LIITE I

NÄYTTEENOTTOMENETELMÄT

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Rehujen virallisessa tarkastuksessa käytettävät näytteet on otettava seuraavassa esitettyjen menetelmien mukaisesti. Näin saatujen näytteiden katsotaan edustavan koko tutkittavaa erää.

2.   NÄYTTEENOTTAJAT

Näytteitä ottavat kyseisen jäsenvaltion tähän tehtävään valtuuttamat henkilöt.

3.   MÄÄRITELMÄT

Tutkittava erä: tuoteyksikkömäärä, jonka katsotaan olevan ominaisuuksiltaan tasalaatuinen.

Osanäyte: tuotemäärä, joka on otettu tutkittavan erän yhdestä kohdasta.

Kokoomanäyte: tutkittavan erän eri kohdista otetuista osanäytteistä muodostettu yhteisnäyte.

Supistettu näyte: kokoomanäytteen edustava osa, joka on saatu kokoomanäytteestä jakomenettelyn avulla.

Lopullinen näyte: supistetun näytteen tai homogenoidun kokoomanäytteen osa.

4.   VÄLINEISTÖ

4.1	Näytteenottovälineiden on oltava valmistettu materiaaleista, jotka eivät aiheuta kontaminaatiota tuotteista otettuihin näytteisiin. Nämä välineet voivat olla jäsenvaltioiden virallisesti hyväksymiä.

4.2   Kiinteiden rehujen näytteenottoon suositellut välineet

4.2.1   Manuaalinen näytteenotto

4.2.1.1

Tasapohjainen kauha, jossa on pystysuorat sivuseinämät.

4.2.1.2

Näytteenottokaira, jossa on pitkä ura tai osastoja. Kairan mittojen on oltava oikeassa suhteessa tutkittavaan erään (esim. astian syvyys, säkin mitat) sekä rehun raekokoon.

4.2.2   Koneellinen näytteenotto

Hyväksyttyä koneellista laitetta voidaan käyttää otettaessa näytteitä liikkuvasta rehusta.

4.2.3   Näytteenjakolaite

Osanäytteiden ottamiseen sekä supistettujen ja lopullisten näytteiden valmistamiseen voidaan käyttää laitetta, joka on suunniteltu jakamaan näyte suunnilleen yhtä suuriin osiin.

5.   MÄÄRÄÄ KOSKEVAT VAATIMUKSET

5.A	Rehut, joissa aineet tai tuotteet ovat tasaisesti jakaantuneina
5.A.1	Tutkittava erä Tutkittavan erän on oltava sen kokoinen, että näyte voidaan ottaa kaikista erän kohdista.
5.A.2	Osanäytteet
5.A.2.1	Irtorehu:	Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä:
5.A.2.1.1	tutkittava erä enintään 2,5 tonnia:	seitsemän
5.A.2.1.2	tutkittava erä yli 2,5 tonnia	√ 20 x tutkittavan erän tonnimäärä (1), kuitenkin enintään 40 osanäytettä
5.A.2.2	Pakattu rehu:	Pienin vaadittu määrä pakkauksia, joista otetaan näyte (2):
5.A.2.2.1	Yli 1 kg:n pakkaukset:
5.A.2.2.1.1	tutkittavassa erässä 1–4 pakkausta	kaikki pakkaukset
5.A.2.2.1.2	tutkittavassa erässä 5–16 pakkausta	neljä
5.A.2.2.1.3	tutkittavassa erässä yli 16 pakkausta	√ tutkittavassa erässä (1) olevien pakkausten lukumäärä, kuitenkin enintään 20 pakkausta
5.A.2.2.2	Pakkausten paino enintään 1 kg	neljä
5.A.2.3	Nestemäinen tai puolijuokseva rehu:	Pienin vaadittu määrä tutkittavia säiliöitä, joista otetaan näyte (2):
5.A.2.3.1	Säiliön tilavuus yli 1 litra:
5.A.2.3.1.1	tutkittavassa erässä 1–4 säiliötä	kaikki säiliöt
5.A.2.3.1.2	tutkittavassa erässä 5–16 säiliötä	neljä
5.A.2.3.1.3	tutkittavassa erässä yli 16 säiliötä	√ tutkittavassa erässä (1) olevien säiliöiden lukumäärä, kuitenkin enintään 20 säiliötä
5.A.2.3.2	Säiliön tilavuus enintään yksi litra	neljä
5.A.2.4	Rehukakut ja nuolukivet	Pienin vaadittu tutkittavien rehukakkujen tai nuolukivien lukumäärä, joista otetaan näyte (2): Yksi rehukakku tai yksi nuolukivi tutkittavan erän jokaista 25 yksikköä kohti, kuitenkin enintään 4 rehukakkua tai nuolukiveä
5.A.3	Kokoomanäyte Tutkittavaa erää kohden riittää yksi kokoomanäyte. Yhden kokoomanäytteen muodostavien osanäytteiden kokonaismäärän on oltava vähintään seuraava:
5.A.3.1	Irtorehu:	4 kg
5.A.3.2	Pakattu rehu:
5.A.3.2.1	pakkauksen paino yli 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2	pakkauksen paino enintään 1 kg	neljän alkuperäisen pakkauksen sisällön paino
5.A.3.3	Nestemäinen tai puolijuokseva rehu:
5.A.3.3.1	säiliön tilavuus yli 1 litra:	neljä litraa
5.A.3.3.2	säiliön tilavuus enintään yksi litra	neljän alkuperäisen säiliön sisällön paino
5.A.3.4	Rehukakut ja nuolukivet
5.A.3.4.1	yksikköpaino yli 1 kg	4 kg
5.A.3.4.2	yksikköpaino enintään 1 kg	neljän alkuperäisen rehukakun tai nuolukiven paino
5.A.4	Lopullinen näyte Lopullinen näyte on kokoomanäyte tarpeen mukaan supistettuna. Analyysi tehdään vähintään yhdestä lopullisesta näytteestä. Analyysia varten valmistetun lopullisen näytteen määrän on oltava vähintään:
	Kiinteä rehu	500 g
	Nestemäinen tai puolijuokseva rehu	500 ml
5.B	Rehut, jotka sisältävät sellaisia haitallisia aineita tai tuotteita, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakaantuneina rehuaineessa, kuten aflatoksiinit, torajyvä, risiinikasvi ja crotalaria (3).
5.B.1	Tutkittava erä: katso 5.A.1
5.B.2	Osanäytteet
5.B.2.1	Irtorehu: katso 5.A.2.1
5.B.2.2	Pakattu rehu:	Pienin vaadittu lukumäärä tutkittavia pakkauksia, joista otetaan näyte:
5.B.2.2.1	tutkittavassa erässä 1–4 pakkausta	kaikki pakkaukset
5.B.2.2.2	tutkittavassa erässä 5–16 pakkausta	neljä
5.B.2.2.3	tutkittavassa erässä yli 16 pakkausta	√ tutkittavan erän (1) pakkausten lukumäärä, kuitenkin enintään 40 pakkausta
5.B.3	Kokoomanäyte Kokoomanäytteiden lukumäärä vaihtelee tutkittavan erän koon mukaan. Seuraavassa annetaan pienin vaadittu kokoomanäytteiden lukumäärä tutkittavaa erää kohti. Yhden kokoomanäytteen muodostavien osanäytteiden yhteispainon on oltava vähintään seuraava:
5.B.3.1	Irtorehu:
	Tutkittavan erän paino (tonnia):	Pienin vaadittu kokoomanäytteiden lukumäärä tutkittavaa erää kohti:
	enintään 1	1
	yli 1 ja enintään 10	2
	yli 10 ja enintään 40	3
	yli 40	4
5.B.3.2	Pakattu rehu
	Tutkittavan erän koko ilmaistuna pakkausten lukumääränä:	Pienin vaadittu kokoomanäytteiden lukumäärä tutkittavaa erää kohti:
	1–16	1
	17–200	2
	201–800	3
	yli 800	4
5.B.4	Lopullinen näyte Lopullinen näyte on kokoomanäyte supistettuna. Analyysi tehdään vähintään yhdestä lopullisesta näytteestä kutakin kokoomanäytettä kohti. Analyysia varten valmistetun lopullisen näytteen on oltava massaltaan vähintään 500 g.

6.   NÄYTTEIDEN OTTAMISTA, VALMISTAMISTA JA PAKKAAMISTA KOSKEVAT OHJEET

6.1   Yleistä

Näytteet on otettava ja valmistettava mahdollisimman nopeasti noudattaen varotoimenpiteitä, joilla varmistetaan, ettei tuote muutu tai saastu. Kaikkien näytteiden kanssa kosketuksiin joutuvien välineiden sekä pintojen ja säiliöiden on oltava puhtaita ja kuivia.

6.2   Osanäytteet

6.2.A   Rehut, joissa aineet tai tuotteet ovat tasaisesti jakaantuneina

Osanäytteet on otettava satunnaisesti koko tutkittavasta erästä, ja niiden on oltava suunnilleen samansuuruisia.

6.2.A.1   Irtorehu

Tutkittava erä kuvitellaan jaetuksi suunnilleen samankokoisiin osiin. Valitaan satunnaisesti sellainen määrä osia, joka vastaa 5.A.2 kohdan mukaista osanäytteiden määrää, ja jokaisesta osasta otetaan vähintään yksi näyte.

Näytteet voidaan tarvittaessa ottaa tutkittavaa erää siirrettäessä (lastauksen tai purkamisen yhteydessä).

6.2.A.2   Pakattu rehu

Kun 5.A.2 kohdan mukainen lukumäärä pakkauksia on valittu näytteenottoa varten, kunkin pakkauksen sisällöstä otetaan osa kairaa tai kauhaa käyttäen. Tarvittaessa näytteet on otettava vasta sitten, kun pakkaukset on erikseen tyhjennetty. Kaikki kokkareet on hajotettava, jolloin ne erotetaan näytteestä ja pannaan hajotettuina takaisin näytteeseen.

6.2.A.3   Homogeeniset ja homogenoituvat nestemäiset tai puolijuoksevat rehut

Kun 5.A.2 kohdan mukainen lukumäärä säiliöitä on valittu näytteenottoa varten, sisältö on tarvittaessa homogenoitava ja vaadittava määrä näytettä otettava kustakin säiliöstä.

Osanäytteet voidaan ottaa säiliöitä tyhjennettäessä.

6.2.A.4   Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut, joita ei voi homogenoida

Kun 5.A.2 kohdan mukainen lukumäärä säiliöitä on valittu näytteenottoa varten, on otettava näytteet rehun eri kerroksista.

Näytteet voidaan ottaa myös säiliötä tyhjennettäessä, kuitenkin siten, että ensimmäisiä jakeita ei oteta talteen.

Kummassakin tapauksessa näytteen kokonaismäärän on oltava vähintään 10 litraa.

6.2.A.5   Rehukakut ja nuolukivet

Kun 5.A.2 kohdan mukainen lukumäärä rehukakkuja tai nuolukiviä on valittu näytteenottoa varten, otetaan pala jokaisesta kakusta tai kivestä.

6.2.B   Rehut, jotka sisältävät sellaisia haitallisia aineita tai tuotteita, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakaantuneina rehuaineessa, kuten aflatoksiinit, torajyvä, risiinikasvi ja crotalaria

Tutkittava erä kuvitellaan jaetuksi suunnilleen samankokoisiin osiin, joiden lukumäärä vastaa 5.B.3 kohdan mukaista kokoomanäytteiden lukumäärää. Jos kyseinen luku on suurempi kuin yksi, jaetaan tutkittava erä 5.B.2 kohdan mukaista osanäytteiden kokonaislukumäärää vastaavaan määrään suunnilleen samankokoisia osia. Jokaisesta osasta otetaan suunnilleen samankokoinen näyte (4) siten, että kustakin osasta otettujen näytteiden yhteispainon on oltava vähintään jokaiselle kokoomanäytteelle asetettu minimi 4 kg. Tutkittavan erän eri osista otettuja osanäytteitä ei saa yhdistää kokoomanäytteeksi.

6.3   Kokoomanäytteen valmistaminen

6.3.A   Rehut, joissa aineet tai tuotteet ovat tasaisesti jakaantuneina

Kokoomanäyte muodostetaan sekoittamalla osanäytteet keskenään.

6.3.B   Rehut, jotka sisältävät sellaisia haitallisia aineita tai tuotteita, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakaantuneina rehuaineessa, kuten aflatoksiinit, torajyvä, risiinikasvi ja crotalaria

Kustakin tutkittavan erän osasta otetut osanäytteet sekoitetaan ja niistä valmistetaan 5.B.3 kohdan mukainen määrä kokoomanäytteitä pitäen huolta siitä, että jokaisen kokoomanäytteen alkuperä on merkitty muistiin.

6.4   Lopullisen näytteen valmistaminen

Kunkin kokoomanäytteen sisältämä aines sekoitetaan huolellisesti, jotta näytteestä tulee homogeeninen. (5) Tarvittaessa kokoomanäyte on ensin pienennettävä vähintään 2 kg:n tai 2 litran suuruiseksi (supistettu näyte) joko käyttämällä koneellista tai automaattista näytteenjakolaitetta tai jakamalla näyte neljännesmenetelmällä.

Tämän jälkeen valmistetaan vähintään kolme lopullista näytettä, jotka ovat suunnilleen samankokoisia ja täyttävät 5.A.4 tai 5.B.4 kohdan määrälliset vaatimukset. Kukin näyte laitetaan asianmukaiseen astiaan. On toteutettava kaikki tarvittavat varotoimenpiteet, jotta vältetään näytteen koostumuksen muuttuminen, saastuminen tai turmeltuminen kuljetuksen tai varastoinnin aikana.

6.5   Lopullisen näytteen pakkaaminen

Näyteastiat tai -pakkaukset sinetöidään ja varustetaan etiketillä siten, ettei niitä voi avata sinettiä vahingoittamatta (koko etiketin on oltava kiinni sinetissä).

7.   NÄYTTEENOTTOPÖYTÄKIRJA

Jokaisesta näytteenotosta on laadittava näytteenottopöytäkirja, josta jokainen tutkittava erä voidaan yksiselitteisesti tunnistaa.

8.   NÄYTTEIDEN LÄHETTÄMINEN

Jokaisesta kokoomanäytteestä on lähetettävä vähintään yksi lopullinen näyte mahdollisimman nopeasti viralliseen laboratorioon yhdessä analyysin suorittajan tarvitsemien tietojen kanssa.

---

(1)  Mikäli saatu luku ei ole kokonaisluku, se pyöristetään ylöspäin lähimpään kokonaislukuun.

(2)  Jos pakkauksen tai säiliön sisältö ei ylitä yhtä kiloa tai yhtä litraa ja jos rehukakun tai nuolukiven paino ei ylitä yhtä kiloa, osanäyte on yhden alkuperäisen pakkauksen tai säiliön sisältö, yksi rehukakku tai yksi nuolukivi.

(3)  5.A kohdassa säädettyjä menetelmiä käytetään aflatoksiinien, torajyvän, risiinikasvin ja crotalarian valvontaan täysrehuissa ja täydennysrehuissa.

(4)  Kun kyseessä on pakattu rehu, kunkin tutkittavan pakkauksen sisällöstä otetaan osa kairaa tai kauhaa käyttäen sen jälkeen, kun pakkaukset on tarvittaessa erikseen tyhjennetty.

(5)  Kaikki kokkareet on hajotettava, jolloin ne erotetaan näytteestä ja pannaan hajotettuina takaisin näytteeseen.

LIITE II

REHUJEN MÄÄRITYSMENETELMIÄ KOSKEVAT YLEISET SÄÄNNÖKSET

A.   NÄYTTEIDEN VALMISTAMINEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN

1.   Tarkoitus

Seuraavassa esitettävät menetelmät koskevat lopullisten näytteiden valmistusta määritystä varten; näytteet lähetetään tutkimuslaboratorioihin sen jälkeen, kun ne on otettu liitteessä I vahvistettujen säännösten mukaisesti.

Näytteet on valmistettava siten, että määritysmenetelmien mukaiset punnitut määrät ovat homogeenisia ja edustavia.

2.   Varotoimenpiteet

Näytteiden valmistusmenettely riippuu käytettävistä määritysmenetelmistä. Tästä syystä on olennaisen tärkeää varmistaa, että näytteiden valmistusmenettely on käytettävien määritysmenetelmien kannalta asianmukainen.

Kaikki toimenpiteet on suoritettava siten, että vältetään mahdollisimman hyvin näytteen saastuminen ja sen koostumuksen muuttuminen.

Näyte on jauhettava, sekoitettava ja seulottava mahdollisimman nopeasti altistaen sitä ilmalle ja valolle mahdollisimman vähän. Sellaisia myllyjä ja jauhatuslaitteita, joissa näytteen huomattava lämpeneminen on todennäköistä, ei pidä käyttää.

On suositeltavaa jauhaa erityisen lämmönarat rehut käsin. Lisäksi on huolehdittava siitä, ettei itse välineistössä ole kontaminaatiota aiheuttavia hivenainejäämiä.

Jos näytettä ei voi valmistaa muuttamatta merkittävästi sen sisällön kosteuspitoisuutta, on kosteuspitoisuus määritettävä ennen valmistusta ja sen jälkeen liitteessä III olevassa A osassa säädetyn menetelmän mukaisesti.

3.   Menettely

Näyte jaetaan sopiviksi eränäytteiksi määritystä ja vertailua varten käyttäen asianmukaisia jakotekniikoita, kuten vuorottelevaa kahtiointia taikka kiinteän tai pyörivän kourujakajan käyttöä. Kartiomurskaimen ja neljännesmenetelmän käyttöä ei suositella, koska ne aiheuttavat eränäytteisiin suuren jakovirheriskin. Vertailunäyte pannaan sopivaan puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan näyteastiaan, ja määritykseen tarkoitetut, vähintään 100 gramman suuruiset eränäytteet valmistetaan jäljempänä esitetyllä tavalla.

3.1   Sellaisenaan jauhettavat rehut

Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, koko näyte seulotaan tarvittaessa jauhamisen jälkeen seulalla, jonka neliönmuotoisten reikien sivu on 1 mm (suosituksen ISO R565 mukaisesti). Liikajauhatusta on vältettävä.

Seulottu näyte sekoitetaan ja pannaan tarkoituksenmukaiseen puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan näyteastiaan. Näyte sekoitetaan uudelleen välittömästi ennen punnitsemista määritystä varten.

3.2   Kuivauksen jälkeen jauhettavat rehut

Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, näyte kuivataan kosteuspitoisuuteen 8–12 % käyttäen esikuivatusmenetelmää, joka esitetään liitteessä III olevan A osan 4.3 kohdassa kuvatun kosteudenmääritysmenetelmän yhteydessä. Tämän jälkeen jatketaan edellä 3.1 kohdassa esitetyllä tavalla.

3.3   Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut

Näyte kerätään sopivaan puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan näyteastiaan. Näyte sekoitetaan perusteellisesti välittömästi ennen näytteen ottamista.

3.4   Muut rehut

Jos näytettä ei voi valmistaa jollain edellä esitetyllä tavalla, se on valmistettava millä tahansa muulla tavalla, jolla varmistetaan, että määritystä varten punnitut ainemäärät ovat homogeenisia ja edustavat lopullisia näytteitä.

4.   Näytteiden säilytys

Näytteet on säilytettävä lämpötilassa, jossa niiden koostumus ei muutu. Vitamiinien tai valolle erityisen herkkien aineiden määritykseen tarkoitetut näytteet on säilytettävä ruskeasta lasista valmistetuissa näyteastioissa.

B.   MÄÄRITYSMENETELMISSÄ KÄYTETTÄVIÄ REAGENSSEJA JA VÄLINEITÄ KOSKEVAT SÄÄNNÖKSET

1.	Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, kaikkien reagenssien on oltava analyysilaatua (p.a.). Hivenainejäämiä määritettäessä reagenssien puhtaus on tarkistettava nollanäytteellä. Saatujen tuloksien mukaan voi reagenssien lisäpuhdistus olla tarpeen.

2.

Määritysmenetelmissä mainituissa toimenpiteissä, joihin liittyy liuosten valmistus, laimennus, huuhtelu tai pesu ja joissa käytettävän liuottimen tai laimentimen laatua ei mainita, on käytettävä vettä. Pääsääntöisesti on käytettävä demineralisoitua tai tislattua vettä. Määritysmenetelmissä mainituissa erityistapauksissa vesi on puhdistettava erityisillä puhdistusmenetelmillä.

3.	Tutkimuslaboratorioissa käytettävistä välineistä määritysmenetelmissä mainitaan ainoastaan erikoisinstrumentit ja -välineet tai erityiskäyttöön tarkoitetut instrumentit ja välineet. Niiden on oltava puhtaita etenkin määritettäessä hyvin pieniä ainemääriä.

C.   MÄÄRITYSMENETELMIEN KÄYTTÖ JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

1.   Uuttomenettely

Useat menetelmät edellyttävät erityistä uuttomenetelmää. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita uuttomenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetyn menettelyn uuttoteho on analysoitavan materiaalin osalta samantasoinen kuin menetelmässä kuvatun menettelyn uuttoteho.

2.   Puhdistusmenettely

Useat menetelmät edellyttävät erityistä puhdistusmenetelmää. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita puhdistusmenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetty puhdistusmenettely johtaa tutkittavaa materiaalia analysoitaessa analyysituloksiin, jotka vastaavat menetelmässä mainittua menettelyä käytettäessä saatuja tuloksia.

3.   Käytetyn määritysmenetelmän ilmoittaminen

Yleensä kunkin rehussa olevan ainesosan määrittämiseksi vahvistetaan vain yksi määritysmenetelmä. Kun useita menetelmiä on mainittu, määritysselosteessa on mainittava tutkimuslaboratorion käyttämä menetelmä.

4.   Määritysten lukumäärä

Määritysselosteessa annetun tuloksen on oltava keskiarvo, joka on saatu ainakin kahdesta määrityksestä, jotka on tehty erillisistä näytteistä ja joiden toistettavuus on tyydyttävä.

Jos kuitenkin haitallisten aineiden määrityksessä ensimmäisen määrityksen tulos on merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu.

Kun kyse on aineen tai ainesosan ilmoitetun pitoisuuden valvonnasta ja jos ensimmäisen määrityksen tulos vahvistaa ilmoitetun pitoisuuden eli määrityksen tulos on ilmoitetun pitoisuuden hyväksyttävällä vaihteluvälillä, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu.

Joissain tapauksissa hyväksyttävä vaihteluväli on määritelty lainsäädännössä, kuten neuvoston direktiivissä 79/373/ETY (1).

5.   Määritystuloksen ilmoittaminen

Määritystulos on ilmaistava määritysmenetelmässä vahvistetulla tavalla asianmukaisella merkitsevien numeroiden tarkkuudella, ja tulos on tarvittaessa korjattava sen mukaan, mikä lopullisen näytteen kosteuspitoisuus oli ennen näytteen valmistamista.

6.   Mittausepävarmuus ja saanto haitallisten aineiden määrityksessä

Direktiivissä 2002/32/EY tarkoitettujen haitallisten aineiden, kuten dioksiinien ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden, ollessa kyseessä eläinten rehuksi tarkoitettua tuotetta ei pidetä vahvistetun enimmäispitoisuuden mukaisena, jos määritystuloksen katsotaan ylittävän enimmäispitoisuuden, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus ja korjaus saannon suhteen. Vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta, joka on korjattu saannon suhteen ja josta on vähennetty laajennettu mittausepävarmuus. Tätä menettelyä sovelletaan ainoastaan silloin, kun määritysmenetelmässä voidaan arvioida mittausepävarmuus ja korjata tulos saannon suhteen (esimerkiksi mikroskooppitutkimuksessa tämä ei ole mahdollista).

Määritystulos on esitettävä seuraavalla tavalla (sikäli kuin käytetty määritysmenetelmän mittausepävarmuus voidaan arvioida ja tulos korjata saannon suhteen):

a)	saannon suhteen korjattuna, saantoaste ilmoitetaan. Korjaus saannon suhteen ei ole tarpeen, jos saantoaste on 90–110 %;

b)	muodossa x +/- U, jossa x on määritystulos ja U on mittaukseen liittyvä laajennettu epävarmuus, käyttäen kattavuuskerrointa 2, jolloin luotettavuustaso on noin 95 %.

Kuitenkin jos määrityksen tulos on merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi ja edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu ja määrityksen ainoana tarkoituksena on todeta säännösten noudattaminen, määritystulos voidaan ilmoittaa ilman korjausta saannon suhteen, ja saantoaste ja mittausepävarmuus voidaan näissä tapauksissa jättää pois.

---

(1)  EYVL L 86, 6.4.1979, s. 30.

LIITE III

REHUAINEIDEN JA REHUSEOSTEN KOOSTUMUKSEN VALVONNASSA KÄYTETTÄVÄT MÄÄRITYSMENETELMÄT

A.   KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehun kosteuspitoisuus. Jos rehu sisältää haihtuvia aineita, kuten orgaanisia happoja, on huolehdittava siitä, että kosteuspitoisuuden kanssa määritetään myös merkittäviä määriä haihtuvia aineita.

Menetelmä ei koske suoraan rehuina käytettäviä maitotuotteita, kivennäisaineita ja pääasiassa kivennäisaineista koostuvia seoksia, eläin- ja kasvirasvoja ja -öljyjä tai öljysiemeniä ja öljypitoisia hedelmiä.

2.   Periaate

Näyte kuivataan määrätyissä olosuhteissa, jotka vaihtelevat rehun laadun mukaan. Painohäviö määritetään punnitsemalla. Hyvin kosteat, kiinteät rehunäytteet on syytä esikuivata ennen varsinaista kosteusmääritystä.

3.   Välineistö

3.1

Kosteutta imemättömästä materiaalista valmistettu mylly, joka on helppo puhdistaa ja jolla saadaan aikaan nopea, tasainen jauhautuminen mutta jolla vältetään havaittavissa oleva kuumentuminen ja ulkopuolisen ilman vaikutus mahdollisimman hyvin ja joka on 4.1.1 ja 4.1.2 kohdassa säädettyjen vaatimusten mukainen (esimerkiksi vasara- tai vesijäähdytteiset pienoismyllyt, kartiomyllyt, hitaasti liikkuvat tai hammaspyörillä varustetut hienonnuslaitteet).

3.2	Analyysivaaka, jonka tarkkuus on 1 mg.

3.3	Lasisia tai korroosionkestävästä metallista valmistettuja kuivausastioita, jotka voidaan sulkea ilmatiiviisti kannella; astian tilavuuden on oltava sellainen, että näytettä voidaan levittää sille noin 0,3 g/cm2.

3.4	Sähkölämmitteinen, tasalämpöinen ja nopeasti säädettävissä oleva lämpökaappi (± 2 oC), jossa on tuuletusjärjestelmä (1).

3.5	Säädettävä sähkölämmitteinen vakuumilämpökaappi, jossa on öljypumppu ja johon voidaan johtaa kuumaa, kuivaa ilmaa tai jossa voidaan käyttää kuivausainetta (kuten kalsiumoksidia).

3.6	Eksikkaattori, jossa on paksu rei’itetty metalli- tai posliinilevy ja joka sisältää tehokasta kuivausainetta.

4.   Menettely

Huomautus:

Tässä jaksossa kuvatut toimenpiteet on suoritettava välittömästi näytelähetyksen avaamisen jälkeen. Määritykset on suoritettava ainakin kahtena rinnakkaismäärityksenä.

4.1   Valmistaminen

4.1.1   Muut kuin 4.1.2 ja 4.1.3 kohdassa tarkoitetut rehut

Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Tarvittaessa se jauhetaan tai jaetaan sopivalla tavalla kosteuspitoisuuden muuttumista välttäen (ks. 6 kohta).

4.1.2   Vilja ja suurimot

Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Se jauhetaan niin hienoksi, että vähintään 50 % näytteestä läpäisee seulan, jonka reikien koko 0,5 mm, eikä 1 mm:n pyöreäreikäistä seulaa jää läpäisemättä yli 10 % näytteestä.

4.1.3   Nestemäiset ja liisterimäiset rehut sekä pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvat rehut

Punnitaan noin 25 g näytettä 10 mg:n tarkkuudella, lisätään sopiva määrä 10 mg:n tarkkuudella punnittua vedetöntä hiekkaa ja sekoitetaan kunnes saadaan homogeeninen seos.

4.2   Kuivaus

4.2.1   Muut kuin 4.2.2 ja 4.2.3 kohdassa tarkoitetut rehut

Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 1 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 103 oC:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua neljän tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 103 oC. Astia suljetaan kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

Pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvia rehuja kuivataan lämpökaapissa 130 oC:ssa vielä 30 minuutin ajan. Kahden punnituksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,1 % kosteudesta.

4.2.2   Vilja, jauhot, suurimot ja rouheet

Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 130 oC:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua kahden tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 130 oC. Astia suljetaan kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

4.2.3

Rehuseokset, jotka sisältävät yli 4 % sakkaroosia tai laktoosia: rehuaineet, kuten johanneksenleipäpuun palot, hydrolysoidut viljatuotteet, maltaat, kuivatut juurikasleikkeet, kala ja liukoisia sokereita sisältävät rehut; rehuseokset, jotka sisältävät yli 25 % mineraalisuoloja kidevesi mukaan luettuna. Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta vakuumilämpökaappiin (3.5), joka on kuumennettu 80–85 oC:seen. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Paine säädetään 100 torriksi ja annetaan kuivua vielä neljän tunnin ajan tässä paineessa joko kuumassa, kuivassa ilmavirrassa tai kuivausainetta käyttäen (noin 300 g 20:tä näytettä kohden). Jälkimmäisessä tapauksessa vakuumipumppu kytketään pois päältä, kun vaadittu paine on saavutettu. Kuivausaika lasketaan siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 80–85 oC. Kuivausajan päätyttyä lämpökaapin paine palautetaan varovasti normaalipaineeseen. Lämpökaappi avataan, näyteastia suljetaan välittömästi kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. Näytteen annetaan kuivua vielä 30 minuuttia vakuumilämpökaapissa 80–85 oC:ssa ja se punnitaan uudelleen. Kahden punnituksen välinen ero ei saa ylittää 0,1 %:a kosteudesta.

4.3   Esikuivaus

4.3.1   Muut kuin 4.3.2 kohdassa tarkoitetut rehut

Kiinteille, vaikeasti jauhettaville rehunäytteille, joiden kosteuspitoisuus on suuri, suoritetaan esikuivaus seuraavasti:

Punnitaan 50 g hienontamatonta näytettä (puristetut tai kokkareina olevat rehut voidaan tarvittaessa hienontaa karkeiksi) 10 mg:n tarkkuudella sopivaan astiaan (esim. 0,5 cm:n reunalla varustettu 20 x 12 cm:n alumiiniastia). Annetaan kuivua lämpökaapissa 60–70 oC:ssa, kunnes kosteuspitoisuus on laskenut 8–12 prosenttiin. Näyteastia otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä avoimena laboratoriossa tunnin ajan ja punnitaan 10 mg:n tarkkuudella. Näyte jauhetaan välittömästi 4.1.1 kohdassa esitetyllä tavalla ja kuivataan rehutyypin mukaan 4.2.1 tai 4.2.3 kohdassa esitetyllä tavalla.

4.3.2   Viljat

Jyvät, joiden kosteuspitoisuus on yli 17 %, on esikuivattava seuraavasti:

Punnitaan 50 g jauhamattomia jyviä 10 mg:n tarkkuudella sopivaan astiaan (esim. 0,5 cm:n reunalla varustettu 20 × 12 cm:n alumiiniastia). Annetaan kuivua lämpökaapissa 130 oC:ssa 5–7 minuuttia. Astia poistetaan lämpökaapista, annetaan jäähtyä avoimena laboratoriossa 2 tunnin ajan ja punnitaan 10 mg:n tarkkuudella. Jyvät jauhetaan välittömästi 4.1.2 kohdassa esitetyllä tavalla ja kuivataan 4.2.2 kohdan mukaisesti.

5.   Tulosten laskeminen

Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, lasketaan käyttäen seuraavia kaavoja:

5.1   Kosteuspitoisuus ilman esikuivausta

jossa:

m	=	näytteen alkuperäinen paino grammoina,
m0	=	näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

5.2   Kosteuspitoisuus esikuivausta käyttäen

jossa:

m	=	näytteen alkuperäinen paino grammoina,
m1	=	näytteen paino grammoina esikuivauksen jälkeen,
m2	=	näytteen paino grammoina hienontamisen tai jauhamisen jälkeen,
m0	=	näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

5.3   Toistettavuus

Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,2 % kosteuden absoluuttisesta arvosta.

6.   Huomautus

Jos jauhaminen on tarpeen ja sen havaitaan muuttavan tuotteen kosteuspitoisuutta, rehun komponenttien määritystulokset on korjattava alkuperäisen näytteen kosteuspitoisuuden perusteella.

B.   ELÄIN- JA KASVIRASVOJEN JA ÖLJYJEN KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen vesipitoisuus ja haihtuvien aineiden pitoisuus.

2.   Periaate

Näyte kuivataan vakiopainoon 103 oC:ssa (kahden peräkkäisen punnituksen välisen painoeron on oltava alle 1 mg). Painohäviö määritetään punnitsemalla.

3.   Välineistö

3.1	Korroosionkestävästä materiaalista valmistettu tasapohjainen astia, jonka läpimitta on 8–9 cm ja jonka korkeus on noin 3 cm.

3.2	Lämpömittari, jossa on vahvistettu säiliö ja yläpäässä oleva paisuntaputki ja joka on varustettu asteikolla noin 80 oC:sta ainakin 110 oC:seen ja jonka pituus on noin 10 cm.

3.3	Hiekkahaude tai sähkölevy.

3.4	Eksikkaattori, jossa on tehokasta kuivausainetta.

3.5	Analyysivaaka.

4.   Menettely

Punnitaan mg:n tarkkuudella noin 20 g homogenisoitua näytettä kuivaan punnittuun astiaan (3.1), jossa on lämpömittari (3.2). Näytettä kuumennetaan hiekkahauteella tai sähkölevyllä (3.3), sekoittaen jatkuvasti lämpömittarilla niin, että lämpötila saavuttaa 90 oC:n noin 7 minuutissa.

Lämpöä vähennetään pitäen silmällä lautasen pohjasta nousevien kuplien syntymisnopeutta. Lämpötila ei saa nousta yli 105 oC:n. Sekoitusta jatketaan astian pohjaa raaputtaen, kunnes kuplien muodostus lakkaa.

Kosteuden täydellisen poistumisen varmistamiseksi kuumennetaan useita kertoja 103 ± 2 oC:seen jäähdyttäen peräkkäisten kuumennusten välillä 93 oC:seen. Sen jälkeen astian sisältöineen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan eksikkaattorissa (3.4) ja punnitaan. Tämä menettely toistetaan niin monta kertaa, että kahden peräkkäisen punnituksen välinen ero ei ole yli 2 mg:aa.

Huomautus

:

Näytteen painon kasvu toistettujen kuumennusten jälkeen viittaa rasvan hapettumiseen, ja tällaisessa tapauksessa tulos lasketaan siitä punnituksesta, joka on tehty välittömästi ennen kuin paino on alkanut kasvaa.

5.   Tulosten laskeminen

Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, saadaan seuraavasta kaavasta:

joissa:

m	=	näytteen paino grammoina,
m1	=	astian paino sisältöineen grammoina ennen kuumennusta,
m2	=	astian paino sisältöineen grammoina kuumennuksen jälkeen.

Tulokset, jotka ovat pienempiä kuin 0,05 %, on varustettava merkinnällä ”alle 0,05 %”.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden samanaikaisen rinnakkaismäärityksen ero ei saa absoluuttisena arvona ilmoitettuna olla yli 0,05 %.

C.   RAAKAVALKUAISPITOISUUDEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan laskea Kjeldahlin menetelmän mukaan saadusta typpipitoisuudesta rehujen raakavalkuaispitoisuus.

2.   Periaate

Näyte hajotetaan rikkihapolla katalysaattorin läsnä ollessa. Hapan liuos tehdään emäksiseksi natriumhydroksidiliuoksella. Ammoniakki tislataan ja kerätään mitattuun määrään rikkihappoa, ja ylimääräinen rikkihappo titrataan natriumhydroksidin standardiliuoksella.

Vaihtoehtoisesti vapautunut ammoniakki tislataan ylimäärään boorihappoliuosta, jonka jälkeen se titrataan kloorivetyhappo- tai rikkihappoliuoksella.

3.   Reagenssit

3.1	Kaliumsulfaatti.

3.2	Katalysaattori: kupari(II)oksidi CuO tai kupari(II)sulfaattipentahydraatti, CuSO45H2O.

3.3	Sinkki, rakeinen.

3.4	Rikkihappo, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5	Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6	Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7	Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8	Metyylipunaindikaattori: 300 g metyylipunaista liuotetaan 100 ml:aan 95–96 % etanolia (v/v)

3.9	Natriumhydroksidiliuos (teknisen laadun käyttö mahdollista) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10	Natriumhydroksidi, standardiliuos c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11	Natriumhydroksidi, standardiliuos c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12	Kiehumakiviä, suolahapossa pestyjä ja hehkutettuja.

3.13	Asetanilidi (sulamispiste = 114 oC, typpipitoisuus = 10,36 %).

3.14	Typetön sakkaroosi.

3.15	Boorihappo (H3BO3).

3.16	Metyylipunaindikaattoriliuos: liuotetaan 0,1 g metyylipunaa 100 ml:aan etanolia tai metanolia.

3.17	Bromikresolivihreäliuos: liuotetaan 100 mg bromikresolivihreää 100 ml:aan etanolia tai metanolia.

3.18

Boorihappoliuos (10–40 g/l, käytettävien laitteiden mukaan) Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, boorihappoliuoksiin on lisättävä metyylipuna- ja bromokresoli-indikaattoreita. Kun boorihappoliuosta valmistetaan 1 litra, siihen on ennen tilavuuden säätämistä lisättävä 7 ml metyylipunaindikaattoriliuosta (3.16) ja 10 ml bromikresolivihreäliuosta (3.17). Käytetystä vedestä johtuen boorihappoliuoksen pH saattaa vaihdella erien välillä. Usein on lisättävä vähän emästä, jotta nollanäyte saadaan positiiviseksi. Huomautus : Säätäminen onnistuu yleensä lisäämällä noin 3–4 ml NaOH:ta (3.11) 1 litraan boorihappoa, jonka pitoisuus on 10 g/l. Liuos säilytetään huoneen lämpötilassa suojattuna valolta ja ammoniakkihöyryiltä.

3.19	Kloorivetyhapon standardiliuos c(HCl) = 0,10 mol/l. Huomautus : Myös muita standardiliuosten konsentraatioita (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ja 3.19) voidaan käyttää, jos konsentraatio korjataan laskelmissa. Konsentraatiot on aina ilmaistava neljän desimaalin tarkkuudella.

4.   Välineistö

Välineet näytteen hajottamista, tislausta ja titrausta varten Kjeldahlin menetelmän mukaan.

5.   Menettely

5.1   Hajotus

Punnitaan 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella Kjeldahl-kolviin hajotuspolttoa varten. Lisätään 15 g kaliumsulfaattia (3.1), sopiva määrä katalysaattoria (3.2) (0,3–0,4 g kupari(II)oksidia tai 0,9–1,2 g kupari(II)sulfaattipentahydraattia, 25 ml rikkihappoa (3.4) ja tarvittaessa muutamia kiehumakiviä (3.12) ja sekoitetaan.

Kolvia kuumennetaan varovasti tarvittaessa ajoittain pyörittäen, kunnes massa on hiiltynyt ja kuohu hävinnyt. Tämän jälkeen kuumennetaan voimakkaammin, kunnes neste kiehuu tasaisesti. Kuumennus on sopiva, jos kiehuva happo tiivistyy kolvin seinämiin. Kolvin seinämien ylikuumennusta ja orgaanisen aineksen tarttumista kolvin seinämiin on vältettävä.

Kun liuos on muuttunut kirkkaaksi ja kirkkaanvihreäksi, keittämistä jatketaan vielä kahden tunnin ajan; tämän jälkeen kolvin annetaan jäähtyä.

5.2   Tislaus

Kolviin lisätään varovasti riittävä määrä vettä, jotta sulfaatit liukenisivat täysin. Annetaan jäähtyä ja lisätään tarvittaessa muutama sinkkirae (3.3). Jatketaan 5.2.1 tai 5.2.2 kohdan mukaisesti.

5.2.1   Tislaus rikkihappoon

Tislauslaitteen keräilyastiaan lisätään oletetun typpipitoisuuden mukaan 25 ml rikkihappoa (3.5) tai (3.7) tarkasti mitattuna. Lisätään muutama pisara metyylipunaindikaattoria (3.8).

Kolvi yhdistetään tislauslaitteen jäähdyttimeen ja jäähdyttimen pää upotetaan keräilyastiassa olevaan liuokseen vähintään 1 cm:n syvyyteen (ks. 8.3 huomautus). Kolviin lasketaan hitaasti 100 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9) siten, ettei ammoniakkia katoa (ks. 8.1 huomautus). Kolvia kuumennetaan siten, että ammoniakki tislautuu kokonaan.

5.2.2   Tislaus boorihappoon

Kun tisleestä titrataan ammoniakki manuaalisesti, noudatetaan alla olevaa menettelyä. Jos tislauslaite on täysin automaattinen ja suorittaa ammoniakin titraamisen tisleestä, noudatetaan valmistajan käyttöohjeita.

Keräilyastia, joka sisältää 25–30 ml boorihappoliuosta (3.18), asetetaan jäähdyttimen ulostulon alle siten, että poistoputki jää boorihappoliuoksen pinnan alapuolelle. Tislauslaite säädetään annostelemaan 50 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9). Tislauslaitetta käytetään valmistajan ohjeiden mukaan ja tislataan pois natriumhydroksidiliuoksen lisäyksen tuloksena vapautunut ammoniakki. Tisle kerätään boorihappoa sisältävään vastaanottoliuokseen. Tisleen määrä (vesihöyrytislauksen aika) riippuu näytteen sisältämän typen määrästä. Valmistajan ohjeita noudatetaan.

Huomautus

:

Puoliautomaattisessa tislauslaitteessa natriumhydroksidiylimäärän lisäys ja vesihöyrytislaus tapahtuvat automaattisesti.

5.3   Titraus

Jatketaan 5.3.1 tai 5.3.2 kohdan mukaisesti.

5.3.1   Rikkihappo

Keräilyastiassa oleva rikkihappoylimäärä titrataan käytetyn rikkihapon konsentraation mukaan natriumhydroksidiliuoksella (3.10 tai 3.11), kunnes loppupiste saavutetaan.

5.3.2   Boorihappo

Keräilyastian sisältö titrataan kloorivetyhapon standardiliuoksella (3.19) tai rikkihapon standardiliuoksella (3.6) byrettiä käyttäen ja todetaan käytetyn titrausliuoksen määrä.

Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, loppupiste on saavutettu, kun sisältöön alkaa ilmestyä vaaleanpunaista väriä. Byretin lukema arvioidaan 0,05 ml:n tarkkuudella. Loppupisteen havaitseminen saattaa olla helpompaa valaistun magneettisekoittimen tai fotometrisen detektorin avulla.

Tämä voidaan tehdä automaattisesti vesihöyrytislaimella, jossa on automaattinen titraus.

Tislauslaitteen tai tislaus/titrauslaitteen käytössä noudatetaan valmistajan ohjeita.

Huomautus

:

Kun käytetään automaattista titrausjärjestelmää, titraus alkaa välittömästi tislauksen alettua ja kun 1-prosenttinen boorihappoliuos (3.18) on kulunut. Käytettäessä täysin automaattista tislausyksikköä ammoniakki voidaan titrata automaattisesti ja loppupiste detektoida käyttämällä potentiometristä pH-järjestelmää. Tässä tapauksessa käytetään automaattista titrauslaitetta, jossa on pH-mittari. pH-mittari on kalibroitava asianmukaisesti välille pH 4–7 noudattaen tavanomaisia laboratorioiden pH-kalibrointimenettelyjä. Titrauksen pH-loppupiste saavutetaan, kun pH on 4,6, mikä on titrauskäyrän jyrkin kohta (käännekohta).

5.4   Nollakoe

Reagenssien typettömyyden varmistamiseksi suoritetaan nollakoe (hajotus, tislaus ja titraus) käyttämällä 1 g sakkaroosia (3.14) näytteen sijasta.

6.   Tulosten laskeminen

Tulokset lasketaan 6.1 tai 6.2 kohdan mukaisesti.

6.1   Tuloksen laskeminen 5.3.1 kohdan mukaisessa titrauksessa

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavaa kaavaa käyttäen:

jossa:

V0	=	nollakokeessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml),
V1	=	näytteen titrauksessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml),
c	=	natriumhydroksidin (3.10 tai 3.11) konsentraatio (mol/l),
m	=	näytteen paino (g).

6.2   Tuloksen laskeminen 5.3.2 kohdan mukaisessa titrauksessa

6.2.1   Titraus kloorivetyhapolla

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

m	=	näytteen paino (g),
c	=	kloorivetyhapon standardiliuoksen (3.19) konsentraatio (mol/l),
V0	=	nollakokeessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml),
V1	=	näytteen titrauksessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml).

6.2.2   Titraus rikkihapolla

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

m	=	näytteen paino (g),
c	=	rikkihapon standardiliuoksen (3.6) konsentraatio (mol/l),
V0	=	nollakokeessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml),
V1	=	näytteen titrauksessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml).

7.   Menetelmän varmistus

7.1   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin:

—	0,2 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on alle 20 %,

—	1,0 %, suhteellisena arvona suuremmasta lukuarvosta, kun raakavalkuaispitoisuus on 20–40 %,

—	0,4 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on yli 40 %.

7.2   Tarkkuus

Määritys (hajotus, tislaus ja titraus) tehdään 1,5–2,0 grammalla asetanilidia (3.13) siten, että läsnä on 1 grammaa sakkaroosia (3.14); 1 g asetanilidia kuluttaa 14,80 ml rikkihappoa (3.5). Saannon on oltava vähintään 99 %.

8.   Huomautukset

8.1

Välineet voivat olla käsikäyttöisiä, puoliautomaattisia tai automaattisia. Jos liuos joudutaan siirtämään astiasta toiseen hajotuksen ja tislauksen välillä, siirto on suoritettava siten, ettei häviöitä tapahdu. Jos tislauslaitteen kolvissa ei ole tiputussuppiloa, lisätään natriumhydroksidi välittömästi ennen kolvin liittämistä jäähdyttimeen kaataen liuos hitaasti kolvin seinämää myöten.

8.2	Jos hajotettu tuote kiinteytyy, määritys on aloitettava alusta käyttämällä suurempaa määrää rikkihappoa (3.4) kuin edellä on mainittu.

8.3	Kun tuotteiden typpipitoisuus on alhainen, voidaan rikkihapon (3.7) määrä keräilyastiassa tarvittaessa vähentää 10–15 ml:aan ja täyttää 25 ml:ksi vettä lisäämällä.

8.4

Raakavalkuaisen rutiinimäärityksissä voidaan käyttää vaihtoehtoisia menetelmiä, mutta vertailumenetelmänä on käsillä olevassa C osassa kuvailtu Kjeldahlin menetelmä. Vaihtoehtoisilla menetelmillä (kuten Dumas-menetelmällä) saatujen tulosten vastaavuus on osoitettava erikseen kunkin analysoitavan materiaalin osalta. Koska vaihtoehtoisilla menetelmillä saadut tulokset saattavat vastaavuuden varmistamisesta huolimatta hieman poiketa vertailumenetelmällä saaduista tuloksista, määritysselosteessa on mainittava, mitä menetelmää raakavalkuaisen määrityksessä on käytetty.

D.   UREAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen ureapitoisuus.

2.   Periaate

Näyte suspendoidaan veteen sellaisen aineen läsnä ollessa, joka saa suspension kirkastumaan. Suspensio suodatetaan. Suodoksen ureamäärä määritetään sen jälkeen kun siihen on lisätty 4-dimetyyliaminobentsaldehydiä (4-DMAB) mittaamalla liuoksen absorbanssi 420 nm:n aallonpituudella.

3.   Reagenssit

3.1	4-dimetyyliaminobentsaldehydiliuos: 1,6 g 4-DMAB:ta liuotetaan 100 ml:aan 96-prosenttista etanolia ja siihen lisätään 10 ml kloorivetyhappoa (ρ201,19 g/ml). Tämä reagenssi säilyy korkeintaan kahden viikon ajan.

3.2	Carrez-liuos I: veteen liuotetaan 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jääetikkaa. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä.

3.3	Carrez-liuos II: Liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6 3H2O. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4	Aktiivihiili, joka ei absorboi ureaa (tarkastettava).

3.5	Urealiuos 0,1 % (w/v).

4.   Välineistö

4.1	Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

4.2	Lasihiostulpallisia koeputkia 160 × 16 mm.

4.3	Spektrofotometri.

5.   Menettely

5.1   Näytteen määritys

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2 g näytettä sekä 1 g aktiivihiiltä (3.4) 500 ml:n mittapulloon. Lisätään 400 ml vettä ja 5 ml Carrez I -liuosta (3.2), sekoitetaan noin 30 sekunnin ajan ja lisätään 5 ml Carrez II -liuosta (3.3). Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään vettä merkkiin asti, sekoitetaan ja suodatetaan.

Läpinäkyvästä, värittömästä suodoksesta pipetoidaan 5 ml lasihiostulpallisiin koeputkiin, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1) ja sekoitetaan. Putket asetetaan 20 C:ssa (+/– 4 C) olevaan vesihauteeseen. Viidentoista minuutin kuluttua mitataan näyteliuoksen absorbanssi spektrofotometrillä 420 nm:n aallonpituudella. Lukemaa verrataan reagensseista valmistettuun nollakoeliuokseen.

5.2   Kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 100 ml:n mittapulloihin 1, 2, 4, 5 ja 10 ml urealiuosta (3.5) ja täytetään merkkiin asti vedellä. Kutakin liuosta pipetoidaan koeputkiin 5 ml, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1), homogenoidaan ja niiden absorbanssi mitataan edellä kuvatulla tavalla verrattuna kontrolliliuokseen, joka sisältää 5 ml 4-DMAB:ta ja 5 ml vettä ja jossa ei ole ureaa. Piirretään kalibrointikäyrä.

6.   Tulosten laskeminen

Urean määrä näytteessä määritetään kalibrointikäyrää käyttäen.

Tulokset ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Huomautukset

7.1	Kun urean määrä ylittää 3 %, näytteen määrä vähennetään 1 g:ksi tai alkuperäinen liuos laimennetaan siten, ettei siinä ole yli 50 mg ureaa 500 ml:ssa.

7.2	Kun ureapitoisuus on alhainen, näytteen kokoa suurennetaan, kunhan suodos säilyy läpinäkyvänä ja värittömänä.

7.3	Jos näyte sisältää yksinkertaisia typpiyhdisteitä, kuten aminohappoja, optinen tiheys on mitattava 435 nm:ssä.

E.   HAIHTUVIEN TYPPIPITOISTEN EMÄSTEN MÄÄRITYS

I   MIKRODIFFUUSIO

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehuista haihtuvien typpipitoisten emästen pitoisuus ammoniakkina ilmoitettuna.

2.   Periaate

Näyte uutetaan vedellä, liuos kirkastetaan ja suodatetaan. Haihtuvat typpipitoiset emäkset vapautetaan mikrodiffuusiolla käyttäen kaliumkarbonaattiliuosta, sidotaan boorihappoliuokseen ja titrataan rikkihapolla.

3.   Reagenssit

3.1	Trikloorietikkahappoliuos, 20 % (w/v).

3.2	Indikaattori: liuotetaan 33 mg bromikresolivihreää ja 65 mg metyylipunaista 100 ml:aan 95–96-prosenttista (v/v) etanolia.

3.3

Boorihappoliuos: liuotetaan 10 g boorihappoa 1 litran mittapullossa 200 ml:aan 95–96-prosenttista (v/v) etanolia ja 700 ml:aan vettä. Lisätään 10 ml indikaattoria (3.2). Sekoitetaan ja liuoksen väri säädetään tarvittaessa vaaleanpunaiseksi lisäämällä natriumhydroksidiliuosta. 1 ml tätä liuosta sitoo enintään 300 μg NH3:a.

3.4	Kyllästetty kaliumkarbonaattiliuos: liuotetaan 100 g kaliumkarbonaattia 100 ml:aan kiehuvaa vettä. Annetaan jäähtyä ja suodatetaan.

3.5	Rikkihappo, 0,01 mol/l.

4.   Välineistö

4.1	Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

4.2	Lasisia tai muovisia Conway-maljoja (ks. oheinen kaavio).

4.3	1/100 ml:n asteikolla varustettuja mikrobyrettejä.

5.   Menettely

Punnitaan 10 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon, johon lisätään 100 ml vettä. Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään 50 ml trikloorietikkahappoliuosta (3.1), täytetään merkkiin asti vedellä, ravistellaan voimakkaasti ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi.

Pipetoidaan Conway-maljan keskiympyrään 1 ml boorihappoliuosta (3.3) ja reunaympyrään 1 ml näytemaljasuodosta. Peitetään osittain rasvatulla kannella. Reunaympyrään lisätään nopeasti 1 ml kyllästettyä kaliumkarbonaattiliuosta (3.4) ja kansi suljetaan ilmatiiviisti. Maljaa pyöritetään varovasti vaakasuorassa tasossa siten, että nämä kaksi reagenssia sekoittuvat. Inkuboidaan vähintään neljä tuntia huoneenlämmössä tai yksi tunti 40 oC:ssa.

Boorihappoliuoksessa olevat haihtuvat emäkset titrataan rikkihapolla (3.5) mikrobyrettiä (4.3) käyttäen.

Nollakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä.

6.   Tulosten laskeminen

1 ml H2SO4:ää, 0,01 mol/l, vastaa 0,34 mg:aa ammoniakkia.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

—	10 %:a, suhteellisena arvona ilmoitettuna, kun ammoniakkipitoisuus on alle 1,0 %,

—	0,1 %:a, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, kun ammoniakkipitoisuus on vähintään 1,0 %.

7.   Huomautus

Jos näytteen ammoniakkipitoisuus ylittää 0,6 %, on alkuperäinen suodos laimennettava.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II   TISLAUSMENETELMÄ

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää haihtuvien typpipitoisten emästen pitoisuus ammoniakkina ilmoitettuna kalajauhosta, joka ei käytännöllisesti katsoen sisällä ureaa. Menetelmä soveltuu ainoastaan näytteisiin, joiden ammoniakkipitoisuus on alle 0,25 %.

2.   Periaate

Näyte uutetaan vedellä, liuos kirkastetaan ja suodatetaan. Haihtuvat typpipitoiset emäkset vapautuvat keitettäessä näyteliuosta magnesiumoksidin kanssa ja ne sidotaan tunnettuun määrään rikkihappoa, jonka ylimäärä titrataan takaisin natriumhydroksidiliuoksella.

3.   Reagenssit

3.1	Trikloorietikkahappoliuos, 20 % (w/v).

3.2	Magnesiumoksidi.

3.3	Kuohunestoaine (esim. silikoni).

3.4	Rikkihappo, 0,05 mol/l.

3.5	Natriumhydroksidiliuos, 0,1 mol/l.

3.6	Metyylipunaliuos, 0,3 % (w/v), joka on valmistettu 95–96-prosenttiseen (v/v) etanoliin.

4.   Välineistö

4.1	Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

4.2	Kjeldahl-tyyppinen tislauslaitteisto.

5.   Menettely

Punnitaan 10 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon, johon lisätään 100 ml vettä. Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään 50 ml trikloorietikkahappoliuosta (3.1), täytetään merkkiin asti vedellä, ravistellaan voimakkaasti ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi.

Otetaan kirkasta liuosta sopiva määrä haihtuvien typpipitoisten emästen oletetun pitoisuuden kannalta (100 ml on yleensä sopiva määrä). Laimennetaan 200 ml:ksi ja lisätään 2 g magnesiumoksidia (3.2) ja muutama pisara kuohunestoainetta (3.3). Liuoksen on oltava lakmuspaperilla määritettynä emäksinen; muussa tapauksessa siihen lisätään hieman magnesiumoksidia (3.2). Jatketaan raakavalkuaispitoisuuden määrityksessä käytettävän menetelmän 5.2 ja 5.3 kohdan mukaisesti (tämän liitteen C osa).

Nollakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä.

6.   Tulosten laskeminen

1 ml H2SO4:ää, 0,05 mol/l, vastaa 1,7 mg:aa ammoniakkia.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suhteellisena arvona ilmoitettuna suurempi kuin 10 % ammoniakkimäärästä.

F.   AMINOHAPPOJEN MÄÄRITYS (TRYPTOFAANIA LUKUUN OTTAMATTA)

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen vapaat aminohapot (synteettiset ja luonnon aminohapot) ja kokonaisaminohapot (peptideihin kiinnittyneet ja vapaat) aminohappoanalysaattorilla. Se sopii seuraaviin aminohappoihin: kyst(e)iini, metioniini, lysiini, treoniini, alaniini, arginiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, glysiini, histidiini, isoleusiini, leusiini, fenyylialaniini, proliini, seriini, tyrosiini ja valiini.

Menetelmällä ei eroteta toisistaan aminohappojen suoloja eikä aminohappojen D- ja L-muotoja. Se ei sovellu tryptofaanin eikä aminohappojen hydroksianalogien määritykseen.

2.   Periaate

2.1   Vapaat aminohapot

Vapaat aminohapot uutetaan laimealla kloorivetyhapolla. Mukana uuttuneet typpipitoiset makromolekyylit saostetaan sulfosalisyylihapolla ja poistetaan suodattamalla. Suodatetun liuoksen pH säädetään arvoon 2,20. Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm.

2.2   Kokonaisaminohapot

Menetelmä valitaan tutkittavien aminohappojen mukaan. Kyst(e)iini ja metioniini on hapetettava kysteiinihapoksi ja metioniinisulfoniksi ennen hydrolyysiä. Tyrosiini on määritettävä näytteistä, joita ei hapeteta ennen hydrolyysiä. Kaikki muut 1 kohdassa mainitut aminohapot voidaan määrittää joko hapetetusta tai hapettamattomasta näytteestä.

Hapettaminen tapahtuu 0 oC:ssa permuurahaishapon ja fenolin seoksella. Hapetusreagenssin ylimäärä hajotetaan natriumdisulfiitin avulla. Hapetettu tai hapettamaton näyte hydrolysoidaan kloorivetyhapolla (3.20) avulla 23 tunnin ajan. Hydrolyysituotteen pH säädetään arvoon 2,20. Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm (proliini 440 nm).

3.   Reagenssit

Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS).

3.1	Vetyperoksidi, w (w/w) = 30 %.

3.2	Muurahaishappo, w (w/w) = 98–100 %.

3.3

Fenoli.

3.4	Natriumdisulfiitti.

3.5	Natriumhydroksidi.

3.6	5-Sulfosalisyylihappo-dihydraatti.

3.7	Kloorivetyhappo, tiheys noin 1,18 g/ml.

3.8	Trinatriumsitraatti-dihydraatti.

3.9	2,2'-Tiodietanoli (tiodiglykoli).

3.10	Natriumkloridi.

3.11	Ninhydriini.

3.12	Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 oC.

3.13	Norleusiini tai muu yhdiste, jota voidaan käyttää sisäisenä standardina.

3.14	Typpikaasu (<10 ppm happea).

3.15	1-Oktanoli.

3.16	Aminohapot.

3.16.1

Edellä 1 kohdassa luetellut standardina käytettävät yhdisteet. Puhtaat yhdisteet, jotka eivät sisällä kidevettä. Kuivataan tyhjiössä P2O5:n tai H2SO4:n päällä viikon ajan ennen käyttöä.

3.16.2

Kysteiinihappo.

3.16.3

Metioniinisulfoni.

3.17	Natriumhydroksidiliuos, c = 7,5 mol/l: liuotetaan 300 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi.

3.18	Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l: liuotetaan 40 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi.

3.19	Muurahaishappo-fenoliliuos: sekoitetaan 889 g muurahaishappoa (3.2) ja 111 g vettä ja lisätään 4,73 g fenolia (3.3).

3.20	Hydrolyysiseos, c = 6 mol HCl/l ja 1 g fenolia litrassa: lisätään 1 g fenolia (3.3) 492 ml:aan HCl (3.7) ja laimennetaan vedellä 1 litraksi.

3.21	Uuttoseos, c = 0,1 mol HCl /l ja 2 % tiodiglykolia litrassa: laimennetaan 8,2 ml HCl (3.7) noin 900 ml:aan vettä, lisätään 20 ml tiodiglykolia (3.9) ja täytetään vedellä yhdeksi litraksi (ei sekoiteta suoraan aineita 3.7 ja 3.9).

3.22	5-Sulfosalisyylihappo, ß = 6 %: Liuotetaan 60 g 5-sulfosalisyylihappoa (3.6) veteen ja laimennetaan vedellä litraksi.

3.23

Hapetusseos (permuurahaishappo-fenoli): sekoitetaan 0,5 ml vetyperoksidia (3.1) 4,5 ml:aan muurahaishappo-fenoliliuosta (3.19) pienessä dekantterilasissa. Inkuboidaan 20–30 oC:ssa tunnin ajan, jotta saadaan permuurahaishappoa, annetaan sitten jäähtyä jäävesihauteessa (15 min) ennen näytteeseen lisäämistä. Varoitus: vältettävä ihokosketusta ja käytettävä suojavaatteita.

3.24	Sitraattipuskuriliuos, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: liuotetaan 19,61 g natriumsitraattia (3.8), 5 ml tiodiglykolia (3.9), 1 g fenolia (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) noin 800 ml:aan vettä. Säädetään pH arvoon 2,20. Laimennetaan vedellä yhdeksi litraksi.

3.25	Eluointipuskurit, valmistetaan analysaattorin vaatimusten mukaisesti (4.9).

3.26	Ninhydriinireagenssi, valmistetaan analysaattorin vaatimusten mukaisesti (4.9).

3.27	Aminohappojen standardiliuokset. Nämä liuokset säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa.

3.27.1

Aminohappojen standardin kantaliuos (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml kutakin aminohappoa kloorivetyhapossa. Saatavana kaupallisesti.

3.27.2

Kysteiinihapon ja metioniinisulfonin standardin kantaliuos, c = 1,25 μmol/ml. Liuotetaan 0,2115 g kysteiinihappoa (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinisulfonia (3.16.3) sitraattipuskuriin (3.24) litran mittapullossa ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla. Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 12 kuukautta. Tätä liuosta ei tarvita, jos standardin kantaliuos (3.27.1) sisältää kysteiinihappoa ja metioniinisulfonia.

3.27.3

Sisäisen standardin kantaliuos, esimerkiksi norleusiini, c = 20 μmol/ml. Liuotetaan 0,6560 g norleusiinia (3.13) sitraattipuskuriin (3.24) mittapullossa ja täytetään 250,0 ml:ksi sitraattipuskurilla (3.24). Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 6 kuukautta.

3.27.4

Aminohappojen kalibrointiliuos hydrolysaateille: kysteiinihappo ja metioniinisulfoni, c = 5 nmol/50 μl, muut aminohapot c = 10 nmol/50 μl. Liuotetaan 2,2 g natriumkloridia (3.10) 30 ml:aan sitraattipuskuria (3.24) 100 ml:n dekantterilasissa. Lisätään 4,00 ml aminohappojen standardin kantaliuosta (3.27.1), 4,00 ml kysteiinihapon ja metioniinisulfonin standardin kantaliuosta (3.27.2) ja tarvittaessa 0,50 ml sisäisen standardin kantaliuosta (3.27.3). Säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidilla (3.18). Siirretään kvantitatiivisesti 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24) ja sekoitetaan. Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta. Katso myös huomautukset 9.1 kohdassa.

3.27.5

Aminohappojen kalibrointiliuos 5.3.3.1 kohdan mukaisesti valmistetuille hydrolysaateille ja uutteille (5.2). Kalibrointiliuos valmistetaan 3.27.4 kohdan mukaisesti kuitenkin jättäen natriumkloridi pois. Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta.

4.   Välineistö

4.1	100 ml:n tai 250 ml:n pyörökolvi, joka on varustettu palautusjäähdyttimellä.

4.2	Borosilikaattilasinen 100 ml:n pullo, jossa on kumi/teflontiivisteinen kierrettävä uuninkestävä korkki (esimerkiksi Duran, Schott).

4.3	Koneellisella ilmanvaihdolla varustettu ja lämpötilaltaan säädettävä kuivausuuni, jonka tarkkuus on parempi kuin ± 2 oC.

4.4	pH-mittari (lukemat kolmen desimaalin tarkkuudella).

4.5	Kalvosuodatin (0,2 μm).

4.6	Sentrifugi.

4.7	Vakuumipyöröhaihdutin.

4.8	Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin.

4.9

Aminohappoanalysaattori tai HPLC-laitteisto, joissa on ioninvaihtokolonni, välineistö kolonnin jälkeistä ninhydriiniderivointia varten ja fotometri. Kolonni täytetään sellaisella sulfonoidulla polystyreenihartsilla, jolla voidaan erottaa eri aminohapot toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista yhdisteistä. Puskuri- ja ninhydriinipumpun virtausnopeuden stabiilisuuden tulee olla ±0,5 % ajanjaksona, jona analysoidaan sekä standardiliuos että näyte. Tietyissä aminohappoanalysaattoreissa voidaan käyttää hydrolyysimenetelmää, jossa hydrolysaatin natriumpitoisuus on c = 0,8 mol/l ja se sisältää näin kaiken hapetuksessa jäljelle jääneen muurahaishapon. Muut laitteet eivät erota tyydyttävästi tiettyjä aminohappoja, jos hydrolysaatti sisältää liikaa muurahaishappoa ja/tai natriumionipitoisuus on suuri. Tässä tapauksessa hapon määrää vähennetään haihduttamalla hydrolysaatti noin 5 ml:aan ennen pH:n säätämistä. Haihduttamisen on tapahduttava tyhjiössä enintään 40 oC:ssa.

5.   Menettely

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joiden kosteuspitoisuus on suuri, on ilmakuivattava korkeintaan 50 oC:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joiden rasvapitoisuus on suuri, on uutettava petrolieetterillä (3.12) ennen jauhamista.

5.2   Vapaiden aminohappojen määrittäminen rehuista ja esiseoksista

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin ja lisätään 100,0 ml uuttoseosta (3.21). Ravistellaan seosta 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.8). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin.

Lisätään koko ajan sekoittaen 5,0 ml sulfosalisyylihappoliuosta (3.22) ja jatketaan sekoittamista 5 minuutin ajan magneettisekoittimella. Suodatetaan tai sentrifugoidaan liuos mahdollisen sakan erottamiseksi. Pipetoidaan 10,0 ml saatua liuosta 100 ml:n dekantterilasiin, säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18), huuhdotaan sopivan kokoiseen mittapulloon sitraattipuskurilla (3.24) ja täytetään merkkiin asti puskuriliuoksella (3.24).

Jos käytetään sisäistä standardia (3.27.3), sitä lisätään 1,00 ml lopullisen liuoksen kutakin 100 ml:aa kohden ja täytetään merkkiin asti purskuriliuoksella (3.24).

Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, uutteet säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa.

5.3   Kokonaisaminohappojen määrittäminen

5.3.1   Hapettaminen

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1–1 g valmistettua näytettä (5.1):

—	100 ml:n pyörökolviin (4.1) avointa hydrolyysiä varten (5.3.2.3), tai

—	250 ml:n pyörökolviin (4.1), jos tarvitaan alhaista natriumpitoisuutta (5.3.3.1), tai

—	100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) suljettua hydrolyysiä varten (5.3.2.4).

Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg ja kosteuspitoisuuden enintään 100 mg.

Asetetaan pyörökolvi tai pullo jää-vesihauteeseen ja jäähdytetään 0 oC:seen, lisätään 5 ml hapetusseosta (3.23) ja sekoitetaan kaarevakärkisellä lasilastalla. Suljetaan kolvi/pullo lastoineen ilmatiiviin kalvon avulla, asetetaan jää-vesihaude näin suljettuine astioineen jääkaappiin, jonka lämpötila on 0 oC, ja jätetään sinne 16 tunniksi. Tämän jälkeen se otetaan jääkaapista ja hajotetaan hapetusreagenssin ylimäärä lisäämällä 0,84 g natriumdisulfiittia (3.4).

Siirrytään 5.3.2.1 kohtaan.

5.3.2   Hydrolyysi

5.3.2.1    Hapetettujen näytteiden hydrolyysi

Edellä 5.3.1. kohdan mukaisesti valmistettuun hapetettuun näytteeseen lisätään 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) huolehtien siitä, että astian seinämiin ja lastaan jäänyt näyte huuhdellaan pois.

Jatketaan valitun hydrolyysimenetelmän mukaan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta.

5.3.2.2    Hapettamattomien näytteiden hydrolyysi

Punnitaan 100 ml:n tai 200 ml:n pyörökolviin (4.1) tai 100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) 0,1–1,0 g valmistettua näytettä (5.1) 0,2 mg:n tarkkuudella. Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään varovasti 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) ja sekoitetaan näytteeseen. Jatketaan joko 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta.

5.3.2.3    Avoin hydrolyysi

Lisätään kolme lasihelmeä kolvissa olevaan seokseen (valmistettu 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti) ja keitetään tasaisesti kuplittaen palautusjäähdyttimen alla 23 tuntia. Hydrolyysin jälkeen huuhdellaan jäähdytin 5 ml:lla sitraattipuskuria (3.24). Kolvi irrotetaan ja jäähdytetään jäähauteessa.

Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti.

5.3.2.4    Suljettu hydrolyysi

Asetetaan 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti valmistettua näyteseosta sisältävä pullo uuniin (4.3) 110 oC:seen. Ensimmäisen tunnin aikana pidetään kierrekorkki sulkematta pullon päällä, jottei kaasun muodostuksen vuoksi syntyisi painetta ja jotta vältyttäisiin räjähdyksiltä. Pulloa ei saa sulkea korkilla. Tunnin kuluttua pullo suljetaan kierrekorkilla ja sen annetaan olla uunissa (4.3) 23 tunnin ajan. Hydrolyysin jälkeen pullo otetaan uunista, avataan korkki varovasti ja asetetaan pullo jää-vesihauteeseen. Annetaan jäähtyä.

Riippuen tavasta, jolla pH säädetään (5.3.3), siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti sitraattipuskurin avulla (3.24) 250 ml:n dekantterilasiin tai 250 ml:n pyörökolviin.

Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti.

5.3.3   pH:n säätäminen

Aminohappoanalysaattorin (4.9) natriuminsietokyvyn mukaan noudatetaan 5.3.3.1 tai 5.3.3.2 kohtaa pH:n säätämiseksi.

5.3.3.1    Kromatografit (4.9), jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta

On suositeltavaa käyttää sisäisen standardin perusliuosta (3.27.3), jos käytetään aminohappoanalysaattoreita, jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta (kun hapon määrää on vähennettävä).

Tässä tapauksessa lisätään 2,00 ml sisäisen standardin perusliuosta (3.27.3) hydrolysaattiin ennen haihdutusta tai sen jälkeen.

Lisätään 2 tippaa 1-oktanolia (3.15) 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdan mukaisesti saatuun hydrolysaattiin.

Haihdutetaan näyte 5–10 ml:aan pyöröhaihduttimella (4.7), jonka hauteen lämpötila on 40 oC. Jos tilavuus pienenee vahingossa alle viiden millilitran, hydrolysaatti on hylättävä ja analyysi aloitettava uudelleen.

pH säädetään arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18) ja jatketaan kohdasta 5.3.4.

5.3.3.2    Muut aminohappoanalysaattorit (4.9):

Kohdan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 mukaisesti saatu hydrolysaatti neutraloidaan osittain lisäämällä varovasti koko ajan sekoittaen 17 ml natriumhydroksidiliuosta (3.17) ja huolehditaan siitä, että lämpötila on alle 40 oC.

Lopullinen pH:n säätäminen 2,20:een tapahtuu huoneen lämpötilassa 3.17 kohdan mukaisen natriumhydroksidiliuoksen avulla ja lopuksi 3.18 kohdan mukaisella natriumhydroksidiliuoksella. Siirrytään 5.3.4 kohtaan.

5.3.4   Näyteliuos kromatografiaa varten

Siirretään kvantitatiivisesti hydrolysaatti, jonka pH on säädetty (5.3.3.1 tai 5.3.3.2.), sitraattipuskurilla (3.24) 200 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti puskurilla (3.24).

Jos sisäistä standardia ei ole vielä käytetty, lisätään sitä 2,00 ml (3.27.3) ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24). Sekoitetaan huolellisesti.

Siirrytään kromatografiavaiheeseen (5.4).

Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, näyteliuokset säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa.

5.4   Kromatografia

Annetaan uutteen (5.2) tai hydrolysaatin (5.3.4) tasoittua huoneenlämpöisiksi ennen kromatografiaa. Ravistellaan seosta ja suodatetaan sopiva määrä 0,2 μm:n kalvosuodattimen läpi (4.5). Saatu kirkas liuos analysoidaan aminohappoanalysaattorilla käyttäen ioninvaihtokromatografiaa (4.9).

Injektio voidaan suorittaa käsin tai automaattisesti. On tärkeää, että kolonniin lisätään aina sama määrä (±0,5 %) vertailu- tai näyteliuosta, paitsi silloin kun käytetään sisäistä standardia, ja että natriumin ja aminohappojen suhde standardi- ja näyteliuoksissa on mahdollisimman lähellä toisiaan.

Kalibrointiajojen tiheys riippuu ninhydriinireagenssin ja analysaattorin toiminnan stabiilisuudesta. Standardi- tai näyteliuosta laimennetaan sitraattipuskurilla (3.24), siten, että standardiliuoksen antama piikin pinta-ala on 30–200 % näytteen aminohapon antaman piikin pinta-alasta.

Aminohappojen kromatografia vaihtelee jonkin verran käytetyn analysaattorin tyypin ja käytetyn hartsin mukaan. Valitun menetelmän on mahdollistettava aminohappojen erottaminen toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista aineista. Pylvääseen ruiskutettujen yhdisteiden pitoisuuden muutosten on käyttöalueella annettava lineaarinen vaste.

Analysoitaessa aminohappojen ekvimolaarisia liuoksia sovelletaan seuraavassa kappaleessa määriteltyjä laakson ja piikin välisiä suhteita. Ekvimolaarisen liuoksen tulee sisältää vähintään 30 % kunkin aminohapon siitä enimmäismäärästä, joka voidaan määrittää tarkasti käytetyllä aminohappoanalysaattorilla (4.9).

Kromatogrammissa treoniinin ja seriinin osittain päällekkäisten piikkien välisen laakson suhde matalamman piikin korkeuteen ei saa olla suurempi kuin 2:10. (Jos määritetään ainoastaan kyst(e)iiniä, metioniiniä, treoniiniä ja lysiiniä, vierekkäisten piikkien riittämätön erottuminen toisistaan häiritsee määritystä.) Muiden aminohappojen osalta erottumisen on oltava parempi kuin 1:10.

Kromatografiajärjestelmän on pystyttävä erottamaan lysiini lysiiniartefaktoista ja ornitiinistä.

6.   Tulosten laskeminen

Näytteen ja vertailuliuoksen piikkien pinta-ala mitataan kunkin yksittäisen aminohapon osalta ja määrä (X) lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti; tulos ilmoitetaan grammoina aminohappoa näytekiloa kohden.

Jos sisäistä standardia käytetään, kerrotaan kaava vielä termillä

A	=	analysoitavan piikin pinta-ala, hydrolysaatti tai uute
B	=	analysoitavan piikin pinta-ala, standardiliuos
C	=	sisäisen standardin piikin pinta-ala hydrolysaatissa tai uutteessa
D	=	sisäisen standardin piikin pinta-ala kalibrointiliuoksessa
M	=	analysoitavan aminohapon molekyylipaino
c	=	standardin konsentraatio μmol/ml
m	=	näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu tai rasva poistettu)
V	=	ml kokonaishydrolysaattia (5.3.4) tai ml uutteen laskettua kokonaislaimennosta (6.1).

Sekä kystiini että kysteiini määritetään kysteiinihappona hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta ne lasketaan kystiiniksi (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) käyttäen molekyylipainoa 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metioniini määritetään metioniinisulfonina hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta lasketaan metioniiniksi käyttäen metioniinin molekyylipainoa 149,21 g/mol.

Lisätty vapaa metioniini määritetään uuttamisen jälkeen metioniinina; laskennassa käytetään samaa molekyylipainoa.

6.1	Uutteiden kokonaislaimennoksen tilavuus (F) vapaiden aminohappojen määrittämistä varten (5.2) lasketaan seuraavasti: V = lopullisen uutteen määrä.

7.   Menetelmän arviointi

Menetelmä on testattu vuonna 1990 tehdyssä kansainvälisessä laboratorioiden välisessä vertailussa käyttäen neljää eri rehua (sikojen täysrehu, broilereiden täysrehu, valkuaistiiviste ja esiseos). Tulosten keskiarvo ja standardipoikkeama poikkeavien arvojen poissulkemisen jälkeen on esitetty tämän kohdan taulukoissa.

Keskiarvot g/kg

Vertailuaine	Aminohappo
	Treoniini	Kyst(e)iini	Metioniini	Lysiini
Sikojen täysrehu	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Broilereiden täysrehu	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Valkuaistiiviste	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Esiseos	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

7.1   Toistettavuus

Toistettavuus edellä mainitussa laboratorioiden välisessä vertailussa on ilmaistu muodossa ”laboratorion sisäinen standardipoikkeama” alla olevassa taulukossa.

Laboratorion sisäinen standardipoikkeama (Sr) g/kg

Vertailuaine	Aminohappo
	Treoniini	Kyst(e)iini	Metioniini	Lysiini
Sikojen täysrehu	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Broilereiden täysrehu	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Valkuaistiiviste	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Esiseos	1,30 n = 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

Variaatiokerroin (%) laskettuna laboratorion sisäisestä standardipoikkeamasta (Sr)

Vertailuaine	Aminohappo
	Treoniini	Kyst(e)iini	Metioniini	Lysiini
Sikojen täysrehu	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Broilereiden täysrehu	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Valkuaistiiviste	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Esiseos	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

7.2   Uusittavuus

Edellä mainitun vertailun laboratorioiden välisten standardipoikkeamien tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

Standardointipoikkeama laboratorioiden välillä (SR) g/kg

Vertailuaine	Aminohappo
	Treoniini	Kyst(e)iini	Metioniini	Lysiini
Sikojen täysrehu	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Broilereiden täysrehu	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Valkuaistiiviste	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Esiseos	2,49 n = 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

Laboratorioiden välisistä standardipoikkeamista (SR) laskettu variaatiokerroin (%)

Vertailuaine	Aminohappo
	Treoniini	Kyst(e)iini	Metioniini	Lysiini
Sikojen täysrehu	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Broilereiden täysrehu	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Valkuaistiiviste	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Esiseos	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

8.   Vertailumateriaalin käyttö

Menetelmän oikea soveltaminen tarkistetaan sertifioidulla vertailumateriaalilla, jos sellainen on saatavilla, tehdyllä kaksoismäärityksellä. Kalibrointi sertifioidulla aminohappojen kalibrointiliuoksella on suotavaa.

9.   Huomautukset

9.1

Aminohappoanalysaattoreiden välisten erojen vuoksi annettuja aminohappojen kalibrointiliuosten (3.27.4 ja 3.27.5) ja hydrolysaattien (5.3.4) lopullisia konsentraatioita on pidettävä suuntaa antavina. Laitteiston lineaarisen vasteen alue on tarkistettava kaikkien aminohappojen osalta. Standardiliuos laimennetaan sitraattipuskurilla siten, että piikit sijoittuvat alueen keskivaiheille.

9.2	Kun hydrolysaattien analysointiin käytetään suuren erotuskyvyn nestekromatografialaitteistoa, koeolosuhteet on optimoitava valmistajan suositusten mukaisesti.

9.3	Jos menetelmää sovelletaan rehuihin, jotka sisältävät enemmän kuin yhden prosentin kloridia (tiiviste, kivennäisaineita sisältävät ravinteet tai lisäravinteet), sillä saatetaan saada metioniinille liian pieniä arvoja, ja erityiskäsittely on tarpeen.

G.   TRYPTOFAANIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmän avulla voidaan määrittää rehuissa olevan tryptofaanin kokonaismäärä ja vapaan tryptofaanin määrä. Menetelmällä ei voi erottaa D- ja L-muotoja toisistaan.

2.   Periaate

Tryptofaanin kokonaismäärän määrittämiseksi näyte hydrolysoidaan emäksisissä olosuhteissa kyllästetyllä bariumhydroksidiliuoksella ja kuumennetaan 110 oC:ssa 20 tuntia. Hydrolyysin jälkeen lisätään sisäinen standardi.

Vapaan tryptofaanin määrittämiseksi näytettä uutetaan lievästi happamissa olosuhteissa yhdessä sisäisen standardin kanssa.

Tryptofaani ja sisäinen standardi hydrolysaatissa tai uutteessa määritetään HPLC:llä käyttäen fluoresenssidetektoria.

3.   Reagenssit

3.1	Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS/cm).

3.2	Standardi: tryptofaani (puhtaus/pitoisuus ≥ 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä.

3.3	Sisäinen standardi: α-metyylitryptofaani (puhtaus/pitoisuus ≥ 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä.

3.4	Bariumhydroksidioktahydraatti (on varottava, ettei Ba(OH)2 8 H2O joudu liiaksi kosketuksiin ilman kanssa; tällöin muodostuisi BaCO3:a, joka voi häiritä määritystä) (ks. huomautus 9.3).

3.5	Natriumhydroksidi.

3.6	Ortofosforihappo, w (w/w) = 85 %

3.7	Kloorivetyhappo, ρ201,19 g/ml.

3.8	Metanoli, HPLC-laatua vastaava.

3.9	Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 oC.

3.10	Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l: Liuotetaan 40,0 g NaOH:ta (3.5) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1).

3.11	Kloorivetyhappo, c = 6 mol/l: Mitataan 492 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.12	Kloorivetyhappo, c = 1 mol/l: Mitataan 82 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.13	Kloorivetyhappo, c = 0,1 mol/l: Mitataan 8,2 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.14	Ortofosforihappo, c = 0,5 mol/l: Mitataan 34 ml ortofosforihappoa (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1).

3.15	Väkevä tryptofaaniliuos (3.2), c = 2,50 μmol/ml: Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2553 g tryptofaania (3.2) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 oC:ssa enintään 4 viikkoa.

3.16	Konsentroitu sisäisen standardin liuos, c = 2,50 μmol/ml: Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2728 g α-metyylitryptofaania (3.3) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 oC:ssa enintään 4 viikkoa.

3.17

Tryptofaanin ja sisäisen standardin kalibrointistandardiliuos: Mitataan 2,00 ml konsentroitua tryptofaaniliuosta (3.15) ja 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin (α-metyylitryptofaanin) liuosta (3.16). Laimennetaan vedellä (3.1) ja metanolilla (3.8) siten, että liuoksen tilavuus ja metanolipitoisuus on suunnilleen sama kuin valmiin hydrolysaatin (metanolia 10–30 %). Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä. Liuos suojataan suoralta auringonvalolta valmistuksen aikana.

3.18	Etikkahappo.

3.19	1,1,1-Trikloori-2-metyyli-2-propanoli.

3.20.

Etanoliamiini w (w/w) > 98 %.

3.21	Valmistetaan liuos, jossa on 1 g 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) 100 ml:ssa metanolia (3.8).

3.22	HPLC:ssä käytettävä liikkuva faasi: 3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.21) (1g/100ml). pH säädetään arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä (3.1).

4.   Välineistö

4.1	HPLC-laitteisto, jossa on spektrofluorimetri-detektori.

4.2	Nestekromatografiakolonni, 125 mm × 4 mm, C18, hartsin (pakkausaineen) hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava.

4.3	pH-mittari.

4.4	Polypropyleenipullo, tilavuus 125 ml, jossa on leveä kaula ja kierretulppa.

4.5	Kalvosuodatin 0,45 μm.

4.6	Autoklaavi, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7	Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin.

4.8	Vortex-sekoitin.

5.   Menettely

5.1   Näytteiden valmistaminen

Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joilla on suuri kosteuspitoisuus, on ilmakuivattava korkeintaan 50 oC:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joilla on suuri rasvapitoisuus, on uutettava petrolieetterillä (3.9) ennen jauhamista.

5.2   Vapaan tryptofaanin määritys (uutteesta)

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin. Lisätään 100,0 ml kloorivetyhappoa (3.13) ja 5,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (3.16). Ravistellaan tai sekoitetaan 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.7). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin. Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Säädetään pH arvoon 3 natriumhydroksidilla (3.10). Lisätään metanolia (3.8) niin että lopputilavuudessa on 10–30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (suunnilleen sama tilavuus kuin kalibrointistandardiliuoksella (3.17)).

Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Standardiliuos ja uutteet suojataan suoralta auringonvalolta. Jos näyteliuoksia ei voida analysoida samana päivänä, uutteita voi säilyttää 5 oC:ssa enintään 3 päivää.

5.3   Tryptofaanin kokonaismäärän määritys (hydrolysaatista)

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1–1 g valmistettua näytettä (5.1) polypropyleenipulloon (4.4). Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään 8,4 g bariumhydroksidioktahydraattia (3.4) ja 10 ml vettä. Sekoitetaan vortex-sekoittimella (4.8) tai magneettisekoittimella (4.7). Teflon-päällystetty magneetti jätetään seokseen. Huuhdotaan pullon seinämät 4 ml:lla vettä. Pullo suljetaan löyhästi kierrekorkilla. Pullo pannaan autoklaaviin (4.6), jossa on kiehuvaa vettä, ja autoklavoidaan 30–60 minuutin ajan. Suljetaan autoklaavi ja autoklavoidaan 110 (± 2) oC:ssa 20 tuntia.

Lämpötila on laskettava juuri alle 100 oC:seen, ennen kuin autoklaavi avataan. Jotta Ba(OH)2 · 8 H2O ei kiteytyisi, lämpimään seokseen lisätään 30 ml huoneenlämpöistä vettä. Ravistellaan tai sekoitetaan varovasti. Lisätään 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (α-metyylitryptofaania, 3.16). Jäähdytetään pulloja vesi/jäähauteessa 15 minuuttia.

Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Pullo pidetään jäähdytyshauteessa ja liuos neutraloidaan HCl:llä (3.11) sekoittaen samalla, ja pH säädetään arvoon 3,0 HCl:llä (3.12). Lisätään metanolia niin että lopputilavuudessa on 10–30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä tiettyyn sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (esim. 100 ml). Metanolin lisääminen ei saa aiheuttaa saostumista.

Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Standardiliuos ja hydrolysaatit suojataan suoralta auringonvalolta. Jos hydrolysaatteja ei voida analysoida samana päivänä, niitä voi säilyttää 5 oC:ssa enintään 3 päivää.

5.4   HPLC-määritys

Seuraavat isokraattisen erotuksen olosuhteet ovat ohjeellisia; ajo voidaan suorittaa muissa olosuhteissa, jos niillä saadaan samanlaiset tulokset (ks. myös huomautukset 9.1 ja 9.2):

Nestekromatografiakolonni (4.2):	125 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava
Kolonnin lämpötila:	huoneenlämpötila
Liikkuva faasi (3.22):	3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) +50,0 ml liuosta (3.21), jossa on 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.8) (1 g/100 ml). Säädetään pH arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä (3.1).
Virtausnopeus:	1 ml/min
Kokonaisajoaika:	noin 34 min
Detektioaallonpituus:	eksitaatio: 280 nm, emissio: 356 nm.
Injektiotilavuus:	20 μl.

6.   Tulosten laskeminen

Lasketaan tryptofaanin määrä (X) grammoina 100 grammassa näytettä.

A	=	sisäisen standardin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17)
B	=	tryptofaanin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3)
V1	=	kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) tilavuus ml (2 ml)
c	=	kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) pitoisuus μmol/ml (= 2,50)
V2	=	uuttovaiheessa (5.2) lisätyn (= 5,00 ml) tai hydrolysaattiin (5.3) lisätyn (= 2,00 ml) konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml
C	=	sisäisen standardin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3)
D	=	tryptofaanin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17)
V3	=	kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml (= 2,00 ml)
m	=	näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu ja/tai rasva poistettu)
M	=	tryptofaanin molekyylipaino (= 204,23 g/mol).

7.   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 10 % suuremmasta tuloksesta.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Järjestetyssä EY-vertailussa (4. vertailututkimus) 12 laboratoriota analysoi kolme näytettä hydrolyysimenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

	Näyte 1 Sian rehu	Näyte 2 Sian rehu, johon on lisätty L-tryptofaania	Näyte 3 Sian rehutiiviste
L	12	12	12
n	50	55	50
Keskiarvo [g/kg]	2,42	3,40	4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2

L	=	laboratorioiden lukumäärä
n	=	keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä)
sr	=	toistettavuuden keskihajonta
SR	=	uusittavuuden keskihajonta
r	=	toistettavuus
R	=	uusittavuus
CVr	=	toistettavuuden variaatiokerroin, %
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin, %.

Toisessa EY-vertailussa (3. vertailututkimus) 13 laboratoriota analysoi kaksi näytettä vapaan tryptofaanin uuttomenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

	Näyte 4 Vehnä-soijaseos	Näyte 5 Vehnä-soijaseos (= näyte 4), johon on lisätty tryptofaania (0,457 g/kg)
L	12	12
n	55	60
Keskiarvo [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11

L	=	laboratorioiden lukumäärä
n	=	keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu suuresti poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä)
sr	=	toistettavuuden keskihajonta
SR	=	uusittavuuden keskihajonta
r	=	toistettavuus
R	=	uusittavuus
CVr	=	toistettavuuden variaatiokerroin, %
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin, %.

Vielä järjestettiin EY-vertailututkimus, jossa seitsemän laboratoriota analysoi neljä näytettä, tarkoituksena tryptofaanin varmentaminen hydrolyysissä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä.

	Näyte 1 Sikarehuseos (CRM 117)	Näyte 2 Vähärasvainen kalajauho (CRM 118)	Näyte 3 Soijajauho (CRM 119)	Näyte 4 Rasvaton maitojauhe (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Keskiarvo [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	laboratorioiden lukumäärä
n	=	keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu suuresti poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä)
sr	=	toistettavuuden keskihajonta
SR	=	uusittavuuden keskihajonta
r	=	toistettavuus
R	=	uusittavuus
CVr	=	toistettavuuden variaatiokerroin, %
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin, %.

9.   Huomautukset

9.1

Seuraavilla erityisillä kromatografiaolosuhteilla voidaan erottaa paremmin tryptofaani ja α-metyylitryptofaani. Isokraattinen erotus, jonka jälkeen kolonni puhdistetaan gradienteilla: Nestekromatografia-kolonni: 125 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 μm, tai vastaava Kolonnin lämpötila: 32 oC Liikkuva faasi: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanoli, 95+5 (V+V). B: metanoli Gradientti: 0 min 100 % A 0 % B   15 min 100 %A 0 % B   17 min 60 % A 40 % B   19 min 60 % A 40 % B   21 min 100 % A 0 % B   33 min 100 % A 0 % B Virtausnopeus: 1,2 ml/min Kokonaisajoaika: noin 33 min.

9.2

Kromatografia vaihtelee HPLC-laitetyypin ja käytetyn kolonnin täytemateriaalin mukaan. Valitun järjestelmän on pystyttävä erottamaan tryptofaanin piikki ja sisäisen standardin piikki pohjaviivalle asti. Lisäksi on tärkeää, että hajoamistuotteet eroavat hyvin tryptofaanista ja sisäisestä standardista. Hydrolysaatteja on ajettava myös ilman sisäistä standardia, jotta voidaan tarkistaa epäpuhtauksien esiintyminen sisäisen standardin kohdalla olevan pohjaviivan avulla. On tärkeää, että ajoaika on riittävän pitkä, jotta kaikki hajoamistuotteet eluoituvat; myöhään eluoituvat piikit saattavat muuten häiritä myöhempiä kromatografia-ajoja. Kromatografiajärjestelmän vasteen on oltava lineaarinen toiminta-alueella. Lineaarinen vaste on mitattava sisäisen standardin vakiopitoisuudella (normaalilla pitoisuudella) ja erilaisilla tryptofaanipitoisuuksilla. On tärkeää, että sekä tryptofaanin että sisäisen standardin piikkien koot ovat HPLC-fluoresenssijärjestelmän lineaarisella alueella. Jos joko tryptofaanin ja/tai sisäisen standardin piikki on liian pieni tai liian suuri (piikit ovat liian pienet tai suuret), analyysi on toistettava käyttäen erilaista näytemäärää ja/tai muuttaen lopputilavuutta.

9.3	Bariumhydroksidi Bariumhydroksidi tulee vanhetessaan vaikealiukoisemmaksi. HPLC-määritystä varten tehty liuos voi sen vuoksi olla samea, minkä vuoksi voidaan saada alhaisia tryptofaanituloksia.

H.   RAAKARASVAN JA RAAKAÖLJYN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä määritetään rehuissa olevan raakarasvan ja -öljyn määrä. Se ei koske öljysiementen ja öljypitoisten hedelmien määrityksiä.

Jäljempänä kuvattavan kahden menettelytavan käyttö riippuu rehun luonteesta ja koostumuksesta sekä määrityksen käyttötarkoituksesta.

1.1   Menettelytapa A — Suoraan uutettavissa oleva raakarasva ja -öljy

Tätä menetelmää voidaan käyttää kasviperäisiin rehuihin lukuun ottamatta niitä, jotka kuuluvat menettelytavan B soveltamisalaan.

1.2   Menettelytapa B — Raakarasvan ja -öljyn kokonaismäärä

Menetelmää voidaan soveltaa eläinperäisiin rehuihin sekä kaikkiin rehuseoksiin. Sitä käytetään kaikkiin sellaisiin rehuihin, joista rasvaa ja öljyä ei voida täysin uuttaa ilman sitä edeltävää hydrolysointia (esim. gluteenit, hiiva, perunaproteiinit ja tuotteet, joita on käsitelty muun muassa ekstrudoimalla, kuumentamalla tai hiutaleiksi tekemällä).

1.3   Tulosten tulkitseminen

Aina, kun menettelytapaa B käyttäen saadaan suurempi tulos kuin menettelytapaa A käyttäen, menettelytavalla B saatua tulosta pidetään todellisena arvona.

2.   Periaate

2.1   Menettelytapa A

Näyte uutetaan petrolieetterillä. Liuotin tislataan pois ja jäännös kuivataan ja punnitaan.

2.2   Menettelytapa B

Näyte käsitellään kuumentamalla sitä kloorivetyhapon kanssa. Seos jäähdytetään ja suodatetaan. Jäännös pestään ja kuivataan ja määritystä jatketaan menettelytavan A mukaisesti.

3.   Reagenssit

3.1	Petrolieetteri, kiehumislämpötila: 40–60 oC. Bromiluvun on oltava alle 1 ja haihdutusjäännöksen alle 2 mg/100 ml.

3.2	Natriumsulfaatti, vedetön.

3.3	Kloorivetyhappo, c = 3 mol /l.

3.4	Suodatuksen apuaine, esim. Kieselgur, Hyflo-supercel.

4.   Välineistö

4.1

Uuttolaitteisto. Jos käytetään Soxhlet-laitteistoa (jossa on sifoni), refluksointinopeuden on oltava sellainen, että Soxhlet-väliosan täyttyminen liuottimella ja tyhjeneminen siitä tapahtuvat noin 10 kertaa tunnissa. Jos laitteistoon kuuluu suoramallinen väliosa, refluksointinopeuden on oltava noin 10 ml minuutissa.

4.2	Uuttohylsyjä, joissa ei ole petrolieetteriin liukenevaa materiaalia ja joiden huokoisuus täyttää 4.1 kohdassa esitetyt vaatimukset.

4.3	Lämpökaappi, joko vakuumikaappi, joka on säädetty 75 ± 3 oC:seen tai kiertoilmakaappi, joka on säädetty 100 ± 3 oC:seen.

5.   Menettely

5.1   Menettelytapa A (katso 8.1 kohta)

Näytettä punnitaan 5 g 1 mg:n tarkkuudella uuttohylsyyn (4.2) ja se peitetään rasvattomalla puuvillavanulla.

Hylsy asetetaan uuttolaitteeseen (4.1) ja sitä uutetaan kuusi tuntia petrolieetterillä (3.1). Petrolieetteriuute otetaan talteen kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää kiehumakiviä (2).

Liuotin tislataan pois. Pullon ja sen sisältämän jäännöksen annetaan kuivua puolentoista tunnin ajan lämpökaapissa (4.3). Pullon jäännöksineen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja se punnitaan. Kuivausta jatketaan edelleen 30 minuutin ajan sen varmistamiseksi, että rasvan ja öljyn paino pysyy vakiona (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 1 mg).

5.2   Menettelytapa B

Näytettä punnitaan 2,5 g 1 mg:n tarkkuudella (ks. 8.2 kohta) 400 ml:n dekantterilasiin tai 300 ml:n erlenmeyerkolviin ja astiaan lisätään 100 ml kloorivetyhappoa (3.3) ja kiehumakiviä. Dekantterilasi peitetään kellonlasilla tai erlenmeyerkolvi yhdistetään palautusjäähdyttimeen. Seos saatetaan varovasti kiehuvaksi käyttäen pientä liekkiä tai sähkölevyä ja seoksen annetaan kiehua hiljalleen tunnin ajan. Näytteen tarttumista astian seinämiin tulee välttää.

Astian sisällön annetaan jäähtyä ja lisätään suodatuksen apuainetta (3.4) sen verran, ettei rasvaa ja öljyä häviä suodatuksessa. Suodatukseen käytetään kostutettua, rasvatonta, kaksinkertaista suodatinpaperia. Jäännös pestään kylmällä vedellä, kunnes saadaan neutraali suodos. Tarkastetaan, ettei suodos sisällä öljyä tai rasvaa. Jos sitä esiintyy, näyte on ennen hydrolysointia uutettava petrolieetterillä menettelytapaa A käyttäen.

Jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi asetetaan kellonlasille ja sen annetaan kuivua puolitoista tuntia 100 ± 3 oC:ssa lämpökaapissa (4.3).

Kuivan jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi pannaan uuttohylsyyn (4.2) ja peitetään rasvattomalla puuvillavanulla. Hylsy pannaan uuttolaitteeseen (4.1) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa esitetyllä tavalla.

6.   Tuloksen ilmoittaminen

Jäännöksen paino ilmoitetaan prosentteina näytteen painosta.

7.   Toistettavuus

Samasta näytteestä saman henkilön suorittaman kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

—	0,2 %:a absoluuttisena arvona, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on alle 5 %,

—	4,0 %:a suhteellisena arvona, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on 5–10 %,

—	0,4 %:a absoluuttisena arvona, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on yli 10 %.

8.   Huomautukset

8.1

Runsaasti rasvaa ja öljyä sisältäviä tuotteita, joita on hankala jauhaa tai joista on vaikea saada homogeenista näytettä, käsitellään seuraavasti: Näytettä punnitaan 20 g 1 mg:n tarkkuudella ja siihen sekoitetaan vähintään 10 g vedetöntä natriumsulfaattia (3.2). Sitä uutetaan petrolieetterillä (3.1) 5.1 kohdassa esitetyllä tavalla. Saadun uutteen tilavuus täydennetään 500 ml:ksi petrolieetterillä (3.1) ja se sekoitetaan. Liuosta otetaan 50 ml ja kaadetaan pieneen, kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää kiehumakiviä. Liuotin tislataan pois, jäännös kuivataan ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan viimeisessä kappaleessa kuvatulla tavalla. Liuottimen annetaan haihtua hylsyssä olevasta uuttojäännöksestä, jäännös jauhetaan 1 mm raekokoon ja siirretään takaisin hylsyyn (lisäämättä natriumsulfaattia) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa kuvatulla tavalla. Rasvan ja öljyn pitoisuus prosentteina näytteestä lasketaan seuraavalla kaavalla: (10m1 + m2) × 5 jossa: m1 = ensimmäisen uuton jälkeen saadun jäännöksen (määräosa uutteesta) paino grammoina, m2 = toisen uuton jälkeen saadun jäännöksen paino grammoina.

8.2	Pieniä rasva- ja öljymääriä sisältävien näytteiden punnitusmäärä voidaan nostaa 5 grammaan.

8.3	Lemmikkieläinten ruokiin, joiden vesipitoisuus on suuri, voi olla tarvetta sekoittaa vedetöntä natriumsulfaattia ennen hydrolysointia ja uuttoa, joka suoritetaan menettelytavassa B kuvatulla tavalla.

8.4	Edellä 5.2 kohdassa voi olla tehokkaampaa käyttää kuumaa vettä kylmän veden sijaan jäännöksen pesemiseksi suodatuksen jälkeen.

8.5	Mainittua 1,5 tunnin kuivatusaikaa saatetaan joutua pidentämään joidenkin rehujen osalta. Liiallista kuivaamista on kuitenkin vältettävä, sillä se voi johtaa alhaisempiin tuloksiin. Myös mikroaaltouunia voidaan käyttää.

8.6	Ennen hydrolysointia tapahtuvaa menettelytavan A mukaista esiuuttoa ja menettelytavan B mukaista uudelleen uuttoa suositellaan, jos raakarasvan/öljyn pitoisuus on yli 15 %. Tämä riippuu jossakin määrin rehun tai rehuseoksen luonteesta ja siinä olevan rasvan/öljyn laadusta.

I.   RAAKAKUIDUN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehusta sen rasvaton orgaaninen aines, joka ei liukene happo- ja emäsliuoksen kanssa keitettäessä ja jota kutsutaan sovitusti raakakuiduksi.

2.   Periaate

Näyte, josta tarvittaessa on poistettu rasva, käsitellään peräkkäin tietyn väkevyisillä kiehuvilla rikkihappo- ja kaliumhydroksidiliuoksilla. Jäännös erotetaan suodattamalla näyte lasisintterisuodattimella, se pestään, kuivataan, punnitaan ja poltetaan tuhkaksi 475–500 oC:ssa. Tuhkaamisesta aiheutuva painohäviö vastaa näytteen raakakuitupitoisuutta.

3.   Reagenssit

3.1	Rikkihappo, c = 0,13 mol/l.

3.2	Kuohunestoaine (esimerkiksi n-oktanoli).

3.3	Suodatuksen apuaine (Celite 545 tai vastaava), jota on kuumennettu 500 oC:n lämpötilassa neljän tunnin ajan (8.6).

3.4

Asetoni.

3.5	Petrolieetteri, kiehumislämpötila: 40–60 oC.

3.6	Kloorivetyhappo, c = 0,5 mol/1.

3.7	Kalumhydroksidiliuos, c = 0,23 mol/l.

4.   Välineistö

4.1

Lämmityslaitteisto rikkihappoliuoksella tai kaliumhydroksidiliuoksella tehtävään kuumauuttoon; lämmityslaitteistoon kuuluu suodatinupokkaan (4.2) jalusta ja letku, jossa on ilmanpoisto- ja tyhjennysventtiili; tarvittaessa laitteistoon saadaan paineilmaa. Ennen kutakin päivittäistä käyttöönottoa laitteisto esilämmitetään keittämällä siinä vettä viiden minuutin ajan.

4.2	Vetoisuudeltaan 50 ml:n suuruinen lasinen suodatinupokas, jossa on huokoisuudeltaan 40–90 μm:n lasisintterisuodatin. Ennen ensimmäistä käyttökertaa upokasta kuumennetaan 500 oC:ssa muutaman minuutin ajan ja jäähdytetään (8.6).

4.3	Vetoisuudeltaan vähintään 270 ml oleva sylinteri, jossa on kiehumisen kestävä palautusjäähdytin.

4.4	Termostaattisäätöinen lämpökaappi.

4.5	Termostaattisäätöinen muhveliuuni.

4.6	Uuttoyksikkö, johon kuuluu suodatinupokkaan jalusta (4.2) ja poistoletku, jossa on ilmanpoisto- ja tyhjennysventtiili.

4.7	Osia lämmityslaitteiston (4.1), upokkaan (4.2) ja sylinterin (4.3) kokoamiseen sekä kylmäuuttoyksikön (4.6) ja upokkaan liittämiseen.

5.   Menettely

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 1 g esikäsiteltyä näytettä upokkaaseen (4.2) (ks. huomautukset 8.1, 8.2 ja 8.3) ja lisätään 1 g suodatuksen apuainetta (3.3).

Liitetään suodatinupokas (4.2) lämmityslaitteistoon (4.1), ja tämän jälkeen liitetään sylinteri (4.3) upokkaaseen. Sylinteri-upokasyhdistelmä täytetään 150 ml:lla kiehuvaa rikkihappoa (3.1) ja tarvittaessa lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.2).

Neste saatetaan kiehuvaksi 5 ± 2 minuutissa ja annetaan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia.

Avataan poistoletkun venttiili (4.1), ja suodatetaan rikkihappo tyhjössä suodatinupokkaan läpi ja pestään jäännös kolme kertaa peräkkäin 30 ml:lla kiehuvaa vettä huolehtien siitä, että jäännös suodatetaan kuivaksi jokaisen pesukerran jälkeen.

Suljetaan tyhjennysventtiili, kaadetaan 150 ml kiehuvaa kaliumhydroksidiliuosta (3.7) sylinteriupokasyhdistelmään ja lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.2). Neste saatetaan kiehuvaksi 5 ± 2 minuutissa ja annetaan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia. Suodatetaan ja toistetaan pesumenettelyt samalla tavoin kuin rikkihapon kanssa.

Viimeisen pesun ja kuivauksen jälkeen upokas sisältöineen irrotetaan ja upokas yhdistetään uudelleen kylmäuuttoyksikköön (4.6). Poistetaan ilma ja pestään jäännös upokkaassa kolme kertaa peräkkäin 25 ml:lla asetonia (3.4) huolehtien siitä, että jäännös kuivuu jokaisen pesukerran jälkeen.

Annetaan upokkaan kuivua vakiopainoon lämpökaapissa, jonka lämpötila on 130 oC. Jokaisen kuivauksen jälkeen jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan nopeasti. Upokas asetetaan muhveliuuniin, jossa näytteen annetaan palaa tuhkaksi vakiopainoon (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 2 mg) 475–500 oC:ssa vähintään 30 minuuttia.

Jokaisen kuumennuksen jälkeen upokkaan annetaan jäähtyä ensin uunissa ja tämän jälkeen eksikkaattorissa ennen punnitusta.

Nollakoe suoritetaan ilman näytettä. Tuhkaamisesta johtuva painohäviö ei saa olla yli 4 mg:aa.

6.   Tulosten laskeminen

Raakakuitupitoisuus prosentteina näytteestä saadaan seuraavasti:

jossa:

m	=	näytteen paino grammoina,
m0	=	määrityksen aikana näytteen polttamisesta aiheutuva painohäviö grammoina,
m1	=	nollakokeessa polttamisesta aiheutuva painohäviö grammoina.

7.   Toistettavuus

Kahden samasta näytteestä suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

—	0,6 %:a absoluuttisena arvona, kun raakakuitupitoisuus on alle 10 %,

—	6 %:a suhteellisena arvona suuremmasta tuloksesta, kun raakakuitupitoisuus on vähintään 10 %.

8.   Huomautukset

8.1

Rehuista, jotka sisältävät yli 10 % öljyjä ja rasvoja, on rasva ennen määritystä poistettava petrolieetterillä (3.5). Liitetään suodatinupokas (4.2) sisältöineen kylmäuuttoyksikköön (4.6), poistetaan ilma ja pestään jäännös kolme kertaa 30 ml:lla petrolieetteriä; varmistetaan, että jäännös on kuiva. Yhdistetään upokas sisältöineen lämmityslaitteistoon (4.1) ja jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla.

8.2

Rehuista, jotka sisältävät öljyjä ja rasvoja, joita ei voida uuttaa suoraan petrolieetterillä (3.5), rasva on poistettava 8.1 kohdassa esitetyllä tavalla ja tämän jälkeen rasva on poistettava vielä uudelleen hapolla kiehuttamisen jälkeen. Hapolla kiehuttamisen ja sitä seuraavien pesujen jälkeen upokas sisältöineen yhdistetään kylmäuuttoyksikköön (4.6) ja jäännöstä pestään kolme kertaa 30 ml:lla asetonia ja tämän jälkeen kolme kertaa 30 ml:lla petrolieetteriä. Suodatetaan tyhjössä kunnes jäännös on kuiva ja jatketaan määritystä kaliumhydroksidikäsittelyllä 5 kohdassa esitetyllä tavalla.

8.3

Jos näyte sisältää yli 5 % karbonaatteja kalsiumkarbonaattina ilmaistuna, upokas (4.2) yhdistetään punnittuine näytteineen lämmityslaitteistoon (4.1). Näyte pestään kolme kertaa 30 ml:lla kloorivetyhappoa (3.6). Jokaisen lisäämiskerran jälkeen odotetaan noin yksi minuutti ennen suodatuksen aloittamista. Näyte pestään kerran 30 ml:lla vettä ja tämän jälkeen jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla.

8.4	Jos käytetään telineenmuotoista laitteistoa (useita upokkaita on liitetty samaan lämmityslaitteistoon), kahta koetta samasta näytteestä ei saa suorittaa samalla kertaa.

8.5	Jos kiehuttamisen jälkeen happamien ja emäksisten liuosten suodatus osoittautuu vaikeaksi, käytetään lämmityslaitteiston tyhjennysletkun kautta annettavaa paineilmaa, minkä jälkeen jatketaan suodatusta.

8.6	Tuhkauslämpötila ei saa olla yli 500:aa oC lasisten suodatinupokkaiden käyttöiän pidentämiseksi. Kuumennus- ja jäähdytysjaksojen aikana on vältettävä suuria lämpötilanvaihteluita.

J.   SOKERIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää pelkistävien sokerien ja kokonaissokerien määrä invertoinnin jälkeen glukoosina, tai tarvittaessa sakkaroosina käyttäen muunnoskerrointa 0,95. Menetelmä soveltuu rehuseoksiin. Muita rehuja varten on säädetty erityismenetelmistä. Laktoosi on tarvittaessa mitattava erikseen ja otettava huomioon tuloksia laskettaessa.

2.   Periaate

Sokerit uutetaan laimeaan etanoliin ja liuos kirkastetaan Carrez-liuoksilla I ja II. Etanolin poiston jälkeen määritykset suoritetaan ennen invertointia ja sen jälkeen saadut Luff-Schoorl-menetelmällä.

3.   Reagenssit

3.1	Etanoli 40 % (v/v), tiheys: 0,948 g/ml 20 oC:ssa, neutraalia fenoliftaleiinilla määritettynä.

3.2	Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia, Zn(CH3COO)2·2H2O, ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.3	Carrez-liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6·3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4	Metyylioranssiliuos 0,1 % (w/v).

3.5	Kloorivetyhappo 4 mol/l.

3.6	Kloorivetyhappo 0,1 mol/l.

3.7	Natriumhydroksidiliuos 0,1 mol/l.

3.8

Luff-Schoorl-reagenssi: Kaadetaan sitruunahappoliuos (3.8.2) natriumkarbonaattiliuokseen (3.8.3) varovasti sekoittaen. Tämän jälkeen lisätään kuparisulfaattiliuos (3.8.1) ja täytetään 1 litraksi vedellä. Annetaan seistä yön yli ja suodatetaan. Näin saadun reagenssin (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l) konsentraatio tarkistetaan; ks. 5.4 kohdan viimeinen kappale. Liuoksen pH:n on oltava noin 9,4.

3.8.1

Kuparisulfaattiliuos: liuotetaan 25 g raudatonta kuparisulfaattia, CuSO4·5H2O, 100 ml:aan vettä.

3.8.2

Sitruunahappoliuos: liuotetaan 50 g sitruunahappoa, C6H8O7·H2O, 50 ml:aan vettä.

3.8.3

Natriumkarbonaattiliuos: liuotetaan 143,8 g vedetöntä natriumkarbonaattia noin 300 ml:aan lämmintä vettä. Annetaan jäähtyä.

3.9	Natriumtiosulfaattiliuos 0,1 mol/l.

3.10	Tärkkelysliuos: 5 g liukoista tärkkelystä lisätään 30 ml:aan vettä, seos lisätään 1 litraan kiehuvaa vettä. Keitetään kolme minuuttia, annetaan jäähtyä ja tarvittaessa lisätään 10 mg elohopeajodidia säilyteaineeksi.

3.11	Rikkihappo, 3 mol/l.

3.12	Kaliumjodidiliuos, 30 % (w/v)

3.13	Kiehumakiviä, jotka keitetään suolahapossa, pestään vedellä ja kuivataan.

3.14	3-metyylibutan-1-oli.

4.   Välineistö

Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

5.   Menettely

5.1   Näytteen uutto

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2,5 g näytettä 250 ml:n mittapulloon. Lisätään 200 ml etanolia (3.1) ja sekoitetaan sekoittajassa yhden tunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.2) ja sekoitetaan noin 30 sekunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.3) ja sekoitetaan uudelleen yhden minuutin ajan. Täytetään pullo etanolilla (3.1), homogenoidaan ja suodatetaan. Otetaan 200 ml suodosta ja haihdutetaan se noin puoleen tilavuuteen, jotta saadaan poistetuksi suurin osa etanolista. Haihdutusjäännös siirretään kvantitatiivisesti 200 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä vettä, jäähdytetään, täytetään vedellä merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan tarvittaessa. Tätä liuosta käytetään pelkistävien sokerien määrittämiseksi ja invertointireaktion jälkeen kokonaissokerien määrittämiseksi.

5.2   Pelkistävien sokerien määritys

Pipetoidaan enintään 25 ml liuosta, joka sisältää alle 60 mg glukoosina ilmoitettuja pelkistäviä sokereita. Tarvittaessa tilavuus säädetään 25 ml:ksi tislatulla vedellä ja pelkistävien sokerien pitoisuus määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä. Tulos ilmoitetaan glukoosiprosenttina.

5.3   Kokonaissokerien määritys invertointireaktion jälkeen

Pipetoidaan 50 ml liuosta 100 ml:n mittapulloon. Lisätään muutama pisara metyylioranssiliuosta (3.4) ja tämän jälkeen lisätään varovasti ja jatkuvasti sekoittaen kloorivetyhappoa (3.5), kunnes neste muuttuu selvästi punaiseksi. Lisätään 15 ml kloorivetyhappoa (3.6), pullo upotetaan voimakkaasti kiehuvaan vesihauteeseen ja pidetään siinä 30 minuutin ajan. Jäähdytetään nopeasti noin 20 oC:seen ja lisätään 15 ml natriumhydroksidiliuosta (3.7). Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä ja homogenoidaan. Otetaan enintään 25 ml:n erä, joka sisältää alle 60 mg glukoosina ilmoitettuja pelkistäviä sokereita. Tarvittaessa tilavuus säädetään 25 ml:ksi tislatulla vedellä, ja pelkistävien sokerien pitoisuus määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä. Tulos ilmoitetaan glukoosiprosenttina tai tarvittaessa sakkaroosina kertomalla kertoimella 0,95.

5.4   Titraus Luff-Schoorl-menetelmällä

Pipetoidaan 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.8) 300 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään tarkalleen 25 ml kirkastettua sokeriliuosta. Lisätään kaksi kiehumakiveä (3.13), lämmitetään keskikokoisen liekin yläpuolella käsin ravistaen ja kuumennetaan neste kiehumapisteeseen noin kahdessa minuutissa. Erlenmeyerkolvi asetetaan välittömästi asbestiverkolle, jossa on noin 6 cm:n läpimittainen reikä ja verkon alla on etukäteen sytytetty liekki. Säädetään liekki sellaiseksi, että erlenmeyerkolvi kuumenee ainoastaan pohjastaan. Tämän jälkeen erlenmeyerkolviin kiinnitetään palautusjäähdytin. Keitetään tarkalleen 10 minuutin ajan. Jäähdytetään välittömästi kylmässä vedessä ja noin viiden minuutin kuluttua titrataan seuraavasti:

Lisätään 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.12) ja välittömästi tämän jälkeen (varoen, koska liuos voi vaahdota runsaasti) lisätään 25 ml rikkihappoa (3.11). Titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (3.9) kunnes väri muuttuu samean keltaiseksi, lisätään tärkkelysindikaattori (3.10) ja titraus suoritetaan loppuun.

Sama titraus suoritetaan liuoksesta, jossa on tarkasti mitattuna 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.8) ja 25 ml vettä, sen jälkeen kun 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.12) ja 25 ml rikkihappoa (3.11) on lisätty kohottamatta lämpötilaa kiehumispisteeseen.

6.   Tulosten laskeminen

Oheisen taulukon avulla määritetään milligrammoissa se glukoosimäärä, joka vastaa näiden kahden titrauksen erotusta ilmaistuna milligrammoina natriumtiosulfaattia, 0,1 mol/l. Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Menettely erityistapauksissa

7.1

Runsaasti melasseja sisältävistä rehuista ja rehuista, jotka eivät ole homogeenisia, punnitaan 20 g näyte 1 litran mittapulloon ja lisätään 500 ml vettä. Sekoitetaan 1 tunti sekoittajassa. Selkeytetään käyttäen Carrez I (3.2) ja II (3.3) -reagensseja 5.1 kohdassa kuvatulla tavalla kuitenkin tällä kertaa käyttäen nelinkertaiset määrät kutakin reagenssia. Täytetään merkkiin asti 80-prosenttisella (v/v) etanolilla. Homogenoidaan ja suodatetaan. Poistetaan etanoli 5.1 kohdan mukaisesti. Jos yhtään dekstrinoitua tärkkelystä ei esiinny, täytetään merkkiin asti tislatulla vedellä.

7.2

Melassista ja runsaasti sokeria sisältävistä ja tärkkelysköyhistä rehuaineista (kuten johanneksenleipäpuun hedelmät, kuivatut sokerijuurikasleikkeet) punnitaan 5 gramman näyte 250 ml:n mittapulloon, lisätään 200 ml tislattua vettä ja sekoitetaan ravistelijassa yhden tunnin ajan tai tarvittaessa kauemmin. Kirkastetaan käyttäen Carrez-reagensseja I (3.2) ja II (3.3) 5.1 kohdassa kuvatulla tavalla. Mittapullo täytetään vedellä merkkiin, liuos homogenoidaan ja suodatetaan. Kokonaissokerien määrän toteamiseksi suoritusta jatketaan 5.3 kohdan mukaisesti.

8.   Huomautukset

8.1	Vaahdonmuodostuksen estämiseksi on suositeltavaa lisätä noin 1 ml 3-metyylibutan-1-olia (3.14) (riippumatta tilavuudesta) ennen Luff-Schoorl-reagenssin kanssa keittämistä.

8.2	Invertoinnin jälkeen saadun glukoosina ilmoitetun kokonaissokeripitoisuuden ja glukoosina ilmoitetun pelkistävien sokerien pitoisuuden välisestä erosta 0,95:lla kerrottuna saadaan sakkaroosin prosentuaalinen pitoisuus.

8.3	Pelkistävien sokerien, paitsi laktoosin, pitoisuuden määrittämiseksi voidaan käyttää kahta menetelmää:

8.3.1

Likimääräisen arvion laskemiseksi laktoosipitoisuus, joka on saatu eri analyysimenetelmällä, kerrotaan 0,675:llä ja saatu tulos vähennetään pelkistävien sokerien pitoisuudesta.

8.3.2

Pelkistävien sokerien, paitsi laktoosin, määrän tarkkaa laskemista varten on tehtävä kaksi lopullista määritystä samasta näytteestä. Toinen määrityksistä suoritetaan liuokselle, joka saadaan osasta 5.1 kohdan mukaisesti saatua liuosta, ja toinen määrityksistä suoritetaan osasta liuosta, joka saadaan laktoosimäärityksen yhteydessä tähän tarkoitukseen kehitetyn menetelmän mukaisesti (sen jälkeen kun muut sokerit on fermentoitu ja liuos kirkastettu). Molemmissa tapauksissa sokerin määrä määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä ja lasketaan milligrammoina glukoosia. Arvot vähennetään toisistaan ja erotus ilmoitetaan prosentteina näytteestä. Esimerkki Kaksi tilavuutta vastaa 250 mg:n näytteestä tehtyjä määrityksiä. Ensimmäisessä tapauksessa on kulunut 17 ml natriumtiosulfaattiliuosta, 0,1 mol/l, joka vastaa 44,2 mg:aa glukoosia; toisessa tapauksessa 11 ml, joka vastaa 27,6 mg:aa glukoosia. Erotus on 16,6 mg glukoosia. Pelkistävien sokerien, laktoosia lukuun ottamatta, glukoosina laskettu määrä on:

Taulukko 25 ml:lle Luff-Schoorl-reagenssia

Na2S2O3, 0,1 mol/l, millilitroina, kahden minuutin kuumennus, 10 minuutin keitto

Na2S2O3 0,1 mol/l	Glukoosi, fruktoosi, inverttisokerit C6H12O6		Laktoosi C12H22O11		Maltoosi C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	erotus	mg	erotus	mg	erotus	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   LAKTOOSIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää laktoosin pitoisuus rehuissa, jotka sisältävät yli 0,5 % laktoosia.

2.   Periaate

Sokerit liuotetaan veteen. Liuokselle suoritetaan fermentointi käyttäen Saccharomyces cerevisiae -hiivaa, joka ei kuluta laktoosia. Selkeyttämisen ja suodatuksen jälkeen määritetään suodoksen laktoosipitoisuus Luff-Schoorl-menetelmällä.

3.   Reagenssit

3.1	Saccharomyces cerevisiae -suspensio: suspendoidaan 25 g tuoretta hiivaa 100 ml:aan vettä. Suspensio säilyy jääkaapissa enintään yhden viikon ajan.

3.2	Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn (CH3COO)2·2H2O ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.3	Carrez-liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6·3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4

Luff-Schoorl-reagenssi: Kaadetaan sitruunahappoliuos (3.4.2) natriumkarbonaattiliuokseen (3.4.3) sekoittaen varovasti lisäyksen aikana. Tämän jälkeen lisätään kuparisulfaattiliuos (3.4.1) ja täytetään 1 litraksi vedellä. Annetaan seistä yön yli ja suodatetaan. Näin saadun reagenssin (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l) konsentraatio tarkistetaan. Liuoksen pH:n on oltava noin 9,4.

3.4.1

Kuparisulfaattiliuos: liuotetaan 25 g raudatonta kuparisulfaattia, CuSO4·5H2O, 100 ml:aan vettä.

3.4.2

Sitruunahappoliuos: liuotetaan 50 g sitruunahappoa, C6H8O7·H2O, 50 ml:aan vettä.

3.4.3

Natriumkarbonaattiliuos: liuotetaan 143,8 g vedetöntä natriumkarbonaattia noin 300 ml:aan lämmintä vettä. Annetaan jäähtyä.

3.5	Kiehumakiviä, jotka keitetään suolahapossa, pestään vedellä ja kuivataan.

3.6	Kaliumjodidiliuos, 30 % (w/v).

3.7	Rikkihappo, 3 mol/l.

3.8	Natriumtiosulfaattiliuos, 0,1 mol/l.

3.9	Tärkkelysliuos: 5 g liukoista tärkkelystä lisätään 30 ml:aan vettä, seos lisätään 1 litraan kiehuvaa vettä. Keitetään kolme minuuttia, annetaan jäähtyä ja tarvittaessa lisätään 10 mg elohopeajodidia säilyteaineeksi.

4.   Välineistö

Vesihaude, jonka termostaatti on säädetty 38–40 oC:seen.

5.   Menettely

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 1 g näytettä 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 25–30 ml vettä. Pullo asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen 30 minuutin ajaksi ja tämän jälkeen se jäähdytetään noin 35 oC:seen. Lisätään 5 ml hiivasuspensiota (3.1) ja homogenoidaan. Annetaan pullon seistä kaksi tuntia vesihauteessa 38–40 oC:n lämpötilassa. Jäähdytetään noin 20 oC:seen.

Lisätään 2,5 ml Carrez-liuosta I (3.2) ja sekoitetaan 30 sekuntia, tämän jälkeen lisätään 2,5 ml Carrez-liuosta II (3.3) ja sekoitetaan uudelleen 30 sekuntia. Täytetään 100 ml:ksi vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan. Suodosta pipetoidaan 300 ml:n erlenmeyerkolviin sellainen määrä, joka sisältää 40–80 mg laktoosia, korkeintaan 25 ml. Tarvittaessa täytetään vedellä 25 ml:ksi.

Nollakoe suoritetaan samalla tavoin käyttäen 5 ml hiivasuspensiota (3.1). Laktoosimäärä määritetään Luff-Schoorlin mukaan seuraavasti. Lisätään tarkalleen 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.4) ja kaksi kiehumakiveä (3.5). Lämmitetään keskikokoisen liekin yläpuolella käsin ravistellen ja kuumennetaan neste kiehumispisteeseen noin kahdessa minuutissa. Erlenmeyerkolvi asetetaan välittömästi asbestiverkolle, jossa on noin 6 cm:n läpimittainen reikä ja verkon alla on etukäteen sytytetty liekki. Säädetään liekki sellaiseksi, että erlenmeyerkolvi kuumenee ainoastaan pohjastaan. Tämän jälkeen erlenmeyerkolviin kiinnitetään pystyjäähdytin. Keitetään tarkalleen 10 minuutin ajan. Jäähdytetään välittömästi kylmässä vedessä ja noin viiden minuutin kuluttua titrataan seuraavasti:

Lisätään 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.6) ja välittömästi tämän jälkeen (varovasti, koska liuos voi vaahdota voimakkaasti) lisätään 25 ml rikkihappoa (3.7). Titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (3.8) kunnes väri muuttuu samean keltaiseksi, lisätään tärkkelysindikaattori (3.9) ja titraus suoritetaan loppuun.

Sama titraus suoritetaan liuoksesta, johon pipetoidaan tarkalleen mitattuna 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.4) ja 25 ml vettä, sen jälkeen kun 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.6) ja 25 ml rikkihappoa (3.7) on lisätty ilman keittämistä.

6.   Tulosten laskeminen

Oheisen taulukon avulla määritetään milligrammoina se laktoosimäärä, joka vastaa näiden kahden titraustuloksen erotusta ilmaistuna natriumtiosulfaattia, 0,1 mol/l, millilitroissa.

Tulos ilmoitetaan vedettömän laktoosin prosentteina näytteestä.

7.   Huomautus

Yli 40 % fermentoituvaa sokeria sisältäville tuotteille käytetään yli 5 ml hiivasuspensiota (3.1).

Taulukko 25 ml:lle Luff-Schoorl-reagenssia

ml Na2S2O3, 0,1 mol/l, kahden minuutin kuumennus, 10 minuutin keitto

Na2S2O3 0,1 mol/l	Glukoosi, fruktoosi, inverttisokerit C6H12O6		Laktoosi C12H22O11		Maltoosi C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	erotus	mg	erotus	mg	erotus	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   TÄRKKELYKSEN MÄÄRITYS

POLARIMETRINEN MENETELMÄ

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää tärkkelyksen ja tärkkelyksen suurimolekyylisten pilkkoutumistuotteiden pitoisuus rehuissa tarkoituksena todeta, onko niiden ilmoitettu energiamäärä liitteen VII mukainen ja ovatko ne neuvoston direktiivin 96/25/EY (3) säännösten mukaisia.

2.   Periaate

Menetelmä perustuu kahteen määritykseen. Ensimmäisessä määrityksessä näyte käsitellään laimealla kloorivetyhapolla. Kun liuos on saatu kirkkaaksi ja suodatettu, liuoksen optinen kiertokyky mitataan polarimetrisesti.

Toisessa määrityksessä näyte uutetaan 40-prosenttisella etanolilla. Kun suodos on tehty happamaksi kloorivetyhapolla ja se on saatu kirkkaaksi ja suodatettu, optinen kiertokyky mitataan kuten ensimmäisessä määrityksessä.

Kun näiden kahden mittauksen erotus kerrotaan tunnetulla kertoimella, saadaan näytteen tärkkelyspitoisuus.

3.   Reagenssit

3.1	Kloorivetyhappoliuos 25 % (w/w) tiheys: 1,126 g/ml.

3.2	Kloorivetyhappoliuos 1,13 % (w/v) Konsentraatio on tarkistettava titraamalla natriumhydroksidiliuoksella 0,1 mol/l, indikaattorina 0,1 % (w/v) metyylipuna 94 % (v/v) etanolissa. 10 ml:n neutralointiin tarvitaan 30,94 ml NaOH:ta, 0,1 mol/l.

3.3	Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia, Zn(CH3COO)2·2H2O, ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4	Carrez-liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6·3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.5	Etanoli 40 % (v/v), tiheys: 0,948 g/ml 20 oC:ssa.

4.   Välineistö

4.1	250 ml:n vakiohioksellinen erlenmeyerkolvi, jossa on palautusjäähdytin.

4.2	Polarimetri tai sakkarimetri.

5.   Menettely

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan niin hienoksi, että se läpäisee kokonaan 0,5 mm:n pyöreäreikäisen seulan.

5.2   Optisen kokonaiskiertokyvyn (P tai S) määritys (ks. huomautus 7.1)

Punnitaan 2,5 g hienoksi jauhettua näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 25 ml kloorivetyhappoa (3.2), ravistellaan kunnes näyte on jakaantunut tasaisesti, sen jälkeen lisätään vielä 25 ml kloorivetyhappoa (3.2). Pullo pannaan kiehuvaan vesihauteeseen ja sitä ravistellaan voimakkaasti ja yhtäjaksoisesti ensimmäisten kolmen minuutin ajan kokkaroitumisen estämiseksi. Vesihauteen vesimäärän on oltava riittävän suuri, jotta haude pysyy kiehuvana kun pullo upotetaan siihen. Pulloa ravisteltaessa sitä ei saa ottaa pois hauteesta. Tarkalleen 15 minuutin kuluttua pullo otetaan hauteesta, lisätään 30 ml kylmää vettä ja jäähdytetään välittömästi 20o:seen.

Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.3) ja ravistellaan noin 30 sekunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.4) ja ravistellaan uudestaan 30 sekunnin ajan. Täytetään merkkiin asti vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan. Jos suodos ei ole täysin kirkas (mikä tapahtuu harvoin), määritys uusitaan käyttäen suurempaa määrää Carrez-liuoksia I ja II (esimerkiksi 10 ml).

Liuoksen optinen kiertokyky mitataan 200 mm:n putkessa polarimetrillä tai sakkarimetrillä.

5.3   40-prosenttiseen etanoliin liukoisten yhdisteiden optisen kiertokyvyn (P' tai S') määritys

Punnitaan 5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon ja lisätään noin 80 ml etanolia (3.5) (ks. huomautus 7.2). Mittapullon annetaan seistä yhden tunnin ajan huoneenlämmössä; tänä aikana sitä ravistellaan voimakkaasti kuusi kertaa siten, että näyte sekoittuu perusteellisesti etanoliin. Täytetään merkkiin asti etanolilla (3.5), sekoitetaan ja suodatetaan.

Pipetoidaan 50 ml suodosta (vastaa 2,5:tä grammaa näytettä) 250 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään 2,1 ml kloorivetyhappoa (3.1) ja ravistellaan voimakkaasti. Erlenmeyerkolviin kiinnitetään pystyjäähdytin ja pullo pannaan kiehuvaan vesihauteeseen. Tarkalleen 15 minuutin kuluttua erlenmeyerkolvi otetaan hauteesta ja liuos siirretään 100 ml:n mittapulloon huuhtomalla pienellä määrällä kylmää vettä ja jäähdytetään 20 oC:seen.

Tämän jälkeen näyteliuos tehdään kirkkaaksi Carrez-liuoksilla I (3.3) ja II (3.4), täytetään merkkiin asti vedellä, sekoitetaan, suodatetaan ja mitataan optinen kiertokyky 5.2 kohdan toisessa ja kolmannessa alakohdassa esitetyllä tavalla.

6.   Tulosten laskeminen

Tärkkelyspitoisuus (%) lasketaan seuraavalla tavalla:

6.1   Polarimetriset mittaukset

P	=	optinen kokonaiskiertokyky asteina
P'	=	40-prosenttiseen etanoliin (V/V) liukoisten yhdisteiden optinen kiertokyky asteina
	=	puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky. Tälle on sovittu seuraavat numeeriset arvot: + 185,9o: riisitärkkelys + 185,7o: perunatärkkelys + 184,6o: maissitärkkelys + 182,7o: vehnätärkkelys + 181,5o: ohratärkkelys + 181,3o: kauratärkkelys + 184,0o: muut tärkkelyslajit sekä tärkkelysseokset rehuseoksissa.

6.2   Sakkarimetriset mittaukset

S	=	optinen kokonaiskiertokyky sakkarimetrin asteina
S'	=	40-prosenttiseen (v/v) etanoliin liukoisten yhdisteiden optinen kiertokyky asteina
N	=	sellainen sakkaroosin määrä grammoina, jonka optinen kiertokyky on 100 sakkarimetrin astetta 100 ml:ssa vettä ja 200 mm:n putkessa mitattuna 16,29 g ranskalaisella sakkarimetrillä 26,00 g saksalaisella sakkarimetrillä 20,00 g muilla sakkarimetreillä. = puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky (ks. 6.1).

6.3   Toistettavuus

Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää 0,4:ää prosenttiyksikköä, jos tärkkelyspitoisuus on alle 40 %, eikä 1:tä prosenttia tärkkelyspitoisuudesta suhteellisena arvona, jos tärkkelyspitoisuus on 40 % tai suurempi.

7.   Huomautukset

7.1	Jos näyte sisältää yli 6 % karbonaatteja, kalsiumkarbonaattina laskettuna, on ne ennen optisen kokonaiskiertokyvyn määritystä hajotettava juuri tarkalleen sopivalla määrällä laimeaa rikkihappoa.

7.2

Paljon laktoosia sisältävien tuotteiden, kuten herajauheen tai rasvattoman maitojauheen, määritystä jatketaan 80 ml:n etanolilisäyksen (3.5) jälkeen seuraavasti. Palautusjäähdytin kiinnitetään pulloon ja pullo pannaan 50 oC:n vesihauteeseen 30 minuutin ajaksi. Annetaan jäähtyä ja jatketaan määritystä 5.3 kohdassa esitetyllä tavalla.

7.3

Seuraavien rehuissa merkittävinä määrinä esiintyvien rehuaineiden tiedetään häiritsevän tärkkelyspitoisuuden määritystä polarimetrisellä menetelmällä ja näin ollen voidaan saada vääriä tuloksia: — (sokeri)juurikastuotteet, kuten (sokeri)juurikasleike, (sokeri)juurikasmelassi, melassoitu (sokeri)juurikasleike, (sokeri)juurikasrankki, (juurikas)sokeri, — sitrushedelmämassa, — pellavansiemenet, pellavansiemenkakku, pellavansiemenrouhe, — rypsinsiemenet, rypsikakku, rypsirouhe, rypsinsiementen kuoret, — auringonkukansiemenet, auringonkukkarouhe, auringonkukkarouhe osaksi kuorituista siemenistä, — kookoskakku, kookosrouhe, — perunapulppa, — kuivahiiva, — runsaasti inuliinia sisältävät tuotteet (esim. maa-artisokkaleike ja -jauho), — rasvan sulatuksessa muodostuva valkuaisjäänne.

M.   RAAKATUHKAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen raakatuhkapitoisuus.

2.   Periaate

Näyte poltetaan tuhkaksi 550 oC:ssa, jäännös punnitaan.

3.   Reagenssit

Ammoniumnitraattiliuos, 20 % (w/v).

4.   Välineistö

4.1	Sähkölevy.

4.2	Sähkökäyttöinen muhveliuuni, jossa on termostaatti.

4.3	Hehkutusupokkaita, jotka on valmistettu kvartsista, posliinista tai platinasta, joko suorakulmaisia (noin 60 × 40 × 25 mm) tai pyöreitä (läpimitta 60–75 mm, korkeus 20–25 mm).

5.   Menettely

Noin 5 grammaa näytettä (2,5 g sellaisia tuotteita, joilla on pyrkimys turvota) punnitaan 1 mg:n tarkkuudella hehkutusupokkaaseen, joka on ensin hehkutettu 550 oC:seen, jäähdytetty ja taarattu. Upokas asetetaan sähkölevylle ja sitä kuumennetaan vähitellen kunnes aine hiiltyy. Tuhkataan 5.1 tai 5.2 kohdan mukaisesti.

5.1

Upokas asetetaan kalibroituun muhveliuuniin, joka on säädetty 550 oC:seen. Upokasta pidetään tässä lämpötilassa, kunnes saadaan valkea, vaaleanharmaa tai punertava tuhka, jossa ei näytä enää olevan orgaanista ainesta. Upokas asetetaan eksikkaattoriin, sen annetaan jäähtyä ja se punnitaan välittömästi.

5.2

Upokas asetetaan kalibroituun muhveliuuniin, joka on säädetty 550 oC:seen. Poltetaan tuhkaksi 3 tunnin ajan. Upokas asetetaan eksikkaattoriin, sen annetaan jäähtyä ja se punnitaan välittömästi. Kuivausta jatketaan edelleen 30 minuutin ajan sen varmistamiseksi, että tuhkan paino pysyy vakiona (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 1 mg).

6.   Tulosten laskeminen

Jäännöksen paino lasketaan vähentämällä taarapaino.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Huomautukset

7.1

Niille näytteille, joita on vaikea polttaa tuhkaksi, on alustava tuhkaksi polttaminen tehtävä ainakin kolmen tunnin ajan, jonka jälkeen näyte jäähdytetään ja siihen lisätään muutama pisara 20 % ammoniumnitraattiliuosta tai vettä (varovasti, välttäen tuhkan leviämistä tai paakkuuntumista). Hehkutusta jatketaan uunissa kuivaamisen jälkeen. Menettely toistetaan tarvittaessa kunnes näyte on tuhkaantunut täydellisesti.

7.2

Ne aineet, joihin 7.1 kohdan käsittely ei vaikuta, käsitellään seuraavasti: Kolmen tunnin polttamisen jälkeen tuhkan joukkoon lisätään lämmintä vettä ja se suodatetaan pienen tuhkattoman suodattimen läpi. Suodatin ja sen sisältö poltetaan tuhkaksi alkuperäisessä upokkaassa. Suodos siirretään jäähtyneeseen upokkaaseen, haihdutetaan kuivaksi, poltetaan tuhkaksi ja punnitaan.

7.3

Jos kyse on öljyistä ja rasvoista, punnitaan tarkasti 25 g näytettä sopivan kokoiseen upokkaaseen. Näytteen annetaan hiiltyä sytyttämällä se tuhkattomalla suodatinpaperiliuskalla. Palamisen jälkeen näytettä kostutetaan mahdollisimman pienellä määrällä vettä. Kuivataan ja poltetaan tuhkaksi 5 kohdan mukaisesti.

N.   KLOORIVETYHAPPOON LIUKENEMATTOMAN TUHKAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää kloorivetyhappoon liukenemattomien kivennäisainesten pitoisuus rehuissa. Näytteen laadun mukaan voidaan käyttää kahta eri menetelmää.

1.1	Menetelmä A: soveltuu orgaanista ainetta oleviin rehuihin ja useimpiin rehuseoksiin;

1.2	Menetelmä B: soveltuu kivennäisrehuihin ja kivennäisrehuseoksiin sekä rehuseoksiin, joiden kloorivetyhappoon liukenemattomien ainesten pitoisuus menetelmällä A määritettynä on suurempi kuin 1 %.

2.   Periaate

2.1	Menetelmä A: näyte poltetaan tuhkaksi, tuhka keitetään kloorivetyhapossa ja liukenematon jäännös suodatetaan ja punnitaan.

2.2	Menetelmä B: näytettä käsitellään kloorivetyhapolla. Liuos suodatetaan, jäännös poltetaan tuhkaksi ja näin saatu tuhka käsitellään menetelmän A mukaan.

3.   Reagenssit

3.1	Kloorivetyhappo, 3 mol/l.

3.2	Trikloorietikkahappoliuos, 20 % (w/v).

3.3	Trikloorietikkahappoliuos, 1 % (w/v).

4.   Välineistö

4.1	Sähkölevy.

4.2	Sähkökäyttöinen muhveliuuni, jossa on termostaatti.

4.3	Hehkutusupokkaita, jotka on valmistettu kvartsista, posliinista tai platinasta, joko suorakulmaisia (noin 60 × 40 × 25 mm) tai pyöreitä (läpimitta 60–75 mm, korkeus 20–25 mm).

5.   Menettely

5.1   Menetelmä A:

Näyte poltetaan tuhkaksi raakatuhkan määritystä varten esitettyä menetelmää käyttäen. Myös tästä määrityksestä saatua tuhkaa voidaan käyttää.

Tuhka siirretään 250–400 ml:n dekantterilasiin käyttäen 75 ml kloorivetyhappoa (3.1). Liuos kuumennetaan hitaasti kiehumapisteeseen ja sitä keitetään varovasti 15 minuuttia. Lämmin liuos suodatetaan tuhkattoman suodatinpaperin läpi ja jäännös pestään lämpimällä vedellä kunnes pesuvesi ei enää ole hapan. Jäännöksen sisältävä suodatinpaperi kuivataan ja poltetaan tuhkaksi taaratussa upokkaassa 550–700 oC:n lämpötilassa. Sen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja se punnitaan.

5.2   Menetelmä B:

Punnitaan 5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 250–400 ml:n dekantterilasiin. Siihen lisätään ensin 25 ml vettä ja sen jälkeen 25 ml kloorivetyhappoa (3.1), sekoitetaan ja odotetaan kunnes kuohuminen lakkaa. Lisätään vielä 50 ml kloorivetyhappoa (3.1). Kun kaasuja ei enää muodostu, dekantterilasi asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen ja pidetään siinä 30 minuuttia tai tarvittaessa pitempään, jotta mahdollinen jäljellä oleva tärkkelys tulisi kokonaan hydrolysoiduksi. Liuos suodatetaan lämpimänä käyttäen tuhkatonta suodatinpaperia, joka pestään 50 ml:lla lämmintä vettä (ks. 7 kohdan huomautus). Suodatinpaperi jäännöksineen siirretään hehkutusupokkaaseen, kuivataan ja poltetaan tuhkaksi 550–700 oC:n lämpötilassa. Tuhka siirretään 250–400 ml:n dekantterilasiin käyttäen 75 ml kloorivetyhappoa (3.1) ja jatketaan 5.1 kohdan toisen alakohdan mukaan.

6.   Tulosten laskeminen

Jäännöksen paino lasketaan vähentämällä taarapaino. Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Huomautus

Jos suodatus osoittautuu vaikeaksi, suoritetaan määritys uudelleen korvaamalla 50 ml kloorivetyhappoa 50 ml:lla 20-prosenttista trikloorietikkahappoa (3.2) ja suodatinpaperin pesuun käytetään lämmintä 1-prosenttista trikloorietikkahappoliuosta (3.3).

O.   KARBONAATTIEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää useimpien rehujen karbonaatit, jotka tavanomaisesti ilmoitetaan kalsiumkarbonaattina.

Tietyissä tapauksissa (esim. rautakarbonaatin osalta) on kuitenkin käytettävä erityismenetelmää.

2.   Periaate

Karbonaatit hajotetaan kloorivetyhapossa, vapautunut hiilidioksidi kerätään talteen asteikolla varustettuun putkeen ja sen tilavuutta verrataan tilavuuteen, jonka tunnettu määrä kalsiumkarbonaattia vapauttaa samoissa olosuhteissa.

3.   Reagenssit

3.1	Kloorivetyhappo, tiheys 1,10 g/ml.

3.2	Kalsiumkarbonaatti.

3.3	Rikkihappo, noin 0,05 mol/l, värjätty metyylipunalla.

4.   Välineistö

Scheibler-Dietrich-laite (ks. kaavio) tai vastaava laite.

5.   Menettely

Näytettä punnitaan karbonaattipitoisuuden mukaan seuraavasti:

—	0,5 g tuotetta, joka sisältää 50–100 % karbonaattia, kalsiumkarbonaattina ilmoitettuna,

—	1 g tuotetta, joka sisältää 40–50 % karbonaattia, kalsiumkarbonaattina ilmoitettuna,

—	2–3 g muita tuotteita.

Punnittu näyte pannaan laitteeseen kuuluvaan pulloon (4), jossa on pieni murtumattomasta materiaalista valmistettu koeputki, joka sisältää 10 ml kloorivetyhappoa (3.1), ja pullo liitetään laitteeseen. Käännetään kolmitiehanaa (5) siten, että putki (1) on auki laitteen ulkopuolelle. Käyttäen liikkuvaa putkea (2), joka on täytetty värjätyllä rikkihapolla (3.3) ja liitetty asteikolla varustettuun putkeen (1), säädetään nesteen taso nollamerkkiin. Käännetään hanaa (5) putkien (1) ja (3) yhdistämiseksi ja tarkastetaan, että taso säilyy nollassa.

Kaadetaan kloorivetyhappo (3.1) koeputkesta hitaasti näyte-erän päälle pulloa (4) kallistaen. Paine tasoitetaan laskemalla putki (2) alemmaksi. Pulloa (4) ravistellaan kunnes hiilidioksidin kehittyminen on kokonaan lakannut.

Paine palautetaan alkuperäiseksi tuomalla neste samalle tasolle putkissa (1) ja (2). Lukema otetaan muutaman minuutin kuluttua siitä, kun kaasutilavuus on saavuttanut vakiotason.

Kontrollikoe suoritetaan samoissa olosuhteissa käyttäen 0,5 g kalsiumkarbonaattia (3.2).

6.   Tulosten laskeminen

Karbonaattipitoisuus kalsiumkarbonaattina ilmaistuna lasketaan kaavasta:

jossa:

X	=	karbonaatti prosentteina (w/w) näytteestä, ilmaistuna kalsiumkarbonaattina,
V	=	ml CO2:ta, jonka punnittu näytemäärä on vapauttanut,
V1	=	ml CO2:ta, jonka 0,5 g CaCO3:a on vapauttanut,
m	=	näytteen paino grammoina.

7.   Huomautukset

7.1	Jos näyte painaa yli 2 g, lisätään ensin 15 ml tislattua vettä pulloon (4) ja sekoitetaan ennen kokeen alkua. Kontrollikokeessa käytetään samaa vesitilavuutta.

7.2	Jos käytetyssä laitteessa on eri tilavuus kuin Scheibler-Dietrich-laitteessa, on näytteestä ja kontrolliaineesta otettavia eriä ja tulosten laskua muutettava vastaavanlaisesti.

P.   KOKONAISFOSFORIN MÄÄRITYS

FOTOMETRINEN MENETELMÄ

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen kokonaisfosforipitoisuus. Se soveltuu erityisesti alhaisten fosforipitoisuuksien analysoimiseen. Tietyissä tapauksissa (runsaasti fosforia sisältävät tuotteet) voidaan käyttää gravimetristä menetelmää.

2.   Periaate

Näyte mineralisoidaan joko polttamalla kuivana ja liuottamalla happoon (orgaaniset rehut) tai happokeiton avulla (mineraaliyhdisteet ja nestemäiset rehut), ja se siirretään happamaan liuokseen. Liuos käsitellään molybdovanadaattireagenssilla. Muodostuneen keltaisen liuoksen optinen tiheys mitataan spektrofotometrissä 430 nm:ssä.

3.   Reagenssit

3.1	Kalsiumkarbonaatti.

3.2	Kloorivetyhappo, ρ20 = 1,10 g/ml (noin 6 mol/l).

3.3	Typpihappo, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4	Typpihappo, ρ201,38–1,42 g/ml.

3.5	Rikkihappo, ρ201,84 g/ml.

3.6	Molybdovanadaattireagenssi: sekoitetaan 200 ml ammoniumheptamolybdaattiliuosta (3.6.1), 200 ml ammoniummonovanadaattiliuosta (3.6.2) ja 134 ml typpihappoa (3.4) 1 litran mittapullossa. Täytetään merkkiin asti vedellä.

3.6.1

Ammoniumheptamolybdaattiliuos: liuotetaan 100 g ammoniumheptamolybdaattia (NH4)6Mo7O24·4H2O kuumaan veteen. Lisätään 10 ml ammoniakkia (tiheys 0,91 g/ml) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.6.2

Ammoniumonovanadaattiliuos: liuotetaan 2,35 g ammoniummonovanadaattia NH4VO3 400 ml:aan kuumaa vettä. Lisätään hitaasti, samalla sekoittaen 20 ml laimeaa typpihappoa (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.7	Fosforistandardiliuos, 1 mg/ml: liuotetaan 4,387 g kaliumdivetyfosfaattia KH2PO4 veteen. Täytetään 1 litraksi vedellä.

4.   Välineistö

4.1	Kvartsi-, posliini- tai platinaupokkaita.

4.2	Sähkölämmitteinen muhveliuuni, jossa on 550 oC:seen säädetty termostaatti.

4.3	250 ml:n Kjeldahl-kolvi.

4.4	Mittapulloja ja tarkkuuspipettejä.

4.5	Spektrofotometri.

4.6	Noin 16 mm:n läpimittaisia koeputkia, joissa on 14,5 mm:n läpimittaiset tulpat ja joiden vetoisuus on 25–30 ml.

5.   Menettely

5.1   Liuoksen valmistaminen

Näytteen pitoisuuden mukaan valmistetaan 5.1.1 tai 5.1.2 kohdassa esitetty liuos.

5.1.1   Tavallinen menettely

Punnitaan vähintään 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella. Näyte pannaan Kjeldahl-kolviin, lisätään 20 ml rikkihappoa (3.5), ravistellaan, jotta happo imeytyisi aineeseen täydellisesti eikä aine tarttuisi pullon seinämiin, kuumennetaan ja pidetään kiehuvana 10 minuutin ajan. Annetaan jäähtyä hieman, lisätään 2 ml typpihappoa (3.4), kuumennetaan varovasti, annetaan jäähtyä hieman, lisätään uudelleen hieman typpihappoa (3.4) ja kohotetaan lämpötila jälleen kiehumispisteeseen. Tämä menettely toistetaan kunnes saadaan väritön liuos. Jäähdytetään, lisätään hieman vettä, neste dekantoidaan 500 ml:n mittapulloon huuhtomalla Kjeldahl-kolvi kuumalla vedellä. Annetaan jäähtyä, täytetään merkkiin asti vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.2   Orgaanisia aineita sisältävät näytteet, jotka eivät sisällä kalsium- ja magnesiumdivetyfosfaatteja

Hehkutusupokkaaseen punnitaan noin 2,5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella. Näytteeseen lisätään 1 g kalsiumkarbonaattia (3.1) ja sekoitetaan kunnes se on täysin sekoittunut näytteeseen. Poltetaan tuhkaksi uunissa 550 oC:ssa kunnes saadaan valkoista tai harmaata tuhkaa (pieni määrä hiiltä ei häiritse). Tuhka siirretään 250 ml:n dekantterilasiin. Lisätään 20 ml vettä ja kloorivetyhappoa (3.2) kunnes kuohuminen lakkaa. Lisätään vielä 10 ml kloorivetyhappoa (3.2). Dekantterilasi asetetaan hiekkahauteelle ja haihdutetaan kuivaksi piin saostamiseksi. Jäännös liuotetaan uudelleen 10 ml:aan typpihappoa (3.3) ja keitetään hiekkahauteella tai sähkölevyllä 5 minuuttia haihduttamatta sitä kuivaksi. Neste dekantoidaan 500 ml:n mittapulloon huuhtomalla dekantterilasi useaan kertaan kuumalla vedellä. Annetaan jäähtyä, täytetään merkkiin asti vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.2   Värin kehitys ja optisen tiheyden mittaus

Laimennetaan 5.1.1 tai 5.1.2 kohdassa saatu suodos siten, että fosforipitoisuus on enintään 40 μg/ml. Pipetoidaan 10 ml tätä liuosta koeputkeen (4.6) ja lisätään siihen 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6). Homogenoidaan ja annetaan seistä ainakin 10 minuuttia 20 oC:ssa. Mitataan optinen tiheys spektrofotometrissä 430 nm:ssä liuosta vastaan, joka on saatu lisäämällä 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6) 10 ml:aan vettä.

5.3   Kalibrointikäyrä

Standardiliuoksesta (3.7) valmistetaan liuokset, joissa on 5, 10, 20, 30 tai 40 μg fosforia/ml. Kaikista liuoksista otetaan 10 ml:n erä ja siihen lisätään 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6). Homogenoidaan ja annetaan seistä ainakin 10 minuuttia 20 oC:ssa. Optinen tiheys mitataan 5.2 kohdan mukaisesti. Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä vastaavia fosforimääriä esittävä kuvaaja. Käyrä on lineaarinen välillä 0–40 μg/ml olevien konsentraatioiden osalta.

6.   Tulosten laskeminen

Tutkittavassa näytteessä oleva fosforimäärä määritetään kalibrointikäyrää käyttäen.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

—	3 %:a, suhteessa korkeampaan tulokseen, alle 5 % olevien fosforipitoisuuksien osalta,

—	0,15 %:a, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, vähintään 5 % olevien fosforipitoisuuksien osalta.

Q.   KLORIDIEN MÄÄRITYS REHUISTA

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää vesiliukoisten kloridien määrä; tulokset ilmoitetaan yleensä natriumkloridina. Menetelmä soveltuu käytettäväksi kaikkiin rehuihin.

2.   Periaate

Kloridit liuotetaan veteen. Jos tuote sisältää orgaanista ainetta, se kirkastetaan. Liuos tehdään hieman happamaksi typpihapolla ja kloridit saostetaan hopeakloridin muodossa hopeanitraattiliuosta käyttäen. Hopeanitraatin ylimäärä titrataan ammoniumtiosyanaattiliuoksella Volhardin menetelmän mukaan.

3.   Reagenssit

3.1	Ammoniumtiosyanaattiliuos 0,1 mol/l.

3.2	Hopeanitraattiliuos 0,1 mol/l.

3.3	Ammoniumferrisulfaattiliuos, kyllästetty liuos (NH4)Fe(SO4)2.

3.4	Typpihappo, tiheys 1,38 g/ml.

3.5	Dietyylieetteri.

3.6

Asetoni.

3.7	Carrez I -liuos: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia, Zn(CH3COO)2·2H2O, ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.8	Carrez-liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6·3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.9	Aktiivihiili, jossa ei ole klorideja ja joka ei absorboi niitä.

4.   Välineistö

Sekoittaja: noin 35–40 kierr./min.

5.   Menettely

5.1   Liuoksen valmistaminen

Näytteen mukaan valmistetaan 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdassa esitetty liuos.

Samanaikaisesti suoritetaan nollakoe, josta määritettävä näyte on jätetty pois.

5.1.1   Näytteet, joissa ei ole orgaanista ainesta

Punnitaan milligramman tarkkuudella enintään 10 g näytettä, joka sisältää alle 3 g kloridien muodossa olevaa klooria. Lisätään 500 ml:n mittapulloon näyte ja 400 ml noin 20 oC:n lämpöistä vettä. Sekoitetaan 30 minuuttia sekoittajassa, täytetään merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.2   Orgaanista ainesta sisältävät näytteet, paitsi 5.1.3 kohdassa luetellut tuotteet.

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g näytettä sekä 1 g aktiivihiiltä 500 ml:n mittapulloon. Lisätään 400 ml noin 20 oC:n lämpöistä vettä ja 5 ml Carrez I -liuosta (3.7), sekoitetaan 30 sekunnin ajan ja tämän jälkeen lisätään 5 ml Carrez II -liuosta (3.8). Sekoitetaan 30 minuuttia sekoittajassa, täytetään merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.3   Keitetyt rehut, pellavansiemenkakut ja -jauho, pellavajauhoa runsaasti sisältävät tuotteet ja muut tuotteet, joissa on runsaasti lima-ainesta tai kolloidisia aineksia (esim. dekstrinoitu tärkkelys).

Valmistetaan liuos 5.1.2 kohdassa esitetyllä tavalla, mutta sitä ei suodateta. Dekantoidaan (tarvittaessa sentrifugoidaan), siirretään 100 ml supernatanttia 200 ml:n mittapulloon. Sekoitetaan asetonin (3.6) kanssa ja täytetään merkkiin asti asetonilla, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.2   Titraus

Pipetoidaan erlenmeyerkolviin 25–100 ml suodosta (oletetun klooripitoisuuden mukaan), joka on saatu 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdassa esitetyllä tavalla. Pipetoitu erä saa sisältää korkeintaan 150 mg klooria (Cl). Laimennetaan tarvittaessa vähintään 50 ml:ksi vedellä, lisätään 5 ml typpihappoa (3.4), 20 ml kyllästettyä ammoniumferrisulfaattiliuosta (3.3) ja kaksi tippaa ammoniumtiosyanaattiliuosta (3.1), joka annostellaan nollamerkkiin täytetystä byretistä. Byrettiä käyttäen lisätään hopeanitraattiliuosta (3.2) siten, että saadaan 5 ml:n ylimäärä. Lisätään 5 ml dietyylieetteriä (3.5) ja ravistellaan voimakkaasti saostuman koaguloimiseksi. Ylimäärä hopeanitraattia titrataan ammoniumtiosyanaattiliuoksella (3.1) kunnes punaruskea väri säilyy noin yhden minuutin ajan.

6.   Tulosten laskeminen

Kloorimäärä (X), joka ilmoitetaan natriumkloridiprosentteina, lasketaan seuraavaa kaavaa käyttäen:

jossa:

V1	=	lisätyn hopeanitraattiliuoksen 0,1 mol/l määrä millilitroina
V2	=	itraukseen käytetyn ammoniumtiosyanaatin 0,1 mol/l määrä millilitroina.
m	=	näytteen paino.

Jos hopeanitraattiliuosta, 0,1 mol/l, on kulunut nollakoetta titrattaessa, kuluneen liuoksen määrä vähennetään tilavuudesta (V1 - V2).

7.   Huomautukset

7.1	Titraus voidaan suorittaa myös potentiometrisesti.

7.2	Jos määritettävät tuotteet sisältävät runsaasti öljyjä ja rasvoja, öljyt ja rasvat on ensin poistettava dietyylieetterillä tai petroolieetterillä.

7.3	Kalajauhon osalta titraus voidaan suorittaa Mohrin menetelmällä.

---

(1)  Viljan, jauhojen, suurimoiden ja rouheiden kuivaamiseen lämpökaapin lämpökapasiteetin on oltava sellainen, että 13 oC:seen etukäteen säädettynä kaapin lämpötila palautuu ennalleen alle 45 minuutissa sen jälkeen, kun siellä on samanaikaisesti suurin mahdollinen määrä näytteitä. Kaapin tuuletuksen on oltava sellainen, että kun siinä kahden tunnin ajan kuivataan niin monta vehnänäytettä kuin sinne mahtuu, tulokset eroavat neljän tunnin ajan suoritetun kuivauksen tuloksista alle 0,15 %.

(2)  Jos rasvalle tai öljylle tehdään vielä tämän jälkeen sen laatuun liittyviä määräyksiä, kiehumakivet korvataan lasihelmillä.

(3)  EYVL L 125, 23.5.1996, s. 35.

LIITE IV

REHUJEN SISÄLTÄMIEN SALLITTUJEN LISÄAINEIDEN VALVONNASSA KÄYTETTÄVÄT MÄÄRITYSMENTELMÄT

A.   A-VITAMIININ MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää A-vitamiinin (retinolin) pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. A-vitamiini käsittää all-trans-retinyylialkoholin ja sen cis-isomeerit, jotka saadaan määritetyiksi tällä menetelmällä. A-vitamiinipitoisuus ilmoitetaan kansainvälisinä yksikköinä (ky) kilogrammaa kohti. Yksi ky vastaa aktiivisuutta, joka on 0,300 μg:lla all-trans-A-vitamiinialkoholia tai 0,344 μg:lla all-trans-A-vitamiiniasetaattia tai 0,550 μg:lla all-trans-A-vitamiinipalmitaattia.

Määritysraja on 2 000 ky A-vitamiinia/kg.

2.   Periaate

Näyte hydrolysoidaan etanoli-kaliumhydroksidiliuoksella, ja A-vitamiini uutetaan petrolieetteriin. Liuotin haihdutetaan pois, haihdutusjäännös liuotetaan metanoliin ja laimennetaan tarvittaessa halutulle pitoisuusalueelle. A-vitamiinipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (RP-HPLC) UV- tai fluoresenssidetektoria käyttäen. Kromatografian ajo-olosuhteet valitaan siten, että all-trans-A-vitamiinialkoholi ja sen cis-isomeerit eivät erotu toisistaan.

3.   Reagenssit

3.1	Etanoli, σ = 96 %.

3.2	Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 oC.

3.3

Metanoli.

3.4	Kaliumhydroksidiliuos, c = 50 g/100 ml.

3.5	Natriumaskorbaattiliuos, c = 10 g/100 ml (ks. 7.7 huomautukset).

3.6	Natriumsulfidi, Na2S · × H2O (x = 7–9).

3.6.1

Natriumsulfidiliuos, c = 0,5 mol/1 glyserolissa, ß = 120 g/l (kun x = 9) (ks. 7.8 huomautukset).

3.7	Fenolftaleiiniliuos, c = 2 g/100 ml etanolissa (3.1).

3.8	2-Propanoli.

3.9	HPLC:ssä käytettävä liikkuva faasi: metanolin (3.3) ja veden seos, esim. 980 + 20 (v + v). Tarkka suhde määräytyy käytetyn kolonnin ominaisuuksien perusteella.

3.10	Typpi, happivapaa.

3.11	All-trans-A-vitamiiniasetaatti, erikoispuhdasta, jonka aktiivisuus on sertifioitu, esim. 2,80 × 106 ky/g.

3.11.1

All-trans-A-vitamiiniasetaatin kantaliuos: Punnitaan 0,1 milligramman tarkkuudella 50 mg A-vitamiiniasetaattia (3.11) 100 ml:n mittapulloon. Liuotetaan 2-propanoliin (3.8) ja täytetään merkkiin asti samalla liuottimella. Tämän liuoksen nimellinen A-vitamiinipitoisuus on 1 400 ky/ml. Tarkka pitoisuus määritetään 5.6.3.1 kohdan mukaisesti.

3.12	All-trans-A-vitamiinipalmitaatti, erikoispuhdasta, jonka aktiivisuus on sertifioitu, esim. 1,80 × 106 ky/g.

3.12.1

All-trans-A-vitamiinipalmitaatin kantaliuos: Punnitaan 0,1 milligramman tarkkuudella 80 mg A-vitamiinipalmitaattia (3.12) 100 ml:n mittapulloon. Liuotetaan 2-propanoliin (3.8) ja täytetään merkkiin asti samalla liuottimella. Tämän liuoksen nimellinen A-vitamiinipitoisuus on 1 400 ky/ml. Tarkka pitoisuus määritetään 5.6.3.2 kohdan mukaisesti.

3.13	2,6-Di-tert-butyyli-4-metyylifenoli (BHT) (ks. 7.5 huomautukset).

4.   Välineistö

4.1	Vakuumipyöröhaihdutin.

4.2	Ruskeita lasiastioita.

4.2.1

Tasapohjaisia tai kartionmuotoisia kolveja, 500 ml, joissa on lasihios.

4.2.2

Mittapulloja, joissa on lasihiostulpat, kapeakaulaisia, 10, 25, 100 ja 500 ml.

4.2.3

Erotussuppiloita, kartiomaisia, 1 000 ml, joissa on lasihiostulpat.

4.2.4

Kartiopohjaisia kolveja, 250 ml, joissa on lasihios.

4.3	Allihn-jäähdytin, vaipan pituus 300 mm, jossa on lasihios ja liitin kaasunsyöttöputkelle.

4.4	Laskostettua suodatinpaperia faasien erotukseen, halkaisija 185 mm (esim. Schleicher & Schüll 597 HY 1/2).

4.5	HPLC-laitteisto, jossa injektori.

4.5.1

Nestekromatografiakolonni, 250 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 tai 10 μm, tai vastaava (suorituskykyvaatimus: vain yksi piikki kaikille retinoli-isomeereille ko. HPLC-ajo-olosuhteilla).

4.5.2

Vaihtuva-aallonpituuksinen UV- tai fluoresenssidetektori.

4.6	Spektrofotometri ja 10 mm:n kvartsikyvettejä.

4.7	Vesihaude, jossa on magneettisekoitin.

4.8	Uuttolaitteisto, jossa on (ks. kuva 1):

4.8.1

Lasisylinteri, tilavuus 1 l, jossa on lasihioskaula ja tulppa.

4.8.2

Lasihiosliitin, jossa on sivuputki ja keskeltä läpi menevä liikuteltava putki. Liikuteltavassa putkessa on oltava U:n muotoinen alapää ja toisessa päässä nokka, niin että sylinterissä oleva ylempi nestekerros voidaan siirtää erotussuppiloon.

5.   Menettely

Huomautus:

A-vitamiini on herkkä (UV-)valolle ja hapettumiselle. Kaikki toimenpiteet on suoritettava valolta suojattuna (käyttäen ruskeita tai alumiinifoliolla suojattuja lasitarvikkeita) ja hapelta suojattuna (typpivirtauksessa). Uuton aikana nestepinnan yläpuolella oleva ilma on korvattava typellä (ylipaineen muodostuminen estettävä raottamalla tulppaa silloin tällöin).

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan niin että se läpäisee 1 mm:n seulan; näytteen lämpenemistä on vältettävä. Näytteen jauhaminen on tehtävä välittömästi ennen punnitusta ja saippuointia A-vitamiinin hajoamisen välttämiseksi.

5.2   Saippuointi

A-vitamiinipitoisuudesta riippuen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2–25 g näytettä 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1). Lisätään peräkkäin kolvia pyörittäen 130 ml etanolia (3.1), noin 100 mg BHT:tä (3.13), 2 ml natriumaskorbaattiliuosta (3.5) ja 2 ml natriumsulfidiliuosta (3.6). Kiinnitetään jäähdytin (4.3) kolviin, ja kolvi pannaan vesihauteeseen, jossa on magneettisekoitin (4.7). Kuumennetaan kiehumispisteeseen ja annetaan kiehua 5 minuuttia. Lisätään 25 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) jäähdyttimen läpi (4.3) ja annetaan kiehua vielä 25 minuuttia sekoittaen hitaassa typpivirrassa. Jäähdytin huuhdellaan noin 20 ml:lla vettä ja kolvin sisältö jäähdytetään huoneenlämpötilaan.

5.3   Uutto

Saippuointiliuos siirretään dekantoimalla kvantitatiivisesti, huuhtomalla kaikkiaan 250 ml:lla vettä, 1 000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3) tai uuttolaitteeseen (4.8). Saippuointikolvi huuhdotaan ensin 25 ml:lla etanolia (3.1) ja sitten 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja huuhteluliuos siirretään erotussuppiloon tai uuttolaitteeseen. Veden ja etanolin lopputilavuuksien suhteen on oltava noin 2:1. Ravistellaan voimakkaasti 2 minuuttia ja annetaan laskeutua 2 minuuttia.

5.3.1   Uutto erotussuppiloa (4.2.3) käyttäen

Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), petrolieetterikerros siirretään toiseen erotussuppiloon (4.2.3). Uutto toistetaan kahdesti 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2).

Yhdistetyt uutteet pestään erotussuppilossa, pyörittäen varovasti (emulsion muodostumisen välttämiseksi), kahdesti 100 ml:lla vettä ja sitten toistuvasti ravistelemalla edelleen 100 ml:lla vettä kerrallaan, kunnes pesuvesi on väritön lisättäessä fenolftaleiiniliuosta (3.7) (neljä pesukertaa riittää yleensä). Pesty uute suodatetaan suspendoitujen vesijäämien poistamiseksi kuivan laskostetun faasinerotussuodatinpaperin läpi (4.4) 500 ml:n mittapulloon (4.2.2). Erotussuppilo ja suodatinpaperi huuhdotaan 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2), täytetään merkkiin asti petrolieetterillä (3.2) ja sekoitetaan hyvin.

5.3.2   Uutto uuttolaitteella (4.8)

Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), pannaan lasisylinterin (4.8.1) tulpan tilalle lasihiosliitin (4.8.2) ja asetetaan liikuteltavan putken U:n muotoinen alapää siten, että se on juuri faasien rajakohdan yläpuolella. Johtamalla paineistettua typpeä sivuputkeen siirretään ylempi petrolieetterikerros 1 000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3). Lisätään 100 ml petrolieetteriä (3.2) lasisylinteriin, suljetaan tulpalla ja ravistellaan hyvin. Annetaan faasien erottua ja siirretään ylempi kerros erotussuppiloon kuten edellä. Uutto toistetaan vielä 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja petrolieetterikerrokset siirretään erotussuppiloon.

Yhdistetyt petrolieetteriuutteet pestään kuten 5.3.1 kohdassa ja jatketaan kuten kyseisessä kohdassa kerrottu.

5.4   Näyteliuoksen valmistaminen HPLC-ajoja varten

Pipetoidaan tietty määrä petrolieetteriliuosta (joka on saatu kohdassa 5.3.1 tai 5.3.2) 250 ml:n päärynänmuotoiseen kolviin (4.2.4). Liuotin haihdutetaan lähes kuiviin pyöröhaihduttimella (4.1) alennetussa paineessa; vesihauteen lämpötila saa olla korkeintaan 40 oC. Ilmanpaine palautetaan normaaliksi typellä (3.10) ja kolvi otetaan pois pyöröhaihduttimesta. Jäljellä oleva liuotin haihdutetaan typpivirrassa (3.10) ja jäännös liuotetaan välittömästi tunnettuun tilavuuteen (10–100 ml) metanolia (3.3) (A-vitamiinipitoisuuden on oltava välillä 5–30 ky/ml).

5.5   Määritys HPLC:llä

A-vitamiini erotetaan C18-käänteisfaasikolonnilla (4.5.1) ja sen pitoisuus mitataan UV-detektorilla (325 nm) tai fluoresenssidetektorilla (eksitaatio: 325 nm, emissio: 475 nm) (4.5.2).

Injektoidaan tietty määrä (esim. 20 μl) kohdassa 5.4 saatua metanoliliuosta ja eluoidaan liikkuvalla faasilla (3.9). Lasketaan useiden saman näyteliuoksen injektioiden sekä useiden kalibrointiliuosten (5.6.2) injektioiden piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo.

HPLC-ajo-olosuhteet

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia; muita ajo-olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset.

Nestekromatografiakolonni (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 tai 10 μm, tai vastaava
Liikkuva faasi (3.9):	Metanolin (3.3) ja veden seos, esim. 980 + 20 (v + v).
Virtausnopeus:	1–2 ml/min
Detektori (4.5.2):	UV-detektori (325 nm) tai fluoresenssidetektori (eksitaatio: 325 nm / emissio: 475 nm)

5.6   Kalibrointi

5.6.1   Käyttöstandardiliuosten valmistaminen

Pipetoidaan 20 ml A-vitamiiniasetaatin kantaliuosta (3.11.1) tai 20 ml A-vitamiinipalmitaatin kantaliuosta (3.12.1) 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin 4.2.1) ja hydrolysoidaan kuten kohdassa 5.2, mutta ilman BHT-lisäystä. Tämän jälkeen uutetaan petrolieetterillä (3.2) kohdan 5.3 mukaisesti ja täytetään 500 ml:aan petrolieetterillä (3.2). Haihdutetaan 100 ml tätä uutetta pyöröhaihduttimella (ks. 5.4) lähes kuiviin, jäljellä oleva liuotin poistetaan typpivirralla (3.10) ja jäännös liuotetaan 10,0 ml:aan metanolia (3.3). Tämän liuoksen nimellinen A-vitamiinipitoisuus on 560 ky/ml. Tarkka pitoisuus on määritettävä kohdan 5.6.3.3 mukaisesti. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä.

Pipetoidaan 2,0 ml tätä käyttöstandardiliuosta 20 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Tämän laimennetun käyttöstandardiliuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia.

5.6.2   Kalibrointiliuosten valmistaminen ja kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 1,0, 2,0, 5,0 ja 10,0 ml laimennettua käyttöstandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,8, 5,6, 14,0 ja 28,0 ky/ml A-vitamiinia.

Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja, ottaen huomioon UV-spektrin tarkistuksen tulokset (5.6.3.3).

5.6.3   Standardiliuosten UV-standardisointi

5.6.3.1    A-vitamiiniasetaattikantaliuos

Pipetoidaan 2,0 ml A-vitamiiniasetaattikantaliuosta (3.11.1) 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia. Pipetoidaan 3,0 ml tätä laimennettua A-vitamiiniasetaattiliuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300–400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325–327 nm.

A-vitamiinipitoisuuden laskeminen:

ky/ml A-vitamiinia = E326 × 19,0

(A-vitamiiniasetaatin = 1 530 aallonpituudella 326 nm 2-propanolissa)

5.6.3.2    A-vitamiinipalmitaattikantaliuos

Pipetoidaan 2,0 ml A-vitamiinipalmitaattikantaliuosta (3.12.1) 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia. Pipetoidaan 3,0 ml tätä laimennettua A-vitamiinipalmitaattiliuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300–400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325–327 nm.

A-vitamiinipitoisuuden laskeminen:

ky/ml A-vitamiinia = E326 × 19,0

(A-vitamiinipalmitaatin = 957 aallonpituudella 326 nm 2-propanolissa)

5.6.3.3    A-vitamiinin käyttöstandardiliuos

Pipetoidaan 3,0 ml laimentamatonta A-vitamiinin käyttöstandardiliuosta, joka on valmistettu kohdan 5.6.1 mukaisesti, 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Pipetoidaan 5,0 ml tätä liuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300–400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325–327 nm.

A-vitamiinipitoisuuden laskeminen:

ky/ml A-vitamiinia = E325 × 18,3

(A-vitamiinialkoholin = 1 821 aallonpituudella 325 nm 2-propanolissa)

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen A-vitamiinipitoisuus (ky/ml) lasketaan näyteliuoksen A-vitamiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.6.2) avulla.

Näytteen A-vitamiinipitoisuus w (ky/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla:

[IU/kg]

jossa:

c	=	näyteliuoksen (5.4) A-vitamiinipitoisuus (ky/ml),
V1	=	näyteliuoksen (5.4) tilavuus (ml),
V2	=	kohdassa 5.4 otetun näyteliuoksen tilavuus (ml),
m	=	näyte-erän paino (g).

7.   Huomautukset

7.1	Jos näytteiden A-vitamiinipitoisuus on alhainen, voi olla hyödyllistä yhdistää kahden saippuointierän petrolieetteriuutteet (punnittu määrä: 25 g) yhdeksi näyteliuokseksi HPLC-määritystä varten.

7.2	Analyysiä varten otetussa näytemäärässä ei saa olla yli 2 g:aa rasvaa.

7.3	Jos faasit eivät erotu, lisätään noin 10 ml etanolia (3.1) emulsion hajottamiseksi.

7.4	Kun on kyseessä kalanmaksaöljy ja muut puhtaat rasvat, saippuointiajan on oltava 45–60 minuuttia.

7.5	Hydrokinonia voi käyttää BHT:n sijasta.

7.6	Käytettäessä normaalifaasikolonnia retinoli-isomeerit voivat erottua toisistaan. Siinä tapauksessa kaikkien cis- ja trans-isomeeripiikkien korkeudet (pinta-alat) on laskettava yhteen.

7.7	Natriumaskorbaattiliuoksen voi korvata noin 150 mg:lla askorbiinihappoa.

7.8	Natriumsulfidiliuoksen voi korvata noin 50 mg:lla EDTA:ta.

7.9

Maidonkorvikkeiden A-vitamiinin määrityksessä on kiinnitettävä erityistä huomiota — saippuointiin (5.2): näytteen sisältämän rasvamäärän vuoksi kaliumhydroksidiliuoksen (3.4) määrää voi olla tarpeen lisätä, — uuttamiseen (5.3): emulsioiden esiintymisen vuoksi veden ja etanolin suhdetta 2:1 voi olla tarpeen muuttaa. Ylimääräisellä näyte-erällä tehtävällä saantokokeella varmistetaan, että käytetty menetelmä tuottaa luotettavat tulokset tällä materiaalilla (maidonkorvikkeella). Jos saantoaste on alempi kuin 80 %, määrityksen tulosta on korjattava saannon suhteen.

8.   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta arvosta.

9.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset  (1)

	Esiseos	Esiseosvalmiste	Kivennäisrehu	Tiiviste	Porsasrehu
L	13	12	13	12	13
n	48	45	47	46	49
keskiarvo [ky/kg]	17,02 × 106	1,21 × 106	537 100	151 800	18 070
sr [ky/kg]	0,51 × 106	0,039 × 106	22 080	12 280	682
r [ky/kg]	1,43 × 106	0,109 × 106	61 824	34 384	1 910
CVr [ %]	3,0	3,5	4,1	8,1	3,8
sR [ky/kg]	1,36 × 106	0,069 × 106	46 300	23 060	3 614
R [ky/kg]	3,81 × 106	0,193 × 106	129 640	64 568	10 119
CVR [ %]	8,0	6,2	8,6	15	20

L	=	laboratorioiden lukumäärä
n	=	yksittäisten arvojen lukumäärä
sr	=	toistettavuuden keskihajonta
sR	=	uusittavuuden keskihajonta
r	=	toistettavuus
R	=	uusittavuus
CVr	=	toistettavuuden variaatiokerroin
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin

B.   E-VITAMIININ MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää E-vitamiinin pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. E-vitamiinipitoisuus ilmoitetaan mg/kg DL-α-tokoferoliasetaattia. 1 mg DL-α-tokoferoliasetaattia vastaa 0,91 mg:aa DL-α-tokoferolia (E-vitamiinia).

Määritysraja on 2 mg E-vitamiinia/kg. Tämä määritysraja voidaan saavuttaa ainoastaan fluoresenssi-detektorilla. UV-detektoria käytettäessä määritysraja on 10 mg/kg.

2.   Periaate

Näyte hydrolysoidaan etanoli-kaliumhydroksidiliuoksella ja E-vitamiini uutetaan petrolieetteriin. Liuotin haihdutetaan pois, haihdutusjäännös liuotetaan metanoliin ja laimennetaan tarvittaessa halutulle pitoisuusalueelle. E-vitamiinipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (RP-HPLC) fluoresenssi- tai UV-detektoria käyttäen.

3.   Reagenssit

3.1	Etanoli, σ = 96 %.

3.2	Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 oC.

3.3

Metanoli.

3.4	Kaliumhydroksidiliuos, c = 50 g/100 ml.

3.5	Natriumaskorbaattiliuos, c = 10 g/100 ml (ks. 7.7 huomautukset).

3.6	Natriumsulfidi, Na2S · × H2O (x = 7–9).

3.6.1

Natriumsulfidiliuos, c = 0,5 mol/1 glyserolissa, β = 120 g/l (kun x = 9) (ks. 7.8 huomautukset).

3.7	Fenolftaleiiniliuos, c = 2 g/100 ml etanolissa (3.1).

3.8	HPLC:ssä käytettävä liikkuva faasi: metanolin (3.3) ja veden seos, esim. 980 + 20 (v + v). Tarkka suhde määräytyy käytetyn kolonnin ominaisuuksien perusteella.

3.9	Typpi, happivapaa.

3.10	DL-α-tokoferoliasetaatti, erikoispuhdas, sertifioitu aktiivisuus.

3.10.1

DL-α-tokoferoliasetaatin kantaliuos: Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 100 mg DL-α-tokoferoliasetaattia (3.10) 100 ml:n mittapulloon. Liuotetaan etanoliin (3.1) ja täytetään merkkiin asti samalla liuottimella. 1 ml tätä liuosta sisältää 1 mg DL-α-tokoferoliasetaattia. (UV-tarkistus, ks. 5.6.1.3; stabilointi, ks. 7.4 huomautukset).

3.11	DL-α-tokoferoli, erikoispuhdas, sertifioitu aktiivisuus.

3.11.1

DL-α-tokoferolin kantaliuos: Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 100 mg DL-α-tokoferolia (3.11) 100 ml:n mittapulloon. Liuotetaan etanoliin (3.1) ja täytetään merkkiin asti samalla liuottimella. 1 ml tätä liuosta sisältää 1 mg DL-α-tokoferolia. (UV-tarkistus, ks. 5.6.2.3; stabilointi, ks. 7.4 huomautukset).

3.12	2,6-Di-tert-butyyli-4-metyylifenoli (BHT) (ks. 7.5 huomautukset).

4.   Välineistö

4.1	Pyörivä kalvohaihdutin.

4.2	Ruskeita lasiastioita.

4.2.1

Tasapohjaisia tai kartionmuotoisia keittokolveja, 500 ml, joissa on lasihios.

4.2.2

Mittapulloja, joissa on lasihiostulpat, kapeakaulaisia, 10, 25, 100 ja 500 ml.

4.2.3

Erotussuppiloita, kartiomaisia, 1 000 ml, joissa on lasihiostulpat.

4.2.4

Päärynänmuotoisia kolveja, 250 ml, joissa on lasihios.

4.3	Allihn-jäähdytin, vaipan pituus 300 mm, jossa on lasihios ja liitin kaasunsyöttöputkelle.

4.4	Laskostettua suodatinpaperia faasien erotukseen, halkaisija 185 mm (esim. Schleicher & Schüll 597 HY 1/2).

4.5	HPLC-laitteisto, jossa injektori.

4.5.1

Nestekromatografiakolonni, 250 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 tai 10 μm, tai vastaava.

4.5.2

Vaihtuva-aallonpituuksinen fluoresenssi- tai UV- detektori.

4.6	Spektrofotometri ja 10 mm:n kvartsikyvettejä.

4.7	Vesihaude, jossa on magneettisekoitin.

4.8	Uuttolaitteisto, jossa on (ks. kuva 1):

4.8.1

Lasisylinteri, tilavuus 1 l, jossa on lasihioskaula ja tulppa.

4.8.2

Lasihiosliitin, jossa on sivuputki ja keskeltä läpi menevä liikuteltava putki. Liikuteltavassa putkessa on oltava U:n muotoinen alapää ja toisessa päässä nokka, niin että sylinterissä oleva ylempi nestekerros voidaan siirtää erotussuppiloon.

5.   Menettely

Huomautus:

E-vitamiini on herkkä (UV-)valolle ja hapettumiselle. Kaikki toimenpiteet on suoritettava valolta suojattuna (käyttäen ruskeita tai alumiinifoliolla suojattuja lasitarvikkeita) ja hapelta suojattuna (typpivirtauksessa). Uuton aikana nestepinnan yläpuolella oleva ilma on korvattava typellä (ylipaineen muodostuminen estettävä raottamalla tulppaa silloin tällöin).

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan niin että se läpäisee 1 mm:n seulan; näytteen lämpenemistä on vältettävä. Näytteen jauhaminen on tehtävä välittömästi ennen punnitusta ja saippuointia E-vitamiinin hajoamisen välttämiseksi.

5.2   Saippuointi

E-vitamiinipitoisuudesta riippuen punnitaan 0,01 g:n tarkkuudella 2–25 g näytettä 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1). Lisätään peräkkäin kolvia pyörittäen 130 ml etanolia (3.1), noin 100 mg BHT:tä (3.12), 2 ml natriumaskorbaattiliuosta (3.5) ja 2 ml natriumsulfidiliuosta (3.6). Kiinnitetään jäähdytin (4.3) kolviin ja kolvi pannaan vesihauteeseen, jossa on magneettisekoitin (4.7). Kuumennetaan kiehumispisteeseen ja annetaan kiehua 5 minuuttia. Lisätään 25 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) jäähdyttimen läpi (4.3) ja annetaan kiehua vielä 25 minuuttia sekoittaen hitaassa typpivirrassa. Jäähdytin huuhdellaan noin 20 ml:lla vettä ja kolvin sisältö jäähdytetään huoneenlämpötilaan.

5.3   Uutto

Saippuointiliuos siirretään dekantoimalla kvantitatiivisesti, huuhtomalla kaikkiaan 250 ml:lla vettä, 1 000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3) tai uuttolaitteeseen (4.8). Saippuointikolvi huuhdotaan ensin 25 ml:lla etanolia (3.1) ja sitten 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja huuhteluliuos siirretään erotussuppiloon tai uuttolaitteeseen. Veden ja etanolin lopputilavuuksien suhteen pitää olla noin 2:1. Ravistellaan voimakkaasti 2 minuuttia ja annetaan laskeutua 2 minuuttia.

5.3.1   Uutto erotussuppiloa (4.2.3) käyttäen

Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), petrolieetterikerros siirretään toiseen erotussuppiloon (4.2.3). Uutto toistetaan kahdesti 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2).

Yhdistetyt uutteet pestään erotussuppilossa, pyörittäen varovasti (emulsion muodostumisen välttämiseksi), kahdesti 100 ml:lla vettä ja sitten toistuvasti ravistelemalla edelleen 100 ml:lla vettä kerrallaan, kunnes pesuvesi on väritön lisättäessä fenolftaleiiniliuosta (3.7) (neljä pesukertaa riittää yleensä). Pesty uute suodatetaan suspendoitujen vesijäämien poistamiseksi kuivan laskostetun suodatinpaperin läpi (4.4) 500 ml:n mittapulloon (4.2.2). Erotussuppilo ja suodatinpaperi huuhdotaan 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2), täytetään merkkiin asti petrolieetterillä (3.2) ja sekoitetaan hyvin.

5.3.2   Uutto uuttolaitteella (4.8)

Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), pannaan lasisylinterin (4.8.1) tulpan tilalle lasihiosliitin (4.8.2) ja asetetaan liikuteltavan putken U:n muotoinen alapää siten, että se on juuri faasien rajakohdan yläpuolella. Johtamalla paineistettua typpeä sivuputkeen siirretään ylempi petrolieetterikerros 1 000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3). Lisätään 100 ml petrolieetteriä (3.2) lasisylinteriin, suljetaan tulpalla ja ravistellaan hyvin. Annetaan faasien erottua ja siirretään ylempi kerros erotussuppiloon kuten edellä. Uutto toistetaan vielä 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja petrolieetterikerrokset siirretään erotussuppiloon.

Yhdistetyt petrolieetteriuutteet pestään kuten 5.3.1 kohdassa ja jatketaan kuten kyseisessä kohdassa kerrottu.

5.4   Näyteliuoksen valmistaminen HPLC-ajoja varten

Pipetoidaan tietty määrä petrolieetteriliuosta (joka on saatu kohdassa 5.3.1 tai 5.3.2) 250 ml:n päärynänmuotoiseen kolviin (4.2.4). Liuotin haihdutetaan lähes kuiviin pyöröhaihduttimella (4.1) alennetussa paineessa; vesihauteen lämpötila saa olla korkeintaan 40 oC. Ilmanpaine palautetaan normaaliksi typellä (3.9) ja kolvi otetaan pois pyöröhaihduttimesta. Jäljellä oleva liuotin haihdutetaan typpivirrassa (3.9) ja jäännös liuotetaan välittömästi tunnettuun tilavuuteen (10–100 ml) metanolia (3.3) (DL-α-tokoferolipitoisuuden on oltava välillä 5–30 μg/ml).

5.5   Määritys HPLC:llä

E-vitamiini erotetaan C18-käänteisfaasikolonnilla (4.5.1) ja sen pitoisuus mitataan fluoresenssidetektorilla (eksitaatio: 295 nm, emissio: 330 nm) tai UV-detektorilla (292 nm) (4.5.2).

Injektoidaan tietty määrä (esim. 20 μl) kohdassa 5.4 saatua metanoliliuosta ja eluoidaan liikkuvalla faasilla (3.8). Lasketaan useiden saman näyteliuoksen injektioiden sekä useiden kalibrointiliuosten (5.6.2) injektioiden piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo.

HPLC-ajo-olosuhteet

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia; muita ajo-olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset.

Nestekromatografiakolonni (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 tai 10 μm, tai vastaava
Liikkuva faasi (3.8):	Metanolin (3.3) ja veden seos, esim. 980 + 20 (v + v).
Virtausnopeus:	1–2 ml/min
Detektori (4.5.2):	Fluoresenssidetektori (eksitaatio: 295 nm / emissio: 330 nm) tai UV-detektori (292 nm)

5.6   Kalibrointi (DL-α-tokoferoliasetaatti tai DL-α-tokoferoli)

5.6.1   DL-α-tokoferoliasetaattistandardi

5.6.1.1    Käyttöstandardiliuoksen valmistaminen

Pipetoidaan 25 ml DL-α-tokoferoliasetaattikantaliuosta (3.10.1) 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1) ja hydrolysoidaan kuten kohdassa 5.2. Tämän jälkeen uutetaan petrolieetterillä (3.2) kohdan 5.3 mukaisesti ja täytetään 500 ml:aan petrolieetterillä. Haihdutetaan 25 ml tätä uutetta pyöröhaihduttimella (ks. 5.4) lähes kuiviin, jäljellä oleva liuotin poistetaan typpivirralla (3.9) ja jäännös liuotetaan 25,0 ml:aan metanolia (3.3). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 45,5 μg/ml DL-α-tokoferolia, mikä vastaa 50 μg/ml:aa DL-α-tokoferoliasetaattia. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä.

5.6.1.2    Kalibrointiliuosten valmistaminen ja kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 1,0, 2,0, 4,0 ja 10,0 ml kantastandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,5, 5,0, 10,0 ja 25,0 μg/ml DL-α-tokoferoliasetaattia eli 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml ja 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolia.

Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja.

5.6.1.3    DL-α-tokoferoliasetaattikantaliuoksen (3.10.1) UV-standardisointi

Laimennetaan 5,0 ml DL-α-tokoferoliasetaattikantaliuosta (3.10.1) 25,0 ml:ksi etanolilla ja mitataan tämän liuoksen UV-spektri etanolia (3.1) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 250–320 nm.

Absorptiomaksimin pitää olla aallonpituudella 284 nm:

= 43,6 aallonpituudella 284 nm etanolissa

Tällä laimennuksella pitää saada ekstinktioarvo 0,84–0,88.

5.6.2   DL-α-tokoferolistandardi

5.6.2.1    Käyttöstandardiliuoksen valmistaminen

Pipetoidaan 2 ml DL-α-tokoferolikantaliuosta (3.11.1) 50 ml:n mittapulloon, liuotetaan metanoliin (3.3) ja täytetään merkkiin asti metanolilla. Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 40 μg/ml DL-α-tokoferolia, mikä vastaa 44,0 μg/ml:aa DL-α-tokoferoliasetaattia. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä.

5.6.2.2    Kalibrointiliuosten valmistaminen ja kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 1,0, 2,0, 4,0 ja 10,0 ml kantastandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,0, 4,0, 8,0 ja 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolia eli 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml ja 22,0 μg/ml DL-α-tokoferoliasetaattia.

Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja.

5.6.2.3    DL-α-tokoferolikantaliuoksen (3.11.1) UV-standardisointi

Laimennetaan 2,0 ml DL-α-tokoferolikantaliuosta (3.11.1) 25,0 ml:ksi etanolilla ja mitataan tämän liuoksen UV-spektri etanolia (3.1) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 250–320 nm. Absorptiomaksimin pitää olla aallonpituudella 292 nm:

= 75,8 aallonpituudella 292 nm etanolissa

Tällä laimennuksella pitää saada ekstinktioarvo 0,6.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen E-vitamiinipitoisuus μg/ml (laskettuna α-tokoferoliasetaattina) määritetään näyteliuoksen E-vitamiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.6.1.2 tai 5.6.2.2) avulla.

Näytteen E-vitamiinipitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla:

[mg/kg]

jossa:

c	=	näyteliuoksen (5.4) E-vitamiinipitoisuus (α-tokoferoliasetaattina) (μg/ml);
V1	=	näyteliuoksen (5.4) tilavuus (ml);
V2	=	näyteliuoksen (5.4) tilavuus (ml);
m	=	näyte-erän paino (g).

7.   Huomautukset

7.1	Jos näytteiden E-vitamiinipitoisuus on alhainen, voi olla hyödyllistä yhdistää kahden saippuointierän petrolieetteriuutteet (punnittu määrä: 25 g) yhdeksi näyteliuokseksi HPLC-määritystä varten.

7.2	Analyysiä varten otetussa näytemäärässä ei saa olla yli 2 g:aa rasvaa.

7.3	Jos faasit eivät erotu, lisätään noin 10 ml etanolia (3.1) emulsion hajottamiseksi.

7.4

Sen jälkeen, kun DL-α-tokoferoliasetaattiliuoksen pitoisuus on määritetty 5.6.1.3 kohdan mukaisesti tai DL-α-tokoferoliliuoksen pitoisuus 5.6.2.3 kohdan mukaisesti spektrofotometrisesti, lisätään noin 10 mg BHT:tä (3.12) liuokseen (3.10.1 tai 3.10.2); liuos säilytetään jääkaapissa (enintään 4 viikkoa).

7.5	Hydrokinonia voi käyttää BHT:n sijasta.

7.6	Käytettäessä normaalifaasikolonnia α-, β-, γ- ja δ-tokoferolit voivat erottua toisistaan.

7.7	Natriumaskorbaattiliuoksen voi korvata noin 150 mg:lla askorbiinihappoa.

7.8	Natriumsulfidiliuoksen voi korvata noin 50 mg:lla EDTA:ta.

7.9

E-vitamiiniasetaatti hydrolysoituu hyvin nopeasti emäksisissä olosuhteissa, ja siksi se hapettuu herkästi eritoten hivenaineiden kuten raudan tai kuparin läsnä ollessa. Jos esiseoksessa on E-vitamiinia yli 5 000 mg/kg, E-vitamiini saattaa hajota. Tästä syystä varmistuksessa suositellaan käytettäväksi HPLC-menetelmää, johon kuuluu E-vitamiiniyhdisteen hajottaminen entsymaattisesti ilman emäksistä saippuointivaihetta.

8.   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta arvosta.

9.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset  (2)

	Esiseos	Esiseosvalmiste	Kivennäisrehu	Tiiviste	Porsasrehu
L	12	12	12	12	12
n	48	48	48	48	48
keskiarvo [mg/kg]	17 380	1 187	926	315	61,3
sr [mg/kg]	384	45,3	25,2	13,0	2,3
r [mg/kg]	1 075	126,8	70,6	36,4	6,4
CVr [ %]	2,2	3,8	2,7	4,1	3,8
sR mg/kg]	830	65,0	55,5	18,9	7,8
R [mg/kg]	2 324	182,0	155,4	52,9	21,8
CVR [ %]	4,8	5,5	6,0	6,0	12,7

L	=	laboratorioiden lukumäärä
n	=	yksittäisten arvojen lukumäärä
sr	=	toistettavuuden keskihajonta
sR	=	uusittavuuden keskihajonta
r	=	toistettavuus
R	=	uusittavuus
CVr	=	toistettavuuden variaatiokerroin
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin.

C.   RAUDAN, KUPARIN, MANGAANIN JA SINKIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehuista hivenaineet rauta, kupari, mangaani ja sinkki. Määritysrajat ovat:

—	rauta (Fe): 20 mg/kg

—	kupari (Cu): 10 mg/kg

—	mangaani (Mn): 20 mg/kg

—	sinkki (Zn): 20 mg/kg.

2.   Periaate

Näytteet liuotetaan kloorivetyhappoon sen jälkeen, kun siinä mahdollisesti esiintyvät orgaaniset aineet on tuhottu. Alkuaineet rauta, kupari, mangaani ja sinkki määritetään sopivan laimennuksen jälkeen atomiabsorbtiospektrometrillä.

3.   Reagenssit

Alustavat huomautukset

Reagenssien ja analyysiliuosten valmistuksessa käytetään määritettävistä kationeista vapaata vettä, joka on saatu joko tislaamalla se kaksi kertaa borosilikaattilasista tai kvartsista valmistetussa tislauslaitteessa tai käsittelemällä se kaksi kertaa ioninvaihtohartsilla.

Reagenssien on oltava vähintään analyysilaatua. Nollakokeella tarkistetaan, ettei määritettävää alkuainetta esiinny. Tarvittaessa reagensseja on puhdistettava lisää.

Seuraavassa kuvattujen standardiliuosten tilalla voidaan käyttää kaupallisesti saatavilla olevia standardiliuoksia, jos ne ovat takuulaatua ja ne on tarkistettu ennen käyttöä.

3.1	Kloorivetyhappo, tiheys 1,19 g/ml.

3.2	Kloorivetyhappo, 6 mol/l.

3.3	Kloorivetyhappo, 0,5 mol/l.

3.4	38–40 % (v/v) fluorivetyhappo, jonka rautapitoisuus on alle 1 mg Fe/l ja haihdutusjäännös alle 10 mg (sulfaattina)/litra.

3.5	Rikkihappo, tiheys 1,84 g/ml.

3.6	Vetyperoksidi, noin 100 tilavuusosaa happea (30 % (w/v)).

3.7	Rautastandardiliuos (1 000 μg Fe/ml), joka on valmistettu seuraavasti, tai vastaava kaupallisesti saatavilla oleva liuos: liuotetaan 1 g rautalankaa 200 ml:aan kloorivetyhappoa, 6 mol/l, (3.2), lisätään 16 ml vetyperoksidia (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.7.1

Rautakäyttöstandardiliuos (100 μg Fe/ml), joka on valmistettu laimentamalla 1 osa standardiliuosta (3.7) 9 osalla vettä.

3.8	Kuparistandardiliuos (1 000 μg Cu/ml), joka on valmistettu seuraavasti, tai vastaava kaupallisesti saatavilla oleva liuos: — liuotetaan 1 g jauhemaista kuparia 25 ml:aan kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), lisätään 5 ml vetyperoksidia (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.8.1

Kuparikäyttöstandardiliuos (10 μg Cu/ml), joka on valmistettu laimentamalla 1 osa standardiliuosta (3.8) 9 osalla vettä ja sen jälkeen laimentamalla 1 osa saatua liuosta 9 osalla vettä.

3.9	Mangaanistandardiliuos (1 000 μg Mn/ml), joka on valmistettu seuraavasti, tai vastaava kaupallisesti saatavilla oleva liuos: — liuotetaan 1 g jauhemaista mangaania 25 ml:aan kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.9.1

Mangaanikäyttöstandardiliuos (10 μg Mn/ml), joka on valmistettu laimentamalla 1 osa standardiliuosta (3.9) 9 osalla vettä ja sen jälkeen laimentamalla 1 osa saatua liuosta 9 osalla vettä.

3.10	Sinkkistandardiliuos (1 000 μg Zn/ml), joka on valmistettu seuraavasti, tai vastaava kaupallisesti saatavilla oleva liuos: — liuotetaan 1 g nauhamaisessa tai lehtimäisessä muodossa olevaa sinkkiä 25 ml:aan kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.10.1

Sinkkikäyttöstandardiliuos (10 μg Zn/ml), joka on valmistettu laimentamalla 1 osa standardiliuosta (3.10) 9 osalla vettä ja sen jälkeen laimentamalla 1 osa saatua liuosta 9 osalla vettä.

3.11	Lantaanikloridiliuos: liuotetaan 12 g lantaanioksidia 150 ml:aan vettä, lisätään 100 ml kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), ja täytetään 1 litraksi vedellä.

4.   Välineistö

4.1	Muhveliuuni, jossa on lämpötilan säätölaite ja mielellään myös piirturi.

4.2	Lasitavaroiden on oltava kestävää borosilikaattityyppiä, ja on suositeltavaa käyttää välineitä, jotka on erityisesti tarkoitettu hivenaineiden määrityksiin.

4.3	Atomiabsorbtiospektrofotometri, jonka herkkyys ja tarkkuus vaaditulla alueella täyttävät menetelmän vaatimukset.

5.   Menettely  (3)

5.1   Orgaanista ainetta sisältävät näytteet

5.1.1   Polttaminen tuhkaksi ja analyysiin tarvittavan liuoksen valmistaminen  (4)

5.1.1.1

Punnitaan 5–10 g näytettä 0,2 mg:n tarkkuudella, pannaan kvartsi- tai platinaupokkaaseen (ks. huomautus b), kuivataan lämpökaapissa 105 oC:ssa ja pannaan upokas kylmään muhveliuuniin (4.1). Uuni suljetaan (ks. huomautus c) ja lämpötila nostetaan vähitellen 450–475 oC:seen noin 90 minuutin aikana. Lämpötila pidetään tässä 4–16 tuntia (esimerkiksi yön yli) hiilipitoisen materiaalin poistamiseksi ja uuni avataan ja sen annetaan jäähtyä (ks. huomautus d). Tuhka kostutetaan vedellä ja siirretään 250 ml:n dekantterilasiin. Upokas pestään yhteensä noin 5 ml:lla kloorivetyhappoa (3.1), happo lisätään hitaasti ja varovasti dekantterilasiin (tällöin voi esiintyä voimakas reaktio, joka johtuu CO2:n muodostumisesta). Lisätään kloorivetyhappoa (3.1) pisaroittain samalla sekoittaen kunnes kupliminen on kokonaan lakannut. Haihdutetaan kuivaksi ajoittain lasisauvalla sekoittaen. Jäännökseen lisätään 15 ml kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), ja noin 120 ml vettä. Sekoitetaan lasisauvalla, joka jätetään dekantterilasiin, ja peitetään astia kellonlasilla. Kuumennetaan varovasti kiehumispisteeseen ja pidetään kiehumispisteessä kunnes enempää tuhkaa ei havaita liukenevan. Suodatetaan tuhkattomalla suodatinpaperilla ja suodos kerätään talteen 250 ml:n mittapulloon. Dekantterilasi ja suodatin pestään 5 ml:lla kuumaa kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), sekä kaksi kertaa kiehuvalla vedellä. Mittapullo täytetään merkkiin asti vedellä (HCl-konsentraatio noin 0,5 mol/l).

5.1.1.2

Jos suodatinpaperissa oleva jäännös on ulkonäöltään mustaa (hiiltä), se viedään takaisin uuniin ja poltetaan uudelleen tuhkaksi 450–475 oC:ssa. Tämä poltto kestää vain muutaman tunnin (noin 3–5 tuntia) ja on suoritettu loppuun silloin, kun tuhka on ulkonäöltään valkeaa tai lähes valkeaa. Jäännös liuotetaan noin 2 ml:aan kloorivetyhappoa (3.1), haihdutetaan kuivaksi ja lisätään 5 ml kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2). Kuumennetaan, suodatetaan mittapulloon ja täytetään merkkiin asti vedellä (HCl-konsentraatio noin 0,5 mol/l). Huomautukset: a) Hivenaineita määritettäessä on tärkeää pitää jatkuvasti mielessä erityisesti sinkistä, kuparista ja raudasta aiheutuvat saastumisriskit. Tästä syystä näytteiden valmistuksessa käytetyt välineet eivät saa sisältää näitä metalleja. Yleisen kontaminaatioriskin vähentämiseksi olisi työskenneltävä pölyttömässä tilassa ja käytettävä huolellisesti puhdistettuja välineitä ja lasitavaroita. Sinkin määritys on erityisen herkkä saastumiselle, joka aiheutuu erityisesti lasitavaroista, reagensseista, pölystä jne. b) Tuhkaksi poltettavan näytteen paino lasketaan rehun likimääräisestä hivenainepitoisuudesta käytetyn spektrofotometrin herkkyyteen suhteutettuna. Tiettyjen pieniä hivenainemääriä sisältävien rehujen määritys on ehkä aloitettava 10–20 g:n näytteellä ja valmistettava lopullista liuosta vain 100 ml. c) Tuhkaksi poltto on suoritettava suljetussa uunissa ilmaa tai happea lisäämättä. d) Pyrometrin osoittama lämpötila ei saa olla yli 475:tä oC.

5.1.2   Spektrofotometrinen määritys

5.1.2.1    Kalibrointiliuosten valmistaminen

Kutakin määritettävää alkuainetta varten valmistetaan 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.1.10 kohdassa mainituista käyttöstandardiliuoksista sarja standardiliuoksia siten, että kunkin standardiliuoksen HCl-konsentraatio on noin 0,5 mol/l ja lantaanikloridikonsentraatio sellainen, joka vastaa 0,1 %:a (w/v) lantaania.

Valittujen hivenainekonsentraatioiden on oltava käytetyn spektrofotometrin herkkyysalueella. Seuraavissa taulukoissa annetaan esimerkiksi erilaisia standardiliuoskoostumuksia; käytetyn spektrofotometrin tyypistä ja herkkyydestä riippuen voi kuitenkin olla tarpeen valita muita pitoisuuksia.

Rauta

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
Käyttöstandardiliuoksen (3.7.1) ml-määrä (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään 100 ml:ksi vedellä

Kupari

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
Käyttöstandardiliuoksen (3.8.1) ml-määrä (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Mangaani

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
Käyttöstandardiliuoksen (3.9.1) ml-määrä (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään 100 ml:ksi vedellä

Sinkki

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
Käyttöstandardiliuoksen (3.10.1) ml-määrä (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään 100 ml:ksi vedellä

5.1.2.2    Liuoksen valmistaminen määritystä varten

Kuparin määritystä varten voidaan 5.1.1 kohdassa valmistettua liuosta käyttää yleensä suoraan. Tarvittaessa sen pitoisuus tuodaan kalibrointiliuosten alueelle, tästä otettu erä voidaan pipetoida 100 ml:n mittapulloon ja täyttää merkkiin asti kloorivetyhapolla, 0,5 mol/l (3.3).

Raudan, mangaanin ja sinkin määritystä varten pipetoidaan erä 5.1.1 kohdassa valmistettua liuosta 100 ml:n mittapulloon, lisätään 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla, 0,5 mol/l (3.3.) (ks. myös 8 kohdan huomautus).

5.1.2.3    Nollakoe

Nollakoe suoritetaan samalla tavalla mutta ilman määritettävää näytettä. Standardiliuosta ’0’ ei saa käyttää nollanäytteenä.

5.1.2.4    Atomiabsorptiomittaus

Standardiliuosten ja määritettävän liuoksen atomiabsorptio mitataan hapettavalla ilma-asetyleeniliekillä seuraavilla aallonpituuksilla:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Kukin mittaus suoritetaan neljä kertaa.

5.2   Kivennäisrehut

Jos näyte ei sisällä orgaanista ainetta, sitä ei ole tarpeen polttaa tuhkaksi. Suoritusta jatketaan 5.1.1.1 kohdan toisesta kappaleesta. Haihdutus fluorivetyhapolla voidaan jättää pois.

6.   Tulosten laskeminen

Määritettävässä liuoksessa oleva hivenainepitoisuus lasketaan kalibrointikäyrältä ja tulos ilmoitetaan milligrammoina hivenainetta kilogrammassa näytettä (ppm).

7.   Toistettavuus

Samasta näytteestä saman henkilön tekemän kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

—	5:tä mg/kg, absoluuttisena arvona, kun hivenainepitoisuus on enintään 50 mg/kg,

—	10 %:a, suurempaan arvoon verrattuna, kun hivenainepitoisuus on 50–100 mg/kg,

—	10:tä mg/kg, absoluuttisena arvona, kun hivenainepitoisuus on 100–200 mg/kg,

—	5 %:a, suurempaan arvoon verrattuna, kun hivenainepitoisuus on yli 200 mg/kg.

8.   Huomautus

Suuret fosfaattimäärät voivat häiritä raudan, mangaanin ja sinkin määritystä. Tällainen häiriö on korjattava lantaanikloridiliuosta (3.11) lisäämällä. Jos näytteessä painosuhde Ca + Mg / P on > 2, voidaan lantaanikloridiliuoksen (3.11) lisäys määritettävään liuokseen ja standardiliuoksiin jättää pois.

D.   HALOFUGINONIN MÄÄRITTÄMINEN

DL-trans-7-bromi-6-kloori-3-[3-(3-hydroksi-2-piperidyyli)asetonyyli]-kinatsoliini-4-(3H)-oni-hydrobromidi

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen halufuginonipitoisuus. Määritysraja on 1 mg/kg.

2.   Periaate

Näytettä käsitellään kuumalla vedellä ja halofuginoni uutetaan tämän jälkeen vapaana emäksenä etyyliasetaattiin ja erotetaan hydrokloridina happamaan vesiliuokseen. Uute puhdistetaan ioninvaihtokromatografialla. Halofuginonipitoisuus määritetään suuren erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) UV-detektoria käyttäen.

3.   Reagenssit

3.1	Asetonitriili, HPLC-laatua vastaava.

3.2	Amberlite XAD-2 -hartsi.

3.3	Ammoniumasetaatti.

3.4	Etyyliasetaatti.

3.5	Jääetikka.

3.6	Halofuginonistandardi (DL-trans-7-bromi-6-kloori-3-[3-hydroksi-2-piperidyyli)asetonyyli]-kinatsoliini-4-(3H)-onihydrobromidi, E 764).

3.6.1

Halofuginonistandardin kantaliuos, 100 μg/ml Mitataan 500 ml:n mittapulloon 50 mg (0,1 mg:n tarkkuudella) halofuginonia (3.6), liuotetaan ammoniumasetaattipuskuriliuokseen (3.18), täytetään merkkiin asti puskuriliuoksella ja sekoitetaan. Tämä liuos säilyy 5 oC:ssa kolmen viikon ajan, jos sitä säilytetään valolta suojattuna.

3.6.2

Kalibrointiliuokset Mitataan sarjaan 100 ml:n mittapulloja 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ja 6,0 ml standardikantaliuosta (3.6.1). Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.21) ja sekoitetaan. Näiden liuosten halofuginonipitoisuudet ovat 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ja 6,0 μg/ml. Liuokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.

3.7	Kloorivetyhappo (ρ20 noin 1,16 g/ml)

3.8

Metanoli

3.9	Hopeanitraatti.

3.10	Natriumaskorbaatti.

3.11	Natriumkarbonaatti.

3.12	Natriumkloridi.

3.13	EDTA (etyleenidiamiinitetraetikkahappo, dinatriumsuola).

3.14	Vesi, HPLC-laatua vastaava.

3.15	Natriumkarbonaattiliuos, c = 10 g/100 ml.

3.16	Natriumkloridilla kyllästetty natriumkarbonaattiliuos, c = 5 g/100 ml. Liuotetaan 50 g natriumkarbonaattia (3.11) veteen, täytetään 1 litraksi ja lisätään natriumkloridia (3.12), kunnes liuos on kyllästetty.

3.17	Kloorivetyhappo: noin 0,1 mol/l. Laimennetaan 10 ml kloorivetyhappoa (3.7) vedellä 1 litraksi.

3.18	Ammoniumasetaattipuskuriliuos, noin 0,25 mol/l. Liuotetaan 19,3 g ammoniumasetaattia (3.3) ja 30 ml etikkahappoa (3.5) veteen (3.14) ja laimennetaan 1 litraksi.

3.19

Amberlite XAD-2 -hartsin valmistaminen. Pestään sopivaa määrää Amberlitea (3.2) vedellä, kunnes pesuun käytetyssä vesifaasissa hopeanitraatilla (3.20) tehtävä koe osoittaa, että kloridi-ioneita ei enää ole. Tämän jälkeen hartsi pestään 50 ml:lla metanolia (3.8), tämä metanoli heitetään pois ja hartsia säilytetään puhtaassa metanolissa.

3.20	Hopeanitraattiliuos, noin 0,1 mol/l. Liuotetaan 0,17 g hopeanitraattia (3.9) 10 ml:aan vettä.

3.21

HPLC:n liikkuva faasi. Sekoitetaan 500 ml asetonitriiliä (3.1) 300 ml:aan ammoniumasetaattipuskuriliuosta (3.18) ja 1 200 ml:aan vettä (3.14). Säädetään pH arvoon 4,3 etikkahapolla (3.5). Suodatetaan 0,22 μm:n suodattimen (4.8) läpi ja poistetaan kaasut liuoksesta (esimerkiksi 10 minuutin ultraäänikäsittelyllä). Tämä liuos säilyy yhden kuukauden ajan, jos sitä säilytetään suljetussa astiassa valolta suojattuna.

4.   Välineistö

4.1	Ultraäänihaude.

4.2	Pyörivä kalvohaihdutin.

4.3	Sentrifugi.

4.4	HPLC-laitteisto, jossa on vaihtuva-aallonpituuksinen UV-detektori tai diodirividetektori.

4.4.1

Nestekromatografiakolonni, 300 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 10 μm, tai vastaava kolonni.

4.5	Lasikolonni (300 mm × 10 mm), joka on varustettu lasisintterisuodattimella ja hanalla.

4.6	Lasikuitusuodattimia, halkaisija 150 mm.

4.7	Kalvosuodattimia, 0,45 μm.

4.8	Kalvosuodattimia, 0,22 μm.

5.   Menettely

Huomautus:

Vapaana emäksenä halofuginoni on epästabiili alkalisissa liuoksissa ja etyyliasetaattiliuoksissa. Se ei saa olla etyyliasetaatissa yli 30 minuuttia.

5.1   Yleistä

5.1.1

Nollanäyte on analysoitava, jotta varmistetaan, ettei se sisällä halofuginonia tai mittausta häiritseviä aineita.

5.1.2

Saanto on määritettävä analysoimalla nollanäyte, johon on tehty näytteen halofuginonipitoisuutta vastaava halofuginonilisäys. Pitoisuuden 3 mg/kg aikaan saamiseksi lisätään 300 μl standardikantaliuosta (3.6.1) 10 grammaan nollarehua, sekoitetaan ja annetaan seistä 10 minuuttia ennen uuttamista (5.2). Huomautus: Tätä menetelmää käytettäessä nollarehun on vastattava koostumukseltaan näytettä, ja halofuginonia ei saa havaita määrityksessä.

5.2   Uutto

Punnitaan 0,1 gramman tarkkuudella 10 g valmistettua näytettä 200 ml:n sentrifugiputkeen, lisätään 0,5 g natriumaskorbaattia (3.10), 0,5 g EDTA:a (3.13) ja 20 ml vettä; sekoitetaan. Asetetaan putki vesihauteeseen (80 oC) 5 minuutiksi. Annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan, jonka jälkeen lisätään 20 ml natriumkarbonaattiliuosta (3.15) ja sekoitetaan. Lisätään viipymättä 100 ml etyyliasetaattia (3.4) ja ravistellaan käsin voimakkaasti 15 sekunnin ajan. Tämän jälkeen putki sijoitetaan kolmeksi minuutiksi ultraäänihauteeseen (4.1) ja korkkia höllennetään. Sentrifugoidaan 2 minuuttia ja dekantoidaan etyyliasetaattifaasi lasikuitusuodattimen (4.6) läpi 500 ml:n erotussuppiloon. Toistetaan näytteen uutto toisella 100 ml:n etyyliasetaattiannoksella. Pestään yhdistettyjä uutteita 1 minuutin ajan 50 ml:lla natriumkloridilla kyllästettyä natriumkarbonaattiliuosta (3.16) ja poistetaan vesifaasi.

Uutetaan orgaanista kerrosta 50 ml:lla kloorivetyhappoa (3.17) 1 minuutin ajan. Juoksutetaan alempi happokerros 250 ml:n erotussuppiloon. Uutetaan orgaanista kerrosta vielä 50 ml:lla kloorivetyhappoa 1,5 minuutin ajan ja yhdistetään uutteet. Pestään yhdistetyt happouutteet heiluttamalla niitä noin 10 sekunnin ajan 10 ml:n etyyliasetaattimäärän kanssa (3.4).

Siirretään vesikerros kvantitatiivisesti 250 ml:n pyörökolviin ja heitetään orgaaninen faasi pois. Haihdutetaan pyörivällä kalvohaihduttimella (4.2) kaikki etyyliasetaattijäämät happoliuoksesta. Vesihauteen lämpötila ei saa olla yli 40:tä oC. Noin 25 mbar:n tyhjössä etyyliasetaattijäämät poistuvat 5 minuutissa 38 oC:ssa.

5.3   Puhdistaminen

5.3.1   Amberlite-kolonnin valmistaminen

Kullekin näyteuutteelle valmistetaan XAD-2-kolonni. Siirretään metanolilla (3.8) 10 g esikäsiteltyä Amberlitea (3.19) lasikolonniin (4.5). Lisätään pieni lasivillatuppo hartsikerroksen päälle. Juoksutetaan metanoli kolonnista ja pestään hartsi 100 ml:lla vettä ja pysäytetään virtaus, kun neste yltää hartsikerroksen yläosaan. Annetaan kolonnin stabiloitua 10 minuuttia ennen sen käyttöä. Kolonnin ei saa koskaan antaa kuivua.

5.3.2   Näytteen puhdistaminen

Siirretään uute (5.2) kvantitatiivisesti valmistetun Amberlite-kolonnin (5.3.1) yläosaan, eluoidaan ja heitetään eluaatti pois. Eluointinopeus ei saa olla yli 20 ml:aa minuutissa. Huuhdellaan pyörökolvi 20 ml:lla kloorivetyhappoa (3.17) ja käytetään tätä liuosta hartsikolonnin pesemiseen. Poistetaan happoliuosjäämä ilmavirralla. Heitetään pesuliuokset pois. Lisätään kolonniin 100 ml metanolia (3.8) ja annetaan eluoitua 5–10 ml ja kerätään eluaatti 250 ml:n pyörökolviin. Annetaan jäljelle jääneen metanolin stabiloitua hartsin kanssa 10 minuutin ajan, jatketaan eluointia alle 20 ml minuutissa olevalla nopeudella ja kerätään eluaatti samaan pyörökolviin. Haihdutetaan metanoli pyöröhaihduttimella (4.2) huolehtien siitä, että vesihauteen lämpötila ei ole yli 40 oC. Siirretään jäännös kvantitatiivisesti 10 ml:n mittapulloon käyttäen liikkuvaa faasia (3.21). Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla ja sekoitetaan. Suodatetaan näyte kalvosuodattimen (4.7) läpi. Säilytetään tämä liuos HPLC-määritystä (5.4) varten.

5.4   HPLC-määritys

5.4.1   Muuttujat

Seuraavat edellytykset ovat ohjeellisia; muita määritysolosuhteita voidaan käyttää sillä edellytyksellä, että niillä saadaan vastaavat tulokset.

Nestekromatografiakolonni (4.4.1)

HPLC:n liikkuva faasi (3.21)

Virtausnopeus: 1,5–2 ml/min

Detektioaallonpituus: 243 nm

Injektiotilavuus: 40–100 μl.

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus on tarkistettava injektoimalla useita kertoja kalibrointiliuosta (3.6.2), jonka pitoisuus on 3,0 μg/ml, kunnes piikkien korkeudet (pinta-alat) ja retentioajat eivät muutu.

5.4.2   Kalibrointikäyrä

Injektoidaan jokaista kalibrointiliuosta (3.6.2) useita kertoja ja mitataan piikkien korkeudet (pinta-alat) jokaiselle pitoisuudelle. Kalibrointikäyrä piirretään siten, että y-akselilla ovat kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta alojen) keskiarvot ja x-akselilla vastaavat konsentraatiot (μg/ml).

5.4.3   Näyteliuos

Injektoidaan useita kertoja näyteuutetta (5.3.2) käyttäen samaa tilavuutta kuin kalibrointiliuoksille ja määritetään halofuginonin piikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Määritetään näyteliuoksen pitoisuus (μg/ml) näyteliuoksen halofuginonin piikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.4.2) avulla.

Näytteessä olevan halofuginonin määrä w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

c	=	näyteliuoksen halofuginonipitoisuus, μg/ml,
m	=	näyte-erän paino grammoina.

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Tutkittavan aineen tunnistaminen voidaan varmistaa yhteiskromatografialla tai käyttämällä diodirividetektoria, jolla voidaan verrata näyteuutteen ja halofuginonia 6,0 μg/ml sisältävän kalibrointiliuoksen (3.6.2) spektrejä.

7.1.1   Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.6.2). Lisätyn halofuginonimäärän on vastattava näyteuutteesta todetun halofuginonin arvioitua määrää.

Ainoastaan halofuginonipiikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä halofuginonia että näyteliuoksen laimeneminen. Piikin puolivälissä sen leveyden on oltava ± 10 % lähtöleveydestä.

7.1.2   Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

a)	näytteen ja standardin spektrien maksimiabsorptioaallonpituuksien on kromatogrammin piikin huipun kohdalla mitattuna oltava samat ilmaisinjärjestelmän erotuskyvyn mukaan määräytyvissä rajoissa. Diodirivimäärityksessä se on yleensä ± 2 nm;

b)

välillä 225–300 nm kromatogrammin piikin huipun kohdalla ajetut näyte- ja standardispektrit eivät saa erota toisistaan niiltä spektrin osilta, joiden suhteellinen absorbanssi on 10–100 %. Tämä edellytys täyttyy, kun maksimit ovat samat ja näiden kahden spektrin välillä havaittu poikkeama ei ole missään kohdassa yli 15 % standardina olevan tutkittavan aineen absorbanssista;

c)

välillä 225–300 nm näyteliuoksesta ajetut spektrit piikin nousun, huipun ja laskun kohdalla eivät saa erota toisistaan niiltä spektrin osilta, joiden suhteellinen absorbanssi on 10–100 %. Tämä edellytys täyttyy, kun samat maksimit esiintyvät ja kun kaikissa havaittavissa kohdissa spektrien välinen poikkeama ei ole suurempi kuin 15 % huipun spektrin absorbanssista.

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla yli 0,5 mg/kg, kun halofuginonipitoisuudet ovat enintään 3 mg/kg.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 80 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Laboratorioiden välisessä tutkimuksessa (5) analysoitiin kolme näytettä kahdeksassa laboratoriossa.

Tulokset

	Näyte A (nollanäyte) vastaanotettaessa	Näyte B (jauhona)		Näyte C (rakeina)
		Vastaanotettaessa	2 kuukauden kuluttua	Vastaanotettaessa	2 kuukauden kuluttua
Keskiarvo [mg/kg]	ND	2,80	2,42	2,89	2,45
SR [mg/kg]	—	0,45	0,43	0,40	0,42
CVR [ %]	—	16	18	14	17
Rec. [ %]		86	74	88	75

ND	=	ei havaittu
SR	=	uusittavuuden keskihajonta
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin, %
Rec.	=	saanto ( %).

E.   ROBENIDIININ MÄÄRITTÄMINEN

1,3-bis[(4-kloori-bentsylideeni)amino]guanidiinihydrokloridi

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää robenidiinin pitoisuus rehuissa. Määritysraja on 5 mg/kg.

2.   Periaate

Näyte uutetaan happamoidulla metanolilla. Uute kuivataan ja määräosa puhdistetaan alumiinioksidikolonnissa. Robenidiini eluoidaan kolonnista metanolilla, konsentroidaan ja saatetaan sopivaksi tilavuudeksi liikkuvalla faasilla. Robenidiinipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) UV-detektoria käyttäen.

3.   Reagenssit

3.1

Metanoli.

3.2	Happamoitu metanoli. Siirretään 4,0 ml kloorivetyhappoa (ρ20 = 1,18 g/ml) 500 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.1) ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

3.3	Asetonitriili, HPLC-laatua vastaava.

3.4	Molekyyliseula. Tyyppiä 3A, 8–12 meshin helmiä (1,6–2,5 mm:n helmiä, kiteistä alumiinisilikaattia, huokosten halkaisija 0,3 mm).

3.5	Alumiinioksidi, hapan, aktiviteettiluokka I pylväskromatografiaa varten. Siirretään 100 grammaa alumiinioksidia sopivaan astiaan ja lisätään 2,0 ml vettä. Suljetaan ja ravistellaan noin 20 minuutin ajan. Säilytetään hyvin suljetussa astiassa.

3.6	Kaliumdivetyfosfaattiliuos, c = 0,025 mol/l. Liuotetaan 3,40 g kaliumdivetyfosfaattia veteen (HPLC-laatua) 1 000 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin asti ja sekoitetaan.

3.7	Dinatriumvetyfosfaattiliuos, c = 0,025 mol/l. Liuotetaan 3,55 g vedetöntä (tai 4,45 g dihydraattia tai 8,95 g dodekahydraattia) dinatriumvetyfosfaattia veteen (HPLC-laatua vastaava) litran mittapullossa, täytetään merkkiin asti ja sekoitetaan.

3.8

HPLC:n liikkuva faasi. Sekoitetaan seuraavat reagenssit:   650 ml asetonitriiliä (3.3),   250 ml vettä (HPLC-laatua vastaava),   50 ml kaliumdivetyfosfaattiliuosta (3.6),   50 ml dinatriumvetyfosfaattiliuosta (3.7). Suodatetaan 0,22 μm:n suodattimen (4.6) läpi ja poistetaan kaasut liuoksesta (esimerkiksi 10 minuutin ultraäänikäsittelyllä).

3.9	Standardiyhdiste. Puhdas robenidiini: 1,3-bis[(4-klooribentsylideeni)amino]guanidiinihydrokloridi.

3.9.1

Robenidiinistandardin kantaliuos: 300 μg/ml Punnitaan 30 mg 0,1 mg:n tarkkuudella robenidiinin standardiyhdistettä (3.9). Liuotetaan happamoituun metanoliin (3.2) 100 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin asti samalla liuottimella ja sekoitetaan. Kääritään pullo alumiinifolioon ja säilytetään valolta suojattuna.

3.9.2

Robenidiinistandardin välimuotoliuos: 12 μg/ml Siirretään 10,0 ml standardikantaliuosta (3.9.1) 250 ml:n pulloon, täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.8) ja sekoitetaan. Kääritään pullo alumiinifolioon ja säilytetään valolta suojattuna.

3.9.3

Kalibrointiliuokset Siirretään sarjassa 50 ml:n mittapulloihin 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 ja 25,0 ml standardin välimuotoliuosta (3.9.2). Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.8) ja sekoitetaan. Näiden liuosten robenidiinipitoisuudet ovat vastaavasti 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 ja 6,0 μg/ml. Liuokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.

3.10	Vesi, HPLC-laatua vastaava.

4.   Välineistö

4.1	Lasikolonni. Valmistettu ruskeasta lasista, varustettu hanalla ja säiliöllä, jonka tilavuus on noin 150 ml, sisähalkaisija 10–15 mm, pituus 250 mm.

4.2	Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin.

4.3	Pyörivä kalvohaihdutin.

4.4	Vaihtuva-aallonpituuksinen HPLC-laitteisto tai diodirividetektori, detektioaallonpituusalue 250–400 nm.

4.4.1

Nestekromatografiakolonni: 300 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 10 μm, tai vastaava

4.5	Lasikuitusuodatinpaperia (Whatman GF/A tai vastaava).

4.6	Kalvosuodattimia, 0,22 μm.

4.7	Kalvosuodattimia, 0,45 μm.

5.   Menettely

Huomautus:

Robenidiini on herkkä valolle. Kaikissa toiminnoissa on käytettävä ruskeaa lasia.

5.1   Yleistä

5.1.1

Nollanäyte on analysoitava, jotta varmistetaan, ettei se sisällä robenidiinia tai mittausta häiritseviä aineita.

5.1.2

Saanto on määritettävä analysoimalla nollanäyte (5.1.1), johon on lisätty näytteen robenidiinipitoisuutta vastaava määrä robenidiinia. Pitoisuuden 60 mg/kg aikaan saamiseksi siirretään 3,0 ml standardikantaliuosta (3.9.1) 250 ml:n erlenmeyerkolviin. liuos haihdutetaan noin 0,5 ml:ksi typpivirrassa. Lisätään 15 g nollarehua, sekoitetaan ja odotetaan 10 minuuttia ennen siirtymistä uuttovaiheeseen (5.2). Huomautus: Tätä menetelmää käytettäessä nollarehun on vastattava tyypiltään näytettä, ja robenidiinia ei saa havaita määrityksessä.

5.2   Uutto

Punnitaan 0,01 g:n tarkkuudella noin 15 g valmistettua näytettä. Siirretään 250 ml:n erlenmeyerkolviin ja lisätään 100,0 ml happamoitua metanolia (3.2), suljetaan astia ja ravistellaan tunnin ajan ravistelijalla (4.2). Suodatetaan liuos lasikuitusuodatinpaperin (4.5) läpi ja koko suodos kerätään talteen 150 ml:n erlenmeyerkolviin. Lisätään 7,5 g molekyyliseulaa (3.4), suljetaan astia ja ravistellaan viisi minuuttia. Suodatetaan välittömästi lasikuitusuodatinpaperin läpi. Tämä liuos säilytetään puhdistusta (5.3) varten.

5.3   Puhdistus

5.3.1   Alumiinioksidikolonnin valmistaminen

Lasikolonnin (4.1) alapäähän laitetaan pieni tuppo lasivillaa ja tiivistetään se lasisauvaa käyttäen. Punnitaan 11,0 g valmistettua alumiinioksidia (3.5) ja siirretään kolonniin. Tässä vaiheessa on pidettävä huolta siitä, että altistuminen ilmalle on mahdollisimman vähäistä. Taputellaan täytetyn kolonnin alapäätä kevyesti, jotta alumiinioksidi tiivistyy sopivasti.

5.3.2   Näytteen puhdistus

Pipetoidaan kolonniin 5,0 ml valmistettua näyteuutetta (5.2). Annetaan pipetin kärjen levätä kolonnin seinää vasten ja liuoksen absorboitua alumiinioksidiin. Eluoidaan robenidiini kolonnista 100 ml:lla metanolia (3.1) virtausnopeudella 2–3 ml/min ja kerätään eluaatti 250 ml:n pyörökolviin. Haihdutetaan metanoliliuos kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttimessa (4.3) lämpötilan ollessa 40 oC. Liuotetaan jäännös uudelleen 3–4 ml:aan liikkuvaa faasia (3.8) ja siirretään kvantitatiivisesti 10 ml:n mittapulloon. Huuhdellaan pullo usealla 1–2 ml:n annoksella liikkuvaa faasia ja siirretään nämä huuhteluliuokset mittapulloon. Täytetään merkkiin asti samalla liuottimella ja sekoitetaan. Suodatetaan näyte 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.7) läpi. Tämä liuos säilytetään HPLC-määritystä (5.4) varten.

5.4   HPLC-määritys

5.4.1   Muuttujat

Seuraavat olosuhteet ovat ohjeellisia, ja myös muita olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset:

Nestekromatografiakolonni (4.4.1)

HPLC:n liikkuva faasi (3.8)

Virtausnopeus: 1,5–2 ml/min

Detektioaallonpituus: 317 nm

Injektiotilavuus: 20–50 μl.

Kromatografisen järjestelmän stabiilisuus tarkastetaan injektoimalla useita kertoja kalibrointiliuosta (3.9.3), jonka pitoisuus on 3,6 μg/ml, kunnes saadaan piikkejä, joiden korkeudet (pinta-alat) ja retentioajat pysyvät vakioina.

5.4.2   Kalibrointikäyrä

Injektoidaan useita kertoja kutakin kalibrointiliuosta (3.9.3) ja mitataan kunkin pitoisuuden piikkien korkeudet (pinta-alat). Kalibrointikäyrä piirretään siten, että y-akselilla ovat kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta alojen) keskiarvot ja x-akselilla vastaavat konsentraatiot μg/ml.

5.4.3   Näyteliuos

Injektoidaan useita kertoja näyteuutetta (5.3.2) käyttäen samaa määrää kuin kalibrointiliuoksille, ja määritetään robenidiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen robenidiinipitoisuus μg/ml lasketaan robenidiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.4.2) avulla.

Näytteen robenidiinipitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

c	=	näyteliuoksen robenidiinipitoisuus, μg/ml,
m	=	näyte-erän paino grammoina.

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Määritettävän aineen tunnistaminen voidaan varmistaa yhteiskromatografialla tai diodirividetektorilla, joka mahdollistaa näyteuutteen ja 6 μg/ml robenidiinia sisältävän kalibrointiliuoksen (3.6.3) spektrien vertailun.

7.1.1   Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.9.3). Lisätyn robenidiinin määrän on vastattava näyteuutteessa olevan robenidiinin arvioitua määrää.

Ainoastaan robenidiinipiikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä että uutteen laimeneminen. Piikin leveyden, sen puolikorkeudella, on oltava noin 10 % sen alkuperäisestä leveydestä.

7.1.2   Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

a)	kromatogrammin piikin huipun kohdalla näytteen ja standardin spektrien maksimiabsorptioaallonpituuksien on oltava samat ilmaisinjärjestelmän erotuskyvyn mukaan määräytyvissä rajoissa. Diodirividetektorimäärityksessä tämä on yleensä noin ± 2 nm;

b)

välillä 250–400 nm kromatogrammin piikin huipun kohdalla ajetut näyte- ja standardispektrit eivät saa erota niiltä spektrin osilta, joiden suhteellinen absorbanssi on 10–100 %. Tämä edellytys täyttyy, kun maksimit ovat samat ja näiden kahden spektrin välillä havaittu poikkeama ei ole missään kohdassa yli 15 % standardina olevan tutkittavan aineen absorbanssista;

c)

välillä 250–400 nm näyteliuoksesta ajetut spektrit piikin nousun, huipun ja laskun kohdalla eivät saa erota toisistaan niiltä spektrin osilta, joiden suhteellinen absorbanssi on 10–100 %. Tämä edellytys täyttyy, kun samat maksimit esiintyvät ja kun kaikissa havaittavissa kohdissa spektrien välinen poikkeama ei ole suurempi kuin 15 % huipun spektrin absorbanssista.

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaisen, samasta näytteestä tehdyn määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 10 % suuremmasta tuloksesta, kun robenidiinipitoisuus on yli 15 mg/kg.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 85 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Euroopan yhteisön laboratorioiden välisessä tarkastelussa 12 laboratoriota määritti neljä jauhon tai rakeiden muodossa olevaa kani- ja siipikarjarehunäytettä. Kukin näyte määritettiin kaksi kertaa. Tulokset esitetään alla olevassa taulukossa:

	Siipikarja		Kanit
	Jauho	Rakeet	Jauho	Rakeet
Keskiarvo [mg/kg]	27,00	27,99	43,6	40,1
Sr [mg/kg]	1,46	1,26	1,44	1,66
CVr [ %]	5,4	4,5	3,3	4,1
SR [mg/kg]	4,36	3,36	4,61	3,91
CVR [ %]	16,1	12,0	10,6	9,7
Saanto [ %]	90,0	93,3	87,2	80,2

sr	=	toistettavuuden keskihajonta
CVr	=	toistettavuuden variaatiokerroin, %
SR	=	uusittavuuden keskihajonta
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin, %.

F.   DIKLATSURIILIN MÄÄRITYS

(+)-4-kloorifenyyli-[2,6-dikloori-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-diokso-1,2,4-triatsin-2-yyli)fenyyli]asetonitriili

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää diklatsuriilin pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. Toteamisraja on 0,1 mg/kg ja määritysraja 0,5 mg/kg.

2.   Periaate

Sisäisen standardin lisäyksen jälkeen näyte uutetaan happamoidulla metanolilla. Osa rehunäytteen uutteesta puhdistetaan C18-kiinteäfaasiuuttopylväällä. Diklatsuriili eluoidaan pylväästä happamoidun metanolin ja veden seoksella. Haihdutuksen jälkeen jäännös liuotetaan DMF-vesiseokseen. Esiseoksista saadut uutteet haihdutetaan ja jäännös liuotetaan DMF-vesiseokseen. Diklatsuriilipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (RP-HPLC) käyttäen ternaarigradienttia ja UV-detektoria.

3.   Reagenssit

3.1	Vesi, HPLC-laatua vastaava.

3.2	Ammoniumasetaatti.

3.3	Tetrabutyyliammoniumvetysulfaatti (TBHS).

3.4	Asetonitriili, HPLC-laatua vastaava.

3.5	Metanoli, HPLC-laatua vastaava.

3.6	N, N-dimetyyliformamidi (DMF).

3.7	Kloorivetyhappo, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8	Standardiyhdiste: diklatsuriili II-24: (+)-4-kloorifenyyli-[2,6-dikloori-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-diokso-1,2,4-triatsin-2-yyli)-fenyyli]asetonitriili, jonka puhtaus on taattu, E 771.

3.8.1

Diklatsuriilistandardin kantaliuos, 500 μg/ml Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 25 mg diklatsuriilistandardia (3.8) 50 ml:n mittapulloon. Liuotetaan DMF:ään (3.6), täytetään merkkiin asti DMF:llä (3.6) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

3.8.2

Diklatsuriilistandardin kantaliuos, 50 μg/ml Pipetoidaan 5,00 ml standardin kantaliuosta (3.8.1) 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti DMF:llä (3.6) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

3.9	Sisäinen standardi: 2,6-dikloori-α-(4-kloorifenyyli)-4-(4,5-dihydro-3,5-diokso-1,2,4-triatsin-2-(3H)-yyli)-α-metyylibentseeniasetonitriili.

3.9.1

Sisäisen standardin kantaliuos, 500 μg/ml Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 25 mg sisäistä standardia (3.9) 50 ml:n mittapulloon. Liuotetaan DMF:ään (3.6), täytetään merkkiin asti DMF:llä (3.6) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

3.9.2

Sisäisen standardin kantaliuos, 50 μg/ml Pipetoidaan 5,00 ml sisäisen standardin kantaliuosta (3.9.1) 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti DMF:llä (3.6) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

3.9.3

Sisäinen standardiliuos esiseoksille, p/1 000 mg/ml (p = diklatsuriilin nimellispitoisuus esiseoksessa, mg/kg) Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 10 mg sisäistä standardia 100 ml:n mittapulloon, liuotetaan DMF:ään (3.6) ultraäänihauteessa (4.6), täytetään merkkiin asti DMF:llä ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa. pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

3.10	Kalibrointiliuos, 2 μg/ml. Pipetoidaan 2,00 ml diklatsuriilin standardiliuosta (3.8.2) ja 2,00 ml sisäistä standardiliuosta (3.9.2) 50 ml:n mittapulloon. Lisätään 16 ml DMF:ää (3.6), täytetään merkkiin asti vedellä ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

3.11	C18-kiinteäfaasiuuttopylväs, esim. Bond Elut, 1 ml, sorbentin paino: 100 mg.

3.12	Uuttoliuos: happamoitu metanoli. Pipetoidaan 5,0 ml suolahappoa (3.7) 1 000 ml:aan metanolia (3.5) ja sekoitetaan.

3.13	HPLC:ssä käytettävä liikkuva faasi.

3.13.1

Eluentti A: ammoniumasetaatti-tetrabutyyliammoniumvetysulfaattiliuos. Liuotetaan 5 g ammoniumasetaattia (3.2) ja 3,4 g TBHS:ää (3.3) 1 000 ml:aan vettä (3.1) ja sekoitetaan.

3.13.2

Eluentti B: asetonitriili (3.4).

3.13.3

Eluentti C: metanoli (3.5).

4.   Välineistö

4.1	Mekaaninen ravistelija.

4.2	Ternaarigradientti HPLC -laitteisto.

4.2.1

Nestekromatografiakolonni, 100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava.

4.2.2

Vaihtuva-aallonpituuksinen UV-detektori tai diodirividetektori.

4.3	Pyörivä kalvohaihdutin.

4.4	Kalvosuodatin, 0,45 μm.

4.5	Tyhjiösuodatuslaite.

4.6	Ultraäänihaude.

5.   Menettely

5.1   Yleistä

5.1.1   Nollarehu

Nollanäyte on analysoitava, jotta varmistetaan, ettei se sisällä diklatsuriilia tai mittausta häiritseviä aineita. Nollanäytteen on oltava näytteen kaltainen, eikä siinä saa olla havaittavia määriä diklatsuriilia tai häiritseviä aineita.

5.1.2   Saantokoe

Saanto on määritettävä analysoimalla nollanäyte, johon on lisätty näytteen diklatsuriilipitoisuutta vastaava määrä diklatsuriilia. Jotta saadaan konsentraatio, joka vastaa arvoa 1 mg/kg diklatsuriilia, siirretään 0,1 ml standardin kantaliuosta (3.8.1) 50 grammaan nollanäytettä, sekoitetaan perusteellisesti ja annetaan tasoittua 10 minuuttia sekoittaen useita kertoja ennen uuttovaiheeseen siirtymistä (5.2).

Jos saatavilla ei ole näytteen kaltaista nollanäytettä (katso 5.1.1), voidaan saantokoe suorittaa vaihtoehtoisesti standardinlisäysmenetelmällä. Tällöin analysoitavaan näytteeseen lisätään suunnilleen näytteiden jo sisältämä määrä diklatsuriilia. Tämä näyte analysoidaan yhdessä varsinaisen näytteen kanssa, ja saanto voidaan laskea vähennyslaskulla.

5.2   Uutto

5.2.1   Rehut

Punnitaan noin 50 g näytettä 0,01 gramman tarkkuudella. Siirretään 500 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään 1,00 ml sisäistä standardiliuosta (3.9.2), 200 ml uuttoliuosta (3.12) ja suljetaan kolvi tulpalla. Seosta ravistellaan ravistelijalla (4.1) yli yön. Annetaan laskeutua 10 minuuttia. Siirretään 20 ml supernatantista sopivaan lasiastiaan ja laimennetaan 20 ml:lla vettä. Siirretään liuos uuttohylsyyn (3.11) ja imetään liuos sen läpi vakuumilla (4.5). Pestään hylsy 25 ml:lla uuttoliuoksen (3.12) ja veden seosta, 65 + 35 (V + V). Kerätyt fraktiot heitetään pois ja määritettävät aineet eluoidaan 25 ml:lla uuttoliuoksen (3.12) ja veden seosta, 80 + 20 (V + V). Tämä fraktio haihdutetaan pyöröhaihduttimella (4.3) 60 oC:ssa niin, että se on juuri ja juuri kuivunut. Jäännös liuotetaan 1,0 ml:aan DMF:ää (3.6), lisätään 1,5 ml vettä (3.1) ja sekoitetaan. Suodatetaan kalvosuodattimella (4.4). Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.2.2   Esiseokset

Punnitaan noin 1 g näytettä 0,001 gramman tarkkuudella. Siirretään 500 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään 1,00 ml sisäistä standardiliuosta (3.9.3), 200 ml uuttoliuosta (3.12) ja suljetaan kolvi tulpalla. Seosta ravistellaan yli yön ravistelijalla (4.1). Annetaan laskeutua 10 minuuttia. Siirretään 10 000/p ml:n (p = diklatsuriilin nimellispitoisuus esiseoksessa mg/kg) erä supernatanttia sopivankokoiseen keittokolviin. Haihdutetaan alipaineessa pyöröhaihduttimella (4.3) 60 oC:ssa niin, että se on juuri ja juuri kuivunut. Jäännös liuotetaan uudelleen 10,0 ml:aan DMF:ää (3.6), lisätään 15,0 ml vettä (3.1) ja sekoitetaan. Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.3   HPLC-määritys

5.3.1   Muuttujat

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia ja niitä voidaan muuttaa, mikäli ne antavat vastaavanlaiset tulokset.

Nestekromatografiakolonni (4.2.1.):	100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava
Liikkuva faasi:	Eluentti A (3.13.1):	ammoniumasetaatin ja tetrabutyyliammoniumvetysulfaatin vesiliuos
	Eluentti B (3.13.2):	asetonitriili
	Eluentti C (3.13.3):	metanoli
Eluointi:	— lineaarinen gradientti — alku: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V) — 10 min kuluttua gradienttieluointi 30 minuutissa: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). Huuhdotaan B:llä 10 min.
Virtausnopeus:	1,5–2 ml/min
Injektoitava määrä:	20 μl
Detektioaallonpituus:	280 nm

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus tarkistetaan injektoimalla useita kertoja kalibrointiliuosta (3.10), jonka konsentraatio on 2 μl/ml, kunnes piikkien korkeudet ja retentioajat ovat vakiot.

5.3.2   Kalibrointiliuos

Injektoidaan 20 μl kalibrointiliuosta (3.10) useita kertoja ja määritetään diklatsuriilin ja sisäisen standardin piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot.

5.3.3   Näyteliuos

Injektoidaan 20 μl näyteliuosta (5.2.1 tai 5.2.2) useita kertoja ja määritetään diklatsuriilin ja sisäisen standardin piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot.

6.   Tulosten laskeminen

6.1   Rehut

Näytteen diklatsuriilipitoisuus w (mg/kg) saadaan seuraavasta kaavasta:

[mg/kg]

jossa:

hd, s	=	näyteliuoksen (5.2.1) diklatsuriilin piikin korkeus (pinta-ala),
hi, s	=	näyteliuoksen (5.2.1) sisäisen standardin piikin korkeus (pinta-ala),
hd, c	=	kalibrointiliuoksen (3.10) diklatsuriilin piikin korkeus (pinta-ala),
hi, c	=	kalibrointiliuoksen (3.10) sisäisen standardin piikin korkeus (pinta-ala),
cd, c	=	kalibrointiliuoksen (3.10) diklatsuriilipitoisuus, μg/ml,
m	=	näyte-erän paino (g),
V	=	5.2.1 kohdan mukaisesti valmistetun näyteuutteen tilavuus (2,5 ml).

6.2   Esiseokset

Näytteen diklatsuriilipitoisuus w (mg/kg) saadaan seuraavasta kaavasta:

[mg/kg]

jossa:

hd, c	=	kalibrointiliuoksen (3.10) diklatsuriilin piikin korkeus (pinta-ala),
hi, c	=	kalibrointiliuoksen (3.10) sisäisen standardin piikin korkeus (pinta-ala),
hd, s	=	näyteliuoksen (5.2.2) diklatsuriilin piikin korkeus (pinta-ala),
hi, s	=	näyteliuoksen (5.2.2) sisäisen standardin piikin korkeus (pinta-ala),
cd, c	=	kalibrointiliuoksen (3.10) diklatsuriilipitoisuus, μg/ml,
m	=	näyte-erän paino (g),
V	=	5.2.2 kohdan mukaisesti valmistetun näyteuutteen tilavuus (25 ml),
p	=	diklatsuriilin nimellispitoisuus esiseoksessa, mg/kg.

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Analyytin tunnistaminen voidaan varmentaa yhteiskromatografialla tai käyttämällä diodirividetektoria, jolla verrataan näyteuutteen (5.2.1 tai 5.2.2) ja kalibrointiliuoksen (3.10) spektrejä.

7.1.1   Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen (5.2.1 tai 5.2.2) lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.10). Lisätyn diklatsuriilin määrän on oltava samaa suuruusluokkaa kuin näytteessä todettu diklatsuriilin määrä.

Ainoastaan diklatsuriilin ja sisäisen standardin piikit saavat kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä että uutteen laimentaminen. Piikin leveys puolivälissä piikin korkeutta on oltava ± 10 % sellaisen näyteuutteen alkuperäisen diklatsuriilipiikin tai sisäisen standardin piikin leveydestä, johon ei ole tehty lisäystä.

7.1.2   Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

a)	Kromatogrammin piikkien huipusta mitattujen näyte- ja standardispektrien maksimiabsorption aallonpituuksien on oltava samat ilmaisinjärjestelmän erotuskyvyn mukaan määräytyvissä rajoissa. Diodirividetektorilla tämä on tyypillisesti ± 2 nm.

b)

Välillä 230–320 nm kromatogrammin piikkien huipun kohdalla ajetut näyte- ja standardispektrit eivät saa erota toisistaan niiltä spektrin osilta, joiden suhteellinen absorbanssi on 10–100 %. Tämä edellytys täyttyy, kun maksimit ovat samat eikä spektrien välinen ero ole missään kohdassa suurempi kuin 15 % standardianalyytin absorbanssista.

c)

Välillä 230–320 nm näyteuutteesta ajetut spektrit piikin nousun, huipun ja laskun kohdalla eivät saa erota toisistaan niiltä spektrin osilta, joiden suhteellinen absorbanssi on 10–100 %. Tämä edellytys täyttyy, kun maksimit ovat samat eikä spektrien välinen ero ole missään kohdassa suurempi kuin 15 % piikin huipun spektrin absorbanssista.

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin

—	30 % suuremmasta rinnakkaistuloksesta, kun diklatsuriilipitoisuus on 0,5–2,5 mg/kg

—	0,75 mg/kg, kun diklatsuriilipitoisuus on 2,5–5 mg/kg

—	15 % suuremmasta rinnakkaistuloksesta, kun diklatsuriilipitoisuus on yli 5 mg/kg.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty mitattavaa ainetta, on oltava vähintään 80 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Laboratorioiden välisessä tutkimuksessa analysoitiin viisi näytettä 11 laboratoriossa. Näytteistä kaksi oli esiseoksia. Toiseen sekoitettiin orgaanista materiaalia (O 100) ja toiseen epäorgaanista materiaalia (A 100). Teoreettinen pitoisuus on 100 mg diklatsuriilia kilogrammassa. Näitä kolmea siipikarjan rehuseosta valmisti kolme eri valmistajaa (L1/Z1/K1) (NL). Teoreettinen pitoisuus on 1 mg diklatsuriilia kilogrammassa. Laboratorioita pyydettiin analysoimaan kukin näyte kerran tai kaksoismäärityksinä. (Tarkempia tietoja tästä laboratorioiden välisestä tutkimuksesta saa julkaisusta Journal of AOAC International, Volume 77, n:o 6, 1994, s. 1 359–1 361.) Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

	Näyte 1 A 100	Näyte 2 O 100	Näyte 3 L1	Näyte 4 Z1	Näyte 5 K1
L	11	11	11	11	6
n	19	18	19	19	12
Keskiarvo	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89
Sr (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03
CVr ( %)	5,83	7,38	17,32	1,92	3,34
SR (mg/kg)	7,59	7,64	0,17	0,11	0,12
CVR ( %)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65
Nimellispitoisuus mg/kg)	100	100	1	1	1

L	=	laboratorioiden lukumäärä
n	=	yksittäisten arvojen lukumäärä
Sr	=	toistettavuuden keskihajonta
CVr	=	toistettavuuden variaatiokerroin
SR	=	uusittavuuden keskihajonta
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin.

9.   Huomautukset

Diklatsuriilivasteen lineaarisuus on osoitettava etukäteen ao. konsentraatioalueilla.

G.   LASALOSID-NATRIUMIN MÄÄRITTÄMINEN

Streptomyces lasaliensis -bakteerin tuottama polyeetterimonokarboksyylihapon natriumsuola

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää lasalosid-natriumin pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. Toteamisraja on 5 mg/kg ja määritysraja 10 mg/kg.

2.   Periaate

Lasalosid-natrium uutetaan näytteestä happamoituun metanoliin ja määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) käyttäen spektrofluorimetridetektoria.

3.   Reagenssit

3.1	Kaliumdivetyfosfaatti (KH2PO4).

3.2	Ortofosforihappo, w (w/w) = 85 %.

3.3	Ortofosforihappoliuos, c = 20 %. Laimennetaan 23,5 ml ortofosforihappoa (3.2) vedellä 100 ml:aan.

3.4	6-metyyli-2-heptyyliamiini (1,5-dimetyyliheksyyliamiini), w (w/w) = 99 %.

3.5	Metanoli, HPLC-laatua vastaava.

3.6	Kloorivetyhappo, tiheys = 1,19 g/ml.

3.7	Fosfaattipuskuriliuos, c = 0,01 mol/1. Liuotetaan 1,36 g kaliumdivetyfosfaattia (3.1) 500 ml:aan vettä (3.11), lisätään 3,5 ml ortofosforihappoa (3.2) ja 10,0 ml 6-metyyli-2-heptyyliamiinia (3.4). Säädetään pH ortofosforihappoliuoksen avulla arvoon 4,0 ja laimennetaan vedellä (3.11) 1 000 ml:aan.

3.8	Happamoitu metanoli. Pipetoidaan 5,0 ml suolahappoa (3.6) 1 000 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.5) ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

3.9	HPLC:n liikkuva faasi, fosfaattipuskuri-metanoliliuos 5 + 95 (V + V). Sekoitetaan 5 ml fosfaattipuskuriliuosta (3.7) ja 95 ml metanolia (3.5).

3.10	Lasalosid-natriumstandardi, jonka puhtaus on taattu, C34H53O8Na (Streptomyces lasaliensis -bakteerin tuottama polyeetterimonokarboksyylihapon natriumsuola), E763.

3.10.1

Lasalosid-natriumstandardin kantaliuos, 500 μg/ml Punnitaan 50 mg lasalosid-natriumia (3.10) 0,1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon, liuotetaan happamoituun metanoliin (3.8), täytetään merkkiin asti samalla liuottimella ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava välittömästi ennen käyttöä.

3.10.2

Lasalosid-natriumstandardin välimuotoliuos, 50 μg/ml Pipetoidaan 10,0 ml standardin kantaliuosta (3.10.1) 100 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti happamoidulla metanolilla (3.8) ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

3.10.3

Kalibrointiliuokset Pipetoidaan 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 ja 10,0 ml standardin välimuotoliuosta (3.10.2) 50 ml:n mittapulloihin. Täytetään merkkiin asti happamoidulla metanolilla (3.8) ja sekoitetaan. Nämä liuokset vastaavat konsentraatioita 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 ja 10,0 μg/ml lasalosid-natriumia. Nämä liuokset on valmistettava aina juuri ennen käyttöä.

3.11.

Vesi, HPLC-laatua vastaava.

4.   Välineistö

4.1	Ultraäänihaude (tai ravisteleva vesihaude), jossa on lämpötilansäätö.

4.2	Kalvosuodattimia, 0,45 μm.

4.3	HPLC-laitteisto, jossa voidaan injektoida 20 μl:n näytteitä.

4.3.1

Nestekromatografiakolonni, 125 mm × 4 mm, käänteisfaasi C18, hiukkaskoko 5 μm, tai vastaava.

4.3.2

Spektrofluorimetri, jossa voidaan säätää eksitaatio- ja emissioaallonpituudet.

5.   Menettely

5.1   Yleistä

5.1.1   Nollarehu

Saantokokeen (5.1.2) suorittamista varten analysoidaan nollanäyte, jotta varmistetaan, ettei se sisällä lasalosid-natriumia tai mittausta häiritseviä aineita. Nollanäytteen on oltava näytteen kaltainen, eikä siinä saa olla havaittavia määriä lasalosid-natriumia tai häiritseviä aineita.

5.1.2   Saantokoe

Saanto on määritettävä analysoimalla nollanäyte, johon on lisätty näytteen lasalosid-natriumia vastaava määrä lasalosid-natriumia. Jotta saadaan liuos, jossa on 100 mg/kg lasalosid-natriumia vastaava lisäys, siirretään 10,0 ml standardin kantaliuosta (3.10.1) 250 ml:n erlenmeyerkolviin ja haihdutetaan noin 0,5 ml:aan. Lisätään 50 g nollanäytettä, sekoitetaan huolellisesti, annetaan tasoittua 10 minuuttia sekoittaen useita kertoja ennen uuttovaiheeseen siirtymistä (5.2).

Jos saatavilla ei ole näytteen kaltaista nollanäytettä (katso 5.1.1), voidaan saantokoe suorittaa vaihtoehtoisesti standardinlisäysmenetelmällä. Tällöin analysoitavaan näytteeseen lisätään näytteiden jo sisältämää määrää vastaava määrä lasalosid-natriumia. Tämä näyte analysoidaan yhdessä varsinaisen näytteen kanssa, ja saanto voidaan laskea vähennyslaskulla.

5.2   Uutto

5.2.1   Rehut

Punnitaan 5–10 g näytettä 0,01 gramman tarkkuudella 250 ml:n tulpalliseen erlenmeyerkolviin. Lisätään pipetillä 100,0 ml happamoitua metanolia (3.8). Suljetaan löyhästi tulpalla ja sekoitetaan kunnes näyte on liuennut. Asetetaan pullo noin 40-asteiseen ultraäänihauteeseen (4.1) 20 minuutiksi, otetaan pois ja jäähdytetään huoneenlämpöiseksi. Annetaan laskeutua noin tunnin ajan ja suodatetaan määräosa 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.2) läpi sopivaan astiaan. Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.2.2   Esiseokset

Punnitaan 2 g jauhamatonta esiseosta 0,001 gramman tarkkuudella 250 ml:n mittapulloon. Lisätään 100,0 ml happamoitua metanolia (3.8) ja sekoitetaan kunnes esiseos on liuennut. Laitetaan pullo sisältöineen noin 40-asteiseen ultraäänihauteeseen (4.1) 20 minuutiksi, otetaan pois ja jäähdytetään huoneenlämpöiseksi. Täytetään merkkiin asti happamoidulla metanolilla (3.8) ja sekoitetaan hyvin. Annetaan laskeutua tunnin ajan ja suodatetaan määräosa 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.2) läpi sopivaan astiaan. Laimennetaan sopiva määrä kirkasta suodosta happamoidulla metanolilla (3.8) siten, että lopullisessa koeliuoksessa on lasalosid-natriumia noin 4 μg/ml. Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.3   HPLC-määritys

5.3.1   Muuttujat

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia; ajo voidaan suorittaa muissa olosuhteissa, jos niillä saadaan samat tulokset:

Nestekromatografia-kolonni (4.3.1):	125 mm × 4 mm, käänteisfaasi C18, hiukkaskoko 5 μm, tai vastaava
Liikkuva faasi (3.9):	Fosfaattipuskuriliuoksen (3.7) ja metanolin (3.5) seos, 5 + 95 (V+V)
Virtausnopeus:	1,2 ml/min
Mittausaallonpituudet:
Eksitaatio:	310 nm
Emissio:	419 nm
Injektoitava määrä:	20 μl.

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus tarkistetaan injektoimalla useita kertoja 4,0 μg/ml:n kalibrointiliuosta (3.10.3), kunnes piikkien korkeudet (tai pinta-alat) ja retentioajat pysyvät vakioina.

5.3.2   Kalibrointikäyrä

Injektoidaan kutakin kalibrointiliuosta (3.10.3) useita kertoja ja lasketaan kutakin konsentraatiota vastaavat piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä merkiten piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot y-akselille ja vastaavat konsentraatiot (μg/ml) x-akselille.

5.3.3   Näyteliuos

Injektoidaan 5.2.1 tai 5.2.2 kohdassa saatuja näyteuutteita useita kertoja käyttäen samaa tilavuutta kuin kalibrointiliuoksille ja määritetään lasalosid-natriumpiikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuosta (5.3.3) injektoimalla saatujen piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvosta määritetään lasalosid-natriumkonsentraatio (μg/ml) kalibrointikäyrän avulla.

6.1   Rehut

Näytteen lasalosid-natriumpitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

[mg/kg]

jossa:

c	=	näyteliuoksen (5.2.1) lasalosid-natriumkonsentraatio (μg/ml),
V1	=	5.2.1 kohdan mukaisesti valmistetun näyteuutteen tilavuus (ts. 100 ml),
m	=	näyte-erän paino (g).

6.2   Esiseokset

Näytteen lasalosid-natriumpitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

[mg/kg]

jossa:

c	=	näyteliuoksen (5.2.2) lasalosid-natriumkonsentraatio (μg/ml),
V2	=	5.2.2 kohdan mukaisesti valmistetun näyteuutteen tilavuus (ts. 250 ml),
f	=	5.2.2 kohdan mukainen laimennuskerroin,
m	=	näyte-erän paino (g).

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Spektrofluorimetriaan perustuvissa menetelmissä on vähemmän häiriömahdollisuuksia kuin UV-mittauksissa. Tutkittavan aineen tunnistaminen voidaan varmentaa yhteiskromatografialla.

7.1.1   Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen (5.2.1 tai 5.2.2) lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.10.3). Lisätyn lasalosid-natriummäärän on oltava suunnilleen sama kuin näyteliuoksesta määritetty lasalosid-natriummäärä. Ainoastaan lasalosid-natriumpiikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä lasalosid-natriumia että näyteliuoksen laimeneminen. Piikin leveyden tulisi olla puolikorkeudessa ± 10 % sellaisen näyteliuoksen piikin leveydestä, johon ei ole lisätty lasalosid-natriumia.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin

—	15 % lasalosid-natriumpitoisuuden korkeammasta arvosta välillä 30–100 mg/kg,

—	15 mg/kg lasalosid-natriumpitoisuuden ollessa 100–200 mg/kg,

—	7,5 % lasalosid-natriumpitoisuuden korkeammasta arvosta pitoisuuksien ollessa yli 200 mg/kg.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 80 %. Sellaisen esiseosnäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, saannon on oltava vähintään 90 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Laboratorioiden välinen vertailu (6) järjestettiin siten, että 12 laboratoriossa tutkittiin 2 esiseosta (näytteet 1 ja 2) ja 5 rehua (näytteet 3–7). Kukin näyte määritettiin kaksi kertaa. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

	Näyte 1 Kananrehun esiseos	Näyte 2 Kalkkunanrehun esiseos	Näyte 3 Kalkkunanrehupelletit	Näyte 4 Kananrehurakeet	Näyte 5 Kalkkunanrehu	Näyte 6 Siipikarjanrehu A	Näyte 7 Siipikarjanrehu B
L	12	12	12	12	12	12	12
n	23	23	23	23	23	23	23
Keskiarvo [mg/kg]	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
sr [mg/kg]	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
CVr [ %]	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
sR [mg/kg]	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR [ %]	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Nimellispitoisuus [mg/kg]	5 000 (7)	16 000 (7)	80 (7)	105 (7)	120 (7)	50 (8)	35 (8)

L	=	laboratorioiden lukumäärä
n	=	yksittäisten tulosten lukumäärä
sr	=	toistettavuuden keskihajonta
sR	=	uusittavuuden keskihajonta
CVr	=	toistettavuuden variaatiokerroin, %
CVR	=	uusittavuuden variaatiokerroin, %.

---

(1)  Vertailun järjestäjä: Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA), rehutyöryhmä.

(2)  Vertailun järjestäjä: Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA), rehutyöryhmä.

(3)  Myös muita hajotusmenetelmiä (kuten mikroaaltouunihajotusta paineen alaisena) voidaan käyttää sillä edellytyksellä, että niiden on osoitettu antavan samanlaiset tulokset.

(4)  Vihreisiin rehuihin (tuoreisiin tai kuivattuihin) oletetaan sisältyvän suuria määriä kasvisperäisiä piiyhdisteitä, jotka saattavat sitoa mikromineraaleja, ja jotka on siksi poistettava. Sellaisten rehujen tarkastuksessa on siksi sovellettava seuraavaa muutettua menettelyä. Menetellään 5.1.1.1 alakohdassa esitetyllä tavalla aina suodattamisvaiheeseen asti. Pestään suodatinpaperi, jossa on liukenemattomat jäämät, kahteen kertaan kiehuvalla vedellä ja siirretään ne kvartsi- tai platinaupokkaaseen. Poltetaan tuhkaksi muhveliuunissa (4.1) alle 550 oC:ssa kunnes kaikki hiilipitoinen aines on hävinnyt kokonaan. Annetaan jäähtyä, lisätään muutama tippa vettä ja sen jälkeen 10–15 ml fluorivetyhappoa (3.4) ja haihdutetaan kuivaksi noin 150 oC:ssa. Jos jäännökseen jää piiyhdisteitä, se liuotetaan uudelleen muutamaan millilitraan fluorivetyhappoa (3.4) ja haihdutetaan kuivaksi. Lisätään viisi tippaa rikkihappoa (3.5) ja kuumennetaan kunnes valkoinen savu on haihtunut. Lisätään viisi tippaa kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), ja noin 30 ml vettä, kuumennetaan ja suodatetaan liuos 250 ml:n vetoiseen mittapulloon ja täytetään merkkiin asti vedellä (HCl-pitoisuus on noin 0,5 mol/l). Sen jälkeen jatketaan menettelyä 5.1.2 kohdasta alkaen.

(5)  The Analyst 108, 1983, s. 1 252–1 256.

(6)  Analyst, 1995, 120, 2175–2180.

(7)  Valmistajan ilmoittama pitoisuus

(8)  Laboratoriossa valmistettu rehu.