit d'un protocole par étapes. Premièrement, on compare des coupes du groupe de dose la plus élevée avec celles du groupe témoin. En l'absence d'observations d'altérations neuropathologiques chez les animaux du groupe de dose élevée, aucune autre analyse n'est requise. Si des preuves d'altérations neuropathologiques sont notées dans ce groupe, les animaux des groupes de doses intermédiaire et faible sont examinés. Si l'étude sur le groupe de dose élevée est interrompue par le décès ou l'observation d'une toxicité parasite sur les animaux, il faut rechercher dans les groupes de dose élevée et intermédiaire des altérations neuropathologiques. Si l'on détecte des signes de neurotoxicité dans les groupes de doses inférieures, il convient de mener l'analyse neuropathologique dans ces groupes. Pour toute altération neuropathologique liée au traitement, observée lors des examens qualitatifs ou quantitatifs, il faudra déterminer la nature dose-dépendante de l'incidence, de la fréquence et du degré de gravité des lésions ou des altérations morphométriques, en se basant sur une évaluation de tous les animaux de tous les groupes de doses. Toutes les régions du cerveau présentant un signe quelconque d'altération neuropathologique doivent être incluses dans cette évaluation. Il conviendra, pour chaque type de lésion, de décrire les caractéristiques choisies pour définir les différents degrés de gravité, en indiquant les critères employés pour différencier chaque degré. La fréquence de chaque type de lésion et son degré de gravité doivent être enregistrés et une analyse statistique permettra d'évaluer la nature de la relation dose-réponse. L'utilisation de lames codées est recommandée (91).

RÉSULTATS ET RAPPORTS

Résultats

46.   Les données doivent être rapportées individuellement et résumées sous forme de tableau, présentant pour chaque groupe d'essai les types de modification et le nombre de mères, de descendants par sexe et de portées présentant chaque type de modification. Dans le cas d'une exposition postnatale des petits, la voie, la durée et la période d'exposition doivent être indiquées.

Évaluation et interprétation des résultats

47.   L'objectif d'une étude de neurotoxicité développementale est de fournir des informations sur les effets d'une exposition répétée à une substance pendant le développement in utero et postnatal précoce. L'étude est axée tant sur la toxicité générale que sur les effets neurotoxiques sur le développement, et c'est pourquoi les résultats de l'étude devront permettre de distinguer les effets neurodéveloppementaux qui apparaissent en l'absence de toxicité maternelle générale de ceux qui ne sont exprimés qu'à des doses également toxiques pour la mère. La complexité des interrelations entre le modèle de l'étude, l'analyse statistique et la signification biologique des résultats exige l'avis d'un expert pour assurer une interprétation correcte des données de neurotoxicité pour le développement (107) (109). L'interprétation des résultats de l'essai observera une approche basée sur le poids de la preuve (20) (92) (93) (94). Il conviendra de discuter les types d'effets comportementaux ou morphologiques observés, s'ils existent, ainsi que les preuves d'une relation dose-réponse. Cette caractérisation doit inclure les données issues de toutes les études d'évaluation de la neurotoxicité pour le développement, en particulier des études épidémiologiques sur l'homme ou des rapports d'études de cas et des études sur animaux expérimentaux (par exemple données toxicocinétiques, informations sur la relation structure-activité, données issues d'autres études de toxicité). Cela comprend aussi les relations entre les doses de la substance d'essai et la présence ou l'absence, l'incidence et l'ampleur d'effets neurotoxiques, quels qu'ils soient, sur chaque sexe (20) (95).

48.   L'évaluation des résultats comprendra une discussion analysant la signification biologique et la signification statistique. L'analyse statistique doit être considérée comme un outil orientant l'interprétation des données sans la déterminer totalement. Une signification statistique ne permet pas de conclure à elle seule, si elle est nulle, à l'absence d'effet lié au traitement, ni, si elle est positive, à un effet lié au traitement. Afin de se prémunir contre l'observation d'éventuels faux négatifs et contre les difficultés inhérentes à la “démonstration d'un résultat négatif”, il conviendra d'inclure dans la discussion des données de témoins positifs et historiques, en particulier dans le cas d'absence d'effets liés au traitement (102) (106). La probabilité d'obtention de faux positifs doit faire l'objet d'une analyse dans le cadre de l'évaluation statistique générale des résultats (96). L'évaluation doit inclure, le cas échéant, la relation entre les altérations neuropathologiques et comportementales observées.

49.   Tous les résultats devront être analysés en utilisant des modèles statistiques adaptés au protocole expérimental (108). Le choix d'une analyse paramétrique ou non paramétrique doit être justifié en tenant compte de facteurs tels que la nature des données (transformées ou non) et leur distribution, mais aussi de la robustesse relative de l'analyse statistique utilisée. Le choix des analyses statistiques doit être guidé par l'objectif et le modèle de l'étude de façon à limiter autant que possible les erreurs de type I (faux positifs) et de type II (faux négatifs) (96) (97) (104) (105). Si les études sur le développement font appel à des espèces multipares dans lesquelles plusieurs petits par portée sont soumis à l'essai, la portée doit être incluse dans le modèle statistique pour éviter l'accroissement des taux d'erreurs de type I (98) (99) (100) (101). L'unité statistique de la mesure doit alors être la portée et non le petit. Les modèles expérimentaux doivent éviter le traitement d'individus de la même portée dans des observations indépendantes. Des effets mesurés à plusieurs reprises sur le même sujet, quels qu'ils soient, doivent être analysés à l'aide de modèles statistiques qui tiennent compte de la non-indépendance de ces mesures.

Rapport d'essai

50.   Le rapport d'essai doit comporter les informations ci-après:

Substance d'essai

—	Nature physique et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques

—	Données permettant son identification, notamment source

—	Pureté de la préparation, et impuretés connues et/ou probables

Véhicule (le cas échéant)

—	Justification du choix du véhicule, s'il ne s'agit ni d'eau ni d'une solution saline physiologique

Animaux expérimentaux

—	Espèces et souches utilisées, et justification si choix d'une autre espèce que le rat

—	Fournisseur des animaux expérimentaux

—	Nombre, âge au début de l'essai, et sexe des animaux

—	Source, conditions d'hébergement, régime alimentaire, eau, etc.

—	Poids de chaque animal au début de l'essai

Conditions expérimentales

—	Justification du choix des doses

—	Justification de la voie et de la période d'administration

—	Précisions sur les doses administrées, notamment détails sur le véhicule, le volume et la forme physique de la substance administrée

—	Précisions sur la formulation de la substance d'essai et la préparation des aliments, concentration finale, stabilité et homogénéité de la préparation

—	Méthode utilisée pour l'identification individuelle des mères et des descendants

—	Description détaillée du ou des protocoles de randomisation employés pour affecter les mères aux groupes de traitement, pour sélectionner les petits éliminés de la portée, et affecter les petits aux groupes d'essai

—	Précisions sur l'administration de la substance d'essai

—	Conversion de la concentration (ppm) de la substance d'essai dans les aliments, l'eau de boisson ou le dispositif d'inhalation en dose réelle (mg/kg de masse corporelle/jour), si possible

—	Conditions environnementales

—	Précisions sur la qualité des aliments et de l'eau (par exemple eau du robinet, eau distillée)

—	Dates de début et de fin de l'étude

Observations et protocoles d'essai

—	Description détaillée des protocoles utilisés pour standardiser les observations et les protocoles, avec définitions utilisées pour la notation des observations

—	Liste de tous les protocoles d'essai utilisés, et justification de leur choix

—	Précisions sur les protocoles d'études comportementales et fonctionnelles, pathologiques, neurochimiques ou électrophysiologiques employés, y compris des informations et des détails sur les appareils automatiques

—	Protocoles d'étalonnage et de vérification de l'équivalence des appareils et de répartition équilibrée des groupes de traitement dans les protocoles d'essai

—	Brève justification explicitant toutes les décisions impliquant une appréciation professionnelle

Résultats (individuels et globaux, avec moyenne et variance, le cas échéant)

—	Nombre d'animaux au début de l'étude et nombre à la fin de l'étude

—	Nombre d'animaux et de portées utilisés pour chaque méthode d'essai

—	Numéro d'identification de chaque animal et de la portée à laquelle il appartient

—	Effectif de la portée et poids moyen à la naissance par sexe

—	Résultats de poids corporel et de variation du poids corporel, y compris poids corporel final pour les mères et les petits

—	Données sur la consommation d'aliments et la consommation d'eau, s'il y a lieu (par exemple si la substance d'essai est administrée par l'intermédiaire de l'eau)

—	Résultat de réponse toxique par sexe et dose, notamment signes de toxicité ou de mortalité, y compris le moment et la cause du décès, le cas échéant

—	Nature, gravité, durée, jour de la survenue, moment de la journée, et évolution ultérieure des observations cliniques détaillées

—	Notation de chaque marqueur du développement (poids, maturité sexuelle et ontogénie comportementale) à chaque moment d'observation

—	Description détaillée de toutes les observations de comportement, fonctionnelles, neuropathologiques, neurobiologiques, électrophysiologiques par sexe, y compris augmentations et diminutions par rapport au témoin

—	Observations à l'autopsie

—	Poids des cerveaux

—	Tout diagnostic, déduit des signes et des légions neurologiques, y compris les maladies ou les conditions naturelles

—	Images des observations représentatives

—	Images à faible grossissement permettant d'évaluer l'homologie des coupes utilisées pour la morphométrie

—	Données d'absorption et de métabolisme, notamment données complémentaires issues d'une étude toxicocinétique séparée, si elle est disponible

—	Traitement statistique des résultats, notamment modèles statistiques employés pour analyser les données, et résultats, qu'ils soient significatifs ou non

—	Liste du personnel impliqué dans l'étude, mentionnant leur formation professionnelle

Discussion des résultats

—	Information sur la relation dose-réponse, par sexe et groupe

—	Lien entre chaque effet toxique et la conclusion proposée sur le potentiel neurotoxique de la substance d'essai, par sexe et groupe

—	Répercussions de toutes les informations toxicocinétiques sur les conclusions

—	Similitudes des effets observés avec ceux de tous les neurotoxiques connus

—	Données démontrant la fiabilité et la sensibilité de la méthode de l'essai (c'est-à-dire résultats des témoins positifs et historiques)

—	Relations éventuelles entre les effets neuropathologiques et fonctionnels

—	CSENO ou dose de référence pour les mères et les petits, par sexe et groupe

Conclusions

—	Discussion sur l'interprétation générale fondée sur les résultats, incluant une conclusion indiquant si la substance chimique d'essai est responsable ou non d'une neurotoxicité pour le développement, et indiquant la CSENO

BIBLIOGRAPHIE

(1)

OCDE (1995), Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity, Copenhague, Danemark, 13-14 juin 1995.

(2)

US EPA (1998), Lignes directrices d'essai de l'Agence des États-Unis pour la protection de l'environnement, OPPTS 870.6300, Developmental Neurotoxicity Study, US EPA 712-C-98-239, disponible à l'adresse suivante: http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/

(3)

US EPA (1998), Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment, US EPA 630/R-95/001F, disponible à l'adresse suivante: http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479

(4)

Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., et Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects, Environ. Health Perspect., 109:79-91.

(5)

Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., et Mileson, B.E. (2001), Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations, Environ. Health Perspect., 109:101-111.

(6)

Garman, R.H., Fix, A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001), Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology, Environ. Health Perspect., 109:93-100.

(7)

OCDE (2003), Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing, Washington DC, US, 23-25 octobre 2000.

(8)

OCDE (2008), OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, no 43, Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment, direction de l'environnement, OCDE, Paris, juillet 2008, disponible à l'adresse suivante: http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage=en

(9)

OCDE (2003), OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, No. 20, Guidance Document for Neurotoxicity Testing, Direction de l'environnement, OCDE, Paris, septembre 2003, disponible à l'adresse suivante: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html

(10)

Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990), Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity, Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11)

Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000), Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12)

Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002), Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits, Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

(13)

Slikker, W.B., et Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14)

Chapitre B.34 de la présente annexe, “Étude de toxicité pour la reproduction sur une génération”.

(15)

Chapitre B.35 de la présente annexe, “Étude de toxicité pour la reproduction sur deux générations”.

(16)

Chapitre B.43 de la présente annexe, “Étude de neurotoxicité chez les rongeurs”.

(17)

Chapitre B.31 de la présente annexe, “Étude de la toxicité pour le développement prénatal”.

(18)

Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (JO L 276 du 20.10.2010, p. 33).

(19)

OMS (1986), Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: Centre des publications de l'Organisation mondiale de la santé, USA, disponible à l'adresse suivante: http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm

(20)

OMS (2001), Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches (Environmental Health Criteria 223), publications de l'Organisation mondiale de la santé, Genève, disponible à l'adresse suivante: http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm

(21)

Chang, L.W., et Slikker, W. (1995), Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22)

De Cabo, C., et Viveros, M.P. (1997), Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders, Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

(23)

Agnish, N.D., et Keller, K.A. (1997), The rationale for culling of rodent litters, Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

(24)

Avery, D.L., et Spyker, J.M. (1977), Foot tattoo of neonatal mice, Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25)

Wier, P.J., Guerriero, et F.J., Walker, R.F. (1989), Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity, Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

(26)

Spear, N.E., et Campbell, B.A. (1979), Ontogeny of Learning and Memory, ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27)

Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., et Smotherman, W. (1987), Perinatal Development: A Psychobiological Perspective, Academic Press, Orlando.

(28)

Zoetis, T., et Walls, I. (2003), Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington DC.

(29)

Moser, V., Walls, I., et Zoetis, T. (2005), Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group, Int. J. Toxicol., 24:87-94.

(30)

Conolly, R.B., Beck, B.D., et Goodman, J.I. (1999), Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment, Toxicol. Sci., 49: 1-4.

(31)

ICH (1993), ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A), International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32)

Lochry, E.A. (1987), Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations, J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

(33)

Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., et Tanimura, T. (1998), Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan, Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

(34)

Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., et Reynolds, V.L. (1999), Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights, Reprod. Toxicol., 13:383-390.

(35)

Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., et Parks, L. (2000), Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat, Toxicol. Sci., 58:350-365.

(36)

Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., et Nelson, B.K. (1985), Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure, Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

(37)

Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., et Weiner, R.W. (1977), Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat, Biol. Reprod., 17:298-303.

(38)

Spear, L.P. (1990), Neurobehavioral assessment during the early postnatal period, Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

(39)

Altman, J., et Sudarshan, K. (1975), Postnatal development of locomotion in the laboratory rat, Anim. Behav., 23:896-920.

(40)

Adams, J. (1986), Methods in Behavioral Teratology, in Handbook of Behavioral Teratology, Riley, E.P., et Vorhees, C.V. (eds) Plenum Press, New York, p. 67-100.

(41)

Reiter, L.W., et MacPhail, R.C. (1979), Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing, Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

(42)

Robbins, T.W. (1977), A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., et Snyder, S.H., (eds), Plenum Press, New York, p. 37-82.

(43)

Crofton, K.M., Peele, D.B., et Stanton, M.E. (1993), Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat, Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

(44)

Ruppert, P.H., Dean, K.F., et Reiter, L.W. (1985), Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes, Dev. Psychobiol., 18:247-260.

(45)

Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., et MacPhail, R.C. (1991), Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments, Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

(46)

Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., et Carr, G. J. (1997), Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats, Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

(47)

Handley, D.E., Ross, J.F., et Carr, G.J. (1998), A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals, Physiol. Behav., 64:661-669.

(48)

Edwards, P.M., et Parker, V.H. (1977), A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats, Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

(49)

Davis, M. (1984), The mammalian startle response, in Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, p. 287-351.

(50)

Koch, M. (1999), The neurobiology of startle, Prog. Neurobiol., 59:107-128.

(51)

Crofton, K.M. (1992), Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction, in Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., et Mitchell, C. (eds), Raven Press, New York, p. 181-211.

(52)

Crofton, K.M., et Sheets, L.P. (1989), Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response, J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

(53)

Crofton, K.M, Lassiter, T.L, et Rebert, C.S. (1994), Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit, Hear, Res., 80:25-30.

(54)

Ison, J.R. (1984), Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure, Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55)

Mattsson, J.L., Boyes, W.K., et Ross, J.F. (1992), Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes, in Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., et Mitchell, C., (eds), Raven Press, New York, p. 125-145.

(56)

Peele, D.B., Allison, S.D., et Crofton, K.M. (1990), Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile, Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

(57)

Bammer, G. (1982), Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results, Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

(58)

Bushnell, P.J. (1988), Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats, Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

(59)

Green, R.J., et Stanton, M.E. (1989), Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat, Behav. Neurosci., 103:98-105.

(60)

Kucharski, D., et Spear, N.E. (1984), Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat, Develop. Psychobiol., 17:465-479.

(61)

Morris, R. (1984), Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat, J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

(62)

Brandeis, R., Brandys, Y., et Yehuda, S. (1989), The use of the Morris water maze in the study of memory and learning, Int. J. Neurosci., 48:29-69.

(63)

D'Hooge, R., et De Deyn, P.P. (2001), Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory, Brain Res. Rev, 36:60-90.

(64)

Vorhees, C.V. (1987), Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin, Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

(65)

Vorhees, C.V. (1997), Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins, Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

(66)

Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., et Sakaguchi, T. (1988), Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly, Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

(67)

Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., et Cox, C. (1983), Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration, Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

(68)

Campbell, B.A., et Haroutunian, V. (1981), Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding, J. Gerontol., 36:338–341.

(69)

Fix, A.S, et Garman, R.H. (2000), Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system, Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

(70)

Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., et Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington DC, p. 84-107.

(71)

Bancroft, J.D., et Gamble, M. (2002), Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72)

Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., et Switzer, R.C. (1996), Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex, Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

(73)

Schmued, L.C., et Hopkins, K.J. (2000), Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration, Brain Res., 874:123-130.

(74)

Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., et Wurmlin, C.H. (2001), Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain, Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

(75)

De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., et de Olmos de Lorenzo, S. (1994), Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma, Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

(76)

De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., et Gundersen, H.J. (2005a), Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives, Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

(77)

De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., et Gundersen, H.J. (2005b), 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity, Reprod. Toxicol., 20:417-432.

(78)

Rodier, P.M., et Gramann, W.J. (1979), Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period, Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79)

Howard, C.V., et Reed, M.G. (1998), Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80)

Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998), Stereology: A practical primer for neuropathology, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57:305-310.

(81)

Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., et Møller, A. (1993), Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method, Brain Res., 609:262-268.

(82)

Schmitz, C. (1997), Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology, J. Neurocytol., 26:707-710.

(83)

West, M.J. (1999), Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias, Trends Neurosci., 22:51-61.

(84)

Schmitz, C., et Hof, P.R. (2005), Design-based stereology in neuroscience, Neuroscience, 130:813-831.

(85)

Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., et Rodier, P.M. (1994), Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM), Teratology, 49:113-121.

(86)

Ohno, M., Aotani, H., et Shimada, M. (1995), Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum, Develop. Brain Res., 84:294-298.

(87)

Jensen KF, et Catalano SM. (1998), Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology, in Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., et Chang, L.W. (eds), Academic Press, New York, p. 3-41.

(88)

Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., et Olney, J.W. (1999), Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain, Science, 283:70-74.

(89)

Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., et Olney, J.W. (2000), Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome, Science, 287:1056–1060.

(90)

Friede, R. L. (1989), Developmental Neuropathology, 2nd edition, Springer-Verlag, Berlin.

(91)

House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., et Simmons, J.E. (1992), Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions, Toxicol. Let., 63:127-133.

(92)

Tilson, H.A., MacPhail, R.C., et Crofton, K.M. (1996), Setting exposure standards: a decision process, Environ. Health Perspect., 104:401-405.

(93)

US EPA (2005), Guidelines for Carcinogen Risk Assessment, US EPA NCEA-F-0644A.

(94)

US EPA (1996), Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register, 61(212): 56274-56322.

(95)

Danish Environmental Protection Agency (1995), Neurotoxicology, Review of Definitions, Methodology and Criteria, Miljøprojekt nr. 282, Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., et Arlien-Søborg, P.

(96)

Muller, K.E., Barton, C.N., et Benignus, V.A. (1984), Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments, Neurotoxicology, 5:113-126.

(97)

Gad, S.C. (1989), Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology, J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

(98)

Abby, H., et Howard, E. (1973), Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring, Dev. Psychobiol., 6:329-335.

(99)

Haseman, J.K., et Hogan, M.D. (1975), Selection of the experimental unit in teratology studies, Teratology, 12:165-172.

(100)

Holson, R.R., et Pearce, B. (1992), Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species, Neurotoxicol. Teratol., 14:221-228.

(101)

Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., et Adams, J. (1985), Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach, Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

(102)

Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., et Raffaele, K.C. (2004), A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies, Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

(103)

Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), A 'best practices' approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today, Toxicol. Pathol., 34:296-313.

(104)

Tamura, R.N., et Buelke-Sam, J. (1992), The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies, Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

(105)

Tukey, J.W., Ciminera, J.L., et Heyse, J.F. (1985), Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug, Biometrics, 41:295-301.

(106)

Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., et Parker, S.P. (2008), Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints, Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

(107)

Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., et Sobrian, S.K. (2008), Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints, Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

(108)

Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., et Phang, W. (2008), Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints, Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

(109)

Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., et Sobotka, T.J. (2008), Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints, Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

Figure 1

Schéma général des essais fonctionnels et comportementaux, de l'évaluation neuropathologique et de la mesure des poids des cerveaux. Ce diagramme s'appuie sur la description présentée dans les paragraphes 13-15 (JAN = jour après la naissance). Des exemples de répartition des animaux sont donnés dans l'appendice 1

B.54.   BIOESSAI UTÉROTROPHIQUE CHEZ LES RONGEURS: ESSAI DE DÉPISTAGE À COURT TERME DES PROPRIÉTÉS ŒSTROGÉNIQUES

INTRODUCTION

1.   La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice pour les essais de produits chimiques no 440 (2007) de l'OCDE. L'OCDE a lancé, en 1998, une activité à caractère hautement prioritaire destinée à réviser les lignes directrices existantes et à établir une nouvelle ligne directrice concernant le dépistage des substances susceptibles d'avoir des effets perturbateurs sur le système endocrinien (1). L'un des éléments de cette activité a été de développer une ligne directrice relative au bioessai utérotrophique chez le rongeur. Le bioessai utérotrophique chez le rongeur a donc fait l'objet d'un programme de validation très complet comprenant l'établissement d'un document de référence détaillé (2) (3) et la conduite d'études intra- et interlaboratoires très complètes, destinées à montrer la pertinence et la reproductibilité du bioessai réalisé avec un puissant œstrogène de référence, des agonistes faibles des récepteurs œstrogéniques, un puissant antagoniste des récepteurs œstrogéniques, et une substance chimique de référence négative (4) (5) (6) (7) (8) (9). La présente méthode d'essai B.54 a été établie à la lumière de l'expérience acquise durant le programme de validation de l'essai et des résultats obtenus concernant les agonistes des œstrogènes.

2.   Le bioessai utérotrophique est un essai de dépistage à court terme qui remonte aux années 30 (27) (28) et qui a été normalisé pour la première fois en 1962 aux fins du dépistage par une commission d'experts (32) (35). Cet essai se fonde sur l'augmentation du poids utérin, encore appelée réponse utérotrophique (voir 29). Il évalue la capacité d'une substance chimique à provoquer une activité biologique analogue à celle des agonistes ou antagonistes des œstrogènes naturels (17ß-estradiol par exemple), mais il est toutefois beaucoup plus rarement utilisé pour la détection d'antagonistes que d'agonistes. L'utérus réagit aux œstrogènes de deux façons. La réponse initiale est un accroissement pondéral dû à l'absorption d'eau. Cette réaction est suivie par une augmentation du poids due à la croissance tissulaire (30). La réaction de l'utérus chez le rat et la souris est qualitativement comparable.

3.   Ce bioessai sert de test de dépistage in vivo et son application doit être envisagée dans le contexte du “Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens” (appendice 2). Dans ce cadre conceptuel, le bioessai utérotrophique intervient au niveau 3 en tant qu'essai in vivo fournissant des données sur un seul mécanisme endocrinien, à savoir le pouvoir œstrogénique.

4.   Le bioessai utérotrophique est censé faire partie d'une batterie d'essais in vitro et in vivo destinés à identifier les substances susceptibles d'agir sur le système endocrinien, pour permettre à terme d'évaluer les risques pour la santé humaine ou l'environnement. Le programme de validation de l'OCDE a utilisé des agonistes œstrogéniques puissants et faibles pour évaluer l'aptitude de l'essai à identifier les composés œstrogéniques (4) (5) (6) (7) (8). La sensibilité de la procédure d'essai aux agonistes œstrogéniques a pu ainsi être démontrée, de même que sa bonne reproductibilité intra- et interlaboratoire.

5.   En ce qui concerne les substances chimiques négatives, seule une substance chimique de référence “négative” déjà identifiée comme telle par l'essai utérotrophique et les essais in vitro de liaison avec les récepteurs a été incluse dans le programme de validation, mais des données complémentaires, extérieures au programme de validation de l'OCDE, ont été évaluées, et ont confirmé la spécificité du bioessai utérotrophique pour le dépistage d'agonistes des œstrogènes (16).

CONSIDÉRATIONS INITIALES ET LIMITATIONS

6.   Les agonistes et antagonistes des œstrogènes agissent comme ligands des récepteurs œstrogéniques α et β et peuvent respectivement activer ou inhiber l'activité transcriptionnelle des récepteurs. Cela peut avoir des conséquences négatives pour la santé, notamment des effets sur la reproduction et le développement. Il est donc nécessaire d'évaluer rapidement les substances chimiques pour déterminer leur éventuelle activité agoniste ou antagoniste des œstrogènes. Bien qu'instructive, l'affinité d'un ligand et d'un récepteur œstrogénique ou l'activation transcriptionnelle des gènes rapporteurs in vitro ne représente qu'un déterminant, parmi plusieurs, d'un danger possible. Les autres facteurs déterminants peuvent être l'activation et la désactivation métaboliques lors de l'entrée dans l'organisme, la distribution entre les tissus cibles et l'élimination de l'organisme, qui dépendent, au moins en partie, de la voie d'administration et de la substance d'essai. Il est par conséquent nécessaire de dépister l'activité éventuelle d'une substance chimique in vivo dans des conditions appropriées, sauf si les caractéristiques ADME (absorption, distribution, métabolisme, élimination) de la substance chimique fournissent déjà les informations indispensables. Les tissus utérins réagissent aux œstrogènes par une croissance rapide et vigoureuse, notamment chez les rongeurs de laboratoire, dont le cycle œstral dure environ 4 jours. Les rongeurs, en particulier le rat, sont aussi largement utilisés dans les études de toxicité pour caractériser les dangers. En conséquence, l'utérus des rongeurs est un organe cible approprié pour le dépistage in vivo des agonistes et antagonistes des œstrogènes.

7.   La présente méthode d'essai s'appuie sur les protocoles employés dans l'étude de validation de l'OCDE qui se sont révélés fiables et reproductibles dans les études intra- et interlaboratoires (5) (7). À l'heure actuelle deux méthodes sont disponibles, l'une utilisant des femelles adultes ovariectomisées (méthode adulte-ovx) et l'autre, des animaux immatures, non ovariectomisés (méthode immature). Le programme de validation des essais de l'OCDE a montré que la sensibilité et la reproductibilité de ces deux méthodes étaient comparables. Cependant, la méthode sur des femelles immatures, dont l'axe hypothalamo-pituito-gonadique (HPG) est intact, est peut-être moins spécifique mais couvre un plus large champ d'investigation que celle pratiquée sur des animaux ovariectomisés, parce qu'elle est sensible à des substances qui interagissent avec l'axe HPG et non pas uniquement avec les récepteurs aux œstrogènes. L'axe HPG de la rate est fonctionnel à partir d'environ 15 jours après la naissance. Avant cet âge, la puberté ne peut pas être accélérée par des traitements comme la GnRH. À l'approche de la puberté, avant l'ouverture du vagin, la femelle a plusieurs cycles silencieux sans ouverture vaginale ni ovulation, mais qui se manifestent par certaines fluctuations hormonales. Si une substance chimique stimule l'axe HPG directement ou indirectement durant cette période, on assiste à une puberté précoce, une ovulation précoce ou une ouverture vaginale accélérée. Les substances chimiques agissant sur l'axe HPG produiront cet effet, mais également certains régimes à niveaux d'énergie métabolisable plus élevés que les autres stimuleront la croissance et accéléreront l'ouverture vaginale sans être œstrogéniques. Ces substances n'induiront pas de réponse utérotrophique chez les animaux adultes ovariectomisés puisque leur axe HPG ne fonctionne pas.

8.   Dans un souci de protection des animaux, on privilégiera la méthode pratiquée sur des rates immatures pour éviter le prétraitement chirurgical des animaux et le risque de ne pas pouvoir utiliser les animaux manifestant des signes de préœstrus (voir le paragraphe 30).

9.   La réponse utérotrophique n'est pas entièrement d'origine œstrogénique, d'autres substances chimiques que les agonistes ou antagonistes des œstrogènes peuvent aussi intervenir. Par exemple, des doses relativement élevées de progestérone, de testostérone ou de diverses progestines synthétiques peuvent aussi induire une stimulation (30). Toutes les réactions peuvent faire l'objet d'une analyse histologique indiquant une kératinisation et une cornification du vagin (30). Indépendamment de l'origine possible de la réponse, tout bioessai utérotrophique positif doit normalement donner lieu à des recherches plus poussées, permettant d'apporter des clarifications. Le pouvoir œstrogénique peut être confirmé par des essais in vitro, notamment par des essais de liaison avec les récepteurs ER et des essais d'activation transcriptionnelle, ou par d'autres essais in vivo, notamment l'essai de puberté chez les femelles.

10.   Sachant que le bioessai utérotrophique sert d'essai de dépistage in vivo, la méthode de validation adoptée a pris en compte le bien-être des animaux et retenu une stratégie d'essai par étapes. À cette fin, des efforts ont été déployés pour valider de façon rigoureuse la reproductibilité et la sensibilité du dépistage du pouvoir œstrogénique (problème majeur pour beaucoup de substances chimiques), mais peu de travaux ont été consacrés à la composante antiœstrogénique de l'essai. Un seul antiœstrogène, puissant, a été testé, étant donné que le nombre de substances chimiques possédant un profil clairement antiœstrogénique (qui ne soit pas masqué par une activité œstrogénique) est très limité. En conséquence, la présente méthode d'essai est dédiée au protocole œstrogénique, tandis que le protocole décrivant le mode antagoniste de l'essai figure dans un document d'orientation (37). La reproductibilité et la sensibilité de l'essai pour les substances chimiques ayant une activité purement antiœstrogénique seront mieux définies ultérieurement, lorsque la procédure d'essai aura été utilisée de façon routinière pendant assez longtemps et que davantage de substances présentant ce mode d'action auront été identifiées.

11.   Il est reconnu que toutes les procédures faisant appel à des animaux respecteront les normes locales en matière de bien-être animal; les descriptifs des soins et traitements figurant ci-après constituent donc des normes minimales auxquelles se substitueront les réglementations locales telles que la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (38). D'autres orientations relatives au traitement humain des animaux ont été formulées par l'OCDE (25).

12.   Comme dans tous les essais faisant appel à des animaux vivants, il est indispensable de s'assurer que les données sont réellement nécessaires avant de commencer l'essai. À titre d'exemple, des données peuvent être réellement nécessaires dans les deux situations suivantes:

—	risque d'exposition élevé (niveau 1 du Cadre conceptuel, appendice 2 du présent chapitre) ou éléments indiquant un pouvoir œstrogénique (niveau 2), d'où nécessité d'étudier si ces effets peuvent se produire in vivo,

—	effets témoignant d'un pouvoir œstrogénique aux niveaux 4 et 5 dans les essais in vivo, d'où nécessité de démontrer que les effets sont liés à un mécanisme œstrogénique qui ne peut être mis en évidence dans les essais in vitro.

13.   La définition des termes utilisés dans la présente méthode d'essai figure à l'appendice 1.

PRINCIPE DE L'ESSAI

14.   La sensibilité du bioessai utérotrophique exige un dispositif d'essai dans lequel l'axe hypothalamo-pituito-ovarien n'est pas fonctionnel, d'où de faibles niveaux d'œstrogènes endogènes en circulation. Cela garantira un poids utérin de référence peu élevé et le plus large éventail possible de réponses aux œstrogènes administrés. Les rongeurs femelles remplissent ces conditions dans deux cas:

i)	femelles immatures, après sevrage et avant la puberté;

ii)	jeunes femelles adultes ovariectomisées, passé le délai nécessaire à la régression des tissus utérins

15.   La substance d'essai est administrée chaque jour par gavage oral ou injection sous-cutanée. Des doses modulées de la substance d'essai sont administrées à au moins deux groupes d'animaux (pour plus de précisions voir le paragraphe 33); on applique un niveau de dose par groupe; la période d'administration est de 3 jours consécutifs dans la méthode sur femelles immatures et d'au minimum 3 jours consécutifs dans la méthode sur femelles adultes ovariectomisées. Les animaux sont sacrifiés environ 24 heures après l'administration de la dernière dose. Pour dépister les agonistes des œstrogènes, on mesure le rapport entre le poids utérin moyen des animaux des groupes d'essai et celui des animaux du groupe témoin qui a reçu le véhicule pour déterminer s'il existe une augmentation statistiquement significative. Une augmentation statistiquement significative du poids utérin moyen d'un groupe d'essai indique une réponse positive à ce bioessai.

DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

Sélection de l'espèce animale

16.   Les souches de rongeurs utilisées communément en laboratoire peuvent convenir. Par exemple, les souches de rats Sprague-Dawley et Wistar ont été utilisées pour la validation. Il conviendra de ne pas utiliser les souches pour lesquelles on sait ou on suspecte que l'utérus est moins réactif. Le laboratoire doit démontrer la sensibilité de la souche utilisée comme indiqué aux paragraphes 26 et 27.

17.   Depuis les années 30, le rat et la souris sont utilisés de façon routinière pour le bioessai utérotrophique. Les études de validation de l'OCDE ont été effectuées seulement sur des rats, étant entendu que ces deux espèces sont en principe équivalentes et qu'une seule devrait suffire pour la validation mondiale, l'idée étant d'économiser les ressources et de préserver les animaux. L'espèce retenue pour la plupart des études de toxicité pour la reproduction et le développement est le rat. Sachant qu'on dispose d'une riche base de données rétrospectives concernant la souris et, pour élargir le champ d'application de la méthode d'essai relative au bioessai utérotrophique chez les rongeurs, une étude de validation complémentaire limitée a été effectuée sur la souris (16). On a adopté une approche comparative faisant intervenir un nombre limité de substances d'essai et de laboratoires, sans tests d'échantillons codés, de façon à respecter l'intention première d'économiser les ressources et de préserver les animaux. L'étude comparative de validation du bioessai utérotrophique chez la jeune femelle de souris adulte ovariectomisée indique une bonne correspondance qualitative et quantitative des données obtenues chez le rat et chez la souris. Lorsque les résultats du bioessai utérotrophique sont obtenus préalablement à une étude à long terme, cela permet d'utiliser les animaux de la même souche et de la même source dans les deux études. L'approche comparative n'a été utilisée que sur la souris ovariectomisée et l'ensemble de données fournies dans le rapport n'est pas assez solide pour valider le modèle sur la souris femelle immature, c'est pourquoi ce modèle n'entre pas dans le champ d'application de la présente méthode d'essai.

18.   Ainsi, dans certains cas, la souris pourra être utilisée à la place du rat. Ce choix devra être justifié par des données toxicologiques, pharmacocinétiques et/ou par d'autres critères. Il pourra nécessiter certaines modifications du protocole. Par exemple, la consommation alimentaire d'une souris rapportée à son poids corporel est plus élevée que celle d'une rate, c'est pourquoi la quantité de phytœstrogènes contenue dans les aliments devra être plus faible pour la souris que pour le rat (9) (20) (22).

Conditions d'élevage et d'alimentation

19.   Toutes les procédures doivent être conformes aux normes locales relatives à l'entretien des animaux de laboratoire. Les conditions d'entretien et de traitement décrites ici sont des normes minimales et seront remplacées par la réglementation applicable, notamment la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (38). La température du local expérimental doit être de 22 °C (± 3 °C). Le taux d'humidité relative devrait être d'au moins 30 % et, de préférence, ne pas dépasser 70 % en dehors des heures de nettoyage du local. On s'efforcera de maintenir le taux d'humidité entre 50 et 60 %. Un éclairage artificiel est utilisé. La séquence doit être de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.

20.   Les animaux recevront de la nourriture et de l'eau potable à volonté. Les jeunes animaux adultes peuvent être placés dans des cages individuelles ou collectives pouvant contenir jusqu'à 3 individus. Compte tenu de leur jeune âge, les animaux immatures seront de préférence placés dans des cages collectives.

21.   On sait que les aliments pour animaux de laboratoire contenant des niveaux élevés de phytœstrogènes font augmenter le poids utérin chez les rongeurs dans des proportions suffisantes pour interférer avec le bioessai utérotrophique (13) (14) (15). Des taux élevés de phytœstrogènes et d'énergie métabolisable dans la nourriture de laboratoire peuvent aussi induire une puberté précoce si l'on utilise des animaux immatures. La présence de phytœstrogènes résulte principalement de l'inclusion de soja et d'alfalfa dans les mélanges de laboratoire, et il a été constaté que les concentrations de phytœstrogènes variaient selon les lots de mélange standard (23). Le poids corporel est une variable importante, étant donné que la quantité de nourriture consommée lui est corrélée. Par conséquent, la dose de phytœstrogène effectivement consommée avec le même régime peut varier selon les espèces et les âges (9). En ce qui concerne les rats femelles immatures, la consommation alimentaire rapportée au poids corporel peut représenter près du double de celle des jeunes femelles adultes ovariectomisées. Pour les jeunes souris adultes, la consommation alimentaire rapportée au poids corporel peut représenter environ quatre fois celle des jeunes rates adultes ovariectomisées.

22.   Les résultats du bioessai utérotrophique (9) (17) (18) (19) indiquent toutefois que de faibles quantités de phytœstrogènes sont acceptables dans la nourriture et ne réduisent pas la sensibilité du bioessai. À titre indicatif, les quantités de phytœstrogènes dans les aliments ne doivent pas dépasser 350 μg d'équivalents génistéine/gramme de mélange de laboratoire pour les rates immatures Sprague Dawley et Wistar (6) (9). Ce régime devrait aussi convenir pour les essais sur les jeunes rates adultes ovariectomisées, car la consommation de nourriture rapportée au poids corporel est moins importante chez les jeunes adultes que chez les animaux immatures. Si l'on doit utiliser des souris adultes ovariectomisées ou des rates plus sensibles aux phytœstrogènes, il faudra envisager de réduire les niveaux de phytœstrogènes en conséquence (20). De plus, les quantités différentes d'énergie métabolisable dans les différents régimes peuvent décaler le début de la puberté (21) (22).

23.   Avant de commencer l'étude, le régime alimentaire sera soigneusement établi en veillant à éviter les taux élevés de phytœstrogènes [voir (6) (9)] ou d'énergie métabolisable, qui peuvent fausser les résultats (15) (17) (19) (22) (36). Il importe de contrôler ces deux facteurs pour assurer la bonne marche du dispositif d'essai utilisé par le laboratoire conformément aux paragraphes 26 et 27. Par mesure de sécurité et en application des bonnes pratiques de laboratoire, un échantillon représentatif de chaque lot de nourriture administré durant l'étude sera prélevé pour permettre une analyse de la présence de phytœstrogènes (par exemple en cas de poids utérin élevé chez les animaux témoins par rapport aux données précédentes, ou de réponse inadéquate à l'œstrogène de référence, 17α-éthinylestradiol). Les aliquotes doivent être analysées dans le cadre de l'étude ou congelées à – 20 °C ou conservées selon une méthode permettant d'éviter que l'échantillon ne se décompose avant analyse.

24.   Certains types de litières peuvent contenir des substances œstrogéniques ou antiœstrogéniques à l'état naturel (par exemple, on sait que la rafle de maïs influe sur le cycle des rates et pourrait avoir des effets antiœstrogéniques). Le type de litière choisi devra contenir le moins possible de phytœstrogènes.

Préparation des animaux

25.   Les animaux d'expérience, choisis après avoir vérifié qu'ils ne présentent pas de signes de maladie ni d'anomalie physique, sont répartis au hasard entre les groupes traités et le groupe témoin. Les cages doivent être disposées de façon à réduire le plus possible les effets éventuels de leur emplacement. Les animaux sont marqués pour permettre une identification individuelle. Pendant la période d'acclimatation, les animaux immatures doivent être gardés dans des cages avec leurs mères ou d'autres femelles allaitantes jusqu'à ce qu'ils soient sevrés. La période d'acclimatation précédant le début de l'expérience doit durer environ 5 jours pour les jeunes femelles adultes et pour les animaux immatures livrés avec leur mère ou d'autres femelles. Si les animaux immatures sont livrés sans leur mère et déjà sevrés, la période d'acclimatation devra être plus courte puisque l'administration doit commencer immédiatement après le sevrage (voir le paragraphe 29).

PROCÉDURE

Vérification des compétences du laboratoire

26.   Deux options sont possibles pour vérifier les compétences d'un laboratoire:

—

Opérer une vérification périodique, en se référant à une étude initiale de contrôle positif (voir le paragraphe 27). Au moins tous les 6 mois et chaque fois qu'un changement risque d'influer sur les résultats de l'essai (nouvelle formulation du mélange alimentaire, modification du personnel chargé des dissections, changement de souche animale ou de fournisseur, etc.), la sensibilité du dispositif (modèle animal) doit être vérifiée en utilisant une dose adéquate (conformément à l'étude de contrôle positive décrite au paragraphe 27) de l'œstrogène de référence: 17α-éthinylestradiol (no CAS 57-63-6) (EE).

—	Opérer des contrôles concomitants, en incluant un groupe recevant une dose appropriée de l'œstrogène de référence dans chaque essai.

Si le dispositif ne produit pas la réponse attendue, les conditions expérimentales devront être revues et modifiées en conséquence. Pour les deux approches, la dose de l'œstrogène de référence recommandée doit correspondre approximativement à la dose efficace 70 à 80.

27.   Étude de référence — témoin positif: Avant d'effectuer pour la première fois une étude suivant la présente méthode d'essai, chaque laboratoire doit démontrer ses compétences en testant la sensibilité du modèle animal et en établissant la relation dose-effet pour un œstrogène de référence, le 17α-éthinylestradiol (no CAS 57-63-6) (EE) avec au minimum quatre doses. L'effet sur le poids utérin sera comparé aux données historiques attestées [voir référence (5)]. Si l'étude de référence ne donne pas les résultats escomptés, les conditions de l'expérience devront être revues et modifiées.

Nombre et répartition des animaux

28.   Chaque groupe d'essai et de référence doit comprendre au moins 6 animaux (pour les protocoles des méthodes sur femelles immatures et ovariectomisées).

Âge des animaux immatures

29.   Pour le bioessai utérotrophique pratiqué sur des animaux immatures, le jour de la naissance doit être spécifié. L'administration de la substance d'essai doit commencer assez tôt pour faire en sorte que, à la fin de la période d'administration, l'augmentation physiologique des œstrogènes endogènes associée à la puberté n'ait pas commencé. D'un autre côté, il a été constaté que les très jeunes animaux peuvent être moins réactifs. Pour définir l'âge optimal des animaux d'essai, chaque laboratoire doit se reporter à son corpus de données de référence sur la maturation.

En règle générale, le traitement des rats peut commencer immédiatement après un sevrage précoce, au jour 18 après la naissance (le jour de la naissance étant le jour 0). Il doit s'arrêter de préférence au jour 21 après la naissance, mais dans tous les cas avant le jour 25 après la naissance, car, au-delà, l'axe hypothalamo-pituito-ovarien devient fonctionnel et les taux d'œstrogènes endogènes peuvent commencer à augmenter avec accroissement concomitant des poids utérins moyens et augmentation des écarts types (2) (3) (10) (11) (12).

Procédure d'ovariectomie

30.   Dans l'essai sur les rats et les souris femelles ovariectomisées (groupes d'essai et groupes témoins), l'ovariectomie doit être pratiquée entre 6 et 8 semaines d'âge. Chez le rat, 14 jours au minimum doivent s'écouler entre l'ovariectomie et la première administration afin de permettre la régression de l'utérus à un poids minimum de référence stable. Chez la souris, 7 jours au minimum doivent s'écouler entre l'ovariectomie et le premier jour de traitement. Une petite quantité de tissu ovarien suffit à produire des taux élevés d'œstrogènes en circulation (3), c'est pourquoi les animaux doivent être contrôlés avant l'essai, en observant les cellules épithéliales prélevées dans le vagin pendant au moins 5 jours consécutifs (par exemple du 10e au 14e jour après ovariectomie pour les rates). Si les animaux présentent des signes de préœstrus, ils ne doivent pas être utilisés. Ultérieurement, lors de la nécropsie, les moignons ovariens doivent être examinés pour repérer s'il reste du tissu ovarien. Si c'est le cas, les données de l'animal ne doivent pas être prises en compte dans les calculs (3).

31.   L'ovariectomie est opérée sur l'animal couché sur le ventre, qui aura été convenablement anesthésié. La paroi abdominale dorsolatérale est incisée sur environ un centimètre au point médian entre la limite costale inférieure et la crête iliaque, à quelques millimètres de la marge latérale du muscle lombaire. Les ovaires sont extraits de la cavité abdominale, déposés sur un champ aseptique puis détachés au niveau de la jonction de l'oviducte et du corps utérin. Après avoir vérifié qu'aucun saignement important ne se produit, on recoud la paroi abdominale puis la peau est refermée par des autoclips ou par suture. Les points de ligature sont indiqués schématiquement à la figure 1. Une analgésie postopératoire appropriée recommandée par un vétérinaire spécialiste des rongeurs doit être pratiquée.

Poids corporel

32.   Dans la méthode sur animaux adultes ovariectomisés, le poids corporel et le poids utérin ne sont pas corrélés parce que le poids utérin est affecté par des hormones telles que les œstrogènes, mais pas par les facteurs de croissance qui régulent la taille du corps. Dans le modèle sur animaux immatures au contraire, le poids corporel est corrélé au poids utérin, pendant la période de maturation (34). Par conséquent, au début de l'étude, la variation pondérale des animaux utilisés, dans le modèle sur animaux immatures, doit être minimale et ne pas excéder± 20 % du poids moyen. Cela signifie que la taille des portées doit être standardisée par l'éleveur pour garantir que les petits de mères différentes sont nourris sensiblement de la même façon. Les animaux sont répartis de façon aléatoire par groupes (témoin et d'essai), de façon à ce qu'il n'y ait aucune différence statistique entre le poids corporel moyen des différents groupes. Il conviendra d'éviter dans la mesure du possible de mettre plusieurs animaux d'une même portée dans le même groupe de traitement, sans que cela fasse augmenter le nombre de portées nécessaires à l'étude.

Dosage

33.   Deux groupes de dose et un groupe témoin suffisent habituellement pour établir si une substance d'essai peut avoir une action œstrogénique in vivo, et on préférera donc cette méthode pour des raisons de protection des animaux. Si l'objectif est d'obtenir une courbe de la relation dose-effet ou d'extrapoler les résultats à des doses plus faibles, au moins 3 groupes de dose seront nécessaires. Si l'on souhaite obtenir des informations plus poussées sur l'activité œstrogénique (estimation du pouvoir œstrogénique, par exemple), un autre système de dosage devra être envisagé. Exception faite de l'administration de la substance d'essai, les animaux du groupe témoin devront avoir exactement le même traitement que ceux des groupes d'essai. Si un véhicule est utilisé pour administrer la substance d'essai, le groupe témoin doit recevoir la même quantité du véhicule utilisé que les groupes traités (ou le volume le plus important administré si les groupes ne reçoivent pas les mêmes doses).

34.   L'objectif, dans le cas du bioessai utérotrophique, est de choisir des doses qui assurent la survie des animaux et n'entraînent pas de détresse ni d'effets toxiques graves après 3 jours consécutifs d'administration de la substance chimique, jusqu'à une dose maximale de 1 000 mg/kg/j. Tous les niveaux de dose doivent être proposés et sélectionnés à la lumière des données existantes sur la toxicité et le comportement (toxico)-cinétique du composé testé ou des substances de même nature. Le niveau de dose le plus élevé doit être établi tout d'abord en fonction de la DL50 et/ou des informations sur la toxicité aiguë afin d'éviter le décès et la détresse ou la souffrance extrêmes des animaux (24) (25) (26). La dose la plus élevée doit représenter la dose maximale tolérée (MTD); une étude menée avec un niveau de dose ayant induit une réaction utérotrophique positive pourra aussi être acceptée. Pour opérer la sélection, on accepte généralement de larges intervalles entre les dosages (une demi-unité logarithmique, soit un facteur de progression de 3,2 ou même jusqu'à une unité logarithmique). En l'absence de données appropriées, une étude de détermination de l'ordre de grandeur peut être effectuée pour aider à définir les doses qu'il convient d'utiliser.

35.   Autre solution, si l'activité œstrogénique d'un agoniste peut être estimée d'après des données in vitro (ou in silico), celles-ci pourront être prises en considération pour établir les doses. Par exemple, la quantité de substance chimique d'essai qui produira une réaction utérotrophique équivalente à celle de l'agoniste de référence (éthinylestradiol) est estimée d'après son activité évaluée in vitro par rapport à celle de l'éthinylestradiol. La dose d'essai la plus élevée sera obtenue en multipliant cette dose équivalente par un facteur adéquat (10 ou 100, par exemple).

Détermination de l'ordre de grandeur

36.   Le cas échéant, une étude de détermination de l'ordre de grandeur peut être effectuée sur un petit nombre d'animaux. À cet égard, le document d'orientation de l'OCDE no 19 (25) qui définit les signes cliniques indicateurs de toxicité ou de détresse des animaux peut être utilisé. Si cela est réalisable dans le cadre de cette étude de détermination, après 3 jours de traitement, les utérus peuvent être excisés et pesés environ 24 heures après la dernière dose. Ces données peuvent ensuite être utilisées pour mettre au point l'étude principale (définir les doses maximales et minimales acceptables et recommander le nombre de groupes de dose).

Administration des doses

37.   La substance d'essai est administrée par gavage ou injection sous-cutanée. La voie d'administration sera déterminée en tenant compte de considérations relatives au bien-être des animaux, et aux aspects toxicologiques tels que le rapport avec l'exposition humaine à la substance chimique (gavage oral pour une exposition par ingestion, injection sous-cutanée pour une exposition par inhalation ou adsorption cutanée), les propriétés physiques/chimiques de la substance d'essai et surtout les informations toxicologiques existantes et les données sur le métabolisme et le comportement cinétique (par exemple la nécessité d'éviter le métabolisme de premier passage, meilleure efficacité d'une voie d'administration plutôt que d'une autre).

38.   Il est recommandé, chaque fois que cela est possible, d'envisager pour commencer l'utilisation d'une solution/suspension aqueuse. Toutefois, les ligands des récepteurs aux œstrogènes ou leurs précurseurs métaboliques sont généralement hydrophobes, c'est pourquoi on utilise le plus souvent une solution/suspension huileuse (huile de maïs, d'arachide, de sésame ou d'olive). Ces différentes huiles n'ont toutefois pas la même valeur calorique, ni la même teneur en matières grasses, c'est pourquoi le véhicule peut influer sur l'apport total d'énergie métabolisable et peut donc potentiellement modifier les paramètres mesurés, notamment le poids utérin, surtout dans la méthode sur animaux immatures (33). Ainsi, avant de commencer l'étude, le véhicule retenu doit être testé au regard de témoins sans véhicule. Les substances d'essai peuvent être dissoutes dans une quantité minimale d'éthanol à 95 % ou d'autres solvants appropriés, puis diluées dans le véhicule de l'essai aux concentrations finales voulues. Les caractéristiques toxiques du solvant doivent être connues et contrôlées sur un groupe témoin traité uniquement avec le solvant. Si la substance d'essai est considérée comme stable, on peut légèrement chauffer le mélange et le soumettre à une action mécanique vigoureuse pour faciliter sa dissolution. La stabilité de la substance d'essai dans le véhicule doit être déterminée. Si la substance d'essai est stable pendant toute la durée de l'étude, une aliquote de la substance d'essai peut être préparée, après quoi les dilutions spécifiées sont préparées quotidiennement.

39.   Le calendrier d'administration dépend du modèle d'essai (voir le paragraphe 29 pour l'essai sur animaux immatures et le paragraphe 30 pour l'essai sur animaux ovariectomisés). La substance d'essai est administrée quotidiennement aux rates immatures pendant 3 jours consécutifs. Un traitement de 3 jours est également recommandé pour les rates ovariectomisées, mais des expositions plus longues peuvent être aussi acceptées et favoriser la détection de substances faiblement actives. Sur les souris femelles ovariectomisées, 3 jours de traitement doivent suffire et il ne semble pas très intéressant de porter la durée du traitement à 7 jours pour les agonistes d'œstrogènes puissants; toutefois, l'étude de validation n'a pas permis d'établir cette relation pour les œstrogènes de plus faible activité (16), aussi la durée d'administration doit-elle être prolongée jusqu'à 7 jours consécutifs chez les souris ovariectomisées. Le produit doit être administré chaque jour à heure fixe. L'administration doit se faire de façon à maintenir un niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux (mg de substance d'essai par kg de poids corporel par jour). On réduira au minimum la variabilité du volume d'essai par rapport au poids corporel en adaptant les concentrations de façon à obtenir un volume constant par rapport au poids corporel à tous les niveaux de doses et pour toutes les voies d'administration.

40.   Lorsque la substance d'essai est administrée par gavage, les animaux reçoivent une seule dose quotidienne à l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule d'intubation appropriée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l'animal d'essai. Les directives locales d'entretien des animaux doivent être observées, mais le volume ne doit pas excéder 5 ml/kg de poids corporel, sauf dans le cas de solutions aqueuses où l'on pourra utiliser 10 ml/kg de poids corporel.

41.   Lorsque la substance d'essai est administrée par injection sous-cutanée, les animaux reçoivent une seule dose quotidienne. Les doses doivent être injectées dans la région dorso-scapulaire ou lombaire à l'aide d'une aiguille stérile (de calibre 23 ou 25) et d'une seringue tuberculine. Le rasage du site d'injection est facultatif. Toute perte ou fuite au moment de l'injection ou toute administration incomplète doivent être consignées. Le volume total injecté par rate par jour ne doit pas dépasser 5 ml/kg de poids corporel, répartis entre 2 sites d'injection, sauf dans le cas de solutions aqueuses où l'on pourra utiliser 10 ml/kg de poids corporel.

Observations

Observations générales et cliniques

42.   Des observations cliniques générales doivent être effectuées au moins une fois par jour, et plus fréquemment si des signes de toxicité sont constatés. Ces observations doivent être effectuées de préférence chaque jour à la (aux) même(s) heure(s) et en tenant compte du moment où les effets devraient être le plus marqués après l'administration des doses. Tous les animaux sont soumis à des observations pour contrôler la mortalité, la morbidité et les signes cliniques généraux tels que les changements de comportement, les changements au niveau de la peau, du pelage, des yeux et des muqueuses, l'apparition de sécrétions et d'excrétions et les activités végétatives (larmoiement, piloérection, taille des pupilles, respiration inhabituelle, par exemple).

Poids corporel et consommation alimentaire

43.   Tous les animaux doivent être pesés quotidiennement à 0,1 g près, en commençant juste avant le début du traitement c'est-à-dire au moment de la répartition des animaux par groupes. La quantité de nourriture consommée durant la période de traitement peut aussi être mesurée cage par cage en pesant les distributeurs d'aliments. Ces données d'alimentation facultatives doivent être exprimées en grammes par rat par jour.

Dissection et pesage de l'utérus

44.   Vingt-quatre heures après le dernier traitement, les rats sont euthanasiés. Idéalement, le sacrifice est effectué de façon aléatoire entre les groupes pour éviter de faire passer en premier ou en dernier l'un ou l'autre groupe, ce qui pourrait légèrement affecter les données. L'objectif du bioessai est de mesurer le poids des utérus séchés et frais. Le poids frais est celui de l'utérus et du fluide luminal. Le poids “séché” est mesuré après avoir exprimé et éliminé le contenu luminal de l'utérus.

45.   Avant la dissection, le vagin sera contrôlé pour repérer une éventuelle ouverture chez les animaux immatures. La procédure de dissection commence par l'ouverture de la paroi abdominale au niveau de la symphyse pubienne. S'ils sont présents, les cornes utérines et les ovaires sont détachés de la paroi abdominale dorsale. La vessie et les uretères sont dégagés de la face ventrale et latérale de l'utérus et du vagin. Les adhérences fibreuses entre le rectum et le vagin sont libérées jusqu'à ce qu'on repère la jonction de l'orifice vaginal et du périnée. L'utérus et le vagin sont détachés du corps par incision de la paroi vaginale juste au-dessus de la jonction du périnée, comme indiqué à la figure 2. L'utérus doit être détaché du corps en découpant soigneusement le mésentère à son point d'attache sur toute la longueur de la façade dorsolatérale de chaque corne. Après extraction de l'utérus, la manipulation doit être assez rapide pour éviter la dessiccation des tissus. La perte de poids due à la dessiccation devient plus importante avec des tissus minces tels que l'utérus (23). S'ils sont présents, les ovaires sont détachés au niveau de l'oviducte en évitant l'écoulement de fluide luminal de la corne utérine. Si l'animal a été ovariectomisé, les cicatrices seront examinées pour repérer l'éventuelle présence de tissu ovarien. La graisse excédentaire et le tissu conjonctif doivent être éliminés. Le vagin est détaché de l'utérus juste à la base du col de l'utérus pour que celui-ci reste solidaire du corps utérin comme indiqué à la figure 2.

46.   Chaque utérus doit être transféré dans un récipient pesé portant un marquage individuel (boîte de Petri ou nacelle de pesée en plastique) en continuant de veiller à ce qu'il ne se dessèche pas avant la pesée (un filtre papier légèrement imbibé de solution saline peut être placé au fond du récipient). L'utérus et le fluide luminal seront pesés à 0,1 mg près (poids frais).

47.   Chaque utérus sera ensuite traité individuellement pour extraire le fluide luminal. Les deux cornes utérines seront percées ou sectionnées selon un axe longitudinal. L'utérus sera placé sur un filtre en papier légèrement humidifié (Whatman no 3, par exemple) puis comprimé doucement avec un second morceau de filtre en papier légèrement humidifié, jusqu'à élimination complète du fluide luminal. L'utérus vidé de son contenu luminal sera ensuite pesé à 0,1 mg près (poids séché).

48.   Le poids utérin en fin d'essai peut être utilisé pour vérifier que les rates immatures intactes n'ont pas dépassé l'âge applicable, bien que les données historiques de la souche utilisée par le laboratoire soient déterminantes à cet égard (voir le paragraphe 56 pour l'interprétation des résultats).

Études optionnelles

49.   Après avoir été pesé, l'utérus peut être placé dans du formol à 10 % tamponné à pH neutre pour examen histopathologique après coloration hématoxyline-éosine. Le vagin peut être aussi examiné (voir le paragraphe 9). Des mesures morphométriques peuvent être par ailleurs effectuées sur l'épithélium endométrial pour opérer des comparaisons quantitatives.

DONNÉES ET RAPPORT D'ESSAIS

Données

50.   Les informations suivantes doivent être fournies:

—	le nombre d'animaux au début de l'essai,

—	le nombre et l'identité des animaux retrouvés morts pendant l'essai ou euthanasiés en raison de leurs souffrances, ainsi que la date et l'heure des décès des animaux morts naturellement ou euthanasiés,

—	le nombre et l'identité des animaux présentant des signes de toxicité, et une description des signes de toxicité observés indiquant notamment la date et l'heure de l'apparition, la durée et la sévérité des effets toxiques, et

—	le nombre et l'identité des animaux présentant des lésions, et une description du type de lésions.

51.   Les données suivantes doivent être consignées pour chaque animal: poids corporels, poids utérin frais et poids de l'utérus séché. Des analyses statistiques unilatérales pour les agonistes doivent être utilisées pour déterminer si l'administration d'une substance d'essai provoque une augmentation statistiquement significative (p < 0,05) du poids utérin. Les analyses statistiques requises doivent être effectuées pour étudier les modifications liées au traitement, des poids des utérus frais et séchés. Par exemple, les données peuvent être évaluées par une analyse de covariance (ANCOVA), la covariable étant le poids corporel à la nécropsie. Une transformation logarithmique stabilisant la variance peut être opérée sur les données utérines avant l'analyse des données. Le test de Dunnett et Hsu peut être utilisé pour opérer des comparaisons par paires entre les groupes traités et les groupes témoins et pour calculer les intervalles de confiance. Une analyse des résidus studentisés peut permettre de détecter les éventuelles valeurs aberrantes et d'évaluer l'homogénéité des variances. Ces procédures ont été appliquées dans le programme de validation de l'OCDE à l'aide de la PROC GLM du Système d'analyse statistique (SAS Institute, Cary, NC), version 8 (6) (7).

52.   Le rapport final doit contenir les informations suivantes:

Établissement réalisant l'essai

—	Personnel chargé de l'étude et responsabilités de chacun

—	Données de l'étude de référence — témoin positif et données périodiques de contrôle positif (voir les paragraphes 26 et 27)

Substance d'essai

—	Caractérisation des substances d'essai

—	Nature physique et, le cas échéant, propriétés physico-chimiques utiles pour la conduite de l'essai

—	Méthode et fréquence de préparation des dilutions

—	Données obtenues sur la stabilité

—	Analyses des solutions administrées

Véhicule

—	Caractérisation du véhicule de l'essai (nature, fournisseur et lot)

—	Justification du choix du véhicule (s'il est autre que l'eau)

Animaux d'expérience

—	Espèce et souches utilisées et justification du choix de ces espèces/souches

—	Fournisseur et équipements particuliers du fournisseur

—	Âge à la livraison et date de naissance

—	Si les animaux sont immatures, sont-ils fournis avec leurs mères ou d'autres femelles allaitantes et date du sevrage ?

—	Détails des procédures d'acclimatation des animaux

—	Nombre d'animaux par cage

—	Données détaillées et méthode d'identification des individus et des groupes d'animaux

Conditions de l'essai

—	Détails de la procédure de randomisation (par exemple méthode utilisée)

—	Justification de la sélection des doses

—	Détails de la formulation de la substance d'essai, concentrations obtenues, stabilité et homogénéité

—	Détails relatifs à l'administration de la substance d'essai et justification de la voie d'exposition

—	Alimentation (nom, type, fournisseur, composition et, s'ils sont connus, taux de phytœstrogènes)

—	Eau distribuée (eau du robinet ou eau filtrée, par exemple) et mode d'administration (par tube alimenté par un grand réservoir, flacons, etc.)

—	Litière (nom, type, fournisseur, composition)

—	Données sur les conditions d'encagement, photopériode, température et humidité du local expérimental, nettoyage du local expérimental

—	Description détaillée des procédures de nécropsie et de pesée des utérus

—	Description des procédures statistiques

Résultats

Pour chaque animal

—	Relevés journaliers du poids corporel (de la répartition en groupes jusqu'à la nécropsie) (à 0,1 g près)

—	Âge de chaque animal (en jours à compter du jour 0, jour de la naissance) au début du traitement

—	Date et heure de l'administration de chaque dose

—	Volume calculé et dose administrée et observations de toute perte de produit pendant ou après l'administration

—	Observations journalières sur l'état de l'animal, notamment symptômes pertinents

—	Cause présumée du décès (si l'animal est trouvé mort ou moribond pendant l'étude)

—	Date et heure de l'euthanasie et temps écoulé depuis l'administration de la dernière dose

—	Poids utérin frais (à 0,1 mg près) et observations concernant les éventuels écoulements de fluide luminal pendant la dissection et la préparation avant pesée

—	Poids utérin séché (à 0,1 mg près)

Pour chaque groupe d'animaux

—	Relevés journaliers du poids corporel moyen (à 0,1 g près) et écarts types (de la répartition en groupes jusqu'à la nécropsie)

—	Poids utérins moyens, frais et séché (à 0,1 mg près) et écarts types

—	Si elle a été mesurée, consommation alimentaire journalière (calculée en grammes de nourriture consommée par animal)

—	Les résultats des analyses statistiques comparant les poids utérins frais et séchés des groupes traités par rapport à ceux des groupes témoins qui ont reçu le véhicule.

—	Les résultats des analyses statistiques comparant le poids corporel total et la prise de poids corporel des groupes traités par rapport à ceux des groupes témoins qui ont reçu le véhicule.

53.   Résumé des principaux éléments et conditions de la méthode d'essai

	Rat	Souris
Animaux
Souche	Souches de rongeurs de laboratoire communément utilisées
Nombre d'animaux	6 animaux par groupe de dose au minimum
Nombre de groupes	Au minimum 2 groupes d'essai (voir le paragraphe 33) et un groupe témoin négatif Pour les groupes témoins positifs, se référer aux paragraphes 26 et 27
Conditions d'encagement et d'alimentation
To du local expérimental	22 °C ± 3 °C
Humidité relative	50-60 %, pas moins de 30 % et pas plus de 70 %
Photopériode journalière	12 heures de lumière, 12 heures d'obscurité
Alimentation et eau potable	À volonté
Encagement	Individuel ou par groupes de jusqu'à 3 animaux (l'hébergement collectif est recommandé pour les animaux immatures)
Alimentation et litière	Faibles niveaux de phytœstrogènes recommandés dans la nourriture et la litière
Protocole
Méthode	Méthode utilisant des femelles immatures non ovariectomisées (méthode à privilégier) Méthode utilisant des femelles adultes ovariectomisées	Méthode utilisant des femelles adultes ovariectomisées
Âge de traitement des animaux immatures	Pas avant le jour 18 après la naissance. Le traitement doit être achevé avant le jour 25 après la naissance	Non applicable pour cette méthode d'essai
Âge à l'ovariectomie	Entre 6 et 8 semaines d'âge
Âge de traitement des animaux ovariectomisés	Il doit s'écouler au minimum 14 jours entre l'ovariectomie et le 1er jour du traitement	Il doit s'écouler au minimum 7 jours entre l'ovariectomie et le 1er jour du traitement
Poids corporel	La variation du poids corporel doit être minimale et ne pas dépasser ± 20 % du poids moyen
Administration
Voie d'administration	Gavage oral ou injection sous-cutanée
Fréquence de l'administration	Une dose journalière
Volume administré par gavage et injection	≤ 5 ml/kg de poids corporel (ou jusqu'à 10 ml/kg de poids corporel dans le cas de solutions aqueuses) (sur 2 sites d'injection par voie sous-cutanée)
Durée de la période d'administration	3 jours consécutifs pour le modèle sur animaux immatures Au minimum 3 jours consécutifs pour le modèle sur animaux ovariectomisés	7 jours consécutifs pour le modèle sur animaux ovariectomisés
Date du sacrifice	Environ 24 heures après la dernière dose
Résultats
Réponse positive	Augmentation statistiquement significative du poids moyen de l'utérus (frais et/ou séché)
Œstrogène de référence	17α-éthinylestradiol

ORIENTATIONS POUR L'INTERPRÉTATION ET L'ACCEPTATION DES RÉSULTATS

54.   En général, un essai évaluant le pouvoir œstrogénique doit être considéré comme positif si l'on constate une augmentation statistiquement significative du poids utérin (p < 0,05) au moins chez le groupe traité avec la dose la plus élevée par rapport au groupe témoin qui a reçu le solvant. Un résultat positif est confirmé par la démonstration d'une relation biologiquement plausible entre la dose et l'ampleur de l'effet produit, sans perdre de vue que les effets œstrogéniques et antiœstrogéniques conjugués de la substance d'essai peuvent modifier la forme de la courbe dose-effet.

55.   Il importe de veiller à ne pas dépasser la dose maximale tolérée pour pouvoir interpréter avec profit les données. La réduction du poids corporel, les signes cliniques et les autres données observées devront être soigneusement évalués à cet effet.

56.   Il est important, pour pouvoir accepter les données du bioessai utérotrophique, de considérer les poids utérins des animaux du groupe témoin qui a reçu le véhicule. Des valeurs témoins élevées peuvent compromettre la réactivité du bioessai et sa capacité de détection des agonistes des œstrogène de faible puissance. L'étude des données issues de la littérature et des données obtenues lors de la validation du bioessai utérotrophique semblent montrer que les moyennes de référence peuvent être élevées spontanément, en particulier chez les animaux immatures (2) (3) (6) (9). Le poids utérin des rates immatures dépend de nombreuses variables, notamment de la souche ou du poids corporel, c'est pourquoi aucune limite supérieure précise ne peut être indiquée pour le poids utérin. À titre indicatif, si le poids des utérus séchés des rates immatures du groupe témoin est compris entre 40 et 45 mg, les résultats peuvent être considérés comme suspects et des poids utérins supérieurs à 45 mg peuvent nécessiter de refaire l'essai. Il conviendra cependant de procéder à une évaluation au cas par cas (3) (6) (8). Dans l'essai sur des rates adultes, toute ovariectomie incomplète peut laisser des tissus ovariens susceptibles de produire des œstrogènes endogènes et de retarder la régression du poids utérin.

57.   Pour les groupes témoins qui ont reçu le véhicule, l'obtention d'utérus séchés de poids inférieurs à 0,09 % du poids corporel pour les rates immatures et à 0,04 % pour les jeunes adultes ovariectomisées semble donner des résultats acceptables [voir tableau 31 (2)]. Si les poids utérins de référence sont supérieurs à ces valeurs, plusieurs facteurs doivent être vérifiés, notamment l'âge des animaux, la qualité de l'ovariectomie, les phytœstrogènes présents dans l'alimentation, et tout résultat négatif (pas d'indication d'activité œstrogénique) devra être considéré avec prudence.

58.   Les données historiques concernant les groupes témoins qui ont reçu le véhicule doivent être conservées dans le laboratoire. Les données historiques concernant les effets des œstrogènes témoins positifs, tels que le 17α-éthinylestradiol, doivent aussi être conservées dans le laboratoire. Les laboratoires peuvent aussi tester les effets d'agonistes d'œstrogènes connus pour leur faible activité. Toutes ces données peuvent être comparées aux données dont on dispose (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) pour s'assurer que la sensibilité des méthodes du laboratoire est suffisante.

59.   Lors de l'étude de validation de l'OCDE, la variabilité pondérale est apparue plus faible pour les utérus séchés que pour les utérus frais (6) (7). Toutefois, on considère qu'une réponse significative dans l'un ou l'autre cas indiquera que la substance d'essai est positive (activité œstrogénique).

60.   La réponse utérotrophique n'est pas uniquement d'origine œstrogénique mais, s'il s'avère positif, le bioessai utérotrophique devra généralement être interprété comme preuve d'une activité œstrogénique potentielle in vivo, et devra normalement donner lieu à recherches plus poussées (voir le paragraphe 9 et le “Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens”, appendice 2).

Figure 1

Schéma de l'ablation chirurgicale des ovaires

La procédure commence en ouvrant la paroi abdominale dorsolatérale au point médian entre la limite costale inférieure et la crête iliaque, et à quelques millimètres de la marge latérale du muscle lombaire. Les ovaires sont localisés dans la cavité abdominale. Sur un champ aseptique, on extrait les ovaires de la cavité abdominale, on pose une ligature entre l'ovaire et l'utérus pour arrêter le saignement, puis on détache l'ovaire par incision au-dessus de la ligature à la jonction de l'oviducte et de chaque corne utérine. Après avoir vérifié qu'aucun saignement important ne persiste, la paroi abdominale doit être recousue, et la peau refermée par des autoclips ou par suture, par exemple. On laisse ensuite les animaux se rétablir et le poids de l'utérus régresser pendant au moins 14 jours avant utilisation.

Figure 2

Prélèvement et préparation des tissus utérins avant pesée

La procédure commence par l'ouverture de la paroi abdominale au niveau de la symphyse pubienne. On détache chaque ovaire, s'ils sont présents, et chaque corne utérine de la paroi abdominale dorsale. La vessie et les uretères sont dégagés de la face ventrale et latérale de l'utérus et du vagin. Les adhérences fibreuses entre le rectum et le vagin sont libérées jusqu'à ce qu'on repère la jonction de l'orifice vaginal et du périnée. L'utérus et le vagin sont détachés du corps par incision de la paroi vaginale juste au-dessus de la jonction du périnée comme indiqué sur la figure. L'utérus doit être détaché du corps en découpant soigneusement le mésentère à son point d'attache sur toute la longueur de la façade dorsolatérale de chaque corne utérine. Après prélèvement, on élimine la graisse excédentaire et le tissu conjonctif. S'ils sont présents, les ovaires sont détachés de l'oviducte en évitant l'écoulement de fluide luminal de la corne utérine. Si l'animal a été ovariectomisé, les cicatrices doivent être examinées pour repérer l'éventuelle présence de tissu ovarien. Le vagin est détaché de l'utérus à la base du col de l'utérus pour que celui-ci reste solidaire du corps utérin, comme l'indique la figure. L'utérus peut alors être pesé.

NOTES SE RAPPORTANT AU CADRE CONCEPTUEL

Note 1:

Il est possible d'entrer dans le cadre et d'en sortir à tous les niveaux, suivant la nature des informations nécessaires.

Note 2:

Le niveau 5 relatif à l'écotoxicologie devrait inclure des indicateurs mettant en évidence le mode d'action des effets néfastes et d'éventuels dégâts au niveau des populations.

Note 3:

S'il existe un modèle multimodal couvrant plusieurs des essais fournissant des données sur un seul indicateur, ce modèle doit remplacer ces essais.

Note 4:

L'évaluation de chaque substance chimique est à effectuer au cas par cas, à la lumière de toutes les informations disponibles et compte tenu de la fonction des niveaux du cadre.

Note 5:

La version actuelle du cadre ne doit pas être considérée comme exhaustive. Aux niveaux 3, 4 et 5, elle inclut des essais déjà disponibles ou en cours de validation. Ces derniers sont provisoirement inclus; ils seront confirmés une fois mis au point et validés.

Note 6:

La portée des essais du niveau 5 n'est pas strictement limitée. Les essais incorporés à ce niveau servent à l'évaluation des dangers et des risques.

BIBLIOGRAPHIE

(1)

OCDE (1998), Rapport de la première réunion du Groupe d'étude de l'OCDE sur l'essai et l'évaluation des perturbateurs endocriniens (EDTA), 10 et 11 mars 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(2)

OCDE (2003), Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: résumé de la documentation disponible à l'appui du projet du Groupe d'étude de l'OCDE sur l'essai et l'évaluation des perturbateurs endocriniens (EDTA) en vue de normaliser et valider le bio-essai utérotrophique, Publications Hygiène et Sécurité de l'environnement — Série sur les essais et évaluations, no 38, ENV/JM/MONO(2003)1.

(3)

Owens, J.W., et Ashby, J. (2002), Critical Review and Evaluation of the Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent, Crit. Rev. Toxicol., 32:445-520.

(4)

OCDE (2006), OECD Report of the Initial Work Towards the Validation of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1, Publications Hygiène et Sécurité de l'environnement — Série sur les essais et évaluations, no 65, ENV/JM/MONO(2006)33.

(5)

Kanno, J., Onyon, L., Haseman, J., Fenner-Crisp, P., Ashby, J., et Owens, W. (2001), The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1, Environ Health Perspect., 109:785-94.

(6)

OCDE (2006), OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories, Publications Hygiène et Sécurité de l'environnement — Série sur les essais et évaluations, no 66, ENV/JM/MONO(2006)34.

(7)

Kanno, J., Onyon, L., Peddada, S., Ashby, J., Jacob, E., et Owens, W. (2003), The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies, Environ. Health Persp., 111:1530-1549

(8)

Kanno, J., Onyon, L., Peddada, S., Ashby, J., Jacob, E., et Owens, W. (2003), The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies, Environ. Health Persp., 111:1550-1558.

(9)

Owens, W., Ashby, J., Odum, J., et Onyon, L. (2003), The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytœstrogene analyses, Environ. Health Persp., 111:1559-1567.

(10)

Ogasawara, Y., Okamoto, S., Kitamura, Y., Matsumoto, K. (1983), Proliferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I125]iododeoxyuridine, Endocrinology, 113:582-587.

(11)

Branham, W.S., Sheehan, D.M., Zehr, D.R., Ridlon, E., et Nelson, C.J. (1985), The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17ß-oestradiol, Endocrinology, 117:2229-2237.

(12)

Schlumpf, M., Berger, L., Cotton, B., Conscience-Egli, M., Durrer, S., Fleischmann, I., Haller, V., Maerkel, K., et Lichtensteiger, W. (2001), Estrogen active UV screens, SÖFW-J, 127:10-15.

(13)

Zarrow, M.X., Lazo-Wasem, E.A., et Shoger, R.L. (1953), Estrogenic activity in a commercial animal ration, Science, 118:650-651.

(14)

Drane, H.M., Patterson, D.S.P., Roberts, B.A., et Saba, N. (1975), The chance discovery of œstrogenic activity in laboratory rat cake, Fd. Cosmet. Toxicol., 13:425-427.

(15)

Boettger-Tong, H., Murphy, L., Chiappetta., C, Kirkland, J.L., Goodwin, B., Adlercreutz, H., Stancel, G.M., et Makela, S. (1998), A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo responses to exogenously administered estrogens, Environ. Health Perspec., 106:369-373.

(16)

OCDE (2007), Additional data supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in rodents, Publications Hygiène et Sécurité de l'environnement — Série sur les essais et évaluations, no 67.

(17)

Degen, G.H., Janning, P., Diel, P., et Bolt, H.M. (2002), Estrogenic isoflavones in rodent diets, Toxicol. Lett., 128:145-157.

(18)

Wade, M.G., Lee, A., McMahon, A., Cooke, G., et Curran, I. (2003), The influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats, Food Chem. Toxicol., 41:1517-1525.

(19)

Yamasaki, K., Sawaki, M., Noda, S., Wada, T., Hara, T., et Takatsuki, M. (2002), Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given different phytœstrogen content diets and the ovarien changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide, Arch. Toxicol., 76:613-620.

(20)

Thigpen, J.E., Haseman, J.K., Saunders, H.E., Setchell, K.D.R., Grant, M.F., et Forsythe, D. (2003), Dietary phytœstrogens accelerate the time of vaginal opening in immature CD-1 mice, Comp. Med., 53:477-485.

(21)

Ashby, J., Tinwell, H., Odum, J., Kimber, I., Brooks, A.N., Pate, I., et Boyle, C.C. (2000), Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development, J. Appl. Toxicol., 20:343-347.

(22)

Thigpen, J.E., Lockear, J., Haseman, J., Saunders, H.E., Caviness, G., Grant, M.F., et Forsythe, D.B. (2002), Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays, Cancer Detect. Prev., 26:381-393.

(23)

Thigpen, J.E., Li, L.-A., Richter, C.B., Lebetkin, E.H., et Jameson, C.W. (1987), The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay, Lab. Anim. Sci., 37:596-601.

(24)

OCDE (2008), Toxicité aiguë par voie orale: méthode de l'ajustement des doses, ligne directrice no 425 de l'OCDE pour les essais de produits chimiques.

(25)

OCDE (2000), Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Publications Hygiène et Sécurité de l'environnement — Série sur les essais et évaluations, no 19, ENV/JM/MONO(2000)7.

(26)

OCDE (2001), Guidance document on acute oral toxicity, Publications Hygiène et Sécurité de l'environnement — Série sur les essais et évaluations, no 24, ENV/JM/MONO(2001)4.

(27)

Bulbring, E., et Burn, J.H. (1935), The estimation of oestrin and of male hormone in oily solution, J. Physiol., 85: 320-333.

(28)

Dorfman, R.I., Gallagher, T.F., et Koch, F.C. (1936), The nature of the estrogenic substance in human male urine and bull testis, Endocrinology, 19: 33-41.

(29)

Reel, J.R., Lamb IV, J.C., et Neal, B.H. (1996), Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization, Fundam. Appl. Toxicol., 34: 288-305.

(30)

Jones, R.C., et Edgren, R.A. (1973), The effects of various steroid on the vaginal histology in the rat, Fertil. Steril., 24: 284-291.

(31)

OCDE (1982), Organisation de coopération et de développement économiques — Principes de l'OCDE relatifs aux bonnes pratiques de laboratoire, ISBN 92-64-12367-9, Paris.

(32)

Dorfman, R.I. (1962), Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: Standard Methods Adopted by Official Organization, New York, Academic Press.

(33)

Thigpen, J.E. e.a. (2004), Selecting the appropriate rodent diet for endocrine disruptor research and testing studies, ILAR J 45(4): 401-416.

(34)

Gray, L.E., et Ostby, J. (1998), Effects of pesticides and toxic substances on behavioral and morphological reproductive development: endocrine versus non-endocrine mechanism, Toxicol Ind Health, 14 (1-2): 159-184.

(35)

Booth, A.N., Bickoff, E.M., et Kohler, G.O. (1960), Estrogen-like activity in vegetable oils and mill by-products, Science, 131:1807-1808.

(36)

Kato, H., Iwata, T., Katsu, Y., Watanabe, H., Ohta, Y., et Iguchi, T. (2004), Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay, J. Agric Food Chem., 52, 14101414.

(37)

OCDE (2007), Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Procedure to Test for Antiœstrogenicity, Series on Testing and Assessment, No. 71.

(38)

Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (JO L 276 du 20.10.2010, p. 33).

B.55.   BIOESSAI DE HERSHBERGER SUR LE RAT: ESSAI DE DEPISTAGE A COURT TERME DE PROPRIETES (ANTI)ANDROGENIQUES

INTRODUCTION

1.   La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice pour les essais de produits chimiques no 441 (2009) de l'OCDE. L'OCDE a lancé, en 1998, une activité à caractère hautement prioritaire dans le but de réviser les lignes directrices existantes et d'en établir de nouvelles relatives au dépistage et à l'essai des substances susceptibles de perturber le système endocrinien (1). L'une des composantes de cette activité concernait le développement d'une ligne directrice pour le bioessai de Hershberger sur le rat. Après plusieurs décennies d'utilisation par l'industrie pharmaceutique, cet essai a été pour la première fois normalisé par un comité d'experts officiels en 1962 comme outil de dépistage de substances chimiques androgéniques (2). Entre 2001 et 2007, le bioessai de Hershberger sur le rat a fait l'objet d'un programme de validation approfondi, comprenant notamment la constitution d'un document d'examen détaillé (23), la compilation d'un article détaillé sur les méthodes (3), l'élaboration d'un guide de dissection (21) et la mise en œuvre d'études intra- et interlaboratoires poussées visant à démontrer la fiabilité et la reproductibilité du bioessai. Ces études de validation ont été menées à l'aide d'un androgène de référence fortement actif [propionate de testostérone (TP)], de deux androgènes synthétiques fortement actifs (acétate de trenbolone et méthyltestostérone), d'un produit pharmaceutique antiandrogénique fortement actif (flutamide), d'un inhibiteur fortement actif (finastéride) de la synthèse de l'androgène naturel (dihydrotestostérone-DHT), de plusieurs pesticides faiblement antiandrogéniques (linuron, vinclozoline, procymidone, p,p' DDE), d'un inhibiteur de 5α-réductase fortement actif (finastéride) et de deux substances chimiques négatives connues (dinitrophénol et nonylphénol) (4) (5) (6) (7) (8). La présente méthode d'essai résulte de la longue expérience acquise par l'utilisation du bioessai et de l'expérience acquise au cours du programme de validation et des résultats obtenus.

2.   Le bioessai de Hershberger est un essai de dépistage in vivo à court terme qui emploie des tissus accessoires de l'appareil reproducteur mâle. L'essai date des années 30 et il a été modifié dans les années 40 par l'inclusion de muscles de l'appareil reproducteur mâle qui répondent aux androgènes (2) (9-15). Au cours des années 60, plus de 700 androgènes putatifs ont été évalués à l'aide d'une version normalisée du mode opératoire (2) (14), et l'utilisation de l'essai a été considérée comme une méthode standard aussi bien pour les androgènes que pour les antiandrogènes pendant les années 60 (2) (15). L'essai biologique actuel est fondé sur les variations de poids de cinq tissus dépendant des androgènes chez le rat mâle péripubertaire castré. Il évalue la capacité d'une substance chimique à induire des activités biologiques analogues à celles induites par des agonistes et des antagonistes d'androgènes ou des inhibiteurs de 5α-réductase. Les cinq tissus cibles dépendant des androgènes inclus dans la présente méthode d'essai sont la prostate ventrale (PV), la vésicule séminale (VS) (plus les fluides et les glandes coagulantes), les muscles élévateurs de l'anus et bulbocaverneux (EABC), la paire de glandes de Cowper (COW) et le gland (G). Chez le rat mâle péripubertaire castré, ces cinq tissus répondent tous aux androgènes par une augmentation du poids absolu. Lorsqu'ils sont stimulés en vue d'augmenter leur poids par l'administration d'un androgène de référence fortement actif, ces cinq tissus répondent tous aux antiandrogènes par une diminution du poids absolu. Le premier modèle du bioessai de Hershberger est le mâle péripubertaire chirurgicalement castré, et il a été validé dans les phases 1, 2 et 3 du programme de validation de Hershberger.

3.   Le bioessai de Hershberger est utilisé comme un test de dépistage mécanistique in vivo des agonistes d'androgènes, des antagonistes d'androgènes et des inhibiteurs de 5α-réductase, et son application est envisagée dans le contexte du “Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens” (appendice 2). Dans ce cadre conceptuel, le bioessai de Hershberger se situe au niveau 3 en tant qu'essai in vivo fournissant des données sur un seul mécanisme endocrinien, à savoir l'(anti)androgénicité. Il est destiné à faire partie d'une batterie d'essais in vitro et in vivo permettant d'identifier les substances chimiques susceptibles d'interagir avec le système endocrinien et, à terme, d'évaluer les risques et les dangers pour la santé humaine ou l'environnement.

4.   Compte tenu des problèmes de bien-être des animaux posés par la castration, le mâle sevré stimulé intact (non castré) a été étudié comme modèle alternatif pour l'essai Hershberger afin d'éviter l'étape de castration. La méthode d'essai utilisant le mâle sevré stimulé a été validée (24). Cependant, dans les études de validation, le modèle adulte sevré de l'essai Hershberger n'a pas montré sa capacité à détecter de façon régulière les effets de substances à faible activité antiandrogène sur le poids d'organes dépendant des androgènes, aux doses testées. C'est la raison pour laquelle ce modèle n'a pas été inclus dans la présente méthode d'essai. Toutefois, considérant que son utilisation peut avoir non seulement des avantages en termes de bien-être des animaux, mais peut aussi fournir des informations sur d'autres modes d'action, il est disponible dans le document d'orientation no 115 de l'OCDE (25).

REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITATIVES

5.   Les agonistes et les antagonistes d'androgènes agissent comme des ligands du récepteur d'androgène et peuvent activer ou inhiber, respectivement, la transcription des gènes contrôlée par le récepteur. De surcroît, certaines substances chimiques inhibent la conversion de la testostérone en androgène dihydrotestostérone naturel plus actif dans certains tissus cibles des androgènes (inhibiteurs de 5α-réductase). Ces substances peuvent avoir des effets néfastes pour la santé, y compris des effets sur la reproduction et le développement. Par conséquent, il est nécessaire, dans des objectifs de réglementation, d'estimer et d'évaluer rapidement les potentialités d'agoniste ou d'antagoniste des androgènes ou d'inhibiteur de 5α-réductase d'une substance chimique. Même si leur valeur informative est appréciable, l'affinité d'un ligand pour un récepteur d'androgène telle que mesurée par sa liaison au récepteur ou par l'activation de la transcription de gènes reporters in vitro n'est pas le seul déterminant d'un danger éventuel. D'autres facteurs critiques sont l'activation et la désactivation métaboliques lors de l'entrée dans l'organisme, la distribution des substances entre les tissus cibles et l'élimination de l'organisme. Il est par conséquent nécessaire de détecter l'activité éventuelle d'une substance chimique in vivo dans des conditions opératoires et d'exposition appropriées. L'évaluation in vivo est moins cruciale si les caractéristiques ADME (absorption, distribution, métabolisme, élimination) de la substance chimique sont connues. Les tissus dépendant des androgènes répondent par une croissance rapide et vigoureuse à une stimulation par des androgènes, notamment chez les rats mâles péripubertaires castrés. Les rongeurs, en particulier le rat, sont aussi largement utilisés dans les études de toxicité visant à caractériser les dangers. Par conséquent, la version de l'essai qui emploie le rat péripubertaire castré et les cinq tissus cibles convient au dépistage in vivo d'agonistes et d'antagonistes des androgènes et d'inhibiteurs de 5α-réductase.

6.   La présente méthode d'essai est fondée sur les protocoles employés dans l'étude de validation de l'OCDE qui se sont révélés fiables et reproductibles dans les analyses intra- et interlaboratoires (4) (5) (6) (7) (8). Dans cette méthode d'essai sont présentés des protocoles pour les androgènes et pour les antiandrogènes.

7.   La dose de TP utilisée pour détecter les antiandrogènes dans le programme de validation du bioessai de Hershberger de l'OCDE variait légèrement selon les différents laboratoires (0,2 versus 0,4 mg/kg/j par injection sous-cutanée), mais la capacité à détecter une activité antiandrogénique faible ou forte présentait peu de différence entre ces deux variantes du mode opératoire. De toute évidence, il ne faut pas utiliser une dose de TP trop élevée qui bloquerait les effets des antagonistes de récepteurs d'androgènes (RA) faibles, ni une dose trop faible, car les tissus androgéniques ne présenteraient alors qu'une réponse de croissance limitée même sans coadministration d'antiandrogène.

8.   La réponse de croissance des tissus dépendant des androgènes individuels n'est pas entièrement d'origine androgénique, des substances qui ne sont pas des agonistes d'androgènes pouvant modifier le poids de certains tissus. Toutefois, la réponse de croissance simultanée de plusieurs tissus corrobore l'hypothèse d'un mécanisme plus spécifique des androgènes. Par exemple, des doses élevées d'œstrogènes fortement actifs peuvent augmenter le poids des vésicules séminales; cependant, les autres tissus dépendant des androgènes de l'essai ne répondront pas de manière similaire. Les substances chimiques antiandrogéniques peuvent agir comme des antagonistes des récepteurs d'androgènes ou des inhibiteurs de 5α-réductase. L'effet des inhibiteurs de 5α-réductase est variable, car la conversion en dihydrotestostérone plus active varie selon les tissus. Les antiandrogènes qui inhibent la 5α-réductase, comme le finastéride, ont des effets plus marqués dans la prostate ventrale que dans les autres tissus lorsqu'on les compare à un antagoniste de RA fortement actif comme le flutamide. Cette différence de réponse en fonction des tissus peut être utilisée pour distinguer les modes d'action médiés par les RA de ceux médiés par la 5α-réductase. De surcroît, le récepteur d'androgène est apparenté en termes d'évolution à celui d'autres hormones stéroïdiennes, et certaines autres hormones, administrées à des doses élevées supraphysiologiques peuvent lier le TP et jouer un rôle d'antagoniste de ses effets d'activation de la croissance (13). De plus, il est également plausible qu'un métabolisme stéroïdien activé et un abaissement corollaire de la teneur sérique en testostérone puissent réduire la croissance des tissus dépendant des androgènes. Par conséquent, tout résultat positif dans le bioessai de Hershberger est normalement évalué par une approche par éléments de preuve qui comprend des essais in vitro, tels que les essais de liaison aux RA et aux récepteurs œstrogéniques (RE) et des essais d'activation de la transcription correspondants, ou d'autres essais in vivo qui analysent des tissus cibles des androgènes similaires, tels que l'essai sur mâle pubère, l'essai sur mâle adulte intact de 15 jours ou les essais à doses répétées pendant 28 jours ou 90 jours.

9.   L'expérience montre que les androgènes xénobiotiques sont plus rares que les antiandrogènes xénobiotiques. On s'attend par conséquent à utiliser plus souvent le bioessai de Hershberger pour le dépistage d'antiandrogènes. Toutefois, le mode opératoire d'essai d'androgènes est parfois recommandé pour des substances chimiques stéroïdiennes ou analogues aux stéroïdes ou pour des substances chimiques pour lesquelles des méthodes intégrées au niveau 1 ou 2 du Cadre conceptuel (appendice 2) ont fourni une indication d'éventuels effets androgéniques. De la même manière, des effets indésirables associés à des profils (anti)androgéniques peuvent être observés dans des essais de niveau 5 et nécessiter une évaluation visant à déterminer si une substance agit par un mode d'action endocrine.

10.   Il est admis que tous les protocoles faisant appel à des animaux respectent les normes locales en matière de bien-être animal; les descriptifs des soins et traitements figurant ci-après constituent donc des normes minimales auxquelles se substitueront les réglementations locales telles que la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (26). D'autres recommandations relatives au traitement humain des animaux ont été formulées par l'OCDE (17).

11.   Comme c'est le cas de tous les essais biologiques sur animaux expérimentaux, il conviendra d'évaluer soigneusement la nécessité d'une mise en œuvre de cette étude. Fondamentalement, deux raisons peuvent justifier une telle décision:

—	risque d'exposition élevé (niveau 1 du Cadre conceptuel) ou indications d'une (anti)androgénicité dans des essais in vitro (niveau 2) incitant à mener des études en vue de déterminer si ces effets pourraient s'exercer in vivo,

—	effets de nature (anti)androgénique dans des essais in vivo de niveau 4 ou 5 justifiant la mise en œuvre d'études sur le mode d'action spécifique, par exemple afin de déterminer si les effets sont dus à un mécanisme (anti)androgénique.

12.   La définition des termes utilisés dans la présente méthode d'essai figure à l'appendice 1.

PRINCIPE DE L'ESSAI

13.   La sensibilité du bioessai de Hershberger est due à l'utilisation de mâles chez lesquels la production d'androgènes endogènes est minimale. En effet, les mâles sont castrés et la castration est suivie d'un délai adéquat permettant la régression des tissus cibles jusqu'à un poids de base minimal et uniforme. Ainsi, lors de la détection d'une activité androgénique potentielle, les teneurs endogènes en androgènes en circulation sont faibles, l'axe hypothalamique-pituitaire-gonadal est incapable de les compenser par des mécanismes de rétroaction, la capacité des tissus à répondre est maximale, et la variabilité du poids initial des tissus est minimale. Lors de la détection d'une activité antiandrogénique potentielle, il est possible d'obtenir un gain pondéral des tissus plus substantiel lorsque ceux-ci sont stimulés par un androgène de référence. Par conséquent, dans le bioessai de Hershberger, il ne faut que 6 animaux par groupe de dose alors que, dans d'autres essais qui emploient des mâles pubères ou adultes, l'utilisation de 15 mâles par groupe de dose est conseillée.

14.   La castration des rats mâles péripubertaires est réalisée de manière appropriée à l'aide d'anesthésiques et d'une technique aseptique approuvés. Des analgésiques sont administrés durant les quelques jours qui suivent l'intervention chirurgicale afin d'éliminer la gêne postchirurgicale. La castration améliore la précision avec laquelle l'essai détecte les androgènes et les antiandrogènes faibles en supprimant les mécanismes de rétroaction endocrines compensatoires qui existent chez l'animal intact et peuvent atténuer les effets des androgènes et des antiandrogènes administrés, et élimine la large variabilité interindividus des teneurs sériques en testostérone. Par conséquent, la castration réduit les nombres d'animaux requis pour le dépistage de ces activités endocrines.

15.   Pour détecter une activité androgénique potentielle, la substance d'essai est administrée chaque jour par gavage oral ou injection sous-cutanée (sc) pendant une période de 10 jours consécutifs. Les substances d'essai sont administrées à au moins deux groupes de traitement d'animaux expérimentaux en utilisant un niveau de dose par groupe. Les animaux sont autopsiés environ 24 heures après l'administration de la dernière dose. Une augmentation de poids statistiquement significative de deux des organes cibles ou plus dans les groupes recevant la substance d'essai comparés aux groupes témoin recevant le véhicule indique un résultat positif pour la substance d'essai relativement à l'activité androgénique potentielle (voir paragraphe 60). Les androgènes comme la trenbolone, qui ne peuvent être réduits en 5α, présentent des effets sur l'EABC et le gland plus prononcés que ceux du TP, mais tous les tissus doivent présenter une augmentation de la croissance.

16.   Pour détecter une activité antiandrogénique potentielle, la substance d'essai est administrée chaque jour par gavage oral ou injection sous-cutanée pendant une période de 10 jours consécutifs simultanément à des doses quotidiennes de TP (0,2 ou 0,4 mg/kg/j) administrées par injection sous-cutanée. Le programme de validation a montré que les doses de 0,2 ou 0,4 mg/kg/j de TP permettaient toutes deux la détection d'antiandrogènes et, par conséquent, il convient de choisir l'une des doses à utiliser dans l'essai. Des doses croissantes de la substance d'essai sont administrées à au moins 3 groupes d'animaux expérimentaux traités, à raison d'un niveau de dose par groupe. Les animaux sont autopsiés environ 24 heures après l'administration de la dernière dose. Une diminution statistiquement significative, par rapport aux groupes témoins ne recevant que du TP, du poids de deux organes cibles ou davantage dans les groupes de substance d'essai plus TP indique un résultat positif pour la substance d'essai en termes d'activité antiandrogénique potentielle (voir paragraphe 61).

DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

Sélection de l'espèce et de la souche

17.   Le rat est utilisé en routine dans le bioessai de Hershberger depuis les années 30. Sur le plan biologique, il est plausible que le rat et la souris présentent des réponses similaires, mais les 70 ans d'expérience avec le modèle de rat en font l'espèce de choix pour le bioessai de Hershberger. De surcroît, les données issues du bioessai pouvant servir de résultats préliminaires à une étude multigénérationnelle à long terme, il est ainsi possible d'utiliser dans les deux études des animaux de la même espèce, de la même souche et de la même source.

18.   Ce mode opératoire remet aux laboratoires le soin de sélectionner la souche de rat à utiliser dans l'essai, qui sera en général celle habituellement employée dans le laboratoire concerné. On peut choisir les souches de rats de laboratoire couramment utilisées; toutefois, il faut éviter les souches dont la maturation est significativement plus longue que 42 jours, car une castration des mâles à 42 jours peut empêcher la mesure des poids de gland, qui ne peut être effectuée qu'après séparation du prépuce de la tige pénienne. Ainsi, on n'utilisera pas de souches dérivées du rat Fisher 344, sauf dans de rares cas. La chronologie du développement sexuel du rat Fisher 344 est différente de celle des autres souches couramment utilisées, telles que les souches Sprague Dawley ou Wistar (16). Dans le cas où une telle souche est utilisée, il conviendra de castrer les individus au laboratoire à un âge légèrement postérieur et il faudra démonter la sensibilité de la souche utilisée. La justification du choix d'une souche de rat est clairement établie par le laboratoire. Si l'essai de dépistage est préalable à une étude par voie orale à doses répétées, à une étude sur la reproduction et le développement ou à une étude à long terme, il conviendra d'utiliser de préférence des animaux issus de la même souche et de la même source dans toutes les études.

Conditions d'hébergement et d'alimentation

19.   Tous les modes opératoires respectent l'ensemble des normes locales en vigueur sur le soin des animaux de laboratoire. Les conditions d'entretien et de traitement décrites ici sont des normes minimales auxquelles se substituent des réglementations locales plus contraignantes, telles que la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (26). La température du local expérimental est de 22 °C (à environ ± 3 °C). Le taux d'humidité relative est d'au moins 30 % et, de préférence, inférieur à 70 % en dehors des heures de nettoyage du local. On s'efforcera de maintenir l'humidité relative entre 50 et 60 %. L'éclairage est artificiel. La séquence d'éclairement est de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.

20.   Il est préférable de loger les animaux en groupes plutôt que de les isoler, en raison de leur jeune âge et parce que les rats sont des animaux sociaux. Le logement de deux ou trois animaux par cage évite la concentration et le stress qui lui est associé, susceptible d'interférer avec le contrôle hormonal du développement du tissu sexuel accessoire. Les cages seront soigneusement nettoyées afin d'en éliminer tous les contaminants possibles et placées de façon à réduire au minimum l'influence éventuelle de leur disposition sur les résultats. Le choix de cages de taille appropriée (~2 000 centimètres carrés) évitera le surpeuplement.

21.   Chaque animal est identifié individuellement (par exemple par une marque ou une étiquette à l'oreille) en utilisant une méthode éthiquement acceptable. La méthode d'identification est consignée.

22.   Les animaux recevront de la nourriture et de l'eau potable à volonté. Les laboratoires qui mettent en œuvre le bioessai de Hershberger utilisent le régime alimentaire du laboratoire qui est normalement utilisé dans les études d'essais sur les produits chimiques. Lors des études de validation du bioessai, aucun effet ni variabilité attribuable au régime alimentaire n'a été observé. Le régime utilisé sera indiqué et un échantillon en sera conservé à des fins d'éventuelle analyse future.

Critères de performance relatifs aux poids des organes dépendant des androgènes

23.   Au cours de l'étude de validation, aucune donnée n'a permis de démontrer qu'une diminution du poids corporel affectait les augmentations ou les réductions de croissance de poids des tissus cibles (c'est-à-dire des tissus qui doivent être pesés).

24.   Les poids des organes dépendant des androgènes des différentes souches de rats utilisées avec succès dans le programme de validation sont plus élevés chez les souches de rats les plus lourdes que chez les souches plus légères. Par conséquent, les critères de performance du bioessai de Hershberger n'incluent pas les poids absolus prévisibles des organes pour les témoins positifs et négatifs.

25.   Le coefficient de variation (CV) d'un tissu étant inversement proportionnel à la puissance statistique, les critères de performance du bioessai de Hershberger sont fondés sur des valeurs de CV maximales pour chaque tissu (tableau 1). Les CV sont tirés des études de validation de l'OCDE. Dans le cas de résultats négatifs, les laboratoires examinent les CV du groupe témoin et du groupe de traitement à dose élevée afin de déterminer si les critères de performance de CV maximal ont été dépassés.

26.   L'étude est répétée dans les cas suivants: 1) trois ou plus des dix CV individuels possibles dans les groupes témoin et de traitement à dose élevée dépassent les valeurs maximales indiquées pour les études d'agonistes et d'antagonistes dans le tableau 1 et 2) au moins deux des tissus cibles sont marginalement non significatifs, c'est-à-dire présentent des valeurs ρ comprises entre 0,05 et 0,10.

Tableau 1

CV maximaux autorisés déterminés pour les tissus sexuels accessoires cibles dans le modèle sur rat castré dans les études de validation de l'OCDE  (12)

Tissu	Effets antiandrogéniques	Effets androgéniques
Vésicules séminales	40 %	40 %
Prostate ventrale	40 %	45 %
EABC	20 %	30 %
Glandes de Cowper	35 %	55 %
Gland	17 %	22 %

MODE OPÉRATOIRE

Respect de la réglementation et vérification au laboratoire

27.   Il est inutile de démontrer la compétence du laboratoire avant le début de l'étude pour l'essai de Hershberger comme c'est le cas pour l'essai utérotrophique (chapitre B.54 de la présente annexe), car des témoins positifs (propionate de testostérone et flutamide) et négatifs sont simultanément inclus dans l'essai.

Nombre et répartition des animaux

28.   Chaque groupe d'essai et témoin comprend au moins 6 animaux. Cela s'applique aux protocoles androgéniques et antiandrogéniques.

Castration

29.   Une période d'acclimatation initiale de plusieurs jours après réception des animaux attestera que les sujets sont sains et performants. Des animaux castrés avant l'âge de 42 jours ou au 42e jour postnatal (JPN) ne présentant pas toujours de séparation préputiale, il faut castrer les animaux au JPN 42 ou après, mais pas avant. Les animaux sont castrés sous anesthésie par incision dans le scrotum et prélèvement des testicules et de l'épididyme avec ligature des vaisseaux sanguins et des canalicules séminifères. Après confirmation de l'absence de saignement, le scrotum est refermé par des sutures ou des agrafes autoserrantes. Les animaux sont traités par des analgésiques pendant les quelques jours qui suivent l'intervention chirurgicale afin d'atténuer toute gêne postchirurgicale. Si les animaux sont acquis déjà castrés auprès d'un fournisseur d'animaux, celui-ci garantira leur âge et leur stade de maturité sexuelle.

Acclimatation après castration

30.   Les animaux restent en acclimatation aux conditions de laboratoire pour permettre la régression des poids des tissus cibles pendant 7 jours au minimum après la castration. Ils sont observés quotidiennement, et tout animal présentant des signes de maladie ou d'anomalie physique est retiré. Ainsi, le début du traitement par administration des doses (à l'étude) peut commencer dès le 49e JPN, mais jamais après le 60e JPN. À l'autopsie, l'animal n'est pas âgé de plus de 70 JPN. Ce degré de flexibilité permet une programmation efficace du travail expérimental au laboratoire.

Poids corporel et randomisation des groupes

31.   Les différences entre les poids corporels individuels représentent une source de variabilité entre les poids des tissus tant entre les groupes d'animaux qu'au sein de ces groupes. L'augmentation de la variabilité des poids des tissus se traduit par une augmentation du coefficient de variation (CV) et réduit la puissance statistique de l'essai (parfois aussi désignée par sensibilité de l'essai). Il convient par conséquent de limiter les variations du poids corporel au niveau expérimental ainsi qu'au niveau statistique.

32.   Au niveau expérimental, il faut s'efforcer de réduire les variations de poids corporels au sein des groupes d'étude et entre eux. Tout d'abord, il convient d'écarter les animaux de taille anormalement grande ou petite et de ne pas les intégrer dans la cohorte de l'étude. Au début de l'étude, les variations de poids entre animaux ne dépassent pas ± 20 % du poids moyen (par exemple 175 g ± 35 g pour les rats péripubertaires castrés). En second lieu, il faut répartir les animaux au hasard dans les groupes (témoin et traités), de façon qu'il n'y ait aucune différence statistique de poids corporel moyen d'un groupe à l'autre. Le protocole de randomisation par blocs utilisé est consigné.

33.   La toxicité étant susceptible de réduire le poids corporel dans les groupes traités par rapport à celui du groupe témoin, il faut utiliser comme covariable statistique le poids corporel au premier jour d'administration de la substance de l'essai et non le poids corporel à l'autopsie.

Posologie

34.   Afin d'établir si une substance d'essai peut avoir une action androgénique in vivo, il suffit généralement d'utiliser 2 groupes de dose de la substance d'essai auxquels s'ajoutent des témoins positifs et de véhicule (négatif) (voir paragraphe 43), et cette posologie est par conséquent préférée pour des raisons de bien-être animal. Si l'objectif est d'obtenir une courbe de la relation dose-effet ou d'extrapoler les résultats à des doses plus faibles, au moins 3 groupes de dose seront nécessaires. Si l'on souhaite obtenir des informations plus détaillées que la simple identification d'une activité androgénique (estimation de la puissance, par exemple), un autre régime posologique devra être envisagé. Si l'on cherche à tester des antiandrogènes, la substance d'essai est administrée en combinaison avec un agoniste d'androgène de référence. Il faut utiliser au moins 3 groupes d'essai avec différentes doses de la substance d'essai et un témoin positif et un témoin négatif (voir paragraphe 44). Exception faite de l'administration de la substance d'essai, les animaux du groupe témoin devront subir exactement le même traitement que ceux des groupes d'essai. Si un véhicule est employé pour administrer la substance d'essai, on administrera au groupe témoin le plus grand volume de véhicule utilisé dans les groupes d'essai.

35.   Tous les niveaux de dose sont proposés et sélectionnés à la lumière des données existantes sur la toxicité et le comportement (toxico)-cinétique de la substance d'essai ou de substances connexes. Le niveau de dose le plus élevé est établi tout d'abord en fonction de la DL50 et/ou des informations sur la toxicité aiguë afin d'éviter le décès et la détresse ou la souffrance extrêmes des animaux (17) (18) (19) (20) et, en second lieu, il convient de tenir compte des informations disponibles sur les doses utilisées dans des études subchroniques et chroniques. En général, la dose la plus élevée ne provoque pas de réduction du poids corporel final des animaux supérieure à 10 % du poids témoin. La dose la plus élevée est la plus haute dose qui assure la survie de l'animal et qui n'induit pas de toxicité ni de détresse significative au bout de 10 jours consécutifs d'administration jusqu'à une dose maximale de 1 000 mg/kg/jour (voir paragraphe 36), ou bien une dose inférieure induisant des effets (anti)androgéniques, quelle qu'elle soit. Pour un dépistage, de larges intervalles entre les doses sont acceptables, par exemple, une demi-unité logarithmique (soit un facteur de progression de 3,2) ou même une unité logarithmique. En l'absence de données appropriées, une étude préliminaire de détermination des doses (voir paragraphe 37) peut permettre de définir les doses qu'il convient d'utiliser.

Dose limite

36.   Lorsque, dans un essai, la dose limite de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour et une dose inférieure dans le cadre des protocoles décrits par cette étude ne permetent pas de produire de changement statistiquement significatif des poids des organes reproducteurs, on peut considérer qu'il est inutile de tester d'autres niveaux de dose. Le concept de dose limite s'applique dans tous les cas, sauf lorsque des données d'exposition pour l'homme indiquent qu'il est nécessaire d'utiliser un niveau de dose plus élevé.

Détermination des doses

37.   Le cas échéant, une étude préliminaire de détermination des doses peut être effectuée sur un petit nombre d'animaux afin de définir les groupes d'essai appropriés [par recours aux méthodes d'essai de la toxicité aiguë (chapitres B.1 bis, B.1 ter de la présente annexe (27), ligne directrice 425 de l'OCDE (19)]. L'objectif, dans le cas du bioessai de Hershberger, est de choisir des doses qui assurent la survie des animaux et n'entraînent pas de détresse ni d'effets toxiques graves après 10 jours consécutifs d'administration de la substance chimique, jusqu'à une dose maximale de 1 000 mg/kg/j, comme il est indiqué dans les paragraphes 35 et 36. À cet égard, le document d'orientation de l'OCDE (17) qui définit les signes cliniques indicateurs de toxicité ou de détresse des animaux peut être utilisé. Lorsque cela est possible dans le cadre de cette étude préliminaire de détermination des doses, après 10 jours d'administration, les tissus cibles peuvent être excisés et pesés environ 24 heures après administration de la dernière dose. Ces données peuvent ensuite contribuer à la sélection des doses dans l'étude principale.

Substances chimiques de référence et véhicule

38.   L'agoniste d'androgènes de référence est le propionate de testostérone (TP), no CAS 57-82-5. La dose de TP de référence peut être égale à 0,2 mg/kg de poids corporel/j ou bien à 0,4 mg/kg de poids corporel/j. L'antagoniste d'androgènes de référence est le flutamide (FT), no CAS 1311-84-7. La dose de FT de référence est égale à 3 mg/kg de poids corporel/j et le FT est coadministré avec la dose de TP de référence.

39.   Il est recommandé d'envisager d'utiliser, dans la mesure du possible, une solution ou une suspension aqueuse pour commencer. Toutefois, de nombreux ligands d'androgènes ou leurs précurseurs métaboliques sont plutôt hydrophobes, c'est pourquoi on utilise le plus souvent une solution ou une suspension dans l'huile (par exemple huile de maïs, d'arachide, de sésame ou d'olive). Les substances d'essai peuvent être dissoutes dans une quantité minimale d'éthanol à 95 % ou d'autres solvants appropriés, puis diluées dans le véhicule de l'essai aux concentrations finales de l'étude. Les caractéristiques toxiques du solvant sont connues et évaluées sur un groupe témoin séparé traité uniquement avec le solvant. Si la substance d'essai est considérée comme stable, on peut légèrement chauffer le mélange et le soumettre à une action mécanique vigoureuse pour faciliter sa dissolution. La stabilité de la substance d'essai dans le véhicule est déterminée. Si la substance d'essai est stable pendant toute la durée de l'étude, une fraction aliquote initiale de la substance d'essai peut être préparée, puis les dilutions spécifiées sont réalisées quotidiennement en prenant soin d'éviter la contamination et la détérioration des échantillons.

Administration des doses

40.   Le TP est administré par injection sous-cutanée, et le FT par gavage oral.

41.   La substance d'essai est administrée par gavage oral ou injection sous-cutanée. Il faut tenir compte du bien-être des animaux et des propriétés physico-chimiques de la substance d'essai lors du choix de la voie d'administration. De surcroît, il convient de considérer les aspects toxicologiques comme l'adéquation à la voie d'exposition de l'homme à la substance chimique (gavage oral pour représenter une exposition par ingestion, injection sous-cutanée pour une exposition par inhalation ou adsorption cutanée), les informations toxicologiques existantes et les données sur le métabolisme et la cinétique (par exemple la nécessité d'éviter le métabolisme de premier passage, meilleure efficacité d'une des voies d'administration), avant de mettre en œuvre un essai approfondi à long terme lorsque des résultats positifs sont obtenus par injection.

42.   Il faut administrer les doses aux animaux de la même manière et avec la même séquence temporelle pendant 10 jours consécutifs à des intervalles d'environ 24 heures. Le niveau de dose est ajusté tous les jours en se fondant sur les mesures quotidiennes simultanées de poids corporel. Le volume de dose et le moment auquel elle est administrée sont notés chaque jour d'exposition. Il importe de veiller à ne pas dépasser la dose maximale mentionnée au paragraphe 35 pour pouvoir interpréter avec profit les données. La réduction du poids corporel, les signes cliniques et les autres données observées devront être soigneusement évalués dans cette perspective. Dans le cas d'un gavage oral, il faut utiliser une sonde gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l'animal expérimental. Les directives locales de soins aux animaux sont observées, mais le volume n'excède pas 5 ml/kg de poids corporel, sauf dans le cas de solutions aqueuses où l'on pourra utiliser 10 ml/kg de poids corporel. Dans le cas d'injections sous-cutanées, les doses sont injectées dans la région dorso-scapulaire ou lombaire à l'aide d'une aiguille stérile (de calibre 23 ou 25) et d'une seringue de tuberculination. Le rasage du site d'injection est facultatif. Toute perte ou fuite au site de l'injection ou toute administration incomplète sont consignées. Le volume total injecté par rat par jour ne dépasse pas 0,5 ml/kg de poids corporel.

Mode opératoire spécifique pour les agonistes d'androgènes

43.   Dans les essais d'agonistes d'androgènes, le véhicule est le témoin négatif et le groupe traité par TP est le témoin positif. L'activité biologique correspondant aux agonistes d'androgènes est testée par administration d'une substance d'essai à des groupes de traitement aux doses choisies pendant 10 jours consécutifs. Les poids des cinq tissus sexuels accessoires des groupes recevant la substance d'essai sont comparés à ceux du groupe recevant le véhicule afin de déterminer des augmentations pondérales statistiquement significatives.

Modes opératoires spécifiques pour les antagonistes d'androgènes et les inhibiteurs de 5α-réductase

44.   En ce qui concerne les essais d'antagonistes d'androgènes et d'inhibiteurs de 5α-réductase, le groupe traité par TP joue le rôle de témoin négatif et le groupe recevant des doses de référence de TP et de FT coadministrées celui de témoin positif. L'activité biologique correspondant aux antagonistes d'androgènes et aux inhibiteurs de 5α-réductase est analysée par administration d'une dose de référence de TP et administration de la substance d'essai pendant 10 jours consécutifs. Les poids des cinq tissus sexuels accessoires des groupes recevant du TP plus la substance d'essai sont comparés à ceux du groupe ne recevant que TP de référence afin de déterminer des diminutions des poids statistiquement significatives.

OBSERVATIONS

Observations cliniques

45.   Des observations cliniques générales sont effectuées au moins une fois par jour et plus fréquemment si des signes de toxicité sont constatés. Il faut les conduire de préférence chaque jour à la (aux) mêmes(s) heure(s) et en tenant compte des prévisions des maxima d'effets après l'administration des doses. La mortalité, la morbidité et les signes cliniques généraux tels que les changements de comportement, les modifications de la peau, du pelage, des yeux et des muqueuses, l'apparition de sécrétions et d'excrétions et les activités végétatives (larmoiement, piloérection, taille des pupilles, respiration inhabituelle, par exemple) sont détectées sur tous les animaux.

46.   Tous les animaux décédés sont retirés et éliminés sans autre analyse de résultat. La mortalité des animaux avant l'autopsie de quelque nature que ce soit est incluse dans le dossier de l'étude ainsi que toutes les raisons apparentes de mortalité. Tous les animaux moribonds sont humainement sacrifiés. Tous les animaux moribonds et sacrifiés par la suite sont inclus dans le dossier de l'étude avec les causes apparentes de morbidité.

Poids corporel et consommation alimentaire

47.   Tous les animaux sont pesés quotidiennement à 0,1 g près, en commençant juste avant le début du traitement c'est-à-dire au moment de la répartition des animaux dans les groupes. La quantité de nourriture consommée durant la période de traitement peut éventuellement être mesurée cage par cage en pesant les distributeurs d'aliments. Ces données sur la consommation alimentaire sont exprimées en grammes par rat par jour.

Dissection et mesure des poids des tissus et des organes

48.   Environ 24 heures après la dernière administration de la substance d'essai, les rats sont sacrifiés et exsanguinés conformément aux protocoles habituels du laboratoire réalisant l'étude, puis l'autopsie est effectuée. La méthode humaine de sacrifice est consignée dans le rapport du laboratoire.

49.   Dans l'idéal, l'ordre dans lequel les groupes d'animaux sont autopsiés est aléatoire et ne suit pas l'ordre de croissance ou de décroissance des doses, ce qui pourrait affecter les données. Toutes les observations effectuées lors de l'autopsie, notamment les modifications pathologiques et les lésions visibles sont notées et consignées.

50.   Les cinq tissus dépendant des androgènes (PV, VS, EABC, COW, G) font l'objet de mesures. Ces tissus sont excisés, soigneusement débarrassés des tissus et des graisses adhérents en excès, et leurs poids frais (non fixé) est déterminé. Chaque tissu est manipulé avec un soin particulier afin d'éviter la perte de fluide et la dessiccation, susceptibles d'introduire des erreurs significatives et une variabilité par réduction des poids consignés. Certains tissus peuvent être très petits ou difficiles à disséquer, ce qui est source de variabilité. Par conséquent, il est important que les modes opératoires de dissection standard utilisés pour les tissus sexuels accessoires soient bien maîtrisés par les personnes chargées de cette tâche. Un manuel de modes opératoires normalisés pour la dissection est disponible auprès de l'OCDE (21). Une formation poussée basée sur le guide de modes opératoires normalisés limitera une source de variation potentielle dans l'étude. Dans l'idéal, le même prosecteur sera chargé de la dissection d'un tissu donné afin d'éliminer les différences de traitement des tissus propres aux individus. Si cette approche s'avère impossible, le programme d'autopsie est conçu de façon que chaque prosecteur dissèque un tissu donné de tous les groupes de traitement, et non pas tous les tissus d'un groupe témoin, tandis qu'un autre est responsable des groupes traités. Chaque tissu sexuel accessoire est pesé sans essuyage préalable à 0,1 mg près, et les poids sont notés pour chaque animal.

51.   Certains tissus sont très petits ou difficiles à disséquer, ce qui est source de variabilité. Des études précédentes ont indiqué un intervalle de coefficients de variation (CV) qui se révèle différent selon les compétences du laboratoire. Dans quelques cas, de grandes différences entre les poids absolus de tissus tels que la PV et les COW ont été observées au sein d'un laboratoire particulier.

52.   Les mesures de poids du foie, de la paire de reins et de la paire de glandes surrénales sont facultatives. Ces tissus sont également débarrassés de tous les fascias et graisses adhérents. Le foie est pesé et la mesure consignée à 0,1 g près et la paire de reins et la paire de glandes surrénales sont pesées et les mesures consignées à 0,1 mg près. Le foie, le rein et les glandes surrénales ne sont pas influencés uniquement par les androgènes; ils fournissent également des indices utiles sur la toxicité systémique.

53.   La mesure des teneurs sériques en hormone lutéinisante (LH), en hormone folliculo-stimulante (FSH) et en testostérone (T) est facultative. Les teneurs sériques en testostérone sont utiles pour déterminer si la substance de l'essai induit un métabolisme hépatique de la testostérone, susceptible de réduire les teneurs sériques. Si l'on ne dispose pas des données concernant la testostérone, cet effet pourrait paraître imputable à un mécanisme antiandrogénique. Les teneurs en LH livrent des informations sur la capacité d'un antiandrogène à réduire les poids des organes, mais également sur son aptitude à affecter la fonction hypothalamique-pituitaire, qui, dans les études à long terme, peut induire des tumeurs des testicules. La FSH est une hormone importante pour la spermatogénèse. La mesure des teneurs sériques en T4 et T3 est également facultative et peut fournir des informations additionnelles utiles sur la capacité à rompre l'homéostase de l'hormone thyroïdienne. En vue d'obtenir des mesures des teneurs en hormones, il faut anesthésier les rats avant l'autopsie et prélever du sang par ponction cardiaque, le procédé d'anesthésie étant choisi avec soin afin qu'il n'affecte pas la mesure des hormones. La méthode de préparation du sérum, la source des kits d'essai radio-immunologique ou d'autres techniques de mesure, les protocoles analytiques et les résultats sont consignés. Les teneurs en LH ainsi que les teneurs en testostérone sont notées en ng/ml de sérum.

54.   La description de la dissection des tissus est basée sur un guide de dissection détaillé qui contient des photographies et est publié sous forme de supplément intégré au programme de validation (21). La page web de la Food and Drug Administration coréenne propose également une vidéo présentant la dissection (22).

—	La surface ventrale de l'animal tournée vers le haut, déterminer si le prépuce du pénis s'est séparé du gland. Si c'est le cas, rétracter le prépuce et retirer le gland, le peser (à 0,1 mg près), et noter le poids.

—

Ouvrir la peau et la paroi abdominales, en exposant les viscères. S'il faut peser les organes facultatifs, prélever et peser le foie à 0,1 g près, prélever l'estomac et les intestins, prélever et peser à 0,1 mg près la paire de reins et la paire de glandes surrénales. Cette dissection expose la vessie et initie la dissection des tissus accessoires mâles cibles.

—

Afin de disséquer la PV, séparer la vessie de la couche musculaire ventrale en découpant le tissu conjonctif le long de la ligne médiane. Déplacer la vessie dans la direction antérieure vers les vésicules séminales (VS), en découvrant les lobes gauche et droit de la prostate ventrale (recouverts d'une couche de graisse). Gratter soigneusement la graisse des lobes droit et gauche de la PV. Écarter doucement le lobe droit de la PV de l'urètre et disséquer le lobe de l'urètre. Tout en maintenant toujours le lobe droit de la PV, écarter doucement le lobe gauche de la PV de l'urètre puis le disséquer; peser à 0,1 mg près et noter le poids.

—

Afin de disséquer la vésicule séminale plus les glandes coagulantes (VSGC), déplacer la vessie en direction caudale, exposer le canal déférent et les lobes droit et gauche des VSGC. Empêcher la fuite du fluide par clampage d'une pince hémostatique à la base des VSGC, au point où le canal déférent rejoint l'urètre. Disséquer soigneusement les VSGC, en maintenant la pince hémostatique en place, retirer la graisse et les annexes, les placer dans une coupelle de pesée tarée, retirer la pince hémostatique et peser à 0,1 mg près, puis noter le poids.

—

Afin de disséquer les muscles élévateurs de l'anus et bulbo-caverneux (EABC), les muscles et la base du pénis sont exposés. Les muscles EA enveloppent le colon, tandis que les muscles EA antérieur et BC sont attachés aux bulbes péniens. La peau et les annexes de la région périanale qui s'étendent de la base du pénis jusqu'à l'extrémité antérieure de l'anus sont retirés. Les muscles BC sont progressivement disséqués du bulbe pénien et des tissus. Le colon est coupé en deux, et la totalité de l'EABC peut être disséquée et retirée. L'EABC est débarrassé des graisses et des annexes, pesé à 0,1 mg près, puis le poids est noté.

—

Après retrait de l'EABC, les glandes de Cowper ou bulbo-urétrales (COW) rondes sont visibles à la base des bulbes péniens et en position légèrement dorsale. Il est nécessaire de procéder à une dissection soigneuse pour éviter de couper la capsule mince et empêcher toute fuite de fluide. Peser la paire de COW à 0,1 mg près et noter le poids.

—	En outre, lorsque du fluide s'échappe d'une glande quelle qu'elle soit au cours de l'autopsie et de la dissection, cette perte est consignée.

55.   Si l'évaluation de chaque substance chimique nécessite d'autopsier davantage d'animaux qu'il n'est raisonnable en un seul jour, le début de l'étude est échelonné sur 2 jours consécutifs, ce qui permettra d'échelonner l'autopsie et les tâches afférentes sur 2 jours. Dans ce type de répartition, il convient d'utiliser la moitié des animaux d'un groupe de traitement par jour.

56.   Les carcasses sont éliminées d'une manière appropriée après l'autopsie

RAPPORT

Données

57.   Les données sont consignées individuellement (à savoir poids corporel, poids des tissus sexuels accessoires, mesures facultatives et autres réponses et observations) et pour chaque groupe d'animaux (les moyennes et écarts types de toutes les mesures sont relevés). Les résultats sont résumés sous forme de tableaux faisant apparaître le nombre d'animaux au début de l'essai, le nombre d'animaux trouvés morts au cours de l'essai ou présentant des signes de toxicité, et une description de ces signes, notamment le moment de leur apparition, leur durée et leur gravité.

58.   Le rapport final contient les informations suivantes:

Établissement réalisant l'essai

—	Nom de l'établissement, adresse

—	Directeur de l'étude et autres membres du personnel ainsi que leur responsabilité dans l'étude

—	Dates de début et de fin de l'étude, c'est-à-dire premier jour d'administration de la substance d'essai et dernier jour de l'autopsie, respectivement

Substance d'essai

—	Source, numéro de lot, identité, pureté, adresse complète du fournisseur et caractérisation de la ou des substances d'essai

—	Nature physique et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques

—	Conditions de stockage et méthode et fréquence de préparation de la dilution

—	Données obtenues sur la stabilité, quelles qu'elles soient

—	Analyses des solutions/suspensions administrées, quelles qu'elles soient

Véhicule

—	Caractérisation du véhicule (identité, fournisseur et numéro de lot)

—	Justification du choix du véhicule (s'il ne s'agit pas d'eau)

Animaux expérimentaux et protocoles d'élevage des animaux

—	Espèce/souche utilisée et justification du choix

—	Source ou fournisseur des animaux, comprenant l'adresse complète

—	Nombre et âge des animaux fournis

—	Conditions d'hébergement (température, éclairage, etc.)

—	Régime alimentaire (nom, type, fournisseur, numéro de lot, contenu et si elles sont connues, teneurs en phytœstrogènes)

—	Litière (nom, type, fournisseur, contenu)

—	Conditions de logement en cage et nombre d'animaux par cage

Conditions de l'essai

—	Âge à la castration et durée de l'acclimatation après castration

—	Poids de chaque animal au début de l'étude (à 0,1 g près)

—	Procédé de randomisation et répartition dans les groupes de véhicule, de référence, de substance d'essai, et dans les cages

—	Moyenne et écart type des poids corporels dans chaque groupe chaque jour de pesée pendant toute l'étude

—	Justification du choix des doses

—	Voie d'administration de la substance d'essai et justification du choix de la voie d'exposition

—	S'il s'agit d'un essai pour déterminer l'antiandrogénicité, traitement par TP (dose et volume)

—	Traitement par la substance d'essai (dose et volume)

—	Moment d'administration

—	Modes opératoires d'autopsie, notamment moyens d'exsanguination et toutes les anesthésies

—	Dans le cas d'analyses du sérum, les détails de la méthode sont consignés. Par exemple, si l'on utilise un RIA, le mode opératoire de RIA, la source des kits de RIA, les dates d'expiration des kits, le mode opératoire de comptage par scintillation et l'étalonnage sont consignés.

Résultats

—	Observations quotidiennes de chaque animal pendant l'administration de la dose, notamment:

—	Poids corporels (à 0,1 g près)

—	Signes cliniques (le cas échéant)

—	Mesures ou notes sur la consommation d'aliments

—	Observations à l'autopsie de chaque animal, notamment:

—	Date de l'autopsie

—	Groupe de traitement de l'animal

—	ID de l'animal

—	Prosecteur

—	Moments de la journée auxquels sont réalisées l'autopsie et la dissection

—	Âge de l'animal

—	Poids corporel final à l'autopsie, en notant toute augmentation ou diminution statistiquement significative

—	Ordre d'exsanguination et de dissection des animaux à l'autopsie

—	Poids des cinq tissus cibles dépendant des androgènes:

—	Prostate ventrale (à 0,1 mg près)

—	Vésicules séminales plus glandes coagulantes, y compris les fluides (par paires à 0,1 mg près)

—	Complexe des muscles élévateurs de l'anus et bulbo-caverneux (à 0,1 mg près)

—	Glandes de Cowper (poids frais, par paires, à 0,1 mg près)

—	Gland (poids frais à 0,1 mg près)

—	Poids des tissus facultatifs, s'ils ont été mesurés:

—	Foie (à 0,1 mg près)

—	Reins (par paires à 0,1 mg près)

—	Glandes surrénales (par paires à 0,1 mg près)

—	Remarques générales et commentaires

—	Analyse des hormones sériques, le cas échéant — LH sérique (facultatif — ng/ml de sérum) et — T sérique (facultatif — ng/ml de sérum)

—	Remarques générales et commentaires

Résumé des données

Les données sont résumées sous forme de tableaux contenant la taille de l'échantillon pour chaque groupe, la moyenne de la valeur, et l'erreur type de la moyenne ou l'écart type. Les tableaux comprennent les poids corporels à l'autopsie, les variations du poids corporel entre le début de l'administration de la substance et l'autopsie, les poids des tissus sexuels accessoires cibles et tous les poids d'organes facultatifs.

Discussion des résultats

Analyse des résultats

59.   Les poids du corps et des organes à l'autopsie font l'objet d'une analyse statistique afin de déterminer des paramètres tels que l'homogénéité de la variance, à l'aide de transformations appropriées des données, selon les besoins. Les groupes de traitement sont comparés à un groupe témoin en utilisant des techniques telles que le test ANOVA, suivi de comparaisons par paires (par exemple test unilatéral de Dunnett) et les critères de différence statistique, par exemple p ≤ 0,05. Les groupes présentant une signification statistique sont identifiés. Néanmoins, il faut éviter les poids d'organe relatifs, car les hypothèses statistiques qui fondent cette manipulation de données sont invalides.

60.   En ce qui concerne l'agonisme des androgènes, le témoin est constitué du groupe d'essai recevant seulement le véhicule. Les caractéristiques du mode d'action d'une substance d'essai peuvent provoquer des réponses relatives différentes selon les tissus, par exemple, la trenbolone, qui ne peut être réduite en position 5α, exerce des effets plus prononcés sur l'EABC et le G que le TP. Une augmentation statistiquement significative (p ≤ 0,05) de deux des cinq poids de tissus dépendant des androgènes cibles ou plus (VP, EABC, G, GC et VSGC) peut être considérée comme un résultat positif d'agoniste d'androgènes, et tous les tissus cibles doivent alors présenter un degré quelconque d'augmentation de croissance. L'évaluation combinée de toutes les réponses de tissus d'organes sexuels annexes peut être réalisée au moyen d'une analyse de données multivariées appropriée. L'analyse peut ainsi être affinée, en particulier dans les cas où un seul tissu donne une réponse statistiquement significative.

61.   Pour étudier l'antagonisme des androgènes, le témoin est constitué du groupe d'essai avec l'androgène de référence (propionate de testostérone seulement). Les caractéristiques du mode d'action d'une substance d'essai peuvent aboutir à des réponses relatives différentes entre les tissus, par exemple les inhibiteurs de 5α-réductase, comme le finastéride, exercent des effets plus prononcés sur la prostate ventrale que sur d'autres tissus par rapport à des antagonistes de RA puissants, comme le flutamide. Une réduction statistiquement significative (p ≤ 0,05) de deux des cinq poids de tissus dépendant des androgènes cibles ou plus (VP, EABC, G, GC et V SGC) par rapport au traitement par TP seul peut être considérée comme un résultat positif d'antagoniste d'androgènes, et tous les tissus cibles doivent alors présenter une réduction de croissance à un degré quelconque. L'évaluation combinée de toutes les réponses de tissus d'organes sexuels annexes peut être réalisée au moyen d'une analyse de données multivariées appropriée. L'analyse peut ainsi être affinée, en particulier dans les cas où un seul tissu donne une réponse statistiquement significative.

62.   Les données seront résumées sous forme de tableaux contenant la moyenne, l'erreur type de la moyenne (l'écart type est également acceptable) et la taille d'échantillon pour chaque groupe. Des tableaux de données individuelles devront également être inclus. Les valeurs individuelles, la moyenne, l'erreur type (écart type) et les valeurs de CV des résultats du témoin devront être examinées afin de déterminer si elles respectent les critères acceptables de cohérence avec les valeurs historiques attendues. Si les CV sont supérieures aux valeurs de CV indiquées dans le tableau 1 (voir paragraphe 25 et 26), il faudra déterminer, pour chaque poids d'organe, si des erreurs entachent l'enregistrement ou l'entrée des données ou si le laboratoire ne maîtrise pas encore la dissection soignée des tissus dépendant des androgènes et si un complément de formation ou de pratique serait justifié. Habituellement, les CV (écart type divisé par poids moyen de l'organe) sont reproductibles d'un laboratoire à l'autre et d'une étude à l'autre. Les données présentées incluent au moins les poids de prostate ventrale, de vésicule séminale, de muscles élévateurs de l'anus et bulbo-caverneux, des glandes de Cowper, du gland, du foie et les poids corporels ainsi que la variation de poids corporel entre le début de l'administration des doses et l'autopsie. Les données peuvent également être présentées après ajustement de covariance du poids corporel, mais sans omettre la présentation des données non ajustées. De surcroît, s'il n'y a pas séparation préputiale dans l'un quelconque des groupes, l'incidence de la séparation est notée et statistiquement comparée au groupe témoin en utilisant un test exact de Fisher.

63.   Lors de la vérification des entrées des résultats dans l'ordinateur par comparaison aux fiches de résultats originelles afin d'en déterminer la précision, les valeurs de poids d'organes qui ne sont pas biologiquement plausibles ou varient de plus de trois écarts types par rapport à celles du groupe de traitement sont minutieusement examinées, et il faudra peut-être les rejeter comme étant vraisemblablement des erreurs de relevés.

64.   La comparaison des résultats de l'étude avec les valeurs de CV de l'OCDE (dans le tableau 1) représente souvent une étape importante de l'interprétation en termes de validité des résultats de l'étude. Les données historiques concernant les groupes témoins qui ont reçu le véhicule sont conservées au laboratoire. Les données historiques concernant les réponses à des substances de référence positives, telles que TP et FT, sont également conservées au laboratoire. Les laboratoires peuvent de surcroît tester périodiquement la réponse à des agonistes et à des antagonistes d'androgènes faibles connus et conserver ces résultats. Ces données peuvent être comparées aux données dont dispose l'OCDE pour s'assurer que les méthodes du laboratoire présentent une précision statistique et une puissance statistique suffisantes.

NOTES SE RAPPORTANT AU CADRE CONCEPTUEL

Note 1:

Il est possible d'entrer dans le cadre et d'en sortir à tous les niveaux, suivant la nature des informations nécessaires à des fins d'évaluation des dangers et des risques.

Note 2:

Le niveau 5 relatif à l'écotoxicologie devrait inclure des indicateurs mettant en évidence le mode d'action des effets néfastes et d'éventuels dégâts au niveau des populations.

Note 3:

S'il existe un modèle multimodal couvrant plusieurs des essais fournissant des données sur un seul indicateur, ce modèle remplace ces essais.

Note 4:

L'évaluation de chaque substance chimique est à effectuer au cas par cas, à la lumière de toutes les informations disponibles et compte tenu de la fonction des niveaux du cadre.

Note 5:

La version actuelle du cadre ne doit pas être considérée comme exhaustive. Aux niveaux 3, 4 et 5, elle inclut des essais déjà disponibles ou en cours de validation. Ces derniers sont provisoirement inclus; ils seront confirmés une fois mis au point et validés.

Note 6:

La portée des essais du niveau 5 n'est pas strictement limitée. Les essais incorporés à ce niveau servent à l'évaluation des dangers et des risques.

BIBLIOGRAPHIE

(1)

OCDE (1988), Rapport de la première réunion du Groupe d'étude de l'OCDE sur l'essai et l'évaluation des perturbateurs endocriniens (EDTA), 10 et 11 mars 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(2)

Dorfman, R.I. (1962), Standard Methods Adopted by Official Organization, Academic Press, NY.

(3)

Gray, L.E. Jr, Furr, J., et Ostby, J.S. (2005), Hershberger assay to investigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandrogenic activity in castrate-immature male rats, in Current Protocols in Toxicology, 16.9.1-16.9.15, J. Wiley and Sons Inc.

(4)

OCDE (2006), Final OECD report of the initial work towards the validation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide, Environmental Health and Safety, Monograph, Series on Testing and Assessment, No. 62, ENV/JM/MONO(2006)30.

(5)

OCDE (2008), Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Laboratories, Environmental Health and Safety, Monograph, Series on Testing and Assessment, No. 86, ENV/JM/MONO(2008)3.

(6)

OCDE (2007), Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol, Environmental Health and Safety, Monograph, Series on Testing and Assessment, No. 73, ENV/JM/MONO(2007)20.

(7)

Owens, W., Zeiger, E., Walker, M., Ashby, J., Onyon, L., et Gray, L.E. Jr (2006), The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol, Env. Health Persp., 114:1265-1269.

(8)

Owens, W., Gray, L.E., Zeiger, E., Walker, M., Yamasaki, K., Ashby, J., Jacob, E. (2007), The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies, Environ. Health Perspect., 115(5):671-8.

(9)

Korenchevsky, V. (1932), The assay of testicular hormone preparations, Biochem. J., 26:413-422.

(10)

Korenchevsky, V., Dennison, M., et Schalit, R. (1932), The response of castrated male rats to the injection of the testicular hormone, Biochem. J., 26:1306-1314.

(11)

Eisenberg, E., et Gordan, G.S. (1950), The levator ani muscle of the rat as an index of myotrophic activity of steroidal hormones, J. Pharmacol. Exp. Therap., 99:38-44.

(12)

Eisenberg, E., Gordan, G.S., et Elliott, H.W. (1949), Testosterone and tissue respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity, Endocrinology, 45:113-119.

(13)

Hershberger, L., Shipley, E., et Meyer, R. (1953), Myotrophic activity of 19-nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani muscle method, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 83:175-180.

(14)

Hilgar, A.G., et Vollmer, E.P. (1964), Endocrine bioassay data: Androgenic and myogenic, Washington DC: United States Public Health Service.

(15)

Dorfman, R.I. (1969), Androgens and anabolic agents, in Dorfman, R.I. (ed) Methods in Hormone Research, volume IIA, New York, Academic Press, 151-220.

(16)

Massaro, E.J. (2002), Handbook of Neurotoxicology, volume I, New York, Humana Press, p. 38.

(17)

OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Publications Hygiène et Sécurité de l'environnement — Série sur les essais et évaluations, no 19, ENV/JM/MONO(2000)7.

(18)

OCDE (1982), Organisation de coopération et de développement économiques — Principes de l'OCDE relatifs aux bonnes pratiques de laboratoire, ISBN 92-64-12367-9, Paris.

(19)

OCDE (2008), Toxicité orale aiguë — Méthode de l'ajustement des doses. Lignes directrices de l'OCDE pour les essais de produits chimiques no 425.

(20)

OCDE (2001), Document d'orientation sur les essais de toxicité orale aiguë, Publications Hygiène et Sécurité de l'environnement — Série sur les essais et évaluations, no 24, ENV/JM/MONO(2001)4.

(21)

Supplemental materials for Owens e.a. (2006), The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol, Env. Health Persp., 114:1265-1269. Voir section II, “The dissection guidance provided to the laboratories”: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf

(22)

Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hershberger assay procedure, including a dissection video, http://rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education fr.html

(23)

OCDE (2008), Background Review Document on the Rodent Hershberger Bioassay, Environmental Health and Safety, Monograph, Series on Testing and Assessment, No. 90, ENV/JM/MONO(2008)17.

(24)

OCDE (2008), Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.

(25)

OCDE (2009), Guidance Document on the Weanling Hershberger Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties, Series on Testing and Assessment, No. 115.

(26)

Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifques (JO L 276 du 20.10.2010, p. 33).

(27)

Les chapitres suivants de la présente annexe:   B.1 bis, Toxicité orale aiguë — Méthode de la dose prédéterminée   B.1 ter, Toxicité orale aiguë — Méthode de la classe de toxicité aiguë

B.56   ÉTUDE ETENDUE DE TOXICITE POUR LA REPRODUCTION SUR UNE GENERATION

INTRODUCTION

1.   La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice pour les essais de produits chimiques no 443 (2012) de l'OCDE. Elle s'appuie sur un projet d'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération F1 réalisée au cours des différents stades de la vie, proposé par le comité technique ACSA (Agricultural Chemical Safety Assessment) du Health and Environmental Sciences Institute (HESI) de l'ILSI (Institut international Life Science Institute), tel que publié dans Cooper e.a., 2006 (1). Plusieurs améliorations et clarifications ont été apportées à la méthodologie de l'étude afin de la rendre adaptable et de mettre en valeur l'importance de s'appuyer sur les connaissances existantes, tout en mettant à profit les observations en cours d'étude pour orienter et développer l'essai. La présente méthode d'essai fournit une description détaillée du mode opératoire de l'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération. Elle décrit trois cohortes d'animaux de génération F1:

cohorte 1: évaluation des effets observés sur la reproduction/le développement; cette cohorte peut ensuite être étendue à des animaux de génération F2,

cohorte 2: évaluation de l'impact potentiel de l'exposition aux produits chimiques sur le développement du système nerveux,

cohorte 3: évaluation de l'impact potentiel de l'exposition aux produits chimiques sur le développement du système immunitaire.

2.   Il convient que les décisions d'étendre l'évaluation à une deuxième génération et d'exclure les cohortes servant à déterminer la neurotoxicité pour le développement et/ou l'immunotoxicité pour le développement soient prises sur la base des connaissances existantes concernant la substance d'essai, ainsi que des impératifs fixés par différentes autorités réglementaires. La présente méthode d'essai vise à détailler la manière dont l'étude peut être menée et dont il convient d'évaluer les diverses cohortes.

3.   La procédure étayant la décision de déclencher en cours d'étude la production d'une seconde génération est décrite dans le document d'orientation no 117 de l'OCDE (39) à l'intention des autorités réglementaires recourant aux déclencheurs internes.

REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET OBJECTIFS

4.   L'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération vise principalement à évaluer les étapes de la vie non couvertes par les autres types d'études de toxicité et à examiner les effets potentiels d'une exposition pré- et postnatale aux produits chimiques. Pour mesurer les effets sur la reproduction, on songera d'abord à utiliser, s'ils sont disponibles, les résultats d'études à doses répétées [notamment études de dépistage de la toxicité pour la reproduction, comme la ligne directrice 422 de l'OCDE (32)], ou d'essais de dépistage à court terme des perturbateurs endocriniens, [par exemple bioessai utérotrophique — méthode d'essai B.54 (36); bioessai de Hershberger, méthode d'essai B.55 (37)] pour mettre en évidence un impact sur les organes reproducteurs mâles et femelles. Ces résultats porteront par exemple sur la spermatogenèse (examen histopathologique des testicules) chez les mâles et sur les cycles œstraux, la numération des follicules/maturation des ovocytes et l'intégrité des ovaires (examen histopathologique) chez les femelles. L'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération permet donc d'examiner les effets sur la reproduction à partir d'interactions entre mâles et femelles, entre femelles et conceptus, et entre femelles et descendants et sur la génération F1 après la maturité sexuelle [voir document d'orientation no 151 en appui à la présente méthode d'essai (40)].

5.   La présente méthode d'essai est élaborée en vue de permettre l'évaluation des effets pré- et postnataux de produits chimiques sur le développement, ainsi que l'examen exhaustif de la toxicité systémique chez les femelles gravides et allaitantes et chez la descendance (petits et adultes). L'examen détaillé des principaux effets sur le développement, comme la viabilité de la descendance, la santé des nouveau-nés, le niveau de développement à la naissance et le développement physique et fonctionnel jusqu'à l'âge adulte, doit permettre de repérer les organes cibles spécifiques chez les descendants. En outre, l'étude fournira et/ou confirmera des informations quant aux effets de la substance d'essai sur l'intégrité et le fonctionnement des appareils reproducteurs mâles et femelles chez l'adulte. On tiendra notamment compte des paramètres suivants, sans s'y limiter: fonction gonadique, cycle œstral, maturation des spermatozoïdes dans l'épididyme, comportement d'accouplement, conception, gestation, mise bas et lactation. Par ailleurs, les résultats de l'évaluation de la neurotoxicité pour le développement et de l'immunotoxicité pour le développement caractériseront les effets potentiels sur ces systèmes. Les données découlant de ces essais devront permettre de déterminer les concentrations sans effet nocif observé (CSENO), les concentrations minimales avec effet nocif observé (CMENO) et/ou les doses de référence pour les divers effets évalués, et/ou servir à caractériser les effets repérés dans des études à doses répétées antérieures et/ou à orienter les essais ultérieurs.

6.   Le protocole est représenté schématiquement à la figure 1. La substance d'essai est administrée en continu à plusieurs groupes de mâles et femelles sexuellement matures, à différentes doses échelonnées suivant une gradation. Cette génération parentale (P) reçoit la substance pendant un temps défini avant l'accouplement (période fixée d'après les informations disponibles sur la substance d'essai, mais ne pouvant pas être inférieure à 2 semaines) puis pendant une période d'accouplement de 2 semaines. Les mâles P sont ensuite traités au moins jusqu'au sevrage de la génération F1. Leur traitement dure au minimum 10 semaines et peut être prolongé s'il y a lieu de clarifier les effets sur la reproduction. Le traitement des femelles P se poursuit pendant la gestation et l'allaitement jusqu'au sacrifice, après le sevrage de leurs portées (soit 8 à 10 semaines de traitement). La descendance F1 reçoit encore la substance d'essai du sevrage jusqu'à l'âge adulte. En cas d'évaluation d'une seconde génération [voir document d'orientation no 117 de l'OCDE (39)], la descendance F1 continue de recevoir le traitement jusqu'au sevrage des petits F2, ou jusqu'à la fin de l'étude.

7.   Tous les animaux subissent un examen clinique et pathologique destiné à mettre en évidence des signes de toxicité; cet examen s'attache particulièrement à l'intégrité et au fonctionnement des appareils reproducteurs mâles et femelles ainsi qu'à la santé, la croissance, le développement et la fonction reproductrice de la descendance. Au moment du sevrage, les descendants sélectionnés sont affectés à divers sous-groupes (cohortes 1 à 3, voir paragraphes 33 et 34 et figure 1) afin de faire l'objet d'évaluations supplémentaires, portant notamment sur la maturation sexuelle, l'intégrité et le fonctionnement des organes reproducteurs, les effets neurologiques et comportementaux, et les fonctions immunitaires.

8.   Lors de la réalisation de l'étude, il est recommandé de suivre les principes et considérations énoncés dans le document d'orientation no 19 de l'OCDE sur la reconnaissance, l'évaluation et l'utilisation des signes cliniques en tant qu'effets mesurés éthiquement acceptables dans les expérimentations animales menées à des fins d'évaluation de la sécurité (34).

9.   Quand un nombre suffisant d'études aura été conduit afin d'analyser l'impact de cette nouvelle méthode d'essai, celle-ci sera examinée et, si nécessaire, révisée à la lumière de l'expérience acquise.

Figure 1

Protocole de l'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération

DESCRIPTION DE LA MÉTHODE/PRÉPARATIONS POUR L'ESSAI

Animaux

Choix des espèces et des souches

10.   L'espèce utilisée pour l'étude de toxicité pour la reproduction est choisie avec soin en fonction de l'ensemble des données disponibles. Cependant, en raison de l'abondance des données existantes et de la comparabilité par rapport aux essais de toxicité générale, le choix se porte généralement sur le rat et les critères et recommandations présentés dans la présente méthode d'essai se rapportent à cette espèce. Si l'on utilise une autre espèce, il faut le justifier et adapter le protocole en conséquence. Les souches présentant un faible taux de fécondité ou une fréquence élevée d'anomalies du développement sont à éviter.

Âge, poids corporel et critères d'inclusion

11.   On utilisera des animaux parents sains, n'ayant pas été soumis à des expériences antérieures. L'étude porte à la fois sur les mâles et les femelles, lesquelles sont nullipares et non gravides. Les animaux P sont sexuellement matures, de poids similaire (à sexe identique) au début du traitement, d'âge similaire (environ 90 jours) au moment de l'accouplement, et représentatifs de l'espèce et de la souche étudiés. Ils sont acclimatés pendant au moins 5 jours après leur arrivée au laboratoire. Les animaux sont répartis au hasard entre groupes de traitement et groupes témoins, de manière que les poids moyens de chaque groupe soient comparables (c'est-à-dire à ± 20 % de la moyenne globale).

Conditions d'encagement et d'alimentation

12.   L'animalerie est à 22 °C (± 3 °C), avec une humidité relative située entre 30 et 70 %, l'idéal étant qu'elle soit maintenue entre 50 et 60 %. L'éclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Un régime alimentaire classique pour animaux de laboratoire, avec eau potable à satiété, conviendra. On contrôlera attentivement la teneur en phytœstrogènes de l'alimentation, qui est susceptible, si elle est élevée, de modifier certains effets sur la reproduction. Les régimes alimentaires standard à formulation libre, dans lesquels la teneur en substances œstrogéniques a été réduite, sont recommandés (2) (30). Le choix des aliments sera guidé par la nécessité d'assurer un mélange convenable de la substance d'essai, lorsque celle-ci est administrée dans les aliments. Il convient de vérifier la concentration, l'homogénéité et la stabilité de la substance d'essai dans l'alimentation. La nourriture et l'eau de boisson seront analysées régulièrement pour rechercher des contaminants. Des échantillons de chaque lot de nourriture utilisé au cours de l'étude sont conservés dans des conditions appropriées (par exemple congelés à – 20 °C), jusqu'à la finalisation du rapport, dans l'éventualité où les résultats exigeraient une analyse supplémentaire des ingrédients consommés.

13.   Les animaux sont encagés par petits groupes d'individus de même sexe recevant la même dose. On envisagera un encagement individuel pour éviter d'éventuelles blessures (par exemple entre mâles après la période d'accouplement). Il convient que l'accouplement se déroule dans des cages propices à cette fin. Dès constatation de la copulation, les femelles présumées gravides sont hébergées séparément dans des cages destinées à la mise bas ou à la maternité, où leur sont fournis des matériaux de nidification appropriés et déterminés. Les portées sont hébergées avec leur mère jusqu'au sevrage. Les animaux F1 sont encagés par petits groupes d'individus de même sexe et recevant la même dose, du sevrage au sacrifice. On peut encager les animaux individuellement si une nécessité scientifique le justifie. Le type de litière choisi contient le moins possible de phytœstrogènes.

Nombre et identification des animaux

14.   Normalement, chaque groupe d'essai ou groupe témoin contient un nombre de couples suffisant pour produire au moins 20 femelles gravides par groupe de dose. On cherche à obtenir suffisamment de gestations pour assurer une évaluation significative de l'action de la substance étudiée sur la fertilité, la gravidité et le comportement maternel de la génération P, ainsi que sur la croissance et le développement de la descendance F1, depuis la conception jusqu'à la maturité. Si le nombre de femelles gravides souhaité n'est pas atteint, l'étude n'est pas nécessairement invalidée et chaque échec sera analysé au cas par cas pour rechercher d'éventuels liens de cause à effet avec la substance d'essai.

15.   Chaque animal P se voit attribuer un numéro d'identification unique avant le début du traitement. Si les données historiques du laboratoire suggèrent qu'une part importante des femelles est susceptible de ne pas présenter des cycles œstraux réguliers (de 4 ou 5 jours), il est conseillé d'étudier les cycles œstraux avant d'administrer les doses. Une autre option consiste à agrandir les groupes de façon à garantir qu'au moins 20 femelles dans chaque groupe présentent des cycles œstraux réguliers (4 ou 5 jours) au moment de commencer le traitement. Tous les descendants F1 sont identifiés de manière unique lors du premier examen des nouveau-nés effectué le jour de leur naissance (jour postnatal: JPN 0) ou un jour après (JPN 1). Tout au long de l'étude, on gardera la trace de la portée d'origine de tous les animaux de la génération F1, puis de la génération F2 si elle est produite.

Substance d'essai

Informations disponibles sur la substance d'essai

16.   Il importe d'examiner les données existantes pour choisir la voie d'administration, le véhicule et l'espèce utilisée, sélectionner les doses et éventuellement adapter le programme de traitement. Ainsi, il convient que la planification d'une étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération tienne compte de toutes les informations pertinentes disponibles concernant la substance d'essai, à savoir propriétés physico-chimiques, toxicocinétiques (y compris métabolisme propre à l'espèce) et toxicodynamiques, relations structure-activité (RSA), mécanismes métaboliques in vitro, résultats des études de toxicité antérieures et données utiles sur les analogues de structure. Certaines informations préliminaires sur l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'élimination (ADME), ainsi que sur la bioaccumulation, peuvent être déduites de la structure chimique, des données physico-chimiques, de la capacité de liaison aux protéines plasmatiques ou des études toxicocinétiques; les résultats des études de toxicité livrent des informations supplémentaires, notamment sur la CSENO, le métabolisme ou l'induction du métabolisme.

Prise en compte des données toxicocinétiques

17.   Même si elles ne sont pas obligatoires, les données toxicocinétiques tirées d'études antérieures préliminaires de détermination des concentrations ou autres études sont extrêmement utiles pour planifier l'étude, sélectionner les niveaux de dose et interpréter les résultats. Sont particulièrement utiles les données qui: 1) vérifient l'exposition à la substance d'essai (ou à ses métabolites importants) des fœtus et des petits en cours de développement, 2) livrent une estimation de la dosimétrie interne et 3) évaluent la saturation potentielle des mécanismes cinétiques en fonction de la dose. Il convient aussi de prendre en compte, lorsqu'elles sont disponibles, d'autres informations toxicocinétiques comme le profil des métabolites, la fonction concentration-temps, etc. On pourra aussi recueillir pendant l'étude principale des données toxicocinétiques supplémentaires, à condition que cela n'interfère pas avec la détermination et l'interprétation des principaux effets étudiés.

En règle générale, les données toxicocinétiques suivantes seront utiles pour planifier l'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération:

—	en fin de gestation (par exemple au 20e jour de gestation) — sang de la mère et du fœtus,

—	au milieu de l'allaitement (JPN 10) — sang maternel, sang du petit et/ou lait,

—	peu après le sevrage (par exemple JPN 28) — échantillons sanguins des petits sevrés.

La souplesse sera de mise dans la détermination des substances spécifiques à analyser (par exemple la substance parente et/ou ses métabolites) et du programme d'échantillonnage. Par exemple, le nombre et le moment des prélèvements d'échantillons le jour prévu dépendront des voies d'exposition et des connaissances existantes concernant les propriétés toxicocinétiques chez les animaux non gravides. Quand la substance d'essai est administrée dans la nourriture, il suffit de prélever les échantillons à heure fixe les jours concernés, tandis que pour l'administration par gavage, des prélèvements supplémentaires peuvent s'avérer nécessaires dans la même journée pour obtenir une meilleure estimation de la gamme des doses internes. Il n'est toutefois pas nécessaire de tracer l'intégralité de la fonction concentration-temps, pour quelque jour de prélèvement que ce soit. Si nécessaire, les prélèvements sanguins destinés aux analyses des fœtus et des nouveau-nés peuvent être regroupés par sexe pour une même portée.

Voie d'administration

18.   Il convient que le choix de la voie d'administration tienne compte de la voie ou des voies les plus appropriées à l'exposition humaine. Bien que le protocole prévoie l'administration de la substance d'essai dans la nourriture, il peut être modifié au profit d'une autre voie (eau de boisson, gavage, inhalation, voie cutanée), en fonction des caractéristiques de la substance chimique et des informations recherchées.

Choix du véhicule

19.   S'il y a lieu, la substance d'essai est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule approprié. On recommande, si possible, de recourir en priorité à une solution ou suspension aqueuse, ou à défaut à une solution ou suspension huileuse (par exemple dans l'huile de maïs). Si le véhicule n'est pas aqueux, il convient que sa toxicité soit connue. Les véhicules susceptibles de présenter une toxicité intrinsèque sont à proscrire (par exemple acétone, DMSO). Il faut déterminer la stabilité de la substance d'essai dans le véhicule. Il convient en outre de tenir compte des caractéristiques suivantes lorsqu'un véhicule ou un autre adjuvant est utilisé pour faciliter l'administration: effets sur l'absorption, la répartition, le métabolisme ou la rétention de la substance d'essai; effets sur les propriétés chimiques de la substance d'essai susceptibles de modifier sa toxicité; effets sur la consommation de nourriture ou d'eau et sur l'état nutritionnel des animaux.

Choix des doses

20.   Normalement, l'étude porte sur au moins trois niveaux de dose et un témoin concomitant. Pour sélectionner les niveaux de dose appropriés, l'expérimentateur tient compte de toutes les informations disponibles, y compris les données relatives au dosage des études antérieures, les résultats toxicocinétiques concernant les animaux gravides ou non gravides, l'importance du transfert dans le lait, et les estimations de l'exposition humaine. Si les données toxicocinétiques disponibles indiquent une saturation des mécanismes toxicocinétiques en fonction de la dose, on s'efforcera d'éviter les doses élevées induisant clairement une saturation, à condition, bien entendu, que les expositions humaines attendues soient bien inférieures à ce seuil de saturation. Le niveau de la dose maximale devra alors correspondre au point d'inflexion vers un comportement toxicocinétique non linéaire, ou lui être légèrement supérieur.

21.   À défaut de données toxicocinétiques pertinentes, les niveaux de dose sont définis en fonction des effets toxiques, dans la limite des propriétés physiques/chimiques de la substance d'essai. Si les niveaux de dose sont fixés d'après la toxicité, la dose maximale est celle qui induit une certaine toxicité systémique, sans provoquer de décès ni de souffrances aiguës des animaux.

22.   On sélectionnera une séquence de doses décroissantes afin de mettre en évidence une éventuelle relation dose-effet et de déterminer les CSENO ou les doses proches de la limite de détection, ce qui permettra de déduire une dose de référence pour le(s) paramètre(s) d'évaluation le(s) plus sensible(s). Pour éviter des écarts de dose importants entre CSENO et CMENO, le recours à des multiples de deux ou quatre est généralement optimal. L'adjonction d'un quatrième groupe d'essai est souvent préférable à l'application d'intervalles très espacés (par exemple supérieur à un facteur 10) entre les doses.

23.   Les animaux du groupe témoin sont manipulés de la même manière que les animaux traités, à l'exception du fait qu'ils ne reçoivent pas la substance d'essai. Ce groupe témoin ne sera pas traité ou recevra un placebo, ou le véhicule si l'administration de la substance d'essai en nécessite un. Si un véhicule est employé, les animaux du groupe témoin devront recevoir le plus grand volume utilisé de ce véhicule.

Essai limite

24.   Si des essais à doses répétées conduits à une dose d'au moins 1 000 mg/kg de poids corporel/jour ne produisent aucun effet toxique observable, ou s'il n'y a pas de raison de penser que la substance est toxique compte tenu des données dont on dispose au sujet de composés présentant une structure et/ou une action métabolique similaires et des propriétés métaboliques in vivo/in vitro similaires, il n'est pas indispensable de mener une étude complète sur plusieurs doses différentes. Dans cette éventualité, l'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération se limitera à un groupe témoin et à une dose unique d'au moins 1 000 mg/kg de poids corporel/jour. Cependant, si cette dose limite provoque des signes de toxicité pour la reproduction ou le développement, d'autres études conduites à des doses inférieures s'imposent pour définir une CSENO. Ces remarques concernant l'essai limite ne sont valables que si le niveau de l'exposition humaine n'implique pas d'évaluer des doses supérieures.

PROTOCOLES

Exposition de la descendance

25.   On privilégiera l'administration dans la nourriture comme voie d'exposition. Dans le cas des études par gavage, il faut noter que, normalement, les petits ne recevront la substance d'essai qu'indirectement par le lait maternel jusqu'à ce qu'on leur administre la dose directement, à partir du sevrage. Lorsque la substance d'essai est mélangée à la nourriture ou à l'eau de boisson, les petits recevront aussi la substance d'essai directement, dès qu'ils commenceront à s'alimenter tout seuls pendant la dernière semaine d'allaitement. La méthodologie est modifiée lorsque l'excrétion de la substance d'essai dans le lait est faible ou que l'exposition continue de la descendance n'est pas avérée. Dans ces cas, on envisagera de traiter directement les petits pendant l'allaitement en fonction des données toxicocinétiques disponibles, de la toxicité pour la descendance ou de l'évolution des biomarqueurs (3), (4). Il convient d'évaluer soigneusement les avantages et les inconvénients avant la mise en œuvre d'études d'administration directe aux petits allaités (5).

Programme de traitement et administration des doses

26.   Il se peut qu'on dispose d'informations sur les cycles œstraux, de données histopathologiques sur les tractus reproducteurs mâles et femelles et d'analyses des spermatozoïdes testiculaires/épididymaires provenant d'études de toxicité à doses répétées antérieures d'une durée adéquate. Pour ce qui est de l'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération, la durée du traitement avant l'accouplement doit donc permettre de détecter les effets des modifications fonctionnelles susceptibles de perturber le comportement d'accouplement et la fertilisation. Il convient que le traitement avant l'accouplement dure suffisamment longtemps pour atteindre des conditions d'exposition stables chez les mâles et les femelles P. Généralement, une période de 2 semaines conviendra pour les deux sexes. Chez les femelles, cette période correspond à 3 à 4 cycles œstraux complets et devrait suffire à identifier d'éventuels effets nocifs sur la cyclicité. Chez les mâles, elle correspond à la durée nécessaire à la migration des spermatozoïdes en maturation dans l'épididyme, et devrait permettre de détecter les effets posttesticulaires sur le sperme (au cours des derniers stades de la spermiation et de la maturation des spermatozoïdes épididymaires) au moment de l'accouplement. Au moment du sacrifice, quand l'examen histopathologique des testicules et épididymes et l'analyse des caractéristiques du sperme sont programmés, les mâles P et F1 auront donc été exposés à la substance d'essai pendant au moins un cycle entier de spermatogenèse [(6) (7) (8) (9) et document d'orientation no 151 de l'OCDE (40)].

27.   Les scénarios d'exposition des mâles avant l'accouplement peuvent être adaptés si des études antérieures ont clairement mis en évidence une toxicité testiculaire (anomalie de la spermatogenèse) ou des effets sur l'intégrité et le fonctionnement des spermatozoïdes. De la même manière, pour les femelles, l'existence d'effets avérés de la substance d'essai sur les cycles œstraux et, par conséquent, sur la réceptivité sexuelle peut motiver une modification des scénarios d'exposition avant l'accouplement. Dans certains cas particuliers, on pourra attendre de détecter des spermatozoïdes par frottis vaginal avant de commencer le traitement des femelles P [voir document d'orientation no 151 de l'OCDE (40)].

28.   Une fois que la durée de la période d'exposition avant l'accouplement est définie, les animaux sont traités en continu avec la substance d'essai, 7 jours sur 7 jusqu'à la nécropsie. Le mode d'administration sera le même pour tous les animaux. Le traitement se poursuivra pendant les deux semaines de la période d'accouplement et, pour les femelles P, au cours de la gestation puis de l'allaitement jusqu'à leur sacrifice après le sevrage. Les mâles seront traités de la même façon jusqu'à leur sacrifice, au moment du sevrage des animaux F1. En ce qui concerne la nécropsie, la priorité est donnée aux femelles qui seront nécropsiées le même jour ou un jour similaire de lactation. La nécropsie des mâles peut s'étaler sur un plus grand nombre de jours, selon les équipements du laboratoire. À moins d'avoir débuté pendant la période de lactation, l'administration de la substance d'essai directement aux mâles et femelles F1 sélectionnés commence au moment du sevrage et se poursuit jusqu'à la date programmée pour la nécropsie, en fonction de la cohorte.

29.   Il importe de s'assurer que les quantités de substance administrées dans la nourriture ou l'eau de boisson n'interfèrent pas avec la nutrition ou l'équilibre hydrique. Lorsque la substance d'essai est ajoutée à la nourriture, deux possibilités sont offertes: soit le maintien d'une concentration constante dans les aliments (ppm), soit le maintien d'un niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux; il y a lieu de préciser l'option retenue.

30.   Si la substance d'essai est administrée par gavage, le volume maximal de liquide administré en une seule fois ne dépasse pas 1 ml/l00 g de poids corporel (0,4 ml/100 g de poids pour l'huile, de maïs par exemple). S'il ne s'agit pas de substances irritantes ou corrosives dont les effets doivent en principe s'intensifier aux concentrations supérieures, on réduira au minimum la variabilité du volume d'essai en adaptant les concentrations de façon à obtenir un volume constant à toutes les doses. Le produit est administré chaque jour à heure fixe. La dose reçue par chaque animal est normalement calculée sur la base de la pesée la plus récente de l'animal, et est ajustée au moins une fois par semaine pour les mâles adultes et les femelles adultes non gravides, et tous les deux jours pour les femelles gravides et les descendants F1 si elle est administrée avant le sevrage et pendant les deux semaines qui suivent le sevrage. Si les données toxicocinétiques indiquent un faible transfert de la substance d'essai dans le placenta, il faudra éventuellement revoir la dose administrée par gavage pendant la dernière semaine de gestation afin d'éviter de traiter la mère avec une dose excessivement toxique. Le jour de la mise bas, les femelles ne sont pas traitées par gavage ou toute autre voie d'administration impliquant la manipulation de l'animal; il est en effet préférable de ne pas les traiter ce jour-là plutôt que de perturber le processus de la naissance.

Accouplement

31.   Chaque femelle P est placée avec un seul mâle non apparenté choisi au hasard dans le même groupe de dose (accouplement 1:1) jusqu'à ce que la copulation soit avérée ou pendant deux semaines. Si le nombre de mâles est insuffisant, en raison par exemple de décès de mâles avant la mise en couple, on pourra placer un ou plusieurs des mâles s'étant déjà accouplé(s) avec une seconde femelle (1:1), afin que toutes les femelles aient un partenaire. Le jour 0 de la gestation est celui où l'accouplement est avéré (observation de sperme ou d'un bouchon vaginal). Les animaux sont séparés dès que possible une fois que la copulation a été confirmée. Si les animaux ne se sont toujours pas accouplés au bout de deux semaines, ils sont séparés sans autre tentative d'accouplement. Les couples sont clairement identifiés dans les résultats.

Taille des portées

32.   Au quatrième jour après la naissance, on peut ajuster la taille de chaque portée en éliminant des petits surnuméraires choisis au hasard, afin de s'approcher autant que possible du nombre de cinq mâles et cinq femelles par portée. Il ne convient pas de procéder à une élimination sélective des petits, par exemple basée sur le poids corporel. Lorsque le nombre de petits mâles et femelles est tel qu'il empêche de disposer de cinq animaux de chaque sexe par portée, il est acceptable de procéder à des ajustements partiels (par exemple six mâles et quatre femelles).

Sélection des petits pour les études après le sevrage (voir figure 1)

33.   Au moment du sevrage (vers le JPN 21), on sélectionne des petits de toutes les portées disponibles, avec un maximum de 20 portées par groupe de dose et témoin, afin de les soumettre à des examens ultérieurs et de les élever jusqu'à la maturation sexuelle (sauf si des essais sont nécessaires avant). La sélection des petits est aléatoire, si ce n'est qu'il convient d'écarter les individus clairement chétifs (dont le poids corporel est inférieur de plus de deux écarts-types au poids moyen des petits de la même portée), dans la mesure où ils ne sont sans doute pas représentatifs du groupe de traitement.

Au JPN 21, les petits F1 sélectionnés sont affectés au hasard à l'une des trois cohortes d'animaux suivantes:

cohorte 1 (1A et 1B)= essai de toxicité pour la reproduction/le développement,

cohorte 2 (2A et 2B)= essai de neurotoxicité pour le développement,

cohorte 3= essai d'immunotoxicité pour le développement.

Cohorte 1A: un mâle et une femelle/portée/groupe (20/sexe/groupe): sélection prioritaire pour l'évaluation primaire des effets sur l'appareil reproducteur et de la toxicité générale.

Cohorte 1B: un mâle et une femelle/portée/groupe (20/sexe/groupe): sélection prioritaire pour l'évaluation ultérieure de la capacité de reproduction lors de l'accouplement d'animaux F1 [voir document d'orientation no 117 de l'OCDE (39)] et pour obtenir des informations histopathologiques supplémentaires dans le cas d'agents présumés toxiques pour la reproduction ou le système endocrinien, ou quand les résultats de la cohorte 1A sont équivoques.

Cohorte 2A: total de 20 petits par groupe (10 mâles et 10 femelles par groupe; 1 mâle ou 1 femelle par portée) destinés à des tests neurocomportementaux suivis d'un examen neurohistopathologique à l'âge adulte.

Cohorte 2B: total de 20 petits par groupe (10 mâles et 10 femelles par groupe; 1 mâle ou 1 femelle par portée) destinés à un examen neurohistopathologique au moment du sevrage (JPN 21 ou JPN 22). Si les animaux ne sont pas assez nombreux, ils seront affectés en priorité à la cohorte 2A.

Cohorte 3: total de 20 petits par groupe (10 mâles et 10 femelles par groupe, dont 1 individu par portée, si possible). Il pourra y avoir lieu d'utiliser des petits supplémentaires issus du groupe témoin, qui serviront de témoins positifs pour l'essai de réponse anticorps dépendante des lymphocytes T, au JPN 56 ± 3.

34.   Si l'une des portées ne compte pas suffisamment de petits pour toutes les cohortes, ils sont affectés en priorité à la cohorte 1, qui peut ensuite servir à produire une génération F2. Il est possible d'affecter davantage de petits à l'une des cohortes en cas de préoccupations spécifiques, par exemple quand une substance chimique est présumée neurotoxique, immunotoxique ou reprotoxique. Ces petits pourront servir à des examens menés à des moments différents ou pour l'évaluation d'effets supplémentaires. Les petits non affectés aux cohortes feront l'objet d'un examen biochimique clinique (paragraphe 55) et d'une nécropsie macroscopique (paragraphe 68).

Second accouplement des animaux P

35.   On déconseille généralement de procéder à un second accouplement des animaux P, ce qui entraînerait la perte d'informations importantes sur le nombre de points d'implantation (et donc de données postimplantation et périnatales, indicatrices d'une éventuelle action tératogène) concernant la première portée. S'il y a lieu de vérifier ou d'élucider un effet chez les femelles exposées, il est préférable d'étendre l'étude à un accouplement de la génération F1. Cependant, il est toujours possible de procéder à un second accouplement des mâles P avec des femelles non traitées afin de clarifier les résultats équivoques ou pour mieux caractériser les effets sur la fertilité observés à la suite du premier accouplement.

OBSERVATIONS IN VIVO

Observations cliniques

36.   Les animaux P et F1 sélectionnés font l'objet d'une observation clinique générale quotidienne. Si l'administration se fait par gavage, ces observations cliniques auront lieu avant et après le traitement (pour rechercher d'éventuels signes de toxicité associés aux pics de concentration plasmatique). On note les changements de comportement pertinents, les signes de mise bas prolongée ou difficile et tous les signes de toxicité. Deux fois par jour, ou une fois par jour pendant le week-end, on surveille les manifestations de toxicité sévère, la morbidité et la mortalité sur l'ensemble des animaux.

37.   En outre, tous les individus P et F1 (après le sevrage) font l'objet une fois par semaine d'un examen plus détaillé, qu'il sera commode d'effectuer à l'occasion d'une pesée de l'animal, ce qui limitera le stress lié à la manipulation. Les observations sont effectuées avec soin et consignées conformément aux systèmes de cotation définis par le laboratoire d'essai. On s'attache particulièrement à réduire au minimum les variations affectant les conditions de l'essai. Les observations notées portent, sans que cette liste soit exhaustive, sur les modifications de la peau, de la fourrure, des yeux et des muqueuses, sur l'apparition de sécrétions et d'excrétions et sur les activités réflexes (par exemple larmes, érection des poils, diamètre de la pupille, rythme respiratoire inhabituel). Il convient également de noter tout changement dans la démarche ou la posture, les réactions à la manipulation ainsi que l'apparition de mouvements spasmodiques ou de contractures, de stéréotypes (par exemple toilettage excessif, circuits répétitifs) ou de comportements bizarres (par exemple automutilation, marche à reculons).

Poids corporel et consommation de nourriture et d'eau

38.   Les animaux P sont pesés le jour de la première administration et ensuite au moins une fois par semaine. En outre, les femelles P sont pesées pendant l'allaitement, les mêmes jours que la pesée des petits de leurs portées (voir paragraphe 44). Tous les animaux F1 sont pesés individuellement au moment du sevrage (JPN 21) et au moins chaque semaine par la suite. On relève aussi le poids corporel des animaux le jour où ils atteignent la puberté (séparation préputiale ou ouverture vaginale observables). Tous les animaux sont pesés au moment du sacrifice.

39.   Au cours de l'étude, la consommation de nourriture et d'eau (si la substance d'essai est administrée dans l'eau de boisson) est consignée au moins une fois par semaine, le même jour que la pesée des animaux (sauf pendant la cohabitation). La consommation de nourriture de chaque cage d'animaux F1 est notée une fois par semaine, dès l'affectation à une cohorte particulière.

Cycles œstraux

40.   Les éventuelles informations préliminaires concernant les effets de la substance d'essai sur le cycle œstral, fournies par de précédentes études de toxicité à doses répétées, pourront être mises à profit pour élaborer un protocole d'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération propre à la substance chimique concernée. Normalement, l'évaluation de la cyclicité œstrale (par cytologie vaginale) commence au début de la période de traitement et se poursuit jusqu'à ce que l'accouplement soit avéré ou jusqu'à la fin de la période d'accouplement de deux semaines. Si l'on a vérifié la normalité des cycles œstraux des femelles avant d'administrer la substance d'essai, il est utile de poursuivre les frottis quand le traitement démarre, mais si l'on craint des effets non spécifiques au démarrage du traitement (par exemple une baisse marquée de la consommation de nourriture), on pourra laisser les animaux s'adapter au traitement pendant 2 semaines au maximum avant la période d'observation des frottis (de 2 semaines) qui précède la période d'accouplement. Si l'on prolonge ainsi la période de traitement des femelles (ce qui porte à 4 semaines le traitement avant accouplement), on pourra envisager d'acheter les animaux plus jeunes et de rallonger aussi la période de traitement des mâles avant la mise en couple. Pour obtenir des cellules vaginales ou cervicales, on prendra soin d'éviter d'agresser la muqueuse ce qui risquerait d'induire une pseudo-gestation (10) (11).

41.   Les frottis vaginaux sont examinés chaque jour pour l'ensemble des femelles F1 de la cohorte 1A, à partir de l'ouverture du vagin jusqu'à l'observation des premières cellules kératinisées, afin de déterminer l'intervalle de temps entre ces deux événements. Il convient également de suivre les cycles œstraux de toutes les femelles F1 de la cohorte 1A pendant 2 semaines, à partir du 75e jour postnatal environ. En outre, si l'accouplement de la génération F1 s'impose, la cytologie vaginale des femelles de la cohorte 1B se poursuivra depuis la mise en couple jusqu'à ce que la copulation ait eu lieu.

Accouplement et gravidité

42.   Outre les paramètres standard (par exemple poids corporel; consommation de nourriture; observations cliniques, dont contrôle de la mortalité/morbidité), on relève les dates de mise en couple, d'insémination et de mise bas, et on calcule l'intervalle précoïtal (entre la mise en couple et l'insémination) et la durée de la gestation (entre l'insémination et la mise bas). Il convient d'examiner minutieusement les femelles P au moment prévu pour la mise bas afin de repérer d'éventuels symptômes de dystocie. Toute anomalie du comportement de nidification ou d'allaitement devra être relevée.

43.   Le jour de la parturition correspond au jour 0 de l'allaitement pour la mère, et au jour postnatal 0 (JPN 0) pour la descendance. Il est aussi possible de compter les jours à partir de la copulation pour éviter les erreurs sur les données relatives au développement postnatal dues aux différences de durée de gestation; il convient toutefois de noter également les jours à partir de la mise bas. Ce changement de référence est particulièrement important lorsque la substance d'essai influence la durée de la gestation.

Caractéristiques de la descendance

44.   On examine chaque portée dès que possible après la mise bas (JPN 0 ou 1) afin d'établir le nombre et le sexe des petits, la mortinatalité, le nombre de naissances vivantes et la présence d'anomalies macroscopiques [anomalies externes visibles (y compris fentes palatines, hémorragies sous-cutanées, anomalies de la couleur ou de la texture de la peau, présence du cordon ombilical, absence de lait dans l'estomac, présence de sécrétions séchées)]. De plus, le premier examen clinique des nouveau-nés est l'occasion d'effectuer une évaluation qualitative de la température corporelle, du degré d'activité et de la réaction à la manipulation. Chez les petits morts à JPN 0 ou plus tard, on recherche d'éventuelles anomalies et la cause du décès. Les petits en vie sont comptés et pesés individuellement à JPN 0 ou JPN 1, puis régulièrement, par exemple au moins aux JPN 4, 7, 14 et 21. Les examens cliniques, qui dépendent de l'âge des animaux, sont répétés à chaque pesée des descendants, voire plus souvent si des cas spécifiques ont été révélés au moment de la naissance. Les symptômes à surveiller sont notamment les suivants (liste non exhaustive): anomalies externes, modifications de l'état de la peau, de la fourrure, des yeux, des muqueuses, apparition de sécrétions et d'excrétions et de réactions neurovégétatives. Il convient également de noter tout changement dans la démarche ou la posture, les réactions à la manipulation ainsi que l'apparition de mouvements spasmodiques ou de contractures, de stéréotypies ou de comportements bizarres.

45.   On mesure la distance anogénitale (DAG) de chaque petit au moins une fois entre les JPN 0 et 4. Le poids corporel des petits est relevé le jour de la mesure de la DAG, qui est rapportée à la taille du petit, de préférence la racine cubique du poids corporel (12). On recherche la présence de tétons/aréoles chez les petits mâles aux JPN 12 ou 13.

46.   On commence à surveiller quotidiennement les signes de séparation balano-préputiale ou d'ouverture vaginale sur tous les animaux F1 avant le jour prévu d'apparition de ces signes, afin de détecter une éventuelle maturation sexuelle précoce. Toute anomalie persistante des organes génitaux, telle que filaments vaginaux, hypospadias ou pénis bifide est notée. La maturité sexuelle des animaux F1 est comparée au développement physique en déterminant l'âge et le poids corporel au moment de la séparation balano-préputiale chez le mâle ou de l'ouverture vaginale chez la femelle (13).

Évaluation du potentiel de neurotoxicité pour le développement (cohortes 2A et 2B)

47.   L'évaluation de la neurotoxicité s'appuie sur les individus des cohortes 2A et 2B, qui comptent chacune 10 mâles et 10 femelles issus de chaque groupe de traitement (1 mâle ou 1 femelle par portée; chaque portée représentée par au moins 1 petit; sélection au hasard). Les animaux de la cohorte 2A seront soumis à une batterie d'observations fonctionnelles, à une évaluation du réflexe de sursaut auditif, de l'activité motrice (voir paragraphes 48-50) et à une évaluation neuropathologique (voir paragraphes 74 et 75). On s'attachera particulièrement à réduire au minimum les variations affectant l'ensemble des conditions de l'essai et à s'assurer qu'elles ne sont pas systématiquement liées au traitement. Parmi les variables susceptibles de jouer sur le comportement figurent le niveau sonore (par exemple bruits intermittents), la température, l'humidité, l'éclairage, les odeurs, l'heure du jour et les distractions liées à l'environnement extérieur. Il convient d'interpréter les résultats des essais de neurotoxicité en fonction des ordres de grandeur de référence appropriés provenant des groupes témoins historiques. L'évaluation neuropathologique des animaux de la cohorte 2B aura lieu aux JPN 21 ou 22 (voir paragraphes 74 et 75).

48.   On testera le réflexe de sursaut auditif des animaux de la cohorte 2A au JPN 24 (± 1 jour). L'évaluation des groupes traités et témoins est répartie de manière équilibrée au cours de la journée. Chaque session comporte 50 essais. Pour ces tests de sursaut auditif, on calculera l'amplitude de la réponse moyenne pour chaque bloc de 10 essais (5 blocs de 10 essais), dont les conditions sont optimisées pour permettre une accoutumance intrasession. Ces protocoles sont conformes à la méthode d'essai B.53 (35).

49.   À un moment approprié entre les JPN 63 et 75, les animaux de la cohorte 2A sont soumis à la batterie d'observations fonctionnelles ainsi qu'à un test automatisé de motricité. Ces procédures sont conformes aux méthodes d'essai B.43 (33) et B.53 (35). La batterie d'observations fonctionnelles comprend une description complète de l'apparence, du comportement et de l'intégrité fonctionnelle du sujet. Ces évaluations sont basées sur des observations effectuées dans la cage d'hébergement puis dans un espace d'observation normalisé (plan ouvert) où l'animal peut se déplacer librement, et sur des tests de manipulation. On procédera aux essais par ordre d'interactivité croissante. Une liste de mesures est présentée à l'appendice 1. Tous les animaux sont examinés soigneusement par des observateurs formés à cet effet et ignorant le traitement reçu par l'animal, suivant des protocoles normalisés destinés à limiter la variabilité liée à l'observateur. Dans la mesure du possible, il est recommandé de confier au même observateur l'évaluation de tous les animaux d'un test donné. À défaut, il convient de démontrer la fiabilité interobservateurs. Pour chaque paramètre de la batterie de tests comportementaux, il faudra se référer à des échelles et des critères de cotation dont les modes opératoires sont définis explicitement. Si possible, des mesures quantitatives objectives sont effectuées pour les observations impliquant une cotation subjective. Concernant l'activité motrice, chaque animal est testé individuellement. La séance d'essai dure assez longtemps pour permettre de démontrer l'accoutumance intrasession des témoins. L'activité motrice est contrôlée à l'aide d'un appareil d'enregistrement automatique capable de détecter aussi bien des augmentations que des diminutions d'activité (c'est-à-dire que l'activité de base mesurée par le dispositif ne doit pas être trop faible, ce qui empêcherait la détection des diminutions d'activité, ni trop forte, ce qui empêcherait la détection d'augmentations). Tous les appareils sont testés selon des protocoles standard afin de garantir, dans la mesure du possible, la reproductibilité entre appareils et entre dates de mesure. Il convient d'équilibrer au mieux les groupes de traitement affectés à chaque appareil. Les groupes d'évaluation de l'essai sont répartis sur la journée pour tenir compte des rythmes d'activité circadiens.

50.   S'il existe des informations indiquant que d'autres essais fonctionnels s'imposent (par exemple sensoriels, sociaux, cognitifs), ces essais seront inclus dans le protocole de l'étude sans compromettre l'intégrité des autres évaluations prévues. Si ces autres essais portent sur les mêmes animaux que ceux soumis au test du sursaut auditif, à la batterie d'observations fonctionnelles et au test de motricité, il convient de les programmer à des moments différents pour limiter le risque de perturbation. Des protocoles supplémentaires peuvent se révéler particulièrement utiles lorsque l'observation empirique, les effets anticipés ou divers aspects liés au mécanisme ou au mode d'action suggèrent un type spécifique de neurotoxicité.

Évaluation du potentiel d'immunotoxicité pour le développement (cohorte 3)

51.   Au JPN 56 (± 3 jours), 10 mâles et 10 femelles de la cohorte 3 issus de chaque groupe de traitement (1 mâle ou 1 femelle par portée; chaque portée représentée par au moins 1 petit; sélection au hasard) seront soumis à un essai de réponse anticorps dépendant des lymphocytes T, pour rechercher des anticorps IgM produits au cours de la réponse primaire à un antigène dépendant des lymphocytes T, par exemple les globules rouges de mouton (GRM) ou l'hémocyanine de patelle (KLH); ces essais seront conformes aux protocoles actuels d'étude de l'immunotoxicité (14) (15). La réponse peut être évaluée par comptage des cellules formatrices de plaques (CFP) spécifiques dans la rate ou par titrage sérique des anticorps IgM spécifiques aux GRM ou à la KLH par ELISA, au moment du pic de réponse. En général, les réponses atteignent un pic 4 jours (pour le comptage des CFP) ou 5 jours (par ELISA) après l'immunisation par voie intraveineuse. Si la réponse primaire des anticorps est évaluée par comptage des CFP, il est permis de répartir les animaux en sous-groupes évalués à des jours différents, aux conditions suivantes: l'intervalle entre l'immunisation et le sacrifice d'un sous-groupe est défini de manière que les CFP soient comptés au moment du pic de la réponse; les sous-groupes contiennent le même nombre de descendants mâles et femelles issus de tous les groupes de dose, y compris les témoins; et les sous-groupes sont examinés à peu près au même âge postnatal. On continuera d'administrer la substance d'essai jusqu'au jour qui précède le prélèvement de la rate des animaux pour l'évaluation de la réponse des CFP ou du sérum pour l'essai ELISA.

Évaluation ultérieure du potentiel de reprotoxicité (cohorte 1B)

52.   On peut continuer d'administrer le traitement aux animaux de la cohorte 1B au-delà du JPN 90, et les élever pour produire une génération F2 si nécessaire. Les mâles et les femelles d'un même groupe de dose cohabitent (en évitant d'accoupler les membres d'une même fratrie) pour une durée allant jusqu'à 2 semaines, à partir du JPN 90 ou après, mais pas au-delà du JPN 120. Les protocoles sont les mêmes que pour les animaux P. Cependant, sur la base du poids de la preuve, il peut s'avérer suffisant de sacrifier les portées au JPN 4 au lieu de les évaluer jusqu'au sevrage ou au-delà.

OBSERVATIONS FINALES

Biochimie clinique/hématologie

53.   On surveillera les effets systémiques chez les animaux P. Des échantillons sanguins sont prélevés à jeun sur un site défini chez dix mâles et femelles P par groupe de dose, sélectionnés au hasard au moment du sacrifice. Ces échantillons sont conservés dans des conditions appropriées et font l'objet d'un examen hématologique partiel ou complet, d'un examen biochimique clinique, d'un dosage de T4 et TSH, ou d'autres examens suggérés par la connaissance du profil d'effets de la substance d'essai [voir document d'orientation no 151 de l'OCDE (40)]. Il convient d'évaluer les paramètres hématologiques suivants: hématocrite, concentration d'hémoglobine, numération des érythrocytes, numération totale et différentielle des leucocytes, numération des plaquettes et mesure du temps et du potentiel de coagulation du sang. Dans le plasma ou le sérum, on mesure les éléments suivants: glucose, cholestérol total, urée, créatinine, protéines totales, albumine et au moins deux enzymes indicatrices d'effets sur les cellules hépatiques (telles que l'alanine aminotransférase, l'aspartate aminotransférase, la phosphatase alcaline, la gamma glutamyl transpeptidase et la sorbitol déshydrogénase). Dans certains cas, le dosage d'enzymes supplémentaires et des acides biliaires peut livrer des informations utiles. En outre, il est possible de conserver des prélèvements sanguins de tous les animaux en vue d'une éventuelle analyse ultérieure destinée à clarifier les effets équivoques ou générer des données d'exposition interne. S'il n'est pas prévu de procéder à un second accouplement, les échantillons sont prélevés dans le cadre du sacrifice programmé ou juste avant. Lorsque les animaux sont maintenus en vie, les prélèvements ont lieu quelques jours avant le second accouplement. Par ailleurs, à moins que des études à doses répétées antérieures indiquent que la substance d'essai n'influe pas sur ce paramètre, il convient de procéder à une analyse d'urine avant le sacrifice, en évaluant les critères suivants: apparence, volume, osmolalité ou densité, pH, protéines, glucose, sang et globules rouges, débris cellulaires. Des prélèvements d'urine peuvent également être effectués afin de suivre l'excrétion de la substance d'essai et/ou de son ou ses métabolites.

54.   On surveillera aussi les effets systémiques chez les animaux F1. Des échantillons sanguins sont prélevés à jeun sur un site défini chez 10 mâles et femelles de la cohorte 1A par groupe de dose, sélectionnés au hasard au moment du sacrifice. Ces échantillons sont conservés dans des conditions appropriées et font l'objet d'un examen biochimique clinique standard, et notamment d'une mesure de la concentration sérique des hormones thyroïdiennes (T4 et TSH), d'un examen hématologique (numération totale et différentielle des leucocytes plus érythrocytes) et d'une analyse d'urine.

55.   Les petits surnuméraires au JPN 4 font l'objet d'une nécropsie macroscopique et on peut mesurer la concentration sérique de l'hormone thyroïdienne T4 à cette occasion. Si nécessaire, les échantillons sanguins des nouveau-nés (JPN 4) peuvent être regroupés par portée aux fins d'analyses biochimiques et du dosage d'hormones thyroïdiennes. Des échantillons sanguins sont également prélevés sur les sujets tout justes sevrés soumis à une nécropsie macroscopique au JPN 22 (petits F1 non sélectionnés pour les cohortes), afin de doser la T4 et la TSH.

Caractéristiques du sperme

56.   On détermine les caractéristiques du sperme pour tous les mâles de la génération P, sauf s'il existe des données montrant que ces caractéristiques ne sont pas modifiées au cours d'une étude sur 90 jours. Les caractéristiques du sperme ne sont évaluées que chez les mâles de la cohorte 1A.

57.   Au moment du sacrifice, on note le poids des testicules et des épididymes de tous les mâles P et F1 (cohorte 1A). On conserve au moins un testicule et un épididyme pour l'examen histopathologique. L'épididyme non conservé sert à la numération des spermatozoïdes stockés dans la queue de l'épididyme (16) (17). Les spermatozoïdes de la queue de l'épididyme (ou du canal déférent) sont par ailleurs récupérés d'une manière qui perturbe le moins possible l'évaluation de leur motilité et de leur morphologie (18).

58.   La motilité des spermatozoïdes est évaluée immédiatement après le sacrifice ou enregistrée en vidéo en vue d'une analyse ultérieure. Le pourcentage de spermatozoïdes progressivement motiles peut être déterminé subjectivement ou objectivement grâce une analyse du mouvement assistée par ordinateur (19) (20) (21) (22) (23) (24). On conduira l'évaluation de la morphologie des spermatozoïdes à partir d'échantillons de sperme prélevés dans l'épididyme (ou le canal déférent) sous forme de préparations fixées ou en milieu humide (25). Au moins 200 spermatozoïdes par échantillon sont classés comme normaux (aussi bien la tête que la pièce intermédiaire et le flagelle paraissent normaux) ou anormaux. Les anomalies morphologiques des spermatozoïdes comprennent, par exemple, la fusion, des têtes isolées et des têtes et/ou des queues déformées (26). Des têtes déformées ou larges peuvent indiquer des anomalies de la spermiation.

59.   Si les échantillons de sperme sont congelés, les frottis fixés et les images de la motilité des spermatozoïdes enregistrées au moment de la nécropsie (27), les analyses ultérieures peuvent ne porter que sur les mâles ayant reçu des doses élevées et sur les mâles témoins. Toutefois, si l'on observe des effets liés au traitement, il faudra aussi évaluer les groupes traités aux doses plus faibles.

Nécropsie macroscopique

60.   Juste après le sacrifice ou le décès en cours d'étude, tous les animaux P et F1 subissent une nécropsie macroscopique destinée à mettre en évidence d'éventuelles anomalies structurelles ou altérations pathologiques. Il faut prêter une attention particulière aux organes de l'appareil reproducteur. Il convient de consigner les petits moribonds qui ont été euthanasiés et les petits morts et, s'ils ne sont pas macérés, de les examiner pour détecter d'éventuelles anomalies et/ou établir la cause de leur mort, et de les conserver.

61.   Un frottis vaginal des femelles P et F1 adultes sera examiné le jour de la nécropsie pour déterminer le stade du cycle œstral et permettre d'établir des corrélations avec l'histopathologie des organes reproducteurs. On examinera les utérus de toutes les femelles P (et F1, le cas échéant) sans compromettre l'évaluation histopathologique, pour voir s'ils présentent des points d'implantation et les dénombrer.

Pesée des organes et conservation des tissus — Animaux adultes P et F1

62.   Après le sacrifice, le poids corporel et le poids des organes énumérés ci-dessous de tous les animaux P et F1 adultes des cohortes concernées (voir ci-après) sont déterminés dès que possible après dissection pour éviter toute dessiccation. Il convient de préserver ensuite ces organes dans des conditions appropriées. Sauf mention contraire, les organes qui vont par paires peuvent être pesés individuellement ou ensemble, conformément aux habitudes du laboratoire.

—	Utérus (dont oviductes et col), ovaires

—	Testicules, épididymes (totalité et queue pour les échantillons servant à la numération des spermatozoïdes)

—

Prostate (ensemble des parties dorsolatérale et ventrale). Il convient d'extraire très soigneusement les tissus adhérents de l'ensemble de la prostate pour éviter de percer les vésicules séminales remplies de liquide. Si le traitement a eu un effet sur le poids total de la prostate, on disséquera minutieusement les lobes dorsolatéral et ventral après les avoir fixés et pesés séparément.

—	Vésicules séminales avec glandes coagulantes et leurs liquides (considérés comme une unité et pesés ensemble)

—	Cerveau, foie, reins, cœur, rate, thymus, hypophyse, glande thyroïde (après fixation), glandes surrénales et organes ou tissus cibles connus.

63.   Outre les organes mentionnés ci-dessus, on conservera, dans des conditions appropriées, des échantillons de nerf périphérique, muscle, colonne vertébrale, œil avec nerf optique, conduit gastro-intestinal, vessie, poumon, trachée (portant encore les glandes thyroïde et parathyroïdes), moelle osseuse, canal déférent (mâles), glandes mammaires (mâles et femelles) et vagin.

64.   Tous les organes des animaux de la cohorte 1A sont pesés et conservés en vue de l'examen histopathologique.

65.   Pour rechercher les effets immunotoxiques pré- et postnataux, 10 mâles et 10 femelles de la cohorte 1A issus de chaque groupe de traitement (1 mâle ou 1 femelle par portée; chaque portée représentée par au moins 1 petit; sélection au hasard) seront soumis aux examens suivants au moment du sacrifice:

—	pesée des ganglions lymphatiques associés ou non à la voie d'exposition (en plus de la pesée des glandes surrénales, du thymus et de la rate, déjà effectuée pour tous les animaux de la cohorte 1A),

—	analyse des sous-populations lymphocytaires spléniques (lymphocytes T CD4+ et CD8+, lymphocytes B, et cellules tueuses naturelles NK) effectuée sur la moitié de la rate, l'autre moitié étant conservée en vue de l'examen histopathologique.

L'analyse des sous-populations lymphocytaires spléniques chez les animaux non immunisés (cohorte 1A) déterminera si l'exposition contribue à une modification de l'équilibre immunologique concernant la distribution des lymphocytes thymiques “auxiliaires” (CD4+) ou cytotoxiques (CD8+) ou des cellules tueuses naturelles (NK) (réponses rapides aux cellules néoplastiques et aux pathogènes).

66.   Il convient de peser les organes suivants des animaux de la cohorte 1B et de traiter leurs tissus jusqu'à leur transformation en blocs:

—	Vagin (non pesé)

—	Utérus (dont col)

—

Ovaires

—	Testicules (au moins un)

—	Épididymes

—	Vésicules séminales et glandes coagulantes

—

Prostate

—

Hypophyse

—	Organes cibles connus

L'examen histopathologique de la cohorte 1B ne sera conduit que si les résultats de la cohorte 1A sont équivoques ou que la substance administrée est présumée toxique pour la reproduction ou le système endocrinien.

67.   Cohortes 2A et 2B: essai de neurotoxicité pour le développement (JPN 21 ou 22 et descendants adultes). Les animaux de la cohorte 2A sont sacrifiés après l'essai comportemental; leur cerveau est ensuite pesé et soumis à un examen neurohistopathologique complet à des fins d'évaluation de la neurotoxicité. Les animaux de la cohorte 2B sont sacrifiés au JPN 21 ou 22; leur cerveau est ensuite pesé et soumis à un examen microscopique pour évaluer la neurotoxicité. La fixation par perfusion est indispensable pour les animaux de la cohorte 2A et facultative pour ceux de la cohorte 2B, conformément à la méthode d'essai B.53 de l'OCDE (35).

Pesée des organes et conservation des tissus — Animaux F1 juste sevrés

68.   Les petits non sélectionnés pour les cohortes, y compris les individus chétifs, sont sacrifiés après le sevrage, au JPN 22, sauf si les résultats indiquent que d'autres recherches in vivo s'imposent. Les petits euthanasiés sont soumis à une nécropsie macroscopique comprenant l'évaluation des organes reproducteurs, conformément aux paragraphes 62 et 63. Le cerveau, la rate et le thymus sont pesés et conservés dans des conditions appropriées pour un nombre maximal de 10 petits par sexe et par groupe, issus d'autant de portées que possible. De plus, on pourra conserver les tissus mammaires de ces petits mâles et femelles en vue d'analyses microscopiques supplémentaires (13) [voir document d'orientation no 151 de l'OCDE (40)]. On conservera également les anomalies macroscopiques et les tissus cibles en vue d'un éventuel examen histologique.

Histopathologie — Animaux P

69.   Un examen histopathologique complet des organes énumérés aux paragraphes 62 et 63 est pratiqué sur l'ensemble des animaux P témoins ou ayant reçu une dose élevée. Il convient aussi d'examiner les organes qui présentent des modifications imputables à la substance d'essai chez tous les animaux traités avec des doses inférieures en vue de définir une CSENO. En outre, un examen histopathologique des organes reproducteurs et de toutes les lésions macroscopiques sera pratiqué sur tous les individus chez lesquels on soupçonne une diminution de la fertilité, par exemple ceux qui ne se sont pas accouplés, n'ont pas conçu, n'ont pas engendré ou n'ont pas donné naissance à des descendants sains, ou dont le cycle œstral ou le nombre, la motilité ou la morphologie des spermatozoïdes ont été affectés.

Histopathologie — Animaux F1

Animaux de la cohorte 1

70.   Un examen histopathologique complet des organes énumérés aux paragraphes 62 et 63 est pratiqué sur l'ensemble des animaux adultes de la cohorte 1A témoins ou ayant reçu une dose élevée. Chaque portée est représentée par au moins un petit de chaque sexe. Il convient aussi d'examiner les organes et les tissus qui présentent des modifications imputables au traitement, ainsi que toutes les lésions macroscopiques, chez tous les animaux traités aux doses inférieures en vue de déterminer une CSENO. L'évaluation des effets pré- et postnataux sur les ganglions lymphatiques requiert un examen histopathologique des ganglions lymphatiques et de la moelle osseuse pratiqué sur 10 mâles et 10 femelles de la cohorte 1A, en plus de l'examen histopathologique du thymus, de la rate et des glandes surrénales déjà effectué sur tous les animaux 1A.

71.   Les tissus reproducteurs et endocriniens de l'ensemble des individus de la cohorte 1B sont traités pour être transformés en blocs. Comme mentionné au paragraphe 66, les organes reproducteurs et endocriniens des animaux de la cohorte 1B subissent un examen histopathologique en cas de suspicion de toxicité pour la reproduction ou le système endocrinien. Il convient aussi de soumettre la cohorte 1B à un examen histologique si les résultats de la cohorte 1A sont équivoques.

72.   Les ovaires des femelles adultes doivent contenir des follicules primordiaux et des follicules en croissance, ainsi que les grands corps jaunes; l'examen histopathologique des femelles F1 vise donc à quantifier les follicules primordiaux, les petits follicules en croissance et les grands corps jaunes; il convient que le nombre d'animaux, le choix de la section ovarienne et la taille des échantillons de section soient statistiquement appropriés à la méthode d'évaluation employée. Il est possible de procéder d'abord à la numération folliculaire des animaux témoins et traités à la dose élevée; si l'examen de ces derniers révèle un effet nocif, on étendra l'évaluation aux individus ayant reçu les doses inférieures. L'examen inclut la numération des follicules primordiaux, lesquels peuvent être combinés à de petits follicules en croissance, à des fins de comparaison entre les ovaires des femelles traitées et témoins [voir document d'orientation no 151 de l'OCDE (40)]. L'évaluation des grands corps jaunes s'effectue parallèlement à l'essai de cyclicité œstrale de sorte que l'étape du cycle puisse être prise en compte. On vérifiera le développement spécifique correct des oviductes, de l'utérus et du vagin.

73.   Un examen histopathologique détaillé des testicules sera pratiqué sur les mâles F1 afin de mettre en évidence des effets liés au traitement sur la différenciation et le développement des testicules, et sur la spermatogenèse (38). Quand c'est possible, des coupes du rete testis seront examinées. On vérifiera le développement spécifique normal de la tête, du corps et de la queue de l'épididyme ainsi que du canal déférent, et on évaluera les paramètres requis pour les mâles P.

Animaux de la cohorte 2

74.   Un examen neurohistopathologique est pratiqué sur tous les animaux de la cohorte 2A témoins et traités à dose élevée, par sexe, juste après le test neurocomportemental (après le JPN 75, mais pas au-delà du JPN 90). L'examen histopathologique du cerveau est effectué sur tous les animaux de la cohorte 2B témoins et traités à dose élevée, par sexe, au JPN 21 ou 22. Il convient aussi d'examiner les organes ou tissus qui présentent des modifications imputables à la substance d'essai chez les animaux traités avec des doses inférieures en vue de déterminer une CSENO. Pour les animaux des cohortes 2A et 2B, plusieurs coupes du cerveau sont réalisées afin d'examiner les bulbes olfactifs, le cortex cérébral, l'hippocampe, les ganglions de la base, le thalamus, l'hypothalamus, le mésencéphale (tectum, tegmentum et pédoncules cérébraux), le tronc cérébral et le cervelet. Seule la cohorte 2A subira par ailleurs un examen des yeux (rétine et nerf optique) et d'échantillons de nerf périphérique, muscle et colonne vertébrale. Tous les protocoles neurohistologiques sont conformes à la méthode d'essai B.53 (35).

75.   Des parties représentatives du cerveau (coupes homologues soigneusement sélectionnées grâce à des repères microscopiques fiables) seront soumises à un examen morphométrique (quantitatif), qui pourra inclure des mesures linéaires et/ou surfaciques de régions spécifiques du cerveau. On réalisera au moins trois coupes consécutives pour chaque repère morphologique (niveau) en vue de sélectionner ensuite la coupe la plus homologue et représentative de la région spécifique du cerveau à analyser. Les neuropathologistes devront juger si les coupes préparées pour les mesures sont homologues aux autres échantillons du lot et si elles peuvent donc être examinées, dans la mesure où les mesures linéaires, en particulier, sont susceptibles de changer sur une distance relativement faible (28). Les coupes jugées non homologues sont exclues. L'objectif est de prélever des échantillons sur tous les animaux réservés à cet effet (10/sexe/niveau de dose), mais un nombre inférieur demeure acceptable. Toutefois, des échantillons prélevés sur moins de 6 animaux/sexe/niveau de dose ne seront en principe pas considérés comme suffisants pour répondre aux objectifs de la présente méthode d'essai. La stéréologie peut permettre d'identifier des effets liés au traitement sur des paramètres tels que le volume ou le nombre de cellules de régions neuroanatomiques spécifiques. Tous les aspects de la préparation des échantillons de tissus, depuis la fixation de tissus jusqu'à la dissection des échantillons de tissus, au traitement des tissus et à la coloration des lames, devront se conformer à un modèle expérimental équilibré tel que chaque lot contienne des échantillons représentatifs de chaque groupe de dose. En cas de recours aux analyses morphométriques ou stéréologiques, les tissus cérébraux sont inclus dans un milieu approprié, simultanément pour toutes les doses, afin d'éviter les artefacts de rétrécissement associés à un stockage prolongé dans le fixateur.

RAPPORT

Résultats

76.   Les résultats sont rapportés individuellement et résumés sous forme de tableaux. S'il y a lieu, on présentera les informations suivantes pour chaque groupe d'essai et chaque génération: nombre d'animaux présents au début de l'essai, nombre d'animaux décédés durant l'essai ou euthanasiés, moment du décès ou de l'euthanasie, nombre d'animaux fertiles, nombre de femelles gravides, nombre de femelles donnant naissance à une portée, et nombre d'animaux manifestant des signes de toxicité. Le rapport contient aussi une description de la toxicité, y compris le moment d'apparition des effets toxiques, leur durée et leur sévérité.

77.   On évaluera les résultats numériques à l'aide d'une méthode statistique appropriée et acceptée. Les méthodes statistiques font partie intégrante de la méthodologie de l'essai et sont choisies comme telles; elles traitent de façon pertinente les données non normales (par exemple les résultats des numérations), les données tronquées (par exemple en raison d'un temps d'observation limité), la non-indépendance (par exemple les effets sur les portées et les mesures répétées) et les variances inégales. Les modèles linéaires généralisés mixtes et les modèles dose-effet couvrent un large éventail d'outils d'analyse qui peuvent convenir au traitement des résultats dans le cadre de la présente méthode d'essai. Le rapport fournit suffisamment d'informations sur la méthode d'analyse et le logiciel employés pour qu'un réviseur ou un statisticien indépendant puissent évaluer/réévaluer l'analyse.

Évaluation des résultats

78.   Les résultats sont évalués en fonction des effets observés, notamment à la nécropsie et lors des examens microscopiques. L'évaluation porte notamment sur la relation ou l'absence de relation entre la dose et la présence, la fréquence et la gravité des anomalies, notamment des lésions macroscopiques. Elle porte aussi sur les organes cibles, la fertilité, les anomalies cliniques, la capacité reproductrice et les portées, les modifications du poids corporel, la mortalité et autres effets toxiques et affectant le développement. Les modifications spécifiques à chaque sexe font l'objet d'une attention particulière. Les propriétés physico-chimiques de la substance d'essai et, le cas échéant, les données toxicocinétiques, y compris le transfert dans le placenta et l'excrétion dans le lait, sont prises en considération lors de l'évaluation des résultats.

Rapport d'essai

79.   Le rapport d'essai comporte les informations énumérées ci-après, obtenues dans la présente étude à partir des animaux P, F1 et F2 (le cas échéant):

Substance d'essai

—	Toutes les informations pertinentes disponibles concernant la substance d'essai et ses propriétés toxicocinétiques et toxicodynamiques

—	Données d'identification

—

Pureté

Véhicule (s'il y a lieu)

—	Justification du choix du véhicule s'il ne s'agit pas d'eau

Animaux d'essai

—	Espèces/souches utilisées

—	Nombre, âge et sexe

—	Source, conditions d'encagement, régime alimentaire, matériaux de nidification, etc.

—	Poids de chaque animal au début de l'essai

—	Résultats des frottis vaginaux des femelles P avant le début du traitement (si ces examens ont été pratiqués à ce moment-là)

—	Données sur l'accouplement de la génération P, précisant les partenaires mâles et femelles du couple, et le succès de l'accouplement

—	Portée d'origine des adultes de la génération F1

Conditions d'essai

—	Justification de la sélection des doses appliquée

—	Détails concernant la préparation de la substance d'essai ou son incorporation aux aliments, ainsi que la concentration obtenue

—	Stabilité et homogénéité de la préparation dans le véhicule ou le milieu d'administration (par exemple la nourriture, l'eau de boisson), dans le sang et/ou le lait, dans les conditions d'utilisation et de stockage entre les utilisations

—	Détails sur l'administration de la substance d'essai

—	Conversion de la concentration de la substance d'essai (ppm) dans la nourriture ou l'eau de boisson en dose administrée (mg/kg de poids corporel/jour), s'il y a lieu

—	Détails concernant la qualité des aliments et de l'eau (y compris la composition de la nourriture, si possible)

—	Description détaillée des protocoles de randomisation utilisés pour sélectionner les petits éliminés de la portée, et pour affecter les petits aux groupes d'essai

—	Conditions environnementales

—	Liste du personnel impliqué dans l'étude, mentionnant leur formation professionnelle

Résultats (récapitulatif et données individuelles par sexe et par dose)

—

Consommation de nourriture, consommation d'eau (si disponible), efficacité alimentaire (gain de poids corporel par gramme de nourriture consommé, sauf lors de la cohabitation et de l'allaitement), et consommation de la substance d'essai (en cas d'administration dans la nourriture/l'eau de boisson) pour les animaux P et F1

—	Données relatives à l'absorption (si disponibles)

—	Poids corporel des animaux P

—	Poids corporel des animaux F1 sélectionnés juste après le sevrage

—	Temps de survie pendant l'étude ou indication de la survie des animaux à la fin de l'expérience

—	Nature, sévérité et durée des signes cliniques (qu'ils soient réversibles ou non)

—	Résultats des analyses hématologique, d'urine et de chimie clinique, y compris dosage des TSH et T4

—	Analyse phénotypique des cellules spléniques (lymphocytes T, B, cellules NK)

—	Cellularité de la moelle osseuse

—	Données sur les effets toxiques

—	Nombre de femelles P et F1 présentant une durée de cycle ou un cycle œstral normal ou anormal

—	Moment de la copulation (intervalle précoïtal, soit nombre de jours entre l'accouplement et la copulation)

—	Effets toxiques ou autres sur la reproduction, y compris nombre et pourcentage d'animaux qui ont copulé, sont gravides, ont mis bas et allaité, de mâles déclenchant une gravidité, de femelles présentant des signes de dystocie ou de mise bas prolongée ou difficile

—	Durée de la gestation et, lorsque c'est possible, de la parturition

—	Nombre d'implantations, taille de la portée et pourcentage de petits mâles

—	Nombre et pourcentage de pertes postimplantation, de naissances vivantes et de mort-nés

—	Poids des portées et poids des petits (mâles, femelles et poids global), nombre d'individus chétifs, s'il est établi

—	Nombre de petits affectés d'anomalies macroscopiques

—	Effets toxiques ou autres sur la descendance, la croissance postnatale, la viabilité, etc.

—	Repères physiques relevés sur les petits et autres données sur le développement postnatal

—	Informations relatives à la maturité sexuelle des animaux F1

—	Observations fonctionnelles réalisées selon les besoins sur les petits et les adultes

—	Poids corporel au moment du sacrifice, et poids absolu et relatif des organes des adultes P et F1

—	Résultats de la nécropsie

—	Description détaillée de toutes les observations histopathologiques

—	Nombre total de spermatozoïdes dans la queue de l'épididyme, pourcentage de spermatozoïdes progressivement motiles, pourcentage de spermatozoïdes de morphologie normale, et pourcentage de spermatozoïdes correspondant à chaque anomalie identifiée pour les mâles P et F1

—	Nombre et stades de maturation des follicules contenus dans les ovaires des femelles P et F1, le cas échéant

—	Numération des grands corps jaunes dans les ovaires des femelles F1

—	Traitement statistique des résultats, le cas échéant

Paramètres de la cohorte 2

—	Description détaillée des protocoles utilisés pour standardiser les observations et les protocoles, et définitions du mode opératoire de notation des observations

—	Liste de tous les protocoles d'essai utilisés, et justification de leur choix

—	Précisions sur les protocoles comportementaux/fonctionnels, neuropathologiques et morphométriques utilisés, y compris informations et détails concernant les appareils automatisés

—	Protocoles d'étalonnage et de vérification de l'équivalence des appareils et de la répartition équilibrée des groupes de traitement dans les protocoles d'essai

—	Brève justification explicitant les éventuelles décisions impliquant une appréciation professionnelle

—	Description détaillée de toutes les observations comportementales/fonctionnelles, neuropathologiques et morphométriques par sexe et par groupe de dose, y compris augmentations et diminutions par rapport aux témoins

—	Poids du cerveau

—	Tout diagnostic, réalisé sur la base de signes et de lésions neurologiques, y compris maladies ou affections d'origine naturelle

—	Images d'observations représentatives

—	Images à faible grossissement permettant d'évaluer l'homologie des coupes utilisées pour la morphométrie

—	Traitement statistique des résultats, notamment modèles statistiques employés pour analyser les données, et résultats, qu'ils soient significatifs ou non

—	Lien entre chaque effet toxique et la conclusion proposée sur le potentiel neurotoxique de la substance d'essai, par sexe et par groupe de dose

—	Répercussions de toutes les informations toxicocinétiques sur les conclusions

—	Données démontrant la fiabilité et la sensibilité de la méthode de l'essai (c'est-à-dire, résultats des témoins positifs et historiques)

—	Relations éventuelles entre les effets neuropathologiques et fonctionnels

—	CSENO ou dose de référence pour les mères et les petits, par sexe et groupe de dose

—	Discussion sur l'interprétation générale des données sur la base des résultats, dont une conclusion indiquant si la substance chimique est responsable ou non d'une neurotoxicité pour le développement, et précisant la CSENO

Paramètres de la cohorte 3

—	Concentration sérique des anticorps IgM (sensibilisation avec GRM ou KLH), ou nombre de CFP dans la rate en réponse aux IgM (sensibilisation avec GRM)

—	Confirmation de la performance de l'essai de réponse anticorps dépendante des lymphocytes T dans le cadre du processus d'optimisation par le laboratoire qui conduit l'essai pour la première fois, puis périodiquement (par exemple tous les ans) par l'ensemble des laboratoires

—	Discussion sur l'interprétation générale des données sur la base des résultats, dont une conclusion indiquant si la substance chimique est responsable ou non d'une immunotoxicité pour le développement, et précisant la CSENO

Discussion des résultats

Conclusions, y compris CSENO concernant les parents et les descendants

Toutes les informations ne résultant pas de l'étude mais utiles pour interpréter les résultats (par exemple similitude des effets avec ceux d'autres neurotoxiques connus), sont également fournies.

Interprétation des résultats

80.   L'étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération fournit des informations sur les effets de l'exposition répétée à une substance chimique durant toutes les phases du cycle de reproduction, si besoin est. Elle livre notamment des informations sur l'appareil reproducteur et sur divers paramètres d'évaluation des effets sur le développement, la croissance, la survie et les fonctions des descendants jusqu'au JPN 90.

81.   L'interprétation des résultats de cette étude tient compte de toutes les informations disponibles sur la substance chimique, notamment ses propriétés physico-chimiques, toxicocinétiques et toxicodynamiques, les données pertinentes disponibles sur les analogues de structure et les résultats des études de toxicité antérieures sur la substance d'essai (par exemple toxicité aiguë, toxicité après application répétée, études mécanistiques et études visant à repérer d'éventuelles différences qualitatives et quantitatives des propriétés métaboliques in vivo/in vitro d'une espèce à une autre). Il convient, si possible, d'interpréter les résultats de la nécropsie macroscopique et de la pesée des organes à la lumière des observations effectuées dans d'autres études à doses répétées. On pourra éventuellement expliquer le ralentissement de la croissance des descendants par une influence de la substance d'essai sur la composition du lait (29).

Cohorte 2 (neurotoxicité pour le développement)

82.   Les résultats des évaluations neurocomportementales et neuropathologiques sont interprétés à la lumière de tous les effets observés, selon une démarche fondée sur le poids de la preuve et le jugement d'experts. Il convient d'inclure dans la discussion les types d'effets comportementaux ou morphologiques éventuellement observés, ainsi que les preuves d'une relation dose-effet. Cette caractérisation devra englober l'évaluation de la neurotoxicité pour le développement, provenant notamment d'études épidémiologiques sur l'homme ou de rapports d'études de cas et d'études animales expérimentales (par exemple données toxicocinétiques, informations sur la relation structure-activité, données issues d'autres études de toxicité). L'évaluation des résultats comprendra une discussion analysant la signification biologique et la signification statistique. Elle inclura, le cas échéant, la relation entre les altérations neuropathologiques et comportementales observées. Pour orienter l'interprétation des résultats relatifs à la neurotoxicité pour le développement, voir la méthode d'essai B.53 de l'OCDE (35) et l'article de Tyl e.a. de 2008 (31).

Cohorte 3 (immunotoxicité pour le développement)

83.   La suppression ou la stimulation de la fonction immune évaluée par l'essai de réponse anticorps dépendant des lymphocytes T est interprétée à la lumière de l'ensemble des observations effectuées. La signification des résultats de cet essai pourrait être appuyée par d'autres effets sur divers indicateurs associés aux facteurs immunologiques (comme la cellularité de la moelle osseuse, le poids et l'histopathologie des tissus lymphoïdes, la distribution des sous-populations lymphocytaires). Les effets mis en évidence par l'essai de réponse anticorps dépendant des lymphocytes T sont susceptibles d'être moins significatifs quand d'autres toxicités se manifestent à des concentrations d'exposition inférieures.

84.   Pour l'interprétation des résultats des études de la toxicité pour la reproduction et de la neurotoxicité, il est recommandé de consulter le document d'orientation no 43 de l'OCDE (26).

BIBLIOGRAPHIE

(1)

Cooper, R.L., Lamb, J.C., Barlow, S.M., Bentley, K., Brady, A.M., Doerr, N., Eisenbrandt, D.L., Fenner-Crisp, P.A., Hines, R.N., Irvine, L.F.H., Kimmel, C.A., Koeter, H., Li, A.A., Makris, S.L., Sheets, L.P., Speijers, G.J.A., et Whitby, K.E. (2006), “A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment”, Critical Reviews in Toxicology, 36, 69-98.

(2)

Thigpen, J.E., Setchell, K.D.R., Ahlmark, K.B., Locklear, J., Spahr, T., Leviness, G.F., Goelz, M.F., Haseman, J.K., Newbold, R.R., et Forsythe, D.B. (1999), “Phytœstrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets”, Lab. Anim. Sci., 49, 530-536.

(3)

Zoetis, T., et Walls, I. (2003), Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington DC.

(4)

Moser, V.C., Walls, I., et Zoetis, T. (2005), “Direct Dosing of Preweaning Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group”, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.

(5)

Conolly, R.B., Beck, B.D., et Goodman, J.I. (1999), “Stimulating Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment”, Toxicological Sciences, 49, 1-4.

(6)

Ulbrich, B., et Palmer, A.K. (1995), “Detection of Effects on Male Reproduction — a Literature Survey”, Journal of the American College of Toxicologists, 14, 293-327.

(7)

Mangelsdorf, I., Buschmann, J., et Orthen, B. (2003), “Some Aspects Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility”, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 37, 356-369.

(8)

Sakai, T., Takahashi, M., Mitsumori, K., Yasuhara, K., Kawashima, K., Mayahara, H., et Ohno, Y. (2000), “Collaborative work to evaluate toxicity on male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies”, Journal of Toxicological Sciences, 25, 1-21.

(9)

Creasy, D.M. (2003), “Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxicologic Pathology”, Birth Defects Research, Part B, 68, 408-415.

(10)

Goldman, J.M., Murr, A.S., Buckalew, A.R., Ferrell, J.M., et Cooper, R.L. (2007), “The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies”, Birth Defects Research, Part B, 80(2), 84-97.

(11)

Sadleir, R.M.F.S. (1979), “Cycles and Seasons”, in Auston, C.R., et Short, R.V. (eds), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.

(12)

Gallavan, R.H. Jr, Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., et Reynolds, V.L. (1999), “Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13:383-390.

(13)

Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., et Weiner, R.I. (1977), “Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat”, Biological Reproduction, 17, 298-303.

(14)

Ladics, G.S. (2007), “Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxicity Testing”, Methods, 41, 9-19.

(15)

Gore, E.R., Gower, J., Kurali, E., Sui, J.L., Bynum, J., Ennulat, D., et Herzyk, D.J. (2004), “Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation”, Toxicology, 197, 23-35.

(16)

Gray, L.E., Ostby, J., Ferrell, J., Rehnberg, G., Linder, R., Cooper, R., Goldman, J., Slott, V., et Laskey, J. (1989), “A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat”, Fundamental and Applied Toxicology, 12, 92-108.

(17)

Robb, G.W., Amann, R.P., et Killian, G.J. (1978), “Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats”, Journal of Reproduction and Fertility, 54, 103-107.

(18)

Klinefelter, G.R., Gray, L.E. Jr, et Suarez, J.D. (1991), “The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat”, Reproductive Toxicology, 5, 39-44.

(19)

Seed, J., Chapin, R.E., Clegg, E.D., Dostal, L.A., Foote, R.H., Hurtt, M.E., Klinefelter, G.R., Makris, S.L., Perreault, S.D., Schrader, S., Seyler, D., Sprando, R., Treinen, K.A., Veeramachaneni, D.N., et Wise, L.D. (1996), “Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report”, Reproductive Toxicology, 10, 237-244.

(20)

Chapin, R.E., Filler, R.S., Gulati, D., Heindel, J.J., Katz, D.F., Mebus, C.A., Obasaju, F., Perreault, S.D., Russell, S.R., et Schrader, S. (1992), “Methods for Assessing Rat Sperm Motility”, Reproductive Toxicology, 6, 267-273.

(21)

Klinefelter, G.R., Roberts, N.L., et Suarez, J.D. (1992), “Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration”, Journal of Andrology, 13, 409-421.

(22)

Slott, V.L., Suarez, J.D., et Perreault, S.D. (1991), “Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations”, Reproductive Toxicology, 5, 449-458.

(23)

Slott, V.L., et Perreault, S.D. (1993), “Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer”, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida. p. 319-333.

(24)

Toth, G.P., Stober, J.A., Read, E.J., Zenick, H., et Smith, M.K. (1989), “The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations”, Journal of Andrology, 10, 401-415.

(25)

Linder, R.E., Strader, L.F., Slott, V.L., et Suarez, J.D. (1992), “Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants”, Reproductive Toxicology, 6, 491-505.

(26)

OCDE (2008), Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/JM/MONO(2008)16, OCDE, Paris.

(27)

Working, P.K., et Hurtt, M. (1987), “Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility”, Journal of Andrology, 8, 330-337.

(28)

Bolin, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad Hoc Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), “A 'Best Practices' Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing — for Today”, Toxicological Pathology, 34, 296-313.

(29)

Stütz, N., Bongiovanni, B., Rassetto, M., Ferri, A., Evangelista de Duffard, A.M., et Duffard, R. (2006), “Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components”, Food Chemicals Toxicology, 44, 8-16.

(30)

Thigpen, JE, Setchell, K.D.R., Haseman, J.K., Saunders, H.E., Caviness, G.F., Kissling, G.E., Grant, M.G., et Forsythe, D.B. (2007), “Variations in Phytœstrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats”, Environmental Health Perspectives, 115(12), 1717-1726.

(31)

Tyl, R.W., CrofÏon, K., Moretto, A., Moser, V., Sheets, L.P., et Sobotka, T.J. (2008), “Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints”, Neurotoxicology and Teratology, 30:349-381.

(32)

OCDE (1996), Étude combinée de toxicité à doses répétées et de dépistage de la toxicité pour la reproduction et le développement, Ligne directrice no 422 de l'OCDE pour les essais de produits chimiques, OCDE, Paris.

(33)

Chapitre B.43 de la présente annexe, “Étude de neurotoxicité sur les rongeurs”.

(34)

OCDE (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.

(35)

Chapitre B.53 de la présente annexe, “Étude de neurotoxicité pour le développement”.

(36)

Chapitre B.54 de la présente annexe, “Bioessai utérotrophique chez les rongeurs: essai de dépistage à court terme des propriétés œstrogéniques”.

(37)

Chapitre B.55 de la présente annexe, “Bioessai de Hershberger sur le rat: essai de dépistage à court terme de propriétés (anti)androgéniques”.

(38)

OCDE (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 106, OCDE, Paris.

(39)

OCDE (2011), Guidance Document on the Current Implementation of Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2009)21, OCDE, Paris.

(40)

OCDE (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OCDE, Paris.

B.57.   ESSAI DE STEROÏDOGENESE H295R

INTRODUCTION

1.   La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice pour les essais de produits chimiques no 456 (2011) de l'OCDE. L'OCDE a lancé en 1998 une activité à caractère hautement prioritaire visant à réviser les lignes directrices existantes ou à en établir de nouvelles concernant le dépistage et l'essai des substances susceptibles d'avoir des effets perturbateurs sur le système endocrinien. Le “Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des produits chimiques perturbateurs endocriniens” de 2002 comprend cinq niveaux, chacun d'entre eux correspondant à un degré de complexité biologique différent (1). L'essai de stéroïdogenèse H295R in vitro (H295R) décrit dans la présente méthode d'essai utilise une lignée cellulaire H295R de carcinome surrénalien humain (cellules NCI-H295R) et constitue un “essai in vitro fournissant des données mécanistiques” de niveau 2, à des fins de détection et de hiérarchisation. Le développement et la normalisation de l'essai en tant que détecteur des effets des substances chimiques sur la stéroïdogenèse, et en particulier la production de 17β-estradiol (E2) et de testostérone (T), ont été réalisés en plusieurs étapes. L'essai H295R a été optimisé et validé (2) (3) (4) (5).

2.   L'essai de stéroïdogenèse H295R a pour but de détecter les substances chimiques qui influent sur la production d'E2 et de T. Il vise à identifier les xénobiotiques qui ont pour site(s) cible(s) les composantes endogènes constituant la voie biochimique intracellulaire qui conduit, par une suite de réactions, du cholestérol à la production d'E2 et/ou de T. L'essai H295R ne vise pas à identifier les substances qui influent sur la stéroïdogenèse en raison de leurs effets sur l'axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique (HHG). Il a pour but d'indiquer si, oui ou non, une substance chimique est susceptible d'induire ou d'inhiber la production de T et d'E2; il est toutefois possible d'obtenir des résultats quantitatifs dans certains cas (voir paragraphes 53 et 54). Les résultats de l'essai s'expriment par des changements relatifs de la production hormonale par comparaison avec les témoins solvant (TS). L'essai ne vise pas à fournir des informations mécanistiques spécifiques concernant l'interaction de la substance d'essai avec le système endocrinien. Des recherches ont été conduites au moyen de la lignée cellulaire afin de déterminer les effets sur des enzymes et des hormones intermédiaires particulières comme la progestérone (2).

3.   Les définitions et abréviations utilisées dans cette méthode d'essai sont présentées à l'appendice. Un protocole détaillé comprenant des instructions sur la façon de préparer les solutions, de cultiver les cellules et d'effectuer divers aspects de l'essai est présenté dans les appendices I à III du document Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production de l'OCDE (4).

CONSIDÉRATIONS INITIALES ET LIMITATIONS

4.   Cinq enzymes différentes catalysant six réactions différentes interviennent dans la biosynthèse des hormones stéroïdiennes sexuelles. La conversion enzymatique du cholestérol en prégnénolone par l'enzyme de coupure de la chaîne latérale du cholestérol (CYP11A) liée au cytochrome P450 (CYP) constitue l'étape initiale d'une série de réactions biochimiques qui aboutissent à la synthèse des hormones stéroïdiennes finales. Selon l'ordre des deux réactions suivantes, la stéroïdogenèse se divise en deux voies, la voie Δ5-hydroxystéroïde et la voie Δ4-cétostéroïde, qui convergent dans la production d'androstènedione (figure 1).

5.   L'androstènedione est convertie en testostérone (T) par la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase (17ß-HSD). La testostérone est à la fois une hormone intermédiaire et une hormone finale. Chez les sujets masculins, la T peut être convertie en dihydrotestostérone (DHT) par la 5α-réductase, qui se trouve dans les membranes cellulaires, l'enveloppe nucléaire et le réticulum endoplasmique de tissus cibles de l'action androgénique comme la prostate et les vésicules séminales. La DHT est un androgène nettement plus puissant que la T et elle est aussi considérée comme une hormone finale. L'essai H295R ne mesure pas la DHT (voir paragraphe 10).

6.   L'enzyme de la voie stéroïdogénique qui convertit les substances androgéniques en substances œstrogéniques est l'aromatase (CYP19). La CYP19 convertit la T en 17ß-estradiol (E2) et l'androstènedione en œstrone. L'E2 et la T sont considérés comme des hormones finales de la voie stéroïdogénique.

7.   La spécificité de l'activité de lyase de la CYP17 diffère entre les espèces pour les substrats intermédiaires. Chez l'homme, l'enzyme favorise les substrats de la voie Δ5-hydroxystéroïde (prégnénolone), alors que les substrats de la voie Δ4-cétostéroïde (progestérone) sont favorisés chez le rat (19). Ces différences dans l'activité de lyase de la CYP17 expliquent peut-être certaines différences entre les espèces dans la réponse aux substances qui altèrent la stéroïdogenèse in vivo (6). Les cellules H295 ont montré qu'elles reflétaient très fidèlement l'expression de l'enzyme surrénalienne chez l'homme adulte et le schéma de production de stéroïdes (20), mais on sait qu'elles expriment les enzymes des voies Δ5-hydroxystéroïde et Δ4-cétostéroïde pour la synthèse des androgènes (7) (11) (13) (15).

Figure 1

Voie stéroïdogénique dans les cellules H295R

Note:

Les enzymes sont en italique, les hormones en gras et les flèches indiquent la direction de la synthèse. Le fond grisé indique les voies/produits de la catégorie des corticostéroïdes. Les voies/produits de la catégorie des stéroïdes sexuels sont entourés d'une courbe. CYP = cytochrome P450; HSD = hydroxystéroïde déshydrogénase; DHEA = déhydroépiandrostérone.

8.   La lignée cellulaire H295R de carcinome surrénalien humain est un modèle in vitro utile pour l'étude des effets sur la synthèse des hormones stéroïdes (2) (7) (8) (9) (10). La lignée cellulaire H295R exprime les gènes qui codent toutes les enzymes clés pour la stéroïdogenèse mentionnées ci-dessus (11) (15) (figure 1). C'est là une propriété unique car l'expression in vivo de ces gènes est spécifique au tissu et au stade de développement: typiquement, aucun tissu ou stade de développement n'exprime à lui seul tous les gènes intervenant dans la stéroïdogenèse (2). Les cellules H295R ont les caractéristiques physiologiques de cellules surrénaliennes fœtales humaines zonalement indifférenciées (11). Ces cellules représentent un système in vitro unique en ce qu'elles ont la capacité de produire toutes les hormones stéroïdes qu'on trouve dans le cortex surrénalien adulte et dans les gonades, et permettent de tester les effets sur la synthèse des corticostéroïdes et sur la production d'hormones stéroïdes sexuelles comme les androgènes et œstrogènes, bien que l'essai n'ait été validé que pour la détection de la T et de l'E2. Les changements enregistrés par le système d'essai sous la forme d'une altération de la production de T et d'E2 peuvent être le résultat d'une multitude d'interactions différentes des substances d'essai avec les fonctions stéroïdogéniques exprimées par les cellules H295R. Cela inclut la modulation de l'expression, de la synthèse ou de la fonction des enzymes intervenant dans la production, la transformation ou l'élimination des hormones stéroïdes (12) (13) (14). L'inhibition de la production d'hormones peut être due à une liaison compétitive directe avec une enzyme dans la voie de synthèse, à l'impact sur des cofacteurs comme la NADPH (Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate) et l'AMPc (Adénosine monophosphate cyclique), et/ou à l'augmentation du métabolisme des stéroïdes ou la suppression de l'expression génique de certaines enzymes dans la voie de la stéroïdogenèse. Si l'inhibition peut être fonction de processus aussi bien directs qu'indirects intervenant dans la production des hormones, l'induction agit typiquement de manière indirecte, par exemple en touchant des cofacteurs comme la NADPH et l'AMPc (comme dans le cas de la forskoline), en diminuant le métabolisme des stéroïdes (13) et/ou en régulant positivement l'expression des gènes stéroïdogéniques.

9.   L'essai H295R présente plusieurs avantages:

—	il permet de détecter aussi bien les augmentations que les diminutions de la production de T et d'E2,

—

il permet d'apprécier directement l'impact potentiel d'une substance chimique sur la viabilité des cellules/la cytotoxicité. C'est là un trait important qui permet de faire la distinction entre les effets dus à la cytotoxicité et ceux dus à l'interaction directe des produits chimiques avec les voies stéroïdogéniques, ce qui n'est pas possible dans les systèmes d'explants de tissus composés de multiples types de cellules de sensibilité et fonctionnalité variables,

—	il ne nécessite pas l'utilisation d'animaux,

—	la lignée de cellules H295R est commercialement disponible.

10.   Les principales limites de l'essai sont les suivantes:

—	sa capacité métabolique est inconnue mais probablement assez limitée; en conséquence, l'essai ne détectera probablement pas les substances qui doivent être métaboliquement activées,

—

étant dérivée de tissu surrénal, la H295R possède les enzymes capables de produire aussi bien les hormones glucocorticoïdes et minéralocorticoïdes que les hormones sexuelles; en conséquence, les effets sur la production de glucocorticoïdes et de minéralocorticoïdes peuvent influer sur les niveaux de T et d'E2 observés dans l'essai,

—	il ne mesure pas la DHT et ne permet donc pas de détecter les substances inhibant la 5α- réductase, auquel cas on peut utiliser l'essai de Hershberger (16),

—	l'essai H295R ne détecte pas les substances qui interfèrent avec la stéroïdogenèse en affectant l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HHG), ce qui ne peut être étudié que chez des animaux intacts.

PRINCIPE DE L'ESSAI

11.   L'essai a pour but la détection des substances chimiques qui influent sur la production de T et d'E2. La T est aussi un intermédiaire dans la voie de production de l'E2. L'essai peut détecter les produits chimiques qui inhibent ou induisent typiquement les enzymes de la voie de la stéroïdogenèse.

12.   L'essai s'effectue habituellement dans des conditions de culture cellulaire standard, sur des plaques de culture à 24 puits. On peut aussi utiliser d'autres tailles de plaque pour réaliser l'essai; toutefois, les conditions d'ensemencement et les conditions expérimentales sont ajustées en conséquence pour maintenir la conformité aux critères de performance.

13.   Après une période d'acclimatation de 24 heures dans les plaques de culture multipuits, les cellules sont exposées pendant 48 heures à 7 concentrations de la substance d'essai, au moins en triplicat. Le solvant ainsi qu'un inhibiteur et un inducteur connus de la production des hormones sont employés à une concentration fixe comme témoins négatifs et positifs. À la fin de la période d'exposition, on retire le milieu de chaque puits. Immédiatement après avoir enlevé le milieu, on analyse la viabilité des cellules de chaque puits. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour mesurer la concentration des hormones dans le milieu, notamment les trousses commerciales de dosage des hormones ou des techniques instrumentales comme les systèmes combinés de chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (CPL-SM). Les données sont exprimées sous la forme d'un facteur multiplicatif de changement (fold change) par rapport au témoin solvant et d'une concentration minimale avec effet observé (CMEO). Si l'essai est négatif, la plus forte concentration testée est indiquée sous la dénomination de “concentration sans effet observé” (CSEO). Les conclusions concernant la capacité d'une substance chimique d'influer sur la stéroïdogenèse reposent sur au moins deux exécutions de l'essai indépendantes. La première peut servir à déterminer les ordres de grandeur de concentrations avec un ajustement ultérieur de ces concentrations pour les expériences 2 et 3, le cas échéant, si l'on rencontre des problèmes de solubilité ou de cytotoxicité ou si l'activité de la substance chimique semble se situer à l'extrémité de l'intervalle des concentrations testées.

PROCÉDURE DE CULTURE

Lignée de cellules

14.   Les cellules NCI-H295R peuvent être obtenues commercialement auprès de l'ATCC (American Type Culture Collections), après signature d'un contrat de transfert de matériel (14).

Introduction

15.   Étant donné que la capacité de production d'E2 des cellules évolue à mesure que leur âge/le nombre de passages en culture (repiquages) augmente (2), il convient de cultiver les cellules suivant un protocole spécifique avant de les utiliser, et de noter le nombre de passages à partir de la décongélation des cellules ainsi que le numéro du passage auquel les cellules ont été congelées et stockées dans l'azote liquide. Le premier chiffre indique le numéro de passage présent et le second, le numéro du passage auquel les cellules ont été congelées et stockées. Par exemple, des cellules qui ont été congelées après le passage no 5, et décongelées puis séparées trois fois (4 passages en comptant les cellules juste décongelées comme le passage no 1) après avoir été remises en culture ont le numéro de passage 4.5. On trouvera à l'appendice I du rapport de validation un exemple de système de numérotation (4).

16.   On utilise un milieu-mère comme base pour le milieu supplémenté et le milieu de congélation. Le milieu supplémenté est une composante nécessaire pour cultiver les cellules. Le milieu de congélation est spécifiquement conçu pour permettre une congélation des cellules sans impact pour un stockage de longue durée. Avant utilisation, le Nu-Serum [ou un sérum comparable ayant les mêmes propriétés et dont il a été démontré qu'il produit des données satisfaisant aux exigences de performance de l'essai et au contrôle de qualité (CQ)], qui est un constituant des milieux supplémentés, est analysé pour les concentrations de fond de T et d'E2. La préparation de ces solutions est décrite à l'appendice II du rapport de validation (4).

17.   Après le lancement d'une culture de cellules H295R à partir d'un lot ATCC d'origine, les cellules sont cultivées pour 5 passages (c'est-à-dire qu'elles sont séparées 4 fois). Les cellules du passage 5 sont alors congelées dans l'azote liquide pour stockage. Avant de congeler les cellules, on teste un échantillon des cellules du passage 4 précédent dans une plaque CQ (voir les paragraphes 36 et 37) pour vérifier si la production basale d'hormones et la réponse aux produits témoins positifs satisfont aux critères de CQ de l'essai énoncés dans le tableau 5.

18.   Les cellules H295R sont cultivées, congelées et stockées dans l'azote liquide pour qu'il y ait toujours des cellules d'âge ou de passage approprié disponibles pour la culture et l'utilisation. Après la mise en culture d'un lot de cellules nouveau (15) ou congelé (16), le nombre maximal de passages acceptable pour l'essai H295R ne dépasse pas 10. Par exemple, pour les cultures de cellules à partir d'un lot congelé au passage 5, les numéros de passage acceptables iraient de 4.5 à 10.5 compris. Pour la préparation des cellules à partir de ces lots congelés, la procédure décrite au paragraphe 19 s'applique. Ces cellules sont cultivées pendant au moins quatre (4) passages supplémentaires (passage 4.5) avant d'être utilisées dans le test.

Préparation des cellules à partir du stock congelé

19.   La procédure de préparation des cellules à partir du stock congelé est utilisée lorsqu'un nouveau lot de cellules est retiré de l'azote liquide pour être cultivé et testé. L'appendice III du rapport de validation (4) décrit cette procédure en détail. Les cellules sont retirées de l'azote liquide, rapidement décongelées, placées dans un milieu supplémenté dans un tube à centrifuger, centrifugées à température ambiante, remises en suspension dans le milieu supplémenté et transférées dans un flacon de culture. Le milieu est changé le jour suivant. Les cellules H295R sont cultivées dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 et le milieu est renouvelé 2 ou 3 fois par semaine. Quand les cellules ont atteint environ 85 à 90 % de confluence, il faut les séparer. Cette séparation est nécessaire pour assurer la santé et la croissance des cellules, et pour les préserver en vue de la réalisation d'essais biologiques. Les cellules sont rincées 3 fois à la solution saline tampon phosphate (PBS, sans Ca2+ ni Mg2+) et libérées du flacon de culture par l'ajout d'une enzyme de décollement appropriée, par exemple la trypsine, dans la PBS (sans Ca2+ ni Mg2+). Dès que les cellules se décollent du flacon de culture, il faut stopper l'action de l'enzyme en ajoutant le milieu supplémenté dans une proportion de 3 fois le volume utilisé pour le traitement par l'enzyme. On place les cellules dans un tube de centrifugation, on les centrifuge à température ambiante, on enlève le surnageant et on resuspend le culot de cellules dans le milieu supplémenté. On met la quantité appropriée de solution de cellules dans le nouveau flacon de culture. La quantité de solution de cellules est ajustée de telle sorte que les cellules soient confluentes dans les 5 à 7 jours. Le ratio de sous-culture recommandé est entre 1:3 et 1:4. La plaque est soigneusement étiquetée. Les cellules sont alors prêtes à être utilisées dans l'essai et les cellules en excédent sont congelées dans l'azote liquide comme décrit dans le paragraphe 20.

Congélation des cellules H295R (préparation des cellules pour le stockage dans l'azote liquide)

20.   Pour préparer les cellules H295R à la congélation, on suit la procédure décrite ci-dessus pour la séparation des cellules jusqu'à l'étape où l'on resuspend le culot de cellules formé au fond du tube de centrifugation. Ici, on resuspend le culot de cellules dans le milieu de congélation. On transfère la solution dans un flacon cryogénique, on l'étiquette convenablement et on la congèle à – 80 °C pendant 24 heures, après quoi le flacon cryogénique est transféré vers l'azote liquide pour stockage. L'appendice III du rapport de validation (4) expose les détails de cette procédure.

Mise en plaque et préincubation des cellules pour les tests

21.   Le nombre de plaques de 24 puits, préparées comme indiqué au paragraphe 19, qui sera nécessaire dépend du nombre de produits chimiques à tester et de la confluence des cellules dans les boîtes de culture. En règle générale, un récipient de culture (75 cm2) à 80-90 % de confluence fournira suffisamment de cellules pour 1 à 1,5 plaque (de 24 puits) à une densité cible de 200 000 à 300 000 cellules par ml de milieu conduisant à une confluence d'environ 50-60 % dans les puits à 24 heures (figure 2). C'est typiquement la densité de cellules optimale pour la production d'hormones dans l'essai. À de plus hautes densités, le profil de production de la T ainsi que de l'E2 est altéré. Avant de réaliser l'essai la première fois, il est recommandé de tester différentes densités entre 200 000 et 300 000 cellules par ml et de choisir pour les expériences ultérieures la densité conduisant à une confluence de 50-60 % dans les puits à 24 heures.

Figure 2

Photomicrographie de cellules H295R à une densité d'ensemencement de 50 % dans une plaque de culture à 24 puits à 24 heures, au bord (A) et au centre (B) d'un puits

22.   On retire le milieu du flacon de culture à la pipette et on rince 3 fois les cellules à la PBS stérile (sans Ca2+ ni Mg2+). On ajoute une solution d'enzyme (dans la PBS) pour décoller les cellules du flacon de culture. Quand le temps approprié pour le décollement des cellules s'est écoulé, il faut stopper l'action de l'enzyme en ajoutant le milieu supplémenté dans une proportion de 3 fois le volume utilisé pour le traitement par l'enzyme. On place les cellules dans un tube de centrifugation, on les centrifuge à température ambiante, on enlève le surnageant et on resuspend le culot de cellules dans le milieu supplémenté. On calcule la densité de cellules au moyen, par exemple, d'un hémocytomètre ou d'un compteur de cellules. La solution de cellules est diluée à la densité de mise en plaque souhaitée et soigneusement mélangée pour assurer une densité de cellules homogène. Les cellules sont mises en plaque avec 1 ml de solution de cellules par puits et les plaques et puits sont étiquetés. Les plaques ensemencées sont incubées à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 24 heures pour permettre aux cellules d'adhérer aux puits.

EXIGENCES DE CONTRÔLE DE LA QUALITÉ

23.   Il est essentiel que des volumes exacts de solutions et d'échantillons soient introduits dans les puits pendant le dosage parce que ces volumes déterminent les concentrations utilisées dans les calculs des résultats de l'essai.

24.   Avant le début de la culture des cellules et tout test ultérieur, chaque laboratoire démontre la sensibilité de son système de mesure des hormones (paragraphes 29-31).

25.   S'il est prévu d'utiliser des systèmes de mesure des hormones à base d'anticorps, il faut analyser les produits chimiques à tester en ce qui concerne leur potentiel d'interférence avec le système de mesure utilisé pour quantifier la T et l'E2, comme indiqué dans le paragraphe 32, avant de commencer les tests.

26.   Le DMSO est le solvant recommandé pour cet essai. Si l'on utilise un autre solvant, il faut déterminer:

—	la solubilité de la substance d'essai, de la forskoline et du prochloraz dans le solvant et

—	la cytotoxicité en fonction de la concentration du solvant.

Il est recommandé que la concentration maximale admissible de solvant ne dépasse pas une dilution au dixième de la plus faible concentration cytotoxique du solvant.

27.   Avant d'effectuer un test pour la première fois, le laboratoire réalise une expérience de qualification démontrant qu'il est capable d'établir et de maintenir les conditions de culture des cellules et les conditions expérimentales appropriées, requises pour tester les produits chimiques, comme il est décrit aux paragraphes 33 à 35.

28.   Quand on commence des tests au moyen d'un lot de cellules nouveau, il faut exécuter un essai sur une plaque de CQ avant l'utilisation du lot afin d'évaluer la performance des cellules, comme il est décrit aux paragraphes 36 et 37.

Performance du système de mesure des hormones

Sensibilité, exactitude, précision de la méthode et réactivité croisée avec la matrice de l'échantillon

29.   Chaque laboratoire peut utiliser un système de mesure des hormones de son choix pour l'analyse de la production de T et d'E2 par les cellules H295R dès lors qu'il satisfait aux critères de performance, y compris la limite de quantification (LdQ). En principe, elle est de 100 pg/ml pour la T et de 10 pg/ml pour l'E2, sur la base des niveaux de base d'hormones observés dans les études de validation. Toutefois, des niveaux moindres ou plus élevés peuvent être appropriés suivant les niveaux de base d'hormones atteints dans le laboratoire d'exécution. Avant de tester des plaques de CQ et des produits chimiques, le laboratoire démontre que le système qu'il utilisera peut mesurer les concentrations d'hormones dans le milieu supplémenté avec une exactitude et une précision suffisantes pour satisfaire aux critères de CQ spécifiés dans les tableaux 1 et 5 en analysant le milieu supplémenté dopé par un étalon d'hormone interne. Le milieu supplémenté est dopé par au moins 3 concentrations de chaque hormone (par exemple 100, 500 et 2 500 pg/ml de T; 10, 50 et 250 pg/ml d'E2; ou on peut utiliser, pour les plus basses concentrations de dopage par la T et l'E2, les concentrations les plus faibles possible sur la base des limites de détection du système de mesure des hormones choisi) et analysé. Il convient que les concentrations d'hormone mesurées des échantillons non extraits ne diffèrent pas de plus de 30 % des concentrations nominales, et que les variations entre les mesures répliquées du même échantillon ne dépassent pas 25 % (voir aussi le tableau 8 pour des critères de CQ additionnels). Si ces critères de CQ sont remplis, on admet que le système de mesure des hormones choisi est suffisamment exact et précis et ne comporte pas de réaction croisée avec les composants du milieu (matrice de l'échantillon) susceptible d'influer significativement sur le résultat de l'essai. Dans ce cas, aucune extraction d'échantillons n'est requise avant la mesure des hormones.

30.   Dans le cas où les critères de CQ des tableaux 1 et 8 ne sont pas remplis, il peut y avoir un effet de matrice significatif et il faut effectuer une expérience en procédant à une extraction sur le milieu dopé. L'appendice II du rapport de validation (4) présente un exemple de procédure d'extraction. Les mesures des concentrations d'hormones dans les échantillons extraits sont faites en triple (17). Si l'on peut montrer qu'après extraction les composants du milieu n'interfèrent pas avec la méthode de détection des hormones conformément aux critères de CQ, toutes les expériences ultérieures sont conduites au moyen d'échantillons extraits. Si les critères de CQ ne sont pas satisfaits après extraction, le système de mesure des hormones utilisé n'est pas approprié aux besoins de l'essai de stéroïdogenèse H295R et il faut employer une autre méthode de détection des hormones.

Courbe standard

31.   Les concentrations d'hormones des témoins solvant (TS) se situent dans la partie linéaire de la courbe standard. De préférence, les valeurs de TS sont proches du centre de la partie linéaire de manière qu'on puisse mesurer l'induction et l'inhibition de la synthèse des hormones. Les dilutions du milieu (ou des extraits) à mesurer sont choisies en conséquence. La relation linéaire est déterminée par une méthode statistique appropriée.

Test d'interférence des substances chimiques

32.   S'il est prévu d'utiliser des essais à base d'anticorps comme les méthodes immunoenzymatiques (ELISA) ou radio-immunologiques (RIA) pour mesurer les hormones, il faut tester chaque substance chimique quant à son interférence potentielle avec le système de mesure des hormones qui doit être employé, avant de commencer à effectuer les essais de substances chimiques elles-mêmes [appendice III du rapport de validation (4)], parce que certaines de ces substances peuvent interférer avec ces tests (17). S'il se produit une interférence ≥ 20 % de la production basale d'hormones pour la T ou l'E2 telle que déterminée par l'analyse des hormones, le “Test d'interférence des substances chimiques avec la mesure des hormones” (décrit dans l'appendice III du rapport de validation (4), section 5.0) est effectué sur toutes les dilutions de solution mère des substances d'essai afin de déterminer la dose seuil à partir de laquelle une interférence significative (≥ 20 %) se produit. Si l'interférence est inférieure à 30 %, on peut corriger les résultats en conséquence. Si l'interférence dépasse 30 %, les données sont invalides et, à ces concentrations, sont rejetées. Si une interférence significative d'une substance d'essai avec un système de mesure des hormones se produit à plusieurs concentrations non cytotoxiques, il faut utiliser un système de mesure des hormones différent. Pour éviter l'interférence de substances contaminantes, il est recommandé d'extraire les hormones du milieu au moyen d'un solvant approprié; on trouvera des méthodes possibles dans le rapport de validation (4).

Tableau 1

Critères de performance pour les systèmes de mesure des hormones

Paramètre	Critère
Sensibilité de la méthode de mesure	Limite de quantification (LdQ) T: 100 pg/ml; E2: 100pg/ml (18)
Rendement d'extraction des hormones (seulement quand l'extraction est nécessaire)	Les taux de récupération moyens (sur la base de mesures en triple) pour les quantités d'hormone ajoutées ne montrent pas un écart supérieur à 30 % par rapport à la quantité ajoutée.
Interférence avec les produits chimiques (seulement systèmes à base d’anticorps)	Il convient qu'il n'y ait pas de réactivité croisée importante(≥ 30 % de la production basale d’hormone pour l’hormone considérée) avec aucune des hormones produites par les cellules (19)  (20)

Test d'aptitude du laboratoire

33.   Avant de tester des substances chimiques inconnues, un laboratoire démontre, en effectuant le test d'aptitude, qu'il est capable d'établir et de maintenir les conditions de culture des cellules et les conditions d'expérience appropriées, requises pour conduire convenablement l'essai. Comme la réussite d'un essai est directement liée au personnel de laboratoire qui le conduit, ces procédures sont en partie répétées en cas de changement de personnel.

34.   Ce test d'aptitude sera conduit dans les mêmes conditions que celles énoncées dans les paragraphes 38 à 40 en exposant les cellules à 7 concentrations croissantes d'inducteurs et d'inhibiteurs forts, modérés et faibles ainsi qu'à une substance chimique négative (voir le tableau 2). Précisément, comme l'indique le tableau 2, les produits chimiques à tester sont: la forskoline (no CAS 66575-29-9), inducteur fort; le prochloraz (no CAS 67747-09-5), inhibiteur fort; l'atrazine (no CAS 1912-24-9), inducteur modéré; l'aminoglutéthimide (no CAS 125-84-8), inhibiteur modéré; le bisphénol A (no CAS 80-05-7), inducteur faible (production d'E2) et inhibiteur faible (production de T); la gonadotrophine chorionique humaine (HCG) (no CAS 9002-61-3), substance négative. Des plaques distinctes sont testées pour tous les produits chimiques suivant le format présenté dans le tableau 6. Une plaque de CQ (tableau 4, paragraphes 36 et 37) est incluse à chaque exécution quotidienne pour les produits chimiques du test d'aptitude

Tableau 2

Substances chimiques du test d'aptitude et concentrations d'exposition

Substance chimique	Concentrations d'essai [μM]
Prochloraz	0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10
Forskoline	0 (21), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30
Atrazine	0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
Aminoglutéthimide	0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
Bisphénol A	0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
HCG	0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100

L'exposition des H295R aux produits chimiques s'effectue dans des plaques à 24 puits durant le test d'aptitude du laboratoire. Le dosage est en μΜ pour toutes les doses des produits chimiques d'essai. Les doses sont administrées dans le DMSO à 0,1 % (v/v) par puits. Toutes les concentrations d'essai sont testées dans des puits en triple (tableau 6). On utilise des plaques distinctes pour chaque substance chimique. Une plaque de CQ est incluse à chaque exécution quotidienne.

35.   Les analyses de viabilité des cellules et d'hormones sont conduites comme indiqué dans les paragraphes 42 à 46. La valeur seuil (concentration minimale avec effet observé, CMEO) et la décision de classification sont enregistrées et comparées aux valeurs du tableau 3. Les données sont considérées comme acceptables si elles satisfont aux conditions du tableau 3 pour la CMEO et la décision de classification.

Tableau 3

Valeurs seuils (CMEO) et décisions de classification pour les substances du test d'aptitude

	no CAS	CMEO [μM]		Décision de classification
		T	E2	T	E2
Prochloraz	67747-09-5	≤ 0,1	≤ 1,0	+ (22) (Inhibition)	+ (Inhibition)
Forskoline	66575-29-9	≤ 10	≤ 0,1	+ (Induction)	+ (Induction)
Atrazine	1912-24-9	≤ 100	≤ 10	+ (Induction)	+ (Induction)
Aminoglutéthimide	125-84-8	≤ 100	≤ 100	+ (Inhibition)	+ (Inhibition)
Bisphénol A	80-05-7	≤ 10	≤ 10	+ (Inhibition)	+ (Induction)
HCG	9002-61-3	n/a	n/a	Négatif	Négatif

Plaque de contrôle de qualité

36.   La plaque de contrôle de qualité (CQ) est utilisée pour vérifier la performance des cellules H295R dans des conditions de culture standard et pour établir une base de données historique pour les concentrations d'hormone dans les témoins solvant et les témoins positifs et négatifs, ainsi que d'autres mesures de CQ au cours du temps.

—	Il faut évaluer la performance des cellules H295R au moyen d'une plaque de CQ pour chaque lot ATCC nouveau ou après utilisation, pour la première fois, d'un stock de cellules précédemment congelées sauf si le test d'aptitude du laboratoire (paragraphes 32-34) a été effectué avec ce lot de cellules.

—	Une plaque de CQ fournit une évaluation complète des conditions de l'essai (par exemple viabilité des cellules, témoins solvant, témoins négatifs et positifs, ainsi que la variabilité intra- et interessai) quand on teste les produits chimiques et elle fait partie de chaque exécution de l'essai.

37.   Le test de CQ s'effectue dans une plaque à 24 puits et suit les mêmes procédures d'incubation, de dosage, de viabilité des cellules/cytotoxicité, d'extraction des hormones et d'analyse des hormones décrites dans les paragraphes 38 à 46 pour l'essai des produits chimiques. La plaque de CQ contient des blancs, des témoins solvant et deux concentrations d'un inducteur connu (forskoline, 1; 10 μΜ) et d'un inhibiteur connu (prochloraz, 0,1; 1 μM) de la synthèse de l'E2 et de la T. En outre, on utilise du MeOH dans certains puits comme témoin positif pour l'essai de viabilité/cytotoxicité. Le tableau 4 présente une description détaillée de la disposition de la plaque. Les critères à satisfaire sur la plaque de CQ sont énoncés dans le tableau 5. Il convient que la production de base d'hormone minimale pour la T et l'E2 soit atteinte dans les témoins solvant et dans les blancs.

Tableau 4

Disposition de la plaque de contrôle de qualité pour tester la performance des cellules H295R non exposées et des cellules exposées à un inhibiteur connu (PRO = prochloraz) et à un inducteur connu (FOR = forskoline) de la production d'E2 et de T. Quand l'expérience d'exposition est terminée et après avoir enlevé le milieu, on ajoute une solution de méthanol à 70 % à tous les puits MeOH pour servir de témoin positif pour la cytotoxicité [voir l'essai de cytotoxicité dans l'appendice III du rapport de validation (4)]

	1	2	3	4	5	6
A	Blanc (23)	Blanc (23)	Blanc (23)	Blanc (23) (+ MeOH) (24)	Blanc (23) (+ MeOH) (24)	Blanc (23) (+ MeOH) (24)
B	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)
C	FOR 1 μM	FOR 1 μM	FOR 1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM
D	FOR 10 μM	FOR 10 μM	FOR 10 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM

Tableau 5

Critères de performance pour la plaque de contrôle de qualité

	T	E2
Production de base d'hormone dans le témoin solvant (TS)	≥ 5 fois la LdQ	≥ 2,5 fois la LdQ
Induction (10 μM forskoline)	≥ 1,5 fois le TS	≥ 7,5 fois le TS
Inhibition (1 μM prochloraze)	≤ 0,5 fois le TS	≤ 0,5 fois le TS

PROCÉDURE D'EXPOSITION AUX SUBSTANCES CHIMIQUES

38.   On retire les cellules préincubées de l'incubateur (paragraphe 21) et on les vérifie au microscope pour s'assurer qu'elles sont en bon état (attachement, morphologie) avant le dosage.

39.   On place les cellules dans une enceinte de biosécurité, on enlève le milieu supplémenté et on le remplace par un nouveau milieu supplémenté (1 ml/puits). Le DMSO est le solvant préconisé pour la présente méthode d'essai. Au cas où il y aurait des raisons d'utiliser d'autres solvants, il faut en présenter la justification scientifique. On expose les cellules à la substance d'essai en ajoutant 1 μl de la solution mère appropriée dans le DMSO [voir l'appendice II du rapport de validation (4)] pour 1 ml de milieu supplémenté (volume du puits). Il en résulte une concentration finale de 0,1 % de DMSO dans les puits. Pour garantir un mélange adéquat, on préfère généralement que la solution mère appropriée de la substance d'essai dans le DMSO soit mélangée avec le milieu supplémenté pour obtenir la concentration finale souhaitée pour chaque dose, et que le mélange soit ajouté dans chaque puits immédiatement après avoir enlevé l'ancien milieu. Si l'on choisit cette option, il convient que la concentration de DMSO (0,1 %) reste la même pour tous les puits. Les puits contenant les deux plus fortes concentrations sont examinés visuellement pour détecter la formation de précipités ou d'une opacité indiquant une solubilité incomplète de la substance d'essai, au moyen d'un microscope stéréoscopique. Si l'on observe ce phénomène (opacité, formation de précipités), on examine aussi les puits contenant la concentration immédiatement inférieure (et ainsi de suite) et il faut exclure de la suite de l'évaluation et de l'analyse les concentrations non complètement dissoutes. On remet la plaque dans l'incubateur à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 48 heures. Le tableau 6 montre la disposition de la plaque pour les substances d'essai. Les désignations “stock 1” à “stock 7” montrent l'emplacement des doses croissantes de la substance d'essai.

Tableau 6

Disposition des doses pour l'exposition des cellules H295R aux substances d'essai dans une plaque à 24 puits

	1	2	3	4	5	6
A	DMSO	DMSO	DMSO	Stock 4	Stock 4	Stock 4
B	Stock 1	Stock1	Stock 1	Stock 5	Stock 5	Stock 5
C	Stock 2	Stock 2	Stock 2	Stock 6	Stock 6	Stock 6
D	Stock 3	Stock 3	Stock 3	Stock 7	Stock 7	Stock 7

40.   Après 48 heures on retire les plaques d'exposition de l'incubateur et on examine tous les puits au microscope pour observer l'état des cellules (attachement, morphologie, degré de confluence) et les signes de cytotoxicité. On divise le milieu de chaque puits en deux parties égales (environ 490 μl chacune) et on les transfère dans deux fioles distinctes convenablement étiquetées (c'est-à-dire qu'une aliquote fournit un échantillon de réserve pour chaque puits). Pour éviter que les cellules ne sèchent, on retire le milieu, un rang ou une colonne à la fois, et on le remplace par le milieu de l'essai de viabilité des cellules/cytotoxicité. Si l'on ne mesure pas immédiatement la viabilité des cellules/cytotoxicité, on ajoute à chaque puits 200 μl de PBS avec Ca2+ et Mg2+. On congèle les milieux à – 80 °C jusqu'aux opérations ultérieures d'analyse des concentrations d'hormone (voir les paragraphes 44-46). La T et l'E2 dans un milieu gardé à – 80 °C sont généralement stables pendant au moins 3 mois, mais il convient que la stabilité des hormones durant le stockage soit documentée dans chaque laboratoire.

41.   Immédiatement après avoir enlevé le milieu, on détermine la viabilité des cellules/cytotoxicité pour chaque plaque d'exposition.

Détermination de la viabilité des cellules

42.   On peut utiliser un essai de viabilité des cellules/cytotoxicité de son choix pour déterminer l'impact potentiel de la substance d'essai sur la viabilité des cellules. Cet essai doit être capable de fournir une mesure exacte du pourcentage de cellules viables présentes dans un puits, ou il convient de démontrer qu'il est directement comparable à/au (une fonction linéaire du) Live/Dead® Assay [voir l'appendice III du rapport de validation (4)]. Le test MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényl tétrazolium] est un autre essai dont on a montré qu'il fonctionne bien également (18). L'évaluation de la viabilité des cellules au moyen des méthodes précitées est une mesure relative qui ne présente pas nécessairement une relation linéaire avec le nombre absolu de cellules dans un puits. En conséquence, l'analyste effectue parallèlement une évaluation visuelle subjective de chaque puits, et des photos numériques des TS et des deux concentrations non cytotoxiques les plus élevées sont prises et archivées de manière à permettre, si nécessaire, une évaluation ultérieure de la densité exacte des cellules. S'il ressort de l'inspection visuelle ou de l'essai de viabilité/cytotoxicité qu'il semble y avoir une augmentation du nombre de cellules, il faut vérifier l'augmentation observée. Si l'augmentation est confirmée, ce point est consigné dans le rapport d'essai. La viabilité des cellules s'exprime par rapport à la réponse moyenne dans les TS, considérée correspondre à 100 % de cellules viables, et est calculée comme il convient selon l'essai de viabilité/toxicité cellulaire utilisé. Pour le test MTT, la formule suivante peut être utilisée:

% de cellules viables = (réponse dans le puits – réponse moyenne dans les puits traités au MeOH [= 100 % de cellules mortes]) ÷ (réponse moyenne dans les puits TS – réponse moyenne dans les puits traités au MeOH [= 100 % de cellules mortes])

43.   Les puits ayant une viabilité inférieure à 80 %, par rapport à la viabilité moyenne dans les TS (= 100 % de viabilité), ne sont pas inclus dans l'analyse finale des données. L'inhibition de la stéroïdogenèse qui a lieu en présence de presque 20 % de cytotoxicité nécessite un examen attentif pour s'assurer que la cytotoxicité n'en est pas la cause.

Analyse des hormones

44.   Chaque laboratoire peut utiliser un système de mesure des hormones de son choix pour l'analyse de la T et de l'E2. On peut utiliser les aliquotes de réserve du milieu provenant de chaque groupe de traitement pour préparer des dilutions amenant la concentration dans la partie linéaire de la courbe standard. Comme indiqué au paragraphe 29, chaque laboratoire démontre la conformité de son système de mesure des hormones (par exemple ELISA, RIA, CPL-SM, CPL-SM/SM) aux critères de CQ en analysant le milieu supplémenté dopé par un étalon d'hormone interne avant d'effectuer des essais de CQ ou de tester des produits chimiques. Pour s'assurer que les composants du système de test n'interfèrent pas avec la mesure des hormones, il peut être nécessaire d'extraire les hormones des milieux avant de les mesurer (voir le paragraphe 30 pour les conditions dans lesquelles une extraction est ou non requise). Il est recommandé d'effectuer l'extraction suivant les procédures de l'appendice III du rapport de validation (4).

45.   Si l'on utilise une trousse de test commerciale pour mesurer la production d'hormones, l'analyse des hormones est conduite comme spécifié dans les manuels fournis par le fabricant. La plupart des fabricants ont leur propre procédure de conduite des analyses d'hormones. Il faut ajuster les dilutions des échantillons de telle sorte que les concentrations d'hormone attendues pour les témoins solvant se situent au centre de la partie linéaire de la courbe standard de l'essai considéré [appendice III du rapport de validation (4)]. Les valeurs en dehors de la partie linéaire de la courbe standard sont rejetées.

46.   Les concentrations finales d'hormone se calculent comme suit:

Exemple:

Extrait:	450 μl de milieu
Reconstitué dans:	250 μl de tampon de l'essai
Dilution dans l'essai:	1:10 (pour amener l'échantillon dans la partie linéaire de la courbe standard)
Concentration d'hormone dans l'essai:	150 pg/ml (déjà ramené à la concentration par ml d'échantillon testé)
Récupération:	89 %
Concentration finale d'hormone =	(concentration d'hormone [par ml] ÷ récupération) (facteur de dilution)
Concentration finale d'hormone =	(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml

Choix des concentrations de test

47.   On procède à au moins deux exécutions indépendantes de l'essai. À moins que des informations antérieures, par exemple sur les limites de solubilité ou la cytotoxicité, fournissent une base pour le choix des concentrations d'essai, il est recommandé d'espacer les concentrations d'essai pour l'exécution initiale par des intervalles log10, avec une concentration maximale de 10-3 M. Si la substance chimique est soluble et non cytotoxique aux concentrations d'essai, et que la première exécution a été négative pour toutes les concentrations, cela est confirmé par une nouvelle exécution dans les mêmes conditions que la première (tableau 7). Si les résultats de la première exécution sont équivoques (c'est-à-dire si le facteur multiplicatif de changement par rapport au TS n'est statistiquement significatif que pour une seule concentration) ou positifs (c'est-à-dire si le facteur multiplicatif est statistiquement significatif pour au moins deux concentrations adjacentes), le test est répété comme l'indique le tableau 7, en affinant les concentrations d'essai choisies. Les concentrations d'essai dans les exécutions 2 et 3 (le cas échéant) sont ajustées sur la base des résultats de l'exécution initiale en affinant les concentrations qui ont généré un effet par un espacement 1/2-log (par exemple si l'exécution initiale avec 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10; 100; 1 000 μΜ a eu pour résultat une induction à 1 et 10 μΜ, les concentrations à tester à la deuxième exécution sont 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30; 100 μΜ), à moins qu'il ne faille employer des concentrations plus faibles pour trouver une CMEO. Dans ce dernier cas, il faut utiliser à la deuxième exécution au moins cinq concentrations au-dessous de la concentration la plus faible testée à la première exécution, avec une échelle 1/2-log. Si la deuxième exécution ne confirme pas la première (c'est-à-dire qu'on n'observe pas de significativité statistique à la concentration précédemment testée positive ± 1 incrément de concentration), il faut exécuter une troisième expérience en revenant aux conditions initiales. Des résultats équivoques à la première exécution sont considérés comme négatifs si l'effet observé ne peut être confirmé dans aucune des deux exécutions suivantes. Les résultats équivoques sont considérés comme des réponses positives (effet) si la réponse peut être confirmée dans au moins une exécution supplémentaire à ± 1 incrément de concentration près (voir le paragraphe 55 pour la procédure d'interprétation des données).

Tableau 7

Matrice de décision pour les scénarios de résultats possibles

Exécution 1	Exécution 2		Exécution 3		Décision
Scénario	Décision	Scénario	Décision	Scénario	Positive	Négative
Négatif	Confirmer (26)	Négatif	Fin			X
Négatif	Confirmer (26)	Positif	Affiner (27)	Négatif		X
Équivoque (28)	Affiner (27)	Négatif	Confirmer (26)	Négatif		X
Équivoque (28)	Affiner (27)	Négatif	Confirmer (26)	Positif	X
Équivoque (28)	Affiner (27)	Positif			X
Positif	Affiner (27)	Négatif	Confirmer (26)	Positif	X
Négatif	Confirmer (26)	Positif	Affiner (27)	Positif	X
Positif	Affiner (27)	Positif	Fin		X

Contrôle de qualité de la plaque de test

48.   En plus des critères afférents à la plaque de CQ, il convient de satisfaire d'autres critères de qualité présentés dans le tableau 8 concernant les variations acceptables entre les puits répliqués, les expériences répliquées, la linéarité et la sensibilité des systèmes de mesure des hormones, la variabilité des mesures d'hormone répliquées d'un même échantillon, et le pourcentage de récupération des dopages d'hormone après extraction du milieu (le cas échéant; voir le paragraphe 30 concernant les conditions dans lesquelles une extraction est requise). Pour être prises en compte dans la suite de l'évaluation, il convient que les données se situent à l'intérieur des intervalles acceptables définis pour chaque paramètre. Si ce n'est pas le cas, il convient de noter dans la feuille de travail que les critères de CQ n'ont pas été remplis pour l'échantillon en question, et de réanalyser cet échantillon ou de le retirer de l'ensemble de données.

Tableau 8

Intervalles et/ou variation (%) acceptables pour les paramètres des plaques de test de l'essai H295R

(LdQ: limite de quantification du système de mesure des hormones. CV: coefficient de variation; TS: témoin solvant; DPM: désintégrations par minute)

	Comparaison	T	E2
Production de base d'hormone dans les TS	Facteur multiplicatif par rapport à la LdQ	≥ 5 fois	≥ 2,5 fois
Expériences d'exposition - CV intra-plaque pour les TS (puits répliqués)	Concentrations absolues	≤ 30 %	≤ 30 %
Expériences d'exposition CV intra-plaques pour les TS (expériences répliquées)	Facteur multiplicatif	≤ 30 %	≤ 30 %
Système de mesure des hormones - sensibilité	Facteur de diminution détectable par rapport aux TS	≥ 5 fois	≥ 2,5 fois
Système de mesure des hormones - CV des mesures répliquées pour les TS (29)	Concentrations absolues	≤ 25 %	≤ 25 %
Extraction du milieu - Récupération de l'étalon 3 H interne (le cas échéant)	DPM	≥ 65 % du nominal

ANALYSE DES DONNÉES ET COMPTE RENDU

Analyse des données

49.   Pour évaluer l'augmentation ou la diminution relative de la production d'hormones chimiquement altérée, il faut normaliser les résultats sur la base de la valeur de TS moyenne de chaque plaque de test et exprimer les résultats sous la forme du changement par rapport aux TS de chaque plaque. Toutes les données sont exprimées sous la forme d'une moyenne ± 1 écart type.

50.   Les données relatives aux hormones ne sont incluses dans l'analyse des données que pour les puits où la cytotoxicité était inférieure à 20 %. Les changements relatifs sont calculés comme suit:

Changement relatif = (concentration d'hormone dans le puits) ÷ (concentration d'hormone moyenne des puits à témoin solvant).

51.   S'il ressort de l'inspection visuelle du puits ou de l'essai de viabilité/cytotoxicité décrit dans le paragraphe 42 qu'il semble y avoir une augmentation du nombre de cellules, il faut vérifier l'augmentation observée. Si l'augmentation est confirmée, ce point est consigné dans le rapport d'essai.

52.   Avant de conduire des analyses statistiques, il faut évaluer les hypothèses de normalité et d'homogénéité des variances. La normalité est évaluée au moyen de graphiques de probabilités standard ou autre méthode statistique appropriée (par exemple test de Shapiro-Wilk). Si les données (changements relatifs) ne sont pas distribuées suivant une loi normale, il faut essayer de les transformer de manière à approcher une distribution normale. Si les données suivent ou approchent une distribution normale, il faut analyser les différences entre les groupes de concentration de la substance chimique et les TS au moyen d'un test paramétrique (par exemple test de Dunnett), la concentration étant la variable indépendante et la réponse (changement relatif), la variable dépendante. Si les données ne suivent pas une distribution normale, il faut utiliser un test non paramétrique approprié (par exemple test de Kruskal-Wallis, test de rangs multiunivoque de Steel). Les différences sont considérées comme significatives à p ≤ 0,05. Les évaluations statistiques se font sur la base des valeurs moyennes des puits représentant des points de données répliqués indépendants. Il est à prévoir que, en raison du large espacement des doses dans la première exécution (échelle log10), il ne sera pas possible, dans de nombreux cas, de décrire une relation claire concentration-réponse où les deux doses les plus élevées soient dans la partie linéaire de la courbe en S. En conséquence, pour la première exécution ou tout autre ensemble de données dans ce cas (par exemple quand on ne peut estimer une efficacité maximale) on appliquera des statistiques à variable fixe de type I, comme décrit ci-dessus.

53.   Si au moins deux points de données se situent dans la partie linéaire de la courbe et si l'on peut calculer les efficacités maximales — comme on le prévoit pour certaines des deuxièmes exécutions effectuées avec un espacement 1/2-log des concentrations d'exposition — un modèle probit, logit ou autre modèle de régression approprié est utilisé pour calculer les concentrations efficaces (par exemple CE50 et CE20).

54.   Les résultats sont fournis à la fois sous forme graphique (diagramme à barres représentant la moyenne ± 1 écart type) et tabulaire (CMEO/CSEO, direction de l'effet et ampleur maximale de la réponse dans la partie dose-réponse des données (voir l'exemple de la figure 3). L'appréciation des données n'est considérée comme valable que si elle repose sur au moins deux expériences exécutées indépendamment. Une expérience est considérée comme indépendante si elle a été exécutée à une date différente avec un nouvel ensemble de solutions et de témoins. L'intervalle des concentrations utilisé dans les exécutions 2 et 3 (si nécessaire) peut être adapté à l'appui des résultats de l'exécution 1, afin de mieux définir l'intervalle dose-réponse contenant la CMEO (voir le paragraphe 47).

Figure 3

Exemple de la présentation et de l'évaluation des données obtenues durant la conduite de l'essai H295R, sous forme graphique et tabulaire

[Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives par rapport au témoin solvant (p < 0,05). CMEO: concentration minimale avec effet observé; changement maximal: ampleur maximale de la réponse observée à une concentration quelconque par rapport à la réponse moyenne des TS (= 1)]

Substance chimique	CMEO	Changement maximal
Forskoline	0,01	0,15 fois
Létrozole	0,001	29 fois

Procédure d'interprétation des données

55.   Une substance d'essai est jugée positive si le rapport multiplicatif d'induction est statistiquement significatif (p ≤ 0,05) par rapport au témoin solvant à deux concentrations adjacentes dans au moins deux exécutions de l'essai indépendantes (tableau 7). Une substance d'essai est jugée négative après deux exécutions négatives indépendantes ou après trois exécutions, dont deux négatives et une équivoque ou positive. Si les données générées dans trois expériences indépendantes ne correspondent à aucun critère de décision énoncé dans le tableau 7, les résultats expérimentaux ne sont pas interprétables. Les résultats à des concentrations qui dépassent les limites de solubilité ou à des concentrations cytotoxiques ne doivent pas être inclus dans l'interprétation des résultats.

Rapport d'essai

56.   Le rapport d'essai contient les informations suivantes:

Établissement réalisant l'essai

—	Nom et adresse de l'établissement

—	Directeur de l'étude et autres membres du personnel et leur responsabilité dans l'étude

—	Dates de début et de fin de l'étude

Substance d'essai, réactifs et témoins

—	Identité (nom/no CAS, le cas échéant), source, numéro de lot, pureté, fournisseur et caractérisation de la substance d'essai, des réactifs et des témoins

—	Nature physique et propriétés physicochimiques pertinentes de la substance d'essai

—	Conditions de stockage et méthode et fréquence de la préparation de la substance d'essai, des réactifs et des témoins

—	Stabilité de la substance d'essai

Cellules

—	Source et type des cellules

—	Nombre de passages des cellules (identifiant de passage de cellules) des cellules utilisées dans l'essai

—	Description des procédures d'entretien des cultures de cellules

Exigences préalables à l'essai (le cas échéant)

—	Description et résultats du test d'interférence de la substance chimique avec la mesure des hormones

—	Description et résultats des mesures de rendement d'extraction des hormones

—	Courbes standard et d'étalonnage pour tous les essais d'analyse à conduire

—	Limites de détection pour les essais d'analyse choisis

Conditions de l'essai

—	Composition des milieux

—	Concentration de la substance d'essai

—	Densité des cellules (concentration des cellules estimée ou mesurée à 24 heures et 48 heures)

—	Solubilité de la substance d'essai (limite de solubilité, si elle a été déterminée)

—	Temps et conditions d'incubation

Résultats de l'essai

—	Données brutes pour chaque puits pour les témoins et les substances d'essai — chaque mesure répliquée sous la forme des données originales fournies par l'instrument utilisé pour mesurer la production d'hormone (par exemple densité optique, unités de fluorescence, DPM, etc.)

—	Validation de la normalité ou exposé de la transformation des données

—	Réponses moyennes ± 1 écart type pour les puits mesurés

—	Données de cytotoxicité (concentrations d'essai ayant provoqué la cytotoxicité)

—	Confirmation de la conformité aux exigences de CQ

—	Changement relatif par rapport au témoin solvant, corrigé de la cytotoxicité

—	Diagramme à barres montrant le changement relatif (facteur multiplicatif) à chaque concentration, l'écart type et la signification statistique comme décrit dans les paragraphes 49-54

Interprétation des données

—	Application de la procédure d'interprétation des données aux résultats et discussion des constatations

Discussion

—	Ressort-il de l'étude des indications quelconques concernant la possibilité que les données T/E2 puissent subir l'influence d'effets indirects sur la voie des glucocorticoïdes ou des minéralocorticoïdes?

Conclusions

BIBLIOGRAPHIE

(1)

OCDE (2002), “Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens”, à l'appendice 2 du chapitre B.54 de la présente annexe.

(2)

Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, R., et Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production, Toxicol. Appl. Pharmacol., 217, 114-124.

(3)

Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., et Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidogenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies, Env. Sci. Pollut. Res., 14, 23-30.

(4)

OCDE (2010), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, série de l'OCDE sur les essais et évaluations, no 132, ENV/JM/MONO(2010)31, OCDE, Paris, disponible à l'adresse suivante: http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html

(5)

OCDE (2010), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for Steroidogenesis, série de l'OCDE sur les essais et évaluations, no 133, ENV/JM/MONO(2010)32, OCDE, Paris, disponible à l'adresse suivante: http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html

(6)

Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, disponible à l'adresse suivante: http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05.pdf|

(7)

Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S., et Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroidogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. Sci., 81, 78-89.

(8)

Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G., et Van den Berg, M. (2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells, Toxicol. Appl. Pharmacol., 182, 44-54.

(9)

Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M., et Conolly, R.B. (2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model development for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118:265-272.

(10)

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P., et Hecker, M. (2010), Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137-1148.

(11)

Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A., et La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses multiple pathways of steroid biosynthesis, Cancer Res., 50, 5488-5496.

(12)

He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, M.G., Martin, J.W., et Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line, Chemosphere, 80:578-584.

(13)

Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S., et Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, Environ. Sci. Technol., 39:2777-2785.

(14)

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P., et Hecker, M. (2010), Differential assessment of chemical effects on aromatase activtity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Pol. Res., 17:1137-1148.

(15)

Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., Mcgee, E. A., Wester, R., et Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. Endocrinol. Metab., 77, 731-737.

(16)

Chapitre B.55 de la présente annexe: “Bioessai de Hershberger sur le rat: essai de dépistage à court terme de propriétés (anti) androgéniques”, ligne directrice de l'OCDE pour les essais de produits chimiques, no 441, OCDE, Paris, disponible à l'adresse suivante: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(17)

Shapiro, R., et Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1-propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2, 222-231.

(18)

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods, 65, 55-63.

(19)

Brock, B.J., et Waterman, M.R. (1999), Biochemical differences between rat and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs of these two species, Biochemistry, 38:1598-1606.

(20)

Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J., et Goldfarb, P.S. (2006), Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484-492.

B.58   ESSAIS DE MUTATIONS GÉNÉTIQUES DES CELLULES SOMATIQUES ET GERMINALES DE RONGEURS TRANSGÉNIQUES

INTRODUCTION

1.   La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice pour les essais de produits chimiques no 488 de l'OCDE (2013). Les méthodes d'essai de l'Union européenne s'appliquent à toute une série d'essais de mutations in vitro permettant de détecter les mutations chromosomiques et/ou géniques. Certaines méthodes d'essai permettent de détecter des effets in vivo (à savoir les aberrations chromosomiques et la synthèse d'ADN non programmée) mais elles ne mesurent pas les mutations génétiques. Les essais de mutations chez les rongeurs transgéniques (RTG) répondent à ce besoin d'essais in vivo de mutations génétiques à la fois pratiques et exploitables à grande échelle.

2.   Les essais de mutations chez les RTG ont fait l'objet d'un examen complet (24) (33). Pour ces essais, on utilise des rats et des souris transgéniques qui comportent de multiples copies de vecteurs navettes de plasmides ou de phages intégrés dans leurs chromosomes. Les transgènes contiennent des gènes rapporteurs pour la détection de différents types de mutations induites in vivo par les substances d'essai.

3.   On compte les mutations qui se produisent chez un rongeur en retrouvant le transgène et en analysant le phénotype du gène rapporteur chez un hôte bactérien démuni du gène rapporteur. Les essais de mutations chez les RTG permettent de mesurer les mutations induites dans des gènes génétiquement neutres présents dans la quasi-totalité des tissus du rongeur. Ces essais permettent donc de surmonter un certain nombre d'obstacles qui entravent actuellement l'étude de la mutation génétique in vivo dans des gènes endogènes (quantité limitée de tissus appropriés pour l'analyse, sélection positive/négative par rapport aux mutations, par exemple).

4.   Les données disponibles démontrent que les transgènes répondent aux mutagènes de manière similaire aux gènes endogènes, notamment en ce qui concerne la détection de substitutions d'une base par une autre, les décalages du cadre de lecture et les petites délétions et insertions (24).

5.   Les ateliers internationaux sur les essais de génotoxicité (IWGT) ont approuvé la prise en compte des essais pour la détection in vivo des mutations génétiques chez les RTG et ont recommandé un protocole de mise en application de ces essais (15) (29). La présente méthode d'essai découle de ces recommandations. Le document référencé (16) donne une analyse plus détaillée des avantages induits par l'emploi de ce protocole.

6.   On prévoit que, à l'avenir, il pourrait être possible de combiner des essais de mutations chez les RTG avec une étude de toxicité à doses répétées (chapitre B.7 de la présente annexe). Cependant, il est préalablement nécessaire d'obtenir des données afin de s'assurer que la sensibilité des essais de mutations chez les RTG n'est pas affectée par la réduction de la durée entre la fin de la période d'administration et le moment de l'échantillonnage. Cette durée est de 1 jour dans les essais de toxicité à doses répétées, alors qu'elle est de 3 jours dans les essais de mutations chez les RTG. Des données sont aussi requises pour s'assurer que la performance de l'étude de toxicité à doses répétées n'est pas affectée par l'utilisation d'une souche transgénique à la place de souches de rongeurs traditionnelles. Quand ces données seront disponibles, la présente méthode d'essai sera actualisée.

7.   La définition des principaux termes figure dans l'appendice.

CONSIDÉRATIONS INITIALES

8.   Les essais de mutations chez les RTG pour lesquels il existe un nombre de données suffisant pour permettre de donner un avis favorable à leur utilisation dans le cadre de la présente méthode d'essai sont les suivants: souris bactériophage lacZ (Muta™Mouse); souris plasmide lacZ; souris et rat gpt delta (gpt et Spi–); souris et rat lacI (Big Blue®), mis en œuvre dans des conditions normales. De plus, l'essai de sélection positive cII peut être utilisé pour évaluer les mutations dans les modèles Big Blue® et Muta™Mouse. Dans les modèles de RTG, le paramètre utilisé pour évaluer la mutagenèse est normalement la fréquence des mutants; toutefois, une analyse moléculaire des mutations peut, si nécessaire, fournir des informations supplémentaires (voir paragraphe 24).

9.   Ces essais de mutations génétiques in vivo chez les rongeurs sont particulièrement pertinents pour évaluer le risque mutagène dans la mesure où les réponses qu'ils apportent dépendent du métabolisme in vivo, de la pharmacocinétique, des processus de réparation de l'ADN et de la synthèse d'ADN de translésion, bien que ces paramètres varient selon les espèces, selon les tissus et selon les types de dommages subis par l'ADN. Un essai in vivo de mutations génétiques sert à analyser plus en détail un effet mutagène détecté par un système in vitro et à effectuer un suivi des résultats d'essais utilisant d'autres indicateurs in vivo (24). Outre le fait qu'elles soient mises en cause dans l'apparition de cancers, les mutations génétiques constituent un indicateur pertinent pour prédire les pathologies non cancéreuses des tissus somatiques dues à des facteurs mutagènes (12) (13) ainsi que les pathologies transmises par le biais des cellules germinales.

10.   Si des éléments prouvent que la substance d'essai ou un métabolite pertinent n'atteindra aucun des tissus d'intérêt, il n'est pas opportun d'avoir recours à l'essai de mutations chez les RTG.

PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI

11.   Dans les essais décrits au paragraphe 8, le gène cible est d'origine bactérienne ou bactériophagique, et sa récupération à partir de l'ADN génomique du rongeur se fait par introduction du transgène dans un vecteur navette de bactériophages λ ou de plasmides. Cette procédure implique l'extraction de l'ADN génomique du tissu d'intérêt du rongeur, le traitement in vitro de l'ADN génomique (à savoir l'encapsidation des vecteurs λ ou la ligature et l'électroporation des plasmides pour retrouver le vecteur navette) et la détection ultérieure des mutations subies par les hôtes bactériens dans des conditions appropriées. Les essais emploient des transgènes neutres faciles à retrouver à partir de la plupart des tissus.

12.   L'essai de base de mutations chez les RTG implique d'administrer une substance chimique au rongeur pendant un certain temps. Toute voie d'administration appropriée est autorisée, y compris l'implantation (essais de dispositifs médicaux, par exemple). La période totale de traitement d'un animal est appelée la période d'administration. L'administration est généralement suivie d'une période, antérieure au sacrifice, au cours de laquelle la substance d'essai n'est pas administrée et au cours de laquelle les lésions d'ADN non réparées se fixent sous forme de mutations stables. Dans la littérature, cette période est désignée sous diverses appellations telles que la période de manifestation, la période de fixation ou la période d'expression; la fin de cette période marque le moment de l'échantillonnage (15) (29). Après le sacrifice de l'animal, l'ADN génomique est isolé du (des) tissus(s) d'intérêt puis purifié.

13.   Les données relatives à un seul tissu par animal, issues d'encapsidations/de ligatures multiples sont généralement agrégées, et la fréquence des mutants est généralement évaluée par le biais d'un nombre total d'unités formant plage ou d'unités formant colonie compris entre 105 et 107. En cas de recours à des méthodes de sélection positive, le nombre total d'unités formant plage est déterminé à l'aide d'un ensemble séparé de plages non sélectives.

14.   Les méthodes de sélection positive ont été développées pour qu'on puisse détecter plus facilement les mutations du gène gpt [souris et rat gpt delta, phénotype gpt– (20) (22) (28)] et du gène lacZ [Muta™Mouse ou souris plasmide lacZ (3) (10) (11) (30)], tandis que les mutations du gène lacI chez les animaux Big Blue® sont détectées par le biais d'une méthode non sélective qui permet d'identifier les mutants en générant des plages de couleur (bleue). Les méthodes de sélection positive permettent également de détecter les mutations ponctuelles du gène cII du bactériophage λ utilisé comme vecteur navette [souris ou rat Big Blue®, Muta™Mouse (17)] et les délétions sur les gènes λ red et gam [sélection Spi– chez souris et rat gpt delta) (21) (22) (28)]. On obtient la fréquence des mutants en divisant le nombre de plages/plasmides contenant les mutations qui se produisent dans le transgène par le nombre total de plages/plasmides retrouvés dans un même échantillon d'ADN. Dans les études de mutations chez les RTG, la fréquence des mutants est le paramètre observé. De plus, une fréquence de mutation peut être déterminée sous forme de fraction de cellules portant des mutations indépendantes; ce calcul nécessite de corriger l'expansion clonale par séquençage des mutants retrouvés (24).

15.   Les mutations notées dans les essais de mutations ponctuelles lacI, lacZ, cII et gpt consistent essentiellement en substitutions d'une base par une autre, en décalages du cadre de lecture et en petites insertions/délétions. La part relative de ces types de mutations dans les mutations spontanées est similaire à celle observée pour le gène endogène Hprt. On observe des délétions importantes uniquement avec les essais de sélection du gène Spi– et de plasmides du gène lacZ (24). Les mutations qui nous préoccupent sont les mutations in vivo chez la souris ou le rat. Les mutations in vitro et ex vivo, qui peuvent se produire lors de la récupération des phages/plasmides, de la réplication ou de la réparation sont relativement rares et peuvent, dans certains systèmes, être spécifiquement identifiées ou exclues par l'hôte bactérien ou le système de sélection positive.

DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

Préparations

Sélection de l'espèce animale

16.   On dispose actuellement de divers modèles de détection des mutations génétiques chez les souris transgéniques, et ces systèmes continuent d'être plus souvent utilisés que les modèles impliquant des rats transgéniques. Si le rat se révèle manifestement plus adapté que la souris pour l'étude (par exemple si l'on étudie le mécanisme de la cancérogenèse d'une tumeur constatée uniquement chez les rats, pour établir une corrélation avec une étude de toxicité chez les rats ou si l'on sait que le métabolisme des rats est plus représentatif du métabolisme humain), le recours à des modèles impliquant des rats transgéniques est envisagé.

Conditions d'encagement et d'alimentation

17.   La température de la salle d'expérimentation animale est idéalement de 22 °C (± 3 °C). Si l'humidité relative est de 30 % au minimum et, de préférence, de 70 % au maximum, sauf pendant le nettoyage de la salle, l'objectif est de maintenir une humidité relative de 50-60 %. La lumière est artificielle, avec une séquence quotidienne de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité. Les aliments classiques pour animaux de laboratoire peuvent être utilisés et l'eau potable est fournie à satiété. Le choix des aliments peut être influencé par la nécessité d'assurer une bonne incorporation de la substance chimique dans la nourriture si l'administration se fait par cette voie. Les animaux sont mis en cage par petits groupes (de cinq au maximum) du même sexe si aucun comportement agressif n'est à craindre. Les animaux peuvent être encagés individuellement si cela est justifié sur le plan scientifique.

Préparation des animaux

18.   De jeunes adultes en bonne santé et sexuellement matures (âgés de 8-12 semaines au début du traitement) sont répartis au hasard dans les groupes témoins et les groupes de traitement. Les animaux sont identifiés individuellement. Les animaux sont gardés dans leurs cages pendant au moins 5 jours avant le commencement de l'étude, de façon à les acclimater aux conditions du laboratoire. Les cages sont disposées de telle manière qu'il n'y ait pas d'effets dus à l'emplacement des cages. Au début de l'étude, il convient que la variation pondérale des animaux soit minimale et ne dépasse pas ± 20 % du poids moyen de chaque sexe.

Préparation des doses

19.   Les substances d'essai solides sont dissoutes, mises en suspension dans des solvants ou véhicules appropriés ou incorporées dans les aliments ou dans l'eau de boisson avant d'être administrées aux animaux. Les substances d'essai liquides peuvent être administrées directement ou diluées avant d'être administrées. En cas d'exposition par inhalation, les substances d'essai peuvent être administrées sous forme de gaz, de vapeur ou d'aérosol solide ou liquide en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. Il faut utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage.

Conditions expérimentales

Solvant/véhicule

20.   Il convient que le solvant/véhicule n'ait pas d'effets toxiques aux volumes de dose administrés et ne soit pas suspecté de réaction chimique avec la substance d'essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels fait l'objet de justification par des données de référence faisant état de leur compatibilité. On recommande d'envisager d'abord l'utilisation d'un solvant/véhicule aqueux chaque fois que c'est possible.

Témoins positifs

21.   Des animaux témoins positifs sont normalement inclus simultanément dans l'essai. Cependant, pour les laboratoires ayant fait preuve de leur compétence (voir paragraphe 23) et qui utilisent ces essais en routine, l'ADN d'animaux témoins positifs traités précédemment peut être pris en compte dans chaque étude pour confirmer la réussite de la méthode. Il convient que cet ADN issu d'expériences précédentes provienne de la même espèce et des mêmes tissus d'intérêt, et soit stocké dans de bonnes conditions (voir paragraphe 36). Quand des témoins positifs sont inclus simultanément dans l'essai, il n'est pas nécessaire de les administrer par la même voie que celle de la substance d'essai; toutefois, il convient d'avoir la certitude que les témoins positifs induisent des mutations dans un ou plusieurs tissus d'intérêt pour la substance d'essai. Les doses des substances testées utilisées comme témoins positifs sont sélectionnées de manière à produire des effets faibles ou modérés qui permettent d'évaluer de manière critique les performances et la sensibilité de l'essai. Des exemples de substances utilisées comme témoins positifs et de certains de leurs tissus cibles figurent dans le tableau 1.

Tableau 1

Exemples de substances utilisées comme témoins positifs et de certains de leurs tissus cibles

Substance servant de témoin positif et no CAS	Dénomination Einecs et no Einecs	Caractéristiques	Tissu cible de la mutation
			Rat	Souris
N-nitroso-N-éthylurée [no CAS 759-73-9]	N-éthyl-N-nitrosurée [212-072-2]	Mutagène à action directe	Foie, poumons	Moelle osseuse, côlon, épithélium du côlon, intestins, foie, poumons, rate, rein, cellules de granulosa entourant l'ovocyte, cellules germinales mâles
Carbamate d'éthyle (uréthane) [no CAS 51-79-6]	Uréthane [200-123-1]	Mutagène, nécessite d'être métabolisé mais ne produit que des effets faibles		Moelle osseuse, secteur gastrique antérieur, intestin grêle, foie, poumons, rate
Toluène-2,4-diamine [no CAS 95-80-7]	4-méthyl-m-phénylènediamine [202-453-1]	Mutagène, nécessite d'être métabolisé, positif également dans l'essai Spi–	Foie	Foie
Benzo[a]pyrène [no CAS 50-32-8]	Benzo[def]chrysène [200-028-5]	Mutagène, nécessite d'être métabolisé	Foie, épiploon	Moelle osseuse, glandes mammaires, côlon, secteur gastrique antérieur, estomac glandulaire, cœur, foie, poumons, cellules germinales mâles

Témoins négatifs

22.   Les témoins négatifs, traités seulement avec le solvant ou avec le véhicule, et sinon traités de manière identique aux groupes témoins, sont inclus à chaque moment d'échantillonnage. En l'absence de données significatives observées ou publiées montrant que le solvant/véhicule choisi n'induit pas d'effets délétères ou mutagènes, des témoins non traités sont également inclus à chaque moment d'échantillonnage afin d'établir l'acceptabilité du témoin contenant le véhicule.

Vérification des compétences du laboratoire

23.   La compétence à mener ces essais est établie sur la base d'informations démontrant l'aptitude à reproduire les résultats escomptés à partir des données publiées (24) concernant: 1) les fréquences de mutants avec les substances des contrôles positifs (réponses faibles comprises) telles que celles énumérées dans le tableau 1, les non mutagènes et les témoins contenant le véhicule et 2) la récupération des transgènes de l'ADN génomique (efficacité de l'encapsidation, par exemple).

Séquençage des mutants

24.   Pour les applications réglementaires, le séquençage de l'ADN des mutants n'est pas obligatoire, notamment en cas de résultat nettement positif ou négatif. Néanmoins, les données de séquençage peuvent être utiles si l'on observe de grandes variations entre les individus. Dans ces cas-là, le séquençage peut servir à exclure l'hypothèse de jackpots ou de clonages en permettant d'identifier la proportion de mutants uniques dans un tissu particulier. Le séquençage de 10 mutants environ par tissu et par animal suffit à déterminer si les mutants clonaux contribuent à la fréquence des mutants; séquencer jusqu'à 25 mutants peut se révéler nécessaire pour corriger mathématiquement les aspects de clonalité dans la fréquence des mutants. Le séquençage des mutants peut également être envisagé si l'on constate que la fréquence des mutants est en légère augmentation (la fréquence est alors légèrement supérieure aux valeurs des témoins non traités). Des différences en matière de spectre de mutants entre les colonies de mutants des animaux traités et des animaux non traités peuvent appuyer l'hypothèse d'un effet mutagène (29). De plus, les spectres de mutation peuvent servir à développer des hypothèses mécanistiques. Si le séquençage fait partie du protocole d'essai, la conception de l'essai fait l'objet d'une attention particulière, notamment en ce qui concerne le nombre de mutants séquencés par échantillon pour obtenir l'efficacité adéquate selon le modèle statistique utilisé (voir paragraphe 43).

DÉROULEMENT DE L'ESSAI

Nombre et sexe des animaux

25.   Un nombre suffisamment important d'animaux est prévu afin d'obtenir l'efficacité statistique nécessaire pour détecter une fréquence de mutants au moins multipliée par deux. Chaque groupe contient au moins 5 animaux; toutefois, si l'efficacité statistique est insuffisante, on utilise un plus grand nombre d'animaux, selon les besoins. On a normalement recours à des mâles. Dans certains cas, le recours exclusif à des femelles peut être justifié, par exemple si l'essai porte sur des médicaments qui concernent spécifiquement la femme dans l'espèce humaine, ou si l'étude porte spécifiquement sur le métabolisme féminin. En cas de différences significatives entre les sexes en matière de toxicité ou de métabolisme, on utilisera à la fois des mâles et des femelles.

Période d'administration

26.   Sachant que les mutations s'accumulent au fil des traitements, un régime de doses répétées est nécessaire, à raison de traitements quotidiens pendant 28 jours. Cette démarche est généralement jugée acceptable à la fois pour produire une accumulation suffisante de mutations par des mutagènes faibles et pour fournir une durée d'exposition adéquate pour la détection des mutations dans les organes à prolifération lente. D'autres régimes de traitement peuvent être adaptés pour certaines évaluations, et il convient que ces autres calendriers de dosage soient scientifiquement justifiés dans le protocole. Les traitements ne sont pas plus courts que le temps nécessaire à l'induction complète de l'ensemble des enzymes impliquées dans les métabolismes mis en jeu, et les traitements de plus courte durée peuvent nécessiter le recours à des moments d'échantillonnage multiples, adaptés aux organes dont les taux de prolifération sont différents. Quel que soit le cas de figure, toutes les informations disponibles (par exemple celles sur la toxicité générale ou le métabolisme et la pharmacocinétique) sont exploitées lorsqu'il s'agit de justifier un protocole, en particulier lorsque ce dernier dévie des recommandations standard décrites précédemment. S'ils permettent certes d'accroître la sensibilité, les traitements de plus de 8 semaines sont expliqués clairement et justifiés, car des traitements de longue durée peuvent engendrer une augmentation apparente de la fréquence de mutants par expansion clonale (29).

Niveaux de doses

27.   Les niveaux de doses sont déterminés à partir des résultats d'une étude préliminaire de détermination des concentrations mesurant la toxicité générale, menée selon la même voie d'exposition, ou à partir de résultats d'études de toxicité subaiguë existantes. Des animaux non transgéniques appartenant à la même souche de rongeur peuvent être utilisés pour déterminer ces ordres de grandeur. Dans l'essai principal, pour obtenir des informations sur la relation dose-réponse, une étude complète comporte un groupe témoin négatif (voir paragraphe 22) et au moins trois niveaux de doses espacés comme il se doit, sauf si la dose limite a été utilisée (voir paragraphe 28). La dose supérieure est la dose maximale tolérée (DMT). La DMT est définie comme la dose induisant des signes de toxicité tels que des niveaux de doses supérieurs à cette dose, dans les mêmes conditions d'administration, seraient susceptibles d'avoir des effets létaux. Les substances d'essai ayant une activité biologique spécifique à des niveaux de doses faibles et non toxiques (telles que les hormones et les mitogènes) et les substances d'essai dont les propriétés toxicocinétiques sont saturées peuvent être considérées comme des exceptions aux critères de détermination des doses et sont évaluées au cas par cas. Les niveaux de doses employés sont compris entre “toxicité maximale” et “faible toxicité” voire “absence de toxicité”.

Essai limite

28.   Si les essais préliminaires de détermination des concentrations ou les données disponibles issues de souches de rongeurs apparentées indiquent qu'un régime de traitement égal ou supérieur à la dose limite (voir ci-dessous) n'engendre pas d'effets toxiques observables, et si la génotoxicité n'est pas escomptée sur la base des données relatives aux substances structurellement apparentées, une étude complète utilisant trois niveaux de doses peut ne pas être considérée comme nécessaire. Pour une période d'administration de 28 jours (soit 28 traitements quotidiens), la dose limite est de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour. Pour les périodes d'administration d'une durée inférieure ou égale à 14 jours, la dose limite est de 2 000 mg/kg de poids corporel/jour (les calendriers de dosage autres que 28 traitements quotidiens font l'objet d'une justification scientifique dans le protocole; voir paragraphe 26).

Administration des doses

29.   La substance d'essai est généralement administrée par gavage à l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule de tubage adaptée. En général, la voie d'exposition humaine anticipée est prise en compte lors de la conception d'un essai. Par conséquent, les autres voies d'exposition (eau de boisson, sous-cutanée, intraveineuse, topique, inhalation, trachéale, alimentaire ou implantation, par exemple) peuvent être acceptables si elles peuvent être justifiées. Les injections intrapéritonéales ne sont pas recommandées, car la cavité péritonéale n'est pas une voie d'exposition humaine physiologiquement pertinente. Le volume maximal de liquide qu'on peut administrer par gavage ou par injection en une seule prise dépend de la taille de l'animal d'essai. Ce volume n'excède pas 2 ml/100 g de poids corporel. Le recours à des volumes plus importants fait l'objet de justification. Sauf pour les substances d'essai irritantes ou corrosives, qui auront normalement des effets exacerbés à des concentrations plus élevées, il convient de réduire la variabilité du volume d'essai par ajustement de la concentration pour garantir un volume constant à tous les niveaux de doses.

Moment d'échantillonnage

Cellules somatiques

30.   Le moment d'échantillonnage est une variable essentielle car elle dépend de la période nécessaire pour que les mutations se fixent. Cette période est différente selon les tissus et semble dépendre du temps de renouvellement de la population cellulaire, la moelle osseuse et les intestins répondant rapidement tandis que le foie répond beaucoup plus lentement. Une période de 28 jours de traitements consécutifs (tel qu'indiqué au paragraphe 26) et un échantillonnage 3 jours après le dernier traitement semblent un compromis acceptable pour l'évaluation des fréquences de mutants à la fois dans les tissus à prolifération rapide et dans ceux à prolifération lente, bien que la fréquence maximale de mutants puisse ne pas se manifester dans les tissus à prolifération lente dans ces conditions. Si les tissus à prolifération lente sont d'une importance cruciale, un moment d'échantillonnage 28 jours après la période d'administration de 28 jours peut se révéler mieux indiqué (16) (29). Dans ce cas-là, le moment d'échantillonnage 28 jours après remplace le moment d'échantillonnage 3 jours après et fait l'objet d'une justification scientifique.

Cellules germinales

31.   Les essais chez les RTG conviennent bien à l'étude de l'induction d'une mutation génétique chez les cellules germinales mâles (7) (8) (27), pour lesquelles la chronologie et la cinétique de la spermatogenèse ont été bien définies (27). Le nombre limité d'ovules disponibles pour l'analyse, même après une superovulation et le fait qu'il n'y ait pas de synthèse de l'ADN dans l'ovocyte empêchent de déterminer, via les essais transgéniques, si les cellules germinales femelles ont subi une mutation (31).

32.   Le moment d'échantillonnage pour les cellules germinales mâles est choisi de telle sorte que la gamme de types de cellules exposées tout au long du cycle de développement des cellules germinales soit échantillonnée et que le stade ciblé dans le cadre de l'échantillonnage ait été suffisamment exposé. La progression des cellules germinales en développement du stade de cellules souches spermatogoniales au stade de sperme mature rejoignant le canal déférent/la queue de l'épididyme dure 49 jours environ chez la souris (36) et 70 jours environ chez le rat (34) (35). Le sperme collecté dans le canal déférent/la queue de l'épididyme après s'y être accumulé pendant une période d'exposition de 28 jours, suivie d'une période d'échantillonnage de 3 jours (7) (8), représente une population de cellules exposées durant approximativement la seconde moitié de la spermatogenèse, population composée de cellules méiotiques et postméiotiques mais pas de cellules spermatogoniales ni de cellules souches. Pour un bon échantillonnage des cellules du canal déférent/de la queue de l'épididyme qui étaient des cellules souches spermatogoniales pendant la période d'exposition, un moment d'échantillonnage supplémentaire à 7 semaines au minimum (souris) ou 10 semaines au minimum (rat) après la fin de traitement est nécessaire.

33.   Les cellules expulsées des tubes séminifères au bout d'un régime de 28 jours + 3 jours sont composées d'une population mixte enrichie pour tous les stades des cellules germinales en développement (7) (8). L'échantillonnage de ces cellules pour la détection de mutations génétiques ne fournit pas une évaluation aussi précise des stades auxquels les mutations de cellules germinales sont induites que l'échantillonnage des spermatozoïdes du canal déférent/de la queue de l'épididyme (car toute une série de types de cellules germinales sont échantillonnés à partir des tubes et des cellules somatiques contaminent cette population cellulaire). Néanmoins, l'échantillonnage des cellules à partir des tubes séminifères allié à celui des spermatozoïdes collectés dans le canal déférent/la queue de l'épididyme au bout d'un régime de 28 jours + 3 jours d'échantillonnage permettrait de couvrir, dans une certaine mesure, les cellules exposées pendant la majorité des phases de développement des cellules germinales et serait utile pour la détection de certains des mutagènes agissant sur les cellules germinales.

Observations

34.   Les animaux font l'objet d'un examen clinique général au moins une fois par jour, de préférence aux mêmes heures, en prenant en considération la période où les effets prévus devraient être les plus marqués après l'administration. L'état de santé des animaux est consigné. Au moins deux fois par jour, l'ensemble des animaux fait l'objet d'un constat de morbidité et de mortalité. Chaque animal est pesé au moins une fois par semaine, et juste après avoir été sacrifié. La consommation alimentaire est mesurée au moins une fois par semaine. Si la substance d'essai est diluée dans de l'eau avant d'être administrée, la consommation d'eau est mesurée à chaque changement d'eau et au moins une fois par semaine. Les animaux montrant des signes non létaux de toxicité excessive sont euthanasiés avant la fin de l'essai (23).

Collecte des tissus

35.   Les arguments invoqués pour justifier la collecte des tissus sont clairement définis. Étant donné qu'il est possible d'étudier l'induction de mutations quel que soit le tissu, ou presque, les tissus à collecter sont choisis en fonction des raisons qui ont motivé la conduite de l'étude et des données existantes relatives à la mutagénicité, à la cancérogénicité ou à la toxicité de la substance d'essai soumise à l'étude. La voie d'administration [basée sur la (les) voie(s) d'exposition humaine potentielle(s)], la distribution tissulaire prévue et le mécanisme d'action possible sont des facteurs importants à prendre en considération. En l'absence de documentation générale, plusieurs tissus somatiques sont collectés, selon l'intérêt qu'ils représentent. Il s'agira de tissus à prolifération rapide, de tissus à prolifération lente et de tissus appartenant au site de contact. En outre, les spermatozoïdes du canal déférent/de la queue de l'épididyme et les cellules germinales en développement des tubes séminifères (tel que décrits aux paragraphes 32 et 33) sont collectés et stockés au cas où l'analyse ultérieure de la mutagénicité des cellules germinales serait nécessaire. Les organes sont pesés, et pour les organes plus gros, la même zone est collectée sur tous les animaux.

Stockage des tissus et de l'ADN

36.   Les tissus (ou homogénats de tissus) sont stockés à une température inférieure ou égale à — 70 °C et utilisés pour l'isolement de l'ADN avant expiration d'un délai de 5 ans. L'ADN isolé, réfrigéré à une température de 4 °C dans un tampon approprié est idéalement utilisé pour l'analyse des mutations avant expiration d'un délai de 1 an.

Sélection des tissus pour l'analyse des mutants

37.   Les tissus sont sélectionnés en fonction des critères suivants: 1) la voie d'administration ou le site de premier contact (estomac glandulaire en cas d'administration par voie orale, poumon en cas d'administration par inhalation ou peau en cas d'administration par voie topique, par exemple); 2) les paramètres pharmacocinétiques observés dans les études de toxicité générale; ils indiquent l'élimination ou la rétention par les tissus, l'accumulation dans les tissus, ou les organes cibles pour la toxicité. Si des études sont menées pour faire suite à des études de cancérogénicité, les tissus cibles pour la cancérogénicité sont pris en considération. La sélection des tissus à analyser doit optimiser la détection de produits chimiques qui sont des mutagènes in vitro à action directe, rapidement métabolisés, hautement réactifs ou faiblement absorbés, ou pour lesquels le tissu cible est déterminé par la voie d'administration (6).

38.   En l'absence de documentation générale, et si l'on tient compte du site de contact en fonction de la voie d'administration, la mutagénicité du foie et d'au moins un tissu à division rapide (estomac glandulaire, moelle osseuse, par exemple) est évaluée. Dans la plupart des cas, ces exigences peuvent être respectées par des analyses de deux tissus soigneusement sélectionnés, mais, dans certains cas, trois tissus, voire plus, sont nécessaires. S'il y a des raisons d'être particulièrement préoccupé par des effets sur les cellules germinales, y compris en raison de réponses positives dans les cellules somatiques, les mutations dans les tissus de cellules germinales sont évaluées.

Méthodes de mesure

39.   Des méthodes standard de laboratoire ou publiées conçues pour la détection des mutants sont à disposition des modèles transgéniques recommandés: bactériophage lambda et plasmide lacZ (30); souris lacI (2) (18); souris gpt delta (22); rat gpt delta (28); cII (17). Les modifications font l'objet d'une justification et sont accompagnées d'une documentation adéquate. Les données issues de multiples encapsidations peuvent être agrégées et utilisées pour atteindre un nombre de plages ou de colonies adéquat. Toutefois, le fait qu'un nombre important de réactions d'encapsidation soit nécessaire pour atteindre le nombre de plages approprié peut être un indicateur d'un ADN de faible qualité. Dans ces cas-là, la prudence s'impose, car les données peuvent être dépourvues de fiabilité. Le nombre optimal de plages ou de colonies par échantillon d'ADN dépend de la probabilité statistique de détecter des mutants en nombre suffisant à une fréquence de mutants spontanés donnée. En général, un minimum de 125 000 à 300 000 plages est nécessaire si la fréquence de mutants spontanés est de l'ordre de 3 × 10-5 (15). Pour l'essai lacI (Big Blue®), il importe de démontrer que la gamme complète de phénotypes mutants de la couleur peut être détectée par inclusion de témoins de la couleur appropriée simultanément à chaque plage. Les tissus et les échantillons (items) qui en découlent sont traités et analysés selon un schéma par bloc où les items du groupe témoin véhicule/solvant, le groupe témoin positif (s'il y en a) ou l'ADN du témoin positif (s'il y a lieu) et chaque groupe de traitement sont traités ensemble.

RÉSULTATS ET RAPPORT

Traitement des résultats

40.   Les résultats individuels pour chaque animal sont présentés sous forme de tableaux. L'unité expérimentale est l'animal. Le rapport comporte le nombre total d'unités formant plage ou d'unités formant colonie, le nombre de mutants et la fréquence des mutants pour chaque tissu de chaque animal. En cas de réactions d'encapsidation/de récupération multiples, le nombre de réactions par échantillon d'ADN est consigné dans le rapport. S'il convient de conserver les données relatives à chaque réaction individuelle, seul le nombre total d'unités formant plage ou d'unités formant colonie est consigné par écrit. Les données de toxicité et les signes cliniques tels que décrits dans le paragraphe 35 sont consignés dans le rapport. Les résultats du séquençage sont présentés pour chaque mutant analysé, et les calculs de la fréquence de mutation qui en résultent pour chaque animal et chaque tissu sont montrés.

Évaluation statistique et interprétation des résultats

41.   Plusieurs critères, tels qu'une augmentation de la fréquence des mutants liée à la dose ou une nette augmentation de la fréquence des mutants dans un seul groupe traité par rapport au groupe témoin solvant/véhicule, permettent de déterminer un résultat positif. Au moins trois groupes de traitement sont analysés pour obtenir des données suffisantes pour l'analyse de la relation dose-réponse. Si la pertinence biologique des résultats est considérée comme prioritaire, des méthodes statistiques appropriées peuvent servir d'aide à l'évaluation des résultats d'essai (4) (14) (15) (25) (26). Les méthodes statistiques employées considèrent l'animal comme unité expérimentale.

42.   Une substance d'essai dont les résultats ne remplissent pas les critères susmentionnés quel que soit le tissu est considérée comme non mutagène dans cet essai. Pour la pertinence biologique d'un résultat négatif, il convient que l'exposition du tissu soit confirmée.

43.   Pour les analyses du séquençage de l'ADN, un certain nombre de méthodes statistiques aident à interpréter les résultats (1) (5) (9) (19).

44.   Le fait d'examiner si les valeurs observées appartiennent ou non à l'ordre de grandeur traditionnel peut fournir des indications au moment de l'évaluation de la signification biologique de la réponse (32).

Rapport d'essai

45.   Le rapport d'essai devrait comporter les informations suivantes:

Substance chimique

—	Données d'identification et no CAS, s'il est connu

—	Source, numéro de lot s'il est disponible

—	État physique et pureté

—	Propriétés physico-chimiques pertinentes pour la conduite de l'étude

—	Stabilité de la substance d'essai, si elle est connue

Solvant/véhicule

—	Justification du choix du véhicule

—	Solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant ou véhicule, si elles sont connues

—	Préparation des formulations pour administration par l'alimentation, par l'eau de boisson ou par inhalation

—	Déterminations analytiques sur les formulations (stabilité, homogénéité, concentrations nominales, par exemple)

Animaux d'expérience

—	Espèce/souche utilisée et justification du choix

—	Nombre, âge et sexe des animaux

—	Source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.

—	Poids individuel des animaux au début de l'essai, y compris la gamme des poids, l'écart moyen et pondéré dans chaque groupe

Conditions expérimentales

—	Données des témoins positifs et négatifs (solvant/véhicule)

—	Données de l'étude préliminaire de détermination des concentrations

—	Justification du choix des doses employées

—	Détails concernant la formulation de la substance d'essai

—	Détails concernant l'administration de la substance d'essai

—	Justification du choix de la voie d'administration

—	Méthodes de mesure de la toxicité animale, y compris, si elles existent, analyses histopathologiques ou hématologiques et fréquence des observations animales et des mesures du poids corporel

—	Méthodes permettant de vérifier que la substance d'essai a atteint le tissu cible ou la circulation sanguine en cas de résultats négatifs

—	Dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour) calculée en fonction de la concentration (ppm) de la substance d'essai contenue dans la nourriture ou l'eau de boisson, et de la consommation, s'il y a lieu

—	Détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau

—	Description détaillée des calendriers de traitement et d'échantillonnage et justification des choix

—	Méthode d'euthanasie

—	Procédures d'isolation et de préservation des tissus

—	Méthodes d'isolation de l'ADN génomique des rongeurs, avec récupération du transgène de l'ADN génomique et transfert de l'ADN génomique vers un hôte bactérien

—	Source et numéros de lot de toutes les cellules, matériels et de tous les réactifs (s'il y a lieu)

—	Méthodes d'énumération des mutants

—	Méthodes d'analyse moléculaire des mutants et utilisation comme correctifs pour la clonalité et/ou pour calculer les fréquences de mutation, s'il y a lieu

Résultats

—	État général de l'animal avant et pendant la période d'essai, y compris signes de toxicité

—	Poids corporels et poids des organes, après sacrifice

—	Pour chaque tissu/animal, évaluation du nombre de mutants, du nombre de plages ou de colonies, fréquence des mutants

—	Pour chaque groupe de tissus/animaux, nombre de réactions d'encapsidation par échantillon d'ADN, nombre total de mutants, fréquence moyenne des mutants, écart type

—	Relation dose-réponse, si possible

—	Pour chaque tissu/animal, nombre de mutants indépendants et fréquence moyenne de mutation si une analyse moléculaire des mutations a été menée

—	Données sur les animaux témoins négatifs inclus simultanément dans l'essai et données antérieures sur ces témoins négatifs avec ordres de grandeur, moyennes et écarts types

—	Données sur les animaux témoins positifs inclus simultanément dans l'essai (ou sur l'ADN d'animaux témoins positifs précédemment obtenus)

—	Déterminations analytiques si elles existent (concentrations d'ADN utilisées dans l'encapsidation, données du séquençage ADN, par exemple)

—	Analyses et méthodes statistiques employées

Discussion des résultats

Conclusion

BIBLIOGRAPHIE

(1)

Adams, W.T., et Skopek, T.R. (1987), “Statistical Test for the Comparison of Samples from Mutational Spectra”, J. Mol. Biol., 194:391-396.

(2)

Bielas, J.H. (2002), “A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement”, Mutation Res., 518:107-112.

(3)

Boerrigter, M.E., Dollé, M.E., Martus, H.-J., Gossen, J.A., et Vijg, J. (1995), “Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo Mutations”, Nature, 377(6550):657-659

(4)

Carr, G.J., et Gorelick, N.J. (1995), “Statistical Design and Analysis of Mutation Studies in Transgenic Mice”, Environ. Mol. Mutagen, 25(3):246-255.

(5)

Carr, G.J., et Gorelick, N.J. (1996), “Mutational Spectra in Transgenic Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency”, Environ. Mol. Mutagen, 28:405-413.

(6)

Dean, S.W., Brooks, T.M., Burlinson, B., Mirsalis, J., Myhr, B., Recio, L., et Thybaud, V. (1999), “Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens”, Mutagenesis, 14(1):141-151.

(7)

Douglas, G.R., Jiao, J., Gingerich, J.D., Gossen, J.A., et Soper, L.M. (1995), “Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7485-7489.

(8)

Douglas, G.R., Gingerich, J.D., Soper, L.M., et Jiao, J. (1997), “Toward an Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells”, Mutation Res., 388(2-3):197-212.

(9)

Dunson, D.B., et Tindall, K.R. (2000), “Bayesian Analysis of Mutational Spectra”, Genetics, 156:1411-1418.

(10)

Gossen, J.A., de Leeuw, W.J., Tan, C.H., Zwarthoff, E.C., Berends, F., Lohman, P.H., Knook, D.L., et Vijg, J. (1989), “Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo”, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86(20):7971-7975.

(11)

Gossen, J.A., et Vijg, J. (1993), “A Selective System for lacZ-Phage using a Galactose-sensitive E. coli Host”, Biotechniques, 14(3):326, 330.

(12)

Erikson, R.P. (2003), “Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer”, Mutation Res., 543:125-136.

(13)

Erikson, R.P. (2010), “Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer: an Update”, Mutation Res., 705:96-106.

(14)

Fung, K.Y., Douglas, G.R. et Krewski, D. (1998), “Statistical Analysis of lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays”, Mutagenesis, 13(3):249-255.

(15)

Heddle, J.A., Dean, S., Nohmi, T., Boerrigter, M., Casciano, D., Douglas, G.R., Glickman, B.W., Gorelick, N.J., Mirsalis, J.C., Martus, H.-J, Skopek, T.R., Thybaud, V., Tindall, K.R. et Yajima, N. (2000), “In vivo Transgenic Mutation Assays”, Environ. Mol. Mutagen., 35:253-259.

(16)

Heddle, J.A., Martus, H.-J., et Douglas, G.R. (2003), “Treatment and Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays”, Environ. Mol. Mutagen., 41:1-6.

(17)

Jakubczak, J.L., Merlino, G., French, J.E., Muller, W.J., Paul, B., Adhya, S., et Garges, S. (1996), “Analysis of Genetic Instability during Mammary Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target”, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93(17):9073-9078.

(18)

Kohler, S.W., Provost, G.S., Kretz, P.L., Fieck, A., Sorge, J.A., et Short, J.M. (1990), “The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing”, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8):212-218.

(19)

Lewis P.D., Manshian, B., Routledge, M.N., Scott, G.B. et Burns, P.A. (2008), “Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra using Multivariate Data Analysis”, Carcinogenesis, 29(4):772-778.

(20)

Nohmi, T., Katoh, M., Suzuki, H., Matsui, M., Yamada, M., Watanabe, M., Suzuki, M., Horiya, N., Ueda, O., Shibuya, T., Ikeda, H., et Sofuni, T. (1996), “A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi- and 6-thioguanine Selections”, Environ. Mol. Mutagen., 28(4):465-470.

(21)

Nohmi, T., Suzuki, M., Masumura, K., Yamada, M., Matsui, K., Ueda, O., Suzuki, H., Katoh, M., Ikeda, H., et Sofuni, T. (1999), “Spi– Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice”, Environ. Mol. Mutagen., 34(1):9-15.

(22)

Nohmi, T., Suzuki, T., et Masumura, K.I. (2000), “Recent Advances in the Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays”, Mutation Res., 455(1-2):191-215.

(23)

OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/M0N0(2000)7, OCDE, Paris.

(24)

OCDE (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No. 103, ENV/JM/MONO(2009)7, OCDE, Paris.

(25)

Piegorsch, W.W., Margolin, B.H., Shelby, M.D., Johnson, A., French, J.E., Tennant, R.W., et Tindall, K.R. (1995), “Study Design and Sample Sizes for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay”, Environ. Mol. Mutagen., 25(3):231-245.

(26)

Piegorsch, W.W., Lockhart, A.C., Carr, G.J., Margolin, B.H., Brooks, T., Douglas, G.R., Liegibel, U.M., Suzuki, T., Thybaud, V., van Delft, J.H., et Gorelick, N.J. (1997), “Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study”, Mutation. Res., 388(2-3):249-289.

(27)

Singer, T.M., Lambert, I.B., Williams, A., Douglas, G.R., et Yauk, C.L. (2006), “Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays”, Mutation. Res., 598:164-193.

(28)

Toyoda-Hokaiwado, N., Inoue, T., Masumura, K., Hayashi, H., Kawamura, Y., Kurata, Y., Takamune, M., Yamada, M., Sanada, H., Umemura, T., Nishikawa, A., et Nohmi, T. (2010), “Integration of in vivo Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers”, Toxicol. Sci., 114(1):71-78.

(29)

Thybaud, V., Dean, S., Nohmi, T., de Boer, J., Douglas, G.R., Glickman, B.W., Gorelick, N.J., Heddle, J.A., Heflich, R.H., Lambert, I., Martus, H.-J., Mirsalis, J.C., Suzuki, T., et Yajima, N. (2003), “In vivo Transgenic Mutation Assays”, Mutation Res., 540:141-151.

(30)

Vijg, J., et Douglas, G.R. (1996), “Bacteriophage λ and Plasmid lacZ Transgenic Mice for studying Mutations in vivo”, in Pfeifer, G. (ed), Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, Plenum Press, New York, NY, USA, p. 391-410.

(31)

Yauk, C.L., Gingerich, J.D., Soper, L., MacMahon, A., Foster, W.G., et Douglas, G.R. (2005), “A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection of Mutations in Follicular Granulosa Cells”, Mutation Res, 578(1-2):117-123.

(32)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J., et Thybaud, V. (2011), “Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.

(33)

OCDE (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No. 145, ENV/JM/MONO(2011)20, OCDE, Paris.

(34)

Clermont, Y. (1972), “Kinetics of spermatogenesis in mammals seminiferous epithelium cycle and spermatogonia! renewal”, Physiol. Rev., 52:198-236.

(35)

Robaire, B., Hinton, B.T., et Oregbin-Crist, M.-C. (2006), “The Epididymis”, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, J.S., et Wassarman, P. M (eds), Physiology of Reproduction, Elsevier, Pays-Bas, p. 1071-1148.

(36)

Russell, L.B. (2004), “Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse”, Genetica, 122:25-36.

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