III LISA

„III LISA

SÖÖDAMATERJALI JA SEGASÖÖDA KOOSTISE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A. NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata sööda niiskusesisaldust. Lenduvaid aineid, näiteks orgaanilisi happeid sisaldava sööda puhul tuleb jälgida, et koos niiskusesisaldusega määrataks ka oluline osa lenduvatest ainetest.

See ei hõlma piimatoodete kui söödamaterjali ja valdavalt piimatoodetest koosneva segasööda analüüsi, loomsete ja taimsete rasvade ja õlide analüüsi ega õliseemnete ja -viljade analüüsi.

Õliseemnete niiskusesisaldus määratakse vastavalt meetodile, mis on esitatud standardis EN ISO 665 „Niiskusesisalduse ja lenduvate ainete sisalduse määramine“, võttes arvesse, et sojaoad tuleb enne niiskusesisalduse määramist jahvatada.

2. Põhimõte

Proov kuivatatakse kindlaksmääratud tingimustel, mis varieeruvad sõltuvalt sööda laadist. Massikadu määratakse kaalumise teel. Suure niiskusesisaldusega tahket sööta tuleb eelnevalt kuivatada.

3. Seadmed

3.1.

Niiskust mitteneelavast materjalist purusti, mis vastab punktides 4.1.1 ja 4.1.2 sätestatud nõuetele, mida on lihtne puhastada ning millega on võimalik kiiresti ja ühtlaselt purustada nii, et ei tekiks märgatavat kuumenemist ja et proov puutuks võimalikult vähe kokku väliskeskkonnaga (nt vasarpurustaja või vesijahutusega mikropurustaja, kokkupandav koonusveski, aeglustatud liikumisega purustaja või hammasratastega purustaja).

3.2.

Analüütilised kaalud täpsusega 1 mg.

3.3.

Õhukindlalt suletavad roostevabast metallist või klaasist kuivad anumad põhjaga, millele saab analüüsitavat proovi laotada tihedusega 0,3 g/cm2.

3.4.

Reguleeritava temperatuuriga (± 2 °C) elektriline kuivatuskapp, mis on nõuetekohaselt ventileeritav ja võimaldab temperatuuri kiiresti reguleerida (1).

3.5.

Reguleeritava temperatuuriga elektriline vaakumkuivatuskapp, mis on varustatud õlipumbaga ning kuhu saab juhtida kuuma ja kuiva õhku või kuhu pannakse kuivatusainet (nt kaltsiumoksiidi).

3.6.

Eksikaator, millel on paks avadega metall- või portselanalus ning mis sisaldab tõhusat kuivatusainet.

4. Töö käik

NB!	Käesolevas punktis kirjeldatud toimingud tuleb teha kohe pärast proovi sisaldavate pakendite avamist. Tuleb teha vähemalt kaks analüüsi.

4.1. Ettevalmistus

4.1.1. Muu sööt kui punktides 4.1.2 ja 4.1.3 nimetatud sööt

Võetakse vähemalt 50 g proovi. Vajaduse korral proov purustatakse või tehakse tükkideks, et vältida niiskusesisalduse kõikumist (vt punkt 6).

4.1.2. Teravili ja tangud

Võetakse vähemalt 50 g proovi. Proov jahvatatakse osakesteks, millest vähemalt 50 % pudeneb läbi sõela, mille avade suurus on 0,5 mm, ja sõelale, mille ümmarguste avade suurus on 1 mm, ei jää rohkem kui 10 %.

4.1.3. Vedel või pastataoline sööt, peamiselt õlidest ja rasvadest koosnev sööt

Võetakse umbes 25 g proovi, kaalutakse see 10 mg täpsusega, lisatakse vajalik kogus 10 mg täpsusega kaalutud veevaba liiva ja segatakse kuni ühtlase toote saamiseni.

4.2. Kuivatamine

Kaanega anumat (punkt 3.3) kuivatatakse 103 °C kuivatuskapis 30 +/- 1 minuti jooksul. Võetakse ahjust ja lastakse eksikaatoris (punkt 3.6) ümbritseva õhu temperatuurini jahtuda.

4.2.1. Muu sööt kui punktides 4.2.2 ja 4.2.3 nimetatud sööt

Kaanega anum kaalutakse 1 mg täpsusega. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 103 °C kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada neli tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 103 °C. Kuivatuskapp avatakse, kaas asetatakse kohe anumale, anum võetakse kapist välja, lastakse jahtuda eksikaatoris (punkt 3.6) 30–45 minutit ja kaalutakse 1 mg täpsusega.

Peamiselt (> 50 %) loomsetest ja taimsetest õlidest ja rasvadest koosneva sööda puhul kuivatatakse proovi kuivatuskapis temperatuuril 103 °C veel 30 minutit. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust.

4.2.2. Teravili, jahu, tangud ja manna

Kaanega anum kaalutakse 0,5 mg täpsusega. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g peenestatud proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 130 °C kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada kaks tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 130 °C. Kuivatuskapp avatakse, kaas asetatakse kohe anumale, anum võetakse kapist välja, lastakse jahtuda eksikaatoris (punkt 3.6) 30–45 minutit ja kaalutakse 1 mg täpsusega.

4.2.3. Segasööt, mis sisaldab üle 4 % sahharoosi või laktoosi: söödatooraine, nt jaanikaunad, hüdrolüüsitud teraviljasaadused, linnaseseemned, kuivatatud peediliistakud, kalast ja suhkrust valmistatud lahustuvsööt

Kaanega anum kaalutakse 0,5 mg täpsusega. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 80–85 °C kuumutatud vaakumkuivatuskappi (punkt 3.5). Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist.

Rõhk tõstetakse 100 torrini ja proovil lastakse sellise rõhu all kas kuuma ja kuiva õhu voolus või kuivatusaine juuresolekul (umbes 300 g 20 proovi kohta) umbes neli tundi kuivada. Kui kasutatakse kuivatusainet, ühendatakse vaakumpump pärast ettenähtud rõhu saavutamist lahti. Kuivamisaega arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 80–85 °C. Ettevaatlikult taastatakse kuivatuskapis atmosfäärirõhk. Kuivatuskapp avatakse, kaas asetatakse kohe anumale, anum võetakse kapist välja, lastakse jahtuda eksikaatoris (punkt 3.6) 30–45 minutit ja kaalutakse 1 mg täpsusega. Kuivatatakse veel 30 minutit vaakumkuivatuskapis temperatuuril 80–85 °C ning kaalutakse uuesti. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust.

4.3. (Osaline) eelkuivatamine

Alla 85 massiprotsendise kuivainesisaldusega „märga“ sööta (nt haljassööt, täisratsiooniline segasööt, tahkesööt, vedelsööt) on vaja enne peenjahvatamist osaliselt eelkuivatada, et nende stabiilseid aineid analüüsida; ebastabiilsete ainete osaline kuivatamine ei ole võimalik.

Osaline kuivatamine võib toimuda kas sundõhuringlusega kuivatuskapis või mikrolaineahjus või külmkuivatamise teel. Muude meetodite kui külmkuivatamise puhul on osalise kuivatamise eesmärk kuivatada sööta, hoides selle temperatuuri alla 60 °C, nii et selle keemiline koostis võimalikult vähe muutuks. Üle 60 °C kuivatamine põhjustab söödas keemilisi muudatusi (nt valkude lagunemist). Kuivatatud söödal lastakse enne osalise kuivainesisalduse mõõtmist umbes 15 minutit toatemperatuuril seista, et minimeerida jahvatamise ja ladustamise ajal toimuda võivat niiskusesisalduse võimalikku muutumist. Alla 60 °C kuivatamine ei kõrvalda söödast kogu vett; seepärast ei näita (esialgne) osaline kuivatamine sööda kogu kuivainesisaldust. Pärast kuivatamist osaproov jahvatatakse ja analüüsitakse osaliselt kuivanud (järelejäänud 3–15 % niiskust) proovi (lõplikku) kuivainesisaldust, kui muud keemilised koostisosad on määratud.

Seepärast soovitatakse kuivainesisalduse määramiseks kaheastmelist menetlust. Kõigepealt määratakse osaline kuivainesisaldus (kui kuivainet on vähem kui 85 %), seejärel määratakse proovi põhjal järelejäänud kuivainesisaldus ja korrutatakse osaline kuivainesisaldus järelejäänud kuivainesisaldusega, et määrata kogu kuivainesisaldus.

5. Tulemuste arvutamine

Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmiste valemite abil.

5.1. Kuivatamine ilma eelkuivatamiseta

kus:

m	=	analüüsitava proovi esialgne mass grammides,
m0	=	kuiva analüüsitava proovi mass grammides.

5.2. Kuivatamine koos eelkuivatamisega (2)

kus:

m	=	analüüsitava proovi esialgne mass grammides,
m1	=	analüüsitava proovi mass grammides pärast eelkuivatamist,
m2	=	analüüsitava proovi mass grammides pärast purustamist või jahvatamist,
m0	=	kuiva analüüsitava proovi mass grammides.

5.3. Korduvus

Sama prooviga tehtud kahe samaaegse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2 % niiskuse absoluutväärtusest, välja arvatud lemmikloomade märgtoit ja koerte närimiskondid, mille puhul ei tohi erinevus olla suurem kui 0,5 % niiskuse absoluutväärtusest.

6. Tähelepanek

Kui purustamine osutub vajalikuks ja kui sellega muutub toote niiskusesisaldus, tuleb sööda koostisosade analüüside tulemusi korrigeerida esialgsel kujul proovi niiskusesisalduse põhjal.

B. LOOMSETE JA TAIMSETE RASVADE JA ÕLIDE NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata loomsete ja taimsete rasvade ja õlide veesisaldust ja lenduvate ainete sisaldust.

2. Põhimõte

Proov kuivatatakse temperatuuril 103 °C püsimassini (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle). Massikadu määratakse kaalumise teel.

3. Seadmed

3.1.

Korrosioonikindlast materjalist lamedapõhjaline anum, mille diameeter on 8–9 cm ja kõrgus umbes 3 cm.

3.2.

Tugevdatud kolviga termomeeter, mille ülaosas on paisumistoru, mis on gradueeritud vahemikus umbes 80 °C kuni vähemalt 110 °C ja mis on umbes 10 cm pikkune.

3.3.

Liivavann või elektriline kuumutusplaat.

3.4.

Tõhusat kuivatusainet sisaldav eksikaator.

3.5.

Analüütilised kaalud.

4. Töö käik

1 mg täpsusega kaalutud umbes 20 g homogeenitud proovi pannakse kuiva kaalutud anumasse (punkt 3.1), milles on termomeeter (punkt 3.2). Kuumutatakse liivavannil või kuumutusplaadil (punkt 3.3) termomeetriga pidevalt segades, nii et temperatuur tõuseb umbes 7 minutiga 90 °C-ni.

Kuumust vähendatakse, jälgides anuma põhjast kerkivate mullide sagedust. Temperatuur ei tohi tõusta üle 105 °C. Segamist jätkatakse anuma põhja kaapides, kuni mullide tekkimine lõpeb.

Niiskuse täielikuks kõrvaldamiseks kuumutatakse proovi mitu korda temperatuurini 103 ± 2 °C, jahutades kuumutamiste vahel proovi temperatuurini 93 °C. Lastakse jahtuda eksikaatoris (punkt 3.4) toatemperatuurini ja kaalutakse. Protseduuri korratakse, kuni massikadu kahel järjestikusel kaalumisel ei ole üle 2 mg.

NB!	Proovi massi suurenemine pärast korduvat kuumutamist viitab rasva oksüdeerumisele, sel juhul arvutatakse tulemus enne massi suurenemist tehtud kaalumisel.

5. Tulemuste arvutamine

Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

kus:

m	=	analüüsitava proovi mass grammides;
m1	=	anuma ja selle sisu mass grammides enne kuumutamist;
m2	=	anuma ja selle sisu mass grammides pärast kuumutamist.

Tulemused, mis on väiksemad kui 0,05 %, tuleb registreerida kujul „alla 0,05 %“.

Korduvus

Sama prooviga tehtud kahel paralleelsel määramisel saadud niiskusesisalduste erinevus ei tohi ületada absoluutväärtuses 0,1 %.

C. LÄMMASTIKUSISALDUSE MÄÄRAMINE JA TOORVALGUSISALDUSE ARVUTAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

See meetod võimaldab määrata toorvalgusisaldust söödas lämmastikusisalduse alusel, mis määratakse Kjeldahli meetodiga (3).

2. Põhimõte

Proov lagundatakse väävelhappega katalüsaatori manulusel. Happelahus leelistatakse naatriumhüdroksiidi lahusega. Ammoniaak destilleeritakse ja kogutakse mõõdetud väävelhappekogusesse, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi standardlahusega.

Teise võimalusena destilleeritakse vabanenud ammoniaak boorhappe lahuse ülejääki, millele järgneb tiitrimine soolhappe või väävelhappe lahusega.

3. Reaktiivid

3.1.

Kaaliumsulfaat.

3.2.

Katalüsaator: vask(II)oksiid CuO või vask(II)sulfaatpentahüdraat CuSO4 5H2O.

3.3.

Granuleeritud tsink.

3.4.

Väävelhape, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Metüülpunane indikaator: 300 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml etanoolis, σ = 95–96 % (v/v).

3.9.

Naatriumhüdroksiidi lahus (võib kasutada tehnilise puhtusega reaktiivi) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Naatriumhüdroksiid, standardne tiitrimislahus, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Naatriumhüdroksiid, standardne tiitrimislahus, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Soolhappes pestud ja läbikuumutatud pimsskivigraanulid.

3.13.

Atseetaniliid (sulamistemperatuur = 114 °C; N = 10,36 %).

3.14.

Sahharoos (lämmastikuvaba).

3.15.

Boorhape (H3BO3).

3.16.

Metüülpunase indikaatorlahus: 100 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml etanoolis või metanoolis.

3.17.

Bromokresoolrohelise lahus: 100 mg bromokresoolrohelist lahustatakse 100 ml etanoolis või metanoolis.

3.18.

Boorhappe lahus (10 g/l kuni 40 g/l olenevalt kasutatavatest vahenditest).

Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, tuleb metüülpunase ja bromokresoolrohelise indikaatorid lisada boorhappe lahustesse. Kui 1 liiter boorhappe lahust on ette valmistatud, tuleb enne vajaliku mahuni korrigeerimist lisada 7 ml metüülpunase indikaatorlahust (punkt 3.16) ja 10 ml bromokresoolrohelise lahust (punkt 3.17).

Olenevalt sellest, millist vett kasutatakse, võib boorhappe lahuse pH-tase olla eri partiides erinev. Boorhappe lahuse pH peab olema 4,3–4,7. Sageli on positiivse tulemuse saamiseks vaja korrigeerida väikse leelisekogusega.

Märkus:

umbes 3–4 ml NaOH (punkt 3.11) lisamine 1 liitrisse 10 g/l boorhappesse annab tavaliselt häid tulemusi. Lahust tuleb hoida toatemperatuuril ja kaitsta valguse ning ammoniaagiaurude eest.

3.19.

Soolhape, standardne tiitrimislahus c(HCl) = 0,10 mol/l.

Märkus:

kasutada võib ka teisi tiitrimislahuste (punktid 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, ja 3.19) kontsentratsioone, kui arvutustes tehakse vastavad parandused. Kontsentratsioonid tuleb alati esitada nelja kümnendkoha täpsusega.

4. Seadmed

Seadmed, mis sobivad Kjeldahli meetodis ettenähtud lagundamise, destilleerimise ja tiitrimise läbiviimiseks.

5. Töö käik

5.1. Lagundamine

1 g proovi kaalutakse 0,001 g täpsusega ja pannakse see mineraliseerimisaparaadi kolbi. Lisatakse 15 g kaaliumsulfaati (punkt 3.1), sobiv kogus katalüsaatorit (punkt 3.2) (0,3–0,4 g vask(II)oksiidi või 0,9–1,2 g vask(II)sulfaadi pentahüdraati), 25 ml väävelhapet (punkt 3.4) ja vajaduse korral mõned pimsskivigraanulid (punkt 3.12) ning segatakse.

Kolbi kuumutatakse esialgu mõõdukalt, aeg-ajalt loksutades, kuni mass on söestunud ja vaht kadunud; seejärel kuumutatakse intensiivsemalt vedeliku püsiva keemiseni. Kuumutamine on küllaldane, kui keev hape kondenseerub kolvi seinale. Tuleb vältida seinte liigset kuumutamist ja orgaanilise aine kleepumist seintele.

Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkatakse keetmist veel kahe tunni jooksul, seejärel jahutatakse.

5.2. Destilleerimine

Lisatakse ettevaatlikult piisav kogus vett, et tagada sulfaatide täielik lahustumine. Lastakse jahtuda ja seejärel lisatakse vajadusel mõned graanulid tsinki (punkt 3.3). Edasi toimida vastavalt punktile 5.2.1 või 5.2.2.

5.2.1. Destilleerimine väävelhappeks

Destilleerimisaparaadi kogumiskolbi pannakse täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet (punkt 3.5) või (punkt 3.7), sõltuvalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisatakse mõni tilk metüülpunast indikaatorit (punkt 3.8).

Mineraliseerimiskolb ühendatakse destilleerimisaparaadi jahutiga ja jahuti ots viiakse kogumiskolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vt tähelepanekute punkt 8.3). Mineraliseerimiskolbi valatakse aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust (punkt 3.9), vältides ammoniaagi kadu (vt tähelepanekute punkt 8.1). Kolbi kuumutatakse, kuni ammoniaak on üle destilleeritud.

5.2.2. Destilleerimine boorhappeks

Kui destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimine toimub käsitsi, siis rakendatakse allpool nimetatud menetlust. Kui destilleerimisseade on täisautomaatne ning hõlmab ka destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimist, siis järgitakse tootja koostatud destilleerimisseadme kasutusjuhendit.

Kogumiskolb, mis sisaldab 25–30 ml boorhappe lahust (punkt 3.18), pannakse jahuti väljalaskeava alla selliselt, et sissevoolutoru jääb allapoole boorhappe lahuse ülejäägi pinda. Destilleerimisseade korrigeeritakse 50 ml naatriumhüdroksiidi lahuse (punkt 3.9) väljastamiseks. Destilleerimisseadet kasutatakse vastavalt tootja kasutusjuhendile ja destilleeritakse naatriumhüdroksiidi lahuse lisamisel vabanenud ammoniaak välja. Destillaat kogutakse boorhappe vastuvõtulahusesse. Destillaadi kogus (veeaurdestillatsiooni aeg) sõltub proovis sisalduva lämmastiku hulgast. Järgitakse tootja kasutusjuhendit.

Märkus:

poolautomaatses destilleerimisseadmes toimuvad naatriumhüdroksiidi ülejäägi lisamine ja veeaurdestillatsioon automaatselt.

5.3. Tiitrimine

Edasi toimida vastavalt punktile 5.3.1 või 5.3.2.

5.3.1. Väävelhape

Väävelhappe ülejääk tiitritakse kogumiskolvis naatriumhüdroksiidi lahusega (punkt 3.10 või 3.11), sõltuvalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt.

5.3.2. Boorhape

Kogumiskolvi sisu tiitritakse soolhappe standardse tiitrimislahusega (punkt 3.19) või väävelhappe standardse tiitrimislahusega (punkt 3.6), kasutades büretti, ning loetakse kokku kasutatud titrandi kogus.

Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, on lõpp-punkt saavutatud, kui ainesse ilmuvad esimesed roosa värvi jäljed. Büreti näitu hinnatakse 0,05 ml täpsusega. Lõpp-punkti nähtavust võib parandada valgustatud magnetseguri plaadi või valgusmõõturi abil.

Seda võib teha automaatselt, kasutades automaatselt tiitrivat veeaurdestillaatorit.

Eri destillaatori või destillaatori/titraatori kasutamisel järgitakse tootja kasutusjuhendeid.

Märkus:

kui kasutatakse automaatset tiitrimissüsteemi, algab tiitrimine vahetult pärast destilleerimise algust ja kasutatakse 1 % boorhappe lahust (punkt 3.18).

Kui kasutatakse täisautomaatset destilleerimisseadet, võib ammoniaagi automaatset tiitrimist läbi viia ka lõpp-punkti määramisega, kasutades potentsiomeetrilist pH-süsteemi.

Sel juhul kasutatakse pH mõõtjaga automaatset titraatorit. PH-meeter tuleb korralikult kalibreerida vahemikus pH 4 kuni pH 7, järgides tavapärast laboratoorset pH kalibreerimise protseduuri.

Tiitrimise pH lõpp-punkt saavutatakse pH 4,6 juures, mis on titreerimiskõvera kõige järsem punkt (murdepunkt).

5.4. Pimekatse

Et kontrollida, kas reaktiivid on lämmastikuvabad, viiakse läbi pimekatse (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine), kasutades proovi asemel 1 g sahharoosi (punkt 3.14).

6. Tulemuste arvutamine

Arvutused tehakse vastavalt punktile 6.1 või 6.2.

6.1. Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.1

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

V0	=	pimekatses kasutatud NaOH (punkt 3.10 või 3.11) maht (ml),
V1	=	proovi tiitrimisel kasutatud NaOH (punkt 3.10 või 3.11) maht (ml),
c	=	naatriumhüdroksiidi (punkt 3.10 või 3.11) kontsentratsioon (mol/l),
m	=	proovi mass (g).

6.2. Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.2

6.2.1. Tiitrimine soolhappega

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

m	=	kaalutise mass grammides,
c	=	soolhappe (punkt 3.19) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l),
V0	=	pimekatses kasutatud soolhappe maht (ml),
V1	=	kaalutises kasutatud soolhappe maht (ml).

6.2.2. Tiitrimine väävelhappega

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

m	=	kaalutise mass grammides,
c	=	väävelhappe (punkt 3.6) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l),
V0	=	pimekatses kasutatud väävelhappe (punkt 3.6) maht (ml),
V1	=	kaalutises kasutatud väävelhappe (punkt 3.6) maht (ml).

7. Meetodi kontrollimine

7.1. Korduvus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	absoluutväärtusena väljendatult 0,4 %, kui toorvalgusisaldus on väiksem kui 20 %.

—	2,0 % suuremast väärtusest, kui toorvalgusisaldus on 20–40 %;

—	absoluutväärtusena väljendatult 0,8 %, kui toorvalgusisaldus on suurem kui 40 %.

7.2. Korratavus

Sama prooviga eri laborites tehtud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	absoluutväärtusena väljendatult 1,8 %, kui toorvalgusisaldus on väiksem kui 20 %.

—	9,0 % suuremast väärtusest, kui toorvalgusisaldus on 20–40 %;

—	absoluutväärtusena väljendatult 3,6 %, kui toorvalgusisaldus on suurem kui 40 %.

7.3. Täpsus

Analüüs (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine) tehakse sobiva koguse (nt 0,2–0,3 g) atseetaniliidiga (punkt 3.13) 1 g sahharoosi (punkt 3.14) manulusel; 1 g atseetaniliidi tarbib 14,80 ml väävelhapet (punkt 3.5). Saagis peab olema vähemalt 99 %.

8. Tähelepanekud

8.1.

Seade võib olla manuaalset, poolautomaatset või automaatset tüüpi. Kui seade nõuab proovi ülekandmist lagundamise ja destilleerimise vahel, tuleb see ülekandmine teostada ilma kadudeta. Kui destillatsiooniaparaadi kolb ei ole varustatud tilklehtriga, lisatakse naatriumhüdroksiid vahetult enne kolvi ühendamist jahutiga, valades vedelikku aeglaselt mööda kolvi külge.

8.2.

Kui proov lagundamisel tahkestub, alustatakse määramist uuesti, kasutades punktis 5.1 näidatust suuremat väävelhappekogust (punkt 3.4).

8.3.

Väikese lämmastikusisaldusega toodete puhul võib kogumiskolbi viidava väävelhappe (punkt 3.7) mahtu vajadusel vähendada 10–15 ml-ni ja täiendada veega 25 ml-ni.

8.4.

Tavapäraste analüüside käigus võib toorvalgu määramiseks kasutada alternatiivseid analüüsimeetodeid, kuid standardmeetodiks on käesoleva lisa C osas kirjeldatud Kjeldahli meetod. Alternatiivmeetodi (nt DUMAS) abil saadud tulemuste samaväärsust standardmeetodiga võrreldes tuleb tõestada iga põhiaine kohta eraldi. Et alternatiivmeetodiga saadud tulemused võivad isegi pärast samaväärsuse kontrolli veidi erineda standardmeetodiga saadud tulemustest, tuleb analüüsiaruandes märkida, millist analüüsimeetodit on toorvalgu määramiseks kasutatud.

D. KARBAMIIDI MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata mäletsejaliste söödas lisandina kasutatava karbamiidi sisaldust.

2. Põhimõte

Proov suspendeeritakse vees selitava ainega. Suspensioon filtritakse. Filtraadi karbamiidisisaldus määratakse pärast 4-dimetüülaminobensaldehüüdi (punkt 4-DMAB) lisamist optilise tiheduse mõõtmise teel lainepikkusel 420 nm.

3. Reaktiivid

3.1.

4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahus: 1,6 g 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahustatakse 100 ml 96 % etanoolis ja lisatakse 10 ml soolhapet (ρ20 1,19 g/ml). See reaktiiv säilib maksimaalselt kaks nädalat.

3.2.

Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3COO)2·2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.3.

Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4Fe(CN)6·3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.4.

Karbamiidi mitte absorbeeriv aktiivsüsi (kontrollida).

3.5.

Karbamiidi 0,1 % lahus (w/v).

4. Seadmed

4.1.

Segisti (trummel): ligikaudu 35–40 p/min

4.2.

Lihvkorgiga katseklaasid: 160 × 16 mm.

4.3.

Spektrofotomeeter

5. Töö käik

5.1. Proovi analüüs

1 mg täpsusega kaalutud 2 g proovi pannakse 1 g aktiivsöega (punkt 3.4) 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett ja 5 ml Carrezi lahust I (punkt 3.2), segatakse umbes 30 sekundit ja lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (punkt 3.3). Segatakse trumlis kolmkümmend minutit. Täidetakse veega kuni märgini, loksutatakse ja filtritakse.

Eemaldatakse 5 ml läbipaistvat värvitut filtraati, pannakse see lihvkorgiga katseklaasidesse, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (punkt 3.1) ja segatakse. Katseklaasid asetatakse 20 °C (+/– 4 °C) veetemperatuuriga veevanni. Viieteistkümne minuti pärast mõõdetakse proovilahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga lainepikkusel 420 nm. Võrreldakse reaktiivide kontroll-lahustega.

5.2. Kalibreerimiskõver

Võetakse 1, 2, 4, 5 ja 10 ml kogused karbamiidilahust (punkt 3.5), pannakse 100 ml mõõtekolbidesse ja täidetakse veega kuni märgini. Igast lahusest võetakse ära 5 ml, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (punkt 3.1), homogeenitakse ja mõõdetakse eespool kirjeldatud viisil optiline tihedus võrrelduna kontroll-lahusega, mis sisaldab 5 ml 4-DMAB lahust ja 5 ml karbamiidivaba vett. Koostatakse kalibreerimiskõver.

6. Tulemuste arvutamine

Proovis sisalduv karbamiidikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.

Tulemust väljendatakse karbamiidisisaldusena milligrammides ühe kilogrammi proovi kohta.

7. Meetodi hindamine

7.1. Korduvus

Sama analüüsija poolt sama prooviga samas laboris tehtud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—

420 nm

—	50 % suuremast tulemusest karbamiidisisalduse vahemikus 3 000 mg/kg kuni alla 5 000 mg/kg;

—	25 % suuremast tulemusest karbamiidisisalduse vahemikus 5 000 mg/kg kuni alla 7 000 mg/kg;

—	20 % suuremast tulemusest, kui karbamiidisisaldus on üle 7 000 mg/kg;

—

435 nm

—	40 % suuremast tulemusest karbamiidisisalduse vahemikus 3 000 mg/kg kuni alla 5 000 mg/kg;

—	25 % suuremast tulemusest karbamiidisisalduse vahemikus 5 000 mg/kg kuni alla 9 000 mg/kg;

—	5 % suuremast tulemusest, kui karbamiidisisaldus on üle 9 000 mg/kg.

7.2. Korratavus

Sama prooviga eri laborites ja/või eri analüüsijate poolt tehtud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—

420 nm

—	3 000 mg/kg absoluutväärtusena karbamiidisisalduse vahemikus 3 000 mg/kg kuni alla 12 000 mg/kg;

—	4 500 mg/kg absoluutväärtusena, kui karbamiidisisaldus on üle 12 000 mg/kg.

—

435 nm

—	50 % suuremast tulemusest karbamiidisisalduse vahemikus 3 000 mg/kg kuni alla 8 000 mg/kg;

—	25 % suuremast tulemusest, kui karbamiidisisaldus on üle 8 000 mg/kg.

8. Võrdlusuuringu tulemused

Toimus ELi laboritevaheline võrdluskatse, millest võttis osa 18 laborit. Analüüsiti (üks analüüs) viit positiivset mäletsejaliste segasöödamaterjali proovi (tabelites 1 ja 2 tähistatud kui MAT) pimedate kordusproovidena ja üks kord üht võrdlussöödaks olevat mäletsejaliste segasööta.

Rahvusvaheliste suuniste kohaselt määratletud korduvuse (r) ja korratavuse (R) piirnormide arvutused tehti pärast võõrväärtuste väljajätmist, kasutades kehtivate väärtuste variatsioonanalüüsi.

Arvutatud analüütilise toimivuse näitajad (korduvus, korratavus) on esitatud järgmistes tabelites. Ükski analüüsitud proov, sh võrdlusmaterjal, ei olnud valepositiivne ega valenegatiivne.

Tabel 1

Analüütilise toimivuse näitajad karbamiidi puhul, mõõdetuna λ = 420 nm juures kõigis materjalides

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Lambad	Veised	Lambad	Lambad	Veised
Sihtmassiprotsent (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Keskmine massiprotsent (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Korratavuse standardhälve sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Korduvuse standardhälve sr (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Korratavuse suhteline standardhälve RSDR (%)	27	19	13	10	14
Korduvuse suhteline standardhälve RSDr (%)	17	9	7	7	6
Korratavuse piirnorm, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Korduvuse piirnorm, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Tabel 2

Analüütilise toimivuse näitajad karbamiidi puhul, mõõdetuna λ = 435 nm juures kõigis materjalides

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Lambad	Veised	Lambad	Lambad	Veised
Sihtmassiprotsent (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Keskmine massiprotsent (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Korratavuse standardhälve sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Korduvuse standardhälve sr (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Korratavuse suhteline standardhälve RSDR (%)	17	18	9	7	12
Korduvuse suhteline standardhälve RSDr (%)	14	10	8	2	1
Korratavuse piirnorm, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Korduvuse piirnorm, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9. Tähelepanekud

9.1.

Üle 3 % karbamiidisisalduse puhul vähendatakse proovi 1 grammini või lahjendatakse esialgset lahust, nii et 500 ml-s ei oleks karbamiidi üle 50 mg.

9.2.

Väikese karbamiidisisalduse puhul võetakse suurem proov, tingimusel et filtraat jääb läbipaistvaks ja värvituks.

9.3.

Eespool esitatud võrdlusuuringutulemused ei näita olulist täpsuse erinevust 420 nm või 435 nm juures mõõdetud karbamiidi puhul.

E. AMINOHAPETE (VÄLJA ARVATUD TRÜPTOFAAN) MÄÄRAMINE

Aminohapete (välja arvatud trüptofaan) määramiseks kasutatavad analüüsimeetodid on järgmised.

—	EN ISO 13903 Loomasööt – Aminohapete sisalduse määramine

—	EN ISO 17180 Loomasööt – Lüsiini, metioniini ja treoniini määramine kaubanduslikes aminohappetoodetes ja eelsegudes (4)

—	Analüüsimeetodit kirjeldatakse järgnevalt punktides 1–10.

1. Eesmärk ja kohaldamisala

See meetod võimaldab aminohappeanalüsaatoriga määrata vabade aminohapete (sünteetilisi ja looduslikke) sisaldust ning aminohapete (peptiidsidemetega ja vabade) üldsisaldust söödamaterjalis, segasöödas ja eelsegudes, mis sisaldavad iga aminohapet vähem kui 10 % (5). Meetodit saab kasutada järgmiste aminohapete puhul: tsüst(e)iin, metioniin, lüsiin, treoniin, alaniin, arginiin, asparagiinhape, glutamiinhape, glütsiin, histidiin, isoleutsiin, leutsiin, fenüülalaniin, proliin, seriin, türosiin ja valiin.

Meetod ei erista aminohapete eri sooli ega aminohapete D- ja L-vorme. See ei sobi trüptofaani ega aminohapete hüdroksüanaloogide määramiseks.

2. Põhimõte

2.1. Vabad aminohapped

Vabad aminohapped ekstraheeritakse lahjendatud soolhappega. Kaasa ekstraheerunud lämmastikku sisaldavad makromolekulid sadestatakse sulfosalitsüülhappega ning eemaldatakse filtrimise teel. Filtritud lahuse pH korrigeeritakse 2,20-le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetrilise määramise teel reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm.

2.2. Aminohapete üldsisaldus

Valitav protseduur sõltub uuritavatest aminohapetest. Tsüst(e)iin ja metioniin tuleb enne hüdrolüüsi oksüdeerida vastavalt tsüsteiinhappeks ja metioniinsulfooniks. Türosiin tuleb määrata oksüdeerimata proovide hüdrolüsaatides. Kõiki teisi punktis 1 (Eesmärk ja kohaldamisala) osutatud aminohappeid saab määrata kas oksüdeeritud või oksüdeerimata proovides.

Oksüdeerimine viiakse läbi persipelghappe ja fenooli seguga 0 °C juures. Ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse naatriumdisulfitiga. Oksüdeeritud või oksüdeerimata proovi hüdrolüüsitakse soolhappega (punkt 3.20) 23 tundi. Hüdrolüsaadi pH korrigeeritakse 2,20-le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetriliselt reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm (proliini puhul 440 nm).

3. Reaktiivid

Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS).

3.1.

Vesinikperoksiid, w (w/w) = 30 %

3.2.

Äädikhape, w (w/w) = 98-100 %

3.3.

Fenool

3.4.

Naatriumdisulfit

3.5.

Naatriumhüdroksiid

3.6.

5-sulfosalitsüülhappe dihüdraat

3.7.

Soolhape (tihedus umbes 1,18 g/ml)

3.8.

Trinaatriumtsitraadi dihüdraat

3.9.

2,2’- tiodietanool (tiodiglükool)

3.10.

Naatriumkloriid

3.11.

Ninhüdriin

3.12.

Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 °C

3.13.

Norleutsiin või muu sisestandardina kasutamiseks sobiv ühend

3.14.

Gaasiline lämmastik (< 10 ppm hapnikku)

3.15.

1-oktanool

3.16.

Aminohapped:

3.16.1.

Aminohapete standardained, mis on loetletud punktis 1 (Eesmärk ja kohaldamisala). Kristallisatsioonivett mitte sisaldavad puhtad ühendid. Kuivatakse vaakumis P2O5 või H2SO4 kohal ühe nädala jooksul enne kasutamist.

3.16.2.

Tsüsteiinhape

3.16.3.

Metioniinsulfoon

3.17.

Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 7,5 mol/l:

300 g NaOH (punkt 3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.18.

Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l:

40 g NaOH (punkt 3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.19.

Sipelghappe-fenoolilahus:

889 g sipelghapet (punkt 3.2) segatakse 111 g veega ja lisatakse 4,73 g fenooli (punkt 3.3).

3.20.

Hüdrolüüsisegu, c = 6 mol HCl/l, mis sisaldab 1 g fenooli/l:

1 g fenooli (punkt 3.3) lisatakse 492 ml HCl-le (punkt 3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.21.

Ekstraheerimissegu, c = 0,1 mol HCl/l, mis sisaldab 2 % tiodiglükooli. Võetakse 8,2 ml HCl (punkt 3.7), lahjendatakse umbes 900 ml veega, lisatakse 20 ml tiodiglükooli (punkt 3.9) ja täidetakse veega 1 liitrini (punkt 3.7 ja 3.9 mitte segada otse omavahel).

3.22.

5-sulfosalitsüülhape, ß = 6 %:

60 g 5-sulfosalitsüülhapet (punkt 3.6) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.23.

Oksüdatsioonisegu (persipelghape – fenool):

0,5 ml vesinikperoksiidi (punkt 3.1) segatakse 4,5 ml sipelghappe ja fenooli lahusega (punkt 3.19) väikses keeduklaasis. Inkubeeritakse 20–30 °C juures ühe tunni jooksul, et moodustuks persipelghape, seejärel jahutatakse jääveevanni kohal (15 min) enne proovile lisamist.

Ettevaatust: vältida kokkupuudet nahaga ja kanda kaitserõivaid.

3.24.

Tsitraatpuhver, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20:

19,61 g naatriumtsitraati (punkt 3.8), 5 ml tiodiglükooli (punkt 3.9), 1 g fenooli (punkt 3.3) ja 16,50 ml HCl (punkt 3.7) lahustatakse umbes 800 ml vees. pH korrigeeritakse 2,20-le. Täidetakse veega 1 liitrini.

3.25.

Elutsioonipuhvrid, mis on valmistatud vastavalt kasutatud analüsaatori tingimustele (punkt 4.9).

3.26.

Ninhüdriini reaktiiv, mis on valmistatud vastavalt kasutatud analüsaatori tingimustele (punkt 4.9).

3.27.

Aminohapete standardlahused. Neid lahuseid tuleks hoida temperatuuril alla 5 °C.

3.27.1.

Aminohapete põhistandardlahus (punkt 3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml iga lahuse kohta soolhappes.

On võimalik osta.

3.27.2.

Tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni põhistandardlahus, c = 1,25 μmol/ml.

0,2115 g tsüsteiinhapet (punkt 3.16.2) ja 0,2265 g metioniinsulfooni (punkt 3.16.3) lahustatakse tsitraatpuhvris (punkt 3.24) 1 l mõõtekolbis ning täidetakse kolb tsitraatpuhvriga märgini. Säilitatakse temperatuuril alla 5 °C mitte üle 12 kuu. Seda lahust ei kasutata, kui põhistandardlahus (punkt 3.27.1) sisaldab tsüsteiinhapet ja metioniinsulfooni.

3.27.3.

Sisestandardi põhistandardlahus, nt norleutsiin, c = 20 μmol/ml.

0,6560 g norleutsiini (punkt 3.13) lahustatakse tsitraatpuhvris (punkt 3.24) mõõtekolbis ning kolb täidetakse tsitraatpuhvriga 250 ml-ni. Säilitatakse temperatuuril alla 5 °C mitte üle 6 kuu.

3.27.4.

Standardaminohapete kalibreerimislahus, mis on mõeldud kasutamiseks hüdrolüsaatidega, tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni c = 5 nmol/50 μl ja teiste aminohapete c = 10 nmol/50 μl. 2,2 g naatriumkloriidi (punkt 3.10) lahustatakse 100 ml keeduklaasis 30 ml tsitraatpuhvriga (punkt 3.24). Lisatakse 4,00 ml aminohapete põhistandardlahust (punkt 3.27.1), 4,00 ml tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni põhistandardlahust (punkt 3.27.2) ja 0,50 ml sisestandardi põhistandardlahust (punkt 3.27.3), kui seda kasutatakse. Naatriumhüdroksiidi (punkt 3.18) abil korrigeeritakse pH 2,20-le.

Kallatakse kvantitatiivselt 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse tsitraatpuhvriga (punkt 3.24) kuni märgini ja segatakse.

Säilitatakse temperatuuril alla 5 °C mitte üle 3 kuu.

Vaata ka punkti 9.1 tähelepanekuid.

3.27.5.

Standardaminohapete kalibreerimislahus, mis on mõeldud kasutamiseks vastavalt punktile 5.3.3.1 valmistatud hüdrolüsaatidega ja ekstraktidega (punkt 5.2). Kalibreerimislahus valmistatakse vastavalt punktile 3.27.4, jättes välja naatriumkloriidi.

Säilitatakse temperatuuril alla 5 °C mitte üle 3 kuu.

4. Seadmed

4.1.

Püstjahutiga varustatud 100 või 250 ml ümarkolb

4.2.

100 ml boorsilikaatklaasist pudel kummist/teflonist tihendiga keermestatud korgiga (nt Duran, Schott) kuivatuskapis kasutamiseks

4.3.

Sundventilatsiooniga ja termoregulaatoriga kuivatuskapp, mille täpsus on parem kui ± 2 °C.

4.4.

pH-meeter (kolme kümnendkoha täpsusega)

4.5.

Membraanfilter (0,22 μm)

4.6.

Tsentrifuug.

4.7.

Vaakumrotaatoraurusti

4.8.

Mehaaniline loksuti või magnetsegur

4.9.

Aminohappe analüsaator või HPLC-seade ioonvahetuskolonni, ninhüdriini kolonnijärgse derivatiseerimise seadme ja valgusmõõturiga.

Kolonn täidetakse sulfoneeritud polüstüreenvaikudega, mis on võimelised eraldama aminohappeid üksteisest ja teistest ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Puhvri ja ninhüdriini jadas tekitatakse vool pumpadega, mille vooluühtlus on ± 0,5 % nii standardkalibreerimise kui proovi analüüsi ajal.

Mõnede aminohapete analüsaatoritega võib kasutada hüdrolüüsimenetlusi, mille puhul on hüdrolüsaadi naatriumikontsentratsioon c = 0,8 mol/l ja mis sisaldab oksüdatsioonietapi kõiki sipelghappe jääke. Teised analüsaatorid ei võimalda teatavaid aminohappeid rahuldaval määral eraldada, kui hüdrolüsaat sisaldab liigselt sipelghapet ja/või kui naatriumioonide kontsentratsioon on kõrge. Sellisel juhul vähendatakse pärast hüdrolüüsi ja enne pH korrigeerimist happe mahtu aurustamisega kuni umbes 5 milliliitrini. Aurustamine peab toimuma vaakumitingimustes temperatuuril kuni 40 °C.

5. Töö käik

5.1. Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 °C või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (punkt 3.12).

5.2. Vabade aminohapete määramine

Ettevalmistatud proovi (punkt 5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 0,2 mg täpsusega koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml ekstraheerimissegu (punkt 3.21). Segu raputatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (punkt 4.8). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle 100 ml keeduklaasi.

Lisatakse loksutades 5,0 ml sulfosalitsüülhappe lahust (punkt 3.22) ning jätkatakse loksutamist 5 min vältel, kasutades magnetsegurit. Supernatant filtritakse või tsentrifuugitakse sademe eemaldamiseks. 10,0 ml saadud lahust pannakse 100 ml keeduklaasi ja korrigeeritakse pH-taset 2,20-ni, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (punkt 3.18), sobiv kogus valatakse tsitraatpuhvri (punkt 3.24) abil mõõtekolbi ja kolb täidetakse puhverlahusega (punkt 3.24) kuni märgini.

Kui kasutatakse sisestandardit, lisatakse 1,00 ml sisestandardit (punkt 3.27.3) igasse 100 ml valmis lahusesse ja täidetakse puhverlahusega (punkt 3.24) kuni märgini.

Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Kui ekstrakte ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 °C.

5.3. Aminohapete üldsisalduse määramine

5.3.1. Oksüdeerimine

0,2 mg täpsusega kaalutakse 0,1–1 g ettevalmistatud proovi (punkt 5.1):

—	100 ml ümarkolbi (punkt 4.1) lahtise hüdrolüüsi (punkt 5.3.2.3) puhul või

—	250 ml ümarkolbi (punkt 4.1), kui on nõutav madal naatriumikontsentratsioon (punkt 5.3.3.1), või

—	100 ml keermestatud korgiga pudelisse (punkt 4.2) (suletud hüdrolüüsi, punkt 5.3.2.4 puhul).

Kaalutud proovi lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg ja niiskusesisaldus kuni 100 mg.

Kolb/pudel asetatakse jääveevanni ja jahutatakse kuni temperatuurini 0 °C, lisatakse 5 ml oksüdatsioonisegu (punkt 3.23) ning segatakse painutatud otsaga klaasspaatli abil. Spaatlit sisaldav kolb/pudel pitseeritakse õhukindla kilega, pitseeritud nõud sisaldav jääveevann asetatakse 16 tunniks külmikusse temperatuuril 0 °C. 16 tunni möödudes võetakse see külmikust välja ja ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse, lisades 0,84 g naatriumdisulfitit (punkt 3.4).

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.1.

5.3.2. Hüdrolüüs

5.3.2.1.

Oksüdeeritud proovide hüdrolüüs

Vastavalt punktile 5.3.1 valmistatud oksüdeeritud proovile lisatakse 25 ml hüdrolüüsisegu (punkt 3.20), pestes hoolikalt maha anuma ja spaatli külge kleepunud proovijäägid.

Olenevalt sellest, millist hüdrolüüsimenetlust kasutatakse, jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.

5.3.2.2.

Oksüdeerimata proovide hüdrolüüs

100 ml või 250 ml ümarkolbi (punkt 4.1) või 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (punkt 4.2) kaalutakse 0,2 mg täpsusega 0,1–1 g ettevalmistatud proovi (punkt 5.1). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse hoolikalt 25 ml hüdrolüüsisegu (punkt 3.20) ja segatakse prooviga. Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Lahtine hüdrolüüs

Kolbis olevale segule (mis on valmistatud vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2) lisatakse 3 klaashelmest ja keedetakse püstjahutiga kolvis 23 tundi pideval mullidega keemisel. Pärast hüdrolüüsi teostamist pestakse jahuti maha 5 ml tsitraatpuhvriga (punkt 3.24). Kolb võetakse lahti ja jahutatakse jäävannis.

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.

5.3.2.4.

Kinnine hüdrolüüs

Vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2 valmistatud segu sisaldav pudel asetatakse kuivatuskappi (punkt 4.3) temperatuuril 110 °C. Et vältida rõhu suurenemist (gaasiliste ainete tekkimise tõttu) ja ära hoida plahvatust, asetatakse esimeseks tunniks surveanuma peale keermestatud kork. Surveanumat ei tohi korgiga sulgeda. Ühe tunni möödudes suletakse surveanum korgiga ja jäetakse 23 tunniks kuivatuskappi (punkt 4.3). Pärast hüdrolüüsi lõpuleviimist võetakse pudel kuivatuskapist välja, avatakse ettevaatlikult pudelikork ja asetatakse pudel jääveevanni. Jahutatakse.

Olenevalt sellest, millist pH korrigeerimise menetlust (punkt 5.3.3) kasutatakse, valatakse pudeli sisu kvantitatiivselt 250 ml keeduklaasi või 250 ml ümarkolbi, kasutades tsitraatpuhvrit (punkt 3.24).

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.

5.3.3. pH korrigeerimine

Olenevalt aminohappe analüsaatori (punkt 4.9) naatriumitaluvusest toimitakse pH korrigeerimisel vastavalt punktile 5.3.3.1 või 5.3.3.2.

5.3.3.1.

Kromatograafilised süsteemid (punkt 4.9), mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus.

Soovitatav on kasutada sisestandardi põhistandardlahust (punkt 3.27.3), juhul kui kasutatakse aminohappe analüsaatorit, mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus (kui happe kogust tuleb vähendada).

Sellisel juhul lisatakse enne aurustamist hüdrolüsaadile 2,00 ml sisestandardi põhistandardlahust (punkt 3.27.3).

Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadile lisatakse 2 tilka 1-oktanooli (punkt 3.15).

Hüdrolüsaadi kogust vähendatakse vaakumrotaatoraurusti (punkt 4.7) abil 5–10 milliliitrini vaakumitingimustes temperatuuril 40 °C. Kui kogust vähendatakse kogemata vähem kui 5 milliliitrini, tuleb hüdrolüsaat välja praakida ja analüüsi tuleb uuesti alustada.

pH-taset korrigeeritakse 2,20-ni naatriumhüdroksiidi lahusega (punkt 3.18) ja jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.

5.3.3.2.

Kõik teised aminohappe analüsaatorid (punkt 4.9)

Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadid neutraliseeritakse osaliselt, lisades hoolikalt loksutades 17 ml naatriumhüdroksiidi lahust (punkt 3.17), jälgides, et temperatuur püsiks allpool 40 °C.

pH korrigeeritakse 2,20-ni toatemperatuuril, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (punkt 3.17) ja lõpuks naatriumhüdroksiidi lahust (punkt 3.18). Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.

5.3.4. Proovilahus kromatograafia jaoks

Korrigeeritud pH-tasemega hüdrolüsaat (punkt 5.3.3.1 või 5.3.3.2) kallatakse kvantitatiivselt koos tsitraatpuhvriga (punkt 3.24) 200 ml mõõtekolbi ja täidetakse puhvriga (punkt 3.24) märgini.

Kui sisestandardit ei ole veel kasutatud, lisatakse 2,00 ml sisestandardit (punkt 3.27.3) ja täidetakse tsitraatpuhvriga (punkt 3.24) märgini. Segatakse hoolikalt.

Seejärel alustatakse kromotograafiat (punkt 5.4).

Kui proovilahuseid ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 °C.

5.4. Kromatograafia

Enne kromotograafiat viiakse ekstrakt (punkt 5.2) või hüdrolüsaat (punkt 5.3.4) toatemperatuurile. Segu loksutatakse ja filtritakse sobiv kogus läbi 0,22 μm membraanfiltri (punkt 4.5). Saadud selge lahusega tehakse ioonvahetuskromatograafia, kasutades aminohappe analüsaatorit (punkt 4.9).

Sissesüstimist võib teostada käsitsi või automaatselt. On oluline, et standardite ja proovide analüüsiks lisataks kolonni sama kogus lahust ± 0,5 %, välja arvatud sisestandardi kasutamisel, ning et naatriumi ja aminohapete vahekord standard- ja proovilahustes oleks võimalikult sarnane.

Üldiselt sõltub kalibreerimiskatsete sagedus ninhüdriini reaktiivi stabiilsusest ja analüütilisest süsteemist. Standard või proov lahjendatakse tsitraapuhvriga (punkt 3.24), et saavutada standardi piigipindalaks 30–200 % proovi aminohappe piigipindalast.

Aminohapete kromatograafia varieerub kergelt vastavalt sellele, millist tüüpi analüsaatorit ja millist vaiku kasutatakse. Valitud süsteem peab suutma eraldada aminohapped üksteisest ja ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma lineaarselt kolonni lisatud aminohapete muutustest.

Kromatograafia etapil kehtivad (määratavate aminohapete) ekvimolaarlahuse analüüsimisel allpool esitatud miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekorrad. Ekvimolaarlahus peab sisaldama vähemalt 30 % iga aminohappe maksimumkogusest, mida on võimalik täpselt mõõta aminohappe analüüsisüsteemi (punkt 4.9) abil.

Treoniini-seriini eraldamiseks ei tohi kahest kattuvast aminohappest madalama aminohappe miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekord kromatogrammil ületada suhet 2:10 (kui määratakse vaid tsüst(e)iini, metioniini, treoniini ja lüsiini, kahjustab nende määramist ebapiisav eraldamine külgnevatest piikidest.). Kõigi teiste aminohapete puhul peab eraldatus olema parem kui suhe 1:10.

Süsteem peab tagama lüsiini eraldamise „lüsiini artefaktidest“ ja ornitiinist.

6. Tulemuste arvutamine

Proovi ja standardi piikide pindala mõõdetakse iga üksiku aminohappe kohta ning arvutatakse kogus (X) ühes grammis aminohappes proovi kilo kohta.

Kui kasutatakse sisestandardit, korrutatakse tulemus liikmega

A	=	piigipindala, hüdrolüsaat või ekstrakt
B	=	piigipindala, kalibreerimisstandardlahus
C	=	piigipindala, sisestandard hüdrolüsaadis või ekstraktis
D	=	piigipindala, sisestandard, kalibreerimisstandardlahus
M	=	määratava aminohappe molaarmass
c	=	standardi kontsentratsioon μmol/ml
m	=	proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud)
V	=	hüdrolüsaat (punkt 5.3.4) kokku milliliitrites või ekstrakti (punkt 6.1) lahjenduse koguruumala milliliitrites

Tsüstiin ja tsüsteiin määratakse mõlemad tsüsteiinhappena oksüdeeritud proovide hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse tsüstiiniks (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), kasutades M väärtust 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metioniin määratakse metioniinsulfoonina oksüdeeritud proovi hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse metioniinina, kasutades metioniini M väärtust: 149,21 g/mol.

Lisatud vaba metioniin määratakse pärast ekstraheerimist metioniinina, arvutamisel kasutatakse sama M väärtust.

6.1.

Ekstraktide lahjenduse koguruumala (F) vabade aminohapete (punkt 5.2) määramiseks arvutatakse järgmiselt:

lõppekstrakti ruumala

7. Meetodi hindamine

Meetodit on katsetatud rahvusvahelises võrdlusuuringus 1990. aastal, kasutades nelja erinevat sööta (sigade segasööt, broilerite segasööt, valgukontsentraat, eelsegu).

Märkus:

Meetodit katsetati teise rahvusvahelise võrdlusuuringu käigus 2003. aastal, kasutades broilerite lõppfaasi sööda, broilerite algfaasi sööda, maisi, kalajahu ja kodulindude tapajäätmejahu pimedaid kordusproove. Üksikasjalik teave standardis EN ISO 13903.

1990. aasta võrdlusuuringu tulemuste keskväärtused ja standardhälbed pärast võõrväärtuste elimineerimist on esitatud käesoleva punkti tabelis.

Keskväärtused g/kg

Viide Materjal

Aminohape

Treoniin

Tsüst(e)iin

Metioniin

Lüsiin

Sigade segasööt

6,94

n = 15

3,01

n = 17

3,27

n = 17

9,55

n = 13

Broilerite segasööt

9,31

n = 16

3,92

n = 18

5,08

n = 18

13,93

n = 16

Valgukontsentraat

22,32

n = 16

5,06

n = 17

12,01

n = 17

47,74

n = 15

Eelsegu

58,42

n = 16

—

90,21

n = 16

98,03

n = 16

n = osalenud laborite arv

7.1. Korduvus

Eelmises tabelis esitatud võrdluskatse korduvus on väljendatud laborisisese standardhälbena ja esitatud järgmistes tabelites: n = osalenud laborite arv

Korduvuse variatsioonikordaja (CVr)(%)

Viide Materjal

Aminohape

Treoniin

Tsüst(e)iin

Metioniin

Lüsiin

Sigade segasööt

1,9

n = 15

3,3

n = 17

3,4

n = 17

2,8

n = 13

Broilerite segasööt

2,1

n = 16

2,8

n = 18

3,1

n = 18

2,1

n = 16

Valgukontsentraat

2,7

n = 16

2,6

n = 17

2,2

n = 17

2,4

n = 15

Eelsegu

2,2

n = 16

—

2,4

n = 16

2,1

n = 16

n = osalenud laborite arv

7.2. Korratavus

Eespool nimetatud võrdluskatse laboritevahelise standardhälbe tulemused on esitatud järgmises tabelis:

Korratavuse variatsioonikordaja (CVR)(%)

Viide Materjal

Aminohape

Treoniin

Tsüst(e)iin

Metioniin

Lüsiin

Sigade segasööt

4,1

n = 15

9,9

n = 17

7,0

n = 17

3,2

n = 13

Broilerite segasööt

5,2

n = 16

8,8

n = 18

10,9

n = 18

5,4

n = 16

Valgukontsentraat

3,8

n = 16

12,3

n = 17

13,0

n = 17

3,0

n = 15

Eelsegu

4,3

n = 16

–

6,9

n = 16

6,7

n = 16

n = osalenud laborite arv

8. Etalonainete kasutamine

Meetodi õige rakendamise kontrollimiseks tehakse korduvaid mõõtmisi sertifitseeritud etalonainetega, kui need ained on kättesaadavad. Soovitatav on kalibreerida aminohapete sertifitseeritud kalibreerimislahusega.

9. Tähelepanekud

9.1.

Aminohappeanalüsaatorite erinevustest tingituna tuleb standardaminohapete kalibreerimislahuste (vt punktid 3.27.4 ja 3.27.5) ja hüdrolüsaadi (vt punkt 5.3.4) lõppkontsentratsioone vaadelda suunistena.

Kõigi aminohapete puhul tuleb kontrollida aparatuuri lineaarse ala vahemikku.

Standardlahus lahjendatakse tsitraatpuhvriga, et piigialad oleksid vahemiku keskel.

9.2.

Kui hüdrolüsaatide analüüsiks kasutatakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia aparatuuri, tuleb katsetingimused optimeerida vastavalt tootja soovitustele.

9.3.

Meetodi rakendamisel segasööda või eelsegude suhtes, mille kloriidisisaldus on suurem kui 1 % (kontsentraadid, mineraalsöödad, täiendsöödad), võib analüüs näidata tegelikust väiksemat metioniinisisaldust ning tuleb kasutada eritöötlust.

10. Tulemuslikkuse näitajad

Kahest võrdlusuuringust (eespool punktis 7 esitatud 1990. aasta uuring ning standardis EN/ISO 13903 esitatud 2005. aasta uuring) saadud tulemuste (v.a türosiini kohta) koondamine annab järgmised korduvuse ja korratavuse kriteeriumid. Need kahest laboritevahelisest katsest saadud väärtused ei pruugi olla kohaldatavad muude kui esitatud kontsentratsioonivahemike ja maatriksite suhtes.

10.1. Korduvus

Sama analüüsija poolt sama prooviga samas laboris tehtud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	6 % suuremast väärtusest aminohapete üldsisalduse puhul, kui tegemist on glütsiini, alaniini, lüsiini, proliini, glutaamhappe, isoleutsiini ja histidiiniga;

—	8 % suuremast väärtusest aminohapete üldsisalduse puhul, kui tegemist on treoniini, fenüülalaniini, metioniini, asparagiinhappe ja leutsiiniga;

—	10 % suuremast väärtusest aminohapete üldsisalduse puhul, kui tegemist on arginiini ja valiiniga;

—	12 % suuremast väärtusest aminohappe seriini üldsisalduse puhul;

—	15 % suuremast väärtusest aminohappe tsüst(e)iini üldsisalduse puhul.

10.2. Korratavus

Sama prooviga eri laborites ja/või eri analüüsijate poolt tehtud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	15 % suuremast väärtusest aminohapete üldsisalduse puhul, kui tegemist on glütsiini, alaniini ja treoniiniga;

—	20 % suuremast väärtusest aminohapete üldsisalduse puhul, kui tegemist on lüsiini, proliini, fenüülalaniini, metioniini ja asparagiinhappega;

—	22 % suuremast väärtusest aminohapete üldsisalduse puhul, kui tegemist on glutaamhappe ja leutsiiniga;

—	27 % suuremast väärtusest aminohappe arginiini üldsisalduse puhul;

—	32 % suuremast väärtusest aminohappe isoleutsiini üldsisalduse puhul;

—	35 % suuremast väärtusest aminohapete üldsisalduse puhul, kui tegemist on valiini ja seriiniga;

—	40 % suuremast väärtusest aminohappe histidiini üldsisalduse puhul;

—	50 % suuremast väärtusest aminohappe tsüst(e)iini üldsisalduse puhul.

F. TRÜPTOFAANI MÄÄRAMINE

Trüptofaani määramiseks kasutatavad analüüsimeetodid on järgmised.

—	EN ISO 13904 Loomasööt – Trüptofaanisisalduse määramine

—	Analüüsimeetodit kirjeldatakse järgnevalt punktides 1–9.

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata trüptofaani üldsisaldust ja vaba trüptofaani sisaldust söödas. Meetod ei erista D- ja L-vormi.

2. Põhimõte

Trüptofaani üldsisalduse määramiseks hüdrolüüsitakse proovi leeliselises keskkonnas küllastunud baariumhüdroksiidi lahusega ja kuumutatakse 110 °C juures 20 tundi. Pärast hüdrolüüsimist lisatakse sisestandard.

Vaba trüptofaani määramiseks ekstraheeritakse proovi nõrgalt happelistes tingimustes sisestandardi juuresolekul.

Trüptofaan ja sisestandard määratakse hüdrolüsaadis või ekstraktis HPLC-ga fluorestsentsdetektori abil.

3. Reaktiivid

3.1.

Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS/cm).

3.2.

Standardaine: trüptofaan (puhtus/sisaldus ≥ 99 %), mis on kuivatatud vaakumis fosforpentoksiidi kohal.

3.3.

Sisestandardaine: α-metüültrüptofaan (puhtus/sisaldus ≥ 99 %), mis on kuivatatud vaakumis fosforpentoksiidi kohal.

3.4.

Baariumhüdroksiidi oktahüdraat (vältida Ba(OH)2.8 H2O ülemäärast kontakti õhuga, kuna see võib viia BaCO3 moodustumiseni, mis võib määramist segada) (vt tähelepanek, punkt 9.3).

3.5.

Naatriumhüdroksiid

3.6.

Ortofosforhape, w (w/w) = 85 %

3.7.

Soolhape, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8.

HPLC-puhtusastmega metanool

3.9.

Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 °C

3.10.

Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l

40,0 g NaOH (punkt 3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega (punkt 3.1) 1 liitrini.

3.11.

Soolhape, c = 6 mol/l

Võetakse 492 ml HCl (punkt 3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.12.

Soolhape, c = 1 mol/l

Võetakse 82 ml HCl (punkt 3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.13.

Soolhape, c = 0,1 mol/l

Võetakse 8,2 ml HCl (punkt 3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.14.

Ortofosforhape, c = 0,5 mol/l:

Võetakse 34 ml ortofosforhapet (punkt 3.6) ja täidetakse veega (punkt 3.1) 1 liitrini.

3.15.

Trüptofaani (punkt 3.2) kontsentreeritud lahus, c = 2,50 μmol/ml:

500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2553 g trüptofaani (punkt 3.2) soolhappes (punkt 3.13) ja täidetakse soolhappega (punkt 3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 °C kuni neli nädalat.

3.16.

Sisestandardi kontsentreeritud lahus, c = 2,50 μmol/ml:

500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2728 g α-metüültrüptofaani (punkt 3.3) soolhappes (punkt 3.13) ja täidetakse soolhappega (punkt 3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 °C kuni neli nädalat.

3.17.

Trüptofaani ja sisestandardi kalibreerimisstandardlahus:

Võetakse 2,00 ml trüptofaani kontsentreeritud lahust (punkt 3.15) ja 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (punkt 3.16). Lahjendatakse veega (punkt 3.1) ja metanooliga (punkt 3.8) umbes sama ruumalani ja umbes sama metanooli kontsentratsioonini (10–30 %), nagu on valmis hüdrolüsaadil.

Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

Valmistamise ajal vältida otsest päikesevalgust.

3.18.

Äädikhape

3.19.

1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanool

3.20.

Etanoolamiin w (w/w) > 98 %

3.21.

1 grammi 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (punkt 3.19) lahus 100 ml metanoolis (punkt 3.8).

3.22.

HPLC liikuv faas: 3,00 g äädikhapet (punkt 3.18) + 900 ml vett (punkt 3.1) + 50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (punkt 3.19) lahust (punkt 3.21) 1 g/100 ml metanoolis (punkt 3.8). Etanoolamiini (punkt 3.20) abil korrigeeritakse pH 5,00-le. Täidetakse veega (punkt 3.1) 1 000 ml-ni.

4. Seadmed

4.1.

HPLC-seadmed spektrofluorimeetrilise detektoriga

4.2.

Vedelikkromatograafia kolonn, 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm, või samaväärne

4.3.

pH-meeter

4.4.

Laia kaela ja keeratava korgiga polüpropüleenkolb, maht 125 ml

4.5.

Membraanfilter, 0,45 μm

4.6.

Autoklaav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar

4.7.

Mehaaniline loksuti või magnetsegur

4.8.

Pöörissegaja

5. Töö käik

5.1. Proovide ettevalmistamine

5.2. Vaba trüptofaani määramine (ekstrakt)

Ettevalmistatud proovi (punkt 5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml soolhapet (punkt 3.13) ja 5,00 ml kontsentreeritud sisestandardlahust (punkt 3.16). Raputatakse või segatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (punkt 4.7). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle keeduklaasi. Lisatakse 5 ml ortofosforhapet (punkt 3.14). Naatriumhüdroksiidi (punkt 3.10) abil korrigeeritakse pH 3-le. Lisatakse piisavalt metanooli (punkt 3.8), et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 protsendini. Lahus viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kuni kromatograafiaks sobiva koguseni (umbes sama kogus kui kalibreerimisstandardlahusel (punkt 3.17)).

Enne HPLC-kolonni süstimist filtritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (punkt 4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Standardlahust ja ekstrakte tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui ekstrakte ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 °C kuni kolm päeva.

5.3. Trüptofaani üldsisalduse määramine (hüdrolüsaat).

0,1–1 g ettevalmistatud proovi (punkt 5.1) kaalutakse 0,2 mg täpsusega polüropüleenkolbi (punkt 4.4). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse 8,4 g baariumhüdroksiidi oktahüdraati (punkt 3.4) ja 10 ml vett. Segatakse pöörissegajaga (punkt 4.8) või magnetseguriga (punkt 4.7). Tefloniga kaetud magnet jäetakse segusse. Nõu seinad loputatakse üle 4 ml veega. Keeratav kork pannakse peale ja kolb suletakse lõdvalt. Kolb pannakse keeva veega autoklaavi (punkt 4.6) ja kuumutatakse aurus 30–60 minutit. Autoklaav suletakse ja kuumutatakse 20 tundi 110 (± 2) °C juures.

Enne autoklaavi avamist langetatakse temperatuur natuke alla 100 °C kraadi. Ba(OH)2.8 H2O kristalliseerumise vältimiseks lisatakse soojale segule 30 ml toatemperatuuril olevat vett. Raputatakse või segatakse kergelt. Lisatakse 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (punkt 3.16). Nõusid jahutatakse vee-/jäävannis 15 minutit.

Seejärel lisatakse 5 ml ortofosforhapet (punkt 3.14). Nõu hoitakse jahutusvannis ja neutraliseeritakse segamisel HCl-iga (punkt 3.11) ning pH korrigeeritakse 3,0-ni HCl (punkt 3.12) abil. Lisatakse piisavalt metanooli, et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 %ni. Viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kindla, kromatograafiaks sobiva ruumalani (näiteks 100 ml). Metanooli lisamine ei tohi tekitada sadenemist.

Enne HPLC-kolonni süstimist filtritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (punkt 4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Standardlahust ja hüdrolüsaate tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui hüdrolüsaate ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 °C kuni kolm päeva.

5.4. HPLC määramine

Soovitatakse juhinduda järgmistest isokraatilise elueerimise tingimustest. Muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused (vt ka tähelepanekute punkte 9.1 ja 9.2):

Vedelikkromatograafia kolonn või kolonn (punkt 4.2):	125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm samaväärne
Kolonni temperatuur:	Ruumitemperatuur
Liikuv faas (punkt 3.22):	3,00 g äädikhapet (punkt 3.18) + 900 ml vett (punkt 3.1) + 50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (punkt 3.19) lahust (punkt 3.21) 1 g/100 ml metanoolis (punkt 3.8). Etanoolamiini (punkt 3.20) abil korrigeeritakse pH 5,00-le. Täidetakse veega (punkt 3.1) 1 000 ml-ni.
Voolukiirus:	1 ml/min
Summaarne voolutamisaeg:	umbes 34 min
Avastamise lainepikkus:	ergastamine: 280 nm, emissioon: 356 nm.
Sissesüstitav ruumala	20 μl

6. Tulemuste arvutamine

Arvutatakse trüptofaani (X) kogus grammides 100 g proovi kohta.

A	=	sisestandardi piipindala, kalibreerimisstandardlahus (punkt 3.17)
B	=	trüptofaani piigipindala, ekstrakt (punkt 5.2) või hüdrolüsaat (punkt 5.3)
V1	=	kalibreerimislahusele (punkt 3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (punkt 3.15) kogus milliliitrites (2 ml)
c	=	kalibreerimislahusele (punkt 3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (punkt 3.15) kontsentratsioon, μmol/ml (= 2,50)
V2	=	kontsentreeritud sisestandardlahuse (punkt 3.16) kogus milliliitrites, mis on lisatud ekstraheerimisel (punkt 5.2) (= 5,00 ml) või hüdrolüsaadile (punkt 5.3) (= 2,00 ml)
C	=	sisestandardi piigipindala, ekstrakt (punkt 5.2) või hüdrolüsaat (punkt 5.3)
D	=	trüptofaani piigipindala, kalibreerimisstandardlahus (punkt 3.17)
V3	=	kalibreerimisstandardlahusele (punkt 3.17) lisatud kontsentreeritud sisestandardlahuse (punkt 3.16) kogus milliliitrites (= 2,00 ml)
m	=	proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud)
M	=	trüptofaani molaarmass (= 204,23 g/mol)

7. Korduvus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10 % suuremast tulemusest.

8. Võrdlusuuringu tulemused

Korraldati liidusisene võrdlusuuring (neljas võrdlusuuring), mille käigus kuni 12 laborit analüüsisid hüdrolüüsimeetodi sertifitseerimiseks kolme proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (punkt 5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

Proov 1

Seasööt

Proov 2

L-trüptofaaniga rikastatud seasööt

Proov 3

Seasöödakontsentraat

Keskväärtus g/kg

2,42

3,40

4,22

sr [g/kg]

0,05

0,08

r [g/kg]

0,14

0,22

CVr [%]

1,9

1,6

1,9

SR [g/kg]

0,15

0,20

0,09

R [g/kg]

0,42

0,56

0,25

CVR [%]

6,3

6,0

2,2

L =	tulemused esitanud laborite arv

n =	üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr =	korduvust iseloomustav standardhälve

SR =	korratavust iseloomustav standardhälve

r =

korduvus

R =	korratavus

CVr =

korduvuse variatsioonikordaja, %

CVR =

korratavuse variatsioonikordaja, %

Teise liidusisese võrdlusuuringu (kolmanda võrdlusuuringu) käigus analüüsisid kuni 13 laborit vaba trüptofaani ekstraheerimise meetodi sertifitseerimiseks kahte proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (punkt 5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

Proov 4

Nisu ja soja segu

Proov 5

Nisu ja soja segu (= proov 4), millele on lisatud trüptofaani (0,457 g/kg)

Keskväärtus g/kg

0,391

0,931

sr [g/kg]

0,005

0,012

r [g/kg]

0,014

0,034

CVr [%]

1,34

SR [g/kg]

0,018

0,048

R [g/kg]

0,050

0,134

CVR [%]

4,71

5,11

L =	tulemused esitanud laborite arv

n =	üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr =	korduvust iseloomustav standardhälve

SR =	korratavust iseloomustav standardhälve

r =

korduvus

R =	korratavus

CVr =

korduvuse variatsioonikordaja, %

CVR =

korratavuse variatsioonikordaja, %

Veel ühe liidusisese võrdlusuuringu käigus analüüsisid kuni seitse laborit trüptofaani hüdrolüüsi sertifitseerimise eesmärgiga nelja proovi. Tulemused on esitatud allpool. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (punkt 5).

Proov 1

Sigade segasööt (CRM 117)

Proov 2

Väikese rasvasisaldusega kalajahu

(CRM 118)

Proov 3

Sojajahu

(CRM 119)

Proov 4

Lõssipulber

(CRM 120)

Keskväärtus g/kg

2,064

8,801

6,882

5,236

sr [g/kg]

0,021

0,101

0,089

0,040

r [g/kg]

0,059

0,283

0,249

0,112

CVr [%]

1,04

1,15

1,30

0,76

SR [g/kg]

0,031

0,413

0,283

0,221

R [g/kg]

0,087

1,156

0,792

0,619

CVR [%]

1,48

4,69

4,11

4,22

L =	tulemused esitanud laborite arv

n =	üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr =	korduvust iseloomustav standardhälve

SR =	korratavust iseloomustav standardhälve

r =

korduvus

R =	korratavus

CVr =

korduvuse variatsioonikordaja, %

CVR =

korratavuse variatsioonikordaja, %

9. Tähelepanekud

9.1.

Järgmised kromatograafia eritingimused võivad tagada trüptofaani ja α-metüültrüptofaani parema eraldumise teineteisest.

Isokraatiline elueerimine, millele järgneb kolonni gradientpuhastus:

Vedelikkromatograafia kolonn:	125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 μm või samaväärne
Kolonni temperatuur:	32 °C
Liikuv faas:	A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanool, 95 + 5 (V+V).
	B: Metanool
Gradientprogramm:	0 min 100 % A	0 % B
	15 min 100 % A	0 % B
	17 min 60 % A	40 % B
	19 min 60 % A	40 % B
	21 min 100 % A	0 % B
	33 min 100 % A	0 % B
Voolukiirus:	1,2 ml/min
Summaarne voolutamisaeg:	umbes 33 min

9.2.

Kromatograafiline määramine oleneb HPLC tüübist ja kasutatavast kolonnitäidisest. Valitud süsteem peab tagama trüptofaani ja sisestandardi piikide täieliku eraldumise (kuni alusjooneni). Lisaks sellele on oluline, et lagunemisproduktid eralduksid hästi trüptofaanist ja sisestandardist. Kolonni tuleb süstida hüdrolüsaate ilma sisestandardita, kontrollimaks, et sisestandardi piigi kohal ei moonutaks alusjoont lisandite väljumine. On oluline, et voolutamisaeg oleks piisavalt pikk kõigi lagunemisproduktide elueerimiseks, vastasel juhul võivad hiljem elueeruvad piigid segada järgnevaid kromatograafilisi määramisi.

Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma kontsentratsioonist lineaarselt. Tulemuste lineaarsust tuleks kontrollida sisestandardi konstantsel (normaalsel) kontsentratsioonil erinevate trüptofaani kontsentratsioonidega. On oluline, et nii trüptofaani kui ka sisestandardi piigid oleksid HPLC-/fluorestsentssüsteemi lineaarses alas. Kui trüptofaani või sisestandardi piigid on liiga väikesed või liiga suured, siis tuleks analüüsi korrata teistsuguse proovi suurusega ja/või teistsuguse lõppruumalaga.

9.3. Baariumhüdroksiid

Baariumhüdroksiidi lahustamine raskeneb baariumhüdroksiidi vananemisel. Selle tulemusel saadakse HPLC-ga määramiseks hägune lahus, mis võib vähendada trüptofaani määramisel saadavaid tulemusi.

G. TOORÕLI JA -RASVA MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

See meetod võimaldab määrata toorõli ja -rasva sisaldust söödas.

Allpool kirjeldatud kahe meetodi kasutamine sõltub sööda laadist ja koostisest ning analüüsi tegemise põhjusest.

Toorõli ja -rasva määramiseks õliseemnetes ja -viljades ning üle 15 % toorõli-/toorrasvasisaldusega söödas tuleks ekstraheerimine teha menetluse A kohaselt ja uuesti ekstraheerimine menetluse B kohaselt (punkt 5.3).

1.1. Meetod A – otse ekstraheeritav toorõli ja -rasv

Seda meetodit kohaldatakse taimse söödamaterjali puhul, välja arvatud meetodiga B hõlmatud ainete puhul.

1.2. Meetod B – kogu toorõli ja -rasv

Seda meetodit kohaldatakse loomse söödamaterjali ja kõigi segasöötade puhul. Seda kasutatakse kõigi ainete puhul, millest ei ole ilma eelneva hüdrolüüsita võimalik õli ja rasva ekstraheerida (nt gluteen, pärm, kartulivalgud ning tooted, mille puhul kasutatakse muu hulgas pressimist, helvestamist või kuumutamist).

1.3. Tulemuste tõlgendamine

Kõigil juhtudel, kui meetodiga B saadakse suurem tulemus kui meetodiga A, loetakse meetodiga B saadud tulemus õigeks väärtuseks.

2. Põhimõte

2.1. Meetod A

Proov ekstraheeritakse petrooleetriga. Solvent destilleeritakse välja ning jääk kuivatatakse ja kaalutakse.

2.2. Meetod B

Proovi töödeldakse kuumalt soolhappega. Segu jahutatakse ja filtritakse. Jääk pestakse, kuivatatakse ja määratakse vastavalt meetodile A.

3. Reaktiivid

3.1.

Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 °C. Broomiarv peab olema väiksem kui 1 ja aurustamise jääk alla 2 mg/100 ml.

3.2.

Veevaba naatriumsulfaat.

3.3.

Soolhape, c = 3 mol/l.

3.4.

Filteraine, nt Kieselguhr, Hyflo-supercel.

4. Seadmed

4.1.

Ekstraheerimisaparaat. Kui see on varustatud sifooniga (Soxhleti aparaat), siis peab tagasivoolu kiirus olema selline, et tekiks umbes 10 tsüklit tunnis; kui aparaat on ilma sifoonita, siis peab tagasivoolu kiirus olema ligikaudu 10 ml minutis.

4.2.

Ekstraheerimishülsid, milles ei ole petrooleetris lahustuvaid aineid ning mille poorsus vastab punkti 4.1 nõuetele.

4.3.

Kuivatuskapp: kas vaakumkuivatuskapp, mis on seatud temperatuurile 75 ± 3 °C, või õhkkuivatuskapp, mis on seatud temperatuurile 100 ± 3 °C.

5. Töö käik

5.1. Meetod A (vt punkt 8.1)

5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse ekstraheerimishülssi (punkt 4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga.

Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (punkt 4.1) ja ekstraheeritakse petrooleetriga (punkt 3.1) kuus tundi. Petrooleetri ekstrakt kogutakse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid (6).

Solvent destilleeritakse välja. Jääk koos kolviga asetatakse poolteiseks tunniks kuivatuskappi (punkt 4.3) kuivama. Lastakse eksikaatoris jahtuda ning kaalutakse. Kuivatatakse veel 30 minutit, et veenduda, et õli ja rasva mass jääb samaks (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle).

5.2. Meetod B

2,5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega (vt punkt 8.2), pannakse 400 ml keeduklaasi või 300 ml Erlenmeyeri kolbi ning lisatakse 100 ml soolhapet (punkt 3.3) ja pimsskivitükke. Keeduklaas kaetakse kellaklaasiga või pannakse Erlenmeyeri kolbi külge püstjahuti. Segu kuumutatakse madala leegi või kuumutusplaadi kohal keemiseni ja keedetakse nõrgalt tund aega. Tuleb vältida toote sadestumist nõu seinte külge.

Jahutatakse ja lisatakse selline kogus filterainet (punkt 3.4), mis on piisav õli- ja rasvakao vältimiseks filtrimisel. Lahus filtritakse läbi niisutatud rasvavaba kahekordse filterpaberi. Jääki pestakse külmas vees kuni filtraadi neutraalse reaktsioonini. Kontrollitakse, et filtraat ei sisalda õli ega rasva. Kui filtraat sisaldab õli või rasva, tuleb proov enne hüdrolüüsi petrooleetriga ekstraheerida, kasutades meetodit A.

Kahekordne filterpaber koos jäägiga asetatakse kellaklaasile ja kuivatatakse poolteist tundi ventileeritavas kuivatuskapis (punkt 4.3) 100 ± 3 °C juures.

Kahekordne filterpaber koos kuivjäägiga asetatakse ekstraheerimishülssi (punkt 4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga. Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (punkt 4.1) ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule.

5.3. Menetlus A ja uuesti ekstraheerimine menetluse B kohaselt.

See tähendab, et pärast petrooleetriga ekstraheerimist (menetlus A) ekstraheeritakse jääki või osa jäägist uuesti soolhappega (menetlus B). Toorõli- ja toorrasvasisaldus on menetluste A ja B tulemuste summa.

6. Tulemuste väljendamine

Jäägi mass väljendatakse protsendimäärana proovist.

7. Korduvus

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	absoluutväärtusena väljendatult 0,2 %, kui õli ja rasva üldsisaldus on alla 5 %;

—	4,0 % suuremast tulemusest, kui toorõli ja -rasva sisaldus on 5–10 %;

—	absoluutväärtusena väljendatult 0,4 %, kui toorõli ja -rasva sisaldus on üle 10 %.

8. Tähelepanekud

8.1.

Suure õli- ja rasvasisaldusega toodete puhul, mida on keeruline peenestada või millest ei saa võtta homogeenset vähendatud proovi, toimitakse järgmiselt.

20 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja segatakse vähemalt 10 g veevaba naatriumsulfaadiga (punkt 3.2). Segu ekstraheeritakse petrooleetriga (punkt 3.1) vastavalt punktile 5.1. Saadud ekstrakti täidetakse petrooleetriga (punkt 3.1) 500 ml-ni ja segatakse. 50 ml lahust pannakse väiksesse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid. Solvent destilleeritakse välja, segu kuivatatakse ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 viimasele lõigule.

Hülssi jäänud ekstraheerimisjäägist eemaldatakse solvent, peenestatakse jääk 1 mm osakesteks, pannakse see tagasi ekstraheerimishülssi (ilma naatriumsulfaati lisamata) ning jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule.

Õli- ja rasvasisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

kus:

m1	=	jäägi mass grammides pärast esimest ekstraheerimist (alikvootne osa ekstraktist),
m2	=	jäägi mass grammides pärast teist ekstraheerimist.

8.2.

Mõne toote (nt väikese õli- ja rasvasisaldusega tooted) puhul võib uuritava proovi massi suurendada.

8.3.

Suure veesisaldusega lemmikloomatoite võib olla vaja segada veevaba naatriumsulfaadiga enne hüdrolüüsi ja ekstraheerimist vastavalt meetodile B.

8.4.

Punktis 5.2 võib olla tõhusam kasutada jäägi pesemiseks pärast filtrimist külma vee asemel sooja vett.

8.5.

Mõne sööda puhul võib olla vaja pikendada 1,5 tunnist kuivamisaega. Tuleb vältida liigset kuivatamist, kuna see võib põhjustada madalaid tulemusi. Kasutada võib ka mikrolaineahju.

H. KOGUKIU MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata söödas happelises ja leeliselises keskkonnas lahustumatuid rasvavabu orgaanilisi aineid, mida harilikult nimetatakse kogukiuks.

Meetodit ei kasutata lignotselluloosi ja taimse söe puhul (liiga väikesed osakesed).

2. Põhimõte

Proovi, mis on vajaduse korral rasvatustatud, töödeldakse mitu korda järjest teatava kontsentratsiooniga väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi keevate lahustega. Jääk eraldatakse filtrimisega läbi paagutatud klaasfiltri ning pestakse, kuivatatakse, kaalutakse ja tuhastatakse temperatuuril vahemikus 475–500 °C. Tuhastamisest tulenev massikadu vastab uuritavas proovis sisalduvale kogukiule.

3. Reaktiivid

3.1.

Väävelhape, c = 0,13 mol/l

3.2.

Vahutamisvastane aine (nt n-oktanool)

3.3.

Filteraine (Celite 545 või samaväärne toode), mida soojendatakse temperatuuril 500 °C neli tundi (punkt 8.6)

3.4.

Atsetoon.

3.5.

Petrooleeter, keemistemperatuur 40–60 °C

3.6.

Soolhape, c = 0,5 mol/l

3.7.

Kaaliumhüdroksiidi lahus, c = 0,23 mol/l

4. Seadmed

4.1.

Väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi lahusega lagundamiseks mõeldud kuumutusseade, mis on varustatud filtertiigli (punkt 4.2) toe ja äravoolutoruga, millel on klapp vedeliku väljavoolu peatamiseks ja võimaluse korral suruõhuga tekitatud vaakum. Iga päev eelkuumutatakse seadet enne kasutamist keeva veega viis minutit.

4.2.

Paagutatud kvartsklaasist filterplaadiga klaasist filtertiigel, poori suurus 40–90 μm. Enne esimest kasutamist kuumutatakse mõni minut kuni temperatuurini 500 °C ja jahutatakse (punkt 8.6).

4.3.

Püstjahutiga vähemalt 270 ml silinder, mis sobib keetmiseks.

4.4.

Termostaadiga kuivatuskapp.

4.5.

Termostaadiga muhvelahi.

4.6.

Ekstraheerimisseade, mis koosneb filtertiigli (punkt 4.2) tugiplaadist ja väljalasketorust, millel on klapp vaakumi ja vedeliku väljavoolu peatamiseks.

4.7.

Ühendusrõngad kuumutusseadme (punkt 4.1), tiigli (punkt 4.2) ja silindri (punkt 4.3) ühendamiseks ning külmekstraheerimisseadme (punkt 4.6) ja tiigli ühendamiseks.

5. Töö käik

1 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse see tiiglisse (punkt 4.2) (vt tähelepanekute punkte 9.1, 9.2 ja 9.3) ning lisatakse 1 g filterainet (punkt 3.3).

Kuumutusseade (punkt 4.1) ja filtertiigel (punkt 4.2) ühendatakse ning seejärel kinnitatakse silinder (punkt 4.3) tiigli külge. 150 ml keevat väävelhapet (punkt 3.1) valatakse ühendatud silindrisse ja tiiglisse ning vajadusel lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (punkt 3.2).

Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit.

Väljalasketoru (punkt 4.1) klapp avatakse, väävelhape filtritakse vaakumitingimustel läbi filtertiigli ning jääki pestakse kolm korda järjest 30 ml keeva veega, tagades, et pärast iga pesemist filtritakse jääk kuivaks.

Äravooluklapp suletakse ning ühendatud silindrisse ja tiiglisse valatakse 150 ml keevat kaaliumhüdroksiidi lahust (punkt 3.7) ning lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (punkt 3.2). Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit. Filtritakse ja korratakse pesemisprotseduuri, mida kasutati väävelhappe juures.

Pärast lõplikku pesemist ja kuivatamist ühendatakse tiigel ja selle sisu lahti ning ühendatakse see külmekstraheerimisseadmega (punkt 4.6). Jääki pestakse tiiglis vaakumitingimustel kolm korda järjest 25 ml atsetooniga (punkt 3.4), tagades, et pärast iga pesemist filtritakse jääk kuivaks.

Tiigel kuivatakse püsikaaluni kuivatuskapis temperatuuril 130 °C. Pärast iga kuivatamist jahutatakse tiiglit eksikaatoris ja kaalutakse kiiresti. Tiigel asetatakse muhvelahju ja tuhastatakse püsikaaluni (massikadu peab kahe järjestikuse kaalumise vahel olema 2 mg või alla selle) temperatuuril 475 °C kuni 500 °C vähemalt 30 minutit.

Pärast iga kuumutamist jahutatakse tiiglit enne kaalumist kõigepealt ahjus ja seejärel eksikaatoris.

Teostatakse ilma proovita pimekatse. Tuhastamisest tingitud massikadu ei tohi olla üle 4 mg.

6. Tulemuste arvutamine

Kogu kiu sisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

kus:

m	=	proovi mass grammides;
m0	=	massikadu pärast tuhastamist määramise ajal, grammides;
m1	=	massikadu pärast tuhastamist pimekatse ajal, grammides.

7. Korduvus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	absoluutväärtuses väljendatult 0,6 %, kui kogukiu sisaldus on alla 10 %;

—	6 % suuremast tulemusest, kui kogukiu sisaldus on 10 % või suurem.

8. Korratavus

Sama prooviga eri laborites tehtud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	absoluutväärtuses väljendatult 1,0 %, kui kogukiu sisaldus on alla 10 %;

—	10 % suuremast tulemusest, kui kogukiu sisaldus on 10 % või suurem.

9. Tähelepanekud

9.1.

Sööt, mis sisaldab üle 10 % rasva, tuleb enne analüüsimist petrooleetriga (punkt 3.5) rasvatustada. Filtertiigel (punkt 4.2) ja selle sisu ühendatakse külmekstraheerimisseadmega (punkt 4.6) ja pestakse jääki vaakumitingimustel kolm korda järjest 30 ml petrooleetriga, tagades, et jääk oleks kuiv. Tiigel ja selle sisu ühendatakse kuumutusseadmega (punkt 4.1) ja jätkatakse vastavalt punktile 5.

9.2.

Sööt, mis sisaldab rasva ja mida ei saa ekstraheerida petrooleetriga (punkt 3.5) otse, tuleb rasvatustada vastavalt punktile 8.1 ja rasvatustada veel üks kord pärast happega keetmist. Pärast happega keetmist ja järgnevat pesemist ühendatakse tiigel ja selle sisu külmekstraheerimisseadmega (punkt 4.6) ja pestakse jääki kolm korda järjest 30 ml atsetooniga ning seejärel veel kolm korda 30 ml petrooleetriga. Filtritakse vaakumitingimustel kuivaks ja jätkatakse analüüsi vastavalt punktile 5, alustades töötlemisest kaaliumhüdroksiidiga.

9.3.

Kui sööt sisaldab üle 5 % karbonaati, mis on väljendatud kaltsiumkarbonaadina, ühendatakse tiigel (punkt 4.2) kaalutud prooviga kuumutusseadme (punkt 4.1) külge. Proovi pestakse kolm korda 30 ml soolhappega (punkt 3.6). Pärast iga lisamist lastakse proovil enne filtrimist umbes üks minut seista. Pestakse üks kord 30 ml veega ja jätkatakse seejärel vastavalt punktile 5.

9.4.

Kui kasutatakse statiivitaolist seadet (mitu tiiglit on kinnitatud sama kuumutusseadme külge), ei või sama analüüsitava proovi suhtes teostada kahte üksikut määramist samas sarjas.

9.5.

Kui pärast keetmist on happelisi ja aluselisi lahuseid raske filtrida, kasutatakse kuumutusseadme väljalasketoru kaudu lastavat suruõhku ja jätkatakse seejärel filtrimist.

9.6.

Tuhastamistemperatuur ei tohi olla üle 500 °C, et pikendada klaasfiltertiiglite eluaega. Tuleb jälgida, et kuumutus- ja jahutustsüklite ajal ei tekiks liigset termolööki.

I. SUHKRU MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata redutseerivate suhkrute hulka ja pärast inversiooni üldsuhkru hulka, väljendatuna glükoosina või sõltuvalt olukorrast sahharoosina, kasutades ümberarvestustegurit 0,95. Seda meetodit kasutatakse segasöötade puhul. Muude söötade puhul on sätestatud erimeetodid. Vajaduse korral tuleb laktoosi hulk mõõta eraldi ja tulemuste arvutamisel seda arvesse võtta.

Seda meetodit tuleb kasutada suhkrusisalduse määramiseks sööda energiaväärtuse arvutamisel.

Kui suhkrusisaldust määratakse muudel eesmärkidel, võib kasutada muid analüüsimeetodeid.

2. Põhimõte

Suhkrud ekstraheeritakse lahjendatud etanoolis; lahus selitatakse Carrezi lahustega I ja II. Pärast etanooli eemaldamist määratakse kogused enne ja pärast inversiooni Luff-Schoorli meetodi abil.

3. Reaktiivid

3.1.

40 % etanoolilahuse (v/v) tihedus: 0,948 g/ml 20 °C juures, fenoolftaleiini suhtes neutraalne

3.2.

Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3 COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.3.

Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4 Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.4.

Metüüloranž, 0,1 % lahus (w/v)

3.5.

Soolhape, 4 mol/l

3.6.

Soolhape, 0,1 mol/l.

3.7.

Naatriumhüdroksiidi lahus, 0,1 mol/l

3.8.

Luff-Schoorli reaktiiv

Ettevaatlikult segades valatakse sidrunhappe lahus (punkt 3.8.2) naatriumkarbonaadi lahusesse (punkt 3.8.3). Lisatakse vasksulfaadi lahus (punkt 3.8.1) ja täidetakse veega 1 liitrini. Lastakse öö läbi settida ja filtritakse.

Selliselt saadud reaktiivi kontsentratsiooni (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l) kontrollitakse, vt punkti 5.4 viimast lõiku. Lahuse pH on umbes 9,4.

3.8.1.

Vasksulfaadi lahus: 25 g rauavaba vasksulfaati (CuSO4 5H2O) lahustatakse 100 ml vees.

3.8.2.

Sidrunhappe lahus: 50 g sidrunhapet (C6H8O7 H2O) lahustatakse 50 ml vees.

3.8.3.

Naatriumkarbonaadi lahus: 143,8 g veevaba naatriumkarbonaati lahustatakse umbes 300 ml soojas vees. Jahutatakse.

3.9.

Naatriumtiosulfaadilahus, 0,1 mol/l

3.10.

Tärkliselahus: 1 liitrile keevale veele lisatakse 5 g lahustuva tärklise ja 30 ml vee segu. Keedetakse kolm minutit, lastakse jahtuda ja vajaduse korral lisatakse säilitusainena 10 mg elavhõbejodiidi.

3.11.

Väävelhape, 3 mol/l.

3.12.

Kaaliumjodiidi lahus, 30 % (w/v)

3.13.

Pimsskivigraanulid, mis on keedetud soolhappes, pestud vees ning kuivatatud.

3.14.

3-metüülbutaan-1-ool

4. Seadmed

Segisti (trummel): ligikaudu 35–40 p/min

5. Töö käik

5.1. Proovi ekstraheerimine

2,5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse 250 ml mõõtekolbi. Lisatakse 200 ml etanooli (punkt 3.1) ning segatakse trumlis tund aega. Lisatakse 5 ml Carrezi lahust I (punkt 3.2) ja segatakse umbes 30 sekundit. Lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (punkt 3.3) ja segatakse veel üks minut. Täidetakse etanooliga (punkt 3.1) märgini, homogeenitakse ja filtritakse. Eemaldatakse 200 ml filtraati ja aurustatakse ligikaudu poole mahuni, et vabaneda enamikust etanoolist. Aurustamise jääk kantakse sooja vett kasutades kvantitatiivselt 200 ml mõõtekolbi, jahutatakse, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja vajaduse korral filtritakse. Seda lahust kasutatakse redutseerivate suhkrute hulga ja pärast inversiooni üldsuhkru hulga määramiseks.

5.2. Redutseerivate suhkrute määramine

Pipetiga eemaldatakse kuni 25 ml lahust, mis sisaldab alla 60 mg redutseerivaid suhkruid, mis on väljendatud glükoosina. Vajaduse korral täidetakse destilleeritud veega 25 ml-ni ja määratakse redutseerivate suhkrute hulk Luff-Schoorli meetodi abil. Tulemus väljendatakse glükoosisisalduse protsendimäärana proovist.

5.3. Üldsuhkru määramine pärast inversiooni

Pipetiga võetakse 50 ml lahust ja kantakse see 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse mõni tilk metüüloranži lahust (punkt 3.4) ning seejärel lisatakse hoolikalt ja samal ajal pidevalt segades soolhapet (punkt 3.5), kuni vedelik värvub selgelt punaseks. Lisatakse 15 ml soolhapet (punkt 3.6), asetatakse kolb tugevalt keeva veega vanni ning hoitakse seal 30 minutit. Jahutatakse kiiresti umbes 20 °C-ni ja lisatakse 15 ml naatriumhüdroksiidi lahust (punkt 3.7). Täidetakse veega 100 ml-ni ja homogeenitakse. Eemaldatakse kuni 25 ml lahust, mis sisaldab alla 60 mg redutseerivaid suhkruid, mis on väljendatud glükoosina. Vajaduse korral täidetakse destilleeritud veega 25 ml-ni ja määratakse redutseerivate suhkrute hulk Luff-Schoorli meetodi abil. Tulemus väljendatakse glükoosi protsendimäärana või sõltuvalt olukorrast sahharoosi protsendimäärana, korrutades tulemuse teguriga 0,95.

5.4. Tiitrimine Luff-Schoorli meetodi järgi

Pipetiga võetakse 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (punkt 3.8) ja kantakse see 300 ml koonilisse kolbi; lisatakse täpselt 25 ml selitatud suhkrulahust. Lisatakse 2 pimsskivigraanulit (punkt 3.13), kuumutatakse käsitsi segades keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja segu kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Kooniline kolb asetatakse viivitamatult asbestkattega traatvõrgule, milles on umbes 6 cm läbimõõduga auk ning mille all on eelnevalt süüdatud leek. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutataks üksnes koonilise kolvi põhja. Koonilise kolvi külge pannakse püstjahuti. Keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitritakse järgmiselt.

Lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi lahust (punkt 3.12) ja kohe seejärel lisatakse (intensiivse vahutamise ohu tõttu ettevaatlikult) 25 ml väävelhapet (punkt 3.11). Tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (punkt 3.9) kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, lisatakse tärkliseindikaator (punkt 3.10) ja viiakse tiitrimine lõpule.

Sama tiitrimine ilma keetmata tehakse seguga, milles on täpselt mõõdetud 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (punkt 3.8) ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust (punkt 3.12) ja 25 ml väävelhapet (punkt 3.11).

6. Tulemuste arvutamine

Tabeli abil määratakse glükoosi hulk milligrammides, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel väljendatuna naatriumtiosulfaadi milliliitrites (0,1 mol/l). Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7. Erimenetlused

7.1.

Melassirikaste söötade ja muude mitte eriti homogeensete söötade puhul kaalutakse 20 g proovi ja pannakse see 500 ml veega üheliitrisse mõõtekolbi. Segatakse trumlis tund aega. Selitatakse Carrezi lahustega I (punkt 3.2) ja II (punkt 3.3) punkti 5.1 kohaselt, kasutades sealjuures iga reaktiivi neljakordset kogust. Täidetakse kuni märgini 80 % etanooliga (v/v).

Homogeenitakse ja filtritakse. Etanool eemaldatakse punkti 5.1 kohaselt. Kui dekstriinitud tärklist ei ole, täidetakse destilleeritud veega kuni märgini.

7.2.

Suhkrurikaste, kuid praktiliselt tärklisevabade melasside ja söödamaterjalide puhul (jaanikaunad, kuivatatud peedipealsed jne) kaalutakse 5 g proovi, pannakse see 250 ml mõõtekolbi, lisatakse 200 ml destilleeritud vett ja segatakse trumlis tund aega või vajaduse korral kauem. Selitatakse Carrezi lahustega I (punkt 3.2) ja II (punkt 3.3) punkti 5.1 kohaselt. Täidetakse külma veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtritakse. Üldsuhkru hulga määramiseks jätkatakse vastavalt punktile 5.3.

8. Tähelepanekud

8.1.

Vahutamise vältimiseks on soovitatav lisada (proovi kogusest sõltumatult) umbes 1 ml 3-metüülbutaan-1-ooli (punkt 3.14) enne keetmist Luff-Schoorli reaktiiviga.

8.2.

Sahharoosisisalduse protsendimäär on glükoosina väljendatud inversioonijärgse üldsuhkrute sisalduse ja glükoosina väljendatud redutseerivate suhkrute sisalduse vahe, mis on korrutatud 0,95-ga.

8.3.

Redutseerivate suhkrute (v.a laktoosi) sisalduse määramiseks võib kasutada kahte meetodit:

8.3.1.

Ligikaudseks arvutamiseks korrutatakse muu meetodi abil saadud laktoosisisaldus 0,675ga ja lahutatakse saadud tulemus redutseerivate suhkrute sisaldusest.

8.3.2.

Redutseerivate suhkrute (v.a laktoosi) täpseks arvutamiseks tuleb sama prooviga teha kaks lõplikku määramist. Üks analüüs tehakse punkti 5.1 kohaselt saadud lahuse ühe osaga, teine analüüs sellise lahuse ühe osaga, mis on saadud laktoosi määramise käigus selleks ettenähtud meetodiga (pärast muude suhkruliikide fermenteerimist ja selitamist).

Mõlemal juhul määratakse proovis sisalduv suhkur Luff-Schoorli meetodi abil ja arvutatakse glükoosi milligrammideks. Üks väärtus lahutatakse teisest ja vahe väljendatakse protsendimäärana proovist.

Näide

Võetud kogused vastavad mõlema määramise puhul 250 mg massiga proovile.

Esimesel juhul tarbitakse 17 ml naatriumtiosulfaadi lahust (0,1 mol/l), mis vastab 44,2 mg glükoosile; teisel juhul tarbitakse 11 ml, mis vastab 27,6 mg glükoosile.

Vahe on 16,6 mg glükoosi.

Redutseerivate suhkrute (v.a laktoosi) sisaldus glükoosiks arvutatuna on seega:

Väärtuste tabel 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi jaoks

ml Na2 S2 O3 (0,1 mol/l) pärast kahte minutit kuumutamist ja 10 minutit keetmist

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

Glükoos, fruktoos invertsuhkrud

C6 H12 O6

Laktoos

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

vahe

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

J. LAKTOOSI MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata laktoosi sisaldust söödas, mis sisaldab laktoosi üle 0,5 %.

2. Põhimõte

Suhkrud lahustatakse vees. Lahus kääritatakse Saccharomyces cerevisiae pärmiga, mis jätab laktoosi esialgsele kujule. Pärast selitamist ja filtrimist määratakse filtraadi laktoosisisaldus Luff-Schoorli meetodi abil.

3. Reaktiivid

3.1.

Saccharomyces cerevisiae suspensioon: 25 g värsket pärmi suspendeeritakse 100 ml vees. Suspensioon säilib külmikus kõige rohkem ühe nädala.

3.2.

Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3 COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.3.

Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4 Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.4.

Luff-Schoorli reaktiiv

Ettevaatlikult segades valatakse sidrunhappe lahus (punkt 3.4.2) naatriumkarbonaadi lahusesse (punkt 3.4.3). Lisatakse vasksulfaadi lahus (punkt 3.4.1) ja täidetakse veega 1 liitrini. Lastakse öö läbi settida ja filtritakse. Selliselt saadud reaktiivi kontsentratsiooni (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l) kontrollitakse. Lahuse pH on umbes 9,4.

3.4.1.

Vasksulfaadi lahus: 25 g rauavaba vasksulfaati (Cu SO4 5H2O) lahustatakse 100 ml vees.

3.4.2.

Sidrunhappe lahus: 50 g sidrunhapet (C6H8O7 · H2O) lahustatakse 50 ml vees.

3.4.3.

Naatriumkarbonaadi lahus: 143,8 g veevaba naatriumkarbonaati lahustatakse umbes 300 ml soojas vees. Jahutatakse.

3.5.

Pimsskivigraanulid, mis on keedetud soolhappes, pestud vees ning kuivatatud.

3.6.

Kaaliumjodiidi lahus, 30 % (w/v)

3.7.

Väävelhape, 3 mol/l.

3.8.

Naatriumtiosulfaadi lahus, 0,1 mol/l.

3.9.

4. Seadmed

Temperatuurile 38–40 °C seatud termostaadiga veevann.

5. Töö käik

1 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse selline kogus proovi 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25–30 ml vett. Kolb asetatakse kolmekümneks minutiks keeva vee vanni ning jahutatakse seejärel umbes 35 °C-ni. Lisatakse 5 ml pärmisuspensiooni (punkt 3.1) ja homogeenitakse. Lastakse kolvil seista kaks tundi veevannis temperatuuril 38–40 °C. Jahutatakse umbes 20 °C-ni.

Lisatakse 2,5 ml Carrezi lahust I (punkt 3.2) ja segatakse kolmkümmend sekundit, seejärel lisatakse 2,5 ml Carrezi lahust II (punkt 3.3) ja segatakse veel kolmkümmend sekundit. Täidetakse veega 100 milliliitrini, segatakse ja filtritakse. Pipetiga eemaldatakse filtraadikogus, mis ei ületa 25 ml ja mis soovitavalt sisaldab 40–80 mg laktoosi, ning kantakse see 300 ml koonilisse kolbi. Vajaduse korral täidetakse veega 25 ml-ni.

5 ml pärmisuspensiooniga (punkt 3.1) tehakse samal viisil pimekatse. Laktoosisisaldus määratakse Luff-Schoorli meetodi abil järgmiselt: lisatakse täpselt 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (punkt 3.4) ja kaks pimsskivigraanulit (punkt 3.5). Segatakse käsitsi keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja segu kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Kooniline kolb asetatakse viivitamatult asbestkattega traatvõrgule, milles on umbes 6 cm läbimõõduga auk ning mille all on eelnevalt süüdatud leek. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutataks üksnes koonilise kolvi põhja. Koonilise kolvi külge pannakse püstjahuti. Keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitritakse järgmiselt.

Lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi lahust (punkt 3.6) ja kohe seejärel lisatakse (intensiivse vahutamise ohu tõttu ettevaatlikult) 25 ml väävelhapet (punkt 3.7). Tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (punkt 3.8) kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, lisatakse tärkliseindikaator (punkt 3.9) ja viiakse tiitrimine lõpule.

Sama tiitrimine ilma keetmata tehakse seguga, milles on täpselt mõõdetud 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (punkt 3.4) ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust (punkt 3.6) ja 25 ml väävelhapet (punkt 3.7).

6. Tulemuste arvutamine

Juuresoleva tabeli abil määratakse laktoosi hulk milligrammides, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel väljendatuna naatriumtiosulfaadi milligrammides (0,1 mol/l).

Veevabale laktoosile vastav tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7. Tähelepanek

Toodete puhul, mis sisaldavad üle 40 % fermenteeritavat suhkrut, kasutatakse rohkem kui 5 ml pärmisuspensiooni (punkt 3.1).

Vähendatud laktoosisisaldusega söödas (nt kassipiim) muundatakse laktoos fruktoosiks, mis ei fermenteeru täielikult kahe tunni jooksul ja mille tulemusena saadakse suuremad näitajad või valepositiivsed tulemused (sest ekstrakti jäävad fruktoosijäägid).

Väärtuste tabel 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi jaoks

ml Na2 S2 O3 (0,1 mol/l) pärast kahte minutit kuumutamist ja 10 minutit keetmist

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

Glükoos, fruktoos invertsuhkrud

C6 H12 O6

Laktoos

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

0,1 mol/l

vahe

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

K. TÄRKLISE MÄÄRAMINE

POLARIMEETRILINE MEETOD

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodi abil on võimalik kindlaks määrata tärklise ja suure molekulmassiga tärklise lagunemisproduktide sisaldust söödas, et kontrollida deklareeritud energiasisalduse (VII lisa sätted) ja määruse (EÜ) nr 767/2009 järgimist.

Seda meetodit tuleb kasutada tärklisesisalduse määramiseks sööda energiaväärtuse arvutamisel.

Kui tärklisesisaldust määratakse muudel eesmärkidel, võib kasutada muid analüüsimeetodeid.

2. Põhimõte

Meetod hõlmab kahte määramist. Esimese juhul töödeldakse proovi lahjendatud soolhappega. Pärast selitamist ja filtrimist mõõdetakse polarimeetrilisel teel lahuse optiline pöörang.

Teisel määramisel ekstraheeritakse proovi 40 % etanooliga. Pärast filtraadi hapestamist soolhappega, selitamist ja filtrimist mõõdetakse lahuse optiline pöörang esimese määramisega analoogsel viisil.

Proovi tärklisesisaldus saadakse nimetatud kahe määramise vahe korrutamisel teadaoleva koefitsiendiga.

3. Reaktiivid

3.1.

Soolhappe 25 % lahus (w/w), tihedus: 1,126 g/ml

3.2.

Soolhappe 1,13 % lahus, (w/v)

Kontsentratsiooni tuleb kontrollida tiitrimise teel, kasutades 0,1 mol/l naatriumhüdroksiidi lahust koos 0,1 % (w/v) metüülpunasega 94 % etanoolis (v/v). 10 ml neutraliseerimiseks on vaja 30,94 ml NaOH (0,1 mol/l).

3.3.

Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3 COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.4.

Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4 Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.5.

Etanooli 40 % lahus (v/v), tihedus: 0,948 g/ml 20 °C juures

4. Seadmed

4.1.

Standardse lihvühenduse ja püstjahutiga 250 ml kooniline kolb.

4.2.

Polarimeeter või sahharimeeter.

5. Töö käik

5.1. Proovi ettevalmistamine

Peenestada proov nii, et see läbib täielikult 0,5 mm ümaravadega sõela.

5.2. Polarisatsioonitasandi optilise kogupöörangu (P või S) määramine (vt tähelepanek, punkt 7.1)

2,5 g peenestatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ning pannakse see 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25 ml soolhapet (punkt 3.2), loksutatakse proovi ühtlase jaotumise saavutamiseks ning lisatakse veel 25 ml soolhapet (punkt 3.2). Kolb asetatakse keeva vee vanni, loksutades seda esimesed kolm minutit tugevasti ja ühtlaselt, et vältida klompide teket. Vannis peab olema piisavalt vett, et vesi säilitaks kolvi vanni asetamisel keemistemperatuuri. Kolbi ei tohi loksutamise ajal vannist välja võtta. Täpselt 15 minuti möödudes võetakse kolb vannist välja, lisatakse 30 ml külma vett ja jahutatakse otsekohe temperatuurini 20 °C.

Lisatakse 5 ml Carrezi lahust I (punkt 3.3) ja loksutatakse umbes 30 sekundit. Seejärel lisatakse 5 ml Carrezi II lahust (punkt 3.4) ja jätkatakse loksutamist veel 30 sekundi jooksul. Täidetakse veega märgini, segatakse ja filtritakse. Kui filtraat ei ole täiesti selge (seda juhtub harva), korratakse määramist, kasutades rohkem Carrezi I ja II lahust (näiteks 10 ml).

Lahuse optiline pöörang mõõdetakse 200 mm torus polarimeetri või sahharimeetri abil.

5.3. 40 % etanoolis lahustuvate ainete optilise pöörangu (P’ või S’) määramine

5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse see 100 ml mõõtekolbi ning lisatakse umbes 80 ml etanooli (punkt 3.5) (vt tähelepanekute punkt 7.2). Kolb jäetakse üheks tunniks toatemperatuurile seisma; selle aja jooksul loksutatakse kolbi kuus korda tugevasti, nii et proov seguneks põhjalikult etanooliga. Täidetakse etanooliga (punkt 3.5) märgini, segatakse ja filtritakse.

50 ml filtraati (vastab 2,5 g proovile) pipetitakse 250 ml koonilisse kolbi, lisatakse 2,1 ml soolhapet (punkt 3.1) ja loksutatakse tugevasti. Püstjahuti ühendatakse koonilise kolviga ja kolb asetatakse keeva vee vanni. Täpselt 15 minuti möödudes eemaldatakse kooniline kolb vannist, viiakse selle sisu 100 ml mõõtekolbi, loputatakse vähese külma veega ja jahutatakse temperatuurini 20 °C.

Selitatakse Carrezi I (punkt 3.3) ja II (punkt 3.4) lahuse abil, täidetakse veega märgini, segatakse, filtritakse ja mõõdetakse optiline pöörang punkti 5.2 teises ja kolmandas lõigus kirjeldatud viisil.

6. Tulemuste arvutamine

Tärklisesisaldus (%) arvutatakse järgmiselt:

6.1. Mõõtmine polarimeetriga

optiline kogupöörang kraadides

P’

40 % etanoolis (v/v) lahustuvate ainete optiline pöörang kraadides;

puhta tärklise optiline eripöörang. Selle teguri puhul on tavaliselt aktsepteeritavad arvulised väärtused järgmised:

+ 185,9°	:	riisitärklis
+ 185,7°	:	kartulitärklis
+ 184,6°	:	maisitärklis
+ 182,7°	:	nisutärklis
+ 181,5°	:	odratärklis
+ 181,3°	:	kaeratärklis
+ 184,0°	:	muud tärkliseliigid ja tärklisesegud segasöödas

6.2. Mõõtmine sahharimeetriga

optiline kogupöörang sahharimeetri kraadides

S’

40 % etanoolis (v/v) lahustuvate ainete optiline pöörang sahharimeetri kraadides

sahharoosi mass (grammides) 100 ml vees, mis annab optiliseks pööranguks 100 sahharimeetri kraadi, kui mõõtmisel kasutatakse 200 mm toru:

16,29 g prantsuse sahharimeetrite puhul;

26,00 g saksa sahharimeetrite puhul;

20,00 g muude sahharimeetrite puhul;

puhta tärklise optiline eripöörang (vt punkt 6.1).

6.3. Korduvus

Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevuse absoluutväärtus ei tohi alla 40 % tärklisesisalduse puhul ületada 0,4 ning suhteline erinevus 40 % või suurema tärklisesisalduse puhul 1 %.

7. Tähelepanekud

7.1.

Kui proov sisaldab üle 6 % karbonaate, arvutatuna kaltsiumkarbonaadina, tuleb need enne optilise kogupöörangu määramist täpselt sobiva koguse lahjendatud väävelhappega töödeldes lagundada.

7.2.

Suure laktoosisisaldusega toodete, näiteks pulbrilise piimavadaku või lõssipulbri puhul tuleb pärast 80 ml etanooli (punkt 3.5) lisamist toimida järgmiselt. Kolviga ühendatakse püstjahuti ning kolb asetatakse 30 minutiks 50 °C veevanni. Lastakse maha jahtuda ja jätkatakse analüüsi punktis 5.3 kirjeldatud viisil.

7.3.

Järgmised söödamaterjalid võivad juhul, kui neid sisaldub loomasöödas märkimisväärses koguses, polarimeetrilise meetodiga tärklisesisalduse määramisel esile kutsuda häireid, mis võivad viia ebaõigetele tulemustele:

—	(suhkru)peedisaadused, näiteks (suhkru)peedipulp, (suhkru)peedimelass, melasseeritud (suhkru)peedipulp, (suhkru)peedimelassi raba, (peedi)suhkur;

—	tsitruspulp;

—	linaseeme; linakook; linasrott;

—	rapsiseeme; rapsikook; rapsisrott; rapsiseemnekestad;

—	päevalilleseemned; päevalillesrott; osaliselt kooritud päevalillesrott;

—	koprakook; koprasrott;

—	kartulipulp;

—	veetustatud pärm;

—	inuliinirikkad tooted (nt maapirniliistakud või -jahu);

—	rasvakõrned;

—	sojatooted. Neil juhtudel võib kohaldada komisjoni määruses (EÜ) nr 121/2008 (7) esitatud analüüsimeetodit. Seda meetodit võib kasutada ka alla 1 % tärklisesisaldusega sööda puhul.

L. KOGUTUHA MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata sööda kogutuha sisaldust.

2. Põhimõte

Proov tuhastatakse 550 °C juures; jääk kaalutakse.

3. Reaktiivid

Ammooniumnitraadi 20 % lahus (w/v)

4. Seadmed

4.1.

Kuumutusplaat.

4.2.

Elektriline termostaadiga muhvelahi.

4.3.

Nelinurksed (umbes 60 × 40 × 25 mm) või ümmargused (läbimõõt: 60–75 mm, kõrgus: 20–40 mm) kvarts-, portselan- või plaatinatiiglid tuhastamiseks.

5. Töö käik

Umbes 5 g proovi (toodete puhul, millel on kalduvus paisuda, 2,5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse tuhastamistiiglisse, mis on eelnevalt kuumutatud temperatuurini 550 °C, maha jahutatud ja tareeritud. Tiigel asetatakse kuumutusplaadile ja kuumutatakse järk-järgult kuni aine söestumiseni. Tuhastatakse vastavalt punktile 5.1 või 5.2.

5.1.

Tiigel asetatakse taadeldud muhvelahju, mis on seatud temperatuurile 550 °C. Tiiglit hoitakse sel temperatuuril, kuni tekib valge, helehall või punakas tuhk, milles ei paista söeosakesi. Tiigel asetatakse eksikaatorisse, lastakse jahtuda ning kaalutakse viivitamata.

5.2.

Tiigel asetatakse taadeldud muhvelahju, mis on seatud temperatuurile 550 °C. Tuhastatakse 3 tundi. Tiigel asetatakse eksikaatorisse, lastakse jahtuda ning kaalutakse viivitamata. Tuhastatakse veel 30 minutit, et veenduda, et tuha mass jääb samaks (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema väiksem kui 1 mg).

6. Tulemuste arvutamine

Jäägi massi arvutamiseks lahutatakse nõu mass.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7. Tähelepanekud

7.1.

Raskesti tuhastatavate ainete tuhka tuleb eelnevalt tuhastada vähemalt kolm tundi, seejärel jahutada ja lisada mõned tilgad 20 % ammooniumnitraadi lahust või vett (ettevaatlikult, et vältida tuha hajumist ja tompude tekkimist). Pärast kuivatuskapis kuivatamist jätkatakse kaltsineerimist. Korratakse seni, kuni aine on täielikult tuhastunud.

7.2.

Ainetega, mille puhul punktis 7.1 kirjeldatud meetod ei anna tulemust, toimitakse järgmiselt: pärast kolmetunnilist tuhastamist pannakse tuhk sooja vette ja filtritakse läbi väikese tuhavaba filtri. Filter ja selle sisu tuhastatakse esialgses tiiglis. Filtraat pannakse jahtunud tiiglisse, aurustatakse kuivaks, tuhastatakse ja kaalutakse.

7.3.

Õlide ja rasvade puhul pannakse sobiva suurusega tiiglisse 25 g suurune täpselt kaalutud proov. Aine süüdatakse tuhavaba filterpaberi ribaga ja söestatakse. Pärast põlemist niisutatakse võimalikult vähese veega. Kuivatatakse ja tuhastatakse punkti 5 kohaselt.

M. SOOLHAPPES LAHUSTUMATU TUHA MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata soolhappes lahustumatute mineraalainete sisaldust söödas. Proovi laadist sõltuvalt võib kasutada kahte meetodit.

1.1.

Meetod A: kasutatakse orgaanilise söödamaterjali ja enamuse segasööda puhul.

1.2.

Meetod B: kasutatakse mineraalsöötade ja söödasegude puhul ning selliste segasöötade puhul, kus soolhappes lahustumatute ainete sisaldus, mis määratakse meetodiga A, on üle 1 %.

2. Põhimõte

2.1.

Meetod A: proov tuhastatakse, tuhk keedetakse soolhappes ning lahustumatu jääk filtritakse ja kaalutakse.

2.2.

Meetod B: proovi töödeldakse soolhappega. Lahus filtritakse, jääk tuhastatakse ja selliselt saadud tuhk töödeldakse meetodi A järgi.

3. Reaktiivid

3.1.

Soolhape, 3 mol/l.

3.2.

Trikloroäädikhappe 20 % lahus (w/v).

3.3.

Trikloroäädikhappe 1 % lahus (w/v).

4. Seadmed

4.1.

Kuumutusplaat.

4.2.

Elektriline termostaadiga muhvelahi.

4.3.

Nelinurksed (umbes 60 × 40 × 25 mm) või ümmargused (läbimõõt: 60–75 mm, kõrgus: 20–40 mm) kvarts-, portselan- või plaatinatiiglid tuhastamiseks.

4.4.

Tuhavabad filtrid

5. Töö käik

5.1. Meetod A:

Proov tuhastatakse kogutuha määramiseks ettenähtud meetodi järgi. Kasutada võib ka kõnealusel analüüsil saadud tuhka.

Tuhk pannakse 250–400 ml keeduklaasi, kasutades 75 ml soolhapet (punkt 3.1). Segu aetakse aeglaselt keema ja keedetakse vaikselt viisteist minutit. Soe lahus filtritakse läbi tuhavaba filterpaberi ja jääk pestakse sooja veega, kuni happe reaktsioon ei ole enam nähtav. Filter jäägiga kuivatatakse ja tuhastatakse tareeritud tiiglis temperatuuril mitte alla 550 °C ja mitte üle 700 °C. Jahutatakse eksikaatoris ja kaalutakse.

5.2. Meetod B

Umbes 5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse 250–400 ml keeduklaasi. Lisatakse üksteise järel 25 ml vett ja 25 ml soolhapet (punkt 3.1), segatakse ning oodatakse, kuni kihisemine on lõppenud. Lisatakse veel 50 ml soolhapet (punkt 3.1). Oodatakse gaaside eraldumise lõppemiseni, seejärel asetatakse keeduklaas keeva vee vanni ja hoitakse seal kolmkümmend minutit või vajaduse korral kauem lahuses sisalduva tärklise täielikuks hüdrolüüsiks. Filtritakse soojalt läbi tuhavaba filtri ning filter pestakse 50 ml soojas vees (vt tähelepanekute punkt 7). Filter jäägiga asetatakse tuhastamiseks ettenähtud tiiglisse, kuivatatakse ja tuhastatakse temperatuuril mitte alla 550 °C ja mitte üle 700 °C. Tuhk pannakse 250–400 ml keeduklaasi, kasutades 75 ml soolhapet (punkt 3.1); jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele lõigule.

6. Tulemuste arvutamine

Jäägi massi arvutamiseks lahutatakse nõu mass. Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7. Tähelepanek

Kui filtrimine osutub raskeks, tehakse analüüs uuesti, sealjuures asendatakse 50 ml soolhapet (punkt 3.1) 50 ml trikloroäädikhappe 20 % lahusega (w/v) (punkt 3.2) ja pestakse filter soojas 1 % trikloroäädikhappe lahuses (punkt 3.3).

N. ÜLDFOSFORI MÄÄRAMINE

Üldfosfori sisaldus määratakse

—	standardis EN 15510 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Kaltsiumi, naatriumi, fosfori, magneesiumi, kaaliumi, raua, tsingi, vase, mangaani, koobalti, molübdeeni ja plii määramine induktiivsidestunud plasma aatomiemissioonspektromeetria (ICP-AES) abil“ esitatud analüüsimeetodiga või

—

standardis EN 15621 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Kaltsiumi, naatriumi, fosfori, magneesiumi, kaaliumi, väävli, raua, tsingi, vase, mangaani ja koobalti määramine pärast rõhu all lagundamist induktiivsidestunud plasma aatomiemissioonspektromeetria (ICP-AES) abil“ esitatud analüüsimeetodiga või

—	järgnevalt kirjeldatud fotomeetrilise meetodi abil.

FOTOMEETRILINE MEETOD

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata üldfosfori sisaldust söötades. See sobib eriti hästi väikese fosforisisaldusega toodete analüüsimiseks. Teatavatel juhtudel (suure fosforisisaldusega toodete puhul) võib kasutada gravimeetrilist meetodit.

2. Põhimõte

Proov mineraliseeritakse kas kuivtuhastamise (orgaanilise sööda puhul) või märgtuhastamise (mineraalsete ühendite ja vedelsööda puhul) teel ja pannakse happelahusesse. Lahust töödeldakse molübdovanadaatreaktiiviga. Sel viisil saadud kollase lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm.

3. Reaktiivid

3.1.

Kaltsiumkarbonaat.

3.2.

Soolhape, ρ20 = 1,10 g/ml (umbes 6 mol/l).

3.3.

Lämmastikhape, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.

Lämmastikhape, ρ20 = 1,38–1,42 g/ml.

3.5.

Väävelhape, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.

Molübdovanadaatreaktiiv: 1 l mõõtekolvis segatakse 200 ml ammooniumheptamolübdaadi lahust (punkt 3.6.1), 200 ml ammooniummonovanadaadi lahust (punkt 3.6.2) ja 134 ml lämmastikhapet (punkt 3.4). Kolb täidetakse veega märgini.

3.6.1.

Ammooniumheptamolübdaadi lahus: 100 g ammooniumheptamolübdaati (NH4) 6Mo7O24.4H2O lahustatakse soojas vees. Lisatakse 10 ml ammooniumhüdroksiidi (tihedus: 0,91 g/ml) ja täidetakse veega kuni 1 liitrini.

3.6.2.

Ammooniummonovanadaadi lahus: 2,35 g ammooniummonovanadaati NH4VO3 lahustatakse 400 ml kuumas vees. Pidevalt segades lisatakse aeglaselt 20 ml lahjendatud lämmastikhapet (7 ml HNO3 (punkt 3.4) + 13 ml H2O) ja täidetakse veega kuni 1 liitrini.

3.7.

Fosfori standardlahus, 1 mg/ml: vees lahustatakse 4,387 grammi kaaliumdivesinikfosfaati KH2PO4. Täidetakse veega 1 liitrini.

4. Seadmed

4.1.

Kvarts-, portselan- või plaatinatiiglid tuhastamiseks.

4.2.

Temperatuurile 550 °C seatud termostaadiga elektriline muhvelahi.

4.3.

250 ml Kjeldahli kolb.

4.4.

Mõõtelkolvid ja gradueeritud pipetid.

4.5.

Spektrofotomeeter

4.6.

16 mm diameetriga katseklaasid, millel on 14,5 mm diameetriga korgid; maht: 25–30 ml.

5. Töö käik

5.1. Lahuse valmistamine

Sõltuvalt proovi laadist valmistatakse lahus punkti 5.1.1 või 5.1.2 kohaselt.

5.1.1. Tavaline menetlus

1 g või rohkem proovi kaalutakse 1 mg täpsusega. Uuritav proov pannakse Kjeldahli kolbi, lisatakse 20 ml väävelhapet (punkt 3.5), raputatakse, et aine seguneks täielikult happega ja et see ei sadestuks kolvi seinte külge, kuumutatakse ja hoitakse 10 minutit keemistemperatuuril. Lastakse veidi jahtuda, lisatakse 2 ml lämmastikhapet (punkt 3.4), kuumutatakse kergelt, lastakse veidi jahtuda, lisatakse veel veidi lämmastikhapet (punkt 3.4) ja viiakse tagasi keemistemperatuurile. Menetlust korratakse värvusetu lahuse saamiseni. Jahutatakse, lisatakse veidi vett, vedelik dekanteeritakse 500 ml mõõtekolbi, loputades Kjeldahli kolbi sooja veega. Lastakse jahtuda, täidetakse kuni märgini veega, homogeenitakse ja filtritakse.

5.1.2. Proovid, mis sisaldavad orgaanilisi aineid ja milles ei leidu kaltsiumdivesinikfosfaati ega magneesiumdivesinikfosfaati

Tuhastustiiglisse pannakse umbes 2,5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega. Uuritavat proovi segatakse, kuni see on täielikult segunenud 1 g kaltsiumkarbonaadiga (punkt 3.1). Tuhastatakse temperatuurile 550 °C seatud kuivatuskapis kuni valge või halli tuha saamiseni (võib sisaldada veidi sütt). Tuhk pannakse 250 ml keeduklaasi. Lisatakse 20 ml vett ja soolhapet (punkt 3.2) kuni kihisemise lakkamiseni. Lisatakse veel 10 ml soolhapet (punkt 3.2). Keeduklaas pannakse liivavannile ja aurustatakse kuivaks, et silikaadid muutuksid lahustumatuks. Jääk lahustatakse uuesti 10 ml lämmastikhappes (punkt 3.3) ja keedetakse liivavannil või kuumutusplaadil 5 minutit, ilma et see kuivaks aurustuks. Vedelik dekanteeritakse 500 ml mõõtekolbi, loputades keeduklaasi mitu korda kuuma veega. Lastakse jahtuda, täidetakse kuni märgini veega, homogeenitakse ja filtritakse.

5.2. Värvuse arendamine ja optilise tiheduse mõõtmine

Punkti 5.1.1 või 5.1.2 kohaselt saadud filtraadi alikvoot lahjendatakse nii, et fosfori kontsentratsioon oleks kuni 40 μg/ml. 10 ml seda lahust pannakse katseklaasi (punkt 4.6) ja lisatakse 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (punkt 3.6). Homogeenitakse ja lastakse seista temperatuuril 20 °C vähemalt 10 minutit. Saadud lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm, lisades 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (punkt 3.6) 10 ml veele.

5.3. Kalibreerimiskõver

Standardlahusest (punkt 3.7) valmistatakse lahused, mis sisaldavad 1 ml kohta 5, 10, 20, 30 ja 40 μg fosforit. Igast lahusest võetakse 10 ml ja lisatakse sellele 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (punkt 3.6). Homogeenitakse ja lastakse seista temperatuuril 20 °C vähemalt 10 minutit. Optiline tihedus mõõdetakse punkti 5.2 kohaselt. Optiliste tiheduste ja vastavate fosforikoguste põhjal joonestatakse kalibreerimiskõver. Kontsentratsioonide puhul, mis jäävad vahemikku 0–40 μg/ml, on kõver lineaarne.

6. Tulemuste arvutamine

Uuritavas proovis sisalduv fosforikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korduvus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	3 % suuremast väärtusest fosforisisalduse puhul, mis on väiksem kui 5 %;

—	absoluutväärtusena väljendatult 0,15 % fosforisisalduse puhul, mis on vähemalt 5 %.

O. KLORIIDIDEST PÄRIT KLOORI MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata kloori kogust vees lahustuvates kloriidides, mida harilikult väljendatakse naatriumkloriidina. Meetodit kasutatakse kõigi söötade puhul.

2. Põhimõte

Kloriidid lahustatakse vees. Kui toode sisaldab orgaanilisi aineid, see selitatakse. Lahus hapestatakse kergelt lämmastikhappega ja kloriidid sadestatakse hõbekloriidina hõbenitraadilahuse abil. Hõbenitraadi ülekogus tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega, kasutades Volhardi meetodit.

3. Reaktiivid

3.1.

Ammooniumtiotsüanaadi lahus, 0,1 mol/l.

3.2.

Hõbenitraadi lahus, 0,1 mol/l.

3.3.

Ammooniumraudsulfaadi (NH4)Fe(SO4)2 küllastunud lahus.

3.4.

Lämmastikhape, tihedus: 1,38 g/ml.

3.5.

Dietüüleeter.

3.6.

Atsetoon.

3.7.

Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3COO)2·2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.8.

Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4Fe(CN)6·3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.9.

Kloriidivaba ja kloriide mitte absorbeeriv aktiivsüsi.

4. Seadmed

Segisti (trummel): ligikaudu 35–40 p/min

5. Töö käik

5.1. Lahuse valmistamine

Sõltuvalt proovi laadist valmistatakse lahus punkti 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kohaselt.

Samal ajal tehakse pimekatse, jättes välja analüüsitava proovi.

5.1.1. Proovid, mis ei sisalda orgaanilisi aineid

Alla 10 g proovi, mis ei sisalda kloriididena rohkem kui 3 g kloori, kaalutakse 1 mg täpsusega. See pannakse 400 ml veega 500 ml mõõtekolbi temperatuuril ligikaudu 20 °C. Segatakse trumlis kolmkümmend minutit, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtritakse.

5.1.2. Orgaanilist ainet sisaldavad proovid, välja arvatud punktis 5.1.3 loetletud tooted

Umbes 5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse 1 g aktiivsöega 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett temperatuuriga ligikaudu 20 °C ja 5 ml Carrezi lahust I (punkt 3.7), segatakse 30 sekundit ning lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (punkt 3.8). Segatakse trumlis kolmkümmend minutit, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.1.3. Kuumtöödeldud söödad, linakoogid ja -jahu, linajahurikkad tooted ja muud taimeliimi- või kolloidaineterikkad tooted (näiteks dekstriinitud tärklis)

Lahus valmistatakse punkti 5.1.2 kohaselt, kuid seda ei filtrita. Dekanteeritakse (vajaduse korral tsentrifuugitakse), eemaldatakse 100 ml supernatanti ja kantakse 200 ml mõõtekolbi. Segatakse atsetooniga (punkt 3.6), täidetakse lahustiga kuni märgini, homogeenitakse ja filtritakse.

5.2. Tiitrimine

Sõltuvalt arvatavast kloorisisaldusest kantakse pipeti abil koonilisse kolbi 25–100 ml punkti 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kohaselt saadud filtraati. Alikvoot ei tohi sisaldada rohkem kui 150 mg kloori (Cl). Vajaduse korral lahjendatakse vähemalt 50 ml veega, lisatakse 5 ml lämmastikhapet (punkt 3.4), 2 ml ammooniumraudsulfaadi küllastunud lahust (punkt 3.3) ja nullmärgini täidetud büreti abil kaks tilka ammooniumtiotsüanaadi lahust (punkt 3.1). Büreti abil lisatakse hõbenitraadi lahust (punkt 3.2), nii et saadakse ülekogus 5 ml. Lisatakse 5 ml dietüüleetrit (punkt 3.5) ja loksutatakse tugevalt sademe koaguleerimiseks. Hõbenitraadi ülekogus tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega (punkt 3.1), kuni punakaspruun värvus püsib ühe minuti.

6. Tulemuste arvutamine

Kloriini (X) kogus, väljendatuna protsendimäärana naatriumkloriidist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

V1	=	lisatud 0,1 mol/l hõbenitraadi lahuse kogus milliliitrites;
V2	=	tiitrimiseks kasutatud 0,1 mol/l ammooniumtiotsüanaadi lahuse kogus milliliitrites;
m	=	proovi mass grammides alikvoodis.

Kui pimekatse näitab 0,1 mol/l hõbenitraadi lahuse tarbimist, lahutatakse see väärtus kogusest (V1 – V2).

7. Tähelepanekud

7.1.

Tiitrida võib ka potentsiomeetriliselt või amperomeetriliselt.

7.2.

Väga õli- ja rasvarikaste toodete puhul rasvatustatakse proov eelnevalt dietüüleetri või petrooleetriga.

7.3.

Kalajahu puhul võib tiitrida Mohri meetodi abil.

“

(1) Teravilja, jahu, tangude ja manna kuivatamisel peab kuivatuskapi soojusmahutavus olema selline, et seatuna temperatuurile 131 °C saavutab kuivatuskapp pärast maksimaalse arvu uuritavate proovide üheaegselt kuivatuskappi kuivama panemist selle temperatuuri uuesti vähem kui 45 minuti jooksul. Ventilatsioon peab olema selline, et kui kuivatuskapis on kahe tunni jooksul kuivatatud nii suurel arvul pehme nisu proove, kui kapp neid mahutab, erinevad saadud tulemused neljatunnise kuivatamise tulemustest vähem kui 0,15 %.

(2) Üksikasjad arvutamise kohta on kättesaadavad standardis EN ISO 6498 „Loomasööt – Proovi ettevalmistamise suunised“.

(3) Lämmastikusisaldust saab määrata kõigis söötades, kuid toorvalgu arvutamise teisendustegurit 6,25 ei pruugi olla võimalik kohaldada putuksööda (väiksem teisendustegur) ja teatava lemmikloomatoidu ning vereplasma valkude (suurem teisendustegur) suhtes.

(4) Standardis EN 17180 esitatud analüüsimeetodile viidatakse kui alternatiivmeetodile, mida kasutatakse ametlikuks kontrolliks, kui määratakse aminohappeid söödas, mis sisaldab üle 10 % aminohappeid.

(5) Seda meetodit ei ole võrdlusuuringuga valideeritud eelsegude puhul, mis sisaldavad üle 10 % söödalisandeid. Asjakohaste väikeste kohandustega saab seda siiski kohaldada ka nende maatriksite suhtes, eeldusel et meetod seejärel laborisiseselt valideeritakse. Täiendava teabe jaoks vaadake https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation.

(6) Kui hiljem tuleb kontrollida õli või rasva kvaliteeti, asendatakse pimsskivitükid klaashelmestega.

(7) Komisjoni 11. veebruari 2008. aasta määrus (EÜ) nr 121/2008, millega sätestatakse loomasöödana kasutatavate toodete (valmististe) (CN-kood 2309 ) tärklisesisalduse määramisemeetod (ELT L 37, 12.2.2008, lk 3).

IV LISA

„IV LISA

SÖÖDAS LUBATUD SÖÖDALISANDITE SISALDUSE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A. A-VITAMIINI SISALDUSE MÄÄRAMINE

A-vitamiini sisaldus määratakse

—	standardis EN 17547 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – A-, E- ja D-vitamiini (1) sisalduse määramine – Tahke faasi ekstraheerimisega (SPE) puhastamist ja kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat (HPLC) kasutav meetod“ esitatud analüüsimeetodiga või

—	kõrgefektiivse pöördfaasilise vedelikkromatograafia (RP-HPLC) abil, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit, nagu on kirjeldatud järgnevates punktides 1–9.

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata A-vitamiini (retinooli) kogust söödas. A-vitamiini all mõistetakse täielikult trans-konfiguratsioonis retinüülalkoholi ja selle cis-isomeere, nii nagu need määratakse käesoleva meetodiga. A-vitamiini sisaldust väljendatakse rahvusvahelistes ühikutes (RÜ) kilogrammi kohta. Üks RÜ vastab 0,300 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkoholi või 0,344 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaadi või 0,550 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaadi aktiivsusele.

Kvantifikatsiooni piir on 2 000 RÜ A-vitamiini kilogrammi kohta.

2. Põhimõte

Proov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja A-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. A-vitamiini sisaldus määratakse pööratud faasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit. Kromatograafilised parameetrid valitakse nii, et täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkohol ja selle cis-isomeerid jääksid lahutamata.

3. Reaktiivid

3.1.

Etanool, σ = 96 %.

3.2.

Petrooleeter, keemisvahemik 40-60 °C.

3.3.

Metanool.

3.4.

Kaaliumhüdroksiidi lahus, c = 50 g/100 ml.

3.5.

Naatriumaskorbaadi lahus, c = 10 g/100 ml (vt tähelepanekute punkt 7.7).

3.6.

Naatriumsulfiid, Na2S·· x H2O (x = 7 – 9).

3.6.1.

Naatriumsulfiidi lahus, c = 0,5 mol/l glütseroolis, ß = 120 g/l (kui x = 9) (vt tähelepanekute punkt 7.8).

3.7.

Fenoolftaleiini lahus, c = 2 g/100 ml etanoolis (punkt 3.1).

3.8.

2-propanool.

3.9.

HPLC liikuv faas: metanooli (punkt 3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v). Täpne vahekord määratakse kasutatava kolonni parameetrite järgi.

3.10.

Hapnikuvaba lämmastik.

3.11.

Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega, nt 2,80 ×106 RÜ/g.

3.11.1.

Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaadi põhilahus: 50 mg A-vitamiini atsetaati (punkt 3.11) kaalutakse 0,1 mg täpsusega ja pannakse see 100 ml mõõtekolbi. Lahustatakse 2-propanoolis (punkt 3.8) ja täidetakse sama lahustiga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 1 400 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.1.

3.12.

Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega, nt 1,80 × 106 RÜ/g.

3.12.1.

Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaadi põhilahus: 80 mg A-vitamiini palmitaati (punkt 3.12) kaalutakse 0,1 mg täpsusega ja pannakse see 100 ml mõõtekolbi. Lahustatakse 2-propanoolis (punkt 3.8) ja täidetakse sama lahustiga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 1 400 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.2.

3.13.

2,6-di-tert-butüül-4-metüülfenool (BHT) (vt tähelepanekute punkt 7.5).

4. Seadmed

4.1.

Vaakumrotaatoraurusti.

4.2.

Tumedast klaasist nõud.

4.2.1.

Lihvavaga lamedapõhjalised või koonilised kolvid, 500 ml.

4.2.2.

Lihvkorgiga kitsakaelalised mõõtkolvid 10, 25, 100 ja 500 ml.

4.2.3.

Lihvkorgiga koonilised jaotuslehtrid, 1 000 ml.

4.2.4.

Lihvavaga pirnkolvid, 250 ml.

4.3.

Lihvühendusega Allihni tagasivoolujahuti, ümbrise pikkus 300 mm, gaasitoru adapteriga.

4.4.

Kurdfilterpaber faaside eraldamiseks, diameeter 185 mm (nt Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4.5.

HPLC-seadmed sissepritsesüsteemiga.

4.5.1.

Vedelikkromatograafia kolonn, 250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne (lahutuskriteerium: ainult üks piik kõigi retinooli isomeeride jaoks antud HPLC tingimustel).

4.5.2.

Muudetava lainepikkusega UV- või fluorestsentsdetektor.

4.6.

Spektrofotomeeter 10 mm kvartsküvettidega.

4.7.

Magnetseguriga veevann.

4.8.

Ekstraktsiooniseade (vt joonis 1), mis koosneb:

4.8.1.

1-liitrisest lihvava ja lihvkorgiga klaassilindrist;

4.8.2.

lihviga klaasotsakust, mis on varustatud kõrvaltoruga ja keskelt läbi mineva üles-alla nihutatava toruga. Nihutataval torul peab olema U-kujuline alumine ots ja teises otsas düüs, nii et silindris oleva vedeliku ülemist kihti oleks võimalik viia üle jaotuslehtrisse.

5. Töö käik

Märkus:

A-vitamiin on tundlik (UV-) valguse ja oksüdeerumise suhtes. Kõik toimingud tuleb teostada valguse ja hapniku juurdepääsuta (kasutades tumedast klaasist või alumiiniumfooliumiga kaetud nõusid ja voolutades lämmastikuga). Ekstraheerimise ajal tuleb vedeliku kohal olev õhk asendada lämmastikuga (ülerõhu vältimiseks tuleb korki aeg-ajalt kergitada).

5.1. Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1 mm avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda A-vitamiini kadusid. Proovi (proove) ei jahvatata, kui osakeste suurusjaotus on sobiv (nt eelsegud ja söödalisandid).

5.2. Seebistamine

500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (punkt 4.2.1) kaalutakse 1 mg täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt A-vitamiini sisaldusest. Väikese kontsentratsiooni korral võib proovi massi suurendada, et kaalutises oleks piisavalt osakesi. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (punkt 3.1), umbes 100 mg BHT (punkt 3.13), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (punkt 3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (punkt 3.6). Kolvi otsa ühendatakse tagasivoolujahuti (punkt 4.3) ja kolb pannakse magnetseguriga veevanni (punkt 4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (punkt 4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (punkt 3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.

5.3. Ekstraheerimine

Seebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (punkt 4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (punkt 4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (punkt 3.1) ja 100 ml petrooleetriga (punkt 3.2) ja viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peab olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.

5.3.1. Ekstraheerimine jaotuslehtriga (punkt 4.2.3)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanekute punkt 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (punkt 4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (punkt 3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (punkt 3.2).

Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergelt loksutades (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100 ml veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100 ml veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (punkt 3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (punkt 4.4) 500 ml mõõtekolbi (punkt 4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (punkt 3.2), täidetakse petrooleetriga (punkt 3.2) märgini ja segatakse hästi.

5.3.2. Ekstraheerimine ekstraktsiooniseadmega (punkt 4.8)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanekute punkt 7.3), pannakse klaassilindri (punkt 4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (punkt 4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (punkt 4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (punkt 3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (punkt 3.2), siis kaks korda 50 ml petrooleetri (punkt 3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.

Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu selles punktis on kirjeldatud.

5.4. Proovilahuse valmistamine HPLC jaoks

Petrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250 ml pirnkolbi (punkt 4.2.4). Vaakumrotaatoraurustiga (punkt 4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks veevanni temperatuuril mitte üle 40 °C. Kolbi lastakse lämmastik (punkt 3.10) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumrotaatoraurustist. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (punkt 3.10) voolutades ja jääk lahustatakse kohe teadaoleva koguse (10–100 ml) metanooliga (punkt 3.3) (A-vitamiini kontsentratsioon peab jääma vahemikku 5–30 RÜ/ml).

5.5. Määramine HPLC-ga

A-vitamiin eraldatakse C18 pöördfaaskolonnil (punkt 4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon UV-detektori (punkt 325 nm) või fluorestsentsdetektori (ergastamine: 325 nm, emissioon: 475 nm) (punkt 4.5.2) abil.

Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (punkt 3.9). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kalibreerimislahuste (punkt 5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).

HPLC tingimused

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).

Vedelikkromatograafia kolonn (punkt 4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne
Liikuv faas (punkt 3.9):	Metanooli (punkt 3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v).
Voolukiirus:	1–2 ml/min
Detektor (punkt 4.5.2):	UV-detektor (325 nm) või fluorestsentsdetektor (ergastamine: 325 nm/emissioon: 475 nm)

5.6. Kalibreerimine

5.6.1. Standardtöölahuste ettevalmistamine

20 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (punkt 3.11.1) või 20 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (punkt 3.12.1) pipetitakse 500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (punkt 4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktile 5.2, kuid ilma BHT-d lisamata. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (punkt 3.2) vastavalt punktile 5.3 ja täidetakse kuni 500 ml-ni petrooleetriga (punkt 3.2). 100 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumrotaatoraurustil (vt punkt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (punkt 3.10) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 10,0 ml metanooliga (punkt 3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 560 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.3. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

2,0 ml kõnealust standardtöölahust pipetitakse 20 ml mõõtekolbi, täidetakse metanooliga (punkt 3.3) kuni märgini ja segatakse. Selle lahjendatud standardtöölahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini ml kohta.

5.6.2. Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0, 2,0, 5,0 ja 10,0 ml lahjendatud standardtöölahust viiakse üle 20 ml mõõtekolbidesse, täidetakse metanooliga (punkt 3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,8, 5,6, 14,0 ja 28,0 RÜ A-vitamiini ml kohta.

Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid) ja arvestades UV-kontrolli (punkt 5.6.3.3) tulemusi.

5.6.3. Standardlahuste UV-standardiseerimine

5.6.3.1. A-vitamiini atsetaadi põhilahus

2,0 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (punkt 3.11.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (punkt 4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (punkt 3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. 3,0 ml A-vitamiini atsetaadi lahjendatud lahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (punkt 3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (punkt 4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (punkt 3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

5.6.3.2. A-vitamiini palmitaadi põhilahus

2,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (punkt 3.12.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (punkt 4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (punkt 3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. 3,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (punkt 3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (punkt 4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (punkt 3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

5.6.3.3. A-vitamiini standardtöölahus

3,0 ml A-vitamiini lahjendamata standardtöölahust, mis on valmistatud vastavalt punktile 5.6.1, pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (punkt 4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (punkt 3.8) märgini. 5,0 ml seda lahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (punkt 3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (punkt 4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (punkt 3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

6. Tulemuste arvutamine

Proovilahuse A-vitamiini piigi keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kalibreerimisgraafiku (punkt 5.6.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon RÜ-des milliliitri kohta.

Proovi A-vitamiini sisaldus w RÜ-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c	=	A-vitamiini kontsentratsioon proovilahuses (punkt 5.4) RÜ/ml;
V1	=	proovilahuse (punkt 5.4) kogus milliliitrites;
V2	=	vastavalt punktile 5.4 võetud alikvoodi kogus milliliitrites;
m	=	kaalutise mass grammides.

7. Tähelepanekud

7.1.

Madala A-vitamiini kontsentratsiooniga proovides võib olla kasulik ühendada kahe seebistamiseks võetud koguse (kaalutud kogus: 25 g) petrooleetri ekstraktid üheks proovilahuseks, mida määratakse HPLC-ga.

7.2.

Analüüsiks võetud proov ei tohi sisaldada üle 2 g rasva.

7.3.

Faaside halva eraldumise puhul lisatakse emulsiooni lõhkumiseks umbes 10 ml etanooli (punkt 3.1).

7.4.

Kalamaksaõli ja muude puhaste rasvade puhul tuleb seebistamise aega pikendada 45–60 minutini.

7.5.

BHT asemel võib kasutada hüdrokinooni.

7.6.

Normaalfaasikolonni kasutamisel on võimalik retinooli isomeeride eraldumine. Kuid sel juhul summeeritakse arvutustes kõigi cis- ja trans-isomeeride piigi kõrgused (pindalad).

7.7.

Naatriumaskorbaadi lahuse asemel võib kasutada umbes 150 mg askorbiinhapet.

7.8.

Naatriumsulfiidi lahuse asemel võib kasutada umbes 50 mg etüleendiamiintetraatsetaati.

7.9.

A-vitamiini analüüsimisel piimaasendajates tuleb erilist tähelepanu pöörata

—	seebistamisele (punkt 5.2): tulenevalt proovi rasvasisaldusest võib olla vaja suurendada kaaliumhüdroksiidi lahuse kogust (punkt 3.4);

—	ekstraheerimisele (punkt 5.3): tulenevalt emulsioonide sisaldusele võib olla vajalik muuta vee ja etanooli vahekorda 2:1.

Et kontrollida rakendatud analüüsimeetodi tulemuste usaldusväärsust kõnealuse spetsiifilise põhiaine (piimaasendaja) puhul, tuleb täiendava kaalutisega teha saagisekatse. Kui saagise määr on alla 80 %, esitatakse analüüsi tulemus saagisekorrektsiooniga.

8. Korduvus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % suuremast tulemusest.

9. Võrdlusuuringu tulemused (2)

Eelsegu

Sööda eelsegu

Mineraal-kontsentraat

Valgurikas sööt

Põrsasööt

keskmine [RÜ/kg]

17,02 × 106

1,21 × 106

537 100

151 800

18 070

sr [RÜ/kg]

0,51 × 106

0,039 × 106

22 080

12 280

682

r [RÜ/kg]

1,43 × 106

0,109 × 106

61 824

34 384

1 910

CVr [%]

3,0

3,5

4,1

8,1

3,8

sR [RÜ/kg]

1,36 × 106

0,069 × 106

46 300

23 060

3 614

R [RÜ/kg]

3,81 × 106

0,193 × 106

129 640

64 568

10 119

CVR [%]

8,0

6,2

8,6

L:	laborite arv

n:	üksikmääramiste arv

sr:	korduvust iseloomustav standardhälve

sR:	korratavust iseloomustav standardhälve

korduvus

R:	korratavus

CVr:	korduvuse variatsioonikordaja

CVR:	korratavuse variatsioonikordaja

Joonis 1

Ekstraktsiooniseade (punkt 4.8)

B. E-VITAMIINI SISALDUSE MÄÄRAMINE

E-vitamiini sisaldus määratakse

—	standardis EN 17547 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – A-, E- ja D-vitamiini (3) sisalduse määramine – Tahke faasi ekstraheerimisega (SPE) puhastamist ja kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat (HPLC) kasutav meetod“ esitatud analüüsimeetodiga või

—	kõrgefektiivse pöördfaasilise vedelikkromatograafia (RP-HPLC) abil, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit, nagu on kirjeldatud järgnevates punktides 1–9.

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata E-vitamiini kogust söödas. E-vitamiini sisaldust väljendatakse DL-α-tokoferoolatsetaadi milligrammides kilogrammi kohta. 1 mg DL-α-tokoferoolatsetaati vastab 0,91 mg DL-α-tokoferoolile (E-vitamiin).

Kvantifitseerimispiir on 2 mg E-vitamiini kilogrammi kohta. See kvantifitseerimispiir on saavutatav vaid fluorestsentsdetektoriga. UV-detektoriga on kvantifitseerimispiir 10 mg/kg.

2. Põhimõte

Proov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja E-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. E-vitamiini sisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit.

3. Reaktiivid

3.1.

Etanool, σ = 96 %.

3.2.

Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 °C.

3.3.

Metanool.

3.4.

Kaaliumhüdroksiidi lahus, c = 50 g/100 ml.

3.5.

Naatriumaskorbaadi lahus, c = 10 g/100 ml (vt tähelepanekute punkt 7.7).

3.6.

Naatriumsulfiid, Na2S·· x H2O (x = 7 – 9).

3.6.1.

Naatriumsulfiidi lahus, c = 0,5 mol/l glütseroolis, β = 120 g/l (kui x = 9) (vt tähelepanekute punkt 7.8).

3.7.

Fenoolftaleiini lahus, c = 2 g/100 ml etanoolis (punkt 3.1).

3.8.

HPLC liikuv faas: metanooli (punkt 3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v). Täpne vahekord määratakse kasutatava kolonni parameetrite järgi.

3.9.

Hapnikuvaba lämmastik.

3.10.

DL-α-tokoferoolatsetaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega.

3.10.1.

DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahus: 100 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,1 mg täpsusega 100 mg DL-α-tokoferoolatsetaati (punkt 3.10). Lahustatakse etanoolis (punkt 3.1) ja täidetakse sama lahustiga märgini. 1 ml seda lahust sisaldab 1 mg DL-α-tokoferoolatsetaati. (UV-kontrolli kohta vt punkt 5.6.1.3; stabiliseerimise kohta vt tähelepanekute punkt 7.4).

3.11.

DL-α-tokoferool, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega.

3.11.1.

DL-α-tokoferooli põhilahus: 100 ml mõõtkolbi kaalutakse 0,1 mg täpsusega 100 mg DL-α-tokoferooli (punkt 3.11). Lahustatakse etanoolis (punkt 3.1) ja täidetakse sama lahustiga märgini. 1 ml seda lahust sisaldab 1 mg DL-α-tokoferooli. (UV-kontrolli kohta vt punkt 5.6.2.3; stabiliseerimise kohta vt tähelepanekute punkt 7.4).

3.12.

2,6-di-tert-butüül-4-metüülfenool (BHT) (vt tähelepanekute punkt 7.5).

4. Seadmed

4.1.

Rotaatorkileaurusti

4.2.

Tumedast klaasist nõud

4.2.1.

Lihvavaga lamedapõhjalised või koonilised kolvid, 500 ml

4.2.2.

Lihvkorgiga kitsakaelalised mõõtkolvid 10, 25, 100 ja 500 ml

4.2.3.

Lihvkorgiga koonilised jaotuslehtrid, 1 000 ml

4.2.4.

Lihvavaga pirnkolvid, 250 ml

4.3.

Lihvühendusega Allihni tagasivoolujahuti, ümbrise pikkus 300 mm, gaasitoru adapteriga

4.4.

Kurdfilterpaber faaside eraldamiseks, diameeter 185 mm (nt Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5.

HPLC-seadmed sissepritsesüsteemiga

4.5.1.

Vedelikkromatograafia kolonn, 250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne

4.5.2.

Muudetava lainepikkusega UV- või fluorestsentsdetektor

4.6.

Spektrofotomeeter 10 mm kvartsküvettidega

4.7.

Magnetseguriga veevann

4.8.

Ekstraktsiooniseade (vt joonis 1), mis koosneb:

4.8.1.

1-liitrisest lihvava ja lihvkorgiga klaassilindrist;

4.8.2.

5. Töö käik

Märkus:

E-vitamiin on tundlik (UV-) valguse ja oksüdeerumise suhtes. Kõik toimingud tuleb teostada valguse ja hapniku juurdepääsuta (kasutades tumedast klaasist või alumiiniumfooliumiga kaetud nõusid ja voolutades lämmastikuga). Ekstraheerimise ajal tuleb vedeliku kohal olev õhk asendada lämmastikuga (ülerõhu vältimiseks tuleb korki aeg-ajalt kergitada).

5.1. Proovi ettevalmistamine

5.2. Seebistamine

500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (punkt 4.2.1) kaalutakse 0,01 g täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt E-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (punkt 3.1), umbes 100 mg BHT (punkt 3.12), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (punkt 3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (punkt 3.6). Kolvi otsa ühendatakse jahuti (punkt 4.3) ja kolb pannakse magnetseguriga veevanni (punkt 4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (punkt 4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (punkt 3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.

5.3. Ekstraheerimine

5.3.1. Ekstraheerimine jaotuslehtriga (punkt 4.2.3)

5.3.2. Ekstraheerimine ekstraktsiooniseadmega (punkt 4.8)

Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.

5.4. Proovilahuse valmistamine HPLC jaoks

Petrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250 ml pirnkolbi (punkt 4.2.4). Vaakumrotaatoraurustiga (punkt 4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks veevanni temperatuuril mitte üle 40 °C. Kolbi lastakse lämmastik (punkt 3.9) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumrotaatoraurustist. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (punkt 3.9) voolutades ja jääk lahustatakse kohe teadaoleva koguse (10–100 ml) metanooliga (punkt 3.3) (DL-α-tokoferooli kontsentratsioon peab jääma vahemikku 5–30 μg/ml).

5.5. Määramine HPLC-ga

E-vitamiin eraldatakse C18 pöördfaasikolonnil (punkt 4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon fluorestsentsdetektori (ergastamine: 295 nm, emissioon: 330 nm) (punkt 4.5.2) abil või UV-detektoriga (292 nm) (punkt 4.5.2).

Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (punkt 3.8). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kalibreerimislahuste (punkt 5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).

HPLC tingimused

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).

Vedelikkromatograafia kolonn (punkt 4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne
Liikuv faas (punkt 3.8):	Metanooli (punkt 3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v).
Voolukiirus:	1–2 ml/min
Detektor (punkt 4.5.2):	Fluorestsentsdetektor (ergastamine: 295 nm/emissioon: 330 nm) või UV-detektor (292 nm)

5.6. Kalibreerimine (DL-α-tokoferoolatsetaat või DL-α-tokoferool)

5.6.1. DL-α-tokoferoolatsetaadi standard

5.6.1.1. Standardtöölahuse valmistamine

25 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (punkt 3.10.1) viiakse pipetiga 500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (punkt 4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktis 5.2 kirjeldatule. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (punkt 3.2) vastavalt punktis 5.3 kirjeldatule ja täidetakse petrooleetriga 500 milliliitrini. 25 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumrotaatoraurustil (vt punkt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (punkt 3.9) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 25,0 ml metanooliga (punkt 3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 45,5 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 50 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus valmistatakse vahetult enne kasutamist.

5.6.1.2. Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0, 2,0, 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20 ml mõõtkolbidesse, täidetakse metanooliga (punkt 3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,5, 5,0, 10,0 ja 25,0 μg/ml DL-α-tokoferoolatsetaati, s.o 2,28, 4,55, 9,10 ja 22,8 μg/ml DL-α-tokoferooli.

Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid), koostatakse kalibreerimisgraafik.

5.6.1.3. DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahuse (punkt 3.10.1) UV-standardiseerimine

5,0 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (punkt 3.10.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (punkt 4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (punkt 3.1) suhtes.

Neeldumismaksimum peaks olema 284 nm:

Sellisel lahjendusel peaks ekstinktsiooni väärtus olema vahemikus 0,84–0,88.

5.6.2. DL-α-tokoferooli standard

5.6.2.1. Standardtöölahuse valmistamine

2 ml DL-α-tokoferooli põhilahust (punkt 3.11.1) viiakse pipetiga 50 ml mõõtekolbi, lahustatakse metanoolis (punkt 3.3) ja täidetakse metanooliga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 40 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 44,0 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus valmistatakse vahetult enne kasutamist.

5.6.2.2. Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0, 2,0, 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20 ml mõõtkolbidesse, täidetakse metanooliga (punkt 3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,0, 4,0, 8,0 ja 20,0 μg/ml DL-α-tokoferooli, s.o 2,20, 4,40, 8,79 ja 22,0 μg/ml DL-α-tokoferoolatsetaati.

5.6.2.3. DL-α-tokoferooli põhilahuse (punkt 3.11.1) UV-standardiseerimine

2,0 ml DL-α-tokoferooli põhilahust (punkt 3.11.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (punkt 4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (punkt 3.1) suhtes. Neeldumismaksimum peaks olema 292 nm:

Sellisel lahjendusel peab ekstinktsiooni väärtus olema 0,6.

6. Tulemuste arvutamine

Proovilahuse E-vitamiini piikide keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kalibreerimisgraafiku (punkt 5.6.1.2 või 5.6.2.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon μg-des milliliitri kohta (arvutatuna DL-α-tokoferoolatsetaadina).

Proovi E-vitamiini sisaldus w mg-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c	=	E-vitamiini (DL-α-tokoferoolatsetaadina) kontsentratsioon (μg/ml) proovilahuses (punkt 5.4);
V1	=	proovilahuse (punkt 5.4) kogus milliliitrites;
V2	=	vastavalt punktile 5.4 võetud alikvoodi kogus milliliitrites;
m	=	kaalutise mass grammides.

7. Tähelepanekud

7.1.

Madala E-vitamiini kontsentratsiooniga proovides võib olla kasulik ühendada kahe seebistamiseks võetud koguse (kaalutud kogus: 25 g) petrooleetri ekstraktid üheks proovilahuseks, mida määratakse HPLC-ga.

7.2.

Analüüsiks võetud proov ei tohi sisaldada üle 2 g rasva.

7.3.

Faaside halva eraldumise puhul lisatakse emulsiooni lõhkumiseks umbes 10 ml etanooli (punkt 3.1).

7.4.

Pärast DL-α-tokoferoolatsetaadi või DL-α-tokoferooli lahuste spektrofotomeetrilist mõõtmist vastavalt punktile 5.6.1.3 või 5.6.2.3 lisatakse lahusele (punkt 3.10.1 või 3.10.2) umbes 10 mg BHT-d (punkt 3.12) ja hoitakse lahust külmkapis (kõlblikkusaeg maksimaalselt neli nädalat).

7.5.

BHT asemel võib kasutada hüdrokinooni.

7.6.

Normaalfaasikolonni kasutamisel on võimalik α-, β-, γ- ja δ-tokoferooli eraldumine.

7.7.

Naatriumaskorbaadi lahuse asemel võib kasutada umbes 150 mg askorbiinhapet.

7.8.

Naatriumsulfiidi lahuse asemel võib kasutada umbes 50 mg etüleendiamiintetraatsetaati.

7.9.

E-vitamiini atsetaat hüdrolüüsub aluselises keskkonnas väga kiiresti ning on seepärast väga tundlik oksüdeerumise suhtes, eriti selliste mikrolementide nagu raua ja vase olemasolul. Kui eelsegudes määratud E-vitamiini kogus on suurem kui 5 000 mg/kg, võib selle tagajärjeks olla E-vitamiini lagunemine. Seepärast soovitatakse kindluse mõttes kasutada HPLC meetodit, mis hõlmab E-vitamiini vormi ensümaatilist mineraliseerimist ilma aluselise seebistamise sammuta.

8. Korduvus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % suuremast tulemusest.

9. Võrdlusuuringu tulemused (4)

Eelsegu

Sööda eelsegu

Mineraal-kontsentraat

Valgurikas sööt

Põrsasööt

Keskmine [mg/kg]

17 380

1 187

926

315

61,3

sr [mg/kg]

384

45,3

25,2

13,0

2,3

r [mg/kg]

1 075

126,8

70,6

36,4

6,4

CVr [%]

2,2

3,8

2,7

4,1

3,8

sR [mg/kg]

830

65,0

55,5

18,9

7,8

R [mg/kg]

2 324

182,0

155,4

52,9

21,8

CVR [%]

4,8

5,5

6,0

12,7

L:	laborite arv

n:	üksikmääramiste arv

sr:	korduvust iseloomustav standardhälve

sR:	korratavust iseloomustav standardhälve

korduvus

R:	korratavus

CVr:	korduvuse variatsioonikordaja

CVR:	korratavuse variatsioonikordaja

Joonis 2

Ekstraktsiooniseade (punkt 4.8)

C. MIKROELEMENTIDE RAUA, VASE, MANGAANI JA TSINGI MÄÄRAMINE

Raua-, vase-, mangaani- ja tsingisisaldus määratakse

—	standardis EN 15510 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Kaltsiumi, naatriumi, fosfori, magneesiumi, kaaliumi, raua, tsingi, vase, mangaani, koobalti, molübdeeni ja plii määramine induktiivsidestunud plasma aatomiemissioonspektromeetria (ICP-AES) abil“ esitatud analüüsimeetodiga või

—

—	standardis EN 17053 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Mikroelementide, raskmetallide ja muude elementide määramine söödas induktiivsidestunud plasma massispektromeetria (ICP-MS) abil“ (erinevad meetodid) või

—	standardis EN 6869 „Loomasööt. Kaltsiumi, vase, raua, magneesiumi, mangaani, kaaliumi, naatriumi ja tsingi määramine. Aatomiabsorptsioonspektromeetriat kasutav meetod“ analüüsimeetodiga või

—	leekaatomiabsorptsioonspektromeetria (FAAS) meetodiga, mida on kirjeldatud järgnevates punktides 1–8.

(1) Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata söödas mikroelemente: rauda, vaske, mangaani ja tsinki (5). Kvantifikatsioonipiirid on:

—	raud (Fe): 20 mg/kg;

—	vask (Cu): 10 mg/kg;

—	mangaan (Mn): 20 mg/kg;

—	tsink (Zn): 20 mg/kg.

2. Põhimõte

Proov lahustatakse soolhappes pärast võimaliku orgaanilise aine hävitamist. Elemendid raud, vask, mangaan ja tsink määratakse aatomiabsorptsioonspektromeetriaga pärast asjakohast lahjendamist.

3. Reaktiivid

Sissejuhatavad märkused

Reaktiivide ja analüütiliste lahuste ettevalmistamiseks kasutatakse katioonivaba vett, mis on saadud kas vee bidestilleerimisel borosilikaat- või kvartsklaasist destillaatoris või kahekordsel töötlemisel ioonvahetusvaikudega.

Reaktiivid peavad olema vähemalt analüütiliselt puhtad. Määratava elemendi puudumist tuleb kontrollida pimekatse abil. Vajaduse korral tuleb reaktiive täiendavalt puhastada.

Allpool kirjeldatud standardlahuste asemel võib kasutada müügil olevaid standardlahuseid, tingimusel, et neil on garantii ning neid on enne kasutamist kontrollitud.

3.1.

Soolhape (d: 1,19 g/ml).

3.2.

Soolhape (6 mol/l).

3.3.

Soolhape (0,5 mol/l).

3.4.

38–40 % vesinikfluoriidhape (v/v), mille raua (Fe) sisaldus on alla 1 mg/l ning jääk pärast aurustamist alla 10 mg/l (sulfaadina).

3.5.

Väävelhape (d: 1,84 g/ml).

3.6.

Vesinikperoksiid (ligikaudu 100 mahuosa hapnikku (30 massiprotsenti)).

3.7.

Raua standardlahus (1 000 μg Fe/ml), mis on valmistatud järgmiselt (või kasutatakse samaväärset müügil olevat lahust): 1 g raudtraati lahustatakse 200 ml 6 mol/l soolhappes (punkt 3.2), lisatakse 16 ml vesinikperoksiidi (punkt 3.6) ning täidetakse veega ühe liitrini.

3.7.1.

Raua standardtöölahus (100 μg Fe/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (punkt 3.7) veega vahekorras 1: 9.

3.8.

Vase standardlahus (1 000 μg Cu/ml), mis on valmistatud järgmiselt (või kasutatakse samaväärset müügil olevat lahust):

—	1 g vasepulbrit lahustatakse 25 ml 6 mol/l soolhappes (punkt 3.2), lisatakse 5 ml vesinikperoksiidi (punkt 3.6) ning täidetakse veega ühe liitrini.

3.8.1.

Vase standardtöölahus (10 μg Cu/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (punkt 3.8) veega vahekorras 1: 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1: 9.

3.9.

Mangaani standardlahus (1 000 μg Mn/ml), mis on valmistatud järgmiselt (või kasutatakse samaväärset müügil olevat lahust):

—	1 g mangaanipulbrit lahustatakse 25 ml 6 mol/l soolhappes (punkt 3.2) ning täidetakse veega ühe liitrini.

3.9.1.

Mangaani standardtöölahus (10 μg Mn/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (punkt 3.9) veega vahekorras 1: 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1: 9.

3.10.

Tsingi standardlahus (1 000 μg Zn/ml), mis on valmistatud järgmiselt (või kasutatakse samaväärset müügil olevat lahust):

—	1 g riba- või lehttsinki lahustatakse 25 ml 6 mol/l soolhappes (punkt 3.2) ning täidetakse veega ühe liitrini.

3.10.1.

Tsingi standardtöölahus (10 μg Zn/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (punkt 3.10) veega vahekorras 1: 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1: 9.

3.11.

Lantaankloriidi lahus: 12 g lantaanoksiidi lahustatakse 150 ml vees, lisatakse 100 ml 6 mol/l soolhapet (punkt 3.2) ning täidetakse veega ühe liitrini.

4. Seadmed

4.1.

Temperatuuriregulaatori ja võimalusel salvestiga muhvelahi.

4.2.

Klaasnõud peavad olema vastupidavast borosilikaatklaasist ning on soovitav kasutada vahendeid, mida kasutatakse üksnes mikroelementide määramiseks.

4.3.

Aatomiabsorptsioonispektrofotomeeter, mis vastab kasutatava meetodi nõuetele, võttes arvesse tundlikkust ning täpsust nõutud ulatuses.

5. Töö käik (6)

5.1. Orgaanilist ainet sisaldavad proovid

5.1.1. Tuhastamine ja lahuse analüüsiks ettevalmistamine (7)

5.1.1.1.

0,2 mg täpsusega kaalutakse 5–10 g proovi, asetatakse kvarts- või plaatinatiiglisse (vt märkus b), kuivatatakse kuivatuskapis 105 °C juures ning tiigel asetatakse külma muhvelahju (punkt 4.1). Ahi suletakse (vt märkus c) ning järk-järgult tõstetakse ligikaudu 90 minuti jooksul temperatuur 450–475 °C-ni. Kõnealust temperatuuri hoitakse 4–16 tundi (nt öö jooksul), et eemaldada söeosakesed, ning seejärel ahi avatakse ning lastakse jahtuda (vt märkus d).

Tuhka niisutatakse veega ja viiakse üle 250 ml keeduklaasi. Tiigel pestakse ligikaudu 5 ml soolhappega (punkt 3.1) ning soolhape lisatakse aeglaselt ja ettevaatlikult keeduklaasi (CO2 moodustumise tõttu võib tekkida tugev reaktsioon). Soolhape (punkt 3.1) lisatakse tilkhaaval ja loksutades kuni kihisemise lakkamiseni. Aurustatakse kuivaks, aeg-ajalt klaaspulgaga segades.

Järgmisena lisatakse jäägile 15 ml 6 mol/l soolhapet (punkt 3.2) ning ligikaudu 120 ml vett. Segatakse klaaspulgaga, mis jäetakse keeduklaasi, ning keeduklaas kaetakse kellaklaasiga. Segu lastakse aeglaselt keema ning hoitakse keemistemperatuuril, kuni lahustuvat tuhka ei ole enam näha. Filtritakse läbi tuhavaba filterpaberi ning filtraat kogutakse 250 ml mõõtekolbi. Keeduklaas ja filter pestakse 5 ml kuuma 6 mol/l soolhappega (punkt 3.2) ning kaks korda keeva veega. Mõõtekolb täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 mol/l).

5.1.1.2.

Kui filtris olev jääk on must (süsinik), pannakse see tagasi ahju ning tuhastatakse uuesti 450–475 °C juures. Kõnealune tuhastamine, mis võtab aega vaid mõne tunni (3–5 tundi), on lõppenud, kui tuhk on valge või peaaegu valge. Jääk lahustatakse ligikaudu 2 ml soolhappega (punkt 3.1), aurustatakse kuivaks ning sellele lisatakse 5 ml 6 mol/l soolhapet (punkt 3.2). Segu kuumutatakse, lahus filtritakse mõõtekolbi ning täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 mol/l).

Märkused

Mikroelementide määramisel on oluline pöörata tähelepanu saastamisohule, eriti tsingi, vase ja rauaga. Seetõttu ei tohi proovide ettevalmistamisel kasutatavad vahendid sisaldada kõnealuseid metalle.

Üldise saastamisohu vähendamiseks tuleb töötada tolmuvabas keskkonnas hoolikalt puhastatud vahendite ja korralikult pestud klaasnõudega. Tsingi määramine on eriti tundlik mitmete saasteallikate suhtes, nt klaasnõud, reaktiivid, tolm jne.

b)	Tuhastatava proovi mass arvutatakse sööda ligikaudse mikroelemendisisalduse põhjal vastavalt kasutatava spektrofotomeetri tundlikkusele. Teatavate väikese mikroelementide sisaldusega söötade puhul alustatakse 10–20 g proovist, mille lõpplahus täidetakse vaid kuni 100 ml lahuse saamiseni.

c)	Tuhastamine peab toimuma suletud ahjus õhu või hapniku juurdepääsuta.

d)	Püromeetri temperatuuri näit ei tohi ületada 475 °C.

5.1.2. Spektrofotomeetriline määramine

5.1.2.1. Kalibreerimislahuste valmistamine

Iga määratava elemendi jaoks valmistatakse punktides 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.10.1 osutatud standardtöölahustest kalibreerimislahused, millest iga lahuse HCl kontsentratsioon on ligikaudu 0,5 mol/l ning (raua, mangaani ja tsingi korral) lantaankloriidi kontsentratsioon on samaväärne 0,1 % lantaaniga (w/v).

Valitud mikroelementide kontsentratsioonid peavad jääma kasutatava spektrofotomeetri tundlikkuse piiresse. Järgmistes tabelites on näitena esitatud tavapäraste kalibreerimislahuste koostised, kuid sõltuvalt kasutatava spektrofotomeetri tüübist ja tundlikkusest võib osutuda vajalikuks valida muud kontsentratsioonid.

Raud

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml standardtöölahust (punkt 3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (punkt 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantaankloriidi lahust (punkt 3.11) ning täidetakse veega 100 ml lahuse saamiseni.

Vask

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml standardtöölahust (punkt 3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (punkt 3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Mangaan

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml standardtöölahust (punkt 3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (punkt 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantaankloriidi lahust (punkt 3.11) ning täidetakse veega 100 ml lahuse saamiseni.

Tsink

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml standardtöölahust (punkt 3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (punkt 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml lantaankloriidi lahust (punkt 3.11) ning täidetakse veega 100 ml lahuse saamiseni.

5.1.2.2. Lahuse ettevalmistamine analüüsiks

Vase määramiseks saab vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahust tavaliselt kohe kasutada. Kui lahuse kontsentratsioon on vaja viia kalibreerimislahuste piiresse, võib lahuse alikvoodi pipettida 100 ml mõõtekolbi ning täita märgini 0,5 mol/l soolhappega (punkt 3.3).

Raua, mangaani ja tsingi määramiseks pipetitakse vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahuse alikvoot 100 ml mõõtekolbi, lisatakse 10 ml lantaankloriidilahust (punkt 3.11) ning täidetakse märgini 0,5 mol/l soolhappega (punkt 3.3) (vt ka punkt 8 „Tähelepanek“).

5.1.2.3. Pimekatse

Pimekatse peab hõlmama kõiki protseduuri ettenähtud etappe, välja arvatud see, et proovimaterjal jäetakse välja. Pimekatsel ei tohi kasutada kalibreerimislahust 0.

5.1.2.4. Aatomiabsorptsiooni mõõtmine

Kalibreerimislahuste ja analüüsitava lahuse aatomiabsorptsiooni mõõdetakse oksüdeerivat õhk-atsetüleenleeki kasutades järgmistel lainepikkustel:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Iga mõõtmist tuleb teha neli korda.

5.2. Mineraalsööt

Kui proov ei sisalda orgaanilist ainet, ei ole eelnev tuhastamine vajalik. Toimitakse vastavalt punktile 5.1.1.1, alustades teisest lõigust. Vesinikfluoriidhappega aurustamise võib ära jätta.

6. Tulemuste arvutamine

Mikroelementide kontsentratsioon analüüsitavas lahuses arvutatakse kalibreerimiskõverat kasutades ning tulemus väljendatakse mikroelementide milligrammides ühe kilogrammi proovi kohta (miljondikkudes).

7. Korduvus

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on kuni 50 mg/kg;

—	10 % suuremast tulemusest, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on 50–100 mg/kg;

—	absoluutväärtusena väljendatult 10 mg/kg, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on 100–200 mg/kg;

—	5 % suuremast tulemusest, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on üle 200 mg/kg.

8. Tähelepanek

Suure koguse fosfaadi sisaldus võib takistada raua, mangaani ja tsingi määramist. See takistus tuleb kõrvaldada, lisades proovi lantaankloriidilahust (punkt 3.11). Kuid kui proovis on massi vahekord Ca + Mg/P > 2, siis võib lantaankloriidilahuse (punkt 3.11) lisamise analüüsitavale lahusele ja kalibreerimislahusele ära jätta.

D. HALOFUGINOONI MÄÄRAMINE

DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hüdroksü-2-piperidüül)atsetonüül]-kinasoliin-4-(3H)-oon-vesinikbromiid

Halofuginoonisisaldus määratakse

—

standardis EN 17299 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Lubatud koktsidiostaatikumide seire ja määramine aditiivsel ja 1 % ja 3 % ristsaastumise tasemel ning registreerimata koktsidiostaatikumide ja ühe antibiootikumi seire ja määramine subaditiivsel tasandil segasöödas kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil koos tandemmassispektromeetriaga (LC-MS/MS)“ esitatud analüüsimeetodiga või

—	kõrgefektiivse pöördfaasilise vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit, nagu on kirjeldatud järgnevates punktides 1–8.

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata halofuginooni kogust söödas. Määramispiir on 1 mg/kg.

2. Põhimõte

Pärast kuuma veega töötlemist ekstraheeritakse halofuginoon vaba alusena etüülatsetaati ning eraldatakse hüdrokloriidina happe vesilahusesse. Ekstrakt puhastatakse ioonvahetuskromatograafia abil. Halofuginoonisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3. Reaktiivid

3.1.

HPLC-puhtusastmega atsetonitriil.

3.2.

Amberlite XAD-2 vaik.

3.3.

Ammooniumatsetaat.

3.4.

Etüülatsetaat.

3.5.

Jää-äädikhape.

3.6.

Halofuginooni standardaine (DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hüdroksü-2-piperidüül)atsetonüül]-kinasoliin-4-(3H)-oon-vesinikbromiid, E 764).

3.6.1.

Halofuginooni põhistandardlahus, 100 μg/ml

50 mg halofuginooni (punkt 3.6) kaalutakse 0,1 mg täpsusega 500 ml mõõtekolbi, lahustatakse ammooniumatsetaadi puhverlahuses (punkt 3.18), täidetakse kuni märgini puhverlahusega ja segatakse. See lahus säilib pimedas 5 °C juures kolm nädalat.

3.6.2.

Kalibreerimislahused

100 ml mõõtekolbidesse kantakse 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ja 6,0 ml põhistandardlahust (punkt 3.6.1). Täidetakse kuni märgini liikuva faasiga (punkt 3.21) ja segatakse. Lahuste halofuginooni kontsentratsioonid on vastavalt 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 and 6,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.7.

Soolhape (ρ20 umbes 1,16 g/ml).

3.8.

Metanool.

3.9.

Hõbenitraat.

3.10.

Naatriumaskorbaat.

3.11.

Naatriumkarbonaat.

3.12.

Naatriumkloriid.

3.13.

EDTA (etüleendiamiintetraäädikhape, dinaatriumsool).

3.14.

HPLC-puhtusastmega vesi.

3.15.

Naatriumkarbonaadi lahus, c = 10 g/100 ml.

3.16.

Naatriumkloriidiga küllastatud naatriumkarbonaadi lahus, c = 5 g/100 ml

50 g naatriumkarbonaati (punkt 3.11) lahustatakse vees, lahjendatakse 1 liitrini ja lisatakse kuni lahuse küllastumiseni naatriumkloriidi (punkt 3.12).

3.17.

Soolhape, umbes 0,1 mol/l

10 ml soolhapet (punkt 3.7) lahjendatakse veega kuni 1 liitrini.

3.18.

Ammooniumatsetaadi puhverlahus, umbes 0,25 mol/l

19,3 g ammooniumatsetaati (punkt 3.3) ja 30 ml äädikhapet (punkt 3.5) lahustatakse vees (punkt 3.14) ja lahjendatakse kuni 1 liitrini.

3.19.

Amberlite XAD-2 vaigu ettevalmistamine

Asjakohane kogus Amberlite’i (punkt 3.2) pestakse veega, kuni äravalatud vesifaasile tehtud hõbenitraadi (punkt 3.20) test näitab, et kõik klooriioonid on eemaldatud. Vaiku pestakse 50 ml metanooliga (punkt 3.8), metanool valatakse ära ja vaik säilitatakse värskes metanoolis.

3.20.

Hõbenitraadi lahus, umbes 0,1 mol/l

0,17 g hõbenitraati (punkt 3.9) lahustatakse 10 ml vees.

3.21.

HPLC liikuv faas

500 ml atsetonitriili (punkt 3.1) segatakse 300 ml ammooniumatsetaadi puhverlahusega (punkt 3.18) ja 1 200 ml veega (punkt 3.14). Äädikhappe (punkt 3.5) abil korrigeeritakse pH 4,3-le. Filtritakse läbi 0,22 μm filtri (punkt 4.8) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit). See lahus säilib suletud mahutis pimedas hoituna üks kuu.

4. Seadmed

4.1.

Ultrahelivann.

4.2.

Rotaatorkileaurusti.

4.3.

Tsentrifuug.

4.4.

HPLC-seade muudetava lainepikkusega ultraviolett-detektoriga või dioodireadetektoriga.

4.4.1.

Vedelikkromatograafia kolonn, 300 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 10 μm, või samaväärne.

4.5.

Klaaskolonn (300 mm × 10 mm), millel on paagutatud klaasfilter ja korkkraan.

4.6.

Klaaskiudfiltrid diameetriga 150 mm.

4.7.

Membraanfiltrid, 0,45 μm.

4.8.

Membraanfiltrid, 0,22 μm.

5. Töö käik

Märkus:

halofuginoon on vaba alusena leelistes ja etüülatsetaadi lahustes ebastabiilne. Seda ei tohi hoida etüülatsetaadis üle 30 minuti.

5.1. Üldsätted

5.1.1.

Tuleb analüüsida võrdlussööta, veendumaks, et selles ei ole halofuginooni ega segavaid aineid.

5.1.2.

Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus halofuginooni. Kontsentratsiooni 3 mg/kg saamiseks lisatakse 10 g võrdlussöödale 300 μl põhistandardlahust (punkt 3.6.1), segatakse ja oodatakse enne ekstraheerimise (punkt 5.2) alustamist 10 minutit.

Märkus:

selle meetodi puhul peab võrdlussööt olema prooviga samalaadne ja analüüsimisel ei tohi selles leiduda halofuginooni.

5.2. Ekstraheerimine

10 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,1 g täpsusega 200 ml tsentrifuugiküvetti, lisatakse 0,5 g naatriumaskorbaati (punkt 3.10), 0,5 g EDTAd (punkt 3.13) ja 20 ml vett ning segatakse. Küvett asetatakse 5 minutiks veevanni (80 °C). Pärast toatemperatuurini jahutamist lisatakse 20 ml naatriumkarbonaadi lahust (punkt 3.15) ja segatakse. Lisatakse kohe 100 ml etüülatsetaati (punkt 3.4) ja loksutatakse käes tugevalt 15 sekundit. Küvett asetatakse kolmeks minutiks ultrahelivanni (punkt 4.1) ning avatakse kork. Tsentrifuugitakse kaks minutit ja dekanteeritakse etüülatsetaadi faas läbi klaaskiudfiltri (punkt 4.6) 500 ml jaotuslehtrisse. Proovi ekstraheerimist korratakse teise 100 ml etüülatsetaadi kogusega. Kogutud ekstrakte pestakse üks minut 50 ml naatriumkloriidiga küllastatud naatriumkarbonaadi lahusega (punkt 3.16) ja veekiht valatakse ära.

Orgaanilist kihti ekstraheeritakse 1 minut 50 ml soolhappega (punkt 3.17). Alumine happekiht kallatakse 250 ml jaotuslehtrisse. Orgaanilist kihti ekstraheeritakse uuesti 1,5 minutit täiendava 50 ml soolhappega ja lisatakse esimesele ekstraktile. Kogutud happeekstrakte pestakse 10 ml etüülatsetaadiga (punkt 3.4) loksutades umbes 10 sekundit.

Veekiht kantakse kvantitatiivselt 250 ml ümarkolbi ja orgaaniline faas valatakse ära. Happelahusest aurustatakse rotaatorkileaurusti (punkt 4.2) abil kogu allesjäänud etüülatsetaat. Veevanni temperatuur ei tohi olla üle 40 °C. Umbes 25-millibaarises vaakumis eemaldatakse 5 minutiga temperatuuril 38 °C kogu allesjäänud etüülatsetaat.

5.3. Puhastamine

5.3.1. Amberlite’i kolonni ettevalmistamine

XAD-2 kolonn valmistatakse ette eraldi iga proovi ekstrakti jaoks. 10 g valmistatud Amberlite’i (punkt 3.19) kantakse metanooliga (punkt 3.8) klaaskolonni (punkt 4.5). Vaigukihi peale pannakse väike klaasvillatropp. Metanool kallatakse kolonnist välja ja vaiku pestakse 100 ml veega, peatades voolu, kui vedelik jõuab vaigukihi ülemise piirini. Kolonnil lastakse enne kasutamist 10 minutit tasakaalustuda. Kolonni ei tohi kunagi lasta ära kuivada.

5.3.2. Proovi puhastamine

Ekstrakt (punkt 5.2) kantakse kvantitatiivselt ettevalmistatud Amberlite’i kolonni (punkt 5.3.1), elueeritakse, valades eluaadi ära. Elueerimiskiirus ei tohi ületada 20 ml/min. Ümarkolb loputatakse 20 ml soolhappega (punkt 3.17) ja seda lahust kasutatakse vaigukolonni pesemiseks. Allesjäänud happelahus kõrvaldatakse õhuvoolu abil. Pesulahused valatakse ära. Kolonni lisatakse 100 ml metanooli (punkt 3.8) ja lastakse elueerida 5–10 ml, kogudes eluaadi 250 ml ümarkolbi. Allesjäänud metanoolil lastakse 10 minutit vaiguga tasakaalustuda ja jätkatakse elueerimist kiirusel kuni 20 ml/min, kogudes eluaadi samasse ümarkolbi. Metanool aurustatakse rotaatorkileaurusti (punkt 4.2) abil, veevanni temperatuur ei tohi olla üle 40 °C. Jääk kantakse liikuva faasi (punkt 3.21) abil kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Täidetakse liikuva faasiga kuni märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtritakse läbi membraanfiltri (punkt 4.7). See lahus hoitakse HPLC määramise (punkt 5.4) jaoks.

5.4. HPLC määramine

5.4.1. Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):

Vedelikkromatograafia kolonn (punkt 4.4.1)

HPLC liikuv faas (punkt 3.21)

Voolukiirus: 1,5–2 ml/min

Avastamise lainepikkus: 243 nm

Sissesüstitav ruumala: 40–100 μl

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides korduvalt kalibreerimislahust (punkt 3.6.2) kontsentratsiooniga 3,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused (pindalad) ja retentsiooniajad.

5.4.2. Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (punkt 3.6.2) süstitakse korduvalt ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.4.3. Proovilahus

Prooviekstrakti (punkt 5.3.2) süstitakse mitu korda samas mahus kui kalibreerimislahuste puhul ja määratakse halofuginoonipiikide keskmine kõrgus (pindala).

6. Tulemuste arvutamine

Proovilahuse halofuginoonipiikide keskmise kõrguse (pindala) alusel määratakse kalibreerimisgraafiku (punkt 5.4.2) abil proovilahuse kontsentratsioon (μg/ml).

Halofuginoonisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c	:	proovilahuse halofuginoonikontsentratsioon (μg/ml);
m	:	kaalutise mass grammides.

7. Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1. Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6,0 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (punkt 3.6.2) spektreid.

7.1.1. Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (punkt 3.6.2). Lisatud halofuginoonikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud halofuginoonikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes halofuginoonipiigi kõrgus. Piigi laius poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti halofuginoonipiigi laiusest.

7.1.2. Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

a)	proovi ja standardi kromatogrammidel oleva piigi tipu spektri suurima neeldumise lainepikkused peavad analüüsiseadme lahutusvõime piires ühte langema. Dioodireadetektori lahutusvõime on tavaliselt ± 2 nm;

lainepikkustel 225–300 nm ning suhtelise neeldumise vahemikus 10–100 % peavad proovi ja standardi piigi tipu spektrid kromatogrammil ühte langema. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui nimetatud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kahe spektri kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % standardainele vastavatest neeldumistest;

lainepikkustel 225–300 nm ei tohi prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduvas osas, tipus ja allapoole suunduvas osas registreeritud spektrid erineda üksteisest nende spektriosade puhul, mis jäävad 10–100 % suhtelise neeldumise piirkonda. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui mainitud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % piigi tipu spektri vastavatest neeldumistest.

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2. Korduvus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi kuni 3 mg/kg suuruste halofuginoonisisalduste puhul ületada 0,5 mg/kg.

7.3. Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %.

8. Võrdlusuuringu tulemused

Korraldati võrdlusuuring, (8) mille käigus kaheksas laboris analüüsiti kolme proovi.

Tulemused

Proov A (võrdlusproov)

Algul

Proov B (jahu)

Proov C (graanulid)

Algul

Kahe kuu pärast

Algul

Kahe kuu pärast

Keskmine [mg/kg]

2,80

2,42

2,89

2,45

SR [mg/kg]

—

0,45

0,43

0,40

0,42

CVR [%]

—

Rec. [%]

ND=	allpool avastamisläve

SR=	korratavust iseloomustav standardhälve

CVR=	korratavuse variatsioonikordaja (%)

Rec.=

saagis: (%)

E. ROBENIDIINI MÄÄRAMINE

1,3-bis[(p-klorobensülideen)amino]guanidiinhüdrokloriid

Robenidiinisisaldus määratakse

—

—	kõrgefektiivse pöördfaasilise vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit, nagu on kirjeldatud järgnevates punktides 1–8.

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata robenidiini kogust söödas. Määramispiir on 5 mg/kg.

2. Põhimõte

Proov ekstraheeritakse hapestatud metanooliga. Ekstrakt kuivatatakse ja selle alikvootne osa puhastatakse alumiiniumoksiidi kolonnis. Robenidiin elueeritakse kolonnist metanooliga, kontsentreeritakse ja viiakse liikuva faasiga sobiva mahuni. Robenidiinisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3. Reaktiivid

3.1.

Metanool

3.2.

Hapestatud metanool

4,0 ml soolhapet (ρ20 = 1,18 g/ml) viiakse 500 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse kuni märgini metanooliga (punkt 3.1) ja segatakse. See lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.3.

HPLC-puhtusastmega atsetonitriil

3.4.

Molekulaarsõel

Tüüp 3A, 8–12 mešši (1,6–2,5 mm osakesed, kristalne alumosilikaat, pooride läbimõõt 0,3 mm)

3.5.

Alumiiniumoksiid, happeline aktiivsusaste 1, kolonnkromatograafia jaoks

100 g alumiiniumoksiidi viiakse sobivasse anumasse ja lisatakse 2,0 ml vett. Suletakse ja loksutatakse ligikaudu 20 minutit. Hoitakse korralikult suletud anumas.

3.6.

Kaaliumdivesinikfosfaadi lahus, c = 0,025 mol/l

1 000 ml mõõtekolvis lahustatakse 3,40 g kaaliumdivesinikfosfaati vees (HPLC-puhtusastmega), kolb täidetakse märgini ja segatakse.

3.7.

Dinaatriumvesinikfosfaadi lahus, c = 0,025 mol/l

1 l mõõtekolvis lahustatakse 3,55 g veevaba dinaatriumvesinikfosfaati (või 4,45 g dihüdraati või 8,95 g dodekahüdraati) vees (HPLC-puhtusastmega), kolb täidetakse märgini veega ja segatakse.

3.8.

HPLC liikuv faas

Segada järgmised reaktiivid:

650 ml atsetonitriili (punkt 3.3),

250 ml vett (HPLC-puhtusastmega),

50 ml kaaliumdivesinikfosfaadi lahust (punkt 3.6),

50 ml kaaliumdivesinikfosfaadi lahust (punkt 3.7).

Filtritakse läbi 0,22 μm filtri (punkt 4.6) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit).

3.9.

Standardaine

Puhas robenidiin: 1,3-bis[(4-klorobensülideen) amino]guanidiinhüdrokloriid.

3.9.1.

Robenidiini põhistandardlahus: 300 μg/ml

30 mg robenidiini standardainet (punkt 3.9) kaalutakse 0,1 mg täpsusega. Lahustatakse hapestatud metanooliga 100 ml mõõtekolvis (punkt 3.2), täidetakse kolb märgini sama lahustiga ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja hoitakse pimedas kohas.

3.9.2.

Robenidiini vahestandardlahus: 12 μg/ml

Valatakse 10,0 ml põhistandardlahust (punkt 3.9.1) 250 ml mõõtekolbi, täidetakse see liikuva faasiga (punkt 3.8) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja hoitakse pimedas kohas.

3.9.3.

Kalibreerimislahused

50 ml mõõtekolbidesse viiakse 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 ja 25,0 ml vahestandardlahust (punkt 3.9.2). Täidetakse kuni märgini liikuva faasiga (punkt 3.8) ja segatakse. Lahuste robenidiinisisaldused on vastavalt 1,2; 2,4; 3,6; 4,8 ja 6,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.10.

HPLC-puhtusastmega vesi

4. Seadmed

4.1.

Klaaskolonn

Valmistatud tumedast klaasist, korkkraaniga, ligikaudu 150 ml reservuaariga, sisemine läbimõõt 10–15 mm, kõrgus 250 mm.

4.2.

Mehaaniline loksuti või magnetsegur.

4.3.

Rotaatorkileaurusti.

4.4.

HPLC-seadmed erinevatel lainepikkustel registreeriva ultraviolettdetektoriga või dioodireadetektoriga, mis töötab vahemikus 250–400 nm

4.4.1.

Vedelikkromatograafia kolonn: 300 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 10 μm või samaväärne

4.5.

Klaaskiudfilterpaber (Whatman GF/A või selle analoog).

4.6.

Membraanfiltrid, 0,22 μm.

4.7.

Membraanfiltrid, 0,45 μm.

5. Töö käik

Märkus:

robenidiin on valgustundlik. Kõikide operatsioonide puhul tuleb kasutada tumedast klaasist anumaid.

5.1. Üldsätted

5.1.1.

Tuleb analüüsida võrdlussööta, veendumaks, et selles ei ole robenidiini ega teisi segavaid aineid.

5.1.2.

Tuleb teha saagisekatse, analüüsides võrdlussööta (punkt 5.1.1), mida on rikastatud ligikaudu sama koguse robenidiiniga, nagu seda sisaldab proov. Et saada kontsentratsiooni 60 mg/kg, kantakse 3,0 ml põhistandardlahust (punkt 3.9.1) 250 ml koonilisse kolbi. Lahus aurustatakse lämmastikuvoolus kuni ligikaudu 0,5 ml-ni. Lisatakse 15 g võrdlussööta, segatakse ja jäetakse enne ekstraheerima (punkt 5.2) asumist 10 minutiks seisma.

Märkus:

selle meetodi puhul peab võrdlussööt olema prooviga samalaadne ja analüüsimisel ei tohi selles leiduda halofuginooni.

5.2. Ekstraheerimine

Umbes 15 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega. Proov pannakse 250 ml koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml hapestatud metanooli (punkt 3.2), kolb suletakse ja loksutatakse üks tund loksutil (punkt 4.2). Lahus filtritakse läbi klaaskiudfilterpaberi (punkt 4.5) ja kogu filtraat kogutakse 150 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 7,5 g molekulaarsõela (punkt 3.4), suletakse ja loksutatakse viis minutit. Filtritakse kohe läbi klaaskiudfilterpaberi. See lahus säilitatakse puhastamiseks (punkt 5.3).

5.3. Puhastamine

5.3.1. Alumiiniumoksiidi kolonni ettevalmistamine

Klaaskolonni (punkt 4.1) põhja asetatakse väike klaasvatist tropp ja surutakse see klaaspulka kasutades kokku. Kaalutakse 11,0 g ettevalmistatud alumiiniumoksiidi (punkt 3.5) ja pannakse kolonni. Tuleb jälgida, et kokkupuutumine õhuga oleks selles etapis minimaalne. Koputatakse kergelt vastu kolonni alumist otsa, et alumiiniumoksiid paigutuks ühtlaselt.

5.3.2. Proovi puhastamine

Kolonni pipetitakse 5,0 ml vastavalt punktile 5.2 ettevalmistatud prooviekstrakti. Pipeti ots asetatakse tihedalt kolonni seina vastu ja lastakse lahusel absorbeeruda alumiiniumoksiidi. Robenidiin elueeritakse kolonnist, kasutades 100 ml metanooli (punkt 3.1) voolukiirusel 2–3 ml/min, ja eluaat kogutakse 250 ml ümarkolbi. Metanoolilahus aurustatakse rotaatorkileaurusti (punkt 4.3) abil kuivaks vähendatud rõhul, temperatuuril 40 °C. Jääk lahustatakse uuesti 3–4 ml liikuvas faasis (punkt 3.8) ja viiakse kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Kolbi loputatakse mitme 1–2 ml koguse liikuva faasiga ja pannakse need loputusvedelikud mõõtekolbi. Kolb täidetakse sama lahustiga märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtritakse läbi 0,45 μm membraanfiltri (punkt 4.7). Seda lahust hoitakse HPLC määramiseks (punkt 5.4).

5.4. HPLC määramine

5.4.1. Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need annavad samaväärsed tulemused):

Vedelikkromatograafia kolonn (punkt 4.4.1)

HPLC liikuv faas (punkt 3.8)

Voolukiirus: 1,5–2 ml/min

Detektori lainepikkus: 317 nm

Sissesüstitav ruumala: 20–50 μl

Kromatograafilise süsteemi stabiilsust kontrollitakse, süstides 3,6 μg/ml sisaldavat kalibreerimislahust (punkt 3.9.3) mitu korda, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused ja retentsiooniajad.

5.4.2. Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (punkt 3.9.3) süstitakse mitu korda ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimiskõver, kasutades kalibreerimislahuste keskmisi piigi kõrgusi või pindalasid ordinaatidena ja vastavaid kontsentratsioone μg/ml abstsissidena.

5.4.3. Proovilahus

Prooviekstrakti (punkt 5.3.2) süstitakse mitu korda, kasutades sama mahtu nagu kalibreerimislahuste puhul, ja määratakse robenidiini piikide keskmine kõrgus (pindala).

6. Tulemuste arvutamine

Proovilahuse robenidiini piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi määratakse proovilahuse kontsentratsioon μg/ml, kasutades kalibreerimisgraafikut (punkt 5.4.2).

Robenidiini sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c	=	proovilahuse robenidiinikontsentratsioon (μg/ml);
m	=	kaalutise mass grammides.

7. Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1. Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (punkt 3.9.3) spektreid.

7.1.1. Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (punkt 3.9.3). Lisatav robenidiinikogus peab olema ligikaudu võrdne prooviekstrakti analüüsimisel leitud robenidiini kogusega.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma ainult robenidiinipiigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti karbadoksipiigi laiusest.

7.1.2. Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

a)	proovi ja standardi kromatogrammidel oleva piigi tipu spektri suurima neeldumise lainepikkused peavad analüüsiseadme lahutusvõime piires ühte langema. Dioodireadetektori puhul on see tavaliselt ligikaudu 2 nm;

lainepikkustel 250–400 nm ning suhtelise neeldumise vahemikus 10–100 % peavad proovi ja standardi piigi tipu spektrid kromatogrammil ühte langema. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui nimetatud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kahe spektri kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % standardainele vastavatest neeldumistest;

lainepikkustel 250–400 nm ei tohi prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduvas osas, tipus ja allapoole suunduvas osas registreeritud spektrid erineda üksteisest nende spektriosade puhul, mis jäävad 10–100 % suhtelise neeldumise piirkonda. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui mainitud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % piigi tipu spektri vastavatest neeldumistest.

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2. Korduvus

Robenidiinisisalduse puhul, mis on suurem kui 15 mg/kg, ei tohi sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ületada 10 % suuremast tulemusest.

7.3. Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 85 %.

8. Võrdlusuuringu tulemused

Korraldati liidu võrdlusuuring, milles 12 laborit analüüsisid nelja kodulindude ja küülikute söödajahu või -graanulite proovi. Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi. Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

Kodulinnud

Küülikud

Jahu

Graanulid

Jahu

Graanulid

Keskmine [mg/kg]

27,00

27,99

43,6

40,1

sr [mg/kg]

1,46

1,26

1,44

1,66

CVr [%]

5,4

4,5

3,3

4,1

SR [mg/kg]

4,36

3,36

4,61

3,91

CVR [%]

16,1

12,0

10,6

9,7

Saagis [%]

90,0

93,3

87,2

80,2

sr=	korduvust iseloomustav standardhälve

CVr=	korduvuse variatsioonikordaja (%)

SR=	korratavust iseloomustav standardhälve

CVR=	korratavuse variatsioonikordaja (%)

F. DIKLASURIILI MÄÄRAMINE

(+)-4-klorofenüül [2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahüdro-3,5-diokso-1,2,4-triasiin-2-üül) fenüül] atsetonitriil

Diklasuriilisisaldus määratakse

—

—	kõrgefektiivse kolmikgradient pöördfaasilise vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit, nagu on kirjeldatud järgnevates punktides 1–9.

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata diklasuriili kogust segasöödas ja eelsegudes (9). Avastamispiir on 0,1 mg/kg, määramispiir 0,5 mg/kg. Saavutada võib veel madalamaid määramispiire, aga kasutaja peab selle valideerima.

2. Põhimõte

Pärast sisestandardi lisamist ekstraheeritakse proov hapestatud metanooliga. Söötade puhul puhastatakse ekstrakti alikvoot tahkefaasilises C18-ekstraktsioonihülsis. Diklasuriil elueeritakse ekstraheerimishülsist välja hapestatud metanooli ja vee seguga. Pärast lahuse aurustamist lahustatakse jääk N, N-dimetüülformamiidi vesilahuses. Eelsegude puhul aurustatakse ekstrakt kohe ja jääk lahustatakse N, N-dimetüülformamiidi vesilahuses. Diklasuriilisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades kolmekomponendilist gradienti ja UV-detektorit.

3. Reaktiivid

3.1.

HPLC-puhtusastmega vesi

3.2.

Ammooniumatsetaat

3.3.

Tetrabutüülammooniumvesiniksulfaat (TBHS)

3.4.

HPLC-puhtusastmega atsetonitriil

3.5.

HPLC-puhtusastmega metanool

3.6.

N, N-dimetüülformamiid (DMF).

3.7.

Soolhape, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8.

Standardaine: diklasuriil: garanteeritud puhtusega (+)-4-klorofenüül [2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahüdro–3,5-diokso-1,2,4-triasiin-2-üül) fenüül] atsetonitriil

3.8.1.

Diklasuriili põhistandardlahus, 500 μg/ml

25 mg diklasuriili standardainet (punkt 3.8) kaalutakse 0,1 mg täpsusega ja viiakse 50 ml mõõtekolbi. Lahustatakse N, N-dimetüülformamiidis (punkt 3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (punkt 3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril kuni 4 °C säilib lahus muutumatuna ühe kuu (10).

3.8.2.

Diklasuriili standardlahus, 50 μg/ml

5,00 ml põhistandardlahust (punkt 3.8.1) pannakse 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (punkt 3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril kuni 4 °C säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

3.9.

Sisestandardaine: 2,6-dikloro-α-(4-klorofenüül)-4-(4,5-dihüdro–3,5-diokso-1,2,4-triasiin-2(3H)-üül)-α-metüülbenseenatsetonitriil (metüüldiklasuriil)

3.9.1.

Sisestandard põhistandardlahus, 500 μg/ml

25 mg sisestandardainet (punkt 3.9) kaalutakse 0,1 mg täpsusega ja pannakse 50 ml mõõtekolbi. Lahustatakse N, N-dimetüülformamiidis (punkt 3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (punkt 3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril kuni 4 °C säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

3.9.2.

Sisestandardlahus, 50 μg/ml

5,00 ml sisestandardi põhistandardlahust (punkt 3.9.1) pannakse 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse N,N-dimetüülformamiidiga (punkt 3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril kuni 4 °C säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

3.9.3.

Sisestandardlahus eelsegude jaoks, p/1 000 mg/ml (p = diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus (mg/kg))

p/10 mg sisestandardlahust kaalutakse 0,1 mg täpsusega, pannakse 100 ml mõõtekolbi, lahustatakse ultrahelivannis (punkt 4.7) N, N-dimetüülformamiidis (punkt 3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril kuni 4 °C säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

3.10.

Kalibreerimislahused

3.10.1.

Kalibreerimislahus, 1 μg/ml (diklasuriil)

1,00 ml diklasuriili standardlahust (punkt 3.8.2) ja 2,00 ml sisestandardlahust (punkt 3.9.2) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi. Lisatakse 17 ml N,N-dimetüülformamiidi (punkt 3.6), täidetakse kolb veega kuni märgini (punkt 3.1) ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.10.2.

Kalibreerimislahus, 2 μg/ml (diklasuriil)

2,00 ml diklasuriili standardlahust (punkt 3.8.2) ja 2,00 ml sisestandardlahust (punkt 3.9.2) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi. Lisatakse 16 ml N,N-dimetüülformamiidi (punkt 3.6), täidetakse kolb veega kuni märgini (punkt 3.1) ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.10.3.

Kalibreerimislahus, 3 μg/ml (diklasuriil)

3,00 ml diklasuriili standardlahust (punkt 3.8.2) ja 2,00 ml sisestandardlahust (punkt 3.9.2) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi. Lisatakse 15 ml N,N-dimetüülformamiidi (punkt 3.6), täidetakse kolb veega kuni märgini (punkt 3.1) ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.10.4.

Kalibreerimislahus, 4 μg/ml (diklasuriil)

4,00 ml diklasuriili standardlahust (punkt 3.8.2) ja 2,00 ml sisestandardlahust (punkt 3.9.2) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi. Lisatakse 14 ml N,N-dimetüülformamiidi (punkt 3.6), täidetakse kolb veega kuni märgini (punkt 3.1) ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.10.5.

Kalibreerimislahus, 5 μg/ml (diklasuriil)

5,00 ml diklasuriili standardlahust (punkt 3.8.2) ja 2,00 ml sisestandardlahust (punkt 3.9.2) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi. Lisatakse 13 ml N,N-dimetüülformamiidi (punkt 3.6), täidetakse kolb veega kuni märgini (punkt 3.1) ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

Märkus:

käesoleva protokolli kasutamisel hõlmavad kalibreerimislahused (punkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 ja 3.10.5) söödas leiduva diklasuriili kontsentratsioone vahemikus 0,5 to 2,5 mg/kg.

3.11.

Tahkefaasiline C18-ekstraktsioonihülss (nt Mega Bond Elut), suurus: 20 cm3, sorbendi mass: 5 000 mg (katseseisundisse viimine tarnija juhiste kohaselt).

3.12.

Ekstrahent: hapestatud metanool.

5,0 ml soolhapet (punkt 3.7) pipetitakse 1 000 ml metanooli (punkt 3.5) ja segatakse.

3.13.

HPLC liikuv faas

3.13.1.

Eluent A: ammooniumatsetaadi ja tetrabutüülammooniumvesiniksulfaadi lahus.

5 g ammooniumatsetaati (punkt 3.2) ja 3,4 g tetrabutüülammooniumvesiniksulfaati (punkt 3.3) lahustatakse 1 000 ml vees (punkt 3.1) ja segatakse.

3.13.2.

Eluent B: atsetonitriil (punkt 3.4).

3.13.3.

Eluent C: metanool (punkt 3.5).

4. Seadmed

4.1.

Mehaaniline loksuti.

4.2.

HPLC seadmed, mis võimaldavad kasutada kolmekomponendilist gradienti:

4.2.1.

Vedelikkromatograafia kolonn 100 × 4,6 mm, täidis: Hypersil ODS, 3 μm või samaväärne.

4.2.2.

Muudetava lainepikkusega UV-detektor või dioodireadetektor.

4.3.

Rotaatorkileaurusti.

4.4.

Membraanfilter (nt kemikaalikindel nailon), 0,45 μm.

4.5.

Ühekorrasüstal, 5 ml.

4.6.

Vaakumkollektor.

4.7.

Ultrahelivann.

5. Töö käik

5.1. Üldsätted

5.1.1. Võrdlussööt

Tuleb analüüsida võrdlussööta, veendumaks, et selles ei ole ei diklasuriili ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ja selles tohi leiduda diklasuriili ega segavaid aineid.

5.1.2. Saagisekatse

Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus diklasuriili. Et saada kontsentratsiooni 1 mg/kg, kantakse 50 g võrdlussöödale 0,1 ml põhistandardlahust (punkt 3.8.1), segatakse hoolikalt ja jäetakse 10 minutiks seisma, segades veel mitu korda enne katse jätkamist vastavalt punktile 5.2.

Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt punkt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse analüüsitavale proovile ligikaudu sama suur diklasuriilikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.

5.2. Ekstraheerimine

5.2.1. Segasööt

Umbes 50 g proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega. See pannakse 500 ml koonilisse kolbi, lisatakse 1,00 ml sisestandardlahust (punkt 3.9.2) ja 200 ml ekstrahenti (punkt 3.12) ning korgitakse kolb kinni. Segu loksutatakse öö jooksul loksutil (punkt 4.1). Lastakse 10 minutit settida. Kantakse 20 ml supernatandi alikvooti sobivasse klaasanumasse ja lahjendatakse 20 ml veega (punkt 3.1). Lahus kantakse ekstraktsioonihülsile (punkt 3.11) ja juhitakse sellest läbi vaakumi abil (punkt 4.6). Hülssi pestakse 25 ml ekstrahendi (punkt 3.12) ja vee (punkt 3.1) seguga, 65 + 35 (v + v). Kogutud fraktsioonid visatakse ära ning elueeritakse ühendid, kasutades 25 ml ekstrahendi (punkt 3.12) ja vee segu 80 + 20 (v + v). Seda fraktsiooni aurustatakse 60 °C juures pöördaurustil (punkt 4.3), kuni see saab kuivaks. Jääk lahustatakse 1,0 ml N, N-dimetüülformamiidis (punkt 3.6), lisatakse 1,5 ml vett (punkt 3.1) ja segatakse. Filtritakse läbi ühekorrasüstlale (punkt 4.5) kinnitatud membraanfiltri (punkt 4.4). Seejärel alustatakse HPLC määramist (punkt 5.3).

5.2.2. Eelsegud

Umbes 1 g proovi kaalutakse 0,001 g täpsusega. See pannakse 500 ml koonilisse kolbi, lisatakse 1,00 ml sisestandardlahust (punkt 3.9.3) ja 200 ml ekstrahenti (punkt 3.12) ning korgitakse kolb kinni. Segu loksutatakse öö jooksul loksutil (punkt 4.1). Lastakse 10 minutit settida. Kantakse 10 000/p ml (p = diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus mg/kg) supernatandi alikvooti sobiva suurusega ümarkolbi. Aurustatakse pöördaurustis (punkt 4.3) alandatud rõhu ja 60 °C juures, kuni proov saab kuivaks. Jääk lahustatakse uuesti 10,0 ml N, N-dimetüülformamiidis (punkt 3.6), lisatakse 15,0 ml vett (punkt 3.1) ja segatakse. Seejärel alustatakse HPLC määramist (punkt 5.3).

5.3. HPLC määramine

5.3.1. Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed või paremad tulemused).

—	Vedelikkromatograafia kolonn (punkt 4.2.1): 100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, täidise terasuurus 3 μm või samaväärne

—

Liikuv faas

—	Eluent A (punkt 3.13.1): ammooniumatsetaadi ja tetrabutüül- ammooniumvesiniksulfaadi vesilahus.

—	Eluent B (punkt 3.13.2): atsetonitriil.

—	Eluent C (punkt 3.13.3): metanool.

—

Elueerimisviis – lineaarne gradient

—	algtingimused: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V);

—	10 minuti pärast gradientelueerimine 30 minutit: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V);

—	Elueeritakse Bga 10 minutit.

—	Voolukiirus: 1,5–2 ml/min

—	Sissesüstitav ruumala: 20 μl

—	Detektori lainepikkus: 280 nm.

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides mitu korda kolonni kalibreerimislahust (punkt 3.10.2), mis sisaldab 2 μg/ml diklasuriili ja sisestandardlahust, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused ja retentsiooniajad.

5.3.2. Kalibreerimislahuste kromatograafiline analüüs

20 μl iga kalibreerimislahust (punkt 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 ja 3.10.5) süstitakse kaks korda, tehakse kindlaks ja integreeritakse diklasuriili ja sisestandardi piigid ning koostatakse kalibreerimiskõver, mis põhineb diklasuriili keskmiste piigi kõrguste või pindalade ja sisestandardi keskmiste piigi kõrguste või pindalade suhtel diklasuriili kontsentratsiooni kalibreerimislahustes (μg/ml).

5.3.3. Proovilahuste kromatograafiline analüüs

Proovilahusest (punkt 5.2.1 või 5.2.2) süstitakse 20 μl kaks korda kolonni ja määratakse diklasuriili ning sisestandardi piikide keskmine kõrgus või pindala.

6. Tulemuste arvutamine

6.1. Segasööt

Diklasuriilisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

või

kus:

—	kõrgus (d,s) on diklasuriili piigi kõrgus proovilahuses (punkt 5.2.1);

—	pindala (d,s) on diklasuriili piigi pindala proovilahuses (punkt 5.2.1);

—	kõrgus (i,s) on sisestandardi piigi kõrgus proovilahuses (punkt 5.2.1);

—	pindala (i,s) on sisestandardi piigi pindala proovilahuses (punkt 5.2.1);

—	b on kalibreerimislahuste (punktid 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 ja 3.10.5) põhjal vastavalt punktile 5.3.2 saadud kalibreerimiskõvera vabaliige;

—	a on kalibreerimislahuste (punktid 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 ja 3.10.5) põhjal vastavalt punktile 5.3.2 saadud kalibreerimiskõvera tõus;

—	m on kaalutise mass grammides;

—	V on prooviekstrakti lõplik maht milliliitrites pärast uuesti lahustamist vastavalt punktile 5.2.1 (s.o 2,5 ml).

6.2. Eelsegud

Diklasuriilisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

või

kus:

—	kõrgus (d,s) on diklasuriili piigi kõrgus proovilahuses (punkt 5.2.2);

—	pindala (d,s) on diklasuriili piigi pindala proovilahuses (punkt 5.2.2);

—	kõrgus (i,s) on sisestandardi piigi kõrgus proovilahuses (punkt 5.2.2);

—	pindala (i,s) on sisestandardi piigi pindala proovilahuses (punkt 5.2.2);

—	b on kalibreerimislahuste (punktid 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 ja 3.10.5) põhjal vastavalt punktile 5.3.2 saadud kalibreerimiskõvera vabaliige;

—	a on kalibreerimislahuste (punktid 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 ja 3.10.5) põhjal vastavalt punktile 5.3.2 saadud kalibreerimiskõvera tõus;

—	m on kaalutise mass grammides;

—	V on prooviekstrakti lõplik maht milliliitrites pärast uuesti lahustamist vastavalt punktile 5.2.2 (s.o 25 ml).

—	p on diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus (mg/kg).

7. Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1. Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti (punkt 5.2.1 või 5.2.2) ja kalibreerimislahuse (punkt 3.10.2) spektreid.

7.1.1. Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile (punkt 5.2.1 või 5.2.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (punkt 3.10.2). Lisatud diklasuriilikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud diklasuriilikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes diklasuriilipiigi ja sisestandardi piigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti diklasuriili piigi või sisestandardi piigi laiusest.

7.1.2. Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

a)	proovi ja standardi kromatogrammidel oleva piigi tipu spektri suurima neeldumise lainepikkused peavad analüüsiseadme lahutusvõime piires ühte langema. Dioodireadetektori lahutusvõime on tavaliselt ± 2 nm;

Lainepikkustel 230–320 nm ning suhtelise neeldumise vahemikus 10–100 % peavad proovi ja standardi piigi tipu spektrid kromatogrammil ühte langema. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui mainitud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kahe spektri kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % standardainele vastavatest neeldumistest;

lainepikkustel 230–320 nm ei tohi prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduvas osas, tipus ja allapoole suunduvas osas registreeritud spektrid erineda üksteisest nende spektriosade puhul, mis jäävad 10–100 % suhtelise neeldumise piirkonda. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui nimetatud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % piigi tipu spektri vastavatest neeldumistest.

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2. Korduvus

Kahe osaprooviga tehtud kahe sõltumatu mõõtmise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	30 % suuremast tulemusest diklasuriilisisalduse vahemikus 0,5–2,5 mg/kg;

—	0,75 mg/kg diklasuriilisisalduse vahemikus 2,5–5 mg/kg;

—	15 % suuremast tulemusest, kui diklasuriilisisaldus on suurem kui 5 mg/kg.

7.3. Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)proovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %.

8. Võrdlusuuringu tulemused

Korraldati kaks võrdlusuuringut. 1994. aastal tegi üks laborite rühm esimese uuringu, mille käigus analüüsis kaht eelsegu proovi (O 100, A 100) ja kolme kodulindude täiendsööda proovi (L1, Z1, K1). Üht eelsegu segati orgaanilise maatriksiga (O 100) ja teist anorgaanilise maatriksiga (A 100). Teoreetiline diklasuriilisisaldus on 100 mg/kg. Laboritele tehti ülesandeks iga proovi üks kord või kaks korda analüüsida. (Üksikasjalikumat teavet esimese võrdlusuuringu kohta võib leida ajakirjas Journal of AOAC International, köide 77, nr 6, 1994, lk 1359–1361.)

Teise võrdlusuuringu käigus analüüsiti kolme kodulindude segasööta – ühe diklasuriilisisaldus oli 0,9 mg/kg (MAT 1), teisel 1,5 mg/kg (MAT 2) ning kolmas oli võrdlussööt (MAT 3). Üksikasjalikumat teavet teise uuringu kohta võib leida Teadusuuringute Ühiskeskuse 2016. aasta tehnilises aruandes ja ajakirjas Journal of AOAC International, köide 102, nr 2, 2019, lk 646–652.) Kahe võrdlusuuringu tulemused on esitatud järgmises tabelis.

Proov 1A 100

Proov 2O 100

Proov 3 L1

Proov 4 Z1

Proov 5 K1

Proov 6

MAT 1

Proov 7

MAT 2

Proov 8

MAT 3

Keskmine (mg/kg)

100,8

103,5

0,89

1,15

0,89

1,0

1,5

< Määramispiir

Sr (mg/kg)

5,88

7,64

0,15

0,02

0,03

0,11

0,07

—

CVr (%)

5,83

7,38

17,32

1,92

3,34

11,2

4,5

—

SR (mg/kg)

7,59

7,64

0,17

0,11

0,12

0,18

0,21

—

CVR (%)

7,53

7,38

18,61

9,67

13,65

18,1

14,3

—

Nominaalsisaldus (mg/kg)

100

1,0

0,9

1,5

—

Viide (*1)

Esimene uuring (1 994 )

Teine uuring (2 015 )

L =	laborite arv

n =	üksikmääramiste arv

Sr =	korduvust iseloomustav standardhälve

CVr =

korduvuse variatsioonikordaja

SR =	korratavust iseloomustav standardhälve

CVR =

korratavuse variatsioonikordaja

LOQ =

määramispiir

9. Üldised märkused

Eelnevalt peab olema näidatud, et diklasuriili piigi kõrgus (pindala) on mõõdetavas vahemikus lineaarses sõltuvuses kontsentratsioonist.

Vähemalt suure rasvasisaldusega (antud juhul üle 12 %) segasööda diklasuriilisisalduse määramiseks võib analüüsimeetodi asendada mõne muu HPLC-l põhineva meetodiga, nt kõrgefektiivne vedelikkromatograafia koos tandemmassispektromeetriaga (LC-MS/MS), eeldusel et alternatiivmeetodil on samaväärsed tulemuslikkusnäitajad (saagis, täpsus korduvuse ja korratavuse tingimustel).

G. NAATRIUMLASALOTSIIDI MÄÄRAMINE

Polüeetermonokarboksüülhappe naatriumsool, saadud Streptomyces lasaliensis’est

Naatriumlasalotsiidisisaldus määratakse

—

—	kõrgefektiivse pöördfaasilise vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades spektrofluorimeetrilist (fluorestsents)detektorit, nagu on kirjeldatud järgnevates punktides 1–8.

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata naatriumlasalotsiidi kogust söödas. Avastamiskünnis on 5 mg/kg, määramispiir 10 mg/kg.

2. Põhimõte

Naatriumlasalotsiid ekstraheeritakse proovist hapestatud metanooliga ja määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades spektrofluoromeetrilist (fluorestsents)detektorit.

3. Reaktiivid

3.1.

Kaaliumdivesinikfosfaat (KH2PO4)

3.2.

Ortofosforhape, w (w/w) = 85 %

3.3.

Ortofosforhappe lahus, c = 20 %

23,5 ml ortofosforhapet (punkt 3.2) lahjendatakse veega 100 milliliitrini.

3.4.

6-metüül-2-heptüülamiin ehk 1,5-dimetüülheksüülamiin, w (w/w) = 99 %

3.5.

HPLC-puhtusastmega metanool

3.6.

Soolhape, tihedus = 1,19 g/ml

3.7.

Fosfaatpuhverlahus, c = 0,01 mol/l

1,36 g KH2PO4 (punkt 3.1) lahustatakse 500 ml vees (punkt 3.11), lisatakse 3,5 ml ortofosforhapet (punkt 3.2) ja 10,0 ml 6-metüül-2-heptüülamiini (punkt 3.4). pH korrigeeritakse ortofosforhappe lahusega (punkt 3.3) 4,0-ni ja lahjendatakse veega (punkt 3.11) 1 000 milliliitrini.

3.8.

Hapestatud metanool

5,0 ml soolhapet (punkt 3.6) pannakse 1 000 ml mõõtekolbi, täidetakse kolb metanooliga (punkt 3.5) kuni märgini ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.9.

HPLC liikuv faas, fosfaatpuhverlahus + metanoolilahus: 5 + 95 (V + V)

5 ml fosfaatpuhverlahust (punkt 3.7) segatakse 95 ml metanooliga (punkt 3.5).

3.10.

Garanteeritud puhtusega naatriumlasalotsiidi standardaine C34H53O8Na (polüeetermonokarboksüülhappe naatriumsool, saadud Streptomyces lasaliensis’est), E763

3.10.1.

Naatriumlasalotsiidi põhistandardlahus, 500 μg/ml

50 mg naatriumlasalotsiidi (punkt 3.10) kaalutakse 0,1 mg täpsusega ja pannakse 100 ml mõõtekolbi, lahustatakse hapestatud metanoolis (punkt 3.8), täidetakse kolb sama lahustiga kuni märgini ja segatakse. See lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.10.2.

Naatriumlasalotsiidi vahestandardlahus, 50 μg/ml

10,0 ml põhistandardlahust (punkt 3.10.1) pipetitakse 100 ml mõõtekolbi, täidetakse kolb hapestatud metanooliga (punkt 3.8) kuni märgini ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.10.3.

Kalibreerimislahused

1,0, 2,0, 4,0, 5,0 ja 10,0 ml vahestandardlahust pannakse (punkt 3.10.2) 50 ml mõõtekolbidesse. Kolvid täidetakse hapestatud metanooliga (punkt 3.8) kuni märgini ja segatakse. Nende lahuste naatriumlasalotsiidisisaldus on vastavalt 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 ja 10,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.11.

HPLC-puhtusastmega vesi

4. Seadmed

4.1.

Temperatuuri reguleerimise seadmetega ultrahelivann (või loksutiga veevann).

4.2.

Membraanfiltrid, 0,45 μm.

4.3.

HPLC seade koos sissepritsesüsteemiga, mis võimaldab süstida mahus 20 μl.

4.3.1.

Vedelikkromatograafia kolonn 125 × 4 mm, pöördfaasiline C18-ekstraktsioonihülss, täidise terasuurus 5 μm või samaväärne.

4.3.2.

Spektrofluorimeeter, mis võimaldab ergastuse ja emissiooni lainepikkusi muuta.

5. Töö käik

5.1. Üldsätted

5.1.1. Võrdlussööt

Selleks et teha saagisekatset (punkt 5.1.2), tuleb eelnevalt teha võrdlussööda analüüs, veendumaks, et selles ei ole naatriumlasalotsiidi ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ning selles ei tohi leiduda naatriumlasalotsiidi ega segavaid aineid.

5.1.2. Saagisekatse

Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus naatriumlasalotsiidi. Et saada kontsentratsiooni 100 mg/kg, kantakse 10,0 ml põhistandardlahust (punkt 3.10.1) 250 ml koonilisse kolbi ja aurustatakse lahus ligikaudu 0,5 milliliitrini. Lisatakse 50 g võrdlussööta, segatakse põhjalikult ja jäetakse 10 minutiks seisma, segades enne ekstraheerima (punkt 5.2) asumist veel mitu korda.

Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt punkt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse analüüsitavale proovile ligikaudu sama suur naatriumlasalotsiidikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.

5.2. Ekstraheerimine

5.2.1. Sööt

5–10 g proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega ja pannakse 250 ml koonilisse korgiga kolbi. Lisatakse pipetiga 100,0 ml hapestatud metanooli (punkt 3.8). Korgitakse kinni ja raputatakse segi. Kolb pannakse 20 minutiks ligikaudu 40 °C ultrahelivanni (punkt 4.1), seejärel võetakse sealt välja ja jahutatakse toatemperatuurini. Lastakse umbes 1 tund seista, kuni heljuv aine on settinud, siis filtritakse alikvoot läbi 0,45 μm membraanfiltri (punkt 4.2) sobivasse anumasse. Seejärel alustatakse HPLC määramist (punkt 5.3).

5.2.2. Eelsegud

Umbes 2 g jahvatamata eelsegu kaalutakse 0,001 g täpsusega ja pannakse 250 ml mõõtekolbi. Lisatakse 100,0 ml hapestatud metanooli (punkt 3.8) ja raputatakse segi. Kolb koos sisuga pannakse 20 minutiks ligikaudu 40 °C ultrahelivanni (punkt 4.1), seejärel võetakse sealt välja ja jahutatakse toatemperatuurini. Lahjendatakse hapestatud metanooliga (punkt 3.8) kuni märgini ja segatakse hoolikalt. Lastakse tund aega seista, kuni heljuv aine on settinud, siis filtritakse alikvoot läbi 0,45 μm membraanfiltri (punkt 4.2). Vajalik kogus selginud filtraati lahjendatakse hapestatud metanooliga (punkt 3.8), et saada lõplik katselahus, mis sisaldab umbes 4 μg/ml naatriumlasalotsiidi. Seejärel alustatakse HPLC määramist (punkt 5.3).

5.3. HPLC määramine

5.3.1. Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).

Vedelikkromatograafia kolonn (punkt 4.3.1):	125 mm × 4 mm, pöördfaasiline C18, täidise terasuurus 5 μm või samaväärne
Liikuv faas (punkt 3.9):	Fosfaatpuhverlahuse (punkt 3.7) ja metanooli (punkt 3.5) segu, 5 + 95 (V + V)
Voolukiirus:	1,2 ml/min
Avastamise lainepikkused:	Ergastamine: 310 nm
	Emissioon: 419 nm
Sissesüstitav ruumala:	20 μl

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides kolonni mitu korda kalibreerimislahust (punkt 3.10.3) kontsentratsiooniga 4,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused (pindalad) ja retentsiooniajad.

5.3.2. Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (punkt 3.10.3) süstitakse mitu korda ja määratakse igale kontsentratsioonile vastavad keskmised piigikõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.3.3. Proovilahus

Punktide 5.2.1 või 5.2.2 kohaselt saadud prooviekstrakte süstitakse mitu korda samas mahus, mis kalibreerimislahuse puhul, ja määratakse naatriumlasalotsiidipiikide keskmine kõrgus (pindala).

6. Tulemuste arvutamine

Proovilahuse (punkt 5.3.3) süstimisega saadud piikide keskmise kõrguse (pindala) alusel leitakse kalibreerimisgraafiku abil naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml).

6.1. Sööt

Naatriumlasalotsiidi sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c	=	naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml) proovilahuses (punkt 5.2.1);
V1	=	prooviekstrakti maht milliliitrites vastavalt punktile 5.2.1 (s.o 100);
m	=	kaalutise mass grammides.

6.2. Eelsegud

Naatriumlasalotsiidi sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c	=	naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml) proovilahuses (punkt 5.2.2);
V2	=	prooviekstrakti maht milliliitrites vastavalt punktile 5.2.2 (s.o 250);
f	=	punkti 5.2.2 kohane lahjendusfaktor;
m	=	kaalutise mass grammides.

7. Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1. Identsus

Spektrofluoromeetrilised meetodid on vähem tundlikud kõrvaliste lisandite suhtes kui UV-meetodid. Analüüsitava proovi identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil.

7.1.1. Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile (punkt 5.2.1 või 5.2.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (punkt 3.10.3). Lisatud naatriumlasalotsiidikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud naatriumlasalotsiidi kogus. Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes naatriumlasalotsiidipiigi kõrgus. Piigi laius poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui ± 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti naatriumlasalotsiidipiigi laiusest.

7.2. Korduvus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	15 % suuremast tulemusest, kui naatriumlasalotsiidi sisaldus on vahemikus 30–100 mg/kg;

—	15 mg/kg, kui naatriumlasalotsiidi sisaldus on vahemikus 100–200 mg/kg;

—	7,5 % suuremast tulemusest, kui naatriumlasalotsiidisisaldus on suurem kui 200 mg/kg.

7.3. Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)söödaproovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %. Suurendatud kontsentratsiooniga eelseguproovi puhul peab saagis olema vähemalt 90 %.

8. Võrdlusuuringu tulemused

Korraldati võrdlusuuring (*2), mille käigus 12 laboris analüüsiti kahte eelsegu (proovid 1 ja 2) ja viit sööta (proovid 3–7). Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi. Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

Proov 1

Kanasööda eelsegu

Proov 2

Kalkunisööda eelsegu

Proov 3

Kalkunite graanulid

Proov 4

Kanade kuivikupuru

Proov 5

Kalkuni-sööt

Proov 6

Kodulindude sööt A

Proov 7

Kodulindude sööt B

Keskmine [mg/kg]

5 050

16 200

76,5

78,4

92,9

48,3

32,6

sr [mg/kg]

107

408

1,71

2,23

2,27

1,93

1,75

CVr [%]

2,12

2,52

2,24

2,84

2,44

4,00

5,37

sR [mg/kg]

286

883

3,85

7,32

5,29

3,47

3,49

CVR [%]

5,66

5,45

5,03

9,34

5,69

7,18

10,70

Nominaalsisaldus [mg/kg]

5 000 (*3)

16 000 (*3)

80 (*3)

105 (*3)

120 (*3)

50 ((+))

35 ((+))

L=	laborite arv

n=	üksiktulemuste arv

sr=	korduvust iseloomustav standardhälve

sR:=	korratavust iseloomustav standardhälve

CVr=	korduvuse variatsioonikordaja (%)

CVR=	korratavuse variatsioonikordaja (%)

H. AMPROOLIUMVESINIKKLORIIDI MÄÄRAMINE

1-[(4-amino-2-propüül-5-pürimidinüül)metüül]-2-metüülpüridiiniumkloriid-monovesinikkloriid

1. Eesmärk ja kohaldamisala

Selle meetodiga on võimalik määrata amprooliumi sisaldust söödas. Avastamiskünnis on 1 mg/kg, määramispiir 5 mg/kg.

2. Põhimõte

Proov ekstraheeritakse metanooli vesilahuses. Pärast liikuva faasiga lahjendamist ja membraanfiltrimist määratakse amprooliumisisaldus kõrgefektiivse katioonvahetus-vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3. Reaktiivid

3.1.

Metanool

3.2.

HPLC-puhtusastmega atsetonitriil

3.3.

HPLC-puhtusastmega vesi

3.4.

Naatriumdivesinikfosfaadi lahus, c = 0,1 mol/l

1 000 ml mõõtekolvis lahustatakse vees (punkt 3.3) 13,80 g naatriumdivesinikfosfaadi monohüdraati, täidetakse kolb veega (punkt 3.3) kuni märgini ja segatakse.

3.5.

Naatriumperkloraadi lahus, c = 1,6 mol/l

1 000 ml mõõtekolvis lahustatakse vees (punkt 3.3) 224,74 g naatriumperkloraadi monohüdraati, täidetakse kolb veega (punkt 3.3) kuni märgini ja segatakse.

3.6.

HPLC liikuv faas (vt tähelepanekute punkt 9.1).

atsetonitriili (punkt 3.2), naatriumi, divesiniksulfaadi lahuse (punkt 3.4) ja naatriumperkloraadi (punkt 3.5) segu, 450 + 450 + 100 (v+v+v) Enne kasutamist filtritakse lahus läbi 0,22 μm membraanfiltri (punkt 4.3) ja degaseeritakse (nt ultrahelivannis (punkt 4.4) vähemalt 15 minutit).

3.7.

Standardaine: puhas amproolium, 1-[(4-amino-2-propüül-5-pürimidinüül)metüül]-2-metüülpüridiiniumkloriid, E 750 (vt punkt 9.2).

3.7.1.

Amprooliumi põhistandardlahus, 500 μg/ml

50 mg amprooliumi (punkt 3.7) kaalutakse 0,1 mg täpsusega, pannakse see 100 ml mõõtekolbi, lahustatakse 80 ml metanoolis (punkt 3.1) ja asetatakse kolb 10 minutiks ultrahelivanni (punkt 4.4). Pärast ultraheliga mõjutamist viiakse lahuse temperatuur toatemperatuurini, täidetakse kolb veega kuni märgini ja segatakse. Temperatuuril ≤ 4 °C säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

3.7.2.

Amprooliumi vahestandardlahus, 50 μg/ml

5,0 ml põhistandardlahust (punkt 3.7.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi, täidetakse see ekstrahendiga (punkt 3.8) kuni märgini ja segatakse. Temperatuuril ≤ 4 °C säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

3.7.3.

Kalibreerimislahused

0,5, 1,0 ja 2,0 ml vahestandardlahust (punkt 3.7.2) pannakse 50 ml mõõtekolbidesse. Kolvid täidetakse liikuva faasiga (punkt 3.6) märgini ja segatakse. Nende lahuste amprooliumisisaldus on 0,5, 1,0 ja 2,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

3.8.

Ekstrahent

Metanooli (punkt 3.1) ja vee segu 2 + 1 (v+v)

4. Seadmed

4.1.

HPLC seade koos sissepritsesüsteemiga, mis võimaldab süstida mahus 100 μl.

4.1.1.

Vedelikkromatograafia kolonn 125 × 4 mm, katioonvahetaja Nucleosil 10 SA, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne

4.1.2.

Muudetava lainepikkusega UV-detektor või dioodireadetektor

4.2.

Membraanfilter, polütetrafluoroetüleenist, 0,45 μm

4.3.

Membraanfilter, 0,22 μm

4.4.

Ultrahelivann

4.5.

Mehaaniline loksuti või magnetsegur

5. Töö käik

5.1. Üldsätted

5.1.1. Võrdlussööt

Selleks et teha saagisekatse (punkt 5.1.2), tuleb eelnevalt teha võrdlussööda analüüs, veendumaks, et selles ei ole ei amprooliumi ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ja selles ei tohi leiduda amprooliumi või segavaid aineid.

5.1.2. Saagisekatse

Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus amprooliumi. Et saada kontsentratsiooni 100 mg/kg, viiakse 10,0 ml põhistandardlahust (punkt 3.7.1) 250 ml koonilisse kolbi ja aurustatakse lahus ligikaudu 0,5 milliliitrini. Lisatakse 50 g võrdlussööta, segatakse hoolikalt ja jäetakse 10 minutiks seisma, segades enne ekstraheerima (punkt 5.2) asumist veel mitu korda.

Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt punkt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse analüüsitavale proovile ligikaudu sama suur amprooliumikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.

5.2. Ekstraheerimine

5.2.1. Eelsegud (amprooliumisisaldus < 1 %) ja söödad

Olenevalt amprooliumisisaldusest kaalutakse 5–40 g proovi 0,01 g täpsusega, kantakse see 500 ml koonilisse kolbi ja lisatakse 200 ml ekstrahenti (punkt 3.8). Kolb asetatakse ultrahelivanni (punkt 4.4) ja jäetakse 15 minutiks seisma. Kolb võetakse ultrahelivannist välja ja loksutatakse loksutil või segatakse magnetseguril (punkt 4.5) üks tund. Ekstrakti alikvoot lahjendatakse liikuva faasiga (punkt 3.6) amprooliumisisalduseni 0,5–2 μg/ml ja segatakse (vt tähelepanekute punkt 9.3). 5–10 ml lahjendatud lahust filtritakse läbi membraanfiltri (punkt 4.2). Seejärel alustatakse HPLC määramist (punkt 5.3).

5.2.2. Eelsegud (amprooliumisisaldus ≥ 1 %)

Olenevalt amprooliumisisaldusest kaalutakse 1–4 g proovi 0,001 g täpsusega, kantakse see 500 ml koonilisse kolbi ja lisatakse 200 ml ekstrahenti (punkt 3.8). Kolb asetatakse ultrahelivanni (punkt 4.4) ja jäetakse 15 minutiks seisma. Kolb võetakse ultrahelivannist välja ja loksutatakse loksutil või segatakse magnetseguril (punkt 4.5) üks tund. Ekstrakti alikvoot lahjendatakse liikuva faasiga (punkt 3.6) amprooliumisisalduseni 0,5–2 μg/ml ja segatakse. 5–10 ml lahjendatud lahust filtritakse läbi membraanfiltri (punkt 4.2). Seejärel alustatakse HPLC määramist (punkt 5.3).

5.3. HPLC määramine

5.3.1. Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):

Vedelikkromatograafia kolonn (punkt 4.1.1):	125 mm × 4 mm, katioonvahetaja Nucleosil 10 SA, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne
Liikuv faas (punkt 3.6):	atsetonitriili (punkt 3.2), naatriumi, divesiniksulfaadi lahuse (punkt 3.4) ja naatriumperkloraadi (punkt 3.5) segu, 450 + 450 + 100 (v + v + v)
Voolukiirus:	0,7 –1 ml/min
Avastamise lainepikkus:	264 nm
Sissesüstitav ruumala:	100 μl

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides kolonni mitu korda kalibreerimislahust (punkt 3.7.3) kontsentratsiooniga 1,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused ja retentsiooniajad.

5.3.2. Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (punkt 3.7.3) süstitakse mitu korda ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad keskmised piigikõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.3.3. Proovilahus

Prooviekstrakti (punkt 5.2) süstitakse mitu korda, kasutades sama mahtu, mis kalibreerimislahuste puhul, ja määratakse amprooliumipiikide keskmine kõrgus (pindala).

6. Tulemuste arvutamine

Proovilahuse amprooliumipiikide keskmise kõrguse (pindala) alusel leitakse kalibreerimisgraafiku (punkt 5.3.2) abil proovilahuse kontsentratsioon (μg/ml).

Proovi amprooliumisisaldus w (mg/kg) arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

V	=	punkti 5.2 kohane ekstrahendi (punkt 3.8) maht milliliitrites (s.o 200 ml);
c	=	amprooliumi kontsentratsioon (μg/ml) prooviekstraktis (punkt 5.2);
f	=	punkti 5.2 kohane lahjendusfaktor;
m	=	kaalutise mass grammides.

7. Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1. Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti (punkt 5.2) ja 2,0 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (punkt 3.7.3) spektreid.

7.1.1. Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile (punkt 5.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (punkt 3.7.3). Lisatud amprooliumikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud amprooliumikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes amprooliumipiigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti amprooliumipiigi laiusest.

7.1.2. Kontrollimine dioodireadetektori abil

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

a)	proovi ja standardi kromatogrammidel oleva piigi tipu spektri suurima neeldumise lainepikkused peavad analüüsiseadme lahutusvõime piires ühte langema. Dioodireadetektori lahutusvõime on tavaliselt ± 2 nm;

lainepikkustel 210–320 nm ning suhtelise neeldumise vahemikus 10–100 % peavad proovi ja standardi piigi tipu spektrid kromatogrammil ühte langema. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui mainitud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kahe spektri kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % standardainele vastavatest neeldumistest;

lainepikkustel 210–320 nm ei tohi prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduvas osas, tipus ja allapoole suunduvas osas registreeritud spektrid erineda üksteisest nende spektriosade puhul, mis jäävad 10–100 % suhtelise neeldumise piirkonda. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui nimetatud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % piigi tipu spektri vastavatest neeldumistest.

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2. Korduvus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

—	15 % suuremast tulemusest, kui amprooliumisisaldus on vahemikus 25–500 mg/kg;

—	75 mg/kg, kui amprooliumisisaldus on vahemikus 500–1 000 mg/kg;

—	7,5 % suuremast tulemusest, kui amprooliumisisaldus on suurem kui 1 000 mg/kg.

7.3. Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)proovi puhul peab saagis olema vähemalt 90 %.

8. Võrdlusuuringu tulemused

Korraldati võrdlusuuring, mille käigus analüüsiti kolme kodulindude sööta (proovid 1–3), ühte mineraalsööta (proov 4) ja ühte eelsegu (proov 5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

proov 1 (võrdlussööt)

proov 2

proov 3

proov 4

proov 5

Keskmine [mg/kg]

—

45,5

188

5 129

25 140

sr [mg/kg]

—

2,26

3,57

178

550

CVr [%]

—

4,95

1,90

3,46

2,20

sR [mg/kg]

—

2,95

11,8

266

760

CVR [%]

—

6,47

6,27

5,19

3,00

nominaalsisaldus [mg/kg]

—

200

5 000

25 000

L:	laborite arv

n:	üksikmääramiste arv

sr:	korduvust iseloomustav standardhälve

CVr:	korduvuse variatsioonikordaja

sR:	korratavust iseloomustav standardhälve

CVR:	korratavuse variatsioonikordaja

9. Tähelepanekud

9.1.

Kui proov sisaldab tiamiini, ilmub kromatogrammil tiamiinipiik veidi enne amprooliumipiiki. Selle meetodi kohaselt peavad amproolium ja tiamiin teineteisest eralduma. Kui amproolium ja tiamiin selle meetodi puhul kasutatavas kolonnis (punkt 4.1.1) teineteisest siiski ei eraldu, tuleb kuni 50 % liikuva faasi (punkt 3.6) atsetonitriilist asendada metanooliga.

9.2.

Briti farmakopöa andmetel on soolhappelahuses (c = 0,1 mol/l) amprooliumi lahuse (c = 0,02 mol/l) neeldumismaksimumid 246 ja 262 nm juures. Neelduvus on 246 nm juures 0,84 ja 262 nm juures 0,80.

9.3.

Ekstrakt tuleb iga kord liikuva faasiga lahjendada, sest vastasel korral võib amprooliumipiigi retentsiooniaeg ioontugevuse muutuste tõttu oluliselt nihkuda.

I. NARASIINI MÄÄRAMINE

Narasiinisisaldus määratakse

—

—	standardis EN ISO 14183 „Loomasööt – Monesiini-, narasiini- ja salinomütsiinisisalduse määramine – Kolonnijärgset derivaatimist kasutav vedelikkromatograafia meetod“ esitatud analüüsimeetodiga.

J. NIKARBASIINI MÄÄRAMINE

Nikarbasiinisisaldus määratakse

—

—	standardis EN 15782 „Loomasööt – Nikarbasiinisisalduse määramine – Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia“ esitatud analüüsimeetodiga.

K. DEKOKVINAADI MÄÄRAMINE

Dekokvinaadisisaldus määratakse

—

—	standardis EN 16162 „Loomasööt – Dekokvinaadisisalduse määramine HPLC-ga fluorestsentsdetektori abil“ esitatud analüüsimeetodiga.

L. MONESIINI MÄÄRAMINE

Monesiinisisaldus määratakse

—

—	standardis EN ISO 14183 „Loomasööt – Monesiini-, narasiini- ja salinomütsiinisisalduse määramine – Kolonnijärgset derivaatimist kasutav vedelikkromatograafia meetod“ esitatud analüüsimeetodiga.

M. SALINOMÜTSIINI MÄÄRAMINE

Salinomütsiinisisaldus määratakse

—

—	standardis EN ISO 14183 „Loomasööt – Monesiini-, narasiini- ja salinomütsiinisisalduse määramine – Kolonnijärgset derivaatimist kasutav vedelikkromatograafia meetod“ esitatud analüüsimeetodiga.

N. SEMDURAMÜTSIINI MÄÄRAMINE

Semduramütsiinisisaldus määratakse

—

—	standardis EN 16158 „Loomasööt – Semduramütsiinisisalduse määramine – Otsustuspuu põhist analüütilist lähenemisviisi kasutav vedelikkromatograafia meetod“ esitatud analüüsimeetodiga.

O. EN STANDARDID

Määruse (EL) 2017/625 artikli 34 lõike 2 punkti a kohaldamisel on asjakohased järgmised EN standardid:

EN ISO 30024 Loomasööt – Fütaasi aktiivsuse määramine

EN 17050 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Joodi määramine loomasöödas induktiivsidestunud plasma massispektromeetria (ICP-MS) abil

EN 17550 Loomasööt: karotenoidide määramine loomade segasöödas ja eelsegudes kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil koos UV-kiirguse määramisega (HPLC-UV)

EN 15784 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Bacillus spp. kindlakstegemine ja loendamine

EN 15785 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Bifidobacterium spp. eraldamine ja loendamine

EN 15786 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Pediococcus spp. kindlakstegemine ja loendamine

EN 15787 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Söödalinsandina kasutatava Lactobacillus spp. kindlakstegemine ja loendamine

EN 15788 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Söödalinsandina kasutatava Enterococcus (E. faecium) sp.p kindlakstegemine ja loendamine

EN 15789 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Söödalinsandina kasutatava Saccharomyces cerevisiae kindlakstegemine ja loendamine

EN 15510 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Kaltsiumi, naatriumi, fosfori, magneesiumi, kaaliumi, raua, tsingi, vase, mangaani, koobalti, molübdeeni ja plii määramine induktiivsidestunud plasma aatomiemissioonspektromeetria (ICP-AES) abil (söödalisandite koobalti ja molübdeeni analüüsimiseks)

EN 15621 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Kaltsiumi, naatriumi, fosfori, magneesiumi, kaaliumi, väävli, raua, tsingi, vase, mangaani ja koobalti määramine pärast rõhu all lagundamist induktiivsidestunud plasma aatomiemissioonspektromeetria (ICP-AES) abil (söödalisandi koobalti analüüsimiseks)

EN 16159 Loomasööt – Seleeni määramine hüdriidide tekitamisega aatomiabsorptsioonspektromeetria (HGAAS) abil pärast mikrolainete toimel lagundamist (lagundamine 65 % lämmastikhappe ja 30 % vesinikperoksiidiga) (söödalisandi seleeni analüüsimiseks)

EN 17053 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Mikroelementide, raskmetallide ja muude elementide määramine söödas induktiivsidestunud plasma massispektromeetria (ICP-MS) abil (erinevad meetodid) (söödalisandite koobalti, molübdeeni ja seleeni analüüsimiseks)

“

(1) Standardis EN 17547 esitatud analüüsimeetodile viidatakse kui alternatiivsele meetodile, mida kasutatakse A- ja E-vitamiini sisalduse määramiseks tehtava ametliku kontrolli käigus A-vitamiini sisalduse määramiseks käesoleva lisa A osas kirjeldatud meetodi asemel ja E-vitamiini sisalduse määramiseks käesoleva lisa B osas kirjeldatud meetodi asemel.

(2) Määramised viis läbi ühenduse Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) söötade uurimisgrupp.

(3) Standardis EN 17547 esitatud analüüsimeetodile viidatakse kui alternatiivsele meetodile, mida kasutatakse ametlikuks kontrolliks A- ja E-vitamiini sisalduse määramisel A-vitamiini sisalduse määramiseks käesoleva lisa A osas kirjeldatud meetodi asemel ja E-vitamiini sisalduse määramiseks käesoleva lisa B osas kirjeldatud meetodi asemel.

(4) Määramised viis läbi ühenduse Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) söötade uurimisgrupp.

(5) See meetod on valideeritud võrdlusuuringuga mitmesuguste söödamaatriksite puhul. Täiendava teabe jaoks vaadake https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation.

(6) Kasutada võib ka teisi lagundamismeetodeid, kui on kindlaks tehtud, et nendega saadakse samaväärsed tulemused (näiteks rõhu all mikrolainelagundamine).

(7) Haljassööt (värske või kuivatatud) võib sisaldada suurel hulgal taimset räni, mis võib hoida kinni mikroelemente ning tuleb eemaldada. Kõnealuse sööda proovide korral tuleb seega järgida järgmist muudetud menetlust. Sooritada punktis 5.1.1.1 osutatud toiming kuni filtrimiseni. Lahustumatut jääki sisaldav filterpaber pestakse kaks korda keeva veega ning asetatakse kvarts- või plaatinatiiglisse.

Põletatakse muhvelahjus (punkt 4.1) temperatuuril alla 550 °C, kuni kõik söeosakesed on täielikult kadunud. Lastakse jahtuda, lisatakse mõned tilgad vett ning 10–15 ml vesinikfluoriidhapet (punkt 3.4) ning aurustatakse kuivaks ligikaudu 150 °C juures. Kui jääkides on siiski räni, lahustatakse see uuesti paaris milliliitris vesinikfluoriidhappes (punkt 3.4) ning aurustatakse kuivaks. Lisatakse viis tilka väävelhapet (punkt 3.5) ning kuumutatakse, kuni enam ei eraldu valget auru. Pärast 5 ml 6 mol/l soolhappe (punkt 3.2) ja ligikaudu 30 ml vee lisamist kuumutatakse, lahus filtritakse 250 ml mõõtekolbi ning täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 mol/l). Mikroelementide määramist jätkatakse punktist 5.1.2.

(8) The Analyst 108, 1983, lk 1252–1256.

(9) Meetodit võib kasutada ka diklasuriili määramiseks söödamaterjalis.

(10) Pikaajalisem stabiilsus (kuni üks aasta) on võimalik, kuid konkreetne labor peab seda kinnitama.

(*1) 1994. aastal tehtud esimene uuring: Journal of AOAC International, köide 77, nr 6, 1994, lk 1359–1361; 2015. aastal tehtud teine uuring: Teadusuuringute Ühiskeskuse tehniline aruanne „Re-validation of a method for the determination of diclazuril by collaborative study“ (2016).

(*2) Analyst, 1995, 120, lk 2175-2180

(*3) Tootja deklareeritud sisaldus

((+)) Laboris valmistatud sööt

V LISA

„V LISA

SÖÖDAS SOOVIMATUTE AINETE SISALDUSE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A) DIOKSIINIDE (PCDD/PCDF) JA PCBde SISALDUSE MÄÄRAMINE

I PEATÜKK

PROOVIVÕTUMEETODID JA ANALÜÜSITULEMUSTE TÕLGENDAMINE

1. Kohaldamisala ja mõisted

Proovid polüklorodibenso-p-dioksiinide (PCDDd), polüklorodibensofuraanide (PCDFid), dioksiinitaoliste polüklooritud bifenüülide (PCBd) (1) ja mittedioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks söödas võetakse I lisa sätete kohaselt. Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimise kvantitatiivseid nõudeid kohaldatakse vastavalt I lisa punktile 5.1. Selliselt võetud koondproove käsitatakse selle partii või osapartii suhtes esindavate proovidena, millest need on võetud. Direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormidele vastavust kontrollitakse laboratoorsete proovides määratud sisalduste alusel.

Käesolevas osas kohaldatakse komisjoni rakendusmääruse (EL) 2021/808 (2) I lisas esitatud mõisteid.

Lisaks neile mõistetele kasutatakse käesolevas osas järgmisi mõisteid.

„Sõeluuringumeetodid“ on meetodid selliste proovide tuvastamiseks, mille PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisaldus ületab piirnormi või häiretaseme. Need meetodid võimaldavad kulutõhusalt analüüsida suurt arvu proove ning see suurendab võimalusi avastada uusi juhtumeid, mis on tarbijate jaoks suure kokkupuute- ja terviseriskiga. Sõeluuringumeetodid peavad põhinema bioanalüütilistel või GC-MS meetoditel. Proovide tulemusi, mis ületavad piirnormile vastavuse kontrolli läviväärtust, tuleb üle kontrollida esialgse proovi täieliku kordusanalüüsiga kinnitaval meetodil.

„Kinnitavad meetodid“ on meetodid, mis annavad täielikku või täiendavat teavet, mis võimaldab PCDD/Fid ja dioksiinitaolised PCBd tuvastada ja määrata üheselt nende sisaldus piirnormile või vajaduse korral häiretasemele vastaval läviväärtusel. Nende meetodite puhul kasutatakse gaasikromatograafiat koos kõrglahutus-massispektromeetriaga (GC-HRMS) või gaasikromatograafiat koos tandemmassispektromeetriaga (GC-MS/MS).

2. Partii või osapartii vastavus piirnormile

2.1. Mittedioksiinitaoliste PCBde puhul

Partii või osapartii vastab piirnormile, kui PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 ja PCB 180 (edaspidi „mittedioksiinitaolised PCBd“) summaarse sisalduse analüüsi tulemus ei ületa direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormi, võttes arvesse mõõtmise laiendmääramatust (3). Partii või osapartii ei vasta direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormile, kui ülemise tõkke põhimõtte kohase (4) kahe analüüsitulemuse põhjal on kordusanalüüsiga (5) saadud aritmeetiline keskmine, mis ületab mõõtmise laiendmääramatust arvesse võttes kahtluseta piirnormi, st vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud kontsentratsiooni väärtust, millest on lahutatud mõõtmise laiendmääramatus.

Mõõtmise laiendmääramatuse arvutamiseks kasutatakse kattetegurit 2, millega tagatakse umbes 95 % usaldusnivoo. Partii või osapartii ei vasta nõuetele, kui mõõtmistulemuste keskväärtusest laiendmääramatuse lahutamisega saadud väärtus ületab piirnormi.

Käesoleva punkti eespool esitatud lõikudes nimetatud eeskirju kohaldatakse ametlikuks kontrolliks ette nähtud proovide analüüsitulemuste suhtes. Teise eksperdiarvamuse saamiseks või vahekohtumenetluse eesmärgil tehtud analüüside suhtes kohaldatakse siseriiklikke eeskirju.

2.2. PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde puhul

Partii või osapartii vastab piirnormile, kui ühe analüüsi tulemus,

—	mis on saadud sõeluuringumeetodiga, mille valenegatiivsete tulemuste osakaal on alla 5 %, näitab, et sisaldus ei ületa asjaomast direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud PCDD/Fide piirnormi ega PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa piirnormi;

—	mis on saadud kinnitava meetodiga, näitab, et sisaldus ei ületa asjaomast direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud PCDD/Fide piirnormi ega PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa piirnormi, kui võetakse arvesse mõõtmise laiendmääramatust.

Sõeluuringu puhul määratakse läviväärtus, mille alusel otsustatakse, kas proov vastab PCDD/Fide jaoks kehtestatud piirnormile või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa jaoks kehtestatud piirnormile.

Partii või osapartii ei vasta direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormile, kui kinnitava meetodiga tehtud kordusanalüüsiga (6) on ülemise tõkke põhimõtte (7) kohase kahe analüüsitulemuse põhjal saadud aritmeetiline keskmine, mis ületab mõõtmise laiendmääramatust arvesse võttes kahtluseta piirnormi, st vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud kontsentratsiooni väärtust, millest on lahutatud mõõtmise laiendmääramatus.

PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa puhul tuleb kasutada PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi määramise analüüsitulemuste hinnanguliste laiendmääramatuste summat.

Käesoleva punkti eespool esitatud lõikudes nimetatud eeskirju kohaldatakse ametlikuks kontrolliks ette nähtud proovide analüüsitulemuste suhtes. Kaitse- või vahekohtumenetluse eesmärgil tehtud analüüside suhtes kohaldatakse siseriiklikke eeskirju.

3. Direktiivi 2002/32/EÜ II lisas sätestatud häiretasemeid ületavad tulemused

Häiretasemeid kasutatakse proovide valimiseks juhul, kui on vaja kindlaks teha saasteallikas ja võtta meetmeid saastumise vähendamiseks või kõrvaldamiseks. Sõeluuringumeetoditega tehakse kindlaks selliste proovide valimiseks sobivad läviväärtused. Kui saasteallika kindlakstegemiseks ja saaste vähendamiseks või kõrvaldamiseks on vaja suuri pingutusi, on asjakohane kontrollida häiretaseme ületamist kinnitaval meetodil kordusanalüüsiga ja võtta seejuures arvesse mõõtmise laiendmääramatust (8).

II PEATÜKK

Proovi ettevalmistamine JA NÕUDED analüüsimeetoditele, MIDA KASUTATAKSE DIOKSIINIDE (PCDD/Fide) JA DIOKSIINITAOLISTE PCBde SISALDUSE AMETLIKUKS KONTROLLIKS SÖÖDAS

1. Kohaldamisala

Käesolevas peatükis sätestatud nõudeid kohaldatakse sööda analüüsimisel 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks, samuti seoses proovide ettevalmistamise ja analüüsimisega muul regulatiivsel eesmärgil, sealhulgas kontrollide puhul, mida söödakäitlejad teevad, et tagada vastavus Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruse (EÜ) nr 183/2005 (9) sätetele.

PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde esinemist söödas võib kontrollida kaht liiki analüüsimeetoditega:

a) Sõeluuringumeetodid

Sõeluuringumeetoditega tuvastatakse sellised proovid, mille PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisaldus ületab piirnormi või häiretaseme. Sõeluuringumeetodid peavad võimaldama kulutõhusalt analüüsida suurt arvu proove ning see suurendab võimalusi avastada uusi juhtumeid, mis on tarbijate jaoks suure kokkupuute- ja terviseriskiga. Nende kasutamise eesmärk on valenegatiivsete tulemuste vältimine. Nende hulka kuulub bioanalüütilisi ja GC-MS-meetodeid.

Sõeluuringumeetoditega võrreldakse analüüsitulemusi läviväärtusega ning saadakse jaatav või eitav vastus piirnormi või häiretaseme võimaliku ületamise kohta. Piirnormile mittevastavuse kahtlusega proovides tuleb PCDD/Fide kontsentratsioon ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarne kontsentratsioon määrata või kinnitada kinnitava meetodi abil.

Peale selle võivad sõeluuringumeetod anda teavet proovis leiduvate PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse kohta. Bioanalüütiliste sõeluuringumeetodite kasutamise korral väljendatakse tulemus bioanalüütilistes ekvivalentides (BEQdes), füüsikalis-keemiliste GC-MS-meetodite kasutamise korral toksilisusekvivalentides (TEQ). Sõeluuringumeetodite numbrilised tulemused sobivad nõuetekohasuse või nõuetele mittevastavuse kahtluse või häiretaseme ületamise tõendamiseks ning kinnitavate meetoditega järelanalüüsi jaoks asjaomase kontsentratsioonivahemiku hindamiseks. Need meetodid ei sobi taustsisalduse ja söödaga saadavate annuste hindamiseks, sisalduse ajatrendide jälgimiseks ega häiretaseme ja piirnormi ümberhindamiseks.

b) Kinnitavad meetodid

Kinnitavate meetoditega on võimalik proovis leiduvaid PCDD/Fe ja dioksiinitaolisi PCBsid üheselt tuvastada ja määrata nende sisaldus ning saada täielikud andmed üksikanaloogide sisalduse kohta. Seega saab selliste meetoditega kontrollida piirnorme ja häiretasemeid, sealhulgas kinnitada sõeluuringumeetoditega saadud tulemusi. Lisaks võib tulemusi kasutada muudel eesmärkidel, nagu sööda seires väikese taustsisalduse määramine, ajatrendide jälgimine, kokkupuute hindamine ning andmebaasi koostamine häiretasemete ja piirnormide võimalikuks ümberhindamiseks. Need meetodid on olulised ka analoogide kombinatsioonide kindlakstegemiseks, et tuvastada võimalik saasteallikas. Nende meetodite puhul kasutatakse GC-HRMSi. Piirnormile vastavuse või mittevastavuse kinnitamiseks võib kasutada ka GC-MS/MSi.

2. Taustteave

Toksilisusekvivalentides (TEQdes) väljendatud kontsentratsioonide arvutamiseks korrutatakse üksikainete kontsentratsioonid asjaomases proovis vastava toksilisusfaktoriga (TEF) (vt I peatüki allmärkus 1) ja liidetakse seejärel kokku, et saada TEQdes väljendatud dioksiinitaoliste ühendite üldkontsentratsioon.

Käesolevas A osas tähendab üksikanaloogi aktsepteeritav määramispiir väikseimat analüüdisisaldust, mida saab mõistliku statistilise usaldusväärsusega mõõta ning mis vastab määramiskriteeriumidele, mis on sätestatud rahvusvaheliselt tunnustatud standardites, nagu standard EN 16215:2012 „Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS“ (Loomasööt – dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse määramine gaasikromatograafia ja kõrglahutus-massispektromeetria (GC-HRMS) abil ning indikaator-PCBde sisalduse määramine GC-HRMSi abil) ja/või EPA meetodid 1613 ja 1668 (läbivaadatud).

Üksikanaloogi määramispiiri võib määratleda järgmiselt:

a)	prooviekstraktis leiduva analüüdi selline kontsentratsioon, mis annab kahe erineva jälgitava iooni puhul mõõteseadmes mõõtmistulemuse, mille puhul nõrgema töötlemata andmesignaali signaali ja müra suhe on 3: 1 või

väikseima kontsentratsiooni punkt kalibreerimiskõveral, mille puhul saadakse vastuvõetav (≤ 30 %) ja järjepidev (mõõdetud vähemalt proovide analüüsiseeria alguses ja lõpus) hälve keskmisest suhtelisest kalibreerimistegurist, mis on arvutatud iga prooviseeria kalibreerimiskõvera kõikide punktide järgi, kui tehnilistel põhjustel signaali ja müra suhte arvutus ei anna usaldusväärset tulemust. Määramispiir LOQ arvutatakse väikseima kontsentratsiooni järgi, võttes arvesse sisestandardite saagist ja proovikogust.

Bioanalüütilised sõeluuringumeetodid ei anna tulemusi analoogi tasemel, vaid näitavad (10) üksnes TEQ väärtust, väljendatuna BEQdes, millega võetakse arvesse asjaolu, et kõik prooviekstraktis leiduvad ühendid, mis katses vastuse annavad, ei tarvitse vastata kõikidele TEQ-põhimõtte nõuetele.

Sõeluuringu- ja kinnitavaid meetodeid võib teatavas maatriksis sisalduse kontrollimiseks kasutada vaid juhul, kui kõnealused meetodid on piisavalt tundlikud, et häiretasemele või piirnormile vastavat sisaldust usaldusväärselt määrata.

3. Kvaliteedi tagamise nõuded

3.1.

Igas proovivõtu- ja analüüsietapis tuleb võtta meetmed ristsaastumise vältimiseks.

3.2.

Proove tuleb säilitada ja transportida säilitamiseks sobivates klaas-, alumiinium-, polüpropüleen- või polüetüleennõudes, mis ei mõjuta proovide PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisaldust. Paberitolmu jäägid tuleb proovinõust eemaldada.

3.3.

Proove tuleb säilitada ja transportida nii, et söödaproovi koostis ei muutuks.

3.4.

Vajaduse korral jahvatatakse iga laboratoorne proov peeneks ja segatakse põhjalikult meetodil, mis tagab tõendatult täielikult homogeense proovi (näiteks jahvatatakse proov nii peeneks, et see läbiks 1 mm suuruste avadega sõela). Liiga suure niiskusesisaldusega proove tuleb enne jahvatamist kuivatada.

3.5.

Oluline on kontrollida, et reaktiivid, klaasnõud ja seadmed ei mõjutaks TEQdes või BEQdes väljendatud tulemusi.

3.6.

Tuleb teha tühikatse, mille puhul tehakse läbi kõik analüüsietapid ilma proovita.

3.7.

Bioanalüütiliste meetodite puhul tuleb kontrollida, et ükski analüüsis kasutatav klaasnõu või lahusti ei sisaldaks ühendeid, mis segavad uuritavate ühendite avastamist meetodi töövahemikus. Klaasnõu tuleb loputada lahustiga või kuumutada temperatuuril, mis sobib selle pinnalt PCDD/Fide, dioksiinitaoliste ühendite ja segavate ühendite jääkide eemaldamiseks.

3.8.

Ekstraheeritava proovi kogus peab olema piisav, et see vastaks nõuetele, mida kohaldatakse piisavalt väikestele kontsentratsioonidele vastavas töövahemikus, sh piirnormile ja häiretasemele vastavas kontsentratsioonide vahemikus.

3.9.

Uuritavatest toodetest võetud proovide ettevalmistamiseks kasutatavate konkreetsete meetodite puhul tuleb järgida rahvusvaheliselt tunnustatud suuniseid, st standardit EN ISO 6498.

4. Nõuded laboritele

4.1.

Vastavalt määrusele (EL) 2017/625 peavad laborid olema ISO/IEC juhendi 58 kohaselt tegutseva tunnustatud asutuse poolt akrediteeritud, millega tagatakse, et laborid kohaldavad analüüsimisel kvaliteeditagamissüsteemi. Laborid tuleb akrediteerida standardi EN ISO/IEC 17025 kohaselt. Järgitakse põhimõtteid, mida on kirjeldatud tehnilistes suunistes, milles käsitletakse mõõtemääramatuse ja määramispiiride hinnangulise väärtuse leidmist PCDD/Fide ja PCBde analüüsimisel (11).

4.2.

Labori pädevust tuleb tõendada pideva eduka osalemisega laboritevahelistes uuringutes, mida korraldatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kontsentratsiooni määramiseks asjakohastes söödamaatriksites ja kontsentratsioonivahemikes.

4.3.

Laborid, kus kasutatakse proovide tavakontrolliks sõeluuringumeetodeid, peavad tegema nii kvaliteedi kontrollimisel kui ka saastekahtlusega proovide analüüsitulemuste kinnitamisel tihedat koostööd kinnitavat meetodit kasutavate laboritega.

5. Põhinõuded dioksiinide (PCDDde/PCDFide) ja dioksiinitaoliste PCBde analüüsile

5.1. Väikeste kontsentratsioonidega töövahemik ja määramispiirid

Kuna osa kõnealustest ühenditest on äärmiselt toksilised, peavad tuvastatavad PCDD/Fide kogused olema femtogrammi (10–15 g) ülemises vahemikus. Enamiku PCBde analoogide puhul piisab nanogrammi täpsusega (10–9 g) määramispiirist. Toksilisemate dioksiinitaoliste PCBde analoogide (eriti ortoasendamata analoogide) sisalduse määramiseks peab töövahemiku alumine osa ulatuma pikogrammi (10–12 g) alumiste väärtusteni. Kõigi muude PCBde analoogide puhul piisab nanogrammi (10–9 g) täpsusega määramispiirist.

5.2. Suur selektiivsus (spetsiifilisus)

5.2.1.

PCDD/Fisid ja dioksiinitaolisi PCBsid peab olema võimalik eristada paljudest muudest kaasa ekstraheeruvatest ja segada võivatest ühenditest, mille kontsentratsioon võib olla mitu suurusjärku suurem kui uuritavate analüütide kontsentratsioon. GC-MS-meetodite korral peab olema võimalik eristada eri analooge, näiteks toksilisi analooge (nt seitseteist 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fi ning kaksteist dioksiinitaolist PCBd) muudest analoogidest.

5.2.2.

Bioanalüütiliste meetoditega peab olema võimalik määrata uuritavaid ühendeid PCDD/Fide ja/või dioksiinitaoliste PCBde summana. Proove tuleb puhastada, et kõrvaldada valepositiivseid tulemusi põhjustavad ühendid ja ühendid, mis võivad signaali vähendada, põhjustades valenegatiivseid tulemusi.

5.3. Suur mõõtetäpsus (tõesus ja kordustäpsus, bioanalüüsi näiline saagis)

5.3.1.

GC-MS-meetodite puhul peab määramine tagama kehtiva hinnangu aine tegeliku kontsentratsiooni kohta proovis. Suur mõõtetäpsus on vajalik, et vältida analüüsitulemuse tagasilükkamist määratud TEQ väärtuse vähese usaldusväärsuse tõttu. Mõõtetäpsust väljendatakse tõesuse (sertifitseeritud materjalis sisalduva analüüdi mõõdetud keskmise väärtuse ja analüüdi sertifitseeritud väärtuse erinevus protsentides) ja kordustäpsusena (RSDR on suhteline standardhälve, mis arvutatakse korratavuse tingimustes saadud tulemuste põhjal).

5.3.2.

Bioanalüütiliste meetodite korral määratakse bioanalüüsi näiline saagis. „Bioanalüüsi näiline saagis“ tähendab BEQ väärtust, mis arvutatakse 2,3,7,8-tetraklorodibenso-p-dioksiini (TCDD) või PCB 126 kaliibrimiskõvera alusel, mida korrigeeritakse tühiprooviga ja jagatakse seejärel kinnitava meetodi abil määratud TEQ väärtusega. Sellega püütakse korrigeerida selliseid tegureid nagu PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste ühendite kadu ekstraheerimisel ja puhastamisel, kaasa ekstraheeruvad ühendid, mis suurendavad või vähendavad tulemust (agonistlik ja antagonistlik mõju), kalibreerimiskõvera sobivus ning toksilisusfaktori (TEF) ja suhtelise potentsuse (REP) väärtuste erinevused. Bioanalüüsi näiline saagis arvutatakse sobivate võrdlusproovide alusel, milles analoogide kombinatsioon on esindav ja nende sisaldus vastab ligikaudu huvipakkuvale sisalduste vahemikule.

5.4. Valideerimine piirnormi vahemikus ja kvaliteedikontrolli üldmeetmed

5.4.1.

Labor peab tõendama valideerimismenetluse ja tavaanalüüsiga meetodi tulemuslikkust piirnormi hõlmavas vahemikus, nt piirnormi 0,5-, 1- ja 2-kordsele väärtusele vastava sisalduse juures, kordusanalüüsi puhul peab variatsioonikordaja väärtus olema vastuvõetav.

5.4.2.

Sisemiste kvaliteedikontrolli meetmetena tuleb teha regulaarseid tühiproovidega ja rikastatud proovidega katseid või analüüsida kontrollproove (võimaluse korral tuleb eelistada sertifitseeritud etalonaineid). Tühiproovide ja rikastatud proovidega katsete ning kontrollproovide analüüsi kohta tuleb koostada kvaliteedikontrolli kaardid, mille alusel kontrollitakse, kas analüüside tulemuslikkus vastab nõuetele.

5.5. Määramispiir

5.5.1.

Bioanalüütilise sõeluuringumeetodi puhul ei ole määramispiiri tingimata vaja kindlaks määrata, kuid tuleb tõendada, et meetodiga on võimalik eristada tühiproovi väärtust läviväärtusest. BEQ väärtuse esitamise korral määratakse kindlaks teatamiskünnis, et oleks võimalik eristada proove, mille puhul saadud väärtus on sellest künnisest väiksem. Tuleb tõendada, et teatamiskünnis erineb tühiproovide väärtusest vähemalt kolm korda ja tulemus jääb töövahemikust allapoole. Seepärast arvutatakse see proovide alusel, mis sisaldavad uuritavaid ühendeid ligikaudu nõutud miinimumkoguses, mitte signaali-müra suhte või tühikatse põhjal.

5.5.2.

Kinnitava meetodi puhul peab määramispiir olema ligikaudu üks viiendik piirnormist.

5.6. Analüüsikriteeriumid

Kinnitava meetodi või sõeluuringumeetodi abil usaldusväärsete tulemuste saamiseks peavad piirnormile vastavasse vahemikku jääva TEQ väärtuse ja vastava BEQ väärtuse puhul olema täidetud järgmised kriteeriumid, olenemata sellest, kas TEQ või BEQ määratakse summaarsena (PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarse sisalduse alusel) või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kohta eraldi.

	Sõeluuring bioanalüütiliste või füüsikalis-keemiliste meetoditega	Kinnitavad meetodid
Valenegatiivsete tulemuste osakaal (*1)	< 5 %
Tõesus		–20 % kuni +20 %
Korduvus (RSDr)	< 20 %
Vahepealne korduvustäpsus (RSD %)	< 25 %	< 15 %

5.7. Sõeluuringumeetodi erinõuded

5.7.1.

Sõeluuringuks võib kasutada nii GC-MS-meetodeid kui ka bioanalüütilisi meetodeid. GC-MS-meetodite suhtes kohaldatakse punktis 6 sätestatud nõudeid. Rakupõhiste bioanalüütiliste meetodite erinõuded on sätestatud punktis 7.

5.7.2.

Laborid, kus proovide tavakontrolliks kasutatakse sõeluuringumeetodeid, peavad tegema tihedat koostööd kinnitavat meetodit kasutavate laboritega.

5.7.3.

Tavaanalüüside käigus tuleb kontrollida sõeluuringumeetodi tulemuslikkust analüüsi kvaliteedi kontrollimise ja meetodi pideva valideerimise teel. Nõuetele vastavate tulemuste kontrollimiseks peab olema kehtestatud pidev kava.

5.7.4.

Raku reaktsiooni võimaliku pärssimise ja tsütotoksilisuse kontroll

20 % prooviekstraktidest tuleb kontrollida tavapärase sõeluuringuga, lisades neile või jättes lisamata piirnormile või häiretasemele vastavas koguses 2,3,7,8-TCDDd, et kontrollida, kas prooviekstraktis esinevad segavad ained võivad reaktsiooni pärssida. Rikastatud proovis mõõdetud kontsentratsiooni võrreldakse rikastamata ekstraktis määratud kontsentratsiooni ja rikastamisel kasutatud kontsentratsiooni summaga. Kui kõnealune mõõdetud kontsentratsioon on arvutatud (summaarsest) kontsentratsioonist üle 25 % väiksem, viitab see signaali võimalikule pärssimisele ning asjaomast proovi tuleb analüüsida GC-HRMS-meetodil tehtava kinnitava analüüsiga. Tulemusi kontrollitakse kvaliteedikontrolli kaartide põhjal.

5.7.5.

Nõuetele vastavate proovide kvaliteedikontroll

Ligikaudu 2–10 % nõuetele vastavate proovide tulemustest tuleb olenevalt proovi maatriksist ja labori kogemustest kinnitada GC-HRMS-meetodiga.

5.7.6.

Valenegatiivsete tulemuste osakaalu arvutamine kvaliteedikontrolli andmete põhjal

Määratakse, kui suur on valenegatiivsete tulemuste osakaal, mis on saadud alla- ja ülespoole piirnormi või häiretaset jäävate proovide sõeluuringul. Valenegatiivsete tulemuste tegelik osakaal peab jääma alla 5 %. Kui proovi maatriksi või maatriksite rühma kohta on olemas vähemalt 20 nõuetele vastava proovi kvaliteedikontrolliga kinnitatud tulemused, arvutatakse nende andmete põhjal valenegatiivsete tulemuste osakaal. Valenegatiivsete tulemuste osakaalu hindamiseks vajaliku 20 tulemuse hulka võib arvata ka laboritevahelistes võrdluskatsetes või seoses saastamisjuhtumiga analüüsitud proovide tulemused, milles määratava aine kontsentratsioon ületab piirnormi näiteks kuni kaks korda. Proovid peavad hõlmama kõige levinumaid analoogide kombinatsioone, mis esindavad eri allikaid.

Ehkki sõeluuringu esmane eesmärk on teha kindlaks häiretaset ületava sisaldusega proovid, lähtutakse valenegatiivsete tulemuste osakaalu kindlakstegemisel piirnormist ning seejuures võetakse arvesse kinnitava meetodi kohast mõõtmise laiendmääramatust.

5.7.7.

Sõeluuringuga tuvastatud võimalikke nõuetele mittevastavaid tulemusi tuleb alati kontrollida esialgse proovi täieliku kordusanalüüsiga, kasutades kinnitavat meetodit. Neid proove võib kasutada ka valepositiivsete tulemuste osakaalu hindamiseks. Sõeluuringumeetodite puhul on valepositiivsete tulemuste osakaal selliste tulemuste osakaal, mis tunnistatakse kinnitava analüüsiga nõuetele vastavaks, kuigi varasemal sõeluuringul on proov osutunud nõuetele mittevastavuse kahtlusega prooviks. Sõeluuringumeetodi eeliste hindamisel tuleb valepositiivse tulemuse andnud proovide arvu võrrelda kontrollitud proovide koguarvuga. See osakaal peab olema piisavalt väike, et sõeluuringumeetodit oleks mõtet kasutada.

5.7.8.

Bioanalüütilised meetodid peavad valideerimistingimustes võimaldama usaldusväärselt, arvutatud ja väljendatud BEQna.

Ka korduvuse tingimustes kasutatavate bioanalüütiliste meetodite puhul peaks laborisisene RSDr olema üldjuhul väiksem kui korratavuse tingimustes (RSDR).

6. GC-MS-meetodite erinõuded, mida tuleb täita sõeluuringu või kinnitava analüüsi puhul

6.1. WHO-TEQ tulemuste ülemise tõkke ja alumise tõkke vaheline vastuvõetav erinevus

Ülemise ja alumise tõkke vaheline erinevus ei tohi piirnormi ja vajaduse korral häiretaseme ületamise kinnitamiseks olla suurem kui 20 %.

6.2. Saagiste kontroll

6.2.1.

Analüüsimeetodi valideerimiseks tuleb 13C-märgistatud 2,3,7,8-klooritud PCDD/Fide sisestandardid ja 13C-märgistatud dioksiinitaoliste PCBde sisestandardid lisada kohe analüüsi alguses, näiteks enne ekstraheerimist. Iga tetra- kuni oktaklooritud PCDD/Fide homoloogilise rühma kohta ning iga dioksiinitaoliste PCBde homoloogilise rühma kohta tuleb lisada vähemalt üks analoog (alternatiivina võib lisada vähemalt ühe analoogi iga valitud iooni massispektromeetrilise registreerimise funktsiooni kohta, mida kasutatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse kontrolliks). Kinnitavate meetodite puhul tuleb kasutada kõiki seitsetteist 13C-märgistatud 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fide sisestandardit ja kõiki kahtteist 13C-märgistatud dioksiinitaoliste PCBde sisestandardit.

6.2.2.

Asjakohaseid kalibreerimislahuseid kasutades tuleb määrata suhtelised kalibreerimistegurid ka neile analoogidele, mille puhul 13C-märgistatud analoogi ei lisata.

6.2.3.

Alla 10 % rasvasisaldusega taimse ja loomse sööda puhul tuleb sisestandardid kindlasti lisada enne ekstraheerimist. Üle 10 % rasvasisaldusega loomse sööda puhul tuleb sisestandardid lisada kas enne või pärast rasva ekstraheerimist. Ekstraheerimise tõhusus tuleb valideerida sobival viisil olenevalt sellest, millises etapis sisestandardid lisatakse.

6.2.4.

Enne GC-MS-analüüsi tuleb lisada 1 või 2 saagise (surrogaat)standardit.

6.2.5.

Saagise kogust tuleb kontrollida. Kinnitava meetodi puhul peavad individuaalsete sisestandardite saagised olema vahemikus 60–120 %. Individuaalsete analoogide, eriti mõne hepta- või oktaklooritud dibenso-p-dioksiini ja dibensofuraani puhul on lubatud väiksemad või suuremad saagised, kui nende panus TEQ väärtusesse ei ületa 10 % TEQ koguväärtusest (PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa alusel). GC-MS-sõeluuringumeetodite puhul peavad saagised olema vahemikus 30–140 %.

6.3. Segavate ainete eemaldamine

—	PCDD/Fid eraldatakse segavatest klooritud ühenditest, näiteks mittedioksiinitaolistest PCBdest ja klooritud difenüüleetritest, sobiva kromatograafilise meetodiga (eelistada tuleks florisil-, alumiiniumoksiid- ja/või süsinikkolonne).

—	Isomeeride gaasikromatograafiline lahutus peab olema selline, et 1,2,3,4,7,8-HxCDFi ja 1,2,3,6,7,8-HxCDFi piikide kattuvus on alla 25 %.

6.4. Kalibreerimine standardkõveraga

Kalibreerimiskõvera vahemik peab hõlmama asjakohast piirnormi või häiretaset.

6.5. Kinnitavate meetodite erikriteeriumid

—

GC-HRMSi puhul:

HRMSi puhul peab lahutusvõime kogu massivahemikus olema üldjuhul vähemalt 10 000, kui piikidevahelise ala kõrgus jääb alla 10 %;

järgitakse rahvusvaheliselt tunnustatud standardites, näiteks standardis EN 16215:2012 „Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS“ (Loomasööt – dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde määramine GC-HRMSiga ning indikaator-PCBde määramine GC-HRMSiga) ja/või USA Keskkonnakaitseameti meetodite 1613 ja 1668 läbivaadatud versioonides kirjeldatud tuvastamise ja kinnitamise lisakriteeriume.

—

GC-MS/MSi puhul:

jälgitakse vähemalt 2 spetsiifilist eellasiooni, millest kummalgi on vastav spetsiifiline ülemineku-järglasioon kõikide märgistatud ja märgistamata analüütide jaoks analüüsitavas vahemikus;

valitud ülemineku-järglasioonide suhteliste signaalitugevuste suurim lubatud hälve võib olla ± 15 % võrreldes arvutatud või mõõdetud väärtustega (kaliibrimisstandardite keskmine), identsetes MS/MSi tingimustes, eelkõige põrkeenergia ja põrkegaasi rõhu osas, iga analüüdi ülemineku puhul;

iga kvadrupooli lahutusvõime peab olema võrdne ühikmassilahutusvõimega või sellest parem (ühikmassilahutusvõime: lahutusvõime, mis on piisav kahe teineteisest ühe massiühiku kaugusel asuva piigi eristamiseks), et minimeerida võimalikku segavat mõju uuritavatele analüütidele;

järgitakse rahvusvaheliselt tunnustatud standardites, näiteks standardis EN 16215:2012 „Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS“ (Loomasööt – dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde määramine GC-HRMSiga ning indikaator-PCBde määramine GC-HRMSiga) ja/või USA Keskkonnakaitseameti meetodite 1613 ja 1668 muudetud versioonides kirjeldatud tuvastamise ja kinnitamise lisakriteeriume, välja arvatud kohustust kasutada GC-HRMSi.

7. BIOANALÜÜTILISTELE MEETODITELE ESITATAVAD ERINÕUDED

Bioanalüütilised meetodid on bioloogilistele põhimõtetele tuginevad meetodid, nagu rakupõhine, retseptor- ja immuunanalüüs. Käesolevas punktis sätestatakse bioanalüütiliste meetodite üldnõuded.

Sõeluuringumeetodiga liigitatakse proov põhimõtteliselt nõuetele vastavaks või nõuetele mittevastavuse kahtlusega prooviks. Sel otstarbel võrreldakse arvutatud BEQ väärtust läviväärtusega (vt punkt 7.3). Läviväärtusest allapoole jäävad proovid tunnistatakse nõuetele vastavaks, läviväärtusega võrdsed või seda ületavad proovid loetakse mittevastavuse kahtlusega proovideks ning neid tuleb analüüsida kinnitava meetodiga. Praktikas võib kõige sobivamaks läviväärtuseks olla BEQ väärtus, mis vastab 2/3 piirnormist, eeldusel, et on tagatud valenegatiivsete tulemuste osakaal alla 5 % ja vastuvõetav valepositiivsete tulemuste osakaal. Kui PCDD/Fide piirnorm ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa piirnorm on erinevad, on proovide nõuetele vastavuse kontrollimiseks ilma fraktsioneerimata vaja PCDD/Fide jaoks asjakohaseid bioanalüüsi läviväärtusi. Häiretaset ületavate proovide kontrollimisel on sobivaks läviväärtuseks asjakohane protsent vastavatest häiretasemetest.

Kui hinnangulist sisaldust väljendatakse BEQna, peavad proovi analüüsitulemused jääma töövahemikku ja ületama teatamiskünnise (vt punktid 7.1.1 ja 7.1.6).

7.1. Analüüsitulemuste hindamine

7.1.1. Üldised nõuded

—

Kui kontsentratsioone arvutatakse TCDD kalibreerimiskõvera alusel, iseloomustab kõvera ülemise osa väärtusi suur hajuvus (variatsioonikordaja CV suur väärtus). Töövahemik on ala, kus CV on alla 15 %. Töövahemiku alumine piir (teatamiskünnis) peab olema vähemalt kolm korda suurem tühikatsete tulemusest. Töövahemiku ülemine piir esitatakse tavaliselt EC70 väärtusena (70 % suurimast efektiivsest kontsentratsioonist), kuid see on väiksem, kui CV on selles vahemikus üle 15 %. Töövahemik määratakse valideerimise käigus. Läviväärtused (vt punkt 7.3) peavad kindlalt jääma töövahemikku.

—

Standardlahuste ja prooviekstraktide analüüsimisel tehakse kolm või vähemalt kaks kordusmõõtmist. Kordusanalüüsi korral annab 4–6 üle plaadi jaotatud kannus analüüsitav standardlahus või kontrollekstrakt tulemuse või kontsentratsiooni (võimalik ainult töövahemikus), mis põhineb CV-l, mis on väiksem kui 15 %.

7.1.2. Kalibreerimine

7.1.2.1. Kalibreerimine standardkõveraga

—	Proovide dioksiinisisalduse hindamiseks võrreldakse analüüsitulemust TCDD (või PCB 126 või PCDD/PCDFi/dioksiinitaolise PCB standardsegu) kalibreerimiskõveraga, millest arvutatakse ekstrakti ja seejärel proovi BEQ väärtus.

—

Kalibreerimiskõver peab hõlmama 8–12 kontsentratsiooni (vähemalt kahe kordusmõõtmisega), nii et kõvera alumises osas (töövahemikus) oleks piisavalt kontsentratsioonipunkte. Erilist tähelepanu tuleb pöörata kõvera sobivusele töövahemikus. Mittelineaarse regressiooni korral ei ole R2 väärtusest regressiooni sobivuse hindamisel eriti või üldse abi. Parem mudeli sobivus saavutatakse arvutatud sisalduse ja mõõdetud sisalduse vahe (nt ruuthälvete summa) minimeerimisega töövahemikule vastavas kõvera osas.

—

Seejärel tuleb korrigeerida prooviekstrakti hinnangulist dioksiinisisaldust uuritava maatriksiga või lahustiga tühiproovi kohta arvutatud BEQ väärtuse põhjal (et võtta arvesse kasutatud lahustites ja kemikaalides esinevaid lisandeid) ning näilise saagise põhjal (arvutatakse sellise sobiva võrdlusproovi BEQ väärtuse alusel, mille esindav analoogide kombinatsioon vastab ligikaudu piirnormile või häiretasemele). Saagise korrigeerimiseks peab näiline saagis alati olema nõutavas vahemikus (vt punkt 7.1.4). Saagise korrigeerimiseks kasutatavad võrdlusproovid peavad vastama punktis 7.2 sätestatud nõuetele.

7.1.2.2. Kalibreerimine võrdlusproovide abil

Teise võimalusena võib kasutada vähemalt nelja võrdlusproovi alusel koostatud kalibreerimiskõverat (vt punkt 7.2.4): üks maatriksiga tühiproov ning kolm võrdlusproovi sisaldustega, mis võrduvad 0,5-, 1,0- ja 2,0-kordse piirnormi või häiretasemega; kui võrdlusproovide maatriksi omadused kattuvad tundmatute proovide maatriksi omadustega, ei ole vaja arvestada tühikatse ja saagise parandit. Sellisel juhul võib otse nende proovide alusel arvutada analüüsitulemuse, mis vastab 2/3 piirnormist (vt punkt 7.3), ja kasutada seda läviväärtusena. Häiretaset ületavate proovide kontrollimisel on sobivaks läviväärtuseks asjakohane protsent sellistest häiretasemetest.

7.1.3. PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi määramine

Ekstraktid võib jagada PCDD/Fisid ja dioksiinitaolisi PCBsid sisaldavateks fraktsioonideks, mis võimaldab eraldi määrata PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde TEQ väärtused (väljendatuna BEQna). Dioksiinitaolisi PCBsid sisaldava fraktsiooni analüüsimise tulemuste hindamiseks tuleb eelistatavalt kasutada standardiga PCB 126 saadud kalibreerimiskõverat.

7.1.4. Bioanalüüsi näilised saagised

Bioanalüüsi näiline saagis arvutatakse sobivate võrdlusproovide alusel, mille esindav analoogide kombinatsioon vastab ligikaudu piirnormile või häiretasemele, ja seda väljendatakse BEQ väärtuse protsendina TEQ väärtusest. Olenevalt analüüsi liigist ja kasutatud TEFidest (12) võib dioksiinitaoliste PCBde TEF- ja REP-kordajate erinevuse tõttu dioksiinitaoliste PCBde näiline saagis olla PCDD/Fide näilise saagisega võrreldes väike. Seepärast peab PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi määramisel bioanalüüsi näiline saagis olema järgmine: dioksiinitaoliste PCBde puhul 20–60 % ja PCDD/Fide puhul 50–130 % (vahemik kehtib TCDD kalibreerimiskõvera kasutamisel). Dioksiinitaoliste PCBde osakaal PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summas võib eri maatriksite ja proovide puhul erineda; need vahemikud kajastuvad PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa bioanalüüsi näilises saagises, mis peab olema 30–130 %. Kui liidu õigusaktides muudetakse oluliselt PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde TEFide väärtusi, tuleb need vahemikud läbi vaadata.

7.1.5. Saagiste kontroll puhastamisel

Valideerimise käigus kontrollitakse ühendite kadu puhastamisel. Analoogide seguga rikastatud tühiproov (korduskatsete arv n on vähemalt 3) puhastatakse ning saagist ja varieeruvust kontrollitakse kinnitava meetodiga. Saagis peab olema vahemikus 60–120 %, eelkõige selliste analoogide puhul, mis moodustavad eri segude TEQ väärtusest üle 10 %.

7.1.6. Teatamiskünnis

BEQ väärtustest teatamisel tuleb teatamiskünnis kindlaks määrata tüüpilisi analoogide kombinatsioone sisaldavast asjakohasest maatriksist võetud proovide alusel, mitte standarditel põhineva kalibreerimiskõvera alusel, kuna kõvera alumises osas on täpsus väike. Arvestada tuleb ekstraheerimise ja puhastamise mõju. Teatamiskünnis peab olema tühikatsete tulemusest vähemalt kolm korda suurem.

7.2. Võrdlusproovide kasutamine

7.2.1.

Võrdlusproovid peavad esindama proovi maatriksit, analoogide kombinatsioone ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kontsentratsioone vahemikus, mis vastab piirnormile või häiretasemele.

7.2.2.

Igas katseseerias tuleb kasutada tühikatset, eelistatavalt maatriksiga tühiproovi, ja piirnormile või häiretasemele vastava sisaldusega võrdlusproovi. Neid proove tuleb ekstraheerida ja analüüsida samal ajal ja samades tingimustes. Võrdlusprooviga saadud väärtus peab olema selgelt suurem tühiprooviga saadud väärtusest, mis tõendab katsemeetodi sobivust. Kõnealuseid proove võib kasutada tühikatset ja saagist arvestava parandi tegemisel.

7.2.3.

Saagist arvestava parandi tegemiseks valitud võrdlusproovid peavad olema analüüsitava proovi suhtes esindavad, st analoogide kombinatsioonid ei tohi põhjustada sisalduse alahindamist.

7.2.4.

Et tõendada analüüsi nõuetekohast tulemuslikkust huvipakkuvas sisalduste vahemikus piirnormi või häiretaseme kontrollimiseks, võib kasutada täiendavaid võrdlusproove, milles uuritava aine sisaldus vastab näiteks piirnormi või häiretaseme 0,5- ja 2-kordsele väärtusele. Üheskoos võib neid proove kasutada analüüsitavate proovide BEQ väärtuste arvutamiseks (vt punkt 7.1.2.2).

7.3. Läviväärtuste määramine

Tuleb teha kindlaks BEQ väärtustes väljendatud bioanalüütiliste tulemuste ja TEQ väärtustes väljendatud kinnitava meetodi tulemuste vaheline seos (nt asjakohase maatriksiga tehtud kalibreerimiskatsetega, milles kasutatakse võrdlusproove, mille rikastustasemed on 0, 0,5-, 1- ja 2-kordne piirnorm, ja mida korratakse igal tasemel 6 korda (n = 24)). Selle seose alusel saab hinnata (tühiproovi ja saagise) parandeid, kuid neid tuleb kontrollida punkti 7.2.2 kohaselt.

Läviväärtused tuleb määrata selleks, et otsustada, kas proov vastab piirnormile, või vajaduse korral häiretaseme kontrollimiseks, kusjuures asjaomased piirnormid või häiretasemed on kehtestatud kas ainult PCDD/Fide või dioksiinitaoliste PCBde jaoks või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa jaoks. Läviväärtus on bioanalüüsi tulemuste (mida on parandatud tühikatse ja saagise arvestamiseks) jaotuse alumine piir, mis vastab 95 % usaldusnivooga kinnitava meetodi otsustuspiirile (eeldades, et valenegatiivsete tulemuste osakaal on < 5 % ja RSDR < 25 %). Kinnitava meetodi otsustuspiir on piirnorm, mille puhul on arvesse võetud mõõtmise laiendmääramatust.

Läviväärtuse (BEQdes) võib arvutada, kasutades üht punktides 7.3.1, 7.3.2 ja 7.3.3 sätestatud lähenemisviisidest (vt joonis 1).

7.3.1.

95 % usaldusnivoole vastava usaldusvahemiku alumise piiri kasutamine, mis vastab kinnitava meetodi otsustuspiirile

kus

BEQDL	on BEQ, mis vastab kinnitava meetodi otsustuspiirile, mis on piirnorm, mille puhul on arvesse võetud mõõtmise laiendmääramatust,
sy,x	on jääkstandardhälve,
t α,f = m-2	on Studenti tegur (α = 5 %, f = vabadusastmete arv, ühepoolse piiranguga),
m	on kalibreerimispunktide koguarv (indeks j),
n	on korduste arv igal tasemel,
xi	on kinnitava meetodiga määratud, TEQna väljendatud kontsentratsioon proovis kaliibrimispunktis i,
	on kõikide kaliibrimisproovide kontsentratsioonide keskväärtus (TEQdes),
	on ruutude summa parameeter, i – kalibreerimispunkti i indeks.

7.3.2.

Arvutamine kinnitava meetodi otsustuspiirile vastava saastumisega proovide korduval analüüsimisel (n ≥ 6) saadud (tühikatse ja saagise arvestamiseks parandatud) bioanalüütiliste tulemuste põhjal; see on jaotuse alumine piir vastava keskmise BEQ väärtuse korral:

kus

SDR	on bioanalüüsi tulemuste standardhälve BEQDL korral, mõõdetuna laborisisese korratavuse tingimustes.

7.3.3.

Arvutamine 2/3 piirnormi või häiretaseme väärtusele (põhineb tähelepanekul, et kõnealune tase vastab umbkaudu punkti 7.3.1 või 7.3.2 alusel kindlaks määratud läviväärtusele) vastava saastumisega proovide korduval analüüsimisel (n ≥ 6) saadud bioanalüütiliste tulemuste (BEQdes, parandatud tühikatse ja saagise arvestamiseks) keskväärtusena:

Läviväärtuste arvutamine 95 % usaldusnivoo korral eeldusel, et valenegatiivsete tulemuste osakaal on < 5 % ja RSDR < 25 %:

1.	95 % usaldusnivoole vastava usaldusvahemiku alumise piiri alusel, mis vastab kinnitava meetodi otsustuspiirile.

2.	kinnitava meetodi otsustuspiirile vastava saastumisega proovide korduva analüüsimise (n ≥ 6) alusel saadud tulemuste jaotuse (Joonisel 1 kellukesekujuline kõver) alumise piiri järgi sellekohase keskmise BEQ väärtuse juures.

Joonis 1

7.3.4.

Läviväärtustele kehtestatud piirangud

BEQ-põhised läviväärtused, mis on arvutatud valideerimise käigus saadud RSDR alusel, kasutades piiratud arvu proove erinevate maatriksite ja analoogide kombinatsiooniga, võivad olla suuremad kui TEQ-põhised piirnormile või häiretasemele vastavad sisaldused, kuna valideerimisel saavutatakse suurem kordustäpsus kui tavaolukorras, kus tuleb kontrollida võimalike analoogide kombinatsioonide tundmatut spektrit. Sellisel juhul võetakse läviväärtuse arvutamisel aluseks kas RSDR = 25 % või eelistatakse sisaldust, mis on 2/3 piirnormi või häiretaseme väärtusest.

7.4. Tulemuslikkuse näitajad

7.4.1.

Bioanalüütiliste meetodite puhul ei ole võimalik kasutada sisestandardeid, mistõttu tuleb katseseeriasisese ja katseseeriatevahelise standardhälbe kohta andmete saamiseks teha katsed bioanalüütiliste meetodite korduvuse kohta. Korduvus peab jääma alla 20 % ja laborisisene korratavus alla 25 %. See peab põhinema arvutatud BEQ väärtustel pärast tühikatse- ja saagiseparandi arvessevõtmist.

7.4.2.

Valideerimise käigus tõendatakse, et analüüs võimaldab eristada tühiproovi ja läviväärtusele vastavat sisaldust, mis võimaldab kindlaks teha proovid, milles asjaomane läviväärtus on ületatud (vt punkt 7.1.2).

7.4.3.

Määratakse uuritavad ühendid, võimalikud segavad tegurid ja tühiproovi suurimad lubatud väärtused.

7.4.4.

Ühe prooviekstrakti kolmekordsel analüüsimisel ei tohi protsentides väljendatud standardhälve olla suurem kui 15 % analüüsitulemusest või selle alusel arvutatud sisaldusest (võimalik üksnes töövahemikus).

7.4.5.

Bioanalüütilise meetodi tulemuslikkuse hindamiseks kindlas ajavahemikus kasutatakse võrdlusproovi(de) (tühiproov ning piirnormile ja häiretasemele vastava sisaldusega proov) korrigeerimata tulemusi, mis on väljendatud BEQdes.

7.4.6.

Tühiproovide ja iga tüüpi võrdlusproovide kohta tuleb koostada kvaliteedikontrolli kaardid ja kontrollida, kas analüüsi tulemuslikkus vastab nõuetele; eelkõige on nõutav teatava miinimumerinevuse olemasolu tühiproovide ja töövahemiku alumise piiri vahel ning võrdlusproovide puhul on nõutav laborisisene korratavus. Tühikatseid tuleb põhjalikult kontrollida, et vältida valenegatiivsete tulemuste saamist pärast tühiproovi tulemuse lahutamist.

7.4.7.

Nõuetele mittevastavuse kahtlusega proovide ja 2–10 % nõuetekohaste proovide (vähemalt 20 proovi iga maatriksi kohta) kinnitava meetodiga saadud tulemused tuleb koondada ning kasutada sõeluuringumeetodi tulemuslikkuse ning BEQ ja TEQ vahelise seose hindamiseks. Neid andmeid võib kasutada asjaomase valideeritud maatriksiga tavaproovide suhtes kohaldatavate läviväärtuste ümberhindamiseks.

7.4.8.

Meetodi tulemuslikkust võib tõendada ka laboritevahelistes võrdluskatsetes osalemisega. Võrdluskatsete käigus analüüsitud proovid hõlmavad nt kuni kahekordse piirnormini ulatuvat kontsentratsioonide vahemikku ja nende tulemusi võib kasutada valenegatiivsete tulemuste osakaalu hindamisel, kui labor suudab tõendada meetodi tulemuslikkust asjaomases laboris. Proovid peavad hõlmama kõige levinumaid analoogide kombinatsioone, mis esindavad eri allikaid.

7.4.9.

Saastumisjuhtumite korral võidakse läviväärtused ümber hinnata, võttes arvesse asjaomase juhtumiga seotud konkreetse maatriksi omadusi ja esinevaid analoogide kombinatsioone.

8. TULEMUSTE ESITAMINE

8.1. Kinnitavad meetodid

8.1.1.

Analüüsitulemused peavad hõlmama iga üksiku PCDD/Fi ja dioksiinitaolise PCB analoogi sisaldusi ning TEQ väärtus tuleb esitada nii alumise ja ülemise tõkke kui ka vaheväärtuse põhisena, et tagada võimalikult suure hulga andmete olemasolu katseprotokollis ja võimaldada tulemuste tõlgendamist lähtuvalt konkreetsetest nõuetest.

8.1.2.

Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod.

8.1.3.

Üksikute sisestandardite saagised tuleb esitada juhul, kui need jäävad väljapoole punktis 6.2.5 nimetatud vahemikku ja kui on ületatud piirnorm (sellisel juhul ühe korduskatse saagised) või kui nõutakse neist teatamist.

8.1.4.

Kuna proovi nõuetekohasuse hindamisel tuleb arvestada mõõtmise laiendmääramatust, esitatakse ka see näitaja. Analüüsitulemused tuleb seega esitada kujul x +/– U, kus x on analüüsitulemus ja U on mõõtmise laiendmääramatus, kusjuures arvutamisel kasutatakse kattetegurit 2, mis annab usaldusnivoo ligikaudu 95 %. Kui PCDD/Fid ja dioksiinitaolised PCBd määratakse eraldi, tuleb PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa kohta kasutada PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi saadud analüüsitulemuste hinnanguliste laiendmääramatuste summat.

8.1.5.

Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid.

8.2. Bioanalüütilised sõeluuringumeetodid

8.2.1.

Sõeluuringu tulemus esitatakse järgmisel kujul: nõuetele vastav või nõuetele mittevastavuse kahtlusega („kahtlane“).

8.2.2.

Lisaks sellele võib PCDDde/Fide ja/või dioksiinitaoliste PCBde esialgse sisalduse esitada BEQdes, mitte TEQdes.

8.2.3.

Allapoole teatamiskünnist jääva tulemusega proovi kohta märgitakse „allpool teatamiskünnist“. Töövahemiku ülempiirist suurema sisaldusega proovi puhul esitatakse tulemus kujul „ületab töövahemiku ülempiiri“ ning märgitakse töövahemiku ülempiirile vastav BEQ väärtus.

8.2.4.

Katseprotokollis tuleb iga proovimaatriksi tüübi kohta esitada piirnorm või häiretase, millel hindamine põhineb.

8.2.5.

Protokollis esitatakse kasutatud analüüsimeetodi liik, analüüsimise aluspõhimõtted ja kalibreerimise viis.

8.2.6.

Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod.

8.2.7.

Mittevastavuse kahtlusega proovide puhul tuleb protokolli lisada märkus võetavate meetmete kohta. Suurema sisaldusega proovides tuleb PCDD/Fide kontsentratsioon ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarne kontsentratsioon määrata/kinnitada kinnitava meetodi abil.

8.2.8.

Esitatakse üksnes kinnitava analüüsiga saadud nõuetele mittevastavad tulemused.

8.3. Füüsikalis-keemilised sõeluuringumeetodid

8.3.1.

Sõeluuringu tulemus esitatakse järgmisel kujul: nõuetele vastav või nõuetele mittevastavuse kahtlusega („kahtlane“).

8.3.2.

Katseprotokollis tuleb iga proovimaatriksi tüübi kohta esitada piirnorm või häiretase, millel hindamine põhineb.

8.3.3.

Peale selle võib esitada iga üksiku PCDD/Fi ja dioksiinitaolise PCB analoogi sisalduse ning TEQ väärtuse alumise tõkke, ülemise tõkke ja vaheväärtuse järgi. Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid.

8.3.4.

8.3.5.

Katseprotokollis märgitakse, millist GC-MSi meetodit kasutati.

8.3.6.

Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod.

8.3.7.

8.3.8.

Otsuse nõuetele mittevastavuse kohta võib teha üksnes pärast kinnitavat analüüsi.

III PEATÜKK

PROOVI ETTEVALMISTAMINE JA NÕUDED ANALÜÜSIMEETODITELE, MIDA KASUTATAKSE MITTEDIOKSIINITAOLISTE PCBDE SISALDUSE AMETLIKUKS KONTROLLIKS SÖÖDAS

1. Kohaldamisala

Käesolevas peatükis sätestatud nõudeid kohaldatakse sööda analüüsimisel mittedioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks, samuti seoses proovide ettevalmistamise ja analüüsimisega muul regulatiivsel eesmärgil, sealhulgas kontrollide puhul, mida söödakäitlejad teevad määruse (EÜ) nr 183/2005 sätetele vastavuse tagamiseks.

2. Kasutatavad tuvastamismeetodid

Gaasikromatograafia koos elektronhaarde detekteerimisega (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS või samaväärsed meetodid.

3. Uuritavate analüütide määramine ja kinnitamine

3.1.

Suhteline retentsiooniaeg vastavalt sisestandarditele või võrdlusstandarditele (lubatud hälve +/– 0,25 %).

3.2.

Mittedioksiinitaoliste PCBde gaasikromatograafiline lahutamine segavatest ainetest, eelkõige nendega koos elueeruvatest PCBdest, eriti juhul, kui sisaldus proovis on ligikaudselt võrreldav kehtiva piirnormiga, ning on vaja kinnitada nõuetele mittevastavust (13).

3.3.

Nõuded GC-MSi meetoditele

Vähemalt järgmise arvu molekulaarioonide või asjaomasesse molekulirühma kuuluvate iseloomulike ioonide jälgimine:

a)	HRMSi puhul kaks spetsiifilist iooni;

b)	LRMSi puhul kolm spetsiifilist iooni;

c)	MS-MSi puhul kaks spetsiifilist eellasiooni, millest kummalgi on üks neil vastav üleminekul tekkinud spetsiifiline järglasioon.

Valitud massiga fragmentide isotoopsuhte suurimad lubatud hälbed:

valitud massiga fragmentide isotoopsuhte suhteline hälve teoreetilisest isotoopide kogusest või uuritava iooni (kõige levinum jälgitav ioon) ja iseloomuliku iooni (iseloomulike ioonide) kalibreerimisstandardist: ± 15 %.

3.4.

Nõuded GC-ECD meetoditele

Piirnormi ületavaid tulemusi tuleb kinnitada kahe GC-kolonniga, millel on eri polaarsusega statsionaarne faas.

4. Meetodi tulemuslikkuse tõendamine

Meetodi tulemuslikkus valideeritakse piirnormile vastava sisalduse vahemikus (0,5- kuni 2-kordsele piirnormile vastava sisaldusega); tõendatakse, et korduvanalüüsi variatsioonikordaja on vastuvõetav (vt vahetäpsuse nõuded, punkt 9).

5. Määramispiir

Mittedioksiinitaoliste PCBde määramispiiride summa (14) ei tohi ületada ühte kolmandikku piirnormi väärtusest (15).

6. Kvaliteedikontroll

Korrapärane tühiproovide, rikastatud proovide ja kvaliteedikontrolli proovide analüüsimine, osalemine asjaomaste maatriksitega tehtavates laboritevahelistes uuringutes.

7. Saagiste kontroll

7.1.

Kasutatakse sobivaid sisestandardeid, mille füüsikalis-keemilised omadused on võrreldavad uuritavate analüütide omadega.

7.2.

Sisestandardite lisamine:

lisamine toodetele (enne ekstraheerimist ja puhastamist).

7.3.

Nõuded meetoditele, mille puhul kasutatakse kõiki kuut isotoopmärgistatud mittedioksiinitaolise PCB analoogi:

a)	tulemustesse viiakse sisse sisestandardite saagiseid arvestav parand;

b)	isotoopmärgistatud sisestandardi saagis peab olema 60–120 %;

c)	individuaalsetel analoogidel, mille osatähtsus mittedioksiinitaoliste PCBde summas on alla 10 %, võivad olla väiksemad või suuremad saagised.

7.4.

Nõuded meetoditele, mille puhul ei kasutata kõiki kuut isotoopmärgistatud sisestandardit või kasutatakse muid sisestandardeid:

a)	kontrollitakse iga proovi sisestandardi(te) saagist;

b)	sisestandardi(te) saagis peab olema 60–120 %;

c)	tulemustesse viiakse sisse sisestandardite saagiseid arvestav parand.

7.5.

Märgistamata analoogide saagiseid kontrollitakse rikastatud proovide või kvaliteedikontrolli proovidega, milles uuritava aine kontsentratsioon on piirnormi lähedane. Selliste analoogide aktsepteeritavad saagised on 60–120 %.

8. Nõuded laboritele

Vastavalt määrusele (EL) 2017/625 peavad laborid olema ISO/IEC juhendi 58 kohaselt tegutseva tunnustatud asutuse poolt akrediteeritud, millega tagatakse, et laborid kohaldavad analüüsimisel kvaliteeditagamissüsteemi. Laborid tuleb akrediteerida standardi EN ISO/IEC 17025 kohaselt. Peale selle järgitakse põhimõtteid, mida on kirjeldatud tehnilistes suunistes, milles käsitletakse mõõtemääramatuse ja määramispiiride hinnangulise väärtuse määramist PCBde analüüsimisel (16).

9. Tulemuslikkuse näitajad: piirnormile vastava mittedioksiinitaoliste PCBde summaarse sisalduse suhtes kohaldatavad kriteeriumid

	Isotooplahjendusega massispektromeetria (*2)	Muud meetodid
Tõesus	–20 kuni +20 %	–30 kuni +30 %
Vahetäpsus (RSD %)	≤ 15 %	≤ 20 %
Ülemise ja alumise tõkke erinevus	≤ 20 %	≤ 20 %

10. Tulemuste esitamine

10.1.

Selleks et katseprotokoll sisaldaks võimalikult palju andmeid ja võimaldaks tulemuste tõlgendamist konkreetsetest nõuetest lähtuvalt, peavad analüüsitulemused hõlmama iga üksiku mittedioksiinitaolise PCB sisaldust ja nende PCB analoogide summaarset sisaldust ning olema esitatud alumise ja ülemise tõkke ning vaheväärtusena.

10.2.

Protokollis esitatakse PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod.

10.3.

Üksikute sisestandardite saagised tuleb esitada juhul, kui need jäävad väljapoole punktis 7 nimetatud vahemikku, kui on ületatud piirnorm või muudel juhtudel, kui nõutakse teatamist.

10.4.

10.5.

Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid.

B. EN STANDARDID

Määruse (EL) 2017/625 artikli 34 lõike 2 punkti a kohaldamisel on asjakohased järgmised EN standardid:

EN 17194 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Desoksünivalenooli, aflatoksiin B1, fumonisiin B1 ja B2, toksiinide T-2 ja HT-2, zearalenooni ja ohratoksiin A määramine söödamaterjalis ja segasöödas LC-MS/MS abil

EN 17270 „Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Teobromiini määramine söödamaterjalis ja segasöödas, sh kakaost saadud koostisainetes, vedelikkromatograafia abil

EN 17504 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Gossüpoli määramine puuvillaseemnetes ja loomasöödas LC-MS/MS abil

EN 17362 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Pentaklorofenooli (PCP) määramine söödamaterjalis ja segasöödas LCMS/MS abil

EN 16279 Loomasööt – Fluoriidisisalduse määramine pärast soolhappega töötlemist ioonitundliku elektroodi meetodi (ISE) abil

EN 17053 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Mikroelementide, raskmetallide ja muude elementide määramine söödas ICP-MS abil (erinevad meetodid)

EN 15550 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Kaadmiumi ja plii määramine grafiitahi-aatomiabsorptsioonspektromeetria (GF-AAS) abil pärast rõhu all lagundamist

EN 16206 Loomasööt – Arseeni määramine hüdriidide tekitamisega aatomiabsorptsioonspektromeetria (HGAAS) abil pärast rõhu all mikrolainete toimel lagundamist (lagundamine 65 % lämmastikhappe ja 30 % vesinikperoksiidiga)

EN 16277 Loomasööt – Elavhõbeda määramine külmauru aatomiabsorptsioonspektromeetria (CVAAS) abil pärast rõhu all mikrolainete toimel lagundamist (lagundamine 65 % lämmastikhappe ja 30 % vesinikperoksiidiga)

EN 16278 Loomasööt – Anorgaanilise arseeni määramine hüdriidide tekitamisega aatomiabsorptsioonspektromeetria (HG-AAS) abil mikrolainete toimel ekstraheerimist ja tahkefaasilise ekstrakstiooni (SPE) abil eraldamist

EN 17374 Loomasööt: proovivõtu- ja analüüsimeetodid – Anorgaanilise arseeni määramine loomasöödas anioonivahetusega HPLC-ICP-MS abil

“

(1) PCDDde, PCDFide ja dioksiinitaoliste PCBde toksilisusfaktorite (TEF) tabel Inimestele avalduva riski hindamisel kasutatavad WHO-TEFid põhinevad 2005. aasta juunis Genfis peetud Maailma Terviseorganisatsiooni rahvusvahelise kemikaaliohutuse programmi (IPCS) ekspertkohtumise järeldustel (Martin van den Berg et al., „The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds“, Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Analoog	TEFi väärtus	Analoog	TEFi väärtus
Dibenso-p-dioksiinid (PCDDd) ja dibenso-p-furaanid (PCDFid)		Dioksiinitaolised PCBd ortoasendamata PCBd + orto-monoasendatud PCBd
2,3,7,8-TCDD	1
1,2,3,7,8-PeCDD	1	Ortoasendamata PCBd
1,2,3,4,7,8-HxCDD	0,1	PCB 77	0,0001
1,2,3,6,7,8-HxCDD	0,1	PCB 81	0,0003
1,2,3,7,8,9-HxCDD	0,1	PCB 126	0,1
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	0,01	PCB 169	0,03
OCDD	0,0003	Orto-monoasendatud PCBd
2,3,7,8-TCDF	0,1	PCB 105	0,00003
1,2,3,7,8-PeCDF	0,03	PCB 114	0,00003
2,3,4,7,8-PeCDF	0,3	PCB 118	0,00003
1,2,3,4,7,8-HxCDF	0,1	PCB 123	0,00003
1,2,3,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 156	0,00003
1,2,3,7,8,9-HxCDF	0,1	PCB 157	0,00003
2,3,4,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 167	0,00003
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	0,01	PCB 189	0,00003
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	0,01
OCDF	0,0003

Kasutatud lühendid: T = tetra; Pe = penta; Hx = heksa; Hp = hepta; O = okta; CDD = klorodibensodioksiin; CDF = klorodibensofuraan; CB = klorobifenüül.

(2) Komisjoni 22. märtsi 2021. aasta rakendusmäärus (EL) 2021/808, milles käsitletakse toiduloomadel kasutatavate farmakoloogiliste toimeainete jääkide analüüsimise meetodeid ja tulemuste tõlgendamist ning proovivõtumeetodeid ning millega tunnistatakse kehtetuks otsused 2002/657/EÜ ja 98/179/EÜ (ELT L 180, 21.5.2021, lk 84).

(3) Vajaduse korral järgitakse dokumendis „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry“ (Juhend mõõtemääramatuse kohta laboritele, kus tehakse PCDDde/PCDFide ja PCBde analüüse isotooplahjendusega massispektromeetria abil) (https://food.ec.europa.eu/system/files/2017-05/animal-feed-guidance_document_pcdd-f_pcb_en.pdf) kirjeldatud põhimõtteid.

(4) Ülemise tõkke põhimõtte kohaselt vastab iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus määramispiiri väärtusele. Alumise tõkke põhimõtte kohaselt vastab iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus nullile. Vaheväärtuse põhimõtte kohaselt vastab iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus poolele määramispiiri väärtusest.

(5) Kordusanalüüs – huvipakkuvate analüütide eraldi analüüs sama homogeniseeritud proovi teise alikvoodi põhjal. Üldiselt kohaldatakse kordusanalüüsi suhtes II lisa C peatüki punktis 3 sätestatud nõudeid. Meetodite puhul, milles kasutatakse asjaomaste analüütide jaoks 13C-märgistatud sisestandardit, on kordusanalüüs vajalik ainult siis, kui esimese määramise tulemus ei vasta nõuetele. Kordusanalüüs on vajalik, et välistada sisemise ristsaastumise või proovide juhusliku segiajamise võimalus. Kui analüüs tehakse seoses saastamisjuhtumiga, võib kinnitava kordusanalüüsi jätta tegemata, kui analüüsiks valitud proovid on jälgitavuse alusel seostatavad asjaomase saastamisjuhtumiga ning tuvastatud saasteainete sisaldus ületab oluliselt piirnormi.

(6) Üldiselt kohaldatakse kordusanalüüsi suhtes II lisa C peatüki punktis 3 sätestatud nõudeid. Kinnitavate meetodite puhul, milles kasutatakse asjaomaste analüütide jaoks 13C-märgistatud sisestandardit, on kordusanalüüs vajalik ainult siis, kui esimese määramise tulemus ei vasta nõuetele. Kordusanalüüs on vajalik, et välistada sisemise ristsaastumise või proovide juhusliku segiajamise võimalus. Kui analüüs tehakse seoses saastamisjuhtumiga, võib kinnitava kordusanalüüsi jätta tegemata, kui analüüsiks valitud proovid on jälgitavuse alusel seostatavad asjaomase saastamisjuhtumiga ning tuvastatud saasteainete sisaldus ületab oluliselt piirnormi.

(7) Ülemise tõkke põhimõtte kohaselt vastab toksilisusekvivalendi (TEQ) arvutamisel iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus määramispiiri väärtusele. Alumise tõkke põhimõtte kohaselt vastab TEQ arvutamisel iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus nullile. Vaheväärtuse põhimõtte kohaselt vastab TEQ arvutamisel iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus poolele määramispiiri väärtusest.

(8) Häiretaseme kontrollimise kordusanalüüsi suhtes kehtivad samad selgitused ja nõuded, mis on esitatud joonealuses märkuses 5 piirnormide kohta.

(9) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 12. jaanuari 2005. aasta määrus (EÜ) nr 183/2005, millega kehtestatakse söödahügieeni nõuded (ELT L 35, 8.2.2005, lk 1).

(10) Bioanalüütiliste meetodid ei ole spetsiifilised toksilisusfaktori (TEF) süsteemi analoogide suhtes. Prooviekstrakt võib sisaldada muid sarnase struktuuriga AhR-aktiivseid ühendeid, mis mõjutavad üldist tulemust. Seega ei saa bioanalüütilist tulemust pidada TEQ taseme hinnanguks, pigem viitab see proovi TEQ võimalikule tasemele.

(11) „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry“ (Juhend mõõtemääramatuse kohta laboritele, kus tehakse PCDDde/PCDFide ja PCBde analüüse isotooplahjendusega massispektromeetria abil) (https://food.ec.europa.eu/system/files/2017-05/animal-feed-guidance_document_pcdd-f_pcb_en.pdf), „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food“ (Juhend avastamispiiri ja määramispiiri hinnangulise väärtuse määramiseks söödas ja toidus esinevate saasteainete mõõtmisel) [https://food.ec.europa.eu/system/files/2016-10/cs_contaminants_sampling_analysis-report_2004_en.pdf].

(*1) Piirnormide puhul.

(12) Kehtivad nõuded põhinevad TEFidel, mis on avaldatud artiklis: M. van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

(13) Sageli koos elueeruvad analoogid on nt PCB 28/31, PCB 52/69 ja PCB 138/163/164. GC-MSi puhul tuleb arvestada ka suuremal määral klooritud analoogide fragmentide võimalikku segavat mõju.

(14) Vajaduse korral järgitakse dokumendis „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food“ (Juhend avastamispiiri ja määramispiiri hinnangulise väärtuse määramiseks söödas ja toidus esinevate saasteainete mõõtmisel) (https://data.europa.eu/doi/10.2787/8931) kirjeldatud põhimõtteid.

(15) On väga soovitatav, et reaktiiviga tühiproovi tulemus oleks väike võrreldes proovis leiduva saasteaine sisaldusega. Labor on kohustatud kontrollima tühiproovi tulemuste varieeruvust, eriti siis, kui tühiproovi tulemus tuleb lahutada.

(16) Vt joonealune märkus 9.

(*2) Nõutav on kõigi kuue 13C-ga märgistatud analoogi kasutamine sisestandardina.

Proovipartii suurus	Vähim üksikproovide arv
≤ 2,5 tonni	7
> 2,5 tonni	√ (20 korda proovipartii suurus tonnides) (*1), kuid kuni 40 üksikproovi

Proovipartii suurus	Vähim üksikproovide arv
≤ 2,5 tonni või ≤ 2 500 liitrit	4 (*2)
> 2,5 tonni või > 2 500 liitrit	7 (*2)

Proovipartii suurus	Vähim pakkeühikute arv, millest tuleb võtta (vähemalt) üks üksikproov (*3)
1 –20 pakkeühikut	1 pakkeühik (*4)
21 –150 pakkeühikut	3 pakkeühikut (*4)
151 –400 pakkeühikut	5 pakkeühikut (*4)
> 400 pakkeühikut	¼ korda √ (proovipartii moodustavate pakkeühikute arv) (*5), kuid kuni 40 pakkeühikut

Proovipartii suurus	Vähim üksikproovide arv (*6)
≤ 5 tonni	5
> 5 tonni	√ (5 korda proovipartii suurus tonnides) (*7), kuid kuni 40 üksikproovi

Proovipartii suurus	Vähim üksikproovide arv
< 80 tonni	Vt arvunõuded punktis 5.1. Üksikproovide arv tuleb korrutada 2,5-ga.
≥ 80 tonni	100

	Sööda liik	Koondproovi vähim kogus (8) (9)
6.1.	Lahtine sööt	4 kg;
6.2.	Pakendatud sööt:	4 kg (*10)
6.3.	Vedel või poolvedel sööt:	4 liitrit
6.4.	Söödabriketid või lakukivid:
6.4.1.	igaüks kaaluga üle 1 kg	4 kg;
6.4.2.	igaüks kaaluga kuni 1 kg	Nelja originaalbriketi või -kivi kaal
6.5.	Koresööt/kuivsööt	4 kg (*11)

Tahke sööt	500 g (12) (13) (14) (15)
Vedel või poolvedel sööt	500 ml (*12)

Mc	:	proovi niiskusesisaldus (%). 100 – Mc näitab seega proovi kuivainesisaldust (%).
Rana	:	proovi analüüsimisel mõõdetud tulemus
R12 %	:	tulemus 12 % niiskusesisaldusega sööda puhul; hinnata võrreldes regulatiivse tasemega.