LISA

Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse järgmiselt.

B osas asendatakse peatükk B.4 järgmisega:

„B.4. ÄGE NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 404 (2015). Kemikaalidega katsete tegemist käsitlevaid OECD katsejuhendeid vaadatakse korrapäraselt läbi eesmärgiga tagada, et need kajastaksid parimaid olemasolevaid teadusandmeid. OECD katsejuhendi nr 404 läbivaatamisel on pööratud erilist tähelepanu võimalikele muudatustele seoses loomade heaolu parandamisega ja uuritavat kemikaali käsitleva kogu olemasoleva teabe hindamisele, et ära hoida tarbetute katsete tegemist laboriloomadega. OECD katsejuhendi nr 404 (algselt vastu võetud 1981. aastal ning muudetud aastatel 1992, 2002 ja 2015) ajakohastatud versioon sisaldab viidet juhenddokumendile nahaärrituse/-söövitusega seotud katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (1); nimetatud dokumendis pakutakse välja modulaarne lähenemisviis nahaärrituse ja nahasöövituse hindamiseks. Kõnealuse katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi raames kirjeldatakse mitut moodulit, milles teabeallikad ja analüüsivahendid on rühmitatud, ning i) antakse suuniseid, kuidas lõimida ja kasutada olemasolevaid katse- ja muid andmeid kemikaalide võimaliku nahka ärritava ja nahka söövitava toime hindamiseks ja ii) pakutakse välja lähenemisviis juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid (1). Peale selle soovitatakse kõnealuses katsejuhendis kasutada algses in vivo katses katseloomal vajaduse korral kolme katselappi mitte üheaegselt, vaid üksteise järel.

Nahaärrituse ja nahasöövituse määratlus on esitatud käesoleva katsemeetodi liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

Nii usaldusväärsete teadustulemuste kui ka loomade heaolu huvides ei tohiks in vivo uuringuid ette võtta enne, kui kõiki kättesaadavaid andmeid uuritava kemikaali võimaliku nahka söövitava/ärritava toime kohta on hinnatud tõendite kaalukusel põhineva analüüsi teel, nagu on kirjeldatud juhenddokumendis nahaärrituse/-söövitusega seotud katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta, st selle juhenddokumendi kolme osa ja neile vastavate moodulite kohaselt (1). Lühidalt kirjeldatuna vaadeldakse olemasolevaid andmeid 1. osas seitsme mooduli alusel, mis hõlmavad andmeid inimese kohta, in vivo andmeid, in vitro andmeid, füüsikalis-keemilisi omadusi (nt pH, eelkõige tugev happelisus või aluselisus) ja katsetel mittepõhinevaid meetodeid. Teises osas viiakse läbi tõendite kaalukusel põhinev analüüs. Kui selle analüüsi tulemused on ebaselged, tuleks teha 3. osa kohased täiendavad katsed, alguses in vitro meetoditega ning viimase võimalusena in vivo katsed. Seega peaks kõnealune analüüs vähendama vajadust teha in vivo katseid selliste uuritavate kemikaalidega, mille puhul on muudest uuringutest saadud juba piisavalt tõendeid nende nahka söövitava/ärritava toime kohta.

IN VIVO KATSE PÕHIMÕTE

Uuritav kemikaal kantakse ühes annuses katselooma nahale; katselooma töötlemata nahapiirkondi kasutatakse negatiivse kontrollina. Ärrituse/söövituse ulatus registreeritakse ja seda hinnatakse kindlate ajavahemike järel ning mõju täielikuks hindamiseks lisatakse selle täiendav kirjeldus. Uuringu kestus peaks olema piisav, et hinnata täheldatud mõju pöörduvust või pöördumatust.

Loomad, kellel täheldatakse mis tahes katseetapis pideva tugeva stressi ja/või valu tunnuseid, tuleks humaanselt surmata ning uuritava kemikaali hindamisel tuleks seda arvesse võtta. Otsustamiskriteeriumid surmaeelses seisundis või raskelt kannatavate loomade humaanseks surmamiseks on esitatud eraldi juhenddokumendis (2).

IN VIVO KATSE ETTEVALMISTAMINE

Loomaliigi valimine

Eelistatud laboriloom on albiinoküülik; kasutatakse noori terveid täiskasvanud küülikuid. Muude liikide kasutamisel tuleks esitada vastav põhjendus.

Loomade ettevalmistamine

Umbes 24 tundi enne katset tuleks loomade seljaosa karvad võimalikult lühikeseks lõigata. Tuleks vältida naha marrastamist ning kasutada tuleks üksnes terveid, terve nahaga loomi.

Mõnel küülikuliinil esineb tiheda karvastikuga laike, mis on teatavatel aastaaegadel silmatorkavamad. Selliseid tiheda karvastikuga piirkondi ei tohiks katses kasutada.

Pidamis- ja söötmistingimused

Loomi tuleks pidada ühekaupa. Katseloomade ruumi temperatuur peaks küülikute puhul olema 20 °C (± 3 °C). Ehkki suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, on sobivaim vahemik 50–60 %. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett.

KATSE KÄIK

Uuritava kemikaali kasutamine

10.

Uuritav kemikaal tuleks kanda väikesele (umbes 6 cm2 suurusele) nahapinnale ning katta see marlilapiga, mida hoiab paigal nahka mitteärritav teip. Kui uuritavat kemikaali ei ole võimalik otse nahale kanda (nt vedelikud ja mõned pastad), kantakse see esmalt marlilapile, mis seejärel asetatakse nahale. Lappi hoitakse kogu kokkupuuteperioodi vältel sobiva poolläbilaskva sideme abil õrnalt vastu nahka. Kui uuritav kemikaal kantakse lapile, tuleks lapp asetada nahale nii, et kemikaal puutuks nahaga korralikult kokku ja oleks nahal ühtlaselt jaotunud. Tuleks takistada looma ligipääsu lapile ning uuritava kemikaali allaneelamist ja sissehingamist.

11.

Vedelaid uuritavaid kemikaale kasutatakse üldjuhul lahjendamata kujul. Kui katses kasutatakse tahket ainet (selle võib vajaduse korral pulbristada), tuleks uuritavat kemikaali niisutada võimalikult väikese koguse veega (või vajaduse korral muu sobiva kandeainega), et tagada hea kokkupuude nahaga. Kui kasutatakse muud kandeainet kui vett, peaks kandeaine võimalik mõju uuritava kemikaali põhjustatud nahaärritusele olema minimaalne või puuduma.

12.

Kokkupuuteperioodi lõppedes ehk tavaliselt nelja tunni möödudes tuleks uuritava kemikaali jäägid võimaluse korral vee või sobiva lahusti abil eemaldada, muutmata seejuures marrasknaha terviklikkust ega selles tekkinud reaktsiooni.

Annustamine

13.

Katses kasutatavale pinnale kantakse 0,5 ml vedelikku või 0,5 g tahket ainet või pastat.

Algkatse (ühe loomaga in vivo katse nahaärrituse/-söövituse hindamiseks)

14.

Kui tõendite kaalukusel põhinevast analüüsist või varasematest in vitro katsetest nähtub, et uuritav kemikaal on söövitav või ärritav või klassifitseerimata, ei ole täiendavate in vivo katsete tegemine tavaliselt vajalik. Kui aga lisaandmete kogumine osutub vajalikuks, viiakse in vivo katse esmalt läbi ühe loomaga ja seejuures kasutatakse järgmist lähenemisviisi. Loomale pannakse üksteise järel kuni kolm katselappi. Esimene lapp eemaldatakse kolme minuti pärast. Kui tõsist nahareaktsiooni ei täheldata, pannakse loomale teine lapp ja eemaldatakse see tunni aja pärast. Kui selles etapis tehtud vaatlustest ilmneb, et kokkupuudet võib humaanselt pikendada nelja tunnini, pannakse loomale kolmas lapp, eemaldatakse see nelja tunni pärast ja hinnatakse tekkinud reaktsiooni.

15.

Kui kolmest kõnealusest järjestikusest kokkupuuteperioodist ükskõik millise järel täheldatakse söövitavat toimet, lõpetatakse katse kohe. Kui pärast viimase lapi eemaldamist ei täheldata söövitavat toimet, jälgitakse looma 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui söövitus ilmneb varem.

16.

Kui uuritav kemikaal ei põhjusta eeldatavalt söövitust, kuid võib olla ärritav, tuleks ühele loomale panna üks lapp neljaks tunniks.

Kinnitav katse (täiendavate loomadega in vivo katse nahaärrituse hindamiseks)

17.

Kui algkatses ei täheldata söövitavat toimet, tuleks ärritava toime olemasolu või puudumise kinnitamiseks kasutada veel kuni kahte looma ja iga looma puhul ühte lappi kokkupuuteperioodiga neli tundi. Kui algkatses täheldatakse ärritavat toimet, võib kinnitavas katses kasutada järjestikust hindamist või kanda kemikaali üheaegselt kahele lisaloomale. Kui erandjuhul ei ole algkatset tehtud, võib kahele või kolmele loomale asetada ühe lapi, mis eemaldatakse nelja tunni pärast. Kui kasutatakse kahte looma ja mõlemal täheldatakse sama reaktsiooni, ei ole vaja enam lisakatseid teha. Muul juhul tehakse katse ka kolmanda loomaga. Ebaselgete tulemuste hindamiseks võib olla vaja kasutada veel loomi.

Vaatlusperiood

18.

Vaatlusperiood peaks olema piisavalt pikk, et võimaldada täielikult hinnata täheldatud toime pöörduvust. Siiski tuleks katse kohe lõpetada, kui loomal täheldatakse pideva tugeva valu või stressi tunnuseid. Toime pöörduvuse kindlakstegemiseks tuleks loomi jälgida kuni 14 päeva vältel pärast lapi eemaldamist. Kui pöörduvust täheldatakse enne 14 päeva möödumist, tuleks katse sel hetkel lõpetada.

Kliinilised vaatlused ja nahareaktsioonide hindamine

19.

Kõikidel loomadel uuritakse nahapunetuse ja turse esinemist ning reaktsioone hinnatakse lapi eemaldamisest 60 minuti ning seejärel 24, 48 ja 72 tunni möödumisel. Ühe loomaga tehtavas algkatses vaadeldakse kokkupuutes olnud nahapinda ka vahetult pärast lapi eemaldamist. Nahareaktsioonide hindamiseks ja registreerimiseks kasutatakse allpool tabelis esitatud hindeid. Kui nahal esineb 72 tunni järel kahjustus, mis ei ole käsitatav ärrituse ega söövitusena, võib olla vaja teha vaatlusi kuni 14. päevani, et teha kindlaks toime pöörduvus. Peale ärrituse jälgimise tuleks täielikult kirjeldada kõiki paikseid mürgisuse ilminguid, näiteks naha rasvkoe kadumist, ja mis tahes süsteemseid kahjulikke toimeid (nt kliinilisi mürgisuse nähte ja mõju kehamassile) ning need registreerida. Ebaselgete tulemuste puhul tuleks kaaluda histopatoloogilise analüüsi tegemist.

20.

Nahareaktsioonide hindamine on paratamatult subjektiivne. Nahareaktsioonide hindamise ühtlustamiseks ning nii katseid läbi viivate laborite kui ka vaatlusi tegevate ja vaatlustulemusi tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatluste läbiviijad kasutatava hindamissüsteemiga (vt tabelit allpool) piisavalt kurssi viia. Seejuures võib olla abi illustreeritud juhendist nahaärrituse ja muude kahjustuste hindamiseks (3).

ANDMED JA ARUANDLUS

21.

Uuringutulemused tuleks esitada lõplikus katseprotokollis tabeli kujul ja need peaksid hõlmama kõiki punktis 24 loetletud üksikasju.

Tulemuste hindamine

22.

Nahaärrituse hindamisel tuleks ühtlasi arvesse võtta kahjustuse laadi ja raskusastet ning selle pöörduvust või pöördumatust. Üksikud hinded ei väljenda eraldivõetuna aine ärritava toime absoluuttaset, kuna samaaegselt hinnatakse ka uuritava aine muud toimet. Selle asemel tuleks üksikuid hindeid käsitada võrdlusväärtusena, mida tuleb hinnata koos kõikide muude uuringu käigus saadud vaatlustulemustega.

23.

Ärritusreaktsioonide hindamisel tuleks arvesse võtta nahakahjustuste pöörduvust. Kui sellised reaktsioonid nagu alopeetsia (piiratud alal), hüperkeratoos, hüperplaasia ja kestendamine püsivad 14-päevase vaatlusperioodi lõpuni, tuleks uuritavat kemikaali käsitada ärritava kemikaalina.

Katseprotokoll

24.

Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.

In vivo uuringu tegemise põhjendus:

—	olemasolevatest katseandmetest, sealhulgas järjestikuse hindamise strateegia rakendamisel saadud tulemustest lähtuv tõendite kaalukusel põhinev analüüs;

—	varasematest katsetest saadud asjakohaste andmete kirjeldus;

—	igas katsestrateegia kohases etapis saadud andmed;

—	tehtud in vitro katsete kirjeldus, sealhulgas katsete üksikasjalik käik ning uuritavate ja võrdlusainetega saadud tulemused;

—	in vivo uuringu tegemist toetav tõendite kaalukusel põhinev analüüs.

Uuritav kemikaal:

—	ühest koostisosast koosnev aine: kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

—

mitmest koostisosast koosnev aine, segu või tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal (UVCB): võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	allikas ja partii number, kui see on olemas;

—	vajaduse korral teave uuritava kemikaali / kontrollaine töötlemise kohta enne katset (näiteks soojendamine, peenestamine);

—	uuritava kemikaali püsivus ja aegumiskuupäev või kordusanalüüsi tegemise tähtpäev, kui see on teada;

—	säilitustingimused.

Kandeaine:

—	identimisandmed, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;

—	kandeaine valimise põhjendus.

Katseloom(ad):

—	kasutatud loomaliik/-liin, muu(de) looma(de) kui albiinoküüliku kasutamise korral sellekohane põhjendus;

—	kummastki soost loomade arv;

—	iga looma kaal katse alguses ja lõpus;

—	vanus katse alguses;

—	looma(de) päritolu, pidamistingimused, toitumisandmed jms.

Katsetingimused:

—	lapi asetuskoha ettevalmistamise meetod;

—	kasutatud lapimaterjalide ja lapi asetamise meetodi üksikasjad;

—	uuritava kemikaali ettevalmistamise, pealekandmise ja eemaldamise üksikasjad.

Tulemused:

—	ärritus-/söövitusnähtude hindamise tulemused iga looma kohta igal mõõtmiskorral tabeli kujul;

—	kõikide täheldatud kahjustuste kirjeldus;

—	täheldatud ärrituse või söövituse laadi ja astme jutustav kirjeldus ja võimalikud histopatoloogilised leiud;

—	nahaärritusele ja -söövitusele lisanduvate muude kahjulike paiksete (nt naha rasvkoe kadumine) ja süsteemsete toimete kirjeldus.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	OECD (2014). Guidance Document on an Integrated Approach to Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 203. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(2)	OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances. Heaks kiidetud kemikaalikomitee ja kemikaalide töörühma 28. ühiskoosolekul novembris 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

Tabel

Nahareaktsioonide Hindamine


Nahapunetust ei esine…	0
Väga nõrk (vaevumärgatav) nahapunetus…	1
Selgesti nähtav nahapunetus…	2
Mõõdukas kuni tugev nahapunetus…	3
Tugev nahapunetus (lihapunane) kuni punetuse hindamist takistava raia esinemine…	4
Suurim võimalik punktide arv: 4

Turset ei esine…	0
Väga kerge (vaevumärgatav) turse…	1
Kerge turse (ala servad on selgesti nähtavalt kõrgemal)…	2
Mõõdukas turse (ala on ligikaudu 1 mm kõrgemal)…	3
Tugev turse (ala on üle 1 mm kõrgemal ja levinud kokkupuutealast väljapoole)…	4
Suurim võimalik punktide arv: 4
Ebaselgete tulemuste puhul võib teha histopatoloogilise analüüsi.

Liide

MÕISTED

Kemikaal – aine või segu.

Nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse, st marrasknahast pärisnahani ulatuva nähtava nekroosi tekkimine uuritava kemikaali kuni neljaks tunniks pealekandmise tagajärjel. Tüüpilised söövitusnähud on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14-päevase vaatlusperioodi lõpuks ilmnev värvimuutus naha valastumise tõttu, täielik alopeetsia ja armistumine. Ebaselgete kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilise analüüsi tegemist.

Nahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine uuritava kemikaali kuni neljaks tunniks pealekandmise tagajärjel.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

“

B osas asendatakse peatükk B.17 järgmisega:

„B.17. HPRT VÕI XPRT GEENIL PÕHINEVAD IN VITRO GEENIMUTATSIOONIKATSED IMETAJARAKKUDEGA

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 476 (2016). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaolu. Käesolevas katsemeetodi B.17 muudetud versioonis kajastuvad selle katse tegemisel saadud peaaegu kolmekümne aasta pikkused kogemused ja samuti tulemused, mis on saadud tümidiini kinaasi geenil põhineva, imetajarakkudega tehtava in vitro geenimutatsioonikatse jaoks uue eraldi meetodi väljatöötamise käigus. Katsemeetod B.17 kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. OECD on välja töötanud dokumendi, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia valdkonna katsete kohta ning ülevaade genotoksilisust käsitlevates OECD katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

Käesoleva meetodi kohase imetajarakkudega läbi viidava in vitro geenimutatsioonikatse eesmärk on tuvastada kemikaalide põhjustatud geenimutatsioone. Kõnealustes katsetes kasutatakse rakuliine, mis võimaldavad tuvastada otsemutatsioone reportergeenides, täpsemalt endogeenses hüpoksantiini-guaniini fosforibosüültransferaasi geenis (näriliserakkudes Hprt ja inimese rakkudes HPRT; käesolevas katsemeetodis viidatakse neile koos kui geenile Hprt ning vastavale katsele kui HPRT-katsele) ja ksantiini-guaniini fosforibosüültransferaasi transgeenis (gpt) (vastavale katsele viidatakse kui XPRT-katsele). HPRT- ja XPRT-mutatsioonikatsega tuvastatakse eri geneetilisi muutusi. Asjaolu, et transgeen gpt paikneb autosoomil, võimaldab tuvastada peale HPRT-katsega kindlaks tehtavate mutatsioonide (nt aluspaarivahetused, raaminihked, väikesed deletsioonid ja insertsioonid) ka suurtest deletsioonidest ja võimalikust mitootilisest rekombinatsioonist põhjustatud mutatsioone, mida HPRT-katsega pole võimalik tuvastada, kuna geen Hprt paikneb X-kromosoomil (2, 3, 4, 5, 6, 7). XPRT-katset kasutatakse regulatiivsel eesmärgil praegu vähem kui HPRT-katset.

Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

In vitro katsete puhul tuleb metabolismi aktiveerimiseks üldjuhul kasutada eksogeenset allikat. Eksogeenne metabolismi aktiveerimise süsteem ei võimalda täielikult matkida in vivo tingimusi.

Tuleks hoiduda kasutamast tingimusi, mille puhul saadakse valepositiivseid tulemusi, mis ei ole põhjustatud uuritava kemikaali vahetust interaktsioonist raku geneetilise materjaliga (st võib esineda vastastikmõju katsesüsteemiga); sellised tingimused hõlmavad pH või osmolaalsuse muutusi (8, 9, 10), söötme koostisosadega reageerimist (11, 12) ja liiga suurt tsütotoksilisust (13). HPRT-katse puhul loetakse liiga suureks tsütotoksilisuseks punktis 19 määratletud soovitatavat suurimat tsütotoksilisuse määra ületavat tsütotoksilisust.

KATSE PÕHIMÕTE

Mutantsed rakud, millel on HPRT-katse puhul kadunud HPRT ensümaatiline aktiivsus ja XPRT-katse puhul XPRT ensümaatiline aktiivsus, on puriini analoogi 6-tioguaniini tsütostaatilise toime suhtes resistentsed. Rakud, kus on olemas Hprt (HPRT-katse puhul) või gpt (XPRT-katse puhul), on aga 6-tioguaniini suhtes tundlikud ning see aine pärsib neis rakkudes ainevahetust ja peatab rakkude edasise jagunemise. Seega on mutantsed rakud võimelised 6-tioguaniini juuresolekul paljunema, ent normaalsed rakud, kus on olemas Hprt (HPRT-katse puhul) või gpt (XPRT-katse puhul), seda ei suuda.

Rakususpensioon või ühekihiline rakukultuur viiakse sobivaks ajavahemikuks (3–6 tunniks) kokkupuutesse uuritava kemikaaliga – nii koos metabolismi aktiveeriva eksogeense allikaga kui ka ilma selleta (vt punkt 14) – ning seejärel külvatakse rakud ümber, et hinnata tsütotoksilisust ja võimaldada fenotüübi avaldumist enne mutantide selekteerimist (14, 15, 16, 17). Tsütotoksilisust hinnatakse suhtelise elulemuse, st kloonimistõhususe järgi, mis tehakse kindlaks kohe pärast töötlemist ja mida kohandatakse lähtuvalt rakkude arvu võimalikust vähenemisest negatiivse kontrolliga võrreldes (punkt 18 ja 2. liide). Töödeldud kultuure kasvatatakse söötmes rakutüübist sõltuva ajavahemiku vältel, mis on piisav tekkinud mutatsioonide fenotüüpide võimalikult optimaalseks avaldumiseks (tavaliselt vähemalt 7–9 päeva). Fenotüübi avaldumise järgselt külvatakse teadaolev arv rakke muteerumissageduse määramiseks nii söötmesse, mis sisaldab mutantsete kolooniate tuvastamist võimaldavat selektiivainet, kui ka selektiivaineta söötmesse, et teha kindlaks kloonimistõhusus (eluvõimelisus). Sobiva inkubatsiooniperioodi lõppedes kolooniad loendatakse. Muteerumissagedus arvutatakse mutantsete kolooniate arvu põhjal, mida on korrigeeritud lähtuvalt kloonimistõhususest mutantide selekteerimise ajal.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistused

Rakud

HPRT- ja XPRT-katses kasutatavate rakutüüpide puhul peaks olema tõendatud, et asjaomased rakud on keemiliste mutageenide suhtes tundlikud, nende kloonimistõhusus on suur, neil on püsiv karüotüüp ja nende spontaanse muteerumise sagedus on püsiv. HPRT-katses kõige sagedamini kasutatavate rakkude hulka kuuluvad hiina hamstri rakuliinid CHO, CHL ja V79, hiire lümfoomi rakuliin L5178Y ja inimese lümfoblastoidne rakuliin TK6 (18, 19). XPRT-katses kasutatakse rakuliinist CHO saadud liini AS52, mis sisaldab transgeeni gpt ja kust on eemaldatud geen Hprt (20, 21); AS52 rakke ei saa kasutada HPRT-katses, kuna Hprt on neist eemaldatud. Muude rakuliinide kasutamist tuleks põhjendada ja need peaksid olema valideeritud.

10.

Rakuliine tuleks regulaarselt kontrollida, et veenduda modaalse kromosoomiarvu püsivuses ning mükoplasmasaastuse puudumises (22, 23); saastunud rakkude ja muutunud modaalse kromosoomiarvuga rakkude kasutamisest tuleks hoiduda. Tuleks kindlaks teha katseid läbi viivas laboris aluseks võetav tavapärane rakutsükli kestus, mis peaks vastama asjaomaste rakkude kohta avaldatud näitajatele. Samuti tuleks kontrollida spontaanse muteerumise sagedust rakkude tüvikultuuris ja kui muteerumissagedus on vastuvõetamatu, ei tohiks seda tüvikultuuri kasutada.

11.

Enne käesoleva meetodi kohases katses kasutamist võib olla vaja puhastada kultuurid olemasolevatest mutantsetest rakkudest; selleks võib kasvatada neid HPRT-katse puhul näiteks HAT-söötmes ja XPRT-katse puhul MPA-söötmes (5, 24) (vt 1. liide). Puhastatud rakud võib krüosäilitada ja seejärel töökultuurina kasutamiseks üles sulatada. Katses võib kasutada värskelt sulatatud töökultuuri pärast rakkude arvu tavapärase kahekordistumisaja saavutamist. XPRT-katse puhul tuleks AS52 rakkude tavapärasel kultiveerimisel kasutada tingimusi, millega tagatakse transgeeni gpt säilimine (20).

Söötmed ja kultiveerimistingimused

12.

Rakukultuuride kasvatamisel tuleks kasutada sobivat söödet ja sobivaid inkubeerimistingimusi (kasvunõud, 5-protsendilise CO2-sisaldusega niiske atmosfäär, inkubeerimistemperatuur 37 °C). Kultiveerimisel tuleks alati järgida tingimusi, millega tagatakse rakkude püsimine logaritmilises kasvufaasis. On väga oluline valida söötmed ja kasvutingimused nii, et oleks tagatud rakkude optimaalne kasv ekspressiooniperioodil ning optimaalne kloonimistõhusus nii muteerunud kui ka muteerumata rakkude puhul.

Rakukultuuride ettevalmistamine

13.

Rakkude paljundamiseks tüvikultuurist külvatakse need söötmesse sellise tihedusega, et rakkude eksponentsiaalne kasv suspensioonis või ühekihilises kultuuris jätkuks kogu töötlemis- ja ekspressiooniperioodi vältel (nt tuleks ühekihiliselt kasvavate rakkude puhul ära hoida konfluentsuse teket).

Metabolismi aktiveerimine

14.

Kui kasutatavate rakkude endogeenne metaboliseerimisvõime on ebapiisav, tuleks kasutada eksogeenseid metabolismisüsteeme. Kui ei ole teisiti põhjendatud, soovitatakse üldjuhul kasutada kõige sagedamini rakendatavat süsteemi, mis koosneb näriliste (tavaliselt roti) maksast valmistatud, mitokondrite eemaldamisel saadud fraktsioonist S9, millele on lisatud kofaktoreid ning mida on töödeldud selliste ensüümiinduktoritega nagu Aroclor 1254 (25, 26, 27, 28) või fenobarbitaali ja β-naftoflavooni kombinatsioon (29, 30, 31, 32). Viimati nimetatud kombinatsiooni kasutamine ei ole vastuolus püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsiooniga (33) ning see on osutunud monooksügenaaside induktorina sama tõhusaks kui Aroclor 1254 (29, 31). Fraktsiooni S9 kasutatakse tavaliselt kontsentratsioonis 1–2 mahuprotsenti, kuid selle kontsentratsiooni lõplikus katsesöötmes võib suurendada kuni 10 mahuprotsendini. Kasutatava eksogeense metabolismi aktiveerimise süsteemi või ensüümiinduktori liigi ja kontsentratsiooni valikut võib mõjutada uuritava aine klass (34, 35, 36).

Uuritava kemikaali ettevalmistamine

15.

Enne rakkude töötlemist tuleks tahke uuritav kemikaal lahustada sobivas lahustis ja vajaduse korral tuleks saadud lahust lahjendada (vt punkt 16). Vedelat uuritavat kemikaali võib lisada otse katsesüsteemi või seda enne lisamist lahjendada. Gaasilise või lenduva kemikaali kasutamisel tuleks standardmeetodit asjakohaselt muuta, näiteks viia kemikaaliga töötlemine läbi suletud kultiveerimisnõus (37, 38). Uuritav kemikaal tuleks katseks ette valmistada vahetult enne kasutamist, välja arvatud juhul, kui püsivuse andmetest nähtub, et kemikaali säilitamine on vastuvõetav.

KATSETINGIMUSED

Lahustid

16.

Lahusti tuleks valida nii, et oleks tagatud uuritava kemikaali optimaalne lahustumine, kuid lahusti ei mõjutaks samal ajal negatiivselt katse käiku näiteks rakkude kasvukiiruse või uuritava kemikaali omaduste muutmise, kultiveerimisnõuga reageerimise või metabolismi aktiveerimise süsteemi kahjustamise teel. Esmajärjekorras soovitatakse võimaluse korral kaaluda veepõhise lahusti (või söötme) kasutamist. Tavapäraselt kasutatavad lahustid on näiteks vesi ja dimetüülsulfoksiid. Üldjuhul ei tohiks orgaanilise lahusti sisaldus töötlemiseks kasutatavas lõppsöötmes ületada 1 mahuprotsenti ja veepõhise lahusti (füsioloogilise lahuse või vee) sisaldus 10 mahuprotsenti. Kui kasutatakse tavapärasest erinevat lahustit (nt etanooli või atsetooni), tuleks esitada tõendavad andmed selle sobivuse kohta uuritava kemikaali ja katsesüsteemi puhul ning genotoksilise toime puudumise kohta kasutataval kontsentratsioonil. Selliste tõendavate andmete puudumisel on oluline lisada katsesse kemikaaliga töötlemata kontrollid (vt 1. liide), et tõendada valitud lahustist tuleneva kahjuliku või mutageense toime puudumist.

Tsütotoksilisuse mõõtmine ja kokkupuutekontsentratsioonide valimine

17.

Uuritava kemikaali suurima kontsentratsiooni valimisel tuleks hoiduda valimast kontsentratsiooni, mille puhul on võimalik saada valepositiivseid tulemusi, näiteks tulenevalt liiga suurest tsütotoksilisusest (vt punkt 20), söötmes sadenemisest (vt punkt 21) või pH või osmolaalsuse olulisest muutumisest (vt punkt 5). Kui uuritav kemikaal muudab lisamise hetkel oluliselt söötme pH-d, võib pH reguleerimiseks lisada töötlemiseks kasutatavasse lõppsöötmesse puhvrit, et hoida ära valepositiivsete tulemuste saamist ja säilitada sobivad kultiveerimistingimused.

18.

Kontsentratsioonide valimisel lähtutakse tsütotoksilisusest ja muudest kaalutlustest (vt punktid 20–22). Ehkki tsütotoksilisuse hindamine eelkatses võib põhikatses kasutatavate kontsentratsioonide täpsemaks kindlakstegemiseks kasulikuks osutuda, ei ole eelkatse tegemine kohustuslik. Põhikatses on tsütotoksilisuse mõõtmine igas kultuuris vajalik ka juhul, kui tsütotoksilisust on eelnevalt juba hinnatud. Tsütotoksilisuse hindamiseks tuleks kasutada suhtelist elulemust, st võrrelda vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhusust, mida on kohandatud rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise ajal, kloonimistõhususe kohandatud väärtusega negatiivsete kontrollide puhul, mille elulemuseks loetakse 100 % (vt valem 2. liites).

19.

Kemikaali tuleks hinnata vähemalt neljal nõuetekohasuse kriteeriumidele (sobiv tsütotoksilisuse määr, rakkude arv jne) vastaval katsekontsentratsioonil (see ei hõlma lahustiga kontrolli ega positiivseid kontrolle). Töötlemisel on soovitatav kasutada iga katsekontsentratsiooni puhul kahte paralleelkultuuri, ent võib kasutada ka suuremat arvu paralleelkultuure või ühteainsat kultuuri. Iga kontsentratsiooni puhul tuleks sõltumatute paralleelkultuuridega saadud tulemused esitada eraldi, kuid andmeanalüüsi jaoks võib need koondada (17). Uuritavate kemikaalide puhul, mille tsütotoksilisus on väike või millel see puudub, sobivad tavaliselt kontsentratsioonid, mis erinevad üksteisest umbes kaks kuni kolm korda. Tsütotoksilisuse esinemisel peaksid valitud katsekontsentratsioonid hõlmama vahemikku tsütotoksilisuse ilmnemise kontsentratsioonist kuni kontsentratsioonideni, mille juures täheldatakse mõõdukat ja väikest või olematut tsütotoksilisust. Paljudel uuritavatel kemikaalidel on toime kontsentratsioonist sõltuvuse kõver järsu tõusuga ning tsütotoksilisuse täieulatuslikuks iseloomustamiseks või kontsentratsioonist sõltuvuse üksikasjalikuks uurimiseks võib olla vaja kasutada üksteisest vähem erinevaid kontsentratsioone ja enam kui nelja kontsentratsiooni, eriti olukorras, kus on vaja teha korduskatse (vt punkt 43). Enam kui nelja kontsentratsiooni kasutamine võib osutuda eriti oluliseks, kui kasutatakse ühteainsat kultuuri.

20.

Kui suurima kontsentratsiooni valimisel lähtutakse tsütotoksilisusest, tuleks see kontsentratsioon valida nii, et saavutataks suhteline elulemus 10–20 %. Selliste positiivsete tulemuste tõlgendamisel, mille puhul täheldatav suhteline elulemus on vaid 10 % või väiksem, tuleks olla ettevaatlik (punkt 43).

21.

Raskesti lahustuva uuritava kemikaali puhul, mis ei ole tsütotoksiline kontsentratsioonidel, mis on väiksemad kui vähim kontsentratsioon, mille juures kemikaal ei lahustu, peaks suurimal analüüsitaval kontsentratsioonil olema pärast kemikaaliga töötlemise lõppemist täheldatav hägusus või silma või invertmikroskoobiga nähtav sade. Isegi kui tsütotoksilisus avaldub suuremal kontsentratsioonil kui vähim kontsentratsioon, mille juures kemikaal ei lahustu, on soovitatav teha katse ainult ühel sellisel kontsentratsioonil, mille puhul tekib hägusus või nähtav sade, sest sade võib põhjustada katsevigu. Sademe moodustumise kontsentratsiooni puhul tuleb hoolikalt veenduda, et sade ei mõjuta katse käiku. Enne katse alustamist võib olla kasulik määrata kemikaali lahustuvus söötmes.

22.

Kui ei täheldata ei sadet ega liigset tsütotoksilisust, peaks suurim katsekontsentratsioon olema vähim järgmistest kontsentratsioonidest: 10 mM, 2 mg/ml või 2 μl/ml (39, 40). Kui uuritava kemikaali koostis ei ole määratav, näiteks kui see on tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal (UVCB) (41), keskkonnast saadud ekstrakt vms, võib juhul, kui ei täheldata kemikaali piisavat tsütotoksilisust, olla vaja selle iga koostisosa kontsentratsiooni suurendamiseks kasutada suuremat maksimumkontsentratsiooni (nt 5 mg/ml). Tuleks siiski märkida, et inimravimite puhul võivad need nõuded olla teistsugused (42).

Kontrollid

23.

Iga katserežiimi puhul tuleks kasutada paralleelseid negatiivseid kontrolle (vt punkt 16), mille puhul töötlemiseks kasutatavale söötmele lisatakse vaid lahusti ja kultuure käideldakse muus osas samamoodi kui uuritava kemikaaliga töödeldud kultuure.

24.

Paralleelsete positiivsete kontrollide kasutamine on vajalik, et tõendada labori pädevust tuvastada rakendatavale katsemeetodile vastavates tingimustes mutageene ning vajaduse korral veenduda metabolismi eksogeense aktiveerimise süsteemi tõhususes. Positiivsete kontrollide näited on esitatud allpool tabelis 1. Kui see on põhjendatud, võib positiivse kontrollina kasutada mõnda muud ainet. Kuna in vitro genotoksilisuse katsed imetajarakkudega on piisavalt standarditud, võib katsetes, kus kasutatakse töötlemist koos metabolismi eksogeense aktiveerimisega ja ilma selleta, kasutada üksnes sellist positiivset kontrolli, mis nõuab metabolismi aktiveerimist. Sel juhul võimaldab kõnealuse üheainsa positiivse kontrolliga saadud tulemus tõendada nii metabolismi aktiveerimise süsteemi toimimist kui ka katsesüsteemi reageerimisvõimet. Iga positiivse kontrolli puhul tuleks kasutada ühte või mitut kontsentratsiooni, mille juures võib eeldada, et saadakse tausttaset reprodutseeritavalt ja tuvastatavalt ületavad tulemused, mis võimaldavad tõendada katsesüsteemi tundlikkust, ning samal ajal ei tohiks tulemused olla mõjutatud käesolevas katsemeetodis sätestatud piirmäära ületavast tsütotoksilisusest (vt punkt 20).

Tabel 1

Labori pädevuse hindamiseks ja positiivsete kontrollide valimiseks soovitatavad võrdlusained

Metabolismi aktiveerimise kasutamine	Lookus	Aine ja CASi nr
Metabolismi eksogeenset aktiveerimist ei kasutata	Hprt	Etüülmetaansulfonaat [CASi nr: 62-50-0] Etüülnitrosouurea [CASi nr: 759-73-9] 4-nitrokinoliin-1-oksiid [CASi nr: 56-57-5]
	xprt	Streptonigriin [CASi nr: 3930-19-6] Mitomütsiin C [CASi nr: 50-07-7]
Kasutatakse metabolismi eksogeenset aktiveerimist	Hprt	3-metüülkolantreen [CASi nr: 56-49-5] 7,12-dimetüülbensantratseen [CASi nr: 57-97-6] Benso[a]püreen [CASi nr: 50-32-8]
	xprt	Benso[a]püreen [CASi nr: 50-32-8]

KATSE KÄIK

Uuritava kemikaaliga töötlemine

25.

26.

Rakkude minimaalse arvu valimisel iga kultuuri (nii kontroll- kui ka töödeldud kultuuride) ja iga katseetapi jaoks tuleks lähtuda spontaanse muteerumise sagedusest. Üldsuunisena tuleks võtta töötlemiseks ja ümberkülvamiseks piisav hulk rakke, et tagada igas katseetapis 10 mutandi spontaanne teke igas kultuuris (17). Spontaanse muteerumise sagedus jääb üldjuhul vahemikku 5 kuni 20 × 10-6. Kui spontaanse muteerumise sagedus on 5 × 10-6, on piisava arvu mutantide (vähemalt 10) spontaanse tekke tagamiseks ka kultuurides, mida on töödeldud kontsentratsioonil, mille juures töötlemisest tulenev tsütotoksilisus on 90 % (suhteline elulemus on 10 %), vaja võtta töötlemiseks vähemalt 20 × 106 rakku. Peale selle tuleb ekspressiooniperioodi vältel kultiveerida ja mutantide selekteerimiseks välja külvata piisaval arvul rakke (alati vähemalt kaks miljonit rakku) (17).

Fenotüübi avaldumise aeg ja muteerumissageduse mõõtmine

27.

Töötlemisperioodi lõppedes kasvatatakse rakke kultuuris, et võimaldada mutantse fenotüübi avaldumist. Uute tekkinud Hprt- ja xprt-mutantide fenotüübi optimumilähedaseks avaldumiseks piisav miinimumperiood on tavaliselt 7–9 päeva (43, 44). Selle ajavahemiku vältel külvatakse rakke regulaarselt ümber, et tagada nende eksponentsiaalne kasv. Pärast fenotüübi avaldumist külvatakse rakud nii selektiivainet 6-tioguaniini sisaldavasse kui ka ilma selektiivaineta söötmesse, et teha kindlaks vastavalt mutantide arv ja selekteerimisaegne kloonimistõhusus. Sellisel külvamisel võib ühekihiliste kultuuride puhul kasutada tasse ja suspensioonina kasvavate rakkude puhul mikrotiiterplaate. Mutantide selekteerimiseks tuleks rakud välja külvata sellisel tihedusel, millega tagatakse optimaalne mutantide tuvastamine (st metaboolne koostöö on takistatud) (17). Rakke kasvatatakse kolooniate optimaalseks kasvuks sobiva ajavahemiku vältel (nt 7–12 päeva) ning seejärel loendatakse kolooniad. Muteerumissagedus arvutatakse mutantsete kolooniate arvu põhjal, mida on korrigeeritud lähtuvalt kloonimistõhususest mutantide selekteerimise ajal (valemid on esitatud 2. liites).

Labori pädevus

28.

Laboris peaks enne katsemeetodi rutiinset kasutamist olema katse läbiviimiseks piisava kogemuse omandamiseks tehtud katseseeria positiivse kontrollina kasutatud võrdlusainetega, millel on eri toimemehhanismid (tabelis 1 loetletud ainete hulgast valitud ained, millest vähemalt üks vajab toimimiseks metabolismi aktiveerimist ja vähemalt üks seda ei vaja), ning eri negatiivsete kontrollidega (eri lahustite/kandeainetega). Selliste positiivsete ja negatiivsete kontrollidega saadud tulemused peaksid olema kooskõlas kirjanduse andmetega. Seda nõuet ei kohaldata kogemusega laborite puhul, kus on olemas varasemate tulemuste andmebaas, nagu on määratletud punktides 30–33.

29.

Positiivseks kontrolliks valitud aineid (vt tabel 1 punktis 25) tuleks uurida nii aktiveeritud kui ka aktiveerimata metabolismi tingimustes, et tõendada mutageensete kemikaalide tuvastamise ja metabolismi aktiveerimise süsteemi tõhususe kindlakstegemise võimekust, samuti rakkude kasvutingimuste sobivust töötlemise, fenotüübi avaldumise ja mutantide selekteerimise ajal ning kasutatavate hindamismeetodite asjakohasust. Kõnealuste valitud ainete puhul tuleb katsesüsteemi tundlikkuse ja dünaamilise kasutusulatuse sobivuse tõendamiseks valida kontsentratsioonivahemikud nii, et oleks võimalik saada reprodutseeritavaid tausttaset ületavaid kontsentratsioonist sõltuvaid tulemusi.

Varasemad andmed kontrollide kohta

30.

Laboris tuleks kindlaks teha:

—	positiivse kontrolliga saadud varasemate tulemuste vahemik ja jaotus,

—	negatiivsete kontrollidega (töötlemata rakud, lahustiga kontroll) saadud varasemate tulemuste vahemik ja jaotus.

31.

Kui negatiivseid kontrolle iseloomustavate tulemuste jaotuse kindlakstegemiseks kogutakse andmeid esmakordselt, peaksid paralleelsete negatiivsete kontrollidega saadud andmed olema kooskõlas kontrolle käsitlevate avaldatud andmetega (22). Kontrollidega saadud tulemuste jaotuse lähteandmetele üha uute katseandmete lisandumisel peaksid paralleelsete negatiivsete kontrollide puhul täheldatavad tulemused jääma ideaaljuhul selle jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 % (17, 45, 46).

32.

Laboris negatiivsete kontrollidega saadud varasemate tulemuste andmebaas peaks algselt hõlmama vähemalt 10 katse andmeid, kuid soovitatavalt peaks see sisaldama vähemalt 20 võrreldavates tingimustes tehtud katse andmeid. Laboris tuleks kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, näiteks kontrollkaarte (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (47)), et teha kindlaks, kui suures ulatuses positiivsete ja negatiivsete kontrollide andmed varieeruvad, ja tõendada, et laboris kasutatav metoodika on usaldusväärne (46). Varasemate katseandmete kogumist ja kasutamist käsitlevaid täiendavaid soovitusi (varasematele andmetele uute tulemuste lisamise või lisamata jätmise kriteeriumid ja konkreetse katse andmete vastuvõetavuse kriteeriumid) võib leida kirjandusest (45).

33.

Negatiivsete kontrollidega saadud andmed peaksid hõlmama muteerumissagedust ühes või soovitatavalt mitmes paralleelses kultuuris, nagu on kirjeldatud punktis 23. Paralleelsete negatiivsete kontrollidega saadud tulemused peaksid ideaaljuhul jääma laboris negatiivsete kontrollidega saadud varasemate tulemuste jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 % (17, 45, 46). Kui paralleelsete negatiivsete kontrollidega saadud tulemused jäävad väljapoole kõnealust usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %, võivad need olla kontrollidega saadud varasemate tulemuste jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmuslike võõrväärtustega ning on tõendatud, et katsesüsteem on usaldusväärne (vt eespool), ja puuduvad tõendid selle kohta, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksimusega.

34.

Katsemeetodi mis tahes muudatuse puhul tuleks kaaluda, kas see mõjutab katseandmete vastavust laboris kontrollidega varem saadud olemasolevatele andmetele. Iga olulise mittevastavuse korral tuleks luua uus kontrollidega saadud varasemate tulemuste andmebaas.

ANDMED JA ARUANDLUS

Tulemuste esitamine

35.

Esitatavad tulemused peaksid hõlmama kõiki vajalikke andmeid suhtelise elulemuse kaudu väljendatud tsütotoksilisuse arvutamiseks. Andmed nii töödeldud kultuuride kui ka kontrollkultuuride kohta peaksid hõlmama rakkude arvu töötluse lõppedes, vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude arvu ja kolooniate arvu (või mikrotiiterplaadi kasutamisel nende kannude arvu, milles kolooniad puudusid). Suhteline elulemus igas kultuuris tuleks esitada protsentuaalse osakaaluna väärtusest, mis on saadud paralleelse lahustit sisaldava kontrolli puhul (mõisted on määratletud 1. liites).

36.

Esitatavad tulemused peaksid samuti hõlmama kõiki vajalikke andmeid muteerumissageduse arvutamiseks. Andmed nii töödeldud kultuuride kui ka kontrollkultuuride kohta peaksid hõlmama 1) koos selektiivainega ja ilma selektiivaineta välja külvatud rakkude arvu (mutantide selekteerimiseks rakkude väljakülvamise hetkel) ning 2) selektiivaine juuresolekul ja ilma selleta kasvanud kultuurides loetletud kolooniate arvu (või mikrotiiterplaadi kasutamisel nende kannude arvu, milles kolooniad puudusid). Muteerumissagedus arvutatakse selektiivaine juuresolekul tekkinud mutantsete kolooniate arvu põhjal, mida on korrigeeritud lähtuvalt selektiivaineta kultuurides täheldatud kloonimistõhususest. Muteerumissagedus tuleks esitada muteerunud rakkude arvuna miljoni eluvõimelise raku kohta (mõisted on määratletud 1. liites).

37.

Andmed tuleks esitada iga kultuuri kohta eraldi. Peale selle tuleks kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

38.

Katse nõuetekohaseks tunnistamine põhineb järgmistel kriteeriumidel:

—	paralleelse negatiivse kontrolliga saadud tulemused loetakse laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste andmebaasi lisamiseks vastuvõetavaks, nagu on kirjeldatud punktis 33;

—	paralleelsete positiivsete kontrollidega (vt punkt 24) saadud tulemused peaksid olema võrreldavad positiivsete kontrollidega varem saadud tulemustega ning saadud väärtused peaksid paralleelset negatiivset kontrolli iseloomustavate väärtustega võrrelduna olema statistiliselt oluliselt suuremad;

—	katse on tehtud kahes eri tingimuses (st metabolismi aktiveerimisega ja ilma selleta), välja arvatud juhul, kui neist ühe puhul on saadud positiivsed tulemused (vt punkt 25);

—	rakkude ja kontsentratsioonide arv on analüüsimiseks piisav (punktid 25, 26 ja 19);

—	suurima kontsentratsiooni valimise kriteeriumid on kooskõlas punktides 20, 21 ja 22 kirjeldatud kriteeriumidega.

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

39.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritava kemikaaliga saadud tulemust selgelt positiivsena, kui mis tahes kasutatud katsetingimustes on täidetud järgmised kriteeriumid:

—	vähemalt ühel katsekontsentratsioonil täheldatakse saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;

—	sobiva trenditestiga hindamisest nähtub, et see suurenemine on kontsentratsioonist sõltuv;

—	mis tahes saadud tulemus jääb väljapoole laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste jaotust (nt väljapoole Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %; vt punkt 33).

Kui kõik need kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali võimelisena põhjustama selles katsesüsteemis geenimutatsioone kultiveeritud imetajarakkudes. Soovitused kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta on esitatud kirjanduses (46, 48).

40.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt negatiivseks, kui kõikides kasutatud katsetingimustes on täidetud järgmised kriteeriumid:

—	ühelgi katsekontsentratsioonil ei täheldata saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;

—	sobiva trenditestiga hindamisest nähtub, et kontsentratsioonist sõltuvat väärtuse suurenemist ei esine;

—	kõik tulemused jäävad laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste jaotusvahemikku (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %; vt punkt 33).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimetuna põhjustama selles katsesüsteemis geenimutatsioone kultiveeritud imetajarakkudes.

42.

Selgelt positiivset või negatiivset tulemust ei ole vaja üle kontrollida.

43.

Juhul, kui tulemus ei ole eespool kirjeldatu kohaselt selgelt negatiivne ega selgelt positiivne või kui eesmärk on aidata kindlaks teha tulemuse bioloogiline olulisus, tuleks andmete hindamiseks kasutada eksperdihinnangut ja/või täiendavaid uuringuid. Sellises olukorras võib olla kasulik teha korduskatse ja muuta vajaduse korral katsetingimusi (nt kontsentratsiooniintervalli või metabolismi aktiveerimise tingimusi – S9 kontsentratsiooni või S9 päritolu).

44.

Harvadel juhtudel ei võimalda andmed isegi pärast täiendavaid uuringuid teha järeldust selle kohta, kas tulemus on positiivne või negatiivne. Seepärast tuleks sel juhul lugeda uuritava kemikaaliga saadud tulemus ebaselgeks (seda tõlgendatakse positiivse ja negatiivse tulemuse võrdvõimalikkusena).

Katseprotokoll

45.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal:

—	allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

—	uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui see on teada;

—	vastavalt vajadusele mõõtmistulemused söötme pH ja osmolaalsuse ning sademe tekke kohta pärast uuritava kemikaali lisamist;

ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

Lahusti:

—	lahusti valimise põhjendus;

—	lahusti protsentuaalne sisaldus lõppsöötmes.

Rakud:

labori tüvikultuuride puhul:

—	rakuliinide tüüp ja päritolu;

—	võimaluse korral ümberkülvide arv ja laboris rakuliinidega tehtud varasemate toimingute andmed;

—	karüotüübi andmed ja/või kromosoomide modaalarv;

—	rakukultuuride säilitamise meetodid;

—	teave mükoplasma puudumise kohta;

—	rakkude arvu kahekordistumise aeg.

Katsetingimused:

—	kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valiku põhjendus, sealhulgas näiteks andmed tsütotoksilisuse ja lahustuvuspiirangute kohta;

—	söötme koostis, CO2 kontsentratsioon, niiskusesisaldus;

—	uuritava kemikaali kontsentratsioon, väljendatuna lõppkontsentratsioonina söötmes (nt μg/ml või mg/ml või mM);

—	söötmele lisatud lahusti ja uuritava kemikaali kontsentratsioon (ja/või ruumala);

—	inkubeerimistemperatuur;

—	inkubeerimisaeg;

—	töötluse kestus;

—	rakkude tihedus töötluse ajal;

—	metabolismi aktiveerimise süsteemi liik ja koostis (fraktsiooni S9 allikas, S9 segu valmistamise meetod, S9 segu ja S9 kontsentratsioon või ruumala lõppsöötmes, S9 kvaliteedikontrolli andmed);

—	positiivse või negatiivse kontrollina kasutatud ained ja nende lõppkontsentratsioonid iga töötlemistingimuse puhul;

—	ekspressiooniperioodi pikkus (samuti väljakülvatud rakkude arv ning vajaduse korral teave ümberkülvide ja söötmevahetusrežiimi kohta);

—	selektiivaine identimisandmed ja kontsentratsioon;

—	katsete nõuetekohasuse kriteeriumid;

—	eluvõimeliste ja muteerunud rakkude loendamiseks kasutatud meetodid;

—	tsütotoksilisuse mõõtmiseks kasutatud meetodid;

—	muu täiendav asjakohane teave tsütotoksilisuse ja kasutatud meetodi kohta;

—	väljakülvamisele järgneva inkubeerimise kestus;

—	kriteeriumid, mille alusel uuringutulemused loetakse positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks;

—	pH, osmolaalsuse ja sademe määramiseks kasutatud meetodid.

Tulemused:

—	töödeldud rakkude arv ja ümberkülvatud rakkude arv igas kultuuris;

—	tsütotoksilisuse andmed ja vajaduse korral muud tähelepanekud;

—	sadenemise ilmingud ja nende täheldamise aeg;

—	selektiivainega ja selektiivaineta söötmesse külvatud rakkude arv;

—	kolooniate arv selektiivaineta söötmes ja resistentsete kolooniate arv selektiivainega söötmes ning vastav muteerumissagedus;

—	võimaluse korral andmed kontsentratsioonist sõltuvuse kohta;

—	andmed paralleelsete negatiivsete (lahustiga) kontrollide ja positiivsete kontrollide kohta (kontsentratsioonid ja lahustid);

—	negatiivsete (lahustiga) kontrollide ja positiivsete kontrollidega varem saadud andmed, sealhulgas väärtusevahemikud, keskväärtused, standardhälbed ja usaldusvahemikud (nt usaldusnivool 95 %), samuti andmepunktide arv;

—	statistilise analüüsi tulemused (iga kultuuri kohta eraldi ja vajaduse korral paralleelkultuuride koondandmed) ja vajaduse korral p-väärtused.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 234. OECD, Pariis.

(2)	Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J., ja Tindall, K. R. (toim.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(3)	Chu, E. H. Y., ja Malling, H. V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 61: 1306–1312.

(4)	Moore, M. M., Harrington-Brock, K., Doerr, C. L., ja Dearfield, K. L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis 4: 394–403.

(5)	Aaron, C. S., ja Stankowski, L. F. Jr. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutat. Res. 223: 121–128.

(6)	Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, L., Theiss, J., ja Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutat. Res. 312: 235–239.

(7)

Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H., ja Wasson, J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutat. Res. 196, 17–36.

(8)	Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J., ja Myhr, B. C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutat. Res. 257: 147–204.

(9)	Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I., ja Okumura, K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutat. Res. 268: 297–305.

(10)	Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environ. Mutagen. 8: 789–886.

(11)	Nesslany, F., Simar-Meintieres, S., Watzinger, M., Talahari, I., ja Marzin, D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutagen. 49: 439–452.

(12)	Long, L. H., Kirkland, D., Whitwell, J., ja Halliwell, B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium. Mutat. Res. 634: 177–183.

(13)	Kirkland, D., Aardema, M., Henderson, L., ja Müller, L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutat. Res. 584: 1–256.

(14)

Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr., ja Yang, L. L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutat. Res. 189: 135–141.

(15)	Liber, H. L., Yandell, D. W., ja Little, J. B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutat. Res. 216: 9–17.

(16)	Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R., ja Hsie, A. W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutat. Res. 160: 133–147.

(17)

Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B., ja Asquith, J. C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. Väljaandes: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J. (toim.), Cambridge University Press. Lk 66–101.

(18)	Hsie, A. W., Casciano, D. A., Couch, D. B., Krahn, D. F., O’Neill, J. P., ja Whitfield, B. L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program. Mutat. Res. 86: 193–214.

(19)	Li, A. P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures. Mutat. Res. 85: 165–175.

(20)	Tindall, K. R., Stankowski, L. F. Jr., Machanoff, R., ja Hsie, A. W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells. Mol. Cell. Biol. 4: 1411–1415.

(21)	Hsie, A. W., Recio, L., Katz, D. S., Lee, C. Q., Wagner, M., ja Schenley, R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge, E., Moore, M., Clements, J., Donovan, M. O., Honma, M., Kohara, A., Van Benthem, J., Galloway, S., Armstrong, M. J., Thybaud, V., Gollapudi, B., Aardema, M., Kim, J., Sutter, A., ja Kirkland, D. J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Pooleliolev käsikiri.)

(23)

Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T., Hay, R., Merten, O. W., Price, A., Schechtman, L., Stacey, G., ja Stokes, W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. Altern. Lab. Anim. 33: 261–287.

(24)	Rosen, M. P., San, R.,H.,C., ja Stich, H. F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures. Cancer Lett. 8: 299–305.

(25)

Natarajan, A. T., Tates, A. D, Van Buul, P. P. W., Meijers, M., ja de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro – I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutat. Res. 37: 83–90.

(26)	Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N., ja Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutat. Res. 46: 365–373.

(27)	Ames, B. N., McCann, J., ja Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutat. Res. 31: 347–364.

(28)	Maron, D. M., ja Ames, B. N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutat. Res. 113: 173–215.

(29)	Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., ja Wolf, R. C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis 7: 175–177.

(30)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., ja Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. Väljaandes: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R., ja Philpot, R. M. (toim.), Elsevier, North-Holland. Lk 85–88.

(31)	Ong, T.-M., Mukhtar, M., Wolf, C. R., ja Zeiger, E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver. J. Environ. Pathol. Toxicol. 4: 55–65.

(32)	Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R., ja Galloway, S. M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9. Environ. Mol. Mutagen. 28: 51–59.

(33)	UNEP (2001). Püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsioon. Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni Keskkonnaprogramm (UNEP). Kättesaadav aadressil [http://www.pops.int.html].

(34)	Tan, E.-L., ja Hsie, A. W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutat. Res. 84: 147–156.

(35)	O’Neill, J. P., Machanoff, R., San Sebastian, J. R., ja Hsie, A. W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mutagen. 4: 7–18.

(36)	Li, A. P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation. 6: 539–544.

(37)	Krahn, D. F., Barsky, F. C., ja McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. Väljaandes: Genotoxic Effects of Airborne Agents. Tice, R. R., Costa, D. L., ja Schaich, K. M. (toim.), New York, Plenum. Lk 91–103.

(38)	Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P., ja Brooks, A. L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen. 5: 795–801.

(39)

OECD (2014). Dokument, millega toetatakse OECD katsejuhendite programmi riiklike koordinaatorite töörühma otsust rakendada imetajarakkudega tehtavate in vitro genotoksilisuse katsete puhul (katsejuhendid nr 473, 476 ja 487) suurima kontsentratsiooni valimise muudetud kriteeriume. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist.

(40)	Brookmire, L., Chen, J. J., ja Levy, D. D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay. Environ. Mol. Mutagen. 54: 36–43.

(41)	USA Keskkonnakaitseameti kemikaaliohutuse ja reostuse ennetamise büroo (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances.

(42)	USA Toidu- ja Ravimiamet (2012). International Conference on Harmonisation; Guidance on S2 (R1) Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Kättesaadav aadressil [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)	O’Neill, J. P., ja Hsie, A. W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system). Mutat. Res. 59: 109–118.

(44)	Chiewchanwit, T., Ma, H., El Zein, R., Hallberg, L., ja Au, W. W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutat. Res. 1335(2): 121–128.

(45)	Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J., ja Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutat. Res. 723: 87–90.

(46)	OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the OECD Test Guidelines on Genotoxicity. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 199. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(47)	Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O., ja Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. Väljaandes: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge. Lk 141–154.

(48)	Fleiss, J. L., Levin, B., ja Paik, M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions. Kolmas väljaanne. John Wiley & Sons, New York.

1. liide

MÕISTED

Aluspaarivahetust põhjustav mutageen: kemikaal, mis kutsub esile aluspaari vahetuse DNAs.

Fenotüübi avaldumise aeg: töötlusele järgnev aeg, mille vältel geneetiline muutus kinnistub genoomis ja mis tahes varem esinenud geeniproduktide sisaldus väheneb nii palju, et asjaomane fenotüübiline tunnus muutub.

Genotoksilisus: üldmõiste, mis hõlmab DNA ja kromosoomide mis tahes liiki kahjustusi, sealhulgas DNA-ahela katkemisi, adukte, ümberkorraldusi, mutatsioone, kromosoomiaberratsioone ja aneuploidsust. Genotoksiline mõju ei väljendu alati mutatsiooni või püsiva kromosoomikahjustusena.

HAT-sööde: sööde, mis sisaldab hüpoksantiini, aminopteriini ja tümidiini ning mida kasutatakse Hprt-mutantide selekteerimiseks.

Kemikaal: aine või segu.

Kloonimistõhusus: väikesel tihedusel välja külvatud rakkude hulgas esinevate selliste rakkude protsentuaalne osakaal, mis on võimelised moodustama loendatava koloonia.

Kontsentratsioon: tähistab uuritava kemikaali lõppkontsentratsiooni söötmes.

Lahustiga kontroll: üldmõiste, millega tähistatakse kontrollkultuuri, kuhu on lisatud üksnes uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatud lahustit.

Maksafraktsioon S9: maksahomogenaadi supernatant, mis on saadud pärast tsentrifuugimist 9 000g juures, st maksa toorekstrakt.

Mitootiline rekombinatsioon: mitoosi ajal homoloogsete kromatiidide vahel toimuv rekombinatsioon, millega võib kaasneda DNA kahe ahela katkemine või heterosügootsuse kadu.

MPA-sööde: sööde, mis sisaldab ksantiini, adeniini, tümidiini, aminopteriini ja mükofenoolhapet ning mida kasutatakse xprt-mutantide selekteerimiseks.

Mutageensus: omadus, mis põhjustab pärilikke muutusi geenide DNA aluspaaride järjestuses või kromosoomide struktuuris (kromosoomiaberratsioonid).

Muteerumissagedus: täheldatud mutantsete kolooniate arvu ja selektiivsöötmesse külvatud rakkude arvu suhe pärast selekteerimisaegse kloonimistõhususe (või elulemuse) suhtes korrigeerimist.

Päripidine mutatsioon: mutatsioon, mille puhul algne geen võtab mutantse vormi ja mille tulemusena muutub või kaob asjaomase kodeeritud valgu ensümaatiline aktiivsus või muu funktsioon.

Raaminihet põhjustav mutageen: kemikaal, mille mõjul lisatakse DNA molekuli või eemaldatakse sealt üks või mitu aluspaari.

S9 segu: maksafraktsiooni S9 ja metaboolsete ensüümide aktiivsuse tagamiseks vajalike kofaktorite segu.

Suhteline elulemus: näitaja, mille kaudu väljendatakse töötlusest tulenevat tsütotoksilisust. Suhteline elulemus on vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhusus, kohandatuna rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise käigus ja võrrelduna kloonimistõhususega negatiivsete kontrollide puhul, mille elulemuseks loetakse 100 %.

Tsütotoksilisus: käesoleva katsemeetodi kohaste katsete puhul on tsütotoksilisus määratletud kui töödeldud rakkude suhtelise elulemuse vähenemine negatiivse kontrolliga võrreldes (vt asjaomane konkreetne punkt).

Töötlemata kontroll: kultuur, mida ei ole töödeldud (st ei uuritava kemikaali ega lahustiga), kuid mida käideldakse samal viisil kui uuritava kemikaaliga töödeldud kultuure ning nendega samaaegselt.

Uuritav kemikaal: iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB: tundmatu või muutuva koostisega kemikaal, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

2. liide

VALEMID TSÜTOTOKSILISUSE JA MUTEERUMISSAGEDUSE HINDAMISEKS

Tsütotoksilisuse hindamiseks kasutatakse suhtelist elulemust, mis on määratletud kui vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhusus, kohandatuna rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise käigus ja võrrelduna kohandatud kloonimistõhususega negatiivsete kontrollide puhul, mille elulemuseks loetakse 100 % (suhtelise elulemuse valem on esitatud allpool).

Uuritava kemikaaliga töödeldud kultuuri kohandatud kloonimistõhusus arvutatakse järgmiselt:

Formula

Uuritava kemikaaliga töödeldud kultuuri suhteline elulemus arvutatakse järgmiselt:

Formula

Muteerumissagedus on mutantsete kolooniate kloonimistõhusus selektiivsöötmes, jagatuna sama kultuuri puhul mõõdetud selekteerimisaegse kloonimistõhususega selektiivaineta söötmes.

Formula

Kui kloonimistõhususe hindamiseks kasutatakse tasse, siis:

kloonimistõhusus = kolooniate arv / välja külvatud rakkude arv.

Kui kloonimistõhususe hindamiseks kasutatakse mikrotiiterplaate, siis iseloomustab kolooniate arvu mikrotiiterplaadi kannu kohta Poissoni jaotus.

Kloonimistõhusus = – lnP(0) / välja külvatud rakkude arv kannu kohta,

kus – lnP(0) on tühjade kannude tõenäoline arv külvamiseks kasutatud kannude hulgas ning on kirjeldatav valemiga

lnP(0) = – ln (tühjade kannude arv / külvamiseks kasutatud kannude arv).

“

B osas asendatakse peatükk B.22 järgmisega:

„B.22. DOMINANTSE LETAALSE MÕJU KATSE NÄRILISTEGA

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 478 (2016). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaoluga seotud kaalutlusi. Käesolevas katsemeetodi muudetud versioonis kajastub selle meetodi kasutamisel saadud enam kui kolmekümne aasta pikkune kogemus, samuti annab see võimaluse lõimida või kombineerida seda meetodit muude mürgisuse hindamise meetoditega, mida kasutatakse näiteks arengu-, reproduktiiv- ja genotoksilisuse uurimiseks. Siiski on see katsemeetod sellega seotud piirangute ja suure arvu loomade kasutamise vajaduse tõttu ette nähtud kasutamiseks mitte peamise, vaid pigem täiendava katsemeetodina, mida võib kasutada üksnes juhul, kui regulatiivsetest nõuetest tulenevalt ei ole sellele alternatiivi. Mürgisuse hindamise meetodite kasutamine kombineerituna võimaldab säästa suure arvu mürgisuskatsetes kasutatavaid loomi. OECD on välja töötanud dokumendi, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia valdkonna katsete kohta ning ülevaade genotoksilisust käsitlevates OECD katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

Dominantse letaalse mõju katse eesmärk on uurida, kas kemikaal põhjustab mutatsioone, mille tagajärjeks on kromosoomiaberratsioonid idurakkudes. Peale selle on kõnealune katse oluline genotoksilisuse hindamiseks, sest ehkki in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA reparatsiooni protsessidega seotud tegurid võivad liigiti varieeruda, on need aktiivsed ja aitavad kaasa vastusreaktsiooni kujunemisele. Dominantse letaalse mutatsiooni mõju ilmnemine pärast uuritava kemikaaliga kokkupuudet osutab asjaolule, et kemikaal on mõjutanud katselooma reproduktiivkudet.

Dominantne letaalne mutatsioon põhjustab embrüo või loote surma. Dominantse letaalse mutatsiooni mõju ilmnemine pärast uuritava kemikaaliga kokkupuudet osutab asjaolule, et kemikaal on mõjutanud katselooma idurakke.

Dominantse letaalse mõju katse on kasulik in vivo somaatilistel lõppnäitajatel põhinevate katsete positiivsete tulemuste kinnitamiseks ning selle lõppnäitaja võimaldab asjakohaselt hinnata ohtu inimesele ja sugurakkude kaudu geneetiliste haiguste edasikandumise riski. Ent kuna see katse nõuab suure arvu loomade kasutamist ja on töömahukas, on selle läbiviimine väga kulukas ja aeganõudev. Kuna spontaansete dominantsete letaalsete mutatsioonide tekkesagedus on küllalt suur, on meetodi tundlikkus muteerumissageduse väikese tõusu tuvastamisel üldjuhul piiratud.

Põhimõistete määratlused on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

Katse viiakse kõige sagedamini läbi hiirtega (2, 3, 4), kuid mõnel juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud, võib olla asjakohane kasutada mõnda muud liiki, näiteks rotte (5, 6, 7, 8). Dominantset letaalset mõju põhjustavad üldjuhul suured kromosoomiaberratsioonid (struktuursed ja arvulised muutused) (9, 10, 11), ent ei saa välistada ka geenimutatsioone. Dominantne letaalne mutatsioon on mutatsioon, mis esineb juba idurakus või kinnistub pärast viljastumist varajases embrüostaadiumis ja mis ei põhjusta gameedi talitlushäireid, kuid on viljastatud munarakule või arenevale embrüole letaalne.

Iga isaslooma paaritatakse sobivate ajavahemike järel järgemööda varem paaritumata emasloomadega. Töötlemisjärgsete paaritamiste arv sõltub dominantse letaalse mõju katse lõppeesmärgist (punkt 23) ja peaks võimaldama tagada, et dominantset letaalset mõju hinnatakse isaslooma idurakkude küpsemise kõikide etappide lõikes (12).

Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav kemikaal või selle metaboliit/metaboliidid ei jõua munandisse, ei ole käesoleva katsemeetodi kasutamine asjakohane.

KATSE PÕHIMÕTE

Üldpõhimõtte kohaselt viiakse isasloomad pärast sobiva kokkupuuteviisi valimist uuritava kemikaaliga kokkupuutesse ning neid paaritatakse varem paaritumata töötlemata emasloomadega. Teatava intervalliga järjestikuste paaritamiste teel on võimalik vaadelda eri tüüpi idurakke. Paaritamisele järgneva sobiva ajavahemiku möödudes surmatakse emasloomad humaanselt ning uuritakse nende emakat, et teha kindlaks pesastunud embrüote ning elus ja surnud embrüote arv. Uuritava kemikaali dominantse letaalse mõju tuvastamiseks võrreldakse pesastunud elus embrüote arvu emaslooma kohta kemikaaliga töödeldud rühmas ja kandeainega/lahustiga töödeldud kontrollide rühmas. Pesastunud surnud embrüote arvu suurenemine emaslooma kohta kemikaaliga töödeldud rühmas kontrollrühmaga võrrelduna osutab uuritavast kemikaalist põhjustatud pesastumisjärgsele embrüote kaole. Pesastumisjärgse embrüote kao arvutamiseks võrreldakse pesastunud surnud embrüote arvu ja pesastunud embrüote üldarvu suhet kemikaaliga töödeldud rühmas ja kontrollrühmas. Pesastumiseelse embrüote kao hindamiseks võib lahutada kollakehade arvust pesastunud embrüote üldarvu või võrrelda pesastunud embrüote üldarvu emaslooma kohta kemikaaliga töödeldud rühmas ja kontrollrühmas.

LABORI PÄDEVUSE TÕENDAMINE

10.

Käesoleva meetodi kasutamise pädevuse kinnitamiseks tuleks tõendada võimekust reprodutseerida dominantsete letaalsete mutatsioonide esinemissageduse kohta avaldatud tulemusi (nt allikad 13, 14, 15, 16, 17, 18) nii positiivse kontrollina kasutatavate ainete, näiteks tabelis 1 loetletud ainete (sealhulgas nõrga toime) puhul kui ka kandeainega töödeldud kontrollide puhul, samuti peaks negatiivsete kontrollide puhul täheldatud sagedus jääma vastuvõetavasse andmevahemikku (vt viited eespool) või laboris kontrollidega varem saadud tulemuste jaotusvahemikku, kui sellised tulemused on olemas.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistused

Loomaliigi valimine

11.

Tuleks kasutada tavapäraste laboriliinide terveid suguküpseid loomi. Tavaliselt kasutatakse hiiri, ent võivad sobida ka rotid. Võib kasutada ka mis tahes muud sobivat imetajaliiki, kui katseprotokollis esitatakse sellekohane teaduslik põhjendus.

Loomade pidamis- ja söötmistingimused

12.

Näriliste puhul peaks loomapidamisruumi temperatuur olema 22 °C (± 3 °C). Suhteline niiskus peaks olema vähemalt 40 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, ideaaljuhul aga 50–60 %. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada sööda sobivus uuritava kemikaali lisamiseks, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Näriliste pidamisel tuleks enne töötlemist ja paaritamist kasutada väikesi samasooliste loomade rühmi (maksimaalselt viis looma rühmas), kui ei ole põhjust eeldada või ei täheldata agressiivset käitumist; soovitatavalt tuleks kasutada sobiva mitmekesistatud keskkonnaga täispõhjaga puure. Loomi võib pidada eraldi, kui see on teaduslikult põhjendatud.

Loomade ettevalmistamine

13.

Terved suguküpsed täiskasvanud isas- ja emasloomad jagatakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühmadesse. Iga looma üheseks identimiseks kasutatakse humaanset minimaalselt invasiivset meetodit (nt rõngastamine, märgistamine, mikrokiibistamine või biomeetriline tuvastamine, kuid mitte kõrva sälkamine ega varba köndistamine) ning loomadel lastakse vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud võimalik mõju oleks võimalikult väike. Tuleks ära hoida positiivse kontrollina kasutatava aine ja uuritava kemikaali vahelist ristsaastumist. Katse alguses peaksid loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte üle ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kehamassist.

Annuste ettevalmistamine

14.

Tahke uuritav kemikaal tuleks enne loomadele annustamist lahustada või suspendeerida sobivas lahustis või kandeaines või segada sööda või joogiveega. Vedelat uuritavat kemikaali võib annustada vahetult või seda enne annustamist lahjendada. Kui kokkupuude toimub sissehingamise teel, võib uuritavat kemikaali sõltuvalt selle füüsikalis-keemilistest omadustest manustada gaasina, auruna või tahke/vedela dispersse faasiga aerosoolina. Tuleks kasutada uuritava kemikaali värsket valmistist, välja arvatud juhul, kui kemikaali püsivusandmetest nähtub säilitamise vastuvõetavus ja on määratletud asjakohased säilitamistingimused.

Katsetingimused

Lahusti/kandeaine

15.

Lahusti/kandeaine ei tohiks avaldada kasutatavate annuste puhul mürgist mõju ning ei tohiks olla kahtlust, et see võib uuritava kemikaaliga keemiliselt reageerida. Kui on valitud vähem tuntud lahusti/kandeaine, tuleks selle sobivuse tõendamiseks esitada selle kasutamist toetavad võrdlusandmed. Kui vähegi võimalik, on soovitatav esmalt kaaluda veepõhise lahusti/kandeaine kasutamist. Tavaliselt kasutatavad lahustid/kandeained on näiteks vesi, füsioloogiline lahus, metüültselluloosi lahus, karboksümetüültselluloosi naatriumisoola lahus, oliiviõli ja maisiõli.

Positiivsed kontrollid

16.

Katses tuleks alati paralleelselt kasutada positiivse kontrollina kasutatava ainega töödeldud loomi, välja arvatud juhul, kui labori pädevus katse läbiviimiseks on tõendatud ja katsemeetodit on lähiminevikus (nt viimase viie aasta jooksul) korrapäraselt kasutatud. Siiski ei ole vaja manustada positiivse kontrollina kasutatavat ainet loomadele samal viisil kui uuritavat kemikaali, samuti ei ole vaja võtta proove iga paaritumisintervalli järel. Positiivse kontrollina kasutatavad ained peaksid katses kasutatavates tingimustes teadaolevalt avaldama dominantset letaalset mõju. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda katserühma loomadega identsel viisil, välja arvatud ainega töötlemisel.

17.

Positiivse kontrollina kasutatava aine annused tuleks valida nii, et positiivne dominantne letaalne mõju oleks nõrk või mõõdukas ja võimaldaks kriitiliselt hinnata meetodi töökindlust ja tundlikkust, kuid oleks samal ajal järjepidevalt tuvastatav. Positiivse kontrollina kasutatavate ainete näited ja sobivad annused on esitatud tabelis 1.

Tabel 1

Positiivse kontrollina kasutatavate ainete näited

Aine [CASi nr] (viitenumber)	Toimivate annuste vahemik (mg/kg) (näriliseliigid)	Manustamisaeg (päevades)
Trietüleenmelamiin [51-18-3] (15)	0,25 (hiired)	1
Tsüklofosfamiid [50-18-0] (19)	50–150 (hiired)	5
Tsüklofosfamiid [50-18-0] (5)	25–100 (rotid)	1
Etüülmetaansulfonaat [62-50-0] (13)	100–300 (hiired)	5
Monomeerne akrüülamiid [79-06-1] (17)	50 (hiired)	5
Kloorambutsiil [305-03-3] (14)	25 (hiired)	1

Negatiivsed kontrollid

18.

Igal proovivõtukorral tuleks kasutada negatiivse kontrollina loomi, kellele on manustatud ainult lahustit või kandeainet ja keda on muidu koheldud samal viisil kui katserühma loomi (20). Valitud lahusti/kandeaine dominantse letaalse ja muu kahjuliku mõju puudumist kinnitavate varasemate laboriandmete või avaldatud kontrollandmete puudumisel tuleks igal proovivõtukorral kasutada kontrollina ka loomi, kellele ei ole midagi manustatud, et tõendada kandeainega töödeldud kontrollrühma andmete vastuvõetavust.

KATSE KÄIK

Loomade arv

19.

Iga isaslooma paaritatakse eelnevalt kindlaks määratud sobivate ajavahemike järel (nt kord nädalas; punktid 21 ja 23) järjestikku soovitatavalt ühe varem paaritumata emasloomaga. Eelnevalt peaks olema kindlaks tehtud, et isasloomade arv rühmas on piisav (hinnatuna koos igal paaritumisperioodil paaritunud emasloomade arvuga), et tagada vähemalt selline statistiline võimsus, mis on vajalik dominantse letaalse mõju esinemissageduse kahekordistumise tuvastamiseks (punkt 44).

20.

Samuti tuleks statistilise võimsuse arvutustega eelnevalt kindlaks teha emasloomade vajalik arv igal paaritumisperioodil, et võimaldada miinimumeesmärgina dominantse letaalse mõju esinemissageduse kahekordistumise tuvastamist (st piisav tiinete emasloomade arv, et pesastunud embrüote üldarv oleks vähemalt 400) (20, 21, 22, 23) ning eeldatavalt vähemalt ühe pesastunud surnud embrüo esinemist analüüsiühiku kohta (st igas paaritamisrühmas iga annuse puhul) (24).

Manustamisperiood ja paaritamisintervallid

21.

Töötlemisjärgsete paaritamisintervallide arv sõltub manustamisrežiimist ja seejuures tuleks tagada, et dominantse letaalse mõju ilmnemist hinnatakse kõikides isaslooma idurakkude küpsemise etappides (12, 25). Ühekordsel töötlemisel, mis hõlmab kuni viie päevaannuse manustamist, tuleks pärast viimast manustamist viia ühenädalase vahega läbi 8 (hiirte puhul) või 10 (rottide puhul) paaritamist. Suurema arvu annuste manustamisel võib paaritamisintervallide arvu vähendada proportsionaalselt manustamisperioodi pikenemisega, ent jätkuvalt tuleks järgida eesmärki hinnata mõju kõikides spermatogeneesi etappides (näiteks piisab hiirte puhul spermatogeneesi igas etapis avalduva mõju hindamiseks 28 päeva pikkuse kokkupuuteperioodi järgselt neljast nädalase vahega toimuvast paaritamisest). Kõik manustamis- ja paaritamisrežiimid peavad olema teaduslikult põhjendatud.

22.

Emasloomad peaksid jääma isasloomade juurde vähemalt üheks innatsükliks (nt hiirtel ja rottidel jääb ühe nädala sisse üks innatsükkel). Emasloomi, kes ei ole nädalapikkuse perioodi jooksul paaritunud, võib kasutada mõnel järgneval paaritamisperioodil. Emasloomad võib isasloomadest eraldada ka juba pärast paaritumist, mille tõendamiseks tehakse kindlaks seemnerakkude esinemine tupes või tupekorgi esinemine.

23.

Kasutatav kokkupuute- ja paaritamisrežiim sõltub dominantse letaalse mõju katse lõppeesmärgist. Kui eesmärk on teha kindlaks, kas asjaomane kemikaal üldse põhjustab dominantseid letaalseid mutatsioone, on vastuvõetav sellise meetodi kasutamine, mille puhul kokkupuude hõlmab kogu spermatogeneesitsüklit (nt hiirte puhul 7 nädalat, 5–7 manustamiskorda nädalas) ja paaritamine toimub kokkupuute järgselt üks kord. Kui aga eesmärk on teha kindlaks, millist tüüpi idurakud on dominantse letaalse mõju suhtes tundlikud, siis on soovitatav kasutada nädalase intervalliga paaritamist pärast ühekordset või viie päeva pikkust kokkupuudet.

Annused

24.

Kui annuste valimist hõlbustavate sobivate andmete puudumise tõttu tehakse annusevahemiku kindlakstegemiseks eeluuring, tuleks see läbi viia samas laboris, samast liigist, liinist ja soost loomadega ning sama manustamisrežiimi alusel kui põhiuuring (26). Eeluuringu eesmärk peaks olema teha kindlaks suurim talutav annus, mis on määratletud kui suurim annus, mida suudetakse uuringuperioodi jooksul taluda nii, et ei täheldata uuringu läbiviimist piirava mürgisuse nähte (näiteks ebatavalised reaktsioonid või käitumine, väike kehamassi vähenemine või tsütotoksilisus vereloomesüsteemi suhtes, mis aga ei põhjusta veel surma ega selliseid kannatusi, valu või stressi, mis nõuaksid loomade humaanset surmamist) (27).

25.

Samuti ei tohi suurima talutava annuse puhul ilmneda kahjulikku mõju paaritumisedukusele (21).

26.

Selliste uuritavate kemikaalide puhul, millel avaldub juba väikese mittemürgise annuse juures konkreetne bioloogiline aktiivsus (näiteks hormoonid ja mitogeenid) või mille puhul esineb toksikokineetiliste omadustega seotud küllastumine, ei pruugi annuste valimise kriteeriumid olla kohaldatavad ning neid kemikaale tuleks igal konkreetsel juhul eraldi hinnata.

27.

Annusest sõltuvuse kohta teabe saamiseks tehtav täielik uuring peaks hõlmama negatiivse kontrolli rühma ja vähemalt kolme eri annust, mis erinevad üksteisest üldjuhul kaks korda, ent kõige rohkem neli korda. Kui uuritav kemikaal ei ole annusevahemiku kindlakstegemise uuringus või olemasolevate andmete põhjal mürgine, peaks suurim korraga manustatav annus olema 2 000 mg kehamassi kilogrammi kohta. Kui aga uuritav kemikaal põhjustab mürgisusnähte, tuleks suurima manustatava annusena kasutada suurimat talutavat annust ning kasutatav annusevahemik peaks soovitatavalt ulatuma suurimast annusest kuni annuseni, mille puhul täheldatav mürgisus on vähene või puudub. Mittemürgiste kemikaalide puhul on piirannus 14 päeva pikkuse või pikema manustamisperioodi puhul 1 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas ning 14 päevast lühema manustamisperioodi puhul 2 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas.

Annuste manustamine

28.

Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese puhul eeldatavat kokkupuuteviisi. Seepärast võib vastavast põhjendusest lähtuvalt kasutada selliseid manustamisviise nagu manustamine söödaga, joogiveega, naha alla, veenisiseselt, paikselt, sissehingamise teel, suu kaudu (toitmissondiga) või implantaadiga. Igal juhul tuleks manustamisviis valida nii, et oleks tagatud sihtkoe/-kudede piisav kokkupuude uuritava kemikaaliga. Intraperitoneaalne süstimine ei ole tavaliselt soovitatav, kuna tegemist ei ole inimese puhul ette nähtud kokkupuuteviisiga, ning seda tuleks kasutada ainult juhul, kui on olemas sellekohane konkreetne teaduslik põhjendus. Kui uuritav kemikaal segatakse sööda või joogiveega, tuleks eriti üheainsa annuse manustamisel jälgida, et sööda ja vee tarbimise ning paaritumise vaheline ajavahemik oleks piisav, et võimaldada kemikaali mõju tuvastamist (punkt 31). Toitmissondi kaudu või süstimise teel korraga manustatav suurim vedelikukogus sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt ei tohiks see kogus olla suurem kui 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, mida võib kasutada koguses 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema koguse kasutamist (kui see on loomade heaolu käsitlevate õigusaktide kohaselt lubatud) tuleks põhjendada. Katses kasutatava ruumala varieeruvuse minimeerimiseks tuleks muuta kemikaali kontsentratsiooni, et tagada kehamassi suhtes püsiva ruumala kasutamine kogu annusevahemiku lõikes.

Vaatlused

29.

Katseloomadel tuleks teha kliinilisi vaatlusi ja registreerida kliinilised sümptomid vähemalt üks kord päevas, igal päeval soovitatavalt samal ajal, ning võtta seejuures arvesse manustamisjärgse eeldatava mõju maksimaalse avaldumise ajavahemikku. Manustamisperioodil tuleks kõiki loomi haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks kontrollida vähemalt kaks korda päevas. Kõikide loomade kaal tuleks määrata uuringu alguses, korduvannustamise uuringu kestel vähemalt kord nädalas ning humaanse surmamise hetkel. Sööda tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist mõõta iga veevahetuse ajal ja vähemalt kord nädalas. Loomad, kellel täheldatakse liigse mittesurmava mürgisuse nähte, tuleks enne katse lõppu humaanselt surmata (27).

Kudede kogumine ja töötlemine

30.

Emasloomad surmatakse humaanselt tiinuse teises pooles, hiirte puhul tiinuse 13. päeval ja rottide puhul tiinuse 14.–15. päeval. Dominantse letaalse mõju tuvastamiseks uuritakse loomade emakat, et teha kindaks pesastunud embrüote, elus ja surnud embrüote ning kollakehade arv.

31.

Paljastatakse emakasarved ja munasarjad, et loendada kollakehad, ning looted eemaldatakse, loendatakse ja kaalutakse. Emakat tuleks hoolikalt uurida elus loodete varju jäävate resorbeerumiskohtade suhtes ja tagada, et kõik resorbeerumisjuhud saavad loendatud. Registreeritakse loodete suremus. Samuti registreeritakse edukalt tiinestunud emasloomade arv, pesastunud embrüote üldarv, pesastumiseelne kadu ja pesastumisjärgne suremus (sealhulgas varased ja hilised resorbeerumisjuhud). Peale selle võib nähtavaid looteid säilitada Bouini fikseerimislahuses vähemalt kaks nädalat ning seejärel uurida, kas neil esineb suuri väliseid väärarenguid (28), et saada lisateavet uuritava aine mõju kohta paljunemisvõimele ja arengule.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmete töötlemine

32.

Andmed tuleks esitada tabelina, kus on välja toodud paaritunud isasloomade arv, tiinete emasloomade arv ja tiinestumata emasloomade arv. Tuleks esitada eraldi iga paaritamise tulemused koos iga isaslooma ja emaslooma identimisandmetega. Iga emaslooma puhul tuleks esitada paaritamisintervall, isasloomadele manustatud annus ning elus ja surnud embrüote arv.

33.

Pesastumisjärgse embrüote kao arvutamiseks võrreldakse pesastunud surnud embrüote arvu ja pesastunud embrüote üldarvu suhet kemikaaliga töödeldud rühmas ja lahustiga/kandeainega töödeldud kontrollrühmas.

34.

Pesastumiseelse embrüote kao leidmiseks arvutatakse kollakehade arvu ja pesastunud embrüote arvu vahe või emaslooma kohta pesastunud embrüote keskmise arvu ja kontrollpaaritamisel saadud vastava näitaja erinevus. Pesastumiseelse embrüote kao hindamise korral tuleks tulemused registreerida.

35.

Dominantse letaalsuse tegur leitakse järgmiselt: (pesastumisjärgsed surmajuhtumid / pesastunud embrüote üldarv emaslooma kohta) × 100.

36.

Tuleks esitada andmed mürgisuse ja kliiniliste sümptomite kohta (vt punkt 29).

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

37.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid on järgmised:

—	paralleelse negatiivse kontrolliga saadud tulemused on kooskõlas varasemaid negatiivse kontrolli andmeid käsitlevate avaldatud normidega, samuti laboris kontrollidega varem saadud tulemustega, kui need on olemas (vt punktid 10 ja 18);

—

paralleelsed positiivsed kontrollid kutsuvad esile reaktsioone, mis on kooskõlas varasemaid positiivsete kontrollide andmeid käsitlevate avaldatud normidega, samuti laboris positiivsete kontrollidega varem saadud tulemustega, kui need on olemas, ning paralleelsete positiivsete kontrollidega saadud väärtused on statistiliselt oluliselt suuremad kui negatiivse kontrolliga saadud väärtused (vt punktid 17 ja 18);

—	analüüsitud pesastunud embrüote üldarv ja eri annuste arv on piisav (punkt 20);

—	suurima annuse valimise kriteeriumid on kooskõlas punktides 24 ja 27 kirjeldatud kriteeriumidega.

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

38.

Annusest sõltuvuse analüüsimiseks piisavate andmete saamiseks on vaja uurida vähemalt kolme rühma, kus on töötlemiseks kasutatud eri annuseid.

39.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt positiivseks, kui:

—	vähemalt ühe katses kasutatud annuse puhul täheldatakse saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes,

—	kõnealune suurenemine on sobiva testiga hindamisel vähemalt ühte tüüpi katsetingimustes (nt nädalase paaritamisintervalli puhul) annusest sõltuv ning

—	mis tahes saadud tulemus jääb väljapoole vastuvõetavat negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste olemasolul selliste tulemuste jaotust (nt väljapoole Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimelisena põhjustama katseloomade idurakkudes dominantseid letaalseid mutatsioone. Kõige asjakohasemaid statistilisi meetodeid käsitlevad soovitused on esitatud punktis 44; kirjandusest võib leida teavet ka muude soovitatavate statistiliste lähenemisviiside kohta (20, 21, 22, 24, 29). Kasutatavate statistiliste testide puhul tuleks katseüksusena käsitada üksikisendit.

40.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt negatiivseks, kui:

—	ühegi katses kasutatud annuse puhul ei täheldata saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes,

—	ühegi katsetingimuse puhul ei esine annusest sõltuvat väärtuse suurenemist ning

—	kõik saadud tulemused jäävad vastuvõetavasse negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste olemasolul selliste tulemuste jaotusvahemikku (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimetuna põhjustama katseloomade idurakkudes dominantseid letaalseid mutatsioone.

41.

Selgelt positiivset või negatiivset tulemust ei ole vaja üle kontrollida.

42.

Juhul, kui tulemus ei ole selgelt negatiivne ega selgelt positiivne ning eesmärk on aidata kindlaks teha tulemuse – näiteks vaadeldava väärtuse väikese või piiripealse suurenemise – bioloogiline olulisus, tuleks andmete hindamiseks kasutada eksperdihinnangut ja/või olemasolevatel katseandmetel põhinevat täiendavat analüüsi, näiteks kaaluda, kas positiivne tulemus jääb väljapoole vastuvõetavat negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste jaotust (30).

43.

Harvadel juhtudel ei võimalda andmed isegi pärast täiendavat analüüsi teha järeldust selle kohta, kas tulemus on positiivne või negatiivne; sel juhul loetakse tulemus ebaselgeks.

44.

Kasutatavate statistiliste testide puhul tuleks katseüksusena käsitada isaslooma. Ehkki loendamisandmed (nt pesastunud embrüote arv emaslooma kohta) võivad olla Poissoni jaotusega ja/või osakaalu andmed (nt pesastunud surnud embrüote osakaal) binoomjaotusega, iseloomustab selliseid andmeid sageli siiski ülehajuvus (31). Sellest lähtuvalt tuleks statistilise analüüsi puhul esmalt kontrollida üle- või alahajuvuse esinemist selliste hajuvustestidega nagu Cochrani binoomjaotuse hajuvuse test (32) või Tarone’i C(α)-test binoomjaotuse ülehajuvuse tuvastamiseks (31, 33). Kui ei tuvastata kõrvalekallet binoomjaotusest, võib annusevahemiku lõikes täheldatavate osakaalumuutuste analüüsimiseks kasutada Cochrani-Armitage’i trenditesti (34) ja paariviisiliseks kontrollrühma andmetega võrdlemiseks Fisheri-Yatesi testi (35). Samamoodi võib juhul, kui ei tuvastata kõrvalekallet Poissoni jaotusest, kasutada loendamistulemustega seotud suundumuste tuvastamiseks Poissoni regressioonimudelit (36) ja Poissoni mudeli kontekstis paariviisiliseks kontrollrühma andmetega võrdlemiseks paariviisilisi kontraste (36). Kui tuvastatakse oluline üle- või alahajuvus, soovitatakse kasutada mitteparameetrilisi meetodeid (23, 31). Nende hulka kuuluvad sellised astakupõhised testid nagu Jonckheere’i-Terpstra trenditest (37) ja Manni-Whitney test (38) paariviisiliseks võrdlemiseks kandeainega/lahustiga töödeldud kontrollrühma andmetega, samuti permutatsiooni-, taasvalimis- ja bootstrap-testid suundumuste analüüsimiseks ja paariviisiliseks võrdlemiseks kontrollrühma andmetega (31, 39).

45.

Dominantse letaalse mõju katse positiivsed tulemused on tõend uuritava kemikaali genotoksilisuse kohta katseliigi töödeldud isaslooma idurakkudes.

46.

Saadud tulemuste bioloogilise olulisuse hindamisel võib juhinduda sellest, kas täheldatud väärtused jäävad laboris kontrollidega varem saadud tulemuste jaotusvahemikku või sellest väljapoole (40).

Katseprotokoll

47.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Kokkuvõte

Uuritav kemikaal:

—	allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

—	uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui see on teada;

—	vastavalt vajadusele mõõtmistulemused söötme pH ja osmolaalsuse ning sademe tekke kohta pärast uuritava kemikaali lisamist;

ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

Uuritava kemikaali ettevalmistamine:

—	kandeaine valimise põhjendus;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines, kui see on teada;

—	sööda või joogiveega või sissehingamise teel manustamiseks sobiva valmistise valmistamine;

—	valmistise analüüsi tulemused (nt püsivus, homogeensus, nominaalne kontsentratsioon), kui need on olemas.

Katseloomad:

—	kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;

—	loomade arv, vanus ja sugu;

—	päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne;

—	loomade ühese identimise meetod;

—	lühiajaliste uuringute puhul: iga isaslooma kehamass katse alguses ja lõpus; ühest nädalast pikemate uuringute puhul: iga looma kehamass uuringu vältel ja sööda tarbimise andmed. Iga rühma kohta tuleks esitada kehamasside vahemik, keskväärtus ja standardhälve.

Katsetingimused:

—	positiivse ja negatiivse (kandeainega/lahustiga) kontrolli andmed;

—	annusevahemiku kindlakstegemise uuringu andmed;

—	annuste valimise põhjendus;

—	uuritava kemikaali ettevalmistamise üksikasjad;

—	uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;

—	manustamisviisi valimise põhjendus;

—	loomadel avalduva mürgisuse mõõtmise meetodid, sealhulgas andmed histopatoloogilise või hematoloogilise analüüsi kohta, kui seda on tehtud, samuti loomade vaatlemise ja kehamassi määramise sagedus;

—	negatiivsete tulemuste korral meetodid selle kontrollimiseks, et uuritav kemikaal on jõudnud sihtkoesse või üldvereringesse;

—	vajaduse korral tegelik annus (milligrammides kehamassi kilogrammi kohta päevas), mis arvutatakse lähtuvalt sööda/joogivee tarbimisest ja selles sisalduva uuritava kemikaali kontsentratsioonist (miljondikes);

—	sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;

—	puurikeskkonna mitmekesistamise üksikasjad;

—	manustamis- ja proovivõturežiimide üksikasjalik kirjeldus ja nende valimise põhjendus;

—	valutustamismeetod;

—	humaanse surmamise meetod;

—	kudede eraldamise ja säilitamise meetodid;

—	kõikide katsekomplektide ja reaktiivide päritolu ja partii number (vajaduse korral);

—	loendamismeetodid dominantse letaalse mõju määramiseks;

—	paaritamise ajakava;

—	paaritumise kindlakstegemiseks kasutatud meetodid;

—	humaanse surmamise aeg;

—	dominantse letaalse mõju hindamise kriteeriumid, sealhulgas kollakehade, pesastunud embrüote, embrüote resorbeerumise, pesastumiseelse kao, pesastunud elus embrüote ja pesastunud surnud embrüote kindlakstegemiseks.

Tulemused:

—	loomade seisund enne katset ja katseperioodi kestel, sealhulgas mürgisuse nähud;

—	isasloomade kehamass manustamisperioodil ja paaritamisperioodil;

—	paaritunud emasloomade arv;

—	võimaluse korral andmed annusest sõltuvuse kohta;

—	paralleelse negatiivse kontrolli andmed ja laboris negatiivse kontrolliga varem saadud andmed, sealhulgas tulemuste vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;

—	paralleelse positiivse kontrolli andmed;

—

tabeli kujul andmed iga tiinestunud emaslooma kohta: kollakehade arv tiinestunud emaslooma kohta; pesastunud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta; resorbeerunud embrüote ja enne pesastumist hävinud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta; pesastunud elus embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta; pesastunud surnud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta; loodete kehamass;

—	eespool nimetatud andmed koondatud kujul iga paaritamisperioodi ja annuse kohta koos dominantse letaalse mõju avaldumissagedusega;

—	teave statistilise analüüsi ja kasutatud meetodite kohta.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 238. OECD, Pariis.

(2)	Bateman, A. J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse. Väljaandes: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. Kilbey, B. J. et al. (toim.), Elsevier, Amsterdam. Lk 235–334.

(3)

Ehling, U. H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., ja Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice Set up by the Work Group „Dominant lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics“. Arch. Toxicol. 39: 173–185.

(4)	Shelby, M. D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutat. Res. 352: 159–167.

(5)	Knudsen, I., Hansen, E. V., Meyer, O. A., ja Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutat. Res. 48: 267–270.

(6)	Anderson, D., Hughes, J. A., Edwards, A. J., ja Brinkworth, M. H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutat. Res. 397: 77–74.

(7)	Shively, C. A., White, D.,M., Blauch, J.,L., ja Tarka, S. M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20: 325–329.

(8)	Rao, K. S., Cobel-Geard, S. R., Young, J. T., Hanley, T. R. Jr., Hayes, W. C., John, J. A., ja Miller, R. R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol. 3: 80–85.

(9)	Brewen, J. G., Payne, H. S., Jones, K. P., ja Preston, R. J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells. Mutat. Res. 33: 239–249.

(10)	Marchetti, F., Bishop, J. B., Cosentino, L., Moore, D., II, ja Wyrobek, A. J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod. 70: 616–624.

(11)	Marchetti, F., ja Wyrobek, A. J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res. C 75: 112–129.

(12)	Adler, I.-D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutat. Res. 352: 169–172.

(13)	Favor, J., ja Crenshaw, J. W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice. Mutat. Res. 53: 21–27.

(14)	Generoso, W. M., Witt, K. L., Cain, K. T., Hughes, L., Cacheiro, N. L. A, Lockhart, A. M. C., ja Shelby, M. D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutat. Res. 345: 167–180.

(15)	Hastings, S. E., Huffman, K. W., ja Gallo, M. A. (1976). The Dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine. Mutat. Res. 40: 371–378.

(16)	James, D. A., ja Smith, D. M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay. Mutat. Res. 99: 303–314.

(17)	Shelby, M. D., Cain, K. T., Hughes, L. A., Braden, P. W., ja Generoso, W. M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutat. Res. 173: 35–40.

(18)	Sudman, P. D., Rutledge, J. C., Bishop, J.,B., ja Generoso, W. M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice. Mutat. Res. 296: 143–156.

(19)	Holstrom, L. M., Palmer, A. K., ja Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. Väljaandes: Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland, D. J., ja Fox, M. (toim.), Cambridge University Press. Lk 129–156.

(20)	Adler, I.-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I., ja Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis. Mutat. Res. 417: 19–30.

(21)

Adler, I.-D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T., ja Tanaka, N. (1994). Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutat. Res. 312: 313–318.

(22)	Generoso, W. M., ja Piegorsch, W. W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Väljaandes: Methods in Toxicology 3A. Lk 124–141.

(23)	Haseman, J. K., ja Soares, E. R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutat. Res. 41: 277–288.

(24)	Whorton, E. B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality. Teratogen. Carcin. Mut. 1: 353–360.

(25)	Anderson, D., Hodge, M. C. E., Palmer, S., ja Purchase, I. F. H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutat. Res. 85: 417–429.

(26)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., ja Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7: 313–319.

(27)	OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(28)	Barrow, M. V., ja Taylor, W. J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. J. Morphol. 127: 291–306.

(29)	Kirkland, D. J. (toim.) (1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Cambridge University Press.

(30)	Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J., ja Thybaud, V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data“. Mutat. Res. 723: 87–90.

(31)	Lockhart, A. C., Piegorsch, W. W., ja Bishop, J. B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutat. Res. 272: 35–58.

(32)	Cochran, W. G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics 10: 417–451.

(33)	Tarone, R. E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika 66: 585–590.

(34)	Margolin, B. H. (1988). Test for Trend in Proportions. Väljaandes: Encyclopedia of Statistical Sciences, 9. köide. Kotz, S., ja Johnson, N. L. (toim.). Lk 334–336. John Wiley & Sons, New York.

(35)	Cox, D. R. (1970). Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London.

(36)	Neter, J. M., Kutner, H. C., Nachtsheim, J., ja Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models. Neljas väljaanne. 14. ja 17. peatükk. McGraw-Hill, Boston.

(37)	Jonckheere, R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika 41: 133–145.

(38)	Conover, W. J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley & Sons, New York.

(39)	Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Tööstus- ja Rakendusmatemaatika Ühing, Philadelphia, PA.

(40)	Fleiss, J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley & Sons, New York.

1. liide

MÕISTED

Dominantne letaalne mutatsioon– idurakus tekkinud või pärast viljastamist kinnistunud mutatsioon, mis kutsub esile embrüo või loote surma.

Kemikaal– aine või segu.

Kollakeha– hormoone eritav moodustis munasarja pinnal, mis tekib munaraku vabastanud folliikuli asukohas. Kollakehade arv munasarjas vastab ovuleerunud munarakkude arvule.

Paaritamisintervall– kokkupuuteperioodi lõpu ja töödeldud isasloomade paaritamise vaheline ajavahemik. Selle intervalli muutmise teel on võimalik hinnata kemikaali mõju eri tüüpi idurakkudele. Hiirtel tehakse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 nädalat pärast kokkupuuteperioodi lõppu toimuva paaritamise teel kindlaks mõju vastavalt seemnerakkudele, kondenseerunud spermatiididele, ümaratele spermatiididele, pahhüteenis spermatotsüütidele, varajastele spermatotsüütidele, diferentseerunud spermatogoonidele, diferentseeruvatele spermatogoonidele ja spermatogoonide tüvirakkudele.

Pesastumiseelne kadu– kollakehade arvu ja pesastunud embrüote arvu vahe. Seda saab hinnata ka nii, et võrreldakse pesastunud embrüote üldarvu emaslooma kohta kemikaaliga töödeldud rühmas ja kontrollrühmas.

Pesastumisjärgne kadu– pesastunud surnud embrüote osakaal kemikaaliga töödeldud rühmas võrrelduna pesastunud surnud embrüote arvu ja pesastunud embrüote üldarvu suhtega kontrollrühmas.

Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB– tundmatu või muutuva koostisega kemikaal, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Viljakuskordaja– paaritunud tiinete emasloomade arvu ja paaritunud emasloomade arvu suhe.

2. liide

IMETAJATE SPERMATOGENEESI ETAPID

Joonis 1. Hiire ja roti isaslooma ning mehe idurakkude arenguetappide kestuse (päevades) võrdlus; varjutusega perioodidel DNA reparatsiooni ei toimu

Eespool on esitatud hiire, roti ja inimese spermatogeneesi skemaatiline joonis (allikas: Adler, 1996). Diferentseerumata spermatogoonid hõlmavad A-tüüpi ühekaupa, A-tüüpi paarikaupa ja A-tüüpi reastunud spermatogoone (Hess ja Renato de Franca, 2008). Tõelisteks tüvirakkudeks peetakse A-tüüpi ühekaupa spermatogoone; seepärast peab ajavahemik uuritava kemikaali viimasest manustamisest kuni paaritamiseni olema vähemalt 49 päeva (hiirtel), et võimaldada hinnata tüvirakkudele avalduvat mõju.

Viited

Adler, I.-D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutat. Res. 352: 169–172.

Hess, R. A., ja Renato de Franca, L. (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Väljaandes: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis. Cheng, C. Y. (toim.), Landes Bioscience ja Springer Science+Business Media. Lk 1–15.

“

B osas asendatakse peatükk B.23 järgmisega:

„B.23. KROMOSOOMIABERRATSIOONIKATSE IMETAJATE SPERMATOGOONIDEGA

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 483 (2016). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaoluga seotud kaalutlusi. Käesolevas katsemeetodi muudetud versioonis kajastub selle meetodi kasutamisel saadud aastatepikkune kogemus, samuti annab see võimaluse lõimida või kombineerida seda meetodit muude mürgisuse või genotoksilisuse hindamise meetoditega. Mürgisuse hindamise meetodite kasutamine kombineerituna võimaldab vähendada mürgisuskatsetes kasutatavate loomade arvu. Käesolev katsemeetod kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. OECD on välja töötanud dokumendi, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia valdkonna katsete kohta ning ülevaade genotoksilisust käsitlevates OECD katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

Imetajate spermatogoonidega tehtava in vivo kromosoomiaberratsioonikatse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis põhjustavad imetajate spermatogoonides struktuurseid kromosoomiaberratsioone (2, 3, 4). Peale selle on kõnealune katse oluline genotoksilisuse hindamiseks, sest ehkki in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA reparatsiooni protsessidega seotud tegurid võivad liigiti varieeruda, on need aktiivsed ja aitavad kaasa vastusreaktsiooni kujunemisele. Käesolev katsemeetod ei ole ette nähtud kromosoomiarvu kõrvalekallete mõõtmiseks ning seda ei kasutata regulaarselt sel eesmärgil.

Käesoleva meetodiga mõõdetakse struktuurseid kromosoomiaberratsioone (nii kromosoomi- kui ka kromatiidiaberratsioone) jagunevates spermatogoonides ning seepärast võimaldab see eeldatavalt ennustada pärilike mutatsioonide tekkimist nimetatud idurakkudes.

Põhimõistete määratlused on esitatud liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

Käesoleva katsemeetodi puhul kasutatakse tavaliselt närilisi, kuid mõnel teaduslikult põhjendatud juhul võib olla asjakohane kasutada mõnda muud liiki. Näriliste munandite tavapäraste tsütogeneetiliste preparaatide puhul analüüsitakse mitoosi metafaasi (spermatogoonides) ja meioosi metafaasi (spermatotsüütides). Mitoosi ja meioosi metafaas tuvastatakse kromosoomide morfoloogia alusel (4). Käesolev in vivo tsütogeneetiline meetod võimaldab teha kindlaks mitoosi ajal täheldatavaid struktuurseid kromosoomiaberratsioone spermatogoonides. Käesolevat meetodit ei kasutata muude sihtkudede puhul.

Spermatogoonides kromatiidiaberratsioonide tuvastamiseks tuleks uurida rakkude esimest töötlemisjärgset mitootilist jagunemist, kuna nimetatud aberratsioonidest saavad rakkude järgnevate jagunemiste käigus kromosoomiaberratsioonid. Lisateabe saamiseks analüüsitakse töödeldud spermatotsüütide kromosoome meioosi vältel diakineesi, I metafaasi ja II metafaasi etappides struktuursete kromosoomiaberratsioonide suhtes.

Munandis esineb mitu spermatogoonide põlvkonda (5) ning kõnealuste eri tüüpi idurakkude tundlikkus kemikaalidega töötlemise suhtes võib olla erinev. Seega kajastavad tuvastatud aberratsioonid töödeldud spermatogoonide populatsioonidele avalduvat koondmõju. Munandipreparaatides on enamik mitoosis rakkudest B-tüüpi spermatogoonid, mille rakutsükli kestus on umbes 26 tundi (3).

Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav kemikaal või selle metaboliit/metaboliidid ei jõua munandisse, ei ole käesoleva katsemeetodi kasutamine asjakohane.

KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Üldpõhimõtte kohaselt viiakse loomad pärast sobiva kokkupuuteviisi valimist uuritava kemikaaliga kokkupuutesse ning sobiva ajavahemiku möödumisel töötlemisest surmatakse loomad humaanselt. Enne surmamist manustatakse loomadele ainet, mis peatab rakkude jagunemise metafaasis (nt kolhitsiin või Colcemid®). Seejärel tehakse idurakkudest kromosoomipreparaadid ja värvitakse need ning metafaasis rakke analüüsitakse kromosoomiaberratsioonide suhtes.

LABORI PÄDEVUSE TÕENDAMINE

10.

Käesoleva meetodi kasutamise pädevuse kinnitamiseks tuleks tõendada võimekust reprodutseerida positiivse kontrollina kasutatavate, näiteks tabelis 1 loetletud (sealhulgas nõrga toimega) ainetega saadud, spermatogoonides täheldatavate struktuursete kromosoomiaberratsioonide esinemissagedust käsitlevaid tulemusi, samuti peaks negatiivsete kontrollide puhul täheldatud sagedus jääma vastuvõetavasse kirjanduses avaldatud kontrollandmete jaotusvahemikku (nt allikad 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10) või laboris kontrollidega varem saadud tulemuste jaotusvahemikku, kui sellised tulemused on olemas.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistused

Loomaliigi valimine

11.

Tuleks kasutada tavapäraste laboriliinide terveid noori täiskasvanud loomi. Tavaliselt kasutatakse isaseid hiiri; kui see on teaduslikult põhjendatud, võib siiski kasutada ka mõne muu sobiva imetajaliigi isasloomi, et käesolevat katsemeetodit oleks võimalik kasutada koos mõne muu katsemeetodiga. Teaduslik põhjendus näriliste asemel mõne muu liigi loomade kasutamise kohta tuleks esitada katseprotokollis.

Loomade pidamis- ja söötmistingimused

12.

Näriliste puhul peaks loomapidamisruumi temperatuur olema 22 °C (± 3 °C). Suhteline niiskus peaks olema vähemalt 40 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, ideaaljuhul aga 50–60 %. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada sööda sobivus uuritava kemikaali lisamiseks, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Näriliste pidamisel tuleks kasutada väikesi loomade rühmi (maksimaalselt viis looma puuri kohta), kui ei ole põhjust eeldada agressiivset käitumist; soovitatavalt tuleks kasutada sobiva mitmekesistatud keskkonnaga täispõhjaga puure. Loomi võib pidada eraldi, kui see on teaduslikult põhjendatud.

Loomade ettevalmistamine

13.

Tavaliselt kasutatakse terveid noori täiskasvanud (töötlemishetkeks 8–12 nädala vanuseid) loomi, kes jagatakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühmadesse. Iga looma üheseks identimiseks kasutatakse humaanset minimaalselt invasiivset meetodit (nt rõngastamine, märgistamine, mikrokiibistamine või biomeetriline tuvastamine, kuid mitte kõrva sälkamine ega varba köndistamine) ning loomadel lastakse vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud võimalik mõju oleks võimalikult väike. Tuleks ära hoida positiivse kontrollina kasutatava aine ja uuritava kemikaali vahelist ristsaastumist. Katse alguses peaksid loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte üle ± 20 %.

Annuste ettevalmistamine

14.

Katsetingimused – lahusti/kandeaine

15.

Lahusti/kandeaine ei tohiks avaldada kasutatavate annuste puhul mürgist mõju ega olla võimeline uuritava kemikaaliga keemiliselt reageerima. Kui on valitud vähem tuntud lahusti/kandeaine, tuleks selle sobivuse tõendamiseks esitada selle kasutamist toetavad võrdlusandmed. Kui vähegi võimalik, on soovitatav esmalt kaaluda veepõhise lahusti/kandeaine kasutamist. Tavaliselt kasutatavad lahustid/kandeained on näiteks vesi, füsioloogiline lahus, metüültselluloosi lahus, karboksümetüültselluloosi naatriumisoola lahus, oliiviõli ja maisiõli. Valitud ebatüüpilisest lahustist/kandeainest põhjustatud struktuursete kromosoomiaberratsioonide ja muu kahjuliku mõju puudumist kinnitavate varasemate laboriandmete või avaldatud kontrollandmete puudumisel tuleks teha eelkatse, et tõendada lahustiga/kandeainega töödeldud kontrollrühma andmete vastuvõetavust.

Positiivsed kontrollid

16.

Katses tuleks alati paralleelselt kasutada positiivse kontrollina kasutatava ainega töödeldud loomi, välja arvatud juhul, kui labori pädevus katse läbiviimiseks on tõendatud ja katsemeetodit on lähiminevikus (nt viimase viie aasta jooksul) korrapäraselt kasutatud. Kui paralleelse positiivse kontrolli rühma ei kasutata, peaks iga katse hõlmama hindamiskontrolle (fikseeritud ja värvimata mikroskoobipreparaadid). Selleks võib uuringu raames hinnata asjakohaseid säilitatud võrdlusproove, mis on saadud positiivse kontrolliga tehtud eraldi katsest, mida viiakse uuringut tegevas laboris läbi korrapäraselt (nt iga 6–18 kuu järel), näiteks pädevuse tõendamise käigus ja seejärel regulaarselt vastavalt vajadusele.

17.

Positiivse kontrollina kasutatavate ainete puhul tuvastatav struktuursete kromosoomiaberratsioonidega rakkude esinemissagedus peaks järjepidevalt olema suurem kui vastav spontaanse esinemise sagedus. Positiivse kontrolli annused tuleks valida nii, et toime oleks selgelt tuvastatav, kuid ei võimaldaks hindajal teha kohe kindlaks kodeeritud proovide identiteeti. Positiivse kontrollina kasutatavate ainete näited on esitatud tabelis 1.

Tabel 1

Positiivse kontrollina kasutatavate ainete näited

Aine [CASi nr] (viitenumber)

Tsüklofosfamiid(monohüdraat) [CASi nr: 50-18-0 (CASi nr: 6055-19-2)] (9)

Tsükloheksüülamiin [CASi nr: 108-91-8] (7)

Mitomütsiin C [CASi nr: 50-07-7] (6)

Monomeerne akrüülamiid [CASi nr: 79-06-1] (10)

Trietüleenmelamiin [CASi nr: 51-18-3] (8)

Negatiivsed kontrollid

18.

Igal proovivõtukorral tuleks kasutada negatiivse kontrollina loomi, kellele on manustatud ainult lahustit või kandeainet ja keda on muidu koheldud samal viisil kui katserühma loomi. Valitud lahustist/kandeainest põhjustatud kromosoomiaberratsioonide ja muu kahjuliku mõju puudumist kinnitavate varasemate laboriandmete või avaldatud kontrollandmete puudumisel tuleks igal proovivõtukorral kasutada kontrollina ka loomi, kellele ei ole midagi manustatud, et tõendada kandeainega töödeldud kontrollrühma andmete vastuvõetavust.

KATSE KÄIK

Loomade arv

19.

Uuringu alguses tuleks kindlaks määrata selline rühmade suurus, et igas rühmas oleks vähemalt viis isaslooma. Sellist loomade arvu peetakse piisavaks, et tagada küllaldane statistiline võimsus (st üldjuhul võimekus tuvastada miinimumeesmärgina kromosoomiaberratsioonide esinemissageduse kahekordistumine 80-protsendilise tõenäosusega olulisusnivool 0,05, kui negatiivse kontrolli puhul täheldatav esinemissagedus on 1 % või suurem) (3, 11). Tüüpilisel juhul on suurim vajalik loomade arv katses, kus on kaks proovivõtuaega ning kolm eri annustele vastavat katserühma, paralleelse negatiivse kontrolli rühm ja positiivse kontrolli rühm (igas rühmas viis looma), 45 isendit.

Manustamiskava

20.

Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt üks kord (st ühekordse annusena); kui see on teaduslikult põhjendatud, võib kasutada ka mõnda muud annustamisrežiimi.

21.

Rühmas, kus kemikaali kasutatakse suurimas annuses, võetakse manustamise järel proove kahel korral. Kuna uuritava(te) kemikaali(de) omastamiseks ja metaboliseerimiseks ning rakutsükli kineetikale mõju avaldumiseks vajalik aeg võib mõjutada kromosoomiaberratsioonide tuvastamise optimaalset aega, võetakse varasemad proovid umbes 24 tundi ja hilisemad proovid umbes 48 tundi pärast kemikaaliga töötlemist. Suurimast annusest erinevate annuste puhul tuleks proovid võtta varasemal proovivõtuajal ehk 24 tundi pärast töötlemist (see ajavahemik on lühem või sama pikk kui B-tüüpi spermatogoonide rakutsükli kestus ning esimese töötlemisjärgse metafaasi hindamise tõenäosus on seega optimaalne), välja arvatud juhul, kui mõne muu proovivõtuaja kasutamine on teadaolevalt asjakohasem ja põhjendatud.

22.

Võib kasutada ka teistsuguseid proovivõtuaegu. Näiteks võib olla asjakohane kasutada S-faasist sõltumatu toimega kemikaalide puhul varasemat proovivõtuaega (st 24 tunnist lühemat ajavahemikku).

23.

Võib kasutada ka korduvannustamisel põhinevat režiimi, näiteks juhul, kui katse viiakse läbi koos katsega, milles hinnatakse mõnda muud lõppnäitajat ja kus kasutatakse 28 päeva pikkust manustamisperioodi (nt vastavalt katsemeetodile B.58); sel juhul on siiski vaja kasutada erinevate proovivõtuaegade puhul täiendavaid loomade rühmi. Sellest lähtuvalt tuleb sellise manustamiskava asjakohasust igal eraldi juhul teaduslikult põhjendada.

24.

Enne humaanset surmamist süstitakse loomadele intraperitoneaalselt sobivas annuses kemikaali, mis peatab rakkude jagunemise metafaasis (nt Colcemid® või kolhitsiin). Seejärel võetakse loomadelt sobiva intervalliga proove. Hiirte ja rottide puhul on see intervall umbes 3–5 tundi.

Annused

25.

Kui annuste valimist hõlbustavate sobivate andmete puudumise tõttu tehakse annusevahemiku kindlakstegemiseks eeluuring, tuleks see vastavalt annusevahemiku kindlakstegemise uuringu tegemist käsitlevatele soovitustele viia läbi samas laboris, samast liigist ja liinist loomadega ning sama manustamisrežiimi alusel kui põhiuuring (12). Eeluuringu eesmärk peaks olema teha kindlaks suurim talutav annus, mis on määratletud kui annus, mille puhul täheldatakse uuringuperioodi jooksul vähest mürgist mõju (näiteks ebatavalised reaktsioonid või käitumine, väike kehamassi vähenemine või tsütotoksilisus vereloomesüsteemi suhtes), kuid mis ei põhjusta surma ega selliseid kannatusi, valu või stressi, mis nõuaksid loomade humaanset surmamist (13).

26.

Suurima annusena võib käsitada ka annust, mille puhul täheldatakse teatavaid mürgisuse ilminguid spermatogoonides (nt mitootiliste spermatogoonide ning meioosi esimeses või teises metafaasis olevate rakkude suhtarvu vähenemine). Kõnealune vähenemine ei tohiks olla suurem kui 50 %.

27.

28.

Annusest sõltuvuse kohta teabe saamiseks tehtav täielik uuring peaks hõlmama negatiivse kontrolli rühma (punkt 18) ja vähemalt kolme eri annust, mis erinevad üksteisest üldjuhul kaks korda, ent kõige rohkem neli korda. Kui uuritav kemikaal ei ole annusevahemiku kindlakstegemise uuringus või olemasolevate andmete põhjal mürgine, peaks suurim korraga manustatav annus olema 2 000 mg kehamassi kilogrammi kohta. Kui aga uuritav kemikaal põhjustab mürgisusnähte, tuleks suurima manustatava annusena kasutada suurimat talutavat annust ning kasutatav annusevahemik peaks soovitatavalt ulatuma suurimast annusest kuni annuseni, mille puhul täheldatav mürgisus on vähene või puudub. Kui mürgisust sihtkoe (st munandite) suhtes täheldatakse kõigi katses kasutatud annuste puhul, on soovitatav teha lisakatse, milles kasutatakse mittemürgiseid annuseid. Uuringutes, milles soovitakse kvantitatiivset annusest sõltuvust lähemalt iseloomustada, võib olla vaja kasutada täiendavaid annuserühmi. Teatavat liiki uuritavate kemikaalide (näiteks inimravimite) puhul, mille suhtes kohaldatakse erinõudeid, võivad asjaomased piirmäärad olla teistsugused. Kui uuritav kemikaal ei ole mürgine, tuleks kasutada piirannust ja kahte väiksemat annust (nagu on kirjeldatud eespool). Piirannus on 14 päeva pikkuse või pikema manustamisperioodi puhul 1 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas ning 14 päevast lühema manustamisperioodi puhul 2 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas.

Annuste manustamine

29.

Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese puhul eeldatavat kokkupuuteviisi. Seepärast võib vastavast põhjendusest lähtuvalt kasutada selliseid manustamisviise nagu manustamine söödaga, joogiveega, paikselt, naha alla, veenisiseselt, suu kaudu (toitmissondiga), sissehingamise teel või implantaadiga. Igal juhul tuleks manustamisviis valida nii, et oleks tagatud sihtkoe piisav kokkupuude uuritava kemikaaliga. Intraperitoneaalne süstimine ei ole tavaliselt soovitatav, kui see ei ole teaduslikult põhjendatud, kuna üldjuhul ei ole tegemist inimese puhul füsioloogiliselt asjakohase kokkupuuteviisiga. Kui uuritav kemikaal segatakse sööda või joogiveega, tuleks eriti üheainsa annuse manustamisel jälgida, et sööda ja vee tarbimise ning proovivõtmise vaheline ajavahemik oleks piisav, et võimaldada kemikaali mõju tuvastamist (vt punkt 33). Toitmissondi kaudu või süstimise teel korraga manustatav suurim vedelikukogus sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt ei tohiks see kogus olla suurem kui 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, mida võib kasutada koguses 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema koguse kasutamist (kui see on loomade heaolu käsitlevate õigusaktide kohaselt lubatud) tuleks põhjendada. Katses kasutatava ruumala varieeruvuse minimeerimiseks tuleks muuta kemikaali kontsentratsiooni, et tagada kehamassi suhtes püsiva ruumala kasutamine kogu annusevahemiku lõikes.

Vaatlused

30.

Katseloomadel tuleks teha kliinilisi vaatlusi ja registreerida kliinilised sümptomid vähemalt üks kord päevas, igal päeval soovitatavalt samal ajal, ning võtta seejuures arvesse manustamisjärgse eeldatava mõju maksimaalse avaldumise ajavahemikku. Kõiki loomi tuleks haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks kontrollida vähemalt kaks korda päevas. Kõikide loomade kaal tuleks määrata uuringu alguses, korduvannustamise uuringu kestel vähemalt kord nädalas ning humaanse surmamise hetkel. Kui uuring kestab vähemalt ühe nädala, tuleks vähemalt kord nädalas mõõta sööda tarbimist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist mõõta iga veevahetuse ajal ja vähemalt kord nädalas. Loomad, kellel täheldatakse liigse mittesurmava mürgisuse nähte, tuleks enne katse lõppu humaanselt surmata (13).

Kromosoomipreparaatide valmistamine

31.

Kohe pärast humaanset surmamist võetakse ühest või kummastki munandist idurakususpensioon, mis viiakse hüpotoonilisse lahusesse ja fikseeritakse väljatöötatud meetodite kohaselt (nt allikad 2, 14, 15). Seejärel kantakse rakud objektiklaasile ja värvitakse (16, 17). Kõik mikroskoobipreparaadid tuleks kodeerida, et nende identiteet ei oleks hindajale teada.

Analüüs

32.

Iga looma puhul tuleks hinnata vähemalt 200 hästi väljendunud metafaasis rakku (3, 11). Kui laboris negatiivse kontrolli puhul varem täheldatud sagedus on < 1 %, tuleks statistilise võimsuse suurendamiseks hinnata üle 200 raku looma kohta (3). Tuleks kasutada tsentromeeri tuvastamist võimaldavaid värvimismeetodeid.

33.

Kromosoomi- ja kromatiidiaberratsioonid tuleks registreerida eraldi ja liigitada need alatüübi alusel (katked, vahetused). Tuleks registreerida ka lüngad, kuid jätta need selle kindlakstegemisel, kas kemikaal põhjustab kromosoomiaberratsioonidega rakkude esinemissageduse olulist suurenemist, arvesse võtmata. Labori eeskirjadega tuleks tagada, et kromosoomiaberratsioone analüüsivad väljaõppinud hindajad. Lähtuvalt asjaolust, et mikroskoobipreparaadi valmistamise käigus puruneb sageli osa metafaasis olevatest rakkudest ning sellega kaasneb kromosoomide kadu, peaks tsentromeeride arv hinnatavates rakkudes olema vähemalt 2n ± 2, kus n on liigiomane haploidne kromosoomiarv.

34.

Ehkki katse eesmärk on tuvastada struktuurseid kromosoomiaberratsioone, on oluline registreerida polüploidsete rakkude ja endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude täheldamisel ka nende esinemissagedus (vt punkt 44).

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmete töötlemine

35.

Andmed iga looma kohta tuleks esitada tabelina. Iga looma puhul tuleks hinnata struktuurse(te) kromosoomiaberratsiooni(de)ga rakkude arvu ja kromosoomiaberratsioonide arvu raku kohta. Alatüüpidesse liigitatud kromatiidi- ja kromosoomiaberratsioonid (katked, vahetused) tuleks loetleda eraldi ning esitada nende arv ja esinemissagedus katse- ja kontrollrühmades. Lüngad registreeritakse eraldi. Lünkade esinemissagedus küll esitatakse, kuid üldjuhul ei võeta seda struktuursete kromosoomiaberratsioonide üldsageduse analüüsimisel arvesse. Polüploidsete rakkude või endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude esinemisel esitatakse ka nende protsentuaalne osakaal.

36.

Tuleks esitada andmed mürgisuse ja kliiniliste sümptomite kohta (vt punkt 30).

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

37.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid on järgmised:

—

paralleelse negatiivse kontrolliga saadud tulemused on kooskõlas varasemaid negatiivse kontrolli andmeid käsitlevate avaldatud normidega, mille kohaselt on kromosoomiaberratsioonidega rakkude osakaal eeldatavalt > 0 % ja ≤ 1,5 %, ning samuti laboris kontrollidega varem saadud tulemustega, kui need on olemas (vt punktid 10 ja 18);

—

—	analüüsitud rakkude ja eri annuste arv on piisav (vt punktid 28 ja 32);

—	suurima annuse valimise kriteeriumid on kooskõlas punktides 25 ja 26 kirjeldatud kriteeriumidega.

38.

Kui vaadeldakse nii meioosi kui ka mitoosi, tuleks tsütotoksilisuse hindamiseks teha iga töödeldud looma ja negatiivse kontrolli looma puhul kindlaks mitootiliste spermatogoonide ja meioosi esimeses või teises metafaasis olevate rakkude suhtarv proovis, kus on kokku 100 jagunevat rakku. Kui vaadeldakse üksnes mitoosi, tuleks iga looma puhul teha vähemalt 1 000 raku põhjal kindlaks mitoosiindeks.

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

39.

Annusest sõltuvuse analüüsimiseks piisavate andmete saamiseks on vaja uurida vähemalt kolme rühma, kus on töötlemiseks kasutatud eri annuseid.

40.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt positiivseks, kui:

—	vähemalt ühe katses kasutatud annuse puhul täheldatakse saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes,

—	kõnealune suurenemine on vähemalt ühe proovivõtuaja puhul annusest sõltuv ning

—	mis tahes saadud tulemus jääb väljapoole vastuvõetavat negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste olemasolul selliste tulemuste jaotust (nt väljapoole Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimelisena põhjustama katseloomade spermatogoonides kromosoomiaberratsioone. Soovitused kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta on esitatud ka kirjanduses (11, 18). Kasutatavate statistiliste testide puhul tuleks katseüksusena käsitada üksikisendit.

41.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt negatiivseks, kui:

—	ühegi katses kasutatud annuse puhul ei täheldata saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes,

—	ühegi katsetingimuse puhul ei esine annusest sõltuvat väärtuse suurenemist ning

—	kõik saadud tulemused jäävad vastuvõetavasse negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste olemasolul selliste tulemuste jaotusvahemikku (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimetuna põhjustama katseloomade spermatogoonides kromosoomiaberratsioone. Soovitused kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta on esitatud ka kirjanduses (11, 18). Negatiivse tulemuse korral ei ole välistatud võimalus, et kemikaal põhjustab kromosoomiaberratsioone mõnes uuringuga hõlmamata hilisemas arenguetapis või kutsub esile geenimutatsioone.

42.

Selgelt positiivset või negatiivset tulemust ei ole vaja üle kontrollida.

43.

44.

Harvadel juhtudel ei võimalda andmed isegi pärast täiendavat analüüsi teha järeldust selle kohta, kas tulemus on positiivne või negatiivne; sel juhul loetakse tulemus ebaselgeks.

45.

Polüploidsete rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav kemikaal on võimeline pärssima mitoosiprotsesse ja põhjustama kromosoomiarvu muutusi (20). Endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav kemikaal on võimeline pärssima rakutsükli edenemist (21, 22) – see kromosoomiarvu muutusi põhjustav mehhanism erineb mitoosiprotsesside pärssimise mehhanismist (vt punkt 2). Seepärast tuleks polüploidsete rakkude ja endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude esinemissagedus registreerida eraldi.

Katseprotokoll

46.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Kokkuvõte

Uuritav kemikaal:

—	allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

—	uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui see on teada;

—	vastavalt vajadusele mõõtmistulemused söötme pH ja osmolaalsuse ning sademe tekke kohta pärast uuritava kemikaali lisamist;

ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

Uuritava kemikaali ettevalmistamine:

—	kandeaine valimise põhjendus;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines;

—	sööda või joogiveega või sissehingamise teel manustamiseks sobiva valmistise valmistamine;

—	valmistise analüüsi tulemused (nt püsivus, homogeensus, nominaalne kontsentratsioon), kui need on olemas.

Katseloomad:

—	kasutatud liik/liin ja selle kasutamise põhjendus;

—	loomade arv ja vanus;

—	päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne;

—	loomade ühese identimise meetod;

—	lühiajaliste uuringute puhul: iga looma kehamass katse alguses ja lõpus; ühest nädalast pikemate uuringute puhul: iga looma kehamass uuringu vältel ja sööda tarbimise andmed. Iga rühma kohta tuleks esitada kehamasside vahemik, keskväärtus ja standardhälve.

Katsetingimused:

—	positiivse ja negatiivse (kandeainega/lahustiga) kontrolli andmed;

—	annusevahemiku kindlakstegemise uuringu andmed, kui need on olemas;

—	annuste valimise põhjendus;

—	manustamisviisi valimise põhjendus;

—	uuritava kemikaali ettevalmistamise üksikasjad;

—	uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;

—	surmamisaja valimise põhjendus;

—	loomadel avalduva mürgisuse mõõtmise meetodid, sealhulgas andmed histopatoloogilise või hematoloogilise analüüsi kohta, kui seda on tehtud, samuti loomade vaatlemise ja kehamassi määramise sagedus;

—	negatiivsete tulemuste korral meetodid selle kontrollimiseks, et uuritav kemikaal on jõudnud sihtkoesse või üldvereringesse;

—	vajaduse korral tegelik annus (milligrammides kehamassi kilogrammi kohta päevas), mis arvutatakse lähtuvalt sööda/joogivee tarbimisest ja selles sisalduva uuritava kemikaali kontsentratsioonist (miljondikes);

—	sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;

—	manustamis- ja proovivõturežiimide üksikasjalik kirjeldus ja nende valimise põhjendus;

—	humaanse surmamise meetod;

—	valutustamismeetod (kui seda kasutati);

—	kudede eraldamise meetodid;

—	kemikaal, mida kasutati rakkude jagunemise peatamiseks metafaasis, selle kontsentratsioon ja manustamise kestus;

—	mikroskoobipreparaadi valmistamise meetodid;

—	aberratsioonide hindamise kriteeriumid;

—	analüüsitud rakkude arv looma kohta;

—	kriteeriumid uuringutulemuse liigitamiseks positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks.

Tulemused:

—	loomade seisund enne katset ja katseperioodi kestel, sealhulgas mürgisuse nähud;

—	kehamass ja organite kaal surmamishetkel (korduvmanustamise korral manustamisperioodi vältel mõõdetud kehamass);

—	mürgisusnähud;

—	mitoosiindeks;

—	mitootiliste spermatogoonide ja meioosi esimeses või teises metafaasis olevate rakkude suhtarv või mõni muu tõend, et sihtkude on kemikaaliga kokku puutunud;

—	aberratsioonitüübid ja aberratsioonide arv eraldi iga looma kohta;

—	aberratsioonide üldarv rühma kohta ning vastavad keskväärtused ja standardhälbed;

—	aberratsioonidega rakkude arv rühma kohta ning vastavad keskväärtused ja standardhälbed;

—	võimaluse korral andmed annusest sõltuvuse kohta;

—	teave statistilise analüüsi ja kasutatud meetodite kohta;

—	paralleelse negatiivse kontrolli andmed;

—	negatiivse kontrolliga varem saadud andmed, sealhulgas väärtusevahemikud, keskväärtused, standardhälbed ja usaldusvahemikud usaldusnivool 95 % (kui need on olemas), või varasemad avaldatud negatiivse kontrolli andmed, mida kasutati katsetulemuste vastuvõetavuse hindamiseks;

—	paralleelse positiivse kontrolli andmed;

—	täheldatud muutused ploidsuses, sealhulgas polüploidsete ja/või endoreduplikatsiooniga rakkude esinemissagedus.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 238. OECD, Pariis.

(2)	Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. Väljaandes: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Venitt, S., ja Parry, J. M. (toim.), IRL Press, Oxford, Washington, D. C. Lk 275–306.

(3)

(4)	Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutat. Res. 455: 167–189.

(5)	Hess, R. A., ja Renato de Franca, L. (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Väljaandes: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis. Cheng, C. Y. (toim.), Landes Bioscience ja Springer Science+Business Media. Lk 1–15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C. Mutat. Res. 23(3): 368–379. Adler, I.-D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. Väljaandes: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis. Ramel, C., Lambert, B., ja Magnusson, J. (toim.), Liss, New York. Lk. 477–484.

(7)	Cattanach, B. M., ja Pollard, C. E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse. Mutat. Res. 12: 472–474.

(8)	Cattanach, B. M., ja Williams, C. E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens. Mutat. Res. 13: 371–375.

(9)	Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia. Humangenetik 29: 135–140.

(10)	Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice. Mutat. Res. 57(3): 313–324.

(11)	Adler, I.-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I., ja Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis. Mutat. Res. 417: 19–30.

(12)

(13)	OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(14)	Yamamoto, K., ja Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutat. Res. 52: 207–209.

(15)	Hsu, T. C., Elder, F., ja Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen. 1: 291–294.

(16)	Evans, E. P., Breckon, G., ja Ford, C. E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenet. Cell Genet. 3: 289–294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G., ja Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays. Väljaandes: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Kirkland, D. J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney. Lk 115–141.

(18)

Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G., ja Savage, J. R. K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. Väljaandes: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part III. Kirkland, D. J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney. Lk 184–232.

(19)	Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J., ja Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutat. Res. 723: 87–90.

(20)	Warr, T. J., Parry, E. M., ja Parry, J. M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens. Mutat. Res. 287: 29–46.

(21)	Huang, Y., Change, C., ja Trosko, J. E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res. 43: 1362–1364.

(22)	Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutat. Res. 119: 403–413.

Liide

MÕISTED

Aneuploidsus– mis tahes kõrvalekalle normaalsest diploidsest (või haploidsest) kromosoomiarvust ühe või enama kromosoomi võrra, kuid mitte terve(te) kromosoomikomplekti(de) võrra (polüploidsus).

Genotoksilisus– üldmõiste, mis hõlmab DNA ja kromosoomide mis tahes liiki kahjustusi, sealhulgas katkeid, deletsioone, adukte, nukleotiidide modifikatsioone ja sidemete teket, ümberkorraldusi, mutatsioone, kromosoomiaberratsioone ja aneuploidsust. Genotoksiline mõju ei väljendu alati mutatsiooni või püsiva kromosoomikahjustusena.

Kemikaal– aine või segu.

Klastogeen– mis tahes kemikaal, mis põhjustab rakkude või organismide populatsioonis struktuurseid kromosoomiaberratsioone.

Kromatiidiaberratsioon– struktuurne kromosoomikahjustus, mis väljendub üksikkromatiidi katkemisena või kromatiidide katkemise ja omavahelise taasühinemisena.

Kromosoomiaberratsioon– struktuurne kromosoomikahjustus, mis väljendub mõlema kromatiidi katkemisena või katkemise ja taasühinemisena samas kohas.

Kromosoomiarvu kõrvalekalle– kasutatud loomadele omase tavapärase kromosoomiarvu muutus.

Kromosoomide varieeruvus– kromosoomide kuju ja suuruse varieeruvus (nt metatsentrilised, akrotsentrilised vm kromosoomid).

Lünk– akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi laius ja millega kaasneb kromatiidi struktuuri minimaalne muutus.

Mitoos– rakutuuma jagunemise protsess, mis tavaliselt jagatakse profaasiks, prometafaasiks, metafaasiks, anafaasiks ja telofaasiks.

Mitoosiindeks– suhtarv, mis saadakse metafaasis olevate rakkude arvu jagamisel vaatlusaluse rakupopulatsiooni rakkude üldarvuga; võimaldab hinnata paljunemismäära selles rakupopulatsioonis.

Mutageensus– omadus, mis põhjustab pärilikke muutusi geenide DNA aluspaaride järjestuses või kromosoomide struktuuris (kromosoomiaberratsioonid).

Polüploidsus– haploidse kromosoomiarvu (n) kordsus, v.a diploidsus (nt 3n, 4n jne).

Struktuurne aberratsioon– raku jagunemise metafaasietapis mikroskoobi abil tuvastatav kromosoomistruktuuri muutus, mis väljendub deletsioonis või fragmentide vahetuses.

Tsentromeer– kromosoomi piirkon(na)d, mille külge kinnituvad raku jagunemise ajal kääviniidid, mis võimaldavad tütarkromosoomidel liikuda korrapäraselt tütarrakkude poolustele.

Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB– tundmatu või muutuva koostisega kemikaal, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

“

B osas asendatakse peatükk B.40 järgmisega:

„B.40. IN VITRO NAHASÖÖVITUS: TRANSKUTAANSE ELEKTRITAKISTUSE (TET) MÕÕTMISEL PÕHINEV KATSEMEETOD

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 430 (2015). Nahasöövituse all mõistetakse läbi marrasknaha pärisnahani ulatuva nähtava nekroosina avalduva pöördumatu nahakahjustuse tekkimist pärast uuritava kemikaaliga töötlemist, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (1) ning Euroopa Liidu (EL) määruses nr 1272/2008, milles käsitletakse ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (edaspidi „CLP-määrus“) (1). Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi B.40 näol on tegemist in vitro meetodiga, mis võimaldab tuvastada mittesöövitavaid ja söövitavaid aineid ja segusid kooskõlas ÜRO GHSi (1) ja CLP-määrusega.

Nahasöövituse hindamisel on tavapäraselt kasutatud laboriloomi (katsemeetod B.4, mis on samaväärne algselt 1981. aastal vastu võetud ning aastatel 1992, 2002 ja 2015 muudetud OECD katsejuhendiga nr 404) (2). Peale käesoleva katsemeetodi B.40 on valideeritud ja vastu võetud muudki in vitro katsemeetodid kemikaalide võimaliku nahka söövitava toime tuvastamiseks – näiteks katsemeetodid B.40b (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 431) (3) ja B.65 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 435) (4), mis võimaldavad vajaduse korral teha kindlaks ka söövitava kemikaali alamkategooria. Samuti on katsemeetodi B.46 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 439) (5) raames vastu võetud mitu valideeritud in vitro katsemeetodit nahaärrituse hindamiseks. OECD juhenddokumendis nahasöövituse ja -ärrituse puhul kasutatava katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta kirjeldatakse mitut moodulit, milles eri teabeallikad ja analüüsivahendid on rühmitatud, ning i) antakse suuniseid, kuidas lõimida ja kasutada olemasolevaid katse- ja muid andmeid kemikaalide võimaliku nahka ärritava ja nahka söövitava toime hindamiseks ja ii) pakutakse välja lähenemisviis juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid (6).

Käesolevas katsemeetodis on käsitletud inimtervisega seotud lõppnäitajana nahasöövitust. Meetod põhineb roti naha transkutaanse elektritakistuse (TET) mõõtmisel ning selle puhul kasutatakse nahakettaid, mille abil tehakse kindlaks söövitavad ained selle järgi, kas need on võimelised kahjustama normaalse sarvkihi terviklikkust ja selle toimimist kaitsekihina. Vastav OECD katsejuhend võeti algselt vastu 2004. aastal ja seda ajakohastati 2015. aastal, et lisada viide eespool nimetatud juhenddokumendile katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta.

In vitro nahasöövituse tuvastamise metoodika hindamiseks regulatiivsel eesmärgil viidi läbi valideerimiseelsed uuringud (7) ja seejärel roti naha TET mõõtmisel põhineva, nahasöövituse hindamiseks kasutatava katsemeetodi ametlik valideerimisuuring (8, 9, 10, 11). Nende uuringute tulemusena esitati soovitus, et kõnealust TET mõõtmisel põhinevat katsemeetodit, mis on määratud valideeritud standardmeetodiks (VSM), võiks kasutada regulatiivsel eesmärgil in vivo nahasöövituse hindamiseks (12, 13, 14).

Enne kui regulatiivsel eesmärgil nahasöövituse hindamiseks saab VSMi kõrval kasutada mõnda muud TET mõõtmisel põhinevat soovitud sarnast või muudetud in vitro katsemeetodit, tuleks teha kindlaks sellise meetodi usaldusväärsus, asjakohasus (täpsus) ja piirangud kavandatava kasutusotstarbe puhul, et tagada selle sarnasus VSMiga kooskõlas tulemuslikkuse standardites sätestatud nõuetega (15). OECD otsuse kohane andmete vastastikune tunnustamine on tagatud üksnes pärast seda, kui tulemuslikkuse standarditele vastav mis tahes välja pakutud uus või ajakohastatud katsemeetod on läbi vaadatud ja asjaomasesse OECD katsejuhendisse lisatud.

MÕISTED

Kasutatud mõisted on määratletud liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

Valideerimisuuringu (10) ja muude avaldatud uuringute (16, 17) andmeil võimaldab roti naha TET mõõtmisel põhinev katsemeetod eristada 122 ainet sisaldavas andmebaasis esindatud teadaolevaid nahka söövitavaid aineid mittesöövitavatest ainetest üldise tundlikkusega 94 % (51/54) ja spetsiifilisusega 71 % (48/68).

Käesolevas katsemeetodis käsitletakse in vitro nahasöövitust. Meetod võimaldab teha kooskõlas ÜRO GHSi / CLP-määrusega kindlaks mittesöövitavad ja söövitavad uuritavad kemikaalid. Nagu nähtub valideerimisuuringutest (8, 9, 10, 11), piirab selle katsemeetodi kasutamist asjaolu, et see ei võimalda liigitada söövitavaid aineid ja segusid ÜRO GHSi / CLP-määruse kohastesse alamkategooriatesse. Käesoleva katsemeetodi kasutusviis määratakse kindlaks kohaldatava õigusraamistikuga. Ehkki käesolev katsemeetod ei võimalda saada piisavat teavet nahaärrituse kohta, tuleks tähele panna, et tervisemõjuna hinnatavat in vitro nahaärritust käsitletakse konkreetselt katsemeetodis B.46 (5). Ühekordse nahakaudse kokkupuute järel nahale avalduva lokaalse toime täielikku hindamist on kirjeldatud OECD juhenddokumendis katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (6).

Käesoleva katsemeetodi valideerimiseks uuriti paljusid eri kemikaale, peamiselt aineid; valideerimisuuringu empiirilises andmebaasis on 60 ainet paljudest eri kemikaaliklassidest (8, 9). Kokkuvõetuna nähtub olemasolevatest andmetest, et katsemeetod on kasutatav paljude eri kemikaaliklasside ja eri füüsikalises olekus ainete, sealhulgas vedelike, pooltahkete ja tahkete ainete ning vahade puhul. Tuleks märkida, et kuna teatud kindlate füüsikaliste olekute puhul ei ole sobivate võrdlusandmetega katseained hõlpsalt kättesaadavad, on valideerimise käigus hinnatud suhteliselt väikest arvu vahasid ja tahkeid söövitavaid aineid. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahustuvad või lahustumatud. Kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa teatud kindla kategooria ainete puhul kasutada, tuleks hoiduda selle kasutamisest sellise kategooria ainete puhul. Peale selle saab käesolevat katsemeetodit ainete kõrval eeldatavalt kasutada ka segude puhul. Ent kuna segud kuuluvad paljudesse eri kategooriatesse ja on eri koostisega ning nende kasutamise kohta katses on praegu piiratud hulgal teavet, tuleks juhul, kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa teatud kindla kategooria segude puhul kasutada (nt strateegia abil, mille on 2012. aastal välja pakkunud Eskes et al.) (18), hoiduda selle kasutamisest sellise kategooria segude puhul. Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud. Gaase ja aerosoole ei ole valideerimisuuringutes veel hinnatud (8, 9). Ehkki on võimalik, et neidki saab uurida TET mõõtmisel põhineva katsemeetodiga, ei võimalda praegune katsemeetod gaaside ega aerosoolide uurimist.

KATSE PÕHIMÕTE

10.

Uuritav aine kantakse kuni 24 tunniks nahaketaste marrasknahale kahekambrilises katsesüsteemis, milles nahakettad toimivad kambritevahelise eralduskihina. Nahakettad võetakse humaanselt surmatud 28–30 päeva vanustelt rottidelt. Söövitavad kemikaalid tehakse kindlaks nende võime järgi kahjustada normaalse sarvkihi terviklikkust ja selle toimimist kaitsekihina; see ilmneb mõõdetud TET vähenemisena allapoole läviväärtust (16) (vt punkt 32). Roti naha TET läviväärtuseks on valitud 5 kΩ; selle väärtuse valimisel on lähtutud suurest hulgast andmetest paljude eri ainete kohta, millest valdava enamiku puhul on TET väärtus nimetatud väärtusest selgelt suurem (sageli > 10 kΩ) või selgelt väiksem (sageli < 3 kΩ) (16). Üldjuhul ei põhjusta uuritavad kemikaalid, mis on loomadele mittesöövitavad ning kas ärritavad või mitteärritavad, TET vähenemist kõnealusest läviväärtusest allapoole. Muude nahapreparaatide või seadmete kasutamine võib aga tingida selle läviväärtuse muutmise ning sel juhul on vajalik täiendav valideerimine.

11.

Käesolev katsemeetod hõlmab värvaine sidumise etappi, et võimaldada katseliselt kinnitada TET mõõtmisel saadud positiivseid tulemusi, sealhulgas juhul, kui saadud väärtus jääb 5 kΩ lähedusse. Värvaine sidumise etapis tehakse kindlaks, kas ioonilise läbitavuse suurenemine on tingitud sarvkihi füüsilisest hävimisest. On tõendatud, et roti naha TET mõõtmisel põhineva meetodiga saab prognoosida katsemeetodi B.4 abil hinnatavat in vivo söövitavat toimet küülikul (2).

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

12.

Enne käesolevale katsemeetodile vastava, roti naha TET mõõtmisel põhineva katsemeetodi regulaarset kasutamist tuleks labori tehnilise pädevuse tõendamiseks õigesti liigitada kaksteist tabelis 1 loetletud soovitatavat pädevusainet. Kui mõni loetletud ainetest ei ole kättesaadav või kui see on põhjendatav, võib kasutada mõnda muud ainet, mille kohta on olemas piisavad in vivo ja in vitro võrdlusandmed (nt võrdluskemikaalide loetelust (16) valitud ainet), ent üksnes juhul, kui kohaldatakse samu valikukriteeriume, nagu on kirjeldatud tabelis 1.

Tabel 1

Pädevusainete loetelu (2)

Aine	CASi nr	Kemikaaliklass (3)	ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane in vivo tulemustel põhinev kategooria (4)	VSMga saadud in vitro tulemustel põhinev kategooria	Füüsikaline olek	pH (5)
In vivo söövitavad ained
N,N’-dimetüüldipropüleentriamiin	10563-29-8	Orgaaniline alus	1A	6 × S	V	8,3
1,2-diaminopropaan	78-90-0	Orgaaniline alus	1A	6 × S	V	8,3
Väävelhape (10 %)	7664-93-9	Anorgaaniline hape	(1A/)1B/1C	5 × S 1 × MS	V	1,2
Kaaliumhüdroksiid (10 % vesilahus)	1310-58-3	Anorgaaniline alus	(1A/)1B/1C	6 × S	V	13,2
Oktaanhape (kaprüülhape)	124-07-2	Orgaaniline hape	1B/1C	4 × S 2 × MS	V	3,6
2-tert-butüülfenool	88-18-6	Fenool	1B/1C	4 × S 2 × MS	V	3,9
In vivo mittesöövitavad ained
Isostearhape	2724-58-5	Orgaaniline hape	MS	6 × MS	V	3,6
4-amino-1,2,4-triasool	584-13-4	Orgaaniline alus	MS	6 × MS	T	5,5
Fenetüülbromiid	103-63-9	Elektrofiil	MS	6 × MS	V	3,6
4-(metüültio)bensaldehüüd	3446-89-7	Elektrofiil	MS	6 × MS	V	6,8
1,9-dekadieen	1647-16-1	Neutraalne orgaaniline aine	MS	6 × MS	V	3,9
Tetrakloroetüleen	127-18-4	Neutraalne orgaaniline aine	MS	6 × MS	V	4,5
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i registrinumber; MS – mittesöövitav; S – söövitav; T – tahkis; V – vedelik; VSM – valideeritud standardmeetod.

KATSE KÄIK

13.

Standardne töökord roti naha TET-l põhineva, nahasöövituse hindamist võimaldava katsemeetodi rakendamiseks on leitav kirjandusest (19). Käesoleva katsemeetodi kohases roti naha TET mõõtmise katses peaksid olema täidetud järgmised tingimused.

Loomad

14.

Tuleks kasutada rotte, sest nende naha tundlikkus ainetele käesoleva katsemeetodi kasutamisel on juba tõendatud (12) ning tegemist on ainsa nahaallikaga, mis on ametlikult valideeritud (8, 9). Väga oluline on roti vanus (naha võtmise hetkel) ja päritoluliin, kuna tuleks tagada, et karvanääpsud on uinuvas olekus ja täiskasvanud looma karvakasv ei ole veel alanud.

15.

Noorte, umbes 22 päeva vanuste (Wistari või sellega võrreldavast liinist pärit) emas- või isasrottide selja- ja küljekarv eemaldatakse hoolikalt väikeste kääridega. Seejärel pestakse loomi hoolikalt pühkimise teel ning pügatud piirkond kastetakse üleni antibiootikumilahusesse (mis sisaldab näiteks streptomütsiini, penitsilliini, klooramfenikooli ja amfoteritsiini kontsentratsioonis, mille juures bakterite kasv on pärsitud). Loomi pestakse antibiootikumidega uuesti kolmandal või neljandal päeval pärast esimest pesu ning kasutatakse kolme päeva jooksul pärast teist pesu, kui sarvkiht on karvade eemaldamisest taastunud.

Nahaketaste ettevalmistamine

16.

Loomad surmatakse humaanselt 28–30 päeva vanuses; see vanus on väga oluline. Seejärel eemaldatakse iga looma selja- ja küljenahk ning tõmmatakse sellelt ettevaatlikult maha liigne nahaalune rasvakiht. Lõigatakse välja nahakettad läbimõõduga umbes 20 mm. Nahka võib enne ketaste kasutamist säilitada, kui on tõendatud, et sellise naha puhul positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud tulemused on samaväärsed värske naha kasutamisel saadud tulemustega.

17.

Iga nahaketas asetatakse polütetrafluoroetüleentoru (PTFE-toru) ühele otsale nii, et marrasknaha pind on toruga kontaktis. Toru otsa surutakse naha paigal hoidmiseks kummist rõngastihend ja liigne kude lõigatakse ära. Seejärel tihendatakse kummist rõngastihendi ja PTFE-toru ühenduskoht hoolikalt vaseliiniga. Toru asetatakse vastuvõtunõusse, mis sisaldab MgSO4 lahust (154 mM), ja kinnitatakse vedruklambriga (joonis 1). Nahaketas peaks jääma üleni MgSO4 lahusesse. Ühe roti nahast võib saada 10–15 nahaketast. Toru ja rõngastihendi mõõtmed on esitatud joonisel 2.

18.

Enne katse algust mõõdetakse iga looma naha kvaliteedi kontrollimiseks kahe nahaketta transkutaanne elektritakistus. Kummagi ketta elektritakistus peaks olema suurem kui 10 kΩ, et ülejäänud kettaid oleks võimalik katses kasutada. Kui takistus on väiksem kui 10 kΩ, tuleks kõik ülejäänud sellest nahast saadud kettad ära visata.

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainetega töötlemine

19.

Katsemudeli piisava töökindluse tõendamiseks tuleks igas mõõtmistsüklis (katses) kasutada paralleelset positiivset ja negatiivset kontrolli. Igas eraldi mõõtmistsüklis (katses) tuleks kasutada ühelt ja samalt loomalt saadud nahakettaid. Soovitatavad positiivse ja negatiivse kontrolli ained on vastavalt 10 M soolhape ja destilleeritud vesi.

20.

Vedelad uuritavad kemikaalid (150 μl) kantakse ühtlaselt toru sees olevale marrasknahale. Tahke aine uurimisel kantakse see ühtlaselt nahakettale piisavas koguses, et kogu marrasknaha pind saaks kaetud. Tahkele ainele lisatakse deioniseeritud vett (150 μl) ja toru loksutatakse ettevaatlikult. Nahaga maksimaalse kontakti saavutamiseks võib olla vaja uuritavat tahket kemikaali sulatamiseks või pehmendamiseks kuni 30 °C-ni soojendada või seda teralise materjali või pulbri saamiseks peenestada.

21.

Iga uuritava kemikaali ja kontrollaine jaoks kasutatakse igas mõõtmistsüklis (katses) kolme nahaketast. Uuritavat kemikaali hoitakse temperatuuril 20–23 °C nahaga kontaktis 24 tundi. Seejärel pestakse nahka uuritava kemikaali eemaldamiseks toatemperatuuril oleva või jahedama kraanivee joaga, kuni materjali enam ei eraldu.

TET mõõtmine

22.

Naha impedantsi määramiseks mõõdetakse TETd madalpingel töötava Wheatstone’i vahelduvvoolusilla abil (18). Mõõtesilla üldised tehnilised näitajad on järgmised: tööpinge 1–3 V, siinus- või ristkülikvahelduvvool sagedusega 50–1 000 Hz ja mõõtepiirkond vähemalt 0,1–30 kΩ. Valideerimisuuringus kasutatud mõõtesillaga mõõdeti sagedusel 100 Hz või 1 kHz induktiivsust, mahtuvust ja takistust väärtuseni vastavalt 2 000 H, 2 000 μF või 2 MΩ; seejuures kasutati jada- või rööpühenduse puhul saadud näitusid. TET-põhises söövitavuskatses mõõdetakse takistust sagedusel 100 Hz ning kasutatakse jadaühenduse puhul saadud näitusid. Enne elektritakistuse mõõtmist lisatakse naha pindpinevuse vähendamiseks 70-protsendilist etanooli koguses, millest piisab marrasknaha katmiseks. Mõne sekundi pärast eemaldatakse etanool torust ja koe niisutamiseks lisatakse 3 ml MgSO4 lahust (154 mM). Nahakettast kummalegi poole paigutatakse mõõtesilla elektroodid, et mõõta nahaketta takistust kilo-oomides (joonis 1). Elektroodide mõõtmed ja hammasklambrist allapoole ulatuva elektroodiosa pikkus on esitatud joonisel 2. Sisemisele elektroodile kinnitatav klamber toetatakse takistuse mõõtmise ajaks PTFE-toru otsale, et elektrood ulatuks alati samas pikkuses MgSO4 lahusesse. Välimine elektrood paigutatakse vastuvõtunõusse nii, et see toetub nõu põhjale. Vedruklambri ja PTFE-toru põhja vahelist kaugust hoitakse konstantsena (joonis 2), sest see kaugus mõjutab saadavat takistuse väärtust. Seega peaks vahemaa sisemise elektroodi ja nahaketta vahel olema konstantne ja minimaalne (1–2 mm).

23.

Kui mõõdetud takistuse väärtus on üle 20 kΩ, võib see olla tingitud uuritava kemikaali jääkidest nahaketta marrasknaha pinnal. Võib proovida neid jääke veel kord eemaldada, näiteks sulgeda PTFE-toru kinnastatud pöidlaga ja loksutada seda umbes kümme sekundit; MgSO4 lahus valatakse ära ja takistuse mõõtmist korratakse värske MgSO4 lahusega.

24.

Katseseadme omadused ja mõõtmed ning katse läbiviimise kord võivad mõjutada saadavaid TET väärtusi. Söövitavuse läviväärtus 5 kΩ on kehtestatud käesolevas katsemeetodis kirjeldatud konkreetse seadme ja mõõtmismeetodiga saadud andmete põhjal. Katsetingimuste muutmisel või teistsuguse seadme kasutamisel võivad lävi- ja kontrollväärtused olla teised. Seepärast on vaja selle meetodi ja takistuse läviväärtuste kaliibrimiseks teha mõõtmisi pädevusainetega, mis on valitud valideerimisuuringus kasutatud ainete hulgast (8, 9) või kemikaaliklassidest, mis on sarnased uuritavate ainete klassidega. Sobivate pädevusainete loetelu on esitatud tabelis 1.

Värvaine sidumisel põhinevad meetodid

25.

Teatavate mittesöövitavate ainetega kokkupuutumise tulemusena võib takistus muutuda läviväärtusest 5 kΩ väiksemaks, kuna sellised ained võimaldavad ioonidel läbi sarvkihi liikuda ja vähendavad seeläbi elektritakistust (9). Näiteks võivad pindaktiivsed neutraalsed orgaanilised ained ja kemikaalid (sealhulgas detergendid, emulgaatorid ja muud pindaktiivsed ained) eemaldada nahast lipiidid ning muuta kaitsekihi ioonidele paremini läbitavaks. Seepärast tuleks juhul, kui selliste kemikaalide puhul täheldatav TET väärtus on nahaketaste nähtavate kahjustuste puudumise korral umbes 5 kΩ või sellest väiksem, hinnata nii kontroll- kui ka katsekoe puhul värvaine imendumist, et teha kindlaks, kas saadud TET väärtus oli põhjustatud naha suurenenud läbilaskvusest või söövitusest (7, 9). Viimasel juhul tungib värvaine sulforodamiin B nahapinnale kantuna vigastatud sarvkihi kohalt kiiresti naha sisse ja põhjustab sarvkihialuste kudede värvumise. See konkreetne värvaine on püsiv paljude kemikaalide suhtes ning seda ei mõjuta allpool kirjeldatud ekstraheerimine.

Värvaine sulforodamiin B pealekandmine ja eemaldamine

26.

Pärast TET määramist valatakse magneesiumsulfaat torust välja ja nahka uuritakse hoolikalt silmanähtavate kahjustuste suhtes. Kui silmanähtavaid suuri kahjustusi (nt perforatsiooni) ei esine, kantakse iga nahaketta marrasknaha pinnale kaheks tunniks 150 μl värvaine sulforodamiin B (happeline punane 52; CI number: 45100; CASi number: 3520-42-1) 10-protsendilist (massiühikutes mahuühiku kohta) lahust destilleeritud vees. Seejärel pestakse nahakettaid toatemperatuuril oleva või jahedama kraaniveega umbes kümme sekundit liigse/seondumata värvaine eemaldamiseks. Iga nahaketas eemaldatakse ettevaatlikult PTFE-torult ja asetatakse viaali (nt 20-milliliitrisesse klaasist stsintillatsiooniviaali), mis sisaldab deioniseeritud vett (8 ml). Viaale loksutatakse ettevaatlikult viis minutit, et eemaldada kogu seondumata värvaine. Loputamist korratakse ning seejäreleemaldatakse nahakettad ja pannakse viaalidesse, mis sisaldavad 5 ml 30-protsendilist (massiühikutes mahuühiku kohta) naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) lahust destilleeritud vees, ning kettaid inkubeeritakse temperatuuril 60 °C hommikuni.

27.

Pärast inkubeerimist nahakettad eemaldatakse ja visatakse ära ning järelejäänud lahust tsentrifuugitakse kaheksa minutit temperatuuril 21 °C (suhtelise tsentrifugaaljõuga ~175 g). Seejärel lahjendatakse supernatandist võetud 1 ml suurust proovi mahuliselt viis korda (st 1 ml + 4 ml) 30-protsendilise (massiühikutes mahuühiku kohta) SDSi lahusega destilleeritud vees. Lahuse optilist tihedust mõõdetakse lainepikkusel 565 nm.

Värvaine sisalduse arvutamine

28.

Värvaine sulforodamiin B sisaldus ketta kohta arvutatakse optilise tiheduse väärtuste alusel (9) (sulforodamiin B molaarne ekstinktsioonikoefitsient lainepikkusel 565 nm on 8,7 × l04ja molekulmass 580). Sobiva kaliibrimiskõvera abil määratakse värvainesisaldus iga nahaketta puhul ning seejärel arvutatakse paralleelproovide keskmine värvainesisaldus.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

29.

Saadud TET keskväärtus on vastuvõetav, kui paralleelse positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud väärtused jäävad katset läbi viivas laboris käesoleva meetodi kasutamise puhul vastuvõetavasse väärtusevahemikku. Vastuvõetavad takistusevahemikud eespool kirjeldatud metoodika ja seadme puhul on esitatud järgmises tabelis.

Kontroll	Aine	Takistusevahemik (kΩ)
Positiivne	10 M soolhape	0,5–1,0
Negatiivne	Destilleeritud vesi	10–25

30.

Värvaine sidumist iseloomustavad keskväärtused on vastuvõetavad tingimusel, et paralleelsete kontrollidega saadud väärtused jäävad kõnealuse meetodi puhul vastuvõetavasse vahemikku. Kontrollainete jaoks soovitatavad vastuvõetavad värvainesisalduse vahemikud on eespool kirjeldatud metoodika ja seadme puhul järgmised.

Kontroll	Aine	Värvainesisalduse vahemik (μg ketta kohta)
Positiivne	10 M soolhape	40–100
Negatiivne	Destilleeritud vesi	15–35

Tulemuste tõlgendamine

31.

TET läviväärtus, mis võimaldab eristada söövitavaid uuritavaid kemikaale mittesöövitavatest, määrati kindlaks katsemeetodi optimeerimise käigus, seda kontrolliti valideerimiseelses etapis ning selle sobivus leidis kinnitust ametlikus valideerimisuuringus.

32.

Allpool on esitatud roti naha TET-l põhineva, nahasöövituse hindamist võimaldava katsemeetodi puhul kasutatav prognoosimudel (9, 19), mis on seotud ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase klassifitseerimissüsteemiga.

Uuritav kemikaal loetakse nahka mitte söövitavaks, kui:

i)	uuritava kemikaali puhul saadud TET keskväärtus on suurem kui (>) 5 kΩ või

ii)

uuritava kemikaali puhul saadud TET keskväärtus on sama suur või väiksem kui (≤) 5 kΩ ning

—	nahaketastel ei täheldata silmanähtavaid kahjustusi (nt perforatsiooni) ja

—	nahaketaste keskmine värvainesisaldus on väiksem kui (<) paralleelse positiivse kontrollina kasutatud 10 M HCl-ga töödeldud nahaketaste keskmine värvainesisaldus (positiivset kontrolli iseloomustavad väärtused on esitatud punktis 30).

Uuritav kemikaal loetakse nahka söövitavaks, kui:

i)	uuritava kemikaali puhul saadud TET keskväärtus on sama suur või väiksem kui (≤) 5 kΩ ning nahakettad on silmanähtavalt kahjustatud (nt perforeeritud) või

ii)

uuritava kemikaali puhul saadud TET keskväärtus on sama suur või väiksem kui (≤) 5 kΩ ning

—	nahaketastel ei täheldata silmanähtavaid kahjustusi (nt perforatsiooni), kuid

—	nahaketaste keskmine värvainesisaldus on sama suur või suurem kui (≥) paralleelse positiivse kontrollina kasutatud 10 M HCl-ga töödeldud nahaketaste keskmine värvainesisaldus (positiivset kontrolli iseloomustavad väärtused on esitatud punktis 30).

33.

Ühese klassifitseerimistulemuse puhul peaks piisama ühest mõõtmistsüklist (katsest), mille käigus analüüsitakse uuritava kemikaali toimet paralleelselt vähemalt kolmele nahakettale. Ebaselgete tulemuste puhul – näiteks kui paralleelproovidega saadud mõõtmisandmed lahknevad ja/või TET keskväärtus on 5 ± 0,5 kΩ – tuleks kaaluda vajadust viia läbi veel üks sõltumatu mõõtmistsükkel (katse) ning esimeses kahes mõõtmistsüklis (katses) saadud tulemuste lahknevuse korral veel kolmaski mõõtmistsükkel (katse).

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmed

34.

Uuritava kemikaali ning positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud takistuse väärtused (kΩ) ja vajaduse korral värvainesisalduse väärtused (μg ketta kohta) tuleks esitada tabelina, millesse kantakse igas mõõtmistsüklis (katses) iga üksiku paralleelproovina kasutatud kettaga saadud andmed ning samuti keskväärtused ± standardhälve. Esitatakse kõikide korduskatsete tulemused. Iga uuritava kemikaali puhul tuleks esitada teave nahaketastes täheldatud kahjustuste kohta.

Katseprotokoll

35.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal ja kontrollained:

—	ühest koostisosast koosnev aine: kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

—	mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu: võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	allikas ja partii number, kui see on olemas;

—	vajaduse korral teave uuritava kemikaali / kontrollaine töötlemise kohta enne katset (näiteks soojendamine, peenestamine);

—	uuritava kemikaali püsivus ja aegumiskuupäev või kordusanalüüsi tegemise tähtpäev, kui see on teada;

—	säilitustingimused.

Katseloomad:

—	kasutatud liin ja sugu;

—	loomade vanus doonorloomana kasutamise hetkel;

—	päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne;

—	naha ettevalmistamise üksikasjad.

Katsetingimused:

—	katseseadme kaliibrimiskõverad;

—	värvaine sidumise katset iseloomustavad kaliibrimiskõverad, optilise tiheduse mõõtmiseks kasutatud ribafiltri spektrivahemik ja vajaduse korral mõõteseadmega (nt spektrofotomeetriga) saavutatav optilise tiheduse väärtuste lineaarsusvahemik;

—	TET mõõtmise meetodi üksikasjad;

—	vajaduse korral üksikasjalik teave värvaine sidumise hindamiseks kasutatud meetodi kohta;

—	katses kasutatud annused, kokkupuuteperioodi(de) kestus ja kokkupuutetemperatuur(id);

—	kokkupuuteperioodi järgsete pesemistoimingute üksikasjad;

—	iga uuritava kemikaali ja kontrollide (positiivse ja negatiivse kontrolli) puhul paralleelproovidena kasutatud nahaketaste arv;

—	kõikide katsemeetodis tehtud muudatuste kirjeldus;

—

viide varasematele andmetele mudeli kohta. See hõlmab vähemalt järgmisi aspekte:

i)	positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud, kilo-oomides väljendatud TET väärtuste vastuvõetavus lähtuvalt positiivset ja negatiivset kontrolli iseloomustavatest takistusevahemikest;

ii)	positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud, nahaketta kohta mikrogrammides väljendatud värvainesisalduse väärtuste vastuvõetavus lähtuvalt positiivset ja negatiivset kontrolli iseloomustavatest värvainesisalduse vahemikest;

iii)	katsetulemuste vastuvõetavus lähtuvalt paralleelproovidena kasutatud nahaketastega saadud varasemate tulemuste varieeruvusest;

—	kasutatud otsustuskriteeriumide/prognoosimudeli kirjeldus.

Tulemused:

—

TET mõõtmise katsetes ja vajaduse korral värvaine sidumise katsetes iga uuritava kemikaali ja kontrolliga saadud, tabelina esitatavad andmed iga mõõtmistsükli (katse) ja iga paralleelproovina kasutatud nahaketta (iga üksiku looma ja nahaproovi) kohta, samuti vastavad keskväärtused, standardhälbed ja variatsioonikordajad;

—	mis tahes täheldatud toime kirjeldus;

—	klassifitseerimistulemused lähtuvalt kasutatud prognoosimudelist/otsustuskriteeriumidest.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Viies, täiendatud väljaanne. ÜRO, New York ja Genf. Kättesaadav aadressil [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)	Käesoleva lisa peatükk B.4 „Äge nahaärritus/-söövitus“.

(3)	Käesoleva lisa peatükk B.40b „In vitro nahasöövitus: inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinev katsemeetod“.

(4)	Käesoleva lisa peatükk B.65 „In vitro membraanibarjääri katsemeetod nahasöövituse uurimiseks“.

(5)	Käesoleva lisa peatükk B.46 „In vitro nahaärritus: inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinev katsemeetod“.

(6)	OECD (2014). Guidance Document on an Integrated Approach to Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 203. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(7)

Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., ja Balls, M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23: 219–255.

(8)	Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem J. H., Gerner I., Walker A. P., ja Worth, A. P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 12: 471–482.

(9)

Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhütter, H.-G., ja Liebsch, M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol. In Vitro 12: 483–524.

(10)

Balls, M., Blaauboer, B. J., Fentem, J. H., Bruner, L., Combes, R. D., Ekwall, B., Fielder, R. J., Guillouzo, A., Lewis, R. W., Lovell, D. P., Reinhardt, C. A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., ja Zucco, F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops. ATLA 23: 129–147.

(11)	Alternatiivsete meetodite valideerimise ametitevaheline koordineerimiskomitee (ICCVAM) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)	ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity). Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC10), 3. aprill 1998.

(13)	ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26: 275–280.

(14)

ICCVAM (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion Testing as described in TG 430. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 218. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(16)	Oliver, G. J. A., Pemberton, M. A., ja Rhodes, C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test – Modifications and Validation. Food Chem. Toxicol. 24: 507–512.

(17)	Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D. J., ja Gardner, J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6: 191–194.

(18)

Eskes, C., Detappe, V., Koëter, H., Kreysa, J., Liebsch, M., Zuang, V., Amcoff, P., Barroso, J., Cotovio, J., Guest, R., Hermann, M., Hoffmann, S., Masson, P., Alépée, N., Arce, L. A., Brüschweiler, B., Catone, T., Cihak, R., Clouzeau, J., D’Abrosca, F., Delveaux, C., Derouette, J. P., Engelking, O., Facchini, D., Fröhlicher, M., Hofmann, M., Hopf, N., Molinari, J., Oberli, A., Ott, M., Peter, R., Sá-Rocha, V. M., Schenk, D., Tomicic, C., Vanparys, P., Verdon, B., Wallenhorst, T., Winkler, G. C., ja Depallens, O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 62: 393–403.

(19)	TET mõõtmise standardne töökord (detsember 2008). Andmebaasi INVITTOX katse-eeskiri nr 115 „Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test“.

(20)	OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 34. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

Joonis 1

Roti Naha Tet Mõõtmiseks Kasutatav Seade

Joonis 2

Polütetrafluoroetüleentoru (Ptfe-Toru) Ja Vastuvõtunõu Ning Kasutatavate Elektroodide Mõõtmed

Olulised tegurid eespool kujutatud seadme puhul:

—	PTFE-toru siseläbimõõt;

—	elektroodide pikkus peaks PTFE-toru ja vastuvõtunõuga võrreldes olema selline, et nahaketas ei puutuks vastu elektroode ja elektroodid oleks teatavas standardpikkuses MgSO4 lahusega kokkupuutes;

—	MgSO4 lahuse hulk vastuvõtunõus peaks olema selline, et vedeliku sügavus võrreldes PTFE-torus oleva vedeliku tasemega vastaks joonisel 1 näidatule;

—	nahaketas peaks olema kinnitatud PTFE-toru külge piisavalt hästi, et elektritakistus iseloomustaks tõeselt naha omadusi.

Liide

MÕISTED

Aine – looduslik või mis tahes tootmisprotsessi tulemusena saadud keemiline element või selle ühend koos püsivuse tagamiseks vajalike lisaainete ja tootmisprotsessi käigus tekkinud lisanditega, mis ei hõlma siiski lahusteid, mida on võimalik aine püsivust mõjutamata või selle koostist muutmata ainest eraldada.

Asjakohasus – näitaja, mille abil kirjeldatakse, kuivõrd katsemeetod võimaldab uurida huvipakkuvat toimet, kas selle kasutamine on mõttekas ja kas see on konkreetse eesmärgi jaoks sobiv. Asjakohasusest nähtub, mil määral saab katsemeetodiga õigesti mõõta või ennustada huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasuse puhul võetakse arvesse ka katsemeetodiga saavutatavat täpsust (vastavust) (20).

GHS (ÜRO ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem) – süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ainete ja segude) klassifitseerimine vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud liigile ja tasemele ning mis hõlmab selliseid asjaomaseid teavituselemente nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ning keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku toime kohta (1).

In vivo nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse tekkimine, st läbi marrasknaha pärisnahani ulatuva nähtava nekroosi tekkimine pärast uuritava kemikaali pealekandmist kuni neljaks tunniks. Tüüpilised söövitusnähud on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14-päevase vaatlusperioodi lõpuks ilmnev värvimuutus naha valastumise tõttu, täielik alopeetsia ja armistumine. Ebaselgete kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilise analüüsi tegemist.

Kemikaal – aine või segu.

Mitmest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja milles enam kui ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 10, kuid väiksem kui 80 massiprotsenti. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse tootmisprotsessi tulemusena. Erinevus segu ja mitmest koostisosast koosneva aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokkusegamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.

MS – mittesöövitav.

(Mõõtmis)tsükkel – ühe uuritava kemikaali analüüsimine üheaegselt vähemalt kolmel paralleelproovina kasutataval nahakettal.

Positiivne kontroll – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida on töödeldud ainega, millega teadaolevalt saadakse positiivne tulemus. Positiivse tulemuse väärtus ei tohiks olla liiga suur, et võimaldada hinnata positiivse kontrolliga saadud tulemuste varieeruvust ajas.

S – söövitav.

Segu – kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

Spetsiifilisus – katsemeetodiga õigesti negatiivseks/reaktsioonivõimetuks liigitatud kemikaalide osakaal kõikide negatiivsete kemikaalide hulgas. Spetsiifilisus kajastab sellise katsemeetodi täpsust, millega saadakse kategoriseeritav tulemus, ning see on oluline näitaja katsemeetodi asjakohasuse hindamiseks (20).

Transkutaanne elektritakistus (TET) – naha elektrilise impedantsi näitaja, mida väljendatakse takistusena kilo-oomides. Lihtne ja töökindel meetod kaitsekihina toimimise hindamiseks Wheatstone’i sillana töötava seadme abil, millega registreeritakse nahka läbiv ioonivoog.

Tulemuslikkuse standardid – valideeritud katsemeetodil põhinevad standardid, mille alusel hinnatakse mehhanismilt ja tööpõhimõttelt sarnase kavandatud katsemeetodi võrreldavust. Need hõlmavad: i) katsemeetodi olulisi elemente, ii) valideeritud katsemeetodi vastuvõetava tulemuslikkuse tõendamiseks kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdluskemikaalide miinimumloetelu ja iii) võrreldavat usaldusväärsuse ja täpsuse taset, mille puhul on lähtutud valideeritud katsemeetodiga saadud tulemustest ja mis tuleks saavutada kavandatud katsemeetodi hindamisel võrdluskemikaalide miinimumloetelu kasutamise teel.

Tundlikkus – katsemeetodiga õigesti positiivseks/reaktsioonivõimeliseks liigitatud kemikaalide osakaal kõikide positiivsete kemikaalide hulgas. Tundlikkus kajastab sellise katsemeetodi täpsust, millega saadakse kategoriseeritav tulemus, ning see on oluline näitaja katsemeetodi asjakohasuse hindamiseks (20).

Täpsus – katsemeetodiga saadud tulemuste ja vastuvõetavate võrdlusväärtuste kooskõla määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda mõistet kasutatakse sageli vastavuse tähenduses, et väljendada katsemeetodiga saadud õigete tulemuste osakaalu (20).

Usaldusväärsus – näitaja, mis iseloomustab katsemeetodiga saadud tulemuste reprodutseeritavust pikema aja jooksul samas laboris ja eri laborites, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus (20).

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Vastavus – katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja katsemeetodite puhul, millega saadakse kategoriseeritav tulemus; üks asjakohastest aspektidest. Seda mõistet kasutatakse mõnikord täpsuse tähenduses ja see on määratletud kui õigesti positiivseks või negatiivseks liigitatud kemikaalide osakaal kõikide uuritud kemikaalide seas. Vastavus sõltub väga suurel määral positiivsete tulemuste osakaalust uuritavale kemikaalile vastavat liiki kemikaalide hulgas (20).

Ühest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja mille ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

“

B osas asendatakse peatükk B.40b järgmisega:

„B.40b. IN VITRO NAHASÖÖVITUS: INIMESE REKONSTRUEERITUD MARRASKNAHAL PÕHINEV KATSEMEETOD

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 431 (2016). Nahasöövituse all mõistetakse läbi marrasknaha pärisnahani ulatuva nähtava nekroosina avalduva pöördumatu nahakahjustuse tekkimist pärast uuritava kemikaaliga töötlemist, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (1) ning Euroopa Liidu (EL) määruses nr 1272/2008, milles käsitletakse ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (edaspidi „CLP-määrus“) (6). Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi B.40b näol on tegemist in vitro meetodiga, mis võimaldab tuvastada mittesöövitavaid ja söövitavaid aineid ja segusid kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega. Meetodiga on osaliselt võimalik liigitada söövitavaid kemikaale alamkategooriatesse.

Kemikaalide võimaliku nahka söövitava toime hindamisel on tavapäraselt kasutatud laboriloomi (katsemeetod B.4, mis on samaväärne algselt 1981. aastal vastu võetud ning aastatel 1992, 2002 ja 2015 muudetud OECD katsejuhendiga nr 404) (2). Peale käesoleva katsemeetodi B.40b on valideeritud ja vastu võetud veel kaks in vitro katsemeetodit kemikaalide võimaliku nahka söövitava toime tuvastamiseks: katsemeetodid B.40 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 430) (3) ja B.65 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 435) (4). Peale selle on vastu võetud in vitro katsemeetod B.46 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 439) (5) võimaliku nahka ärritava toime hindamiseks. OECD juhenddokumendis nahasöövituse ja -ärrituse puhul kasutatava katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta kirjeldatakse mitut moodulit, milles teabeallikad ja analüüsivahendid on rühmitatud, ning i) antakse suuniseid, kuidas lõimida ja kasutada olemasolevaid katse- ja muid andmeid kemikaalide võimaliku nahka ärritava ja nahka söövitava toime hindamiseks ja ii) pakutakse välja lähenemisviis juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid (6).

Käesolevas katsemeetodis on käsitletud inimtervisega seotud lõppnäitajana nahasöövitust. Selle meetodi puhul kasutatakse inimese rekonstrueeritud marrasknahka, mille saamiseks kasutatakse inimese marrasknaha transformeerumata keratinotsüüte ja mis on oma histoloogiliste, morfoloogiliste, biokeemiliste ja füsioloogiliste omaduste poolest väga sarnane inimese naha pealmiste kihtidega, st marrasknahaga. Vastavasisuline OECD katsejuhend võeti algselt vastu 2004. aastal ja seda ajakohastati 2013. aastal, et lisada täiendavad inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelitel põhinevad katsemeetodid ning võimalus kasutada neid meetodeid selleks, et toetada söövitavate kemikaalide liigitamist alamkategooriatesse, samuti 2015. aastal, et lisada viide juhenddokumendile katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta ning võimaldada ühe eluvõimelisuse mõõtmiseks sobiva alternatiivse meetodi kasutuselevõttu.

Käesolev katsemeetod hõlmab nelja turul kättesaadavat inimese rekonstrueeritud marrasknaha valideeritud katsemudelit. Neist kahe – standardmudeli (SM) EpiSkin™ ja meetodi EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) – puhul on läbi viidud nii valideerimiseelsed uuringud (7) kui ka ametlik valideerimisuuring nahasöövituse hindamiseks (8, 9, 10, 11, 12) (allpool on neile osutatud kui valideeritud standardmeetoditele (VSM)). Kõnealuste uuringute tulemusena esitati soovitus, mille kohaselt võib eespool nimetatud kahte VSMi regulatiivsel eesmärgil kasutada söövitavate (S) ainete eristamiseks mittesöövitavatest (MS) ning peale selle võib mudelit EpiSkin™ kasutada selleks, et toetada söövitavate ainete liigitamist alamkategooriatesse (13, 14, 15). Ülejäänud kahe turul kättesaadava inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva nahasöövituse in vitro katsemudeliga on tulemuslikkuse standarditest lähtuval valideerimisel saadud tulemused, mis on sarnased VSMiga EpiDerm™ saadud tulemustega (16, 17, 18). Need mudelid on SkinEthic™ RHE (7) ja epiCS® (varasema nimega EST-1000) ning neid võib samuti kasutada regulatiivsel eesmärgil, et eristada söövitavaid aineid mittesöövitavatest (19, 20). Valideerimisjärgsete uuringute kohaselt, mille viisid aastatel 2012–2014 läbi inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevate mudelite tootjad vastavalt täiustatud katse-eeskirjale, millega nähakse ette uuritavate kemikaalide põhjustatud mittespetsiifilisest MTT redutseerumisest tulenevad parandused, on kõnealuste meetodite tulemuslikkus nii söövitavate ja mittesöövitavate kemikaalide eristamisel kui ka söövitavate kemikaalide alamkategooriatesse liigitamise toetamisel varem eeldatust suurem (21, 22). Meetodite EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE ja epiCS® puhul saadud valideerimisjärgsete andmete täiendava statistilise analüüsi teel on tehtud kindlaks alternatiivsed prognoosimudelid, mis võimaldavad suurendada nende meetodite ennustusvõimet alamkategooriatesse liigitamisel (23).

Enne kui regulatiivsel eesmärgil nahasöövituse hindamiseks saab VSMide kõrval kasutada mõnda muud inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevat soovitud sarnast või muudetud in vitro katsemeetodit, tuleks teha kindlaks sellise meetodi usaldusväärsus, asjakohasus (täpsus) ja piirangud kavandatava kasutusotstarbe puhul, et tagada selle sarnasus VSMidega kooskõlas tulemuslikkuse standardites sätestatud nõuetega (24), mis on kehtestatud kooskõlas OECD juhenddokumendis nr 34 esitatud põhimõtetega (25). Andmete vastastikune tunnustamine on tagatud üksnes pärast seda, kui tulemuslikkuse standarditele vastav mis tahes välja pakutud uus või ajakohastatud katsemeetod on läbi vaadatud ja asjaomasesse katsejuhendisse lisatud. Kõnealusesse katsejuhendisse lisatud katsemudeleid võib kasutada in vitro nahasöövituse hindamise meetodiga saadavaid katsetulemusi käsitlevate siseriiklike nõuete järgimiseks ning seejuures saadakse kasu andmete vastastikusest tunnustamisest.

MÕISTED

Kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

Käesolev katsemeetod võimaldab tuvastada mittesöövitavaid ja söövitavaid aineid ja segusid kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega. Ühtlasi võimaldab katsemeetod toetada söövitavate ainete ja segude vabatahtlikku liigitamist 1A alamkategooriasse kooskõlas ÜRO GHSiga (1), samuti 1B ja 1C alamkategooriate ühiskategooriasse (21, 22, 23). Käesoleva katsemeetodi piiranguna ei võimalda see teineteisest eristada nahka söövitavaid 1B ja 1C alamkategooria kemikaale kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega, kuna in vivo nahka söövitavaid 1C alamkategooriasse kuuluvaid tuntud kemikaale on vähe. Katsemudelid EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE ja epiCS® võimaldavad liigitamist alamkategooriatesse (st 1A alamkategooriasse, 1B ja 1C ühiskategooriasse ning mittesöövitavaks).

Valideerimisel, mille tulemusena toetatakse käesoleva katsemeetodiga hõlmatud katsemudelite kasutamist mittesöövitavate ja söövitavate kemikaalide tuvastamiseks, uuriti paljusid eri kemikaale, peamiselt eraldi aineid; valideerimisuuringu empiirilises andmebaasis on 60 kemikaali paljudest eri kemikaaliklassidest (8, 9, 10). Katsed meetodi tundlikkuse, spetsiifilisuse ja täpsuse ning tulemuste laborisisese reprodutseeritavuse tõendamiseks alamkategooriatesse liigitamisel viisid läbi katsemeetodi väljatöötajad ning saadud tulemused vaatas läbi OECD (21, 22, 23). Kokkuvõetuna nähtub olemasolevatest andmetest, et käesolev katsemeetod on kasutatav paljude eri kemikaaliklasside ja eri füüsikalises olekus ainete, sealhulgas vedelike, pooltahkete ja tahkete ainete ning vahade puhul. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahustuvad või lahustumatud. Võimaluse korral tuleks tahked ained enne kasutamist peeneks pulbriks jahvatada; proovi muul viisil eeltöötlemine ei ole vajalik. Kui on võimalik tõendada, et käesolevas katsemeetodis kirjeldatud katsemudeleid ei saa teatud kindla kategooria uuritavate kemikaalide puhul kasutada, tuleks hoiduda nende kasutamisest sellise kategooria uuritavate kemikaalide puhul. Peale selle saab käesolevat katsemeetodit ainete kõrval eeldatavalt kasutada ka segude puhul. Ent kuna segud kuuluvad paljudesse eri kategooriatesse ja on eri koostisega ning nende kasutamise kohta katses on praegu piiratud hulgal teavet, tuleks juhul, kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa teatud kindla kategooria segude puhul kasutada (nt allikas 26 välja pakutud strateegia abil), hoiduda selle kasutamisest sellise kategooria segude puhul. Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud. Gaase ja aerosoole ei ole valideerimisuuringutes veel hinnatud (8, 9, 10). Ehkki on võimalik, et neidki saab uurida inimese rekonstrueeritud marrasknaha kasutamisel põhineva tehnoloogia abil, ei võimalda praegune katsemeetod gaaside ega aerosoolide uurimist.

Uuritavad kemikaalid, mis neelavad valgust samas vahemikus kui MTT formasaan, ning vitaalvärvaine MTT otsest MTT formasaaniks redutseerumist põhjustada võivad uuritavad kemikaalid võivad segada kudede eluvõimelisuse mõõtmist ja tingida vajaduse kasutada tulemuste korrigeerimiseks kohandatud kontrolle. Sõltuvalt uuritava kemikaali põhjustatud kõrvalekallete laadist ja MTT formasaani mõõtmise meetodist võib olla vaja kasutada eri liiki kohandatud kontrolle (vt punktid 25–31).

10.

Ehkki käesolev katsemeetod ei võimalda saada piisavat teavet nahaärrituse kohta, tuleks tähele panna, et tervisemõjuna hinnatavat in vitro nahaärritust käsitletakse konkreetselt katsemeetodis B.46, mis põhineb samal inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsesüsteemil, ehkki seal kasutatakse teistsugust katse-eeskirja (5). Ühekordse nahakaudse kokkupuute järel nahale avalduva lokaalse toime täielikku hindamist on kirjeldatud OECD juhenddokumendis katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (6). Nimetatud lähenemisviisiga nähakse ette, et enne elusloomadega katsete tegemise kaalumist viiakse läbi in vitro katsed, mille abil hinnatakse nahasöövitust (näiteks käesolevas katsemeetodis kirjeldatud viisil) ja nahaärritust. Inimese naha kasutamine toimub mõistagi kooskõlas asjaomases riigis kehtivate ja rahvusvaheliste eetiliste tõekspidamiste ja tingimustega.

KATSE PÕHIMÕTE

11.

Uuritav kemikaal kantakse paikselt kolmemõõtmelisele inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelile, mis koosneb inimese marrasknaha transformeerumata keratinotsüütidest, mida on kasvatatud nii, et need moodustavad inimese mitmekihilise tugevalt diferentseerunud marrasknaha mudeli. See koosneb korrastatud basaalkihist, ogakihist ja sõmerkihist ning mitmekihilisest sarvkihist, mis sisaldab rakkudevahelisi õhukesi lipiidikihte, kus on analoogselt in vivo koele esindatud peamiste lipiidiklasside lipiidid.

12.

Inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva katsemeetodi puhul lähtutakse eeldusest, et söövitavad kemikaalid suudavad difusiooni või erosiooni teel tungida läbi sarvkihi ja on sellest allpool paiknevate kihtide rakkudele tsütotoksilised. Rakkude eluvõimelisuse hindamiseks jälgitakse vitaalvärvaine MTT (3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid; tiasolüülsinise tetrasooliumbromiid; CASi number: 298-93-1) ensümaatilist muundumist siniseks formasaansoolaks, mida mõõdetakse kvantitatiivselt pärast kudedest ekstraheerimist (27). Söövitavad kemikaalid tehakse kindlaks nende võime järgi vähendada rakkude eluvõimelisust nii palju, et see jääb allapoole kindlaksmääratud läviväärtust (vt punktid 35 ja 36). On tõendatud, et inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinev nahasöövituse hindamiseks kasutatav katsemeetod võimaldab prognoosida katsemeetodi B.4 kohaselt mõõdetavat nahka söövitavat in vivo toimet küülikutel (2).

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

13.

Enne käesoleva katsemeetodi kohasest neljast inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevast valideeritud katsemudelist ükskõik millise regulaarset kasutamist tuleks labori tehnilise pädevuse tõendamiseks õigesti liigitada kaksteist tabelis 1 loetletud pädevusainet. Kui asjaomast meetodit kasutatakse täpsemaks liigitamiseks, tuleks tõendada ka õigesti alamkategooriatesse liigitamise võimekust. Kui mõni loetletud ainetest ei ole kättesaadav või kui see on põhjendatav, võib kasutada mõnda muud ainet, mille kohta on olemas piisavad in vivo ja in vitro võrdlusandmed (nt võrdluskemikaalide loetelust (24) valitud ainet), ent üksnes juhul, kui kohaldatakse samu valikukriteeriume, nagu on kirjeldatud tabelis 1.

Tabel 1

Pädevusainete loetelu (8)

Aine	CASi nr	Kemikaaliklass (9)	ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane in vivo tulemustel põhinev kategooria (10)	VSMga saadud in vitro tulemustel põhinev kategooria (11)	MTT redutseerija (12)	Füüsikaline olek
In vivo söövitavad 1A alamkategooria kemikaalid
Bromoäädikhape	79-08-3	Orgaaniline hape	1A	(3) 1A	—	T
Boortrifluoriiddihüdraat	13319-75-0	Anorgaaniline hape	1A	(3) 1A	—	V
Fenool	108-95-2	Fenool	1A	(3) 1A	—	T
Dikloroatsetüülkloriid	79-36-7	Elektrofiil	1A	(3) 1A	—	V
In vivo söövitavad 1B ja 1C alamkategooriate ühiskategooria kemikaalid
Glüoksüülhappe monohüdraat	563-96-2	Orgaaniline hape	1B/1C	(3) 1B/1C	—	T
Piimhape	598-82-3	Orgaaniline hape	1B/1C	(3) 1B/1C	—	V
Etanoolamiin	141-43-5	Orgaaniline alus	1B	(3) 1B/1C	J	Viskoosne
Soolhape (14,4 %)	7647-01-0	Anorgaaniline hape	1B/1C	(3) 1B/1C	—	V
In vivo mittesöövitavad kemikaalid
Fenetüülbromiid	103-63-9	Elektrofiil	MS	(3) MS	J	V
4-amino-1,2,4-triasool	584-13-4	Orgaaniline alus	MS	(3) MS	—	T
4-(metüültio)bensaldehüüd	3446-89-7	Elektrofiil	MS	(3) MS	J	V
Lauriinhape	143-07-7	Orgaaniline hape	MS	(3) MS	—	T
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i registrinumber; J – jah; MS – mittesöövitav; T – tahkis; V – vedelik; VSM – valideeritud standardmeetod.

14.

Pädevuse tõendamise osana soovitatakse kasutajal pärast kudede saabumist kontrollida nende toimivust kaitsekihina vastavalt inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva asjaomase mudeli tootja kirjeldusele. See on eriti oluline pärast kudede pikaajalist transporti või tarnet pika vahemaa taha. Pärast katsemeetodi edukat kasutuselevõttu ja selle kasutamise pädevuse tõendamist ei ole selline tavapärane kontrollimine enam vajalik. Meetodi regulaarse kasutamise korral soovitatakse siiski jätkata kaitsekihina toimivuse hindamist korrapäraste ajavahemike järel.

KATSE KÄIK

15.

Allpool on esitatud üldine kirjeldus käesoleva katsemeetodi kohaste nahasöövituse hindamiseks kasutatavate inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsemudelite elementide ja asjaomase katsemenetluse kohta. Käesoleva katsemeetodi raames kasutamiseks heaks kiidetud teaduslikult usaldusväärsed inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelid EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE ja epiCS® (16, 17, 19, 28, 29, 30, 31, 32, 33) on turul kättesaadavad. Standardne töökord kõnealusest neljast iga mudeli kasutamiseks on samuti kättesaadav (34, 35, 36, 37) ning meetodite põhielemendid on kokkuvõtlikult esitatud 2. liites. Ükskõik millise kõnealuse mudeli kasutuselevõtmisel ja rakendamisel laboris soovitatakse järgida asjaomast standardset töökorda. Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud, inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva kõnealuse nelja mudeli kasutamisel peaksid olema täidetud järgmised tingimused.

INIMESE REKONSTRUEERITUD MARRASKNAHAL PÕHINEVA KATSEMEETODI ELEMENDID

Üldtingimused

16.

Epiteelkoe rekonstrueerimiseks tuleks kasutada inimese transformeerumata keratinotsüüte. Talitlusvõimelise sarvkihi all peaks olema mitu kihti eluvõimelisi epiteelirakke (basaalkiht, ogakiht ja sõmerkiht). Sarvkiht peaks olema mitmekihiline ja sisaldama selliseid vajalikke lipiide, et moodustuks funktsionaalne kaitsekiht, mis suudab takistada tsütotoksiliste võrdluskemikaalide, näiteks naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) või Triton X-100 kiiret läbitungimist. Nimetatud kaitsekihina toimimist tuleks tõendada; selle hindamiseks võib teha kindlaks kontsentratsiooni, mille juures võrdluskemikaal vähendab kindlaksmääratud kokkupuuteaja vältel kudede eluvõimelisust 50 % võrra (IC50), või määrata kokkupuuteaja, mille vältel võrdluskemikaal vähendab teatud kindla kontsentratsiooni juures kudede eluvõimelisust 50 % võrra (ET50) (vt punkt 18). Kasutatav inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudel peaks olema selline, et aine ei saaks jõuda eluskoeni sarvkihti läbimata, kuna vastasel korral ei ole nahakaudse kokkupuute mudeliga saadud tulemused usaldusväärsed. Kasutatav mudel ei tohiks olla saastunud bakterite, viiruste, mükoplasma ega seentega.

Funktsionaaltingimused

Eluvõimelisus

17.

Kudede eluvõimelisuse kvantifitseerimiseks kasutatakse MTT-põhist meetodit (27). Vitaalvärvaine MTT redutseeritakse inimese rekonstrueeritud marrasknaha eluvõimelistes rakkudes siniseks sadestuvaks MTT formasaaniks, mis ekstraheeritakse seejärel koest isopropanooli (või muu sarnase lahusti) abil. Ekstraheerimiseks kasutatava lahusti enda optiline tihedus peaks olema piisavalt väike, st < 0,1. Ekstraheeritud MTT formasaani kvantifitseerimiseks võib kasutada kas tavapärast neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmist või HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat (38). Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli kasutajad peaksid tagama, et mudeli iga kasutatav partii vastab negatiivse kontrolli kindlaksmääratud kriteeriumidele. Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/tarnija peaks kindlaks määrama negatiivse kontrolli optilise tiheduse väärtuste lubatud vahemiku (ülem- ja alampiiri). Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud, inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva nelja valideeritud katsemudeli puhul lubatud väärtusevahemikud negatiivse kontrolli optilise tiheduse jaoks on esitatud tabelis 2. HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutaja peaks negatiivse kontrolli vastuvõetavuse kriteeriumina kasutama tabelis 2 negatiivse kontrolli kohta esitatud optilise tiheduse väärtusevahemikku. Tuleks dokumentaalselt tõendada, et negatiivse kontrolliga töödeldud koed on kokkupuuteperioodi kestel kultuuris stabiilsed (võimaldavad saada sarnaseid optilise tiheduse väärtusi).

Tabel 2

Partii kvaliteedi kontrollimiseks kasutatav negatiivse kontrolli optilise tiheduse lubatud väärtusevahemik

	Vastuvõetavate väärtuste alampiir	Vastuvõetavate väärtuste ülempiir
EpiSkin™ (SM)	> 0,6	< 1,5
EpiDerm™ SCT (EPI-200)	> 0,8	< 2,8
SkinEthic™ RHE	> 0,8	< 3,0
epiCS®	> 0,8	< 2,8

Toimimine kaitsekihina

18.

Sarvkiht ja selle lipiidne koostis peavad olema sellised, et takistada teatud kindlate tsütotoksiliste võrdluskemikaalide (nt SDSi või Triton X-100) kiiret läbitungimist; seda hinnatakse IC50 või ET50 alusel (tabel 3). Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/müüja peaks lõppkasutajale kudede tarnimisel tõendama mudeli iga kasutatava partii puhul toimivust kaitsekihina (vt punkt 21).

Morfoloogia

19.

Tuleks läbi viia inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli histoloogiline analüüs, et tõendada inimese marrasknahaga sarnaneva, basaal-, oga-, sõmer- ja sarvkihti sisaldava mitmekihilise struktuuri olemasolu ning inimese marrasknaha lipiidsele koostisele lähedase lipiidse koostise esinemist. Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/müüja peaks lõppkasutajale kudede tarnimisel esitama mudeli iga kasutatava partii histoloogilise analüüsi tulemused, millest nähtub kudede morfoloogia nõuetekohasus (vt punkt 21).

Reprodutseeritavus

20.

Katsemeetodi kasutajad peaksid tõendama meetodiga saadavate positiivseid ja negatiivseid kontrolle iseloomustavate tulemuste reprodutseeritavust pikema aja jooksul. Peale selle tuleks käesolevat katsemeetodit kasutada üksnes juhul, kui inimese rekonstrueeritud marrasknaha asjaomase mudeli väljatöötaja/tarnija on esitanud andmed, millest nähtub söövitavate ja mittesöövitavate kemikaalidega, näiteks pädevusainete loetelust (tabel 1) valitud kemikaalidega saadavate tulemuste reprodutseeritavus pikema aja jooksul. Kui asjaomast meetodit kasutatakse täpsemaks liigitamiseks, tuleks tõendada tulemuste reprodutseeritavust ka alamkategooriatesse liigitamisel.

Kvaliteedikontroll

21.

Asjaomast inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelit tuleks kasutada üksnes juhul, kui selle väljatöötaja/tarnija on tõendanud, et kasutatava mudeli iga partii vastab tootele kehtestatud kvaliteedikriteeriumidele, mille hulgas kõige olulisemad on eluvõimelisuse (punkt 17), kaitsekihina toimivuse (punkt 18) ja morfoloogiaga (punkt 19) seotud kriteeriumid. Sellised andmed esitatakse meetodi kasutajatele, et nad saaksid lisada selle teabe katseprotokolli. Söövitavate kemikaalide liigituse usaldusväärse prognoosimise eesmärgil on vastuvõetavad üksnes sellised tulemused, mis on saadud kvaliteedikontrolli edukalt läbinud koepartiidega. IC50 või ET50 väärtuste lubatud vahemiku (ülem- ja alampiiri) määrab kindlaks inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/tarnija. Kõnealuse nelja valideeritud katsemudeli puhul lubatud väärtusevahemikud on esitatud tabelis 3.

Tabel 3

Partii kvaliteedikontrolli kriteeriumid

	Vastuvõetavate väärtuste alampiir	Vastuvõetavate väärtuste ülempiir
EpiSkin™ (SM) (18-tunnine töötlus SDSiga) (33)	IC50 = 1,0 mg/ml	IC50 = 3,0 mg/ml
EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)	ET50 = 4,0 tundi	ET50 = 8,7 tundi
SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)	ET50 = 4,0 tundi	ET50 = 10,0 tundi
epiCS® (1 % Triton X-100) (36)	ET50 = 2,0 tundi	ET50 = 7,0 tundi

Uuritava kemikaali ja kontrollkemikaalidega töötlemine

22.

Iga uuritava kemikaali ja kontrolli puhul tuleks igal kokkupuuteperioodil kasutada vähemalt kahte paralleelset koeproovi. Nii vedelate kui ka tahkete kemikaalide puhul tuleks töötlemiseks kasutada piisavat kogust uuritavat kemikaali, et marrasknaha pind saaks ühtlaselt kaetud, ent seejuures tuleks hoiduda lõpmata suure annuse kasutamisest; see tähendab, et kemikaali tuleks peale kanda koguses vähemalt 70 μl/cm2 või 30 mg/cm2. Sõltuvalt mudelist tuleks marrasknaha pinda enne tahke kemikaali pealekandmist niisutada deioniseeritud või destilleeritud veega, et parandada uuritava kemikaali kontakti marrasknaha pinnaga (34, 35, 36, 37). Võimaluse korral tuleks tahket kemikaali kasutada peene pulbri kujul. Töötlemismeetod peaks olema uuritava kemikaali jaoks sobiv (vt nt allikad 34–37). Kokkupuuteperioodi lõppedes tuleks uuritav kemikaal veepõhisepuhverlahuse või 0,9 % NaCl lahusega marrasknaha pinnalt hoolikalt maha pesta. Sõltuvalt sellest, millist kõnealusest neljast inimese rekonstrueeritud marrasknaha valideeritud katsemudelist kasutatakse, tuleb iga uuritava kemikaali puhul kasutada kahte või kolme kokkupuuteperioodi (kõigi nelja mudeli puhul kokkupuuteperioode kestusega 3 minutit ja 1 tund ning mudeli EpiSkin™ puhul täiendavat kokkupuuteperioodi kestusega 4 tundi). Kasutatavast inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsemudelist ja konkreetsest kokkupuuteperioodist sõltuvalt võib kokkupuuteaegne inkubeerimistemperatuur varieeruda toatemperatuurist kuni 37 °C-ni.

23.

Igas mõõtmistsüklis tuleks kasutada paralleelset negatiivset ja positiivset kontrolli selle tõendamiseks, et kudede eluvõimelisus (negatiivse kontrolli puhul), toimivus kaitsekihina ja sellest sõltuv kudede tundlikkus (positiivse kontrolli puhul) jääb varasemate andmete alusel kindlaks määratud lubatud piiridesse. Soovitatav positiivseks kontrolliks sobiv kemikaal on kasutatavast inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelist sõltuvalt jää-äädikhape või 8 N KOH. Tuleks silmas pidada, et 8 N KOH on MTT otsene redutseerija ja selle kemikaali puhul võib olla vaja kasutada kohandatud kontrolle, nagu on kirjeldatud punktides 25 ja 26. Soovitatav negatiivne kontroll on 0,9 % (massiühikutes mahuühiku kohta) NaCl või vesi.

Rakkude eluvõimelisuse mõõtmine

24.

Käesoleva katsemeetodi raames tuleks rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks kasutada kvantitatiivset MTT-põhist meetodit (27). Koeproov asetatakse kolmeks tunniks sobiva kontsentratsiooniga (0,3 või 1 mg/ml) MTT lahusesse. Sadestunud sinine formasaan ekstraheeritakse seejärel lahusti (näiteks isopropanooli või hapestatud isopropanooli) abil ning formasaani kontsentratsiooni määramiseks mõõdetakse lahuse optiline tihedus lainepikkusel 570 nm – seejuures kasutatakse filtrit ribalaiusega kuni ± 30 nm – või rakendatakse HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat (vt punktid 30 ja 31) (38).

25.

Uuritav kemikaal võib MTT-põhise katse tulemusi moonutada tulenevalt MTT otsesest redutseerimisest siniseks formasaaniks ja/või värvuse muutmise kaudu, kui asjaomane uuritav kemikaal neelab looduslikult või töötlemisprotsessi tulemusena valgust samas vahemikus, mida kasutatakse formasaanilahuse optilise tiheduse mõõtmiseks (570 ± 30 nm; seda täheldatakse peamiselt siniste ja lillade kemikaalide puhul). Selliste uuritavate kemikaalide võimaliku segava mõju tuvastamiseks ja tulemuste korrigeerimiseks tuleks kasutada täiendavaid kontrolle, näiteks MTT mittespetsiifilist redutseerimist (NSMTT) kajastavat kontrolli ja mittespetsiifilist värvumist (NSC) kajastavat kontrolli (vt punktid 26–30). See on eriti oluline juhul, kui konkreetset uuritavat kemikaali ei saa loputamise teel koepinnalt täielikult eemaldada või kui see tungib marrasknahka ja jääb seega eluvõimelisuse MTT-põhise määramise ajaks kudedesse. Üksikasjalik kirjeldus selle kohta, kuidas korrigeerida tulemusi MTT otsese redutseerimise ja värvust muutvate ainete mõju suhtes, on esitatud asjaomast katsemudelit käsitlevas standardses töökorras (34, 35, 36, 37).

26.

MTT otseste redutseerijate tuvastamiseks tuleks lisada iga uuritavat kemikaali värskelt valmistatud MTT lahusesse (34, 35, 36, 37). Kui MTT lahus värvub uuritava kemikaali toimel siniseks/lillaks, siis käsitatakse asjaomast uuritavat kemikaali MTT otsese redutseerijana ning sel juhul tuleks tavapärasest neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisest või HPLC/UPLC-spektrofotomeetrial põhinevast määramisest sõltumatult kasutada täiendavat funktsionaalset kontrolli eluvõimetu marrasknahaga. Sellise täiendava funktsionaalse kontrolli puhul kasutatakse surmatud kudesid, mille metaboolne aktiivsus on peaaegu kadunud, kuid mis absorbeerivad uuritavat kemikaali eluvõimeliste kudedega sarnasel määral. Iga MTT-d redutseeriva kemikaaliga töödeldakse vähemalt kahte surmatud kudede paralleelproovi kokkupuuteperioodi kohta ning nende proovidega viiakse läbi täismahus nahasöövituskatse. Seejärel arvutatakse kudede tegeliku eluvõimelisuse kindlakstegemiseks asjaomase MTT redutseerijaga kokkupuutes olnud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal, millest lahutatakse sama MTT redutseerijaga kokkupuutes olnud surmatud kudedega saadud, MTT mittespetsiifilist redutseerimist kajastav protsentuaalse osakaaluna väljendatud väärtus (NSMTT(%)); nimetatud väärtused arvutatakse korrigeeritavate andmete saamiseks kasutatud proovidega paralleelselt analüüsitud negatiivset kontrolli iseloomustava väärtuse suhtes.

27.

Värviliste uuritavate kemikaalide või vee või isopropanooliga kokku puutumisel värviliseks muutuvate kemikaalide võimaliku segava mõju tuvastamiseks ja täiendavate kontrollide kasutamise vajaduse üle otsustamiseks tuleks teha uuritava kemikaali spektraalanalüüs vees (kokkupuutekeskkond) ja/või isopropanoolis (ekstraheerimislahus). Kui uuritav kemikaal neelab vees ja/või isopropanoolis valgust vahemikus 570 ± 30 nm, tuleks kasutada täiendavaid värvumiskontrolle või teise võimalusena HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat; viimasel juhul ei ole kõnealused kontrollid vajalikud (vt punktid 30 ja 31). Tavapärasel neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisel töödeldakseiga segavat mõju avaldava värvilise uuritava kemikaaliga vähemalt kahte paralleelset eluskoe proovi kokkupuuteperioodi kohta ning nende proovidega viiakse läbi täismahus nahasöövituskatse, ent MTTga inkubeerimise etapis kasutatakse MTT lahuse asemel söödet, et saada mittespetsiifilist värvumist (NSCelus) kajastavad kontrollproovid. Eluskudedele iseloomulikust bioloogilisest varieeruvusest tulenevalt tuleb NSCelus-kontrolli kasutada igas mõõtmistsüklis iga kokkupuuteperioodi puhul samaaegselt uuritava värvilise kemikaaliga. Seejärel arvutatakse kudede tegeliku eluvõimelisuse kindlakstegemiseks asjaomase segavat mõju avaldava uuritava kemikaaliga kokkupuutes olnud ja MTT lahuses inkubeeritud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal, millest lahutatakse kõnealuse segavat mõju avaldava uuritava kemikaaliga kokkupuutes olnud ja ilma MTT-ta söötmes inkubeeritud eluskudedega saadud, mittespetsiifilist värvumist kajastav protsentuaalse osakaaluna väljendatud väärtus (NSCelus(%)), mille leidmiseks kasutatud kontrollproove on käideldud korrigeeritavate andmete saamiseks kasutatud proovidega paralleelselt.

28.

Selliste uuritavate kemikaalide puhul, millega saadud tulemustest nähtub nii MTT otsese redutseerimise võime (vt punkt 26) kui ka värvusest tulenev segav mõju (vt punkt 27), on tavapärasel neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisel vaja kasutada eelmistes punktides kirjeldatud NSMTT-kontrolli ja NSCelus-kontrolli kõrval veel kolmandat liiki kontrolli. See on tavaliselt vajalik tumedavärviliste (nt siniste, lillade ja mustade) uuritavate kemikaalide puhul, mis avaldavad MTT-põhises katses segavat mõju, kuna takistavad neile omase värvuse tõttu MTT otsese redutseerimise võime hindamist vastavalt punktis 26 kirjeldatule. Sellised uuritavad kemikaalid võivad seonduda nii eluskudede kui ka surmatud kudedega ja seepärast võib juhtuda, et NSMTT-kontrolli abil korrigeeritakse tulemusi mitte üksnes uuritava kemikaali põhjustatud MTT võimaliku otsese redutseerimise suhtes, vaid ka värvusest tuleneva segava mõju suhtes, mis ilmneb uuritava kemikaali seondumisel surmatud kudedega. See võib kaasa tuua kahekordse korrigeerimise, kuna NSCelus-kontrolli abil juba korrigeeritakse tulemusi värvusest tuleneva segava mõju suhtes, mis ilmneb uuritava kemikaali seondumisel eluskudedega. Et hoida ära võimalikku kahekordset korrigeerimist värvusest tuleneva segava mõju suhtes, tuleb kasutada kolmandat kontrolli, mis võimaldab hinnata surmatud kudede mittespetsiifilist värvumist (NSCsurmatud). Selle täiendava kontrolli puhul töödeldakse uuritava kemikaaliga vähemalt kahte paralleelset surmatud kudede proovi kokkupuuteperioodi kohta ning nende proovidega viiakse läbi täismahus katse, ent MTTga inkubeerimise etapis kasutatakse MTT lahuse asemel söödet. Olenemata sellest, kui suur on sõltumatult läbi viidavate katsete/mõõtmistsüklite arv, piisab iga uuritava kemikaali puhul ühest NSCsurmatud-kontrollist, ent seda tuleks käidelda samaaegselt NSMTT-kontrolliga ja võimaluse korral tuleks kasutada sama partii kudesid. Seejärel arvutatakse kudede tegeliku eluvõimelisuse kindlakstegemiseks asjaomase uuritava kemikaaliga kokkupuutes olnud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal, millest lahutatakse NSMTT(%) ja NSCelus(%) ning liidetakse kõnealuse segavat mõju avaldava uuritava kemikaaliga kokkupuutes olnud ja ilma MTT-ta söötmes inkubeeritud surmatud kudedega saadud, mittespetsiifilist värvumist kajastav protsentuaalse osakaaluna väljendatud väärtus (NSCsurmatud(%)); nimetatud väärtused arvutatakse korrigeeritavate andmete saamiseks kasutatud proovidega paralleelselt analüüsitud negatiivset kontrolli iseloomustava väärtuse suhtes.

29.

On oluline silmas pidada, et MTT mittespetsiifilise redutseerimise ja värvusest tuleneva mittespetsiifilise segava mõju tulemusena võivad koeekstraktiga saadud näidud olla suuremad kui spektrofotomeetri lineaarsusvahemikule vastavad väärtused. Sellest lähtuvalt tuleks igas laboris enne regulatiivsel eesmärgil uuritavate kemikaalidega katsete alustamist teha kaubanduslikust allikast pärit MTT formasaani (CASi nr: 57360-69-7) abil kindlaks kasutatava spektrofotomeetri lineaarsusvahemik. Eelkõige on tavapärane neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmine spektrofotomeetriga MTT otseste redutseerijate ja värvusest tuleneva segava mõjuga uuritavate kemikaalide puhul asjakohane juhul, kui asjaomase uuritava kemikaaliga töödeldud kudede ekstraktide optiline tihedus jääb enne MTT otsese redutseerimise ja/või värvusest tuleneva segava mõju suhtes korrigeerimist spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku või kui uuritav kemikaal on eluvõimeliste kudede korrigeerimata protsentuaalse osakaalu alusel juba liigitatav söövitavaks (vt punktid 35 ja 36). Selliste uuritavate kemikaalide puhul, millega saadud NSMTT(%) ja/või NSCelus(%) on negatiivse kontrolliga võrrelduna > 50 %, tuleks siiski suhtuda tulemustesse ettevaatusega.

30.

Tavapäraseks neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmiseks sobimatute värviliste uuritavate kemikaalide puhul, mis avaldavad MTT-põhises katses liiga tugevat segavat mõju, võib MTT formasaani määramiseks kasutada alternatiivina HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat (vt punkt 31) (37). HPLC/UPLC-spektrofotomeetria võimaldab MTT formasaani enne selle kvantifitseerimist uuritavast kemikaalist eraldada (38). Sel põhjusel ei ole NSCelus-kontroll ega NSCsurmatud-kontroll HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutamisel uuritava kemikaali omadustest sõltumata kunagi vajalikud. NSMTT-kontrolli aga tuleks siiski kasutada, kui on põhjust eeldada, et uuritav kemikaal on MTT otsene redutseerija või selle värvus takistab MTT otsese redutseerimise võime hindamist (vastavalt punktis 26 kirjeldatule). Kui MTT formasaani määramiseks kasutatakse HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat, arvutatakse eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal uuritava kemikaaliga kokku puutunud eluskudede puhul saadud MTT formasaani piigi pindala protsentuaalse osakaaluna paralleelse negatiivse kontrolliga saadud MTT formasaani piigi pindalast. Kemikaalide puhul, mis on võimelised MTT-d otse redutseerima, arvutatakse kudedetegelik eluvõimelisus uuritava kemikaaliga kokku puutunud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalse osakaaluna, millest on lahutatud NSMTT(%). Lõpuks tuleks märkida, et selliseid MTT otseseid redutseerijaid, mis võivad avaldada ka värvusest tulenevat segavat mõju ning mis jäävad pärast töötlemist kudedesse ja redutseerivad MTT-d nii tugevalt, et analüüsitavate koeekstraktide puhul täheldatud optiline tihedus (tavapärasel optilise tiheduse mõõtmisel) või piigi pindala (HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutamisel) jääb väljapoole spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku, ei ole võimalik hinnata; seda juhtub eeldatavalt siiski väga harva.

31.

HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat võib MTT formasaani määramiseks kasutada iga liiki (värviliste, värvitute, MTT-d redutseerivate ja MTT-d mitteredutseerivate) uuritavate kemikaalide puhul (38). Kuna on olemas eri HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteeme, tuleks enne sellise süsteemi kasutamist koeekstraktides sisalduva MTT formasaani määramiseks tõendada asjaomase HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteemi nõuetekohasust; selleks tõendatakse vastavust teatud standardnäitajatega seotud vastuvõetavuskriteeriumidele, mille puhul on lähtutud bioanalüüsimeetodite valideerimist käsitlevates ettevõtjatele ette nähtud USA Toidu- ja Ravimiameti suunistes kirjeldatud kriteeriumidest (38, 39). Kõnealused põhinäitajad ja neile vastavad vastuvõetavuskriteeriumid on esitatud 4. liites. Kui 4. liites määratletud vastuvõetavuskriteeriumid on täidetud, loetakse asjaomane HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteem nõuetekohaseks ja seda võib hakata kasutama MTT formasaani määramiseks käesolevas katsemeetodis kirjeldatud katsetingimustes.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

32.

Iga katsemeetodi puhul, kus kasutatakse inimese rekonstrueeritud marrasknaha nõuetekohast mudelit, peaks negatiivse kontrolliga töödeldud kudesid iseloomustav optiline tihedus kajastama kudede kvaliteeti vastavalt tabelis 2 kirjeldatule ega tohiks olla väiksem kui varasemate andmete põhjal kindlaks määratud alampiir. Positiivse kontrolliga, st jää-äädikhappe või 8 N KOH-ga töödeldud kudedega saadud tulemused peaksid kajastama kudede võimet reageerida söövitavale kemikaalile asjaomase katsemudeli puhul kasutatavates tingimustes (vt 2. liide). Paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste vaheline varieeruvus peaks inimese rekonstrueeritud marrasknaha iga valideeritud mudeli puhul jääma uuritava kemikaaliga ja/või kontrollkemikaaliga töötlemisel kõikide nõuete puhul vastuvõetavasse vahemikku (vt 2. liide) (näiteks ei tohiks kahe paralleelse koeprooviga saadud eluvõimelisuse näitajate vaheline erinevus olla suurem kui 30 %). Kui mõõtmistsüklis kasutatud negatiivse kontrolli või positiivse kontrolliga saadud väärtus jääb väljapoole lubatud vahemikku, loetakse asjaomases mõõtmistsüklis saadud tulemused kehtetuks ning mõõtmisi tuleks korrata. Kui uuritava kemikaaliga saadud väärtuste varieeruvus on suurem, kui on lubatud kindlaksmääratud vahemikus püsimiseks, tuleks sellega teha uus katse.

Tulemuste tõlgendamine ja prognoosimudel

33.

Iga uuritava kemikaaliga saadud optilise tiheduse väärtuste alusel tuleks arvutada eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal negatiivse kontrolli puhul saadud väärtusest, mis on võetud võrdseks 100 protsendiga. HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutamise korral arvutatakse eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal uuritava kemikaaliga kokku puutunud eluskudede puhul saadud MTT formasaani piigi pindala protsentuaalse osakaaluna paralleelse negatiivse kontrolliga saadud MTT formasaani piigi pindalast. Eluvõimeliste rakkude protsentuaalse osakaalu läviväärtused söövitavate uuritavate kemikaalide eristamiseks mittesöövitavatest (või söövitavate kemikaalide eri alamkategooriatesse liigitamiseks) on iga käesolevas katsemeetodis käsitletud katsemudeli jaoks sätestatud allpool punktides 35 ja 36 ning tulemuste tõlgendamisel tuleks kasutada just neid väärtusi.

34.

Kui uuritava kemikaali liigitamisel saadakse ühene tulemus, piisab ühest mõõtmistsüklist, kus on kasutatud vähemalt kahte paralleelset koeproovi. Ebaselgete tulemuste puhul – näiteks kui paralleelproovidega saadud mõõtmisandmed lahknevad – võib kaaluda vajadust viia läbi veel üks mõõtmistsükkel ning esimeses kahes mõõtmistsüklis saadud tulemuste lahknevuse korral veel kolmaski mõõtmistsükkel.

35.

Nahasöövituse katsemudeli EpiSkin™ puhul kasutatav prognoosimudel (9, 22, 34), mis on seotud ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase klassifitseerimissüsteemiga, on esitatud tabelis 4.

Tabel 4

Mudeli EpiSkin™ puhul kasutatav prognoosimudel

Kokkupuuteperioodi (t = 3, 60 või 240 minutit) järgselt mõõdetud eluvõimelisus

Kaalutav prognoos

< 35 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit

Söövitav:

•	vabatahtlikult kohaldatavasse 1A alamkategooriasse liigitatav (*1)

≥ 35 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit NING

< 35 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 60 minutit

VÕI

≥ 35 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 60 minutit NING

< 35 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 240 minutit

Söövitav:

•	vabatahtlikult kohaldatavasse 1B ja 1C alamkategooriate ühiskategooriasse liigitatav

≥ 35 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 240 minutit

Mittesöövitav

36.

Nahasöövituse katsemudelite EpiDerm™ SCT (10, 23, 35), SkinEthic™ RHE (17, 18, 23, 36) ja epiCS® (16, 23, 37) puhul kasutatavad prognoosimudelid, mis on seotud ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase klassifitseerimissüsteemiga, on esitatud tabelis 5.

Tabel 5

Mudelite EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE ja epiCS® puhul kasutatavad prognoosimudelid

Kokkupuuteperioodi (t = 3 või 60 minutit) järgselt mõõdetud eluvõimelisus	Kaalutav prognoos
1. ETAPP mudelite EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE ja epiCS® puhul
< 50 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit	Söövitav
≥ 50 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit NING< 15 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 60 minutit	Söövitav
≥ 50 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit NING≥ 15 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 60 minutit	Mittesöövitav
2. ETAPP mudeli EpiDerm™ SCT puhul – 1. etapis söövitavaks liigitatud ainete/segude puhul
< 25 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit	Vabatahtlikult kohaldatavasse 1A alamkategooriasse liigitatav*
≥ 25 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit	Vabatahtlikult kohaldatavasse 1B ja 1C alamkategooriate ühiskategooriasse liigitatav
2. ETAPP mudeli SkinEthic™ RHE puhul – 1. etapis söövitavaks liigitatud ainete/segude puhul
< 18 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit	Vabatahtlikult kohaldatavasse 1A alamkategooriasse liigitatav*
≥ 18 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit	Vabatahtlikult kohaldatavasse 1B ja 1C alamkategooriate ühiskategooriasse liigitatav
2. ETAPP mudeli epiCS® puhul – 1. etapis söövitavaks liigitatud ainete/segude puhul
< 15 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit	Vabatahtlikult kohaldatavasse 1A alamkategooriasse liigitatav*
≥ 15 % pärast kokkupuuteperioodi kestusega 3 minutit	Vabatahtlikult kohaldatavasse 1B ja 1C alamkategooriate ühiskategooriasse liigitatav

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmed

37.

Iga katse puhul tuleks esitada tabeli kujul andmed iga paralleelse koeproovi kohta (näiteks optilise tiheduse väärtused ja eluvõimeliste rakkude protsentuaalne osakaal iga uuritava kemikaali puhul koos liigitamise tulemusega), sealhulgas vajaduse korral korduskatsete tulemused. Peale selle tuleks iga katse puhul esitada keskväärtused, eluvõimelisust kajastavate väärtuste vahemikud ja paralleelsete koeproovidega saadud andmete variatsioonikordajad. Iga asjaomase uuritava kemikaali puhul tuleks esitada andmed seoses MTT otsese redutseerija puhul täheldatud mõjuga MTT-le või värvilise uuritava kemikaali segava mõjuga.

Katseprotokoll

38.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal ja kontrollkemikaalid:

—	ühest koostisosast koosnev aine: kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

—	mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu: võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	allikas ja partii number, kui see on olemas;

—	vajaduse korral teave uuritava kemikaali / kontrollaine töötlemise kohta enne katset (näiteks soojendamine, peenestamine);

—	uuritava kemikaali püsivus ja aegumiskuupäev või kordusanalüüsi tegemise tähtpäev, kui see on teada;

—	säilitustingimused.

Kasutatud inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudel ja katse-eeskiri ning nende valimise põhjendus (vajaduse korral)

Katsetingimused:

—	kasutatud inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudel (sealhulgas partii number);

—	mõõteseadme (nt spektrofotomeetri) kaliibrimisandmed, MTT formasaani kvantifitseerimiseks kasutatud lainepikkus ja filtri ribalaius (vajaduse korral) ning mõõteseadme lineaarsusvahemik;

—	MTT formasaani kvantifitseerimiseks kasutatud meetodi kirjeldus;

—	vajaduse korral HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteemi nõuetekohasuse tõendamise kirjeldus;

—

kogu täiendav teave konkreetse kasutatud inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli, sealhulgas selle kasutamise tulemuslikkuse kohta. See hõlmab vähemalt järgmisi aspekte:

i)	eluvõimelisus;

ii)	toimimine kaitsekihina;

iii)	morfoloogia;

iv)	reprodutseeritavus ja ennustusjõud;

v)	mudeli kvaliteedi kontroll;

—	viide varasematele andmetele mudeli kohta. See hõlmab vähemalt kvaliteedikontrolli andmete vastuvõetavust lähtuvalt varasematest andmetest partii kohta;

—	pädevusainetega katsete tegemine eesmärgiga tõendada katsemeetodi kasutamise pädevust enne meetodi regulaarset rakendamist.

Katse käik:

—	kasutatud katse-eeskirja üksikasjalik kirjeldus (sealhulgas teave kokkupuuteperioodi järgsete pesemisetappide kohta);

—	kasutatud uuritava kemikaali ja kontrollkemikaalide annused;

—	kokkupuuteperioodi(de) kestus ja kokkupuutetemperatuur(id);

—	MTT otseste redutseerijate ja/või värviliste uuritavate kemikaalide puhul kasutatud kontrollid;

—	iga uuritava kemikaali ja iga kontrolli (positiivse ja negatiivse kontrolli ning vajaduse korral NSMTT-kontrolli, NSCelus-kontrolli ja/või NSCsurmatud-kontrolli) puhul iga kokkupuuteperioodi jaoks kasutatud paralleelsete koeproovide arv;

—	kasutatud otsustuskriteeriumide/prognoosimudeli kirjeldus lähtuvalt kasutatud inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelist;

—	kõikide katsemeetodis tehtud (sealhulgas pesemisetappidega seotud) muudatuste kirjeldus.

Mõõtmistsüklis või katses saadavate tulemuste vastuvõetavuse kriteeriumid:

—	varasemate andmete kohased positiivse ja negatiivse kontrolli puhul saadud keskväärtused ja vastuvõetavate väärtuste vahemikud;

—	positiivse ja negatiivse kontrolli puhul paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste varieeruvuse vastuvõetav määr;

—	uuritava kemikaali puhul paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste varieeruvuse vastuvõetav määr.

Tulemused:

—

tabeli kujul mõõtmisandmed iga uuritava kemikaali ja kontrolli kohta iga mõõtmistsükli, iga kokkupuuteperioodi ja iga paralleelproovi puhul, sealhulgas vastavalt vajadusele optilise tiheduse või MTT formasaani piigi pindala väärtused, eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal ja selle näitaja keskväärtus, paralleelproovide vahelise varieeruvuse andmed, standardhälbed ja/või variatsioonikordajad;

—

vajaduse korral MTT otseste redutseerijate ja/või värviliste uuritavate kemikaalide puhul kasutatud kontrollidega saadud tulemused, sealhulgas vastavalt vajadusele optilise tiheduse või MTT formasaani piigi pindala väärtused, NSMTT(%), NSCelus(%) ja/või NSCsurmatud(%), paralleelsete koeproovide vahelise varieeruvuse andmed, standardhälbed ja/või variatsioonikordajad ning eluvõimeliste kudede lõplik korrigeeritud protsentuaalne osakaal;

—	uuritava(te) kemikaali(de) ja kontrollkemikaalidega saadud tulemuste vastavus mõõtmistsüklis või katses saadavate tulemuste vastuvõetavuse kindlaksmääratud kriteeriumidele;

—	muu täheldatud toime kirjeldus;

—	klassifitseerimistulemused lähtuvalt kasutatud prognoosimudelist/otsustuskriteeriumidest.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	ÜRO (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Viies, täiendatud väljaanne. ÜRO, New York ja Genf. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

(2)	Käesoleva lisa peatükk B.4 „Äge nahaärritus/-söövitus“.

(3)	Käesoleva lisa peatükk B.40 „In vitro nahasöövitus: transkutaanse elektritakistuse (TET) mõõtmisel põhinev katsemeetod“.

(4)	Käesoleva lisa peatükk B.65 „In vitro membraanibarjääri katsemeetod nahasöövituse uurimiseks“.

(5)	Käesoleva lisa peatükk B.46 „In vitro nahaärritus: inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinev katsemeetod“.

(6)	OECD (2014). Guidance Document on an Integrated Approach to Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 203. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(7)

(8)	Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem J. H., Gerner I., Walker A. P., ja Worth, A. P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 12: 471–482.

(9)

(10)	Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., Wilkins, S., Wiemann, C., Kaufmann, T., Remmele, M., ja Holzhütter, H.-G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing. ATLA 28: 371–401.

(11)

(12)	Alternatiivsete meetodite valideerimise ametitevaheline koordineerimiskomitee (ICCVAM) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(13)

(14)	ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity). Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC10), 3. aprill 1998.

(15)	ECVAM (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing. Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC14), 21. märts 2000.

(16)	Hoffmann, J., Heisler, E., Karpinski, S., Losse, J., Thomas, D., Siefken, W., Ahr, H. J., Vohr. H. W., ja Fuchs, H. W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000) – A New Reconstructed Epidermis for In Vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol. In Vitro 19: 925–929.

(17)

Kandárová, H., Liebsch, M., Spielmann, H., Genschow, E., Schmidt, E., Traue, D., Guest, R., Whittingham, A., Warren, N., Gamer, A. O., Remmele, M., Kaufmann, T., Wittmer, E., De Wever, B., ja Rosdy, M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In Vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol. In Vitro 20: 547–559.

(18)	Tornier, C., Roquet, M., ja Fraissinette, A. B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0,5 cm2 Tissue Sample. Toxicol. In Vitro 24: 1379–1385.

(19)	ECVAM (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing. Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC25), 17. november 2006.

(20)	ECVAM (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000. Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC30), 12. juuni 2009.

(21)	OECD (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 190. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(22)	Alépée, N., Grandidier, M. H., ja Cotovio, J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. In Vitro 28: 131–145.

(23)	Desprez, B., Barroso, J., Griesinger, C., Kandárová, H., Alépée, N., ja Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. In Vitro 29: 2055–2080.

(24)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion Testing as described in TG 431. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 219. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(25)	OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 34. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(26)	Eskes, C., et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 62: 393–403.

(27)	Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65: 55–63.

(28)	Tinois, E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In Vitro. Väljaandes: In Vitro Skin Toxicology. Rougier, A., Goldberg, A. M., ja Maibach, H. I. (toim.). Lk 133–140.

(29)	Cannon, C. L., Neal, P. J., Southee, J. A., Kubilus, J., ja Klausner, M. (1994). New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol. In Vitro 8: 889–891.

(30)	Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Bouwstra, J., ja Mommaas, M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Int. J. Pharm. 203: 211–225.

(31)	Tinois, E., Tiollier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M., ja Thivolet, J. (1991). In Vitro and Post-Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193: 310–319.

(32)	Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., ja Rosenberg, M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotechnology 9: 163–171.

(33)	Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., ja Parenteau, N. L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotechnol. Bioeng. 43(8): 747–756.

(34)	Standardne töökord mudeli EpiSkin™ jaoks (detsember 2011). Andmebaasi INVITTOX katse-eeskiri nr 118 „EpiSkin™ Skin Corrosivity Test“.

(35)	Standardne töökord mudeli EpiDerm™ jaoks (veebruar 2012). Versioon MK-24-007-0024. Katse-eeskiri „In Vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT). For Use with MatTek Corporation’s Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm™“.

(36)	Standardne töökord mudeli SkinEthic™ RHE jaoks (jaanuar 2012). Andmebaasi INVITTOX katse-eeskiri „SkinEthic™ Skin Corrosivity Test“.

(37)	Standardne töökord mudeli EpiCS® jaoks (jaanuar 2012). Versioon 4.1. In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test: Epidermal Skin Test 1000 (epiCS®) CellSystems.

(38)

Alépée, N., Barroso, J., De Smedt, A., De Wever, B., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K. R., Millet, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Templier, M., ja McNamee, P. (2015). Use of HPLC/UPLC-Spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)-Based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29: 741–761.

(39)	USA Toidu- ja Ravimiamet (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. USA tervishoiu- ja sotsiaalteenuste ministeerium, Toidu- ja Ravimiamet (mai 2001). Kättesaadav aadressil [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

1. liide

MÕISTED

ET50 – näitaja, mille hinnangulise väärtuse leidmiseks tehakse kindlaks kokkupuuteperiood, mille jooksul rakkude eluvõimelisus väheneb teatava kindlaksmääratud kontsentratsiooniga võrdluskemikaaliga töötlemise tagajärjel 50 % võrra; vt ka mõistet IC50.

GHS (ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem) – süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ainete ja segude) klassifitseerimine vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud liigile ja tasemele ning mis hõlmab selliseid asjaomaseid teavituselemente nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ning keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku toime kohta (1).

HPLC – kõrgefektiivne vedelikkromatograafia.

IC50 – näitaja, mille hinnangulise väärtuse leidmiseks tehakse kindlaks kontsentratsioon, mille juures võrdluskemikaal vähendab teatava kindlaksmääratud kokkupuuteperioodi jooksul kudede eluvõimelisust 50 % võrra; vt ka mõistet ET50.

Kemikaal – aine või segu.

Lõpmata suur annus – marrasknahale kantud uuritava kemikaali kogus, mis on suurem kui marrasknaha pinna täielikuks ja ühtlaseks katmiseks vajalik kogus.

Mitmest koostisosast koosnev aine – – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja milles enam kui ühe põhikoostisosa sisaldus on suurem kui 10, kuid väiksem kui 80 massiprotsenti. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse tootmisprotsessi tulemusena. Erinevus segu ja mitmest koostisosast koosneva aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokkusegamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.

MS – mittesöövitav.

MTT – 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid; tiasolüülsinise tetrasooliumbromiid.

Mõõtmistsükkel – ühe või mitme uuritava kemikaali analüüsimine negatiivse ja positiivse kontrolliga paralleelselt.

NSCelus-kontroll – eluskudede mittespetsiifilist värvumist kajastav kontroll.

NSCsurmatud-kontroll – surmatud kudede mittespetsiifilist värvumist kajastav kontroll.

NSMTT – MTT mittespetsiifiline redutseerumine.

Positiivne kontroll – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida on töödeldud kemikaaliga, millega teadaolevalt saadakse positiivne tulemus. Positiivse tulemuse väärtus ei tohiks olla liiga suur, et võimaldada hinnata positiivse kontrolliga saadud tulemuste varieeruvust ajas.

Rakkude eluvõimelisus – näitaja, mis väljendab rakupopulatsiooni summaarset aktiivsust, näiteks raku mitokondri dehüdrogenaaside võimet redutseerida vitaalvärvainet MTT (3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid; tiasolüülsinine), ning mis olenevalt mõõdetavast lõppnäitajast ja kasutatavast katseplaanist korreleerub elusrakkude üldarvu ja/või elujõulisusega.

Segu – kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus, mille koostisained ei reageeri üksteisega.

UPLC – ülikõrgefektiivne vedelikkromatograafia.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Ühest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja mille ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

2. liide

NAHASÖÖVITUSE HINDAMISEKS VALIDEERITUD INIMESE REKONSTRUEERITUD MARRASKNAHA KATSEMUDELITE PÕHIELEMENDID

Katsemudeli elemendid

EpiSkin™

EpiDerm™SCT

SkinEthic™ RHE

epiCS®

Mudeli pindala

0,38 cm2

0,63 cm2

0,5 cm2

0,6 cm2

Paralleelsete koeproovide arv

Vähemalt 2 iga kokkupuuteperioodi kohta

2–3 iga kokkupuuteperioodi kohta

Vähemalt 2 iga kokkupuuteperioodi kohta

Töötlemisel kasutatavad annused ja pealekandmine

Vedelikud ja viskoossed kemikaalid: 50 ± 3 μl (131,6 μl/cm2)

Tahked kemikaalid: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 ± 5μl NaCl lahust (9 g/l)

Vahajad/kleepuvad kemikaalid: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) nailonvõrgu abil

Vedelikud: 50 μl (79,4 μl/cm2) nailonvõrgu abil või ilma selleta

Eelkatsega kontrollitakse, kas uuritav kemikaal sobib kasutamiseks koos nailonvõrguga

Pooltahked kemikaalid: 50 μl (79,4 μl/cm2)

Tahked kemikaalid: 25 μl H2O (või vajaduse korral rohkem) + 25 mg (39,7 mg/cm2)

Vahad: koe pinnale, mida on niisutatud 15 μl H2O-ga, asetatakse lame ketasjas tükk läbimõõduga umbes 8 mm

Vedelikud ja viskoossed kemikaalid: 40 ± 3μl (80 μl/cm2) nailonvõrgu abil

Eelkatsega kontrollitakse, kas uuritav kemikaal sobib kasutamiseks koos nailonvõrguga

Tahked kemikaalid: 20 ± 2μl H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2)

Vahajad/kleepuvad kemikaalid: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) nailonvõrgu abil

Vedelikud: 50 μl (83,3 μl/cm2) nailonvõrgu abil

Eelkatsega kontrollitakse, kas uuritav kemikaal sobib kasutamiseks koos nailonvõrguga

Pooltahked kemikaalid: 50 μl (83,3 μl/cm2)

Tahked kemikaalid: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 μl H2O (või vajaduse korral rohkem)

Vahajad kemikaalid: koe pinnale, mida on niisutatud 15 μl H2O-ga, asetatakse lame küpsisekujuline tükk läbimõõduga umbes 8 mm

Eelkontroll MTT otsese redutseerimise suhtes

50 μl (vedelikud) või 20 mg (tahkised)+ 2 ml MTT

lahust (0,3 mg/ml); inkubeeritakse 180 ± 5 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

→ Kui lahus muutub siniseks/lillaks, tuleks kasutada veega surmatud kohandatud kontrollkudesid

50 μl (vedelikud) või 25 mg (tahkised)+ 1 ml MTT

lahust (1 mg/ml); inkubeeritakse 60 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

→ Kui lahus muutub siniseks/lillaks, tuleks kasutada külmutamise teel surmatud kohandatud kontrollkudesid

40 μl (vedelikud) või 20 mg (tahkised)+ 1 ml MTT

lahust (1 mg/ml); inkubeeritakse 180 ± 15 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

→ Kui lahus muutub siniseks/lillaks, tuleks kasutada külmutamise teel surmatud kohandatud kontrollkudesid

50 μl (vedelikud) või 25 mg (tahkised)+ 1 ml MTT

lahust (1 mg/ml); inkubeeritakse 60 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

→ Kui lahus muutub siniseks/lillaks, tuleks kasutada külmutamise teel surmatud kohandatud kontrollkudesid

Eelkontroll värvusest tuleneva segava mõju suhtes

10 μl (vedelikud) või 10 mg (tahkised) + 90 μl H2O; inkubeeritakse segamisega 15 minutit toatemperatuuril

→ Kui lahus värvub, tuleks kasutada kohandatud kontrollina eluskudesid

50 μl (vedelikud) või 25 mg (tahkised) + 300 μl H2O; inkubeeritakse 60 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

→ Kui lahus värvub, tuleks kasutada kohandatud kontrollina eluskudesid

40 μl (vedelikud) või 20 mg (tahkised) + 300 μl H2O; inkubeeritakse segamisega 60 minutit toatemperatuuril

→ Kui uuritav kemikaal on värviline, tuleks kasutada kohandatud kontrollina eluskudesid

50 μl (vedelikud) või 25 mg (tahkised) + 300 μl H2O; inkubeeritakse 60 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

→ Kui lahus värvub, tuleks kasutada kohandatud kontrollina eluskudesid

Kokkupuuteperioodid ja -temperatuurid

3 minutit, 60 minutit (± 5 minutit) ja 240 minutit (± 10 minutit)

ventileeritud kapis toatemperatuuril (18–28 °C)

3 minutit toatemperatuuril ja 60 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

Loputamine

25 ml 1 x PBS-ga (2 ml loputuskorra kohta)

20 korda 1 x PBS-i katkematu nõrga joa all

Negatiivne kontroll

50 μl NaCl lahust (9 g/l)

Kasutatakse iga kokkupuuteperioodi puhul

50 μl H2O

Kasutatakse iga kokkupuuteperioodi puhul

40 μl H2O

Kasutatakse iga kokkupuuteperioodi puhul

50 μl H2O

Kasutatakse iga kokkupuuteperioodi puhul

Positiivne kontroll

50 μl jää-äädikhapet

Kasutatakse üksnes neljatunnisel inkubeerimisel

50 μl 8 N KOH

Kasutatakse iga kokkupuuteperioodi puhul

40 μl 8 N KOH

Kasutatakse üksnes ühetunnisel inkubeerimisel

50 μl 8 N KOH

Kasutatakse iga kokkupuuteperioodi puhul

MTT lahus

2 ml kontsentratsiooniga 0,3 mg/ml

300 μl kontsentratsiooniga 1 mg/ml

MTT-ga inkubeerimise aeg ja temperatuur

180 minutit (± 15 minutit) 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

180 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

180 minutit (± 15 minutit) 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

180 minutit 37 °C juures atmosfääris, mis sisaldab 5 % CO2 ja mille suhteline niiskus on 95 %

Ekstraheerimislahusti

500 μl hapestatud isopropanooli

(0,04 N HCl isopropanoolis)

(eraldatud kude on lahusega täielikult kaetud)

2 ml isopropanooli

(ekstraheeritakse inserdi üla- ja alapoolelt)

1,5 ml isopropanooli

(ekstraheeritakse inserdi üla- ja alapoolelt)

2 ml isopropanooli

(ekstraheeritakse inserdi üla- ja alapoolelt)

Ekstraheerimisperiood ja -temperatuur

Öö läbi toatemperatuuril valguse eest kaitstuna

Loksutamiseta öö läbi toatemperatuuril või loksutamisega (~120 pööret minutis) 120 minutit toatemperatuuril

Optilise tiheduse mõõtmine

570 nm (545–595 nm), võrdlusfiltrita

570 nm (või 540 nm), võrdlusfiltrita

570 nm (540–600 nm), võrdlusfiltrita

540–570 nm, võrdlusfiltrita

Kudede kvaliteedikontroll

18-tunnine töötlus SDS-ga

1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,0 mg/ml

Töötlemine 1 % Triton X-100-ga

4,08 tundi ≤ ET50 ≤ 8,7 tundi

Töötlemine 1 % Triton X-100-ga

4,0 tundi ≤ ET50 ≤ 10,0 tundi

Töötlemine 1 % Triton X-100-ga

2,0 tundi ≤ ET50 ≤ 7,0 tundi

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

1.	Negatiivse kontrolliga (NaCl) töödeldud paralleelsete koeproovidega saadud optilise tiheduse keskväärtus peaks iga kokkupuuteperioodi puhul jääma vahemikku 0,6–1,5

2.	Positiivse kontrolliga (jää-äädikhape) 4 tunni vältel töödeldud paralleelsetes koeproovides täheldatud eluvõimelisuse keskväärtus, väljendatuna protsentuaalse osakaaluna negatiivse kontrolliga saadud väärtusest, peaks olema ≤ 20 %

3.	Kahes paralleelses koeproovis täheldatud eluvõimelisuse erinevus ei tohiks eluvõimelisuse vahemikus 20–100 % ja optilise tiheduse väärtustel ≥ 0,3 olla suurem kui 30 %

1.	Negatiivse kontrolliga (H2O) töödeldud paralleelsete koeproovidega saadud optilise tiheduse keskväärtus peaks iga kokkupuuteperioodi puhul jääma vahemikku 0,8–2,8

2.	Positiivse kontrolliga (8 N KOH) 1 tunni vältel töödeldud paralleelsetes koeproovides täheldatud eluvõimelisuse keskväärtus, väljendatuna protsentuaalse osakaaluna negatiivse kontrolliga saadud väärtusest, peaks olema < 15 %

3.	Paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste variatsioonikordaja peaks eluvõimelisuse vahemikus 20–100 % olema ≤ 30 %

1.	Negatiivse kontrolliga (H2O) töödeldud paralleelsete koeproovidega saadud optilise tiheduse keskväärtus peaks iga kokkupuuteperioodi puhul jääma vahemikku 0,8–3,0

2.	Positiivse kontrolliga (8 N KOH) 1 tunni vältel (ja vajaduse korral 4 tunni vältel) töödeldud paralleelsetes koeproovides täheldatud eluvõimelisuse keskväärtus, väljendatuna protsentuaalse osakaaluna negatiivse kontrolliga saadud väärtusest, peaks olema < 15 %

3.	Kahes paralleelses koeproovis täheldatud eluvõimelisuse erinevus ei tohiks eluvõimelisuse vahemikus 20–100 % ja optilise tiheduse väärtustel ≥ 0,3 olla suurem kui 30 %

1.	Negatiivse kontrolliga (H2O) töödeldud paralleelsete koeproovidega saadud optilise tiheduse keskväärtus peaks iga kokkupuuteperioodi puhul jääma vahemikku 0,8–2,8

2.	Positiivse kontrolliga (8 N KOH) 1 tunni vältel töödeldud paralleelsetes koeproovides täheldatud eluvõimelisuse keskväärtus, väljendatuna protsentuaalse osakaaluna negatiivse kontrolliga saadud väärtusest, peaks olema < 20 %

3.	Kahes paralleelses koeproovis täheldatud eluvõimelisuse erinevus ei tohiks eluvõimelisuse vahemikus 20–100 % ja optilise tiheduse väärtustel ≥ 0,3 olla suurem kui 30 %

3. liide

KATSEMUDELITE USALDUSVÄÄRSUS ALAMKATEGOORIATESSE LIIGITAMISEL

Allpool tabelis on esitatud kõnealust nelja katsemudelit iseloomustavad tulemusnäitajad, mis on arvutatud lähtuvalt nende mudelite väljatöötajate katseandmetest 80 analüüsitud kemikaali kohta Arvutused on teinud OECD sekretariaat ning need on läbi vaadanud ja heaks kiitnud asjaomane ekspertide allrühm (21, 23).

Katsemudelid EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™ ja epiCS® võimaldavad liigitamist alamkategooriatesse (st 1A alamkategooriasse, 1B ja 1C ühiskategooriasse ning mittesöövitavaks).

Nimetatud nelja katsemudelit iseloomustavad tulemusnäitajad, üleklassifitseerimise ja alaklassifitseerimise määrad ning täpsus (ennustusjõud), mis põhinevad andmetel 80 kemikaali kohta, millest igaühte on iga katsemudeli puhul analüüsitud 2 või 3 mõõtmistsüklis, on järgmised.

STATISTILISED ANDMED KÕIKIDE ANALÜÜSITUD KEMIKAALIDE PUHUL TEHTUD PROGNOOSIDE KOHTA

(80 kemikaali analüüsiti mudeli epiCS® puhul 2 sõltumatus mõõtmistsüklis ning mudelite EpiDerm™ SCT, EpiSkin™ ja SkinEthic™ RHE puhul 3 sõltumatus mõõtmistsüklis, st saadi vastavalt 159 (*2) või 240 liigitamistulemust)

	EpiSkin™	EpiDerm™	SkinEthic™	epiCS®
Üleklassifitseerimine:
1B ja 1C ühiskategooria kemikaali üleklassifitseerimine 1A alamkategooriasse	21,50 %	29,0 %	31,2 %	32,8 %
MS kemikaali üleklassifitseerimine 1B ja 1C ühiskategooriasse	20,7 %	23,4 %	27,0 %	28,4 %
MS kemikaali üleklassifitseerimine 1A alamkategooriasse	0,00 %	2,7 %	0,0 %	0,00 %
Söövitavaks kemikaaliks üleklassifitseerimine	20,7 %	26,1 %	27,0 %	28,4 %
Üldine üleklassifitseerimise määr (kõikide kategooriate lõikes)	17,9 %	23,3 %	24,5 %	25,8 %
Alaklassifitseerimine:
1A alamkategooria kemikaali alaklassifitseerimine 1B ja 1C ühiskategooriasse	16,7 %	16,7 %	16,7 %	12,5 %
1A alamkategooria kemikaali alaklassifitseerimine MS-ks	0,00 %	0,00 %	0,00 %	0,00 %
1B ja 1C ühiskategooria kemikaali alaklassifitseerimine MS-ks	2,2 %	0,00 %	7,5 %	6,6 %
Üldine alaklassifitseerimise määr (kõikide kategooriate lõikes)	3,3 %	2,5 %	5,4 %	4,4 %
Õigesti liigitamine:
Õigesti liigitamine 1A alamkategooriasse	83,3 %	83,3 %	83,3 %	87,5 %
Õigesti liigitamine 1B ja 1C ühiskategooriasse	76,3 %	71,0 %	61,3 %	60,7 %
Õigesti liigitamine MS-ks	79,3 %	73,9 %	73,0 %	71,62 %
Üldine täpsus	78,8 %	74,2 %	70 %	69,8 %

MS – mittesöövitav

4. liide

HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteemi nõuetekohasuse kriteeriumid ja põhinäitajad inimese rekonstrueeritud marrasknahast ekstraheeritud MTT formasaani määramise võimaldamiseks

Näitaja

USA Toidu- ja Ravimiameti suunistel põhinev katse-eeskiri (37, 38)

Nõuetekohasuse kriteeriumid

Selektiivsus

Isopropanooli, eluskudede tühiproovi (isopropanooliekstrakt inimese rekombineeritud marrasknaha eluskudedest, mida ei ole ühelgi viisil töödeldud) ja surmatud kudede tühiproovi (isopropanooliekstrakt inimese rekombineeritud marrasknaha surmatud kudedest, mida ei ole ühelgi viisil töödeldud) analüüsimine

Segavale signaalile vastav pindala on ≤ 20 % LLOQ-le (13) vastavast pindalast

Kordustäpsus

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused (st MTT formasaan kontsentratsioonis 1,6 μg/ml, 16 μg/ml ja 160 μg/ml) isopropanoolis (n = 5)

Variatsioonikordaja on LLOQ puhul ≤ 15 % või ≤ 20 %

Mõõtetäpsus

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 5)

Hälve on ≤ 15 % või LLOQ puhul ≤ 20 %

Maatriksiefekt

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused eluskudede tühiproovis (n = 5)

85 % ≤ maatriksiefekt ≤ 115 %

Ülekandumine

Isopropanooli analüüsimine pärast ULOQ2 puhul kasutatavat standardit (14)

Segavale signaalile vastav pindala on ≤ 20 % LLOQ-le vastavast pindalast

Reprodutseeritavus (samal päeval)

3 sõltumatut kaliibrimiskõverat, mis põhinevad MTT formasaani kuuel järjestikusel 1: 3 lahjendusel isopropanoolis alates ULOQ-st, st kontsentratsioonist 200 μg/ml;

kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 5)

Kaliibrimiskõverad: hälve on ≤ 15 % või LLOQ puhul ≤ 20 %

Kvaliteedikontrolli proovid: hälve on ≤ 15 % ja variatsioonikordaja ≤ 15 %

Reprodutseeritavus (eri päevade lõikes)

1. päev	:	1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 3)
2. päev	:	1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 3)
3. päev	:	1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 3)

MTT formasaani lühiajaline püsivus inimese rekonstrueeritud marrasknaha koeekstraktis

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused eluskudede tühiproovis (n = 3); analüüsitakse valmistamise päeval ja pärast 24-tunnist toatemperatuuril säilitamist

Hälve on ≤ 15 %

MTT formasaani pikaajaline püsivus inimese rekonstrueeritud marrasknaha koeekstraktis (vajaduse korral)

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused eluskudede tühiproovis (n = 3); analüüsitakse valmistamise päeval ja pärast mitmepäevast säilitamist kindlaksmääratud temperatuuril (nt 4oC, –20oC, –80oC)

Hälve on ≤ 15 %

“

B osas asendatakse peatükk B.46 järgmisega:

„B.46. IN VITRO NAHAÄRRITUS: INIMESE REKONSTRUEERITUD MARRASKNAHAL PÕHINEV KATSEMEETOD

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 439 (2015). Nahaärrituse all mõistetakse pöörduva nahakahjustuse tekkimist pärast kuni 4 tunni pikkust uuritava kemikaaliga töötlemist, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (1) ning Euroopa Liidu (EL) määruses nr 1272/2008, milles käsitletakse ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (edaspidi „CLP-määrus“) (15). Käesoleva katsemeetodi näol on tegemist in vitro meetodiga, mida võib kasutada ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 2. kategooriasse kuuluvate ärritavate kemikaalidega (ainete ja segudega) seotud ohu tuvastamiseks (2). Piirkondades, kus ei kasutata ÜRO GHSi kohast vabatahtlikult kohaldatavat 3. kategooriat (nõrgalt ärritavad kemikaalid), võib käesolevat katsemeetodit kasutada ka liigitamata kemikaalide toime kindlakstegemiseks. Sellest tulenevalt võib käesolevat katsemeetodit sõltuvalt kohaldatavast õigusraamistikust ja klassifitseerimissüsteemist kasutada kemikaalide nahka ärritava toime kindlakstegemisel kas eraldi meetodina in vivo nahaärrituse hindamise meetodite asendamiseks või katsestrateegia raames kohaldatava osalist asendamist võimaldava meetodina (3).

Nahaärrituse hindamisel on tavapäraselt kasutatud laboriloomi (katsemeetod B.4, mis on samaväärne algselt 1981. aastal vastu võetud ning aastatel 1992, 2002 ja 2015 muudetud OECD katsejuhendiga nr 404) (4). Söövitava toime hindamiseks on vastu võetud kolm valideeritud in vitro katsemeetodit: ELi katsemeetodid B.40 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 430), B.40b (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 431) ja B.65 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 435) (5, 6, 7). OECD juhenddokumendis nahasöövituse ja -ärrituse puhul kasutatava katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta kirjeldatakse mitut moodulit, milles teabeallikad ja analüüsivahendid on rühmitatud, ning i) antakse suuniseid, kuidas lõimida ja kasutada olemasolevaid katse- ja muid andmeid kemikaalide võimaliku nahka ärritava ja nahka söövitava toime hindamiseks ja ii) pakutakse välja lähenemisviis juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid (3).

Käesolevas katsemeetodis on käsitletud inimtervisega seotud lõppnäitajana nahaärritust. Selle meetodi puhul lähtutakse in vitro katsesüsteemist, mis põhineb inimese rekonstrueeritud marrasknahal, mis on oma biokeemiliste ja füsioloogiliste omaduste poolest väga sarnane inimese naha pealmiste kihtidega, st marrasknahaga. Inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevas katsesüsteemis kasutatakse rakkude allikana inimese transformeerumata keratinotsüüte, mille abil luuakse representatiivsete histoloogiliste omaduste ja representatiivse rakulise ülesehitusega rekonstrueeritud marrasknaha mudel. Vastavalt OECD juhenddokumendis nr 34 sätestatud põhimõtetele on kehtestatud tulemuslikkuse standardid, mis hõlbustavad inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevate sarnaste ja muudetud katsemeetodite valideerimist ja hindamist (8, 9). Vastavasisuline katsejuhend võeti algselt vastu 2010. aastal ja seda ajakohastati 2013. aastal, et lisada täiendavad inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelid, samuti 2015. aastal, et lisada viide juhenddokumendile katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta ning võimaldada ühe eluvõimelisuse mõõtmiseks sobiva alternatiivse meetodi kasutuselevõttu.

Praeguseks on viidud läbi valideerimiseelsed, optimeerimis- ja valideerimisuuringud nelja turul kättesaadava in vitro katsemudeliga (10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28), mille puhul kasutatakse inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevat katsesüsteemi (tundlikkus 80 %, spetsiifilisus 70 % ja täpsus 75 %). Kõnealust nelja katsemudelit on kirjeldatud käesolevas katsemeetodis ja need on loetletud 2. liites, kus on ühtlasi esitatud teave vastavate meetodite valideerimiseks kasutatud valideerimisuuringute liigi kohta. Nagu on märgitud 2. liites, on käesoleva katsemeetodi ja tulemuslikkuse standardite (8) väljatöötamiseks kasutatud valideeritud standardmeetodit (VSM).

OECD otsuse kohane andmete vastastikune tunnustamine on tagatud üksnes selliste katsemudelite puhul, mis on valideeritud vastavuses tulemuslikkuse standarditega (8), ning üksnes juhul, kui OECD on sellised mudelid läbi vaadanud ja vastu võtnud. In vitro nahaärrituse hindamise meetoditega saadavaid katsetulemusi käsitlevate siseriiklike nõuete järgimiseks võib kasutada ükskõik millist käesolevasse katsemeetodisse ja vastavasse OECD katsejuhendisse lisatud katsemudelit ning seejuures saadakse kasu andmete vastastikusest tunnustamisest.

Käesolevas dokumendis kasutatud mõistete määratlused on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Nagu nähtub inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevate katsemeetodite hindamiseks ja iseloomustamiseks läbi viidud täismahus prospektiivsest valideerimisuuringust (16), on üks käesoleva katsemeetodiga seotud piirangutest see, et meetod ei võimalda liigitada kemikaale vabatahtlikult kohaldatavasse ÜRO GHSi kohasesse 3. kategooriasse (nõrgalt ärritavad kemikaalid) (1). Sellest tulenevalt määratakse käesoleva katsemeetodi kasutusviis kindlaks asjaomases liikmesriigis kohaldatava õigusraamistikuga. ELis ei ole 3. kategooriat CLP-määruses kasutusele võetud. Ühekordse nahakaudse kokkupuute järel nahale avalduva lokaalse toime täielikku hindamist on kirjeldatud OECD juhenddokumendis katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (3). Inimese naha kasutamine toimub mõistagi kooskõlas asjaomases riigis kehtivate ja rahvusvaheliste eetiliste tõekspidamiste ja tingimustega.

Käesolevas katsemeetodis on käsitletud inimtervisega seotud lõppnäitajana nahaärritust. Ehkki käesolev katsemeetod ei võimalda saada piisavat teavet nahasöövituse kohta, tuleks tähele panna, et nahasöövitust käsitlev katsemeetod B.40b (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 431) põhineb samal inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsesüsteemil, ehkki seal kasutatakse teistsugust katse-eeskirja (6). Käesolev katsemeetod põhineb inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelitel, mille puhul kasutatakse inimese keratinotsüüte ja mis seega kajastavad huvipakkuva liigi sihtelundi omadusi in vitro. Peale selle hõlmab see meetod otseselt in vivo nahaärrituse puhul täheldatava põletikukaskaadi/toimemehhanismi algetappi (raku- ja koekahjustus, mille tulemusena tekib lokaalne trauma). Käesoleva katsemeetodi valideerimiseks uuriti paljusid eri kemikaale; valideerimisuuringu andmebaasis on kokku 58 kemikaali (16, 18, 23). Meetodit saab kasutada tahkete ainete, vedelike, pooltahkete ainete ja vahade puhul. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahustuvad või lahustumatud. Võimaluse korral tuleks tahked ained enne kasutamist peeneks pulbriks jahvatada; proovi muul viisil eeltöötlemine ei ole vajalik. Gaase ja aerosoole ei ole valideerimisuuringu raames veel hinnatud (29). Ehkki on võimalik, et neidki saab uurida inimese rekonstrueeritud marrasknaha kasutamisel põhineva tehnoloogia abil, ei võimalda praegune katsemeetod gaaside ega aerosoolide uurimist.

Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud. Ent kuna segud kuuluvad paljudesse eri kategooriatesse ja on eri koostisega ning nende kasutamise kohta katses on praegu piiratud hulgal teavet, tuleks juhul, kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa teatud kindla kategooria segude puhul kasutada (nt strateegia abil, mille on 2012. aastal välja pakkunud Eskes et al. (30)), hoiduda selle kasutamisest sellise kategooria segude puhul. Samamoodi tuleks olla ettevaatlik, kui teatud kindlasse klassi kuuluvate või teatavate füüsikalis-keemiliste omadustega kemikaalide puhul täheldatakse, et käesolevat katsemeetodit ei saa nende uurimiseks kohaldada.

10.

11.

Kui uuritava kemikaali liigitamisel saadakse ühene tulemus, piisab ühest mõõtmistsüklist, kus on kasutatud kolme paralleelset koeproovi. Ebaselgete tulemuste puhul – näiteks kui paralleelproovidega saadud mõõtmisandmed lahknevad ja/või keskmine eluvõimelisus on 50 ± 5 % – tuleks kaaluda vajadust viia läbi veel üks mõõtmistsükkel ning esimeses kahes mõõtmistsüklis saadud tulemuste lahknevuse korral veel kolmaski mõõtmistsükkel.

KATSE PÕHIMÕTE

12.

13.

Kemikaali tekitatud nahaärritus, mis avaldub peamiselt punetuse ja tursena, on põhjustatud sellisest sündmuste kaskaadist, mis algab kemikaali läbitungimisega sarvkihist ning sellega kaasneda võiva sarvkihialuste keratinotsüütide ja muude naharakkude kihtide kahjustumisega. Kahjustatud rakkudest võivad vabaneda põletikku vahendavad ained või sellised rakud võivad kutsuda esile põletikureaktsioonide kaskaadi, mis mõjutab ka pärisnaha rakke, eelkõige veresoonte strooma- ja endoteelirakke. Veresoonte laienemine ja endoteelirakkude läbilaskvuse suurenemine põhjustabki nähtava punetuse ja turse (29). Ehkki inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevate katsemeetodite puhul puuduvad in vitro katsesüsteemis veresooned, hinnatakse nende meetoditega kõnealust kaskaadi vallandavaid sündmusi, näiteks raku- või koekahjustust (16, 17), mille näitajana kasutatakse rakkude eluvõimelisust.

14.

Inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevates mudelites jälgitakse rakkude eluvõimelisuse hindamiseks vitaalvärvaine MTT (3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid; tiasolüülsinine; CASi number: 298-93-1) ensümaatilist muundumist siniseks formasaansoolaks, mida mõõdetakse kvantitatiivselt pärast kudedest ekstraheerimist (31). Ärritavad kemikaalid tehakse kindlaks nende võime järgi vähendada rakkude eluvõimelisust nii palju, et see jääb allapoole kindlaksmääratud läviväärtust (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase 2. kategooria kemikaalide puhul on see ≤ 50 %). Kemikaalid, mille puhul rakkude eluvõimelisus on kindlaksmääratud läviväärtusest suurem (st > 50 %), võidakse olenevalt asjaomasest õigusraamistikust ja katsemeetodi kohaldatavusest tunnistada mitteärritavaks (kategoriseerimata) kemikaaliks.

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

15.

Enne käesoleva katsemeetodi kohasest neljast valideeritud katsemudelist (2. liide) ükskõik millise regulaarset kasutamist tuleks labori tehnilise pädevuse tõendamiseks kasutada kümmet tabelis 1 loetletud pädevusainet. Kui näiteks mõni loetletud ainetest ei ole kättesaadav, võib kasutada mõnda muud ainet, mille kohta on olemas piisavad in vivo ja in vitro võrdlusandmed (nt võrdluskemikaalide loetelust (8) valitud ainet), ent üksnes juhul, kui kohaldatakse samu valikukriteeriume, nagu on kirjeldatud tabelis 1. Pädevuse tõendamiseks mõne muu aine kasutamine peaks olema põhjendatud.

16.

Pädevuse tõendamise osana soovitatakse kasutajal pärast kudede saabumist kontrollida nende toimivust kaitsekihina vastavalt inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva asjaomase mudeli tootja kirjeldusele. See on eriti oluline pärast kudede pikaajalist transporti või tarnet pika vahemaa taha. Pärast katsemeetodi edukat kasutuselevõttu ning selle kasutamises pädevuse omandamist ja selle tõendamist ei ole selline tavapärane kontrollimine enam vajalik. Meetodi regulaarse kasutamise korral soovitatakse siiski jätkata kaitsekihina toimivuse hindamist korrapäraste ajavahemike järel.

Tabel 1

Pädevusained (16)

Aine	CASi nr	In vivo hindamistulemus (17)	Füüsikaline olek	ÜRO GHSi kohane kategooria
KATEGORISEERIMATA AINED (ÜRO GHSi kohastesse kategooriatesse mittekuuluvad ained)
Naftüüläädikhape	86-87-3	0	Tahkis	Kategoriseerimata
Isopropanool	67-63-0	0,3	Vedelik	Kategoriseerimata
Metüülstearaat	112-61-8	1	Tahkis	Kategoriseerimata
Heptüülbutüraat	5870-93-9	1,7	Vedelik	Kategoriseerimata (vabatahtlikult kohaldatav 3. kategooria) (18)
Heksüülsalitsülaat	6259-76-3	2	Vedelik	Kategoriseerimata (vabatahtlikult kohaldatav 3. kategooria) (18)
KATEGORISEERITUD AINED (ÜRO GHSi kohase 2. kategooria ained)
3-p-kumenüül-2-metüülpropioonaldehüüd	103-95-7	2,3	Vedelik	2. kategooria
1-bromoheksaan	111-25-1	2,7	Vedelik	2. kategooria
Kaaliumhüdroksiid (5 % vesilahus)	1310-58-3	3	Vedelik	2. kategooria
1-metüül-3-fenüül-1-piperasiin	5271-27-2	3,3	Tahkis	2. kategooria
Heptanaal	111-71-7	3,4	Vedelik	2. kategooria

KATSE KÄIK

17.

Allpool on esitatud inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva, nahaärrituse hindamiseks kasutatava katsemeetodi elementide ja katse käigu kirjeldus (3. liites on esitatud ka iga katsemudeliga seotud parameetrid). Standardne töökord käesoleva katsemeetodi kohase nelja mudeli rakendamiseks on leitav kirjandusest (32, 33, 34, 35).

INIMESE REKONSTRUEERITUD MARRASKNAHAL PÕHINEVA KATSEMEETODI ELEMENDID

Üldtingimused

18.

Epiteelkoe rekonstrueerimiseks tuleks kasutada inimese transformeerumata keratinotsüüte. Talitlusvõimelise sarvkihi all peaks olema mitu kihti eluvõimelisi epiteelirakke (basaalkiht, ogakiht ja sõmerkiht). Sarvkiht peaks olema mitmekihiline ja sisaldama selliseid vajalikke lipiide, et moodustuks funktsionaalne kaitsekiht, mis suudab takistada tsütotoksiliste võrdluskemikaalide, näiteks naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) või Triton X-100 kiiret läbitungimist. Nimetatud kaitsekihina toimimist tuleks tõendada; selle hindamiseks võib teha kindlaks kontsentratsiooni, mille juures võrdluskemikaal vähendab kindlaksmääratud kokkupuuteaja vältel kudede eluvõimelisust 50 % võrra (IC50), või määrata kokkupuuteaja, mille vältel võrdluskemikaal vähendab teatud kindla kontsentratsiooni juures kudede eluvõimelisust 50 % võrra (ET50). Kasutatav inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudel peaks olema selline, et aine ei saaks jõuda eluskoeni sarvkihti läbimata, kuna vastasel korral ei ole nahakaudse kokkupuute mudeliga saadud tulemused usaldusväärsed. Kasutatav mudel ei tohiks olla saastunud bakterite, viiruste, mükoplasma ega seentega.

Funktsionaaltingimused

Eluvõimelisus

19.

Eluvõimelisuse kvantifitseerimiseks kasutatakse MTT-põhist meetodit (31). Vitaalvärvaine MTT redutseeritakse inimese rekonstrueeritud marrasknaha eluvõimelistes rakkudes siniseks sadestuvaks MTT formasaaniks, mis ekstraheeritakse seejärel koest isopropanooli (või muu sarnase lahusti) abil. Ekstraheerimiseks kasutatava lahusti enda optiline tihedus peaks olema piisavalt väike, st < 0,1. Ekstraheeritud MTT formasaani kvantifitseerimiseks võib kasutada kas tavapärast neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmist või HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat (36). Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli kasutajad peaksid tagama, et mudeli iga kasutatav partii vastab negatiivse kontrolli kindlaksmääratud kriteeriumidele. Nahaärrituse hindamiseks kasutatava katsemeetodi kohastes tingimustes saadavate negatiivse kontrolli optilise tiheduse väärtuste lubatud vahemiku (ülem- ja alampiiri) määrab kindlaks asjaomase inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/tarnija. Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud, inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva nelja valideeritud katsemudeli puhul lubatud väärtusevahemikud on esitatud tabelis 2. HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutaja peaks negatiivse kontrolli vastuvõetavuse kriteeriumina kasutama tabelis 2 negatiivse kontrolli kohta esitatud optilise tiheduse väärtusevahemikku. Tuleks dokumentaalselt tõendada, et negatiivse kontrolliga töödeldud koed on katses kasutatava kokkupuuteperioodi kestel kultuuris stabiilsed (nende eluvõimelisuse näitajad on sarnased).

Tabel 2

Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud katsemudelite puhul lubatud väärtusevahemikud negatiivse kontrolli optilise tiheduse jaoks

	Vastuvõetavate väärtuste alampiir	Vastuvõetavate väärtuste ülempiir
EpiSkin™ (SM)	≥ 0,6	≤ 1,5
EpiDerm™ SIT (EPI-200)	≥ 0,8	≤ 2,8
SkinEthic™ RHE	≥ 0,8	≤ 3,0
LabCyte EPI-MODEL24 SIT	≥ 0,7	≤ 2,5

Toimimine kaitsekihina

20.

Sarvkiht ja selle lipiidne koostis peavad olema sellised, et takistada tsütotoksiliste võrdluskemikaalide, näiteks SDSi või Triton X-100 kiiret läbitungimist; seda hinnatakse IC50 või ET50 alusel (tabel 3).

Morfoloogia

21.

Tuleks esitada asjaomase inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli histoloogilise analüüsi tulemused, et tõendada inimese marrasknahaga sarnaneva, muu hulgas mitmekihilist sarvkihti sisaldava struktuuri olemasolu.

Reprodutseeritavus

22.

Tuleks tõendada katsemeetodiga saadavate positiivseid ja negatiivseid kontrolle iseloomustavate tulemuste reprodutseeritavust pikema aja jooksul.

Kvaliteedikontroll

23.

Asjaomast inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelit tuleks kasutada üksnes juhul, kui selle väljatöötaja/tarnija on tõendanud, et kasutatava mudeli iga partii vastab tootele kehtestatud kvaliteedikriteeriumidele, mille hulgas kõige olulisemad on eluvõimelisuse (punkt 19), kaitsekihina toimivuse (punkt 20) ja morfoloogiaga (punkt 21) seotud kriteeriumid. Sellised andmed tuleks esitada meetodi kasutajatele, et nad saaksid lisada selle teabe katseprotokolli. IC50 või ET50 väärtuste lubatud vahemiku (ülem- ja alampiiri) peaks kindlaks määrama inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/tarnija. Ärritavate kemikaalide liigituse usaldusväärse prognoosimise eesmärgil on vastuvõetavad üksnes sellised tulemused, mis on saadud kvaliteedikontrolli edukalt läbinud kudedega. Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud nelja katsemudeli puhul lubatud väärtusevahemikud on esitatud tabelis 3.

Tabel 3

Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud katsemudeleid käsitlevad partii kvaliteedikontrolli kriteeriumid

	Vastuvõetavate väärtuste alampiir	Vastuvõetavate väärtuste ülempiir
EpiSkin™ (SM) (18-tunnine töötlus SDS-ga) (32)	IC50 = 1,0 mg/ml	IC50 = 3,0 mg/ml
EpiDerm™ SIT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (33)	ET50 = 4,0 tundi	ET50 = 8,7 tundi
SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (34)	ET50 = 4,0 tundi	ET50 = 10,0 tundi
LabCyte EPI-MODEL24 SIT (18-tunnine töötlus SDS-ga) (35)	IC50 = 1,4 mg/ml	IC50 = 4,0 mg/ml

Uuritava kemikaali ja kontrollkemikaalidega töötlemine

24.

Iga uuritava kemikaali ja kontrolli puhul tuleks igas mõõtmistsüklis kasutada vähemalt kolme paralleelproovi. Nii vedelate kui ka tahkete kemikaalide puhul tuleks töötlemiseks kasutada piisavat kogust uuritavat kemikaali, et marrasknaha pind saaks ühtlaselt kaetud, ent seejuures tuleks hoiduda lõpmata suure annuse kasutamisest; see tähendab, et kemikaali tuleks peale kanda koguses 26–83 μl/cm2 või mg/cm2 (vt 3. liide). Tahke kemikaali puhul tuleks marrasknaha pinda enne kemikaali pealekandmist niisutada deioniseeritud või destilleeritud veega, et parandada uuritava kemikaali kontakti marrasknaha pinnaga. Võimaluse korral tuleks tahket kemikaali kasutada peene pulbri kujul. Mõnel juhul võib ühtlasema jaotuse saavutamiseks kasutada nailonvõrku (vt 3. liide). Kokkupuuteperioodi lõppedes tuleks uuritav kemikaal veepõhise puhverlahuse või 0,9 % NaCl lahusega marrasknaha pinnalt hoolikalt maha pesta. Sõltuvalt kasutatavast inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsemudelist on kokkupuuteperioodi pikkus 15–60 minutit ja inkubeerimistemperatuur 20–37 °C. Iga konkreetse katsemudeli jaoks tehakse kindlaks optimaalne kokkupuuteperiood ja -temperatuur, mis vastavad asjaomast mudelit iseloomustavatele eriomadustele (näiteks toimivus kaitsekihina) (vt 3. liide).

25.

Rakkude eluvõimelisuse mõõtmine

26.

Vastavalt katse-eeskirjale on väga oluline, et eluvõimelisust mõõdetakse mitte vahetult pärast uuritava kemikaaliga kokku puutumist, vaid pärast töötlemisjärgset piisavalt pikaajalist puhtaks loputatud koe inkubeerimist värskes söötmes. Selline inkubeerimine võimaldab nõrgast tsütotoksilisest toimest taastuda ja selgel tsütotoksilisel toimel esile tulla. Käesoleva katsemeetodi aluseks olevatest inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevatest katsemudelitest kahe puhul leiti meetodi optimeerimise käigus, et optimaalne töötlemisjärgne inkubeerimisperiood on 42 tundi (11, 12, 13, 14, 15).

27.

Käesoleva katsemeetodi raames tuleks rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks kasutada kvantitatiivset MTT-põhist standardmeetodit. See sobib kasutamiseks kolmemõõtmelise koestruktuuri puhul. Koeproov asetatakse kolmeks tunniks sobiva kontsentratsiooniga (nt 0,3–1 mg/ml) MTT lahusesse. MTT muundatakse eluvõimelistes rakkudes siniseks formasaaniks. Sadestunud sinine formasaan ekstraheeritakse seejärel lahusti (näiteks isopropanooli või hapestatud isopropanooli) abil ning formasaani kontsentratsiooni määramiseks mõõdetakse lahuse optiline tihedus lainepikkusel 570 nm – seejuures kasutatakse filtrit ribalaiusega kuni ± 30 nm – või rakendatakse HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat (vt punkt 34) (36).

28.

Uuritava kemikaali optilised omadused või keemiline reageerimine MTTga (näiteks võib kemikaal takistada värvuse teket või põhjustada selle kadu või hoopis selle avaldumist) võivad määramist segada ja põhjustada vigu eluvõimelisuse hindamisel. See võib juhtuda, kui uuritavat kemikaali ei ole loputamise teel koepinnalt täielikult eemaldatud või kui see on tunginud marrasknahka. Kui uuritav kemikaal reageerib otse MTTga (näiteks redutseerib MTTd), on värviline või muutub värviliseks koega kokku puutumisel, tuleks kemikaali põhjustatud, eluvõimelisuse mõõtmist segava mõju tuvastamiseks ja tulemuste korrigeerimiseks kasutada täiendavaid kontrolle (vt punktid 29 ja 33). Üksikasjalik kirjeldus selle kohta, kuidas korrigeerida tulemusi MTT otsese redutseerimise ja värvust muutvate ainete mõju suhtes, on esitatud käesoleva katsemeetodiga hõlmatud nelja valideeritud mudelit käsitlevates standardse töökorra dokumentides (32, 33, 34, 35).

29.

MTT otseste redutseerijate tuvastamiseks tuleks lisada iga uuritavat kemikaali värskelt valmistatud MTT lahusesse. Kui MTT lahus värvub uuritava kemikaali toimel siniseks/lillaks, siis käsitatakse asjaomast uuritavat kemikaali MTT otsese redutseerijana ning sel juhul tuleks tavapärasest neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisest või HPLC/UPLC-spektrofotomeetrial põhinevast määramisest sõltumatult kasutada täiendavat funktsionaalset kontrolli inimese rekonstrueeritud marrasknaha eluvõimetute kudedega. Sellise täiendava funktsionaalse kontrolli puhul kasutatakse surmatud kudesid, mille metaboolne aktiivsus on peaaegu kadunud, kuid mis absorbeerivad uuritavat kemikaali eluvõimeliste kudedega sarnasel määral. Iga MTTd redutseeriva uuritava kemikaaliga töödeldakse vähemalt kahte paralleelset surmatud kudede proovi, millega viiakse seejärel läbi täismahus katse, et saada MTT mittespetsiifilist redutseerimist (NSMTT) kajastavad kontrollandmed (32, 33, 34, 35). Olenemata sellest, kui suur on sõltumatult läbi viidavate katsete/mõõtmistsüklite arv, piisab iga uuritava kemikaali puhul ühest NSMTT-kontrollist. Seejärel arvutatakse kudede tegeliku eluvõimelisuse kindlakstegemiseks asjaomase MTT redutseerijaga kokkupuutes olnud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal, millest lahutatakse sama MTT redutseerijaga kokkupuutes olnud surmatud kudedega saadud, MTT mittespetsiifilist redutseerimist kajastav protsentuaalse osakaaluna väljendatud väärtus (NSMTT(%)); nimetatud väärtused arvutatakse korrigeeritavate andmete saamiseks kasutatud proovidega paralleelselt analüüsitud negatiivset kontrolli iseloomustava väärtuse suhtes.

30.

Värviliste uuritavate kemikaalide või vee või isopropanooliga kokku puutumisel värviliseks muutuvate kemikaalide võimaliku segava mõju tuvastamiseks ja täiendavate kontrollide kasutamise vajaduse üle otsustamiseks tuleks teha uuritava kemikaali spektraalanalüüs vees (kokkupuutekeskkond) ja/või isopropanoolis (ekstraheerimislahus). Kui uuritav kemikaal neelab vees ja/või isopropanoolis valgust vahemikus 570 ± 30 nm, tuleks kasutada täiendavaid värvumiskontrolle või teise võimalusena HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat; viimasel juhul ei ole kõnealused kontrollid vajalikud (vt punktid 33 ja 34). Tavapärasel neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisel töödeldakse iga segavat mõju avaldava värvilise uuritava kemikaaliga vähemalt kahte paralleelset eluskoe proovi, millega viiakse seejärel läbi täismahus katse, ent MTTga inkubeerimise etapis kasutatakse MTT lahuse asemel söödet, et saada mittespetsiifilist värvumist (NSCelus) kajastavad kontrollproovid. Eluskudedele iseloomulikust bioloogilisest varieeruvusest tulenevalt tuleb NSCelus-kontrolli kasutada samaaegselt uuritava värvilise kemikaaliga ning mitme katse tegemisel tuleb kasutada igas katses (igas mõõtmistsüklis) eraldi sõltumatut NSCelus-kontrolli. Seejärel arvutatakse kudede tegeliku eluvõimelisuse kindlakstegemiseks asjaomase segavat mõju avaldava uuritava kemikaaliga kokkupuutes olnud ja MTT lahuses inkubeeritud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal, millest lahutatakse kõnealuse segavat mõju avaldava uuritava kemikaaliga kokkupuutes olnud ja ilma MTT-ta söötmes inkubeeritud eluskudedega saadud, mittespetsiifilist värvumist kajastav protsentuaalse osakaaluna väljendatud väärtus (NSCelus(%)), mille leidmiseks kasutatud kontrollproove on käideldud korrigeeritavate andmete saamiseks kasutatud proovidega paralleelselt.

31.

Selliste uuritavate kemikaalide puhul, millega saadud tulemustest nähtub nii MTT otsese redutseerimise võime (vt punkt 29) kui ka värvusest tulenev segav mõju (vt punkt 30), on tavapärasel neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisel vaja kasutada eelmistes punktides kirjeldatud NSMTT-kontrolli ja NSCelus-kontrolli kõrval veel kolmandat liiki kontrolli. See on tavaliselt vajalik tumedavärviliste (nt siniste, lillade ja mustade) uuritavate kemikaalide puhul, mis avaldavad MTT-põhises katses segavat mõju, kuna takistavad neile omase värvuse tõttu MTT otsese redutseerimise võime hindamist vastavalt punktis 29 kirjeldatule. Sellised uuritavad kemikaalid võivad seonduda nii eluskudede kui ka surmatud kudedega ja seepärast võib juhtuda, et NSMTT-kontrolli abil korrigeeritakse tulemusi mitte üksnes uuritava kemikaali põhjustatud MTT võimaliku otsese redutseerimise suhtes, vaid ka värvusest tuleneva segava mõju suhtes, mis ilmneb uuritava kemikaali seondumisel surmatud kudedega. See võib kaasa tuua kahekordse korrigeerimise, kuna NSCelus-kontrolli abil jubakorrigeeritakse tulemusi värvusest tuleneva segava mõju suhtes, mis ilmneb uuritava kemikaali seondumisel eluskudedega. Et hoida ära võimalikku kahekordset korrigeerimist värvusest tuleneva segava mõju suhtes, tuleb kasutada kolmandat kontrolli, mis võimaldab hinnata surmatud kudede mittespetsiifilist värvumist (NSCsurmatud). Selle täiendava kontrolli puhul töödeldakse uuritava kemikaaliga vähemalt kahte paralleelset surmatud kudede proovi, millega viiakse seejärel läbi täismahus katse, ent MTTga inkubeerimise etapis kasutatakse MTT lahuse asemel söödet. Olenemata sellest, kui suur on sõltumatult läbi viidavate katsete/mõõtmistsüklite arv, piisab iga uuritava kemikaali puhul ühest NSCsurmatud-kontrollist, ent seda tuleks käidelda samaaegselt NSMTT-kontrolliga ja võimaluse korral tuleks kasutada sama partii kudesid. Seejärel arvutatakse kudede tegeliku eluvõimelisuse kindlakstegemiseks asjaomase uuritava kemikaaliga kokkupuutes olnud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal, millest lahutatakse NSMTT(%) ja NSCelus(%) ning liidetakse kõnealuse segavat mõju avaldava uuritava kemikaaliga kokkupuutes olnud ja ilma MTT-ta söötmes inkubeeritud surmatud kudedega saadud, mittespetsiifilist värvumist kajastav protsentuaalse osakaaluna väljendatud väärtus (NSCsurmatud(%)); nimetatud väärtused arvutatakse korrigeeritavate andmete saamiseks kasutatud proovidega paralleelselt analüüsitud negatiivset kontrolli iseloomustava väärtuse suhtes.

32.

On oluline silmas pidada, et MTT mittespetsiifilise redutseerimise ja värvusest tuleneva mittespetsiifilise segava mõju tulemusena võivad koeekstraktiga saadud näidud olla suuremad kui spektrofotomeetri lineaarsusvahemikule vastavad väärtused. Sellest lähtuvalt tuleks igas laboris enne regulatiivsel eesmärgil uuritavate kemikaalidega katsete alustamist teha kaubanduslikust allikast pärit MTT formasaani (CASi nr: 57360-69-7) abil kindlaks kasutatava spektrofotomeetri lineaarsusvahemik. Tavapärane neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmine spektrofotomeetriga on MTT otseste redutseerijate ja värvusest tuleneva segava mõjuga uuritavate kemikaalide puhul asjakohane juhul, kui asjaomase uuritava kemikaaliga töödeldud kudede ekstraktide optiline tihedus jääb enne MTT otsese redutseerimise ja/või värvusest tuleneva segava mõju suhtes korrigeerimist spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku või kui uuritava kemikaali puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal on juba enne korrigeerimist ≤ 50 %. Selliste uuritavate kemikaalide puhul, millega saadud NSMTT(%) ja/või NSCelus(%) on negatiivse kontrolliga võrrelduna ≥ 50 %, tuleks siiski suhtuda tulemustesse ettevaatusega, kuna kõnealust väärtust kasutatakse läviväärtusena, mille alusel eristatakse kategoriseeritud kemikaale kategoriseerimata kemikaalidest (vt punkt 36).

33.

Tavapäraseks neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmiseks sobimatute värviliste uuritavate kemikaalide puhul, mis avaldavad MTT-põhises katses liiga tugevat segavat mõju, võib MTT formasaani määramiseks kasutada alternatiivina HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat (vt punkt 34) (36). HPLC/UPLC-spektrofotomeetria võimaldab MTT formasaani enne selle kvantifitseerimist uuritavast kemikaalist eraldada (36). Sel põhjusel ei ole NSCelus-kontroll ega NSCsurmatud-kontroll HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutamisel uuritava kemikaali omadustest sõltumata kunagi vajalikud. NSMTT-kontrolli aga tuleks siiski kasutada, kui on põhjust eeldada, et uuritav kemikaal on MTT otsene redutseerija või selle värvus takistab MTT otsese redutseerimise võime hindamist (vastavalt punktis 29 kirjeldatule). Kui MTT formasaani määramiseks kasutatakse HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat, arvutatakse eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal uuritava kemikaaliga kokku puutunud eluskudede puhul saadud MTT formasaani piigi pindala protsentuaalse osakaaluna paralleelse negatiivse kontrolliga saadud MTT formasaani piigi pindalast. Kemikaalide puhul, mis on võimelised MTT-d otse redutseerima, arvutatakse kudede tegelik eluvõimelisus uuritava kemikaaliga kokku puutunud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalse osakaaluna, millest on lahutatud NSMTT(%). Lõpuks tuleks märkida, et selliseid MTT otseseid redutseerijaid, mis võivad avaldada ka värvusest tulenevat segavat mõju ning mis jäävad pärast töötlemist kudedesse ja redutseerivad MTT-d nii tugevalt, et analüüsitavate koeekstraktide puhul täheldatud optiline tihedus (tavapärasel optilise tiheduse mõõtmisel) või piigi pindala (HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutamisel) jääb väljapoole spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku, ei ole võimalik hinnata; seda juhtub eeldatavalt siiski väga harva.

34.

HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat võib MTT formasaani määramiseks kasutada iga liiki (värviliste, värvitute, MTT-d redutseerivate ja MTT-d mitteredutseerivate) uuritavate kemikaalide puhul (36). Kuna on olemas eri HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteeme, tuleks enne sellise süsteemi kasutamist koeekstraktides sisalduva MTT formasaani määramiseks tõendada asjaomase HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteemi nõuetekohasust; selleks tõendatakse vastavust teatud standardnäitajatega seotud vastuvõetavuskriteeriumidele, mille puhul on lähtutud bioanalüüsimeetodite valideerimist käsitlevates ettevõtjatele ette nähtud USA Toidu- ja Ravimiameti suunistes kirjeldatud kriteeriumidest (36, 37). Kõnealused põhinäitajad ja neile vastavad vastuvõetavuskriteeriumid on esitatud 4. liites. Kui 4. liites määratletud vastuvõetavuskriteeriumid on täidetud, loetakse asjaomane HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteem nõuetekohaseks ja seda võib hakata kasutama MTT formasaani määramiseks käesolevas katsemeetodis kirjeldatud katsetingimustes.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

35.

Iga katsemeetodi puhul, kus kasutatakse inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli nõuetekohaseid partiisid (vt punkt 23), peaks negatiivse kontrolliga töödeldud kudesid iseloomustav optiline tihedus kajastama kudede nõutavat kvaliteeti pärast nende tarnimist, vastuvõtmist ja kõikide katse-eeskirja kohaste töötlemistoimingute tegemist. Negatiivse kontrolli puhul täheldatav optiline tihedus ei tohiks olla väiksem kui varasemate andmete põhjal kindlaks määratud alampiir. Samuti peaksid positiivse kontrolliga, st SDSi 5 % vesilahusega töödeldud kudedega saadud tulemused kajastama kudede võimet reageerida ärritavale kemikaalile katsemeetodiga ette nähtud tingimustes (vt 3. liide; täiendav teave on esitatud käesoleva katsemeetodiga hõlmatud nelja katsemudelit käsitlevates standardse töökorra dokumentides (32, 33, 34, 35)). Nimetatud kontrollide puhul kasutatud paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste vahelist varieeruvust iseloomustav sobiv näitaja – st standardhälve – peaks jääma kasutatud katsemudeli puhul kehtestatud vastuvõetavasse vahemikku (vt 3. liide).

Tulemuste tõlgendamine ja prognoosimudel

36.

Iga uuritava kemikaaliga saadud optilise tiheduse väärtuste alusel saab arvutada eluvõimeliste kudede protsentuaalse osakaalu negatiivse kontrolli puhul saadud väärtusest, mis on võetud võrdseks 100 protsendiga. HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutamise korral arvutatakse eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal uuritava kemikaaliga kokku puutunud eluskudede puhul saadud MTT formasaani piigi pindala protsentuaalse osakaaluna paralleelse negatiivse kontrolliga saadud MTT formasaani piigi pindalast. Rakkude eluvõimelisuse protsentuaalse osakaalu läviväärtus, mille alusel eristatakse ärritavaid uuritavaid kemikaale kategoriseerimata uuritavatest kemikaalidest, ning tulemuste hindamiseks ja ärritavate kemikaalide tuvastamiseks kasutatav(ad) statistiline/statistilised meetod(id) peaksid olema üheselt kindlaks määratud ja dokumenteeritud ning nende sobivus peaks olema tõendatud (sellekohane teave on esitatud katsemudeleid käsitlevates standardse töökorra dokumentides). Ärritava toime prognoosimiseks kasutatavad läviväärtused on järgmised.

—

Uuritavat kemikaali käsitatakse ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt kategoriseerimist ja märgistamist vajava (1. või 2. kategooria) kemikaalina, kui eluvõimeliste kudede keskmine protsentuaalne osakaal pärast kemikaaliga kokkupuudet ja töötlemisjärgset inkubeerimist on 50 % või väiksem. Kuna käesoleva meetodiga hõlmatud, inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevad katsemudelid ei võimalda eristada ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase 1. kategooria kemikaale 2. kategooria kemikaalidest, on uuritava kemikaali lõplikuks kategoriseerimiseks vaja lisateavet kemikaali nahka söövitava toime kohta (vt ka OECD juhenddokument katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (3)). Kui uuritav kemikaal leitakse olevat mittesöövitav (näiteks lähtuvalt katsemeetodist B.40, B.40b või B.65) ning sellega kokku puutunud kudede eluvõimelisus pärast töötlemisjärgset inkubeerimist on 50 % või väiksem, käsitatakse seda ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 2. kategooriasse kuuluva nahka ärritava kemikaalina.

—	Uuritav kemikaal, millega kokku puutunud kudede eluvõimelisus pärast töötlemisjärgset inkubeerimist on suurem kui 50 %, võidakse olenevalt asjaomase liikmesriigi õigusraamistikust tunnistada nahka mitte ärritavaks, ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt kategoriseerimata kemikaaliks.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmed

37.

Iga mõõtmistsükli puhul tuleks esitada tabeli kujul andmed iga paralleelse koeproovi kohta (näiteks optilise tiheduse väärtused ja eluvõimeliste rakkude protsentuaalne osakaal iga uuritava kemikaali puhul koos liigitamise tulemusega), sealhulgas vajaduse korral korduskatsete tulemused. Peale selle tuleks esitada igas mõõtmistsüklis saadud tulemuste keskväärtused koos standardhälbega. Iga asjaomase uuritava kemikaali puhul tuleks esitada andmed seoses täheldatud mõjuga MTT-le või värvilise uuritava kemikaali segava mõjuga.

Katseprotokoll

38.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal ja kontrollkemikaalid:

—	ühest koostisosast koosnev aine: kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

—	mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu: võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	allikas ja partii number, kui see on olemas;

—	vajaduse korral teave uuritava kemikaali / kontrollkemikaali töötlemise kohta enne katset (näiteks soojendamine, peenestamine);

—	uuritava kemikaali püsivus ja aegumiskuupäev või kordusanalüüsi tegemise tähtpäev, kui see on teada;

—	säilitustingimused.

Kasutatud inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudel ja katse-eeskiri (ning vajaduse korral nende valimise põhjendus)

Katsetingimused:

—	kasutatud inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudel (sealhulgas partii number);

—	mõõteseadme (nt spektrofotomeetri) kaliibrimisandmed, MTT formasaani kvantifitseerimiseks kasutatud lainepikkus ja filtri ribalaius (vajaduse korral) ning mõõteseadme lineaarsusvahemik; MTT formasaani kvantifitseerimiseks kasutatud meetodi kirjeldus;

—

vajaduse korral HPLC/UPLC-spektrofotomeetriasüsteemi nõuetekohasuse tõendamise kirjeldus; kogu täiendav teave konkreetse kasutatud inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli, sealhulgas selle kasutamise tulemuslikkuse kohta. See hõlmab vähemalt järgmisi aspekte:

i)	eluvõimelisus;

ii)	toimimine kaitsekihina;

iii)	morfoloogia;

iv)	reprodutseeritavus ja ennustusjõud;

v)	mudeli kvaliteedi kontroll;

—	viide varasematele andmetele mudeli kohta. See hõlmab vähemalt kvaliteedikontrolli andmete vastuvõetavust lähtuvalt varasematest andmetest partii kohta;

—	pädevusainetega katsete tegemine eesmärgiga tõendada katsemeetodi kasutamise pädevust enne meetodi regulaarset rakendamist.

Katse käik:

—	kasutatud katse-eeskirja üksikasjalik kirjeldus (sealhulgas teave kokkupuuteperioodi järgsete pesemisetappide kohta);

—	kasutatud uuritava kemikaali ja kontrollkemikaalide annused;

—	kokkupuuteperioodi ja kokkupuutejärgse inkubeerimisperioodi kestus ja temperatuur; MTT otseste redutseerijate ja/või värviliste uuritavate kemikaalide puhul kasutatud kontrollid;

—	iga uuritava kemikaali ja iga kontrolli (positiivse ja negatiivse kontrolli ning vajaduse korral NSMTT-kontrolli, NSCelus-kontrolli ja/või NSCsurmatud-kontrolli) puhul kasutatud paralleelsete koeproovide arv;

—	kasutatud otsustuskriteeriumide/prognoosimudeli kirjeldus lähtuvalt kasutatud inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelist;

—	kõikide katsemeetodis tehtud (sealhulgas pesemisetappidega seotud) muudatuste kirjeldus.

Mõõtmistsüklis või katses saadavate tulemuste vastuvõetavuse kriteeriumid:

—	varasemate andmete kohased positiivse ja negatiivse kontrolli puhul saadud keskväärtused ja vastuvõetavate väärtuste vahemikud; positiivse ja negatiivse kontrolli puhul paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste varieeruvuse vastuvõetav määr;

—	uuritava kemikaali puhul paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste varieeruvuse vastuvõetav määr.

Tulemused:

—	tabeli kujul mõõtmisandmed iga uuritava kemikaali kohta iga mõõtmistsükli ja iga paralleelproovi puhul, sealhulgas optilise tiheduse või MTT formasaani piigi pindala väärtused, eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal ja selle näitaja keskväärtus koos standardhälbega;

—

vajaduse korral MTT otseste redutseerijate ja/või värviliste uuritavate kemikaalide puhul kasutatud kontrollidega saadud tulemused, sealhulgas optilise tiheduse või MTT formasaani piigi pindala väärtused, NSMTT(%), NSCelus(%) ja/või NSCsurmatud(%), standardhälbed ning eluvõimeliste kudede lõplik korrigeeritud protsentuaalne osakaal;

—	uuritava(te) kemikaali(de) ja kontrollidega saadud tulemuste vastavus mõõtmistsüklis või katses saadavate tulemuste vastuvõetavuse kindlaksmääratud kriteeriumidele;

—	muu täheldatud toime kirjeldus;

—	klassifitseerimistulemused lähtuvalt kasutatud prognoosimudelist/otsustuskriteeriumidest.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Viies, täiendatud väljaanne. ÜRO, New York ja Genf. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

(2)

Alternatiivsete Meetodite Valideerimise Euroopa Keskus (ECVAM) (2009). Statement on the Performance Under UN GHS of Three In-Vitro Assays for Skin Irritation Testing and the Adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM Skin Irritation Performance Standards. Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC31), 9. aprill 2009. Kättesaadav aadressil https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication//ESAC31_skin-irritation-statement_20090922.pdf.

(3)	OECD (2014). Guidance Document on an Integrated Approach to Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 203. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(4)	Käesoleva lisa peatükk B.4 „Äge nahaärritus/-söövitus“.

(5)	Käesoleva lisa peatükk B.40 „In vitro nahasöövitus: transkutaanse elektritakistuse (TET) mõõtmisel põhinev katsemeetod“.

(6)	Käesoleva lisa peatükk B.40b „In vitro nahasöövitus: inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinev katsemeetod“.

(7)	Käesoleva lisa peatükk B.65 „In vitro membraanibarjääri katsemeetod nahasöövituse uurimiseks“.

(8)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RhE) Test Methods for Skin Irritation Testing as described in TG 439. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 220. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(9)	OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 34. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(10)	Fentem, J. H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G. R., Harbell, J. W., Heylings, J. R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J. J. M., ja Botham, P. (2001). A Prevalidation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol. In Vitro 15: 57–93.

(11)	Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C., ja Roguet, R. (2002). Refinement of the EPISKIN Protocol for the Assessment of Acute Skin Irritation of Chemicals: Follow-Up to the ECVAM Prevalidation Study. Toxicol. In Vitro 16: 765–770.

(12)	Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B., ja Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX 21: 107–114.

(13)	Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., ja Spielmann, H. (2005). The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33: 351–367.

(14)	Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R., ja Rubinsteen, G. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model Within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33: 329–349.

(15)

Zuang, V., Balls, M., Botham, P. A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R. D., Elliot, G. R., Fentem, J. H., Heylings, J. R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van de Sandt, J. J. M., Wiemann, C., ja Worth, A. (2002). Follow-Up to the ECVAM Prevalidation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation. The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30: 109–129.

(16)

Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I., ja Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35: 559–601.

(17)	Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α.

(18)	Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I., ja Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35: 603–619.

(19)	Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E., ja Leclaire, J. (2007). In Vitro Acute Skin Irritancy of Chemicals Using the Validated EPISKIN Model in a Tiered Strategy – Results and Performances with 184 Cosmetic Ingredients. ALTEX 14: 351–358.

(20)	ECVAM (2007). Statement on the Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation. Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC26), 27. aprill 2007. Kättesaadav aadressil https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication//ESAC26_statement_SkinIrritation_20070525_C.pdf.

(21)

ECVAM (2007). Performance Standards for Applying Human Skin Models to In Vitro Skin Irritation Testing. NB! Tegemist on algsete tulemuslikkuse standarditega, mida on kasutatud kahe katsemeetodi valideerimiseks. Neid tulemuslikkuse standardeid ei tohiks enam kasutada, kuna nüüd on kättesaadav nende ajakohastatud versioon (8).

(22)	ECVAM (2008). Statement on the Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation Testing. Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC29), 5. november 2008. https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication/ESAC_Statement_SkinEthic-EpiDerm-FINAL-0812-01.pdf.

(23)	OECD (2010). Explanatory Background Document to the OECD Test Guideline on In Vitro Skin Irritation Testing. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 137. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(24)	Katoh, M., Hamajima, F., Ogasawara, T., ja Hata, K. (2009). Assessment of Human Epidermal Model LabCyte EPI-MODEL for In Vitro Skin Irritation Testing According to European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM)-Validated Protocol. J. Toxicol. Sci. 34: 327–334.

(25)	Katoh, M., ja Hata, K. (2011). Refinement of LabCyte EPI-MODEL24 Skin Irritation Test Method for Adaptation to the Requirements of OECD Test Guideline 439. AATEX 16: 111–122.

(26)	OECD (2011). Validation Report for the Skin Irritation Test Method Using LabCyte EPI-MODEL24. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 159. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(27)	OECD (2011). Peer Review Report of Validation of the Skin Irritation Test Using LabCyte EPI-MODEL24. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 155. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(28)	Kojima, H., Ando, Y., Idehara, K., Katoh, M., Kosaka, T., Miyaoka, E., Shinoda, S., Suzuki, T., Yamaguchi, Y., Yoshimura, I., Yuasa, A., Watanabe, Y., ja Omori, T. (2012). Validation Study of the In Vitro Skin Irritation Test with the LabCyte EPI-MODEL24. Altern. Lab. Anim. 40: 33–50.

(29)	Welss, T., Basketter, D. A., ja Schröder, K. R. (2004). In Vitro Skin Irritation: Fact and Future. State of the Art Review of Mechanisms and Models. Toxicol. In Vitro 18: 231–243.

(30)	Eskes, C., et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 62: 393–403.

(31)	Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65: 55–63.

(32)	Standardne töökord mudeli EpiSkin™ jaoks (veebruar 2009). Versioon 1.8. ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkin™ Test Method 15 min – 42 hours for the Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals.

(33)	Standardne töökord mudeli EpiDerm™ jaoks (muudetud märtsis 2009). Versioon 7.0. Katse-eeskiri „In Vitro EpiDerm™ Skin Irritation Test (EPI-200-SIT). For Use with MatTek Corporation’s Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm™ (EPI 200-SIT)“.

(34)	Standardne töökord mudeli SkinEthic™ RHE jaoks (veebruar 2009). Versioon 2.0. SkinEthic Skin Irritation Test-42bis Test Method for the Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals: 42 Minutes Application + 42 Hours Post-Incubation.

(35)	LabCyte (juuni 2011). Standardne töökord mudeli EPI-MODEL24 SIT jaoks. Versioon 8.3. Skin Irritation Test Using the Reconstructed Human Model „LabCyte EPI-MODEL24“.

(36)

Alépée, N., Barroso, J., De Smedt, A., De Wever, B., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K. R., Millet, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Templier, M., ja McNamee, P. Use of HPLC/UPLC-Spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)-Based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Pooleliolev käsikiri.

(37)	USA Toidu- ja Ravimiamet (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. USA tervishoiu- ja sotsiaalteenuste ministeerium, Toidu- ja Ravimiamet (mai 2001). Kättesaadav aadressil [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

(38)	Harvell, J. D., Lamminstausta, K., ja Maibach, H. I. (1995). Irritant Contact Dermatitis. Väljaandes: Practical Contact Dermatitis. Guin, J. D. (toim.), McGraw-Hill, New York. Lk 7–18.

(39)

ECVAM (2009). Performance Standards for In Vitro Skin Irritation Test Methods Based on Reconstructed Human Epidermis (RhE). NB! Tegemist on ECVAMi tulemuslikkuse standardite praeguse versiooniga, mida ajakohastati 2009. aastal seoses ÜRO GHSi rakendamisega. Neid tulemuslikkuse standardeid ei tohiks enam kasutada, kuna nüüd on kättesaadav nende ajakohastatud versioon (8), mis on seotud käesoleva katsemeetodiga.

(40)	ECVAM (2009). ESAC Statement on the Performance Standards (PS) for In Vitro Skin Irritation Testing Using Reconstructed Human Epidermis. Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC31), 8. juuli 2009.

(41)

Euroopa Komisjon (2001). Komisjoni 6. augusti 2001. aasta direktiiv 2001/59/EÜ, millega kahekümne kaheksandat korda kohandatakse tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta. Euroopa Ühenduste Teataja L 225, lk 1–333.

1. liide

MÕISTED

Asendav meetod – katsemeetod, mis on kavandatud tavakasutuses oleva, ohu tuvastamiseks ja/või riski hindamiseks heaks kiidetud meetodi asendamiseks ning mille puhul on kindlaks tehtud, et sellega tagatakse iga võimaliku määramisolukorra ja kemikaali puhul vastavalt vajadusele inimeste või loomade tervise või keskkonna samaväärne või parem kaitse kui heakskiidetud meetodiga (9).

HPLC – kõrgefektiivne vedelikkromatograafia.

In vivo nahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine uuritava kemikaali kuni neljaks tunniks pealekandmise tagajärjel. Nahaärritus on mõjutatud nahakoe kohalik reaktsioon, mis tekib lühikese aja jooksul pärast kokkupuudet (38). Seda põhjustab kohalik põletikureaktsioon, milles osaleb nahakoe kaasasündinud (mittespetsiifilise) immuunsuse süsteem. Selle peamine iseloomulik tunnus on pöörduv kulg, mis hõlmab põletikureaktsiooni ja enamikku põletikuga seotud iseloomulikest kliinilistest ärritusnähtudest (punetus, turse, sügelus ja valu).

Kemikaal – aine või segu.

Lõpmata suur annus – marrasknahale kantud uuritava kemikaali kogus, mis on suurem kui marrasknaha pinna täielikuks ja ühtlaseks katmiseks vajalik kogus.

MTT – 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid; tiasolüülsinise tetrasooliumbromiid.

Mõõtmistsükkel – ühe või mitme uuritava kemikaali analüüsimine negatiivse ja positiivse kontrolliga paralleelselt.

NSCelus – eluskudede mittespetsiifiline värvumine.

NSCsurmatud – surmatud kudede mittespetsiifiline värvumine.

NSMTT – MTT mittespetsiifiline redutseerumine.

Segu – kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

Spetsiifilisus – katsemeetodiga õigesti negatiivseks/reaktsioonivõimetuks liigitatud uuritavate kemikaalide osakaal kõikide negatiivsete kemikaalide hulgas. Spetsiifilisus kajastab sellise katsemeetodi täpsust, millega saadakse kategoriseeritav tulemus, ning see on oluline näitaja katsemeetodi asjakohasuse hindamiseks (9).

Tundlikkus – katsemeetodiga õigesti positiivseks/reaktsioonivõimeliseks liigitatud uuritavate kemikaalide osakaal kõikide positiivsete kemikaalide hulgas. Tundlikkus kajastab sellise katsemeetodi täpsust, millega saadakse kategoriseeritav tulemus, ning see on oluline näitaja katsemeetodi asjakohasuse hindamiseks (9).

UPLC – ülikõrgefektiivne vedelikkromatograafia.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Vastavus – tulemuslikkuse näitaja katsemudeli puhul, millega saadakse kategoriseeritav tulemus; üks asjakohastest aspektidest. Seda mõistet kasutatakse mõnikord täpsuse tähenduses ja see on määratletud kui õigesti positiivseks või negatiivseks liigitatud kemikaalide osakaal kõikide uuritud kemikaalide seas. Vastavus sõltub väga suurel määral positiivsete tulemuste osakaalust uuritavale kemikaalile vastavat liiki kemikaalide hulgas (9).

Ühest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja mille ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

2. liide

KÄESOLEVA KATSEMEETODIGA HÕLMATUD KATSEMUDELID

Katsemudeli nimetus

Valideerimisuuringu liik

Allikaviited

EpiSkin™

Täismahus prospektiivne valideerimisuuring (2003–2007). Selle katsemudeli elemente kasutati katsemeetodi oluliste elementide määratlemiseks ECVAMi algsetes ja ajakohastatud tulemuslikkuse standardites (39, 40, 21) (*3). Peale selle kasutati kõnealuse meetodiga saadud andmeid, mis on seotud kategoriseerimata ainete eristamisega kategoriseeritud ainetest, peamise lähtealusena spetsiifilisuse ja tundlikkuse määrade kehtestamiseks algsetes tulemuslikkuse standardites (*3).

2, 10, 11, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 32, 39, 40

EpiDerm™ SIT (EPI-200)

EpiDerm™ (algversioon): algselt viidi selle katsemudeliga aastatel 2003–2007 läbi täismahus prospektiivne valideerimisuuring, mis hõlmas ka mudelit nr 1. Selle katsemudeli elemente kasutati katsemeetodi oluliste elementide määratlemiseks ECVAMi algsetes ja ajakohastatud tulemuslikkuse standardites (39, 40, 21) (*3). EpiDerm™ SIT (EPI-200):algversioonis mudeli EpiDerm™ muudetud versioon valideeriti ECVAMi algsete tulemuslikkuse standardite (21) alusel 2008. aastal (*3).

2, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 23, 33, 39, 40,2, 21, 22, 23, 33

SkinEthic™ RHE

ECVAMi algsetel tulemuslikkuse standarditel (21) põhinev 2008. aastal tehtud valideerimisuuring (*3).

2, 21, 22, 23, 31

LabCyte EPI-MODEL24 SIT

Valideerimisuuring (2011–2012), mille puhul lähtuti OECD katsejuhendiga nr 439 seotud tulemuslikkuse standarditest (8), mis põhinevad ECVAMi ajakohastatud tulemuslikkuse standarditel (*3) (39, 40).

24, 25, 26, 27, 28, 35, 39, 40 ning käesoleva katsemeetodi kohased tulemuslikkuse standardid (8) (*3)

SIT	–	nahaärrituskatse.
RHE	–	inimese rekonstrueeritud marrasknahk.

3. liide

KATSE-EESKIRJA KOHASED SPETSIIFILISED PARAMEETRID KÄESOLEVA KATSEMEETODIGA HÕLMATUD IGA KATSEMUDELI KOHTA

Asjaomaseid inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeleid käsitlevad katse-eeskirjad on väga sarnased; tuleb märkida, et neist kõikide puhul on töötlemisjärgse inkubatsiooniperioodi kestus 42 tundi (32, 33, 34, 35). Erinevused on seotud eelkõige järgmise kolme parameetriga, mis kajastavad katsemudelite erisusi kaitsekihina toimimisel: A) eelinkubeerimise aeg ja söötme kogus, B) uuritava kemikaaliga töötlemine ning C) söötme kogus töötlemisjärgsel inkubeerimisel.

	EpiSkin™ (SM)	EpiDermTM SIT (EPI-200)	SkinEthic™ RHE	LabCyte EPI-MODEL24 SIT
A) Eelinkubeerimine
Inkubeerimisaeg	18–24 tundi	18–24 tundi	< 2 tundi	15–30 tundi
Söötme kogus	2 ml	0,9 ml	0,3 või 1 ml	0,5 ml
B) Uuritava kemikaaliga töötlemine
Vedelike puhul	10 μl (26 μl/cm2)	30 μl (47 μl/cm2)	16 μl (32 μl/cm2)	25 μl (83 μl/cm2)
Tahkete ainete puhul	10 mg (26 mg/cm2) + DV (5 μl)	25 mg (39 mg/cm2) + DPBS (25 μl)	16 mg (32 mg/cm2) + DV (10 μl)	25 mg (83 mg/cm2) + DV (25 μl)
Nailonvõrgu kasutamine	Ei kasutata	Vajaduse korral	Kasutatakse	Ei kasutata
Kokkupuuteperioodi kestus	15 minutit	60 minutit	42 minutit	15 minutit
Kokkupuutetemperatuur	Toatemperatuur	a) 25 minutit toatemperatuuril b) 35 minutit 37oC juures	Toatemperatuur	Toatemperatuur
C) Söötme kogus töötlemisjärgsel inkubeerimisel
Söötme kogus	2 ml	0,9 ml × 2	2 ml	1 ml
D) Suurim lubatav varieeruvus
Paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste standardhälve (SD)	SD≤18	SD≤18	SD≤18	SD≤18
DV: destilleeritud vesi. DPBS: fosfaadiga puhverdatud Dulbecco soolalahus.

4. liide

HPLC/UPLC-SPEKTROFOTOMEETRIASÜSTEEMI NÕUETEKOHASUSE KRITEERIUMID JA PÕHINÄITAJAD INIMESE REKONSTRUEERITUD MARRASKNAHAST EKSTRAHEERITUD MTT FORMASAANI MÄÄRAMISE VÕIMALDAMISEKS

Näitaja

USA Toidu- ja Ravimiameti suunistel põhinev katse-eeskiri (36, 37)

Nõuetekohasuse kriteeriumid

Selektiivsus

Segavale signaalile vastav pindala on ≤ 20 % LLOQ-le (19) vastavast pindalast

Kordustäpsus

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused (st MTT formasaan kontsentratsioonis 1,6 μg/ml, 16 μg/ml ja 160 μg/ml) isopropanoolis (n = 5)

Variatsioonikordaja on LLOQ puhul ≤ 15 % või ≤ 20 %

Mõõtetäpsus

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 5)

Hälve on ≤ 15 % või LLOQ puhul ≤ 20 %

Maatriksiefekt

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused eluskudede tühiproovis (n = 5)

85 % ≤ maatriksiefekt ≤ 115 %

Ülekandumine

Isopropanooli analüüsimine pärast ULOQ (20) puhul kasutatavat standardit

Segavale signaalile vastav pindala on ≤ 20 % LLOQ-le vastavast pindalast

Reprodutseeritavus (samal päeval)

3 sõltumatut kaliibrimiskõverat, mis põhinevad MTT formasaani kuuel järjestikusel 1: 3 lahjendusel isopropanoolis alates ULOQ-st, st kontsentratsioonist 200 μg/ml;

kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 5)

Kaliibrimiskõverad: hälve on ≤ 15 % või LLOQ puhul ≤ 20 %

Kvaliteedikontrolli proovid: hälve on ≤ 15 % ja variatsioonikordaja ≤ 15 %

Reprodutseeritavus (eri päevade lõikes)

1. päev	:	1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 3)
2. päev	:	1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 3)
3. päev	:	1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedikontrolli kemikaali lahused isopropanoolis (n = 3)

MTT formasaani lühiajaline püsivus inimese rekonstrueeritud marrasknaha koeekstraktis

Kvaliteedikontrolli kemikaali lahused eluskudede tühiproovis (n = 3); analüüsitakse valmistamise päeval ja pärast 24-tunnist toatemperatuuril säilitamist

Hälve on ≤ 15 %

MTT formasaani pikaajaline püsivus inimese rekonstrueeritud marrasknaha koeekstraktis (vajaduse korral)

Hälve on ≤ 15 %

“

B osasse lisatakse järgmised peatükid:

„B.63. REPRODUKTIIV-/ARENGUTOKSILISUSE SÕELUURING

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 421 (2016). Kemikaalide uurimist käsitlevaid OECD katsejuhendeid vaadatakse teaduse arengu arvessevõtmiseks korrapäraselt läbi. Algne sõeluuringut käsitlev katsejuhend nr 421 võeti vastu 1995. aastal ühe esialgse reproduktiivtoksilisuse sõeluuringu katse-eeskirja põhjal, mida arutati kahel ekspertide koosolekul, mis toimusid 1990. aastal Londonis (1) ja 1992. aastal Tokyos (2).

Käesolevat katsemeetodit on ajakohastamise eesmärgil täiendatud endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivate lõppnäitajatega, mis lisati järelmeetmena lähtuvalt prioriteetsest tegevussuunast, mille OECD käivitas 1998. aastal eesmärgiga vaadata läbi olemasolevad ja töötada välja uued katsejuhendid, et võimaldada sõeluuringute tegemist võimalike endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide tuvastamiseks ja selliste kemikaalide hindamist (3). Näiteks täiendati 2008. aastal OECD katsejuhendit nr 407 (käesoleva lisa peatükk B.7 „Suukaudse kordusdoosi toksilisuse 28-päevane uuring närilistel“) parameetritega, mis sobivad uuritavate kemikaalide endokriinse toime tuvastamiseks. Katsejuhendi nr 421 ajakohastamise eesmärk oli lisada sõeluuringut käsitlevasse juhendisse teatavad endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivad lõppnäitajad, mida saab hinnata juhul, kui kokkupuuteperiood hõlmab mõnda tundlikku arenguperioodi (sünnieelset või varajast sünnijärgset perioodi).

Peale selle lisati katsejuhendisse nr 421 täiendavad endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivad lõppnäitajad, mida sisaldab ka katsejuhend nr 443 (käesoleva lisa peatükk B.56 „Laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuring“); need lõppnäitajad valiti lähtuvalt ühest teostatavusuuringust, milles käsitletakse asjaomaste lõppnäitajate lisamisega seotud teaduslikke ja tehnilisi küsimusi, ning võimalikust vajadusest katsemeetodit nende lisamiseks kohandada (4).

Käesolev katsemeetod on kavandatud piiratud hulga andmete saamiseks uuritava kemikaali mõju kohta isas- ja emasloomade paljunemisvõimele, näiteks sugunäärmete talitlusele, paaritumiskäitumisele, eostumisele, sügoodi arengule ja sünnitamisele. See ei ole ette nähtud kasutamiseks olemasolevate katsemeetodite B.31, B.34, B35 või B.56 alternatiivina ega nende asendamiseks.

LÄHTEKAALUTLUSED

Käesolevat sõeluuringumeetodit võib kasutada paljunemisvõimele ja/või arengule avalduva võimaliku mõju kohta esialgse teabe saamiseks kas kemikaalide toksikoloogiliste omaduste hindamise varajases etapis või probleemsete kemikaalide uurimisel. Seda võib kasutada ka osana esialgsete sõeluuringute seeriast, mille abil hinnatakse olemasolevaid kemikaale, mille kohta on vähe või ei ole üldse toksikoloogilisi andmeid, samuti ulatuslikumate paljunemisvõimet/arengut käsitlevate uuringute jaoks annusevahemiku kindlaksmääramiseks ning muudel asjakohaseks peetavatel juhtudel. Uuringu tegemisel tuleks järgida juhtpõhimõtteid ja kaalutlusi, mis on esitatud OECD juhenddokumendis nr 19, milles käsitletakse ohutuse hindamiseks kasutatavatel katseloomadel avalduvate kliiniliste tunnuste kindlakstegemist, hindamist ja kasutamist humaanse sekkumise vajadusele viitavate näitajatena (5).

Käesolev katsemeetod ei võimalda saada ammendavat teavet kõikide paljunemisvõime ja arenguga seotud aspektide kohta. Eelkõige lubab see tuvastada sünnieelse kokkupuute tagajärjel sünnijärgselt avalduvaid ilminguid ja sünnijärgsest kokkupuutest tulenevat mõju üksnes piiratud ulatuses. Käesoleva meetodiga ei saa koguda tõendeid, mis lubaksid lõplikult kinnitada mõju puudumist; see on muu hulgas tingitud loomade suhteliselt väikesest arvust annuserühmades, lõppnäitajate selektiivsusest ja uuringu lühikesest kestusest. Täheldatavaid positiivseid tulemusi aga on võimalik muudest reproduktiiv-/arengutoksilisuse uuringutest saadavate andmete puudumisel kasutada esialgseks ohuhindamiseks ning need aitavad teha otsuseid täiendavate uuringute tegemise vajaduse ja selliste uuringute ajastuse kohta.

Sisesekretsioonisüsteemiga seotud näitajaid käsitlevaid tulemusi tuleks vaadelda endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku (6) kontekstis. Nimetatud kontseptuaalses raamistikus on OECD täiendatud katsejuhendi nr 421 kohast meetodit käsitatud 4. taseme in vivo meetodina, mis võimaldab saada andmeid sisesekretsioonisüsteemiga seotud lõppnäitajate kaudu tuvastatava kahjuliku mõju kohta. Sisesekretsioonisüsteemist sõltuvat signaali ei pruugita eraldi võetuna siiski pidada piisavaks tõendiks selle kohta, et uuritava kemikaali puhul on tegemist endokriinfunktsiooni kahjustava kemikaaliga.

Käesoleva katsemeetodi puhul eeldatakse, et uuritavat kemikaali manustatakse suu kaudu. Muu manustamisviisi kasutamise korral võib olla vaja teha meetodis muudatusi.

10.

Kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.

KATSE PÕHIMÕTE

11.

Uuritavat kemikaali manustatakse astmeliselt suurenevates annustes mitme rühma isas- ja emasloomadele. Isasloomade puhul peaks manustamine toimuma vähemalt nelja nädala kestel kuni kavandatud surmamispäevale eelneva päevani, sealhulgas surmamiseelsel päeval (see hõlmab vähemalt kahte paaritumiseelset nädalat, paaritumisperioodi ja umbes kahte paaritumisjärgset nädalat). Kuna isasloomadel on paaritumiseelne manustamisperiood piiratud kestusega, ei pruugi viljakus olla eriti tundlik munanditele avalduva mürgisuse näitaja. Seepärast on vaja teha munandite üksikasjalik histoloogiline analüüs. Kahe nädala pikkust paaritumiseelset manustamisperioodi koos järgneva paaritumise/viljakuse jälgimisega ning manustamisperioodi üldkestusega vähemalt neli nädalat, millele järgneb isaslooma sugunäärmete üksikasjalik histopatoloogiline analüüs, peetakse enamiku isasloomal täheldatavate viljakusele ja spermatogeneesile avalduva mõju ilmingute tuvastamiseks piisavaks.

12.

Emasloomade puhul peaks manustamine toimuma kogu uuringu kestel. See hõlmab kahte paaritumiseelset nädalat (eesmärk on jälgida vähemalt kahte tervet innatsüklit), eostumisele eelnevat varieeruva pikkusega ajavahemikku, tiinuse kestust ja vähemalt kolmeteistkümne päeva pikkust sünnitusjärgset perioodi, mis kestab kuni kavandatud surmamispäevale eelneva päevani ja hõlmab ka surmamiseelset päeva.

13.

Kohanemisperioodile ja innatsükli manustamiseelsele hindamisele järgneva uuringu kestus sõltub emasloomade seisundist ning on umbes 63 päeva (vähemalt 14 päeva pikkune paaritumiseelne periood, (kuni) 14 päeva pikkune paaritumisperiood, 22 päeva pikkune tiinusperiood ja 13 päeva pikkune imetamisperiood).

14.

Manustamisperioodi jooksul jälgitakse loomi iga päev hoolikalt mürgisusnähtude suhtes. Uuringu kestel surnud või surmatud loomad lahatakse ning uuringu lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.

MEETODI KIRJELDUS

Loomaliigi valimine

15.

Käesolev katsemeetod on kavandatud kasutamiseks rotil. Kui käesolevas katsemeetodis kirjeldatud näitajaid hinnatakse mõne muu liigi närilistel, tuleks seda üksikasjalikult põhjendada. Endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide kindlakstegemise rahvusvahelises valideerimisprogrammis, mille puhul on lähtutud OECD katsejuhendist nr 407 (see vastab käesoleva lisa peatükile B.7), kasutati ainsa liigina rotte. Ei tohiks kasutada liine, kus sigivus on väike või kus teadaolevalt esineb sageli arenguhäireid. Tuleks kasutada terveid varem paaritamata loomi, keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomi tuleks iseloomustada liigi, liini, soo, kehamassi ja vanuse järgi. Uuringu alguses peaksid kasutatavate loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte üle 20 % kummastki soost loomade keskmisest kehamassist. Kui uuring viiakse läbi pikaajalise või tervet põlvkonda hõlmava uuringu eeluuringuna, tuleks mõlemas uuringus soovitatavalt kasutada samast liinist ja sama päritolu loomi.

Pidamis- ja söötmistingimused

16.

Kõik katsetoimingud peaksid vastama kohalikele laboriloomade hooldamise normidele. Katseloomade ruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Ehkki suhteline õhuniiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, on sobivaim vahemik 50–60 %. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada sööda sobivus uuritava kemikaali lisamiseks, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil.

17.

Loomade pidamisel tuleks kasutada väikesi samasooliste isendite rühmi; loomi võib pidada eraldi, kui see on teaduslikult põhjendatud. Rühmas pidamisel ei tohiks puuris olla rohkem kui viis looma. Paaritamine peaks toimuma selleks sobivas puuris. Tiined emasloomad tuleks paigutada igaüks eraldi puuri, kus on olemas pesamaterjal. Imetavad emasloomad paigutatakse igaüks eraldi puuri koos järglaskonnaga.

18.

Sööta tuleks korrapäraselt analüüsida saasteainete suhtes. Asjaomase sööda proov tuleks kuni katseprotokolli lõpliku valmimiseni alles hoida.

Loomade ettevalmistamine

19.

Terved noored täiskasvanud loomad jagatakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühmadesse. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud võimalik mõju oleks võimalikult väike. Loomad idenditakse üheselt ja neil lastakse enne uuringu algust puuris vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda.

Annuste ettevalmistamine

20.

Uuritavat kemikaali on soovitatav manustada suu kaudu, välja arvatud juhul, kui mõnda muud manustamisviisi peetakse sobivamaks. Uuritava kemikaali suukaudseks manustamiseks kasutatakse tavaliselt toitmissondi; selle asemel võib siiski kasutada ka sööda või joogiveega manustamist.

21.

Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas kandeaines. Kui vähegi võimalik, on soovitatav esmalt kaaluda vesilahuse või veepõhise suspensiooni ja seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ning pärast seda lahustamist mõnes muus kandeaines. Muu kandeaine kui vee puhul peaksid olema teada selle mürgisusnäitajad. Tuleks teha kindlaks uuritava kemikaali püsivus ja homogeensus kandeaines.

KATSE KÄIK

Loomade arv ja sugu

22.

Annused

23.

Üldjuhul tuleks kasutada vähemalt kolme katserühma ja ühte kontrollrühma. Annuste valimisel võib lähtuda ägeda mürgisuse hindamise katsetega saadud andmetest või korduvannustamisel põhinevate uuringute tulemustest. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda täpselt samal viisil kui katserühma loomi; ainus erinevus seisneb uuritava kemikaali manustamata jätmises. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet, tuleks võrdlusrühma loomadele manustada kandeainet suurimas kasutatavas koguses.

24.

Annuste valimisel tuleks võtta arvesse kõiki kättesaadavaid mürgisusandmeid ja (toksiko)kineetilisi andmeid. Samuti tuleks arvesse võtta, et tiinete ja mittetiinete loomade tundlikkus võib olla erinev. Suurim annus tuleks valida nii, et kemikaal avaldaks mürgist mõju, kuid ei põhjustaks surma ega tõsiseid kannatusi. Seejärel tuleks valida rida järk-järgult vähenevaid annuseid, mis võimaldaksid tõendada mõju sõltuvust annusest ja teha väikseima annuse põhjal kindlaks täheldatava kahjuliku toime puudumise annuse (NOAEL). Sageli on optimaalne vähenevate annuste vaheline erinevus kahe- kuni neljakordne ning üksteisest väga palju (näiteks üle 10 korra) erinevate annuste kasutamise asemel on tihti soovitatav lisada neljas katserühm.

25.

Kui täheldatakse üldist mürgisust (nt kehamassi vähenemine, mõju maksale, südamele, kopsudele või neerudele jne) või muid muutusi, mis ei pruugi olla tingitud mürgisusest (nt väiksem söödatarbimine, maksa suurenemine), tuleks täheldatud mõju sisesekretsioonisüsteemiga seotud lõppnäitajatele tõlgendada ettevaatusega.

Piirsisalduskatse

26.

Kui käesoleva meetodi kohaselt läbi viidud suukaudse manustamise uuringus, milles kasutatakse ainsa annusena annust vähemalt 1 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas või sööda või joogiveega manustamise korral sellega samaväärset protsentuaalset sisaldust söödas või joogivees, ei täheldata mürgist mõju ja kui mürgisus ei ole uuritava kemikaaliga struktuurilt sarnaste ainetega saadud andmete põhjal ootuspärane, ei pruugita pidada mitme eri annusega täismahus uuringu tegemist vajalikuks. Piirsisalduskatse tulemused on kohaldatavad, kui inimese kokkupuutega seotud andmed ei viita vajadusele kasutada suukaudsel manustamisel suuremat annusemäära. Muu manustamisviisi korral, näiteks sissehingamise teel või naha kaudu manustamisel võib uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest tulenevalt olla tihti vaja kasutada suurimat saavutatavat kontsentratsiooni.

Annuste manustamine

27.

Uuritavat kemikaali manustatakse loomadele seitsmel päeval nädalas. Kui manustamiseks kasutatakse toitmissondi, tuleks kemikaali loomadele manustada ühe annusena maosondi või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Suurim korraga manustatav vedelikukogus sõltub katselooma suurusest. See kogus ei tohiks olla suurem kui 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuse puhul, mida võib manustada koguses 2 ml 100 g kehamassi kohta. Katses kasutatava vedelikukoguse varieeruvuse minimeerimiseks tuleks reguleerida uuritava kemikaali kontsentratsiooni nii, et lahuse maht oleks kõikide annuste puhul ühesugune; see ei ole nõutav ärritava või söövitava uuritava kemikaali puhul, mille mõju kontsentratsiooni suurenedes tavaliselt tugevneb.

28.

Sööda või joogiveega manustatava uuritava kemikaali puhul on oluline tagada, et seda kasutatakse koguses, mis ei muuda tavapärast toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas muutumatut kontsentratsiooni söödas (ppm) või looma kehamassi suhtes muutumatut annusemäära; tuleks täpsustada, kumba võimalust kasutatakse. Toitmissondi kaudu manustatava uuritava kemikaali puhul peaks manustamine toimuma igal päeval sarnasel kellaajal ning annusemäära tuleks vähemalt kord nädalas kohandada, et see püsiks looma kehamassi suhtes muutumatuna.

Katse ajakava

29.

Annuste manustamist tuleks kummagi soo puhul alustada vähemalt kaks nädalat enne paaritamist pärast seda, kui loomadel on lastud vähemalt viis päeva kohaneda ja emasloomi on hinnatud lähtuvalt innatsükli tavapärasest kestusest (töötlemiseelse kahe nädala pikkuse perioodi vältel). Uuringu ajakava peaks olema selline, et innatsükli hindamist alustatakse varsti pärast seda, kui loomad on saanud täielikult suguküpseks. See aeg võib olla eri rotiliinidel ja eri laborites veidi erinev: näiteks Sprague Dawley rottidel saabub suguküpsus 10 nädala vanuses ja Wistari rottidel umbes 12 nädala vanuses. Järglastega emasloomad tuleks surmata 13. sünnitusjärgsel päeval või veidi hiljem. Sünnitamispäeva (päev, mil sünnitus lõpeb) loetakse sünnitusjärgseks 0-päevaks. Emasloomad, kellel ei täheldata paaritumise ilminguid, surmatakse 24–26 päeva pärast paaritumisperioodi viimast päeva. Paaritumisperioodi vältel jätkatakse kummastki soost loomadele kemikaali manustamist. Isasloomadele manustamist tuleks paaritumisperioodi järgselt jätkata vähemalt seni, kuni manustamisperioodi algusest on möödunud kokku minimaalselt 28 päeva. Seejärel loomad surmatakse või teise võimalusena jätkatakse neile kemikaali manustamist, et viia võimaluse korral läbi teine paaritamine, kui seda peetakse asjakohaseks.

30.

Tiinestunud emasloomade puhul tuleks igapäevast manustamist jätkata kogu tiinuse vältel ning vähemalt kuni 13. sünnitusjärgse päevani, sealhulgas nimetatud päeval, või kuni surmamiseelse päevani. Uuringute puhul, kus uuritavat kemikaali manustatakse sissehingamise teel või naha kaudu, tuleks manustamist jätkata vähemalt kuni 19. tiinuspäevani, sealhulgas nimetatud päeval, ning taasalustada seda võimalikult varakult ja mitte hiljem kui 4. sünnitusjärgsel päeval.

31.

Katse skemaatiline ajakava on esitatud 2. liites.

Paaritamine

32.

Käesoleva meetodi kohases uuringus tuleks üldjuhul kasutada paaritamisel suhet 1: 1 (üks isasloom ühe emaslooma kohta). Erandi võib teha juhul, kui isasloomad juhtuvad surema. Emaslooma tuleks hoida sama isaslooma juures seni, kuni täheldatakse paaritumise ilminguid või on möödunud kaks nädalat. Emasloomi tuleks igal hommikul uurida sperma või tupekorgi esinemise suhtes. Tiinuse 0-päevaks loetakse päeva, mil paaritumise toimumine leiab kinnitust (leitakse tupekork või spermat). Kui paaritamine ebaõnnestub, võib kaaluda emaslooma uuesti paaritamist sama rühma viljakaks osutunud isasloomaga.

Pesakonna suurus

33.

Neljandal sünnijärgsel päeval võib iga pesakonna suurust korrigeerida; selleks kõrvaldatakse juhuvaliku alusel üleliigsed järglased nii, et pesakonda jääks sõltuvalt kasutatava rotiliini puhul tavapärasest pesakonna suurusest võimalikult täpselt neli või viis järglast kummagi soo kohta. Üleliigsetest järglastest kahelt tuleks võtta vereproov, moodustada nendest koondproov ja kasutada seda seerumi T4-sisalduse määramiseks. Järglaste selektiivne kõrvaldamine, näiteks kehamassi või anogenitaalse vahemaa (AGD) alusel, ei ole sobiv. Kui emaste või isaste järglaste arv ei võimalda jätta pesakonda nelja või viit järglast kummastki soost, on vastuvõetav ka osaline korrigeerimine (nt kuus isast ja neli emast). Kui pesakond jääks kõrvaldamise tagajärjel väiksemaks kui kõrvaldamisega saavutatav soovitud sihtarv (8 või 10 järglast pesakonna kohta), ei kõrvaldata ühtki järglast. Kui kõrvaldamisega saavutatava soovitud sihtarvuga võrreldes on üle ainult üks järglane, kõrvaldataksegi vaid üks järglane, kellelt võetakse vereproov võimalikuks seerumi T4-sisalduse hindamiseks.

34.

Kui pesakonna suurust ei korrigeerita, surmatakse 4. sünnijärgsel päeval igast pesakonnast kaks järglast ning neilt võetakse vereproov seerumi kilpnäärmehormoonisisalduse mõõtmiseks. Võimaluse korral peaksid kõnealused kaks järglast igast pesakonnast olema emased, et võimaldada isaste järglaste kasutamist nisade esinemise hindamiseks; see soovitus ei kehti juhul, kui kõnealuse kahe järglase eemaldamisel ei jääks pesakonda ühtki emast, keda uuringu lõpus hinnata. Kui pesakonda jääks kõrvaldamise tagajärjel vähem kui 8 või 10 järglast (olenevalt kasutatava rotiliini puhul tavapärasest pesakonna suurusest), ei kõrvaldata ühtki järglast. Kui pesakonna tavapärase suurusega võrreldes on üle ainult üks järglane, kõrvaldataksegi vaid üks järglane, kellelt võetakse vereproov võimalikuks seerumi T4-sisalduse hindamiseks.

Elusloomadel tehtavad vaatlused

Kliinilised vaatlused

35.

Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks kogu uuringuperioodi vältel teha vähemalt kord päevas ja mürgisusnähtude ilmnemisel sagedamini. Vaatlusi tuleks soovitatavalt teha igal päeval samal ajal või samadel aegadel; seejuures tuleks võtta arvesse manustamisjärgse eeldatava mõju maksimaalse avaldumise aega. Tuleks registreerida asjakohased muutused käitumises, raskele või kauakestnud sünnitusele viitavad ilmingud ja kõik mürgisusnähud, sealhulgas suremus. Registreeritavad andmed peaksid hõlmama mürgisusnähtude esinemise algusaega, ulatust ja kestust.

Kehamass ja sööda/vee tarbimine

36.

Isas- ja emasloomi tuleks kaaluda esimesel manustamispäeval ning seejärel vähemalt kord nädalas, samuti surmamise ajal. Tiinuse ajal tuleks emasloomi kaaluda tiinuse 0-päeval, 7., 14. ja 20. päeval, samuti tuleks neid kaaluda 24 tunni jooksul pärast sünnitust (sünnitusjärgsel 0-päeval või 1. päeval) ning vähemalt 4. ja 13. sünnitusjärgsel päeval. Nimetatud vaatluste tulemused tuleks esitada eraldi iga täiskasvanud looma kohta.

37.

Paaritumiseelsel perioodil ning tiinuse ja imetamise ajal tuleks söödatarbimist mõõta vähemalt kord nädalas. Paaritumisperioodil ei ole söödatarbimise mõõtmine kohustuslik. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks eelnimetatud perioodidel mõõta ka veetarbimist.

Innatsükkel

38.

Enne töötlemise alustamist tuleks jälgida innatsüklit ning valida selle alusel uuringusse emasloomad, kelle tsükkel on korrapärane (vt punkt 22). Tupeäigeid tuleks igapäevaselt hinnata ka alates töötlemisperioodi algusest kuni paaritumise ilmingute tuvastamiseni. Kui on kahtlus, et innatsükkel võib pärast manustamise alustamist ägeda stressi mõjul muutuda, võib katseloomi laboris 2 nädala vältel uuritava kemikaaliga töödelda ning seejärel koguda paaritumiseelsel perioodil innatsükli jälgimiseks vähemalt kahe nädala jooksul iga päev tupeäigeid ja jätkata jälgimist ka paaritumisperioodil, kuni täheldatakse paaritumise ilminguid. Tupe-/emakakaelarakkude võtmisel tuleks olla ettevaatlik, et mitte kahjustada limaskesta, kuna see võib põhjustada pseudotiinuse teket (7, 8).

Järglastega seotud näitajad

39.

Tiinuse kestus tuleks registreerida; selle arvutamisel lähtutakse tiinuse 0-päevast. Iga pesakonda tuleks pärast sündi võimalikult varakult hinnata, et teha kindlaks järglaste arv ja sugu, surnultsünnid, elussünnid, kängunud järglaste (vastavatest kontrolljärglastest palju väiksemate järglaste) arv ja silmaga nähtavate kõrvalekallete esinemine.

40.

Elus järglased tuleks loendada ja määrata nende sugu ning pesakonda tuleks kaaluda 24 tunni jooksul pärast sünnitust (sünnitusjärgsel 0-päeval või 1. päeval) ning vähemalt 4. ja 13. sünnitusjärgsel päeval. Peale punktis 35 kirjeldatud vaatluste tulemuste tuleks registreerida ka kõik järglaste ebatavalise käitumise ilmingud.

41.

Kõikidel järglastel tuleks ajavahemikul sünnijärgsest 0-päevast kuni 4. sünnijärgse päevani mõõta ühel ja samal päeval AGD. Järglaste kehamassi andmed tuleks koguda AGD mõõtmise päeval ja AGD tuleks normaliseerida järglase suurust kajastava näitaja, soovitatavalt kehamassi kuupjuure suhtes (9). Isastel järglastel tuleks 12. või 13. sünnijärgsel päeval loendada nisade/areoolide arv, nagu on soovitatud OECD katsejuhendis nr 151 (10).

Kliiniline biokeemiline analüüs

42.

Vereproovid võetakse kindlaksmääratud kohast järgmise kava alusel:

—	igas pesakonnas vähemalt kahelt järglaselt 4. sünnijärgsel päeval, kui järglaste arv seda võimaldab (vt punktid 33–34),

—	kõikidelt järglastega emasloomadelt ja igas pesakonnas vähemalt kahelt järglaselt surmamise ajal 13. päeval ning

—	kõikidelt täiskasvanud isasloomadelt surmamise ajal.

Kõiki vereproove säilitatakse sobivates tingimustes. Järglastelt 13. päeval võetud vereproovides ja täiskasvanud isasloomade vereproovides analüüsitakse kilpnäärmehormoonide (T4) sisaldust seerumis. Kui see on asjakohane, hinnatakse T4 sisaldust ka järglastega emasloomade vereproovides ja järglastelt 4. päeval võetud vereproovides. Kui see on asjakohane, võib soovi korral mõõta ka muude hormoonide sisaldust. Järglaste vere võib kilpnäärmehormoonide analüüsimiseks pesakonnakaupa kokku koondada. Soovitatavalt tuleks mõõta kilpnäärmehormoonide (T4 ja TSH) üldsisaldust.

43.

Hormoonide määramisel võivad varieeruvust ja absoluutset kontsentratsiooni mõjutada järgmised tegurid:

—	surmamise aeg tulenevalt asjaolust, et hormoonide kontsentratsioon ööpäeva jooksul muutub;

—	surmamisviis – tuleks hoiduda tekitamast loomadele tarbetut stressi, mis võib mõjutada hormoonide kontsentratsiooni;

—	hormoonide määramise komplektid, milles kasutatavad standardkõverad võivad olla erinevad.

44.

Konkreetselt hormoonide määramiseks ette nähtud eri plasmaproovid tuleks koguda umbes samal kellaajal. Hormoonisisalduse analüüsimisel saadavad arvväärtused on müügilolevate eri katsekomplektide puhul erinevad.

Patoloogiline analüüs

Täielik lahkamine

45.

Surmatud või uuringu vältel surnud täiskasvanud loomi tuleks kohe pärast surma makroskoopiliselt uurida mis tahes kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivsüsteemi elunditele. Tuleks registreerida pesastumiskohtade arv. Lahkamispäeva hommikul tuleks analüüsida tupeäiet, et teha kindlaks innatsükli etapp ja võimaldada korreleerimist munasarja histopatoloogilise analüüsi tulemustega.

46.

Kõikide täiskasvanud isasloomade munandid ja munandimanused ning eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega tuleks vajaduse korral vabastada nende külge jäänud kudedest ja kuivamise ärahoidmiseks tuleks elundite märgmass määrata võimalikult kiiresti pärast nende väljalõikamist. Peale selle võib soovi korral kaaluda isasloomade puhul sellised elundid nagu pärakutõsturlihase ja sibulakäsnkeha-lihase kompleks, Cowperi näärmed ja sugutilukk ning emasloomade puhul munasarjade paar (märgmass) ja emakas (koos emakakaelaga); kui seda tehakse, peaks kaalumine toimuma võimalikult kiiresti pärast elundite väljalõikamist.

47.

Surnud järglasi ja 13. sünnijärgsel päeval või varsti pärast seda surmatud järglasi tuleks miinimumnõudena väliselt hoolikalt uurida silmaga nähtavate kõrvalekallete suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata välistele suguelunditele, mida tuleks uurida arenguhäirete ilmingute suhtes. Kolmeteistkümnendal sünnijärgsel päeval tuleks võtta säilitamiseks kilpnääre iga pesakonna ühelt isaselt ja ühelt emaselt järglaselt.

48.

Samuti tuleks säilitada kõikide täiskasvanud loomade munasarjad, munandid, suguelundid (emakas ja emakakael, munandimanused, eesnääre, seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega), kilpnääre ja kõik makroskoopiliste kahjustustega elundid. Munandite ja munandimanuste tavapärasel analüüsil ei soovitata kasutada fikseerimist formaliiniga. Nende kudede puhul võib vastuvõetava meetodina kasutada Bouini fikseerimislahust või muudetud Davidsoni lahust (11). Fikseerimislahuse kiire sissetungimise võimaldamiseks võib elundi kummaski otsas valkjaskesta ettevaatlikult väikese sügavuseni nõelaga läbi torgata.

Histopatoloogiline analüüs

49.

Suurima annusega töödeldud rühma ja kontrollrühma loomade puhul tuleks viia läbi munasarjade, munandite ja munandimanuste üksikasjalik histoloogiline uuring (seejuures tuleks pöörata erilist tähelepanu spermatogeneesi etappidele ja munandite interstitsiaalrakustruktuuri histopatoloogilisele analüüsile). Vajaduse korral võib uurida ka teisi säilitatud elundeid, sealhulgas järglastelt ja täiskasvanud loomadelt saadud kilpnääret. Kilpnäärme massi võib määrata pärast fikseerimist. Liigsed koed tuleks samuti eemaldada väga ettevaatlikult alles pärast fikseerimist, et kudesid mitte kahjustada. Koekahjustus võib mõjutada histopatoloogilise analüüsi tulemusi. Kui suurima annusega töödeldud rühmas täheldatakse muutusi, peaks analüüs hõlmama ka teiste annuserühmade loomi. Täiendav üksikasjalik teave sisesekretsioonisüsteemi kudede väljalõikamise, fikseerimise, neist lõikude tegemise ja nende histopatoloogilise analüüsi kohta on esitatud histopatoloogilise analüüsi juhendis (11).

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmed

50.

Andmed tuleks esitada iga looma kohta eraldi. Peale selle tuleks esitada kõik andmed kokkuvõtliku tabeli kujul, kus on iga katserühma puhul toodud ära loomade arv katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel kaalutlustel surmatud loomade arv ning surma või humaanse surmamise aeg, viljakate loomade arv, tiinete emasloomade arv, mürgisusnähtudega loomade arv, mürgisusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise mõju ilmnemisaeg, kestus ja tugevus, histopatoloogiliste muutuste liik ja kõik asjakohased andmed pesakonna kohta. Paljunemisele/arengule avalduva mõju hindamiseks väga kasulikuks osutunud aruandevorm kokkuvõtliku tabeli kujul on esitatud 3. liites.

51.

Uuringu piiratud ulatusest tulenevalt on tulemuste olulisuse tuvastamiseks tehtava statistilise analüüsi väärtus paljude lõppnäitajate, eelkõige paljunemisega seotud lõppnäitajate puhul piiratud. Statistilise analüüsi kasutamisel tuleks valida meetod, mis on uuritava muutuja väärtuste jaotuse analüüsimiseks sobiv, ning see valik tuleks teha enne uuringu alustamist. AGD ja nisade esinemise statistiline analüüs peaks põhinema iga üksiku järglase andmetel ning seejuures tuleks arvesse võtta pesakonnas ilmnevat mõju. Vajaduse korral käsitatakse analüüsiüksusena pesakonda. Järglaste kehamassi statistiline analüüs peaks põhinema iga üksiku järglase andmetel ning seejuures tuleks arvesse võtta pesakonna suurust. Ühtlasi võib rühmade väiksusest tulenevalt olla kasulik kasutada uuringutulemuste tõlgendamise hõlbustamiseks varasemaid kontrollidega saadud andmeid (nt pesakonna suuruse kohta), kui need on olemas.

Tulemuste hindamine

52.

Käesoleva meetodi kohase mürgisusuuringu tulemusi tuleks hinnata lähtuvalt täheldatud mõjust, lahkamistulemustest ja mikroskoopilistest leidudest. Hindamine hõlmab seose kindlakstegemist uuritava kemikaali annuse ja kõrvalekallete – sealhulgas silmaga nähtavate kahjustuste, tuvastatud sihtelunditele avalduva mõju, viljatuse, kliiniliste kõrvalekallete, paljunemisvõimele ja pesakonnale avalduva mõju, kehamassi muutuste, suremusele avalduva mõju ja mis tahes muu mürgise mõju – esinemise või puudumise, esinemissageduse ja raskusastme vahel.

53.

Isasloomade töötlemise lühiajalisuse tõttu tuleks isasloomade paljunemisele avalduva mõju hindamisel vaadelda munandite ja munandimanuste histopatoloogilise analüüsi tulemusi koos viljakusandmetega. Ühtlasi võib uuringutulemuste tõlgendamise hõlbustamiseks olla kasulik kasutada kontrollidega saadud varasemaid paljunemist/arengut käsitlevaid andmeid (nt pesakonna suuruse, AGD, nisade esinemise või seerumi T4-sisalduse kohta), kui need on olemas.

54.

Kvaliteedikontrolli eesmärgil on soovitatav koguda kontrolle käsitlevaid varasemaid andmeid ja arvutada arvandmete jaoks variatsioonikordajad, eriti näitajate puhul, mis on seotud endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide kindlakstegemisega. Neid andmeid võib kasutada võrdlusalusena käsiloleva uuringu tulemuste hindamiseks.

Katseprotokoll

55.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal:

—	allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

—	uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

Kandeaine (vajaduse korral):

—	kandeaine valimise põhjendus, kui kandeaine ei ole vesi.

Katseloomad:

—	kasutatud liik/liin;

—	loomade arv, vanus ja sugu;

—	päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne;

—	iga looma kehamass katse alguses;

—	liigi valimise põhjendus, kui katseloom ei ole rott.

Katsetingimused:

—	annuste valimise põhjendus;

—	üksikasjad uuritava kemikaali valmistise / söödavalmistise, saavutatud kontsentratsioonide ning valmistise püsivuse ja homogeensuse kohta;

—	uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;

—	vajaduse korral andmed söödas/joogivees sisalduva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (ppm) teisendamiseks tegelikuks annuseks (mg kehamassi kilogrammi kohta päevas);

—	sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;

—	järglaste surmamise korral üksikasjalik kirjeldus surmatavate järglaste juhusliku valimise korra kohta.

Tulemused:

—	kehamass / kehamassi muutused;

—	söödatarbimine ja veetarbimise andmed, kui need on olemas;

—	mürgise mõju andmed kummagi soo ja iga annusemäära kohta, sealhulgas viljakusele ja tiinusele avalduva mõju ning mis tahes muude mürgisusnähtude kohta;

—	tiinuse kestus;

—	mürgisus või muu mõju paljunemisele, järglastele, sünnijärgsele kasvule jne;

—	kliiniliste ilmingute laad, raskusaste ja kestus (nähtude pöörduvus või pöördumatus);

—	normaalse või ebanormaalse innatsükliga täiskasvanud emasloomade arv ja tsükli kestus;

—	elussündide arv ja pesastumisjärgne kadu;

—	järglaste kehamassi andmed;

—	iga järglase AGD (ja kehamass AGD mõõtmise päeval);

—	nisade esinemine isastel järglastel;

—	kilpnäärmehormoonide sisaldus järglastelt 13. päeval võetud proovides ja täiskasvanud isasloomade proovides (ning järglastega emasloomade proovides ja järglastelt 4. päeval võetud proovides, kui seda on mõõdetud);

—	silmaga nähtavate kõrvalekalletega järglaste arv, väliste suguelundite makroskoopilise hindamise tulemused, kängunud järglaste arv;

—	katse vältel suremise aeg või teave selle kohta, et loomad olid kuni surmamiseni elus;

—	pesastunud embrüote arv, pesakonna suurus ja pesakonna kaal mõõtmishetkel;

—	andmed järglastega loomade kehamassi kohta surmamise hetkel ning selliste loomade elundite massi kohta;

—	lahkamistulemused;

—	histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;

—	andmed absorbeerumise kohta (kui on olemas);

—	vajaduse korral tulemuste statistilise analüüsi andmed.

Tulemuste arutelu

Järeldused

Tulemuste tõlgendamine

56.

Kirjeldatud uuring võimaldab hinnata annuste korduval manustamisel täheldatavat paljunemisele/arengule avalduvat mürgist mõju (vt punktid 5 ja 6). Saadud tulemused võivad viidata vajadusele teha täiendavaid uuringuid ja hõlbustavad järgnevate uuringute kavandamist. Paljunemise ja arenguga seotud tulemuste hõlpsamaks tõlgendamiseks tuleks tutvuda OECD juhenddokumendiga nr 43 (12). Käesoleva katsemeetodi puhul võib olla kasu närilistega tehtavate sisesekretsioonisüsteemi ja paljunemisega seotud katsete tulemuste histoloogilist hindamist käsitlevas OECD juhenddokumendis nr 106 (11) esitatud teabest (sisesekretsiooni)elundite ja tupeäiete ettevalmistamise ja hindamise kohta.

KIRJANDUS

(1)	OECD (1990). Kemikaalide töörühma ja halduskomitee 14. ühiskoosoleku koosolekudokument nr 1. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis.

(2)	OECD (1992). Ajutise eksperdirühma esimehe aruanne reproduktiivtoksilisust käsitlevate sõeluuringumeetodite alase koosoleku kohta. Tokyo, 27.–29. oktoober 1992. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis.

(3)	OECD (1998). Endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise (EDTA) OECD rakkerühma esimese koosoleku aruanne. 10.–11. märts 1998. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis.

(4)	OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 217. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(5)	OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(6)	OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(7)	Goldman, J. M., Murr, A. S., ja Cooper, R. L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies. Birth Defects Res. B 80(2): 84–97.

(8)	Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons. Väljaandes: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization. Auston, C. R., ja Short, R. V. (toim.), Cambridge, New York.

(9)	Gallavan, R. H. Jr., Holson, J. F., Stump, D. G., Knapp, J. F., ja Reynolds, V. L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights. Reprod. Toxicol. 13: 383–390.

(10)	OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 151. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(11)	OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 106. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(12)	OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 43. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

1. liide

MÕISTED (VT KA OECD JUHENDDOKUMENT NR 150 (6))

Androgeensus – kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik androgeen (nt testosteroon).

Annus – manustatav uuritava kemikaali kogus. Annust väljendatakse uuritava kemikaali kogusena massiühikutes katselooma kehamassi ühiku kohta päevas (näiteks milligrammides kehamassi kilogrammi kohta päevas) või kemikaali püsiva kontsentratsioonina söödas.

Annustamine – üldmõiste, mis hõlmab annust, selle manustamise sagedust ja annustamise kestust.

Antiandrogeensus – kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku androgeeni (nt testosterooni) toimet.

Antitüreoidne aktiivsus – kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku kilpnäärmehormooni (nt T3) toimet.

Antiöstrogeensus – kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku östrogeeni (nt 17β-östradiooli) toimet.

Arengutoksilisus – reproduktiivtoksilisuse ilming, mis avaldub järglaste sünnieelse, perinataalse või sünnijärgse struktuuri- või funktsioonihäirena.

Emale avalduv mürgisus – tiinele emasloomale avalduv kahjulik mõju, mis on spetsiifiline (otsene mõju) või mittespetsiifiline (kaudne mõju).

Ilmne mürgisus – üldmõiste, mille abil kirjeldatakse uuritava kemikaali manustamise järel täheldatavaid selgeid mürgisusnähte. Kõnealused nähud peaksid olema ohu hindamiseks piisavad ja sellised, et manustatava annuse suurendamisega kaasnevad eeldatavalt tõsised mürgisusnähud ja tõenäoliselt ka surm.

Kemikaal – aine või segu.

NOAEL – lühend, millega tähistatakse annusemäära, mille juures ei täheldata kahjulikku toimet. Tegemist on suurima annusega, mis ei põhjusta manustamisest tingitud kahjulikke ilminguid.

Reproduktiivtoksilisus – kahjulik mõju järglastele ja/või isas- või emasloomade paljunemisfunktsioonile või paljunemisvõimele.

Türeoidne aktiivsus – kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik kilpnäärmehormoon (nt T3).

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Valideerimine – teaduslik protsess, mille eesmärk on iseloomustada katsemeetodi rakendamisega seotud nõudeid ja piiranguid ning tõendada meetodi usaldusväärsust ja sobivust konkreetsel eesmärgil kasutamiseks.

Viljakuse vähenemine – isas- või emaslooma paljunemisfunktsiooni häire või paljunemisvõime langus.

Östrogeensus – kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik östrogeen (nt 17β-östradiool).

2. liide

UURINGU MAKSIMUMKESTUSELE VASTAV TÄISPIKAL 14-PÄEVASEL PAARITUMISPERIOODIL PÕHINEV KATSE SKEMAATILINE AJAKAVA

3. liide

TABELI KUJUL KOKKUVÕTLIK ARUANNE PALJUNEMISELE/ARENGULE AVALDUVA MÕJU KOHTA

VAATLUSED	VÄÄRTUSED
Annus (ühik)	0 (kontroll)	…	…	…	…
Paaride arv katse alguses (N)
Innatsükkel (vähemalt keskmine pikkus ja ebaregulaarsete tsüklite esinemissagedus)
Emasloomad, kellel täheldatakse paaritumise ilminguid (N)
Tiinestunud emasloomad (N)
Eostunud 1.–5. päeval (N)
Eostunud 6.–… (21) päeval (N)
Tiinuse kestus ≤ 21 päeva (N)
Tiinuse kestus 22 päeva (N)
Tiinuse kestus ≥ 23 päeva (N)
Elusalt sündinud järglastega emasloomad (N)
4. sünnijärgse päevani elus püsinud järglastega emasloomad (N)
Pesastunud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta (keskmine)
Elussündide arv järglastega emaslooma kohta (keskmine)
4. päevani elus püsinud järglaste arv järglastega emaslooma kohta (keskmine)
Sugude vahekord (isased/emased) sünnihetkel (keskmine)
Sugude vahekord (isased/emased) 4. päeval (keskmine)
Pesakonna kaal sünnihetkel (keskmine)
Pesakonna kaal 4. päeval (keskmine)
Järglaste kehamass sünnihetkel (keskmine)
Järglaste kehamass AGD mõõtmise hetkel (isasloomade keskmine, emasloomade keskmine)
Järglaste AGD samal sünnijärgsel päeval ajavahemikul sündimispäevast kuni 4. päevani (isasloomade keskmine, emasloomade keskmine; märkida sünnijärgne mõõtmispäev)
Järglaste kehamass 4. päeval (keskmine)
Nisade esinemine isastel järglastel 13. päeval (keskmine)
Järglaste kehamass 13. päeval (keskmine)
KÕRVALEKALLETEGA JÄRGLASED
Järglastega emasloomad, kellel on 0 kõrvalekalletega järglast
Järglastega emasloomad, kellel on 1 kõrvalekalletega järglane
Järglastega emasloomad, kellel on ≥ 2 kõrvalekalletega järglast
JÄRGLASTE KADU
Sünnieelne/pesastumisjärgne (pesastunud embrüote arvu ja elussündide arvu vahe)
0 järglast kaotanud emasloomad
1 järglase kaotanud emasloomad
2 järglast kaotanud emasloomad
≥ 3 järglast kaotanud emasloomad
Sünnijärgne (elussündide arvu ja 13. sünnijärgse päevani elus püsinud järglaste arvu vahe)
0 järglast kaotanud emasloomad
1 järglase kaotanud emasloomad
2 järglast kaotanud emasloomad
≥ 3 järglast kaotanud emasloomad

B.64 REPRODUKTIIV-/ARENGUTOKSILISUSE SÕELUURINGUT HÕLMAV KORDUVANNUSTAMISEL PÕHINEV MÜRGISUSUURING

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 422 (2016). Kemikaalide uurimist käsitlevaid OECD katsejuhendeid vaadatakse teaduse arengu arvessevõtmiseks korrapäraselt läbi. Algne sõeluuringut käsitlev katsejuhend nr 422 võeti vastu 1996. aastal ühe reproduktiiv-/arengutoksilisuse hindamist hõlmava korduvannustamisel põhineva sõeluuringu katse-eeskirja põhjal, mida arutati kahel ekspertide koosolekul, mis toimusid 1990. aastal Londonis (1) ja 1992. aastal Tokyos (2).

Käesoleva katsemeetodi puhul on reproduktiiv-/arengutoksilisuse sõeluuring, mis põhineb liikmesriikides suures mahus toodetavate olemasolevate kemikaalide hindamiseks kasutatud algse meetodiga omandatud ja positiivseid kontrollaineid hõlmavatest ettevalmistavatest katsetest saadud kogemustel (3, 4), ühendatud korduvannustamisel avalduva mürgisuse uuringuga, mis on kooskõlas OECD katsejuhendiga nr 407 (sellele vastab käesoleva lisa peatükk B.7 „Suukaudse kordusdoosi toksilisuse 28-päevane uuring närilistel“).

Käesolevat katsemeetodit on ajakohastamise eesmärgil täiendatud endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivate lõppnäitajatega, mis lisati järelmeetmena lähtuvalt prioriteetsest tegevussuunast, mille OECD käivitas 1998. aastal eesmärgiga vaadata läbi olemasolevad ja töötada välja uued katsejuhendid, et võimaldada sõeluuringute tegemist võimalike endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide tuvastamiseks ja selliste kemikaalide hindamist (5). Selles kontekstis täiendati 2008. aastal katsejuhendit nr 407 (sellele vastab käesoleva lisa peatükk B.7) parameetritega, mis sobivad uuritavate kemikaalide endokriinse toime tuvastamiseks. Katsejuhendi nr 422 ajakohastamise eesmärk oli lisada sõeluuringut käsitlevasse juhendisse teatavad endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivad lõppnäitajad, mida saab hinnata juhul, kui kokkupuuteperiood hõlmab mõnda tundlikku arenguperioodi (sünnieelset või varajast sünnijärgset perioodi).

Peale selle lisati katsejuhendisse nr 422 täiendavad endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivad lõppnäitajad, mida sisaldab ka katsejuhend nr 443 (sellele vastab käesoleva lisa peatükk B.56 „Laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuring“); need lõppnäitajad valiti lähtuvalt ühest teostatavusuuringust, milles käsitletakse asjaomaste lõppnäitajate lisamisega seotud teaduslikke ja tehnilisi küsimusi, ning võimalikust vajadusest katsemeetodit nende lisamiseks kohandada (6).

LÄHTEKAALUTLUSED

Uuritava kemikaali mürgisust põhjustavate omaduste kindlakstegemiseks ja hindamiseks võib teha korduval suukaudsel manustamisel avalduva mürgisuse uuringu pärast seda, kui ägeda mürgisuse katsetest on saadud esialgsed andmed kemikaali mürgisuse kohta. Käesoleva meetodi kohane uuring võimaldab saada teavet võimalike terviseohtude kohta, mis avalduvad suhteliselt piiratud ajavahemiku jooksul toimuva korduva kokkupuute tagajärjel. Käesolev meetod hõlmab lihtsat korduvannustamisel põhinevat mürgisusuuringut, mida võib kasutada kemikaalide jaoks, mille puhul 90-päevase uuringu tegemine ei ole põhjendatud (näiteks kui tootmismaht ei ületa teatavat piiri), või eeluuringuna enne pikaajalise uuringu läbiviimist. Uuringu tegemisel tuleks järgida juhtpõhimõtteid ja kaalutlusi, mis on esitatud OECD juhenddokumendis nr 19, milles käsitletakse ohutuse hindamiseks kasutatavatel katseloomadel avalduvate kliiniliste tunnuste kindlakstegemist, hindamist ja kasutamist humaanse sekkumise vajadusele viitavate näitajatena (7).

Peale selle hõlmab käesolev katsemeetod ka reproduktiiv-/arengutoksilisuse sõeluuringut ning seepärast saab seda ühtlasi kasutada uuritava kemikaali toksikoloogiliste omaduste hindamise varajases etapis või probleemse kemikaali uurimisel esialgse teabe saamiseks võimaliku mõju kohta isas- ja emasloomade paljunemisvõimele, näiteks sugunäärmete talitlusele, paaritumiskäitumisele, eostumisele, sügoodi arengule ja sünnitamisele. Käesolev katsemeetod ei võimalda saada ammendavat teavet kõikide paljunemisvõime ja arenguga seotud aspektide kohta. Eelkõige lubab see tuvastada sünnieelse kokkupuute tagajärjel sünnijärgselt avalduvaid ilminguid ja sünnijärgsest kokkupuutest tulenevat mõju üksnes piiratud ulatuses. Käesoleva meetodiga ei saa koguda tõendeid, mis lubaksid lõplikult kinnitada paljunemisele/arengule avalduva mõju puudumist; see on muu hulgas tingitud lõppnäitajate selektiivsusest ja uuringu lühikesest kestusest. Täheldatavaid positiivseid tulemusi aga on võimalik muudest reproduktiiv-/arengutoksilisuse uuringutest saadavate andmete puudumisel kasutada esialgseks ohuhindamiseks ning need aitavad teha otsuseid täiendavate uuringute tegemise vajaduse ja selliste uuringute ajastuse kohta.

Sisesekretsioonisüsteemiga seotud näitajaid käsitlevaid tulemusi tuleks vaadelda endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku (8) kontekstis. Nimetatud kontseptuaalses raamistikus on OECD täiendatud katsejuhendi nr 422 kohast meetodit käsitatud 4. taseme in vivo meetodina, mis võimaldab saada andmeid sisesekretsioonisüsteemiga seotud lõppnäitajate kaudu tuvastatava kahjuliku mõju kohta. Sisesekretsioonisüsteemist sõltuvat signaali ei pruugita eraldi võetuna siiski pidada piisavaks tõendiks selle kohta, et uuritava kemikaali puhul on tegemist endokriinfunktsiooni kahjustava kemikaaliga.

Käesoleva katsemeetodi puhul pööratakse ühtlasi suurt tähelepanu konkreetse lõppnäitajana vaadeldavale neuroloogilisele mõjule ja rõhutatakse loomade hoolika kliinilise jälgimise vajadust, et saada võimalikult palju teavet. Meetod peaks võimaldama teha kindlaks kemikaalide võimaliku neurotoksilisuse, mida võib olla vaja täiendavalt põhjalikumalt uurida. Peale selle võib käesoleva meetodiga saada esialgset teavet immunoloogilise mõju kohta.

10.

Täheldatavaid positiivseid tulemusi on võimalik muudest süsteemse mürgisuse, reproduktiiv-/arengutoksilisuse, neurotoksilisuse ja/või immunotoksilisuse uuringutest saadavate andmete puudumisel kasutada esialgseks ohuhindamiseks ning need aitavad teha otsuseid täiendavate uuringute tegemise vajaduse ja selliste uuringute ajastuse kohta. Katse tulemused võivad olla eriti kasulikud OECD sõeluuringute andmekogumi (SIDS) osana selliste olemasolevate kemikaalide hindamisel, mille kohta on vähe toksikoloogilist teavet või see puudub, ning sellist katset saab kasutada kahe eraldi katse asemel, milles hinnatakse vastavalt korduvannustamisel avalduvat mürgisust (OECD katsejuhend nr 407, mis vastab käesoleva lisa peatükile B.7) ja reproduktiiv-/arengutoksilisust (OECD katsejuhend nr 421, mis vastab käesoleva lisa peatükile B.63). Samuti võib seda kasutada ulatuslikumate paljunemisvõimet/arengut käsitlevate uuringute jaoks annusevahemiku kindlaksmääramiseks ning muudel asjakohaseks peetavatel juhtudel.

11.

Üldjuhul eeldatakse, et tiinete ja mittetiinete loomade tundlikkus on erinev. Seepärast võib kõnealuses ühendkatses kahe eraldi katse läbiviimisega võrreldes olla keerulisem teha kindlaks sobivad annusemäärad, mis võimaldaksid üheaegselt hinnata nii üldist süsteemset mürgisust kui ka konkreetselt reproduktiiv-/arengutoksilisust. Peale selle võib üldise süsteemse mürgisusega seotud katsetulemuste tõlgendamine olla raskem kui korduvannustamisel põhineva eraldi katse tegemisel, eriti juhul, kui seeruminäitajaid ja histopatoloogilisi näitajaid ei analüüsita uuringus üheaegselt. Nende tehniliste aspektide keerukusest tulenevalt nõuab kõnealuse ühendatud sõeluuringu läbiviimine ulatuslikke kogemusi mürgisuse hindamisel. Teisest küljest võimaldab selline ühendkatse peale väiksema arvu loomade kasutamise paremini eristada paljunemisele/arengule avalduvat otsest mõju mõjust, mis ilmneb muu (süsteemse) mõju tagajärjel.

12.

Käesoleva meetodi puhul on manustamisperiood pikem kui tavapärases 28-päevases korduvannustamisel põhinevas uuringus. Samal ajal on kummastki soost loomade arv igas rühmas väiksem kui olukorras, kus peale tavapärase 28-päevase korduvannustamisel põhineva uuringu tehakse veel ka reproduktiiv-/arengutoksilisuse sõeluuring.

13.

Käesoleva katsemeetodi puhul eeldatakse, et uuritavat kemikaali manustatakse suu kaudu. Muu manustamisviisi kasutamise korral võib olla vaja teha meetodis muudatusi.

14.

15.

Kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.

KATSE PÕHIMÕTE

16.

Uuritavat kemikaali manustatakse astmeliselt suurenevates annustes mitme rühma isas- ja emasloomadele. Isasloomade puhul peaks manustamine toimuma vähemalt nelja nädala kestel kuni kavandatud surmamispäevale eelneva päevani, sealhulgas surmamiseelsel päeval (see hõlmab vähemalt kahte paaritumiseelset nädalat, paaritumisperioodi ja umbes kahte paaritumisjärgset nädalat). Kuna isasloomadel on paaritumiseelne manustamisperiood piiratud kestusega, ei pruugi viljakus olla eriti tundlik munanditele avalduva mürgisuse näitaja. Seepärast on vajateha munandite üksikasjalik histoloogiline analüüs. Kahe nädala pikkust paaritumiseelset manustamisperioodi koos järgneva paaritumise/viljakuse jälgimisega ning manustamisperioodi üldkestusega vähemalt neli nädalat, millele järgneb isaslooma sugunäärmete üksikasjalik histopatoloogiline analüüs, peetakse enamiku isasloomal täheldatavate viljakusele ja spermatogeneesile avalduva mõju ilmingute tuvastamiseks piisavaks.

17.

18.

19.

MEETODI KIRJELDUS

Loomaliigi valimine

20.

Käesolev katsemeetod on kavandatud kasutamiseks rotil. Kui katsejuhendis nr 422 kirjeldatud näitajaid hinnatakse mõne muu liigi närilistel, tuleks seda üksikasjalikult põhjendada. Endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide kindlakstegemise rahvusvahelises valideerimisprogrammis, mille puhul on lähtutud katsejuhendist nr 407, kasutati ainsa liigina rotte. Ei tohiks kasutada liine, kus sigivus on väike või kus teadaolevalt esineb sageli arenguhäireid. Tuleks kasutada terveid varem paaritamata loomi, keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomi tuleks iseloomustada liigi, liini, soo, kehamassi ja vanuse järgi. Uuringu alguses peaksid kasutatavate loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte üle ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kehamassist. Kui uuring viiakse läbi pikaajalise või tervet põlvkonda hõlmava uuringu eeluuringuna, tuleks mõlemas uuringus soovitatavalt kasutada samast liinist ja sama päritolu loomi.

Pidamis- ja söötmistingimused

21.

Kõik katsetoimingud peaksid vastama kohalikele laboriloomade hooldamise normidele. Katseloomade ruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Suhteline õhuniiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada sööda sobivus uuritava kemikaali lisamiseks, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil.

22.

23.

Sööta tuleks korrapäraselt analüüsida saasteainete suhtes. Asjaomase sööda proov tuleks kuni katseprotokolli lõpliku valmimiseni alles hoida.

Loomade ettevalmistamine

24.

Terved noored täiskasvanud loomad jagatakse juhuvaliku alusel katserühmadesse ja puuridesse. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud võimalik mõju oleks võimalikult väike. Loomad idenditakse üheselt ja neil lastakse enne uuringu algust puuris vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda.

Annuste ettevalmistamine

25.

Uuritavat kemikaali on soovitatav manustada suu kaudu, välja arvatud juhul, kui mõnda muu manustamisviisi peetakse sobivamaks. Uuritava kemikaali suukaudseks manustamiseks kasutatakse tavaliselt toitmissondi; selle asemel võib siiski kasutada ka sööda või joogiveega manustamist.

26.

Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas kandeaines. Kui vähegi võimalik, on soovitatav esmalt kaaluda vesilahuse või veepõhise suspensiooni ja seejärel õlilahuse või õlipõhise suspensiooni (nt maisiõli) kasutamist ning pärast seda lahustamist mõnes muus kandeaines. Muu kandeaine kui vee puhul peaksid olema teada selle mürgisusnäitajad. Tuleks teha kindlaks uuritava kemikaali püsivus ja homogeensus kandeaines.

KATSE KÄIK

Loomade arv ja sugu

27.

Soovitatavalt peaks igas rühmas olema alguses vähemalt 10 isaslooma ja 12–13 emaslooma. Emasloomi hinnatakse kokkupuute eel innatsükli alusel ja loomad, kelle innatsükkel erineb tavapärasest 4–5 päeva pikkusest tsüklist, jäetakse uuringust välja; seepärast on soovitatav kasutada suuremat arvu emasloomi, et igas rühmas oleks lõpuks 10 emaslooma. Eeldatavalt tiinestub igas rühmas vähemalt 8 emaslooma – seda peetakse tavapäraselt minimaalseks vastuvõetavaks tiinestumismääraks –, välja arvatud juhul, kui ilmneb märkimisväärne mürgine mõju. Eesmärk on saada piisav arv tiineid emasloomi, et oleks võimalik usaldusväärselt hinnata uuritava kemikaali võimet mõjutada viljakust, tiinust, ema- ja imetamiskäitumist ning F1-põlvkonna järglaste kasvu ja arengut eostamisest kuni kolmeteistkümnenda sünnijärgse päevani. Kui osa loomi on kavas surmata juba katse ajal, tuleks suurendada loomade arvu nende loomade arvu võrra, kes surmatakse plaanijärgselt enne katse lõppu. Tuleks kaaluda võimalust luua kontrollrühma ja suurima annusega töödeldava rühma juurde täiendrühm, millesse kuulub kummastki soost viis looma, et jälgida vähemalt 14 päeva jooksul pärast manustamise lõpetamist süsteemse mürgise mõju pöörduvust, püsivust või viivitusega avaldumist. Täiendrühma loomi ei paaritata ja neid ei kasutata seega reproduktiiv-/arengutoksilisuse hindamisel.

Annused

28.

Üldjuhul tuleks kasutada vähemalt kolme katserühma ja ühte kontrollrühma. Sobivate üldise mürgisuse andmete puudumisel võib kasutatavate annuste kindlaksmääramise hõlbustamiseks teha annusevahemiku kindlaksmääramise uuringu, kus kasutatakse samast liinist ja sama päritolu loomi. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda täpselt samal viisil kui katserühma loomi; ainus erinevus seisneb uuritava kemikaali manustamata jätmises. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet, tuleks võrdlusrühma loomadele manustada kandeainet suurimas kasutatavas koguses.

29.

Annuste valimisel tuleks võtta arvesse kõiki kättesaadavaid mürgisusandmeid ja (toksiko)kineetilisi andmeid. Samuti tuleks arvesse võtta, et tiinete ja mittetiinete loomade tundlikkus võib olla erinev. Suurim annus tuleks valida nii, et kemikaal avaldaks mürgist mõju, kuid ei põhjustaks surma ega ilmseid kannatusi. Seejärel tuleks valida rida järk-järgult vähenevaid annuseid, mis võimaldaksid tõendada mõju sõltuvust annusest ja väikseima annuse puhul kahjuliku mõju puudumist. Sageli on eri annuste vaheline optimaalne erinevus kahe- kuni neljakordne ning üksteisest väga palju (näiteks üle 10 korra) erinevate annuste kasutamise asemel on tihti soovitatav lisada neljas katserühm.

30.

Piirsisalduskatse

31.

Kui käesoleva meetodi kohaselt läbi viidud suukaudse manustamise uuringus, milles kasutatakse ainsa annusena annust vähemalt 1 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas või sööda või joogiveega manustamise korral sellega samaväärset protsentuaalset sisaldust söödas või joogivees (see määratakse kindlaks kehamassi mõõtmise alusel), ei täheldata mürgist mõju ja kui mürgisus ei ole uuritava kemikaaliga struktuurilt sarnaste ainetega saadud andmete põhjal ootuspärane, ei pruugita pidada mitme eri annusega täismahus uuringu tegemist vajalikuks. Piirsisalduskatse tulemused on kohaldatavad, kui inimese kokkupuutega seotud andmed ei viita vajadusele kasutada suuremat annusemäära. Muu manustamisviisi korral, näiteks sissehingamise teel või naha kaudu manustamisel võib uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest tulenevalt olla tihti vaja kasutada suurimat saavutatavat kokkupuutemäära.

Annuste manustamine

32.

Uuritavat kemikaali manustatakse loomadele seitsmel päeval nädalas. Kui manustamiseks kasutatakse toitmissondi, tuleks kemikaali loomadele manustada ühe annusena maosondi või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Suurim korraga manustatav vedelikukogus sõltub katselooma suurusest. See kogus ei tohiks olla suurem kui 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuse puhul, mida võib manustada koguses 2 ml 100 g kehamassi kohta. Katseskasutatava vedelikukoguse varieeruvuse minimeerimiseks tuleks reguleerida uuritava kemikaali kontsentratsiooni nii, et lahuse maht oleks kõikide annuste puhul ühesugune; see ei ole nõutav ärritava või söövitava uuritava kemikaali puhul, mille mõju kontsentratsiooni suurenedes tavaliselt tugevneb.

33.

Katse ajakava

34.

Annuste manustamist tuleks kummagi soo puhul alustada kaks nädalat enne paaritamist pärast seda, kui loomadel on lastud vähemalt viis päeva kohaneda ja emasloomi on hinnatud lähtuvalt innatsükli tavapärasest kestusest (töötlemiseelse kahe nädala pikkuse perioodi vältel). Uuringu ajakava peaks olema selline, et innatsükli hindamist alustatakse varsti pärast seda, kui loomad on saanud täielikult suguküpseks. See aeg võib olla eri rotiliinidel ja eri laborites veidi erinev: näiteks Sprague Dawley rottidel saabub suguküpsus 10 nädala vanuses ja Wistari rottidel umbes 12 nädala vanuses. Järglastega emasloomad tuleks surmata 13. sünnitusjärgsel päeval või veidi hiljem. Järglastega emasloomi ja järglasi ei pea tingimata surmama samal päeval, kui järglastega emasloomadel eelistatakse lasta enne vereproovi võtmist hommikuni paastuda. Sünnitamispäeva (päev, mil sünnitus lõpeb) loetakse sünnitusjärgseks 0-päevaks. Emasloomad, kellel ei täheldata paaritumise ilminguid, surmatakse 24–26 päeva pärast paaritumisperioodi viimast päeva. Paaritumisperioodi vältel jätkatakse kummastki soost loomadele kemikaali manustamist. Isasloomadele manustamist tuleks paaritumisperioodi järgselt jätkata vähemalt seni, kuni manustamisperioodi algusest on möödunud kokku minimaalselt 28 päeva. Seejärel loomad surmatakse või teise võimalusena jätkatakse neile kemikaali manustamist, et viia võimaluse korral läbi teine paaritamine, kui seda peetakse asjakohaseks.

35.

36.

Järelvaatluste jaoks ette nähtud täiendrühma kasutamisel jäetakse sellise rühma loomad paaritamata. Neid tuleks pärast järglastega emasloomade esimest plaanijärgset surmamist pidada veel vähemalt 14 päeva ja selle aja jooksul ei tohiks neile kemikaali manustada, et oleks võimalik hinnata mürgise mõju viivitusega avaldumist või selle püsivust või mürgisest mõjust taastumist.

37.

Katse skemaatiline ajakava on esitatud 2. liites.

Innatsükkel

38.

Enne töötlemise alustamist tuleks jälgida innatsüklit ning valida selle alusel uuringusse emasloomad, kelle tsükkel on korrapärane (vt punkt 27). Tupeäigeid tuleks igapäevaselt hinnata ka alates töötlemisperioodi algusest kuni paaritumise ilmingute tuvastamiseni. Kui on kahtlus, et innatsükkel võib pärast manustamise alustamist ägeda stressi mõjul muutuda, võib katseloomi laboris 2 nädala vältel uuritava kemikaaliga töödelda ning seejärel koguda paaritumiseelsel perioodil innatsükli jälgimiseks vähemalt kahe nädala jooksul iga päev tupeäigeid ja jätkata jälgimist ka paaritumisperioodil, kuni täheldatakse paaritumise ilminguid. Tupe-/emakakaelarakkude võtmisel tuleks olla ettevaatlik, et mitte kahjustada limaskesta, kuna see võib põhjustada pseudotiinuse teket (8, 9).

Paaritamine

39.

Pesakonna suurus

40.

41.

Vaatlused

42.

Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas, igal päeval soovitatavalt samal ajal või samadel aegadel; seejuures tuleks võtta arvesse manustamisjärgse eeldatava mõju maksimaalse avaldumise aega. Tuleks registreerida loomade tervislik seisund. Kõiki loomi kontrollitakse haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks vähemalt kaks korda päevas.

43.

Kõikide paaritatavate loomade puhul tuleks läbi viia üksikasjalikud kliinilised vaatlused üks kord enne uuritava kemikaali manustamist (võimaldamaks sama loomaga saadud tulemuste võrdlemist) ning seejärel vähemalt kord nädalas. Need vaatlused tuleks teha standardalal väljaspool looma pidamiseks kasutatavat puuri ja igal vaatluste tegemise päeval soovitatavalt samal kellaajal. Tulemused tuleks hoolikalt registreerida; selleks tuleks soovitatavalt kasutada katset läbi viivas laboris selgelt kindlaks määratud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et katsetingimused varieeruksid võimalikult vähe ja vaatlusi teeksid soovitatavalt isikud, kes ei ole asjaomasest töötlemisest teadlikud. Tuleks registreerida vähemalt järgmised ilmingud: nahal, karvastikus, silmades ja limaskestadel täheldatavad muutused, sekreetide ja eritiste esinemine ning autonoomse närvisüsteemiga seotud ilmingud (nt pisaravoolus, piloerektsioon, pupillide suuruse muutus, ebaharilik hingamisrütm). Peale selle tuleks registreerida muutused kõnnakus, kehahoius ja selles, kuidas loomad nendega ümberkäimisele reageerivad, samuti klooniliste ja tooniliste liigutuste esinemine, stereotüüpia (nt ülemäärane karvastiku hooldamine, ringiratast keerlemine), raske või kauakestnud sünnitus ja kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi kõndimine) (10).

44.

Uuringu kestel tuleks igast rühmast juhuvaliku alusel valitud viiel isasloomal ja viiel emasloomal hinnata ühel korral sensoorseid reaktsioone eri liiki ärritajatele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptiivsetele ärritajatele) (8, 9, 11), haardetugevust (12) ja motoorset tegevust (13). Asjaomaste võimalike meetodite täpsem kirjeldus on esitatud vastavate viidete kohastes allikates. Viidatud meetodite asemel võib siiski kasutada ka muid meetodeid. Isasloomadel tuleks kõnealused funktsionaalsed vaatlused läbi viia manustamisperioodi lõppjärgus veidi enne plaanijärgset surmamist, kuid enne hematoloogiliseks uuringuks või kliiniliseks biokeemiliseks analüüsiks vereproovi võtmist (vt punktid 53–56, sh joonealune märkus 1). Emasloomad peaksid nende funktsionaalsete vaatluste ajal olema sarnases füsioloogilises seisundis ja neid tuleks soovitatavalt vaadelda ühel korral viimasel imetamisnädalal (nt 6.–13. imetamispäeval) veidi enne plaanijärgset surmamist. Ajavahemik, mille vältel järglased on emast eraldatud, peaks olema võimalikult lühike.

45.

Uuringu lõppjärgus ühel korral tehtavad funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta, kui uuring viiakse läbi järgnevalt tehtava subkroonilise mürgisuse 90-päevase uuringu või pikaajalise uuringu eeluuringuna. Sellisel juhul tuleks kõnealused funktsionaalsed vaatlused läbi viia vastava järeluuringu käigus. Teisest küljest aga võivad käesoleva meetodi kohase korduvannustamisel põhineva uuringu käigus tehtud funktsionaalsete vaatluste andmed hõlbustada järgnevalt tehtava subkroonilise mürgisuse uuringu või pikaajalise uuringu jaoks annusemäärade valimist.

46.

Funktsionaalsed vaatlused võib erandkorras ära jätta ka rühmade puhul, kus täheldatakse nii ulatuslikke mürgisusnähte, et see mõjutab märkimisväärselt funktsionaalse hindamise tulemuslikkust.

47.

48.

Elus järglased tuleks loendada ja määrata nende sugu ning pesakonda tuleks kaaluda 24 tunni jooksul pärast sünnitust (sünnitusjärgsel 0-päeval või 1. päeval) ning vähemalt 4. ja 13. sünnitusjärgsel päeval. Peale paaritatavatel loomadel tehtavate vaatluste tulemuste (vt punktid 43–44) tuleks registreerida ka kõik järglaste ebatavalise käitumise ilmingud.

49.

Kõikidel järglastel tuleks ajavahemikul sünnijärgsest 0-päevast kuni 4. sünnijärgse päevani mõõta ühel ja samal päeval AGD. Järglaste kehamassi andmed tuleks koguda AGD mõõtmise päeval ja AGD tuleks normaliseerida järglase suurust kajastava näitaja, soovitatavalt kehamassi kuupjuure suhtes (14). Isastel järglastel tuleks 12. või 13. sünnijärgsel päeval loendada nisade/areoolide arv, nagu on soovitatud OECD katsejuhendis nr 151 (15).

Kehamass ja sööda/vee tarbimine

50.

51.

Paaritumiseelsel perioodil ning tiinuse ja imetamise ajal tuleks söödatarbimist mõõta vähemalt kord nädalas. Paaritumisperioodil ei ole söödatarbimise mõõtmine kohustuslik. Kui uuritavat kemikaali manustatakse veega, tuleks eelnimetatud perioodidel mõõta ka veetarbimist.

Hematoloogiline analüüs

52.

Uuringu vältel tuleks igast rühmast juhuvaliku alusel valitud viiel emasloomal ja viiel isasloomal viia ühel korral läbi hematoloogiline analüüs järgmiste näitajate määramiseks: hematokrit, hemoglobiinisisaldus, erütrotsüütide arv, retikulotsüütide arv, leukotsüütide üldarv ja eri tüüpi leukotsüütide arv, vereliistakute arv ja vere hüübimisaeg/hüübimisvõime. Kui uuritav kemikaal või mõni selle võimalikest metaboliitidest on või võib olla oksüdeerivate omadustega, tuleks teha muu hulgas kindlaks veel ka methemoglobiinisisaldus ja Heinzi kehakeste esinemine.

53.

Vereproov tuleks võtta kindlaksmääratud kohast. Emasloomad peaksid proovivõtu ajal olema sarnases füsioloogilises seisundis. Tiinuse algusaja varieeruvusega seotud praktilistest raskustest tulenevalt võib emasloomadelt vereproovi võtta juba paaritumiseelse perioodi lõpus, selmet võtta see loomade humaanse surmamise käigus või vahetult enne seda. Isasloomadelt tuleks vereproov võtta loomade humaanse surmamise käigus või vahetult enne seda. Teise võimalusena võib isasloomadelt vereproovi samuti võtta paaritumiseelse perioodi lõpus, kui emasloomade puhul eelistatakse seda proovivõtuaega.

54.

Vereproove tuleks säilitada sobivates tingimustes.

Kliiniline biokeemiline analüüs

55.

Kliinilise biokeemilise analüüsi jaoks, mille eesmärk on hinnata kudedes avalduvat olulist mürgist mõju ning konkreetset mõju neerudele ja maksale, tuleks kasutada kõnealuse igast rühmast valitud viie emaslooma ja viie isaslooma vereproove. Loomadel on soovitatav enne vereproovi võtmist hommikuni paastuda (22). Plasma või seerumi analüüs peaks hõlmama naatriumi, kaaliumi, glükoosi, kolesterooli üldsisalduse, karbamiidi, kreatiniini, valgu üldsisalduse ja albumiini, vähemalt kahe maksarakkudele avalduvale toimele osutava ensüümi (näiteks alaniini aminotransferaasi, aspartaadi aminotransferaasi ja sorbitooli dehüdrogenaasi) ning sapphapete määramist. Teatavatel juhtudel võib kasulikku teavet saada veel muude (maksas või mujal toodetud) ensüümide ja bilirubiini määramisest.

56.

Vereproovid võetakse kindlaksmääratud kohast järgmise kava alusel:

—	igas pesakonnas vähemalt kahelt järglaselt 4. sünnijärgsel päeval, kui järglaste arv seda võimaldab (vt punktid 40-41),

—	kõikidelt järglastega emasloomadelt ja igas pesakonnas vähemalt kahelt järglaselt surmamise ajal 13. päeval ning

—	kõikidelt täiskasvanud isasloomadelt surmamise ajal.

57.

Uuringu viimasel nädalal võib igast rühmast juhuvaliku alusel valitud viielt isasloomalt koguda teatud kindla aja jooksul uriiniproovi ja määrata uriinianalüüsi käigus järgmised näitajad: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valgusisaldus, glükoosisisaldus ja veresisaldus / vererakkude sisaldus.

58.

Peale selle tuleks kaaluda üldistele koekahjustustele osutavate seerumimarkerite uurimist. Kui uuritav kemikaal on oma teadaolevatest omadustest tulenevalt võimeline mõjutama asjaomast ainevahetusprofiili või kui esineb sellekohane kahtlus, peaks määramine muu hulgas hõlmama veel ka kaltsiumi, fosfaati, paastumisjärgselt määratavaid triglütseriide ja glükoosi, teatavaid hormoone, methemoglobiini ja koliini esteraasi. Kõnealused näitajad tuleb igal konkreetsel juhul eraldi kindlaks määrata.

59.

Hormoonide määramisel võivad varieeruvust ja absoluutset kontsentratsiooni mõjutada järgmised tegurid:

—	surmamise aeg tulenevalt asjaolust, et hormoonide kontsentratsioon ööpäeva jooksul muutub;

—	surmamisviis – tuleks hoiduda tekitamast loomadele tarbetut stressi, mis võib mõjutada hormoonide kontsentratsiooni;

—	hormoonide määramise komplektid, milles kasutatavad standardkõverad võivad olla erinevad.

60.

61.

Kui varasemad võrdlusandmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja kliiniliste biokeemiliste näitajate määramist enne manustamisperioodi algust või soovitatavalt loomadel, kes ei kuulu ühessegi katserühma. Emasloomade puhul tuleb andmete saamiseks kasutada imetavaid loomi.

PATOLOOGILINE ANALÜÜS

Täielik lahkamine

62.

Kõikidele uuringus kasutatud täiskasvanud loomadele tuleks teha täielik, põhjalik lahkamine, mille käigus uuritakse hoolikalt keha välispinda, kõiki avausi ning kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivsüsteemi elunditele. Tuleks registreerida pesastumiskohtade arv. Lahkamispäeval tuleks analüüsida tupeäiet, et teha kindlaks innatsükli etapp ja võimaldada korreleerimist emassuguelundite histopatoloogilise analüüsi tulemustega.

63.

64.

Kõikidelt täiskasvanud isas- ja emasloomadelt ning igast pesakonnast ühelt isaselt ja ühelt emaselt 13 päeva vanuselt järglaselt võetud kilpnääret tuleks säilitada fikseerimislahuses, mis on järgneva kavandatud histopatoloogilise analüüsi läbiviimiseks kõige sobivam. Kilpnäärme massi võib määrata pärast fikseerimist. Liigsed koed tuleks samuti eemaldada väga ettevaatlikult alles pärast fikseerimist, et kudesid mitte kahjustada. Koekahjustus võib mõjutada histopatoloogilise analüüsi tulemusi. Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast vahetult enne loomade humaanset surmamist või selle ajal ja neid tuleks säilitada sobivates tingimustes (vt punkt 56).

65.

Peale selle tuleks igast rühmast juhuvaliku alusel valitud vähemalt viielt täiskasvanud isas- ja emasloomalt (juhuvalik ei hõlma loomi, kes on leitud olevat surmaeelses seisundis ja/või on enne uuringu lõppu humaanselt surmatud) võtta maks, neerud, neerupealised, harknääre, põrn, aju ja süda, eemaldada vastavalt vajadusele nende külge jäänud koed ning määrata kuivamise ärahoidmiseks võimalikult kiiresti pärast väljalõikamist nende märgmass. Nii koetüübi kui ka kavandatud järgneva histopatoloogilise uuringu jaoks kõige sobivamas fikseerimislahuses tuleks säilitada järgmisi kudesid: kõik silmaga nähtavate kahjustustega koed, aju (representatiivsed piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju ja ajusild), seljaaju, silm, magu, peensool ja jämesool (sealhulgas Peyeri naastud), maks, neerud, neerupealised, põrn, süda, harknääre, hingetoru ja kopsud (säilitamiseks täidetakse need fikseerimislahusega ja sukeldatakseseejärel lahusesse), sugunäärmed (munandid ja munasarjad), suguelundid (emakas ja emakakael, munandimanused, eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega), tupp, kusepõis, lümfisõlmed (peale manustamiskohale kõige lähemal asuva lümfisõlme tuleks võtta labori kogemustest lähtuvalt veel teinegi lümfisõlm (16)), perifeerne närv (istmiku- või sääreluunärv), soovitatavalt lihase läheduses, skeletilihas ning luu koos luuüdiga (lõik või teise võimalusena värskelt aspireeritud luuüdi preparaat). Munandid on soovitatav fikseerida Bouini või muudetud Davidsoni fikseerimislahusesse sukeldamise teel (16, 17, 18); formaliinis fikseerimine ei ole nende kudede puhul soovitatav. Fikseerimislahuse kiire sissetungimise võimaldamiseks võib elundi kummaski otsas valkjaskesta ettevaatlikult väikese sügavuseni nõelaga läbi torgata. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Tuleks säilitada ka kõik elundid, mida uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt peetakse tõenäoliseks sihtelundiks.

66.

Sisesekretsioonisüsteemiga seotud mõju kohta võib saada väärtuslikku teavet järgmiste kudede uurimisel: sugunäärmed (munasarjad ja munandid), suguelundid (emakas koos emakakaelaga, munandimanused, seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega, eesnäärme dorsolateraalne ja ventraalne osa), tupp, ajuripats, isaslooma rinnanäärmed ja neerupealised. Isaslooma rinnanäärmetes aset leidvad muutused on ebapiisavalt dokumenteeritud, kuid see näitaja võib olla väga tundlik östrogeense toimega ainete suhtes. Punktis 65 loetlemata elundite/kudede analüüsimine ei ole kohustuslik.

67.

Histopatoloogiline analüüs

68.

Kontrollrühmast ja suurima annusega töödeldud rühmast valitud loomadelt pärit säilitatud elundite ja kudede puhul tuleks viia läbi täismahus histopatoloogiline uuring (seejuures tuleks pöörata erilist tähelepanu spermatogeneesi etappidele isaslooma sugunäärmetes ja munandite interstitsiaalrakustruktuuri histopatoloogilisele analüüsile). Vajaduse korral võib uurida ka järglastelt ja ülejäänud täiskasvanud loomadelt võetud kilpnääret. Kui suurima annusega töödeldud rühmas täheldatakse manustamisega seotud muutusi, peaks kõnealune analüüs hõlmama ka teiste annuserühmade loomi. Täiendav üksikasjalik teave sisesekretsioonisüsteemi kudede väljalõikamise, fikseerimise, neist lõikude tegemise ja nende histopatoloogilise analüüsi kohta on esitatud histopatoloogilise analüüsi juhendis (10).

69.

Tuleks uurida kõiki silmaga nähtavaid kahjustusi. NOAELi kindlakstegemise hõlbustamiseks tuleks analüüsida ka teiste annuserühmade loomade sihtelundeid, eelkõige sellistest rühmadest pärit sihtelundeid, mida iseloomustavate tulemuste põhjal saab väidetavalt määrata kindlaks NOAELi.

70.

Täiendrühma kasutamise korral tuleks histopatoloogilise analüüsi raames hinnata neid kudesid ja elundeid, kus katserühmade loomade puhul täheldati mõju avaldumist.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmed

71.

72.

Numbrilisi tulemusi tuleks võimaluse korral hinnata asjakohase üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Eri annuste puhul täheldatud mõju võrdlemisel tuleks hoiduda mitme t-testi kasutamisest. Kasutatavad statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis. AGD ja nisade esinemise statistiline analüüs peaks põhinema iga üksiku järglase andmetel ning seejuures tuleks arvesse võtta pesakonnas ilmnevat mõju. Vajaduse korral käsitatakse analüüsiüksusena pesakonda. Järglaste kehamassi statistiline analüüs peaks põhinema iga üksiku järglase andmetel ning seejuures tuleks arvesse võtta pesakonna suurust. Uuringu piiratud ulatusest tulenevalt on tulemuste olulisuse tuvastamiseks tehtava statistilise analüüsi väärtus paljude lõppnäitajate, eelkõige paljunemisega seotud lõppnäitajate puhul piiratud. Mõned kõige sagedamini kasutatavatest meetoditest, eelkõige parameetrilised testid keskmise suundumuse näitajate analüüsimiseks, on ebasobivad. Statistilise analüüsi kasutamisel tuleks valida meetod, mis on uuritava muutuja väärtuste jaotuse analüüsimiseks sobiv, ning see valik tuleks teha enne uuringu alustamist.

Tulemuste hindamine

73.

74.

75.

Katseprotokoll

76.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal:

—	allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

—	uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

Kandeaine (vajaduse korral):

—	kandeaine valimise põhjendus, kui kandeaine ei ole vesi.

Katseloomad:

—	kasutatud liik/liin;

—	loomade arv, vanus ja sugu;

—	päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne;

—	iga looma kehamass katse alguses;

—	liigi valimise põhjendus, kui katseloom ei ole rott.

Katsetingimused:

—	annuste valimise põhjendus;

—	üksikasjad uuritava kemikaali valmistise / söödavalmistise, saavutatud kontsentratsioonide ning valmistise püsivuse ja homogeensuse kohta;

—	uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;

—	vajaduse korral andmed söödas/joogivees sisalduva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (ppm) teisendamiseks tegelikuks annuseks (mg kehamassi kilogrammi kohta päevas);

—	sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;

—	järglaste surmamise korral üksikasjalik kirjeldus surmatavate järglaste juhusliku valimise korra kohta.

Tulemused:

—	kehamass / kehamassi muutused;

—	vajaduse korral söödatarbimine ja veetarbimine;

—	mürgise mõju andmed kummagi soo ja iga annusemäära kohta, sealhulgas viljakusele ja tiinusele avalduva mõju ning mis tahes muude mürgisusnähtude kohta;

—	tiinuse kestus;

—	mürgisus või muu mõju paljunemisele, järglastele, sünnijärgsele kasvule jne;

—	kliiniliste ilmingute laad, raskusaste ja kestus (nähtude pöörduvus või pöördumatus);

—	sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hindamise tulemused;

—	hematoloogilise analüüsi tulemused koos asjaomaste võrdlusväärtustega;

—	kliinilise biokeemilise analüüsi tulemused koos asjaomaste võrdlusväärtustega;

—	normaalse või ebanormaalse innatsükliga täiskasvanud emasloomade arv ja tsükli kestus;

—	elussündide arv ja pesastumisjärgne kadu;

—	silmaga nähtavate kõrvalekalletega järglaste arv; väliste suguelundite makroskoopilise hindamise tulemused, kängunud järglaste arv;

—	katse vältel suremise aeg või teave selle kohta, et loomad olid kuni surmamiseni elus;

—	pesastunud embrüote arv, pesakonna suurus ja pesakonna kaal mõõtmishetkel;

—	järglaste kehamassi andmed;

—	iga järglase AGD (ja kehamass AGD mõõtmise päeval);

—	nisade esinemine isastel järglastel;

—	kilpnäärmehormoonide sisaldus järglastelt 13. päeval võetud proovides ja täiskasvanud isasloomade proovides (ning järglastega emasloomade proovides ja järglastelt 4. päeval võetud proovides, kui seda on mõõdetud);

—	andmed järglastega loomade kehamassi kohta surmamise hetkel ning selliste loomade elundite massi kohta;

—	lahkamistulemused;

—	histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;

—	andmed absorbeerumise kohta (kui on olemas);

—	vajaduse korral tulemuste statistilise analüüsi andmed.

Tulemuste arutelu

Järeldused

Tulemuste tõlgendamine

77.

Kirjeldatud uuring võimaldab hinnata annuste korduval manustamisel täheldatavat paljunemisele/arengule avalduvat mürgist mõju. Kuna rõhk on seatud nii üldise mürgisuse kui ka reproduktiiv-/arengutoksilisuse lõppnäitajate hindamisele, võimaldavad uuringu tulemused eelkõige eristada üldise mürgisuse puudumisel paljunemisele/arengule avalduvat mõju sellisest mõjust paljunemisele/arengule, mis avaldub üksnes kontsentratsioonil, mille juures kemikaal on mürgine ka järglaste vanematele (vt punktid 7–11). Saadud tulemused võivad viidata vajadusele teha täiendavaid uuringuid ja võivad hõlbustada järgnevate uuringute kavandamist. Paljunemise ja arenguga seotud tulemuste hõlpsamaks tõlgendamiseks tuleks tutvuda OECD juhenddokumendiga nr 43 (19). Käesoleva katsemeetodi puhul võib olla kasu närilistega tehtavate sisesekretsioonisüsteemi ja paljunemisega seotud katsete tulemuste histoloogilist hindamist käsitlevas OECD juhenddokumendis nr 106 (16) esitatud teabest (sisesekretsiooni)elundite ja tupeäiete ettevalmistamise ja hindamise kohta.

KIRJANDUS

(1)

OECD (1990). Kemikaalide töörühma ja halduskomitee 14. ühiskoosoleku koosolekudokument nr 1. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis.

(2)

OECD (1992). Ajutise eksperdirühma esimehe aruanne reproduktiivtoksilisust käsitlevate sõeluuringumeetodite alase koosoleku kohta. Tokyo, 27.–29. oktoober 1992. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis.

(3)

Mitsumori, K., Kodama, Y., Uchida, O., Takada, K., Saito, M., Naito, K., Tanaka, S., Kurokawa, Y., Usami, M., Kawashima, K., Yasuhara, K., Toyoda, K., Onodera, H., Furukawa, F., Takahashi, M., ja Hayashi, Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol. Sci. 19: 141–149.

(4)

Tanaka, S., Kawashima, K., Naito, K., Usami, M., Nakadate, M., Imaida, K., Takahashi, M., Hayashi, Y., Kurokawa, Y., ja Tobe, M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol. 18: 89–95.

(5)

OECD (1998). Endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise (EDTA) OECD rakkerühma esimese koosoleku aruanne. 10.–11. märts 1998. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis.

(6)

OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 217. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(7)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(8)

Goldman, J. M., Murr, A. S., ja Cooper, R. L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies. Birth Defects Res. B 80(2): 84–97.

(9)

Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons. Väljaandes: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization. Auston, C. R., ja Short, R. V. (toim.), Cambridge, New York.

(10)

Rahvusvaheline kemikaaliohutuse programm (IPCS) (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.

(11)

Moser, V. C., McDaniel, K. M., ja Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.

(12)

Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., ja Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.

(13)

Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., ja MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.

(14)

Gallavan, R. H. Jr., Holson, J. F., Stump, D. G., Knapp, J. F., ja Reynolds, V. L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights. Reprod. Toxicol. 13: 383–390.

(15)

OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 151. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(16)

OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 106. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(17)

Hess, R. A., ja Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. Väljaandes: Methods in Reproductive Toxicology. Chapin, R. E., ja Heindel, J. J. (toim.), Academic Press, San Diego, CA. Lk 52–85.

(18)

Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R., Jonassen, H., ja Creasy, D. M. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s Fluid. Toxicol. Pathol. 30: 524–533.

(19)

OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 43. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(20)

OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Series on Testing and Assessment No. 150. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

1. liide

MÕISTED (VT KA OECD JUHENDDOKUMENT NR 150 (20))

Androgeensus kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik androgeen (nt testosteroon).

Annus manustatav uuritava kemikaali kogus. Annust väljendatakse uuritava kemikaali kogusena massiühikutes katselooma kehamassi ühiku kohta päevas (näiteks milligrammides kehamassi kilogrammi kohta päevas) või kemikaali püsiva kontsentratsioonina söödas.

Annustamine üldmõiste, mis hõlmab annust, selle manustamise sagedust ja annustamise kestust.

Antiandrogeensus kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku androgeeni (nt testosterooni) toimet.

Antitüreoidne aktiivsus kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku kilpnäärmehormooni (nt T3) toimet.

Antiöstrogeensus kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku östrogeeni (nt 17β-östradiooli) toimet.

Arengutoksilisus reproduktiivtoksilisuse ilming, mis avaldub järglaste sünnieelse, perinataalse või sünnijärgse struktuuri- või funktsioonihäirena.

Emale avalduv mürgisus tiinele emasloomale avalduv kahjulik mõju, mis on spetsiifiline (otsene mõju) või mittespetsiifiline (kaudne mõju) ning on seotud tiinusega.

Ilmne mürgisus üldmõiste, mille abil kirjeldatakse uuritava kemikaali manustamise järel täheldatavaid selgeid mürgisusnähte. Kõnealused nähud peaksid olema ohu hindamiseks piisavad ja sellised, et manustatava annuse suurendamisega kaasnevad eeldatavalt tõsised mürgisusnähud ja tõenäoliselt ka surm.

Kemikaal aine või segu.

NOAEL lühend, millega tähistatakse annusemäära, mille juures ei täheldata kahjulikku toimet. Tegemist on suurima annusega, mis ei põhjusta manustamisest tingitud kahjulikke ilminguid.

Reproduktiivtoksilisus kahjulik mõju järglastele ja/või isas- või emasloomade paljunemisfunktsioonile või paljunemisvõimele.

Türeoidne aktiivsus kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik kilpnäärmehormoon (nt T3).

Uuritav kemikaal iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Valideerimine teaduslik protsess, mille eesmärk on iseloomustada katsemeetodi rakendamisega seotud nõudeid ja piiranguid ning tõendada meetodi usaldusväärsust ja sobivust konkreetsel eesmärgil kasutamiseks.

Viljakuse vähenemine isas- või emaslooma paljunemisfunktsiooni häire või paljunemisvõime langus.

Östrogeensus – kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik östrogeen (nt 17β-östradiool).

2. liide

UURINGU MAKSIMUMKESTUSELE VASTAV TÄISPIKAL 14-PÄEVASEL PAARITUMISPERIOODIL PÕHINEV KATSE SKEMAATILINE AJAKAVA

3. liide

TABELI KUJUL KOKKUVÕTLIK ARUANNE PALJUNEMISELE/ARENGULE AVALDUVA MÕJU KOHTA

VAATLUSED	VÄÄRTUSED
Annus (ühik)	0 (kontroll)	…	…	…	…
Paaride arv katse alguses (N)
Innatsükkel (vähemalt keskmine pikkus ja ebaregulaarsete tsüklite esinemissagedus)
Emasloomad, kellel täheldatakse paaritumise ilminguid (N)
Tiinestunud emasloomad (N)
Eostunud 1.–5. päeval (N)
Eostunud 6.–…. (23) päeval (N)
Tiinuse kestus ≤ 21 päeva (N)
Tiinuse kestus 22 päeva (N)
Tiinuse kestus ≥ 23 päeva (N)
Elusalt sündinud järglastega emasloomad (N)
4. sünnijärgse päevani elus püsinud järglastega emasloomad (N)
Pesastunud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta (keskmine)
Elussündide arv järglastega emaslooma kohta (keskmine)
4. päevani elus püsinud järglaste arv järglastega emaslooma kohta (keskmine)
Sugude vahekord (isased/emased) sünnihetkel (keskmine)
Sugude vahekord (isased/emased) 4. päeval (keskmine)
Pesakonna kaal sünnihetkel (keskmine)
Pesakonna kaal 4. päeval (keskmine)
Järglaste kehamass sünnihetkel (keskmine)
Järglaste kehamass AGD mõõtmise hetkel (isasloomade keskmine, emasloomade keskmine)
Järglaste AGD samal sünnijärgsel päeval ajavahemikul sündimispäevast kuni 4. päevani (isasloomade keskmine, emasloomade keskmine; märkida sünnijärgne mõõtmispäev)
Järglaste kehamass 4. päeval (keskmine)
Järglaste kehamass 13. päeval (keskmine)
Nisade esinemine isastel järglastel 13. päeval (keskmine)
KÕRVALEKALLETEGA JÄRGLASED
Järglastega emasloomad, kellel on 0 kõrvalekalletega järglast
Järglastega emasloomad, kellel on 1 kõrvalekalletega järglane
Järglastega emasloomad, kellel on ≥ 2 kõrvalekalletega järglast
JÄRGLASTE KADU
Sünnieelne (pesastunud embrüote arvu ja elussündide arvu vahe)
0 järglast kaotanud emasloomad
1 järglase kaotanud emasloomad
2 järglast kaotanud emasloomad
≥ 3 järglast kaotanud emasloomad
Sünnijärgne (elussündide arvu ja 13. sünnijärgse päevani elus püsinud järglaste arvu vahe)
0 järglast kaotanud emasloomad
1 järglase kaotanud emasloomad
2 järglast kaotanud emasloomad
≥ 3 järglast kaotanud emasloomad

B.65 IN VITRO MEMBRAANIBARJÄÄRI KATSEMEETOD NAHASÖÖVITUSE UURIMISEKS

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 435 (2015). Nahasöövitus on Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni (ÜRO) ühtse ülemaailmse kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS (Globally Harmonized System) (1) ning Euroopa Liidu määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus), (24) esitatud määratluse kohaselt pöördumatu nahakahjustuse, st marrasknahast pärisnahani ulatuva nähtava nekroosi tekkimine uuritava kemikaali pealekandmise tagajärjel. Käesolev katsemeetod, mis on samaväärne ajakohastatud OECD katsejuhendiga nr 435, on in vitro membraanibarjääri katsemeetod, mis saab kasutada söövitavate kemikaalide kindlakstegemiseks. Katsemeetodis kasutatakse tehismembraani, mis on kavandatud söövitavatele kemikaalidele reageerima sarnaselt loomanahale in situ.

Nahka söövitavat toimet on tavapäraselt hinnatud, kandes uuritavat kemikaali elusloomade nahale ja hinnates nahakahjustuse ulatust pärast kindla perioodi möödumist (2). Peale käesoleva meetodi on söövitavate kemikaalide kindlakstegemiseks kasutatava standardse küüliku in vivo nahakatse (käesoleva lisa peatükk B.4, samaväärne OECD katsejuhendiga nr 404) (2) alternatiividena vastu võetud mitu muud in vitro katsemeetodit (3, 4). ÜRO GHSi astmelise katsetamise ja hindamise strateegia nahka söövitava toime hindamiseks ja klassifitseerimiseks ning OECD juhenddokumendis nahaärrituse/-söövitusega seotud katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta soovitatakse kasutada valideeritud ja heaks kiidetud in vitro katsemeetodeid moodulite 3 ja 4 kohaselt (1, 5). Kõnealuse katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi raames kirjeldatakse mitut moodulit, milles teabeallikad ja analüüsivahendid on rühmitatud, ning i) antakse suuniseid, kuidas lõimida ja kasutada olemasolevaid katse- ja muid andmeid kemikaalide võimaliku nahka ärritava ja nahka söövitava toime hindamiseks ja ii) pakutakse välja lähenemisviis juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid, kaasa arvatud juhuks, kui saadakse negatiivsed tulemused (5). Selle modulaarse lähenemisviisi korral saab kasutada in vitro katsemeetoditega saadud positiivseid tulemusi kemikaali klassifitseerimiseks söövitavana, ilma et oleks vaja täiendavaid loomkatseid; seega vähendatakse ja täiustatakse loomade kasutamist ja välditakse nende kasutamisega kaasneda võivaid valu ja kannatusi.

Valideerimisuuringud viidi läbi in vitro membraanibarjääri mudeliga, mis on müügil nimega Corrositex® (6, 7, 8) ja millega 163 ainest ja segust koosneva andmebaasi järgi oli kogutäpsus nahka söövitava toime prognoosimisel 79 % (128/163), tundlikkus 85 % (76/89) ning spetsiifilisus 70 % (52/74) (7). Tunnustatud nõuetekohasuse alusel on seda valideeritud võrdlusmeetod (VRM) soovitatav kasutada astmelise katsetamise strateegia osana kemikaalide võimalik nahka söövitava toime hindamisel (5, 7). Enne kui in vitro membraanibarjääri mudeliga katsemeetodit nahasöövituse uurimiseks võib kasutada regulatiivsel eesmärgil, tuleb kooskõlas eelnevalt kindlaksmääratud toimivusnõuetega (10) kindlaks teha selle usaldusväärsus, asjakohasus (täpsus) ja selle kavandatud kasutusega seotud piirangud, et tagada selle sarnasus valideeritud võrdlusmeetodiga (9). Andmete vastastikune tunnustamine vastavalt OECD kokkuleppele tagatakse ainult pärast seda, kui mis tahes uus või ajakohastatud kavandatud meetod on toimivusnõudeid järgides läbi vaadatud ja lisatud samaväärsesse OECD katsejuhendisse. Praegu on OECD katsejuhendiga nr 435 hõlmatud ainult üks in vitro ja käesoleva katsemeetod müügil oleva Corrositex®i mudeliga.

Teised katsemeetodid nahka söövitava toime uurimiseks põhinevad rekonstrueeritud inimnaha (OECD katsejuhend nr 431) (3) ja isoleeritud rotinaha kasutamisel (OECD katsejuhend nr 430) (4). Käesoleva katsesuunise järgi saab söövitavaid kemikaali jagada kolme ÜRO GHSi kohasesse söövitavuse alamkategooriatesse ja söövitusohu järgi kolme ÜRO veopakendi rühma. Käesolev katsejuhend võeti esmakordselt vastu 2006. aastal ja seda ajakohastati 2015. aastal, et viidata katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi juhenddokumendile ning ajakohastada pädevuse tõendamise ainete loendit.

MÕISTED

Kasutatud mõisted on esitatud liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Selles katsemeetodis kirjeldatud katse-eeskiri võimaldab kvalitatiivselt analüüsida söövitavaid uuritavaid kemikaale ning jagada need ÜRO GHSi / CLP-määruse kohastesse alamkategooriatesse (tabel 1). Peale selle võib sellist katsemeetodit kasutada otsustamaks konkreetsete kemikaaliklasside, nt orgaaniliste ja anorgaaniliste hapete, happederivaatide (25) ja aluste söövitavate ja mittesöövitavate omaduste üle teatavate veokatsete puhul (7, 11, 12). Käesolevas katsemeetodis kirjeldatakse valideeritud võrdlusmeetodile (7) sarnanevat üldmetoodikat. See katsemeetod ei anna asjakohast teavet nahaärrituse kohta, seega tuleb märkida, et katsemeetodiga B.46 (samaväärne OECDkatsejuhendiga nr 439) uuritakse spetsiaalselt in vitro sellist tervisemõju nagu nahaärritus (13). Nahale pärast ühekordset kokkupuudet avalduva paikse toime täielikuks hindamiseks tuleb juhinduda OECD juhenddokumendist katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (5).

Tabel 1

ÜRO GHSi kohane nahka söövitava aine kategooria ja alamkategooriad (26)

Söövituskategooria (1. kategooria) (ametiasutustele, kes alamkategooriaid ei kasuta)	Võimalikud söövituse alamkategooriad (26) (ametiasutustele, kes kasutavad alamkategooriaid, sealhulgas CLP-määrust)	Söövitav vähemalt ühe looma puhul kolmest
		Kokkupuuteaeg	Vaatlus
Söövitav	Söövitav, alamkategooria 1A	≤ 3 minutit	≤ 1 tund
	Söövitav, alamkategooria 1B	> 3 minutit / ≤ 1 tund	≤ 14 päeva
	Söövitav, alamkategooria 1C	> 1 tund / ≤ 4 tundi	≤ 14 päeva

Valideeritud võrdlusmeetodi (7) puuduseks on asjaolu, et paljud mittesöövitavad kemikaalid ja mõned söövitavad kemikaalid ei tarvitse esialgse sobivuskatse (vt punkt 13 alusel) uurimiseks sobida. Sageli ei sobi uurimiseks kemikaalide vesilahused, mille pH on vahemikus 4,5…8,5; 85 % kõnealuse pH-vahemikuga uuritud kemikaalidest osutusid loomkatsetel mittesöövitavaks (7). In vitro membraanibarjääri meetodit võib kasutada tahkete ainete (vees lahustuvad või mittelahustuvad), vedelike (vesilahused või mitte) ja emulsioonide uurimiseks. Kuid uuritavaid kemikaale, mis sobivuskatsel tuvastatavat muutust (nt värvuse muutust valideeritud võrdlusmeetodi kemikaalide detekteerimissüsteemis) esile ei kutsu, ei saa membraanibarjääri meetodiga uurida ning nende uurimiseks tuleks kasutada muid katsemeetodeid.

KATSE PÕHIMÕTE

Katsesüsteem koosneb kahest osast: sünteetilisest makromolekulaarsest biobarjäärist ja kemikaalide detekteerimissüsteemist; selle katsemeetodiga tuvastatakse kemikaalide detekteerimissüsteemi abil membraanibarjääri kahjustus, mille on põhjustanud söövitav uuritav kemikaal pärast sünteetilise makromolekulaarse membraanibarjääri pinnale kandmist (7) eeldatavast sama(de) söövitusmehhanismi(de) järgi mis toimivad elusorganismi nahal.

Membraanibarjääri läbimist saab mõõta mitme toiminguga või kemikaali detekteerimissüsteemiga, sealhulgas pH indikaatori värvuse muutuse või mõne muu indikaatorlahuse omaduse muutusega barjääri all.

10.

Membraanibarjäär peab olema ettenähtud kasutamiseks nõuetekohane, st asjakohane ja usaldusväärne. Muu hulgas peavad olema tagatud preparaatide ühtsed barjääriomadused, st barjääri säilimine mittesöövitavate kemikaalide suhtes ja võimalus liigitada kemikaalid söövitusomaduste järgi erinevatesse ÜRO GHSi söövitavuse alamkategooriatesse (1). Klassifitseerimine põhineb ajal, mis kulub kemikaali läbitungimiseks membraanibarjäärist ja indikaatorlahuseni jõudmiseks.

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

11.

Enne käesoleval meetodil põhinevat in vitro membraanibarjääri meetodi rutiinset kasutamist tuleb laboril tõendada oma tehnilist pädevust, klassifitseerides õigesti tabelis 2 soovitatud kaksteist pädevuse kontrolli ainet. Olukorras, kus loetletud aine ei ole kättesaadav, või kui see on põhjendatud, võib kasutada muud ainet (nt võrdluskemikaalide loetelust (10)), mille puhul on kättesaadavad piisavad võrdlusandmed in vivo ja in vitro katsete kohta, eeldusel, et järgitakse samu valikukriteeriumeid nagu esitatud tabelis 1.

Tabel 2

Pädevuse kontrolli ained (27)

Aine (28)	CASi nr	Aineklass	In vivo ÜRO GHSi kohane alamkategooria (29)	In vitro ÜRO GHSi kohane alamkategooria (29)
Boortrifluoriiddihüdraat	13319-75-0	Anorgaanilised happed	1A	1A
Lämmastikhape	7697-37-2	Anorgaanilised happed	1A	1A
Fosforpentakloriid	10026-13-8	Anorgaaniliste hapete prekursorid	1A	1A
Valerüülkloriid	638-29-9	Hapete kloriidid	1B	1B
Naatriumhüdroksiid	1310-73-2	Anorgaanilised alused	1B	1B
1-(2-aminoetüül)piperasiin	140-31-8	Alifaatsed amiinid	1B	1B
Benseensulfonüülkloriid	98-09-9	Hapete kloriidid	1C	1C
N,N-dimetüülbensüülamiin	103-83-3	Aniliinid	1C	1C
Tetraetüleenpentamiin	112-57-2	Alifaatsed amiinid	1C	1C
Eugenool	97-53-0	Fenoolid	MS	MS
Nonüülakrülaat	2664-55-3	Akrülaadid/metakrülaadid	MS	MS
Naatriumvesinikkarbonaat	144-55-8	Anorgaanilised soolad	MS	MS

METOODIKA

12.

Järgmistes punktides kirjeldatakse söövitavate omaduste hindamiseks kasutatava tehismembraanibarjääri katsemeetodi (7, 15) osi ja metoodikaid, mis põhinevad praegusel valideeritud võrdlusmeetodil, st müügil oleval Corrositex®-iga kasutaval meetodil. Membraanibarjääri, sobivuskatsel kasutatavad ja indikaatorlahused ning lahused, mis võimaldavad klassifitseerimist, võib sünteesida, valmistada või osta, nagu valideeritud võrdlusmeetodi puhul ostetakse Corrositex®. Saadaval on valideeritud katsemeetodi katse-eeskirja näidis (7). Katsed tuleb läbi viia toatemperatuuril (17–25 °C) ja nende osad peavad vastama järgmistele tingimustele.

Uuritava kemikaali sobivuskatse

13.

Enne membraanibarjääri katse tegemist tehakse sobivuskatse, et selgitada välja, kas kemikaali detekteerimissüsteem suudab uuritavat kemikaali avastada. Kui kemikaali detekteerimissüsteem uuritavat kemikaali avastada ei suuda, ei sobi membraanibarjääri katsemeetod selle konkreetse uuritava kemikaali võimalike söövitavate omaduste hindamiseks ja selleks tuleks kasutada teistsugust katsemeetodit. Sobivuskatses kasutatav kemikaali detekteerimissüsteem ja valitsevad kokkupuutetingimused peavad imiteerima järgnevas membraanibarjäärikatses toimuvat kokkupuudet.

Uuritava kemikaali ajakategooria katse

14.

Kui see on katsemeetodi juures asjakohane, peab sobivuskatse läbinud uuritav kemikaal läbima ka ajakategooria katse, st sõelkatse, millega eristatakse üksteisest nõrgad ja tugevad happed ja alused. Näiteks valideeritud võrdlusmeetodis kasutatakse ajakategooria katset selleks, et teha kindlaks, millist ajavahemikku kahest võimalikust kasutada, võttes aluseks leitud puhvermahtuvuse suuruse. Olenevalt uuritava kemikaali puhvermahtuvusest tuleks söövitavate omaduste ja ÜRO GHSi nahasöövituse alamkategooriate kindlaksmääramisel kasutada kaht erinevat läbimisaja vahemikku.

MEMBRAANIBARJÄÄRI KATSEMEETODI OSAD

Membraanibarjäär

15.

Membraanibarjäär koosneb kahest osast: Makromolekulaarne veepõhine valgugeel ja läbitav tugimembraan. Valgugeel peab olema vedelikele ja tahketele ainetele läbitungimatu, kuid see võib muutuda läbitavaks söövitamise tulemusena. Valmis konstrueeritud membraanibarjääri tuleb hoida eelnevalt kindlaksmääratud tingimustes, mis välistavad geeli riknemise, nt kuivamise, mikroobide kasvu, kihistumise, pragunemise vms, mis halvendaks selle toimivust. Tuleb kindlaks määrata vastuvõetav säilitusaeg ja pärast selle möödumist membraanbarjääri preparaate mitte kasutada.

16.

Läbitav tugimembraan pakub valgugeelile mehaanilist tuge geelistumise ja uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal. Tugimembraan peaks takistama geeli kortsumist ja nihkumist ning laskma hästi läbi kõiki uuritavaid kemikaale.

17.

Valgugeel, mis koosneb näiteks keratiinist, kollageenist või valkude segust, mis moodustavad geelimaatriksi, on uuritava kemikaali sihtobjekt. Valgumaterjal kantakse tugimembraani pinnale ja lastakse enne membraanibarjääri indikaatorlahuse kohale seadmist geelistuda. Valgugeel peab olema läbivalt ühtlase paksuse ja tihedusega, ilma õhumullide ja muude defektideta, mis võiksid mõjutada selle funktsionaalset terviklikkust.

Kemikaalide detekteerimissüsteem

18.

Indikaatorlahus, mis on sama mis sobivuskatses kasutatud, peab reageerima uuritava kemikaali olemasolule. Kasutada tuleb värvainest või värvainete segust pH-indikaatorit, nt kresoolpunast või metüüloranži, mis uuritava kemikaali olemasolule reageerides värvi muudavad. Mõõtesüsteem võib olla visuaalne või elektrooniline.

19.

Detekteerimissüsteeme, mis on välja töötatud tuvastama uuritava kemikaali läbiminekut membraanibarjäärist, tuleb hinnata asjakohasuse ja usaldusväärsuse seisukohast, et teha kindlaks avastatavate kemikaalide hulk ja kvantitatiivne avastamispiir.

KATSE KÄIK

Katsemeetodi osade kokkupanek

20.

Membraanibarjäär paigutatakse indikaatorlahust sisaldavasse viaali (või katseklaasi), nii et tugimembraan on indikaatorlahusega täielikus kontaktis ja õhumulle ei esine. Tuleb olla ettevaatlik, et barjääri terviklikkus säiliks.

Uuritava kemikaaliga töötlemine

21.

Membraanibarjääri pealmisele pinnale kantakse hoolikalt ühe kihina sobiv kogus (nt 500 μl vedelikku või 500 mg pulbristatud tahket ainet (7)) uuritavat kemikaali ja aetakse ühtlaselt laiali. Iga uuritava kemikaaliga tehakse sobiv hulk paralleelproove, nt neli (7), samuti tehakse paralleelsed kontrollproovid (vt punktid 23–25). Registreeritakse uuritava kemikaali membraanibarjäärile kandmise aeg. Et tagada lühikese söövitusaja täpne registreerimine, ei kanta uuritavat kemikaali paralleelproovidega viaalidesse samaaegselt.

Membraanibarjääri läbimise mõõtmine

22.

Iga viaali jälgitakse ning registreeritakse ajahetk, mil indikaatorlahus esmakordselt muutub, st barjäär läbitakse, samuti tehakse kindlaks kemikaali pealekandmisest membraanibarjääri läbimiseni kulunud aeg.

Kontrollproovid

23.

Katsetes, kus koos uuritava kemikaaliga kasutatakse kandeainet või lahustit, peab kandeaine või lahusti membraanibarjäärisüsteemiga sobima, st see ei tohi muuta membraanibarjääri süsteemi terviklikkust ega uuritava kemikaali söövitavaid omadusi. Vajaduse korral tuleb uuritava kemikaaliga paralleelselt teha kontrollproov lahusti (või kandeainega), et veenduda lahusti sobivuses membraanibarjäärisüsteemiga.

24.

Selleks, et hinnata katsesüsteemi vastuvõetavat toimivust, tehakse uuritava kemikaaliga paralleelselt katse positiivse (söövitava) kontrollprooviga, mille söövitavad omadused on keskmised, nt 110 ± 15 mg naatriumhüdroksiidiga (ÜRO GHSi söövitavate ainete alamkategooria 1B) (7). Söövitava uuritava kemikaali suhtelise söövituspotentsiaali hindamiseks võib kasutada teist positiivset kontrollproovi ainest, mis kuulub uuritava kemikaaliga samasse aineklassi. Positiivsetesse kontrollproovidesse tuleb valida ained, mille söövitavad omadused on keskmise tugevusega (nt ÜRO GHSi alamkategooriasse 1B kuuluvad ained), et avastada muutusi läbitungimisajas, mis võib olla lubamatult pikem või lühem kui kindlaksmääratud võrdlusväärtus, näidates seega, et katsesüsteem ei toimi nõuetekohaselt. Sellisel juhul on vähe kasu äärmiselt söövitavatest (ÜRO GHSi alamkategooria 1A) ja mittesöövitavatest kemikaalidest. Söövitav kemikaal, mis kuulub ÜRO GHSi alamkategooriast 1B, võimaldaks avastada liiga pikka või liiga lühikest läbitungimisaega. Nõrgalt söövitavat ainet (ÜRO GHSi alamkategooria 1C) võib kasutada positiivses kontrollproovis, et mõõta, kui järjepidevalt on katsemeetodiga võimalik eristada nõrgalt söövitavaid ja mittesöövitavaid kemikaale. Olenemata lähenemisviisist tuleks positiivse kontrollproovidega saadud vastuvõetavate tulemuste vahemik välja töötada laboris varem kasutatud positiivsete kontrollproovidega saadud läbitungimisaegade vahemiku (nt keskväärtus ± 2–3 standardhälvet) alusel. Iga uuringu käigus tuleb määrata positiivse kontrollproovi täpne läbitungimisaeg, et tuvastada vastuvõetavast vahemikust väljapoole langevad kõrvalekalded.

25.

Paralleelselt uuritava kemikaaliga tuleb teha katse ka negatiivse (mittesöövitava) kontrollprooviga (nt 10 % sidrunhape, 6 % propioonhape (7)), mis on veel üks kvaliteedikontrolli meede membraanibarjääri funktsionaalse terviklikkuse tõendamiseks.

Uuringu nõuetekohasuse kriteeriumid

26.

Vastavalt iga ÜRO GHSi söövitavate omaduste alamkategooria kohta kindlaksmääratud ajaparameetritele kasutatakse uuritava kemikaali söövitavate omaduste prognoosimiseks uuritava kemikaali membraanibarjäärile kandmisest barjääri läbimiseni kulunud aega (minutites). Et uuringut saaks lugeda nõuetekohaseks, peab paralleelne positiivne kontrollproov andma eeldatava läbitungimisaja (st 8–16 minutit, kui positiivse kontrollainena kasutatakse naatriumhüdroksiidi), paralleelne negatiivne kontrollproov ei tohi olla söövitav ja lahusti kontrollproov, kui seda uuritakse, et tohi olla söövitav ega muuta uuritava kemikaali söövituspotentsiaali. Enne käesoleval katsemeetodil põhineva meetodi rutiinset kasutamist peaksid laborid tõendama oma tehnilist pädevust, kasutades tabelis 2 soovitatud kahtteistkümmet ainet. Niisuguste käesoleva katsemeetodi alusel välja töötatud samalaadsete meetodite puhul, mis on valideeritud võrdlusmeetodiga (14) struktuurilt ja funktsioonilt sarnased, tuleks kasutada eelnevalt kindlaksmääratud toimivusnõudeid, et tõendada uue meetodi usaldusväärsust ja täpsust enne selle kasutamist regulatiivsel eesmärgil (10).

Tulemuste tõlgendamine ja uuritavate kemikaalide klassifitseerimine söövitava toime järgi

27.

Uuritava kemikaali membraanibarjäärile kandmisest barjäärist läbitungimiseni kulunud aja (minutites) järgi klassifitseeritakse uuritav kemikaal ÜRO GHSi söövitavate ainete alamkategooriasse (1) ja ÜRO pakendirühma (16), kui see on asjakohane. Iga soovitatava katsemeetodi jaoks tehakse kindlaks läbitungimisaja läviväärtused kõigi kolme söövitavate omaduste alamkategooria puhul. Läbitungimisaja läviväärtuste kohta lõpliku otsuse tegemisel tuleb arvestada vajadust minimeerida söövitusohu alahindamist ja madalamasse kategoorias klassifitseerimist (st valenegatiivseid tulemusi). Praeguse katsejuhendi kohaselt tuleks kasutada Corrositex®iga kehtivaid läbitungimisaja läviväärtusi, mis on esitatud tabelis 3, sest see on ainus katsemeetod, mis hetkel katsejuhendile vastab (7).

Tabel 3

Corrositex®i prognoosimismudel

Keskmine läbitungimisaeg (min)		Prognoositav ÜRO GHSi kategooria (32)
1. kategooria uuritav kemikaal (30) (määratud meetodi kategoriseerimiskatse alusel)	2. kategooria uuritav kemikaal (31) (määratud meetodi kategoriseerimiskatse alusel)	Prognoositav ÜRO GHSi kategooria (32)
0–3 min	0–3 min	Söövitav võimalik alamkategooria 1A
> 3 kuni 60 min	> 3 kuni 30 min	Söövitav võimalik alamkategooria 1B
> 60 kuni 240 min	> 30 kuni 60 min	Söövitav võimalik alamkategooria 1C
> 240 min	> 60 min	Mittesöövitav

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Andmed

28.

Uuritava kemikaaliga ja positiivse(te) kontrollproovi(de)ga saadud aeg (minutites), mis kulus pealekandmisest barjääri läbimiseni, tuleb esitada tabelina, kus on näidatud nii eraldi andmed iga paralleelproovi kohta kui ka iga katse keskmine tulemus ± standardhälve.

Katseprotokoll

29.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal ja kontrollained

—	Ühest koostisosast koosnev aine: kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

—

mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal ja segu: võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	tarnija ja partii number, kui see on olemas;

—	vajaduse korral teave uuritava kemikaali / kontrollaine töötlemise kohta enne katset (näiteks soojendamine, peenestamine);

—	uuritava kemikaali püsivus ja aegumiskuupäev või kordusanalüüsi tegemise tähtpäev, kui see on teada;

—	säilitustingimused.

Kandeaine

—	Identimisandmed, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud ruumala;

—	kandeaine valimise põhjendus.

Kasutatud in vitro membraanibarjäär ja metoodika, sealhulgas tõendatud täpsus ja usaldusväärsus

Katsetingimused:

—	kasutatud aparatuur ja preparaadi ettevalmistusmeetodid;

—	kasutatud in vitro membraanibarjääri tarnija ja koostis;

—	indikaatorlahuse koostis ja omadused;

—	avastamismeetod;

—	uuritava kemikaali ja kontrollainete kogused;

—	paralleelproovide arv;

—	ajakategooria katse kirjeldus ja selle valimise põhjendus;

—	pealekandmismeetod;

—	vaatluse aeg;

—	kasutatud hindamis- ja klassifitseerimiskriteeriumide kirjeldus;

—	Katsemeetodi kasutamise pädevuse tõendamine, analüüsides asjaomaseid kemikaale enne meetodi rutiinset kasutamist.

Tulemused

—	Iga uuritava ja kontrollprooviga igal paralleelkatsel saadud andmed tabelina;

—	muude täheldatud toimete kirjeldus;

—	tuletatud klassifikatsioon(id) viitega kasutatud prognoosimudelile ja/või otsustamiskriteeriumidele.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), 5. täiendatud väljaanne, United Nations, New York ja Genf, 2013. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

(2)	Käesoleva lisa peatükk B.4, „Äge nahaärritus, söövitus“.

(3)	Käesoleva lisa peatükk B.40bis, „Nahasöövituskatse in vitro: rekonstrueeritud inimese epidermist (RHE) kasutav katsemeetod“.

(4)	Käesoleva lisa peatükk B.40, „Nahasöövituskatse in vitro: transkutaanse elektritakistuse (TER) mõõtmine“.

(5)	OECD (2015), „Guidance Document on an Integrated Approach to Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation“, Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 203), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(6)

Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G. ja Liebsch, M. (1998), „The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team“, Toxicology In Vitro, nr 12, lk 483–524.

(7)	ICCVAM (1999), „Corrositex®. An In Vitro Test Method for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by ICCVAM, NTP and NICEATM“, NIEHS, NIH Publication (nr 99–4495).

(8)	Gordon V.C., Harvell J.D. ja Maibach H.I. (1994), „Dermal Corrosion, the Corrositex® System: A DOT Accepted Method to Predict Corrosivity Potential of Test Materials. In vitro Skin Toxicology-Irritation, Phototoxicity, Sensitization“, Alternative Methods in Toxicology, nr 10, lk 37–45.

(9)	OECD (2005), „Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment“, Environmental, Health and Safety Publications, Series on testing and Assessment (nr 34).

(10)

OECD (2014), „Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 435“, Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/PerfStand-TG430-June14.pdf.

(11)	ECVAM (2001), „Statement on the Application of the CORROSITEX® Assay for Skin Corrosivity Testing“, ECVAMi teadusliku nõuandekomitee 15. istungjärk, ISPRA; Itaalia. ATLA nr 29, lk 96–97.

(12)	USA Transpordiministeerium (2002), Exemption DOT-E-10904 (5. täiendatud väljaanne), (20. september 2002), Washington, D.C., U.S. DOT.

(13)

Käesoleva lisa peatükk B.46, „Nahasöövituskatse in vitro: rekonstrueeritud inimese epidermist (RHE) kasutav katsemeetod“, ICCVAM (2004), „ICCVAM Recommended Performance Standards for In Vitro Test Methods for Skin Corrosion“, NIEHS, NIH Publication (nr 04–4510). Kättesaadav aadressil http://www.ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/dermal_docs/ps/ps044510.pdf.

(14)	USA Keskkonnakaitseamet (1996), „Method 1120, Dermal Corrosion“. Kättesaadav aadressil http://www.epa.gov/osw/hazard/testmethods/sw846/pdfs/1120.pdf.

(15)	Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO) (2013), UN Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Model Regulations, 18. täiendatud väljaanne (peatükk 2.8), UN, 2013. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/unrec/rev18/English/Rev18_Volume1_Part2.pdf.

Liide

MÕISTED

Täpsus : katsemeetodiga saadud tulemuste ja nõuetekohaste võrdlusväärtuste kokkulangevuse määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks olulistest aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse (9).

Kemikaal : aine või segu.

Kemikaalide detekteerimissüsteem : visuaalne või elektrooniline mõõtesüsteem indikaatorlahusega, mis reageerib uuritava kemikaali või muude kemikaalide olemasolule või elektrokeemilise reaktsiooni toimumisele nt pH-indikaatorvärvaine või värvainete segu värvuse muutusega.

Vastavus : katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja katsemeetodite puhul, millega saadakse kategooriline tulemus, on üks asjakohasuse aspekte. Terminit kasutatakse mõnikord ka täpsuse tähenduses ja määratletakse kõigi nende uuritavate kemikaalide osakaaluna, mis saadud positiivse või negatiivse tulemuse alusel klassifitseeritakse õigesti. Vastavus on tugevas sõltuvuses positiivset tulemust andvate kemikaalide esinemissagedusest uuritavate kemikaalide hulgas (9).

GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals – kemikaalide ühtne ülemaailmne klassifitseerimis- ja märgistamissüsteem) : süsteem, milles kemikaalid (ained ja segud) on klassifitseeritud vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud tüübile ja -tasemele ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda edasi inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ja keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku mõju kohta (1).

IATA : Integrated Approach on Testing and Assessment – ühtne lähenemisviis katsete tegemisele ja hindamisele.

Segu : kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

Ühest koostisosast koosnev aine : aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles ühe peamise koostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

Mitme koostisosaga aine : aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles rohkem kui ühe peamise koostisosa kontsentratsioon on ≥ 10 % ja < 80 % (massiprotsendid). Mitme koostisosaga aine saadakse tootmisprotsessi käigus. Erinevus segu ja mitme koostisosaga aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokku segamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitme koostisosaga aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.

MS : mittesöövitav

Toimivusnõuded : valideeritud katsemeetodil põhinevad nõuded, mille alusel hinnatakse, kuivõrd saab esitatud katsemeetodit võrrelda teostuslikult ja tööpõhimõttelt samalaadse meetodiga. See hõlmab järgmist: i) olulisemad katsemeetodi osad; ii) valideeritud katsemeetodi nõuetekohase toimivuse tõendamiseks kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdluskemikaalide miinimumloend ja iii) sarnased usaldusväärsuse ja täpsuse tasemed, mis põhinevad valideeritud katsemeetodiga saadud tulemustel ja mis tuleks kavandatud katsemeetodi hindamisel saavutada võrdluskemikaalide miinimumloendi kasutamisel (9).

Asjakohasus : mõiste, millega väljendatakse seda, kas katsemeetod võimaldab uurida huvipakkuvat mõju, kas meetod on mõttekas ja sobib konkreetse eesmärgi jaoks. See näitab, mil määral saab katsemeetodiga õigesti mõõta või prognoosida huvipakkuvat bioloogilist mõju. Asjakohasus hõlmab ka katsemeetodi täpsuse (vastavuse) aspekti (9).

Usaldusväärsus : iseloomustab katsemeetodi korratavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline korratavus (9).

Tundlikkus : kõigi positiivsete/reaktsioonivõimeliste kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega iseloomustatakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (9).

Nahasöövitus in vivo : naha pöördumatu kahjustuse tekitamine, läbi epidermise pärisnahka (dermasse) ulatuv nähtav nekroos, mis tekib kuni neljatunnisel kokkupuutel katseainega. Tüüpilised söövitusnähud on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14-päevase vaatlusperioodi lõpuks ilmnev värvimuutus naha valastumise tõttu, täielik alopeetsia ja armistumine. Ebaselgete kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilise analüüsi tegemist.

Spetsiifilisus : kõigi niisuguste negatiivsete/mittereageerivate kemikaalide osakaal, mis katsemeetodiga klassifitseeritakse õigesti. Spetsiifilisusega iseloomustatakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (9).

Aine : looduslik või tootmisprotsessi teel saadud keemiline element ja selle ühendid, kaasa arvatud stabiilsuse säilitamiseks vajalikud lisaained ja tootmisprotsessist tingitud lisandid, välja arvatud mis tahes lahusti, mida on võimalik aine stabiilsust vähendamata ja selle koostist muutmata eraldada.

Uuritav kemikaal : iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB : tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid.

B.66 STABIILSE TRANSFEKTSIOONIGA TRANSAKTIVATSIOONI IN VITRO KATSEMEETODID, MILLEGA AVASTATAKSE ÖSTROGEENIRETSEPTORITE AGONISTE JA ANTAGONISTE

ÜLDINE SISSEJUHATUS

OECD toimivusel põhinev katsejuhend

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 455 (2016). Katsejuhend nr 455 on toimivusel põhinev katsejuhend, milles kirjeldatakse stabiilse transfektsiooniga transaktivatsiooni in vitro katsemeetodeid östrogeeniretseptorite agonistide ja antagonistide tuvastamiseks (ER TA katsed). See hõlmab mitut teostuslikult ja tööpõhimõttelt samalaadset katsemeetodit östrogeeniretseptorite (st ERα, ja/või ERβ) agonistide ja antagonistide kvalitatiivseks määramiseks ning peaks hõlbustama uute samaväärsete või modifitseeritud katsemeetodite väljatöötamist kooskõlas valideerimispõhimõtetega, mis on esitatud OECD juhenddokumendis uute ja ajakohastatud ohu hindamise katsemeetodite valideerimise ja rahvusvahelise tunnustamise kohta (1). Täielikult valideeritud võrdlusmeetodid (liited 2 ja 3), mis on toimivuse põhineva katsejuhendi aluseks, on järgmised:

—	stabiilse transfektsiooniga transaktivatsiooni katsemeetod (2), milles kasutatakse rakuliini (h)ERα-HeLa-9903 ning

—	VM7Luc ER TA katsemeetod (3), milles kasutatakse rakuliini VM7Luc4E2, (33) mis ekspresseerib peamiselt hERα-d ja mõningal määral hERβ-d (4, 5).

Sama ohunäitaja analüüsimiseks kasutatavate samaväärsete katsemeetodite väljatöötamiseks ja valideerimiseks on olemas toimivusnõuded (6, 7) ja neid tuleks kasutada. Need võimaldavad toimivusel põhinevat katsejuhendit nr 455 õigeaegselt muuta, nii et ajakohastatud katsejuhendisse saaks lisada uued samalaadsed katsemeetodid, kuid need lisatakse üksnes pärast seda, kui OECD on need läbi vaadanud ja nõustunud, et toimivusnõuded on täidetud. Selleks, et täita OECD liikmesriikide nõuded östrogeeniretseptorite transaktivatsioonikatse tulemustele, võib kasutada suvalist meetodit katsejuhendiga nr 455 hõlmatud katsemeetoditest, kasutades ühtlasi andmete vastastikust tunnustamist vastavalt OECD kokkuleppele.

Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud meetodite taust ja põhimõtted

OECD algatas 1998. aastal prioriteetse tegevussuunana olemasolevate katsejuhendite läbivaatamise ja uute väljatöötamise, et sõeluuringutega selgitada välja endokriinfunktsiooni potentsiaalselt kahjustava kemikaalid ja neid katsetada. OECD kontseptuaalne raamistik endokriinfunktsiooni potentsiaalselt kahjustavate kemikaalide uurimiseks ja hindamiseks vaadati läbi 2012. aastal. Esialgne ja läbivaadatud kontseptuaalne raamistik on esitatud endokriinseid häireid põhjustavate kemikaalide hindamist käsitlevate standarditud katsejuhendite kohta koostatud OECD juhenddokumendi (8) lisades. Kontseptuaalne raamistik koosneb viiest tasemest, millest igaüks vastab erinevale bioloogilise keerukuse tasemele. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud ERi transaktivatsiooni katsed on 2. tasemel, mis hõlmab „in vitro katseid, millega saadakse andmeid teatud kindla(te) endokriinse(te) mehhanismi(de) või raja/radade kohta.“ See katsemeetod kirjeldab in vitro transaktivatsiooni (TA) katseid, mis on välja töötatud östrogeeniretseptorite (ER) agonistide ja antagonistide määramiseks.

Östrogeenide vastastiktoime östrogeeniretseptoritega võib mõjutada östrogeenide reguleeritavate geenide transkriptsiooni, mis võib põhjustada rakuprotsesside induktsiooni või pärssimist, kaasa arvatud rakkude paljunemiseks, loote normaalseks arenguks ja reproduktiivfunktsiooni tööks vajalikud protsessid (9, 10, 11). Normaalse östrogeensõltuva süsteemi häirimine võib olla kahjuliku toimega normaalsele arengule (ontogeneesile), reproduktiivtervisele ja reproduktiivsüsteemi terviklikkusele.

In vitro transaktivatsiooni katsemeetodid põhinevad ainete otsese või kaudse vastastikmõjul konkreetse retseptoriga, mis reguleerib reportergeeni produkti transkriptsiooni. Selliseid katsemeetodeid on laialdaselt kasutatud spetsiifiliste tuumaretseptorite, nt ERide poolt reguleeritud geeniekspressiooni hindamiseks (12, 13, 14, 15, 16). Neid on soovitatud kasutada ERi reguleeritava östrogeense transaktivatsiooni tuvastamiseks (17, 18, 19). Tuuma ERidel on olemas vähemalt kaks peamist alatüüpi, α ja β, mida kodeerivad erinevad geenid. Vastavatel valkudel on erinevad bioloogilised funktsioonid, samuti erinev jaotumine kudedes ja erinev ligandisidumisvõime (20, 21, 22, 23, 24, 25, 26). Tuuma ERα vahendab klassikalist reaktsiooni östrogeenile (27, 28, 29, 30) ning seetõttu on enamik ERi aktiveerimise või inhibeerimise mõõtmiseks hetkel välja töötatavaid mudelid ERα-spetsiifilised. Katsemeetodeid kasutatakse selleks, et välja selgitada kemikaalid, mis aktiveerivad (või pärsivad) ERi pärast ligandi sidumist, misjärel retseptori-ligandi kompleks seondub DNA spetsiifilise vastuselemendiga ja transaktiveerib reportergeeni, mille tulemuseks on markervalgu suurenenud rakusisene ekspressioon. Nendes katsemeetodites võib kasutada erinevate reporterite reaktsioone. Lutsiferaasil põhinevates süsteemides transformeerib ensüüm lutsiferaas substraadilutsiferiini helendavaks bioloogiliseks saaduseks, mida saab kvantitatiivselt mõõta luminomeetriga. Muud näited levinud reporteritest on fluorestseeruv valk ja lacZ-geen, mis kodeerib β-galaktosidaasi, ensüümi, mis transformeerib värvitu substraadi X-gal-i (5-bromo-4-kloro-indolüülgalaktopüranosiid) siniseks saaduseks, mida saab kvantitatiivselt mõõta spektrofotomeetriga. Neid reportereid saab kiiresti ja odavalt hinnata müügilolevate katsekomplektidega.

STTA ja VM7Luc TA katsemeetodite valideerimisuuringutest nähtub, et need on ettenähtud eesmärgil kasutades asjakohased ja usaldusväärsed (3, 4, 5, 30). Rinna rakuliine kasutavate ja luminestsentsil põhinevate ERi transaktivatsiooni katsemeetodite toimivusnõuded on esitatud ICCVAMi katsemeetodi hindamisaruandes „ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals“ (3). Neid toimivusnõudeid on muudetud, et neid saaks kohaldada nii STTA kui ka VM7Luc TA katsemeetoditele (2).

Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted ja lühendid on esitatud 1. liites.

Transaktivatsiooni katsemeetodite rakendusala ja piirangud

Käesolevaid katsemeetodeid on soovitatav kasutada sõelumise ja prioriseerimise eesmärgil, kuid need võivad anda ka niisugust teavet mehhanismide kohta, mida saab kasutada tõendite kaalukust arvestava lähenemisviisi korral. Need katsed uurivad ERiga seondunud kemikaali esilekutsutud transaktsiooni in vitro süsteemis. Seega ei tohiks tulemust otse ekstrapoleerida terve in vivo endokriinsüsteemi keerukale signaliseerimis- ja reguleerimismehhanismidele.

ERide vahendatud transaktsiooni peetakse üheks peamiseks endokriinse häire põhjustamise mehhanismiks, kuigi endokriinne häire võib ilmneda ka muude mehhanismide kaudu, sealhulgas i) vastasmõjud endokriinsüsteemi teiste retseptorite ja ensüümisüsteemidega, ii) hormoonide süntees, iii) hormoonide metaboolne aktiveerimine ja/või inaktiveerimine, iv) hormoonide jaotumine sihtkudedes ja v) hormoonide väljumine organismist. Neid toimemehhanisme ei käsitle ükski käesoleva katsemeetodiga hõlmatud meetod.

See katsemeetod uurib kemikaalide võimet ER-sõltuvat transkriptsiooni aktiveerida (st toimida agonistina) ja pärssida (st toimida antagonistina). Mõned kemikaalid võivad olenevalt rakutüübist toimida nii agonisti kui ka antagonistina, olles tuntud kui selektiivsed östrogeeniretseptori modulaatorid (SERMid). Nende katsemeetoditega negatiivse tulemuse andnud kemikaale võiks enne järeldamist, et kemikaal ei seo retseptorit, hinnata ERi sidumise katse abil. Peale selle annavad katsed tõenäoliselt teavet üksnes lähtemolekuli toime kohta, võttes arvesse, et in vitro rakusüsteemide metaboliseerimisvõime on piiratud. Arvestades, et valideerimisel kasutati üksnes puhtaid aineid, ei ole rakendatavust uuritavate segude puhul kontrollitud. See katsemeetod on siiski teoreetiliselt kohaldatav mitme koostisosaga ainete, tundmatu või muutuva koostisega ainete ning segude uurimiseks. Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega aine või segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud.

10.

Teavitamise eesmärgil on tabelis 1 esitatud agonistikatse tulemused 34 aine kohta, mille uurimisel kasutati mõlemat käesolevas katsemeetodis kirjeldatud täielikult valideeritud võrdlusmeetodit. Nendest ainetest 26 on liigitatud kindlateks ERi agonistideks ja 8 negatiivseteks, võttes aluseks avaldatud aruanded, sealhulgas in vitro ERi sidumise ja transaktivatsiooni katsemeetodite ja/või uterotroofse katsemeetodi kohta (2, 3, 18, 31, 32, 33, 34). Tabelis 2 on esitatud antagonistikatse tulemused 15 aine kohta, mille uurimisel kasutati mõlemat käesolevas katsemeetodis kirjeldatud täielikult valideeritud võrdlusmeetodit. Nendest ainetest 4 on liigitatud kindlateks/eeldatavateks ERi antagonistideks ja 10 negatiivseteks, võttes aluseks avaldatud aruanded, sealhulgas in vitro ERi sidumise ja transaktivatsiooni katsemeetodite kohta (2, 3, 18, 31). Tabelites 1 ja 2 esitatud andmete kohaselt langesid kahe võrdlusmeetodiga saadud klassifitseerimise aluseks olevad tulemused 100 % kokku kõigi ainete puhul, välja arvatud ühe aine (mifepristoon) antagonistikatse tulemus, ning kõik ained klassifitseeriti korrektselt ERi agonistiks/antagonistiks või negatiivseks. Lisateave selle kemikaalirühma kohta, samuti muud kemikaalid, mida valideerimisuuringute käigus STTA ja VM7Luc ER TA katsemeetoditega uuriti, on esitatud 2. liites ER TA toimivusnõuetes (tabelid 1, 2 ja 3) (6, 7).

Tabel 1

STTA ja VM7Luc ER TA katsemeetodite tulemuste ülevaade ainete kohta, mida uuriti mõlema agonistikatsega ja mis klassifitseeriti kas ERi agonistideks (POS) või negatiivseteks (NEG)

	Aine	CASi nr	STTA katsemeetod (34)			VM7Luc ER TA katsemeetod (35)		Klassifitseerimise andmete allikas (37)
	Aine	CASi nr	ER TA toime	PC10 väärtus (M)	PC50 väärtus (2) (M)	ER TA toime	EC50 väärtus (2), (36) (M)	Muud ER TAd (3)	ERi siduv	Uterotroofne
1	17ß-östradiool (1)	50-28-2	POS	< 1,00 × 10-11	< 1,00 × 10-11	POS	5,63 × 10-12	POS (227/227)	POS	POS
2	17α-östradiool (1)	57-91-0	POS	7,24 × 10-11	6,44 × 10-10	POS	1,40 × 10-9	POS (11/11)	POS	POS
3	17α-etinüülöstradiool (1)	57-63-6	POS	< 1,00 × 10-11	< 1,00 × 10-11	POS	7,31 × 10-12	POS (22/22)	POS	POS
4	17β-trenboloon	10161-33-8	POS	1,78 × 10-8	2,73 × 10-7	POS	4,20 × 10-8	POS (2/2)	NT	NT
5	19-nortestosteroon (1)	434-22-0	POS	9,64 × 10-9	2,71 × 10-7	POS	1,80 × 10-6	POS (4/4)	POS	POS
6	4-kumüülfenool (1)	599-64-4	POS	1,49 × 10-7	1,60 × 10-6	POS	3,20 × 10-7	POS (5/5)	POS	NT
7	4-tert-oktüülfenool (1)	140-66-9	POS	1,85 × 10-9	7,37 × 10-8	POS	3,19 × 10-8	POS (21/24)	POS	POS
8	Apigeniin (1)	520-36-5	POS	1,31 × 10-7	5,71 × 10-7	POS	1,60 × 10-6	POS (26/26)	POS	NT
9	Atrasiin (1)	1912-24-9	NEG	—	—	NEG	—	NEG (30/30)	NEG	NT
10	Bisfenool A (1)	80-05-7	POS	2,02 × 10-8	2,94 × 10-7	POS	5,33 × 10-7	POS (65/65)	POS	POS
11	Bisfenool B (1)	77-40-7	POS	2,36 × 10-8	2,11 × 10-7	POS	1,95 × 10-7	POS (6/6)	POS	POS
12	Butüülbensüülftalaat (1)	85-68-7	POS	1,14 × 10-6	4,11 × 10-6	POS	1,98 × 10-6	POS (12/14)	POS	NEG
13	Kortikosteroon (1)	50-22-6	NEG	—	—	NEG	—	NEG (6/6)	NEG	NT
14	Kumestrool (1)	479-13-0	POS	1,23 × 10-9	2,00 × 10-8	POS	1,32 × 10-7	POS (30/30)	POS	NT
15	Daidseiin (1)	486-66-8	POS	1,76 × 10-8	1,51 × 10-7	POS	7,95 × 10-7	POS (39/39)	POS	POS
16	Dietüülstilböstrool (1)	56-53-1	POS	< 1,00 × 10-11	2,04 × 10-11	POS	3,34 × 10-11	POS (42/42)	POS	NT
17	Di-n-butüülftalaat	84-74-2	POS	4,09 × 10-6		POS	4,09 × 10-6	POS (6/11)	POS	NEG
18	Etüülparabeen	120-47-8	POS	5,00 × 10-6	(PC50 puudub)	POS	2,48 × 10-5	POS		NT
19	Östroon (1)	53-16-7	POS	3,02 × 10-11	5,88 × 10-10	POS	2,34 × 10-10	POS (26/28)	POS	POS
20	Genisteiin (1)	446-72-0	POS	2,24 × 10-9	2,45 × 10-8	POS	2,71 × 10-7	POS (100/102)	POS	POS
21	Haloperidool	52-86-8	NEG	—	—	NEG	—	NEG (2/2)	NEG	NT
22	Kamferool (1)	520-18-3	POS	1,36 × 10-7	1,21 × 10-6	POS	3,99 × 10-6	POS (23/23)	POS	NT
23	Kepoon (1)	143-50-0	POS	7,11 × 10-7	7,68 × 10-6	POS	4,91 × 10-7	POS (14/18)	POS	NT
24	Ketokonasool	65277-42-1	NEG	—	—	NEG	—	NEG (2/2)	NEG	NT
25	Linuroon (1)	330-55-2	NEG	—	—	NEG	—	NEG (8/8)	NEG	NT
26	meso-heksöstrool (1)	84-16-2	POS	< 1,00 × 10-11	2,75 × 10-11	POS	1,65 × 10-11	POS (4/4)	POS	NT
27	Metüültestosteroon (1)	58-18-4	POS	1,73 × 10-7	4,11 × 10-6	POS	2,68 × 10-6	POS (5/6)	POS	NT
28	Moriin	480-16-0	POS	5,43 × 10-7	4,16 × 10-6	POS	2,37 × 10-6	POS (2/2)	POS	NT
29	Noretünodreel (1)	68-23-5	POS	1,11 × 10-11	1,50 × 10-9	POS	9,39 × 10-10	POS (5/5)	POS	NT
30	p,p’-metoksükloor (1)	72-43-5	POS	1,23 × 10-6	(PC50 puudub) (2)	POS	1,92 × 10-6	POS (24/27)	POS	POS
31	Fenobarbitaal (1)	57-30-7	NEG	—	—	NEG	—	NEG (2/2)	NEG	NT
32	Reserpiin	50-55-5	NEG	—	—	NEG	—	NEG (4/4)	NEG	NT
33	Spironolaktoon (1)	52-01-7	NEG	—	—	NEG	—	NEG (4/4)	NEG	NT
34	Testosteroon	58-22-0	POS	2,82 × 10-8	9,78 × 10-6	POS	1,75 × 10-5	POS (5/10)	POS	NT
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i number; M = molaarsus; EC50 = 50 % uuritava kemikaali suurima toime avaldumise kontsentratsioonist; NEG = negatiivne; POS = positiivne; NT = ei uuritud; PC10 (ja PC50) = uuritava aine kontsentratsioon, mille puhul toime on 10 % (või PC50 korral 50 %) võrreldes positiivse kontrollaine (E2, 1nM) toimega igal plaadil.

Tabel 2

STTA ja VM7Luc ER TA katsemeetodite tulemuste võrdlus ainete kohta, mida uuriti mõlema antagonistikatsega ja mis klassifitseeriti kas ERi antagonistideks (POS) või negatiivseteks (NEG)

	Aine (4)	CASi nr	ER STTA katsemeetod (38)		VM7Luc ER TA katsemeetod (39)		ER STTA oletatav toime (41)	ICCVAMi (42) konsensusklassifikatsioon	MeSHi (43) aineklass	Tooteklass (44)
	Aine (4)	CASi nr	ER TA toime	IC50 väärtus (5) (M)	ER TA toime	IC50 väärtus (5), (40) (M)	ER STTA oletatav toime (41)	ICCVAMi (42) konsensusklassifikatsioon	MeSHi (43) aineklass	Tooteklass (44)
1	4-hüdroksütamoksüfeen	68047-06-3	POS	3,97 × 10-9	POS	2,08 × 10-7	Mõõdukalt POS	POS	Süsivesinik (tsükliline)	Ravim
2	Dibenso[a,h]antratseen	53-70-3	POS	IC50 puudub	POS	IC50 puudub	POS	PP	Polütsükliline ühend	Laborikemikaal, looduslik toode
3	Mifepristoon	84371-65-3	POS	5,61 × 10-6	NEG	—	Nõrgalt POS	NEG	Steroid	Ravim
4	Raloksüfeenvesinikkloriid	82640-04-8	POS	7,86 × 10-10	POS	1,19 × 10-9	Mõõdukalt POS	POS	Süsivesinik (tsükliline)	Ravim
5	Tamoksüfeen	10540-29-1	POS	4,91 × 10-7	POS	8,17 × 10-7	POS	POS	Süsivesinik (tsükliline)	Ravim
6	17β-östradiool	50-28-2	NEG	—	NEG	—	PN	PN	Steroid	Ravim, veterinaarravim
7	Apigeniin	520-36-5	NEG	—	NEG	—	NEG	NEG	Heterotsükliline ühend	Värvaine, looduslik toode, ravimite vaheaine
8	Atrasiin	1912-24-9	NEG	—	NEG	—	NEG	PN	Heterotsükliline ühend	Herbitsiid
9	Di-n-butüülftalaat	84-74-2	NEG	—	NEG	—	NEG	NEG	Ester, ftaalhape	Kosmeetikatoodete koostisaine, tööstuskemikaal, plastifikaator
10	Fenarimool	60168-88-9	NEG	—	NEG	—	pole katsetatud	PN	Heterotsükliline ühend, pürimidiin	Fungitsiid
11	Flavoon	525-82-6	NEG	—	NEG	—	PN	PN	Flavonoid, heterotsükliline ühend	Looduslik toode, ravim
12	Flutamiid	13311-84-7	NEG	—	NEG	—	NEG	PN	Amiid	Ravim, veterinaarravim
13	Genisteiin	446-72-0	NEG	—	NEG	—	PN	NEG	Flavonoid, heterotsükliline ühend	Looduslik toode, ravim
14	p-n-nonüülfenool	104-40-5	NEG	—	NEG	—	pole katsetatud	NEG	Fenool	Keemiline vaheühend
15	Resveratrool	501-36-0	NEG	—	NEG	—	PN	NEG	Süsivesinik (tsükliline)	Looduslik toode
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i number; M = molaarsus; IC50 = 50 % uuritava kemikaali suurima inhibeeriva toime avaldumise kontsentratsioonist; NEG = negatiivne; PN = eeldatavasti negatiivne; POS = positiivne; PP = eeldatavasti positiivne.

ER TA KATSEMEETODI OSAD

Katsemeetodi olulised osad

11.

Käesolev katsemeetod kirjeldab katseid, milles kasutatakse stabiilse transfektsiooniga või endogeenseid ERα retseptori ja stabiilse transfektsiooniga reportergeeni konstrukti, mida reguleerib üks või mitu östrogeeni vastuselementi; leiduda võib siiski ka muid retseptoreid, nt ERβ. Need on katsemeetodi olulised osad.

Kontrollproovid

12.

Kirjeldada tuleb iga agonisti- ja antagonistikatse paralleelsetes kontrollproovides kasutatavate etalonainete soovituste alust. Asjakohaste paralleelsete kontrollproovide (negatiivne, lahusti ja positiivne) eesmärk on näidata, et katsemeetod katsetingimustes toimib, ning olla eksperimentide omavahelise võrdlemise aluseks; tavaliselt on paralleelsed kontrollproovid osa konkreetse eksperimendi nõuetekohasuse kriteeriumidest (1).

Kvaliteedikontrolli standardkord

13.

Kvaliteedikontrolli standardkorda tuleb kirjeldatud viisil järgida iga katse puhul tagamaks, et rakuliin on püsivalt stabiilne mitme passaaži jooksul, ei sisalda mükoplasmat (st ei ole bakteriaalselt saastunud) ja säilitab võime anda aja jooksul oodatavaid ERi vahendatud vastuseid. Lisaks tuleb kontrollida rakuliinide õiget identiteeti, samuti teiste saasteainete (nt seened, pärmseened ja viirused) sisaldust.

Labori pädevuse tõendamine

14.

Enne tundmatute kemikaalide uurimist mis tahes selle katsemeetodiga hõlmatud meetodi abil peab iga labor tõendama oma pädevust kõnealuse katsemeetodi kasutamiseks. Pädevuse tõendamiseks peab iga labor viima läbi katsed tabelis 3 loetletud 14 pädevuse tõendamise ainega agonistikatse puhul ja tabelis 4 loetletud 10 pädevuse tõendamise ainega antagonistikatse puhul. Pädevuskatsed kinnitavad ühtlasi katsesüsteemi reageerimisvõimet. Pädevuse tõendamise ainete loetelu on osa võrdlusainete loetelust, mis on esitatud ER TA katsemeetodite toimivusnõuetes (6). Need ained on müügil, esindavad niisuguseid kemikaaliklasse, mida üldiselt seostatakse ER agonistliku või antagonistliku toimega, avaldavad ER agonisti või antagonisti puhul eeldatavat toimet sobivas vahemikus (st on tugevad või nõrgad) ja hõlmavad negatiive. Pädevuse tõendamise ainetega tuleb teha vähemalt kaks korduskatset eri päevadel. Pädevust tõendab iga pädevuse tõendamise aine õige klassifitseerimine (positiivne/negatiivne). Pädevuskatset peaks katsemeetodite õppimise ajal korduvalt tegema iga laboritöötaja. Olenevalt rakutüübist võivad mõned neist pädevuse tõendamise ainetest käituda SERMidena ja toimida nii agonisti kui ka antagonistina. Tabelites 3 ja 4 on pädevuse tõendamise ained siiski klassifitseeritud nende teadaoleva peamise toime järgi, mida tuleks pädevuse tõendamisel arvesse võtta.

15.

Tulemuslikkuse tõendamiseks ja kvaliteedi kontrolli eesmärgil peaks iga labor võrdlema aja jooksul agonistide ja antagonistide kohta koostatud andmebaase andmetega etalonaine (nt 17β-östradiool ja tamoksüfeen), positiivses ja negatiivses kontrollproovis kasutatud kemikaalide ning lahusti (nt DMSO) kontrollproovi kohta. Kõigepealt tuleks luua andmebaas vähemalt 10 sõltumatu agonisti (nt 17β-östradiool) ja 10 sõltumatu antagonisti (nt tamoksüfeen) katse andmete põhjal. Kõnealuste etalonainete ja lahusti kontrollproovidega edaspidi saadud tulemused tuleks andmebaasi laiendamiseks sinna lisada; nii tagatakse laboris biokatsemeetodi järjepidevus ja tulemuslikkus läbi aja.

Tabel 3

Pädevuse tõendamise ainete (14) loetelu agonistikatse jaoks (52)

Nr (51)	Aine	CASi nr	Eeldatav vastus (45)	STTA katsemeetod			VM7Luc ER TA katsemeetod		MeSHi aineklass (49)	Tooteklass (50)
Nr (51)	Aine	CASi nr	Eeldatav vastus (45)	PC10 väärtus (M) (46)	PC50 väärtus (M) (46)	Katsel kasutatud kontsentratsioonivahemik (M)	VM7Luc EC50 väärtus (M) (47)	Suurim kontsentratsioon vahemikuotsingus (M) (48)	MeSHi aineklass (49)	Tooteklass (50)
14	Dietüülstilböstrool	56-53-1	POS	< 1,00 × 10-11	2,04 × 10-11	10-14 – 10-8	3,34 × 10-11	3,73 × 10-4	Süsivesinik (tsükliline)	Ravim, veterinaarravim
12	17α-östradiool	57-91-0	POS	4,27 × 10-11	6,44 × 10-10	10-11 – 10-5	1,40 × 10-9	3,67 × 10-3	Steroid	Ravim, veterinaarravim
15	meso-heksöstrool	84-16-2	POS	< 1,00 × 10-11	2,75 × 10-11	10-11 – 10-5	1,65 × 10-11	3,70 × 10-3	Süsivesinik (tsükliline), fenool	Ravim, veterinaarravim
11	4-tert-oktüülfenool	140-66-9	POS	1,85 × 10-9	7,37 × 10-8	10-11 – 10-5	3,19 × 10-8	4,85 × 10-3	Fenool	Keemiline vaheühend
9	Genisteiin	446-72-0	POS	2,24 × 10-9	2,45 × 10-8	10-11 – 10-5	2,71 × 10-7	3,70 × 10-4	Flavonoid, heterotsükliline ühend	Looduslik toode, ravim
6	Bisfenool A	80-05-7	POS	2,02 × 10-8	2,94 × 10-7	10-11 – 10-5	5,33 × 10-7	4,38 × 10-3	Fenool	Keemiline vaheühend
2	Kamferool	520-18-3	POS	1,36 × 10-7	1,21 × 10-6	10-11 – 10-5	3,99 × 10-6	3,49 × 10-3	Flavonoid, heterotsükliline ühend	Looduslik toode
3	Butüülbensüülftalaat	85-68-7	POS	1,14 × 10-6	4,11 × 10-6	10-11 – 10-5	1,98 × 10-6	3,20 × 10-4	Karboksüülhape, ester, ftaalhape	Plastifikaator, tööstuskemikaal
4	p,p’-metoksükloor	72-43-5	POS	1,23 × 10-6	—	10-11 – 10-5	1,92 × 10-6	2,89 × 10-3	Süsivesinik (halogeenitud)	Pestitsiid, veterinaarravim
1	Etüülparabeen	120-47-8	POS	5,00 × 10-6	—	10-11 – 10-5	2,48 × 10-5	6,02 × 10-3	Karboksüülhape, fenool	Ravim, konservant
17	Atrasiin	1912-24-9	NEG	—	—	10-10 – 10-4	—	4,64 × 10-4	Heterotsükliline ühend	Herbitsiid
20	Spironolaktoon	52-01-7	NEG	—	—	10-11 – 10-5	—	2,40 × 10-3	Laktoon, steroid	Ravim
21	Ketokonasool	65277-42-1	NEG	—	—	10-11 – 10-5	—	9,41 × 10-5	Heterotsükliline ühend	Ravim
22	Reserpiin	50-55-5	NEG	—	—	10-11 – 10-5	—	1,64 × 10-3	Heterotsükliline ühend, indool	Ravim, veterinaarravim
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i number; EC50 = 50 % uuritava kemikaali suurima toime avaldumise kontsentratsioonist; NEG = negatiivne; POS = positiivne; PC10 (ja PC50) = uuritava aine kontsentratsioon, mille puhul toime on 10 % (või PC50 korral 50 %) võrreldes positiivse kontrollaine (E2, 1nM) toimega igal plaadil.

Tabel 4

Pädevuse tõendamise ainete (10) loetelu antagonistikatse jaoks

Aine (6)

CASi nr

ER STTA katsemeetod (53)

VM7Luc ER TA katsemeetod (54)

ER STTA (53) oletatav mõju

ICCVAMi (57) konsensusklassifikatsioon

MeSHi (58) aineklass

Tooteklass (59)

ER TA toime

IC50 (M)

Katsel kasutatud kontsentratsioonivahemik (M)

ER TA toime

IC50 (55) (M)

Suurim kontsentratsioon vahemikuotsingus (M) (56)

4-hüdroksütamoksüfeen

68047-06-3

POS

3,97 × 10-9

10-12 – 10-7

POS

2,08 × 10-7

2,58 × 10-4

Mõõdukalt POS

POS

Süsivesinik (tsükliline)

Ravim

Raloksüfeenvesinikkloriid

82640-04-8

POS

7,86 × 10-10

10-12 – 10-7

POS

1,19 × 10-9

1,96 × 10-4

Mõõdukalt POS

POS

Süsivesinik (tsükliline)

Ravim

Tamoksüfeen

10540-29-1

POS

4,91 × 10-7

10-10 – 10-5

POS

8,17 × 10-7

2,69 × 10-4

POS

Süsivesinik (tsükliline)

Ravim

17β-östradiool

50-28-2

NEG

—

10-9 – 10-4

NEG

—

3,67 × 10-3

eeldatavalt negatiivne (*4)

Steroid

Ravim, veterinaarravim

Apigeniin

520-36-5

NEG

—

10-9 – 10-4

NEG

—

3,70 × 10-4

NEG

Heterotsükliline ühend

Värvaine, looduslik toode, ravimite vaheaine

Di-n-butüülftalaat

84-74-2

NEG

—

10-8 – 10-3

NEG

—

3,59 × 10-3

NEG

Ester, ftaalhape

Kosmeetikatoodete koostisaine, tööstuskemikaal, plastifikaator

Flavoon

525-82-6

NEG

—

10-8 – 10-3

NEG

—

4,50 × 10-4

eeldatavalt negatiivne (*4)

Flavonoid, heterotsükliline ühend

Looduslik toode, ravim

Genisteiin

446-72-0

NEG

—

10-9 – 10-4

NEG

—

3,70 × 10-4

eeldatavalt negatiivne (*4)

NEG

Flavonoid, heterotsükliline ühend

Looduslik toode, ravim

p-n-nonüülfenool

104-40-5

NEG

—

10-9 – 10-4

NEG

—

4,54 × 10-4

pole katsetatud

NEG

Fenool

Keemiline vaheühend

Resveratrool

501-36-0

NEG

—

10-8 – 10-3

NEG

—

4,38 × 10-4

eeldatavalt negatiivne (*4)

NEG

Süsivesinik (tsükliline)

Looduslik toode

Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i number; M = molaarsus; IC50 = 50 % uuritava kemikaali suurima inhibeeriva toime avaldumise kontsentratsioonist; NEG = negatiivne; PN = eeldatavasti negatiivne; POS = positiivne.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

16.

Katse nõuetekohaseks tunnistamise või tagasilükkamise aluseks on iga katse tegemisel kasutatud etalonaine ja kontrollproovidega saadud tulemuste hinnang. Etalonainete PC50 (EC50) või IC50 väärtused peaksid vastama valitud katsemeetodi (vt 2. liide STTA kohta ja 3. liide VM7Luc ER TA kohta) nõuetekohasuse kriteeriumidele ning kõik positiivsed/negatiivsed kontrollproovid peaksid igas nõuetekohaseks tunnistatud katses olema õigesti klassifitseeritud. Katse järjepideva läbiviimise võimet tuleb tõendada aja jooksul etalonainete ja kontrollproovide kohta kogutud andmeid sisaldava andmebaasi arendamise ja hooldamisega (vt punkt 15). Laborisisese korratavuse mõõduna võib kasutada mitme katsega saadud etalonainete kõverate ja parameetrite sobitamise tulemusel leitud keskväärtuste standardhälbeid (SD) või variatsioonikordajaid (CV). Peale selle peavad seoses nõuetekohasuse kriteeriumidega olema täidetud järgmised tingimused:

—	andmed peavad olema ERi aktiveerimise (agonistikatse) või pärssimise (antagonistikatse) (st tõhususe ja toime) kvantitatiivseks hindamiseks piisavad;

—

piisava tundlikkuse tagamiseks peab reporteri keskmine aktiivsus võrdlusöstrogeeni võrdluskontsentratsiooni puhul olema võrdne vähemalt kandeaine (lahusti) kontrollproovi analüüsil määratud miinimumiga. STTA ja VM7Luc ER TA katsemeetodite korral on see igal plaadil neljakordne kandeaine kontrollprooviga saadud keskmine;

—	uuritavad kontsentratsioonid peaksid jääma uuritavate kemikaalide lahustuvusvahemikku ega tohiks olla tsütotoksilised.

Andmeanalüüs

17.

Positiivse ja negatiivse vastuse klassifitseerimiseks tuleks iga katsemeetodi puhul järgida kindlaksmääratud andmete tõlgendamise eeskirja.

18.

Nõuetekohasuse kriteeriumide (punkt 16) täitmine näitab, et katsemeetod toimib korrektselt, kuid see ei taga täpsete andmete saamist mis tahes konkreetsel katsel. Esimese katse tulemuste kordumine on parim märk täpsete andmete saamisest. Kui kahe katsega saadakse korratavad tulemused (st mõlema katse tulemused näitavad, et uuritav kemikaal on positiivne), ei ole kolmanda katse tegemine vajalik.

19.

Kui kahe katsega saadud tulemused ei ole korratavad (nt uuritav kemikaal on ühe katse põhjal positiivne ja teise põhjal negatiivne) või kõnealuse katsemeetodi tulemuste puhul on nõutav suurem paikapidavuse aste, tuleks läbi viia vähemalt kolm sõltumatut katset. Sellisel juhul võetakse klassifitseerimisel aluseks kaks kokkulangevat tulemust kolmest.

Andmete tõlgendamise üldkriteeriumid

20.

Praegu ei ole olemas üldtunnustatud meetodit ER TA andmete tõlgendamiseks. Kuid nii ERi vahendatud toime kvalitatiivne (nt positiivne/negatiivne) kui ka kvantitatiivne (nt EC50, PC50, IC50) hindamine peab põhinema empiiriliste andmetel ja põhjendatud teaduslikel otsustel. Positiivseid tulemusi tuleks võimaluse korral iseloomustada nii toime suurusjärgu poolest kandeaine (lahusti) kontrollproovi või etalonöstrogeeniga võrreldes kui ka toime avaldumise kontsentratsiooni (nt EC50, PC50, RPCmax, IC50 jms) poolest.

Katseprotokoll

21.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Katsemeetod:

—	kasutatud katsemeetod;

—	kontrollaine, etalonaine, uuritav kemikaal;

—	tarnija, partii number, aegumise kuupäev, kui olemas;

—	uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja stabiilsus lahustis, kui teada;

—	vastavalt vajadusele mõõtmistulemused söötme pH ja osmolaalsuse ning sademe tekke kohta pärast uuritava kemikaali lisamist.

Ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne.

Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal ja segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

Lahusti/kandeaine:

—	iseloomustus (omadused, tarnija ja partii);

—	lahusti/kandeaine valiku põhjendus;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines, kui teada.

Rakud:

—

rakkude tüüp ja päritolu:

—	kas ERi ekspresseeritakse endogeenselt? Kui ei, siis milline/millised retseptor(id) transfekteeriti?

—	kasutatud reporterikonstrukt(id) (sealhulgas päritoluliigid);

—	transfektsioonimeetod;

—	stabiilse transfektsiooni säilitamiseks kasutatud selekteerimismeetod (kui asjakohane);

—	kas transfektsioonimeetod on stabiilsete liinide puhul asjakohane?

—	rakupassaažide arv (sulatamisest alates);

—	rakupassaažide arv sulatamisel;

—	rakukultuuride säilitamise meetodid.

Katsetingimused:

—	lahustuvusest tingitud piirangud;

—	eluvõimelisuse hindamiseks kasutatud meetodite kirjeldus;

—	söötme koostis, CO2 kontsentratsioon;

—	uuritava kemikaali kontsentratsioonid;

—	kandeaine ja lisatud uuritava kemikaali kogus;

—	inkubeerimise temperatuur ja niiskus;

—	töötluse kestus;

—	rakutiheduse töötluse alguses ja selle ajal;

—	positiivsed ja negatiivsed etalonained;

—	reporterreagendid (toote nimetus, tarnija ja partii);

—	kriteeriumid, mille alusel katsetulemused liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.

Nõuetekohasuse kontroll:

—	kordne induktsioon iga analüüsitava plaadi puhul ja kas need vastavad katses nõutavatele miinimumnõuetele, mille aluseks on aja jooksul kontrollproovidega saadud tulemused;

—	nõuetekohasuse kriteeriumide, nt log10EC50, log10PC50, logIC50 tegelikud väärtused ja Hilli kõvera tõusu väärtused paralleelselt uuritud positiivsete kontrollainete / etalonainete korral.

Tulemused

—	toor- ja normaliseeritud andmed;

—	maksimaalne kordse induktsiooni tase;

—	tsütotoksilisuse andmed;

—	vähim toimet avaldav kontsentratsioon, kui see on olemas;

—	RPCMax, PCmax, PC50, IC50 ja/või EC50 väärtused, vajaduse korral;

—	võimaluse korral andmed vastuse sõltuvuse kohta kontsentratsioonist;

—	statistiline analüüs, kui see on olemas, koos mõõtevea ja usalduspiiridega (nt aritmeetilise keskmise standardviga, standardhälve, variatsioonikordaja või usaldusvahemik usaldusnivool 95 %) ning kirjeldus selle kohta, kuidas need väärtused saadi.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	OECD (2005), „Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 34), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(2)	OECD (2015), „Report of the Inter-Laboratory Validation for Stably Transfected Transactivation Assay to detect Estrogenic and Anti-estrogenic Activity“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 225), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(3)	ICCVAM (2011), „ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method, an In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists“, National Institute of Environmental Health Sciences: Research Triangle Park, NC.

(4)	Pujol, P. et al. (1998), „Differential Expression of Estrogen Receptor-Alpha and -Beta Messenger RNAs as a Potential Marker of Ovarian Carcinogenesis“, Cancer. Res., nr 58(23), lk 5367–73.

(5)

Rogers, J. M. ja Denison, M. S. (2000), „Recombinant Cell Bioassays for Endocrine Disruptors: Development of a Stably Transfected Human Ovarian Cell Line for the Detection of Estrogenic and Anti-Estrogenic Chemicals“, In Vitro and Molecular Toxicology: Journal of Basic and Applied Research, nr 13(1), lk 67–82.

(6)	OECD (2012), „Performance Standards For Stably Transfected Transactivation In Vitro Assay to Detect Estrogen Receptor Agonists (for TG 455)“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 173), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(7)	OECD (2015), „Performance Standards For Stably Transfected Transactivation In Vitro Assay to Detect Estrogen Receptor Antagonists“ Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 174), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(8)	OECD (2012), „Guidance Document on Standardized Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 150), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(9)	Cavailles, V. (2002), „Estrogens and Receptors: an Evolving Concept“, Climacteric, nr 5, 2 lisa, lk 20–6.

(10)	Welboren, W. J. et al. (2009), „Genomic Actions of Estrogen Receptor Alpha: What are the Targets and how are they Regulated?“, Endocr. Relat. Cancer, nr 16(4), lk 1073–89.

(11)	Younes, M. ja Honma, N. (2011), „Estrogen Receptor Beta“, Arch. Pathol. Lab. Med., nr 135(1), lk 63–6.

(12)	Jefferson, W.N. et al. (2002), „Assessing Estrogenic Activity of Phytochemicals Using Transcriptional Activation and Immature Mouse Uterotrophic Responses“, Journal of Chromatography B, nr 777(1–2), lk 179–189.

(13)	Sonneveld, E. et al. (2006), „Comparison of In Vitro and In Vivo Screening Models for Androgenic and Estrogenic Activities“, Toxicol. Sci., nr 89(1), lk 173–187.

(14)	Takeyoshi, M. et al. (2002), „The Efficacy of Endocrine Disruptor Screening Tests in Detecting Anti- Estrogenic Effects Downstream of Receptor-Ligand Interactions“, Toxicology Letters, nr 126(2), lk 91–98.

(15)	Combes, R. D. (2000), „Endocrine Disruptors: a Critical Review of In Vitro and In Vivo Testing Strategies for Assessing their Toxic Hazard to Humans“, ATLA Alternatives to Laboratory Animals, nr 28(1), lk 81–118.

(16)	Escande, A. et al. (2006), „Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta“, Biochem. Pharmacol., nr 71(10), lk 1459–69.

(17)	Gray, L.E. Jr. (1998), „Tiered Screening and Testing Strategy for Xenoestrogens and Antiandrogens“, Toxicol. Lett., nr 102–103, lk 677–680.

(18)	EDSTAC (1998), „Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee (EDSTAC) Final Report“.

(19)	ICCVAM (2003), „ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays“.

(20)	Gustafsson, J. Ö. (1999), „Estrogen Receptor ß - A New Dimension in Estrogen Mechanism of Action“, Journal of Endocrinology, nr 163(3), lk 379–383.

(21)	Ogawa, S. et al. (1998), „The Complete Primary Structure of Human Estrogen Receptor ß (hERß) and its Heterodimerization with ERαIn Vivo and In Vitro“, Biochemical and Biophysical Research Communications, nr 243 (1), lk 122–126.

(22)	Enmark, E. et al. (1997), „Human Estrogen Receptor ß-Gene Structure, Chromosomal Localization, and Expression Pattern“, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, nr 82(12), lk 4258–4265.

(23)	Ball, L. J. et al. (2009), „Cell Type- and Estrogen Receptor-Subtype Specific Regulation of Selective Estrogen Receptor Modulator Regulatory Elements“, Molecular and Cellular Endocrinology, nr 299(2), lk 204–211.

(24)	Barkhem, T. et al. (1998), „Differential Response of Estrogen Receptor Alpha and Estrogen Receptor Beta to Partial Estrogen Agonists/Antagonists“, Mol. Pharmacol., nr 54(1), lk 105–12.

(25)	Deroo, B. J. ja Buensuceso, A. V. (2010), „Minireview: Estrogen Receptor-ß: Mechanistic Insights from Recent Studies“, Molecular Endocrinology, nr 24(9), lk 1703–1714.

(26)	Harris, D. M. et al. (2005), „Phytoestrogens Induce Differential Estrogen Receptor Alpha- or Beta- Mediated Responses in Transfected Breast Cancer Cells“, Experimental Biology and Medicine, nr 230(8), lk 558–568.

(27)	Anderson, J. N., Clark, J. H. ja Peck, E. J. Jr. (1972), „The Relationship Between Nuclear Receptor- Estrogen Binding and Uterotrophic Responses“, Biochemical and Biophysical Research Communications, nr 48(6), lk 1460–1468.

(28)	Toft, D. (1972), „The Interaction of Uterine Estrogen Receptors with DNA“, Journal of Steroid Biochemistry, nr 3(3): lk 515–522.

(29)	Gorski, J. et al. (1968), „Hormone Receptors: Studies on the Interaction of Estrogen with the Uterus“, Recent Progress in Hormone Research, nr 24, lk 45–80.

(30)	Jensen, E. V. et al. (1967), „Estrogen-Receptor Interactions in Target Tissues“, Archives d’Anatomie Microscopique et de Morphologie Experimentale, nr 56(3), lk 547–569.

(31)	ICCVAM (2002), „Background Review Document: Estrogen Receptor Transcriptional Activation (TA) Assay. Appendix D, Substances Tested in the ER TA Assay“, NIH Publication Report (No 03-4505.).

(32)	Kanno, J. et al. (2001), „The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay to Screen Compounds for In Vivo Estrogenic Responses: Phase 1“, Environ. Health Persp., nr 109, lk 785–94.

(33)	Kanno, J. et al. (2003), „The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay: Phase Two Dose -Response Studies“, Environ. Health Persp., nr 111, lk 1530–1549.

(34)	Kanno, J. et al. (2003), „The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay: Phase Two – Coded Single-Dose Studies“, Environ. Health Persp., nr 111, lk 1550–1558.

(35)	Geisinger et al. (1989), „Characterization of a human ovarian carcinoma cell line with estrogen and progesterone receptors“, Cancer, nr 63, lk 280–288.

(36)	Baldwin et al. (1998), „BG-1 ovarian cell line: an alternative model for examining estrogen-dependent growth in vitro“, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, nr 34, lk 649–654.

(37)	Li, Y. et al. (2014), „Research resource: STR DNA profile and gene expression comparisons of human BG-1 cells and a BG-1/MCF-7 clonal variant“, Mol. Endo., nr 28, lk 2072–2081.

(38)	Rogers, J. M. ja Denison, M. S. (2000), „Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors: development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenic and anti-estrogenic chemicals“, In Vitro & Molec. Toxicol. nr 13, lk 67–82.

1. liide

MÕISTED JA LÜHENDID

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid : katse kontrollproovide ja etalonainete toimivuse miinimumnõuded. Selleks, et katse loetaks kehtivaks, peavad kõik nõuetekohasuse kriteeriumid olema täidetud.

Täpsus (vastavus) : katsemeetodiga saadud tulemuste ja nõuetekohaste võrdlusväärtuste kokkulangevuse määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks olulistest aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse (1).

Agonist : aine, mis konkreetse retseptoriga seondudes põhjustab vastuse, nt transkriptsiooni.

Antagonist : retseptori ligandi või kemikaali liik, mis retseptoriga seondudes ei kutsu esile bioloogilist vastust, vaid blokeerib või summutab agonisti vahendatud vastuseid.

Antiöstrogeenne toime : kemikaali võime pärssida 17β-östradiooli toimet, mida vahendatakse östrogeeniretseptorite kaudu.

Raku morfoloogia : koekultuuri plaadi süvendis monokihis kasvanud rakkude kuju ja välimus. Surevate rakkude morfoloogia on sageli ebatavaline.

CF : OECD kontseptuaalne raamistik endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks ja hindamiseks.

Töötlemine aktiivsöe/dekstraaniga : rakukultuuris kasutatud seerumi töötlemine. Aktiivsöe/dekstraaniga töötlemise teel eemaldatakse endogeensed hormoonid ja hormoone siduvad valgud.

Kemikaal : aine või segu.

Tsütotoksilisus : kahjulik mõju raku struktuurile või funktsioonile, mis lõpuks võib põhjustada raku surma ning mida kajastab pärast kokkupuuteperioodi lõppemist süvendis leiduvate rakkude arvu vähenemine või rakufunktsiooni mõõtnäitajate vähenemine paralleelselt uuritud kandeaine kontrollprooviga võrreldes.

CV : variatsioonikordaja.

DCC-FBS : dekstraaniga kaetud aktiivsöega töödeldud veiselooteseerum.

DMEM : Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde.

DMSO : dimetüülsulfoksiid.

E2 : 17β-östradiool.

EC50 : 50 % uuritava kemikaali suurima toime avaldumise kontsentratsioonist.

ED : endokriinsed häired.

hERα : inimese östrogeeni alfa-retseptor.

hERß : inimese östrogeeni beeta-retseptor.

EFM : östrogeenivaba sööde. Dulbecco modifitseeritud Eagle'i minimaalsööde (DMEM), millele on lisatud 4,5 % aktiivsöe/dekstraaniga töödeldud veiselooteseerumit, 1,9 % L-glutamiini ja 0,9 % Pen-Strepi.

ER : östrogeeniretseptor.

ERE : östrogeeni vastuselement.

Östrogeenne toime : kemikaali võime matkida 17β-östradiooli, sidudes östrogeeniretseptoreid ja neid aktiveerides. hERα vahendatud östrogeenset toimet saab tuvastada käesoleva katsemeetodiga.

ERTA : östrogeeniretseptori transaktivatsioon.

FBS : veiselooteseerum.

HeLa : inimese emakakaelarakkude surematu liin.

HeLa9903 : HeLa raku subkloon, millesse on stabiilselt transfekteeritud hERαα ja lutsiferaasi reportergeen.

IC 50 : 50 % uuritava pärssiva kemikaali suurima toime avaldumise kontsentratsioonist.

ICCVAM : The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods.

Laboritevaheline korratavus : suurus, mis näitab, millisel määral suudavad erinevad kvalifitseeritud laborid, kasutades sama katse-eeskirja ja uurides samu aineid, saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt sarnaseid tulemusi. Laboritevaheline reprodutseeritavus määratakse eelvalideerimise ja valideerimise käigus ning see näitab, millisel määral võib uurimismeetodit edukalt üle viia ühest laborist teise (1).

Laborisisene korratavus : suurus, mis näitab, millisel määral suudavad sama labori kvalifitseeritud töötajad konkreetset katse-eeskirja kasutades saada eri aegadel samasuguseid tulemusi (1).

LEC : vähim toimet avaldav kontsentratsioon on uuritava kemikaali vähim kontsentratsioon, mis kutsub esile vastuse (st uuritava kemikaali vähim kontsentratsioon, mille juures kordne induktsioon on paralleelselt uuritud kandeaine kontrollproovi omaga võrreldes statistiliselt erinev).

Samalaadne katsemeetod : katsemeetod, mis on struktuurilt ja funktsioonilt sarnane valideeritud ja tunnustatud võrdlusmeetodiga. Nimetatakse ka samaväärseks katsemeetodiks.

MT : metallotioneiin.

MMTV : hiire piimanäärmekasvaja viirus.

OHT : 4-hüdroksütamoksüfeen.

PBTG : toimivusel põhinev katsejuhend.

PC (positiivne kontrollproov) : väga aktiivne aine, eelistatavalt 17ß-östradiool, mida uuritakse kõigis katsetes, et tagada katsemeetodi nõuetekohane toimivus.

PC 10 : uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures agonistikatses mõõdetud toime on 10 % maksimaalsest toimest, mida positiivne kontrollproov (STTA katsemeetodi korral E2 kontsentratsiooniga 1 nM) igal plaadil esile kutsub.

PC 50 : uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures agonistikatses mõõdetud toime on 50 % maksimaalsest toimest, mida positiivne kontrollproov (E2 katsemeetodis täpsustatud võrdluskontsentratsioonis) igal plaadil esile kutsub.

PC max : uuritava kemikaali kontsentratsioon, mis kutsub esile maksimaalse vastuse.

Toimivusnõuded : valideeritud katsemeetodil põhinevad nõuded, mille alusel hinnatakse, kuivõrd saab esitatud katsemeetodit võrrelda teostuslikult ja tööpõhimõttelt samalaadse meetodiga. Sealhulgas on 1) katsemeetodi olulised osad, 2) valideeritud katsemeetodi vastuvõetava tulemuslikkuse tõendamiseks kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdluskemikaalide miinimumloetelu ja 3) võrreldavat usaldusväärsuse ja täpsuse taset, mille puhul on lähtutud valideeritud katsemeetodiga saadud tulemustest ja mis tuleks saavutada kavandatud katsemeetodi hindamisel võrdluskemikaalide miinimumloetelu kasutamise teel (1).

Pädevuse tõendamise ained : toimivusnõuetes sisalduvas alamloetelus esitatud võrdlusained, mida laborid võivad kasutada, et tõendada oma tehnilist pädevust standardse katsemeetodi kasutamiseks. Nende ainete tüüpilised valikukriteeriumid on, et need esindaks laia vastusevahemikku, oleksid müügil ja et nende kohta oleksid kättesaadavad kvaliteetsed võrdlusandmed.

Pädevus : enne tundmatute ainete uurimist tõendatud võime katsemeetodit korrektselt kasutada.

Võrdlusöstrogeen (positiivne kontrollaine) : 17β-östradiool (E2, CAS 50-28-2).

Etalonaine : võrdlusaine, mida kasutatakse katsemeetodi sobivuse tõendamiseks. STTA ja VM7Luc ER TA katsemeetodite puhul on etalonaineks 17β-östradiool.

Valideeritud katsemeetodid : katsemeetodid, millel põhineb toimivusel põhinev katsejuhend nr 455.

Usaldusväärsus : iseloomustab katsemeetodi korratavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamisel arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline korratavus.

RLU : suhteline valgusühik.

RNA : ribonukleiinhape.

RPCmax : uuritava kemikaali indutseeritud maksimaalne vastus, väljendatuna protsendina 1 nM E2 indutseeritud vastusest samal plaadil.

RPMI : sööde RPMI-1 640, millele on lisatud 0,9 % Pen-Strepi ja 8,0 % veiselooteseerumit (FBS).

Katse : üksikeksperiment, millega hinnatakse kemikaali mõju bioloogilise analüüsi tulemustele. Iga katse on tervikeksperiment, mis viiakse läbi paralleelsüvendites rakkudega, mis on külvatud ühisest rakukogumist ühel ja samal ajal.

Sõltumatu katse : eraldiseisev sõltumatu eksperiment, millega hinnatakse kemikaali mõju bioloogilise analüüsi tulemustele, kasutades teisest rakukogumist pärit rakke ja värskelt valmistatud kemikaalilahuseid; katse võib läbi viia erineval päeval võiv võib seda samal päeval teha teine töötaja.

SD : standardhälve.

Tundlikkus : kõigi niisuguste positiivsete/aktiivsete ainete osakaal, mis katse tulemusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega iseloomustatakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (1).

Spetsiifilisus : kõigi niisuguste negatiivsete/mitteaktiivsete ainete osakaal, mis katse tulemusel klassifitseeritakse õigesti. Spetsiifilisusega iseloomustatakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (1).

Stabiilne transfektsioon : kui DNA transfekteeritakse kultiveeritud rakkudesse nii, et see integreerub stabiilselt rakkude genoomi, mille tulemusena toimub transfekteeritud geenide stabiilne ekspressioon. Stabiilselt transfekteeritud rakkude kloonid valitakse välja stabiilsete markerite järgi (nt G418-resistentsus).

STTA katsemeetod : stabiilse transfektsiooniga transaktivatsiooni katse, ERα transkriptsiooni aktivatsiooni katse, milles kasutatakse rakuliini HeLa 9 903.

Uuring : kogu katsetega seotud töö, mis on tehtud, et hinnata üht konkreetset ainet, kasutades konkreetset katsemeetodit. Uuring koosneb etappidest, mis hõlmavad kasutatavas uuritava aine söötmes lahustuvuse uurimist, eelkatseid vahemiku leidmiseks, kõiki vajalikke tervikkatseid kokku, andmeanalüüsi, kvaliteedi tagamist, tsütotoksilisuse hindamist jms. Uuringu lõpuleviimine võimaldab klassifitseerida uuritava kemikaali toimet (st, kas on aktiivne, mitteaktiivne või ei anna ühest tulemust) uuritava toksilise omaduse seisukohast, mida kasutava katsemeetodi abil hinnatakse, ja hinnata mõju tugevust positiivse võrdluskemikaaliga võrreldes.

Aine : REACH-määruses (60) on aine määratletud kui looduslik või tootmisprotsessi teel saadud keemiline element või selle ühendid koos stabiilsuse säilitamiseks vajalike ja tootmisprotsessist johtuvate lisanditega, välja arvatud lahustid, mida on võimalik ainest eraldada, mõjutamata aine stabiilsust või muutmata selle koostist. ÜRO GHSis (1) on kasutatud väga sarnast määratlust.

TA (transaktivatsioon): mRNA sünteesi alustamine vastusena keemilisele signaalile, näiteks östrogeeni seondumisele östrogeeniretseptoriga.

Katsemeetod : siinses kontekstis on katsemeetod üks metoodikatest, mis on tunnistatud valiidseks, sest see vastab väljatöötatud toimivuskriteeriumidele. Katsemeetodi osad hõlmavad näiteks konkreetset rakuliini koos sellega seotud kasvutingimustega, konkreetset söödet, milles katse läbi viiakse, plaadi ettevalmistamise tingimusi, uuritavate kemikaalide valimist ja lahjendamist, samuti mis tahes muid nõutavaid kvaliteedikontrolli meetmeid ja meetodiga seotud andmehindamisetappe.

Uuritav kemikaal : iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Transkriptsioon : mRNA süntees.

UVCB : tundmatu või muutuva koostisega kemikaal, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Valideeritud katsemeetod : katsemeetod, mille valideerimisuuringud on lõpule viidud, st on määratud selle asjakohasus (sealhulgas täpsus) ja usaldusväärsus konkreetse eesmärgi puhul. Oluline on märkida, et valideeritud katsemeetod ei tarvitse olla piisavalt kasutuskõlblik täpsuse ja usaldusväärsuse osas, et seda saaks lugeda vastuvõetavaks konkreetse eesmärgi puhul (1).

Valideerimine : protsess, millega tehakse kindlaks konkreetse lähenemisviisi, meetodi, analüüsi, protsessi või hindamisviisi usaldusväärsus ja asjakohasus seoses määratud eesmärgiga (1).

VC (kandeaine kontrollproov) : uuritavate ja kontrollkemikaalide lahustamiseks kasutatavat lahustit uuritakse eraldi kui kandeainet, mis ei sisalda lahustatud kemikaali.

VM7 : immortaliseeritud adenokartsinoomirakk, mis ekspresseerib endogeenselt östrogeeniretseptorit.

VM7Luc4E2 : rakuliin VM7Luc4E2 aretati inimese immortaliseeritud VM7 adenokartsinoomirakkudest, mis ekspresseerivad endogeenselt mõlemat liiki östrogeeniretseptorit (ERα ja ERβ) ning millesse on stabiilselt transfekteeritud plasmiid pGudLuc7.ERE. Kõnealune plasmiid sisaldab nelja sünteetilise oligonukleotiidi koopiat, milles östrogeeni vastuselement jääb ülespoole hiire piimanäärmekasvaja viiruse promootorist ja jaanimardika lutsiferaasi geenist.

Nõrgalt positiivne kontrollaine : võrdluskemikaalide loetelust valitud nõrgalt aktiivne aine, mida uuritakse kõigis katsetes, et tagada katsemeetodi nõuetekohane toimivus.

2. liide

STABIILSE TRANSFEKTSIOONIGA INIMESE ÖSTROGEENI Α-RETSEPTORI TRANSAKTIVATSIOONI (TA) KATSEMEETOD, MILLES UURITAKSE KEMIKAALIDE TOIMET ÖSTROGEENI AGONISTI VÕI ANTAGONISTINA, KASUTADES RAKULIINI HERΑ-HELA-9903

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD (VT KA ÜLDIST SISSEJUHATUST)

Transaktivatsiooni (TA) katsemeetodis kasutatakse rakuliini hERα-HeLa-9 903, et tuvastada toime östrogeeni agonistina, mida vahendab inimese östrogeeni α-retseptor (hERα). Stabiilse transfektsiooniga transaktivatsiooni (STTA) katsemeetodi valideerimisuuring, mille tegi Jaapani kemikaalide hindamise ja uurimise instituut (CERI), kasutades inimese östrogeeni α-retseptori vahendatava östrogeeni agonistliku ja antagonistliku toime tuvastamiseks rakuliini hERα-HeLa-9 903, tõendas katsemeetodi asjakohasust ja usaldusväärsust ettenähtud eesmärgil kasutades (1).

See katsemeetod on välja töötatud spetsiaalselt hERα-vahendatud transaktivatsiooni tuvastamiseks, kasutades mõõdetava parameetrina kemoluminestsentsi. Kuid üle 1 μM fütoöstrogeeni kontsentratsioonide juures on teadaolevalt saadud luminestsentssignaali, mida ei vahenda retseptorid, vaid mida põhjustab lutsiferaasi reportergeeni üleaktiveerimine (2, 3). Kuigi annuse-vastuse kõver näitab, et ERi süsteemi aktiveerumine toimub väiksematel kontsentratsioonidel, tuleb stabiilse transfektsiooniga ER TA katsesüsteemides hoolitalt uurida suurtel kontsentratsioonidel ilmnevat lutsiferaasi ekspressiooni, mida põhjustavad fütoöstrogeenid või samalaadsed ühendid, mis sarnaselt fütoöstrogeenile tekitavad lutsiferaasi reportergeeni üleaktivatsiooni (1. liide).

Enne käesoleva katsemeetodi regulatiivsel eesmärgil kasutamist tuleks lugeda peatükke „Üldine sissejuhatus“ ja „ER TA katsemeetodi osad“. Käesolevas katsejuhendis kasutatud mõisted ja lühendid on esitatud liites 2.1.

KATSEMEETODI PÕHIMÕTE (VT KA ÜLDIST SISSEJUHATUST)

Katsemeetodit kasutatakse selleks, et tuvastada östrogeeniretseptori seondumist ligandiga. Ligandi seondumise järel translokeerub retseptori-ligandi kompleks tuuma, kus seondub DNA spetsiifiliste vastuselementidega ja transaktiveerib jaanimardika lutsiferaasi reportergeeni, mille tulemusena suureneb ensüüm lutsiferaasi ekspressioon rakus. Lutsiferiin on substraat, mille ensüüm lutsiferaas transformeerib bioluminestsentsiga, mida saab luminomeetriga kvantitatiivselt mõõta. Lutsiferaasi aktiivsust saab kiiresti ja odavalt hinnata paljude müügilolevate katsekomplektidega.

Katsesüsteemi kasutatakse rakuliini hERα-HeLa-9 903, mis on saadud inimese emakakaelakasvajast ja millele on stabiilselt lisatud kaks konstrukti: i) hERαα ekspressiooni konstrukt (kodeerib inimese täispikkusega retseptorit) ja ii) jaanimardika lutsiferaasi reporterkonstrukt, milles on viis vitellogeniini östrogeeni vastuselemendi (ERE) tandemkordust, mida juhib hiire metallotioneiini (MT) promootori TATA-element. Hiire MT TATA geenikonstrukt on osutunud kõige paremini toimivaks ja seetõttu seda enamasti kasutatakse. Sellest tulenevalt saab selle hERα-HeLa-9 903 rakuliiniga mõõta uuritava kemikaali võimet indutseerida lutsiferaasi geeni ekspressiooni hERα-vahendatud transaktivatsiooni.

ERi agonistikatse korral oleneb andmete tõlgendamine sellest, kas uuritava kemikaali indutseeritud maksimaalse vastuse tase on suurem või võrdne 10 %-ga positiivse kontrollaine (PC) 17β-östradiooli (E2) maksimaalselt indutseeriva kontsentratsiooniga (1 nM) indutseeritud vastuse tasemest (st PC10-ga). ERi antagonistikatse korral oleneb andmete tõlgendamine sellest, kas vastuse toime on vähemalt 30 % väiksem kui vastus, mille indutseeris mittetsütotoksiline kontrollproov, kuhu oli lisatud võrdlusainet (25 pM E2). Andmete analüüsimist ja tõlgendamist on üksikasjalikult kirjeldatud punktides 34–48.

METOODIKA

Rakuliinid

Katsemeetodiga tuleks kasutada stabiilse transfektsiooniga hERα-HeLa-9 903 rakuliini. Seda rakuliini saab osta Jaapani teadusbioressursside kogu (Japanese Collection of Research Bioresources, JCRB) rakupangast (61) materjali üleandmise lepingu (Material Transfer Agreement, MTA) allakirjutamisel.

Katsete tegemisel tohib kasutada üksnes mükoplasmavabu rakke. Mükoplasmainfektsiooni tuvastamiseks on sobiv tundlik meetod RT-PCR-meetod (polümeraasiahela reaktsioon reaalajas) (4, 5, 6).

Rakuliini stabiilsus

Rakuliini stabiilsuse jälgimiseks tuleks agonistikatse korral kasutada etalonainetena E2, 17α-östradiooli, 17α-metüültestosterooni ja kortikosterooni ning kontrollida kogu kontsentratsiooni-vastuse kõverat tabelis 1 esitatud uuritavate kontsentratsioonide vahemikus vähemalt üks kord iga kord, kui katsemeetodit kasutatakse; tulemused peavad langema kokku tabelis 1 esitatud tulemustega.

10.

Antagonistikatse korral tuleks iga katsega paralleelselt kontrollida kahe etalonaine, tamoksüfeeni ja flutamiidi täielikke kontsentratsioonikõveraid. Jälgida tuleb nende kahe kemikaali korrektset positiivseks või negatiivseks klassifitseerimist.

Rakkude kasvatamine ja plaadile kandmise tingimused

11.

Rakke tuleb hoida ilma fenoolpunaseta Eagle'i essentsiaalses minimaalsöötmes (EMEM), millele on lisatud 60 mg/l of antibiootikumi kanamütsiini ja 10 % dekstraankattega aktiivsöega töödeldud veiselooteseerumit (DCC-FBS), in a CO2-inkubaatoris (5 % CO2) temperatuuril 37±1 °C. 75–90 % konfluentsuse saavutamisel võib rakud ümber külvata, lisades 100 mm Petri tassi 10 ml rakukultuuri tihedusega 0,4 × 105 – 1 × 105 rakku/ml. Rakud suspendeeritakse 10 % FBS-EMEMiga (sama mis DCC-FBSiga EMEM) ning külvatakse mikroplaadi süvenditesse tihedusega 1 × 104 rakku/(100 μl × süvend). Järgmiseks inkubeeritakse rakke 5 % CO2 inkubaatoris temperatuuril 37±1 °C kolme tunni jooksul enne kemikaaliga kokku puutumist. Plasttarvikud ei tohi ilmutada östrogeenset toimet.

12.

Vastuse usaldusväärsuse säilitamiseks tuleks rakke kasvatada külmutatud varudest konditsioneeritud söötmes rohkem kui ühe passaaži võrra, kuid mitte üle 40 passaaži. hERα-HeLa-9 903 rakuliini puhul kestab see alla kolme kuu. Rakkude toimivus võib väheneda, kui neid kasvatatakse ebasobivates kasvutingimustes.

13.

DCC-FBSi võib valmistada liites 2.2 esitatud kirjelduse järgi või hankida kaubandusest.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

ERi agonistikatses kasutatavad positiivsed ja negatiivsed etalonained

14.

Enne uuringut ja selle ajal tuleb kontrollida katsesüsteemi reageerimisvõimet, kasutades asjakohastes kontsentratsioonides tugevat östrogeeni (E2), nõrka östrogeeni (17α-östradiooli), väga nõrka agonisti (17α-metüültestosterooni) ja negatiivset ainet (kortikosterooni). Valideerimisuuringus (1) leitud vastuvõetava vahemiku väärtused on esitatud tabelis 1. Nende nelja etalonaine paralleelproovid tuleb lisada igasse katsesse ning saadud tulemused peavad jääma antud vastuvõetavatesse piiridesse. Kui see nii ei ole, siis tuleb kindlaks teha nõuetekohasuse kriteeriumidele mittevastavuse põhjus (kontrollida nt rakkude käitlemist, seerumi ja antibiootikumi kvaliteeti ja kontsentratsiooni) ning analüüsi korrata. Kui nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, on äärmiselt oluline rakkude kasvatamise materjalide ühtlane kasutamine, et tagada EC50, PC50 ja PC10 väärtuste minimaalne varieeruvus. Nelja etalonaine paralleelproovidega,mis lisatakse igasse katsesse (uuritakse samades tingimustes, sealhulgas samade materjalide, rakupassaažide arvu ja tehnikutega), saab kontrollida analüüsi tundlikkust, sest kolme positiivse etalonaine PC10 väärtused peaksid jääma vastuvõetavatesse piiridesse, samuti ka PC50 ja EC50 väärtused, kui neid on võimalik arvutada (vt tabelit 1).

Tabel 1

ERi agonistikatses kasutatava nelja etalonaine vastuvõetava vahemiku väärtused

Nimetus	logPC50	logPC10	logPC50	Hilli kõvera tõus	Uuritav vahemik
17β-östradiool (E2) CASi nr: 50-28-2	–11,4 ~ –10,1	< –11	–11,3 ~ –10,1	0,7 ~ 1,5	10–14 ~ 10–8 M
17α-östradiool CASi nr: 57-91-0	–9,6 ~ –8,1	–10,7 ~ –9,3	–9,6 ~ –8,4	0,9 ~ 2,0	10–12 ~ 10–6 M
Kortikosteroon CASi nr: 50-22-6	—	—	—	—	10–10 ~ 10–4 M
17α-metüültestosteroon CASi nr: 58-18-4	–6,0 ~ –5,1	–8,0 ± –6,2	—	—	10–11 ~ 10–5 M

ERi antagonistikatses kasutatavad positiivsed ja negatiivsed etalonained

15.

Enne uuringut ja selle ajal tuleb kontrollida katsesüsteemi reageerimisvõimet, kasutades asjakohastes kontsentratsioonides positiivset ainet (tamoksüfeeni) ja negatiivset ainet (flutamiidi). Valideerimisuuringus (1) leitud vastuvõetava vahemiku väärtused on esitatud tabelis 2. Nende kahe etalonaine paralleelproovid tuleb lisada igasse katsesse ning saadud tulemused hinnata õigeks vastavalt kriteeriumidele. Kui seda teha ei saa, siis tuleb kindlaks teha kriteeriumidele mittevastavuse põhjus (kontrollida nt rakkude käitlemist, seerumi ja antibiootikumi kvaliteeti ja kontsentratsiooni) ning analüüsi korrata. Peale selle tuleb arvutada positiivse aine (tamoksüfeeni) IC50 väärtused ning tulemused peavad jääma esitatud vastuvõetavatesse piiridesse. Kui nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, on äärmiselt oluline rakkude kasvatamise materjalide ühtlane kasutamine, et tagada IC50 väärtuste minimaalne varieeruvus. Kahe etalonaine paralleelproovidega, mis lisatakse igasse katsesse (uuritakse samades tingimustes, sealhulgas samade materjalide, rakupassaažide arvu ja tehnikutega), saab kontrollida analüüsi tundlikkust (vt tabelit 2).

Tabel 2

ERi antagonistikatses kasutatava kahe etalonaine kriteeriumid ja vastuvõetava vahemiku väärtused

Nimetus	Kriteeriumid	LogIC50	Uuritav vahemik
Tamoksüfeen CASi nr: 10 540 -29-1	Positiivne: arvutada tuleb IC50	–5,942 ~ –7,596	10–10 ~ 10–5 M
Flutamiid CASi nr: 13 311 -84-7	Negatiivne: IC30 ei pea arvutama	—	10–10 ~ 10–5 M

Positiivne kontrollproov ja kandeaine kontrollproov

16.

ERi agonistikatses kasutatavast positiivsest kontrollainest (1 nM E2) ja ERi antagonistikatses kasutatavast positiivsest kontrollainest (10 μM TAM) tuleb igale plaadile lisada vähemalt kolm paralleelproovi. Uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatavast kandeainest tuleb igale plaadile lisada vähemalt kolm paralleelproovi. Kui positiivse kontrollaine lahustamiseks kasutatakse muud kandeainet, kui seda, milles lahustatakse uuritav kemikaal, tuleb positiivsete kontrollproovidega samale plaadile lisada kolm paralleelproovi ka teisest kandeainest.

ERi agonistikatse kvaliteedi kriteeriumid

17.

Positiivse kontrollainega (1 nM E2) saavutatud lutsiferaasi keskmine aktiivsuse peab olema vähemalt neljakordne igal plaadil kandeaine kontrollprooviga saavutatud keskmisega võrreldes. See kriteerium on kindlaks määratud valideerimisuuringus leitud näitajate väärtustega (aja jooksul mõõdetud 4- kuni 30-kordsed).

18.

Katsemeetodi kvaliteedikontrolli seisukohast peaks positiivse kontrollproovi (1 nM E2) PC10 väärtusele vastav kordne induktsioon olema suurem kui 1+2 SD kandeaine kontrollproovi kordse induktsiooni väärtusest (= 1). Prioriseerimise eesmärgil võib PC10 väärtus olla kasulik andmete vajalik analüüsimise hõlbustamiseks statistilise analüüsiga võrreldes. Kuigi statistiline analüüs annab teavet olulisuse kohta, ei ole niisugune analüüs kvantitatiivne parameeter kontsentratsioonil põhineva võimaliku toime puhul ega ole seega prioriseerimise seisukohast nii kasulik.

ERi antagonistikatse kvaliteedi kriteeriumid

19.

Kontrollproovi lisatud ainega (25 pM E2) saavutatud lutsiferaasi keskmine aktiivsuse peab olema vähemalt neljakordne igal plaadil kandeaine kontrollprooviga saavutatud keskmisega võrreldes. See kriteerium on kindlaks määratud valideerimisuuringus leitud näitajate väärtustega.

20.

Katsemeetodi kvaliteedikontrolli seisukohast peaks 1 nM E2 suhteline transkriptsiooni aktivatsioon (RTA) olema üle 100 %, 1 μM 4-hüdroksütamoksüfeeni (OHT) RTA alla 40,6 % ja 100 μM digitoniini (Dig) RTA alla 0 %.

Labori pädevuse tõendamine (vt käesoleva katsemeetodi jaotise „ER TA katsemeetodi osad“ punkti 14 ning tabeleid 3 ja 4).

Kandeaine

21.

Kandeaine kontrollprooviks tuleks kasutada dimetüülsulfoksiidi (DMSO) või asjakohast lahustit samas kontsentratsiooni, nagu seda kasutatakse erinevates positiivsetes ja negatiivsetes kontrollproovides ja uuritavate kemikaalide proovides. Uuritavad kemikaalid tuleb lahustada lahustis, milles nad lahustuvad ja mis on võimeline segunema rakkude söötmega. Sobivad kandeained on vesi, etanool (puhtusega 95–100 %) ja DMSO. Kui kasutatakse DMSOd, ei tohi selle kontsentratsioon ületada 0,1 mahuprotsenti. Mis tahes kandeaine korral tuleb tõendada, et maksimaalne kasutatav kogus ei ole tsütotoksiline ega sega analüüsimeetodi toimivust.

Uuritavate kemikaalide ettevalmistamine

22.

Üldiselt tuleks kemikaalid lahustada DMSOs või muus sobivas lahustis ning seejärel lahjendada sama lahustiga tavapärases vahekorras 1: 10, et saada lahused söötmega lahjendamiseks.

Lahustuvus ja tsütotoksilisus: vahemiku leidmise kaalutlused

23.

Uuritava kemikaali sobiva kontsentratsioonivahemiku määramiseks ning kontrollimiseks, kas uuritava kemikaali puhul võib tekkida probleeme lahustuvuse või tsütotoksilisusega, tuleb teha eelkatse. Kõigepealt uuritakse kemikaale maksimaalse kontsentratsiooniga kuni 1 μl/ml, 1 mg/ml või 1 mM olenevalt sellest, milline on väikseim. Olenevalt eelkatse täheldatud tsütotoksilisuse ulatusest või lahustuvuse puudumisest uuritakse esimeses põhikatses kemikaali 10-kordsete lahjenduste seerias alates maksimaalsest vastuvõetavast kontsentratsioonist (nt 1 mM, 100 μM, 10 μM jne) ning dokumenteeritakse täheldatav hägusus, sade või tsütotoksilisus. Teises ja vajaduse korral ka kolmandas katses tuleks kontsentratsioone sobivalt kohandada, nii et oleks võimalik paremini iseloomustada kontsentratsiooni-vastuse kõverat ning vältida kontsentratsioone, mille juures lahustuvus puudus või mis indutseerisid liigset tsütotoksilisust.

24.

ERi agonistide ja antagonistide korral võib suurenenud tsütotoksilisus tüüpilist sigmoidset vastust oluliselt moonutada või summutada ning seda tuleks andmete tõlgendamisel arvesse võtta. Kasutada tuleks tsütotoksilisuse uurimismeetodeid, millega on võimalik saada teavet 80 % rakkude eluvõimelisuse kohta, kasutades labori kogemuste põhinevat asjakohast katset.

25.

Kui tsütotoksilisuse katse tulemus näitab, et uuritava kemikaali kontsentratsioon on rakkude arvu vähendanud 20 % või rohkem, tuleb see kontsentratsioon lugeda tsütotoksiliseks ning tsütotoksilise kontsentratsiooni lähedased ja sellest kõrgemad kontsentratsioonid tuleb hindamisest välja jätta.

Kemikaaliga kokkupuude ja analüüsiplaadi jaotus

26.

Kemikaali lahjendamise (1. ja 2. etapp) ning rakkudega kokkupuute (3. etapp) saab läbi viia järgmiselt.

1. etapp: igast uuritavast kemikaalist tehakse DMSO või sobiva lahustiga lahjenduste seeria ning lisatakse need mikroplaadi süvenditesse, et saada vahemiku leidmise eelkatses määratud lõplik lahjenduste seeria (tavaliselt on seerias nt kontsentratsioonid 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM ja 10 pM (10–3 – 10–11 M)) kolme paralleelprooviga.

2. etapp: kemikaali lahjendamine: kõigepealt lahjendada 1,5 μl uuritavat kemikaali lahust nii, et saadakse 500 μl söödet.

3. etapp: rakkude kokkupuude kemikaaliga: lisada 50 μl söötmes lahust (valmistati 2. etapis) analüüsisüvendis, mis sisaldab 104 rakku/100 μl/süvend.

Igas süvendis on söötme soovitatav lõplik ruumala 150 μl. Uuritavad proovid ja etalonained võib paigutada nii, nagu näidatud tabelites 3 ja 4.

Tabel 3

Etalonainete eri kontsentratsioonidega proovide mikroplaadile paigutamise näide ERi agonistikatse puhul.

Rida

17α-metüültestosteroon

Kortikosteroon

17α-östradiool

Konts. 1 (10 μM)

→

100 μM

→

1 μM

→

10 nM

→

Konts. 2 (1 μM)

→

10 μM

→

100 nM

→

1 nM

→

Konts. 3 (100 nM)

→

1 μM

→

10 nM

→

100 pM

→

Konts. 4 (10 nM)

→

100 nM

→

1 nM

→

10 pM

→

Konts. 5 (1 nM)

→

10 nM

→

100 pM

→

1 pM

→

Konts. 6 (100 pM)

→

1 nM

→

10 pM

→

0,1 pM

→

Konts. 7 (10 pM)

→

100 pM

→

1 pM

→

0,01 pM

→

VC: kandeaine kontrollproov (0,1 % DMSO); PC: positiivne kontrollproov (1 nM E2)

27.

Etalonaineid (E2, 17α-östradiool, 17α-metüültestosteroon ja kortikosteroon) tuleb analüüsida iga katse käigus (tabel 3). Igal uuritaval plaadil peavad olema süvendid positiivse kontrollprooviga (1 nM E2), mis on võimeline esile kutsuma E2 maksimaalse vastuse, ja kandeaine kontrollprooviga (DMSO või sobiv lahusti). Kui sama katse käigus kasutatakse eri allikatest pärit rakke (nt erineva passaažide arvuga, eri partiidest pärit vms), tuleb etalonaineid analüüsida iga päritoluga rakkudega.

Tabel 4

Eri kontsentratsioonidega uuritava kemikaali ja kontrollproovide mikroplaadile paigutamise näide ERi agonistikatse puhul.

Rida

Uuritav kemikaal 1

Uuritav kemikaal 2

Uuritav kemikaal 3

Uuritav kemikaal 4

Konts. 1 (10 μM)

→

1 mM

→

1 μM

→

10 nM

→

Konts. 2 (1 μM)

→

100 μM

→

100 nM

→

1 nM

→

Konts. 3 (100 nM)

→

10 μM

→

10 nM

→

100 pM

→

Konts. 4 (10 nM)

→

1 μM

→

1 nM

→

10 pM

→

Konts. 5 (1 nM)

→

100 nM

→

100 pM

→

1 pM

→

Konts. 6 (100 pM)

→

10 nM

→

10 pM

→

0,1 pM

→

Konts. 7 (10 pM)

→

1 nM

→

1 pM

→

0,01 pM

→

VC: kandeaine kontrollproov (0,1 % DMSO); PC: positiivne kontrollproov (1 nM E2)

Tabel 5

Etalonainete eri kontsentratsioonidega proovide mikroplaadile paigutamise näide ERi antagonistikatse puhul

28.

Selleks, et hinnata kemikaalide antagonistlikku toimet, tuleb ridades A kuni G olevatesse süvenditesse lisada 25 pM E2. Etalonaineid (tamoksüfeen ja flutamiid) tuleb analüüsida iga katse käigus. Igal katses analüüsitaval plaadil peaks olema positiivsete kontrollproovidega süvendid (töödeldud 1 nM E2ga, millega saab kontrollida hERα-HeLa-9 903 rakuliini kvaliteeti), kandeaine kontrollproovidega süvendid (töödeldud DMSO või sobiva lahustiga), 0,1 % DMSOga süvendid, kuhu lisatakse veel E2 (rikastatud kontrollproov), lõplikus kontsentratsioonis 1 μM OHTga töödeldud süvendid ja 100 μM digitoniiniga töödeldud süvendid (tabel 5). Järgmisel analüüsitaval plaadil peaks olema sama paigutus ilma etalonaineteta (tabel 6). Kui sama katse käigus kasutatakse eri allikatest pärit rakke (nt erineva passaažide arvuga, eri partiidest pärit vms), tuleb etalonaineid analüüsida iga päritoluga rakkudega.

Tabel 6

Eri kontsentratsioonidega uuritava kemikaali ja kontrollproovide mikroplaadile paigutamise näide ERi antagonistikatse puhul

29.

Vajadust mööda tuleb kinnitada ääreefektide puudumist, kuid kui on ääreefektide kahtlus, tuleks plaadi paigutust muuta nii, et neid efekte saaks vältida. Näiteks võib proovide paigutamisel plaadile äärmised süvendid kasutamata jätta.

30.

Pärast kemikaalide lisamist inkubeeritakse analüüsitavaid plaate 5 % CO2 inkubaatoris temperatuuril 37±1 °C 20–24 tunni jooksul, et indutseerida reportergeeni produkte.

31.

Väga lenduvate ühendite korral tuleb rakendada eritingimusi. Sellisel juhul võivad lähedalasuvate süvendites kontrollproovid anda valepositiivseid tulemusi, mida tuleb eeldatavate ja aja jooksul kogutud kontrollväärtuse puhul arvesse võtta. Mõnel juhul, kui lenduvus võib olla probleemiks, võib kasutada kilekatteid, mis tõhusalt eraldavad üksikud süvendid katse läbiviimise ajaks ja mille kasutamine on seetõttu sellistel juhtudel soovitatav.

32.

Sõltumatuse tagamiseks tuleb sama kemikaaliga korduskatsed läbi viia eri päevadel.

Lutsiferaasi mõõtmine

33.

Kui nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, võib mõõtmiseks kasutada müügilolevat lutsiferaasi analüüsireagenti [nt Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega, E2510, või samaväärne)] või standardset lutsiferaasi analüüsisüsteemi (nt Promega, E1500 või samaväärne). Analüüsireagendid tuleb valida kasutatava luminomeetri tundlikkusest lähtuvalt. Standardset lutsiferaasi analüüsisüsteemi kasutades tuleks enne substraadi lisamist kasutada rakukultuuri lüüsimise reagenti (nt Promega, E1531 või samaväärne). Lutsiferaasi analüüsireagenti tuleb kasutada vastavalt tootja juhistele.

ANDMEANALÜÜS

ERi agonistikatse

34.

ERi agonistikatse korral tuleb positiivse kontrollaine (1 nM E2) suhtelise transkriptsiooni aktiivsuse leidmiseks analüüsida sama plaadi luminestsentssignaale, järgides järgmisi etappe (ka muud matemaatilised võtted on lubatud):

1. etapp. Arvutada kandeaine kontrollproovi keskväärtus.

2. etapp. Andmete normaliseerimiseks lahutada kandeaine kontrollproovi keskväärtus iga süvendi puhul saadud väärtusest.

3. etapp. Arvutada normaliseeritud positiivse kontrollproovi keskväärtus.

4. etapp. Jagada plaadi iga süvendi normaliseeritud väärtus normaliseeritud positiivse kontrollproovi keskväärtusega (PC = 100 %).

Viimane iga süvendi kohta saadu väärtus on kõnealuse süvendi suhteline transkriptsiooni aktiivsus positiivse kontrollproovi vastusega võrreldes.

5. etapp. Arvutada uuritava kemikaali iga kontsentratsioonirühma suhteliste transkriptsiooni aktiivsuste keskväärtus. Vastusega on seotud kaks mõõdet: keskmine transkriptsiooni aktiivsus (vastus) ja kontsentratsioon, mille juures vastus ilmneb (vt järgmist jaotist).

Kaalutlused EC50, PC50 ja PC10 induktsiooni kohta

35.

EC50 arvutamiseks on nõutav täielik kontsentratsiooni-vastuse kõver, kuid alati ei ole seda võimalik koostada või ei ole see praktiline uuritavast kontsentratsioonivahemikust tulenevate piirangute tõttu (nt tsütotoksilisus või probleemid lahustuvusega). EC50 ja maksimaalne induktsioonitase (mis vastab Hilli võrrandi suurimale väärtusele) on informatiivsed parameetrid, mida võimaluse korral tuleks dokumenteerida. EC50 ja maksimaalse induktsioonitaseme arvutamiseks tuleks kasutada asjakohast statistikatarkvara (nt Graphpad Prism). Kui Hilli logistiline võrrand on kontsentratsiooni-vastuse andmetele rakendatav, tuleks EC50 arvutada järgmise valemi alusel (7):

Y = alumine + (ülemine – alumine) / (1+10 exp ((log EC50 –X) × Hilli tõus)), kus:

X on logaritm kontsentratsioonist ning

Y on vastus, mis algab sigmoidse kõvera alumiselt platoolt ja liigub ülemise platooni. Alumiseks platooks on Hilli logistilises võrrandis võetud null.

36.

Iga uuritava kemikaali kohta peavad olema esitatud järgmised andmed:

RPCmax, mis on uuritava kemikaali indutseeritud maksimaalne vastus, väljendatuna protsendina 1 nM E2 indutseeritud vastusest samal plaadil, samuti PCmax (RPCmax-ga seotud kontsentratsioon) ning

positiivsete kemikaalide korral indutseerivad kontsentratsioonid PC10 ja, kui see on asjakohane, siis PC50.

37.

PCx väärtuse saab arvutada, interpoleerides kahe punkti x- ja y-koordinaadi vahel, kusjuures üks neist punktidest on vahetult all- ja teine vahetult ülalpool PCx väärtust. Vahetult all- ja ülalpool PCx väärtust olevate andmepunktide koordinaatide (vastavalt (a,b) ja (c,d)) alusel saab järgmise valemi abil arvutada PCx väärtuse:

log[PCx] = log[c]+(x–d)/(d–b)

38.

PC väärtusi kirjeldatakse allpool joonisel 1.

Joonis 1

Näide PC väärtuste arvutamisest. PC (1 nM E2) on lisatud igale analüüsitavale plaadile.

ERi antagonistikatse

39.

ERi antagonistikatse korral tuleb positiivse kontrollaine (25 nM E2) suhtelise transkriptsiooni aktiivsuse (rikastatud kontrollproovi suhtes, 25 pM E2) leidmiseks analüüsida sama plaadi luminestsentssignaale, järgides järgmisi etappe (ka muud matemaatilised võtted on lubatud):

1. etapp. Arvutada kandeaine kontrollproovi keskväärtus.

2. etapp. Andmete normaliseerimiseks lahutada kandeaine kontrollproovi keskväärtus iga süvendi puhul saadud väärtusest. 3. etapp. Arvutada normaliseeritud rikastatud kontrollproovi keskväärtus.

4. etapp. Jagada plaadi iga süvendi normaliseeritud väärtus normaliseeritud rikastatud kontrollproovi keskväärtusega (rikastatud kontrollproov = 100 %).

Viimane iga süvendi kohta saadu väärtus on kõnealuse süvendi suhteline transkriptsiooni aktiivsus rikastatud kontrollproovi vastusega võrreldes.

5. etapp. Arvutada iga töötluse kohta suhteliste transkriptsiooni aktiivsuste keskväärtus.

Kaalutlused IC30 ja IC50 induktsiooni kohta

40.

Positiivsete kemikaalide korral tuleb esitada indutseerivad kontsentratsioonid IC30 ja, kui see on asjakohane, siis IC50.

41.

ICx väärtuse saab arvutada, interpoleerides kahe punkti x- ja y-koordinaadi vahel, kusjuures üks neist punktidest on vahetult all- ja teine vahetult ülalpool ICx väärtust. Vahetult all- ja ülalpool ICx väärtust olevate andmepunktide koordinaatide (vastavalt (a,b) ja (c,d)) alusel saab järgmise valemi abil arvutada PCx väärtuse:

lin ICx = a–(b–(100–x)) (a–c) /(b–d)

Joonis 2

Näide IC väärtuste arvutamisest. Rikastatud kontrollproov (25 pM E2) on lisatud igale analüüsitavale plaadile

RTA: suhteline transkriptsiooni aktiivsus.

42.

Tulemused peavad põhinema kahel (või kolmel) sõltumatul katsel. Kui kaks katset annavad võrreldavad ja seega korratavad tulemused, ei ole kolmandat katset vaja teha. Selleks, et olla vastuvõetavad, peavad tulemused:

—	vastama nõuetekohasuse kriteeriumidele (vt nõuetekohasuse kriteeriumid punktides 14–20),

—	olema korratavad.

Andmete tõlgendamise kriteeriumid

Tabel 7

Positiivseks ja negatiivseks klassifitseerimise otsuse kriteeriumid ERi agonistikatse korral

Positiivne	Kui leitud RPCmax on suurem kui 10 % positiivse kontrollprooviga vähemalt kahel katsel kahest või kolmest saadud vastusest või sellega võrdne.
Negatiivne	Kui leitud RPCmax ei ole vähemalt 10 % positiivse kontrollprooviga vähemalt kahel katsel kahest või kolmest saadud vastusest.

Tabel 8

Positiivseks ja negatiivseks klassifitseerimise otsuse kriteeriumid ERi antagonistikatse korral

Positiivne	Kui vähemalt kahel katsel kahest või kolmest on võimalik arvutada IC30.
Negatiivne	Kui vähemalt kahel katsel kahest või kolmest ei ole võimalik IC30 arvutada.

43.

Andmete tõlgendamise kriteeriumid on esitatud tabelites 7 ja 8. Positiivset tulemust iseloomustatakse nii toime suurusjärgu kui ka kontsentratsiooniga, mille juures toime avaldub. Selleks võib tulemusi väljendada kontsentratsioonina, mille juures agonistikatses saadakse 50 % (PC50) või 10 % (PC10) positiivse kontrollproovi väärtustest ning antagonistikatses 50 % (IC50) või 30 % (IC30) rikastatud kontrollproovi väärtustest. Uuritav kemikaal määratakse siiski positiivseks, kui tema maksimaalne indutseeritud vastus (RPCmax) on suurem kui 10 % positiivse kontrollprooviga vähemalt kahel katsel kahest või kolmest saadud vastusest või sellega võrdne, ning uuritav kemikaal loetakse negatiivseks, kui RPCmax jääb vähemalt kahel katsel kahest või kolmest alla 10 % positiivse kontrollprooviga saadud vastusest.

44.

ERi agonistikatse PC10, PC50 ja PCmax ning ERi antagonistikatse IC30 ja IC50 arvutused võib teha OECD avalikul veebisaidil (62) katsejuhendi juures leitava arvutustabeli abil.

45.

On piisav, kui PC10 või PC50 ja IC30 või IC50 väärtused saadakse vähemalt kaks korda. Kuid kui sama kontsentratsioonivahemiku andmete baasjoon on varieeruv ning vastuvõetamatult suure variatsioonikordajaga (CV, %), võidakse andmed lugeda ebausaldusväärseks ning suure varieeruvuse põhjus tuleb kindlaks teha. PC10 arvutamiseks kasutatavate andmepunktide andmed, mida saadakse kolmest paralleelkatsest (st luminestsentsi intensiivsuse andmed), peavad olema variatsioonikordajaga alla 20 %.

46.

Nõuetekohasuse kriteeriumide täitmine näitab, et katsesüsteem toimib korrektselt, kuid see ei taga täpsete andmete saamist mis tahes konkreetsel katsel. Esimese katse tulemuste kordamine on parim võimalus tagada täpsete andmete saamine.

47.

Kui tegemist on ERi agonistikatsega, kus lisaks sõelumise ja prioriseerimise eesmärgile on nõutav täiendav teave, on positiivsete uuritavate kemikaalide puhul, eriti nende puhul, mille PC väärtus on 10–49 %, samuti kemikaalide puhul, mida kahtlustatakse olevat lutsiferaasi ülestimuleerijad, võimalik ERα antagonisti kasutades kinnitada, et tähendatud lutsiferaasi aktiivsus on üksnes ERα-spetsiifiline vastus (vt liide 2.1).

KATSEPROTOKOLL

48.

Vt punkti 20 jaotises „ER TA katsemeetodi osad“.

KIRJANDUS

(1)	OECD (2015), „Report of the Inter-Laboratory Validation for Stably Transfected Transactivation Assay to detect Estrogenic and Anti-estrogenic Activity“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 225), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(2)	Escande, A. et al. (2006), „Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta“, Biochem. Pharmacol., nr 71, lk 1 459–1 469.

(3)	Kuiper, G. G., et al. (1998), „Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor Beta“, Endocrinol., nr 139, 4 252–4 263.

(4)	Spaepen, M., et al. (1992), „Detection of Bacterial and Mycoplasma Contamination in Cell Cultures by Polymerase Chain Reaction“, FEMS Microbiol. Lett., nr 78(1), lk 89–94.

(5)	Kobayashi, H., et al. (1995), „Rapid Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Cultures by Enzymatic Detection of Polymerase Chain Reaction (PCR) Products“, J. Vet. Med. Sci., nr 57(4), lk 769–71.

(6)	Dussurget, O. ja Roulland-Dussoix, D. (1994), „Rapid, Sensitive PCR-Based Detection of Mycoplasmas in Simulated Samples of Animal Sera“, Appl. Environ. Microbiol., nr 60(3), lk 953–9.

(7)	De Lean, A., Munson, P. J. ja Rodbard, D. (1978), „Simultaneous Analysis of Families of Sigmoidal Curves: Application to Bioassay, Radioligand Assay, and Physiological Dose-Response Curves“, Am. J. Physiol., nr 235, lk E97–E102.

Liide 2.1

VALEPOSITIIVSED TULEMUSED: NENDE LUMINESTSENTSSIGNAALIDE HINDAMINE, MIDA RETSEPTORID EI VAHENDA

ERi agonistikatse valepositiivsed tulemused võivad olla põhjustatud lutsiferaasigeeni aktivatsioonist, mida ei vahenda ER, või geeniprodukti otsesest aktivatsioonist või sõltumatust fluorestsentsist. Selliseid mõjusid kajastab mittetäielik või ebahariliku kujuga annuse-vastuse kõver. Kui esineb selliste mõjude kahtlus, tuleks uurida ERi antagonisti (nt 4-hüdroksütamoksüfeen (OHT) mittetoksilises kontsentratsioonis) mõju vastusele. Puhas antagonist ICI 1827 80 ei pruugi selleks otstarbeks sobida, sest piisavas kontsentratsioonis võib ICI 1827 80 kandeaine kontrollprooviga saadud väärtust vähendada, mis omakorda mõjutab andmete analüüsi.

Selle lähenemisviisi nõuetekohasuse tagamiseks tuleb samal plaadil analüüsida järgmist:

—	tundmatu kemikaali agonistlik toime koos 10 μM OHTga ja ilma selleta;

—	kandeaine kontrollproov (kolm proovi);

—	OHT (kolm proovi);

—	1 nM E2 (kolm proovi), agonisti positiivne kontrollproov;

—	1 nM E2 + OHT (kolm proovi).

Andmete tõlgendamise kriteeriumid

Märkus: Kõigis süvendites olevaid proove tuleb töödelda samas kontsentratsioonis kandeainega.

—	Kui ERi antagonistiga töötlemine ei mõjuta tundmatu kemikaali agonistlikku toimet, klassifitseeritakse tundmatu kemikaal negatiivseks.

—	Kui tundmatu kemikaali agonistlik toime täielikult pärsitakse, rakendada otsustuskriteeriume.

—

Kui madalaima kontsentratsiooni juures on agonistlik toime suurem kui PC10 saadud vastus või sellega võrdne, siis on tundmatu kemikaal inhibeeritud PC10 saadud vastusega võrdselt või rohkem. Arvutatakse ERiga töödeldud ja töötlemata süvendites saadud vastuste vahe, mida käsitletakse tõese vastusena ja kasutatakse asjakohaste parameetrite arvutamisel, mis võimaldavad teha otsuse klassifitseerimise kohta.

Andmete analüüs

Kontrollida toimivusnõudeid.

Kontrollida samades tingimustes töödeldud süvendites saadud tulemuste variatsioonikordajaid.

1.	Arvutada kandeaine kontrollproovi keskväärtus.

2.	Lahutada kandeaine kontrollproovi keskväärtus igas niisuguses süvendis saadud väärtusest, mida ei ole OHTga töödeldud.

3.	Arvutada OHTga saadud tulemuste keskväärtus.

4.	Lahutada kandeaine kontrollproovi keskväärtus igas OHTga töödeldud süvendis saadud väärtusest.

5.	Arvutada positiivse kontrollproovi keskväärtus.

6.	Arvutada kõigi teiste süvendite suhteline transkriptsiooni aktiivsus positiivse kontrollprooviga võrreldes.

Liide 2.2

DEKSTRAANIGA KAETUD AKTIIVSÖEGA (DCC) TÖÖDELDUD SEERUMI VALMISTAMINE

Seerumi töötlemine dekstraaniga kaetud aktiivsöega (DCC) on levinud meetod rakkudes söötmesse lisatavast seerumist östrogeensete komponentide eemaldamiseks, et vältida vastuse nihet seoses seerumis sisalduvate jääköstrogeenidega. Seda metoodikat järgides saab töödelda 500 ml veiselooteseerumit (FBS).

Osad

Vaja läheb järgmisi materjale ja seadmeid.

Materjalid

Aktiivsüsi

Dekstraan

Magneesiumkloriidheksahüdraat, (MgCl2· 6H2O)

Sahharoos

1 M HEPES-puhverlahus (pH 7,4)

Filtrisüsteemist saadud ülipuhas vesi

Seadmed

Autoklaavitud klaasanum (suurus valitakse vajaduse järgi) Harilik laboritsentrifuug (mille temperatuuriks saab seada 4 °C)

Töö käik

Allpool kirjeldatud toimingud sobivad kasutamiseks 50 ml tsentrifuugianumatega.

[1. päev] Valmistada dekstraankattega aktiivsöe suspensioon 1 l ülipuhta veega, mis sisaldab 1,5 mM MgCl2, 0,25 M sahharoosi, 2,5 g aktiivsütt, 0,25 g dekstraani ja 5 mM HEPES-puhvrit, ning segada seda 4 °C juures üleöö.

[2. päev] Jaotada suspensioon 50 ml tsentrifuugianumatesse ja tsentrifuugida kiirusel 10 000 p/min 4 °C juures 10 minutit. Eemaldada supernatant ja säilitada pool söesadet 4 °C juures 3. päeval kasutamiseks. Teine pool söest suspendeerida FBSis, mis on sadenemise vältimiseks aeglaselt sulatatud ning 30 minuti jooksul 56 °C juures inaktiveeritud, seejärel viia suspensioon autoklaavitud klaasnõusse, näiteks koonilisse kolbi. Segada suspensiooni aeglaselt 4 °C juures üleöö.

[3. päev] Jaotada FBSis valmistatud suspensioon tsentrifuugianumatesse ja tsentrifuugida kiirusel 10 000 p/min 4 °C juures 10 minutit. Koguda FBS kokku ja viia uude söesademesse, mis valmistati 2. päeval. Suspendeerida söesade ja segada saadud suspensiooni aeglaselt autoklaavitud klaasnõus 4 °C juures üleöö.

[4. päev] Jaotada suspensiooni tsentrifuugianumatesse ja tsentrifuugida kiirusel 10 000 p/min 4 °C juures 10 minutit, seejärel steriliseerida supernatant läbi 0,2 μm steriilse filtri filtrimise teel. Seda DCCga töödeldud FBSi tuleb säilitada -20 °C juures ja see tuleb ära kasutada ühe aasta jooksul.

3. Liide

VM7LUC ÖSTROGEENIRETSEPTORITE TRANSAKTIVATSIOONI KATSEMEETOD, MILLEGA TEHAKSE KINDLAKS ÖSTROGEENIRETSEPTORI AGONISTID JA ANTAGONISTID

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD (VT KA ÜLDIST SISSEJUHATUST)

Selle katsemeetodiga kasutatakse rakuliini VM7Luc4E2 (63). Selle on valideerinud Ameerika Ühendriikide riikliku toksikoloogiaprogrammi alternatiivsete toksikoloogiameetodite ametitevaheline keskus (National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, NICEATM) ja alternatiivmeetodite valideerimise ametitevaheline koordineerimiskomitee (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) (1). VM7Luc-rakuliinid ekspresseerivad valdavalt endogeenset ERα-d ja vähesel määral endogeenset ERβ-d (2, 3, 4).

See katsemeetod sobib paljude ainete uurimiseks eeldusel, et neid saab lahustada dimetüülsulfoksiidis (DMSO, CASi nr 67-68-5), need ei reageeri DMSOga ega rakkude söötmega ega ole uuritavate kontsentratsioonide juures tsütotoksilised. Kui DMSOd ei saa kasutada, võib kasutada muud kandeainet, näiteks etanooli või vett (vt punkt 12). VM7Luc ER TA (ant)agonistikatse tõendatud toimivus lubab oletada, et käesoleva katsemeetodiga saadud andmed võivad anda teavet ERi vahendatud toimemehhanismide kohta ning tuleks kaaluda nende kasutamist ainete prioriseerimiseks edasise uurimise eesmärgil.

See katsemeetod on välja töötatud spetsiaalselt hERα ja hERß vahendatud transaktivatsiooni tuvastamiseks, kasutades mõõdetava parameetrina kemoluminestsentsi. Kemoluminestsentsi kasutamine biokatsetes on laialt levinud, sest luminestsentsil on suur signaali-müra suhe. Jaanimardika lutsiferaasi aktiivsust võivad rakupõhistes katsetes segada ained, mis inhibeerivad lutsiferaasi ensüümi, põhjustades kas näilist inhibitsiooni või suurenenud luminestsentsi valgu stabiliseerimise tõttu. Peale selle on mõnede lutsiferaasipõhiste ERi reportergeeni uurivate katsemeetoditega üle 1 μM fütoöstrogeeni kontsentratsioonide juures teadaolevalt saadud luminestsentssignaali, mida ei vahenda retseptorid, vaid mida põhjustab lutsiferaasi reportergeeni üleaktiveerimine. Kuigi annuse-vastuse kõver näitab, et ERi süsteemi aktiveerumine toimub väiksematel kontsentratsioonidel, tuleb stabiilse transfektsiooniga ER TA katsesüsteemides hoolitalt uurida suurtel kontsentratsioonidel ilmnevat lutsiferaasi ekspressiooni, mida põhjustavad fütoöstrogeenid või samalaadsed ühendid, mis sarnaselt fütoöstrogeenile tekitavad lutsiferaasi reportergeeni üleaktivatsiooni.

Enne käesoleva katsemeetodi regulatiivsel eesmärgil kasutamist tuleks lugeda peatükke „Üldine sissejuhatus“ ja „ER TA katsemeetodi osad“. Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted ja lühendid on esitatud 1. liites.

KATSEMEETODI PÕHIMÕTE (VT KA ÜLDIST SISSEJUHATUST)

Katsemeetodit kasutatakse ERi ligandi sidumise kindlakstegemiseks, millele järgneb retseptori-ligandi kompleksi translokatsioon tuuma. Tuumas seondub retseptori-ligandi kompleks spetsiifilise DNA-vastuselemendiga ja transaktiveerib reportergeeni (luc), mille tulemusena tekib lutsiferaas ja valguse eraldumine, mida saab luminomeetriga kvantitatiivselt mõõta. Lutsiferaasi aktiivsust saab kiiresti ja odavalt hinnata paljude müügilolevate komplektidega. VM7Luc ER TA katsemeetodis kasutatakse in vitro ERi agonisti või antagonistina toimivate ainete kindlakstegemiseks inimese rinna adenokartsinoomi ER-tundlikku rakuliini VM7, millele on stabiilselt transfekteeritud jaanimardika luc-reporterkonstrukt, mida kontrollivad neli hiire piimanäärmekasvaja promootorist (MMTV) ülespoole jäävad östrogeeni vastuselementi. MMTV promootor annab ainult vähesel määral ristreaktsioone teiste steroidsete jamittesteroidsete hormoonidega (8). Andmete tõlgendamise kriteeriumeid on üksikasjalikult kirjeldatud punktis 41. Lühidalt öeldes tehakse positiivne vastus kindlaks kontsentratsiooni-vastuse kõvera abil, millel on vähemalt kolm punkti, mille veavahemikud (keskväärtus ± SD) ei kattu, samuti amplituudi muutusena (normeeritud suhtelisi valgusühikuid (RLU) vähemalt 20 % etalonainega (agonistikatse korral 17β-östradiool (E2, CASi nr 50-28-2)), antagonistikatse korral raloksüfeen HCl (Ral, CASi nr 84449-90-1) / E2 saadud maksimumväärtusest).

METOODIKA

Rakuliin

Katsemeetodiga tuleks kasutada stabiilse transfektsiooniga VM7Luc4E2 rakuliini. See rakuliin on praegu saadaval ainult tehnilise litsentsilepingu alusel California Ülikoolist asukohaga Davis, California, USA (64) ja ettevõttest Xenobiotic Detection Systems Inc., asukohaga Durham, North Carolina, USA (65).

Rakuliini stabiilsus

Rakuliini stabiilsuse ja terviklikkuse säilitamiseks tuleks rakke kasvatada külmutatud varudest kultiveerimissöötmes rohkem kui ühe passaaži võrra (vt punkt 9). Rakke ei tohiks kasvatada rohkem kui 30 passaaži. VM7Luc4E2 rakuliini puhul kestavad 30 passaaži kokku ligikaudu 3 kuud.

Rakkude kasvatamine ja plaadile kandmise tingimused

Järgida tuleb rakkude kasvatamise heas tavas (5, 6) esitatud eeskirju, et tagada kõigi materjalide ja meetodite kvaliteet ning säilitada mis tahes tehtava töö terviklikkus, nõuetekohasus ja korratavus.

VM7Luc4E2 rakke hoitakse RPMI 1 640 söötmes, millele on lisatud 0,9 % Pen-Strepi ja 8,0 % veiselooteseerumit (FBS), spetsiaalses koekultuuride inkubaatoris temperatuuril 37 ± 1oC ja 90 ± 5 % niiskuse juures keskkonnas, kus õhk sisaldab 5,0 ± 1 % CO2.

10.

Ligikaudu 80 % konfluentsuse saavutamisel külvatakse VM7Luc4E2 rakud ümber ja lastakse kohaneda östrogeenivaba keskkonnaga 48 tunni jooksul enne nende kandmist 96 süvendiga plaatidele, et neid uuritavate kemikaalidega töödelda ning analüüsida östrogeenist sõltuvat lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni. Östrogeenivaba sööde (EFM) sisaldab Dulbecco modifitseeritud fenoolpunasevaba Eagle’i minimaalsöödet (DMEM), millele on lisatud 4,5 % aktiivsöe/dekstraaniga töödeldud veiselooteseerumit, 1,9 % L-glutamiini ja 0,9 % Pen-Strepi. Ükski plasttarvik ei tohi ilmutada östrogeenset toimet (vt üksikasjalikku juhendit (7))

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

11.

Katse nõuetekohaseks tunnistamise või tagasilükkamise aluseks on kõigi 96 süvendiga plaadil tehtud katsete puhul kasutatud etalonaine ja kontrollproovidega saadud tulemuste hinnang. Iga etalonainet uuritakse mitme eri kontsentratsiooni juures ning iga etalonaine ja kontrollaine kontsentratsiooniga tehakse mitu paralleelproovi. Tulemusi võrreldakse nende kvaliteedikontrolli proovide (QC) parameetritega, mis saadi agonistide ja antagonistide kohtaaja jooksul kogutud andmeid sisaldavatest andmebaasidest, mille iga labor on koostanud pädevuse tõendamise käigus. Kogutud andmetega andmebaase ajakohastatakse pidevalt etalonaine ja kontrollprooviga saadud väärtustega. Varustuse või laboritingimuste muutused võivad tingida vajaduse ajakohastatud andmebaasi loomiseks.

Agonistikatse

Vahemiku leidmise katse

•

Induktsioon: induktsiooni mõõtmiseks plaadil jagatakse etalonaine E2 suurima kontsentratsiooni juures saadud suhteliste valgusühikute (RLU) keskväärtus DMSO kontrollprooviga saadud RLU keskväärtusega. Tavaliselt saavutatakse viiekordne induktsioon ning nõuetekohaseks tunnistamiseks peab induktsioon olema vähemalt neljakordne.

•	DMSO kontrollprooviga saadud tulemused: lahusti kontrollprooviga saadud RLU väärtused ei tohi aja jooksul kogutud lahusti kontrollproovide tulemuste keskmisest RLU väärtusest erineda rohkem kui 2,5 standardhälbe võrra.

•	Katse, mille puhul ei ole täidetud ükskõik kumb nõuetekohasuse kriteerium, tuleb tühistada ja uuesti läbi viia.

Tervikkatse

See hõlmab agonisti vahemiku leidmise katse nõuetekohasuse kriteeriume ning järgmist.

•	Etalonainega saadud tulemused: etalonaine E2 kontsentratsiooni-vastuse kõver peab olema sigmoidne ning vähemalt kolm väärtust peavad paiknema kontsentratsiooni-vastuse kõvera lineaarvahemikus.

•	Positiivse kontrolliga saadud tulemused: metoksükloori kontrollprooviga saadud RLU väärtused peavad olema suuremad kui DMSOga saadud keskväärtus pluss kolmekordne DMSO keskväärtuse standardhälve.

•	Katse, mille puhul ei ole täidetud ükskõik milline nõuetekohasuse kriteerium, tuleb tühistada ja uuesti läbi viia.

Antagonistikatse

Vahemiku leidmise katse

•	Vähenemine: vähenemise mõõtmiseks jagatakse etalonaine Ral/E2 suurima kontsentratsiooni juures saadud RLU keskväärtus DMSO kontrollprooviga saadud RLU keskväärtusega. Tavaliselt saavutatakse viiekordne vähenemine ning nõuetekohaseks tunnistamiseks peab vähenemine olema vähemalt kolmekordne.

•	E2 kontrollproovidega saadud tulemused: E2 kontrollprooviga saadud RLU väärtused ei tohi aja jooksul kogutud E2 kontrollproovide tulemuste keskmisest RLU väärtusest erineda rohkem kui 2,5 standardhälbe võrra.

•	DMSO kontrollprooviga saadud tulemused: DMSO kontrollprooviga saadud RLU väärtused ei tohi aja jooksul kogutud lahusti kontrollproovide tulemuste keskmisest RLU väärtusest erineda rohkem kui 2,5 standardhälbe võrra.

•	Katse, mille puhul ei ole täidetud ükskõik milline nõuetekohasuse kriteerium, tühistatakse ja tehakse uuesti.

Tervikkatse

See hõlmab antagonisti vahemiku leidmise katse nõuetekohasuse kriteeriume ning järgmist.

•	Etalonainega saadud tulemused: etalonaine Ral/E2 kontsentratsiooni-vastuse kõver peab olema sigmoidne ning vähemalt kolm väärtust peavad paiknema kontsentratsiooni-vastuse kõvera lineaarvahemikus.

•	Positiivse kontrolliga saadud tulemused: tamoksüfeeni/E2 kontrollprooviga saadud RLU väärtused peavad olema väiksemad kui E2 kontrollprooviga saadud keskväärtus miinus kolmekordne E2 kontrollproovi keskväärtuse standardhälve.

•	Katse, mille puhul ei ole täidetud ükskõik milline nõuetekohasuse kriteerium, tühistatakse ja tehakse uuesti.

Etalonained, positiivsed ja lahusti kontrollproovid

Lahusti kontrollproov (agonisti- ja antagonistikatsed)

12.

Uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatavat kandeainet tuleb katseliselt kontrollida kandeaine kontrollproovina. VM7Luc ER TA katsemeetodi valideerimisel kasutatud kandeaine oli 1 % (mahuprotsent) dimetüülsulfoksiid (DMSO, CASi nr 67-68-5) (vt punkt 24). Kui DMSO asemel kasutatakse muud kandeainet, tuleb katsed kõigi etalonainete, kontrollproovide ja uuritavate kemikaalidega vajaduse korral läbi viia samas kandeaines.

Etalonaine (agonisti vahemiku leidmine)

13.

Etalonaine on E2 (CASi nr 50-28-2). Vahemiku leidmiskatseks tehakse etalonainest järjestikused lahjendused, nii et saadakse neljas kontsentratsioonis E2 (1,84 × 10-10, 4,59 × 10-11, 1,15 × 10-11 ja 2,87 × 10-12 M), ning iga kontsentratsiooniga tehakse katse kahes süvendis.

Etalonaine (agonisti tervikkatse)

14.

Tervikkatses koosnevad E2 proovid järjestikustest 1 : 2 lahjendustest, mille tulemusena saadakse 11 eri kontsentratsiooniga (3,67 × 10-10 kuni 3,59 × 10-13 M) E2 proovi, millest igaüht analüüsitakse paralleelselt kahes süvendis.

Etalonaine (antagonisti vahemiku leidmine)

15.

Etalonaineks on Rali (CASi nr 84449-90-1) ja E2 (CASi nr 50-28-2) segu. Vahemiku leidmise katses valmistatakse Ral/E2 järjestikused lahjendused nii, et saadakse kolmes kontsentratsioonis Ral (3,06 × 10-9, 7,67 × 10-10 ja 1,92 × 10-10M), millest igaühele on lisatud muutmatus kontsentratsioonis (9,18 × 10-11 M) E2, analüüsitakse paralleelselt kahes süvendis.

Etalonaine (antagonisti tervikkatse)

16.

Tervikkatses valmistatakse Ral/E2 järjestikused 1 : 2 lahjendused nii, et saadakse üheksas kontsentratsioonis Ral (2,45× 10-8 kuni 9,57 × 10-11M), millest igaühele on lisatud muutmatus kontsentratsioonis (9,18 × 10-11 M) E2, analüüsitakse paralleelselt kahes süvendis.

Nõrgalt positiivne kontrollaine (agonist)

17.

Nõrgalt positiivne kontrollaine on 9,06 × 10-6 M p,p’-metoksükloor (metoksükloor; CASi nr 72-43-5) EFMis.

Nõrgalt positiivne kontrollaine (antagonist)

18.

Nõrgalt positiivne kontrollaine on 3,36 × 10-6 M tamoksüfeen (CASi nr 10540-29-1) EFMis, millele on lisatud 9,18 × 10-11 M E2.

E2 kontrollproov (ainult agonistikatse)

19.

E2 kontrollproov koosneb 9,18 × 10-11 M E2-st EFMis ja seda kasutatakse negatiivse kontrollproovi baasjoone leidmiseks.

Kordne induktsioon (agonist)

20.

Lutsiferaasi aktiivsuse indutseerimine etalonaine (E2) mõjul leitakse, jagades etalonaine E2 suurima kontsentratsiooniga saadud RLU keskväärtuse DMSO kontrollprooviga saadud RLU keskväärtusega ning tulemus peab olema rohkem kui neljakordne.

Kordne vähenemine (antagonist)

21.

Etalonaine (Ral/E2) lutsiferaasi keskmine aktiivsus leitakse, jagades etalonaine Ral/E2 suurima kontsentratsiooniga saadud RLU keskväärtuse DMSO kontrollprooviga saadud RLU keskväärtusega ning tulemus peab olema rohkem kui kolmekordne.

Labori pädevuse tõendamine (vt käesoleva katsemeetodi jaotise „ER TA katsemeetodi osad“ punkti 14 ning tabeleid 3 ja 4).

Kandeaine

22.

Uuritavad kemikaalid tuleb lahustada lahustis, milles nad lahustuvad ja mis on võimeline segunema rakkude söötmega. Sobivad kandeained on vesi, etanool (puhtusega 95–100 %) ja DMSO. Kui kasutatakse DMSOd, ei tohi selle kontsentratsioon ületada 1 mahuprotsenti. Mis tahes kandeaine korral tuleb tõendada, et maksimaalne kasutatav kogus ei ole tsütotoksiline ega sega analüüsimeetodi toimivust. Etalonaine ja kontrollained lahustatakse 100 % lahustis ning lahjendatakse seejärel EFMiga sobivate kontsentratsioonideni.

Uuritavate kemikaalide ettevalmistamine

23.

Uuritavad kemikaalid lahustatakse 100 % DMSOs (või sobivas lahustis) ning lahjendatakse seejärel EFMiga sobivate kontsentratsioonideni. Enne lahustamist ja lahjendamist tuleb kõigil uuritavatel kemikaalidel lasta saavutada toatemperatuur. Uuritavate kemikaalide lahused tuleb iga katse jaoks värskelt valmistada. Lahustes ei tohi olla nähtavat sadet ega hägu. Etalonaine ja kontrollainetega võib valmistada suurema koguse põhilahust, kuid etalonaine, kontrollaine ja uuritavate kemikaalide lõplikud lahused tuleb valmistada värskelt enne igat katset ning kasutada 24 tunni jooksul valmistamisest alates.

Lahustuvus ja tsütotoksilisus: vahemiku leidmise kaalutlused

24.

Vahemiku leidmise katse koosneb seitsme punkti leidmisest järjestikuste 1 : 10 lahjendustega, millest igaühest tehakse kaks paralleelproovi. Kõigepealt tehakse uuritavate kemikaalidega katseid kuni maksimaalse kontsentratsioonini 1 mg/ml (~1 mM) agonistikatse korral ja 20 μg/ml (~10 μM) antagonistikatse korral. Vahemiku leidmise katsete abil määratakse järgmised parameetrid:

—	uuritava kemikaali algkontsentratsioon tervikkatses kasutamiseks;

—	uuritava kemikaali lahjendused (1 : 2 või 1 : 5) tervikkatses kasutamiseks.

25.

Agonisti- ja antagonistikatse eeskirjad hõlmavad raku eluvõimelisuse / tsütotoksilisuse hindamist ning see kuulub ka vahemiku leidmise ja tervikkatse juurde. VM7Luc ER TA valideerimisel (1) rakkude eluvõimelisuse hindamiseks kasutatud tsütotoksilisuse määramise meetod oli skaleeritud kvalitatiivne visuaalne jälgimismeetod, kuid tsütotoksilisuse määramiseks võib kasutada ka kvantitatiivset meetodit (vt eeskirja (7)). Nende uuritava kemikaali kontsentratsioonidega saadud andmeid, mis põhjustavad eluvõimelisuse rohkem kui 20 % vähenemise, ei saa kasutada.

Kemikaaliga kokkupuude ja analüüsiplaadi jaotus

26.

Rakud loendatakse ja külvatakse 96 süvendiga koekultuuriplaadile (2 × 105 rakku süvendi kohta), kus neid inkubeeritakse EFMis 24 tundi, et võimaldada rakkudel plaadile kinnituda. EFM eemaldatakse ning asendatakse EFMis lahustatud uuritavate ja võrdluskemikaalidega, plaati inkubeeritakse 19–24 tundi. Suure lenduvusega ainete korral on vaja erimeetmeid, sest kontrollproovid lähedal paiknevates süvendites võivad anda valepositiivseid tulemusi. Sellisel juhul on soovitatav kasutada kilekatteid, mis tõhusalt eraldavad üksikud süvendid katse läbiviimise ajaks.

Vahemiku leidmise katsed

27.

Vahemiku leidmise katsetes kasutatakse kõiki 96 süvendiga plaadi süvendeid, et katsetada kuni kuut uuritavat kemikaali seitsmes järjestikuste 1 : 10 lahjendustega saadud kontsentratsioonis kahe paralleelproovina (vt jooniseid 1 ja 2).

—	Agonisti vahemiku leidmise katses kasutatakse etalonainena E2 nelja kontsentratsiooni kahes paralleelproovis ning neli süvendit kulub DMSO kontrolli paralleelproovidele.

—	Antagonisti vahemiku leidmise katses kasutatakse etalonainena Ral/E2, kus Ral on kolmes eri kontsentratsioonis, millele on lisatud 9,18 × 10-11 M E2; seda lahust analüüsitakse kahes paralleelproovis ning nii E2 kontrollproovile kui ka DMSO-kontrollproovile kulub kolm paralleelsüvendit.

Joonis 1.

Agonisti vahemiku leidmise katse 96 süvendiga plaadi paigutus

Lühendid: E2-1 kuni E2-4 = etalonaine E2 kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC1-1 kuni TC1-7 = 1. uuritava kemikaali (TC1) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC2-1 kuni TC2-7 = 2. uuritava kemikaali (TC2) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC3-1 kuni TC3-7 = 3. uuritava kemikaali (TC3) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC4-1 kuni TC4-7 = 4. uuritava kemikaali (TC4) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC5-1 kuni TC5-7 = 5. uuritava kemikaali (TC5) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC6-1 kuni TC6-7 = 6. uuritava kemikaali (TC6) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); VC = kandeaine kontrollproov (DMSO [1 % (mahuprotsent) EFM]).

Joonis 2.

Antagonisti vahemiku leidmise katse 96 süvendiga plaadi paigutus

Lühendid: E2 = E2 kontrollproov; Ral-1 kuni Ral-3 = etalonaine raloksüfeeni/E2 kontsentratsioonid (suuremasti väiksemani); TC1-1 kuni TC1-7 = 1. uuritava kemikaali (TC1) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC2-1 kuni TC2-7 = 2. uuritava kemikaali (TC2) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC3-1 kuni TC3-7 = 3. uuritava kemikaali (TC3) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC4-1 kuni TC4-7 = 4. uuritava kemikaali (TC4) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC5-1 kuni TC5-7 = 5. uuritava kemikaali (TC5) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC6-1 kuni TC6-7 = 6. uuritava kemikaali (TC6) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); VC = kandeaine kontrollproov (DMSO [1 % (mahuprotsent) EFM]).

Märkus: kõigi uuritavate kemikaalidega viiakse katse läbi 9,18 × 10-11 M E2 juuresolekul.

28.

Igas süvendis on söötme soovitatav lõplik ruumala 200 μl. Kasutada ainult neid analüüsitavaid plaate, milles rakkude eluvõimelisus kõigis süvendites on vähemalt 80 %.

29.

Agonisti tervikkatse jaoks lähtekontsentratsioonide määramist kirjeldatakse põhjalikult agonistikatse eeskirjas (7). Lühidalt, kasutatakse järgmisi kriteeriume.

—

Kui uuritava kemikaali kontsentratsioonikõveral ei ole punkte, mis on suuremad kui DMSO kontrollprooviga saadud keskväärtus pluss kolmekordne standardhälve, viiakse tervikkatse läbi 11 järjestikuste 1 : 2 lahjendustega saadud kontsentratsioonis, alustades maksimaalsest lahustuvast kontsentratsioonist.

—

Kui uuritava kemikaali kontsentratsioonikõveral on punkte, mis on suuremad kui DMSO kontrollprooviga saadud keskväärtus pluss kolmekordne standardhälve, peab 11 lahjenduse lähtekontsentratsioon tervikkatses olema 1 log suurem kui kontsentratsioon, millega vahemiku leidmise katses saadi suurim kohandatud RLU väärtus. 11 kontsentratsiooniga lahjendusskeem põhineb kas 1 : 2 või 1 : 5 lahjendustel vastavalt järgmistele kriteeriumidele:

11 kontsentratsiooniga järjestikusi 1 : 2 lahjendusi tuleks kasutada, kui vahemiku leidmise katses saadud kontsentratsiooni-vastuse kõveral põhjal kajastab saadav kontsentratsioonide vahemik kogu vastuste vahemikku. Muul juhul tuleks lahjendada vahekorras 1 : 5.

—	Kui uuritava kemikaali vahemiku leidmise katses saadud kontsentratsiooni-vastuse kõver on kahefaasiline, peab ka tervikkatse kajastama mõlemat faasi.

30.

Antagonisti tervikkatse jaoks lähtekontsentratsioonide määramist kirjeldatakse põhjalikult antagonistikatse eeskirjas (7). Lühidalt, kasutatakse järgmisi kriteeriume.

—

Kui uuritava kemikaali kontsentratsioonikõveral ei ole punkte, mis on väiksemad kui E2 kontrollprooviga saadud keskväärtus miinus kolmekordne standardhälve, viiakse tervikkatse läbi 11 järjestikuste 1 : 2 lahjendustega saadud kontsentratsioonis, alustades maksimaalsest lahustuvast kontsentratsioonist.

—

Kui uuritava kemikaali kontsentratsioonikõveral on punkte, mis on väiksemad kui E2 kontrollprooviga saadud keskväärtus miinus kolmekordne standardhälve, peab 11 lahjenduse lähtekontsentratsioon tervikkatses olema üks järgmistest:

—	kontsentratsioon, mis vahemiku leidmise katses annab vähima kohandatud RLU väärtuse;

—	maksimaalne lahustuv kontsentratsioon (vt agonistikatse eeskiri (7), joonis 14-2);

—	vähim tsütotoksiline kontsentratsioon (vt näiteks antagonistikatse eeskiri (7), joonis 14-3).

—

11 kontsentratsiooniga lahjendusskeem põhineb kas järjestikustel 1 : 2 või 1 : 5 lahjendustel vastavalt järgmistele kriteeriumidele:

Tervikkatsed

31.

Tervikkatse koosneb 11 kontsentratsiooniga järjestikustest lahjendustest (järjestikused lahjendused vahekorras kas 1 : 2 või 1 : 5 olenevalt tervikkatse kriteeriumide kohasest lähtekontsentratsioonist), kusjuures iga kontsentratsiooniga tehakse paralleelkatse 96 süvendiga plaadi kolmes süvendis (vt joonised 3 ja 4).

—	Agonisti tervikkatses kasutatakse etalonainena E2 11 kontsentratsioonis kahes paralleelproovis. Igal plaadil tehakse neljas süvendis DMSO kontrollproovi paralleelkatsed ja veel neljas metoksükloori kontrollproovi (9,06 × 10-6 M) paralleelkatsed.

—	Antagonisti tervikkatses kasutatakse etalonainena Ral/E2 lahust Rali üheksas kontsentratsioonis, millele on lisatud muutumatult 9,18 × 10-11 M E2, neljas süvendis on 9,18 × 10-11 M E2 paralleelkontrollproovid, neljas DMSO kontrollproovid ja neljas 3,36 × 10-6M tamoksüfeeni paralleelproovid.

Joonis 3.

Agonisti tervikkatse 96 süvendiga plaadi paigutus

Lühendid: TC1-1 kuni TC1-11 = 1. uuritava kemikaali kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC2-1 kuni TC2-11 = 2. uuritava kemikaali kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); E2-1 kuni E2-11 = etalonaine E2 kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); Meth = p,p’-metoksükloori nõrgalt positiivne kontrollproov; VC = DMSO (1 mahuprotsent) EFM kandeaine kontrollproov

Joonis 4.

Antagonisti tervikkatse 96 süvendiga plaadi paigutus

Lühendid: E2 = E2 kontrollproov; Ral-1 kuni Ral-9 = etalonaine raloksüfeeni/E2 kontsentratsioonid (suuremasti väiksemani); Tam = tamoksüfeeni/E2 nõrgalt positiivne kontrollproov; TC1-1 kuni TC1-11 = 1. uuritava kemikaali (TC1) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); TC2-1 kuni TC2-11 = 2. uuritava kemikaali (TC2) kontsentratsioonid (suuremast väiksemani); VC = kandeaine kontrollproov (DMSO [1 % (mahuprotsent) EFM]).

Märkus: nagu märgitud, sisaldavad kõik süvendid muutumatus kontsentratsioonis E2 (9,18 × 10-11 M).

32.

Sõltumatuse tagamiseks tuleb sama kemikaaliga tervikkatseid korrata eri päevadel. Kokku tuleks teha vähemalt kaks tervikkatset. Kui katsete tulemused on vasturääkivad (nt üks positiivne, teine negatiivne) või kui üks katsetest ei ole nõuetekohane, tuleb täiendavalt teha kolmas katse.

Luminestsentsi mõõtmine

33.

Luminestsentsi mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 300 kuni 650 nm injektoriga luminomeetriga ning tarkvaraga, mis reguleerib süstitavat kogust ja mõõteintervalli (7). Igast süvendist emiteeritud valgust väljendatakse RLUdes süvendi kohta.

ANDMEANALÜÜS

EC50/IC50 määramine

34.

EC50 väärtus (50 % uuritava kemikaali suurima toime avaldumise kontsentratsioonist (agonisti puhul)) ja IC50 väärtus (50 % uuritava kemikaali suurima inhibeeriva toime avaldumise kontsentratsioonist (antagonisti puhul)) määratakse kontsentratsiooni-vastuse andmete järgi. Ühe või mitme kontsentratsiooni juures positiivse uuritava kemikaali puhul arvutatakse uuritava kemikaali kontsentratsioon, mis on 50 % suurima toime avaldumise kontsentratsioonist (IC50 või EC50), Hilli funktsiooni analüüsi või asjakohase alternatiivi abil. Hilli funktsioon on nelja parameetriga matemaatiline logistiline mudel, mis esitab uuritava kemikaali kontsentratsiooni seose vastusega (tavaliselt sigmoidse kõvera järgi) allpool toodud võrrandi kohaselt,

Formula

kus:

Y= vastus (st RLUd);

X= logaritm kontsentratsioonist;

alumine (platoo)= minimaalne vastus;

ülemine (platoo)= maksimaalne vastus;

lg EC50 (või lg IC50)= logaritm X-ist, vastusest, mis jääb ülemise ja alumise platoo vahele;

Hilli tõus= kõvera tõus.

Mudeliga arvutatakse parim sobiv joon ülemise ja alumise platoo ning tõusu järgi ning parameetrite IC50 ja EC50. EC50 ja IC50 väärtuste arvutamiseks tuleks kasutada asjakohast statistikatarkvara (nt Graphpad PrismR).

Võõrväärtuste määramine

35.

Head statistilist hindamist võib hõlbustada Q-testi jms (vt eeskirjad agonisti ja antagonisti puhul (7)) kasutamine „kasutute“ süvendite leidmiseks, millega saadud tulemused tuleb andmete analüüsimisel kõrvale jätta.

36.

E2 etalonaine paralleelproovide (kaks tk) korral loetakse paralleelproovi igasugune kohandatud RLU väärtus antud E2 kontsentratsiooni juures võõrväärtuseks, kui selle on rohkem kui 20 % suurem või väiksem kui aja jooksul kogutud andmete andmebaasis olev kohandatud RLU väärtus kõnealuse kontsentratsiooni jaoks.

Luminomeetriliste andmete kogumine ja kohandamine vahemiku leidmise katseks

37.

Luminomeetrist saadud töötlemata andmed tuleb kanda katse jaoks välja töötatud arvutustabelisse. Tuleb kindlaks teha, kas on olemas võõrväärtusi, mis tuleks eemaldada. (Vt katse nõuetekohasuse kriteeriume nende parameetrite osas, mida analüüsides määratakse.) Teha tuleb järgmised arvutused.

Agonist

1. etapp	Arvutada kandeaine (DMSO) kontrollproovi (VC) keskväärtus.
2. etapp	Andmete normaliseerimiseks lahutada kandeaine (DMSO) kontrollproovi (VC) keskväärtus iga süvendi puhul saadud väärtusest.
3. etapp	Arvutada etalonaine (E2) kordse induktsiooni keskväärtus.
4. etapp	Arvutada uuritavate kemikaalide EC50 keskväärtused.

Antagonist

1. etapp	Arvutada kandeaine DMSO kontrollproovi (VC) keskväärtus.
2. etapp	Andmete normaliseerimiseks lahutada kandeaine (DMSO) kontrollproovi (VC) keskväärtus iga süvendi puhul saadud väärtusest.
3. etapp	Arvutada etalonaine (Ral/E2) põhjustatud kordse vähenemise keskväärtus.
4. etapp	Arvutada etalonaine E2 kontrollproovide keskväärtus.
5. etapp	Arvutada uuritavate kemikaalide IC50 keskväärtused.

Luminomeetriliste andmete kogumine ja kohandamine tervikkatseks

38.

Agonist

1. etapp	Arvutada kandeaine DMSO kontrollproovi (VC) keskväärtus.
2. etapp	Andmete normaliseerimiseks lahutada kandeaine (DMSO) kontrollproovi (VC) keskväärtus iga süvendi puhul saadud väärtusest.
3. etapp	Arvutada etalonaine (E2) kordse induktsiooni keskväärtus.
4. etapp	Arvutada E2 ja uuritavate kemikaalide EC50 keskväärtused.
5. etapp	Arvutada metoksükloori kohandatud RLU keskväärtus.

Antagonist

1. etapp	Arvutada kandeaine DMSO kontrollproovi (VC) keskväärtus.
2. etapp	Andmete normaliseerimiseks lahutada kandeaine (DMSO) kontrollproovi (VC) keskväärtus iga süvendi puhul saadud väärtusest.
3. etapp	Arvutada etalonaine (Ral/E2) põhjustatud kordse induktsiooni keskväärtus.
4. etapp	Arvutada Ral/E2 ja uuritavate kemikaalide IC50 keskväärtused.
5. etapp	Arvutada tamoksüfeeni kohandatud RLU keskväärtus.
6. etapp	Arvutada etalonaine E2 kontrollproovide keskväärtus.

Andmete tõlgendamise kriteeriumid

39.

VM7Luc ER TA katsemeetod on kavandatud osana tõendite kaalukust arvestavast lähenemisviisist, et aidata aineid prioriseerida endokriinse häire põhjustamise in vivo uurimiseks. Üks kõnealuse prioriseerimise osadest on uuritava kemikaali klassifitseerimine kas positiivseks või negatiivseks ERi suhtes agonistliku või antagonistliku toime seisukohast. VM7Luc ER TA valideerimisuuringus kasutatud positiivseks ja negatiivseks klassifitseerimise otsustuskriteeriumid on esitatud tabelis 1.

Tabel 1.

Positiivseks ja negatiivseks klassifitseerimise otsustuskriteeriumid

AGONISTLIK TOIME

Positiivne

—

Kõigil uuritavatel kemikaalidel, mis on ERi agonistliku toime järgi klassifitseeritud positiivseks, pean kontsentratsiooni-vastuse kõver sisaldama baasjoont, millele järgneb positiivne tõus, mis lõpeb platoo või tipuga. Mõnel juhul on võimalik kindlaks määrata üksnes kaks neist osadest (alumine platoo ja tõus või tõus ja ülemine platoo).

—	Positiivse tõusu joonel peab olema vähemalt kolm punkti, mille veavahemikud (keskväärtus ± SD) ei kattu. Alumist platood moodustavad punktid jäetakse välja, kuid kõvera lineaarvahemikku moodustavad punktid võivad sisaldada tipupunkti või platoo esimest punkti.

—	Positiivseks klassifitseerimiseks peab vastuse amplituud, st alumise ja ülemise platoo vaheline erinevus olema vähemalt 20 % etalonainega E2 saadud maksimaalsest väärtusest (st vähemalt 2000 RLUd, kui etalonaine (E2) vastuse maksimaalseks väärtuseks on seatud 10 000 ) RLUd).

—	Võimaluse korral arvutatakse iga positiivse uuritava kemikaali EC50 väärtus.

Negatiivne

Konkreetse kontsentratsiooni keskmine kohandatud RLU on väiksem või võrdne DMSO kontrollproovi RLU keskväärtusega, millele on liidetud DMSO kontrollproovi RLU väärtuse kolmekordne standardhälve.

Ebapiisav

Ebapiisavaks loetakse andmed, mida suurte kvalitatiivsete või kvantitatiivsete puuduste tõttu ei saa tõlgendada usaldusväärsetena toime olemasolu või selle puudumise kajastamisel, ning neid andmeid ei saa kasutada määramaks, kas uuritav kemikaal on positiivne või negatiivne. Kemikaalidega tuleks teha uued katsed.

ANTAGONISTLIK TOIME

Positiivne

—	Uuritava kemikaalide andmetest saab koostada kontsentratsiooni-vastuse kõvera, mis koosneb baasjoonest, millele järgneb negatiivne tõus.

—	Negatiivse tõusu joonel peab olema vähemalt kolm punkti, mille veavahemikud ei kattu. Baasjoont moodustavad punktid jäetakse välja, kuid kõvera lineaarvahemikku moodustavad punktid võivad sisaldada platoo esimest punkti.

—	Toime peaks olema vähemalt 20 % väiksem etalonainega Ral/E2 saadud maksimaalsest väärtusest (st 8 000 RLUd või vähem, kui etalonaine (Ral/E2) vastuse maksimaalseks väärtuseks on seatud 10 000 RLUd).

—	Uuritava kemikaali suurim mittetsütotoksiline kontsentratsioon peab olema 1 × 10-5 M või alla selle.

—	Võimaluse korral arvutatakse iga positiivse uuritava kemikaali IC50 väärtus.

Negatiivne

Kõik andmepunktid on suuremad kui EC80 väärtus (80 % E2-ga saadud vastusest või 8 000 RLUd) kontsentratsioonil alla 1,0 × 10-5 M.

Ebapiisav

40.

Positiivset tulemust iseloomustatakse nii toime suurusjärgu kui ka võimaluse korral kontsentratsiooniga, mille juures toime avaldub. Näited positiivsetest, negatiivsetest ja ebapiisavatest andmetest on esitatud joonistel 5 ja 6.

Joonis 5.

Näited agonisti kohta: positiivsed, negatiivsed ja ebapiisavad andmed

Punktiirjoon tähistab 20 % E2-ga saadud vastusest, 2000 kohandatud ja normaliseeritud RLUd.

Joonis 6.

Näited antagonisti kohta: positiivsed, negatiivsed ja ebapiisavad andmed

Punktiirjoon tähistab 80 % Ral/E2-ga saadud vastusest, 8 000 kohandatud ja normaliseeritud RLUd.

Pidevjoon tähistab kontsentratsiooni 1,00 × 10-5 M. Selleks, et vastus loetakse positiivseks, peab see kontsentratsioonidel alla 1,00 × 10-5M jääma allapoole 8 000 RLU joont.

Meso-heksestrooli kõveral tärniga tähistatud kontsentratsioonidel juures on eluvõimelisus 2 või suurem.

Meso-heksestrooliga saadud katsetulemused loetakse ebapiisavateks andmetest, sest ainus vastus, mis jääb alla 8 000 RLU, ilmneb kontsentratsioonil 1,00 × 10-5 M.

41.

EC50 ja IC50 saab arvutada nelja parameetriga Hilli funktsiooni abil (täpsem teave on agonistikatse ja antagonistikatse eeskirjades (7)). Nõuetekohasuse kriteeriumide täitmine näitab, et süsteem toimib korrektselt, kuid see ei taga täpsete andmete saamist mis tahes konkreetsel katsel. Esimese katse tulemuste kordamine on parim võimalus tagada täpsete andmete saamine (vt punkti 19 jaotises „ER TA katsemeetodi osad“).

KATSEPROTOKOLL

42.

Vt punkti 20 jaotises „ER TA katsemeetodi osad“.

KIRJANDUS

(1)	ICCVAM (2011), „ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method, an In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists“, National Institute of Environmental Health Sciences: Research Triangle Park, NC.

(2)	Monje P., Boland R. (2001). Subcellular Distribution of Native Estrogen Receptor α and β Isoforms in Rabbit Uterus and Ovary, J. Cell Biochem., 82(3): 467-479.

(3)	Pujol P., et al. (1998). Differential Expression of Estrogen Receptor-Alpha and -Beta Messenger RNAs as a Potential Marker of Ovarian Carcinogenesis, Cancer Res., 58(23): 5367-5373.

(4)	Weihua Z., et al. (2000). Estrogen Receptor (ER) β, a Modulator of ERα in the Uterus, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97(11): 936-5941.

(5)	Balls, M. et al. (2006), „The Importance of Good Cell Culture Practice (GCCP)“, ALTEX, nr 23 (Lisa), lk 270–273.

(6)	Coecke, S. et al. (2005), „Guidance on Good Cell Culture Practice: a Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice“, Alternatives to Laboratory Animals, nr 33, lk 261–287.

(7)	ICCVAM (2011), „ICCVAM Test Method Evaluation Report, The LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals“, NIH Publication nr 11–7850.

(8)	Rogers, J.M., Denison, M.S. (2000), „Recombinant Cell Bioassays for Endocrine Disruptors: Development of a Stably Transfected Human Ovarian Cell Line for the Detection of Estrogenic and Anti-Estrogenic Chemicals“, In Vitro Mol. Toxicol., nr 13(1), lk 67–82.

(9)	Escande, A. et al. (2006), „Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta“, Biochem. Pharmacol., nr 71(10), lk 1459–69.

(10)	Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. (2010), „Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology“, Chemistry and Biology nr 17(6), lk 646–57.

(11)	Kuiper, G. G. et al. (1998), „Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor Beta“, Endocrinology, nr 139(10), lk 4252–63.

(12)	Geisinger et al. (1989), „Characterization of a human ovarian carcinoma cell line with estrogen and progesterone receptors“, Cancer, nr 63, lk 280–288.

(13)	Baldwin et al. (1998), „BG-1 ovarian cell line: an alternative model for examining estrogen-dependent growth in vitro“, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, nr 34, lk 649–654.

(14)	Li, Y. et al. (2014), „Research resource: STR DNA profile and gene expression comparisons of human BG-1 cells and a BG-1/MCF-7 clonal variant“, Mol. Endo., nr 28, lk 2072–2081.

(15)	Rogers, J. M. ja Denison, M. S. (2000), „Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors: development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenic and anti-estrogenic chemicals“, In Vitro & Molec. Toxicol., nr 13, lk 67–82.

4. Liide

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD (VT KA ÜLDIST SISSEJUHATUST)

ERα CALUX transaktivatsiooni katsemeetodis kasutatakse inimese rakuliini U2OS, et tuvastada toime östrogeeni agonistina või antagonistina, mida vahendab inimese östrogeeni α-retseptor (hERα). Stabiilse transfektsiooniga ERα CALUX biokatsemeetodi valideerimisuuring, mille tegi BioDetection Systems BV (Amsterdam, Madalmaad), tõendas katsemeetodi asjakohasust ja usaldusväärsust ettenähtud eesmärgil kasutades (1). Rakuliin ERα CALUX ekspresseerib ainult stabiilse transfektsiooniga inimese ERα-d (2) (3).

See katsemeetod on välja töötatud spetsiaalselt hERα-vahendatud transaktivatsiooni tuvastamiseks, kasutades mõõdetava parameetrina bioluminestsentsi. Bioluminestsentsi kasutamine on suure signaali-müra suhte tõttu biokatsetes üldlevinud (4).

Üle 1 μM fütoöstrogeeni kontsentratsioonid teadaolevalt üleaktiveerivad lutsiferaasi reportergeeni, mille tulemusena toimub luminestsents, mida ei vahenda retseptorid (5, 6, 7). Seetõttu tuleb stabiilse transfektsiooniga ERi transaktivatsiooni katsesüsteemides hoolikalt uurida fütoöstrogeenide või muude sarnaste ühendite suuri kontsentratsioone, mis võivad lutsiferaasi ekspressiooni üleaktiveerida (vt 2. liide).

KATSEMEETODI PÕHIMÕTE (VT KA ÜLDIST SISSEJUHATUST)

Biokatsemeetodit kasutatakse ERi ligandi sidumise ja sellele järgneva retseptori-ligandi kompleksi tuuma suunatud translokatsiooni hindamiseks. Tuumas seondub retseptori-ligandi kompleks DNA spetsiifiliste vastuselementidega ja transaktiveerib jaanimardika lutsiferaasi reportergeeni, mille tulemusena suureneb ensüüm lutsiferaasi ekspressioon rakus. Pärast lutsiferaasi substraadi lutsiferiini lisamist muundatakse lutsiferiin bioluminestseeruvaks saaduseks. Eralduvat valgust on luminomeetri abil lihtne tuvastada ja kvantitatiivselt mõõta.

Katsesüsteemis kasutatakse stabiilse transfektsiooniga ERα CALUX rakke. ERα CALUX rakud on pärit inimese osteoblastilise osteosarkoomi rakuliinist U2OS. Inimese U2OS rakud transfekteeriti stabiilselt 3xHRE-TATA-Luci ja pSG5-neo-hERα-ga, kasutades kaltsiumfosfaadiga kaassadestamise meetodit. Rakuliin U2OS valiti välja kui parim östrogeenile (ja teistele steroidhormoonidele) reageeriv reporterrakuliin, mis põhineb tähelepanekul, et rakuliinil U2OS on retseptori endogeenne aktiivsus väike või puudub hoopis. Endogeensete retseptorite puudumist hinnati ainult lutsiferaasi reporterplasmiidide abil, mis ei ilmutanud retseptorligandide lisamisel mingit aktiivsust. Peale selle toetas nimetatud rakuliin tugevat hormoonvahendatud vastust, kui sellesse viidi ajutiselt sugulasretseptoreid (2, 3, 8).

Kemikaalide östrogeense või antiöstrogeense toime uurimine rakuliini ERα CALUX abil hõlmab eelnevat sõelkatset ja tervikkatseid. Eelneva sõelkatse käigus määratakse uuritavate kemikaalide lahustuvus, tsütotoksilisus ja täpsustatud, tervikkatses uuritavate kontsentratsioonide vahemik. Tervikkatsete käigus analüüsitakse uuritavaid kemikaale täpsustatud kontsentratsioonide vahemikus ERα CALUX biokatsemeetodi abil, millele järgneb uuritavate kemikaalide klassifitseerimine agonistideks ja antagonistideks.

Andmete tõlgendamise kriteeriumeid on üksikasjalikult kirjeldatud punktis 59. Lühidalt loetakse uuritav kemikaal antagonismi seisukohast positiivseks, kui vähemalt kaks uuritava kemikaali järjestikust kontsentratsiooni annavad vastuse, mis on suurem või võrdne 10 %ga etalonaine 17β-östradiooliga saadud maksimaalsest vastusest (PC10). Uuritav kemikaal loetakse antagonismi seisukohast positiivseks, kui vähemalt kaks uuritava kemikaali järjestikust kontsentratsiooni annavad vastuse, mis on väiksem või võrdne 80 %ga etalonaine tamoksüfeeniga saadud maksimaalsest vastusest (PC80).

METOODIKA

Rakuliinid

Katsemeetodiga tuleks kasutada stabiilse transfektsiooniga rakuliini U2OS ERα CALUX. Rakuliin on tehnilise litsentsilepingu alusel saadaval ettevõttest BioDetection Systems BV, asukohaga Amsterdam, Madalmaad.

10.

Kasutada tuleks ainult mükoplasmavabu rakukultuure. Rakupartiidel peab olema sertifikaat, mis tõendab, et need ei ole mükoplasmaga saastunud, või tuleb enne kasutamist mükoplasma olemasolu katseliselt kontrollida. Mükoplasmainfektsiooni tuvastamiseks tuleks kasutada tundlikku RT-PCR-meetodit (polümeraasiahela reaktsioon reaalajas) (9).

Rakuliini stabiilsus

11.

CALUX-rakkude stabiilsuse ja terviklikkuse säilitamiseks tuleb rakke hoida vedelas lämmastikus (–80 °C). Pärast rakkude sulatamist uue kultuuri külvamiseks tuleks rakke vähemalt kaks korda ümber külvata, enne kui neid kasutatakse kemikaalide agonistliku ja antagonistliku toime hindamiseks östrogeeni suhtes. Rakke ei tohiks ümber külvata rohkem kui 30 passaaži.

12.

Selleks, et jälgida rakuliini stabiilsust ajas, tuleb kontrollida agonistliku ja antagonistliku toime katsesüsteemi reageerimisvõimet, hinnates etalonainega saadud parameetri EC50 või IC50 väärtusi. Peale selle tuleb kontrollida positiivse kontrollprooviga (PC) ja negatiivse kontrollprooviga (NC) saadud suhtelist induktsiooni. Tulemused peavad olema kooskõlas agonistliku toime (tabel 3C) või antagonistliku toime (tabel 4C) hindamiseks tehtava ERα CALUXi biokatse nõuetekohasuse kriteeriumidega. Etalonained ning positiivsed ja negatiivsed kontrollained on agonistliku ja antagonistliku toime hindamiseks esitatud vastavalt tabelites 1 ja 2.

Rakkude kasvatamine ja külvamistingimused

13.

U2OS rakke kasvatatakse söötmes (sööde DMEM/F12 (1 : 1), mis sisaldab indikaatorina fenoolpunast ja millele on lisatud veiselooteseerumit (7,5 %), asendatavaid aminohappeid (1 %), 10 ühikut/ml penitsilliini, streptomütsiini ja selektiivainena genetitsiini (G-418)). Rakud pannakse CO2-inkubaatorisse (5 % CO2), kus temperatuur on 37 °C ja õhuniiskus 100 %. Kui rakud saavutavad 85–95 % konfluentsuse, külvatakse need ümber või valmistatakse ette külvamiseks 96 süvendiga mikrotiiterplaadile. Viimasel juhul suspendeeritakse rakud uuesti kontsentratsiooniga 1 × 105 rakku/ml katsesöötmes (DMEM/F12 (1 : 1), mis ei sisalda fenoolpunast ja millele on lisatud dekstraankattega aktiivsöega töödeldud veiselooteseerumit (5 mahuprotsenti), asendatavaid aminohappeid (1 mahuprotsent), 10 ühikut/ml penitsilliini ja streptomütsiini) ja külvatakse 96 süvendiga mikrotiiterplaadi süvenditesse (100 μl homogeniseeritud rakususpensiooni). Enne uuritava ainega töötlemist inkubeeritakse rakke 24 tundi CO2-inkubaatoris (5 % CO2, 37 °C, õhuniiskus 100 %) Plasttarvikud peavad olema östrogeenivabad.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

14.

Uuritava(te) kemikaali(de) agonistlikku ja antagonistlikku toimet uuritakse katseseeriate abil. Katseseeria koosneb maksimaalselt kuuest mikrotiiterplaadist. Igas katseseerias on vähemalt üks täisseeria etalonaine lahjendustest, positiivne kontrollproov, negatiivne kontrollproov ja lahusti kontrollproovid. Joonistel 1 ja 2 on esitatud proovide paigutus plaadil agonisti ja antagonisti katseseeriate korral.

15.

Iga etalonaine lahjendust, uuritavat kemikaali, lahusti kontrollproovi ning positiivset ja negatiivset kontrollproovi analüüsitakse kolme paralleelproovina. Kõik need kolm paralleelset analüüsi peavad vastama tabelis 3A ja 4A esitatud nõuetele.

16.

Iga katseseeria esimesel plaadil mõõdetakse etalonaine (agonismi korral 17β-östradiool, antagonismi korral tamoksüfeen) täielikku lahjenduste seeriat. Selleks, et oleks võimalik võrrelda ülejäänud viie mikrotiiterplaadi analüüsi tulemusi etalonaine täieliku kontsentratsiooni-vastuse kõvera punkte sisaldava esimese mikrotiiterplaadi omadega, peavad kõik plaadid sisaldama kolme kontrollproovi: lahusti kontrollproov, uuritava etalonaine suurim kontsentratsioon ning etalonaine ligikaudne kontsentratsioon EC50 (agonismi korral) või IC50 (antagonismi korral). Esimese plaadi ja ülejäänud viie plaadi kontrollproovide keskmine suhtarv peab vastama tabelis 3C (agonismi korral) või 4C (antagonismi korral) esitatud nõuetele.

17.

Iga katseseeria osaks oleva mikrotiiterplaadi kohta arvutatakse z-tegur (10). Z-teguri arvutamiseks kasutatakse etalonaine suurima ja vähima kontsentratsiooniga saadud vastuste abil. Mikrotiiterplaat loetakse nõuetekohaseks, kui see vastab tabelis 3C (agonismi korral) või 4C (antagonismi korral) esitatud nõuetele.

18.

Etalonainega saadud annuse-vastuse kõver peab olema sigmoidne. Etalonaine lahjenduste seeriaga saadud vastustest tuletatud EC50 või IC50 peab vastama tabelis 3C (agonismi korral) või 4C (antagonismi korral) esitatud nõuetele.

19.

Igas katseseerias peab olema positiivne ja negatiivne kontrollproov. Nii positiivse kui ka negatiivse kontrollproovi kohta arvutatud suhteline induktsioon peab vastama tabelis 3C (agonismi korral) või 4C (antagonismi korral) esitatud nõuetele.

20.

Kõigi mõõtmiste käigus tuleb mõõta etalonaine suurima kontsentratsiooni induktsioonitegur, jagades selleks etalonaine 17β-östradiooli suurima kontsentratsiooniga saadud vastuse (suhtelistes valgusühikutes, RLU) keskmise väärtuse lahusti kontrollprooviga saadud vastuse (RLU) keskmise väärtusega. See induktsioonitegur peab vastama kordse induktsiooni miinimumnõuetele, mis on esitatud tabelis 3C (agonismi korral) või 4C (antagonismi korral).

21.

Nõuetekohaseks loetakse ainult need mikrotiiterplaadid, mis vastavad kõigile eespool nimetatud kriteeriumidele; sel juhul võib neid kasutada uuritavate kemikaalide esile kutsutud vastuste hindamiseks.

22.

Nõuetekohasuse kriteeriume kohaldatakse nii eelneva sõelkatse kui ka tervikkatsete suhtes.

Tabel 1.

Etalonaine, positiivse kontrollaine (PC) ja negatiivse kontrollaine (NC) kontsentratsioonid agonistliku toime uurimiseks CALUXiga biokatsemeetodiga

	Aine	CASi nr	Uuritav vahemik (M)
Etalonaine	17β-östradiool	50-28-2	1 × 10-13 – 1 × 10-10
Positiivne kontrollaine (PC)	17α-metüültestosteroon	58-18-4	3 × 10-6
Negatiivne kontrollaine (NC)	Kortikosteroon	50-22-6	1 × 10-8

Tabel 2.

Etalonaine, positiivse kontrollaine (PC) ja negatiivse kontrollaine (NC) kontsentratsioonid antagonistliku toime uurimiseks CALUX biokatsemeetodiga

	Aine	CASi nr	Uuritav vahemik (M)
Etalonaine	Tamoksüfeen	10540-29-1	3 × 10-9 – 1 × 10-5
Positiivne kontrollaine (PC)	4-hüdroksütamoksüfeen	68047-06-3	1 × 10-9
Negatiivne kontrollaine (NC)	Resveratrool	501-36-0	1 × 10-5

Tabel 3.

Nõuetekohasuse kriteeriumid agonistliku toime uurimiseks ERα CALUX biokatsemeetodiga

A – üksikproove plaadil		Kriteerium
1	Kolmes süvendis paralleelproovide (negatiivne kontrollproov, positiivne kontrollproov, kõik uuritava kemikaali ja etalonaine lahjendused, välja arvatud C0) maksimaalne %SD	< 15 %
2	Kolmes süvendis paralleelproovide (etalonaine ja uuritava kemikaali lahusti kontrollproovid (C0, SC)) maksimaalne %SD	< 30 %
3	Maksimaalne LDH teke tsütotoksilisuse mõõduna.	< 120 %
B – ühe mikrotiiterplaadi ulatuses
4	Etalonaine lahusti kontrollproovi (C0, plaat 1) ja uuritava kemikaali lahusti kontrollproovi (SC; plaadid 2–x) suhe	0,5 – 2,0
5	Plaadil 1 oleva etalonaine ligikaudse EC50 ja suurima kontsentratsiooni ning plaatidel 2–x olevate etalonaine ligikaudsete EC50 ja suurimate kontsentratsioonide (C4, C8) suhe	0,70 – 1,30
6	Iga plaadi z-tegur	> 0,6
C – ühe analüüsiseeria ulatuses (kõik ühe analüüsiseeria plaadid)
7	Etalonaine sigmoidne kõver	Jah (17ß-östradiool)
8	Etalonaine 17ß-östradiooli EC50 vahemik	4 × 10-12 – 4 × 10-11 M
9	17ß-östradiooli suurima kontsentratsiooni vähim kordne induktsioon võrrelduna etalonaine lahusti kontrollprooviga.	5
10	Positiivse kontrollproovi suhteline induktsioon (%)	> 30 %
11	Negatiivse kontrollproovi suhteline induktsioon (%)	< 10 %

PC: positiivne kontrollproov; NC: negatiivne kontrollproov; SC: uuritava kemikaali lahusti kontrollproov; C0: etalonaine lahusti kontrollproov; SD: standardhälve; LDH: laktaadi dehüdrogenaas

Tabel 4.

Nõuetekohasuse kriteeriumid antagonistliku toime uurimiseks ERα CALUX biokatsemeetodiga

A – üksikproove plaadil		Kriteerium
1	Kolmes süvendis paralleelproovide (negatiivne kontrollproov, positiivne kontrollproov, kõik uuritava kemikaali ja etalonaine lahjendused, lahusti kontrollproov C0) maksimaalne %SD	< 15 %
2	Kolmes süvendis paralleelproovide (kandeaine kontrollproov (VC) ja etalonaine suurim kontsentratsioon (C8)) maksimaalne %SD	< 30 %
3	Maksimaalne LDH teke tsütotoksilisuse mõõduna.	< 120 %
B – ühe mikrotiiterplaadi ulatuses
4	Etalonaine lahusti kontrollproovi (C0, plaat 1) ja uuritava kemikaali lahusti kontrollproovi (SC; plaadid 2–x) suhe	0,70 – 1,30
5	Plaadil 1 oleva etalonaine ligikaudse IC50 kontsentratsiooni ning plaatidel 2–x olevate etalonaine ligikaudsete IC50 kontsentratsioonide (C4) suhe	0,70 – 1,30
6	Plaadil 1 oleva etalonaine suurima kontsentratsiooni ning plaatidel 2–x olevate etalonaine suurimate kontsentratsioonide (C8) suhe	0,50 – 2,0
7	Iga plaadi z-tegur	> 0,6
C – ühe analüüsiseeria ulatuses (kõik ühe analüüsiseeria plaadid)
8	Etalonaine sigmoidne kõver	Jah (tamoksüfeen)
9	Etalonaine (tamoksüfeen) IC50 vahemik	1 × 10-8 – 1 × 10-7 M
10	Etalonaine lahusti kontrollproovi vähim kordne induktsioon võrrelduna tamoksüfeeni suurima kontsentratsiooniga.	2,5
11	Positiivse kontrollproovi suhteline induktsioon (%)	< 70 %
12	Negatiivse kontrollproovi suhteline induktsioon (%)	< 85 %

PC: positiivne kontrollproov; NC: negatiivne kontrollproov; VC: kandeaine kontrollproov (lahusti kontroll ilma agonisti etalonaine määratud kontsentratsioonita); SC: uuritava kemikaali lahusti kontrollproov; C0: etalonaine lahusti kontrollproov; SD: standardhälve; LDH: laktaadi dehüdrogenaas

Lahusti/kandeaine kontrollproov, etalonained, positiivsed kontrollproovid, negatiivsed kontrollproovid

23.

Eelnevas sõelkatses ja tervikkatsetes kasutatakse sama lahusti/kandeaine kontrollproovi, samu etalonaineid, positiivseid ja negatiivsed kontrollproove. Lisaks peab etalonainete, positiivsete ja negatiivsete kontrollproovide kontsentratsioon olema sama.

Lahusti kontrollproov

24.

Uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatavat lahustit tuleb katseliselt kontrollida lahusti kontrollproovina. ERα CALUX biokatsemeetodi valideerimisel kasutati kandeainena dimetüülsulfoksiidi (DMSO, 1 % (mahuprotsent), CASi nr 67-68-5). Kui DMSO asemel kasutatakse muud lahustit, tuleb katsed kõigi etalonainete, kontrollproovide ja uuritavate kemikaalidega läbi viia samas kandeaines. Antagonistlike omaduste uurimise korral sisaldab lahusti kontrollproov kindlas kontsentratsioonis agonistlikku etalonainet 17β-östradiooli (ligikaudne EC50 kontsentratsioon). Antagonistlike omaduste uurimisel kasutatava lahusti kontrollimiseks valmistatakse kandeaine kontrollproov ja analüüsitakse seda.

Kandeaine kontrollproov (antagonism)

25.

Antagonistlike omaduste uurimiseks lisatakse katsesöötmesse kindlas kontsentratsioonis agonistlikku etalonainet 17β-östradiooli (ligikaudne EC50 kontsentratsioon). Antagonistlike omaduste suhtes uuritavate kemikaalide lahustamiseks kasutatava lahusti katseliseks kontrollimiseks valmistatakse katsesööde ilma kindlas kontsentratsioonis lisatud agonistliku etalonaineta (17β-östradiool). Seda kontrollproovi nimetatakse kandeaine kontrollprooviks. ERα CALUX biokatsemeetodi valideerimisel kasutati kandeainena dimetüülsulfoksiidi (DMSO, 1 % (mahuprotsent), CASi nr 67-68-5). Kui DMSO asemel kasutatakse muud lahustit, tuleb katsed kõigi etalonainete, kontrollproovide ja uuritavate kemikaalidega läbi viia samas kandeaines.

Etalonained

26.

Agonistlik etalonaine on 17β-östradiool (tabel 1). Etalonaineteks on 17β-östradiooli lahjenduste seeria, mis hõlmab kaheksat kontsentratsiooni (1 × 10-13, 3 × 10-13, 1 × 10-12, 3 × 10-12, 6 × 10-12, 1 × 10-11, 3 × 10-11, 1 × 10-10 M).

27.

Antagonistlik etalonaine on tamoksüfeen (tabel 2). Etalonaineteks on tamoksüfeeni lahjenduste seeria, mis hõlmab kaheksat kontsentratsiooni (3 × 10-9, 1 × 10-8, 3 × 10-8, 1 × 10-7, 3 × 10-7, 1 × 10-6, 3 × 10-6, 1 × 10-5 M). Antagonistliku etalonaine kõigis kontsentratsioonides lahjendusi inkubeeritakse koos kindlas kontsentratsioonis lisatud agonistliku etalonainega (17β-östradiool, 3 × 10-12 M)

Positiivne kontrollproov

28.

Agonistlike omaduste uurimise korral on positiivseks kontrollaineks 17α-metüültestosteroon (tabel 1).

29.

Antagonistlike omaduste uurimise korral on positiivseks kontrollaineks 4-hüdroksütamoksüfeen (tabel 2). Antagonistlikku positiivset kontrollproovi inkubeeritakse koos kindlas kontsentratsioonis lisatud agonistliku etalonainega (17β-östradiool, 3 × 10-12 M)

Negatiivne kontrollproov

30.

Agonistlike omaduste uurimise korral on negatiivseks kontrollaineks kortikosteroon (tabel 1).

31.

Antagonistlike omaduste uurimise korral on negatiivseks kontrollaineks resveratrool (tabel 2). Antagonistlikku negatiivset kontrollproovi inkubeeritakse koos kindlas kontsentratsioonis lisatud agonistliku etalonainega (17β-östradiool, 3 × 10-12 M)

Labori pädevuse tõendamine (vt käesoleva katsemeetodi jaotise „ER TA katsemeetodi osad“ punkti 14 ning tabeleid 3 ja 4).

Kandeaine

32.

Uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatav lahusti peab uuritava kemikaali täielikult lahustama ja segunema rakkude kasvusöötmega. Sobivad kandeained on DMSO, vesi ja etanool (puhtusega 95–100 %). Kui lahustina kasutatakse DMSOd, ei tohi DMSO maksimaalne kontsentratsioon inkubeerimise ajal ületada 1 mahuprotsenti. Enne kasutamist tuleb katseliselt kontrollides veenduda, et lahusti ei ole tsütotoksiline ega häiri katsemeetodi toimivust.

Etalonainete, positiivsete ja negatiivsete kontrollproovide ning uuritavate kemikaalide ettevalmistamine

33.

Etalonained, positiivsed ja negatiivsed kontrollained ning uuritavad kemikaalid lahustatakse 100 % DMSOs (või sobivas lahustis). Seejärel valmistatakse samas lahustis asjakohased lahjendused (seeriana). Enne lahustamist lastakse kõigil ainetele saavutada toatemperatuur. Etalonainete, positiivsete ja negatiivsete kontrollainete ning uuritava kemikaalide värskelt valmistatud põhilahustes ei tohi olla nähtavat sadet ega hägu. Etalonaine ja kontrollainetega võib valmistada suurema koguse põhilahust. Uuritavate kemikaalide põhilahused valmistatakse värskelt enne igat katset. Etalonainete, positiivsete ja negatiivsete kontrollainete ja uuritavate kemikaalide lõplikud lahjendused tuleb valmistada värskelt enne igat katset ning kasutada 24 tunni jooksul valmistamisest alates.

Lahustuvus, tsütotoksilisus ja vahemiku leidmine

34.

Eelneva sõelkatsega määratakse uuritava kemikaali lahustuvus valitud lahustis. Valmistatakse põhilahus maksimaalse kontsentratsiooniga 0,1 M. Kui selle kontsentratsiooni juures tekib probleeme lahustuvusega, valmistatakse lahjemaid põhilahuseid, kuni uuritavad kemikaalid täielikult lahustuvad. Eelneva sõelkatse käigus analüüsitakse uuritava kemikaali lahjenduste seeriat, mis valmistatakse vahekorras 1 : 10. Maksimaalne analüüsitav kontsentratsioon agonistlike ja antagonistlike omaduste uurimisel on 1 mM. Pärast eelnevat sõelkatset tuletatakse täpsem sobivate kontsentratsioonide vahemik, mida tervikkatsete käigus analüüsida. Tervikkatsetes kasutatavad lahjendused peaksid olema 1-, 3-, 10-, 30-, 100-, 300-, 1000- ja 3000-kordsed.

35.

Agonisti- ja antagonistikatse eeskirjad (11) hõlmavad tsütotoksilisuse uurimist. Tsütotoksilisuse katseline kontrollimine on ka eelneva sõelkatse ja tervikkatsete osa. ERα CALUXi biokatsemeetodi valideerimisel tsütotoksilisuse hindamiseks kasutatud meetod oli laktaadi dehüdrogenaasi (LDH) eraldumise katse koos rakkude kvalitatiivse visuaalse kontrolliga (vt liide 4.1) pärast uuritava kemikaaliga töötlemist. Tsütotoksilisuse määramiseks võib kasutada ka muid kvantitatiivseid meetodeid (nt kolorimeetriline (MTT) meetod tetrasooliumiga, või CALUXi tsütotoksilisuse biokatse). Üldiselt loetakse tsütotoksiliseks uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures rakkude eluvõimelisus väheneb rohkem kui 20 % ning mida seetõttu ei saa andmete hindamisel kasutada. LDH eraldumise katse korral loetakse uuritava kemikaali kontsentratsioon tsütotoksiliseks, kui LDH eraldumine on üle 120 %.

Uuritava kemikaaliga kokkupuude ja analüüsiplaadi jaotus

36.

Pärast kolvitäie konfluentse rakukultuuri trüpsineerimist suspendeeritakse rakud uuesti kontsentratsiooniga 1 × 105 rakku/ml östrogeenivabas katsesöötmes. 100 μl uuesti suspendeeritud rakke külvatakse 96 süvendiga mikrotiiterplaadi seesmistesse süvenditesse. Välimised süvendid täidetakse 200 μl fosfaadiga puhverdatud füsioloogilise lahusega (PBS) (vt joonised 1 ja 2). Plaadile külvatud rakke inkubeeritakse 24 tundi CO2-inkubaatoris (5 % CO2, 37 °C, õhuniiskus 100 %).

37.

Pärast inkubeerimist kontrollitakse plaate visuaalselt tsütotoksilisuse (vt liide 4.1), saastumise ja konfluentsuse suhtes. Katse läbiviimiseks kasutatakse ainult neid plaate, millel ei ole märke tsütotoksilisusest ega saastumisest ja mille konfluentsus on vähemalt 85 %. Seesmistest süvenditest eemaldatakse hoolikalt sööde ning asendatakse see 200 μl östrogeenivaba katsesöötmega, mis sisaldab asjakohases seeriana saadud lahjendusastmes etalonaineid, uuritavaid kemikaale, positiivseid ja negatiivseid kontrollaineid ning lahusti kontrollproovi (tabel 5: agonistlike omaduste uuring; tabel 6: antagonistlike omaduste uuring). Kõiki etalonaineid, uuritavaid kemikaale, positiivseid janegatiivseid kontrollproove ning lahusti kontrollproove analüüsitakse kolme paralleelproovina. Joonisel 1 on esitatud plaadi paigutus agonistikatse korral. Joonisel 2 on esitatud plaadi paigutus antagonistikatse korral. Eelneva sõelkatse ja tervikkatsete korral on plaadi paigutus samasugune. Antagonistikatse korral sisaldavad kõik seesmised süvendid peale kandeaine kontrollproovidega süvendite (VC) ka kindlas kontsentratsioonis agonistlikku etalonainet 17β-östradiooli (3 × 10-12 M). Etalonained C8 ja C4 tuleb lisada igale uuritava kemikaali proove sisaldavale plaadile.

38.

Pärast rakkude töötlemist kõigi kemikaalidega inkubeeritakse 96 süvendiga mikrotiiterplaati veel 24 tundi CO2-inkubaatoris (5 % CO2, 37 °C, õhuniiskus 100 %).

Joonis 1.

Proovide paigutus 96 süvendiga mikrotiiterplaadil eelneva sõelkatse ja agonistliku toime hindamise korral.

C0 = etalonaine lahusti.

C(1–8) = etalonaine lahjenduste seeria (1–8, vähimast kontsentratsioonist suurimani).

PC = positiivne kontrollproov.

NC = negatiivne kontrollproov.

TCx-(1–8) = uuritava kemikaali lahjendused (1–8, vähimast kontsentratsioonist suurimani) eelnevaks sõelkatseks ja uuritava kemikaali × agonistliku toime hindamiseks.

SC = uuritava kemikaali lahusti kontrollproov (optimaalne on sama lahusti, mis proovis C0, kuid see võib olla teisest põhilahusest).

Hallid väljad = välimised süvendid, mis täidetakse 200 μl PBSiga.

Joonis 2.

Proovide paigutus 96 süvendiga mikrotiiterplaadil antagonistliku toime uuringule eelneva sõelkatse ja antagonistliku toime hindamise korral.

C0 = etalonaine lahusti.

C(1–8) = etalonaine lahjenduste seeria (1–8, vähimast kontsentratsioonist suurimani).

NC = negatiivne kontrollproov.

PC = positiivne kontrollproov.

TCx-(1–8) = uuritava kemikaali lahjendused (1–8, vähimast kontsentratsioonist suurimani) eelnevaks sõelkatseks ja uuritava kemikaali × agonistliku toime hindamiseks.

SC = uuritava kemikaali lahusti kontrollproov (optimaalne on sama lahusti, mis proovis C0, kuid see võib olla teisest põhilahusest).

VC = kandeaine kontrollproov (lahusti kontroll ilma agonisti etalonaine 17β-östradiooli määratud kontsentratsioonita).

Hallid väljad = välimised süvendid, mis täidetakse 200 μl PBSiga.

Märkus: kõik seesmised süvendid peale kandeaine kontrollproovidega süvendite (VC) sisaldavad ka kindlas kontsentratsioonis agonistlikku etalonainet 17β-östradiooli (3,0 × 10-12 M).

Luminestsentsi mõõtmine

39.

Luminestsentsi mõõtmist on üksikasjalikult kirjeldatud agonisti- ja antagonistikatse eeskirjades (10). Süvenditest eemaldatakse sööde ja rakud lüüsitakse, millele järgneb 24 tundi inkubeerimist, et rakumembraan avaneks ja lutsiferaasi aktiivsust oleks võimalik mõõta.

40.

Luminestsentsi mõõtmiseks on vaja kahe injektoriga luminomeetrit. Lutsiferaasi reaktsioon käivitatakse substraadi lutsiferiini süstimisega. Reaktsioon peatatakse 0,2 M NaOH lisamisega. Reaktsiooni peatatakse, et vältida luminestsentsi ülekandumist ühest süvendist teise.

41.

Igast süvendist eraldunud valgus väljendatakse suhtelistes valgusühikutes (RLU) süvendi kohta.

Eelnev sõelkatse

42.

Eelnevas sõelkatses saadud analüüsitulemusi kasutatakse uuritavate kemikaalide täpsema kontsentratsioonivahemiku määramiseks tervikkatsete jaoks. Eelnevas sõelkatses saadud analüüsitulemuste hindamist ja uuritavate kemikaalide täpsema kontsentratsioonivahemiku määramist tervikkatsete jaoks on süvitsi kirjeldatud agonisti- ja antagonistikatse eeskirjades (10). Siin on esitatud lühikokkuvõte eeskirjadest, mida järgides määratakse uuritavate kemikaalide kontsentratsioonivahemik agonisti- ja antagonistikatse jaoks. Lahjendusteseeria ülesehituse juhised on esitatud tabelites 5 ja 6.

Kontsentratsioonide valimine agonistliku toime hindamiseks

43.

Eelnevas sõelkatses analüüsitakse uuritavaid kemikaale, kasutades tabelites 5 (agonism) ja 6 (antagonism) esitatud lahjendusteseeriaid. Kõiki kontsentratsioone analüüsitakse paralleelproovidena kolmes süvendis vastavalt joonisel 1 (agonism) või 2 (antagonism) esitatud proovide paigutusele plaadil.

44.

Nõuetekohaseks loetakse ainult need analüüsitulemused, mis vastavad nõuetekohasuse kriteeriumidele (tabel 3); sel juhul võib neid kasutada uuritavate kemikaalide esile kutsutud vastuste hindamiseks. Kui üks või mitu mikrotiiterplaati analüüsiseerias ei vasta nõuetekohasuse kriteeriumidele, tuleb vastavaid mikrotiiterplaate uuesti analüüsida. Kui nõuetekohasuse kriteeriumidele ei vasta esimene plaat, mis sisaldab etalonaine lahjenduste täielikku seeriat, tuleb uuesti analüüsida kogu katseseeria (6 plaati).

45.

Uuritavate kemikaalide kontsentratsioonide vahemikku tuleb kohandada ja eelnevat sõelkatset korrata, kui:

—	ilmneb tsütotoksilisus. Eelnevalt sõelkatset tuleb korrata uuritava kemikaali väiksema kontsentratsiooniga, mis ei ole tsütotoksiline;

—	uuritava kemikaali eelnevas sõelkatses ei saa täielikku doosi-vastuse kõverat, sest uuritavad kontsentratsioonid annavad maksimaalse induktsiooni. Eelnevalt sõelkatset tuleb korrata uuritava kemikaali väiksema kontsentratsiooniga.

46.

Kui leitakse nõuetekohane doosi-vastuse seos, tuleb valida (vähim) kontsentratsioon, mille juures saadakse maksimaalne induktsioon ega esine tsütotoksilisust. Tervikkatsetes analüüsitav uuritava kemikaali suurim kontsentratsioon peaks olema kõnealusest valitud kontsentratsioonist 3 korda suurem.

47.

Uuritava kemikaali täielik täpsem lahjenduste seeria valmistatakse tabelis 5 esitatud lahjendusetappide kohaselt, alustatud eespool määratud suurimast kontsentratsioonist.

48.

Uuritavat kemikaali, mille puhul ei ilmne mingit agonistlikku toimet, tuleks tervikkatsetes analüüsida, alustades eelnevas sõelkatses määratud suurima kontsentratsiooniga, mis ei ole tsütotoksiline.

Kontsentratsioonide valimine antagonistliku toime hindamiseks

49.

Nõuetekohaseks loetakse ainult need analüüsitulemused, mis vastavad nõuetekohasuse kriteeriumidele (tabel 4); sel juhul võib neid kasutada uuritavate kemikaalide esile kutsutud vastuste hindamiseks. Kui üks või mitu mikrotiiterplaati analüüsiseerias ei vasta nõuetekohasuse kriteeriumidele, tuleb vastavaid mikrotiiterplaate uuesti analüüsida. Kui nõuetekohasuse kriteeriumidele ei vasta esimene plaat, mis sisaldab etalonaine lahjenduste täielikku seeriat, tuleb uuesti analüüsida kogu katseseeria (6 plaati).

50.

Uuritavate kemikaalide kontsentratsioonide vahemikku tuleb kohandada ja eelnevat sõelkatset korrata, kui:

—	ilmneb tsütotoksilisus. Eelnevalt sõelkatset tuleb korrata uuritava kemikaali väiksema kontsentratsiooniga, mis ei ole tsütotoksiline;

—	uuritava kemikaali eelnevas sõelkatses ei saa täielikku doosi-vastuse kõverat, sest uuritavad kontsentratsioonid annavad maksimaalse inhibitsiooni. Eelnevalt sõelkatset tuleb korrata uuritava kemikaali väiksema kontsentratsiooniga.

51.

Kui leitakse nõuetekohane doosi-vastuse seos, tuleb valida (vähim) kontsentratsioon, mille juures saadakse maksimaalne inhibitsioon ega esine tsütotoksilisust. Tervikkatsetes analüüsitav uuritava kemikaali suurim kontsentratsioon peaks olema kõnealusest valitud kontsentratsioonist 3 korda suurem.

52.

Uuritava kemikaali täielik täpsem lahjenduste seeria valmistatakse tabelis 6 esitatud lahjendusetappide kohaselt, alustatud eespool määratud suurimast kontsentratsioonist.

53.

Uuritavat kemikaali, mille puhul ei ilmne mingit antagonistlikku toimet, tuleks tervikkatsetes analüüsida, alustades eelnevas sõelkatses uuritud suurima kontsentratsiooniga, mis ei ole tsütotoksiline.

Tervikkatsed

54.

Pärast täpsema kontsentratsioonivahemiku valimist analüüsitakse uuritavaid kemikaale tervikkatsetes, kasutades tabelites 5 (agonism) ja 6 (antagonism) esitatud lahjendusteseeriaid. Kõiki kontsentratsioone analüüsitakse paralleelproovidena kolmes süvendis vastavalt joonisel 1 (agonism) või 2 (antagonism) esitatud proovide paigutusele plaadil.

55.

Nõuetekohaseks loetakse ainult need analüüsitulemused, mis vastavad nõuetekohasuse kriteeriumidele (tabelid 3 ja 4); sel juhul võib neid kasutada uuritavate kemikaalide esile kutsutud vastuste hindamiseks. Kui üks või mitu mikrotiiterplaati analüüsiseerias ei vasta nõuetekohasuse kriteeriumidele, tuleb vastavaid mikrotiiterplaate uuesti analüüsida. Kui nõuetekohasuse kriteeriumidele ei vasta esimene plaat, mis sisaldab etalonaine lahjenduste täielikku seeriat, tuleb uuesti analüüsida kogu katseseeria (6 plaati).

Tabel 5.

Etalonainete, kontrollainete ja uuritavate kemikaalide kontsentratsioonid ja lahjendused agonistikatse jaoks

Etalonaine 17β-östradiool		TCx – eelkatse		TCx – tervikkatse		Kontrollproovide
konts. (M)		lahjendus		Lahjendus		konts. (M)
C0	0	TCx-1	10 000 000 ×	TCx-1	3 000 ×	PC	3 × 1006
C1	1 × 10-13	TCx-2	1 000 000 ×	TCx-2	1 000 ×	NC	1 × 10-8
C2	3 × 10-13	TCx-3	100 000 ×	TCx-3	300 ×	C0	0
C3	1 × 10-12	TCx-4	10 000 ×	TCx-4	100 ×	SC	0
C4	3 × 10-12	TCx-5	1 000 ×	TCx-5	30 ×
C5	6 × 10-12	TCx-6	100 ×	TCx-6	10 ×
C6	1 × 10-11	TCx-7	10 ×	TCx-7	3 ×
C7	3 × 10-11	TCx-8	1 ×	TCx-8	1 ×
C8	1 × 10-10
TCx – uuritav kemikaal x PC – positiivne kontrollproov (17α-metüültestosteroon) NC – negatiivne kontrollproov (kortikosteroon) C0 – etalonaine lahusti kontrollproov SC – uuritava kemikaali lahusti kontrollproov

Tabel 6.

Etalonainete, kontrollainete ja uuritavate kemikaalide kontsentratsioonid ja lahjendused antagonistikatse jaoks

Etalonaine tamoksüfeen		TCx – eelkatse		TCx – tervikkatse		Kontrollproovide
konts. (M)		lahjendus		lahjendus		konts. (M)
C0	0	TCx-1	10 000 000 ×	TCx-1	3 000 ×	PC	1 × 10-9
C1	3 × 10-09	TCx-2	1 000 000 ×	TCx-2	1 000 ×	NC	1 × 10-5
C2	1 × 10-08	TCx-3	100 000 ×	TCx-3	300 ×	C0	0
C3	3 × 10-08	TCx-4	10 000 ×	TCx-4	100 ×	SC	0
C4	1 × 10-07	TCx-5	1 000 ×	TCx-5	30 ×
C5	3 × 10-07	TCx-6	100 ×	TCx-6	10 ×	Lisatud agonisti
C6	1 × 10-06	TCx-7	10 ×	TCx-7	3 ×	konts. (M)
C7	3 × 10-06	TCx-8	1 ×	TCx-8	1 ×	17β-östradiool	3 × 10-12
C8	1 × 10-05
TCx – uuritav kemikaal x PC – positiivne kontrollproov (4-hüdroksütamoksüfeen) NC – negatiivne kontrollproov (resveratrool) C0 – etalonaine lahusti kontrollproov SC – uuritava kemikaali lahusti kontrollproov VC – kandeaine kontrollproov (ei sisalda kindlas kontsentratsioonis lisatud agonistlikku etalonainet (17β-östradiool, 3,0 × 10-12 M)

Andmete kogumine ja analüüs

56.

Pärast eelnevat sõelkatset ja tervikkatseid määratakse agonistikatse korral uuritava kemikaali EC10, EC50, PC10, PC50 ning maksimaalset induktsiooni esile kutsuv kontsentratsioon (TCxmax). Antagonistikatse korral arvutatakse IC20, IC50, PC80, PC50 ja minimaalset induktsiooni esile kutsuv kontsentratsioon (TCxmin). Joonistel 3 (agonism) ja 4 (antagonism) on need parameetrid graafiliselt esitatud. Nõutavad parameetrid arvutatakse iga uuritava kemikaali suhtelise induktsiooni (võrreldes etalonaine maksimaalse induktsiooniga (= 100 %)) järgi. Andmete hindamiseks kasutatakse mittelineaarset regressiooni (muutuv tõus, 4 parameetrit) vastavalt järgmisele võrrandile:

Formula

kus:

X = doosi või kontsentratsiooni logaritm

Y = vastus (suhteline induktsioon (%))

Ülemine (platoo) = maksimaalne induktsioon (%)

Alumine (platoo) = minimaalne induktsioon (%)

LogEC50 = logaritm kontsentratsioonist, mille juures täheldati 50 % maksimaalsest vastusest

HillSlope = Hilli tõus (Hilli koefitsient)

57.

Luminomeetrist saadud töötlemata andmed tuleb kanda eelneva sõelkatse ja tervikkatsete jaoks välja töötatud arvutustabelisse. Töötlemata andmed peavad vastama nõuetekohasuse kriteeriumidele, mis on esitatud tabelites 3A ja 3B (antagonism) või 4A ja 4B (antagonism). Kui töötlemata andmed vastavad nõuetekohasuse kriteeriumidele, määratakse nõutavad parameetrid järgmisi arvutusetappi järgides.

Agonism

—	Lahutada etalonaine lahusti kontrollproovi keskmine RLU väärtus etalonainete töötlemata analüüsitulemusest.

—	Lahutada uuritava kemikaali lahusti kontrollproovi keskmine RLU väärtus uuritava kemikaali proovide töötlemata analüüsitulemusest.

—	Arvutada etalonaine iga kontsentratsiooni jaoks suhteline induktsioon. Võtta 100 % induktsiooniks etalonaine suurima kontsentratsiooniga saadud induktsioon.

—	Arvutada uuritava kemikaali iga kontsentratsiooniga seotud suhteline induktsioon võrreldes etalonaine suurima kontsentratsiooniga saadud induktsiooniga (100 %).

—	Hinnata analüüsitulemust mittelineaarse regressiooni (muutuv tõus, 4 parameetrit) alusel.

—	Leida etalonaine EC50 ja EC10.

—	Leida uuritavate kemikaalide EC50 ja EC10.

—	Leida uuritava kemikaali maksimaalne suhteline induktsioon (TCmax).

—	Leida uuritavate kemikaalide PC10 ja PC50.

Uuritavate kemikaalide puhul ei ole näiteks tsütotoksilisuse või lahustuvusprobleemide tõttu võimalik alati täielikku doosi-vastuse kõverat leida. Sel juhul ei saa EC50, EC10 ja PC50 leida. Siis saab leida üksnes PC10 ja TCmax.

Antagonism

—	Lahutada etalonaine suurima kontsentratsiooniga saadud keskmine RLU väärtus etalonainete töötlemata analüüsitulemusest.

—	Lahutada etalonaine suurima kontsentratsiooniga saadud keskmine RLU väärtus uuritavate kemikaalide töötlemata analüüsitulemusest.

—	Arvutada etalonaine iga kontsentratsiooni jaoks suhteline induktsioon. Võtta 100 % induktsiooniks etalonaine vähima kontsentratsiooniga saadud induktsioon.

—	Arvutada uuritava kemikaali iga kontsentratsiooniga seotud suhteline induktsioon võrreldes etalonaine vähima kontsentratsiooniga saadud induktsiooniga (100 %).

—	Hinnata analüüsitulemust mittelineaarse regressiooni (varieeruv tõus, 4 parameetrit) alusel.

—	Leida etalonaine IC50 ja IC20.

—	Leida uuritavate kemikaalide IC50 ja IC20.

—	Leida uuritava kemikaali minimaalne suhteline induktsioon (TCmin).

—	Leida uuritavate kemikaalide PC80 ja PC50.

Joonis 3.

Agonistikatsega leitud parameetrite ülevaade

EC10 = aine kontsentratsioon, mille juures täheldati 10 % selle maksimaalsest vastusest.

EC50 = aine kontsentratsioon, mille juures täheldati 50 % selle maksimaalsest vastusest.

PC10 = uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures vastus on võrdne etalonaine EC10 väärtusega.

PC50 = uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures vastus on võrdne etalonaine EC50 väärtusega.

TCxmax = uuritava kemikaali maksimaalne suhteline induktsioon.

Joonis 4.

Antagonistikatsega leitud parameetrite ülevaade

IC20 = aine kontsentratsioon, mille juures täheldati 80 % selle maksimaalsest vastusest (20 % inhibeerimine).

IC50 = aine kontsentratsioon, mille juures täheldati 50 % selle maksimaalsest vastusest (50 % inhibeerimine).

PC80 = uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures vastus on võrdne etalonaine IC20 väärtusega.

PC50 = uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures vastus on võrdne etalonaine IC50 väärtusega.

TCxmin = uuritava kemikaali minimaalne suhteline induktsioon.

Uuritavate kemikaalide puhul ei ole näiteks tsütotoksilisuse või lahustuvusprobleemide tõttu võimalik alati täielikku doosi-vastuse kõverat leida. Sel juhul ei saa IC50, IC20 ja PC50 leida. Siis saab leida üksnes PC20 ja TCmin.

58.

—	vastama nõuetekohasuse kriteeriumidele (vt nõuetekohasuse kriteeriumid punktides 14-22),

—	olema korratavad.

Andmete tõlgendamise kriteeriumid

59.

Andmete tõlgendamiseks ja otsustamiseks, kas uuritav kemikaal lugeda positiivseks või negatiivseks, kasutatakse järgmisi kriteeriume.

Agonism

Iga tervikkatse korral loetakse uuritav kemikaal positiivseks, kui:

1.	TCmax on suurem kui 10 % etalonainega (REF10) saadud maksimaalsest vastusest või sellega võrdne.

2.	Vähemalt kaks uuritava kemikaali kontsentratsiooniga saadud tulemust on suuremad kui REF10 või sellega võrdsed.

Iga tervikkatse korral loetakse uuritav kemikaal negatiivseks, kui:

1.	TCmax ei ületa 10 % etalonainega (REF10) saadud maksimaalsest vastusest.

2.	Vähem kui kahe uuritava kemikaali kontsentratsiooniga saadud tulemused on suuremad kui REF10 või sellega võrdsed.

Antagonism

Iga tervikkatse korral loetakse uuritav kemikaal positiivseks, kui:

1.	TCmin on väiksem kui 80 % etalonainega (REF80 = 20 % inhibeerimine) saadud maksimaalsest vastusest või sellega võrdne.

2.	Vähemalt kaks uuritava kemikaali kontsentratsiooniga saadud tulemust on väiksemad kui REF80 või sellega võrdsed.

Iga tervikkatse korral loetakse uuritav kemikaal negatiivseks, kui:

1.	TCmin on suurem kui 80 % etalonainega (REF80 = 20 % inhibeerimine) saadud maksimaalsest vastusest.

2.	Vähem kui kahe uuritava kemikaali kontsentratsiooniga saadud tulemused on väiksemad kui REF80 või sellega võrdsed.

60.

Selleks, et iseloomustada uuritava kemikaali võimet kutsuda esile positiivset vastust, tuleb katseprotokolli kanda toime suurusjärk (agonism: TCmax; antagonism: TCmin) ning kontsentratsioon, mille juures toime avaldub (agonism: EC10, EC50, PC10, PC50; antagonism: IC20, IC50, PC80, PC50).

KATSEPROTOKOLL

61.

Vt punkti 20 jaotises „ER TA katsemeetodi osad“.

KIRJANDUS

(1)

OECD (2016), „Draft Validation report of the (anti-) ERα CALUX bioassay - transactivation bioassay for the detection of compounds with (anti)estrogenic potential“, Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 240), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(2)	Sonneveld, E., Jansen, H. J., Riteco, J. A., Brouwer, A., van der Burg, B. (2005), „Development of androgen- and estrogen-responsive bioassays, members of a panel of human cell line-based highly selective steroid-responsive bioassays“, Toxicol Sci., nr 83(1), lk 136–148.

(3)

Quaedackers, M. E., van den Brink, C. E., Wissink, S., Schreurs, R. H. M. M., Gustafsson, J. A., van der Saag, P. T. ja van der Burg, B. (2001), „4-Hydroxytamoxifen trans-represses nuclear factor-kB Activity in human osteoblastic U2OS cells through estrogen receptor (ER)α and not through ERβ“, Endocrinology, nr 142(3), lk 1156–1166.

(4)	Thorne, N., Inglese, J. ja Auld, D. S. (2010), „Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology“, Chemistry and Biology, nr 17(6), lk 646–57.

(5)	Escande, A., Pillon, A., Servant, N., Cravedi, J. P., Larrea, F., Muhn, P., Nicolas, J. C., Cavaillès, V. ja Balaguer, P.(2006), „Evaluation of ligand selectivity using reporter cell lines stably expressing estrogen receptor alpha or beta“, Biochem. Pharmacol., nr 71, lk 1459–1469.

(6)	Kuiper, G. G., Lemmen, J. G., Carlsson, B., Corton, J. C., Safe, S. H., van der Saag, P. T., van der Burg, B. ja Gustafsson, J. A. (1998), „Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta“, Endocrinol., nr 139, lk 4252–4263.

(7)

Sotoca, A. M., Bovee, T. F. H., Brand, W., Velikova, N., Boeren, S., Murk, A.J., Vervoort, J., Rietjens, I. M. C. M. (2010), „Superinduction of estrogen receptor mediated gene expression in luciferase based reporter gene assays is mediated by a post-transcriptional mechanism“, J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., nr 122, lk 204–211.

(8)	Sonneveld, E., Riteco, J. A. C., Jansen, H. J., Pieterse, B., Brouwer, A., Schoonen, W. G. ja van der Burg, B. (2006), „Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities“, Toxicol. Sci., nr 89(1), lk 173–187.

(9)	Kobayashi, H., Yamamoto, K., Eguchi, M., Kubo, M., Nakagami, S., Wakisaka, S., Kaizuka, M. ja Ishii, H. (1995), „Rapid detection of mycoplasma contamination in cell cultures by enzymatic detection of polymerase chain reaction (PCR) products“, J. Vet. Med. Sci., nr 57(4), lk 769–771.

(10)	Zhang, J.-H., Chung, T. D. Y. ja Oldenburg, K. R. (1999), „A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throuphut screening assays“, J. Biomol. Scr., nr 4, lk 67–73.

(11)	Besselink, H., Middelhof, I. ja Felzel, E. (2014), „Transactivation assay for the detection of compounds with (anti)estrogenic potential using ERα CALUX cells“. BioDetection Systems BV (BDS), Amsterdam, Madalmaad.

Liide 4.1

RAKKUDE ELUVÕIMELISUSE VISUAALNE KONTROLL

B.67 TÜMIDIINI KINAASI GEENIL PÕHINEVAD IN VITRO GEENIMUTATSIOONIKATSED IMETAJARAKKUDEGA

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 490 (2016). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi ja täiendatakse, et võtta arvesse teaduse arengut, regulatiivseid vajadusi ja loomade heaolu. Hiire lümfoomi katse (MLA) ja TK6-katse, milles kasutatakse tümidiini kinaasi (TK) lookust, olid varem hõlmatud katsemeetodiga B.17. Genotoksilisuse uuringute rahvusvahelise seminari (IWGT) MLA ekspertide töörühm on välja töötanud rahvusvaheliselt ühtlustatud soovitused katsemeetodi nõuetekohasuse kriteeriumide ja andmete tõlgendamise kohta MLA korral (1, 2, 3, 4, 5) ja need soovitused on hõlmatud käesoleva uue katsemeetodiga B.67. Käesoleva katsemeetod on kirjutatud MLA jaoks, samuti TK6-katse jaoks, kuna viimases kasutatakse samuti TK lookust. Kuigi MLAd on regulatiivsel eesmärgil laialdaselt kasutatud, on TK6 kasutus palju harvem. Näitajate sarnasusest hoolimata ei ole kaks rakuliini üksteisega asendatavad ning regulatiivsetes kavades võidakse õiguspäraselt väljendada konkreetse regulatiivse eesmärgiga seoses eelistust ühe või teise katse suhtes. Näiteks on MLA valideerimine tõendanud selle sobivust mitte üksnes geenimutatsioonide tuvastamiseks, vaid ka selle kindlakstegemiseks, kas uuritav kemikaal võib indutseerida struktuurse kromosoomiaberratsiooni. Käesolev katsemeetod kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. OECD on välja töötanud dokumendi, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia valdkonna katsete kohta ning ülevaade genotoksilisust käsitlevates OECD katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (6).

Käesoleva meetodi kohaste imetajarakkudega läbi viidavate in vitro geenimutatsioonikatsete eesmärk on tuvastada kemikaalide põhjustatud geenimutatsioone. Kõnealustes katsetes kasutatakse rakuliine, mis võimaldavad tuvastada otsemutatsioone reportergeenides, täpsemalt endogeenses tümidiini kinaasi geenis (inimese rakkudes TK ja näriliserakkudes Tk, käesolevas katsemeetodis viidatakse neile koos kui geenile TK). Käesolev katsemeetod on ette nähtud kasutamiseks kahe rakuliiniga: hiire lümfoomi rakuliin the L5178Y TK+/--3.7.2C (üldise nimetusega L5178Y) ja inimese lümfoblastoidi rakuliin TK6 (üldise nimetusega TK6). Kuigi kahe rakuliini päritolu, rakkude kasvamine, p53-staatus jms varieerub, saab TK-geenimutatsioonikatsed mõlema rakutüübiga läbi viia sarnasel viisil, nagu käesolevas katsemeetodis kirjeldatud.

Tümidiini kinaasi geeni autosoomsus ja heterosügootsus võimaldavad tuvastada eluvõimelisi kolooniaid, mille rakkudel esineb ensüümi tümidiini kinaasi defitsiit mutatsiooni TK+/- –> TK-/- tagajärjel. Kõnealune defitsiit võib olla TK-geeni mõjutavate sündmuste tagajärg, kusjuures sündmusteks võivad olla nii geenimutatsioonid (punktmutatsioonid, raaminihkemutatsioonid, väikesed deletsioonid jms) kui ka kromosoomidega toimuvad sündmused (suured deletsioonid, kromosoommutatsioonid ja mitootiline rekombinatsioon). Viimased sündmused väljenduvad heterosügootsuse kaoga, mis on tuumorsupressorgeeni tavaline geneetiline muutus inimesel kasvaja tekke puhul. Teoreetiliselt saab MLAga tuvastada mitoosikäävi kahjustusest ja/või mitootilisest mittelahknemisest põhjustatud terve TK-geeni kandva kromosoomi kadu. Kombineeritud tsütogeneetiline ja molekulaaranalüüs näitavad tõepoolest selgesti, et MLA TK-mutandid on mittelahknemise tagajärg. Kuid tõendite kaalukusest nähtub, et TK-geenimutatsioonikatsetega ei ole võimalik usaldusväärselt tuvastada aneugeene, kui kohaldatakse standardseid tsütotoksilisuse kriteeriume (nagu käesolevas katsemeetodis kirjeldatud), ning seetõttu ei sobi nimetatud katsed aneugeenide tuvastamiseks (7, 8, 9).

TK-geenimutatsioonikatsetes luuakse kaks erinevat TK-mutantide fenotüübiklassi; normaalse kasvuga mutandid, mis kasvavad sama kiirusega nagu TK heterosügootsed rakud, ning aeglase kasvuga mutandid, mille kasvamisel on populatsiooni kahekordistumisaeg pikenenud. Normaalse kasvuga ja aeglase kasvuga mutante nimetatakse MLA korral suurte kolooniate ja väikeste kolooniatega mutantideks ning TK6 korral vara tekkivate kolooniate ja hilja tekkivate kolooniatega mutantideks. Nii suurte kui ka väikeste kolooniatega MLA mutantide molekulaarset ja tsütogeneetilist olemust on uuritud täpsemalt (8, 10, 11, 12, 13). Vara tekkivate kolooniate ja hilja tekkivate kolooniatega TK6 mutantide molekulaarset ja tsütogeneetilist olemust on samuti täpsemalt uuritud (14, 15, 16, 17). Mõlemat tüüpi rakkude aeglase kasvuga mutandid on saanud geneetilise kahjustuse, mis hõlmab oletatavat/oletatavaid kasvu regulaatorgeeni või -geene TK-lookuse lähedal, mille tulemusena kahekordistumise aeg pikeneb ja kolooniad moodustuvad hiljem või on väikesed (18). Aeglase kasvuga mutantide tekkimist on seostatud kemikaalidega, mis põhjustavad suuri struktuurimuutusi kromosoomi tasandil. Rakud, mille kahjustus ei hõlma oletatavat/oletatavaid kasvu regulaatorgeeni või -geene TK-lookuse lähedal, kasvavad vanemrakkudele sarnase kiirusega ja neist saavad normaalse kasvuga mutandid. Peamiselt normaalse kasvuga mutantide tekkimist on seostatud kemikaalidega, mis toimivad peamiselt punktmutageenidena. Sellest tulenevalt on oluline loendada nii aeglase kui ka normaalse kasvuga mutante, et leida kõik mutandid ja saada ülevaade uuritava kemikaali põhjustatud kahjustuste liigist või liikidest (mutageenid vs. klastogeenid) (10, 12, 18, 19).

Katsemeetod on koostatud nii, et see annaks üldist teavet nii MLA kui ka TK6 kohta ning spetsiifilisi suuniseid kummagi katse kohta eraldi.

Kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

In vitro katsete puhul tuleb metabolismi aktiveerimiseks üldjuhul kasutada eksogeenset allikat. Eksogeenne metabolismi aktiveerimise süsteem ei võimalda täielikult matkida in vivo tingimusi.

Tuleks hoiduda kasutamast tingimusi, mille puhul võib saada valepositiivseid tulemusi, mis ei ole põhjustatud uuritava kemikaali interaktsioonist raku geneetilise materjaliga (st võib esineda vastastikmõju katsesüsteemiga); sellised tingimused hõlmavad pH või osmolaalsuse muutusi, söötme koostisosadega reageerimist (20, 21) või liiga suurt tsütotoksilisust (22, 23, 24). MLA ja TK6-katse puhul loetakse liiga suureks tsütotoksilisuseks punktis 28 määratletud soovitatavat suurimat tsütotoksilisuse määra ületavat tsütotoksilisust. Lisaks tuleb tähelepanu pöörata sellele, et uuritavad kemikaalid, mis on tümidiini analoogid või käituvad sellisena, võivad raku töötlemise ajal suurendada muteerumissagedust muude spontaansete mutantide selektiivse kasvu teel ning nende nõuetekohaseks hindamiseks tuleb kasutada täiendavaid katsemeetodeid (25).

Tehislike nanomaterjalide uurimiseks võib olla vaja käesolevat katsemeetodit kohandada, kuid neid kohandusi ei ole käesolevas katsemeetodis kirjeldatud.

10.

Enne kui kasutada käesolevat meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud.

11.

Muteerunud rakud, millel TK +/- —> TK -/--mutatsiooni tulemusel puudub ensüümi tümidiini kinaasi aktiivsus, on resistentsed pürimidiini analoogi trifluorotümidiini (TFT) tsütotoksiliste mõjude suhtes. Rakud, kus on olemas TK, on tundlikud TFT suhtes, mis pärsib rakkude ainevahetust ja peatab rakkude edasise jagunemise. Seega on muteerunud rakud võimelised TFT juuresolekul paljunema ja nähtavaid kolooniaid moodustama, kuid ensüümi TK sisaldavad rakud seda ei suuda.

KATSE PÕHIMÕTE

12.

Rakususpensioon viiakse sobivaks ajavahemikuks (vt punkt 33) kokkupuutesse uuritava kemikaaliga – nii koos metabolismi aktiveeriva eksogeense allikaga kui ka ilma selleta (vt punkt 19) – ning seejärel külvatakse rakud ümber, et hinnata tsütotoksilisust ja võimaldada fenotüübi avaldumist enne mutantide selekteerimist. Tsütotoksilisuse hindamiseks kasutatakse MLA korral suhtelist kogukasvu (vt punkt 25) ja TK6 korral suhtelist ellujäämust (vt punkt 26). Töödeldud kultuure hoitakse söötmes piisava aja jooksul, mis on iseloomulik igale rakutüübile (vt punkt 37), võimaldamaks saavutatud mutatsioonide fenotüüpide avaldumist võimalikult lähedal optimaalsele tasemele. Fenotüübi avaldumise järgselt külvatakse teadaolev arv rakke muteerumissageduse määramiseks nii söötmesse, mis sisaldab muteerunud kolooniate tuvastamist võimaldavat selektiivainet, kui ka selektiivaineta söötmesse, et teha kindlaks kloonimistõhusus (eluvõimelisus). Sobiva inkubatsiooniperioodi lõppedes kolooniad loendatakse. Muteerumissagedus arvutatakse muteerunud kolooniate arvu põhjal, mida on korrigeeritud lähtuvalt kloonimistõhususest mutantide selekteerimise ajal.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistused

Rakud

13.

MLA korral: kuna MLA on välja töötatud L5178Y rakkude alaliini TK +/- -3.7.2C kasutades ning selle kasutamine seda katsemeetodit iseloomustab, tuleb MLA korral kasutada seda konkreetset alaliini. Rakuliin L5178Y on saadud DBA-2 hiire tüümuse lümfoomist, mille on esile kutsunud metüülkolantreen (26). Clive ja kaastöötajad töötlesid L5178Y rakke (Clive'i tähistus TK+/+ -3) etüülmetaansulfonaadiga ja eraldasid TK-/- (tähistus TK-/- -3.7) klooni, kasutades selektiivainena bromodeoksüuridiini. TK-/- kloonist eraldati spontaanne TK+/- kloon (tähistus TK+/- -3.7.2.) ja alamkloon (tähistus TK+/--3.7.2C) ning iseloomustati neid MLAs kasutamiseks sobivana (27). Rakuliini karüotüüp on avaldatud (28, 29, 30, 31). Modaalne kromosoomiarv on 40. Leidub üks metatsentrilinekromosoom (t12;13), mis tuleb loendada ühe kromosoomina. Hiire TK lookus asub kromosoomi 11 distaalses otsas. Rakuliinil L5178Y TK +/- -3.7.2C on mutatsioonid mõlemas p53 alleelis ning see toodab muteerunud p53 valku (32, 33). TK+/--3.7.2C rakuliini p53 seisund mõjutab tõenäoliselt seda, kuidas on katsega võimalik tuvastada ulatuslikke kahjustusi (17).

14.

TK6 korral: TK6 on inimese lümfoblastoidi rakuliin. Vanemrakuliin on Epstein-Barri viiruse toimel transformeerunud rakuliin WI-L2, mis algselt saadi päriliku sferotsütoosiga 5aastaselt meesisikult. Esimene isoleeritud kloon HH4 mutageniseeriti ICR191ga ja saadi TK heterosügootne rakuliin TK6 (34). TK6 rakud on peaaegu diploidsed ja esindav karüotüüp on 47, XY, 13+, t(14; 20), t(3; 21) (35). Inimese TK lookus asub kromosoomi 17 pikas õlas. TK6 on p53 sisaldav rakuliin, sest selle mõlemas alleelis on metsiktüüpi p53 järjestus ning see ekspresseerib üksnes metsiktüüpi p53 valku (36).

15.

Nii MLA kui ka TK6 puhul on soovitatav, et katselabor rakkude tüvikultuuri luues või uuendades veenduks Mycoplasma puudumises, kontrolliks rakkude karüotüüpi või värviks TK lookusega kromosoomid ning kontrolliks populatsiooni kahekordistumise aegu. Katselaboris kasutatavate rakkude puhul tuleb teha kindlaks normaalne rakutsükliks kuluv aeg ja see peab vastama rakkude kohta avaldatud iseloomulikele näitajatele (16, 19, 37). Tüvikultuuri säilitatakse –150 °C juures või madalamal temperatuuril ning kasutatakse kõigi rakkude töökultuuride valmistamiseks.

16.

Enne suure hulga krüosäilitatud töökultuuride valmistamist või otse enne katses kasutamist võib olla vajalik puhastada kultuur eelnevalt leiduvatest muteerunud rakkudest (kui lahusti kontrollproovi muteerumissagedus (MF) jääb juba lubatavatesse piiridesse – vt tabel 2 MLA kohta). Selleks kasutatakse metotreksaati (aminopteriini), et selekteerida rakud, mis ei ole TK defitsiidiga, ning lisatakse kultuurile tümidiini, hüpoksantiini ja glütsiini (L5178Y) või 2’-deoksütsütidiini (TK6), et tagada TK sisaldusega rakkude optimaalne kasv (19, 38, 39) (ja TK6 kohta (40)). Üldised nõuanded rakukultuuride säilitamise hea tava kohta ning konkreetsed nõuanded L5178Y ja TK6 rakkude kohta on esitatud allikates (19, 31, 37, 39, 41). Laboritele, kus on vaja tüvikultuure MLA või TK6 alustamiseks või uusi tüvikultuure, on ligipääsetav hästi iseloomustatud rakkudega rakupank (37).

Söötmed ja kultiveerimistingimused

17.

Mõlema katsemeetodi korral tuleks rakukultuuride kasvatamisel kasutada sobivat söödet ja sobivaid inkubeerimistingimusi (nt kasvunõud, 5 % CO2-sisaldusega niiske atmosfäär, inkubeerimistemperatuur 37 °C). Kultiveerimisel tuleks alati järgida tingimusi, millega tagatakse rakkude püsimine logaritmilises kasvufaasis. On väga oluline valida söötmed ja kasvutingimused nii, et oleks tagatud rakkude optimaalne kasv ekspressiooniperioodil ning optimaalne kloonimine nii muteerunud kui ka muteerumata rakkude puhul. MLA ja TK6 korral on oluline ka see, et kultiveerimistingimused tagaksid nii suurte / vara tekkivate kolooniatega kui ka väikeste / hilja tekkivate kolooniatega Tk mutantide optimaalse kasvu. Rohkem üksikasju kultiveerimise, kaasa arvatud vajaduse kohta hobuseseerum soojusega korralikult inaktiveerida, kui kasutatakse RPMI söödet, on leitavad allikatest (19, 31, 38, 39, 40, 42).

Rakukultuuride ettevalmistamine

18.

Rakkude paljundamiseks tüvikultuurist külvatakse need söötmesse sellise tihedusega, et rakkude eksponentsiaalne kasv suspensioonis jätkuks kogu töötlemis- ja ekspressiooniperioodi vältel.

Metabolismi aktiveerimine

19.

L5178Y jaTK6 rakkude kasutamise korral tuleks kasutada eksogeenseid metabolismisüsteeme, sest nende rakkude endogeenne metaboliseerimisvõime on ebapiisav. Kui ei ole teisiti põhjendatud, soovitatakse vaikevalikuna kõige sagedamini kasutatavat süsteemi, milleks on näriliste (tavaliselt roti) maksast valmistatud postmitokondriline fraktsioon S9, millele on lisatud kofaktor ning mida on töödeldud ensüümide induktoritega, nagu Aroclor 1254 (43, 44, 45) või fenobarbitaali ja β-naftoflavooni kombinatsiooniga (46, 47, 48, 49, 50, 51). Viimati nimetatud kombinatsiooni kasutamine ei ole vastuolus püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsiooniga (52) ning seeon osutunud segafunktsiooniga oksüdaaside induktorina sama tõhusaks kui Aroclor 1254 (45, 46, 47, 48, 49). S9-fraktsiooni kasutatakse tavaliselt kontsentratsioonivahemikus 1–2 % (mahuprotsent), kuid lõplikus katsesöötmes võib kontsentratsiooni suurendada kuni 10 %-ni (mahuprotsent). Kasutatava eksogeense metabolismi aktiveerimise süsteemi või ensüümiinduktori liigi ja kontsentratsiooni valikut võib mõjutada uuritava kemikaali klass.

Uuritava kemikaali ettevalmistamine

20.

Enne rakkude töötlemist tuleks tahke uuritav kemikaal lahustada sobivas lahustis ja vajaduse korral tuleks saadud lahust lahjendada (vt punkt 21). Vedelat uuritavat kemikaali võib lisada otse katsesüsteemi või seda enne lisamist lahjendada. Gaasilise või lenduva kemikaali kasutamisel tuleks standardmeetodit asjakohaselt muuta, näiteks viia kemikaaliga töötlemine läbi suletud kultiveerimisnõus (53, 54, 55). Uuritav kemikaal tuleks katseks ette valmistada vahetult enne kasutamist, välja arvatud juhul, kui püsivuse andmetest nähtub, et kemikaali säilitamine on vastuvõetav.

KATSETINGIMUSED

Lahustid

21.

Lahusti tuleks valida nii, et oleks tagatud uuritava kemikaali optimaalne lahustumine, kuid lahusti ei mõjutaks samal ajal negatiivselt katse käiku näiteks rakkude kasvukiiruse või uuritava kemikaali omaduste muutmise, kultiveerimisnõuga reageerimise või metabolismi aktiveerimise süsteemi kahjustamise teel. Esmajärjekorras soovitatakse võimaluse korral kaaluda veepõhise lahusti (või söötme) kasutamist. Tavalised lahustid on näiteks vesi või dimetüülsulfoksiid. Üldjuhul ei tohiks töötlusetapis kasutatavas lõppsöötmes orgaanilise lahusti sisaldus ületada 1 % (mahuprotsent) ja veepõhise lahusti (füsioloogiline lahus või vesi) sisaldus ei tohiks ületada 10 % (mahuprotsent). Kui kasutatakse muid kui tavaliselt kasutatavaid lahusteid (nt etanooli või atsetooni), tuleb nende kasutamiseks esitada andmed, millest nähtub nende kokkusobivus uuritava kemikaali ja katsesüsteemiga ning genotoksilise toime puudumine kasutatava kontsentratsiooni juures. Selliste tõendavate andmete puudumisel on oluline lisada katsesse kemikaaliga töötlemata kontrollproovid (vt 1. liide, määratlused), et tõendada valitud lahustist tuleneva kahjuliku või mutageense toime puudumist.

TSÜTOTOKSILISUSE MÕÕTMINE JA TÖÖTLEMISKONTSENTRATSIOONIDE VALIMINE

22.

Uuritava kemikaali suurima kontsentratsiooni valimisel tuleks hoiduda valimast kontsentratsiooni, mille puhul on võimalik saada valepositiivseid tulemusi, näiteks tulenevalt liiga suurest tsütotoksilisusest (vt punkt 28), söötmes sadenemisest (vt punkt 29) või pH või osmolaalsuse olulisest muutumisest (vt punkt 8). Kui uuritav kemikaal muudab lisamise hetkel oluliselt söötme pH-d, võib pH reguleerimiseks lisada töötlemiseks kasutatavasse lõppsöötmesse puhvrit, et hoida ära valepositiivsete tulemuste saamist ja säilitada sobivad kultiveerimistingimused.

23.

Kontsentratsioonide valimisel lähtutakse tsütotoksilisusest ja muudest kaalutlustest (vt punktid 27–30). Ehkki tsütotoksilisuse hindamine eelkatses võib põhikatses kasutatavate kontsentratsioonide täpsemaks kindlakstegemiseks kasulikuks osutuda, ei ole eelkatse tegemine kohustuslik. Põhikatses on tsütotoksilisuse mõõtmine igas kultuuris vajalik ka juhul, kui tsütotoksilisust on eelnevalt juba hinnatud. Kui tehakse vahemiku leidmise katse, peab see hõlmama suurt kontsentratsioonide vahemikku ning selle võib lõpetada kas 1. päeval pärast töötlemist või pikendada seda ekspresseerimiseni ja mutantide selekteerimiseni 2. päeval (kui selgub, et kasutatavad kontsentratsioonid on selleks sobivad).

24.

Tsütotoksilisust tuleks määrata iga üksiku katsekultuuri ja kontrollkultuuri puhul: MLA (2) ja TK6 (15) korral kasutatavad meetodid on määratletud rahvusvaheliselt kokkulepitud tavaga.

25.

Nii MLA agari- kui ka mikrotiiterplaadi variandi korral: tsütotoksilisuse hindamiseks tuleks kasutada suhtelist kogukasvu, mille määratlesid esmakordselt Clive ja Spector 1975. aastal (2). See näitaja hõlmab suhtelist suspensioonikasvu (katsekultuur vs. lahusti kontrollproov) rakkude töötlemise ajal, ekspresseerimisaega ja kloonimise suhtelist tõhusust (katsekultuur vs. lahusti kontrollproov) mutantide selekteerimise ajal (2). Tuleks võtta arvesse, et suhteline suspensioonikasv hõlmab igasugust rakkude arvu võimalikku vähenemist, mis töötlemise ajal katsekultuuris tekib (vt valemid 2. liites).

26.

TK6 korral: tsütotoksilisuse hindamiseks tuleks kasutada suhtelist ellujäämust, st võrrelda vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhusust, mida on kohandatud rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise ajal, negatiivsete kontrollproovidega, mille ellujäämuseks loetakse 100 % (vt valem 2. liites).

27.

Kemikaali tuleks hinnata vähemalt neljal nõuetekohasuse kriteeriumidele (sobiv tsütotoksilisuse määr, rakkude arv jne) vastaval katsekontsentratsioonil (see ei hõlma lahusti kontrollproovi ega positiivseid kontrollproove). Katse läbiviimisel on soovitatav kasutada iga katsekontsentratsiooni puhul kahte paralleelkultuuri, ent võib kasutada ka suuremat arvu paralleelkultuure või ühteainsat kultuuri. Iga kontsentratsiooni puhul tuleks paralleelkultuuridega saadud tulemused esitada eraldi, kuid andmeanalüüsi jaoks võib need koondada (55). Uuritavate kemikaalide puhul, mille tsütotoksilisus on väike või millel see puudub, sobivad tavaliselt kontsentratsioonid, mis erinevad üksteisest umbes kaks kuni kolm korda. Tsütotoksilisuse avaldumise korral, tuleb kontsentratsioonid valida nii, et need kataksid tsütotoksilisuse vahemiku alates kontsentratsioonist, mille juures avaldub tsütotoksilisus (nagu on kirjeldatud punktis 28), ja hõlmama kontsentratsioonid, mille juures esineb mõõdukas ja väike (või olematu) tsütotoksilisus. Paljudel uuritavatel kemikaalidel on kontsentratsiooni-vastuse kõver järsu tõusuga ning tsütotoksilisuse täieliku vahemiku katmiseks või kontsentratsioonist-vastuse sõltuvuse üksikasjalikuks uurimiseks võib olla vaja kasutada üksteisest vähem erinevaid kontsentratsioone ja enam kui nelja kontsentratsiooni, eriti olukorras, kus on vaja teha korduskatse (vt punkt 70). Enam kui nelja kontsentratsiooni kasutamine võib osutuda eriti oluliseks, kui kasutatakse ühteainsat kultuuri.

28.

Kui suurima kontsentratsiooni valimisel lähtutakse tsütotoksilisusest, tuleks suurim kontsentratsioon valida nii, et MLA puhul saavutataks suhteline kogukasv 10–20 % ning TK6 puhul suhteline ellujäämus 10–20 % (punkt 67).

29.

Raskesti lahustuva uuritava kemikaali puhul, mis ei ole tsütotoksiline kontsentratsioonidel, mis on väiksemad kui vähim kontsentratsioon, mille juures kemikaal ei lahustu, peaks suurimal analüüsitaval kontsentratsioonil olema pärast uuritava kemikaaliga töötlemise lõppemist täheldatav hägusus või silma või invertmikroskoobiga nähtav sade. Isegi kui tsütotoksilisus avaldub suuremal kontsentratsioonil kui vähim kontsentratsioon, mille juures kemikaal ei lahustu, on soovitatav teha katse ainult ühe sellise kontsentratsiooniga, mille juures tekib hägusus või nähtav sade, sest sade võib toimet moonutada. Kuna MLA ja TK6 korral kasutatakse suspendeeritud kultuure, tuleb eriti hoolikalt veenduda, et sade ei mõjuta katse käiku. Enne katse alustamist võib olla kasulik määrata ka kemikaali lahustuvus söötmes.

30.

Kui ei täheldata ei sadet ega liigset tsütotoksilisust, peaks suurim katsekontsentratsioon olema vähim järgmistest kontsentratsioonidest: 10 mM, 2 mg/ml või 2 μl/ml (57, 58). Kui uuritava kemikaali koostis ei ole määratav, näiteks kui see on tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal (UVCB), keskkonnast saadud ekstrakt vms, võib juhul, kui ei täheldata kemikaali piisavat tsütotoksilisust, olla vaja selle iga koostisosa kontsentratsiooni suurendamiseks kasutada suuremat maksimumkontsentratsiooni (nt 5 mg/ml). Tuleks siiski märkida, et inimravimite puhul võivad need nõuded olla teistsugused (59).

Kontrollproovid

31.

Iga katserežiimi puhul tuleks kasutada paralleelseid negatiivseid kontrollproove (vt punkt 21), mis koosnevad üksnes töötlemiseks kasutatavale söötmele lisatud lahustist ja mida käideldakse samamoodi kui töödeldud kultuure.

32.

Paralleelseid positiivseid kontrollproove on vaja, et tõendada labori pädevust kasutatud katsemetoodika tingimustel määrata mutageene ja eksogeense metaboolse aktivatsiooni süsteemi tõhusust (kui asjakohane) ning tõendada suutlikkust nii väikeste / hilja tekkivate kui ka suure / vara tekkivate TK mutantide piisaval tuvastamisel. Positiivsete kontrollainete näited on esitatud allpool tabelis 1. Kui see on põhjendatud, võib positiivse kontrollainena kasutada mõnda muud ainet. Kuna in vitro genotoksilisuse katsed imetajarakkudega on piisavalt standarditud lühiajaliste (3–4 tundi) töötluste puhul, mis tehakse paralleelkatsetena metaboolse aktivatsiooniga või ilma selleta, kasutades sama kestusega töötlust, võib positiivse kontrollproovi osas piirduda metaboolset aktiveerimist vajava mutageeniga. Sel juhul võimaldab üheainsa kõnealuse positiivse kontrollprooviga saadud tulemus tõendada nii metabolismi aktiveerimise süsteemi toimimist kui ka katsesüsteemi reageerimisvõimet. Pikaajalise töötluse jaoks (st 24 tundi ilma S9-fraktsioonita), kui seda kasutatakse, peab siiski olema oma positiivne kontrollproov, sest töötluse kestus erineb sellest, mida kasutatakse metaboolse aktivatsiooniga katses. Iga positiivset kontrollainet puhul tuleks kasutada ühes või mitmes kontsentratsioonis, mille juures võib eeldada, et saadakse korratavad ja tuvastatavad, tausttaset ületavad tulemused, mis võimaldavad tõendada katsesüsteemi tundlikkust, ning samal ajal ei tohiks tulemused olla mõjutatud käesolevas katsemeetodis sätestatud piirmäära ületavast tsütotoksilisusest (vt punkt 28).

Tabel 1

Labori pädevuse hindamiseks ja positiivsete kontrollainete valimiseks soovitatavad etalonained

Kategooria	Aine	CASi nr
1. Metaboolse aktivatsioonita toimivad mutageenid
Metüülmetaansulfonaat		66-27-3
Mitomütsiin C		50-07-7
4-nitrokinoliin-N-oksiid		56-57-5
2. Metaboolset aktivatsiooni vajavad mutageenid
Benso[a]püree		50-32-8
Tsüklofosfamiid (monohüdraat)		50-18-0 (6055-19-2)
7,12-dimetüülbensantratseen		57-97-6
3-metüülkolantreen		56-49-5

METOODIKA

Uuritava kemikaaliga töötlemine

33.

Paljunevaid rakke töödeldakse uuritava kemikaaliga nii metabolismi aktiveerimise süsteemi juuresolekul kui ka ilma selleta. Kokkupuuteperiood peab olema sobiva pikkusega (tavaliselt piisab 3–4 tunnist). Tuleks siiski märkida, et inimravimite puhul võivad need nõuded olla teistsugused (59). Kui MLA korral annab lühiajaline töötlemine negatiivsed tulemused ja leidub teavet, mille kohaselt oleks vaja pikemat töötlemist [nt nukleosiidi analoogid, halvasti lahustuvad kemikaalid (5, 59)], tuleks kaaluda katse tegemist pikema, nt 24-tunnise töötlemisega ilma S9-fraktsioonita.

34.

Rakkude minimaalse arvu valimisel iga katsekultuuri (nii kontroll- kui ka töödeldud kultuuride) ja iga katseetapi jaoks tuleks lähtuda spontaanse muteerumise sagedusest. Üldsuunisena tuleks igas katsekultuuris töödelda ja ümber külvata piisav hulk rakke, et tagada igas katseetapis (töötlemine, fenotüübi ekspressioon ja mutantide selektsioon) vähemalt 10, kuid ideaaljuhul 100 mutandi spontaanne teke (56).

35.

MLA puhul on soovituslik vastuvõetav spontaanse muteerumise sagedus vahemikus 35–140 × 10-6 (agarivariant) ja 50–170 × 10-6 (mikrotiiterplaadi variant) (vt tabel 2). Selleks, et saada igas katsekultuuris vähemalt 10, kuid ideaaljuhul 100 töötluses ellujäänud, spontaanselt tekkinud mutanti, on vaja töödelda vähemalt 6 × 106 rakku. Sellise arvu rakkude töötlemine ja rakkude piisava arvu tagamine ekspresseerumise ning mutantide selekteerimiseks vajaliku kloonimise etappides tagab katse igas etapis piisava arvu (10 või rohkem) spontaanselt tekkinud mutante ka juhul, kui kultuure töödeldakse kontsentratsioonidel, mis on 90 % ulatuses tsütotoksilised (mõõdetuna 10 % suhtelise kogukasvuna) (19, 38, 39).

36.

TK6 korral jääb spontaanse muteerumise sagedus üldjuhul vahemikku 2–20 × 10-6. Selleks, et saada igas kultuuris vähemalt 10 töötluses ellujäänud, spontaanselt tekkinud mutanti, on vaja töödelda vähemalt 20 × 106 rakku. Sellise arvu rakkude töötlemine tagab piisava arvu (10 või rohkem) spontaanselt tekkinud mutante ka juhul, kui kultuure töödeldakse kontsentratsioonidel, mis on 90 % ulatuses tsütotoksilised (suhteline ellujäämus 10 %). Peale selle tuleb ekspressiooniperioodi vältel kultiveerida ja mutantide selekteerimiseks välja külvata piisaval arvul rakke (60).

Fenotüübi avaldumise aeg ning tsütotoksilisuse ja muteerumissageduse mõõtmine

37.

Töötlemisperioodi lõppedes kasvatatakse rakke teatava ajavahemiku jooksul, et võimaldada äsja tekkinud mutantide fenotüübi optimaalset või sellelähedast avaldumist; ajavahemik oleneb kasutavavast rakuliinist. MLA korral on fenotüübi avaldumise periood 2 päeva. TK6 korral on fenotüübi avaldumise periood 3–4 päeva. Kui kasutatakse 24-tunnist töötlemist, algab avaldumisperiood pärast töötlemise lõppu.

38.

Fenotüübi avaldumise perioodi jooksul loendatakse rakke iga päev. MLA korral kasutatakse päevaseid rakkude arve päevase suspensioonikasvu arvutamiseks. Pärast 2-päevast avaldumisperioodi suspendeeritakse rakud nii selektiivainet sisaldavas kui ka ilma selektiivaineta söötmes, et teha kindlaks mutantide arv (selekteerimisplaadid) ja kloonimistõhusus (eluvõimelisuse plaadid). MLA korral on kaks võrdselt tunnustatud meetodit mutantide selektiivseks kloonimiseks: üks pehmes agaris ja teine vedelsöötmes 96 süvendiga plaatidel (19, 38, 39). TK6 korral kloonitakse vedelsöötmetes 96 süvendiga plaatidel (16).

39.

TK mutantide puhul on ainus soovitatav selektiivaine trifluorotümidiin (TFT) (61).

40.

MLA korral loendatakse agariplaate ja mikrotiiterplaate pärast 10–12-päevast inkubeerimist. TK6 korral loendatakse mikrotiiterplaatidel vara tekkivaid mutante 10–14 päeva möödudes. Aeglase kasvuga (hilja tekkivate) TK6 mutantide avastamiseks on vaja rakkudele pärast vara tekkivate mutantide loendamist lisada söödet ja TFT-d ning inkubeerida plaate veel 7–10 päeva (62). Punktides 42 ja 44 on arutletud aeglase ja normaalse kasvuga TK mutantide loendamise üle.

41.

MLA puhul sobivad, mõlemat meetodit (agar ja mikrotiiterplaat) hõlmavad arvutused on esitatud 2. liites. Muteerumissageduse arvutamiseks MLA agarimeetodi korral loendatakse kolooniad ja kohandatakse mutantide kolooniate arvu kloonimistõhususe järgi. MLA ja TK6 mikrotiiterplaadimeetodi korral tehakse kloonimistõhusus nii selekteerimis- kui ka kloonimistõhususe plaatidel kindlaks vastavalt Poissoni jaotusele (63). Muteerumissagedus arvutatakse nende kahe kloonimistõhususe alusel.

Mutantide kolooniate iseloomustamine

42.

Kui MLA meetodil uuritav kemikaal on positiivne (vt punktid 62–63), tuleks kolooniaid iseloomustada nende arvu või kasvukiirusega vähemalt ühes uuritavas kultuuris (tavaliselt suurim vastuvõetav positiivne kontsentratsioon) ning negatiivsetes ja positiivsetes kontrollproovides. Kui uuritav kemikaal on negatiivne (vt punkt 64), tuleks mutantide kolooniaid iseloomustada nende arvuga negatiivsetes ja positiivsetes kontrollproovides. MLA mikrotiiterplaadimeetodi korral määratletakse väikese kolooniaga mutandid kui mutandid, mis katavad alla 25 % süvendi diameetrist, ja suure kolooniaga mutandid kui mutandid, mis katavad üle 25 % süvendi diameetrist. Agarimeetodi korral kasutatakse mutantide kolooniate loendamiseks ja suuruse määramiseks kolooniate automaatloendurit. Üksikasjalikud lähenemisviisid kolooniate suuruse määramisele on esitatud kirjandusallikates (19, 38, 40). Kolooniate iseloomustamine negatiivsetes ja positiivsete kontrollproovides on vajalik, et tõendada uuringute asjakohast läbiviimist.

43.

Uuritavat kemikaali ei saa lugeda negatiivseks, kui positiivses kontrollproovis ei tuvastata piisavalt ei suure ega väikese kolooniaga mutante. Kolooniate iseloomustust võib kasutada üldise teabe saamiseks uuritava kemikaali võime kohta põhjustada punktmutatsioone ja/või kromosoomidega toimuvaid sündmusi (punkt 4).

44.

TK6: Normaalse ja aeglase kasvuga mutandid eristatakse üksteisest erinevate inkubatsiooniaegade abil (vt punkt 40). TK6 puhul loendatakse üldiselt kõigis kultuurides, kaasa arvatud negatiivsetes ja positiivsete kontrollproovides nii vara kui ka hilja tekkivad mutandid. Kolooniate iseloomustamine negatiivsetes ja positiivsete kontrollproovides on vajalik, et tõendada uuringute asjakohast läbiviimist. Uuritavat kemikaali ei saa lugeda negatiivseks, kui positiivses kontrollproovis ei tuvastata piisavalt ei vara ega hilja tekkivaid mutante. Kolooniate iseloomustust võib kasutada üldise teabe saamiseks uuritava kemikaali võime kohta põhjustada punktmutatsioone ja/või kromosoomidega toimuvaid sündmusi (punkt 4).

Labori pädevus

45.

Laboris peaks enne katsemeetodi rutiinset kasutamist olema katse läbiviimiseks piisava kogemuse tõendamiseks tehtud katseseeria positiivse kontrollainena kasutatud etalonainetega, millel on eri toimemehhanismid (tabelis 1 loetletud ainete hulgast valitud ained, millest vähemalt üks vajab toimimiseks metabolismi aktiveerimist ja vähemalt üks seda ei vaja), ning mitmesuguste negatiivsete kontrollainetega (sealhulgas töötlemata kultuurid ja mitmesugused lahustid/kandeained). Selliste positiivsete ja negatiivsete kontrollainetega saadud tulemused peaksid olema kooskõlas kirjanduse andmetega. Seda nõuet ei kohaldata kogemusega laborite puhul, kui on olemas varasemate tulemuste andmebaas, nagu on määratletud punktides 47–50. MLA korral peavad nii positiivsete kui ka negatiivsete kontrollainetega saadud tulemused olema kooskõlas IWGT soovitustega (vt tabel 2).

46.

Valitud positiivseid kontrollaineid (vt tabel 1) tuleks uurida nii lühiajalise kui ka pikaajalise töötlusega (kui pikaajalist töötlust kasutatakse) aktiveerimata metabolismi tingimustes ning lühiajalise töötlusega aktiveeritud metabolismi tingimustes, et tõendada mutageensete kemikaalide tuvastamise ja metabolismi aktiveerimise süsteemi tõhususe kindlakstegemise võimekust, samuti rakkude kasvutingimuste sobivust töötlemise, fenotüübi avaldumise ja mutantide selekteerimise ajal ning kasutatavate hindamismeetodite asjakohasust. Kõnealuste valitud ainete puhul tuleb katsesüsteemi tundlikkuse ja dünaamilise kasutusulatuse sobivuse tõendamiseks valida kontsentratsioonivahemikud nii, et oleks võimalik saada korratavaid, tausttaset ületavaid ja kontsentratsioonist sõltuvaid tulemusi.

Varasemad andmed kontrollproovide kohta

47.

Laboris tuleks kindlaks teha:

—	positiivsete kontrollainetega saadud varasemate tulemuste vahemik ja jaotus,

—	negatiivsete kontrollainetega (töötlemata rakud, lahusti kontrollproov) saadud varasemate tulemuste vahemik ja jaotus.

48.

Kui hangitakse algandmeid varasemate negatiivsete kontrollproovide tulemuste jaotuse määramiseks, peavad paralleelsete negatiivsete kontrollproovidega saadud andmed olema kooskõlas kontrollproovide kohta avaldatud andmetega. Kontrollproovidega saadud tulemuste jaotuse lähteandmetele üha uute katseandmete lisandumisel peaksid paralleelsete negatiivsete kontrollproovidega saadavad tulemused jääma ideaaljuhul selle jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 % (64, 65).

49.

Laboris negatiivsete kontrollproovidega saadud varasemate tulemuste andmebaas peaks algselt hõlmama vähemalt 10 katse andmeid, kuid soovitatavalt peaks see sisaldama vähemalt 20 võrreldavates tingimustes tehtud katse andmeid. Laboris tuleks kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, näiteks kontrollkaarte (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (65)), et teha kindlaks, kui suures ulatuses positiivsete ja negatiivsete kontrollproovide andmed varieeruvad, ja tõendada, et laboris kasutatav metoodika on usaldusväärne (66). Üksikasju ja soovitusi aja jooksul andmete kogumise ja kasutamise kohta võib leida kirjandusest (64).

50.

Negatiivsete kontrollproovidega saadud andmed peaksid hõlmama muteerumissagedust ühes või soovitatavalt mitmes paralleelses kultuuris, nagu on kirjeldatud punktis 27. Paralleelsete negatiivsete kontrollproovide tulemused peaksid ideaaljuhul jääma labori varasemate kontrollproovi tulemuste jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %. Kui negatiivsete kontrollproovidega saadud tulemused jäävad väljapoole kõnealust usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %, võivad need olla kontrollproovidega saadud varasemate tulemuste jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmuslike võõrväärtustega ning on tõendatud, et katsesüsteem on usaldusväärne (vt punkt 49), ja puuduvad tõendid selle kohta, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksimusega.

51.

Katsemetoodika mis tahes muudatuse puhul tuleks kaaluda, kas see mõjutab katseandmete vastavust laboris kontrollproovidega varem saadud olemasolevatele andmetele. Iga olulise mittevastavuse korral tuleks luua uus kontrollproovidega saadud varasemate tulemuste andmebaas.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Tulemuste esitamine

52.

Nii MLA kui ka TK6 korral kuuluvad esitatavate andmete hulka nii töötlemata kui ka kontrollkultuuridega saadud andmed, mis on vajalik tsütotoksilisuse (vastavalt suhteline kogukasv või suhteline ellujäämus) ja muteerumissageduse arvutamiseks allpool kirjeldatud viisil.

53.

MLA korral tuleb iga üksiku kultuuri kohta esitada suhteline suspensioonikasv, suhteline kogukasv, kloonimistõhusus mutantide selekteerimise ajal ning mutantide kolooniate arv (agarivariandi korral) või tühjade süvendite arv (mikrotiiterplaadi variandi korral). Muteerumissagedust väljendatakse mutantrakkude arvuga miljoni ellujäänud raku kohta. Kui vastus on positiivne, esitatakse väikese ja suure koloonia muteerumissagedused (ja/või protsentuaalne osakaal muteerumise üldsagedusest), mis on leitud uuritava kemikaali vähemalt ühe kontsentratsiooniga (tavaliselt suurim positiivne kontsentratsioon), negatiivse kontrollprooviga ja positiivse kontrollprooviga. Negatiivse vastuse korral tuleb esitada negatiivse kontrollproovi ja positiivse kontrollprooviga saadud väikese ja suure koloonia muteerumissagedused.

54.

TK6 korral tuleb iga üksiku kultuuri kohta esitada suhteline ellujäämus, kloonimistõhusus mutantide selekteerimise ajal ning tühjade süvendite arv vara ja hilja tekkivate mutantide puhul. Muteerumissagedust väljendatakse mutantrakkude arvuga ellujäänud rakkude arvu kohta ning see peaks hõlmama muteerumise üldsagedust ning vara ja hilja tekkivate mutantide muteerumissagedust (ja/või protsentuaalselt osakaalu muteerumise üldsagedusest).

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

55.

Nii MLA kui ka TK6 korral peavad enne konkreetse uuritava kemikaali üldiste tulemuste määramist olema täidetud järgmised kriteeriumid:

—	katse on tehtud kahes eri tingimuses (lühiajaline töötlus metabolismi aktiveerimisega ja ilma selleta, vt punkt 33), välja arvatud juhul, kui neist ühe puhul on saadud positiivsed tulemused;

—	analüüsitud rakkude ja kontsentratsioonide arv on piisav (vt punktid 27 ja 34–36);

—	suurima kontsentratsiooni valimise kriteeriumid on kooskõlas kriteeriumidega, mis on kirjeldatud punktides 28–30.

Negatiivsete ja positiivsete kontrollproovide nõuetekohasuse kriteeriumid

56.

IWGT MLA ekspertide töörühma tehtud analüüs suure hulga MLA andmete kohta andis tulemuseks rahvusvahelise konsensuse MLA konkreetsete nõuetekohasuse kriteeriumide osas (1, 2, 3, 4, 5). Seega annab käesolev katsemeetod konkreetseid soovitusi negatiivsete ja positiivsete kontrollproovide vastuvõetavuse kindlakstegemiseks ning MLAga saadud üksikainete tulemuste hindamiseks. TK6 andmebaas on palju väiksem ja töörühm ei ole seda hinnanud.

57.

MLA korral tuleb iga katse juures hinnata, kas töötlemata/lahusti kontrollproov vastab IWGT MLA töörühma koostatud nõuetekohasuse kriteeriumidele ((4) ja tabel 2 allpool) järgmiste näitajate poolest: 1) muteerumissagedus (tuleb arvestada, et IWGT nõuetekohased muteerumissagedused on MLA agari- ja mikrotiiterplaadi variandi puhul erinevad); 2) kloonimistõhusus mutantide selekteerimise ajal ja 3) suspensioonikasv lahusti kontrollproovis (valemid on leitavad 2. liites).

Tabel 2

MLA nõuetekohasuse kriteeriumid

Näitaja	Pehme agari meetod	Mikrotiiterplaadi meetod
Muteerumissagedus:	35–140 × 10-6	50–170 × 10-6
Kloonimistõhusus	65–120 %	65–120 %
Suspensioonikasv	8–32-kordne (3–4-tunnine töötlus) 32–180-kordne (24-tunnine töötlus, kui seda kasutatakse)	8–32-kordne (3–4-tunnine töötlus) 32–180-kordne (24-tunnine töötlus, kui seda kasutatakse)

58.

Samuti tuleb MLA korral iga katse juures hinnata, kas positiivne kontrollkatse või positiivsed kontrollkatse vastavad vähemalt ühele järgmisest kahest nõuetekohasuse kriteeriumist, mille on välja töötanud IWGT töörühm:

—

positiivses kontrollproovis peab ilmnema muteerumise üldsageduse absoluutne suurenemine, st suurenemine spontaansest muteerumisest tulenevast taustsagedusest (indutseeritud muteerumissagedus) ülespoole vähemalt 300 × 10-6. Vähemalt 40 % indutseeritud muteerumissagedusest peab kajastuma väikese koloonia muteerumissageduses;

—	positiivses kontrollproovis peab väikese koloonia muteerumissagedus olema vähemalt 150 × 10-6 võrra suurem töötlemata/lahusti kontrollproovis esinevast (väikese koloonia indutseeritud muteerumissagedus 150 × 10-6).

59.

TK6 korral on katse nõuetekohane, kui paralleelsete negatiivsete kontrollproovide tulemused on vastuvõetavad, et lisada need labori varasemate negatiivsete kontrollproovidega saadud tulemuste andmebaasi, nagu on kirjeldatud punktides 48–49. Peale selle peavad paralleelsete positiivsete kontrollproovidega (vt punkt 32) saadud tulemused olema võrreldavad positiivsete kontrollproovidega varem saadud tulemustega ning saadud väärtused peaksid paralleelset negatiivset kontrollproovi iseloomustavate väärtustega võrrelduna olema statistiliselt oluliselt suuremad.

60.

Mõlema katse korral peab positiivses kontrollkultuuris leitud tsütotoksilisus olema sama mis katsekultuurides. See tähendab, et suhteline kogukasv või suhteline ellujäämus ei tohi jääda alla 10 % Positiivse kontrollproovi vastuvõetavuse kriteeriumidele vastavuse tõendamiseks piisab ühe kontsentratsiooni kasutamisest (või kui kasutatakse rohkem kontsentratsioone, siis ühe positiivse kontrollkultuuriga kasutatava kontsentratsiooni kasutamisest). Peale selle peab positiivse kontrollproovi muteerumissagedus jääma labori jaoks määratud vastuvõetavasse vahemikku.

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

61.

MLA kohta on IWGT hiire lümfoomi ekspertide töörühm ära teinud olulise töö positiivse vastuse bioloogilise olulisuse ja kriteeriumidega seoses (4). Seega annab käesolev katsemeetod konkreetseid soovitusi uuritava kemikaali MLA-katsega saadud tulemuste tõlgendamiseks (vt punktid 62–64). TK6 andmebaas on palju väiksem ja töörühm ei ole seda hinnanud. Seepärast on TK6 puhul esitatud soovitused andmete tõlgendamiseks üldisemad (vt punktid 65–66). Täiendavad soovitused kehtivad mõlema katsemeetodi kohta (vt punktid 67–71).

MLA

62.

Positiivsete ja negatiivsete vastuste määratlemiseks on soovitatav kasutada lähenemisviisi, mis tagab, et suurenenud muteerumissagedus on bioloogiliselt oluline. Muude katsete puhul tavaliselt kasutatava statistilise analüüsi asemel põhineb see lähenemisviis eelnevalt määratletud indutseeritud muteerumise sagedusel (st muteerumissageduse suurenemisel ülespoole paralleelse kontrollprooviga saadud väärtusest), mis on nimetatud globaalseks hindamisteguriks (GEF) ja mille aluseks on osalevate laborite negatiivse kontrollproovi muteerumissageduse andmete jaotuse analüüs (4). MLA agariversiooni korral on GEF 90 × 10-6 ja MLA mikrotiiterplaadi variandi korral 126 × 10-6.

63.

Tingimusel, et kõik nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt positiivseks, kui ükskõik millistel uuritud katsetingimustel (vt punkt 33) ületab muteerumissageduse kasv paralleelprooviga mõõdetud taustasageduse rohkem kui GEF võrra ning suurenemine on sõltuv kontsentratsioonist (nt kasutades trenditesti meetodit). Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimelisena põhjustama selles katsesüsteemis mutatsiooni.

64.

Tingimusel, et kõik nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt negatiivseks, kui kõigis uuritud katsetingimustes (vt punkt 33) puudub kontsentratsioonist sõltuv vastus või kui muteerumissagedus on suurenenud, siis see ei ületa GEFi. Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimetuna põhjustama selles katsesüsteemis mutatsioone.

TK6

65.

Tingimusel, et kõik nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt positiivseks, kui mis tahes uuritud katsetingimustes (vt punkt 33):

—	vähemalt ühe katsekontsentratsiooni juures täheldatakse saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrollprooviga võrreldes;

—	sobiva trenditestiga hindamisest nähtub, et see suurenemine on kontsentratsioonist sõltuv (vt punkt 33);

—	ükski nendest tulemustest ei ole väljaspool labori varasemate negatiivse kontrollprooviga saadud tulemuste jaotust (nt väljaspool Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %; vt punkt 48).

Kui kõik need kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali võimelisena põhjustama selles katsesüsteemis mutatsiooni. Soovitused kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta on esitatud kirjanduses (66, 67).

66.

Tingimusel, et kõik nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt negatiivseks, kui kõikides uuritud katsetingimustes (vt punkt 33):

—	ei täheldata ühegi katsekontsentratsiooni juures saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrollprooviga võrreldes;

—	sobiva trenditestiga hindamisest nähtub, et kontsentratsioonist sõltuvat väärtuse suurenemist ei esine;

—	kõik need tulemused on labori varasemate negatiivse kontrollprooviga saadud tulemuste jaotuse vahemikus (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikus usaldusnivool 95 %; vt punkt 48).

67.

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimetuna põhjustama selles katsesüsteemis mutatsioone.

MLA ja TK6

68.

Kui suurima kontsentratsiooni valimisel lähtutakse tsütotoksilisusest, tuleks suurim kontsentratsioon valida nii, et saavutataks suhteline kogukasv / suhteline ellujäämus 10–20 %. Ühine seisukoht on, et tuleb olla hoolikas niisuguste positiivsete tulemuste tõlgendamisel, mis on leitud suhtelise kogukasvu / suhtelise ellujäämuse vahemikus 10–20 %, ning et tulemust ei loeta positiivseks, kui muteerumissageduse suurenemine ilmnes üksnes 10 % või väiksema suhtelise kogukasvu / suhtelise ellujäämuse juures (kui seda hinnati) (2, 59).

69.

Leidub asjaolusid, mille puhul täiendav teave võib olla abiks otsustamisel, et uuritav kemikaal ei ole mutageenne, kui ühegi kultuuriga ei saada suhtelise kogukasvu / suhtelise ellujäämuse väärtust vahemikus 10–20 %. Niisugused olukorrad on järgmised: 1) tõendid mutageensuse kohta puuduvad (st puudub doosi-vastuse seos, puuduvad paralleelse negatiivse kontrollprooviga saadud muteerumissagedusest või aja jooksul kogutud andmetest saadud taustväärtusest suuremad muteerumissagedused) andmepunktide seerias, mis on suhtelise kogukasvu / suhtelise ellujäämuse vahemikus 20–100 %, ning vähemalt üks andmepunkt on suhtelise kogukasvu / suhtelise ellujäämuse vahemikus 20–25 %; 2) tõendid mutageensuse kohta puuduvad (st puudub doosi-vastuse seos, puuduvad paralleelse negatiivse kontrollprooviga saadud muteerumissagedusest või aja jooksul kogutud andmetest saadud taustväärtusest suuremad muteerumissagedused) andmepunktide seerias, mis on suhtelise kogukasvu / suhtelise ellujäämuse vahemikus 25–100 %, ning olemas on ka negatiivne andmepunkt, mis jääb veidi alla 10 % suhtelise kogukasvu / suhtelise ellujäämuse. Mõlemal juhul võib uuritava kemikaali lugeda negatiivseks.

70.

Selgelt positiivset või negatiivset vastust ei ole vaja üle kontrollida.

71.

Juhul, kui vastus ei ole eespool kirjeldatu kohaselt selgelt negatiivne ega selgelt positiivne ja/või kui eesmärk on aidata kindlaks teha tulemuse bioloogiline olulisus, tuleks andmete hindamiseks kasutada eksperdihinnangut ja/või täiendavaid uuringuid. Sellises olukorras võib olla kasulik teha korduskatse ja muuta vajaduse korral katsetingimusi (nt kontsentratsiooniintervalli, et suurendada andmepunktide saamise tõenäosust suhtelise kogukasvu / suhtelise ellujäämuse vahemikus 10–20 %, või metabolismi aktiveerimise tingimusi (st S9 kontsentratsiooni või S9 päritolu) ja töötlemise kestust).

72.

Harvadel juhtudel ei võimalda andmed isegi pärast täiendavaid uuringuid teha järeldust selle kohta, kas tulemus on positiivne või negatiivne. Seepärast tuleks sel juhul lugeda uuritava kemikaaliga saadud vastus ebaselgeks (seda tõlgendatakse positiivse ja negatiivse tulemuse võrdvõimalikkusena).

KATSEPROTOKOLL

73.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal:

—	allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

—	uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui see on teada;

—	vastavalt vajadusele mõõtmistulemused söötme pH ja osmolaalsuse ning sademe tekke kohta pärast uuritava kemikaali lisamist.

Ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne.

Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal ja segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

Lahusti:

—	lahusti valimise põhjendus;

—	lahusti protsentuaalne sisaldus lõppsöötmes.

Rakud:

labori tüvikultuuride puhul:

—	rakkude tüüp ja päritolu ning nendega katselaboris tehtud toimingud;

—	karüotüübi andmed ja/või kromosoomide modaalarv;

—	rakukultuuride säilitamise meetodid;

—	teave mükoplasma puudumise kohta;

—	rakkude arvu kahekordistumise aeg.

Katsetingimused:

—	kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valiku põhjendus, sealhulgas näiteks andmed tsütotoksilisuse ja lahustuvuspiirangute kohta;

—	söötme koostis, CO2 kontsentratsioon, niiskusesisaldus;

—	uuritava kemikaali kontsentratsioon, väljendatuna lõppkontsentratsioonina söötmes (nt μg/ml või mg/ml või mM);

—	söötmele lisatud lahusti ja uuritava kemikaali kontsentratsioon (ja/või ruumala);

—	inkubeerimistemperatuur;

—	inkubeerimisaeg;

—	töötluse kestus;

—	rakutihedus töötluse ajal;

—	metabolismi aktiveerimise süsteemi liik ja koostis (fraktsiooni S9 allikas, S9 segu valmistamise meetod, S9 segu ja S9 kontsentratsioon või ruumala lõppsöötmes, S9 kvaliteedikontrolli andmed);

—	positiivsed ja negatiivsed kontrollained ja nende lõppkontsentratsioonid iga töötlemistingimuse puhul;

—	ekspressiooniperioodi pikkus (samuti väljakülvatud rakkude arv ning vajaduse korral teave ümberkülvide ja söötmevahetusrežiimi kohta);

—	selektiivaine identimisandmed ja kontsentratsioon;

—	MLA korral tuleb näidata kasutatud variant (agar või mikrotiiterplaat);

—	katse nõuetekohasuse kriteeriumid;

—	eluvõimeliste ja muteerunud rakkude loendamiseks kasutatud meetodid;

—	tsütotoksilisuse mõõtmiseks kasutatud meetodid;

—	muu täiendav asjakohane teave tsütotoksilisuse ja kasutatud meetodi kohta;

—	väljakülvamisele järgneva inkubeerimise kestus;

—	kolooniate määratlus, milles on arvesse võetud kolooniate arvu ja tüüpi (sh „väikeste“ ja „suurte“ kolooniate kriteeriumid, vajaduse korral);

—	uuringutulemuse positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks liigitamise kriteeriumid;

—	pH, osmolaalsuse (kui määratakse) ja sademe määramiseks kasutatud meetodid, kui on asjakohane.

Tulemused:

—	töödeldud rakkude arv ja ümberkülvatud rakkude arv igas kultuuris;

—	toksilisuse näitajad (MLA korral suhteline kogukasv ja TK6 korral suhteline ellujäämus);

—	sadenemise ilmingud ja nende täheldamise aeg;

—	selektiivainega ja selektiivaineta söötmesse külvatud rakkude arv;

—	kolooniate arv selektiivaineta söötmes ja resistentsete kolooniate arv selektiivainega söötmes ning vastav muteerumissagedus;

—	kolooniate suurus negatiivsetes ja positiivsete kontrollproovides ning kui uuritav kemikaal on positiivne, siis vähemalt ühe kontsentratsiooni juures, samuti vastavad muteerumissagedused;

—	võimaluse korral andmed vastuse sõltuvuse kohta kontsentratsioonist;

—	andmed paralleelsete negatiivsete (lahusti) kontrollproovide ja positiivsete kontrollproovide kohta (kontsentratsioonid ja lahustid);

—	varasemate negatiivsete (lahusti) ja positiivsete kontrollproovide andmed (kontsentratsioonid ja lahustid), sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed; kontrollkatsete arv, mille alusel varasemad andmed on saadud;

—	statistilise analüüsi tulemused (iga kultuuri kohta eraldi ja vajaduse korral paralleelkultuuride koondandmed) ja vajaduse korral p-väärtused ning MLA korral GEF-hinnang.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

Moore, M. M., Honma, M., Clements, J. (koostaja), Awogi, T., Bolcsfoldi, G., Cole, J., Gollapudi, B., Harrington-Brock, K., Mitchell, A., Muster, W., Myhr, B., O'Donovan, M., Ouldelhkim, M-C., San, R., Shimada, H. ja Stankowski, L.F. Jr. (2000), „Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus (TK) Gene Mutation Assay: International Workshop on Genotoxicity Test Procedures (IWGTP) Workgroup Report“, Environ. Mol. Mutagen., nr 35 (3), lk 185–190.

(2)

Moore, M. M., Honma, M., Clements, J., Harrington-Brock, K., Awogi, T., Bolcsfoldi, G., Cifone, M., Collard, D., Fellows, M., Flanders, K., Gollapudi, B., Jenkinson, P., Kirby, P., Kirchner, S., Kraycer, J., McEnaney, S., Muster, W., Myhr, B., O’Donovan, M., Oliver, Ouldelhkim, M-C., Pant, K., Preston, R., Riach, C., San, R., Shimada, H. ja Stankowski, L.F. Jr. (2002), „Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus Gene Mutation Assay: Follow-Up International Workshop on Genotoxicity Test Procedures, New Orleans, Louisiana, (Aprill 2000)“, Environ. Mol. Mutagen., nr 40 (4), lk 292–299.

(3)

Moore, M. M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Cifone, M., Delongchamp, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Jenkinson, P., Kirby, P., Kirchner, S., Muster, W., Myhr, B., O’Donovan, M., Ouldelhkim, M-C., Pant, K., Preston, R., Riach, C., San, R., Stankowski, L.F. Jr., Thakur, A., Wakuri, S. ja Yoshimura, I. (2003), „Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus Gene Mutation Assay: International Workshop (Plymouth, UK) on Genotoxicity Test Procedures Workgroup Report“, Mutation Res., nr 540, lk 127–140.

(4)

Moore, M. M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Burlinson, B., Cifone, M., Clarke, J., Delongchamp, R., Durward, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Hou, S., Jenkinson, P., Lloyd, M., Majeska, J., Myhr, B., O’Donovan, M., Omori, T., Riach, C., San, R., Stankowski, L.F. Jr., Thakur, A.K., Van Goethem, F., Wakuri, S. ja Yoshimura, I. (2006), „Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Gene Mutation Assay: Follow-Up Meeting of the International Workshop on Genotoxicity Tests – Aberdeen, Scotland, 2003 – Assay Acceptance Criteria, Positive Controls, and Data Evaluation“, Environ. Mol. Mutagen., nr 47 (1), lk 1–5.

(5)

Moore, M. M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Burlinson, B., Cifone, M., Clarke, J., Clay, P., Doppalapudi, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Hou, S., Jenkinson, P., Muster, W., Pant, K., Kidd, D.A., Lorge, E., Lloyd, M., Myhr, B., O’Donovan, M., Riach, C., Stankowski, L.F. Jr., Thakur A.K. ja Van Goethem, F. (2007), „Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Mutation Assay: Meeting of the International Workshop on Genotoxicity Testing, San Francisco, 2005, Recommendations for 24-h Treatment“, Mutation. Res., nr 627 (1), lk 36–40.

(6)	OECD (2016), Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 238. OECD, Pariis.

(7)	Fellows M. D., Luker, T., Cooper, A. ja O'Donovan, M.R. (2012), „Unusual Structure-Genotoxicity Relationship in Mouse Lymphoma Cells Observed with a Series of Kinase Inhibitors“, Mutation, Res., nr 746 (1), lk 21–28.

(8)	Honma, M., Momose, M., Sakamoto, H., Sofuni, T. ja Hayashi, M. (2001), „Spindol Poisons Induce Allelic Loss in Mouse Lymphoma Cells Through Mitotic Non-Disjunction“, Mutation Res., nr 493 (1–2), lk 101–114.

(9)	Wang, J., Sawyer, J.R., Chen, L., Chen, T., Honma, M., Mei, N. ja Moore, M. M. (2009), „The Mouse Lymphoma Assay Detects Recombination, Deletion, and Aneuploidy“, Toxicol. Sci., nr 109 (1), lk 96–105.

(10)	Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. ja Hozier, J. C. (1990), „Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells“, Proc. National. Academy. Sci. USA, nr 87 (1), lk 51–55.

(11)	Hozier, J., Sawyer, J., Moore, M., Howard, B. ja Clive, D. (1981), „Cytogenetic Analysis of the L5178Y/TK+/- Leads to TK-/- Mouse Lymphoma Mutagenesis Assay System“, Mutation Res., nr 84 (1), lk 169–181.

(12)	Hozier, J., Sawyer, J., Clive, D. ja Moore, M. M. (1985), „Chromosome 11 Aberrations in Small Colony L5178Y TK-/- Mutants Early in their Clonal History“, Mutation Res., nr 147 (5), lk 237–242.

(13)	Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. ja Sawyer, J. (1985), „Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells“, Mutation Res., nr 151 (1), lk 161–174.

(14)	Liber, H. L., Call, K. M. ja Little, J. B. (1987), „Molecular and Biochemical Analyses of Spontaneous and X-Ray-Induced Mutants in Human Lymphoblastoid Cells“, Mutation Res., nr 178 (1), lk 143–153.

(15)	Li, C. Y., Yandell, D. W. ja Little, J. B. (1992), „Molecular Mechanisms of Spontaneous and Induced Loss of Heterozygosity in Human Cells In Vitro“, Somat. Cell Mol. Genet., nr 18 (1), lk 77–87.

(16)	Honma, M., Hayashi, M. ja Sofuni, T. (1997), „Cytotoxic and Mutagenic Responses to X-Rays and Chemical Mutagens in Normal and P53-Mutated Human Lymphoblastoid Cells“, Mutation. Res., nr 374 (1), lk 89–98.

(17)	Honma, M., Momose, M., Tanabe, H., Sakamoto, H., Yu, Y., Little, J.B., Sofuni, T. ja Hayashi, M. (2000), „Requirement of Wild-Type P53 Protein for Maintenance of Chromosomal Integrity“, Mol. Carcinogen., nr 28 (4), lk 203–14.

(18)	Amundson, S. A. ja Liber, H. L. (1992), „A Comparison of Induced Mutation at Homologous Alleles of the TK Locus in Human Cells. II. Molecular Analysis of Mutants“, Mutation Res., nr 267 (1), lk 89–95.

(19)	Schisler, M. R., Moore, M. M. ja Gollapudi, B. B. (2013), „In Vitro Mouse Lymphoma (L5178Y TK+/- -3.7.2C) Forward Mutation Assay“, Protocols in Genotoxicity Assessment, toim. A. Dhawan ja M. Bajpayee, Springer Protocols, Humana Press, lk 27–50.

(20)	Long, L. H., Kirkland, D., Whitwell, J. ja Halliwell, B. (2007), „Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium“, Mutation Res., nr 634 (1–2), lk 177–183.

(21)	Nesslany, F., Simar-Meintieres, S., Watzinger, M., Talahari, I. ja Marzin, D. (2008), „Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid“, Environ. Mol. Mutagen., nr 49 (6), lk 439–452.

(22)	Brusick, D. (1986), „Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion Concentrations“, Environ. Mutagen., nr 8 (6), lk 879–886.

(23)	Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. ja Okumura, K. (1992), „Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells“, Mutation Res., nr 268 (2), lk 297–305.

(24)	Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr, Brusick, D., Ashby, J. ja Myhr, B. C. (1991), „Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9“, Mutation Res., nr 257, lk 147–204.

(25)	Wang, J., Heflich, R. H. ja Moore, M. M. (2007), „A Method to Distinguish Between the De Novo Induction of Thymidine Kinase Mutants and the Selection of Pre-Existing Thymidine Kinase Mutants in the Mouse Lymphoma Assay“, Mutation Res., nr 626 (1–2), lk 185–190.

(26)	Fischer, G. A. (1958), „Studies on the Culture of Leukemic Cells In Vitro“, Ann. N.Y. Academy Sci., nr 76, lk 673–680.

(27)	Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson, A. G. ja Brown, M. M. M. (1979), „Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/– Mouse Lymphoma Mutagen Assay System“, Mutation Res., nr 59(1), lk 61–108.

(28)	Sawyer, J., Moore, M. M., Clive, D. ja Hozier, J. (1985), „Cytogenetic Characterization of the L5178Y TK+/- 3.7.2C Mouse Lymphoma Cell Line“, Mutation Res., nr 147 (5), lk 243–253.

(29)	Sawyer J. R., Moore M. M. ja Hozier J. C. (1989), „High-Resolution Cytogenetic Characterization of the L5178Y TK+/- Mouse Lymphoma Cell Line“, Mutation Res., nr 214 (2), lk 181–193.

(30)	Sawyer, J. R., Binz, R. L., Wang, J. ja Moore, M. M. (2006), „Multicolor Spectral Karyotyping of the L5178Y TK+/--3.7.2C Mouse Lymphoma Cell Line“, Environ. Mol. Mutagen., nr 47 (2), lk 127–131.

(31)

Fellows, M. D., McDermott, A., Clare, K. R., Doherty, A. ja Aardema, M. J. (2014), „The Spectral Karyotype of L5178Y TK+/- Mouse Lymphoma Cells Clone 3.7.2C and Factors Affecting Mutant Frequency at the Thymidine Kinase (TK) Locus in the Microtitre Mouse Lymphoma Assay“, Environ. Mol. Mutagen., nr 55 (1), lk 35–42.

(32)	Storer, R. D., Jraynak, A. R., McKelvey, T. W., Elia, M. C., Goodrow, T.L. ja DeLuca, J.G. (1997), „The Mouse Lymphoma L5178Y TK+/- Cell Line is Heterozygous for a Codon 170 Mutation in the P53 Tumor Suppressor Gene“, Mutation. Res., nr 373 (2), lk 157–165.

(33)	Clark L. S., Harrington-Brock, K., Wang, J., Sargent, L., Lowry, D., Reynolds, S. H. ja Moore, M. M. (2004), „Loss of P53 Heterozygosity is not Responsible for the Small Colony Thymidine Kinase Mutant Phenotype in L5178Y Mouse Lymphoma Cells“, Mutagen., nr 19 (4), lk 263–268.

(34)	Skopek, T. R., Liber, H. L., Penman, B. W. ja Thilly, W. G. (1978), „Isolation of a Human Lymphoblastoid Line Heterozygous at the Thymidine Kinase Locus: Possibility for a Rapid Human Cell Mutation Assay“, Biochem. Biophys. Res. Commun., nr 84 (2), lk 411–416.

(35)	Honma, M. (2005), „Generation of Loss of Heterozygosity and its Dependency on P53 Status in Human Lymphoblastoid Cells“, Environ. Mol. Mutagen., nr 45 (2–3): lk 162–176.

(36)	Xia, F., Wang, X., Wang, Y. H., Tsang, N. M., Yandell, D. W., Kelsey, K. T. ja Liber, H. L. (1995), „Altered P53 Status Correlates with Differences in Sensitivity to Radiation-Induced Mutation and Apoptosis in Two Closely Related Human Lymphoblast Lines“, Cancer. Res., nr 55 (1), lk 12–15.

(37)

Lorge, E., Moore, M., Clements, J., O'Donovan, M., Honma, M., Kohara, A., van Benthem, J., Galloway, S., Armstrong, M. J., Thybaud, V., Gollapudi, B., Aardema, M., Kim, J., Sutter, A., Kirkland, D. J. (2015), „Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing.“ (Pooleliolev käsikiri.)

(38)	Lloyd, M. ja Kidd, D. (2012), „The Mouse Lymphoma Assay“, Springer Protocols: Methods in Molecular Biology 817, Genetic Toxicology Principles and Methods, toim. Parry ja Parry, Humana Press, ISBN 978-1-61779-420-9, lk 35–54.

(39)	Mei, N., Guo, X. ja Moore M. M. (2014), „Methods for Using the Mouse Lymphoma Assay to Screen for Chemical Mutagenicity and Photo-Mutagenicity“ väljaandes Optimization in Drug Discover: In Vitro Methods, toim. Yan, Z. ja Caldwell, 2. trükk, GW; Humana Press, Totowa, NJ.

(40)	Liber, H. L. ja Thilly, W. G. (1982), „Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploidhuman Lymphoblasts“, Mutation Res., nr 94 (2), lk 467–485.

(41)

Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T., Hay, R., Merten, O. W., Price, A., Schechtman, L., Stacey, G. ja Stokes, W. (2005), „Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice“, ATLA, nr 33 (3), lk 261–287.

(42)	Moore, M. M. ja Howard, B. E. (1982), „Quantitation of Small Colony Trifluorothymidine-Resistant Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells in RPMI-1640 Medium“, Mutation Res., nr 104 (4–5), lk 287–294.

(43)	Ames, B. N., McCann, J. ja Yamasaki, E. (1975), „Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test“, Mutation Res., nr 31 (6), lk 347–364.

(44)	Maron, D. M. ja Ames, B. N. (1983), „Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test“, Mutation Res., nr 113 (3–4), lk 173–215.

(45)

Natarajan, A. T., Tates, A. D, Van Buul, P. P. W., Meijers, M. ja de Vogel, N. (1976), „Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens After Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes“, Mutation Res., nr 37 (1), lk 83–90.

(46)	Matsuoka, A., Hayashi, M. ja Ishidate, M. Jr. (1979), „Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro“, Mutation Res., nr 66 (3), lk 277–290.

(47)	Ong, T. M. et al. (1980), „Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver“, J. Environ. Pathol. Toxicol., nr 4 (1), lk 55–65.

(48)	Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. ja Wolf, R. C. (1992), „Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays“, Mutagen., nr 7 (3), lk 175–177.

(49)	Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. ja Sugimura, T. (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“ väljaandes In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, toim. de Serres F. J. et al. , Elsevier, North-Holland, lk 85–88.

(50)	Galloway, S. M. et al. (1994), „Report from Working Group on In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations“, Mutation Res., nr 312 (3), lk 241–261.

(51)	Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R. ja Galloway, S. M. (1996), „Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/Beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9“, Environ. Mol. Mutagen., nr 28 (1), lk 51–59.

(52)	UNEP (2001), Püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsioon. Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni Keskkonnaprogramm (UNEP).

(53)	Krahn, D. F., Barsky, F. C. ja McCooey, K. T. (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“ väljaandes Genotoxic Effects of Airborne Agents, toim. Tice, R. R., Costa, D. L. ja Schaich, K. M., New York, Plenum, lk 91–103.

(54)	Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. ja Brooks, A. L. (1983), „Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay“, Environ. Mutagen., nr 5 (6), lk 795–801.

(55)	Asakura, M., Sasaki, T., Sugiyama, T., Arito, H., Fukushima, S. ja Matsushima, T. (2008), „An Improved System for Exposure of Cultured Mammalian Cells to Gaseous Compounds in the Chromosomal Aberration Assay“, Mutation Res., nr 652 (2), lk 122–130.

(56)	Arlett, C. F. et al. (1989), „Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation“ väljaandes Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, toim. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, lk 66–101.

(57)	Morita, T., Honma, M. ja Morikawa, K. (2012), „Effect of Reducing the Top Concentration Used in the In Vitro Chromosomal Aberration Test in CHL Cells on the Evaluation of Industrial Chemical Genotoxicity“, Mutation Res., nr 741 (1–2), lk 32–56.

(58)	Brookmire, L., Chen, J. J. ja Levy, D. D. (2013), „Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay“, Environ. Mol. Mutagen., nr 54 (1), lk 36–43.

(59)	USA Toidu- ja Ravimiamet (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Kättesaadav aadressil [https://www.federalregister.gov/a/2012-13774].

(60)	Honma, M. ja Hayashi, M. (2011), „Comparison of In Vitro Micronucleus and Gene Mutation Assay Results for P53-Competent Versus P53-Deficient Human Lymphoblastoid Cells“, Environ. Mol. Mutagen., nr 52 (5), lk 373–384.

(61)	Moore-Brown, M. M., Clive, D., Howard, B. E., Batson, A. G. ja Johnson, K. O. (1981), „The Utilization of Trifluorothymidine (TFT) to Select for Thymidine Kinase-Deficient (TK-/-) Mutants from L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells“, Mutation Res., nr 85 (5), lk 363–378.

(62)	Liber, H. L., Yandell, D. W. ja Little, J. B. (1989), „A Comparison of Mutation Induction at the TK and HRPT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK locus“, Mutation Res., nr 216 (1), lk 9–17.

(63)	Furth, E. E., Thilly, W. G., Penman, B. W., Liber, H. L. ja Rand, W. M. (1981), „Quantitative Assay for Mutation in Diploid Human Lymphoblasts Using Microtiter Plates“, Anal. Biochem., nr 110 (1), lk 1–8.

(64)	Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J. ja Thybaud, V. (2011), „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data“, Mutation Res., nr 723 (2), lk 87–90.

(65)	Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement. 2. trükk. John Wiley & Sons, New York.

(66)	OECD (2014), Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 199), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(67)	Fleiss, J. L., Levin, B. ja Paik, M. C. (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions. 3. trükk. John Wiley & Sons, New York.

1. liide

MÕISTED

Aneugeen : iga kemikaal või protsess, mis põhjustab interaktsiooni kaudu mitootilise või meiootilise rakujagunemise tsükli komponentidega rakkude või organismide aneuploidsust.

Aneuploidsus : iga kõrvalekalle normaalsest diploidsest (või haploidsest) kromosoomiarvust ühe või enama kromosoomi võrra, kuid mitte terve(te) kromosoomikomplekti(de) võrra (polüploidsus).

Aluspaarivahetust põhjustav mutageen : kemikaal, mis kutsub esile aluspaari vahetuse DNAs.

Kemikaal : aine või segu.

Kloonimistõhusus : väikesel tihedusel välja külvatud rakkude hulgas esinevate selliste rakkude protsentuaalne osakaal, mis on võimelised moodustama loendatava koloonia.

Klastogeen : iga kemikaal, mis põhjustab rakkude või organismide populatsioonis struktuurseid kromosoomiaberratsioone.

Tsütotoksilisus : käesoleva katsemeetodi kohaste katsete puhul on tsütotoksilisus määratletud kui suhtelise kogukasvu (MLA korral) või suhtelise ellujäämuse (TK6 korral) vähenemine.

Otsemutatsioon : geenimutatsioon, mille puhul algne geen võtab mutantse vormi ja mille tulemusena muutub või kaob asjaomase kodeeritud valgu ensümaatiline aktiivsus või funktsioon.

Raaminihet põhjustav mutageen : kemikaal, mille mõjul lisatakse DNA molekuli või eemaldatakse sealt üks või mitu aluspaari.

Genotoksilisus : üldmõiste, mis hõlmab DNA ja kromosoomide igat liiki kahjustusi, sealhulgas DNA-ahela katkemisi, adukte, ümberkorraldusi, mutatsioone, kromosoomiaberratsioone ja aneuploidsust põhjustavaid omadusi. Genotoksiline mõju ei väljendu alati mutatsiooni või püsiva kromosoomikahjustusena.

Mitootiline rekombinatsioon : mitoosi ajal homoloogsete kromatiidide vahel toimuv rekombinatsioon, millega võib kaasneda DNA kahe ahela katkemine või heterosügootsuse kadu.

Mutageensus : omadus, mis põhjustab pärilikke muutusi geenide DNA aluspaaride järjestuses või kromosoomide struktuuris (kromosoomiaberratsioonid).

Muteerumissagedus (MF) : vaadeldud mutantrakkude arv, mis on jagatud elujõuliste rakkude arvuga.

Fenotüübi ekspressiooniaeg : töötlusele järgnev aeg, mille vältel geneetiline muutus kinnistub genoomis ja mis tahes varem esinenud geeniproduktide sisaldus väheneb nii palju, et asjaomane fenotüübiline tunnus muutub.

Suhteline ellujäämus (RS) : näitaja, mille kaudu TK6 korral väljendatakse töötlusest tulenevat tsütotoksilisust. See on vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhusus (CE), mida on kohandatud rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise ajal, võrrelduna negatiivse kontrollprooviga leitud kloonimistõhususega.

Suhteline suspensioonikasv (RSG) : MLA korral katsekultuuri kogu suhteline suspensioonikasv kahe päeva jooksul, võrrelduna negatiivse/lahusti kontrollprooviga leitud kogu suspensioonikasvuga kahe päeva jooksul (Clive ja Spector, 1975). RSG peaks hõlmama katsekultuuri suhtelist kasvu võrrelduna negatiivse/lahusti kontrollprooviga töötlemisperioodi jooksul.

Suhteline kogukasv (RTG) : näitaja, mille kaudu MLA korral väljendatakse töötlusest tulenevat tsütotoksilisust. Sellega väljendatakse katsekultuuride suhtelist (kandeaine kontrollprooviga võrreldud) kasvu katse töötlemis-, kahepäevases avaldumis- ja mutantide selektiivse kloonimise faasis. Iga katsekultuuri RSG korrutatakse katsekultuuri suhtelise kloonimistõhususega mutantide selekteerimise ajal ning väljendatakse negatiivse/kandeaine kontrollprooviga leitud kloonimistõhususe suhtes (Clive ja Spector, 1975).

Maksafraktsioon S9 : maksa homogenaadi supernatant, mis on eraldatud pärast tsentrifuugimist 9 000g juures, st maksa toorekstrakt.

S9 segu : maksafraktsiooni S9 ja metaboolsete ensüümide aktiivsuse tagamiseks vajalike kofaktorite segu.

Suspensioonikasv (SG) : rakkude arvu kordne suurenemine MLA töötlemis- ja avaldumisfaasi jooksul. SG arvutamiseks korrutatakse lühiajalise töötlemise (3 või 4 tundi) korral kordne kasv 1. päeval kordse kasvuga 2. päeval. Kui kasutati 24-tunnist töötlemist, on SG 24 tunnise töötlemisaja kordse kasvu korrutis 1. ja 2. avaldumispäeva kordsete kasvudega.

Lahusti kontrollproov : üldmõiste, millega tähistatakse kontrollkultuuri, kuhu on lisatud üksnes uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatud lahustit.

Uuritav kemikaal : iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Töötlemata kontrollproov : töötlemata kontrollproovid on rakukultuurid, mida ei ole töödeldud (st ei uuritava kemikaali ega lahustiga), kuid mida on käideldud samaaegselt samal viisil kui uuritava kemikaaliga töödeldud rakukultuure.

2. liide

VALEMID

Tsütotoksilisus

Nii MLA agari- kui ka mikrotiiterplaadi variandi korral

Tsütotoksilisus on määratletud suhtelise kogukasvuna (RTG), mis hõlmab suhtelise kogukasvu (RSG) 2-päevase avaldumisperioodi jooksul ja mutantide selekteerimise ajal leitud suhtelise kloonimistõhususe (RCE). Nii RTG, RSG kui ka RCE väljendatakse protsentides.

RSG arvutamine: suspensioonikasv SG1 on 0-päeva ja 1. päeva vaheline kasvumäär (rakkude kontsentratsiooni 1. päeval / rakkude kontsentratsioon 0-päeval) ja suspensioonikasv SG2 on 1. päeva ja 2. päeva vaheline kasvumäär (rakkude kontsentratsioon 2. päeval / rakkude kontsentratsioon 1. päeval). RSG on töödeldud kultuuri kogu SG (SG1 × SG2) võrrelduna töötlemata/lahusti kontrollproovi omaga. Seega: RSG = [SG1(uuritav) × SG2(uuritav)] / [SG1(kontrollproov) × SG2(kontrollproov)]. SG1 arvutamisel tuleb lähtuda rakkude algsest kontsentratsioonist, mida kasutati rakkude töötlemise alguses. Seega võetakse arvesse rakkude töötlemise ajal katsekultuuris ilmnevaid erinevaid tsütotoksilisi toimeid.

RCE on katsekultuuri suhteline kloonimistõhusus võrreldes töötlemata/lahusti kontrollproovi suhtelise kloonimistõhususega mutantide selekteerimise ajal.

Suhteline kogukasv (RTG): RTG=RSG × RCE

TK6

Suhteline Ellujäämus (RS):

tsütotoksilisust hinnatakse suhtelise ellujäämusega, st vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhususega, kohandatuna rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise käigus ja võrrelduna kloonimistõhususega negatiivsete kontrollproovide puhul, mille ellujäämuseks loetakse 100 %. Kohandusarvutus, mis võtab arvesse rakkude arvu vähenemist töötlemise ajal, on järgmine:

Formula

Uuritava kemikaaliga töödeldud kultuuri RS arvutatakse järgmiselt:

Formula

Muteerumissagedus MLA ja TK6 Korral

Muteerumissagedus (MF) on mutantsete kolooniate kloonimistõhusus selektiivsöötmes (CEM), mis on kohandatud selekteerimisaegse kloonimistõhususega selektiivaineta söötmes (CEV). Seega MF = CEM/CEV. Nende kahe kloonimistõhususe arvutuskäigud on esitatud allpool kloonimise agari- ja mikrotiiterplaadimeetodi jaoks.

MLA agarivariant: MLA pehme agari variandi korral saadakse kolooniate arv mutantide selekteerimisplaadil (CM) ja kolooniate arv selektiivaineta või kloonimistõhususe (eluvõimeliste rakkude arv) leidmise plaadil (CV) vahetult kolooniaid loendades. Kui 600 rakku külvatakse kloonimistõhususe (CE) määramiseks mutantide selekteerimisplaatidele (CEM) ja selektiivaineta või kloonimistõhususe (eluvõimeliste rakkude arv) määramise plaatidele (CEV) ja mutantide selekteerimiseks kasutatakse 3 × 106 rakku, siis

CEM = CM / (3 × 106) = (CM / 3) × 10-6

CEV = CV / 600

MLA ja TK6 mikrotiiterplaadi variant: MLA ja TK6 mikrotiiterplaadi variandi korral arvutatakse CM ja CV korrutisena mikrotiiterplaadi süvendite koguarvust (TW) ja tõenäolisest kolooniate arvust süvendi kohta (P).

CM = PM × TWM

CV = PV × TWV

Lähtudes Poissoni jaotuse kujust, kui argument on null (Furth et al., 1981), saab P avaldada järgmiselt:

P = – ln (EW / TW),

kus EW on tühjade süvendite arv ja TW on süvendite koguarv. Niisiis:

CEM = CM / TM = (PM × TWM) / TM

CEV = CV / TV = (PV × TWV) / TV

MLA mikrotiiterplaadi variandi korral arvutatakse väikeste ja suurte kolooniate muteerumissagedused samal viisil, kasutades vastavalt väikeste ja suurte kolooniatega seotud tühjade süvendite arvu.

TK6 korral on väikeste ja suurte kolooniate muteerumissageduste aluseks vara tekkivad ja hilja tekkivad mutandid.

B.68 LÜHIAJALISE KOKKUPUUTE IN VITRO KATSEMEETOD SELLISTE KEMIKAALIDE KINDLAKSTEGEMISEKS, I) MIS TEKITAVAD RASKEID SILMAKAHJUSTUSI, JA II) MIDA EI OLE VAJA KLASSIFITSEERIDA SEOSES SILMADE ÄRRITUSE VÕI RASKE SILMAKAHJUSTUSEGA

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 491 (2017). Lühiajalise kokkupuute katsemeetod on in vitro meetod, mida võib teatavatel asjaoludel ja teatavate piirangutega kasutada, et klassifitseerida ja märgistada kemikaale (aineid ja segusid), mis põhjustavad rasket silmakahjustust või silmade ärritust, nagu need on määratletud Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (1) ning Euroopa Liidu määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus) (66).

Paljude aastate jooksul on kemikaalidest tingitud silmakahjustuse ohu hindamiseks kasutatud peamiselt in vivo silmakatset küülikul (katsemeetod B.5 (8), samaväärne OECD katsejuhendiga nr 405). Üldiselt ollakse arvamusel, et lähitulevikus ei ole võimalik rasket silmakahjustust tekitava / silmi ärritava toime kogu ulatuse prognoosimisel eri kemikaaliklasside puhul ühegi alternatiivse in vitro katsega täielikult asendada in vivo silmakatset küülikul. Kuid astmelise katsetamise strateegia osana kasutatava mitme alternatiivse katsemeetodi strateegilise kombineerimisega võib siiski olla võimalik küüliku silmakatset (2) täielikult asendada. Ülalt-alla lähenemisviisi tuleks kasutada katsetes kemikaalidega, mille puhul olemasoleva teabe põhjal võib eeldada, et asjaomane kemikaal võib silma tugevasti ärritada või põhjustada raske silmakahjustuse. Alt-üles lähenemisviisi tuleks kasutada vastupidiselt katsetes kemikaalidega, millel puhul olemasoleva teabe põhjal võib eeldada, et asjaomane kemikaal ei põhjusta klassifitseerimiseks piisavat silmade ärritust. Kuigi ei peeta võimalikuks, et lühiajalise kokkupuute katsemeetod asendaks täielikult in vivo silmakatset küülikuga, sobib see kasutamiseks astmelise katsetamise strateegia osana õigusliku klassifitseerimise ja märgistamise jaoks näiteks ülalt-alla ja alt-üles lähenemisviisi puhul, et teha täiendava katsetamiseta kindlaks i) kemikaalid, mis põhjustavad raske silmakahjustuse (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 1. kategooria) ja ii) kemikaalid (välja arvatud väga lenduvad ained ja kõik tahked kemikaalid peale pindaktiivsete ainete), mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane kategooria puudub) (1, 2). Kuid niisugune kemikaal, mille puhul lühiajalise kokkupuute katsemeetodiga ei prognoosita raske silmakahjustuse põhjustamist (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 1. kategooria) ega ka ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooria puudumist (ei põhjusta rasket silmakahjustust ega silmade ärritust), vajab siiski täiendavat uurimist, et saaks määrata lõpliku klassifikatsiooni. Peale selle tuleks konsulteerida asjakohaste reguleerivate asutustega, enne kui lühiajalise kokkupuute katset hakatakse muu kui ÜRO GHSi / CLP-määruse klassifitseerimisskeemi korral kasutama alt-üles lähenemisviisi rakendamiseks. Kõige asjakohasema katsemeetodi valimist ja selle kasutamist tuleks vaadelda raske silmakahjustuse ja silmade ärrituse põhjustamise uurimiseks ja hindamiseks kasutatavaid kompleksseid lähenemisviise käsitleva OECD juhenddokumendi (14) kontekstis.

Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada eeskirju, mida kasutatakse, et hinnata uuritava kemikaali võimalikku ohtlikkust silmale selle võime põhjal kutsuda esile tsütotoksilisust lühiajalise kokkupuute meetodi kasutamisel. Kemikaalide tsütotoksiline mõju sarvkesta epiteelirakkudele on oluline toimemehhanism, mille tulemusena tekib sarvkesta epiteeli kahjustus ja silmade ärritus. Lühiajalise kokkupuute katsemeetodiga mõõdetakse rakkude eluvõimelisust vitaalvärvaine MTT (3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine) ensümaatilise muundamise järgi siniseks formasaansoolaks, mis pärast rakkudest ekstraheerimist määratakse kvantitatiivselt (3). Saadud rakkude eluvõimelisust võrreldakse lahusti kontrollprooviga (suhteline eluvõimelisus) ja kasutatakse uuritavast kemikaalist tingitud võimaliku silmakahjustuse ohu hindamiseks. Uuritav kemikaal klassifitseeritakse ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 1. kategooriasse, kui nii 5 % kui ka 0,05 % kontsentratsiooni juures on rakkude eluvõimelisus alla 70 % või sellega võrdne. Kui rakkude eluvõimelisus nii 5 % kui ka 0,05 % kontsentratsiooni juures on üle 70 %, viidatakse kemikaalile kui ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooriata kemikaalile.

Käesolevas katsemeetodis kasutatakse terminit „uuritav kemikaal“ uurimisobjektile viitava terminina ja see ei ole seotud lühiajalise kokkupuute katsemeetodi kohaldatavusega ainete ja/või segude uurimiseks. Mõisted on esitatud liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Käesolev katsemeetod põhineb Kao Corporationi välja töötatud metoodikal (4), millega viidi läbi kaks eraldi valideerimisuuringut: ühe tegi Jaapani loomkatsete alternatiivide ühing (JSAAE) (5) ning teise Jaapanialternatiivmeetodite valideerimiskeskus (JaCVAM) (6). Vastastikuse eksperdihinnangu tegid Ameerika Ühendriikide riikliku toksikoloogiaprogrammi (NTP) alternatiivsete toksikoloogiameetodite ametitevaheline keskus (National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, NICEATM) ja alternatiivmeetodite valideerimise ametitevaheline koordineerimiskomitee (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) (7) valideerimisuuringute aruannete ning katsemeetodi taustaülevaatedokumentide põhjal.

Kui lühiajalise kokkupuute katsemeetodit kasutatakse selliste kemikaalide (ainete ja segude) kindlakstegemiseks, mis tekitavad rasket silmakahjustust (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 1. kategooria) (1), on lühiajalise kokkupuute katsemeetodil 125 kemikaali (nii ained kui ka segud) kohta saadud andmete kogutäpsus 83 % (104/125), valepositiivsete tulemuste määr on 1 % (1/86) ja valenegatiivsete tulemuste määr 51 % (20/39), võrreldes küüliku in vivo silmakatsega (7). Saadud valenegatiivsete tulemuste määr ei ole selles kontekstis kriitiline, sest kõiki uuritavaid kemikaale, mille puhul rakkude eluvõimelisus 5 % kontsentratsiooni juures on ≤ 70 % ja 0,05 % kontsentratsiooni juures > 70 %, uuritakse järgmiseks muude asjakohaselt valideeritud in vitro katsemeetoditega või viimase võimalusena, olenevalt regulatiivsetest nõuetest, küüliku in vivo silmakatsetes kooskõlas järjestikuse katsete tegemise strateegia ning hetkel soovitatava tõendite kaalukuse lähenemisviisiga (1, 8). Põhiliselt uuriti ühe koostisosaga aineid, kuigi piiratud kogus andmeid on olemas ka katsetest segudega. See katsemeetod on siiski tehniliselt kohaldatav mitme koostisosaga ainete ja segude uurimiseks. Enne kui kasutada seda katsemeetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb siiski kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi, ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist. Lühiajalise kokkupuute katsemeetodil ei ole spetsiifilisi puudusi, kui seda kasutatakse nende uuritavate kemikaalide kindlakstegemisel, mis kuuluvad ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 1. kategooriasse. Teadlased võiksid kaaluda uuritavate kemikaalide puhul kõnealuse katsemeetodi kasutamist, kusjuures rakkude eluvõimelisus ≤ 70 % nii 5 % kui ka 0,05 % kontsentratsiooni juures tuleks lugeda tõendiks, et kemikaal põhjustab rasket silmakahjustust ja tuleks liigitada ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 1. kategooriasse ilma edasise katsete tegemiseta.

Kui lühiajalise kokkupuute katsemeetodit kasutatakse selliste kemikaalide (ainete ja segude) kindlakstegemiseks, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse ja raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane kategooria puudub), on lühiajalise kokkupuute katsemeetodil 130 kemikaali (nii ained kui ka segud) kohta saadud andmete kogutäpsus 85 % (110/130), valenegatiivsete tulemuste määr on 12 % (9/73) ja valepositiivsete tulemuste määr 19 % (11/57), võrreldes küüliku in vivo silmakatsega (7). Kui andmestikust jäetakse välja väga lenduvad ained ja tahked ained peale pindaktiivsete ainete, paraneb kogutäpsus 90 %-ni (92/102), valenegatiivsete tulemuste määra 2 %-ni (1/54) ja valepositiivsete tulemuste määr 19 %-ni (9/48) (7). Seega on lühiajalise kokkupuute katsemeetodi võimalik puudus nende kemikaalide kindlakstegemiseks kasutamise korral, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane kategooria puudub), suur valepositiivsete tulemuste määr, kui tegemist on i) üle 6 kPa aururõhuga väga lenduvate ainetega ning ii) tahkete kemikaalidega (ained ja segud), välja arvatud pindaktiivsed ained ja ainult pindaktiivsetest ainetest koosnevad segud. Niisugused kemikaalid jäetakse lühiajalise kokkupuute katsemeetodi (7) kohaldamisvaldkonnast välja.

Lisaks punktides 6 ja 7 nimetatud kemikaalidele sisaldab lühiajalise kokkupuute katsemeetodiga saadud andmestik ettevõttesiseseid andmeid 40 segu kohta ning võrreldes Draize'i in vivo silmakatsega on nende andmete täpsus 88 % (35/40), valepositiivsete tulemuste määr 50 % (5/10) ja valenegatiivsete tulemuste määr 0 % (0/30), kui prognoosida nende segude omadusi, mida ei ole vaja ÜRO GHSi / CLP-määruse klassifitseerimissüsteemide kohaselt klassifitseerida (9). Seega võib lühiajalise kokkupuute katsemeetodit kasutada ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooriata segude kindlakstegemiseks alt-üles lähenemisviisi järgides, välja arvatud muude tahkete segude korral kui ainult pindaktiivsetest ainetest koosnevad segud, kuna nendele laieneb tahkete ainetega seotud piirang. Peale selle tuleks segusid, mis sisaldavad üle 6 kPa aururõhuga aineid, hoolikalt hinnata, et vältida võimalikku alahindamist, ning see peab olema igal üksikjuhtumil põhjendatud.

Lühiajalise kokkupuute katsemeetodit ei saa kasutada nende uuritavate kemikaalide kindlakstegemiseks, mida klassifitseerida ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 2. kategooriasse, ÜRO GHSi kohasesse 2A (silmade ärritus) või 2B kategooriasse (kerge silmade ärritus); selle põhjuseks on nende ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase 1. kategooria kemikaalide suur arv, mis on alahinnatud 2., 2A või 2B kategooriasse kuuluvaks, samuti nende ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooriata kemikaalide suur arv, mis on ülehinnatud 2., 2A või 2B kategooriasse kuuluvaks (7). Selleks võib vaja minna täiendavaid uuringuid muu sobiva meetodiga.

10.

Lühiajalise kokkupuute meetod sobib uuritavate kemikaalide puhul, mis lahustuvad füsioloogilises lahuses, 5 % dimetüülsulfoksiidisisaldusega füsioloogilises lahuses või mineraalõlis või suspendeeruvad nendes ühtlaselt vähemalt viieks minutiks. Lühiajalise kokkupuute meetod ei sobi uuritavate kemikaalide puhul, mis füsioloogilises lahuses, 5 % dimetüülsulfoksiidisisaldusega füsioloogilises lahuses või mineraalõlis ei lahustu ega nendes vähemalt viieks minutiks ühtlaselt ei suspendeeru. Mineraalõli kasutamine lühiajalise kokkupuute meetodi korral on võimalik lühiajalise kokkupuute tõttu. Seega sobib lühiajalise kokkupuute meetod vees lahustumatute uuritavate kemikaalide (nt pikaahelalised rasvhapped või ketoonid) võimaliku silmale ohtlikkuse hindamiseks tingimusel, et kõnealused kemikaalid segunevad vähemalt ühega kolmest eespool soovitatud lahustist (4).

11.

Käesolevas katsemeetodis kasutatakse terminit „uuritav kemikaal“ uurimisobjektile viitava terminina (67) ja see ei ole seotud lühiajalise kokkupuute katsemeetodi kohaldatavusega ainete ja/või segude uurimiseks.

KATSE PÕHIMÕTE

12.

Lühiajalise kokkupuute katsemeetod on tsütotoksilisusel põhinev in vitro meetod, mis viiakse läbi Taani riikliku seerumiinstituudi küüliku sarvkesta (Statens Seruminstitut Rabbit Cornea – SIRC) rakkude konfluentse monokihiga, mis kasvatatakse 96 süvendiga, polükarbonaadist mikrotiiterplaadil (4). Pärast 5-minutist kokkupuudet uuritava kemikaaliga määratakse tsütotoksilisus kvantitatiivselt SIRC-rakkude suhtelise eluvõimelisusena MTT-katsel (4). Rakkude vähenenud eluvõimelisuse alusel prognoositakse silmakahjustusi põhjustavat võimalikku kahjulikku mõju.

13.

On teatatud, et 80 % küüliku silma tilgutatud lahusest väljutatakse sidekestakoti kaudu kolme kuni nelja minuti jooksul ning üle 80 % inimese silma tilgutatud lahusest väljutatakse ühe kuni kahe minuti jooksul (10). Lühiajalise kokkupuute katsemeetodiga on püütud neid kokkupuuteaegu ühtlustada ning kasutatud tsütotoksilisust näitajana, mille alusel hinnata pärast 5-minutist kokkupuudet uuritava kemikaaliga SIRC-rakkudele tekitatud kahjustuste ulatust.

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

14.

Enne käesoleval katsemeetodil põhineva lühiajalise kokkupuute meetodi rutiinset kasutamist tuleb laboril tõendada oma tehnilist pädevust, klassifitseerides õigesti tabelis 1 soovitatud üksteist ainet. Need ained on valitud nii, et need esindavad rasket silmakahjustust või silmade ärritust tekitavate ainete põhjustatud reaktsioonide täielikku vahemikku, mis põhineb küüliku silma in vivo katse (katsemeetod 405) ja ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase klassifitseerimissüsteemi tulemustel (1). Teisteks valikukriteeriumideks olid ainete kaubanduslik kättesaadavus, kvaliteetsete võrdlusandmete kättesaadavus in vivo katsete kohta ning kvaliteetsete võrdlusandmete kättesaadavus lühiajalise kokkupuute meetodil tehtud in vitro katsete kohta (3). Olukorras, kus loetletud aine ei ole kättesaadav, või kui see on põhjendatud, võib kasutada muud ainet, mille puhul on kättesaadavad piisavad võrdlusandmed in vivo ja in vitro katsete kohta, eeldusel, et järgitakse eespool kirjeldatud kriteeriumeid.

Tabel 1

Pädevuse tõendamise ainete loend

Aine	CASi nr	Aineklass (68)	Füüsikaline olek	In vivo katsel määratud ÜRO GHSi /CLP-määruse kohane kategooria (69)	Lühiajalise kokkupuute katsel kasutatud lahusti	Lühiajalise kokkupuute katsel määratud ÜRO GHSi /CLP-määruse kohane kategooria
Bensalkooniumkloriid (10 % vesilahus)	8001-54-5	Ooniumühend	Vedel	1. kategooria	Füsioloogiline lahus	1. kategooria
Triton X-100 (100 %)	9002-93-1	Eeter	Vedel	1. kategooria	Füsioloogiline lahus	1. kategooria
Happeline punane 92	18472-87-2	Heterotsükliline ühend; broomiühend; klooriühend	Tahke	1. kategooria	Füsioloogiline lahus	1. kategooria
Naatriumhüdroksiid	1310-73-2	Leelis; anorgaaniline aine	Tahke	1. kategooria (70)	Füsioloogiline lahus	1. kategooria
Butürolaktoon	96-48-0	Laktoon; heterotsükliline ühend	Vedel	2A kategooria (CLP-määruse kohane 2. kategooria)	Füsioloogiline lahus	Prognoosida ei ole võimalik
1-oktanool	111-87-5	Alkohol	Vedel	2A/B kategooria (71)(CLP-määruse kohane 2. kategooria)	Mineraalõli	Prognoosida ei ole võimalik
Tsüklopentanool	96-41-3	Alkohol; süsivesinik (tsükliline)	Vedel	2A/B kategooria (72) (CLP-määruse kohane 2. kategooria)	Füsioloogiline lahus	Prognoosida ei ole võimalik
2-etoksüetüülatsetaat	111-15-9	Alkohol; eeter	Vedel	Kategooriata	Füsioloogiline lahus	Kategooriata
Dodekaan	112-40-3	Süsivesinik (atsükliline)	Vedel	Kategooriata	Mineraalõli	Kategooriata
Metüülisobutüülketoon	108-10-1	Ketoon	Vedel	Kategooriata	Mineraalõli	Kategooriata
1,1-dimetüülguanidiinsulfaat	598-65-2	Amidiin Väävliühend	Tahke	Kategooriata	Füsioloogiline lahus	Kategooriata
Lühendid: CASi nr = Chemical Abstracts Service’i registrinumber

KATSE KÄIK

Rakkude monokihi valmistamine

15.

Lühiajalise kokkupuute katsemeetodi rakendamiseks tuleks kasutada küüliku sarvkesta rakkude SIRC-liini. Soovitatav on soetada SIRC-rakud usaldusväärsest rakupangast, näiteks USA tüüpkultuuride kollektsioonist (American Type Culture Collection), tootekood CCL60.

16.

SIRC-rakke kasvatatakse 37 °C juures reguleeritud õhuniiskusega 5 % CO2-sisaldusega atmosfääris kultuurikolvis, mis sisaldab kasvusöödet, mis koosneb Eagle'i essentsiaalsest minimaalsöötmest (MEM), millele on lisatud 10 % veise loote seerumit (FBS), 2 mM L-glutamiini, 50–100 ühikut/ml penitsilliini ja 50–100 μg/ml streptomütsiini. Rakud, mis on saavutanud kultuurikolvis konfluentsuse, eraldatakse trüpsiini etüleendiamiintetraäädikhappe lahusega, kasutada võib rakukaabitsat. Enne rutiinanalüüsis kasutamist kasvatatakse rakke (nt 2–3 passaaži) kultuurikolvis ning need ei tohiks pärast sulatamist läbida üle 25 passaaži.

17.

Lühiajalise kokkupuute katses kasutamiseks valmis rakud külvatakse sobiva tihedusega 96 süvendiga plaatidesse. Kui kultuuri ruumala on 200 μl, on rakkude soovitatav külvitihedus 6,0 × 103 rakku süvendis, kui rakke kasutatakse neli päeva pärast külvamist, või 3,0 × 103 rakku süvendis, kui rakke kasutatakse viis päeva pärast külvamist. Lühiajalise kokkupuute katses kasutatavad rakud, mis külvatakse kasvusöötmesse sobiva tihedusega, saavutavad katse läbiviimise ajaks, st 4. või 5. külvijärgseks päevaks üle 80 % konfluentsuse.

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainete kasutamine

18.

Uuritavate kemikaalide lahustamiseks või suspendeerimiseks tuleks esmajoones valida füsioloogiline lahus. Kui uuritavad kemikaalid lahustuvad füsioloogilises lahuses halvasti või neid ei saa selles vähemalt viieks minutiks lahustada või ühtlaselt suspendeerida, tuleks teise lahustina valida 5 % DMSO (CASi nr 67-68-5) sisaldusega füsioloogiline lahus. Nende uuritavate kemikaalide jaoks, mida ei saa vähemalt viieks minutiks lahustada või ühtlaselt suspendeerida ei füsioloogilises lahuses ega 5 % DMSO-sisaldusega füsioloogilises lahuses, kasutatakse kolmanda valikuna mineraalõli (CASi nr 8042-47-5).

19.

Uuritavad kemikaalid lahustatakse või suspendeeritakse valitud lahustis ühtlaselt 5 % kontsentratsiooni (massiprotsent) juures ning valmistatakse järjestikuste 10-kordsete lahjendamiste teel 0,5 % ja 0,05 % kontsentratsiooniga lahused. Iga uuritava kemikaaliga viiakse katse läbi nii 5 % kui ka 0,05 % kontsentratsiooni juures. 96 süvendiga plaadis kasvatatud rakud viiakse toatemperatuuril viieks minutiks kokkupuutesse uuritava kemikaali lahuse või suspensiooniga, mille kontsentratsioon on kas 5 % või 0,05 % ja mida lisatakse 200 μl süvendi kohta. Uuritavaid kemikaale (ühe või mitme koostisainega ained või segud) käsitletakse nende puhtusastet arvestamata puhaste ainetena ning need lahustatakse või suspendeeritakse vastavalt meetodis esitatud juhistele.

20.

Punktis 16 kirjeldatud kasvusöödet kasutatakse söötmega kontrolliks iga korduskatse igas plaadis. Peale selle tuleb rakud iga korduskatse igas plaadis viia kokkupuutesse ka lahusti kontrollproovidega. On kindlaks tehtud, et punktis 18 loetletud lahustitel ei ole kahjulikku mõju SIRC-rakkude eluvõimelisusele.

21.

Lühiajalise kokkupuute katsemeetodi korral kasutatakse iga korduskatse igas plaadis positiivseks kontrolliks 0,01 % naatriumlaurüülsulfaadisisaldusega füsioloogilist lahust. Positiivse kontrolli rakkude eluvõimelisuse arvutamiseks peab iga korduskatse iga plaat hõlmama ka lahusti kontrollproovi füsioloogilise lahusega.

22.

Tühiproov on vajalik optilise tiheduse kompensatsiooni määramiseks ja seda tuleks kontrollida süvendites, mis sisaldavad ainult fosfaadiga puhverdatud füsioloogilist lahust (PBS) ega sisalda kaltsiumi, magneesiumi ega rakke.

23.

Igat proovi (uuritava kemikaali 5 % ja 0,05 % lahus, lahusti kontrollproov, söötme kontrollproov ja positiivne kontroll) tuleb igas korduskatses analüüsida kolme paralleelproovina, viies rakud toatemperatuuril viieks minutiks kokku 200 μl asjaomase uuritava või kontrollkemikaaliga.

24.

Võrdlusained võimaldavad hinnata teatavasse kemikaali- või tooteklassi kuuluva uurimata kemikaali omadust põhjustada silmade ärritust või hinnata teatava silmi ärritava aine mõju tugevust teatavas ärritava toime vahemikus.

Raku eluvõimelisuse mõõtmine

25.

Pärast kokkupuudet pestakse rakke kaks korda 200 μl PBSiga ja lisatakse 200 μl MTT lahust (0,5 mg MTTd 1 ml kasvusöötme kohta). Pärast kahetunnise reaktsiooniaja möödumist inkubaatoris (37 °C, 5 % CO2) MTT lahus dekanteeritakse ja lisatakse MTT formasaani ekstraheerimiseks 200 μl 0,04 N vesinikkloriidhappe lahust isopropanoolis, lastakse lahusel 60 minutit pimedas toatemperatuuril seista ning mõõdetakse plaadilugeriga neelduvus MTT formasaani lahuses lainepikkusel 570 nm. Uuritavate kemikaalide segav mõju MTT-katses (värvainete või MTT otseste redutseerijate puhul) esineb ainult juhul, kui uuritavasse süsteemi jääb pärast kokkupuutejärgset pesu märkimisväärne kogus uuritavat kemikaali. Seda juhtub inimese kolmemõõtmelise rekonstrueeritud sarvkesta või inimese kolmemõõtmelise rekonstrueeritud epidermise kudede puhul, kuid lühiajalise kokkupuute katsemeetodis kasutatud kahemõõtmeliste rakukultuuride puhul on see tähtsusetu.

Tulemuste tõlgendamine ja prognoosimismudel

26.

Iga uuritava kemikaali kohta saadud optilise tiheduse (OD) väärtusi kasutatakse selleks, et arvutada rakkude eluvõimelisus lahusti kontrollproovi suhtes, mille puhul eluvõimelisuseks loetakse 100 %. Rakkude suhtelist eluvõimelisust väljendatakse protsentides ning see saadakse, jagades uuritava kemikaali optilise tiheduse väärtuse lahusti kontrollproovi omaga, kusjuures eelnevalt on neist mõlemast lahutatud tühiproovi optilise tiheduse väärtus.

Formula

Samamoodi väljendatakse protsentides rakkude suhtelist eluvõimelisust igas lahusti kontrollproovis ning see saadakse, jagades iga lahusti kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse söötme kontrollproovi omaga, kusjuures eelnevalt on neist mõlemast lahutatud tühiproovi optilise tiheduse väärtus.

27.

Läbi tuleb viia kolm sõltumatut korduskatset, millest igaüks toimub paralleelselt kolme süvendiga (st n=9). Rakkude suhtelise eluvõimelisuse aritmeetilise keskmise arvutamiseks kasutatakse sõltumatutel korduskatsetel iga uuritava kemikaali ja lahustiga kontrollprooviga kolmes süvendis saadud tulemuste aritmeetilist keskmist. Rakkude eluvõimelisuse lõplik aritmeetiline keskmine arvutatakse kolme sõltumatu korduskatse põhjal.

28.

Rakkude eluvõimelisuse läviväärtused, mille järgi uuritavaid kemikaale, mis põhjustavad rasket silmakahjustust (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 1. kategooria), eristatakse uuritavatest kemikaalidest, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooriata kemikaal), on esitatud allpool.

Tabel 2

Lühiajalise kokkupuute katsemeetodi prognoosimismudel

Rakkude eluvõimelisus		ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane klassifikatsioon	Kohaldamine
5 % korral	0,05 % korral	ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane klassifikatsioon	Kohaldamine
> 70 %	> 70 %	Kategooriata	Ained ja segud, välja arvatud: i) väga lenduvad ained aururõhuga üle 6 kPa (73) ja ii) tahked kemikaalid (ained ja segud) peale pindaktiivsete ainete ja ainul pindaktiivsetest ainetest koosnevate segude
≤ 70 %	> 70 %	Prognoosida ei ole võimalik	Ei kohaldata
≤ 70 %	≤ 70 %	1. kategooria	Ained ja segud (74)

Nõuetekohasuse kriteeriumid

29.

Katsetulemused loetakse nõuetekohaseks, kui on täidetud kõik järgmised kriteeriumid.

a)	Söötme kontrollproovi (kasvusööde, mida kokkupuutel kasutati) optiline tihedus peab pärast tühiproovi optilise tiheduse väärtuse lahutamist olema vähemalt 0,3;

Eluvõimelisus lahusti kontrollproovis peab olema vähemalt 80 %, võrreldes eluvõimelisusega söötme kontrollproovis. Kui igal korduskatsel kasutatakse mitut lahusti kontrollproovi, peab neist igaühes rakkude eluvõimelisus olema üle 80 %, et nende lahustitega analüüsitud uuritavate kemikaalide omadusi oleks võimalik nõuetekohaselt hinnata.

Positiivse kontrollprooviga (0,01 % naatriumlaurüülsulfaat) saadud rakkude eluvõimelisus võib varasemate uuringute keskväärtusest erineda kahe standardhälbe ulatuses. Positiivse kontrollproovi nõuetekohasuse ülem- ja alampiiri tuleb sageli, st iga kolme kuu möödudes ajakohastada, või tuleb laborites, kus katseid tehakse harva (st vähem kui kord kuus), iga kord teha ka nõuetekohane katse. Kui laboris ei viida läbi piisaval arvul eksperimente, et saavutada positiivse kontrollproovi tulemuste statistiliselt robustne jaotus, on lubatud kasutada meetodi väljatöötaja antud nõuetekohasuse ülem- ja alampiiri, st vahemikku 21,1–62,3 % vastavalt laboris aja jooksul kogutud andmetele, samas kui laborisisene jaotus tehakse kindlaks esimeste rutiinsete katsetega.

Kolmest sõltumatust korduskatsest saadud rakkude lõpliku eluvõimelisuse standardhälve peab nii uuritava kemikaali 5 % kui ka 0,05 % kontsentratsiooni juures jääma alla 15 %.

Kui üks või mitu nendest kriteeriumidest ei ole täidetud, tuleb tulemused kehtetuks lugeda ja läbi viia veel kolm sõltumatut korduskatset.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmed

30.

Esitada tuleb iga korduskatse iga üksiksüvendi kohta saadud andmed (nt rakkude eluvõimelisuse väärtused) ning üldine keskväärtus, standardhälve ja klassifikatsioon.

Katseprotokoll

31.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal ja kontrollained

—	Ühest koostisosast koosnev aine: kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid;

—

—	füüsikaline olek, lenduvus, pH, log P, molekulmass, aineklass ja muud uuringu tegemisega seotud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;

—	puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;

—	töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);

—	säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses.

Katsetingimused ja -eeskirjad

—	Sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;

—	kasutatud katsemeetodi kirjeldus;

—	kasutatud rakuliin, selle päritolu, passaažide arv ja katses kasutatud rakkude konfluentsus;

—	kasutatud katse-eeskirja üksikasjad;

—	kordus- ja paralleelproovide arv;

—	uuritava kemikaali kasutatud kontsentratsioonid (kui erinevad soovitatust);

—	iga uuritava kemikaali puhul lahusti valimise põhjendus;

—	uuritava kemikaaliga kokkupuute kestus (kui erineb soovitatust);

—	kõikide katse-eeskirjas tehtud muudatuste kirjeldus;

—	kasutatud hindamis- ja otsustamiskriteeriumide kirjeldus;

—	viide aja jooksul kogutud positiivsete kontrollproovide tulemuste keskväärtusele ja standardhälbele;

—	– labori kasutatud meetod, millega tõendatakse katsemeetodi kasutamise pädevust (nt pädevuse kontrolli ainetega katsetamine) või meetod, millega tõendatakse katsemeetodi korratavat toimivust ajas.

Tulemused

—

Iga uuritava kemikaali ja kontrollaine ning iga uuritava kontsentratsiooni kohta tuleb tabeli kujul esitada optiline tihedus igas paralleelkatse süvendis, iga sõltumatu korduskatse optilise tiheduse väärtuste aritmeetiline keskmine, iga sõltumatu korduskatse rakkude eluvõimelisus protsentides ning kokku kolmes korduskatses saadud rakkude eluvõimelisuse (%) lõplik aritmeetiline keskmine ja standardhälve;

—	söötme kontrollproovi, lahusti kontrollproovi ja positiivse kontrollproovi tulemused, mis tõendavad vastavust uuringu nõuetekohasuse kriteeriumidele;

—	muude täheldatud toimete kirjeldus;

—	tuletatud üldine/üldised klassifikatsioon(id) viitega kasutatud prognoosimudelile ja/või otsustamiskriteeriumidele.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). 5. täiendatud väljaanne, United Nations Publications, New York & Genf, 2013. ISBN: 978-92-1-117006-1. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

(2)	Scott, L. et al. (2010), „A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches“, Toxicol. in Vitro, nr 24, lk 1–9.

(3)	Mosmann, T. (1983). „Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to 7 Proliferation and Cytotoxicity Assays“, J. Immunol. Methods, nr 65, lk 55–63.

(4)	Takahashi, Y. et al. (2008), „Development of the Short Time Exposure (STE) Test: an In Vitro Eye Irritation Test Using SIRC Cells“, Toxicol. In Vitro, nr 22, lk 760–770.

(5)	Sakaguchi, H. et al. (2011), „Validation Study of the Short Time Exposure (STE) Test to Assess the Eye Irritation Potential of Chemicals“, Toxicol. In Vitro, nr 25, lk 796–809.

(6)	Kojima, H. et al. (2013), „Second-Phase Validation of Short Time Exposure Tests for Assessment of Eye Irritation Potency of Chemicals“, Toxicol. In Vitro, nr 27, lk 1855–1869.

(7)	ICCVAM (2013), Short Time Exposure (STE) Test Method Summary Review Document, NIH. Kättesaadav aadressil [http://www.ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/ocutox_docs/STE-SRD-NICEATM-508.pdf].

(8)	Käesoleva lisa peatükk B.5 „Äge mürgisus: silmade ärritus/söövitus“.

(9)	Saito, K. et al (2015), „Predictive Performance of the Short Time Exposure Test for Identifying Eye Irritation Potential of Chemical Mixtures“,

(10)	Mikkelson, T.J., Chrai, S.S. ja Robinson, J.R. (1973), „Altered Bioavailability of Drugs in the Eye Due to Drug-Protein Interaction“, J. Pharm. Sci., lk 1 648–1 653.

(11)	ECETOC (1998), Eye Irritation Reference Chemicals Data Bank. Technical Report (No 48. (2)), Brüssel, Belgia.

(12)	Gautheron, P. et al. (1992). „Bovine Corneal Opacity and Permeability Test: an In Vitro Assay of Ocular Irritancy“, Fundam. Appl. Toxicol., nr 18, lk 442–449.

(13)	OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34). Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(14)	OECD (2017), Guidance Document on an Integrated Approaches on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye irritation. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 263). Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

Liide

MÕISTED

Võrdlusaine : aine, mida kasutatakse standardina võrdlemiseks uuritava kemikaaliga. Võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega; iii) teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused; iv) teadaolevat toimet tõendavad andmed ja v) teadaolev mõjusus soovitavas reaktsioonitugevuse vahemikus.

Alt-üles lähenemisviis : etapiviisiline lähenemisviis, mida kasutatakse niisuguste uuritavate kemikaalide korral, mille puhul on põhjust arvata, et need ei vaja klassifitseerimist silmade ärrituse või raske silmakahjustusega seoses; nimetatud lähenemisviisi puhul eristatakse kõigepealt kemikaalid, mis ei vaja klassifitseerimist (tulemus on negatiivne), muudest kemikaalidest (tulemus on positiivne).

Kemikaal : aine või segu.

Silmade ärritus : muutuse tekkimine silmas pärast uuritava kemikaali silma eespinnale manustamist, seejuures on muutus 21 päeva jooksul pärast manustamist täielikult taandunud. Samatähenduslik mõistetega „pöörduv mõju silmale“ ja „ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 2. kategooria“.

Valenegatiivsete tulemuste määr : kõikide selliste kemikaalide osakaal, mis peaksid andma positiivse tulemuse, kuid on katsemeetodit järgides andnud negatiivse tulemuse. See on üks katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja.

Valepositiivsete tulemuste määr : kõikide selliste kemikaalide osakaal, mis peaksid andma negatiivse tulemuse, kuid on katsemeetodit järgides andnud positiivse tulemuse. See on üks katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja.

Oht : niisuguse mõjuri või olukorra loomupärane omadus, mis võib avaldada kahjulikku toimet, kui organism, süsteem või (ala)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.

Söötme kontrollproov : töötlemata paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente. Seda proovi analüüsitakse koos uuritava kemikaaliga töödeldud proovide ja teiste kontrollproovidega, et teha kindlaks, kas lahusti mõjutab katsesüsteemi.

Segu : kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

Ühe koostisosaga aine : aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles ühe peamise koostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

MTT : 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine.

OD : optiline tihedus.

Positiivne kontrollproov : paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemide komponente ja mida on töödeldud ainega, mis teadaolevalt kutsub esile positiivse reaktsiooni. Selleks, et oleks võimalik hinnata positiivse kontrollproovi esilekutsutud reaktsiooni varieeruvust ajas, ei tohi positiivne reaktsioon olla ülemäära tugev.

Tundlikkus : kõigi niisuguste positiivsete/reaktsioonivõimeliste kemikaalide osakaal, mis katse tulemusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega iseloomustatakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (10).

Raske silmakahjustus : sellise koekahjustuse tekkimine silmas või selline tugev nägemisteravuse langus pärast seda, kui uuritavat kemikaali on manustatud silma eespinnale, mis ei ole 21 päeva jooksul pärast manustamist täielikult pöörduv. Samatähenduslik mõistetega „pöördumatu mõju silmale“ ja „ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 1. kategooria“.

Lahusti/kandeaine kontrollproov : töötlemata proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente, sealhulgas lahustit või kandeainet, ning mida analüüsitakse koos uuritava kemikaaliga töödeldud proovide ja muude kontrollproovidega, et määrata kindlaks samas lahustis või kandeaines lahustatud uuritava kemikaaliga töödeldud proovide nulljoonetase. Kui seda proovi analüüsitakse samaaegselt söötme kontrollprooviga, näitab see samuti, kas lahusti või kandeaine mõjutab katsesüsteemi.

Spetsiifilisus : kõigi niisuguste negatiivsete/mittereageerivate kemikaalide osakaal, mis katse tulemusel klassifitseeritakse õigesti. Spetsiifilisusega iseloomustatakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (13).

Pindaktiivne aine : kemikaal, näiteks pesuaine, mis vähendab vedeliku pindpinevust ning muudab selle vahutavaks või tahket materjali läbivaks, seda nimetatakse ka märgavaks aineks.

Uuritav kemikaal : iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Astmelise katsetamise strateegia : etapiviisi katsete tegemise strateegia, milles enne järgmise etapiga alustamist vaadatakse kindlaksmääratud korras läbi kogu uuritava kemikaali kohta olemasolev teave, kasutades igas etapis tõendite kaalukuse menetlust, et otsustada, kas teave on ohuklassi määramiseks piisav. Kui olemasoleva teabe põhjal saab otsustada uuritava kemikaali ärritava toime üle, ei ole täiendavaid katseid vaja teha. Kui olemasoleva teabe põhjal ei saa otsustada uuritava kemikaali ärritava toime üle, jätkatakse järjestikuste loomkatsete etapiti tegemist, kuni kemikaali saab üheselt klassifitseerida.

Ülalt-alla lähenemisviis : etapiviisiline lähenemisviis, mida kasutatakse niisuguste uuritavate kemikaalide korral, mille puhul on põhjust arvata, et need põhjustavad rasket silmakahjustust; nimetatud lähenemisviisi puhul eristatakse kõigepealt rasket silmakahjustust tekitavad kemikaalid (tulemus on positiivne) muudest kemikaalidest (tulemus on negatiivne).

Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS (Globally Harmonized System)) : süsteem, milles kemikaalid (ained ja segud) on klassifitseeritud vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud tüübile ja -tasemele ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda edasi inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ja keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku mõju kohta (1).

ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 1. kategooria : vt „Raske silmakahjustus“.

ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 2. kategooria : vt „Silmade ärritus“.

ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooriata : kemikaalid, mis ei ole klassifitseeritud ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 1. ega 2. kategooriasse (ega ÜRO GHSi 2A või 2B kategooriasse).

UVCB : tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

B.69 REKONSTRUEERITUD INIMESE SARVKESTA SARNASE EPITEELI (RhCE) KATSEMEETOD NENDE KEMIKAALIDE KINDLAKSTEGEMISEKS, MIDA EI OLE VAJA KLASSIFITSEERIDA EGA MÄRGISTADA SEOSES SILMADE ÄRRITUSE VÕI RASKE SILMAKAHJUSTUSEGA

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 492 (2017). Raske silmakahjustus on Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtse ülemaailmse kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (ÜRO GHS (Globally Harmonized System) (1) ning Euroopa Liidu määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus) (75), esitatud määratluse kohaselt sellise koekahjustuse tekkimine silmas või selline tugev nägemisteravuse langus pärast seda, kui uuritavat kemikaali on manustatud silma eespinnale, mis ei ole 21 päeva jooksul pärast manustamist täielikult pöörduv. Samuti on ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohaselt silmade ärritus muutuste tekkimine silmas pärast uuritava kemikaali silma eespinnale manustamist, seejuures on muutus 21 päeva jooksul pärast manustamist täielikult taandunud. Raske silmakahjustust põhjustavad uuritavad kemikaalid klassifitseeritakse ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohasesse 1. kategooriasse ning silmade ärritust põhjustavad uuritavad kemikaalid ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohasesse 2. kategooriasse. Kemikaal, mida ei klassifitseerita seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega, on määratletud kui kemikaal, mis ei vasta ÜRO GHSi 1. või 2. (2A või 2B) kategooriasse klassifitseerimise nõuetele, see tähendab, et sellele viidatakse kui ÜRO GHSi kategooriata kemikaalile.

Rasket silmakahjustust / silmade ärritust tekitava toime hindamisel on tavaliselt kasutatud laboriloomi (katsemeetod B.5 (2)). Kõige asjakohasema katsemeetodi valimist ja selle kasutamist tuleks vaadelda raske silmakahjustuse ja silmade ärrituse põhjustamise uurimiseks ja hindamiseks kasutatavaid kompleksseid lähenemisviise käsitleva OECD juhenddokumendi (39) kontekstis.

Käesolevas katsemeetodis kirjeldatakse in vitro meetodit, mis võimaldab kindlaks teha kemikaalid (ained ja segud), mida ei ole vaja seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohaselt klassifitseerida ega märgistada. Meetodis kasutatakse rekonstrueeritud inimese sarvkesta sarnast epiteeli, mille histoloogilised, morfoloogilised, biokeemilised ja füsioloogilised omadused on ülimalt sarnased inimese sarvkesta epiteeli omadele. Valideeritud, teaduslikult põhjendatuiks arvatud ning katsemeetoditena B.47 (3), B.48 (4), B.61 (5) ja B.68 (6) vastu võetud on veel neli in vitro katsemeetodit, mis uurivad rasket silmakahjustust / silmade ärritust inimtervisega seotud näitajana.

Käesolev katsemeetod hõlmab kaht valideeritud katset, mille puhul kasutatakse müügil olevaid RhCE-mudeleid. Valideerimisuuringud silmade ärrituse / raske silmakahjustuse hindamiseks viidi läbi (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13) EpiOcular™i silmaärrituse katse ja SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katse põhjal. Mõlemas katses kasutatakse katsesüsteemina müügil olevaid RhCE-koemudeleid, millele edaspidises tekstis viidatakse kui valideeritud võrdlusmeetoditele VRM1 ja VRM2 (VRM – Validated Reference Methods). Nende valideerimisuuringute ja seotud sõltumatu vastastikuse eksperdihinnangu (9, 12) põhjal tehti järeldus, et EpiOcular™i silmaärrituse katse ja SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse sobivad nende kemikaalide (nii ainete kui ka segude) korrektseks kindlakstegemiseks, mida ei ole vaja seoses silmade ärrituse ega raske silmakahjustusega ÜRO GHSi kohaselt klassifitseerida ja märgistada, ning soovitati kõnealuseid meetodeid kui selleks eesmärgiks sobivaid teaduslikult põhjendatud meetodeid (13).

Praegu ollakse üldiselt arvamusel, et lähitulevikus ei ole võimalik rasket silmakahjustust tekitava / silmi ärritava toime kogu ulatuse prognoosimisel eri kemikaaliklasside puhul ühegi in vitro katsemeetodiga täielikult asendada Draize’i in vivo silmakatset (2, 14). Kuid mitme alternatiivse katsemeetodi kombineerimisega (astmelise) katsetamise strateegiat (nt alt-üles või ülalt-alla lähenemisviisi) rakendades võib siiski olla võimalik Draize’i silmakatset (15) täielikult asendada. Alt-üles lähenemisviisi (15) tuleks kasutada siis, kui olemasoleva teabe põhjal võib eeldada, et kemikaal ei põhjusta piisavalt silma ärritust, et seda oleks vaja klassifitseerida; ülalt-alla lähenemisviisi (15) tuleks kasutada siis, kui olemasoleva teabe põhjal võib eeldada, et kemikaal põhjustab raske silmakahjustuse. EpiOcular™i silmaärrituse katset ja SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutavat silmaärrituse katset soovitatakse kasutada selleks, et teha täiendava katsetamiseta kindlaks need kemikaalid, mida ei ole vaja seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt klassifitseerida (kategooria puudub), kasutades neid näiteks Scott et al. soovitatud alt-üles / ülalt-alla lähenemisviisidele sarnastes katsestrateegiates, nt esimese etapina alt-üles lähenemisviisipuhul ja ühena viimastest etappidest ülalt-alla lähenemisviisi puhul (15). EpiOcular™i silmaärrituse katse ja SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse ei ole siiski ette nähtud ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase 1. kategooria (raske silmakahjustus) ja 2. kategooria (silmade ärritus) eristamiseks. Selliseks eristamiseks peab katsestrateegias olema mõni muu etapp (15). Kui EpiOcular™i silmaärrituse katse või SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katsega on kindlaks tehtud, et uuritavat kemikaali on vaja seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega klassifitseerida, on lõpliku järelduse (kas tegemist on ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooriata, 1. kategooria või 2. kategooria kemikaaliga) tegemiseks vaja täiendavaid katseid (in vitro ja/või in vivo), kasutades näiteks katsemeetodit B.47, B.48, B.61 või B.68.

Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada eeskirja, mida kasutatakse, et hinnata uuritava kemikaali võimalikku ohtlikkust silmale selle võime põhjal kutsuda esile tsütotoksilisust RhCE-koemudelis; kõnealust võimet mõõdetakse MTT-katsega (16) (vt punkt 21). RhCE-koe eluvõimelisuse määramiseks pärast uuritava kemikaaliga kokkupuudet võrreldakse seda kudedega, mida on töödeldud negatiivse kontrollainega (saadakse eluvõimelisuse %), ning saadud tulemust kasutatakse, et prognoosida uuritava kemikaali võimalikku ohtlikkust silmale.

Kättesaadavad on toimivusnõuded (17), mis hõlbustavad EpiOcular™i silmaärrituse katsega või SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katsega sarnaste uute või modifitseeritud RhCE-põhiste in vitro katsemeetodite valideerimist kooskõlas OECD juhenddokumendis nr 34 (18) esitatud põhimõtetega, ning võimaldavad OECD katsejuhendit nr 492 õigeaegselt muuta, lisades sinna kõnealused meetodid. Andmete vastastikune tunnustamine vastavalt OECD kokkuleppele tagatakse vaid nende katsemeetodite puhul, mis on valideeritud kooskõlas toimivusnõuetega, kui need katsemeetodid on läbi vaadatud ja lisatud OECD poolt vastavasse juhendisse.

MÕISTED

Mõisted on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Käesolevas katsemeetodis kasutatakse kaubanduslikult saadaolevaid kolmemõõtmelisi RhCE-koemudeleid, mis on valmistatud kas inimese epidermise esmastest keratinotsüütidest (nt EpiOcular™ OCL-200) või inimese sarvkesta immortaliseeritud epiteelirakkudest (nt SkinEthic™ HCE/S). RhCE-koemudelid EpiOcular™ OCL-200 ja SkinEthic™ HCE/S sarnanevad in vivo sarvkesta kolmemõõtmelise struktuuriga epiteelile ning nende valmistamiseks kasutatakse huvipakkuva liigi rakke (19, 20). Peale selle mõõdetakse nende katsetega otseselt tsütotoksilisust, mis ilmneb kemikaali tungimisel läbi sarvkesta ning raku- ja koekahjustuste tekkides; tsütotoksilisusreaktsioon on aluseks üldisele in vivo katsel saadud tulemusele raske silmakahjustuse / silmade ärrituse kohta. Rakukahjustuse tekkimise mehhanismid võivad olla erinevad (vt punkt 20), kuid tsütotoksilisusel on koekahjustust põhjustanud füüsikalis-keemilistest protsessidest olenemata oluline või isegi peamine mehhanistlik roll kemikaali põhjustatud üldise reaktsiooni (raske silmakahjustus või silmade ärritus) määramisel, reaktsioon avaldub in vivo peamiselt sarvkesta läbipaistmatuse, vikerkestapõletiku, sidekesta punetuse ja/või sidekesta tursena.

10.

Käesoleva katsemeetodi valideerimisuuringus uuriti katseliselt paljusid kemikaale, mis kuulusid mitmesse eri liiki ja kemikaaliklassi ning millel oli erinev molekulmass, log P, keemiline struktuur jne. EpiOcular™i silmaärrituse katse valideerimise andmebaas sisaldas kokku andmeid 113 kemikaali kohta, millel olid OECD rakendusega QSAR Toolbox tehtud analüüsi (8) kohaselt esindatud 95 erinevat funktsionaalrühma. Enamik neist kemikaalidest olid ühe koostisosaga ained, kuid uuringusse oli võetud ka mitu mitme koostisosaga ainet (sealhulgas 3 homopolümeeri, 5 kopolümeeri ja 10 kvaasipolümeeri). Füüsikalise oleku ja ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooria järgi jagunesid 113 uuritud kemikaali järgmiselt: 13 vedelikku 1. kategooriast, 15 tahket ainet 1. kategooriast, 6 vedelikku 2A kategooriast, 10 tahket ainet 2A kategooriast, 7 vedelikku 2B kategooriast, 7 tahket ainet 2B kategooriast, 27 kategooriata vedelikku ja 28 kategooriata tahket ainet (8). SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katse valideerimise andmebaas sisaldas kokku andmeid 200 kemikaali kohta, milles esindatud 165 erinevat funktsionaalrühma (8, 10, 11). Enamik neist kemikaalidest olid ühe koostisosaga ained, kuid uuringusse oli võetud ka mitu mitme koostisosaga ainet (sealhulgas 10 polümeeri). Füüsikalise oleku ja ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase kategooria järgi jagunesid 200 uuritud kemikaali järgmiselt: 27 vedelikku 1. kategooriast, 24 tahket ainet 1. kategooriast, 19 vedelikku 2A kategooriast, 10 tahket ainet 2A kategooriast, 9 vedelikku 2B kategooriast, 8 tahket ainet 2B kategooriast, 50 kategooriata vedelikku ja 53 kategooriata tahket ainet (10, 11).

11.

Seda katsemeetodit saab kasutada ainete ja segude uurimiseks tahkete ainete, vedelike, pooltahkete ainete ja vahade puhul. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahustuvad või lahustumatud. Tahked ained tuleks enne pealekandmist võimaluse korral peenestada peeneks pulbriks; proovi muud eeltöötlust ei ole vaja. Gaase ja aerosoole ei ole valideerimisuuringuga veel hinnatud. Kuigi on mõeldav, et neidki saab uurida RhCE-koemudeli abil, ei võimalda praegune katsemeetod gaaside ega aerosoolide uurimist.

12.

Uuritavad kemikaalid, mis (iseloomulikult või pärast töötlemist) neelavad valgust MTT formasaaniga samas lainepikkuste vahemikus või suudavad vitaalvärvaine MTT-d otse redutseerida (MTT formasaaniks), võivad koe eluvõimelisuse mõõtmist segada ning siis on vaja kasutada kohandatud kontrollproove paranduste tegemiseks. Vajalike kohandatud kontrollproovide liik varieerub olenevalt uuritava kemikaali põhjustatud häire iseloomust ja MTT formasaani kvantitatiivse mõõtmise metoodikast (vt punkte 36–42).

13.

Eelvalideerimisel (21, 22) ja täielikus valideerimisuuringus (8, 10, 11) saadud tulemused näitasid, et nii EpiOcular™i silmaärrituse katse kui ka SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse on rakendatavad laboris, millel ei ole nimetatud analüüside tegemise kogemust, samuti on need korratavad nii laborisiseselt kui ka laboritevaheliselt. Kõnealuste uuringute kohaselt on 113 kemikaali kohta saadud andmete põhjal EpiOcular™i silmaärrituse katse eeldatav korratavuse suurusjärk prognooside kokkulangevuse järgi laborisisese korratavuse puhul 95 % ja laboritevahelise korratavuse puhul 93 %. 120 kemikaali kohta saadud andmete põhjal on SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katse eeldatav korratavuse suurusjärk prognooside kokkulangevuse järgi laborisisese korratavuse puhul 92 % ja laboritevahelise korratavuse puhul 95 %.

14.

EpiOcular™i silmaärrituse katset saab kasutada niisuguste kemikaalide kindlakstegemiseks, mida ei ole vaja seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega ÜRO GHSi / CLP-määruse klassifitseerimissüsteemi järgi klassifitseerida. Võttes arvesse valideerimisuuringus saadud andmeid (8), on EpiOcular™i silmaärrituse katse kogutäpsus 80 % (112 kemikaali põhjal), tundlikkus 96 % (57 kemikaali põhjal), valenegatiivsete tulemuste määr 4 % (57 kemikaali põhjal), spetsiifilisus 63 % (55 kemikaali põhjal) ja valepositiivsete tulemuste määr 37 % (55 kemikaali põhjal), võrreldes võrdluskatsena kasutataval küüliku in vivo silmakatsel (katsemeetod B.5) (2, 14) saadud andmetega, mille põhjal loetletud tooted olid klassifitseeritud ÜRO GHSi / CLP-määruse klassifikatsioonisüsteemi kohaselt. 97 vedel agrokeemiatoote uuringus EpiOcular™i silmaärrituse katsega leiti et katsemeetodi toimivus seda liiki segude puhul sarnaneb valideerimisuuringus leitud toimivusega (23). Nimetatud 97 toodet jagunesid järgmiselt: 21 toodet 1. kategooriast, 19 toodet 2A kategooriast, 14 toodet 2B kategooriast ja 43 kategooriata toodet, mis olid klassifitseeritud ÜRO GHSi klassifitseerimissüsteemi järgi võrdluskatsena kasutataval küüliku in vivo silmakatsel (katsemeetod B.5) (2, 14) saadud andmete alusel. Leiti, et kogutäpsus on 82 % (97 toote põhjal), tundlikkus 91 % (54 toote põhjal), valenegatiivsete tulemuste määr 9 % (54 toote põhjal), spetsiifilisus 72 % (43 toote põhjal) ja valepositiivsete tulemuste määr 28 % (43 toote põhjal) (23).

15.

SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katset saab kasutada niisuguste kemikaalide kindlakstegemiseks, mida ei ole vaja seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega ÜRO GHSi / CLP-määruse klassifitseerimissüsteemi järgi klassifitseerida. Võttes arvesse valideerimisuuringus saadud andmeid (10, 11), on SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katse kogutäpsus 84 % (200 kemikaali põhjal), tundlikkus 95 % (97 kemikaali põhjal), valenegatiivsete tulemuste määr 5 % (97 kemikaali põhjal), spetsiifilisus 72 % (103 kemikaali põhjal) ja valepositiivsete tulemuste määr 28 % (103 kemikaali põhjal), võrreldes võrdluskatsena kasutataval küüliku in vivo silmakatsel (katsemeetod B.5) (2, 14) saadud andmetega, mille põhjal loetletud tooted olid klassifitseeritud ÜRO GHSi / CLP-määruse klassifikatsioonisüsteemi kohaselt.

16.

Mõlema RhCE-põhise katsemeetodiga nii ainete kui ka segude puhul korduvatel katsetel saadud valenegatiivsete tulemuste määrade alusel on üldine tõenäosus 12 %, et kemikaalid klassifitseeritakse Draize’i in vivo silmakatse tulemusena kas ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohasesse 2. kategooriasse või neil ÜRO GHSi ja CLP-määrusekohane kategooria puudub. seda põhjustab meetodile iseloomulik katsesisene hajuvus (24). Mõlema RcHE-põhise katsemeetodiga nii ainete kui ka segude puhul saadud valepositiivsete tulemuste määrad ei ole selle katsemeetodi kontekstis kriitilised, sest kõiki uuritavaid kemikaale, mille puhul koe eluvõimelisus on võrdne kindlaksmääratud läviväärtusega (vt punkt 44) või sellest väiksem, tuleb järgmiseks uurida muude in vitro katsemeetoditega või viimase võimalusena, olenevalt regulatiivsetest nõuetest, katsetes küülikutega kooskõlas järjestikuse katsete tegemise strateegia ning tõendite kaalukuse lähenemisviisiga. Neid katsemeetodeid võib kasutada iga tüüpi kemikaalide puhul, kusjuures negatiivse tulemuse võib aktsepteerida kui tõendi, et kemikaali ei ole vaja seoses silmaärrituse või raske silmakahjustusega klassifitseerida (ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohane kategooria puudub). Kui EpiOcular™i silmaärrituse katset ja SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutavat silmaärrituse katset hakatakse kasutama muu kui ÜRO GHSi / CLP-määruse klassifitseerimisskeemiga seoses, tuleks eelnevalt konsulteerida asjakohaste reguleerivate asutustega.

17.

Selle katsemeetodi kasutamist piirab asjaolu, et see ei võimalda vahet teha silmade ärritusel / pöörduval mõjul silmale (2. kategooria) ja tõsisel silmakahjustusel / pöördumatul mõjul silmale (1. kategooria), nagu need on määratletud ÜRO GHSis ja CLP-määruses, ega ka silma ärritaval (valikuline 2A kategooria) ja silma kergelt ärritaval (valikuline 2B kategooria) kemikaalil, nagu need on määratletud ÜRO GHSis (1). Selleks on vajalik täiendav uuring muude in vitro katsemeetoditega.

18.

Käesolevas katsemeetodis kasutatakse terminit „uuritav kemikaal“ uurimisobjektile viitava terminina (76) ja see ei ole seotud RhCE-põhise katsemeetodi kohaldatavusega ainete ja/või segude uurimiseks.

KATSE PÕHIMÕTE

19.

Uuritav kemikaal kantakse vähemalt kahele kolmemõõtmelisele RhCE-koemudelile ning pärast kokkupuute ja töötlemise järgset ajavahemikku mõõdetakse koe eluvõimelisus. RhCE-koed rekonstrueeritakse inimese epidermise esmastest keratinotsüütidest või inimese sarvkesta immortaliseeritud epiteelirakkudest, mida on mitme päeva jooksul kasvatatud, et saada mitmekihiline, ülimalt diferentseerunud lameepiteel, mis morfoloogiliselt sarnaneb inimese sarvkestal leiduvale. EpiOcular™i RhCE-koemudel koosneb vähemalt kolmest eluvõimelisest rakukihist ja sarvestumata pinnast, mille struktuur on sarvkesta sarnane ja analoogne in vivo esinevale. SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli RhCE-koemudel koosneb vähemalt neljast eluvõimelisest rakukihist, sealhulgas kolumnaarsed basaalrakud, sarvkesta pealispinnaalused üleminekurakud ja pindmised lamerakud, ning sarnaneb tavalisele inimese sarvkesta epiteelile (20, 26).

20.

Kemikaalist põhjustatud raske silmakahjustus / silmade ärritus, mis avaldub in vivo peamiselt sarvkesta läbipaistmatuse, vikerkestapõletiku, sidekesta punetuse ja/või sidekesta tursena, on selliste järjestikuste muutuste tagajärg, mis algavad kemikaali tungimisega läbi sarvkesta ja/või sidekesta ja rakukahjustuse tekitamisega. Rakukahjustuse tekkimise mehhanismid võivad olla erinevad, sealhulgas rakumembraani lüüs (nt pindaktiivsete ainete, orgaaniliste lahustite toimel), makromolekulide (eelkõige valkude) koaguleerumine (nt pindaktiivsete ainete, orgaaniliste lahustite, leeliste ja hapete toimel), lipiidide seebistumine (nt leeliste toimel) ning alküülimine või muud kovalentsed vastastikmõjud makromolekulidega (nt pleegitite, peroksiidide ja alküülijate toimel) (15, 27, 28). Siis on näidatud, et tsütotoksilisusel on koekahjustust põhjustanud füüsikalis-keemilistest protsessidest olenemata oluline või isegi peamine mehhanistlik roll kemikaali põhjustatud üldise reaktsiooni (raske silmakahjustus või silmade ärritus) määramisel (29, 30). Peale selle määratakse kemikaali võime põhjustada rasket silmakahjustust / silmade ärritust põhimõtteliselt esialgse vigastuse ulatuse järgi (31), mis on vastavuses rakkude hävimise (29) ning sellest tulenevate reaktsioonide ja lõpptulemuse ulatusega (32). Seega mõjutavad silma kergelt ärritavad kemikaalid üldiselt üksnes sarvkesta pindmist epiteeli, kergelt ja mõõdukalt ärritavad kemikaalid kahjustavad põhimõtteliselt epiteeli ja pindmist stroomat ning tugevalt ärritavad kemikaalid kahjustavad epiteeli, strooma süvakihte ja kohati sarvkesta endoteeli (30, 33). RhCE-koemudeli eluvõimelisuse mõõtmine pärast pindmist kokkupuudet uuritava kemikaaliga, et teha kindlaks kemikaalid, mida ei ole vaja seoses raske silmakahjustuse / silmade ärritusega klassifitseerida (ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohane kategooria puudub), põhineb eeldusel, et kõik kemikaalid, mis põhjustavad raske silmakahjustuse või silmade ärrituse, põhjustavad sarvkesta epiteelis ja/või sidekestas tsütotoksilisust.

21.

Tavapäraselt mõõdetakse RhCE-koe eluvõimelisust vitaalvärvaine MTT [3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine; CASi number 298-93-1] ensümaatilise muundamise järgi siniseks MTT formasaansoolaks, mis pärast koest ekstraheerimist määratakse kvantitatiivselt (16). Kemikaalid, mida ei ole vaja ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt klassifitseerida ja märgistada (kategooria puudub), on kemikaalid, mis uurimisel ei vähenda koe eluvõimelisust allapoole määratud läviväärtust (st EpiOcular™i silmaärrituse katsel ja SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutavat silmaärrituse katsel EITL (77) koe eluvõimelisus > 60 % või SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutavat silmaärrituse katsel EITS (78) > 50 %) (vt punkt 44).

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

22.

Enne RhCE-koemudeliga tehtavate katsete rutiinset kasutamist regulatiivsel eesmärgil tuleb laboril tõendada oma tehnilist pädevust, prognoosides õigesti tabelis 1 loetletud pädevuse tõendamise kemikaalide omadused. Need kemikaalid valiti välja valideeritud võrdlusmeetodite valideerimisuuringutes kasutatud kemikaalide seast (8, 10, 11). Valikus on võimaluste piires esindatud järgmiste omadustega kemikaalid: i) neil erinevad füüsikalised olekud; ii) nad esindavad in vivo raske silmakahjustuse / silmade ärrituse reaktsioonide täit vahemikku võrdluskatsena kasutataval küüliku in vivo silmakatsel (katsemeetod B.5) (2, 14) saadud kvaliteetsete andmete ning ÜRO GHSi klassifitseerimissüsteemi (st 1. kategooria, 2A, 2B kategooria või klassifitseerimata) ja CLP-määruse kohase klassifitseerimissüsteemi (st 1. või 2. kategooria või kategooria puudub) alusel; iii) nad esindavad mitmesuguseid aluseid in vivo klassifitseerimiseks (24, 25); iv) kuuluvad samadesse kemikaaliklassidesse, mida kasutati valideerimisuuringus (8, 10, 11); v) neis on hästi esindatud mitmesugused funktsionaalrühmad (8, 10, 11); vi) nende keemiline ehitus on hästi teada (8, 10, 11); vii) nad on värvilised ja/või MTT otsesed redutseerijad; viii) nad andsid valideerimisel RhCE-koemudelitega katsemeetodeid kasutades korratavad tulemused; ix) nende omadused prognoositi valideerimisuuringutes RhCE-koemudeleid kasutavate katsemeetoditega õigesti; x) nad esindavad RhCE-koemudelit kasutava katsemeetodiga saadud kvaliteetsete andmete kohaselt in vitro reaktsioonide täit vahemikku (eluvõimelisus 0 kuni 100 %) xi) nad on müügil ja xii) nendega ei kaasne ülemääraseid soetamis- ja/või kõrvaldamiskulusid. Kui mõnda loetletud kemikaali ei ole saada või seda ei saa muul õigustatud põhjusel kasutada, võib kasutada muud eespool kirjeldatud kriteeriumidele vastavat kemikaali näiteks valideeritud võrdlusmeetodi valideerimisel kasutatud kemikaalide hulgast. Sellised kõrvalekalded peavad siiski olema põhjendatud.

Tabel 1

Pädevuse tõendamise kemikaalide loend

Keemiline nimetus	CASi nr	Funktsionaalrühm (79)	Füüsikaline olek	Eluvõimelisus meetodiga VRM1 (%) (80)	Eluvõimelisus meetodiga VRM2 (%) (81)	Prognoos VRM-meetodiga	MTT redutseerija	Segava värvusega
In vivo 1. kategooria (82)
Metüültioglükolaat	2365-48-2	Karboksüülhappeester, tioalkohol	Vedel	10,9 ± 6,4	5,5 ± 7,4	Prognoosida ei ole võimalik	Jah (tugev)	Ei
Hüdroksüetüülakrülaat	818-61-1	Akrülaat, alkohol	Vedel	7,5 ± 4,7 (83)	1,6 ± 1,0	Prognoosida ei ole võimalik	Ei	Ei
2,5-dimetüül-2,5-heksaandiool	110-03-2	Alkohol	Tahke	2,3 ± 0,2	0,2 ± 0,1	Prognoosida ei ole võimalik	Ei	Ei
Naatriumoksalaat	62-76-0	Oksokarboksüülhape	Tahke	29,0 ± 1,2	5,3 ± 4,1	Prognoosida ei ole võimalik	Ei	Ei
In vivo 2A kategooria (82)
N,N″-bis(4-klorofenüül)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraasatetradekaandiimiidamiidi di-D-glükonaat (20 % vesilahus) (84)	18472-51-0	Aromaatne heterotsükliline haliid, arüülhaliid, dihüdroksüülrühm, guanidiin	Vedel	4,0 ± 1,1	1,3 ± 0,6	Prognoosida ei ole võimalik	Ei	Jah (nõrk)
Naatriumbensoaat	532-32-1	Arüül, karboksüülhape	Tahke	3,5 ± 2,6	0,6 ± 0,1	Prognoosida ei ole võimalik	Ei	Ei
In vivo 2B kategooria (82)
Dietüültoluamiid	134-62-3	Bensamiid	Vedel	15,6 ± 6,3	2,8 ± 0,9	Prognoosida ei ole võimalik	Ei	Ei
2,2-dimetüül-3-metüleenbitsüklo[2.2.1]heptaan	79-92-5	Alkaan, hargnev, tertsiaarse süsinikuga; alkeen; bitsükloheptaan; sildtsüklilised ühendid; tsükloalkaan	Tahke	4,7 ± 1,5	15,8 ± 1,1	Prognoosida ei ole võimalik	Ei	Ei
In vivo kategooria puudub (82)
1-etüül-3-metüülimidasooliumetüülsulfaat	342573-75-5	Alkoksürühm; ammooniumsool; arüülrühm; imidasool; sulfaat	Vedel	79,9 ± 6,4	79,4 ± 6,2	Kategooria puudub	Ei	Ei
Dikaprülüüleeter	629-82-3	Alkoksürühm; eeter	Vedel	97,8 ± 4,3	95,2 ± 3,0	Kategooria puudub	Ei	Ei
Piperonüülbutoksiid	51-03-6	Alkoksürühm; bensodioksool; bensüülrühm; eeter	Vedel	104,2 ± 4,2	96,5 ± 3,5	Kategooria puudub	Ei	Ei
Hüdrogeenitud kastoorõli polüetüleenglükoolester (PEG-40)	61788-85-0	Atsülaalrühm, alkohol; allüülrühm, eeter	Viskoosne	77,6 ± 5,4	89,1 ± 2,9	Kategooria puudub	Ei	Ei
1-(4-klorofenüül)-3-(3,4-diklorofenüül)karbamiid	101-20-2	Aromaatne heterotsükliline haliid, arüülhaliid, Karbamiidi derivaadid	Tahke	106,7 ± 5,3	101,9 ± 6,6	Kategooria puudub	Ei	Ei
2,2ʹ-metüleen-bis-(6-(2H-bensotriasool-2-üül)-4-(1,1,3,3-tetrametüülbutüül)fenool	103597-45-1	Alkaan, hargnev, kvaternaarse süsinikuga; kondenseerunud tsüklitega aromaatne ühend; kondenseerunud küllastunud heterotsüklid; kinoidühendite prekursor; tert-butüülrühm	Tahke	102,7 ± 13,4	97,7 ± 5,6	Kategooria puudub	Ei	Ei
Kaaliumtetrafluoroboraat	14075-53-7	Anorgaaniline sool	Tahke	88,6 ± 3,3	92,9 ± 5,1	Kategooria puudub	Ei	Ei
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i number; ÜRO GHS – Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (1); VRM1 – valideeritud võrdlusmeetod (Validated Reference Method), EpiOcular™i silmaärrituse katse; VRM2 – valideeritud võrdlusmeetod (Validated Reference Method), SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse; segava värvusega – ühendi värvus segab MTT formasaani neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmist.

23.

Pädevuse tõendamise katsete osana soovitatakse kasutajal pärast kudede saamist kontrollida nende kaitsekihiomaduste vastavust RhCE-koemudeli tootja kirjeldusele (vt punktid 25, 27 ja 30). See on eriti oluline pärast kudede pikaajalist või kaugvedu. Kui katsemeetod on edukalt omandatud ning oskus seda kasutada on saavutatud ja tõendatud, ei ole katse rutiinse kasutamise puhul selline kontrollimine igapäevaselt vajalik. Katse rutiinse kasutamise puhul soovitatakse siiski jätkata kaitsekihiomaduste kontrollimist korrapäraste ajavahemike järel.

KATSE KÄIK

24.

Selle katsemeetodiga praegu hõlmatud katsed on teaduslikult põhjendatud EpiOcular™i silmaärrituse katse ja SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse, millele viidatakse kui valideeritud võrdlusmeetoditele (vastavalt VRM1 ja VRM2). RhCE-koemudelit kasutava katsemeetodi standardeeskiri on kättesaadav ja seda tuleb järgida katsemeetodi juurutamisel ja kasutamisel laboris (34, 35). Järgmistes punktides ja 2. liites kirjeldatakse RhCE-koemudelit kasutavate katsete peamisi osi ja eeskirju.

RHCE-KOEMUDELIT KASUTAVA KATSEMEETODI OSAD

Üldtingimused

25.

Sarvkesta epiteelile sarnaneva kolmemõõtmelise koe rekonstrueerimiseks tuleb kasutada asjakohaseid inimese rakke; kude peaks koosnema progressiivselt kihistunud, kuid mitte sarvestunud rakkudest. RhCE-koemudel valmistatakse plaatidel, millel on sünteetiline poorne membraan, millest toitained läbi liiguvad ja rakkudesse suunduvad. Rekonstrueeritud sarvkesta epiteelile sarnanevas koes peab olema mitu kihti eluvõimelisi sarvestumata epiteelirakke. RhCE-koemudeli epiteelipind peaks olema otseses kokkupuutes õhuga, et võimaldada otsest pindmist kokkupuudet uuritavate kemikaalidega sarnaselt sellele, kuidas sarvkesta epiteeli kokkupuude toimuks in vivo. RhCE-koemudel peab moodustama funktsionaalse kaitsekihi, mis on piisavalt tugev, et takistada tsütotoksiliste võrdlusainete, nt Triton X-100 või naatriumdodetsüülsulfaadi kiiret läbitungimist. Nimetatud kaitsekihina toimimist tuleks tõendada ja seda saab hinnata kas sellise kokkupuuteaja määramisega, mille jooksul võrdlusaine teatava kindla kontsentratsiooni (nt 100 μl 0,3-mahuprotsendilist Triton X-100) juures vähendab koe eluvõimelisust 50 % võrra (ET50), või sellise kontsentratsiooni määramisega, mille juures võrdlusaine vähendab kindla kokkupuuteaja (nt 30-minutine töötlemine 50 μl naatriumdodetsüülsulfaadiga) jooksul koe eluvõimelisust 50 % võrra (IC50). RhCE-koemudel peab olema selline, et uuritav kemikaal ei saaks tungida eluskudedesse ümber serva, vastasel korral ei oleks tegemist sarvkesta ja uuritava aine kokkupuute õige mudeliga. RhCE-koemudeli valmistamiseks kasutatavad inimese rakud ei tohi olla saastunud bakterite, viiruste, mükoplasma ega seentega. Koemudeli steriilsust peaks kontrollima tarnija, kes jälgib, et mudel ei oleks saastatud seente ega bakteritega.

Funktsionaalsed tingimused

Eluvõimelisus

26.

Koe eluvõimelisuse määramiseks kasutatakse MTT-katset (16). RhCE-koemudeli eluvõimelised rakud redutseerivad vitaalvärvaine MTT siniseks MTT formasaaniks, mis sadeneb ning ekstraheeritakse seejärel koestisopropanooliga (või sarnase lahustiga). Ekstraheeritud MTT formasaani saab määrata kvantitatiivselt kas neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisega või HPLC-/UPLC-spektromeetrilise ühendmeetodiga (36). Puhta ekstraheerimislahusti optiline tihedus peab olema piisavalt madal, väiksem kui 0,1. RhCE-koemudeli kasutajad peaksid tagama, et iga kasutatav RhCE-koemudeli partii vastab kindlaksmääratud negatiivse kontrollproovi kriteeriumidele. Negatiivse kontrollproovi optilise tiheduse lubatavad vahemikud valideeritud võrdlusmeetodite puhul on esitatud tabelis 2. HPLC-/UPLC-spektromeetrilise ühendmeetodi kasutaja peaks negatiivse kontrollproovi nõuetekohasuse kriteeriumina kasutama tabelis 2 esitatud negatiivse kontrollproovi optilise tiheduse vahemikke. Katseprotokollis peaks olema dokumenteeritud, et negatiivse võrdlusainega töödeldud koed on kultuuris stabiilsed (annavad sarnaseid koe eluvõimelisuse mõõtmistulemusi) katses kasutatava kokkupuuteaja jooksul. Samasugust eeskirja peaks koepartii kvaliteedikontrolli osana järgima koemudeli tootja, kuid sellisel juhul võivad kehtida teised nõuetekohasuse kriteeriumid kui tabelis 2 esitatud. RhCE-koemudeli väljatöötaja/tarnija peaks kindlaks määrama negatiivse kontrollproovi optilise tiheduse väärtuste (kvaliteedikontrolli katsetingimuste korral) nõuetekohasuse vahemiku (ülem- ja alampiiri).

Tabel 2

Negatiivse kontrollproovi optilise tiheduse väärtuste nõuetekohasuse vahemik (katse läbiviijatele)

Katse	Vastuvõetav alampiir	Vastuvõetav ülempiir
EpiOcular™i silmaärrituse katse (OCL-200) – VRM1 (nii vedelate kui ka tahkete ainetega töötlemisel)	> 0,8 (85)	> 2,5
SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse (HCE/S) – VRM2 (nii vedelate kui ka tahkete ainetega töötlemisel)	> 1,0	≤ 2,5

Toimimine kaitsekihina

27.

RhCE-koemudel peab olema piisavalt paks ja tugev, et takistada tsütotoksiliste võrdlusainete kiiret läbitungimist, seda hinnatakse ET50 (Triton X-100) või IC50 (naatriumdodetsüülsulfaat) abil (tabel 3). RhCE-koemudeli väljatöötaja/müüja peab lõppkasutajale kudesid tarnides tõendama iga RhCE-koemudeli partii toimivust kaitsekihina (vt punkt 30).

Morfoloogia

28.

RhCE-koemudeli histoloogilisel uuringul peab see osutuma olevaks inimese sarvkesta epiteeli sarnase struktuuriga (sealhulgas vähemalt kolm eluvõimeliste epiteelirakkude kihti ja sarvestumata pind). VRMide puhul on sobiv morfoloogiline struktuur väljatöötaja/tarnija poolt kindlaks määratud ning seetõttu ei pea katsemeetodi kasutaja selle omadusi iga kasutatava koepartii juures uuesti tõendama.

Korratavus

29.

Katsemeetodiga peavad positiivsete ja negatiivsete kontrollproovide tulemused olema ajas korratavad.

Kvaliteedikontroll

30.

RhCE-koemudelit tuleks kasutada üksnes siis, kui selle väljatöötaja/tarnija tõendab, et kõik kasutatavad RhCE-koemudelipartiid vastavad toote kindlaksmääratud kvaliteedikriteeriumidele, mille seas kõige olulisemad on eluvõimelisuse (punkt 26) ja kaitsekihina toimivuse (vt punkti 27) kriteeriumid. RhCE-koemudeli väljatöötaja/tarnija peaks kindlaks määrama ET50- või IC50-meetodiga (vt punktid 25 ja 26) mõõdetava kaitsekihina toimivuse nõuetekohasuse vahemiku (ülem- ja alampiiri). ET50 ja IC50 nõuetekohasuse vahemikud, mida RhCE-koemudelite (kasutatavad VRMides) väljatöötaja/tarnija kasutab partii kvaliteedikontrolli kriteeriumina, on esitatud tabelis 3. RhCE-koemudeli väljatöötaja/tarnija peab esitama katsemeetodi kasutajale andmed, mis tõendavad vastavust kõigile toote kvaliteedikriteeriumidele, nii et meetodi kasutaja saaks selle teabe katseprotokolli lisada. Ainult kõigile toote kvaliteedikriteeriumidele vastavate kudedega saadud tulemused sobivad nende kemikaalide kohta usaldusväärsete prognooside tegemiseks, mida ei ole vaja seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt klassifitseerida ega märgistada.

Tabel 3

Partii kvaliteedi kontrollimise kriteerium

Katse	Vastuvõetav alampiir	Vastuvõetav ülempiir
EpiOcular™i silmaärrituse katse (OCL-200) – VRM1 (100 μl 0,3-mahuprotsendilist Triton X-100)	ET50 = 12,2 min	ET50 = 37,5 min
SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse (HCE/S) – VRM2 (30-minutine töötlemine 50 μl naatriumdodetsüülsulfaadiga)	IC50 = 1 mg/ml	IC50 = 3,2 mg/ml

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainete kasutamine

31.

Iga uuritava kemikaali ja iga kontrollainega tuleks iga kord kasutada vähemalt kaht koe paralleelproovi. Kasutatakse kaht erinevat töötlemismeetodit, üht vedelate ja teist tahkete uuritavate kemikaalide puhul (34, 35). Mõlema meetodi ja töötlemismeetodi korral tuleb koemudeli pinda enne uuritava kemikaaliga töötlemist niisutada kaltsiumi- ja magneesiumvaba Dulbecco fosfaadiga puhverdatud füsioloogilise lahusega (Ca2+/Mg2+-vaba DPBS), et jäljendada inimsilma niiskustingimusi. Kudede töötlemine algab kokkupuutesse viimisega uuritava(te) kemikaali(de) ja kontrollainetega. Mõlemas valideeritud võrdlusmeetodis tuleb mõlema töötlemismeetodi puhul kanda piisav kogus uuritavat kemikaali või kontrollainet ühtlaselt epiteeli pinnale, vältides lõpmatut annust (vt punktid 32 ja 33) (liide 2).

32.

Uuritavaid kemikaale, mida 37 °C juures või madalamal temperatuuril saab pipeteerida (vajaduse korral kolbpipetti kasutades), käsitletakse valideeritud võrdlusmeetodites vedelikena, muul juhul tuleb neid käsitleda tahkete ainetena (vt punkt 33). Valideeritud võrdlusmeetodites levitatakse vedelad uuritavad kemikaalid ühtlaselt koe pinnale (st kantakse peale vähemalt 60 μl pinna cm2 kohta) (vt liidet 2) (33, 34). Plaadile kantavate väikeste ruumalade tõttu ilmneda võivat kapillaarjõudu (pindpinevusjõudu) tuleks võimalikult palju vältida, et tagada õige annustamine koele. Vedela uuritava kemikaaliga töödeldud kudesid inkubeeritakse 30 minutit rakkude kasvatamise standardtingimustes (37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %). Kokkupuuteaja lõppedes tuleb vedel uuritav kemikaal ja kontrollained koe pinnalt hoolikalt eemaldada, loputades ohtra Ca2+/Mg2+-vaba DPBSiga toatemperatuuril. Loputusetapile järgneb kokkupuutejärgne sukeldamine värskesse söötmesse toatemperatuuril (et eemaldada igasugune koesse imendunud uuritav kemikaal) eelnevalt kindlaks määratud ajavahemikuks, mis varieerub olenevalt kasutatavast valideeritud võrdlusmeetodist. Kokkupuutejärgset inkubeerimist värskes söötmes rakkude kasvatamise standardtingimustes enne MTT-katse tegemist rakendatakse üksnes VRM1 korral (vt liide 2) (34, 35).

33.

Uuritavaid kemikaale, mida temperatuuril kuni 37 °C pipeteerida ei saa, käsitletakse valideeritud võrdlusmeetodites tahkete ainetena. Pealekantava uuritava kemikaali kogus peaks olema piisav, et katta kogu koepind, st peale tuleb kanda vähemalt 60 mg ainet pinna cm2 kohta (liide 2). Võimaluse korral tuleks tahket ainet alati katsetada peene pulbri kujul. Tahke uuritava kemikaaliga töödeldud kudesid inkubeeritakse eelnevalt kindlaks määratud ajavahemiku (oleneb kasutatavast valideeritud võrdlusmeetodist) jooksul rakkude kasvatamise standardtingimustes (vt liide 2) (34, 35). Kokkupuuteaja lõppedes tuleb tahke uuritav kemikaal ja kontrollained koe pinnalt hoolikalt eemaldada, loputades ohtra Ca2+/Mg2+-vaba DPBSiga toatemperatuuril. Loputusetapile järgneb kokkupuutejärgne sukeldamine värskesse söötmesse toatemperatuuril (et eemaldada igasugune koesse imendunud uuritav kemikaal) eelnevalt kindlaks määratud ajavahemikuks, mis varieerub olenevalt kasutatavast valideeritud võrdlusmeetodist, ning kokkupuutejärgne inkubeerimine värskes söötmes rakkude kasvatamise standardtingimustes enne MTT-katse tegemist (vt liide 2) (34, 35).

34.

Iga analüüsitsükkel peaks sisaldama ühtlasi ka negatiivset ja positiivset kontrollproovi, millega tõendatakse, et kudede eluvõimelisus (määratakse negatiivse kontrollprooviga) ja tundlikkus (määratakse positiivse kontrollprooviga) jäävad aja jooksul kogutud andmete põhjal kindlaks määratud nõuetekohasesse vahemikku. Samaaegselt analüüsitav negatiivne kontrollproov annab samuti lähtetaseme (koe eluvõimelisus 100 %) uuritava kemikaaliga töödeldud kudede suhtelise eluvõimelisuse arvutamiseks protsentides (%eluvõimelisustuuritav). Valideeritud võrdlusmeetoditega kasutamiseks soovitatav positiivne kontrollaine on puhas metüülatsetaat (CASi nr 79-20-9, saab osta nt Sigma-Aldrichist, katalooginr 45997, vedelik). Valideeritud võrdlusmeetoditega VRM1 ja VRM2 kasutamiseks soovitatavad negatiivsed kontrollained on vastavalt ülipuhas H2O ja Ca2+/Mg2+-vaba DPBS. Neid kasutati kontrollainetena valideeritud võrdlusmeetodite valideerimisuuringutes ja nende kohta on olemas kõige rohkem aja jooksul kogutud andmeid. Sobivate alternatiivsete positiivsete ja negatiivsete kontrollainete kasutamine peab olema teaduslikult ja piisavalt põhjendatud. Negatiivsete ja positiivsete kontrollainetega tuleb katse teha sama(de) katse-eeskirja(de) järgi, mida kasutatakse analüüsitsüklis olevate uuritavate kemikaalide puhul (nt vedelike ja tahkete ainete puhul). Sellele peaks järgnema töötlemine kokkupuutesse viimise teel, loputamine, kokkupuutejärgne sukeldamine ja vajaduse korral kokkupuutejärgne inkubeerimine, nagu kirjeldatud vedelate uuritavate kemikaalidega paralleelselt samas analüüsitsüklis kasutatavate kontrollainete puhul (vt punkt 32) ja tahkete uuritavate kemikaalidega paralleelselt samas analüüsitsüklis kasutatavate kontrollainete puhul (vt punkt 33), enne kui tehakse MTT-katse (vt punkt 35) (34, 35). Ühest negatiivsete ja positiivsete kontrollproovide komplektist piisab kõigi samas analüüsitsüklis uuritavate samas olekus (vedelad või tahked) kemikaalide jaoks.

Koe eluvõimelisuse mõõtmine

35.

MTT-katse on standarditud kvantitatiivne meetod (16), mida tuleks käesoleva katsemeetodi puhul kasutada koe eluvõimelisuse mõõtmiseks. Meetodit saab kasutada kolmemõõtmelises koemudelis. MTT-katse tehakse vahetult pärast kokkupuutejärgse inkubatsiooniperioodi lõppemist. Valideeritud võrdlusmeetodite puhul asetatakse RhCE-koemudeli proov rakkude kasvatamise standardtingimustes 180±15 minutiks 0,3 ml MTT-lahusesse, mille kontsentratsioon on 1 mg/ml. RhCE-koemudeli eluvõimelised rakud redutseerivad vitaalvärvaine MTT siniseks sadenevaks MTT formasaaniks. Seejärel ekstraheeritakse sadenenud sinine MTT formasaan koest sobiva koguse isopropanooliga (või sarnase lahustiga) (34, 35). Vedelate kemikaalide uurimiseks kasutatud kudede puhul tuleks ekstraheerida nii koe pealt kui ka alt, kuid tahkete kemikaalide ja värviliste vedelike uurimiseks kasutatud kudede puhul tuleks ekstraheerida ainult koe alt (et minimeerida ekstraheerimiseks kasutatava isopropanoolilahuse võimalikku saastumist igasuguse uuritava kemikaaliga, mis võib olla koesse jäänud). Niisuguste vedelate kemikaalide uurimiseks kasutatud kudede puhul, mida ei saa hõlpsasti maha pesta, võib samuti ekstraheerida üksnes koe alt. Samaaegselt uuritud negatiivse ja positiivse kontrollaine proove tuleb töödelda sarnaselt uuritava kemikaali proovidega. Ekstraheeritud MTT formasaani võib kvantitatiivselt määrata kas neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisega lainepikkusel 570 nm, kasutades spektririba laiust kuni ± 30 nm, või HPLC-/UPLC-spektrofotomeetrilisel ühendmeetodil (vt punkt 42) (11, 36).

36.

Uuritava kemikaali optilised omadused või selle keemiline reaktsioon MTTga võib MTT formasaani mõõtmist segada ja põhjustada vea koe eluvõimelisuse hindamisel. Uuritava kemikaalid võivad MTT formasaani mõõtmist segada, redutseerides MTT siniseks MTT formasaaniks ja/või olles segava värvusega, st uuritav kemikaal neelab tavaolekus või töötlemisprotsessi tõttu samas lainepikkuste vahemikus kui MTT formasaan (st 570 nm ümbruses). Enne katse läbiviimist tuleks teha eelkontroll, et teha kindlaks võimalikud MTT otsesed redutseerijad ja/või segava värvusega kemikaalid, samuti tuleks kasutada täiendavaid kontrollproove, et leida niisuguste kemikaalide põhjustatud võimalikud häired ja neid korrigeerida (vt punktid 37–41). See on eriti oluline, kui konkreetsest uuritavat kemikaali ei saa loputades RhCE-koemudelist täielikult eemaldada või kui see läbib sarvkesta epiteeliga sarnase koe ja esineb seetõttu RhCE-koemudelis MTT-katse tegemise ajal. Nende MTT formasaaniga samas lainepikkuste vahemikus valgust neelavate uuritavate kemikaalide puhul, mis ei võimalda tugeva segava mõju tõttu (st tugeva neelduvuse tõttu lainepikkusel 570±30 nm) MTT-formasaani neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmist, võib MTT formasaani sisalduse mõõtmiseks kasutada HPLC-/UPLC-spektromeetrilist ühendmeetodit (vt punktid 41 ja 42) (11, 36). Üksikasjalik kirjeldus, kuidas tuvastada MTT otsene redutseerimine ja värviliste ainete segav mõju ning teha parandusi nende arvestamiseks, on esitatud valideeritud võrdlusmeetodite standardeeskirjades (34, 35). Samuti on III ja IV liites esitatud vastavalt VRM1- ja VRM2-meetodi puhul illustreerivad vooskeemid, millest juhinduda MTT otseste redutseerijate ja/või segava värvusega kemikaalide kindlakstegemisel ja nendega tegelemisel.

37.

MTT formasaaniga samas lainepikkuste vahemikus valgust neelavate (loomulikus olekus või pärast töötlemist) uuritavate kemikaalide võimaliku segava mõju kindlakstegemiseks ning täiendavate kontrollproovide vajalikkuse üle otsustamiseks lisatakse uuritavat kemikaali vette ja/või isopropanooli ning inkubeeritakse sobiva aja jooksul toatemperatuuril (vt liide 2) (34, 35). Kui VRM1-meetodi puhul neelab vees ja/või etanoolis lahustatud uuritav kemikaal küllaldaselt valgust vahemikus 570±20 nm (vt liide 3) või VRM2-meetodi puhul saadakse uuritava kemikaali segamisel veega värviline lahus (vt liide 4), segab uuritav kemikaal eeldatavalt MTT formasaani neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmist ning teha tuleks täiendavaid kontrollkatseid värvainetega või tuleks kasutada HPLC-/UPLC-spektromeetrilist ühendmeetodit – sel juhul ei ole nimetatud kontrollkatsete tegemine vajalik (vt punkte 41 ja 41 ning III ja IV liidet) (34, 35). Neelavuse (optilise tiheduse) mõõtmise korral tuleb iga uuritavat kemikaali kanda vähemalt kahele elujõulise koe paralleelproovile, millega tehakse läbi kogu katse käik, kuid MTTga inkubeerimise etapis inkubeeritakse neid MTT asemel söötmega, et saada kontrollproov, mille eluskudedes on mittespetsiifiline värvus (NSCelus) (34, 35). Katse NSCelus-kontrollprooviga tuleb läbi viia paralleelselt uuritava värvilise kemikaali prooviga ning korduvate katsete korral tuleb eluskudede bioloogilise varieeruvuse tõttu koos iga tehtava katsega (igas analüüsitsüklis) analüüsida ka eraldi NSCelus-kontrollproovi. Koe tegelik eluvõimelisus arvutatakse järgmiselt: segava uuritava kemikaaliga kokku puutunud ja MTT-lahusega inkubeeritud eluskudedega saadud eluvõimelisuse protsent (%eluvõimelisustuuritav) miinus segava uuritava kemikaaliga kokku puutunud ning söötmega ja ilma MTTta inkubeeritud eluskudedega saadud mittespetsiifiline värvus (%NSCelus), mis saadakse paralleelselt selle katse läbiviimisega, mille tulemused vajavad korrigeerimist, st koe tegelik eluvõimelisus = [%eluvõimelisustuuritav] – [%NSCelus].

38.

MTT otseste redutseerijate kindlakstegemiseks tuleb iga uuritavat kemikaali lisada värskelt valmistatud MTT-lahusele. MTT-lahusele lisatakse sobiv kogus uuritavalt kemikaali ning segu inkubeeritakse rakkude kasvatamise standardtingimustes ligikaudu 3 tundi (vt III ja IV liide) (34, 35). Kui uuritavat kemikaali sisaldav MTT-segu (või mittelahustuvate kemikaalide korral suspensioon) muutub siniseks/lillaks, võib eeldada, et uuritav kemikaal redutseerib otseselt MTTd ning olenemata sellest, kas kasutatakse neelavuse (optilise tiheduse) mõõtmist või HPLC-/UPLC-spektromeetrilist ühendmeetodit, tuleb mitteeluvõimelise RhCE-koemudeliga toimimist täiendavalt kontrollida. Täiendav toimivuskontroll tehakse surnud kudedega, millel on üksnes metaboolne jääkaktiivsus, kuid mis imavad ja seovad uuritavat kemikaali sarnaselt eluvõimeliste kudedega. VRM1-meetodi puhul saadakse surnud koed madalal temperatuuril hoides (edaspidi „külmutades saadud surnud koed“). VRM2-meetodi puhul saadakse surnud koed pikaajalisel (vähemalt 24±1 tundi) hoidmisel vees, millele järgneb säilitamine madalal temperatuuril (edaspidi „vees saadud surnud koed“). Iga MTT-d redutseeriv uuritav kemikaal kantakse vähemalt kahele surnud loe paralleelproovile, mis läbivad kogu katse käigu, et saada kontrollproov, milles MTT redutseerimine on mittespetsiifiline (NSMTT) (34, 35). Piisab ühest NSMTT-kontrollproovist iga uuritava kemikaali kohta, olenemata sellest, kui palju üksikkatseid/katsetsükleid tehakse. Koe tegelik eluvõimelisus arvutatakse järgmiselt: MTT redutseerijaga kokku puutunud eluskudedega saadud eluvõimelisuse protsent (%eluvõimelisustuuritav) miinus sama MTT redutseerijaga kokku puutunud surnud kudedega saadud MTT redutseerimine, mis arvutatakse negatiivse kontrollproovi suhtes, mida analüüsitakse paralleelselt korrigeerimist vajavate tulemustega katse läbiviimisega, st koe tegelik eluvõimelisus = [%eluvõimelisustuuritav] – [%NSMTT].

39.

Kui on selgunud, et uuritav kemikaal on nii segava värvusega (vt punkt 37) kui ka MTT otsene redutseerija (vt punkt 38), on neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmise korral peale eelmistes punktides kirjeldatud NSMTT- ja NSCelus-kontrollproovide vajalik ka kolmas kontrollproovide komplekt. See on tavaline tumeda värvusega uuritavate kemikaalide puhul, mis neelavad valgust lainepikkuste vahemikus 570±30 nm (nt sinine, lilla, must), sest nende loomulik värv takistab nende MTT otsese redutseerimise võime hindamist vastavalt punktis 38 kirjeldatule. Selline olukord nõuab automaatselt nii NSMTT- kui ka NSCelus-kontrollproovide kasutamist. Uuritavaid kemikaale, millega viiakse läbi nii NSMTT- kui ka NSCelus-kontrollproovid, võivad absorbeerida ja siduda nii elus kui ka surnud loed. Seega võib juhtuda, et NSMTT-kontrollproov ei aita parandustes arvestada mitte ainult uuritava kemikaali MTT otsese redutseerimise võimet, vaid ka uuritava kemikaali surnud kudedesse absorbeerumisel ja seal püsimisel tekkivat segavat värvust. See võib põhjustada segavast värvusest tingitud vigade topeltparandusi, sest uuritava kemikaali elusas koes absorbeerumisest ja seal püsimisest tingitud värvuse häirivat mõju korrigeeritakse juba NSCelus-kontrollproovi järgi. Et vältida segavast värvusest tingitud vigade topeltparandusi, on vaja teha kolmas kontrollkatse, millega analüüsitakse mittespetsiifilist värvust surnud kudedes (NSCsurnud) (vt III ja IV liide) (34, 35). Uuritavat kemikaali kantakse vähemalt kahele surnud koe paralleelproovile, millega tehakse läbi kogu katse käik, kuid MTTga inkubeerimise etapis inkubeeritakse neid MTT lahuse asemel söötmega. Piisab ühest NSCsurnud-kontrollproovist iga uuritava kemikaalikohta, olenemata sellest, kui palju üksikkatseid/katsetsükleid tehakse, kuid kõnealust kontrollproovi tuleks uurida paralleelselt NSMTT-kontrollprooviga ning kasutada mõlemas sama koepartiid. Koe tegelik eluvõimelisus arvutatakse järgmiselt: uuritava kemikaaliga kokku puutunud eluskudedega saadud eluvõimelisuse protsent (%eluvõimelisustuuritav) miinus %NSMTT miinus %NSCelus pluss segava värvusega uuritava kemikaaliga kokku puutunud ning söötmega ja ilma MTTta inkubeeritud surnud kudedega saadud mittespetsiifilise värvuse %, mis arvutatakse negatiivse kontrollproovi suhtes, mida analüüsitakse paralleelselt korrigeerimist vajavate tulemustega katse läbiviimisega, st koe tegelik eluvõimelisus = [%eluvõimelisustuuritav] – [%NSMTT] – [%NSCelus] + [%NSCsurnud].

40.

Oluline on arvestada, et mittespetsiifiline MTT redutseerimine ja mittespetsiifilise värvuse häiriv mõju võivad suurendada koeekstrakti optilist tihedust (kui mõõdetakse neelduvust) nii, et see jääb ülespoole spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku, ning et mittespetsiifiline MTT redutseerimine võib suurendada koeekstraktis sisalduva MTT formasaani piigi pindala (kui mõõdetakse HPLC-/UPLC-spektromeetrilise ühendmeetodiga) nii, et see jääb ülespoole spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku. Seetõttu on oluline et iga labor määraks näiteks MTT formasaaniga (CASi nr 57360-69-7, saab osta nt Sigma-Aldrichist, katalooginr M2003) kindlaks oma spektrofotomeetri optilise tiheduse / piigi pindala lineaarsusvahemiku, enne kui alustab uuritavate kemikaalide analüüsimist regulatiivsel eesmärgil.

41.

Neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmine spektrofotomeetriga on asjakohane MTT otseste redutseerijate ning segava värvusega uuritavate kemikaalide hindamisel, kui MTT formasaaniga mõõtmisel täheldatud segav mõju ei ole väga tugev (st uuritava kemikaaliga saadud koeekstraktide optilised tihedused ilma MTT otsest redutseerimist ja/või värvuse segavat mõju arvestavate parandusteta on spektrofotomeetri lineaarsusvahemikus). Sellegipoolest tuleb ettevaatlikult suhtuda nende uuritavate kemikaalide puhul saadud tulemustesse, mille negatiivse kontrollproovi tulemus on %NSMTT ja/või %NSCelus ≥ 60 % (VRM1, ja VRM2 vedelike analüüsimise metoodika) või 50 % (VRM2 tahkete ainete analüüsimise metoodika), sest need on kindlaksmääratud läviväärtused, mille järgi valideeritud võrdlusmeetodites eristatakse klassifitseeritud ja klassifitseerimata kemikaale (vt punkt 44). Neelduvust (optilist tihedust) ei saa siiski mõõta, kui MTT formasaani sisalduse mõõtmist segav mõju on liiga tugev (st põhjustab uuritavate koeekstraktide korrigeerimata optiliste tiheduste sattumist väljapoole spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku). Neid uuritavaid kemikaale, mis on värvilised või muutuvad värviliseks kokkupuutel vee või isopropanooliga ja segavad liiga tugevalt MTT formasaani neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmist, saab siiski analüüsida HPLC-/UPLC-spektromeetrilist ühendmeetodit kasutades (vt III ja IV liidet). HPLC-/UPLC-aparatuur võimaldab MTT formasaani enne selle kvantitatiivset määramist kemikaalist eraldada (36). Sel põhjusel ei ole HPLC-/UPLC-spektromeetrist ühendmeetodit kasutades vaja analüüsida NSCelus- või NSCsurnud-kontrollproove olenemata sellest, missugust kemikaali uuritakse. Siiski tuleks uurida NSMTT-kontrollproove, kui on kahtlus, et uuritav kemikaal redutseerib otseselt MTTd (toimides punktis 38 kirjeldatu kohaselt). Samuti tuleks NSMTT-kontrollproove kasutada värviliste (iseloomuliku või veega kokkupuutel tekkiva värvusega) uuritavate kemikaalide puhul, kui värvus takistab hinnata nende võimet otseselt MTTd redutseerida (nimetatud kontrollproovide kasutamist on kirjeldatud punktis 38). Kui MTT formasaani sisalduse mõõtmiseks kasutatakse HPLC-/UPLC-spektromeetrilist ühendmeetodit, arvutatakse koe eluvõimelisus (protsentides) uuritava kemikaaliga kokku puutunud elusa koega saadud MTT formasaani piigi pindala protsendina paralleelse negatiivse kontrollprooviga saadud MTT formasaani piigi suhtes. Nende uuritavate kemikaalide puhul, mis on võimelised otseselt MTT redutseerima, arvutatakse koe tegelik eluvõimelisus järgmiselt: %Eluvõimelisustuuritav miinus %NSMTT, nagu on kirjeldatud punkti 38 viimases lauses. Lõpuks tuleb märkida, et neid otseseid MTT redutseerijaid (mis võivad olla ka segava värvusega), mis jäävad kudedesse pärast töötlemist püsima ja redutseerivad MTTd nii tugevalt, et see põhjustab uuritavate koeekstraktide optiliste tiheduste (kui mõõdetakse optilist tihedust) või piigi pindalade (kui kasutatakse HPLC-/UPLC-spektromeetrilist ühendmeetodit) sattumist väljapoole spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku, ei saa analüüsida RhCE-katsemeetoditega, kuigi neid esineb eeldatavast väga harva.

42.

HPLC-/UPLC-spektromeetrilist ühendmeetodit võib kasutada MTT formasaani sisalduse mõõtmiseks igat tüüpi uuritava kemikaali korral (värvilised, värvitud, MTT redutseerijad ja mitteredutseerijad) (11, 36). Kuna HPLC-/UPLC-spektrofotomeetria aparatuurid on erinevad, ei ole igal kasutajal lihtne luua süsteemis täpselt samasugused tingimused. Enne HPLC-/UPLC-spektromeetria aparatuuri kasutamist koeekstraktidest pärit MTT formasaani kvantitatiivseks mõõtmiseks tuleb tõendada aparatuuri nõuetekohasust; selleks peavad olema täidetud mitme standardse kvalifikatsiooninäitajaga seotud nõuetekohasuse kriteeriumid, mille aluseks on näitajad ja kriteeriumid, mida on kirjeldatud USA Toidu- ja Ravimiameti juhendis bioanalüütilise meetodi valideerimise kohta tööstuses (36, 38). Need põhinäitajad ja nende nõuetekohasuse kriteeriumid on esitatud 5. liites. Kui 5. liites määratletu nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse HPLC-/UPLC-fotomeetriaaparatuur nõuetekohaseks ning see on valmis MTT formasaani sisalduse mõõtmiseks käesolevas katsemeetodis kirjeldatud katsetingimuste juures.

Nõuetekohasuse kriteeriumid

43.

Igas analüüsitsüklis, kus kasutakse kvaliteedikontrolli (vt punkt 30) läbinud RhCE-koepartiisid, peab negatiivse kontrollainega töödeldud kudede optiline tihedus kajastama kudede veo-, vastuvõtu- ja katse-eeskirjakohaste töötluste järgset kvaliteeti ega tohi jääda väljapoole varem kindlaksmääratud piire, mis on esitatud tabelis 2 (vt punkt 26). Samuti peab positiivse kontrollainega, nt metüülatsetaadiga töödeldud kudede keskmine eluvõimelisus negatiivse kontrollprooviga võrreldes olema < 50 %, kui järgitakse VRM1-meetodi vedelike või tahkete ainete katse-eeskirja, ja ≤ 30 % (vedelikel) või ≤ 20 % (tahketel ainetel), kui kasutatakse VRM2-meetodit; see näitaja kirjeldab kudede võimet reageerida ärritavale uuritavale kemikaalile katsemeetodiga ettenähtud tingimustes (34, 35). Uuritava kemikaalide ja kontrollainetega töödeldud paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste varieeruvus peab jääma vastuvõetavatesse piiridesse (st kahe paralleelse koeproovi eluvõimelisuse erinevus peab olema alla 20 % või ei tohi kolme paralleelse koeprooviga saadud tulemuste standardhälve ületada 18 %). Kui analüüsitsüklisse võetud negatiivse või positiivse kontrollprooviga saadud tulemus jääb väljapoole vastuvõetavaid piire, loetakse analüüsitsükkel ebakvaliteetseks ja seda tuleb korrata. Kui uuritava kemikaalige töödeldud paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste varieeruvus jääb väljapoole vastuvõetavaid piire, loetakse katse ebakvaliteetseks ja katset uuritava kemikaaliga tuleb korrata.

Tulemuste tõlgendamine ja prognoosimismudel

44.

Iga uuritava kemikaaliga töödeldud paralleelsete koeproovide ekstraktidega saadud optilise tiheduse väärtuste / piikide pindalade järgi arvutatakse protsentides koe keskmine eluvõimelisus (paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste keskväärtus) normaliseerituna negatiivse kontrollproovi järgi, mille väärtuseks võetakse 100 %. Koe eluvõimelisuse (protsentides) läviväärtused nende uuritavate kemikaalide kindlakstegemiseks, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane kategooria puudub), on esitatud tabelis 4. Tulemusi tuleb seega tõlgendada järgmiselt:

—

uuritav kemikaal määratletakse ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohast klassifitseerimist ja märgistamist mittevajava kemikaalina (kategooria puudub), kui koe keskmine eluvõimelisus (protsentides) pärast kemikaaliga kokkupuudet ja kokkupuutejärgset inkubeerimist on suurem kui (>) koe eluvõimelisuse (protsentides) kindlaksmääratud läviväärtus, mis on esitatud tabelis 4. Sellisel juhul ei ole vaja täiendavaid katseid teiste katsemeetoditega;

—

kui koe keskmine eluvõimelisus (protsentides) pärast kemikaaliga kokkupuudet ja kokkupuutejärgset inkubeerimist on väiksem kui koe eluvõimelisuse (protsentides) kindlaksmääratud läviväärtus või sellega võrdne (≤), ei ole võimalik prognoose teha, nagu näidatud tabelis 4. Sellisel juhul on vaja täiendavaid kaitset teiste katsemeetoditega, sest RhCEd kasutavad katsemeetodid annavad teatava hulga valepositiivseid tulemusi (vt punktid 14–15) ega suuda eristada URO GHSi ja CLP-määruse kohastesse kategooriatesse 1 ja 2 kuuluvaid kemikaale (vt punkt 17)

Tabel 4

Prognoosimismudelid ÜRO GHSi ja CLP-määruse klassifikatsiooni järgi

VRM	Kategooriata	Prognoosida ei ole võimalik
VRM1 – EpiOcular™i silmaärrituse katse (mõlemad katse-eeskirjad)	Koe keskmine eluvõimelisus > 60 %	Koe keskmine eluvõimelisus ≤ 60 %
VRM2 – SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse (katse-eeskiri vedelike korral)	Koe keskmine eluvõimelisus > 60 %	Koe keskmine eluvõimelisus ≤ 60 %
VRM2 – SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse (katse-eeskiri tahkete ainete korral)	Koe keskmine eluvõimelisus > 50 %	Koe keskmine eluvõimelisus ≤ 50 %

45.

Üksainus katse vähemalt kahe paralleelse koeprooviga uuritava kemikaali kohta peaks olema piisav, kui tulemus on ühene. Piiripealse tulemuse puhul, nagu lahkuminevad tulemused paralleelproovide mõõtmisel ja/või keskmine eluvõimelisuse protsent 60 ± 5 % (VRM1 ja VRM2 vedelike korral) või 50 ± 5 % (VRM2 tahkete ainete korral), tuleks kaaluda teise ja isegi kolmanda katse läbiviimist, kui kaks esimest katset annavad vastuolulise tulemuse.

46.

Kui see on asjakohane ja õigustatud, võib teatavat liiki segude puhul kaaluda teistsuguste koe eluvõimelisuse (protsentides) läviväärtuste kasutamist, millega eristatakse klassifitseeritud ja klassifitseerimata uuritavad kemikaalid, et suurendada katsemeetodi üldist toimivust seda liiki segude korral (vt punkt 14). Võrdluskemikaalid võivad aidata hinnata tundmatu uuritava kemikaali või tooteklassi võimet põhjustada rasket silmakahjustust / silmade ärritust või hinnata klassifitseeritud kemikaali võimalikku suhtelist toksilisust silmade suhtes teatavas positiivsete reaktsioonide vahemikus.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmed

47.

Iga analüüsitsüklis oleva paralleelse koeprooviga saadud andmed (nt uuritavate kemikaalide ja kontrollainete optilise tiheduse väärtused / piikide pindalad ja arvutatud koe eluvõimelisuse (protsentides) andmed ning RhCE-katsemeetodi kohane lõplik prognoos) esitatakse tabelina iga uuritava kemikaali kohta, samuti tuleb vajaduse korral esitada korduskatsetel saadud andmed. Peale selle tuleb esitada kudede keskmine eluvõimelisus (protsentides) ja kahe paralleelse koeproovi eluvõimelisuse erinevus (kui n = 2 paralleelset koeproovi) või iga uuritava kemikaali ja kontrollainega saadud tulemuste standardhälve (kui n ≥ 3 paralleelset koeproovi). Kui uuritud kemikaali puhul täheldati segavat mõju MTT formasaani sisalduse mõõtmisele MTT otsese redutseerimise tõttu ja/või segavat värvust, tuleb iga niisuguse kemikaali puhul esitada sellekohased andmed.

Katseprotokoll

48.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Uuritav kemikaal

Ühest koostisosast koosnev aine:

—	kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid;

—	füüsikaline olek, lenduvus, pH, log P, molekulmass, aineklass ja muud uuringu tegemisega seotud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;

—	puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;

—	töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);

—	säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses.

Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal ja segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest (vt eespool), kättesaadavas ulatuses;

—	füüsikaline olek ja muud uuringu tegemisega seotud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;

—	puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;

—	töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);

—	säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses.

Positiivsed ja negatiivsed kontrollained

—	Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid;

—	füüsikaline olek, lenduvus, molekulmass, aineklass ja muud uuringu tegemisega seotud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;

—	puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;

—	töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);

—	säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;

—	muu negatiivse kontrollaine kui ülipuhta H2O või Ca2+/Mg2+-vaba DPBSi kasutamise põhjendus, kui see on asjakohane;

—	muu positiivse kontrollaine kui puhta metüülatsetaadi kasutamise põhjendus, kui see on asjakohane;

—	viide varasematele positiivse ja negatiivse kontrollproovi tulemustele, mis tõendavad sobivaid analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriume.

Teave sponsori ja katselabori kohta

—	Sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress.

—	Kasutatud RhCE-koemudel ja katse-eeskiri (koos valikute põhjendustega, kui see on asjakohane)

Katsemeetodi tingimused

—	Kasutatud RhCE-koemudel, sealhulgas partii number;

—	MTT formasaani kvantitatiivseks määramiseks kasutatud lainepikkus ja spektririba laius (kui asjakohane) ning mõõteseadme (nt spektrofotomeetri) lineaarsusvahemik;

—	MTT formasaani kvantitatiivse määramise meetodi kirjeldus;

—	kasutatud HPLC-/UPLC-fotomeetriaaparatuuri kirjeldus, kui asjakohane;

—

kogu täiendav teave kasutatud konkreetse RhE-koemudeli ja selle toimivuse kohta. See hõlmab vähemalt järgmist:

i)	eluvõimelisus kvaliteedi kontrollil (tarnija andmed);

ii)	eluvõimelisus katsemeetodiga nõutavates tingimustes (kasutaja andmed);

iii)	kaitsekihina toimivuse kontroll;

iv)	morfoloogiaandmed, kui on olemas;

v)	reprodutseeritavus ja prognoosivõime;

vi)	muude RhCE-koemudeli kvaliteedi kontrollide andmed, kui on olemas;

—	viide varasematele andmetele RhCE-koemudeli kohta. See hõlmab vähemalt järgmist: kvaliteedikontrolli andmete nõuetekohasus, arvestades varasemaid partii andmeid;

—	kinnitus, et katselabor on enne katsemeetodi rutiinset kasutamist tõendanud oma pädevust asjaomaseid kemikaale analüüsides.

Analüüsiseeria ja katse nõuetekohasuse kriteeriumid

—	Positiivsete ja negatiivsete kontrollproovidega saadud tulemuste keskväärtused ja nõuetekohased vahemikud, mille aluseks on aja jooksul kogutud andmed;

—	positiivsel ja negatiivsel kontrollkatsel paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste lubatav varieeruvus;

—	uuritava kemikaaliga paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste lubatav varieeruvus.

Katse käik

—	Kasutatud katse-eeskirja üksikasjad;

—	uuritava kemikaali ja kontrollainete kasutatud doosid;

—	kokkupuute, kokkupuutejärgse sukeldatuse ja inkubeerimise kestus ja temperatuur nende ajal (kui asjakohane);

—	kõikide katse-eeskirjas tehtud muudatuste kirjeldus;

—	otseste MTT redutseerijate ja/või värviliste uuritavate kemikaalide puhul kasutatud kontrollproovid, kui asjakohane;

—	kasutatud paralleelsete koeproovide arv uuritava kemikaali kohta ja kontrollproovid (positiivne kontrollproov, negatiivse kontrollproov, NSMTT, NSCelus ja NSCsurnud, kui asjakohane).

Tulemused

—

Tabeli kujul esitatud andmed igas analüüsitsüklis ja paralleelmõõtmises olnud iga uuritava kemikaali ja kontrollaine kohta (kaasa arvatud korduskatsete andmed, kui see on asjakohane), sealhulgas optilise tiheduse väärtus või MTT formasaani piigi pindala, koe eluvõimelisus (protsentides), koe keskmine eluvõimelisus (protsentides), paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste erinevus või standardhälve ning lõplik prognoos;

—

kui see on asjakohane, siis otseselt MTT redutseerivate ja/või värviliste uuritavate kemikaalide puhul kasutatud kontrollproovide tulemused, sealhulgas optilise tiheduse väärtus või MTT formasaani piigi pindala, %NSMTT, %NSCelus, %NSCsurnud, paralleelsete koeproovidega saadud tulemuste erinevus või standardhälve, lõplik korrigeeritud koe eluvõimelisus (protsentides) ja lõplik prognoos;

—	uuritava(te) kemikaali(de)ga ja kontrollainetega saadud tulemuste võrdlus analüüsitsükli ja katsete nõuetekohasuse kriteeriumidega;

—	muude täheldatud mõjude (nt kudede värvumine värvilise uuritava kemikaali tõttu) kirjeldus.

Tulemuste arutelu

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO), „United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS)“, ST/SG/AC.10/30/Rev 6, 6., täiendatud väljaanne, United Nations, New York ja Genf, 2015. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/English/ST-SG-AC10-30-Rev6e.pdf.

(2)	Käesoleva lisa peatükk B.5 „Äge mürgisus: silmade ärritus/söövitus“.

(3)	Käesoleva lisa peatükk B.47, „Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega“.

(4)	Käesoleva lisa peatükk B.48, „Isoleeritud kanasilma katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida“.

(5)	Käesoleva lisa peatükk B.61, „Fluorestseiini lekke katsemeetod silmi söövitavate ja tugevalt ärritavate kemikaalide kindlakstegemiseks“.

(6)	Käesoleva lisa peatükk B.68, „Lühiajalise kokkupuute in vitro katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega“.

(7)	Freeman, S.J., Alépée N., Barroso, J., Cole, T., Compagnoni, A., Rubingh, C., Eskes, C., Lammers, J., McNamee, P., Pfannenbecker, U., Zuang, V. (2010), „Prospective Validation Study of Reconstructed Human Tissue Models for Eye Irritation Testing“, ALTEX, nr 27, eriväljaanne 2010, lk 261–266.

(8)

EC EURL ECVAM (2014), „The EURL ECVAM – Cosmetics Europe prospective validation study of Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE)-based test methods for identifying chemicals not requiring classification and labelling for serious eye damage/eye irritation: Validation Study Report.“ EUR 28 125 EN; doi:10.2787/41680. Kättesaadav aadressil http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC100280.

(9)

EURL ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (2014), „ESAC Opinion on the EURL ECVAM Eye Irritation Validation Study (EIVS) on EpiOcular™ EIT and SkinEthic™ HCE and a related Cosmetics Europe study on HPLC/UPLC-spectrophotometry as an alternative endpoint detection system for MTT-formazan.“ ESACi arvamus nr 2014-03, 17. november 2014; EUR 28 173 EN; doi: 10.2787/043697. Kättesaadav aadressil http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103702.

(10)

Alépée, N., Leblanc, V., Adriaens, E., Grandidier, M.H., Lelièvre, D, Meloni, M., Nardelli, L., Roper, C.S, Santirocco, E., Toner, F., Van Rompay, A., Vinall, J., Cotovio, J. (2016), „Multi-laboratory validation of SkinEthic HCE test method for testing serious eye damage/eye irritation using liquid chemicals“, Toxicol. In Vitro, nr 31, lk 43–53.

(11)

Alépée, N., Adriaens, E., Grandidier, M.H., Meloni, M., Nardelli, L., Vinall, C.J., Toner, F., Roper, C.S, Van Rompay, A.R., Leblanc, V., Cotovio, J. (2016), „Multi-laboratory evaluation of SkinEthic HCE test method for testing serious eye damage/eye irritation using solid chemicals and overall performance of the test method with regard to solid and liquid chemicals testing“, Toxicol. In Vitro, nr 34, lk 55–70.

(12)

EURL ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (2016), „ESAC Opinion on the SkinEthic™ Human Corneal Epithelium (HCE) Eye Irritation Test (EIT)“, ESACi arvamus nr 2016-02, 24. juuni 2016; EUR 28 175 EN; doi: 10.2787/390390. Kättesaadav aadressil http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103704.

(13)	EC EURL ECVAM (2016), „Recommendation on the Use of the Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Methods for Identifying Chemicals not Requiring Classification and Labelling for Serious Eye Damage/Eye Irritation According to UN GHS“ (pooleliolev käsikiri).

(14)	Draize, J.H., Woodard, G., Calvery, H.O. (1944), „Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes“, Journal of Pharmacol. and Exp. Therapeutics, nr 82, lk 377–390.

(15)

Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., Zuang, V. (2010), „A Proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace In Vivo Studies Using Bottom-Up and Top-Down Approaches“, Toxicol. In Vitro, nr 24, lk 1–9.

(16)	Mosmann, T. (1983), „Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays“, J. Immunol. Methods, nr 65, lk 55–63.

(17)

OECD (2016), „Series on Testing and Assessment No 216: Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Cornea-Like Epithelium (RhCE) Test Methods for Identifying Chemicals not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage, Based on the Validated Reference Methods EpiOcular™ EIT and SkinEthic™ HCE EIT described in TG 492“, Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(18)	OECD (2005), „Series on Testing and Assessment No 34: Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment“, Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(19)

Kaluzhny, Y., Kandárová, H., Hayden, P., Kubilus, J., d’Argembeau-Thornton, L., Klausner, M. (2011), „Development of the EpiOcular™ Eye Irritation Test for Hazard Identification and Labelling of Eye Irritating Chemicals in Response to the Requirements of the EU Cosmetics Directive and REACH Legislation“, Altern. Lab. Anim., nr 39, lk 339–364.

(20)	Nguyen, D.H., Beuerman, R.W., De Wever, B., Rosdy, M. (2003), „Three-dimensional construct of the human corneal epithelium for in vitro toxicology“, Väljaandes: Salem, H., Katz, S.A. (toim.), Alternative Toxicological Methods, CRC Press, lk 147–159.

(21)

Pfannenbecker, U., Bessou-Touya, S., Faller, C., Harbell, J., Jacob, T., Raabe, H., Tailhardat, M., Alépée, N., De Smedt, A., De Wever, B., Jones, P., Kaluzhny, Y., Le Varlet, B., McNamee, P., Marrec-Fairley, M., Van Goethem, F. (2013), „Cosmetics Europe multi-laboratory pre-validation of the EpiOcular™ reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation“, Toxicol. In Vitro, nr 27, lk 619–626.

(22)

Alépée, N., Bessou-Touya, S., Cotovio, J., de Smedt, A., de Wever, B., Faller, C., Jones, P., Le Varlet, B., Marrec-Fairley, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., van Goethem, F., McNamee, P. (2013), „Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the SkinEthic™ Reconstituted Human Corneal Epithelium Test Method for the Prediction of Eye Irritation“, Toxicol. In Vitro, nr 27, lk 1 476–1 488.

(23)

Kolle, S.N., Moreno, M.C.R., Mayer, W., van Cott, A., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. (2015), „The EpiOcular™ Eye Irritation Test is the Method of Choice for In Vitro Eye Irritation Testing of Agrochemical Formulations: Correlation Analysis of EpiOcular™ Eye Irritation Test and BCOP Test Data to UN GHS, US EPA and Brazil ANIVSA Classifications“, Altern. Lab. Anim., nr 43, lk 1–18.

(24)

Adriaens, E., Barroso, J., Eskes, C., Hoffmann, S., McNamee, P., Alépée, N., Bessou-Touya, S., De Smedt, A., De Wever, B., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Zuang, V. (2014), „Retrospective Analysis of the Draize Test for Serious Eye Damage/Eye Irritation: Importance of Understanding the In Vivo Endpoints Under UN GHS/EU CLP for the Development and Evaluation of In Vitro Test Methods“, Arch. Toxicol., nr 88, lk 701–723.

(25)

Barroso, J., Pfannenbecker, U., Adriaens, E., Alépée, N., Cluzel, M., De Smedt, A., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K.R., Millet, M., Templier, M., McNamee, P. (2017), „Cosmetics Europe compilation of historical serious eye damage/eye irritation in vivo data analysed by drivers of classification to support the selection of chemicals for development and evaluation of alternative methods/strategies: the Draize eye test Reference Database (DRD)“, Arch. Toxicol., nr 91, lk 521–547.

(26)	Meloni, M., De Servi, B., Marasco, D., Del Prete, S. (2011), „Molecular mechanism of ocular surface damage: Application to an in vitro dry eye model on human corneal epithelium“, Molecular Vision, nr 17, lk 113–126.

(27)	Hackett, R.B., McDonald, T.O. (1991), „Eye Irritation“, väljaandes Advances in Modern Toxicology: Dermatoxicology Marzulli F.N. ja Maibach H.I. (toim.), 4th trükk, lk 749–815, Hemisphere Publishing Corporation, Washington, DC, USA.

(28)	Fox, D.A., Boyes, W.K. (2008), „Toxic Responses of the Ocular and Visual System,“ Väljaandes „Casarett & Doull’s Toxicology: The Basic Science of Poisons“, Klaassen C.D. (toim.), 7. trükk, lk 665–697, McGraw-Hill Ryerson, Withby, ON, Kanada.

(29)	Jester, J.V., Li, H.F., Petroll, W.M., Parker, R.D., Cavanagh, H.D., Carr, G.J., Smith, B., Maurer, J.K. (1998), „Area and Depth of Surfactant Induced Corneal Injury Correlates with Cell Death“, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., nr 39, lk 922–936.

(30)	Maurer, J.K., Parker, R.D., Jester, J.V. (2002), „Extent of Corneal Injury as the Mechanistic Basis for Ocular Irritation: Key Findings and Recommendations for the Development of Alternative Assays“, Reg. Tox. Pharmacol., nr 36, lk 106–117.

(31)	Jester, J.V., Li, L., Molai, A., Maurer, J.K. (2001), „Extent of Corneal Injury as a Mechanistic Basis for Alternative Eye Irritation Tests“, Toxicol. In Vitro, nr 15, lk 115–130.

(32)	Jester, J.V., Petroll, W.M., Bean, J., Parker, R.D., Carr, G.J., Cavanagh, H.D., Maurer, J.K. (1998), „Area and Depth of Surfactant-Induced Corneal Injury Predicts Extent of Subsequent Ocular Responses“, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., nr 39, lk 2 610–2 625.

(33)	Jester, J.V. (2006), „Extent of Corneal Injury as a Biomarker for Hazard Assessment and the Development of Alternative Models to the Draize Rabbit Eye Test“, Cutan. Ocul. Toxicol., nr 25, lk 41–54.

(34)	EpiOcular™i silmaärrituse katse standardeeskiri, 8. versioon (5. märts 2013), „EpiOcular™ EIT for the Prediction of Acute Ocular Irritation of Chemicals“, kättesaadav aadressil https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index

(35)

SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katse standardeeskiri, 1. versioon (20. juuli 2015), „SkinEthic™ HCE Eye Irritation Test (EITL for Liquids, EITS for Solids) for the Prediction of Acute Ocular Irritation of Chemicals“, kättesaadav aadressil https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index.

(36)

Alépée, N., Barroso, J., De Smedt, A., De Wever, B., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K.R., Millet, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Templier, M., McNamee, P. (2015), „Use of HPLC/UPLC-Spectrophotometry for Detection of Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)-Based Test Methods Employing the MTT-Reduction Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals“, Toxicol. In Vitro, nr 29, lk 741–761.

(37)

Kaluzhny, Y., Kandárová, H., Handa, Y., DeLuca, J., Truong, T., Hunter, A., Kearney, P., d’Argembeau-Thornton, L., Klausner, M. (2015), „EpiOcular™ Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times“, Altern. Lab. Anim., nr 43, lk 101–127.

(38)	USA Toidu- ja Ravimiamet (2001), „Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation“, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, mai 2001. Kättesaadav aadressil http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf.

(39)	OECD (2017), „Guidance Document on an Integrated Approaches on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye irritation. Series on Testing and Assessment No 263“, ENV Publications, Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

1. liide

MÕISTED

Võrdluskemikaal : kemikaal, mida kasutatakse standardina võrdlemiseks uuritava kemikaaliga. Võrdluskemikaalil peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne tarnija, kes kemikaali identifitseerib ja seda kirjeldab; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava(te) kemikaali(de)ga ja/või sellega/nendega sarnane kemikaali-/tooteklass; iii) teadaolevad füüsikalis-keemilised omadused; iv) teadaolevat toimet tõendavad andmed ja v) teadaolev mõjusus soovitavas reaktsioonitugevuse vahemikus.

Alt-üles lähenemisviis : etapiviisiline lähenemisviis, mida kasutatakse niisuguste uuritavate kemikaalide korral, mille puhul on põhjust arvata, et need ei vaja klassifitseerimist ega märgistamist silmade ärrituse või raske silmakahjustusega seoses; nimetatud lähenemisviisi puhul eristatakse kõigepealt kemikaalid, mis ei vaja klassifitseerimist ega märgistamist (tulemus on negatiivne), muudest kemikaalidest (tulemus on positiivne).

Kemikaal : aine või segu.

Vastavus : vt „Täpsus“.

Sarvkest : silmamuna esikülje läbipaistev osa, mis katab vikerkesta ja pupilli ning laseb valgusel tungida silma sisse.

CV : variatsioonikordaja.

Dev : hälve.

EIT : silmaärrituse katse.

EURL ECVAM : loomkatsete alternatiivide Euroopa Liidu referentlabor.

ET50 : kokkupuuteaeg, mille jooksul pealekantud, teatava kindla kontsentratsiooniga võrdluskemikaal vähendab koe eluvõimelisust 50 % võrra.

Valenegatiivsete tulemuste määr : kõikide selliste ainete osakaal, mis peaksid andma positiivse tulemuse, kuid on katsemeetodit järgides andnud negatiivse tulemuse. See on üks katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja.

Valepositiivsete tulemuste määr : kõikide selliste ainete osakaal, mis peaksid andma negatiivse tulemuse, kuid on katsemeetodit järgides andnud positiivse tulemuse. See on üks katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja.

Oht : niisuguse mõjuri või olukorra loomupärane omadus, mis võib avaldada kahjulikku toimet, kui organism, süsteem või (ala)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.

HCE : SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteel.

HPLC : kõrgefektiivne vedelikkromatograafia.

IC50 : kontsentratsioon, mille juures võrdluskemikaal vähendab kindla kokkupuuteaja (nt 30-minutine töötlemine naatriumdodetsüülsulfaadiga) jooksul koe eluvõimelisust 50 % võrra.

Lõpmatu annus : RhCE-koemudelile kantud uuritava kemikaali kogus, mis on suurem epiteeli pinna täielikuks ja ühtlaseks katmiseks vajalikust kogusest.

Pöördumatu mõju silmale : vt „Raske silmakahjustus“.

LLOQ : alumine määramispiir.

LogP : oktanool-vesi jaotuskoefitsiendi logaritm.

Segu : kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

Ühe koostisosaga aine : aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles ühe peamise koostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

MTT : 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine.

Negatiivne kontrollproov : proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida on töödeldud ainega, mis teadaolevalt kutsub katsesüsteemis esile positiivse reaktsiooni. Seda proovi analüüsitakse koos uuritava kemikaaliga töödeldud proovide ja teiste kontrollproovidega, et määrata kindlaks 100 % koe eluvõimelisus.

Klassifitseerimata : kemikaalid, mida ei ole klassifitseeritud seoses silmade ärrituse (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 2. kategooria, ÜRO GHSi kategooria 2A või 2B) ega raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane 1. kategooria). Samatähenduslik mõistega „ÜRO GHSi /CLP-määruse kohane kategooria puudub“.

NSCsurnud : mittespetsiifiline värvus surnud koes.

NSCelus : mittespetsiifiline värvus elavas koes.

NSMTT : mittespetsiifiline MTT redutseerimine.

OD : optiline tihedus.

Toimivusnõuded : teaduslikult põhjendatuks arvatud valideeritud katsemeetodil põhinevad nõuded, mille alusel hinnatakse, kuivõrd saab kavandatud katsemeetodit võrrelda teostuslikult ja tööpõhimõttelt samalaadse meetodiga. Hõlmab järgmist: i) katsemeetodi olulised osad; ii) valideeritud katsemeetodi nõuetekohase toimivuse tõendamiseks kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdluskemikaalide miinimumloend ja iii) võrreldavad täpsuse ja usaldusväärsuse tasemed, mis põhinevad valideeritud katsemeetodiga saadud tulemustel ja mis tuleks kavandatud katsemeetodi hindamisel saavutada võrdluskemikaalide miinimumloendi kasutamisel (18).

Positiivne kontrollproov : proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida on töödeldud ainega, mis teadaolevalt kutsub katsesüsteemis esile positiivse reaktsiooni. Seda proovi analüüsitakse koos uuritava kemikaaliga töödeldud proovide ja teiste kontrollproovidega. Selleks, et oleks võimalik hinnata positiivse kontrollproovi esilekutsutud reaktsiooni varieeruvust ajas, ei tohi positiivne reaktsioon olla ülemäära tugev.

Asendav meetod : katsemeetod, mis on kavandatud rutiinses kasutuses oleva kinnitatud meetodi asendamiseks ohtude kindlakstegemise ja/või riskide hindamise meetodina ning mille puhul on kindlaks tehtud, et see tagab kas inimeste või loomade tervise või keskkonna samaväärse või parema kaitse kui kinnitatud katsemeetod kõikide võimalike määramisolukordade ja kemikaalide puhul (18).

Korratavus : sama uuritava kemikaali ja sama katsemetoodikaga korduvatel katsetel saadud tulemuste kokkulangevus (18).

Pöörduv mõju silmale : vt „Silmade ärritus“.

RhCE : rekonstrueeritud inimese sarvkesta sarnane epiteel.

Analüüsitsükkel : analüüsitsükkel hõlmab ühe või mitme uuritava kemikaali analüüsi koos negatiivse ja positiivse kontrollprooviga.

SD : standardhälve.

Tundlikkus : kõigi niisuguste positiivsete/reaktsioonivõimeliste uuritavate kemikaalide osakaal, mis katse tulemusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega iseloomustatakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (18).

Raske silmakahjustus : sellise koekahjustuse tekkimine silmas või selline tugev nägemisteravuse langus pärast seda, kui uuritavat ainet on manustatud silma eespinnale, mis ei ole 21 päeva jooksul pärast manustamist täielikult pöörduv. Samatähenduslik mõistetega „pöördumatu mõju silmale“ ja „ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohane 1. kategooria“.

Standardeeskiri : kirjalik formaalne eeskiri, mis kirjeldab üksikasjalikult, kuidas viia läbi rutiinseid ja katsega seotud laboritoiminguid. See on nõutav hea laboritava kohaselt.

Spetsiifilisus : kõigi niisuguste negatiivsete/mittereageerivate uuritavate kemikaalide osakaal, mis katse tulemusel klassifitseeritakse õigesti. Spetsiifilisusega iseloomustatakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (18).

Katse : ühe uuritava kemikaali analüüsimine vähemalt kahe paralleelse koeprooviga, nagu määratletud vastavas standardeeskirjas.

Koe eluvõimelisus : rekonstrueeritud koe rakupopulatsiooni üldist aktiivsust (nt rakkude võimet redutseerida vitaalvärvainet MTT) väljendav parameeter, mis olenevalt mõõdetavast näitajast ja katseplaanist on vastavuses elusrakkude koguarvu ja/või elujõulisusega.

Ülalt-alla lähenemisviis : etapiviisiline lähenemisviis, mida kasutatakse niisuguste kemikaalide korral, mille puhul on põhjust arvata, et need põhjustavad rasket silmakahjustust; nimetatud lähenemisviisi puhul eristatakse kõigepealt rasket silmakahjustust tekitavad kemikaalid (tulemus on positiivne) muudest kemikaalidest (tulemus on negatiivne).

Uuritav kemikaal : iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Astmelise katsetamise strateegia : Etapiviisi katsete tegemise strateegia, milles kasutatakse järjestikku eri katsemeetodeid. Enne strateegia järgmise etapiga alustamist vaadatakse igas etapis läbi kogu uuritava kemikaali kohta olemasolev teave, kasutades tõendite kaalukuse menetlust, et otsustada, kas teave on ohuklassi määramiseks piisav. Kui olemasoleva teabe põhjal saab antud etapis otsustada uuritava kemikaali võimaliku ohtlikkuse üle, ei ole täiendavaid katseid vaja teha (18).

ULOQ : ülemine määramispiir.

ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohane 1. kategooria : vt „Raske silmakahjustus“.

ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohane 2. kategooria : vt „Silmade ärritus“.

ÜRO GHSi ja CLP-määruse kohase kategooriata : kemikaalid, mis ei vasta ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 1. ega 2. kategooriasse (ega ÜRO GHSi 2A või 2B kategooriasse) klassifitseerimise nõuetele. Samatähenduslik mõistega „Klassifitseerimata“.

UPLC : ultraefektiivne vedelikkromatograafia.

UVCB : tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Teaduslikult põhjendatud katsemeetod : katsemeetod, mille asjakohasust ja usaldusväärsust konkreetse eesmärgi puhul käsitatakse piisavana ning mis põhineb teaduslikult tõendatud põhimõtetel. Katsemeetod ei ole kunagi teaduslikult põhjendatud absoluutses tähenduses, vaid ainult seoses määratud eesmärgiga (18).

VRM : valideeritud võrdlusmeetod.

VRM1 : EpiOcular™i silmaärrituse katsele viidatakse kui 1. valideeritud võrdlusmeetodile.

VRM2 : SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katsele viidatakse kui 2. valideeritud võrdlusmeetodile.

Tõendusmaterjali kaalukuse hindamine : protsess, milles kaalutakse mitmesuguste andmete tugevaid ja nõrku külgi, et jõuda otsuseni uuritava aine võimaliku ohtlikkuse kohta ja toetada sellist otsust.

2. liide

KATSEMEETODI PEAMISED OSAD – RHCE-KOEMUDELIT KASUTAV KATSEMEETOD, MIS ON VALIDEERITUD NENDE KEMIKAALIDE KINDLAKSTEGEMISEKS, MIDA EI OLE VAJA KLASSIFITSEERIDA EGA MÄRGISTADA SEOSES SILMADE ÄRRITUSE VÕI RASKE SILMAKAHJUSTUSEGA

Katse osad

EpiOcular™i silmaärrituse katse

(VRM 1)

SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutav silmaärrituse katse

(VRM 2)

Metoodikad

Vedelikud

(pipeteeritavad 37 ± 1 °C juures või madalamal temperatuuril 15 minuti jooksul)

Tahked ained

(mittepipeteeritavad)

Vedelikud ja viskoossed ained

(pipeteeritavad)

Tahked ained

(mittepipeteeritavad)

Mudeli pindala

0,6 cm2

0,5 cm2

Paralleelsete koeproovide arv

Vähemalt 2

Segava värvuse eelkontroll

50 μl + 1 ml H2O 60 minuti jooksul temperatuuril 37 ± 2oC, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 % (värvuseta uuritavad kemikaalid) või 50 μl + 2 ml isopropanooli, segada toatemperatuuril 2–3 tundi (värvilised uuritavad kemikaalid)

kui uuritava kemikaali optiline tihedus lainepikkusel 570 ± 20 nm pärast isopropanooli või vee optilise tiheduse lahutamist on > 0,08 (mis on ligikaudu 5 % negatiivse kontrollproovi keskmisest optilisest tihedusest), tuleks teha kohandatud kontrollkatsed eluskoega.

50 mg + 1 ml H2O 60 minuti jooksul temperatuuril 37 ± 2oC, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

(värvuseta uuritavad kemikaalid) või

50 mg + 2 ml isopropanooli, segada toatemperatuuril 2–3 tundi (värvilised ja värvuseta uuritavad kemikaalid)

10 μl + 90 μl H2O, segada 30 ± 2 minutit toatemperatuuril (18–28oC)

kui uuritav kemikaal on värviline, tuleks teha kohandatud kontrollkatsed eluskoega.

10 mg + 90 μl H2O, segada 30 ± 2 minutit toatemperatuuril

kui uuritav kemikaal on värviline, tuleks teha kohandatud kontrollkatsed eluskoega.

MTT otsese redutseerimise eelkontroll

50 μl + 1 ml MTT 1 mg/ml lahust, 180 ± 15 min 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

kui lahus muutub siniseks/lillaks, tuleks teha kohandatud kontrollkatsed külmutades saadud surnud kudedega

(negatiivse kontrollainena kasutatakse 50 μl steriilset deioniseeritud vett MTT lahuses)

50 μg + 1 ml MTT 1 mg/ml lahust, 180 ± 15 min 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

kui lahus muutub siniseks/lillaks, tuleks teha kohandatud kontrollkatsed külmutades saadud surnud kudedega

(negatiivse kontrollainena kasutatakse 50 μl steriilset deioniseeritud vett MTT lahuses)

30 μl + 300 μl MTT 1 mg/ml lahust, 180 ± 15 min 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

kui lahus muutub siniseks/lillaks, tuleks teha kohandatud kontrollkatsed vees saadud surnud kudedega

(negatiivse kontrollainena kasutatakse 30 μl steriilset deioniseeritud vett MTT lahuses)

30 mg + 300 μl MTT 1 mg/ml lahust, 180 ± 15 min 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

kui lahus muutub siniseks/lillaks, tuleks teha kohandatud kontrollkatsed vees saadud surnud kudedega

(negatiivse kontrollainena kasutatakse 30 μl steriilset deioniseeritud vett MTT lahuses)

Eeltöötlus

20 μl Ca2+/Mg2+-vaba DPBS,

30 ± 2 min 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %, valguse eest kaitstud.

20 μl Ca2+/Mg2+-vaba DPBS,

30 ± 2 min 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %, valguse eest kaitstud.

–

Töötlemiskogused ja pealekandmine

50 μl (83,3 μl/cm2)

50 mg (83,3 mg/cm2) kalibreeritud vahendiga (nt tasandatud lusikatäis lusikaga, mis on kalibreeritud 50 g naatriumkloriidi mõõtmiseks).

10 μl Ca2+/Mg2+-vaba DPBS, + 30 ± 2 μl (60 μl/cm2)

Viskoossete vedelike korral kasutada nailonvõrku

30 μl Ca2+/Mg2+-vaba DPBS, + 30 ± 2 mg (60 mg/cm2)

Kokkupuuteaeg ja -temperatuur

30 min (± 2 min)

söötmes

37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

6 tundi (± 0,25 tundi)

söötmes

37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

30 min (± 2 min)

söötmes

37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

4 tundi (± 0,1 tundi)

söötmes

37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

Loputamine toatemperatuuril

3 korda 100 ml Ca2+/Mg2+-vaba DPBSiga

20 ml Ca2+/Mg2+-vaba DPBSiga

25 ml Ca2+/Mg2+-vaba DPBSiga

Kokkupuutejärgne sukeldamine

12 min (± 2 min) toetemperatuuril söötmes

25 min (± 2 min) toetemperatuuril söötmes

30 min (± 2 min) 37oC juures, 5 % CO2, suhteline õhuniiskus 95 %, söötmes

30 min (± 2 min) toatemperatuuril söötmes

Kokkupuutejärgne inkubeerimine

120 min (± 15 min) söötmes 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

18 tundi (± 0,25 tundi) söötmes 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

puudub

18 tundi (± 0,5 tundi) söötmes 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

Negatiivne kontrollproov

50 μl H2O

Analüüsitakse paralleelselt

50 μl H2O

Analüüsitakse paralleelselt

30 ± 2 μl Ca2+/Mg2+-vaba DPBSi

Analüüsitakse paralleelselt

30 ± 2 μl Ca2+/Mg2+-vaba DPBSi

Analüüsitakse paralleelselt

Positiivne kontrollproov

50 μl metüülatsetaati

Analüüsitakse paralleelselt

50 μl metüülatsetaati

Analüüsitakse paralleelselt

30 ± 2μl metüülatsetaati

Analüüsitakse paralleelselt

30 ± 2μl metüülatsetaati

Analüüsitakse paralleelselt

MTT lahus

300 μl, 1 mg/ml

MTT inkubeerimisaeg ja -temperatuur

180 min (± 15 min) 37 ± 2oC juures, 5 ± 1 % CO2, suhteline õhuniiskus ≥ 95 %

Ekstraheerimislahusti

2 ml isopropanooli

(ekstraheerimine plaadi pealt ja alt, kude läbi torgates)

2 ml isopropanooli

(ekstraheerimine plaadi alt, kude läbi torgates)

1,5 ml isopropanooli

(ekstraheerimine plaadi pealt ja alt)

1,5 ml isopropanooli

(ekstraheerimine plaadi alt)

Ekstraheerimisaeg ja -temperatuur

2–3 tundi loksutades (~120 pööret minutis) toatemperatuuril või üle öö temperatuuril 4–10 °C

4 tundi loksutades (~120 pööret minutis) toatemperatuuril või vähemalt üle öö ilma loksutamata temperatuuril 4–10 °C

Vähemalt 2 tundi loksutades (~120 pööret minutis) toatemperatuuril

Optilise tiheduse mõõtmine

570 nm (550–590 nm)

ilma võrdlusfiltrita

570 nm (550–590 nm)

ilma võrdlusfiltrita

570 nm (540–600 nm)

ilma võrdlusfiltrita

570 nm (540–600 nm)

ilma võrdlusfiltrita

Koe kvaliteedi kontroll

Töötlemine 100 μl 0,3-mahuprotsendilise Triton X-100-ga

12,2 min ≤ ET50 ≤ 37,5 min

Töötlemine 100 μl 0,3-mahuprotsendilise Triton X-100-ga

12,2 min ≤ ET50 ≤ 37,5 min

30-minutine töötlemine naatriumdodetsüülsulfaadiga (50 μl)

1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,5 mg/ml

30-minutine töötlemine naatriumdodetsüülsulfaadiga (50 μl)

1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,2 mg/ml

Nõuetekohasuse kriteeriumid

1.	Negatiivse kontrollainega töödeldud paralleelsete koeproovide keskmine optiline tihedus peab olema > 0,8 ja < 2,5

2.	30 minutit positiivse kontrollainega kokku puutunud paralleelsete koeproovide keskmine eluvõimelisus, väljendatuna protsendina negatiivse kontrollainega saadud tulemusest, peab olema < 50 %

3.	Kahe paralleelse koeproovi eluvõimelisuse erinevus ei tohi ületada 20 %

1.	Negatiivse kontrollainega töödeldud paralleelsete koeproovide keskmine optiline tihedus peab olema > 0,8 ja < 2,5

2.	6 tundi positiivse kontrollainega kokku puutunud paralleelsete koeproovide keskmine eluvõimelisus, väljendatuna protsendina negatiivse kontrollainega saadud tulemusest, peab olema < 50 %

3.	Kahe paralleelse koeproovi eluvõimelisuse erinevus ei tohi ületada 20 %

1.	Negatiivse kontrollainega töödeldud paralleelsete koeproovide keskmine optiline tihedus peab olema > 1,0 ja ≤ 2,5

2.	30 minutit positiivse kontrollainega kokku puutunud paralleelsete koeproovide keskmine eluvõimelisus, väljendatuna protsendina negatiivse kontrollainega saadud tulemusest, peab olema ≤ 30 %

3.	Kahe paralleelse koeproovi eluvõimelisuse erinevus ei tohi ületada 20 %

1.	Negatiivse kontrollainega töödeldud paralleelsete koeproovide keskmine optiline tihedus peab olema > 1,0 ja ≤ 2,5

2.	4 tundi positiivse kontrollainega kokku puutunud paralleelsete koeproovide keskmine eluvõimelisus, väljendatuna protsendina negatiivse kontrollainega saadud tulemusest, peab olema ≤ 20 %

3.	Kahe paralleelse koeproovi eluvõimelisuse erinevus ei tohi ületada 20 %

3. liide

VRM1 STANDARDEESKIRJAL PÕHINEV ILLUSTREERIV VOOSKEEM, MILLEST JUHINDUDA MTT OTSESTE REDITSEERIJATE JA/VÕI SEGAVA VÄRVUSEGA KEMIKAALIDE KINDLAKSTEGEMISEL JA NENDEGA TEGELEMISEL

4. liide

VRM2 STANDARDEESKIRJAL PÕHINEV ILLUSTREERIV VOOSKEEM, MILLEST JUHINDUDA MTT OTSESTE REDITSEERIJATE JA/VÕI SEGAVA VÄRVUSEGA KEMIKAALIDE KINDLAKSTEGEMISEL JA NENDEGA TEGELEMISEL

5. liide

HPLC-/UPLC-SPEKTROMEETRIA APARATUURI PEAMISED KVALIFIKATSIOONINÄITAJAD JA NENDE NÕUETEKOHASUSE KRITEERIUMID SEOSES RHCE-KOEMUDELIST EKSTRAHEERITUD MTT FORMASAANI MÕÕTMISEGA

Näitaja	USA Toidu- ja Ravimiameti juhendist (36, 38) tuletatud eeskiri	Nõuetekohasuse kriteeriumid
Selektiivsus	Isopropanooliga ekstraheeritud eluskoe tühiproovi (töötlemata elusa RhCE-koemudeli ekstrakt isopropanooliga), surnud koe tühiproovi (töötlemata surnud RhCE-koemudeli ekstrakt isopropanooliga) ja värvaine (nt metüleensinine) analüüs	Pindalasegav ≤ 20 % pindalastLLOQ (86)
Kordustäpsus	Kvaliteedi kontrollimise katsed (st MTT formasaan kontsentratsiooniga 1,6 μg/ml, 16 μg/ml ja 160 μg/ml) isopropanooliga (n = 5)	CV ≤ 15 % või alumise määramispiiri korral ≤ 20 %
Täpsus	Kvaliteedi kontrollimise katsed isopropanooliga (n = 5)	%Dev ≤ 15 % või alumise määramispiiri korral ≤ 20 %
Maatriksefekt	Kvaliteedi kontrollimise katsed elusa koega tühiprooviga (n = 5)	85 % ≤ %maatriksefekt ≤ 115 %
Proovimälu	Isopropanooli analüüs pärast ULOQ (87) standardit	Pindalasegav ≤ 20 % pindalastLLOQ
Korratavus (samal päeval)	3 sõltumatut kaliibrimisgraafikut (MTT formasaani lahus isopropanoolis, 6 järjestikust lahjendust 1/3 võrra alates ülemisest määramispiirist, st 200 μg/ml) Kvaliteedi kontrollimise katsed isopropanooliga (n = 5)	Kaliibrimiskõverad: %Dev ≤ 15 % või alumise määramispiiri korral ≤ 20 % Kvaliteedi kontrollimise katsed: %Dev ≤ 15 % ja CV ≤ 15 %
Korratavus (eri päevadel)	1. päev: 1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedi kontrollimise katsed isopropanooliga (n=3) 2. päev: 1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedi kontrollimise katsed isopropanooliga (n=3) 3. päev: 1 kaliibrimiskõver ja kvaliteedi kontrollimise katsed isopropanooliga (n=3)
MTT formasaani lühiajaline stabiilsus RhCE-koe ekstraktis	Kvaliteedi kontrollimise katsed elusa koega tühiproovidega (n = 3), analüüsitud valmistamise päeval ja pärast 24 tundi toatemperatuuril seismist	%Dev ≤ 15 %
MTT formasaani pikaajaline stabiilsus RhCE-koe ekstraktis, kui see on nõutav	Kvaliteedi kontrollimise katsed elusa koega tühiproovidega (n = 3), analüüsitud valmistamise päeval ja pärast mitu päeva –20 °C juures seismist	%Dev ≤ 15 %

B.70 REKOMBINANTSEL INIMESE ÖSTROGEENIRETSEPTORIL (hrER) PÕHINEVAD IN VITRO ANALÜÜSIMEETODID ÖSTROGEENIRETSEPTORIGA SEONDUVATE KEMIKAALIDE TUVASTAMISEKS

ÜLDINE SISSEJUHATUS

Tulemusnäitajatel põhinev Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsiooni (OECD) katsejuhend

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 493 (2015). Katsejuhend nr 493 on tulemusnäitajatel põhinev katsejuhend, milles kirjeldatakse in vitro analüüsimeetodeid inimese rekombinantse östrogeeniretseptoriga (ER) seonduvate ainete tuvastamiseks (hrERiga seondumise katsed). See hõlmab kahte vaadeldava mehhanismi ja funktsionaalsuse poolest sarnast analüüsimeetodit östrogeeniretseptoriga (st α-ERiga) seonduvate kemikaalide tuvastamiseks ja peaks hõlbustama uute sarnaste või modifitseeritud analüüsimeetodite väljatöötamist vastavalt valideerimispõhimõtetele, mis on esitatud ohuhindamiseks kasutatavate uute või ajakohastatud katsemeetodite valideerimist ja rahvusvahelist tunnustamist käsitlevas OECD juhenddokumendis (1). Kõnealuse tulemusnäitajatel põhineva katsejuhendi aluseks on järgmised täielikult valideeritud võrdlusmeetodid (2. ja 3. liide):

—	täispikal rekombinantsel inimese α-ERil põhinev Freybergeri-Wilsoni (FW) in vitro meetod östrogeeniretseptoriga seondumise analüüsimiseks (2) ja

—	ligandiga seonduval rekombinantsel inimese valgudomeenil põhinev Jaapani Kemikaalide Hindamise ja Uurimise Instituudi (CERI) in vitro meetod östrogeeniretseptoriga seondumise analüüsimiseks (2).

On kehtestatud tulemuslikkuse standardid (3), mis hõlbustavad sama ohunäitaja hindamiseks kasutatavate sarnaste katsemeetodite väljatöötamist ja valideerimist ning võimaldavad tulemusnäitajatel põhinevat katsejuhendit nr 493 õigeaegselt muuta, et täiendada seda ajakohastamise eesmärgil uute sarnaste analüüsimeetoditega. Siiski lisatakse sarnased katsemeetodid juhendisse üksnes pärast seda, kui OECD on need läbi vaadanud ja kinnitanud nende vastavust tulemuslikkuse standarditele. Östrogeeniretseptoriga seondumise katsete tulemusi käsitlevatele OECD liikmesriikide nõuetele vastavuse saavutamiseks võib kasutada ükskõik millist katsejuhendis nr 493 esitatud analüüsimeetodit ning seejuures saadakse kasu OECD otsuse kohasest andmete vastastikusest tunnustamisest.

Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud analüüsimeetodite taust ja põhimõtted

OECD algatas 1998. aastal prioriteetse tegevussuunana olemasolevate katsejuhendite läbivaatamise ja uute väljatöötamise, et võimaldada sõeluuringute tegemist võimalike endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide tuvastamiseks ja selliste kemikaalide hindamist. OECD kontseptuaalset raamistikku võimalike endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide analüüsimiseks ja hindamiseks muudeti 2012. aastal. Nii algne kui ka muudetud kontseptuaalne raamistik on esitatud kemikaalide võimaliku endokriinfunktsiooni kahjustava toime hindamise standardiseeritud katsejuhendeid käsitleva juhenddokumendi lisadena (4). Kõnealune kontseptuaalne raamistik hõlmab viit taset; iga tase vastab bioloogilise keerukuse eri tasemele. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud ERiga seondumise katsed kuuluvad 2. tasemele, mis hõlmab „in vitro katseid valitud endokriinse(te) mehhanismi(de) või raja/radade kohta andmete saamiseks“. Käesolev katsemeetod on ette nähtud retseptoriga seondumise in vitro katsete tegemiseks eesmärgiga tuvastada inimese östrogeeniretseptori α-vormi (α-ER) ligandid.

ERiga tehtavate in vitro seondumiskatsete asjakohasus bioloogiliste funktsioonide hindamisel on selgelt tõendatud. ERiga tehtavad seondumiskatsed on ette nähtud selliste kemikaalide tuvastamiseks, millel võib olla kahjulik mõju östrogeenirajale, ning neid on viimase kahe kümnendi jooksul laialdaselt kasutatud, et iseloomustada ERi jaotust kudedes ja identifitseerida ERi agoniste/antagoniste. Need katsed põhinevad ligandi ja retseptori vahelisel interaktsioonil, mis on esimene samm östrogeeni signaalirajas ja on hädavajalik kõigi selgroogsete paljunemisvõime tagamiseks.

Östrogeenide interaktsioon ERidega võib mõjutada östrogeeni kontrollitavate geenide transkriptsiooni ja avaldada mittegenoomset mõju, mille tulemusena võidakse käivitada või pärssida muu hulgas selliseid rakuprotsesse, mis on vajalikud rakkude paljunemiseks, loote normaalseks arenguks ja paljunemisvõime säilitamiseks (5, 6, 7). Normaalsete östrogeensete süsteemide häiretel võib olla kahjulik mõju normaalsele arengule (ontogenees), reproduktiivtervisele ja reproduktiivsüsteemi terviklikkusele. Ebasobiv ERist lähtuv signaaliülekanne võib näiteks suurendada hormoonsõltuva vähi tekke riski, vähendada viljakust ja põhjustada muutusi loote kasvus ja arengus (8).

In vitro seondumiskatsed põhinevad aine otsesel interaktsioonil retseptori spetsiifilise ligandiseondumiskohaga, mille kaudu reguleeritakse geenitranskriptsiooni. Inimese rekombinantse α-östrogeeniretseptoriga (hr-α-ER) seondumise katses mõõdetakse põhinäitajana radiomärgistatud ligandi ([3H]17β-östradiool) võimet seonduda ERiga üha suuremas kontsentratsioonis esineva uuritava kemikaali (st konkureeriva ligandi) juuresolekul. Uuritavad kemikaalid, millel on ERi suhtes suur afiinsus, konkureerivad radiomärgistatud ligandiga väiksemal kontsentratsioonil kui kemikaalid, mille afiinsus retseptori suhtes on väiksem. Kõnealune meetod hõlmab kahte põhielementi: küllastava seondumise katset, millega iseloomustatakse retseptori ja ligandi vahelise interaktsiooni parameetreid ja dokumenteeritakse spetsiifilisus ERi suhtes, ning sellele järgnevat konkureeriva seondumise katset, millega iseloomustatakse uuritava kemikaali ja radiomärgistatud ligandi vahelist konkurentsi ERile seondumisel.

CERI ja FW seondumiskatsete asjakohasus ja usaldusväärsus sihtotstarbelisel kasutamisel on valideerimisuuringutega tõendatud (2).

Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted ja lühendid on esitatud 1. liites.

Retseptoriga seondumise katsete rakendusala ja piirangud

Kõnealused katsed on ette nähtud sõeluuringu tegemiseks ja prioriseerimiseks, kuid nende käigus võib ühtlasi saada teavet molekulaarse lähtesündmuse kohta, mida saab kasutada tõendite kaalukusel põhineva lähenemisviisi puhul. Katsetes vaadeldakse kemikaali seondumist α-ERi ligandi siduvale domeenile in vitro süsteemis. Seega tuleks hoiduda saadud tulemuste otsesest ekstrapoleerimisest tervikliku endokriinsüsteemi keerukale signaaliülekande- ja reguleerimismehhanismile in vivo.

Loodusliku ligandi 17β-östradiooli seondumine on esimene samm selliste molekulaarsete sündmuste jadas, mille abil aktiveeritakse sihtgeenide transkriptsioon ja mille lõpptulemuseks on füsioloogiline muutus (9). Seega on seondumine α-ERi ligandi siduvale domeenile üks peamisi ERi vahendatavate endokriinsüsteemi häirete tekkemehhanisme, kuigi kõnealuseid häireid võivad põhjustada ka muud mehhanismid, sealhulgas i) interaktsioon α-ERi teiste piirkondadega peale ligandisidumistasku, ii) interaktsioon östrogeeni signaalirajaga seotud muude retseptoritega, α-ERiga ja G-valguga seotud östrogeeniretseptoriga ning teiste endokriinsüsteemi retseptorite ja ensüümisüsteemidega, iii) hormoonide süntees, iv) hormoonide metaboolne aktiveerimine ja/või inaktiveerimine, v) hormoonide jaotumine sihtkudedes ja vi) hormoonide väljutamine kehast. Selliseid toimemehhanisme ei vaadelda üheski käesoleva katsemeetodi kohases katses.

10.

Käesoleva katsemeetodi puhul uuritakse ainete võimet seonduda inimese α-ERiga ja see ei võimalda eristada α-ERi agoniste α-ERi antagonistidest. Kõnealustes katsetes ei vaadelda ka seondumisele järgnevaid sündmusi, näiteks geenitranskriptsiooni ega füsioloogilisi muutusi. Kuna valideerimisel kasutati ühekaupa aineid, mis koosnevad ainult ühest koostisosast, ei ole uuritud selle meetodi kohaldatavust segude analüüsimiseks. Teoreetiliselt on kõnealustes katsetes siiski võimalik analüüsida ka mitut koostisosa sisaldavaid aineid ja segusid. Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud.

11.

Rakuvabadel retseptorisüsteemidel puudub metaboliseerimisvõime ja neid ei ole valideeritud kombinatsioonis metaboolsete ensüümisüsteemidega. Siiski võib olla võimalik lisada uuringumudelisse metaboliseerimisvõimet tagavad elemendid, kuid see nõuab täiendavat valideerimist.

12.

Kemikaale, mis võivad valku (st retseptorvalku) denatureerida – näiteks pindaktiivseid aineid ja analüüsipuhvri pH-d muuta võivaid kemikaale –, ei tohi analüüsida või võib analüüsida üksnes kontsentratsioonidel, mille juures selline mõju puudub. Muudel juhtudel võib uuritava kemikaali analüüsimiseks kasutada kontsentratsioonivahemikku, mille puhul kemikaal on analüüsipuhvris lahustuv.

13.

Tabelis 1 on teavitamise eesmärgil esitatud katsetulemused 24 aine kohta, mida on analüüsitud mõlema käesolevas katsemeetodis kirjeldatud täielikult valideeritud analüüsimeetodiga. Avaldatud aruannete kohaselt, mis muu hulgas hõlmavad in vitro katseid ERi-seoselise transkriptsiooni aktiveerimise tuvastamiseks ja uterotroofse mõju analüüsi, liigitati nendest ainetest 17 ERiga seonduvateks aineteks ja kuus mitteseonduvateks aineteks (9, 10, 11, 12, 13, 14, 15). Vastavalt tabelis 1 esitatud kokkuvõtlikele andmetele on kahe analüüsimeetodiga saadud liigitamistulemused kõigi ainete puhul kuni kontsentratsioonini 10-4 M peaaegu täielikult kattuvad ja iga aine on õigesti liigitatud ERiga seonduvaks või ERiga mitteseonduvaks. Lisateave selle ainete rühma ja valideerimisuuringute raames tehtud ERiga seondumise katsetes analüüsitud täiendavate ainete kohta on esitatud hrERiga seondumise katsete tulemuslikkuse standardite (3) 2. lisas (tabelid 1, 2 ja 3).

Tabel 1

Ainete liigitamine ERiga seonduvaks või mitteseonduvaks nende analüüsimisel FW ja CERI meetodite kohastes hrERiga seondumise katsetes ning võrdlus eeldatava tulemusega

	Aine nimetus	CASi nr	Eeldatav tulemus	FW meetod		CERI meetod		MeSHi kemikaaliklass	Tootekategooria
	Aine nimetus	CASi nr		Kontsentratsioonivahemik (M)	Liigitus	Kontsentratsioonivahemik (M)	Liigitus	MeSHi kemikaaliklass	Tootekategooria
1	17β-östradiool	50-28-2	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-6	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-6	Seonduv	Steroid	Ravim, veterinaarravim
2	Noretünodreel	68-23-5	Seonduv	3 × 10-9 – 30 × 10-4	Seonduv	3 × 10-9 – 30 × 10-4	Seonduv	Steroid	Ravim, veterinaarravim
3	Noretindroon	68-22-4	Seonduv	3 × 10-9 – 30 × 10-4	Seonduv	3 × 10-9 – 30 × 10-4	Seonduv	Steroid	Ravim, veterinaarravim
4	Di-n-butüülftalaat	84-74-2	Mitteseonduv (*5)	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Mitteseonduv (*6) (1)	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Mitteseonduv (*6) (1)	Süsivesinik (tsükliline), ester	Plastifikaator, keemiline vaheühend
5	DES	56-53-1	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Süsivesinik (tsükliline), fenool	Ravim, veterinaarravim
6	17α-etünüülöstradiool	57-63-6	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Steroid	Ravim, veterinaarravim
7	Mesoheksöstrool	84-16-2	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Süsivesinik (tsükliline), fenool	Ravim, veterinaarravim
8	Genisteiin	446-72-0	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Süsivesinik (heterotsükliline), flavonoid	Looduslik ühend
9	Ekvool	531-95-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Fütoöstrogeeni metaboliit	Looduslik ühend
10	Butüülparabeen (n-butüül-4-hüdroksübensoaat)	94-26-8	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Parabeen	Säilitusaine
11	Nonüülfenool (segu)	84852-15-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Alküülfenool	Vaheühend
12	o,p’-DDT	789-02-6	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Kloororgaaniline ühend	Insektitsiid
13	Kortikosteroon	50-22-6	Mitteseonduv (*5)	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Mitteseonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Mitteseonduv	Steroid	Looduslik ühend
14	Zearalenoon	17924-92-4	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Süsivesinik (heterotsükliline), laktoon	Looduslik ühend
15	Tamoksifeen	10540-29-1	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Süsivesinik (tsükliline)	Ravim, veterinaarravim
16	5α-dihüdrotestosteroon	521-18-6	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Steroid, mittefenoolne	Looduslik ühend
17	Bisfenool A	80-05-7	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Fenool	Keemiline vaheühend
18	4-n-heptüülfenool	1987-50-4	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Ebaselge (7)	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Alküülfenool	Vaheühend
19	Kepoon (kloordekoon)	143-50-0	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Süsivesinik (halogeenitud)	Pestitsiid
20	Bens[a]antratseen	56-55-3	Mitteseonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Mitteseonduv (8)	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Mitteseonduv (8)	Aromaatne süsivesinik	Vaheühend
21	Enterolaktoon	78473-71-9	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Seonduv	Fütoöstrogeen	Looduslik ühend
22	Progesteroon	57-83-0	Mitteseonduv (*5)	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Mitteseonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Mitteseonduv	Steroid	Looduslik ühend
23	Oktüültrietoksüsilaan	2943-75-1	Mitteseonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Mitteseonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Mitteseonduv	Silaan	Pinnamodifikaator
24	Atrasiin	1912-24-9	Mitteseonduv (*5)	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Mitteseonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Mitteseonduv	Heterotsükliline ühend	Herbitsiid

hrER-GA SEONDUMISE KATSE ELEMENDID

Katse põhielemendid

14.

Käesolevat katsemeetodit kohaldatakse katsete puhul, kus kasutatakse östrogeeniretseptorit ja sellega tugevalt seonduvat sobivat ligandi, mida on võimalik kasutada markeri/märgistusainena ja mida saab uuritava kemikaali kontsentratsiooni suurendamise teel välja tõrjuda. Seondumiskatsed hõlmavad kahte järgmist põhielementi: 1) küllastav seondumine ja 2) konkureeriv seondumine. Küllastava seondumise katset kasutatakse retseptoripreparaadi spetsiifilisuse ja aktiivsuse kontrollimiseks, konkureeriva seondumise katset aga selleks, et hinnata uuritava kemikaali võimet seonduda hrERiga.

Kontrollid

15.

Kavandatud paralleelsete kontrollide ja võrdlusöstrogeeni valikut tuleks põhjendada. Paralleelseid kontrolle (lahusti (kandeaine), positiivsed kontrollid (ERiga tugevalt seonduv aine ja nõrgalt seonduv aine), negatiivne kontroll (mitteseonduv aine)) kasutatakse vastavalt vajadusele meetodi töökindluse kontrollimiseks asjaomastes katsetingimustes ja nende alusel saab katseid omavahel võrrelda; need kuuluvad tavaliselt katse nõuetekohasuse kriteeriumide hulka (1). Igas analüüsitsüklis tuleks ühel plaadil kasutada võrdlusöstrogeeni ja kontrolle (st nõrgalt seonduv aine ja mitteseonduv aine) täieliku kontsentratsioonikõvera ulatuses. Kõik ülejäänud plaadid peaksid sisaldama: 1) nii E2 kui ka nõrgalt seonduvat ainet suures (umbes radiomärgistatud ligandi täielikuks väljatõrjumiseks vajalikus) ja keskmises (umbes IC50-le vastavas) kontsentratsioonis kolmes paralleelis; 2) lahustiga kontrolli ja mittespetsiifilise seondumise kontrolli, kumbagi kolmes paralleelis.

Standardne kvaliteedikontrolli kord

16.

Standardset kvaliteedikontrolli korda tuleks kohaldada vastavalt iga analüüsimeetodi kohta esitatud kirjeldusele, et tagada retseptorite aktiivsus, õigete kemikaalikontsentratsioonide kasutamine, hälbepiirides püsimine mitme korduskatse vältel ja ERiga seondumist käsitlevate ootuspäraste tulemuste saamise võimekus pikema aja vältel.

Labori pädevuse tõendamine

17.

Enne tundmatute kemikaalide analüüsimist käesoleva katsemeetodi kohases katses tuleks igas laboris tõendada asjaomase meetodi kasutamise pädevust; selleks viiakse läbi küllastava seondumise katsed, et kontrollida ERi preparaadi spetsiifilisust ja aktiivsust, ning konkureeriva seondumise katsed võrdlusöstrogeeni ja kontrollidega (nõrgalt seonduv aine ja mitteseonduv aine). Laboris tuleks luua varasemate tulemuste andmebaas, mis sisaldab võrdlusöstrogeeni ja kontrollidega saadud tulemusi eri päevadel läbi viidud 3–5 sõltumatust katsest. Nende katsetega luuakse laboris varasemate võrdlusöstrogeeni ja kontrolle hõlmavate tulemuste näol võrdlusalus, mida kasutatakse järgnevate katsete nõuetekohasuse hindamise osana.

18.

Katsesüsteemi reageerimisvõime kontrollimiseks analüüsitakse ka tabelis 2 loetletud pädevusaineid. Sellesse loetellu kantud pädevusained on valitud võrdlusainete hulgast, mida on kirjeldatud ERiga seondumise katsete tulemuslikkuse standardites (3). Kõnealused ained on turul kättesaadavad, kuuluvad kemikaaliklassidesse, mida tavaliselt seostatakse ERiga seondumise võimega, nende afiinsus ERi suhtes jääb sobivasse vahemikku (st tugevast kuni nõrgani) ja nende hulgas on ka mitteseonduvaid aineid (st negatiivsed kontrollid). Iga pädevusaine puhul kasutatavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama tabelis 2 esitatud vahemikku. Iga ainega tuleks läbi viia vähemalt kolm katset ning nende katsete tulemused peaksid vastama aine eeldatavale aktiivsusele. Iga katse tuleks läbi viia sõltumatult (st kasutada retseptori, kemikaalide ja reaktiivi värskelt valmistatud lahjendusi); seejuures tuleks iga kontsentratsiooni puhul kasutada kolme paralleelproovi. Pädevuse tõendamiseks tuleb iga pädevusaine liigitada õigesti positiivseks või negatiivseks. Pädevuse tõendamise katsed peaks läbi viima iga asjaomaseid analüüsimeetodeid omandav laborant.

Tabel 2

hrERiga tehtavas konkureeriva seondumise katses kasutatavate kontrollide ja pädevusainete loetelu (88)

Nr	Aine nimetus	CASi nr (89)	Eeldatav tulemus (90) (91)	Uuritav kontsentratsioonivahemik (M)	MeSHi kemikaaliklass (92)	Tootekategooria (93)
Kontrollid (võrdlusöstrogeen, nõrgalt seonduv aine, mitteseonduv aine)
1	17β-östradiool	50-28-2	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-6	Steroid	Ravim, veterinaarravim
2	Noretünodreel (või) Noretindroon	68-23-5 (või) 68-22-4	Seonduv	3 × 10-9 – 30 × 10-6	Steroid	Ravim, veterinaarravim
3	Oktüültrietoksüsilaan	2943-75-1	Mitteseonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Silaan	Pinnamodifikaator
Pädevusained (93)
4	Dietüülstilböstrool	56-53-1	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-6	Süsivesinik (tsükliline), fenool	Ravim, veterinaarravim
5	17α-etünüülöstradiool	57-63-6	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-6	Steroid	Ravim, veterinaarravim
6	Mesoheksöstrool	84-16-2	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-6	Süsivesinik (tsükliline), fenool	Ravim, veterinaarravim
7	Tamoksifeen	10540-29-1	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-6	Süsivesinik (tsükliline)	Ravim, veterinaarravim
8	Genisteiin	446-72-0	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Heterotsükliline ühend, flavonoid	Looduslik ühend
9	Bisfenool A	80-05-7	Seonduv	1 × 10-10 – 1 × 10-3	Fenool	Keemiline vaheühend
10	Zearalenoon	17924-92-4	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-3	Heterotsükliline ühend, laktoon	Looduslik ühend
11	Butüülparabeen	94-26-8	Seonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-3	Karboksüülhape, fenool	Säilitusaine
12	Atrasiin	1912-24-9	Mitteseonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-6	Heterotsükliline ühend	Herbitsiid
13	Di-n-butüülftalaat (DBP) (94)	84-74-2	Mitteseonduv (95)	1 × 10-10 – 1 × 10-4	Süsivesinik (tsükliline), ester	Plastifikaator, keemiline vaheühend
14	Kortikosteroon	50-22-6	Mitteseonduv	1 × 10-11 – 1 × 10-4	Steroid	Looduslik ühend

Uuritava kemikaali lahustuvuse analüüsimine ja kontsentratsioonivahemiku kindlakstegemine

19.

Iga uuritava kemikaali puhul tuleks teha eelkatse, et määrata lahustuvuspiir ja teha kindlaks katse läbiviimiseks sobiv kontsentratsioonivahemik. Iga uuritava kemikaali lahustuvuspiir tuleb algselt määrata lahustis ja seejärel tuleb kontrollida seda katsetingimustes. Katses kasutatav lõppkontsentratsioon ei tohiks olla suurem kui 1 mM. Kontsentratsioonivahemiku kindlakstegemise katses kasutatakse lahustiga kontrolli koos kaheksa järjestikuse üksteisest log-ühiku võrra erineva lahjendusega, mille puhul alustatakse maksimaalsest vastuvõetavast kontsentratsioonist (nt 1 mM või väiksem, olenevalt lahustuvuspiirist), ja registreeritakse hägu või sademe tekkimine. Teises ja kolmandas katses tuleks kontsentratsioone vajaduse korral kohandada, et kontsentratsioonist sõltuvuse kõverat oleks võimalik paremini iseloomustada.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

20.

Katse tunnistamine nõuetekohaseks või nõuetele mittevastavaks põhineb igas analüüsitsüklis kasutatud võrdlusöstrogeeni ja kontrollidega saadud tulemuste hindamisel. Esiteks peaks 1. plaadil olevate võrdluskontrollide täielikud kontsentratsioonikõverad igas analüüsitsüklis vastama lähenduskõvera parameetritega (nt IC50 ja Hilli tõus) seotud tulemusnäitajatele, mis põhinevad vastavates CERI ja FW meetodite kohastes katse-eeskirjades käsitletud tulemustel (2. ja 3. liide) ja katset läbi viivas laboris kontrollidega varem saadud andmetel. Kõik kontrollid (võrdlusöstrogeen, nõrgalt seonduv aine ja mitteseonduv aine) peaksid igas analüüsitsüklis olema õigesti liigitatud. Teiseks tuleb hinnata kõigil ülejäänud plaatidel olevate kontrollide andmete kooskõla 1. plaadi puhul saadud tulemustega. Tuleks kasutada piisavalt suurt uuritava kemikaali kontsentratsioonide vahemikku, et konkureeriva seondumise kõvera ülemine osa selgelt välja joonistuks. Paralleelproovide vaheline varieeruvus igal uuritava kemikaali kontsentratsioonil ja kolme sõltumatu analüüsitsükli vaheline varieeruvus peaks olema mõõdukas ja teaduslikult põhjendatav. Katse järjepideva läbiviimise võimekuse tõendamiseks tuleks luua võrdlusöstrogeeni ja kontrolle iseloomustavate varasemate tulemuste andmebaas ja seda hallata. Laborisisese reprodutseeritavuse hindamiseks võib kasutada mitmest eri katsest pärinevate võrdlusöstrogeenile ja nõrgalt seonduvale kontrollainele vastavate lähenduskõverate parameetrite keskväärtuste standardhälbeid (SD) ja variatsioonikordajaid (CV). Plaatidel olevate kontrollidega saadud tulemuste hindamine igas analüüsitsüklis ja iga uuritava kemikaali puhul peaks põhinema eksperdihinnangul.

Lisaks tuleks juhinduda järgmistest katse nõuetekohasuse kriteeriumidega seotud põhimõtetest:

—	andmed peaksid olema piisavad ERiga seondumise kvantitatiivseks hindamiseks;

—	kasutatud kontsentratsioonid peaksid jääma uuritava kemikaali lahustuvusvahemikku.

Andmeanalüüs

21.

Küllastava ja konkureeriva seondumise andmete analüüsimise kindlaksmääratud korra puhul tuleks järgida retseptor ja ligandi vaheliste interaktsioonide iseloomustamise aluspõhimõtteid. Tavaliselt kasutatakse küllastava seondumise andmete analüüsimiseks mittelineaarse regressiooni mudelit, milles võetakse arvesse summaarset ja mittespetsiifilist seondumist. Bmax-i ja Kd määramisel võib olla vaja korrigeerida andmeid ligandi väljatõrjumise suhtes (nt Swillens, 1995 (19)). Konkureeriva seondumise katsete puhul kasutatakse tavaliselt transformeeritud andmeid (nt spetsiifiline seondumine protsentides ja uuritava kemikaali kontsentratsioon (log M)). Iga uuritava kemikaali puhul tuleks IC50 hinnangulise logaritmitud väärtuse kindlakstegemiseks kasutada sobivat mittelineaarse kõvera lähendamise tarkvara, milles rakendatakse neljaparameetrilist Hilli võrrandit. Pärast esmast analüüsi tuleks määrata lähenduskõvera parameetrid ja visuaalselt hinnata, kui hästi sobituvad seondumisandmed saadud konkureeriva seondumise kõveraga. Mõnel juhul võib olla vaja viia läbi täiendav analüüs, et leida parim lähenduskõver (nt kõvera ülemise ja/või alumise osa piiritlemine, 10 % reegli kasutamine; vt 4. liide ja allikas 2 (jaotis III.A.2)).

22.

Katsete vastavus nõuetekohasuse kriteeriumidele (punkt 20) viitab sellele, et katsesüsteem töötab nõuetekohaselt, kuid sellega ei ole tagatud, et igas konkreetses katses saadavad andmed on täpsed. Esimese katse nõuetekohaste tulemuste korduvus on parim viide sellele, et saadud andmed on täpsed.

Üldised andmete tõlgendamise kriteeriumid

23.

Praegu puudub ühtne kokkulepitud meetod ERiga seondumise andmete tõlgendamiseks. Siiski tuleks hrERi vahendatava mõju kvalitatiivsel (nt seonduv/mitteseonduv) ja/või kvantitatiivsel (nt log IC50, suhteline seondumisafiinsus (RBA) jne) analüüsimisel lähtuda empiirilistest andmetest ja usaldusväärsest teaduslikust hinnangust.

Katseprotokoll

24.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Analüüsimeetod:

—	kasutatud analüüsimeetod.

Kontrollkemikaal / võrdluskemikaal / uuritav kemikaal:

—	allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on teada;

—	uuritava kemikaali püsivus, kui on teada;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui on teada;

—	lisatud uuritava kemikaaliga söötme pH ja osmolaalsus ning sademe teke selles (vastavalt vajadusele);

ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

—	kemikaali identifitseerimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

mitut koostisosa sisaldav aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal (UVCB) või segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

Lahusti/kandeaine:

—	kirjeldus (aine liik, tarnija ja partii);

—	lahusti/kandeaine valiku põhjendus;

—	uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines, kui see on teada.

Retseptorid:

—	retseptorite päritolu (tarnija, katalooginumber, partii, retseptori liik, retseptori aktiivne kontsentratsioon tarnija andmetel, sertifikaat tarnijalt)

—	retseptorite kirjeldus (sh küllastava seondumise tulemused): Kd, Bmax;

—	retseptorite säilitamine.

—	Radiomärgistatud ligand:

—	tarnija, katalooginumber, partii, eriaktiivsus.

Katsetingimused:

—	lahustuvuspiir katsetingimustes;

—	seondumispuhvri koostis;

—	retseptori kontsentratsioon;

—	märgistusaine (st radiomärgistatud ligandi) kontsentratsioon;

—	uuritava kemikaali kontsentratsioonid;

—	kandeaine protsentuaalne sisaldus lõppkatses;

—	inkubeerimise temperatuur ja kestus;

—	meetod vaba aine eraldamiseks seondunud ainest;

—	positiivsed ja negatiivsed kontrollid/võrdlusained;

—	kriteeriumid, mille alusel katsetulemus liigitatakse positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks.

Nõuetekohasuse kontroll:

—	paralleelsete positiivsete kontrollidega/võrdlusainetega saadud tegelikud IC50 ja Hilli tõusu väärtused.

Tulemused:

—	algandmed ja andmed seondunud/vaba aine kohta;

—	vajaduse korral denatureerumise kontrollimise tulemused;

—	väikseim efektiivne kontsentratsioon (LEC), kui see on olemas;

—	vastavalt vajadusele RBA ja/või IC50 väärtused;

—	võimaluse korral mõju sõltuvus kontsentratsioonist;

—	statistilise analüüsi tulemused, kui need on olemas, koos veamäära ja usaldusnivooga (nt keskväärtuse standardviga (SEM), SD, CV või usaldusvahemik usaldusnivool 95 %) ning kirjeldus selle kohta, kuidas need väärtused saadi.

Tulemuste arutelu:

—	10 % reegli rakendamine.

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 34. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(2)	OECD (2015). Integrated Summary Report: Validation of Two Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα). Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 226. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(3)	OECD (2015). Performance Standards for Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα). Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 222. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(4)	OECD (2012). Guidance Document on Standardized Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(5)	Cavailles, V. (2002). Estrogens and Receptors: an Evolving Concept. Climacteric 5 Suppl. 2: 20–26.

(6)	Welboren, W. J. et al. (2009). Genomic Actions of Estrogen Receptor Alpha: What are the Targets and How are they Regulated? Endocr. Relat. Cancer 16(4): 1073–1089.

(7)	Younes, M., ja Honma, N. (2011). Estrogen Receptor Beta. Arch. Pathol. Lab. Med. 135(1): 63–66.

(8)	Diamanti-Kandarakis et al. (2009). Endocrine-Disrupting Chemicals: an Endocrine Society Scientific Statement. Endocr. Rev. 30(4): 293–342.

(9)	ICCVAM (2002). Background Review Document. Current Status of Test Methods for Detecting Endocrine Disruptors: In Vitro Estrogen Receptor Binding Assays. NIH Publication No 03-4504. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC.

(10)	ICCVAM (2003). ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays.

(11)	ICCVAM (2006). ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays.

(12)	Akahori, Y. et al. (2008). Relationship Between the Results of In Vitro Receptor Binding Assay to Human Estrogen Receptor Alpha and In Vivo Uterotrophic Assay: Comparative Study with 65 Selected Chemicals. Toxicol. In Vitro 22(1): 225–231.

(13)	OECD (2007). Additional Data Supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 67. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(14)

Takeyoshi, M. (2006). Draft Report of Pre-validation and Inter-laboratory Validation For Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay to Detect Estrogenic Activity – The Human Estrogen Receptor Alpha Mediated Reporter Gene Assay Using hER-HeLa-9903 Cell Line. Jaapani Kemikaalide Hindamise ja Uurimise Instituut (CERI), Jaapan. Lk 1–188.

(15)	Yamasaki, K., Noda, S., Imatanaka, N., ja Yakabe, Y. (2004). Comparative Study of the Uterotrophic Potency of 14 Chemicals in a Uterotrophic Assay and their Receptor-Binding Affinity. Toxicol. Lett. 146: 111–120.

(16)	Kummer, V., Maskova, J., Zraly, Z., Neca, J., Simeckova, P., Vondracek, J., ja Machala, M. (2008). Estrogenic Activity of Environmental Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Uterus of Immature Wistar Rats. Toxicol. Lett. 180: 213–221.

(17)	Gozgit, J. M., Nestor, K. M., Fasco, M. J., Pentecost, B. T., ja Arcaro, K. F. (2004). Differential Action of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons on Endogenous Estrogen-Responsive Genes and on a Transfected Estrogen-Responsive Reporter in MCF-7 Cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 196: 58–67.

(18)	Santodonato, J. (1997). Review of the Estrogenic and Antiestrogenic Activity of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Relationship to Carcinogenicity. Chemosphere 34: 835–848.

(19)	Swillens, S. (1995). Interpretation of Binding Curves Obtained with High Receptor Concentrations: Practical Aid for Computer Analysis. Mol. Pharmacol. 47(6): 1197–1203.

1. liide

MÕISTED JA LÜHENDID

10 % reegel– võimalus jätta analüüsist välja andmepunktid, kus [3H]17β-östradiooli spetsiifilist seondumist iseloomustav paralleelproovide andmete keskväärtus on vähemalt 10 % suurem kui vastav keskväärtus mõnel väiksemal kontsentratsioonil (vt 4. liide).

Asjakohasus– näitaja, mille abil kirjeldatakse, kuivõrd katsemeetod võimaldab uurida huvipakkuvat toimet, kas selle kasutamine on mõttekas ja kas see on konkreetse eesmärgi jaoks sobiv. Asjakohasusest nähtub, mil määral saab katsemeetodiga õigesti mõõta või ennustada huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasuse puhul võetakse arvesse ka katsemeetodiga saavutatavat täpsust (vastavust) (1).

CV– variatsioonikordaja.

E2– 17β-östradiool.

ER– östrogeeniretseptor.

hr-α-ER– rekombinantne inimese α-östrogeeniretseptor.

IC50– kontsentratsioon, mille juures pärssiva uuritava kemikaali mõju on poole väiksem maksimaalsel efektiivsel kontsentratsioonil avalduvast mõjust.

ICCVAM– alternatiivsete meetodite valideerimise ametitevaheline koordineerimiskomitee.

Kemikaal– aine või segu.

Kontseptuaalne raamistik– OECD kontseptuaalne raamistik võimalike endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide analüüsimiseks ja hindamiseks.

Laborisisene reprodutseeritavus– näitaja, mis iseloomustab seda, millisel määral suudavad sama labori kvalifitseeritud töötajad saada konkreetset katse-eeskirja kasutades eri aegadel ühesuguseid tulemusi (1).

Laboritevaheline reprodutseeritavus– näitaja, mis iseloomustab seda, millisel määral suudavad eri pädevad laborid sama katse-eeskirja alusel samu aineid uurides saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt sarnaseid tulemusi. Laboritevaheline reprodutseeritavus määratakse valideerimiseelse ja valideerimisega seotud tegevuse käigus ja see näitab, millisel määral on katsemeetod eri laborites edukalt kasutatav (1).

LEC– väikseim efektiivne kontsentratsioon: uuritava kemikaali väikseim kontsentratsioon, mille juures kemikaal avaldab veel mõju (st uuritava kemikaali väikseim kontsentratsioon, mille juures mõju on statistiliselt erinev üksnes kandeainet sisaldava paralleelse kontrolli puhul täheldatavast mõjust).

Mina-ka-meetod– kõnekeelne väljend katsemeetodi kohta, mis on oma ülesehituselt ja funktsionaalsuse poolest sarnane valideeritud ja tunnustatud standardse katsemeetodiga. Seda väljendit kasutatakse sarnase katsemeetodi tähenduses.

Nõuetekohasuse kriteeriumid– katses kasutatavate kontrollide ja võrdlusstandardite minimaalsed tulemuslikkuse standardid. Katse nõuetekohaseks tunnistamiseks peaksid kõik nõuetekohasuse kriteeriumid olema täidetud.

Pädevus– enne tundmatute ainete analüüsimist tõendatud võimekus katsemeetodi kohaseid katseid nõuetekohaselt läbi viia.

Pädevusained– tulemuslikkuse standarditega hõlmatud alarühm võrdlusaineid, mida võib laboris kasutada standardiseeritud analüüsimeetodi abil tehnilise pädevuse tõendamiseks. Nende ainete valikukriteeriumide hulka kuulub tavaliselt nõue, et nende ainete mõju tugevus oleks erinev, need oleksid turul kättesaadavad ja nende kohta oleksid olemas kvaliteetsed võrdlusandmed.

RBA– suhteline seondumisafiinsus. Aine RBAd väljendatakse aine IC50 logaritmitud väärtuse protsentuaalse osakaaluna 17β-östradiooli IC50 logaritmitud väärtusest.

SD– standardhälve.

Standardsed katsemeetodid– analüüsimeetodid, millele tuginetakse tulemusnäitajatel põhinevas katsejuhendis nr 493.

Tulemuslikkuse standardid– valideeritud katsemeetodil põhinevad standardid, mille alusel hinnatakse vaadeldava mehhanismi ja funktsionaalsuse poolest sarnase kavandatud katsemeetodi võrreldavust. Need hõlmavad 1) katsemeetodi olulisi elemente, 2) valideeritud katsemeetodi vastuvõetava tulemuslikkuse tõendamiseks kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdluskemikaalide miinimumloetelu ja 3) võrreldavat usaldusväärsuse ja täpsuse taset, mille puhul on lähtutud valideeritud katsemeetodiga saadud tulemustest ja mis tuleks saavutada kavandatud katsemeetodi hindamisel võrdluskemikaalide miinimumloetelu kasutamise teel (1).

Täpsus (vastavus)– katsetulemuste ja vastuvõetavate võrdlusväärtuste kooskõla määr. Täpsus näitab analüüsimeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda mõistet kasutatakse sageli vastavuse tähenduses, et väljendada õigete katsetulemuste osakaalu (1).

Usaldusväärsus– näitaja, mis iseloomustab katsemeetodiga saadud tulemuste reprodutseeritavust pikema aja jooksul samas laboris ja eri laborites, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus.

Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Valideerimine– tegevus, mille käigus määratakse teatud kindla lähenemisviisi, meetodi, katsemudeli, protsessi või hindamisviisi usaldusväärsus ja asjakohasus kindlaksmääratud eesmärgil kasutamisel (1).

Valideeritud katsemeetod– katsemeetod, mille puhul valideerimisuuringud on lõpule viidud, st on määratud selle asjakohasus (sealhulgas täpsus) ja usaldusväärsus konkreetsel eesmärgil kasutamisel. Oluline on märkida, et valideeritud katsemeetod ei pruugi olla täpsuse ja usaldusväärsuse poolest piisavalt tulemuslik, et seda saaks lugeda kavandatud eesmärgi puhul vastuvõetavaks (1).

Võrdlusöstrogeen– 17ß-östradiool (E2, CASi nr: 50-28-2).

Östrogeenne toime– kemikaali võime jäljendada 17β-östradiooli võimet seonduda östrogeeniretseptoriga. Käesolev katsemeetod võimaldab tuvastada seondumist inimese α-ERiga.

2. liide

ÖSTROGEENIRETSEPTORIL (A-ER) PÕHINEVAD FREYBERGERI-WILSONI IN VITRO MEETODID KÜLLASTAVA JA KONKUREERIVA SEONDUMISE ANALÜÜSIMISEKS TÄISPIKA REKOMBINANTSE A-ER-I ABIL

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD (VT KA ÜLDINE SISSEJUHATUS)

Käesoleva östrogeeniretseptoril (α-ER) põhineva, küllastava ja konkureeriva seondumise analüüsimist võimaldava in vitro meetodi puhul kasutatakse täispikka inimese α-östrogeeniretseptorit (hr-α-ER), mille tootmiseks ja eraldamiseks on kasutatud bakuloviirusega nakatatud putukarakke. Freybergeri ja Wilsoni välja töötatud katse-eeskirja on hinnatud rahvusvahelises mitme labori osalusel läbi viidud valideerimisuuringus (2), mille käigus tõendati, et see analüüsimeetod on kavandatud kasutuseesmärgi puhul asjakohane ja usaldusväärne.

Käesolev meetod on rakendatav sõeluuringu jaoks, mille eesmärk on tuvastada aineid, mis on võimelised seonduma täispika hr-α-ERiga. Seda kasutatakse selleks, et hinnata uuritava kemikaali võimet konkureerida hr-α-ERile seondumisel 17β-östradiooliga. Kvantitatiivsed katsetulemused võivad hõlmata uuritava kemikaali IC50 (uuritava kemikaali kontsentratsioon, mis on vajalik poole [3H]17β-östradiooli väljatõrjumiseks hr-α-ERilt) ja suhtelist seondumisafiinsust hr-α-ERi suhtes võrreldes 17β-östradiooliga. Kemikaalide sõeluuringu puhul võivad vastuvõetavad kvalitatiivsed katsetulemused hõlmata uuritava kemikaali liigitamist hr-α-ERiga seonduvaks aineks, mitteseonduvaks aineks või ebaselge mõjuga aineks lähtuvalt seondumiskõverate suhtes kohaldatavatest kriteeriumidest.

Käesoleva analüüsimeetodi puhul kasutatakse radioaktiivset ligandi, mille jaoks peab laboril olema radioaktiivsete materjalide käitlemise luba. Kõikide radioisotoopide ja ohtlike kemikaalidega tehtavate toimingute puhul tuleks järgida siseriiklikes õigusaktides kirjeldatud eeskirju ja korda.

Enne käesoleva meetodi kasutamist regulatiivsel eesmärgil tuleks lugeda peatükke „ÜLDINE SISSEJUHATUS“ ja „hrER-GA SEONDUMISE KATSE ELEMENDID“. Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted ja lühendid on esitatud 1. liites.

MEETODI PÕHIMÕTE (VT KA ÜLDINE SISSEJUHATUS)

Inimese rekombinantse α-östrogeeniretseptoriga (hr-α-ER) seondumise analüüsimisel mõõdetakse radiomärgistatud ligandi ([3H]17β-östradiool) võimet seonduda ERiga üha suuremas kontsentratsioonis esineva uuritava kemikaali (st konkureeriva ligandi) juuresolekul. Uuritavad kemikaalid, millel on ERi suhtes suur afiinsus, konkureerivad radiomärgistatud ligandiga väiksemal kontsentratsioonil kui kemikaalid, mille afiinsus retseptori suhtes on väiksem.

Kõnealune meetod hõlmab kahte põhielementi: küllastava seondumise katset, millega iseloomustatakse retseptori ja ligandi vahelise interaktsiooni parameetreid, ning sellele järgnevat konkureeriva seondumise katset, millega iseloomustatakse uuritava kemikaali ja radiomärgistatud ligandi vahelist konkurentsi ERile seondumisel.

Küllastava seondumise katse eesmärk on teha konkureeriva seondumise katse eel kindlaks konkreetse partii retseptorite seondumisafiinsus ja arv. Küllastava seondumise katses mõõdetakse tasakaalutingimustes teatud kindlas kontsentratsioonis kasutatava östrogeeniretseptori afiinsust loodusliku ligandi suhtes (seda väljendab dissotsiatsioonikonstant Kd) ja retseptori aktiivsete seondumiskohtade kontsentratsiooni (Bmax).

Konkureeriva seondumise katses mõõdetakse aine afiinsuse hindamiseks selle võimet konkureerida ERile seondumisel [3H]17β-östradiooliga. Afiinsust väljendatakse uuritava kemikaali sellise kontsentratsiooni kaudu, mille juures kemikaal vähendab tasakaalutingimustes [3H]17β-östradiooli spetsiifilist seondumist 50 % võrra (sellele vastab mõiste „50 % ulatuses inhibeeriv kontsentratsioon“ ehk IC50). Afiinsust on võimalik hinnata ka suhtelise seondumisafiinsuse (RBA) kaudu, mis määratakse samas analüüsitsüklis eraldi mõõdetud östradiooli IC50 suhtes. Konkureeriva seondumise katses mõõdetakse teatud kindlas kontsentratsioonis kasutatava [3H]17β-östradiooli seondumist laia vahemikku (kaheksat suurusjärku) hõlmavates kontsentratsioonides esineva uuritava kemikaali juuresolekul. Seejärel kohaldatakse saadud andmete suhtes võimaluse korral teatavat liiki Hilli võrrandit (Hill, 1910), millega kirjeldatakse radioligandi väljatõrjumist konkureeriva seonduva ainega, millel on üks seondumiskoht. Radiomärgistatud östradiooli väljatõrjumise ulatust tasakaalutingimustes kasutatakse uuritava kemikaali liigitamiseks seonduvaks aineks, mitteseonduvaks aineks või ebaselge mõjuga aineks.

KATSE KÄIK

hr-α-ERi vastuvõetava funktsionaalsuse tõendamine

Enne küllastava seondumise ja konkureeriva seondumise katsete regulaarset kasutamist tuleks iga uue hr-α-ERi partii puhul tõendada selle nõuetekohast funktsionaalsust laboris, kus seda kasutama hakatakse. Funktsionaalsuse tõendamine peaks hõlmama kahte etappi. Need etapid on järgmised.

—

Viiakse läbi [3H]17β-östradiooli küllastava seondumise katse, et tõendada hr-α-ERi spetsiifilisust ja küllastumist. Nende andmete analüüsimisel mittelineaarse regressiooni teel (nt BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995) ja järgnevalt saadud Scatchardi graafiku alusel tuleks iga hr-α-ERi partii puhul dokumenteerida [3H]17β-östradiooli seondumisafiinsus hr-α-ERi suhtes (Kd) ja retseptorite arv (Bmax).

—

Viiakse läbi konkureeriva seondumise katse kontrollainetega (võrdlusöstrogeen (17β-östradiool)), nõrgalt seonduv aine (nt noretünodreel või noretindroon) ja mitteseonduv aine (oktüültrietoksüsilaan (OTES)). Igas laboris tuleks luua varasemate tulemuste andmebaas, et võimaldada dokumenteerida võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva aine IC50 ja muude asjakohaste näitajate väärtuste kooskõla määra eri katsete lõikes ja hr-α-ERi eri partiide puhul. Kontrollaineid iseloomustavate konkureeriva seondumise kõverate parameetrid peaksid jääma usaldusnivoole 95 % vastavasse usaldusvahemikku (vt tabel 1), mis tehti kindlaks kõnealuse analüüsimeetodi valideerimise uuringus osalenud laborites saadud andmete põhjal (2).

Tabel 1.

FW meetodi kohases hrERiga seondumise katses võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva aine puhul kohaldatavad tulemuslikkuse kriteeriumid

Aine	Näitaja	Keskmine (9)	Standardhälve (n)	Usaldusvahemik usaldusnivool 95 % (10)
Aine	Näitaja	Keskmine (9)	Standardhälve (n)	Alampiir	Ülempiir
17β-östradiool	Maksimumväärtus (%)	100,44	10,84 (67)	97,8	103,1
	Miinimumväärtus (%)	0,29	1,25 (67)	-0,01	0,60
	Hilli tõus	-1,06	0,20 (67)	-1,11	-1,02
	Log IC50 (M)	-8,92 (11)	0,18 (67)	-8,97	-8,88
Noretünodreel	Maksimumväärtus (%)	99,42	8,90 (68)	97,27	101,60
	Miinimumväärtus (%)	2,02	3,42 (68)	1,19	2,84
	Hilli tõus	-1,01	0,38 (68)	-1,10	-0,92
	Log IC50 (M)	-6,39	0,27 (68)	-6,46	-6,33
Noretindroon (11)	Maksimumväärtus (%)	96,14	8,44 (27)	92,80	99,48
	Miinimumväärtus (%)	2,38	5,02 (27)	0,40	4,37
	Hilli tõus	-1,41	0,32 (27)	-1,53	-1,28
	Log IC50 (M)	-5,73	0,27 (27)	-5,84	-5,62

Labori pädevuse tõendamine

10.

Tutvuge käesoleva katsemeetodi punktidega 17 ja 18 ning tabeliga 2 peatükis „hrER-GA SEONDUMISE KATSE ELEMENDID“. Iga katse (nii küllastava kui ka konkureeriva seondumise puhul) peaks koosnema kolmest eri päevadel läbi viidavast sõltumatust analüüsitsüklist (st kasutatakse retseptori, kemikaalide ja reaktiivide värskelt valmistatud lahjendusi) ja igas tsüklis tuleks kasutada kolme paralleelproovi.

Retseptori (hr-α-ER) kontsentratsiooni määramine

11.

Aktiivse retseptori kontsentratsioon varieerub pisut eri partiide ja säilitustingimuste puhul. Seepärast tuleks määrata tarnijalt saadud aktiivse retseptori kontsentratsioon. See võimaldab kasutada katses sobivat aktiivse retseptori kontsentratsiooni.

12.

Retseptorit tuleks konkureerivale seondumisele vastavates tingimustes (st 1 nM [3H]östradiool) inkubeerida nominaalsel kontsentratsioonil 0,25, 0,5, 0,75 ja 1 nM ilma märgistamata östradioolita (summaarne seondumine) ja koos 1 μM märgistamata östradiooliga (mittespetsiifiline seondumine). Spetsiifiline seondumine, mis arvutatakse summaarse ja mittespetsiifilise seondumise vahena, esitatakse graafikul vastavuses retseptori nominaalse kontsentratsiooniga. Retseptori kontsentratsioon, mille puhul spetsiifilise seondumise määr vastab 20 protsendile lisatud radiomärgise kogusest, on seotud retseptori vastava nominaalse kontsentratsiooniga ja seda retseptori kontsentratsiooni tuleks kasutada küllastava ja konkureeriva seondumise katsetes. Sageli vastab nendele tingimustele hrERi lõppkontsentratsioon 0,5 nM.

13.

Kui 20 % kriteeriumi täitmine korduvalt ebaõnnestub, tuleks kontrollida katseplaani võimalike vigade suhtes. Suutmatus saavutada vastavust 20 % kriteeriumile võib viidata sellele, et rekombinantse valgu partiis on väga vähe aktiivset retseptorit, ning sel juhul tuleks kaaluda mõne muu retseptoripartii kasutamist.

Küllastava seondumise katse

14.

[3H]17β-östradiooli tuleks hindamiseks kasutada kaheksas eri kontsentratsioonis, iga kontsentratsiooni puhul kolmes paralleelis, ning kohaldada seejuures järgmist kolme tingimust (vt tabel 2).

—	Seondumine märgistamata 17β-östradiooli puudumisel ja ERi juuresolekul. Nii määratakse summaarne seondumine, mida väljendab radioaktiivsus kannudes, kus on ainult [3H]17β-östradiool.

—

Seondumine märgistamata 17β-östradiooli juuresolekul 1000-kordses liias, võrreldes radiomärgistatud 17β-östradiooliga, ning ERi juuresolekul. Nende tingimuste puhul on eesmärk küllastada aktiivsed seondumiskohad märgistamata 17β-östradiooliga ja määrata kannudes radioaktiivsuse mõõtmise teel mittespetsiifiline seondumine. Radioaktiivse östradiooli mis tahes kogus, mis on veel võimeline retseptoriga seonduma, loetakse olevat seondunud mittespetsiifiliselt, sest märgistamata östradiooli kontsentratsioon peaks olema nii suur, et kõik saadaolevad spetsiifilise seondumise kohad retseptoril on hõivatud.

—	Seondumine märgistamata 17β-östradiooli puudumisel ja ERi puudumisel (summaarse radioaktiivsuse määramine).

[3H]17β-östradiooli ja märgistamata 17β-östradiooli lahuste valmistamine

15.

[3H]17β-östradiooli lahjenduste saamiseks tuleks 12 nM [3H]17β-östradiooli põhilahusele analüüsipuhvri lisamise teel valmistada lahused, kus kontsentratsioon jääb algselt vahemikku 0,12 nM kuni 12 nM. Pärast 40 μl sellise lahuse lisamist 96-kannulise mikrotiiterplaadi vastavasse kannu (saadav lõppruumala on 160 μl) saadakse lahused lõpliku katsekontsentratsiooniga 0,03 kuni 3,0 nM. Analüüsipuhvri, [3H]17β-östradiooli põhilahuse ja lahjenduste valmistamist ning kontsentratsiooni määramist on põhjalikult kirjeldatud FW meetodi kohases katse-eeskirjas (2).

16.

Etanoolis lahustatud 17β-östradiooli lahjenduste saamiseks tuleks analüüsipuhvri lisamise teel valmistada kaheksa eri kontsentratsioonidega lahust, mille kontsentratsioon jääb algselt vahemikku 0,06 μM kuni 6 μM. Pärast 80 μl sellise lahuse lisamist 96-kanulise mikrotiiterplaadi vastavasse kannu (saadav lõppruumala on 160 μl) saadakse lahused lõpliku katsekontsentratsiooniga 0,03 μM kuni 3 μM. Märgistamata 17β-östradiooli lõppkontsentratsioon igas mittespetsiifilise seondumise mõõtmiseks kasutatavas kannus peaks olema 1000 korda suurem kui märgistatud [3H]17β-östradiooli kontsentratsioon. Märgistamata 17β-östradiooli lahjenduste valmistamist on põhjalikult kirjeldatud FW meetodi kohases katse-eeskirjas (2).

17.

Tuleks kasutada retseptori sellist nominaalset kontsentratsiooni, mille puhul spetsiifiline seondumine on 20 ± 5 % (vt punktid 12–13). hr-α-ERi lahus tuleks valmistada vahetult enne kasutamist.

18.

96-kannulised mikrotiiterplaadid valmistatakse ette vastavalt tabelis 2 esitatud skeemile, kus iga kontsentratsiooni puhul kasutatakse kolme paralleelproovi. Näide plaadil kasutatavate [3H]17β-östradiooli, märgistamata 17β-östradiooli, puhvri ja retseptori kontsentratsioonide ja koguste kohta on esitatud liites 2.2.

Tabel 2.

Küllastava seondumise katses kasutatav mikrotiiterplaadi skeem

0,03 nM [3H]E2 + ER

0,06 nM [3H]E2 + ER

0,08 nM [3H]E2 + ER

0,10 nM [3H]E2 + ER

Summaarne seondumine(ainult lahusti)

0,30 nM [3H]E2 + ER

0,60 nM [3H]E2 + ER

1,0 nM [3H]E2 + ER

3,0 nM [3H]E2 + ER

0,03 nM [3H]E2 + ER + 0,03 μM E2

0,06 nM [3H]E2 + ER + 0,06 μM E2

0,08 nM [3H]E2 + ER + 0,08 μM E2

0,10 nM [3H]E2 + ER + 0,10 μM E2

Mittespetsiifiline seondumine

0,30 nM [3H]E2 + ER + 0,30 μM E2

0,60 nM [3H]E2 + ER + 0,60 μM E2

1,0 nM [3H]E2 + ER + 1,0 μM E2

3,0 nM [3H]E2 + ER + 3,0 μM E2

[3H]E2– [3H]17β-östradiool

ER– östrogeeniretseptor

E2– märgistamata 17β-östradiool

19.

Katses kasutatavaid mikrotiiterplaate tuleks inkubeerida pöördloksutil 2–8 °C juures 16 kuni 20 tundi.

hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiooli koguse mõõtmine

20.

hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiooli eraldamiseks vabast [3H]17β-östradioolist tuleks lisada igasse kannu 80 μl külma DCC suspensiooni, loksutada mikrotiiterplaate 10 minutit ja tsentrifuugida neid 10 minutit kiirusel umbes 2500 pööret minutis. Et vähendada seondunud [3H]17β-östradiooli dissotsieerumist hr-α-ERilt eraldamisprotsessi käigus, on väga oluline hoida puhvreid ja analüüsitavaid kanne temperatuuril 2–8 °C ning viia kõik etapid läbi kiirelt. Mikrotiiterplaadiloksuti on vajalik, et plaate tõhusalt ja kiiresti töödelda.

21.

Seejärel tuleks DCC puudutamisest tuleneda võiva kannude saastumise ärahoidmiseks väga ettevaatlikult võtta 50 μl supernatanti, mis sisaldab hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiooli, ning kanda see teisele mikrotiiterplaadile.

22.

Seejärel lisatakse igasse kannu (A1–B12 ja D1–E12) 200 μl stsintillatsioonivedelikku, mis on võimeline muutma tuumakiirguse kineetilise energia valgusenergiaks. Mõõteplaadi kannudesse G1–H12 (kasutatakse summaarse radioaktiivsuse mõõtmiseks) tuleks otse stsintillatsioonivedelikku lisada [3H]17β-östradiooli lahused (40 μl) järjestikuste lahjendustena, nagu on näidatud tabelis 3; need kannud sisaldavad seega üksnes 200 μl stsintillatsioonivedelikku ja vastava lahjendusastmega [3H]17β-östradiooli lahust. Nendest kannudest saadud andmetest nähtub, kui palju [3H]17β-östradiooli (mõõdetuna dpm-des) lisati iga rühma kannudesse summaarse seondumise ja mittespetsiifilise seondumise hindamiseks.

Tabel 3.

Küllastava seondumise katses radioaktiivsuse mõõtmisel kasutatav mikrotiiterplaadi skeem

0,03 nM [3H]E2 + ER

0,06 nM [3H]E2 + ER

0,08 nM [3H]E2 + ER

0,10 nM [3H]E2 + ER

Summaarne seondumine(ainult lahusti)

0,30 nM [3H]E2 + ER

0,60 nM [3H]E2 + ER

1,0 nM [3H]E2 + ER

3,0 nM [3H]E2 + ER

0,03 nM [3H]E2 + ER + 0,03 μM E2

0,06 nM [3H]E2 + ER + 0,06 μM E2

0,08 nM [3H]E2 + ER + 0,08 μM E2

0,10 nM [3H]E2 + ER + 0,10 μM E2

Mittespetsiifiline seondumine

0,30 nM [3H]E2 + ER + 0,30 μM E2

0,60 nM [3H]E2 + ER + 0,60 μM E2

1,0 nM [3H]E2 + ER + 1,0 μM E2

3,0 nM [3H]E2 + ER + 3,0 μM E2

0,03 nM [3H]E2 (summaarne radioaktiivsus dpm-des)

0,06 nM [3H]E2

0,08 nM [3H]E2

0,10 nM [3H]E2

Summaarne radioaktiivsus dpm-des (*7)

0,30 nM [3H]E2

0,60 nM [3H]E2

1,0 nM [3H]E2

3,0 nM [3H]E2

[3H]E2– [3H]17β-östradiool

ER– östrogeeniretseptor

E2– märgistamata 17β-östradiool

dpm– lagunemiste arv minutis

23.

Mõõtmist tuleks alustada pärast vähemalt kahe tunni pikkust viivitust ja loendamisaeg peaks olema 40 minutit kannu kohta. Radioaktiivsuse mõõtmiseks dpm-des kannu kohta tuleks kasutada mikrotiiterplaadi stsintillatsiooniloendurit ja võtta seejuures arvesse sumbumisparandit. Kui mikrotiiterplaadi stsintillatsiooniloendur ei ole kättesaadav, võib proovide analüüsimiseks kasutada tavalist loendurit. Sellisel juhul võib kaaluda loendamisaja lühendamist.

Konkureeriva seondumise katse

24.

Konkureeriva seondumise katse käigus mõõdetakse ühel kontsentratsioonil kasutatava [3H]17β-östradiooli seondumist üha suuremas kontsentratsioonis esineva uuritava kemikaali juuresolekul. Igas analüüsitsüklis tuleks iga kontsentratsiooni puhul kasutada üheaegselt kolme paralleelproovi. Lisaks tuleks iga uuritava kemikaaliga läbi viia kolm järjestikust analüüsitsüklit. Katse läbiviimiseks tuleks kasutada ühte või mitut 96-kannulist mikrotiiterplaati.

Kontrollid

25.

Katse läbiviimisel tuleks igas analüüsitsüklis kasutada paralleelset lahustiga kontrolli ja teisi kontrolle (st võrdlusöstrogeeni, nõrgalt seonduvat ainet ja mitteseonduvat ainet). Igas analüüsitsüklis tuleks ühel plaadil kasutada võrdlusöstrogeeni ja kontrollaineid (st nõrgalt seonduvat ainet ja mitteseonduvat ainet) täieliku kontsentratsioonikõvera ulatuses. Kõikidele ülejäänud plaatidele tuleks kanda i) E2 ja nõrgalt seonduv aine suures (maksimaalsele väljatõrjumisele vastavas) ja keskmises (umbes IC50-le vastavas) kontsentratsioonis kolmes paralleelis ning ii) lahustiga kontroll ja mittespetsiifilise seondumise kontroll, kumbki vähemalt kolmes paralleelis. Analüüsipuhvri, kontrollide, [3H]17β-östradiooli, hr-α-ERi ja uuritava kemikaali lahuste valmistamist on kirjeldatud allikas 2 (K lisa; vt FW meetodi kohane katse-eeskiri).

Lahustiga kontroll

26.

Lahustiga kontroll võimaldab tõendada, et lahusti ei mõjuta katsesüsteemi, ja ühtlasi mõõta summaarset seondumist (SS). Eelistatud lahusti on etanool. Kui uuritav kemikaal on suurimal kontsentratsioonil etanoolis mittelahustuv, võib lahustina kasutada DMSOd. Etanooli või DMSO lõppkontsentratsioon katsekannudes on 1,5 %; see ei tohi olla suurem kui 2 %.

Puhvrikontroll

27.

Puhvrikontroll (PK) ei tohiks sisaldada lahustit ega uuritavat kemikaali, kuid peaks sisaldama kõiki teisi analüüsikomponente. Puhvrikontrolliga saadud tulemusi võrreldakse lahustiga kontrolliga saadud tulemustega, tõendamaks, et kasutatud lahusti ei mõjuta analüüsisüsteemi.

Tugevalt seonduv aine (võrdlusöstrogeen)

28.

17β-östradiool (CASi nr: 50-28-2) on ERi endogeenne ligand ja seondub retseptori α-vormiga suure afiinsusega. Igas hr-α-ERiga tehtavas konkureeriva seondumise katses tuleks kasutada märgistamata 17β-östradiooli standardkõverat, et oleks võimalik hinnata katsetulemuste varieeruvust samas laboris pikema aja jooksul. Märgistamata 17β-östradioolist tuleks katsekannudes kasutamiseks valmistada etanoolis kaheksa lahust kontsentratsioonivahemikus 100 nM kuni 10 pM (-7 [log M] kuni -11 [log M]); lahuste kontsentratsioonid on järgmised: -7 [log M], -8 [log M], -8,5 [log M], -9 [log M], - 9,5 [log M], -10 [log M], -11 [log M]. Märgistamata 17β-östradiooli suurimat kontsentratsiooni (1 μM) kasutatakse ka mittespetsiifilise seondumise hindamiseks. See kontsentratsioon on tabelis 4 tähistatud märgisega „MSS“, kuigi see on samuti osa standardkõverast.

Nõrgalt seonduv aine

29.

Igas analüüsitsüklis tuleks tundlikkuse tõendamiseks ja pikema aja jooksul saadud tulemuste varieeruvuse hindamiseks kasutada ka nõrgalt seonduvat ainet (noretünodreeli (CASi nr: 68-23-5) või noretindrooni (CASi nr: 68-22-4)). Nõrgalt seonduvast ainest tuleks katsekannudes kasutamiseks valmistada etanoolis kaheksa lahust kontsentratsioonvahemikus 3 nM kuni 30 μM (-8,5 [log M] kuni -4,5 [log M]); lahuste kontsentratsioonid on järgmised: -4,5 [log M], -5 [log M], -5,5 [log M], -6 [log M], -6,5 [log M], -7 [log M], -7,5 [log M], -8,5 [log M].

Mitteseonduv aine

30.

Negatiivse kontrollina (mitteseonduva ainena) tuleks kasutada oktüültrietoksüsilaani (OTES; CASi nr: 2943-75-1). Sellega tagatakse, et katse käigus on võimalik tuvastada hr-α-ERiga mitteseonduvaid uuritavaid kemikaale. Mitteseonduvast ainest tuleks katsekannudes kasutamiseks valmistada etanoolis kaheksa lahust log-ühiku kaupa suurenevate kontsentratsioonide vahemikus 0,1 nM kuni 1000 μM (-10 [log M] kuni -3 [log M]). Alternatiivse mitteseonduva ainena võib kasutada di-n-butüülftalaati (DBP). Selle maksimaalne lahustuvus on teadaolevalt -4 [log M].

hr-α-ERi kontsentratsioon

31.

Tuleks kasutada sellist retseptori kogust, mille puhul spetsiifiline seondumine radioligandi kontsentratsioonil 1 nM on 20 ± 5 % (vt 2. liite punktid 12–13). hr-α-ERi lahus tuleks valmistada vahetult enne kasutamist.

[3H]17β-östradiool

32.

[3H]17β-östradiooli kontsentratsioon katsekannudes peaks olema 1,0 nM.

Uuritavad kemikaalid

33.

Iga uuritava kemikaali puhul on esmalt vaja läbi viia lahustuvuskatse, et määrata lahustuvuspiir ja teha kindlaks katse-eeskirja järgimiseks sobiv kontsentratsioonivahemik. Iga uuritava kemikaali lahustuvuspiir tuleb algselt määrata lahustis ja seejärel kontrollida seda katsetingimustes. Katses kasutatav lõppkontsentratsioon ei tohiks olla suurem kui 1 mM. Kontsentratsioonivahemiku leidmise katses kasutatakse lahustiga kontrolli koos kaheksa järjestikuse üksteisest log-ühiku võrra erineva lahjendusega, mille puhul alustatakse maksimaalsest vastuvõetavast kontsentratsioonist (nt 1 mM või väiksem, olenevalt lahustuvuspiirist), ja registreeritakse nähtava hägu või sademe tekkimine (vt ka punkt 35). Uuritava kemikaali analüüsimiseks tuleks kasutada eelnevas kontsentratsioonivahemiku leidmise katses kindlaks tehtud kaheksal järjestikusel üksteisest log-ühiku võrra erineval kontsentratsioonil põhinevat kõverat. Teises ja kolmandas katses tuleks kontsentratsioone vajaduse korral kohandada, et kontsentratsioonist sõltuvuse kõverat oleks võimalik paremini iseloomustada.

34.

Uuritava kemikaali lahjendused tuleks valmistada sobivas lahustis (vt 2. liite punkt 26). Kui uuritav kemikaal ei lahustu suurimal kontsentratsioonil etanoolis ega DMSO-s ja suurema koguse lahusti lisamisel tõuseks lahusti sisaldus lõpplahuses üle lubatud piirmäära, võib suurima kontsentratsioonina kasutada lahjenduste reas järgmist väiksemat kontsentratsiooni. Sellisel juhul võib lisada kontsentratsioonirea lahjemasse otsa ühe lisalahjenduse. Teised kontsentratsioonid lahjenduste reas tuleks jätta muutmata.

35.

Uuritava kemikaali lahuseid tuleks pärast katsekannu lisamist hoolikalt jälgida, sest uuritav kemikaal võib kannu lisamisel välja sadeneda. Kõigi sadet sisaldavate kannude andmed tuleks kõvera lähendamisel välja jätta ja registreerida andmete väljajätmise põhjus.

36.

Kui eelnevalt on olemas muudest allikatest pärinev teave uuritava kemikaali log IC50 kohta, võib olla asjakohane kasutada lahjenduste geomeetrilist jaotust eeldatava log IC50 ümber (nt sammuga 0,5 log-ühikut). Lõpptulemuses peaks kajastuma piisav kontsentratsioonide ulatus kummalgi pool log IC50 väärtust, sealhulgas kõvera ülemine ja alumine osa, nii et seondumiskõverat oleks võimalik piisavalt iseloomustada.

Katseplaatide kasutusskeemid

37.

Mikrotiiterplaatide ettevalmistamisel tuleks need tähistada koodidega, mis vastavad lahustiga kontrollile, võrdlusöstrogeeni suurimale kontsentratsioonile – selle abil hinnatakse ühtlasi mittespetsiifilist seondumist (MSS) – ja puhvrikontrollile, mida kõiki kasutatakse kuues paralleelis, ning igale kontsentratsioonile kaheksast mitteseonduva kontrollaine (oktüültrietoksüsilaani) kontsentratsioonist, võrdlusöstrogeeni seitsmest väiksemast kontsentratsioonist, nõrgalt seonduva aine kaheksast kontsentratsioonist ja iga uuritava kemikaali (UK) kaheksast kontsentratsioonist, mida kõiki kasutatakse kolmes paralleelis. Võrdlusöstrogeeni ja kontrollide täielikke kontsentratsioonikõveraid hõlmav plaadi näidisskeem on esitatud tabelis 4. Uuritavate kemikaalide analüüsimiseks kasutatakse eraldi mikrotiiterplaate, mis peaksid sisaldama ka järgmisi plaadikontrolle: 1) E2 ja nõrgalt seonduvat ainet suures (maksimaalsele väljatõrjumisele vastavas) ja keskmises (umbes IC50-le vastavas) kontsentratsioonis, kõikidel juhtudel kolmes paralleelis; 2) lahustiga kontrolli ja mittespetsiifilise seondumise kontrolli, kummalgi juhul kuues paralleelis (tabel 5). Konkureeriva seondumise katses kasutatavale mikrotiiterplaadi skeemile vastav näidistööleht kolme tundmatu uuritava kemikaali analüüsimiseks on esitatud liites 2.3. Tabelites 4 ja 5 on esitatud katses kasutatavad lõppkontsentratsioonid. E2 maksimaalne kontsentratsioon peaks olema 1 × 10-7 M ja nõrgalt seonduva aine puhul tuleks kasutada 1. plaadil kasutatud suurimat kontsentratsiooni. IC50 tuleb laboris määrata kontrollidega varem saadud tulemuste andmebaasi alusel. Eeldatavalt on see väärtus sarnane valideerimisuuringutes täheldatud väärtusega (vt tabel 1).

Tabel 4.

Konkureeriva seondumise katses kasutatav mikrotiiterplaadi skeem, mis hõlmab võrdlusöstrogeeni ja kontrollide täielikke kontsentratsioonikõveraid (1. plaat)

SS (ainult lahusti)

MSS

E2 (1 × 10-7)

E2 (1 × 10-8)

E2 (1 × 10-8,5)

E2 (1 × 10-9)

E2 (1 × 10-9,5)

E2 (1 × 10-10)

E2 (1 × 10-11)

Tühi kann (*8)

NE (1 × 10-4,5)

NE (1 × 10-5)

NE (1 × 10-5,5)

NE (1 × 10-6)

NE (1 × 10-6,5)

NE (1 × 10-7)

NE (1 × 10-7,5)

NE (1 × 10-8,5)

OTES (1 × 10-3)

OTES (1 × 10-4)

OTES (1 × 10-5)

OTES (1 × 10-6)

OTES (1 × 10-7)

OTES (1 × 10-8)

OTES (1 × 10-9)

OTES (1 × 10-10)

Tühiproov (radiomärgise jaoks) (*9)

Puhvrikontroll

Selles näites on nõrgalt seonduv aine noretinodreel (NE).

Tabel 5.

Konkureeriva seondumise katses kasutatav mikrotiiterplaadi skeem, mis hõlmab uuritavate kemikaalide täielikke kontsentratsioonikõveraid ja plaadikontrolle

SS (ainult lahusti)

MSS

UK1 (1 × 10-3)

UK1 (1 × 10-4)

UK1 (1 × 10-5)

UK1 (1 × 10-6)

UK1 (1 × 10-7)

UK1 (1 × 10-8)

UK1 (1 × 10-9)

UK1 (1 × 10-10)

UK2 (1 × 10-3)

UK2 (1 × 10-4)

UK2 (1 × 10-5)

UK2 (1 × 10-6)

UK2 (1 × 10-7)

UK2 (1 × 10-8)

UK2 (1 × 10-9)

UK2 (1 × 10-10)

UK3 (1 × 10-3)

UK3 (1 × 10-4)

UK3 (1 × 10-5)

UK3 (1 × 10-6)

UK3 (1 × 10-7)

UK3 (1 × 10-8)

UK3 (1 × 10-9)

UK3 (1 × 10-10)

NE (IC50)

NE (1 × 10-4,5)

E2 (IC50)

E2 (1 × 10-7)

Selles näites on nõrgalt seonduv aine noretinodreel (NE).

Konkureeriva seondumise katse lõpetamine

38.

Nagu on näidatud tabelis 6, tuleks kannudesse lisada 80 μl lahustiga kontrolli, puhvrikontrolli, võrdlusöstrogeeni, nõrgalt seonduvat ainet, mitteseonduvat ainet ja uuritavaid kemikaale, mille lahused on valmistatud analüüsipuhvris. Seejärel lisatakse igasse kannu 40 μl 4 nM [3H]17β-östradiooli lahust. Pärast 10 kuni 15 minuti pikkust tasast loksutamist temperatuuril 2–8 °C tuleks lisada 40 μl hr-α-ERi lahust. Katses kasutatavaid mikrotiiterplaate tuleks inkubeerida pöördloksutil 2–8 °C juures 16 kuni 20 tundi.

Tabel 6.

hrERil põhineva konkureeriva seondumise katse komponentide kogused mikrotiiterplaadil

Kogus (μl)	Koostisosa
80	Märgistamata 17β-östradiool, noretünodreel, OTES, uuritav kemikaal, lahusti või puhver
40	4 nM [3H]17β-östradiooli lahus
40	Määratud kontsentratsiooniga hr-α-ERi lahus
160	Lõppruumala igas katsekannus

39.

Seejärel tuleks viia läbi hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiooli kvantifitseerimine pärast seda, kui hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiool on eraldatud vabast [3H]17β-östradioolist igasse kannu 80 μl külma DCC suspensiooni lisamise teel, nagu on kirjeldatud küllastava seondumise katset käsitlevates punktides 20–23.

40.

Kannusid H1–H6 (tabelis 4 tähistatud kui tühiproovid (radiomärgise jaoks)) kasutatakse 40 μl [3H]-ga märgistatud östradiooli radioaktiivsuse määramiseks dpm-des. 40 μl suurused alikvoodid tuleks lisada otse kannudes H1–H6 olevasse stsintillatsioonivedelikku.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

Küllastava seondumise katse

41.

Spetsiifilise seondumise kõver peaks jõudma [3H]17β-östradiooli kontsentratsiooni suurenedes platoole; see viitab hr-α-ERi küllastumisele ligandiga.

42.

Spetsiifiline seondumine [3H]17β-östradiooli kontsentratsioonil 1 nM peaks jääma vastuvõetavasse vahemikku 15–25 % eri analüüsitsüklites mõõdetud, lisatud radiomärgise kogusele vastava summaarse radioaktiivsuse näitajate keskväärtusest. Aeg-ajalt esinevad väikesed kõrvalekalded sellest vahemikust on lubatud, ent kui analüüsitsüklites saadud tulemused on pidevalt sellest vahemikust väljaspool või mõnes konkreetses analüüsitsüklis saadud väärtus jääb sellest vahemikust väga kaugele, tuleks valgu kontsentratsiooni kohandada ja küllastamiskatset korrata.

43.

Andmed peaksid võimaldama saada lineaarse Scatchardi graafiku.

44.

Mittespetsiifiline seondumine ei tohi olla liiga ulatuslik. Mittespetsiifilise seondumise määr on tavaliselt < 35 % summaarse seondumise määrast. See suhtarv võib siiski olla aeg-ajalt suurem, kui mõõdetakse väga väikest dpm-des väljendatavat radioaktiivsust radiomärgistatud 17β-östradiooli väikseimal katses kasutataval kontsentratsioonil.

Konkureeriva seondumise katse

45.

Märgistamata 17β-östradiool peaks kontsentratsiooni suurenedes tõrjuma [3H]17β-östradiooli retseptorilt välja viisil, mis vastab konkureerivale seondumisele ühes seondumiskohas.

46.

Võrdlusöstrogeeni (st 17β-östradiooli) IC50 väärtus peaks olema ligikaudselt võrdne [3H]17β-östradiooli molaarse kontsentratsiooni ja küllastava seondumise katses määratud Kd summaga.

47.

Spetsiifiline seondumine peaks järjepidevalt olema vastuvõetavas vahemikus 20 ± 5 %, kui igas kannus täheldatavale summaarsele radioaktiivsusele vastav lisatud radiomärgise keskmine mõõdetud kontsentratsioon on eri analüüsitsüklite lõikes 1 nM. Aeg-ajalt esinevad väikesed kõrvalekalded sellest vahemikust on lubatud, ent kui analüüsitsüklites saadud tulemused on pidevalt sellest vahemikust väljaspool või mõnes konkreetses analüüsitsüklis saadud väärtus jääb sellest vahemikust väga kaugele, tuleks valgu kontsentratsiooni kohandada.

48.

Lahusti ei tohiks mõjutada analüüsimeetodi tundlikkust ega tulemuste reprodutseeritavust. Lahustiga kontrolliga (SSi kannudega) saadud tulemusi võrreldakse puhvrikontrolliga saadud tulemustega, tõendamaks, et kasutatud lahusti ei mõjuta katsesüsteemi. Kui lahustil puudub mõju katsetulemustele, peaksid SSi proove ja puhvrikontrolli iseloomustavad tulemused olema võrreldavad.

49.

Mitteseonduv aine ei tohiks tõrjuda hr-α-ERilt välja rohkem kui 25 % [3H]17β-östradioolist, kui sellist ainet analüüsitakse kontsentratsioonil kuni 10-3 M (OTES) või 10-4 M (DBP).

50.

Tulemuslikkuse kriteeriumide väljatöötamiseks võrdlusöstrogeeni ja kahe nõrgalt seonduva aine (nt noretünodreeli ja noretindrooni) jaoks on kasutatud hrERiga seondumist analüüsida võimaldava FW meetodi valideerimise uuringu andmeid (allikas 2, N lisa). Valideerimisuuringus osalenud laborites tehtud kõikide kontrollkatsete tulemuste puhul on keskväärtuse (n) ± SD kõrval esitatud ka usaldusvahemik usaldusnivool 95 %. Usaldusvahemik usaldusnivool 95 % on arvutatud võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduvaid aineid iseloomustavate lähenduskõvera parameetrite (st maksimumi, miinimumi, Hilli tõusu, log IC50) jaoks ning võrdlusöstrogeeni suhtes väljendatava nõrgalt seonduvate ainete log10 RBA jaoks ning seda näitajat kasutatakse positiivsete kontrollide puhul tulemuslikkuse kriteeriumina. Tabelis 1 on esitatud tulemuslikkuse kriteeriumidena kasutatavate lähenduskõvera parameetrite eeldatavad väärtusevahemikud. Praktikas võib IC50 väärtuste vahemik retseptoripreparaadi Kd-st ja ligandi kontsentratsioonist sõltuvalt pisut varieeruda.

51.

Uuritavate kemikaalide jaoks ei ole lähenduskõvera parameetreid käsitlevaid tulemuslikkuse kriteeriume kindlaks määratud, kuna olemasolevate võimalike uuritavate kemikaalide hulk on lai ning nende võimalik afiinsus ja saadavad tulemused varieeruvad (nt täielik kõver, osaline kõver, sobiva kõvera puudumine). Uuritava kemikaaliga igas analüüsitsüklis saadud tulemuste hindamisel tuleks siiski lähtuda eksperdihinnangust. Tuleks kasutada piisavalt suurt uuritava kemikaali kontsentratsioonide vahemikku, et konkureeriva seondumise kõvera ülemine osa (nt osa, kus seondumine on 90–100 %) selgelt välja joonistuks. Paralleelproovide vaheline varieeruvus igal uuritava kemikaali kontsentratsioonil ja kolme järjestikuse analüüsitsükli vaheline varieeruvus peaks olema mõõdukas ja teaduslikult põhjendatav. Uuritava kemikaali hindamisel peaksid kontrollidega saadud tulemused igas analüüsitsüklis ligilähedaselt vastama FW meetodit iseloomustavatele tulemusnäitajatele ja olema kooskõlas asjaomases laboris kontrollidega varem saadud tulemustega.

ANDMEANALÜÜS

Küllastava seondumise katse

52.

Mõõdetakse nii summaarset kui ka mittespetsiifilist seondumist. Nende väärtuste põhjal arvutatakse üha suuremas kontsentratsioonis esineva [3H]17β-östradiooli spetsiifilise seondumise näitaja tasakaalutingimustes; selleks lahutatakse summaarse seondumise näitajast mittespetsiifilise seondumise näitaja. [3H]17β-östradiooli kontsentratsioonist sõltuva spetsiifilise seondumise kõver peaks jõudma platoole, kus [3H]17β-östradiooli spetsiifiline seondumine on hr-α-ERi küllastumisest tulenevalt maksimaalne. Lisaks peaks andmeanalüüsist nähtuma [3H]17β-östradiooli seondumine ühteainsasse suure afiinsusega seondumiskohta. Küllastava seondumise graafikul peaks olema näidatud mittespetsiifiline, summaarne ja spetsiifiline seondumine. Järgnevas andmeanalüüsis tuleks kasutada mittelineaarset regressiooni (nt BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995) ja andmed tuleks lõplikul kujul esitada Scatchardi graafikul.

53.

Andmeanalüüsi käigus tuleks määrata Bmax ja Kd üksnes summaarse seondumise andmete põhjal ning lähtuda seejuures eeldusest, et mittespetsiifiline seondumine on lineaarne, v.a juhul, kui esitatakse põhjendus teistsuguse meetodi kasutamise kohta. Lisaks tuleks parima lähenduskõvera leidmiseks kasutada robustset regressioonanalüüsi, v.a juhul, kui esitatakse põhjendus muu lähenemisviisi kasutamise kohta. Tuleks märkida, millist robustse regressioonanalüüsi meetodit kasutatakse. Küllastava seondumise andmete alusel Bmax-i ja Kd määramisel tuleks andmeid alati korrigeerida ligandi väljatõrjumise suhtes (nt meetodi abil, mida on kirjeldanud Swillens (1995)).

Konkureeriva seondumise katse

54.

Konkureeriva seondumise kõver esitatakse graafikul nii, et ühel teljel on [3H]17β-östradiooli spetsiifiline seondumine ja teisel konkureeriva aine kontsentratsioon (log10-ühikutes). Uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures [3H]17β-östradiooli spetsiifiline seondumine on 50 % maksimummäärast, on IC50 väärtus.

55.

Positiivsete kontrollide (nt võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva aine) log IC50 hinnanguliste väärtuste kindlakstegemiseks tuleks kasutada sobivat mittelineaarse kõvera lähendamise tarkvara, milles rakendatakse neljaparameetrilist Hilli võrrandit (nt BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995). Kõnealuste kõverate lähendamisel tuleks kõvera ülemine ja alumine osa, tõus ja log IC50 üldjuhul jätta piiritlemata. Parima lähenduskõvera leidmiseks tuleks kasutada robustset regressioonanalüüsi, v.a juhul, kui esitatakse põhjendus muu lähenemisviisi kasutamise kohta. Andmeid ei tohiks korrigeerida ligandi väljatõrjumise suhtes. Pärast esmast analüüsi tuleks iga seondumiskõver üle vaadata, et veenduda mudeli ja andmete omavahelises sobivuses. Nõrgalt seonduva aine suhtelise seondumisafiinsuse (RBA) leidmiseks tuleks arvutada nõrgalt seonduva aine log IC50 väärtuse protsentuaalne osakaal 17β-östradiooli log IC50 väärtusest. Positiivsete kontrollidega ja mitteseonduval ainel põhineva kontrolliga saadud tulemusi tuleks hinnata lähtuvalt käesoleva 2. liite punktide 45–50 kohastest katsemeetodi tulemuslikkuse näitajatest.

56.

Kõigi uuritavate kemikaalide andmete analüüsimisel tuleks kasutada astmelist lähenemist, et tagada andmete asjakohane analüüs ja kõigi konkureeriva seondumise kõverate nõuetekohane liigitamine. Soovitatavalt tuleks uuritava kemikaaliga läbi viidud iga analüüsitsükli puhul esmalt rakendada täpselt sama standardiseeritud andmeanalüüsi, mida kasutatakse võrdlusöstrogeenil ja nõrgalt seonduval ainel põhinevate kontrollide puhul (vt eespool punkt 55). Pärast esmast analüüsi tuleks iga analüüsitsükli puhul teha lähenduskõvera parameetrite tehniline kontroll ja visuaalselt hinnata, kui hästi sobituvad seondumisandmed saadud konkureeriva seondumise kõveraga. Tehnilise kontrolli käigus täheldatav kontsentratsioonist sõltuv [3H]17β-östradiooli spetsiifilise seondumise protsentuaalse määra vähenemine, tehniliste paralleelproovide andmete vaheline väike varieeruvus kemikaali kõigil kontsentratsioonidel ja lähenduskõvera parameetrite sarnased väärtused kolmes analüüsitsüklis viitavad sellele, et katse ja andmeanalüüs on läbi viidud nõuetekohaselt.

Andmete tõlgendamine

57.

Kui kõik nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal hr-α-ERiga seonduvaks, kui seondumiskõver sobitub andmetega ja katseandmete vahemikku jäävale sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus on väiksem kui 50 % (joonis 1).

58.

Kui kõik nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal hr-α-ERiga mitteseonduvaks, kui:

—	seondumiskõver sobitub andmetega ja katseandmete vahemikku jäävale lähendatud sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus on suurem kui 75 % või

—	sobiv seondumiskõver puudub ja väikseim silumata keskmine seondumisprotsent eri kontsentratsioonidel saadud andmete hulgas on suurem kui 75 %.

59.

Kui ükski eespool kirjeldatud tingimus ei ole täidetud (nt lähendatud sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus on vahemikus 75–50 %), liigitatakse uuritav kemikaal ebaselgeks.

Tabel 7.

Uuritava kemikaali konkureeriva seondumise kõveral põhinevad liigitamiskriteeriumid

Liigitus	Kriteeriumid
Seonduva	Seondumiskõver sobitub andmetega. Katseandmete vahemikku jäävale sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus on väiksem kui 50 %.
Mitteseonduvb	Seondumiskõvera sobitumisel andmetega on katseandmete vahemikku jäävale lähendatud sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus suurem kui 75 %. Sobiva seondumiskõvera puudumisel on väikseim silumata keskmine seondumisprotsent eri kontsentratsioonidel saadud andmete hulgas suurem kui 75 %.
Ebaselgec	Ükskõik millises nõuetekohases analüüsitsüklis saadud tulemus, mille alusel ei saa uuritavat kemikaali liigitada seonduvaks aineks ega mitteseonduvaks aineks (näiteks vastab lähendatud sõltuvuskõvera madalaim punkt väärtusele 75–50 %).

Joonis 1

Näited uuritava kemikaali liigitamise kohta konkureeriva seondumise kõvera alusel

60.

Samas laboris uuritava kemikaaliga läbi viidud mitme analüüsitsükli tulemuste kokkuvõtmiseks omistatakse iga analüüsitsükli tulemusele arvväärtus ja leitakse nende arvväärtuste keskmine, nagu on kirjeldatud tabelis 8. Igas laboris analüüsitsüklite tulemuste koondamisel saadud tulemust võrreldakse iga uuritava kemikaali puhul eeldatava liigitamistulemusega.

Tabel 8.

Meetod uuritava kemikaali liigitamiseks samas laboris läbi viidud mitme analüüsitsükli alusel

Iga analüüsitsükli tulemusele väärtuse omistamine
Liigitus	Arvväärtus
Seonduv	2
Ebaselge	1
Mitteseonduv	0
Liigitamine eri analüüsitsüklites saadud arvväärtuste keskmise alusel
Liigitus	Arvväärtus
Seonduv	Keskmine ≥ 1,5
Ebaselge	0,5 ≤ keskmine < 1,5
Mitteseonduv	Keskmine < 0,5

KATSEPROTOKOLL

61.

Vt käesoleva katsemeetodi punkt 24 peatükis „hrER-GA SEONDUMISE KATSE ELEMENDID“.

Liide 2.1

MÕISTETE LOETELU

[3H]E2– triitiumiga radiomärgistatud 17β-östradiool.

Analüüsipuhver– 10 mM Tris, veise seerumi albumiin kontsentratsioonis 10 mg/ml, 2 mM DTT, 10 % glütserooli, 0,2 mM leupeptiin, pH 7,5.

Analüüsitsükkel– mikrotiiterplaadi katsekannude täieliku komplekti üheaegne analüüs, mille tulemusena saadakse kogu vajalik teave uuritava kemikaali ja hr-α-ERi omavahelise seondumise iseloomustamiseks (nimelt katsekannu lisatud [3H]17β-östradiooli üldkogus, [3H]17β-östradiooli maksimaalne seondumismäär hr-α-ERiga seondumisel, mittespetsiifilise seondumise määr ja summaarse seondumise määr uuritava kemikaali eri kontsentratsioonidel). Analüüsitsüklis võidakse igal kontsentratsioonil kasutada ka ainult ühte katsekannu (st paralleeli), ent kuna käesolevas katse-eeskirjas nõutakse kolme paralleelproovi kasutamist, analüüsitakse käesoleval juhul ühes analüüsitsüklis iga kontsentratsiooni puhul kolme katsekannu. Peale selle viiakse käesoleva katse-eeskirja kohaselt iga kemikaaliga läbi kolm iseseisvat (st järjestikust) analüüsitsüklit.

DCC– dekstraaniga kaetud süsi.

E2– märgistamata 17β-östradiool (inertne).

hr-α-ER– rekombinantne inimese α-östrogeeniretseptor.

Paralleelproov– üks mitmest kannust, mis sisaldavad samu koostisaineid samas kontsentratsioonis ning mida analüüsitakse üheaegselt samas analüüsitsüklis. Käesoleva katse-eeskirja puhul analüüsitakse uuritavat kemikaali igal kontsentratsioonil kolmes paralleelis, st igal uuritava kemikaali kontsentratsioonil analüüsitakse üheaegselt kolme paralleelproovi.

Liide 2.2

TAVAPÄRANE [3H]17β-ÖSTRADIOOLIGA KÜLLASTAMISE KATSE KOLME PARALLEELKANNUGA

Tavapärane [3H]17β-östradiooliga küllastamise katse kolme paralleelkannuga
Asukoht	Paralleelproov	Kannuliigi kood	Radioaktiivse E2 algkontsentratsioon (nM)	Radioaktiivse E2 kogus (μl)	Radioaktiivse E2 lõppkontsentratsioon (nM)	Märgistamata E2 algkontsentratsioon (μM)	Märgistamata E2 kogus (μl)	Märgistamata E2 lõppkontsentratsioon (μM)	Puhvri kogus (μl)	Retseptori kogus (μl)	Üldkogus kannus (μl)
A1	1	R	0,12	40	0,03	—	—	—	80	40	160
A2	2	R	0,12	40	0,03	—	—	—	80	40	160
A3	3	R	0,12	40	0,03	—	—	—	80	40	160
A4	1	R	0,24	40	0,06	—	—	—	80	40	160
A5	2	R	0,24	40	0,06	—	—	—	80	40	160
A6	3	R	0,24	40	0,06	—	—	—	80	40	160
A7	1	R	0,32	40	0,08	—	—	—	80	40	160
A8	2	R	0,32	40	0,08	—	—	—	80	40	160
A9	3	R	0,32	40	0,08	—	—	—	80	40	160
A10	1	R	0,40	40	0,10	—	—	—	80	40	160
A11	2	R	0,40	40	0,10	—	—	—	80	40	160
A12	3	R	0,40	40	0,10	—	—	—	80	40	160
B1	1	R	1,20	40	0,30	—	—	—	80	40	160
B2	2	R	1,20	40	0,30	—	—	—	80	40	160
B3	3	R	1,20	40	0,30	—	—	—	80	40	160
B4	1	R	2,40	40	0,60	—	—	—	80	40	160
B5	2	R	2,40	40	0,60	—	—	—	80	40	160
B6	3	R	2,40	40	0,60	—	—	—	80	40	160
B7	1	R	4,00	40	1,00	—	—	—	80	40	160
B8	2	R	4,00	40	1,00	—	—	—	80	40	160
B9	3	R	4,00	40	1,00	—	—	—	80	40	160
B10	1	R	12,00	40	3,00	—	—	—	80	40	160
B11	2	R	12,00	40	3,00	—	—	—	80	40	160
B12	3	R	12,00	40	3,00	—	—	—	80	40	160
D1	1	RM	0,12	40	0,03	0,06	80	0,03	—	40	160
D2	2	RM	0,12	40	0,03	0,06	80	0,03	—	40	160
D3	3	RM	0,12	40	0,03	0,06	80	0,03	—	40	160
D4	1	RM	0,24	40	0,06	0,12	80	0,06	—	40	160
D5	2	RM	0,24	40	0,06	0,12	80	0,06	—	40	160
D6	3	RM	0,24	40	0,06	0,12	80	0,06	—	40	160
D7	1	RM	0,32	40	0,08	0,16	80	0,08	—	40	160
D8	2	RM	0,32	40	0,08	0,16	80	0,08	—	40	160
D9	3	RM	0,32	40	0,08	0,16	80	0,08	—	40	160
D10	1	RM	0,40	40	0,10	0,2	80	0,1	—	40	160
D11	2	RM	0,40	40	0,10	0,2	80	0,1	—	40	160
D12	3	RM	0,40	40	0,10	0,2	80	0,1	—	40	160
E1	1	RM	1,20	40	0,30	0,6	80	0,3	—	40	160
E2	2	RM	1,20	40	0,30	0,6	80	0,3	—	40	160
E3	3	RM	1,20	40	0,30	0,6	80	0,3	—	40	160
E4	1	RM	2,40	40	0,60	1,2	80	0,6	—	40	160
E5	2	RM	2,40	40	0,60	1,2	80	0,6	—	40	160
E6	3	RM	2,40	40	0,60	1,2	80	0,6	—	40	160
E7	1	RM	4,00	40	1,00	2	80	1	—	40	160
E8	2	RM	4,00	40	1,00	2	80	1	—	40	160
E9	3	RM	4,00	40	1,00	2	80	1	—	40	160
E10	1	RM	12,00	40	3,00	6	80	3	—	40	160
E11	2	RM	12,00	40	3,00	6	80	3	—	40	160
E12	3	RM	12,00	40	3,00	6	80	3	—	40	160
G1	1	Radiomärgis	0,12	40	0,03	—	—	—	—	—	40
G2	2	Radiomärgis	0,12	40	0,03	—	—	—	—	—	40
G3	3	Radiomärgis	0,12	40	0,03	—	—	—	—	—	40
G4	1	Radiomärgis	0,24	40	0,06	—	—	—	—	—	40
G5	2	Radiomärgis	0,24	40	0,06	—	—	—	—	—	40
G6	3	Radiomärgis	0,24	40	0,06	—	—	—	—	—	40
G7	1	Radiomärgis	0,32	40	0,08	—	—	—	—	—	40
G8	2	Radiomärgis	0,32	40	0,08	—	—	—	—	—	40
G9	3	Radiomärgis	0,32	40	0,08	—	—	—	—	—	40
G10	1	Radiomärgis	0,40	40	0,10	—	—	—	—	—	40
G11	2	Radiomärgis	0,40	40	0,10	—	—	—	—	—	40
G12	3	Radiomärgis	0,40	40	0,10	—	—	—	—	—	40
H1	1	Radiomärgis	1,20	40	0,30	—	—	—	—	—	40
H2	2	Radiomärgis	1,20	40	0,30	—	—	—	—	—	40
H3	3	Radiomärgis	1,20	40	0,30	—	—	—	—	—	40
H4	1	Radiomärgis	2,40	40	0,60	—	—	—	—	—	40
H5	2	Radiomärgis	2,40	40	0,60	—	—	—	—	—	40
H6	3	Radiomärgis	2,40	40	0,60	—	—	—	—	—	40
H7	1	Radiomärgis	4,00	40	1,00	—	—	—	—	—	40
H8	2	Radiomärgis	4,00	40	1,00	—	—	—	—	—	40
H9	3	Radiomärgis	4,00	40	1,00	—	—	—	—	—	40
H10	1	Radiomärgis	12,00	40	3,00	—	—	—	—	—	40
H11	2	Radiomärgis	12,00	40	3,00	—	—	—	—	—	40
H12	3	Radiomärgis	12,00	40	3,00	—	—	—	—	—	40
Tuleb silmas pidada, et kannud tähisega „Radiomärgis“ on inkubeerimise ajal tühjad. Ettenähtud 40 μl lisatakse ainult stsintillatsioonide loendamiseks.

Liide 2.3

KONKUREERIVA SEONDUMISE KATSES KASUTATAV MIKROTIITERPLAADI SKEEM

Plaat	Asukoht	Paralleelproov	Kannu liik	Kannu kood	Kontsentratsiooni kood	Konkureeriva aine algkontsentratsioon (M)	hrERi põhilahus (μl)	Puhvri kogus (μl)	Märgise (radioaktiivse E2) kogus (μl)	Lahjendusplaadilt lisatav kogus (μl)	Lõppruumala (μl)	Konkureeriva aine lõppkontsentratsioon (M)
S	A1	1	Summaarne seondumine	SS	SS1	—	40		40	80	160	—
S	A2	2	Summaarne seondumine	SS	SS2	—	40		40	80	160	—
S	A3	3	Summaarne seondumine	SS	SS3	—	40		40	80	160	—
S	A4	1	Summaarne seondumine	SS	SS4	—	40		40	80	160	—
S	A5	2	Summaarne seondumine	SS	SS5	—	40		40	80	160	—
S	A6	3	Summaarne seondumine	SS	SS6	—	40		40	80	160	—
S	A7	1	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	A8	2	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	A9	3	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	A10	1	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	A11	2	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	A12	3	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	B1	1	Märgistamata E2	S	S1	2,00E-07	40	—	40	80	160	1,0E-07
S	B2	2	Märgistamata E2	S	S1	2,00E-07	40	—	40	80	160	1,0E-07
S	B3	3	Märgistamata E2	S	S1	2,00E-07	40	—	40	80	160	1,0E-07
S	B4	1	Märgistamata E2	S	S2	2,00E-08	40	—	40	80	160	1,0E-08
S	B5	2	Märgistamata E2	S	S2	2,00E-08	40	—	40	80	160	1,0E-08
S	B6	3	Märgistamata E2	S	S2	2,00E-08	40	—	40	80	160	1,0E-08
S	B7	1	Märgistamata E2	S	S3	6,00E-09	40	—	40	80	160	3,0E-09
S	B8	2	Märgistamata E2	S	S3	6,00E-09	40	—	40	80	160	3,0E-09
S	B9	3	Märgistamata E2	S	S3	6,00E-09	40	—	40	80	160	3,0E-09
S	B10	1	Märgistamata E2	S	S4	2,00E-09	40	—	40	80	160	1,0E-09
S	B11	2	Märgistamata E2	S	S4	2,00E-09	40	—	40	80	160	1,0E-09
S	B12	3	Märgistamata E2	S	S4	2,00E-09	40	—	40	80	160	1,0E-09
S	C1	1	Märgistamata E2	S	S5	6,00E-10	40	—	40	80	160	3,0E-10
S	C2	2	Märgistamata E2	S	S5	6,00E-10	40	—	40	80	160	3,0E-10
S	C3	3	Märgistamata E2	S	S5	6,00E-10	40	—	40	80	160	3,0E-10
S	C4	1	Märgistamata E2	S	S6	2,00E-10	40	—	40	80	160	1,0E-10
S	C5	2	Märgistamata E2	S	S6	2,00E-10	40	—	40	80	160	1,0E-10
S	C6	3	Märgistamata E2	S	S6	2,00E-10	40	—	40	80	160	1,0E-10
S	C7	1	Märgistamata E2	S	S7	2,00E-11	40	—	40	80	160	1,0E-11
S	C8	2	Märgistamata E2	S	S7	2,00E-11	40	—	40	80	160	1,0E-11
S	C9	3	Märgistamata E2	S	S7	2,00E-11	40	—	40	80	160	1,0E-11
S	C10	1	Tühiproov	Tühiproov	T1	—	—	160	—	—	160	—
S	C11	2	Tühiproov	Tühiproov	T2	—	—	160	—	—	160	—
S	C12	3	Tühiproov	Tühiproov	T3	—	—	160	—	—	160	—
S	D1	1	Noretünodreel	NE	WP1	6,00E-05	40	—	40	80	160	3,0E-05
S	D2	1	Noretünodreel	NE	WP1	6,00E-05	40	—	40	80	160	3,0E-05
S	D3	1	Noretünodreel	NE	WP1	6,00E-05	40	—	40	80	160	3,0E-05
S	D4	1	Noretünodreel	NE	WP2	2,00E-05	40	—	40	80	160	1,0E-05
S	D5	1	Noretünodreel	NE	WP2	2,00E-05	40	—	40	80	160	1,0E-05
S	D6	1	Noretünodreel	NE	WP2	2,00E-05	40	—	40	80	160	1,0E-05
S	D7	1	Noretünodreel	NE	WP3	6,00E-06	40	—	40	80	160	3,0E-06
S	D8	1	Noretünodreel	NE	WP3	6,00E-06	40	—	40	80	160	3,0E-06
S	D9	1	Noretünodreel	NE	WP3	6,00E-06	40	—	40	80	160	3,0E-06
S	D10	1	Noretünodreel	NE	WP4	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	D11	1	Noretünodreel	NE	WP4	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	D12	1	Noretünodreel	NE	WP4	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	E1	1	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-07	40	—	40	80	160	3,0E-07
S	E2	2	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-07	40		40	80	160	3,0E-07
S	E3	3	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-07	40		40	80	160	3,0E-07
S	E4	1	Noretünodreel	NE	WP	2,00E-07	40		40	80	160	1,0E-07
S	E5	2	Noretünodreel	NE	WP	2,00E-07	40		40	80	160	1,0E-07
S	E6	3	Noretünodreel	NE	WP	2,00E-07	40		40	80	160	1,0E-07
S	E7	1	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-08	40	—	40	80	160	3,0E-08
S	E8	2	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-08	40	—	40	80	160	3,0E-08
S	E9	3	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-08	40	—	40	80	160	3,0E-08
S	E10	1	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-09	40	—	40	80	160	3,0E-09
S	E11	2	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-09	40	—	40	80	160	3,0E-09
S	E12	3	Noretünodreel	NE	WP	6,00E-09	40	—	40	80	160	3,0E-09
S	F1	1	OTES	N	OTES	2,00E-03	40	—	40	80	160	1,0E-03
S	F2	2	OTES	N	OTES	2,00E-03	40	—	40	80	160	1,0E-03
S	F3	3	OTES	N	OTES	2,00E-03	40	—	40	80	160	1,0E-03
S	F4	1	OTES	N	OTES	2,00E-04	40	—	40	80	160	1,0E-04
S	F5	2	OTES	N	OTES	2,00E-04	40	—	40	80	160	1,0E-04
S	F6	3	OTES	N	OTES	2,00E-04	40	—	40	80	160	1,0E-04
S	F7	1	OTES	N	OTES	2,00E-05	40	—	40	80	160	3,0E-05
S	F8	2	OTES	N	OTES	2,00E-05	40	—	40	80	160	3,0E-05
S	F9	3	OTES	N	OTES	2,00E-05	40	—	40	80	160	3,0E-05
S	F10	1	OTES	N	OTES	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	F11	2	OTES	N	OTES	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	F12	3	OTES	N	OTES	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
S	G1	1	OTES	N	OTES	2,00E-07	40	—	40	80	160	3,0E-07
S	G2	2	OTES	N	OTES	2,00E-07	40	—	40	80	160	3,0E-07
S	G3	3	OTES	N	OTES	2,00E-07	40	—	40	80	160	3,0E-07
S	G4	1	OTES	N	OTES	2,00E-08	40	—	40	80	160	1,0E-08
S	G5	2	OTES	N	OTES	2,00E-08	40	—	40	80	160	1,0E-08
S	G6	3	OTES	N	OTES	2,00E-08	40	—	40	80	160	1,0E-08
S	G7	1	OTES	N	OTES	2,00E-09	40	—	40	80	160	1,0E-09
S	G8	2	OTES	N	OTES	2,00E-09	40	—	40	80	160	1,0E-09
S	G9	3	OTES	N	OTES	2,00E-09	40	—	40	80	160	1,0E-09
S	G10	1	OTES	N	OTES	2,00E-10	40	—	40	—	160	1,0E-10
S	G11	2	OTES	N	OTES	2,00E-10	40	—	40	—	160	1,0E-10
S	G12	3	OTES	N	OTES	2,00E-10	40	—	40	—	160	1,0E-10
S	H1	1	Radiomärgis	R	R	—	—	—	40	—	40	—
S	H2	1	Radiomärgis	R	R	—	—	—	40	—	40	—
S	H3	1	Radiomärgis	R	R	—	—	—	40	—	40	—
S	H4	1	Radiomärgis	R	R	—	—	—	40	—	40	—
S	H5	1	Radiomärgis	R	R	—	—	—	40	—	40	—
S	H6	1	Radiomärgis	R	R	—	—	—	40	—	40	—
S	H7	1	Puhvrikontroll	PK	PK	—	40	80	40	—	160	—
S	H8	1	Puhvrikontroll	PK	PK	—	40	80	40	—	160	—
S	H9	1	Puhvrikontroll	PK	PK	—	40	80	40	—	160	—
S	H10	1	Puhvrikontroll	PK	PK	—	40	80	40	—	160	—
S	H11	1	Puhvrikontroll	PK	PK	—	40	80	40	—	160	—
S	H12	1	Puhvrikontroll	PK	PK	—	40	80	40	—	160	—

Tuleb silmas pidada, et kannud tähisega „Radiomärgis“ on inkubeerimise ajal tühjad. Ettenähtud 40 μl lisatakse ainult stsintillatsioonide loendamiseks.

Konkureeriva seondumise katses kasutatav mikrotiiterplaadi skeem
Plaat	Asukoht	Paralleelproov	Kannu liik	Kannu kood	Kontsentratsiooni kood	Konkureeriva aine algkontsentratsioon (M)	hrERi põhilahus (μl)	Puhvri kogus (μl)	Märgise (radioaktiivse E2) kogus (μl)	Lahjendusplaadilt lisatav kogus (μl)	Lõppruumala (μl)	Konkureeriva aine lõppkontsentratsioon (M)
P1	A1	1	Summaarne seondumine	SS	SS1	—	40	—	40	80	160	—
P1	A2	2	Summaarne seondumine	SS	SS2	—	40	—	40	80	160	—
P1	A3	3	Summaarne seondumine	SS	SS3	—	40	—	40	80	160	—
P1	A4	1	Summaarne seondumine	SS	SS4	—	40	—	40	80	160	—
P1	A5	2	Summaarne seondumine	SS	SS5	—	40	—	40	80	160	—
P1	A6	3	Summaarne seondumine	SS	SS6	—	40	—	40	80	160	—
P1	A7	1	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
P1	A8	2	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
P1	A9	3	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
P1	A10	1	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
P1	A11	2	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
P1	A12	3	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S0	2,00E-06	40	—	40	80	160	1,0E-06
P1	B1	1	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	B2	2	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	B3	3	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	B4	1	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	B5	2	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	B6	3	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	B7	1	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	B8	2	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	B9	3	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	B10	1	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	B11	2	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	B12	3	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	C1	1	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	C2	2	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	C3	3	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	C4	1	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	6	2,00E-08	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	C5	2	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	6	2,00E-08	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	C6	3	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	6	2,00E-08	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	C7	1	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	7	2,00E-09	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	C8	2	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	7	2,00E-09	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	C9	3	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	7	2,00E-09	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	C10	1	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	8	2,00E-10	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	C11	2	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	8	2,00E-10	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	C12	3	Uuritav kemikaal nr 1	UK1	8	2,00E-10	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	D1	1	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	D2	2	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	D3	3	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	D4	1	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	D5	2	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	D6	3	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	D7	1	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	D8	2	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	D9	3	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	D10	1	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	D11	2	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	D12	3	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	E1	1	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	E2	2	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	E3	3	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	E4	1	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	6	—	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	E5	2	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	6	—	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	E6	3	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	6	—	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	E7	1	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	7	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	E8	2	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	7	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	E9	3	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	7	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	E10	1	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	8	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	E11	2	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	8	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	E12	3	Uuritav kemikaal nr 2	UK2	8	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	F1	1	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	F2	2	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	F3	3	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	1	2,00E-03	40	0	40	80	160	1,0E-03
P1	F4	1	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	F5	2	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	F6	3	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	2	2,00E-04	40	0	40	80	160	1,0E-04
P1	F7	1	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	F8	2	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	F9	3	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	3	2,00E-05	40	0	40	80	160	1,0E-05
P1	F10	1	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	F11	2	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	F12	3	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	4	2,00E-06	40	0	40	80	160	1,0E-06
P1	G1	1	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	G2	2	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	G3	3	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	5	2,00E-07	40	0	40	80	160	1,0E-07
P1	G4	1	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	6	2,00E-08	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	G5	2	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	6	2,00E-08	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	G6	3	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	6	2,00E-08	40	0	40	80	160	1,0E-08
P1	G7	1	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	7	2,00E-09	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	G8	2	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	7	2,00E-09	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	G9	3	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	7	2,00E-09	40	0	40	80	160	1,0E-09
P1	G10	1	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	8	2,00E-10	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	G11	2	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	8	2,00E-10	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	G12	3	Uuritav kemikaal nr 3	UK3	8	2,00E-10	40	0	40	80	160	1,0E-10
P1	H1	1	Noretünodreel	NE		IC50	40	0	40	80	160
P1	H2	2	Noretünodreel	NE		IC50	40	0	40	80	160
P1	H3	3	Noretünodreel	NE		IC50	40	0	40	80	160
P1	H4	1	Noretünodreel	NE		1,00E-4,5	40	0	40	80	160
P1	H5	2	Noretünodreel	NE		1,00E-4,5	40	0	40	80	160
P1	H6	3	Noretünodreel	NE		1,00E-4,5	40	0	40	80	160
P1	H7	1	Märgistamata E2	S		IC50	40	0	40	80	160
P1	H8	2	Märgistamata E2	S		IC50	40	0	40	80	160
P1	H9	3	Märgistamata E2	S		IC50	40	0	40	80	160
P1	H10	1	Märgistamata E2	S		1,00E-7	40	0	40	80	160
P1	H11	2	Märgistamata E2	S		1,00E-7	40	0	40	80	160
P1	H12	3	Märgistamata E2	S		1,00E-7	40	0	40	80	160

3. liide

LIGANDIGA SEONDUVAL REKOMBINANTSEL INIMESE α-ER-I VALGUDOMEENIL PÕHINEV JAAPANI KEMIKAALIDE HINDAMISE JA UURIMISE INSTITUUDI (CERI) IN VITRO MEETOD ÖSTROGEENIRETSEPTORIGA SEONDUMISE ANALÜÜSIMISEKS

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD (VT KA ÜLDINE SISSEJUHATUS)

Käesoleva östrogeeniretseptoril (α-ER) põhineva, küllastava ja konkureeriva seondumise analüüsimist võimaldava in vitro meetodi puhul kasutatakse inimese α-ERi (hr-α-ER) ligandiga seonduvat domeeni (LBD). See valgukonstrukt on toodetud Jaapani Kemikaalide Hindamise ja Uurimise Instituudis (CERI) ja seda ekspresseeritakse glutatiooni S-transferaasiga (GST) ühendatud liitvalguna bakteris E. coli. CERI katse-eeskirja on hinnatud rahvusvahelises mitme labori osalusel läbi viidud valideerimisuuringus (2), mille käigus tõendati, et see analüüsimeetod on kavandatud kasutuseesmärgi puhul asjakohane ja usaldusväärne.

Käesolev meetod on rakendatav sõeluuringu jaoks, mille eesmärk on tuvastada aineid, mis on võimelised seonduma hr-α-ERiga. Seda kasutatakse selleks, et hinnata uuritava kemikaali võimet konkureerida hr-α-ERi LBD-le seondumisel 17β-östradiooliga. Kvantitatiivsed katsetulemused võivad hõlmata uuritava kemikaali IC50 (uuritava kemikaali kontsentratsioon, mis on vajalik poole [3H]17β-östradiooli väljatõrjumiseks hr-α-ERilt) ja suhtelist seondumisafiinsust hr-α-ERi suhtes võrreldes 17β-östradiooliga. Kemikaalide sõeluuringu puhul võivad vastuvõetavad kvalitatiivsed katsetulemused hõlmata uuritavate kemikaalide liigitamist hr-α-ERiga seonduvaks aineks, mitteseonduvaks aineks või ebaselge mõjuga aineks lähtuvalt seondumiskõverate suhtes kohaldatavatest kriteeriumidest.

Enne käesoleva katsemeetodi kasutamist regulatiivsel eesmärgil tuleks lugeda peatükke „ÜLDINE SISSEJUHATUS“ ja „hrER-GA SEONDUMISE KATSE ELEMENDID“. Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted ja lühendid on esitatud 1. liites.

MEETODI PÕHIMÕTE (VT KA ÜLDINE SISSEJUHATUS)

Kõnealune meetod hõlmab kahte põhielementi: küllastava seondumise katset, millega iseloomustatakse retseptor ja ligandi vahelise interaktsiooni parameetreid, ning sellele järgnevat konkureeriva seondumise katset, millega iseloomustatakse uuritava kemikaali ja radiomärgistatud ligandi vahelist konkurentsi ERile seondumisel.

KATSE KÄIK

hr-α-ERi vastuvõetava funktsionaalsuse tõendamine

—

Viiakse läbi konkureeriva seondumise katse kontrollainetega (võrdlusöstrogeen (17β-östradiool), nõrgalt seonduv aine (nt noretünodreel või noretindroon) ja mitteseonduv aine (oktüültrietoksüsilaan (OTES)). Igas laboris tuleks luua varasemate tulemuste andmebaas, et võimaldada dokumenteerida võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva aine IC50 ja muude asjakohaste näitajate väärtuste kooskõla määra eri katsete lõikes ja hr-α-ERi eri partiide puhul. Kontrollaineid iseloomustavate konkureeriva seondumise kõverate parameetrid peaksid jääma usaldusnivoole 95 % vastavasse usaldusvahemikku (vt tabel 1), mis tehti kindlaks kõnealuse analüüsimeetodi valideerimise uuringus osalenud laborites saadud andmete põhjal (2).

Tabel 1

CERI meetodi kohases hrERiga seondumise katses võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva aine puhul kohaldatavad tulemuslikkuse kriteeriumid

Aine	Näitaja	Keskmine (12)	Standardhälve (n)	Usaldusvahemik usaldusnivool 95 % (13)
Aine	Näitaja	Keskmine (12)	Standardhälve (n)	Alampiir	Ülempiir
17β-östradiool	Maksimumväärtus	104,74	13,12 (70)	101,6	107,9
	Miinimumväärtus	0,85	2,41 (70)	0,28	1,43
	Hilli tõus	–1,22	0,20 (70)	–1,27	–1,17
	Log IC50	–8,93	0,23 (70)	–8,98	–8,87
Noretünodreel	Maksimumväärtus	101,31	10,55 (68)	98,76	103,90
	Miinimumväärtus	2,39	5,01 (68)	1,18	3,60
	Hilli tõus	–1,04	0,21 (68)	–1,09	–0,99
	Log IC50	–6,19	0,40 (68)	–6,29	–6,10
Noretindroon (14)	Maksimumväärtus	92,27	7,79 (23)	88,90	95,63
	Miinimumväärtus	16,52	10,59 (23)	11,94	21,10
	Hilli tõus	–1,18	0,32 (23)	–1,31	–1,04
	Log IC50	–6,01	0,54 (23)	–6,25	–5,78

Labori pädevuse tõendamine

10.

Tutvuge käesoleva katsemeetodi punktidega 17 ja 18 ning tabeliga 2 peatükis „hrER–GA SEONDUMISE KATSE ELEMENDID“. Iga katse (nii küllastava kui ka konkureeriva seondumise puhul) peaks koosnema kolmest eri päevadel läbi viidavast sõltumatust analüüsitsüklist (st kasutatakse retseptori, kemikaalide ja reaktiivide värskelt valmistatud lahjendusi) ja igas tsüklis tuleks kasutada kolme paralleelproovi.

Retseptori (hr-α-ER) kontsentratsiooni määramine

11.

12.

Retseptorit tuleks konkureerivale seonduvale vastavates tingimustes (st 0,5 nM [3H]östradiool) inkubeerida nominaalsel kontsentratsioonil 0,1, 0,2, 0,4 ja 0,6 nM ilma märgistamata östradioolita (summaarne seondumine) ja koos 1 μM märgistamata östradiooliga (mittespetsiifiline seondumine). Spetsiifiline seondumine, mis arvutatakse summaarse ja mittespetsiifilise seondumise vahena, esitatakse graafikul vastavuses retseptori nominaalse kontsentratsiooniga. Retseptori kontsentratsioon, mille puhul spetsiifilise seondumise määr vastab 40 protsendile lisatud radiomärgise kogusest, on seotud retseptori vastava nominaalse kontsentratsiooniga ja seda retseptori kontsentratsiooni tuleks kasutada küllastava ja konkureeriva seondumise katsetes. Sageli vastab neile tingimustele hrERi lõppkontsentratsioon 0,2 nM.

13.

Kui 40 % kriteeriumi täitmine korduvalt ebaõnnestub, tuleks kontrollida katseplaani võimalike vigade suhtes. Suutmatus saavutada vastavust 40 % kriteeriumile võib viidata sellele, et rekombinantse valgu partiis on väga vähe aktiivset retseptorit, ning sel juhul tuleks kaaluda mõne muu retseptoripartii kasutamist.

Küllastava seondumise katse

14.

[3H]17β-östradiooli tuleks hindamiseks kasutada kaheksas eri kontsentratsioonis, iga kontsentratsiooni puhul kolmes paralleelis, ning kohaldada seejuures järgmist kolme tingimust (vt tabel 2).

a.	Seondumine märgistamata 17β-östradiooli puudumisel ja ERi juuresolekul. Nii määratakse summaarne seondumine, mida väljendab radioaktiivsus kannudes, kus on ainult [3H]17β-östradiool.

Seondumine märgistamata 17β-östradiooli juuresolekul 2000-kordses liias, võrreldes radiomärgistatud 17β-östradiooliga, ning ERi juuresolekuga. Nende tingimuse puhul on eesmärk küllastada aktiivsed seondumiskohad märgistamata 17β-östradiooliga ja määrata kannudes radioaktiivsuse mõõtmise teel mittespetsiifiline seondumine. Radioaktiivse östradiooli mis tahes kogus, mis on veel võimeline retseptoriga seonduma, loetakse olevat seondunud mittespetsiifiliselt, sest märgistamata östradiooli kontsentratsioon peaks olema nii suur, et kõik saadaolevad spetsiifilise seondumise kohad retseptoril on hõivatud.

c.	Seondumine märgistamata 17β-östradiooli puudumisel ja ERi puudumisel (summaarse radioaktiivsuse määramine).

[3H]17β-östradiooli, märgistamata 17β-östradiooli ja hr-α-ERi lahuste valmistamine

15.

[3H]17β-östradiooli 1 μM põhilahusest tuleks valmistada [3H]17β-östradiooli 40 nM lahus DMSOs; selleks lisatakse toatemperatuuril DMSOd (et saada 200 nM lahus) ja analüüsipuhvrit (et saada 40 nM lahus). Saadud 40 nM lahusest valmistatakse toatemperatuuril analüüsipuhvri lisamise teel rida [3H]17β-östradiooli lahjendusi kontsentratsiooniga 0,313 nM kuni 40 nM (nagu on kirjeldatud tabeli 2 kaheteistkümnendas veerus). Lõplik katsekontsentratsioon vahemikus 0,0313–4,0 nM saavutatakse 10 μl sellise lahuse lisamisega 96-kannulise mikrotiiterplaadi vastavasse katsekannu (vt tabelid 2 ja 3). Analüüsipuhvri valmistamist, eriaktiivsusel põhinevat [3H]17β-östradiooli algse põhilahuse kontsentratsiooni arvutamist, lahjenduste valmistamist ning kontsentratsiooni määramist on põhjalikult kirjeldatud CERI katse-eeskirjas (2).

16.

Märgistamata 17β-östradiooli lahuse lahjenduste valmistamiseks tuleks kasutada 17β-östradiooli 1 nM põhilahust, millele lisatakse analüüsipuhvrit, et saada kaheksa eri kontsentratsioonidega lahust, mille kontsentratsioon jääb algselt vahemikku 0,625 μM kuni 80 μM. Lõplik katsekontsentratsioon vahemikus 0,0625–8 μM saavutatakse 10 μl sellise lahuse lisamisega 96-kannulise mikrotiiterplaadi vastavasse katsekannu, mis on ette nähtud mittespetsiifilise seondumise mõõtmiseks (vt tabelid 2 ja 3). Märgistamata 17β-östradiooli lahjenduste valmistamist on põhjalikult kirjeldatud CERI katse-eeskirjas (2).

17.

Tuleks kasutada retseptori sellist kontsentratsiooni, mille puhul spetsiifiline seondumine on 40 ± 10 % (vt punktid 12–13). hr-α-ERi lahus tuleks valmistada jääkülma analüüsipuhvri lisamise teel vahetult enne kasutamist, st pärast seda, kui kõik summaarse seondumise, mittespetsiifilise seondumise ja ainult radioaktiivse ligandi määramiseks ette nähtud kannud on katseks ette valmistatud.

18.

96-kannulised mikrotiiterplaadid valmistatakse ette vastavalt tabelis 2 esitatud skeemile, kus [3H]17β-östradiooli iga kontsentratsiooni puhul kasutatakse kolme paralleelproovi. Kasutatavad [3H]17β-östradiooli, märgistamata 17β-östradiooli, puhvri ja retseptori kogused on esitatud tabelis 3.

Tabel 2

Küllastava seondumise katses kasutatav mikrotiiterplaadi skeem

1 (*10)

2 (*10)

3 (*10)

4 (*10)

5 (*10)

6 (*10)

7 (*10)

8 (*10)

9 (*10)

11 (*11)

12 (*11)

SSi mõõtmiseks

MSSi mõõtmiseks

Ainult radioaktiivse ligandi määramiseks

Märgistamata E2 lahjendused plaadi 4.–6. tulba jaoks

[3H]E2 lahjendused plaadi 1.–9. tulba jaoks

0,0313 nM [3H]E2+ ER

0,0313 nM [3H]E2+ 0,0625 μM E2+ ER

0,0313 nM

0,625 μM

0,313 nM

0,0625 nM [3H]E2+ ER

0,0625 nM [3H]E2+ 0,125 μM E2+ ER

0,0625 nM

1,25 μM

0,625 nM

0,125 nM [3H]E2+ ER

0,125 nM [3H]E2+ 0,25 μM E2+ ER

0,125 nM

2,5 μM

1,25 nM

0,250 nM [3H]E2+ ER

0,250 nM [3H]E2+ 0,5 μM E2+ ER

0,250 nM

5 μM

2,5 nM

0,50 nM [3H]E2+ ER

0,50 nM [3H]E2+ 1 μM E2+ ER

0,50 nM

10 μM

5 nM

1,00 nM [3H]E2+ ER

1,00 nM [3H]E2+ 2 μM E2+ ER

1,00 nM

20 μM

10 nM

2,00 nM [3H]E2+ ER

2,00 nM [3H]E2+ 4 μM E2+ ER

2,00 nM

40 μM

20 nM

4,00 nM [3H]E2+ ER

4,00 nM [3H]E2+ 8 μM E2+ ER

4,00 nM

80 μM

40 nM

SS	-	summaarne seondumine
MSS	-	mittespetsiifiline seondumine
[3H]E2	-	[3H]17β-östradiool
E2	-	märgistamata 17β-östradiool

Tabel 3

Reaktiivide kogused küllastamiskatses kasutataval mikrotiiterplaadil

Tulba number		1	2	3	4	5	6	7 (*12)	8 (*12)	9 (*12)
Katseetapid		SSi kannud			MSSi kannud			Ainult radioaktiivne ligand
Eespool kirjeldatud reaktsioonikannudesse lisatavate komponentide kogused ja lisamise järjekord	Puhver	60 μl			50 μl			90 μl
	Märgistamata E2 tabeli 2 üheteistkümnendast veerust	–			10 μl			–
	[3H]E2 tabeli 2 kaheteistkümnendast veerust	10 μl			10 μl			10 μl
	hr-α-ER	30 μl			30 μl			—
Reaktsiooni koguruumala		100 μl			100 μl			100 μl
Inkubeerimine		PÄRAST 2 TUNNI PIKKUST INKUBEERIMIST						Radioaktiivsuse kvantifitseerimine kohe pärast lahuse valmistamist; inkubeerimist ei toimu
Töötlus 0,4 % DCCga		Jah			Jah			Ei
0,4 % DCC kogus		100 μl			100 μl			–
Filtrimine		Jah			Jah			Ei
RADIOAKTIIVSUSE MÕÕTMINE DPM-DES
Stsintillatsioonikokteilile kvantifitseerimiseks lisatav kogus		100 μl (*13)			100 μl (*13)			50 μl

19.

Summaarse seondumise ja mittespetsiifilise seondumise määramiseks kasutatavaid mikrotiiterplaate tuleks inkubeerida toatemperatuuril (22–28 °C) kaks tundi.

hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiooli mõõtmine

20.

Pärast kahetunnist inkubatsiooniperioodi tuleks hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiooli eraldamiseks vabast [3H]17β-östradioolist lisada kannudesse 100 μl jääkülma 0,4 % DCC suspensiooni. Seejärel tuleks plaadid asetada 10 minutiks jääle ning DCC eraldamiseks tuleks reaktsioonisegu ja DCC suspensioon kanda filtrimiseks mikrotiiterplaadifiltrile. Järgnevalt tuleks 100 μl filtraati lisada vedelikstsintillatsiooniloenduri viaalis olevale stsintillatsioonivedelikule, et määrata vedelikstsintillatsiooniloenduri abil igas viaalis lagunemiste arv minutis (dpm).

21.

Kui mikrotiiterplaadifilter ei ole kättesaadav, võib DCC eemaldamiseks kasutada tsentrifuugimist. Seejärel tuleks DCC puudutamisest tuleneda võiva kannude saastumise ärahoidmiseks väga ettevaatlikult võtta 50 μl supernatanti, mis sisaldab hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiooli, ning kasutada seda stsintillatsioonide loendamiseks.

22.

Ainult radioaktiivset ligandi sisaldavaid proove kasutatakse selleks, et määrata katsekannudesse lisatud [3H]17β-östradioolis toimuvate lagunemiste arv minutis (dpm). Radioaktiivsus tuleks kvantifitseerida vahetult pärast proovide valmistamist. Kõnealuseid kanne ei tohiks inkubeerida ega töödelda DCC suspensiooniga, vaid nende sisu tuleks lisada otse stsintillatsioonivedelikku. Saadavatest mõõtmistulemustest nähtub, kui palju [3H]17β-östradiooli lisati dpm-des iga rühma kannudesse summaarse seondumise ja mittespetsiifilise seondumise hindamiseks.

Konkureeriva seondumise katse

23.

Kontrollid

24.

Katse läbiviimisel tuleks igas analüüsitsüklis kasutada paralleelset lahustiga kontrolli ja teisi kontrolle (st võrdlusöstrogeeni, nõrgalt seonduvat ainet ja mitteseonduvat ainet). Igas analüüsitsüklis tuleks ühel plaadil kasutada võrdlusöstrogeeni ja kontrollaineid (st nõrgalt seonduvat ainet ja mitteseonduvat ainet) täieliku kontsentratsioonikõvera ulatuses. Kõikidele ülejäänud plaatidele tuleks kanda i) E2 ja nõrgalt seonduv aine suures (maksimaalsele väljatõrjumisele vastavas, st radiomärgistatud ligandi praktiliselt täielikuks väljatõrjumiseks vajalikus) ja keskmises (umbes IC50-le vastavas) kontsentratsioonis kolmes paralleelis ning ii) lahustiga kontroll ja mittespetsiifilise seondumise kontroll, kumbki kolmes paralleelis. Analüüsipuhvri, [3H]17β-östradiooli, hr-α-ERi ja uuritava kemikaali lahuste valmistamist on põhjalikult kirjeldatud CERI katse-eeskirjas (2).

Lahustiga kontroll

25.

Lahustiga kontroll võimaldab tõendada, et lahusti ei mõjuta katsesüsteemi, ja ühtlasi mõõta summaarset seondumist (SS). Eelistatud lahusti on DMSO. Kui uuritav kemikaal on suurimal kontsentratsioonil DMSOs mittelahustuv, võib lahustina kasutada etanooli. DMSO lõppkontsentratsioon katsekannudes peaks olema 2,05 %; kui uuritav kemikaal on vähelahustuv, võib DMSO sisaldust suurendada kuni 2,5 protsendini. DMSOd ei tohiks kasutada kontsentratsioonis üle 2,5 %, sest suuremal kontsentratsioonil hakkab lahusti mõjutama katsetulemusi. Kui uuritav kemikaal ei ole DMSOs lahustuv, kuid lahustub etanoolis, võib katses kasutada etanooli maksimaalses kontsentratsioonis 2 %, ilma et see mõjutaks katsetulemusi.

Puhvrikontroll

26.

Tugevalt seonduv aine (võrdlusöstrogeen)

27.

17β-östradiool (CASi nr: 50-28-2) on ERi endogeenne ligand ja seondub retseptori α-vormiga suure afiinsusega. Igas hr-α-ERiga tehtavas konkureeriva seondumise katses tuleks kasutada märgistamata 17β-östradiooli standardkõverat, et oleks võimalik hinnata katsetulemuste varieeruvust samas laboris pikema aja jooksul. DMSOs ja analüüsipuhvris tuleks valmistada kaheksa märgistamata 17β-östradiooli lahust; lõppkontsentratsioonid standardkõverate saamiseks kasutatavates katsekannudes on järgmised: 10–6, 10–7, 10–8, 10–8,5, 10–9, 10–9,5, 10–10, 10–11 M. Märgistamata 17β-östradiooli suurimat kontsentratsiooni (1 μM) kasutatakse ka mittespetsiifilise seondumise hindamiseks. See kontsentratsioon on tabelis 4 tähistatud märgisega „MSS“, kuigi see on samuti osa standardkõverast.

Nõrgalt seonduv aine

28.

Igas analüüsitsüklis tuleks tundlikkuse tõendamiseks ja pikema aja jooksul saadud tulemuste varieeruvuse hindamiseks kasutada ka nõrgalt seonduvat ainet (noretünodreeli (CASi nr: 68-23-5) või noretindrooni (CASi nr: 68-22-4)). Nõrgalt seonduvast ainest tuleks valmistada DMSOs ja analüüsipuhvris kaheksa lahust; katsekannudes kasutatavad lõppkontsentratsioonid on järgmised: 10–4,5, 10–5,5, 10–6, 10–6,5, 10–7, 10–7,5, 10–8 ja 10–9 M.

Mitteseonduv aine

29.

Negatiivse kontrollina (mitteseonduva ainena) tuleks kasutada oktüültrietoksüsilaani (OTES; CASi nr: 2943-75-1). Sellega tagatakse, et katse käigus on võimalik tuvastada hr-α-ERiga mitteseonduvaid uuritavaid kemikaale. Mitteseonduvast ainest tuleks valmistada DMSOs ja analüüsipuhvris kaheksa lahust; katsekannudes kasutatavad lõppkontsentratsioonid on järgmised: 10–3, 10–4, 10–5, 10–6, 10–7, 10–8, 10–9, 10–10 M. Alternatiivse mitteseonduva ainena võib kasutada di-n-butüülftalaati (DBP; CASi nr: 84-72-2), ent seda võib analüüsida üksnes kontsentratsioonini 10–4 M. DBP maksimaalne lahustuvus katsetingimustes on teadaolevalt 10–4 M.

hr-α-ERi kontsentratsioon

30.

Tuleks kasutada sellist retseptori kogust, mille puhul spetsiifiline seondumine on 40 ± 10 % (vt 3. liite punktid 12–13). hr-α-ERi lahus, mis saadakse funktsionaalse hr-α-ERi lahjendamisel jääkülmas analüüsipuhvris, tuleks valmistada vahetult enne kasutamist.

[3H]17β-östradiool

31.

[3H]17β-östradiooli lõppkontsentratsioon katsekannudes peaks olema 0,5 nM.

Uuritavad kemikaalid

32.

Iga uuritava kemikaali puhul on esmalt vaja läbi viia lahustuvuskatse, et määrata lahustuvuspiir ja teha kindlaks katse-eeskirja järgimiseks sobiv kontsentratsioonivahemik. Iga uuritava kemikaali lahustuvuspiir tuleb algselt määrata lahustis ja seejärel kontrollida seda katsetingimustes. Katses kasutatav lõppkontsentratsioon ei tohiks olla suurem kui 1 mM. Kontsentratsioonivahemiku leidmise katses kasutatakse lahustiga kontrolli koos vähemalt kaheksa järjestikuse üksteisest log-ühiku võrra erineva lahjendusega, mille puhul alustatakse maksimaalsest vastuvõetavast kontsentratsioonist (nt 1 mM või väiksem, olenevalt lahustuvuspiirist), ja registreeritakse nähtava hägu või sademe tekkimine (vt ka 3. liite punkt 35). Kui katse jaoks sobiv kontsentratsioonivahemik on kindlaks tehtud, tuleks uuritavat kemikaali analüüsida eelnevas kontsentratsioonivahemiku leidmise katses kindlaks tehtud kaheksal üksteisest log-ühiku võrra erineval kontsentratsioonil. Teises ja kolmandas katses tuleks kontsentratsioone vajaduse korral kohandada, et kontsentratsioonist sõltuvuse kõverat oleks võimalik paremini iseloomustada.

33.

Uuritava kemikaali lahjendused tuleks valmistada sobivas lahustis (vt 3. liite punkt 25). Kui uuritava kemikaal ei lahustu suurimal kontsentratsioonil DMSOs ega etanoolis ja suurema koguse lahusti lisamisel tõuseks lahusti sisaldus lõpplahuses üle lubatud piirmäära, võib suurima kontsentratsioonina kasutada lahjenduste reas järgmist väiksemat kontsentratsiooni. Sellisel juhul võib lisada kontsentratsioonirea lahjemasse otsa ühe lisalahjenduse. Teised kontsentratsioonid lahjenduste reas tuleks jätta muutmata.

34.

35.

Kui eelnevalt on olemas muudest allikatest pärinev teave uuritava kemikaali log IC50 kohta, võib olla asjakohane kasutada lahjenduste geomeetrilist väiksema sammuga jaotust eeldatava log IC50 ümber (nt sammuga 0,5 log-ühikut). Lõpptulemuses peaks kajastuma piisav kontsentratsioonide ulatus kummalgi pool log IC50 väärtust, sealhulgas kõvera ülemine ja alumine osa, nii et seondumiskõverat oleks võimalik piisavalt iseloomustada.

Katseplaatide kasutusskeemid

36.

Tähistatud mikrotiiterplaatide ettevalmistamisel tuleks lähtuda sellest, et katses kasutatakse lahustiga kontrolli, võrdlusöstrogeeni (E2) suurimat kontsentratsiooni – selle abil hinnatakse ühtlasi mittespetsiifilist seondumist (MSS) – ja puhvrikontrolli kuues paralleelis ning mitteseonduva kontrollaine (oktüültrietoksüsilaani) kaheksat kontsentratsiooni, võrdlusöstrogeeni (E2) seitset väiksemat kontsentratsiooni, nõrgalt seonduva aine (noretünodreeli või noretindrooni) kaheksat kontsentratsiooni ja iga uuritava kemikaali (UK) kaheksat kontsentratsiooni kolmes paralleelis. Võrdlusöstrogeeni ja kontrollide täielikke kontsentratsioonikõveraid hõlmav plaadi näidisskeem on esitatud tabelis 4. Uuritavate kemikaalide analüüsimiseks kasutatakse eraldi mikrotiiterplaate, mis peaksid sisaldama ka järgmisi plaadikontrolle: i) E2 ja nõrgalt seonduvat ainet suures (maksimaalsele väljatõrjumisele vastavas) ja keskmises (umbes IC50-le vastavas) kontsentratsioonis, kõikidel juhtudel kolmes paralleelis; ii) lahustiga kontrolli (summaarse seondumise hindamiseks) ja mittespetsiifilise seondumise kontrolli, kummalgi juhul kuues paralleelis (tabel 5). Konkureeriva seondumise katses kasutatavale mikrotiiterplaadi skeemile vastav näidistööleht kolme tundmatu uuritava kemikaali analüüsimiseks on esitatud liites 3.3. Töölehel ning tabelites 4 ja 5 on esitatud igas katsekannus kasutatavad lõppkontsentratsioonid. E2 maksimaalne kontsentratsioon peaks olema 1 × 10–7 M ja nõrgalt seonduva aine puhul tuleks kasutada 1. plaadil kasutatud suurimat kontsentratsiooni. IC50 tuleb laboris määrata kontrollidega varem saadud tulemuste andmebaasi alusel. Eeldatavalt on see väärtus sarnane valideerimisuuringutes täheldatud väärtusega (vt tabel 1).

Tabel 4

Konkureeriva seondumise katses kasutatav mikrotiiterplaadi skeem (96), (97), mis hõlmab võrdlusöstrogeeni ja kontrollide täielikke kontsentratsioonikõveraid (1. plaat)

Puhvrikontroll ja positiivne kontroll (E2)

Nõrgalt positiivne aine (noretünodreel)

Negatiivne kontroll (OTES)

SS ja MSS

Tühi kann (*14)

1 × 10–9 M

1 × 10–10 M

SS (lahustiga kontroll) (2,05 % DMSO)

E2 (1 × 10–11 M)

1 × 10–8 M

1 × 10–9 M

E2 (1 × 10–10 M)

1 × 10–7,5 M

1 × 10–8 M

MSS (10–6 M E2)

E2 (1 × 10–9,5 M)

1 × 10–7 M

E2 (1 × 10–9 M)

1 × 10–6,5 M

1 × 10–6 M

Puhvrikontroll

E2 (1 × 10–8,5 M)

1 × 10–6 M

1 × 10–5 M

E2 (1 × 10–8 M)

1 × 10–5,5 M

1 × 10–4 M

Tühiproov (radiomärgise jaoks) (*15)

E2 (1 × 10–7 M)

1 × 10–4,5 M

1 × 10–3 M

Tabel 5

Konkureeriva seondumise katses kasutatav mikrotiiterplaadi skeem uuritavaid kemikaale (UK) ja plaadikontrolle sisaldavate ülejäänud plaatide jaoks

Uuritav kemikaal nr 1 (UK-1)

Uuritav kemikaal nr 2 (UK-2)

Uuritav kemikaal nr 3 (UK-3)

Kontrollid

UK-1 (1 × 10–10 M)

UK-2 (1 × 10–10 M)

UK-3 (1 × 10–10 M)

E2 (1 × 10 -7 M)

UK-1 (1 × 10–9 M)

UK-2 (1 × 10–9 M)

UK-3 (1 × 10–9 M)

E2 (IC50)

UK-1 (1 × 10–8 M)

UK-2 (1 × 10–8 M)

UK-3 (1 × 10–8 M)

NE (1 × 10 -4,5 M)

UK-1 (1 × 10–7 M)

UK-2 (1 × 10–7 M)

UK-3 (1 × 10–7 M)

NE (IC50)

UK-1 (1 × 10–6 M)

UK-2 (1 × 10–6 M)

UK-3 (1 × 10–6 M)

MSS (10–6 M E2)

UK-1 (1 × 10–5 M)

UK-2 (1 × 10–5 M)

UK-3 (1 × 10–5 M)

UK-1 (1 × 10–4 M)

UK-2 (1 × 10–4 M)

UK-3 (1 × 10–4 M)

SS (lahustiga kontroll)

UK-1 (1 × 10–3 M)

UK-2 (1 × 10–3 M)

UK-3 (1 × 10–3 M)

Selles näites on nõrgalt seonduv aine noretinodreel (NE).

Konkureeriva seondumise katse lõpetamine

37.

Nagu on näidatud tabelis 6, tuleks igasse kannu – välja arvatud summaarse seondumise ja tühiproovide (radiomärgise) analüüsimiseks ette nähtud kannud – lisada 50 μl analüüsipuhvrit ja seejärel 10 μl lahustiga kontrolli, võrdlusöstrogeeni (E2), nõrgalt seonduvat ainet, mitteseonduvat ainet või uuritavat kemikaali ning 10 μl 5 nM [3H]17β-östradiooli lahust. Seejärel lisatakse igasse kannu 30 μl jääkülma retseptorilahust ja segatakse saadud lahust ettevaatlikult. hr-α-ERi lahus tuleks lisada viimasena. Katses kasutatavaid mikrotiiterplaate inkubeeritakse toatemperatuuril (22–28 °C) kaks tundi.

Tabel 6

hrERil põhineva konkureeriva seondumise katse komponentide kogused mikrotiiterplaadil

Ettevalmistusetapid		Muud kannud peale SSi kannude	SSi kannud	Tühiproov (radiomärgise jaoks)
Eespool kirjeldatud reaktsioonikannudesse lisatavate komponentide kogused ja lisamise järjekord	Toatemperatuuril analüüsipuhver	50 μl	60 μl	90 μl
	Märgistamata E2, nõrgalt seonduv aine, mitteseonduv aine, lahusti või uuritav kemikaal (*16)	10 μl	—	—
	[3H]17β-östradiool kontsentratsioonis, mille puhul saadav lõppkontsentratsioon on 0,5 nM (st 5 nM)	10 μl	10 μl	10 μl
	Määratud kontsentratsiooniga hr-α-ERi lahus (vt punktid 12–13)	30 μl	30 μl	—
Lõppruumala igas katsekannus		100 μl	100 μl	100 μl

38.

Seejärel tuleks viia läbi hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiooli kvantifitseerimine pärast seda, kui hr-α-ERiga seondunud [3H]17β-östradiool on eraldatud vabast [3H]17β-östradioolist igasse kannu 100 μl jääkülma DCC suspensiooni lisamise teel, nagu on kirjeldatud küllastava seondumise katset käsitlevates 3. liite punktides 21–23.

39.

Kannusid G10–G12 ja H10–H12 (tabelis 4 tähistatud kui tühiproovid (radiomärgise jaoks)) kasutatakse 10 μl [3H]-ga märgistatud östradiooli radioaktiivsuse määramiseks dpm-des. 10 μl suurused alikvoodid tuleks lisada otse stsintillatsioonivedelikku.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

Küllastava seondumise katse

40.

Spetsiifilise seondumise kõver peaks jõudma [3H]17β-östradiooli kontsentratsiooni suurenedes platoole; see viitab hr-α-ERi küllastumisele ligandiga.

41.

Spetsiifiline seondumine [3H]17β-östradiooli kontsentratsioonil 0,5 nM peaks jääma vastuvõetavasse vahemikku 30–50 % eri analüüsitsüklites mõõdetud, lisatud radiomärgise kogusele vastava summaarse radioaktiivsuse näitajate keskväärtusest. Aeg-ajalt esinevad väikesed kõrvalekalded sellest vahemikust on lubatud, ent kui analüüsitsüklites saadud tulemused on pidevalt sellest vahemikust väljaspool või mõnes konkreetses analüüsitsüklis saadud väärtus jääb sellest vahemikust väga kaugele, tuleks valgu kontsentratsiooni kohandada ja küllastamiskatset korrata.

42.

Andmed peaksid võimaldama saada lineaarse Scatchardi graafiku.

43.

Konkureeriva seondumise katse

44.

Märgistamata 17β-östradiool peaks kontsentratsiooni suurenedes tõrjuma [3H]17β-östradiooli retseptorilt välja viisil, mis vastab konkureerivale seondumisele ühes seondumiskohas.

45.

Võrdlusöstrogeeni (st 17β-östradiooli) IC50 väärtus peaks olema ligikaudselt võrdne [3H]17β-östradiooli molaarse kontsentratsiooni ja küllastava seondumise katses määratud Kd summaga.

46.

Spetsiifiline seondumine peaks järjepidevalt olema vastuvõetavas vahemikus 40 ± 10 %, kui igas kannus täheldatavale summaarsele radioaktiivsusele vastav lisatud radiomärgise keskmine mõõdetud kontsentratsioon on eri analüüsitsüklite lõikes 0,5 nM. Aeg-ajalt esinevad väikesed kõrvalekalded sellest vahemikust on lubatud, ent kui analüüsitsüklites saadud tulemused on pidevalt sellest vahemikust väljaspool või mõnes konkreetses analüüsitsüklis saadud väärtus jääb sellest vahemikust väga kaugele, tuleks valgu kontsentratsiooni kohandada.

47.

48.

Mitteseonduv aine ei tohiks tõrjuda hr-α-ERilt välja rohkem kui 25 % [3H]17β-östradioolist, kui sellist ainet analüüsitakse kontsentratsioonil kuni 10–3 M (OTES) või 10–4 M (DBP).

49.

Tulemuslikkuse kriteeriumide väljatöötamiseks võrdlusöstrogeeni ja kahe nõrgalt seonduva aine (nt noretünodreeli ja noretindrooni) jaoks on kasutatud hrERiga seondumist analüüsida võimaldava CERI meetodi valideerimise uuringu andmeid (allikas 2, N lisa). Valideerimisuuringus osalenud neljas laboris tehtud kõikide kontrollkatsete tulemuste puhul on keskväärtuse ± SD (n) kõrval esitatud ka usaldusvahemik usaldusnivool 95 %. Usaldusvahemik usaldusnivool 95 % on arvutatud võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduvaid aineid iseloomustavate lähenduskõvera parameetrite (st maksimumi, miinimumi, Hilli tõusu, log IC50) jaoks ning võrdlusöstrogeeni suhtes väljendatava nõrgalt seonduvate ainete log10 RBA jaoks. Tabelis 1 on esitatud tulemuslikkuse kriteeriumidena kasutatavate lähenduskõvera parameetrite eeldatavad väärtusevahemikud. Praktikas võib IC50 väärtuste vahemik retseptoripreparaadi katseliselt määratud Kd-st ja katses kasutatavast ligandi kontsentratsioonist sõltuvalt pisut varieeruda.

50.

Uuritavate kemikaalide jaoks ei ole lähenduskõvera parameetreid käsitlevaid tulemuslikkuse kriteeriume kindlaks määratud, kuna olemasolevate võimalike uuritavate kemikaalide hulk on lai ning nende võimalik afiinsus ja saadavad tulemused varieeruvad (nt täielik kõver, osaline kõver, sobiva kõvera puudumine). Uuritava kemikaaliga igas analüüsitsüklis saadud tulemuste hindamisel tuleks siiski lähtuda eksperdihinnangust. Tuleks kasutada piisavalt suurt uuritava kemikaali kontsentratsioonide vahemikku, et konkureeriva seondumise kõvera ülemine osa (nt osa, kus seondumine on 90–100 %) selgelt välja joonistuks. Paralleelproovide vaheline varieeruvus igal uuritava kemikaali kontsentratsioonil ja kolme järjestikuse analüüsitsükli vaheline varieeruvus peaks olema mõõdukas ja teaduslikult põhjendatav. Uuritava kemikaali hindamisel peaksid kontrollidega saadud tulemused igas analüüsitsüklis ligilähedaselt vastama CERI meetodit iseloomustavatele tulemusnäitajatele ja olema kooskõlas asjaomases laboris kontrollidega varem saadud tulemustega.

ANDMEANALÜÜS

Küllastava seondumise katse

51.

52.

Konkureeriva seondumise katse

53.

54.

Positiivsete kontrollide (nt võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva aine) log IC50 hinnanguliste väärtuste kindlakstegemiseks tuleks kasutada sobivat mittelineaarse kõvera lähendamise tarkvara, milles rakendatakse neljaparameetrilist Hilli võrrandit (nt BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995). Kõnealuste kõverate lähendamisel tuleks kõvera ülemine ja alumine osa, tõus ja log IC50 üldjuhul jätta piiritlemata. Parima lähenduskõvera leidmiseks tuleks kasutada robustset regressioonanalüüsi, v.a juhul, kui esitatakse põhjendus muu lähenemisviisi kasutamise kohta. Andmeid ei tohiks korrigeerida ligandi väljatõrjumise suhtes. Pärast esmast analüüsi tuleks iga seondumiskõver üle vaadata, et veenduda mudeli ja andmete omavahelises sobivuses. Nõrgalt seonduva aine suhtelise seondumisafiinsuse (RBA) leidmiseks tuleks arvutada nõrgalt seonduva aine log IC50 väärtuse protsentuaalne osakaal 17β-östradiooli log IC50 väärtusest. Positiivsete kontrollidega ja mitteseonduval ainel põhineva kontrolliga saadud tulemusi tuleks hinnata lähtuvalt käesoleva 3. liite punktide 44–49 kohastest katsemeetodi tulemuslikkuse näitajatest.

55.

Kõigi uuritavate kemikaalide andmete analüüsimisel tuleks kasutada astmelist lähenemist, et tagada andmete asjakohane analüüs ja kõigi konkureeriva seondumise kõverate nõuetekohane liigitamine. Soovitatavalt tuleks uuritava kemikaaliga läbi viidud iga analüüsitsükli puhul esmalt rakendada täpselt sama standardiseeritud andmeanalüüsi, mida kasutatakse võrdlusöstrogeenil ja nõrgalt seonduval ainel põhinevate kontrollide puhul (vt käesoleva 3. liite punkt 54). Pärast esmast analüüsi tuleks iga analüüsitsükli puhul teha lähenduskõvera parameetrite tehniline kontroll ja visuaalselt hinnata, kui hästi sobituvad seondumisandmed saadud konkureeriva seondumise kõveraga. Tehnilise kontrolli käigus täheldatav kontsentratsioonist sõltuv [3H]17β-östradiooli spetsiifilise seondumise protsentuaalse määra vähenemine, tehniliste paralleelproovide andmete vaheline väike varieeruvus kemikaali kõigil kontsentratsioonidel ja lähenduskõvera parameetrite sarnased väärtused kolmes analüüsitsüklis viitavad sellele, et katse ja andmeanalüüs on läbi viidud nõuetekohaselt.

Andmete tõlgendamine

56.

Kui kõik nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal hr-α-ERiga seonduvaks, kui seondumiskυver sobitub andmetega ja katseandmete vahemikku jδδvale sυltuvuskυvera madalaimale punktile vastav vδδrtus on vδiksem kui 50 % (joonis 1).

57.

Kui kυik nυuetekohasuse kriteeriumid on tδidetud, loetakse uuritav kemikaal hr-α-ERiga mitteseonduvaks, kui:

—	seondumiskõver sobitub andmetega ja katseandmete vahemikku jäävale lähendatud sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus on suurem kui 75 % või

—	sobiv seondumiskõver puudub ja väikseim silumata keskmine seondumisprotsent eri kontsentratsioonidel saadud andmete hulgas on suurem kui 75 %.

58.

Kui ükski eespool kirjeldatud tingimus ei ole täidetud (nt lähendatud sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus on vahemikus 75–50 %), liigitatakse uuritav kemikaal ebaselgeks.

Tabel 7

Uuritava kemikaali konkureeriva seondumise kõveral põhinevad liigitamiskriteeriumid

Liigitus	Kriteeriumid
Seonduva	Seondumiskõver sobitub andmetega. Katseandmete vahemikku jäävale sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus on väiksem kui 50 %.
Mitteseonduvb	Seondumiskõvera sobitumisel andmetega on katseandmete vahemikku jäävale lähendatud sõltuvuskõvera madalaimale punktile vastav väärtus suurem kui 75 %. Sobiva seondumiskõvera puudumisel on väikseim silumata keskmine seondumisprotsent eri kontsentratsioonidel saadud andmete hulgas suurem kui 75 %.
Ebaselgec	Ükskõik millises nõuetekohases analüüsitsüklis saadud tulemus, mille alusel ei saa uuritavat kemikaali liigitada seonduvaks aineks ega mitteseonduvaks aineks (näiteks vastab lähendatud sõltuvuskõvera madalaim punkt väärtusele 75–50 %).

Joonis 1.

Näited uuritava kemikaali liigitamise kohta konkureeriva seondumise kõvera alusel

59.

Tabel 8

Meetod uuritava kemikaali liigitamiseks samas laboris läbi viidud mitme analüüsitsükli alusel

Iga analüüsitsükli tulemusele väärtuse omistamine
Liigitus	Arvväärtus
Seonduv	2
Ebaselge	1
Mitteseonduv	0
Liigitamine eri analüüsitsüklites saadud arvväärtuste keskmise alusel
Liigitus	Arvväärtus
Seonduv	Keskmine ≥ 1,5
Ebaselge	0,5 ≤ keskmine < 1,5
Mitteseonduv	Keskmine < 0,5

KATSEPROTOKOLL

60.

Vt käesoleva katsemeetodi punkt 24 peatükis „hrER-GA SEONDUMISE KATSE ELEMENDID“.

Liide 3.1

MÕISTETE LOETELU

[3H]E2 – triitiumiga radiomärgistatud 17β-östradiool.

Analüüsipuhver – 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 % glütserooli, 0,2 mM leupeptiin, 1 mM ditiotreitool ja veise seerumi albumiin kontsentratsioonis 10 mg/ml.

Analüüsitsükkel – mikrotiiterplaadi katsekannude täieliku komplekti üheaegne analüüs, mille tulemusena saadakse kogu vajalik teave uuritava kemikaali ja hr-α-ERi omavahelise seondumise iseloomustamiseks (nimelt katsekannu lisatud [3H]17β-östradiooli üldkogus, [3H]17β-östradiooli maksimaalne seondumismäär hr-α-ERiga seondumisel, mittespetsiifilise seondumise määr ja summaarse seondumise määr uuritava kemikaali eri kontsentratsioonidel). Analüüsitsüklis võidakse igal kontsentratsioonil kasutada ka ainult ühte katsekannu (st paralleeli), ent kuna käesolevas katse-eeskirjas nõutakse kolme paralleelproovi kasutamist, analüüsitakse käesoleval juhul ühes analüüsitsüklis iga kontsentratsiooni puhul kolme katsekannu. Peale selle viiakse käesoleva katse-eeskirja kohaselt iga kemikaaliga läbi kolm iseseisvat (st järjestikust) analüüsitsüklit.

DCC – dekstraaniga kaetud süsi.

E2 – märgistamata 17β-östradiool (inertne).

hr-α-ER – rekombinantne inimese α-östrogeeniretseptor (ligandiga seonduv domeen).

Paralleelproov – Üks mitmest kannust, mis sisaldavad samu koostisaineid samas kontsentratsioonis ning mida analüüsitakse üheaegselt samas analüüsitsüklis. Käesoleva katse-eeskirja puhul analüüsitakse uuritavat kemikaali igal kontsentratsioonil kolmes paralleelis, st igal uuritava kemikaali kontsentratsioonil analüüsitakse üheaegselt kolme paralleelproovi.

Liide 3.2

KONKUREERIVA SEONDUMISE KATSES KASUTATAV MIKROTIITERPLAADI SKEEM

Plaat	Asukoht	Paralleelproov	Kannu liik	Kannu kood	Kontsentratsiooni kood	Konkureeriva aine algkontsentratsioon (M)	hrERi põhilahus (μl)	Puhvri kogus (μl)	Märgise (radioaktiivse E2) kogus (μl)	Lahjendusplaadilt lisatav kogus (μl)	Lõppruumala (μl)	Konkureeriva aine lõppkontsentratsioon (M)
S	A1	1	Tühi kann	TK	TK1	—	—	—	—	—	—	—
S	A2	2	Tühi kann	TK	TK2	—	—	—	—	—	—	—
S	A3	3	Tühi kann	TK	TK3	—	—	—	—	—	—	—
S	B1	1	Märgistamata E2	S	S1	1,00E-10	30	50	10	10	100	1,0E-11
S	B2	2	Märgistamata E2	S	S1	1,00E-10	30	50	10	10	100	1,0E-11
S	B3	3	Märgistamata E2	S	S1	1,00E-10	30	50	10	10	100	1,0E-11
S	C1	1	Märgistamata E2	S	S2	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
S	C2	2	Märgistamata E2	S	S2	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
S	C3	3	Märgistamata E2	S	S2	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
S	D1	1	Märgistamata E2	S	S3	3,16E-09	30	50	10	10	100	3,2E-10
S	D2	2	Märgistamata E2	S	S3	3,16E-09	30	50	10	10	100	3,2E-10
S	D3	3	Märgistamata E2	S	S3	3,16E-09	30	50	10	10	100	3,2E-10
S	E1	1	Märgistamata E2	S	S4	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	E2	2	Märgistamata E2	S	S4	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	E3	3	Märgistamata E2	S	S4	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	F1	1	Märgistamata E2	S	S5	3,16E-08	30	50	10	10	100	3,2E-09
S	F2	2	Märgistamata E2	S	S5	3,16E-08	30	50	10	10	100	3,2E-09
S	F3	3	Märgistamata E2	S	S5	3,16E-08	30	50	10	10	100	3,2E-09
S	G1	1	Märgistamata E2	S	S6	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	G2	2	Märgistamata E2	S	S6	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	G3	3	Märgistamata E2	S	S6	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	H1	1	Märgistamata E2	S	S7	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	H2	2	Märgistamata E2	S	S7	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	H3	3	Märgistamata E2	S	S7	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	A4	1	Noretünodreel	NE	WP1	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	A5	2	Noretünodreel	NE	WP1	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	A6	3	Noretünodreel	NE	WP1	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	B4	1	Noretünodreel	NE	WP2	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	B5	2	Noretünodreel	NE	WP2	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	B6	3	Noretünodreel	NE	WP2	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	C4	1	Noretünodreel	NE	WP3	3,16E-07	30	50	10	10	100	3,2E-08
S	C5	2	Noretünodreel	NE	WP3	3,16E-07	30	50	10	10	100	3,2E-08
S	C6	3	Noretünodreel	NE	WP3	3,16E-07	30	50	10	10	100	3,2E-08
S	D4	1	Noretünodreel	NE	WP4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	D5	2	Noretünodreel	NE	WP4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	D6	3	Noretünodreel	NE	WP4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	E4	1	Noretünodreel	NE	WP5	3,16E-06	30	50	10	10	100	3,2E-07
S	E5	2	Noretünodreel	NE	WP5	3,16E-06	30	50	10	10	100	3,2E-07
S	E6	3	Noretünodreel	NE	WP5	3,16E-06	30	50	10	10	100	3,2E-07
S	F4	1	Noretünodreel	NE	WP6	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	F5	2	Noretünodreel	NE	WP6	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	F6	3	Noretünodreel	NE	WP6	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	G4	1	Noretünodreel	NE	WP7	3,16E-05	30	50	10	10	100	3,2E-06
S	G5	2	Noretünodreel	NE	WP7	3,16E-05	30	50	10	10	100	3,2E-06
S	G6	3	Noretünodreel	NE	WP7	3,16E-05	30	50	10	10	100	3,2E-06
S	H4	1	Noretünodreel	NE	WP8	3,16E-04	30	50	10	10	100	3,2E-05
S	H5	2	Noretünodreel	NE	WP8	3,16E-04	30	50	10	10	100	3,2E-05
S	H6	3	Noretünodreel	NE	WP8	3,16E-04	30	50	10	10	100	3,2E-05
S	A7	1	OTES	N	OTES1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
S	A8	2	OTES	N	OTES1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
S	A9	3	OTES	N	OTES1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
S	B7	1	OTES	N	OTES2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	B8	2	OTES	N	OTES2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	B9	3	OTES	N	OTES2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
S	C7	1	OTES	N	OTES3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	C8	2	OTES	N	OTES3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	C9	3	OTES	N	OTES3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
S	D7	1	OTES	N	OTES4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	D8	2	OTES	N	OTES4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	D9	3	OTES	N	OTES4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
S	E7	1	OTES	N	OTES5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	E8	2	OTES	N	OTES5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	E9	3	OTES	N	OTES5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	F7	1	OTES	N	OTES6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
S	F8	2	OTES	N	OTES6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
S	F9	3	OTES	N	OTES6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
S	G7	1	OTES	N	OTES7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
S	G8	2	OTES	N	OTES7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
S	G9	3	OTES	N	OTES7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
S	H7	1	OTES	N	OTES8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
S	H8	2	OTES	N	OTES8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
S	H9	3	OTES	N	OTES8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
S	A10	1	Summaarne seondumine	SS	SS1	—	30	60	10	—	100	—
S	A11	2	Summaarne seondumine	SS	SS2	—	30	60	10	—	100	—
S	A12	3	Summaarne seondumine	SS	SS3	—	30	60	10	—	100	—
S	B10	4	Summaarne seondumine	SS	SS4	—	30	60	10	—	100	—
S	B11	5	Summaarne seondumine	SS	SS5	—	30	60	10	—	100	—
S	B12	6	Summaarne seondumine	SS	SS6	—	30	60	10	—	100	—
S	C10	1	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S1	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	C11	2	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S2	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	C12	3	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S3	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	D10	4	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S4	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	D11	5	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	D12	6	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S6	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
S	E10	1	Puhvrikontroll	PK	PK1	—	—	100	—	—	100	—
S	E11	2	Puhvrikontroll	PK	PK2	—	—	100	—	—	100	—
S	E12	3	Puhvrikontroll	PK	PK3	—	—	100	—	—	100	—
S	F10	4	Puhvrikontroll	PK	PK4	—	—	100	—	—	100	—
S	F11	5	Puhvrikontroll	PK	PK5	—	—	100	—	—	100	—
S	F12	6	Puhvrikontroll	PK	PK6	—	—	100	—	—	100	—
S	G10 (*17)	1	Tühiproov (radiomärgise jaoks)	Radiomärgis	H1	—	90	—	10	—	100	—
S	G11 (*17)	2	Tühiproov (radiomärgise jaoks)	Radiomärgis	H2	—	90	—	10	—	100	—
S	G12 (*17)	3	Tühiproov (radiomärgise jaoks)	Radiomärgis	H3	—	90	—	10	—	100	—
S	H10 (*17)	4	Tühiproov (radiomärgise jaoks)	Radiomärgis	H4	—	90	—	10	—	100	—
S	H11 (*17)	5	Tühiproov (radiomärgise jaoks)	Radiomärgis	H5	—	90	—	10	—	100	—
S	H12*	6	Tühiproov (radiomärgise jaoks)	Radiomärgis	H6	—	90	—	10	—	100	—
P1	A1	1	Tundmatu nr 1	T1	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	A2	2	Tundmatu nr 1	T1	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	A3	3	Tundmatu nr 1	T1	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	B1	1	Tundmatu nr 1	T1	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	B2	2	Tundmatu nr 1	T1	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	B3	3	Tundmatu nr 1	T1	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	C1	1	Tundmatu nr 1	T1	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	C2	2	Tundmatu nr 1	T1	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	C3	3	Tundmatu nr 1	T1	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	D1	1	Tundmatu nr 1	T1	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	D2	2	Tundmatu nr 1	T1	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	D3	3	Tundmatu nr 1	T1	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	E1	1	Tundmatu nr 1	T1	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	E2	2	Tundmatu nr 1	T1	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	E3	3	Tundmatu nr 1	T1	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	F1	1	Tundmatu nr 1	T1	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	F2	2	Tundmatu nr 1	T1	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	F3	3	Tundmatu nr 1	T1	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	G1	1	Tundmatu nr 1	T1	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	G2	2	Tundmatu nr 1	T1	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	G3	3	Tundmatu nr 1	T1	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	H1	1	Tundmatu nr 1	T1	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	H2	2	Tundmatu nr 1	T1	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	H3	3	Tundmatu nr 1	T1	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	A4	1	Tundmatu nr 2	T2	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	A5	2	Tundmatu nr 2	T2	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	A6	3	Tundmatu nr 2	T2	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	B4	1	Tundmatu nr 2	T2	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	B5	2	Tundmatu nr 2	T2	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	B6	3	Tundmatu nr 2	T2	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	C4	1	Tundmatu nr 2	T2	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	C5	2	Tundmatu nr 2	T2	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	C6	3	Tundmatu nr 2	T2	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	D4	1	Tundmatu nr 2	T2	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	D5	2	Tundmatu nr 2	T2	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	D6	3	Tundmatu nr 2	T2	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	E4	1	Tundmatu nr 2	T2	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	E5	2	Tundmatu nr 2	T2	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	E6	3	Tundmatu nr 2	T2	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	F4	1	Tundmatu nr 2	T2	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	F5	2	Tundmatu nr 2	T2	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	F6	3	Tundmatu nr 2	T2	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	G4	1	Tundmatu nr 2	T2	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	G5	2	Tundmatu nr 2	T2	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	G6	3	Tundmatu nr 2	T2	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	H4	1	Tundmatu nr 2	T2	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	H5	2	Tundmatu nr 2	T2	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	H6	3	Tundmatu nr 2	T2	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	A7	1	Tundmatu nr 3	T3	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	A8	2	Tundmatu nr 3	T3	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	A9	3	Tundmatu nr 3	T3	1	1,00E-09	30	50	10	10	100	1,0E-10
P1	B7	1	Tundmatu nr 3	T3	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	B8	2	Tundmatu nr 3	T3	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	B9	3	Tundmatu nr 3	T3	2	1,00E-08	30	50	10	10	100	1,0E-09
P1	C7	1	Tundmatu nr 3	T3	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	C8	2	Tundmatu nr 3	T3	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	C9	3	Tundmatu nr 3	T3	3	1,00E-07	30	50	10	10	100	1,0E-08
P1	D7	1	Tundmatu nr 3	T3	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	D8	2	Tundmatu nr 3	T3	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	D9	3	Tundmatu nr 3	T3	4	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,0E-07
P1	E7	1	Tundmatu nr 3	T3	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	E8	2	Tundmatu nr 3	T3	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	E9	3	Tundmatu nr 3	T3	5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	F7	1	Tundmatu nr 3	T3	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	F8	2	Tundmatu nr 3	T3	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	F9	3	Tundmatu nr 3	T3	6	1,00E-04	30	50	10	10	100	1,0E-05
P1	G7	1	Tundmatu nr 3	T3	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	G8	2	Tundmatu nr 3	T3	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	G9	3	Tundmatu nr 3	T3	7	1,00E-03	30	50	10	10	100	1,0E-04
P1	H7	1	Tundmatu nr 3	T3	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	H8	2	Tundmatu nr 3	T3	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	H9	3	Tundmatu nr 3	T3	8	1,00E-02	30	50	10	10	100	1,0E-03
P1	A10	1	Kontroll: E2 (maks.)	S	E2maks1	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,00E-07
P1	A11	2	Kontroll: E2 (maks.)	S	E2maks2	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,00E-07
P1	A12	3	Kontroll: E2 (maks.)	S	E2maks3	1,00E-06	30	50	10	10	100	1,00E-07
P1	B10	1	Kontroll: E2 (IC50)	S	E2IC501	E2 IC50 × 10	30	50	10	10	100	E2 IC50
P1	B11	2	Kontroll: E2 (IC50)	S	E2IC502	E2 IC50 × 10	30	50	10	10	100	E2 IC50
P1	B12	3	Kontroll: E2 (IC50)	S	E2IC503	E2 IC50 × 10	30	50	10	10	100	E2 IC50
P1	C10	1	Kontroll: NE (maks.)	S	NEmaks1	1,00E-3,5	30	50	10	10	100	1,00E-4,5
P1	C11	2	Kontroll: NE (maks.)	S	NEmaks2	1,00E-3,5	30	50	10	10	100	1,00E-4,5
P1	C12	3	Kontroll: NE (maks.)	S	NEmaks3	1,00E-3,5	30	50	10	10	100	1,00E-4,5
P1	D10	1	Kontroll: NE (IC50)	S	NEIC501	NE IC50 × 10	30	50	10	10	100	NE IC50
P1	D11	2	Kontroll: NE (IC50)	S	NEIC502	NE IC50 × 10	30	50	10	10	100	NE IC50
P1	D12	3	Kontroll: NE (IC50)	S	NEIC503	NE IC50 × 10	30	50	10	10	100	NE IC50
P1	E10	1	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S1	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	E11	2	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S2	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	E12	3	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S3	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	F10	4	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S4	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	F11	5	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S5	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	F12	6	Märgistamata E2 (suur)	MSS	S6	1,00E-05	30	50	10	10	100	1,0E-06
P1	G10	1	Summaarne seondumine	SS	SS1	—	30	60	10	—	100	—
P1	G11	2	Summaarne seondumine	SS	SS2	—	30	60	10	—	100	—
P1	G12	3	Summaarne seondumine	SS	SS3	—	30	60	10	—	100	—
P1	H10	4	Summaarne seondumine	SS	SS4	—	30	60	10	—	100	—
P1	H11	5	Summaarne seondumine	SS	SS5	—	30	60	10	—	100	—
P1	H12	6	Summaarne seondumine	SS	SS6	—	30	60	10	—	100	—

4. liide

hrER-IL PÕHINEVA KONKUREERIVA SEONDUMISE KATSE ANDMETE ANALÜÜSIMISE KAALUTLUSED

hr-α-ERil põhineva konkureeriva seondumise katse käigus mõõdetakse ühel kontsentratsioonil kasutatava [3H]17β-östradiooli seondumist üha suuremas kontsentratsioonis esineva uuritava kemikaali juuresolekul. Konkureeriva seondumise kõver esitatakse graafikul nii, et ühel teljel on [3H]17β-östradiooli spetsiifiline seondumine ja teisel konkureeriva aine kontsentratsioon (log10-ühikutes). Uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures [3H]17β-östradiooli spetsiifiline seondumine on 50 % maksimummäärast, on IC50 väärtus.

Võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva aine andmete analüüs (1)

Kontrollidega saadud andmete edasiseks analüüsimiseks need transformeeritakse (st [3H]17β-östradiooli spetsiifilist seondumist väljendatakse protsentides ja kontrollkemikaali kontsentratsiooni logaritmituna). Positiivsete kontrollide (nt võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva aine) log IC50 hinnangulise väärtuse kindlakstegemiseks tuleks kasutada sobivat mittelineaarse kõvera lähendamise tarkvara, milles rakendatakse neljaparameetrilist Hilli võrrandit (nt BioSoft; GraphPad Prism) (2). Kõnealuste kõverate lähendamisel tuleks kõvera ülemine ja alumine osa, tõus ja log IC50 üldjuhul jätta piiritlemata. Parima lähenduskõvera leidmiseks tuleks kasutada robustset regressioonanalüüsi, v.a juhul, kui esitatakse põhjendus muu lähenemisviisi kasutamise kohta. Tuleks märkida, millist robustse regressioonanalüüsi meetodit kasutatakse. Andmete korrigeerimine ligandi väljatõrjumise suhtes ei ole hrERil põhinevate FW ja CERI meetodite puhul vajalik, kuid seda võib vajaduse korral kaaluda. Pärast esmast analüüsi tuleks iga seondumiskõver üle vaadata, et veenduda mudeli ja andmete omavahelises sobivuses. Nõrgalt seonduva aine suhtelise seondumisafiinsuse (RBA) leidmiseks võib arvutada nõrgalt seonduva aine log IC50 väärtuse protsentuaalne osakaal 17β-östradiooli log IC50 väärtusest. Positiivsete kontrollidega ja mitteseonduval ainel põhineva kontrolliga saadud tulemusi tuleks hinnata lähtuvalt katsemeetodi tulemuslikkuse näitajatest ja nõuetekohasuse kriteeriumidest, mida on kirjeldatud käesolevas katsemeetodis (punkt 20), 2. liites (FW analüüsimeetod, punktid 41–51) ja 3. liites (CERI analüüsimeetod, punktid 41–51). Võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduva ainega läbi viidud kolme analüüsitsükli tulemusi hõlmavad näited on esitatud joonisel 1.

Joonis 1.

Võrdlusöstrogeeni ja nõrgalt seonduvat kontrollainet iseloomustavate konkureeriva seondumise kõverate näited

Uuritavate kemikaalide andmete analüüs

Kõigi uuritavate kemikaalide andmete analüüsimisel tuleks kasutada astmelist lähenemist, et tagada andmete asjakohane analüüs ja kõigi konkureeriva seondumise kõverate nõuetekohane liigitamine. Uuritava kemikaaliga läbi viidud iga analüüsitsükli puhul tuleks esmalt rakendada täpselt sama standardiseeritud andmeanalüüsi, mida kasutatakse võrdlusöstrogeenil ja nõrgalt seonduval ainel põhinevate kontrollide puhul. Pärast esmast analüüsi tuleks iga analüüsitsükli puhul teha lähenduskõvera parameetrite tehniline kontroll ja visuaalselt hinnata, kui hästi sobituvad seondumisandmed saadud konkureeriva seondumise kõveraga. Tehnilise kontrolli käigus täheldatav kontsentratsioonist sõltuv [3H]17β-östradiooli spetsiifilise seondumise protsentuaalse määra vähenemine, tehniliste paralleelproovide andmete vaheline väike varieeruvus kemikaali kõigil kontsentratsioonidel ja lähenduskõvera parameetrite sarnased väärtused kolmes analüüsitsüklis viitavad sellele, et katse ja andmeanalüüs on läbi viidud nõuetekohaselt. Uuritava kemikaaliga igas analüüsitsüklis saadud andmete hindamisel tuleks lähtuda eksperdihinnangust ja tulemused, mille alusel iga uuritav kemikaal liigitatakse seonduvaks või mitteseonduvaks, peaksid olema teaduslikult põhjendatavad.

Aeg-ajalt võib esineda andmeid, mis vajavad täiendavat tähelepanu, et hrERiga seondumise tulemusi oleks võimalik nõuetekohaselt analüüsida ja tõlgendada. Varasemates uuringutes on täheldatud juhtumeid, kus retseptoripõhise konkureeriva seondumise andmete analüüsi võib muuta keeruliseks asjaolu, et spetsiifilise seondumise protsentuaalne määr kemikaali suurimatel kontsentratsioonidel suureneb (joonis 2). See on tuntud probleem, millega on kokku puututud mitme retseptoripõhist konkureerivat seondumist käsitleva katse-eeskirja puhul (3). Sellistel juhtudel täheldatakse väiksematel kontsentratsioonidel kontsentratsioonist sõltuvust, kuid kui uuritava kemikaali kontsentratsioon läheneb lahustuvuspiirile, ei suurene [3H]17β-östradiooli väljatõrjumine enam. Sellisel juhul nähtub suurematel kontsentratsioonidel saadud andmetest, et on jõutud analüüsimeetodi bioloogilise kasutuspiirini. Näiteks on seda nähtust paljudel juhtudel seostatud kemikaali mittelahustuvusega ja väljasadenemisega suurel kontsentratsioonil, kuid see võib olla põhjustatud ka asjaolust, et dekstraaniga kaetud süsi ei ole kemikaali suurimatel kontsentratsioonidel võimeline siduma eraldamisetapis enam rohkem radiomärgistatud vaba ligandi. Selliste andmepunktide sissejätmine sigmoidkõvera lähendamisel konkureeriva seondumise katse andmetele võib vahel põhjustada uuritava kemikaali valesti liigitamist ERiga seondumise võime alusel (joonis 2). Sellise olukorra ärahoidmiseks on hrERiga seondumisel põhinevate FW ja CERI meetodite katse-eeskirjas nähtud ette võimalus jätta analüüsist välja andmepunktid, kus [3H]17β-östradiooli spetsiifilist seondumist iseloomustav paralleelproovide andmete keskväärtus on vähemalt 10 % suurem kui vastav keskväärtus mõnel väiksemal kontsentratsioonil (sellele viidatakse tavaliselt kui 10 % reeglile). Seda reeglit võib iga kõvera puhul kasutada ainult ühe korra ja seejuures peavad allesjäänud andmed hõlmama vähemalt kuut kontsentratsiooni, et kemikaali oleks võimalik kõvera alusel õigesti liigitada.

Joonis 2.

Näide konkureeriva seondumise kõvera kohta enne ja pärast 10 % reegli kasutamist

Asjaomaste kõverate korrigeerimisel tuleks 10 % reegli asjakohast kasutamist hoolikalt kaaluda ja kasutada seda üksnes juhul, kui esineb selgeid viiteid selle kohta, et tegemist on hrERiga seonduva ainega. hrERiga seondumisel põhineva FW meetodi kohaste katsete tegemisel valideerimisuuringu raames täheldati, et 10 % reegli kasutamisel on mõnikord soovimatu ja ettenägematu tagajärg. Kemikaalide puhul, mis retseptoriga ei interakteeru (st tõelised mitteseonduvad ained), täheldati tasemel, kus radioligandi seondumine oli umbes 100 %, kasutatud kontsentratsioonide lõikes sageli varieeruvust, mis oli suurem kui 10 %. Kui väikseimale täheldatud väärtusele vastas juhtumisi väike kontsentratsioon, olnuks võimalik kõik sellest suuremal kontsentratsioonil saadud andmed 10 % reegli alusel analüüsist välja jätta, isegi kui kõnealustest andmetest võinuks olla kasu kemikaali liigitamisel mitteseonduvaks. Joonisel 3 on esitatud näited, mille puhul 10 % reegli kasutamine ei ole asjakohane.

Joonis 3.

Näited konkureeriva seondumise andmete kohta, mille puhul 10 % reegli kasutamine ei ole asjakohane

Viited

(1)

OECD (2015). Integrated Summary Report: Validation of Two Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα). Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 226. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(2)

Motulsky, H., ja Christopoulos, A. (2003). The law of mass action. Väljaandes: Fitting Models to Biological Data Using Linear and Non-linear Regression. GraphPad Software Inc., San Diego, CA. Lk 187–191. www.graphpad.com/manuals/Prism4/RegressionBook.pdf.

(3)

Laws, S. C., Yavanhxay, S., Cooper, R. L., ja Eldridge, J. C. (2006). Nature of the Binding Interaction for 50 Structurally Diverse Chemicals with Rat Estrogen Receptors. Toxicol. Sci. 94(1): 46–56.

B.71 NAHA SENSIBILISEERIMISE IN VITRO KATSED, MILLEGA UURITAKSE DENDRIITRAKKUDE AKTIVEERIMISEGA SEOTUD OLULIST ETAPPI NAHA SENSIBILISEERIMISES SEISNEVA KAHJULIKU TOIME RAJAS

ÜLDINE SISSEJUHATUS

Dendriitrakkude aktiveerimisega seotud olulisel etapil põhinev katsemeetod

Naha sensibilisaator on aine, mis põhjustab nahaga kokkupuutel allergilise reaktsiooni, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (ÜRO GHS) (1) ja Euroopa Liidu määruses (EL) 1272/2008, milles käsitletakse ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus) (98). Naha sensibiliseerimise oluliste bioloogiliste etappide suhtes on olemas ühisarusaam. Praegused teadmised naha sensibiliseerimisega seotud keemiliste ja bioloogiliste mehhanismide kohta on kokku võetud kahjuliku toime radu käsitleva OECD programmiga hõlmatud asjaomase kahjuliku toime raja käsitluses (2), milles kirjeldatakse nii protsessi käivitavat molekulaarset sündmust, järgnevaid vaheetappe kui ka kahjuliku toime, st allergilise kontaktdermatiidi avaldumist. Kõnealusel juhul on käivitav molekulaarne sündmus (st esimene oluline etapp) elektrofiilsete ainete kovalentne seondumine naha valkude nukleofiilsete tsentritega. Kahjuliku toime raja teine oluline etapp toimub keratinotsüütides ning hõlmab nii põletikureaktsioone kui ka geeniekspressiooni muutusi, mis on seotud selliste konkreetsete signaaliülekanderadadega nagu antioksüdatiivse/elektrofiiliseoselise reaktsiooni elemendist (ARE) sõltuvad rajad. Kolmas oluline etapp on dendriitrakkude aktiveerimine, mida hinnatakse tavaliselt spetsiifiliste raku pinnamarkerite, kemokiinide ja tsütokiinide ekspressiooni alusel. Neljas oluline etapp on T-rakkude aktiveerimine ja paljunemine, mida hinnatakse kaudselt hiire lokaalsete lümfisõlmede katses (LLNA) (3).

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 442E (2017). Selles kirjeldatakse in vitro katseid, millega uuritakse naha sensibiliseerimises seisneva kahjuliku toime rajas dendriitrakkude aktiveerimisega seotud olulise etapi puhul kirjeldatud mehhanisme (2). Katsemeetodit kasutatakse selleks, et aidata kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri.

Käesolevas katsemeetodis kirjeldatakse järgmisi katseid:

—	inimese rakuliini aktiveerimise katse (h-CLAT);

—	rakuliini U937 aktiveerimise katse (U-SENS™);

—	interleukiin 8 reportergeeni katse (IL-8 lutsiferaasikatse).

Käesolev katsemeetod ja OECD vastav katsejuhend võivad erineda andmete ja mõõdetavate näitajate saamiseks kasutatavate menetluste poolest, kuid OECD otsuse kohase andmete vastastikuse tunnustamise raames võib kasutada ükskõik kumba meetodit, et saada asjaomases riigis kehtivate nõuete kohaseid katsetulemusi naha sensibiliseerimises seisneva kahjuliku toime rajas dendriitrakkude aktiveerimisega seotud olulise etapi kohta.

Olulisel etapil põhineva katsemeetodi kohaste katsete taust ja põhimõtted

Nahka sensibiliseeriva toime hindamiseks on tavaliselt kasutatud laboriloomi. Merisigade kasutamisel põhinevate klassikaliste meetoditega – merisigadega tehtava Magnussoni ja Kligmani maksimeerimiskatse ja Buehleri katsega (katsemeetod B.6) (4) – uuritakse nii naha sensibiliseerimise induktsiooni- kui ka esilekutsumisfaasi. Hiirtega läbi viidavate katsetega – LLNA (katsemeetod B.42) (3) ja selle kahe radioaktiivsest märgisest loobumist võimaldava modifikatsiooniga (LLNA: DA (katsemeetod B.50) (5) ja LLNA: BrdU-ELISA (katsemeetod B.51) (6)) – hinnatakse ainult indutseerivat toimet ja need on samuti heaks kiidetud, sest need on merisigadega tehtavate katsetega võrreldes eelistatud nii loomade heaolu seisukohast kui ka seepärast, et nendega saab naha sensibiliseerimise induktsioonifaasi objektiivselt mõõta.

Viimasel ajal on kemikaalidest tingitud naha sensibiliseerimise ohu hindamiseks kasutusele võetud mehhanistlikul käsitlusel põhinevad in chemico ja in vitro katsemeetodid, millega uuritakse naha sensibiliseerimises seisneva kahjuliku toime raja esimest olulist etappi (katsemeetod B.59: otsene reaktsioonivõime katse peptiididega (7)) ja teist olulist etappi (katsemeetod B.60: ARE-Nrf2 lutsiferaasikatse (8)).

Käesoleva meetodi kohaste katsetega tehakse kvantitatiivselt kindlaks raku pinnamarkeri(te) (nt CD54, CD86) ekspressiooni muutus monotsüütide ja dendriitrakkude aktiveerimisel pärast kokkupuudet sensibilisaatoritega või dendriitrakkude aktiveerimisega seotud tsütokiini IL-8 ekspressiooni muutus. Naha sensibilisaatorite kohta on teatatud, et need indutseerivad selliste rakumembraani markerite nagu CD40, CD54, CD80, CD83 ja CD86 ekspressiooni, lisaks kutsuvad need esile dendriitrakkude aktiveerimisega seotud (2), põletikku soodustavate tsütokiinide, näiteks IL-1β ja TNF-α, ning mitme kemokiini, näiteks IL-8 (CXCL8) ja CCL3 ekspressiooni (9, 10, 11, 12).

Ent kuna dendriitrakkude aktiveerimine on ainult üks oluline etapp naha sensibiliseerimises seisneva kahjuliku toime rajas (2, 13), ei pruugi üksnes dendriitrakkude aktiveerimise markerite mõõtmisel põhinevate katsetega kogutud teave olla piisav, et teha järeldusi kemikaali nahka sensibiliseeriva toime olemasolu või puudumise kohta. Seepärast ollakse seisukohal, et käesoleva meetodiga saadud andmed võimaldavad toetada naha sensibilisaatorite (st ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt 1. kategooria kemikaalide) eristamist nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest, kui neid andmeid kasutatakse katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi (edaspidi „ühtne lähenemisviis“) raames koos asjakohase täiendava teabega, näiteks teabega, mis on saadud naha sensibiliseerimises seisneva kahjuliku toime raja teisi olulisi etappe hõlmavate in vitro katsetega ning muude mittekatseliste meetoditega, sealhulgas võrdlemisel kemikaali analoogidega (13). On avaldatud näiteid kõnealuste katsetega saadud andmete kasutamisest vastavalt kindlaksmääratud metoodikale, mille puhul on standarditud nii kasutatavate teabeallikate kogum kui ka andmete töötlemise viis prognooside tegemiseks (13), ning neid saab rakendada ühtse lähenemisviisi kasulike osadena.

Käesoleva katsemeetodi kohaseid katseid ei saa kasutada eraldiseisvana selleks, et liigitada naha sensibilisaatoreid ÜRO GHSis / CLP-määruses määratletud alamkategooriatesse 1A või 1B ametiasutuste jaoks, kes neid mittekohustuslikke alamkategooriaid kasutavad, ega ka selleks, et prognoosida toime tugevust ohutushindamisega seotud otsuste tegemiseks. Sõltuvalt õigusraamistikust võib kõnealuste meetoditega saadud positiivseid tulemusi siiski kasutada eraldiseisvana kemikaali klassifitseerimiseks ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 1. kategooriasse.

Käesolevas katsemeetodis kasutatakse mõistet „uuritav kemikaal“ uurimisobjektile viitava mõistena (99) ning see ei ole seotud meetodi sobivusega ühest või mitmest koostisosast koosnevate ainete ja/või segude uurimiseks. Praegu on vähe andmeid meetodi kohaldatavuse kohta mitmest koostisosast koosnevate ainete ja segude puhul (14, 15). Kõnealuste katsete kasutamine mitmest koostisosast koosnevate ainete ja segude uurimiseks on tehniliselt võimalik. Enne katsemeetodi kasutamist selleks, et saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks siiski kaaluda, kas ja kuidas see meetod võimaldab saada taotletava eesmärgi jaoks vastuvõetavaid tulemusi. (100) Seda ei ole vaja kaaluda, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud. Peale selle tuleks mitmest koostisosast koosnevate ainete ja segude uurimisel võtta arvesse tsütotoksiliste koostisosade võimalikku segavat mõju vaadeldavatele toimetele.

KIRJANDUS

(1)

Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO) (2015). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Kuues, täiendatud väljaanne. New York ja Genf: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Kättesaadav aadressil https://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/06files_e.html.

(2)

OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=ENV/JM/MONO(2012)10/PART1&docLanguage=En.

(3)	Käesoleva lisa peatükk B.42 „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse“.

(4)	Käesoleva lisa peatükk B.6 „Naha sensibiliseerimine“.

(5)	Käesoleva lisa peatükk B.50 „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse: DA“.

(6)	Käesoleva lisa peatükk B.51 „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse: BrdU-ELISA“.

(7)	Käesoleva lisa peatükk B.59 „Naha sensibiliseerimine in chemico: otsene reaktsioonivõime katse peptiididega (direct peptide reactivity assay, DPRA)“.

(8)	Käesoleva lisa peatükk B.60 „Naha sensibiliseerimine in vitro: ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetod“.

(9)	Steinman, R. M. (1991). The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu. Rev. Immunol. 9: 271–296.

(10)	Caux, C., Vanbervliet, B., Massacrier, C., Azuma, M., Okumura, K., Lanier, L. L., ja Banchereau, J. (1994). B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J. Exp. Med. 180: 1841–1847.

(11)	Aiba, S., Terunuma, A., Manome, H., ja Tagami, H. (1997). Dendritic cells differently respond to haptens and irritants by their production of cytokines and expression of co-stimulatory molecules. Eur. J. Immunol. 27: 3031–3038.

(12)

Aiba, S., Manome, H., Nakagawa, S., Mollah, Z. U., Mizuashi, M., Ohtani, T., Yoshino, Y., ja Tagami, H. (2003). p38 mitogen-activated protein kinase and extracellular signal-regulated kinases play distinct roles in the activation of dendritic cells by two representative haptens, NiCl2 and DNCB. J. Invest. Dermatol. 120: 390–398.

(13)

OECD (2016). Series on Testing and Assessment No 256. Guidance Document On The Reporting Of Defined Approaches And Individual Information Sources To Be Used Within Integrated Approaches To Testing And Assessment (IATA) For Skin Sensitisation, Annex 1 and Annex 2. ENV/JM/HA(2016)29. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil https://community.oecd.org/community/iatass.

(14)

Ashikaga, T., Sakaguchi, H., Sono, S., Kosaka, N., Ishikawa, M., Nukada, Y., Miyazawa, M., Ito, Y., Nishiyama, N., ja Itagaki, H. (2010). A comparative evaluation of in vitro skin sensitisation tests: the human cell-line activation test (h-CLAT) versus the local lymph node assay (LLNA). Altern. Lab. Anim. 38: 275–284.

(15)	Piroird, C., Ovigne, J. M., Rousset, F., Martinozzi-Teissier, S., Gomes, C., Cotovio, J., ja Alépée, N. (2015). The Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS) addresses the activation of dendritic cell event in the adverse outcome pathway for skin sensitization. Toxicol. In Vitro 29: 901–916.

1. liide

NAHA SENSIBILISEERIMINE IN VITRO: INIMESE RAKULIINI AKTIVEERIMISE KATSE (H-CLAT)

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Inimese rakuliini aktiveerimise katses tehakse inimese monotsüütse leukeemia rakuliinis THP-1 kindlaks monotsüütide ja dendriitrakkude aktiveerimisega seotud raku pinnamarkerite (CD86 ja CD54) ekspressiooni kvantitatiivsed muutused pärast kokkupuudet sensibilisaatoriga (1, 2). Seejärel kasutatakse raku pinnamarkerite CD86 ja CD54 ekspressiooni mõõdetud taset toetava teabena, mis aitab eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri.

h-CLATd on hinnatud loomkatsete alternatiivide Euroopa Liidu referentlabori (EURL ECVAM) koordineeritud valideerimisuuringus ning seejärel on selle sõltumatult läbi vaadanud EURL ECVAMi teaduslik nõuandekomitee. Võttes arvesse kõiki kättesaadavaid andmeid ning reguleerivate asutuste ja sidusrühmade seisukohti, soovitas EURL ECVAM kasutada h-CLATd (3) ühtse lähenemisviisi osana, et aidata ohu alusel klassifitseerimise ja märgistamise eesmärgil eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri. Näited h-CLATga saadud andmete kasutamisest muu teabega kombineerituna on avaldatud kirjanduses (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11).

h-CLAT on osutunud rakendatavaks laborites, kus on olemas rakukultuurimeetodite kasutamise ja läbivoolutsütomeetrilise analüüsi kogemus. Selle meetodi puhul eeldatav prognooside reprodutseeritavuse määr on nii laborisisese kui ka laboritevahelise reprodutseeritavuse puhul ligikaudu 80 % (3, 12). Valideerimisuuringust (13) ja muudest avaldatud uuringutulemustest (14) nähtub üldiselt, et LLNA tulemustega võrreldes on selles katses naha sensibilisaatorite (st ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt 1. kategooria kemikaalide) mittesensibiliseerivatest kemikaalidest eristamise täpsus 85 % (N = 142), tundlikkus 93 % (94/101) ja spetsiifilisus 66 % (27/41) (vastavalt EURL ECVAMi kordusanalüüsile (12), milles võeti arvesse kõiki olemasolevaid andmeid ning vastavalt punktis 4 esitatud kirjeldusele jäeti arvestamata negatiivsed tulemused selliste kemikaalide puhul, mille log Kow on suurem kui 3,5). h-CLAT kohaste valenegatiivsete prognooside tõenäosus on suurem vähesel määral kuni mõõdukalt nahka sensibiliseerivate (st ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt alamkategooria 1B) kemikaalide puhul ja väiksem siis, kui tegemist on tugevalt nahka sensibiliseeriva (st ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt alamkategooria 1A) kemikaaliga (4, 13, 15). Kokkuvõttes nähtub sellest teabest, et h-CLAT on kasulik meetod, mis aitab kindlaks teha naha sensibiliseerimise ohtu. Ainsa meetodina kasutatava h-CLATga saavutatav eespool nimetatud täpsus on siiski üksnes orienteeriv, sest katseandmeid tuleks vaadelda ühtse lähenemisviisi kontekstis koos muudest allikatest pärit teabega ja kooskõlas üldise sissejuhatuse punktide 7 ja 8 sätetega. Kui hinnatakse naha sensibiliseerimise katsemeetodeid, mille puhul ei kasutata katseloomi, tuleb lisaks arvesse võtta, et LLNA ja muude loomkatsete tulemused ei pruugi täielikult kajastada kemikaali toimet inimesele.

Praeguse olemasoleva teabe põhjal on tõendatud, et h-CLAT on kohaldatav paljude uuritavate kemikaalide puhul, mis erinevad üksteisest orgaanilise funktsionaalrühma, toimemehhanismi, in vivo katsetega määratud nahka sensibiliseeriva toime tugevuse ja füüsikalis-keemiliste omaduste poolest (3, 14, 15). h-CLAT on kohaldatav uuritavate kemikaalide puhul, mis on sobivas lahustis/kandeaines lahustuvad või moodustavad selles püsiva dispersiooni (st kolloidlahuse või suspensiooni, milles uuritav kemikaal ei sadestu ega eraldu lahustist/kandeainest eri faasi) (vt punkt 14). Kui uuritava kemikaali log Kow on suurem kui 3,5, saadakse sageli valenegatiivsed tulemused (14). Seepärast tuleks uuritavate kemikaalide puhul, mille log Kow on suurem kui 3,5, jätta negatiivsed tulemused arvesse võtmata. Kui uuritava kemikaali log Kow on üle 3,5, võib saadud positiivseid tulemusi sellegipoolest kasutada uuritava kemikaali naha sensibilisaatoriks liigitamise toetamiseks. Peale selle võidakse kasutatud rakuliini piiratud metaboliseerimisvõime (16) või katsetingimuste tõttu saada h-CLATga negatiivseid tulemusi ka prohapteenide (st ained, mis vajavad ensümaatilist aktiveerimist, nt P450 ensüümide abil) ja prehapteenide (st ained, mis aktiveeruvad oksüdeerumisel) puhul, eelkõige aeglaselt oksüdeeruvad ainete puhul (15). h-CLAT võimaldab hinnata ka fluorestseeruvaid uuritavaid kemikaale (17), kuid tugevalt fluorestseeruvad uuritavad kemikaalid, mille kiiratava kiirguse lainepikkus on sama kui fluorestseiinisotiotsüanaadil (FITC) või propiidiumjodiidil (PI), segavad läbivoolutsütomeetrilist analüüsi ning neid ei ole võimalik FITCga konjugeeritud antikehade või PI abil õigesti hinnata. Sellisel juhul võib kasutada vastavalt muu fluorokroomiga märgistatud antikehasid või muud tsütotoksilisuse markerit, kui näiteks katsetega, mis tehakse liites 1.2 loetletud pädevusainetega, on võimalik tõendada, et sellise fluorokroomi või markeriga saadakse samasugused tulemused kui FITCga märgistatud antikehade (vt punkt 24) või PIga (vt punkt 18). Eespool kirjeldatust lähtuvalt tuleks negatiivseid tulemusi tõlgendada kõnealuste piirangute kontekstis ja koos ühtse lähenemisviisi raames muudest allikatest saadud teabega. Kui leidub andmeid, mille kohaselt h-CLATd ei saa kasutada mõne muu konkreetse uuritavate kemikaalide rühma puhul, ei tohiks seda asjaomase konkreetse kemikaalirühma puhul kasutada.

Nagu eespool kirjeldatud, aitab h-CLAT eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri. Ent kui seda kasutatakse näiteks katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi raames, võib see aidata hinnata ka sensibiliseeriva toime tugevust (4, 5, 9). Võimalust kasutada h-CLATga saadud tulemusi toime tugevuse hindamisel on siiski vaja täiendavalt uurida, soovitatavalt inimuuringutest saadud andmete alusel.

Mõisted on esitatud liites 1.1.

KATSE PÕHIMÕTE

h-CLAT on in vitro meetod, millega määratakse kvantitatiivselt raku pinnamarkerite (CD86 ja CD54) ekspressiooni muutusi inimese monotsüütse leukeemia rakuliini THP-1 rakkudes pärast 24-tunnist kokkupuudet uuritava kemikaaliga. Kõnealused pinnamolekulid on monotsüütse THP-1 tüüpilised markerid ja võivad võimaldada jäljendada dendriitrakkude aktiveerimist, millel on väga oluline roll T-rakkude aktivatsioonis. Pinnamarkerite ekspressiooni muutusi mõõdetakse läbivoolutsütomeetriliselt pärast rakkude värvimist fluorokroomiga märgistatud antikehadega. Samal ajal mõõdetakse ka tsütotoksilisust, et hinnata, kas pinnamarkerite ekspressiooni suurenemine toimub kontsentratsioonil, mille juures ei täheldata tsütotoksilisust. Arvutatakse pinnamarkerite fluorestsentssignaali suhteline tugevus lahustiga/kandeainega kontrolli näitajatega võrrelduna ja seda tulemust kasutatakse prognoosimudelis (vt punkt 26), et aidata eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri.

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

Enne katsemeetodi B.71 juurde kuuluvas käesolevas liites kirjeldatud meetodi rutiinset kasutamist tuleks tõendada labori tehnilist pädevust ning kasutada selleks liites 1.2 loetletud kümmet pädevusainet. Lisaks peaksid meetodi kasutajad haldama reageerimisvõime kontrollimise käigus kogutud andmeid (vt punkt 11) ning positiivsete ja lahustiga/kandeainega kontrollidega saadud varasemaid andmeid (vt punktid 20–22) sisaldavat andmebaasi ning kontrollima nende andmete põhjal, kas katsetulemused on laboris aja möödudes jätkuvalt reprodutseeritavad.

KATSE KÄIK

Käesolev meetod põhineb loomkatsetele alternatiivsete meetodite andmebaasi (DataBase on ALternative Methods, DB-ALM) teenusena kättesaadaval h-CLATd käsitleval katse-eeskirjal nr 158 (18), mis vastab EURL ECVAMi koordineeritud valideerimisuuringus kasutatud katse-eeskirjale. Seda katse-eeskirja soovitatakse kasutada laboris h-CLAT juurutamisel ja rakendamisel. Allpool kirjeldatakse h-CLAT põhikomponente ja katse käiku, mis koosneb kahest etapist: annuse kindlaksmääramise katsest ja CD86/CD54 ekspressiooni mõõtmisest.

Rakkude ettevalmistamine

10.

h-CLAT puhul tuleks kasutada inimese monotsüütse leukeemia rakuliini THP-1. Soovitatavalt tuleks rakud (TIB-202™) soetada usaldusväärsest rakupangast, näiteks Ameerika Tüüpkultuuride Kollektsioonist (American Type Culture Collection).

11.

THP-1 rakke kasvatatakse 37oC juures reguleeritud õhuniiskusega 5-protsendilise CO2-sisaldusega atmosfääris söötmes RPMI-1640, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, 2-merkaptoetanooli kontsentratsioonis 0,05 mM, 100 ühikut penitsilliini milliliitri kohta ja streptomütsiini kontsentratsioonis 100 μg/ml. Penitsilliini ja streptomütsiini kasutamisest söötmes võib loobuda. Sel juhul peavad kasutajad siiski kontrollima, et antibiootikumide puudumine söötmest ei mõjuta tulemusi. Näiteks võib selleks teha katseid liites 1.2 loetletud pädevusainetega. Igal juhul tuleb saastumisohu vähendamiseks järgida rakukultuuridega töötamise head tava olenemata sellest, kas rakukultuuri sööde sisaldab antibiootikume või mitte. THP-1 rakke külvatakse regulaarselt iga 2–3 päeva järel ümber algtihedusega 0,1–0,2 × 106 rakku/ml. Kultuure tuleb säilitada tihedusvahemikus 0,1–1,0 × 106 rakku/ml. Enne rakkude kasutamist katses tuleb teha reageerimisvõime kontroll, et veenduda rakkude sobivuses. Rakkude reageerimisvõime kontroll tuleks teha kaks nädalat pärast sulatamist ning kasutada selleks positiivse kontrollina 2,4-dinitroklorobenseeni (DNCB) (CASi nr: 97-00-7; puhtus ≥ 99 %) ja nikkelsulfaati (NiSO4) (CASi nr: 10101-97-0; puhtus ≥ 99 %) ning negatiivse kontrollina piimhapet (CASi nr: 50-21-5; puhtus ≥ 85 %). Nii DNCB kui ka NiSO4 peaksid esile kutsuma raku pinnamarkerite CD86 ja CD54 alusel tuvastatava positiivse reaktsiooni, piimhape aga negatiivse reaktsiooni. Katses võib kasutada ainult reageerimisvõime kontrolli läbinud rakke. Rakke võib paljundada kuni kahe kuu jooksul pärast sulatamist. Passaažide arv ei tohiks ületada 30. Reageerimisvõime kontroll tuleb teha vastavalt punktides 20–24 esitatud kirjeldusele.

12.

Katses kasutamiseks külvatakse THP-1 rakud välja tihedusega 0,1 × 106 rakku/ml või 0,2 × 106 rakku/ml ning eelkasvatatakse neid rakukultuuripudelis vastavalt 72 või 48 tundi. Rakkude tihedus rakukultuuripudelis peaks vahetult pärast eelkasvatamise perioodi lõppu olema igas katses võimalikult sarnane (selle saavutamiseks kasutatakse ühte kahest eespool kirjeldatud eelkasvatamise tingimusest), sest rakkude tihedus pudelis vahetult pärast eelkasvatamist võib mõjutada allergeenide indutseeritavat CD86/CD54 ekspressiooni (19). Katse päeval eemaldatakse rakud rakukultuuripudelist ja suspendeeritakse uuesti värskes söötmes tihedusel 2 × 106 rakku/ml. Seejärel jaotatakse rakud 500 μl kaupa 24-kannulise lamedapõhjalise plaadi kannudesse (1 × 106 rakku kannu kohta) või 80 μl kaupa 96-kannulise lamedapõhjalise plaadi kannudesse (1,6 × 105 rakku kannu kohta).

Annuse kindlaksmääramise katse

13.

Annuse kindlaksmääramise katse eesmärk on leida CV75 väärtus ehk uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures rakkude eluvõimelisus on 75 % lahustiga/kandeainega kontrolli puhul täheldatud väärtusest. CV75 väärtuse põhjal tehakse kindlaks CD86/CD54 ekspressiooni mõõtmisel (vt punktid 20–24) kasutatav uuritava kemikaali kontsentratsioon.

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainete ettevalmistamine

14.

Uuritavad kemikaalid ja kontrollained valmistatakse ette katse tegemise päeval. h-CLAT puhul tehakse uuritavatest kemikaalidest lahus või püsiv dispersioon (vt ka punkt 4); lahustina/kandeainena kasutatakse eelistatavalt füsioloogilist lahust või söödet või kui uuritav kemikaal ei ole nendes lahustuv või ei moodusta neis püsivat dispersiooni, siis dimetüülsulfoksiidi (DMSO, puhtusega ≥ 99 %). Kemikaali lõppkontsentratsioon peab olema 100 mg/ml (füsioloogilises lahuses või söötmes) või 500 mg/ml (DMSOs). Kui see on teaduslikult piisavalt põhjendatud, võib kasutada ka eespool nimetatutest erinevat lahustit/kandeainet. Arvesse tuleks võtta uuritava kemikaali püsivust lahustis/kandeaines lõppkontsentratsioonil.

15.

Uuritava kemikaali põhilahust kontsentratsiooniga 100 mg/ml (füsioloogilises lahuses või söötmes) või 500 mg/ml (DMSOs) lahjendatakse järgmiselt.

—

Lahustina/kandeainena füsioloogilise lahuse või söötme kasutamisel: asjaomase lahustiga/kandeainega valmistatakse kahekordsete lahjenduste reana kaheksa eri kontsentratsiooniga põhilahust. Seejärel lahjendatakse neid põhilahuseid söötmes veel 50 korda (töölahused). Kui plaadil kasutataval suurimal lõppkontsentratsioonil 1 000 μg/ml ei täheldata mürgisust, tuleks maksimaalne kontsentratsioon uue tsütotoksilisuse katsega uuesti kindlaks määrata. Füsioloogilises lahuses või söötmes lahustatud või püsiva dispersiooni moodustanud uuritava kemikaali lõppkontsentratsioon plaadil ei tohiks ületada 5 000 μg/ml.

—

Lahustina/kandeainena DMSO kasutamisel: asjaomase lahustiga/kandeainega valmistatakse kahekordsete lahjenduste reana kaheksa eri kontsentratsiooniga põhilahust. Seejärel lahjendatakse neid põhilahuseid söötmes veel 250 korda (töölahused). Lõppkontsentratsioon plaadil ei tohiks ületada 1 000 μg/ml, isegi kui sellel kontsentratsioonil ei täheldata mürgisust.

Seejärel kasutatakse töölahuseid kokkupuutekatses: plaadil olevale THP-1 rakkude suspensioonile lisatakse võrdne kogus töölahust (vt ka punkt 17), et saavutada täiendav kahekordne lahjendus (tavaliselt on lõppkontsentratsioonide vahemik plaadil 7,81–1 000 μg/ml).

16.

h-CLAT puhul kontrollina kasutatav lahusti/kandeaine on sööde (kui uuritavast kemikaalist tehakse lahus või püsiv dispersioon (vt punkt 4) söötmes või füsioloogilises lahuses) või DMSO (kui uuritavast kemikaalist tehakse lahus või püsiv dispersioon DMSOs), mida kasutatakse plaadil ühes lõppkontsentratsioonis 0,2 %. Seda lahjendatakse samal viisil, nagu on kirjeldatud töölahuste saamist käsitlevas punktis 15.

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainetega töötlemine

17.

Punktides 15 ja 16 kirjeldatud sööde ja töölahused segatakse 24- või 96-kannulisele lamedapõhjalisele plaadile kantud rakususpensiooniga (vt punkt 12) mahuvahekorras 1:1. Seejärel inkubeeritakse töödeldud plaate 37oC juures 5-protsendilise CO2-sisaldusega atmosfääris 24 ± 0,5 tundi. Tuleb jälgida, et lenduvad uuritavad kemikaalid ei aurustuks, ning hoida ära kannudevahelist uuritava kemikaaliga ristsaastumist. Selleks võib plaadi enne uuritava kemikaaliga inkubeerimist näiteks tihedalt kinni katta (20).

Propiidiumjodiidiga (PI) värvimine

18.

Pärast 24 ± 0,5 tundi kestnud kokkupuudet viiakse rakud katsutitesse ja eraldatakse tsentrifuugimise teel. Supernatant visatakse ära ja allesjäänud rakud suspendeeritakse uuesti 200 (96-kannulise plaadi puhul) või 600 (24-kannulise plaadi puhul) mikroliitris fosfaadiga puhverdatud soolalahuses, mis sisaldab 0,1 % veise seerumi albumiini (värvimispuhver). 200 μl rakususpensiooni viiakse üle 96-kannulisele ümarapõhjalisele plaadile (96-kannulise plaadi puhul) või mikrokatsutisse (24-kannulise plaadi puhul) ning rakke pestakse kaks korda 200 μl (96-kannulise plaadi puhul) või 600 μl (24-kannulise plaadi puhul) värvimispuhvriga. Lõpuks suspendeeritakse rakud uuesti värvimispuhvris (nt 400 μl) ning lisatakse PI lahus (nt 20 μl; PI lõppkontsentratsioon võib olla näiteks 0,625 μg/ml). Võib kasutada ka muid tsütotoksilisuse markereid, näiteks 7-aminoaktinomütsiin D-d (7-AAD) või trüpaansinist, kui näiteks katsetega, mis tehakse liites 1.2 loetletud pädevusainetega, on võimalik tõendada, et asjaomase muu värvainega ja PIga saadavad tulemused on sarnased.

Tsütotoksilisuse mõõtmine läbivoolutsütomeetriga ja CV75 väärtuse hindamine

19.

PI sisenemist rakkudesse analüüsitakse läbivoolutsütomeetriga; seejuures kasutatakse registreerimiskanalit FL3. Kokku registreeritakse 10 000 elusat (PIga värvumata) rakku. Tsütomeetri analüüsiprogrammi abil rakkude eluvõimelisuse arvutamiseks võib kasutada allpool esitatud valemit. Kui rakkude eluvõimelisus on väike, tuleks registreerida koos surnud rakkudega kokku kuni 30 000 rakku. Teine võimalus on registreerida andmeid ühe minuti jooksul alates analüüsi alustamise hetkest.

Formula

CV75 väärtus (vt punkt 13) ehk kontsentratsioon, mille juures elusate THP-1 rakkude osakaal on 75 % (tsütotoksilisus on 25 %), arvutatakse log-lineaarse interpolatsiooni teel järgmise valemiga:,

Formula

kus

a on rakkude eluvõimelisuse vähim väärtus, mis ületab 75 %,

c on rakkude eluvõimelisuse suurim väärtus, mis jääb alla 75 %, ning

b ja d on kontsentratsioonid, mille juures rakkude eluvõimelisus on vastavalt a või c.

CV75 leidmiseks on lubatud kasutada ka muid meetodeid, kui on tõendatud (näiteks katsetega, mis on tehtud pädevusainetega), et see ei mõjuta tulemusi.

CD86/CD54 ekspressiooni mõõtmine

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainete ettevalmistamine

20.

Uuritava kemikaali lahuse või püsiva dispersiooni valmistamiseks kasutatakse sobivat lahustit/kandeainet (füsioloogiline lahus, sööde või DMSO; vt punkt 14). Kõigepealt lahjendatakse uuritavat kemikaali kontsentratsioonini, mis on 100 korda (füsioloogilise lahuse või söötme puhul) või 500 korda (DMSO puhul) suurem kui 1,2 × CV75, mis on kindlaks tehtud annuse kindlaksmääramise katsega (vt punkt 19). Kui CV75 väärtust ei ole võimalik kindlaks teha (nt annuse kindlaksmääramise katses ei täheldata piisavat tsütotoksilisust), tuleks lähtekontsentratsioonina kasutada suurimat kontsentratsiooni, mille juures uuritav kemikaal on asjaomases lahustis/kandeaines veel lahustuv või moodustab selles püsiva dispersiooni. Tuleb silmas pidada, et lõppkontsentratsioon plaadil ei tohi olla suurem kui 5 000 μg/ml (füsioloogilise lahuse või söötme puhul) või 1 000 μg/ml (DMSO puhul). Seejärel tehakse vastava lahustiga/kandeainega 1,2-kordsete lahjenduste rida, et saada h-CLAT puhul kasutatavad põhilahused (kaheksa kontsentratsiooni vahemikus 100 × 1,2 × CV75 kuni 100 × 0,335 × CV75 (füsioloogilise lahuse või söötme puhul) või vahemikus 500 × 1,2 × CV75 kuni 500 × 0,335 × CV75 (DMSO puhul); annuste kasutamise näide on esitatud DB-ALMi katse-eeskirjas nr 158). Seejärel lahjendatakse põhilahuseid söötmes veel 50 korda (füsioloogilise lahuse või söötme puhul) või 250 korda (DMSO puhul) (töölahused). Neid töölahuseid kasutatakse lõpuks kokkupuutekatses, kus neist tehakse plaadil veel viimane kahekordne lahjendus. Kui rakkude eluvõimelisuse hindamise tulemused ei vasta punktides 29 ja 30 kirjeldatud nõuetekohasuse kriteeriumitele, võib CV75 väärtuse täpsemaks kindlakstegemiseks annuse kindlaksmääramise katset korrata. CD86/CD54 ekspressiooni mõõtmiseks saab kasutada ainult 24-kannulisi plaate.

21.

Lahustiga/kandeainega kontroll valmistatakse ette vastavalt punktis 16 esitatud kirjeldusele. h-CLAT puhul kasutatav positiivne kontroll on DNCB (vt punkt 11), millest tehakse DMSOs põhilahused, mida lahjendatakse vastavalt punktis 20 esitatud põhilahuste lahjendamise juhistele. DNCBd kasutatakse CD86/CD54 ekspressiooni mõõtmisel positiivse kontrollina plaadil ühes lõppkontsentratsioonis (tavaliselt 4,0 μg/ml). DNCB kasutamiseks plaadil kontsentratsioonis 4,0 μg/ml valmistatakse DNCBst DMSOs põhilahus kontsentratsiooniga 2 mg/ml ning lahjendatakse seda seejärel söötmes 250 korda, et saada töölahus kontsentratsiooniga 8 μg/ml. Teise variandina võib positiivse kontrolli kontsentratsioonina kasutada DNCBga saadud CV75 väärtust, mis tehakse kindlaks igas katselaboris. Võib kasutada ka mõnda muud sobivat positiivset kontrolli, kui on olemas varasemad andmed, mis võimaldavad kindlaks määrata võrreldavad analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriumid. Positiivse kontrolli lõppkontsentratsioon plaadil ei tohiks olla suurem kui 5 000 μg/ml (füsioloogilise lahuse või söötme puhul) või 1 000 μg/ml (DMSO puhul). Analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriumid on samad kui uuritava kemikaali puhul (vt punkt 29), välja arvatud viimane nõuetekohasuse kriteerium, sest positiivset kontrolli hinnatakse vaid ühel kontsentratsioonil.

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainetega töötlemine

22.

Iga uuritava kemikaali ja kontrollaine puhul on prognoosi saamiseks vaja ühte katset. Iga katse koosneb vähemalt kahest sõltumatust analüüsitsüklist CD86/CD54 ekspressiooni mõõtmiseks (vt punktid 26–28). Iga sõltumatu analüüsitsükkel viiakse läbi eri päeval; samal päeval võib läbi viia mitu tsüklit juhul, kui iga analüüsitsükli, jaoks: a) valmistatakse sõltumatult värsked uuritava kemikaali põhilahused ja töölahused ning antikehade lahused; b) kasutatakse sõltumatult kogutud rakke (st rakud kogutakse erinevatest rakukultuuripudelitest); rakud võivad olla siiski samast passaažist. Uuritavate kemikaalide ja kontrollainete töölahused (500 μl) segatakse 500 μl rakususpensiooniga (1 × 106 rakku) vahekorras 1:1 ja rakke inkubeeritakse 24 ± 0,5 tundi, nagu on kirjeldatud punktides 20 ja 21. Igas tsüklis piisab ühest proovist uuritava kemikaali ja kontrollaine iga kontsentratsiooni kohta, kuna prognoosi saamiseks on vaja vähemalt kahte sõltumatut tsüklit.

Rakkude värvimine ja analüüs

23.

Pärast 24 ± 0,5 tundi kestnud kokkupuudet viiakse rakud 24-kannuliselt plaadilt katsutisse, kogutakse tsentrifuugimise teel ja seejärel pestakse kaks korda 1 ml värvimispuhvriga (vajaduse korral võib pesemisetappe lisada). Pärast värvimist blokeeritakse rakud 600 μl blokeerimislahusega (värvimispuhver, mis sisaldab 0,01 % (massiühikutes mahuühiku kohta) globuliini (inimese globuliini Cohni fraktsioonid II, III (SIGMA, #G2388-10G) või samaväärne)) ja inkubeeritakse neid 4oC juures 15 min. Pärast blokeerimist jaotatakse rakud kolme 180 μl suuruse alikvoodina 96-kannulisele ümarapõhjalisele plaadile või mikrokatsutitesse.

24.

Pärast tsentrifuugimist värvitakse rakke 4oC juures 30 minuti vältel 50 μl CD86- või CD54-vastase antikehaga või hiire IgG1-ga (isotüübikontroll), mis on märgistatud FITCga. Tuleks kasutada DB-ALMi h-CLATi katse-eeskirjas nr 158 (18) kirjeldatud antikehasid, mis lahjendatakse värvimispuhvris mahuvahekorras 3: 25 (CD86 puhul (BD-PharMingen, #5556 57, kloon Fun-1)) või 3: 50 (CD54 puhul (DAKO, #F7143, kloon 6.5B5) ja IgG1 puhul (DAKO, #X0927)). Katsemeetodi väljatöötajate andmetel saavutatakse nimetatud lahjendusteguritega kõige paremsignaali ja müra suhe. Katsemeetodi väljatöötajate kogemuste põhjal on eri partiide antikehade fluorestsentssignaali tugevus tavaliselt sarnane. Kasutajad võivad siiski kaaluda antikehade tiitrimist oma labori tingimustes, et teha kindlaks kõige paremad kasutamiseks sobivad kontsentratsioonid. Mõne muu fluorokroomiga märgistatud CD86-vastaseid ja/või CD54-vastaseid antikehasid võib kasutada juhul, kui näiteks katsetega, mis tehakse liites 1.2 loetletud pädevusainetega, on võimalik tõendada, et asjaomaste antikehade ja FITCga konjugeeritud antikehade puhul saadavad tulemused on sarnased. Tuleks arvesse võtta, et DB-ALMi h-CLATi katse-eeskirjas nr 158 (18) kirjeldatud antikehade klooni või tarnija vahetamine võib tulemusi mõjutada. Pärast vähemalt kaks korda 150 μl värvimispuhvriga pesemist suspendeeritakse rakud uuesti värvimispuhvris (nt 400 μl), millele lisatakse PI lahust (nt 20 μl lõppkontsentratsiooni 0,625 μg/ml saamiseks) või muu tsütotoksilisuse markeri lahust (vt punkt 18). CD86 ja CD54 ekspressiooni taset ning rakkude eluvõimelisust analüüsitakse läbivoolutsütomeetriga.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmete hindamine

25.

CD86 ja CD54 ekspressiooni analüüsitakse läbivoolutsütomeetriga; seejuures kasutatakse registreerimiskanalit FL1. Fluorestsentssignaali tugevuse geomeetrilise keskväärtuse (mean fluorescence intensity, MFI) põhjal arvutatakse positiivse kontrolli rakkude CD86 ja CD54 puhul täheldatav fluorestsentssignaali suhteline tugevus (relative fluorescence intensity, RFI) vastavalt järgmisele valemile:.

Formula

Lisaks arvutatakse punktis 19 esitatud valemi järgi IgG1-ga värvitud isotüübikontrolli rakkude eluvõimelisus.

Prognoosimudel

26.

CD86/CD54 ekspressiooni mõõtmisel hinnatakse iga uuritavat kemikaali vähemalt kahes sõltumatus analüüsitsüklis, mille põhjal tehakse üks prognoosijäreldus (POSITIIVNE või NEGATIIVNE). h-CLAT kohast prognoosi käsitatakse POSITIIVSENA, kui vähemalt kahes kolmest sõltumatust analüüsitsüklist on täidetud vähemalt üks järgmistest tingimustest; vastasel korral tunnistatakse h-CLAT kohane prognoos NEGATIIVSEKS (joonis 1):

—	CD86 puhul on RFI mis tahes kasutatud kontsentratsioonil 150 % või suurem (ja rakkude eluvõimelisus ≥ 50 %);

—	CD54 puhul on RFI mis tahes kasutatud kontsentratsioonil 200 % või suurem (ja rakkude eluvõimelisus ≥ 50 %).

27.

Seega kui kahes esimeses analüüsitsüklis saadakse CD86 ja/või CD54 puhul positiivne tulemus, tunnistatakse h-CLAT kohane prognoos POSITIIVSEKS ja kolmandat analüüsitsüklit ei ole vaja läbi viia. Kui kahes esimeses analüüsitsüklis saadakse kummagi markeri puhul negatiivne tulemus, tunnistatakse h-CLAT kohane prognoos NEGATIIVSEKS (seejuures võetakse nõuetekohaselt arvesse punkti 30 sätteid) ja kolmandat tsüklit ei ole vaja. Kui aga kahe esimese tsükli tulemused ei lange vähemalt ühe markeri (CD54 või CD86) puhul kokku, on vaja kolmandat tsüklit ja lõplik prognoos tehakse kolme tsükli lõikes suurema osakaaluga tulemuse põhjal (st kaks kolmest). Seoses sellega tuleb silmas pidada, et kui viiakse läbi kaks sõltumatut tsüklit, millest ühes saadakse positiivne tulemus ainult CD86 puhul (edaspidi P1) ja teises positiivne tulemus ainult CD54 puhul (edaspidi P2), tuleb läbi viia kolmas tsükkel. Kui kolmandas tsüklis saadakse kummagi markeri puhul negatiivne tulemus (edaspidi N), tunnistatakse h-CLAT kohane prognoos NEGATIIVSEKS. Ent kui kolmandas tsüklis saadakse ükskõik kumma markeri puhul positiivne tulemus (P1 või P2) või mõlema markeri puhul positiivne tulemus (edaspidi P12), tunnistatakse h-CLAT kohane prognoos POSITIIVSEKS.

Joonis 1. h-CLAT puhul kasutatav prognoosimudel; h-CLAT kohast prognoosi tuleb arvesse võtta ühtse lähenemisviisi raamistikus ning kooskõlas üldise sissejuhatuse punktide 7 ja 8 sätetega

P1 – analüüsitsükkel, kus ainult CD86 on positiivne; P2 – analüüsitsükkel, kus ainult CD54 on positiivne; P12 – analüüsitsükkel, kus nii CD86 kui ka CD54 on positiivsed; N – analüüsitsükkel, kus ei CD86 ega CD54 ei ole positiivne.

* Kastides on esitatud kahe esimese analüüsitsükli tulemuste kombinatsioonid järjekorras, mis ei pruugi vastata nende saamise järjekorrale.

# Kastides on esitatud kolme analüüsitsükli tulemuste kombinatsioonid lähtuvalt ülemises kastis esitatud kahe esimese tsükli tulemustest, kuid esitatu ei kajasta tulemuste saamise järjekorda.

28.

h-CLAT kohase POSITIIVSE prognoosi saanud uuritava kemikaali puhul võib soovi korral määrata kaks toime avaldumise kontsentratsiooni: CD86 puhul EC150 ja CD54 puhul EC200. Need vastavad kontsentratsioonile, mille juures uuritava kemikaali põhjustatud RFI on vastavalt 150 või 200. Kui neid EC väärtusi kasutatakse näiteks katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi raames (4, 5, 6, 7, 8), võivad need aidata hinnata sensibiliseeriva toime tugevust (9). Neid saab arvutada järgmiste valemitega: , ,

EC 150 (for CD86) = Bconc + [(150 - BRFI )/ARFI - BRFI ) × (Aconc - Bconc )]

EC 200 (for CD86) = Bconc + [(200 - BRFI )/ARFI - BRFI ) × (Aconc - Bconc )]

kus

Aconc on väikseim kontsentratsioon (μg/ml), mille juures RFI > 150 (CD86) või 200 (CD54),

Bconc on suurim kontsentratsioon (μg/ml), mille juures RFI < 150 (CD86) või 200 (CD54),

ARFI on RFI väärtus väikseimal kontsentratsioonil, mille juures RFI > 150 (CD86) või 200 (CD54), ning

BRFI on RFI väärtus suurimal kontsentratsioonil, mille juures RFI < 150 (CD86) või 200 (CD54).

EC150 ja EC200 väärtuste täpsemaks määramiseks võib vaja minna kolme sõltumatut CD86/CD54 ekspressiooni mõõtmist. Lõplikud EC150 ja EC200 väärtused arvutatakse seejärel kolmes sõltumatus analüüsitsüklis saadud EC väärtuste mediaanina. Kui positiivsuse tingimused (vt punktid 26–27) on täidetud ainult kahes sõltumatus analüüsitsüklis kolmest, kasutatakse kahest asjaomasest arvutatud EC150 või EC200 väärtusest suuremat.

Nõuetekohasuse kriteeriumid

29.

h-CLAT kasutamisel peaksid olema täidetud järgmised katse nõuetekohasuse kriteeriumid (22, 27).

—	Söötmega ja lahustiga/kandeainega kontrollide puhul peaks rakkude eluvõimelisus olema suurem kui 90 %.

—

Lahustiga/kandeainega kontrollis ei tohiks RFI väärtus CD86 ega CD54 puhul ületada positiivsuse kriteeriumi kohast väärtust (CD86 puhul RFI ≥ 150 % ja CD54 puhul RFI ≥ 200 %). Lahustiga/kandeainega kontrolli puhul arvutatakse RFI väärtus punktis 25 esitatud valemiga ("kemikaaliga" tuleks asendada muutujaga "lahustiga/kandeainega" ning "lahustiga/kandeainega töödeldud" tuleks asendada muutujaga "(söötmega) kontrolli").

—	Söötmega ja lahustiga/kandeainega kontrollide puhul peaks nii CD86 kui ka CD54 puhul olema vastava MFI väärtuse ja isotüübikontrolliga saadud MFI väärtuse suhtarv > 105 %.

—	Positiivse kontrolli (DNCB) puhul peaks RFI väärtus nii CD86 kui ka CD54 puhul vastama positiivsuse kriteeriumile (CD86 puhul RFI ≥ 150 % ja CD54 puhul RFI ≥ 200 %) ning rakkude eluvõimelisus peaks olema üle 50 %.

—	Uuritava kemikaali puhul peaks rakkude eluvõimelisus olema igas tsüklis vähemalt neljal kasutatud kontsentratsioonil suurem kui 50 %.

30.

Negatiivsed tulemused võetakse arvesse üksnes juhul, kui uuritava kemikaali puhul on rakkude eluvõimelisus suurimal katses kasutatud kontsentratsioonil (st 1,2 × CV75 vastavalt punktis 20 kirjeldatud järjestikuse lahjendamise skeemile) väiksem kui 90 %. Kui rakkude eluvõimelisus 1,2 × CV75 juures on 90 % või suurem, tuleks negatiivne tulemus kõrvale jätta. Sellisel juhul soovitatakse kasutatava annuse täpsustamiseks korrata CV75 määramist. Tuleb märkida, et kui uuritava kemikaali suurim katsekontsentratsioon on füsioloogilises lahuses (või söötmes või muus lahustis/kandeaines) 5 000 μg/ml või DMSOs 1 000 μg/ml või suurim kontsentratsioon, mille juures kemikaal veel lahustub, võetakse negatiivne tulemus arvesse ka siis, kui rakkude eluvõimelisus on üle 90 %.

Katseprotokoll

31.

Katseprotokoll peaks sisaldama järgmist teavet.

Uuritav kemikaal

Ühest koostisosast koosnev aine:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed), CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muu identimisteave;

füüsiline välimus, log Kow, lahustuvus vees, lahustuvus DMSOs, molekulmass ja muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti/kandeaine valimise põhjendus.

Mitmest koostisosast koosnev aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal või segu:

võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt näiteks koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), puhtusest, kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohaseid füüsikalis-keemilisi omadusi käsitlevatest kättesaadavatest andmetest (vt eespool);

füüsiline välimus, lahustuvus vees, lahustuvus DMSOs ja muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

teadaoleva koostisega segu/polümeeri puhul molekulmass või näiline molekulmass või muu uuringu tegemiseks asjakohane teave;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti/kandeaine valimise põhjendus.

Kontrollid

Positiivne kontroll:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed), CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muu identimisteave;

füüsiline välimus, log Kow, lahustuvus vees, lahustuvus DMSOs, molekulmass ja vajaduse korral muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

vajaduse korral viide varasematele positiivse kontrolliga saadud tulemustele, millest nähtub vastavus asjakohastele analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriumidele.

Negatiivne ja lahustiga/kandeainega kontroll:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed), CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muu identimisteave;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

asjaomases katsejuhendis nimetamata lahusti/kandeaine kasutamisel kontrollina kättesaadav teave selle füüsilise välimuse, molekulmassi ja muude asjakohaste füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti/kandeaine valimise põhjendus.

Katsetingimused:

sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;

kasutatud katsemeetodi kirjeldus;

kasutatud rakuliin, selle säilitamise tingimused ning päritolu (nt asutus, kellelt rakud saadi);

kasutatud läbivoolutsütomeeter (nt mudel) ja selle seaded, kasutatud globuliin, antikehad ja tsütotoksilisuse marker;

pädevusainete analüüsimise meetod, mida kasutati labori pädevuse tõendamiseks, ning katsemeetodiga saadud tulemuste pikaajalise reprodutseeritavuse tõendamise viis, näiteks laboris kontrollidega ja/või reageerimisvõime kontrollimisel varem saadud andmed.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid:

lahustiga/kandeainega kontrolli puhul saadud rakkude eluvõimelisuse, MFI ja RFI väärtused võrrelduna vastavate nõuetekohasust kajastavate vahemikega;

positiivse kontrolliga saadud rakkude eluvõimelisuse ja RFI väärtused võrrelduna vastavate nõuetekohasust kajastavate vahemikega;

rakkude eluvõimelisus uuritud kemikaali igal katses kasutatud kontsentratsioonil.

Katse käik:

analüüsitsüklite arv;

uuritava kemikaali kontsentratsioonid, lisamisviis ja kasutatud kokkupuuteaeg (kui erineb soovitatust);

kasutatud hindamis- ja otsustamiskriteeriumide kirjeldus;

kõikide katse käigus tehtud muudatuste kirjeldus.

Tulemused:

tabeli kujul andmed uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli kohta igas analüüsitsüklis, sh CV75 (vajaduse korral), eraldi MFI, RFI ja rakkude eluvõimelisuse väärtused, EC150/EC200 väärtused (vajaduse korral) ning prognoosimudelil põhinev hinnang uuritava kemikaali kohta;

vajaduse korral mis tahes muude asjakohaste vaatlusandmete kirjeldus.

Tulemuste arutelu:

h-CLATga saadud tulemuste arutelu;

katse tulemuste hindamine ühtse lähenemisviisi kontekstis, kui muu asjakohane teave on kättesaadav.

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

Ashikaga, T., Yoshida, Y., Hirota, M., Yoneyama, K., Itagaki, H., Sakaguchi, H., Miyazawa, M., Ito, Y., Suzuki, H., ja Toyoda, H. (2006). Development of an in vitro skin sensitization test using human cell lines: The human Cell Line Activation Test (h-CLAT) I. Optimization of the h-CLAT protocol. Toxicol. In Vitro 20: 767–773.

(2)	Miyazawa, M., Ito, Y., Yoshida, Y., Sakaguchi, H., ja Suzuki, H. (2007). Phenotypic alterations and cytokine production in THP-1 cells in response to allergens. Toxicol. In Vitro 21: 428–437.

(3)	EURL ECVAM (2013). Recommendation on the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for skin sensitisation testing. Kättesaadav aadressil https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations.

(4)

Takenouchi, O., Fukui, S., Okamoto, K., Kurotani, S., Imai, N., Fujishiro, M., Kyotani, D., Kato, Y., Kasahara, T., Fujita, M., Toyoda, A., Sekiya, D., Watanabe, S., Seto, H., Hirota, M., Ashikaga, T., ja Miyazawa, M. (2015). Test battery with the human cell line activation test, direct peptide reactivity assay and DEREK based on a 139 chemical data set for predicting skin sensitizing potential and potency of chemicals. J. Appl. Toxicol. 35: 1318–1332.

(5)

Hirota, M., Fukui, S., Okamoto, K., Kurotani, S., Imai, N., Fujishiro, M., Kyotani, D., Kato, Y., Kasahara, T., Fujita, M., Toyoda, A., Sekiya, D., Watanabe, S., Seto, H., Takenouchi, O., Ashikaga, T., ja Miyazawa, M. (2015). Evaluation of combinations of in vitro sensitization test descriptors for the artificial neural network-based risk assessment model of skin sensitization. J. Appl. Toxicol. 35: 1333–1347.

(6)	Bauch, C., Kolle, S. N., Ramirez, T., Fabian, E., Mehling, A., Teubner, W., van Ravenzwaay, B., ja Landsiedel, R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potencials. Regul. Toxicol. Parmacol. 63: 489–504.

(7)	Van der Veen, J. W., Rorije, E., Emter, R., Natch, A., van Loveren, H., ja Ezendam, J. (2014). Evaluating the performance of integrated approaches for hazard identification of skin sensitizing chemicals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 69: 371–379.

(8)

Urbisch, D., Mehling, A., Guth, K., Ramirez, T., Honarvar, N., Kolle, S., Landsiedel, R., Jaworska, J., Kern, P. S., Gerberick, F., Natsch, A., Emter, R., Ashikaga, T., Miyazawa, M., ja Sakaguchi, H. (2015). Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul. Toxicol. Parmacol. 71: 337–351.

(9)

Jaworska, J. S., Natsch, A., Ryan, C., Strickland, J., Ashikaga, T., ja Miyazawa, M. (2015). Bayesian integrated testing strategy (ITS) for skin sensitization potency assessment: a decision support system for quantitative weight of evidence and adaptive testing strategy. Arch. Toxicol. 89: 2355–2383.

(10)	Strickland, J., Zang, Q., Kleinstreuer, N., Paris, M., Lehmann, D. M., Choksi, N., Matheson, J., Jacobs, A., Lowit, A., Allen, D., ja Casey, W. (2016). Integrated decision strategies for skin sensitization hazard. J. Appl. Toxicol. DOI 10.1002/jat.3281.

(11)	Nukada, Y., Ashikaga, T., Miyazawa, M., Hirota, M., Sakaguchi, H., Sasa, H., ja Nishiyama, N. (2012). Prediction of skin sensitization potency of chemicals by human Cell Line Activation Test (h-CLAT) and an attempt at classifying skin sensitization potency. Toxicol. In Vitro 26: 1150–60.

(12)

EURL ECVAM (2015). Re-analysis of the within and between laboratory reproducibility of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT). Kättesaadav aadressil https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-human-cell-line-activation-test-h-clat-for-skin-sensitisation-testing.

(13)	EURL ECVAM (2012). Human Cell Line Activation Test (h-CLAT) Validation Study Report. Kättesaadav aadressil https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations.

(14)	Takenouchi, O., Miyazawa, M., Saito, K., Ashikaga, T., ja Sakaguchi, H. (2013). Predictive performance of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for lipophilic with high octanol-water partition coefficients. J. Toxicol. Sci. 38: 599–609.

(15)

(16)	Fabian, E., Vogel, D., Blatz, V., Ramirez, T., Kolle, S., Eltze, T., van Ravenzwaay, B., Oesch, F., ja Landsiedel, R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87: 1683–1969.

(17)

Okamoto, K., Kato, Y., Kosaka, N., Mizuno, M., Inaba, H., Sono, S., Ashikaga, T., Nakamura, T., Okamoto, Y., Sakaguchi, H., Kishi, M., Kuwahara, H., ja Ohno, Y. (2010). The Japanese ring study of a human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for predicting skin sensitization potential (6th report): A study for evaluating oxidative hair dye sensitization potential using h-CLAT. AATEX 15: 81–88.

(18)	DB-ALM (INVITTOX) (2014). Protocol No. 158: human Cell Line Activation Test (h-CLAT). 23 lk. Kättesaadav aadressil http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.

(19)

Mizuno, M., Yoshida, M., Kodama, T., Kosaka, N., Okamato, K., Sono, S., Yamada, T., Hasegawa, S., Ashikaga, T., Kuwahara, H., Sakaguchi, H., Sato, J., Ota, N., Okamoto, Y., ja Ohno, Y. (2008). Effects of pre-culture conditions on the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) results; Results of the 4th Japanese inter-laboratory study. AATEX 13: 70–82.

(20)

Sono, S., Mizuno, M., Kosaka, N., Okamoto, K., Kato, Y., Inaba, H., Nakamura, T., Kishi, M., Kuwahara, H., Sakaguchi, H., Okamoto, Y., Ashikaga, T., ja Ohno, Y. (2010). The Japanese ring study of a human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for predicting skin sensitization potential (7th report): Evaluation of volatile, poorly soluble fragrance materials. AATEX 15: 89–96.

(21)	OECD (2005). Guidance Document No. 34 on The Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis, Prantsusmaa. 96 lk.

(22)

(23)

Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Viies, täiendatud väljaanne. United Nations Publications, New York ja Genf. ISBN: 978-92-1-117006-1. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

(24)	Euroopa Kemikaalide Ökotoksikoloogia ja Toksikoloogia Keskus (ECETOC) (2003). Contact Sensitization: Classification According to Potency. Technical Report No. 87. Euroopa Kemikaalide Ökotoksikoloogia ja Toksikoloogia Keskus.

(25)

Ashikaga, T., Sakaguchi, H., Okamoto, K., Mizuno, M., Sato, J., Yamada, T., Yoshida, M., Ota, N., Hasegawa, S., Kodama, T., Okamoto, Y., Kuwahara, H., Kosaka, N., Sono, S., ja Ohno, Y. (2008). Assessment of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for Skin Sensitization; Results of the First Japanese Inter-laboratory Study. AATEX 13: 27–35.

Liide 1.1

MÕISTED

Aine : looduslik või mis tahes tootmisprotsessi tulemusena saadud keemiline element või selle ühend koos püsivuse tagamiseks vajalike lisaainete ja tootmisprotsessi käigus tekkinud lisanditega, mis ei hõlma siiski lahusteid, mida on võimalik aine püsivust mõjutamata või selle koostist muutmata ainest eraldada.

Analüüsitsükkel : ühe või mitme uuritava kemikaali analüüsimine lahustiga/kandeainega kontrolli ja positiivse kontrolliga paralleelselt.

Asjakohasus : näitaja, mille abil kirjeldatakse, kuivõrd katsemeetod võimaldab uurida huvipakkuvat toimet, kas selle kasutamine on mõttekas ja kas see on konkreetse eesmärgi jaoks sobiv. Asjakohasusest nähtub, mil määral saab katsemeetodiga õigesti mõõta või ennustada huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasuse puhul võetakse arvesse ka katsemeetodiga saavutatavat täpsust (vastavust) (21).

CV75 : hinnanguline kontsentratsioon, mille juures rakkude eluvõimelisus on 75 %.

EC150 : kontsentratsioon, mille juures CD86 ekspressiooni kajastav RFI väärtus on 150.

EC200 : kontsentratsioon, mille juures CD54 ekspressiooni kajastav RFI väärtus on 200.

Fluorestsentssignaali suhteline tugevus (RFI) : kemikaaliga töödeldud rakkude fluorestsentssignaali tugevuse väärtuste geomeetrilise keskmise suhteline väärtus võrrelduna lahustiga/kandeainega töödeldud rakkude fluorestsentssignaali tugevuse väärtuste geomeetrilise keskmisega.

Kahjuliku toime rada : sündmuste ahel alates sihtkemikaali või rühma sarnaste kemikaalide keemilisest struktuurist sõltuvast käivitavast molekulaarsest sündmusest kuni vaadeldava toime avaldumiseni in vivo (22).

Katsete tegemist ja hindamist käsitlev ühtne lähenemisviis : struktureeritud lähenemisviis, mida kasutatakse kemikaali või rühma kemikaalide ohtlikkuse tuvastamiseks (võimalik toime), ohu kirjeldamiseks (toime tugevus) ja/või ohutuse hindamiseks (võimalik toime / toime tugevus ja kokkupuude) ning mille raames lõimitakse strateegiliselt ja kaalutakse läbi kõik asjakohased andmed võimalikku ohtu ja/või riski ja/või täiendavate sihipäraste ja seega minimaalses ulatuses katsete tegemise vajadust käsitleva regulatiivse otsuse tegemiseks.

Kemikaal : aine või segu.

Lahustiga/kandeainega kontroll : töötlemata proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente peale uuritava kemikaali, sealhulgas lahustit/kandeainet. Selle abil tehakse kindlaks lähtetase samas lahustis/kandeaines lahustatud või püsiva dispersiooni moodustanud uuritava kemikaaliga töödeldud proovide jaoks. Kui sellist töötlemata proovi hinnatakse paralleelselt söötmega kontrolliga, võimaldab see ühtlasi kindlaks teha, kas lahusti/kandeaine mõjutab katsesüsteemi.

Läbivoolutsütomeetria : tsütomeetriline meetod, mille puhul vedelikus suspendeeritud rakud liiguvad üksteise järel läbi ergastava valguse fookuse ning sellest tingitud valguse hajumise viis kajastab rakkude ja nende koostisosade omadusi; sageli märgistatakse rakud fluorestseeruvate markeritega, mille puhul valgus kõigepealt neeldub ja seejärel kiirgub muutunud sagedusel.

Mitmest koostisosast koosnev aine : aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja milles enam kui ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 10, kuid väiksem kui 80 massiprotsenti. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse tootmisprotsessi tulemusena. Erinevus segu ja mitmest koostisosast koosneva aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokku segamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.

Nõuetekohane katsemeetod : katsemeetod, mille asjakohasust ja usaldusväärsust konkreetse eesmärgi puhul peetakse piisavaks ning mis rajaneb teaduslikult usaldusväärsetel põhimõtetel. Katsemeetod ei ole kunagi nõuetekohane absoluutses tähenduses, vaid üksnes seoses teatud kindla eesmärgiga (21).

Ohtlikkus : mõjurit või olukorda iseloomustav omadus, millest võib tuleneda kahjulik toime, kui organism, süsteem või (alam)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.

Positiivne kontroll : paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida on töödeldud ainega, millega teadaolevalt saadakse positiivne tulemus. Positiivse tulemuse väärtus ei tohiks olla liiga suur, et võimaldada hinnata positiivse kontrolliga saadud tulemuste varieeruvust ajas.

Prehapteenid : kemikaalid, mis muutuvad sensibilisaatoriks abiootilise muundumise teel.

Prohapteenid : kemikaalid, mis vajavad nahka sensibiliseeriva toime tekkimiseks ensümaatilist aktiveerimist.

Segu : kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

Spetsiifilisus : katsemeetodiga õigesti negatiivseks/reaktsioonivõimetuks liigitatud uuritavate kemikaalide osakaal kõikide negatiivsete kemikaalide hulgas. Spetsiifilisus kajastab sellise katsemeetodi täpsust, millega saadakse kategoriseeritav tulemus, ning see on oluline näitaja katsemeetodi asjakohasuse hindamiseks (21).

Söötmega kontroll : töötlemata paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente. Sellist proovi käideldakse koos uuritava kemikaaliga töödeldud proovidega ja muude kontrollproovidega, et teha kindlaks, kas lahusti/kandeaine mõjutab katsesüsteemi.

Tundlikkus : katsemeetodiga õigesti positiivseks/reaktsioonivõimeliseks liigitatud uuritavate kemikaalide osakaal kõikide positiivsete kemikaalide hulgas. Tundlikkus kajastab sellise katsemeetodi täpsust, millega saadakse kategoriseeritav tulemus, ning see on oluline näitaja katsemeetodi asjakohasuse hindamiseks (21).

Täpsus : katsetulemuste ja vastuvõetavate võrdlusväärtuste kooskõla määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda mõistet kasutatakse sageli vastavuse tähenduses, et väljendada katsemeetodiga saadud õigete tulemuste osakaalu (21).

Usaldusväärsus : näitaja, mis iseloomustab katsemeetodiga saadud tulemuste reprodutseeritavust pikema aja jooksul samas laboris ja eri laborites, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus ning laborisisene korratavus (21).

Uuritav kemikaal : iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB : tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Värvimispuhver : fosfaadiga puhverdatud soolalahus, mis sisaldab 0,1 % veise seerumi albumiini.

Ühest koostisosast koosnev aine : aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja mille ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS) : süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ainete ja segude) klassifitseerimine vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud liigile ja tasemele ning mis hõlmab selliseid asjaomaseid teavitustähiseid nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ning keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku toime kohta (23).

Liide 1.2

PÄDEVUSAINED

Enne katsemeetodi B.71 juurde kuuluvas käesolevas liites kirjeldatud meetodi rutiinset kasutamist tuleks tõendada labori tehnilist pädevust. Selleks tuleks h-CLAT kasutamisel saada tabelis 1 esitatud kümne soovitatava aine puhul eeldatavale tulemusele vastav prognoos ning CV75, EC150 ja EC200 väärtused, mis jäävad kümnest pädevusainest vähemalt kaheksa puhul asjaomasesse võrdlusvahemikku. Pädevusained on valitud nii, et nende puhul oleksid esindatud naha sensibiliseerimise ohuga seotud eri reaktsioonid. Peale selle on valikukriteeriumidena võetud arvesse ainete kaubanduslikku kättesaadavust, kvaliteetsete in vivo võrdlusandmete olemasolu ja h-CLATga saadud kvaliteetsete in vitro andmete olemasolu. Lisaks on h-CLAT kohta olemas avaldatud võrdlusandmed (3, 14).

Tabel 1.

h-CLAT kasutamise tehnilise pädevuse tõendamiseks soovitatavad ained

Pädevusained	CASi nr	Füüsikaline olek	In vivo toime prognoos (101)	CV75 võrdlusvahemik, μg/ml (102)	h-CLAT tulemus CD86 puhul (EC150 võrdlusvahemik, μg/ml) (102)	h-CLAT tulemus CD54 puhul (EC200 võrdlusvahemik, μg/ml) (102)
2,4-dinitroklorobenseen	97-00-7	Tahkis	Sensibilisaator (äärmiselt tugev)	2–12	Positiivne (0,5–10)	Positiivne (0,5–15)
4-fenüleendiamiin	106-50-3	Tahkis	Sensibilisaator (tugev)	5–95	Positiivne (< 40)	Negatiivne (> 1,5) (103)
Nikkelsulfaat	10101-97-0	Tahkis	Sensibilisaator (mõõdukas)	30–500	Positiivne (< 100)	Positiivne (10–100)
2-merkaptobensotiasool	149-30-4	Tahkis	Sensibilisaator (mõõdukas)	30–400	Negatiivne (> 10) (103)	Positiivne (10–140)
R(+)-limoneen	5989-27-5	Vedelik	Sensibilisaator (nõrk)	> 20	Negatiivne (> 5) (103)	Positiivne (< 250)
Imidasolidinüülkarbamiid	39236-46-9	Tahkis	Sensibilisaator (nõrk)	25–100	Positiivne (20–90)	Positiivne (20–75)
Isopropanool	67-63-0	Vedelik	Sensibiliseeriva toimeta	> 5 000	Negatiivne (> 5 000 )	Negatiivne (> 5 000 )
Glütserool	56-81-5	Vedelik	Sensibiliseeriva toimeta	> 5 000	Negatiivne (> 5 000 )	Negatiivne (> 5 000 )
Piimhape	50-21-5	Vedelik	Sensibiliseeriva toimeta	1 500 –5 000	Negatiivne (> 5 000 )	Negatiivne (> 5 000 )
4-aminobensoehape	150-13-0	Tahkis	Sensibiliseeriva toimeta	> 1 000	Negatiivne (> 1 000 )	Negatiivne (> 1 000 )
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i registrinumber.

2. liide

NAHA SENSIBILISEERIMINE IN VITRO: RAKULIINI U937 AKTIVEERIMISE KATSE (U-SENS™)

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Katsemeetodiga U-SENS™ tehakse inimese histiotsüütse lümfoomi rakuliinis U937 kindlaks monotsüütide ja dendriitrakkude aktiveerimisega seotud raku pinnamarkeri (CD86) ekspressiooni kvantitatiivsed muutused pärast kokkupuudet sensibilisaatoriga (1). Seejärel kasutatakse rakuliinis U937 mõõdetud raku pinnamarkeri CD86 ekspressioonitaset toetava teabena, mis aitab eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri.

Katsemeetodit U-SENS™ on hinnatud L’Oreali koordineeritud valideerimisuuringus (2) ning seejärel on selle sõltumatult läbi vaadanud loomkatsete alternatiivide Euroopa Liidu referentlabori (EURL ECVAM) teaduslik nõuandekomitee (3). Võttes arvesse kõiki kättesaadavaid andmeid ning reguleerivate asutuste ja sidusrühmade seisukohti, soovitas EURL ECVAM kasutada katsemeetodit U-SENS™ (4) ühtse lähenemisviisi osana, et aidata ohu alusel klassifitseerimise ja märgistamise eesmärgil eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri. Oma juhenddokumendis, milles käsitletakse naha sensibiliseerimisega seotud ühtse lähenemisviisi puhul kasutatavaid andmete lõimimise struktureeritud metoodikaid ja teabeallikaid, vaatleb OECD mitut juhtumiuuringut, milles kirjeldatakse eri katsestrateegiaid ja prognoosimudeleid. Üks kõnealustest kindlaksmääratud metoodikatest põhineb katsemeetodil U-SENS (5). Näited meetodiga U-SENS™ saadud andmete kasutamisest kombineerituna muu teabega, sealhulgas varasemate katseandmete ja nõuetekohastest inimuuringutest saadud andmetega (6) on avaldatud kirjanduses (4, 5, 7).

U-SENS™ on osutunud rakendatavaks laborites, kus on olemas rakukultuurimeetodite kasutamise ja läbivoolutsütomeetrilise analüüsi kogemus. Selle meetodi puhul eeldatav prognooside reprodutseeritavuse ligikaudne määr on laborisisese ja laboritevahelise reprodutseeritavuse puhul vastavalt 90 % ja 84 % (8). Valideerimisuuringust (8) ja muudest avaldatud uuringutulemustest (1) nähtub üldiselt, et LLNA tulemustega võrreldes on selles katses naha sensibilisaatorite (st ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt 1. kategooria kemikaalide) mittesensibiliseerivatest kemikaalidest eristamise täpsus 86 % (N = 166), tundlikkus 91 % (118/129) ja spetsiifilisus 65 % (24/37). Inimuuringute tulemustega võrreldes on naha sensibilisaatorite (st ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt 1. kategooria kemikaalide) mittesensibiliseerivatest kemikaalidest eristamise täpsus 77 % (N = 101), tundlikkus 100 % (58/58) ja spetsiifilisus 47 % (20/43). LLNA tulemustega võrreldes on meetodi U-SENS™ kohaste valenegatiivsete prognooside tõenäosus suurem vähesel määral kuni mõõdukalt nahka sensibiliseerivate (st ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt alamkategooria 1B) kemikaalide puhul ja väiksem siis, kui tegemist on tugevalt nahka sensibiliseeriva (st ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt alamkategooria 1A) kemikaaliga (1, 8, 9). Kokkuvõttes nähtub sellest teabest, et U-SENS™ on kasulik meetod, mis aitab kindlaks teha naha sensibiliseerimise ohtu. Ainsa meetodina kasutatava U-SENS™-iga saavutatav eespool nimetatud täpsus on siiski üksnes orienteeriv, sest katseandmeid tuleks vaadelda ühtse lähenemisviisi kontekstis koos muudest allikatest pärit teabega ja kooskõlas üldise sissejuhatuse punktide 7 ja 8 sätetega. Kui hinnatakse naha sensibiliseerimise katsemeetodeid, mille puhul ei kasutata katseloomi, tuleb lisaks arvesse võtta, et LLNA ja muude loomkatsete tulemused ei pruugi täielikult kajastada kemikaali toimet inimesele.

Praeguse olemasoleva teabe põhjal on tõendatud, et U-SENS™ on kohaldatav paljude uuritavate kemikaalide (sealhulgas kosmeetikatoodete koostisainete, nt säilitusainete, pindaktiivsete ainete, toimeainete, värvainete) puhul, mis erinevad üksteisest orgaanilise funktsionaalrühma, füüsikalis-keemiliste omaduste, in vivo katsetega määratud nahka sensibiliseeriva toime tugevuse ja teadaolevalt naha sensibiliseerimisega seotud reaktsioonimehhanismide (Michaeli aktseptor, Schiffi aluse teke, atsüülrühma ülekande reaktiiv, nukleofiilne bimolekulaarne asendusreaktsioon [SN2] või nukleofiilne aromaatne asendusreaktsioon [SNAr]) poolest (1, 8, 9, 10). U-SENS™ on kohaldatav uuritavate kemikaalide puhul, mis on sobivas lahustis/kandeaines lahustuvad või moodustavad selles püsiva dispersiooni (st kolloidlahuse või suspensiooni, milles uuritav kemikaal ei sadestu ega eraldu lahustist/kandeainest eri faasi) (vt punkt 13). Andmestikus esindatud kemikaalidega, mis on teadaolevalt prehapteenid (oksüdeerumisel aktiveeruvad ained) või prohapteenid (ained, mis vajavad ensümaatilist aktiveerimist, nt P450 ensüümide abil), saadi meetodi U-SENS™ kasutamisel õige prognoositulemus (1, 10). Membraani lõhkuvate ainete puhul võidakse CD86 ekspressiooni mittespetsiifilise suurenemise tõttu saada valepositiivsed tulemused, nagu nähtub asjaolust, et in vivo võrdlusliigitusest lähtuvalt saadud seitsmest valepositiivsest tulemusest kolm olid seotud pindaktiivsete ainetega (1). Seetõttu tuleks pindaktiivsete ainetega saadud positiivsetesse tulemustesse suhtuda ettevaatusega, aga pindaktiivsete ainetega saadudnegatiivseid tulemusi võib arvesse võtta uuritava kemikaali liigitamisel kemikaaliks, mis nahka ei sensibiliseeri. U-SENS™ võimaldab hinnata ka fluorestseeruvaid uuritavaid kemikaale (1), kuid tugevalt fluorestseeruvad uuritavad kemikaalid, mille kiiratava kiirguse lainepikkus on sama kui fluorestseiinisotiotsüanaadil (FITC) või propiidiumjodiidil (PI), segavad läbivoolutsütomeetrilist analüüsi ning neid ei ole võimalik FITCga konjugeeritud antikehade või PI abil õigesti hinnata (esimese puhul võidakse saada valepositiivsed tulemused ja teise puhul ei saa mõõta eluvõimelisust). Sellisel juhul võib kasutada vastavalt muu fluorokroomiga märgistatud antikehasid või muud tsütotoksilisuse markerit, kui näiteks katsetega, mis tehakse liites 2.2 loetletud pädevusainetega, on võimalik tõendada, et sellise fluorokroomi või markeriga saadakse samasugused tulemused kui FITCga märgistatud antikehade või PIga (vt punkt 18). Eespool kirjeldatust lähtuvalt tuleks pindaktiivsete ainetega saadud positiivseid tulemusi ja tugevalt fluorestseeruvate uuritavate kemikaalidega saadud negatiivseid tulemusi tõlgendada kõnealuste piirangute kontekstis ja koos ühtse lähenemisviisi raames muudest allikatest saadud teabega. Kui leidub andmeid, mille kohaselt U-SENS™ ei sobi kasutamiseks mõne muu konkreetse uuritavate kemikaalide rühma puhul, ei tohiks seda asjaomase konkreetse kemikaalirühma puhul kasutada.

Nagu eespool kirjeldatud, aitab U-SENS™ eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri. Ent kui seda kasutatakse näiteks katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi raames, võib see aidata hinnata ka sensibiliseeriva toime tugevust. Võimalust kasutada meetodiga U-SENS™ saadud tulemusi toime tugevuse hindamisel on siiski vaja täiendavalt uurida, soovitatavalt inimuuringutest saadud andmete alusel.

Mõisted on esitatud liites 2.1.

KATSE PÕHIMÕTE

U-SENS™ on in vitro meetod, millega määratakse kvantitatiivselt raku pinnamarkeri CD86 ekspressiooni muutusi inimese histiotsüütse lümfoomi rakuliini U937 rakkudes pärast 45 ± 3 tunni pikkust kokkupuudet uuritava kemikaaliga. Pinnamarker CD86 on üks U937 aktiveerimise tüüpiline marker. Teadaolevalt on CD86 kostimulatoorne molekul, mis võib võimaldada jäljendada monotsüütide aktiveerimist, millel on väga oluline roll T-rakkude aktivatsioonis. Pinnamarkeri CD86 ekspressiooni muutusi mõõdetakse läbivoolutsütomeetriliselt pärast rakkude värvimist, milleks tavaliselt kasutatakse fluorestseiinisotiotsüanaadiga (FITC) märgistatud antikehasid. Samal ajal mõõdetakse ka tsütotoksilisust (nt PIga), et hinnata, kas pinnamarkeri CD86 ekspressiooni suurenemine toimub kontsentratsioonil, mille juures ei täheldata tsütotoksilisust. Arvutatakse pinnamarkeri CD86 stimulatsiooniindeks (SI) lahustiga/kandeainega kontrolli näitajaga võrrelduna ja seda tulemust kasutatakse prognoosimudelis (vt punkt 19), et aidata eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri.

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

Enne katsemeetodi B.71 juurde kuuluva käesolevas liites kirjeldatud meetodi rutiinset kasutamist tuleks tõendada labori tehnilist pädevust ning kasutada selleks liites 2.2 loetletud kümmet pädevusainet kooskõlas in vitro meetodeid käsitleva hea tavaga (11). Lisaks peaksid meetodi kasutajad haldama reageerimisvõime kontrollimise käigus kogutud andmeid (vt punkt 11) ning positiivsete ja lahustiga/kandeainega kontrollidega saadud varasemaid andmeid (vt punktid 15–16) sisaldavat andmebaasi ning kontrollima nende andmete põhjal, kas katsetulemused on laboris aja möödudes jätkuvalt reprodutseeritavad.

KATSE KÄIK

Käesolev meetod põhineb loomkatsetele alternatiivsete meetodite andmebaasi (DataBase on ALternative Methods, DB-ALM) teenusena kättesaadaval U-SENS™-i käsitleval katse-eeskirjal nr 183 (12). Meetodi U-SENS™ laboris juurutamisel ja rakendamisel tuleks kasutada standardset töökorda. U-SENS™-i rakendamiseks võib kasutada automaatsüsteemi, kui näiteks katsetega, mis tehakse liites 2.2 loetletud pädevusainetega, on võimalik tõendada, et sellise süsteemi kasutamisel saadakse sarnased tulemused. Allpool on kirjeldatud U-SENS™-i põhielemente ja katse käiku.

Rakkude ettevalmistamine

10.

U-SENS™-i puhul tuleks kasutada inimese histiotsüütse lümfoomi rakuliini U937 (13). Soovitatavalt tuleks rakud (kloon CRL1593.2) soetada usaldusväärsest rakupangast, näiteks Ameerika Tüüpkultuuride Kollektsioonist (American Type Culture Collection).

11.

U937 rakke kasvatatakse 37 °C juures reguleeritud õhuniiskusega 5-protsendilise CO2-sisaldusega atmosfääris söötmes RPMI-1 640, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, 2 mM L-glutamiini, 100 ühikut penitsilliini milliliitri kohta ja streptomütsiini kontsentratsioonis 100 μg/ml (täissööde). U937 rakke külvatakse regulaarselt iga 2–3 päeva järel ümber algtihedusega vastavalt 1,5 või 3 × 105 rakku/ml. Rakkude tihedus ei tohiks olla suurem kui 2 × 106 rakku/ml ja trüpaansinisega mittevärvumise alusel mõõdetud rakkude eluvõimelisus peaks olema ≥ 90 % (ei kohaldata esimesel sulatamisjärgsel väljakülvamisel). Enne katses kasutamist tuleks iga rakkude, veiselooteseerumi ja antikehade partii puhul teha reageerimisvõime kontroll, et veenduda nende sobivuses. Rakkude reageerimisvõime kontroll tuleks teha vähemalt üks nädal pärast sulatamist ning kasutada selleks positiivse kontrollina pikrüülsulfoonhapet (2,4,6-trinitrobenseensulfoonhape, TNBS) (CASi nr: 2 508-19-2; puhtus ≥ 99 %) ja negatiivse kontrollina piimhapet (CASi nr: 50-21-5, puhtus ≥ 85 %). Reageerimisvõime kontrollimisel tuleks kummagi kontrollkemikaali puhul kasutada kuut lõppkontsentratsiooni (TNBS puhul 1, 12,5, 25, 50, 75 ja 100 μg/ml ning piimhappe puhul 1, 10, 20, 50, 100 ja 200 μg/ml). Täissöötmes lahustatud TNBS peaks esile kutsuma CD86 alusel tuvastatava positiivse kontsentratsioonist sõltuva reaktsiooni (nt kui kontsentratsioonile, mille puhul reaktsioon on positiivne, st CD86 SI ≥ 150, järgneb kontsentratsioon, mille juures CD86 SI kasvab) ning täissöötmes lahustatud piimhappe puhul peaks CD86 alusel saadav tulemus olema negatiivne (vt punkt 21). Katses tuleks kasutada üksnes reageerimisvõime kontrolli kaks korda läbinud rakke. Rakke võib paljundada kuni seitsme nädala jooksul pärast sulatamist. Passaažide arv ei tohiks ületada 21. Reageerimisvõime kontroll tuleks teha vastavalt punktides 18–22 esitatud kirjeldusele.

12.

Katses kasutamiseks külvatakse U937 rakud välja tihedusega 3 × 105 rakku/ml või 6 × 105 rakku/ml ning eelkasvatatakse neid rakukultuuripudelis vastavalt kaks päeva või üks päev. Eespool kirjeldatust erinevaid eelkasvatamise tingimusi võib kasutada juhul, kui see on teaduslikult piisavalt põhjendatud ja näiteks katsetega, mis tehakse liites 2.2. loetletud pädevusainetega, on võimalik tõendada, et saadavad tulemused on sarnased. Katse päeval eemaldatakse rakud rakukultuuripudelist ja suspendeeritakse uuesti värskes söötmes tihedusel 5 × 105 rakku/ml. Seejärel jaotatakse rakud 100 μl kaupa 96-kannulise lamedapõhjalise plaadi kannudesse (rakkude lõpptihedus on 0,5 × 105 rakku kannu kohta).

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainete ettevalmistamine

13.

Enne katse tegemist hinnatakse lahustuvust. Selleks tehakse uuritavast kemikaalist lahus või püsiv dispersioon kontsentratsiooniga 50 mg/ml; lahustina/kandeainena kasutatakse eelistatavalt täissöödet või kui uuritav kemikaal ei ole täissöötmes lahustuv, siis dimetüülsulfoksiidi (DMSO, puhtusega ≥ 99 %). Katse tegemiseks lahustatakse uuritav kemikaal täissöötmes lõppkontsentratsioonini 0,4 mg/ml, kui kemikaal on kõnealuses lahustis/kandeaines lahustuv. Kui kemikaal lahustub üksnes DMSOs, lahustatakse kemikaal selles kontsentratsioonil 50 mg/ml. Kui see on teaduslikult piisavalt põhjendatud, võib kasutada ka eespool nimetatutest erinevat lahustit/kandeainet. Tuleks võtta arvesse uuritava kemikaali püsivust lahustit/kandeainet sisaldavas lõpplahuses.

14.

Uuritavad kemikaalid ja kontrollained valmistatakse ette katse tegemise päeval. Kuna annuse kindlaksmääramise katset ei tehta, kasutatakse esimeses analüüsitsüklis kuut lõppkontsentratsiooni (1, 10, 20, 50, 100 ja 200 μg/ml) vastavas lahustis/kandeaines, milleks on kas täissööde või 0,4 % DMSOd sisaldav sööde. Järgnevate analüüsitsüklite jaoks valmistatakse uuritavast kemikaalist vastava lahusti/kandeaine abil vähemalt neli töölahust (st vähemalt nelja eri kontsentratsiooniga); seejuures alustatakse täissöötmes lahustamisel kontsentratsioonist 0,4 mg/ml ja DMSOs lahustamisel kontsentratsioonist 50 mg/ml. Lõpuks lisatakse töölahustega töötlemiseks plaadil olevale töölahusele võrdne kogus U937 rakkude suspensiooni (vt punkt 11), et saavutada täiendav kahekordne lahjendus (12). Võimalikes täiendavates analüüsitsüklites kasutatavad kontsentratsioonid (vähemalt neli) valitakse kõigi eelnenud analüüsitsüklite tulemuste põhjal (8). Kasutamiseks sobivad lõppkontsentratsioonid on 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ja 200 μg/ml. Suurim lubatud lõppkontsentratsioon on 200 μg/ml. Kui kontsentratsioonil 1 μg/ml täheldatakse CD86 puhul positiivset väärtust, hinnatakse kontsentratsiooni 0,1 μg/ml, et leida uuritava kemikaali selline kontsentratsioon, mille juures CD86-põhist positiivsuse läviväärtust ei ületata. Igas analüüsitsüklis, kus täheldatakse CD86-põhist kontsentratsioonist sõltuvat positiivset reaktsiooni, arvutatakse EC150 (kemikaali kontsentratsioon, mille juures saavutatakse CD86-põhine positiivsuse läviväärtus 150 %; vt punkt 19). Kui uuritav kemikaal kutsub esile kontsentratsioonist sõltumatu positiivse CD86-põhisereaktsiooni, ei pruugi EC150 arvutamine olla asjakohane, nagu on kirjeldatud U-SENS™-i käsitlevas DB-ALMi katse-eeskirjas nr 183 (12). Igas analüüsitsüklis arvutatakse võimaluse korral alati CV70 (kontsentratsioon, mille juures kemikaali tsütotoksilisus saavutab läviväärtuse 70 %; vt punkt 19) (12). Et uurida CD86 taseme tõusu sõltuvust kontsentratsioonist, tuleks kasutamiseks sobivate kontsentratsioonide hulgast valida sellised kontsentratsioonid, mis on ühtlaselt jaotunud vahemikus EC150-st (või suurimast mittetsütotoksilisest kontsentratsioonist, mille juures CD86-põhine tulemus on negatiivne) kuni CV70-ni (või suurima lubatud kontsentratsioonini 200 μg/ml). Igas analüüsitsüklis tuleks kasutada vähemalt nelja kontsentratsiooni, millest kaks peaksid võrdlemise võimaldamiseks olema samad kui eelnenud analüüsitsükli(te)s.

15.

U-SENS™-i puhul kontrollina kasutatav lahusti/kandeaine on täissööde (kui uuritavast kemikaalist tehakse lahus või püsiv dispersioon söötmes) (vt punkt 4) või 0,4 % DMSO täissöötmes (kui uuritavast kemikaalist tehakse lahus või püsiv dispersioon DMSOs).

16.

U-SENS™-i puhul kasutatav positiivne kontroll on TNBS (vt punkt 11), mille ettevalmistamiseks kasutatakse täissöödet. TNBSi tuleks CD86 ekspressiooni mõõtmisel kasutada plaadil positiivse kontrollina ühes lõppkontsentratsioonis (50 μg/ml), mille puhul rakkude eluvõimelisus on > 70 %. TNBSi kasutamiseks plaadil kontsentratsioonis 50 μg/ml valmistatakse TNBSist täissöötmes 1 M põhilahus (st kontsentratsiooniga 293 mg/ml) ning lahjendatakse seda seejärel täissöötmes 2 930 korda, et saada töölahus kontsentratsiooniga 100 μg/ml. Negatiivse kontrollina tuleks kasutada piimhapet (CASi nr: 50-21-5), mille põhilahusest kontsentratsiooniga 0,4 mg/ml valmistatakse täissöötmes lahus kontsentratsiooniga 200 μg/ml. Igas analüüsitsüklis valmistatakse igal plaadil ette kolm täissöödet sisaldava töötlemata kontrolli, lahustiga/kandeainega kontrolli ning negatiivse ja positiivse kontrolli paralleelproovi (12). Võib kasutada ka mõnda muud sobivat positiivset kontrolli, kui on olemas varasemad andmed, mis võimaldavad kindlaks määrata võrreldavad analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriumid. Kõnealused analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriumid on samad kui uuritava kemikaali puhul (vt punkt 12).

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainetega töötlemine

17.

Punktides 14–16 kirjeldatud lahustiga/kandeainega kontrollproovid ja töölahused segatakse 96-kannulisele lamedapõhjalisele plaadile kantud rakususpensiooniga (vt punkt 12) mahuvahekorras 1: 1. Seejärel inkubeeritakse töödeldavaid plaate 37 °C juures 5-protsendilise CO2-sisaldusega atmosfääris 45 ± 3 tundi. Enne inkubeerimist kaetakse plaadid poolläbilaskva membraaniga, et takistada lenduvate uuritavate kemikaalide aurustumist ja uuritavate kemikaalidega töödeldud rakkude ristsaastumist (12).

Rakkude värvimine

18.

Pärast 45 ± 3 tundi kestnud kokkupuudet viiakse rakud V-kujuliste kannudega mikrotiiterplaadile ja kogutakse tsentrifuugimise teel. Lahustuvushäire korral tekivad kristallid või tilgad, mis on mikroskoobi all vaadeldavad pärast 45 ± 3 tunni pikkust töötlemist (enne rakkude värvimist). Supernatant visatakse ära ja allesjäänud rakke pestakse üks kord 100 μl jääkülmas fosfaadiga puhverdatud soolalahuses (PBS), mis sisaldab 5 % veiselooteseerumit (värvimispuhver). Pärast tsentrifuugimist suspendeeritakse rakud uuesti 100 μl värvimispuhvris ja neid värvitakse 4 °C juures 30 minuti vältel valguse eest kaitstult 5 μl (nt 0,25 μg) CD86-vastase antikehaga või hiire IgG1ga (isotüübikontroll), mis on märgistatud FITCga. Tuleks kasutada U-SENS™-i käsitlevas DB-ALMi katse-eeskirjas nr 183 (12) kirjeldatud antikehasid (CD86 puhul: BD-PharMingen, katalooginumber 5556 57, kloon Fun-1, või Caltag/Invitrogen, katalooginumber MHCD8601, kloon BU63; IgG1 puhul: BD-PharMingen, katalooginumber 5557 48, või Caltag/Invitrogen, katalooginumber GM4992). Katsemeetodi väljatöötajate kogemuste põhjal on eri partiide antikehade fluorestsentssignaali tugevus tavaliselt sarnane. Katses võib kasutada muid kloone või muu tarnija antikehi, millega on edukalt viidud läbi reageerimisvõime kontroll (vt punkt 11). Kasutajad võivad siiski kaaluda antikehade tiitrimist oma labori tingimustes, et teha kindlaks kõige paremad kasutamiseks sobivad kontsentratsioonid. Mõnda muud tuvastamissüsteemi, näiteks muu fluorokroomiga märgistatud CD86-vastaseid antikehasid võib kasutada juhul, kui näiteks katsetega, mis tehakse liites 2.2 loetletud pädevusainetega, on võimalik tõendada, et asjaomaste antikehadeja FITCga konjugeeritud antikehade puhul saadavad tulemused on sarnased. Pärast vähemalt kaks korda 100 μl värvimispuhvriga ja üks kord 100 μl jääkülma PBSiga pesemist suspendeeritakse rakud uuesti jääkülmas PBSis (nt katsuti kaupa käsitsi analüüsitavate proovide puhul 125 mikroliitris või proovide automaatsisestamiseks ette nähtud plaadi kasutamisel 50 mikroliitris) ning lisatakse PI lahus (lõppkontsentratsioon 3 μg/ml). Võib kasutada ka muid tsütotoksilisuse markereid, näiteks 7-aminoaktinomütsiin D-d (7-AAD) või trüpaansinist, kui näiteks katsetega, mis tehakse liites 2.2 loetletud pädevusainetega, on võimalik tõendada, et asjaomase muu värvainega ja PIga saadavad tulemused on sarnased.

Läbivoolutsütomeetriga analüüsimine

19.

CD86 ekspressioonitaset ja rakkude eluvõimelisust analüüsitakse läbivoolutsütomeetriga. Esimeses väravas R1 täheldatava rakupopulatsiooni selgeks tuvastamiseks ja rakuprügi elimineerimiseks kujutatakse rakke suuruse (FSC) ja granulaarsuse (SSC) punktdiagrammil, mis on esitatud logaritmskaalal. Iga kannu kohta registreeritakse väravas R1 kokku 10 000 rakku. Sama värava R1 rakke kujutatakse FL3 või FL4 ja SSC punktdiagrammil. Eluvõimeliste rakkude eristamiseks kasutatakse teist väravat R2, mille abil valitakse välja propiidiumjodiidi suhtes negatiivsete rakkude populatsioon (kanal FL3 või FL4). Tsütomeetri analüüsiprogrammi abil rakkude eluvõimelisuse arvutamiseks võib kasutada allpool esitatud valemit. Kui rakkude eluvõimelisus on väike, võib registreerida koos surnud rakkudega kokku kuni 20 000 rakku. Teine võimalus on registreerida andmeid ühe minuti jooksul alates analüüsi alustamise hetkest.

Formula

Seejärel mõõdetakse väravas R2 (R1 sees) olevate eluvõimeliste rakkude seas kanalis FL1 positiivsena registreeritud rakkude protsentuaalne osakaal. CD86 ekspressiooni rakkude pinnal analüüsitakse eluvõimelisi rakke (R2) kujutaval FL1 ja SSC punktdiagrammil.

Täissöötmega/IgG1ga kannude puhul seadistatakse analüüsimarker põhipopulatsioonile lähedale selliselt, et IgG1 signaaliga rakkude osakaal täissöötmega kontrollides jääks vahemikku 0,6–0,9 %.

Värvusest tulenev segav mõju avaldub nihkena FITCga märgistatud IgG1 punktdiagrammil (kanalis FL1 registreeritud IgG1 signaalile vastava SI geomeetriline keskmine on ≥ 150 %).

Töötlemata või 0,4 % DMSOd sisaldavate kontrollproovide rakkude ja kemikaaliga töödeldud rakkude CD86 stimulatsiooniindeks arvutatakse vastavalt järgmisele valemile:.

Formula

IgG1+-rakkude % töötlemata kontrollis – töötlemata eluvõimeliste rakkude seas analüüsimarkeriga kindlaks määratud, kanalis FL1 registreeritud positiivsete IgG1 signaaliga rakkude protsentuaalne osakaal (lubatav vahemik on ≥ 0,6 % ja < 1,5 %; vt punkt 22).

IgG1+/CD86+-rakkude % kontrollis/töödeldud proovis – kanalis FL1 registreeritud positiivsete IgG1/CD86 signaaliga rakkude protsentuaalne osakaal, mille mõõtmisel ei ole analüüsimarkerit eluvõimeliste kontrollrakkude / töödeldud rakkude suhtes nihutatud.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmete hindamine

20.

U-SENS™-i puhul arvutatakse järgmised näitajad: CV70 väärtus ehk kontsentratsioon, mille juures elusate U937 rakkude osakaal on 70 % (tsütotoksilisus on 30 %), ja EC150 väärtus ehk kontsentratsioon, mille juures uuritava kemikaali põhjustatud CD86 stimulatsiooniindeks (SI) on 150 %.

CV70 arvutatakse log-lineaarse interpolatsiooni teel järgmise valemiga:

CV70 = C1 + [(V1 – 70) / (V1 – V2) * (C2 – C1)],

kus

V1 on rakkude eluvõimelisuse vähim väärtus, mis ületab 70 %,

V2 on rakkude eluvõimelisuse suurim väärtus, mis jääb alla 70 %, ning

C1 ja C2 on kontsentratsioonid, mille juures rakkude eluvõimelisus on vastavalt V1 või V2.

CV70 leidmiseks on lubatud kasutada ka muid meetodeid, kui on tõendatud (nt katsetega, mis on tehtud pädevusainetega), et see ei mõjuta tulemusi.

EC150 arvutatakse log-lineaarse interpolatsiooni teel järgmise valemiga:

EC150 = C1 + [(150 – SI1) / (SI2 – SI1) * (C2 – C1)],

kus

C1 on suurim kontsentratsioon (μg/ml), mille juures CD86 SI < 150 % (SI1), ja

C2 on vähim kontsentratsioon (μg/ml), mille juures CD86 SI ≥ 150 % (SI2).

EC150 ja CV70 väärtused arvutatakse järgmiselt:

—	iga analüüsitsükli puhul saadud konkreetseid EC150 ja CV70 väärtusi kasutatakse selleks, et uurida CD86 taseme tõusu sõltuvust kontsentratsioonist (vt punkt 14);

—	keskmiste eluvõimelisuse väärtuste põhjal tehakse kindlaks üldine CV70 (12);

—	keskmiste CD86 SI väärtuste põhjal tehakse U-SENS™-i kohase prognoosi järgi POSITIIVSEKS loetud uuritava kemikaali puhul (vt punkt 21) kindlaks üldine EC150 (12).

Prognoosimudel

21.

CD86 ekspressiooni mõõtmisel hinnatakse iga uuritavat kemikaali vähemalt neljal kontsentratsioonil ja vähemalt kahes sõltumatus eri päevadel läbi viidavas analüüsitsüklis, mille põhjal tehakse üks prognoosijäreldus (NEGATIIVNE või POSITIIVNE).

—

U-SENS™-i iga üksiku analüüsitsükli kohast prognoosi käsitatakse negatiivsena (N), kui CD86 SI on kõigil mittetsütotoksilistel kontsentratsioonidel (rakkude eluvõimelisus on ≥ 70 %) alla 150 % ja ei täheldata segavat mõju (seoses tsütotoksilisusega, lahustuvusega (vt punkt 18) või värvusega (vt punkt 19), olenemata mittetsütotoksilisest kontsentratsioonist, mille juures segav mõju ilmneb). Kõigil muudel juhtudel – kui CD86 SI on 150 % või suurem ja/või täheldatakse segavat mõju – käsitatakse U-SENS™-i iga üksiku analüüsitsükli kohast prognoosi positiivsena (P).

—

U-SENS™-i kohast prognoosi käsitatakse NEGATIIVSENA, kui vähemalt kahe sõltumatu analüüsitsükli kohased prognoosid on negatiivsed (N) (joonis 1). Kui kahes esimeses analüüsitsüklis saadakse negatiivne (N) tulemus, siis tunnistatakse U-SENS™-i kohane prognoos NEGATIIVSEKS ja kolmandat analüüsitsüklit ei ole vaja läbi viia.

—

U-SENS™-i kohast prognoosi käsitatakse POSITIIVSENA, kui vähemalt kahe sõltumatu analüüsitsükli kohased prognoosid on positiivsed (P) (joonis 1). Kui kahes esimeses analüüsitsüklis saadakse positiivne (P) tulemus, siis tunnistatakse U-SENS™-i kohane prognoos POSITIIVSEKS ja kolmandat analüüsitsüklit ei ole vaja läbi viia.

—

Kuna annuse kindlaksmääramise katset ei tehta, käsitatakse erandina olukorda, kus esimeses analüüsitsüklis on CD86 SI 150 % või suurem üksnes suurimal mittetsütotoksilisel kontsentratsioonil. Sel juhul käsitatakse analüüsitsüklis saadud tulemust EBASELGENA (ES) ning tuleks läbi viia täiendavad analüüsitsüklid, kus kasutatakse ka muid kontsentratsioone (mis jäävad suurima mittetsütotoksilise ja vähima tsütotoksilise kontsentratsiooni vahele; vt punkt 20). Kui analüüsitsükli tulemus on ES, tuleks läbi viia veel vähemalt kaks analüüsitsüklit, millele lisandub neljas analüüsitsükkel juhul, kui teise ja kolmanda tsükli tulemused (teineteisest sõltumatult N ja/või P) ei lange kokku (joonis 1). Täiendavate analüüsitsüklite tulemust käsitatakse positiivsena isegi juhul, kui CD86 SI väärtust 150 % või enam täheldatakse üksnes ühel mittetsütotoksilisel kontsentratsioonil, sest kontsentratsioone on kohandatud vastavalt konkreetsele uuritavale kemikaalile. Lõplik prognoos tehakse selle põhjal, millise tulemuse osakaal on kolme või nelja eraldi analüüsitsükli lõikes suurem (st kaks kolmest või kaks neljast) (joonis 1).

Joonis 1. U-SENS™-i puhul kasutatav prognoosimudel; U-SENS™-i kohast prognoosi tuleks vaadelda ühtse lähenemisviisi raames ning kooskõlas punkti 4 ja üldise sissejuhatuse punktide 7, 8 ja 9 nõuetega

N – analüüsitsükkel, kus CD86 ei ole positiivne ja segavat mõju ei täheldata;

P – analüüsitsükkel, kus CD86 on positiivne ja/või täheldatakse segavat mõju;

ES – ebaselge; ebaselge tulemusega esimene analüüsitsükkel, kus CD86 on positiivne üksnes suurima mittetsütotoksilise kontsentratsiooni juures;

# – üksnes esimese analüüsitsükli põhjal ebaselgeks (ES) loetud üksiktulemus tingib automaatselt vajaduse viia läbi kolmas analüüsitsükkel, et saavutada positiivsete (P) või negatiivsete (N) tulemuste ülekaal vähemalt kolmest sõltumatust analüüsitsüklist vähemalt kahes;

$ – kastides on esitatud kolme analüüsitsükli tulemuste kombinatsioonid lähtuvalt ülemises kastis esitatud kahe esimese tsükli tulemustest;

° – kastides on esitatud nelja analüüsitsükli tulemuste kombinatsioonid lähtuvalt ülemises kastis esitatud kolme esimese tsükli tulemustest.

Nõuetekohasuse kriteeriumid

22.

Meetodi U-SENS™ kasutamisel peaksid olema täidetud järgmised katse nõuetekohasuse kriteeriumid (12).

—	U937 rakkude keskmine eluvõimelisus kolmes töötlemata paralleelproovis peab 45 ± 3 tundi kestnud kokkupuute lõpus olema > 90 % ja CD86 ekspressioonis ei tohi esineda triivi. Töötlemata U937 rakkude CD86 ekspressiooni baastasemele vastav väärtus peab jääma vahemikku ≥ 2 % ja ≤ 25 %.

—

DMSO kasutamisel lahustina arvutatakse DMSO juuresolekul saadud SI võrrelduna töötlemata rakkudega saadud SIga, et hinnata kandeainena DMSOd sisaldava kontrolli nõuetekohasust; seejuures peab kolme paralleelproovi rakkude keskmine eluvõimelisus olema > 90 %. Kandeainena DMSOd sisaldav kontroll on nõuetekohane, kui selle kolme paralleelprooviga saadud CD86 SI keskväärtus on väiksem kui 250 % töötlemata U937 rakkude kolme paralleelprooviga saadud CD86 SI keskväärtusest.

—	Analüüsitsükkel tunnistatakse nõuetekohaseks, kui töötlemata U937 rakkude puhul jääb vähemalt kaks kolmest IgG1ga saadud signaali väärtusest vahemikku ≥ 0,6 % ja < 1,5 %.

—	Samaaegselt hinnatav negatiivne kontroll (piimhappega) tunnistatakse nõuetekohaseks, kui kolmest paralleelproovist vähemalt kaks on negatiivsed (CD86 SI on < 150 %) ja neis ei täheldata tsütotoksilisust (rakkude eluvõimelisus on ≥ 70 %).

—	Positiivne kontroll (TNBSiga) tunnistatakse nõuetekohaseks, kui kolmest paralleelproovist vähemalt kaks on positiivsed (CD86 SI on ≥ 150 %) ja neis ei täheldata tsütotoksilisust (rakkude eluvõimelisus on ≥ 70 %).

Katseprotokoll

23.

Katseprotokoll peaks sisaldama järgmist teavet.

Uuritav kemikaal

Ühest koostisosast koosnev aine:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muu identimisteave;

füüsiline välimus, lahustuvus täissöötmes, lahustuvus DMSOs, molekulmass ja muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti/kandeaine valimise põhjendus.

Mitmest koostisosast koosnev aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal või segu:

füüsiline välimus, lahustuvus täissöötmes, lahustuvus DMSOs ja muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

teadaoleva koostisega segu/polümeeri puhul molekulmass või näiline molekulmass või muu uuringu tegemiseks asjakohane teave;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti/kandeaine valimise põhjendus.

Kontrollid

Positiivne kontroll:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muu identimisteave;

füüsiline välimus, lahustuvus DMSOs, molekulmass ja vajaduse korral muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

vajaduse korral viide varasematele positiivse kontrolliga saadud tulemustele, millest nähtub vastavus asjakohastele analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriumidele.

Negatiivne ja lahustiga/kandeainega kontroll:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muu identimisteave;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

asjaomases katsejuhendis nimetamata lahusti/kandeaine kasutamisel kontrollina kättesaadav teave selle füüsilise välimuse, molekulmassi ja muude asjakohaste füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti/kandeaine valimise põhjendus.

Katsetingimused:

sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;

kasutatud katsemeetodi kirjeldus;

kasutatud rakuliin, selle säilitamistingimused ning päritolu (nt asutus, kellelt rakud saadi);

kasutatud läbivoolutsütomeeter (nt mudel) ja selle seaded, kasutatud globuliin, antikehad ja tsütotoksilisuse marker;

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid:

lahustiga/kandeainega kontrolli puhul saadud rakkude eluvõimelisuse ja CD86 SI väärtused võrrelduna vastavate nõuetekohasust kajastavate vahemikega;

positiivse kontrolliga saadud rakkude eluvõimelisuse ja SI väärtused võrrelduna vastavate nõuetekohasust kajastavate vahemikega;

rakkude eluvõimelisus uuritud kemikaali igal katses kasutatud kontsentratsioonil.

Katse käik:

analüüsitsüklite arv;

uuritava kemikaali kontsentratsioonid, lisamisviis ja kasutatud kokkupuuteaeg (kui erineb soovitatust);

kokkupuute kestus;

kasutatud hindamis- ja otsustamiskriteeriumide kirjeldus;

kõikide katse käigus tehtud muudatuste kirjeldus.

Tulemused:

tabeli kujul andmed uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli kohta igas analüüsitsüklis, sh CV70 (vajaduse korral), SI, rakkude eluvõimelisuse väärtused, EC150 väärtused (vajaduse korral) ja prognoosimudelil põhinev hinnang uuritava kemikaali kohta;

vajaduse korral mis tahes muude asjakohaste vaatlusandmete kirjeldus.

Tulemuste arutelu:

U-SENS™-iga saadud tulemuste arutelu;

katse tulemuste hindamine ühtse lähenemisviisi kontekstis, kui muu asjakohane teave on kättesaadav.

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	Piroird, C., Ovigne, J. M., Rousset, F., Martinozzi-Teissier, S., Gomes, C., Cotovio, J., ja Alépée, N. (2015). The Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS) addresses the activation of dendritic cell event in the adverse outcome pathway for skin sensitization. Toxicol. In Vitro 29: 901–916.

(2)	ECVAM (2017). The U-SENS™ test method Validation Study Report. Kättesaadav aadressil http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations.

(3)	ECVAM (2016). ESAC Opinion No 2016-03 on the L'Oréal-coordinated study on the transferability and reliability of the U-SENS™ test method for skin sensitisation testing. EUR 28 178 EN; doi 10.2787/815737. Kättesaadav aadressil [http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103705].

(4)

ECVAM (2017). EURL ECVAM Recommendation on the use of non-animal approaches for skin sensitisation testing. EUR 28 553 EN; doi 10.2760/588955. Kättesaadav aadressil https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/eur-scientific-and-technical-research-reports/eurl-ecvam-recommendation-use-non-animal-approaches-skin-sensitisation-testing.

(5)	Steiling, W. (2016). Safety Evaluation of Cosmetic Ingredients Regarding their Skin Sensitization Potential. doi:10.3390/cosmetics3020014. Cosmetics 3: 14.

(6)

OECD (2016). Guidance Document on The Reporting of Defined Approaches and Individual Information Sources to be Used Within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) For Skin Sensitisation. Series on Testing and Assessment No. 256. ENV/JM/MONO(2016)29. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil [http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

(7)

(8)	Alépée, N., Piroird, C., Aujoulat, M., Dreyfuss, S., Hoffmann, S., Hohenstein, A., Meloni, M., Nardelli, L., Gerbeix, C., ja Cotovio, J. (2015). Prospective multicentre study of the U-SENS test method for skin sensitization testing. Toxicol. In Vitro 30: 373–382.

(9)

Reisinger, K., Hoffmann, S., Alépée, N., Ashikaga, T., Barroso, J., Elcombe, C., Gellatly, N., Galbiati, V., Gibbs, S., Groux, H., Hibatallah, J., Keller, D., Kern, P., Klaric, M., Kolle, S., Kuehnl, J., Lambrechts, N., Lindstedt, M., Millet, M., Martinozzi-Teissier, S., Natsch, A., Petersohn, D., Pike, I., Sakaguchi, H., Schepky, A., Tailhardat, M., Templier, M., van Vliet, E., ja Maxwell, G. (2014). Systematic evaluation of non-animal test methods for skin sensitisation safety assessment. Toxicol. In Vitro 29: 259–270.

(10)	Fabian, E., Vogel, D., Blatz, V., Ramirez, T., Kolle, S., Eltze, T., van Ravenzwaay, B., Oesch, F., ja Landsiedel, R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87: 1 683–1 696.

(11)

OECD. (2018). Draft Guidance Document on Good In Vitro Method Practices (GIVIMP) for the Development and Implementation of In Vitro Methods for Regulatory Use in Human Safety Assessment. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/ehs/testing/OECDFinal Draft GIVIMP.pdf.

(12)	DB-ALM (2016). Protocol no. 183: Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS™). 33 lk. Kättesaadav aadressil http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.

(13)	Sundström, C., ja Nilsson, K. (1976). Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). Int. J. Cancer 17: 565–577.

(14)

OECD (2005). Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Series on Testing and Assessment No. 34. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

(15)

Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO) (2015). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). ST/SG/AC.10/30/Rev.6. Kuues, täiendatud väljaanne. United Nations Publications, New York ja Genf. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/English/ST-SG-AC10-30-Rev6e.pdf.

(16)

OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

(17)	ECETOC (2003). Contact Sensitization: Classification According to Potency. Technical Report No. 87. Euroopa Kemikaalide Ökotoksikoloogia ja Toksikoloogia Keskus, Brüssel. Kättesaadav aadressil https://ftp.cdc.gov/pub/Documents/OEL/06.%20Dotson/References/ECETOC_2003-TR87.pdf.

Liide 2.1

MÕISTED

Analüüsitsükkel – ühe või mitme uuritava kemikaali analüüsimine lahustiga/kandeainega kontrolli ja positiivse kontrolliga paralleelselt.

CD86 – le avalduv kontsentratsioonist sõltuv mõju sõltuvus kontsentratsioonist esineb juhul, kui positiivse tulemuse (CD86 SI ≥ 150) saamiseks vajalikule kontsentratsioonile järgneval kontsentratsioonil täheldatakse CD86 SI suurenemist.

CV70 – hinnanguline kontsentratsioon, mille juures rakkude eluvõimelisus on 70 %.

EC150 – hinnanguline kontsentratsioon, mille puhul CD86 ekspressiooni kajastav SI on 150 %.

Kahjuliku toime rada – sündmuste ahel alates sihtkemikaali või rühma sarnaste kemikaalide keemilisest struktuurist sõltuvast käivitavast molekulaarsest sündmusest kuni vaadeldava toime avaldumiseni in vivo (15).

Katsete tegemist ja hindamist käsitlev ühtne lähenemisviis – struktureeritud lähenemisviis, mida kasutatakse kemikaali või rühma kemikaalide ohtlikkuse tuvastamiseks (võimalik toime), ohu kirjeldamiseks (toime tugevus) ja/või ohutuse hindamiseks (võimalik toime / toime tugevus ja kokkupuude) ning mille raames lõimitakse strateegiliselt ja kaalutakse läbi kõik asjakohased andmed võimalikku ohtu ja/või riski ja/või täiendavate sihipäraste ja seega minimaalses ulatuses katsete tegemise vajadust käsitleva regulatiivse otsuse tegemiseks.

Kemikaal – aine või segu.

Lahustiga/kandeainega kontroll – töötlemata proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente peale uuritava kemikaali, sealhulgas lahustit/kandeainet. Selle abil tehakse kindlaks lähtetase samas lahustis/kandeaines lahustatud või püsiva dispersiooni moodustanud uuritava kemikaaliga töödeldud proovide jaoks. Kui sellist töötlemata proovi hinnatakse paralleelselt söötmega kontrolliga, võimaldab see ühtlasi kindlaks teha, kas lahusti/kandeaine mõjutab katsesüsteemi.

Läbivoolutsütomeetria – tsütomeetriline meetod, mille puhul vedelikus suspendeeritud rakud liiguvad üksteise järel läbi ergastava valguse fookuse ning sellest tingitud valguse hajumise viis kajastab rakkude ja nende koostisosade omadusi; sageli märgistatakse rakud fluorestseeruvate markeritega, mille puhul valgus kõigepealt neeldub ja seejärel kiirgub muutunud sagedusel.

Mitmest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja milles enam kui ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 10, kuid väiksem kui 80 massiprotsenti. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse tootmisprotsessi tulemusena. Erinevus segu ja mitmest koostisosast koosneva aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokku segamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.

Nõuetekohane katsemeetod – katsemeetod, mille asjakohasust ja usaldusväärsust konkreetse eesmärgi puhul peetakse piisavaks ning mis rajaneb teaduslikult usaldusväärsetel põhimõtetel. Katsemeetod ei ole kunagi nõuetekohane absoluutses tähenduses, vaid üksnes seoses teatud kindla eesmärgiga (14).

Ohtlikkus – mõjurit või olukorda iseloomustav omadus, millest võib tuleneda kahjulik toime, kui organism, süsteem või (alam)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.

Prehapteenid – kemikaalid, mis muutuvad sensibilisaatoriks abiootilise muundumise, nt oksüdeerumise teel.

Prohapteenid – kemikaalid, mis vajavad nahka sensibiliseeriva toime tekkimiseks ensümaatilist aktiveerimist.

Segu – kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

SI – stimulatsiooniindeks. Kemikaaliga töödeldud rakkude fluorestsentssignaali tugevuse väärtuste geomeetrilise keskmise suhteline väärtus võrrelduna lahustiga töödeldud rakkude fluorestsentssignaali tugevuse väärtuste geomeetrilise keskmisega.

Triiv – triiv esineb juhul, kui i) kolmanda töötlemata kontrollprooviga saadud korrigeeritud CD86+(%) väärtus on väiksem kui 50 % esimese ja teise töötlemata kontrollprooviga saadud korrigeeritud CD86+(%) väärtuste keskmisest ning ii) negatiivse kontrolli kolmanda prooviga saadud korrigeeritud CD86+(%) väärtus on väiksem kui 50 % negatiivse kontrolli esimese ja teise prooviga saadud korrigeeritud CD86+(%) väärtuste keskmisest.

Täpsus – katsetulemuste ja vastuvõetavate võrdlusväärtuste kooskõla määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda mõistet kasutatakse sageli vastavuse tähenduses, et väljendada katsemeetodiga saadud õigete tulemuste osakaalu (14).

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Värvimispuhver – fosfaadiga puhverdatud soolalahus, mis sisaldab 5 % veiselooteseerumit.

Ühest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja mille ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS) – süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ainete ja segude) klassifitseerimine vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud liigile ja tasemele ning mis hõlmab selliseid asjaomaseid teavitustähiseid nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ning keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku toime kohta (16).

Liide 2.2

PÄDEVUSAINED

Enne katsemeetodi B.71 juurde kuuluvas käesolevas liites kirjeldatud meetodi rutiinset kasutamist tuleks tõendada labori tehnilist pädevust. Selleks tuleks U-SENS™-i kasutamisel saada tabelis 1 esitatud soovitatava kümne aine puhul eeldatavale tulemusele vastav prognoos ning CV70 ja EC150 väärtused, mis jäävad kümnest pädevusainest vähemalt kaheksa puhul asjaomasesse võrdlusvahemikku. Pädevusained on valitud nii, et nende puhul oleksid esindatud naha sensibiliseerimise ohuga seotud eri reaktsioonid. Peale selle on valikukriteeriumidena võetud arvesse ainete kaubanduslikku kättesaadavust, kvaliteetsete in vivo võrdlusandmete olemasolu ja U-SENS™-iga saadud kvaliteetsete in vitro andmete olemasolu. Lisaks on U-SENS™-i kohta olemas avaldatud võrdlusandmed (1, 8).

Tabel 1. 1

U-SENS™-i kasutamise tehnilise pädevuse tõendamiseks soovitatavad ained

Pädevusained	CASi nr	Füüsikaline olek	In vivo toime prognoos (104)	U-SENS Lahusti/kandeaine	U-SENS CV70 võrdlusvahemik, μg/ml (105)	U-SENS EC150 võrdlusvahemik, μg/ml (105)
4-fenüleendiamiin	106-50-3	Tahkis	Sensibilisaator (tugev)	Täissööde (106)	< 30	Positiivne (≤ 10)
Pikrüülsulfoonhape	2508-19-2	Vedelik	Sensibilisaator (tugev)	Täissööde	> 50	Positiivne (≤ 50)
Dietüülmaleaat	141-05-9	Vedelik	Sensibilisaator (mõõdukas)	DMSO	10–100	Positiivne (≤ 20)
Resortsinool	108-46-3	Tahkis	Sensibilisaator (mõõdukas)	Täissööde	> 100	Positiivne (≤ 50)
Kaneelalkohol	104-54-1	Tahkis	Sensibilisaator (nõrk)	DMSO	> 100	Positiivne (10–100)
4-allüülanisool	140-67-0	Vedelik	Sensibilisaator (nõrk)	DMSO	> 100	Positiivne (< 200)
Sahhariin	81-07-2	Tahkis	Sensibiliseeriva toimeta	DMSO	> 200	Negatiivne (> 200)
Glütserool	56-81-5	Vedelik	Sensibiliseeriva toimeta	Täissööde	> 200	Negatiivne (> 200)
Piimhape	50-21-5	Vedelik	Sensibiliseeriva toimeta	Täissööde	> 200	Negatiivne (> 200)
Salitsüülhape	69-72-7	Tahkis	Sensibiliseeriva toimeta	DMSO	> 200	Negatiivne (> 200)
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i registrinumber.

3. liide

NAHA SENSIBILISEERIMINE IN VITRO: IL-8 LUTSIFERAASIKATSE

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Erinevalt raku pinnamarkerite ekspressiooni analüüsimiseks ette nähtud katsetest mõõdetakse IL-8 lutsiferaasikatsega muutusi IL-8 ekspressioonis. IL-8 on tsütokiin, mis on seotud dendriitrakkude aktiveerimisega. IL-8 ekspressiooni mõõdetakse THP-1 baasil loodud IL-8 reporterrakuliinis (THP-G8, mis on saadud inimese ägeda monotsüütse leukeemia rakuliinist THP-1) pärast rakkude kokkupuudet sensibilisaatoriga (1). Selle meetodi puhul hinnatakse lutsiferaasi ekspressiooni, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri.

IL-8 lutsiferaasikatse meetodit on hinnatud Alternatiivsete Meetodite Valideerimise Jaapani Keskuse (JaCVAM), Jaapani majandus-, kaubandus- ja tööstusministeeriumi ning Loomkatsete Alternatiivide Jaapani Ühingu (JSAAE) läbi viidud valideerimisuuringus (2) ning seejärel on see vastastikuse eksperdihinnangu raames sõltumatult läbi vaadatud (3) JaCVAMi ning Jaapani tervishoiu-, töö- ja sotsiaalministeeriumi egiidi all ning alternatiivsete meetodite alase rahvusvahelise koostöö foorumi (ICATM) toetusel. Kõikidest kättesaadavatest andmetest ning reguleerivate asutuste ja sidusrühmade seisukohtadest lähtuvalt peetakse IL-8 lutsiferaasikatset ühtse lähenemisviisi kasulikuks osaks, mis võimaldab aidata ohu alusel klassifitseerimise ja märgistamise eesmärgil eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri. Näited IL-8 lutsiferaasikatsega saadud andmete kasutamisest muu teabega kombineerituna on avaldatud kirjanduses (4, 5, 6).

IL-8 lutsiferaasikatse meetod on osutunud rakendatavaks laborites, kus on olemas rakukultuuride kasutamise ja lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmise kogemus. Laborisisese ja laboritevahelise reprodutseeritavuse määr on vastavalt 87,7 % ja 87,5 % (2). Valideerimisuuringu (2) ja muude avaldatud tööde (1, 6) andmetest nähtub, et LLNA tulemustega võrreldes liigitati IL-8 lutsiferaasikatsega 143 kemikaalist 118 positiivseks või negatiivseks ja 25 kemikaali puhul oli tulemus ebaselge ning IL-8 lutsiferaasikatses oli naha sensibilisaatorite (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt 1. kategooria kemikaalide) mittesensibiliseerivatest kemikaalidest (ÜRO GHSi /CLP-määruse kohaselt kategoriseerimata kemikaalidest) eristamise täpsus 86 % (101/118), tundlikkus 96 % (92/96) ja spetsiifilisus 41 % (9/22). Kui allpool kirjeldatud kohaldamisalast (punkt 5) välja jäävad ained kõrvale jätta, liigitati IL-8 lutsiferaasikatsega 136 kemikaalist 113 positiivseks või negatiivseks ja 23 kemikaali puhul oli tulemus ebaselge ning IL-8 lutsiferaasikatse meetodi täpsus oli 89 % (101/113), tundlikkus 96 % (92/96) ja spetsiifilisus 53 % (9/17). Inimuuringute andmete alusel, millele on osutanud Urbisch et al. (7), liigitati IL-8 lutsiferaasikatsega 90 kemikaalist 76 positiivseks või negatiivseks ja 14 kemikaali puhul oli tulemus ebaselge ning meetodi täpsus oli 80 % (61/76), tundlikkus 93 % (54/58) ja spetsiifilisus 39 % (7/18). Kui kohaldamisalast välja jäävad ained kõrvale jätta, liigitati IL-8 lutsiferaasikatsega 84 kemikaalist 71 positiivseks või negatiivseks ja 13 kemikaali puhul oli tulemus ebaselge ning meetodi täpsus oli 86 % (61/71), tundlikkus 93 % (54/58) ja spetsiifilisus 54 % (7/13). IL-8 lutsiferaasikatses valenegatiivsete prognooside saamise tõenäosus on suurem vähesel määral kuni mõõdukalt nahka sensibiliseerivate (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt alamkategooria 1B) kemikaalide puhul ja väiksem siis, kui tegemist on tugevalt nahka sensibiliseeriva (ÜRO GHSi / CLP-määruse kohaselt alamkategooria 1A) kemikaaliga (6). Kokkuvõttes nähtub sellest teabest, et IL-8 lutsiferaasikatset saab kasutada naha sensibiliseerimise ohu kindlakstegemisel. Ainsa meetodina kasutatava IL-8 lutsiferaasikatsega saavutatav eespool nimetatud täpsus on siiski üksnes orienteeriv, sest katseandmeid tuleks vaadelda ühtse lähenemisviisi kontekstis koos muudest allikatest pärit teabega ja kooskõlas üldise sissejuhatuse punktide 8 ja 7 sätetega. Kui hinnatakse naha sensibiliseerimise katsemeetodeid, mille puhul ei kasutata katseloomi, tuleb lisaks meeles pidada, et LLNA ja muude loomkatsete tulemused ei pruugi täielikult kajastada kemikaali toimet inimesele.

Praeguse olemasoleva teabe põhjal on tõendatud, et IL-8 lutsiferaasikatse meetod on kohaldatav paljude uuritavate kemikaalide puhul, mis erinevad üksteisest orgaanilise funktsionaalrühma, toimemehhanismi, in vivo katsetega määratud nahka sensibiliseeriva toime tugevuse ja füüsikalis-keemiliste omaduste poolest (2, 6).

Kuigi kõnealuses IL-8 lutsiferaasikatses kasutatav lahusti on X-VIVOTM 15, võimaldab see katse anda õige hinnangu kemikaalide kohta, mille log Kow > 3,5 ja vees lahustuvus on programmiga EPI SuiteTM tehtud arvutuste kohaselt ligikaudu 100 μg/ml, ning tuvastada vees halvasti lahustuvaid nahka sensibiliseerivaid kemikaale tõhusamalt kui IL-8 lutsiferaasikatse, milles kasutatakse lahustina dimetüülsulfoksiidi (DMSO) (2). Ent kontsentratsioonil 20 mg/ml mittelahustuvate kemikaalide puhul saadavad negatiivsed tulemused võivad olla valenegatiivsed, kuna sellised kemikaalid ei lahustu X-VIVOTM 15-s. Seepärast tuleks kõnealuste kemikaalide puhul jätta negatiivsed tulemused arvesse võtmata. Valideerimisuuringus täheldati suurt valenegatiivsete tulemuste määra anhüdriidide puhul. Peale selle võidakse kasutatava rakuliini piiratud metaboliseerimisvõime (8) või katsetingimuste tõttu saada katses negatiivseid tulemusi ka prohapteenidega (ained, mis vajavad metaboolset aktiveerimist) ja prehapteenidega (ained, mis aktiveeruvad õhus oksüdeerumisel). Ehkki võimaliku pre- või prohapteeni puhul saadavate negatiivsete tulemuste tõlgendamisel tuleks olla ettevaatlik, oli IL-8 lutsiferaasikatset käsitlevas andmestikus esindatud ainete kohta tehtud õigete järelduste määr prehapteenide puhul 11/11, prohapteenide puhul 6/6 ja pre-/prohapteenide puhul 6/8 (2). Lähtuvalt pre- ja prohapteenide tuvastamiseks kasutatava kolme loomadega mitteseotud katsemeetodi (DPRA, KeratinoSens™ ja h-CLAT) hiljutisest põhjalikust analüüsist (9) ja tulenevalt asjaolust, et IL-8 lutsiferaasikatses kasutatav rakuliin THP-G8 on saadud h-CLATs kasutatavast rakuliinist THP-1, võib IL-8 lutsiferaasikatse meetod muude meetoditega kombineerituna aidata suurendada muudel kui loomkatsetel põhinevate meetodite tundlikkust pre- ja prohapteenide tuvastamisel. Seni uuritud pindaktiivsete ainetega on saadud (vale)positiivsed tulemused, seda olenemata nende liigist (nt katioonsed, anioonsed või mitteioonsed). Lisaks võivad lutsiferaasile segavat mõju avaldavad kemikaalid moonutada selle aktiivsust või mõõtmistulemusi ning seeläbi põhjustada näilist inhibitsiooni või tugevamat luminestsentsi (10). Näiteks on muude lutsiferaasipõhiste reportergeenikatsete puhul täheldatud, et fütoöstrogeenid, mis esinevad suuremas kontsentratsioonis kui 1 μM, mõjutavad luminestsentsisignaale lutsiferaasi reportergeeni üleaktiveerimise teel. Seepärast tuleb lutsiferaasi ekspressioonitaset, mis on mõõdetud suures kontsentratsioonis esineva fütoöstrogeeni või sellise ühendi juuresolekul, mille puhul kahtlustatakse fütoöstrogeeniga sarnast lutsiferaasi reportergeeni aktiveerivat toimet, hoolikalt analüüsida (11). Eespool kirjeldatust tulenevalt ei kuulu pindaktiivsed ained, anhüdriidid ja lutsiferaasile segavat mõju avaldavad kemikaalid käesoleva katsemeetodi kohaldamisalasse. Kui leidub andmeid, mille kohaselt IL-8 lutsiferaasikatset ei saa kasutada mõne muu konkreetse uuritavate kemikaalide rühma puhul, ei tohiks seda asjaomase konkreetse kemikaalirühma puhul kasutada.

Nagu eespool kirjeldatud, aitab IL-8 lutsiferaasikatse eristada naha sensibilisaatoreid kemikaalidest, mis nahka ei sensibiliseeri. Täiendavalt on vaja uurida seda, kas IL-8 lutsiferaasikatse tulemusi saab muudest allikatest pärit teabega kombineerituna kasutada toime tugevuse hindamisel; seda tuleks soovitatavalt teha inimuuringutest saadud andmete alusel.

Mõisted on esitatud liites 3.1.

KATSE PÕHIMÕTE

IL-8 lutsiferaasikatses kasutatakse inimese monotsüütse leukeemia rakuliini THP-1, mis on pärit Ameerika Tüüpkultuuride Kollektsioonist (Manassas, VA, Ameerika Ühendriigid). Selle rakuliini baasil on Tohoku Ülikooli arstiteaduskonna dermatoloogiaosakonnas loodud IL-8 reporterrakuliin THP-G8, mis sisaldab oranži valgust tekitava püsiva lutsiferaasi (SLO) ja punast valgust tekitava püsiva lutsiferaasi (SLR) geene, mis on vastavalt IL-8 ja glütseeraldehüüd-3-fosfaadi dehüdrogenaasi (GAPDH) promootori kontrolli all (1). See võimaldab pärast kokkupuudet sensibiliseeriva kemikaaliga luminestsentskiirguse tuvastamise teel kvantitatiivselt mõõta lutsiferaasi geeni aktiveerumist IL-8 ja GAPDH aktiivsuse näitajana; selleks otstarbeks kasutatakse üldkasutatavaid valgust tekitavaid lutsiferaasi substraate.

Kahe värvuse tekitamist võimaldav katsesüsteem koosneb oranži valgust tekitavast lutsiferaasist (SLO; λmaks = 580 nm) (12), mis võimaldab mõõta IL-8 promootorist sõltuvat geeniekspressiooni, ja punast valgust tekitavast lutsiferaasist (SLR; λmaks = 630 nm) (13), mis võimaldab mõõta sisemise kontrollina kasutatavat GAPDH promootorist sõltuvat geeniekspressiooni. Jaanimardika D-lutsiferiin kiirgab nende kahe lutsiferaasiga reageerides eri värvi valgust ning tekkivat luminestsentskiirgust mõõdetakse üheaegselt üheetapilises reaktsioonis: selleks kasutatakse katsesegust lähtuva valguskiirguse lahutamist optilise filtri abil (14) (liide 3.2).

10.

THP-G8 rakke töödeldakse 16 tunni jooksul uuritava kemikaaliga ning seejärel mõõdetakse lutsiferaasi SLO aktiivsus (SLO-LA), mis kajastab IL-8 promootori aktiivsust, ja lutsiferaasi SLR aktiivsus (SLR-LA), mis kajastab GAPDH promootori aktiivsust. Parema arusaadavuse huvides kasutatakse lühendite SLO-LA ja SLR-LA asemel vastavalt tähiseid IL8LA ja GAPLA. Tabelis 1 on esitatud ülevaade IL-8 lutsiferaasikatse puhul kasutatavatest lutsiferaasi aktiivsusega seotud mõistetest. Mõõdetud väärtuste põhjal arvutatakse järgmised näitajad: normaliseeritud IL8LA (nIL8LA), mida väljendatakse IL8LA ja GAPLA suhtarvuna; nIL8LA suurenemine (Ind-IL8LA), mida väljendatakse neljas uuritava kemikaaliga töödeldud THP-G8 rakkude paralleelproovis mõõdetud nIL8LA väärtuste aritmeetilise keskmise ja neljas töötlemata THP-G8 rakkude paralleelproovis mõõdetud nIL8LA väärtuste aritmeetilise keskmise suhtarvuna; GAPLA inhibeerimise määr (Inh-GAPLA), mida väljendatakse neljas uuritava kemikaaliga töödeldud THP-G8 rakkude paralleelproovis mõõdetud GAPLA väärtuste aritmeetilise keskmise ja neljas töötlemata THP-G8 rakkude paralleelproovis mõõdetud GAPLA väärtuste aritmeetilise keskmise suhtarvuna ning mida kasutatakse tsütotoksilisuse näitajana.

Tabel 1.

IL-8 lutsiferaasikatse puhul kasutatavad lutsiferaasi aktiivsusega seotud mõisted

Lühendid	Määratlus
GAPLA	Lutsiferaasi SLR aktiivsus, mis kajastab GAPDH promootori aktiivsust
IL8LA	Lutsiferaasi SLO aktiivsus, mis kajastab IL-8 promootori aktiivsust
nIL8LA	IL8LA: GAPLA
Ind-IL8LA	nIL8LA kemikaaliga töödeldud THP-G8 rakkudes: nIL8LA töötlemata rakkudes
Inh-GAPLA	GAPLA kemikaaliga töödeldud THP-G8 rakkudes: GAPLA töötlemata rakkudes
CV05	Kemikaali vähim kontsentratsioon, mille juures Inh-GAPLA on < 0,05

11.

Siin kirjeldatud IL-8 lutsiferaasikatse meetodiga sarnaste muudetud in vitro IL-8 lutsiferaasikatse meetodite valideerimise hõlbustamiseks on olemas tulemuslikkuse standardid (15), mis võimaldavad OECD katsejuhendit 442E selliste meetodite lisamiseks õigeaegselt muuta. OECD otsuse kohane andmete vastastikune tunnustamine on tagatud vaid sellise katsemeetodi puhul, mis on valideeritud kooskõlas tulemuslikkuse standarditega ning mille OECD on läbi vaadanud ja katsejuhendisse 442E lisanud (16).

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

12.

Enne katsemeetodi B.71 juurde kuuluvas käesolevas liites kirjeldatud meetodi rutiinset kasutamist tuleks tõendada labori tehnilist pädevust ning kasutada selleks liites 3.3 loetletud kümmet pädevusainet kooskõlas in vitro meetodeid käsitleva hea tavaga (17). Lisaks peaksid meetodi kasutajad haldama reageerimisvõime kontrollimise käigus kogutud andmeid (vt punkt 15) ning positiivsete ja lahustiga/kandeainega kontrollidega saadud varasemaid andmeid (vt punktid 21–24) sisaldavat andmebaasi ning kontrollima nende andmete põhjal, kas katsetulemused on laboris aja möödudes jätkuvalt reprodutseeritavad.

KATSE KÄIK

13.

IL-8 lutsiferaasikatse jaoks on olemas standardne töökord, mida tuleks katsemeetodi rakendamisel kasutada (18). Katset läbi viia soovivad laborid saavad soetada rekombinantse THP-G8 rakuliini Jaapanis Tottoris asuvastettevõttest GPC Lab. Co. Ltd., kui nad allkirjastavad OECD vormil esitatud tingimustele vastava materjali üleandmise lepingu. Järgmistes punktides on kirjeldatud katsemeetodi põhielemente ja katse käiku.

Rakkude ettevalmistamine

14.

IL-8 lutsiferaasikatse tegemiseks tuleks kasutada THP-G8 rakuliini, mis on soetatud Jaapanis Tottoris asuvast ettevõttest GPC Lab. Co. Ltd. (vt punktid 8 ja 13). Pärast rakkude kättesaamist paljundatakse neid (2–4 passaaži) ja säilitatakse need külmutatult homogeense tüvikultuurina. Kõnealuse tüvikultuuri rakkude paljundamiseks võib neid kuni 12 korda ümber külvata või kasvatada neid kuni kuue nädala jooksul. Paljundamiseks kasutatakse söödet RPMI-1640, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, antibiootikume / seentevastast ainet (0,85 % füsioloogilises lahuses 100 ühikut penitsilliin G-d milliliitri kohta, streptomütsiini kontsentratsioonis 100 μg/ml ja amfoteritsiin B-d kontsentratsioonis 0,25 μg/ml) (nt GIBCO, katalooginumber 15240-062), puromütsiini (nt CASi numbriga 58-58-2) kontsentratsioonis 0,15 μg/ml ja G418 (nt CASi numbriga 108321-42-2) kontsentratsioonis 300 μg/ml.

15.

Enne rakkude kasutamist katses tuleks teha reageerimisvõime kontroll, et veenduda rakkude sobivuses. Kõnealune kontroll tuleks teha 1–2 nädalat pärast sulatamist või pärast 2–4 korda ümber külvamist ning kasutada selleks positiivse kontrollina 4-nitrobensüülbromiidi (4-NBB) (CASi nr: 100-11-8; puhtus ≥ 99 %) ja negatiivse kontrollina piimhapet (CASi nr: 50-21-5; puhtus ≥ 85 %). 4-NBB puhul peaks Ind-IL8LA alusel tuvastatav reaktsioon olema positiivne (Ind-IL8LA ≥ 1,4) ja piimhappe puhul negatiivne (Ind-IL8LA < 1,4). Katses kasutatakse üksnes reageerimisvõime kontrolli läbinud rakke. Reageerimisvõime kontroll tuleb teha vastavalt punktides 22–24 esitatud kirjeldusele.

16.

Katses kasutamiseks külvatakse THP-G8 rakud välja tihedusega 2–5 × 105 rakku/ml ning eelkasvatatakse neid rakukultuuripudelis 48–96 tundi. Katse päeval pestakse rakukultuuripudelist eemaldatud rakke söötmega RPMI-1640, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, aga ei sisalda antibiootikume, ja rakud suspendeeritakse uuesti 10 % veiselooteseerumit sisaldavas antibiootikumideta söötmes RPMI-1640 tihedusel 1 × 106 rakku/ml. Seejärel jaotatakse rakud 50 μl kaupa 96-kannulise lamedapõhjalise plaadi kannudesse (nt Costar, katalooginumber 3603) (5 × 104 rakku kannu kohta).

Uuritava kemikaali ja kontrollainete ettevalmistamine

17.

Uuritav kemikaal ja kontrollained valmistatakse ette katse tegemise päeval. IL-8 lutsiferaasikatse puhul lahustatakse uuritav kemikaal turul kättesaadavas seerumita söötmes X-VIVOTM 15 (Lonza, 04-418Q) lõppkontsentratsioonini 20 mg/ml. X-VIVOTM 15 lisatakse mikrotsentrifuugi katsutis olevale 20 mg uuritavale kemikaalile (olenemata kemikaali lahustuvusest) kuni koguseni 1 ml. Seejärel segatakse lahust ägedalt keerissegistil ja loksutatakse 30 minutit rootori maksimumkiirusel 8 pööret minutis ümbritseva õhu temperatuuril umbes 20oC juures. Kui katsutisse jääb veel lahustumata tahket kemikaali, töödeldakse seda ultraheliga, kuni kemikaal on täielikult lahustunud või moodustab püsiva dispersiooni. Kui uuritav kemikaal on X-VIVOTM 15-s lahustuv, siis lahjendatakse lahust viis korda X-VIVOTM 15-ga ja kasutatakse saadud lahust X-VIVOTM 15-s lahustatud uuritava kemikaali põhilahusena (4 mg/ml). Kui uuritav kemikaal ei ole X-VIVOTM 15-s lahustuv, loksutatakse segu pöördloksutil veel vähemalt 30 minutit ning tsentrifuugitakse seejärel 5 minutit kiirusel 15000 pööret minutis (≈ 20 000 g); saadud supernatanti kasutatakse X-VIVOTM 15-s lahustatud uuritava kemikaali põhilahusena. Muu lahusti, näiteks DMSO, vee või söötme kasutamisel tuleks esitada sellekohane teaduslik põhjendus. Kemikaalide lahustamise korda on üksikasjalikult kirjeldatud liites 3.5. Punktides 18–23 kirjeldatud X-VIVOTM 15 lahused segatakse 96-kannulisele lamedapõhjalisele mustale plaadile kantud rakususpensiooniga (vt punkt 16) mahuvahekorras 1: 1.

18.

Esimese analüüsitsükli puhul on eesmärk teha kindlaks tsütotoksilisuse avaldumise kontsentratsioon ja uurida kemikaali võimet nahka sensibiliseerida. X-VIVOTM 15-s lahustatud uuritava kemikaali põhilahusest tehakse 96-kannulisel katseplaadil (nt Costar, katalooginumber EW-01729-03) X-VIVOTM 15 abil rida kahekordseid lahjendusi (vt liide 3.5). Seejärel lisatakse 96-kannulisele lamedapõhjalisele mustale plaadile kantud 50 μl rakususpensioonile 50 μl lahjendatud lahust kannu kohta. Nii saadakse X-VIVOTM 15-s lahustuva uuritava kemikaali lõppkontsentratsioonid vahemikus 0,002–2 mg/ml (liide 3.5). Selliste uuritavate kemikaalide puhul, mis X-VIVOTM 15-s kontsentratsioonil 20 mg/ml ei lahustu, tehakse kindlaks ainult lahjendustegurid vahemikus 2–210, kuid uuritava kemikaali tegelikud lõppkontsentratsioonid ei ole teada ja sõltuvad uuritava kemikaali küllastuskontsentratsioonist X-VIVOTM 15-s valmistatud põhilahuses.

19.

Järgnevates analüüsitsüklites (st teises, kolmandas ja neljandas tsüklis) valmistatakse põhilahus X-VIVOTM 15-s neli korda suurema kontsentratsiooniga, kui oli esimeses tsüklis kasutatud kontsentratsioon, mille juures rakkude eluvõimelisus oli läviväärtusest väiksem (CV05 – väiksem kontsentratsioon, mille juures Inh-GAPLA on < 0,05). Kui Inh-GAPLA ei lange alla 0,05 ka kõige suuremal esimeses analüüsitsüklis kasutatud kontsentratsioonil, valmistatakse põhilahus X-VIVOTM 15-s esimeses analüüsitsüklis kasutatud suurima kontsentratsiooniga. CV05-le vastava kontsentratsiooni arvutamiseks jagatakse esimeses analüüsitsüklis kasutatud põhilahuse kontsentratsioon CV05 puhul kasutatud lahendusteguriga X (lahjendustegur CV05 (X) – lahjendustegur, mida tuleb kasutada põhilahuse lahjendamiseks kontsentratsioonini CV05) (vt liide 3.5). Selliste uuritavate ainete puhul, mis kontsentratsioonil 20 mg/ml X-VIVOs ei lahustu, tehakse CV05 kindlaks nii, et põhilahuse kontsentratsioon korrutatakse teguriga 1/X. 2.–4. analüüsitsükli jaoks valmistatakse teine põhilahus kontsentratsiooniga 4 × CV05 (liide 3.5).

20.

Teisest põhilahusest valmistatakse X-VIVOTM 15-ga 96-kannulisel katseplaadil rida 1,5-kordseid lahjendusi. Seejärel lisatakse 96-kannulise lamedapõhjalise musta plaadi kannudesse kantud 50 μl rakususpensioonile 50 μl lahjendatud lahust kannu kohta. Iga uuritavat kemikaali tuleks igal kontsentratsioonil analüüsida neljas kannus. Järgnevalt segatakse proovid plaadiloksutil ja neid inkubeeritakse 37oC juures 5-protsendilise CO2-sisaldusega atmosfääris 16 tundi. Seejärel mõõdetakse lutsiferaasi aktiivsus allpool kirjeldatud viisil.

21.

Lahustiga kontrollina kasutatakse segu, mis sisaldab kannu kohta 50 μl X-VIVOTM 15 ja 50 μl rakususpensiooni 10 % veiselooteseerumit sisaldavas RPMI-1640-s.

22.

Soovitatav positiivse kontrolli aine on 4-NBB. 1,5 ml mikrotsentrifuugi katsutisse viiakse 20 mg 4-NBBd ning lisatakse X-VIVOTM 15 kuni koguseni 1 ml. Lahust segatakse ägedalt keerissegistil ja loksutatakse vähemalt 30 minutit jooksul rootori maksimumkiirusel 8 pööret minutis. Pärast 5 minutit tsentrifuugimist kiirendusega 20000 g lahjendatakse supernatanti X-VIVOTM 15-ga neli korda ning 500 μl lahjendatud supernatanti kantakse 96-kannulise katseplaadi ühte kannu. Lahjendatud supernatanti lahjendatakse X-VIVOTM 15-ga uuesti kaks ja neli korda ning igast saadud lahusest lisatakse 50 μl 96-kannulise lamedapõhjalise musta plaadi kannudesse, mis sisaldavad 50 μl THP-G8 rakkude suspensiooni (liide 3.6). Positiivset kontrolli tuleks igal kontsentratsioonil analüüsida neljas kannus. Plaati loksutatakse plaadiloksutil ja inkubeeritakse CO2 inkubaatoris 37oC juures 5-protsendilise CO2-sisaldusega atmosfääris 16 tundi. Seejärel mõõdetakse punktis 29 kirjeldatud viisil lutsiferaasi aktiivsus.

23.

Soovitatav negatiivse kontrolli aine on piimhape. 1,5 ml mikrotsentrifuugi katsutisse viiakse 20 mg piimhapet ning lisatakse X-VIVOTM 15 kuni koguseni 1 ml (20 mg/ml). Piimhappelahust kontsentratsiooniga 20 mg/ml lahjendatakse X-VIVOTM 15-ga veel viis korda (4 mg/ml); 500 μl saadud piimhappelahusest kontsentratsiooniga 4 mg/ml kantakse 96-kannulise katseplaadi ühte kannu. Seda lahust lahjendatakse X-VIVOTM 15-ga kaks korda ja seejärel uuesti kaks korda, et saada lahused kontsentratsiooniga 2 mg/ml ja 1 mg/ml. Igast saadud kolmest lahusest ja kandeainega kontrollist (X-VIVOTM 15) lisatakse 50 μl 96-kannulise lamedapõhjalise musta plaadi kannudesse, mis sisaldavad 50 μl THP-G8 rakkude suspensiooni. Negatiivset kontrolli analüüsitakse igal kontsentratsioonil neljas kannus. Plaati loksutatakse plaadiloksutil ja inkubeeritakse CO2 inkubaatoris 37oC juures 5-protsendilise CO2-sisaldusega atmosfääris 16 tundi. Seejärel mõõdetakse punktis 29 kirjeldatud viisil lutsiferaasi aktiivsus.

24.

Võib kasutada ka mõnda muud sobivat positiivset või negatiivset kontrolli, kui on olemas varasemad andmed, mis võimaldavad kindlaks määrata võrreldavad analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriumid.

25.

Tuleks jälgida, et lenduvad uuritavad kemikaalid ei aurustuks, ning hoida ära kannudevahelist uuritava kemikaaliga ristsaastumist. Selleks võib plaadi enne uuritava kemikaaliga inkubeerimist näiteks tihedalt kinni katta.

26.

Uuritavate kemikaalide ja lahustiga kontrolli puhul on positiivse või negatiivse prognoosi saamiseks vaja läbi viia 2–4 analüüsitsüklit (vt tabel 2). Iga analüüsitsükkel viiakse läbi eri päeval; igas tsüklis kasutatakse X-VIVOTM 15-s lahustatud uuritava kemikaali värsket põhilahust ja sõltumatult kogutud rakke. Rakud võivad pärineda samast passaažist.

Lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmine

27.

Luminestsentskiirgust mõõdetakse 96-kannulise mikroplaadi jaoks ette nähtud luminomeetriga, mis on varustatud optiliste filtritega – nt seadmega Phelios (ATTO, Tokyo, Jaapan) või Tristan 941 (Berthold, Bad Wildbad, Saksamaa) või ARVO-seeria seadmega (PerkinElmer, Waltham, MA, Ameerika Ühendriigid). Reprodutseeritavuse tagamiseks tuleb luminomeeter iga katse eel kalibreerida (19). Kalibreerimiseks on saadaval oranži või punast valgust tekitavad rekombinantsed lutsiferaasid.

28.

Igasse kemikaaliga töödeldud või töötlemata rakususpensiooni sisaldavasse plaadi kannu lisatakse 100 μl lutsiferaasikatse eelsoojendatud reaktiivi Tripluc® (Tripluc). Plaati loksutatakse 10 minutit ümbritseva õhu temperatuuril umbes 20oC juures. Lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmiseks asetatakse plaat luminomeetrisse. Bioluminestsentsi mõõdetakse 3 sekundit ilma optilise filtrita (F0) ja 3 sekundit optilise filtriga (F1). Kui kasutatakse muid seadeid, mis võivad sõltuda näiteks kasutatava luminomeetri mudelist, tuleks seda põhjendada.

29.

Mõõdetud väärtuste põhjal arvutatakse soovitud näitajad iga kontsentratsiooni puhul, nt IL8LA, GAPLA, nIL8LA, Ind-IL8LA, Inh-GAPLA, IL8LA keskväärtus ± standardhälve, GAPLA keskväärtus ± standardhälve, nIL8LA keskväärtus ± standardhälve, Ind-IL8LA keskväärtus ± standardhälve, Inh-GAPLA keskväärtus ± standardhälve ja Ind-IL8LA usaldusvahemik usaldusnivool 95 %. Käesolevas punktis nimetatud näitajate määratlused on esitatud liidetes 3.1 ja 3.4.

30.

Mitme värvuse tuvastamist võimaldavate reporterkatsete puhul kasutatakse mõõtmise eel eri värvuste lahutamiseks üldjuhul selliseid detektorseadmeid (luminomeeter ja plaadilugemisseade), mis on varustatud optiliste filtritega, nt teravapiiriliste madal- või kõrgpääsufiltrite või ribapääsufiltritega. Enne katset tuleks määrata filtrite läbilaskvustegurid iga bioluminestsentssignaali värvuse jaoks vastavalt liitele 3.2.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmete hindamine

31.

Positiivseks/negatiivseks liigitamise otsus tehakse igas analüüsitsüklis järgmiste kriteeriumide alusel:

—	IL-8 lutsiferaasikatsel põhinev prognoos tunnistatakse positiivseks, kui uuritava kemikaaliga saadud Ind-IL8LA väärtus on ≥ 1,4 ja Ind-IL8LAd iseloomustava usaldusnivoole 95 % vastava usaldusvahemiku alampiir on ≥ 1,0;

—	IL-8 lutsiferaasikatsel põhinev prognoos tunnistatakse negatiivseks, kui uuritava kemikaaliga saadud Ind-IL8LA väärtus on < 1,4 ja/või Ind-IL8LAd iseloomustava usaldusnivoole 95 % vastava usaldusvahemiku alampiir on < 1,0.

Prognoosimudel

32.

Uuritav kemikaal, mille puhul on esimese, teise, kolmanda ja neljanda analüüsitsükli lõikes saadud kaks positiivset tulemust, tunnistatakse positiivseks; uuritav kemikaal, mille puhul on esimese, teise, kolmanda ja neljanda analüüsitsükli lõikes saadud kolm negatiivset tulemust, tunnistatakse arvatavalt negatiivseks (tabel 2). Arvatavalt negatiivsete kemikaalide seas tunnistatakse negatiivseks sellised kemikaalid, mis lahustuvad X-VIVOTM 15-s kontsentratsioonil 20 mg/ml; kemikaalid, mis X-VIVOTM 15-s kontsentratsioonil 20 mg/ml ei lahustu, tuleks kõrvale jätta (joonis 1).

Tabel 2.

Positiivsete ja arvatavalt negatiivsete kemikaalide kindlakstegemise kriteeriumid

1. tsükkel	2. tsükkel	3. tsükkel	4. tsükkel	Lõplik prognoos
Positiivne	Positiivne	—	—	Positiivne
	Negatiivne	Positiivne	—	Positiivne
		Negatiivne	Positiivne	Positiivne
		Negatiivne	Negatiivne	Arvatavalt negatiivne
Negatiivne	Positiivne	Positiivne	—	Positiivne
		Negatiivne	Positiivne	Positiivne
		Negatiivne	Negatiivne	Arvatavalt negatiivne
	Negatiivne	Positiivne	Positiivne	Positiivne
		Positiivne	Negatiivne	Arvatavalt negatiivne
		Negatiivne	—	Arvatavalt negatiivne

Joonis 1.

Prognoosimudel lõppotsuse tegemiseks

Nõuetekohasuse kriteeriumid

33.

IL-8 lutsiferaasikatse puhul peaksid olema täidetud järgmised nõuetekohasuse kriteeriumid.

—	Ind-IL8LA peaks olema igas analüüsitsüklis vähemalt ühel positiivse kontrolli (4-NBB) kontsentratsioonil suurem kui 5,0.

—	Ind-IL8LA peaks olema igas analüüsitsüklis kõikidel negatiivse kontrolli (piimhape) kontsentratsioonidel väiksem kui 1,4.

—

Andmed, mis on saadud plaatidelt, kus rakke ja Triplucit sisaldavates ilma kemikaalita kontrollkannudes täheldatud GAPLA väärtus on alla viie korra suurem kui GAPLA väärtus kannus, mis sisaldab ainult katsesöödet (kannu kohta 50 μl söödet RPMI-1640, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, ja 50 μl X-VIVOTM 15), tuleks jätta arvesse võtmata.

—

Andmed, mis on saadud plaatidelt, kus uuritava või kontrollkemikaaliga saadud Inh-GAPLA väärtus on kõigil kontsentratsioonidel väiksem kui 0,05, tuleks jätta arvesse võtmata. Sellisel juhul tuleks esimest katset korrata nii, et korduskatses kasutatakse suurima lõppkontsentratsioonina eelmises katses kasutatud vähimat lõppkontsentratsiooni.

Katseprotokoll

34.

Katseprotokoll peaks sisaldama järgmist teavet.

Uuritavad kemikaalid

Ühest koostisosast koosnev aine:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muu identimisteave;

füüsiline välimus, lahustuvus vees, molekulmass ja muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

lahustuvus X-VIVOTM 15-s. X-VIVOTM 15-s mittelahustuvate kemikaalide puhul teave selle kohta, kas pärast tsentrifuugimist on näha sadet või hõljumit;

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti/kandeaine valimise põhjendus juhul, kui ei kasutatud X-VIVOTM 15.

Mitmest koostisosast koosnev aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal või segu:

füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

teadaoleva koostisega segu/polümeeri puhul molekulmass või näiline molekulmass või muu uuringu tegemiseks asjakohane teave;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

lahustuvus X-VIVOTM 15-s. X-VIVOTM 15-s mittelahustuvate kemikaalide puhul teave selle kohta, kas pärast tsentrifuugimist on näha sadet või hõljumit;

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti/kandeaine valimise põhjendus juhul, kui ei kasutatud X-VIVOTM 15.

Kontrollid

Positiivne kontroll:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muu identimisteave;

füüsiline välimus, lahustuvus vees, molekulmass ja muud asjakohased kättesaadavad andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

vajaduse korral teave töötlemise kohta enne katset (nt soojendamine, peenestamine);

kasutatud kontsentratsioon(id);

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

vajaduse korral viide varasematele positiivse kontrolliga saadud tulemustele, millest nähtub vastavus asjakohastele nõuetekohasuse kriteeriumidele.

Negatiivne kontroll:

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid ja/või muu identimisteave;

puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

asjaomases katsejuhendis nimetamata negatiivsete kontrolli aine kasutamisel kättesaadav teave selle füüsilise välimuse, molekulmassi ja muude asjakohaste füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

kättesaadav teave säilitamistingimuste ja püsivuse kohta;

iga uuritava kemikaali puhul lahusti valimise põhjendus.

Katsetingimused:

sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;

kasutatud katsemeetodi kirjeldus;

kasutatud rakuliin, selle säilitamistingimused ning päritolu (nt asutus, kellelt rakud saadi);

veiselooteseerumi partiinumber ja päritolu, tarnija nimi, 96-kannulise lamedapõhjalise musta plaadi partiinumber ja reaktiivi Tripluc partiinumber;

passaaži number ja rakkude tihedus katses kasutamisel;

enne katset rakkude külvamisel kasutatud rakuloendusmeetod ning võetud meetmed, millega tagati rakkude homogeenne jaotus;

kasutatud luminomeeter (nt mudel), sealhulgas seadme seaded, kasutatud lutsiferaasisubstraat ja liites 3.2 kirjeldatud kontrollkatsel põhinev tõendus asjakohaste luminestsentskiirguse mõõtmiste läbiviimise kohta;

laboris katse tegemiseks vajaliku pädevuse tõendamiseks (nt pädevusainetega katsete tegemiseks) kasutatud meetod või katsemeetodiga saadud tulemuste pikaajalise reprodutseeritavuse tõendamiseks kasutatud meetod.

Katse käik:

proovide ja analüüsitsüklite arv;

uuritava kemikaali kontsentratsioonid, lisamisviis ja kasutatud kokkupuuteaeg (kui erineb soovitatust);

kasutatud hindamis- ja otsustamiskriteeriumide kirjeldus;

kasutatud katse nõuetekohasuse kriteeriumide kirjeldus;

kõikide katse käigus tehtud muudatuste kirjeldus.

Tulemused:

mõõdetud IL8LA ja GAPLA väärtused;

arvutatud nIL8LA, Ind-IL8LA ja Inh-GAPLA väärtused;

Ind-IL8LA usaldusvahemik usaldusnivool 95 %;

graafik, millel on kujutatud lutsiferaasi aktiivsuse ja rakkude eluvõimelisuse kontsentratsioonist sõltuvuse kõverad;

vajaduse korral mis tahes muude asjakohaste vaatlusandmete kirjeldus.

Tulemuste arutelu:

IL-8 lutsiferaasikatsega saadud tulemuste arutelu;

katse tulemuste hindamine ühtse lähenemisviisi kontekstis, kui muu asjakohane teave on kättesaadav.

Järeldused

KIRJANDUS

(1)	Takahashi, T., Kimura, Y., Saito, R., Nakajima, Y., Ohmiya, Y., Yamasaki, K., ja Aiba, S. (2011). An in vitro test to screen skin sensitizers using a stable THP-1-derived IL-8 reporter cell line, THP-G8. Toxicol. Sci. 124: 359–369.

(2)

OECD (2017). Validation report for the international validation study on the IL-8 Luc assay as a test evaluating the skin sensitizing potential of chemicals conducted by the IL-8 Luc Assay. Series on Testing and Assessment No. 267. ENV/JM/MONO(2017)19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

(3)

OECD (2017). Report of the Peer Review Panel for the IL-8 Luciferase (IL-8 Luc) Assay for in vitro skin sensitisation. Series on Testing and Assessment No. 258. ENV/JM/MONO(2017)20. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

(4)

OECD (2016). Guidance Document On The Reporting Of Defined Approaches And Individual Information Sources To Be Used Within Integrated Approaches To Testing And Assessment (IATA) For Skin Sensitisation. Series on Testing and Assessment No. 256. ENV/JM/MONO(2016)29. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm.

(5)	van der Veen, J. W., Rorije, E., Emter, R., Natsch, A., van Loveren, H., ja Ezendam, J. (2014). Evaluating the performance of integrated approaches for hazard identification of skin sensitizing chemicals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 69: 371–379.

(6)	Kimura, Y., Fujimura, C., Ito, Y., Takahashi, T., Nakajima, Y., Ohmiya, Y., ja Aiba, S. (2015). Optimization of the IL-8 Luc assay as an in vitro test for skin sensitization. Toxicol. In Vitro 29: 1816–1830.

(7)	Urbisch, D., Mehling, A., Guth, K., Ramirez, T., Honarvar, N., Kolle, S., Landsiedel, R., Jaworska, J., Kern, P. S., Gerberick, F., et al. (2015). Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul. Toxicol. Pharmacol. 71: 337–351.

(8)

(9)	Patlewicz, G., Casati, S., Basketter, D. A., Asturiol, D., Roberts, D. W., Lepoittevin, J.-P., Worth, A., ja Aschberger, K. (2016). Can currently available non-animal methods detect pre and pro haptens relevant for skin sensitisation? Regul. Toxicol. Pharmacol. 82: 147–155.

(10)	Thorne, N., Inglese, J., ja Auld, D. S. (2010). Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17: 646–657.

(11)	OECD (2016). Test No 455: Performance-Based Test Guideline for Stably Transfected Transactivation In Vitro Assays to Detect Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Publishing, Pariis. http://dx.doi.org/10.1787/9789264265295-en.

(12)	Viviani, V., Uchida, A., Suenaga, N., Ryufuku, M., ja Ohmiya, Y. (2001). Thr226 is a key residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:1286–1291.

(13)	Viviani, V. R., Bechara, E. J., ja Ohmiya, Y. (1999). Cloning, sequence analysis, and expression of active Phrixothrix railroad-worms luciferases: relationship between bioluminescence spectra and primary structures. Biochemistry 38: 8271–8279.

(14)	Nakajima, Y., Kimura, T., Sugata, K., Enomoto, T., Asakawa, A., Kubota, H., Ikeda, M., ja Ohmiya, Y. (2005). Multicolor luciferase assay system: one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate. Biotechniques 38: 891–894.

(15)	OECD (2017). Performance Standards for the assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation IL-8 luc test methods. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. Avaldamisel. OECD, Pariis, Prantsusmaa.

(16)	OECD (2005). Guidance Document the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Pariis, Prantsusmaa.

(17)

OECD (2018). Draft Guidance Document on Good In Vitro Method Practices (GIVIMP) for the Development and Implementation of In Vitro Methods for Regulatory Use in Human Safety Assessment. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/ehs/testing/OECD Final Draft GIVIMP.pdf.

(18)	JaCVAM (2016). IL-8 Luc assay protocol. Kättesaadav aadressil http://www.jacvam.jp/en_effort/effort02.html.

(19)	Niwa, K., Ichino, Y., Kumata, S., Nakajima, Y., Hiraishi, Y., Kato, D., Viviani, V. R., ja Ohmiya, Y. (2010). Quantum yields and kinetics of the firefly bioluminescence reaction of beetle luciferases. Photochem. Photobiol. 86: 1046–1049.

(20)	OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Pariis, Prantsusmaa.

(21)

Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (2015). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Kuues, täiendatud väljaanne. United Nations Publications, New York ja Genf. ISBN: 978-92-1-117006-1. Kättesaadav aadressil http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

Liide 3.1

MÕISTED

Analüüsitsükkel – ühe või mitme uuritava kemikaali analüüsimine lahustiga/kandeainega kontrolli ja positiivse kontrolliga paralleelselt.

CV05 – rakkude eluvõimelisu se tasemes kajastuv näitaja ehk vähim kontsentratsioon, mille juures kemikaali toimel avalduv Inh-GAPLA on väiksem kui 0,05.

FInSLO-LA – IL-8 lutsiferaasikatset käsitlevas valideerimisaruandes ja varasemates väljaannetes kasutatud lühend, millega osutatakse näitajale Ind-IL8LA. Mõiste Ind-IL8LA määratlus on esitatud allpool.

GAPLA – punast valgust tekitava püsiva lutsiferaasi (SLR) (λmaks = 630 nm) aktiivsus, mida reguleerib GAPDH promootor ning mis kajastab rakkude eluvõimelisust ja eluvõimeliste rakkude arvu.

II-SLR-LA – IL-8 lutsiferaasikatset käsitlevas valideerimisaruandes ja varasemates väljaannetes kasutatud lühend, millega osutatakse näitajale Inh-GAPLA. Mõiste Inh-GAPLA määratlus on esitatud allpool.

IL-8 (interleukiin 8) – endoteelirakkude, fibroblastide, keratinotsüütide, makrofaagide ja monotsüütide toodetav tsütokiin, mis põhjustab neutrofiilide ja T-lümfotsüütide kemotaksist.

IL8LA – oranži valgust tekitava püsiva lutsiferaasi (SLO) (λmaks = 580 nm) aktiivsus, mida reguleerib IL-8 promootor.

Ind-IL8LA – nIL8LA suurenemine kordades. Selle arvutamiseks jagatakse kemikaaliga töödeldud THP-G8 rakkude puhul täheldatud nIL8LA väärtus töötlemata THP-G8 rakkude puhul täheldatud nIL8LA väärtusega ning see näitab, mil määral kemikaal suurendab IL-8 promootori aktiivsust.

Induktsiooni alampiir (MIT) – väiksem kontsentratsioon, mille juures kemikaal vastab positiivsuse kriteeriumidele.

Inh-GAPLA – GAPLA inhibeerimise määr. Selle arvutamiseks jagatakse kemikaaliga töödeldud THP-G8 rakkude puhul täheldatud GAPLA väärtus töötlemata THP-G8 rakkude puhul täheldatud GAPLA väärtusega ning see näitab kemikaali tsütotoksilisust.

Kemikaal – aine või segu.

Mitmest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja milles enam kui ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 10, kuid väiksem kui 80 massiprotsenti. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse tootmisprotsessi tulemusena. Erinevus segu ja mitmest koostisosast koosneva aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokku segamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.

nIL8LA – IL-8 promootori aktiivsust kajastav lutsiferaasi SLO aktiivsus (IL8LA), mis on normaliseeritud GAPDH promootori aktiivsust kajastava lutsiferaasi SLR aktiivsuse (GAPLA) suhtes. Sellega väljendatakse IL-8 promootori aktiivsust pärast rakkude eluvõimelisuse või rakkude arvu arvessevõtmist.

nSLO-LA – IL-8 lutsiferaasikatset käsitlevas valideerimisaruandes ja varasemates väljaannetes kasutatud lühend, millega osutatakse näitajale nIL8LA. Mõiste nIL8LA määratlus on esitatud eespool.

Ohtlikkus – mõjurit või olukorda iseloomustav omadus, millest võib tuleneda kahjulik toime, kui organism, süsteem või (alam)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.

Pindaktiivne aine – detergent või muu aine, mis võib vähendada vedeliku pindpinevust ja võimaldab sellel vahutada või tungida tahkesse ainesse; sama mis märgav aine (katsejuhend nr 437).

Prehapteenid – kemikaalid, mis muutuvad sensibilisaatoriks abiootilise muundumise teel.

Prohapteenid – kemikaalid, mis vajavad nahka sensibiliseeriva toime tekkimiseks ensümaatilist aktiveerimist.

Segu – kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

SLO-LA – IL-8 lutsiferaasikatset käsitlevas valideerimisaruandes ja varasemates väljaannetes kasutatud lühend, millega osutatakse näitajale IL8LA. Mõiste IL8LA määratlus on esitatud eespool.

SLR-LA – IL-8 lutsiferaasikatset käsitlevas valideerimisaruandes ja varasemates väljaannetes kasutatud lühend, millega osutatakse näitajale GAPLA. Mõiste GAPLA määratlus on esitatud eespool.

THP-G8 – IL-8 lutsiferaasikatses kasutatav IL-8 reporterrakuliin. Inimese makrofaagilaadsete rakkude liin THP-1, millesse on transfekteeritud lutsiferaaside SLO ja SLR geenid, mis on vastavalt IL-8 ja GAPDH promootori kontrolli all.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Ühest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja mille ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

Liide 3.2

LUTSIFERAASI AKTIIVSUSE MÕÕTMISE PÕHIMÕTE NING SLO JA SLR-I PUHUL KOHALDATAVATE OPTILISE FILTRI LÄBILASKVUSTEGURITE KINDLAKSTEGEMINE

Mitme reporteriga katsesüsteemi Tripluc on võimalik kasutada mitme värvuse tuvastamist võimaldava mikroplaatide jaoks ette nähtud luminomeetriga, mille saab varustada optilise filtriga (nt Phelios AB-2350 (ATTO), ARVO (PerkinElmer), Tristar LB941 (Berthold)). Mõõtmiseks kasutatav optiline filter on madal- või kõrgpääsufilter piirlainepikkusega 600–620 nm või ribapääsufilter lainepikkusele 600–700 nm.

Lutsiferaaside tekitatava kahe värvuse mõõtmine optilise filtri abil

Selles näites kasutatakse luminomeetrit Phelios AB-2350 (ATTO). See luminomeeter on varustatud 600 nm madalpääsufiltriga (R60, HOYA Co., filter 1), mis võimaldab eristada SLO (λmaks = 580 nm) ja SLRi (λmaks = 630 nm) põhjustatud luminestsentsi.

600 nm madalpääsufiltri läbilaskvustegurite kindlakstegemiseks kasutatakse puhastatud lutsiferaase SLO ja SLR ning i) mõõdetakse SLO ja SLRi põhjustatud bioluminestsentsi tugevus ilma filtrita (F0), ii) mõõdetakse SLO ja SLRi põhjustatud, 600 nm madalpääsufiltri (filter 1) läbinud bioluminestsentskiirguse tugevus ja iii) arvutatakse allpool loetletud 600 nm madalpääsufiltri läbilaskvustegurid SLO ja SLRi puhul.

Läbilaskvustegurid		Lühend	Määratlus
SLO	Filter 1: läbilaskvustegur	=κOR60	Filtri läbilaskvustegur SLO puhul
SLR	Filter 1: läbilaskvustegur	κRR60	Filtri läbilaskvustegur SLRi puhul

Kui valida katseproovis SLO ja SLRi põhjustatud luminestsentsi tugevuse tähisteks vastavalt O ja R, siis on i) filtri puudumisel täheldatav kogu optilist spektrit hõlmava valguse tugevus F0 ja ii) 600 nm madalpääsufiltri (filter 1) läbinud valguse tugevus F1 kirjeldatavad järgmiste valemitega.

F0 = O + R

F1 = κOR60 × O + κRR60 × R

Need valemid võib esitada ka järgmisel kujul:

Seejärel saab arvutatud läbilaskvustegurite (κOR60 ja κRR60) ning mõõdetud F0 ja F1 väärtuste abil leida O ja Ri väärtused järgmise valemiga:.

Läbilaskvusteguri kindlakstegemiseks kasutatavad materjalid ja meetodid

Reaktiivid

Puhastatud eraldi lutsiferaasid:

lüofiliseeritud puhastatud SLO

lüofiliseeritud puhastatud SLR

(valideerimisuuringu jaoks hangiti need koos rakuliiniga THP-G8 Jaapanis Tottoris asuvast ettevõttest GPC Lab. Co. Ltd.)

Katsereaktiiv:

lutsiferaasikatse reaktiiv Tripluc® (nt ettevõttest TOYOBO; katalooginumber MRA-301)

Sööde: lutsiferaasikatse sööde (30 ml, säilitatakse temperatuuril 2–8 °C)

Reaktiiv	Konts.	Lõppkonts. söötmes	Vajalik kogus
RPMI-1640	—	—	27 ml
Veiselooteseerum	—	10 %	3 ml

Ensüümilahuse valmistamine

Lüofiliseeritud puhastatud lutsiferaasi lahustamiseks katsutis lisatakse sellele 200 μl 10–100 mM Tris/HCl-i või Hepes/HCl-i (pH 7,5–8,0), mis sisaldab 10 % glütserooli massiühikutes ruumalaühiku kohta. Ensüümilahus jaotatakse 10 μl alikvootidena ühekordsetesse 1,5 ml katsutitesse ja säilitatakse sügavkülmikus temperatuuril -80 °C. Külmutatud ensüümilahus on kasutatav kuni kuue kuu jooksul. Kasutamisel lisatakse igasse ensüümilahust (lahjendatud ensüümilahust) sisaldavasse katsutisse 1 ml lutsiferaasikatse söödet (10 % veiselooteseerumit sisaldav RPMI-1640) ja inaktiveerumise takistamiseks hoitakse katsuteid jääl.

Bioluminestsentsi mõõtmine

Lutsiferaasikatse reaktiiv Tripluc® sulatatakse ja seda hoitakse toatemperatuuril veevannis või ümbritseva õhu temperatuuril. Luminomeeter lülitatakse sisse 30 minutit enne mõõtmise algust, et fotokordisti jõuaks stabiliseeruda. 100 μl lahjendatud ensüümilahust kantakse 96-kannulisele mustale lamedapõhjalisele plaadile (SLO proovid kannudesse B1, B2 ja B3, SLRi proovid kannudesse D1, D2, ja D3). Seejärel kantakse igasse ensüümilahust sisaldavasse plaadi kannu pipetiga 100 μl eelsoojendatud Triplucit. Plaati loksutatakse plaadiloksutil toatemperatuuril (umbes 25 °C) 10 minutit. Vajaduse korral kõrvaldatakse kannudes olevast lahusest mullid. Lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmiseks asetatakse plaat luminomeetrisse. Bioluminestsentsi mõõdetakse 3 sekundit ilma optilise filtrita (F0) ja 3 sekundit optilise filtriga (F1).

Optilise filtri läbilaskvustegur arvutatakse vastavalt järgmistele valemitele.

Läbilaskvustegur (SLO (κOR60)) = (B1/F1 + B2/F1 + B3/F1): (B1/F0 + B2/F0 + B3/F0)

Läbilaskvustegur (SLR (κRR60)) = (D1/F1 + D2/F1 + D3/F1): (D1/F0 + D2/F0 + D3/F0)

Arvutatud läbilaskvustegureid kasutatakse kõigi sama luminomeetriga tehtavate mõõtmiste puhul.

Seadmete kvaliteedi kontrollimine

Tuleks kasutada IL-8 lutsiferaasikatset käsitlevas katse-eeskirjas kirjeldatud korda (18).

Liide 3.3

PÄDEVUSAINED

Enne katsemeetodi B.71 juurde kuuluvas käesolevas liites kirjeldatud meetodi rutiinset kasutamist tuleks tõendada labori tehnilist pädevust. Selleks tuleks IL-8 lutsiferaasikatses saada tabelis 1 esitatud soovitatava üheksa aine puhul eeldatavale tulemusele vastav prognoos ning üheksast pädevusainest vähemalt kaheksa puhul väärtused, mis jäävad asjaomasesse võrdlusvahemikku (pädevusained on valitud nii, et nende puhul oleksid esindatud naha sensibiliseerimise ohuga seotud eri reaktsioonid). Peale selle on valikukriteeriumidena võetud arvesse ainete kaubanduslikku kättesaadavust, kvaliteetsete in vivo võrdlusandmete olemasolu ja IL-8 lutsiferaasikatsega saadud kvaliteetsete in vitro andmete olemasolu. Lisaks on IL-8 lutsiferaasikatse kohta olemas avaldatud võrdlusandmed (1, 6).

Tabel 1.

IL-8 lutsiferaasikatse puhul tehnilise pädevuse tõendamiseks soovitatavad ained

Pädevusained	CASi nr	Olek	Lahustuvus X-VIVO15-s kontsentratsioonil 20 mg/ml	In vivo toime prognoos (107)	IL-8 lutsiferaasikatse kohane prognoos (108)	Võrdlusvahemik (μg/ml) (109)
Pädevusained	CASi nr	Olek	Lahustuvus X-VIVO15-s kontsentratsioonil 20 mg/ml	In vivo toime prognoos (107)		CV05 (110)	IL-8 lutsiferaasikatse kohane MIT (111)
2,4-dinitroklorobenseen	97-00-7	Tahkis	Ei lahustu	Sensibilisaator (äärmiselt tugev)	Positiivne	2,3–3,9	0,5–2,3
Formaldehüüd	50-00-0	Vedelik	Lahustub	Sensibilisaator (tugev)	Positiivne	9–30	4–9
2-merkaptobensotiasool	149-30-4	Tahkis	Ei lahustu	Sensibilisaator (mõõdukas)	Positiivne	250–290	60–250
Etüleendiamiin	107-15-3	Vedelik	Lahustub	Sensibilisaator (mõõdukas)	Positiivne	500–700	0,1–0,4
Etüleenglükooldimetakrülaat	97-90-5	Vedelik	Ei lahustu	Sensibilisaator (nõrk)	Positiivne	> 2000	0,04–0,1
4-allüülanisool (estragool)	140-67-0	Vedelik	Ei lahustu	Sensibilisaator (nõrk)	Positiivne	> 2000	0,01–0,07
Streptomütsiinsulfaat	3810-74-0	Tahkis	Lahustub	Sensibiliseeriva toimeta	Negatiivne	> 2000	> 2000
Glütserool	56-81-5	Vedelik	Lahustub	Sensibiliseeriva toimeta	Negatiivne	> 2000	> 2000
Isopropanool	67-63-0	Vedelik	Lahustub	Sensibiliseeriva toimeta	Negatiivne	> 2000	> 2000
Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i registrinumber.

Liide 3.4

INDEKSID JA HINDAMISKRITEERIUMID

nIL8LA (nSLO-LA)

IL8LA (SLO-LA) ja GAPLA (SLR-LA) puhul tehakse mõõtmisi j-ndas analüüsitsüklis (j = 1–4) i-ndal kontsentratsioonil (i = 0–11). Normaliseeritud IL8LA tähis on nIL8LA (nSLO-LA) ja selle määratlus on järgmine: .

nIL8LAij = IL8LAij/GAPLAij

See on käesoleva katsemeetodi puhul kasutatav lähtesuurus.

Ind-IL8LA (FInSLO-LA)

Ind-IL8LA on käesoleva katsemeetodi puhul peamine näitaja, mis väljendab nIL8LA (nSLO-LA) keskmise väärtuse suurenemist kordades konkreetses analüüsitsüklis i-ndal kontsentratsioonil võrrelduna sama näitaja väärtusega nullkontsentratsioonil. Kõnealune suhe on esitatav järgmise valemiga:

Formula

Juhtlabori ettepaneku kohaselt vastab uuritava kemikaali puhul positiivsele tulemusele väärtus 1,4. Nimetatud väärtus põhineb juhtlabori varasemate katseandmete analüüsil. Andmehalduse töörühm on kasutanud seda väärtust valideerimisuuringu kõigis etappides. Nagu valemist nähtub, on katse esmane tulemusnäitaja Ind-IL8LA kahe aritmeetilise keskmise suhtarv.

Usaldusvahemik usaldusnivool 95 % (CI95 %)

Kõnealuse esmase mõõdetava tulemusnäitaja kordustäpsuse hindamiseks saab leida nimetatud suhtarvul põhineva usaldusnivoole 95 % vastava usaldusvahemiku (CI95 %). Kui CI95 % alampiir on ≥ 1, siis see näitab, et kontsentratsioonil nr i on nIL8LA oluliselt suurem kui lahustiga kontrolli puhul. CI95 % leidmiseks on mitu võimalust. Valideerimisuuringus kasutatud meetod põhineb Fielleri teoreemil. Selle teoreemi järgi leitakse usaldusvahemik usaldusnivool 95 % valemiga

Formula

kus .

Formula

on keskse t-jaotuse 97,5-protsentiil vabadusastmete arvu ν puhul, kus

Formula

Inh-GAPLA (II-SLR-LA)

Inh-GAPLA on konkreetses analüüsitsüklis i-ndal kontsentratsioonil täheldatava GAPLA (SLR-LA) keskväärtuse ja lahustiga kontrolli puhul täheldatava sama näitaja keskväärtuse suhtarv ning see on esitatav järgmisel kujul:

Formula

Kuna GAPLA asub nIL8LA arvutamise valemi nimetajas, põhjustab see väga väikestel väärtustel suurt varieeruvust nIL8LA väärtustes. Seepärast võib Ind-IL8LA väärtusi, mis on saadud Inh-GAPLA väga väikeste väärtuste puhul (alla 0,05), pidada ebatäpseks.

Liide 3.5

IL-8 LUTSIFERAASIKATSES KASUTATAV KEMIKAALIDE LAHUSTAMISE SKEEM

a)	X-VIVOTM 15-s kontsentratsioonil 20 mg/ml lahustuvad kemikaalid

b)	X-VIVOTM 15-s kontsentratsioonil 20 mg/ml lahustumatud kemikaalid

Liide 3.6

IL-8 LUTSIFERAASIKATSES POSITIIVSE KONTROLLINA KASUTATAVA 4-NBB LAHUSTAMISE SKEEM

“

C osasse lisatakse järgmised peatükid:

„C.52 ÜHTE PÕLVKONDA HÕLMAV PIKENDATUD SIGIVUSKATSE JAAPANI RIISIKALAGA (MEOGRT)

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 240 (2015). Jaapani riisikalaga tehtava ühte põlvkonda hõlmava pikendatud sigivuskatse (MEOGRT) juhendis kirjeldatakse põhjalikku katsemeetodit, mille aluseks on kalade kokkupuude kemikaaliga mitme põlvkonna jooksul, et koguda ökoloogilise ohu ja kemikaalide, sealhulgas võimalikud endokriinfunktsiooni kahjustavad kemikaalid, riskihindamise aspektist olulisi andmeid. MEOGRT puhul kestab kokkupuude kemikaaliga kuni teise põlvkonna (F2) koorumiseni (kaks nädalat pärast viljastamist). Täiendavalt oleks vaja uurida seda, kas põlvkonna F2 uurimine koorumisjärgsel perioodil oleks põhjendatud; praegu ei ole piisavalt teavet, mille põhjal saaks esitada põlvkonna F2 uurimise pikendamist põhjendavaid asjakohaseid tingimusi või kriteeriume. Käesolevat katsemeetodit võidakse siiski uue teabe ja andmete põhjal ajakohastada. Näiteks võivad juhised põlvkonna F2 uurimise pikendamiseks kuni sigimiseni olla kasulikud teatud asjaoludel (nt suure biokontsentratsiooni potentsiaaliga kemikaalid või andmed põlvkondadevahelise toime kohta muudes taksonites). Käesoleva katsemeetodi abil saab hinnata kemikaalide, sealhulgas potentsiaalselt endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide võimalikku kroonilist toimet kaladele. Meetodis keskendutakse eelkõige võimalikule populatsiooni mõjutavale toimele (kahjulik mõju ellujäämusele, arengule, kasvule ja sigimisele), et arvutada täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) või toimet avaldav kontsentratsioon (ECx), kuid tuleks arvesse võtta, et ECx-il põhinevad meetodid ei sobi tavaliselt sellist tüüpi suurte uuringute jaoks, kus ECx-i kindlakstegemise eesmärgil uuritavate kontsentratsioonide arvu suurendamine võib olla ebaotstarbekas ja põhjustada kasutatavate loomade suure arvu tõttu loomade heaoluga seotud probleeme. Kemikaalide puhul, mis ei vaja mitmes põlvkonnas hindamist või millel puudub endokriinfunktsiooni kahjustamise potentsiaal, võivad olla sobivamad muud katsemeetodid (1). Jaapani riisikala on käesoleva katsemeetodiga kasutamiseks sobiv liik tänu lühikesele elutsüklile ja võimalusele tuvastada selle geneetilist sugu (2), mida peetakse selle katsemeetodi keskse tähtsusega komponendiks. Meetodis kirjeldatud konkreetsed meetodid ja vaatluste lõppnäitajad on kohaldatavad üksnes jaapani riisikala suhtes. Sarnase katse-eeskirja jaoks võivad sobida ka muud väikesed kalaliigid (nt vöötdaanio).

Käesoleva katsemeetodi kohaselt mõõdetakse mitmeid bioloogilisi lõppnäitajaid. Esmajoones pööratakse tähelepanu võimalikule kahjulikule toimele, mis avaldub populatsiooni näitajates, sealhulgas ellujäämus, üldine areng, kasv ja sigimine. Teises järjekorras kogutakse muud kasulikku teavet vitellogeniini (vtg) mRNA (või vitellogeniini valgu, VTG) ja geneetilise sooga seotud fenotüübi teiseste sootunnuste mõõtmise ning histopatoloogia hindamise teel, et saada andmeid toimemehhanismide kohta ja seostada neid muudes valdkondades ja laboriuuringutes saadud tulemustega juhul, kui leidub a posteriori tõendeid kemikaali endokriinfunktsiooni kahjustava potentsiaali kohta (nt muude katsetega on leitud androgeenide või östrogeenide funktsiooni kahjustav toime). Tuleb märkida, et kui kemikaalil või selle metaboliitidel endokriinfunktsiooni kahjustavat toimet ei kahtlustata, võib nimetatud teiseste lõppnäitajate mõõtmise vajadus puududa ning sobivam on kasutada vähem ressursse ja loomi vajavaid uuringuid (1). Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Kuna uuritud kemikaalide arv on väike ja kõnealuse üsna keeruka katse valideerimisse on kaasatud vähe laboreid, võib eeldada, et katsemeetod vaadatakse läbi ja seda muudetakse saadud kogemuste valguses pärast seda, kui on tehtud piisavalt uuringuid kõnealuse uue uuringukava toimivuse kinnitamiseks. Andmeid saab kasutada endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide analüüsimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku 5. tasemel. Meetodi kohaselt algab katse sellega, et täiskasvanud kalad (põlvkond F0) viiakse sigimisperioodil kokkupuutesse uuritava kemikaaliga. Kokkupuude jätkub põlvkonna ja F1 arengu ja sigimise perioodil kuni põlvkonna F2 koorumiseni. Tänu sellele võimaldab katse hinnata nii struktuurseid kui ka aktiveerivaid radasid, mis mõjutavad endokriinfunktsiooni. Endokriinfunktsiooniga seotud lõppnäitajate tõlgendamisel võib kasutada tõendite kaalukusel põhinevat meetodit.

Katsesse tuleks kaasata vajalikul arvul isendeid, et saavutada sigimisega seotud lõppnäitajate hindamiseks piisav statistiline võimsus (vt 3. liide), tagades samal ajal loomade heaolu kaalutlustel, et kasutatavate loomade arv on võimalikult väike. Arvestades kasutatavate katseloomade suurt arvu, tuleb katse vajalikkust hoolikalt kaaluda seoses olemasolevate andmetega, mis võivad juba hõlmata asjakohast teavet paljude MEOGRT lõppnäitajate kohta. Sellega seoses võib abi saada OECD koostatud raamistikust kaladele avalduva mürgisuse katsete kohta (1).

Katsemeetod on välja töötatud eelkõige üksiku aine toime eristamiseks. Ent kui tekib vajadus teha katse seguga, siis tuleks kaaluda, kas meetodiga saadakse kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks sobivad tulemused.

KATSE PÕHIMÕTE

Katse alustamiseks viiakse suguküpsed isas- ja emasisendid (vähemalt 12 nädalat pärast viljastamist) sigimispaarides kolmeks nädalaks kemikaaliga kokkupuutesse. Selle aja jooksul levitatakse uuritavat kemikaali vanemate põlvkonna (F0) organismis vastavalt kemikaali toksikokineetilistele omadustele. Võimalikult lähedal neljanda nädala esimesele päevale korjatakse mari, et saada põlvkond F1. Põlvkonna F1 kasvatamise ajal (kokku 15 nädalat) hinnatakse kooruvust ja ellujäämust. Lisaks võetakse 9.–10. viljastamisjärgsel nädalal kaladelt proove arengu lõppnäitajate kindlakstegemiseks ning 12.–14. viljastamisjärgsel nädalal hinnatakse kolme nädala jooksul kudemist. Põlvkond F2 luuakse pärast kolmandat sigivuse hindamise nädalat ja seda kasvatatakse kuni koorumise lõpuni.

KATSE NÕUETEKOHASUSE KRITEERIUMID

Katse nõuetekohasuse suhtes kohaldatakse järgmisi kriteeriume.

—	Lahustunud hapniku kontsentratsioon peaks kogu katse vältel olema ≥ 60 % õhu küllastuskontsentratsioonist.

—	Keskmine veetemperatuur peaks kogu uuringu vältel olema vahemikus 24–26 °C. Üksikutes akvaariumides esinevad põgusad kõrvalekalded keskmisest ei tohiks ületada 2 °C.

—

Keskmine sigivus iga põlvkonna (F0 ja F1) kontrollrühmades peaks olema suurem kui 20 marjatera paari kohta päevas. Kõikide hindamise jooksul valminud marjaterade viljakus peaks olema üle 80 %. Lisaks peaks kontrollrühma soovituslikust 24 sigimispaarist 16 (> 65 %) väljutama päevas rohkem kui 20 marjatera paari kohta.

—	Marjaterade (keskmine) kooruvus kontrollrühmades peaks olema ≥ 80 % (nii põlvkonnas F1 kui ka põlvkonnas F2).

—	Kontrollrühmas (F1) peaks (keskmine) ellujäämus kuni 3. viljastamisjärgse nädalani ja alates 3. viljastamisjärgsest nädalast kuni põlvkonnaga F1 katse lõpetamiseni (15. viljastamisjärgne nädal) olema vastavalt ≥ 80 % ja ≥ 90 %.

—	Tuleks esitada tõendid selle kohta, et uuritava kemikaali kontsentratsioone lahuses on suudetud hoida rahuldavalt vahemikus ± 20 % mõõtmistulemuste keskväärtusest.

Kuigi see ei ole nõuetekohasuse kriteerium, ei tohiks ühe kontsentratsioonirühma paralleelnõude ega katse kontsentratsioonirühmade vahel olla statistilisi erinevusi vee temperatuuris (igapäevaste temperatuurimõõtmiste põhjal; välja arvatud põgusad kõrvalekalded).

Kuigi suurema kokkupuutega rühmades võib täheldada vähenenud sigivust, peaks põlvkonna F0 sigivus kokkupuute suuruse järgi vähemalt kolmandast rühmast alates ja kõigis väiksema kokkupuutega rühmades olema piisav koorumisinkubaatorite täitmiseks. Peale selle peaks põlvkonna F1 embrüote ellujäämus olema kokkupuute suuruse järgi kolmandas rühmas ja kõigis väiksema kokkupuutega rühmades piisav selleks, et hinnata lõppnäitajaid noorkaladest proovide võtmise etapil (vt punktid 36 ja 38 ja 9. liide). Lisaks peaks põlvkonna F1 koorumisjärgne ellujäämus olema kokkupuute suuruse järgi teises rühmas vähemalt nõutaval miinimumtasemel (~ 20 %). Need ei ole otseselt nõuetekohasuse kriteeriumid, vaid soovitused, mis võimaldavad arvutata usaldusväärseid NOEC väärtusi.

10.

Kui leitakse kõrvalekaldeid katse nõuetekohasuse kriteeriumidest, tuleks kaaluda selliste kõrvalekallete mõju katsetulemuste usaldusväärsusele ning esitada need kõrvalekalded ja kaalutlused katseprotokollis.

MEETODI KIRJELDUS

Seadmed

11.

Tavapärased laboriseadmed, eeskätt järgmised seadmed:

a)	hapnikumõõtur ja pH-meeter;

b)	seadmed vee kareduse ja leelisuse määramiseks;

c)	asjakohased temperatuuri reguleerimise ja soovitatavalt selle pideva jälgimise seadmed;

d)	soovitatava biomassisisalduse ja asustustiheduse jaoks piisava suurusega keemiliselt inertsest materjalist proovinõud (vt 3. liide);

e)	sobiva täpsusega kaal (st täpsusega ± 0,5 mg).

Vesi

12.

Katses võib kasutada sellist vett, milles katsealune liik kasvab ja milles tal on piisavalt pikk eluiga. Vesi peab olema kogu katse jooksul püsiva kvaliteediga. Tagamaks, et lahjendamiseks kasutatav vesi ei mõjutaks liigselt katsetulemusi ega põhjustaks näiteks uuritava kemikaaliga komplekside moodustumist või avaldaks negatiivset mõju sugukarja jõudlusele, tuleks kindlate ajavahemike järel võtta analüüsimiseks veeproove. Kui lahjendusvesi on teadaolevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga, tuleks raskemetallide (nt Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ja Ni), peamiste anioonide ja katioonide (nt Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl- ja SO4 2-), pestitsiidide, orgaanilise süsiniku ja hõljuvaine sisaldus määrata näiteks iga kuue kuu järel. Lahjendusvee mõned nõutavad keemilised omadused on esitatud 2. liites. Vee pH peaks olema vahemikus 6,5–8,5, kuid ei tohiks ühe katse jooksul muutuda rohkem kui ± 0,5 pH-ühikut.

Kokkupuutesüsteem

13.

Kokkupuutesüsteemi konstruktsiooni ja selles kasutatavaid materjale ei ole täpsustatud. Katsesüsteemi ehitamiseks tuleks kasutada klaasi, roostevaba terast või muid keemiliselt inertseid materjale, mis ei ole varasemate katsete käigus saastunud. Käesolevas katses kasutamiseks sobiv kokkupuutesüsteem võib koosneda pideva läbivooluga süsteemist (4–13).

Katselahused

14.

Uuritava kemikaali põhilahus tuleks viia kokkupuutesüsteemi sobiva pumba abil. Põhilahuse vooluhulka tuleb kalibreerida enne kokkupuute algust põhilahuse kohta tehtava analüüsi tulemuste põhjal ning seda tuleb katse jooksul regulaarselt volumeetriliselt kontrollida. Igas kambris olevat uuritavat lahust värskendatakse piisaval määral (nt vähemalt 5 ja kuni 16 kambri mahu värskendust päevas või voolukiirus kuni 20 ml/min) olenevalt uuritava kemikaali püsivusest ja vee kvaliteedist.

15.

Valitud kontsentratsiooniga katselahused valmistatakse põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahuse valmistamiseks tuleks uuritavat kemikaali lahjendusvees mehaanilisel teel (nt segamine ja/või ultrahelitöötlus) soovitatavalt lihtsalt segada või loksutada. Sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks võib kasutada küllastuskolonne/-süsteeme või passiivse doseerimise meetodeid (14). Lahustite ja kandeainete kasutamist tuleks kõigi vahenditega vältida, sest 1) teatud lahustid võivad ise põhjustada mürgisust ja/või soovimatud või ootamatuid reaktsioone; 2) kemikaalide uurimine nende vees lahustuvusest kõrgemal kontsentratsioonil (nagu lahustite kasutamise puhul sageli juhtub) võib raskendada toimet avaldava kontsentratsiooni täpset kindlakstegemist; 3) lahustite kasutamine pikaajalistes katsetes võib põhjustada mikroobide tegevusega seotud märkimisväärset bioloogilist määrdumist, mis võib mõjutada keskkonnatingimusi ja kokkupuutekontsentratsioonide säilitamise võimet ning 4) kui puuduvad varasemad andmed, mille kohaselt lahusti ei moonuta uuringu tulemust, tuleb lahusti kasutamiseks teha lahustiga kontroll, mis aga mõjutab loomade heaolu, kuna katse jaoks on sel juhul vaja rohkem loomi. Raskesti uuritava kemikaali puhul võib lahustit kasutada viimase võimalusena ning parima meetodi kindlakstegemisel tuleb arvesse võtta OECD juhendit nr 23 raskesti uuritavate ainete ja segude veekeskkonna suhtes avalduva mürgisuse uurimise kohta (15). Lahusti valiku määravad uuritava kemikaali keemilised omadused ja olemasolevad varasemad andmed lahusti kasutamise kohta. Lahusti kandeainete kasutamise korral tuleb lisaks ilma lahustita (negatiivsetele) kontrollidele (üksnes lahjendusvesi) hinnata ka sobivaid lahustiga kontrolle. Kui lahusti kasutamine on vältimatu ja tekib mikroobne aktiivsus (bioloogiline määrdumine), on soovitatav iga paagi bioloogiline määrdumine kogu katse jooksul (vähemalt kord nädalas) registreerida/protokollida. Ideaaljuhul peaks lahusti kontsentratsioon olema lahustiga kontrollis ja kõigis katseproovides pidevalt ühtlane. Kui lahusti kontsentratsioon ei ole pidevalt ühtlane, tuleks lahustiga kontrolliks kasutada katseproovide kõige suuremat lahusti kontsentratsiooni. Lahusti kandeaine kasutamise korral ei tohiks lahusti suurim kontsentratsioon ületada 100 μl/l või 100 mg/l (15) ja soovitatavalt tuleks hoida lahusti kontsentratsioon võimalikult madalal (nt < 20 μl/l), et vältida lahusti võimalikku mõju mõõdetavatele lõppnäitajatele (16).

Katseloomad

Kalade valimine ja pidamine

16.

Katses kasutatav liik on jaapani riisikala Oryzias latipes, kuna sellel on lühike elutsükkel ja võimalus teha kindlaks geneetilist sugu. Kuigi sarnase katse-eeskirja jaoks võivad sobida ka muud väikesed kalaliigid, on käesolevas katsemeetodis kirjeldatud konkreetsed katsemeetodid ja vaatluste lõppnäitajad kohaldatavad üksnes jaapani riisikala suhtes (vt punkt 1). Riisikala paljunemist vangistuses on lihtne esile kutsuda; on olemas selle kasvatamist käsitlevad avaldatud meetodid (17–19), samuti andmed lühiajalise letaalsuse, varase elujärgu ja kogu elutsükli katsete kohta (5–6, 8–9, 20). Kõigi kalade puhul kasutatakse valgusrežiimi 16 h valgust ja 8 h pimedust. Kalu söödetakse soolase vee krevettide (Artemia spp.) elusate noorjärgus isenditega, millele võib vajadusel lisada kaubanduslikult müüdavat helvessööta. Kaubanduslikult müüdavat helvessööta tuleb korrapäraselt analüüsida saasteainete suhtes.

17.

Sobivate kasvatusmeetodite järgimise korral ei ole kohustuslik rakendada konkreetset kasvatuseeskirja. Näiteks võib riisikala kuni 4. viljastamisjärgse nädalani kasvatada 2 l proovinõudes tihedusega 240 kalavastset nõu kohta, seejärel kuni 8. viljastamisjärgse nädalani 2 l nõudes tihedusega 10 kala nõu kohta. Pärast seda paigutatakse kalad sigimispaaridena 2 l nõudesse.

Kalade kohandamine ja valimine

18.

Katsealused kalad tuleks valida ühest laboriparvest, mida on vähemalt kahe nädala vältel enne katset kohandatud selliste veekvaliteedi ja valgustustingimustega, mis sarnanevad katses kasutatavatele tingimustele (märkus: nimetatud kohanemisperiood ei asenda kokkupuute-eelset perioodi). Soovitatavalt tuleks katsealused kalad soetada kohalikust kasvandusest, sest täiskasvanud kalade transportimine põhjustab stressi ja võib häirida kudemist. Pidamisperioodil tuleks kalu kaks korda päevas sööta soolase vee krevettidega ning kokkupuute etapil tuleks sellele vajaduse korral lisada kaubanduslikult müüdavat helvessööta. Piisava replitseeritavuse tagamiseks peetakse katse alustamise eeltingimuseks vähemalt 42 sigimispaari olemasolu (54 sigimispaari juhul, kui on vaja kasutada lahustiga kontrolli, kuna puuduvad piisavad varasemad andmed, mis võimaldaksid kasutada ainult lahustita kontrolli). Lisaks tuleb põlvkonna F0 iga sigimispaari puhul kontrollida XX-XY kromosoomide (st kummagi soo sugukromosoomide normaalkomplekti) olemasolu, et vältida spontaansete XX isaste kaasamist (vt punkt 39).

19.

Kohanemise etapil tuleb registreerida kasvukalade seas esinev suremus ning pärast 48-tunnist rahunemisperioodi kohaldatakse järgmisi kriteeriume.

—	Kui suremus kasvupopulatsioonis on seitsme päeva jooksul enne katsesüsteemi üleviimist suurem kui 10 %, jäetakse kogu partii kõrvale.

—	Kui suremus populatsioonis on seitsme päeva jooksul enne katsesüsteemi üleviimist suurem kui 5–10 %, lastakse kaladel veel seitse päeva kohaneda nii, et kohanemisperiood on kokku kaks nädalat. Kui kõnealuse järgmise seitsme päeva jooksul on suremus suurem kui 5 %, jäetakse kogu partii kõrvale.

—	Kui suremus populatsioonis on seitsme päeva jooksul enne katsesüsteemi üleviimist väiksem kui 5 %, loetakse partii vastuvõetavaks.

20.

Katsele eelneva kahenädalase kohanemisperioodi vältel ja kokkupuute ajal ei tohiks kaladel haigusi ravida ning võimaluse korral tuleks haiguste ravi täielikult vältida. Kliiniliste haigustunnustega kalu ei tohiks uuringus kasutada. Katsele eelnenud perioodil tehtud vaatlused ning haiguste ennetamiseks ja raviks kasutatud meetodid tuleks dokumenteerida.

21.

Kokkupuuteperioodi tuleks alustada eristatavate sootunnuste ja geneetiliselt kindlaks tehtud sooga täiskasvanud kaladega, kes pärinevad temperatuuril 25 ± 2 °C kasvatatud labori suguküpsete loomade varudest. Kalade sigimisvõime (st varasem eluvõimeliste järglaste saamine) peaks olema kokkupuutele eelneva nädala jooksul kontrollitud. Katses kasutatavas kalade rühmas peaks kõikide kalade kehamass soo järgi jääma katse alguses vahemikku ± 20 % samasooliste kalade massi aritmeetilisest keskmisest. Hinnangulise keskmise kehamassi leidmiseks tuleks enne katset kalu osaliselt kaaluda. Valitud kalad peaksid olema vähemalt 12 nädalat vanad (alates viljastamisest) ning nende kehamass peaks olema emastel ≥ 300 mg ja isastel ≥ 250 mg.

KATSEPLAAN

Katsekontsentratsioonid

22.

Soovitatavalt tuleks kasutada kemikaali viit kontsentratsiooni ja kontrolli/kontrolle. Katsekontsentratsioonide vahemiku valimisel tuleks arvesse võtta kõiki teabeallikaid, sealhulgas kvantitatiivseid struktuur-aktiivsussõltuvusi (QSAR), analoogmeetodeid, kaladega tehtud muude katsete, näiteks ägeda mürgisuse katsete (käesoleva lisa peatükk C.1), kalade paljunemise lühiajaliste katsete (käesoleva lisa peatükk C.48) ja muude katsemeetoditega (nt käesoleva lisa peatükid C.15, C.37, C.41, C.47 või C.49; (21–26) saadud tulemusi, kui need on kättesaadavad, ning vajaduse korral ka vahemiku leidmise katsega (mis võib hõlmata sigimisetappi) kogutud andmeid. Vajaduse korral võib vahemiku leidmise katse läbi viia lõpliku katsega sarnastel tingimustel (veekvaliteet, katsesüsteem, loomade biomass). Kui tuleb kasutada lahustit, mille kohta puuduvad varasemad andmed, saab vahemiku leidmise katse abil kontrollida lahusti sobivust. Suurim katsekontsentratsioon ei tohiks ületada vees lahustuvuse taset 10 mg/l või ühtekümnendikku 96h-LC50 väärtusest (27). Vähim kontsentratsioon peaks olema 10–100 korda väiksem kui suurim kontsentratsioon. Lisaks annuse-toime seoste mõõtmisele võimaldab käesolevas katses viie kontsentratsiooni kasutamine kindlaks määrata ka vähima täheldatavat toimet avaldava kontsentratsiooni (LOEC) ja toimet mitte avaldava kontsentratsiooni (NOEC), mis on mõnes regulatiivses kavas või jurisdiktsioonis nõutavad riskihindamise jaoks. Üldiselt peaks uuritava kemikaali järjestikuste nominaalsete kontsentratsioonide vahe kordaja olema ≤ 3,2.

Katse- ja kontrollrühmades kasutatavad paralleelnõud

23.

Iga katsekontsentratsiooni kohta tuleks kasutada vähemalt kuut paralleelnõud (vt 7. liide). Sigimisetapil (välja arvatud põlvkonna F0 puhul) tuleks paralleelnõude arv viljakuse hindamiseks kahekordistada ning iga paralleelnõu peab sisaldama üksnes ühte sigimispaari (vt punkt 42).

24.

Lisaks katsekontsentratsioonidele tuleks kasutada ka lahjendusveega kontrolli ja vajaduse korral lahustiga kontrolli. Piisava statistilise võimsuse tagamiseks tuleks kontrollide puhul kasutada kahekordset paralleelkambrite arvu (st vähemalt 12 paralleelnõud). Sigimisetapil kontrollrühma paralleelnõude arv kahekordistatakse (st vähemalt 24 paralleelnõud, millest igaüks sisaldab üksnes ühte sigimispaari). Pärast sigimist peaksid kontrollrühma paralleelnõud sisaldama kuni 20 embrüot (kala).

KATSE KÄIK

Katse alustamine

25.

Katse põlvkonnana F0 kasutatakse suguliselt aktiivseid täiskasvanud kalu, kes valitakse kahe kriteeriumi põhjal: vanus (üldjuhul rohkem kui 12. viljastamisjärgne nädal, aga soovitatavalt mitte rohkem kui 16. viljastamisjärgne nädal) ja kehamass (emastel ≥ 300 mg ja isastel ≥ 250 mg).

26.

Nimetatud tingimustele vastavad emase-isase paarid paigutatakse eraldi paralleelnõudesse: katse alguses 12 paralleelnõud kontrollrühmas ja kuus paralleelnõud kemikaaliga töödeldavates rühmades. Proovinõud jaotatakse juhuslikkuse alusel kontsentratsioonirühma (nt T1–T5 ja kontroll) ja paralleelrühma (nt kontrollid A–L ja kontsentratsiooniproovid A–F) ning asetatakse seejärel kokkupuutesüsteemi, kus igas nõus kasutatakse sellele ette nähtud vooluhulka.

Kokkupuutetingimused

27.

Katse parameetrite ja tingimuste täielik ülevaade on esitatud 3. liites. Nende nõuete järgimise korral peaksid kontrollrühma kalade lõppnäitajad olema sarnased 4. liites loetletud väärtustele.

28.

Katse ajal tuleks iga kontsentratsioonirühma ja kontrollrühma kohta vähemalt ühes katsenõus mõõta lahustunud hapniku sisaldust, pH-d ja temperatuuri. Nimetatud mõõtmisi (v.a temperatuur) tuleks teha kokkupuuteperioodi vältel vähemalt kord nädalas. Keskmine veetemperatuur peaks olema kogu uuringu vältel vahemikus 24–26 °C. Temperatuuri tuleks mõõta kokkupuuteperioodi vältel iga päev. Vee pH peaks olema vahemikus 6,5–8,5, kuid ei tohiks ühe katse jooksul muutuda rohkem kui ± 0,5 pH-ühikut. Ühe kontsentratsioonirühma paralleelnõude ega katse kontsentratsioonirühmade vahel ei tohiks olla statistilisi erinevusi vee temperatuuris (igapäevaste temperatuurimõõtmiste põhjal; välja arvatud põgusad kõrvalekalded).

Kokkupuute kestus

29.

Katses viiakse põlvkonna F0 sigimisvõimelised kalad kemikaaliga kokkupuutesse kolmeks nädalaks. Neljandal nädalal (u 24. katsepäeval) moodustatakse põlvkond F1, põlvkonna F0 sigimispaarid surmatakse humaansel viisil ning nende kehamass ja pikkus registreeritakse (vt punkt 34). Seejärel viiakse põlvkond F1 veel 14 nädalaks kemikaaliga kokkupuutesse (põlvkonna F1 kokkupuuteaeg on kokku 15 nädalat) ja põlvkond F2 jääb kokkupuutesse kaheks nädalaks kuni koorumiseni. Katse põhiosa kogukestus on 19 nädalat (st kuni põlvkonna F2 koorumiseni). Katse ajakava on esitatud tabelis 2 ja seda on täpsemalt selgitatud 9. liites.

Söötmisrežiim

30.

Kalu võib sööta piiramatus koguses soolase vee krevettide (Artemia spp.) 24 tunni vanuste noorjärgus isenditega, millele võib vajadusel lisada kaubanduslikult müüdavat helvessööta. Kaubanduslikult müüdavat helvessööta tuleks regulaarselt analüüsida saasteainete, näiteks kloororgaaniliste pestitsiidide, polütsükliliste aromaatsete süsivesinike ja polüklooritud bifenüülide sisalduse suhtes. Suures koguses endokriinse toimega aineid (nt fütoöstrogeenid) sisaldavat sööta, mis võib katses tekkivat reaktsiooni mõjutada, ei tohiks kasutada. Sööda ülejäägid ja väljaheited tuleks eemaldada katsenõudest vastavalt vajadusele, näiteks iga nõu põhja ettevaatliku puhastamisega sifooni abil. Üks või kaks korda nädalas tuleks puhastada ka iga nõu külgi ja põhja (nt spaatliga kaapimise teel). Üks söötmisgraafiku näide on esitatud 5. liites. Söödaratsioon sõltub kalade arvust paralleelnõus. Seetõttu vähendatakse söödaratsiooni juhul, kui paralleelnõus esineb kalade suremust.

Analüüsid ja mõõtmised

31.

Enne kokkupuuteperioodi algust tuleks tagada kemikaali lisamise süsteemi nõuetekohane toimimine. Tuleks kindlaks teha kõik vajalikud analüüsimeetodid, sealhulgas peaks olema piisavalt teavet uuritava kemikaali püsivuse kohta katsesüsteemis. Katse ajal määratakse uuritava kemikaali kontsentratsioonid sobivate ajavahemike järel, soovitavalt vähemalt igal nädalal iga kontsentratsioonirühma ühes paralleelnõus, jälgides, et eri nädalatel kasutataks samas kontsentratsioonirühmas erinevaid paralleelnõusid.

32.

Katse ajal tuleks ettenähtud ajavahemike järel (nt vähemalt kolm korda nädalas) kontrollida lahjendusvedeliku ja põhilahuse vooluhulka. Tulemused peaksid soovitatavalt põhinema mõõdetud kontsentratsioonidel. Ent kui uuritava kemikaali kontsentratsiooni lahuses on suudetud kogu katse jooksul säilitada rahuldavalt vahemikus ± 20 % keskmisest mõõdetud väärtusest, võivad tulemused põhineda kas nominaalsetel või mõõdetud väärtustel. Olulisel määral kaladesse kogunevate uuritavate kemikaalide puhul võivad katsekontsentratsioonid kalade kasvades väheneda. Sellisel juhul soovitatakse kohandada iga kambri katselahuse värskendamise sagedust, et hoida katsekontsentratsioone võimalikult ühtlasena.

Vaatlused ja mõõdetavad lõppnäitajad

33.

Populatsiooni tasemel ilmneva võimaliku toime hindamiseks mõõdetavad lõppnäitajad on sigivus, viljakus, koorumine, kasv ja ellujäämus. Lisaks tuleks iga päev vaadelda kalade käitumist ja registreerida ebatavaline käitumine. Muud mehhanistlikud lõppnäitajad on maksa vitellogeniini (vtg) mRNA või vitellogeniini valgu (VTG) tase, mis määratakse immuunanalüüsiga (28), fenotüübilised soomarkerid (nt isaskaladele iseloomulikud pärakuuime papillaarjätked), sugunäärmete koeanalüüsi põhjal määratud sugu ning neerude, maksa ja sugunäärmete histopatoloogiline hindamine (vt tabelis 1 esitatud lõppnäitajate loendit). Kõikide nimetatud konkreetsete lõppnäitajate hindamisel lähtutakse isendi geneetilise soo kindlakstegemisest riisikala isassugu määrava geeni dmy esinemise või puudumise põhjal (vt punkt 41). Lisaks hinnatakse kudemise aega. Peale selle võib pärakuuime papillaarjätkete loendamise teel kogutud andmete põhjal kindlaks teha lihtsa fenotüüpse soolise jagunemise, et liigitada riisikala isendid fenotüübi järgi isaseks või emaseks. Käesoleva katsemeetodi puhul ei eeldata, et sellega on võimalik tuvastada mõõdukaid kõrvalekaldeid eeldatavast soolisest jagunemisest, kuna kalade suhteliselt väike arv proovi kohta ei taga piisavat statistilist võimsust. Pelegi uuritakse histopatoloogilise hindamise käigus sugunääret ja viiakse läbi palju põhjalikumad analüüsid sugunäärme fenotüübi hindamiseks geneetilise soo kontekstis.

34.

Käesoleva katsemeetodi peamine eesmärk on hinnata uuritava kemikaali võimalikku toimet populatsioonile. Lisaks aitavad mehhanistlikud lõppnäitajad (vitellogeniin, teisesed sootunnused ja mõned sugunäärmete histopatoloogiaga seotud toimed) kindlaks teha, kas mõni toime avaldub endokriinfunktsiooni vahendusel. Samas võivad kõnealuseid mehhanistlikke lõppnäitajaid mõjutada ka süsteemsed või muud mürgised toimed. Seetõttu võidakse üksikasjalikult hinnata ka maksa ja neerude histopatoloogiat, et mehhanistlikes lõppnäitajates avalduvaid reaktsioone paremini mõista. Ent juhul, kui nimetatud üksikasjalikke hindamisi ei tehta, tuleks siiski tähele panna ja aruannetes kajastada histopatoloogilise hindamise käigus juhuslikult avastatud suuri kõrvalekaldeid.

Kalade humaanne surmamine

35.

Põlvkondade F0 ja F1 kokkupuute lõpetamisel ning noorkalade osaproovide võtmisel tuleks kalad surmata vajaliku koguse anesteetikumilahusega (nt trikaiinmetaansulfonaat, MS-222, CASi nr 886-86-2, kontsentratsiooniga 100–500 mg/l), mis on limaskesta ärrituse vähendamiseks puhverdatud NaHCO3-ga (naatriumvesinikkarbonaat, CASi nr 144-55-8) kontsentratsioonis 300 mg/l. Kui kaladel ilmneb märkimisväärsete kannatuste tunnuseid (mis on väga raskekujulised ja kalade surm on usaldusväärselt prognoositav) ja nad on surmaeelses seisundis, tuleks nad tuimastada ja surmata ning arvestada nende andmetega suremuse analüüsimisel. Haigestunud kalade surmamise juhud tuleb üles märkida ja neid aruannetes kajastada. Olenevalt sellest, millisel uuringu etapil kalad surmatakse, võidakse kalu säilitada histopatoloogiliseks analüüsiks (kalade fikseerimine võimalikuks histopatoloogia uuringuks).

Marja ja kalavastsete käitlemine

Sigimispaaride marjaterade kogumine järgmise põlvkonna paljundamiseks

36.

Põlvkondade F0 ja F1 vahel kogutakse marja 4. katsenädala esimesel päeval (või vajadusel esimesel kahel päeval) ning põlvkondade F1 ja F2 vahel 18. katsenädala esimesel päeval. Põlvkond F1 on 18. katsenädalaks täiskasvanud ja elanud viljastamisest alates 15 nädalat. Kõik marjaterad tuleb eemaldada nõust üks päev enne nende kogumist tagamaks, et kõik sigimispaarilt kogutud marjaterad pärinevad samast kudust. Mõnikord kannavad emased riisikalad oma marjaterasid pärast kudemist pärakuava juures, et paigutada need substraadile. Kuna nõus substraati ei ole, võib marjaterad leida emase kala küljest või nõu põhjast. Olenevalt asukohast eemaldatakse marjaterad ettevaatlikult emase kala küljest või kogutakse põhjast sifooniga 4. katsenädalal (põlvkond F0) või 18. katsenädalal (F1). Kõigist samast kontsentratsioonirühmast kogutud marjateradest moodustatakse enne inkubatsioonikambritesse paigutamist üks koondkogum.

37.

Marjaterasid koos hoidvad kuduniidid eemaldatakse. Igalt sigimispaarilt (üks paar paralleelnõu kohta) kogutakse viljastatud marjaterad (kuni 20), millest moodustatakse kontsentratsioonirühmade lõikes koondkogumid, mis jaotatakse süstemaatiliselt sobivatesse inkubatsioonikambritesse (6. ja 7. liide). Kvaliteetse stereomikroskoobi all on võimalik näha esimesi viljastamise/arengu tunnuseid, näiteks kõldkesta (koorioni) kerkimist, rakkude jagunemist või blastula kujunemist. Inkubatsioonikambrid võib paigutada iga kontsentratsioonirühma jaoks valmis pandud eraldi inkubatsiooniakvaariumidesse (sel juhul tuleb nendes mõõta veekvaliteedi näitajaid ja uuritava kemikaali kontsentratsioone) või paralleelakvaariumisse, mis hakkab sisaldama koorunud vastseid (nt eelvastseid). Kui vaja on ka teist kogumispäeva (katse 23. päev), tuleb mõlemal päeval kogutud marjateradest moodustada koondkogum, mis jaotatakse seejärel süstemaatiliselt kontsentratsioonirühma paralleelnõudesse.

Marjaterade kasvatamine koorumiseni

38.

Viljastatud marjaterasid loksutatakse näiteks marjainkubaatoris pidevalt õhumullide abil või marjainkubaatori üles-alla liigutamise teel. Viljastatud marjaterade (embrüote) suremust kontrollitakse ja registreeritakse iga päev. Surnud marjaterad eemaldatakse inkubaatoritest (9. liide). Seitsmendal viljastamisjärgsel päeval loksutamine lõpetatakse või seda vähendatakse, et viljastatud marjaterad sadestuksid inkubaatori põhja. See soodustab koorumist, mis tavaliselt toimub järgmise ühe kuni kahe päeva jooksul. Igas menetlus- ja kontrollrühmas loendatakse (paralleelnõude lõikes koondatult) vastkoorunud isendid (noored vastsed; eelvastsed). Viljastatud marjaterad, mis ei ole koorunud kontrollrühma koorumispäeva mediaaniga võrreldes kaks korda pikema aja jooksul (tavaliselt 16 või 18 päeva pärast viljastamist), tunnistatakse eluvõimetuks ja jäetakse kõrvale.

39.

Igasse paralleelnõusse pannakse 12 vastkoorunud isendit. Inkubatsioonikambritest kogutud vastkoorunud isenditest moodustatakse koondkogum, mis jaotatakse süstemaatiliselt paralleelnõudesse (7. liide). Selleks võib valida kontsentratsioonirühmast juhuslikult ühe vastkoorunud isendi ning lisada selle üksteise järel juhuslikult valitud paralleelakvaariumisse. Iga nõu peaks sisaldama võrdsel arvul (n = 12) koorunud vastseid (mitte rohkem kui 20 vastset nõu kohta). Kui vastsete arv ei ole kontsentratsiooni rühma kõikide paralleelnõude täitmiseks piisav, soovitatakse moodustada võimalikult palju 12 vastsega paralleelnõusid. Vastsete ohutuks käitlemiseks saab kasutada suure avaga klaaspipetti. Kõik üle jäävad vastsed surmatakse humaanselt anesteetikumi abil. Mõne nädala jooksul enne sigimispaaride ettevalmistamist tuleks iga paralleelnõu puhul registreerida esimese kudemissündmuse päev.

Sigimispaaride ettevalmistamine

Uimede lõikamine ja genotüübilise soo kindlakstegemine

40.

Genotüübiline sugu tehakse uimest lõigatud tükkide abil kindlaks 9.–10. viljastamisjärgsel nädalal (st põlvkonna F1 puhul 12.–13. katsenädalal). Kõik nõus olevad kalad tuimastatakse (kasutades heakskiidetud meetodit, nt IACUC) ning iga kala sabauime selja- või kõhupoolsest otsast võetakse väike koeproov, et teha kindlaks isendi genotüübiline sugu (29). Paralleelrühma kalu võib hoida paralleelnõus väikestes puurides (võimaluse korral üks kala puuri kohta). Teise variandina võib igas puuris hoida kahte kala, kui need on üksteisest eristatavad. Üks eristamise meetod on teha koeproovi võtmisel sabauime erinevad lõiked (nt ühel kalal seljapoolsest ja teisel kõhupoolsest otsast).

41.

Riisikala genotüübiline sugu määratakse Y-kromosoomis asuva tuvastatud järjestusega geeni (dmy) põhjal. Dmy olemasolu näitab, et tegemist on XY-isendiga, olenemata kala fenotüübist, samas kui dmy puudumine osutab XX-isendile, olenemata fenotüübist (30, 31). Igast uimetükist eraldatakse desoksüribonukleiinhape (DNA) ja dmy olemasolu või puudumise kindlakstegemiseks saab kasutada polümeraasi ahelereaktsiooni (PCR) meetodeid (vt käesoleva lisa peatüki C.419. liide või (29) 3. ja 4. liide).

Sigimispaaride moodustamine

42.

Genotüübilise soo andmete põhjal moodustatakse XX-XY sigimispaarid, olenemata välisest fenotüübist, mis võib uuritava kemikaaliga kokku puutudes muutuda. Iga kala genotüübilise soo kindlakstegemisele järgneval päeval valitakse igast paralleelnõust juhuslikult kaks XX-kala ja kaks XY-kala ning neist moodustatakse kaks XX-XY sigimispaari. Kui paralleelnõu ei sisalda kahte XX- või XY-kala, tuleb vastavad kalad võtta sama kontsentratsioonirühma teistest paralleelnõudest. Eesmärk on saada soovitatud arvul paralleelseid sigimispaare nii igasse kontsentratsioonirühma (12 paari) kui ka kontrollrühma (24 paari). Sigimispaaride moodustamisel tuleks välistada ilmsete kõrvalekalletega kalad (probleemid ujupõiega, deformeerunud selgroog, äärmuslikult suur või väike kasv jne). Põlvkonna F1 sigimisetapil peaks iga paralleelnõu sisaldama üksnes ühte sigimispaari.

Noorkalade proovide võtmine ja lõppnäitajate hindamine

Sigimispaaridesse mittekuuluvate kalade proovide võtmine

43.

Pärast sigimispaaride moodustamist surmatakse valimata jäänud kalad humaanselt 12.–13. katsenädalal (põlvkond F1), et mõõta noorkalade lõppnäitajaid. Äärmiselt oluline on käidelda kalu nii, et säiliks sigimispaaride valimise eesmärgil kindlaks tehtud genotüübilise soo tuvastamise võimalus. Kõigi kogutud andmeid analüüsitakse konkreetse kala genotüübilisest soost lähtudes. Iga kala kasutatakse erinevates lõppnäitajate mõõtmistes, mis hõlmavad järgmist: noorkalade ellujäämismäärad (7.–12./13. katsenädal, põlvkond F1), pikkuse (kui sabauime on geneetilise soo analüüsiks kasutatud proovide võtmise tõttu lühendatud, võib mõõta standardpikkust; kui dmy määramiseks onsabauime selja või kõhu poolt üksnes osaliselt kärbitud, võib mõõta üldpikkust) ja kehamassi (st märgmass, kuivatuspaberiga kuivatatult) juurdekasv, maksa vtg mRNA (või VTG) ja pärakuuime papillaarjätked (vt tabelid 1 ja 2). Pange tähele, et kontsentratsioonirühma keskmise juurdekasvu arvutamiseks tuleb mõõta ka sigimispaaride massid ja pikkused.

Koeproovide võtmine ja vitellogeniinisisalduse mõõtmine

44.

Maks eraldatakse ning säilitatakse temperatuuril ≤ –70 °C kuni vtg mRNA (või VTG) mõõtmiseni. Kala saba koos pärakuuimega konserveeritakse sobivas (nt Davidsoni) fiksaatoris või pildistatakse nii, et hiljem oleks võimalik loendada pärakuuime papillaarjätkeid. Soovi korral võib sellel etapil konserveerimiseks proove võtta ka muudest kudedest (nt sugunäärmed). Maksa VTG kontsentratsioon tuleks määrata homoloogse ELISA meetodiga (riisikala puhul soovitatav menetlus on esitatud käesoleva lisa peatüki C.486. liites). Teise variandina on USA Keskkonnakaitseamet kirjeldanud vtg mRNA kvantitatiivse määramise meetodeid: vtg I geeni mRNA eraldamine maksaproovist ja vtg I geeni koopiate loendamine (ühe nanogrammi mRNA üldkoguse kohta) kvantitatiivse PCR-meetodiga (29). Selle asemel, et loendada vtg geeni koopiaid nii kontrollrühmas kui ka kontsentratsioonirühmades, võib vähem ressursinõudliku ja tehniliselt lihtsama meetodina uurida vtg I ekspressiooni suhtelist muutust kontrollrühma ja kontsentratsioonirühmade võrdluses.

Teisesed sootunnused

45.

Tavaoludes on ainult suguküpsetel isastel riisikaladel papillaarjätked, mis kasvavad teiseste sootunnustena mõnedele pärakuuime kiirelülidele ning mida saab kasutada endokriinfunktsiooni kahjustava toime biomarkerina. Pärakuuime papillaarjätkete (papillaarjätketega kiirelülide) loendamise meetod on esitatud 8. liites. Isendi pärakuuime papillaarjätkete arvu kasutatakse ka selleks, et liigitada isendid välise fenotüübi järgi isaseks või emaseks ning arvutada selle põhjal sooline jaotumine igas paralleelnõus. Rohkem kui 0 papillaarjätkega riisikala liigitatakse isaseks; 0 papillaarjätkega riisikala liigitatakse emaseks.

Sigivuse ja viljakuse hindamine

46.

Sigivust ja viljakust hinnatakse põlvkonna F0 puhul 1.–3. katsenädalal ning põlvkonna F1 puhul 15.–17. katsenädalal. Igalt sigimispaarilt kogutakse 21 järjestikusel päeval marjaterasid. Igal hommikul eemaldatakse marjaterad ettevaatlikult võrku püütud emaste küljest ja/või kogutakse sifooni abil akvaariumi põhjast. Iga päev registreeritakse kõigi paralleelsete sigimispaaride sigivuse ja viljakuse näitajad. Sigivuse näitajana käsitatakse koetud marjaterade arvu ning viljakust mõõdetakse loendamise hetkeks viljastatud ja eluvõimeliste marjaterade arvu põhjal. Marjaterad tuleks loendada võimalikult kiiresti pärast kogumist.

47.

Sigivuse registreerimiseks märgitakse iga päev üles iga paralleelse sigimispaari marjaterade arv, mida analüüsitakse soovitatud statistiliste meetoditega, kasutades paralleelnõude keskmisi väärtusi. Sigimispaari viljakuse näitaja on sellelt paarilt pärit viljastatud marjaterade arv, mis on jagatud sellelt paarilt pärit marjaterade koguarvuga. Statistiliselt analüüsitakse viljakust suhtarvuna iga paralleelnõu kohta. Kooruvuse näitaja on vastkoorunud isendite arv, mis on jagatud paralleelnõusse pandud embrüote arvuga (tavaliselt 20). Statistiliselt analüüsitakse kooruvust suhtarvuna iga paralleelnõu kohta.

Täiskasvanud kalade proovide võtmine ja lõppnäitajate hindamine

Sigimispaaridesse kuuluvate kalade proovide võtmine

48.

Pärast 17. katsenädalat (st pärast põlvkonna F2 edukat sigitamist) surmatakse põlvkonna F1 täiskasvanud kalad humaansel viisil ja hinnatakse nende erinevaid lõppnäitajaid (vt tabelid 1 ja 2). Pärakuuime papillaarjätkete loendamiseks (vt 8. liide) tehakse pärakuuimedest pildid ja/või eemaldatakse saba vahetult pärakuava tagant tehtava lõikega ning fikseeritakse see hilisemaks papillaarjätkete loendamiseks. Soovi korral võib sellel etapil võtta arhiveerimiseks proovi sabauimest, mis võimaldab kontrollida geneetilist sugu (dmy). Vajadusel võib võtta koeproovi, et kontrollida konkreetsete kalade sugu korduva dmy analüüsi abil. Enne kogu keha sobivasse (nt Davidsoni) fiksaatorisse asetamist avatakse kehaõõnsus, et võimaldada selle perfusiooni fiksaatoriga. Ent kui enne fikseerimist kasutatakse sobivat fiksaatori sissepääsu soodustavat meetodit, siis ei ole vaja kehaõõnsust avada.

Histopatoloogiline analüüs

49.

Iga kala analüüsitakse histoloogiliselt, et leida võimalikke patoloogiaid sugunäärmete koes (30, 29). Nagu on osutatud punktis 33, võivad süsteemsed või muud mürgised toimed mõjutada käesoleva katsemeetodiga hinnatavaid muid mehhanistlikke lõppnäitajad (VTG, teisesed sootunnused ja mõned sugunäärmete histopatoloogiaga seotud toimed). Seetõttu võidakse üksikasjalikult hinnata ka maksa ja neerude histopatoloogiat, et mehhanistlikes lõppnäitajates avalduvaid reaktsioone paremini mõista. Ent juhul, kui nimetatud üksikasjalikke hindamisi ei tehta, tuleks siiski tähele panna ja aruannetes kajastada histopatoloogilise hindamise käigus juhuslikult avastatud suuri kõrvalekaldeid. Kaaluda võib meetodit, mille puhul alustatakse analüüsi suurima kemikaalikontsentratsiooniga rühmast (võrreldes kontrollrühmaga) ja jätkatakse allapoole liikudes kontsentratsioonirühmani, kus toimet ei avaldu, kuid soovitatav on tutvuda asjakohaste histopatoloogia juhenditega (29). Üldjuhul töödeldakse kõiki proove / tehakse proovidest lõiked, mida patoloog seejärel analüüsib. Seoses allapoole liikumise meetodi kasutamisega tuleb märkida, et Rao-Scotti kohandusega Cochrane’i-Armitage’i lõiktestis (RSCABS) lähtutakse eeldusest, et dooside kasvades suureneb ka bioloogiline toime (patoloogia). Seetõttu on järelduste statistiline võimsus väiksem, kui vaadeldakse üksnes ühte suurt doosi ilma vahepealsete doosideta. Selline meetodi võib olla vastuvõetav juhul, kui suure doosi toime puudumises veendumiseks ei ole vaja teha statistilist analüüsi. Kõnealuse hindamise käigus selgitatakse välja ka sugunäärme fenotüüp.

Muud tähelepanekud

50.

MEOGRTga saadavate andmete abil saab samaaegselt hinnata (nt tõendite kaalukuse meetodiga) vähemalt kahte liiki kahjuliku toime radasid, mis viivad sigimisvõime häireni: a) endokriinse toime rajad, mille puhul esinevad endokriinfunktsiooni häired hüpotalamuse-ajuripatsi-sugunäärmete (HAS) teljel, ja b) muu kui endokriinse mürgisuse kaudu ellujäämust, kasvamist (pikkuses ja massis) ja sigimist pärssivad rajad. Käesolev katse hõlmab ka tavaliselt kroonilise mürgisuse katsetes (nt kogu elutsükli ja varase elujärgu katsed) mõõdetavaid lõppnäitajaid, mille abil saab hinnata nii endokriinse mürgisuse radasid kui ka muu kui endokriinse mehhanismi kaudu avalduvat mürgisust. Katse ajal tuleks iga päev vaadelda kalade käitumist ja registreerida ebatavaline käitumine. Lisaks tuleks registreerida suremuse näitajad ja arvutada kalade ellujäämus kuni väljapraakimise etapini (6./7. katsenädal), väljapraakimisest kuni noorkalade proovide võtmiseni (9.–10. viljastamisjärgne nädal) ning paaride moodustamisest kuni täiskasvanud kalade proovide võtmiseni.

Tabel 1

Ülevaade MEOGRT lõppnäitajatest (*18)

Arengujärk	Lõppnäitaja	Põlvkond
Embrüo (2. viljastamisjärgne nädal)	Koorumine (% ja koorumiseni kulunud aeg)	F1, F2
Maim (4. viljastamisjärgne nädal)	Ellujäämus	F1
Noorkala (9. või 10. viljastamisjärgne nädal)	Ellujäämus	F1
	Kasv (pikkus ja mass)
	Vitellogeniin (mRNA või valk)
	Teisesed sootunnused (pärakuuime papillaarjätked)
	Sooline jaotumine välistunnuste järgi
	1. kudemiseni kulunud aeg
Täiskasvanu (12.-14. viljastamisjärgne nädal)	Paljunemine (sigivus ja viljakus)	F0, F1
Täiskasvanu (15. viljastamisjärgne nädal)	Ellujäämus	F1
	Kasv (pikkus ja mass)
	Teisesed sootunnused (pärakuuime papillaarjätked)
	Histopatoloogiline analüüs (sugunääre, maks, neerud)

AJAKAVA

51.

MEOGRT näitlik ajakava on esitatud tabelis 2. MEOGRT hõlmab 4-nädalast põlvkonna F0 täiskasvanud isendite ja 15-nädalast põlvkonna F1 kokkupuudet ning teise põlvkonna (F2) kokkupuuteperioodi, mis kestab kuni koorumiseni (2. viljastamisjärgne nädal). Kokkuvõte MEOGRT käigus läbi viidavatest tegevustest on esitatud 9. liites.

Tabel 2

MEOGRT kokkupuute ja mõõtmise lõppnäitajate ajakava

ANDMED JA ARUANDLUS

Statistiline analüüs

52.

Kuna genotüübiline sugu tehakse kindlaks kõikide katsealuste kalade puhul, tuleks andmeid analüüsida mõlema genotüübilise soo (XY-isased ja XX-emased) kohta eraldi. Selle tegemata jätmine vähendab oluliselt mis tahes analüüsi statistilist võimsust. Andmete statistiline analüüs peaks eelistatavalt toimuma vastavalt meetoditele, mida on kirjeldatud OECD koostatud juhendis ökotoksilisuse andmete statistilise analüüsi kaasaegsete meetodite rakendamise kohta (32). Täiendavaid juhiseid statistilise analüüsi tegemiseks on esitatud 10. liites.

53.

Katseplaan ja valitud statistilised testid peaksid tagama piisava statistilise võimsuse, et tuvastada bioloogiliselt olulisi lõppnäitajate muutusi katses, mille puhul tuleb esitada täheldatava toime puudumise kontsentratsioon (NOEC) (32). Konkreetsetest toime avaldumise kontsentratsioonidest aru andmine võib sõltuda asjaomasest õigusraamistikust. Kindlaks tuleks teha iga olulise tuvastatava või hinnatava lõppnäitaja protsentuaalne muutus. Katseplaani tuleks sellest lähtuvalt kohandada. On vähetõenäoline, et kõikide lõppnäitajate puhul täheldatakse sama protsentuaalset muutust ning et on võimalik koostada selline katseplaan, kus kõnealused kriteeriumid on täidetud kõikide lõppnäitajate puhul; seepärast on tähtis keskenduda nõuetekohase katse kavandamisel lõppnäitajatele, mis on asjaomase katse puhul olulised. Andmete töötlemise ja sobivaima statistilise testi või mudeli valimise lihtsustamiseks on 10. liites esitatud statistiline vooskeem ja juhised. Võib kasutada ka muid statistilisi meetodeid, kui need on teaduslikult põhjendatud.

54.

Igas paralleelide rühmas on vaja analüüsida varieeruvust dispersioonanalüüsi või sagedustabeli abil ning kasutada selle analüüsi alusel valitud piisavaid ja asjakohaseid statistilisi analüüsimeetodeid. Igal eraldi kontsentratsioonil ja kontrollrühmas saadud tulemuste mitmeseks võrdlemiseks soovitatakse pideva tunnuse puhul kasutada muutujate sammuviisilise elimineerimisega meetodit (nt Jonckheere’i-Terpstra testi). Kui andmete puhul ei täheldata monotoonset kontsentratsioonist sõltuvust, tuleks kasutada Dunnetti või Dunni testi (pärast andmete sobivat teisendamist, kui see on vajalik).

55.

Sigivuse puhul tuleks marjaterasid loendada iga päev, kuid analüüsis võib kasutada marjaterade koguarvu või kordusmõõtmise näitajaid. Kõnealuse lõppnäitaja analüüsimist on täpsemalt selgitatud 10. liites. Raskusastme kujul esitatavate histopatoloogia andmete jaoks on välja töötatud uus statistiline test: Rao-Scotti kohandusega Cochrane’i-Armitage’i lõiktest (RSCABS) (33).

56.

Protokollis tuleks kajastada kõik kemikaaliga kontsentratsioonirühmades ilmnenud lõppnäitajad, mis erinevad oluliselt vastavatest kontrollrühma väärtustest.

Andmete analüüsiga seotud kaalutlused

Ebaõnnestunud kokkupuutetasemekatsete andmete kasutamine

57.

Kui otsustatakse, et kas ühe paralleelrühma või terve kokkupuutetaseme puhul võib avalduda selge mürgisus ja see tuleks analüüsist kõrvale jätta, tuleb arvestada mitut tegurit. Määratluse kohaselt esineb selge mürgisus juhul, kui 3. ja 9. viljastamisjärgse nädala vahel mis tahes paralleelrühmas esinenud surmajuhtumite arv on > 4 ja see ei saa olla tingitud tehnilisest veast. Muud selge mürgisuse nähud on järgmised: veritsemine, ebatavaline käitumine, ebatavaline ujumisviis, isutus ja muud kliinilised haigustunnused. Subletaalse mürgisuse puhul võib olla vajalik kvalitatiivne hindamine; selle tegemisel peaks alati olema aluseks võrdlus lahjendusveega (üksnes puhas vesi) kontrollrühmaga. Kui suurima kontsentratsiooniga rühma(de)s esineb selge mürgisus, soovitatakse need rühmad analüüsist välja jätta.

Lahustiga kontrollid

58.

Lahusti kasutamist tuleks kaaluda üksnes viimase abinõuna, kui kõik muud kemikaali lisamise võimalused on läbi vaadatud. Kui kasutatakse lahustit, tuleb samal ajal teha kontrollkatse lahjendusveega. Katse lõpetamisel tuleb hinnata lahusti võimalikku mõju. Seda tehakse lahustiga kontrollrühma ja lahjendusveega kontrollrühma statistilise võrdlemisega. Kõige asjakohasemad lõppnäitajad, mida tuleks kõnealuses analüüsis arvesse võtta, on kasvuga (massiga) seotud tegurid, kuna neid võib mõjutada üldine mürgisus. Kui nende lõppnäitajate puhul tuvastatakse lahjendusveega kontrollrühma ja lahustiga kontrollrühma vahel statistiliselt olulisi erinevusi, tuleb parimatest erialateadmistest lähtudes hinnata, kas see ohustab katse nõuetekohasust. Kui kahe kontrollrühma näitajad erinevad, tuleks kemikaaliga kokku puutunud rühmi võrrelda lahustiga kontrollrühmaga, välja arvatud juhul, kui on teada, et eelistada tuleb võrdlust lahjendusveega kontrollrühmaga. Kui kahe kontrollrühma vahel statistiliselt olulisi erinevusi ei ole, soovitatakse võrrelda uuritava kemikaaliga kokku puutunud rühmi mõlema kontrollrühma (lahustiga ja lahjendusveega) ühendatud näitajatega, välja arvatud juhul, kui on teada, et eelistada tuleb võrdlust ainult lahjendusveega või ainult lahustiga kontrollrühmaga.

Katseprotokoll

59.

Katseprotokoll peaks sisaldama järgmist teavet.

Uuritav kemikaal:

—	füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;

—

kemikaali identimisandmed;

—

ühest koostisosast koosnev aine:

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne, sealhulgas vajaduse korral orgaanilise süsiniku sisaldus;

—

mitmest koostisosast koosnev aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal või segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohaseid füüsikalis-keemilisi omadusi käsitlevatest andmetest.

Katsealune liik:

—	teaduslik nimetus, liin (kui on), päritolu ning viljastatud marjaterade kogumise ja järgneva käitlemise meetod.

Katsetingimused:

—	valgusrežiim(id);

—	katseplaan (nt kambrite suurus, materjal ja veesisaldus, katsekambrite ja paralleelrühmade arv, vastkoorunud isendite arv paralleelnõu kohta);

—	põhilahuste valmistamise meetod ja uuendamise sagedus (lahusti kasutamise korral tuleks esitada selle nimetus ja kontsentratsioon);

—	uuritava kemikaali annustamismeetod (nt pump, lahjendussüsteem);

—	meetodiga saavutatav tuvastamise tõhusus ja nominaalsed katsekontsentratsioonid, määramispiir, katsenõudes mõõdetud väärtuste keskmised ja standardhälbed ja nende arvutamise meetod ning tõendid selle kohta, et mõõtmistulemused kajastavad uuritava kemikaali sisaldust tõelises lahuses;

—	lahjendusvee omadused: pH, karedus, temperatuur, lahustunud hapniku sisaldus, kloorijääkide sisaldus (kui on mõõdetud), orgaanilise süsiniku üldsisaldus (kui on mõõdetud), hõljuvaine sisaldus (kui on mõõdetud), katselahuse soolsus (kui on mõõdetud) ja kõik muud mõõdetud näitajad;

—	nominaalsed katsekontsentratsioonid, mõõdetud väärtuste keskmised ja nende standardhälbed;

—	vee kvaliteet katsenõudes: pH, temperatuur (iga päev) ja lahustunud hapniku sisaldus;

—	üksikasjalik teave söötmise kohta (nt sööda liik, päritolu, lisatud kogus ja söötmissagedus).

Tulemused:

—	tõendid selle kohta, üldised nõuetekohasuse kriteeriumid on kontrollrühmades täidetud;

—

järgmised andmed kontrollrühma (ja selle kasutamise korral lahustiga kontrollrühma) ja kontsentratsioonirühmade kohta: koorumine (kooruvus ja koorumiseni kulunud aeg) põlvkondades F1 ja F2, koorumisjärgne ellujäämus põlvkonnas F1, kasv (pikkus ja kehamass) põlvkonnas F1, genotüübiline sugu ja sooline eristumine (nt pärakuuime papillaarjätkete ja sugunäärme histoloogia põhjal kindlaks tehtud teisesed sootunnused) põlvkonnas F1, fenotüübiline sugu põlvkonnas F1, teisesed sootunnused (pärakuuime papilaarjätked) põlvkonnas F1, vtg mRNA (või VTG valk) põlvkonnas F1, põlvkonna F1 histopatoloogiline analüüs (sugunääre, maks ja neerud) ning põlvkondade F0 ja F1 paljunemise näitajad (sigivus ja viljakus); (vt tabelid 1 ja 2);

—	statistilise analüüsi puhul kasutatud meetod (regressioonanalüüs või dispersioonanalüüs) ja andmetöötlusviis (kasutatud statistilised testid ja mudelid);

—	täheldatava toime puudumise kontsentratsioon (NOEC) iga hinnatud näitaja puhul;

—

vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon (LOEC) iga hinnatud näitaja puhul (tasemel p = 0,05); vajaduse korral ECx iga hinnatud näitaja puhul koos usaldusvahemikuga (nt usaldusnivool 90 % või 95 %) ja graafik selle arvutamiseks kasutatud lähendatud kõveraga, kontsentratsioonist sõltuvuse kõvera tõus, regressioonimudeli võrrand ning mudeli hinnangulised parameetrid ja nende standardviga;

—	kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist ja nõuetekohasuse kriteeriumidest ning nende võimalik mõju katse tulemustele.

60.

Lõppnäitajate mõõtmistulemuste puhul tuleb esitada keskväärtused ja nende standardhälbed (võimaluse korral nii paralleelrühmade kui ka kontsentratsioonide lõikes).

KIRJANDUS

(1)	OECD (2012a). Fish Toxicity Testing Framework, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 171), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(2)	Padilla, S., Cowden, J., Hinton, D.E., Yuen, B., Law, S., Kullman, S.W., Johnson, R., Hardman, R.C., Flynn, K. ja Au, D.W.T. (2009). Use of Medaka in Toxicity Testing. Current Protocols in Toxicology 39: 1–36.

(3)	OECD (2012b). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Endocrine Disrupters. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 150), Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(4)	Benoit, D.A., Mattson, V.R. ja Olson, D.L. (1982). A Continuous-Flow Mini-Diluter System for Toxicity Testing. Water Research 16: 457–464.

(5)	Yokota, H., Tsuruda, Y., Maeda, M., Oshima, Y., Tadokoro, H., Nakazono, A., Honjo, T. ja Kobayashi, K. (2000). Effect of Bisphenol A on the Early Life Stage in Japanese Medaka (Oryzias Latipes). Environmental Toxicology and Chemistry 19: 1925–1930.

(6)	Yokota, H., Seki, M., Maeda, M., Oshima, Y., Tadokoro, H., Honjo, T. ja Kobayashi, K. (2001). Life-Cycle Toxicity of 4-Nonylphenol to Medaka (Oryzias Latipes). Environmental Toxicology and Chemistry 20: 2552–2560.

(7)	Kang, I.J., Yokota, H., Oshima, Y., Tsuruda, Y., Yamaguchi, T., Maeda, M., Imada, N., Tadokoro, H. ja Honjo, T. (2002). Effects of 17β-Estradiol on the Reproduction of Japanese Medaka (Oryzias Latipes). Chemosphere 47: 71–80.

(8)	Seki, M., Yokota, H., Matsubara, H., Tsuruda, Y., Maeda, M., Tadokoro, H. ja Kobayashi, K. (2002). Effect of Ethinylestradiol on the Reproduction and Induction of Vitellogenin and Testis-Ova in Medaka (Oryzias Latipes). Environmental Toxicology and Chemistry 21: 1692–1698.

(9)	Seki, M., Yokota, H., Matsubara, H., Maeda, M., Tadokoro, H. ja Kobayashi, K. (2003). Fish Full Life-Cycle Testing for the Weak Estrogen 4-Tert-Pentylphenol on Medaka (Oryzias Latipes). Environmental Toxicology and Chemistry 22: 1487–1496.

(10)	Hirai, N., Nanba, A., Koshio, M., Kondo, T., Morita, M. ja Tatarazako, N. (2006a). Feminization of Japanese Medaka (Oryzias latipes) Exposed to 17β-Estradiol: Effect of Exposure Period on Spawning Performance in Sex-Transformed Females. Aquatic Toxicology 79: 288–295.

(11)	Hirai, N., Nanba, A., Koshio, M., Kondo, T., Morita, M. ja Tatarazako, N. (2006b). Feminization of Japanese Medaka (Oryzias latipes) Exposed to 17β-Estradiol: Formation of Testis-Ova and Sex-Transformation During Early-Ontogeny. Aquatic Toxicology 77: 78–86.

(12)	Nakamaura, A., Tamura, I., Takanobu, H., Yamamuro, M., Iguchi, T. ja Tatarazako, N. (2015). Fish Multigeneration Test with Preliminary Short-Term Reproduction Assay for Estrone Using Japanese Medaka (Oryzias Latipes). Journal of Applied Toxicology 35:11–23.

(13)	U.S. Environmental Protection Agency (2013). Validation of the Medaka Multigeneration Test: Integrated Summary Report. Kättesaadav aadressil http://www.epa.gov/scipoly/sap/meetings/2013/062513meeting.html.

(14)	Adolfsson-Erici, M., Åkerman, G., Jahnke, A., Mayer, P. ja McLachlan, M. (2012). A Flow-Through Passive Dosing System for Continuously Supplying Aqueous Solutions of Hydrophobic Chemicals to Bioconcentration and Aquatic Toxicity Tests. Chemosphere 86: 593–599.

(15)	OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 23.), Majanduskoostöö ja Arengu organisatsioon, Pariis.

(16)	Hutchinson, T.H., Shillabeer, N., Winter, M.J. ja Pickford, D.B. (2006). Acute and Chronic Effects of Carrier Solvents in Aquatic Organisms: A Critical Review. Review. Aquatic Toxicology 76: 69–92.

(17)	Denny, J.S., Spehar, R.L., Mead, K.E. ja Yousuff, S.C. (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. US EPA/600/3-91/064.

(18)	Koger, C.S., Teh, S.J. ja Hinton, D.E. (1999). Variations of Light and Temperature Regimes and Resulting Effects on Reproductive Parameters in Medaka (Oryzias Latipes). Biology of Reproduction 61: 1287–1293.

(19)	Kinoshita, M., Murata, K., Naruse, K. ja Tanaka, M. (2009). Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols, Wiley- Blackwell.

(20)	Gormley, K. ja Teather, K. (2003). Developmental, Behavioral, and Reproductive Effects Experienced by Japanese Medaka in Response to Short-Term Exposure to Endosulfan. Ecotoxicology and Environmental Safety 54: 330–338.

(21)	Käesoleva lisa peatükk C.15 „Kala embrüo ja rebukotiga vastsetega tehtav lühiajaline toksilisuse katse“.

(22)	Käesoleva lisa peatükk C.37 „21-päevane katse kaladega: lühiajaline sõelkatse östrogeense ja androgeense toime ning aromataasi inhibeerimise kontrollimiseks“.

(23)	Käesoleva lisa peatükk C.41 „Kalade sugulise arengu katse“.

(24)	Käesoleva lisa peatükk C.48 „Lühiajaline kalade paljunemise katse“.

(25)	Käesoleva lisa peatükk C.47 „Varases arengujärgus kaladele avalduva mürgisuse katse“.

(26)	Käesoleva lisa peatükk C.49 „Ägeda mürgisuse katse kalaembrüotega“.

(27)	Wheeler, J.R., Panter, G.H., Weltje, L. ja Thorpe, K.L. (2013). Test Concentration Setting for Fish In Vivo Endocrine Screening Assays. Chemosphere 92: 1067–1076.

(28)	Tatarazako, N., Koshio, M., Hori, H., Morita, M. ja Iguchi, T. (2004). Validation of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Method for Vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50: 301–308.

(29)	OECD (2015). Guidance Document on Medaka Histopathology Techniques and Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 227). Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(30)	Nanda, I., Hornung, U., Kondo, M., Schmid, M. ja Schartl, M. (2003). Common Spontaneous Sex-Reversed XX Males of the Medaka Oryzias Latipes. Genetics 163: 245–251.

(31)	Shinomiya, A., Otake, H., Togashi, K., Hamaguchi, S. ja Sakaizumi, M. (2004). Field Survey of Sex-Reversals in the Medaka, Oryzias Latipes: Genotypic Sexing of Wild Populations. Zoological Science 21: 613–619.

(32)	OECD (2014). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A guidance to application (väljaande lisad on avaldatud eraldi dokumendina), OECD Publishing, Pariis.

(33)	Green, J.W., Springer, T.A., Saulnier, A.N. ja Swintek, J. (2014). Statistical Analysis of Histopathology Endpoints. Environmental Toxicology and Chemistry 33: 1108–1116.

1. liide

MÕISTED

Asustustihedus – kalade arv vee ruumalaühiku kohta.

Biomassisisaldus – kalade märgmass vee ruumalaühiku kohta.

ECx (kontsentratsioon, mille puhul mõju ulatus on x %) – kontsentratsioon, mille juures teatava kokkupuuteperioodi vältel katseorganismidele avalduva mõju ulatus on x % kontrollrühma asjaomase näitaja väärtusest. Näiteks EC50 on kontsentratsioon, mille puhul kindlaksmääratud kokkupuuteperioodi vältel avaldub kemikaali mõju katses uuritavale näitajale 50 protsendil kemikaaliga kokku puutuvast populatsioonist.

ELISA – ensüümimmuunsorptsioonanalüüs.

HAS-telg – hüpotalamuse-ajuripatsi-sugunäärmete telg.

IACUC – Institutional Animal Care and Use Committee (institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee).

IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry (Rahvusvaheline Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liit).

Kemikaal – aine või segu.

Kooruvus – vastkoorunud isendite arv: inkubaatorisse pandud embrüote arv.

Letaalne mediaankontsentratsioon (LC50) – uuritava kemikaali hinnanguline kontsentratsioon, mille juures kemikaal on katse vältel letaalne 50 %-le katseorganismidest.

Läbivoolukatse – katse, mille puhul katselahused voolavad kokkupuuteperioodi vältel pidevalt läbi katsesüsteemi.

Pikkus sabauime hargnemiskohani – kala pikkus ninamiku tipust kuni sabauime keskmiste kiirte otsani; kasutatakse kalade puhul, kelle selgroo lõppemiskohta on keeruline kindlaks teha (www.fishbase.org).

Sigivus – marjaterade arv.

SMILES – Simplified Molecular Input Line Entry Specification (lihtsustatud molekulaarse sisendrea sisestamissüsteem).

Standardpikkus – kala pikkus ninamiku tipust viimase selgroolüli tagaotsani või hüpuraalplaadi külje keskosa tagaotsani. Lihtsamalt öeldes ei hõlma see pikkus sabauime pikkust (www.fishbase.org).

Täheldatava toime puudumise kontsentratsioon (NOEC) – uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures ei täheldata kindlaksmääratud kokkupuuteperioodi jooksul kontrolliga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) toimet ja mis on kasutatud kontsentratsioonide jadas vahetult allpool vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsiooni.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Viljakus – eluvõimeliste marjaterade arv: sigivus.

VTG – vitellogeniin on fosfolipoglükoproteiin, mis on munarebu valkude eelkäija ja mida tavaliselt leidub kõikide ovipaarsete liikide seksuaalselt aktiivsetes emasloomades.

Vähima täheldatud toime avaldumise kontsentratsioon (LOEC) – uuritava kemikaali väikseim kasutatud kontsentratsioon, mille puhul täheldatakse kemikaali statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju võrdluses kontrolliga. Kemikaal peaks kõikidel kõnealusest kontsentratsioonist suurematel kontsentratsioonidel avaldama vähemalt sama tugevat kahjulikku mõju kui kõnealusel kontsentratsioonil. Kui nimetatud kahte tingimust ei ole võimalik täita, tuleks lisada ammendav selgitus, kuidas kõnealune kontsentratsioon (ja sellest lähtuvalt ka täheldatava toime puudumise kontsentratsioon) on valitud. Sellekohased juhised on esitatud 5. ja 6. liites.

Üldpikkus – kala pikkus ninamiku tipust sabauime pikema hõlma tipuni; tavaliselt surutakse hõlmad mõõtmiseks keskjoonele kokku. Seda pikkust mõõdetakse piki sirgjoont, mitte mööda keha kumerust (www.fishbase.org).

Joonis 1.

Kasutatavate eri pikkuste kirjeldus

2. liide

MÕNED NÕUETEKOHASE LAHJENDUSVEE KEEMILISED OMADUSED

Koostisosa	Piirsisaldus
Tahked osakesed	5 mg/l
Orgaanilise süsiniku üldsisaldus	2 mg/l
Ioniseerimata ammoniaak	1 μg/l
Kloorijäägid	10 μg/l
Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus	50 ng/l
Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide summaarne üldsisaldus	50 ng/l
Orgaanilistes ühendites sisalduva kloori üldsisaldus	25 ng/l
Alumiinium	1 μg/l
Arseen	1 μg/l
Kroom	1 μg/l
Koobalt	1 μg/l
Vask	1 μg/l
Raud	1 μg/l
Plii	1 μg/l
Nikkel	1 μg/l
Tsink	1 μg/l
Kaadmium	100 ng/l
Elavhõbe	100 ng/l
Hõbe	100 ng/l

3. liide

MEOGRT PUHUL KASUTATAVAD KATSETINGIMUSED

1.Soovitatav liik	Jaapani riisikala (Oryzias latipes)
2.Katse tüüp	Pideva läbivooluga katse
3.Vee temperatuur	Nominaalne katsetemperatuur on 25 °C. Kogu katseperioodi keskmine temperatuur igas nõus on 24–26 °C.
4.Valgustuse kvaliteet	Luminofoorlambid (laia spektriga ja valgusvooga ~150 lm/m2) (valgustihedusega ~150 lx).
5.Valgusrežiim	16 tundi valgust, 8 tundi pimedust
6.Biomassisisaldus	F0: 2 täiskasvanut paralleelnõu kohta; F1: alguses kuni 20 marjatera (embrüot) paralleelnõu kohta, pärast koorumist 12 embrüot paralleelnõu kohta, seejärel sigimisetapis 9.–10. viljastamisjärgsel nädalal 2 täiskasvanut (XX-XY sigimispaar)
7.Katsekambri minimaalne kasutatav ruumala	1,8 l (nt katsekamber suurusega 18 x 9 x 15 cm)
8.Katselahuse uuendamine kogu ruumala ulatuses	Vähemalt 5 ja kuni 16 lahuse uuendamist päevas (või vooluhulk 20 ml/min)
9.Katseorganismide vanus katse alguses	F0: > 12. viljastamisjärgne nädal, aga soovitatavalt mitte rohkem kui 16. viljastamisjärgne nädal
10.Organismide arv paralleelnõu kohta	F0: 2 kala (isase ja emase paar); F1: kuni 20 kala (marjatera) paralleelnõu kohta (saadud põlvkonna F0 või F1 sigimispaaridelt)
11.Kontsentratsioonirühmade arv	5 uuritava kemikaaliga töödeldavat kontsentratsioonirühma ja vajalikud kontrollrühmad
12.Paralleelnõudearv kontsentratsioonirühma kohta	Vähemalt 6 paralleelnõud uuritava kemikaali kontsentratsioonirühma kohta ja vähemalt 12 paralleelnõud kontrollrühma ja lahustiga kontrollrühma (kui kasutatakse) kohta (põlvkonna F1 sigimisetapil paralleelnõude arv kahekordistatakse)
13. Organismide arv katses	Vähemalt 84 kala põlvkonnas F0 ja 504 kala põlvkonnas F1. (Lahustiga kontrolli kasutamise korral 108 kala põlvkonnas F0 ja 648 kala põlvkonnas F1.) Loendatav üksus on eelvastsejärgule järgnevas arengujärgus olev vastne.
14. Söötmisrežiim	Kaladele söödetakse piiramatus koguses soolase vee krevettide (Artemia spp.) 24 tunni vanuseid noorjärgus isendeid, millele vajadusel lisatakse kaubanduslikult müüdavat helvessööta (tõhusat paljunemist toetava kasvu ja arengu tagamiseks sobiva söötmisgraafiku näide on esitatud 5. liites).
15. Aereerimine	Üksnes siis, kui lahustunud hapniku sisaldus hakkab langema alla 60 % küllastuskontsentratsioonist
16. Lahjendusvesi	Puhas pinnavesi, kaevuvesi, taastatud vesi või deklooritud kraanivesi
17. Kokkupuuteaeg	Esmaselt 19 nädalat (põlvkonnast F0 kuni põlvkonna F2 koorumiseni)
18. Bioloogilised lõppnäitajad (esmased)	Kooruvus (F1 ja F2); ellujäämus (F1, koorumisest kuni 4. viljastamisjärgse nädalani (vastsejärgu lõpp / maimujärgu algus), 4. kuni 9. (või 10.) viljastamisjärgse nädalani (maimust noorkalaks) ja 9. kuni 15. viljastamisjärgse nädalani (noorkalast kuni täiskasvanud kalade surmamiseni)); kas (F1, pikkus ja mass 9. ja 15. viljastamisjärgsel nädalal); teisesed sootunnused (F1, pärakuuime papillaarjätked 9. ja 15. viljastamisjärgsel nädalal); vitellogeniin (F1, vtg mRNA või VTG valk 15. viljastamisjärgsel nädalal); fenotüübiline sugu (F1, sugunäärme histoloogia põhjal 15. viljastamisjärgsel nädalal); paljunemine (F0 ja F1, sigivus ja viljakus 21 päeva vältel); aeg kudemiseni (F1); histopatoloogia (F1, sugunääre, maks ja neerud 15. viljastamisjärgsel nädalal)
19. Katse nõuetekohasuse kriteeriumid	Lahustunud hapniku sisaldus ≥ 60 % õhu küllastuskontsentratsioonist; vee keskmine temperatuur kogu katse vältel 24–26oC; sigimise õnnestumine ≥ 65 % kontrollrühma(de) emaste puhul; keskmine päevane sigivus kontrollrühma(de)s ≥ 20 marjatera; keskmine kooruvus kontrollrühmades ≥ 80 % (nii põlvkonnas F1 kui ka põlvkonnas F2); kontrollrühmades keskmine koorumisjärgne ellujäämus 3. viljastamisjärgse nädalani ≥ 80 % ja 3. viljastamisjärgsest nädalast kuni surmamiseni ≥ 90 % (F1); uuritava kemikaali kontsentratsioon lahuses peab olema püsivalt vahemikus ± 20 % keskmisest mõõdetud väärtusest.

4. liide

TÜÜPILISTE KONTROLLVÄÄRTUSTEGA SEOTUD JUHISED

Tuleb arvestada, et nimetatud kontrollväärtused põhinevad vähesel arvul valideerimisuuringutel ja neid võidakse täiendavate kogemuste valguses muuta.

Kasv

Kõigi proovis sisalduvate kalade massi ja pikkust mõõdetakse 9. (või 10.) ja 15. viljastamisjärgsel nädala. Kirjeldatud katse-eeskirjast lähtuvalt peaks kalade eeldatav märgmass 9. viljastamisjärgsel nädala olema isaste puhul 85–145 mg ja emaste puhul 95–150 mg. Eeldatav mass 15. viljastamisjärgsel nädalal peaks olema isaste puhul 250–330 mg ja emaste puhul 280–350 mg. Üksikisendite puhul võib küll esineda märkimisväärseid kõrvalekaldeid esitatud vahemikest, aga kui mõne kontrollrühma kaalutud keskmine näitaja peaks jääma nendest vahemikest oluliselt väljapoole, siis võib see osutada probleemidele, mis on tingitud söötmisest, temperatuuri reguleerimisest, vee kvaliteedist, haigustest või nende tegurite mis tahes kombinatsioonist.

Koorumine

Koorumise edukuse määr kontrollrühmades on üldjuhul 90 % kandis, kuid ka 80 % tase ei ole ebatavaline. Kui koorumise edukus jääb alla 75 %, võib see osutada arenevate marjaterade puudulikule loksutamisele või marjaterade hooletule käitlemisele (nt surnud marjaterade õigel ajal eemaldamata jätmine, mis põhjustab seentega saastumist).

Ellujäämus

Ellujäämus koorumisest kuni 3. viljastamisjärgse nädalani ja sealt edasi on kontrollrühmades tavaliselt vähemalt 90 %, kuid ka 80 % ellujäämus kontrollrühma kalade varastes elujärkudes ei ole veel probleem. Muret tuleks tunda juhul, kui kontrollrühmades jääb ellujäämus alla 80 %, sest see võib osutada akvaariumide puudulikule puhastamisele, mis põhjustab kalavastsete surma haiguste või vähese lahustunud hapniku sisaldusest tingitud lämbumise tõttu. Suremust võivad põhjustada ka katsenõu puhastamise käigus tekitatud vigastused ja kalavastsete sattumine nõu äravoolusüsteemi.

Vitellogeniini geen

Kui vitellogeniini (vtg) geeni absoluuttasemed, mida väljendatakse koopiate arvuna ühe nanogrammi mRNA üldkoguse kohta, võivad erinevate kasutatavate menetluste või seadmete tõttu laborite vahel suuresti erineda, siis suhtarvuna peaks kontrollrühmades emaste kalade vtg tase olema ligi 200 korda kõrgem kui isastel. Vahel võivad emaste ja isaste näitajad erineda lausa 1 000–2 000 korda, aga alla 200 jääv suhtarv võib osutada probleemidele proovi saastumisega või kasutatud menetluse ja/või reaktiividega.

Teisesed sootunnused

Isaste kalade puhul on teiseste sootunnuste (papillaarjätketega lülide arv pärakuuime kiirtel) normaalvahemik 9.–10. viljastamisjärgsel nädalal 40–80 papilaarjätketega lüli. 15. viljastamisjärgseks nädalaks peaks see näitaja kontrollrühma isastel olema vahemikus 80–120 ja emastel 0. Teadmata põhjustel võivad mõnel üksikul isasel papilaarjätked puududa 9. viljastamisjärgsel nädalal, aga kuna kõigil kontrollrühma isastel kujunevad need välja 15. viljastamisjärgseks nädalaks, siis on see kõige tõenäolisemalt tingitud hilisest arengust. Kui papillaarjätkeid leitakse ka kontrollrühma emastelt, siis osutab see XX-isaste esinemisele populatsioonis.

XX-isased

XX-isaste tavapärane esinemissagedus temperatuuril 25oC kasvatatud kalade seas näib olevat kuni 4 % ning kõrgematel temperatuuridel see suureneb. Tuleks rakendada sobivaid meetmeid, et XX-isaste osakaalu populatsioonis vähendada. Kuna XX-isaste esinemine on arvatavasti seotud geneetiliste ja pärilike põhjustega, saab nende esinemist populatsioonis tõhusalt vähendada kasvatatava kalavaru jälgimisega ja XX-isaste väljapraakimisega kalade paljundamisel.

Kudemisaktiivsus

Enne sigivuse hindamist tuleks kudemisaktiivsust kontrollrühma paralleelnõudes iga päev jälgida. Kudemisaktiivsuse tundemärkide esinemist saab kontrollrühma paaridel vaatluse teel kvalitatiivselt hinnata. Enamik kontrollrühma paare peaks olema alustanud kudemist 12.–14. viljastamisjärgseks nädalaks. Kui selleks ajaks tekkinud kudevate paaride arv on väike, osutab see probleemidele kalade tervise, suguküpsuse või heaoluga.

Sigivus

Terved ja hästi söödetud riisikalad koevad 12.–14. viljastamisjärgsel nädalal üldjuhul iga päev, andes päevas 15–50 marjatera. Kontrollrühma soovituslikust 24 sigimispaarist 16 (> 65 %) peaks väljutama päevas rohkem kui 20 marjatera paari kohta ning see näitaja võib tõusta ka ligi 40 marjaterani päevas. Osutatud tasemest väiksem sigivus võib osutada sigimispaaride ebaküpsusele, alatoitumisele või haigustele.

Viljakus

Kontrollrühmas on viljastatud marjaterade osakaal tavaliselt 90 % kandis, aga haruldane ei ole ka 95 % või sellest kõrgem määr. Kui kontrollrühma marjaterade viljakus jääb alla 80 %, võib see osutada isendite haigustele või ebasoodsatele kasvatustingimustele.

5. liide

SÖÖTMISGRAAFIKU NÄIDE

Tabelis 1 on esitatud kalade tõhusat paljunemist toetava kasvu ja arengu tagamiseks sobiva söötmisgraafiku näide. Kõrvalekalded esitatud söötmisgraafikust võivad olla lubatud, aga soovitatavalt tuleks sel juhul katseliselt kontrollida, kas kasvu ja paljunemise näitajad jäävad nõutud tasemele. Soovitatud söötmisgraafiku järgimiseks tuleb enne katse algust kindlaks teha soolase vee krevettide kuivmass seda sisaldava vedelsööda mahuühiku kohta. Selleks võib kaaluda kindlaksmääratud koguse soolase vee krevette sisaldavat vedelsööta, mida on teadaoleva kaaluga alustel 60 °C juures 24 tundi kuivatatud. Vedelsöödas sisalduvate soolade massi arvessevõtmiseks kuivatatakse ka sama kogus vedelsööda valmistamiseks kasutatud soolalahust, mille kuivatamisjärgne mass lahutatakse soolase vee krevette sisaldava vedelsööda kuivatamisjärgsest massist. Teise variandina võib soolase vee krevette enne kuivatamist filtreerida ja destilleeritud veega loputada, et poleks vaja mõõta puhta soolalahuse massi. Saadud andmete põhjal teisendatakse soolase vee krevettide kuivmass tabeli järgi iga kala kohta arvestatud, soolase vee krevette sisaldava vedelsööda koguseks. Lisaks soovitatakse soolase vee krevette sisaldava vedelsööda alikvoote igal nädalal uuesti kaaluda, et kontrollida söödetava krevetikoguse kuivmassi õigsust.

Tabel 1.

Söötmisgraafiku näide

Aeg (pärast koorumist)	Soolase vee krevettide kogus (kuivmassi mg kala kohta päevas)
1. päev	0,5
2. päev	0,5
3. päev	0,6
4. päev	0,7
5. päev	0,8
6. päev	1,0
7. päev	1,3
8. päev	1,7
9. päev	2,2
10. päev	2,8
11. päev	3,5
12. päev	4,2
13. päev	4,5
14. päev	4,8
15. päev	5,2
16.–21. päev	5,6
4. nädal	7,7
5. nädal	9,0
6. nädal	11,0
7. nädal	13,5
8. nädal – surmamine	22,5

6. liide

MARJATERADE INKUBATSIOONIKAMBRI NÄIDISED

Näidis A

See inkubaator koosneb ristuva kinnitusega tsentrifuugiklaasist, mida ühendab roostevabast terasest hülss ja hoiab paigal keeratav tsentrifuugikork. Korki läbib väike klaasist või roostevabast terasest toru, mis ulatub peaaegu tsentrifuugiklaasi ümara põhjani ning mille kaudu puhutakse õhumulle marjaterade suspendeerimiseks, saprofüütiliste seennakkuste leviku tõkestamiseks ning ka kemikaalide vahetamiseks inkubaatori ja seda sisaldava nõu vahel.

Näidis B

See inkubaator koosneb klaassilindrist (läbimõõt 5 cm ja pikkus 10 cm) ja roostevabast sõelast (sõelumiskoefitsient 0,25 φ ja tihedus 32), mis kinnitatakse silindri põhja külge PTFE-võru abil. Tõstelati külge kinnitatud inkubaatorid langetatakse katsenõudesse ja neid loksutatakse vertikaalselt (u 5 cm amplituudiga) riisikala marjaterade jaoks sobiva sagedusega (u üks kord 4 s jooksul).

7. liide

MEOGRT PUHUL KASUTATAV PARALLEELPROOVIDE KOONDAMISE JA MOODUSTAMISE SKEEM

Joonis 1.

Paralleelproovide koondamine ja moodustamine MEOGRT puhul. Joonisel kujutatu vastab ühele kontsentratsioonirühmale või poolele kontrollrühmast. Koondamise tõttu ei ole paralleelproovid kogu katse vältel pidevalt eraldi jälgitavad. Mõistet „marjatera“ kasutatakse eluvõimelise viljastatud marjatera tähenduses (samaväärne embrüoga)

Kontsentratsioonirühmad ja paralleelproovid

Katsemeetodis soovitatakse kasutada tehniliselt puhaste materjalidega viit uuritava kemikaali kontsentratsioonirühma ja negatiivset kontrolli. Paralleelproovide arv kontsentratsioonirühma kohta ei ole MEOGRTs alati ühetaoline ja kontrollrühma paralleelproovide arv peaks olema kaks korda suurem kui uuritava kemikaali ühes kontsentratsioonirühmas. Põlvkonnas F0 on uuritava kemikaali igas kontsentratsioonirühmas kuus paralleelproovi ja negatiivse kontrolli rühmas 12 paralleelproovi. Lahustite kasutamist soovitatakse võimalusel alati vältida, aga nende kasutamise korral tuleb MEOGRT protokollis esitada nii lahusti kasutamise kui ka kasutatud lahusti valiku põhjendus. Lisaks on lahusti kasutamise korral vaja kahte liiki kontrollrühmasid: a) lahustiga kontroll ja b) negatiivne kontroll. Mõlemas kontrollrühmas peaks olema MEOGRT kõigis etappides täiskomplekt paralleelproove. Kirjeldatud paralleelproovide struktuur jääb samaks põlvkonna F1 katseorganismi kogu kasvuperioodi vältel (ja põlvkonnas F2 kuni selle koorumiseni). Ent täiskasvanud põlvkonna F1 sigimispaaride moodustamise ajal tuleks paralleelsete sigimispaaride arv igas kontsentratsioonirühmas võimaluse korral kahekordistada. See tähendab, et igas uuritava kemikaali kontsentratsioonirühmas oleks 12 paralleelset paari ja kontrollrühmas oleks 24 paralleelset paari (lisaks vajaduse korral 24 paralleelset paari lahusti kontrollrühmas). Generatsiooni F1 paaride koetud embrüote koorumine tehakse kindlaks sama paralleelproovide struktuuri alusel nagu põlvkonna F0 koetud embrüote koorumisel, s.t algselt kuus paralleelproovi uuritava kemikaali iga kontsentratsioonirühma kohta ja 12 paralleelproovi kontrollrühma(de)s.

8. liide

PÄRAKUUIME PAPILLAARJÄTKETE LOENDAMINE

Peamised materjalid ja reaktiivid

—	Stereomikroskoop (soovi korral koos kaameraga)

—	Fiksaator (soovitavalt Davidsoni fiksaator, Bouini fiksaatori kasutamine pole soovitav) juhul, kui jätkeid ei loendata pildilt

Loendamise kord

Pärast lahangut tuleks pärakuuime pildistada, et pärakuuime papillaarjätkeid oleks lihtsam loendada. Kuigi pildistamine on soovitatav meetod, võib teise variandina pärakkuuime Davidsoni või muus sobivas fiksaatoris ligikaudu ühe minuti jooksul fikseerida. Papillaarjätkete loendamise lihtsustamiseks tuleb hoida pärakuuime fikseerimise ajal tasapinnalisena. Pärakuuimega rümpa võib säilitada Davidsoni või muus sobivas fiksaatoris kuni analüüsimiseni. Loendada tuleb uime kiirelüli tagumiselt servalt välja ulatuvate papillaarjätketega kiirelülide arv (vt joonis 1).

Joonis 1.

Pärakuuime papillaarjätked

9. liide

MEOGRT ÜKSIKASJALIK AJAKAVA

1.–3. katsenädal (põlvkond F0)

Valikukriteeriumidele vastavad (vt punktid 16–20) põlvkonna F0 kudevad kalad kaasatakse katsesse kolmeks nädalaks, et arenevad sugurakud ja sugunäärmekoed saaksid uuritava kemikaaliga kokku puutuda. Igas paralleelnõus on üks sigiv kalapaar (XX-emase ja XY-isase sigimispaar). Paari koetud marjaterasid kogutakse, loendatakse ja nende viljakust hinnatakse 21 järjestikusel päeval alates 1. katsepäevast.

4. katsenädal (põlvkonnad F0 ja F1)

Eelistatavalt tuleks katse järgmisel etapil kasutatavad viljastatud ja eluvõimelised marjaterad (embrüod) koguda ühel päeval, kuid embrüote ebapiisava arvu korral võib neid siiski koguda ka kahe päeva vältel. Kahel päeval kogumise korral pannakse kõik esimesel päeval kogutud embrüod kontsentratsioonirühmade lõikes kokku teisel päeval kogutud embrüotega. Kõik kontsentratsioonirühma jaoks moodustatud koondkogumis olevad embrüod jaotatakse juhuslikult selle rühma paralleelsete inkubaatorite vahel nii, et igas inkubaatoris on 20 embrüot. Viljastatud marjaterade (embrüote) suremust kontrollitakse ja registreeritakse iga päev. Surnud marjaterad eemaldatakse inkubaatoritest (viljastatud marjaterade surma näitab eelkõige varastes etappides märkimisväärne läbipaistvuse kadu ja värvuse muutus, mis on põhjustatud valkude koaguleerumisest ja/või sadenemisest ja mille tulemusena marjaterad muutuvad valgeks ja läbipaistmatuks; OECD 2010).

Märkus. Kui marjaterasid on vaja koguda kahel päeval ainult ühe kontsentratsioonirühma puhul, tuleb seda kogumismenetlust kasutada kõikide kontsentratsioonirühmade (ja kontrollrühmade) puhul. Kui ka pärast teist kogumispäeva ei ole mõnes kontsentratsioonirühmas piisavalt embrüoid, et panna igasse inkubaatorisse 20 embrüot, siis tuleb selles konkreetses kontsentratsioonirühmas vaadeldavate embrüote arvu vähendada 15 embrüoni inkubaatori kohta. Kui embrüoid ei jätku ka juhul, kui igas inkubaatoris oleks 15 embrüot, tuleb vähendada paralleelsete inkubaatorite arvu nii, et igasse inkubaatorisse saaks panna 15 embrüot. Lisaks võib põlvkonnas F0 kasutada iga kontsentratsiooni- ja kontrollrühma kohta rohkem sigimispaare, et suurendada saadavate marjaterade arvu ja saavutada soovitatav tase 20 marjatera paralleelnõu kohta.

Põlvkonna F0 sigimispaarid surmatakse 24. katsepäeval humaanselt ning nende kehamass ja pikkus registreeritakse. Vajaduse korral võib põlvkonna F0 sigimispaare veel 1–2 päeva elus hoida, et põlvkonna F1 sigitamist korrata.

5.–6. katsenädal (põlvkond F1)

Üks kuni kaks päeva enne eeldatavat koorumise algust peatatakse inkubeeritavate marjaterade loksutamine või vähendatakse seda, et koorumist kiirendada. Igal päeval embrüost koorunud vastsed kogutakse kontsentratsioonirühmade lõikes koondkogumitesse ning jaotatakse süstemaatiliselt vastava kontsentratsioonirühma paralleelsete vastsenõude vahel nii, et ühes nõus on kuni 12 vastkoorunud isendit. Selleks valitakse vastkoorunud isendeid juhuslikkuse põhimõttel ning lisatakse need üksteise järel vastava kontsentratsioonirühma juhuslikult valitud paralleelnõudesse, kuni igas paralleelnõus on 12 vastkoorunud isendit. Kui vastkoorunud isenditest ei jätku kõikide paralleelnõude täitmiseks, tuleb tagada, et etapi F1 alguses oleks võimalikult paljudes paralleelnõudes 12 vastkoorunud isendit.

Marjaterad, mis ei ole koorunud kontrollrühma koorumispäeva mediaaniga võrreldes kaks korda pikema aja jooksul, tunnistatakse eluvõimetuks ja jäetakse kõrvale. Vastkoorunud isendite arv registreeritakse ja iga paralleelnõu kohta arvutatakse koorumise edukuse määr (kooruvus).

7.–11. katsenädal (põlvkond F1)

Kalavastsete ellujäämust kontrollitakse ja registreeritakse iga päev kõikide paralleelnõude puhul. 43. katsepäeval registreeritakse igas paralleelnõus ellu jäänud kalade arv ja algselt paralleelnõusse asetatud vastkoorunud isendite arv (soovitatavalt 12). Selle põhjal saab arvutada protsentuaalse ellujäämuse koorumisest kuni noorkala arengujärguni.

12. katsenädal (põlvkond F1)

Katsepäevadel 78–85 võetakse iga kala sabauimest väike koeproov (uimetükk), mille põhjal tehakse kindlaks kõikide isendite genotüübiline sugu. Selle teabe põhjal moodustatakse sigimispaarid.

Kolme päeva jooksul pärast iga kala genotüübilise soo kindlakstegemist moodustatakse juhuslikkuse põhimõttel 12 sigimispaari iga kontsentratsioonirühma ja 24 sigimispaari kontrollrühma kohta. Igast paralleelnõust valitakse juhuslikult kaks XX- ja XY-kala, need rühmitatakse soo järgi koondkogumiteks ja sigimispaarid (XX-XY paarid) moodustatakse kummastki koondkogumist juhuslikult valitud kaladest Moodustatakse 12 paralleelset paari kemikaali iga kontsentratsioonirühma ja 24 paralleelset paari kontrollrühma kohta ning igasse paralleelnõusse pannakse üks sigimispaar. Kui mõni paralleelnõu ei sisalda koondkogumisse lisamiseks kahte XX- või XY-kala, tuleb sobiva soolise genotüübiga kalad võtta sama kontsentratsioonirühma teistest paralleelnõudest.

Ülejäänud kalad (kuni kaheksa kala paralleelnõu kohta) surmatakse humaanselt ja neil mõõdetakse noorkala arengujärgu lõppnäitajad. Kõikide noorkalaproovide dmy andmed (XX või XY) säilitatakse, et tagada võimalus seostada kõiki lõppnäitajate andmeid iga isendi geneetilise sooga.

13.–14. katsenädal (põlvkond F1)

Kokkupuude kemikaaliga jätkub kogu selle aja vältel, mil sigimispaarid arenevad noorkalast täiskasvanuks. 98. katsepäeval (st üks päev enne marjaterade kogumise algust) eemaldatakse akvaariumidest ja emaste kalade küljest kõik seal olevad marjaterad.

15.–17. katsenädal (põlvkond F1)

Koetud marjaterasid kogutakse igast paralleelnõust 21 järjestikuse päeva jooksul ning hinnatakse nende sigivust ja viljakust.

18. katsenädal (4. nädala tegevuste kordus) (põlvkonnad F1 ja F2)

120. katsepäeva hommikul kogutakse igast paralleelnõust marjaterad. Kogutud marjaterasid hinnatakse, viljastatud marjaterad rühmitatakse (pärast kuduniitide eemaldamist) kontsentratsioonirühmade lõikes koondkogumiteks ning jaotatakse sealt süstemaatiliselt inkubatsioonikambritesse nii, et igas inkubaatoris on 20 viljastatud marjatera. Inkubaatorid võib asetada iga kontsentratsioonirühma jaoks ette valmistatud eraldi inkubatsiooninõudesse või paralleelnõudesse, kuhu hiljem jäävad ka koorunud vastsed. Eelistatavalt tuleks embrüod koguda ühel päeval, aga kui nende arv ei ole piisav, võib embrüoid koguda ka kahe päeva vältel. Kahel päeval kogumise korral pannakse kõik esimesel päeval kogutud embrüod kontsentratsioonirühmade lõikes kokku teisel päeval kogutud embrüotega. Kõik kontsentratsioonirühma jaoks moodustatud koondkogumis olevad embrüod jaotatakse juhuslikult selle rühma paralleelsete inkubaatorite vahel nii, et igas inkubaatoris on 20 embrüot. Märkus. Kui marjaterasid on vaja koguda kahel päeval ainult ühe kontsentratsioonirühma puhul, tuleb seda kogumismenetlust kasutada kõikide kontsentratsioonirühmade (ja kontrollrühmade) puhul. Kui ka pärast teist kogumispäeva ei ole mõnes kontsentratsioonirühmas piisavalt embrüoid, et panna igasse inkubaatorisse 20 embrüot, siis tuleb selles konkreetses kontsentratsioonirühmas vaadeldavate embrüote arvu vähendada 15 embrüoni inkubaatori kohta. Kui embrüoid ei jätku ka juhul, kui igas inkubaatoris oleks 15 embrüot, tuleb vähendada paralleelsete inkubaatorite arvu nii, et igasse inkubaatorisse saaks panna 15 embrüot.

121. katsepäeval (või 122. katsepäeval, kui on vaja veenduda, et põlvkonna F2 sigitamine õnnestus) surmatakse põlvkonna F1 sigimispaarid humaanselt ja neil mõõdetakse täiskasvanud kalade arengujärgu lõppnäitajad. Vajaduse korral võib põlvkonna F1 sigimispaare veel 1–2 päeva elus hoida, et põlvkonna F2 sigitamist korrata.

19.–20. katsenädal (põlvkond F2)

Üks kuni kaks päeva enne eeldatavat koorumise algust peatatakse inkubeeritavate marjaterade loksutamine või vähendatakse seda, et koorumist kiirendada. Kui katse lõpeb põlvkonna F2 koorumisega, siis iga päev koorunud vastsed loendatakse ja seejärel kõrvaldatakse. (Embrüod, mis ei ole ka pikendatud inkubatsiooniaja – st kontrollrühma koorumispäeva mediaaniga võrreldes kaks korda pikema aja – järel koorunud, tunnistatakse eluvõimetuks.)

10. liide

STATISTILINE ANALÜÜS

MEOGRTga kogutavad bioloogiliste andmete kategooriad ei ole sellele katsele eriomased ja, kui patoloogiate andmed välja arvata, siis on sarnaste andmete nõuetekohaseks analüüsimiseks välja töötatud palju sobivaid statistilisi meetodeid, mille valik sõltub andmete omadustest: normaaljaotus, dispersiooni homogeensus, uuringuplaani sobivus hüpoteesi kontrollimiseks või regressioonanalüüsiks, parameetrilisteks või mitteparameetrilisteks testideks jne. Üldpõhimõttena on soovitatavad statistilised analüüsimeetodid valitud lähtuvalt ökotoksilisuse andmeid käsitlevast OECD juhendist (OECD 2006) ning joonisel 2 on esitatud MEOGRT andmete jaoks analüüsimeetodi valimise vooskeem.

Võib eeldada, et kõige sagedamini esinevad andmestikes monotoonsed sõltuvused. Lisaks tuleks kaaluda, kas kasutada ühepoolset või kahepoolset statistilist testi. Üldiselt soovitatakse kasutada ühepoolseid teste, välja arvatud juhul, kui need on mingil bioloogilisel põhjusel sobimatud. Käesolevas jaotises soovitatakse küll teatavaid statistilisi teste, aga kui konkreetselt MEOGRTga kogutavate andmete jaoks töötatakse välja sobivamad ja/või võimsamad statistilised meetodid, tuleks nendest saadavate eeliste tõttu kasutada vastavaid uusi statistilisi teste.

MEOGRTga kogutavaid andmeid tuleks analüüsida iga genotüübilise soo lõikes eraldi. Pööratud sooga kalade (XX-isaste või XY-emaste) kohta kogutud andmete analüüsimiseks on kaks võimalikku strateegiat. 1) Jätta pööratud sooga kalade andmed (välja arvatud pööratud sooga kalade osakaal igas paralleelproovis) kogu katse ulatuses analüüsist välja. 2) Jätta kõikide pööratud sooga kalade kohta kogutud andmed andmestikku sisse ja teha analüüs genotüübi põhjal.

Histopatoloogilised andmed

Histopatoloogilised andmed esitatakse raskusastme kujul, mida analüüsitakse hiljuti välja töötatud uue statistilise meetodiga: Rao-Scotti kohandusega Cochrane’i-Armitage lõiktest (RSCABS) (Green et al., 2014). Rao-Scotti kohandus säilitab teabe katseparalleelide kohta; lõiktesti menetlusega on arvesse võetud bioloogilist eeldust, et kemikaali kontsentratsioonide suurenedes kasvab ka raskusaste. RSCABSi tulemused näitavad iga diagnoosi puhul, millises kontsentratsioonirühmas on patoloogiate osakaal suurem kui kontrollrühmas ja milline on nende raskusaste.

Sigivuse andmed

Andmete monotoonse kontsentratsioonist sõltuvuse korral kasutatakse sigivuse analüüsides sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere’i-Terpstra või Williamsi testi. Sammuviisilise elimineerimise testis tehakse kõik võrdlused olulisuse nivool 0,05 ja puuduvad võrdluste arvust sõltuvad kohandused. Eeldatakse, et andmete puhul esineb monotoonne kontsentratsioonist sõltuvus, aga seda saab ka kontrollida andmete visuaalse vaatlusega või pärast andmete järkudeks teisendamist kontsentratsioonirühmade keskväärtuste lineaar- ja ruutkontrastide konstrueerimise teel. Kui ei esine olukorda, kus ruutkontrast on oluline ja lineaarkontrast ei ole oluline, siis kasutatakse trenditesti. Muul juhul kasutatakse kemikaali toime kindlakstegemiseks Dunnetti testi – tingimusel, et andmed on normaaljaotuse ja homogeense dispersiooniga. Kui nimetatud tingimused ei ole täidetud, kasutatakse Dunni testi koos Bonferroni-Holmi kohandusega. Kõik osutatud testid tehakse F-testist või Kruskali-Wallise testist sõltumatult. Täpsemad üksikasjad on esitatud dokumendis OECD 2006.

Piisava statistilise põhjendatuse korral võib kasutada ka muid meetodeid, näiteks marjaterade arvu puhul üldistatud lineaarset mudelit koos vigade Poissoni jaotusega (Cameron ja Trividi, 2013). Muu meetodi kasutamise korral on soovitatav nõu pidada statistikutega.

Igapäevane marjaterade loendus ühes põlvkonnas

Kasutatakse dispersioonanalüüsi (ANOVA) mudelit, kus tunnus Y = Aeg*Aeg+Kontsentratsioon + *Kontsentratsioon + Aeg*Kontsentratsioon + *Aeg*Kontsentratsioon ja juhuslik mõju avaldub tegurites Paralleelproov(Põlvkond*Kontsentratsioon) ning Aeg*Paralleelproov(Kontsentratsioon), mis võimaldab põlvkondades mõlemat liiki ebavõrdseid dispersioonikomponente. Tegur Aeg osutab siin marjaterade loendamise sagedusele (nt iga päev või kord nädalas). See on kordusmõõtmiste analüüs, mille puhul sama paralleelproovi kohta tehtud tähelepanekute korrelatsioonid on seotud andmete kordusmõõtmistega.

Kontsentratsiooni peamist mõju kontrollitakse Dunnetti (või Dunnetti-Hsu) testiga, mis on kohandatav vastavalt võrdluste arvule. Lisaks on vaja kohandusi põlvkonna ja aja mõju arvessevõtmiseks, sest nende kahe teguri puhul puudub kontrolltase ning iga tasemete paar võib osutuda huvi pakkuvaks võrdluseks. Kui olulisusnivooga 0,05 F-test näitab nimetatud kahe mõjuteguri puhul olulist peamist mõju, siis saab vastava teguri paare tasemete kaupa võrrelda olulisusnivooga 0,05 ilma täiendavaid kohandusi tegemata.

Mudel hõlmab kahe ja kolme teguriga vastasmõjusid, mistõttu näiteks aja peamine mõju ei pruugi olla statistiliselt oluline, kuigi aeg avaldab olulist mõju tulemustele. Seega kui mõni kahe või kolme teguriga (millest üks on aeg) vastasmõju on nivool 0,05 oluline, siis võib aja tasemete võrdlused olulisusnivool 0,05 sobivaks tunnistada ilma täiendavate kohandusteta.

Järgmiseks uuritakse F-testidega kontsentratsiooni olulisust ajas; need esitatakse dispersioonanalüüsi tabelis nn lõikudena. Kui näiteks põlvkonnas F1 aja 12 jooksul kasutatud kontsentratsiooni lõik on nivool 0,05 oluline, siis võib selle kontsentratsioonirühma võrdlused põlvkonnas F1 ajaga 12 olulisusnivool 0,05 sobivaks tunnistada ilma täiendavate kohandusteta. Sama kehtib nende testide puhul, millega uuritakse aja olulisust põlvkonnas F1 ja kontsentratsioonis ning põlvkonna olulisust ajas ja kontsentratsioonis.

Võrdluste suhtes, mis ei kuulu ühtegi eespool nimetatud kategooriasse, tuleks kasutada Bonferroni-Holmi meetodit p-väärtuste kohandamiseks. Lisateavet taoliste mudelite analüüsimise kohta võib leida allikatest Hocking (1985) ning Hochberg ja Tamhane (1987).

Teine võimalus on registreerida toorandmed ning esitada need uuringuraportis iga päeva kohta kui sigivusnäitaja (marjaterade arv) paralleelproovi kohta. Seejärel tuleks arvutada paralleelproovi toorandmete keskväärtus ja teha sellega ruutjuurteisendus. Paralleelproovide teisendatud keskväärtustega tuleks teha esmalt ühefaktoriline dispersioonanalüüs ning seejärel moodustada Dunnetti kontrastid. Kasulik võib olla ka see, kui vaadelda iga kontsentratsioonirühma ja/või paralleelproovi sigivuse andmeid visuaalselt dispersioonidiagrammil, mis näitab andmete muutumist ajas. See võimaldab esitada mitteformaalseid hinnanguid ajas avalduva võimaliku toime kohta.

Kõik ülejäänud bioloogilised andmed

Statistiliste analüüside aluseks on eeldus, et õigesti valitud dooside korral on andmed monotoonsed. Seega eeldatakse, et andmed on monotoonsed ning nende monotoonsust hinnatakse formaalselt lineaar- ja ruutkontrastidega. Kui andmed on monotoonsed, soovitatakse kasutada paralleelproovide mediaanväärtuste suhtes Jonckheere’i-Terpstra trenditesti (vastavalt dokumendile OECD 2006). Kui ruutkontrast on oluline ja lineaarkontrast ei ole, siis tunnistatakse andmed mittemonotoonseks.

Kui andmed on mittemonotoonsed ja eriti kui see on tingitud nõrgemast reaktsioonist ühes või kahes kõige kõrgemas kontsentratsioonirühmas, siis tuleks kaaluda võimalust jätta need kontsentratsioonirühmad analüüsiandmestikust välja. Kõnealune otsus tuleb teha pädeva erialase hinnangu põhjal, võttes arvesse kõiki olemasolevaid andmeid, eriti andmeid, mis osutavad asjaomastel kontsentratsioonitasemetel esinevale selgele mürgisusele.

Kehamassi ja pikkuse puhul teisendusi ei soovitata, kuigi need võivad olla mõnikord vajalikud. Vitellogeniini käsitlevate andmete puhul soovitatakse kasutada logaritmteisendust; teiseseid sootunnuseid (pärakuuime papillaarjätked) käsitlevate andmete puhul soovitatakse kasutada ruutjuurteisendust; kooruvust, elulemust, soolist jaotumist ja viljastatud marjaterade osakaalu käsitlevate andmete puhul soovitatakse kasutada arkussiinus-ruutjuurteisendust. Koorumiseni ja esimese kudemiseni kulunud aega tuleks käsitada kui sündmuse toimumiseni kulunud aja andmeid ning andmeid kindla aja jooksul koorumata üksikembrüote või kuduta paralleelproovide kohta kui paremalt tsenseeritud andmeid. Koorumiseni kulunud aeg tuleks arvutada iga paralleelproovi koorumispäeva mediaani põhjal. Nimetatud lõppnäitajaid tuleks analüüsida segamõjudega proportsionaalseid ohte käsitleva Coxi mudeli abil.

Täiskasvanud kalade proovide bioloogilised andmed sisaldavad ühte mõõteväärtust paralleelproovi kohta, st igas paralleelnõus on üks XX-kala ja üks XY-kala. Seetõttu soovitatakse kasutada paralleelproovide keskväärtuste suhtes ühefaktorilist dispersioonanalüüsi. Kui dispersioonanalüüsi eeldused on täidetud (normaaljaotus ja dispersiooni homogeensus, mida hinnatakse dispersioonanalüüsi jääkide põhjal vastavalt Shapiro-Wilksi ja Levene’i testiga), tuleks kontrollrühmast erinevad kontsentratsioonirühmad kindlaks teha Dunnetti kontrastide abil. Ent kui dispersioonanalüüsi eeldused ei ole täidetud, tuleks kontrollrühmast erinevate kontsentratsioonirühmade kindlakstegemiseks kasutada Dunni testi. Sarnast menetlust soovitatakse kasutada protsentuaalsete andmete (viljakus, kooruvus ja ellujäämus) puhul.

Noorkalade proovidest kogutud andmetel on üks kuni kaheksa mõõteväärtust paralleelproovi kohta, st iga genotüübilise soo puhul võib paralleelproovi keskväärtuse arvutamisel aluseks võetud isendite arv olla erinev. Seetõttu soovitatakse kasutada esmalt segamõjuga dispersioonanalüüsi mudelit ja seejärel Dunnetti kontraste – tingimusel, et normaaljaotuse ja dispersiooni homogeensuse tingimused on täidetud (segamõjuga dispersioonanalüüsi jääkide põhjal). Kui need tingimused ei ole täidetud, tuleks kontrollrühmast erinevate kontsentratsioonirühmade kindlakstegemiseks kasutada Dunni testi.

Joonis 2.

MEOGRTga kogutud andmete analüüsimiseks soovitatavate statistiliste meetodite vooskeem

KIRJANDUS

(1)	OECD (2014). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. (Väljaande lisad on avaldatud eraldi dokumendina.) OECD Publishing, Pariis.

(2)	Cameron, A. C., ja Trivedi, P. K. (2013). Regression Analysis of Count Data. 2. väljaanne. Econometric Society Monograph No 53. Cambridge University Press.

(3)	Hocking, R. R. (1985). The Analysis of Linear Models. Brooks/Cole, Monterey, CA.

(4)	Hochberg, Y., ja Tamhane, A. C. (1987). Multiple Comparison Procedures. John Wiley and Sons, New York.

C.53 KULLESTE KASVU JA ARENGU KATSE (LAGDA)

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 241 (2015). Vajadus töötada välja ja valideerida katse, millega saab välja selgitada ja kirjeldada mürgiste kemikaalidega kokkupuute kahjulikke tagajärgi kahepaiksetele, tuleneb kartusest, et kemikaalid võivad juba keskkonnas esineva kontsentratsiooni juures avaldada kahjulikku mõju nii inimesele kui ka elusloodusele. Kulleste kasvu ja arengu katset (LAGDA) käsitlevas OECD katsejuhendis kirjeldatakse kahepaiksete liigiga tehtavat mürgisuse katset, mille käigus vaadeldakse kasvu ja arengut viljastamisest kuni varase noorlooma arengujärguni. Katsega (mis tavaliselt kestab 16 nädalat) hinnatakse kulleste varast arengut, moonet, ellujäämust, kasvu ja osalist suguküpsemist. Samuti võimaldab see mõõta mitmeid muid näitajaid, mille abil saab diagnostiliselt hinnata võimalikke endokriinfunktsiooni kahjustavaid kemikaale või muid arengu- ja reproduktiivtoksilisi aineid. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud meetod põhineb kannuskonnaga (Xenopus laevis) tehtud valideerimisuuringul, mille viis läbi Ameerika Ühendriikide Keskkonnakaitseamet ja mida toetavaid uuringuid on tehtud Jaapanis (1). Kuigi kasvu ja arengu jälgimise katse metoodika jaoks, mille oluline komponent on geneetilise soo kindlakstegemise võimalus, võivad sobida ka muud kahepaikseliigid, on käesolevas katsemeetodis kirjeldatud konkreetsed meetodid ja vaadeldavad näitajad kohaldatavad üksnes Xenopus laevis’e suhtes.

LAGDA on kahepaiksega tehtav kõrgema taseme katse, mille eesmärk on koguda kahjuliku toime kohta kontsentratsiooni-toime seost kirjeldavat põhjalikumat teavet, mida saaks kasutada ohtude väljaselgitamiseks ja kirjeldamiseks ning ökoloogilise riski hindamiseks. Katse vastab endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku 4. tasemele, kus in vivo katsetega kogutakse andmeid ka kahjuliku mõju kohta endokriinfunktsiooniga seotud näitajatele (2). Katse üldpõhimõtte kohaselt viiakse X. laevis’e embrüod, mis on Nieuwkoopi ja Faberi (NF) järgi 8.–10. staadiumis (3), kokkupuutesse uuritava kemikaali vähemalt nelja eri kontsentratsiooniga (mis üldjuhul erinevad üksteisest vähemalt poole logaritmintervalli võrra) ja kontrollaine(te)ga. Kokkupuudet jätkatakse 10. nädalani pärast kontrollrühmas NFi järgi 62. staadiumi saabumise mediaanaega ning 62. staadiumis (≤ 45 päeva pärast viljastamist; tavaliselt 45. viljastamisjärgse päeva paiku) võetakse üks osaline vaheproov. Iga uuritava kontsentratsiooni juures tehakse neli paralleelproovi ja kontrollainega kaheksa paralleelproovi. Kokkupuute jooksul hinnatakse (osalise vaheprooviga ja katse lõpus võetava prooviga) nii üldise mürgisusega seotud näitajaid (suremus, ebatavaline käitumine ning kasvu ja kehamassi juurdekasv) kui ka näitajaid, millega kirjeldatakse konkreetselt endokriinsüsteemi kahjustavaid toimemehhanisme, mis mõjutavad östrogeenide, androgeenide või kilpnäärme vahendusel toimivaid füsioloogilisi protsesse. Meetodis keskendutakse eelkõige võimalikule populatsiooni mõjutavale toimele (kahjulik mõju ellujäämusele, arengule, kasvule ja sigimisvõime arengule), et arvutada täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) või toimet avaldav kontsentratsioon, mis põhjustab mõõdetava näitaja muutumise × protsendi võrra (ECx). Samas tuleb arvestada, et ECx-il põhinevad meetodid ei sobi sageli sellist tüüpi suurte uuringute jaoks, kus uuritavate kontsentratsioonide arvu suurendamine ECx-i kindlakstegemise eesmärgil võib olla ebaotstarbekas. Samuti tuleb tähele panna, et meetod ei hõlma sigimisetappi ennast. Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

Kuna uuritud kemikaalide arv on väike ja kõnealuse üsna keeruka katse valideerimises osales vähe laboreid, ei ole laboritevahelist korratavust seni katseandmetega dokumenteeritud ning võib eeldada, et OECD katsejuhend nr 241 vaadatakse läbi ja seda muudetakse saadud kogemuste valguses pärast seda, kui on tehtud piisavalt uuringuid kõnealuse uue uuringukava toimivuse kinnitamiseks. LAGDA on oluline katse, mis aitab hinnata kahepaiksete populatsiooni vähenemise võimalikke mõjutegureid, kuna selles hinnatakse kemikaalidega kokkupuute mõju tundlikus kullesestaadiumis, kus kemikaalide kahjulik mõju ellujäämusele ja arengule, sealhulgas suguorganite normaalsele arengule, võib üle kanduda populatsioonile.

Katse on üles ehitatud nii, et sellega saaks tuvastada nii endokriinfunktsiooni kui ka muude mehhanismide kaudu tekkivat lõppmõju, ning osa selle diagnostilisi näitajaid on spetsiifilised põhiliste endokriinsüsteemi toimemehhanismide suhtes. Tuleb märkida, et enne LAGDA väljatöötamist puudus kirjeldatud ülesannet täitev valideeritud katsemeetod kahepaiksete jaoks.

Enne katse alustamist on oluline koguda andmeid uuritava kemikaali füüsikalis-keemiliste omaduste kohta, eelkõige selleks, et oleks võimalik valmistada püsivaid kemikaalilahuseid. Samuti tuleb kasutada piisavalt tundlikku analüüsimeetodit uuritava kemikaali kontsentratsioonide kontrollimiseks. Ligikaudu 16 nädalat kestva katse jaoks läheb vaja kokku 480 looma ehk X. laevis’e embrüot (lahusti kontrollproovi kasutamisel 640 embrüot), et tagada populatsiooniga seotud näitajate (nt kasv, areng ja suguküpsus) hindamiseks piisav statistiline võimsus.

Enne katsemeetodi kasutamist segu analüüsimiseks regulatiivsel eesmärgil tuleks kaaluda, kas meetodiga saadakse taotletava eesmärgi jaoks vastuvõetavad tulemused. Peale selle ei saa käesoleva katsemeetodiga hinnata otseselt sigivust ning järelikult see ei pruugi olla kasutatav kõrgemal tasemel kui endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku 4. tase.

KATSEMEETODI TEADUSLIK ALUS

Suur osa meie praegustest teadmistest kahepaiksete bioloogia kohta on saadud tänu kannuskonna (Xenopus laevis) kasutamisele laboratoorse mudelliigina. Seda liiki on laboris lihtne kasvatada, sellel ovulatsiooni esilekutsumiseks sobib inimese kooriongonadotropiin (hCG) ning loomavarud on hõlpsasti kättesaadavad kaubanduslikel eesmärkidel kasvatajatelt.

Sarnaselt kõikide selgroogsetega reguleerib kahepaiksete sigimisfunktsiooni hüpotalamuse-ajuripatsi-sugunäärmete (HAS) telg (4). Östrogeenid ja androgeenid täidavad selles endokriinsüsteemis vahendaja rolli ning juhivad sooliselt dimorfsete kudede arengut ja füsioloogiat. Kahepaiksete elutsüklis on kolm selgesti eristatavat etappi, mille vältel kõnealune telg on eriti aktiivne: 1) sugunäärmete diferentseerumine kullese arengu käigus, 2) teiseste sootunnuste kujunemine ja sugunäärmete küpsemine noorlooma staadiumis ning 3) täiskasvanud loomade sigimine. Vastuvõtlikkus endokriinfunktsiooni häiretele, mida põhjustavad teatavad kemikaalid (nt östrogeenid ja androgeenid) ning mis võib lõpuks viia organismide sigimisvõime kadumiseni, on kõigis nimetatud arenguetappides tõenäoliselt suurem.

Sugunäärmete areng algab NFi järgi 43. staadiumis, mil tekib bipotentsiaalne genitaalkurd. Sugunäärmete diferentseerumine algab NFi järgi 52. staadiumis, mil sugurakkude eellasrakud liiguvad säsikoesse (isastel) või jäävad arenevate sugunäärmete koorepiirkonda (emastel) (3). Asjaolust, et kõnealune sugunäärmete soolise diferentseerumise protsess on Xenopus’e puhul keemiliselt mõjutatav, teatati esimest korda 1950ndatel aastatel (5, 6). Kui kullesed puutuvad sugunäärmete diferentseerumise perioodil kokku östradiooliga, toimub isastel soo arengu pöördumine ning neist saavad täiskasvanuna kõigi toimivate funktsioonidega emased (7, 8). Võimalik on ka soo arengufunktsionaalne pöördumine emasest isaseks, mida on esile kutsutud kullestesse munandikoe siirdamisega (9). Ent kui liigil Xenopus tropicalis kutsub kokkupuude aromataasi inhibiitoriga esile soo arengu funktsionaalse pöördumise (10), siis Xenopus laevis’e puhul ei ole katsed seda kinnitanud. Varasemates katsetes on mürgiste ainete mõju sugunäärmete diferentseerumisele hinnatud moondeetapil tehtavate sugunäärmekoe uuringutega ja soo arengu pöördumist oli võimalik kindlaks teha üksnes soolise jaotumise analüüsi abil. Kuni viimase ajani puudus võimalus Xenopus’e geneetilise soo kindlakstegemiseks. Ent hiljutine X. laevis’e sooga seotud markerite avastamine annab võimaluse teha kindlaks geneetilist sugu ja tuvastada vahetult loomad, kellel soo areng on pöördunud (11).

10.

Isastel noorloomadel jätkub areng vere testosteroonisisalduse kasvuga, millega kaasneb teiseste sootunnuste kujunemine ja munandite areng. Emastel loomadel toodavad munasarjad östradiooli ning selle tagajärjel ilmub nende plasmasse vitellogeniin (VTG), munasarjades tekivad vitellogeniini toimel ootsüüdid ja arenevad munajuhad (12). Munajuhad on emase teisesed sootunnused, mis aitavad sigimise käigus ootsüütidel küpseda. Munajuha läbivatele ootsüütidele tekib kallerkest ning need kogunevad emakasse ja on siis valmis viljastamiseks. Munajuhade arengut näivad reguleerivat östrogeenid, kuna nende kujunemine on X. laevis’e (13) ja X. tropicalis’e (12) puhul korrelatsioonis vere östradioolisisaldusega. Teatatud on munajuhade kujunemisest isastel, mida on põhjustanud kokkupuude polüklooritud bifenüüli ühenditega (14) ja 4-tert-oktüülfenooliga (15).

KATSE PÕHIMÕTE

11.

Katsekava kohaselt viiakse NFi järgi 8.–10. staadiumis olevad X. laevis’e embrüod vee kaudu kokkupuutesse uuritava kemikaaliga neljas eri kontsentratsioonis, samuti kontrollproovi(de)ga. Kokkupuudet jätkatakse 10. nädalani pärast kontrollrühmas NFi järgi 62. staadiumi saabumise mediaanaega ning 62. staadiumis võetakse üks vaheproov. Kui kemikaalid on väga hüdrofoobsed, võib olla võimalik neid manustada söödaga, kuid seda kokkupuute tekitamise viisi ei ole käesoleva katsemeetodi rakendamisel seni kuigi palju kasutatud. Iga uuritava kontsentratsiooniga tehakse neli paralleelkatset ja iga kontrollprooviga kaheksa paralleelkatset. Kokkupuute jooksul hinnatakse nii üldise mürgisusega seotud lõppnäitajaid (suremus, kõrvalekalded käitumises ning kasvu ja kehamassi juurdekasv) kui ka lõppnäitajaid (nt kilpnäärme histopatoloogia, sugunäärme ja -juhade histopatoloogia, väärarengud, plasma vitellgoeniinisisaldus (valikuline) ning genotüübiline/fenotüübiline sooline jaotumine), millega kirjeldatakse konkreetselt endokriinsüsteemi kahjustavaid toimemehhanisme, mis mõjutavad östrogeenide, androgeenide või kilpnäärme vahendusel toimivaid füsioloogilisi protsesse.

KATSE NÕUETEKOHASUSE KRITEERIUMID

12.

Kehtivad järgmised katse nõuetekohasuse kriteeriumid.

—	Lahustunud hapniku kontsentratsioon peaks kogu katse vältel olema ≥ 40 % küllastuskontsentratsioonist õhus.

—	Vee temperatuur peaks olema vahemikus 21 ± 1 °C ning temperatuuride erinevus paralleelproovide ja eri kontsentratsioonidega töödeldavate rühmade vahel ei tohiks ületada 1,0 °C.

—	Katselahuse pH tuleks hoida vahemikus 6,5–8,5 ning paralleelproovide ja eri kontsentratsioonidega töödeldavate rühmade vaheline erinevus ei tohiks ületada 0,5.

—	Tuleks esitada tõendid selle kohta, et uuritava kemikaali kontsentratsiooni lahuses on suudetud rahuldavalt hoida vahemikus ± 20 % mõõtmistulemuste keskväärtusest.

—	Kokkupuuteperioodil esinenud suremus peaks olema kõikides kontrollrühmade paralleelproovides ≤ 20 %.

—	Uuringu alustamiseks valitud kudu eluvõimelisus peaks olema ≥ 70 %.

—	Kontrollrühmades NFi järgi 62. staadiumisse jõudmiseks kuluv mediaanaeg peaks olema ≤ 45 päeva.

—	Katseorganismide keskmine mass NFi järgi 62. staadiumisse jõudmisel ja katse lõpetamisel peaks olema kontrollrühmades ja lahusti kontrollrühmades (kui neid kasutatakse) vastavalt 1,0 ± 0,2 g ja 11,5 ± 3 g.

13.

Kuigi see ei ole nõuetekohasuse kriteerium, soovitatakse analüüsil kasutada vähemalt kolme töötlemiskontsentratsiooni kolme rikkumata paralleelprooviga. Töödeldud rühma näitajaid rikkuvaks liigseks suremuseks peetakse kahes või enamas paralleelproovis esinevat rohkem kui nelja surmajuhtu (> 20 %), mis ei saa olla tingitud tehnilisest veast. Analüüsiks peaks olema võimalik kasutada vähemalt kolme töötlemiskontsentratsiooni, mille puhul ei ilmne selget mürgisust. Selge mürgisuse tunnused on muu hulgas katseorganismi hõljumine pinnal, lebamine nõu põhjas, ümberpööratud asendis või ebakorrapärane ujumine, pinnale mittetõusmine, ärritajatele mittereageerimine, morfoloogilised kõrvalekalded (nt jäsemedeformatsioonid), veritsevad haavandid ja kõhuturse.

14.

MEETODITE KIRJELDUS

Seadmed

15.

Tavapärased laboriseadmed, eeskätt järgmised seadmed:

a)	temperatuuri reguleerimise seade (nt kütteseadmed või jahutid, mis on reguleeritavad temperatuurile 21 ± 1 °C);

b)	termomeeter;

c)	stereomikroskoop ja lahkamiseks vajalikud vahendid;

d)	mikroskoobiga ühendatav digifotoaparaat vähemalt 4-megapikslise lahutusvõimega (vajadusel);

e)	analüütiline kaal, millega on võimalik kaaluda 0,001 mg või 1 μg täpsusega;

f)	lahustunud hapniku mõõtur ja pH-meeter;

g)	valgustustiheduse mõõtur, mis näitab tulemust luksides.

Vesi

Päritolu ja kvaliteet

16.

Kasutada võib kohapeal kättesaadavat lahjendusvett (nt allikavesi või aktiivsöega filtreeritud kraanivesi), mis võimaldab X. laevis’e normaalset kasvu ja arengut, ning olemas peavad olema tõendid selles vees aset leidva normaalse kasvu kohta. Kuna kohaliku vee kvaliteet võib olenevalt asukohast oluliselt erineda, tuleb teha vee kvaliteedi analüüs, eriti juhul, kui puuduvad varasemad andmed selle vee kasutamise kohta kulleste kasvatamiseks. Raskemetallide (nt Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ja Ni), peamiste anioonide ja katioonide (nt Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO4 2-), pestitsiidide, orgaanilise süsiniku ja hõljuvaine sisaldus tuleks kindlaks teha enne katse algust ja/või kui lahjendusvesi on teadaolevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga, siis näiteks iga kuue kuu järel. Mõned nõuetekohase lahjendusvee keemilised omadused on esitatud 2. liites.

Jodiidi kontsentratsioon katses kasutatavas vees

17.

Selleks et kilpnääre saaks sünteesida normaalset moonet toetavaid kilpnäärmehormoone, peab kullestele olema vee ja sööda kaudu kättesaadav piisav kogus jodiidi. Praegu ei ole empiirilisi suuniseid söödas või vees sisalduva jodiidi minimaalse kontsentratsiooni kohta, mis on vajalik normaalse arengu tagamiseks. Siiski võib jodiidi kättesaadavus mõjutada kilpnäärmesüsteemi reageerimisvõimet kilpnääret aktiveerivatele ainetele ja on teada, et see mõjutab kilpnäärme baasaktiivsust, millele tasub tähelepanu pöörata kilpnäärme histopatoloogilise uuringu tulemuste tõlgendamisel. Varasemate uurimuste põhjal on katse edukalt läbi viidud, kui jodiidi (I-) kontsentratsioon lahjendusvees on olnud vahemikus 0,5–10 μg/l. Ideaaljuhul peaks jodiidi kontsentratsioon lahjendusvees olema kogu katse vältel 0,5 μg/l (seda lisatakse veele naatrium- või kaaliumsoola kujul). Kui katses kasutatav vesi saadakse deioniseeritud veest kunstlikult, tuleks sellele lisada jodiidi kontsentratsioonis vähemalt 0,5 μg/l. Katseprotokollis tuleks registreerida katses kasutatud vees (lahjendusvees) mõõdetud jodiidikontsentratsioonid ning joodi või muude soolade lisamine katsevette (kui neid kasutatakse). Lisaks veele võib mõõta ka sööda joodisisaldust.

Kokkupuutesüsteem

18.

Katse väljatöötamisel kasutati läbivooluga lahjendussüsteemi. Süsteemi kõik veega kokkupuutuvad osad peaksid olema klaasist, roostevabast terasest ja/või muust keemiliselt inertsest materjalist. Kokkupuutenõudeks peaksid olema klaasist või roostevabast terasest akvaariumid kasuliku ruumalaga vahemikus 4,0–10,0 l (veesügavusega vähemalt 10–15 cm). Süsteem peaks võimaldama kasutada kõiki kokkupuutekontsentratsioone, kontrollrühma ja lahusti kontrollrühma (kui see on vajalik) nii, et iga kontsentratsiooniga töödeldavas rühmas on neli ja igas kontrollrühmas kaheksa paralleelproovi. Vooluhulk igas nõus peaks olema konstantne, nii et püsiksid bioloogilised tingimused ja säiliks kokkupuude kemikaaliga. Soovitatavalt peaks vooluhulk olema piisav (nt vähemalt viis nõu täielikku veevahetust päevas), et vältida kemikaali kontsentratsiooni vähenemist katseorganismide ja akvaariumis leiduvate veemikroobide ainevahetuse, abiootilise lagunemise (hüdrolüüs, fotolüüs) või kadude (aurustumine, sorptsioon) tagajärjel. Katsenõud tuleks kokkupuutesüsteemis kohtadele asetada juhuslikkuse alusel, et vähendada asukoha, sealhulgas temperatuuri, valgustugevuse ja muude väikeste erinevuste võimalikku mõju. Lisateavet läbivooluga kokkupuutesüsteemide koostamise kohta võib leida kalade, suurselgrootute ja kahepaiksetega tehtavaid ägeda mürgisuse katseid käsitlevast ASTMi standardjuhendist (16).

Kemikaali lisamine: katselahuste valmistamine

19.

Katselahuste valmistamiseks kokkupuutesüsteemis tuleks uuritava kemikaali põhilahust manustada kokkupuutesüsteemi sobiva pumba või muu seadme abil. Põhilahuse vooluhulka tuleb enne kokkupuute alustamist kalibreerida vastavalt katselahustega tehtud analüüsi tulemustele, ning seda tuleb katse jooksul regulaarselt volumeetriliselt kontrollida. Katselahust tuleb igas nõus iga päev mahu järgi vähemalt viis korda uuendada.

20.

Meetod, mida kasutatakse uuritava kemikaali lisamiseks süsteemi, sõltub kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Seetõttu tuleks enne katset koguda asjaomase kemikaali kohta lähteandmeid, et kontrollida selle sobivust katses kasutamiseks. Uuritava kemikaali kohta on kasulik teada selle struktuurivalemit, molekulmassi, puhtust, püsivust vees ja valguse käes, pKa-d, Kow-d, lahustuvust vees (soovitavalt selles, mida kasutatakse katses) ja aururõhku, samuti kiire biolagundatavuse katse tulemusi (katsemeetod C.4 (17) või C.29 (18)). Lahustuvuse ja aururõhu põhjal võib arvutada Henry konstandi, mis võimaldab hinnata, kas katse ajal võib esineda uuritava kemikaali kadu aurustumise tõttu. Katset läbiviimist ilma eespool osutatud andmeteta tuleks hoolikalt kaaluda, sest uuringu kavandamisel tuleb arvesse võtta uuritava kemikaali füüsikalis-keemilisi omadusi ning ilma sellekohaste andmeteta võib katse tulemuste tõlgendamine osutuda raskeks või võimatuks. Uuritava kemikaali kvantitatiivseks määramiseks katselahustes peaks olemas olema usaldusväärne teadaoleva dokumenteeritud täpsuse ja avastamispiiriga analüüsimeetod. Vees lahustuvat uuritavat kemikaali võib lahustada lahjendusvee alikvootides kontsentratsioonis, mis võimaldab kemikaali lisada läbivoolusüsteemi kaudu vajalikus katsekontsentratsioonis. Toatemperatuuril vedelate või tahkete ja vees mõõdukalt lahustuvate kemikaalide puhul võib olla vajalik vedelikul või tahkel materjalil (nt klaasvill) põhinev küllastuskolonn (19). Väga hüdrofoobseid uuritavaid kemikaale võib olla võimalik manustada söödaga, kuid seda kokkupuuteviisi ei ole käesoleva katsemeetodi rakendamisel kuigi palju kasutatud.

21.

Valitud kontsentratsiooniga katselahused valmistatakse põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahuse valmistamiseks tuleks uuritavat kemikaali lahjendusvees lihtsalt mehaaniliselt segada või loksutada (kasutades nt segurit ja/või ultrahelitöötlust). Sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks võib kasutada küllastuskolonne/-süsteeme või passiivse doseerimise meetodeid (20). Eelistatavalt tuleks kasutada ilma kaaslahustita katsesüsteemi, kuid kuna uuritavatel kemikaalidel on erinevad füüsikalis-keemilised omadused, tuleb kokkupuutevee valmistamisel tõenäoliselt kasutada erinevaid lähenemisviise. Lahustite ja kandeainete kasutamist tuleks kõigi vahenditega vältida, sest 1) teatavad lahustid võivad olla ise mürgised ja/või põhjustada soovimatuid või ootamatuid reaktsioone; 2) kemikaalide uurimine nende vees lahustuvusest kõrgemal kontsentratsioonil (nagu lahusteid kasutades sageli juhtub) võib raskendada toimet avaldava kontsentratsiooni täpset määramist; 3) lahustite kasutamine pikaajalistes katsetes võib põhjustada mikroobide tegevusega seotud märkimisväärset biokile moodustumist, mis võib mõjutada keskkonnatingimusi ja kokkupuutekontsentratsioonide säilitamise võimet ning 4) kui puuduvad varasemad andmed, mille kohaselt lahusti ei moonuta uuringu tulemust, tuleb lahusti kasutamiseks teha lahusti kontrollprooviga töötlemine, mis aga mõjutab oluliselt loomade heaolu, kuna katse jaoks on sel juhul vaja rohkem loomi. Raskesti uuritava kemikaali korral võib lahustit kasutada viimase võimalusena ning arvesse tuleb võtta OECD juhendit raskesti uuritavate ainete ja segude veekeskkonnas avalduva mürgisuse uurimise kohta (21), et teha kindlaks parim meetod. Lahusti valiku määravad uuritava kemikaali keemilised omadused ja olemasolevad varasemad kontrollandmed lahusti kasutamise kohta. Varasemate andmete puudumise korral tuleks lahusti sobivus kindlaks teha enne lõplikku uuringut. Kui lahusti kasutamine on vältimatu ja ilmneb mikroobne aktiivsus (biokile teke), on soovitatav biokile tekkimine igas nõus kogu katse jooksul (vähemalt kord nädalas) registreerida/protokollida. Ideaaljuhul peaks lahusti kontsentratsioon olema lahusti kontrollrühmas ja kõigis töödeldavates rühmades pidevalt ühtlane. Kui lahusti kontsentratsioon ei ole pidevalt ühtlane, tuleks lahusti kontrollrühmas kasutada töödeldavates rühmades kasutatavat suurimat lahusti kontsentratsiooni. Lahusti kandeaine kasutamise korral ei tohiks lahusti suurim kontsentratsioon ületada 100 μl/l või 100 mg/l (21) ja soovitatav on hoida lahusti kontsentratsioon võimalikult väike (nt ≤ 20 μl/l), et vältida lahusti võimalikku mõju mõõdetavatele näitajatele (22).

Katseloomad

Katseliik

22.

Katseliik X. laevis on valitud järgmistel põhjustel: 1) seda kasvatatakse laborites kõikjal maailmas, 2) see on kaubanduses lihtsalt kättesaadav ning 3) sellel on võimalik kindlaks teha geneetilist sugu.

Täiskasvanute hooldus ja järglaste saamine

23.

X. laevis’e nõuetekohast hooldust ja järglaste saamist on kirjeldatud standardjuhendis (23). X. laevis’e kasvatuskohta ja hooldamist on kirjeldanud ka Read (24). Sigimise esilekutsumiseks süstitakse kolmele kuni viiele täiskasvanud emas- ja isaslooma paarile kõhuõõnde inimese kooriongonadotropiini (hCG). Emas- ja isasisenditele süstitakse näiteks vastavalt ligikaudu 800–1 000 RÜd ja 500–800 RÜd hCG-d, mis on lahustatud 0,6–0,9 % füsioloogiliseks lahuses (või Ringeri lahuses, mis on kahepaiksetel kasutatav isotooniline füsioloogiline lahus). Süstemaht peaks olema ligikaudu 10 μl kehamassi grammi kohta (~1 000 μl). Sigimispaare hoitakse seejärel suurtes nõudes, häirimata ja püsivates tingimustes, et esile kutsuda kopulatsiooni. Igas sigimisnõus peaks olema roostevabast terasvõrgust topeltpõhi (nt võrguavadega 1,25 cm), millest munad kukuvad läbi nõu põhjale. Hilisel pärastlõunal hCG-ga süstitud konnad koevad enamiku mune järgmise päeva hommikupoolikul. Kui on koetud ja viljastatud piisav kogusmune, eemaldatakse täiskasvanud isendid sigimisnõust. Seejärel kogutakse munad kokku ja nende kallerkest eemaldatakse L-tsüsteiini abil (23). Selleks valmistatakse 2 % L-tsüsteiini lahus, mille pH viiakse 1 M NaOH abil väärtuseni 8,1. Saadud lahus temperatuuriga 21 °C lisatakse ühe kudu mune sisaldavasse 500 ml koonilisse kolbi, mida keerutatakse ettevaatlikult üks kuni kaks minutit. Seejärel loputatakse mune põhjalikult 6–8 korda 21 °C kasvatamisveega. Seejärel pannakse munad kristallisaatorisse ning kontrollitakse, kas nende eluvõimelisus on > 70 % ning alanud rakkude jagunemisega embrüote seas ei esine olulisel määral kõrvalekaldeid.

KATSEPLAAN

Uuritavad kontsentratsioonid

24.

Soovitatav on kasutada vähemalt kemikaali nelja kontsentratsiooni ning lisaks sobivaid kontrollproove (sealhulgas lahusti kontrollproov, kui see on vajalik). Üldiselt soovitatakse, et kontsentratsioonide jada lahjendustegur ei oleks üle 3,2.

25.

Käesoleva katsemeetodi puhul tuleks suurima uuritava kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võimaluste piires kasutada kahepaiksetega tehtud varasemate uuringute tulemusi, et vältida selgelt mürgiseid kontsentratsioone. Kõnealuse kontsentratsiooni kindlaksmääramisel võib kasutada näiteks kvantitatiivse struktuur-aktiivsussõltuvusest, analoogmeetoditest ja varasematest kahepaiksetega tehtud uuringutest saadavat teavet. Sellised uuringud on näiteks kahepaiksete metamorfoosi katse (katsemeetod C.38 (25)), konnaembrüo teratogeneesi katse – Xenopus (23) ja/või näiteks katsemeetodite C.48, C.41 ja C.49 kohaselt kaladega tehtud katsed (26–28). Enne LAGDAt võib läbi viia vahemiku leidmise katse. Soovitatavalt tuleks vahemiku leidmiseks kasutatavat kokkupuudet alustada 24 tunni jooksul pärast viljastamist ning see peaks kestma 7–14 päeva (vajadusel kauem). Uuritavad kontsentratsioonid valitakse nii, et nende vahe ei oleks suurem kui 10-kordne. Vahemiku leidmise katse tulemuste põhjal tuleks valida suurim LAGDAs kasutatav uuritav kontsentratsioon. Pange tähele, et kui on vaja kasutada lahustit, siis saab lahusti sobivuse (st kas see võib mõjutada uuringu tulemusi) samuti välja selgitada vahemiku leidmise katse osana.

Töödeldavate rühmade ja kontrollrühmade paralleelnõud

26.

Iga uuritava kontsentratsiooni kohta tuleks kasutada vähemalt nelja ja kontrollproovidega (sh vajadusel lahusti kontrollprooviga) vähemalt kaheksat paralleelnõud (st vajaliku statistilise võimsuse tagamiseks peaks katsenõude arv tavalises ja vajadusel lahusti kontrollrühmas olema kaks korda suurem kui igas töödeldavas rühmas). Ühes paralleelnõus olevate loomade arv ei tohiks olla suurem kui 20. Väikseim lubatud loomade arv on 15 (viis NFi järgi 62. staadiumis võetava osaproovi jaoks ja kümme noorlooma staadiumini kasvatamiseks). Ent igasse paralleelnõusse lisatakse täiendavaid loomi, et võimaliku suremuse korral ei langeks loomade arv alla 15 looma alampiiri.

KATSE KÄIK

Katse ülevaade

27.

Katset alustatakse äsja koetud embrüotega (NFi järgi 8.–10 staadium) ja see kestab kuni noorlooma staadiumini. Iga päev kontrollitakse loomade suremust ja kõrvalekaldeid käitumises. NFi järgi 62. staadiumis võetakse kullestest osaproov (kuni 5 looma paralleelnõu kohta) ja mõõdetakse neil erinevaid näitajaid (tabel 1). Kui kõik loomad on jõudnud NFi järgi 66. staadiumisse, st läbinud moonde (või 70. päeval pärast katse alustamist, kui see saabub varem), vähendatakse juhuslikkuse alusel (aga ilma osaproovi võtmata) loomade arvu (10 loomani nõu kohta; vt punkt 43) ning alles jäänud loomadel jätkatakse kokkupuudet, kuni on möödunud veel 10 nädalat kontrollrühmas NFi järgi 62. staadiumi saabumise mediaanajast alates. Katse lõpus (noorloomade proov) tehakse täiendavad mõõtmised (tabel 1).

Kokkupuutetingimused

28.

Katse parameetrite täielik ülevaade on esitatud 3. liites. Kokkupuuteperioodil tuleks katselahustes iga päev mõõta lahustunud hapnikku, temperatuuri ja pH-d. Elektrijuhtivust, leelisust ja karedust mõõdetakse kord kuus. Katselahuse temperatuuride (päevasisene) erinevus paralleelnõude ja eri kontsentratsioonidega töödeldavate rühmade vahel ei tohiks ületada 1,0 °C. Samuti ei tohiks pH mõõtmisel paralleelnõude ja eri kontsentratsioonidega töödeldavate rühmade vaheline erinevus olla suurem kui 0,5.

29.

Kokkupuutenõudest võib iga päev sifooni abil eemaldada alles jäänud sööda ja jäätmed, vältides sealjuures hoolikalt nõude ristsaastumist. Loomadele tuleb tekitada võimalikult vähe stressi ja traumasid, eriti nende ümbertõstmise ja käsitsemise ning akvaariumi puhastamise ajal. Vältida tuleb stressi tekitavaid tingimusi/tegevusi (nt vali ja/või lakkamatu müra, akvaariumidele koputamine, nõu vibratsioon).

Uuritava kemikaaliga kokkupuute kestus

30.

Kokkupuutekatset alustatakse äsja koetud embrüotega (NFi järgi 8.–10. staadium) ning seda jätkatakse kümne nädala möödumiseni kontrollrühmas NFi järgi 62. staadiumi saabumise mediaanajast (≤ 45 päeva alates katse algusest). Üldjuhul kestab LAGDA 16 nädalat (maksimaalselt 17 nädalat).

Katse alustamine

31.

Katse alustamiseks tuleb valida sellised vanemloomad, kes on kontrollitult suutnud anda geneetiliselt kindlakstehtavast soost järglasi (5. liide). Kui täiskasvanud loomad on kudenud, kogutakse embrüod, millelt eemaldatakse tsüsteiiniga töötlemise teel kallerkest ja mille eluvõimelisust kontrollitakse (23). Tsüsteiiniga töötlemine võimaldab embrüoid kontrolli ajal käsitseda, ilma et need pindade külge kleepuksid. Kontroll tehakse stereomikroskoobi all ja eluvõimetud embrüod eemaldatakse sobiva suurusega pipeti abil. Eelistatult tuleks katses kasutada ühte kudu, milles eluvõimeliste embrüote osakaal on üle 70 %. NFi järgi 8.–10. staadiumis olevad embrüod jaotatakse juhuslikkuse alusel ettenähtud koguses lahjendusvett sisaldavate katsenõude vahel, kuni igas nõus on 20 embrüot. Embrüoid tuleks ümberpaigutamise ajal käsitseda ettevaatlikult, et vähendada sellest tingitud stressi ja vältida nende vigastamist. Kui viljastamisest on möödunud 96 tundi, peaksid kullesed olema veesambas ülespoole liikunud ja hakanud kinnituma nõu külgedele.

Söötmisrežiim

32.

Sööt ja söödaratsiooni muutmine X. laevis’e eri arengustaadiumides on LAGDA metoodika puhul väga oluline. Kulleste ülesöötmine suurendab tavaliselt skolioosi esinemissagedust ja raskusastet (8. liide) ning sellest tuleks hoiduda. Teisalt põhjustab kulleste alasöötmine kontrollrühmas väga suuri erinevusi loomade arengu kiiruses, mis võib vähendada katse tulemuste statistilist võimsust või selgust. Läbivoolusüsteemides kasutatavat X. laevis’e kulleste ja noorloomade sööta ja söötmisrežiimi käsitlevad soovitused on esitatud 4. liites, kuid tingimusel, et katseorganismide kasv ja areng on rahuldav, on lubatud ka muud variandid. Oluline on arvestada, et kui mõõdetakse endokriinsüsteemiga seotud näitajaid, ei tohi sööt sisaldada endokriinsüsteemi mõjutavaid ained, näiteks sojajahu.

Kulleste söötmine

33.

Kulleste puhul soovitatakse söödana kasutada kasvatamisvees (või lahjendusvees) kokku segatud forelli noorkalade sööda, Spirulina vetika tablettide ja kuldkala söödahelveste (nt helbed TetraFin®, Tetra, Saksamaa) segu. Kõnealust segu antakse kullestele tööpäevadel kolm korda päevas ja nädalavahetusel kord päevas. Lisaks söödetakse kulleseid alates kaheksandast viljastamisjärgsest päevast tööpäevadel kaks korda päevas ja nädalavahetustel üks kord päevas 24 tunni vanuste elusate soolavähivastsetega (Artemia spp.). Kulleste söödaratsioon peaks olema igas katsenõus ühesugune ning võimaldama katse tulemuste korratavuse ja ülekantavuse tagamiseks katseloomade piisavat kasvu ja arengut: 1) NFi järgi 62. staadiumisse jõudmise mediaanaeg kontrollrühmas peaks olema ≤ 45 päeva ja 2) kontrollrühma loomade keskmine kehamass 62. staadiumis peaks olema 1,0 ± 0,2 g.

Noorloomade söötmine

34.

Pärast moonet tuleks söötmisrežiimis kasutada kvaliteetset uppuvat konnasööta, nt Sinking Frog Food 3/32 (Xenopus Express, FL, Ameerika Ühendriigid) (4. liide). Kui noorkonnad on veel väikesed, jahvatatakse graanuleid põgusalt kohviveskis, blenderis või peenestatakse uhmris, et vähendada nende suurust. Kui noorloomad on piisavalt suured täismõõdus graanulite söömiseks, ei ole jahvatamine või peenestamine enam vajalik. Loomi tuleks sööta kord päevas. Noorloomade söötmine peaks võimaldama organismide piisavat kasvu ja arengut: soovitatavalt peaks noorloomade keskmine kehamass kontrollrühmas katse lõpetamise ajaks olema 11,5 ± 3 g.

Analüütiline keemia

35.

Enne katse alustamist tuleb hinnata uuritava kemikaali püsivust (nt lahustuvust, lagundatavust ja lenduvust) ning kõik vajalikud analüüsimeetodid tuleb valida olemasolevate andmete või teadmiste põhjal. Kui kemikaali annustatakse lahjendusveega, on soovitav enne katse algust analüüsida kõikidest paralleelnõudest võetud uuritavaid lahuseid, et kontrollida süsteemi toimivist. Kokkupuuteperioodil määratakse uuritava kemikaali kontsentratsioonid sobivate ajavahemike järel, eelistatavalt igal nädalal iga töödeldava rühma vähemalt ühes paralleelnõus, jälgides, et eri nädalatel kasutataks sama töödeldava rühma erinevaid paralleelnõusid. Tulemused peaksid soovitatavalt põhinema mõõdetud kontsentratsioonidel. Ent kui uuritava kemikaali kontsentratsiooni lahuses on suudetud kogu katse jooksul säilitada rahuldavalt vahemikus ± 20 % nimikontsentratsioonist, võivad tulemused põhineda kas nimi- või mõõdetud väärtustel. Lisaks ei tohi ühegi töödeldava rühma sees mõõdetud katsekontsentratsioonide variatsioonikoefitsient kogu katse vältel ühegi kontsentratsiooni puhul ületada 20 % Kui mõõdetud kontsentratsioonid ei jää nimikontsentratsiooniga võrreldes vahemikku 80–120 % (nt kui uuritakse tugevalt biolagunevaid või adsorbeeruvaid kemikaale), tuleb määrata toimet avaldavad kontsentratsioonid ning esitada need suhtarvuna läbivoolukatsete kontsentratsioonide aritmeetilise keskmise suhtes.

36.

Lahjendusvee ja põhilahuse vooluhulkasid tuleb kontrollida sobivate ajavahemike järel (nt kolm korda nädalas) kogu kokkupuuteperioodi vältel. Kui kasutatakse kemikaale, mille esinemist ei ole võimalik mõne või ühegi nimikontsentratsiooni juures tuvastada (nt seepärast, et nad lagunevad kiiresti või adsorbeeruvad katsenõule või akumuleeruvad suurel määral katseloomade kehasse), soovitatakse kõikides kambrites katselahuse uuendamise sagedust kohandada nii, et uuritavad kontsentratsioonid püsiksid võimalikult ühtlased.

Vaatlused ja näitajate mõõtmine

37.

Kokkupuute käigus hinnatakse nii mürgisusele osutavaid näitajaid (sh suremus, ebatavaline käitumine, näiteks kliinilised haiguse ja/või üldised mürgisuse sümptomid ning pikkusel ja kehamassil põhinevad kasvunäitajad) kui ka patoloogilisi näitajaid, mis võivad reageerida nii üldisele mürgisusele kui ka östrogeenide, androgeenide või kilpnäärme kaudu mõjuvatele endokriinsetele toimemehhanismidele. Lisaks võib katse lõpetamisel mõõta plasma VTG kontsentratsiooni. VTG mõõtmine võib aidata mõista uuringu tulemusi endokriinsete mehhanismide valguses, kui uuritakse võimalikke endokriinfunktsiooni kahjustavaid kemikaale. Tabelis 1 on esitatud ülevaade mõõdetavatest näitajatest ja mõõtmisaegadest.

Tabel 1

Ülevaade LAGDA näitajatest

Näitajad (*19)	Iga päev	Vaheproov (kulleste proov)	Katse lõpetamisel (noorkonnade proov)
Suremus ja kõrvalekalded	X
NFi järgi 62. staadiumisse jõudmiseks kulunud aeg		X
Histo(pato)loogia (kilpnääre)		X
Morfoloogia (kehamassi ja pikkuse juurdekasv)		X	X
Maksa somaatiline indeks (LSI)			X
Geneetiline/fenotüübiline sooline jaotumine			X
Histopatoloogia (sugunäärmed, sugujuhad, neerud ja maks)			X
Vitellogeniin (VTG) (valikuline)			X

Suremus ja igapäevased vaatlused

38.

Kõiki katsenõusid tuleb iga päev kontrollida surnud loomade suhtes ja iga nõu puhul tuvastatud suremus registreeritakse. Surnud loomad tuleks katsenõust eemaldada kohe, kui neid märgatakse. Surnud loomad liigitatakse arengustaadiumi põhjal (NFi järgi) järgmistesse rühmadesse: enne 58. staadiumit (esijäsemete moodustumist), 58.–62. staadium, 63.–66. staadium (62. staadiumi ja saba täieliku resorbeerumise vahel), pärast 66. staadiumit (kullesejärgne staadium). Suremuse määr üle 20 % võib osutada sobimatutele katsetingimustele või uuritava kemikaali selgele mürgisusele. Loomade suremine kemikaalist sõltumatutel põhjustel on kõige tõenäolisem esimestel arengupäevadel pärast kudemist ja moonde haripunkti ajal. Taolistel põhjustel tekkinud suremust võib olla võimalik tuvastada kontrollrühma andmete põhjal.

39.

Lisaks tuleks registreerida igasugune täheldatud ebatavaline käitumine, selgelt nähtavad väärarendid (nt skolioos) ja haavandid. Vaadeldud skolioosijuhud tuleks loendada (esinemissagedus) ja neile tuleks määrata raskusaste (nt ebaoluline – NR, kerge – 1, mõõdukas – 2, raske – 3; 8. liide). Mõõduka ja raske skolioosi esinemist tuleks püüda kogu uuringu vältel piirata (nt et see jääks kontrollrühmades alla 10 %), kuigi ka kontrollrühmades esinev suurem esinemissagedus ei ole tingimata põhjus katse katkestamiseks. Normaalse käitumisega kullesed hõljuvad veesambas, saba peast kõrgemal, sabauim peksleb korrapäraselt kindlas rütmis, nad tõusevad aeg-ajalt pinnale, nende lõpusekatted liiguvad ja nad reageerivad ärritajatele. Ebatavalise käitumise näideteks on pinnal hõljumine, nõu põhjas lebamine, kõht ülespidi või ebakorrapärane ujumine, pinnale mittetõusmine ja ärritajatele mitte reageerimine. Pärast moonet tuleks lisaks eespool nimetatud ebatavalisele käitumisele registreerida ka töödeldavate rühmade vahel esinevad suured erinevused sööda tarbimises. Olulisteks väärarenditeks ja kahjustusteks võivad muu hulgas olla morfoloogilised kõrvalekalded (nt deformeerunud jäsemed), veritsevad haavandid, kõhuturse, bakteri- või seennakkused. Noorkonnade peas vahetult sõõrmete taga esinevad haavandid võivad osutada ebapiisavale niiskustasemele. Kõnealused otsustused on kvalitatiivsed ja neid tuleks võrdluses kontrollrühma loomadega käsitada kui haiguse või stressi kliinilisi tunnuseid. Kui selliste tunnuste esinemissagedus on kokkupuutenõudes suurem kui kontrollnõudes, tuleks neid käsitada selge mürgisuse tunnustena.

Kulleste osaproov

Kulleste osaproovi kirjeldus

40.

NFi järgi 62. staadiumisse jõudnud kullesed tuleks nõudest eemaldada ning kasutada neid proovi võtmiseks või viia nad kokkupuutekatse järgmiseks etapiks üle uude nõusse või eraldada nad vaheseinaga teistest samasse nõusse jäävatest kullestest. Kulleseid kontrollitakse iga päev ning iga kullese puhul registreeritakse uuringupäev, mil see jõuab NFi järgi 62. staadiumisse. Kõnealune hinnang antakse eelkõige peakuju põhjal. Isend tunnistatakse NFi järgi 62. staadiumisse jõudnuks siis, kui pea suurus on nii palju vähenenud, et selle laius on ligikaudu võrdne kullese kehatüve laiusega ja esijäsemed on kohakuti südame keskjoonega.

41.

Eesmärk on võtta igast paralleelnõust prooviks viis NFi järgi 62. staadiumisse jõudnud kullest. Seda tuleks teha täiesti juhuslikult, aga juhusliku valiku numbrid peaksid olema eelnevalt otsustatud. Joonisel 1 on esitatud paralleelnõu hüpoteetiline näidis. Kui nõus on elus kõik 20 kullest, tuleks selle nõu esimese isendi NFi järgi 62. staadiumisse jõudmise hetkel valida vahemikust 1–20 viis juhuslikku numbrit. Kulles nr 1 on isend, kes jõudis NFi järgi 62. staadiumisse esimesena, ja kulles nr 20 on isend, kes jõudis selles nõus 62. staadiumisse viimasena. Kui nõus on elus 18 kullest, siis valitakse viis juhuslikku numbrit sarnasel moel vahemikust 1–18. Seda tuleks teha iga paralleelnõu puhul siis, kui esimene kulles jõuab seal NFi järgi 62. staadiumisse. Kui NFi järgi 62. staadiumis olevatest kullestest proovide võtmise ajal esineb surmajuhtumeid, tuleb juhuslikku valikut korrata, lähtudes veel NFi järgi 62. staadiumi eelsesse olekusse jäänud kulleste arvust ja nõu kohta viie proovini jõudmiseks vajalike võtmata proovide arvust. Päeval, kui mõni kulles jõuab NFi järgi 62. staadiumisse, vaadatakse varem koostatud proovivõtutabelist, kas see kulles tuleb võtta proovi või eraldada kokkupuutekatse jätkamiseks füüsiliselt ülejäänud kullestest. Esitatud näites (joonisel 1) tuleb esimene NFi järgi 62. staadiumisse jõudnud isend (lahter 1) ülejäänud kullestest füüsiliselt eraldada ja jätta kemikaaliga kokkupuutesse; ühtlasi tuleb registreerida uuringupäev, millal isend NFi järgi 62. staadiumisse jõudis. Järgnevaid isendeid nr 2 ja nr 3 koheldakse samuti nagu esimest, aga isend nr 4 (selle konkreetse näite puhul) võetakse proovi, et mõõta juurdekasvu ja kilpnäärme histoloogiat. Sama toimingut korratakse kuni 20. isendi lisamiseni teistele NFi järgi 62. staadiumi järgses katseetapis olevatele isenditele või proovi võtmiseni. Kasutatav juhusliku valiku kord peab tagama igale katseorganismile ühesuguse tõenäosuse olla valitud. Selle saavutamiseks võib kasutada mis tahes juhusliku valiku meetodit, aga samas kehtib nõue, et iga kulles tuleb NFi järgi 62. staadiumi proovide võtmise perioodil mingil hetkel võrgu abil nõust välja tõsta.

Joonis 1

Hüpoteetiline näide NFi järgi 62. staadiumi proovivõturežiimi kohta ühe paralleelnõu puhul

42.

Kulleste osaproovi võtmisel mõõdetakse järgmised näitajad: 1) NFi järgi 62. staadiumisse jõudmiseks kulunud aeg (st päevade arv viljastamisest 62. staadiumisse jõudmiseni), 2) välised väärarengud, 3) morfoloogilised näitajad (kehamass ja pikkus) ning 4) kilpnäärme histoloogia.

Kulleste humaanne surmamine

43.

Osaproovi võetud NFi järgi 62. staadiumis olevate kulleste (viis isendit paralleelnõu kohta) surmamiseks tuleks nad asetada 30 minutiks vajalikus koguses (nt 500 ml) anesteetikumilahusesse (nt trikaiinmetaansulfonaadi (MS-222, CASi nr 886-86-2) 0,3 % lahus). MS-222 lahust tuleks puhverdada naatriumvesinikkarbonaadiga kuni pH ligikaudse väärtuseni 7,0, sest puhverdamata MS-222 lahus on happeline, ärritab konnade nahka ning põhjustab halba imendumist ja tarbetut lisastressi organismidele.

44.

Kullese eemaldamiseks katsenõust ja surmamislahusesse asetamiseks kasutatakse sõelvõrku. Loom on nõuetekohaselt surmatud ja lahanguks valmis siis, kui ta ei reageeri välistele ärritajatele (nt tagajäseme pigistamisele pintsettidega).

Morfoloogilised näitajad (kehamass ja pikkus)

45.

Iga kullese märgmassi (milligrammi täpsusega) ja pikkust ninamikust pärakuavani (0,1 mm täpsusega) tuleks mõõta kohe, kui kulles on anesteetikumi mõjul reaktsioonivõimetuks muutunud (joonis 2a). Pildianalüüsi tarkvara kasutades võib ninamiku ja pärakuava vahekaugust mõõta ka fotodelt. Liigse vee eemaldamiseks tuleks kullesed enne kaalumist kuivatuspaberiga kuivatada. Pärast kasvunäitajate (kehamass ning ninamiku ja pärakuava vahekaugus) mõõtmist tuleks registreerida (soovitavalt elektrooniliselt) või üles märkida tuvastatud suured morfoloogilised kõrvalekalded ja/või mürgisuse kliinilised tundemärgid, näiteks skolioos (vt 8. liide), petehhia ja verejooksud. Petehhia avaldub nahakapillaaride punaste või lillade täppverevalumitena.

Koeproovide võtmine ja fikseerimine

46.

Kulleste osaproovi puhul kasutatakse histoloogiliseks analüüsiks kilpnääret. Alakeha lõigatakse esijäsemete tagant maha ja kõrvaldatakse. Lühendatud rümp fikseeritakse Davidsoni fikseerimislahuses. Fikseerimislahuse kogus nõus peaks olema vähemalt 10 korda suurem kui kudede ligikaudne ruumala. Fikseerimislahust tuleb huvi pakkuvate kudede nõuetekohaseks fikseerimiseks piisavalt loksutada või keerutada. Kõik koeproovid jäetakse Davidsoni fikseerimislahusesse vähemalt 48 tunniks, aga mitte rohkem kui 96 tunniks. Seejärel loputatakse neid deioniseeritud vees ja säilitatakse neutraalse puhvriga 10 % formaliini lahuses (1, 29).

Kilpnäärme histoloogia

47.

Kõigil kulleseproovidel tehakse (pärast kudede fikseerimist) kilpnäärme histoloogiline analüüs: diagnoos ja raskusastme määramine (29, 30).

Joonis 2. LAGDAs kasutatavad ninamiku ja pärakuava vahekauguse mõõtmise punktid NFi järgi 62. staadiumis (a) ja noorkonnadel (b). NFi järgi 62. staadiumi (a) iseloomulikud tunnused: pea laius on võrdne kehatüve laiusega, haistmisnärvi pikkus on väiksem kui haistmissibula läbimõõt (selgvaates) ja esijäsemed on südamega samal joonel (kõhtvaates). Piltide allikas: Nieuwkoop ja Faber (1994).

Kulleste kokkupuute lõpetamine

48.

Kulleste algset arvu arvestades võib eeldada, et väike osa isenditest ei arene normaalselt ega lõpeta moonet (NFi järgi 66. staadium) mõistliku aja jooksul. Kullesestaadiumis kasutatav kokkupuuteaeg ei tohiks ületada 70 päeva. Kõik selle perioodi lõpuks alles jäänud kullesed tuleks surmata (vt punkt 43) ning seejärel mõõta nende märgmass ning ninamiku ja pärakuava vahekaugus, kindlaks teha nende arengustaadium Nieuwkoopi ja Faberi (1994) järgi ning märkida üles nende väärarengud.

Praakimine NFi järgi 66. staadiumi järel

49.

Alates NFi järgi 66. staadiumist (saba täielik resorbeerumine) tuleks kokkupuutekatse lõpuni alles jätta kümme isendit nõu kohta. Seega tuleks praakimine läbi viia siis, kui kõik loomad on jõudnud NFi järgi 66. staadiumisse, või 70 päeva möödumisel (olenevalt sellest, kumb on varasem). NFi järgi 66. staadiumi järel kokkupuutekatsest eemaldatavad loomad valitakse juhuslikult.

50.

Loomad, kellega kokkupuutekatset ei jätkata, surmatakse (vt punkt 43). Igal loomal mõõdetakse arengustaadium, märgmass ning ninamiku ja pärakuava vahekaugus (joonis 2b), samuti tehakse üldine lahang. Fenotüübiliseks sooks (sugunäärme morfoloogia põhjal) märgitakse emane, isane või ebaselge.

Noorkonnade proov

Noorkonnade proovi kirjeldus

51.

Alles jäänud loomad jäetakse kemikaaliga kokkupuutesse kümnenda nädalani pärast lahjendusvee (ja/või vajadusel lahusti) kontrollrühmas NFi järgi 62. staadiumi saabumise mediaanaega. Kokkupuuteperioodi lõpuks alles jäänud loomad (kuni 10 konna paralleelnõu kohta) surmatakse, nende erinevaid näitajaid mõõdetakse või hinnatakse ning need registreeritakse: 1) morfoloogilised näitajad (kehamass ja pikkus), 2) fenotüübiline/genotüübiline sooline jaotumine, 3) maksa mass (maksa somaatiline indeks), 4) histopatoloogia (sugunäärmed, sugujuhad, maks ja neerud) ning valikuliselt 5) plasma VTG-sisaldus.

Konnade humaanne surmamine

52.

Moonde läbinud noorkonnad surmatakse anesteetikumi (nt sobiva fosfaadipuhvriga 10 % MS-222 lahus) süstimisega kõhuõõnde. Konnadelt proovide võtmist võib alustada pärast seda, kui nad ei reageeri enam ärritajatele (tavaliselt umbes kaks minutit pärast süsti, kui kasutatakse 10 % MS-222 lahust annuses 0,01 ml konna kehamassi grammi kohta). Kuigi noorkonnad võib panna ka suurema kontsentratsiooniga anesteetikumilahusesse (MS-222), on kogemused näidanud, et selle meetodi korral kulub nende tuimastamiseks rohkem aega ja see võib proovide võtmist raskendada. Süst tagab tõhusa ja kiire surmamise enne proovide võtmist. Proovide võtmist ei tohiks alustada enne, kui konnade reaktsioonivõime kadumist on kontrollitud veendumaks, et loomad on surnud. Kui konnadel ilmneb märkimisväärsete kannatuste tunnuseid (mis on väga raskekujulised ja konnade surm on usaldusväärselt prognoositav) ja nad on surmaeelses seisundis, tuleks nad tuimastada ja surmata ning arvestada nende andmetega suremuse analüüsimisel. Haigestunud konnade surmamise juhud tuleb üles märkida ja neid katseprotokollis kajastada. Olenevalt sellest, millisel uuringuetapil konn surmatakse, võidakse konna säilitada histopatoloogiliseks analüüsiks (konnade fikseerimine võimalikuks histopatoloogia uuringuks).

Morfoloogilised näitajad (kehamass ja pikkus)

53.

Märgmassi ning ninamiku ja pärakuava vahekaugust (joonis 2b) mõõdetakse samuti nagu kulleste osaproovi puhul.

Plasma VTG -sisaldus (valikuline)

54.

VTG on laialdaselt kasutatav biomarker, mis näitab kokkupuudet östrogeensete kemikaalidega. LAGDA puhul võib plasma VTG-sisaldust soovi korral mõõta noorkonnade proovides (eelkõige võib see olla vajalik juhul, kui uuritav kemikaal võib olla östrogeen).

55.

Surmatud noorkonna tagajäsemed lõigatakse maha ja vereproov võetakse hepariniseeritud kapillaartoruga (aga sobida võib ka mõni muu vereproovi võtmise meetod, nt südame punktsioon). Veri lastakse mikrotsentrifuugianumase (nt mahuga 1,5 ml) ja seda tsentrifuugitakse plasma eraldamiseks. Plasmaproove tuleks hoida –70 °C juures või sellest madalamal temperatuuril kuni VTG määramiseni. VTG kontsentratsiooni plasmas saab mõõta ensüümimmuunsorptsioonanalüüsi (ELISA) meetodiga (6. liide) või mõne muu meetodi, näiteks massispektromeetria abil (31). Suurema tundlikkuse tõttu eelistatakse liigispetsiifiliste antikehade kasutamist.

Geneetilise soo määramine

56.

Iga noorkonna geneetilist sugu hinnatakse Yoshimoto et al. (11) välja töötatud markerite põhjal. Geneetilise soo määramiseks eemaldatakse lahkamise ajal osaliselt (või tervikuna) üks tagajäse (või muu kude), mida säilitatakse mikrotsentrifuugianumas (konnade koeproove võib võtta mis tahes koest). Koeproove hoitakse –20 °C juures või sellest madalamal temperatuuril kuni desoksüribonukleiinhappe (DNA) eraldamiseni. Koest DNA eraldamiseks võib kasutada müügilolevaid komplekte ning markeri esinemise või puudumise analüüsiks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodit (5. liide). Üldjuhul on histoloogilise ja genotüübilise soo kokkulangevus kontrollrühmade noorkonnade seas proovi võtmise hetkel üle 95 %.

Koeproovide võtmine ja fikseerimine histopatoloogilise analüüsi jaoks

57.

Viimase proovivõtu ajal võetakse loomadelt histoloogilise analüüsi tegemiseks sugunäärmed, sugujuhad, neerud ja maksad. Kõhuõõs avatakse ning maks lõigatakse välja ja kaalutakse. Järgmiseks eemaldatakse alakõhust ettevaatlikult seedeorganid (nt magu, sooled), et paljastada sugunäärmed, neerud ja sugujuhad. Sugunäärmetel leitud suured morfoloogilised kõrvalekalded tuleb üles märkida. Lõpuks tuleb eemaldada tagajäsemed, kui neid ei ole vereproovi võtmiseks juba varem eemaldatud. Eemaldatud maksad ja in situ jäetud sugunäärmetega rümp tuleb kohe asetada Davidsoni fikseerimislahusesse. Fikseerimislahuse kogus nõus peaks olema vähemalt 10 korda suurem kui kudede ligikaudne ruumala. Kõik koeproovid jäetakse Davidsoni fikseerimislahusesse vähemalt 48 tunniks, aga mitte rohkem kui 96 tunniks. Seejärel loputatakse neid deioniseeritud vees ja säilitatakse neutraalse puhvriga 10 % formaliini lahuses (1, 29).

Histopatoloogiline analüüs

58.

Kõiki noorkonnadelt võetud proove analüüsitakse histoloogiliselt, et leida sugunäärmete, sugujuhade, neerude ja maksakoe patoloogiaid, panna diagnoos ja määrata raskusaste (32). Hindamise käigus selgitatakse välja ka sugunäärmete (nt munajuhad, munandid, intersoolised organid) fenotüüp ning neid vaatlusandmeid saab koos isendi geneetilise soo mõõtmise andmetega kasutada fenotüübilise/genotüübilise soolise jaotumise arvutamiseks.

ANDMED JA ARUANDLUS

Statistiline analüüs

59.

LAGDAga saadakse kolme liiki andmeid, mida tuleb statistiliselt analüüsida: 1) kvantitatiivsed pidevandmed (kehamass, ninamiku ja pärakuava vahekaugus, maksa somaatiline indeks, VTG), 2) arengu kiirust näitavad sündmuseni kulunud aja andmed (päevade arv katse algusest kuni NFi järgi 62. staadiumini) ning 3) järjestusandmed, mis esitatakse histopatoloogilise analüüsi põhjal raskusastme või arengustaadiumi kujul.

60.

Katseplaan ja valitud statistilised testid peaksid soovitatavalt tagama piisava statistilise võimsuse, et tuvastada näitajate bioloogiliselt olulisi muutusi katses, mille puhul tuleb esitada täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) või toimet avaldav kontsentratsioon (ECx). Andmete statistiline analüüs (üldjuhul paralleelproovide keskväärtuste põhjal) peaks eelistatavalt toimuma vastavalt meetoditele, mida on kirjeldatud OECD koostatud juhendis ökotoksilisuse andmete statistilise analüüsi kaasaegsete meetodite rakendamise kohta (33). Käesoleva katsemeetodi 7. liites on esitatud soovitatav otsustusskeem statistilise analüüsimeetodi leidmiseks ja juhised andmete töötlemiseks ning LAGDA puhul sobivaima statistilise testi või mudeli valimiseks.

61.

Kuna genotüübiline sugu tehakse kindlaks kõikide konnade puhul, tuleks noorkonnade proovi andmeid (nt kasv, maksa somaatiline indeks) analüüsida mõlema genotüübilise soo kohta eraldi.

Andmete analüüsiga seotud kaalutlused

Rikutud paralleelproovide ja töödeldud rühmade kasutamine

62.

Paralleelproove ja töödeldud rühmasid võib rikkuda selgest mürgisusest, haigusest või tehnilisest veast tingitud liiga kõrge suremus. Kui mõni töödeldud rühm on haiguse või tehnilise vea tagajärjel rikutud, peaks analüüsiks alles jääma kolm rikkumata töödeldud rühma, milles on kolm rikkumata paralleelproovi. Kui suure kontsentratsiooniga töödeldavates rühmades esineb selge mürgisus, oleks analüüsiks eelistatavalt vaja vähemalt kolme eri kontsentratsioonidega töödeldavat rühma, milles on kolm rikkumata paralleelproovi (vastavalt OECD katsejuhendites esitatud maksimaalse talutava kontsentratsiooni põhimõttele (34)). Lisaks suremusele võib selge mürgisuse tunnuseks olla ka teatav käitumine (nt pinnal hõljumine, nõu põhjas lebamine, ümberpööratud asendis või ebakorrapärane ujumine), morfoloogiline kahjustus (nt veritsev haavand, kõhuturse) või normaalse toitumise pärsitus, mis ilmneb kvalitatiivses võrdluses kontrollrühma loomadega.

Lahusti kontrollrühm

63.

Katse lõpetamisel tuleb hinnata lahusti (kui seda kasutatakse) võimalikku mõju. Seda tehakse lahusti kontrollrühma ja lahjendusvee kontrollrühma statistilise võrdlemisega. Kõnealuses analüüsis vaadeldavad kõige olulisemad näitajad on seotud kasvuga (kehamass ja pikkus), kuna neid võib mõjutada üldine mürgisus. Kui nende näitajate puhul tuvastatakse lahjendusvee kontrollrühma ja lahusti kontrollrühma vahel statistiliselt olulisi erinevusi, tuleb parimatest erialateadmistest lähtudes hinnata, kas see ohustab katse nõuetekohasust. Kui kahe kontrollrühma näitajad erinevad, tuleks kemikaaliga kokku puutunud rühmi võrrelda lahusti kontrollrühmaga, välja arvatud juhul, kui on teada, et eelistada tuleb võrdlust lahjendusvee kontrollrühmaga. Kui kahe kontrollrühma vahel statistiliselt olulisi erinevusi ei ole, soovitatakse võrrelda uuritava kemikaaliga kokku puutunud rühmi mõlema kontrollrühma (lahusti ja lahjendusvesi) koondatud näitajatega, välja arvatud juhul, kui on teada, et eelistada tuleb võrdlust ainult lahjendusvee või ainult lahusti kontrollrühmaga.

Katseprotokoll

64.

Katseprotokoll peaks sisaldama järgmist teavet.

Uuritav kemikaal:

—	füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;

—

Ühest koostisosast koosnev aine –

—	füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased andmed füüsikalis-keemiliste omaduste kohta;

—	kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne, sealhulgas vajaduse korral orgaanilise süsiniku sisaldus;

—

Mitmest koostisosast koosnev aine, tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal või segu:

—	võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohaseid füüsikalis-keemilisi omadusi käsitlevatest andmetest.

Katsealune liik:

—	teaduslik nimetus, liin (kui on), päritolu ning viljastatud munade kogumise ja järgneva käitlemise meetod;

—	skolioosi esinemissagedus kasutatud kasvandusloomade varasemates kontrollrühmades.

Katsetingimused:

—	valgusrežiim(id);

—	katseplaan (nt nõude suurus, materjal ja veesisaldus, katsenõude ja paralleelnõude arv, katsealuste organismide arv paralleelnõu kohta);

—	põhilahuste valmistamise meetod ja uuendamise sagedus (lahusti kasutamise korral tuleks esitada selle nimetus ja kontsentratsioon);

—	uuritava kemikaali annustamismeetod (nt pump, lahjendussüsteem);

—	meetodiga saavutatav tuvastamise tõhusus ja uuritavad nimikontsentratsioonid, määramispiir, katsenõudes mõõdetud väärtuste keskmised ja standardhälbed ja nende arvutamise meetod ning tõendid selle kohta, et mõõtmistulemused kajastavad uuritava kemikaali kontsentratsiooni tõelises lahuses;

—

lahjendusvee omadused: pH, karedus, temperatuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, jääk-kloori sisaldus (kui on mõõdetud), joodi üldsisaldus, orgaanilise süsiniku üldsisaldus (kui on mõõdetud), hõljuvaine sisaldus (kui on mõõdetud), katselahuse soolsus (kui on mõõdetud) ja kõik muud mõõdetud näitajad;

—	uuritavad nimikontsentratsioonid, mõõdetud väärtuste keskmised ja nende standardhälbed;

—	vee kvaliteet katsenõudes: pH, temperatuur (iga päev) ja lahustunud hapniku kontsentratsioon;

—	üksikasjalik teave söötmise kohta (nt sööda liik, päritolu, lisatud kogus ja söötmissagedus).

Tulemused:

—	tõendid selle kohta, et nõuetekohasuse kriteeriumid on kontrollrühmades täidetud;

—

järgmised andmed kontrollrühma (ja lahusti kasutamise korral lahusti kontrollrühma) ja töödeldud rühmade kohta: suremus ja täheldatud kõrvalekalded, NFi järgi 62. staadiumisse jõudmiseks kulunud aeg, kilpnäärme histoloogia (ainult kulleste proovis), kasv (kehamass ja pikkus), maksa somaatiline indeks (ainult noorkonnade proovis), geneetiline/fenotüübiline sooline jaotumine (ainult noorkonnade proovis), sugunäärmete, sugujuhade, neerude ja maksa histopatoloogilise analüüsi tulemused (ainult noorkonnade proovis) ja plasma VTG-sisaldus (ainult noorkonnade proovis, kui on mõõdetud);

—	statistilise analüüsi ja andmetöötluse meetod (kasutatud statistiline test või mudel);

—	täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) iga hinnatud näitaja puhul;

—

vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) iga hinnatud näitaja puhul (tasemel α = 0,05); vajaduse korral ECx iga hinnatud näitaja puhul koos usaldusvahemikuga (nt usaldusnivool 95 %) ja selle arvutamiseks kasutatud lähendatud mudeli graafik, kontsentratsiooni-vastuse kõvera tõus, regressioonimudeli võrrand ning mudeli hinnangulised parameetrid ja nende standardviga;

—	kõik kõrvalekalded katsemeetodist ja nõuetekohasuse kriteeriumidest ning nende võimalik mõju katse tulemustele.

65.

Näitajate mõõtmistulemuste kohta tuleb esitada keskväärtused ja nende standardhälbed (võimaluse korral nii paralleelrühmade kui ka kontsentratsioonide lõikes).

66.

Kontrollrühmades NFi järgi 62. staadiumisse jõudmiseks kulunud aeg tuleks arvutada paralleelnõude mediaanväärtuste keskväärtusena ja esitada koos standardhälbega. Sarnaselt tuleks töödeldud rühmade puhul arvutada töödeldud rühma mediaanväärtus, mis esitatakse paralleelnõude mediaanväärtuste keskväärtusena koos standardhälbega.

KIRJANDUS

(1)	U.S. Environmental Protection Agency (2013), Validation of the Larval Amphibian Growth and Development Assay: Integrated Summary Report.

(2)	OECD (2012a), „Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Endocrine Disrupters“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, nr 150, Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(3)	Nieuwkoop, P.D. ja Faber, J. (1994), Normal Table of Xenopus laevis (Daudin), Garland Publishing, Inc, New York, NY, USA.

(4)	Kloas, W. ja Lutz, I. (2006), „Amphibians as Model to Study Endocrine Disrupters“, Journal of Chromatography, A 1 130, lk 16–27.

(5)	Chang, C., Witschi, E. (1956), „Genic Control and Hormonal Reversal of Sex Differentiation in Xenopus“, Journal of the Royal Society of Medicine, nr 93, lk 140–144.

(6)	Gallien, L. (1953), „Total Inversion of Sex in Xenopus laevis Daud, Following Treatment with Estradiol Benzoate Administered During Larval Stage“, Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances de l'Académie des Sciences, nr 237, lk 1 565.

(7)	Villalpando, I. ja Merchant-Larios, H. (1990), „Determination of the Sensitive Stages for Gonadal Sex-Reversal in Xenopus Laevis Tadpoles“, International Journal of Developmental Biology, nr 34, lk 281–285.

(8)	Miyata, S., Koike, S. ja Kubo, T. (1999), „Hormonal Reversal and the Genetic Control of Sex Differentiation in Xenopus“, Zoological Science, nr 16, lk 335–340.

(9)	Mikamo, K. ja Witschi, E. (1963), „Functional Sex-Reversal in Genetic Females of Xenopus laevis, Induced by Implanted Testes“, Genetics, nr 48, lk 1 411.

(10)	Olmstead, A.W., Kosian, P.A., Korte, J.J., Holcombe, G.W., Woodis, K. ja Degitz, S.J. (2009)a, „Sex reversal of the Amphibian, Xenopus tropicalis, Following Larval Exposure to an Aromatase Inhibitor“, Aquatic Toxicology, nr 91, lk 143–150.

(11)

Yoshimoto, S., Okada, E., Umemoto, H., Tamura, K., Uno, Y., Nishida-Umehara, C., Matsuda, Y., Takamatsu, N., Shiba, T. ja Ito, M. (2008), „A W-linked DM-Domain Gene, DM-W, Participates in Primary Ovary Development in Xenopus Laevis“, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, nr 105, lk 2 469–2 474.

(12)	Olmstead, A.W., Korte, J.J., Woodis, K.K., Bennett, B.A., Ostazeski, S. ja Degitz, S.J. (2009)b, „Reproductive Maturation of the Tropical Clawed Frog: Xenopus tropicalis“, General and Comparative Endocrinology, nr 160, lk 117–123.

(13)	Tobias, M.L., Tomasson, J. ja Kelley, D.B. (1998), „Attaining and Maintaining Strong Vocal Synapses in Female Xenopus laevis“, Journal of Neurobiology, nr 37, lk 441–448.

(14)	Qin, Z.F., Qin, X.F., Yang, L., Li, H.T., Zhao, X.R. ja Xu, X.B. (2007), „Feminizing/Demasculinizing Effects of Polychlorinated Biphenyls on the Secondary Sexual Development of Xenopus Laevis“, Aquatic Toxicology, nr 84, lk 321–327.

(15)	Porter, K.L., Olmstead, A.W., Kumsher, D.M., Dennis, W.E., Sprando, R.L., Holcombe, G.W., Korte, J.J., Lindberg-Livingston, A. ja Degitz, S.J. (2011), „Effects of 4-Tert-Octylphenol on Xenopus Tropicalis in a Long Term Exposure“, Aquatic Toxicology, nr 103, lk 159–169.

(16)	ASTM (2002), „Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians“, ASTM E729-96, Philadelphia, PA, USA.

(17)	Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine“.

(18)	Käesoleva lisa peatükk C.29 „Kiire biolagundatavus – CO2 suletud nõudes (vabaruumi katse)“.

(19)	Kahl, M.D., Russom, C.L., DeFoe, D.L. ja Hammermeister, D.E. (1999), „Saturation Units for Use in Aquatic Bioassays“, Chemosphere nr 39, lk 539–551.

(20)	Adolfsson-Erici, M., Åkerman, G., Jahnke, A., Mayer, P., McLachlan, M.S. (2012), „A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests“, Chemosphere, nr 86(6), lk 593–599.

(21)	OECD (2000), „Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, nr 23. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(22)	Hutchinson, T.H., Shillabeer, N., Winter, M.J. ja Pickford, D.B. (2006), „Acute and Chronic Effects of Carrier Solvents in Aquatic Organisms: A Critical Review“ (ülevaade), Aquatic Toxicology, nr 76, lk 69–92.

(23)	ASTM (2004), „Standard Guide for Conducting the Frog Embryo Teratogenesis Assay - Xenopus (FETAX)“, ASTM E1439-98, Philadelphia, PA, USA.

(24)	Read, B.T. (2005), Guidance on the Housing and Care of the African Clawed Frog Xenopus Laevis, Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA), Horsham, Sussex, Ühendkuningriik, 84 lk.

(25)	Käesoleva lisa peatükk C.38 „Kahepaiksete metamorfoosi katse“.

(26)	Käesoleva lisa peatükk C.48 „Lühiajaline kalade paljunemise katse“.

(27)	Käesoleva lisa peatükk C.41 „Kalade sugulise arengu katse“.

(28)	Käesoleva lisa peatükk C.49 „Ägeda mürgisuse katse kalaembrüotega“.

(29)	OECD (2007), „Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, nr 82, Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(30)	Grim, K.C., Wolfe, M., Braunbeck, T., Iguchi, T., Ohta, Y., Tooi, O., Touart, L., Wolf, D.C. ja Tietge, J. (2009), „Thyroid Histopathology Assessments for the Amphibian Metamorphosis Assay to Detect Thyroid-Active Substances“, Toxicological Pathology, nr 37, lk 415–424.

(31)	Luna, L.G. ja Coady, K.(2014), „Identification of X. laevis Vitellogenin Peptide Biomarkers for Quantification by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry“, Analytical and Bioanalytical Techniques, nr 5(3), lk 194.

(32)	OECD (2015), „Guidance on histopathology techniques and evaluation“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, nr 228, Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(33)	OECD (2006), „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application“, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, nr 54, Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(34)	Hutchinson, T.H., Bögi, C, Winter, M.J. ja Owens, J.W. (2009), „Benefits of the Maximum Tolerated Dose (MTD) and Maximum Tolerated concentration (MTC) Concept in Aquatic Toxicology“, Aquatic Toxicology, nr 91(3), lk 197–202.

1. liide

MÕISTED

Lõppnäitaja : näitaja, mis iseloomustab mõju populatsiooni tasandil.

Kemikaal : aine või segu.

ELISA : ensüümimmuunsorptsioonanalüüs.

ECx : (kontsentratsioon, mille puhul mõju ulatus on x %) kontsentratsioon, mille juures teatava kokkupuuteperioodi vältel on katseorganismidele avalduva mõju ulatus x % kontrollrühma asjaomase näitaja väärtusest. Näiteks EC50 on kontsentratsioon, mille puhul kindlaksmääratud kokkupuuteperioodi vältel avaldub kemikaali mõju katses uuritavale näitajale 50 protsendil kemikaaliga kokku puutuvast populatsioonist.

dpf : päeva pärast viljastamist.

Läbivoolukatse : katse, mille puhul katselahused voolavad kokkupuuteperioodi vältel pidevalt läbi katsesüsteemi.

HAS-telg : hüpotalamuse-ajuripatsi-sugunäärmete telg.

IUPAC : Rahvusvaheline Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liit (International Union of Pure and Applied Chemistry).

Vähim täheldatud toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) : uuritava kemikaali väikseim uuritav kontsentratsioon, mille puhul täheldatakse kemikaali statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju võrdluses kontrollprooviga. Kemikaal peaks kõigi LOEC-st suuremate kontsentratsioonide juures avaldama vähemalt sama tugevat kahjulikku mõju kui LOEC juures. Kui nimetatud kahte tingimust ei ole võimalik täita, tuleks lisada ammendav selgitus, kuidas LOEC (ja sellest lähtuvalt ka NOEC) on valitud. Sellekohased juhised on esitatud 7. liites.

Letaalne mediaankontsentratsioon (LC50) : uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures kemikaal on katse vältel hinnanguliselt letaalne 50 %-le katseorganismidest.

Täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) : uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures ei täheldata kindlaksmääratud kokkupuuteperioodi jooksul kontrolliga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) toimet ja mis on LOEC-st vahetult madalam.

SMILES : lihtsustatud molekulaarse sisendrea sisestamissüsteem (Simplified Molecular Input Line Entry Specification).

Uuritav kemikaal : iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB : tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

VTG : vitellogeniin on fosfolipoglükoproteiin, mis on munarebu valkude eelkäija ja mida tavaliselt leidub kõikide ovipaarsete liikide seksuaalselt aktiivsetes emasloomades.

Liide 2

MÕNED NÕUETEKOHASE LAHJENDUSVEE KEEMILISED OMADUSED

Koostisosa	Kontsentratsiooni piirnorm
Tahked osakesed	5 mg/l
Orgaanilise süsiniku üldsisaldus	2 mg/l
Ioniseerimata ammoniaak	1 μg/l
Jääk-kloor	10 μg/l
Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus	50 ng/l
Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide summaarne üldsisaldus	50 ng/l
Orgaanilise kloori üldsisaldus	25 ng/l
Alumiinium	1 μg/l
Arseen	1 μg/l
Kroom	1 μg/l
Koobalt	1 μg/l
Vask	1 μg/l
Raud	1 μg/l
Plii	1 μg/l
Nikkel	1 μg/l
Tsink	1 μg/l
Kaadmium	100 ng/l
Elavhõbe	100 ng/l
Hõbe	100 ng/l

3. liide

LAGDA KATSETINGIMUSED

Katseliik

Xenopus laevis

2.	Katse tüüp

Pideva läbivooluga katse

3.	Vee temperatuur

Nimitemperatuur on 21 °C. Keskmine temperatuur kogu katse vältel 21 ± 1oC (temperatuuride erinevus paralleelproovide ja töödeldavate rühmade vahel ei tohiks ületada 1,0oC).

4.	Valgustuse kvaliteet

Luminofoorlambid (laia spektriga), valgustihedus vee pinnal 600–2 000 lx (lm/m2)

5.	Valgusrežiim

12 tundi valgust, 12 tundi pimedust

6.	Uuritava lahuse ruumala ja katsenõu

4–10 l (vee sügavus vähemalt 10–15 cm)

Klaasist või roostevabast terasest nõu

7.	Uuritavate lahuste uuendamine kogu ruumala ulatuses

Konstantne, nii et säiliksid nii bioloogilised tingimused kui ka kemikaaliga kokkupuude (nt lahuse uuendamine kogu ruumala ulatuses viis korda päevas).

8.	Katseorganismide vanus katse alguses

Nieuwkoopi ja Faberi (NF) järgi 8.–10. staadium

9.	Organismide arv paralleelnõu kohta

Kokkupuute alguses 20 looma (embrüot) paralleelnõu kohta ja alates NFi järgi 66. staadiumist kuni kokkupuute lõpetamiseni 10 looma (noorkonna) paralleelnõu kohta

10.	Töödeldavate rühmade arv

Vähemalt neli uuritava kemikaaliga töödeldavat rühma ja vajalikud kontrollrühmad

11.	Paralleelnõude arv töödeldavate rühma kohta

Neli paralleelnõud uuritava kemikaali ühe kontsentratsiooniga töödeldava rühma kohta ja kaheksa paralleelnõud kontrollrühma kohta

12.	Organismide arv uuritava kontsentratsiooni kohta

Vähemalt 80 looma uuritava kemikaali ühe kontsentratsiooniga töödeldava rühma kohta ja vähemalt 160 paralleelset looma kontrollrühma kohta

13.	Lahjendusvesi

X. laevis’e normaalset kasvu ja arengut võimaldav vesi (nt allikavesi või aktiivsöega filtreeritud kraanivesi)

14.	Aereerimine

Ei ole nõutav, kuid nõude aereerimine võib osutuda vajalikuks juhul, kui lahustunud hapniku sisaldus langeb alla soovitatavat piirtaset ja uuritava lahuse vooluhulka ei saa enam suurendada.

15.	Lahustunud hapniku sisaldus uuritavas lahuses

Lahustunud hapnik: ≥ 40 % küllastuskontsentratsioonist õhus või ≥ 3,5 mg/l

16.	Uuritava lahuse pH

6,5–8,5 (erinevus paralleelproovide ja töödeldavate rühmade vahel ei tohiks ületada 0,5)

17.	Katselahuse karedus ja leelisus

10–250 mg CaCO3/l

18.	Söötmisrežiim

(Vt 4. liide)

19.	Kokkupuuteaeg

Alates NFi järgi 8.–10. staadiumist kümnenda nädalani pärast vee ja/või lahusti kontrollrühmas NFi järgi 62. staadiumi saabumise mediaanaega (maksimaalselt 17 nädalat)

20.	Bioloogilised näitajad

Suremus (ja välised kõrvalekalded), NFi järgi 62. staadiumisse jõudmiseks kulunud aeg (kulleste proovis), kilpnäärme histoloogia (kulleste proovis), kasv (kehamass ja pikkus), maksa somaatiline indeks (noorkonnade proovis), geneetiline/fenotüübiline sooline jaotumine (noorkonnade proovis), sugunäärmete, sugujuhade, neerude ja maksa histopatoloogilise analüüsi tulemused (noorkonnade proovis) ja plasma VTG-sisaldus (noorkonnade proovis, valikuline)

21.	Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

Lahustunud hapniku sisaldus peaks olema > 40 % küllastuskontsentratsioonist õhus; keskmine veetemperatuur peaks olema vahemikus 21 ± 1 °C ning temperatuuride erinevus paralleelproovide ja eri kontsentratsioonidega töödeldavate rühmade vahel peaks olema < 1,0oC; uuritava lahuse pH peaks olema vahemikus 6,5–8,5; suremus kontrollrühma igas paralleelnõus peaks olema ≤ 20 % ja NFi järgi 62. staadiumisse jõudmise keskmine aeg kontrollrühmas peaks olema ≤ 45 päeva; katseorganismide keskmine mass NFi järgi 62. staadiumisse jõudmisel ja katse lõpetamisel peaks olema kontrollrühmades ja lahusti kontrollrühmades (kui neid kasutatakse) vastavalt 1,0 ± 0,2 g ja 11,5 ± 3 g; tuleks esitada tõendid selle kohta, et uuritava kemikaali kontsentratsiooni lahuses on suudetud hoida rahuldavalt vahemikus ± 20 % mõõdetud keskväärtusest.

4. liide

SÖÖTMISREŽIIM

Kuigi käesoleva söötmisrežiimi kasutamine on soovitatav, on lubatud ka muud variandid tingimusel, et katseorganismid kasvavad ja arenevad piisava kiirusega.

Kulleste söötmine

Kulleste sööda ettevalmistamine

Forelli noorkalade sööt ja vetikad/TetraFin® (või samaväärne sööt) mahuvahekorras 1:1

1.	Forelli noorkalade sööt: 50 g forelli noorkalade sööta (väikesed graanulid või pulber) segatakse blenderis suurel kiirusel 20 sekundi vältel 300 ml sobiva filtreeritud veega.

Vetikate/TetraFin®-i (või samaväärse sööda) segu: 12 g spirulina vetika tablette segatakse blenderis suurel kiirusel 40 sekundi vältel 500 ml filtreeritud veega, 12 g Tetrafin®-i (või samaväärset sööta) segatakse 500 ml filtreeritud veega ning seejärel segud ühendatakse, et saada 1 l söödasegu, mis sisaldab 12 g/l spirulina vetikaid ja 12 g/l Tetrafin®-i (või samaväärset sööta).

3.	Forelli noorkalade sööda segu ja vetikate/TetraFin®-i (või samaväärse sööda) segu segatakse kokku võrdses mahuvahekorras.

Soolavähivastsed:

15 ml soolavähimarjal lastakse kooruda 1 l soolvees (selle valmistamiseks lisatakse 1 l deioniseeritud veele 20 ml NaCl). Pärast 24 tundi toatemperatuuril pideva valguse käes aereerimist korjatakse soolavähivastsed. Aereerimine peatatakse 30 minutiks, et soolavähivastsed saaksid põhja sadestuda. Nõu pinnal ujuvad tsüstid valatakse ära ja kõrvaldatakse ning soolavähivastses filtreeritakse sobivate filtritega ning neile lisatakse 30 ml filtreeritud vett.

Söötmisrežiim

Tabelis 1 esitatakse ülevaade kulleste kokkupuuteperioodil kasutatava sööda liigi ja koguse kohta. Loomi tuleks sööta esmaspäevast reedeni kolm korda päevas ja nädalavahetustel üks kord päevas.

Tabel 1.

X. laevis’e kulleste söötmisrežiim läbivoolusüsteemis.

Aeg (*20) (pärast viljastamist)	Forelli noorkalade sööt: vetikate/TetraFin®-i (või samaväärse sööda) segu		Soolavähivastsed
Aeg (*20) (pärast viljastamist)	Tööpäeval (kolm korda päevas)	Nädalavahetusel (üks kord päevas)	Tööpäeval (kaks korda päevas)	Nädalavahetusel (üks kord päevas)
4.–14. päev (0–1. nädal)	0,33 ml	1,2 ml	0,5 ml (8.–15. päev) 1 ml (alates 16. päevast)	0,5 ml (8.–15. päev) 1 ml (alates 16. päevast)
2. nädal	0,67 ml	2,4 ml	0,5 ml (8.–15. päev) 1 ml (alates 16. päevast)	0,5 ml (8.–15. päev) 1 ml (alates 16. päevast)
3. nädal	1,3 ml	4,0 ml	1 ml	1 ml
4. nädal	1,5 ml	4,0 ml	1 ml	1 ml
5. nädal	1,6 ml	4,4 ml	1 ml	1 ml
6. nädal	1,6 ml	4,6 ml	1 ml	1 ml
7. nädal	1,7 ml	4,6 ml	1 ml	1 ml
8.–10. nädal	1,7 ml	4,6 ml	1 ml	1 ml

Sööda muutmine üleminekul kullesest noorkonna staadiumisse

Pärast kulleste moonet hakatakse neid toitma noorkonnadele ette nähtud söödaseguga, mida on kirjeldatud allpool. Üleminekuperioodil tuleks kulleste söödasegu kogust järk-järgult vähendada ja noorkonnade sööda kogust suurendada. Selleks võib kullesesööda kogust proportsionaalselt vähendada ja noorkonnasööda kogust proportsionaalselt suurendada, võttes aluseks viieliikmelised kulleserühmad vastavalt sellele, kuidas nad läbivad NFi järgi 62. staadiumi ja lähenevad NFi järgi 66. staadiumis moonde lõpule.

Noorkonnade söötmine

Noorkonnade sööt

Kui moone on lõppenud (66. staadium) tuleks söötmisrežiimis täielikult üle minna 3/32-tollisele kvaliteetsele uppuvale konnasöödale (nt Xenopus ExpressTM, FL, Ameerika Ühendriigid, või samaväärne sööt).

Graanulite peenestamine kullese noorkonnaks arenemise etapil

Uppuva konnasööda graanuleid jahvatatakse põgusalt kohviveskis, blenderis või peenestatakse uhmris, et vähendada nende suurust ligikaudu 1/3 võrra. Liiga pikalt töötlemine muudaks graanulid pulbriks ja seda ei soovitata.

Söötmisrežiim

Tabelis 2 esitatakse ülevaade noorkonna ja täiskasvanud konna staadiumis kasutatava sööda liigi ja koguse kohta. Loomi tuleks sööta kord päevas. Oluline on märkida, et moondeperioodil jätkatakse loomade söötmist soolavähivastsetega seni, kuni > 95 % loomadest on moonde läbinud.

Loomi ei tohiks sööta katse lõpetamise päeval, et sööt ei moonutaks kehamassi mõõtmise tulemusi.

Tabel 2.

X. laevis’e noorkonnade söötmisrežiim läbivoolusüsteemis. Tuleb arvestada, et moonde-eelses staadiumis loomad (k.a need, kelle moone kemikaaliga töötlemise tõttu hilineb) ei suuda süüa peenestamata graanuleid

Aeg (*21) (nädalat pärast moonde mediaanpäeva)	Peenestatud graanulid (mg noorkonna kohta)	Terved graanulid (mg noorkonna kohta)
Vastavalt moonde läbinud loomade arvule	25	0
0–1. nädal	25	28
2.–3. nädal	0	110
4.–5. nädal	0	165
6.–9. nädal	0	220

5. liide

GENEETILISE SOO MÄÄRAMINE

Xenopus laevis’e puhul kasutatav geneetilise soo määramise meetod põhineb Yoshimoto et al. (2008) esitatud kirjeldusel. Genotüübi määramise metoodika üksikasju saab vajaduse korral lugeda viidatud publikatsioonist. Kasutada võib ka muid sobivaks tunnistatud meetodeid (nt kõrge läbilaskevõimega qPCR).

X. laevis’e praimerid

DM-W marker

Otsepraimer	:	5’-CCACACCCAGCTCATGTAAAG-3’
Pöördpraimer	:	5’-GGGCAGAGTCACATATACTG-3’

Positiivne kontroll

Otsepraimer	:	5’-AACAGGAGCCCAATTCTGAG-3’
Pöördpraimer	:	5’-AACTGCTTGACCTCTAATGC-3’

DNA puhastamine

DNA puhastamiseks lihas- või nahakoest kasutatakse näiteks verele ja kudedele ette nähtud Qiagen DNeasy komplekti (kat nr 69 506) või muud sarnast toodet vastavalt selle kasutusjuhendile. DNA voolutamisel segamiskolonnist võib kasutada vähem puhvrit, et saada suurema kontsentratsiooniga proove, kui seda peetakse PCRi jaoks vajalikuks. Pange tähele, et DNA on küllaltki püsiv ja seetõttu tuleks rakendada meetmeid, et vältida ristsaastumist, mis võib põhjustada isaste ekslikku emaseks pidamist või vastupidi.

PCR

Tabelis 1on esitatud ülevaade analüüsimetoodikast, milles kasutatakse Sigma toodetud ensüümi JumpStartTM Taq.

Tabel 1.

Sigma toodetud ensüümil JumpStartTM Taq põhinev analüüsimetoodika

Põhisegu	1x (μl)	[Lõplik]
NFW (112)	11	—
10x puhver	2,0	—
MgCl2 (25 mM)	2,0	2,5 mM
dNTP-d (igaüks 10 mM)	0,4	200 μM
Praimeri marker (8 μM)	0,8	0,3 μM
Pöördpraimeri marker (8 μM)	0,8	0,3 μM
Praimeri kontroll (8 μM)	0,8	0,3 μM
Pöördpraimeri kontroll (8 μM)	0,8	0,3 μM
JumpStartTM Taq	0,4	0,05 ühikut/μl
DNA matriits	1,0	~200 pg/μl
Märkus. Põhisegu tuleks valmistada varuga, et kompenseerida pipeti kasutamisel tekkivaid kadusid (näide: 24 reaktsiooni jaoks 25-kordne kogus).

Reaktsioon:

Põhisegu	19,0 μl
Matriits	1,0 μl
Kokku	20,0 μl

Termotsükleri programm:

1. etapp	94oC	1 min
2. etapp	94oC	30 s
3. etapp	60oC	30 s
4. etapp	72oC	1 min
5. etapp	Tagasi 2. etappi.	35 tsüklit
6. etapp	72oC	1 min
7. etapp	4oC	hoida

Polümeraasi ahelreaktsiooni saadustega võib kohe teha analüüsi geelis või hoida neid 4oC juures.

Elektroforees agaroosgeeliga (3 %) (analüüsimetoodika)

50X TAE

Tris	24,2 g
Jää-äädikhape	5,71 ml
Na2 (EDTA)·2H2O	3,72 g

Lisada vett mahuni 100 ml

1X TAE

H2O	392 ml
50X TAE	8 ml

3: 1 agaroos

3 osa NuSieve™ GTG™ agaroosi

1 osa madala elektroendoosmoosiga Fisheri agaroosi

Meetod

1.	Valmistada 3 % geel: 43 ml 1X TAE puhvrile lisada 1,2 g agaroosisegu. Keerutada segu suurte klompide eemaldamiseks.

2.	Kuumutada agaroosisegu mikrolaineahjus kuni täieliku lahustumiseni (vältida ülekeemist). Lasta veidi jahtuda.

3.	Lisada 1,0 μL etiidiumbromiidi (10 mg/ml). Keerutada kolbi. Etiidiumbromiid on mutageenne aine ning seetõttu tuleks kõnealusel etapil tehnilise võimaluse korral kasutada muid kemikaale, et vältida ohtu töötajate tervisele (113).

4.	Valada geel kammi abil vormi. Lasta täielikult jahtuda.

5.	Lisada geel seadmesse. Katta geel 1X TAE puhvriga.

6.	Lisada igale 10 μl PCRi produktile 1 μl 6x laadimisvärvi.

7.	Kanda proovid pipetiga süvenditesse.

8.	Rakendada ~20 minuti jooksul ühtlast 160 V pinget.

Joonisel 1 on kujutatud agaroosgeelipilti, millel on näha isas- ja emasisendite iseloomulikud ribamustrid.

Joonis 1. Agaroosgeelipilt, millel on näha isase (♂) isendi ribamuster (üks riba ~203 bp: DMRT1) ja emase (♀) isendi ribamuster (kaks riba ~259 bp: DM-W ja 203 bp: DMRT1).

KIRJANDUS

Yoshimoto, S., Okada, E., Umemoto, H., Tamura, K., Uno, Y., Nishida-Umehara, C., Matsuda, Y., Takamatsu, N., Shiba, T. ja Ito, M. (2008), „A W-linked DM-domain gene, DM-W, participates in primary ovary development in Xenopus laevis“, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, nr 105, lk 2469–2474.

6. liide

VITELLOGENIINI MÕÕTMINE

Vitellogeniini (VTG) mõõdetakse ensüümimmuunsorptsioonanalüüsi (ELISA) meetodiga, mis töötati algselt välja lepamaimu VTG uurimiseks (Parks et al., 1999). Praegu ei ole X. laevis’e analüüsi jaoks müügil antikehasid. Ent arvestades kõnealuse valgu kohta kättesaadavate andmete rohkust ja soodsate kaubanduslike antikehade valmistamise teenuste olemasolu, võib eeldada, et laboritel on lihtne välja töötada ELISA metoodika kõnealuse näitaja mõõtmiseks (Olmstead et al., 2009). Olmstead et al. (2009) kirjeldavad ka analüüsimeetodit, mida on kohandatud X. tropicalis’e jaoks, nagu allpool näidatud. Meetodi kohaselt kasutatakse X. tropicalis’e VTG vastast antikeha, kuid teadaolevalt toimib see ka X. laevis’e VTG puhul. Kasutada võib ka mittekonkurentseid ELISA meetodeid, mille puhul alumine avastamispiir võib olla madalam kui allpool kirjeldatud meetodiga.

Materjalid ja reaktiivid

—	Eeladsorbeertud 1. antikeha seerum

—	Segada üks osa X. tropicalis’e VTG 1. antikeha seerumit kahe osa kontrollisase plasmaga ja jätta u 75 minutiks toatemperatuurile, panna 30 minutiks jääle, tsentrifuugida 4oC juures ühe tunni jooksul kiirendusega > 20K × G, eemaldada supernatant, võtta alikvoot, hoida temperatuuril –20oC.

—	2. antikeha

—	Kitse anti-küüliku IgG-HRP konjugaat (nt Bio-Rad 172-1019)

—	VTG etalon

—	Puhastatud X. laevis’e VTG kontsentratsiooniga 3,3 mg/ml

—	TMB (3,3',5,5'-tetrametüülbensidiin) (nt KPL 50-76-00 või Sigma T0440)

—	Kitse normaalseerum (NGS)(nt Chemicon® S26 – 100 ml)

—	96 süvendiga ensüümimmuunanalüüsiks kasutatavad polüstüreenist mikrotiiterplaadid (nt ICN 76-381-04, Costar 53590, Fisher 07-200-35)

—	37oC hübridisatsiooniahi (või kiiresti tasakaalustuv õhuinkubaator) plaatidele, vesivann katseklaasidele

—	Muud tavapärased laboriseadmed, kemikaalid ja materjalid

Koostised

Kattepuhver (50 mM karbonaatpuhver, pH 9,6):

NaHCO3	1,26 g
Na2CO3	0,68 g
vesi	428 ml

10X fosfaatpuhvri lisandiga soolalahus (PBS) (0,1 M fosfaati, 1,5 M NaCl):

NaH2PO4.H2O	0,83 g
Na2HPO4.7 H2O	20,1 g
NaCl	71 g
vesi	810 ml

Pesupuhver (PBST):

10X PBS	100 ml
vesi	900 ml

1 M HCl abil reguleerida pH väärtusele 7,3, seejärel lisada 0,5 ml Tween-20

Analüüsipuhver:

Kitse normaalseerum (NGS)	3,75 ml
Pesupuhver	146,25 ml

Proovide võtmine

Vereproov võetakse hepariniseeritud mikrohematokriti katseklaasiga ja asetatakse jääle. Pärast 3 minuti vältel tsentrifuugimist tehakse katseklaasile täke, see murtakse lahti ja plasma valatakse 0,6 ml mikrotsentrifuugianumatesse, mis sisaldavad 0,13 ühikut lüofiilitud aprotiniini. (Need anumad valmistatakse juba varem ette: neisse lisatakse vajalik kogus aprotiniini, mis külmutatakse ja lüofiilitakse vaakumkuivatis madalal kuumusel kuivamiseni.) Plasmat hoitakse kuni analüüsi tegemiseni temperatuuril –80oC.

Plaadi puhul kasutatav metoodika

Plaadi katmine

Segada 20 μl puhastatud VTGd 22 ml karbonaatpuhvriga (lõppkontsentratsioon 3 μg/ml). Lisada 200 μl 96 süvendiga plaadi igasse süvendisse. Katta plaat kleepuva kattekilega ja panna 37oC juures 2 tunniks (või 4oC juures ööks) inkubeerima.

Plaadi blokeerimine

Blokeerimislahuse valmistamiseks lisatakse 38 ml karbonaatpuhvrile 2 ml kitse normaalseerumit (NGS). Eemaldada kattelahus ja raputada kuivaks. Lisada igasse süvendisse 350 μl blokeerimislahust. Katta kleepuva kattekilega ja panna 37oC juures 2 tunniks (või 4oC juures ööks) inkubeerima.

Standardlahuste valmistamine

5,8 μl puhastatud VTG etalonainet segatakse borosilikaadist ühekordses 12 × 75 mm katseklaasis 1,5 ml analüüsipuhvriga. Nii saadakse kontsentratsioon 12 760 ng/ml. Seejärel tehakse lahjenduste seeria: selleks lisatakse iga kord 750 μl eelmise kontsentratsiooniga lahust 750 μl analüüsipuhvrile, et saada lõppkontsentratsioonid 12 760, 6 380, 3 190, 1 595, 798, 399, 199, 100 ja 50 ng/ml.

Proovide ettevalmistamine

Alustuseks võtta plasmat, mis on analüüsipuhvris lahustatud vahekorras 1: 300 (1 μl plasmat segatud 299 μl analüüsipuhvriga) või 1: 30. Kui oletatakse, et VTG sisaldus on suur, võib kasutada täiendavaid või suuremaid lahjendusi. B/Bo tuleks püüda hoida etalonainete vahemikus. Kui proovide eeldatav VTG sisaldus ei ole märkimisväärne, näiteks kontrollrühma (suguküpsemata) emaste ja isaste puhul, kasutatakse lahjendusvahekorda 1: 30. Sellest väiksema lahjendusega proovidel võivad ilmneda ebasoovitavad maatriksefektid.

Lisaks soovitatakse igal plaadil analüüsida positiivset kontrollproovi. Selleks kasutatakse kõrge indutseeritud VTG sisaldusega plasmat. Plasma lahjendatakse algselt kitse normaalseerumis, jagatakse alikvootideks ja säilitatakse –80oC juures. Iga plaadi jaoks sulatatakse üks alikvoot, mida lahjendatakse täiendavalt analüüsipuhvris ja mida töödeldakse samuti nagu uuritavat proovi.

1. antikehaga inkubeerimine

Esimese antikeha ettevalmistamiseks tehakse eeladsorbeeritud 1. antikeha seerumist analüüsipuhvris lahjendus vahekorras 1: 2000 (nt 8 μl seerumit 16 ml analüüsipuhvri kohta). Segada 300 μl 1. antikeha lahust katseklaasis 300 μl proovi/standardlahusega. Sarnaselt valmistatakse 300 μl analüüsipuhvri ja 300 μl antikehalahusega ette katseklaas Bo. Lisaks tuleks ette valmistada mittespetsiifilise sideme (NSB) katseklaas, kuhu lisatakse üksnes 600 μl analüüsipuhvrit (ilma antikehadeta). Katseklaasid kaetakse Parafilm-kilega ja keerutatakse ettevaatlikult nende sisu segamiseks. Inkubeerida tund aega 37oC veevannis.

Plaadi pesemine

Plaati tuleb pesta vahetult enne 1. antikehaga inkubeerimise lõppu. Selleks raputatakse plaat tühjaks ja patsutatakse kuivatuspaberiga kuivaks. Seejärel täidetakse süvendid 350 μl pesulahusega, valatakse tühjaks ja patsutatakse kuivaks. Selleks on hea kasutada mitme kanaliga pipetti või plaadipesurit. Pesemist korratakse veel kaks korda nii, et kokku tehakse kolm pesu.

Plaadi täitmine

Pärast plaadi pesemist eemaldada katseklaasid veevannist ja keerutada neid õrnalt. Lisada igast proovist, standardlahusest ning Bo- ja NSB-klaasist 200 μl plaadi kahte süvendisse. Katta plaat kleepuva kattekilega ja panna 37oC juures üheks tunniks inkubeerima.

2. antikehaga inkubeerimine

Eelmise etapi inkubatsiooniosa lõpus tuleks plaati taas kolm korda pesta nagu enne. 2. antikehaga lahjenduse valmistamiseks segatakse 2,5 μl 2. antikeha seerumit 50 ml analüüsipuhvriga. Lisada igasse süvendisse 200 μl 2. antikeha lahjendust, katta kinni, nagu eespool kirjeldatud, ja inkubeerida 37oC juures üks tund.

Substraadi lisamine

Pärast 2. antikehaga inkubeerimist tuleb plaati kolm korda pesta, nagu eespool kirjeldatud. Seejärel lisada igasse süvendisse 100 μl TMB substraati. Lasta reaktsioonil 10 minutit toimuda, eelistatavalt nii, et plaat ei ole ereda valguse käes. Reaktsiooni peatamiseks lisada 100 μl 1 M fosforhapet. Seepeale muutub vedeliku värv sinisest erekollaseks. Mõõta plaadilugeriga neelduvus lainepikkusel 450 nm.

Suhtarvu B/B0 arvutamine

Kõikidest mõõtmistulemustest lahutatakse NSB keskväärtus. Iga proovi ja standardlahuse B/B0 arvutamiseks jagatakse neelduvuse väärtus (B) proovi keskmise neelduvusega B0.

Standardkõvera loomine ja tundmatute koguste kindlakstegemine

Standardkõver luuakse arvutitarkvaraga (nt SlidewriteTM või Sigma Plot®), mis ekstrapoleerib standardlahuste B/B0 väärtusi kasutades proovi B/B0 põhjal uuritava valgu koguse. Tavaliselt märgitakse logaritmilisel skaalal esitatud kogus graafikul sigmoidikujulise kõverana. Ent kitsa standardlahuste vahemiku kasutamise korral võib see olla ka lineaarne. Proovi koguseid korrigeeritakse lahjendusteguri arvessevõtmiseks ning tulemused esitatakse VTG sisaldusena milligrammides plasma milliliitri kohta.

Alumise avastamispiiri määramine

Sageli, eriti normaalsete isaste puhul, ei ole selge, kuidas esitada väga väikeste väärtustega tulemusi. Sel juhul tuleks 95 % usalduspiiri kasutades otsustada, kas märkida väärtuse kohta protokolli null või mõni muu number. Kui proovi tulemus jääb nullkontsentratsiooniga standardlahuse (B0) usaldusvahemikku, tuleks tulemuseks märkida null. Alumine avastamispiir on kõige väiksem standardlahuse kontsentratsioon, mis erineb püsivalt nullkontsentratsiooniga standardlahusest ehk väärtus, mille puhul kaks usaldusvahemikku ei kattu. Prooviga saadud tulemuse korral, mis jääb alumise avastamispiiri usaldusvahemikku või on sellest suurem, märgitakse arvutatud väärtus. Kui prooviga saadud tulemus jääb nullkontsentratsiooniga standardlahuse ja alumise avastamispiiri usaldusvahemiku vahele, tuleks vastava proovi tulemuseks märkida pool alumise avastamispiiri väärtusest.

KIRJANDUS

Olmstead, A.W., Korte, J.J., Woodis, K.K., Bennett, B.A., Ostazeski, S. ja Degitz, S.J. (2009), „Reproductive maturation of the tropical clawed frog: Xenopus tropicalis“, General and Comparative Endocrinology, nr 160, lk 117–123.

Parks, L.G., Cheek, A.O., Denslow, N.D., Heppell, S.A., McLachlan, J.A., LeBlanc, G.A. ja Sullivan, C.V. (1999), „Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterisation and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds“, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, nr 123, lk 113–125.

7. liide

STATISTILINE ANALÜÜS

LAGDAga saadakse kolme liiki andmeid, mida tuleb statistiliselt analüüsida: 1) kvantitatiivsed pidevandmed, 2) arengu kiirust näitavad sündmuseni kulunud aja andmed (aeg NFi järgi 62. staadiumini) ning 3) järjestusandmed, mis esitatakse histopatoloogilise analüüsi põhjal raskusastme või arengustaadiumi kujul. Joonisel 1 on esitatud soovitatav otsustusskeem statistilise analüüsimeetodi leidmiseks. Lisaks on allpool esitatud mõned kommentaarid, mis võivad olla vajalikud LAGDAga kogutud mõõtmisandmete statistilise analüüsi tegemiseks. Analüüsimeetodite otsustusskeemi järgi tuleb suremuse, kasvu (kehamass ja pikkus) ja maksa somaatilise indeksi (LSI) mõõtmistulemusi analüüsida vastavalt harule „Muud lõppnäitajad“.

Pidevandmed

Pidevate näitajate andmete puhul tuleks kõigepealt kontrollida nende monotoonsust. Selleks tehakse andmetega dispersioonanalüüsi mudeli jaoks sobiv astakteisendus ning võrreldakse lineaar- ja ruutkontraste. Kui andmed on monotoonsed, tuleks paralleelproovide mediaanväärtuste suhtes rakendada sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere-Terpstra trenditesti ilma edasiste analüüsideta. Teine variant, mida saab kasutada normaaljaotuse ja homogeense dispersiooniga andmete puhul, on sammuviisilise elimineerimisega Williamsi test. Kui andmed ei ole monotoonsed (ruutkontrast on oluline ja lineaarkontrast ei ole), tuleks neid analüüsida segamõjuga dispersioonanalüüsi mudeli abil. Seejärel tuleks hinnata andmete normaaljaotust (eelistatavalt Shapiro-Wilki või Anderson-Darlingi testiga) ja dispersiooni homogeensust (eelistatavalt Levene’i testiga). Mõlemad testid tehakse segamõjuga dispersioonanalüüsi mudeli jääkidega. Normaaljaotuse ja dispersiooni homogeensuse formaalsete testide asemel võib kasutada ka eksperthinnangut, kuid formaalseid teste tuleb eelistada. Kui andmed on normaaljaotuse ja homogeense dispersiooniga, siis on segamõjuga dispersioonanalüüsi eeldused täidetud ja kontsentratsiooni oluline toime tehakse kindlaks Dunnetti testiga. Mittenormaaljaotuse või heterogeense dispersiooni korral Dunnetti testi eeldused ei kehti ning vaja on leida normaliseeriv ja dispersiooni ühtlustav teisendus. Kui selline teisendus leitakse, tehakse kontsentratsiooni oluline toime kindlaks Dunni testiga. Võimaluse korral tuleks eelistada ühepoolset testi kahepoolsele, aga seda, kumb neist on konkreetse näitaja puhul asjakohane, tuleks otsustada eksperdihinnangu põhjal.

Suremus

Suremuse andmeid tuleks analüüsida kogu katset hõlmava ajavahemiku ulatuses ning need tuleks esitada konkreetses nõus surnud isendite protsendina. Ettenähtud aja jooksul moonet mitteläbinud kulleste, kulleste osaprooviks välja võetud kulleste, väljapraagitud noorkonnade ja katse läbiviija vea tagajärjel surnud loomade andmed tuleks analüüsist välja jätta ning mitte lisada neid protsendimäära arvutamise valemi nimetajasse. Enne mis tahes statistilist analüüsi tuleks suremuse protsendi andmetega teha arkussiinus-ruutjuurteisendus. Teine variant on kasutada astmelise elimineerimisega Cochran-Armitage’i testi, mida võidakse üledispersiooni korral täiendada Rao-Scotti kohandusega.

Kehamass ja pikkus (kasvuandmed)

Isaste ja emaste sootunnused ei ole moonde ajal eristatavad ja seetõttu tuleks kulleste osaproovis mõõdetud kasvuandmeid analüüsida soost sõltumatult. Seevastu noorkonnade kasvuandmeid tuleks analüüsida geneetiliste sugude lõikes. Kõnealuste näitajate puhul võib vajalik olla logaritmteisendus, sest suuruseandmetes esineb sageli logaritmilist normaaljaotust.

Maksa somaatiline indeks (LSI)

Maksa massi käsitlevate andmete normaliseerimiseks tuleks need esitada osakaaluna kehamassist (st LSI kujul) ja neid tuleks analüüsida eraldi geneetiliste sugude lõikes.

NFi järgi 62. staadiumisse jõudmiseks kulunud aeg

Moondeni kulunud aeg tuleks liigitada sündmuse toimumiseni kulunud aja andmete kategooriasse, kus surmajuhte ja 70 päeva jooksul NFi järgi 62. staadiumisse mittejõudnud isendite andmeid käsitatakse paremalt tsenseeritud andmetena (st tegelik väärtus on suurem kui 70 päeva, aga uuring lõppes enne, kui loomad jõudsid NFi järgi 62. staadiumisse). Katse lõpetamise päeva kindlaksmääramise aluseks tuleks võtta lahjendusveega kontrollrühmades NFi järgi 62. staadiumi (moonde) läbimiseni kulunud mediaanaeg. Moonde lõpetamiseni kulunud mediaanaeg tuleks kindlaks teha Kaplan-Meieri hinnangufunktsioonidega ajapiiri määramiseks. Kõnealust näitajat tuleks analüüsida segamõjudega proportsionaalseid ohte käsitleva Coxi mudeli abil, milles võetakse arvesse uuringu paralleelproovide struktuuri.

Histopatoloogilised andmed (raskusastmed ja arengustaadiumid)

Histopatoloogilised andmed esitatakse raskusastmete või arengustaadiumite kujul. Testis RSCABS (Rao-Scotti kohandusega Cochrane-Armitage’i lõiktest) kasutatakse iga histopatoloogilise raskusastme suhtes Rao-Scotti kohandusega astmelise elimineerimise Cochran-Armitage’i trenditesti (Green et al., 2014). Rao-Scotti kohandus võimaldab testis arvesse võtta katses rakendatud paralleelnõude kasutamise kava. Nn lõiktesti metoodikas on arvesse võetud bioloogilist eeldust, et kemikaali kontsentratsioonide suurenedes kasvab ka raskusaste, säilitades samal ajal subjektide individuaalsed skoorid ja tuues välja tuvastatud toimete tugevuse. Lisaks sellele, et RSCABSi metoodika võimaldab kindlaks teha, millised töödeldud rühmad erinevad statistiliselt kontrollrühmadest (st neis esinevad patoloogiad on raskekujulisemad kui kontrollrühmades), aitab see ka välja selgitada, millise raskusastme juures erinevus tekib, andes seeläbi analüüsi jaoks hädavajalikku taustteavet. Sugunäärmete ja sugujuhade arenguga seotud andmeid on vaja täiendavalt töödelda, kuna RSCABSi aluseks on eeldus, et toime tugevus kasvab koos annusega. Kõnealusel juhul avaldub toime tavalisest aeglasemas või kiiremas arengus. Seetõttu tuleks arenguga seotud andmeid esmalt analüüsida esitatud kujul, et tuvastada kiirenenud arengut, ning seejärel enne teist analüüsi manuaalselt ümber pöörata, et tuvastada arengu mahajäämusi.

Joonis 1

LAGDAga kogutud andmete statistilise analüüsi otsustusskeem.

KIRJANDUS

Green, J.W., Springer, T.A., Saulnier, A.N. ja Swintek, J. (2014), „Statistical analysis of histopathology endpoints“, Environmental Toxicology and Chemistry, nr 33, lk 1 108–1 116.

8. liide

SKOLIOOSI JÄLGIMISE JA SELLE ESINEMISE VÄHENDAMISEGA SEOTUD KAALUTLUSED

Idiopaatiline skolioos, mis avaldub Xenopus laevis’e kullestel tavaliselt kõverdunud saba kujul, võib raskendada uuritavate populatsioonide morfoloogia ja käitumise vaatlemist. Nii katseorganismide kasvatamise ajal kui ka katse tingimustes tuleb püüda skolioosi esinemist vähendada või see välistada. Lõplikus katses ei tohiks mõõduka ja raske skolioosi levimus soovitatavalt ületada 10 %, kuna see tagab suurema kindluse, et katsega on võimalik tuvastada just kemikaalist tingitud toimet muidu tervete kulleste arengule.

Lõpliku katse ajal tehtavate igapäevaste vaatluste käigus tuleks registreerida nii avastatud skolioosijuhtude arv kui ka raskusaste. Väärarengu kirjelduses tuleks märkida selle asukoht (nt pärakuavast ees- või tagapool) ja kõverdumise suund (nt külgmine või selja poolt kõhu poole). Raskusastmeid võib liigitada järgmiselt:

NR – ebaoluline: kõverdumist ei esine;

1) – kerge: väike külgmine kõverdumine pärakuavast tagapool; nähtav üksnes puhkeolekus;

2) – mõõdukas: külgmine kõverdumine pärakuavast tagapool; nähtav kogu aeg, aga ei takista liikumist;

3 – raske: külgmine kõverdumine pärakuavast eespool VÕI liikumist takistav mis tahes kõverdumine VÕI mis tahes kõverdumine selja poolt kõhu poole.

USA Keskkonnakaitseameti juures tegutsev insektitsiidide, fungitsiide ja rodentitsiide käsitlev teadusnõukogu (FIFRA SAP 2013) on läbi vaadanud X. laevis’ega (NFi järgi 51. kuni 60. või kõrgemas staadiumis) tehtud viieteistkümne kahepaiksete moonde katse koondandmed skolioosi kohta ning on esitanud üldised soovitused selle kõrvalekalde levimuse vähendamiseks uuritavates populatsioonides. Need soovitused on asjakohased ka LAGDA puhul, kuigi see katse hõlmab pikemat arenguperioodi.

Varasemad kudemisnäitajad

Üldjuhul tuleks sigimispaarid moodustada kvaliteetsetest tervetest täiskasvanud isenditest. Skolioosiga järglasi andvate sigimispaaride kõrvaldamine võib aja jooksul selle esinemissagedust vähendada. Konkreetsemalt võib kasu olla sellest, kui kasutatakse vähem loodusest püütud sigimisloomi. LAGDA kokkupuuteperiood algab siis, kui embrüod on NFi järgi 8.–10. arengustaadiumis, ning katse alguses ei ole praktiliselt võimalik kindlaks teha, kas konkreetsetel isenditel tekib skolioos. Seega tuleks lisaks skolioosi varasema esinemise kontrollimisele katsesse kaasatud loomade seas dokumenteerida ka kurnade haiguslood (sh skolioosi levimus nende kulleste seas, kellel lastakse areneda). Kasu võib olla ka sellest, kui jälgida uuringus kasutamata jäänud kurnaosa edasist arengut ja nende vaatluste tulemused teatavaks teha (FIFRA SAP 2013).

Vee kvaliteet

Oluline on tagada piisavalt hea vee kvaliteet nii labori kasvukeskkonnas kui ka katse ajal. Lisaks veeorganismidele mõjuva mürgisuse katsete jaoks tavapäraselt kontrollitavatele veekvaliteedi näitajatele võib olla kasulik jälgida ja korrigeerida ka võimalikke toiteainete puudujääke (nt C-vitamiini-, kaltsiumi- või fosforivaegus) või liigne seleeni- ja vasesisaldus, mille puhul on täheldatud skolioosi põhjustavat mitmesuguse tugevusega toimet laboris kasvatatud Rana ja Xenopus’e liikidele (Marshall et al. 1980; Leibovitz et al. 1992; Martinez et al. 1992; andmed publikatsioonist FIFRA SAP 2013). Üldiselt saab vee kvaliteeti ja katsealuste liikide tervist parandada sobiva söötmisrežiimi valimise (vt 4. liide) ja nõu regulaarse puhastamisega.

Söötmine

Konkreetsed soovitused LAGDA puhul edukaks osutunud söötmisrežiimi kohta on esitatud 4. liites. Soovitatavalt tuleks kasutatavat sööta kontrollida bioloogiliste mürkainete, herbitsiidide ja muude X. laevis’el või teistel veeloomadel skolioosi põhjustavate pestitsiidide suhtes (Schlenk ja Jenkins 2013). Näiteks on leitud seos mõnede koliinesteraasi inhibiitorite ja skolioosi vahel nii kaladel (Schultz et al. 1985) kui ka konnadel (Bacchetta et al. 2008).

KIRJANDUS

Bacchetta, R., Mantecca, P., Andrioletti, M., Vismara, C. ja Vailati, G. (2008), „Axial-skeletal defects caused by carbaryl in Xenopus laevis embryos”, Science of the Total Environment, nr 392, lk 110–118.

Schultz, T.W., Dumont, J.N. ja Epler, R.G. (1985), The embryotoxic and osteolathyrogenic effects of semicarbazide“, Toxicology, nr 36, lk 185–198.

Leibovitz, H.E., Culley, D.D. ja Geaghan, J.P. (1982), „Effects of vitamin C and sodium benzoate on survival, growth and skeletal deformities of intensively culture bullfrog larvae (Rana catesbeiana) reared at two pH levels”, Journal of the World Aquaculture Society, nr 13, lk 322–328.

Marshall, G.A., Amborski, R.L. ja Culley, D.D. (1980), „Calcium and pH requirements in the culture of bullfrog (Rana catesbeiana) larvae”, Journal of the World Aquaculture Society, nr 11, lk 445–453.

Martinez, I., Alvarez, R., Herraez, I. ja Herraez, P. (1992), „Skeletal malformations in hatchery reared Rana perezi tadpoles”, Anatomical Records, nr 233(2), lk 314–320.

Schlenk, D. ja Jenkins, F. (2013), „Endocrine Disruptor Screening Prog (EDSP) Tier 1 Screening Assays and Battery Performance”, US EPA FIFRA SAP Minutes, nr 2013-03. 21.–23. mai 2013. Washington, DC.

“

(1) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).

(2) Need pädevusained, mis on järjestatud esmalt nii, et söövitavad ained on esitatud enne mittesöövitavaid aineid, ning seejärel söövitavuse alamkategooria ja edasi kemikaaliklassi järgi, on valitud ainete hulgast, mida kasutati Alternatiivsete Meetodite Valideerimise Euroopa Keskuse (ECVAM) uuringus roti naha TET-l põhineva katsemeetodi valideerimiseks (8, 9). Kui ei ole teisiti märgitud, uuriti kõnealuseid aineid sellise puhtusastme juures, nagu need kaubanduslikust allikast osteti (8). Ainete valimisel lähtuti võimalikult suurel määral sellest, et: i) need oleksid VSMi abil mõõdetava või ennustatava eri söövitavusega (nt mittesöövitavad, nõrgalt söövitavad ja tugevalt söövitavad ained), ii) need esindaksid valideerimisuuringus kasutatud kemikaaliklasse, iii) VSMi tulemuslikkuse näitajad oleksid arvesse võetud, iv) ainetel oleks täpselt määratletud keemiline struktuur, v) need võimaldaksid saada standardse in vivo katsemeetodiga selgepiirilisi tulemusi, vi) need oleksid turul kättesaadavad ning vii) nende kõrvaldamise kulud ei oleks liiga suured.

(3) Kemikaaliklass, mille on kindlaks määranud Barratt et al. (8).

(4) ÜRO GHSi / CLP-määruse kohastele 1A, 1B ja 1C kategooriatele vastavad ÜRO I, II ja III pakendirühm.

(5) Need pH väärtused on avaldanud Fentem et al. (9) ja Barratt et al. (8).

(6) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).

(7) Mõiste „inimese rekonstrueeritud marrasknahk“ ingliskeelse vaste lühendit RhE (Reconstructed human Epidermis) kasutatakse kõikide inimese rekonstrueeritud marrasknaha tehnoloogial põhinevate mudelite puhul. Mudeli SkinEthic™ puhul kasutatava lühendi RHE tähendus on sama, ent kuna see on osa nimest, mille all kõnealust konkreetset katsemeetodit turustatakse, kirjutatakse see läbivalt suurtähtedega.

(8) Need pädevusained, mis on järjestatud esmalt nii, et söövitavad ained on esitatud enne mittesöövitavaid aineid, ning seejärel söövitavuse alamkategooria ja edasi kemikaaliklassi järgi, on valitud ainete hulgast, mida kasutati Alternatiivsete Meetodite Valideerimise Euroopa Keskuse (ECVAM) uuringutes mudelite EpiSkin™ ja EpiDerm™ valideerimiseks (8, 9, 10) ning valideerimisjärgsetes uuringutes vastavalt andmetele, mille on esitanud mudelite EpiSkin™ (22), EpiDerm™, SkinEthic™ ja epiCS® väljatöötajad (23). Kui ei ole teisiti märgitud, uuriti kõnealuseid aineid sellise puhtusastme juures, nagu need kaubanduslikust allikast osteti (8, 10). Ainete valimisel lähtuti võimalikult suurel määral sellest, et: i) need oleksid VSMide abil mõõdetava või ennustatava eri söövitavusega (nt mittesöövitavad, nõrgalt söövitavad ja tugevalt söövitavad ained), ii) need esindaksid valideerimisuuringutes kasutatud kemikaaliklasse, iii) ainetel oleks täpselt määratletud keemiline struktuur, iv) VSMi abil nendega saadud tulemused oleksid reprodutseeritavad, v) need võimaldaksid saada standardse in vivo katsemeetodiga selgepiirilisi tulemusi, vi) need oleksid turul kättesaadavad ning vii) nende kõrvaldamise kulud ei oleks liiga suured.

(9) Kemikaaliklass, mille on kindlaks määranud Barratt et al. (8).

(10) ÜRO GHSi / CLP-määruse kohastele 1A, 1B ja 1C alamkategooriatele vastavad ÜRO I, II ja III pakendirühm.

(11) Tabelis esitatud prognoos, mis põhineb in vitro tulemustel, on saadud katsemudelite EpiSkin™ ja EpiDerm™ (VSMid) kasutamisel valideerimisjärgsetes katsetes, mille viisid läbi kõnealuste meetodite väljatöötajad.

(12) Nahasöövituse hindamiseks tehtud ECVAMi valideerimisuuringutes saadud eluvõimelisuse näitajaid ei ole korrigeeritud MTT otsese redutseerimise suhtes (valideerimisuuringutes ei kasutatud surmatud rakkudega kontrolle). Ent nende tabelis esitatud andmete puhul, mis on saadud katsemeetodite väljatöötajate tehtud valideerimisjärgsetest katsetest, on kasutatud kohandatud kontrolle (23).

(*1) Andmetest, mis koguti selleks, et hinnata inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsemudelite kasutatavust alamkategooriatesse liigitamise toetamiseks, nähtub, et katsemudeliga EpiSkin™ saadud tulemuste alusel 1A alamkategooriasse liigitatud ainetest/segudest võib umbes 22 % kuuluda tegelikult 1B või 1C alamkategooriasse (st need on üleklassifitseeritud) (vt 3. liide).

(*2) Ühte kemikaali analüüsiti mudeli epiCS® puhul vaid korra, kuna see ei olnud enam kättesaadav (23)

(13) LLOQ – alumine määramispiir, mis määratluse kohaselt vastab kudede eluvõimelisuse määrale 1–2 %; st 0,8 μg/ml.

(14) ULOQ – ülemine määramispiir, millele vastav kontsentratsioon on määratluse kohaselt vähemalt kaks korda suurem kui MTT formasaani suurim eeldatav kontsentratsioon negatiivsetest kontrollproovidest saadud isopropanooliekstraktides; st 200 μg/ml. [[G1]]

(15) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).

(16) Need pädevusained on valitud valideerimisuuringus kasutatud ainete hulgast järgmiste kriteeriumide alusel: i) asjaomased kemikaalid on turul kättesaadavad, ii) nendega saadud tulemused hõlmavad kogu Draize’i ärritavusskaalat (mitteärritavatest ainetest tugevalt ärritavate aineteni), iii) nende keemiline struktuur on täpselt teada, iv) need esindavad valideerimisel kasutatud kemikaalide funktsionaalklasse, v) nendega on saadud eri katsetes ja eri laborites reprodutseeritavad in vitro tulemused, vi) need on in vitro tingimustes õigesti liigitatud ning vii) need ei ole äärmiselt mürgised (nt kantserogeensed või reproduktiivtoksilised) ja nende kõrvaldamise kulud ei ole liiga suured.

(17) Katsemeetodiga B.4 (4) saadud in vivo hindamistulemus.

(18) Käesoleva katsemeetodi raames käsitatakse ÜRO GHSi kohase vabatahtlikult kohaldatava 3. kategooria kemikaale (nõrgalt ärritavad kemikaalid) (1) kategoriseerimata kemikaalidena.

(*3) ECVAMi algsed tulemuslikkuse standardid (21) töötati välja 2007. aastal pärast seda, kui oli viidud lõpule prospektiivne valideerimisuuring (16), milles hinnati katsemudelite nr 1 ja 2 tulemuslikkust seoses ohtlikke aineid käsitlevas kahekümne kaheksandat korda muudetud ELi direktiivis (41) kirjeldatud klassifitseerimissüsteemiga. Aastal 2008 hakati kohaldama ÜRO GHSi (1) ja ELi CLP-määrust, millega suurendati in vivo läviväärtust, mille alusel eristatakse kategoriseerimata aineid kategoriseeritud ainetest, väärtuselt 2,0 väärtuseni 2,3. Selle muutunud regulatiivse nõude järgimiseks ajakohastati 2009. aastal ECVAMi tulemuslikkuse standardites sätestatud täpsuse väärtusi ja võrdluskemikaalide loetelu (2, 39, 40). Sarnaselt algsetele tulemuslikkuse standarditele lähtuti ka ajakohastatud tulemuslikkuse standardite puhul peamiselt mudelitega nr 1 ja 2 saadud andmetest (16), ent peale selle kasutati ka mudeliga nr 3 saadud andmeid võrdluskemikaalide kohta. Aastal 2010 kasutati kõnealuseid ECVAMi ajakohastatud tulemuslikkuse standardeid käesoleva katsemeetodi kohaste tulemuslikkuse standardite sätestamiseks (8). Käesoleva katsemeetodi puhul käsitatakse VSMina meetodit EpiSkin™, kuna seda kasutati kõikide tulemuslikkuse standardites sätestatud kriteeriumide väljatöötamiseks. Üksikasjalik teave valideerimisuuringute kohta, kogutud andmed koondatud kujul ja taustteave tulemuslikkuse standardites tehtud vajalike kohanduste kohta seoses ÜRO GHSi / CLP-määruse rakendamisega on esitatud asjaomast OECD katsejuhendit nr 439 käsitlevas ECVAMi / Saksamaa Föderaalse Riskihindamise Instituudi (BfR) selgitavas taustdokumendis (23).

(19) LLOQ – alumine määramispiir, mis määratluse kohaselt vastab kudede eluvõimelisuse määrale 1–2 %; st 0,8 μg/ml.

(20) ULOQ – ülemine määramispiir, millele vastav kontsentratsioon on määratluse kohaselt vähemalt kaks korda suurem kui MTT formasaani suurim eeldatav kontsentratsioon negatiivsetest kontrollproovidest saadud isopropanooliekstraktides; st 200 μg/ml.

(21) Paaritumisperioodi viimane päev.

(22) Mitme seerumist või plasmast määratava näitaja, eelkõige glükoosi mõõtmisel on soovitatav hommikuni paastuda, peamiselt seepärast, et söömise korral oleks tulemuste varieeruvus paratamatult suurem ning see segaks nõrgema mõju tuvastamist ja muudaks andmete tõlgendamise raskeks. Teisest küljest aga võib hommikuni paastumine häirida (tiinete) loomade üldist ainevahetust ning mõjutab piimaeritust ja imetamiskäitumist, samuti võib see muuta igapäevast uuritava kemikaaliga kokkupuutumise määra, eelkõige uuringutes, kus kasutatakse söödaga manustamist. Kui loomadel lastakse hommikuni paastuda, tuleks kliiniline biokeemiline analüüs teha isasloomade puhul uuringu neljandal nädalal pärast funktsionaalsete vaatluste läbiviimist. Järglastega emasloomi tuleks pärast järglaste eemaldamist (seda tehakse näiteks 13. sünnijärgsel päeval) veel ühe päeva elus hoida. Neil tuleks lasta 13. imetamispäevast 14. imetamispäeva hommikuni paastuda ja kasutada kliiniliste biokeemiliste näitajate määramiseks surmamise ajal võetud vereproovi.

(23) Paaritumisperioodi viimane päev.

(24) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353/1, 31.12.2008).

(25) Happederivaadid ei ole konkreetne klass ning on üldiselt määratletud kui happest kas otseselt, muundamis- või asendusreaktsiooni käigus saadud kemikaal. Sellesse klassi kuuluvad anhüdriidid, halogenohapped, soolad ja muud liiki kemikaalid.

(26) ELis kohaldatakse CLP-määrust, milles on esitatud kolm nahka söövitava aine alamkategooriat: 1A, 1B ja 1C.

(27) Eespool loetletud kaheteistkümne aine seas on igast ÜRO GHSi söövitavate ainete alamkategooriast kolm ainet ja kolm mittesöövitavat ainet; kõik ained on kaubanduses kättesaadavad ja ÜRO GHSi alamkategooriasse on nad määratud in vivo katsel saadud kvaliteetsete tulemuste alusel. Need ained on võetud loendist, mis sisaldab 40 ainet, mis omakorda kuuluvad miinimumloendisse kemikaalidest, mis on kindlaks määratud struktuurilt ja funktsioonilt valideeritud katsemeetodiga sarnaste katsemeetodite täpsuse ja usaldusväärsuse tõendamiseks, ning valiti 163 võrdluskemikaali seast, mida algselt kasutati võrdlusmeetodi (Corrositex®) valideerimiseks (7, 10, 14). Sellise valimise eesmärk oli, et võimaluste piires oleks valikuga hõlmatud kemikaalid, mis: kutsuvad esile söövitusreaktsiooni kogu vahemikus, mida valideeritud võrdlusmeetodiga on võimalik mõõta või prognoosida (st on mittesöövitavad või kuuluvad ÜRO I, II ja III söövitavate ainete pakendirühma); esindavad samu aineklasse, mida kasutati valideerimisel; on hästi teada oleva keemilise struktuuriga; andsid valideeritud võrdlusmeetodiga korratavaid tulemusi; andsid in vivo võrdluskatsel üheselt mõistetavaid tulemusi; on müügil ja mille kõrvaldamine ei ole seotud ülemääraste kuludega (14).

(28) Uuritavad ained puhtal kujul või puhtusastmega ≥ 90 %.

(29) ÜRO pakendirühmad I, II ja III vastavad ÜRO GHSi alamkategooriatele 1A, 1B ja 1C. MS: mittesöövitav.

(30) Suure puhvermahtuvusega uuritavad kemikaalid (6)

(31) Väikese puhvermahtuvusega uuritavad kemikaalid (6)

(32) ÜRO GHSi alamkategooriad 1A, 1B ja 1C vastavad ÜRO I, II ja III pakendirühmale

(33) Enne 2016. aasta juuni nimetati see rakuliin rakuliiniks BG1Luc. BG-1 rakke kirjeldasid algselt Geisinger jt (1998) (35) ning hiljem iseloomustasid neid Ameerika Ühendriikide riikliku keskkonnatervise instituudi (National Institute of Environmental Health Sciences – NIEHS) teadlased (36). Suhteliselt hiljuti avastati, et teadlaste kasutatavatel BG-11 rakkudel on olemas kaks varianti, BG-1 Fr ja BG-1 NIEHS. Nende kahe BG-1 rakuliini variandi põhjalik analüüs (sealhulgas DNA uuring), mille viis läbi Li koos kaastöötajatega (2014) (37), näitas, et BG-1 Fr oli unikaalne ja et BG-1 NIEHS, st katsemeetodi väljatöötamiseks kasutatud algne rakuliin, ei olnud BG-1 inimese munasarja kartsinoomi rakuliin, vaid hoopis inimese rinnavähi rakuliini MCF7 variant. Katsemeetodis kasutatud rakuliini, mida algselt nimetati BG1Luc4E2 (38), nimetatakse nüüd VM7Luc4E2 (V – variant; M7 – MCF7 rakud). Samuti nimetatakse katsemeetodit nüüd VM7Luc ER TA katsemeetodiks. Kuigi katsemeetodi aluseks oleva rakuliini päritolu on teine, ei mõjuta see avaldatud valideerimisuuringuid ega käesoleva katsemeetodi kasutamist östrogeense/antiöstrogeense toimega kemikaalide sõelumiseks.

(1) STTA ja VM7Luc ER TA katsemeetoditega uuritud levinuimad ained, mis määrati kas östrogeeniretseptori agonistiks või negatiivseks ja mida kasutati täpsuse hindamiseks VM7Luc ER TA valideerimisuuringus (ICCVAMi VM7Luc ER TA hindamisaruanne, tabel 4-1 (3)).

(2) Kui puudusid tsütotoksilisusest või mittelahustuvusest tingitud piirangud, olid maksimaalsed uuritavad kontsentratsioonid 1 × 10-5 M (STTA katsemeetod) ja 1 × 10-3 M (VM7Luc ER TA katsemeetod).

(3) Sulgudes esitatud number näitab, mitu positiivset (POS) või negatiivset (NEG) uuringutulemust saavutati kõigis viidatud uuringutes kokku.

(34) Väärtused, mis on esitatud östrogeense toime tuvastamiseks kasutatava stabiilse transfektsiooniga transkriptsiooni aktivatsiooni (TA) katsemeetodi (meetod, milles uuritakse inimese östrogeeni α-retseptori vahendatud reportergeeni, kasutades rakuliini hER-HeLa-9903) eelvalideerimise ja laboritevahelise valideerimise esialgses aruandes (2).

(35) ICCVAMi katsemeetodi hindamisaruanne „ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists“ (3).

(36) Keskmised EC50 väärtused arvutati VM7Luc ER TA katse valideerimisuuringus osalenud laborite (XDS, ECVAM ja Hiyoshi) esitatud väärtuste alusel (3).

(37) ERi agonistiks või negatiivseks klassifitseerimise aluseks olid ICCVAMi taustaülevaatedokumentides ERi sidumise ja TA katsemeetodite kohta esitatud andmed (31) ning pärast ICCVAMi taustaülevaatedokumentide koostamist avaldatud ja täiendatud publikatsioonidest (2, 3, 18, 31, 33, 34) saadud teave.

Märkused. Kõigi katsemeetodiga hõlmatud meetodite puhul ei tehtud samu mõõtmisi. Mõnel juhul ei ole võimalik EC50 arvutada, sest ei ole koostatud annuse-reaktsiooni seose täielikku kõverat. STTA katsemeetodi puhul on PC10 väärtus peamiseks mõõdetud väärtuseks, kuid võib leiduda ka muid näiteid PCx väärtuse abil kasuliku teabe saamisest.

(4) STTA ja VM7Luc ER TA katsetemeetoditega uuritud levinuimad ained, mis määrati kas östrogeeniretseptori antagonistiks või negatiivseks ja mida kasutati täpsuse hindamiseks VM7Luc ER TA valideerimisuuringus (2, 3).

(5) Kui puudusid tsütotoksilisusest või mittelahustuvusest tingitud piirangud, olid maksimaalsed uuritavad kontsentratsioonid 1 × 10-3 M (STTA katsemeetod) ja 1 × 10-5 M (VM7Luc ER TA katsemeetod).

(38) Östrogeeniretseptori vahendatud toime tuvastamiseks kasutatava stabiilse transfektsiooniga transkriptsiooni aktivatsiooni katsemeetodi valideerimisaruanne, B. osa (2).

(39) ICCVAMi katsemeetodi hindamisaruanne „ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists“ (3).

(40) Keskmised IC50 väärtused arvutati VM7Luc ER TA katse valideerimisuuringus osalenud laborite (XDS, ECVAM, and Hiyoshi) esitatud väärtuste alusel (3).

(41) ER STTA eeldatav toime CERI östrogeeniretseptori sidumise katsemeetodi kohta aja jooksul kogutud andmete, uterotroofse katse ning avaldatud kirjandusandmetest kogutud teabe põhjal (2).

(42) ERi antagonistiks või negatiivseks klassifitseerimise aluseks olid ICCVAMi taustaülevaatedokumentides ERi sidumise ja TA katsemeetodite kohta esitatud andmed (31) ning pärast ICCVAMi taustaülevaatedokumentide koostamist avaldatud ja täiendatud publikatsioonidest (2, 3, 18, 31) saadud teave.

(43) Aineklass on igale ainele omistatud rahvusvaheliselt tunnustatud standardse klassifitseerimisskeemi kohaselt, mis põhineb USA meditsiiniraamatukogu meditsiiniteemade klassifitseerimissüsteemil (leitav veebisaidil http//www.nlm.nih.gov/mesh).

(44) Tooteklass on igale ainele omistatud USA meditsiiniraamatukogu ohtlike ainete andmebaasi (leitav veebisaidil http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB) alusel).

(45) Positiivse või negatiivse ERi antagonistliku toimega ühendiks klassifitseerimise aluseks olid ICCVAMi taustaülevaatedokumentides ERi sidumise ja TA katsemeetodite kohta esitatud andmed (31) ning empiirilised andmed ja muu teave, mis saadi pärast ICCVAMi taustaülevaatedokumentide koostamist avaldatud ja läbivaadatud viidatud uuringutest (2, 3, 18, 31, 32, 33, 34).

(46) Väärtused, mis on esitatud östrogeense toime tuvastamiseks kasutatava stabiilse transfektsiooniga transkriptsiooni aktivatsiooni (TA) katsemeetodi (meetod, milles uuritakse inimese östrogeeni α-retseptori vahendatud reportergeeni, kasutades rakuliini hER-HeLa-9903) eelvalideerimise ja laboritevahelise valideerimise esialgses aruandes (30).

(47) Keskmised EC50 väärtused arvutati VM7Luc ER TA katse valideerimisuuringus osalenud laborite (XDS, ECVAM, and Hiyoshi) esitatud väärtuste alusel (3).

(48) Esitatud kontsentratsioonid on suurimad kontsentratsioonid (vahemikuotsing), mida VM7Luc ER TA katsemeetodi valideerimise käigus uuriti. Kui kontsentratsioonid olid eri laborites erinevad, on esitatud suurim kontsentratsioon. Vt tabelit 4-10 ICCVAMi katsemeetodi hindamisaruandes „ICCVAM Test Method Evaluation Report; The LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals“ (3).

(49) Aineklass on igale ainele omistatud rahvusvaheliselt tunnustatud standardse klassifitseerimisskeemi kohaselt, mis põhineb USA meditsiiniraamatukogu meditsiiniteemade klassifitseerimissüsteemil (leitav veebisaidil http://www.nlm.nih.gov/mesh).

(50) Tooteklass on igale ainele omistatud USA meditsiiniraamatukogu ohtlike ainete andmebaasi (leitav veebisaidil http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB) alusel.

(51) Tabelist 1 (Võrdluskemikaalide loetelu (22) ERi agonistikatse täpsuse hindamiseks) toimivusnõuete juures (6).

(52) Kui pädevuse tõendamise ainet enam müügil ei ole, võib kasutada samasuguseks klassifitseeritud ning võrreldava võimaliku toime, toimimismehhanismi ja aineklassiga ainet.

(*4) kirjandusandmete järgi klassifitseeritud negatiivseks (2).

(6) STTA ja VM7Luc ER TA katsetemeetodiga uuritud levinuimad ained, mis määrati kas östrogeeniretseptori antagonistiks või negatiivseks ja mida kasutati täpsuse hindamiseks VM7Luc ER TA valideerimisuuringus (2, 3).

(53) Östrogeeniretseptori vahendatud toime tuvastamiseks kasutatava stabiilse transfektsiooniga transkriptsiooni aktivatsiooni katsemeetodi valideerimisaruanne, B. osa (2).

(54) ICCVAMi katsemeetodi hindamisaruanne „ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists“ (3).

(55) Keskmised IC50 väärtused arvutati VM7Luc ER TA katse valideerimisuuringus osalenud laborite (XDS, ECVAM, and Hiyoshi) esitatud väärtuste alusel (3).

(56) Esitatud kontsentratsioonid on suurimad kontsentratsioonid (vahemikuotsing), mida VM7Luc ER TA katsemeetodi valideerimise käigus uuriti. Kui kontsentratsioonid olid eri laborites erinevad, on esitatud suurim kontsentratsioon. Vt tabelit 4-11 ICCVAMi katsemeetodi hindamisaruandes „ICCVAM Test Method Evaluation Report; The LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals“ (3).

(57) ERi antagonistiks või negatiivseks klassifitseerimise aluseks olid ICCVAMi taustaülevaatedokumentides ERi sidumise ja TA katsemeetodite kohta esitatud andmed (31) ning pärast ICCVAMi taustaülevaatedokumentide koostamist avaldatud ja täiendatud publikatsioonidest (2, 3, 18, 31) saadud teave.

(58) Aineklass on igale ainele omistatud rahvusvaheliselt tunnustatud standardse klassifitseerimisskeemi kohaselt, mis põhineb USA meditsiiniraamatukogu meditsiiniteemade klassifitseerimissüsteemil (leitav veebisaidil http//www.nlm.nih.gov/mesh).

(59) Tooteklass on igale ainele omistatud USA meditsiiniraamatukogu ohtlike ainete andmebaasi (leitav veebisaidil http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB) alusel.

(60) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrus (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ. ELT L 304, 22.11.2007, lk 1.

(61) JCRB Cell Bank: National Institute of Biomedical Innovation, 7-6-8 Asagi Saito, Ibaraki-shi, Osaka 567-0085, Japan. Faks: +81-72-641-9812

(62) http://www.oecd.org/env/testguidelines

(63) Enne 2016. aasta juuni nimetati see rakuliin rakuliiniks BG1Luc. BG-1 rakke kirjeldasid algselt Geisinger jt (1998) (12) ning hiljem iseloomustasid neid Ameerika Ühendriikide riikliku keskkonnatervise instituudi (National Institute of Environmental Health Sciences – NIEHS) teadlased (13). Suhteliselt hiljuti avastati, et teadlaste kasutatavatel BG-11 rakkudel on olemas kaks varianti, BG-1 Fr ja BG-1 NIEHS. Nende kahe BG-1 rakuliini variandi põhjalik analüüs (sealhulgas DNA uuring), mille viis läbi Li koos kaastöötajatega (2014) (14), näitas, et BG-1 Fr oli unikaalne ja et BG-1 NIEHS, st katsemeetodi väljatöötamiseks kasutatud algne rakuliin, ei olnud BG-1 inimese munasarja kartsinoomi rakuliin, vaid hoopis inimese rinnavähi rakuliini MCF7 variant. Katsemeetodis kasutatud rakuliini, mida algselt nimetati BG1Luc4E2 (15), nimetatakse nüüd VM7Luc4E2 (V – variant; M7 – MCF7 rakud). Samuti nimetatakse katsemeetodit nüüd VM7Luc ER TA katsemeetodiks. Kuigi katsemeetodi aluseks oleva rakuliini päritolu on teine, ei mõjuta see avaldatud valideerimisuuringuid ega käesoleva katsemeetodi kasutamist östrogeense/antiöstrogeense toimega kemikaalide sõelumiseks.

(64) Michael S. Denison, Ph.D. Professor, Dept. of Environmental Toxicology, 4241 Meyer Hall, One Shields Ave, University of California, Davis, CA 95616, e-post: msdenison@ucdavis.edu, (530) 754-8649

(65) Xenobiotic Detection Systems Inc., 1601 East Geer Street, Suite S, Durham NC, 27704 USA, e-post: info@dioxins.com, telefon: 919-688-4804, faks: 919-688-4404

(66) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353/1, 31.12.2008).

(67) 2013. aasta juunis lepiti ühiskoosolekul kokku, et võimaluse korral kasutatakse uute ja ajakohastatud katsemeetodite kirjeldustes uurimisobjektile viitamiseks järjepidevamalt terminit „uuritav kemikaal“.

(68) Aineklasside määramisel kasutati NICEATMi varem avaldatud materjalist saadud teavet ning kui see ei olnud kättesaadav, siis USA riikliku meditsiiniraamatukogu (National Library of Medicine) tesaurust MeSH® (Medical Subject Headings) (andmebaasi ChemIDplus® kaudu, kättesaadav veebisaidil http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/) ning NICEATMi määratlusi.

(69) Põhineb küüliku in vivo silmakatse (OECD katsejuhend nr 405) tulemustel ning selles kasutatakse ÜRO GHSi / CLP-määruse kohast klassifikatsiooni (1).

(70) Klassifitseeritud 1. kategooriasse 100 % naatriumhüdroksiidi nahasöövitusvõime (loetletud OECD katsejuhendis 435 pädevuse tõendamise kemikaalina, millel on nahasöövitusvõime) ja ÜRO GHSi / CLP-määruse kohasesse 1. kategooriasse klassifitseerimise kriteeriumi alusel (1).

(71) Klassifitseerimine 2A või 2B kategooriasse oleneb selle ÜRO GHSi kriteeriumi tõlgendusest, mille alusel neid kahte kategooriat eristatakse, st 7. päeval peab mõju avalduma veel vastavalt kahel või neljal loomal kuuest; viimasel juhul klassifitseeritakse kemikaal 2A kategooriasse. In vivo katsetel saadud andmestik hõlmab kaht uuringut, millest kummaski kasutati kolme looma. Ühes uuringus ilmnesid 7. päeval mõjud kahel loomal kolmest, mis klassifitseerimist õigustab 2A kategooriasse (11), kuid teises uuringus olid kõigil kolmel loomal 7. päevaks kõik näitajad saavutanud nulltaseme, mis õigustab klassifitseerimist 2B kategooriasse (12).

(72) Klassifitseerimine 2A või 2B kategooriasse oleneb selle ÜRO GHSi kriteeriumi tõlgendusest, mille alusel neid kahte kategooriat eristatakse, st 7. päeval peab mõju avalduma veel vastavalt ühel või kahel loomal kolmest; viimasel juhul klassifitseeritakse kemikaal 2A kategooriasse. In vivo uuringus kasutati kolme looma. Kõik näitajad peale sarvkesta läbipaistmatuse ja sidekesta punetuse ühel loomal saavutasid hiljemalt 7. päevaks nulltaseme. Ühel loomal, kes ei paranenud täielikult 7. päevaks, oli 7. päeval sarvkesta läbipaistmatuse aste 1 ja sidekesta punetuse aste 1, mis paranesid täielikult 14. päevaks (11).

(73) Segusid, mis sisaldavad üle 6 kPa aururõhuga aineid, tuleks hoolikalt hinnata, et vältida võimalikku alahindamist, ning see peab olema igal üksikjuhtumil põhjendatud.

(74) Põhineb peamiselt ühe koostisosaga ainetega saadud tulemustel, kuigi leidub ka piiratud kogus andmeid segudega katsetamise kohta. See katsemeetod on siiski tehniliselt kohaldatav mitme koostisosaga ainete ja segude uurimiseks. Enne kui kasutada käesolevat meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist.

(75) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353/1, 31.12.2008).

(76) 2013. aasta juunis lepiti OECD ühiskoosolekul kokku, et võimaluse korral kasutatakse uute ja ajakohastatud OECD katsejuhendites uurimisobjektile viitamiseks järjepidevamalt terminit „uuritav kemikaal“.

(77) EITL: silmaärrituse katse vedelikega, kui kasutatakse SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli

(78) EITS: silmaärrituse katse tahkete ainetega, kui kasutatakse SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli

(79) Funktsionaalrühm on omistatud vastavalt hierarhilisele analüüsile OECD rakendusega Toolbox 3.1 (8).

(80) Põhineb EpiOcular™i silmaärrituse katsega saadud tulemustel EURL ECVAMi ja ühenduse Cosmetics Europe tehtud silmaärrituse katsemeetodi valideerimisuuringus (8).

(81) Põhineb SkinEthic™i inimese sarvkesta epiteeli kasutava silmaärrituse katsega valideerimisuuringus (10, 11) saadud tulemustel.

(82) Põhineb küüliku in vivo silmakatse (katsemeetod B.5 / OECD katsejuhend nr 405) (2, 14) tulemustel ja selles kasutatakse ÜRO GHSi klassifikatsiooni.

(83) Põhineb konsortsiumi CEFIC in vitro silmaärrituse katsete tegemise strateegia (CON4EI) uuringus saadud tulemustel.

(84) Klassifitseerimine 2A või 2B kategooriasse oleneb selle ÜRO GHSi kriteeriumi tõlgendusest, mille alusel neid kahte kategooriat eristatakse, st 7. päeval peab mõju avalduma veel vastavalt ühel või kahel loomal kolmest; viimasel juhul klassifitseeritakse kemikaal 2A kategooriasse. In vivo uuringus kasutati kolme looma. Kõik näitajad peale sarvkesta läbipaistmatuse ühel loomal saavutasid hiljemalt 7. päevaks nulltaseme. Ühel loomal, kes ei paranenud täielikult 7. päevaks, oli 7. päeval sarvkesta läbipaistmatuse aste 1, mis paranes täielikult 9. päevaks.

(85) Selle vastuvõetavuspiiri juures arvestatakse võimalikku pikaajalist vedu või ladustamist (nt kauem kui 4 päeva), mis ei ole osutunud katsemeetodi toimivust mõjutavaks (37).

(86)

LLOQ: alumine määramispiir, peab olema 1–2 % koe eluvõimelisusest, st 0,8 μg/ml.

(87)

ULOQ: ülemine määramispiir, peab olema vähemalt kaks korda suurem MTT formasaani suurimast eeldatavast kontsentratsioonist isopropanooliga negatiivsetest kontrollproovidest saadud ekstraktides (valideeritud võrdlusmeetodis ~70 μg/ml), st 200 μg/ml.

(*5) Lahustuvuspiir < 1 × 10-4 M.

(*6) Di-n-butüülftalaadi (DBP) kasutamine ja klassifitseerimine mitteseonduva ainena põhineb analüüsimisel kuni kontsentratsioonini 10-4 M, sest valideerimiseelsete uuringute käigus täheldati mõnes laboris, et aine on kontsentratsioonil 10-3 M mittelahustuv (nt ilmneb hägusus).

(1) Valideerimisuuringus analüüsiti di-n-butüülftalaati (DBP) kodeeritud katseainena kontsentratsioonidel kuni 10-3 M. Nendes tingimustes täheldati mõnes laboris radiomärgistatud ligandi seondumise vähenemist kõige suuremal kontsentratsioonil (10-3 M) ja/või lähenduskõvera ebasobivust. Neis katsetes liigitati DBP „ebaselgeks“ või „seonduvaks“ CERI meetodi puhul viiest laborist kolmes ja FW meetodi puhul kuuest laborist viies (vt allikas 2, jaotise IV.B.3 alajaotised a ja b ning jaotis VI.A).

(7) Liigitus ei vasta eeldatavale tulemusele. 4-n-heptüülfenooli liigitamine „ebaselgeks“ või „mitteseonduvaks“ viiest laborist kolmes andis keskmiseks liigitamistulemuseks „ebaselge“. Täpsemal uurimisel ilmnes, et sellise liigitamise põhjuseks oli kemikaali piiratud lahustuvus, mis takistas täieliku seondumiskõvera saamist.

(8) Valideerimisuuringu ajal liigitati bens[a]antratseen ümber mitteseonduvaks aineks (st negatiivne tulemus) lähtuvalt avaldatud kirjandusandmetest, mille alusel on tõendatud, et kõnealuse aine puhul täheldatav in vitro östrogeenne toime (16) põhineb peamiselt selle metaboolsel aktiveerimisel (17, 18). Kõnealuses laboritevahelises valideerimisuuringus kasutatud rakuvabades hrERiga seondumise katsetes aine ensümaatilist metaboolset aktiveerimist eeldatavalt ei toimu. Seega on see aine õige liigituse kohaselt „mitteseonduv“, kui seda kasutatakse FW ja CERI meetoditele vastavates katsetingimustes.

(88) Kui pädevusaine ei ole enam turul kättesaadav, võib kasutada ainet, millel on ERiga seondumise võimet iseloomustav sama liigitus ja võrreldav toime tugevus ning mis kuulub samasse kemikaaliklassi.

(89) Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i registrinumber.

(90) hrERiga seondumist käsitlevate CERI ja FW meetodite valideerimise uuringus α-ERiga seonduvaks või mitteseonduvaks aineks liigitamise tulemus (2).

(91) ERiga seondumise võimet hinnati lähtuvalt alternatiivsete meetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomitee (ICCVAM) taustülevaatedokumentidest ERiga seondumise ja transkriptsiooni aktiveerimise katsete kohta (9) ning empiirilistest andmetest ja muust teabest, mis on avaldatud kirjanduse loetelus viidatud läbivaadatud uuringutulemustena (10, 11, 12, 13, 14, 15).

(92) Ainete liigitamiseks ühte või mitmesse kemikaaliklassi kasutati rahvusvaheliselt tunnustatud standardiseeritud klassifitseerimissüsteemina USA riikliku meditsiiniraamatukogu meditsiiniterminite andmebaasi (MeSH) (kättesaadav aadressil http://www.nlm.nih.gov/mesh).

(93) Ainete liigitamiseks ühte või mitmesse tootekategooriasse kasutati USA riikliku meditsiiniraamatukogu ohtlike ainete andmebaasi (kättesaadav aadressil http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB.)

(94) DBP-d võib kasutada alternatiivse mitteseonduva kontrollainena suurimas kontsentratsioonis 10-4 M.

(95) Selle aine lahustuvuspiir on 10-4 M. Di-n-butüülftalaadi (DBP) kasutamine ja klassifitseerimine mitteseonduva ainena põhineb analüüsimisel kuni kontsentratsioonini 10-4 M, sest valideerimiseelsete uuringute käigus täheldati mõnes laboris, et aine on kontsentratsioonil 10-3 M mittelahustuv (nt ilmneb hägusus).

(9) Keskmine ± standardhälve (SD) (n) on arvutatud lähtuvalt lähenduskõvera hinnangulistest näitajatest (neljaparameetriline Hilli võrrand) kontrollkatsetes, mis viidi valideerimisuuringu jooksul läbi neljas laboris (vt allikas 2, N lisa).

(10) Usaldusvahemik usaldusnivool 95 % on esitatud katse nõuetekohasuse kriteeriumide kehtestamise võimaldamiseks.

(11) Noretindrooni analüüsimine ei olnud valideerimisuuringus 4. alategevuse raames kohustuslik (vt allikas 2, 4. alategevus). Seega on keskmine ± SD (n) arvutatud lähtuvalt lähenduskõvera hinnangulistest näitajatest (neljaparameetriline Hilli võrrand) kontrollkatsetes, mis viidi läbi kahes laboris.

IC50 väärtuste vahemik sõltub konkreetses laboris kasutatava retseptoripreparaadi Kd väärtusest ja radiomärgistatud ligandi kontsentratsioonist. IC50 väärtuste vahemiku asjakohane kohandamine sõltuvalt katse läbiviimiseks kasutatud tingimustest on lubatud.

(*7) Kannudes G1–H12 tuleks [3H]-ga märgistatud radioaktiivse östradiooli lahused lisada järjestikuste lahjendustena otse 200 mikroliitrile stsintillatsioonivedelikule.

(*8) Täiesti tühi kasutamata kann.

(*9) Tühiproov, mida ei kasutata inkubeerimise ajal, kuid mida kasutatakse lisatud radiomärgise summaarse radioaktiivsuse kontrollimiseks.

(12) Keskmine ± standardhälve (SD) koos valimi suurusega (n) on arvutatud lähtuvalt lähenduskõvera hinnangulistest näitajatest (neljaparameetriline Hilli võrrand) kontrollkatsetes, mis viidi valideerimisuuringu jooksul läbi neljas laboris (vt allikas 2, N lisa).

(13) Usaldusvahemik usaldusnivool 95 % on esitatud katse nõuetekohasuse kriteeriumide kehtestamise võimaldamiseks.

(14) Noretindrooni analüüsimine ei olnud valideerimisuuringus 4. alategevuse raames kohustuslik (vt allikas 2, 4. alategevus). Seega on keskmine ± SD (n) arvutatud lähtuvalt lähenduskõvera hinnangulistest näitajatest (neljaparameetriline Hilli võrrand) kontrollkatsetes, mis viidi läbi kahes laboris.

(*10) Siin on esitatud lõppkontsentratsioon igas kannus.

(*11) Märgistamata E2 ja [3H]E2 lahjendused võib valmistada ka eraldi plaadil.

(*12) Kui radioaktiivsuse mõõtmiseks dpm-des kasutatakse mikrotiiterplaatide jaoks ette nähtud vedelikstsintillatsiooniloendurit, ei ole ainult radioaktiivset ligandi sisaldava proovi lisamine SSi ja MSSi kanne sisaldavale katseplaadile asjakohane. Ainult radioaktiivset ligandi sisaldav proov tuleks sel juhul valmistada eraldi plaadil.

(*13) Kui DCC eraldamiseks kasutatakse tsentrifuugimist, tuleks vedelikstsintillatsiooniloenduriga mõõtmiseks kasutada 50 μl supernatanti, et hoida ära DCCga saastumist.

(96) Proovide skeem standardeid sisaldaval mikrotiiterplaadil, mida tuleb kasutada igas analüüsitsüklis.

(97) Tuleb silmas pidada, et sellel mikrotiiterplaadil olevate proovide jaoks kasutatakse lahjendusplaadil valmistatud eespool kirjeldatud standardite lahjendusi.

Selles näites on nõrgalt seonduv aine noretinodreel (NE).

(*14) Täiesti tühi kasutamata kann.

(*15) Tühiproov, mida ei kasutata inkubeerimise ajal, kuid mida kasutatakse lisatud radiomärgise summaarse radioaktiivsuse kontrollimiseks.

(*16) Nõuetekohaselt nii valmistatud, et saadava lõppkontsentratsiooni puhul jääb lahusti sisaldus vastuvõetavasse vahemikku.

(*17) Tuleb silmas pidada, et kannud tähisega „Radiomärgis“ on inkubeerimise ajal tühjad. Ettenähtud 10 μl lisatakse ainult stsintillatsioonide loendamiseks.

(98) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353/1, 31.12.2008).

(99) 2013. aasta juunis lepiti OECD ühisistungil kokku, et võimalusel korral kasutatakse OECD uutes ja ajakohastatud katsejuhendites mõistet „uuritav kemikaal“ järjekindlamalt uurimisobjektile viitava mõistena.

(100) Selle lause lisamise kohta tehti ettepanek ja selles lepiti kokku katsejuhendite programmi riiklike koordinaatorite töörühma koosolekul 2014. a aprillis.

(101) In vivo ohu (ja toime tugevuse) prognoos põhineb LLNA andmetel (3, 14). In vivo toime tugevuse väljendamisel on lähtutud ECETOCi soovitatud kriteeriumidest (24).

(102) Varasemate katsete andmete põhjal (13, 25).

(103) Selle markeriga seotud varasemad tulemused on valdavalt negatiivsed, mistõttu negatiivne tulemus on üldjuhul ootuspärane. Esitatud vahemik on kindlaks määratud varasemate üksikute positiivsete tulemuste põhjal. Positiivse tulemuse korral peaks toime avaldumise kontsentratsioon jääma esitatud võrdlusvahemikku.

(104) In vivo ohu (ja toime tugevuse) prognoos põhineb LLNA andmetel (1, 8). In vivo toime tugevuse väljendamisel on lähtutud ECETOCi soovitatud kriteeriumidest (17).

(105) Varasemate katsete andmete põhjal (1, 8).

(106) Täissööde – sööde RPMI-1640, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, 2 mM L-glutamiini, 100 ühikut penitsilliini milliliitri kohta ja streptomütsiini kontsentratsioonis 100 μg/ml (8).

(107) In vivo toime tugevuse väljendamisel on lähtutud ECETOCi soovitatud kriteeriumidest (19).

(108) Varasemate katsete andmete põhjal (1, 6).

(109) CV05 ja IL-8 lutsiferaasikatse kohase MIT arvutamiseks kasutati programmiga EPI SuiteTM saadud vees lahustuvuse andmeid.

(110) CV05 – vähim kontsentratsioon, mille juures kemikaali toimel avalduv Inh-GAPLA on väiksem kui 0,05.

(111) MIT – väiksem kontsentratsioon, mille juures kemikaal vastab positiivsuse kriteeriumidele.

(*18) Neid lõppnäitajaid tuleb statistiliselt analüüsida.

(*19) Kõiki näitajaid analüüsitakse statistiliselt.

(*20) Nullpäev on hCG süstimise päev.

(*21) Nullnädala esimene päev on kontrollrühma loomade moonde mediaanpäev.

(112) Nukleaasivaba vesi

(113) Vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu 29. aprilli 2004. aasta direktiivi 2004/37/EÜ (töötajate kaitse kohta tööl kantserogeenide ja mutageenidega kokkupuutest tulenevate ohtude eest (kuues üksikdirektiiv nõukogu direktiivi 89/391/EMÜ artikli 16 lõike 1 tähenduses) (ELT L 158, 30.4.2004, lk 50)) artikli 4 lõikele 1.