a) ’eläimillä’ tarkoitetaan taksoneihin Proboscidea ja Artiodactyla kuuluvien lajien maanisäkkäitä ja niiden risteytyksiä;

b) ’tilalla’ tarkoitetaan maatilaa tai muuta virallisesti valvottua maatalous-, teollisuus- tai kaupallista yritystä, myös eläintarhoja, huvipuistoja, villieläin- ja metsästysalueita, joissa eläimiä säännöllisesti pidetään tai jalostetaan;

c) ’erotelluilla muilla eläimenosilla’ tarkoitetaan muita eläimenosia, joista on kokonaan poistettu luut, rustot, henkitorvi ja suuret keuhkoputket, imusolmukkeet, sidekudos, rasva ja lima; kotieläiminä pidettyjen nautaeläinten osalta erotelluiksi muiksi eläimenosiksi katsotaan myös kokonaiset puremalihakset, jotka on leikattu direktiivin 64/433/ETY liitteessä I olevan VIII luvun 41 kohdan A alakohdan mukaisesti.

i) viipymättä teurastettaviksi tarkoitetut eläimet on toimitettava heti määräpaikkana olevaan teurastamoon, jossa ne on teurastettava viiden työpäivän kuluessa;

ii) jalostukseen, tuotantoon tai lihotukseen tarkoitetut eläimet sekä sirkuksiin tai huvipuistoihin-, metsästys- tai villieläinalueille tarkoitetut eläimet on toimitettava heti määräpaikkana olevalle tilalle, jonne niiden on jäätävä vähintään 30 päiväksi ennen kuin ne siirretään edelleen tilan ulkopuolelle, paitsi jos eläimet lähetetään suoraan teurastamoon.

a) ihmisravinnoksi jatkojalostuksen jälkeen tarkoitetut, luonnonvaraisten riistasorkkaeläinten nylkemättömät ruhot;

b) kotieläiminä pidettyjen nautaeläinten erotellut muut eläimenosat, jotka on tarkoitettu lihatuotteina ihmisravinnoksi sen jälkeen, kun niitä on kuumennettu keittämällä vähintään 80 °C:n sisälämpötilan saavuttamiseksi tai kun ne on steriloitu ilmatiiviisti suljetuissa astioissa Fo-arvon ≥ 3 saavuttamiseksi.

a) 2 kohdassa tarkoitettujen laitosten nimet ja osoitteet sekä näiden laitosten valvonnasta vastaava paikallinen toimivaltainen viranomainen sekä

b) tuoteluokat, joiden osalta nämä laitokset on hyväksytty ja rekisteröity.

a) ne tulevat kolmannen maan alueelta tai alueen osasta, joka on mainittu tämän päätöksen liitteessä II olevassa 1 osassa kyseisen lajin tuoreen lihan tuontia varten laaditussa luettelossa;

b) ne täyttävät kyseisen lajin eläinten terveyttä koskevat, liitteessä II olevan 2 osan kyseisen lajin eläinten terveystodistusmallin mukaiset vaatimukset;

c) niiden mukana on liitteen III mallin mukainen kyseisen kolmannen maan toimivaltaisen eläinlääkintäviranomaisen virkaeläinlääkärin allekirjoittama eläinten terveystodistus;

d) ne on saapumisrajatarkastusaseman virkaeläinlääkärin antamassa yhteisessä eläinlääkinnällisessä tuloasiakirjassa hyväksytty passitettaviksi tai varastoitaviksi (tarpeen mukaan).

a) toimivaltainen eläinlääkintäviranomainen on EY:n saapumisrajatarkastusasemalla sinetöinyt erän sarjanumeroidulla sinetillä;

b) erän mukana olevissa direktiivin 97/78/EY 7 artiklassa tarkoitetuissa asiakirjoissa on jokaisella sivulla rajatarkastusasemasta vastuussa olevan toimivaltaisen viranomaisen virkaeläinlääkärin leima: ”ONLY FOR TRANSIT TO RUSSIA VIA THE EC”(”VAIN YHTEISÖN KAUTTA VENÄJÄLLE PASSITUSTA VARTEN”);

c) direktiivin 97/78/EY 11 artiklassa säädettyjä menettelyä koskevia vaatimuksia noudatetaan;

d) saapumisrajatarkastusaseman virkaeläinlääkäri on yhteisessä eläinlääkinnällisessä tuloasiakirjassa todistanut, että erä on hyväksytty passitettavaksi.

I Ne ovat virkaeläinlääkärin valvonnassa.

II Ne sijaitsevat keskellä aluetta, jolla ei 20 km:n säteellä 30 päivän aikana ennen paikan käyttämistä hyväksyttynä keskuksena ole virallisten tietojen mukaan ilmoitettu yhtään suu- ja sorkkatautitapausta.

III Aina ennen käyttöä hyväksyttynä keskuksena ne on puhdistettava ja desinfioitava desinfiointiaineella, joka on viejämaassa virallisesti hyväksytty edellä II kohdassa mainitun taudin tehokkaasti torjuvana desinfiointiaineena.

IV Niissä on oltava eläinkapasiteetti huomioon ottaen: a) yksinomaan tällaista käyttöä varten varatut tilat; b) tarkoituksenmukaiset helposti puhdistettavissa ja desinfioitavissa olevat tilat eläinten lastaamiseen ja lastien purkamiseen, eläinten sijoittamiseen asianmukaisella ja riittävällä tavalla sekä niiden juottamiseen, ruokintaan ja mahdollisiin hoitotoimenpiteisiin; c) tarkoituksenmukaiset tilat tarkastuksia ja eristämistä varten; d) tarkoituksenmukaiset laitteet tilojen ja eläinkuljetusautojen puhdistamiseksi ja desinfioimiseksi; e) tarkoituksenmukaiset rehun, kuivikkeen ja lannan varastointitilat; f) tarkoituksenmukainen jätevedenkeruu- ja käsittelyjärjestelmä; g) virkaeläinlääkärin toimisto.

V Niillä on oltava riittävästi eläinlääkäreitä kaikkien tehtävien suorittamiseksi.

VI Ne ottavat vastaan ainoastaan eläimet, joilla on yksilöllinen tunniste niiden jäljittämisen mahdollistamiseksi. Tämän vuoksi eläimiä hyväksyttäessä keskuksen omistajan tai siitä vastuussa olevan henkilön on varmistettava, että eläimet ovat asianmukaisesti tunnistettuja ja että niiden mukana on kyseisiä lajeja tai luokkia koskevat terveyteen liittyvät asiakirjat tai todistukset. Lisäksi tämän henkilön on kirjattava rekisteriin tai tietokantaan seuraavat tiedot ja säilytettävä ne vähintään kolmen vuoden ajan: omistajan nimi, alkuperä, saapumis- ja poistumispäivä, eläinten numero ja tunnistemerkki tai alkuperäkarjan rekisteröintinumero ja niiden määräpaikka sekä eläinkuljetuksen harjoittajan rekisteröintinumero ja eläimiä keräyskeskuksen vievien tai sieltä pois kuljettavien kuorma-autojen rekisterinumero.

VII Kaikkien eläinten, joita kuljetetaan keräyskeskusten kautta, on täytettävä kyseisen luokan Euroopan yhteisöön tuontia koskevat terveysvaatimukset.

VIII Euroopan yhteisöön vietäväksi tarkoitetut, keräyskeskuksen kautta kulkevat eläimet on kuuden päivän kuluessa saapumisesta lastattava ja kuljetettava suoraan viejämaan rajalle seuraavasti: a) ne eivät saa olla kosketuksissa muiden kuin Euroopan yhteisöön tuontia koskevat terveysvaatimukset kyseisen eläinluokan osalta täyttävien sorkkaeläinten kanssa; b) ne on jaettuna lähetyksiin siten, että missään lähetyksessä ei ole samanaikaisesti jalostus- tai tuotantoeläimiä ja viipymättä teurastettaviksi tarkoitettuja eläimiä; c) ne on kuljetettava kuljetusvälineissä tai konteissa, jotka on ennalta puhdistettu ja desinfioitu desinfiointiaineella, joka on viejämaassa virallisesti hyväksytty edellä II kohdassa mainitun taudin tehokkaasti torjuvana desinfiointiaineena, ja jotka on varustettu siten, ettei niistä kuljetuksen aikana voi valua tai pudota ulosteita, virtsaa, kuivikkeita tai rehua.

IX Kun yhteisöön vietäviä eläimiä koskevat vaatimukset edellyttävät testausta tietyssä määräajassa ennen lastausta, kyseiseen määräaikaan lasketaan kuuluvaksi enintään kuuden päivän pituinen keräysaika, joka alkaa eläinten saapumisesta hyväksyttyyn keskukseen.

X Viejämaan on nimettävä jalostus- ja tuotantoeläimien osalta hyväksytyt keskukset ja teuraseläinten osalta hyväksytyt keskukset ja ilmoitettava komissiolle ja jäsenvaltioiden toimivaltaisille keskusviranomaisille näiden paikkojen nimet ja osoitteet sekä niitä koskevat päivitetyt tiedot säännöllisesti.

XI Viejämaan on määritettävä hyväksyttyihin keskuksiin sovellettavat viralliset valvontamenettelyt ja varmistettava, että valvontaa toteutetaan.

XII Ne on tarkastettava säännöllisesti sen varmistamiseksi, että hyväksymisvaatimukset täyttyvät. Jos hyväksymisvaatimukset eivät enää täyty ja hyväksyntä peruutetaan, hyväksyntä voidaan palauttaa ainoastaan, jos toimivaltainen viranomainen pystyy varmistamaan, että keskus täyttää kaikki edellä mainitut vaatimukset.

A. Esto-ELISA- tai kilpaileva (kompetitiivinen ) ELISA-testi on tehtävä seuraavalla tavalla:

Aineet ja reagenssit:

Testitapa

Cc: konjugaattikontrolli (ei seerumia / ei monoklonaalista vasta-ainetta); C++: vahva positiivinen seerumikontrolli; C+: heikko positiivinen seerumikontrolli; C-: negatiivinen seerumikontrolli; Cm: monoklonaalinen vasta-ainekontrolli (ei seerumia).

Testitapa:

Konjugaattikontrolli (Cc)

:

BTV-antigeenia ja konjugaattia sisältävät kuopat 1A ja 1B ovat sokeakoe, jolla voidaan kalibroida ELISA-lukija.

MAb-kontrolli (Cm)

:

Sarakkeet 1 ja 2, rivit G ja H ovat monoklonaalinen vasta-ainekontrolli, joka sisältää BTV-antigeenia, monoklonaalista vasta-ainetta ja konjugaattia. Kuopista näkyy enimmäisväri. Tämän kontrollin optisen tiheyden keskiarvo vastaa 0 prosentin inhibitioarvoa.

Positiivinen kontrolli (C++, C+)

:

Sarakkeet 1 ja 2, rivit C-D-E-F. Nämä kuopat sisältävät BTV-antigeenia, BTV:n vahvaa ja heikkoa positiivista antiseerumia, MAb:ta ja konjugaattia.

Negatiivinen kontrolli (C-)

:

Kuopat 2A ja 2B ovat negatiivisia kontrolleja, jotka sisältävät BTV-antigeenia, BTV:n negatiivista antiseerumia, MAb:ta ja konjugaattia.

Testiseerumi

:

Laajamittaisissa serologisissa tutkimuksissa ja nopeissa seulontatesteissä seerumit voidaan testata yhtenä laimennoksena 1:5 (lisäys 1). Vaihtoehtoisesti 10 seerumia voidaan testata laimennusvälillä 1:5-1:640 (lisäys 2). Tulokseksi saadaan tietoja testiseerumien vasta-aineiden pitoisuuksista.

Menettely:

Tulosten määritys:

Tietokoneohjelmiston avulla tulostetaan OD-arvot (optinen tiheys) ja inhibitioprosentti (PI) testi- ja kontrolliseerumeille vertaamalla tuloksia antigeenikontrollikuoppien keskiarvoihin. OD- ja PI-arvoja käytetään arvioitaessa, onko testitulos hyväksyttävissä rajoissa. MAb-kontrollin (antigeeni sekä MAb, jos ei testiseerumeita) yläraja-arvot (UCL) ja alaraja-arvot (LCL) ovat OD-arvojen 0,4 ja 1,4 välillä. Kaikki ne levyt, jotka eivät täytä edellä olevia perusteita, on hylättävä.

Jos tietokoneohjelmistoa ei ole käytettävissä, OD-arvot tulostetaan ELISA-tulostimella. 100 %:n arvoa vastaava OD-arvon keskiarvo lasketaan antigeenikontrollikuopille. 50 %:n OD-arvo määritetään ja kunkin näytteen positiivisuus ja negatiivisuus lasketaan manuaalisesti.

Inhibitioprosentti (PI) -arvo = 100 - (kunkin testikontrollin OD / Cm:n OD:n keskiarvo) × 100.

Negatiivista kontrolliseerumia sisältävien rinnakkaiskuoppien PI-arvojen olisi oltava välillä +25 % ja -25 % ja rinnakkaisten nollakoekuoppien PI-arvojen välillä +95 % ja +105 %. Näiden rajojen ulkopuolella olevat arvot eivät välttämättä merkitse sitä, ettei lukemaa voisi hyväksyä, mutta viittaavat siihen, että on kehittymässä taustaväri. Vahvojen positiivisen kontrolliseerumien PI-arvojen olisi oltava välillä +81 % ja +100 % ja heikkojen positiivisten kontrolliseerumien välillä +51 % ja +80 %.

Testiseerumien diagnostinen raja-arvo on 50 % (PI 50 % tai OD 50 %). Näytteet, joiden PI-arvot ovat >50 %, ovat negatiivisia. Rinnakkaiskuoppien raja-arvot ylittäviä tai alittavia näytteitä pidetään epäilyttävinä. Tällaiset näytteet voidaan testata uudelleen spot-testillä ja/tai titraamalla. Positiiviset näytteet voidaan titrata, jolloin selviää näytteen positiivisuuden taso.

Silmämääräinen tulosten luku: Positiiviset ja negatiiviset näytteet erottaa silmämääräisesti helposti; heikkojen positiivisten tai vahvojen negatiivisten näytteiden silmämääräinen tulkinta saattaa olla vaikeampaa.

BTV-ELISA-antigeenin esikäsittely:

BTV-ELISA-antigeenin titraus:

Bluetongue-taudin ELISA-antigeeni titrataan epäsuoralla ELISA-tekniikalla. Antigeenin kaksoislaimennokset titrataan monoklonaaliseen vasta-aineen 3-17-A3 vakiolaimennoksella (1/100). Testitapa on seuraava:

Koska vertailukokeessa monoklonaalista vasta-ainetta on oltava ylimäärin, on valittava antigeenilaimennos, joka on titrauskäyrällä (eikä tasaisella alueella), joka antaa suunnilleen 0,8 OD:n kymmenen minuutin jälkeen.

B) Agargeeli-immunodiffuusiotutkimus on tehtävä seuraavalla tavalla:

Antigeeni:

Presipitoiva antigeeni valmistetaan missä tahansa soluviljelmässä, jossa BTV:n referenssikanta jakautuu nopeasti. Suositellaan BHK- tai Vero-soluja. Antigeeni esiintyy viruskasvun lopussa supernatantissa, mutta ollakseen tehokas se on väkevöitävä 50-100-kertaiseksi. Tähän päästään millä tahansa proteiinien väkevöinnin standardimenetelmällä; virus voidaan inaktivoida lisäämällä 0,3 % (v/v) beeta-propiolaktonia.

Tunnettu positiivinen kontrolliseerumi:

Kansainvälistä vertailuseerumia ja antigeenia käyttäen valmistetaan kansallinen vertailuseerumi, joka standardoidaan optimaalisen suhteen aikaansaamiseksi kansainvälisen seerumin kanssa. Tämä seerumi kylmäkuivataan ja sitä käytetään kaikkien testien tunnettuna kontrolliseerumina.

Testiseerumi

Menettely

:

Kaadetaan 1-prosenttista agaroosia boraatti- tai natriumbarbitolipuskurissa, pH 8,5-9,0, vähintään 3,0 mm:n syvyiseen petrimaljaan. Agariin leikataan seitsemän kosteudesta vapaata, halkaisijaltaan 5,0 mm:n kuoppaa. Kuviossa keskelle tulee yksi kuoppa ja sen ympärille 3 cm:n säteellä kuusi kuoppaa. Keskimmäinen kuoppa täytetään standardiantigeenilla. Kehällä olevat kuopat 2, 4 ja 6 täytetään tunnetuilla positiivisilla seerumeilla, kuopat 1, 3 ja 5 testiseerumeilla. Petrimaljoja inkuboidaan enintään 72 tuntia huoneenlämmössä kosteassa hyvin suljetussa tilassa.

Tulkinta

:

Testiseerumi on positiivinen, jos se muodostaa määrätyn presipitaatioviivan antigeenin kanssa sekä täysin samanlaisen viivan kontrolliseerumin kanssa. Testiseerumi on negatiivinen, ellei se muodosta määrättyä viivaa antigeenin kanssa eikä taivuta kontrolliseerumin viivaa. Petrimaljoja on tutkittava tummaa taustaa vasten ja epäsuorassa valossa.

A) Seerumineutralisaatiotesti on tehtävä seuraavalla tavalla:

Seerumi

:

Kaikki seerumit inaktivoidaan 56 °C:ssa 30 minuuttia ennen käyttöä.

Menettely

:

Mikrotiitterilevyllä tehtävässä seerumineutralisaatiotestissä, jossa virusmäärä on vakio ja seerumimäärä vaihtelee, käytetään MDBK- tai muita herkkiä soluja. Käytetään Colorado- tai Oxford- viruskantaa taikka muuta vertailukantaa annoksena 100 TCID50 / 0,025 ml. Inaktivoidut laimentamattomat seeruminäytteet sekoitetaan yhtä suureen määrään (0,025 ml) virussuspensiota. Virus/seerumiseoksia inkuboidaan 24 tuntia 37 °C:ssa mikrotiitterilevyillä ennen MDBK-solujen lisäämistä. Soluja käytetään sellaisena pitoisuutena, että ne muodostavat 24 tunnin kuluttua ehjän yksikerroksisen viljelmän.

Kontrollit

:

i) virustitraus, ii) seerumin toksisuuskontrolli, iii) siirrostamattomat kontrollisolut, iv) vertailuantiseerumit.

Tulkinta

:

Neutralisaatiotestin tulokset ja käytetyn viruksen pitoisuus kirjataan 3-6 päivän 37 °C:ssa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen. Seerumi todetaan negatiiviseksi ellei laimennoksella ½ (laimentamaton seerumi) tapahdu neutralisoitumista.

B) Nautojen tarttuvaa rinotrakeiittia koskevista lisätakeista taudista vapaisiin jäsenvaltioihin tai niiden taudista vapaille alueille tarkoitettujen nautojen osalta tehdyn komission päätöksen 93/42/ETY mukaisesti tunnustetut muut testit.

A) Näytteenotto ruokatorvesta/nielusta ja testaus on suoritettava seuraavalla tavalla:

Reagenssit

:

Ennen näytteenottoa on valmistettava kuljetuselatusaine. Kuljetuselatusainetta pannaan 2 ml kuhunkin näytepurkkiin. Purkkien on kestettävä pakastus kiinteällä CO2:lla tai nestetypessä. Näyte otetaan tarkoitukseen valmistetun kaapimen (sputum collector) avulla tai ”probang”-tekniikalla. Näyte otetaan siten, että kaavinkuppi työnnetään eläimen suuhun kielen ylitse ruokatorven yläosaan. Ruokatorven yläosasta ja nielusta yritetään kaapia pintakudosta raaputtamalla sivusuuntaisesti ja dorsaalisesti. Kaavin vedetään pois mieluummin sen jälkeen, kun eläin on niellyt; kupin on oltava täynnä ja siinä on oltava sekaisin limaa, sylkeä, ruokatorvinestettä ja pintakudosta. Varmistetaan, että jokaisessa näytteessä on näkyvillä pintakudosta. Rajuja verenvuotoa aiheuttavia liikkeitä on vältettävä. Joistakin eläimistä otettuihin näytteisiin on saattanut sekoittua paljon pötsin sisältöä. Siinä tapauksessa näytteet heitetään pois ja eläimen suu huuhdellaan vedellä tai mieluummin fysiologisella suolaliuoksella ennen kuin toimenpide uusitaan.

Näytteiden käsittely

:

Jokaisen probang-kuppiin kerätyn näytteen laatu tutkitaan, 2 ml sen sisällöstä lisätään samaan määrään kuljetuselatusainetta ja tämä seos siirretään pakastuksenkestävään purkkiin. Purkit suljetaan ilmatiiviisti, sinetöidään, desinfioidaan ja varustetaan nimilapuilla. Näytteet säilytetään viileässä (+ 4 °C), ja ne tutkitaan 3-4 tunnin sisällä tai asetetaan hiilihappojäähän (- 69 °C) tai nestetyppeen ja säilytetään pakastettuina tutkimukseen asti. Jokaisen näytteenoton jälkeen probang-kuppi desinfioidaan ja pestään kolmeen kertaan puhtaalla vedellä.

Suu- ja sorkkatautiviruksen varalta tehtävä testi

:

Näytteet siirrostetaan primaareihin naudan kilpirauhassoluviljelmiin käyttäen vähintään kolmea pulloa näytettä kohti. Muita soveltuvia soluja, esimerkiksi naudan- tai sianmunuaisen primaarisoluja, voidaan myös käyttää, mutta on muistettava, että nämä solut eivät ole kovin herkkiä suu- ja sorkkatautiviruksen tietyille kannoille. Pullot inkuboidaan 37 °C:ssa sylinterikojeessa ja niitä tutkitaan päivittäin 48 tunnin ajan solutuhovaikutuksen (CPE) havaitsemiseksi. Jos tulokset ovat negatiiviset, viljelmät siirretään sokkona uusiin viljelmiin ja niitä tutkitaan 48 tunnin ajan. Jokainen CPE:n spesifisyys on varmistettava.

Suositeltavat kuljetuselatusaineet:

B) Virusneutralisaatiotesti on tehtävä seuraavalla tavalla:

Reagenssit

:

FMD-antigeenia valmistetaan varastoon soluviljelmissä tai naudan kielellä ja antigeeni varastoidaan -70 °C:n lämpötilassa tai alle -20 °C:n lämpötilassa, kun ensin on lisätty 50 % glyserolia. Tämä on varastoantigeeni. Suu- ja sorkkatautivirus on stabiili näissä olosuhteissa eikä virusmäärä juurikaan muutu kuukausien kuluessa.

Menettely

:

Testi suoritetaan tasapohjaisilla kudosviljelmiin tarkoitetuilla mikrotiitterilevyillä käyttäen herkkiä soluja kuten IB-RS-2, BHK-21 tai vasikan munuaissoluja. Testiseerumit laimennetaan ¼ seerumittomalla soluviljelyelatusaineella, johon on lisätty 100 IU/ml neomysiiniä tai muuta soveltuvaa antibioottia. Seerumit inaktivoidaan 56 °C:ssa 30 minuutissa ja niitä käytetään 0,05 ml:n erissä kaksoissarjojen valmistamiseen mikrotiitterilevyillä käyttäen 0,05 ml:n laimennossilmukoita. Tämän jälkeen jokaiseen kuoppaan lisätään esititrattua virusta, joka on myös laimennettu seerumittomalla soluviljelyelatusaineella, jossa on virusta 100 TCID50 / 0,05 ml. Inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa, jonka jälkeen jokaiseen kuoppaan lisätään 0,05 ml solususpensiota, joka sisältää 0,5-1,0 × 106 solua/ml soluviljelyelatusainetta, jossa on suu- ja sorkkataudin vasta-aineesta vapaata seerumia, ja levyt sinetöidään. Levyt inkuboidaan 37 °C:ssa. Yksikerroksiset viljelmät muuttuvat yhtenäisiksi tavallisesti 24 tunnin sisällä. Tavallisesti CPE on kehittynyt 48 tunnissa niin paljon, että tulos on luettavissa mikroskoopilla. Tällöin voidaan tehdä lopullinen mikroskooppiluenta tai levyt voidaan kiinnittää ja värjätä makroskooppista luentaa varten esimerkiksi käyttäen fysiologista suolaliuosta, jossa on 10 % formolia ja 0,05 % metyleenisiniä.

Kontrollit

:

Jokaisessa testissä on mukana homologinen tunnettu antiseerumi, solukontrolli, seerumin toksisuuskontrolli, elatusainekontrolli ja virustitraus, jonka perusteella lasketaan testiin sisältyvien virusten todellinen määrä.

Tulkinta

:

Solutuhovaikutusta osoittavia kuoppia pidetään tartunnan saaneina ja neutralointipitoisuudet ilmaistaan seerumi-virusseoksissa esiintyvän seerumin, joka on määritetty kohdalla 50 % arvioidusta loppupisteestä Spearman-Karber-menetelmän mukaisesti, loppulaimennoksen käänteislukuna (Karber, G., 1931, Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmokologie, 162, 480). Kokeita pidetään hyväksyttävinä, kun kokeessa käytetty viruksen määrä kuoppaa kohti on välillä 101,5 ja 102,5 TCID50 ja kun vertailuseerumin pitoisuus on sen odotetun pitoisuuden kaksinkertaisen pitoisuuden alueella. Jos tulokset jäävät näiden rajojen ulkopuolelle, kokeet uusitaan. Jos lopullinen pitoisuus on 1/11 tai alhaisempi, tulosta pidetään negatiivisena.

C) Vasta-aineen osoittaminen ja määrän toteaminen ELISA-tekniikalla on tehtävä seuraavasti:

Reagenssit

:

Suu- ja sorkkatautiviruksen seitsemää antigeeni 146S -tyyppistä virusta vastaan olevia kanin antiseerumeja käytettynä ennalta määriteltynä optimipitoisuutena 9,6 pH:n karbonaatti/bikarbonaattipuskurissa. Antigeenit valmistetaan BHK 21 -solujen yksikerroksisissa viljelmissä kasvatetuista valikoiduista viruskannoista. Käytetään supernatantteja, joita ei ole puhdistettu ja jotka esititrataan testitavan mukaisesti, mutta ilman seerumia, jotta saadaan laimennos, jonka optinen tiheyslukema on välillä 1,2-1,5 sen jälkeen, kun PBST:tä (fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suolaliuos, joka sisältää 0,05 % Tween-20:tä ja fenolipunaindikaattorin) on lisätty yhtä suuri määrä. Viruksia voidaan käyttää inaktivoidussa muodossa. PBST:ta käytetään laimentimena. Valmistetaan marsun antiseerumeita siirrostamalla marsuihin jokaisen serotyypin 146S-antigeenia. Valmistetaan optimaalinen pitoisuus PBST:hen ennalta määritettynä optimipitoisuutena, joka sisältää 10 % tavallista nautaseerumia ja 5 % tavallista kaniseerumia. Käytetään sian antimarsu-immunoglobuliinia konjugoituna retikka-peroksidaasiin PBST:hen ennalta määriteltynä optimipitoisuutena, joka sisältää 10 % tavallista nautaseerumina ja 5 % tavallista kaniseerumia. Testiseerumit laimennetaan PBST:hen.

Menettely:

Levyt luetaan spektrofotometrisesti 492 nm:ssä mikrotietokoneeseen kytketyn ELISA-lukulaitteen avulla.

Kontrollit

:

Jokaista käytettyä antigeenia kohti on 40 kuoppaa, jotka eivät sisällä seerumia vaan PBST:hen laimennettua antigeenia. Homologisen vertailu-nauta-antiseerumin 2 laimennoksen kaksoissarja. Negatiivisen nautaseerumin 2 laimennoksen kaksoissarja.

Tulkinta

:

Vasta-ainepitoisuudet ilmaistaan testiseerumien lopullisena laimennoksena, jotka antavat tulokseksi 50 % sellaisten viruskontrollikuopissa todettujen OD-arvojen keskiarvoista, joissa ei ole testiseerumia. Positiivisina pidetään 1/40 ylittäviä pitoisuuksia.

Viiteteokset

:

Viiteteokset: Hamblin C, Barnett ITR ja Hedger RS (1986) ”A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. I. Development and method of ELISA.” Journal of Immunological Methods, 93, 115-121.11.

A) Seerumineutralisaatiotesti on tehtävä seuraavalla tavalla:

Seerumi

:

Seerumi: Kaikki seerumit inaktivoidaan 56 °C:ssa 30 minuuttia ennen käyttöä.

Menettely

:

Mikrotiitterilevyllä tehtävässä seerumineutralisaatiotestissä, jossa viruksen määrä on vakio ja seerumin määrä vaihtelee, käytetään Vero- tai muita herkkiä soluja. Aujeszkyn taudin virusta käytetään annoksena 100 TCID50 / 0,25 ml. Inaktivoidut laimentamattomat seeruminäytteet sekoitetaan yhtä suureen määrään (0,025 ml) virussuspensiota. Virus-seerumiseoksia inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa mikrotiitterilevyillä ennen sopivien solujen lisäämistä. Soluja käytetään sellaisena pitoisuutena, että ne muodostavat 24 tunnin kuluttua ehjän yksikerroksisen viljelmän.

Kontrollit

:

i) virustitraus, ii) seerumin toksisuuskontrolli, iii) siirrostamattomat kontrollisolut, iv) vertailuantiseerumit.

Tulkinta

:

Neutralisaatiotestin tulokset ja käytetyn viruksen pitoisuus kirjataan 3-7 päivän 37 °C:ssa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen. Negatiivisena pidetään alle ½:n seerumipitoisuuksia (laimentamaton seerumi).

B) Aujeszkyn tautia koskevista lisätakeista tiettyihin yhteisön alueen osiin tarkoitettujen sikojen osalta tehdyn komission päätöksen 2001/618/EY mukaisesti tunnustetut muut testit.

1. Saint Pierre ja Miqueloniin tuotavien eläinten on oleskeltava hyväksytyllä karanteeniasemalla vähintään 60 päivää ennen niiden viemistä Euroopan yhteisöön. Tätä ajanjaksoa voidaan pidentää yksittäisiä lajeja koskevien testausvaatimusten vuoksi. Eläinten on lisäksi täytettävä seuraavat vaatimukset:

2. Karanteenitilojen on täytettävä ainakin direktiivin 91/496/ETY liitteessä B asetetut vähimmäisstandardit ja seuraavat edellytykset:

a) Käytettävä testi: nahansisäinen rinnakkaistutkimus käyttäen boviini- ja aviäärituberkuliineja (PPD), jotka vastaavat neuvoston direktiivin 64/432/ETY liitteessä B kuvattuja boviini- ja aviäärituberkuliinien valmistusvaatimuksia. Testi on tehtävä hartioiden takana olevalle alueelle (kainaloalueelle) neuvoston direktiivin 64/432/ETY liitteessä B kuvatulla menetelmällä.

b) Ajoitus: eläimet on testattava kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Testien tulkinta

reaktiota on pidettävä

d) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen

Jos eläin saa positiivisen tuloksen boviinituberkuliinilla (PPD) tehdystä nahansisäisestä reaktiotestistä, eläin erotetaan ryhmästä, ja muut eläimet on testattava uudelleen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisen positiivisen testin tekemisestä: tätä on pidettävä ensimmäisenä b kohdassa kuvattuna testinä.

Jos useampi kuin yksi ryhmän eläimistä saa positiivisen tuloksen, EY:hyn ei saa viedä yhtään kyseiseen ryhmään kuuluvaa eläintä.

Jos yksi tai useampi saman ryhmän eläimistä saa epävarman tuloksen, koko ryhmä on testattava uudelleen 42 päivän kuluttua, ja tätä testiä on pidettävä ensimmäisenä b kohdassa kuvattuna testinä.

a) Käytettävä testi

b) Ajoitus: eläimet on testattava kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Testien tulkinta

Direktiivin 64/432/ETY liitteessä C on määritelty positiivinen testitulos.

d) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen

Johonkin näistä testeistä positiivisesti reagoineet eläimet on erotettava ryhmästä, ja muut eläimet on testattava uudelleen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisen positiivisen testin tekemisestä: tätä on pidettävä ensimmäisenä b kohdassa kuvattuna testinä.

EY:hyn saa viedä ainoastaan sellaisia eläimiä, jotka ovat saaneet negatiivisen testituloksen kahdessa b kohdassa kuvatussa perättäisessä testissä.

a) Käytettävä testi: Agid-testi siten kuin se on kuvattu päätöksen 79/542/ETY liitteessä I olevan 3 osan C kohdassa.

Jos saadaan positiivinen reaktio, eläimet on testattava päätöksen 79/542/ETY liitteessä I olevan 3 osan C kohdassa kuvatulla kompetitiivisella Elisa-testillä.

b) Ajoitus

Eläinten on saatava negatiivinen testitulos kahdesta testistä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 21 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen

a) Käytettävä testi: Diagnostiset testit (probang-instrumentti ja serologiset tutkimukset) käyttäen Elisa- ja NV -menetelmiä päätöksen 79/542/ETY liitteessä I olevan 3 osan C kohdassa kuvattujen testausmenettelyjen mukaisesti.

b) Ajoitus: Eläinten on saatava negatiivinen testitulos kahdesta testistä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Jos jokin eläin saa positiivisen tuloksen suu- ja sorkkatautivirustesteissä, yhtäkään karanteeniasemalla olevaa eläintä ei kelpuuteta vientiin EY:hyn.

Huom: Jos havaitaan suu- ja sorkkatautiviruksen rakenneproteiinien ja muiden kuin rakenneproteiinien vasta-aineita, tämän katsotaan aina johtuvan aiemmasta suu- ja sorkkatautitartunnasta rokotustilanteesta riippumatta.

a) Käytettävä testi: Maailman eläintautijärjestön käsikirjassa kuvattu kompetitiivinen Elisa-testi on kansainvälisessä kaupassa pakollinen testi ja samalla yleisimmin käytössä oleva testi. Lisäksi voidaan käyttää seerumin neutralisaatiotestiä tai muuta Maailman eläintautijärjestön käsikirjan asianomaisissa kohdissa kuvatun testausmenetelmän mukaisesti hyväksyttyä testiä.

b) Ajoitus: Eläimille on tehtävä kaksi testiä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Jos jokin eläin saa positiivisen tuloksen karjaruttovirustesteissä, yhtäkään karanteeniasemalla olevaa eläintä ei kelpuuteta vientiin EY:hyn.

a) Käytettävä testi: Elisa-testi, virusten neutralisaatiotesti tai muu Maailman eläintautijärjestön käsikirjan asianomaisissa kohdissa kuvatun testausmenetelmän mukaisesti hyväksytty testi.

b) Ajoitus: Eläimille on tehtävä kaksi testiä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Jos jokin eläin saa positiivisen tuloksen vesikulääristä stomatiittia aiheuttavan viruksen varalta tehtävissä testeissä, yhtäkään karanteeniasemalla olevaa eläintä ei kelpuuteta vientiin EY:hyn.

a) Käytettävä testi: Elisa-testi, virusten neutralisaatiotesti tai muu Maailman eläintautijärjestön käsikirjan asianomaisissa kohdissa kuvatun testausmenetelmän mukaisesti hyväksytty testi.

b) Ajoitus: Eläimille on tehtävä kaksi testiä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Jos jossakin eläimessä näkyy merkkejä altistumisesta Rift Valley -kuumetta aiheuttavalle tekijälle, yhtäkään karanteeniasemalla olevaa eläintä ei kelpuuteta vientiin EY:hyn.

a) Käytettävä testi: serologiset tutkimukset, joissa käytetään Elisa-testiä, virusten neutralisaatiotestiä tai muuta Maailman eläintautijärjestön käsikirjan asianomaisissa kohdissa kuvatun testausmenetelmän mukaisesti hyväksyttyä testiä.

b) Ajoitus: Eläimille on tehtävä kaksi testiä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Jos jossakin eläimessä näkyy merkkejä altistumisesta lumpy skin -taudille, EY:hyn ei saa viedä yhtään kyseiseen ryhmään kuuluvaa eläintä.

a) Käytettävä testi: Elisa-testi, virusten neutralisaatiotesti, immunofluoresenssitesti tai muu hyväksytty testi.

b) Ajoitus: Eläimille on tehtävä kaksi testiä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Jos jossakin eläimessä näkyy merkkejä altistumisesta Krimin-Kongon verenvuotokuumetta aiheuttavalle tekijälle, kyseinen eläin erotetaan ryhmästä.

a) Käytettävä testi: Loinen voidaan tunnistaa konsentroiduissa verinäytteissä Maailman eläintautijärjestön käsikirjan asianomaisissa kohdissa kuvatun testausmenetelmän mukaisesti.

b) Ajoitus: Eläimille on tehtävä kaksi testiä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Jos jostakin eläimestä löytyy T. evansi -loinen, kyseinen eläin erotetaan ryhmästä. Ryhmän muille eläimille on tämän jälkeen tehtävä sisäinen ja ulkoinen loiskäsittely käyttäen T. evansi -loisen torjuntaan soveltuvia välineitä.

a) Käytettävä testi: Viruksen DNA:n osoittaminen on suosituin menetelmä. Se perustuu viruksen tunnistamiseen immunofluoresenssilla tai immunosytokemialla käyttäen Maailman eläintautijärjestön käsikirjan asianomaisissa kohdissa kuvattua testausmenetelmää.

b) Ajoitus: Eläimille on tehtävä kaksi testiä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Jos jossakin eläimessä näkyy merkkejä altistumisesta kinokuumeelle, EY:hyn ei saa viedä yhtään kyseiseen ryhmään kuuluvaa eläintä.

a) Käytettävä testi: Agid-testi tai esto-Elisa Maailman eläintautijärjestön käsikirjassa kuvattujen testausmenetelmien mukaisesti.

b) Ajoitus: Eläimille on tehtävä kaksi testiä: ensimmäinen testi tehdään kahden päivän kuluessa niiden saapumisesta karanteeniasemalle ja toinen aikaisintaan 42 päivän kuluttua ensimmäisestä testistä.

c) Toimintavaihtoehdot testauksen jälkeen: Positiivisen testituloksen saaneet eläimet erotetaan ryhmästä, ja muut eläimet on testattava uudelleen aikaisintaan 21 päivän kuluttua ensimmäisen positiivisen testin tekemisestä: tätä on pidettävä ensimmäisenä b kohdassa kuvattuna testinä.