1991R2568 — FR — 01.01.2014 — 025.001

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►B	RÈGLEMENT (CEE) No 2568/91 DE LA COMMISSION du 11 juillet 1991 ►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes d'analyse y afférentes ◄ (JO L 248 du 5.9.1991, p. 1)

Modifié par:

		Journal officiel
		No	page	date
►M1	RÈGLEMENT (CEE) No 3682/91 DE LA COMMISSION du 17 décembre 1991	L 349	36	18.12.1991
►M2	RÈGLEMENT (CEE) No 1429/92 DE LA COMMISSION du 26 mai 1992	L 150	17	2.6.1992
M3	RÈGLEMENT (CEE) No 1683/92 DE LA COMMISSION du 29 juin 1992	L 176	27	30.6.1992
M4	RÈGLEMENT (CEE) No 1996/92 DE LA COMMISSION du 15 juillet 1992	L 199	18	18.7.1992
►M5	RÈGLEMENT (CEE) No 3288/92 DE LA COMMISSION du 12 novembre 1992	L 327	28	13.11.1992
►M6	RÈGLEMENT (CEE) No 183/93 DE LA COMMISSION du 29 janvier 1993	L 22	58	30.1.1993
M8	RÈGLEMENT (CEE) No 620/93 DE LA COMMISSION du 17 mars 1993	L 66	29	18.3.1993
M9	RÈGLEMENT (CE) No 177/94 DE LA COMMISSION du 28 janvier 1994	L 24	33	29.1.1994
M10	RÈGLEMENT (CE) No 2632/94 DE LA COMMISSION du 28 octobre 1994	L 280	43	29.10.1994
►M11	RÈGLEMENT (CE) No 656/95 DE LA COMMISSION du 28 mars 1995	L 69	1	29.3.1995
M12	RÈGLEMENT (CE) No 2527/95 DE LA COMMISSION du 27 octobre 1995	L 258	49	28.10.1995
►M13	RÈGLEMENT (CE) No 2472/97 DE LA COMMISSION du 11 décembre 1997	L 341	25	12.12.1997
M14	RÈGLEMENT (CE) No 282/98 DE LA COMMISSION du 3 février 1998	L 28	5	4.2.1998
M15	RÈGLEMENT (CE) No 2248/98 DE LA COMMISSION du 19 octobre 1998	L 282	55	20.10.1998
M16	RÈGLEMENT (CE) No 379/1999 DE LA COMMISSION du 19 février 1999	L 46	15	20.2.1999
►M17	RÈGLEMENT (CE) No 455/2001 DE LA COMMISSION du 6 mars 2001	L 65	9	7.3.2001
M18	RÈGLEMENT (CE) No 2042/2001 DE LA COMMISSION du 18 octobre 2001	L 276	8	19.10.2001
►M19	RÈGLEMENT (CE) No 796/2002 DE LA COMMISSION du 6 mai 2002	L 128	8	15.5.2002
►M20	RÈGLEMENT (CE) No 1989/2003 DE LA COMMISSION du 6 novembre 2003	L 295	57	13.11.2003
►M21	RÈGLEMENT (CE) No 702/2007 DE LA COMMISSION du 21 juin 2007	L 161	11	22.6.2007
►M22	RÈGLEMENT (CE) No 640/2008 DE LA COMMISSION du 4 juillet 2008	L 178	11	5.7.2008
►M23	RÈGLEMENT (UE) No 61/2011 DE LA COMMISSION du 24 janvier 2011	L 23	1	27.1.2011
M24	RÈGLEMENT D'EXÉCUTION (UE) No 661/2012 DE LA COMMISSION du 19 juillet 2012	L 192	3	20.7.2012
►M25	RÈGLEMENT D’EXÉCUTION (UE) No 299/2013 DE LA COMMISSION du 26 mars 2013	L 90	52	28.3.2013

Rectifié par:

►C1	Rectificatif, JO L 347 du 28.11.1992, p. 69 (2568/1991)
C2	Rectificatif, JO L 176 du 20.7.1993, p. 26 (183/1993)
►C3	Rectificatif, JO L 111 du 30.4.2011, p. 48 (61/2011)

▼B

RÈGLEMENT (CEE) No 2568/91 DE LA COMMISSION

du 11 juillet 1991

►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes d'analyse y afférentes ◄

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu le règlement no 136/66/CEE du Conseil, du 22 septembre 1966, portant établissement d'une organisation commune des marchés dans le secteur des matières grasses ( 1 ), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no 3577/90 ( 2 ), et notamment son article 35 bis,

considérant que l'annexe du règlement no 136/66/CEE prévoit les dénominations et définitions des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive commercialisées à l'intérieur de chaque État membre ainsi que dans les échanges intracommunautaires et avec les pays tiers;

considérant que, pour pouvoir distinguer les divers types d'huile, il y a lieu de définir les caractéristiques physico-chimiques de chacun d'eux ainsi que les caractéristiques organoleptiques des huiles vierges, de manière à assurer la pureté et la qualité des produits en cause, sans préjudice d'autres dispositions existant en la matière;

considérant qu'il convient de déterminer de manière uniforme dans toute la Communauté la présence des caractéristiques des différents types d'huile; que, à cette fin, il y a lieu d'établir les méthodes communautaires d'analyse chimique et d'appréciation organoleptique; qu'il convient cependant de permettre, pendant une période transitoire, l'utilisation d'autres méthodes d'analyse appliquées dans les États membres, tout en prévoyant que, en cas de divergence des résultats, ceux obtenus selon la méthode commune soient déterminants;

considérant que la définition des caractéristiques physico-chimiques des huiles d'olives et des méthodes d'analyse entraîne l'adaptation des notes complémentaires du chapitre 15 de la nomenclature combinée;

considérant que la méthode d'évaluation des caractéristiques organoleptiques des huiles vierges comporte la création de jurys de dégustateurs sélectionnés et entraînés; qu'il convient, dès lors, de prévoir le délai nécessaire pour la mise en place d'une telle structure; que, compte tenu des difficultés que rencontreront certains États membres pour la constitution des jurys de dégustateurs, il convient d'autoriser le recours aux jurys existant dans d'autres États membres;

considérant que, pour assurer le fonctionnement correct du système des prélèvements applicables à l'importation de grignons d'olive, il convient de prévoir une méthode unique pour la détermination de la teneur en huile de ces produits;

considérant que, pour ne pas causer un préjudice au commerce, il est opportun de prévoir une période limitée pour l'écoulement de l'huile conditionnée avant l'entrée en vigueur du présent règlement;

considérant qu'il y a lieu d'abroger le règlement (CEE) no 1058/77 de la Commission ( 3 ), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no 1858/88 ( 4 );

considérant que le comité de gestion des matières grasses n'a pas émis d'avis dans le délai imparti par son président,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

▼M20

Article premier

1. Sont considérées comme huiles d'olive vierges, au sens du point 1 a), et b) de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, les huiles dont les caractéristiques respectives sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, points 1 et 2, du présent règlement.

2. Est considérée comme huile d'olive lampante, au sens du point 1 c) de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 3, du présent règlement.

3. Est considérée comme huile d'olive raffinée, au sens du point 2 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 4, du présent règlement.

4. Est considérée comme huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huiles d'olive vierges, au sens du point 3 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 5, du présent règlement.

5. Est considérée comme huile de grignons d'olive brute, au sens du point 4 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 6, du présent règlement.

6. Est considérée comme huile de grignons d'olive raffinée, au sens du point 5 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 7, du présent règlement.

7. Est considérée comme huile de grignons d'olive, au sens du point 6 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 8, du présent règlement.

▼B

Article 2

1. La détermination des caractéristiques des huiles prévues à l'annexe I est effectuée selon les méthodes d'analyse suivantes:

— pour la détermination des acides gras libres, exprimés en pourcentage d'acide oléique, la méthode reprise à l'annexe II,

— pour la détermination de l'indice de peroxyde, la méthode reprise à l'annexe III,

▼M19

— pour la détermination de la teneur en cires, la méthode reprise à l'annexe IV,

▼B

— pour la détermination du contenu en stérols, la méthode reprise à l'annexe V,

— pour la détermination de l'érythrodiol et de l'uvaol, la méthode reprise à l'annexe VI,

▼M21

— pour la détermination du pourcentage du 2-glycéril monopalmitate, la méthode reprise à l’annexe VII,

▼M20 —————

▼B

— pour l'analyse spectrophotométrique, la méthode reprise à l'annexe IX,

— pour la détermination de la composition en acides gras, la méthode reprise aux annexes X «A» et X «B».

— pour la détermination des solvants halogénés volatils, la méthode reprise à l'annexe XI,

— pour l'appréciation des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges, la méthode reprise à l'annexe XII, appliquée conformément au paragraphe 2,

▼M20 —————

▼M11

— pour la détermination des stigmastadiènes, la méthode reprise à l'annexe XVII,

▼M13

— pour la détermination de la composition des triglycérides à ECN42, la méthode reprise à l'annexe XVIII,

▼M19

— pour la détermination du contenu en alcools aliphatiques, la méthode reprise à l'annexe XIX,

▼M23

— pour la détermination de la teneur en cires et en esters méthyliques et éthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire, la méthode reprise à l'annexe XX.

▼M19

2. La vérification par les autorités nationales ou leurs représentants des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges est réalisée par des jurys de dégustateurs agréés par les États membres.

Les caractéristiques organoleptiques d'une huile d'olive visée au premier alinéa sont considérées comme conformes à la catégorie d'huile d'olive déclarée, si un jury agréé par l'État membre concerné confirme le classement à cet égard.

Dans le cas où le jury agréé ne confirme pas la déclaration en ce qui concerne les caractéristiques organoleptiques de la catégorie d'huile d'olive déclarée, les autorités nationales ou leurs représentants font procéder à la demande de l'intéressé à deux contre analyses, par d'autres jurys agréés, dont au moins une est effectuée par un jury agréé par l'État membre producteur concerné. Les caractéristiques en question sont considérées comme conformes à celles qui sont déclarées si les deux contre analyses confirment le classement déclaré. Dans le cas contraire les frais des contre analyses, sans préjudice des sanctions encourues, sont imputées à l'intéressé.

▼M17

3. En ce qui concerne la vérification par les autorités nationales ou leurs représentants des caractéristiques des huiles, prévues au paragraphe 1, le prélèvement des échantillons est effectué selon les normes internationales EN ISO 661 et EN ISO 5555 relatives à la préparation des échantillons pour essai et à l'échantillonnage. Toutefois, par dérogation au point 6.8 de la norme EN ISO 5555, pour les lots constitués par lesdites huiles, en emballages immédiats inférieurs ou égaux à 100 litres, le prélèvement de l'échantillon s'effectue conformément à l'annexe I bis du présent règlement.

▼M19

Sans préjudice des dispositions de la norme EN ISO 5555 et du chapitre 6 de la norme EN ISO 661, les échantillons sont mis à l'abri de la lumière et des fortes chaleurs dans le plus bref délai et sont envoyés au laboratoire pour les analyses au plus tard:

— le dixième jour ouvrable suivant celui du prélèvement, pendant les mois d'octobre à mai et

— le cinquième jour ouvrable suivant celui du prélèvement, pendant les mois de juin à septembre.

▼M17

4. ►M20 Pour la vérification prévue au paragraphe 3, les analyses visées aux annexes II, III, IX, X et XII, ainsi que, le cas échéant, les contre-analyses prévues par les législations nationales, sont effectuées avant la date de durabilité minimale. Dans le cas où la prise de l'échantillon s'effectue plus de quatre mois avant la date de durabilité minimale, lesdites analyses sont effectuées au plus tard le quatrième mois suivant celui de la prise de l'échantillon. Aucun délai ne s'applique pour les autres analyses prévues par ledit règlement. ◄

Sauf si la prise d'échantillon a eu lieu moins d'un mois avant la date de durabilité minimale, dans le cas où les résultats des analyses ne correspondent pas aux caractéristiques de la catégorie d'huile d'olive ou de grignons d'olive déclarée, l'intéressé en reçoit notification au plus tard un mois avant la fin du délai visé au premier alinéa.

▼M19

5. Pour la détermination des caractéristiques des huiles d'olive effectuée selon les méthodes prévues au paragraphe 1, les résultats des analyses sont directement comparés avec les limites prévues par le présent règlement.

▼M25

Article 2 bis

1. Aux fins du présent article, on entend par «huile d’olive commercialisée», la quantité totale d’huile d’olive et d’huile de grignons d’olive d’un État membre qui est consommée dans cet État membre ou exportée à partir de cet État membre.

2. Les États membres veillent à ce que des contrôles de conformité soient réalisés de manière sélective, sur la base d’une analyse de risques et à une fréquence appropriée, afin de garantir que l’huile d’olive commercialisée correspond à la catégorie déclarée.

3. Les critères d’évaluation du risque peuvent porter sur:

a) la catégorie de l’huile, la période de production, le prix des huiles par rapport à celui des autres huiles végétales, les opérations de mélange et de conditionnement, les installations et conditions de stockage, le pays d’origine, le pays de destination, le moyen de transport ou le volume du lot;

b) la position des opérateurs dans la chaîne de commercialisation, le volume et/ou la valeur, ainsi que la gamme de catégories d’huiles qu’ils commercialisent, le type d’activité économique menée telle que le pressage, le stockage, le raffinage, le mélange, le conditionnement ou la vente au détail;

c) les constatations faites lors des contrôles précédents, notamment en ce qui concerne le nombre et le type d’irrégularités constatés, la qualité habituelle des huiles commercialisées et le niveau de performance de l’équipement technique utilisé;

d) la fiabilité des systèmes d’assurance qualité des opérateurs ou de leurs systèmes d’autocontrôle, au regard de la conformité aux normes de commercialisation;

e) le lieu où le contrôle est effectué, en particulier s’il s’agit du premier point d’entrée dans l’Union, du dernier point de sortie de l’Union ou du lieu où les huiles sont produites, conditionnées, chargées ou vendues au consommateur final;

f) toute autre information susceptible d’indiquer un risque de non-conformité.

4. Les États membres arrêtent à l’avance:

a) les critères d’évaluation du risque de non-conformité des lots;

b) sur la base d’une analyse des risques portant sur chaque catégorie de risques, le nombre minimal d’opérateurs ou de lots et/ou les quantités minimales qu’il y a lieu de soumettre à un contrôle de conformité.

Au moins un contrôle annuel de conformité est effectué pour mille tonnes d’huile d’olive commercialisée dans l’État membre.

5. Les États membres vérifient la conformité:

a) en procédant, dans n’importe quel ordre, aux analyses prévues à l’annexe I, ou

b) dans l’ordre prévu par l’arbre décisionnel figurant à l’annexe I ter, jusqu’à aboutir à l’une des décisions prévues par ledit arbre.

▼M19 —————

▼M25

Article 3

Lorsqu’il est constaté qu’une huile ne correspond pas à la description de sa catégorie, les États membres concernés appliquent, sans préjudice d’autres sanctions éventuelles, des sanctions effectives, proportionnées et dissuasives arrêtées en fonction de la gravité de l’irrégularité constatée.

Si les contrôles font apparaître des irrégularités importantes, les États membres renforcent la fréquence des contrôles portant sur le stade de commercialisation, la catégorie de l’huile, son origine ou d’autres critères.

▼M5

Article 4

▼M19

1. Aux fins de l'appréciation et du contrôle par les autorités nationales ou leur représentant des caractéristiques organoleptiques, les États membres peuvent agréer des jurys de dégustateurs.

Les conditions d'agrément sont établies par les États membres, notamment de façon à:

— répondre aux conditions de l'annexe XII, point 4.

— assurer que la formation du chef du jury soit effectuée par un établissement et dans des conditions, reconnus à cet effet par l'État membre.

— soumettre la validité de l'agrément aux résultats des performances obtenues dans le cadre d'un système de contrôle annuel institué par l'État membre.

Chaque État membre communique à la Commission la liste des jurys agréés ainsi que les mesures prises en conformité avec le présent paragraphe.

▼M5

2. Au cas où un État membre rencontre des difficultés pour instituer un jury de dégustateurs sur son territoire, il peut recourir à un jury de dégustateurs agréé dans un autre État membre.

3. Chaque État membre établit la liste des jurys de dégustateurs institués par des organisations professionnelles ou interprofessionnelles conformément aux conditions décrites au paragraphe 1 et veille au respect de ces conditions.

▼M19 —————

▼B

Article 6

1. La teneur en huile des grignons et des autres résidus de l'extraction de l'huile relevant des codes NC 2306 90 11 et 2306 90 19 est déterminée conformément à la méthode figurant à l'annexe XV.

2. la teneur en huile visée au paragraphe 1 est exprimée en pourcentage de son poids rapporté à celui de la matière sèche.

▼M20

Article 7

Les dispositions communautaires concernant la présence de contaminants sont applicables.

En ce qui concerne la teneur en solvants halogénés les limites pour toutes les catégories d'huiles d'olive sont les suivantes:

— teneur maximale de chaque solvant halogéné détecté: 0,1 mg/kg,

— teneur maximale de la somme des solvants halogénés détectés: 0,2 mg/kg

▼M25

Article 7 bis

Les personnes et groupes de personnes physiques ou morales qui détiennent, à quelque titre que ce soit, pour l’exercice de leur profession ou à des fins commerciales, de l’huile d’olive et de l’huile de grignons d’olive, depuis le stade de l’extraction au pressoir jusqu’à l’embouteillage inclus, sont tenus de tenir des registres d’entrée et de sortie pour chaque catégorie de ces huiles.

Les États membres veillent à ce que l’obligation prévue au premier paragraphe soit respectée.

▼M25

Article 8

1. Les États membres communiquent à la Commission les mesures qui mettent en œuvre le présent règlement. Ils informent la Commission de toute modification ultérieure de ces mesures.

▼B

2. Les États membres communiquent à la Commission, au début de chaque semestre, un état récapitulatif des données analytiques des déterminations effectuées au cours du semestre précédent.

Ces résultats sont examinés par le comité de gestion des matières grasses selon la procédure prévue à l'article 39 du règlement no 136/66/CEE.

▼M25

3. Les notifications visées dans le présent règlement sont effectuées conformément au règlement (CE) no 792/2009 de la Commission ( 5 ).

▼B

Article 9

Le règlement (CEE) no 1058/77 est abrogé.

Article 10

1. Le présent règlement entre en vigueur le jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes. Toutefois, la méthode reprise à l'annexe XII est mise en application à partir du ►M1 1er novembre 1992 ◄ , sauf en ce qui concerne les opérations liées à l'intervention.

▼M5

Cette méthode ne s'applique pas aux huiles d'olive vierges conditionnées avant le 1er novembre 1992.

▼B

2. Le présent règlement ne s'applique pas aux huiles d'olive et de grignons d'olive conditionnées avant la date d'entrée en vigueur du présent règlement et commercialisées jusqu'au 31 octobre 1992.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

ANNEXES

Sommaire

Annexe I:	Caractéristiques des huiles d'olive
Annexe I bis:	Échantillonnage des lots d'huile d'olive ou d'huile de grignons d'olive en emballages immédiats de 100 litres au maximum
Annexe I ter:	Schéma décisionnel
Annexe II:	►M21 Détermination des acides gras libres, méthode à froid ◄
Annexe III:	Détermination de l'indice de peroxyde
Annexe IV:	►M6 Détermination de la teneur en cires au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire ◄
Annexe V:	Détermination de la composition et du contenu en stérols au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire
Annexe VI:	Détermination de la teneur en érythrodiol et en uvaol
Annexe VII:	►M21 Détermination du pourcentage du 2-glycéril monopalmitate ◄
▼M20 —————
▼B
Annexe IX:	Analyse spectrophotométrique dans l’ultraviolet
Annexe X «A»:	Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras
Annexe X «B»:	Préparation des esters méthyliques d'acides gras
Annexe XI:	Détermination de la teneur en solvants halogénés volatils dans l'huile d'olive
Annexe XII:	Évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge
▼M20 —————
▼M19 —————
▼B
Annexe XV:	Teneur en huile des grignons d'olive
Annexe XVI:	Détermination de l'indice d'iode
Annexe XVII:	Méthode de détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales
Annexe XVIII:	Détermination de la différence entre la composition réelle et la composition théorique des triglycérides à ECN 42
Annexe XIX:	Méthode de détermination du contenu en alcools aliphatiques
▼M23
Annexe XX:	méthode de détermination de la teneur en cires et en esters méthyliques et éthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire
▼M25
Annexe XXI:	Résultats des contrôles de conformité réalisés sur les huiles d’olive visés à l’article 8, paragraphe 2

▼M23

ANNEXE I

CARACTERISTIQUES DES HUILES D'OLIVE

Catégorie

Esters méthyliques d'acides gras (EMAG) et esters éthyliques d'acides gras (EEAG)

Acidité

(%)

(*)

Indice de peroyxide

mEq O2/kg

(*)

Cires

mg/kg

(**)

2 glyceril monopalmitate

(%)

Stigmastadiène

mg/kg (1)

Différence ECN42 HPLC - et ECN42

Calcul théorique

K232 (*)

K270 (*)

Delta-K (*)

Évaluation organoleptique

Médiane du défaut (Md) (*)

Évaluation organoleptique

Médiane du fruité (Mf) (*)

1. Huile d'olive vierge extra

Σ EMAG + EEAG ≤ 75 mg/kg ou 75 mg/kg <Σ EMAG + EEAG ≤ 150 mg/kg et (EEAG/EMAG) ≤ 1,5

≤ 0,8

≤ 20

≤ 250

≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 %

≤ 0,10

≤ 0,2

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Md = 0

Mf > 0

≤ 1,0 si % Acide palmitique total > 14 %

2. Huile d'olive vierge

—

≤ 2,0

≤ 20

≤ 250

≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 %

≤ 0,10

≤ 0,2

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Md ≤ 3,5

Mf > 0

≤ 1,0 si % Acide palmitique total > 14 %

3. Huile d'olive lampante

—

> 2,0

—

≤ 300 (3)

≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ 0,3

—

Md > 3,5 (2)

—

≤ 1,1 si % Acide palmitique total > 14 %

4. Huile d'olive raffinée

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 350

≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 %

—

≤ 0,3

—

≤ 1,10

≤ 0,16

—

≤ 1,1 si % Acide palmitique total > 14 %

5. Huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huile d'olive

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 350

≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 %

—

≤ 0,3

—

≤ 0,90

≤ 0,15

—

≤ 1,0 si % Acide palmitique total > 14 %

6. Huile de grignons d'olive brute

—

> 350 (4)

≤ 1,4

—

≤ 0,6

—

7. Huile de grignons d'olive raffinée

—

≤ 0,3

≤ 5

> 350

≤ 1,4

—

≤ 0,5

—

≤ 2,00

≤ 0,20

—

8. Huile de grignons d'olive

—

≤ 1,0

≤ 15

> 350

≤ 1,2

—

≤ 0,5

—

≤ 1,70

≤ 0,18

—

Catégorie

Teneur en acides (1)

Sommes des Isomères transoléiques

(%)

Sommes des Isomères Translinoléiques + translinoléniques

(%)

Composition des stérols

Stérols totaux

(mg/kg)

Erythrodiol et uvaol

(%) (**)

Myristique

(%)

Linolénique

(%)

Arachidique

(%)

Eicosenoïque

(%)

Béhénique

(%)

Lignocérique

(%)

Choléstérol

(%)

Brassicastérol

(%)

Campestérol

(%)

Stigmastérol

(%)

Bétasitostérol

(%) (2)

Delta-7- Stigmasténol

(%)

1. Huile d'olive vierge extra

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Huile d'olive vierge

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Huile d'olive lampante

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (3)

4. Huile d'olive raffinée

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huile d'olive vierge

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Huile de grignons d'olive brute

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (4)

7. Huile de grignons d'olive raffinée

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Huile de grignons d'olive

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

▼M20

ANNEXE I bis

Échantillonnage d'huile d'olive ou d'huile de grignons d'olive livrées en emballages immédiats de 100 litres au maximum

La présente méthode d'échantillonnage s'applique pour des livraisons d'huiles d'olive ou de grignons d'olive de 125 000 litres au maximum, conditionnées en emballages immédiats de 100 litres au maximum.

Lorsque la livraison comporte plus de 125 000 litres, elle est subdivisée en lots de quantités égales ou inférieures à 125 000 litres. Lorsque la livraison est inférieure à 125 000 litres, elle constitue un lot. La méthode s'applique alors à chaque lot.

En fonction de la taille du lot, il est établi le nombre minimal de prélèvements élémentaires, conformément au tableau figurant au point 1.

L'importance du prélèvement élémentaire est établie en fonction de la capacité des emballages immédiats, selon le tableau prévu au point 2.1.

On entend par «livraison», «prélèvement élémentaire» et «échantillon de laboratoire», les définitions visées à la norme EN ISO 5555.

On entend par «lot» un ensemble d'unités de vente qui sont produites, fabriquées et conditionnées dans des circonstances telles que l'huile contenue dans chacune de ces unités de vente est considérée comme homogène pour toutes les caractéristiques analytiques.

1. NOMBRE DE PRÉLÈVEMENTS ÉLÉMENTAIRES

Le nombre minimal de prélèvements élémentaires est établi en fonction de la taille du lot conformément au tableau suivant:

Taille du lot inférieure à (en litres)	Nombre minimal de prélèvements élémentaires
7 500	2
25 000	3
75 000	4
125 000	5

Les emballages immédiats d'un même prélèvement élémentaire doivent être choisis de façon contiguë dans le lot.

En cas de doute, l'État membre augmente le nombre de prélèvements élémentaires à effectuer.

2. CONTENU D'UN PRÉLÈVEMENT ÉLÉMENTAIRE

2.1. Chaque prélèvement élémentaire est constitué par:

Dans le cas où les emballages immédiats ont une capacité:	Le prélèvement élémentaire porte sur l'huile de:
a) Supérieure ou égale à 5 litres	a) 3 emballages immédiats
b) Supérieure ou égale à 3 litres et inférieure à 5 litres	b) 3 emballages immédiats
c) Supérieure ou égale à 2 litres et inférieure à 3 litres	c) 3 emballages immédiats
d) Supérieure ou égale à 1 litre et inférieure à 2 litres	d) 6 emballages immédiats
e) Supérieure ou égale à 0,75 litre et inférieure à 1 litre	e) 6 emballages immédiats
f) Inférieure à 0,75 litre	f) 3 fois l'huile du nombre minimal d'emballages dont la capacité totale dépasse 1,5 litre

2.2. Les prélèvements élémentaires devront être maintenus dans les emballages immédiats jusqu'au moment des analyses. L'huile des prélèvements élémentaires est en suite, le cas échéant, subdivisée en trois échantillons de laboratoire en vue d'effectuer:

a) les analyses visées aux annexes II, III, IX et X;

b) l'analyse visée à l'annexe XII;

c) les autres analyses.

2.3. Les emballages qui constituent un prélèvement élémentaire sont subdivisés selon les procédures de contrôle prévues par les législations nationales.

3. ANALYSES ET RÉSULTATS

a) Chacun des prélèvements élémentaires visés au point 1 est subdivisé en échantillons de laboratoire, conformément au point 2.5 de la norme EN ISO 5555, pour être soumis aux analyses suivantes:

— détermination des acides gras libres, visée à l'article 2, paragraphe 1, premier tiret,

— détermination de l'indice de peroxydes, visée à l'article 2, paragraphe 1, deuxième tiret,

— analyse spectrophotométrique, visée à l'article 2, paragraphe 1, huitième tiret,

— composition en acides gras, visée à l'article 2, paragraphe 1, neuvième tiret.

b) Dans le cas où, pour au moins un des prélèvements élémentaires pris sur le même lot, les résultats d'analyses visées au point a) ne sont pas tous conformes aux caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée, l'ensemble du lot concerné est déclaré non conforme.

Dans le cas où, pour chacun des prélèvements élémentaires pris sur le même lot, les résultats des analyses visées au point a) ne sont pas tous homogènes, compte tenu des caractéristiques de répétabilité des méthodes concernées, l'ensemble du lot est déclaré non homogène et chaque prélèvement élémentaire doit être soumis aux autres analyses requises. Dans le cas contraire, un seul des prélèvements élémentaires sur ledit lot est soumis aux autres analyses requises.

c) Dans les cas où un des résultats d'analyses visées au point b), deuxième alinéa, n'est pas conforme aux caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée, l'ensemble du lot concerné est déclaré non conforme.

Dans le cas où tous les résultats des analyses visées au point b), deuxième alinéa, sont conformes aux caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée, l'ensemble du lot concerné est déclaré conforme.

▼M20

ANNEXE I ter

SCHÉMA DÉCISIONNEL POUR LA VÉRIFICATION DE LA CONFORMITÉ D'UN ÉCHANTILLON D'HUILE D'OLIVE AVEC LA CATÉGORIE DÉCLARÉE

L'analyse de la conformité d'une huile d'olive ou de grignons d'olive à la catégorie déclarée peut s'effectuer:

a) soit en réalisant dans n'importe quel ordre les analyses prévues pour vérifier le respect des caractéristiques stipulées à l'annexe I;

b) soit en réalisant dans l'ordre indiqué par le schéma décisionnel les analyses qui y sont prévues, jusqu'à aboutir à une des décisions mentionnées par ledit schéma décisionnel.

Les analyses relatives aux contaminants nécessaires pour vérifier la conformité avec les normes de la Communauté européenne sont à réaliser indépendamment.

Le schéma décisionnel s'applique à toutes les catégories d'huiles d'olive et de grignons d'olive. Il se compose de tableaux numérotés de 1 à 11 qui doivent être abordés en fonction de la déclaration de la catégorie de l'huile en présence selon l'ordre prévu dans le tableau général.

Pour la lecture du tableau général au tableau 11:

— La double ligne (=) indique le chemin à suivre en cas de conformité (réponse positive) avec les conditions prévues dans la case qui précède. La ligne pointillée (…) indique à l'inverse le chemin à suivre en cas de non conformité.

— Les titres des cases figurant dans les tableaux 1 à 11 se réfèrent aux analyses prévues par le présent règlement selon les correspondances mentionnées à l'appendice 1 de la présente annexe.

— Les lettres de renvoi figurant dans les cercles de décision négative des tableaux 1 à 11 correspondent à des informations indicatives mentionnées à l'appendice 2 de la présente annexe. Elles n'impliquent pas par elles-même l'obligation de poursuivre les analyses ou la certitude des présomptions mentionnées.

Tableau général

Tableau 1

Tableau 2

Tableau 3

Tableau 4

Tableau 5

Tableau 6

Tableau 7

Tableau 8

Tableau 9

Tableau 10

Tableau 11

Appendice 1

Correspondance entre les annexes du présent règlement et les analyses visées par le schéma décisionnel

▼M21
— Acidité	Annexe II	Détermination des acides gras libres, méthode à froid
▼M20
— Indice de peroxydes	Annexe III	Détermination de l'indice de peroxyde
— Spectrophotométrie dans l'ultraviolet	Annexe IX	Analyse spectrophotométrique
— Évaluation organoleptique	Annexe XII	Évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge
— Stigmasta-3,5-diène	Annexe XVII	Méthode de détermination des stigamastadiènes dans les huiles végétales
— Isomères trans des acides gras	Annexe X a et	Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras
— Isomères trans des acides gras	Annexe X b	Préparation des esters méthyliques d'acides gras
— Composition en acides gras	Annexe X a et	Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras
— Composition en acides gras	Annexe X b	Préparation des esters méthyliques d'acides gras
— ΔECN42	Annexe XVIII	Détermination de la composition des triglycérides à ECN42 (différence entre composition réelle et composition théorique)
— Composition en stérols et stérols totaux	Annexe V	Détermination de la composition et du contenu en stérols au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire
— Érythrodiol et uvaol	Annexe VI	Détermination de la composition en érythrodiol et en uvaol
— Cires	Annexe IV	Détermination de la teneur en cires au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire
— Alcools aliphatiques	Annexe XIX	Détermination du contenu en alcools aliphatiques au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire
▼M21
— Acides gras saturés en position 2	Annexe VII	Détermination du pourcentage du 2-glycéril monopalmitate
▼M20

Appendice 2

Tableau 1

a) Voir huile d'olive vierge ou lampante (critères de qualité, tableau 2, ou critères de qualité et de pureté, tableau 4)

b) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4)

Tableau 2

a) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4)

b) Voir huile d'olive vierge extra (critères de qualité, tableau 1)

Tableau 3

a) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)

b) Présence d'huile de grignons d'olive

Tableau 4

a) Voir huile d'olive vierge extra et huile d'olive vierge (critères de qualité, tableaux 1 et 2)

b) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)

c) Présence d'huile de grignons d'olive

d) Présence d'huiles estérifiées

Tableau 7

a) Présence d'huile de grignons d'olive

b) Présence d'huiles estérifiées

Tableau 8

a) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)

b) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4)

c) Présence d'huiles estérifiées

Tableau 11

a) Présence d'huiles estérifiées

▼B

ANNEXE II

▼M21

DÉTERMINATION DES ACIDES GRAS LIBRES, MÉTHODE À FROID

▼B

1. OBJET

Détermination des acides gras libres dans les huiles d'olive. La teneur en acides gras libres est exprimée par l'acidité calculée conventionnellement.

1.1. Principe

Mise en solution d'une prise d'essai dans un mélange de solvants, puis titrage des acides gras libres présents à l'aide d'une solution éthanolique d'hydroxyde de potassium.

1.2. Réactifs

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et l'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de pureté équivalente.

1.2.1.

Oxyde diéthylique éthanol à 95 % (V/V), mélange 1-1 en volume.

Note:

L'oxyde diéthylique est très inflammable et peut former des peroxydes explosifs. Il doit être utilisé en prenant des précautions particulières.

Neutraliser exactement au moment de l'emploi avec la solution d'hydroxyde de potassium (1.2.2) en présence de 0,3 millilitre de la solution de phénolphtaléine (1.2.3) pour 100 millilitres de mélange.

Note:

S'il n'est pas possible d'utiliser l'oxyde diéthylique, un mélange de solvants formé d'éthanol et de toluène peut être utilisé. Si nécessaire, l'éthanol peut être remplacé par le propanol 2.

1.2.2.

Hydroxyde de potassium, solution éthanolique titrée c(KOH) - 0,1 mole par litre environ ou, si nécessaire, c(KOH) - 0,5 mole par litre environ.

La concentration exacte de la solution éthanolique d'hydroxyde de potassium doit être connue et vérifiée immédiatement avant l'emploi. Utiliser une solution préparée au moins cinq jours avant emploi et décantée dans un flacon en verre brun fermé avec un bouchon de caoutchouc. La solution doit être incolore ou jaune paille.

Note:

Une solution incolore stable d'hydroxyde de potassium peut être préparée de la façon suivante. Porter et maintenir durant une heure à ébullition à reflux 1 000 millilitres d'éthanol avec 8 grammes d'hydroxyde de potassium et 0,5 gramme de rognures d'aluminium. Distiller immédiatement. Dissoudre dans le distillat la quantité requise d'hydroxyde de potassium. Laisser reposer durant plusieurs jours et décanter le liquide clair surnageant du précipité de carbonate de potassium.

La solution peut aussi être préparée sans distillation de la façon suivante. À 1 000 millilitres d'éthanol, ajouter 4 millilitres de butylite d'aluminium et laisser reposer le mélange durant quelques jours. Décanter le liquide surnageant et y dissoudre la quantité requise d'hydroxyde de potassium. Cette solution est prête pour l'emploi.

1.2.3.

Phénolphtaléine, solution à 10 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V) ou bleu alcalin (dans le cas de corps gras fortement coloré) solution à 20 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V).

1.3. Appareillage

Matériel courant de laboratoire, et notamment:

1.3.1.

Balance analytique

1.3.2.

Fiole conique de 250 millilitres de capacité

1.3.3.

Burette de 10 millilitres de capacité, graduée en 0,05 millilitre.

1.4. Mode opératoire

1.4.1.

Préparation de l'échantillon pour essai

La détermination est effectuée sur l'échantillon filtré. Si la teneur globale en humidité et en impuretés est inférieure à 1 %, la détermination est effectuée sur l'échantillon tel quel.

1.4.2.

Prise d'essai

Prélever une prise d'essai, selon l'indice d'acide présumé, d'après les indications du tableau suivant.

Indice d'acide présumé	Masse de la prise d'essai (en g)	Précision de la pesée de la prise d'essai (en g)
< 1	20	0,05
1 à 4	10	0,02
4 à 15	2,5	0,01
15 à 75	0,5	0,001
> 75	0,1	0,0002

Peser la prise d'essai dans la fiole conique (1.3.2).

1.4.3.

Détermination

Dissoudre la prise d'essai (4.5.2) dans 50 à 150 millilitres du mélange oxyde diéthylique/éthanol (1.2.1), préalablement neutralisé.

Titrer, en agitant, avec la solution d'hydroxyde de potassium à 0,1 mole par litre (1.2.2) (voir note 2) jusqu'à virage de l'indicateur (coloration rose de la phénolpthaléine persistant durant au moins 10 secondes).

Note 1:

La solution éthanolique titrée d'hydroxyde de potassium (1.2.2) peut être remplacée par une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium ou de sodium lorsque le volume d'eau introduit n'entraîne pas une séparation de phases.

Note 2:

Si la quantité nécessaire de solution d'hydroxyde de potassium à 0,1 mole par litre dépasse 10 millilitres, utiliser une solution à 0,5 mole par litre.

Note 3:

Si la solution devient trouble pendant le titrage, ajouter une quantité suffisante du mélange de solvants (1.2.1) pour donner une solution claire.

1.5. Expression de l'acidité en pourcentage de l'acide oléique

L'acidité, exprimée en pourcentage en poids, est égale à:

où:

V : volume, en millilitres, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium utilisée;

c : concentration exacte, en moles par litre, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium utilisée;

M : poids molaire, en grammes par mole, de l'acide adopté pour l'expression du résultat (= 282);

m : poids en grammes, de la prise d'essai.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique ►M6 de deux déterminations ◄ .

ANNEXE III

DÉTERMINATION DE L'INDICE DE PEROXYDE

1. OBJET

La présente norme décrit une méthode de détermination de l'indice de peroxyde dans les huiles et matières grasses.

2. CHAMP D'APPLICATION

La présente norme est applicable aux huiles et matières grasses animales et végétales.

3. DÉFINITION

L'indice de peroxyde représente la quantité des substances de l'échantillon (exprimée en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme) qui oxydent l'iodure de potassium dans les conditions de travail décrites.

4. PRINCIPE

La prise d'essai en solution dans un mélange acide acétique et chloroforme est traitée par une solution d'iodure de potassium. L'iode libéré est titré avec une solution de thiosulfate de sodium.

5. APPAREILLAGE

Les équipements utilisés doivent être exempts de toute trace de substances oxydantes ou réductrices.

Nota bene:

ne pas graisser les surfaces rodées.

5.1.	Cuiller en verre de 3 millilitres.

5.2.	Fioles d'environ 250 millilitres, avec col et bouchons rodés, séchées au préalable et remplies d'un gaz inerte, sec et pur (azote ou, de préférence, dioxyde de carbone).

5.3.	Burette de 25 ou 50 millilitres avec graduations de 0,1 millilitre.

6. RÉACTIFS

6.1.	Chloroforme de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).

6.2.	Acide acétique glacial de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz sec et pur).

6.3.	Iodure de potassium en solution aqueuse saturée de préparation récente, exempte d'iode et d'iodates.

6.4.	Solution aqueuse de thiosulfate de sodium 0,01 ou 0,002 N, soigneusement normalisée juste avant l'emploi.

6.5.	Solution d'amidon (dispersion aqueuse de 10 grammes par litre) récemment préparée à partir d'amidon naturel soluble.

7. ÉCHANTILLON

Veiller à ce que l'échantillon soit prélevé et stocké hors de la lumière, conservé au frais et enfermé dans des conteneurs de verre remplis entièrement et fermés hermétiquement à l'aide de bouchons de liège ou de verre rodé.

8. MODE OPÉRATOIRE

L'essai doit être réalisé sous une lumière diffuse (lumière du jour) ou artificielle. Dans une cuiller en verre (5.1) ou, à défaut, dans une fiole (5.2), peser, à 0,001 gramme près, une des masses de l'échantillon visées dans le tableau ci-après en fonction de l'indice de péroxyde prévu.

Indice de peroxyde prévu (en meq 02/kg)	Poids de la prise d'essai (en g)
de 0 à 12	de 5,0 à 2,0
de 12 à 20	de 2,0 à 1,2
de 20 à 30	de 1,2 à 0,8
de 30 à 50	de 0,8 à 0,5
de 50 à 90	de 0,5 à 0,3

Déboucher une fiole (5.2) et introduire la cuiller en verre contenant la prise d'essai. Ajouter 10 millilitres de chloroforme (6.1). Dissoudre rapidement la prise d'essai en agitant. Ajouter 15 millilitres d'acide acétique (6.2) puis 1 millilitre de solution d'iodure de potassium (6.3). Remettre le bouchon rapidement, agiter pendant une minute et laisser reposer pendant exactement 5 minutes à l'abri de la lumière et à une température de 15 à 25 °C.

Ajouter environ 75 millilitres d'eau distillée. Titrer l'iode libéré avec la solution de thiosulfate de sodium (6.4) (solution 0,002 N, si les indices prévus sont inférieurs à 12, et 0,001 N, s'ils sont supérieurs à 12) en agitant vigoureusement et en employant la solution d'amidon (6.5) comme indicateur.

Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.

Effectuer simultanément un essai à blanc. Si le résultat de ce dernier exède 0,05 millilitre de solution de thiosulfate de sodium (6.4) 0,001 N, remplacer les réactifs impurs.

9. EXPRESSION DES RÉSULTATS

L'indice de péroxyde (IP), exprimé en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme, est fourni par la formule:

où:

V: = nombre de millilitres de solution de thiosulfate de sodium normalisée (6.4) utilisé pour l'essai, corrigé en fonction des résultats de l'essai à blanc;

T: = facteur de normalité exact de la solution de thiosulfate de sodium (6.4) utilisée;

m: = poids (en grammes) de la prise d'essai.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.

▼M21

ANNEXE IV

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN CIRES AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1. OBJET

Cette méthode décrit un procédé pour la détermination de la teneur en cires des huiles d’olive. Les cires sont séparées en fonction du nombre d’atomes de carbone. La méthode peut être employée notamment pour différencier l’huile d’olive de pression de celle d’extraction (huile de grignons).

2. PRINCIPE

La matière grasse, additionnée d’un étalon interne approprié, est fractionnée par chromatographie sur colonne de gel de silice hydraté; la fraction éluée en premier dans les conditions de l’essai (à polarité inférieure à celle des triglycérides) est récupérée puis analysée directement par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. MATÉRIEL

3.1.	Erlenmeyer de 25 ml.

3.2.	Colonne en verre pour chromatographie en phase gazeuse, diamètre intérieur 15,0 mm, hauteur 30 à 40 cm, équipée d’un robinet.

3.3.

Appareil de chromatographie en phase gazeuse approprié pour le fonctionnement avec colonne capillaire, équipé d’un système d’introduction directe dans la colonne, constitué par:

3.3.1.

Chambre à thermostat pour les colonnes, équipée d’un programmateur de température.

3.3.2.

Injecteur à froid pour introduction directe dans la colonne.

3.3.3.

Révélateur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur.

3.3.4.

Enregistreur-intégrateur approprié pour le fonctionnement avec le convertisseur-amplificateur (3.3.3), vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et vitesse de déroulement du papier variable. (Il est également possible d’utiliser des systèmes informatisés qui prévoient l’acquisition des données de chromatographie en phase gazeuse au moyen d’un PC.)

3.3.5.

Colonne capillaire en verre ou silice fondue, longueur 8 à 12 m, diamètre intérieur 0,25 à 0,32 mm, recouverte à l’intérieur de liquide de répartition, à l’épaisseur uniforme comprise entre 0,10 et 0,30 μm. (Liquides de répartition adaptés à l’emploi, du type SE52 ou SE 54 dans le commerce.)

3.4.	Microseringue pour introduction directe dans la colonne de 10 μl, équipée d’une aiguille cémentée.

3.5.	Vibrateur électrique.

3.6.	Évaporateur rotatif.

3.7.	Four à moufle.

3.8.	Balance analytique garantissant une précision de la mesure de ± 0,1 mg.

3.9.	Verrerie normale de laboratoire.

4. RÉACTIFS

4.1.

Gel de silice d’une granulométrie comprise entre 60 et 200 μm.

Le gel de silice doit être placé dans le four à 500 °C pendant au moins 4 heures. Après refroidissement, y ajouter 2 % d’eau par rapport à la quantité de gel de silice prélevée. Agiter convenablement afin d’homogénéiser la masse. Conserver à l’obscurité pendant au moins 12 heures avant emploi.

4.2.	n-hexane, pour chromatographie.

4.3.	Éther éthylique, pour chromatographie.

4.4.	n-Heptane, pour chromatographie.

4.5.

Solution étalon d’arachidate laurique, solution à 0,1 % (m/V) dans l’hexane (étalon interne). (Il est également possible d’utiliser du palmitate de palmityle ou du stéarate de myristyle)

4.5.1.

Soudan 1 (1-phenyl-azo-2-naphthol).

4.6.	Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.7.	Gaz auxiliaires: — hydrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse, — air pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de la colonne chromatographique

Suspendre 15 g de gel de silice (4.1) dans le n-hexane (4.2) et l’introduire dans la colonne (3.2). Après tassement spontané, le compléter à l’aide d’un agitateur électrique (3.5) pour rendre la couche chromatographique plus homogène. Percoler 30 ml de n-hexane afin d’éliminer les impuretés éventuelles. Peser exactement à l’aide de la balance (3.8) 500 mg de l’échantillon dans l’Erlenmeyer de 25 ml (3.1), ajouter la quantité appropriée d’étalon interne (4.5), en fonction du contenu présumé de cires. Par exemple, ajouter 0,1 mg d’arachidate laurique dans le cas de l’huile d’olive et 0,25 à 0,5 mg dans le cas de l’huile de grignons. Transférer l’échantillon ainsi préparé dans la colonne chromatographique à l’aide de deux portions de 2 ml chacune de n-hexane (4.2).

Laisser s’écouler le solvant jusqu’à 1 mm au-dessus du niveau supérieur de l’absorbant puis percoler 70 ml de n-hexane supplémentaires afin d’éliminer les n-alcanes naturellement présents. Commencer alors l’élution chromatographique en recueillant 180 ml du mélange n-hexane/éther éthylique, rapport 99:1, tout en respectant un débit d’environ 15 gouttes toutes les 10 secondes. L’élution de l’échantillon doit être effectuée à une température ambiante de 22 °C ± 4.

Notes:

— Le mélange n-hexane/éther éthylique (99:1) doit être préparé chaque jour.

— Pour contrôler visuellement l’élution correcte des cires, il est possible d’ajouter à l’échantillon en solution 100 μl de soudan à 1 % dans le mélange d’élution. Le colorant ayant une rétention intermédiaire entre les cires et les triglycérides, lorsque la coloration atteint le fonds de la colonne chromatographique, il convient de suspendre l’élution car toutes les cires ont été éluées.

La fraction ainsi obtenue est séchée dans l’évaporateur rotatif (3.6) jusqu’à élimination pratiquement totale du solvant. Les deux derniers ml du solvant sont éliminés à l’aide d’un faible courant d’azote; ajouter ensuite 2-4 ml de n-heptane

5.2. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.2.1. Opérations préliminaires

Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse (3.3), en branchant le terminal d’entrée au système «on-column» et le terminal de sortie au révélateur. Effectuer les contrôles généraux de l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse (tenue des circuits des gaz, efficience du révélateur et du système d’enregistrement, etc.).

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est recommandé de procéder à son conditionnement. Laisser s’écouler un léger débit de gaz à travers la colonne, puis allumer l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse. Chauffer graduellement jusqu’à atteindre, au bout d’environ 4 heures, une température de 350 °C. Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis procéder au réglage de l’appareillage aux conditions de fonctionnement [réglage du débit des gaz, allumage de la flamme, branchement à l’enregistreur électronique (3.3.4), réglage de la température de la chambre pour la colonne, du révélateur, etc.] et enregistrer le signal à une sensibilité au moins 2 fois supérieure à celle prévue pour l’exécution de l’analyse. Le tracé de la ligne de base doit être linéaire, exempt de pics de toute nature, et ne doit pas présenter de déviation.

Une déviation rectiligne négative indique une tenue imparfaite des connexions de la colonne; une déviation positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

5.2.2. Choix des conditions opératoires

D’une manière générale, les conditions opératoires à observer sont les suivantes:

— température de la colonne:

—

20 °C/minute

5 °C/minute

20 °C/minute

au départ 80 °C

(1′)

→

240 °C

→

325 °C

(6′)

→

340 °C

(10′)

— température du révélateur: 350 °C,

— quantité de matière injectée: 1 μl de la solution (2-4 ml) de n-heptane,

— gaz vecteur: hélium ou hydrogène à la vitesse linéaire optimale pour le gaz sélectionné (voir appendice),

— sensibilité instrumentale: en mesure de répondre aux conditions ci-dessous:

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et de l’appareil de chromatographie en phase gazeuse, de manière à obtenir une séparation de toutes les cires, une résolution satisfaisante des pics (voir figure) et un temps de rétention de l’étalon interne C32 qui doit être de 18 ± 3 minutes. Le pic des cires le plus représentatif doit avoir mesuré au moins 60 % du fond de l’échelle.

Les paramètres d’intégration des pics doivent être déterminés de façon à obtenir une évaluation correcte des aires des pics pris en considération.

Note:Vu la température finale élevée, on admet une dérive positive qui de doit pas être supérieure à 10 % du fonds de l’échelle.

5.3. Exécution de l’analyse

Prélever 1 μl de la solution à l’aide de la microseringue de 10 μl; retirer le piston de la seringue de manière à ce que l’aiguille soit vide. Introduire l’aiguille dans le dispositif d’injection et, après 1-2 secondes, injecter rapidement; au bout d’environ 5 secondes, extraire lentement l’aiguille.

Effectuer l’enregistrement jusqu’à élution complète des cires.

La ligne de base doit toujours répondre aux conditions requises.

5.4. Identification des pics

L’identification des différents pics doit être effectuée à partir des temps de rétention et par comparaison avec des mélanges de cires aux temps de rétention connus, analysés dans les mêmes conditions.

La figure ci-après représente un chromatogramme des cires d’une huile d’olive vierge.

5.5. Évaluation quantitative

Procéder au calcul des aires des pics de l’étalon interne et des esters aliphatiques de C40 à C46 à l’aide de l’intégrateur.

Calculer la teneur en cires de chacun des esters, en mg/kg de matière grasse, par la formule:

Où:

aire du pic de chaque ester, en millimètres carrés;

aire du pic de l’étalon interne, en millimètres carrés;

masse d’étalon interne ajoutée, en milligrammes;

masse de l’échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Indiquer la somme des teneurs des différentes cires de C40 à C46, en mg/kg de matière grasse (ppm).

Note:Les composants à quantifier font référence aux pics à nombre de carbone paires compris entre les esters C40 et C46, selon l’exemple de chromatogramme des cires de l’huile d’olive reporté dans la figure ci-après. Si l’ester C46 apparaît en double, il est conseillé, pour l’identifier, d’analyser la fraction des cires d’une huile de grignons d’olive où le pic C46 est facilement identifiable car nettement majoritaire.

Les résultats sont exprimés avec une décimale.

Figure

Chromatogramme des cires d’une huile d’olive ( 6 )

Légende:

I.S.

Arachidate laurique

Esters diterpéniques

2 + 2′

Esters C40

3 + 3′

Esters C42

4 + 4′

Esters C44

Esters C46

Esters stérols et alcool triterpéniques

APPENDICE

Détermination de la vitesse linéraire du gaz

Injecter de 1 à 3 μl de méthane (ou propane) dans l'appareil de chromatographie en phase gazeuse, après son réglage aux conditions opératoires normales. Chronométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, à partir du moment de son injection jusqu'au moment de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire, en cm/s, est donnée par la formule L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.

▼B

ANNEXE V

DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION ET DU CONTENU EN STÉROLS AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1. OBJET

La méthode décrit le procédé de détermination du contenu en stérols, simples et totaux, des matières grasses.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse, additionnée d'α-cholestanol comme standard interne, est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La fraction stérolique est séparée de l'extrait insaponifiable par chromatographie sur plaque de gel de silice basique; les stérols récupérés dans le gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE

3.1.	Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts rodés.

3.2.	►C1 Ampoules ◄ à décanter de 500 millilitres.

3.3.	Ballons de 250 millilitres.

3.4.	Équipement complet pour chromatographie en phase solide, avec plaques de verre de 20 × 20 centimètres.

3.5.	Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.

3.6.	Microseringues de 100 et 500 microlitres.

3.7.	Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40 micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout rodé mâle 12/21.

3.8.	Fiole à vide 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable à l'ampoule filtrante (3.7).

3.9.	Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.

3.10.

Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec colonne capillaire, doté d'un système de séparation, constitué de:

3.10.1.

Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la température désirée avec une précision d'environ 1° C

3.10.2.

Ensemble de vaporisation thermoréglable avec élément vaporisateur en verre persilanisé

3.10.3.

Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur

3.10.4.

Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertisseur-amplificateur.

3.11.

Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de long, de 0,25 à 0,32 millimètres de diamètre intérieur, recouverte intérieurement de liquide. SE-52 ou SE-54 ou équivalent, avec une épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.

3.12.

Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10 ►C1 microlitres ◄ avec aiguille cémentée.

4. RÉACTIFS

4.1.

Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre, tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titre minimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles de verre opaque bien bouchées (éthanol 95 % V/V).

4.2.	Éther éthylique pur, pour analyses.

4.3.	Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.

4.4.	Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluorescence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le commerce déjà prêtes à l'emploi).

4.5.	Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2N: dissoudre 13 grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol.

4.6.	Benzène, pour chromatographie (5.2.2).

4.7.	Acétone, pour chromatographie (5.2.2).

4.8.	Hexane pour chromatographie (5.2.2).

4.9.	Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).

4.10.

Chloroforme pur, pour analyses.

4.11.

►C1 Solution de référence ◄ pour la chromatographie sur plaque: cholestérol ou phytostérol, solution à ►M6 2 % ◄ dans le chloroforme.

4.12.

Dichloro-2′ -7′ fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solution alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.

4.13.

Pyridine anhydre, pour chromatographie.

4.14.

Hexaméthyldisilazane.

4.15.

Triméthylchlorosilane.

4.16.

Solution échantillon des triméthylsilyléthers des stérols: à préparer au moment de l'emploi à partir des stérols tirés des huiles qui les contenaient.

4.17.

α-cholestanol, solution à 0,2 % (m/V) dans le chloroforme (standard interne).

4.18.

Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.19.

Gaz auxiliaire: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5. PROCÉDÉ

5.1.

Préparation de l'insaponifiable

5.1.1.

Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microseringue de 500 microlitres, un volume de solution d'α-cholestanol à 0,2 % dans le chloroforme (4.17) qui contienne une quantité d'α-cholestanol correspondant à environ 10 % des stérols contenus dans l'aliquote d'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple, pour 5 grammes d'échantillon, il faut ajouter 500 microgrammes de la solution d'α-cholestane à 0,2 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive et 1 500 microlitres s'il s'agit ►M6 ————— ◄ d'huile de grignons d'olive.

Évaporer dans un courant d'azote jusquà dessication, puis peser exactement 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon.

Dans le cas d'huiles ►M6 ————— ◄ qui contiennent des quantités considérables de cholestérol, un pic ayant un temps de rétention identique à celui du cholestanol peut être présent. Dans de tels cas, il faut analyser la fraction stérolique en double, avec et sans standard interne ►M6 ou utiliser, au lieu de choléstanol, le betulinol ◄ .

5.1.2.

Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium à 2N, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer au bain-marie jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation énergique jusqu'à que la saponification se soit produite (la solution devient limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis ajouter 50 millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du réfrigérant, débrancher le réfrigérant et refroidir le ballon à environ 30° C.

5.1.3.

Transvaser le contenu du ballon de façon quantitative, dans une ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillé à plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1).

Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillant dans une autre ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse, selon les mêmes modalités en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres d'éther éthylique.

Note 1:

Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant, avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou méthylique.

5.1.4.

Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à l'eau distillée (50 ml à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de l'eau de lavage.

Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 ml pesé au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités d'éther éthylique.

5.1.5.

Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il en reste de petites quantités, puis porter à sec sous un léger vide ou dans un courant d'azote, parfaire le séchage à l'étuve à 100° C durant un quart d'heure environ et peser après refroidissement dans un dessicateur.

5.2.

Séparation de la fraction stérolique.

5.2.1.

Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice (4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser les ensuite enfermées sous hotte pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve à 100° C pendant une heure.

Retirer de l'étuve et conserver dans un dessicateur à chlorure de calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent être employées dans les quinze jours).

Note 2:

L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la séparation de la fraction stérolique élimine le besoin du traitement de l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des stérols nettement séparée de la bande des alcools aliphatiques et terpéniques.

5.2.2.

Introduire dans la cuve de développement un mélange benzène-acétone 95/5 (V/V) jusqu'à une hauteur d'environ 1 centimètre. On peut utiliser à la place un mélange hexane-éther éthylique 55/35 (V/V). Fermer la cuve à l'aide d'une couvercle approprié et laisser ainsi pendant une demi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur s'établisse. Il est possible de fixer sur les surfaces intérieures de la cuve des bandes de papier filtré qui plongent dans l'éluant: cette précaution permet de réduire d'un tiers environ le temps de migration du front du liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.

Note 3:

Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproductibles, le mélange doit être chargé à chaque essai.

5.2.3.

Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le chloroforme et, avec la microseringue de ►C1 100 microlitres ◄ , déposer sur la plaque chromatographique (5.2.1), à 2 centimètres environ d'un bord, 0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne continue, la plus fine et uniforme possible. Dans l'alignement de la ligne de dépôt, déposer, à une des extrémités de la plaque, 2 à 3 microlitres de la solution de référence des stérols (4.11), dans le but d'identifier la bande des stérols lors du dernier développement.

5.2.4.

Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme décrit en (5.2.2). La température ambiante doit être maintenue entre 15 et 20° C. Fermer aussitôt la chambre avec le couvercle et laisser éluer jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et faire évaporer le solvant dans un courant d'air chaud ou bien en laissant la plaque sous hotte pendant un petit moment.

5.2.5.

Vaporiser légèrement la plaque et de façon uniforme avec la solution de dichloro-22-72 fluorescéine. Identifier la bande des stérols par alignement avec la tache obtenue avec la solution de référence; délimiter la bande avec un crayon noir le long des bords de la fluorescence.

5.2.6.

Racler avec une spatule métallique le gel de silice compris dans la zone délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans l'ampoule filtrante (3.7); ajouter 10 millilitres de chloroforme chaud, mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer à l'aide du vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (3.8) reliée à l'ampoule filtrante.

Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ 10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en chauffant légèrement dans un léger courant d'azote, reprendre avec quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes environ à l'étuve à 105° C, puis laisser refroidir au dessicateur et peser.

Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction stérolique.

5.3.

Préparation des triméthylsilyléthers

5.3.1.

Ajouter, dans le tube contenant la fraction stérolique, le réactif de silylation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 4) dans une proportion de 50 microlitres par milligramme de stérols, en évitant toute absorption d'humidité (note 5).

Note 4:

Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi; en outre, d'autres réactifs silanisants, tels que, par exemple, le bis-triméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosilane à diluer par un même volume de pyridine anhydre.

5.3.2.

Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète solubilisation des stérols. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes: la solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse.

Note 5:

La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont l'indice de la présence d'humidité ou de l'altération du réactif. Dans ce cas, l'essai doit être répété.

5.4.

Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.4.1.

Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne

5.4.1.1.

Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant l'extrémité d'entrée à l'évaporateur connecté au système de séparation et l'extrémité de sortie au détecteur.

Effectuer les contrôles généraux du complexe de chromatographie en phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur, efficacité du système de séparation et du système d'enregistrement, etc.).

5.4.1.2.

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est conseillé de procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie en phase gazeuse et commencer un chauffage graduel jusqu'à rejoindre une température d'au moins 20° C supérieure à celle d'exercice (note 6). Maintenir cette température pendant au moins deux heures, puis porter le complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux gazeux et du fractionnement, allumage de la flamme, jonction avec l'enregistreur électronique, régulation de la température de la chambre pour la colonne du détecteur et de l'initiateur, etc.) et enregistrer le signal à une sensibilité d'au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l'exécution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas présenter de dérive.

Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

Note 6:

La température de conditionnement doit être toujours inférieure d'au moins 20° C à la température maximale prévue pour le liquide de répartition employé.

5.4.2.

Choix des conditions opératoires

5.4.2.1.

Les conditions opératoires maximales sont les suivantes:

— température de la colonne: 260° C ± 5° C,

— température de l'évaporateur: 280° C,

— température du détecteur: 290° C,

— vitesse linéaire du gaz de transport: hélium, 20 à 35 centimètres par seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde,

— ►C1 rapport de division ◄ : de 1/50 à 1/100,

— sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,

— sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond,

— vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure,

— quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de TMSE.

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et du chromatographe en phase gazeuse de façon à obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:

— le temps de rétention du β-sitostérol doit être de 20 ± 5 minutes,

— le pic de campestérol doit être: pour l'huile d'olive (contenu moyen 3 %) 15 ± 5 % de l'échelle de fond, pour l'huile de soja (contenu moyen 20 %) 80 ± 10 % de l'échelle de fond,

— il doit y avoir séparation de tous les stérols présents; il est nécessaire que les autres pics séparés soient aussi complètement résolus, ce qui veut dire que le tracé du pic doit rejoindre la ligne de base avant la sortie du pic suivant. Une résolution incomplète est toutefois tolérée à condition, cependant, qu'elle soit quantifiable selon la perpendiculaire au pic à TRR 1,02.

5.4.3.

Exécution de l'analyse

5.4.3.1.

Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane, aspirer 0,5 microlitre d'air et successivement 0,5 et 1 microlitre de la solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes environ.

5.4.3.2.

Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des stérols présents.

La ligne de base doit toujours correspondre aux qualités requises (5.4.1.2).

5.4.4.

Identification des pics

L'identification des pics uniques est effectuée sur la base des temps de rétention et par comparaison avec le mélange des TMSE des stérols, analysés dans les mêmes conditions.

Les stérols sont élués dans l'ordre suivant: cholestérol, brassicastérol, 24-méthylène-cholestérol, campestérol, campestanol, stigmastérol, Δ 7 campestérol, Δ 5,23 stigmastadiénol, chlérostérol, β-sitostérol, sitostanol, Δ 5-avénastérol, 5,24 stigmastadiénol, Δ 7-stigmasténol, Δ 7-avénastérol.

Dans le tableau 1 sont reportés les temps de rétention relatifs au sitostérol pour les colonnes SE 52 et SE 54.

Les figures 1 et 2 illustrent les chromatogrammes typiques de quelques huiles.

5.4.5.

Évaluation quantitative

5.4.5.1.

Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l'α-cholestanol et des stérols. Ne pas considérer les pics éventuels de compositions non comprises dans celles énumérées dans le tableau 1. Le coefficient de réponse GLC de l'α-cholestanol s'entend égal à 1.

5.4.5.2.

Calculer le contenu en chaque stérol simple, en milligrammes par 100 grammes de matière grasse, comme suit:

où:

Ax = aire du pic du stérol x ►M6 ————— ◄ ;

As = aire du pic d'α-cholestanol ►M6 ————— ◄ ;

ms = poids d'α-cholestanol ajouté, en milligrammes;

m: = poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1.	Rapporter les contenus de chaque stérol en milligrammes par 100 grammes de matière grasse et leur somme comme «stérols totaux».

6.2.	On calcule le pourcentage de chaque stérol à partir du rapport entre l'aire du pic correspondant et la somme des aires des pics des stérols. Ax = aire du pic x. A = somme des aires de tous les pics.

APPENDICE

Détermination de la vitesse linéaire du gaz

Dans le chromatographe en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires normales, injecter 1 à 3 microlitres de méthane (ou propane) et chronométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de l'injection et celui de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.

Tableau I

Temps de rétention relatifs des stérols

Pic	Identification		Temps de rétention relatif
Pic	Identification		Colonne SE 54	Colonne SE 52
1	cholestérol	Δ-5-cholestène-3β-ol	0,67	0,63
2	cholestanol	5α-cholestane	0,68	0,64
3	brassicastérol	[24S]-24-méthyl-Δ-5,22-cholestadiène-3β-ol	0,73	0,71
4	24-méthylène-cholestérol	24-méthylén-Δ-5,24-cholestadiène-3β-ol	0,82	0,80
5	campestérol	[24R]-24-méthyl-Δ-5-cholestène-3β-ol	0,83	0,81
6	campestanol	[24R]-24-méthyl-cholestane-3β-ol	0,85	0,82
7	stigmastérol	[24S]-24-éthyl-Δ-5,22-cholestadiène-3β-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-campestérol	[24R]-24-méthyl-Δ-7-cholestène-3β-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stigmastadiénol	[24S,R]-24-éthyl-Δ-5,23-cholestadiène-3β-ol	0,95	0,95
10	chlérostérol	[24S]-24-éthyl-Δ-5,25- ►C1 cholestadiène ◄ -3β-ol	0,96	0,96
11	β-sitostérol	[24R]-24-éthyl-Δ-5-cholestène-3β-ol	1,00	1,00
12	sitostanol	24-éthyl-cholestane-3β-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-avénastérol	[24Z]-24-éthyliden-5-cholestène-3β-ol	1,03	1,03
14	Δ-5,24-stigmastadiénol	[24S,R]-24-éthyl-Δ-5,24-cholestadiène-3β-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmasténol	[24S,R]-24-éthyl- ►C1 Δ-7-cholestène ◄ -3β-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avénestérol	[24Z]-24-éthyliden-Δ-7-cholestène-3β-ol	1,16	1,16

Figure 1 Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive brute

Figure 2 Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive raffinée

ANNEXE VI

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN ÉRYTHRODIOL ET EN UVAOL

AVANT-PROPOS

L'érythrodiol (terme générique qui désigne conventionnellement l'ensemble des diols érythrodiol et uvaol) est un élément constitutif de l'insaponifiable que l'on trouve dans certains types de matières grasses. Son dosage peut servir à vérifier la présence d'huile d'olive d'extraction, sa concentration y étant nettement plus élevée que dans d'autres huiles (huiles d'olive de pression, huiles de pépins de raisin).

1. OBJET

La méthode décrit le procédé de détermination de la teneur en érythrodiol des matières grasses.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans de l'éthanol. L'insaponifiable est ensuite extrait avec de l'éther éthylique, purifié par passage sur une colonne d'alumine et fractionné par chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice. Les bandes des fractions stérolique et érythrodiolique sont alors isolées.

Les stérols et l'érythrodiol récupérés sur la plaque sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse.

Le résultat est exprimé en pourcentage d'érythrodiol par rapport à l'ensemble érythrodiol + stérols.

3. APPAREILLAGE

3.1.	Appareillage décrit à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).

4. RÉACTIFS

4.1.	Réactifs énumérés à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).

4.2.	Solution de référence d'érythrodiol à 0,5 % dans du chloroforme.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de l'insaponifiable

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.1.2 de l'annexe V.

5.2. Séparation de l'érythrodiol et des stérols

5.2.1.

Voir paragraphe 5.2.1 de la méthode de l'annexe V.

5.2.2.

Voir paragraphe 5.2.2 de la même méthode.

5.2.3.

Préparer une solution d'insaponifiable (à 5 %) dans le chloroforme.

Avec la microseringue de 0,1 millilitre, déposer sur une plaque chromatographique, à environ 1,5 centimètre du bord inférieur, 0,3 millilitre de la solution susmentionnée, en une ligne la plus fine et la plus uniforme possible. À une extrémité de la plaque, déposer, pour référence, quelques microlitres des solutions de cholestérol et d'érythrodiol.

5.2.4.

Mettre la plaque dans la cuve de développement préparée comme indiquée au paragraphe 5.2.1. La température ambiante doit être d'environ 20° C. Fermer aussitôt avec le couvercle et éluer jusqu'à ce que le niveau du solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et évaporer le solvant dans un courant d'air chaud.

5.2.5.

Vaporiser uniformément la solution de dichloro-2′ 7′ fluorescéine sur la plaque. En examinant cette dernière à la lumière ultraviolette, identifier les bandes de stérols et de l'érythrodiol par alignement avec les éléments de référence, puis délimiter avec une pointe légèrement en dehors des bords de la fluorescence.

5.2.6.

Avec une spatule métallique, racler le gel de silice compris dans les zones délimitées. Introduire le matériau retiré de la plaque dans une fiole de 50 millilitres. Ajouter 15 millilitres de chloroforme chaud, bien agiter et filtrer dans l'ampoule à filtre poreux en transférant le gel de silice sur le filtre même. Laver par trois fois au chloroforme chaud (environ 10 millilitres à chaque fois) et receuillir le filtrat dans un ballon de 100 millilitres. Évaporer jusqu'à obtention d'un volume de 4 à 5 millilitres, transvaser, dans un tube centrifugeur à fond conique de 10 millilitres préalablement pesé, porter à sec en chauffant légèrement dans un courant d'azote, et peser.

5.3. Préparation des triméthylsilyléthers

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.3 de la méthode de l'annexe V.

5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.4 de la même méthode.

L'analyse par chromatographie en phase gazeuse doit être réalisée dans des conditions permettant le respect des exigences de l'analyse des stérols et la séparation des TMSE de l'érythrodiol et de l'uvaol.

Après avoir injecté l'échantillon, laisser le papier se dérouler jusqu'à élution complète des stérols présents, de l'érythrodiol et de l'uvaol. Identifier ensuite les pics (les temps de rétention relatifs de l'érythrodiol et de l'uvaol, par rapport au β-sitostérol, sont respectivement de 1,4 et 1,55 environ).

Calculer ensuite les aires comme indiqué pour les stérols.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

où:

A1 : aire du pic de l'érythrodiol ►M6 ————— ◄ ;

A2 : aire du pic de l'uvaol ►M6 ————— ◄ ;

Astérols : somme des aires des stérols présents ►M6 ————— ◄ .

Indiquer le résultat avec une décimale.

▼M21

ANNEXE VII

DÉTERMINATION DU POURCENTAGE DU 2-GLYCÉRIL MONOPALMITATE

1. OBJET ET DOMAINE D’APPLICATION

Cette méthode décrit la procédure analytique pour la détermination du pourcentage d’acide palmitique en position 2 des triglycérides au moyen de l’évaluation du 2-glycéril monopalmitate.

Cette méthode est applicable aux huiles végétales liquides à température ambiante (20 °C).

2. PRINCIPE

Après préparation, l’échantillon d’huile est soumis à l’action de la lipase pancréatique: une hydrolyse partielle et spécifique dans les positions 1 et 3 de la molécule de triglycéride entraîne l’apparition des monoglycérides en position 2. Le pourcentage de 2-glycéril monopalmitate dans la fraction monoglycéridique est déterminé, après silylation, par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE ET MATÉRIEL COURANT

3.1.	Erlenmeyer, 25 ml

3.2.	Béchers 100, 250 et 300 ml

3.3.	Colonne en verre pour chromatographie, diamètre intérieur 21-23 mm, longueur 400 mm, équipée d’une plaque en verre fritté et d’un robinet

3.4.	Éprouvettes graduées de 10, 50, 100 et 200 ml

3.5.	Ballons de 100 et 250 ml

3.6.	Évaporateur rotatif

3.7.	Tubes de centrifugeuse à fond conique de 10 ml, avec bouchon rodé

3.8.	Centrifugeuse pour des tubes de 10 et 100 ml

3.9.	Thermostat permettant de maintenir la température à 40 ± 0,5 °C

3.10.

Pipettes graduées de 1 et 2 ml

3.11.

Seringue hypodermique de 1 ml

3.12.

Microseringue de 100 μl

3.13.

Entonnoir, 1 000 ml

3.14.

Chromatographe en phase gazeuse pour colonnes capillaires, équipé d’un dispositif d’injection «on-column» à froid pour l’introduction directe de l’échantillon dans la colonne et d’un four susceptible de maintenir la température choisie à 1 °C près

3.15.

Injecteur «on-column» à froid pour l’introduction directe de l’échantillon dans la colonne

3.16.

Détecteur à ionisation de flamme et électromètre

3.17.

Enregistreur-intégrateur adapté à l’électromètre avec une vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et une vitesse variable de déroulement du papier

3.18.

Colonne capillaire en verre ou en silice fondue de 8 à 12 mètres, d’un diamètre intérieur de 0,25 à 0,32 mm, recouverte de methylpolysiloxane ou de phényl méthylpolysiloxane 5 %, d’une épaisseur de 0,10-0,30 μm, pouvant être utilisée à 370 °C

3.19.

Microseringue de 10 μl munie d’une aiguille cémentée, d’au moins 7,5 cm de long, pour injection directe sur colonne

4. RÉACTIFS

4.1.

Gel de silice ayant une granulométrie comprise entre 0,063 et 0,200 mm (70/280 mesh), préparé comme suit: mettre le gel de silice dans une capsule de porcelaine, sécher à l’étuve à 160 °C pendant 4 heures, puis laisser refroidir à température ambiante dans un dessiccateur. Ajouter un volume d’eau équivalent à 5 % du poids du gel de silice, comme suit: dans un Erlenmeyer de 500 ml, peser 152 g de gel de silice et ajouter 8 g d’eau distillée, boucher et agiter délicatement pour obtenir une répartition uniforme de l’eau. Laisser reposer au moins 12 heures avant l’emploi.

4.2.	n-hexane (pour chromatographie)

4.3.	Isopropanol

4.4.	Isopropanol, solution aqueuse 1/1 (V/V)

4.5.	Lipase pancréatique. La lipase utilisée doit avoir une activité comprise entre 2,0 et 10 unités de lipase par mg. (Il existe dans le commerce des lipases pancréatiques ayant une activité comprise entre 2 et 10 unités par mg d’enzyme.)

4.6.	Solution tampon de tris-hydroxy-méthylaminométhane: solution aqueuse 1 M amenée jusqu’à pH 8 (contrôle potentiométrique) par du HCI concentré (1/1 V/V)

4.7.	Cholate de sodium, qualité enzymatique, solution aqueuse à 0,1 % (cette solution doit être utilisée dans les 15 jours suivant sa préparation)

4.8.	Chlorure de calcium, solution aqueuse à 22 %

4.9.	Éther diéthylique pour chromatographie

4.10.

Solvant de développement: mélange n-hexane/éther diéthylique (87/13) (V/V)

4.11.

Hydroxyde de sodium, solution à 12 % en poids

4.12.

Phénolphtaléine, solution à 1 % dans l’éthanol

4.13.

Gaz vecteur: hydrogène ou hélium, pour chromatographie en phase gazeuse

4.14.

Gaz auxiliaires: hydrogène, à 99 % minimum, exempt d’humidité et de substances organiques; et air, pour chromatographie en phase gazeuse de la même pureté

4.15.

Réactif de silanisation: mélange pyridine/hexamethyldisilazane, trimethylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V). (Des solutions prêtes à l'emploi existent dans le commerce. D’autres réactifs de silylation peuvent être employés, notamment bis-trimethylsilyl trifluoracetamide + 1 % trimethylchlorosilane, dilués avec un volume identique de pyridine anhydre.)

4.16.

Échantillons de référence: monoglycérides purs ou mélanges de monoglycérides ayant une composition en pourcentage connue similaire à celle de l’échantillon.

5. PROCÉDURE

5.1. Préparation de l’échantillon

5.1.1.

Les huiles ayant une acidité libre inférieure à 3 % n’ont pas besoin d’être neutralisées avant la chromatographie sur colonne de gel de silice. Les huiles ayant une acidité libre supérieure à 3 % devront être soumises à la neutralisation conformément au point 5.1.1.1.

5.1.1.1.

Dans l’entonnoir de 1 000 ml (3.13), verser 50 g d’huile et 200 ml de n-hexane. Ajouter 100 ml d’isopropanol et une quantité de la solution d’hydroxyde de sodium à 12 % (4.11) correspondant à l’acidité libre de l’huile majorée de 5 %. Agiter énergiquement pendant une minute. Ajouter 100 ml d’eau distillée, agiter de nouveau et laisser reposer.

Après décantation, éliminer la couche inférieure contenant les savons. Éliminer les éventuelles couches intermédiaires (mucilage et substances insolubles). Laver la solution hexanique de l’huile neutralisée avec des portions successives de 50-60 ml de la solution isopropanol/eau 1/1 (V/V) (4.4) jusqu’à disparition de la coloration rosée de la phénolphtaléine.

Éliminer la plus grande partie de l’hexane par distillation sous vide (utiliser par exemple un évaporateur rotatif) et transférer l’huile dans un ballon de 100 ml (3.5). Sécher l’huile sous vide jusqu’à élimination totale du solvant.

À la fin de cette opération, l’acidité de l’huile doit être inférieure à 0,5 %.

5.1.2.

Introduire 1,0 g d’huile préparée comme indiqué ci-dessus dans un Erlenmeyer de 25 ml (3.1) et dissoudre dans 10 ml de mélange de développement (4.10). Laisser reposer la solution pendant au moins 15 minutes avant la chromatographie sur colonne de gel de silice.

Si la solution est trouble, la centrifuger pour garantir des conditions optimales pour la chromatographie. (Des cartouches de gel de silice SPE de 500 mg prêtes à l’emploi peuvent être utilisées.)

5.1.3.

Préparation de la colonne chromatographique

Verser dans la colonne (3.3) environ 30 ml du solvant de développement (4.10), introduire un morceau de coton dans la partie inférieure de la colonne à l’aide d’une baguette de verre; presser pour éliminer l’air.

Dans un bécher, préparer une suspension de 25 g de gel de silice (4.1) dans environ 80 ml de solvant de développement et le verser dans la colonne à l’aide d’un entonnoir.

Vérifier que tout le gel de silice a été introduit dans la colonne; laver avec le solvant de développement (4.10), ouvrir le robinet et laisser le niveau du liquide atteindre environ 2 mm au-dessus du niveau supérieur du gel de silice.

5.1.4.

Chromatographie sur colonne

Dans un Erlenmeyer de 25 ml (3.1), peser exactement 1,0 g d’échantillon préparé conformément au point 5.1.

Dissoudre l’échantillon dans 10 ml de solvant de développement (4.10). Verser la solution dans la colonne chromatographique préparée conformément au point 5.1.3. Éviter de remuer la surface de la colonne.

Ouvrir le robinet et laisser s’écouler la solution de l’échantillon jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau du gel de silice. Développer avec 150 ml de solvant de développement. Ajuster le débit à 2 ml/min (de façon à ce que 150 ml s’écoulent dans la colonne en 60-70 minutes environ).

Récupérer l’éluat dans un ballon de 250 ml préalablement taré. Évaporer le solvant sous vide et enlever les dernières traces de celui-ci sous un courant d’azote.

Peser le ballon et calculer l’extrait récupéré

[En cas d’utilisation de cartouches SPE de silice prêtes à l’emploi, procéder comme suit: introduire 1 ml de solution (5.1.2) dans les cartouches préalablement préparées avec 3 ml de n-hexane.

Après percolation de la solution, développer avec 4 ml de n-hexane/éther diéthylique 9/1 (V/V).

Récupérer l’éluat dans un tube de 10 ml et le soumettre à évaporation sous un courant d’azote jusqu’à siccité.

Soumettre le résidu sec à l’action de la lipase pancréatique (5.2). Il est fondamental de vérifier la composition en acide gras avant et après passage sur cartouche SPE].

5.2. Hydrolyse par la lipase pancréatique

5.2.1.

Dans le tube de la centrifugeuse, peser 0,1 g de l’huile préparée conformément au point 5.1. Ajouter 2 ml de solution tampon (4.6), 0,5 ml de la solution de cholate de sodium (4.7) et 0,2 ml de la solution de chlorure de calcium, en agitant bien après chaque addition. Fermer le tube par le bouchon rodé et le placer dans le thermostat à 40 ± 0,5 °C.

5.2.2.

Ajouter 20 mg de lipase, agiter soigneusement (en évitant de mouiller le bouchon) et mettre le tube dans le thermostat pendant exactement 2 minutes, puis le retirer, agiter énergiquement pendant 1 minute exactement et laisser refroidir.

5.2.3.

Ajouter 1 ml d’éther diéthylique, boucher et agiter énergiquement, puis centrifuger et transférer la solution d’éther dans un tube propre et sec, à l’aide d’une microseringue.

5.3. Préparation des dérivés silanisés et de la chromatographie en phase gazeuse

5.3.1.

À l’aide d’une microseringue, introduire 100 μl de solution (5.2.3) dans un tube à fond conique de 10 ml.

5.3.2.

Éliminer le solvant sous un léger courant d’azote, ajouter 200 μl de réactif de silanisation (4.15), boucher le tube et laisser reposer pendant 20 minutes.

5.3.3.

Après 20 minutes, ajouter 1 à 5 ml de n-hexane (en fonction des conditions chromatographiques): la solution résultant est prête pour la chromatographie en phase gazeuse.

5.4. Chromatographie en phase gazeuse

Les conditions d’opération sont les suivantes:

— température de l’injecteur (injecteur «on-column») inférieure à la température d’ébullition du solvant (68 °C),

— température du détecteur: 350 °C,

— température de la colonne: programmation de la température du four: 60 °C pendant 1 minute, en augmentant de 15 °C par minute jusqu’à 180 °C, puis de 5 °C par minute jusqu’à 340 °C, puis 340 °C pendant 13 minutes,

— gaz vecteur: hydrogène ou hélium, réglé à la vitesse linéaire adéquate en vue d’obtenir la résolution reflétée dans la figure 1. Le temps de rétention du triglycéride C54 doit être de 40 ± 5 minutes (voir figure 2). (Les conditions d’opérations indiquées ci-dessus sont proposées à titre indicatif. Chaque opérateur devra les optimiser pour atteindre la résolution désirée. La hauteur du pic correspondant au 2-glycéryl monopalmitate doit avoir une hauteur minimale égale à 10 % de l’échelle de l’enregistreur),

— quantité de substance injectée: 0,5-1 μl de la solution (5 ml) de n-hexane (5.3.3).

5.4.1. Identification des pics

Les monoglycérides individuels sont identifiés en fonction des temps de rétention obtenus et par rapport à ceux obtenus avec les mélanges standards de monoglycérides analysés dans les mêmes conditions.

5.4.2. Évaluation quantitative

L’aire de chaque pic est calculée au moyen d’un intégrateur électronique.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Le pourcentage de glycéril monopalmitate est calculé à partir du rapport entre l’aire du pic correspondant et la somme des aires des pics de tous les monoglycérides (voir figure 2), selon la formule:

Glycéryl monopalmitate (%):

Où:

aire du pic correspondant au glycéryl monopalmitate;

ΣA

somme des aires de la totalité des pics des monoglycérides.

Le résultat doit être donné avec une décimale.

7. COMPTE RENDU DE L’ANALYSE

Le compte rendu de l’analyse devra spécifier:

— la référence à cette méthode,

— toute information nécessaire à l’identification complète de l’échantillon,

— le résultat de l’analyse,

— tout écart de cette méthode, qu’il s’agisse d’une décision des parties concernées ou pour une autre raison,

— les détails d’identification du laboratoire, la date de l’analyse et la signature des responsables de celle-ci.

Figure 1

Chromatogramme des produits de la réaction de silanisation obtenus par l’action de la lipase sur une huile d’olive raffinée additionnée de 20 % d’huile estérifiée (100 %)

Figure 2

Chromatogramme de:

huile d’olive non estérifiée, après lipase; après silanisation; dans ces conditions (colonne capillaire 8-12 m), la fraction de cire est éluée en même temps que la fraction de diglycéride ou peu de temps après.

Après lipase, la teneur en triglycérides ne devrait pas excéder 15 %.

Légende:

Acides gras libres

Monoglycérides

Diglycérides

Triglycérides

2-monopalmitine

Triglycéride C54

Chromatogramme de:

huile estérifiée après lipase; après silanisation; dans ces conditions (colonne capillaire 8-12 m), la fraction de cire est éluée en même temps que la fraction de diglycéride ou peu de temps après.

Après lipase, la teneur en triglycérides ne devrait pas excéder 15 %.

Légende:

Acides gras libres

Monoglycérides

Diglycérides

Triglycérides

2-monopalmitine

Triglycéride C54

8. NOTES

PRÉPARATION DE LA LIPASE

Il existe dans le commerce des lipases ayant une activité satisfaisante. Il est également possible de les préparer au laboratoire de la façon suivante:

Refroidir à 0 °C 5 kg de pancréas frais de porc. Débarrasser de la graisse solide et du tissu conjonctif qui les entourent et les triturer dans un moulin à lames jusqu’à obtention d’une pâte fluide. Agiter cette pâte pendant 4 à 6 heures avec 2,5 litres d’acétone anhydre puis centrifuger. Extraire le résidu trois autres fois avec le même volume d’acétone anhydre, puis deux fois avec un mélange acétone/éther diéthylique (1/1) (V/V) et deux fois avec de l’éther diéthylique.

Sécher le résidu pendant 48 heures sous vide pour obtenir une poudre stable qui se conservera longtemps au réfrigérateur et à l’abri de l’humidité.

CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ LIPASIQUE

Préparer une émulsion d’huile d’olive comme suit:

Agiter pendant 10 minutes dans un mélangeur un mélange constitué de 165 ml d’une solution de gomme arabique à 100 g/l, 15 g de glace pilée et 20 ml d’une huile d’olive préalablement neutralisée.

Introduire successivement 10 ml de cette émulsion dans un bécher de 50 ml puis 0,3 ml d’une solution de cholate de sodium à 0,2 g/ml et 20 ml d’eau distillée.

Placer le bécher dans un thermostat régulé à 37 °C; introduire les électrodes du pH-mètre et l’agitateur à hélice.

Ajouter goutte à goutte, à l’aide d’une burette, une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N jusqu’à obtention d’un pH de 8,3.

Ajouter un volume de suspension de poudre de lipase dans l’eau (0,1 g/ml de lipase). Dès que le pH-mètre indique un pH de 8,3, mettre en marche le chronomètre et ajouter la solution d’hydroxyde de sodium, goutte à goutte, au rythme nécessaire pour maintenir le pH à la valeur de 8,3. Noter chaque minute le volume de solution consommé.

Reporter les données dans un système d’axes de coordonnées en portant en abscisses les temps et en ordonnées les millilitres de solution alcaline 0,1 N consommés pour maintenir le pH constant. Un graphique linéaire doit être obtenu.

L’activité de la lipase, mesurée en unités lipase par mg, est donnée par la formule suivante:

où:

A	est l’activité en unités lipase/mg;

V	est le nombre de millilitres de solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N par minute (calculé à partir du graphique);

N	est la normalité de la solution d’hydroxyde de sodium;

m	est la masse en mg de la lipase d’essai.

L’unité lipase est définie comme la quantité d’enzyme qui libère 10 micro-équivalents d’acide par minute.

▼M20 —————

▼M25

ANNEXE IX

ANALYSE SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DANS L’ULTRAVIOLET

AVANT-PROPOS

L’analyse spectrophotométrique dans l’ultraviolet peut fournir des indications sur la qualité d’une matière grasse, sur son état de conservation et sur les modifications subies du fait des processus technologiques qui lui sont appliqués.

L’absorption aux longueurs d’onde spécifiées dans la méthode est due à la présence de systèmes de diènes et triènes conjugués. Les valeurs de cette absorption sont exprimées comme l’extinction spécifique E 1 % 1 cm (l’extinction d’une solution de matière grasse à 1 % dans le solvant spécifié, pour une épaisseur de 1 cm), notée de façon conventionnelle K (également dénommé «coefficient d’extinction»).

1. DOMAINE D’APPLICATION

La méthode décrit la procédure à suivre pour réaliser une analyse spectrophotométrique de l’huile d’olive (telle que décrite dans l’appendice) dans l’ultraviolet.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse en question est dissoute dans le solvant prescrit, puis on détermine l’extinction de la solution aux longueurs d’onde spécifiées, par rapport au solvant pur. Les valeurs de l’extinction spécifique sont calculées à partir des relevés spectrophotométriques. On calcule l’absorbance spécifique à 232 nm et à 268 nm dans de l’iso-octane ou à 232 nm et 270 nm dans du cyclohexane pour une concentration de 1 g pour 100 ml dans une cuve de 10 mm.

3. APPAREILLAGE

3.1.

Spectrophotomètre pour mesurer l’extinction dans l’ultraviolet entre 220 et 360 nm, avec possibilité de lecture nanométrique. Avant utilisation, il est recommandé de contrôler l’échelle des longueurs d’onde et l’échelle d’absorbance du spectromètre, en procédant comme suit:

3.1.1. Échelle des longueurs d’onde: Ce contrôle peut être réalisé à l’aide d’un matériau de référence consistant en un filtre de verre optique contenant de l’oxyde d’holmium, qui possède des bandes d’absorption distinctes. Ce matériau de référence est destiné à la vérification et à l’étalonnage de l’échelle des longueurs d’onde des spectrophotomètres UV-visible dont la largeur de bande spectrale nominale est inférieure ou égale à 5 nm. Le filtre de verre à l’oxyde d’holmium est mesuré en mode d’absorbance en comparaison avec un blanc à l’air, sur la plage de longueurs d’onde comprise entre 640 et 240 nm. Pour chaque largeur de bande spectrale (0,10 – 0,25 – 0,50 – 1,00 – 1,50 – 2,00 et 3,00), on procède à une correction des valeurs initiales à l’aide d’un porte-cuve vide. Dans la norme ISO 3656, les longueurs d’onde correspondant à la largeur de bande spectrale sont énumérées dans le certificat du matériau de référence.

3.1.2. Échelle d’absorbance: Le contrôle peut être effectué au moyen d’un matériau de référence consistant en quatre solutions de dichromate de potassium dans de l’acide perchlorique, scellées dans quatre cuves UV en quartz, qui sont utilisées pour mesurer la linéarité et la précision photométrique de référence dans l’UV. Les cuves contenant le dichromate de potassium (40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml et 100 mg/ml) sont mesurées en comparaison avec un blanc contenant uniquement de l’acide perchlorique. Dans la norme ISO 3656, les valeurs d’absorbance nettes sont énumérées dans le certificat du matériau de référence.

3.2.	Cuves en quartz rectangulaires, avec couvercle, d’une longueur optique de 1 cm. Les cuves remplies d’eau ou d’un autre solvant approprié ne doivent pas présenter entre elles de différence supérieure à 0,01 unité d’extinction.

3.3.	Fioles jaugées de 25 ml.

3.4.	Balance analytique, permettant une lecture au 0,0001 g près.

4. RÉACTIFS

Sauf indication contraire, il convient d’utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.

Solvant: Iso-octane (2,2,4-triméthylpentane) (pour la mesure à 232 nm et à 268 nm) ou cyclohexane (pour la mesure à 232 nm et à 270 nm), présentant une absorbance inférieure à 0,12 à 232 nm et inférieure à 0,05 à 250 nm par rapport à l’eau distillée, mesurée dans une cuve de 10 mm.

5. PROCÉDURE

5.1.

L’échantillon en question doit être parfaitement homogène et exempt d’impuretés en suspension. Les huiles liquides à température ambiante sont filtrées sur papier à une température d’environ 30 °C; les graisses solides sont homogénéisées et filtrées à une température n’excédant pas leur point de fusion de plus de 10 °C.

5.2.

Introduire environ 0,25 g (au mg près) de l’échantillon ainsi préparé dans une fiole jaugée de 25 ml, compléter avec le solvant prescrit et homogénéiser. La solution obtenue doit être parfaitement limpide. Au cas où la solution présenterait une opalescence ou un trouble, filtrer rapidement sur papier.

5.3.

Remplir une cuve en quartz de la solution obtenue et mesurer les valeurs d’extinction à une longueur d’onde appropriée, entre 232 et 276 nm, le solvant employé servant de référence.

Les valeurs d’extinction lues doivent être comprises entre 0,1 et 0,8. Dans le cas contraire, il faut répéter les mesures en utilisant des solutions plus concentrées ou plus diluées, selon le cas.

Remarque: Il n’est pas forcément nécessaire de mesurer l’absorbance sur toute la plage des longueurs d’onde.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1.

Relever les extinctions spécifiques (coefficients d’extinction) aux diverses longueurs d’onde, calculées comme suit:

où:

Κλ

extinction spécifique à la longueur d’onde λ,

Ελ

extinction mesurée à la longueur d’onde λ,

concentration de la solution en g/100 ml,

épaisseur de la cuve en quartz, en cm.

Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

6.2.

Variation de l’extinction spécifique (ΔΚ)

L’analyse spectrophotométrique de l’huile d’olive conformément à la méthode officielle prévue par la législation européenne requiert également la détermination de la variation de la valeur absolue de l’extinction spécifique (ΔΚ), donnée par l’équation suivante:

où Km est la variation spécifique à la longueur d’onde m; la longueur d’onde correspondant à l’absorption maximale est fonction du solvant utilisé, à savoir 270 nm pour le cyclohexane et 268 nm pour l’iso-octane.

Appendice

CARACTÉRISTIQUES DES HUILES D'OLIVE

Catégorie

Esters méthyliques d'acides gras (EMAG) et esters éthyliques d'acides gras (EEAG)

Acidité (%) (*)

indice de peroxyde mEq O2/kg (*)

Cires mg/kg (**)

2 glycéryl monopalmitate (%)

Stigmastadiène mg/kg (1)

Différence: ECN42 (CLHP) et ECN42 (calcul théorique)

K232 (*)

K270 (*) «K 270 ou K 268 (5)»

Delta-K (*) (5)

Évaluation organoleptique Médiane du défaut (Md) (*)

défaut Évaluation organoleptique Médiane du fruité (Mf) (*)

Huile d'olive vierge extra

Σ FAME + FAEE ≤75 mg/kg ou 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤150 mg/kg et (FAEE/FAME) ≤1,5

≤ 0,8

≤ 20

≤ 250

≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 %

≤ 0,10

≤ 0,2

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Md = 0

Mf > 0

1,0 si % acide palmitique total > 14%

Huile d'olive vierge

—

≤ 2,0

≤ 20

≤ 250

≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14%

≤ 0,10

≤ 0,2

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Md ≤ 3,5

Mf > 0

≤ 1,0 si % acide palmitique total > 14%

Huile d'olive lampante

—

> 2,0

—

≤ 300 (3)

≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ 0,3

—

Md > 3,5 (2)

—

≤ 1,1 si % acide palmitique total > 14%

Huile d'olive raffinée

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 350

≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 %

—

≤ 0,3

—

≤ 1,10

≤ 0,16

—

≤ 1,1 si % acide palmitique total % > 14%

Huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huile d'olive vierge

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 350

≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 %

—

≤ 0,3

—

≤ 0,90

≤ 0,15

—

≤ 1,0 si % acide palmitique total > 14%

Huile de grignons d'olive brute

—

> 350 (4)

≤ 1,4

—

≤ 0,6

—

Huile de grignons d'olive raffinée

—

≤ 0,3

≤ 5

> 350

≤ 1,4

—

≤ 0,5

—

≤ 2,00

≤ 0,20

—

Huile de grignons d'olive

≤ 1,0

≤ 15

> 350

≤ 1,2

—

≤ 0,5

—

≤ 1,70

≤ 0,18

—

(1) Somme des isomères qui pourraient (ou pas) être séparés par colonne capillaire.

(2) Ou lorsque la médiane du défaut est inférieure ou égale à 3,5 et la médiane du fruité est égale à 0.

(3) Les huiles ayant une teneur en cires comprise entre 300mg/kg and 350 mg/kg sont considérées comme des huiles d'olive lampantes si leur teneur totale en alcools aliphatiques est inférieure ou égale à 350 mg/kg, ou si leur teneur en érythrodiol et en uvaol est inférieure ou égale à 3,5 %.

(4) Les huiles ayant une teneur en cires comprise entre 300mg/kg et 350 mg/kg sont considérées comme des huiles de grignons d'olive brutes si leur teneur totale en alcools aliphatiques est supérieure à 350 mg/kg et si leur teneur en érythrodiol et en uvaol est supérieure à 3,5 %.

(5) K 270 si le solvant est du cyclohexane, K 268 si le solvant est de l'iso-octane.

▼B

ANNEXE X «A»

ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS

1. DOMAINE D'APPLICATION

La présente méthode donne des directives générales pour la détermination par chromatographie en phase gazeuse de la composition qualitative et quantitative d'un mélange d'esters méthyliques d'acides gras obtenu selon la méthode visée à l'annexe X B.

La méthode n'est pas applicable aux acides gras polymérisés.

2. RÉACTIFS

2.1. Gaz vecteur

Gaz inerte (azote, hélium, argon, hydrogène, etc.) soigneusement desséché et contenant moins de 10 milligrammes par kilogramme d'oxygène.

Note 1:

L'hydrogène que l'on utilise comme gaz vecteur uniquement avec les colonnes capillaires permet de doubler la vitesse d'analyse mais présente des dangers. Il existe cependant des dispositifs de sécurité.

2.2. Gaz auxiliaires

2.2.1.

Hydrogène (de pureté ≥ 99,9 %), ne contenant pas d'impuretés organiques.

2.2.2.

Air ou oxygène ne contenant pas d'impuretés organiques.

2.3. Produits d'étalonnage

Mélange d'esters méthyliques d'acides gras purs, ou esters méthyliques d'un corps gras, de composition connue, si possible voisine de celle du corps gras à analyser.

Prendre toutes précautions afin d'éviter l'oxydation des acides gras polyinsaturés.

3. APPAREILLAGE

Les prescriptions fournies concernent les appareils usuels de chromatographie en phase gazeuse utilisant des colonnes remplies et/ou capillaires et un détecteur à ionisation de flamme. Tout appareillage ayant la même efficacité et la même résolution que celles définies au point 5.1.2 convient.

3.1. Appareil de chromatographie en phase gazeuse

L'appareil de chromatographie en phase gazeuse doit comprendre les éléments suivants.

3.1.1. Dispositif d'injection

Utiliser un dispositif d'injection:

a) soit avec des colonnes remplies, le dispositif ayant le plus faible volume mort possible (dans ce cas, il doit pouvoir être porté à une température supérieure, de 20° C à 50° C, à celle de la colonne);

b) soit avec des colonnes capillaires, auquel cas le dispositif doit être spécialement conçu pour l'utilisation de telles colonnes. Il peut être du type diviseur ou du type à injection totale en tête de colonne refroidie (injecteur «non column»).

Note 2:

En l'absence de corps gras contenant des acides gras à moins de 16 atomes de carbone, un injecteur à aiguille mobile peut être utilisé.

3.1.2. Four

Le four doit être en mesure de porter la colonne à une température d'au moins 260° C et de maintenir la température choisie à 1° C près avec une colonne remplie et à 0,1° C près avec une colonne capillaire. Cette dernière caractéristique est particulièrement importante lorsqu'on utilise un tube en silice fondue.

L'utilisation d'un appareil équipé d'un programmateur de température est recommandée dans tous les cas et, en particulier, en présence d'acides gras à moins de 16 atomes de carbone.

3.1.3. Colonne remplie

3.1.3.1.

Colonne, en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser: verre ou, à défaut, acier inoxydable, ayant les dimensions suivantes:

a) longueur: de 1 à 3 mètres. Une colonne relativement courte sera utilisée dans le cas où des acides gras à longue chaîne (> C20) sont présents. Dans le cas de la détermination des acides en C4 et en C6, il est recommandé d'utiliser une colonne de 2 m;

b) diamètre intérieur: de 2 à 4 millimètres.

Note 3:

Si des constituants polyinsaturés à plus de trois doubles liaisons sont présents, une colonne en acier inoxydable peut provoquer leur décomposition.

Note 4:

Un système à double colonne remplie peut être utilisé.

3.1.3.2.

Remplissage, comprenant les éléments suivants:

a) support: terre de diatomées lavée aux acides et silanisée, ou tout autre support inerte pouvant convenir, avec un étroit intervalle de granulométrie (25 micromètres entre 125 et 200 micromètres), la dimension moyenne étant liée au diamètre intérieur et à la longueur de la colonne;

b) phase stationnaire: phase polaire de type polyester (par exemple polysuccinate de diéthylèneglycol, polysuccinate de butanediol, polyadipate d'éthylèneglycol, etc.), cyanosilicones ou toute autre phase permettant la séparation chromatographique (voir article 5). Le taux d'imprégnation sera compris entre 5 % (m/m) et 20 % (m/m). Pour certaines séparations, des phases apolaires pourront être utilisées.

3.1.3.3.

Conditionnement de la colonne

Après avoir déconnecté la colonne du côté du détecteur, porter progressivement le four à 185° C et maintenir la colonne venant d'être préparée sous un courant de gaz inerte de 20 à 60 millilitres par minute durant au moins 16 heures à cette température, puis durant 2 heures à 195° C.

3.1.4. Colonne capillaire

3.1.4.1.

Tube en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser, généralement en verre ou en silice fondue. Le diamètre interne doit être compris entre 0,2 et 0,8 millimètre. Intérieurement, il devra subir des traitements appropriés (préparation de l'état de surface, inactivation) avant de recevoir le film de phase stationnaire. Une longueur de 25 mètres est suffisante dans la plupart des cas.

3.1.4.2.

Phase stationnaire, principalement de type polyglycols [poly(éthylène glycol) 20 000 ], polyesters (polysuccinate de butanediol) ou polysiloxanes polaires (cyanosilicones). Les colonnes greffées, ou réticulées, conviennent.

Note 5:

Toutefois les polysiloxanes polaires risquent de donner des difficultés dans l'identification et la séparation de l'acide linolénique et des acides en C20.

Les épaisseurs de film doivent être faibles: 0,1 à 0,2 micromètre.

3.1.4.3.

Montage et conditionnement de la colonne

Respecter les précautions habituelles de montage des colonnes capillaires, c'est-à-dire la disposition de la colonne dans le four (support), le choix et le montage des joints (étanchéité), le positionnement des extrémités de la colonne dans l'injecteur et le détecteur (réduction des volumes morts). Mettre la colonne sous gaz vecteur [par exemple, 0,3 bar (30 kPa) pour une colonne de 25 mètres de longueur et d'un diamètre intérieur de 0,3 millimètre].

Conditionner la colonne par programmation de la température du four à 3° C par minute depuis la température ambiante jusqu'à une température inférieure à 10° C à la limite de décomposition de la phase stationnaire. Maintenir à cette température 1 heure, jusqu'à stabilisation de la ligne de base. Revenir à 180° C pour travailler dans des conditions isothermes.

Note 6:

Des colonnes préconditionnées adéquates sont disponibles commercialement.

3.1.5.

Détecteur, de préférence capable d'être porté à une température supérieure à celle de la colonne.

3.2. Seringue

La seringue doit avoir une capacité de 10 ►C1 microlitres au maximum et être graduée en 0,1 microlitres ◄ .

3.3. Enregistreur

Lorsque la courbe enregistrée est utilisée pour calculer la composition du mélange analysé, l'enregistreur doit être un appareil électronique de grande précision, compatible avec l'appareillage utilisé, et ayant les caractéristiques suivantes:

a) vitesse de réponse inférieure à 1,5 seconde, de préférence 1 seconde (la vitesse de réponse est le temps nécessaire pour que la plume de l'enregistreur aille de 0 à 90 % lors de l'introduction soudaine d'un signal de 100 %);

b) largeur du papier, 20 centimètres au minimum;

c) vitesse de déroulement du papier, réglable à des valeurs comprises entre 0,4 et 2,5 centimètres par minute.

3.4. Intégrateur ou calculateur (facultatif)

L'emploi d'un intégrateur électronique ou d'un calculateur permet un calcul rapide et précis. Celui-ci doit fournir une réponse linéaire, avoir une sensibilité suffisante, et la correction de la déviation de la ligne de base doit être satisfaisante.

4. MODE OPÉRATOIRE

Les détails opératoires donnés en 4.1 à 4.3 concernent l'emploi d'un détecteur à ionisation de flamme.

En variante, un appareil de chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à conductibilité thermique (catharomètre) peut être utilisé. Les conditions opératoires doivent alors être modifiées comme décrit à l'article 6.

4.1. Conditions d'essai

4.1.1.

Choix des conditions optimales de travail

4.1.1.1.

Sur colonne remplie

Pour choisir les conditions de travail, il y a lieu de tenir compte des variables suivantes:

a) la longueur et le diamètre de la colonne;

b) la nature et la quantité de la phase stationnaire;

c) la température de la colonne;

d) le débit du gaz vecteur;

e) la résolution souhaitée;

f) l'importance de la prise d'essai, choisie de façon telle que l'ensemble détecteur-électromètre fournisse une réponse linéaire;

g) la durée de l'analyse.

En général, les valeurs données dans le tableau 1 et le tableau 2 seront celles donnant les résultats désirés, à savoir un nombre de plateaux théoriques, au moins égal à 2 000 par mètre de colonne pour le stéarate de méthyle, et élution de celui-ci en 15 minutes environ.

Lorsque l'appareil le permet, l'injecteur devrait être à une température voisine de 200° C, et le détecteur à une température égale ou supérieure à celle de la colonne.

En général, le rapport du débit d'hydrogène du détecteur à ionisation de flamme à celui du gaz vecteur, varie de 1:2 à 1:1, selon le diamètre de la colonne. Le débit d'oxygène est d'environ 5 à 10 fois celui de l'hydrogène.

Tableau 1

Diamètre intérieur de la colonne (en mm)	Vitesse du gaz vecteur (en ml/min)
2	15 à 25
3	20 à 40
4	40 à 60

Tableau 2

Concentration de la phase stationnaire [en % (m/m)]	Température de la colonne (en °C)
5	175
10	180
15	185
20	185

4.1.1.2.

Sur colonne capillaire

Les caractéristiques d'efficacité et de perméabilité des colonnes capillaires font que la séparation entre constituants et la durée de l'analyse sont très dépendantes du débit de gaz vecteur dans la colonne. Il y aura nécessité, en jouant sur ce paramètre (ou plus simplement sur la perte de charge en tête de colonne), d'optimiser les conditions opératoires selon que l'on recherche, soit à améliorer les séparations, soit à faire de l'analyse rapide.

4.1.2.

Détermination du nombre de plateaux théoriques (efficacité) et de la résolution

(Voir figure 1)

Effectuer l'analyse d'un mélange de stéarate et d'oléate de méthyle en proportions sensiblement équivalentes (par exemple, esters méthyliques de beurre de cacao).

Choisir l'importance de la prise d'essai, la température de la colonne et le débit du gaz vecteur, de façon que le maximum du pic du stéarate de méthyle soit enregistré environ 15 minutes après le pic du solvant, et que ce pic corresponde à environ les trois quarts de l'échelle totale.

Calculer le nombre de plateaux théoriques, n, à l'aide de la formule

et la résolution R, par la formule

où:

dr(I) : distance de rétention, en millimètres, mesurée à partir du début du chromatogramme jusqu'au maximum du pic du stéarate de méthyle;

w(I) et w(II) : largeurs, en millimètres, des pics du stéarate et de l'oléate de méthyle, mesurées entre les points d'intersection avec la ligne de base des tangentes aux points d'inflexion de la courbe;

Δ : distance, en millimètres, entre les maxima relatifs des pics du stéarate et de l'oléate de méthyle;

▼M2

et l'indice de résolution Ir, par la formule

où:

a = la hauteur du pic le plus petit, mesurée par rapport à la ligne de base,

b = la hauteur du point le plus bas du val compris entre les deux pics adjacents, mesurée par rapport à la ligne de base.

▼B

Figure 1 Chromatogramme pour la détermination du nombre de plateaux théoriques (efficacité) et de la résolution.

Les conditions opératoires sont celles donnant un nombre de plateaux théoriques pour le stéarate de méthyle, au moins égal à 2 000 par mètre de colonne, et une résolution d'au moins 1.25.

4.2. Prise d'essai

À l'aide de la seringue (4.2), prélever de 0,1 à 2 microlitres de la solution d'esters méthyliques obtenue selon la méthode visée à l'annexe X «B» et les injecter dans la colonne.

Dans le cas des esters exempts de solvants, préparer une solution à 100 milligrammes par millilitre environ dans de l'heptane pour chromatographie en phase gazeuse et injecter 0,1 à 1 microlitre de cette solution.

Pour la recherche de constituants présents à l'état de traces, cette prise d'essai pourra être augmentée (jusqu'à dix fois).

4.3. Analyse

Dans les cas usuels, opérer dans les conditions décrites en 5.1.1.

Toutefois, il est possible d'opérer avec une température de colonne plus basse, dans le cas où il est nécessaire de doser des acides gras dont le nombre d'atomes de carbone est inférieur à 12, ou plus élevée, dans le cas où il est nécessaire de doser des acides gras dont le nombre d'atomes de carbone est supérieur à 20.

Éventuellement, il est possible d'opérer en température programmée dans les deux cas. Par exemple, si l'échantillon contient des esters méthyliques d'acides gras à moins de 12 atomes de carbone, injecter l'échantillon à 100° C (ou à 50-60° C si l'acide butyrique est présent) et programmer immédiatement à un débit de 4 à 8° C par minute jusqu'à la température optimale. Dans certains cas les deux procédés peuvent être combinés.

Après la période de programmation de température, continuer l'élution en température isotherme jusqu'à élution de tous les constituants. Si l'appareil ne peut pas travailler en température programmée, opérer à deux températures fixées entre 100 et 195° C.

Si nécessaire, il est recommandé de faire une analyse sur deux phases fixes de polarités différentes pour vérifier l'absence de pics masqués, par exemple dans le cas de la présence simultanée de C18:3 et C20:0 ou de C18:3 et C18:2 conjugués.

4.4. Préparation du chromatogramme de référence et des courbes de référence

Analyser le mélange témoin (voir point 2.3), dans les conditions opératoires identiques à celles de l'essai, et déterminer les temps de rétention ou les distances de rétention pour les acides gras constitutifs. Tracer sur papier semi-logarithmique pour chaque taux d'insaturation, les courbes donnant le logarithme du temps de rétention ou de la distance de rétention en fonction du nombre d'atomes de carbone; dans des conditions isothermes et pour des esters à chaîne droite et un taux d'insaturation fixé, ces courbes doivent être des droites. Ces droites doivent être pratiquement parallèles.

Éviter les conditions opératoires favorisant l'existence de «pics masqués», c'est-à-dire que deux constituants ne puissent être distingués par suite d'une résolution insuffisante.

5. EXPRESSION DES RÉSULTATS

5.1. Analyse qualitative

Pour l'essai, identifier les pics du méthyl ester en se reportant aux courbes préparées au point 4.4 au besoin en interpolant.

5.2. Analyse quantitative

5.2.1. Détermination de la composition

Utiliser la méthode de normalisation interne (sauf exceptions), c'est-à-dire admettre que la totalité des constituants présents dans l'échantillon est représentée sur le chromatogramme, donc que la somme des aires des pics représente 100 % des constituants (élution totale).

Si l'appareillage comporte un intégrateur, utiliser les chiffres fournis par celui-ci. Dans le cas contraire, déterminer l'aire de chaque pic en multipliant la hauteur du pic par sa largeur à mi-hauteur, en tenant compte des diverses atténuations éventuellement utilisées au cours de l'enregistrement.

5.2.2. Mode de calcul

5.2.2.1.

Cas général

Calculer la teneur en un constituant donné, exprimée en pourcentage en masse, des esters méthyliques, en déterminant le pourcentage représenté par le rapport de l'aire du pic correspondant à la somme des aires de la totalité des pics, à l'aide de la formule:

où:

Ai : aire du pic correspondant au composé i;

A : somme des aires de la totalité des pics.

Donner le résultat avec une décimale.

Note 7:

Dans ce cas général, le résultat du calcul basé sur les aires relatives est considéré représenter un pourcentage en masse. Dans le cas où cette hypothèse n'est pas permise, voir le point 5.2.2.2.

5.2.2.2.

Cas de l'emploi des facteurs de correction

Dans certains cas, par exemple en présence d'acides gras dont le nombre d'atomes de carbone est inférieur à 8 ou d'acides à fonctions secondaires, lors de l'emploi de détecteurs à conductivité thermique, ou si le plus grand degré de précision est spécialement demandé, il y a lieu de faire intervenir des facteurs de correction pour convertir les pourcentages des aires des pics en pourcentages en masse des constituants.

Déterminer les facteurs de correction à l'aide d'un chromatogramme obtenu à partir d'un mélange témoin d'esters méthyliques de composition exactement connue dans des conditions identiques à celles de l'essai.

Pour ce mélange témoin, le pourcentage en masse du composé i est donné par la formule:

où:

mi : masse du composé i dans le mélange témoin.

m : somme des masses des divers constituants du mélange témoin.

À partir du chromatogramme du mélange témoin (4.4), calculer le pourcentage (aire/aire) du composé i comme suit:

où:

Ai : aire du pic correspondant au composé i;

A : somme des aires de la totalité des pics.

D'où, le facteur de correction:

Habituellement, les facteurs de correction sont exprimés par rapport à KC16 et les facteurs relatifs deviennent:

Pour l'échantillon, la teneur en chaque composé i, exprimée en pourcentage en masse des esters méthyliques, est:

Donner le résultat avec une décimale.

5.2.2.3.

Cas de l'emploi d'un étalon interne

Dans certaines analyses (par exemple, lorsque tous les acides gras ne sont pas quantifiés, et que des acides en C4 et en C6 sont présents à côté d'acides en C16 et en C18, ou bien lorsqu'il est nécessaire de déterminer la quantité absolue d'acides gras dans un échantillon), il est nécessaire d'utiliser un étalon interne. Des acides gras en C5, C15 ou C17 sont utilisés fréquemment. Le facteur de correction de l'étalon interne doit être déterminé (s'il y a lieu).

Le pourcentage en masse du composé i, exprimé en esters méthyliques, est par suite donné par la formule:

où:

Ai : surface du pic correspondant au constituant i;

As : surface du pic correspondant à l'étalon interne;

K′i : facteur de correction du compose i (relatif à KC16);

K′s : facteur de correction de l'étalon interne (relatif à KC16);

m : masse, en milligrammes, de l'échantillon;

ms : masse, en milligrammes, de l'étalon interne.

Donner le résultat avec une décimale.

▼M2

6. CAS PARTICULIER DE LA DÉTERMINATION DES ISOMÈRES «TRANS»

Il est possible de déterminer le contenu des isomères «trans» des acides gras avec un nombre d'atomes de carbone compris entre 10 et 24, par séparation des esters méthyliques, en utilisant des colonnes chromatographiques capillaires présentant une polarité particulière.

6.1.	Colonne capillaire en silice d'un diamètre interne de 0,25 à 0,32 millimètre et d'une longueur de 50 mètres, recouverte de cyanopropysilicone, l'épaisseur du film étant comprise entre 0,1 et 0,3 micromètre (type SP 2340, type SP 2380, C.P. sil 88, Silor 10 et types similaires).

▼M21

6.2.	Les esters méthyliques sont préparés selon le procédé B présenté dans l’autre annexe X B. Les substances grasses ayant une acidité libre supérieure à 3 % doivent être préalablement neutralisées conformément au point 5.1.1 de l’annexe VII.

▼M2

6.3.

Les conditions de travail pour la chromatographie en phase gazeuse sont dans l'ensemble les suivantes:

— température de la colonne programmée de 150 °C à 230 °C (par exemple 165 °C pendant 15 minutes puis augmentation de 5 °C par minute jusqu'à 200 °C),

— température de l'injecteur: 250 °C si on utilise le système d'injecteur diviseur ou la température initiale de la colonne si on emploie le système on column,

— température du détecteur: 260 °C,

— débit du gaz vecteur (hélium et hydrogène): 1,2 millilitre par minute.

La quantité injectée doit être telle que dans les conditions de sensibilité employées la hauteur du pic correspondant à l'ester méthylique de l'acide arachidique soit égale ou supérieure à 20 % du bas de l'échelle.

6.4.

L'identification des divers esters méthyliques s'effectue sur la base des temps de rétention qui sont comparés à ceux de mélanges de référence. (Comme indiqué au point 2.3).

Les esters des acides gras «trans» sont élués avant les isomères correspondants «cis». Un exemple de chromatogramme est présenté dans la figure 2.

Figure 2 Chromatographie type en phase gazeuse relative à la détermination des isomères trans des acides gras avec colonne capillaire

6.5.	L'efficacité de la colonne déterminée selon le point 4.1.2 doit permettre une séparation de certains couples critiques, par exemple le couple formé par le massif des acides transoléiques et le pic de l'acide oléique, trans C 18: 1/ «cis» C 18: 1, avec un indice de résolution supérieur à 2.

6.6.

Le pourcentage des divers acides gras «trans» est calculé sur la base du rapport entre la surface du pic y afférent et la somme des surfaces de tous les pics présents.

Sont pris en considération les pourcentages des acides:

— «trans» octadécénoïques (T 18: 1), indiqués à l'annexe I du présent règlement comme somme des isomères transoléiques,

— «cis-trans» et «trans-cis» octadécadiénoïques [(CT/TC) 18: 2] indiqués à l'annexe I du présent règlement comme somme des isomères translinoléiques,

— «trans-cis-trans», «cis-cis-trans», «cis-trans-cis», «trans-cis-cis», octadécatriénoïques [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], indiqués à l'annexe I du présent règlement comme somme des isomères translinoléniques.

Note 8:

Compte tenu des caractéristiques particulières de cette méthode, donner les résultats avec deux décimales.

▼B

7. CAS PARTICULIER DE L'UTILISATION D'UN DÉTECTEUR À CONDUCTIBILITÉ THERMIQUE (CATHAROMÈTRE)

Un appareil de chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à conductibilité thermique (catharomètre), peut être utilisé également pour la détermination de la composition qualitative et quantitative d'un mélange d'esters méthyliques d'acides gras. Dans ce cas, les conditions spécifiées aux points 3 et 4, doivent être modifiées comme indiqué dans le tableau 3.

Pour l'analyse quantitative, utiliser les facteurs de correction définis en 5.2.2.2.

Tableau 3

Variable	Valeur/condition
Colonne	Longueur: 2 à 4 m diamètre intérieur: 4 mm
Support	Granulométrie entre 160 et 200 μm
Taux d'imprégnation de la phase stationnaire	15 à 25 % (m/m)
Gaz vecteur	Hélium, ou à défaut hydrogène, à teneur aussi faible que possible en oxygène
Gaz auxiliaires	Néant
Température de l'injecteur	De 40 à 60 °C supérieure à celle de la colonne
Température de la colonne	180 à 200 °C
Débit du gaz vecteur	Généralement compris entre 60 et 80 ml/min
Quantités injectées	Généralement comprises entre 0,5 et 2 μl

8. RAPPORT D'ESSAI

Le rapport d'essai doit indiquer les méthodes utilisées pour la préparation des esters méthyliques et pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse, ainsi que les résultats obtenus. Il doit, en outre, mentionner tous les détails opératoires non prévus dans la présente norme internationale, ou facultatifs, ainsi que les incidents éventuels susceptibles d'avoir agi sur les résultats.

Le rapport d'essai doit donner tous les renseignements nécessaires à l'identification complète de l'échantillon.

▼M19

ANNEXE X «B»

PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS DE L'HUILE D'OLIVE ET DE L'HUILE DE GRIGNONS D'OLIVE

Les deux méthodes suivantes sont recommandées pour la préparation des esters méthyliques d'acides gras des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive.

Méthode A : Transestérification à froid au moyen d'une solution méthanolique d'hydroxyde de potassium.

Méthode B : Méthylation à chaud au moyen d'une solution méthanolique de méthylate de sodium suivie d'une estérification en milieu acide.

Le choix entre l'une ou l'autre méthode dépendra du paramètre analytique à déterminer et de la catégorie de l'huile, comme indiqué ci-après:

a) détermination de la différence entre la teneur réelle et la teneur théorique des triglycérides à ECN42 (ΔECN42):

— la méthode A sera appliquée aux échantillons des huiles de toutes les catégories après purification de l'huile par passage sur une colonne de gel de silice.

b) détermination de la composition en acides gras:

— la méthode A sera appliquée directement aux échantillons d'huiles des catégories suivantes:

—

— huiles d'olive vierges avec une acidité libre inférieure à 3,3 %,

— huile d'olive raffinée,

— huile d'olive (coupage d'huiles d'olive vierges et d'huile d'olive raffinée),

— huile de grignons d'olive raffinée,

— huile de grignons d'olive (coupage d'huiles d'olive vierges et d'huile de grignons d'olive raffinée),

— la méthode B sera appliquée directement aux échantillons d'huiles des catégories suivantes:

—

— huile d'olive vierge avec une acidité libre supérieure à 3,3 %,

— huile de grignons d'olive brute;

c) détermination des acides gras des isomères trans

— la méthode A sera appliquée directement aux échantillons d'huiles des catégories suivantes:

—

— huiles d'olive vierges avec une acidité libre inférieure à 3,3 %,

— huile d'olive raffinée,

— huile d'olive (coupage d'huiles d'olive vierges et d'huile d'olive raffinée),

— huile de grignons d'olive raffinée,

— huile de grignons d'olive (coupage d'huiles d'olive vierges et d'huile de grignons d'olive raffinée),

— la méthode A sera appliquée aux échantillons d'huiles des catégories suivantes après purification de l'huile par passage sur une colonne de gel de silice:

—

— Huile d'olive vierge avec une acidité libre supérieure à 3,3 %.

— Huile de grignons d'olive brute.

PURIFICATION DES ÉCHANTILLONS D'HUILE

Si nécessaire, les échantillons seront purifiés par passage de l'huile sur une colonne de gel de silice, en utilisant comme solvant d'élution de l'hexane/oxyde diéthylique (87:13, v/v) comme décrit dans la méthode IUPAC 2.507.

Comme procédure alternative, il est possible d'avoir recours à l'extraction en phase solide en utilisant des cartouches de gel de silice. Placer une cartouche de gel de silice (1 g, 6 ml) dans un appareil d'élution à vide et laver avec 6 ml d'hexane. Cesser d'appliquer le vide pour éviter que la colonne ne sèche. Introduire ensuite dans la colonne une solution d'huile (environ 0,12 g) dans 0,5 ml d'hexane et appliquer le vide pour que la solution s'introduise dans la silice, puis éluer avec 10 ml d'hexane/oxyde diéthylique (87:13 v/v) sous vide. Homogénéiser la totalité des éluats et diviser en deux volumes similaires. Faire évaporer un des volumes jusqu'à dessiccation dans un évaporateur rotatif sous pression réduite et à température ambiante. Dissoudre le résidu dans 1 ml d'heptane. La solution obtenue est prête pour l'analyse des acides gras par CPG. Faire évaporer le second volume et dissoudre le résidu dans 1 ml d'acétone pour l'analyse des triglycérides par HPCL si nécessaire.

MÉTHODES POUR LA PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS

1. Méthode A: Transestérification à froid au moyen d'une solution méthanolique d'hydroxyde de potassium

1.1. Application

Cette méthode rapide est applicable aux huiles d'olive et aux huiles de grignons d'olive ayant une teneur en acides gras libres inférieure à 3,3 %. Les acides gras libres ne sont pas estérifiés par l'hydroxyde de potassium. Les esters éthyliques d'acides gras se transestérifient plus lentement que les esters glycéridiques et il est possible qu'ils ne se méthylent que partiellement.

1.2. Principe

Les esters méthyliques se forment par transestérification dans une solution méthanolique d'hydroxyde de potassium comme phase intermédiaire avant la saponification (point 5 de la méthode ISO 5509:2000, point 5 de la méthode IUPAC 2.301).

1.3. Réactifs

Méthanol ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) d'eau

Heptane pour chromatographie

Hydroxyde de potassium, solution méthanolique d'environ 2 N: dissoudre 11,2 g d'hydroxyde de potassium dans 100 ml de méthanol.

1.4. Matériel

Éprouvettes à bouchon vissant (de 5 ml de capacité) avec un bouchon muni d'un joint de PTFE.

Pipettes graduées ou automatiques de 2 ml et 0,2 ml.

1.5. Mode opératoire

Dans une éprouvette à bouchon vissant de 5 ml, peser environ 0,1 g de l'échantillon d'huile. Ajouter 2 ml d'heptane et agiter. Ajouter 0,2 ml de la solution méthanolique 2 N d'hydroxyde de potassium, boucher à l'aide du bouchon muni d'un joint en PTFE, bien fermer et agiter énergiquement pendant 30 secondes. Laisser reposer jusqu'à ce que la partie supérieure de la solution devienne claire. Décanter la couche supérieure, qui est celle qui contient les esters méthyliques. La solution d'heptane est prête pour l'injection dans le chromatographe. Il est conseillé de maintenir la solution au réfrigérateur jusqu'au moment de l'analyse chromatographique. Il n'est pas recommandé de stocker la solution pendant plus de 12 heures.

2. Méthode B: Méthylation à chaud au moyen d'une solution méthanolique de méthylate de sodium suivie d'une estérification en milieu acide

2.1. Application

Cette méthode est applicable aux huiles d'olive et aux huiles de grignons d'olive ayant une teneur en acides gras libres supérieure à 3,3 %.

2.2. Principe

Neutralisation des acides gras libres et méthanolyse alcaline des glycérides, suivie d'une estérification des acides gras en milieu acide (point 4.2 de la méthode IUPAC no 2.301).

2.3. Réactifs

— Heptane pour chromatographie.

— Méthanol ne contenant pas plus de 0,05 % d'eau (m/m).

— Méthylate de sodium, solution méthanolique 0,2 N: dissoudre 5 g de sodium dans 1 000 ml de méthanol (peut être préparé à partir de solutions commerciales).

— Phénolphtaléine, 0,2 % solution méthanolique.

— Acide sulfurique, dans la solution méthanolique 1 N: ajouter 3 ml d'acide sulfurique à 96 % à 100 ml de méthanol.

— Solution saturée de chlorure de sodium dans l'eau.

2.4. Matériel

— Ballon volumétrique de 50 ml de capacité, à fond plat et à col rodé long et étroit

— Réfrigérant à reflux. Réfrigérant à air (de 1 m de long) muni d'un joint rodé

— Régularisateur d'ébullition

— Entonnoir en verre.

2.5. Mode opératoire

Verser 0,25 g de l'échantillon d'huile dans un ballon volumétrique muni d'un col rodé de 50 ml. À l'aide de l'entonnoir, ajouter 10 ml de la solution méthanolique 0,2 N de méthylate de sodium et le régularisateur d'ébullition. Adapter le réfrigérant à reflux, agiter et porter à ébullition. La solution doit devenir limpide au bout d'environ 10 minutes. La réaction est pratiquement terminée après 15 minutes. Retirer le ballon de la source de chaleur, attendre l'arrêt du reflux, retirer le réfrigérant et ajouter deux gouttes de la solution de phénolphtaléine. Ajouter quelques ml d'acide sulfurique 1 N dans la solution méthanolique jusqu'à ce qu'elle devienne incolore, puis ajouter encore 1 ml en excès. Brancher le réfrigérant et porter de nouveau à ébullition pendant environ 20 minutes. Retirer le ballon de la source de chaleur et le refroidir sous un courant d'eau. Retirer le réfrigérant, ajouter 20 ml de la solution saturée de chlorure de sodium et agiter. Ajouter 5 ml d'heptane, boucher le ballon et agiter énergiquement pendant 15 secondes.

Laisser décanter jusqu'à séparation complète des deux phases. Ajouter de nouveau une partie de la solution saturée de chlorure de sodium jusqu'à ce que la phase aqueuse atteigne la partie inférieure du col du ballon. La couche supérieure qui se trouve dans le col du ballon est celle qui contient les esters méthyliques. La solution obtenue est prête pour l'injection dans le chromatographe en phase gazeuse.

Précaution: La méthylation avec la méthode B doit être réalisée sous hotte ventilée.

2.6. Alternatives à la méthylation selon la méthode B

2.6.1. Méthode C

2.6.1.1. Principe

La matière grasse soumise à l'analyse est traitée avec une solution méthanolique d'acide chlorhydrique dans une ampoule fermée, à 100 °C

2.6.1.2. Matériel

— Ampoule de verre épais d'une capacité d'environ 5 ml (hauteur 40 à 45 mm, diamètre 14 à 16 mm).

— Pipettes graduées de 1 et 2 ml.

2.6.1.3. Réactifs

Solution d'acide chlorhydrique dans 2 % de méthanol, préparée à partir d'acide chlorhydrique gazeux et de méthanol anhydre (note 1).

Hexane pour chromatographie

Il est possible d'employer des solutions commerciales de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. En laboratoire, il est facile de préparer de petites quantités d'acide chlorhydrique gazeux en modifiant la solution commerciale (p = 1,18), par l'ajout de quelques gouttes d'acide sulfurique concentré. Le méthanol étant très avide de gaz chlorhydrique, il est bon de prendre toutes les précautions d'usage pour la dissolution (par exemple introduire le gaz à l'aide d'un petit entonnoir renversé qui arrive juste à affleurement du niveau du méthanol). Il est possible de préparer à l'avance des quantités importantes de solutions méthanoliques d'acide chlorhydrique qui se conservent parfaitement à l'obscurité dans des flacons munis de bouchons de verre. Ce réactif peut également être préparé en dissolvant du chlorure d'acétyle dans le méthanol anhydre.

2.6.1.4. Mode opératoire

— Verser dans l'ampoule de verre 0,2 g de la matière grasse préalablement séchée au sulfate de sodium et filtrée, puis 2 ml de la solution méthanolique d'acide chlorhydrique. Fermer l'ampoule.

— Submerger l'ampoule à 100 °C pendant 40 minutes.

— Faire refroidir l'ampoule sous un courant d'eau, l'ouvrir et ajouter 2 ml d'eau distillée et 1 ml d'hexane.

— Centrifuger et extraire la phase d'hexane, prête à l'emploi.

2.6.2. Méthode D

2.6.2.1. Principe

La matière grasse analysée est chauffée à reflux avec du méthanol, de l'hexane et de l'acide sulfurique. Les esters méthyliques obtenus sont extraits à l'éther de pétrole.

2.6.2.2. Matériel

— Tube à essai d'environ 20 ml de capacité avec réfrigérant à reflux d'air d'environ 1 m de long, muni d'un joint rodé.

— Pipette graduée de 5 ml.

— Entonnoir à décantation de 50 ml.

— Éprouvettes de 10 ml et 25 ml.

— Tube à essai à fond conique de 15 ml.

2.6.2.3. Réactifs

— Réactif de méthylation: méthanol anhydre, hexane et acide sulfurique concentré (p = 1,84 dans la proportion suivante: 75:25:1 (V/V/V).

— Éther de pétrole 40-60 °C.

— Sulfate de sodium anhydre.

2.6.2.4. Mode opératoire

Introduire dans le tube de 20 ml, 0,1 g d'huile et ajouter 5 ml du réactif de méthylation.

Adapter le réfrigérant à reflux et chauffer au bain-marie à ébullition pendant 30 minutes (note 2).

Transférer quantitativement le mélange dans un entonnoir à décantation de 50 ml avec 10 ml d'eau distillée et 10 ml d'éther de pétrole. Agiter vigoureusement et attendre que se produise la séparation des phases. Séparer la phase aqueuse et laver deux fois la couche éthérée avec 20 ml d'eau distillée. Ajouter dans l'entonnoir à décantation une petite quantité de sulfate de sodium anhydre, agiter, laisser reposer quelques minutes et filtrer, en recueillant le filtrat dans un tube à fond conique de 15 ml.

Évaporer le solvant au bain-marie dans un courant d'azote.

Pour contrôler l'ébullition, introduire une baguette de verre dans le tube et limiter la température du bain-marie à 90 °C.

3. Paramètres de précision

L'évaluation statistique de la précision des méthodes A et B a été publiée par le Conseil Oléicole International dans sa méthode COI/T.20/DOC. no 24.

RECOMMANDATIONS POUR L'ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE DES ESTERS D'ACIDES GRAS DE L'HUILE D'OLIVE ET DE L'HUILE DE GRIGNONS D'OLIVE

1. Mode opératoire

L'analyse par chromatographie en phase gazeuse de solutions d'esters gras dans l'hexane sera réalisée conformément à la norme ISO 5508, au moyen d'une colonne capillaire (50 m de long × 0,25 ou 0,32 mm de diamètre interne) recouverte de cyanopropylsilicone, tel qu'indiqué pour la détermination des acides gras isomères trans (COI/T.20/Doc. no 17).

La Figure 1 présente le profil chromatographique typique d'une huile de grignons d'olive contenant des esters méthyliques et éthyliques d'acides gras et des isomères trans d'esters méthyliques.

2. Calculs

2.1.

Pour calculer la composition en acides gras et le ΔECN42, les acides gras suivants doivent être pris en compte:

Myristique (C14:0)

Palmitique (C16:0). Somme des aires des pics correspondant aux esters méthyliques et éthyliques.

Palmitoléique (C16:1). Somme des aires des pics correspondant aux isomères ω9 et ω7 de l'ester méthylique.

Heptadécanoïque (C17:0).

Heptadécénoïque (C17:1).

Stéarique (C18:0).

Oléique (C18:1). Somme des aires des pics correspondant aux isomères ω9 et ω7 de l'ester méthylique, de l'ester éthylique et des isomères trans de l'ester méthylique.

Linoléique (C18:2). Somme des aires des pics correspondant aux esters méthyliques et éthyliques et aux isomères trans de l'ester méthylique.

Arachidique (C20:0).

Linolénique (C18:3). Somme des aires de l'ester méthylique et des isomères trans de l'ester méthylique.

Eïcosénoïque (C20:1)

Béhénique (C22:0)

Lignocérique (C24:0)

Le squalène n'est pas pris en compte pour le calcul de l'aire totale.

2.2.

Pour calculer le pourcentage de trans-C18:1, on utilisera le pic correspondant aux esters méthyliques de cet acide gras. Pour la somme [trans-C18:2 + trans-C18:3], on additionnera tous les pics correspondant aux isomères trans de ces deux acides gras. Pour calculer l'aire totale, on tiendra compte de tous les pics mentionnées en 2.1 (voir COI/T.20/Doc. no 17).

Le calcul du pourcentage de chaque acide gras sera effectué conformément à la formule suivante:

Figure 1: Profil chromatographique d'une huile de grignons d'olive, obtenu avec la méthode de méthylation à froid. Les pics chromatographiques correspondent aux esters méthyliques, sauf indication contraire.

▼B

ANNEXE XI

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN SOLVANTS HALOGÉNÉS VOLATILS DANS L'HUILE D'OLIVE

1. PRINCIPE

Analyse par chromatographie en phase gazeuse selon la technique de l'espace de tête (head space).

2. APPAREILLAGE

2.1.	Appareil de chromatographie en phase gazeuse, équipé d'un détecteur à capture d'électrons (ECD).

2.2.	Appareillage pour espace de tête (head space).

2.3.	Colonne de chromatographie en phase gazeuse en verre de 2 mètres de long et de 2 millimètres de diamètre, phase stationnaire. OV101 à 10 % ou équivalent, imprégnant une terre de diatomée calcinée, lavée aux acides et silanisée, de granulométrie de 80 à 100 Mesh.

2.4.	Gaz vecteur et gaz auxiliaire: azote pour chromatographie en phase gazeuse, adaptée à la détection par capture d'électrons.

2.5.	Flacons en verre de 10 à 15 millimètres munis d'une garniture en téflon et d'un bouchon en aluminium muni d'un office pour prélèvement par seringue.

2.6.	Pinces à fermeture hermétique.

2.7.	Seringue pour gaz de 0,5 à 2 millilitres.

3. RÉACTIFS

Standard: solvants halogénés volatils à un degré de pureté approprié à un usage de chromatographie en phase gazeuse.

4. PROCÉDURE D'ANALYSE

4.1.

Peser exactement environ 3 grammes d'huile dans un flacon en verre (à ne pas réutiliser), boucher le flacon jusqu'à fermeture hermétique. Introduire le flacon dans un thermostat à 70 °C pendant 1 heure. Prélever avec précision au moyen de la seringue un volume de 0,2 à 0,5 millilitre de l'espace de tête. L'injecter dans la colonne de l'appareil de chromatographie en phase gazeuse réglé comme suit:

— température injecteur: 150 °C,

— température colonne: 70 à 80 °C,

— température détecteur: 200 à 250 °C.

4.2.

Solutions de référence. Préparer des solutions standard, en utilisant de l'huile d'olive raffinée sans trace de solvants, à des concentrations variables entre 0,05 et 1 milligramme par kilogramme et en rapport à la teneur présumée de l'échantillon. La dilution éventuelle doit être effectuée avec du pentane.

4.3.

Évaluation quantitative. Faire le rapport entre les surfaces ou les hauteurs des pics de l'échantillon et de la solution standard ayant la concentration présumée le plus proche. Si l'écart relatif est supérieur à 10 %, il est nécessaire de refaire l'analyse par comparaison avec une nouvelle solution standard jusqu'à ce que sa concentration respecte l'écart relatif susmentionné. La teneur est établie sur la base d'une moyenne d'injections élémentaires.

4.4.	Expression des résultats. Les résultats sont exprimés en milligrammes par kilogramme (ppm). La limite de détection de la méthode est de 0,01 milligramme par kilogramme.

▼M22

ANNEXE XII

MÉTHODE DU CONSEIL OLÉICOLE INTERNATIONAL POUR L'ÉVALUATION ORGANOLEPTIQUE DES HUILES D'OLIVE VIERGES

1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION

La présente méthode est fondée sur la décision No DEC-21/95-V/2007 du 16 novembre 2007 relative à la méthode révisée pour l'évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge du Conseil oléicole international. Elle a pour but d'établir la procédure pour évaluer les caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges au sens du point 1 de l'annexe XVI du règlement (CE) no 1234/2007 et d'établir la méthode pour leur classement sur la base de ces caractéristiques. La méthode contient également des indications pour un étiquetage optionnel.

La méthode décrite n'est applicable qu'aux huiles d'olive vierges et à leur classement ou à leur étiquetage en fonction de l'intensité des défauts perçus, du fruité et des autres attributs positifs, déterminée par un groupe de dégustateurs sélectionnés, entraînés et testés, constitués en jury.

2. GÉNÉRALITÉS

Pour le vocabulaire général de base, la salle de dégustation, le verre de dégustation des huiles et toute autre question liée à la présente méthode, il est recommandé de se conformer aux prescriptions prévues par le Conseil oléicole international, en particulier la décision No DEC-21/95-V/2007 du 16 novembre 2007 relative à la méthode révisée pour l'évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge.

3. VOCABULAIRE SPÉCIFIQUE

3.1. Attributs positifs

Fruité :

ensemble des sensations olfactives caractéristiques de l'huile, dépendant de la variété des olives, provenant de fruits sains et frais, verts ou mûrs, perçues par voie directe et/ou rétronasale.

L'attribut fruité est qualifié de vert lorsque les sensations olfactives rappellent celles des fruits verts, caractéristiques de l'huile provenant de fruits verts.

L'attribut fruité est qualifié de mûr lorsque les sensations olfactives rappellent celles des fruits mûrs, caractéristiques de l'huile provenant de fruits verts et mûrs.

Amer : goût élémentaire caractéristique de l'huile obtenue d'olives vertes ou au stade de véraison, perçu par les papilles caliciformes formant le V lingual.

Piquant : sensation tactile de picotement, caractéristique des huiles produites au début de la campagne, principalement à partir d'olives encore vertes pouvant être perçu dans toute la cavité buccale, en particulier dans la gorge.

3.2. Attributs négatifs

Chômé/Lies : flaveur caractéristique de l’huile tirée d’olives entassées ou stockées dans des conditions telles qu'elles se trouvent dans un état avancé de fermentation anaérobie ou de l'huile restée en contact avec les «boues» de décantation, ayant elles aussi subi un processus de fermentation anaérobie, dans les piles et les cuves.

Moisi-humide : flaveur caractéristique de l’huile obtenue d'olives attaquées par des moisissures et des levures par suite d'un stockage des fruits pendant plusieurs jours dans l'humidité.

Vineux-vinaigré/Acide-aigre : flaveur caractéristique de certaines huiles rappelant le vin ou le vinaigre. Elle est due fondamentalement à un processus de fermentation aérobie des olives ou des restes de pâte d'olive dans des scourtins qui n'auraient pas été correctement lavés, qui donne lieu à la formation d'acide acétique, d'acétate d'éthyle et d'éthanol.

Métallique : flaveur qui rappelle les métaux. Elle est caractéristique de l'huile qui est demeurée longtemps en contact avec des surfaces métalliques, au cours des processus de broyage, de malaxage, de pression ou de stockage.

Rance : flaveur des huiles ayant subi un processus d'oxydation intense.

Cuit ou brûlé : flaveur caractéristique des huiles qui tire son origine d'un réchauffement excessif et/ou prolongé au cours de son obtention et tout particulièrement pendant le thermo-malaxage de la pâte, si celui-ci est réalisé dans des conditions thermiques inappropriées.

Foin-bois : flaveur caractéristique de certaines huiles provenant d'olives sèches.

Grossier : sensation bucco-tactile dense et pâteuse produite par certaines vieilles huiles.

Lubrifiants : flaveur de l'huile qui rappelle celle du gazole, de la graisse ou de l'huile minérale.

Margines : flaveur acquise par l'huile à la suite d'un contact prolongé avec les eaux de végétation qui ont subi des processus de fermentation.

Saumure : flaveur de l’huile obtenue d'olives conservées en saumure.

Sparte : flaveur caractéristique de l'huile obtenue d'olives pressées dans des scourtins en sparte neufs. Elle peut être différente selon qu'il s'agit de scourtins fabriqués à partir de sparte vert ou de sparte sec.

Terre : flaveur de l'huile obtenue d'olives ramassées avec de la terre ou boueuses et non lavées.

Ver : flaveur de l'huile issue d'olives ayant subi une forte attaque de larves de la mouche de l'olive (Bactrocera Oleae).

Concombre : flaveur de l'huile caractéristique d'un conditionnement hermétique excessivement prolongé, notamment dans des récipients en fer-blanc, et qui est attribuée à la formation de 2-6 nonadiénal.

Bois humide : flaveur caractéristique d'huiles extraites d'olives ayant fait l'objet d'un processus de congélation sur l'arbre.

3.3. Terminologie optionnelle aux fins de l'étiquetage

Sur demande, le chef du jury peut certifier que les huiles évaluées remplissent les définitions et intervalles correspondant aux expressions et aux adjectifs suivants en fonction de l'intensité et de la perception des attributs:

a) pour chacun des attributs positifs mentionnés au point 3.1 (fruité, le cas échéant qualifié de vert ou de mûr, piquant et amer):

i) le terme «intense» peut être employé lorsque la médiane de l'attribut concerné est supérieure à 6;

ii) le terme «moyen» peut être employé lorsque la médiane de l'attribut concerné est comprise entre 3 et 6;

iii) le terme «léger» peut être employé lorsque la médiane de l'attribut concerné est inférieure à 3;

iv) les attributs concernés peuvent être employés sans référence aux adjectifs mentionnés aux points i), ii) et iii) lorsque la médiane de l'attribut concerné est supérieure ou égale à 3;

b) le terme «équilibré» peut être employé pour une huile qui n'est pas déséquilibrée. On entend par déséquilibre la sensation olfacto-gustative et tactile de l'huile dans laquelle la médiane de l'attribut amer et/ou celle de l'attribut piquant est supérieure de deux points à la médiane de l'attribut fruité;

c) l'expression «huile douce» peut être employée pour une huile dans laquelle la médiane de l'attribut amer et celle de l'attribut piquant sont inférieures ou égales à 2.

4. JURY

Le jury est composé d’un chef de jury et de huit à douze dégustateurs.

Le chef du jury doit avoir reçu une formation solide et être un connaisseur et un expert averti des différents types d’huiles. Il est responsable du jury, de son organisation et de son fonctionnement, de la préparation, de la codification et de la présentation des échantillons aux dégustateurs ainsi que du recueil des données et de leur traitement statistique.

Le chef du jury sélectionne les dégustateurs et veille à leur entraînement et au contrôle de leurs performances, afin d'assurer qu'ils se maintiennent à un niveau d'aptitude adéquat.

Les dégustateurs pour les contrôles organoleptiques d'huile d'olive doivent être choisis et entraînés en fonction de leur habilité à distinguer entre des échantillons similaires, conformément au guide du Conseil oléicole international pour la sélection, l’entraînement et le contrôle des dégustateurs qualifiés d’huiles d'olive vierges.

Les jurys doivent s'engager à participer à des évaluations organoleptiques prévues sur les plans national, communautaire ou international pour le contrôle périodique et l'harmonisation des critères de perception. Par ailleurs, dans le cas des jurys agréés conformément aux dispositions de l'article 4, paragraphe 1, du présent règlement, ils doivent fournir annuellement à l’État membre concerné tous renseignements sur leur composition et le nombre d'évaluations réalisées en tant que jury agréé.

5. PROCÉDURE POUR L'ÉVALUATION ORGANOLEPTIQUE ET LE CLASSEMENT

5.1. Utilisation de la feuille de profil par le dégustateur

La feuille de profil à utiliser par le dégustateur figure à l'appendice A de la présente méthode.

Chaque dégustateur faisant partie du jury doit flairer, puis déguster l'huile soumise à examen. Il doit ensuite porter sur les échelles de 10 cm de la feuille de profil à sa disposition l'intensité à laquelle il perçoit chacun des attributs négatifs et positifs ( 7 ). En cas de perception du caractère vert ou mûr de l'attribut fruité, le dégustateur coche la case correspondante de la feuille de profil.

Au cas où des attributs négatifs non indiqués sur la feuille de profil seraient perçus, ils doivent être portés sous la rubrique «autres», en employant le ou les termes les décrivant avec le plus de précision parmi ceux définis.

5.2. Utilisation des données par le chef de jury

Le chef du jury doit recueillir les feuilles de profil remplies par chacun des dégustateurs; il doit contrôler les intensités assignées aux différents attributs; dans l'hypothèse d'une anomalie constatée, il demandera au dégustateur de réviser sa feuille de profil et, si nécessaire, de répéter l'essai.

Le chef du jury peut saisir les données de chaque dégustateur sur un logiciel informatique conforme à la méthode du calcul statistique de la médiane figurant à l'appendice B. L'insertion des données pour un échantillon est à réaliser à l'aide d'une matrice composée de neuf colonnes correspondant aux neuf attributs sensoriels et de n lignes correspondant aux n dégustateurs du jury.

Lorsqu'un attribut négatif perçu par au moins 50 % du jury est porté sous la rubrique «autres», la médiane de ce défaut sera calculée et l'huile classée en conséquence.

Le chef de jury ne peut certifier que l'huile évaluée remplit les conditions mentionnées au point 3.3.a en ce qui concerne les termes «vert» et «mûr» que lorsqu'au moins 50 % du jury a signalé avoir perçu le caractère vert ou mûr de l'attribut fruité.

Dans le cas des analyses effectuées dans le cadre de contrôles de conformité, un essai est réalisé. Dans le cas d'analyses contradictoires, le chef de jury doit faire procéder à la réalisation de l'analyse en double. Dans le cas d'analyses dirimantes, l'évaluation doit être réalisée en triplicata. Dans ces cas, la médiane des attributs sera calculée à partir de la moyenne des médianes. Tous les réplicats de ces analyses devront être réalisés au cours de séances distinctes.

5.3. Classement des huiles

L'huile est classée dans les catégories ci-dessous, en fonction de la médiane des défauts et de la médiane de l’attribut fruité. La médiane des défauts est définie comme la médiane du défaut perçu avec la plus grande intensité. La médiane des défauts et la médiane du fruité sont exprimées avec une seule décimale, et la valeur du coefficient de variation robuste qui les définit devra être inférieure ou égale à 20 %.

Le classement de l'huile est effectué par comparaison de la valeur de la médiane des défauts et de la médiane du fruité avec les intervalles de référence exposés ci-après. Les limites de ces intervalles ayant été établies en tenant compte de l'erreur de la méthode, elles sont considérées comme absolues. Les logiciels informatiques permettent un classement visualisé sur un tableau des données statistiques ou graphiquement.

a)	Huile d'olive vierge extra : la médiane des défauts est égale à 0 et la médiane du fruité est supérieure à 0;

b)	huile d'olive vierge : la médiane des défauts est supérieure à 0 et inférieure ou égale à 3,5, et la médiane du fruité est supérieure à 0;

c)	huile d'olive lampante : la médiane des défauts est supérieure à 3,5; ou la médiane des défauts est inférieure ou égale à 3,5 et la médiane du fruité est égale à 0.

5.4. Cas particulier

Lorsque la médiane d’un attribut positif autre que le fruité est supérieure à 5,0, le chef de jury le signalera sur le certificat d'analyse de l'huile.

Appendice A

Feuille de profil de l'huile d'olive vierge

Appendice B

MÉTHODE DE CALCUL DE LA MÉDIANE ET DES INTERVALLES DE CONFIANCE

Médiane

La médiane est définie comme le nombre réel Xm caractérisé par le fait que la probabilité (P) que les valeurs de la distribution (X) soient inférieures à ce nombre (Xm) est inférieure ou égale à 0,5 et que, simultanément, la probabilité (P) que les valeurs de la distribution (X) soient inférieures ou égales à Xm est supérieure ou égale à 0,5. Une autre définition considère la médiane comme étant le cinquantième percentile d'une distribution de nombres ordonnés par ordre croissant. En termes plus simples, la médiane représente la valeur centrale d'une série ordonnée de nombres impairs, ou bien la moyenne des deux valeurs centrales d'une série ordonnée de nombres pairs.

Écart type robuste

Pour obtenir une estimation fiable de la variabilité qui se produit autour de la médiane, il faut se reporter à l'estimation de l'écart type robuste d'après Stuart et Kendall. La formule suivante indique l'écart type asymptotique, c'est-à-dire l'estimation robuste de la variabilité des données considérées, où N est le nombre d'observations et IQR l'intervalle interquartile, qui renferme exactement 50 % des cas d'une distribution de probabilité quelconque.

Le calcul de l'intervalle interquartile s'effectue en calculant la magnitude de l'écart entre le soixante-quinzième et le vingt-cinquième percentile.

IQR = 75e percentile – 25e percentile

Le percentile est la valeur Xpc caractérisée par le fait que la probabilité (P) que les valeurs de la distribution soient inférieures à Xpc est inférieure ou égale à un centième déterminé et que, simultanément, la probabilité (P) que les valeurs de la distribution soient inférieures ou égales à Xpc est supérieure ou égale audit centième. Le centième indique la fraction de distribution retenue. Dans le cas de la médiane, celle-ci est égale à 50/100.

Dans la pratique, le percentile est la valeur de distribution correspondant à une aire déterminée tracée à partir de la courbe de distribution ou de densité. À titre d'exemple, le vingt-cinquième percentile représente la valeur de distribution correspondant à une aire égale à 0,25 ou à 25/100.

Coefficient de variation % robuste

Le CVr% représente un nombre pur, c'est-à-dire sans dimension, qui indique le pourcentage de variabilité de la série de nombres analysée. C'est pour cette raison que ce coefficient est très utile pour vérifier la fiabilité des membres du jury.

Intervalles de confiance à 95 % sur la médiane

Les intervalles de confiance à 95 % (valeur de l'erreur de première espèce égale à 0,05 ou à 5 %) représentent l'intervalle où la valeur de la médiane pourrait varier dans l'hypothèse où il serait possible de répéter l'expérience un nombre de fois infini. Dans la pratique, cet intervalle indique l'intervalle de variabilité de l'essai dans les conditions opératoires retenues, si l'on part de l'hypothèse que l'essai pourrait être répété plusieurs fois. L'intervalle aide à évaluer, comme dans le cas du CVr%, la fiabilité de l'essai.

ICsup = Me + (c.S*)

ICinf = Me – (c.S*)

Où c, dans le cas de l'intervalle de confiance à 0,95, est égal à 1,96.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

ANNEXE XV

1. TENEUR EN HUILE DES GRIGNONS D'OLIVE

1.1. Matériel

— appareil d'extraction approprié muni d'un ballon de 200 à 250 millilitres,

— bain à chauffage électrique (bain de sable, bain d'eau, etc.) ou plaque chauffante,

— balance analytique,

— étuve réglée à 80 °C au maximum,

— étuve à chauffage électrique muni d'un dispositif de thermorégulation réglé à 103 °C ± 2 °C et permettant de réaliser une insufflation d'air ou une pression réduite,

— broyeur mécanique facile à nettoyer et permettant le broyage sans échauffement et sans diminution sensible de leur teneur en eau et en huile,

— cartouche d'extraction et coton hydrophile ou papier filtre, exempts de produits extractibles à l'hexane,

— dessiccateur,

— tamis à trous de 1 millimètre de diamètre,

— pierre ponce en petits grains, préalablement séchée.

1.2. Réactif

n-hexane technique dont le résidu à l'évaporation complète doit être inférieur à 0,002 gramme pour 100 millilitres.

2. MODE OPÉRATOIRE

2.1. Préparation de l'échantillon pour essai

Broyer l'échantillon pour laboratoire, si nécessaire, dans le broyeur mécanique préalablement bien nettoyé afin de le réduire en particules pouvant traverser complètement le tamis.

Utiliser un vingtième environ de l'échantillon pour parfaire le nettoyage du broyeur, rejeter cette mouture, broyer le reste, le recueillir, le mélanger avec soin et l'analyser sans délai.

2.2. Prise d'essai

Peser, à 0,01 gramme près, dès la fin du broyage, environ 10 grammes de l'échantillon pour essai.

2.3. Préparation de la cartouche d'extraction

Placer la prise d'essai dans la cartouche et boucher celle-ci avec le tampon de coton hydrophile. Dans le cas où on a utilisé un papier filtre, emballer la mouture dans ce papier.

2.4. Préséchage

Si le grignon est très humide (teneur en eau et en matières volatiles supérieure à 10 %), effectuer un préséchage en plaçant pendant un temps convenable la cartouche remplie (ou le papier filtre) dans l'étuve chauffée à 80 °C au maximum, pour ramener la teneur en eau et en matières volatiles au-dessous de 10 %.

2.5. Préparation du ballon

Peser, à 1 milligramme près, le ballon contenant 1 à 2 grains de pierre ponce, préalablement séché à l'étuve à 103 °C ± 2 °C puis refroidi pendant au moins une heure dans un dessiccateur.

2.6. Première extraction

Placer dans l'appareil d'extraction la cartouche (ou le papier filtre) contenant la prise d'essai. Verser dans le ballon la quantité nécessaire d'hexane. Adapter le ballon à l'appareil d'extraction et placer le tout sur le bain à chauffage électrique. Conduire le chauffage dans des conditions telles que le débit du reflux soit au moins de trois gouttes à la seconde (ébullition modérée, non tumultueuse).

Après quatre heures d'extraction, laisser refroidir. Enlever la cartouche de l'appareil d'extraction et la placer dans un courrant d'air afin d'éliminer la majeure partie du solvant qui l'imprègne.

2.7. Deuxième extraction

Vider la cartouche dans le microbroyeur et broyer aussi finement que possible. Replacer quantitativement le mélange dans la cartouche et celle-ci dans l'appareil d'extraction.

Recommencer l'extraction pendant encore deux heures en utilisant le même ballon contenant la première extraction.

La solution obtenue dans le ballon d'extraction doit être limpide. À défaut, la filtrer sur un papier filtre en lavant plusieurs fois le premier ballon et le papier filtre avec de l'hexane. Recueillir le filtrat et le solvant de lavage dans un deuxième ballon préalablement séché et taré à 1 milligramme près.

2.8. Élimination du solvant et pesée de l'extrait

Chasser par distillation sur bain à chauffage électrique la majeure partie du solvant. Éliminer les dernières traces de solvant en chauffant le ballon à l'étuve à 103 °C ± 2 °C pendant 20 minutes. Faciliter cette élimination, soit en insufflant de l'air de temps à autre ou de préférence un gaz inerte, soit en opérant sous pression réduite.

Laisser refroidir le ballon dans un dessiccateur pendant au moins une heure, et le peser à 1 milligramme près.

Chauffer à nouveau 10 minutes dans les mêmes conditions, refroidir au dessiccateur et peser.

La différence entre les résultats de ces deux pesées doit être inférieure ou égale à 10 milligrammes. Sinon, chauffer à nouveau pendant des périodes de dix minutes suivies du refroidissement et de la pesée, jusqu'à ce que la différence de masse soit au plus égale à 10 milligrammes. Retenir la dernière pesée du ballon.

Effectuer deux déterminations sur le même échantillon pour essai.

3. EXPRESSION DES RÉSULTATS

3.1. Mode de calcul et formule

a) L'extrait exprimé en pourcentage en masse du produit tel quel, est égal à:

où:	S est le pourcentage en masse d'extrait du produit tel quel, m0 est la masse, en grammes, de la prise d'essai, m1 est la masse, en grammes, de l'extrait après séchage.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations, si les conditions de répétabilité sont remplies.

Exprimer le résultat avec une seule décimale.

b) L'extrait est rapporté à la matière sèche en utilisant la formule suivante:

où:	S est le pourcentage en masse d'extrait du produit tel quel [voir sous a)], U est sa teneur en eau et en matières volatiles.

3.2. Répétabilité

La différence entre les résultats des deux déterminations, effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste, ne doit pas être supérieure à 0,2 gramme d'extrait à l'hexane pour 100 grammes d'échantillon.

Dans le cas contraite, répéter l'analyse sur deux autres prises d'essai. Si cette fois encore la différence dépasse 0,2 gramme, prendre comme résultat la moyenne arithmétique des quatre déterminations effectuées.

ANNEXE XVI

DÉTERMINATION DE L'INDICE D'IODE

1. OBJET

La présente norme internationale décrit une méthode destinée à la détermination de l'indice d'iode dans les corps gras d'origine animale et végétale.

2. DÉFINITION

Aux fins de la présente norme internationale, les définitions suivantes sont applicables.

2.1.	Indice d'iode: la masse d'iode absorbée par l'échantillon dans les conditions opératoires spécifiées par la présente norme internationale. L'indice d'iode est exprimé en nombre de grammes d'iode par 100 grammes d'échantillon.

3. PRINCIPE

Mise en solution d'une prise d'essai dans un solvant et addition du réactif de Wijs. Au terme d'un laps de temps déterminé, addition d'une solution d'iodure de potassium et d'eau; titrage de l'iode libéré par une solution de thiosulfate de sodium.

4. RÉACTIFS

Tous les réactifs sont de qualité analytique reconnue.

4.1.	Iodure de potassium, solution à 100 grammes par litre, exempte d'iode ou d'iodate.

4.2.	Solution d'amidon. Mélanger 5 grammes d'amidon soluble dans 30 millilitres d'eau, ajouter ce mélange à 1 000 millilitres d'eau bouillante, bouillir 3 minutes et laisser refroidir.

4.3.	Solution volumétrique standard de thiosulfate de sodium. c(Na2S303.5H20) = 0,1 mole par litre, normalisé pas plus de sept jours avant l'usage.

4.4.	Solvant préparé en mélangeant des volumes égaux de cyclohexane et d'acide acétique.

4.5.	Réactif de Wijs contenant du monochlorure d'iode dans de l'acide acétique. Utiliser le réactif de Wijs se trouvant dans le commerce. Note: Le réactif contient 9 grammes de ICI3 + 9 grammes de I dans l'acide acétique.

5. APPAREILLAGE

Le matériel courant de laboratoire et notamment:

5.1.	Nacelles de pesée en verre, appropriées à la prise d'essai et pouvant être introduites dans les fioles (5.2).

5.2.	Fioles coniques, d'une capacité de 500 millilitres, pourvues de bouchons en verre et complètement sèches.

6. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON À ANALYSER. L'ÉCHANTILLON HOMOGÉNÉISÉ EST SÉCHÉ SUR SULFATE DE SODIUM ET FILTRÉ.

7. MODE OPÉRATOIRE

7.1.

Prise d'essai

La masse de la prise d'essai varie selon l'indice d'iode présumé, comme l'indique le tableau 1.

Tableau 1

Indice d'iode présumé	Masse de la prise d'essai (en g)
moins que 5	3,00
5 à 20	1,00
21 à 50	0,40
51 à 100	0,20
101 à 150	0,13
151 à 200	0,10

Peser la prise d'essai à 0,1 milligramme près dans une nacelle de pesée en verre (5.1).

7.2.

Détermination

Introduire la prise d'essai dans une fiole de 500 millilitres (5.2). Ajouter 20 millilitres de solvant (4.4) pour dissoudre les corps gras. Ajouter exactement 25 millilitres du réactif de Wijs (4.5), boucher, agiter le contenu et placer la fiole dans un endroit sombre. Ne pas utiliser de pipette pour le réactif de Wijs.

Préparer un essai à blanc avec le solvant et le réactif mais sans la prise d'essai.

Pour les échantillons ayant un indice d'iode inférieur à 150, laisser les fioles dans un endroit sombre pendant 1 heure; pour ceux ayant un indice d'iode supérieur à 150 et pour les produits polymérisés ou des produits oxydés dans une mesure considérable, les laisser pendant 2 heures.

Une fois ce laps de temps écoulé, ajouter 20 millilitres de la solution d'iodure de potassium (4.1) et 150 millilitres d'eau dans chaque fiole.

Titrer avec la solution de thiosulfate de sodium volumétrique standard (4.3) jusqu'à ce que la couleur jaune due à l'iode ait pratiquement disparu. Ajouter quelques gouttes de la solution d'amidon (4.2) et poursuivre la titration jusqu'au moment où la couleur bleue disparaît après avoir agité vigoureusement le contenu.

Note:

La détermination potentiométrique du point final est tolérée.

7.3.	Nombre de déterminations Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.

8. EXPRESSION DES RÉSULTATS

L'indice d'iode est égal à:

où:

c : valeur numérique de la concentration exacte, en moles par litre, de la solution de thiosulfate de sodium volumétrique standard (4.3) utilisée;

V1 : valeur numérique du volume, en millilitres, de la solution de thiosulfate de sodium volumétrique standard (4.3) utilisée pour l'essai à blanc;

V2 : valeur numérique du volume, en millilitres, de la solution de thiosulfate de sodium volumétrique standard (4.3) utilisée pour la détermination;

m : valeur numérique de la masse, en grammes, de la prise d'essai (7.1).

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations, à condition que le critère de répétabilité soit rempli.

▼M11

ANNEXE XVII

MÉTHODE DE DÉTERMINATION DES STIGMASTADIÈNES DANS LES HUILES VÉGÉTALES

1. OBJET

Détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales contenant de faibles concentrations de ces hydrocarbures, en particulier dans les huiles d'olive vierge et les huiles de grignons d'olive.

2. CHAMP D'APPLICATION

La méthode est utilisable pour toutes les huiles végétales, mais les mesures ne sont fiables que lorsque la teneur en hydrocarbures est comprise entre 0,01 et 4 mg/kg. Cette méthode est particulièrement adaptée pour détecter la présence d'huiles végétales raffinées (olive, grignons d'olive, tournesol, palme, etc) dans l'huile d'olive vierge, étant donné que les huiles raffinées contiennent des stigmastadiènes, alors que les huiles vierges n'en contiennent pas.

3. PRINCIPE

Isolement de l'insaponifiable. Séparation de la fraction d'hydrocarbures stéroïdes par chromatographie sur colonne sur gel de silice et analyse par chromatographie capillaire en phase gazeuse.

4. APPAREILLAGE

4.1.	Flacons appropriés de 250 millilitres avec condenseur à reflux.

4.2.	Ampoules à décanter de 500 millilitres.

4.3.	Flacons à fond rond de 100 millilitres.

4.4.	Évaporateur rotatif.

4.5.

Colonne de chromatographie en verre (de 1,5 à 2,0 centimètres de diamètre interne sur 50 centimètres de longueur) avec bouchon en Teflon et tampon de laine de verre ou disque de verre fritté dans le fond. Pour préparer la colonne de gel de silice, verser de l'hexane dans la colonne de chromatographie sur une hauteur d'environ 5 centimètres, puis compléter avec une suspension de gel de silice dans de l'hexane (15 grammes dans 40 millilitres) en utilisant des fractions d'hexane. Laisser reposer, puis soumettre à de légères vibrations. Ajouter du sulfate de sodium anhydre sur environ 0,5 centimètre de hauteur, puis éluer l'hexane en excès.

4.6.	Appareil de chromatographie en phase gazeuse avec détecteur d'ionisation à flamme, injecteur-diviseur ou sur colonne refroidie («on -column») et four programmable à ± 1 °C près.

4.7.

Colonne capillaire en silice fondue pour chromatographie en phase gazeuse (0,25 ou 0,5 millimètre de diamètre interne sur 25 mètres de longueur) recouvertes d'une phase de phénylméthylsilicone à 5 % formant un film de 0,25 micron d'épaisseur.

Remarque 1.

Il est possible d'utiliser d'autres colonnes de polarité similaire ou inférieure.

4.8.	Intégrateur-enregistreur permettant une intégration de vallée à vallée.

4.9.	Microseringue de 5 à 10 μl (microlitres) pour chromatographie en phase gazeuse avec aiguille cémentée.

4.10.

Chauffe-ballon électrique ou plaque chauffante.

5. RÉACTIFS

Sauf indication contraire, tous les réactifs doivent être purs. Il convient d'utiliser de l'eau distillée ou de l'eau d'une pureté au moins équivalente.

5.1.	Hexane ou mélange d'alcanes de point d'ébullition compris entre 65 et 70 °C, distillés à l'aide d'une colonne de fractionnement. Remarque 2. Le solvant doit être distillé pour éliminer les impuretés.

5.2.	Éthanol à 96 v/v.

5.3.	Sulfate de sodium anhydre.

5.4.

Solution d'hydroxyde de potassium alcoolique à 10 %. Ajouter 10 millilitres d'eau à 50 grammes d'hydroxyde de potassium, mélanger, puis dissoudre le mélange dans de l'éthanol jusqu'à obtention de 500 millilitres de solution.

Remarque 3.

La potasse alcoolique brunit au repos. Elle doit être préparée fraîchement chaque jour et conservée dans des flacons en verre brun bin fermés.

5.5.

Gel de silice 60 pour colonne de chromatographie, maille 70 à 230 (Merck réf. 7734 ou similaire).

Remarque 4.

En général, le gel de silice peut être utilisé directement tel qu'il se présente dans le conteneur, sans traitement préalable. Toutefois, certains lots de silice peuvent présenter une faible activité, ce qui se traduit par une mauvaise séparation chromatographique. Dans ce cas, il convient de traiter le gel de silice de la façon suivante: désactiver le gel de silice en le chauffant à 550 °C pendant 4 heures au minimum. Après chauffage, placer le gel de silice dans un déssicateur jusqu'à refroidissement, puis le transvaser dans un flacon fermé. Ajouter 2 % d'eau et secouer jusqu'à disparition des grumeaux et obtention d'une poudre flottant librement. Si certains lots de gel de silice donnent des chromatogrammes présentant des pics parasites, le gel de silice doit être traité comme indiqué ci-dessus. Une autre solution consiste à utiliser un autre gel de silice pur (Merck, réf. 7754).

5.6.	Solution mère (200 ppm) de cholesta-3,5-diène (Sigma, pureté de 99 %) dans de l'hexane. (10 milligrammes dans 50 millilitres).

5.7.	Solution standard de cholesta-3,5-diène dans de l'hexane à une concentration de 20 ppm, obtenue par dilution de la solution précédente. Remarque 5. Conservées à une température inférieure à 4 °C, les solutions désignées aux points 5.6 et 5.7 se conserveront pendant au moins 4 mois.

5.8.	Solution de n-nonacosane dans de l'hexane à une concentration d'environ 100 ppm.

5.9.	Gaz vecteur pour la chromatographie: hélium ou hydrogène d'une pureté de 99,9990 %.

5.10.

Gaz auxiliaires pour le détecteur d'ionisation à flamme: hydrogène d'une pureté de 99,9990 % et air purifié.

6. MÉTHODE

6.1. Préparation de l'insaponifiable:

6.1.1.

Peser 20 ± 0,1 grammes d'huile dans un flacon de 250 millilitres (point 4.1), ajouter 1 millilitre de la solution standard de cholesta-3,5-diène (20 microgrammes) et 75 millilitres de potasse alcoolique à 10 %, mettre en place le condenseur à reflux et chauffer en maintenant en légère ébullition pendant 30 minutes. Éloigner le flacon contenant l'échantillon de la source de chaleur et laisser refroidir légèrement (ne pas laisser refroidir complètement, sinon l'échantillon figerait). Ajouter 100 millilitres d'eau et transvaser la solution dans une ampoule à décanter (point 4.2) avec 100 millilitres d'hexane. Secouer le mélange énergiquement pendant 30 secondes et laisser les différentes couches se former.

Remarque 6.

S'il se forme une émulsion qui ne disparaît pas rapidement, ajouter de petites quantités d'éthanol.

6.1.2.

Transférer la phase aqueuse du dessous dans une seconde ampoule à décanter et extraire à nouveau avec 100 millilitres d'hexane. Récupérer à nouveau la phase inférieure et laver les extraits d'hexane (regroupés dans une autre ampoule à décanter) trois fois avec chaque fois 100 millilitres d'un mélange éthanol-eau (1: 1) jusqu'à obtention d'un pH neutre.

6.1.3.

Faire passer la solution d'hexane sur du sulfate de sodium anhydre (50 grammes), laver avec 20 millilitres d'hexane et faire sécher dans un évaporateur rotatif à 30 °C et à une faible pression.

6.2. Séparation de la fraction d'hydrocarbures stéroïdes:

6.2.1.

Placer le résidu dans la colonne de fractionnement avec deux fractions d'1 millilitre d'hexane, faire s'écouler l'échantillon le long de la colonne en amenant le niveau de la solution au-dessus du sulfate de sodium et commencer l'élution chromatographique avec l'hexane à un débit de 1 millilitre par minute environ. Éliminer le premier éluat de 25 à 30 millilitres, puis recueillir la fraction de 40 millilitres suivante. Ensuite, transférer cette fraction dans un flacon à fond rond de 100 millilitres (point 4.3).

Remarque 7.

La première fraction contient les hydrocarbures saturés (figure 1a) et la seconde, les hydrocarbures stéroïdes. En poursuivant l'élution, on obtient du squalène et des composés apparentés. Pour obtenir une bonne séparation entre les hydrocarbures saturés et les hydrocarbures stéroïdes, le volume des fractions doit être optimal. À cet effet, il convient d'ajuster le volume de la première fraction de manière que, lors de l'analyse de la seconde fraction, les pics représentant les hydrocarbures saturés soient faibles (figure 1c); si ces pics ne se forment pas, mais que l'intensité du pic standard est faible, il faut réduire le volume. En tout état de cause, il est inutile de séparer complètement les composants de la première et de la seconde fractions, étant donné qu'il n'y a pas de chevauchement des pics lors de l'analyse par chromatographie en phase gazeuse si les conditions de la CG sont ajustées conformément au point 6.3.1. En général, il est inutile d'optimaliser le volume de la seconde fraction car on obtient une bonne séparation avec les composants suivants. Quoi qu'il en soit. la formation d'un grand pic à un temps de rétention inférieur d'environ 1,5 minute à celui du pic standard est due au squalène et témoigne d'une mauvaise séparation.

6.2.2.

Faire évaporer la seconde fraction dans un évaporateur à 30 °C et à une faible pression jusqu'à séchage, puis dissoudre immédiatement le résidu dans 0,2 millilitre d'hexane. Conserver la solution au réfrigérateur jusqu'à analyse.

Remarque 8.

Les résidus désignés aux points 6.1.3 et 6.2.2 ne doivent pas être conservés secs et à température ambiante. Dès leur obtention, il convient d'ajouter le solvant et de conserver les solutions au réfrigérateur.

6.3. Chromatographie en phase gazeuse

6.3.1.

Conditions opératoires applicables à l'injection:

— température de l'injecteur: 300 °C,

— température du détecteur: 320 °C,

— intégrateur-enregistreur: les paramètres d'intégration doivent être fixés de manière à permettre une évaluation correcte des aires. Le mode d'intégration de vallée à vallée est recommandé,

— sensibilité: environ 16 fois l'atténuation minimale,

— quantité de solution injectée: 1 microlitre,

— températures de programmation du four: température initiale de 235 °C pendant 6 minutes, puis élévation de 2 °C par minute jusqu'à 285 °C,

— injecteur avec diviseur de débit 1: 15,

— vecteur: hélium ou hydrogène à une pression d'environ 120 kPa.

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques du chromatographe et de la colonne, de manière que les chromatogrammes répondent aux exigences suivantes: formation du pic standard interne à plus ou moins 5 minutes du temps indiqué au point 6.3.2; le pic standard interne doit s'étirer sur au moins 80 % de l'échelle totale.

Il y a lieu de vérifier le système de chromatographie en phase gazeuse en injectant un mélange de solution mère de cholestadiène (point 5.6) et de solution de n-nonacosane (point 5.8). Le pic du cholesta-3,5-diène doit se former avant celui du n-nonacosane (figure 1c); si cela ne se produit pas, deux mesures peuvent être prises: réduire la température du four et/ou utiliser une colonne moins polaire.

6.3.2.

Identification des pics

Le pic standard interne se forme à environ 19 minutes et le stigmasta-3,5-diène à un temps de rétention relatif d'environ 1,29 (voir figure 1b). Le stigmastadiène s'accompagne de faibles quantités d'isomère et, généralement, ils produisent un pic chromatographique unique. Néanmoins, si la colonne est trop polaire ou si elle présente un grand pouvoir de résolution, l'isomère peut former un petit pic avant celui du stigmasta-3,5-diène et très près de lui (figure 2). Pour garantir que les stigmastadiènes produisent un pic unique, il est conseillé de remplacer la colonne par une autre moins polaire ou à diamètre interne plus large.

Remarque 9.

La méthode de détermination des hydrocarbures stéroïdes appliquée à l'analyse d'une huile végétale raffinée permet d'obtenir un pic témoin pour les stigmastadiènes. La substance fait apparaître un pic de hauteur appréciable, facilement identifiable.

6.3.3.

Analyse quantitative

La teneur en stigmastadiène est déterminée par la formule suivante:

mg/kg de stigmastadiènes =

où:	As = aire du pic de stigmastadiène (si le pic est résolu en deux isomères, somme des aires des deux isomères). Ac = aire du standard interne (cholestadiène). Mc = masse de standard ajoutée, en microgrammes. Mo = masse d'huile prélevée, en grammes.

Limite de détection: 0,01 mg/kg environ.

Figure 1

Chromatogrammes (chromatographie en phase gazeuse) obtenus par analyse d'échantillons d'huile d'olive sur une colonne capillaire en silice fondue (0,25 millimètre de diamètre interne sur 25 mètres de longueur) recouverte d'un film de 0,25 micron d'épaisseur de phénylméthylsilicone à 5 %.

a) Première fraction (30 millilitres) d'une huile vierge, éluée avec le standard.

b) Seconde fraction (40 millilitres) d'une huile d'olive contenant 0,10 mg/kg de stigmastadiènes.

c) Seconde fraction (40 millilitres) contenant une petite proportion de la première fraction.

Figure 2

Chromatogramme en phase gazeuse obtenu à partir d'un échantillon d'huile d'olive raffinée analysé sur une colonne DB-5 sur laquelle figure l'isomère de stigmasta-3,5-diène.

▼M25

ANNEXE XVIII

DÉTERMINATION DE LA DIFFÉRENCE ENTRE LA COMPOSITION RÉELLE ET LA COMPOSITION THÉORIQUE DES TRIGLYCÉRIDES À ECN 42

1. CHAMP D’APPLICATION

Détermination de la différence absolue entre les valeurs expérimentales des triglycérides (TG) à nombre équivalent d’atomes de carbone égal à 42 (ECN 42CLHP) obtenues par détermination dans l’huile par chromatographie liquide haute performance (CLHP) et la valeur théorique des TG à nombre équivalent d’atomes de carbone égal à 42 (ECN 42théorique) calculée d’après la composition en acides gras.

2. DOMAINE D’APPLICATION

La méthode s’applique aux huiles d’olive. Elle vise à détecter la présence de faibles quantités d’huiles de graines (riches en acide linoléique) dans chaque catégorie d’huile d’olive.

3. PRINCIPE

Dans le cas des huiles d’olive pures, la composition des triglycérides à ECN 42 déterminée par CLHP est plus ou moins équivalente à la composition théorique des triglycérides à ECN 42 (calculée à partir de la composition en acides gras déterminée par chromatographie en phase gazeuse). Une différence supérieure aux valeurs adoptées pour chaque catégorie d’huile indique que l’huile contient des huiles de graines.

4. MÉTHODE

La méthode permettant de calculer la composition théorique des triglycérides à ECN 42 ainsi que la différence par rapport aux données CLHP consiste essentiellement en la coordination des résultats d’analyse obtenus par d’autres méthodes. On distingue trois phases: la détermination de la composition en acides gras par chromatographie en phase gazeuse (CPG) sur colonne capillaire, le calcul de la composition théorique des triglycérides à ECN 42 et la détermination des triglycérides à ECN 42 par CLHP.

4.1. Appareillage

4.1.1.

Ballons à fond rond de 250 et 500 ml.

4.1.2.

Béchers de 100 ml.

4.1.3.

Colonne de chromatographie en verre (diamètre intérieur: 21 mm; longueur: 450 mm) avec robinet et cône normalisé (femelle) au sommet.

4.1.4.

Ampoules à décanter de 250 ml avec cône normalisé (mâle) à la base, pouvant s’adapter au sommet de la colonne.

4.1.5.

Baguette en verre de 600 mm de longueur.

4.1.6.

Entonnoir en verre de 80 mm de diamètre.

4.1.7.

Fioles jaugées de 50 ml

4.1.8.

Fioles jaugées de 20 ml

4.1.9.

Évaporateur rotatif.

4.1.10.

Chromatographe en phase liquide à haute performance, équipé d’un réglage thermostatique de la température de la colonne.

4.1.11.

Vannes d’injection pour 10 μl.

4.1.12.

Détecteur: réfractomètre différentiel. La sensibilité pleine échelle doit atteindre au moins 10–4 unités d’indice de réfraction.

4.1.13.

Colonne: tube en acier inoxydable de 250 mm de longueur et de 4,5 mm de diamètre intérieur, rempli de particules de silice de 5 μm de diamètre contenant 22 à 23 % de carbone sous forme d’octadécylsilane.

4.1.14.

Logiciel de traitement des données.

4.1.15.

Flacons d’environ 2 ml, avec bouchon à vis et septa en téflon.

4.2. Réactifs

Les réactifs doivent être de pureté analytique. Les solvants d’élution doivent être dégazés et peuvent être recyclés plusieurs fois sans que cela ait une incidence sur les séparations.

4.2.1.

éther de pétrole 40-60 °C pour chromatographie ou hexane.

4.2.2.

Éther éthylique, exempt de peroxydes, fraîchement distillé.

4.2.3.

Solvant d’élution pour la purification de l’huile par chromatographie sur colonne: mélange d’éther de pétrole/éther éthylique dans les proportions 87/13 (v/v).

4.2.4.

Gel de silice, granulométrie 70-230, type Merck 7734, à teneur en eau normalisée de 5 % (m/m).

4.2.5.

Laine de verre.

4.2.6.

Acétone pour CLHP.

4.2.7.

Acétonitrile ou propionitrile pour CLHP.

4.2.8.

Solvant d’élution pour CLHP: acétonitrile + acétone (proportions à ajuster pour obtenir la séparation souhaitée; commencer avec le mélange 50:50) ou propionitrile.

4.2.9.

Solvant de solubilisation: acétone.

4.2.10.

Triglycérides de référence: soit des triglycérides que l’on trouve dans le commerce (tripalmitine, trioléine, etc.); dans ce cas, les temps de rétention sont reportés sur un diagramme en fonction du nombre équivalent d’atomes de carbone; soit des chromatogrammes de référence obtenus pour de l’huile de soja, pour un mélange 30:70 d’huile de soja et d’huile d’olive, et pour de l’huile d’olive pure (voir notes 1 et 2 et figures 1 à 4).

4.2.11.

Colonne d’extraction en phase solide avec phase de silice 1 g, 6 ml.

4.3. Préparation des échantillons

Étant donné qu’un certain nombre de substances peuvent interférer et donner lieu à des résultats faux positifs, l’échantillon doit toujours être purifié selon la méthode IUPAC 2.507 utilisée pour la détermination des composés polaires dans les graisses de friture.

4.3.1. Préparation de la colonne de chromatographie

Remplir la colonne (4.1.3) avec 30 ml environ de solvant d’élution (4.2.3); introduire ensuite un tampon de laine de verre (4.2.5) dans la colonne et l’enfoncer jusqu’au fond de la colonne au moyen de la baguette en verre (4.1.5).

Préparer dans un bécher de 100 ml une suspension avec 25 g de gel de silice (4.2.4) dans 80 ml de mélange d’élution (4.2.3); la transférer ensuite dans la colonne au moyen d’un entonnoir en verre (4.1.6).

Afin de s’assurer que la totalité du gel de silice a été transférée dans la colonne, laver le bécher avec le mélange d’élution et transférer également le liquide de lavage dans la colonne.

Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler jusqu’à ce que son niveau se situe à environ 1 cm au-dessus du gel de silice.

4.3.2. Chromatographie sur colonne

Peser, avec un degré de précision de 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g d’huile, préalablement filtrée, homogénéisée et, si nécessaire, déshydratée dans une fiole jaugée de 50 ml (4.1.7).

Diluer dans environ 20 ml de solvant d’élution (4.2.3); si nécessaire, chauffer légèrement pour faciliter la dissolution. Refroidir à température ambiante et porter au volume avec du solvant d’élution.

À l’aide d’une pipette jaugée, introduire 20 ml de solution dans la colonne préparée conformément au point 4.3.1, ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler jusqu’au niveau de la couche de gel de silice.

Éluer ensuite avec 150 ml de solvant d’élution (4.2.3), en réglant le débit du solvant à 2 ml par minute environ (de telle sorte que 150 ml s’écoulent dans la colonne en 60-70 minutes).

Recueillir l’éluat dans un ballon à fond rond de 250 ml (4.1.1) préalablement taré et placé dans un four et le peser avec précision. Éliminer le solvant sous pression réduite dans un évaporateur rotatif (4.1.9) et peser le résidu qui sera utilisé pour préparer la solution pour l’analyse CLHP et pour la préparation des esters méthyliques.

Après passage dans la colonne, l’échantillon doit être récupéré à 90 % au moins pour les catégories d’huile d’olive vierge extra, vierge et raffinée normalement, et à 80 % au moins pour les huiles lampantes et les huiles de grignons.

4.3.3. Purification par extraction en phase solide

Activer la colonne d’extraction en phase solide sur silice en passant 6 ml d’hexane (4.2.3) sous vide, en évitant la dessiccation.

Peser 0,12 g avec un degré de précision de 0,001 g dans un flacon de 2 ml (4.1.15) et dissoudre dans 0,5 ml d’hexane (4.2.3).

Charger la colonne d’extraction en phase solide avec la solution et éluer avec 10 ml de mélange hexane-éther diéthylique (87:13 v/v) (4.2.3) sous vide.

La fraction recueillie est évaporée à sec dans un évaporateur rotatif (4.1.9) à pression réduite et à température ambiante. Le résidu est dissous dans 2 ml d’acétone (4.2.6) en vue de l’analyse des triglycérides (TG).

4.4. Analyse CLHP

4.4.1. Préparation des échantillons pour l’analyse chromatographique

Préparer une solution à 5 % de l’échantillon à analyser en pesant 0,5 ± 0,001 g de l’échantillon dans une fiole jaugée de 10 ml et compléter à 10 ml avec le solvant de solubilisation (4.2.9).

4.4.2. Procédure

Régler le système chromatographique. Pomper du solvant d’élution (4.2.8) à un débit de 1,5 ml par minute de façon à purger l’ensemble du système. Attendre d’avoir une ligne de base stable.

Injecter 10 μl de l’échantillon préparé selon le point 4.3.

4.4.3. Calcul et expression des résultats

Utiliser la méthode de normalisation des aires des pics, qui consiste à admettre que la somme des aires des pics correspondant aux triglycérides (TG) de ECN 42 à ECN 52 est égale à 100 %.

Calculer le pourcentage relatif de chaque triglycéride selon la formule:

Les résultats doivent comporter au moins deux chiffres après la virgule.

Voir notes 1 et 4.

4.5. Calcul de la composition des triglycérides (% de moles) à partir de la composition en acides gras (% de l’aire)

4.5.1. Détermination de la composition en acides gras

La composition en acides gras est déterminée par la norme ISO 5508 au moyen d’une colonne capillaire. Les esters méthyliques sont préparés selon la méthode COI/T.20/doc. no 24.

4.5.2. Acides gras pris en considération dans le calcul

Les glycérides sont regroupés selon leur nombre équivalent d’atomes de carbone (ECN — Equivalent Carbon Number), compte tenu des équivalences suivantes entre ECN et acides gras. Seuls les acides gras à 16 ou 18 atomes de carbone ont été pris en considération, car ce sont les seuls qui sont importants pour l’huile d’olive. Les acides gras doivent être normalisés à 100 %.

Acide gras (AG)	Abréviation	Poids moléculaire (PM)	ECN
Acide palmitique	P	256,4	16
Acide palmitoléique	Po	254,4	14
Acide stéarique	S	284,5	18
Acide oléique	O	282,5	16
Acide linoléique	L	280,4	14
Acide linolénique	Ln	278,4	12

4.5.3. Conversion en moles du % de l’aire pour tous les acides gras (1)

4.5.4. Normalisation à 100 % des moles d’acides gras (2)

Le résultat indique le pourcentage de chaque acide gras, en moles, dans la position globale (1,2,3) des TG.

On calcule ensuite la somme des acides gras saturés P et S (AGS) et des acides gras insaturés Po, O, L et Ln (AGI):

4.5.5. Calcul de la composition des acides gras en position 2 et en positions 1, 3 des TG

Les acides gras sont répartis en trois groupes, comme suit: un groupe pour la position 2 et deux groupes identiques pour les positions 1 et 3, avec des coefficients différents pour les acides saturés (P et S) et les acides insaturés (Po, O, L et Ln).

4.5.5.1. Acides gras saturés en position 2 [P(2) et S(2)] (4):

4.5.5.2. Acides gras insaturés en position 2 [Po(2), O(2), L(2) et Ln(2)] (5):

4.5.5.3. Acides gras en positions 1 et 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)] (6):

4.5.6. Calcul des triglycérides

4.5.6.1. TG à un acide gras (AAA, ici LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2. TG à deux acides gras (AAB, ici PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3. TG à trois acides gras distincts (ABC, ici OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4. Triglycérides à ECN 42

Les triglycérides à ECN 42 sont calculés selon les équations 7, 8 et 9, et sont ensuite indiqués par ordre d’élution attendu en CLHP (en général, on observe seulement trois pics).

LLL

PoLL et l’isomère de position LPoL

OLLn et les isomères de position OLnL et LnOL

PoPoL et l’isomère de position PoLPo

PoOLn et les isomères de position OPoLn et OLnPo

PLLn et les isomères de position LLnP et LnPL

PoPoPo

SLnLn et l’isomère de position LnSLn

PPoLn et les isomères de position PLnPo et PoPLn

Les triglycérides à ECN 42 s’obtiennent en additionnant les neuf triglycérides, y compris leurs isomères de position. Les résultats doivent comporter au moins deux chiffres après la virgule.

5. ÉVALUATION DES RÉSULTATS

On compare la composition théorique calculée et celle déterminée par CLHP. Si, en valeur absolue, la différence «données CLHP moins données théoriques» est supérieure aux valeurs spécifiées pour la catégorie d’huile concernée dans la norme de commercialisation, l’échantillon contient de l’huile de graines.

Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

6. EXEMPLE (LA NUMÉROTATION RENVOIE AUX SECTIONS DU TEXTE DE LA MÉTHODE)

— 4.5.1. Calcul du % de moles d’acides gras à partir des données de la CPG (% de l’aire normalisé)

La détermination de la composition en acides gras par CPG donne les valeurs suivantes:

AG	P	S	Po	O	L	Ln
PM	256,4	284,5	254,4	282,5	280,4	278,4
% aire	10,0	3,0	1,0	75,0	10,0	1,0

— 4.5.3 Conversion en moles du % de l’aire pour tous les acides gras [voir formule (1)]

moles P

moles S

moles Po

moles O

moles L

moles Ln

Total

0,35821 moles TG

— 4.5.4 Normalisation à 100 % des moles d’acides gras [voir formule (2)]

% moles P(1,2,3)

% moles S(1,2,3)

% moles Po(1,2,3)

% moles O(1,2,3)

% moles L(1,2,3)

% moles Ln(1,2,3)

Total % moles

100 %

Somme des acides gras saturés et insaturés en position 1, 2 et 3 des TG [voir formule (3)]:

— 4.5.5 Calcul de la composition en acides gras en position 2 et en position 1 et 3 des TG

— 4.5.5.1 Acides gras saturés en position 2 [P(2) et S(2)] [voir formule (4)]

— 4.5.5.2 Acides gras insaturés en position 2 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)] [voir formule (5)]

— 4.5.5.3 Acides gras en position 1 et 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)] [voir formule (6)]

— 4.5.6. Calcul des triglycérides

À partir de la composition calculée en acides gras en position 2 et en position 1 et 3 (voir tableau suivant):

AG en	positions 1 et 3	position 2
P	16,004 %	0,653 %
S	4,325 %	0,177 %
Po	1,015 %	1,262 %
O	68,526 %	85,296 %
L	9,204 %	11,457 %
Ln	0,927 %	1,153 %
Total	100,0 %	100,0 %

Les triglycérides suivants sont calculés:

LLL

PoPoPo

PoLL avec un isomère de position

SLnLn avec un isomère de position

PoPoL avec un isomère de position

PPoLn avec 2 isomères de position

OLLn avec 2 isomères de position

PLLn avec 2 isomères de position

PoOLn avec 2 isomères de position

— 4.5.6.1. TG à un acide gras (LLL, PoPoPo) [voir formule (7)]

, = 0,09706 mol LLL

— 4.5.6.2 TG à deux acides gras (PoLL, SLnLn, PoPoL) (voir formule (8)]

0,03210 mol PoLL

0,00094 mol SLnLn

0,00354 mol PoPoL

— 4.5.6.3 TG à trois acides gras distincts (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) [voir formule (9)]

0,00761 mol PPoLn

0,43655 mol OLLn

0,06907 mol PLLn

0,04812 mol PoOLn

ECN 42 = 0,69512 mol TG

Note 1: Il est possible de déterminer l’ordre d’élution en calculant le nombre équivalent d’atomes de carbone, souvent défini par la relation , dans laquelle CN est le nombre d’atomes de carbone et n le nombre de doubles liaisons; on peut affiner le calcul en tenant compte de l’origine de la double liaison. Si no, nl et nln sont les nombres de doubles liaisons attribués respectivement aux acides oléique, linoléique et linolénique, le nombre équivalent d’atomes de carbone peut être calculé selon la formule suivante:

dans laquelle les coefficients do, dl et dln peuvent être calculés à l’aide des triglycérides de référence. Dans les conditions spécifiées dans la présente méthode, la relation obtenue sera voisine de:

Note 2: Avec plusieurs triglycérides de référence, il est également possible de calculer la résolution par rapport à la trioléine:

de la trioléineen utilisant le temps de rétention réduit

La représentation graphique de log α en fonction de f (nombre de doubles liaisons) permet de déterminer les valeurs de rétention pour tous les triglycérides à acides gras contenus dans les triglycérides de référence — voir figure 1.

Note 3: L’efficacité de la colonne doit permettre de séparer nettement le pic de la trilinoléine des pics des triglycérides dont le TR est proche. L’élution est effectuée jusqu’au pic ECN 52.

Note 4: Une mesure correcte des aires de tous les pics intéressants pour la présente détermination est garantie si le deuxième pic correspondant à ECN 50 est égal à 50 % du maximum de l’échelle.

Figure 1

Représentation graphique de log α en fonction de f (nombre de doubles liaisons)

Nombre de doubles liaisons

La: acide laurique; My: acide myristique; P: acide palmitique; S: acide stéarique; O: acide oléique; L: acide linoléique; Ln: acide linolénique

Figure 2

Huile d’olive à faible teneur en acide linoléique

Solvant: acétone/acétonitrile.

Tracé a: Principaux composants des pics chromatographiques: ECN 42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN 44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN 46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN 48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN 50: (17) SOO; (18) POS + SLS.

Solvant: propionitrile.

Tracé b: Principaux composants des pics chromatographiques: ECN 42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN 44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN 46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN 48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN 50: (17) SOO; (18) POS + SLS

Figure 3

Huile d’olive à teneur élevée en acide linoléique

Solvant: acétone/acétonitrile (50:50).

Tracé a: Principaux composants des pics chromatographiques: ECN 42: (1’) LLL + PoLL; (2’) OLLn + PoOLn; (3’) PLLn; ECN 44: (4’) OLL + PoOL; (5’) OOLn + PLL; (6’) POLn + PPoPo; ECN 46: (7’) OOL + PoOO; (8’) PLO + SLL + PoOP; (9’) PLP + PoPP; ECN 48: (10’) OOO; (11’) POO + SLL + PPoO; (12’) POP + PLS; ECN 50: (13’) SOO; (14’) POS + SLS

Solvant: propionitrile.

Tracé b: Principaux composants des pics chromatographiques: ECN 42: (1) LLL; (2 + 2’) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN 44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN 46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN 48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN 50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN 52: (19) AOO.

▼M19

ANNEXE XIX

DÉTERMINATION DU CONTENU EN ALCOOLS ALIPHATIQUES AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1. OBJET

La méthode décrit un procédé de détermination du contenu en alcools aliphatiques, simples et totaux, des matières grasses.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse, additionnée de 1-eicosanol comme standard interne, est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La fraction des alcools est séparée de l'extrait insaponifiable par chromatographie sur plaque de gel de silice basique; les alcools récupérés dans le gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE

3.1. Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts rodés.

3.2. Ampoule à décanter de 500 millilitres.

3.3. Ballons de 250 millilitres.

3.4. Équipement complet pour chromatographie en phase solide, avec plaques de verre de 20 × 20, centimètres.

3.5. Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.

3.6. Microseringues de 100 et 500 microlitres.

3.7. Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40 micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout rodé mâle 12/21.

3.8. Fiole à vide de 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable à l'ampoule filtrante (3.7).

3.9. Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.

3.10. Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec colonne capillaire, équipé d'un système de fractionnement, constitué de:

3.10.1. Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la température désirée avec une précision d'environ 1 °C.

3.10.2. Ensemble d'injection thermoréglable avec élément vaporisateur en verre persilanisé.

3.10.3. Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur.

3.10.4. Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertisseur-amplificateur avec un temps de réponse non supérieur à 1 seconde et avec une vitesse de papier variable.

3.11. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de long, de 0,25 à 0,32 millimètre de diamètre intérieur, recouverte intérieurement de liquide SE-52 ou SE-54 ou équivalent, avec une épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.

3.12. Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10 microlitres avec aiguille cémentée.

3.13. Balance de précision ayant une sensibilité de 1 mg (avec affichage 0.1 mg).

4. RÉACTIFS

4.1. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre, tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titre minimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles de verre opaque bien bouchées.

4.2. Éther éthylique, pour analyses.

4.3. Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.

4.4. Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluorescence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le commerce déjà prêtes à l'emploi).

4.5. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2 N: dissoudre 13 grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol.

4.6. Benzène, pour chromatographie (5.2.2).

4.7. Acétone, pour chromatographie (5.2.2).

4.8. Hexane pour chromatographie (5.2.2).

4.9. Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).

4.10. Chloroforme pur, pour analyse.

4.11. Solution de référence pour la chromatographie sur plaque: cholestérol ou phytostérol, solution à 0,5 % dans le chloroforme.

4.12. Dichloro-2'-7' fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solution alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.

4.13. Pyridine anhydre, pour chromatographie.

4.14. Hexaméthyldisilazane.

4.15. Triméthylchlorosilane.

4.16. Solution étalon de triméthylsilyléthers des alcools aliphatiques de C20 à C28. À préparer au moment de l'emploi à partir de mélanges d'alcools purs.

4.17. 1-eicosanol, solution à 0,1 % (m/V) dans le chloroforme (standard interne).

4.18. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.19. Gaz auxiliaire: nitrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5. PROCÉDÉ

5.1. Préparation de l'insaponifiable

5.1.1.

Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microseringue de 500 microlitres, un volume de solution d'1-eicosanol à 0,1 % dans le chloroforme (4.17) qui contient une quantité d'1-eicosanol qui corresponde à environ 10 % du contenu en alcools aliphatiques dans l'aliquote de l'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple, pour 5 grammes d'échantillon, il faut ajouter 250 microlitres de la solution d'1-eicosanol à 0,1 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive et 1 500 microlitres s'il s'agit d'huile de grignons d'olive.

Evaporer dans un courant d'azote jusqu'à dessiccation, puis peser exactement 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon.

5.1.2.

Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium à 2 N, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer au bain-marie jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation énergique jusqu'à ce que la saponification se soit produite (la solution devient limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis ajouter 50 millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du réfrigérant, débrancher le réfrigérant et refroidir le ballon à environ 30 °C.

5.1.3.

Transvaser le contenu du ballon, de façon quantitative, dans une ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillée à plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1).

Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillant dans une autre ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse, selon les mêmes modalités, en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres d'éther éthylique.

Note 1:

Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant, avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou méthylique.

5.1.4.

Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à l'eau distillée (50 millilitres à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de l'eau de lavage.

Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 millilitres pesé au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités d'éther éthylique.

5.1.5.

Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il n'en reste qu'une petite quantité, puis porter à sec sous un léger vide ou dans un courant d'azote, parfaire le séchage à l'étuve à 100 °C durant un quart d'heure environ et peser après refroidissement dans un dessiccateur.

5.2. Séparation de la fraction alcoolique

5.2.1.

Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice (4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser agir ensuite; bien sécher sous hotte aspirante, pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve à 100 °C pendant une heure.

Retirer de l'étuve et conserver dans un dessiccateur à chlorure de calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent être employées dans les quinze jours).

Note 2:

L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la séparation de la fraction alcoolique élimine le besoin du traitement de l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des alcools aliphatiques et terpéniques nettement séparée de la bande des stérols.

5.2.2.

Introduire dans la cuve de développement un mélange hexane-éther éthylique 65/35 (V/V) jusqu'à une hauteur d'environ 1 centimètre ( 8 ).

Fermer la cuve à l'aide d'un couvercle approprié et laisser ainsi pendant une demi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur s'établisse. Il est possible de fixer sur les surfaces intérieures de la cuve des bandes de papier filtre qui plongent dans l'éluant: cette précaution permet de réduire d'un tiers environ les temps de migration du front du liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.

Note 3:

Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproductibles, le mélange doit être changé à chaque essai.

5.2.3.

Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le chloroforme et, avec la microseringue de 100 microlitres, déposer sur la plaque chromatographique (5.2.1) à 2 centimètres environ d'un bord, 0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne continue, la plus fine et uniforme possible. Dans l'alignement de la ligne de dépôt, déposer, à une des extrémités de la plaque, 2 à 3 microlitres de la solution de référence des alcools aliphatiques (4.11), dans le but d'identifier la bande des alcools aliphatiques lors du dernier développement.

5.2.4.

Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme décrit au point 5.2.2. La température ambiante doit être maintenue entre 15 et 20 °C. Fermer aussitôt la cuve avec le couvercle et laisser éluer jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque.

Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et faire évaporer le solvant dans un courant d'air chaud ou bien en laissant la plaque sécher sous hotte aspirante pendant un petit moment.

5.2.5.

Vaporiser la plaque légèrement et uniformément avec la solution de dichloro-2'-7' fluorescéine. Identifier la bande des alcools aliphatiques par alignement avec la tache obtenue avec la solution de référence; délimiter la bande avec un crayon noir l'ensemble de la bande des alcools aliphatiques et de la bande immédiatement supérieure qui correspond aux alcools terpéniques.

Note 4:

La précision faite de recueillir l'ensemble de la bande des alcools aliphatiques et de la bande des alcools terpéniques est due au fait que dans celle-ci, dans les conditions de la méthode, sont englobées des quantités significatives d'alcools aliphatiques.

5.2.6.

Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ 10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en chauffant légèrement dans un léger courant d'azote, reprendre avec quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes environ à l'étuve à 105 °C, puis laisser refroidir au dessiccateur et peser.

Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction alcoolique.

5.3. Préparation des triméthylsilyléthers

5.3.1.

Ajouter, dans le tube contenant la fraction alcoolique, le réactif de silylation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 5) dans une proportion de 50 microlitres par milligramme d'alcools aliphatiques, en évitant toute absorption d'humidité (note 6).

Note 5:

Note 6:

La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont l'indice de la présence d'humidité ou d'altération du réactif. Dans ce cas, l'essai doit être répété.

5.3.2.

Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète solubilisation des alcools aliphatiques. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes: la solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse.

5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.4.1. Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne

5.4.1.1.

Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant l'extrémité d'entrée à l'injecteur connecté au système de fractionnement et l'extrémité de sortie au détecteur. Effectuer les contrôles généraux du complexe de chromatographie en phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur, efficacité du système de fractionnement et du système d'enregistrement, etc.).

5.4.1.2.

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est conseillé de procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie en phase gazeuse et commencer un chauffage graduel jusqu'à atteindre une température d'au moins 20 °C supérieure à celle d'exercice (note 7). Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis porter le complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux gazeux et de la séparation, allumage de la flamme, jonction avec l'enregistreur électronique, régulation de la température de la chambre pour la colonne, du détecteur et de l'initiateur etc.) et enregistrer le signal à une sensibilité au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l'exécution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas présenter de dérive. Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

Note 7:

La température de conditionnement doit être toujours inférieure d'au moins 20 °C à la température maximale prévue pour le liquide de répartition employé.

5.4.2. Choix des conditions opératoires

5.4.2.1. Les conditions opératoires indicatives sont les suivantes:

— température de la colonne: début isotherme 8 minutes à 180 °C, puis programme de 5 °C par minute jusqu'à 260 °C puis encore 15 minutes à 260 °C,

— température de l'évaporateur: 280 °C,

— température du détecteur: 290 °C,

— vitesse linéaire du gaz vecteur: hélium, 20 à 35 centimètres par seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde,

— rapport de division: de 1/50 à 1/100,

— sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,

— sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond,

— vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure,

— quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de TMSE.

— le temps de rétention de l'alcool en C26 doit être de 18 ± 5 minutes,

— le pic de l'alcool en C22 doit être 80 ± 20 % de l'échelle de fond pour l'huile d'olive et pour l'huile de semences 40 ± 20 % de l'échelle de fond.

5.4.2.2. Pour vérifier les conditions exigées ci-dessus, effectuer des injections répétées avec les échantillons de mélanges des TMSE des alcools et retoucher les conditions opératoires jusqu'à obtenir les meilleurs résultats.

5.4.2.3. Les paramètres d'intégration des pics doivent être imposés de façon à obtenir des valeurs correctes pour les pics qui sont pris en considération.

5.4.3. Exécution de l'analyse

5.4.3.1. Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane, aspirer 0,5 microlitre d'air et successivement 0,5 à 1 microlitre de la solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes environ.

5.4.3.2. Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des alcools aliphatiques présents. La ligne de base doit toujours correspondre aux conditions requises (5.4.1.2):

5.4.4. Identification des pics

L'identification des pics individuels est effectuée sur la base des temps de rétention et par comparaison avec le Mélange des TMSE des alcools aliphatiques, analysés dans les mêmes conditions.

La figure 1 montre un chromatogramme de la fraction alcoolique d'une huile d'olive vierge.

5.4.5. Évaluation quantitative

5.4.5.1. Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l'1-eicosanol et des alcools aliphatiques C22, C24, C26 et C28.

5.4.5.2. Calculer le contenu en chaque alcool aliphatique individuel, en milligrammes pour

1 000

grammes de matière grasse, comme suit:

où:

Ax=aire du pic de l'alcools x

As=aire du pic d'1-eicosanol

ms=poids d'1-eicosanol ajouté, en milligrammes

m =poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Rapporter les contenus en alcools aliphatiques simples en milligrammes pour 1 000 grammes de matière grasse et leur somme comme «alcools aliphatiques totaux».

APPENDICE

Détermination de la vitesse linéaire du gaz

La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.

Figure 1 — Chromatogramme de la fraction alcoolique d'une huile vierge 1 = Eicosanol 2 = Docosanol 3 = Tricosanol 4 = Tétracosanol 5 = Pentacosanol 6 = Hexacosanol 7 = Heptacosanol 8 = Octacosanol

▼M23

ANNEXE XX

Méthode de détermination de la teneur en cires et en esters méthyliques et éthyliques d'acides gras par chromatographie gazeuse sur colonne capillaire

1. OBJET

Cette méthode décrit un procédé pour déterminer la teneur en cires et en esters méthyliques et éthyliques d'acides gras dans les huiles d’olive. Les cires et les alkyls esters sont séparés en fonction du nombre d’atomes de carbone. La méthode peut être employée notamment pour différencier l’huile d’olive de l’huile de grignons d’olive et comme paramètre de qualité pour les huiles d’olive vierges extra, dans la mesure où elle permet la détection des mélanges frauduleux d’huiles d’olive vierge extra avec des huiles de qualité inférieure, notamment les huiles d’olive vierges, lampantes ou désodorisées.

2. PRINCIPE

L'huile, additionnée d'étalons internes appropriés, est fractionnée par chromatographie sur colonne de gel de silice hydraté; la fraction éluée dans les conditions de l’essai (à polarité inférieure à celle des triglycérides) est recueillie puis analysée directement par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE

3.1.	Erlenmeyer de 25 ml.

3.2.	Colonne en verre pour chromatographie en phase liquide, diamètre intérieur 15,0 mm, hauteur 30 à 40 cm, équipée d’un robinet approprié.

3.3.

Appareil de chromatographie en phase gazeuse approprié pour le fonctionnement avec colonne capillaire, équipé d’un système d'injection directe sur colonne, constitué des éléments suivants:

3.3.1.

Four à thermostat équipé d’un programmateur de température.

3.3.2.

Injecteur à froid pour introduction directe dans la colonne

3.3.3.

Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur.

3.3.4.

Enregistreur-intégrateur (Note 1) approprié pour fonctionner avec le convertisseur-amplificateur (point 3.3.3), vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et vitesse de déroulement du papier variable.

Note 1: Il est également possible d’utiliser des systèmes informatisés qui permettent la saisie des données de chromatographie en phase gazeuse au moyen d’un ordinateur.

3.3.5.

Colonne capillaire, silice fondue (pour analyse des cires et des esters méthyliques et éthyliques), longueur 8 à 12 m, diamètre intérieur 0,25 à 0,32 mm, recouverte à l’intérieur de liquide de répartition (Note 2) à l’épaisseur uniforme comprise entre 0,10 et 0,30 μm.

Note 2: Il existe des phases liquides dans le commerce qui peuvent être utilisées à cette fin, telles que SE52 ou SE 54.

3.4.	Microseringue de 10 μl, équipée d’une aiguille en acier trempé, pour injection directe sur colonne.

3.5.	Agitateur électrique.

3.6.	Évaporateur rotatif.

3.7.	Four à moufle.

3.8.	Balance analytique garantissant une précision de la mesure de ± 0,1 mg.

3.9.	Verrerie normale de laboratoire.

4. RÉACTIFS

4.1.

Gel de silice, d’une granulométrie comprise entre 60 et 200 μm mesh [NdT: les deux unités de mesure coexistent dans l'original]. Le gel de silice doit être placé dans le four à moufle à 500 °C pendant au moins 4 h. Après refroidissement, y ajouter 2 % d’eau par rapport à la quantité de gel de silice utilisée. Agiter convenablement afin d’homogénéiser la suspension. Conserver dans le dessiccateur pendant au moins 12 heures avant emploi.

4.2.

n-hexane, pour chromatographie ou analyse de résidus (la pureté doit être vérifiée).

AVERTISSEMENT: risques d’inflammation des vapeurs. Tenir à l’écart de sources de chaleur, étincelles ou flammes nues. Bien fermer les récipients et utiliser dans un local bien aéré. Éviter l’accumulation de vapeurs et éliminer toute cause possible d’incendie, telle que radiateurs et appareils électriques non antidéflagrants. Nocif par inhalation: peut nuire aux cellules du système nerveux. Éviter de respirer les vapeurs. Utiliser si nécessaire un appareil respiratoire adéquat. Éviter tout contact avec les yeux et la peau.

4.3.

Éther éthylique, pour chromatographie.

AVERTISSEMENT: extrêmement inflammable. Modérément toxique. Irritant pour la peau. Nocif par inhalation. Peut être nuisible pour les yeux. Les effets peuvent être différés. Risque de formation de peroxydes explosifs. Risques d’inflammation des vapeurs. Tenir à l’écart de sources de chaleur, étincelles ou flammes nues. Bien fermer les récipients et utiliser dans un local bien aéré. Éviter l’accumulation de vapeurs et éliminer toute cause possible d’incendie, telle que radiateurs et appareils électriques non antidéflagrants. Ne pas évaporer jusqu’à dessiccation totale ou quasi totale. L’adjonction d’eau ou d’un autre agent réducteur approprié peut réduire la formation des peroxydes. Ne pas ingérer. Éviter de respirer les vapeurs. Éviter le contact prolongé ou répété avec la peau.

4.4.

n-heptane, pour chromatographie, ou iso-octane.

AVERTISSEMENT: inflammable. Nocif par inhalation. Tenir à l’écart de sources de chaleur, étincelles ou flammes nues. Bien fermer les récipients et utiliser dans un local bien aéré. Éviter de respirer les vapeurs. Éviter le contact prolongé ou répété avec la peau.

4.5.	Solution étalon d’arachidate laurique (Note 3), diluée à 0,05 % (m/V) dans de l’heptane (étalon interne pour cires). Note 3: Il est également possible d’utiliser du palmitate de palmityle, du stéarate de myristyle ou du lauréate d’arachidyle.

4.6.	Solution étalon d'heptadécanoate méthylique, diluée à 0,02 % (m/V) dans de l’heptane (étalon interne pour esters méthyliques et éthyliques).

4.7.	Soudan 1 (1-phényl-azo-2-naphthol)

4.8.

Gaz vecteur: hydrogène ou hélium, pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

AVERTISSEMENT:

Hydrogène. extrêmement inflammable, sous pression. Tenir à l’écart de sources de chaleur, étincelles ou flammes nues ou d’appareils électriques non antidéflagrants. S’assurer que la soupape de la bouteille est bien fermée lorsqu’elle n’est pas utilisée. Utiliser exclusivement avec un réducteur de pression. Desserrer le ressort du réducteur avant l’ouverture de la soupape de la bouteille. S’éloigner du point de sortie du gaz de la bouteille au moment de l’ouverture de la soupape. Utiliser dans un local bien aéré. Ne pas transférer l’hydrogène d’une bouteille à une autre. Ne pas mélanger de gaz dans la bouteille. S’assurer que les bouteilles ne risquent pas de tomber. Éloigner les bouteilles des rayons du soleil ou de toute autre source de chaleur. Ne pas stocker dans des espaces corrosifs. Ne pas utiliser de bouteilles abîmées ou sans étiquette.

Hélium. comprimé sous haute pression. Réduit l’oxygène disponible pour la respiration. Conserver le conteneur fermé. Utiliser dans un local bien aéré. Ne pas entrer dans les locaux de stockage s’ils ne sont pas bien ventilés. Utiliser exclusivement avec un réducteur de pression. Desserrer le ressort du réducteur avant l’ouverture de la soupape de la bouteille. Ne pas transférer le gaz d’une bouteille à une autre. S’assurer que les bouteilles ne risquent pas de tomber. S’éloigner du point de sortie du gaz de la bouteille au moment de l’ouverture de la soupape. Éloigner les bouteilles des rayons du soleil ou de toute autre source de chaleur. Ne pas stocker dans des espaces corrosifs. Ne pas utiliser de bouteilles abîmées ou sans étiquette. Ne pas inhaler. Utiliser exclusivement à des fins techniques.

4.9.

Gaz auxiliaires:

— hydrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

— air pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

AVERTISSEMENT:

Air. Comprimé sous haute pression. Utiliser avec précaution en présence de substances combustibles car la température d’auto-allumage de la plupart des composés organiques dans l’air diminue fortement à haute pression. S’assurer que la soupape de la bouteille est bien fermée lorsqu’elle n’est pas utilisée. Utiliser exclusivement avec un réducteur de pression. Desserrer le ressort du réducteur avant l’ouverture de la soupape de la bouteille. S’éloigner du point de sortie du gaz de la bouteille au moment de l’ouverture de la soupape. Ne pas transférer le gaz d’une bouteille à une autre. Ne pas mélanger de gaz dans la bouteille. S’assurer que les bouteilles ne risquent pas de tomber. Éloigner les bouteilles des rayons du soleil ou de toute autre source de chaleur. Ne pas stocker dans des espaces corrosifs. Ne pas utiliser de bouteilles abîmées ou sans étiquette. Ne pas inhaler et ne pas utiliser pour des appareils respiratoires l’air destiné à des fins techniques.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de la colonne chromatographique

Mettre 15 g de gel de silice (point 4.1) en suspension dans le n-hexane (point 4.2) et l’introduire dans la colonne (point 3.2). Laisser se déposer spontanément, puis utiliser un agitateur électrique pour rendre la couche chromatographique plus homogène. Filtrer 30 ml de n-hexane afin d’éliminer les impuretés éventuelles. Peser exactement à l’aide de la balance analytique (point 3.8) environ 500 mg de l’échantillon dans l’Erlenmeyer de 25 ml (point 3.1). Ajouter une quantité appropriée d’étalon interne (point 4.5), en fonction du contenu présumé de cires. Par exemple, ajouter 0,1 mg d’arachidate laurique dans le cas de l’huile d’olive et 0,25 à 0,5 mg dans le cas de l’huile de grignons d'olive et 0,05 mg de heptadécanoate méthylique dans le cas des huiles d’olive (point 4.6).

Introduire l’échantillon ainsi préparé dans la colonne chromatographique à l’aide de deux fractions de 2 ml de n-hexane (point 4.2.).

Laisser couler le solvant jusqu’à 1 mm au-dessus du niveau supérieur de l’absorbant. Filtrer [NdT: passage manquant dans l'original] supplémentaires de n-hexane/éther éthylique (99:1) et recueillir 220 ml à un débit d’environ 15 gouttes toutes les 10 secondes. (Cette fraction contient les esters méthyliques et éthyliques et les cires). (Note 4) (Note 5).

Note 4: Un nouveau mélange n-hexane/éther éthylique (99:1) doit être préparé chaque jour.

Note 5: Pour contrôler visuellement l’élution correcte des cires, il est possible d’ajouter à la solution échantillon 100μl de colorant soudan I dilué à 1 % dans le mélange d’élution.

Le colorant ayant un temps de rétention compris entre celui des cires et des triglycérides, il convient de suspendre l’élution lorsque le colorant atteint le fond de la colonne chromatographique, car toutes les cires ont alors été éluées.

Évaporer les fractions ainsi obtenues dans l’évaporateur rotatif jusqu’à l'évacuation pratiquement totale du solvant. Les 2 derniers ml sont évacués avec un faible flux d’azote. Recueillir la fraction contenant les esters méthyliques et éthyliques est diluée avec 2 à 4 ml de n-heptane ou d'iso-octane [NdT: cette phrase est entachée d'une erreur de syntaxe dans l'original].

5.2. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.2.1. Opérations préliminaires

Connecter la colonne et le chromatographe en phase gazeuse (point 3.3), en raccordant, d'une part, le point d'admission au système sur colonne et, d'autre part, le point de sortie au détecteur. Vérifier le bon fonctionnement de l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse (fonctionnement des circuits des gaz, efficacité du système de détection et d'enregistrement, etc.).

Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis régler l’appareillage sur les conditions opératoires (réglage du débit de gaz, allumage de la flamme, raccordement à l’enregistreur électronique (point 3.3.4), réglage de la température du four en fonction de la colonne, réglage du détecteur, etc.) et enregistrer le signal à une sensibilité au moins deux fois supérieure à celle requise pour l’analyse. Le tracé de la ligne de base doit être linéaire, exempt de tout pic, et ne doit présenter aucune déviation.

Une déviation rectiligne négative indique que les raccordements de la colonne sont mauvais; une déviation positive indique un conditionnement inadéquat de la colonne.

5.2.2. Choix des conditions opératoires pour les cires et les esters éthyliques et méthyliques (Note 6)

Les conditions opératoires sont en général les suivantes:

—	température de la colonne : 20 °C/min 5 °C/min 80 °C au départ (1 minute) 140 °C 335 °C (20)

—	température du détecteur : 350 °C.

—	quantité injectée : 1μl de solution de n-heptane (2-4 ml).

—	gaz vecteur : hélium ou hydrogène à la vitesse linéaire optimale pour le gaz choisi (voir Appendice A).

—	sensibilité instrumentale : telle qu'elle permet de satisfaire aux conditions ci-dessus.

Note 6: En raison de la température finale élevée, on admet une déviation positive qui ne doit toutefois pas être supérieure à 10 % de la valeur réelle.

Ces conditions peuvent être modifiées de façon à les adapter aux caractéristiques de la colonne et de l’appareil de chromatographie en phase gazeuse, afin de séparer toutes les cires et tous les esters éthyliques et méthyliques d'acides gras et d'obtenir une séparation satisfaisante des pics (voir figures 2, 3 et 4) et un temps de rétention de l’étalon interne d'arachidate laurique de 18 ± 3 minutes. Le pic des cires le plus représentatif doit être supérieur à 60 % de l'amplitude réelle, tandis que l’étalon interne d'heptadécanoate méthylique pour les esters méthyliques et éthyliques doit atteindre l'amplitude réelle.

Les paramètres d’intégration des pics doivent être déterminés de façon à obtenir une évaluation correcte des aires des pics pris en considération.

5.3. Exécution de l’analyse

Prélever 10 μl de la solution à l’aide de la microseringue de 10 μl; tirer le piston de la seringue en arrière jusqu'à ce que l’aiguille soit vide. Introduire l’aiguille dans le dispositif d’injection et après 1-2 secondes, injecter rapidement. Au bout d’environ 5 secondes, extraire délicatement l’aiguille.

Effectuer l’enregistrement jusqu’à l'élution complète des cires ou des stigmastadiènes, selon la fraction analysée.

La ligne de base doit toujours satisfaire aux conditions requises.

5.4. Identification des pics

Les différents pics sont identifiés en comparant les temps de rétention et les mélanges de cires dont les temps de rétention sont connus du fait qu'ils ont été analysés dans les mêmes conditions. Les alkyl esters sont identifiés à partir de mélanges d’esters méthyliques et éthyliques des principaux acides gras contenus dans l’huile d’olive (palmitique et oléique).

La Figure 1 représente un chromatogramme des cires d’une huile d’olive vierge. Les figures 2 et 3 représentent les chromatogrammes de deux huiles d’olive vierges extra disponibles dans le commerce, l’une contenant des esters méthyliques et éthyliques et l’autre non. La figure 4 représente le chromatogramme d’une huile d’olive vierge extra de qualité optimale et le chromatogramme de la même huile, mais qui contient des pics correspondant à 20 % d’huile désodorisée.

5.5. Analyse quantitative des cires

Procéder au calcul de l'aire des pics correspondant à l’étalon interne d'arachidate laurique et aux esters aliphatiques de C40 à C46 à l’aide de l’intégrateur.

Calculer la teneur totale en cires en additionnant chaque cire, en mg/kg de matière grasse, par la formule:

où:

aire correspondant au pic de chaque ester, en données de comptage sous forme numérique

aire correspondant au pic de l’étalon interne d'arachidate laurique, en données de comptage sous forme numérique

masse de l’étalon interne d'arachidate laurique ajouté, en milligrammes

masse de l’échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

5.5.1. Analyse quantitative des esters méthyliques et éthyliques

Procéder au calcul des aires des pics correspondant à l’étalon interne d'heptadécanoate méthylique, aux esters méthyliques des acides gras C16 et C18 et aux esters éthyliques des acides gras C16 et C18 à l’aide de l’intégrateur.

Calculer la teneur de chacun des alkyl esters, en mg/kg de matière grasse, par la formule:

où:

aire correspondant au pic de chaque ester C16 et C18, en données de comptage sous forme numérique

aire correspondant au pic de l’étalon interne d'heptadécanoate méthylique, en données de comptage sous forme numérique

masse de l’étalon interne d'heptadécanoate méthylique ajouté, en milligrammes

masse de l’échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Indiquer la somme des teneurs en cires de C40 à C46 (Note 7), en mg/kg de matière grasse.

Indiquer la somme des teneurs en esters méthyliques et éthyliques de C16 à C18, et le total des deux.

Il convient d'indiquer les résultats en arrondissant au mg/kg inférieur ou supérieur.

Note 7: Les constituants à quantifier correspondent aux pics des esters C40 à C46 ayant un nombre d'atomes de carbone pair, selon l’exemple de chromatogramme des cires contenues dans une huile d’olive reproduit dans la figure ci-après. À des fins d'identification, si l’ester C46 est scindé, il est conseillé d’analyser la fraction des cires d’une huile de grignons d’olive dont le pic C46 est clairement identifiable du fait qu'il prédomine.

Indiquer le ratio entre les esters éthyliques et les esters méthyliques.

Figure 1

Chromatogramme de la fraction de cires d’une huile d’olive, à titre d'exemple ( 9 )

Pics avec un temps de rétention de 5 à 8 min des esters éthyliques et méthyliques d'acides gras

Légende:

I.S.

Arachidate laurique

Esters diterpéniques

2+2′

esters C40

3+3′

esters C42

4+4′

esters C44

esters 46

Esters stéroliques et alcools triterpéniques

Figure 2

Esters méthyliques, esters éthyliques et cires dans une huile d’olive vierge

Légende:

–

Méthyl C16

–

Éthyl C16

–

Heptadécanoate méthylique I.S.

–

Méthyl C18

–

Éthyl C18

–

Squalene

–

Arachidate laurique I.S.

–

Esters diterpéniques

–

Cires

–

Esters stéroliques et esters triterpéniques

Figure 3

Esters méthyliques, esters éthyliques et cires dans une huile d’olive vierge extra

Légende:

–

Heptadécanoate méthylique I.S.

–

Méthyl C18

–

Éthyl C18

–

Squalène

–

Arachidate laurique I.S.

–

Esters diterpéniques

–

Cires

–

Esters stéroliques et esters triterpéniques

Figure 4

Partie d’un chromatogramme d’une huile d’olive vierge extra et de la même huile contenant des pics d’huile désodorisée

Légende:

–

Myristate méthylique I.S.

–

Palmitate méthylique

–

Palmitate éthylique

–

Heptadécanoate méthylique I.S.

–

Linoléate méthylique

–

Oléate méthylique

–

Stéarate méthylique

–

Linoléate éthylique

–

Oléate éthylique

–

Stéarate éthylique

Appendice A

Détermination de la vitesse linéaire du gaz

Injecter de 1 à 3 μl de méthane (ou propane) dans l’appareil de chromatographie en phase gazeuse, après l'avoir réglé sur les conditions opératoires normales. Chronométrer le temps mis par le gaz pour parcourir la colonne, depuis son injection jusqu’à l'apparition du pic (tM).

La vitesse linéaire, en cm/s, est donnée par la formule L/tM, où L est la longueur de la colonne, en centimètres, et tM le temps chronométré en secondes.

▼M25

ANNEXE XXI

Résultats des contrôles de conformité réalisés sur les huiles d’olive visés à l’article 8, paragraphe 2

Étiquetage

Paramètres chimiques

Caractéristiques organoleptiques (4)

Conclusion finale

Échantillon

Catégorie

Pays d’origine

Lieu du contrôle (1)

Dénomination légale

Appellation d’origine

Conditions de stockage

Informations erronées

Lisibilité

C/NC (3)

Paramètres hors limites

O/N

Dans l’affirmative, veuillez indiquer le(s)quel(s) (2)

C/NC (3)

Médiane du défaut

Médiane du fruité

C/NC (3)

Mesures requises

Sanction

(1) Marché intérieur (pressoir, embouteillage, vente au détail), exportation, importation

(2) Un code est attribué à chacune des caractéristiques de l’huile d’olive mentionnées à l’annexe I

(3) Conforme/non conforme

(4) Pas nécessaire pour l’huile d’olive et l’huile de grignons d’olive.

( 1 ) JO no 172 du 30.9.1966, p. 3025/66.

( 2 ) JO no L 353 du 17.12.1990, p. 23.

( 3 ) JO no L 128 du 24.5.1977, p. 6.

( 4 ) JO no L 166 du 1.7.1988, p. 10.

( 5 ) JO L 228 du 1.9.2009, p. 3.

( 6 ) Après l’élution des esters des stérols, le tracé chromatographique ne doit pas présenter de pics significatifs (triglycérides).

( 7 ) Le dégustateur pourra s'abstenir de déguster une huile quand il appréciera par voie olfactive directe quelque attribut négatif extrêmement intense. Il notera sur la feuille de profil cette circonstance exceptionnelle.

( 8 ) Dans ces cas en particuliers, il faut employer le mélange éluant benzène-acétona 95/5 (v/v) pour obtenir une bonne séparation de bandes.

( 9 ) Après l’élution des esters stéroliques, le chromatogramme ne devrait pas présenter de pics significatifs (triglycérides).