KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 3942/92,

annettu 22 päivänä joulukuuta 1992,

vertailumenetelmästä sitosterolin ja stigmasterolin määrittämiseksi voiöljystä

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon maito- ja maitotuotealan yhteisestä markkinajärjestelystä 27 päivänä kesäkuuta 1968 annetun neuvoston asetuksen (ETY) N:o 804/68(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 2071/92(2), ja erityisesti sen 6 artiklan,

sekä katsoo, että

voiöljy on merkittävä ja merkitty voiöljy on tarkastettava komission asetuksen (ETY) N:o 3143/85(3), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1264/92(4), mukaisesti ja erityisesti sen 5 ja 6 artiklan mukaisesti,

voiöljy on merkittävä ja merkityt tuotteet on tarkastettava komission asetuksen (ETY) N:o 570/88(5), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 124/92(6), mukaisesti ja erityisesti sen 3 ja 6 artiklan mukaisesti,

voiöljy on merkittävä ja merkitty voiöljy on tarkastettava komission asetuksen (ETY) N:o 429/90(7), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1264/92, mukaisesti ja erityisesti sen 10 ja 11 artiklan mukaisesti,

voiöljyn merkitsemiseen liittyvien olosuhteiden tiukka noudattaminen on välttämätöntä mainitun voin väärinkäytön ehkäisemiseksi,

ottaen huomioon merkitsemisen merkitys näiden järjestelmien hyvälle toiminnalle, olisi määriteltävä kaikkien näissä järjestelmissä vaadittujen merkkiaineiden yhteiset määritysmenetelmät; tämä mahdollistaisi erityisesti kaikkien näitä järjestelmiä käyttävien toimijoiden tasavertaisen käsittelyn, ja kilpailuolosuhteissa ilmenevien epätasa-arvoisuuksien poistamisen, jotka voivat johtua kansallisesti käytettävien määritysmenetelmien eroavaisuuksista,

on vaikea määritellä määritysmenetelmät kaikille merkkiaineille samanaikaisesti; määritysmenetelmä stigmasterolin ja sitosterolin määrittämiseksi voiöljyssä on ensimmäinen vaihe tässä tarkoituksessa, ja

tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat maidon ja maitotuotteiden hallintokomitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:

1 artikla

Liitteessä täsmennettyä analyysin vertailumenetelmää sovelletaan silloin, kun määritetään stigmasterolin pitoisuus voiöljyssä asetuksen (ETY) N:o 3143/85 6 artiklan mukaisesti, asetuksen (ETY) N:o 570/88 6 artiklan mukaisesti tai asetuksen (ETY) N:o 429/90 11 artiklan mukaisesti. Lisäksi vertailumenetelmää sovelletaan silloin, kun määritetään â-sitosterolin pitoisuus voiöljyssä asetuksen (ETY) N:o 570/88 6 artiklan mukaisesti.

Voiöljy on merkitty oikein, jos saadut tulokset vastaavat tämän asetuksen liitteen 8 kohdassa täsmennettyjä edellytyksiä.

2 artikla

Tämä asetus tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä.

Sitä sovelletaan 1 päivästä helmikuuta 1993.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

Tehty Brysselissä 22 päivänä joulukuuta 1992.

Komission puolesta

Ray MAC SHARRY

Komission jäsen

(1) EYVL N:o L 148, 28.6.1968, s. 13

(2) EYVL N:o L 215, 30.7.1992, s. 64

(3) EYVL N:o L 298, 12.11.1985, s. 9

(4) EYVL N:o L 135, 19.5.1992, s. 5

(5) EYVL N:o L 55, 1.3.1988, s. 31

(6) EYVL N:o L 14, 21.1.1992, s. 28

(7) EYVL N:o L 45, 21.2.1990, s. 8

LIITE

SITOSTEROLIN TAI STIGMASTEROLIN MÄÄRITYS VOIÖLJYSTÄ KAASUKROMATOGRAFISESTI KAPILLAARIKOLONNIN AVULLA

1 PÄÄMÄÄRÄ JA SOVELTAMISALA

Menetelmässä kuvataan voiöljyn sitosterolin tai stigmasterolin kvantitatiivinen määritysmenetelmä. Sitosteroli on â-sitosterolin ja 22-dihydro-â-sitosterolin summa pidettäessä muita sitosteroleita merkityksettöminä. Tätä menetelmää sovelletaan näytteisiin, jotka on saatu asetusten (ETY) N:o 3143/85, (ETY) N:o 570/88 ja (ETY) N:o 429/90 mukaisesti.

2 PERIAATE

Voiöljy saippuoidaan kaliumhydroksidilla etanoliliuoksessa ja saippuoitumattomat osat uutetaan eetterillä.

Sterolit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kaasukromatografisesti kapillaarikolonnin avulla suhteessa sisäiseen standardiin betuliiniin.

3 VÄLINEISTÖ

3.1 Saippuoimispullo, 150 ml, varustettuna palautusjäähdyttimellä, jossa lasihiokset.

3.2 Erotussuppiloita, 500 ml.

3.3 Pulloja, 250 ml.

3.4 Paineentasaussuppiloita, 250 ml tai vastaavia poisheitettävän eetterin keräämiseksi.

3.5 Lasikolonni, 350 mm x 20 mm, varustettuna lasisintteriliitoksella.

3.6 Vesihaude tai tasalämpöinen mantteli.

3.7 Pieniä reaktiopulloja, 2 ml.

3.8 Kaasukromatografialaitteisto, jota voidaan käyttää kapillaarikolonnin kanssa varustettuna jakojärjestelmällä ja johon kuuluu:

3.8.1 termostoitu uuni kolonneille, joka ylläpitää halutun lämpötilan ± 1 °C tarkkuudella;

3.8.2 lämpötilasäätöinen injektori;

3.8.3 liekki-ionisaatiodetektori ja muuntaja-vahvistin;

3.8.4 integraattori-piirturi, jota voidaan käyttää muuntaja-vahvistimen (3.8.3) kanssa.

3.9 Kvartsilasinen kapillaarikolonni, joka on kokonaan päällystetty BP 1:llä tai vastaavalla aineella tasaisesti 0,25 ìm paksuudella; kolonnin on pystyttävä erottamaan lanosterolin ja sitosterolin trimetyylisilyyli-johdannaiset. Kolonni BP 1, jonka pituus on 12 m ja sisähalkaisija 0,2 mm, on sopiva.

3.10 Mikroruisku, jossa on karkaistusta teräksestä oleva neula, 1 ìl, kaasukromatografiaa varten.

4 REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua. Käytettävän veden on oltava tislattua vettä tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa.

4.1 Etanoli, vähintään 95 % puhdasta.

4.2 Kaliumhydroksidi, 60 % liuos, liuotetaan 600 g kaliumhydroksidia (vähintään 85 %) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä.

4.3 Betuliini, puhtaudeltaan vähintään 99 %.

4.3.1 Betuliinin eetteriliuoksia (4.4).

4.3.1.1 Sitosterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on oltava 1,0 mg/ml.

4.3.1.2 Stigmasterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on oltava 0,4 mg/ml.

4.4 Dietyylieetteri, analyysilaatua (ei sisällä peroksideja tai jäännöksiä).

4.5 Natriumsulfaatti, vedetön, rakeina, kuivattu ennalta 102 °C:ssa 2 tuntia.

4.6 Silylointireagenssi, esimerkiksi TRI-SIL (saatavana yritykseltä Pierce Chemical Co., Cat No 49001) tai vastaava. (VAROITUS: TRI-SIL on helposti syttyvä ja myrkyllinen, syövyttävä ja se voi olla syöpää aiheuttava. Laboratoriohenkilökunnan on tunnettava hyvin TRI-SILiin liittyvät turvallisuussäännöt ja noudatettava asianmukaisia varotoimenpiteitä).

4.7 Lanosteroli

4.8 Sitosteroli, puhtaudeltaan tunnettu, vähintään 90 % (P).

Huomautus 1: Kalibrointiin käytettävien standardiaineiden puhtaus on määritettävä standardisointimenetelmällä. Lähdetään olettamuksesta, että kaikki näytteessä esiintyvät sterolit ovat kromatogrammissa edustettuina, että piikkien kokonaispinta-ala vastaa 100 % steroleiden ainesosista, ja että sterolit antavat saman detektorivasteen. Järjestelmän lineaarisuus on tarkistettava kyseeseen tulevilla pitoisuusalueilla.

4.8.1 Sitosterolin standardiliuos: valmistetaan noin 0,001 mg/ml liuos, joka sisältää noin 0,5 mg/ml (W1) sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4).

4.9 Stigmasteroli, puhtaudeltaan tunnettu, vähintään 90 % (P).

4.9.1 Stigmasterolin standardiliuos: valmistetaan noin 0,001 mg/ml liuos, joka sisältää noin 0,2 mg/ml (W2) stigmasterolia (4.9) dietyylieetterissä (4.4).

4.10 Seos erotuskyvyn testaamiseen: valmistetaan liuos, joka sisältää 0,05 mg/ml lanosterolia (4.7) ja 0,5 mg/ml sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4).

5 MENETTELY

5.1 Standardiliuosten valmistus kromatografiaa varten: sisäinen standardiliuos (4.3.1) on lisättävä asianmukaisen sterolin standardiliuokseen samanaikaisesti kuin se lisätään saippuoituun näytteeseen (5.2.2).

5.1.1 Sitosterolin standardi kromatografiliuos: siirretään 1 ml sitosterolin standardiliuosta (4.8.1) kumpaankin 2 ml reaktiopulloon (3.7) ja poistetaan eetteri typpivirralla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1) ja poistetaan eetteri typpivirralla.

5.1.2 Stigmasterolin standardi kromatografiliuos: siirretään 1 ml stigmasterolin standardiliuosta (4.9.1) kumpaankin 2 ml reaktiopulloon (3.7) ja poistetaan eetteri typpivirralla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.2) ja poistetaan eetteri typpivirralla.

5.2 Saippuoitumattomien osien valmistus.

5.2.1 Punnitaan 1 mg tarkkuudella noin 1 g voiöljyä (W2) 150 ml pulloon (3.1). Lisätään 50 ml etanolia (4.1) ja 10 ml kaliumhydroksidiliuosta (4.2). Liitetään palautusjäähdytin ja kuumennetaan noin 75 °C:ssa 30 minuuttia. Irrotetaan jäähdytin ja annetaan pullon jäähtyä ympäröivään lämpötilaan.

5.2.2 Lisätään pulloon 1,0 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1), jos on määritettävä sitosteroli tai (4.3.1.2), jos on määritettävä stigmasteroli. Sekoitetaan huolellisesti. Siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti 500 ml erotussuppiloon (3.2). Pestään pullo 50 ml:lla vettä, sitten 250 ml:lla dietyylieetteriä (4.4). Ravistetaan voimakkaasti erotussuppiloa 2 minuuttia ja annetaan faasien erottua. Poistetaan alempi vesifaasi ja pestään eetterifaasi ravistellen 4 peräkkäisellä 100 ml:aan tasan menevällä osalla vettä.

Huomautus 2: Emulsion muodostumisen välttämiseksi on välttämätöntä, että 2 ensimmäistä vesipesua tehdään varoen (10 kertaa käännellen). Kolmannessa pesussa voidaan ravistella voimakkaasti 30 sekuntia. Jos emulsio muodostuu, se voidaan poistaa lisäämällä 5 10 ml etanolia. Jos etanolia lisätään, on välttämätöntä tehdä 2 uutta voimakasta vesipesua.

5.2.3 Kaadetaan kirkas, saippuaton eetterifaasi lasikolonniin (3.5), joka sisältää 30 g vedetöntä natriumsulfaattia (4.5). Kerätään eetteri 250 ml pulloon (3.3). Lisätään kiehumakiviä ja haihdutetaan vesihauteessa tai tasalämpöisessä manttelissa lähes kuivaksi huolehtien siitä, että poistettavat liuottimet kerätään talteen.

Huomautus 3: Jos näytteiden uutteet haihdutetaan kuivaksi liian korkeassa lämpötilassa, voi tapahtua sterolihäviöitä.

5.3 Trimetyylisilyylieettereiden valmistus.

5.3.1 Siirretään pulloon jäänyt eetteriliuos 2 ml:n reaktiopulloon (3.7) 2 ml:n avulla eetteriä ja poistetaan eetteri typpivirralla. Pestään pullo 2 ylimääräisellä 2 ml:aan tasan menevällä osalla eetteriä siirtäen tämä pesuosa reaktiopulloon ja poistaen eetteri joka kerta typellä.

5.3.2 Näyte silyloidaan lisäämällä 1 ml TRI-SILiä (4.6). Suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti aineen liukenemiseksi. Jos liukeneminen on epätäydellistä, kuumennetaan 65 70 °C:seen. Seisotetaan vähintään 5 minuuttia ennen injektointia kaasukromatografiin. Standardit silyloidaan samoin kuin näytteet. Erotuskyvyn testaamiseen käytettävä seos (4.10) silyloidaan samoin kuin näytteet.

Huomautus 4: Silyloinnin on tapahduttava vedettömässä ympäristössä. Betuliinin epätäydellinen silylointi näkyy betuliinipiikin lähellä olevana toisena piikkinä.

Etanolin läsnäolo silyloinnin aikana häiritsee silylointia. Tämä voi johtua riittämättömästä pesusta uuton aikana. Jos tämä ongelma säilyy, uuttovaiheeseen voidaan lisätä 5:s pesu ravistellen voimakkaasti 30 sekuntia.

5.4 Kaasukromatografinen analyysi.

5.4.1 Toimintaolosuhteiden valinta.

Asennetaan kaasukromatografi valmistajan ohjeiden mukaan.

Ohjeelliset toimintaolosuhteet ovat seuraavat:

>TAULUKON PAIKKA>

- näytteen jako: 10:1 50:1; jakosuhde on optimoitava suhteessa valmistajan antamiin ohjeisiin ja detektorivasteen lineaarisuus on tarkistettava sen jälkeen kyseeseen tulevalla pitoisuusalueella.

Huomautus 5: On erityisen tärkeää, että höyrystymiskammio puhdistetaan säännöllisesti.

- injektoitavan aineen määrä: 1 ìl TMSE-liuosta.

Annetaan järjestelmän tasapainottua, kunnes saadaan riittävän stabiili vaste ennen minkään analyysin aloittamista.

Näitä olosuhteita voidaan muuttaa suhteessa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksiin, jotta saadaan seuraavat vaatimukset täyttävät kromatogrammit:

- sitosterolin piikin on erotuttava riittävästi suhteessa lanosteroliin. Kuva 1 esittää tyypillisen kromatogrammin, jollainen on saatava erotuskyvyn testaamiseen käytettävästä silyloidusta seoksesta (4.10)

- seuraavien sterolien suhteellisten retentioaikojen on oltava suunnilleen:

>TAULUKON PAIKKA>

- betuliinin retentioajan on oltava noin 24 minuuttia.

5.4.2 Analyyttinen menettely:

Injektoidaan 1 ìl silyloitua standardiliuosta (stigmasterolia tai sitosterolia) ja säädetään integraattorin kalibrointiparametrit.

Injektoidaan uudelleen 1 ìl silyloitua standardiliuosta vastekertoimen määrittämiseksi betuliinin suhteen.

Injektoidaan 1 ìl silyloitua näyteliuosta ja mitataan piikkien pinta-alat. Jokaista näytesarjaa on edellettävä ja seurattava standardien injektointi.

Yleisenä sääntönä standardit voidaan injektioida 6 näytteen sarjan jälkeen.

Huomautus 6: Stigmasterolipiikin integroinnin olisi käsitettävä kaikki kuvan 2b kohtien 1,2 ja 3 määrittelemät alueet.

Arvioitaessa sitosteroleja kokonaisuudessaan sitosterolipiikin integroinnin olisi sisällettävä 22-dihydro-â-sitosteroli- (stigmastanoli-) piikin pinta-ala, joka eluoituu välittömästi sitosterolin jälkeen (kuva 3b).

6 TULOSTEN LASKEMINEN

6.1 Määritetään sterolipiikin ja betuliinipiikin pinta-ala 2 standardista jokaisen sarjan alussa ja lopussa ja lasketaan R1:

R1 = >NUM>sterolipiikin pinta-alan keskiarvo standardissa/

>DEN>betuliinipiikin pinta-alan keskiarvo standardissa

Määritetään näytteen sterolipiikin (stigmasteroli tai sitosteroli) ja betuliinipiikin pinta-ala ja lasketaan R2:

R2 = >NUM>sterolipiikin pinta-ala näytteessä/

>DEN>betuliinipiikin pinta-ala näytteessä

W1 = 1 ml standardiliuosta (4.8.1 tai 4.9.1) sisältämän standardisterolin määrä (mg)

W2 = näytteen paino (g) (5.2.1)

P = standardisterolin puhtaus (4.8 tai 4.9).

Näytteensterolipitoisuus(mg/kg) = >NUM>R2/

>DEN>R1

x >NUM>W1/

>DEN>W2

x P x 10.

7 MENETELMÄN TARKKUUS

7.1 Toistettavuus

7.1.1 Stigmasteroli

Kahden mahdollisimman lyhyellä aikavälillä tehdyn 1 henkilön samalla laitteistolla täsmälleen samasta näytemateriaalista tekemän määrityksen tulosten ero ei saa olla suurempi kuin 10,2 mg/kg.

7.1.2 Sitosteroli

Kahden mahdollisimman lyhyellä aikavälillä tehdyn 1 henkilön samalla laitteistolla täsmälleen samasta näytemateriaalista tekemän määrityksen tulosten ero ei saa olla suurempi kuin 3,6 % suhteessa määritysten keskiarvoon.

7.2 Uusittavuus

7.2.1 Stigmasteroli

Eri henkilöiden eri laboratorioissa eri laitteistolla täsmälleen samasta näytemateriaalista tekemien 2 määrityksen tulosten ero ei saa olla suurempi kuin 25,3 mg/kg.

7.2.2 Sitosteroli

Eri henkilöiden eri laboratorioissa eri laitteistolla täsmälleen samasta näytemateriaalista tekemien 2 määrityksen tulosten ero ei saa olla suurempi kuin 8,9 % suhteessa määritysten keskiarvoon.

7.3 Tarkkuustietojen lähde

Tiedot tarkkuudesta on määritetty 1991 tehdystä kokeesta, johon osallistui 9 laboratoriota ja 6 stigmasterolinäytettä (3 kaksoiskappaletta sokeanäytettä); 6 sitosterolinäytettä (3 kaksoiskappaletta sokeanäytettä).

8 HYVÄKSYTTÄVYYSRAJAT

8.1 Tasakoosteisuuden tarkistamiseksi merkitystä tuotteesta on otettava 3 näytettä.

8.2 Stigmasteroli

8.2.1 Stigmasterolin osalta lisättävä määrä on 150 g puhtaudeltaan vähintään 95 % stigmasterolia tonnia voiöljyä kohden eli 142,5 mg/kg; tai 170 g puhtaudeltaan vähintään 85 % stigmasterolia tonnia voiöljyä kohden eli 144,5 mg/kg.

8.2.2 Jos otetaan huomioon kriittinen ero 95 % todennäköisyydellä (CrD95), 3 tuloksen keskiarvo ei saa olla vähemmän kuin:

- 128,3 mg/kg, kun lisätään puhtaudeltaan 95 % stigmasterolia,

- 130,3 mg/kg, kun lisätään puhtaudeltaan 85 % stigmasterolia.

8.2.3 Edellä 8.2.2 kohdassa annettujen perusteiden lisäksi käytetään tuotteen analyysistä saatua pienintä tulosta merkkiaineen tasaisen jakautumisen tarkistamiseksi ja tämä tehdään vertaamalla seuraaviin rajoihin:

- 120,4 mg/kg (95 % lisättävästä vähimmäismäärästä puhtaudeltaan 95 % stigmasterolia ottaen huomioon 1 CrD95-näyte),

- 122,3 mg/kg (95 % lisättävästä vähimmäismäärästä puhtaudeltaan 85 % stigmasterolia ottaen huomioon 1 CrD95-näyte),

- 99,0 mg/kg (80 % lisättävästä vähimmäismäärästä puhtaudeltaan 95 % stigmasterolia ottaen huomioon 1 CrD95-näyte),

- 100,6 mg/kg (80 % lisättävästä vähimmäismäärästä puhtaudeltaan 85 % stigmasterolia ottaen huomioon 1 CrD95-näyte).

Näytteen merkkiainepitoisuutta, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpolointiin 120,4 mg/kg 99,0 mg/kg tai 122,3 mg/kg 100,6 mg/kg.

8.3 Sitosteroli.

8.3.1 Lisättävä määrä sitosterolia on 600 g puhtaudeltaan vähintään 90 % sitosterolia tonnia voiöljyä kohden eli 540 mg/kg.

8.3.2 Jos otetaan huomioon CrD95, 3 tuloksen keskiarvo ei saa olla vähemmän kuin 513,0 mg/kg.

8.3.3 Edellä 8.3.2 kohdassa annettujen perusteiden lisäksi käytetään tuotteen määrityksestä saatua pienintä tulosta merkkiaineen tasaisen jakautumisen tarkistamiseksi ja tämä tehdään vertaamalla seuraaviin rajoihin:

- 484,4 mg/kg (95 % lisättävästä vähimmäismäärästä puhtaudeltaan 90 % sitosterolia ottaen huomioon 1 CrD95-näyte),

- 403,4 mg/kg (80 % lisättävästä vähimmäismäärästä puhtaudeltaan 90 % sitosterolia ottaen huomioon 1 CrD95-näyte).

Näytteen merkkiainepitoisuutta, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpolointiin 484,4 mg/kg 403,4 mg/kg.

Kuva 1 Kromatogrammi testiseoksen erottumisesta

Täydellinen on suotavaa eli lanosterolipiikin jäljen on palattava perusviivalle ennen nousua sitosterolipiikiski vaikka epätäydellinen erottuminen on hyväksyttävissä.

>VIITTAUS KAAVIOON>

Kuva 2a Kuva 2b

Stigmasterolistandardi Stigmasterolilla denaturoitu

voiöljynäyte

>VIITTAUS KAAVIOON>

Kuva 3a Kuva 3a

Sitosterolistandardi â-sitosterolilla denaturoitu

voiöljynäyte >VIITTAUS KAAVIOON>