Règlement (CE) no 535/2002 de la Commission

du 21 mars 2002

modifiant l'annexe C de la directive 64/432/CEE du Conseil et la décision 2000/330/CE

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu la directive 64/432/CEE du Conseil du 26 juin 1964 relative à des problèmes de police sanitaire en matière d'échanges intracommunautaires d'animaux des espèces bovine et porcine(1), modifiée en dernier lieu par la décision 2001/298/CE de la Commission(2), et notamment son article 16, paragraphe 1, deuxième alinéa,

considérant ce qui suit:

(1) Le 11 octobre 1999, le comité scientifique de la santé et du bien-être des animaux a adopté un rapport(3) concernant la modification des annexes techniques de la directive 64/432/CEE en vue de tenir compte des développements scientifiques en matière de tuberculose, de brucellose et de leucose bovine enzootique.

(2) Selon ce rapport, les tests de recherche de la brucellose devraient être effectués conformément au Manuel des normes de l'Office international des épizooties (OIE), pour les tests de diagnostic et les vaccins, troisième édition, 1996.

(3) En août 2001, l'OIE a publié la quatrième édition de 2000 dudit manuel apportant certaines modifications à la description des tests de la brucellose.

(4) Il est par conséquent nécessaire de modifier l'annexe C de la directive 64/432/CEE afin d'établir des procédures de test applicables aux fins de la surveillance et des échanges à l'intérieur de la Communauté et correspondant dans la mesure du possible aux normes de l'OIE tout en tenant compte de l'avis du comité scientifique et des laboratoires nationaux de référence des États membres coopérant dans le cadre du Réseau de l'Union européenne de laboratoires nationaux de référence pour la brucellose.

(5) La décision 2000/330/CE de la Commission du 18 avril 2000 autorisant les essais de recherche d'anticorps contre la brucellose bovine dans le cadre de la directive 64/432/CEE du Conseil(4) devrait être modifiée en conséquence.

(6) Les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

L'annexe C de la directive 64/432/CEE est remplacée par l'annexe du présent règlement.

Article 2

La décision 2000/330/CE est modifiée comme suit:

1) Le texte de l'article 1er est remplacé par le texte suivant: "Article premier

L'épreuve de fixation du complément, les épreuves à l'antigène brucellique tamponné et les tests ELISA effectués conformément aux dispositions de l'annexe C de la directive 64/432/CEE sont autorisés aux fins de la certification."

2) L'annexe est supprimée.

Article 3

Le présent règlement entre en vigueur le vingtième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 21 mars 2002.

Par la Commission

David Byrne

Membre de la Commission

(1) JO 121 du 29.7.1964, p. 1977/64.

(2) JO L 102 du 12.4.2001, p. 63.

(3) SANCO/B3/R10/1999.

(4) JO L 114 du 13.5.2000, p. 37.

ANNEXE

"ANNEXE C

BRUCELLOSE

1. IDENTIFICATION DE L'AGENT

La démonstration par coloration acido-résistante modifiée ou immunospécifique de la présence d'organismes ayant la morphologie de Brucella dans des matières abortives, des sécrétions vaginales ou du lait indique la possibilité de brucellose, notamment lorsqu'elle est corroborée par des tests sérologiques.

Après avoir isolé les micro-organismes, l'espèce et le biovar doivent être identifiés par lyse de phages et/ou des tests du métabolisme oxydatif selon des critères culturaux, biochimiques et sérologiques.

Les techniques et les moyens utilisés, leur standardisation et l'interprétation des résultats doivent être conformes aux indications figurant dans le Manuel des normes de l'OIE pour les tests de diagnostic et les vaccins, quatrième édition, 2000, chapitre 2.3.1 (brucellose bovine), chapitre 2.4.2 (brucellose caprine et ovine) et chapitre 2.6.2 (brucellose porcine).

2. TESTS IMMUNOLOGIQUES

2.1. Normes

2.1.1. La souche n° 99 de Weybridge ou la souche USDA 1119-3 du biovar 1 de Brucella abortus doit être utilisée pour la préparation de tous les antigènes employés dans le test au rose bengale, l'épreuve de séro-agglutination, l'épreuve de fixation du complément et l'épreuve de l'anneau sur le lait.

2.1.2. Le sérum étalon pour les tests susmentionnés est le sérum étalon international de l'OIE (OIEISS) antérieurement dénommé second sérum étalon international anti-Brucella abortus de l'OMS.

2.1.3. Les sérums étalons pour les tests ELISA sont les suivants:

- le sérum étalon de référence international de l'OIE (OIEISS),

- le sérum étalon ELISA faiblement positif de l'OIE (OIEELISAWPSS),

- le sérum étalon ELISA fortement positif de l'OIE (OIEELISASPSS),

- le sérum étalon ELISA négatif de l'OIE (OIEELISANSS).

2.1.4. Les sérums étalons énumérés ci-dessus sont fournis par l'Agence des laboratoires vétérinaires ["Veterinary Laboratories Agency (VLA)"], de Weybridge (Royaume-Uni).

2.1.5. Les sérums étalons OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS et OIEELISANSS sont des étalons primaires internationaux à partir desquels des étalons secondaires nationaux ("étalons de travail") doivent être établis pour chaque test dans chaque État membre.

2.2. Épreuves d'immuno-absorption enzymatique (ELISA) ou autres épreuves d'agglutination destinées à la détection de la brucellose bovine dans le sérum ou le lait

2.2.1. Matériel et réactifs

La technique utilisée et l'interprétation des résultats doivent avoir été validées conformément aux principes établis au chapitre 1.1.3 de la quatrième édition de 2000 du Manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l'OIE et doivent comprendre au minimum des études de laboratoire et de diagnostic.

2.2.2. Standardisation de l'épreuve

2.2.2.1. Standardisation de la procédure de test pour les échantillons individuels de sérum:

a) une prédilution du sérum OIEISS au 1/150(1) ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/2 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/16 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) doit produire une réaction positive;

b) une prédilution du sérum OIEISS au 1/600 ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/8 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/64 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) doit produire une réaction négative;

c) le sérum OIEELISANSS doit dans tous les cas produire une réaction négative.

2.2.2.2. Standardisation de la procédure de test pour les échantillons de sérums en mélange:

a) une prédilution du sérum OIEISS au 1/150 ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/2 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/16 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) et à nouveau diluée dans des sérums négatifs avec un facteur de dilution identique au nombre de sérums constituant le mélange doit produire une réaction positive;

b) le sérum OIEELISANSS doit dans tous les cas produire une réaction négative;

c) le test doit être en mesure de détecter la présence d'une infection chez un seul animal du groupe d'animaux dont des échantillons de sérum constituent le mélange.

2.2.2.3. Standardisation de la procédure de test pour les mélanges de lait ou de lactosérum:

a) une prédilution du sérum OIEISS au 1/1000 ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/16 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/125 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) et diluée à nouveau au 1/10 dans du lait négatif doit produire une réaction positive;

b) le sérum OIEELISANSS dilué au 1/10 dans du lait négatif doit produire dans tous les cas une réaction négative;

c) le test doit être en mesure de détecter la présence d'une infection chez un seul animal du groupe d'animaux dont des échantillons de lait ou de lactosérum constituent le mélange.

2.2.3. Conditions d'utilisation des tests ELISA dans le diagnostic de la brucellose bovine

2.2.3.1. Si l'on utilise les conditions de standardisation susmentionnées pour les tests ELISA sur des échantillons de sérum, la sensibilité diagnostique de l'ELISA doit être égale ou supérieure à celle du test au rose bengale ou de l'épreuve de fixation du complément compte tenu de la situation épidémiologique dans laquelle l'épreuve est utilisée.

2.2.3.2. Si l'on utilise les conditions de standardisation susmentionnées pour l'ELISA sur des échantillons de lait de mélange, la sensibilité diagnostique de l'ELISA doit être égale ou supérieure à celle de l'épreuve de l'anneau sur le lait compte tenu non seulement de la situation épidémiologique mais également des effectifs moyens ou élevés des élevages considérés.

2.2.3.3. Lorsque les tests ELISA sont utilisés à des fins de certification conformément à l'article 6, paragraphe 1, ou pour l'établissement et le maintien du statut d'un troupeau conformément à l'annexe A, titre II, point 10, le mélange d'échantillons de sérum doit être effectué de manière à ce que les résultats des tests puissent être rapportés de manière indiscutable aux différents animaux inclus dans le mélange. Tout test de confirmation doit être effectué sur des échantillons de sérum individuels.

2.2.3.4. Les tests ELISA peuvent être appliqués à un échantillon de lait prélevé sur le lait collecté dans une exploitation comptant au moins 30 % de vaches en période de lactation. Si cette méthode est utilisée, des mesures doivent être prises afin que les échantillons prélevés pour être examinés puissent être rapportés de manière indiscutable aux différents animaux dont provient le lait. Tout test de confirmation doit être effectué sur des échantillons de sérum individuels.

2.3. Test de fixation du complément (TFC)

2.3.1. L'antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline phénolée [NaCl à 0,85 % (m/v) et phénol à 0,5 % (v/v)] ou dans du tampon véronal. Les antigènes peuvent être livrés à l'état concentré pour autant que le facteur de dilution à utiliser soit mentionné sur l'étiquette du flacon. L'antigène doit être stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé.

2.3.2. Les sérums doivent être inactivés de la manière suivante:

- sérum bovin: à une température de 56 à 60 °C pendant 30 à 50 minutes,

- sérum porcin: à une température de 60 °C pendant 30 à 50 minutes.

2.3.3. Afin d'obtenir une réaction satisfaisante, il convient d'utiliser une dose de complément supérieure à la dose minimale nécessaire pour une hémolyse complète.

2.3.4. Les contrôles suivants doivent être effectués lors de chaque série d'épreuves de fixation du complément:

a) contrôle du pouvoir anticomplémentaire du sérum;

b) contrôle de l'antigène;

c) contrôle des hématies sensibilisées;

d) contrôle du complément;

e) contrôle à l'aide d'un sérum positif de la sensibilité au déclenchement de la réaction;

f) contrôle de la spécificité de la réaction à l'aide d'un sérum négatif.

2.3.5. Calcul des résultats:

Le sérum étalon OIEISS contient 1000 unités internationales de FC (UIFC) par ml. Si le sérum étalon est testé dans une méthode donnée, le résultat est exprimé sous la forme d'un titre (TOIEISS). Le résultat de l'épreuve pour un sérum exprimé sous la forme de titre (TSERUM) doit être converti en UIFC par ml. De manière à convertir l'expression d'un titre en UIFC, le facteur F nécessaire à la conversion du titre d'un sérum inconnu (TSERUM) éprouvé au moyen de cette méthode est obtenu au moyen de la formule suivante:

>PIC FILE= "L_2002080FR.002501.TIF">

et le contenu en UIFC par ml du sérum (UIFCSERUM) par la formule:

>PIC FILE= "L_2002080FR.002502.TIF">

2.3.6. Interprétation des résultats:

Un sérum contenant 20 UIFC par ml est considéré comme positif.

2.4. Épreuve de l'anneau sur le lait

2.4.1. L'antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline phénolée [NaCl à 0,85 % (m/v) et phénol à 0,5 % (v/v)] colorée à l'hématoxyline. L'antigène doit être stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé.

2.4.2. La sensibilité de l'antigène doit être étalonnée par rapport au sérum étalon OIEISS de manière à obtenir une réaction positive avec une dilution du 1/500 de ce sérum étalon dans du lait négatif et une réaction négative à une dilution du 1/1000 de ce même sérum.

2.4.3. L'épreuve de l'anneau doit être effectuée sur des échantillons représentatifs du contenu de chaque bidon de lait ou du contenu de chaque tank de l'exploitation.

2.4.4. Les échantillons de lait ne doivent pas avoir été congelés, chauffés ni violemment agités.

2.4.5. La réaction doit être réalisée en utilisant l'une des méthodes suivantes:

- sur une colonne de lait d'au moins 25 mm de hauteur et un volume de lait de 1 ml additionné de 0,03 ou 0,05 ml d'un antigène coloré et titré,

- sur une colonne de lait d'au moins 25 mm de hauteur et un volume de lait de 2 ml additionné de 0,05 ml d'un antigène coloré et titré,

- sur un volume de lait de 8 ml additionné de 0,08 ml d'un antigène coloré et titré.

2.4.6 Le mélange de lait et d'antigène doit être incubé à 37 °C pendant 60 minutes et l'épreuve doit être effectuée parallèlement sur des laits de contrôle positif et négatif. La sensibilité de l'épreuve est améliorée si l'incubation est prolongée à 4 °C durant une période de 16 à 24 heures.

2.4.7. Interprétation des résultats:

a) réaction négative: lait coloré, crème non colorée;

b) réaction positive:

- lait et crème colorés de façon identique, ou

- lait non coloré et crème colorée.

2.5. Épreuve sur lame au rose bengale (RB)

2.5.1. L'antigène consiste en une suspension bactérienne dans un diluant d'antigène de Brucella tamponné à pH 3,65 ± 0,05 colorée au rose bengale. L'antigène doit être livré prêt à l'emploi, stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé.

2.5.2. L'antigène est préparé sans référence à la concentration cellulaire, mais sa sensibilité doit être étalonnée par rapport au sérum étalon OIEISS de manière à obtenir une réaction positive pour une dilution du sérum de 1/45 et une réaction négative pour une dilution du 1/55.

2.5.3. Le test RB est réalisé de la manière suivante:

a) le sérum (20-30 μl) est mélangé avec un volume égal d'antigène sur un carreau blanc ou une plaque émaillée pour produire une zone d'un diamètre de 2 cm environ. Le mélange est agité délicatement pendant 4 minutes à la température ambiante puis est observé sous un bon éclairage pour visualiser toute agglutination;

b) une méthode automatisée peut être utilisée pour autant qu'elle soit au moins aussi sensible et exacte que la méthode manuelle.

2.5.4. Interprétation des résultats:

Toute réaction visible est considérée comme positive à moins que le séchage ne soit excessif sur les bords.

Des sérums de contrôle positifs et négatifs doivent être inclus dans chaque série d'épreuves.

2.6. Épreuve de séro-agglutination

2.6.1. L'antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline au phénol [NaCl à 0,85 % (m/v) et phénol à 0,5 % (v/v)]. Le formaldéhyde ne doit pas être utilisé.

L'antigène peut être livré à l'état concentré pour autant que le facteur de dilution à utiliser soit mentionné sur l'étiquette du flacon.

De l'EDTA peut être ajouté à la suspension d'antigène jusqu'à l'obtention d'une dilution finale d'épreuve de 5 mM afin de réduire le taux de réactions faussement positives dans l'épreuve de séro-agglutination. Le pH doit ultérieurement être réajusté à 7,2 dans la suspension d'antigène.

2.6.2. Le sérum étalon OIEISS contient 1000 unités internationales d'agglutination.

2.6.3. L'antigène est préparé sans référence à la concentration cellulaire mais sa sensibilité doit être étalonnée par rapport au sérum étalon OIEISS de manière à obtenir une agglutination de 50 % pour une dilution finale du sérum entre le 1/600 et le 1/1000 ou une agglutination de 75 % pour une dilution finale du sérum entre le 1/500 et le 1/750.

Il peut également être utile de comparer la réactivité des nouveaux lots d'antigène et des lots d'antigène étalonnés antérieurement en utilisant un groupe de sérums définis.

2.6.4. Le test est effectué dans des tubes ou sur des microplaques. Le mélange d'antigène et de dilutions de sérum doit être incubé pendant une durée de 16 à 24 heures à une température de 37 °C.

Trois dilutions au moins doivent être préparées pour chaque sérum. Les dilutions de sérum suspect doivent être effectuées de manière à ce que la lecture de la réaction à la limite de la positivité soit réalisée dans le tube intermédiaire (ou le puits intermédiaire pour la méthode des microplaques).

2.6.5. Interprétation des résultats:

Le degré d'agglutination de Brucella dans un sérum doit être exprimé en UI par ml.

Un sérum contenant 30 UI par ml ou plus est considéré comme positif.

3. TESTS COMPLÉMENTAIRES

3.1. Test cutané de la brucellose

3.1.1. Conditions d'utilisation du test

a) Le test cutané de la brucellose ne peut pas être utilisé à des fins de certification dans les échanges intracommunautaires.

b) Le test cutané de la brucellose est l'une des épreuves les plus spécifiques pour la détection de la brucellose chez les animaux non vaccinés; le diagnostic ne doit toutefois pas reposer uniquement sur des réactions intradermiques positives.

c) Les animaux de l'espèce bovine ayant produit un résultat négatif à l'un des tests sérologiques définis à la présente annexe et une réaction positive au test cutané de la brucellose sont considérés comme infectés.

d) Les animaux de l'espèce bovine ayant donné un résultat positif à l'un des tests sérologiques définis à la présente annexe peuvent être soumis à un test cutané de la brucellose afin de confirmer l'interprétation des résultats des tests sérologiques notamment quand une réaction croisée avec des anticorps dirigés contre d'autres bactéries ne peut être exclue dans le cas des troupeaux indemnes ou officiellement indemnes de brucellose.

3.1.2. L'épreuve doit être effectuée en utilisant une préparation allergénique standardisée et définie ne contenant pas d'antigène lipopolyosidique (LPS) lisse, celui-ci pouvant provoquer des réactions inflammatoires non spécifiques ou interférer avec des tests sérologiques ultérieurs.

L'une de ces préparations est la brucelline INRA provenant d'une souche non lisse de B. melitensis. Les conditions de sa production sont décrites en détail à la section B2 du chapitre 2.4.2 du Manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l'OIE, quatrième édition, 2000.

3.1.3. Procédure du test

3.1.3.1. Un volume de 0,1 ml d'allergène de la brucellose est injecté par voie intradermique au pli caudal, au flanc ou sur le côté de l'encolure.

3.1.3.2. Le test est lu au bout de 48 à 72 heures.

3.1.3.3. Avant l'injection et lors du réexamen, l'épaisseur de la peau au site d'injection est mesurée avec un cutimètre.

3.1.3.4. Interprétation des résultats:

Les réactions fortes sont facilement identifiables en raison d'une inflammation et d'une induration locales.

Un épaississement de la peau de 1,5 à 2 mm est considéré comme réaction positive au test cutané de la brucellose.

3.2. Test d'immuno-absorption enzymatique de compétition (cELISA)

3.2.1. Conditions d'utilisation du test cELISA

a) Le test cELISA ne peut pas être utilisé à des fins de certification dans les échanges intracommunautaires.

b) Le test cELISA a été démontré comme plus spécifique que par exemple le test ELISA indirect et peut ainsi être utilisé pour aider à l'interprétation de résultats de tests sérologiques.

3.2.2. Procédure du test

Le test sera mis en oeuvre selon les prescriptions du chapitre 2.3.1. 2) a) du Manuel des normes de l'OIE pour les tests de diagnostic et les vaccins, quatrième édition, 2000.

4. LABORATOIRES NATIONAUX DE RÉFÉRENCE

4.1. Tâches et responsabilités

Les tâches des laboratoires nationaux de référence sont les suivantes:

a) approbation des résultats des études de validation démontrant la fiabilité de la méthode de test utilisée dans l'État membre;

b) détermination du nombre maximal d'échantillons pouvant constituer un mélange dans les kits ELISA utilisés;

c) étalonnage des sérums étalons nationaux secondaires ("étalons de travail") par rapport au sérum étalon primaire international visé au paragraphe 2.1;

d) contrôles de la qualité de tous les lots de kits ELISA et d'antigènes utilisés dans l'État membre;

e) coopération au sein du réseau des laboratoires nationaux de référence pour la brucellose.

4.2. Liste des laboratoires nationaux de référence

BELGIQUE

Centre d'études et de recherches vétérinaires et agrochimiques (CERVA/CODA) Groeselenberg 99 B - 1180 Bruxelles

DANEMARK

Danish Veterinary Institute Bulowsvej 27 DK - 1790 Copenhagen

ALLEMAGNE

Bundesinstitut für Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGVV) Nationales Veterinärmedizinisches Referenzlabor für Brucellose Postfach 33 00 13 D - 14191 Berlin

GRÈCE

Veterinary Laboratory of Larissa Department of Microbiology 6th km of National Road Larissa-Trikala GR - 4111 10 Larissa

ESPAGNE

Laboratorio Central de Veterinaria de Santa Fe Camino del Jau S/N E - 18320 Santa Fe ( Granada )

FRANCE

Laboratoire national et OIE/FAO de référence pour la brucellose Agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) BP 67 F - 94703 Maisons-Alfort Cedex

IRLANDE

Brucellosis Laboratory Model Farm Road Cork Irlande

ITALIE

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise Via Campo Boario I - 64100 Teramo

LUXEMBOURG

State Laboratory for Veterinarian Medicine 54, avenue Gaston Diderich BP 2081 L - 1020 Luxembourg

PAYS-BAS

Centraal Instituut DierziekteControle

CIDC-Lelystad

Houtribweg 39 PO Box 2004 8203 AA Lelystad Nederland

AUTRICHE

Bundesanstalt für veterinärmedizinische Untersuchungen Robert-Koch-Gasse 17 A - 2340 Modling

PORTUGAL

Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV) Estrada de Benfica, n.o 701 P - 1549-011 Lisboa

FINLANDE

National Veterinary and Food Research Institute Hämeentie 57 PO Box 45 FIN - 00581 Helsinki

SUÈDE

National Veterinary Institute S - 751 89 Uppsala

ROYAUME-UNI

1) FAO/WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Brucellosis

Veterinary Laboratories Agency

New Haw Addlestone Surrey KT15 3NB United Kingdom

2) Immunodiagnostics Department

Veterinary Sciences Division

Stoney Road Stormont Belfast BT4 3SD United Kingdom

(1) Aux fins de la présente annexe, les dilutions indiquées pour la préparation des réactifs liquides sont exprimées par exemple comme 1/150, c'est-à-dire une dilution de 1 pour 150."