1.3.2016   

FI

Euroopan unionin virallinen lehti

L 54/1


KOMISSION ASETUS (EU) 2016/266,

annettu 7 päivänä joulukuuta 2015,

testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan unionin toiminnasta tehdyn sopimuksen,

ottaa huomioon kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta 18 päivänä joulukuuta 2006 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (1) ja erityisesti sen 13 artiklan 2 kohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

(1)

Komission asetuksessa (EY) N:o 440/2008 (2) vahvistetaan asetuksen (EY) N:o 1907/2006 soveltamiseksi käytettävät testimenetelmät, joilla määritellään kemikaalien fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, myrkyllisyys ja myrkyllisyys ympäristölle.

(2)

On tarpeen saattaa ajan tasalle asetus (EY) N:o 440/2008, jotta siihen sisällytettäisiin OECD:n vastikään hyväksymät uudet ja ajantasaistetut testimenetelmät tekniikassa saavutetun kehityksen huomioon ottamiseksi ja sen varmistamiseksi, että koetarkoituksiin käytettävien eläinten määrää vähennetään Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivin 2010/63/EU (3) mukaisesti. Sidosryhmiä on kuultu tästä säädösluonnoksesta.

(3)

Mukautukseen sisältyy 20 testimenetelmää: yksi uusi testimenetelmä fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien määrittämiseksi, 11 uutta testimenetelmää ja kolme ajantasaistettua testimenetelmää ympäristömyrkyllisyyden arvioimiseksi sekä viisi uutta testimenetelmää aineen ympäristössä käyttäytymisen arvioimiseksi.

(4)

Sen vuoksi asetusta (EY) N:o 440/2008 olisi muutettava.

(5)

Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat asetuksen (EY) N:o 1907/2006 133 artiklalla perustetun komitean lausunnon mukaiset,

ON HYVÄKSYNYT TÄMÄN ASETUKSEN:

1 artikla

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite tämän asetuksen liitteen mukaisesti.

2 artikla

Tämä asetus tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

Tehty Brysselissä 7 päivänä joulukuuta 2015.

Komission puolesta

Puheenjohtaja

Jean-Claude JUNCKER


(1)  EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Komission asetus (EY) N:o 440/2008, annettu 30 päivänä toukokuuta 2008, testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla (EUVL L 142, 31.5.2008, s. 1).

(3)  Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta (EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33).


LIITE

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite seuraavasti:

1)

Lisätään liitteen alkuun ennen A osaa seuraava huomautus:

”Huomautus:

Ennen kuin mitään seuraavista testimenetelmistä käytetään useammasta ainesosasta koostuvan aineen, koostumukseltaan tuntemattoman tai vaihtelevan aineen, kompleksin reaktiotuotteen tai biologisen materiaalin tai seoksen testauksessa ja siinä tapauksessa, että testimenetelmän soveltuvuutta useammasta ainesosasta koostuvan aineen, koostumukseltaan tuntemattoman tai vaihtelevan aineen, kompleksin reaktiotuotteen tai biologisen materiaalin tai seosten testaamiseen ei ole esitetty kyseisessä testimenetelmässä, on harkittava, onko menetelmä riittävä suunnitellun sääntelytarkoituksen kannalta.

Jos testimenetelmää käytetään useammasta ainesosasta koostuvan aineen, koostumukseltaan tuntemattoman tai vaihtelevan aineen, kompleksin reaktiotuotteen tai biologisen materiaalin tai seoksen testaamiseen, seoksen koostumuksesta olisi saatava riittävästi tietoa, mahdollisuuksien mukaan esimerkiksi seuraavien avulla: ainesosien kemiallinen koostumus, esiintymistiheys ja aineosan asiaa koskevat erityisominaisuudet.”

2)

Lisätään luku A.24:

A.24.   JAKAANTUMISKERROIN (N-OKTANOLI/VESI), KORKEAN SUORITUSKYVYN NESTEKROMATOGRAFIA (HPLC-MENETELMÄ)

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 117 (2004).

1.

Määritelmän mukaan jakaantumiskerroin (P) on liuotetun aineen tasapainopitoisuuksien (ci) välinen suhde kaksifaasijärjestelmässä, jossa on kaksi toisiinsa heikosti sekoittuvaa liuotinta:

Formula

Jakaantumiskerroin on siis kahden pitoisuuden välinen suhde ja dimensioton suure, joka ilmoitetaan normaalisti kymmenkantaisena logaritmina.

2.

Pow on keskeinen parametri, kun tarkastellaan kemiallisten aineiden kulkeutumista ympäristössä. Aineiden ionisoitumattoman muodon Pow-arvon sekä niiden biokertyvyyden välillä kalojen osalta on osoitettu erittäin merkittävä suhde. On myös osoitettu, että Pow on hyödyllinen parametri, kun ennustetaan adsorptiota maaperään ja sedimentteihin tai todetaan kvantitatiivisia rakenne-aktiivisuussuhteita erilaisten biologisten vaikutusten osalta.

3.

Tätä testimenetelmää koskeva alkuperäinen esitys perustui C. V. Eadsforthin ja P. Moserin kirjoittamaan artikkeliin (1). Testimenetelmän kehittämistä sekä OECD-maiden laboratorioiden välistä vertailutestiä koordinoi Saksan liittotasavallan Umweltbundesamt vuonna 1986 (2).

ALUSTAVAT HUOMIOT

4.

log Pow -arvot, jotka ovat välillä – 2 … 4 (toisinaan jopa 5 tai enemmän) (1), voidaan määrittää kokeellisesti ravistuspullomenetelmällä (tämän liitteen A.8 luku sekä OECD:n testiohje (TG)107). HPLC-menetelmä kattaa log Pow -arvot välillä 0–6 (1), (2), (3), (4), (5). Tämän menetelmän käyttö saattaa edellyttää Pow-arvon määrittämistä sopivien vertailuaineiden valintaa varten sekä testin tuottaman datan perusteella tehtyjen johtopäätösten tueksi. Laskentamenetelmiä käsitellään lyhyesti tämän testausmenetelmän lisäyksessä. HPLC-menetelmä toteutetaan isokraattisesti.

5.

Pow-arvot riippuvat ympäristöolosuhteista, kuten esimerkiksi lämpötilasta, pH-arvosta ja ionivahvuudesta. Nämä on määriteltävä kokeen yhteydessä, jotta Pow-tiedot osataan tulkita oikein. Ionisoituville aineille voidaan mahdollisuuksien mukaan käyttää jotain muuta, vaihtoehtoista menetelmää (esimerkiksi OECD:n ohjeluonnosta ionisoituneille aineille käytettävästä pH-metrisestä menetelmästä (6)). Kyseinen OECD:n ohjeluonnos saattaa sopia näiden ionisoituvien aineiden Pow-arvon määrittämiseen, mutta joissakin tapauksissa on tarkoituksenmukaisempaa käyttää HPLC-menetelmää ympäristön kannalta merkityksellisille pH-arvoille (ks. 9 kohta).

MENETELMÄN PERIAATE

6.

Käänteisfaasi-HPLC tapahtuu analyyttisessa kolonnissa, joka on täytetty kaupallisesti saatavana olevalla, pitkiä hiilivetyketjuja (esimerkiksi C8, C18) sisältävällä kiinteällä faasilla, joka on kemiallisesti sidottu piidioksidiin.

7.

Kolonniin ruiskutetut kemikaalit jakaantuvat liikkuvan liuotinfaasin ja kiinteän hiilivetyfaasin välillä kulkeutuessaan kolonnia pitkin liikkuvan faasin välityksellä. Kolonni pidättää aineita niiden hiilivety-vesi-jakaantumiskertoimen suhteessa siten, että hydrofiiliset aineet eluoituvat ensin ja lipofiiliset aineet viimeisenä. Retentioaikaa kuvataan käyttökertoimen k avulla seuraavasti:

Formula

jossa tR on näytteen retentioaika ja t0 viive eli liuotinmolekyylin keskimääräinen läpäisyaika. Kvantitatiivisia analyyttisia menetelmiä ei tarvita. Retentioaikojen määritys riittää.

8.

Näytteen oktanoli-vesi-jakaantumiskerroin voidaan laskea määrittämällä käyttökerroin k kokeellisesti ja käyttämällä saatua arvoa seuraavassa yhtälössä:

Formula

jossa

a, b

=

lineaariset regressiokertoimet.

Edellä mainittu yhtälö saadaan vertailuaineiden oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimen logaritmin ja vertailuaineiden käyttökertoimen logaritmin lineaarisesta regressioanalyysista.

9.

Käänteisfaasi-HPLC:n avulla voidaan arvioida, että jakaantumiskertoimen log Pow on 0–6, mutta poikkeustapauksissa log Pow voi olla jopa 6–10. Tämä saattaa edellyttää liikkuvan faasin modifiointia (3). Menetelmää ei voi käyttää väkevien happojen ja emästen, metallikompleksien, eluentin kanssa reagoivien aineiden tai pinta-aktiivisten aineiden testaukseen. Ionisoituvia aineita voidaan mitata niiden ionisoitumattomassa muodossa (vapaa happo tai vapaa emäs), kunhan käytetään sopivaa puskuria, jonka pH on vähintään yhden pH-yksikön pKa-arvoa pienempi (vapaa happo) tai suurempi (vapaa emäs) Ionisoituvien aineiden testaamiseen (6) saatetaan saada käyttöön myös pH-metrinen menetelmä, jota voidaan käyttää vaihtoehtona (6). Jos log Pow:n määritys tehdään ympäristöriskiluokitusta tai -riskinarviointia varten, testissä käytettävän pH-alueen olisi oltava kyseisen luonnonympäristön kannalta merkityksellinen eli 5,0–9.

10.

Joissakin tapauksissa epäpuhtaudet voivat vaikeuttaa tulosten tulkintaa, koska piikkien kohdentaminen on tällöin epävarmaa. Jos seoksen testauksessa saadaan määrittämätön kaista, on ilmoitettava log Pow:n ylä- ja alaraja sekä kunkin log Pow -piikin pinta-alaprosentti. Jos seokset kuuluvat samaan homologiryhmään, on lisäksi ilmoitettava log Pow:n painotettu keskiarvo (7), joka on laskettu yksittäisten Pow-arvojen sekä vastaavien pinta-alaprosenttiarvojen perusteella (8). Seuraavassa laskelmassa on otettava huomioon piikit, jotka muodostavat vähintään 5 prosenttia piikkien yhteispinta-alasta (9):

Formula

log Pow:n painotettua keskiarvoa voidaan käyttää vain homologeista (esimerkiksi alkaanisarjasta) koostuville aineille tai seoksille (esimerkiksi mäntyöljyille). Seosten mittaamisesta voidaan saada mielekkäitä tuloksia, jos käytetyn detektorin herkkyys on sama kaikille seoksen aineille, jotta ne voidaan erottaa toisistaan riittävästi.

TESTIAINETTA KOSKEVIA TIETOJA

11.

Ennen menetelmän käyttöä on oltava tiedossa dissosiaatiovakio, rakennekaava sekä liukoisuus liikkuvassa faasissa. Lisäksi hydrolyysiä koskevasta tiedosta on hyötyä.

LAATUKRITEERIT

12.

Mittaustulokset varmistetaan tekemällä kaksi määritystä.

Toistettavuus: log Pow -arvot, jotka on saatu samoissa koeolosuhteissa tehdyistä toistuvista mittauksista samoja vertailuaineita käyttämällä, voivat erota toisistaan enintään ± 0.1 logaritmiyksikköä.

Uusittavuus: Jos mittaukset toistetaan eri vertailuaineryhmälle, voidaan saada erilaisia tuloksia. log k:n ja log Pow:n välinen korrelaatiokerroin R jollekin vertailuaineryhmälle on tyypillisesti noin 0,9, mikä vastaa log Pow:n oktanoli-vesi-jakaantumiskerrointa ± 0,5 logaritmiyksikköä.

13.

Laboratorioiden välisessä vertailutestissä on osoitettu, että HPLC-menetelmällä päästään log Pow-arvoihin, jotka ovat ± 0,5 yksikköä ravistuspullomenetelmällä saaduista arvoista (2). Muita vertailuja on esitetty kirjallisuudessa (4), (5), (10), (11), (12). Tarkimmat tulokset saadaan rakenteellisesti testiainetta muistuttavien vertailuaineiden perusteella laadituista korrelaatiokäyristä (13).

VERTAILUAINEET

14.

Aineen mitatun käyttökertoimen k ja sen Pow-arvon välille korrelaatiota muodostettaessa on laadittava kalibrointikäyrä, jossa on vähintään kuusi pistettä (ks. 24 kohta). Käyttäjä valitsee sopivat vertailuaineet. Vertailuaineiden log Pow -arvoihin olisi normaalisti sisällyttävä testiaineen log Pow -arvo. Toisin sanoen ainakin yhden vertailuaineen Pow-arvon olisi oltava testiainetta suurempi ja ainakin yhden vertailuaineen Pow-arvon testiainetta pienempi. Ekstrapolointia voi käyttää vain poikkeustapauksissa. Suositeltavaa on, että vertailuaineet muistuttavat rakenteellisesti testiainetta. Kalibroinnissa käytettävien vertailuaineiden log Pow -arvojen on perustuttava luotettaviin koetuloksiin. Kuitenkin aineille, joiden log Pow -arvo on korkea (yleensä yli 4), voidaan käyttää laskennallisia arvoja, ellei luotettavia koetuloksia ole saatavana. Ekstrapoloituja arvoja käytettäessä raja-arvo on mainittava.

15.

Lähdekirjallisuudessa on laajat luettelot monien kemikaaliryhmien log Pow -arvoista (14), (15). Jos näytteen kanssa rakenteeltaan samankaltaisten aineiden tietoja ei ole käytettävissä, voidaan käyttää yleisempää kalibrointia, joka perustuu muihin vertailuaineisiin. Suositeltavat vertailuaineet ja niiden Pow-arvot on esitetty taulukossa 1. Ionisoituvien aineiden osalta annettuja arvoja sovelletaan ionisoitumattomiin muotoihin. Arvojen uskottavuus ja laatu on todettu laboratorioiden välisessä vertailutestissä.

Taulukko 1

Suositeltavat vertailuaineet

 

CAS-numero

Vertailuaine

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanoni

(metyylietyyliketoni)

0,3

 

2

1122-54-9

4-asetyylipyridiini

0,5

 

3

62-53-3

Aniliini

0,9

 

4

103-84-4

Asetanilidi

1,0

 

5

100-51-6

Bentsyylialkoholi

1,1

 

6

150-76-5

4-metoksifenoli

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Fenoksietikkahappo

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenoli

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenoli

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Bentsonitriili

1,6

 

11

140-29-4

Fenyyliasetonitriili

1,6

 

12

589-18-4

4-metyylibentsyylialkoholi

1,6

 

13

98-86-2

Asetofenoni

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenoli

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-nitrobentsoehappo

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-kloorianiliini

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobentseeni

1,9

 

18

104-54-1

Kinnamyylialkoholi

(kanelialkoholi)

1,9

 

19

65-85-0

Bentsoehappo

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-kresoli

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Kanelihappo

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anisoli

2,1

 

23

93-58-3

Metyylibentsoaatti

2,1

 

24

71-43-2

Bentseeni

2,1

 

25

99-04-7

3-metyylibentsoehappo

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-klorofenoli

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Trikloorietyleeni

2,4

 

28

1912-24-9

Atratsiini

2,6

 

29

93-89-0

Etyylibentsoaatti

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-diklorobentsonitriili

2,6

 

31

535-80-8

3-klorobentsoehappo

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Tolueeni

2,7

 

33

90-15-3

1-naftoli

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dikloroanilliini

2,8

 

35

108-90-7

Klooribentseeni

2,8

 

36

1746-13-0

Allyylifenyylieetteri

2,9

 

37

108-86-1

Bromobentseeni

3,0

 

38

100-41-4

Etyylibentseeni

3,2

 

39

119-61-9

Bentsofenoni

3,2

 

40

92-69-3

4-fenyylifenoli

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Tymoli

3,3

 

42

106-46-7

1,4-diklooribentseeni

3,4

 

43

122-39-4

Difenyylilamiini

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftaleeni

3,6

 

45

93-99-2

Fenyylibentsoaatti

3,6

 

46

98-82-8

Isopropyylibentseeni

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-trikloorifenoli

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenyyli

4,0

 

49

120-51-4

Bentsyylibentsoaatti

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sek-butyylifenoli

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-triklooribentseeni

4,2

 

52

143-07-7

Dodekaanihappo

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenyylieetteri

4,2

 

54

85-01-8

Fenantreeni

4,5

 

55

104-51-8

n-butyylibentseeni

4,6

 

56

103-29-7

Dibentsyyli

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenyylipyridiini

4,9

 

58

206-44-0

Fluoranteeni

5,1

 

59

603-34-9

Trifenyyliamiini

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

MENETELMÄN KUVAUS

Jakaantumiskertoimen alustava arviointi

16.

Testiaineen jakaantumiskerrointa voidaan tarvittaessa arvioida. Suositeltavinta on käyttää laskentamenetelmää (ks. lisäys) tai määrätyissä tapauksissa testiaineen liukoisuutta puhtaisiin liuottimiin.

Laitteisto

17.

Menetelmässä tarvitaan nestefaasikromatografi, jossa on pulssittomasti toimiva pumppu ja sopiva detektorijärjestelmä. RI-detektoria tai aallonpituutta 210 nm käyttävää UV-detektoria voidaan käyttää useille erilaisille kemiallisille ryhmille. Kiinteässä faasissa olevat polaariset ryhmät saattavat vakavasti häiritä HPCL-kolonnin tehokkuutta, minkä vuoksi polaaristen ryhmien määrä kiinteissä faaseissa (16) on minimoitava. Menetelmässä voidaan käyttää kaupallisesti saatavana olevia mikrohiukkas-vastafaasipakkauksia tai valmiiksi pakattuja kolonneja. Ruiskutusjärjestelmän ja analyyttisen kolonnin välissä voidaan pitää suojakolonnia.

Liikkuva faasi

18.

Eluutioliuotin valmistetaan HPLC-laatuisesta metanolista ja tislatusta tai ionivaihdetusta vedestä. Liuottimelle tehdään kaasunpoisto ennen käyttöä. Eluution pitäisi olla isokraattinen. Metanoli-vesiseoksessa on oltava vähintään 25 prosenttia vettä. Yleensä seoksella, jossa on metanolia ja vettä tilavuussuhteessa 3:1, saadaan tyydyttäviä tuloksia, kun eluoidaan aineita, joiden log P -arvo on 6, yhdessä tunnissa virtausnopeudella 1 ml/min. Jos aineiden log P -arvo on yli 6, saattaa olla tarpeen lyhentää eluointiaikaa (myös vertailuaineiden kohdalla) vähentämällä liikkuvan faasin polaarisuutta tai kolonnin pituutta.

19.

Testiaineen ja vertailuaineiden liukoisuuden liikkuvaan faasiin on oltava tarpeeksi suuri niiden havaitsemista varten. Lisäaineita voidaan käyttää metanoli-vesiseoksen yhteydessä vain poikkeustapauksissa, koska lisäaineet muuttavat kolonnin ominaisuuksia. Tällöin on varmistettava, etteivät lisäaineet vaikuta testiaineen ja vertailuaineiden retentioaikaan. Jos metanoli-vesiseos ei sovellu tarkoitukseen, voidaan käyttää muita orgaanisen liuottimen ja veden seoksia, esimerkiksi etanoli-vesiseosta, asetonitriili-vesiseosta tai isopropyylialkoholi (2-propanoli)-vesiseosta.

20.

Ionisoivien aineiden osalta eluentin pH on kriittinen. Sen on oltava kolonnin pH-alueella eli yleensä 2–8. Puskurointia suositellaan. On varottava suolan saostumista ja kolonnin huononemista, mitä voi tapahtua eräiden orgaanisten faasi-puskuriseosten yhteydessä. HPLC-mittauksia, joissa piidioksidipohjaisen kiinteän faasin pH on yli 8, ei yleensä suositella, koska emäksinen liikkuva faasi voi aiheuttaa kolonnin suorituskyvyn nopeaa huononemista.

Liuotetut aineet

21.

Testiaineen ja vertailuaineiden on oltava riittävän puhtaita, jotta kromatogrammien piikit voidaan kohdentaa oikeille aineille. Testi- ja kalibrointitarkoituksiin käytettävät aineet liuotetaan liikkuvaan faasiin mahdollisuuksien mukaan. Jos muuta kuin liikkuvassa faasissa olevaa liuotinta käytetään testi- ja vertailuaineiden liuottamiseen, liikkuvaa faasia on käytettävä injektointia edeltävässä viimeisessä laimennuksessa.

Testiolosuhteet

22.

Mittauksen aikana lämpötila saa vaihdella enintään ± 1 °C.

Kuollut aika to

23.

Kuollut aika t0 voidaan mitata käyttämällä kolonnin läpi pidättymättä kulkevia orgaanisia aineita (esimerkiksi tiokarbamidia tai formamidia). Tarkemmin kuollut aika saadaan mitatuista retentioajoista tai noin seitsenosaisesta homologisesta sarjasta (esimerkiksi n-alkyylimetyyliketoneista) (17). Retentioajat tR (nC + 1) piirretään ajan tR (nC) funktiona, jossa nC on hiiliatomien määrä. Tuloksena saadaan suora linja tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, jossa yhtälöä k(nC + 1)/k(nC) edustava A on vakio. Kuollut aika t0 saadaan vakiotermistä (1 – A)t0 sekä kaltevuudesta A.

Regressioyhtälö

24.

Seuraavaksi laaditaan korrelaatiokäyrä, jossa soveltuvien vertailuaineiden log k -arvot esitetään log P -arvojen funktiona. log P -arvot ovat lähellä testiaineen odotettavissa olevaa arvoa. Käytännössä samanaikaisesti injektoidaan 6–10 vertailuainetta. Retentioajat on suositeltavaa määrittää detektorijärjestelmään kytketyllä tallentavalla integraattorilla. Käyttökertoimen k vastaavat logaritmit merkitään käyrään log P -arvojen funktiona. Regressioyhtälö lasketaan määrätyin välein, vähintään kerran päivässä, jotta kolonnin suorituskyvyn mahdolliset muutokset voidaan ottaa huomioon.

TESTIAINEEN POW-ARVON MÄÄRITTÄMINEN

25.

Testiainetta injektoidaan määrinä, jotka ovat vielä juuri ja juuri havaittavissa. Retentio määritetään kaksi kertaa. Testiaineen jakaantumiskerroin saadaan interpoloimalla laskettu käyttökerroin kalibrointikäyrälle. Jos jakaantumiskerroin on hyvin pieni tai hyvin suuri, on käytettävä ekstrapolointia. Etenkin näissä tapauksissa on otettava huomioon regressiosuoran luottamusrajat. Jos näytteen retentioaika on standardeja varten saatujen retentioaikojen vaihteluvälin ulkopuolella, on mainittava myös raja-arvo.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Testiraportti

26.

Testiraportissa on oltava seuraavat tiedot:

alustava arvio jakaantumiskertoimesta (jos määritetty), arvioidut arvot sekä käytetty menetelmä; laskentamenetelmää käytettäessä kattava kuvaus menetelmästä, mukaan lukien tietokannan nimi sekä tarkat tiedot valituista fragmenteista

testi- ja vertailuaineista puhtaus, rakennekaava ja CAS-numero

laitteiston ja käyttöolosuhteiden kuvaus: analyyttinen kolonni, suojakolonni,

liikkuva faasi, käytetty detektori, lämpötila-alue, pH-arvo

eluointiprofiilit (kromatogrammit)

kuollut aika ja sen mittaustapa

retentiotiedot ja lähdekirjallisuudesta saadut, kalibroinnissa käytettyjen vertailuaineiden log Pow -arvot

regressiosuoran tiedot (log k:n riippuvuus log Pow:stä) sekä suoran korrelaatiokerroin, mukaan lukien luottamusvälit

retentiotietojen keskiarvo ja testiaineen interpoloitu log Pow -arvo

seosta käytettäessä eluointiprofiilin kromatogrammi, johon lopetuskohdat on merkitty

log Pow -piikin pinta-alaprosenttiin suhteutetut log Pow -arvot

regressiosuoraa käyttävä laskelma

tarvittaessa log Pow -arvojen laskennallinen painotettu keskiarvo.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). ’Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995’, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, s. 529–537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Lisäys

Pow-arvojen laskentamenetelmät

JOHDANTO

1.

Tämä lisäys sisältää lyhyen johdatuksen Pow-arvojen laskentamenetelmiin. Lisätietoa on oppikirjoissa (1), (2).

2.

Laskettuja Pow-arvoja voidaan käyttää seuraaviin tarkoituksiin:

kokeellisen menetelmän valinta: ravistuspullomenetelmä, kun log Pow on – 2…4, ja HPLC-menetelmä, kun log Pow on 0…6;

HPLC-menetelmässä käytettävien testiolosuhteiden valinta (vertailuaineet, metanolin ja veden suhde);

kokeellisilla menetelmillä saatujen arvojen uskottavuuden tarkistaminen;

arvioiden tekeminen silloin, kun kokeellisia menetelmiä ei voi soveltaa.

Laskentamenetelmien periaate

3.

Tässä esitetyt laskentamenetelmät perustuvat molekyylin teoreettiseen fragmentointiin sopiviin alarakenteisiin, joille on tiedossa luotettavat log Pow -differentiaalit. log Pow -arvo saadaan laskemalla yhteen fragmenttiarvot sekä korjaustermit, jotka perustuvat molekyylin sisäisiin vuorovaikutuksiin. Luettelot fragmenttivakioista ja korjaustermeistä ovat saatavana lähteistä (1), (2), (3), (4), (5), (6). Joitakin niistä päivitetään säännöllisesti (3).

Laskettujen arvojen luotettavuus

4.

Yleisesti ottaen laskentamenetelmien luotettavuus heikkenee, kun tutkittavan yhdisteen monimutkaisuus kasvaa. Kun tutkitaan yksinkertaisia molekyyleja, joilla on alhainen molekyylipaino ja yksi tai kaksi funktionaalista ryhmää, voidaan odottaa, että poikkeama fragmentaatiomenetelmien ja mitatun arvon välillä on 0,1–0,3 log Pow -yksikköä. Virhemarginaali riippuu käytettyjen fragmenttivakioiden luotettavuudesta sekä siitä, miten hyvin molekyylin sisäiset vuorovaikutukset (esimerkiksi vetysidokset) ovat tunnistettavissa ja miten hyvin korjaustermejä osataan käyttää. Kun käsitellään ionisoivia yhdisteitä, on tärkeää ottaa huomioon varaus ja ionisointiaste (10).

Fujita-Hansch π -menetelmä

5.

Hydrofobinen substituenttivakio π, jonka esittivät ensimmäisinä Fujita ym. (7), määritetään seuraavasti:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

jossa PhX on aromaattinen johdannainen ja PhH on emoyhdiste.

Esimerkiksi:

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

π-menetelmää käytetään lähinnä aromaattisille aineille. π-arvot suurelle määrälle substituentteja on esitetty kirjallisuudessa (4), (5).

Rekker-menetelmä

6.

Rekker-menetelmällä (8) log Pow -arvo lasketaan seuraavasti:

Formula

jossa ai ilmaisee, montako kertaa tietty fragmentti esiintyy molekyylissä, ja fi on fragmentin log Pow -differentiaali. Vuorovaikutustermit voidaan esittää yhden ainoan vakion Cm integraalikerrannaisina (niin sanottuna maagisena vakiona). Fragmenttivakiot fi and Cm on määritetty 1 054 kokeellista Pow -arvoa (825 ainetta) sisältävän luettelon perusteella moninkertaista regressioanalyysiä käyttäen (6), (8). Vuorovaikutustermien määritys tehdään tiettyjen sääntöjen mukaan (6), (8), (9).

Hansch-Leon menetelmä

7.

Hansch-Leon-menetelmällä (4) log Pow -arvo lasketaan seuraavasti:

Formula

jossa fi on fragmenttivakio, Fj korjaustermi (tekijä) ja ai ja bj ovat vastaavia esiintymistaajuuksia. Luettelot atomien ja ryhmien fragmenttiarvoista sekä korjaustermeistä Fj on laadittu yrityksen ja erehdyksen kautta kokeellisten Pow-arvojen perusteella. Korjaustermit on jaettu useaan eri luokkaan (1), (4). Markkinoilla olevat erikoisohjelmat huomioivat kaikki säännöt ja korjaustermit (3).

YHDISTETTY MENETELMÄ

8.

Monimutkaisten molekyylien Pow-laskentaa voidaan helpottaa huomattavasti jakamalla molekyylit suurehkoihin alarakenteisiin, joille on saatavana luotettavia Pow-arvoja joko taulukoista (3), (4) tai valmiiksi tehdyistä mittauksista. Tällaiset fragmentit (esimerkiksi heterosykliset renkaat, antrakinoni ja atsobentseeni) voidaan sen jälkeen yhdistää Hanschin π-arvoihin tai Rekkerin tai Leon fragmenttivakioihin.

Huomautuksia

i)

Laskentamenetelmiä voidaan soveltaa vain osittain tai kokonaan ionisoituihin aineisiin, jos tarpeelliset korjauskertoimet on otettu huomioon.

ii)

Jos voidaan 4olettaa, että molekyylin sisällä on vetysidoksia, on lisättävä vastaavat korjaustermit (noin + 0,6…+ 0,1 log Pow -yksikköä) (1). Indikaatiot vetysidosten olemassaolosta saadaan stereomalleista tai spektroskooppisista tiedoista.

iii)

Jos useat tautomeeriset muodot ovat mahdollisia, todennäköisintä muotoa käytetään laskennan perustana.

iv)

Fragmenttivakioluetteloiden päivityksiä on seurattava huolella.

LASKENTAMENETELMIÄ KÄSITTELEVÄ LÄHTEKIRJALLISUUS

(1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R.A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, s. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

3)

Korvataan luku C.3 seuraavasti:

C.3.   MAKEAN VEDEN LEVIEN JA SYANOBAKTEERIEN KASVUNESTYMISTESTI

JOHDANTO

1.

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 201 (2006, liite oikaistu vuonna 2011). On todettu tarpeelliseksi laajentaa testimenetelmää, jotta siihen voidaan lisätä uusia lajeja ja jotta menetelmää voidaan päivittää siten, että vaaranarviointia ja kemikaalien luokitusta koskevat vaatimukset täyttyvät. Menetelmän tarkistus perustuu laajaan käytännön kokemukseen, tieteen kehitykseen leviin kohdistuvien myrkyllisyystutkimusten alalla sekä testimenetelmän aiemman version laajaan käyttöön sääntelyssä.

2.

Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

TESTIN PERIAATE

3.

Testin tavoitteena on määrittää testattavan kemikaalin vaikutukset makean veden viherlevien ja/tai syanobakteereiden kasvuun. Eksponentiaalisesti kasvavat koe-eliöt altistetaan testikemikaalille panosviljelmissä yleensä 72 tunnin ajan. Vaikka testi on suhteellisen lyhyt, sillä voidaan arvioida useaan sukupolveen kohdistuvia vaikutuksia.

4.

Järjestelmän vasteena on kasvun väheneminen sarjassa leväviljelmiä (testiyksiköitä), jotka on altistettu testikemikaalin eri pitoisuuksille. Vastetta arvioidaan altistuspitoisuuden funktiona vertaamalla sitä rinnakkaisten, altistumattomien kontrolliviljelmien keskimääräiseen kasvuun. Jotta järjestelmän vaste myrkkyvaikutuksiin ilmenisi kokonaan (optimaalinen herkkyys), viljelmien kasvua ei rajoiteta vaan niiden annetaan kasvaa eksponentiaalisesti olosuhteissa, joissa on riittävästi ravinteita ja valonsaanti on jatkuvaa, kunnes spesifisen kasvunopeuden pieneneminen on mitattavissa.

5.

Kasvua ja kasvun estymistä kvantifioidaan mittaamalla leväbiomassa ajan funktiona. Leväbiomassa määritetään kuivapainona tilavuutta kohden, esimerkiksi milligrammoina levää yhtä litraa testiliuosta kohden. Kuivapainoa on kuitenkin vaikea mitata, minkä vuoksi käytetään korvaavia parametreja. Useimmin käytettyjä ovat solumäärät. Muita korvaavia parametreja ovat muun muassa solutilavuus, fluoresenssi ja optinen tiheys. Mitatun korvaavan parametrin ja biomassan välinen muuntokerroin on tunnettava.

6.

Testin loppupisteenä on kasvun estyminen, joka ilmenee biomassan logaritmisesta kasvusta (keskimääräisestä spesifisestä kasvunopeudesta) altistusaikana. Testiliuossarjassa mitattujen keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien avulla määritetään pitoisuus, jossa kasvunopeus vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan ErCx-arvona (esimerkiksi ErC50).

7.

Toinen testimenetelmässä käytetty vastemuuttuja on tuotos, jota voidaan tarvita joissakin maissa erityisten sääntelyvaatimusten täyttämiseksi. Tuotoksella tarkoitetaan altistusajan lopussa mitatun biomassan ja altistusajan alussa mitatun biomassan erotusta. Testiliuossarjassa mitatun tuotoksen avulla määritetään pitoisuus, jossa tuotos vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan EyCx-arvona (esimerkiksi EyC50).

8.

Tilastollisesti voidaan määrittää myös pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) sekä pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC).

TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA

9.

Testikemikaalia koskevia tietoja, joista voi olla hyötyä päätettäessä testiolosuhteista, ovat rakennekaava, puhtaus, stabiilius valossa, stabiilius testiolosuhteissa, valonabsorbointiominaisuudet, pKa ja muuntumistutkimusten tulokset, mukaan luettuna biohajoavuus vedessä.

10.

Testikemikaalin vesiliukoisuus, oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin (Pow) ja höyrynpaine on tunnettava, ja testiliuoksissa olevan testikemikaalin kvantifioimiseen tarvitaan validoitu menetelmä, jonka saantoteho ja havaitsemisraja tunnetaan.

TESTIN VALIDITEETTI

11.

Jotta testi olisi validi, sen on täytettävä seuraavat vaatimukset:

Biomassan on täytynyt kasvaa kontrolliviljelmissä eksponentiaalisesti vähintään 16-kertaiseksi 72 tunnin testijakson aikana. Tämä vastaa spesifistä kasvunopeutta 0,92 päivää kohden. Useimmin käytetyillä lajeilla kasvunopeus on yleensä huomattavasti suurempi (ks. lisäys 2). Tämä vaatimus ei välttämättä täyty käytettäessä lajeja, jotka kasvavat hitaammin kuin lisäyksessä 2 luetellut lajit. Siinä tapauksessa testijaksoa on pidennettävä, jotta kontrolliviljelmissä saavutettaisiin vähintään 16-kertainen kasvu, ja kasvun on oltava eksponentiaalista koko testijakson ajan. Testijaksoa voidaan lyhentää 48 tuntiin saakka rajoittamattoman eksponentiaalisen kasvun ylläpitämiseksi koko testin ajan, jos kasvukerroin on vähintään 16.

Kontrolliviljelmien jaksoittaisten spesifisten kasvunopeuksien (72 tunnin testeissä päivät 0–1, 1–2 ja 2–3) keskimääräinen variaatiokerroin (ks. lisäys 1 kohdassa ’Variaatiokerroin’) saa olla enintään 35 prosenttia. Jaksoittaisen spesifisen kasvunopeuden laskemista käsitellään 49 kohdassa. Tämä vaatimus koskee rinnakkaisia kontrolliviljelmiä varten laskettujen variaatiokertoimien keskiarvoa.

Rinnakkaisten kontrolliviljelmien keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien variaatiokerroin saa olla koko testijakson aikana enintään 7 prosenttia, jos testeissä käytetään lajeja Pseudokirchneriella subcapitata ja Desmodesmus subspicatus. Käytettäessä muita, harvemmin testattuja lajeja tämä arvo saa olla enintään 10 prosenttia.

VERTAILUKEMIKAALI

12.

Testimenetelmä voidaan tarkistaa testaamalla vertailukemikaali (-kemikaalit), kuten 3,5-dikloorifenoli, jota on käytetty kansainvälisessä yhteistutkimuksessa (1). Viherleviä viljeltäessä vertailukemikaalina voidaan käyttää myös kaliumdikromaattia. Vertailukemikaali olisi hyvä testata vähintään kahdesti vuodessa.

TESTIN SOVELTUVUUS

13.

Tätä testimenetelmää voidaan parhaiten soveltaa vesiliukoisiin kemikaaleihin, jotka todennäköisesti pysyvät veteen liuenneina testiolosuhteissa. Testattaessa kemikaaleja, jotka ovat haihtuvia, voimakkaasti adsorboivia, värillisiä tai huonosti veteen liukenevia, tai kemikaaleja, jotka voivat vaikuttaa testiviljelyaineessa olevien ravinteiden tai kivennäisaineiden saantiin, voi olla tarpeen tehdä tiettyjä mukautuksia tässä kuvattuun menetelmään (esimerkiksi suljettu järjestelmä ja koeastioiden erityisvalmistelu). Kirjallisuusviitteissä (2), (3) ja (4) annetaan ohjeita joistakin sopivista mukautuksista.

TESTIMENETELMÄN KUVAUS

Laitteisto

14.

Astioiden ja muiden laitteiden, jotka joutuvat kosketuksiin testiliuosten kanssa, on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia. Ne on pestävä huolellisesti, jotta mitkään orgaaniset tai epäorgaaniset epäpuhtaudet eivät vaikuttaisi leväkasvuun tai testiliuosten koostumukseen.

15.

Koeastiat ovat yleensä lasipulloja, jotka ovat niin suuria, että viljelmän tilavuus riittää testin aikaisiin mittauksiin ja CO2:n siirtyminen ilmakehästä on riittävää (ks. 30 kohta). Nestetilavuuden täytyy olla riittävän suuri analyyttisiä määrityksiä varten (ks. 37 kohta).

16.

Lisäksi saatetaan tarvita joitakin tai kaikkia seuraavista laitteista:

Viljelylaite: Suosituksena on käyttää kaappia tai kammiota, jossa valittua inkubointilämpötilaa voidaan pitää yllä ± 2 °C:n tarkkuudella.

Valonmittauslaitteet: On tärkeää muistaa, että valon voimakkuuden mittausmenetelmä ja erityisesti mittausanturin (keräimen) tyyppi saattavat vaikuttaa mitattuun arvoon. Mittauksissa olisi mieluimmin käytettävä pyöreää (4 π) mittausanturia (joka reagoi suoraan valoon ja heijastuneeseen valoon mistä tahansa kulmasta mittaustason ylä- ja alapuolelta) tai 2 π:n mittausanturia (joka reagoi valoon mistä tahansa kulmasta mittaustason yläpuolelta).

Leväbiomassan määrityslaite: Solumäärä, joka on yleisin leväbiomassan sijasta käytetty parametri, voidaan laskea käyttämällä elektronista hiukkaslaskinta, laskukammiolla varustettua mikroskooppia tai virtaussytometria. Muita biomassan sijasta käytettyjä parametreja voidaan mitata virtaussytometrilla, fluorimetrilla, spektrofotometrilla tai kolorimetrilla. On hyödyllistä laskea solumäärän ja kuivapainon välinen muuntokerroin. Jotta mittaukset onnistuisivat spektrofotometrilla pienissä biomassapitoisuuksissa, voi olla tarpeen käyttää kyvettejä, joissa valotien pituus on vähintään 4 cm.

Testiorganismit

17.

Testissä voidaan käyttää monia kiinnittymättömiä mikrolevä- ja syanobakteerilajeja. Lisäyksessä 2 lueteltujen kantojen on todettu soveltuvan tähän testimenetelmään.

18.

Jos testissä käytetään muita lajeja, niiden kanta ja/tai alkuperä on ilmoitettava. Varmista, että testiin valitun levän eksponentiaalista kasvua voidaan pitää yllä testiolosuhteissa koko testijakson ajan.

Viljelyaine

19.

Testiä varten suositetaan kahta vaihtoehtoista viljelyainetta: OECD- ja AAP-viljelyainetta. Niiden koostumus esitetään lisäyksessä 3. On syytä huomata, että näiden kahden viljelyaineen alkuperäinen pH-arvo ja puskurikapasiteetti (joka säätelee pH:n kasvua) ovat erilaisia, minkä vuoksi ne voivat antaa erilaisia tuloksia varsinkin, kun testataan ionisoivia kemikaaleja.

20.

Viljelyaineita voidaan joutua mukauttamaan esimerkiksi silloin, kun testataan metalleja ja kelatoivia aineita tai kun testaus suoritetaan erilaisilla pH-arvoilla. Mukautetun viljelyaineen käyttö on perusteltava ja kuvattava yksityiskohtaisesti (3), (4).

Biomassan alkupitoisuus

21.

Biomassan alkupitoisuuden on oltava sama kaikissa testiviljelmissä ja niin pieni, että kasvu on eksponentiaalista koko inkubointiajan ilman, että ravinteet uhkaavat loppua. Biomassan alkupitoisuus saa olla enintään 0,5 mg/l kuivapainona ilmaistuna. Suosituksena on käyttää seuraavia solujen alkupitoisuuksia:

Pseudokirchneriella subcapitata

5 × 103…104 solua/ml

Desmodesmus subspicatus

2…5 × 103 solua/ml

Navicula pelliculosa

104 solua/ml

Anabaena flos-aquae

104 solua/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104…105 solua/ml

Testikemikaalin pitoisuudet

22.

Pitoisuusalue, jolla vaikutuksia todennäköisesti esiintyy, voidaan määrittää alueenmäärityskokeiden avulla. Varsinaista testiä varten on valittava vähintään viisi pitoisuutta, jotka muodostavat geometrisen sarjan, jonka suhdeluku on enintään 3,2. Suurempikin suhdeluku voi olla aiheellinen, jos testikemikaalilla saadaan laakea pitoisuus-vastekäyrä. Pitoisuussarjan tulisi käsittää pitoisuusalue, jolla levän kasvunopeus hidastuu 5–75 prosenttia.

Toistot ja kontrollit

23.

Testiin on kuuluttava kolme toistoa kutakin pitoisuutta kohden. Jos NOEC-pitoisuutta ei tarvitse määrittää, koejärjestelyä voidaan muuttaa lisäämällä pitoisuuksien määrää ja vähentämällä toistojen määrää pitoisuutta kohden. Kontrollitoistoja on oltava vähintään kolme, ja niitä on mieluimmin tehtävä kaksi kertaa enemmän kuin kutakin testipitoisuutta kohden tehtyjä toistoja.

24.

Testikemikaalin pitoisuuksien analyyttisiä määrityksiä varten voidaan valmistaa erillinen testiliuossarja (ks. 36 ja 38 kohdat).

25.

Jos testikemikaali on liuotettava liuottimella, koejärjestelyyn on kuuluttava ylimääräisiä kontrolliviljelmiä, jotka sisältävät liuotinta samana pitoisuutena kuin testiviljelmät.

Inokulaattiviljelmän valmistaminen

26.

Jotta testissä käytettävät levät sopeutuisivat testiolosuhteisiin ja olisivat eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa, kun ne siirrostetaan testiliuoksiin, testiviljelyaineeseen valmistetaan 2–4 päivää ennen testin alkua inokulaattiviljelmä. Leväbiomassaa on säädeltävä siten, että eksponentiaalinen kasvu jatkuu inokulaattiviljelmässä testin alkuun saakka. Inkuboi inokulaattiviljelmää samoissa olosuhteissa kuin testiviljelmiä. Biomassan kasvu inokulaattiviljelmässä mitataan sen varmistamiseksi, että kasvu vastaa testissä käytettävän kannan normaalia kasvua viljelyolosuhteissa. Lisäyksessä 4 annetaan yksi esimerkki levänviljelymenetelmistä. Inokulaattiviljelmässä voidaan joutua käynnistämään toinen lisäysvaihe, jotta testin aikana ei tapahtuisi synkronista solunjakautumista.

Testiliuosten valmistaminen

27.

Viljelyaineen pitoisuuden ja testilevän biomassan alkupitoisuuden on oltava samat kaikissa testiliuoksissa. Halutun pitoiset testiliuokset valmistetaan yleensä sekoittamalla testikemikaalin kantaliuos viljelyaineen ja inokulaattiviljelmän kanssa. Kantaliuokset valmistetaan yleensä liuottamalla testattava kemikaali testiviljelyaineeseen.

28.

Liuottimia, kuten asetonia, t-butyylialkoholia ja dimetyyliformamidia, voidaan käyttää kantoaineina, kun testiviljelyaineeseen lisätään huonosti veteen liukenevia kemikaaleja (2), (3). Liuottimen pitoisuus saa olla enintään 100 μl/l, ja kaikkiin testisarjan viljelmiin (kontrolliviljelmät mukaan luettuina) on lisättävä samanpitoista liuotinta.

Inkubointi

29.

Koeastiat suljetaan ilmaa läpäisevillä tulpilla. Astioita ravistellaan ja ne asetetaan viljelylaitteeseen. Niitä on ravisteltava ja sekoitettava koko testin ajan, jotta levät pysyisivät suspendoituneina ja CO2:n siirtyminen liuoksiin helpottuisi. Viljelmien lämpötila pidetään alueella 21–24 °C (säätötarkkuus ± 2 °C). Käytettäessä muita kuin lisäyksessä 2 lueteltuja lajeja, kuten trooppisia lajeja, lämpötila voi olla korkeampikin, kunhan validiteettivaatimukset täyttyvät. Suositeltavaa on sijoittaa pullot satunnaiseen järjestykseen ja vaihtaa niiden paikkaa inkubaattorissa päivittäin.

30.

Yleensä kontrolliviljelyaineen pH-arvo saa kokeen aikana vaihdella enintään 1,5 yksikön verran. Kun on kyse metalleista ja kemikaaleista, jotka ionisoituvat osittain jotakuinkin samassa pH:ssa kuin testissä, pH-muutoksia voidaan joutua rajoittamaan tarkkojen ja toistettavien tulosten saamiseksi. Muutokset voidaan rajoittaa teknisesti alle 0,5 yksikköön varmistamalla, että CO2:ta siirtyy riittävän nopeasti ilmasta testiliuokseen. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi lisäämällä ravistelunopeutta. Toinen mahdollisuus on vähentää CO2:n tarvetta pienentämällä biomassan alkupitoisuutta tai lyhentämällä testin kestoa.

31.

Pintaa, jolla viljelmät inkuboidaan, on valaistava tasaisella loistevalolla, esimerkiksi kylmänvalkoisella tai päivänvalon kaltaisella valolla. Levien ja syanobakteerien valontarpeet vaihtelevat eri kantojen välillä. Valon voimakkuus on valittava koe-eliön mukaan. Suositeltuja viherlevälajeja varten valitse valon voimakkuus siten, että se on testiliuosten tasolla 60–120 μE · m– 2 s– 1, kun se mitataan sopivalla mittausanturilla fotosynteesille suotuisalla aallonpituusalueella 400–700 nm. Eräät lajit, erityisesti Anabaena flos-aquae, kasvavat hyvin heikommassakin valaistuksessa ja voivat vahingoittua suurilla valon voimakkuuksilla. Tällaisia lajeja varten keskimääräinen valon voimakkuus on valittava alueelta 40–60 μE·m– 2 s– 1. (Jos valonmittauslaitteet on kalibroitu lux-yksikköä varten, suositeltu valonvoimakkuus 60–120 μE·mm– 2 s– 1 vastaa suunnilleen kylmänvalkoisen valon voimakkuusaluetta 4 440–8 880 lux.) Huolehdi, että valon voimakkuus ei vaihtele yli ± 15 prosenttia inkubointialueen keskimääräisestä valon voimakkuudesta.

Testin kesto

32.

Testi kestää yleensä 72 tuntia. Se voi kestää myös lyhyemmän tai pitemmän ajan, jos kaikki 11 kohdassa esitetyt validiteettivaatimukset täyttyvät.

Mittaukset ja analyyttiset määritykset

33.

Kussakin pullossa oleva leväbiomassa määritetään ainakin kerran päivässä testijakson aikana. Jos mittauksissa käytetään testiliuoksesta pipetoituja pieniä tilavuuksia, niitä ei saa korvata vastaavilla tilavuuksilla.

34.

Biomassa mitataan laskemalla solut manuaalisesti mikroskoopin avulla tai käyttämällä elektronista hiukkaslaskinta (solunlaskenta ja/tai biovolyymin määritys). Muutkin tekniikat, kuten virtaussytometria, klorofyllin in vitro- tai in vivo -fluoresenssin määritys (5), (6) tai optisen tiheyden määritys, ovat sallittuja, jos voidaan osoittaa, että ne korreloivat tyydyttävästi biomassan kanssa testin biomassa-arvoilla.

35.

Mittaa liuosten pH testin alussa ja lopussa.

36.

Jos käytettävissä on analyysimenetelmä, jolla testikemikaali voidaan määrittää testissä käytetyllä pitoisuusalueella, testiliuokset on analysoitava, jotta voidaan tarkistaa alkupitoisuudet sekä altistuspitoisuuksien säilyminen testin aikana.

37.

Jos altistuspitoisuudet todennäköisesti vaihtelevat alle 20 prosenttia nimellisarvoista testin aikana, voi olla riittävää analysoida testikemikaalin pitoisuus testin alussa ja lopussa pienessä ja suuressa testipitoisuudessa sekä pitoisuudessa, joka on lähellä oletettua EC50-arvoa. Kaikkien testipitoisuuksien analysointia testin alussa ja lopussa suositellaan silloin, kun pitoisuudet eivät todennäköisesti pysy 80:n ja 120 prosentin välillä nimellispitoisuudesta. Jos testikemikaali on haihtuva, epästabiili tai voimakkaasti adsorboivia, suosituksena on ottaa analysoitaviksi lisänäytteitä 24 tunnin välein altistusajan kuluessa, jotta testikemikaalin häviö olisi helpommin määritettävissä. Tällaisia kemikaaleja varten saatetaan tarvita ylimääräisiä toistoja. Kaikissa tapauksissa testikemikaalin pitoisuudet tarvitsee määrittää vain yhdestä toistossa käytetystä astiasta (tai kaikkien toistoissa käytettyjen astioiden yhdistetystä sisällöstä) kutakin testipitoisuutta kohden.

38.

Testiviljelyaineita, jotka on valmistettu erityisesti altistuspitoisuuksien analysoimiseksi testin aikana, on käsiteltävä samalla tavalla kuin testaukseen käytettyjä liuoksia, toisin sanoen niihin on siirrostettava leviä ja niitä on inkuboitava samoissa olosuhteissa. Jos liuenneen testikemikaalin pitoisuus on analysoitava, voi olla tarpeen erottaa levät viljelyaineesta. Levien erottaminen on mieluimmin tehtävä sentrifugoimalla käyttämällä pientä g-voimaa, joka riittää kuitenkin niiden erottamiseen.

39.

Jos on näyttöä siitä, että testattavan kemikaalin pitoisuus on pysynyt tyydyttävästi ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta tai mitatusta alkupitoisuudesta koko testin ajan, tulosten analysointi voi perustua nimellispitoisuuksiin tai mitattuihin alkupitoisuuksiin. Jos pitoisuus poikkeaa enemmän kuin ± 20 prosenttia nimellispitoisuudesta tai mitatusta alkupitoisuudesta, tulosten analysoinnin on perustuttava pitoisuuksien geometriseen keskiarvoon altistuksen aikana tai malleihin, jotka kuvaavat testikemikaalin pitoisuuden vähenemistä (3), (7).

40.

Leväkasvun estymistesti on dynaamisempi testijärjestelmä kuin useimmat muut lyhytaikaiset kokeet, joilla testataan aineiden myrkyllisyyttä vesieliöille. Sen vuoksi todellisten altistuspitoisuuksien määritys voi olla vaikeaa varsinkin, kun on kyse adsorboituvista kemikaaleista, joita testataan pienillä pitoisuuksilla. Jos kemikaali tällaisissa tapauksissa katoaa liuoksesta adsorboitumalla kasvavaan leväbiomassaan, se ei kuitenkaan merkitse sitä, että se olisi kadonnut koko testijärjestelmästä. Analysoitaessa testin tuloksia on tarkistettava, liittyykö testikemikaalin pitoisuuden väheneminen testin aikana kasvun estymisen vähenemiseen. Jos näin on, voidaan harkita sopivan mallin käyttöä kuvaamaan testikemikaalin pitoisuuden pienenemistä (7). Muussa tapauksessa voi olla aiheellista analysoida tuloksia (nimellisten tai mitattujen) alkupitoisuuksien pohjalta.

Muut havainnot

41.

Mikroskoopin avulla on varmistettava, että inokulaattiviljelmä näyttää normaalilta ja terveeltä, sekä tutkittava testin lopussa levissä esiintyvät epänormaaliudet (jotka voivat johtua altistumisesta testikemikaalille).

Raja-annostesti

42.

Joissakin tapauksissa, esimerkiksi silloin, kun alustava testi osoittaa, että testikemikaalilla ei ole myrkkyvaikutuksia pitoisuusarvoon 100 mg/l saakka tai siihen liukoisuusrajaan asti, joka testiaineella on testiviljelyaineessa (sen mukaan, kumpi näistä on pienempi), voidaan tehdä raja-annostesti, jossa verrataan yhden kontrolliryhmän ja yhden käsitellyn ryhmän vasteita (pitoisuudessa 100 mg/l tai liukoisuusrajaa vastaavassa pitoisuudessa). On erittäin suotavaa analysoida altistuspitoisuus rajatestin tueksi. Kaikki edellä kuvatut testiolosuhteet ja validiteettivaatimukset koskevat myös raja-annostestiä, lukuun ottamatta käsiteltyjen toistojen määrää, jonka on oltava vähintään kuusi. Kontrolli- ja käsitellyn ryhmän vastemuuttujia voidaan analysoida Studentin t-testin kaltaisella tilastotutkimuksella, jossa verrataan keskiarvoja. Jos näiden kahden ryhmän varianssit eivät ole yhtä suuria, on tehtävä erisuuruisiin variansseihin mukautettu t-testi.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Kasvukäyrien piirtäminen

43.

Koeastioissa oleva biomassa voidaan ilmaista mittauksissa käytetyn korvaavan parametrin (esimerkiksi solumäärän ja fluoresenssin) yksikkönä.

44.

Biomassan määritetty pitoisuus testi- ja kontrolliviljelmissä esitetään kasvukäyrien piirtämistä varten taulukkona, josta ilmenevät myös testiaineen pitoisuudet ja mittausajankohdat, jotka on rekisteröity vähintään täysien tuntien tarkkuudella. Tässä ensimmäisessä vaiheessa voi olla hyödyllistä käyttää sekä logaritmiasteikkoja että lineaarisia asteikkoja, mutta logaritmisasteikot ovat pakollisia ja antavat yleensä paremman kuvan kasvun vaihteluista testijakson aikana. On syytä huomata, että kun eksponentiaalista kasvua kuvataan logaritmiasteikolla, tuloksena on suora viiva, ja viivan kaltevuus ilmaisee spesifisen kasvunopeuden.

45.

Käyrien avulla tutkitaan, kasvavatko kontrolliviljelmät oletetulla nopeudella eksponentiaalisesti koko testin ajan. Tarkastele kriittisesti kaikkia datapisteitä ja käyrien muotoa ja tarkista raakatiedot ja menetelmät mahdollisten virheiden havaitsemiseksi. Erityisesti tarkistetaan ne datapisteet, jotka näyttävät poikkeavan systemaattisen virheen vuoksi. Jos havaitaan ilmeisiä menetelmävirheitä ja/tai niitä pidetään hyvin todennäköisinä, kyseinen datapiste merkitään vieraaksi havainnoksi eikä sitä oteta huomioon myöhemmässä tilastoanalyysissä. (Jos leväpitoisuus on nolla yhdessä kahdesta tai kolmesta toistoissa käytetyssä astiassa, tämä voi olla merkki siitä, että levien siirrostamista astiaan ei ole tehty oikein tai astiaa ei ole puhdistettu kunnolla.) Testiraportissa on perusteltava selvästi, minkä vuoksi datapiste on hylätty vieraana havaintona. Hyväksyttäviä syitä ovat ainoastaan (harvinaiset) menetelmävirheet eikä pelkästään huono tarkkuus. Tämäntyyppisissä ongelmissa ei ole kovin hyödyllistä yrittää tunnistaa vieraita havaintoja tilastomenetelmien avulla, eivätkä tällaiset menetelmät voi korvata asiantuntijan arviota. Vieraat havainnot (jotka on merkitty sellaisiksi) tulisi säilyttää niiden datapisteiden joukossa, jotka merkitään myöhemmin graafisiin tai taulukkomuotoisiin esityksiin.

Vastemuuttujat

46.

Testin tarkoituksena on määrittää testikemikaalin vaikutukset levien kasvuun. Tässä testimenetelmässä kuvataan kahta eri vastemuuttujaa, koska eri oikeudenkäyttöalueilla suositaan erilaisia käytänteitä ja noudatetaan erilaisia sääntelyvaatimuksia. Jotta testitulokset voitaisiin hyväksyä kaikilla oikeudenkäyttöalueilla, vaikutuksia olisi arvioitava käyttämällä molempia vastemuuttujia a ja b, joita kuvataan jäljempänä.

a)    Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus : tämän vastemuuttujan laskentaperusteena on biomassan logaritminen kasvu päivää kohden testijakson aikana.

b)    Tuotos : tällä vastemuuttujalla tarkoitetaan testin lopussa mitattua biomassaa, josta on vähennetty testin alussa mitattu biomassa.

47.

On syytä huomata, että näiden kahden vastemuuttujan avulla lasketut myrkyllisyysarvot eivät ole vertailukelpoisia, mikä on otettava huomioon käytettäessä testin tuloksia. Jos testiolosuhteet ovat tämän testimenetelmän mukaiset, keskimääräiseen spesifiseen kasvunopeuteen perustuvat ECx-arvot (ErCx) ovat yleensä suurempia kuin tuotokseen perustuvat arvot (EyCx), mikä johtuu niiden matemaattisista perusteista. Tätä ei pidä tulkita siten, että näiden kahden vastemuuttujan herkkyydet olisivat erilaiset, vaan arvojen välinen ero on puhtaasti matemaattinen. Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus perustuu yleiseen kasvumalliin, joka kuvaa levän eksponentiaalista kasvua rajoittamattomissa viljelmissä, joista toksisuus arvioidaan kasvunopeuteen kohdistuvien vaikutusten perusteella ottamatta huomioon kontrollin spesifisen kasvunopeuden absoluuttista tasoa, pitoisuus-vastekäyrän kaltevuutta tai testin kestoa. Tuotosta kuvaavaan vastemuuttujaan perustuvat tulokset riippuvat sen sijaan kaikista näistä muista muuttujista. EyCx riippuu kussakin testissä käytetyn levälajin spesifisestä kasvunopeudesta ja suurimmasta spesifisestä kasvunopeudesta, joka voi vaihdella eri lajien ja jopa eri leväkantojen välillä. Tätä vastemuuttujaa ei saa käyttää vertailtaessa eri levälajien tai eri kantojenkaan herkkyyttä myrkyllisille aineille. Vaikka tieteen kannalta on parempi arvioida myrkyllisyyttä keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden perusteella, tähän testimenetelmään on otettu mukaan myös tuotokseen perustuvat myrkyllisyyden arvioinnit, jotta voidaan täyttää eräiden maiden nykyiset sääntelyvaatimukset.

Keskimääräinen kasvunopeus

48.

Tietyn ajanjakson keskimääräinen spesifinen kasvunopeus lasketaan biomassan logaritmisena kasvuna soveltamalla seuraavaa kaavaa [1] kuhunkin kontrolli- ja käsittelyryhmän astiaan:

Formula

[1],

jossa

μi-j

keskimääräinen spesifinen kasvunopeus aikavälillä i–j

Xi

biomassa hetkellä i

Xj

biomassa hetkellä j.

Kullekin testiryhmälle ja kontrolliryhmälle lasketaan kasvunopeuden keskiarvo varianssiestimaatteineen.

49.

Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus lasketaan koko testin ajalta (yleensä päivästä 0 päivään 3) käyttämällä lähtöarvona siirrostetun biomassan nimellisarvoa mitatun lähtöarvon sijasta, koska näin saadaan yleensä parempi tarkkuus. Biomassan mitattua alkupitoisuutta voidaan käyttää, jos inokulaatin pieni biomassa voidaan määrittää riittävän tarkasti biomassan mittauslaitteella (esimerkiksi virtaussytometrilla). Lisäksi määritetään jaksoittainen kasvunopeus, joka saadaan laskemalla spesifiset kasvunopeudet kultakin päivältä testin aikana (päivät 0–1, 1–2 ja 2–3), ja tutkitaan, pysyykö kontrolliryhmän kasvunopeus vakiona (ks. validiteettivaatimukset, 11 kohta). Jos spesifinen kasvunopeus on huomattavasti pienempi ensimmäisenä päivänä kuin spesifisten kasvunopeuksien keskiarvo, se voi olla merkki viivevaiheesta. Vaikka viivevaihe voidaan minimoida ja poistaa käytännössä kokonaan kontrolliviljelmistä esiviljelmän asianmukaisella lisäyksellä, testiaineelle altistetuissa viljelmissä viivevaihe voi osoittaa toipumista toksisuuden aiheuttamasta alkustressistä tai vähentynyttä altistumista, joka johtuu testikemikaalin häviämisestä (esimerkiksi sorptiosta levämassaan) alkuvaiheen altistumisen jälkeen. Tällöin voidaan tarkastella jaksoittaista kasvunopeutta, jonka avulla voidaan arvioida testikemikaalin vaikutuksia altistusaikana. Merkittävät erot jaksoittaisen kasvunopeuden ja keskimääräisen kasvunopeuden välillä osoittavat, että kasvu poikkeaa jatkuvasta eksponentiaalisesta kasvusta, jolloin kasvukäyriä on syytä tarkastella lähemmin.

50.

Kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen kussakin käsitellyssä toistossa lasketaan seuraavan kaavan [2] avulla:

Formula

[2],

jossa

%Ir

=

keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen

μC

=

keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden (μ) keskiarvo kontrolliryhmässä

μT

=

keskimääräinen spesifinen kasvunopeus käsitellyssä toistossa.

51.

Jos testiliuosten valmistamisessa käytetään liuottimia, kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen on laskettava liuottimia sisältävistä kontrolliviljelmistä eikä niistä kontrolliviljelmistä, joissa ei ole liuottimia.

Tuotos

52.

Tuotos lasketaan vähentämällä testin lopussa mitatusta biomassasta testin alussa mitattu biomassa kontrolli- ja käsittelyryhmän kunkin astian osalta. Kullekin testipitoisuudelle ja kontrollille lasketaan tuotoksen keskiarvo varianssiestimaatteineen. Tuotoksen prosentuaalinen estyminen ( % Iy) voidaan laskea kutakin käsiteltyä toistoa varten seuraavasti:

Formula

[3]

jossa

% Iy

=

tuotoksen prosentuaalinen estyminen

YC

=

tuotoksen keskiarvo kontrolliryhmässä

YT

=

tuotoksen arvo käsitellyssä toistossa.

Pitoisuus-vastekäyrän piirtäminen

53.

Prosentuaalinen estyminen merkitään graafisesti suhteessa testikemikaalin pitoisuuden logaritmiin. Näin saatuja pisteitä tarkastellaan huolellisesti ottamatta huomioon datapisteitä, joita pidettiin ensimmäisessä vaiheessa vieraina havaintoina. Datapisteiden kautta vedetään tasaisesti muuttuva viiva joko silmämääräisesti tai interpoloimalla tietokoneen avulla, jotta pitoisuuden ja vasteen suhteesta saataisiin alustava käsitys. Tämän jälkeen käytetään tarkempaa menetelmää, mieluimmin tietokonepohjaista tilastomenetelmää. Sen perusteella, mihin tietoja aiotaan käyttää, mikä on niiden laatu (tarkkuus) ja määrä ja mitä välineitä on käytettävissä niiden analysoimiseen, voidaan päättää, että tietojen analysointi lopetetaan tähän vaiheeseen (mikä on joskus hyvin aiheellistakin), ja ainoastaan lukea keskeiset arvot EC50 ja EC10 (ja/tai EC20) silmämääräisesti piirretyltä käyrältä (ks. myös jäljempänä oleva kohta stimuloivista vaikutuksista). Päteviä syitä olla käyttämättä tilastomenetelmää ovat muun muassa seuraavat syyt:

Vaikka tietoja käsiteltäisiin tietokoneistetulla menetelmällä, tulokset eivät olisi sen luotettavampia kuin jos tiedot olisi annettu asiantuntijan arvioitaviksi. Tällaisissa tapauksissa on jopa mahdollista, että eräillä tietokoneohjelmilla ei saada minkäänlaista luotettavaa tulosta (esimerkiksi sen vuoksi, että iteraatiot eivät konvergoidu).

Tietokoneohjelmilla ei pystytä käsittelemään kunnolla stimuloinnin aiheuttamia kasvuvasteita (ks. jäljempänä).

Tilastomenetelmät

54.

Tavoitteena on saada kvantitatiivinen pitoisuus-vastesuhde regressioanalyysin avulla. Painotettua lineaarista regressiota voidaan käyttää sen jälkeen, kun vastetiedoille on tehty linearisoiva muunnos – esimerkiksi probitti-, logitti- tai Weibull-yksiköiksi (8) – mutta suositeltavampaa on käyttää epälineaarisia regressiomenetelmiä, joilla voidaan paremmin käsitellä tiedoissa väistämättä esiintyviä epäsäännöllisyyksiä sekä poikkeamia tasaisista jakaumista. Lähestyttäessä tilaa, jossa kasvu ei esty ollenkaan tai estyminen on täydellistä, linearisoiva muunnos voi suurentaa epäsäännöllisyyksiä ja haitata siten analyysiä (8). On syytä huomata, että standardianalyysimenetelmät, joissa käytetään probitti-, logitti- tai Weibull-muunnoksia, on tarkoitettu dikotomisia tietoja varten (kun vasteita on kaksi, esimerkiksi kuolleisuus tai eloonjääminen), minkä vuoksi niitä on mukautettava, jos niitä aiotaan käyttää kasvu- tai tuotostietojen analysointiin. Kirjallisuusviitteissä (9), (10) ja (11) kuvataan erityismenetelmiä, joilla ECx-arvot voidaan määrittää jatkuvista tiedoista. Epälineaarisen regressioanalyysin käyttöä käsitellään tarkemmin lisäyksessä 5.

55.

Kunkin vastemuuttujan analysoimiseksi käytetään pitoisuus-vastesuhdetta, jonka avulla lasketaan ECx-arvojen piste-estimaatit. Jokaiselle estimaatille on määritettävä 95 prosentin luottamusväli, jos se on mahdollista. Vastetietojen ja regressiomallin välinen yhteensopivuuden aste on arvioitava joko graafisesti tai tilastollisesti. Regressionanalyysi on tehtävä käyttämällä yksittäisiä toistojen vasteita eikä käsittelyryhmien keskiarvoja. Jos epälineaariseen käyrän sovitus on vaikeaa tai mahdotonta, koska tiedot ovat liian hajallaan, ongelma voidaan kiertää tekemällä regressio ryhmien keskiarvoille, mikä on käytännöllinen tapa vähentää mahdollisten vieraiden havaintojen vaikutusta. Tämän vaihtoehdon käyttö on mainittava testiraportissa tavanomaisesta menetelmästä poikkeavana keinona, jota on käytetty sen vuoksi, että käyrän sovittaminen yksittäisiin toistoihin ei antanut hyvää tulosta.

56.

EC50-estimaatit ja luottamusvälit voidaan saada myös käyttämällä lineaarista interpolointia bootstrap-menetelmän kanssa (13), jos käytettävissä olevat regressiomallit tai -menetelmät eivät sovellu kyseisten tietojen käsittelyyn.

57.

Jotta voidaan arvioida LOEC-pitoisuus ja siten myös NOEC-pitoisuus sekä testikemikaalin vaikutukset kasvunopeuteen, käsiteltyjen liuosten keskiarvoja on verrattava varianssianalyysitekniikoiden avulla (ANOVA). Sen jälkeen on verrattava kunkin pitoisuuden keskiarvoa kontrolliryhmän keskiarvoon käyttämällä sopivaa moniulotteista vertailumenetelmää tai trenditestimenetelmää. Dunnettin tai Williamsin testi voi olla käyttökelpoinen (12), (14), (15), (16), (17). Lisäksi on arvioitava, pitääkö ANOVA-oletus varianssin homogeenisuudesta paikkansa. Arviointi voidaan tehdä graafisesti tai virallisen testin avulla (17). Sopivia testejä ovat Levenen ja Bartlettin testit. Jos oletus varianssin homogeenisuudesta ei pidä paikkaansa, tilanne on joskus korjattavissa tietojen logaritmimuunnoksella. Jos varianssin heterogeenisuus on erittäin suuri eikä se ole korjattavissa muunnoksella, on harkittava analysointia sellaisilla menetelmillä kuin Jonckheeren alaspäin askeltava trenditesti. Kirjallisuusviitteessä (11) annetaan lisäohjeita NOEC-arvon määrittämisestä.

58.

Tieteen viimeaikaisen kehityksen perusteella on suositeltu, että NOEC-käsitteestä luovuttaisiin ja se korvattaisiin regressioanalyysiin perustuvilla ECx:n piste-estimaateilla. Sopivaa x:n arvoa ei ole vielä vahvistettu tätä levätestiä varten. Sopivalta vaikuttaisi väli 10–20 prosenttia (valitun vastemuuttujan mukaan), ja suositeltavaa on ilmoittaa sekä EC10- että EC20-arvo.

Kasvun edistyminen

59.

Pienissä pitoisuuksissa havaitaan joskus kasvun edistymistä (negatiivista estymistä). Tämä voi johtua joko hormesis-vaikutuksesta (’toksisuudesta johtuva kasvun edistyminen’) tai stimuloivien kasvutekijöiden lisäämisestä testiaineen kanssa testissä käytettyyn minimaaliseen viljelyaineeseen. On muistettava, että epäorgaanisten ravinteiden lisäämisellä ei pitäisi olla suoranaista vaikutusta, koska testiliuoksessa on oltava ravinteita ylimäärin koko testin ajan. Pieniannoksinen stimulointi voidaan yleensä jättää huomioimatta EC50-arvon laskemisessa, jollei se ole hyvin merkittävää. Jos se on merkittävää tai jos ECx-arvo on laskettava pientä x:n arvoa varten, voi olla tarpeen käyttää erityismenetelmiä. Stimuloinnin aiheuttamien vasteiden poistamista tietojen analysoinnista olisi vältettävä mahdollisuuksien mukaan, ja jos käytettävissä oleva käyränsovitusohjelmisto ei pysty käsittelemään vähäistä stimulointia, voidaan käyttää lineaarista interpolointia yhdessä bootstrap-menetelmän kanssa. Jos stimulointi on hyvin merkittävää, voidaan harkita hormesis-mallin käyttöä (18).

Muusta kuin toksisuudesta johtuva kasvun estyminen

60.

Valoa absorboivat testimateriaalit voivat hidastaa kasvunopeutta, koska varjostus vähentää käytettävissä olevan valon määrää. Tällaiset fysikaaliset vaikutukset olisi erotettava myrkkyvaikutuksista muuttamalla testiolosuhteita, ja fysikaalisista vaikutuksista olisi raportoitava erikseen. Tästä annetaan ohjeita kirjallisuusviitteissä (2) ja (3).

TESTIRAPORTTI

61.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

 

Testikemikaali:

fysikaalinen olomuoto ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, joilla on merkitystä, muun muassa vesiliukoisuuden raja-arvo,

kemialliset tunnistetiedot (esimerkiksi CAS-numero), mukaan luettuna puhtaus (epäpuhtaudet).

 

Koelajit:

kanta, sen toimittaja tai lähde ja viljelyolosuhteet.

 

Testiolosuhteet:

testin alkamispäivä ja kesto,

koejärjestelyn kuvaus: koeastiat, viljelmien tilavuudet ja biomassan tiheys testin alussa,

viljelyaineen koostumus,

testipitoisuudet ja toistot (esimerkiksi toistojen määrä, testipitoisuuksien määrä ja testissä käytetty geometrinen porrastus),

kuvaus testiliuosten valmistamisesta, muun muassa liuottimien käyttö,

viljelylaite,

valon voimakkuus ja laatu (lähde, homogeenisuus),

lämpötila,

testatut pitoisuudet: nimelliset testipitoisuudet ja mahdolliset tulokset analyyseistä, joilla on määritetty testikemikaalin pitoisuus koeastioissa. Menetelmän saantoteho ja määritysraja testimatriisissa on ilmoitettava,

kaikki poikkeamat tästä testimenetelmästä,

biomassan määritysmenetelmä sekä näyttö mitatun parametrin ja kuivapainon korrelaatiosta.

 

Tulokset:

pH-arvot kokeen alussa ja lopussa kaikista käsittelyistä,

kussakin pullossa oleva biomassa kunakin mittausajankohtana sekä biomassan mittausmenetelmä,

kasvukäyrät (biomassa ajan funktiona),

kunkin käsitellyn toiston lasketut vastemuuttujat sekä toistojen keskiarvot ja variaatiokerroin,

pitoisuuden ja vaikutuksen suhteen graafinen esitys,

myrkyllisyyden arvioinnit vastemuuttujien osalta, esimerkiksi EC50, EC10 ja EC20, ja vastaavat luottamusvälit; LOEC- ja NOEC-pitoisuudet, jos ne on laskettu, ja niiden määrityksessä käytetyt tilastomenetelmät,

jos on käytetty ANOVA-analyysiä, havaittavissa olevan vaikutuksen suuruus (esimerkiksi vähiten merkitsevä erotus),

mahdollinen kasvun edistyminen käsitellyissä liuoksissa,

muut havaitut vaikutukset, esimerkiksi levien morfologiset muutokset,

tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita tästä testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

International Organisation for Standardization (ISO) (1993). ISO 8692: Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardization (ISO) (1998). ISO/DIS 14442: Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardization (ISO) (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919–925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073–2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713–718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157–167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096–1121.

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.

Lisäys 1

Määritelmät

Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä ja lyhenteitä:

Biomassa : Populaatiossa olevan elävän materiaalin kuivapaino ilmaistuna tiettyä tilavuutta kohden, esimerkiksi milligrammoina levää yhtä litraa testiliuosta kohden. Yleensä ’biomassa’ määritellään massaksi, mutta tässä testissä sillä tarkoitetaan massaa tilavuutta kohden. Tässä testissä biomassaa mitataan usein myös epäsuorasti esimerkiksi solumäärien ja fluoresenssin avulla, minkä vuoksi ’biomassa’-termi käsittää myös nämä korvaavat menetelmät.

Kemikaali : aine tai seos.

Variaatiokerroin : Parametrin vaihtelua ilmaiseva dimensioton suure, joka määritellään keskihajonnan ja keskiarvon suhteeksi. Se voidaan ilmaista myös prosenttiarvona. Rinnakkaisten kontrolliviljelmien keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden keskimääräinen variaatiokerroin lasketaan seuraavasti:

1.

Keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden variaatiokerroin lasketaan (prosentteina) kunkin rinnakkaisviljelmän päivittäisistä tai jaksoittaisista kasvunopeuksista.

2.

Lasketaan kaikkien kohdassa 1 laskettujen arvojen keskiarvo, jotta saadaan rinnakkaisten kontrolliviljelmien päivittäisen tai jaksoittaisen spesifisen kasvunopeuden keskimääräinen variaatiokerroin.

Ecx : Testiviljelyaineeseen liuenneen testikemikaalin pitoisuus, jossa testattavan eliön kasvu vähenee x prosenttia (esimerkiksi 50 prosenttia) määrätyn altistusajan kuluessa (altistusaika on mainittava erikseen, jos se poikkeaa testin kokonaiskestosta tai normaalista kestosta). Jotta kasvunopeudesta ja tuotoksesta johdetut EC-arvot erottuisivat selvästi toisistaan, edellisestä käytetään symbolia ’ErC’ ja jälkimmäisestä symbolia ’EyC’.

Viljelyaine : Täydellinen synteettinen ravinneliuos, jossa testilevät kasvavat, kun ne altistetaan testikemikaalille. Yleensä testikemikaali liuotetaan testiviljelyaineeseen.

Kasvunopeus (keskimääräinen spesifinen kasvunopeus): biomassan logaritminen kasvu altistuksen aikana.

Pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) : Pienin testattu pitoisuus, jossa kemikaalilla havaitaan olevan tietyn altistusajan kuluessa tilastollisesti merkittävä kasvua vähentävä vaikutus verrattuna kontrolliin (kun p < 0,05). Ehtona on myös, että kaikilla LOEC-pitoisuutta suuremmilla testipitoisuuksilla on oltava vähintään yhtä suuri haitallinen vaikutus kuin LOEC-pitoisuudella. Jos nämä kaksi ehtoa eivät täyty, on annettava tyhjentävä selitys siitä, miten LOEC-pitoisuus (ja myös NOEC-pitoisuus) on valittu.

Pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC) : lähin LOEC-pitoisuutta pienempi testipitoisuus.

Vastemuuttuja : Muuttuja, jonka avulla arvioidaan myrkyllisyyttä. Vastemuuttuja johdetaan erilaisia laskentamenetelmiä käyttämällä mistä tahansa mitatusta muuttujasta, joka kuvaa biomassaa. Tässä testimenetelmässä kasvunopeudet ja tuotos ovat vastemuuttujia, jotka on johdettu mittaamalla biomassaa suoraan tai käyttämällä edellä mainittuja korvaavia menetelmiä.

Spesifinen kasvunopeus : vastemuuttuja, joka määritellään havainnoitavan parametrin (tässä testimenetelmässä biomassan) luonnollisten logaritmien erotuksen ja vastaavan ajanjakson väliseksi suhteeksi.

Testikemikaali : tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.

Tuotos : altistusajan lopussa mitattu biomassaa ilmaisevan mittausmuuttujan arvo, josta on vähennetty altistusajan alussa mitattu saman mittausmuuttujan arvo.

Lisäys 2

Testiin sopivat kannat

Viherlevät

 

Pseudokirchneriella subcapitata (aiemmin Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (aiemmin Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG

Piilevät

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Syanobakteerit

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Kantojen alkuperä

Suositellut kannat ovat saatavissa vain yhtä levää sisältävinä viljelminä seuraavista kokoelmista (jotka luetellaan aakkosjärjestyksessä):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

YHDYSVALLAT

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

YHDISTYNYT KUNINGASKUNTA

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

University of Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

SAKSA

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

YHDYSVALLAT

Suositeltujen lajien ulkonäkö ja ominaisuudet

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Ulkonäkö

Kaarevia ja kierteisiä yksittäisiä soluja

Soikeita, yleensä yksittäisiä soluja

Sauvoja

Soikeiden solujen muodostamia ketjuja

Sauvoja

Koko (pituus × leveys) μm

8–14 × 2–3

7–15 × 3–12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Solutilavuus (μm3/solu)

40–60 (2)

60–80 (2)

40–50 (2)

30–40 (2)

2,5 (3)

Solujen kuivapaino (mg/solu)

2–3 × 10– 8

3–4 × 10– 8

3–4 × 10– 8

1–2 × 10– 8

2–3 × 10– 9

Kasvunopeus (4) (päivä– 1)

1,5–1,7

1,2–1,5

1,4

1,1–1,4

2,0–2,4

Suositeltujen koelajien viljelyä ja käsittelyä koskevat erityissuositukset

Pseudokirchneriella subcapitata ja Desmodesmus subspicatus

Näitä viherleviä on yleensä helppo ylläpitää erilaisissa viljelyaineissa. Kantakokoelmia pitävät laitokset antavat tietoja sopivista viljelyaineista. Solut ovat yleensä yksittäisinä soluina, ja solutiheys on helposti mitattavissa elektronisen hiukkaslaskimen tai mikroskoopin avulla.

Anabaena flos-aquae

Kantaviljelmää voidaan pitää erilaisissa viljelyaineissa. On erityisen tärkeää huolehtia siitä, että panoskasvatuksessa ei ohiteta kasvun viivevaihetta vaihdon yhteydessä, koska muuten palautuminen on vaikeaa.

Anabaena flos-aquae muodostaa solurihmoista vyyhtimäisiä kasaumia. Näiden kasaumien koko voi vaihdella viljelyolosuhteiden mukaan. Voi olla tarpeen rikkoa nämä kasaumat, jos biomassan määrityksessä käytetään mikroskooppilaskentaa tai elektronista hiukkaslaskinta.

Rihmojen pilkkomiseen voidaan käyttää osanäytteiden ultraäänihajotusta, millä voidaan vähentää laskentatulosten vaihtelevuutta. Solut voivat kuitenkin tuhoutua, jos ultraäänihajotusta jatketaan kauemmin kuin rihmojen pilkkominen lyhyemmiksi kappaleiksi edellyttää. Ultraäänihajotuksen voimakkuuden ja keston on oltava sama kaikissa käsittelyissä.

Hemosytometrilla lasketaan riittävän monta kenttää (vähintään 400 solua) vaihtelevuuden tasoittamiseksi. Tämä parantaa mikroskooppisten tiheysmääritysten luotettavuutta.

Kun solurihmat on pilkottu huolellisella ultraäänihajotuksella, Anabaena-solujen kokonaistilavuus voidaan määrittää elektronisella hiukkaslaskimella. Ultraäänihajotuksen energia on säädettävä siten, etteivät solut rikkoudu.

Käyttämällä Vortex-ravistelijaa tai muuta vastaavaa menetelmää varmistetaan, että leväsuspensio, jota käytetään koeastioiden siirostamiseen, on hyvin sekoitettu ja homogeeninen.

Koeastiat on sijoitettava tasoravistelijaan, joka tekee edestakaista tai orbitaaliliikettä frekvenssillä 150 rpm. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää jaksoittaista ravistelua, joka vähentää Anabaenan taipumusta muodostaa rykelmiä. Jos rykelmiä kuitenkin muodostuu, on varmistettava, että biomassan mittauksia varten saadaan edustavia näytteitä. Ennen näytteiden ottoa voi olla tarpeen ravistella astioita voimakkaasti levärykelmien hajottamiseksi.

Synechococcus leopoliensis

Kantaviljelmää voidaan pitää erilaisissa viljelyaineissa. Kantakokoelmia pitävät laitokset antavat tietoja sopivista viljelyaineista.

Synechococcus leopoliensis kasvaa yksittäisinä sauvanmuotoisina soluina. Solut ovat hyvin pieniä, mikä vaikeuttaa mikroskooppilaskennan käyttöä biomassan mittauksissa. Elektroniset hiukkaslaskimet, joilla voidaan laskea jopa noin 1 μm:n suuruisia hiukkasia, ovat käyttökelpoisia. Lisäksi voidaan käyttää in vitro -fluoresenssimittauksia.

Navicula pelliculosa

Kantaviljelmää voidaan pitää erilaisissa viljelyaineissa. Kantakokoelmia pitävät laitokset antavat tietoja sopivista viljelyaineista. Viljelyaineissa on oltava silikaattia.

Navicula pelliculosa voi tietyissä kasvuolosuhteissa muodostaa kasaumia. Lipidituotannon vuoksi leväsolut pyrkivät joskus kerääntymään pintakalvoon. Siinä tapauksessa on ryhdyttävä erityistoimiin, jotta biomassan määritykseen saadaan edustavat osanäytteet. Voimakas ravistelu esimerkiksi Vortex-ravistimella voi olla tarpeen.

Lisäys 3

Viljelyaine

Tässä testimenetelmässä voidaan käyttää jompaakumpaa seuraavista viljelyaineista:

OECD-viljelyaine: alkuperäinen OECD:n testiohjeen (TG) nro 201 mukainen viljelyaine, joka on myös ISO 8692 -standardin mukainen.

Yhdysvaltojen ympäristönsuojeluviraston (US EPA) viljelyaine AAP, joka on myös ASTM-standardin mukainen.

Näitä viljelyaineita valmistettaessa on käytettävä reagenssi- tai analyysilaatua olevia kemikaaleja ja deionisoitua vettä.

AAP-viljelyaineen (US EPA) ja OECD:n testiohjeen (TG) nro 201 mukaisen viljelyaineen koostumus

Komponentit

AAP

OECD

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 ·6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2·2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4·7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3·6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA·2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2·4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2·6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4·2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 .2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

EDTA:n ja raudan moolisuhde on hieman suurempi kuin yksi. Näin estetään raudan saostumisen ja minimoidaan samalla raskasmetalli-ionien kelatoituminen.

Testissä, jossa käytetään Navicula pelliculosa -piilevää, molempiin viljelyaineisiin on lisättävä Na2SiO3 · 9H20:ta, kunnes Si-pitoisuudeksi saadaan 1,4 mg/l.

Viljelyaineen pH saadaan, kun viljelyaineen karbonaattijärjestelmä ja CO2:n osapaine ilmassa ovat päässeet tasapainoon. Viljelyaineen pH:n ja molaarisen bikarbonaattipitoisuuden likimääräinen suhde 25 °C:ssa saadaan seuraavan kaavan avulla:

pHeq = 11,30 + log [HCO3]

Kun NaHCO3 on 15 mg/l, pHeq = 7,5 (US EPA -viljelyaine), ja kun NaHCO3 on 50 mg/l, pHeq = 8,1 (OECD-viljelyaine).

Testiaineen alkuainekoostumus

Alkuaine

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

OECD-viljelyaineen valmistus

Ravinne

Pitoisuus kantaliuoksessa

Kantaliuos 1:

makroravinteet

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Kantaliuos 2:

rauta

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Kantaliuos 3:

hivenaineet

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Kantaliuos 4:

bikarbonaatti

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Kantaliuokset steriloidaan kalvoerotuksella (keskimääräinen huokoskoko 0,2 μm) tai autoklavoimalla (120 °C, 15 min). Liuoksia säilytetään pimeässä 4 °C:n lämpötilassa.

Kantaliuoksia 2 ja 4 ei saa käsitellä autoklaavissa, vaan ne on steriloitava kalvoerotuksella.

Viljelyaine valmistetaan lisäämällä veteen sopiva määrä kantaliuoksia 1–4:

 

Noin 500 ml:aan steriloitua vettä lisätään:

 

10 ml kantaliuosta 1

 

1 ml kantaliuosta 2

 

1 ml kantaliuosta 3

 

1 ml kantaliuosta 4

 

Liuokseen lisätään steriloitua vettä, kunnes tilavuus on 1 000 ml.

Sen jälkeen on odotettava, kunnes viljelyaine ja ilman CO2 ovat päässeet tasapainoon. Tarvittaessa liuokseen johdetaan tätä varten steriiliä suodatettua ilmaa muutaman tunnin ajan.

US EPA -viljelyaineen valmistus

1.

Lisätään 1 ml kutakin 2.1–2.7 kohdissa mainittua kantaliuosta noin 900 ml:aan deionisoitua tai tislattua vettä ja laimennetaan liuos 1 litraksi.

2.

Makroravinteita sisältävät kantaliuokset valmistetaan liuottamalla seuraavat aineet 500 ml:aan deionisoitua tai tislattua vettä. Reagenssit 2.1, 2.2, 2.3 ja 2.4 voidaan yhdistää yhdeksi kantaliuokseksi.

2.1

NaNO3

12,750 g

2.2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g

2.3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g

2.4

Mikroravinteitä sisältävä kantaliuos (ks. 3)

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g

2.6

K2HPO4

0,522 g

2.7

NaHCO3

7,500 g

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

ks. huomautus 1.

Huomautus 1: Käytetään vain piilevälajien viljelyssä. Voidaan lisätä suoraan (202,4 mg) tai kantaliuoksessa, jotta viljelyaineen lopulliseksi Si-pitoisuudeksi saadaan 20 mg/l.

3.

Mikroravinteita sisältävä kantaliuos valmistetaan liuottamalla seuraavat aineet 500 ml:aan deionisoitua tai tislattua vettä.

3.1

H3BO3

92,760 mg

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg

3.3

ZnCl2

1,635 mg

3.4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg

3.5

CoCl2·6H2O

0,714 mg

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg. [Dinatrium(eteenidinitrilo)tetra-asetaatti]

3.9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg (ks. huomautus 2)

Huomautus 2: Käytetään kantaviljelmien viljelyaineessa vain, kun viljellään piilevälajeja.

4.

Säädetään pH arvoon 7,5 ± 0,1 käyttämällä 0,1 N tai 1,0 N NaOH:ta tai HCl:a.

5.

Viljelyaine suodatetaan steriiliin astiaan kalvosuodattimen läpi, jonka huokoskoko on 0,22 μm, jos käytetään hiukkaslaskinta. Jollei käytetä hiukkaslaskinta, huokoskoko on 0,45 μm.

6.

Viljelyainetta säilytetään käyttöön saakka pimeässä noin 4 °C:een lämpötilassa.

Lisäys 4

Esimerkki levänviljelymenetelmästä

Yleisiä huomautuksia

Tässä kuvattavan menetelmän avulla voidaan viljellä leviä myrkyllisyyskokeita varten.

Sopivien menetelmien avulla varmistetaan, että leväviljelmissä ei ole bakteeritartuntaa. Aina on varmistettava, että viljelmissä esiintyy vain yhtä levälajia. Tämä pätee myös akseenisia viljelmiä käytettäessä.

Bakteerien tai muiden levien pääsy viljelmään on estettävä tekemällä kaikki toimet steriileissä olosuhteissa.

Välineet ja materiaalit

Katso testimenetelmän kohta Laitteisto.

Leväviljelmien tuottaminen

Ravintoliuosten (viljelyaineiden) valmistus:

Kaikki viljelyaineen ravintosuolat valmistetaan väkevänä kantaliuoksena, ja niitä säilytetään pimeässä ja viileässä. Liuokset steriloidaan suodattamalla tai autoklavoimalla.

Viljelyaine valmistetaan lisäämällä sopiva määrä kantaliuosta steriiliin tislattuun veteen. Samalla on huolehdittava siitä, ettei synny infektioita. Jos viljelyaine on kiinteää, lisätään 0,8 prosenttia agaria.

Kantaviljelmä:

Kantaviljelmät ovat pieniä leväviljelmiä, jotka siirretään säännöllisesti tuoreeseen elatusaineeseen, jossa ne toimivat testin alkumateriaalina. Jos viljelmiä ei käytetä säännöllisesti, ne valutetaan kallistettuihin agarputkiin. Putket siirretään tuoreeseen elatusaineeseen vähintään kahden kuukauden väliajoin.

Kantaviljelmiä viljellään sopivaa elatusainetta sisältävissä erlenmeyerpulloissa (tilavuus noin 100 ml). Kun leviä inkuboidaan 20 °C:ssa jatkuvassa valaistuksessa, siirrot on tehtävä viikoittain.

Siirrossa ’vanhan’ viljelmän osa siirretään steriilin pipetin avulla tuoretta elatusainetta sisältävään pulloon. Jos laji on nopeasti kasvava, alkupitoisuuden on oltava noin sadasosa vanhan viljelmän pitoisuudesta.

Lajin kasvunopeus voidaan määrittää kasvukäyrän avulla. Näin on mahdollista arvioida, kuinka usein viljelmä on siirrettävä uuteen elatusaineeseen. Siirto on tehtävä, ennen kuin viljelmä kuolee.

Esiviljely:

Esiviljelyn avulla saadaan levämäärä, joka on sopiva testiviljelmien siirrostukseen. Esiviljelmää inkuboidaan testiolosuhteissa, ja viljelmä käytetään sen ollessa vielä eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa, yleensä 2–4 päivän pituisen inkubaation jälkeen. Leväviljelmät, jotka sisältävät epämuodostuneita tai poikkeavia soluja, on hylättävä.

Lisäys 5

Tietojen analysointi epälineaarisen regression avulla

Yleisiä huomautuksia

Levätesteissä ja muissa testeissä, joissa mitataan mikro-organismien kasvua (biomassan kasvua), vastetta kuvaava muuttuja on luonnostaan jatkuva ja metrinen: prosessin nopeus, jos käytetään kasvunopeutta, ja sen integraali ajan funktiona, jos käytetään biomassaa. Molempia muuttujia verrataan toistoina tehtyjen altistumattomien kontrollien vastaavaan keskimääräiseen vasteeseen ottaen huomioon, että kontrollit reagoivat maksimaalisesti kulloisiinkin olosuhteisiin; levätestissä valo ja lämpötila ovat pääasialliset määräävät tekijät. Järjestelmä voi olla jakautunut tai homogeeninen, ja biomassaa voidaan pitää jatkumona ottamatta huomioon yksittäisiä soluja. Tämän järjestelmän vastetyypin varianssin jakautuminen riippuu ainoastaan testiolosuhteista (joille ovat luonteenomaisia virheiden logaritmiset normaalijakaumat tai normaalijakaumat). Tämä poikkeaa tyypillisistä dikotomisista vasteista biologisissa testeissä, joissa oletetaan usein, että yksittäisten organismien toleranssi (jolle on tyypillistä binomijakauma) on hallitseva varianssikomponentti. Tällöin kontrollivasteet ovat nolla tai taustan tasoa.

Normalisoitu tai suhteellinen vaste r pienenee yksinkertaisessa tapauksessa tasaisesti 1:stä (ei kasvun estymistä) 0:aan (100-prosenttinen estyminen). On muistettava, että kaikkiin vasteisiin liittyy virhe ja että ilmeinen negatiivinen kasvun estyminen voi laskelmissa johtua pelkästään satunnaisvirheestä.

Regressioanalyysi

Mallit

Regressioanalyysin tavoitteena on kuvata pitoisuus-vastekäyrää matemaattisena regressiofunktiona Y = f (C) tai yleisemmin F (Z), jossa Z = log C. Käänteisesti funktio C = f– 1 (Y) antaa mahdollisuuden laskea ECx-arvot, kuten EC50-, EC10- ja EC20-arvot, ja niiden 95 prosentin luottamusvälit. Useiden yksinkertaisten matemaattisten funktioiden on todettu soveltuvan pitoisuusvastesuhteen kuvaamiseen leväkasvun estymistesteissä. Niihin kuuluvat muun muassa logistinen kaava, epäsymmetrinen Weibull-jakauma ja logaritminen normaalijakauma, jotka ovat kaikki S-käyriä, jotka lähestyvät asymptoottisesti arvoa nolla, kun C → 0, ja yhtä, kun C → ääretön.

Jatkuvan kynnysfunktion malleja (esimerkiksi Kooijmanin malli, joka kuvaa populaation kasvun estymistä; Kooijman ym., 1996) on hiljattain ehdotettu vaihtoehdoiksi asymptoottisille malleille. Tällaisissa malleissa oletetaan, että vaikutuksia ei esiinny tiettyä kynnysarvoa EC0+ pienemmillä pitoisuuksilla. Tämä pitoisuus arvioidaan ekstrapoloimalla vaste–pitoisuus-suhde siten, että se leikkaa pitoisuusakselin, käyttämällä yksinkertaista jatkuvaa funktiota, joka ei ole differentioituva lähtöpisteessä.

Analyysinä voi olla jäännösneliösummien yksinkertainen minimointi (kun varianssin oletetaan olevan vakio) tai painotettujen neliösummien yksinkertainen minimointi, jos varianssin heterogeenisuus kompensoidaan.

Menettely

Menettely on seuraava: Valitaan sopiva funktionaaliyhtälö Y = f(C) ja sovitetaan se tietoihin epälineaarisella regressiolla. Tässä yhteydessä on parempi käyttää jokaisesta yksittäisestä pullosta tehtyjä mittauksia kuin toistojen keskiarvoja, jotta tiedoista saataisiin mahdollisimman paljon informaatiota. Toisaalta käytännön kokemus viittaa siihen, että jos varianssi on suuri, toistojen keskiarvoilla saadaan luotettavampi matemaattinen arviointi, johon tiedoissa esiintyvät satunnaisvirheet eivät vaikuta yhtä paljon kuin jos jokainen yksittäinen datapiste säilytettäisiin.

Sovitettu käyrä ja mitatut tiedot esitetään graafisesti, minkä jälkeen tutkitaan, onko käyrä sovitettu asianmukaisesti. Jäännösten analysointi voi olla erityisen käyttökelpoinen keino tähän tarkoitukseen. Jos pitoisuus–vaste-käyrän kuvaamiseen valittu funktionaalinen suhde ei kuvaa hyvin koko käyrää tai jotain sen olennaista osaa, kuten vastetta pienillä pitoisuuksilla, valitaan toisenlainen käyränsovitus, esimerkiksi Weibull-funktion kaltainen epäsymmetrinen käyrä symmetrisen käyrän sijasta. Negatiiviset inhibitiot voivat olla ongelmallisia muun muassa logaritmisen normaalijakauman yhteydessä ja voivat vaatia vaihtoehtoisen regressiofunktion käyttöä. Ei ole suositeltavaa merkitä näitä negatiivisia arvoja nollaksi tai antaa niille pientä positiivista arvoa, koska se vääristää virhejakaumaa. Voi olla aiheellista tehdä erilliset käyränsovitukset joillekin käyrän osille, esimerkiksi sille osalle, jossa kasvun estyminen on pientä, ECpieni x-estimaattien määrittämiseksi. Sovitetusta yhtälöstä lasketaan (käänteisfunktiolla C = f– 1 (Y)) ECx:n luonteenomaiset piste-estimaatit, ja niistä ilmoitetaan ainakin EC50-arvo ja yksi tai kaksi ECpieni x-arvoa. Käytännön testauksesta saadut kokemukset ovat osoittaneet, että levätestillä saadaan yleensä kohtuullisen tarkka estimaatti pitoisuuksilla, joilla kasvun estyminen on 10-prosenttista, jos datapisteitä on riittävästi ja pienillä pitoisuuksilla ei esiinny kasvun edistymistä häiritsevänä tekijänä. EC20-estimaatin tarkkuus on yleensä huomattavasti parempi kuin EC10-estimaatin, koska EC20 sijaitsee yleensä pitoisuus–vaste-käyrän keskiosan lähes lineaarisessa osassa. Joskus EC10-arvoa voi olla vaikea tulkita kasvun edistymisen vuoksi. Sen vuoksi on suositeltavaa ilmoittaa aina myös EC20-arvo, vaikka EC10-arvo saadaankin yleensä riittävän tarkasti.

Painotuskertoimet

Testissä varianssi ei yleensä ole vakio, ja tavallisesti siihen sisältyy suhteellinen komponentti. Sen vuoksi on hyödyllistä tehdä painotettu regressio rutiininomaisesti. Tähän analyysin tarvittavien painotuskertoimien oletetaan yleensä olevan käänteisesti verrannollisia varianssiin:

Wi = 1/Var(ri)

Monet regressio-ohjelmat antavat mahdollisuuden tehdä painotettu regressioanalyysi painotuskertoimilla, jotka valitaan taulukosta. Painotuskertoimet voidaan helposti normalisoida kertomalla ne luvulla n/Σ wi (jossa n on datapisteiden määrä), jotta niiden summa olisi yksi.

Vasteiden normalisointi

Normalisointi kontrollien keskimääräisen vasteen avulla aiheuttaa joitakin periaatteellisia ongelmia ja johtaa melko mutkikkaaseen varianssirakenteeseen. Vastearvojen jakaminen kontrollien keskimääräisellä vastearvolla kasvunestymisprosentin määrittämiseksi aiheuttaa lisävirheen, joka johtuu kontrollien keskiarvoon liittyvästä virheestä. Jollei tämä virhe ole mitättömän pieni, regressioon sovellettavat painotuskertoimet ja luottamusvälit on korjattava ottaen huomioon kovarianssi kontrollin kanssa (Draper ja Smith, 1981). On tärkeää, että kontrollien keskimääräinen vaste estimoidaan hyvin tarkasti, jotta voidaan minimoida suhteellisen vasteen kokonaisvarianssi. Varianssi saadaan seuraavasti:

(Alaindeksi i tarkoittaa pitoisuutta i ja alaindeksi 0 tarkoittaa kontrolleja.)

Yi = Suhteellinen vaste = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

kun varianssi on: Var(Yi) = Var(ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

ja koska (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 ja (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2

kun data on normaalisti jakautunut ja mi ja m0 ovat toistoja: Var(ri) = σ2/mi

suhteellisen vasteen Yi kokonaisvarianssi on:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

Kontrollien keskiarvoon liittyvä virhe on kääntäen verrannollinen niiden kontrollitoistojen määrän neliöjuureen, joista keskiarvo on laskettu. Joskus voi olla aiheellista ottaa mukaan aiempia tietoja, jotta virhettä voidaan pienentää merkittävästi. Vaihtoehtoisena menetelmänä on, että tietoja ei normalisoida eikä absoluuttisia vasteita soviteta, kontrolleja koskevat vastetiedot mukaan luettuina, vaan kontrollivasteen arvo otetaan käyttöön lisäparametrina, joka sovitetaan epälineaarisella regressiolla. Käytettäessä tavanomaista kahden parametrin regressioyhtälöä tämä menetelmä edellyttää kolmen parametrin sovittamista ja vaatii sen vuoksi enemmän datapisteitä kuin sellaisten tietojen epälineaarinen regressio, jotka on normalisoitu käyttämällä ennalta määritettyä kontrollivastetta.

Käänteiset luottamusvälit

On melko monimutkaista laskea epälineaarisen regression luottamusvälit estimoimalla käänteisfunktion avulla, eikä tätä vaihtoehtoa ole saatavilla tavanomaisissa tilasto-ohjelmistopaketeissa. Likimääräiset luottamusvälit voidaan saada tavanomaisilla ohjelmilla, joita käytetään epälineaarisen regression laskemiseen, käyttämällä uudelleenparametrisointia (Bruce ja Versteeg, 1992), jolloin matemaattinen kaava kirjoitetaan uudelleen käyttämällä haluttuja piste-estimaatteja, esimerkiksi EC10- ja EC50-arvoa, arvioitavina parametreina. (Funktioksi valitaan I = f (α, β, pitoisuus) ja käytetään määritelmäsuhteita f (α, β, EC10) = 0,1 ja f (α, β, EC50) = 0,5 korvaamaan f (α, β, pitoisuus) vastaavalla funktiolla g(EC10, EC50, pitoisuus).

Laskenta voidaan tehdä suoraan (Andersen ym., 1998) säilyttämällä alkuperäinen yhtälö ja käyttämällä Taylorin laajennusta ri:n ja r0:n keskiarvojen ympäristössä.

Viimeaikoina on käytetty yhä enemmän ’bootstrap’-menetelmiä. Näissä menetelmissä arvioidaan empiiristä varianssijakaumaa käyttämällä mitattuja tietoja ja tiheää uusintanäytteiden ottoa, jota ohjataan satunnaislukugeneraattorilla.

VIITTEET

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R..D. and Versteeg,, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485–1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.

4)

Korvataan luku C.11 seuraavasti:

C.11.   AKTIIVILIETTEEN SOLUHENGITYKSEN INHIBITIOTESTI (HIILEN JA AMMONIUMIN HAPETTUMINEN)

JOHDANTO

1.

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 209 (2010). Tässä testimenetelmässä kuvataan menetelmä, jolla voidaan määrittää kemikaalin vaikutukset aktiivilietteestä peräisin oleviin mikro-organismeihin (enimmäkseen bakteereihin) mittaamalla niiden soluhengitystasoa (hiilen ja/tai ammoniumin hapettumista) tietyissä olosuhteissa, joissa testikemikaalia on läsnä eri pitoisuuksina. Testimenetelmä perustuu ETAD:n (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing Industry) testiin (1), (2), aikaisempaan OEC:n testiohjeeseen (TG) 209 sekä tarkistettuun ISO-standardiin 8192 (4). Testin on tarkoitus toimia nopeana seulontamenetelmänä, jolla voidaan arvioida kemikaalien vaikutusta jätevedenkäsittelylaitosten biologisen (aerobisen) vaiheen aktiivilietteessä oleviin mikro-organismeihin. Testin tuloksia voidaan käyttää myös osoittamaan testikemikaalien biologisiin hajoamiskokeisiin sopivat pitoisuudet, joilla ei ole inhibitiovaikutusta (esimerkiksi tämän liitteen C.4 A–F, C.9, C.10, C.12 ja C.29 luvut sekä OECD:n testiohje (TG) 302C). Tällöin testi voidaan tehdä pitoisuusalueen määritystestiä tai raja-annostestiä vastaavana seulontakokeena (ks. 39 kohta), jossa otetaan huomioon vain soluhengitys yleensä. Tietoa on kuitenkin sovellettava harkiten helpon biohajoavuuden testeihin (tämän liitteen C.4 A–F ja C.29 luvut), joissa inokulaattipitoisuus on merkittävästi tässä testimenetelmässä käytettyä pienempi. Inhibition puuttuminen tässä soluhengitystestissä ei siis ilman muuta tarkoita, että tämän liitteen C.4 A–F tai C.29 luvuissa kuvatun helpon biohajoavuuden testin olosuhteilla ei ole inhibitiovaikutusta.

2.

Soluhengityksen inhibitiotestiä on yleensä sovellettu ilmeisen onnistuneesti julkistamisestaan saakka, mutta joissakin tapauksissa tulosten on ilmoitettu olleen virheellisiä. Pitoisuuksia koskevat soluhengityskäyrät ovat toisinaan olleet kaksifaasisia ja annosvastekuvaajat vääristyneitä sekä EC50-arvot odottamattoman alhaisia (5). Tarkemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tällaisia tuloksia on saatu tapauksissa, joissa testissä käytetty aktiiviliete nitrifioituu huomattavasti ja testikemikaalilla on suurempi vaikutus ammoniumin hapettumiseen kuin heterotrofiseen hapettumiseen yleensä. Virheelliset tulokset voidaan siis välttää lisätestillä, jossa käytetään spesifistä nitrifikaatioinhibiittoria. Kun hapenotto mitataan inhibiittoria (esimerkiksi N-allyylitioureaa (ATU)) käytettäessä ja ilman sitä, voidaan laskea erikseen kokonaishapenottotaso, heterotrofinen hapenotto sekä nitrifikaation hapenotto (4), (7), (8). Näin voidaan todeta testikemikaalin inhibitiovaikutus näihin kahteen prosessiin, ja sekä orgaanisen hiilen hapettumisen (heterotrofisen) että ammoniumin hapettumisen (nitrifikaation) EC50-arvot voidaan laskea tavanomaiseen tapaan. On syytä huomata, että joissakin harvinaisissa tapauksissa N-allyylitiourean inhibitiovaikutus voi mitätöityä osittain tai kokonaan testikemikaalien tai ravinneliuoksen lisäaineiden (esimerkiksi Cu++-ioneiden) kanssa tapahtuvan kompleksoinnin vuoksi (6). Cu++-ionit ovat Nitrosomonas-bakteereille välttämättömiä, mutta suurempina pitoisuuksina myrkyllisiä.

3.

Varsinkin Euroopan maissa on syntynyt selkeä tarve hyödyntää nitrifikaatiota jätevesien aerobisessa puhdistuksessa poistettaessa typpiyhdisteitä jätevesistä denitrifikoimalla ne kaasumaisiksi aineiksi, kun EU on määrännyt alhaisemmat rajat vesistöihin päästettävien käsiteltyjen jätevesien typpipitoisuudelle (5).

4.

Useimmissa tapauksissa riittää pelkästään menetelmä, jolla arvioidaan vaikutusta orgaanisen hiilen hapettumisprosesseihin. Joissakin tapauksissa on kuitenkin tarkasteltava vaikutusta pelkästään nitrifikaatioon tai erikseen sekä nitrifikaatioon että orgaanisen hiilen hapettumiseen, jotta tulokset osataan tulkita ja vaikutuksia ymmärtää oikein.

TESTIMENETELMÄN PERIAATE

5.

Standardiannoksella synteettistä jätevettä ravitun aktiivilietteen soluhengitystaso mitataan happielektrodin sisältävässä suljetussa kennossa kolmen tunnin kontaktiajan kuluttua. Jos realistinen altistusskenaario tätä edellyttää, tarvittava kontaktiaika voi olla pitempikin. Jos testikemikaali hajoaa nopeasti esimerkiksi abioottisesti hydrolyysin kautta tai on erittäin haihtuvaa, jolloin pitoisuutta ei saada pidettyä samana, voidaan lisäksi käyttää lyhyempää altistusaikaa, esimerkiksi 30 minuuttia. Kunkin aktiiviliete-erän herkkyys olisi tarkistettava soveltuvan vertailukemikaalin avulla altistuspäivänä. Testiä käytetään yleensä testikemikaalin ECx:n (esimerkiksi EC50:n) ja/tai NOEC-pitoisuuden (pitoisuuden, josta ei aiheudu vaikutuksia) määrittämiseen.

6.

Orgaanista hiiltä hapettavien mikro-organismien hapenoton inhibitio voidaan ilmaista erillisenä ammoniumia hapettavien mikro-organismien hapenoton inhibitiosta mittaamalla hapenotto sekä N-allyylitioureaa käytettäessä että ilman sitä. N-allyylitiourea on spesifinen inhibiittori, jolla estetään ensimmäisen vaiheen nitrifioivia bakteereita hapettamasta ammoniumia nitriitiksi. Tässä tapauksessa hapenottotason prosentuaalinen inhibitio lasketaan vertaamalla hapenottoa testikemikaalin läsnä ollessa vastaavien, testikemikaalia sisältämättömien kontrollien keskimääräiseen hapenottoon sekä spesifistä inhibiittoria N-allyylitioureaa käytettäessä että ilman sitä.

7.

Mahdollinen abioottisista prosesseista johtuva hapenotto voidaan todeta määrittämällä taso testikemikaalin, synteettisen jäteveden ja veden seoksissa, joista aktiiviliete on jätetty pois.

TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA

8.

Testikemikaalin tunnisteen (mieluiten CAS-numeron), nimen (IUPAC), puhtauden, vesiliukoisuuden, höyrynpaineen sekä haihtuvuus- ja adsorptio-ominaisuuksien on oltava tiedossa, jotta tulokset voidaan tulkita oikein. Haihtuvia kemikaaleja ei tavallisesti voi testata riittävällä tavalla ilman erityisiä varotoimia (katso kohta 21).

TESTIMENETELMÄN SOVELLETTAVUUS

9.

Testimenetelmää voidaan käyttää vesiliukoisille, heikosti liukeneville ja haihtuville kemikaaleille. Aina ei kuitenkaan ole välttämättä mahdollista saada EC50-arvoja kemikaaleista, joiden liukoisuus on rajallinen, ja haihtuvista kemikaaleista saadaan paikkansapitäviä tuloksia vain silloin, kun testikemikaalista suurin osa (esimerkiksi > 80 prosenttia) on edelleen reaktioseoksessa altistusajan tai -aikojen lopussa. ECx-pitoisuus on määritettävä analyysiin perustuvien lisätietojen avulla, jos testikemikaalin stabiilisuutta tai haihtuvuutta ei tunneta tarkasti.

VERTAILUKEMIKAALIT

10.

Vertailukemikaalien säännöllisin väliajoin toistuvilla testeillä varmistetaan testimenetelmän ja testiolosuhteiden luotettavuus ja tarkistetaan kunkin mikrobi-inokulaattina käytetyn aktiiviliete-erän herkkyys altistuspäivänä. Inhiboivaksi vertailukemikaaliksi suositellaan 3,5-dikloorifenolia (3,5-DCP), sillä kyseessä on tunnettu hengitysinhibiittori, jota käytetään monenlaisissa inhibitio- ja myrkyllisyyskokeissa (4). Kokonaissoluhengityksen inhiboivana vertailukemikaalina voidaan käyttää myös kupari(II)sulfaatin pentahydraattia (9). Nitrifikaation spesifisenä vertailuinhibiittorina voidaan käyttää N-metyylianiliinia.

VALIDITEETTIVAATIMUKSET JA TOISTETTAVUUS

11.

Nollanäytteissä (joissa ei ole testi- tai vertailukemikaalia) hapenoton on oltava tunnissa vähintään 20 mg happea yhtä aktiivilietegrammaa kohti (kiintoaineen kuivapaino). Jos taso on pienempi, testi on toistettava pestyllä aktiivilietteellä tai toisesta lähteestä saadulla lietteellä. Kontrollirinnakkaisnäytteissä hapenoton variaatiokertoimen on oltava varsinaisen testin lopussa enintään 30 prosenttia.

12.

ISO:n vuonna 2004 järjestämässä kansainvälisessä yhteistutkimuksessa (4), jossa käytettiin kotitalousjätevedestä saatua aktiivilietettä, 3,5-DCP:n EC50:n todettiin olevan kokonaissoluhengityksessä 2–25 mg/l, heterotrofisessa soluhengityksessä 5–40 mg/l ja nitrifikaatiosoluhengityksessä 0,1–10 mg/l. Jos 3,5-DCP:n EC50 ei ole odotetulla vaihteluvälillä, testi on toistettava käyttäen toisesta lähteestä saatua aktiivilietettä. Kupari(II)sulfaatin pentahydraatin EC50:n olisi oltava kokonaissoluhengityksessä 53–155 mg/l (9).

TESTIMENETELMÄN KUVAUS

Koeastiat ja -välineet

13.

Testissä tarvitaan tavallinen laboratoriolaitteisto ja seuraavat välineet:

a)

Koeastioita; esimerkiksi 1 000 ml:n dekantterilaseja, joihin tulee 500 ml reaktioseosta (ks. kuvan 1 kohta 5).

b)

Kenno ja tarvikkeet liuenneen hapen pitoisuuden mittaamista varten; sopiva happielektrodi; suljettu kenno, johon näyte sijoitetaan niin, että avointa tilaa ei jää, sekä piirturi (esimerkiksi lisäyksen 2 kuvan 1 kohdat 7, 8, 9); vaihtoehtoisesti voidaan käyttää BOD-pulloa, jossa on sopiva sovitinholkki, jolla happielektrodi voidaan kiinnittää pullon kaulaa vasten (ks. lisäyksen 3 kuva 2). Suositeltavinta on laittaa holkin läpi ensin suppilo tai lasiputki tai käyttää astioita, joiden reunat levenevät ulospäin, jotta nestettä ei joudu hukkaan happielektrodin kiinnittämisen yhteydessä. Molemmissa tapauksissa on käytettävä magneettisekoitinta tai jotain muuta sekoitusmenetelmää, esimerkiksi automaattista sekoitinpuikkoa;

c)

Inertillä materiaalilla päällystettyjä magneettisekoittimia ja magneettisauvoja, joita käytetään mittauskammiossa ja/tai koeastioissa;

d)

Ilmastuslaite: paineilmaa puhalletaan tarvittaessa sopivan suodattimen läpi pölyn ja öljyn poistamiseksi sekä vettä sisältävien pesupullojen läpi ilman kosteuttamiseksi. Astioiden sisältöä ilmastetaan Pasteur-pipeteillä tai muilla kemikaaleja adsorboimattomilla ilmastuslaitteilla. Orbitaaliliikettä tekevää ravistinta, jonka kierrosnopeus esimerkiksi 2 000 ml:n pulloille on 150–250 rpm, käyttämällä voidaan huolehtia lietteen hapenkulutuksesta sekä käyttää ongelmitta myös kemikaaleja, jotka vaahtoavat runsaasti, katoavat helposti haihtuvuutensa takia tai ovat vaikeasti dispergoitavissa, jos ilmastamisessa käytetään ilmahuuhtelua. Testijärjestelmä koostuu yleensä dekanttereista, joita ilmastetaan jatkuvasti ja joiden liike pysäytetään yksi toisensa jälkeen (esimerkiksi noin 10–15 minuutin välein), minkä jälkeen niiden sisältö analysoidaan yksi kerrallaan. Mahdollista on myös käyttää validoituja instrumentteja, joiden avulla seoksia voidaan samanaikaisesti ilmastaa ja niiden hapenkulutusta mitata;

e)

ph-mittari;

f)

sentrifugi: tavanomainen lietteelle tarkoitettu pöytäsentrifugi, kiihtyvyys 10 000 m/s2.

Reagenssit

14.

Koko testin ajan käytetään analyysilaatuisia reagensseja.

Vesi

15.

Käytetään tislattua tai deionisoitua vettä, jonka DOC-pitoisuus on alle 1 mg/l, ellei testissä erityisesti vaadita klooritonta talousvettä.

Synteettinen jätevesiravinne

16.

Väliaine on valmisteltava siten, että se sisältää seuraavia ainesosia mainitun määrän verran:

peptonia

16 g

lihauutetta (tai vastaavaa kasvisuutetta)

11 g

ureaa

3 g

natriumkloridia (NaCl)

0,7 g

kalsiumklorididihydraattia (CaC12, 2H2O)

0,4 g

magnesiumsulfaattiheptahydraattia (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

vedetöntä dikaliumvetyfosfaattia (K2HPO4)

2,8 g

tislattua tai deionisoitua vettä lisätään, kunnes liuosta on yhteensä 1 litra.

 

17.

Liuoksen pH-arvon on oltava 7,5 ±0,5. Ellei ravintoainetta käytetä välittömästi valmistuksen jälkeen, sitä säilytetään enintään viikon ajan pimeässä 0–4 °C:n lämpötilassa tai olosuhteissa, joissa aineen koostumus ei muutu säilytyksen aikana. On syytä huomata, että synteettinen jätevesi on 100-kertainen tiiviste OECD:n teknisessä raportissa ’Proposed method for the determination of the biodegrability of surfactants used in synthetic detergents’ (11. kesäkuuta 1976) esitetystä jätevedestä, paitsi että se sisältää myös dikaliumvetyfosfaattia.

18.

Ravinneliuoksen ainesosat voidaan vaihtoehtoisesti steriloida yksitellen ennen säilytystä, tai peptoni ja lihauute voidaan lisätä juuri ennen testiä. Ennen käyttöä ravinneliuos on sekoitettava kauttaaltaan ja pH-arvoa on tarvittaessa säädettävä siten, että se on 7,5 ±0,5.

Testikemikaali

19.

Veteen helposti liukeneville testiaineille kantaliuosta valmistetaan enintään suurinta veteen liukenevuutta vastaava määrä (saostumia ei saa olla). Heikosti veteen liukenevat aineet, seokset, joiden ainesosat liukenevat veteen eri tavoin, ja adsorptiiviset aineet on punnittava suoraan testiastioihin. Näissä tapauksissa vaihtoehtona voi olla kantaliuosten käyttäminen, jos testikemikaalien liuenneet pitoisuudet määritetään analyyttisesti testiastioissa (ennen aktiivilietteen lisäämistä). Veteen liuenneita fraktioita (Water Accommodated Fractions) käytettäessä on myös määritettävä analyyttisesti testikemikaalien liuenneet pitoisuudet testiastioissa. Orgaanisia liuottimia käytettäessä on vältettävä liukoisuuden lisäämistä dispergointiaineiden/emulgaattoreiden avulla. Kantaliuosten sonikaatiota ja suspensioiden esisekoittamista esimerkiksi yön yli voidaan käyttää, jos testikemikaalin stabiiliudesta näissä olosuhteissa on riittävästi tietoa.

20.

Testikemikaali voi vaikuttaa haitallisesti pH-arvoon testijärjestelmässä. Testikemikaalilla käsiteltyjen seosten pH-arvo määritetään ennen testiä esikokeella, jonka avulla todetaan, onko pH-arvon säätäminen tarpeen ennen varsinaista testiä ja uudelleen varsinaisena testipäivänä. Veteen liuennut tai suspendoitunut testikemikaali on tarvittaessa neutraloitava ennen inokulaatin lisäämistä. Neutralointi voi kuitenkin muuttaa kemikaalin kemiallisia ominaisuuksia, minkä vuoksi lisätesteillä voidaan tutkimuksen tavoitteiden mukaan arvioida testikemikaalin vaikutusta lietteeseen ilman pH:n säätämistä.

21.

Haihtuvien kemikaalien myrkyllisten vaikutusten johdosta etenkin testeissä, joissa ilmakuplia puhalletaan järjestelmän läpi, vaikutukset voivat vaihdella, koska ainetta häviää altistusjakson aikana. Näiden aineiden käsittelyssä on noudatettava huolellisuutta tekemällä ainetta sisältäville kontrolliseoksille ainekohtainen analyysi sekä muuttamalla ilmastusaikataulua.

Vertailukemikaali

22.

Jos vertailukemikaalina käytetään 3,5-dikloorifenolia, valmistetaan liuos, jossa 1,00 g 3,5-dikloorifenolia sekoitetaan 1 000 ml:aan vettä (15). Liukenemista nopeutetaan käyttämällä lämmintä vettä ja/tai sonikaatiota, ja kun liuos on jäähtynyt huoneenlämpöiseksi, haihtunut vesi korvataan uudella. On syytä kuitenkin varmistaa, että vertailukemikaalin rakenne ei muutu. Liuoksen pH tarkistetaan ja sitä säädetään tarvittaessa NaOH:lla tai H2SO4:lla siten, että pH-arvo on 7–8.

23.

Jos vertailukemikaalina käytetään kupari(II)sulfaattipentahydraattia, käytettävät pitoisuudet ovat 58 mg/l, 100 mg/l ja 180 mg/l (kerroin 1,8). Aine punnitaan suoraan testiastioihin (29, 50 ja 90 mg, jolloin kokonaistilavuudeksi saadaan 500 ml). Tämän jälkeen aine liuotetaan 234 ml:aan autoklaavissa käsiteltyä talousvettä. Kupari(II)sulfaattipentahydraatti on helposti liukenevaa. Kun testi aloitetaan, lisätään 16 ml synteettistä jätevettä sekä 250 ml aktiivilietettä.

Nitrifikaation spesifinen inhibiittori

24.

Valmistetaan kantaliuos, jonka N-allyylitioureapitoisuus (ATU) on 2,32 g/l. Kun tätä kantaliuosta lisätään 2,5 ml inkubaatioseokseen, jonka lopullinen tilavuus on 500 ml, saadaan lopulliseksi pitoisuudeksi 11,6 mg ATU/l (10– 4mol/l). Tiedossa on, että tämä riittää inhiboimaan nitrifikaation 100-prosenttisesti nitrifioivassa aktiivilietteessä, joka sisältää kiintoainetta 1,5 g/l.

Abioottinen kontrolli

25.

Eräissä harvoin esiintyvissä olosuhteissa testikemikaali, jolla on voimakkaasti pelkistäviä ominaisuuksia, saattaa aiheuttaa mitattavissa olevaa abioottista hapenkulutusta. Tällöin on välttämätöntä erottaa toisistaan testikemikaalin abioottinen hapen yhteytys ja mikrobien soluhengitys. Abioottiset kontrollit voidaan valmistaa jättämällä inokulaatti pois testiseoksista. Inokulaattia sisältämättömät abioottiset kontrollit voidaan myös ottaa mukaan tehtäessä analyyttisiä mittauksia, joilla määritetään testin altistusvaiheen aikana saavutettu pitoisuus esimerkiksi silloin, kun käytetään heikosti veteen liukenevia kemikaaleja sisältäviä kantaliuoksia, joiden ainesosat liukenevat veteen eri tavoin. Erityistapauksissa voi olla tarpeen valmistaa abioottinen kontrolli, jossa inokulaatti on steriloitu (esimerkiksi autoklaavia käyttämällä tai lisäämällä steriloivia myrkyllisiä aineita). Eräät kemikaalit saattavat tuottaa tai kuluttaa happea silloinkin, jos pinta-ala on reaktiolle riittävän suuri, vaikka reaktio normaalisti edellyttäisi huomattavasti korkeampaa lämpötilaa tai painetta. Tässä suhteessa on kiinnitettävä erityistä huomiota peroksiaineisiin. Steriloidun inokulaatin pinta-ala on suuri.

Inokulaatti

26.

Yleiseen käyttöön tarkoitettu aktiiviliete kerätään pääasiassa kotitalousjätettä käsittelevän, hyvin hoidetun jätevedenkäsittelylaitoksen ilmastussäiliön poistoaukosta tai sen läheltä. Testin tarkoituksen mukaan voidaan käyttää myös muunlaisia sopivia aktiivilietelähteitä tai -tyyppejä, esimerkiksi laboratoriossa kasvatettua lietettä, jonka kiintoainepitoisuus on 2–4 g/l. Eri käsittelylaitoksista peräisin olevien lietteiden ominaisuudet ja herkkyydet kuitenkin todennäköisesti poikkeavat toisistaan.

27.

Lietettä voidaan käyttää sellaisena kuin se on kerätty, mutta karkeat hiukkaset poistetaan antamalla lietteen laskeutua lyhyen aikaa, esimerkiksi 5–15 minuuttia, ja dekantoimalla hienojakoisempia kiintoaineita sisältävä ylin kerros tai siivilöimällä liete (esimerkiksi siivilällä, jonka silmäkoko on 1 mm2). Vaihtoehtoisesti liete voidaan homogenoida sekoittamalla sitä tehosekoittimessa vähintään 15 sekunnin ajan, mutta tällöin on syytä ottaa huomioon leikkuuvoimat ja lämpötilan muutos, jonka pitkäaikainen sekoittaminen saattaa aiheuttaa.

28.

Liete on usein pestävä esimerkiksi silloin, jos endogeeninen soluhengitystaso on alhainen. Lietettä olisi ensin sentrifugoitava jonkin aikaa (esimerkiksi 10 minuuttia nopeudella 10 000 m/s2), jotta saadaan aikaan kirkas kelluva neste ja kiintoaineesta muodostuva kakku. Kelluva neste heitetään pois ja liete suspendoidaan uudelleen kloorittomaan talousveteen ravistelemalla astiaa, minkä jälkeen pesuvesi poistetaan sentrifugoimalla uudelleen ja heittämällä kelluva neste jälleen pois. Pesu- ja sentrifugointiprosessi toistetaan tarvittaessa. Tilavuudeltaan tunnetun uudelleen suspendoituneen lietteen kuivapaino määritetään, minkä jälkeen liete konsentroidaan poistamalla siitä lientä tai sitä laimennetaan edelleen kloorittomalla talousvedellä, jotta lietteen kiintoainepitoisuudeksi saadaan vaadittu 3 g/l. Aktiivilietteeseen on syötettävä jatkuvasti ilmaa (esimerkiksi 2 l minuutissa) testilämpötilassa, ja se on mahdollisuuksien mukaan käytettävä keräämispäivänä. Jos tämä ei ole mahdollista, lietteeseen on syötettävä päivittäin synteettistä jätevesiravinnetta (50 ml synteettistä jätevesiravinnetta yhteen litraan aktiivilietettä) vielä kahden päivän ajan. Tämän jälkeen lietettä käytetään testiin, ja testin tulokset katsotaan paikkansapitäviksi, jos lietteen aktiivisuudessa ei endogeenisen heterotrofisen soluhengitystason ja nitrifikaatiosoluhengitystason perusteella arvioituna ole tapahtunut merkittävää muutosta.

29.

Vaikeuksia voi ilmetä, jos inkubaation aikana muodostuu niin runsaasti vaahtoa, että vaahto ja sen mukana lietteen kiintoaineet tulevat ulos ilmastusastioista. Vaahtoaminen voi toisinaan johtua pelkästään synteettisen jäteveden olemassaolosta, mutta sitä on odotettavissa, jos testikemikaali on pinta-aktiivinen aine tai sisältää sellaista. Lietteen kiintoaineiden poistuminen testiseoksista johtaa keinotekoisesti alentuneisiin soluhengitystasoihin, jotka saatetaan virheellisesti tulkita inhibitiosta johtuviksi. Pinta-aktiivista ainetta sisältävän liuoksen ilmastaminen saa lisäksi pinta-aktiivisen aineen kerääntymään vaahtokerrokseen, jolloin vaahdon poistuminen testijärjestelmästä alentaa altistuspitoisuuksia. Vaahtoamista voidaan hallita yksinkertaisilla mekaanisilla menetelmillä (esimerkiksi satunnaisesti lasisauvalla sekoittamalla), lisäämällä pinta-aktiivista ainetta sisältämätöntä silikoniemulsioon perustuvaa vaahdonestoainetta ja/tai käyttämällä ilmastuksessa ravistuspullomenetelmää. Jos ongelma johtuu synteettisen jäteveden olemassaolosta, jäteveden koostumusta muutetaan lisäämällä vaahdonestoreagenssia esimerkiksi 50 μl/l. Jos vaahtoaminen johtuu testikemikaalista, vaahdonestoon tarvittava määrä todetaan maksimitestipitoisuudessa, minkä jälkeen jokainen ilmastusastia käsitellään samalla tavoin (myös ne, joissa vaahtoa ei muodostu, esimerkiksi nollanäytteet ja vertailuastiat). Vaahdonestoaineita käytettäessä vältetään interaktio inokulaatin ja/tai testikemikaalin kanssa.

TESTIMENETTELY

30.

Hapenoton inhibointi voidaan määrittää kolmella eri tavalla: kokonaisinhibointi, pelkkä heterotrofinen inhibointi sekä nitrifikaatiosta johtuva inhibointi. Yleensä riittää pelkkä kokonaishapenoton inhiboinnin mittaaminen. Orgaanisen hiilen hapettumisesta johtuvaa vaikutusta heterotrofiseen hapenottoon sekä ammoniumin hapettumisen vaikutusta tarvitaan, kun tietylle kemikaalille tarvitaan jostain erityisestä syystä molemmat erilliset loppupisteet tai kun halutaan (tarvittaessa) selittää kokonaishapenoton inhiboinnista muodostuvia epätyypillisiä annosvastekäyriä.

Testiolosuhteet

31.

Testi tehdään lämpötilassa, jonka vaihteluväli on 20 ± 2 °C.

Testiseokset

32.

Vettä, synteettistä jätevesiravinnetta sekä testikemikaalia sisältävät testiseokset (taulukon 1 FT) valmistetaan siten, että testikemikaalin nimellispitoisuudet niissä poikkeavat toisistaan (ainesosien esimerkkitilavuuksista ks. taulukko 1). pH-arvoa säädetään tarvittaessa siten, että se on 7,5 ± 0,5. Seoksia laimennetaan vedellä ja inokulaattia lisätään siten, että kaikkien astioiden lopulliset tilavuudet ovat samat ja ilmastaminen voidaan aloittaa.

Vertailuseokset

33.

Seokset (FR) valmistetaan samalla tavoin kuin testiseokset, mutta testikemikaali korvataan vertailukemikaalilla, kuten 3,5-dikloorifenolilla.

Nollanäytteet

34.

Nollanäytteet (FB) valmistetaan altistusjakson alussa ja lopussa testeissä, joissa testidekanttereita valmistetaan yksi kerrallaan säännöllisin väliajoin. Testeissä, joissa käytettävien laitteiden avulla hapenkulutusta koskevat mittaukset voidaan tehdä samanaikaisesti, jokaisessa samanaikaisesti analysoitavassa erässä on oltava ainakin kaksi nollanäytettä. Nollanäytteissä on yhtä paljon aktiivilietettä sekä synteettistä ravinneliuosta, mutta ei testi- tai vertailukemikaalia. Nollanäytteet laimennetaan vedellä samaan tilavuuteen kuin testi- ja vertailuseokset.

Abioottinen kontrolli

35.

Tapauksissa, joissa testikemikaalilla esimerkiksi tiedetään tai epäillään olevan voimakkaasti pelkistäviä ominaisuuksia, on tarvittaessa valmistettava seos FA abioottisen hapenkulutuksen mittaamista varten. Seoksessa on oltava samat määrät testikemikaalia ja synteettistä jätevesiravinnetta ja sen tilavuuden on oltava sama kuin testiseosten, mutta aktiiviliete puuttuu.

Yleinen menetelmä ja mittaukset

36.

Testiseokset, vertailuseokset sekä nollanäytteet ja abioottiset kontrollit inkuboidaan testilämpötilassa koneellisesti ilmastaen (0,5–1 l/min), jotta liuenneen hapen kyllästymispitoisuus on jatkuvasti yli 60–70 prosenttia ja lietehiutaleet pysyvät suspendoituneina. Viljelmiä on myös sekoitettava, jotta lietehiutaleet pysyvät suspendoituneina. Inkubaation katsotaan alkavan, kun aktiivilieteinokulaatti joutuu ensimmäistä kertaa kosketuksiin lopullisen seoksen muiden ainesosien kanssa. Inkubaation lopussa määritellyn altistusajan (yleensä kolme tuntia) jälkeen näytteet kerätään pois ja liuenneen hapen pitoisuuden lasku mitataan tätä varten tarkoitetussa kennossa (lisäyksen 3 kuva 2) tai kokonaan täytetyssä BOD-pullossa. Inkubaation alkamistapa riippuu myös hapenkulutuksen mittaamiseen tarkoitetun laitteiston kapasiteetista. Jos laitteistoon kuuluu esimerkiksi vain yksi happianturi, mittaukset tehdään yksitellen. Tällöin synteettisessä jätevedessä tehtävää testiä varten tarvittavat seokset valmistetaan, mutta inokulaattia ei käytetä, ja lietteen tarvittavat osat lisätään kuhunkin sarjaan kuuluvaan astiaan. Inkubaatiot aloitetaan yksi kerrallaan sopivin väliajoin, esimerkiksi 10–15 minuutin välein. Vaihtoehtoisesti mittausjärjestelmään voi kuulua useita antureita, jolloin useita mittauksia voidaan tehdä samanaikaisesti. Tässä tapauksessa inokulaattia voidaan lisätä yhtä aikaa sopiviin astiaryhmiin.

37.

Nimellinen aktiivilietepitoisuus kaikissa testi- ja vertailuseoksissa sekä nollanäytteissä (muttei abioottisissa kontrolleissa) on 1,5 g kiintoainetta litrassa. Hapenkulutus mitataan kolmen tunnin altistusajan päätteeksi. Tarvittaessa 5 kohdassa kuvatuissa tapauksissa tehdään vielä lisää altistusmittauksia 30 minuutin välein.

Lietteen nitrifikaatiopotentiaali

38.

Lietteen mahdollisen nitrifikaation ja nitrifikaatiotason selville saamiseksi valmistetaan seokset (FB) samaan tapaan kuin nollanäytteet ja lisäkontrolliseokset (FN), mutta näissä seoksissa on myös N-allyylitioureaa 11,6 mg litrassa. Seoksia ilmastetaan ja inkuboidaan lämpötilassa 20° ± 2 °C kolmen tunnin ajan. Tämän jälkeen mitataan hapenottotaso ja lasketaan nitrifikaatiosta johtuva hapenotto.

Testijärjestelyt

Raja-annostesti

39.

Alustavalla testillä voidaan tarvittaessa arvioida, millä testikemikaalin pitoisuuksien vaihteluvälillä voidaan lopullisessa testissä määrittää hapenkulutuksen estyminen. Jos testikemikaali ei toisaalta estä hapenkulutusta alustavassa testissä, tämä voi osoittaa, että lopullista testiä ei tarvita. Tähän tarvitaan kuitenkin kolme testiä korkeimmalla alustavassa testissä käytetyllä pitoisuudella (yleensä 1 000 mg/l, kuitenkin tarvittavan tiedon määrän mukaan).

Taulukko 1

Esimerkkejä alustavassa testissä käytettävistä seoksista

Reagenssi

Lähtöpitoisuus

Testikemikaalin kantaliuos

10 g/l

Synteettisen ravinneliuoksen kantaliuos

Katso edellä kohta 16.

Aktiivilietteen kantasuspensio

Kiintoainetta 3 g/l

Seosten ainesosat

Annostelu testiastioihin (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Testikemikaalin kantaliuos (ml)

(19–21 kohdat)

0,5

5

50

0

50

Synteettisen jätevesiravinteen kantaliuos (ml)

(16 kohta)

16

16

16

16

16

Aktiivilietesuspensio (ml)

(26–29 kohdat)

250

250

250

250

0

Vesi

(15 kohta)

233,5

229

184

234

434

Seosten kokonaismäärä (ml)

500

500

500

500

500

Pitoisuudet seoksessa

 

 

 

 

 

Testisuspensio (mg/l)

Aktiiviliete

10

10

1 000

0

1 000

(kiintoaineita) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Testiä tehtäessä käytetään testikemikaalia vähintään kolmena eri pitoisuutena (esimerkiksi 10 mg/l, 100 mg/l ja 1 000 mg/l) sekä nollanäytettä ja tarvittaessa lisäksi vähintään kolmea abioottista kontrollia, joissa testikemikaalia on suurin mahdollinen pitoisuus (esimerkkinä ks. taulukko 1). Ihannetapauksessa pienimmällä pitoisuudella ei ole vaikutusta hapenkulutukseen. Hapenottotasot sekä tarvittaessa nitrifikaatiotaso lasketaan ensin, minkä jälkeen lasketaan hapenoton prosentuaalinen estyminen. Testin tarkoituksen mukaan on mahdollista myös määrittää pelkkä rajapitoisuuden myrkyllisyys, esimerkiksi 1 000 mg/l. Jos tilastollisesti merkittävää myrkyllistä vaikutusta ei esiinny tässä pitoisuudessa, lisätestejä suuremmilla tai pienemmillä pitoisuuksilla ei tarvita. On syytä huomata, että heikosti veteen liukenevat aineet, seokset, joiden ainesosat liukenevat veteen eri tavoin sekä adsorptiiviset aineet on punnittava suoraan testiastioihin. Tässä tapauksessa testiaineen kantaliuokselle varattu tilavuus korvataan laimennusvedellä.

Varsinainen testi

Kokonaishapenoton estyminen

41.

Testissä käytetään alustavan testin perusteella määriteltyjä pitoisuuksia. Useimmissa tapauksissa suositellaan kuutta kontrollia ja viittä geometrisen sarjan muodostavaa käsittelypitoisuutta sekä viittä rinnakkaisnäytettä, jotta saadaan sekä NOEC että ECx (esimerkiksi EC50). Abioottista kontrollia ei ole tarpeen toistaa, jos alustavassa testissä ei tapahtunut hapenottoa. Jos hapenotto on huomattavaa, jokaista testikemikaalin pitoisuutta varten tarvitaan abioottiset kontrollit. Lietteen herkkyys tarkistetaan vertailukemikaalia (3,5-dikloorifenoli) käyttämällä. Lietteen herkkyys on tarkistettava erikseen jokaiselle testisarjalle, sillä herkkyyden tiedetään vaihtelevan. Kaikissa tapauksissa näytteet poistetaan testiastioista kolmen tunnin tai tarvittaessa 30 minuutin lisäajan kuluttua hapenottotason mittaamiseksi happielektrodikennossa. Kerätystä tiedosta lasketaan kontrollille ja testiseoksille ominaiset soluhengitystasot, minkä jälkeen prosentuaalinen inhibitio lasketaan alla olevasta yhtälöstä 7.

Heterotrofisen soluhengityksen ja nitrifikaation erottaminen

42.

Nitrifikaation spesifistä inhibiittoria (ATU) käyttämällä voidaan arvioida suoraan testikemikaalien inhibitiovaikutusta heterotrofiseen hapettumiseen. Vaikutus nitrifikaatioon voidaan laskea vähentämällä ATUa käytettäessä saatu hapenotto kokonaishapenotosta (ilman ATUa). Kaksi reaktioseossarjaa valmistetaan 41 kohdassa kuvatun ECx- tai NOEC-testijärjestelyjen mukaisesti, mutta lisäksi toisen sarjan jokaiseen seokseen lisätään ATUa lopullisena pitoisuutena 11,6 mg/l. Tämän pitoisuuden on osoitettu inhiboivan nitrifikaation täydellisesti lietteessä, jonka kiintoainepitoisuus on enintään 3 000 mg/l (4). Hapenotto mitataan altistusjakson jälkeen; nämä suorat arvot edustavat pelkkää heterotrofista soluhengitystä, ja näiden arvojen sekä vastaavien kokonaissoluhengitystä ilmaisevien arvojen erotus ilmaisee nitrifikaatiota. Tämän jälkeen lasketaan eri inhibitioasteet.

Mittaukset

43.

Altistusjakson tai -jaksojen jälkeen siirretään näyte ensimmäisestä ilmastusastiasta happielektrodikennoon (lisäyksen 2 kuva 1) ja liuenneen hapen pitoisuus mitataan välittömästi. Useita elektrodeja sisältävää järjestelmää käytettäessä mittaukset voidaan tehdä samanaikaisesti. Sekoittaminen (päällystetyllä magneetilla) samalla nopeudella, jolla elektrodi on kalibroitu, on välttämätöntä, jotta anturi varmasti reagoi mahdollisimman nopeasti muuttuviin happipitoisuuksiin ja mittausastiasta voidaan tehdä säännöllisiä ja toistettavissa olevia happimittauksia. Eräissä happielektrodeissa käytettävä automaattinen sekoitinpuikko on useimmiten riittävä. Kenno huuhdellaan vedellä mittausten välillä. Näytteellä voidaan vaihtoehtoisesti täyttää magneettisekoittimella varustettu BOD-pullo (lisäyksen 3 kuva 2). Tämän jälkeen pullon kaulasta laitetaan sisään happianturi, jossa on sovitinholkki, ja magneettisekoitin käynnistetään. Molemmissa tapauksissa liuenneen hapen pitoisuutta on mitattava jatkuvasti ja kirjattava muistiin tietyn aikaa, tavallisesti 5–10 minuutin ajan tai siihen saakka, että happipitoisuus on alle 2 mg/l. Elektrodi poistetaan, seos kaadetaan takaisin ilmastusastiaan ja ilmastusta ja sekoittamista jatketaan, jos mittauksia on tarpeen tehdä pitemmän altistusajan jälkeen.

Testikemikaalin pitoisuuden toteaminen

44.

Toisinaan saattaa olla tarpeen mitata testikemikaalin pitoisuus testiastioissa. On syytä huomata, että jos käytettävänä kantaliuoksena on

heikosti veteen liukenevaa ainetta,

seosta, jonka ainesosat liukenevat veteen eri tavoin, tai

aineita, jotka liukenevat veteen hyvin, mutta pitoisuus kantaliuoksessa on lähellä vesiliukoisuuden maksimimäärää,

liuennut osa on tuntematon, ja testiastioihin siirrettävän testikemikaalin todellista pitoisuutta ei tunneta. Altistuksen kuvaamiseksi on tehtävä analyyttinen estimaatti testikemikaalin pitoisuuksista testiastioissa. Yksinkertaisuuden vuoksi analyyttinen estimaatti on syytä tehdä ennen inokulaatin lisäämistä. Koska testiastioihin siirtyvät vain liuenneet osat, mitatut pitoisuudet saattavat olla hyvin alhaisia.

45.

Aikaa vievien ja kalliiden analyysien välttämiseksi suositellaan, että testikemikaali yksinkertaisesti punnitaan suoraan testiastioihin ja alkuperäistä punnittua nimellispitoisuutta käytetään myöhemmissä laskelmissa. Testikemikaalin liuenneen, liukenemattoman tai adsorboituneen osan erottaminen ei ole tarpeen, sillä kaikki osat ilmenevät samoin myös jätevesien käsittelylaitokseen todellisissa käyttöolosuhteissa, ja osissa voi olla vaihtelua jäteveden koostumuksen mukaan. Testimenetelmän tarkoituksena on tehdä realistinen estimaatti pitoisuudesta, jossa inhibitiota ei tapahdu, eikä sillä voida tutkia yksityiskohtaisesti, mitkä osat vaikuttavat aktiivilietteen organismien inhibitioon. Lopuksi mainittakoon, että myös adsorptiiviset aineet on punnittava suoraan testiastioihin ja astiat on silanoitava, jotta ainetta menetetään adsorption vuoksi mahdollisimman vähän.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Hapenottotasojen laskeminen

46.

Hapenotto lasketaan mitattujen arvojen keskiarvosta, esimerkiksi happipitoisuutta ajan funktiona esittävän kuvaajan lineaarisesta osasta siten, että laskelmia tehdään vain happipitoisuuksista 2,0–7,0 mg/l, sillä suuremmat ja pienemmät pitoisuudet saattavat itsessään vaikuttaa kulutukseen. Nämä pitoisuudet ylittävien arvojen käyttämistä ei aina voi välttää, ja se voi olla tarpeen esimerkiksi silloin, kun soluhengitys on voimakkaasti estynyt ja tapahtuu erittäin hitaasti, tai jos soluhengitys jossakin tietyssä aktiivilietteessä on erityisen nopeaa. Tämä on hyväksyttävää, kunhan hapenottoa esittävässä kuvaajassa on pitkiä suoria osuuksia, eivätkä niiden gradientit muutu ylitettäessä raja-arvoja 2,0 mg/l tai 7,0 mg/l O2. Jos kuvaajassa on mutkia, tämä tarkoittaa, että mittausjärjestelmä on stabiloitumassa tai hapenotto muuttumassa, eikä näitä kohtia käytetä soluhengitystason laskemisessa. Hapenotto ilmaistaan milligrammoina litrassa tuntia kohti (mg/lh) tai milligrammoina yhtä kuivalietegrammaa kohti tunnissa (mg/gh). Hapenkulutus R (mg/lh) voidaan laskea tai interpoloida havaittua happipitoisuuden laskua esittävän kuvaajan lineaarisesta osasta käyttämällä yhtälöä 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

jossa

Q1

on happipitoisuus lineaarisen osan valitun kohdan alussa (mg/l);

Q2

on happipitoisuus lineaarisen osan valitun kohdan lopussa (mg/l);

Δt

on näiden kahden mittauksen välillä kulunut aika (min).

47.

Ominaissoluhengitystaso (Rs) ilmaistaan lietteen yhtä kuivapainogrammaa kohti kulutetun hapen määränä tunnissa (mg/gh) käyttämällä yhtälöä 2:

Rs = R/SS

(2)

jossa SS on testiseoksen kiintoainepitoisuus (g/l).

48.

R:n yhdisteltävissä olevat indeksit ovat seuraavat:

S

ominaistaso

T

kokonaissoluhengitystaso

N

nitrifikaatiosoluhengityksestä johtuva taso

H

heterotrofisesta soluhengityksestä johtuva taso

A

abioottisista prosesseista johtuva taso

B

nollakokeisiin perustuva taso (keskiarvo)

Nitrifikaatiosta johtuvan hapenoton laskeminen

49.

Kokonaissoluhengityksen (RT), nitrifikaatiosoluhengityksen (RN) sekä heterotrofisen soluhengityksen (RH) välinen suhde esitetään yhtälössä 3:

RN = RT – RH

(3)

jossa

RN

on nitrifikaatiosta johtuva hapenotto (mg/lh);

RT

on hapenoton taso mitattuna nollanäytteistä (eivät sisällä ATUa; FB) (mg/lh)

RH

on hapenoton taso mitattuna nollanäytteistä (lisätty ATUa; FN) (mg/lh).

50.

Tämä suhde on voimassa nollanäytteille (RNB, RTB, RHB), abioottisille kontrolleille (RNA, RTA, RHA) sekä testikemikaaleja sisältäville analyyseille (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Ominaissoluhengitystasot saadaan seuraavista yhtälöistä:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Jos RN on alustavassa testissä merkityksetön (esimerkiksi < 5 % RT-arvosta nollanäytteissä), voidaan olettaa, että heterotrofinen hapenotto vastaa kokonaishapenottoa, eikä nitrifikaatiota esiinny. Aktiivilietettä on hankittava toisesta lähteestä, jos testeillä halutaan tutkia vaikutusta heterotrofisiin ja nitrifioiviin mikro-organismeihin. Varsinainen testi tehdään, jos havaitaan merkkejä estyneestä hapenotosta testikemikaalin eri pitoisuuksia käytettäessä.

Prosentuaalisen inhibition laskeminen

52.

Hapenkulutuksen kokonaistason prosentuaalinen inhibitio IT testikemikaalin eri pitoisuuksilla saadaan yhtälöstä 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Heterotrofisen hapenkulutuksen prosentuaalinen inhibitio IH testikemikaalin eri pitoisuuksilla saadaan vastaavasti yhtälöstä 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] / 100 %

(8)

54.

Hapenkulutuksen nitrifikaatiosta johtuva inhibitio IN eri pitoisuuksilla saadaan yhtälöstä 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Hapenkulutuksen prosentuaalinen inhibitio piirretään testikemikaalin pitoisuuden logaritmin funktiona (inhibitiokäyrä; ks. lisäyksen 4 kuva 3). Inhibitiokäyrät piirretään erikseen jokaiselle kolmen tunnin ilmastusjaksolle tai 30 minuutin lisäajan jälkeen. Testikemikaalin pitoisuus, joka inhiboi hapenottoa 50 % (EC50), lasketaan tai interpoloidaan käyrästä. Jos käytössä on sopivaa dataa, voidaan laskea tai interpoloida EC50:n 95 prosentin luottamusvälit, käyrän kaltevuus sekä sopivat arvot, jotka ilmaisevat inhibition alkamishetken (esimerkiksi EC10 tai EC20) sekä inhibitiovälin päättymisen (esimerkiksi EC80 tai EC90).

56.

On syytä huomata, että tuloksissa usein havaitun vaihtelun vuoksi monissa tapauksissa riittänee, kun tulokset lisäksi ilmaistaan suuruusjärjestyksessä esimerkiksi seuraavalla tavalla:

EC50

< 1 mg/l

EC50

1–10 mg/l

EC50

10–100 mg/l

EC50

> 100 mg/l

Tulosten tulkinta

ECx

57.

ECx-arvot, mukaan lukien niitä koskevat parametrin 95 prosentin luottamusvälit, lasketaan sopivien tilastollisten menetelmien avulla (esimerkiksi tilastollinen koestus, logistinen funktio tai Weibullin funktio, viritetty Spearmanin ja Kärberin menetelmä tai yksinkertainen interpolointi (11)). ECx saadaan lisäämällä yhtälöön kontrollin keskiarvon x prosenttia vastaava arvo. Jos halutaan laskea EC50 tai jokin muu ECx-arvo, käsittelyä edeltävälle keskiarvolle (x) olisi tehtävä regressioanalyysi.

NOEC-estimointi

58.

Jos tilastollisella analyysilla on tarkoitus määrittää NOEC-arvo, astiakohtaiset tilastot (yksittäisiä astioita pidetään rinnakkaisnäytteinä) ovat tarpeen. Tässä käytetään sopivia tilastollisia menetelmiä, jotka perustuvat OECD:n asiakirjaan Document on Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). Yleensä testikemikaalin haitallisia vaikutuksia verrattuna kontrolliin tutkitaan käyttämällä yksisuuntaista (pienempää) hypoteesitestausta, jossa p ≤ 0,05.

Testiraportti

59.

Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:

 

Testikemikaali

yleisnimi, kemiallinen nimi, CAS-numero, puhtaus;

testikemikaalin fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (esimerkiksi log Kow, vesiliukoisuus, höyrynpaine, Henryn vakio (H) sekä mahdolliset tiedot testikemikaalin kulkeutumisesta, esimerkiksi adsorboituminen aktiivilietteeseen);

 

Testijärjestelmä

hankintapaikka, jäteveden käsittelylaitoksen toimintaolosuhteet ja sille saapuva tulovesi, pitoisuus, aktiivilietteen esikäsittely ja hoitotapa;

 

Testiolosuhteet

testilämpötila, pH testin aikana sekä altistusvaiheen tai -vaiheiden kesto;

 

Tulokset

kontrollien ominaishapenkulutus (mg O2/(g lietettä × h);

kaikki mitatut tiedot, inhibitiokäyrä tai -käyrät sekä EC50:n laskentamenetelmä;

EC50 sekä mahdollisuuksien mukaan 95 prosentin luottamusvälit, mahdollisesti EC20 ja EC80; mahdollisesti NOEC sekä käytetyt tilastolliset menetelmät, jos EC50:n määrittäminen ei ole mahdollista;

kokonaisinhibitiota sekä tarvittaessa heterotrofista ja nitrifikaatioinhibitiota koskevat tulokset;

abioottinen hapen yhteytys fysikaalis-kemiallisessa kontrollissa (jos käytössä);

vertailukemikaalin nimi ja sillä saadut tulokset;

kaikki tarkkailutulokset ja tuloksiin mahdollisesti vaikuttavat poikkeamat standarditestausmenetelmästä.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245–261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27–39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471–483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515–524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556–1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

Lisäys 1

Määritelmät

Tässä testimenetelmässä sovelletaan seuraavia määritelmiä:

Kemikaali : aine tai seos.

ECx (Effect concentration for x % effect = vaikuttava pitoisuus, joka aiheuttaa × prosenttia muutoksia) : Pitoisuus, joka aiheuttaa x prosentin suuruisen vaikutuksen testiorganismeihin tietyn altistusjakson aikana kontrolliin verrattuna. Esimerkiksi EC50-arvo on pitoisuus, jonka on arvioitu aiheuttavan vaikutuksen testiominaisuuteen 50 prosentilla altistuneesta populaatiosta tietyn altistusjakson aikana.

NOEC (no observed effect concentration = pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta) : testikemikaalin pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia. Tässä testissä NOEC-arvoa vastaavalla pitoisuudella ei ole tilastollisesti merkittävää vaikutusta (p < 0,05) tietyn altistusajan kuluessa kontrolliin verrattuna.

Testikemikaali : tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.

Lisäys 2

Kuva 1:   Esimerkkejä mittausyksiköstä

Image

Selitykset

1

Aktiiviliete

2

Synteettinen ravinneliuos

3

Testikemikaali

4

Ilmaa

5

Sekoitusastia

6

Magneettisekoitin

7

Hapenmittauskenno

8

Happielektrodi

9

Hapenmittausinstrumentti

10

Piirturi

Lisäys 3

Kuva 2:   Esimerkki mittausyksiköstä BOD-pulloa käytettäessä

Image

Selitykset

1

Testiastia

2

Happielektrodi

3

Hapenmittausinstrumentti

Lisäys 4

Kuva 3:   Esimerkki inhibitiokäyristä

Image

Selitykset

X

3,5-dikloorifenolin pitoisuus (mg/l)

Y

inhibitio ( %)

Image

heterotrofisen soluhengityksen inhibitio nitrifioivaa lietettä käytettäessä

Image

nitrifikaation inhibitio nitrifioivaa lietettä käytettäessä.

5)

Korvataan luku C.26 seuraavasti:

C.26   LIMASKOJEN (LEMNA-LAJIEN) KASVUNESTYMISTESTI

JOHDANTO

1.

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 221 (2006). Tällä testimenetelmällä arvioidaan kemikaalien myrkyllisyyttä Lemna-sukua (limaskat) oleville makean veden kasveille. Menetelmä perustuu olemassa oleviin menetelmiin (1), (2), (3), (4), (5), (6), mutta niitä on muutettu viimeaikaisten tutkimustulosten ja keskeisiä kysymyksiä koskevien konsultointien pohjalta. Testimenetelmä on validoitu kansainvälisellä yhteistutkimuksella (ring test) (7).

2.

Testimenetelmässä kuvataan myrkyllisyyden testausta, jossa käytetään Lemna gibba- ja Lemna minor -lajeja. Kumpaakin lajia on tutkittu laajalti ja käytetty edellä mainituissa standardeissa. Lemna-suvun lajien taksonomia on hankala, koska fenotyyppejä on monta. Vaikka Lemna-suvussa voi esiintyä geneettistä vaihtelevuutta vasteessa myrkyllisiin aineisiin, vaihtelevuuden syistä ei toistaiseksi ole saatavilla riittävästi tietoja, joiden pohjalta voitaisiin suositella tietyn kloonin käyttöä tässä testimenetelmässä. On syytä huomata, että testiä ei suoriteta aksenikaalisesti, vaan testin eri vaiheissa toteutetaan toimia, joilla muista eliöistä johtuva kontaminaatio pyritään pitämään mahdollisimman pienenä.

3.

Testimenetelmässä kuvataan yksityiskohtaisesti testausta, jossa testiliuos vaihtuu (semistaattinen ja läpivirtausmenetelmä) tai ei vaihdu (staattinen menetelmä). Testin tavoitteista ja sääntelyvaatimuksista riippuen on suositeltavaa harkita semistaattisten tai läpivirtausmenetelmien käyttöä muun muassa sellaisten kemikaalien testauksessa, jotka häviävät nopeasti liuoksesta haihtumisen, valohajoamisen, saostumisen tai biohajoavuuden vuoksi. Tästä annetaan tarkempia ohjeita kirjallisuusviitteessä (8).

4.

Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

TESTIN PERIAATE

5.

Lemna-sukuun kuuluvien eksponentiaalisesti kasvavien kasviviljelmien annetaan kasvaa seitsemän päivän ajan monokulttuureina testikemikaalin eri pitoisuuksissa. Testin tavoitteena on kvantifioida testikemikaaliin liittyvät vaikutukset kasvien kasvuun tämän ajan kuluessa tiettyjen mittausmuuttujien arvioinnin perusteella. Ensisijaisena mittausmuuttujana on versojen lukumäärä. Lisäksi mitataan ainakin yhtä muuta mittausmuuttujaa (versojen kokonaispinta-alaa, kuivapainoa tai tuorepainoa), koska eräät kemikaalit voivat vaikuttaa huomattavasti enemmän muihin mittausmuuttujiin kuin versojen lukumäärään. Testikemikaaliin liittyvien vaikutusten kvantifioimiseksi testiliuoksissa tapahtunutta kasvua verrataan kontrolliryhmässä tapahtuneeseen kasvuun, minkä jälkeen määritetään pitoisuus, jossa kasvu estyy ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan ECx-arvona (esimerkiksi EC50).

6.

Testin loppupisteenä on kasvun estyminen, joka ilmenee mittausmuuttujan logaritmisesta kasvusta (keskimääräisestä spesifisestä kasvunopeudesta) altistusaikana. Testiliuossarjassa mitattujen keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien avulla määritetään pitoisuus, jossa kasvunopeus vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan ErCx-arvona (esimerkiksi ErC50).

7.

Toinen testimenetelmässä käytetty vastemuuttuja on tuotos, jota voidaan tarvita joissakin maissa erityisten sääntelyvaatimusten täyttämiseksi. Sillä tarkoitetaan altistusajan lopussa mitattua mittausmuuttujien arvoa, josta on vähennetty altistusajan alussa mitattu mittausmuuttujien arvo. Testiliuossarjassa mitatun tuotoksen avulla määritetään pitoisuus, jossa tuotos vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan EyCx-arvona (esimerkiksi EyC50).

8.

Tilastollisesti voidaan määrittää myös pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) sekä pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC).

TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA

9.

Käytettävissä on oltava analyysimenetelmä, jolla testiviljelyaineessa oleva testikemikaali voidaan kvantifioida riittävän herkästi.

10.

Testikemikaalia koskevia tietoja, joista voi olla hyötyä päätettäessä testiolosuhteista, ovat rakennekaava, puhtaus, vesiliukoisuus, stabiilius vedessä ja valossa, pKa, Kow, höyrynpaine ja biohajoavuus. Vesiliukoisuutta ja höyrynpainetta voidaan käyttää laskettaessa Henryn vakiota, josta voidaan päätellä, onko todennäköistä, että testikemikaalia häviää merkittävästi testin aikana. Tämän perusteella voidaan päättää, vaativatko tällaiset häviöt erityistoimia. Jos testikemikaalin liukoisuutta ja stabiiliutta koskevat tiedot ovat epäluotettavia, nämä ominaisuudet olisi arvioitava testiolosuhteissa, toisin sanoen siinä viljelyaineessa, lämpötilassa ja valaistuksessa, joita testissä käytetään.

11.

Jos on erityisen tärkeää säädellä testiviljelyaineen pH:ta, esimerkiksi testattaessa metalleja tai hydrolyyttisesti epästabiileja kemikaaleja, on suositeltavaa lisätä testiviljelyaineeseen puskuria (ks. 21 kohta). Kirjallisuusviitteessä (8) annetaan lisäohjeita sellaisten kemikaalien testauksesta, joiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet vaikeuttavat niiden testaamista.

TESTIN VALIDITEETTI

12.

Jotta testi olisi validi, versojen lukumäärän on kaksinkertaistuttava kontrolliviljelmässä alle 2,5 päivässä (60 tunnissa), mikä vastaa noin seitsenkertaista kasvua seitsemän päivän kuluessa, kun keskimääräinen spesifinen kasvunopeus on 0,275 päivää kohden. Käytettäessä tässä testimenetelmässä kuvattuja testiliuoksia ja -olosuhteita tämä vaatimus voidaan täyttää käyttämällä staattista testausta (5). Vaatimus voidaan oletettavasti täyttää myös sellaisissa testiolosuhteissa, joissa käytetään semistaattista tai läpivirtausmenetelmää. Kaksinkertaistumisajan laskemista käsitellään tarkemmin 49 kohdassa.

VERTAILUKEMIKAALI

13.

Testimenetelmä voidaan tarkistaa testaamalla vertailukemikaali (-kemikaalit), kuten 3,5-dikloorifenoli, jota on käytetty kansainvälisessä yhteistutkimuksessa (7). Vertailukemikaali on suotavaa testata vähintään kahdesti vuodessa tai, jos testausta tehdään harvemmin, rinnakkain määritettäessä testikemikaalin myrkyllisyyttä.

MENETELMÄN KUVAUS

Välineet

14.

Kaikkien välineiden, jotka joutuvat kosketuksiin testiliuosten kanssa, on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia. Viljelyyn ja testaukseen käytettävien lasiastioiden on oltava steriilejä, ja ne on puhdistettava kemiallisista epäpuhtauksista, jotka voivat päästä testiviljelyaineeseen. Koeastioiden on oltava niin tilavia, että eri kolonioiden versot voivat kasvaa kontrolliastioissa peittämättä toisiaan testin lopussa. Ei ole haitaksi, vaikka juuret ulottuvat testiastioiden pohjaan, mutta on suositeltavaa, että kaikki koeastiat ovat syvyydeltään vähintään 20 mm ja tilavuudeltaan vähintään 100 ml. Koeastioiden valinnalla ei ole muuten ratkaisevaa merkitystä, jos nämä vaatimukset täyttyvät. Sopivan kokoiset dekantterilasit, kiteytysmaljat ja lasiset petrimaljat ovat kaikki osoittautuneet käyttökelpoisiksi. Haihtumisen ja tahattoman kontaminaation minimoimiseksi koeastiat on peitettävä, mutta samalla on huolehdittava riittävästä ilmanvaihdosta. Koeastiat ja varsinkaan niiden sulkimet eivät saa varjostaa tai muuttaa valon spektriominaisuuksia.

15.

Viljelmiä ja koeastioita ei saa säilyttää toistensa kanssa. Sen vuoksi on paras käyttää erillisiä ilmastoituja kasvatuskaappeja, inkubaattoreita tai huoneita. Valaistuksen ja lämpötilan on oltava säädettävissä, ja ne on pidettävä tasaisina (ks. 35–36 kohdat).

Koe-eliö

16.

Testissä käytetään Lemna gibba- tai Lemna minor -lajia. Myrkyllisyyden testauksessa käytettyjä limaskalajeja kuvataan lyhyesti lisäyksessä 2. Kasvimateriaali voidaan hankkia kantakokoelmasta, toisesta laboratoriosta tai luonnosta. Jos kasvit kerätään luonnosta, niitä on viljeltävä testissä käytettävässä viljelyaineessa vähintään kahdeksan viikkoa ennen käyttöä. Paikoissa, joista alkuviljelmien kasvit kerätään, ei saa olla ilmeisiä kontaminaatiolähteitä. Jos kasvit hankitaan toisesta laboratoriosta tai kantakokoelmasta, niitä on viljeltävä vastaavalla tavalla kolmen viikon ajan. Kasvimateriaalin lähde sekä testauksessa käytettävät lajit ja klooni (jos tiedossa) on aina ilmoitettava.

17.

Testissä on käytettävä monokulttuureita, joissa ei ole muita organismeja, kuten leviä tai alkueläimiä, näkyvinä epäpuhtauksina. L. minor -lajin terveet kasvit ovat kolonioina, joissa on 2–5 versoa, kun taas L. gibba -lajin terveissä kolonioissa voi olla jopa seitsemän versoa.

18.

Testissä käytettävät kasvit on valittava huolellisesti, koska niiden laatu ja yhtenäisyys vaikuttavat merkittävästi testin tulokseen. Testissä on käytettävä nuoria, nopeasti kasvavia kasveja, joissa ei ole näkyviä vaurioita tai värimuutoksia (kloroosia). Hyvälaatuisen viljelmän tunnistaa siitä, että siinä esiintyy runsaasti vähintään kahdesta versosta koostuvia kolonioita. Jos viljelmässä on monia yksittäisiä versoja, se on merkki ympäristörasituksesta, kuten ravinteiden puutteesta, eikä testissä saa käyttää tällaisista viljelmistä peräisin olevaa kasvimateriaalia.

Viljely

19.

Viljelmien ylläpidon helpottamiseksi (esimerkiksi silloin, kun Lemna-testejä ei aiota tehdä tiettynä aikana) niitä voidaan säilyttää normaalia heikommassa valaistuksessa ja alhaisemmassa lämpötilassa (4–10 °C). Viljelyä käsitellään tarkemmin lisäyksessä 3. Jos viljelmässä näkyy selviä merkkejä levien ja muiden eliöiden aiheuttamasta kontaminaatiosta, Lemna-versoista on mahdollisesti otettava osanäyte, jolle tehdään pintasterilointi, jonka jälkeen se siirretään tuoreeseen viljelyaineeseen (ks. lisäys 3). Jäljelle jäävä kontaminoitunut viljelmä on heitettävä pois.

20.

Riittävä määrä kolonioita siirretään aseptisesti vähintään seitsemän päivää ennen testausta tuoreeseen steriiliin viljelyaineeseen, ja kolonioita viljellään 7–10 päivän ajan testiolosuhteissa.

Testiviljelyaine

21.

Lemna minor- ja Lemna gibba -lajeja varten suositetaan erilaisia viljelyaineita, joita kuvataan jäljempänä. On syytä harkita huolellisesti pH-puskurin lisäämistä testiviljelyaineeseen (MOPS (4-morfoliinipropaanisulfonihappo, CAS-numero: 1132-61-2) L. minor -lajin viljelyaineeseen ja NaHCO3 L. gibba -lajin viljelyaineeseen), jos testiviljelyaineen epäillään voivan reagoida testikemikaalin kanssa ja vaikuttaa sen myrkyllisyyden ilmentymiseen. Steinbergin viljelyainetta (9) voidaan käyttää, jos validiteettivaatimukset täyttyvät.

22.

Ruotsalaisen standardin (SIS) mukaisen Lemna-viljelyaineen muunnosta suositetaan käytettäväksi testauksessa, jossa viljellään ja käytetään L. minor -lajia. Tämän viljelyaineen koostumus esitetään lisäyksessä 4.

23.

Lisäyksessä 4 kuvattua 20X-AAP-viljelyainetta suositetaan käytettäväksi testauksessa, jossa viljellään ja käytetään L. gibba -lajia.

24.

L. minor -lajille soveltuu myös lisäyksessä 4 kuvattu Steinbergin viljelyaine, mutta sitä voidaan käyttää myös L. gibba -lajin viljelyssä, jos validiteettivaatimukset täyttyvät.

Testiliuokset

25.

Testiliuokset valmistetaan yleensä laimentamalla kantaliuosta. Testikemikaalin kantaliuokset valmistetaan tavallisesti liuottamalla kemikaali viljelyaineeseen.

26.

Testikemikaalin suurin testattu pitoisuus ei yleensä saa ylittää kyseisen kemikaalin vesiliukoisuutta testiolosuhteissa. On kuitenkin huomattava, että Lemna-suvun lajit kelluvat pinnalla ja voivat altistua kemikaaleille, jotka kerääntyvät veden ja ilman rajapintaan (esimerkiksi huonosti veteen liukenevat tai hydrofobiset kemikaalit taikka pinta-aktiiviset kemikaalit). Tällaisissa olosuhteissa kasvit altistuvat muille kuin liuoksessa olevalle aineille, ja testipitoisuudet voivat testikemikaalin ominaisuuksista riippuen ylittää vesiliukoisuuden. Jos testikemikaali liukenee huonosti veteen, voi olla tarpeen valmistaa kyseisestä kemikaalista väkevä kantaliuos tai dispersio käyttämällä orgaanista liuotinta tai dispergointiainetta, joilla voidaan helpottaa tarkkojen testikemikaalimäärien lisäämistä testiviljelyaineeseen sekä testikemikaalin dispersiota ja liukenemista. Tällaisten aineiden käyttöä on vältettävä mahdollisimman pitkälle. Jos liuottimia tai dispergointiaineita käytetään apuna testiliuosten valmistuksessa, niistä ei saa aiheutua fytotoksisuutta. Asetoni ja dimetyyliformamidi ovat esimerkkejä yleisesti käytetyistä liuottimista, jotka eivät aiheuta fytotoksisuutta pitoisuuden ollessa enintään 100 μl·l. Jos liuotinta tai dispergointiainetta käytetään, sen lopullinen pitoisuus on ilmoitettava ja pidettävä mahdollisimman pienenä (≤ 100 μl/l), ja liuoksen tai dispergointiaineen pitoisuuden on oltava sama kaikissa käsitellyissä ja kontrolliliuoksissa. Dispergointiaineiden käytöstä annetaan lisäohjeita kirjallisuusviitteessä (8).

Testi- ja kontrolliryhmät

27.

Sopivat testipitoisuudet on helpompi valita, jos testikemikaalin myrkyllisyydestä Lemna-lajeille on saatavilla aiempia tietoja esimerkiksi alustavista pitoisuusalueen määrityskokeista. Lopullisessa myrkyllisyystestissä on yleensä oltava vähintään viisi testipitoisuutta, jotka muodostavat geometrisen sarjan. Testipitoisuuksien suhdeluvun ei tulisi olla suurempi kuin 3,2, mutta suurempikin suhdeluku sallitaan, jos pitoisuus-vastekäyrä on laakea. Vähemmän kuin viiden pitoisuuden käyttö on perusteltava. Jokaisesta testipitoisuudesta on tehtävä vähintään kolme toistoa.

28.

Valittaessa testin pitoisuusaluetta (pitoisuusalueen määritystä ja/tai lopullista myrkyllisyystestiä varten) on otettava huomioon seuraavat näkökohdat:

ECx-pitoisuuden määrittämiseksi testipitoisuudet on valittava siten, että ECx-arvo on kyseisellä pitoisuusalueella, jotta saavutettaisiin riittävä luottamustaso. Esimerkiksi EC50-pitoisuutta arvioitaessa suurimman testipitoisuuden on ylitettävä EC50-arvo. Jos EC50-arvo on testin pitoisuusalueen ulkopuolella, vastaavat luottamusvälit ovat suuria, jolloin voi olla mahdotonta arvioida mallin tilastollista sopivuutta.

Jos tavoitteena on arvioida LOEC- tai NOEC-pitoisuus, pienimmän testipitoisuuden on oltava niin pieni, että kasvu ei ole merkittävästi vähäisempää kuin kontrolliryhmässä. Suurimman testipitoisuuden on myös oltava niin suuri, että kasvu on huomattavasti vähäisempää kuin kontrolliryhmässä. Muussa tapauksessa testi on toistettava käyttämällä toista pitoisuusaluetta (jollei suurin pitoisuus ole liukoisuusrajalla tai jollei se ole suurin vaadittu rajapitoisuus, esimerkiksi 100 mg/l).

29.

Jokaiseen testiin on kuuluttava kontrolliryhmä, jossa ravinneliuos, versojen ja kolonioiden lukumäärä, ympäristöolosuhteet ja menettelyt ovat samat kuin testiryhmässä mutta ilman testikemikaalia. Jos apuna käytetään liuotinta tai dispergointiainetta, testiin on kuuluttava ylimääräinen kontrollikäsittely, jossa liuottimen tai dispergointiaineen pitoisuus on sama kuin testikemikaalia sisältävissä astioissa. Toistoissa kontrolliastioiden (ja liuotinta käytettäessä liuotinta sisältävien astioiden) lukumäärän on oltava vähintään yhtä suuri kuin kunkin testipitoisuuden testaamiseen käytettyjen astioiden lukumäärä ja mielellään kaksinkertainen.

30.

Jos NOEC-pitoisuutta ei tarvitse määrittää, testimenetelmää voidaan muuttaa lisäämällä pitoisuuksien määrää ja vähentämällä toistojen määrää pitoisuutta kohden. Kontrollitoistoja on kuitenkin oltava vähintään kolme.

Altistus

31.

Koloniat, jotka koostuvat 2–4 näkyvästä versosta, siirretään siirrosviljelmästä ja jaetaan satunnaisesti koeastioihin aseptisissa olosuhteissa. Jokaisessa koeastiassa on oltava yhteensä 9–12 versoa. Versoja ja kolonioita on oltava yhtä monta kaikissa koeastioissa. Tästä testimenetelmästä saadut kokemukset ja yhteistutkimusten (ring tests) tulokset ovat osoittaneet, että jos jokaista käsittelyä kohden tehdään kolme toistoa, joissa kaikissa on aluksi 9–12 versoa, käsittelyjen välillä voidaan jo havaita kasvueroja, jotka vastaavat 4–7 prosentin inhibitiota, jos se lasketaan kasvunopeuden perusteella (ja 10–15 prosentin inhibitiota, jos se lasketaan tuotoksen perusteella) (7).

32.

Koeastiat on sijoitettava inkubaattoriin satunnaistetusti, jotta valon voimakkuuden ja lämpötilan spatiaalisista eroista johtuvat vaikutukset olisivat mahdollisimman pienet. Vaatimuksena on myös, että jokaisella havainnointikerralla käytetään lohkoittaista järjestystä tai astioiden satunnaistettua uudelleensijoittelua (joka voidaan tehdä useamminkin)

33.

Jos alustava stabiiliustesti osoittaa, että testikemikaalin pitoisuutta ei voida pitää yllä testin ajan eli 7 päivää (toisin sanoen mitattu pitoisuus vähenee alle 80 prosenttiin mitatusta alkupitoisuudesta), on suositeltavaa käyttää semistaattista testijärjestelmää. Siinä tapauksessa koloniat on altistettava vasta valmistetuille testi- ja kontrolliliuoksille ainakin kahdesti testin aikana (esimerkiksi päivinä 3 ja 5). Testikemikaalin stabiiliudesta riippuu, kuinka usein koloniat on altistettava vastavalmistetulle viljelyaineelle. Testattaessa hyvin epästabiileja tai haihtuvia kemikaaleja pitoisuuksien pitäminen lähes vakioina voi vaatia useampia altistuskertoja. Joissakin tapauksissa voi olla tarpeen käyttää läpivirtausmenetelmää (8), (10).

34.

Tähän testimenetelmään ei kuulu versojen altistaminen ruiskuttamalla, mutta sitä käsitellään kirjallisuusviitteessä (11).

Inkubaatio-olosuhteet

35.

Testissä käytetään tasaista lämpimän- tai kylmänvalkoista loistevaloa, jotta valon voimakkuudeksi saadaan 85–135 μE · m– 2s– 1, kun se mitataan fotosyynteesille suotuisalla aallonpituusalueella (400–700 nm) pisteissä, jotka ovat samalla etäisyydellä valolähteestä kuin Lemna-versot (tämä vastaa voimakkuusaluetta 6 500–10 000 luksia). Valon voimakkuus ei saa vaihdella enempää kuin ± 15 prosenttia testialueen yläpuolella. Valoilmaisin- ja valonmittausmenetelmä ja erityisesti anturityyppi vaikuttavat mittausarvoon. Pallomaiset anturit (jotka reagoivat valoon mistä tahansa kulmasta mittaustason ylä- ja alapuolelta) ja kosinikorjaimella varustetut anturit (jotka reagoivat valoon mistä tahansa kulmasta mittaustason yläpuolelta) ovat suositeltavampia kuin yksisuuntaiset anturit. Ensin mainitut antavat suurempia lukemia mitattaessa tässä kuvatun kaltaista monipisteistä valonlähdettä.

36.

Lämpötilan on oltava koeastioissa 24 ± 2 °C. Yleensä kontrolliviljelyaineen pH-arvo saa kokeen aikana vaihdella enintään 1,5 yksikön verran. Tätä suurempi poikkeama ei kuitenkaan mitätöi testiä, jos validiteettivaatimusten voidaan osoittaa täyttyvän. Erityistapauksissa, esimerkiksi testattaessa epästabiileja kemikaaleja tai metalleja, on kiinnitettävä erityistä huomiota pH:n vaihteluun. Tästä annetaan lisäohjeita kirjallisuusviitteessä (8).

Kesto

37.

Testi päättyy seitsemän päivän kuluttua kasvien siirtämisestä koeastioihin.

Mittaukset ja analyyttiset määritykset

38.

Testin alussa lasketaan ja kirjataan koeastioissa olevien versojen lukumäärä. Tällöin on laskettava kaikki esiin työntyvät ja selvästi näkyvät versot. Normaaleilta ja epänormaaleilta vaikuttavien versojen määrä lasketaan testin alussa, vähintään joka kolmas päivä altistuksen aikana (eli ainakin kaksi kertaa seitsemän päivän jakson aikana) sekä kokeen päättyessä. Kasvien kehityksessä tapahtuvat muutokset rekisteröidään. Niitä ovat esimerkiksi versojen koossa ja ulkonäössä tapahtuvat muutokset, merkit nekroosista, kloroosista tai kupruisuudesta, kolonian hajoaminen tai kelluvuuden heikkeneminen sekä muutokset juurien pituudessa ja ulkonäössä. Lisäksi on rekisteröitävä testiviljelyaineen erityiset ominaisuudet (esimerkiksi liukenemattoman materiaalin esiintyminen ja levien kasvu koeastiassa).

39.

Versojen lukumäärän laskemisen lisäksi testin aikana arvioidaan myös testikemikaalin vaikutuksia yhteen (tai useampaan) seuraavista mittausmuuttujista:

i)

versojen kokonaispinta-ala;

ii)

kuivapaino;

iii)

tuorepaino.

40.

Versojen kokonaispinta-alaan liittyy se etu, että se voidaan määrittää jokaisesta testi- ja kontrolliastiasta testin alussa, sen aikana ja sen lopussa. Kuiva- tai tuorepaino on määritettävä testin alussa siirrosviljelmästä otetusta näytteestä, jonka on oltava edustava näyte testin käynnistämiseen käytetystä materiaalista, sekä testin lopussa jokaisesta testi- ja kontrolliastiasta otetusta kasvimateriaalista. Jos versojen pinta-alaa ei mitata, on parempi mitata kuivapaino tuorepainon sijasta.

41.

Versojen kokonaispinta-ala, kuivapaino ja tuorepaino voidaan määrittää seuraavasti:

i)

Versojen kokonaispinta-ala: Kaikkien kolonioiden versojen kokonaispinta-ala voidaan määrittää kuva-analyysillä. Koeastiasta ja kasveista voidaan ottaa siluettikuva videokameralla (esimerkiksi sijoittamalla koeastia valolaatikon päälle), ja näin saatu kuva digitalisoidaan. Koeastiassa olevien versojen kokonaispinta-ala voidaan määrittää tekemällä kalibrointi tunnetun pinta-alan tasokuvioiden avulla. Tällöin on huolehdittava siitä, että koeastian reunan aiheuttamat vaikutukset eivät vääristä määritystä. Vaihtoehtoisena mutta työläämpänä menetelmänä on valokuvata koeastiat ja kasvit, leikata näin saatu kolonioiden siluetti ja määrittää niiden pinta-ala käyttämällä lehtialan analysaattoria. Muutkin tekniikat voivat olla käyttökelpoisia (esimerkiksi kolonioiden siluetin pinta-alan ja tietyn pinta-alayksikön välinen painosuhde paperin painon mukaan laskettuna).

ii)

Kuivapaino: Jokaisesta koeastiasta kerätään kaikki koloniat, jotka huuhdotaan tislatulla tai deionisoidulla vedellä. Kolonioissa oleva ylimääräinen vesi imeytetään paperiin, minkä jälkeen niitä kuivataan 60 °C:ssa, kunnes niiden paino on vakio. Juurenpalaset on otettava mukaan. Kuivapaino on ilmoitettava vähintään 0,1 mg:n tarkkuudella.

iii)

Tuorepaino: Kaikki koloniat siirretään ennalta punnittuihin polystyreeniputkiin (tai muihin inerttiä materiaalia oleviin putkiin), joiden pyöreissä pohjissa on pieniä (1 mm) aukkoja. Putkia sentrifugoidaan kierrosluvulla 3 000 rpm huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Putket, jotka sisältävät näin kuivatut koloniat, punnitaan uudelleen, ja tuorepaino lasketaan vähentämällä punnitustuloksesta tyhjän putken paino.

Mittausten ja analyyttisten määritysten tiheys

42.

Käytettäessä staattista testimenetelmää kunkin käsittelyn liuoksen pH on mitattava testin alussa ja lopussa. Jos testimenetelmä on semistaattinen, pH on mitattava jokaisesta erästä ’tuoretta’ testiliuosta ennen kutakin vaihtoa ja myös vastaavista ’käytetyistä’ liuoksista.

43.

Valon voimakkuus kasvatuskaapissa, inkubaattorissa tai huoneessa on mitattava pisteistä, jotka ovat samalla etäisyydellä valolähteestä kuin Lemna-versot. Mittaukset on tehtävä ainakin kerran testin aikana. Viljelyaineen lämpötila surrogaattiastiassa, jota säilytetään kasvatuskaapissa, inkubaattorissa tai huoneessa samoissa olosuhteissa, on mitattava vähintään kerran päivässä.

44.

Testikemikaalin pitoisuudet määritetään testin aikana sopivin väliajoin. Staattisissa testeissä vähimmäisvaatimuksena on määrittää pitoisuudet testin alussa ja lopussa.

45.

Semistaattisissa testeissä, joissa testikemikaalin pitoisuuden ei oleteta pysyvän ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta, on analysoitava kaikki vastavalmistetut testiliuokset ja samat liuokset käytettyinä kunkin vaihdon yhteydessä (ks. 33 kohta). Kuitenkin niissä testeissä, joissa testikemikaalin mitattu alkupitoisuus ei ole ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta, mutta joissa voidaan antaa riittävä näyttö siitä, että alkupitoisuudet ovat toistettavissa ja stabiileja (toisin sanoen 80–120 prosenttia alkupitoisuudesta), kemialliset määritykset voidaan tehdä ainoastaan suurimmista ja pienimmistä testipitoisuuksista. Kaikissa tapauksissa on testikemikaalin pitoisuudet ennen vaihtoa määritettävä vain yhdestä toistossa käytetystä astiasta (tai kaikkien toistoissa käytettyjen astioiden yhdistetystä sisällöstä) kutakin testipitoisuutta kohden.

46.

Läpivirtaustestissä voidaan käyttää samanlaista näytteenottomenettelyä kuin semistaattisessa testissä ja tehdä analyysi testin alussa, puolivälissä ja lopussa, mutta ’käytettyjen’ liuosten mittaaminen ei ole aiheellista. Tämäntyyppisessä testissä laimenteen ja testikemikaalin tai testikemikaalin kantaliuoksen virtausnopeus on tarkistettava päivittäin.

47.

Jos on näyttöä siitä, että testattavan kemikaalin pitoisuus on pysynyt tyydyttävästi ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta tai mitatusta alkupitoisuudesta koko testin ajan, tulosten analysointi voi perustua nimellispitoisuuksiin tai mitattuihin alkupitoisuuksiin. Jos pitoisuus poikkeaa enemmän kuin ± 20 prosenttia nimellispitoisuudesta tai mitatusta alkupitoisuudesta, tulosten analysoinnin on perustuttava pitoisuuksien geometriseen keskiarvoon altistuksen aikana tai malleihin, jotka kuvaavat testikemikaalin pitoisuuden vähenemistä (8).

Raja-annostesti

48.

Joissakin tapauksissa, esimerkiksi silloin, kun alustava testi osoittaa, että testikemikaalilla ei ole myrkkyvaikutuksia pitoisuusarvoon 100 mg/l saakka tai siihen liukoisuusrajaan asti, joka testiaineella on testiviljelyaineessa (sen mukaan, kumpi näistä on pienempi), voidaan tehdä raja-annostesti, jossa verrataan yhden kontrolliryhmän ja yhden käsitellyn ryhmän vasteita (pitoisuudessa 100 mg/l tai liukoisuusrajaa vastaavassa pitoisuudessa). On erittäin suotavaa analysoida altistuspitoisuus rajatestin tueksi. Kaikki edellä kuvatut testiolosuhteet ja validiteettivaatimukset koskevat myös raja-annostestiä, lukuun ottamatta käsiteltyjen toistojen määrää, joka on kaksinkertaistettava. Kontrolli- ja käsitellyssä ryhmässä tapahtunutta kasvua voidaan analysoida Studentin t-testin kaltaisella tilastotutkimuksella, jossa verrataan keskiarvoja.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Kaksinkertaistumisaika

49.

Seuraavan kaavan avulla, jota sovelletaan kontrolliastioita koskeviin tietoihin, voidaan määrittää versojen lukumäärän kaksinkertaistumisaika (Td) ja varmistaa samalla, että testi täyttää tämän validiteettivaatimuksen (12 kohta):

Td = ln 2/μ

Kaavassa μ on keskimääräinen spesifinen kasvunopeus, joka lasketaan 54–55 kohdissa kuvatulla tavalla.

Vastemuuttujat

50.

Testin tarkoituksena on määrittää testikemikaalin vaikutukset Lemnan kasvuun. Tässä testimenetelmässä kuvataan kahta eri vastemuuttujaa, koska eri oikeudenkäyttöalueilla suositaan erilaisia käytänteitä ja noudatetaan erilaisia sääntelyvaatimuksia. Jotta testitulokset voitaisiin hyväksyä kaikilla oikeudenkäyttöalueilla, vaikutuksia olisi arvioitava käyttämällä molempia vastemuuttujia a ja b, joita kuvataan jäljempänä.

a)

Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus: Tämä vastemuuttuja lasketaan kontrolleista ja kustakin käsitellystä ryhmästä seuraavien kahden muuttujan avulla: versojen lukumäärän logaritmiarvossa tietyn (päivinä ilmaistun) ajan kuluessa tapahtunut muutos ja jonkin toisen mittausmuuttujan (versojen kokonaispinta-alan, kuivapainon tai tuorepainon) logaritmiarvossa tietyn (päivinä ilmaistun) ajan kuluessa tapahtunut muutos. Tätä kasvunopeutta kutsutaan joskus suhteelliseksi kasvunopeudeksi (12).

b)

Tuotos: Tämä vastemuuttuja lasketaan seuraavien kahden muuttujan avulla: versojen lukumäärän muutokset ja jonkin toisen mittausmuuttujan (versojen kokonaispinta-alan, kuivapainon tai tuorepainon) muutokset kontrolleissa ja kussakin käsitellyssä ryhmässä testin loppuun saakka.

51.

On syytä huomata, että näiden kahden vastemuuttujan avulla lasketut myrkyllisyysarvot eivät ole vertailukelpoisia, mikä on otettava huomioon käytettäessä testin tuloksia. Jos testiolosuhteet ovat tämän testimenetelmän mukaiset, keskimääräiseen spesifiseen kasvunopeuteen perustuvat ECx-arvot (ErCx) ovat yleensä suurempia kuin tuotokseen perustuvat arvot (EyCx), mikä johtuu niiden matemaattisista perusteista. Tätä ei pidä tulkita siten, että näiden kahden vastemuuttujan herkkyydet olisivat erilaiset, vaan arvojen välinen ero on puhtaasti matemaattinen. Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus perustuu yleiseen kasvumalliin, joka kuvaa limaskan eksponentiaalista kasvua rajoittamattomissa viljelmissä, joista toksisuus arvioidaan kasvunopeuteen kohdistuvien vaikutusten perusteella ottamatta huomioon kontrollin spesifisen kasvunopeuden absoluuttista tasoa, pitoisuus-vastekäyrän kaltevuutta tai testin kestoa. Tuotosta kuvaavaan vastemuuttujaan perustuvat tulokset riippuvat sen sijaan kaikista näistä muista muuttujista. EyCx riippuu kussakin testissä käytetyn limaskalajin spesifisestä kasvunopeudesta ja suurimmasta spesifisestä kasvunopeudesta, joka voi vaihdella eri lajien ja jopa eri kloonien välillä. Tätä vastemuuttujaa ei saa käyttää vertailtaessa eri limaskalajien tai eri kloonienkaan herkkyyttä myrkyllisille aineille. Vaikka tieteen kannalta on parempi arvioida myrkyllisyyttä keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden perusteella, tähän testimenetelmään on otettu mukaan myös tuotokseen perustuvat myrkyllisyyden arvioinnit, jotta voidaan täyttää eräiden lainkäyttöalueiden nykyiset sääntelyvaatimukset.

52.

Myrkyllisyyden arviointien on perustuttava sekä versojen lukumäärään että johonkin toiseen mittausmuuttujaan (versojen kokonaispinta-alaan, kuivapainoon tai tuorepainoon), koska eräät kemikaalit voivat vaikuttaa enemmän muihin mittausmuuttujiin kuin versojen lukumäärään. Tätä vaikutusta ei havaittaisi laskemalla pelkästään versojen lukumäärä.

53.

Versojen lukumäärä ja muut kirjatut mittausmuuttujat (versojen kokonaispinta-ala, kuivapaino tai tuorepaino) esitetään taulukkona, josta ilmenevät myös testikemikaalin pitoisuudet kussakin mittauksessa. Kun tietoja analysoidaan myöhemmin esimerkiksi LOEC-, NOEC- tai ECx-pitoisuuden arvioimiseksi, analyysin perustana on käytettävä yksittäisistä toistoista saatuja arvoja eikä kunkin käsitellyn ryhmän laskettuja keskiarvoja.

Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus

54.

Tietyn ajanjakson keskimääräinen spesifinen kasvunopeus lasketaan kasvumuuttujien – versojen lukumäärän ja jonkin toisen mittausmuuttujan (versojen kokonaispinta-alan, kuivapainon tai tuorepainon) – logaritmisena kasvuna soveltamalla seuraavaa kaavaa kaikkiin kontrolliliuosten ja käsiteltyjen liuosten toistoihin:

Formula

jossa

μi–j

keskimääräinen spesifinen kasvunopeus aikavälillä i–j

Ni

testi- tai kontrolliryhmän astiasta määritetty mittausmuuttujan arvo hetkellä i

Nj

testi- tai kontrolliryhmän astiasta määritetty mittausmuuttujan arvo hetkellä j

t

aikaväli i–j.

Kullekin testiryhmälle ja kontrolliryhmälle lasketaan kasvunopeuden keskiarvo varianssiestimaatteineen.

55.

Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus on laskettava koko testijaksolta (edellä olevassa kaavassa hetki ’i’ tarkoittaa testin alkua ja hetki ’j’ testin päättymistä). Kullekin testipitoisuudelle ja kontrollille lasketaan keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden keskiarvo varianssiestimaatteineen. Sen lisäksi on määritettävä jaksoittaiset kasvunopeudet, jotta voidaan arvioida testikemikaalin vaikutuksia koko altistusaikana (esimerkiksi analysoimalla logaritmisia kasvukäyriä). Merkittävät erot jaksoittaisen kasvunopeuden ja keskimääräisen kasvunopeuden välillä osoittavat, että kasvu poikkeaa jatkuvasta eksponentiaalisesta kasvusta, jolloin kasvukäyriä on syytä tarkastella lähemmin. Siinä tapauksessa varovaisena lähestymistapana on verrata käsiteltyjen viljelmien spesifisiä kasvunopeuksia suurimman kasvunestymisen aikana kontrollien vastaaviin kasvunopeuksiin samana aikana.

56.

Kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen (Ir) voidaan sen jälkeen laskea kutakin testipitoisuutta varten (käsittelyryhmässä) seuraavan kaavan avulla:

Formula

jossa

=

% Ir

=

keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen

=

μC

=

μ:n keskiarvo kontrolliryhmässä

=

μT

=

μ:n keskiarvo käsittelyryhmässä.

Tuotos

57.

Tuotokseen kohdistuvat vaikutukset määritetään seuraavien kahden mittausmuuttujan avulla: versojen lukumäärä ja jokin toinen mittausmuuttuja (versojen kokonaispinta-ala, kuivapaino tai tuorepaino), joka mitataan jokaisesta koeastiasta testin alussa ja lopussa. Jos toisena mittausmuuttujana käytetään kuivapainoa tai tuorepainoa, testin alussa oleva biomassa määritetään samasta erästä otetun versonäytteen avulla, jota on käytetty koeastioiden siirrostamiseen (ks. 20 kohta). Kullekin testipitoisuudelle ja kontrollille lasketaan tuotoksen keskiarvo varianssiestimaatteineen. Tuotoksen prosentuaalinen estyminen ( % Iy) voidaan laskea kutakin käsittelyryhmää varten seuraavasti:

Formula

jossa

=

% Iy

=

tuotoksen prosentuaalinen estyminen

=

bC

=

kontrolliryhmän lopullinen biomassa, josta on vähennetty sen biomassa testin alussa

=

bT

=

käsittelyryhmän lopullinen biomassa, josta on vähennetty sen biomassa testin alussa.

Pitoisuus-vastekäyrien piirtäminen

58.

Pitoisuus-vastekäyrät piirretään merkitsemällä y-akselille vastemuuttujan keskimääräinen prosentuaalinen estyminen (vastemuuttujana on Ir tai Iy, joka lasketaan 56 tai 57 kohdan mukaan) ja x-akselille testiaineen pitoisuuden logaritmi.

ECx-pitoisuuden arviointi

59.

ECx-pitoisuuden estimaattien (esimerkiksi EC50-arvon) on perustuttava sekä keskimääräiseen spesifiseen kasvunopeuteen (ErCx) että tuotokseen (EyCx). Näistä kummankin on puolestaan perustuttava versojen lukumäärään ja johonkin toiseen mittausmuuttujaan (versojen kokonaispinta-alaan, kuivapainoon tai tuorepainoon), koska eräät testiaineet vaikuttavat eri tavalla versojen lukumäärään kuin muihin mittausmuuttujiin. Tavoitteena on siis saada myrkyllisyysparametreiksi seuraavat neljä ECx-arvoa kutakin laskettua kasvunestymistasoa x kohden: ErCx (versojen lukumäärä); ErCx (versojen kokonaispinta-ala, kuivapaino tai tuorepaino); EyCx (versojen lukumäärä) ja EyCx (versojen kokonaispinta-ala, kuivapaino tai tuorepaino).

Tilastomenetelmät

60.

Tavoitteena on saada kvantitatiivinen pitoisuus-vastesuhde regressioanalyysin avulla. Painotettua lineaarista regressiota voidaan käyttää sen jälkeen, kun vastetiedoille on tehty linearisoiva muunnos – esimerkiksi probitti-, logitti- tai Weibull-yksiköiksi (13) – mutta suositeltavampaa on käyttää epälineaarisia regressiomenetelmiä, joilla voidaan paremmin käsitellä tiedoissa väistämättä esiintyviä epäsäännöllisyyksiä sekä poikkeamia tasaisista jakaumista. Lähestyttäessä tilaa, jossa kasvu ei esty ollenkaan tai estyminen on täydellistä, linearisoiva muunnos voi suurentaa epäsäännöllisyyksiä ja haitata siten analyysiä (13). On syytä huomata, että standardianalyysimenetelmät, joissa käytetään probitti-, logitti- tai Weibull-muunnoksia, on tarkoitettu dikotomisia tietoja varten (kun vasteita on kaksi, esimerkiksi kuolleisuus tai eloonjääminen), minkä vuoksi niitä on mukautettava, jos niitä aiotaan käyttää kasvu- tai tuotostietojen analysointiin. Kirjallisuusviitteissä (14), (15) ja (16) kuvataan erityismenetelmiä, joilla ECx-arvot voidaan määrittää jatkuvista tiedoista.

61.

Kunkin vastemuuttujan analysoimiseksi käytetään pitoisuus-vastesuhdetta, jonka avulla lasketaan ECx-arvojen piste-estimaatit. Jokaiselle estimaatille on määritettävä 95 prosentin luottamusväli, jos se on mahdollista. Vastetietojen ja regressiomallin välinen yhteensopivuuden aste on arvioitava joko graafisesti tai tilastollisesti. Regressionanalyysi on tehtävä käyttämällä yksittäisiä toistojen vasteita eikä käsittelyryhmien keskiarvoja.

62.

EC50-estimaatit ja luottamusvälit voidaan saada myös käyttämällä lineaarista interpolointia bootstrap-menetelmän kanssa (17), jos käytettävissä olevat regressiomallit tai -menetelmät eivät sovellu kyseisten tietojen käsittelyyn.

63.

LOEC-pitoisuuden ja siten myös NOEC-pitoisuuden arvioimiseksi on verrattava käsiteltyjen liuosten keskiarvoja käyttämällä varianssianalyysitekniikoita (ANOVA). Sen jälkeen on verrattava kunkin pitoisuuden keskiarvoa kontrolliryhmän keskiarvoon käyttämällä sopivaa moniulotteista vertailumenetelmää tai trenditestimenetelmää. Dunnettin tai Williamsin testi voi olla käyttökelpoinen (18), (19), (20), (21). Lisäksi on arvioitava, pitääkö ANOVA-oletus varianssin homogeenisuudesta paikkansa. Arviointi voidaan tehdä graafisesti tai virallisen testin avulla (22). Sopivia testejä ovat Levenen ja Bartlettin testit. Jos oletus varianssin homogeenisuudesta ei pidä paikkaansa, tilanne on joskus korjattavissa tietojen logaritmimuunnoksella. Jos varianssin heterogeenisuus on erittäin suuri eikä se ole korjattavissa muunnoksella, on harkittava analysointia sellaisilla menetelmillä kuin Jonckheeren alaspäin askeltava trenditesti. Kirjallisuusviitteessä (16) annetaan lisäohjeita NOEC-arvon määrittämisestä.

64.

Tieteen viimeaikaisen kehityksen perusteella on suositeltu, että NOEC-käsitteestä luovuttaisiin ja se korvattaisiin regressioanalyysiin perustuvilla ECx:n piste-estimaateilla. Sopivaa x:n arvoa ei ole vielä vahvistettu tätä Lemna-testiä varten. Sopivalta kuitenkin vaikuttaisi väli 10–20 prosenttia (valitun vastemuuttujan mukaan), ja suositeltavaa on ilmoittaa sekä EC10- että EC20-arvo.

Raportointi

65.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

 

Testikemikaali:

fysikaalinen olomuoto ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, muun muassa vesiliukoisuuden raja-arvo,

kemialliset tunnistetiedot (esimerkiksi CAS-numero), mukaan luettuna puhtaus (epäpuhtaudet).

 

Koelajit:

tieteellinen nimi, klooni (jos tiedossa) ja alkuperä.

 

Testiolosuhteet:

testauksessa käytetty menetelmä (staattinen, semistaattinen tai läpivirtausmenetelmä),

testin alkamispäivä ja kesto,

testiviljelyaine,

koejärjestely: koeastiat ja niiden sulkimet, liuostilavuudet, kolonioiden ja versojen lukumäärä koeastiaa kohden testin alussa,

testipitoisuudet (nimellis- ja mitatut pitoisuudet tapauksen mukaan) sekä toistojen määrä pitoisuutta kohden,

kanta- ja testiliuosten valmistusmenetelmät, mukaan luettuina tiedot mahdollisesta liuottimen tai dispergointiaineen käytöstä,

lämpötila testin aikana,

valolähde, valon voimakkuus ja homogeenisuus,

testi- ja kontrolliviljelyaineen pH-arvot,

testikemikaalin pitoisuudet ja analyysimenetelmä sekä laadunarviointiin tarvittavat tiedot (validointitutkimukset, analyysien keskihajonnat ja luottamusvälit),

versojen lukumäärän ja muiden mittausmuuttujien, kuten kuivapainon, tuorepainon tai versojen kokonaispinta-alan, määritysmenetelmät,

kaikki poikkeamat tästä testimenetelmästä.

 

Tulokset:

raakatiedot: versojen lukumäärä ja muut mittausmuuttujat jokaisessa testaukseen ja toistoihin käytetyssä koeastiassa kullakin havainnointi- ja analysointikerralla,

kunkin mittausmuuttujan keskiarvot ja keskihajonnat,

kutakin pitoisuutta vastaavat kasvukäyrät (suosituksena on käyttää mittausmuuttujan logaritmimuunnosta, ks. 55 kohta),

kaksinkertaistumisaika/kasvunopeus kontrollissa versojen lukumäärän avulla laskettuna,

kunkin käsitellyn toiston lasketut vastemuuttujat sekä toistojen keskiarvot ja variaatiokerroin,

pitoisuuden ja vaikutuksen välisen suhteen graafinen esitys,

myrkyllisyysarvioinnin päätepisteiden estimaatit vastemuuttujien osalta, esimerkiksi EC50, EC10 ja EC20, ja vastaavat luottamusvälit; LOEC- ja/tai NOEC-pitoisuus, jos ne on laskettu, ja niiden määrityksessä käytetyt tilastomenetelmät,

jos on käytetty ANOVA-analyysiä, havaittavissa olevan vaikutuksen suuruus (esimerkiksi vähiten merkitsevä erotus),

mahdollinen kasvun edistyminen käsitellyissä liuoksissa,

näkyvät merkit fytotoksisuudesta ja testiliuoksia koskevat havainnot,

tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita tästä testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (hyväksytty uudelleen vuonna 1998). s. 733–742. Teoksessa Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ’Public draft’. EPA 712-C-96-156. 8 s.

(3)

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 s.

(4)

SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Vattenundersökningar – Bestämning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytbladsväxten Lemna minor, andmat. SS 02 82 13. 15 s.

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – 120 s.

(6)

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(9)

International Organisation for Standardisation (ISO). ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

(11)

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353–359.

(12)

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481–483.

(13)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713–718.

(14)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.

(15)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494.

(16)

OECD. (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(17)

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096–1121.

(19)

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482–491.

(20)

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.

(21)

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519–531.

(22)

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.

Lisäys 1

Määritelmät

Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä ja lyhenteitä:

Biomassa : Populaatiossa olevan elävän materiaalin kuivapaino. Tässä testissä biomassaa mitataan usein epäsuorasti esimerkiksi versojen lukumäärän tai pinta-alan avulla, minkä vuoksi ’biomassa’-termi viittaa myös näihin korvaaviin menetelmiin.

Kemikaali : aine tai seos.

Kloroosi : versosolukon kellastuminen.

Klooni : Eliö tai solu, joka on saanut alkunsa yhdestä yksilöstä suvuttoman lisääntymisen tuloksena. Samaan klooniin kuuluvat yksilöt ovat siis geneettisesti identtisiä.

Kolonia : Versojen muodostama yhdyskunta, jossa emo- ja tytäryksilöt (yleensä 2–4 yksilöä) ovat kiinnittyneet toisiinsa. Kutsutaan joskus kasviksi.

ECx : Testiviljelyaineeseen liuenneen testikemikaalin pitoisuus, jossa Lemnan kasvu vähenee x prosenttia (esimerkiksi 50 prosenttia) määrätyn altistusajan kuluessa (altistusaika on mainittava erikseen, jos se poikkeaa testin kokonaiskestosta tai normaalista kestosta). Jotta kasvunopeudesta ja tuotoksesta johdetut EC-arvot erottuisivat selvästi toisistaan, edellisestä käytetään symbolia ’ErC’ ja jälkimmäisestä symbolia ’EyC’, joiden jälkeen mainitaan mittausmuuttuja, esimerkiksi ErC (versojen lukumäärä).

Läpivirtaustesti : testi, jossa testiliuokset vaihtuvat jatkuvasti.

Verso : Limaskakasvin yksittäinen lehden kaltainen rakenne. Se on pienin lisääntymiskykyinen yksikkö eli yksilö.

Kupruisuus : kupuroiden tai turpoamien esiintyminen versoissa.

Kasvu : mittausmuuttujan, kuten versojen lukumäärän, kuivapainon, märkäpainon tai versojen pinta-alan, kasvaminen testijakson aikana.

Kasvunopeus (keskimääräinen spesifinen kasvunopeus): biomassan logaritminen kasvu altistuksen aikana.

Pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) : Pienin testattu pitoisuus, jossa kemikaalilla havaitaan olevan tietyn altistusajan kuluessa tilastollisesti merkittävä kasvua vähentävä vaikutus verrattuna kontrolliin (kun p < 0,05). Ehtona on myös, että kaikilla LOEC-pitoisuutta suuremmilla testipitoisuuksilla on oltava vähintään yhtä suuri haitallinen vaikutus kuin LOEC-pitoisuudella. Jos nämä kaksi ehtoa eivät täyty, on annettava tyhjentävä selitys siitä, miten LOEC-pitoisuus (ja myös NOEC-pitoisuus) on valittu.

Mittausmuuttujat : Kaikentyyppiset muuttujat, jotka mitataan testin päätepisteen ilmaisemiseksi yhden tai useamman erilaisen vastemuuttujan avulla. Tässä menetelmässä mittausmuuttujia ovat versojen lukumäärä, versojen pinta-ala sekä tuorepaino ja kuivapaino.

Monokulttuuri : yhtä kasvilajia sisältävä viljelmä.

Nekroosi : kuollut (valkoinen tai veden turvottama) versosolukko.

Pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC) : lähin LOEC-pitoisuutta pienempi testipitoisuus.

Fenotyyppi : eliön havaittavissa olevat ominaisuudet, jotka määräytyvät eliön geenien ja ympäristön välisestä vuorovaikutuksesta.

Vastemuuttuja : Muuttujat, joiden avulla arvioidaan myrkyllisyyttä. Vastemuuttujat johdetaan erilaisia laskentamenetelmiä käyttämällä mistä tahansa mitatusta muuttujasta, joka kuvaa biomassaa. Tässä testimenetelmässä kasvunopeudet ja tuotos ovat vastemuuttujia, jotka on johdettu mittausmuuttujista, kuten versojen lukumäärästä, versojen pinta-alasta, tuorepainosta tai kuivapainosta.

Semistaattinen (ajoittaisvaihtoinen) testi : testi, jossa testiliuos vaihdetaan tietyin väliajoin testin aikana.

Staattinen testi : testi, jossa testiliuosta ei vaihdeta testin aikana.

Testikemikaali : tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.

Testin päätepiste : Kuvaa yleistä tekijää, joka testin tavoitteen mukaisesti muuttuu testikemikaalin vaikutuksesta verrattuna kontrolliin. Tässä testimenetelmässä testin päätepisteenä on kasvun estyminen, joka voidaan ilmaista erilaisilla vastemuuttujilla, jotka perustuvat yhteen tai useampaan mittausmuuttujaan.

Testiviljelyaine : Täydellinen synteettinen ravinneliuos, jossa testikasvit kasvavat, kun ne altistetaan testikemikaalille. Yleensä testikemikaali liuotetaan testiviljelyaineeseen.

Tuotos : altistusajan lopussa mitattu biomassaa ilmaisevan mittausmuuttujan arvo, josta on vähennetty altistusajan alussa mitattu saman mittausmuuttujan arvo.

Lisäys 2

Lemna spp:n kuvaus

Limaskaksi yleisesti kutsuttu vesikasvi Lemna spp. kuuluu Lemnaceae-heimoon. Siihen kuuluu neljä sukua, joiden lajeja esiintyy kaikkialla maailmassa. Niiden erilaisia ulkomuotoja ja taksonomiaa on käsitelty perusteellisesti kirjallisuusviitteissä (1), (2). Lemna gibba ja L. minor ovat lauhkean vyöhykkeen alueille luonteenomaisia lajeja. Niitä käytetään yleisesti myrkyllisyystesteissä. Molemmilla lajeilla on kelluva tai vedenalainen levymäinen verso, ja kunkin verson alapinnan keskiosasta lähtee hyvin ohut juuri. Lemna spp. kukkii hyvin harvoin ja lisääntyy kasvullisesti tuottamalla uusia versoja (3). Nuoremmat kasvit ovat vanhempiin kasveihin verrattuna yleensä vaaleampia, niillä on lyhyemmät juuret ja niissä on kaksi tai kolme erikokoista versoa. Lemna-suvun kasvit sopivat erittäin hyvin laboratoriokokeisiin pienen kokonsa, yksinkertaisen rakenteensa, suvuttoman lisääntymisensä ja lyhyen generaatioaikansa ansiosta (4), (5).

Koska kasvien herkkyys luultavasti vaihtelee lajista toiseen, herkkyyttä vertailtaessa hyväksytään ainoastaan lajin sisäiset vertailut.

Esimerkkejä testauksessa käytetyistä Lemna-lajeista:

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935–941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ’Public draft’. EPA 712-C-96-156. 8 s.

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 s.

Svenska standardiseringsinstitutet (SIS). (1995). Vattenundersökningar – Bestämning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytbladsväxten Lemna minor, andmat. SS 02 82 13. 15 s.

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (hyväksytty uudelleen vuonna 1998). s. 733–742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ’Public draft’. EPA 712-C-96-156. 8 s.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.

Lemna-lajien hankintalähteitä

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2

Puhelin: +1-416-978-3641

Faksi: +1-416-978-5878

Sähköposti: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

Yhdysvallat

Puhelin: +1 (919) 515-7572

Sähköposti: astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

Stockholm

Ruotsi

Puhelin: +46 8 674 7240

Faksi: + 46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

Saksa

Sähköposti: lemna@uba.de

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7–22.

Lisäys 3

Kantaviljelmän ylläpito

Kantaviljelmiä voidaan säilyttää alhaisissa lämpötiloissa (4–10 °C) suhteellisen pitkiä aikoja käynnistämättä niitä uudelleen. Lemna-kasvien viljelyaine voi olla sama kuin testauksessa käytetty viljelyaine, mutta kantaviljelmissä voidaan käyttää myös muita ravinteikkaita viljelyaineita

Joukko nuoria, vaaleanvihreitä kasveja siirretään säännöllisesti aseptisella menetelmällä uusiin, tuoretta viljelyainetta sisältäviin viljelyastioihin. Jatkoviljelmiä voidaan käynnistää jopa kolmen kuukauden väliajoin tässä liitteessä ehdotetuissa viileissä olosuhteissa.

Kasveja viljeltäessä on käytettävä kemiallisesti puhtaita (happopestyjä) ja steriilejä lasisia kasvatusastioita sekä aseptisia käsittelytekniikoita. Jos esimerkiksi levät tai sienet kontaminoivat kantaviljelmän, on ryhdyttävä toimiin näiden eliöiden poistamiseksi. Levät ja useimmat muut kontaminoivat eliöt voidaan poistaa pintasteriloinnilla. Kontaminoituneesta kasvimateriaalista otetaan näyte, ja juuret leikataan pois. Materiaalia ravistellaan puhtaassa vedessä voimakkaasti, minkä jälkeen se upotetaan 0,5 tilavuusprosentin natriumhypokloriittiliuokseen, jossa sitä pidetään 30 sekunnista 5 minuuttiin. Sen jälkeen kasvimateriaali huuhdellaan steriilillä vedellä ja siirretään erinä tuoretta viljelyainetta sisältäviin kasvatusastioihin. Monet versot kuolevat tämän käsittelyn jälkeen varsinkin, jos altistusajat ovat pitkiä, mutta osa eloon jäävistä versoista on yleensä vapautunut kontaminaatiosta. Näitä versoja voidaan käyttää uusien viljelmien siirrostamiseen.

Lisäys 4

Viljelyaine

L. minor- ja L. gibba -lajin viljelyyn suositellaan eri viljelyaineita. L. minor -lajin viljelyyn suositellaan ruotsalaisen standardin (SIS) mukaisen viljelyaineen muunnosta, kun taas L. gibba -lajin viljelyyn suositellaan 20X-AAP-viljelyainetta. Kummankin viljelyaineen koostumus esitetään jäljempänä. Näitä viljelyaineita valmistettaessa on käytettävä reagenssi- tai analyysilaatua olevia kemikaaleja ja deionisoitua vettä.

Ruotsalaisen standardin (SIS) mukainen viljelyaine Lemnan viljelyä varten

Kantaliuokset I–V steriloidaan autoklaavikäsittelyllä (120 °C, 15 minuuttia) tai kalvosuodatuksella (huokoskoko noin 0,2 μm).

Kantaliuos VI (ja valinnaisesti kantaliuos VII) voidaan steriloida vain kalvosuodatuksella; näitä liuoksia ei saa käsitellä autoklaavissa.

Steriilejä kantaliuoksia säilytetään viileässä ja pimeässä. Kantaliuokset I–V on heitettävä pois kuuden kuukauden kuluttua. Kantaliuosta VI (ja valinnaista kantaliuosta VII) voidaan säilyttää yhden kuukauden ajan.

Kantaliuoksen numero

Aine

Pitoisuus kantaliuoksessa

(g/l)

Pitoisuus valmistetussa viljelyaineessa

(mg/·l)

Valmistettu viljelyaine

 

 

 

 

Alkuaine

Pitoisuus

(mg/·l)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (puskuri)

490

490

Yksi litra SIS-viljelyainetta valmistetaan lisäämällä seuraavat aineet 900 ml:aan deionisoitua vettä:

10 ml kantaliuosta I

5 ml kantaliuosta II

5 ml kantaliuosta III

5 ml kantaliuosta IV

1 ml kantaliuosta V

5 ml kantaliuosta VI

1 ml kantaliuosta VII (valinnaisesti).

Huomautus: Eräitä testiaineita varten voidaan tarvita ylimääräistä kantaliuosta VII (MOPS-puskuria) (ks. 11 kohta).

Viljelyaineen pH säädetään arvoon 6,5 ± 0,2 käyttämällä 0,1 tai 1 mol HCl:a tai NaOH:a, minkä jälkeen lisätään deionisoitua vettä, kunnes tilavuus on yksi litra.

20X-AAP-viljelyaine

Kantaliuokset valmistetaan steriiliin tislattuun tai deionisoituun veteen.

Steriilejä kantaliuoksia säilytetään viileässä ja pimeässä. Tällaisissa olosuhteissa kantaliuokset säilyvät ainakin 6–8 viikkoa.

20X-AAP-viljelyainetta varten valmistetaan viisi ravinnepitoista kantaliuosta (A1, A2, A3, B ja C) käyttämällä reagenssilaatua olevia kemikaaleja. Viljelyaineen valmistamiseksi lisätään 20 ml kutakin ravinnepitoista kantaliuosta noin 850 ml:aan deionisoitua vettä. Viljelyaineen pH säädetään arvoon 7,5 ± 0,1 käyttämällä 0,1 tai 1 mol HCl:a tai NaOH:a, minkä jälkeen lisätään deionisoitua vettä, kunnes tilavuus on yksi litra. Sen jälkeen viljelyaine suodatetaan steriiliin astiaan kalvosuodattimen läpi, jonka huokoskoko on noin 0,2 μm.

Testauksessa käytettävä viljelyaine on valmistettava 1–2 päivää ennen käyttöä, jotta pH stabiloituisi. Viljelyaineen pH on tarkistettava ennen käyttöä ja tarvittaessa säädettävä uudelleen lisäämällä 0,1 tai 1 mol NaOH:a tai HCl:a, kuten edellä on kuvattu.

Kantaliuoksen numero

Aine

Pitoisuus kantaliuoksessa

(g/·l) (7)

Pitoisuus valmistetussa viljelyaineessa

(mg/·l) (7)

Valmistettu viljelyaine

 

 

 

 

Alkuaine

Pitoisuus

(mg/·l) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na; N

190; 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2 · O

1,4

30

K; P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na; C

220; 43

Steinbergin viljelyaine (ISO 20079 -standardin mukaan)

Pitoisuudet ja kantaliuokset

Muutettua Steinbergin viljelyainetta käytetään ISO 20079 -standardissa ainoastaan Lemna minor -lajin viljelyyn (koska standardissa ei sallita muita lajeja), mutta testit ovat osoittaneet, että sillä voidaan saada hyviä tuloksia myös Lemna gibba -lajin viljelyssä.

Viljelyainetta valmistettaessa on käytettävä reagenssi- tai analyysilaatua olevia kemikaaleja ja deionisoitua vettä.

Ravinneliuos valmistetaan kantaliuoksesta tai 10 kertaa väkevämmästä viljelyaineesta, jolloin liuoksen pitoisuus saadaan mahdollisimman suureksi ilman saostumista.

Taulukko 1

pH-stabiloitu Steinbergin viljelyaine (muutettu Altenburgerin mukaan)

Aine

Ravinneliuos

Makroravinteet

moolipaino

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroravinteet

moolipaino

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA-dinatriumdihydraatti

372,24

1 500,00

4,03


Taulukko 2

Kantaliuokset (makroravinteet)

1.

Makroravinteet (50-kertainen väkevöinti)

g/l

Kantaliuos 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Kantaliuos 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Kantaliuos 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Taulukko 3

Kantaliuokset (mikroravinteet)

2.

Mikroravinteet (1 000-kertainen väkevöinti)

mg/l

Kantaliuos 4:

H3BO3

120,0

Kantaliuos 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Kantaliuos 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Kantaliuos 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Kantaliuos 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA-dinatriumdihydraatti

1 500,00

Kantaliuokset 2 ja 3 voidaan yhdistää, samoin kuin kantaliuokset 4–7 (ottaen samalla huomioon vaaditut pitoisuudet).

Jotta kantaliuokset säilyisivät pitempään, ne voidaan käsitellä autoklaavissa 121 °C:ssa 20 minuutin ajan tai niille voidaan tehdä steriili suodatus (huokoskoko 0,2 μm). Kantaliuoksen 8 steriili suodatus (huokoskoko 0,2 μm) on erittäin suositeltavaa.

Steinbergin (muutetun) viljelyaineen lopullisen pitoisuuden valmistaminen

Lisätään 20 ml kantaliuoksia 1, 2 ja 3 (ks. taulukko 2) noin 900 ml:aan deionisoitua vettä saostumisen ehkäisemiseksi.

Lisätään 1,0 ml kantaliuoksia 4, 5, 6, 7 ja 8 (ks. taulukko 3).

Liuoksen pH:n on oltava 5,5 ± 0,2 (säädetään lisäämällä mahdollisimman vähän NaOH-liuosta tai HCl:a).

Lisätään vettä, kunnes tilavuus on 1 000 ml.

Jos kantaliuokset on steriloitu ja niihin on käytetty sopivaa vettä, uutta sterilointia ei tarvita. Jos lopullinen viljelyaine steriloidaan, autoklaavikäsittelyn jälkeen (20 minuuttia 121 °C:ssa) on lisättävä kantaliuosta 8.

Steinbergin (muutetun) viljelyaineen kymmenkertainen väkevöinti väliaikaista varastointia varten

Lisätään 20 ml kantaliuoksia 1, 2 ja 3 (ks. taulukko 2) noin 30 ml:aan vettä saostumisen ehkäisemiseksi.

Lisätään 1,0 ml kantaliuoksia 4, 5, 6, 7 ja 8 (ks. taulukko 3). Lisätään vettä, kunnes tilavuus on 100 ml.

Jos kantaliuokset on steriloitu ja niihin on käytetty sopivaa vettä, uutta sterilointia ei tarvita. Jos lopullinen viljelyaine steriloidaan, autoklaavikäsittelyn jälkeen (20 minuuttia 121 °C:ssa) on lisättävä kantaliuosta 8.

Viljelyaineen pH:n on (lopullisessa pitoisuudessa) oltava 5,5 ± 0,2.

6)

Lisätään C.31–C.46 luvut seuraavasti:

C.31.   MAAKASVITESTI: ITÄVYYDEN JA ALKUKASVUN TESTAUS

JOHDANTO

1.

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 208 (2006). Testimenetelmiä tarkastellaan säännöllisesti uudelleen tieteen kehityksen ja sääntelyyn sovellettavuuden perusteella. Tällä päivitetyllä testimenetelmällä arvioidaan kemikaalien mahdollisia vaikutuksia itävyyteen ja alkukasvuun. Tässä muodossa testi ei kata kroonisia vaikutuksia tai lisääntymiselle aiheutuvia vaikutuksia (eli vaikutuksia siementen ja kukkien muodostukselle tai hedelmien kypsymiselle). Altistusolosuhteet sekä testattavan kemikaalin ominaisuudet on otettava huomioon, jotta käytettävät testimenetelmät ovat asianmukaisia (esimerkiksi metalleja/metalliyhdisteitä testattaessa on otettava huomioon pH-arvon ja siihen liittyvien vastaioneiden vaikutukset) (1). Tämä testimenetelmä ei koske kasveja, jotka altistuvat kemikaalihöyryille. Testimenetelmää voidaan soveltaa yleisten kemikaalien, torjunta-aineiden ja kasvinsuojeluaineiden (eli biosidien) testaamiseen. Testimenetelmä on kehitetty olemassaolevien menetelmien pohjalta (2), (3), (4), (5), (6), (7). Huomioon on otettu myös muuta kasvien testaamisen kannalta olennaista lähdekirjallisuutta (8), (9), (10). Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

TESTIN PERIAATE

2.

Testillä arvioidaan maaperässä (tai muussa sopivassa kasvualustana toimivassa maa-aineksessa) olevan testikemikaalin aiheuttaman altistuksen vaikutuksia korkeampien kasvien itävyyteen ja varhaiseen kasvuun. Siemenet tuodaan kosketuksiin testikemikaalilla käsitellyn maa-aineksen kanssa ja vaikutuksia arvioidaan yleensä 14–21 vuorokauden kuluttua siitä, kun kontrolliryhmän siemenistä on itänyt 50 prosenttia. Mitatut loppupisteet ovat itävyyden silmämääräinen arviointi, versojen kuivapaino (vaihtoehtoisesti versojen tuorepaino) ja joissakin tapauksissa versojen korkeus sekä näkyvien haittavaikutusten arviointi kasvin eri osissa. Mittauksia ja havaintoja verrataan käsittelemättömistä kontrollikasveista tehtyihin.

3.

Odotetun altistusreitin mukaan testikemikaali joko viedään maaperän (tai mahdollisesti kasvualustana toimivan keinomaan) sisään tai sitä levitetään maan pinnalle sen mukaan, kumpi edustaa todenmukaisemmin mahdollista altistumisreittiä kemikaalille. Maaperän sisään vieminen tehdään käsittelemällä ritsosfääriin kuulumatonta maa-ainesta. Kemikaalin lisäämisen jälkeen maa-aines siirretään ruukkuihin, minkä jälkeen tutkittavan kasvilajin siemenet kylvetään maa-ainekseen. Pintalevitys tehdään ruukuissa olevalle maa-ainekselle, johon siemenet on jo kylvetty. Testiyksiköt (kontrollit ja käsitellyt maa-ainekset sekä siemenet) sijoitetaan tämän jälkeen sopiviin, kasvien itämistä/kasvua tukeviin olosuhteisiin.

4.

Testi voidaan tehdä halutun tarkoituksen mukaan annosvastekäyrän määrittämiseksi tai raja-annostestinä käyttämällä vain yhtä pitoisuutta/tasoa. Jos yhdellä pitoisuudella/tasolla tehdyn testin tulokset ylittävät tietyn myrkyllisyystason (esimerkiksi kun havaitaan yli x prosentin vaikutuksia), tehdään pitoisuusalueen määritystesti, jonka avulla määritellään myrkyllisyyden ylä- ja alarajat, minkä jälkeen laaditaan annosvastekäyrä toistamalla testi usealla pitoisuudella/tasolla. Sopivalla tilastollisella analyysilla saadaan vaikuttava pitoisuus (effective concentration) ECx tai vaikuttava käyttömäärä (effective application rate) ERx (esimerkiksi EC25, ER25, EC50, ER50) yhdelle tai useammalle herkimmälle tutkittavalle parametrille. Testissä voidaan lisäksi laskea pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia (NOEC) sekä pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC).

TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA

5.

Seuraavien tietojen avulla voidaan tunnistaa kemikaalin odotettavissa oleva altistusreitti ja helpottaa koejärjestelyn suunnittelua: rakennekaava, puhtaus, vesiliukoisuus, liukoisuus orgaanisiin liuottimiin, 1-oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin, maaperän sorptiokäyttäytyminen, höyrynpaine, kemiallinen stabiilisuus vedessä ja valossa sekä biohajoavuus.

TESTIN VALIDITEETTI

6.

Jotta testi olisi luotettava, kontrollin on täytettävä seuraavat kriteerit:

itävyys on vähintään 70 prosenttia;

taimissa ei ole näkyviä fytotoksisia vaikutuksia (esimerkiksi kloroosia, nekroosia, kuihtumista, lehtien ja versojen epämuodostumia) ja kasveissa ilmenee vain kyseiselle lajille tavanomaista kasvussa ja morfologiassa tapahtuvaa vaihtelua;

itäneiden kontrollitaimien keskimääräinen eloonjääneisyys on vähintään 90 prosenttia koko tutkimuksen ajan;

yksittäisen lajin ympäristöolosuhteet ovat identtiset ja kasvualustassa on yhtä paljon samasta lähteestä peräisin olevaa maa-ainesta, tukiainetta tai substraattia.

VERTAILUKEMIKAALI

7.

Vertailukemikaalin säännöllisin väliajoin tapahtuvalla testaamisella voidaan todeta, että testin toimivuus, tiettyjen testikasvien vaste tai testiolosuhteet eivät ole merkittävästi muuttuneet ajan myötä. Vaihtoehtoisesti testijärjestelmän toimivuutta tietyissä laboratoriossa voidaan arvioida mittaamalla kontrollien historiallista biomassaa tai kasvua, mikä toimii myös laboratorion sisäisenä laadunvalvontatoimenpiteenä.

MENETELMÄN KUVAUS

Luonnollinen maaperä – Keinotekoinen substraatti

8.

Kasveja voidaan kasvattaa ruukuissa, joissa käytetään hiekkapitoista hiesua, savista hiekkaa tai hiekkapitoista savimultaa, joka sisältää enintään 1,5 prosenttia orgaanista hiiltä (noin kolme prosenttia orgaanista ainesta). Kaupallisesti myytävää kukkamultaa tai synteettistä maaperäseosta voidaan myös käyttää, kunhan se sisältää enintään 1,5 prosenttia orgaanista hiiltä. Savimaata ei käytetä, jos tiedossa on, että testikemikaalin affiniteetti saveen on suuri. Peltomaa homogenisoidaan ja karkeat hiukkaset poistetaan seulomalla 2 mm:n raekokoon. Valmiista lopullisesta maaperästä ilmoitetaan tyyppi ja rakenne, orgaanisen hiilen pitoisuus prosentteina, pH-arvo sekä suolapitoisuus sähkönjohtavuutena. Maaperä luokitellaan tavanmukaisen luokittelujärjestelmän mukaan (11). Maaperä voidaan pastöroida tai lämpökäsitellä maaperän patogeenien vaikutuksen vähentämiseksi.

9.

Luonnollinen maaperä saattaa vaikeuttaa tulosten tulkintaa ja lisätä vaihtelua fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien sekä mikrobipopulaatioiden vaihtelevuuden vuoksi. Nämä muuttujat puolestaan muuttavat vedenpidätyskykyä, kemikaalien sitomiskykyä, tuulettumista sekä ravinne- ja hivenainepitoisuutta. Näiden fysikaalisten ominaisuuksien vaihtelun lisäksi vaihtelua on myös kemiallisissa ominaisuuksissa, kuten pH-arvossa ja hapetus-pelkistyspotentiaalissa, mikä saattaa vaikuttaa testikemikaalin biologiseen hyötyosuuteen (12), (13), (14).

10.

Keinotekoisia substraatteja ei yleensä käytetä kasvinsuojeluaineiden testaamisessa, mutta niitä voidaan käyttää yleisten kemikaalien testaamisessa tai silloin, kun halutaan pitää luonnollisen maaperän käytöstä aiheutuva vaihtelu mahdollisimman pienenä ja lisätä testitulosten vertailukelpoisuutta. Käytettyjen substraattien on oltava inerttiä materiaalia, joiden vuorovaikutus testikemikaalin, kantoaineena toimivan liuottimen tai molempien kanssa on mahdollisimman pieni. Happopesty kvartsihiekka, mineraalivilla ja lasihelmet (halkaisijaltaan esimerkiksi 0,35–0,85 mm) on todettu riittävän inerteiksi materiaaleiksi, jotka absorboivat testikemikaalia mahdollisimman vähän (15), millä varmistetaan, että kemikaalia on mahdollisimman paljon taimen saatavana juuriston kautta. Käyttötarkoitukseen soveltumattomia substraatteja ovat vermikuliitti, perliitti ja muut erittäin imukykyiset materiaalit. Kasvin kasvuaan varten tarvitsemia ravinteita on oltava saatavilla, jotta kasvit eivät kärsi ravinteiden puutostiloista. Ravinteiden saantia on mahdollisuuksien mukaan arvioitava kontrollikasvien kemiallisella analyysilla tai silmämääräisellä arvioinnilla.

Testilajien valintakriteerit

11.

Valittavien lajien olisi oltava keskenään riittävän erilaisia esimerkiksi levinneisyyden, yleisyyden, lajikohtaisten elinkaaren ominaisuuksien, luontaisen levinneisyysalueen sekä kasvikunnan taksonomisen monimuotoisuuden näkökulmasta, jotta vasteissa olisi vaihtelua (8), (10), (16), (17), (18), (19), (20). Valinnassa olisi otettava huomioon mahdollisten testilajien seuraavat ominaisuudet:

lajilla on yhdenmukaisia siemeniä, joita on helposti saatavilla tavanomaisista, luotettavista siemenlähteistä ja joiden itävyys on johdonmukaista, luotettavaa ja tasaista, ja alkukasvu on yhdenmukaista;

kasvi soveltuu laboratoriokokeisiin ja antaa luotettavia ja toistettavia tuloksia samassa testilaitoksessa sekä eri testilaitosten kesken;

testattavan lajin herkkyys vastaa johdonmukaisesti kemikaalille alttiina olevassa ympäristössä tavattujen lajien vastetta;

lajeja on käytetty aiemmissa myrkyllisyyskokeissa ja niiden käyttö esimerkiksi torjunta-aineiden biologisissa testeissä, raskasmetallien seulonnassa, suolapitoisuus- tai mineraalirasituskokeissa tai allelopatiatutkimuksissa osoittaa herkkyyttä monille erilaisille stressitekijöille;

lajit sopivat testimenetelmän edellyttämiin kasvuolosuhteisiin;

lajit täyttävät testin validiteettikriteerit.

Eräitä eniten käytettyjä testilajeja on lueteltu lisäyksessä 2 ja mahdollisia ravintokasveihin kuulumattomia lajeja lisäyksessä 3.

12.

Testattavien lajien määrä riippuu sovellettavista sääntelyvaatimuksista, minkä vuoksi määrään ei oteta kantaa tämän testimenetelmän yhteydessä.

Testikemikaalin lisääminen

13.

Kemikaalia lisätään sopivaan kantaja-aineeseen (esimerkiksi vesi, asetoni, etanoli, polyeteeniglykoli, arabikumi tai hiekka). Testattavaksi sopivat myös seokset (kaupallisesti saatavat tuotteet tai valmisteet), jotka sisältävät aktiivisia ainesosia ja erilaisia apuaineita.

Maa-aineksen / keinotekoisen substraatin sisään vieminen

14.

Vesiliukoiset tai veteen suspendoituneet kemikaalit voidaan lisätä veteen, minkä jälkeen liuos sekoitetaan maa-ainekseen sopivalla sekoituslaitteella. Tämäntyyppinen testaaminen voi olla tarpeen, jos altistuminen kemikaalille tapahtuu maaperän tai maaperän huokosveden kautta ja tutkittavana seikkana on imeytyminen juuriin. Testikemikaalia lisäämällä ei pidä ylittää maa-aineksen vedenpidätyskykyä. Lisätyn veden määrän on oltava sama kaikille testipitoisuuksille, mutta sitä on rajoitettava, jotta maaperän sidosaineet eivät paakkuunnu.

15.

Heikosti veteen liukenevat kemikaalit liuotetaan sopivaan haihtuvaan liuottimeen (esimerkiksi asetoniin tai etanoliin) ja sekoitetaan hiekkaan. Liuotin voidaan tämän jälkeen poistaa hiekasta ilmavirralla, kun hiekkaa samalla sekoitetaan jatkuvasti. Käsitelty hiekka sekoitetaan testissä käytettävään maa-ainekseen. Toiseen kontrolliin lisätään vain hiekkaa ja liuotinta. Kaikkiin käsittelytasoihin sekä toiseen kontrolliin lisätään yhtä paljon hiekkaa, johon liuotin on sekoitettu ja josta se on poistettu. Kiinteät, liukenemattomat testikemikaalit sekoitetaan kuivaan maa-ainekseen sopivalla sekoituslaitteella. Tämän jälkeen maa-aines lisätään ruukkuihin ja siemenet kylvetään välittömästi.

16.

Jos maa-aineksen sijasta käytetään keinotekoista substraattia, vesiliukoiset kemikaalit voidaan liuottaa ravinneliuokseen juuri ennen testin aloittamista. Kemikaalit, jotka eivät liukene veteen, mutta jotka voidaan suspendoida veteen kantoaineena toimivan liuottimen avulla, lisätään kantoaineen kanssa ravinneliuokseen. Veteen liukenemattomat kemikaalit, joille ei ole olemassa myrkytöntä vesiliukoista kantoainetta, liuotetaan sopivaan haihtuvaan liuottimeen. Liuos sekoitetaan hiekkaan tai lasihelmiin, sijoitetaan pyörivään tyhjiölaitteeseen ja haihdutetaan, jolloin hiekka tai helmet saavat tasaisen kemikaalipäällysteen. Punnittu määrä helmiä otetaan erilleen samaa orgaanista liuotinta käyttäen ja kemikaalin määrä analysoidaan ennen kylvöastioiden täyttämistä.

Pintalevitys

17.

Kasvinsuojeluaineille testikemikaalin lisäysmenetelmänä käytetään usein maa-aineksen pinnan ruiskuttamista testiliuoksella. Kaikkien testissä käytettävien välineiden, mukaan lukien testikemikaalin valmistus- ja annosteluvälineet, on oltava malliltaan ja kapasiteetiltaan sellaisia, että näitä välineitä hyödyntävät testit voidaan tehdä täsmällisesti ja peittävyys on toistettavissa. Peittävyyden on oltava sama kaikilla maa-ainespinnoilla. Kemikaalien mahdollista adsorboitumista välineisiin tai reagoimista niiden kanssa (esimerkiksi käytettäessä muoviputkia ja lipofiilisiä kemikaaleja tai teräsosia ja alkuaineita) olisi vältettävä huolellisesti. Testikemikaalia ruiskutetaan maa-aineksen pinnalle simuloiden tavanomaisia levitystapoja ruiskusäiliötä käyttämällä. Ruiskutettavan määrän on yleensä oltava tavanomaisen maatalouskäytännön tasolla, ja määrät (esimerkiksi veden määrä) kirjataan muistiin. Suutin valitaan siten, että peittävyys on sama kautta koko maa-aineksen pinnan. Liuottimia ja kantoaineita käytettäessä perustetaan toinen kontrollikasvien ryhmä, jolle annetaan vain liuotinta/kantoainetta. Tämä ei kuitenkaan ole tarpeen silloin, kun testataan kasvinsuojeluaineita valmisteina.

Testikemikaalin pitoisuuden/tason toteaminen

18.

Käytetyt pitoisuudet/tasot on vahvistettava tarkoitukseen sopivalla analyyttisella todentamismenetelmällä. Kun käytetään liukoisia kemikaaleja, kaikki testipitoisuudet/-tasot voidaan todentaa analysoimalla pitoisuudeltaan suurin testissä käytettävä liuos sekä dokumentoimalla sen laimentaminen ja käyttämällä kemikaalin lisäämisessä kalibroituja välineitä (esimerkiksi kalibroituja analyysilaseja sekä kalibroituja ruiskutusvälineitä). Liukenemattomia kemikaaleja käytettäessä seosmateriaalin todentaminen tehdään ilmoittamalla maa-ainekseen lisätyn testikemikaalin paino. Mahdollista homogeenisuuden osoittamista varten voidaan tarvita maa-aineksen analyysi.

MENETTELY

Testijärjestely

19.

Saman kasvilajin siemenet kylvetään ruukkuihin. Ruukkua kohti kylvettävien siementen lukumäärä riippuu lajista, ruukun koosta ja testin kestosta. Yhdessä ruukussa olevien kasvien määrän olisi tarjottava riittävät kasvuolosuhteet siten, ettei ruukku käy liian ahtaaksi testin kuluessa. Kasvien enimmäistiheys on noin 3–10 siementä 100 cm2:ä kohti siementen koon mukaan. Viidentoista senttimetrin ruukkuun suositellaan esimerkiksi yhtä tai kahta maissin, soijapavun, tomaatin, kurkun tai sokerijuurikkaan tainta, kolmea rapsin tai herneen tainta tai 5–10:tä pientä siementä, kuten sipulin tai vehnän siementä. Siementen ja rinnakkaisnäyteruukkujen lukumäärän (yksi rinnakkaisnäyte tarkoittaa yhtä ruukkua, eikä samassa ruukussa olevia kasveja siis lasketa rinnakkaisnäytteiksi) olisi oltava riittävä optimaalista tilastollista analyysia varten (21). On syytä huomata, että vaihtelu on suurempaa testilajeilla, joista kylvetään muutama suuri siemen ruukkua kohti (rinnakkaisnäyte), kuin lajeilla, joita voidaan kylvää suurempi määrä pieniä siemeniä ruukkua kohti. Vaihtelua saadaan vähennettyä kylvämällä jokaiseen ruukkuun yhtä monta siementä.

20.

Kontrolliryhmien avulla varmistetaan, että havaitut vaikutukset ovat yhteydessä vain testikemikaalille tapahtuvaan altistukseen tai johtuvat siitä. Asianmukainen kontrolliryhmä on joka suhteessa identtinen testiryhmän kanssa testikemikaalille altistusta lukuun ottamatta. Kaikkien samassa testissä käytettävien testikasvien, mukaan lukien kontrollit, on oltava peräisin samasta lähteestä. Tulosten vääristymisen välttämiseksi testi- ja kontrolliruukut on määriteltävä satunnaisesti.

21.

Hyönteismyrkyllä tai sienitautien torjunta-aineella käsiteltyjen siementen (eli peitattujen siementen) käyttöä on vältettävä. Eräiden maiden sääntelyviranomaiset kuitenkin sallivat tiettyjen muiden kuin systeemisten kosketusvaikutteisten sienitautien torjunta-aineiden (esimerkiksi kaptaanin ja tiraamin) käytön (22). Jos on syytä epäillä siementen välityksellä kulkeutuvia patogeenejä, siemenet voidaan upottaa lyhyeksi aikaa 5-prosenttiseen hypokloriittiliuokseen, minkä jälkeen ne huuhdellaan huolellisesti juoksevassa vedessä ja kuivataan. Jälkikäsittely muilla kasvinsuojeluaineilla on kielletty.

Testiolosuhteet

22.

Testiolosuhteiden on oltava mahdollisimman lähellä testattavien lajien ja lajikkeiden normaalisti edellyttämiä kasvuolosuhteita (esimerkkejä testiolosuhteista on lisäyksessä 4). Itäviä kasveja olisi hoidettava hyvän puutarhanhoidon käytäntöjen mukaisesti ympäristöolosuhteiltaan säädeltävissä kasvatuskammioissa, fytotroneissa tai kasvihuoneissa. Kasvatustiloja käytettäessä näihin käytäntöihin kuuluu yleensä ainakin seuraavien valvonta ja riittävän säännöllinen kirjaaminen (esimerkiksi päivittäin): lämpötila, kosteus, hiilidioksidipitoisuus, valo (voimakkuus, aallonpituus, fotosynteesille suotuisa aallonpituusalue), valoisa aika sekä kastelutapa. Näin varmistetaan kasvien hyvä kasvu, jota voidaan arvioida valittuja lajeja edustavien kontrollikasvien avulla. Kasvihuoneiden lämpötilaa säädellään tuuletus-, lämmitys- ja/tai jäähdytysjärjestelmän avulla. Kasvihuoneessa tapahtuvaa testaamista varten suositellaan yleisesti seuraavanlaisia olosuhteita:

lämpötila: 22 °C ± 10 °C;

kosteus: 70 % ± 25 %;

valoisa aika: vähintään 16 tuntia valoa;

valovoima: 350 ± 50 μE/m2/s. Lisävalaistusta saatetaan tarvita, jos valovoima laskee alle 200 μE/m2/s:iin ja aallonpituus alle 400–700 nm:iin, paitsi eräillä lajeilla, jotka tarvitsevat vähemmän valoa.

Ympäristöolosuhteita valvotaan ja ne kirjataan muistiin tutkimuksen ajan. Kasvatusruukkujen on oltava lasitettuja tai muuta kuin huokoista muovia, ja ruukun alle tulee lautanen. Ruukkujen sijaintia voidaan muuttaa määräajoin, jotta kasvien kasvussa ilmenevä vaihtelu jää mahdollisimman pieneksi (sillä kasvatustiloissa vallitsevissa testiolosuhteissa on eroja). Ruukkujen on oltava niin suuria, että normaali kasvu on mahdollista.

23.

Kasvien elinvoiman ylläpitämiseksi maa-ainekseen voidaan tarvittaessa lisätä ravinteita. Lisäravinteiden tarpeesta ja ajoituksesta päätetään kontrollikasveja tarkkailemalla. Suositeltavaa on kastella testiruukut pohjan kautta (esimerkiksi lasikuituisen kastelulangan avulla). Aluksi ruukkuja voidaan kuitenkin kastella päältä, jotta siementen itäminen nopeutuu. Jos testikemikaalia on levitetty maa-aineksen pintaan, kasteluvesi helpottaa kemikaalin tunkeutumista maa-ainekseen.

24.

Valittujen kasvuolosuhteiden olisi oltava testattavalle lajille ja tutkittavalle testikemikaalille sopivat. Kontrollikasvit ja käsitellyt kasvit pidetään samoissa ympäristöolosuhteissa, mutta eri tavoin käsiteltyjen kasvien välinen ristialtistus sekä kontrollikasvien altistuminen testikemikaalille (esimerkiksi haihtuvia kemikaaleja käytettäessä) on estettävä riittävin toimenpitein.

Testaaminen yhdellä pitoisuudella/tasolla

25.

Yhdellä pitoisuudella tai tasolla testaamiseen (altistuskoe/raja-annostesti) sopivan kemikaalin pitoisuuden/tason määrittämisessä on otettava huomioon useita tekijöitä. Yleisiä kemikaaleja testattaessa näitä ovat esimerkiksi kemikaalin fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet. Kasvinsuojeluaineita testattaessa on otettava huomioon testikemikaalin fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ja käyttötapa, suurin pitoisuus tai käyttötaso, käyttökertojen määrä kasvukautta kohti ja/tai testikemikaalin pysyvyys. Kun halutaan selvittää, onko yleisellä kemikaalilla fytotoksisia ominaisuuksia, saattaa olla tarpeen tehdä testi enimmäistasolla 1 000 mg yhdessä kilogrammassa kuivaa maa-ainesta.

Pitoisuusalueen määritystesti

26.

Tarvittaessa voidaan tehdä pitoisuusalueen määritystesti, joka auttaa selvittämään lopullisessa annosvastetutkimuksessa testattavat pitoisuudet/tasot. Pitoisuusalueen määritystestissä käytetään kaukana toisistaan olevia pitoisuuksia (esimerkiksi 0,1, 1,0, 10, 100 ja 1 000 mg yhdessä kilogrammassa kuivaa maa-ainesta). Kasvinsuojeluaineiden pitoisuudet/tasot voivat perustua suositeltuun tai suurimpaan pitoisuuteen tai käyttötasoon ja olla esimerkiksi 1/100, 1/10 ja 1/1 suositellusta tai suurimmasta pitoisuudesta tai käyttötasosta.

Testaaminen useammalla pitoisuudella/tasolla

27.

Testillä, jossa käytetään useita pitoisuuksia/tasoja, todetaan sääntelyviranomaisten edellyttämällä tavalla annosvastesuhde ja määritetään ECx- tai ERx-arvo itävyydelle, biomassalle ja/tai silmämääräisesti havaittaville vaikutuksille verrattuna kontrolleihin, joita ei ole altistettu testikemikaalille.

28.

Pitoisuuksien tai tasojen lukumäärän ja välimatkojen on oltava riittäviä luotettavan annosvastesuhteen määrittämiseen ja regressioyhtälön muodostamiseen sekä ECx- ja ERx-arvojen arviointiin. Valittujen pitoisuuksien/tasojen on katettava määritettävät ECx- tai ERx-arvot. Jos esimerkiksi halutaan saada selville EC50-arvo, on suotavaa tehdä testi tasoilla, jotka tuottavat 20–80 prosentin vaikutuksen. Tuloksen saamiseksi suositellaan käytettävän vähintään viittä geometrisessa sarjassa olevaa pitoisuutta/tasoa, joiden etäisyyden määrittävä kerroin on enintään kolme, sekä käsittelemätöntä kontrollia. Rinnakkaisnäytteiden määrän kaikissa käsittely- ja kontrolliryhmissä on oltava vähintään neljä, ja siemeniä on oltava ainakin 20 kappaletta. Tietyille kasveille, joiden itävyys on heikko tai kasvutavassa esiintyy paljon vaihtelua, voidaan tarvita enemmän rinnakkaisnäytteitä, jotta testin tilastollinen voima paranee. Rinnakkaisnäytteiden määrää voidaan vähentää, jos testipitoisuuksia/tasoja on enemmän. NOEC-arvon arvioinnissa riittävä tilastollinen voima saattaa edellyttää useampia rinnakkaisnäytteitä (23).

Havainnot

29.

Tarkkailujakson aikana eli 14–21 päivän kuluessa siitä, kun 50 prosenttia kontrollikasveista (tarvittaessa myös liuotinkontrolleista) on itänyt, kasveja tarkkaillaan säännöllisesti (vähintään viikoittain, mutta mieluiten päivittäin) itämisen, silmämääräisesti havaittavan fytotoksisuuden sekä kuolleisuuden havaitsemiseksi. Testin lopussa kirjataan muistiin mitattu itävyysprosentti, elossa olevien kasvien biomassa sekä kasvin eri osissa näkyvät haittavaikutukset, joita ovat esimerkiksi poikkeamat itäneiden taimien ulkonäössä, kloroosi, värimuutokset, kuolleisuus sekä vaikutukset kasvin kehitykseen. Lopullinen biomassa voidaan mitata elossa olevien kasvien versojen lopullisesta keskimääräisestä kuivapainosta keräämällä versot maan pintaa myöten ja kuivaamalla ne vakiopainoon 60 asteen lämpötilassa. Vaihtoehtoisesti lopullinen biomassa voidaan mitata versojen tuorepainosta. Toinen päätepiste on esimerkiksi versojen korkeus, jos sääntelyviranomaiset tätä edellyttävät. Havaittavien toksisten vasteiden arvioinnissa käytetään yhtenäistä silmämääräisten vaurioiden pisteytysjärjestelmää. Esimerkkejä kvalitatiivisten ja kvantitatiivisten silmämääräisten luokitusten tekemisestä on lähdeteoksissa (23), (24).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tilastoanalyysi

Yhden pitoisuuden/tason testi

30.

Kutakin kasvilajia koskevat tiedot analysoidaan sopivalla tilastollisella menetelmällä (21). Kasvilajista ilmoitetaan vaikutuksen taso testipitoisuudella/-tasolla tai se, että tiettyä vaikutusta ei tapahtunut testipitoisuudella/-tasolla (esimerkiksi < x prosentin vaikutus havaittiin y-pitoisuudella tai tasolla).

Usean pitoisuuden/tason testi

31.

Annosvastesuhde määritetään regressioyhtälöllä. Tässä voidaan käyttää erilaisia malleja: esimerkiksi ECx:n tai ERx:n (esim. EC25, ER25, EC50, ER50) sekä ERx:n itävyyden luottamusvälien arviointiin dikotomisena tietona sopivat esimerkiksi logitti-, probitti- tai Weibull-menetelmät, Spearmanin ja Kärberin menetelmä tai viritetty Spearmanin ja Kärberin menetelmä. Taimien kasvun (painon ja pituuden) jatkuvina loppupisteinä ECx:ää tai ERx:ää ja sen luottamusvälejä voidaan arvioida sopivalla regressioanalyysilla (esimerkiksi Bruce-Versteegin epälineaarinen regressioanalyysi (25)). R2:n pitäisi herkimmille lajeille olla mahdollisuuksien mukaan 0,7 tai enemmän ja käytettyjen testipitoisuuksien/-tasojen käsittää 20 %:n ja 80 %:n vaikutukset. NOEC-arvoa arvioitaessa kiinnitetään huomiota ennen kaikkea testin voimaan, ja testien valintaperusteena on tiedon hajonta (21), (26).

Testiraportti

32.

Testiraportista käyvät ilmi tutkimusten tulokset, minkä lisäksi siinä kuvataan yksityiskohtaisesti testiolosuhteet, pohditaan tuloksia huolellisesti, analysoidaan tiedot ja tehdään johtopäätöksiä analyysin pohjalta. Tulokset esitetään myös taulukkomuotoisena yhteenvetona ja tiivistelmänä. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

 

Testikemikaali:

kemikaalin tunnistetiedot, testatun kemikaalin testin kannalta olennaiset ominaisuudet (esimerkiksi log Pow, vesiliukoisuus ja höyrynpaine sekä tietoa kulkeutumisesta ja käyttäytymisestä ympäristössä, jos näitä on saatavilla);

kuvaus testiliuoksen valmistuksesta sekä testipitoisuuksien vahvistamisesta 18 kohdassa mainitulla tavalla.

 

Testilajit:

testiorganismin tiedot: laji/lajike, kasvisuku, tieteellinen nimi ja yleisnimi, siementen lähde ja historia mahdollisimman tarkasti (siis esimerkiksi toimittajan nimi, prosentuaalinen itävyys, siementen kokoluokka, eränumero, siementen vuosiluku tai kasvukausi, jolloin ne on kerätty, itävyysluokituksen päiväys ja elinkelpoisuus);

testattujen yksi- ja kaksisirkkaisten lajien lukumäärä;

perustelut lajien valinnalle;

kuvaus siementen varastoinnista, käsittelystä ja hoidosta.

 

Testiolosuhteet:

testauslaitos (esimerkiksi kasvatuskaappi, fytotroni tai kasvihuone);

testijärjestelmän kuvaus (esimerkiksi ruukkujen mitat ja materiaali sekä maa-aineksen määrä);

maa-aineksen ominaisuudet (maa-aineksen rakenne tai tyyppi: maa-aineshiukkasten jakautuminen ja luokitus, fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, mukaan lukien orgaanisen aineksen osuus, orgaanisen hiilen osuus ja pH-arvo);

maa-aineksen tai substraatin (esimerkiksi maa-aineksen, keinomaan, hiekan tai muun) valmistelutoimet ennen testiä;

ravinneliuoksen kuvaus, jos sellaista on käytetty;

testikemikaalin käyttö: applikointimenetelmän kuvaus, käytettyjen välineiden kuvaus, altistustasot ja -määrät, mukaan lukien kemikaalien todentaminen, kalibrointimenetelmän kuvaus sekä kuvaus ympäristöolosuhteista applikoinnin aikana;

kasvuolosuhteet: valon voimakkuus (esimerkiksi fotosynteesille suotuisa aallonpituusalue (PAR)), valoisa aika, enimmäis- ja vähimmäislämpötilat, kasteluaikataulu ja -menetelmä, lannoittaminen;

yhteen ruukkuun kylvettyjen siementen lukumäärä, kasvien lukumäärä annosta kohti, rinnakkaisnäytteiden (ruukkujen) määrä altistustasoa kohti;

kontrollien tyyppi ja lukumäärä (negatiiviset ja/tai positiiviset kontrollit, mahdollinen liuotinkontrolli);

testin kesto.

 

Tulokset:

taulukko kaikista loppupisteistä kunkin rinnakkaisnäytteen osalta, testipitoisuus/-taso ja laji;

itäneiden siementen lukumäärä ja prosenttiosuus kontrolleihin verrattuna;

biomassaa koskevat mittaukset: kasvien versojen kuivapaino tai tuorepaino prosenttiosuutena kontrolleista;

kasvien versojen pituus prosenttiosuutena kontrolleista, jos mitattu;

silmämääräisten vaurioiden prosenttiosuus sekä kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen kuvaus testikemikaalin aiheuttamista silmämääräisistä vaurioista (kloroosi, nekroosi, kuihtuminen, lehtien ja versojen epämuodostumat tai tieto siitä, että mitään vaikutuksia ei ollut) kontrollikasveihin verrattuna;

kuvaus silmämääräisten vaurioiden arvioinnissa käytetystä asteikosta, jos silmämääräistä arviointia käytetään;

yksittäisen tason tutkimuksista ilmoitetaan vaurioiden prosenttiosuus;

ECx- tai ERx-arvot (esimerkiksi EC50, ER50, EC25, ER25) sekä niiden luottamusvälit. Regressioanalyysia käytettäessä ilmoitetaan regressioyhtälön keskivirhe sekä yksittäisten parametrien (esimerkiksi kaltevuuden tai vakiotermin) estimoinnin keskivirhe;

NOEC- ja LOEC-arvot, jos ne on laskettu;

kuvaus tilastollisista menetelmistä ja käytetyistä olettamuksista;

edellä mainittujen tietojen sekä testattujen lajien annosvastesuhteen esitys graafisessa muodossa.

Lisäksi ilmoitetaan poikkeukset tässä testimenetelmässä kuvatuista menettelyistä ja kaikki testin aikana ilmenneet epätavallisuudet.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189–193.

(2)

International Organisation of Standards (ISO). (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth.

(3)

International Organisation of Standards (ISO). (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants.

(4)

American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests.

(5)

U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1.

(6)

US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:

850.4000: Background – Non-target Plant Testing;

850.4025: Target Area Phytotoxicity;

850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence);

850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test;

850.4225: Seedling Emergence, Tier II;

850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.

(7)

AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines.

(8)

Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada.

(9)

Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48.

(10)

Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada.

(11)

Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

(12)

Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. Teoksessa: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, s. 163–206.

(13)

Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571–575.

(14)

Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247–250.

(15)

U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC.

(16)

McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161–1174

(17)

Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349–369.

(18)

Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255–271.

(19)

Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155–271.

(20)

Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532–2541.

(21)

OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(22)

Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1–63.

(23)

Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386–389.

(24)

Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. Teoksessa: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15–23.

(25)

Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485–1492.

(26)

Tämän liitteen luku C.33. Lisääntymistesti lieroilla (Eisenia fetida/Eisenia andrei).

Lisäys 1

Määritelmät

Tehoaine tai aktiivinen ainesosa : Aine, joka on suunniteltu tuottamaan tietyn biologisen vaikutuksen (esimerkiksi hyönteisten rajoitttaminen, kasvitautien hallinta, rikkakasvien hallinta käsittelyalueella). Kutsutaan myös teknistä laatua olevaksi tehoaineeksi tai aktiiviseksi aineeksi.

Kemikaali : aine tai seos.

Kasvinsuojeluaine tai torjunta-aine : aine, jonka tiettyä biologista aktiivisuutta käytetään tarkoituksellisesti suojelemaan kasveja tuholaisilta (esimerkiksi sienitaudeilta, hyönteisiltä ja kilpailijakasveilta).

ECx, x prosenttia vaikutuspitoisuudesta tai ERx, x prosenttia vaikutustasosta : pitoisuus tai taso, joka saa aikaan x prosentin suuruisen epätoivottavan muutoksen testin loppupisteessä kontrolliin verrattuna (esimerkiksi 25 tai 50 prosentin vähenemä itävyydessä, versojen painossa tai jäljelle jääneiden kasvien määrässä taikka samansuuruinen silmämääräisten vaurioiden lisääntyminen on EC25/ER25 tai EC50/ER50).

Itäminen : itutupen tai sirkkalehtien ilmestyminen maanpinnalle.

Valmiste : Kaupallisesti valmistettu tuote, joka sisältää tehoainetta (vaikuttavaa ainesosaa). Kutsutaan myös lopulliseksi valmisteeksi (8) tai tyypilliseksi loppukäyttötuotteeksi.

LOEC (Lowest Observed Effect Concentration, pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus) : Testikemikaalin pienin pitoisuus, jolla vaikutus havaitaan. Tässä testissä LOEC-arvoa vastaavalla pitoisuudella on tilastollisesti merkittävä vaikutus (p < 0,05) tietyn altistusajan kuluessa kontrolliin verrattuna ja se on suurempi kuin NOEC-arvo.

Muut kuin kohdekasvit : Kasvit, jotka eivät ole kohteena olevalla alueella. Kasvinsuojeluaineiden yhteydessä tällä tarkoitetaan yleensä käsittelyalueen ulkopuolella olevia kasveja.

NOEC (No Observed Effect Concentration, pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia) : Testikemikaalin suurin pitoisuus, josta ei ole havaittavaa vaikutusta. Tässä testissä NOEC-arvoa vastaavalla pitoisuudella ei ole tilastollisesti merkittävää vaikutusta (p < 0,05) tietyn altistusajan kuluessa kontrolliin verrattuna.

Fytotoksisuus : haitalliset poikkeamat (mitatut ja silmämääräisesti arvioidut) kasvien normaalista ulkonäöstä ja kasvusta tietyn kemikaalin vuoksi.

Rinnakkaisnäyte : Kokeellinen yksikkö, joka edustaa kontrolliryhmää ja/tai käsittelyryhmää. Tässä tutkimuksessa rinnakkaisnäyte on yksi ruukku.

Silmämääräinen arviointi : silmämääräisten vaurioiden arviointi kasvin asennosta, elinvoimasta, epämuodostumista, kloroosista, nekroosista ja yleisestä ulkonäöstä tehtyjen havaintojen perusteella kontrolliin verrattuna.

Testikemikaali : tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.

Lisäys 2

Luettelo kasvikokeissa historiallisesti käytetyistä lajeista

Heimo

Laji

Yleisnimet

KAKSISIRKKAISET

Sarjakukkaiskasvit

Daucus carota

Porkkana

Mykerökukkaiskasvit

Helianthus annuus

Auringonkukka

Mykerökukkaiskasvit

Lactuca sativa

Salaatti

Ristikukkaiskasvit

Sinapis alba

Keltasinappi

Ristikukkaiskasvit

Brassica campestris var. chinensis

Kiinankaali

Ristikukkaiskasvit

Brassica napus

Rapsi

Ristikukkaiskasvit

Brassica oleracea var. capitata

Keräkaali

Ristikukkaiskasvit

Brassica rapa

Nauris

Ristikukkaiskasvit

Lepidium sativum

Vihanneskrassi

Ristikukkaiskasvit

Raphanus sativus

Retiisi

Savikkakasvit

Beta vulgaris

Sokerijuurikas

Kurkkukasvit

Cucumis sativus

Kurkku

Hernekasvit

Glycine max (G. soja)

Soija

Hernekasvit

Phaseolus aureus

Mungopapu

Hernekasvit

Phaseolus vulgaris

Tarhapapu

Hernekasvit

Pisum sativum

Herne

Hernekasvit

Trigonella foenum-graecum

Sarviapila

Hernekasvit

Lotus corniculatus

Keltamaite

Hernekasvit

Trifolium pratense

Puna-apila

Hernekasvit

Trifolium incarnatum

Rehuvirna

Pellavakasvit

Linum usitatissimum

Pellava

Tatarkasvit

Fagopyrum esculentum

Tattari

Koisokasvit

Solanum lycopersicon

Tomaatti

YKSISIRKKAISET

Liljakasvit

Allium cepa

Sipuli

Heinäkasvit

Avena sativa

Kaura

Heinäkasvit

Hordeum vulgare

Ohra

Heinäkasvit

Lolium perenne

Englanninraiheinä

Heinäkasvit

Oryza sativa

Riisi

Heinäkasvit

Secale cereale

Ruis

Heinäkasvit

Sorghum bicolor

Jyvädurra

Heinäkasvit

Triticum aestivum

Vehnä

Heinäkasvit

Zea mays

Maissi

Lisäys 3

Luettelo mahdollisista ravintokasveihin kuulumattomista lajeista

OECD:n mahdolliset lajit kasvien myrkyllisyyskokeita varten

Huomautus: Seuraavassa taulukossa on tietoa 52:sta ravintokasveihin kuulumattomasta lajista (kutakin kohtaa koskevat kirjallisuusviitteet ilmoitetaan sulkeissa). Mainitut itävyysprosentit on saatu julkaistusta kirjallisuudesta, ja ne on tarkoitettu vain yleisohjeeksi. Yksittäiset kokemukset voivat vaihdella esimerkiksi siementen alkuperän ja muiden tekijöiden mukaan.

HEIMO Lajin tieteellinen nimi

(suomenkielinen yleisnimi)

Elinaika (9) ja kasvupaikka

Siemenpaino

(mg)

Itämistä tai kasvua varten tarvittava valoisa aika (10)

Kylvösyvyys

(mm) (11)

Itämiseen kuluva aika

(vuorokausina) (12)

Erikoiskäsittelyt (13)

Myrkyllisyyskoe (14)

Siementen toimittajat (15)

Muut kirjallisuusviitteet (16)

SARJAKUKKAISKASVIT

Torilis japónica

(Punakatko)

Y, K, kulutukselle alttiit alueet, pensasaidat, laidunmaat (16, 19)

1,7–1,9 (14, 19)

V = P (14)

0

(1, 19)

5 (50 %) (19)

kylmästratifiointi (7, 14, 18, 19), saattavat vaatia kypsymistä (19), pimeys estää itämisen (1, 19), ei erikoiskäsittelyitä (5)

JÄLKEEN (5)

 

 

MYKERÖKUKKAISKASVIT

Bellis perennis

(Tuhatkauno)

Ρ

niityt, nurmet, viljelysmaat

0,09–0,17 (4, 19)

V = P (14)

0

(4)

3 (50 %) (19)

11 (100 %) (18)

säteily ei vaikuta itävyyteen (18, 19), ei erikoiskäsittelyitä (4, 14)

JÄLKEEN (4)

A, D, F

7

Centaurea cyanus

(Ruiskaunokki)

Y

pellot, pientareet, avoimet kasvupaikat (16)

4,1–4,9 (4, 14)

V = P (14)

0–3 (2, 4, 14)

14–21 (100 %) (14)

ei erikoiskäsittelyitä (2, 4)

JÄLKEEN (2, 4)

A, D, E, F

7

Centaurea nigra

(Mustakaunokki)

Ρ

pellot, pientareet, avoimet kasvupaikat (16, 19)

2,4–2,6 (14, 19)

V = P (14)

0 (19)

3 (50 %) (19)

4 (97 %) (18)

saattavat vaatia kypsymistä (18, 19), pimeys estää itämisen (19), ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 26)

JÄLKEEN (5, 22, 26)

A

 

Inula helenium

(Isohirvenjuuri)

Ρ

kosteat, kulutukselle alttiit paikat

(16)

1–1,3 (4, 14, 29)

 

0

(4, 29)

 

ei erikoiskäsittelyitä (4)

JÄLKEEN (4)

A, F

 

Leontodon hispidus

(Kesämaitiainen)

Ρ

pellot, pientareet, kulutukselle alttiit alueet (16, 19)

0,85–1,2 (14, 19)

V = P (14)

0 (19)

4 (50 %) (19)

7 (80 %) (18)

pimeys estää itämisen (17, 18, 19), ei erikoiskäsittelyitä (5, 23)

JÄLKEEN (5, 22, 23)

 

 

Rudbeckia hirta

(Kesäpäivänhattu)

K, Ρ, kulutukselle alttiit alueet

(16)

0,3 (4, 14)

V = P (14)

0

(4, 33)

< 10 (100 %) (33)

ei erikoiskäsittelyitä

(4, 14, 33)

JÄLKEEN (4, 33)

C, D, E, F

 

Solidago canadensis

(Kanadanpiisku)

Ρ

laidunmaat, avoimet paikat (16)

0,06–0,08 (4, 14)

V = P (11)

0

(4)

14–21

(11)

sekoitetaan yhtä suureen määrään hiekkaa ja liotetaan gibberelliinihapossa (pitoisuus 500 ppm) 24 h ajan (11), ei erikoiskäsittelyitä (4)

JÄLKEEN (4)

E, F

 

Xanthium pensylvanicum

(Sappiruoho)

Y

pellot, avoimet kasvupaikat (16)

25–61 (14, 29)

 

0 (1)

5 (29)

 

pimeys saattaa estää itämisen (1), liotetaan lämpimässä vedessä 12 h ajan (29)

ENNEN JA JÄLKEEN (31)

A

 

Xanthium spinosum

(Piikkisappiruoho)

Y

avoimet kasvupaikat (16)

200 (14)

V = P (14)

V > P (6)

10

(6)

 

karheuttaminen (14), ei erikoiskäsittelyitä (6)

ENNEN JA JÄLKEEN (6)

A

 

Xanthium strumarium

(Karheasappiruoho)

Y

pellot, avoimet kasvupaikat (16)

67,4 (14)

V = P (14)

10–20 (6, 21)

 

ei erikoiskäsittelyitä

(6, 14, 21)

ENNEN JA JÄLKEEN (6, 21, 28, 31)

A

 

RISTIKUKKAISKASVIT

Cardamine pratensis

(Luhtalitukka)

Ρ

pellot, pientareet, nurmet (16, 19)

0,6 (14, 19)

V = P (14)

0 (19)

5 (50 %) (19)

15 (98 %) (18)

pimeys estää itämisen (18, 19), ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 22)

JÄLKEEN (5, 22)

F

 

KOHOKKIKASVIT

Lychnis flos-cuculi

(Käenkukka)

Ρ

(16)

0,21 (14)

V = P (14)

 

< 14 (100 %) (14, 25)

saattavat vaatia kypsymistä (18), ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 15, 22–26)

JÄLKEEN (5, 15, 22–26)

F

 

SAVIKKAKASVIT

Chenopodium album

(Jauhosavikka)

Y

pellonreunat, kulutukselle alttiit alueet (16, 19)

0,7–1,5 (14, 19, 34)

V = P (14)

0

(1, 19)

2 (50 %) (19)

käsittelyt eroavat siementen värin mukaan (19), lepotilassa kuivavarastoinnin aikana (19), pimeys estää itämisen (1, 18, 19), kylmästratifiointi (18), ei erikoiskäsittelyitä (14, 34)

ENNEN JA JÄLKEEN (28, 31, 34)

A

32

KLUSIAKASVIT

Hypericum perforatum

(Mäkikuisma)

Ρ

pellot, viljelysmaat, avoimet kasvupaikat (16, 19)

0,1–0,23

(14, 19)

V = P

(14)

0

(1, 19)

3 (19)

11 (90 %) (18)

pimeys estää itämisen (1, 18, 19)

ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 15, 25, 27)

JÄLKEEN

(5, 15, 25, 27)

A, E, F

 

KIERTOKASVIT

Ipomoea hederacea

(Liuskaelämänlanka)

Y

pientareet, avoimet kasvupaikat, viljapellot (16)

28,2

(14)

V > P

(6, 10)

10-20.

(6, 10, 21)

4 (100 %)

(10)

säteily ei vaikuta itävyyteen (1)

ei erikoiskäsittelyitä (6, 21)

ENNEN JA JÄLKEEN

(6, 12, 21, 28)

A

 

SARAKASVIT

Cyperus rotundus

(–)

Ρ

viljelysmaat, laidunmaat, pientareet (16, 30)

0,2

(14)

V = P

(14)

0 (1)

10–20 (6, 10)

12 (91 %)

(10)