”LIITE IX

SPEKTROFOTOMETRINEN MÄÄRITYS ULTRAVIOLETTIVALOSSA

JOHDANTO

Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa antaa tietoa rasvan laadusta ja säilymisestä sekä muutoksista, joita käsittelyt ovat siinä aiheuttaneet. Tässä menetelmässä käytetyillä aallonpituuksilla tapahtuva absorptio johtuu konjugoiduista dieeni- ja trieenijärjestelmistä, jotka ovat peräisin hapetusprosesseista ja/tai puhdistusmenetelmistä. Nämä absorptiot ilmaistaan ominaisekstinktiona

(ekstinktio, joka tapahtuu tiettyyn liuottimeen valmistetun 1-prosenttisen w/v-rasvaliuoksen 10 mm:n paksuisessa kerroksessa), josta tavallisesti käytetään merkkiä K (kutsutaan myös ekstinktiokertoimeksi).

1.   SOVELTAMISALA

Tässä liitteessä kuvataan menetelmä, jolla oliiviöljylle tehdään spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa.

2.   MENETELMÄN PERIAATE

Näyte liuotetaan määrättyyn liuottimeen ja liuoksen absorbanssi mitataan tietyllä aallonpituudella käyttäen vertailuliuoksena puhdasta liuotinta.

Lasketaan spesifinen ekstinktio iso-oktaanissa aallonpituuksilla 232 nm ja 268 nm tai sykloheksaanissa aallonpituuksilla 232 nm ja 270 nm, kun pitoisuus on 1 % w/v 10 mm:n kyvetissä.

3.   VÄLINEISTÖ

3.1   Spektrometri, jolla voidaan mitata ultraviolettivalon aallonpituuksia (220–360 nm) yhden nanometrin tarkkuudella. Spektrometrin aallonpituus- ja absorbanssiasteikkojen tarkkuuden ja uusittavuuden sekä hajavalon osalta suositellaan säännöllisiä tarkastuksia.

3.1.1    Aallonpituusasteikko Voidaan tarkistaa käyttämällä vertailumateriaalia, joka muodostuu holmiumoksidia tai holmiumoksidiliuosta (sinetöity tai ei) sisältävästä optisesta lasisuodattimesta, jossa on selvät absorptiokaistat. Vertailumateriaali on tarkoitettu UV/VIS-spektrofotometrien, joiden spektrikaistan nominaaliset leveydet ovat enintään 5 nm, aallonpituusasteikkojen tarkistamiseen ja kalibrointiin. Mittaukset tehdään vertaamalla ilmanollanäytteeseen aallonpituudella 640–240 nm vertailumateriaalin ohjeiden mukaisesti. Perusviivan korjaus tehdään tyhjällä säteen reitillä jokaisessa raon leveyden muutoksessa. Standardin aallonpituudet on lueteltu vertailumateriaalin sertifikaatissa.

3.1.2    Absorbanssiasteikko Voidaan tarkistaa käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa sinetöityä vertailumateriaalia, jossa on hapanta kaliumdikromaattiliuosta tiettyinä pitoisuuksina ja sertifioidut absorbanssin arvot aallonpituudella λmax (4 kaliumdikromaattiliuosta perkloorihapossa sinetöityinä 4:ään UV-kvartsikyvettiin lineaarisuuden ja fotometrisen tarkkuuden vertailuarvon mittaamiseksi ultraviolettivalossa). Kaliumdikromaattiliuokset mitataan käytettyä happoa vastaan perusviivan korjauksen jälkeen vertailumateriaalin ohjeiden mukaisesti. Absorbanssiarvot on lueteltu vertailumateriaalin sertifikaatissa.

Toinen mahdollisuus tarkistaa valokennon ja valomonistimen vastaus on seuraavanlainen: Punnitaan 0,2000 g spektrofotometrisesti puhdasta kaliumkromaattia ja liuotetaan se 0,05 N kaliumhydroksidiliuokseen 1 000 ml:n mittapulloon niin, että liuosta on 1 000 ml. Mitataan tasan 25 ml tätä liuosta 500 ml:n mittapulloon ja täytetään pullo kaliumhydroksidiliuoksella.

Näin saadun liuoksen ekstinktio mitataan aallonpituudella 275 nm ja käytetään kaliumhydroksidiliuosta vertailuliuoksena. Mitatun ekstinktion on oltava 0,200 ± 0,005, kun käytetään 1 cm:n optista kyvettiä.

3.2   Suorakaiteen muotoisia kvartsikyvettejä kansineen, optinen väli 10 mm, joilla voidaan mitata ultraviolettivalon aallonpituuksia (220–360 nm). Vedellä tai muulla sopivalla liuottimella täytettynä kyvettien antamien lukemien ero saa olla enintään 0,01 ekstinktioyksikköä.

3.3   A-luokan mittapulloja, 25 ml.

3.4   Analyysivaaka, jonka tarkkuus 0,0001 g.

4.   REAGENSSIT

Kaikkien määrityksessä käytettävien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua, jollei toisin mainita, ja veden on oltava joko tislattua tai demineralisoitua tai vastaavaa puhtausastetta.

Liuotin: Iso-oktaani (2,2,4-trimetyylipentaani) mitattavaksi aallonpituudella 232 nm ja 268 nm ja sykloheksaani mitattavaksi aallonpituudella 232 nm ja 270 nm; liuottimen absorbanssin on oltava alle 0,12 aallonpituudella 232 nm ja alle 0,05 aallonpituudella 270 nm suhteessa tislattuun veteen, mitattuna 10 mm:n kyvettiin.

5.   MENETTELY

5.1   Näytteen on oltava täysin homogeenista eikä siinä saa olla suspendoituneita epäpuhtauksia. Jos näin ei ole, näyte suodatetaan paperin läpi noin 30 °C:ssa.

5.2   Punnitaan noin 0,25 g näytettä (1 mg:n tarkkuudella), joka on esikäsitelty edellä kuvatulla tavalla, 25 ml:n mittapulloon, joka täytetään merkkiin liuottimella ja homogenoidaan. Syntyvän liuoksen on oltava täysin kirkasta. Jos ilmenee sameutta tai sakkaa, liuos suodatetaan nopeasti paperin läpi.

HUOM. Yleensä 0,25–0,30 g:n massa on riittävä neitsyt- ja ekstraneitsytoliiviöljyjen absorbanssimittauksiin aallonpituuksilla 268 ja 270 nm. Aallonpituudella 232 nm tehtäviin mittauksiin näytettä tarvitaan yleensä 0,05 g, joten tavallisesti valmistetaan kaksi erillistä liuosta. Oliivin puristemassaöljyjen, jalostettujen oliiviöljyjen ja väärennettyjen oliiviöljyjen absorbanssimittauksiin tarvitaan niiden suuremman absorbanssin vuoksi yleensä pienempi näyte, esim. 0,1 g.

5.3   Tarvittaessa korjataan perusviiva (220–290 nm) molemmissa kvartsikyveteissä (näyte ja vertailuliuos), täytetään näytteen sisältävä kvartsikyvetti testiliuoksella ja mitataan ekstinktiot aallonpituuksilla 232, 268 ja 270 nm vertailuliuoksena käytettyä liuotinta vastaan.

Saatujen ekstinktioarvojen on oltava 0,1–0,8 tai spektrofotometrin lineaarisuusalueella, joka on tarkistettava. Jollei tällaisia tuloksia saada, koe on uusittava käyttäen vahvempia tai laimeampia liuoksia tarpeen mukaan.

5.4   Kun absorbanssi on mitattu aallonpituudella 268 tai 270 nm, mitataan aallonpituudet λmax, λmax + 4 ja λmax – 4. Näitä absorbanssiarvoja käytetään ominaisekstinktion variaation (ΔΚ) määrittämiseksi.

HUOM. Aallonpituutena λmax pidetään liottimena käytetyn isotaanin osalta 268 nm ja sykloheksaanin osalta 270 nm.

6   TULOSTEN ESITTÄMINEN

6.1   Lasketaan ominaisekstinktiot (ekstinktiokertoimet) eri aallonpituuksilla seuraavasta kaavasta:

jossa

Kλ	=	ominaisekstinktio aallonpituudella λ
Eλ	=	aallonpituudella λ mitattu ekstinktio
c	=	liuoksen väkevyys g/100 ml
s	=	kvartsikyvetin valotie senttimetreinä

ilmaistuna kahden desimaalin tarkkuudella.

6.2   Ominaisekstinktion variaatio (ΔΚ)

Ominaisekstinktion absoluuttisen arvon variaatio (ΔΚ) saadaan seuraavalla kaavalla:

jossa Km on ominaisekstinktio maksimiabsorbtion aallopituuden ollessa 270 ja 268 nm käytetystä liuottimesta riippuen.

Tulokset ilmaistaan kahden desimaalin tarkkuudella.”

”LIITE X

RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN MÄÄRITTÄMINEN KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1.   SOVELTAMISALA

Tässä liitteessä esitetään ohjeet kasvirasvoissa ja -öljyissä esiintyvien vapaiden ja sidottujen rasvahappojen määrittämiseksi kaasukromatografisella menetelmällä sen jälkeen kun ne on muunnettu rasvahappojen metyyliestereiksi.

Triasyyliglyseridien sidotut rasvahapot ja esteröintimenetelmästä riippuen vapaat rasvahapot muunnetaan rasvahappojen metyyliestereiksi, jotka määritetään kaasukromatografisella menetelmällä.

Tässä liitteessä kuvatun menetelmän avulla voidaan määrittää rasvahappojen metyyliesterit C12–C24, mukaan lukien tyydyttyneet, cis-kertatyydyttymättömät ja trans-kertatyydyttymättömät sekä cis-monityydyttymättömät ja trans-monityydyttymättömät rasvahappojen metyyliesterit.

2.   PERIAATE

Rasvahappojen metyyliesterien kvantitatiiviseen määritykseen käytetään kaasukromatografista menetelmää. Rasvahappojen metyyliesterit valmistellaan A osan mukaisesti. Ne syötetään injektoriin ja höyrystetään. Rasvahappojen metyyliesterit erotetaan analyyttisissä kolonneissa, joilla on tietty polariteetti ja pituus. Rasvahappojen metyyliesterien havaitsemiseksi käytetään liekki-ionisaatiodetektoria. Määritysedellytykset esitetään B osassa.

Kun rasvahappojen metyyliestereitä määritetään liekki-ionisaatiodetektorin avulla, kantajakaasuna (liikkuva faasi) voidaan käyttää vetyä tai heliumia. Vety nopeuttaa erottumista ja antaa terävämmät piikit. Stationäärifaasi on mikroskooppisen ohut nestekerros kvartsilasista tehdyn inertin kiinteän pinnan päällä.

Kun analysoitavat haihtuvat yhdisteet kulkevat kapillaarikolonnissa, ne joutuvat vuorovaikutukseen kolonnin sisäpintaa verhoavan stationäärifaasin kanssa. Koska eri yhdisteiden vuorovaikutus on erilainen, ne eluoituvat eri aikaan. Tätä kutsutaan yhdisteen retentioajaksi tietyn määritysparametriyhdistelmän osalta. Eri yhdisteet tunnistetaan retentioaikoja vertaamalla.

A OSA

OLIIVIÖLJYN JA OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYN RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN VALMISTAMINEN

1.   SOVELTAMISALA

Tässä osassa kuvataan rasvahappojen metyyliesterien valmistamista. Siihen sisältyy menetelmät oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn rasvahappojen metyyliesterien valmistamiseksi.

2.   SOVELTAMISALA

Oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn rasvahappojen metyyliesterit valmistetaan transesteröimällä kaliumhydroksidin metanoliliuoksella huoneenlämmössä. Näytteen puhdistustarve ennen transesteröintiä riippuu näytteen vapaiden rasvahappojen pitoisuudesta ja määriteltävästä analyyttisestä parametrista, ja menetelmä voidaan valita seuraavan taulukon mukaisesti:

Öljyluokka	Menetelmä
Neitsytoliiviöljy, jonka happamuus ≤ 2,0 %	1. Rasvahapot 2. Transrasvahapot 3. ΔECN42 (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE)
Jalostettu oliiviöljy
Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä koostuva oliiviöljy
Jalostettu oliivin puristemassaöljy
Oliivin puristemassaöljy
Neitsytoliiviöljy, jonka happamuus > 2,0 % Raaka oliivin puristemassaöljy	1. Rasvahapot (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) 2. Transrasvahapot (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) 3. ΔECN42 (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE)

3.   MENETELMÄ

3.1   Transesteröinti kaliumhydroksidin metanoliliuoksella huoneenlämmössä

3.1.1   Periaate

Metyyliesterit muodostuvat transesteröitymällä kaliumhydroksidin metanoliliuoksessa välivaiheessa ennen saippuointia.

3.1.2   Reagenssit

3.1.2.1   Metanolia, jossa enintään 0,5 % (m/m) vettä.

3.1.2.2   Heksaania kromatografiaa varten

3.1.2.3   Heptaania kromatografiaa varten.

3.1.2.4   Dietyylieetteri, stabiloitu analyysia varten.

3.1.2.5   Asetonia kromatografiaa varten.

3.1.2.6   Eluutioliuotin öljyn puhdistamiseksi kolonni-/SPE-kromatografialla: heksaanin ja dietyylieetterin seos 87/13 (v/v).

3.1.2.7   Kaliumhydroksidi, noin 2 M metanoliliuos: Liuotetaan 11,2 g kaliumhydroksidia 100 ml:aan metanolia.

3.1.2.8   Piihappopatruunoita, 1 g (6 ml) kiinteäfaasiuuttoa varten.

3.1.3   Välineistö

3.1.3.1   Kierrekorkkisia koeputkia (tilavuus 5 ml), joiden korkissa PTFE-liitos.

3.1.3.2   Mitta- tai automaattipipetit, 2 ml ja 0,2 ml.

3.1.4   Öljynäytteiden puhdistaminen

Näytteet on tarvittaessa puhdistettava ajamalla öljy piihappopatruunan läpi kiinteäfaasiuuttona. Piihappopatruuna (3.1.2.8) pannaan tyhjiöeluutiolaitteeseen ja pestään 6 ml:lla heksaania (3.1.2.2) ilman tyhjiötä. Kolonniin pannaan öljyliuos (noin 0,12 g) 0,5 ml:ssa heksaania (3.1.2.2). Imeytetään liuos piihappoon ja eluoidaan 10 ml:lla heksaania/dietyylioksidia (87:13 v/v) (3.1.2.6). Homogenoidaan eluaatti kokonaan ja jaetaan se kahdeksi yhtä suureksi näytteeksi. Toinen näyte haihdutetaan kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttajassa huoneenlämmössä. Jäännös liotetaan 1 ml:aan heptaania. Saadusta liuoksesta voidaan määrittää rasvahapot kaasukromatografialla. Toinen näyte haihdutetaan ja liuotetaan jäännös 1 ml:aan asetonia triglyseridien määrittämiseksi tarvittaessa HPCL-menetelmällä.

3.1.5   Menettely

Mitataan 5 ml:n kierrekorkilliseen koeputkeen (3.1.3.1) noin 0,1 grammaa näyteöljyä. Lisätään 2 ml heptaania (3.1.2.2) ja ravistetaan. Lisätään 0,2 ml kaliumhydroksidin metanoliliuosta (3.1.2.7), suljetaan tiiviisti PTFE-liitoksella varustetulla korkilla, ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia. Putken annetaan seistä kunnes liuoksen pintakerros kirkastuu. Erotetaan pintakerros, jossa metyyliesterit ovat. Heptaaniliuos voidaan injektoida kromatografiin. Liuos on syytä säilyttää jääkaapissa kunnes se määritetään kromatografilla. Liuosta ei suositella säilytettäväksi yli 12:ta tuntia.

B OSA

RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN ANALYSOINTI KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1.   SOVELTAMISALA

Tässä osassa annetaan yleisohjeita kapillaarikaasukromatografian käyttöön, kun tarkoituksena on määrittää A osassa kuvatulla menetelmällä saadun rasvahappojen metyyliesterien seoksen koostumus kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti.

Tätä osaa ei sovelleta polymeroitujen rasvahappojen tutkimiseen.

2.   REAGENSSIT

2.1   Kantajakaasu

Inertti kaasu (helium tai vety), huolellisesti kuivattu; ei saa sisältää happea yli 10 mg/kg.

Huomautus 1:

Vety kaksinkertaistaa määritysnopeuden, mutta sen käyttö on vaarallista. Turvalaitteita on kuitenkin saatavana.

2.2   Apukaasut

2.2.1   Vety (puhtaus ≥ 99,9 %), ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.

2.2.2   Ilmaa tai happea, ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.

2.2.3   Typpi (puhtaus > 99 %).

2.3   Vertailustandardi

Rasvahappojen puhtaiden metyyliestereiden seos tai sellaisen tunnetun rasvan metyyliesterit, jotka ovat mahdollisimman samanlaisia kuin tutkittava rasva. Oktadekeeni-, oktadekadieeni- ja oktadekatrieenihappojen metyyliesterien cis- ja trans-isomeerit ovat hyödyllisiä tyydyttymättömien happojen trans-isomeerien havaitsemiseksi.

Monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista on vältettävä.

3.   VÄLINEISTÖ

Nämä ohjeet koskevat tavallista kapillaarikolonnilla varustettua kaasukromatografista laitteistoa sekä liekki-ionisaatiodetektoria.

3.1   Kaasukromatografi

Kaasukromatografissa on oltava seuraavat osat.

3.1.1   Injektiojärjestelmä

On käytettävä injektiojärjestelmää, jossa on kapillaarikolonnit, jolloin injektiojärjestelmän on oltava erityisesti suunniteltu tällaisten kolonnien kanssa käytettäväksi. Järjestelmä voi olla jakajatyyppiä tai jakajaton, kolonniin liitetty (on-column) injektori.

3.1.2   Uuni

Uunin tulee pystyä lämmittämään kolonni vähintään 260 °C:n lämpötilaan ja pitämään se valitussa lämpötilassa 0,1 °C:n tarkkuudella. Viimeksi mainittu vaatimus on erittäin tärkeä, jos käytetään kvartsilasiputkea.

Lämpötilaohjelmoidun laitteen käyttöä suositellaan kaikissa tapauksissa ja erityisesti rasvahapoille, joissa on alle 16 hiiliatomia.

3.1.3   Kapillaarikolonni

3.1.3.1   Putki, joka on valmistettu analysoitaville aineille inertistä aineesta (tavallisesti lasista tai kvartsilasista). Sisähalkaisijan on oltava 0,20–0,32 mm. Sisäpinta on käsiteltävä sopivalla menetelmällä (esim. pintakäsittely, inaktivointi) ennen kuin se päällystetään stationäärifaasikerroksella. Riittävä pituus rasvahapoille ja rasvahappojen cis- ja trans-isomeereille on 60 m.

3.1.3.2   Stationäärifaasi, polaarista polysiloksaanityyppiä (syanosilikonit) olevat kytketyt kolonnit (kolonniverkot) ovat sopivia.

Huomautus 2:

On olemassa vaara, että polaariset polysiloksaanit vaikeuttavat linoleenihapon ja C20-happojen erottumista ja tunnistamista.

Päällysteen on oltava ohut, 0,1–0,2 μm.

3.1.3.3   Kolonnin kokoaminen ja esivalmistelut

Tavanomaisia varotoimenpiteitä on noudatettava kapillaarikolonnien kokoamisessa, ts. kolonnin sijoittelu uuniin (tukirakenteet), liitosten valinta ja asennus (tiiviys), kolonnin päiden liittäminen injektiojärjestelmään ja detektoriin (mahdollisimman vähän kuollutta tilaa). Kantajakaasuvirta johdetaan kolonnin läpi (esimerkiksi 0,3 baaria, 30 kPa, 25 m pitkään kolonniin, jonka sisähalkaisija on 0,3 mm).

Kolonni esilämmitetään ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee 3 °C minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 °C alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on tasoittunut. Lämpötila palautetaan 180 °C:seen ja työskentelyä jatketaan vakiolämpötilassa.

Huomautus 3:

Esivalmisteltuja kolonneja voi myös ostaa.

3.1.4   Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntaja-vahvistin

3.2   Ruisku

Ruiskun enimmäistilavuuden on oltava 10 μl ja jakovälin 0,1 μl.

3.3   Tiedonkeruujärjestelmä

Verkkoon yhdistettävä tiedonkeruujärjestelmä detektoreineen sekä ohjelmisto piikkien integroimiseksi ja standardoimiseksi.

4.   MENETTELY

Toimenpiteet kohdissa 4.1–4.3 koskevat liekki-ionisaatiodetektorin käyttöä.

4.1   Testiolosuhteet

4.1.1   Optimaalisten koeolosuhteiden valinta kapillaarikolonneille

Kapillaarikolonnien tehokkuus- ja permeabiliteettiominaisuuksien vuoksi aineosien erottuminen ja määrityksen kesto riippuvat voimakkaasti kantajakaasun virtausnopeudesta kolonnissa. Sen vuoksi koeolosuhteet on optimoitava muuttamalla tätä parametria (eli kolonnin täytehäviötä) sen mukaan, halutaanko parantaa erotuskykyä vai saada tulos nopeasti.

Seuraavat olosuhteet ovat osoittautuneet sopiviksi rasvahappojen metyyliesterien (C4–C26) erottamiseen. Esimerkkejä kromatogrammeista esitetään lisäyksessä B:

Injektorin lämpötila:	250 °C
Detektorin lämpötila:	250 °C
Uunin lämpötila:	165 °C:sta (8 min) 210 °C:seen nostaen lämpötilaa 2 °C/min
Kantajakaasuna vety	kolonnin pään paine: 179 kPa
Kokonaisvirtaus:	154,0 ml/min
Jakosuhde:	1:100
Injektiotilavuus:	1 μl

4.1.2   Resoluution määrittäminen (ks. lisäys A)

Viereisten piikkien I ja II resoluutio (R) lasketaan seuraavalla kaavalla:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) tai R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia),

tai

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia))

jossa

d r(I) on piikin I retentioetäisyys;

d r(II) on piikin II retentioetäisyys;

t r(I) on piikin I retentioaika;

t r(II) on piikin II retentioaika;

ω(I) on piikin I kannan leveys;

ω(II) on piikin II kannan leveys;

ω0,5 on piikin leveys tietyssä yhdisteessä piikin keskivälissä.

Jos ω(I) ≈ ω(II), R lasketaan seuraavilla kaavoilla:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

jossa

σ on keskihajonta (ks. lisäys A, kuvio 1).

Jos piikkien d r(II) – d r(I) välinen etäisyys dr on yhtä suuri kuin 4σ, resoluutiotekijä R = 1.

Jos piikit eivät ole erottuneet toisistaan kokonaan, piikkien käännepisteisiin piirretyt tangentit leikkaavat kohdan C. Jotta piikit saadaan erottumaan täysin, niiden välisen etäisyyden on oltava

d r(II) – d r(I) = 6 σ josta R = 1,5 (ks. lisäys A, kuvio 3).

5.   TULOSTEN ILMOITTAMINEN

5.1   Kvalitatiivinen analyysi

Näytteen metyyliesteripiikit tunnistetaan lisäyksessä B, kuva 1, esitetyn kromatogrammin avulla, tarvittaessa interpoloimalla tai vertaamalla vertailuseosten vastaaviin metyyliesteripiikkeihin (kuten 2.3 kohdassa esitetään).

5.2   Kvantitatiivinen analyysi

5.2.1   Koostumuksen määrittäminen

Lasketaan yksittäisten rasvahappojen metyyliesterien massaosuus wi ilmaistuna prosenttiosuutena metyyliesterien massasta seuraavasti:

5.2.2   Laskentamenetelmä

5.2.2.1   Yleinen tapaus

Lasketaan tietyssä aineosassa i olevien metyyliesterien pitoisuus massaprosentteina määrittämällä piikin pinta-alan suhteellinen osuus kaikkien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta seuraavan kaavan avulla:

wi = (Ai/ΣA) × 100

jossa

Ai on pinta-ala yksittäisen rasvahappojen metyyliesterin i piikin alla;

ΣA on kaikkien yksittäisten rasvahappojen metyyliesterien kaikkien piikkien alla olevien pinta-alojen summa.

Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

Huomautus 4:

Rasvoissa ja öljyissä rasvahappojen metyyliesterien massaosuus on yhtä suuri kuin triasyyliglyseridien massaosuus grammoina 100 grammassa. Tapauksissa, joissa näin ei voida olettaa, menetellään 5.2.2.2 alakohdan mukaan.

5.2.2.2   Korjauskertoimien käyttö

Joissakin tapauksissa, esimerkiksi silloin kun rasvahapossa on vähemmän kuin 8 hiiliatomia tai hapossa on sekundaarisia ryhmiä, pinta-alat on korjattava soveltamalla erityisiä korjauskertoimia (Fci). Nämä tekijät on määriteltävä jokaisen yksittäisen välineen osalta. Tähän on käytettävä sopivia vertailumateriaaleja, joiden rasvahappokoostumus on sertifioitu vastaavilla vertailuväleillä.

Huomautus 5:

Korjauskertoimet eivät ole identtiset lisäyksessä A esitettyjen teoreettisten liekki-ionisaatiodetektorin korjauskerrointen kanssa, koska niihin sisältyy muun muassa injektiojärjestelmän suorituskyky. Jos erot ovat suurempia, koko järjestelmän suorituskyky olisi tarkistettava.

Vertailuseoksen rasvahappojen metyyliesterien i prosentuaalinen massaosuus saadaan kaavasta:

wi = (mi /Σm) × 100

jossa

mi on rasvahappojen metyyliesterien i massa vertailuseoksessa;

Σm on eri aineosien massojen kokonaismäärä vertailuseoksen rasvahappojen metyyliestereinä

Lasketaan vertailuseoksen kromatogrammista rasvahappojen metyyliesterien i prosentuaalinen pinta-ala:

wi = (Ai/ΣA) × 100

jossa

Ai on rasvahappojen metyyliesterien i pinta-ala vertailuseoksessa;

ΣA on vertailuseoksen kaikkien rasvahappojen metyyliesterien pinta-alojen summa.

Näin ollen korjauskerroin Fc on

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Näytteen jokaisen rasvahappojen metyyliesterin i prosentuaalinen massaosuus on:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

Huomautus 6:

Laskettu arvo vastaa triasyyliglyserideinä laskettua yksittäisten rasvahappojen prosentuaalista massaosuutta 100 rasvagrammaa kohden.

5.2.2.3   Sisäisen standardin käyttö

Tietyissä määrityksissä (esimerkiksi jos kaikkien rasvahappojen määriä ei tunneta, kuten silloin kun 16 ja 18 hiiliatomia sisältävien rasvahappojen ohella esiintyy neljä ja kuusi hiiliatomia sisältäviä happoja tai kun on tarpeen määrittää näytteessä olevien rasvahappojen absoluuttinen määrä) on tarpeen käyttää sisäistä standardia. Usein käytetään rasvahappoja, joissa on 5, 15 tai 17 hiiliatomia. Sisäisen standardin korjauskerroin on määritettävä tarvittaessa.

Aineen i prosentuaalinen massaosuus metyyliestereinä ilmaistuna saadaan kaavasta:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

jossa

A i on rasvahappojen metyyliesterien i pinta-ala;

A IS on sisäisen standardin pinta-ala;

F i on rasvahapon i korjauskerroin rasvahapon metyyliestereinä ilmaistuna;

F IS on sisäisen standardin korjauskerroin;

m on näytteen massa milligrammoina;

m IS on sisäisen standardin massa milligrammoina.

Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

6.   KOESELOSTE

Koeselosteessa on ilmoitettava metyyliestereiden valmistusmenetelmät ja käytetty kaasukromatografinen menetelmä. Siinä on myös mainittava kaikki menettelylliset yksityiskohdat, joista ei määrätä tässä standardimenetelmässä, tai joita pidetään valinnaisina, sekä kaikki tapahtumat, jotka ovat voineet vaikuttaa tuloksiin.

Koeselosteessa on oltava kaikki tarpeelliset tiedot, jotka tarvitaan näytteen täydelliseen tunnistamiseen.

7.   TARKKUUS

7.1   Monilaboratoriotestin tulokset

Yksityiskohtaiset tiedot menetelmän tarkkuutta koskevasta monilaboratoriotestistä esitetään standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C. Tästä monilaboratoriotestistä saatuja arvoja ei välttämättä voi soveltaa muihin kuin esitettyihin pitoisuusalueisiin ja matriiseihin.

7.2   Toistettavuus

Kahden riippumattoman yksittäisen testituloksen, jotka sama henkilö on saanut samassa laboratoriossa samalla menetelmällä ja samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille lyhyen ajan kuluessa, absoluuttinen ero saa korkeintaan 5 prosentissa tapauksista olla suurempi kuin standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C olevissa taulukoissa 1–14 esitetty r.

7.3   Uusittavuus

Kahden yksittäisen testituloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa samalla menetelmällä mutta eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, absoluuttinen ero saa korkeintaan 5 prosentissa tapauksista olla suurempi kuin standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C olevissa taulukoissa 1–14 esitetty R.