1.

Määritelmän mukaan jakaantumiskerroin (P) on liuotetun aineen tasapainopitoisuuksien (ci) välinen suhde kaksifaasijärjestelmässä, jossa on kaksi toisiinsa heikosti sekoittuvaa liuotinta:

Jakaantumiskerroin on siis kahden pitoisuuden välinen suhde ja dimensioton suure, joka ilmoitetaan normaalisti kymmenkantaisena logaritmina.

2.

Pow on keskeinen parametri, kun tarkastellaan kemiallisten aineiden kulkeutumista ympäristössä. Aineiden ionisoitumattoman muodon Pow-arvon sekä niiden biokertyvyyden välillä kalojen osalta on osoitettu erittäin merkittävä suhde. On myös osoitettu, että Pow on hyödyllinen parametri, kun ennustetaan adsorptiota maaperään ja sedimentteihin tai todetaan kvantitatiivisia rakenne-aktiivisuussuhteita erilaisten biologisten vaikutusten osalta.

3.

Tätä testimenetelmää koskeva alkuperäinen esitys perustui C. V. Eadsforthin ja P. Moserin kirjoittamaan artikkeliin (1). Testimenetelmän kehittämistä sekä OECD-maiden laboratorioiden välistä vertailutestiä koordinoi Saksan liittotasavallan Umweltbundesamt vuonna 1986 (2).

4.

log Pow -arvot, jotka ovat välillä – 2 … 4 (toisinaan jopa 5 tai enemmän) (1), voidaan määrittää kokeellisesti ravistuspullomenetelmällä (tämän liitteen A.8 luku sekä OECD:n testiohje (TG)107). HPLC-menetelmä kattaa log Pow -arvot välillä 0–6 (1), (2), (3), (4), (5). Tämän menetelmän käyttö saattaa edellyttää Pow-arvon määrittämistä sopivien vertailuaineiden valintaa varten sekä testin tuottaman datan perusteella tehtyjen johtopäätösten tueksi. Laskentamenetelmiä käsitellään lyhyesti tämän testausmenetelmän lisäyksessä. HPLC-menetelmä toteutetaan isokraattisesti.

5.

Pow-arvot riippuvat ympäristöolosuhteista, kuten esimerkiksi lämpötilasta, pH-arvosta ja ionivahvuudesta. Nämä on määriteltävä kokeen yhteydessä, jotta Pow-tiedot osataan tulkita oikein. Ionisoituville aineille voidaan mahdollisuuksien mukaan käyttää jotain muuta, vaihtoehtoista menetelmää (esimerkiksi OECD:n ohjeluonnosta ionisoituneille aineille käytettävästä pH-metrisestä menetelmästä (6)). Kyseinen OECD:n ohjeluonnos saattaa sopia näiden ionisoituvien aineiden Pow-arvon määrittämiseen, mutta joissakin tapauksissa on tarkoituksenmukaisempaa käyttää HPLC-menetelmää ympäristön kannalta merkityksellisille pH-arvoille (ks. 9 kohta).

6.

Käänteisfaasi-HPLC tapahtuu analyyttisessa kolonnissa, joka on täytetty kaupallisesti saatavana olevalla, pitkiä hiilivetyketjuja (esimerkiksi C8, C18) sisältävällä kiinteällä faasilla, joka on kemiallisesti sidottu piidioksidiin.

7.

Kolonniin ruiskutetut kemikaalit jakaantuvat liikkuvan liuotinfaasin ja kiinteän hiilivetyfaasin välillä kulkeutuessaan kolonnia pitkin liikkuvan faasin välityksellä. Kolonni pidättää aineita niiden hiilivety-vesi-jakaantumiskertoimen suhteessa siten, että hydrofiiliset aineet eluoituvat ensin ja lipofiiliset aineet viimeisenä. Retentioaikaa kuvataan käyttökertoimen k avulla seuraavasti:

jossa tR on näytteen retentioaika ja t0 viive eli liuotinmolekyylin keskimääräinen läpäisyaika. Kvantitatiivisia analyyttisia menetelmiä ei tarvita. Retentioaikojen määritys riittää.

8.

Näytteen oktanoli-vesi-jakaantumiskerroin voidaan laskea määrittämällä käyttökerroin k kokeellisesti ja käyttämällä saatua arvoa seuraavassa yhtälössä:

jossa

Edellä mainittu yhtälö saadaan vertailuaineiden oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimen logaritmin ja vertailuaineiden käyttökertoimen logaritmin lineaarisesta regressioanalyysista.

9.

Käänteisfaasi-HPLC:n avulla voidaan arvioida, että jakaantumiskertoimen log Pow on 0–6, mutta poikkeustapauksissa log Pow voi olla jopa 6–10. Tämä saattaa edellyttää liikkuvan faasin modifiointia (3). Menetelmää ei voi käyttää väkevien happojen ja emästen, metallikompleksien, eluentin kanssa reagoivien aineiden tai pinta-aktiivisten aineiden testaukseen. Ionisoituvia aineita voidaan mitata niiden ionisoitumattomassa muodossa (vapaa happo tai vapaa emäs), kunhan käytetään sopivaa puskuria, jonka pH on vähintään yhden pH-yksikön pKa-arvoa pienempi (vapaa happo) tai suurempi (vapaa emäs) Ionisoituvien aineiden testaamiseen (6) saatetaan saada käyttöön myös pH-metrinen menetelmä, jota voidaan käyttää vaihtoehtona (6). Jos log Pow:n määritys tehdään ympäristöriskiluokitusta tai -riskinarviointia varten, testissä käytettävän pH-alueen olisi oltava kyseisen luonnonympäristön kannalta merkityksellinen eli 5,0–9.

10.

Joissakin tapauksissa epäpuhtaudet voivat vaikeuttaa tulosten tulkintaa, koska piikkien kohdentaminen on tällöin epävarmaa. Jos seoksen testauksessa saadaan määrittämätön kaista, on ilmoitettava log Pow:n ylä- ja alaraja sekä kunkin log Pow -piikin pinta-alaprosentti. Jos seokset kuuluvat samaan homologiryhmään, on lisäksi ilmoitettava log Pow:n painotettu keskiarvo (7), joka on laskettu yksittäisten Pow-arvojen sekä vastaavien pinta-alaprosenttiarvojen perusteella (8). Seuraavassa laskelmassa on otettava huomioon piikit, jotka muodostavat vähintään 5 prosenttia piikkien yhteispinta-alasta (9):

log Pow:n painotettua keskiarvoa voidaan käyttää vain homologeista (esimerkiksi alkaanisarjasta) koostuville aineille tai seoksille (esimerkiksi mäntyöljyille). Seosten mittaamisesta voidaan saada mielekkäitä tuloksia, jos käytetyn detektorin herkkyys on sama kaikille seoksen aineille, jotta ne voidaan erottaa toisistaan riittävästi.

11.

Ennen menetelmän käyttöä on oltava tiedossa dissosiaatiovakio, rakennekaava sekä liukoisuus liikkuvassa faasissa. Lisäksi hydrolyysiä koskevasta tiedosta on hyötyä.

12.

Mittaustulokset varmistetaan tekemällä kaksi määritystä.

13.

Laboratorioiden välisessä vertailutestissä on osoitettu, että HPLC-menetelmällä päästään log Pow-arvoihin, jotka ovat ± 0,5 yksikköä ravistuspullomenetelmällä saaduista arvoista (2). Muita vertailuja on esitetty kirjallisuudessa (4), (5), (10), (11), (12). Tarkimmat tulokset saadaan rakenteellisesti testiainetta muistuttavien vertailuaineiden perusteella laadituista korrelaatiokäyristä (13).

14.

Aineen mitatun käyttökertoimen k ja sen Pow-arvon välille korrelaatiota muodostettaessa on laadittava kalibrointikäyrä, jossa on vähintään kuusi pistettä (ks. 24 kohta). Käyttäjä valitsee sopivat vertailuaineet. Vertailuaineiden log Pow -arvoihin olisi normaalisti sisällyttävä testiaineen log Pow -arvo. Toisin sanoen ainakin yhden vertailuaineen Pow-arvon olisi oltava testiainetta suurempi ja ainakin yhden vertailuaineen Pow-arvon testiainetta pienempi. Ekstrapolointia voi käyttää vain poikkeustapauksissa. Suositeltavaa on, että vertailuaineet muistuttavat rakenteellisesti testiainetta. Kalibroinnissa käytettävien vertailuaineiden log Pow -arvojen on perustuttava luotettaviin koetuloksiin. Kuitenkin aineille, joiden log Pow -arvo on korkea (yleensä yli 4), voidaan käyttää laskennallisia arvoja, ellei luotettavia koetuloksia ole saatavana. Ekstrapoloituja arvoja käytettäessä raja-arvo on mainittava.

15.

Lähdekirjallisuudessa on laajat luettelot monien kemikaaliryhmien log Pow -arvoista (14), (15). Jos näytteen kanssa rakenteeltaan samankaltaisten aineiden tietoja ei ole käytettävissä, voidaan käyttää yleisempää kalibrointia, joka perustuu muihin vertailuaineisiin. Suositeltavat vertailuaineet ja niiden Pow-arvot on esitetty taulukossa 1. Ionisoituvien aineiden osalta annettuja arvoja sovelletaan ionisoitumattomiin muotoihin. Arvojen uskottavuus ja laatu on todettu laboratorioiden välisessä vertailutestissä.

Taulukko 1

Suositeltavat vertailuaineet

16.

Testiaineen jakaantumiskerrointa voidaan tarvittaessa arvioida. Suositeltavinta on käyttää laskentamenetelmää (ks. lisäys) tai määrätyissä tapauksissa testiaineen liukoisuutta puhtaisiin liuottimiin.

17.

Menetelmässä tarvitaan nestefaasikromatografi, jossa on pulssittomasti toimiva pumppu ja sopiva detektorijärjestelmä. RI-detektoria tai aallonpituutta 210 nm käyttävää UV-detektoria voidaan käyttää useille erilaisille kemiallisille ryhmille. Kiinteässä faasissa olevat polaariset ryhmät saattavat vakavasti häiritä HPCL-kolonnin tehokkuutta, minkä vuoksi polaaristen ryhmien määrä kiinteissä faaseissa (16) on minimoitava. Menetelmässä voidaan käyttää kaupallisesti saatavana olevia mikrohiukkas-vastafaasipakkauksia tai valmiiksi pakattuja kolonneja. Ruiskutusjärjestelmän ja analyyttisen kolonnin välissä voidaan pitää suojakolonnia.

18.

Eluutioliuotin valmistetaan HPLC-laatuisesta metanolista ja tislatusta tai ionivaihdetusta vedestä. Liuottimelle tehdään kaasunpoisto ennen käyttöä. Eluution pitäisi olla isokraattinen. Metanoli-vesiseoksessa on oltava vähintään 25 prosenttia vettä. Yleensä seoksella, jossa on metanolia ja vettä tilavuussuhteessa 3:1, saadaan tyydyttäviä tuloksia, kun eluoidaan aineita, joiden log P -arvo on 6, yhdessä tunnissa virtausnopeudella 1 ml/min. Jos aineiden log P -arvo on yli 6, saattaa olla tarpeen lyhentää eluointiaikaa (myös vertailuaineiden kohdalla) vähentämällä liikkuvan faasin polaarisuutta tai kolonnin pituutta.

19.

Testiaineen ja vertailuaineiden liukoisuuden liikkuvaan faasiin on oltava tarpeeksi suuri niiden havaitsemista varten. Lisäaineita voidaan käyttää metanoli-vesiseoksen yhteydessä vain poikkeustapauksissa, koska lisäaineet muuttavat kolonnin ominaisuuksia. Tällöin on varmistettava, etteivät lisäaineet vaikuta testiaineen ja vertailuaineiden retentioaikaan. Jos metanoli-vesiseos ei sovellu tarkoitukseen, voidaan käyttää muita orgaanisen liuottimen ja veden seoksia, esimerkiksi etanoli-vesiseosta, asetonitriili-vesiseosta tai isopropyylialkoholi (2-propanoli)-vesiseosta.

20.

Ionisoivien aineiden osalta eluentin pH on kriittinen. Sen on oltava kolonnin pH-alueella eli yleensä 2–8. Puskurointia suositellaan. On varottava suolan saostumista ja kolonnin huononemista, mitä voi tapahtua eräiden orgaanisten faasi-puskuriseosten yhteydessä. HPLC-mittauksia, joissa piidioksidipohjaisen kiinteän faasin pH on yli 8, ei yleensä suositella, koska emäksinen liikkuva faasi voi aiheuttaa kolonnin suorituskyvyn nopeaa huononemista.

21.

Testiaineen ja vertailuaineiden on oltava riittävän puhtaita, jotta kromatogrammien piikit voidaan kohdentaa oikeille aineille. Testi- ja kalibrointitarkoituksiin käytettävät aineet liuotetaan liikkuvaan faasiin mahdollisuuksien mukaan. Jos muuta kuin liikkuvassa faasissa olevaa liuotinta käytetään testi- ja vertailuaineiden liuottamiseen, liikkuvaa faasia on käytettävä injektointia edeltävässä viimeisessä laimennuksessa.

22.

Mittauksen aikana lämpötila saa vaihdella enintään ± 1 °C.

23.

Kuollut aika t0 voidaan mitata käyttämällä kolonnin läpi pidättymättä kulkevia orgaanisia aineita (esimerkiksi tiokarbamidia tai formamidia). Tarkemmin kuollut aika saadaan mitatuista retentioajoista tai noin seitsenosaisesta homologisesta sarjasta (esimerkiksi n-alkyylimetyyliketoneista) (17). Retentioajat tR (nC + 1) piirretään ajan tR (nC) funktiona, jossa nC on hiiliatomien määrä. Tuloksena saadaan suora linja tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, jossa yhtälöä k(nC + 1)/k(nC) edustava A on vakio. Kuollut aika t0 saadaan vakiotermistä (1 – A)t0 sekä kaltevuudesta A.

24.

Seuraavaksi laaditaan korrelaatiokäyrä, jossa soveltuvien vertailuaineiden log k -arvot esitetään log P -arvojen funktiona. log P -arvot ovat lähellä testiaineen odotettavissa olevaa arvoa. Käytännössä samanaikaisesti injektoidaan 6–10 vertailuainetta. Retentioajat on suositeltavaa määrittää detektorijärjestelmään kytketyllä tallentavalla integraattorilla. Käyttökertoimen k vastaavat logaritmit merkitään käyrään log P -arvojen funktiona. Regressioyhtälö lasketaan määrätyin välein, vähintään kerran päivässä, jotta kolonnin suorituskyvyn mahdolliset muutokset voidaan ottaa huomioon.

25.

Testiainetta injektoidaan määrinä, jotka ovat vielä juuri ja juuri havaittavissa. Retentio määritetään kaksi kertaa. Testiaineen jakaantumiskerroin saadaan interpoloimalla laskettu käyttökerroin kalibrointikäyrälle. Jos jakaantumiskerroin on hyvin pieni tai hyvin suuri, on käytettävä ekstrapolointia. Etenkin näissä tapauksissa on otettava huomioon regressiosuoran luottamusrajat. Jos näytteen retentioaika on standardeja varten saatujen retentioaikojen vaihteluvälin ulkopuolella, on mainittava myös raja-arvo.

26.

Testiraportissa on oltava seuraavat tiedot:

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). ’Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995’, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, s. 529–537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

1.

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 201 (2006, liite oikaistu vuonna 2011). On todettu tarpeelliseksi laajentaa testimenetelmää, jotta siihen voidaan lisätä uusia lajeja ja jotta menetelmää voidaan päivittää siten, että vaaranarviointia ja kemikaalien luokitusta koskevat vaatimukset täyttyvät. Menetelmän tarkistus perustuu laajaan käytännön kokemukseen, tieteen kehitykseen leviin kohdistuvien myrkyllisyystutkimusten alalla sekä testimenetelmän aiemman version laajaan käyttöön sääntelyssä.

2.

Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

3.

Testin tavoitteena on määrittää testattavan kemikaalin vaikutukset makean veden viherlevien ja/tai syanobakteereiden kasvuun. Eksponentiaalisesti kasvavat koe-eliöt altistetaan testikemikaalille panosviljelmissä yleensä 72 tunnin ajan. Vaikka testi on suhteellisen lyhyt, sillä voidaan arvioida useaan sukupolveen kohdistuvia vaikutuksia.

4.

Järjestelmän vasteena on kasvun väheneminen sarjassa leväviljelmiä (testiyksiköitä), jotka on altistettu testikemikaalin eri pitoisuuksille. Vastetta arvioidaan altistuspitoisuuden funktiona vertaamalla sitä rinnakkaisten, altistumattomien kontrolliviljelmien keskimääräiseen kasvuun. Jotta järjestelmän vaste myrkkyvaikutuksiin ilmenisi kokonaan (optimaalinen herkkyys), viljelmien kasvua ei rajoiteta vaan niiden annetaan kasvaa eksponentiaalisesti olosuhteissa, joissa on riittävästi ravinteita ja valonsaanti on jatkuvaa, kunnes spesifisen kasvunopeuden pieneneminen on mitattavissa.

5.

Kasvua ja kasvun estymistä kvantifioidaan mittaamalla leväbiomassa ajan funktiona. Leväbiomassa määritetään kuivapainona tilavuutta kohden, esimerkiksi milligrammoina levää yhtä litraa testiliuosta kohden. Kuivapainoa on kuitenkin vaikea mitata, minkä vuoksi käytetään korvaavia parametreja. Useimmin käytettyjä ovat solumäärät. Muita korvaavia parametreja ovat muun muassa solutilavuus, fluoresenssi ja optinen tiheys. Mitatun korvaavan parametrin ja biomassan välinen muuntokerroin on tunnettava.

6.

Testin loppupisteenä on kasvun estyminen, joka ilmenee biomassan logaritmisesta kasvusta (keskimääräisestä spesifisestä kasvunopeudesta) altistusaikana. Testiliuossarjassa mitattujen keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien avulla määritetään pitoisuus, jossa kasvunopeus vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan ErCx-arvona (esimerkiksi ErC50).

7.

Toinen testimenetelmässä käytetty vastemuuttuja on tuotos, jota voidaan tarvita joissakin maissa erityisten sääntelyvaatimusten täyttämiseksi. Tuotoksella tarkoitetaan altistusajan lopussa mitatun biomassan ja altistusajan alussa mitatun biomassan erotusta. Testiliuossarjassa mitatun tuotoksen avulla määritetään pitoisuus, jossa tuotos vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan EyCx-arvona (esimerkiksi EyC50).

8.

Tilastollisesti voidaan määrittää myös pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) sekä pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC).

9.

Testikemikaalia koskevia tietoja, joista voi olla hyötyä päätettäessä testiolosuhteista, ovat rakennekaava, puhtaus, stabiilius valossa, stabiilius testiolosuhteissa, valonabsorbointiominaisuudet, pKa ja muuntumistutkimusten tulokset, mukaan luettuna biohajoavuus vedessä.

10.

Testikemikaalin vesiliukoisuus, oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin (Pow) ja höyrynpaine on tunnettava, ja testiliuoksissa olevan testikemikaalin kvantifioimiseen tarvitaan validoitu menetelmä, jonka saantoteho ja havaitsemisraja tunnetaan.

11.

Jotta testi olisi validi, sen on täytettävä seuraavat vaatimukset:

12.

Testimenetelmä voidaan tarkistaa testaamalla vertailukemikaali (-kemikaalit), kuten 3,5-dikloorifenoli, jota on käytetty kansainvälisessä yhteistutkimuksessa (1). Viherleviä viljeltäessä vertailukemikaalina voidaan käyttää myös kaliumdikromaattia. Vertailukemikaali olisi hyvä testata vähintään kahdesti vuodessa.

13.

Tätä testimenetelmää voidaan parhaiten soveltaa vesiliukoisiin kemikaaleihin, jotka todennäköisesti pysyvät veteen liuenneina testiolosuhteissa. Testattaessa kemikaaleja, jotka ovat haihtuvia, voimakkaasti adsorboivia, värillisiä tai huonosti veteen liukenevia, tai kemikaaleja, jotka voivat vaikuttaa testiviljelyaineessa olevien ravinteiden tai kivennäisaineiden saantiin, voi olla tarpeen tehdä tiettyjä mukautuksia tässä kuvattuun menetelmään (esimerkiksi suljettu järjestelmä ja koeastioiden erityisvalmistelu). Kirjallisuusviitteissä (2), (3) ja (4) annetaan ohjeita joistakin sopivista mukautuksista.

14.

Astioiden ja muiden laitteiden, jotka joutuvat kosketuksiin testiliuosten kanssa, on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia. Ne on pestävä huolellisesti, jotta mitkään orgaaniset tai epäorgaaniset epäpuhtaudet eivät vaikuttaisi leväkasvuun tai testiliuosten koostumukseen.

15.

Koeastiat ovat yleensä lasipulloja, jotka ovat niin suuria, että viljelmän tilavuus riittää testin aikaisiin mittauksiin ja CO2:n siirtyminen ilmakehästä on riittävää (ks. 30 kohta). Nestetilavuuden täytyy olla riittävän suuri analyyttisiä määrityksiä varten (ks. 37 kohta).

16.

Lisäksi saatetaan tarvita joitakin tai kaikkia seuraavista laitteista:

17.

Testissä voidaan käyttää monia kiinnittymättömiä mikrolevä- ja syanobakteerilajeja. Lisäyksessä 2 lueteltujen kantojen on todettu soveltuvan tähän testimenetelmään.

18.

Jos testissä käytetään muita lajeja, niiden kanta ja/tai alkuperä on ilmoitettava. Varmista, että testiin valitun levän eksponentiaalista kasvua voidaan pitää yllä testiolosuhteissa koko testijakson ajan.

19.

Testiä varten suositetaan kahta vaihtoehtoista viljelyainetta: OECD- ja AAP-viljelyainetta. Niiden koostumus esitetään lisäyksessä 3. On syytä huomata, että näiden kahden viljelyaineen alkuperäinen pH-arvo ja puskurikapasiteetti (joka säätelee pH:n kasvua) ovat erilaisia, minkä vuoksi ne voivat antaa erilaisia tuloksia varsinkin, kun testataan ionisoivia kemikaaleja.

20.

Viljelyaineita voidaan joutua mukauttamaan esimerkiksi silloin, kun testataan metalleja ja kelatoivia aineita tai kun testaus suoritetaan erilaisilla pH-arvoilla. Mukautetun viljelyaineen käyttö on perusteltava ja kuvattava yksityiskohtaisesti (3), (4).

21.

Biomassan alkupitoisuuden on oltava sama kaikissa testiviljelmissä ja niin pieni, että kasvu on eksponentiaalista koko inkubointiajan ilman, että ravinteet uhkaavat loppua. Biomassan alkupitoisuus saa olla enintään 0,5 mg/l kuivapainona ilmaistuna. Suosituksena on käyttää seuraavia solujen alkupitoisuuksia:

22.

Pitoisuusalue, jolla vaikutuksia todennäköisesti esiintyy, voidaan määrittää alueenmäärityskokeiden avulla. Varsinaista testiä varten on valittava vähintään viisi pitoisuutta, jotka muodostavat geometrisen sarjan, jonka suhdeluku on enintään 3,2. Suurempikin suhdeluku voi olla aiheellinen, jos testikemikaalilla saadaan laakea pitoisuus-vastekäyrä. Pitoisuussarjan tulisi käsittää pitoisuusalue, jolla levän kasvunopeus hidastuu 5–75 prosenttia.

23.

Testiin on kuuluttava kolme toistoa kutakin pitoisuutta kohden. Jos NOEC-pitoisuutta ei tarvitse määrittää, koejärjestelyä voidaan muuttaa lisäämällä pitoisuuksien määrää ja vähentämällä toistojen määrää pitoisuutta kohden. Kontrollitoistoja on oltava vähintään kolme, ja niitä on mieluimmin tehtävä kaksi kertaa enemmän kuin kutakin testipitoisuutta kohden tehtyjä toistoja.

24.

Testikemikaalin pitoisuuksien analyyttisiä määrityksiä varten voidaan valmistaa erillinen testiliuossarja (ks. 36 ja 38 kohdat).

25.

Jos testikemikaali on liuotettava liuottimella, koejärjestelyyn on kuuluttava ylimääräisiä kontrolliviljelmiä, jotka sisältävät liuotinta samana pitoisuutena kuin testiviljelmät.

26.

Jotta testissä käytettävät levät sopeutuisivat testiolosuhteisiin ja olisivat eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa, kun ne siirrostetaan testiliuoksiin, testiviljelyaineeseen valmistetaan 2–4 päivää ennen testin alkua inokulaattiviljelmä. Leväbiomassaa on säädeltävä siten, että eksponentiaalinen kasvu jatkuu inokulaattiviljelmässä testin alkuun saakka. Inkuboi inokulaattiviljelmää samoissa olosuhteissa kuin testiviljelmiä. Biomassan kasvu inokulaattiviljelmässä mitataan sen varmistamiseksi, että kasvu vastaa testissä käytettävän kannan normaalia kasvua viljelyolosuhteissa. Lisäyksessä 4 annetaan yksi esimerkki levänviljelymenetelmistä. Inokulaattiviljelmässä voidaan joutua käynnistämään toinen lisäysvaihe, jotta testin aikana ei tapahtuisi synkronista solunjakautumista.

27.

Viljelyaineen pitoisuuden ja testilevän biomassan alkupitoisuuden on oltava samat kaikissa testiliuoksissa. Halutun pitoiset testiliuokset valmistetaan yleensä sekoittamalla testikemikaalin kantaliuos viljelyaineen ja inokulaattiviljelmän kanssa. Kantaliuokset valmistetaan yleensä liuottamalla testattava kemikaali testiviljelyaineeseen.

28.

Liuottimia, kuten asetonia, t-butyylialkoholia ja dimetyyliformamidia, voidaan käyttää kantoaineina, kun testiviljelyaineeseen lisätään huonosti veteen liukenevia kemikaaleja (2), (3). Liuottimen pitoisuus saa olla enintään 100 μl/l, ja kaikkiin testisarjan viljelmiin (kontrolliviljelmät mukaan luettuina) on lisättävä samanpitoista liuotinta.

29.

Koeastiat suljetaan ilmaa läpäisevillä tulpilla. Astioita ravistellaan ja ne asetetaan viljelylaitteeseen. Niitä on ravisteltava ja sekoitettava koko testin ajan, jotta levät pysyisivät suspendoituneina ja CO2:n siirtyminen liuoksiin helpottuisi. Viljelmien lämpötila pidetään alueella 21–24 °C (säätötarkkuus ± 2 °C). Käytettäessä muita kuin lisäyksessä 2 lueteltuja lajeja, kuten trooppisia lajeja, lämpötila voi olla korkeampikin, kunhan validiteettivaatimukset täyttyvät. Suositeltavaa on sijoittaa pullot satunnaiseen järjestykseen ja vaihtaa niiden paikkaa inkubaattorissa päivittäin.

30.

Yleensä kontrolliviljelyaineen pH-arvo saa kokeen aikana vaihdella enintään 1,5 yksikön verran. Kun on kyse metalleista ja kemikaaleista, jotka ionisoituvat osittain jotakuinkin samassa pH:ssa kuin testissä, pH-muutoksia voidaan joutua rajoittamaan tarkkojen ja toistettavien tulosten saamiseksi. Muutokset voidaan rajoittaa teknisesti alle 0,5 yksikköön varmistamalla, että CO2:ta siirtyy riittävän nopeasti ilmasta testiliuokseen. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi lisäämällä ravistelunopeutta. Toinen mahdollisuus on vähentää CO2:n tarvetta pienentämällä biomassan alkupitoisuutta tai lyhentämällä testin kestoa.

31.

Pintaa, jolla viljelmät inkuboidaan, on valaistava tasaisella loistevalolla, esimerkiksi kylmänvalkoisella tai päivänvalon kaltaisella valolla. Levien ja syanobakteerien valontarpeet vaihtelevat eri kantojen välillä. Valon voimakkuus on valittava koe-eliön mukaan. Suositeltuja viherlevälajeja varten valitse valon voimakkuus siten, että se on testiliuosten tasolla 60–120 μE · m– 2 s– 1, kun se mitataan sopivalla mittausanturilla fotosynteesille suotuisalla aallonpituusalueella 400–700 nm. Eräät lajit, erityisesti Anabaena flos-aquae, kasvavat hyvin heikommassakin valaistuksessa ja voivat vahingoittua suurilla valon voimakkuuksilla. Tällaisia lajeja varten keskimääräinen valon voimakkuus on valittava alueelta 40–60 μE·m– 2 s– 1. (Jos valonmittauslaitteet on kalibroitu lux-yksikköä varten, suositeltu valonvoimakkuus 60–120 μE·mm– 2 s– 1 vastaa suunnilleen kylmänvalkoisen valon voimakkuusaluetta 4 440–8 880 lux.) Huolehdi, että valon voimakkuus ei vaihtele yli ± 15 prosenttia inkubointialueen keskimääräisestä valon voimakkuudesta.

32.

Testi kestää yleensä 72 tuntia. Se voi kestää myös lyhyemmän tai pitemmän ajan, jos kaikki 11 kohdassa esitetyt validiteettivaatimukset täyttyvät.

33.

Kussakin pullossa oleva leväbiomassa määritetään ainakin kerran päivässä testijakson aikana. Jos mittauksissa käytetään testiliuoksesta pipetoituja pieniä tilavuuksia, niitä ei saa korvata vastaavilla tilavuuksilla.

34.

Biomassa mitataan laskemalla solut manuaalisesti mikroskoopin avulla tai käyttämällä elektronista hiukkaslaskinta (solunlaskenta ja/tai biovolyymin määritys). Muutkin tekniikat, kuten virtaussytometria, klorofyllin in vitro- tai in vivo -fluoresenssin määritys (5), (6) tai optisen tiheyden määritys, ovat sallittuja, jos voidaan osoittaa, että ne korreloivat tyydyttävästi biomassan kanssa testin biomassa-arvoilla.

35.

Mittaa liuosten pH testin alussa ja lopussa.

36.

Jos käytettävissä on analyysimenetelmä, jolla testikemikaali voidaan määrittää testissä käytetyllä pitoisuusalueella, testiliuokset on analysoitava, jotta voidaan tarkistaa alkupitoisuudet sekä altistuspitoisuuksien säilyminen testin aikana.

37.

Jos altistuspitoisuudet todennäköisesti vaihtelevat alle 20 prosenttia nimellisarvoista testin aikana, voi olla riittävää analysoida testikemikaalin pitoisuus testin alussa ja lopussa pienessä ja suuressa testipitoisuudessa sekä pitoisuudessa, joka on lähellä oletettua EC50-arvoa. Kaikkien testipitoisuuksien analysointia testin alussa ja lopussa suositellaan silloin, kun pitoisuudet eivät todennäköisesti pysy 80:n ja 120 prosentin välillä nimellispitoisuudesta. Jos testikemikaali on haihtuva, epästabiili tai voimakkaasti adsorboivia, suosituksena on ottaa analysoitaviksi lisänäytteitä 24 tunnin välein altistusajan kuluessa, jotta testikemikaalin häviö olisi helpommin määritettävissä. Tällaisia kemikaaleja varten saatetaan tarvita ylimääräisiä toistoja. Kaikissa tapauksissa testikemikaalin pitoisuudet tarvitsee määrittää vain yhdestä toistossa käytetystä astiasta (tai kaikkien toistoissa käytettyjen astioiden yhdistetystä sisällöstä) kutakin testipitoisuutta kohden.

38.

Testiviljelyaineita, jotka on valmistettu erityisesti altistuspitoisuuksien analysoimiseksi testin aikana, on käsiteltävä samalla tavalla kuin testaukseen käytettyjä liuoksia, toisin sanoen niihin on siirrostettava leviä ja niitä on inkuboitava samoissa olosuhteissa. Jos liuenneen testikemikaalin pitoisuus on analysoitava, voi olla tarpeen erottaa levät viljelyaineesta. Levien erottaminen on mieluimmin tehtävä sentrifugoimalla käyttämällä pientä g-voimaa, joka riittää kuitenkin niiden erottamiseen.

39.

Jos on näyttöä siitä, että testattavan kemikaalin pitoisuus on pysynyt tyydyttävästi ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta tai mitatusta alkupitoisuudesta koko testin ajan, tulosten analysointi voi perustua nimellispitoisuuksiin tai mitattuihin alkupitoisuuksiin. Jos pitoisuus poikkeaa enemmän kuin ± 20 prosenttia nimellispitoisuudesta tai mitatusta alkupitoisuudesta, tulosten analysoinnin on perustuttava pitoisuuksien geometriseen keskiarvoon altistuksen aikana tai malleihin, jotka kuvaavat testikemikaalin pitoisuuden vähenemistä (3), (7).

40.

Leväkasvun estymistesti on dynaamisempi testijärjestelmä kuin useimmat muut lyhytaikaiset kokeet, joilla testataan aineiden myrkyllisyyttä vesieliöille. Sen vuoksi todellisten altistuspitoisuuksien määritys voi olla vaikeaa varsinkin, kun on kyse adsorboituvista kemikaaleista, joita testataan pienillä pitoisuuksilla. Jos kemikaali tällaisissa tapauksissa katoaa liuoksesta adsorboitumalla kasvavaan leväbiomassaan, se ei kuitenkaan merkitse sitä, että se olisi kadonnut koko testijärjestelmästä. Analysoitaessa testin tuloksia on tarkistettava, liittyykö testikemikaalin pitoisuuden väheneminen testin aikana kasvun estymisen vähenemiseen. Jos näin on, voidaan harkita sopivan mallin käyttöä kuvaamaan testikemikaalin pitoisuuden pienenemistä (7). Muussa tapauksessa voi olla aiheellista analysoida tuloksia (nimellisten tai mitattujen) alkupitoisuuksien pohjalta.

41.

Mikroskoopin avulla on varmistettava, että inokulaattiviljelmä näyttää normaalilta ja terveeltä, sekä tutkittava testin lopussa levissä esiintyvät epänormaaliudet (jotka voivat johtua altistumisesta testikemikaalille).

42.

Joissakin tapauksissa, esimerkiksi silloin, kun alustava testi osoittaa, että testikemikaalilla ei ole myrkkyvaikutuksia pitoisuusarvoon 100 mg/l saakka tai siihen liukoisuusrajaan asti, joka testiaineella on testiviljelyaineessa (sen mukaan, kumpi näistä on pienempi), voidaan tehdä raja-annostesti, jossa verrataan yhden kontrolliryhmän ja yhden käsitellyn ryhmän vasteita (pitoisuudessa 100 mg/l tai liukoisuusrajaa vastaavassa pitoisuudessa). On erittäin suotavaa analysoida altistuspitoisuus rajatestin tueksi. Kaikki edellä kuvatut testiolosuhteet ja validiteettivaatimukset koskevat myös raja-annostestiä, lukuun ottamatta käsiteltyjen toistojen määrää, jonka on oltava vähintään kuusi. Kontrolli- ja käsitellyn ryhmän vastemuuttujia voidaan analysoida Studentin t-testin kaltaisella tilastotutkimuksella, jossa verrataan keskiarvoja. Jos näiden kahden ryhmän varianssit eivät ole yhtä suuria, on tehtävä erisuuruisiin variansseihin mukautettu t-testi.

43.

Koeastioissa oleva biomassa voidaan ilmaista mittauksissa käytetyn korvaavan parametrin (esimerkiksi solumäärän ja fluoresenssin) yksikkönä.

44.

Biomassan määritetty pitoisuus testi- ja kontrolliviljelmissä esitetään kasvukäyrien piirtämistä varten taulukkona, josta ilmenevät myös testiaineen pitoisuudet ja mittausajankohdat, jotka on rekisteröity vähintään täysien tuntien tarkkuudella. Tässä ensimmäisessä vaiheessa voi olla hyödyllistä käyttää sekä logaritmiasteikkoja että lineaarisia asteikkoja, mutta logaritmisasteikot ovat pakollisia ja antavat yleensä paremman kuvan kasvun vaihteluista testijakson aikana. On syytä huomata, että kun eksponentiaalista kasvua kuvataan logaritmiasteikolla, tuloksena on suora viiva, ja viivan kaltevuus ilmaisee spesifisen kasvunopeuden.

45.

Käyrien avulla tutkitaan, kasvavatko kontrolliviljelmät oletetulla nopeudella eksponentiaalisesti koko testin ajan. Tarkastele kriittisesti kaikkia datapisteitä ja käyrien muotoa ja tarkista raakatiedot ja menetelmät mahdollisten virheiden havaitsemiseksi. Erityisesti tarkistetaan ne datapisteet, jotka näyttävät poikkeavan systemaattisen virheen vuoksi. Jos havaitaan ilmeisiä menetelmävirheitä ja/tai niitä pidetään hyvin todennäköisinä, kyseinen datapiste merkitään vieraaksi havainnoksi eikä sitä oteta huomioon myöhemmässä tilastoanalyysissä. (Jos leväpitoisuus on nolla yhdessä kahdesta tai kolmesta toistoissa käytetyssä astiassa, tämä voi olla merkki siitä, että levien siirrostamista astiaan ei ole tehty oikein tai astiaa ei ole puhdistettu kunnolla.) Testiraportissa on perusteltava selvästi, minkä vuoksi datapiste on hylätty vieraana havaintona. Hyväksyttäviä syitä ovat ainoastaan (harvinaiset) menetelmävirheet eikä pelkästään huono tarkkuus. Tämäntyyppisissä ongelmissa ei ole kovin hyödyllistä yrittää tunnistaa vieraita havaintoja tilastomenetelmien avulla, eivätkä tällaiset menetelmät voi korvata asiantuntijan arviota. Vieraat havainnot (jotka on merkitty sellaisiksi) tulisi säilyttää niiden datapisteiden joukossa, jotka merkitään myöhemmin graafisiin tai taulukkomuotoisiin esityksiin.

46.

Testin tarkoituksena on määrittää testikemikaalin vaikutukset levien kasvuun. Tässä testimenetelmässä kuvataan kahta eri vastemuuttujaa, koska eri oikeudenkäyttöalueilla suositaan erilaisia käytänteitä ja noudatetaan erilaisia sääntelyvaatimuksia. Jotta testitulokset voitaisiin hyväksyä kaikilla oikeudenkäyttöalueilla, vaikutuksia olisi arvioitava käyttämällä molempia vastemuuttujia a ja b, joita kuvataan jäljempänä.

a)    Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus : tämän vastemuuttujan laskentaperusteena on biomassan logaritminen kasvu päivää kohden testijakson aikana.

b)    Tuotos : tällä vastemuuttujalla tarkoitetaan testin lopussa mitattua biomassaa, josta on vähennetty testin alussa mitattu biomassa.

47.

On syytä huomata, että näiden kahden vastemuuttujan avulla lasketut myrkyllisyysarvot eivät ole vertailukelpoisia, mikä on otettava huomioon käytettäessä testin tuloksia. Jos testiolosuhteet ovat tämän testimenetelmän mukaiset, keskimääräiseen spesifiseen kasvunopeuteen perustuvat ECx-arvot (ErCx) ovat yleensä suurempia kuin tuotokseen perustuvat arvot (EyCx), mikä johtuu niiden matemaattisista perusteista. Tätä ei pidä tulkita siten, että näiden kahden vastemuuttujan herkkyydet olisivat erilaiset, vaan arvojen välinen ero on puhtaasti matemaattinen. Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus perustuu yleiseen kasvumalliin, joka kuvaa levän eksponentiaalista kasvua rajoittamattomissa viljelmissä, joista toksisuus arvioidaan kasvunopeuteen kohdistuvien vaikutusten perusteella ottamatta huomioon kontrollin spesifisen kasvunopeuden absoluuttista tasoa, pitoisuus-vastekäyrän kaltevuutta tai testin kestoa. Tuotosta kuvaavaan vastemuuttujaan perustuvat tulokset riippuvat sen sijaan kaikista näistä muista muuttujista. EyCx riippuu kussakin testissä käytetyn levälajin spesifisestä kasvunopeudesta ja suurimmasta spesifisestä kasvunopeudesta, joka voi vaihdella eri lajien ja jopa eri leväkantojen välillä. Tätä vastemuuttujaa ei saa käyttää vertailtaessa eri levälajien tai eri kantojenkaan herkkyyttä myrkyllisille aineille. Vaikka tieteen kannalta on parempi arvioida myrkyllisyyttä keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden perusteella, tähän testimenetelmään on otettu mukaan myös tuotokseen perustuvat myrkyllisyyden arvioinnit, jotta voidaan täyttää eräiden maiden nykyiset sääntelyvaatimukset.

48.

Tietyn ajanjakson keskimääräinen spesifinen kasvunopeus lasketaan biomassan logaritmisena kasvuna soveltamalla seuraavaa kaavaa [1] kuhunkin kontrolli- ja käsittelyryhmän astiaan:

jossa

Kullekin testiryhmälle ja kontrolliryhmälle lasketaan kasvunopeuden keskiarvo varianssiestimaatteineen.

49.

Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus lasketaan koko testin ajalta (yleensä päivästä 0 päivään 3) käyttämällä lähtöarvona siirrostetun biomassan nimellisarvoa mitatun lähtöarvon sijasta, koska näin saadaan yleensä parempi tarkkuus. Biomassan mitattua alkupitoisuutta voidaan käyttää, jos inokulaatin pieni biomassa voidaan määrittää riittävän tarkasti biomassan mittauslaitteella (esimerkiksi virtaussytometrilla). Lisäksi määritetään jaksoittainen kasvunopeus, joka saadaan laskemalla spesifiset kasvunopeudet kultakin päivältä testin aikana (päivät 0–1, 1–2 ja 2–3), ja tutkitaan, pysyykö kontrolliryhmän kasvunopeus vakiona (ks. validiteettivaatimukset, 11 kohta). Jos spesifinen kasvunopeus on huomattavasti pienempi ensimmäisenä päivänä kuin spesifisten kasvunopeuksien keskiarvo, se voi olla merkki viivevaiheesta. Vaikka viivevaihe voidaan minimoida ja poistaa käytännössä kokonaan kontrolliviljelmistä esiviljelmän asianmukaisella lisäyksellä, testiaineelle altistetuissa viljelmissä viivevaihe voi osoittaa toipumista toksisuuden aiheuttamasta alkustressistä tai vähentynyttä altistumista, joka johtuu testikemikaalin häviämisestä (esimerkiksi sorptiosta levämassaan) alkuvaiheen altistumisen jälkeen. Tällöin voidaan tarkastella jaksoittaista kasvunopeutta, jonka avulla voidaan arvioida testikemikaalin vaikutuksia altistusaikana. Merkittävät erot jaksoittaisen kasvunopeuden ja keskimääräisen kasvunopeuden välillä osoittavat, että kasvu poikkeaa jatkuvasta eksponentiaalisesta kasvusta, jolloin kasvukäyriä on syytä tarkastella lähemmin.

50.

Kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen kussakin käsitellyssä toistossa lasketaan seuraavan kaavan [2] avulla:

jossa

51.

Jos testiliuosten valmistamisessa käytetään liuottimia, kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen on laskettava liuottimia sisältävistä kontrolliviljelmistä eikä niistä kontrolliviljelmistä, joissa ei ole liuottimia.

52.

Tuotos lasketaan vähentämällä testin lopussa mitatusta biomassasta testin alussa mitattu biomassa kontrolli- ja käsittelyryhmän kunkin astian osalta. Kullekin testipitoisuudelle ja kontrollille lasketaan tuotoksen keskiarvo varianssiestimaatteineen. Tuotoksen prosentuaalinen estyminen ( % Iy) voidaan laskea kutakin käsiteltyä toistoa varten seuraavasti:

jossa

53.

Prosentuaalinen estyminen merkitään graafisesti suhteessa testikemikaalin pitoisuuden logaritmiin. Näin saatuja pisteitä tarkastellaan huolellisesti ottamatta huomioon datapisteitä, joita pidettiin ensimmäisessä vaiheessa vieraina havaintoina. Datapisteiden kautta vedetään tasaisesti muuttuva viiva joko silmämääräisesti tai interpoloimalla tietokoneen avulla, jotta pitoisuuden ja vasteen suhteesta saataisiin alustava käsitys. Tämän jälkeen käytetään tarkempaa menetelmää, mieluimmin tietokonepohjaista tilastomenetelmää. Sen perusteella, mihin tietoja aiotaan käyttää, mikä on niiden laatu (tarkkuus) ja määrä ja mitä välineitä on käytettävissä niiden analysoimiseen, voidaan päättää, että tietojen analysointi lopetetaan tähän vaiheeseen (mikä on joskus hyvin aiheellistakin), ja ainoastaan lukea keskeiset arvot EC50 ja EC10 (ja/tai EC20) silmämääräisesti piirretyltä käyrältä (ks. myös jäljempänä oleva kohta stimuloivista vaikutuksista). Päteviä syitä olla käyttämättä tilastomenetelmää ovat muun muassa seuraavat syyt:

54.

Tavoitteena on saada kvantitatiivinen pitoisuus-vastesuhde regressioanalyysin avulla. Painotettua lineaarista regressiota voidaan käyttää sen jälkeen, kun vastetiedoille on tehty linearisoiva muunnos – esimerkiksi probitti-, logitti- tai Weibull-yksiköiksi (8) – mutta suositeltavampaa on käyttää epälineaarisia regressiomenetelmiä, joilla voidaan paremmin käsitellä tiedoissa väistämättä esiintyviä epäsäännöllisyyksiä sekä poikkeamia tasaisista jakaumista. Lähestyttäessä tilaa, jossa kasvu ei esty ollenkaan tai estyminen on täydellistä, linearisoiva muunnos voi suurentaa epäsäännöllisyyksiä ja haitata siten analyysiä (8). On syytä huomata, että standardianalyysimenetelmät, joissa käytetään probitti-, logitti- tai Weibull-muunnoksia, on tarkoitettu dikotomisia tietoja varten (kun vasteita on kaksi, esimerkiksi kuolleisuus tai eloonjääminen), minkä vuoksi niitä on mukautettava, jos niitä aiotaan käyttää kasvu- tai tuotostietojen analysointiin. Kirjallisuusviitteissä (9), (10) ja (11) kuvataan erityismenetelmiä, joilla ECx-arvot voidaan määrittää jatkuvista tiedoista. Epälineaarisen regressioanalyysin käyttöä käsitellään tarkemmin lisäyksessä 5.

55.

Kunkin vastemuuttujan analysoimiseksi käytetään pitoisuus-vastesuhdetta, jonka avulla lasketaan ECx-arvojen piste-estimaatit. Jokaiselle estimaatille on määritettävä 95 prosentin luottamusväli, jos se on mahdollista. Vastetietojen ja regressiomallin välinen yhteensopivuuden aste on arvioitava joko graafisesti tai tilastollisesti. Regressionanalyysi on tehtävä käyttämällä yksittäisiä toistojen vasteita eikä käsittelyryhmien keskiarvoja. Jos epälineaariseen käyrän sovitus on vaikeaa tai mahdotonta, koska tiedot ovat liian hajallaan, ongelma voidaan kiertää tekemällä regressio ryhmien keskiarvoille, mikä on käytännöllinen tapa vähentää mahdollisten vieraiden havaintojen vaikutusta. Tämän vaihtoehdon käyttö on mainittava testiraportissa tavanomaisesta menetelmästä poikkeavana keinona, jota on käytetty sen vuoksi, että käyrän sovittaminen yksittäisiin toistoihin ei antanut hyvää tulosta.

56.

EC50-estimaatit ja luottamusvälit voidaan saada myös käyttämällä lineaarista interpolointia bootstrap-menetelmän kanssa (13), jos käytettävissä olevat regressiomallit tai -menetelmät eivät sovellu kyseisten tietojen käsittelyyn.

57.

Jotta voidaan arvioida LOEC-pitoisuus ja siten myös NOEC-pitoisuus sekä testikemikaalin vaikutukset kasvunopeuteen, käsiteltyjen liuosten keskiarvoja on verrattava varianssianalyysitekniikoiden avulla (ANOVA). Sen jälkeen on verrattava kunkin pitoisuuden keskiarvoa kontrolliryhmän keskiarvoon käyttämällä sopivaa moniulotteista vertailumenetelmää tai trenditestimenetelmää. Dunnettin tai Williamsin testi voi olla käyttökelpoinen (12), (14), (15), (16), (17). Lisäksi on arvioitava, pitääkö ANOVA-oletus varianssin homogeenisuudesta paikkansa. Arviointi voidaan tehdä graafisesti tai virallisen testin avulla (17). Sopivia testejä ovat Levenen ja Bartlettin testit. Jos oletus varianssin homogeenisuudesta ei pidä paikkaansa, tilanne on joskus korjattavissa tietojen logaritmimuunnoksella. Jos varianssin heterogeenisuus on erittäin suuri eikä se ole korjattavissa muunnoksella, on harkittava analysointia sellaisilla menetelmillä kuin Jonckheeren alaspäin askeltava trenditesti. Kirjallisuusviitteessä (11) annetaan lisäohjeita NOEC-arvon määrittämisestä.

58.

Tieteen viimeaikaisen kehityksen perusteella on suositeltu, että NOEC-käsitteestä luovuttaisiin ja se korvattaisiin regressioanalyysiin perustuvilla ECx:n piste-estimaateilla. Sopivaa x:n arvoa ei ole vielä vahvistettu tätä levätestiä varten. Sopivalta vaikuttaisi väli 10–20 prosenttia (valitun vastemuuttujan mukaan), ja suositeltavaa on ilmoittaa sekä EC10- että EC20-arvo.

59.

Pienissä pitoisuuksissa havaitaan joskus kasvun edistymistä (negatiivista estymistä). Tämä voi johtua joko hormesis-vaikutuksesta (’toksisuudesta johtuva kasvun edistyminen’) tai stimuloivien kasvutekijöiden lisäämisestä testiaineen kanssa testissä käytettyyn minimaaliseen viljelyaineeseen. On muistettava, että epäorgaanisten ravinteiden lisäämisellä ei pitäisi olla suoranaista vaikutusta, koska testiliuoksessa on oltava ravinteita ylimäärin koko testin ajan. Pieniannoksinen stimulointi voidaan yleensä jättää huomioimatta EC50-arvon laskemisessa, jollei se ole hyvin merkittävää. Jos se on merkittävää tai jos ECx-arvo on laskettava pientä x:n arvoa varten, voi olla tarpeen käyttää erityismenetelmiä. Stimuloinnin aiheuttamien vasteiden poistamista tietojen analysoinnista olisi vältettävä mahdollisuuksien mukaan, ja jos käytettävissä oleva käyränsovitusohjelmisto ei pysty käsittelemään vähäistä stimulointia, voidaan käyttää lineaarista interpolointia yhdessä bootstrap-menetelmän kanssa. Jos stimulointi on hyvin merkittävää, voidaan harkita hormesis-mallin käyttöä (18).

60.

Valoa absorboivat testimateriaalit voivat hidastaa kasvunopeutta, koska varjostus vähentää käytettävissä olevan valon määrää. Tällaiset fysikaaliset vaikutukset olisi erotettava myrkkyvaikutuksista muuttamalla testiolosuhteita, ja fysikaalisista vaikutuksista olisi raportoitava erikseen. Tästä annetaan ohjeita kirjallisuusviitteissä (2) ja (3).

61.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

(1)

International Organisation for Standardization (ISO) (1993). ISO 8692: Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardization (ISO) (1998). ISO/DIS 14442: Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardization (ISO) (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919–925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073–2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713–718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157–167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096–1121.

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.

1.

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 209 (2010). Tässä testimenetelmässä kuvataan menetelmä, jolla voidaan määrittää kemikaalin vaikutukset aktiivilietteestä peräisin oleviin mikro-organismeihin (enimmäkseen bakteereihin) mittaamalla niiden soluhengitystasoa (hiilen ja/tai ammoniumin hapettumista) tietyissä olosuhteissa, joissa testikemikaalia on läsnä eri pitoisuuksina. Testimenetelmä perustuu ETAD:n (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing Industry) testiin (1), (2), aikaisempaan OEC:n testiohjeeseen (TG) 209 sekä tarkistettuun ISO-standardiin 8192 (4). Testin on tarkoitus toimia nopeana seulontamenetelmänä, jolla voidaan arvioida kemikaalien vaikutusta jätevedenkäsittelylaitosten biologisen (aerobisen) vaiheen aktiivilietteessä oleviin mikro-organismeihin. Testin tuloksia voidaan käyttää myös osoittamaan testikemikaalien biologisiin hajoamiskokeisiin sopivat pitoisuudet, joilla ei ole inhibitiovaikutusta (esimerkiksi tämän liitteen C.4 A–F, C.9, C.10, C.12 ja C.29 luvut sekä OECD:n testiohje (TG) 302C). Tällöin testi voidaan tehdä pitoisuusalueen määritystestiä tai raja-annostestiä vastaavana seulontakokeena (ks. 39 kohta), jossa otetaan huomioon vain soluhengitys yleensä. Tietoa on kuitenkin sovellettava harkiten helpon biohajoavuuden testeihin (tämän liitteen C.4 A–F ja C.29 luvut), joissa inokulaattipitoisuus on merkittävästi tässä testimenetelmässä käytettyä pienempi. Inhibition puuttuminen tässä soluhengitystestissä ei siis ilman muuta tarkoita, että tämän liitteen C.4 A–F tai C.29 luvuissa kuvatun helpon biohajoavuuden testin olosuhteilla ei ole inhibitiovaikutusta.

2.

Soluhengityksen inhibitiotestiä on yleensä sovellettu ilmeisen onnistuneesti julkistamisestaan saakka, mutta joissakin tapauksissa tulosten on ilmoitettu olleen virheellisiä. Pitoisuuksia koskevat soluhengityskäyrät ovat toisinaan olleet kaksifaasisia ja annosvastekuvaajat vääristyneitä sekä EC50-arvot odottamattoman alhaisia (5). Tarkemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tällaisia tuloksia on saatu tapauksissa, joissa testissä käytetty aktiiviliete nitrifioituu huomattavasti ja testikemikaalilla on suurempi vaikutus ammoniumin hapettumiseen kuin heterotrofiseen hapettumiseen yleensä. Virheelliset tulokset voidaan siis välttää lisätestillä, jossa käytetään spesifistä nitrifikaatioinhibiittoria. Kun hapenotto mitataan inhibiittoria (esimerkiksi N-allyylitioureaa (ATU)) käytettäessä ja ilman sitä, voidaan laskea erikseen kokonaishapenottotaso, heterotrofinen hapenotto sekä nitrifikaation hapenotto (4), (7), (8). Näin voidaan todeta testikemikaalin inhibitiovaikutus näihin kahteen prosessiin, ja sekä orgaanisen hiilen hapettumisen (heterotrofisen) että ammoniumin hapettumisen (nitrifikaation) EC50-arvot voidaan laskea tavanomaiseen tapaan. On syytä huomata, että joissakin harvinaisissa tapauksissa N-allyylitiourean inhibitiovaikutus voi mitätöityä osittain tai kokonaan testikemikaalien tai ravinneliuoksen lisäaineiden (esimerkiksi Cu++-ioneiden) kanssa tapahtuvan kompleksoinnin vuoksi (6). Cu++-ionit ovat Nitrosomonas-bakteereille välttämättömiä, mutta suurempina pitoisuuksina myrkyllisiä.

3.

Varsinkin Euroopan maissa on syntynyt selkeä tarve hyödyntää nitrifikaatiota jätevesien aerobisessa puhdistuksessa poistettaessa typpiyhdisteitä jätevesistä denitrifikoimalla ne kaasumaisiksi aineiksi, kun EU on määrännyt alhaisemmat rajat vesistöihin päästettävien käsiteltyjen jätevesien typpipitoisuudelle (5).

4.

Useimmissa tapauksissa riittää pelkästään menetelmä, jolla arvioidaan vaikutusta orgaanisen hiilen hapettumisprosesseihin. Joissakin tapauksissa on kuitenkin tarkasteltava vaikutusta pelkästään nitrifikaatioon tai erikseen sekä nitrifikaatioon että orgaanisen hiilen hapettumiseen, jotta tulokset osataan tulkita ja vaikutuksia ymmärtää oikein.

5.

Standardiannoksella synteettistä jätevettä ravitun aktiivilietteen soluhengitystaso mitataan happielektrodin sisältävässä suljetussa kennossa kolmen tunnin kontaktiajan kuluttua. Jos realistinen altistusskenaario tätä edellyttää, tarvittava kontaktiaika voi olla pitempikin. Jos testikemikaali hajoaa nopeasti esimerkiksi abioottisesti hydrolyysin kautta tai on erittäin haihtuvaa, jolloin pitoisuutta ei saada pidettyä samana, voidaan lisäksi käyttää lyhyempää altistusaikaa, esimerkiksi 30 minuuttia. Kunkin aktiiviliete-erän herkkyys olisi tarkistettava soveltuvan vertailukemikaalin avulla altistuspäivänä. Testiä käytetään yleensä testikemikaalin ECx:n (esimerkiksi EC50:n) ja/tai NOEC-pitoisuuden (pitoisuuden, josta ei aiheudu vaikutuksia) määrittämiseen.

6.

Orgaanista hiiltä hapettavien mikro-organismien hapenoton inhibitio voidaan ilmaista erillisenä ammoniumia hapettavien mikro-organismien hapenoton inhibitiosta mittaamalla hapenotto sekä N-allyylitioureaa käytettäessä että ilman sitä. N-allyylitiourea on spesifinen inhibiittori, jolla estetään ensimmäisen vaiheen nitrifioivia bakteereita hapettamasta ammoniumia nitriitiksi. Tässä tapauksessa hapenottotason prosentuaalinen inhibitio lasketaan vertaamalla hapenottoa testikemikaalin läsnä ollessa vastaavien, testikemikaalia sisältämättömien kontrollien keskimääräiseen hapenottoon sekä spesifistä inhibiittoria N-allyylitioureaa käytettäessä että ilman sitä.

7.

Mahdollinen abioottisista prosesseista johtuva hapenotto voidaan todeta määrittämällä taso testikemikaalin, synteettisen jäteveden ja veden seoksissa, joista aktiiviliete on jätetty pois.

8.

Testikemikaalin tunnisteen (mieluiten CAS-numeron), nimen (IUPAC), puhtauden, vesiliukoisuuden, höyrynpaineen sekä haihtuvuus- ja adsorptio-ominaisuuksien on oltava tiedossa, jotta tulokset voidaan tulkita oikein. Haihtuvia kemikaaleja ei tavallisesti voi testata riittävällä tavalla ilman erityisiä varotoimia (katso kohta 21).

9.

Testimenetelmää voidaan käyttää vesiliukoisille, heikosti liukeneville ja haihtuville kemikaaleille. Aina ei kuitenkaan ole välttämättä mahdollista saada EC50-arvoja kemikaaleista, joiden liukoisuus on rajallinen, ja haihtuvista kemikaaleista saadaan paikkansapitäviä tuloksia vain silloin, kun testikemikaalista suurin osa (esimerkiksi > 80 prosenttia) on edelleen reaktioseoksessa altistusajan tai -aikojen lopussa. ECx-pitoisuus on määritettävä analyysiin perustuvien lisätietojen avulla, jos testikemikaalin stabiilisuutta tai haihtuvuutta ei tunneta tarkasti.

10.

Vertailukemikaalien säännöllisin väliajoin toistuvilla testeillä varmistetaan testimenetelmän ja testiolosuhteiden luotettavuus ja tarkistetaan kunkin mikrobi-inokulaattina käytetyn aktiiviliete-erän herkkyys altistuspäivänä. Inhiboivaksi vertailukemikaaliksi suositellaan 3,5-dikloorifenolia (3,5-DCP), sillä kyseessä on tunnettu hengitysinhibiittori, jota käytetään monenlaisissa inhibitio- ja myrkyllisyyskokeissa (4). Kokonaissoluhengityksen inhiboivana vertailukemikaalina voidaan käyttää myös kupari(II)sulfaatin pentahydraattia (9). Nitrifikaation spesifisenä vertailuinhibiittorina voidaan käyttää N-metyylianiliinia.

11.

Nollanäytteissä (joissa ei ole testi- tai vertailukemikaalia) hapenoton on oltava tunnissa vähintään 20 mg happea yhtä aktiivilietegrammaa kohti (kiintoaineen kuivapaino). Jos taso on pienempi, testi on toistettava pestyllä aktiivilietteellä tai toisesta lähteestä saadulla lietteellä. Kontrollirinnakkaisnäytteissä hapenoton variaatiokertoimen on oltava varsinaisen testin lopussa enintään 30 prosenttia.

12.

ISO:n vuonna 2004 järjestämässä kansainvälisessä yhteistutkimuksessa (4), jossa käytettiin kotitalousjätevedestä saatua aktiivilietettä, 3,5-DCP:n EC50:n todettiin olevan kokonaissoluhengityksessä 2–25 mg/l, heterotrofisessa soluhengityksessä 5–40 mg/l ja nitrifikaatiosoluhengityksessä 0,1–10 mg/l. Jos 3,5-DCP:n EC50 ei ole odotetulla vaihteluvälillä, testi on toistettava käyttäen toisesta lähteestä saatua aktiivilietettä. Kupari(II)sulfaatin pentahydraatin EC50:n olisi oltava kokonaissoluhengityksessä 53–155 mg/l (9).

13.

Testissä tarvitaan tavallinen laboratoriolaitteisto ja seuraavat välineet:

14.

Koko testin ajan käytetään analyysilaatuisia reagensseja.

15.

Käytetään tislattua tai deionisoitua vettä, jonka DOC-pitoisuus on alle 1 mg/l, ellei testissä erityisesti vaadita klooritonta talousvettä.

16.

Väliaine on valmisteltava siten, että se sisältää seuraavia ainesosia mainitun määrän verran:

17.

Liuoksen pH-arvon on oltava 7,5 ±0,5. Ellei ravintoainetta käytetä välittömästi valmistuksen jälkeen, sitä säilytetään enintään viikon ajan pimeässä 0–4 °C:n lämpötilassa tai olosuhteissa, joissa aineen koostumus ei muutu säilytyksen aikana. On syytä huomata, että synteettinen jätevesi on 100-kertainen tiiviste OECD:n teknisessä raportissa ’Proposed method for the determination of the biodegrability of surfactants used in synthetic detergents’ (11. kesäkuuta 1976) esitetystä jätevedestä, paitsi että se sisältää myös dikaliumvetyfosfaattia.

18.

Ravinneliuoksen ainesosat voidaan vaihtoehtoisesti steriloida yksitellen ennen säilytystä, tai peptoni ja lihauute voidaan lisätä juuri ennen testiä. Ennen käyttöä ravinneliuos on sekoitettava kauttaaltaan ja pH-arvoa on tarvittaessa säädettävä siten, että se on 7,5 ±0,5.

19.

Veteen helposti liukeneville testiaineille kantaliuosta valmistetaan enintään suurinta veteen liukenevuutta vastaava määrä (saostumia ei saa olla). Heikosti veteen liukenevat aineet, seokset, joiden ainesosat liukenevat veteen eri tavoin, ja adsorptiiviset aineet on punnittava suoraan testiastioihin. Näissä tapauksissa vaihtoehtona voi olla kantaliuosten käyttäminen, jos testikemikaalien liuenneet pitoisuudet määritetään analyyttisesti testiastioissa (ennen aktiivilietteen lisäämistä). Veteen liuenneita fraktioita (Water Accommodated Fractions) käytettäessä on myös määritettävä analyyttisesti testikemikaalien liuenneet pitoisuudet testiastioissa. Orgaanisia liuottimia käytettäessä on vältettävä liukoisuuden lisäämistä dispergointiaineiden/emulgaattoreiden avulla. Kantaliuosten sonikaatiota ja suspensioiden esisekoittamista esimerkiksi yön yli voidaan käyttää, jos testikemikaalin stabiiliudesta näissä olosuhteissa on riittävästi tietoa.

20.

Testikemikaali voi vaikuttaa haitallisesti pH-arvoon testijärjestelmässä. Testikemikaalilla käsiteltyjen seosten pH-arvo määritetään ennen testiä esikokeella, jonka avulla todetaan, onko pH-arvon säätäminen tarpeen ennen varsinaista testiä ja uudelleen varsinaisena testipäivänä. Veteen liuennut tai suspendoitunut testikemikaali on tarvittaessa neutraloitava ennen inokulaatin lisäämistä. Neutralointi voi kuitenkin muuttaa kemikaalin kemiallisia ominaisuuksia, minkä vuoksi lisätesteillä voidaan tutkimuksen tavoitteiden mukaan arvioida testikemikaalin vaikutusta lietteeseen ilman pH:n säätämistä.

21.

Haihtuvien kemikaalien myrkyllisten vaikutusten johdosta etenkin testeissä, joissa ilmakuplia puhalletaan järjestelmän läpi, vaikutukset voivat vaihdella, koska ainetta häviää altistusjakson aikana. Näiden aineiden käsittelyssä on noudatettava huolellisuutta tekemällä ainetta sisältäville kontrolliseoksille ainekohtainen analyysi sekä muuttamalla ilmastusaikataulua.

22.

Jos vertailukemikaalina käytetään 3,5-dikloorifenolia, valmistetaan liuos, jossa 1,00 g 3,5-dikloorifenolia sekoitetaan 1 000 ml:aan vettä (15). Liukenemista nopeutetaan käyttämällä lämmintä vettä ja/tai sonikaatiota, ja kun liuos on jäähtynyt huoneenlämpöiseksi, haihtunut vesi korvataan uudella. On syytä kuitenkin varmistaa, että vertailukemikaalin rakenne ei muutu. Liuoksen pH tarkistetaan ja sitä säädetään tarvittaessa NaOH:lla tai H2SO4:lla siten, että pH-arvo on 7–8.

23.

Jos vertailukemikaalina käytetään kupari(II)sulfaattipentahydraattia, käytettävät pitoisuudet ovat 58 mg/l, 100 mg/l ja 180 mg/l (kerroin 1,8). Aine punnitaan suoraan testiastioihin (29, 50 ja 90 mg, jolloin kokonaistilavuudeksi saadaan 500 ml). Tämän jälkeen aine liuotetaan 234 ml:aan autoklaavissa käsiteltyä talousvettä. Kupari(II)sulfaattipentahydraatti on helposti liukenevaa. Kun testi aloitetaan, lisätään 16 ml synteettistä jätevettä sekä 250 ml aktiivilietettä.

24.

Valmistetaan kantaliuos, jonka N-allyylitioureapitoisuus (ATU) on 2,32 g/l. Kun tätä kantaliuosta lisätään 2,5 ml inkubaatioseokseen, jonka lopullinen tilavuus on 500 ml, saadaan lopulliseksi pitoisuudeksi 11,6 mg ATU/l (10– 4mol/l). Tiedossa on, että tämä riittää inhiboimaan nitrifikaation 100-prosenttisesti nitrifioivassa aktiivilietteessä, joka sisältää kiintoainetta 1,5 g/l.

25.

Eräissä harvoin esiintyvissä olosuhteissa testikemikaali, jolla on voimakkaasti pelkistäviä ominaisuuksia, saattaa aiheuttaa mitattavissa olevaa abioottista hapenkulutusta. Tällöin on välttämätöntä erottaa toisistaan testikemikaalin abioottinen hapen yhteytys ja mikrobien soluhengitys. Abioottiset kontrollit voidaan valmistaa jättämällä inokulaatti pois testiseoksista. Inokulaattia sisältämättömät abioottiset kontrollit voidaan myös ottaa mukaan tehtäessä analyyttisiä mittauksia, joilla määritetään testin altistusvaiheen aikana saavutettu pitoisuus esimerkiksi silloin, kun käytetään heikosti veteen liukenevia kemikaaleja sisältäviä kantaliuoksia, joiden ainesosat liukenevat veteen eri tavoin. Erityistapauksissa voi olla tarpeen valmistaa abioottinen kontrolli, jossa inokulaatti on steriloitu (esimerkiksi autoklaavia käyttämällä tai lisäämällä steriloivia myrkyllisiä aineita). Eräät kemikaalit saattavat tuottaa tai kuluttaa happea silloinkin, jos pinta-ala on reaktiolle riittävän suuri, vaikka reaktio normaalisti edellyttäisi huomattavasti korkeampaa lämpötilaa tai painetta. Tässä suhteessa on kiinnitettävä erityistä huomiota peroksiaineisiin. Steriloidun inokulaatin pinta-ala on suuri.

26.

Yleiseen käyttöön tarkoitettu aktiiviliete kerätään pääasiassa kotitalousjätettä käsittelevän, hyvin hoidetun jätevedenkäsittelylaitoksen ilmastussäiliön poistoaukosta tai sen läheltä. Testin tarkoituksen mukaan voidaan käyttää myös muunlaisia sopivia aktiivilietelähteitä tai -tyyppejä, esimerkiksi laboratoriossa kasvatettua lietettä, jonka kiintoainepitoisuus on 2–4 g/l. Eri käsittelylaitoksista peräisin olevien lietteiden ominaisuudet ja herkkyydet kuitenkin todennäköisesti poikkeavat toisistaan.

27.

Lietettä voidaan käyttää sellaisena kuin se on kerätty, mutta karkeat hiukkaset poistetaan antamalla lietteen laskeutua lyhyen aikaa, esimerkiksi 5–15 minuuttia, ja dekantoimalla hienojakoisempia kiintoaineita sisältävä ylin kerros tai siivilöimällä liete (esimerkiksi siivilällä, jonka silmäkoko on 1 mm2). Vaihtoehtoisesti liete voidaan homogenoida sekoittamalla sitä tehosekoittimessa vähintään 15 sekunnin ajan, mutta tällöin on syytä ottaa huomioon leikkuuvoimat ja lämpötilan muutos, jonka pitkäaikainen sekoittaminen saattaa aiheuttaa.

28.

Liete on usein pestävä esimerkiksi silloin, jos endogeeninen soluhengitystaso on alhainen. Lietettä olisi ensin sentrifugoitava jonkin aikaa (esimerkiksi 10 minuuttia nopeudella 10 000 m/s2), jotta saadaan aikaan kirkas kelluva neste ja kiintoaineesta muodostuva kakku. Kelluva neste heitetään pois ja liete suspendoidaan uudelleen kloorittomaan talousveteen ravistelemalla astiaa, minkä jälkeen pesuvesi poistetaan sentrifugoimalla uudelleen ja heittämällä kelluva neste jälleen pois. Pesu- ja sentrifugointiprosessi toistetaan tarvittaessa. Tilavuudeltaan tunnetun uudelleen suspendoituneen lietteen kuivapaino määritetään, minkä jälkeen liete konsentroidaan poistamalla siitä lientä tai sitä laimennetaan edelleen kloorittomalla talousvedellä, jotta lietteen kiintoainepitoisuudeksi saadaan vaadittu 3 g/l. Aktiivilietteeseen on syötettävä jatkuvasti ilmaa (esimerkiksi 2 l minuutissa) testilämpötilassa, ja se on mahdollisuuksien mukaan käytettävä keräämispäivänä. Jos tämä ei ole mahdollista, lietteeseen on syötettävä päivittäin synteettistä jätevesiravinnetta (50 ml synteettistä jätevesiravinnetta yhteen litraan aktiivilietettä) vielä kahden päivän ajan. Tämän jälkeen lietettä käytetään testiin, ja testin tulokset katsotaan paikkansapitäviksi, jos lietteen aktiivisuudessa ei endogeenisen heterotrofisen soluhengitystason ja nitrifikaatiosoluhengitystason perusteella arvioituna ole tapahtunut merkittävää muutosta.

29.

Vaikeuksia voi ilmetä, jos inkubaation aikana muodostuu niin runsaasti vaahtoa, että vaahto ja sen mukana lietteen kiintoaineet tulevat ulos ilmastusastioista. Vaahtoaminen voi toisinaan johtua pelkästään synteettisen jäteveden olemassaolosta, mutta sitä on odotettavissa, jos testikemikaali on pinta-aktiivinen aine tai sisältää sellaista. Lietteen kiintoaineiden poistuminen testiseoksista johtaa keinotekoisesti alentuneisiin soluhengitystasoihin, jotka saatetaan virheellisesti tulkita inhibitiosta johtuviksi. Pinta-aktiivista ainetta sisältävän liuoksen ilmastaminen saa lisäksi pinta-aktiivisen aineen kerääntymään vaahtokerrokseen, jolloin vaahdon poistuminen testijärjestelmästä alentaa altistuspitoisuuksia. Vaahtoamista voidaan hallita yksinkertaisilla mekaanisilla menetelmillä (esimerkiksi satunnaisesti lasisauvalla sekoittamalla), lisäämällä pinta-aktiivista ainetta sisältämätöntä silikoniemulsioon perustuvaa vaahdonestoainetta ja/tai käyttämällä ilmastuksessa ravistuspullomenetelmää. Jos ongelma johtuu synteettisen jäteveden olemassaolosta, jäteveden koostumusta muutetaan lisäämällä vaahdonestoreagenssia esimerkiksi 50 μl/l. Jos vaahtoaminen johtuu testikemikaalista, vaahdonestoon tarvittava määrä todetaan maksimitestipitoisuudessa, minkä jälkeen jokainen ilmastusastia käsitellään samalla tavoin (myös ne, joissa vaahtoa ei muodostu, esimerkiksi nollanäytteet ja vertailuastiat). Vaahdonestoaineita käytettäessä vältetään interaktio inokulaatin ja/tai testikemikaalin kanssa.

30.

Hapenoton inhibointi voidaan määrittää kolmella eri tavalla: kokonaisinhibointi, pelkkä heterotrofinen inhibointi sekä nitrifikaatiosta johtuva inhibointi. Yleensä riittää pelkkä kokonaishapenoton inhiboinnin mittaaminen. Orgaanisen hiilen hapettumisesta johtuvaa vaikutusta heterotrofiseen hapenottoon sekä ammoniumin hapettumisen vaikutusta tarvitaan, kun tietylle kemikaalille tarvitaan jostain erityisestä syystä molemmat erilliset loppupisteet tai kun halutaan (tarvittaessa) selittää kokonaishapenoton inhiboinnista muodostuvia epätyypillisiä annosvastekäyriä.

31.

Testi tehdään lämpötilassa, jonka vaihteluväli on 20 ± 2 °C.

32.

Vettä, synteettistä jätevesiravinnetta sekä testikemikaalia sisältävät testiseokset (taulukon 1 FT) valmistetaan siten, että testikemikaalin nimellispitoisuudet niissä poikkeavat toisistaan (ainesosien esimerkkitilavuuksista ks. taulukko 1). pH-arvoa säädetään tarvittaessa siten, että se on 7,5 ± 0,5. Seoksia laimennetaan vedellä ja inokulaattia lisätään siten, että kaikkien astioiden lopulliset tilavuudet ovat samat ja ilmastaminen voidaan aloittaa.

33.

Seokset (FR) valmistetaan samalla tavoin kuin testiseokset, mutta testikemikaali korvataan vertailukemikaalilla, kuten 3,5-dikloorifenolilla.

34.

Nollanäytteet (FB) valmistetaan altistusjakson alussa ja lopussa testeissä, joissa testidekanttereita valmistetaan yksi kerrallaan säännöllisin väliajoin. Testeissä, joissa käytettävien laitteiden avulla hapenkulutusta koskevat mittaukset voidaan tehdä samanaikaisesti, jokaisessa samanaikaisesti analysoitavassa erässä on oltava ainakin kaksi nollanäytettä. Nollanäytteissä on yhtä paljon aktiivilietettä sekä synteettistä ravinneliuosta, mutta ei testi- tai vertailukemikaalia. Nollanäytteet laimennetaan vedellä samaan tilavuuteen kuin testi- ja vertailuseokset.

35.

Tapauksissa, joissa testikemikaalilla esimerkiksi tiedetään tai epäillään olevan voimakkaasti pelkistäviä ominaisuuksia, on tarvittaessa valmistettava seos FA abioottisen hapenkulutuksen mittaamista varten. Seoksessa on oltava samat määrät testikemikaalia ja synteettistä jätevesiravinnetta ja sen tilavuuden on oltava sama kuin testiseosten, mutta aktiiviliete puuttuu.

36.

Testiseokset, vertailuseokset sekä nollanäytteet ja abioottiset kontrollit inkuboidaan testilämpötilassa koneellisesti ilmastaen (0,5–1 l/min), jotta liuenneen hapen kyllästymispitoisuus on jatkuvasti yli 60–70 prosenttia ja lietehiutaleet pysyvät suspendoituneina. Viljelmiä on myös sekoitettava, jotta lietehiutaleet pysyvät suspendoituneina. Inkubaation katsotaan alkavan, kun aktiivilieteinokulaatti joutuu ensimmäistä kertaa kosketuksiin lopullisen seoksen muiden ainesosien kanssa. Inkubaation lopussa määritellyn altistusajan (yleensä kolme tuntia) jälkeen näytteet kerätään pois ja liuenneen hapen pitoisuuden lasku mitataan tätä varten tarkoitetussa kennossa (lisäyksen 3 kuva 2) tai kokonaan täytetyssä BOD-pullossa. Inkubaation alkamistapa riippuu myös hapenkulutuksen mittaamiseen tarkoitetun laitteiston kapasiteetista. Jos laitteistoon kuuluu esimerkiksi vain yksi happianturi, mittaukset tehdään yksitellen. Tällöin synteettisessä jätevedessä tehtävää testiä varten tarvittavat seokset valmistetaan, mutta inokulaattia ei käytetä, ja lietteen tarvittavat osat lisätään kuhunkin sarjaan kuuluvaan astiaan. Inkubaatiot aloitetaan yksi kerrallaan sopivin väliajoin, esimerkiksi 10–15 minuutin välein. Vaihtoehtoisesti mittausjärjestelmään voi kuulua useita antureita, jolloin useita mittauksia voidaan tehdä samanaikaisesti. Tässä tapauksessa inokulaattia voidaan lisätä yhtä aikaa sopiviin astiaryhmiin.

37.

Nimellinen aktiivilietepitoisuus kaikissa testi- ja vertailuseoksissa sekä nollanäytteissä (muttei abioottisissa kontrolleissa) on 1,5 g kiintoainetta litrassa. Hapenkulutus mitataan kolmen tunnin altistusajan päätteeksi. Tarvittaessa 5 kohdassa kuvatuissa tapauksissa tehdään vielä lisää altistusmittauksia 30 minuutin välein.

38.

Lietteen mahdollisen nitrifikaation ja nitrifikaatiotason selville saamiseksi valmistetaan seokset (FB) samaan tapaan kuin nollanäytteet ja lisäkontrolliseokset (FN), mutta näissä seoksissa on myös N-allyylitioureaa 11,6 mg litrassa. Seoksia ilmastetaan ja inkuboidaan lämpötilassa 20° ± 2 °C kolmen tunnin ajan. Tämän jälkeen mitataan hapenottotaso ja lasketaan nitrifikaatiosta johtuva hapenotto.

39.

Alustavalla testillä voidaan tarvittaessa arvioida, millä testikemikaalin pitoisuuksien vaihteluvälillä voidaan lopullisessa testissä määrittää hapenkulutuksen estyminen. Jos testikemikaali ei toisaalta estä hapenkulutusta alustavassa testissä, tämä voi osoittaa, että lopullista testiä ei tarvita. Tähän tarvitaan kuitenkin kolme testiä korkeimmalla alustavassa testissä käytetyllä pitoisuudella (yleensä 1 000 mg/l, kuitenkin tarvittavan tiedon määrän mukaan).

Taulukko 1

Esimerkkejä alustavassa testissä käytettävistä seoksista

40.

Testiä tehtäessä käytetään testikemikaalia vähintään kolmena eri pitoisuutena (esimerkiksi 10 mg/l, 100 mg/l ja 1 000 mg/l) sekä nollanäytettä ja tarvittaessa lisäksi vähintään kolmea abioottista kontrollia, joissa testikemikaalia on suurin mahdollinen pitoisuus (esimerkkinä ks. taulukko 1). Ihannetapauksessa pienimmällä pitoisuudella ei ole vaikutusta hapenkulutukseen. Hapenottotasot sekä tarvittaessa nitrifikaatiotaso lasketaan ensin, minkä jälkeen lasketaan hapenoton prosentuaalinen estyminen. Testin tarkoituksen mukaan on mahdollista myös määrittää pelkkä rajapitoisuuden myrkyllisyys, esimerkiksi 1 000 mg/l. Jos tilastollisesti merkittävää myrkyllistä vaikutusta ei esiinny tässä pitoisuudessa, lisätestejä suuremmilla tai pienemmillä pitoisuuksilla ei tarvita. On syytä huomata, että heikosti veteen liukenevat aineet, seokset, joiden ainesosat liukenevat veteen eri tavoin sekä adsorptiiviset aineet on punnittava suoraan testiastioihin. Tässä tapauksessa testiaineen kantaliuokselle varattu tilavuus korvataan laimennusvedellä.

41.

Testissä käytetään alustavan testin perusteella määriteltyjä pitoisuuksia. Useimmissa tapauksissa suositellaan kuutta kontrollia ja viittä geometrisen sarjan muodostavaa käsittelypitoisuutta sekä viittä rinnakkaisnäytettä, jotta saadaan sekä NOEC että ECx (esimerkiksi EC50). Abioottista kontrollia ei ole tarpeen toistaa, jos alustavassa testissä ei tapahtunut hapenottoa. Jos hapenotto on huomattavaa, jokaista testikemikaalin pitoisuutta varten tarvitaan abioottiset kontrollit. Lietteen herkkyys tarkistetaan vertailukemikaalia (3,5-dikloorifenoli) käyttämällä. Lietteen herkkyys on tarkistettava erikseen jokaiselle testisarjalle, sillä herkkyyden tiedetään vaihtelevan. Kaikissa tapauksissa näytteet poistetaan testiastioista kolmen tunnin tai tarvittaessa 30 minuutin lisäajan kuluttua hapenottotason mittaamiseksi happielektrodikennossa. Kerätystä tiedosta lasketaan kontrollille ja testiseoksille ominaiset soluhengitystasot, minkä jälkeen prosentuaalinen inhibitio lasketaan alla olevasta yhtälöstä 7.

42.

Nitrifikaation spesifistä inhibiittoria (ATU) käyttämällä voidaan arvioida suoraan testikemikaalien inhibitiovaikutusta heterotrofiseen hapettumiseen. Vaikutus nitrifikaatioon voidaan laskea vähentämällä ATUa käytettäessä saatu hapenotto kokonaishapenotosta (ilman ATUa). Kaksi reaktioseossarjaa valmistetaan 41 kohdassa kuvatun ECx- tai NOEC-testijärjestelyjen mukaisesti, mutta lisäksi toisen sarjan jokaiseen seokseen lisätään ATUa lopullisena pitoisuutena 11,6 mg/l. Tämän pitoisuuden on osoitettu inhiboivan nitrifikaation täydellisesti lietteessä, jonka kiintoainepitoisuus on enintään 3 000 mg/l (4). Hapenotto mitataan altistusjakson jälkeen; nämä suorat arvot edustavat pelkkää heterotrofista soluhengitystä, ja näiden arvojen sekä vastaavien kokonaissoluhengitystä ilmaisevien arvojen erotus ilmaisee nitrifikaatiota. Tämän jälkeen lasketaan eri inhibitioasteet.

43.

Altistusjakson tai -jaksojen jälkeen siirretään näyte ensimmäisestä ilmastusastiasta happielektrodikennoon (lisäyksen 2 kuva 1) ja liuenneen hapen pitoisuus mitataan välittömästi. Useita elektrodeja sisältävää järjestelmää käytettäessä mittaukset voidaan tehdä samanaikaisesti. Sekoittaminen (päällystetyllä magneetilla) samalla nopeudella, jolla elektrodi on kalibroitu, on välttämätöntä, jotta anturi varmasti reagoi mahdollisimman nopeasti muuttuviin happipitoisuuksiin ja mittausastiasta voidaan tehdä säännöllisiä ja toistettavissa olevia happimittauksia. Eräissä happielektrodeissa käytettävä automaattinen sekoitinpuikko on useimmiten riittävä. Kenno huuhdellaan vedellä mittausten välillä. Näytteellä voidaan vaihtoehtoisesti täyttää magneettisekoittimella varustettu BOD-pullo (lisäyksen 3 kuva 2). Tämän jälkeen pullon kaulasta laitetaan sisään happianturi, jossa on sovitinholkki, ja magneettisekoitin käynnistetään. Molemmissa tapauksissa liuenneen hapen pitoisuutta on mitattava jatkuvasti ja kirjattava muistiin tietyn aikaa, tavallisesti 5–10 minuutin ajan tai siihen saakka, että happipitoisuus on alle 2 mg/l. Elektrodi poistetaan, seos kaadetaan takaisin ilmastusastiaan ja ilmastusta ja sekoittamista jatketaan, jos mittauksia on tarpeen tehdä pitemmän altistusajan jälkeen.

44.

Toisinaan saattaa olla tarpeen mitata testikemikaalin pitoisuus testiastioissa. On syytä huomata, että jos käytettävänä kantaliuoksena on

liuennut osa on tuntematon, ja testiastioihin siirrettävän testikemikaalin todellista pitoisuutta ei tunneta. Altistuksen kuvaamiseksi on tehtävä analyyttinen estimaatti testikemikaalin pitoisuuksista testiastioissa. Yksinkertaisuuden vuoksi analyyttinen estimaatti on syytä tehdä ennen inokulaatin lisäämistä. Koska testiastioihin siirtyvät vain liuenneet osat, mitatut pitoisuudet saattavat olla hyvin alhaisia.

45.

Aikaa vievien ja kalliiden analyysien välttämiseksi suositellaan, että testikemikaali yksinkertaisesti punnitaan suoraan testiastioihin ja alkuperäistä punnittua nimellispitoisuutta käytetään myöhemmissä laskelmissa. Testikemikaalin liuenneen, liukenemattoman tai adsorboituneen osan erottaminen ei ole tarpeen, sillä kaikki osat ilmenevät samoin myös jätevesien käsittelylaitokseen todellisissa käyttöolosuhteissa, ja osissa voi olla vaihtelua jäteveden koostumuksen mukaan. Testimenetelmän tarkoituksena on tehdä realistinen estimaatti pitoisuudesta, jossa inhibitiota ei tapahdu, eikä sillä voida tutkia yksityiskohtaisesti, mitkä osat vaikuttavat aktiivilietteen organismien inhibitioon. Lopuksi mainittakoon, että myös adsorptiiviset aineet on punnittava suoraan testiastioihin ja astiat on silanoitava, jotta ainetta menetetään adsorption vuoksi mahdollisimman vähän.

46.

Hapenotto lasketaan mitattujen arvojen keskiarvosta, esimerkiksi happipitoisuutta ajan funktiona esittävän kuvaajan lineaarisesta osasta siten, että laskelmia tehdään vain happipitoisuuksista 2,0–7,0 mg/l, sillä suuremmat ja pienemmät pitoisuudet saattavat itsessään vaikuttaa kulutukseen. Nämä pitoisuudet ylittävien arvojen käyttämistä ei aina voi välttää, ja se voi olla tarpeen esimerkiksi silloin, kun soluhengitys on voimakkaasti estynyt ja tapahtuu erittäin hitaasti, tai jos soluhengitys jossakin tietyssä aktiivilietteessä on erityisen nopeaa. Tämä on hyväksyttävää, kunhan hapenottoa esittävässä kuvaajassa on pitkiä suoria osuuksia, eivätkä niiden gradientit muutu ylitettäessä raja-arvoja 2,0 mg/l tai 7,0 mg/l O2. Jos kuvaajassa on mutkia, tämä tarkoittaa, että mittausjärjestelmä on stabiloitumassa tai hapenotto muuttumassa, eikä näitä kohtia käytetä soluhengitystason laskemisessa. Hapenotto ilmaistaan milligrammoina litrassa tuntia kohti (mg/lh) tai milligrammoina yhtä kuivalietegrammaa kohti tunnissa (mg/gh). Hapenkulutus R (mg/lh) voidaan laskea tai interpoloida havaittua happipitoisuuden laskua esittävän kuvaajan lineaarisesta osasta käyttämällä yhtälöä 1:

jossa

47.

Ominaissoluhengitystaso (Rs) ilmaistaan lietteen yhtä kuivapainogrammaa kohti kulutetun hapen määränä tunnissa (mg/gh) käyttämällä yhtälöä 2:

jossa SS on testiseoksen kiintoainepitoisuus (g/l).

48.

R:n yhdisteltävissä olevat indeksit ovat seuraavat:

49.

Kokonaissoluhengityksen (RT), nitrifikaatiosoluhengityksen (RN) sekä heterotrofisen soluhengityksen (RH) välinen suhde esitetään yhtälössä 3:

jossa

50.

Tämä suhde on voimassa nollanäytteille (RNB, RTB, RHB), abioottisille kontrolleille (RNA, RTA, RHA) sekä testikemikaaleja sisältäville analyyseille (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Ominaissoluhengitystasot saadaan seuraavista yhtälöistä:

51.

Jos RN on alustavassa testissä merkityksetön (esimerkiksi < 5 % RT-arvosta nollanäytteissä), voidaan olettaa, että heterotrofinen hapenotto vastaa kokonaishapenottoa, eikä nitrifikaatiota esiinny. Aktiivilietettä on hankittava toisesta lähteestä, jos testeillä halutaan tutkia vaikutusta heterotrofisiin ja nitrifioiviin mikro-organismeihin. Varsinainen testi tehdään, jos havaitaan merkkejä estyneestä hapenotosta testikemikaalin eri pitoisuuksia käytettäessä.

52.

Hapenkulutuksen kokonaistason prosentuaalinen inhibitio IT testikemikaalin eri pitoisuuksilla saadaan yhtälöstä 7:

53.

Heterotrofisen hapenkulutuksen prosentuaalinen inhibitio IH testikemikaalin eri pitoisuuksilla saadaan vastaavasti yhtälöstä 8:

54.

Hapenkulutuksen nitrifikaatiosta johtuva inhibitio IN eri pitoisuuksilla saadaan yhtälöstä 9:

55.

Hapenkulutuksen prosentuaalinen inhibitio piirretään testikemikaalin pitoisuuden logaritmin funktiona (inhibitiokäyrä; ks. lisäyksen 4 kuva 3). Inhibitiokäyrät piirretään erikseen jokaiselle kolmen tunnin ilmastusjaksolle tai 30 minuutin lisäajan jälkeen. Testikemikaalin pitoisuus, joka inhiboi hapenottoa 50 % (EC50), lasketaan tai interpoloidaan käyrästä. Jos käytössä on sopivaa dataa, voidaan laskea tai interpoloida EC50:n 95 prosentin luottamusvälit, käyrän kaltevuus sekä sopivat arvot, jotka ilmaisevat inhibition alkamishetken (esimerkiksi EC10 tai EC20) sekä inhibitiovälin päättymisen (esimerkiksi EC80 tai EC90).

56.

On syytä huomata, että tuloksissa usein havaitun vaihtelun vuoksi monissa tapauksissa riittänee, kun tulokset lisäksi ilmaistaan suuruusjärjestyksessä esimerkiksi seuraavalla tavalla:

57.

ECx-arvot, mukaan lukien niitä koskevat parametrin 95 prosentin luottamusvälit, lasketaan sopivien tilastollisten menetelmien avulla (esimerkiksi tilastollinen koestus, logistinen funktio tai Weibullin funktio, viritetty Spearmanin ja Kärberin menetelmä tai yksinkertainen interpolointi (11)). ECx saadaan lisäämällä yhtälöön kontrollin keskiarvon x prosenttia vastaava arvo. Jos halutaan laskea EC50 tai jokin muu ECx-arvo, käsittelyä edeltävälle keskiarvolle (x) olisi tehtävä regressioanalyysi.

58.

Jos tilastollisella analyysilla on tarkoitus määrittää NOEC-arvo, astiakohtaiset tilastot (yksittäisiä astioita pidetään rinnakkaisnäytteinä) ovat tarpeen. Tässä käytetään sopivia tilastollisia menetelmiä, jotka perustuvat OECD:n asiakirjaan Document on Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). Yleensä testikemikaalin haitallisia vaikutuksia verrattuna kontrolliin tutkitaan käyttämällä yksisuuntaista (pienempää) hypoteesitestausta, jossa p ≤ 0,05.

59.

Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245–261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27–39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471–483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515–524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556–1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1.

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 221 (2006). Tällä testimenetelmällä arvioidaan kemikaalien myrkyllisyyttä Lemna-sukua (limaskat) oleville makean veden kasveille. Menetelmä perustuu olemassa oleviin menetelmiin (1), (2), (3), (4), (5), (6), mutta niitä on muutettu viimeaikaisten tutkimustulosten ja keskeisiä kysymyksiä koskevien konsultointien pohjalta. Testimenetelmä on validoitu kansainvälisellä yhteistutkimuksella (ring test) (7).

2.

Testimenetelmässä kuvataan myrkyllisyyden testausta, jossa käytetään Lemna gibba- ja Lemna minor -lajeja. Kumpaakin lajia on tutkittu laajalti ja käytetty edellä mainituissa standardeissa. Lemna-suvun lajien taksonomia on hankala, koska fenotyyppejä on monta. Vaikka Lemna-suvussa voi esiintyä geneettistä vaihtelevuutta vasteessa myrkyllisiin aineisiin, vaihtelevuuden syistä ei toistaiseksi ole saatavilla riittävästi tietoja, joiden pohjalta voitaisiin suositella tietyn kloonin käyttöä tässä testimenetelmässä. On syytä huomata, että testiä ei suoriteta aksenikaalisesti, vaan testin eri vaiheissa toteutetaan toimia, joilla muista eliöistä johtuva kontaminaatio pyritään pitämään mahdollisimman pienenä.

3.

Testimenetelmässä kuvataan yksityiskohtaisesti testausta, jossa testiliuos vaihtuu (semistaattinen ja läpivirtausmenetelmä) tai ei vaihdu (staattinen menetelmä). Testin tavoitteista ja sääntelyvaatimuksista riippuen on suositeltavaa harkita semistaattisten tai läpivirtausmenetelmien käyttöä muun muassa sellaisten kemikaalien testauksessa, jotka häviävät nopeasti liuoksesta haihtumisen, valohajoamisen, saostumisen tai biohajoavuuden vuoksi. Tästä annetaan tarkempia ohjeita kirjallisuusviitteessä (8).

4.

Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

5.

Lemna-sukuun kuuluvien eksponentiaalisesti kasvavien kasviviljelmien annetaan kasvaa seitsemän päivän ajan monokulttuureina testikemikaalin eri pitoisuuksissa. Testin tavoitteena on kvantifioida testikemikaaliin liittyvät vaikutukset kasvien kasvuun tämän ajan kuluessa tiettyjen mittausmuuttujien arvioinnin perusteella. Ensisijaisena mittausmuuttujana on versojen lukumäärä. Lisäksi mitataan ainakin yhtä muuta mittausmuuttujaa (versojen kokonaispinta-alaa, kuivapainoa tai tuorepainoa), koska eräät kemikaalit voivat vaikuttaa huomattavasti enemmän muihin mittausmuuttujiin kuin versojen lukumäärään. Testikemikaaliin liittyvien vaikutusten kvantifioimiseksi testiliuoksissa tapahtunutta kasvua verrataan kontrolliryhmässä tapahtuneeseen kasvuun, minkä jälkeen määritetään pitoisuus, jossa kasvu estyy ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan ECx-arvona (esimerkiksi EC50).

6.

Testin loppupisteenä on kasvun estyminen, joka ilmenee mittausmuuttujan logaritmisesta kasvusta (keskimääräisestä spesifisestä kasvunopeudesta) altistusaikana. Testiliuossarjassa mitattujen keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien avulla määritetään pitoisuus, jossa kasvunopeus vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan ErCx-arvona (esimerkiksi ErC50).

7.

Toinen testimenetelmässä käytetty vastemuuttuja on tuotos, jota voidaan tarvita joissakin maissa erityisten sääntelyvaatimusten täyttämiseksi. Sillä tarkoitetaan altistusajan lopussa mitattua mittausmuuttujien arvoa, josta on vähennetty altistusajan alussa mitattu mittausmuuttujien arvo. Testiliuossarjassa mitatun tuotoksen avulla määritetään pitoisuus, jossa tuotos vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan EyCx-arvona (esimerkiksi EyC50).

8.

Tilastollisesti voidaan määrittää myös pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) sekä pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC).

9.

Käytettävissä on oltava analyysimenetelmä, jolla testiviljelyaineessa oleva testikemikaali voidaan kvantifioida riittävän herkästi.

10.

Testikemikaalia koskevia tietoja, joista voi olla hyötyä päätettäessä testiolosuhteista, ovat rakennekaava, puhtaus, vesiliukoisuus, stabiilius vedessä ja valossa, pKa, Kow, höyrynpaine ja biohajoavuus. Vesiliukoisuutta ja höyrynpainetta voidaan käyttää laskettaessa Henryn vakiota, josta voidaan päätellä, onko todennäköistä, että testikemikaalia häviää merkittävästi testin aikana. Tämän perusteella voidaan päättää, vaativatko tällaiset häviöt erityistoimia. Jos testikemikaalin liukoisuutta ja stabiiliutta koskevat tiedot ovat epäluotettavia, nämä ominaisuudet olisi arvioitava testiolosuhteissa, toisin sanoen siinä viljelyaineessa, lämpötilassa ja valaistuksessa, joita testissä käytetään.

11.

Jos on erityisen tärkeää säädellä testiviljelyaineen pH:ta, esimerkiksi testattaessa metalleja tai hydrolyyttisesti epästabiileja kemikaaleja, on suositeltavaa lisätä testiviljelyaineeseen puskuria (ks. 21 kohta). Kirjallisuusviitteessä (8) annetaan lisäohjeita sellaisten kemikaalien testauksesta, joiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet vaikeuttavat niiden testaamista.

12.

Jotta testi olisi validi, versojen lukumäärän on kaksinkertaistuttava kontrolliviljelmässä alle 2,5 päivässä (60 tunnissa), mikä vastaa noin seitsenkertaista kasvua seitsemän päivän kuluessa, kun keskimääräinen spesifinen kasvunopeus on 0,275 päivää kohden. Käytettäessä tässä testimenetelmässä kuvattuja testiliuoksia ja -olosuhteita tämä vaatimus voidaan täyttää käyttämällä staattista testausta (5). Vaatimus voidaan oletettavasti täyttää myös sellaisissa testiolosuhteissa, joissa käytetään semistaattista tai läpivirtausmenetelmää. Kaksinkertaistumisajan laskemista käsitellään tarkemmin 49 kohdassa.

13.

Testimenetelmä voidaan tarkistaa testaamalla vertailukemikaali (-kemikaalit), kuten 3,5-dikloorifenoli, jota on käytetty kansainvälisessä yhteistutkimuksessa (7). Vertailukemikaali on suotavaa testata vähintään kahdesti vuodessa tai, jos testausta tehdään harvemmin, rinnakkain määritettäessä testikemikaalin myrkyllisyyttä.

14.

Kaikkien välineiden, jotka joutuvat kosketuksiin testiliuosten kanssa, on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia. Viljelyyn ja testaukseen käytettävien lasiastioiden on oltava steriilejä, ja ne on puhdistettava kemiallisista epäpuhtauksista, jotka voivat päästä testiviljelyaineeseen. Koeastioiden on oltava niin tilavia, että eri kolonioiden versot voivat kasvaa kontrolliastioissa peittämättä toisiaan testin lopussa. Ei ole haitaksi, vaikka juuret ulottuvat testiastioiden pohjaan, mutta on suositeltavaa, että kaikki koeastiat ovat syvyydeltään vähintään 20 mm ja tilavuudeltaan vähintään 100 ml. Koeastioiden valinnalla ei ole muuten ratkaisevaa merkitystä, jos nämä vaatimukset täyttyvät. Sopivan kokoiset dekantterilasit, kiteytysmaljat ja lasiset petrimaljat ovat kaikki osoittautuneet käyttökelpoisiksi. Haihtumisen ja tahattoman kontaminaation minimoimiseksi koeastiat on peitettävä, mutta samalla on huolehdittava riittävästä ilmanvaihdosta. Koeastiat ja varsinkaan niiden sulkimet eivät saa varjostaa tai muuttaa valon spektriominaisuuksia.

15.

Viljelmiä ja koeastioita ei saa säilyttää toistensa kanssa. Sen vuoksi on paras käyttää erillisiä ilmastoituja kasvatuskaappeja, inkubaattoreita tai huoneita. Valaistuksen ja lämpötilan on oltava säädettävissä, ja ne on pidettävä tasaisina (ks. 35–36 kohdat).

16.

Testissä käytetään Lemna gibba- tai Lemna minor -lajia. Myrkyllisyyden testauksessa käytettyjä limaskalajeja kuvataan lyhyesti lisäyksessä 2. Kasvimateriaali voidaan hankkia kantakokoelmasta, toisesta laboratoriosta tai luonnosta. Jos kasvit kerätään luonnosta, niitä on viljeltävä testissä käytettävässä viljelyaineessa vähintään kahdeksan viikkoa ennen käyttöä. Paikoissa, joista alkuviljelmien kasvit kerätään, ei saa olla ilmeisiä kontaminaatiolähteitä. Jos kasvit hankitaan toisesta laboratoriosta tai kantakokoelmasta, niitä on viljeltävä vastaavalla tavalla kolmen viikon ajan. Kasvimateriaalin lähde sekä testauksessa käytettävät lajit ja klooni (jos tiedossa) on aina ilmoitettava.

17.

Testissä on käytettävä monokulttuureita, joissa ei ole muita organismeja, kuten leviä tai alkueläimiä, näkyvinä epäpuhtauksina. L. minor -lajin terveet kasvit ovat kolonioina, joissa on 2–5 versoa, kun taas L. gibba -lajin terveissä kolonioissa voi olla jopa seitsemän versoa.

18.

Testissä käytettävät kasvit on valittava huolellisesti, koska niiden laatu ja yhtenäisyys vaikuttavat merkittävästi testin tulokseen. Testissä on käytettävä nuoria, nopeasti kasvavia kasveja, joissa ei ole näkyviä vaurioita tai värimuutoksia (kloroosia). Hyvälaatuisen viljelmän tunnistaa siitä, että siinä esiintyy runsaasti vähintään kahdesta versosta koostuvia kolonioita. Jos viljelmässä on monia yksittäisiä versoja, se on merkki ympäristörasituksesta, kuten ravinteiden puutteesta, eikä testissä saa käyttää tällaisista viljelmistä peräisin olevaa kasvimateriaalia.

19.

Viljelmien ylläpidon helpottamiseksi (esimerkiksi silloin, kun Lemna-testejä ei aiota tehdä tiettynä aikana) niitä voidaan säilyttää normaalia heikommassa valaistuksessa ja alhaisemmassa lämpötilassa (4–10 °C). Viljelyä käsitellään tarkemmin lisäyksessä 3. Jos viljelmässä näkyy selviä merkkejä levien ja muiden eliöiden aiheuttamasta kontaminaatiosta, Lemna-versoista on mahdollisesti otettava osanäyte, jolle tehdään pintasterilointi, jonka jälkeen se siirretään tuoreeseen viljelyaineeseen (ks. lisäys 3). Jäljelle jäävä kontaminoitunut viljelmä on heitettävä pois.

20.

Riittävä määrä kolonioita siirretään aseptisesti vähintään seitsemän päivää ennen testausta tuoreeseen steriiliin viljelyaineeseen, ja kolonioita viljellään 7–10 päivän ajan testiolosuhteissa.

21.

Lemna minor- ja Lemna gibba -lajeja varten suositetaan erilaisia viljelyaineita, joita kuvataan jäljempänä. On syytä harkita huolellisesti pH-puskurin lisäämistä testiviljelyaineeseen (MOPS (4-morfoliinipropaanisulfonihappo, CAS-numero: 1132-61-2) L. minor -lajin viljelyaineeseen ja NaHCO3 L. gibba -lajin viljelyaineeseen), jos testiviljelyaineen epäillään voivan reagoida testikemikaalin kanssa ja vaikuttaa sen myrkyllisyyden ilmentymiseen. Steinbergin viljelyainetta (9) voidaan käyttää, jos validiteettivaatimukset täyttyvät.

22.

Ruotsalaisen standardin (SIS) mukaisen Lemna-viljelyaineen muunnosta suositetaan käytettäväksi testauksessa, jossa viljellään ja käytetään L. minor -lajia. Tämän viljelyaineen koostumus esitetään lisäyksessä 4.

23.

Lisäyksessä 4 kuvattua 20X-AAP-viljelyainetta suositetaan käytettäväksi testauksessa, jossa viljellään ja käytetään L. gibba -lajia.

24.

L. minor -lajille soveltuu myös lisäyksessä 4 kuvattu Steinbergin viljelyaine, mutta sitä voidaan käyttää myös L. gibba -lajin viljelyssä, jos validiteettivaatimukset täyttyvät.

25.

Testiliuokset valmistetaan yleensä laimentamalla kantaliuosta. Testikemikaalin kantaliuokset valmistetaan tavallisesti liuottamalla kemikaali viljelyaineeseen.

26.

Testikemikaalin suurin testattu pitoisuus ei yleensä saa ylittää kyseisen kemikaalin vesiliukoisuutta testiolosuhteissa. On kuitenkin huomattava, että Lemna-suvun lajit kelluvat pinnalla ja voivat altistua kemikaaleille, jotka kerääntyvät veden ja ilman rajapintaan (esimerkiksi huonosti veteen liukenevat tai hydrofobiset kemikaalit taikka pinta-aktiiviset kemikaalit). Tällaisissa olosuhteissa kasvit altistuvat muille kuin liuoksessa olevalle aineille, ja testipitoisuudet voivat testikemikaalin ominaisuuksista riippuen ylittää vesiliukoisuuden. Jos testikemikaali liukenee huonosti veteen, voi olla tarpeen valmistaa kyseisestä kemikaalista väkevä kantaliuos tai dispersio käyttämällä orgaanista liuotinta tai dispergointiainetta, joilla voidaan helpottaa tarkkojen testikemikaalimäärien lisäämistä testiviljelyaineeseen sekä testikemikaalin dispersiota ja liukenemista. Tällaisten aineiden käyttöä on vältettävä mahdollisimman pitkälle. Jos liuottimia tai dispergointiaineita käytetään apuna testiliuosten valmistuksessa, niistä ei saa aiheutua fytotoksisuutta. Asetoni ja dimetyyliformamidi ovat esimerkkejä yleisesti käytetyistä liuottimista, jotka eivät aiheuta fytotoksisuutta pitoisuuden ollessa enintään 100 μl·l. Jos liuotinta tai dispergointiainetta käytetään, sen lopullinen pitoisuus on ilmoitettava ja pidettävä mahdollisimman pienenä (≤ 100 μl/l), ja liuoksen tai dispergointiaineen pitoisuuden on oltava sama kaikissa käsitellyissä ja kontrolliliuoksissa. Dispergointiaineiden käytöstä annetaan lisäohjeita kirjallisuusviitteessä (8).

27.

Sopivat testipitoisuudet on helpompi valita, jos testikemikaalin myrkyllisyydestä Lemna-lajeille on saatavilla aiempia tietoja esimerkiksi alustavista pitoisuusalueen määrityskokeista. Lopullisessa myrkyllisyystestissä on yleensä oltava vähintään viisi testipitoisuutta, jotka muodostavat geometrisen sarjan. Testipitoisuuksien suhdeluvun ei tulisi olla suurempi kuin 3,2, mutta suurempikin suhdeluku sallitaan, jos pitoisuus-vastekäyrä on laakea. Vähemmän kuin viiden pitoisuuden käyttö on perusteltava. Jokaisesta testipitoisuudesta on tehtävä vähintään kolme toistoa.

28.

Valittaessa testin pitoisuusaluetta (pitoisuusalueen määritystä ja/tai lopullista myrkyllisyystestiä varten) on otettava huomioon seuraavat näkökohdat:

29.

Jokaiseen testiin on kuuluttava kontrolliryhmä, jossa ravinneliuos, versojen ja kolonioiden lukumäärä, ympäristöolosuhteet ja menettelyt ovat samat kuin testiryhmässä mutta ilman testikemikaalia. Jos apuna käytetään liuotinta tai dispergointiainetta, testiin on kuuluttava ylimääräinen kontrollikäsittely, jossa liuottimen tai dispergointiaineen pitoisuus on sama kuin testikemikaalia sisältävissä astioissa. Toistoissa kontrolliastioiden (ja liuotinta käytettäessä liuotinta sisältävien astioiden) lukumäärän on oltava vähintään yhtä suuri kuin kunkin testipitoisuuden testaamiseen käytettyjen astioiden lukumäärä ja mielellään kaksinkertainen.

30.

Jos NOEC-pitoisuutta ei tarvitse määrittää, testimenetelmää voidaan muuttaa lisäämällä pitoisuuksien määrää ja vähentämällä toistojen määrää pitoisuutta kohden. Kontrollitoistoja on kuitenkin oltava vähintään kolme.