1.3.2016   

ET

Euroopa Liidu Teataja

L 54/1


KOMISJONI MÄÄRUS (EL) 2016/266,

7. detsember 2015,

millega muudetakse tehnika arenguga kohandamise eesmärgil määrust (EÜ) nr 440/2008, millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Liidu toimimise lepingut,

võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrust (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ, (1) eriti selle artikli 13 lõiget 2,

ning arvestades järgmist:

(1)

Komisjoni määruses (EÜ) nr 440/2008 (2) on esitatud kemikaalide füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramise katsemeetodid, mida kasutatakse määruse (EÜ) nr 1907/2006 kohaldamisel.

(2)

Määrust (EÜ) nr 440/2008 on vaja ajakohastada tehnika arengu arvessevõtmiseks ning vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivile 2010/63/EL (3) katseteks kasutatavate loomade arvu vähendamiseks ning et lisada sellesse uued ja ajakohastatud katsemeetodid, mille on hiljuti vastu võtnud Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon (OECD). Käesoleva eelnõuga seoses on konsulteeritud sidusrühmadega.

(3)

Käesolevas kohandamismääruses on esitatud kakskümmend katsemeetodit: üks uus meetod füüsikalis-keemilise omaduse määramiseks, üksteist uut ja kolm ajakohastatud meetodit ökotoksilisuse hindamiseks ning viis uut meetodit, millega hinnatakse kemikaalide säilivust ja käitumist keskkonnas.

(4)

Määrust (EÜ) nr 440/2008 tuleks seepärast vastavalt muuta.

(5)

Käesoleva määrusega ette nähtud meetmed on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 133 kohaselt asutatud komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:

Artikkel 1

Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse vastavalt käesoleva määruse lisale.

Artikkel 2

Käesolev määrus jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.

Brüssel, 7. detsember 2015

Komisjoni nimel

president

Jean-Claude JUNCKER


(1)  ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.

(2)  Komisjoni määrus (EÜ) nr 440/2008, 30. mai 2008, millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) (ELT L 142, 31.5.2008, lk 1).

(3)  Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 2010, teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 20.10.2010, lk 33).


LISA

Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse järgmiselt.

1)

Lisa algusse A osa ette lisatakse järgmine märkus:

„Märkus

Kui ükskõik millise allpool kirjeldatud katsemeetodi puhul ei ole määratletud selle sobivust segude, mitut koostisosa sisaldavate ainete (multi-constituent substance, MCS) või tundmatu või muutuva koostisega ainete, komplekssete reaktsioonisaaduste või bioloogilist päritolu materjalide (UVCB) analüüsimiseks, tuleb enne meetodi kasutamist segu, mitut koostisosa sisaldava aine või UVCB analüüsimiseks kaaluda, kas asjaomane meetod on taotletavat regulatiivset eesmärki silmas pidades sobiv.

Kui asjaomast katsemeetodit kasutatakse segu, mitut koostisosa sisaldava aine või UVCB analüüsimiseks, tuleks teha kättesaadavaks piisav ja võimalikult ammendav teave sellise segu või aine koostise kohta, nt selle koostisosade keemilise määratluse, kvantitatiivse sisalduse ja asjakohaste omaduste kohta.”

2)

Lisatakse peatükk A.24:

A.24.   JAOTUSKOEFITSIENT (N-OKTANOOL/VESI): KÕRGEFEKTIIVSE VEDELIKKROMATOGRAAFIA (HPLC) MEETOD

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 117 (2004).

1.

Jaotuskoefitsient (P) on määratletud kui kahest omavahel praktiliselt segunematust lahustist koosnevas kahefaasilises süsteemis lahustunud aine tasakaalukontsentratsioonide suhe. Lahustite n-oktanooli ja vee puhul:

Formula.

Kuna jaotuskoefitsient on kahe kontsentratsiooni suhtarv, puudub sellel mõõtühik ning seda väljendatakse tavaliselt suhtarvu kümnendlogaritmina.

2.

Pow on oluline näitaja, mille abil kirjeldatakse keemiliste ainete käitumist keskkonnas. On tõendatud, et esineb väga tugev seos ainete ioniseerimata vormi Pow ja nende ainete kalades bioakumuleerumise vahel. Samuti on leitud, et Pow on kasulik näitaja ainete pinnases ja setetes adsorbeerumise ennustamiseks ning ainete struktuuri ja toime vahelise kvantitatiivse seose kindlakstegemiseks paljude erinevate bioloogilise mõju viiside puhul.

3.

Algne ettepanek selle katsemeetodi kasutamiseks põhineb C. V. Eadsforthi ja P. Moseri artiklil (1). Katsemeetodi väljatöötamist ja OECD laboritevahelise võrdlusuuringu tegemist kooskõlastas 1986. aastal Saksamaa Liitvabariigi asutus Umweltbundesamt (2).

LÄHTEKAALUTLUSED

4.

Log Pow väärtused vahemikus – 2 kuni 4 (vahel kuni 5 või rohkem) (1) saab eksperimentaalselt kindlaks teha loksutamismeetodil (käesoleva lisa peatükk A.8, OECD katsejuhend nr 107). HPLC-meetod võimaldab määrata log Pow väärtusi vahemikus 0–6 (1, 2, 3, 4, 5). Selle meetodi puhul võib olla vaja hinnata Pow väärtust, et valida sobivad võrdlusained ja toetada saadavate katsetulemuste põhjal tehtavaid järeldusi. Arvutusmeetodeid kirjeldatakse lühidalt selle katsemeetodi liites. Kasutatakse isokraatilist HPLC töörežiimi.

5.

Pow väärtus sõltub keskkonnatingimustest, näiteks temperatuurist, pH-st, ioonsest jõust jne, ning need katsetingimused tuleks kindlaks määrata, et Pow andmeid oleks võimalik õigesti tõlgendada. Ioniseeritavate ainete puhul võib kasutusele tulla teinegi meetod (nt kavandatav OECD juhend pH mõõtmisel põhineva meetodi kohta ioniseeritud ainete jaoks (6)), mida saaks kasutada alternatiivmeetodina. Ehkki kõnealune kavandatav OECD juhend võib sobida selliste ioniseeritavate ainete Pow määramiseks, on mõnel juhul asjakohasem kasutada HPLC-meetodit, mille puhul lähtutakse keskkonnas esinevatest pH väärtustest (vt punkt 9).

MEETODI PÕHIMÕTE

6.

Pöördfaasilise HPLC jaoks kasutatakse analüütilisi kolonne, mis on täidetud müügiloleva tahke täidisega, mis sisaldab ränidioksiidiga kovalentselt seotud pikki süsivesinikuahelaid (nt C8, C18).

7.

Sellisesse kolonni süstitud kemikaal jaotub liikuvas faasis piki kolonni edasikandumisel liikuva lahustifaasi ja liikumatu süsivesinikufaasi vahel. Ainete jaotumine toimub proportsionaalselt nende jaotuskoefitsiendiga süsteemis süsivesinik/vesi ning sellest tulenevalt elueeritakse hüdrofiilsed ained esimesena ja lipofiilsed ained viimasena. Retentsiooniaega kirjeldab mahtuvustegur k, mis arvutatakse järgmise võrrandiga:

Formula,

kus tR on uuritava aine retentsiooniaeg ja t0 on surnud aeg, st keskmine aeg, mille jooksul lahustimolekul läbib kolonni. Kvantitatiivsete analüüsimeetodite kasutamine ei ole vajalik, tuleb kindlaks teha üksnes retentsiooniaeg.

8.

Uuritava aine jaotuskoefitsiendi arvutamiseks süsteemis oktanool/vesi määratakse katseliselt mahtuvustegur k ning sisestatakse see siis järgmisse võrrandisse:

Formula,

kus

a ja b on lineaarse regressiooni kordajad.

Selle võrrandi lahendamiseks leitakse regressioonanalüüsi teel lineaarne seos süsteemis oktanool/vesi täheldatava võrdlusainete jaotuskoefitsiendi logaritmi ja nende võrdlusainete mahtuvusteguri logaritmi vahel.

9.

Pöördfaasilisel HPLC-l põhinev meetod võimaldab määrata jaotuskoefitsiendi Pow logaritmitud väärtusi vahemikus 0–6, ent meetodi ulatust on erandjuhul võimalik laiendada kuni log Pow vahemikuni 6–10. Sel juhul võib olla vaja modifitseerida liikuvat faasi (3). Kõnealune meetod ei ole kasutatav tugevate hapete ja aluste, metallikomplekside, elueerimiseks kasutatava lahusega reageerivate ainete või pindaktiivsete ainete puhul. Ioniseeritavate ainete puhul saab mõõta nende ioniseerimata vormi (vaba hape või vaba alus) üksnes juhul, kui kasutatakse sobivat puhvrit, mille pH on väiksem kui vaba happe pKa või suurem kui vaba aluse pKa. Ioniseeritavate ainete analüüsimiseks võib kasutusele tulla ka pH mõõtmisel põhinev meetod (6), mida saaks kasutada alternatiivmeetodina (6). Kui log Pow väärtus määratakse keskkonnaohtlikkuse alusel klassifitseerimiseks või keskkonnaohu hindamiseks, tuleks katse teha pH väärtuste vahemikus, mis vastab looduskeskkonnas esinevatele pH väärtustele, st vahemikus 5,0–9,0.

10.

Mõnel juhul võivad lisandid raskendada tulemuste tõlgendamist, kuna piike ei saa enam üheselt identifitseerida. Lahutamata jäänud piikidega segu puhul tuleks esitada log Pow ülem- ja alampiir ning igale log Pow väärtusele vastava piigi protsentuaalne pindala. Homoloogsete ainete rühmast koosneva segu puhul tuleks märkida ka kaalutud keskmine log Pow (7), mis on arvutatud iga üksiku Pow väärtuse ja sellele vastava piigi protsentuaalse pindala põhjal (8). Arvutustes tuleks arvesse võtta kõiki piike, mille pindala on vähemalt 5 % piikide kogupindalast (9):

Formula.

Kaalutud keskmine log Pow kehtib üksnes homoloogidest (nt alkaanidest) koosneva aine või segu (nt tallõli) kohta. Segu mõõtmisel võib mõtestatud tulemusi saada juhul, kui kasutatava analüütilise detektori tundlikkus on kõikide segus sisalduvate ainete suhtes ühesugune ja neid aineid on võimalik üksteisest piisavalt lahutada.

TEAVE UURITAVA AINE KOHTA

11.

Enne meetodi kasutamist peaks olema teada aine dissotsiatsioonikonstant, struktuurivalem ja lahustuvus liikuvas faasis. Peale selle oleks abiks teave aine hüdrolüüsi kohta.

KVALITEEDIKRITEERIUMID

12.

Mõõtmistulemuste usaldusväärsuse suurendamiseks tuleb iga mõõtmist teha kaks korda.

Korratavus: identsetes katsetingimustes ja sama võrdlusainete rühmaga tehtud korduvmõõtmistel saadud log Pow väärtused ei tohiks logaritmskaalal erineda rohkem kui ± 0,1 ühikut.

Reprodutseeritavus: mõõtmiste kordamisel erineva võrdlusainete rühmaga võidakse saada erinevad tulemused. Tavaliselt on log k ja log Pow vahelist seost väljendava korrelatsioonikordaja R väärtus katses kasutatavate ainete rühma puhul umbes 0,9, mis vastab oktanool-vee jaotuskoefitsiendi log Pow varieeruvusele ± 0,5 logaritmilist ühikut.

13.

Laboritevahelisest võrdlusuuringust on selgunud, et HPLC-meetodiga saadud log Pow väärtused erinevad loksutamismeetodiga saadud väärtustest kuni ± 0,5 ühikut (2). Kirjandusest võib leida ka muid võrdlusandmeid (4, 5, 10, 11, 12). Kõige täpsemad tulemused saadakse struktuurilt lähedastel võrdlusainetel põhinevate korrelatsioonigraafikute kasutamisel (13).

VÕRDLUSAINED

14.

Aine mõõdetud mahtuvusteguri k korreleerimiseks aine Pow-ga tuleb koostada vähemalt kuuest punktist koosnev kaliibrimisgraafik (vt punkt 24). Katse tegija valib ise sobivad võrdlusained. Võrdlusainete log Pow väärtused peaksid üldjuhul moodustama vahemiku, mis hõlmab uuritava aine log Pow väärtust, st vähemalt ühe võrdlusaine Pow peaks olema suurem kui uuritaval ainel ja vähemalt ühe võrdlusaine Pow peaks olema uuritava aine omast väiksem. Ekstrapoleerimist tuleks kasutada ainult erandjuhul. Sellised võrdlusained peaksid eelistatult olema oma struktuurilt uuritava ainega sarnased. Kaliibrimiseks kasutatavad võrdlusainete log Pow väärtused peaksid põhinema usaldusväärsetel katseandmetel. Ainete puhul, mille log Pow väärtus on suur (tavaliselt üle 4), võib usaldusväärsete katseandmete puudumisel kasutada siiski ka arvutatud väärtusi. Ekstrapoleeritud väärtuste kasutamisel tuleks märkida ülempiir.

15.

On olemas log Pow väärtuste ulatuslikud loetelud paljude kemikaalirühmade kohta (14, 15). Kui struktuurilt sarnaste ainete jaotuskoefitsiente käsitlevad andmed ei ole kättesaadavad, võib kasutada muudel võrdlusainetel põhinevat üldisemat kaliibrimist. Soovitatavad võrdlusained ja nende Pow väärtused on loetletud tabelis 1. Ioniseeritavate ainete kohta esitatud väärtused kehtivad ioniseerimata vormi puhul. Esitatud väärtuste usaldusväärsust ja kvaliteeti on kontrollitud laboritevahelise võrdlusuuringu käigus.

Tabel 1.

Soovitatavad võrdlusained.

 

CASi number

Võrdlusaine

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanoon

(metüületüülketoon)

0,3

 

2

1122-54-9

4-atsetüülpüridiin

0,5

 

3

62-53-3

Aniliin

0,9

 

4

103-84-4

Atseetaniliid

1,0

 

5

100-51-6

Bensüülalkohol

1,1

 

6

150-76-5

4-metoksüfenool

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Fenoksüäädikhape

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenool

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenool

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Bensonitriil

1,6

 

11

140-29-4

Fenüülatsetonitriil

1,6

 

12

589-18-4

4-metüülbensüülalkohol

1,6

 

13

98-86-2

Atsetofenoon

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenool

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-nitrobensoehape

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-kloroaniliin

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobenseen

1,9

 

18

104-54-1

Tsinnamüülalkohol

(kaneelalkohol)

1,9

 

19

65-85-0

Bensoehape

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-kresool

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Kaneelhape

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anisool

2,1

 

23

93-58-3

Metüülbensoaat

2,1

 

24

71-43-2

Benseen

2,1

 

25

99-04-7

3-metüülbensoehape

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-klorofenool

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Trikloroetüleen

2,4

 

28

1912-24-9

Atrasiin

2,6

 

29

93-89-0

Etüülbensoaat

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-diklorobensonitriil

2,6

 

31

535-80-8

3-klorobensoehape

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Tolueen

2,7

 

33

90-15-3

1-naftool

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dikloroaniliin

2,8

 

35

108-90-7

Klorobenseen

2,8

 

36

1746-13-0

Allüülfenüüleeter

2,9

 

37

108-86-1

Bromobenseen

3,0

 

38

100-41-4

Etüülbenseen

3,2

 

39

119-61-9

Bensofenoon

3,2

 

40

92-69-3

4-fenüülfenool

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Tümool

3,3

 

42

106-46-7

1,4-diklorobenseen

3,4

 

43

122-39-4

Difenüülamiin

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftaleen

3,6

 

45

93-99-2

Fenüülbensoaat

3,6

 

46

98-82-8

Isopropüülbenseen

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-triklorofenool

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenüül

4,0

 

49

120-51-4

Bensüülbensoaat

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sec-butüülfenool

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-triklorobenseen

4,2

 

52

143-07-7

Dodekaanhape

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenüüleeter

4,2

 

54

85-01-8

Fenantreen

4,5

 

55

104-51-8

n-butüülbenseen

4,6

 

56

103-29-7

Dibensüül

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenüülpüridiin

4,9

 

58

206-44-0

Fluoranteen

5,1

 

59

603-34-9

Trifenüülamiin

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

MEETODI KIRJELDUS

Jaotuskoefitsiendi esialgne hindamine

16.

Vajaduse korral võib uuritava aine jaotuskoefitsienti hinnata, kasutades soovitatavalt kas arvutusmeetodit (vt liide) või kui see on asjakohane, siis suhtarvu, mis iseloomustab aine lahustuvust puhastes lahustites.

Seadmed

17.

Läheb vaja vähepulseeriva pumba ja sobiva tuvastamissüsteemiga vedelikukromatograafi. Paljude keemiliste rühmade tuvastamiseks sobib UV-detektor, mis töötab lainepikkusel 210 nm, või murdumisnäitaja detektor. Polaarsete rühmade esinemine liikumatus faasis võib HPLC-kolonni efektiivsust oluliselt vähendada. Seepärast peaks polaarsete rühmade sisaldus liikumatus faasis olema võimalikult väike (16). Võib kasutada müügilolevaid pöördfaasilisi mikrograanultäidiseid või valmiskolonne. Sisestamissüsteemi ja analüütilise kolonni vahele võib paigaldada kaitsekolonni.

Liikuv faas

18.

Elueerimislahuse valmistamiseks kasutatakse HPLC jaoks piisava puhtusega metanooli ja destilleeritud või deioniseeritud vett ning enne kasutamist lahus degaseeritakse. Tuleks kasutada isokraatilist elueerimist. Metanooli ja vee suhe peaks olema selline, et lahuse veesisaldus on vähemalt 25 %. Tavaliselt piisab ainete puhul, mille log P on 6, elueerimisest ühe tunni jooksul voolukiirusel 1 ml/min seguga, milles metanooli ja vee ruumalasuhe on 3:1. Ainete puhul, mille log P on üle 6, võib olla vaja uuritava aine ja võrdlusainete elueerimisaega lühendada; selleks vähendatakse liikuva faasi polaarsust või kolonni pikkust.

19.

Uuritav aine ja võrdlusained peavad olema liikuvas faasis piisaval määral lahustuvad, et võimaldada nende tuvastamist. Lisaaineid võib metanooli ja vee segus kasutada üksnes erandjuhul, kuna need muudavad kolonni omadusi. Sellisel juhul tuleb kontrollida, et lisaaine ei mõjuta uuritava aine ja võrdlusainete retentsiooniaega. Metanooli ja vee segu sobimatuse korral võib kasutada muid orgaanilise lahusti ja vee segusid, nt etanooli ja vee, atsetonitriili ja vee või isopropüülalkoholi (2-propanooli) ja vee segu.

20.

Ioniseeritavate ainete puhul on oluline eluendi pH. See peaks jääma kolonni töövahemikku, mis on tavaliselt 2–8. Soovitatav on kasutada puhverlahust. Tuleks ära hoida soolade väljasadenemist ja kolonni omaduste halvenemist, mis võib juhtuda mõne orgaanilise lahusti ja puhverlahuse segu puhul. Ränidioksiidil põhineva liikumatu faasi kasutamisel ei ole soovitatav teha HPLC-analüüsi pH väärtustel üle 8, kuna leeliseline liikuv faas võib kolonni omadusi järsult halvendada.

Lahustatavad ained

21.

Uuritav aine ja võrdlusained peavad olema piisavalt puhtad, et võimaldada igale ainele vastava piigi tuvastamist kromatogrammil. Võimaluse korral lahustatakse uuritavad ja kaliibrimiseks kasutatavad ained liikuvas faasis. Kui uuritava aine ja võrdlusainete lahustamiseks kasutatakse liikuva faasi lahusest erinevat lahustit, tuleks enne ainete süstimist kasutada lõpplahjenduse tegemiseks liikuva faasi lahust.

Katsetingimused

22.

Temperatuur ei tohiks mõõtmiste käigus kõikuda rohkem kui ± 1 °C.

Surnud aja t0 määramine

23.

Surnud aja t0 mõõtmiseks võib kasutada kolonnis mittepeetuvaid orgaanilisi aineid (nt tiokarbamiid või formamiid). Täpsema surnud aja saamiseks võib määrata homoloogsete ainete (nt n-alküülmetüülketoonid) seeriasse kuuluva umbes seitsme aine retentsiooniaja (17). Koostatakse graafik retentsiooniaegade tR(nC + 1) ja tR(nC) vahelise sõltuvuse kohta; nC tähistab süsinikuaatomite arvu. Saadakse sirge tR(nC + 1) = A × tR(nC) + (1 – A) × t0, kus A väljendab suhet k(nC + 1)/k(nC) ja on konstantne. Surnud aeg t0 leitakse algordinaadi (1 – A) × t0 ja tõusu A väärtuste alusel.

Regressioonivõrrand

24.

Järgmise sammuna koostatakse log k ja log P vahelist sõltuvust väljendav graafik sobivate võrdlusainete kohta, mille log P väärtused on sarnased uuritava aine eeldatava log P väärtusega. Praktikas süstitakse seadmesse üheaegselt kuus kuni kümme võrdlusainet. Määratakse retentsiooniajad, soovitatavalt meerikuga integraatori abil, mis on ühendatud tuvastamissüsteemiga. Vastavad mahtuvusteguri k logaritmitud väärtused esitatakse graafikul log P funktsioonina. Regressioonivõrrandit kontrollitakse korrapäraste ajavahemike järel, vähemalt kord päevas, et võtta arvesse võimalikke muutusi kolonni efektiivsuses.

UURITAVA AINE POW MÄÄRAMINE

25.

Uuritav aine süstitakse seadmesse väikseimas tuvastatavas koguses. Retentsiooniaeg määratakse kahes korduses. Uuritava aine jaotuskoefitsient saadakse arvutatud mahtuvusteguri interpoleerimisel kaliibrimisgraafiku abil. Väga väikeste ja väga suurte jaotuskoefitsiendi väärtuste korral tuleb kasutada ekstrapoleerimist. Sel juhul tuleb pöörata erilist tähelepanu regressioonisirge usaldusvahemikule. Kui proovi retentsiooniaeg on võrdlusainete retentsiooniaegade vahemikust väljaspool, tuleks märkida asjaomane ülem- või alampiir.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Katseprotokoll

26.

Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:

esialgse hindamise kohane jaotuskoefitsiendi väärtus, kui see on määratud, ning kasutatud meetod; arvutusmeetodi kasutamisel selle täielik kirjeldus, sealhulgas andmed kasutatud andmebaasi kohta ja üksikasjalik teave fragmentide valimise kohta;

uuritava aine ja võrdlusainete puhtus, struktuurivalem ja CASi number;

seadmete ja katsetingimuste kirjeldus: analüütiline kolonn, kaitsekolonn,

liikuv faas, määramismeetod, temperatuurivahemik, pH;

elueerimisprofiilid (kromatogrammid);

surnud aeg ja selle määramise meetod;

kaliibrimisel kasutatud võrdlusainete retentsiooniandmed ja nende log Pow väärtused kirjanduse andmeil;

andmed sobitatud regressioonisirge (log k versus log Pow) ja vastava korrelatsioonikordaja kohta, sealhulgas usaldusvahemik;

uuritava aine keskmine retentsiooniaeg ja interpoleeritud log Pow väärtus;

segu puhul elueerimisprofiili kromatogramm, kus on märgitud piikide piirid;

log Pow väärtused võrrelduna neile vastavate piikide protsentuaalse pindalaga;

regressioonisirge põhjal tehtud arvutused;

vajaduse korral arvutatud kaalutud keskmine log Pow väärtus.

KIRJANDUS

(1)

Eadsforth, C. V., ja Moser, P. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere 12: 1459.

(2)

Klein, W. Kördel, W., Weiss, M., ja Poremski, H. J. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere 17: 361.

(3)

Eadsforth, C. V. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pestic. Sci. 17: 311.

(4)

Ellgehausen, H., D'Hondt, C., ja Fuerer, R. (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pestic. Sci. 12: 219.

(5)

McDuffie, B. (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere 10: 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Juhendi kavand, november 2000.

(7)

OSPAR (1995). „Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995”, 10. lisa. Merereostuse ärahoidmise Oslo ja Pariisi konventsioonide programmide ja meetmete komitee, Oviedo, 20.–24. veebruar 1995.

(8)

Thatcher, M., Robinson, M., Henriquez, L. R., ja Karman, C. C. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Versioon 1.0, 3. august.

(9)

Vik, E. A., Bakke, S., ja Bansal, K. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environ. Model. Software 13: 529–537.

(10)

Renberg, L. O., Sundstroem, S. G., ja Sundh-Nygård, K. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere 9: 683.

(11)

Hammers, W. E., Meurs, G. J., ja De-Ligny, C. L. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chrom. 247: 1.

(12)

Haky, J. E., ja Young, A. M. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromat. 7: 675.

(13)

Fujisawa, S., ja Masuhara, E. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. J. Biomed. Mater. Res. 15: 787.

(14)

Hansch, C., ja Leo, A. J. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York.

(15)

Hansch, C., esimees; Leo, A. J., dir. (1982). „Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity” – kättesaadav järgmisel aadressil: Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

Rekker, R. F., ja de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14: 479.

(17)

Berendsen, G. E., Schoenmakers, P. J., de Galan, L., Vigh, G., Varga-Puchony, Z., ja Inczédy J. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromat. 3: 1669.

Liide

POW arvutamise meetodid

SISSEJUHATUS

1.

Käesolevas liites tutvustatakse lühidalt Pow arvutamist. Lisateave on kättesaadav käsiraamatutes (1, 2).

2.

Pow arvutatud väärtusi kasutatakse:

katsemeetodi valimiseks: log Pow väärtuste vahemiku –2 kuni 4 puhul loksutamismeetod ja log Pow väärtuste vahemiku 0–6 puhul HPLC-meetod;

HPLC kasutustingimuste (võrdlusained, metanooli ja vee suhe) valimiseks;

katseliselt saadud väärtuste usaldusväärsuse kontrollimiseks;

hinnangulise väärtusena, kui katsemeetodeid ei saa kasutada.

Arvutusmeetodite põhimõte

3.

Allpool kirjeldatud arvutusmeetodid põhinevad molekuli teoreetilisel jagamisel sobivateks alaosadeks, mille kohta on teada usaldusväärsed log Pow osaväärtused. Log Pow saamiseks liidetakse alaosade log Pow osaväärtused ja molekulisiseseid vastasmõjusid arvestavad parandustegurid. Alaosade konstandid ja parandustegurid on loetletud mitmes allikas (1, 2, 3, 4, 5, 6). Mõnda allikat ajakohastatakse korrapäraselt (3).

Arvutatud väärtuste usaldusväärsus

4.

Üldjuhul on arvutusmeetodite usaldusväärsus seda väiksem, mida keerukam on uuritav aine. Väikese molekulmassiga lihtsate, ühe või kahe funktsionaalrühmaga molekulide puhul on eeldatav vahe erinevate osadeks jagamise meetodite abil leitud ja mõõdetud log Pow väärtuste vahel 0,1–0,3 ühikut. Veamäär sõltub kasutatud alaosade konstantide usaldusväärsusest, oskusest võtta arvesse molekulisiseseid vastasmõjusid (nt vesiniksidemed) ja parandustegurite õigest kasutamisest. Ioniseeruvate ainete puhul tuleb arvesse võtta laengut ja ioniseerituse ulatust (10).

Fujita-Hanschi π-meetod

5.

Hüdrofoobse asendaja konstant π, mille algselt võtsid kasutusele Fujita et al. (7), on määratletud järgmiselt:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH),

kus PhX aromaatne derivaat on ja PhH on lähteaine.

Nt:

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

π-meetodit kasutatakse eelkõige aromaatsete ainete puhul. π väärtused on kättesaadavad paljude asendajate kohta (4, 5).

Rekkeri meetod

6.

Rekkeri meetodi (8) kohaselt arvutatakse log Pow väärtus järgmiselt:

Formula,

kus ai on arv, mis näitab, mitu korda konkreetne alaosa molekulis esineb, ja fi on selle alaosa log Pow osaväärtus. Vastasmõjutegurid on summaarselt väljendatavad konstandi Cm (nn maagiline konstant) kordsena. Alaosade konstandid fi ja konstant Cm on määratud 825 aine 1 054 katseliselt saadud Pow väärtuse põhjal, kasutades mitme muutujaga regressioonanalüüsi (6, 8). Vastasmõjutegurite määramine toimub kindlate eeskirjade kohaselt (6, 8, 9).

Hanschi-Leo meetod

7.

Hanschi-Leo meetodi (4) kohaselt arvutatakse log Pow väärtus järgmiselt:

Formula,

kus fi on alaosa konstant, Fj on parandustegur ning ai ja bj on vastavad esinemissagedused. Aatomite ja funktsionaalrühmade konstantide ja parandustegurite Fj loetelud on koostatud katse-eksituse meetodil katseliselt saadud Pow väärtuste alusel. Parandustegurid on jagatud mitmesse eri klassi (1, 4). Kõikide eeskirjade ja parandustegurite arvessevõtmiseks on välja töötatud tarkvarapaketid (3).

KOMBINEERITUD MEETOD

8.

Keerukate molekulide log Pow arvutamise täpsust on võimalik oluliselt suurendada, kui molekul jagatakse suuremateks alaosadeks, mille kohta on olemas tabelites esitatud (3, 4) või mõõtmiste teel saadud usaldusväärsed log Pow väärtused. Selliste alaosade (nt heterotsüklid, antrakinoon, asobenseen) osaväärtused saab seejärel kombineerida Hanschi π väärtustega või Rekkeri või Leo meetodi puhul kasutatavate alaosa konstantidega.

Märkused

i)

Need arvutusmeetodid on osaliselt või täielikult ioniseeritud ainete puhul kasutatavad üksnes juhul, kui võetakse arvesse vajalikke parandustegureid.

ii)

Kui võib eeldada molekulisiseste vesiniksidemete olemasolu, tuleb lisada vastavad parandustegurid (umbes + 0,6 kuni + 1,0 log Pow ühikut) (1). Viiteid selliste sidemete olemasolule saab stereomudelitest ja spektroskoopiaandmetest.

iii)

Mitme tautomeerse vormi võimaliku esinemise korral lähtutakse arvutustes kõige tõenäolisemast vormist.

iv)

Tuleks hoolikalt jälgida alaosade konstantide loeteludes tehtavaid muudatusi.

ARVUTUSMEETODEID KÄSITLEV KIRJANDUS

(1)

Lyman, W. J., Reehl, W. F., ja Rosenblatt, D. H. (toim.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

Lyman, W. J., Block, J. H., ja Pearlman, R. S. (toim.). Partition Coefficient, Determination and Estimation. Pergamon Press, Elmsford (New York) ja Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA. Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

Hansch, C., ja Leo, A. J. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, A., Hansch, C., ja Elkins, D. (1971). Partition coefficients and their uses. Chem. Rev. 71: 525.

(6)

Rekker, R. F., ja de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14: 479.

(7)

Fujita, T., Iwasa, J., ja Hansch, C. (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients J. Amer. Chem. Soc. 86: 5175.

(8)

Rekker, R. F. The Hydrophobic Fragmental Constant. Pharmacochemistry Library, 1. köide, Elsevier, New York (1977).

(9)

Eadsforth, C. V., ja Moser, P. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere 12: 1459.

(10)

Scherrer, R. A. ACS – Symposium Series 255, lk 225. American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

3)

Peatükk C.3 asendatakse järgmisega:

C.3.   MAGEVEEVETIKATE JA TSÜANOBAKTERITE KASVU PIDURDUMISE KATSE

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 201 (2006, lisa parandatud 2011. aastal). On ilmnenud vajadus laiendada käesolevat katsemeetodit uutele liikidele ning seda ajakohastada, et viia see kooskõlla kemikaalide ohu hindamist ja nende klassifitseerimist käsitlevate nõuetega. Meetodi läbivaatamisel võeti aluseks ulatuslik praktiline kogemus, teaduse areng vetikatele mürgiste kemikaalide uurimise valdkonnas ja meetodi laialdane regulatiivsel eesmärgil kasutamine pärast algse meetodi vastuvõtmist.

2.

Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.

KATSE PÕHIMÕTE

3.

Katse eesmärk on teha kindlaks uuritava kemikaali mõju magevee-mikrovetikate ja/või tsüanobakterite kasvule. Eksponentsiaalse kasvu faasis olevatel katseorganismidel lastakse mittepidevas kultuuris puutuda kokku uuritava kemikaaliga tavaliselt 72 tunni jooksul. Vaatamata katse suhteliselt lühikesele kestusele võimaldab see hinnata kemikaali mõju mitmes katseorganismide põlvkonnas.

4.

Katse eeldatav tulemus on seeria vetikakultuuride (katseüksused) kasvu pidurdumine kokkupuutel eri kontsentratsioonides esineva uuritava kemikaaliga. Katsetulemuste hindamiseks uuritakse kasvu sõltuvust kemikaali kontsentratsioonist ja võrreldakse seda keskmise kasvuga paralleelsetes kontrollkultuurides, kuhu uuritavat kemikaali ei ole lisatud. Et võimaldada mürgise mõju täielikku avaldumist sellises süsteemis (optimaalne tundlikkus), lastakse kultuuridel küllaldase toitainete sisalduse juures ja pideva valguse käes piisava aja jooksul piiramatult eksponentsiaalselt kasvada, et oleks võimalik mõõta kasvu erikiiruse vähenemist.

5.

Kasvu ja selle pidurdumise kvantitatiivseks iseloomustamiseks mõõdetakse vetikate biomassi sõltuvust ajast. Vetikate biomassi kogus on määratletud kuivmassina ruumalaühiku kohta, nt milligrammides katselahuse liitri kohta. Kuna kuivmassi on raske mõõta, kasutatakse asendusparameetreid. Kõige sagedamini kasutatakse asendusparameetrina rakkude arvu. Asendusparameetriteks võivad olla ka rakkude summaarne ruumala, fluorestsents, optiline tihedus jne. On vaja teada kordajat, mille abil saab mõõdetava asendusparameetri ümber arvutada biomassiks.

6.

Katse lõppnäitaja on kasvu pidurdumine, kusjuures kasvu väljendatakse biomassi koguse logaritmitud väärtuse suurenemisena kokkupuuteaja jooksul (keskmine kasvu erikiirus). Katselahuste seerias määratud keskmiste kasvu erikiiruste põhjal tehakse kindlaks kontsentratsioon, mille puhul kasvukiirus väheneb teatud kindla protsendi x (nt 50 %) võrra; seda kontsentratsiooni väljendatakse kujul ErCx (nt ErC50).

7.

Käesoleva meetodi puhul kasutatakse süsteemi vastust iseloomustava muutujana ka saagist, mille määramine võib olla vajalik mõnes riigis kehtivate regulatiivsete erinõuete täitmiseks. Saagis on määratletud kui kokkupuuteperioodi lõpus ja alguses määratud biomassikoguste vahe. Katselahuste seerias määratud saagiste põhjal arvutatakse kontsentratsioon, mille puhul saagis väheneb teatud kindla protsendi x (nt 50 %) võrra; seda kontsentratsiooni väljendatakse kujul EyCx (nt EyC50).

8.

Peale selle võib statistiliselt kindlaks teha vähima täheldatavat toimet avaldava kontsentratsiooni (LOEC) ja täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni (NOEC).

TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA

9.

Katsetingimuste kindlaksmääramiseks võib uuritava kemikaali kohta olla kasulik teada muu hulgas järgmisi andmeid: struktuurivalem, puhtus, püsivus valguse käes, püsivus katsetingimuste juures, valguse neeldumisega seotud omadused, pKa ja andmed kemikaali muundumise kohta, sealhulgas biolagunduvus vees.

10.

On vaja teada uuritava kemikaali lahustuvust vees, jaotuskoefitsienti süsteemis oktanool/vesi (Pow) ja aururõhku, ning kemikaali sisalduse määramiseks katselahuses tuleks kasutada valideeritud meetodit, mille puhul on teada kemikaali tuvastamise tõhusus ja meetodi määramispiir.

KATSE NÕUETEKOHASUS

11.

Katse vastab nõuetele, kui on täidetud järgmised kriteeriumid.

Kontrollkultuuri biomass peab 72-tunnise katse kestel olema eksponentsiaalselt suurenenud vähemalt 16 korda. Sellele vastav kasvu erikiirus ööpäevas on 0,92. Kõige sagedamini kasutatavate liikide puhul on kasvukiirus tavaliselt palju suurem (vt 2. liide). See kriteerium ei pea olema täidetud, kui kasutatakse 2. liites loetletud liikidest aeglasemalt kasvavaid liike. Sellisel juhul tuleb katseaega pikendada nii, et kontrollkultuuri biomass kasvaks vähemalt 16 korda, kusjuures kasv peab kogu katse vältel olema eksponentsiaalne. Piiramatu eksponentsiaalse kasvu tagamiseks kogu katse vältel võib katse kestust lühendada, nii et see on minimaalselt 48 tundi, kui selle ajaga saavutatakse biomassi nõutav 16-kordne kasv.

Kontrollkultuurides ajavahemike kaupa (72-tunnise katse puhul katsepäevad 0–1, 1–2 ja 2–3) arvutatud kasvu erikiiruste keskmine variatsioonikordaja (vt 1. liide, mõiste „variatsioonikordaja”) ei tohi olla üle 35 %. Kasvu erikiiruse arvutamist ajavahemike kaupa kirjeldatakse punktis 49. Seda kriteeriumi rakendatakse paralleelsete kontrollkultuuride kohta arvutatud keskmise variatsioonikordaja suhtes.

Katsetes Pseudokirchneriella subcapitata ja Desmodesmus subspicatus'ega ei tohi paralleelsete kontrollkultuuride keskmise kasvu erikiiruse variatsioonikordaja olla kogu katse kestel suurem kui 7 %. Harvemini kasutatavate muude liikide puhul ei tohi see väärtus olla üle 10 %.

VÕRDLUSKEMIKAAL

12.

Katsemeetodi kontrollimiseks võib kasutada rahvusvahelises võrdlusuuringus (1) kasutatud võrdluskemikaale, näiteks 3,5-diklorofenooli. Rohevetikate puhul võib võrdluskemikaalina kasutada ka kaaliumdikromaati. Võrdluskemikaaliga kontrollimist soovitatakse teha vähemalt kaks korda aastas.

KATSEMEETODI KASUTATAVUS

13.

Käesolev katsemeetod on kõige hõlpsamalt kasutatav vees lahustuvate kemikaalide puhul, mis katsetingimustes tõenäoliselt püsivad vesilahuses. Kui uuritav kemikaal on lenduv, tugevasti adsorbeeruv, värviline või vees raskesti lahustuv või võib mõjutada toit- või mineraalainete kättesaadavust söötmes, võib olla vaja teha kirjeldatud katsemeetodis teatavaid muudatusi (nt kasutada suletud süsteemi või valmistada katsenõud eelnevalt ette). Juhendid mõne asjakohase muudatuse tegemiseks on esitatud allikates 2, 3 ja 4.

KATSEMEETODI KIRJELDUS

Seadmed

14.

Katsenõud ja muud seadmed, mis puutuvad kokku katselahustega, peaksid olema üleni klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. Seadmed peavad olema hoolikalt pestud, et tagada vetikate kasvu või katselahuste koostist mõjutada võivate orgaaniliste ja anorgaaniliste saasteainete puudumine.

15.

Katsenõuna kasutatakse tavaliselt klaaskolbi, mis on piisavalt suur, et katse ajal saaks mõõtmisteks võtta küllaldases mahus kultuuri ja oleks tagatud piisav CO2 massiülekanne atmosfäärist (vt punkt 30). Tuleb silmas pidada, et vedeliku maht peab olema analüüside tegemiseks piisav (vt punkt 37).

16.

Lisaks võib vaja minna järgmisi seadmeid.

Kultiveerimisseade: soovitatav on kasutada kappi või kambrit, mis võimaldab hoida inkubatsioonitemperatuuri täpsusega ± 2 °C.

Fotomeetrid: on oluline silmas pidada, et valgustustiheduse mõõtmise meetod ja eriti anduri (kollektori) tüüp võivad mõjutada mõõdetavat väärtust. Mõõtmiseks soovitatakse kasutada kerakujulist (4 π) andurit, mis reageerib nii ülalt- kui ka altpoolt mõõtetasapinda mis tahes nurga all saabuvale otsesele ja peegeldunud valgusele, või poolkerakujulist (2 π) andurit, mis reageerib ülaltpoolt mõõtetasapinda mis tahes nurga all saabuvale valgusele.

Seade vetikate biomassi määramiseks. Rakkude arvu, mis on kõige sagedamini kasutatav vetikate biomassi asendusparameeter, võib määrata elektroonilise osakeste loenduriga, mikroskoobi ja loenduskambriga või läbivoolutsütomeetriga. Muid biomassi asendusparameetreid võib mõõta läbivoolutsütomeetri, fluorimeetri, spektrofotomeetri või kolorimeetri abil. On kasulik arvutada kordaja, mille abil saab rakkude arvu teisendada kuivmassiks. Spektrofotomeetri kasutamisel võib biomassi väikese kontsentratsiooni juures olla kasutuskõlblike mõõtmistulemuste saamiseks vaja küvette, milles valguse teepikkus on vähemalt 4 cm.

Katseorganismid

17.

Võib kasutada vabalt ujuvaid mitme liigi mikrovetikaid ja tsüanobaktereid. On tõendatud, et käesoleva meetodi kohane katse käik sobib 2. liites loetletud tüvede puhul.

18.

Muu liigi organismide kasutamisel tuleb märkida asjaomane tüvi ja/või organismi päritolu. Tuleb tõendada, et valitud katsevetikate kasv on kohaldatavates tingimustes kogu katse vältel eksponentsiaalne.

Sööde

19.

Soovitatakse kasutada kas OECD söödet või söödet AAP. Nende söötmete koostis on esitatud 3. liites. Tuleb silmas pidada, et nende söötmete pH algväärtus ja puhverdusvõime (pH tõusu kompenseerimise võime) on erinevad. Seepärast võivad katsetulemused sõltuda kasutatud söötmest, eriti kui uuritav kemikaal võib moodustada ioone.

20.

Teatavatel juhtudel, näiteks kui uuritakse metalle ja kelaativaid kemikaale või kui katsed tehakse eri pH väärtuste juures, võib olla vaja söötme koostist muuta. Sellist muudetud söödet tuleks üksikasjalikult kirjeldada ja selle kasutamist põhjendada (3, 4).

Biomassi algkontsentratsioon

21.

Biomassi algkontsentratsioon peab kõigis katsekultuurides olema sama ja piisavalt väike, et võimaldada eksponentsiaalset kasvu kogu inkubatsiooniaja kestel, ilma et tekiks toitainete ammendumise ohtu. Biomassi algkontsentratsioon kuivmassina ei tohiks olla suurem kui 0,5 mg/l. Soovitatakse kasutada järgmisi rakkude algkontsentratsioone:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103 – 104 rakku/ml;

Desmodesmus subspicatus:

2 – 5 × 103 rakku/ml;

Navicula pelliculosa:

104 rakku/ml;

Anabaena flos-aquae:

104 rakku/ml;

Synechococcus leopoliensis:

5 × 104 – 105 rakku/ml.

Uuritava kemikaali kontsentratsioon

22.

Kontsentratsioonivahemiku, mille puhul mõju tõenäoliselt avaldub, võib määratleda sellise vahemiku leidmiseks tehtud katsete tulemuste põhjal. Lõpliku katse tegemisel kasutatakse vähemalt viit kontsentratsiooni, mis moodustavad geomeetrilise jada, mille tegur ei ole suurem kui 3,2. Kui uuritava kemikaali mõju sõltuvus kontsentratsioonist on nõrk, võib olla õigustatud suurema teguri kasutamine. Kontsentratsioonide jada peaks eelistatult hõlmama vahemikku, mille puhul vetikate kasvukiirus väheneb 5–75 % võrra.

Paralleel- ja kontrollkultuurid

23.

Katseplaanis tuleks ette näha kolm paralleelkultuuri iga kasutatava kontsentratsiooni kohta. Kui ei nõuta täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni (NOEC) kindlakstegemist, võib katseplaani muuta nii, et suurendatakse kasutatavate kontsentratsioonide arvu ja vähendatakse paralleelkultuuride arvu iga kontsentratsiooni kohta. Paralleelseid kontrollkultuure peab olema vähemalt kolm ja parimal juhul võiks neid olla kaks korda rohkem kui paralleelkultuure iga kasutatava kontsentratsiooni kohta.

24.

Uuritava kemikaali kontsentratsioonide määramiseks võib valmistada eraldi katselahuste seeria (vt punktid 36 ja 38).

25.

Kui uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatakse lahustit, tuleb katseplaanis ette näha täiendavad kontrollkultuurid, mis sisaldavad lahustit samas kontsentratsioonis kui uuritava kemikaaliga kultuurid.

Inokulum-kultuuri valmistamine

26.

Et võimaldada katsevetikatel kohaneda katsetingimustega ja tagada, et katselahuste inokuleerimisel on vetikad eksponentsiaalse kasvu faasis, valmistatakse 2–4 päeva enne katse algust katsesöötmel põhinev inokulum-kultuur. Vetikate biomassi kogust tuleks kohandada nii, et inokulum-kultuuris oleks enne katse algust ülekaalus eksponentsiaalne kasv. Inokulum-kultuuri inkubeeritakse samades tingimustes kui katsekultuure. Et veenduda, et katses kasutatav tüvi kasvab kultiveerimistingimustes normaalselt, mõõdetakse biomassi suurenemist inokulum-kultuuris. Üks vetikate kultiveerimise meetodi näide on esitatud 4. liites. Rakkude sünkroonse jagunemise ärahoidmiseks katse ajal võib olla vajalik inokulum-kultuuri teistkordne ümberkülvamine.

Katselahuste valmistamine

27.

Kõigis katselahustes peab söötme kontsentratsioon ja katsevetikate biomassi algkontsentratsioon olema ühesugune. Tavaliselt valmistatakse valitud kontsentratsiooniga katselahused uuritava kemikaali põhilahuse, söötme ja inokulum-kultuuri segamise teel. Põhilahuse saamiseks lahustatakse uuritav kemikaal tavaliselt katsesöötmes.

28.

Vees raskesti lahustuvate kemikaalide lisamiseks katsesöötmesse võib kasutada lahusteid, näiteks atsetooni, t-butüülalkoholi või dimetüülformamiidi (2, 3). Lisatud lahusti kontsentratsioon ei tohiks olla suurem kui 100 μl/l ja see peaks olema sama kõigis katseseeria kultuurides, sealhulgas kontrollkultuurides.

Inkubeerimine

29.

Katsenõud suletakse õhku läbi laskvate korkidega. Nõusid loksutatakse ja need asetatakse kultiveerimisseadmesse. Katse ajal on vaja hoida vetikaid suspensioonis ja soodustada CO2 ülekannet lahusesse. Selleks tuleks kultuure pidevalt loksutada või segada. Kultuure tuleks kasvatada temperatuurivahemikus 21–24 °C ning temperatuuri tuleks hoida täpsusega ± 2 °C. Kui kasutatakse 2. liites loetlemata liike (nt troopilised liigid), võib valida kõrgema temperatuuri, kui see ei takista nõuetele vastavuse kriteeriumide täitmist. Kolvid soovitatakse paigutada inkubaatoris juhuslikult ja muuta iga päev nende paigutust.

30.

Katse ajal ei tohiks kontrollsöötme pH tõusta rohkem kui 1,5 ühiku võrra. Kui uuritakse metalle või kemikaale, mis katses kasutatavale pH-le lähedasel pH väärtusel osaliselt ioniseeruvad, võib reprodutseeritavate ja üheselt tõlgendatavate tulemuste saamiseks olla vaja piirata pH muutumise ulatust. Tehniliselt on võimalik saavutada olukord, kus pH muutus on väiksem kui 0,5 ühikut, kui tagatakse piisav CO2 massiülekanne ümbritsevast õhust katselahusesse, näiteks loksutamiskiiruse suurendamise teel. Teine võimalus on vähendada CO2 tarvet, vähendades algset biomassi või lühendades katse kestust.

31.

Pinda, kus kultuure inkubeeritakse, tuleks valgustada pidevalt ja ühtlaselt luminofoorlambiga, mille valgus on näiteks külmvalge või päevavalguse spektriga. Vetikate ja tsüanobakterite tüvede valgusevajadus on erinev. Valgustustihedus tuleks valida lähtuvalt kasutatavast katseorganismist. Soovitatavate rohevetikaliikide puhul valitakse valgustustiheduseks katselahuste tasapinnal 60–120 μE m– 2 s– 1, mõõdetuna sobiva anduri abil fotosünteesiks sobivas lainepikkuste vahemikus 400–700 nm. Mõne liigi, eriti Anabaena flos-aquae tsüanobakterid kasvavad hästi väiksema valgustustiheduse juures ja suurem valgustustihedus võib neid kahjustada. Sellise liigi puhul tuleks valida keskmiseks valgustustiheduseks 40–60 μE m– 2 s– 1. (Luksides kaliibritud fotomeetri puhul vastab külmvalge valgustustiheduse vahemikule 60–120 μE m– 2 s– 1 vahemik 4 440–8 880 luksi.) Valgustustihedus inkubatsioonipinnal ei tohi hälbida keskmisest valgustustihedusest rohkem kui ± 15 %.

Katse kestus

32.

Katse kestab tavaliselt 72 tundi. Võib siiski kasutada ka lühema või pikema kestusega katseid tingimusel, et on võimalik täita kõiki punkti 11 kohaseid nõuetele vastavuse kriteeriume.

Mõõtmised ja analüüsid

33.

Vetikate biomassi igas kolvis määratakse katse ajal vähemalt üks kord ööpäevas. Kui mõõtmiseks kasutatakse katselahusest pipetiga võetud väikesi vedelikukoguseid, ei viida neid enam katselahusesse tagasi.

34.

Biomassi mõõdetakse kas mikroskoobi abil rakkude loendamise teel või elektroonilise osakeste loenduriga (määratakse rakkude arv ja/või biomaht). Võib kasutada ka alternatiivmeetodeid, näiteks läbivoolutsütomeetriat, klorofülli fluorestsentsi määramist in vitro või in vivo (5, 6) või optilise tiheduse mõõtmist, kui on võimalik tõendada, et katses esinevas biomassivahemikus on asjaomaste parameetrite ja biomassi vahel piisav korrelatsioon.

35.

Lahuste pH-d mõõdetakse katse alguses ja lõpus.

36.

Kui on olemas meetod uuritava kemikaali määramiseks katses kasutatavas kontsentratsioonivahemikus, tuleks kontrollida kemikaali algsisaldust katselahuses ja selle sisalduse püsimist katse vältel.

37.

Kui kontsentratsiooni muutus katse vältel on eeldatavalt alla 20 % nominaalväärtusest, võib piisata uuritava kemikaali sisalduse määramisest katse alguses ja lõpus ühel väiksel ja ühel suurel kontsentratsioonil ja eeldatavale EC50-le lähedasel kontsentratsioonil. Kui kontsentratsioon tõenäoliselt ei püsi vahemikus 80–120 % nominaalväärtusest, soovitatakse määrata uuritava kemikaali sisaldus katse alguses ja lõpus igal kasutataval kontsentratsioonil. Kui uuritav kemikaal on lenduv, ebapüsiv või tugevasti adsorbeeruv, soovitatakse katse ajal võtta määramiseks iga 24 tunni järel lisaproove, et paremini jälgida uuritava kemikaali kadu. Selliste kemikaalide puhul võib olla vaja kasutada täiendavaid paralleelkultuure. Kõikidel juhtudel on uuritava kemikaali sisaldust igal kasutataval kontsentratsioonil vaja määrata ainult ühes paralleelkultuuris (või paralleelkultuuridest kokku segatud ühes proovis).

38.

Söötmeid, mis on spetsiaalselt valmistatud kokkupuutekontsentratsiooni määramiseks katse ajal, tuleks käidelda täpselt samal viisil kui katses kasutatavaid söötmeid, st need inokuleeritakse vetikatega ja neid inkubeeritakse samades tingimustes. Kui on vaja määrata uuritava lahustunud kemikaali sisaldust, võib olla vaja eraldada söötmest vetikad. Eraldamiseks tuleks eelistatult kasutada tsentrifuugimist väikesel kiirendusel, millest piisab vetikate sadestamiseks.

39.

Kui on tõendatud, et uuritava kemikaali sisaldus ei kõigu katse vältel nominaalväärtuse või mõõdetud algväärtusega võrreldes rohkem kui ± 20 %, võib tulemuste analüüsimisel võtta aluseks nominaalväärtuse või mõõdetud algväärtuse. Kui kõrvalekalle sisalduse nominaalväärtusest või mõõdetud algväärtusest on suurem kui ± 20 %, tuleks tulemuste analüüsimisel võtta aluseks katse vältel esinevate väärtuste geomeetriline keskmine või mõni uuritava kemikaali sisalduse vähenemist kirjeldav mudel (3, 7).

40.

Vetikate kasvu pidurdumise katse on dünaamilisem kui enamik muid veeorganismidele avalduva lühiajalise mürgisuse määramise katseid. Seepärast võib tegeliku kokkupuutekontsentratsiooni kindlakstegemine olla raskendatud, eriti kui uuritakse adsorbeeruvat kemikaali väiksel kontsentratsioonil. Sellisel juhul ei tähenda uuritava kemikaali kadu lahusest seoses vetikate suurenevale biomassile adsorbeerumisega, et kemikaal on katsesüsteemist kadunud. Katsetulemuste analüüsimisel tuleks kontrollida, kas uuritava kemikaali sisalduse vähenemisega katse ajal kaasneb kasvu pidurdumise vähenemine. Kui see on nii, võib kaaluda uuritava kemikaali sisalduse vähenemist kirjeldava sobiva mudeli rakendamist (7). Kui kasvu pidurdumine ei vähene, võib olla sobiv võtta tulemuste analüüsimisel aluseks nominaalsisaldus või mõõdetud algsisaldus.

Muud vaatlused

41.

Inokulum-kultuuri tuleks vaadelda mikroskoobi all, et veenduda, et kultuur näeb välja normaalne ja elujõuline, ning katse lõpus tuleks vetikakultuuri samal viisil uurida morfoloogiliste muutuste tuvastamiseks, mis võivad olla põhjustatud kokkupuutest uuritava kemikaaliga.

Piirsisalduskatse

42.

Teatavatel juhtudel, näiteks kui eelkatsest selgub, et uuritav kemikaal ei avalda kontsentratsioonil kuni 100 mg/l või katsesöötmes lahustuvuse piirkontsentratsioonil (olenevalt sellest, kumb on väiksem) mürgist mõju, võib teha piirsisalduskatse, milles võrreldakse kasvu kontrollrühmas ja ühes katserühmas, kus kemikaal esineb kontsentratsioonis 100 mg/l või lahustuvuse piirkontsentratsioonis. Piirsisalduskatse tegemisel soovitatakse tungivalt määrata ka kokkupuutekontsentratsioon. Piirsisalduskatse puhul kohaldatakse kõiki eespool kirjeldatud katsetingimusi ja nõuetele vastavuse kriteeriume; ainsa erandina nähakse ette, et uuritava kemikaaliga paralleelkultuure peaks olema vähemalt kuus. Kontroll- ja katserühmas mõõdetud muutujate analüüsil võib keskväärtusi võrrelda statistilise testi (nt Studenti t-testi) abil. Kui kahe rühma andmete hajuvused on erinevad, tuleks kasutada ebavõrdse hajuvuse suhtes kohandatud t-testi.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Kasvukõverate koostamine

43.

Katsenõus oleva biomassi kogust võib väljendada mõõtmisel kasutatud asendusparameetri (nt rakkude arv, fluorestsents) ühikutes.

44.

Katse- ja kontrollkultuurides määratud biomassi ja uuritava kemikaali kontsentratsioonid ning mõõtmise ajad, mis registreeritakse vähemalt täistunni täpsusega, kantakse tabelisse ja nende andmete põhjal koostatakse kasvukõverad. Siin kirjeldatud esimeses etapis võib olla kasulik kasutada nii logaritmilist kui ka lineaarset skaalat, kuid logaritmiline skaala on kohustuslik ja võimaldab katse kestel esinevaid kasvukiiruse muutusi üldjuhul paremini esitada. Tuleb silmas pidada, et logaritmilisel skaalal saadakse eksponentsiaalse kasvu puhul sirge, mille tõus väljendab kasvu erikiirust.

45.

Kasvukõverate abil kontrollitakse, kas kontrollkultuurid kasvavad kogu katse jooksul eksponentsiaalselt ja eeldatava kiirusega. Iga andmepunkti ja graafikute kuju hinnatakse kriitiliselt ning veendutakse, et töötlemata andmetes ei ole vigu ja katse on läbi viidud korrektselt. Eelkõige kontrollitakse andmepunkte, mille puhul kõrvalekalle näib tulenevat süstemaatilisest veast. Kui on võimalik tuvastada viga katse läbiviimisel või vea esinemist võib pidada väga tõenäoliseks, tähistatakse asjaomane andmepunkt võõrväärtusena ja jäetakse järgnevast statistilisest analüüsist välja. (Näiteks võib vetikate nullsisaldus ühes kahest või kolmest paralleelnõust osutada sellele, et inokuleerimine ei toimunud selles nõus õigesti või nõu ei olnud korralikult puhastatud.) Katseprotokollis esitatakse selgelt põhjus, miks teatav andmepunkt on võõrväärtusena analüüsist välja jäetud. Vastuvõetavaks põhjuseks loetakse ainult (harva esinevaid) vigu katse läbiviimisel, mitte aga vähest täpsust. Kõnealuse probleemi puhul on statistiliste meetodite kasutusvõimalused võõrväärtuste kindlakstegemiseks piiratud ja need ei asenda eksperdihinnangut. Katseandmete esitamisel graafikul või tabelis on soovitatav esitada koos teiste andmepunktidega ka võõrväärtustele vastavad (ja sellisena tähistatud) punktid.

Uuritavad muutujad

46.

Katse eesmärk on teha kindlaks uuritava kemikaali mõju vetikate kasvule. Kuna eelistused ja regulatiivsed vajadused eri jurisdiktsioonides on erinevad, kirjeldatakse käesolevas katsemeetodis kahte uuritavat muutujat. Et tagada katsetulemuste vastuvõetavus kõikides jurisdiktsioonides, tuleks vaadeldava mõju hindamisel kasutada mõlemat allpool kirjeldatud muutujat (a ja b).

a)    Keskmine kasvu erikiirus : see uuritav muutuja arvutatakse katse ajal toimunud biomassi juurdekasvu logaritmitud väärtuste alusel ja seda väljendatakse kasvukiirusena ööpäevas.

b)    Saagis : see uuritav muutuja on biomassi koguste vahe katse lõpus ja alguses.

47.

Tuleks silmas pidada, et nende kahe uuritava muutuja abil arvutatud mürgisuse väärtused ei ole võrreldavad, ning seda erinevust tuleb katsetulemuste kasutamisel arvesse võtta. Käesolevas katsemeetodis sätestatud tingimuste kohase katse puhul on keskmisel kasvu erikiirusel põhinevad ECx väärtused (ErCx) üldjuhul suuremad kui saagisel põhinevad väärtused (EyCx), kuna asjaomaste lähenemisviiside matemaatiline alus on erinev. Seda erinevust ei tohiks tõlgendada kahe kõnealuse uuritava muutuja tundlikkuse erinevusena; asjaomased väärtused on lihtsalt matemaatiliselt erinevad. Keskmise kasvu erikiiruse määratlus põhineb vetikate üldisel piiramatul eksponentsiaalsel kasvul kultuuris, kusjuures mürgisust hinnatakse kasvukiirusele avalduva mõju alusel ja see ei olene kontrollkultuuri absoluutsest kasvu erikiirusest, kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera tõusust ega katse kestusest. Kui uuritav muutuja on aga saagis, sõltuvad tulemused kõikidest eespool nimetatud lisamuutujatest. EyCx väärtus sõltub katses kasutatud vetikaliigi kasvu erikiirusest ja maksimaalsest kasvu erikiirusest, mis võib eri vetikaliikidel ja isegi sama liigi eri tüvedel olla erinev. Seda uuritavat muutujat ei tohiks kasutada, kui võrreldakse vetikaliikide või -tüvede tundlikkust mürgiste kemikaalide suhtes. Ehkki keskmise kasvu erikiiruse kasutamine mürgisuse hindamiseks on teaduslikult paremini põhjendatud, käsitletakse käesolevas katsemeetodis mõnes riigis kehtivate regulatiivsete nõuete järgimise võimaldamiseks ka saagisel põhinevat mürgisuse hindamist.

Keskmine kasvukiirus

48.

Keskmine kasvu erikiirus teataval ajavahemikul arvutatakse kontrollrühma ja katserühmade iga nõu puhul biomassi juurdekasvu logaritmitud väärtuse põhjal vastavalt järgmisele võrrandile:

Formula

[1],

kus

μi–j

on keskmine kasvu erikiirus ajavahemikul ij,

Xi

on biomass ajahetkel i ja

Xj

on biomass ajahetkel j.

Kontrollrühma ja iga katserühma puhul arvutatakse kasvukiiruse keskmine väärtus ja tulemuste hajuvus.

49.

Arvutatakse keskmine kasvu erikiirus kogu katseaja (tavaliselt päevad 0–3) jooksul, võttes aluseks inokuleerimiseks kasutatud biomassi nominaalväärtuse, mitte mõõdetud algväärtuse, sest tavaliselt saadakse sel viisil täpsem tulemus. Biomassi mõõdetud algsisaldust võib siiski kasutada juhul, kui biomassi mõõtmise seade (nt läbivoolutsütomeeter) võimaldab määrata inokulumi biomassi piisavalt täpselt. Kasvu erikiiruse hindamiseks ajavahemike kaupa arvutatakse see katse vältel iga ööpäeva kohta (katsepäevad 0–1, 1–2 ja 2–3) ja kontrollitakse, kas kontrollkultuuri kasvukiirus püsib muutumatuna (vt nõuetele vastavuse kriteeriumid punktis 11). Kui kasvu erikiirus esimesel katsepäeval on üldisest keskmisest väärtusest oluliselt väiksem, võib see osutada ootefaasi esinemisele. Kontrollkultuuri ootefaasi saab minimeerida või praktiliselt kõrvaldada eelkultuuri õige paljundamisega; uuritava kemikaaliga kultuuride puhul aga võib ootefaas osutada taastumisele esialgsest mürgise mõjuga seotud stressist või uuritava kemikaali sisalduse vähenemisele seoses esialgse kokkupuute järgse kemikaali kaoga (muu hulgas vetikate biomassile adsorbeerumise tõttu). Seega võib kasvukiiruse hindamist ajavahemike kaupa kasutada uuritava kemikaali mõju jälgimiseks kokkupuuteaja jooksul. Ajavahemike kaupa arvutatud kasvukiiruste ja keskmise kasvukiiruse vahelised olulised erinevused osutavad pidevast eksponentsiaalsest kasvust kõrvalekaldumisele ning sel juhul on vaja kasvukõveraid üksikasjalikult uurida.

50.

Uuritavat kemikaali sisaldava iga paralleelkultuuri puhul arvutatakse kasvukiiruse pidurdumise määr protsentides järgmise võrrandi abil:

Formula

[2],

kus

% Ir

on keskmise kasvu erikiiruse pidurdumise määr protsentides,

μC

on keskmise kasvu erikiiruse (μ) keskväärtus kontrollrühmas ja

μT

on keskmine kasvu erikiirus uuritava kemikaaliga paralleelkultuuris.

51.

Kui katselahuste valmistamiseks kasutatakse lahusteid, tuleks pidurdumise määr arvutada lahustit sisaldavate, mitte lahustivabade kontrollkultuuride põhjal.

Saagis

52.

Saagis arvutatakse kontrollrühma ja katserühmade iga nõu kohta, lahutades katse lõpus määratud biomassi kogusest biomassi algkoguse. Kontrollrühmas ja uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul arvutatakse keskmine saagis ning tulemuste hajuvus. Saagise vähenemise määra protsentides ( % Iy) võib uuritavat kemikaali sisaldava iga paralleelkultuuri puhul arvutada järgmiselt:

Formula

[3],

kus

% Iy

on saagise vähenemise määr protsentides,

YC

on keskmine saagis kontrollrühmas ja

YT

on saagis uuritava kemikaaliga paralleelkultuuris.

Kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera koostamine

53.

Koostatakse graafik, mis väljendab kasvukiiruse pidurdumise või saagise vähenemise protsentuaalse määra sõltuvust uuritava kemikaali kontsentratsiooni logaritmitud väärtusest; graafikut uuritakse üksikasjalikult, jättes kõrvale kõik esimeses etapis võõrväärtustena välja jäetud andmepunktid. Läbi punktide tõmmatakse käsitsi või arvutipõhise interpoleerimise abil sujuv kõver, mis annab esmapildi kontsentratsiooni ja mõju vahelisest seosest, ning seejärel rakendatakse üksikasjalikumat lähenemisviisi, soovitatavalt mõnda arvutipõhist statistilist meetodit. Olenevalt andmete kasutusotstarbest, kvaliteedist (täpsusest) ja hulgast ning andmeanalüüsi meetodite kättesaadavusest võidakse andmete analüüsimine sellega lõpetada (teatavatel juhtudel on see õigustatud) ja lugeda silma järgi koostatud kõveralt kõige olulisemad näitajad EC50 ja EC10 (ja/või EC20) (vt ka stimuleerivat mõju käsitlev punkt allpool). Mõjuvad põhjused statistiliste meetodite kasutamisest loobumiseks võivad olla näiteks järgmised:

andmed ei võimalda saada arvutipõhiste meetoditega usaldusväärsemaid tulemusi kui eksperdihinnangu alusel saadud tulemused – sellisel juhul ei pruugi mõned arvutiprogrammid üldse anda usaldusväärseid lahendeid (iteratsioonid ei pruugi koonduda jne);

olemasolevad arvutiprogrammid ei võimalda piisavalt hästi hinnata stimuleerivat mõju kasvule (vt allpool).

Statistilised meetodid

54.

Eesmärk on leida regressioonanalüüsi abil kvantitatiivne seos kontsentratsiooni ja mõju vahel. On võimalik kasutada kaalutud lineaarset regressiooni pärast mõjuandmete lineariseerivat teisendamist näiteks probit-, logit- või Weibulli jaotuse kujule (8), kuid tuleks siiski eelistada mittelineaarse regressiooni meetodeid, mis sobivad paremini vältimatute andmevigade ja sujuvast jaotusest kõrvalekallete puhul. Kasvu täielikule pidurdumisele või pidurdumise täielikule puudumisele lähedases olukorras võib kõnealune teisendamine andmevigu võimendada ja analüüsi segada (8). Tuleks silmas pidada, et probit-, logit- või Weibulli teisendusel põhinevad standardsed analüüsimeetodid on ette nähtud binaarsete tunnuste (nt suremus või elulemus) analüüsimiseks ning neid tuleb kasvu- või biomassiandmete analüüsimiseks kohandada. Konkreetsed meetodid ECx väärtuste leidmiseks pidevate andmete alusel on esitatud allikates 9, 10 ja 11. Mittelineaarse regressiooni kasutamist on üksikasjalikult käsitletud 5. liites.

55.

Kummagi uuritava muutuja puhul arvutatakse kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera põhjal ECx hinnangulised väärtused. Võimaluse korral tuleks määrata iga hinnangulise väärtuse usalduspiirid usaldusnivool 95 %. Mõjuandmete sobivust regressioonimudeliga tuleks hinnata graafiliselt või statistiliselt. Regressioonanalüüsi tegemisel tuleks kasutada mitte katserühmade andmete keskväärtusi, vaid igas üksikus paralleelkultuuris saadud väärtusi. Kui andmete suure hajuvuse tõttu on kõvera mittelineaarne lähendamine raske või võimatu, võib probleemi lahendamiseks kasutada regressioonanalüüsi puhul siiski rühmade keskväärtusi – selle praktilise lähenemisviisiga vähendatakse eeldatavate võõrväärtuste mõju. Sellise võimaluse kasutamise korral tuleks katseprotokolli lisada märkus, et tavapärasest analüüsimeetodist kalduti kõrvale, kuna iga üksiku paralleelkultuuri andmetest lähtuv kõvera lähendamine ei andnud head tulemust.

56.

Kui olemasolevad regressioonimudelid ja -meetodid ei ole katseandmete jaoks sobivad, võib EC50 hinnangulise väärtuse ja usalduspiiride leidmiseks kasutada ka lineaarset interpoleerimist koos andmete usaldusväärsuse iteratiivse kontrollimisega (bootstrapping) (13).

57.

Et teha kasvukiiruse puhul kindlaks uuritava kemikaali vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) ja selle alusel ka täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC), on vaja võrrelda katserühmade keskväärtusi dispersioonanalüüsi (ANOVA) meetoditega. Iga kontsentratsiooni puhul leitud keskväärtust võrreldakse seejärel kontrollrühmas saadud keskväärtusega, kasutades sobivat mitmese võrdluse või trenditesti meetodit. Selleks võib sobida Dunnetti või Williamsi test (12, 14, 15, 16, 17). Tuleb hinnata, kas kehtib dispersioonanalüüsi eeldus, et hajuvus on homogeenne. Seda võib teha graafiku alusel või formaalse testi (17), näiteks Levene'i või Bartletti testi abil. Kui hajuvuse homogeensuse eeldus ei kehti, võib mõnikord homogeensuse saavutada andmete logaritmilise teisendamisega. Kui hajuvuse heterogeensus on väga suur ja seda ei saa teisendamisega korrigeerida, tuleks kaaluda mõne muu meetodi, näiteks muutujate sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere'i trenditesti kasutamist. Lisajuhised NOEC väärtuse määramiseks on esitatud allikas 11.

58.

Uute teadussaavutuste põhjal on soovitatud loobuda NOEC väärtuse mõistest ja asendada see regressiooni teel leitud hinnangulise näitajaga ECx. Kõnealuse vetikatega tehtava katse jaoks ei ole sobivat x väärtust veel kindlaks määratud. Sobiv väärtuste vahemik näib olevat 10–20 % (olenevalt uuritavast muutujast) ning soovitatavalt tuleks esitada nii EC10 kui ka EC20.

Stimuleeriv mõju kasvule

59.

Mõnikord täheldatakse väikestel kontsentratsioonidel stimuleerivat mõju kasvule (negatiivne pidurdumine). Selle põhjuseks võib olla hormees (mürgise kemikaali stimuleeriv mõju) või kasutatavasse minimaalsöötmesse stimuleeriva kasvufaktori lisamine koos uuritava kemikaaliga. Tuleb silmas pidada, et anorgaaniliste toitainete lisamine ei tohiks avaldada otsest mõju, sest katsesöötmes peaks kogu katse vältel olema tagatud toitainete liig. Tavaliselt võib EC50 arvutamisel väikeste koguste stimuleeriva mõju arvestamata jätta, kui see mõju ei ole väga suur. Kui stimuleeriv mõju on väga suur või on vaja leida ECx, mille puhul x väärtus on väike, võib olla vaja kasutada erimeetodeid. Võimaluse korral tuleks hoiduda stimuleerivat mõju kajastavate tulemuste väljajätmisest andmeanalüüsil; kui olemasolev kõvera lähendamise tarkvara ei võimalda nõrka stimuleerivat mõju arvesse võtta, võib kasutada lineaarset interpoleerimist koos andmete usaldusväärsuse iteratiivse kontrollimisega. Kui stimuleeriv mõju on väga tugev, võib kaaluda hormeesimudeli kasutamist (18).

Kasvu pidurdumine muul põhjusel kui mürgisus

60.

Valgust neelavad uuritavad kemikaalid võivad vähendada kasvukiirust kättesaadava valgushulga vähendamise kaudu. Seda tüüpi füüsikalist mõju tuleks katsetingimuste muutmisega mürgisest mõjust lahus hoida ja eraldi kirjeldada. Asjaomased juhised on esitatud allikates 2 ja 3.

KATSEPROTOKOLL

61.

Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.

 

Uuritav kemikaal:

füüsikaline iseloomustus ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, sealhulgas vees lahustuvuse piirkontsentratsioon;

kemikaali identifitseerimisandmed (nt CASi number) ja puhtus (lisandid).

 

Katseliik:

tüvi, tarnija või päritolu ja kasutatud kultiveerimistingimused.

 

Katsetingimused:

katse alustamise kuupäev ja kestus;

katseplaani kirjeldus: katsenõud, kultuuride maht, biomassi tihedus katse alguses;

söötme koostis;

kasutatud kontsentratsioonid ja paralleelkultuurid (paralleelkultuuride arv, kasutatud kontsentratsioonide arv ja geomeetrilise jada tegur);

katselahuste valmistamise, sealhulgas lahustite jms kasutamise kirjeldus;

kultiveerimisseade;

valgustustihedus ja valguse kvaliteet (valgusallikas, valguse ühtlus);

temperatuur;

kasutatud kontsentratsioonid: nominaalne sisaldus ja katsenõudes oleva uuritava kemikaali sisalduse määramise tulemused; tuleks märkida asjaomase meetodi tõhusus kemikaali tuvastamisel ja meetodi määramispiir katselahuses;

kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist;

biomassi määramise meetod ning tõendid mõõdetava parameetri ja kuivmassi vahelise korrelatsiooni kohta.

 

Tulemused:

pH väärtused katse alguses ja lõpus igal uuritava kemikaali kontsentratsioonil;

biomass igas kolvis igas ajapunktis ning biomassi mõõtmise meetod;

kasvukõverad (biomassi ajas muutumise graafikud);

uuritavate muutujate arvutatud väärtused igas uuritava kemikaaliga paralleelkultuuris ning paralleelkultuuride andmete keskväärtused ja variatsioonikordajad;

kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse graafik;

uuritavate muutujate kaudu määratud mürgisuse näitajad – nt EC50, EC10, EC20 – ja vastavad usaldusvahemikud; asjaomaste andmete olemasolu korral LOEC ja NOEC ning nende määramiseks kasutatud statistilised meetodid;

dispersioonanalüüsi (ANOVA) kasutamise korral mõju määr, mida on võimalik tuvastada (nt väikseim oluline erinevus);

katserühma mis tahes kultuuris täheldatud stimuleeriv mõju kasvule;

mis tahes muu täheldatud mõju, nt vetikate morfoloogilised muutused;

tulemuste arutelu, milles muu hulgas käsitletakse võimaliku käesolevast katsemeetodist kõrvalekaldumise mõju katsetulemustele.

KIRJANDUS

(1)

Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1993). ISO 8692: Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1998). ISO/DIS 14442: Water quality – Guidance for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(4)

Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1998). ISO 5667-16: Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R., ja Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Res. 31: 2525–2531.

(6)

Slovacey, R. E., ja Hanna, P. J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll. Limnol. Oceanogr. 22: 919–925.

(7)

Simpson, S. L., Roland, M. G. E., Stauber, J. L., ja Batley, G. E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073–2079.

(8)

Christensen, E. R., ja Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Environ. Sci. Technol. 19: 713–718.

(9)

Nyholm, N., Sørensen, P. S., Kusk, K. O., ja Christensen, E. R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157–167.

(10)

Bruce, R. D., ja Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(12)

Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Am. Stat. Assoc. 50: 1096–1121.

(13)

Norberg-King, T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. USA Keskkonnakaitseamet, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(15)

Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.

(16)

Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.

(17)

Draper, N. R., ja Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, teine väljaanne. Wiley, New York.

(18)

Brain, P., ja Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Res. 29: 93–96.

1. liide

Mõisted

Käesoleva katsemeetodi puhul kasutatakse järgmisi mõisteid ja lühendeid.

Biomass – populatsiooni elusaine kuivmass ruumalaühiku kohta, nt vetikate kuivmass milligrammides katselahuse liitri kohta. Tavaliselt tähendab „biomass” massi, kuid käesoleva katsemeetodi tähenduses on see mass ruumalaühiku kohta. Kuna käesoleva meetodi puhul mõõdetakse tavaliselt biomassi asendusparameetreid, näiteks rakkude arvu, fluorestsentsi vms, tähistatakse mõistega „biomass” ka kõnealuseid asendusparameetreid.

Kemikaal – aine või segu.

Variatsioonikordaja – mõõtühikuta suurus, mis iseloomustab asjaomase parameetri varieeruvust ning on määratletud standardhälbe ja keskväärtuse suhtarvuna. Seda võib väljendada ka protsentides. Paralleelsete kontrollkultuuride keskmise kasvu erikiiruse keskmine variatsioonikordaja tuleks arvutada järgmiselt:

1.

ajavahemike kaupa, st iga ööpäeva kohta arvutatud kasvukiiruste põhjal leitakse asjaomase paralleelkultuuri keskmise kasvu erikiiruse variatsioonikordaja protsentides;

2.

paralleelsete kontrollkultuuride puhul iga ajavahemiku ehk ööpäeva kohta arvutatud keskmise kasvu erikiiruse keskmise variatsioonikordaja leidmiseks arvutatakse eelmise punkti kohaselt leitud väärtuste keskmine.

ECx – katsesöötmes lahustatud uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille puhul katseorganismi kasv pidurdub x % (nt 50 %) võrra kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul (kui kokkupuuteaeg erineb katse tavapärasest või täiskestusest, tuleb täpselt märkida selle kestus). Kasvukiiruse või saagise alusel arvutatava EC väärtuse üheselt arusaadavaks tähistamiseks kasutatakse kasvukiiruse puhul tähist „ErC” ja saagise puhul tähist „EyC”.

Sööde – täielik sünteetiline kasvukeskkond, milles katsevetikaid kasvatatakse uuritava kemikaaliga kokkupuutumise ajal. Tavaliselt lahustatakse uuritav kemikaal katsesöötmes.

Kasvukiirus (keskmine kasvu erikiirus)– biomassi logaritmiline suurenemine kokkupuuteperioodi jooksul.

Vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC)– väikseim kasutatud kontsentratsioon, mille puhul kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul täheldatakse kemikaali statistiliselt olulist (p < 0,05) kasvu pidurdavat mõju võrdluses kontrolliga. Kemikaal peab kõikidel kõnealusest kontsentratsioonist suurematel kontsentratsioonidel avaldama vähemalt sama tugevat kahjulikku mõju kui kõnealusel kontsentratsioonil avalduv kahjulik mõju. Kui nimetatud kahte tingimust ei ole võimalik täita, tuleb lisada ammendav selgitus, kuidas kõnealune kontsentratsioon (ja sellest lähtuvalt ka NOEC) on valitud.

Täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC)– kontsentratsioon, mis on kasutatud kontsentratsioonide jadas vahetult allpool LOEC väärtust.

Uuritav muutuja – mürgisuse hindamiseks kasutatav muutuja, mis on tuletatud biomassi kirjeldava mõõdetud parameetri põhjal vastavalt asjakohasele arvutusmeetodile. Käesoleva katsemeetodi tähenduses on uuritavateks muutujateks kasvukiirus ja saagis, mis tuletatakse biomassi otsesel või asendusparameetrite kaudu mõõtmisel saadud andmete põhjal.

Kasvu erikiirus – uuritav muutuja, mis on määratletud kui jälgitava parameetri (käesoleva katsemeetodi puhul biomass) väärtuste naturaallogaritmide vahe ja asjaomase ajavahemiku jagatis.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Saagis – kokkupuuteperioodi lõpus ja alguses määratud mõõdetava muutuja väärtuste vahe, mis väljendab biomassi suurenemist katse vältel.

2. liide

Tüved, mille sobivus käesoleva katsemeetodi puhul on tõendatud

Rohevetikad

 

Pseudokirchneriella subcapitata (varasem liiginimi Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (endine liiginimi Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG

Ränivetikad

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Tsüanobakterid

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Tüvekollektsioonid

Soovitatavad tüved on kättesaadavad ühest isendist saadud vetikakultuurina järgmistest kollektsioonidest (tähestikulises järjestuses):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110–2209

USA

 

CCAP: Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

ÜHENDKUNINGRIIK

 

SAG: Sammlung von Algenkulturen

Albrecht-von-Haller-Institut für Pflanzenwissenschaften

Universität Göttingen

Nikolausberger Weg 18

D-37073 Göttingen

SAKSAMAA

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

USA

Soovitatavate liikide organismide kuju ja omadused

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Kuju

Kõverdunud kruvijad eraldi rakud

Ovaalsed enamasti eraldi rakud

Kepikujulised rakud

Ovaalsete rakkude ahelad

Kepikujulised rakud

Mõõtmed (pikkus × läbimõõt), μm

8–14 × 2–3

7–15 × 3–12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Raku ruumala (μm3/rakk)

40–60 (2)

60–80 (2)

40–50 (2)

30–40 (2)

2,5 (3)

Raku kuivmass (mg/rakk)

2–3 × 10– 8

3–4 × 10– 8

3–4 × 10– 8

1–2 × 10– 8

2–3 × 10– 9

Kasvukiirus (4) (ööpäevas)

1,5–1,7

1,2–1,5

1,4

1,1–1,4

2,0– 2,4

Konkreetsed soovitused soovitatavate katseliikide kultiveerimiseks ja käitlemiseks

Pseudokirchneriella subcapitata ja Desmodesmus subspicatus

Nende rohevetikate säilitamine mitmesugustes söötmetes on üldjuhul hõlbus. Teavet sobivate söötmete kohta saab vetikakultuuride kollektsioonidest. Rakud on tavaliselt üksteisest eraldi ja nende kontsentratsiooni on kerge määrata elektroonilise osakeste loenduri või mikroskoobi abil.

Anabaena flos-aquae

Tüvikultuuri säilitamiseks võib kasutada eri söötmeid. Kultuuri uuendamisel on eriti tähtis ära hoida mittepideva kultuuri kasvu väljumist logaritmilisest faasist, sest kultuuri taastamine on sellisel juhul raske.

Anabaena flos-aquae kokkukeerdunud rakuahelad moodustavad kogumikke. Nende rakukogumike suurus võib olenevalt kultiveerimistingimustest olla erinev. Kui biomassi määramiseks kasutatakse loendamist mikroskoobi abil või elektroonilist osakeste loendurit, võib olla vaja need kogumikud lõhkuda.

Rakuahelate lõhkumiseks võib osaproove töödelda ultraheliga, et vähendada loendamistulemuste varieeruvust. Kui osaproove töödeldakse ultraheliga kauem, kui on vaja rakuahelate lõhkumiseks väiksema pikkusega juppideks, võivad rakud hävida. Ultraheliga töötlemise intensiivsus ja kestus peab olema kõigi proovide puhul ühesugune.

Tulemuste varieeruvuse vähendamiseks hemotsütomeetriga loendamisel kasutatakse piisaval arvul väljasid (loendatakse vähemalt 400 rakku). See muudab rakkude kontsentratsiooni mikroskoobiga määramise usaldusväärsemaks.

Pärast hoolika ultrahelitöötluse abil rakuahelate lõhkumist võib Anabaena rakkude üldmahu määramiseks kasutada elektroonilist osakeste loendurit. Ultraheli energia tuleb reguleerida tasemele, mille puhul rakud jäävad terveks.

Katsenõude inokuleerimiseks kasutatava vetikasuspensiooni korralikuks läbisegamiseks ja homogeensuse tagamiseks kasutatakse keerissegistit või muud sobivat meetodit.

Katsenõud tuleks paigutada orbitaal- või võnkloksuti plaadile ja loksutada neid kiirusel umbes 150 pööret minutis. Anabaena rakukogumike moodustumist võib takistada ka perioodilise loksutamisega. Kui rakukogumikud siiski tekivad, tuleb jälgida, et biomassi mõõtmiseks võetavad proovid oleksid representatiivsed. Vetikakogumike lõhkumiseks võib olla vaja kultuuri enne proovivõtmist tugevalt loksutada.

Synechococcus leopoliensis

Tüvikultuuri säilitamiseks võib kasutada eri söötmeid. Teavet sobivate söötmete kohta saab vetikakultuuride kollektsioonidest.

Synechococcus leopoliensiskasvab eraldi kepikujuliste rakkudena. Rakud on väga väikesed ning see raskendab biomassi mõõtmist rakkude mikroskoobi abil loendamise teel. Võib kasutada sellist elektroonilist osakeste loendurit, mis võimaldab loendada osakesi, mille väikseim läbimõõt on 1 μm. Võib kasutada ka fluorimeetrilist mõõtmist in vitro.

Navicula pelliculosa

Tüvikultuuri säilitamiseks võib kasutada eri söötmeid. Teavet sobivate söötmete kohta saab vetikakultuuride kollektsioonidest. Tuleb silmas pidada, et sööde peab sisaldama silikaati.

Navicula pelliculosa võib teatavates kasvutingimustes moodustada rakukogumikke. Lipiidide sünteesi tõttu võivad vetikarakud mõnikord koguneda pindkilesse. Sel juhul tuleb biomassi määramiseks vajalike osaproovide võtmisel rakendada erimeetmeid, et tagada proovide representatiivsus. Kultuuri võib olla vaja tugevalt segada, kasutades näiteks keerissegistit.

3. liide

Söötmed

Võib kasutada ühte järgmistest söötmetest.

OECD sööde: OECD katsejuhendile nr 201 vastav originaalsööde, vastab ka standardile ISO 8692.

USA Keskkonnakaitseameti sööde AAP, vastab ka USA Materjalide Katsetamise Ühingu standardile.

Nende söötmete valmistamisel tuleks kasutada analüütilise või reaktiivi puhtusastmega kemikaale ja deioniseeritud vett.

Söötme AAP (USA Keskkonnakaitseamet) ja OECD katsejuhendi nr 201 kohase söötme koostis

Koostisaine

AAP

OECD

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6H2O

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2H2O

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7H2O

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6H2O

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2H2O

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4H2O

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6H2O

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2H2O

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 · 2H2O

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

EDTA ja raua moolisuhe on veidi suurem kui 1. See hoiab ära raua sadestumise ning samal ajal on kelaatide moodustumine raskmetallide ioonidega minimeeritud.

Kui katses kasutatakse ränivetikat Navicula pelliculosa, lisatakse kummalegi söötmele ainet Na2SiO3 · 9H2O kontsentratsioonini 1,4 mg Si/l.

Söötme nõutav pH saavutatakse, kui söötme karbonaatsüsteem on tasakaalus CO2 osarõhuga atmosfääriõhus. Temperatuuril 25 °C on pH väärtuse ja vesinikkarbonaadi molaarse kontsentratsiooni vaheline ligikaudne seos järgmine:

pHeq = 11,30 + log[HCO3].

NaHCO3 kontsentratsioonil 15 mg/l on pHeq 7,5 (sööde AAP) ja NaHCO3 kontsentratsioonil 50 mg/l on pHeq 8,1 (OECD sööde).

Elementide sisaldus katsesöötmes

Element

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

OECD söötme valmistamine

Toitaine

Sisaldus põhilahuses

Põhilahus 1:

makrotoitained

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Põhilahus 2:

raud

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Põhilahus 3:

mikrotoitained

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Põhilahus 4:

vesinikkarbonaat

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H2O

 

Põhilahused steriliseeritakse membraanfiltrimise (keskmine poori läbimõõt 0,2 μm) või autoklaavimise (120 °C, 15 min) teel. Lahuseid hoitakse valguse eest kaitstult 4 °C juures.

Põhilahuseid 2 ja 4 ei autoklaavita, vaid need steriliseeritakse membraanfiltrimise teel.

Söötme valmistamiseks lisatakse veele vajalikus mahus põhilahuseid 1–4.

 

500 ml steriliseeritud veele lisatakse:

 

10 ml põhilahust 1;

 

1 ml põhilahust 2;

 

1 ml põhilahust 3;

 

1 ml põhilahust 4.

 

Lahuse ruumala viiakse steriliseeritud veega 1 000 milliliitrini.

Lahusel lastakse piisavalt kaua seista, et sööde saavutaks tasakaalu atmosfääris oleva süsihappegaasiga; vajaduse korral barboteeritakse filtritud steriilset õhku mõne tunni jooksul läbi lahuse.

Söötme AAP valmistamine

1.

Umbes 900 milliliitrile deioniseeritud või destilleeritud veele lisatakse 1 ml iga põhilahust 2.1–2.7 ja saadud lahuse ruumala viiakse 1 liitrini.

2.

Makrotoitainete põhilahuse valmistamiseks lahustatakse 500 ml deioniseeritud või destilleeritud vees järgmised kogused aineid. Reaktiividest 2.1, 2.2, 2.3 ja 2.4 võib valmistada ühe kombineeritud põhilahuse.

2.1.

NaNO3

12,750 g.

2.2.

MgCl2 · 6H2O

6,082 g.

2.3.

CaCl2 · 2H2O

2,205 g.

2.4.

Mikrotoitainete põhilahus (vt punkt 3).

2.5.

MgSO4 · 7H2O

7,350 g.

2.6.

K2HPO4

0,522 g.

2.7.

Na2SiO3 · 9H2O

7,500 g.

2.8.

Na2SiO3 · 9H2O

vt märkus 1.

Märkus 1: kasutatakse ainult katsetes ränivetikaliikidega. Võib lisada söötmesse otse (202,4 mg) või põhilahuse kujul, et saavutada söötmes räni lõppkontsentratsioon 20 mg/l.

3.

Mikrotoitainete põhilahuse saamiseks lahustatakse 500 ml deioniseeritud või destilleeritud vees järgmised kogused aineid.

3.1.

H3BO3

92,760 mg.

3.2.

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg.

3.3.

ZnCl2

1,635 mg.

3.4.

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg.

3.5.

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg.

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

0,006 mg.

3.7.

CuCl2 · 2H2O

3,630 mg.

3.8.

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg [dinaatriumetüleendiamiintetraatsetaat].

3.9.

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg (vt märkus 2).

Märkus 2: kasutatakse ainult ränivetikaliikide tüvikultuuride jaoks ette nähtud söötmetes.

4.

pH reguleeritakse 0,1 N või 1,0 N NaOH või HCl lahusega väärtusele 7,5 ± 0,1.

5.

Sööde filtritakse steriilsesse nõusse läbi membraanfiltri, mille poori läbimõõt on 0,22 μm (kui kasutatakse osakeste loendurit) või 0,45 μm (kui osakeste loendurit ei kasutata).

6.

Söödet hoitakse kuni kasutamiseni valguse eest kaitstult 4 °C juures.

4. liide

Vetikate kultiveerimise meetodi näide

Üldised märkused

Allpool kirjeldatud meetodit kasutatakse vetikate kultiveerimiseks mürgisuse määramise katsete jaoks.

Rakendatakse sobivaid meetmeid, et hoida ära vetikakultuuride nakatumine bakteritega. Tuleks eelistada puhaskultuuri; kasutatav vetikakultuur tuleb aga kindlasti saada ühestainsast organismist.

Teiste vetikate ja bakteritega saastumise ärahoidmiseks töötatakse steriilsetes tingimustes.

Seadmed ja materjalid

Vt jaotise „Katsemeetodi kirjeldus” alljaotist „Seadmed”.

Vetikakultuuride saamise meetodid

Toitelahuste (söötmete) valmistamine

Kõikidest söötmes kasutatavatest toitesooladest valmistatakse kontsentreeritud põhilahused, mida hoitakse jahedas ja valguse eest kaitstult. Need lahused steriliseeritakse filtrimise või autoklaavimise teel.

Söötme valmistamiseks lisatakse steriilsele destilleeritud veele vajalik kogus põhilahust, jälgides, et lahusesse ei satuks nakatumist põhjustavaid organisme. Tahke söötme saamiseks lisatakse 0,8 % agarit.

Tüvikultuur

Tüvikultuur on väikesemahuline vetikakultuur, mida kantakse korrapäraselt üle värskesse söötmesse ja kasutatakse katse algmaterjalina. Kui tüvikultuuri regulaarselt ei kasutata, külvatakse see viirgudena katseklaasidesse längagarile. Vähemalt kord kahe kuu jooksul kantakse kultuur üle uuele söötmele.

Tüvikultuuri kasvatatakse sobivat söödet sisaldavates koonilistes kolbides mahuga umbes 100 ml. Vetikate inkubeerimisel 20 °C juures pideva valgustuse tingimustes tuleb kultuur igal nädalal värskesse söötmesse üle kanda.

Selleks viiakse teatav kogus vana kultuuri steriilse pipetiga üle värske söötmega kolbi nii, et kiirelt kasvava liigi puhul oleks vetikate algsisaldus umbes 100 korda väiksem kui vanas kultuuris.

Asjaomase liigi kasvukiiruse võib määrata kasvukõvera alusel. Kui see on teada, on võimalik hinnata, millise tiheduse juures tuleks kultuur üle viia uude söötmesse. Kultuur tuleb üle kanda enne, kui see jõuab suremisfaasi.

Eelkultuur

Eelkultuur on ette nähtud sellise vetikakoguse saamiseks, mis on piisav katsenõude inokuleerimiseks. Eelkultuuri inkubeeritakse asjaomastes katsetingimustes ja kasutatakse siis, kui see on veel eksponentsiaalse kasvu faasis, tavaliselt pärast 2–4 päeva kestnud inkubeerimist. Kui vetikakultuur sisaldab moondunud või ebanormaalse väljanägemisega rakke, tuleb see kõrvaldada.

5. liide

Mittelineaarsel regressioonil põhinev andmeanalüüs

Üldkaalutlused

Vetikate ja muude mikroorganismide kasvu katsetes on uuritav muutuja biomassi kasv, mis on oma olemuselt pidev mõõdetav muutuja ja mis väljendub protsessi kiiruses, kui vaadeldakse kasvukiirust, või selle ajaintegraalis, kui vaadeldakse saagist. Kumbagi uuritavat muutujat võrreldakse vastava muutuja keskmise väärtusega paralleelsetes uuritava kemikaalita kontrollkultuurides, kus asjaomane muutuja omandab kohaldatavates tingimustes – vetikakatse puhul on peamised kasvu mõjutavad tegurid valgus ja temperatuur – maksimaalse väärtuse. Tegemist on hajus- või homogeense süsteemiga, mille biomassi võib käsitada pideva suurusena, arvestamata iga üksikut rakku. Sellises süsteemis sõltub uuritava muutuja jaotuse hajuvus üksnes katsetingimustest (tavaliselt on vea jaotus lognormaalne või normaalne). See olukord on teistsugune kui tavapäraste binaarse muutujaga biokatsete puhul, kus hajuvuse peamise komponendina käsitatakse sageli iga üksiku organismi taluvust ja mille andmed on tavaliselt binoomjaotusega. Käesoleval juhul on null- ehk tausttase uuritava muutuja väärtus kontrollrühmas.

Lihtsal juhul kahaneb uuritava muutuja normaliseeritud ehk suhteline väärtus r monotoonselt, vähenedes väärtuselt 1 (pidurdumine puudub) väärtuseni 0 (täielik pidurdumine). Tuleb silmas pidada, et uuritava muutuja mõõtmine on alati seotud veaga ning arvutatud näiline negatiivne pidurdumine saab tuleneda üksnes juhuslikust veast.

Regressioonanalüüs

Mudelid

Regressioonanalüüsi eesmärk on kirjeldada kvantitatiivselt kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõverat matemaatilise regressioonifunktsiooni Y = f(C) kujul või sagedamini funktsioonina Y = F(Z), kus Z = log C. Pöördfunktsioon C = f– 1(Y) võimaldab arvutada ECx väärtused, sealhulgas EC50, EC10 ja EC20, ning nende usalduspiirid usaldusnivool 95 %. Vetikate kasvu pidurdumise katsetes on kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kirjeldamisel edukalt kasutatud mitut lihtsat matemaatilist funktsiooni. Sellised funktsioonid on näiteks logistiline võrrand, mittesümmeetriline Weibulli võrrand ja lognormaalse jaotuse funktsioon, mis kõik kujutavad endast sigmoidkõveraid ning lähenevad asümptootiliselt nullile, kui C → 0, ja ühele, kui C → ∞.

Viimasel ajal on asümptootiliste mudelite alternatiivina välja pakutud pideva lävifunktsiooni mudelid (nt Kooijmani mudel populatsiooni kasvu pidurdumise kirjeldamiseks; Kooijman et al., 1996). Kooijmani mudeli puhul eeldatakse, et teatavast kontsentratsiooni läviväärtusest EC0+ allpool uuritav mõju puudub; selle läviväärtuse leidmiseks ekstrapoleeritakse kontsentratsiooni ja mõju sõltuvuse kõverat kuni lõikumiseni kontsentratsiooniteljega, kasutades lihtsat pidevat funktsiooni, mis ei ole algpunktis diferentseeruv.

Analüüs võib seisneda lihtsalt hälvete ruutude summa minimeerimises (kui eeldatakse, et hajuvus on ühtlane) või kaalutud hälvete ruutude summa minimeerimises (hajuvuse heterogeensuse kompenseerimise puhul).

Analüüsi käik

Analüüsi käiku võib kirjeldada järgmiselt. Valitakse sobiv funktsioon Y = f(C) ja lähendatakse see katseandmetele mittelineaarse regressiooni teel. Et saada katseandmete alusel võimalikult palju teavet, soovitatakse paralleelkultuuride keskmiste väärtuste asemel kasutada iga üksiku kolvi kohta saadud mõõteväärtusi. Praktilisest kogemusest nähtub siiski, et kui hajuvus on suur, võib paralleelkultuuride keskmise väärtuse kasutamisel saada usaldusväärsema, katseandmetes esinevatest süstemaatilistest vigadest vähem mõjutatud matemaatilise hinnangu kui iga üksiku andmepunkti kasutamisel.

Lähendatud kõver ja mõõteandmed kantakse graafikule ning kontrollitakse kõvera sobivust andmetega. Selleks võib olla eriti kasulik rakendada hälvete analüüsi. Kui kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse väljendamiseks valitud funktsionaalne seos ei kirjelda hästi kogu kõverat või mõnda selle olulist osa, nt kemikaali mõju väikestel kontsentratsioonidel, valitakse lähendamiseks mõni muu kõver – näiteks võib sümmeetrilise kõvera asemel valida mittesümmeetrilise kõvera, mis vastab näiteks Weibulli funktsioonile. Kasvu negatiivne pidurdumine võib näiteks lognormaalse jaotuse funktsiooni korral probleeme tekitada ning ka sel juhul tuleb kasutada mõnda alternatiivset regressioonifunktsiooni. Sellistele negatiivsetele väärtustele ei soovitata omistada nullväärtust või väikest positiivset väärtust, kuna sellega moonutatakse vigade jaotust. Kõvera teatud lõikudes – näiteks kasvu vähese pidurdumise lõigus – võib olla vaja kasutada eraldi lähendust ECx leidmiseks väikestel x väärtustel. Lähendatud võrrandi ja pöördfunktsiooni C = f– 1(Y) abil arvutatakse mõju iseloomustavate punktide ECx hinnangulised väärtused ning esitatakse vähemalt EC50 väärtus ja üks või kaks ECx väärtust väikestel x väärtustel. Praktilistest katsetest saadud kogemusest nähtub, et vetikakatse puhul on tavaliselt võimalik hinnata piisava täpsusega kontsentratsiooni, mille juures kasv pidurdub 10 % võrra, kui andmepunkte on küllaldaselt ja väikestel kontsentratsioonidel ei täheldata segava tegurina stimuleerivat mõju. EC20 hinnanguline väärtus on sageli oluliselt täpsem kui EC10 väärtus, kuna EC20 asub tavaliselt kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera keskmises, ligikaudu lineaarses osas. Kasvule avalduva stimuleeriva mõju tõttu on EC10 väärtust mõnikord raske tõlgendada. Ehkki tavaliselt on EC10 piisava täpsusega määratav, soovitatakse seepärast alati esitada ka EC20.

Kaalutegurid

Katsetulemuste hajuvus ei ole üldjuhul ühtlane ja hõlmab tavaliselt proportsionaalsuskomponenti; seepärast eelistatakse alati kasutada kaalutud regressiooni. Tavaliselt eeldatakse sellise analüüsi puhul, et kaalutegur on pöördvõrdeline hajuvusega:

Wi = 1/Var(ri).

Paljud regressiooniprogrammid võimaldavad kasutada kaalutud regressiooni, millele vastavad kaalutegurid esitatakse tabelina. Kaalutegurid tuleks normaliseerida, korrutades need teguriga n/Σwi (n on andmepunktide arv), nii et kõikide kaalutegurite summa on 1.

Uuritava muutuja normaliseerimine

Kontrollrühmas määratud muutuja keskväärtuse alusel normaliseerimine toob kaasa mõned põhimõttelised probleemid ja muudab hajuvuse struktuuri küllalt keeruliseks. Kui kasvu pidurdumise protsentuaalse määra leidmiseks jagatakse uuritava muutuja väärtus asjaomase muutuja keskväärtusega kontrollrühmas, tuuakse sisse kõnealuse keskväärtuse määramise veast tulenev lisaviga. Kui see viga ei ole tühiselt väike, tuleb regressiooni kaalutegureid ja usalduspiire korrigeerida, võttes arvesse kovariatsiooni kontrollväärtusega (Draper ja Smith, 1981). Tuleb silmas pidada, et kontrollrühma andmete keskväärtuse täpne määramine on oluline, sest selle kaudu minimeeritakse uuritava muutuja suhtelise väärtuse üldhajuvus. Seda hajuvust väljendatakse järgmiselt.

(Alaindeks i tähistab kontsentratsiooni i ja alaindeks 0 kontrollrühma.)

Yi = uuritava muutuja suhteline väärtus = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

ning hajuvus Var(Yi) = Var(ri/r0) ≅ (∂Yi/∂ri)2 · Var(ri) + (∂Yi/∂r0)2 · Var(r0)

ning kuna (∂Yi/∂ri) = 1/r0 ja (∂Y i/∂r0) = ri/r0 2

ning andmete normaaljaotuse ja paralleelkultuuride arvu mi ja m0 puhul Var(ri) = σ2/mi,

on uuritava muutuja suhtelise väärtuse Yi üldhajuvus järgmine:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/(r0 4 · m0).

Kontrollrühma andmete keskväärtuse viga on pöördvõrdeline kontrollkultuuride keskmistatud arvu ruutjuurega; seepärast võib vea oluliseks vähendamiseks mõnikord olla õigustatud varasemate andmete kaasamine analüüsi. Teine võimalus on loobuda andmete normaliseerimisest ja kasutada lähendamisel uuritava muutuja absoluutseid väärtusi, sealhulgas kontrollkultuuride andmeid, käsitledes kontrollrühmas leitud uuritava muutuja väärtust siiski mittelineaarse regressiooni teel lähendatava lisaparameetrina. Tavalise kaheparameetrilise regressioonivõrrandi puhul nõuab see meetod lähendamist kolme parameetri alusel ja sellest tulenevalt suuremat hulka andmepunkte võrreldes mittelineaarse regressiooniga, mis põhineb kontrollrühma kindlaksmääratud tulemuste alusel normaliseeritud andmetel.

Usaldusvahemike leidmine pöördhinnangu abil

Mittelineaarse regressiooni usaldusvahemike arvutamine pöördhinnangu abil on üsna keeruline ega kuulu tavaliste statistilise tarkvara pakettide standardsete võimaluste hulka. Ligikaudsed usalduspiirid võib arvutada standardsete mittelineaarset regressiooni võimaldavate programmide abil, kasutades ümberparametriseerimist (Bruce ja Versteeg, 1992), mille puhul matemaatiline võrrand kirjutatakse ümber nii, et hinnatavateks parameetriteks on soovitavad hinnangulised väärtused, nt EC10 ja EC50. (Olgu funktsioon I = f (α, β, kontsentratsioon); kasutatakse määratlusest tulenevaid seoseid f (α, β, EC10) = 0,1 ja f (α, β, EC50) = 0,5, et asendada f (α, β, kontsentratsioon) samaväärse funktsiooniga g(EC10, EC50, kontsentratsioon).)

Otsesema arvutusmeetodi kasutamisel (Andersen et al., 1998) jäetakse võrrand originaalkujule ja arendatakse funktsioon Taylori ritta ri ja r0 keskväärtuste ümbruses.

Viimasel ajal on muutunud populaarseks andmete usaldusväärsuse iteratiivsel kontrollimisel põhinevad meetodid (bootstrap-meetodid). Nende meetodite puhul kasutatakse hajuvuse empiirilise jaotuse hindamiseks katseandmeid ja sagedast korduvat valimi moodustamist juhuslike arvude generaatori abil.

KIRJANDUS

Kooijman, S. A. L. M., Hanstveit, A. O., ja Nyholm, N. (1996). No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Res. 30: 1625–1632.

Draper, N. R., ja Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, teine väljaanne. Wiley, New York.

Bruce, R. D., ja Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.

Andersen, J. S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A., ja Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. J. Agr. Biol. Envir. St. 3: 405–420.C

4)

Peatükk C.11 asendatakse järgmisega:

C.11.   AKTIIVMUDA MIKROORGANISMIDE HINGAMISE (SÜSINIKU JA AMMOONIUMI OKSÜDEERIMISE) PÄRSSIMISE KATSE

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 209 (2010). Selle meetodiga tehakse kindlaks kemikaali mõju aktiivmuda organismidele (eelkõige bakterid), mõõtes nende hingamise (süsiniku ja/või ammooniumi oksüdeerimise) kiirust kindlaksmääratud tingimustes uuritava kemikaali eri kontsentratsioonidel. Katsemeetod põhineb Värvainetootjate Ökoloogia- ja Toksikoloogiaühingu (ETAD) metoodikal (1, 2), varasemal OECD katsejuhendil nr 209 (3) ja muudetud standardil ISO 8192 (4). Katse eesmärk on hinnata kiirsõelumismeetodi abil kemikaali mõju reoveepuhastites bioloogilises (aeroobses) etapis kasutatava aktiivmuda organismidele. Katse tulemusi võib kasutada ka uuritava kemikaali selliste kontsentratsioonide kindlakstegemiseks, mille puhul hingamine ei pärssu ja mis sobivad kasutamiseks biolagunduvuse katsetes (nt käesoleva lisa peatüki C.4 meetodid C.4-A kuni C.4-F, peatükid C.9, C.10, C.12 ja C.29 ning OECD katsejuhend nr 302C). Sel juhul võib katse läbi viia sõelkatsena, mis sarnaneb kontsentratsioonivahemiku leidmise katse või piirsisalduskatsega (vt punkt 39) ja milles vaadeldakse üksnes üldist hingamist. Kõnealusesse teabesse tuleks siiski suhtuda ettevaatlikult kohese biolagunduvuse katsete puhul (käesoleva lisa peatüki C.4 meetodid C.4-A kuni C.4-F ja peatükk C.29), kus inokulumi sisaldus on oluliselt väiksem kui käesoleva katsemeetodi puhul. Seega ei tähenda pärssiva mõju puudumine käesoleva meetodi kohases hingamiskatses automaatselt seda, et pärssiv mõju puudub ka käesoleva lisa peatüki C.4 meetodite C.4-A kuni C.4-F ja peatüki C.29 kohaselt tehtava kohese biolagunduvuse katse tingimustes.

2.

Näib, et hingamise pärssumise katset on pärast käesoleva meetodi avaldamist üldjuhul kasutatud edukalt, kuid mõnel juhul on teatatud kahtlastest tulemustest (2, 4, 5). Kontsentratsiooni ja hingamise vahelise sõltuvuse kõverad on mõnikord kahefaasilised, asjaomased graafikud on moonutatud ja EC50 väärtused on eeldatust väiksemad (5). Uuringutest on selgunud, et sellised tulemused saadakse juhul, kui katses kasutatud aktiivmuda olulisel määral nitrifitseerib ja uuritava kemikaali mõju ammooniumi oksüdeerimisele on suurem kui üldisele heterotroofsele oksüdeerimisele. Seepärast võib selliste kahtlaste tulemuste tõlgendamiseks teha lisakatseid, kus kasutatakse spetsiifilist nitrifitseerimise inhibiitorit. Kui mõõta hapniku sidumise kiirust sellise inhibiitori, nt N-allüültiokarbamiidi juuresolekul ja selle puudumisel, on võimalik arvutada hapniku sidumise kiirus eraldi üldise hingamise, heterotroofse oksüdeerimise ja nitrifitseerimise puhul (4, 7, 8). Seega saab kindlaks teha uuritava kemikaali pärssiva mõju kahes kõnealuses protsessis ja arvutada tavapärasel viisil EC50 väärtused nii orgaanilise süsiniku oksüdeerimise (heterotroofne oksüdeerimine) kui ka ammooniumi oksüdeerimise (nitrifitseerimine) puhul. Tuleks silmas pidada, et mõnel üksikul juhul võib N-allüültiokarbamiidi inhibeeriv toime osaliselt või täielikult kaduda uuritava kemikaaliga või söötmelisandite, nt Cu++-ioonidega kompleksi moodustamise tõttu (6). Cu++-ioonid on Nitrosomonas'e puhul vajalikud, kuid on suuremas kontsentratsioonis mürgised.

3.

On tekkinud tungiv vajadus kasutada reovee aeroobsel töötlemisel nitrifitseerimist, mis on vajalik etapp reoveest lämmastikuühendite kõrvaldamisel denitrifitseerimise teel gaasiliste lõppsaadustena; see vajadus ilmneb eelkõige Euroopa riikides, kuna EL on praeguseks kehtestanud veekogudesse juhitava puhastatud heitvee lämmastikusisalduse väiksemad piirmäärad (5).

4.

Enamikul juhtudel piisab meetodist, millega saab hinnata kemikaali mõju üksnes orgaanilise süsiniku oksüdeerimise protsessidele. Mõnel juhul on tulemuste tõlgendamiseks ja toime mõistmiseks siiski vaja uurida kemikaali mõju üksnes nitrifitseerimisele või eraldi nii nitrifitseerimisele kui ka orgaanilise süsiniku oksüdeerimisele.

KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

5.

Hingamise kiirust kunstliku reoveega kokku puutuvates aktiivmuda proovides mõõdetakse hapnikuelektroodi sisaldavas suletud kambris kolme tunni pikkuse kokkupuuteaja järel. Tegelikus olukorras esinevaid kokkupuutetingimusi arvesse võttes võib olla asjakohane kokkupuuteaega pikendada. Kui uuritav kemikaal laguneb kiiresti, näiteks abiootilise hüdrolüüsi teel, või kui selle kontsentratsiooni nõuetekohane hoidmine ei ole kemikaali lenduvuse tõttu võimalik, võib lisaks kasutada lühemat kokkupuuteaega – nt 30 minutit. Aktiivmuda iga partii tundlikkust tuleks kokkupuute päeval kontrollida sobiva võrdluskemikaaliga. Meetodit kasutatakse tavaliselt uuritava kemikaali ECx (nt EC50) ja/või täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni (NOEC) määramiseks.

6.

Orgaanilist süsinikku oksüdeerivate mikroorganismide ja ammooniumi oksüdeerivate mikroorganismide hapnikusidumise pärssimist võib väljendada eraldi, kui mõõta hapniku sidumise kiirust spetsiifilise inhibiitori N-allüültiokarbamiidi juuresolekul ja selle puudumisel; nimetatud inhibiitor pärsib ammooniumi oksüdeerimist nitritiks esimese etapi nitrifitseerivate bakterite toimel. Sellisel juhul arvutatakse hapniku sidumise kiiruse vähenemise määr protsentides, võrreldes hapniku sidumise kiirust uuritava kemikaali juuresolekul sama näitaja keskväärtusega vastavates uuritava kemikaalita kontrollproovides nii spetsiifilise inhibiitori N-allüültiokarbamiidi juuresolekul kui ka selle puudumisel.

7.

Abiootilistest protsessidest tuleneva hapniku sidumise määramiseks võib teha kindlaks kõnealuse näitaja väärtuse uuritava kemikaali, kunstliku reovee ja vee segudes, mis ei sisalda aktiivmuda.

TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA

8.

Tulemuste õigeks tõlgendamiseks on vaja teada uuritava kemikaali identifitseerimisandmeid (soovitatavalt CASi number), nimetust (IUPAC), puhtust, vees lahustuvust, aururõhku, lenduvust ja adsorbeerumisega seotud omadusi. Tavaliselt ei ole lenduvaid kemikaale võimalik nõuetekohaselt katsetada ilma erimeetmeid võtmata (vt punkt 21).

KATSEMEETODI KASUTATAVUS

9.

Katsemeetodit võib kasutada vees lahustuvate, raskesti lahustuvate ja lenduvate kemikaalide puhul. Alati ei pruugi siiski olla võimalik määrata piiratud lahustuvusega kemikaalide EC50 väärtusi ning lenduvate kemikaalide puhul saadakse nõuetekohased tulemused üksnes juhul, kui suurem osa uuritavast kemikaalist (hinnanguliselt > 80 %) jääb kokkupuuteperioodi(de) lõpuks reaktsioonisegusse. Kui uuritava kemikaali püsivuse või lenduvuse suhtes on kahtlusi, tuleks ECx väärtuse täpsustamise võimaldamiseks esitada täiendavad toetavad analüüsiandmed.

VÕRDLUSKEMIKAALID

10.

Võrdluskemikaalidega kontrollimist tuleks teha korrapäraselt, et tagada katsemeetodi ja katsetingimuste usaldusväärsus ning kontrollida aktiivmuda iga partiid, mida kasutatakse kokkupuute päeval mikroobide inokulumina. Pärssiva võrdluskemikaalina soovitatakse kasutada 3,5-diklorofenooli, mis on tuntud hingamise pärssija ja mida kasutatakse paljudes pärssiva mõju või mürgisuse tuvastamise katsetes (4). Samuti võib üldist hingamist pärssiva võrdluskemikaalina kasutada vask(II)sulfaatpentahüdraati (9). Nitrifitseerimist pärssiva võrdluskemikaalina võib kasutada N-metüülaniliini.

NÕUETEKOHASUSE KRITEERIUMID JA REPRODUTSEERITAVUS

11.

Hapniku sidumise kiirus kontrollproovides (ilma uuritava kemikaali või võrdluskemikaalita) ei tohiks olla väiksem kui 20 mg hapnikku aktiivmuda (hõljuvaine kuivmassi) grammi kohta tunnis. Väiksema kiiruse korral tuleks katset korrata pestud aktiivmuda või muust allikast pärit mudaga. Paralleelsetes kontrollproovides mõõdetud hapniku sidumise kiiruse variatsioonikordaja ei tohiks lõpliku katse lõpus olla suurem kui 30 %.

12.

Rahvusvahelise Standardiorganisatsiooni (ISO) korraldatud 2004. aasta rahvusvahelises võrdlusuuringus (4), kus kasutati olmereoveest pärit aktiivmuda, leiti 3,5-diklorofenooli EC50 jäävat üldise hingamise puhul vahemikku 2–25 mg/l, heterotroofse hingamise puhul vahemikku 5–40 mg/l ja nitrifitseerimist põhjustava hingamise puhul vahemikku 0,1–10 mg/l. Kui 3,5-diklorofenooli EC50 ei ole asjaomases eeldatavas vahemikus, tuleks katset korrata muust allikast pärit aktiivmudaga. Vask(II)sulfaatpentahüdraadi EC50 peaks üldise hingamise puhul jääma vahemikku 53–155 mg/l (9).

KATSEMEETODI KIRJELDUS

Katsenõud ja seadmed

13.

Lisaks tavapärastele laboriseadmetele tuleks kasutada järgmist:

a)

katsenõud, näiteks keeduklaasid mahuga 1 000 ml, kuhu saab lisada 500 ml reaktsioonisegu (vt joonis 1, nr 5);

b)

ühendustega kamber lahustunud hapniku sisalduse mõõtmiseks; sobiv hapnikuelektrood; suletud kamber proovi jaoks ilma vabaruumita ning salvestusseade (vt 2. liites joonis 1, nr 7, 8 ja 9); alternatiivina võib kasutada BHT pudelit, millel on hapnikuelektroodi kasutamist võimaldav sobiv kork pudelisuu õhukindlaks sulgemiseks (vt 3. liites joonis 2). Et hoida ära väljasurutava vedeliku kadu hapnikuelektroodi sisestamisel, on soovitatav sisestada läbi korgi esmalt lehter või klaastoru või kasutada väljakaarduva suuga nõusid. Mõlemal juhul tuleks kasutada magnetsegistit või mõnda muud segamismeetodit, nt segistiga andurit;

c)

magnetsegistid ja inertse materjaliga kaetud segamispulgad mõõtekambris ja/või katsenõudes kasutamiseks;

d)

aereerimisseade: vajaduse korral tuleks suruõhk juhtida tolmu ja õli kõrvaldamiseks läbi sobiva filtri ja õhu niisutamiseks läbi vett sisaldavate pesupudelite. Nõude sisu aereerimiseks tuleks kasutada Pasteuri pipette või muid aereerimisseadmeid, mis ei adsorbeeri kemikaale. Muda hapnikutarbe rahuldamiseks ja raskuste vältimiseks töötamisel selliste kemikaalidega, mis tekitavad palju vahtu, kaovad oma lenduvuse tõttu või on õhu barboteerimisel põhineva aereerimise puhul raskesti hajutatavad, võib kasutada orbitaalloksutit, mis töötab pöörlemiskiirusel 150–250 p/min ja võimaldab kasutada kolbe mahuga näiteks 2 000 ml. Katsesüsteem hõlmab tavaliselt mitut pidevalt aereeritavat keeduklaasi, millega alustatakse katset järgemööda (nt intervalliga umbes 10–15 minutit) ja mida seejärel järgemööda analüüsitakse. Võib kasutada ka valideeritud seadmeid, mis võimaldavad üheaegselt segusid aereerida ja neis hapnikutarbimise kiirust mõõta;

e)

pH-meeter;

f)

üldotstarbeline lauatsentrifuug muda jaoks, kiirendusega vähemalt 10 000 m/s2.

Reaktiivid

14.

Katses tuleks kõikjal kasutada analüütilise puhtusastmega reaktiive.

Vesi

15.

Tuleks kasutada destilleeritud või deioniseeritud vett, mis sisaldab vähem kui 1mg/l lahustunud hapnikku, välja arvatud juhul, kui on ette nähtud kasutada kloorivaba kraanivett.

Kunstlik reovesi

16.

Söötme valmistamiseks tuleks kasutada koostisainete järgmisi koguseid:

peptoon

16 g;

lihaekstrakt (või sellega võrreldav köögiviljaekstrakt)

11 g;

karbamiid

3 g;

naatriumkloriid (NaCl)

0,7 g;

kaltsiumkloriiddihüdraat (CaC12 · 2H2O)

0,4 g;

magneesiumsulfaatheptahüdraat (MgSO4 · 7H2O)

0,2 g;

veevaba dikaaliumvesinikfosfaat (K2HPO4)

2,8 g;

lahuse ruumala viiakse destilleeritud või deioniseeritud veega 1 liitrini.

 

17.

Lahuse pH peaks olema 7,5 ± 0,5. Kui valmistatud lahust ei kasutata kohe, tuleks seda säilitada valguse eest kaitstult temperatuuril 0–4 °C mitte kauem kui üks nädal või tingimustes, mille juures lahuse koostis ei muutu. Tuleks silmas pidada, et kõnealune kunstlik reovesi on 100 korda kontsentreeritum kui reovesi, mida kirjeldatakse OECD 11. juuni 1976. aasta tehnilises aruandes „Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents” („Kavandatav meetod sünteetilistes detergentides kasutatavate pindaktiivsete ainete biolagunduvuse määramiseks”), ning peale selle on sinna lisatud dikaaliumvesinikfosfaati.

18.

Söötme koostisained võib enne säilitamist ka eraldi steriliseerida, samuti võib peptooni ja lihaekstrakti lisada vahetult enne katse algust. Söödet tuleks enne kasutamist korralikult segada ja vajaduse korral tuleks pH reguleerida tasemele 7,5 ± 0,5.

Uuritav kemikaal

19.

Vees hästi lahustuva uuritava aine sisaldus põhilahuses ei tohiks ületada aine vees lahustuvuse piirkontsentratsiooni (sademe esinemine ei ole vastuvõetav). Vees raskesti lahustuv aine, adsorbeeruv aine ja selline segu, mille koostisained on erineva vees lahustuvusega, tuleks vajalik kogus kaaluda otse katsenõusse. Sellises olukorras võib olla võimalik kasutada põhilahuseid, kui lahustunud uuritava kemikaali sisaldus katsenõus määratakse analüüsi teel enne aktiivmuda lisamist. Lahustunud uuritava kemikaali sisalduse analüütiline määramine katsenõus on vajalik ka juhul, kui valmistatakse vesiekstraktid. Tuleks hoiduda orgaaniliste lahustite ja dispergeerivate ainete või emulgaatorite kasutamisest lahustuvuse suurendamiseks. Põhilahuste töötlemine ultraheliga ja suspensioonide eelsegamine näiteks öö läbi on võimalik juhul, kui on olemas piisav teave uuritava kemikaali püsivuse kohta sellistes tingimustes.

20.

Uuritav kemikaal võib mõjutada pH-d katsesüsteemis. pH tuleks enne katse alustamist määrata uuritavat kemikaali sisaldavas segus eelkatse abil, millega tehakse kindlaks, kas pH-d on vaja enne põhikatset reguleerida, ning põhikatse päeval tuleks pH-d uuesti kontrollida. Vajaduse korral tuleks uuritava kemikaali lahused/suspensioonid enne inokulumi lisamist neutraliseerida. Kuna neutraliseerimine võib aga muuta kemikaali keemilisi omadusi, võib olenevalt uuringu eesmärgist teha lisakatseid, et hinnata uuritava kemikaali mõju mudale olukorras, kus pH-d ei reguleerita.

21.

Lenduva kemikaali mürgine mõju võib kemikaali kao tõttu kokkupuuteperioodi vältel muutuda, eriti katsetes, kus läbi süsteemi barboteeritakse õhku. Sellise aine puhul tuleks olla ettevaatlik ja analüüsida asjaomast ainet sisaldavaid kontrollsegusid aine sisalduse suhtes ning muuta aereerimistingimusi.

Võrdluskemikaal

22.

Kui võrdluskemikaalina kasutatakse 3,5-diklorofenooli, tuleks valmistada 1 000 ml vesilahust, mis sisaldab 1,00 g 3,5-diklorofenooli (15). Lahustumise kiirendamiseks tuleks kasutada sooja vett ja/või ultraheliga töötlemist ning lasta lahusel enne selle ruumala vajalikule tasemele viimist toatemperatuurini jahtuda. Seejuures tuleks tagada, et võrdluskemikaali struktuur lahustamise käigus ei muutu. Lahuse pH-d tuleks kontrollida ja vajaduse korral reguleerida see NaOH või H2SO4 abil tasemele 7–8.

23.

Kui võrdluskemikaalina kasutatakse vask(II)sulfaatpentahüdraati, kasutatakse kontsentratsioone 58 mg/l, 100 mg/l ja 180 mg/l (jada tegur 1,8). Aine kaalutud kogus (lõppruumala 500 ml puhul 29, 50 või 90 mg) lisatakse otse katsenõusse. Seejärel lahustatakse see 234 ml autoklaavitud kraanivees. Vask(II)sulfaatpentahüdaat on hästi lahustuv. Katse alustamisel lisatakse 16 ml kunstlikku reovett ja 250 ml aktiivmuda.

Nitrifitseerimist spetsiifiliselt pärssiv aine

24.

Tuleks valmistada N-allüültiokarbamiidi põhilahus kontsentratsiooniga 2,32 g/l. Selle põhilahuse lisamisel koguses 2,5 ml inkubeerimissegusse lõppruumalaga 500 ml saadakse N-allüültiokarbamiidi lõppsisalduseks 11,6 mg/l (10– 4 mol/l); see on olemasolevate andmete kohaselt piisav (4), et täielikult pärssida nitrifitseerimine nitrifitseerivas aktiivmudas, mille hõljuvaine sisaldus on 1,5 g/l.

Abiootilised kontrollproovid

25.

Teatud harvaesinevates tingimustes võib tugeva redutseerija omadustega uuritav kemikaal tekitada mõõdetava abiootilise hapnikutarbimise. Sellisel juhul on vaja kasutada abiootilisi kontrollproove, et eristada uuritava kemikaali abiootilist hapnikusidumist mikroobide hingamisest. Abiootilised kontrollproovid võib valmistada nii, et katsesegust jäetakse välja inokulum. Inokulumita abiootilisi kontrollproove võib kasutada ka toetavate analüütiliste mõõtmiste tegemisel, et määrata katse kokkupuuteetapis saavutatav kontsentratsioon, näiteks kui kasutatakse vees raskesti lahustuvate kemikaalide põhilahuseid ja asjaomaste koostisainete lahustuvus vees on erinev. Erijuhul võib olla vajalik kasutada abiootilise kontrollproovi valmistamisel inokulumi, mis on steriliseeritud näiteks autoklaavimise teel või steriliseerivate mürkainetega. Mõni kemikaal võib vabastada või siduda hapnikku ka üksnes piisavalt suure reaktsioonipinna korral, ehkki tavaliselt võib selleks olla vaja palju kõrgemat temperatuuri või rõhku. Seda silmas pidades tuleks pöörata erilist tähelepanu peroksüühenditele. Steriliseeritud inokulumi puhul on tegemist suure reaktsioonipinnaga.

Inokulum

26.

Üldotstarbel kasutatavat aktiivmuda tuleks koguda tõhusalt käitatava, peamiselt olmereovett töötleva reoveepuhasti aereerimisbasseini väljalaskekohast või selle koha lähedalt. Olenevalt katse eesmärgist võib kasutada ka muud tüüpi või muust allikast pärit sobivat aktiivmuda, näiteks laboris kasvatatud muda, kui selle hõljuvaine sisaldus viiakse sobivasse kontsentratsioonivahemikku 2–4 g/l. Eri puhastitest pärit mudal on tõenäoliselt siiski erinevad omadused ja tundlikkus.

27.

Muda võib kasutada sellisel kujul, nagu see on kogutud, kuid sellel tuleks suurte osakeste kõrvaldamiseks lasta lühikest aega, näiteks 5–15 minutit settida ja väiksemaid osakesi sisaldav ülemine kiht dekanteerida või kõrvaldada suured osakesed sõelumise teel (nt sõelaga, mille ava pindala on 1 mm2). Teise võimalusena võib muda homogeniseerida segisti abil umbes 15 sekundi vältel või kauem, kuid tuleb hoolikalt jälgida, et ei esineks kauakestva homogeniseerimise puhul tekkida võivaid nihkejõude ega temperatuurimuutust.

28.

Sageli on vaja muda pesta, näiteks kui endogeenne hingamiskiirus on väike. Esmalt tuleks muda niikaua tsentrifuugida, kuni supernatant selgineb ja reovee tahked osakesed sademesse kogunevad, näiteks 10 minutit kiirendusel umbes 10 000 m/s2. Vedel supernatant tuleks eemaldada ja muda tuleks kloorivabas kraanivees uuesti suspendeerida loksutamise teel ning seejärel tuleks pesuvesi pärast uuesti tsentrifuugimist eemaldada. Vajaduse korral tuleks pesemist ja tsentrifuugimist korrata. Tuleks määrata taassuspendeeritud muda kuivmass teadaolevas ruumalas ning seejärel tuleks muda vedeliku eemaldamise teel kontsentreerida või kloorivaba kraaniveega veelgi lahjendada, et saavutada muda tahkete osakeste nõutav kontsentratsioon 3 g/l. Aktiivmuda tuleks katsetemperatuuril pidevalt aereerida (nt kiirusel 2 l/min) ja võimaluse korral tuleks see kogumise päeval ära kasutada. Kui see ei ole võimalik, tuleks mudale kahe järgneva päeva jooksul lisada kummalgi päeval kunstlikku reovett (50 ml kunstlikku reovett aktiivmuda liitri kohta). Seejärel kasutatakse muda katses ja katsetulemused loetakse nõuetekohaseks, kui hindamistulemustest selgub, et endogeense heterotroofse ja nitrifitseerimist põhjustava hingamise kiirus mudas ei ole oluliselt muutunud.

29.

Inkubeerimisel võib tekitada probleeme vahutamine, kui vahu pinnal olevad tahked mudaosakesed aereerimisnõust koos vahuga välja kantakse. Mõnikord võib vahutamist põhjustada ka lihtsalt kunstliku reovee juuresolek, kuid vahutamine on ootuspärane sellise kemikaali puhul, mis on pindaktiivne aine või sisaldab sellist ainet. Muda tahkete osakeste kadu katsesegust toob kaasa hingamiskiiruse kunstliku vähenemise, mida võidakse ekslikult tõlgendada hingamise pärssimise tulemusena. Peale selle kaasneb pindaktiivse aine lahuse aereerimisega aine kontsentreerumine vahukihti ning vahu kadu katsesüsteemist põhjustab kokkupuutekontsentratsiooni vähenemist. Vahutamist on võimalik vähendada lihtsate mehaaniliste võtetega (nt aeg-ajalt käsitsi klaaspulgaga segades) või sellise vahutamisvastase silikooniemulsiooni lisamisega, mis ei sisalda pindaktiivset ainet, ja/või loksutamisel põhineva aereerimismeetodi kasutamisega. Kui vahutamine on seotud kunstliku reovee juuresolekuga, tuleks reovee koostist muuta ja lisada sellesse vahutamisvastast ainet näiteks koguses 50 μl reovee liitri kohta. Kui vahutamist põhjustab uuritav kemikaal, tuleks määrata vahutamise vähendamiseks vajalik kogus kemikaali suurimal katses kasutataval kontsentratsioonil ning lisada sama kogus igasse aereerimisnõusse, sealhulgas nõudesse, kus vahutamist ei esine (nt uuritava kemikaalita kontrollnõud ja võrdluskemikaaliga nõud). Vahutamisvastase aine kasutamisel ei tohiks see aine reageerida inokulumi ega uuritava kemikaaliga.

KATSE KÄIK

30.

Võib teha kindlaks kemikaali pärssiva mõju hapniku sidumisele kolmel eri viisil: üldisele, üksnes heterotroofsele ja nitrifitseerimisega seotud sidumisele. Tavaliselt piisab üldist hapnikusidumist pärssiva mõju kindlakstegemisest. Orgaanilise süsiniku oksüdeerimisega seotud heterotroofse hapnikusidumise ja ammooniumi oksüdeerimisega seotud hapnikusidumise mõju on vaja määrata juhul, kui asjaomase kemikaali puhul on nõutav kahe nimetatud näitaja eraldi kindlakstegemine või kui soovitakse selgitada, miks üldise hapnikusidumise pärssumise ja kemikaali kontsentratsiooni vahelise sõltuvuse kõver on ebatüüpilise kujuga.

Katsetingimused

31.

Katse tuleks teha temperatuuril 20 ± 2 °C.

Katsesegud

32.

Tuleks valmistada vett, kunstlikku reovett ja uuritavat kemikaali sisaldavad katsesegud (FT), milles uuritava kemikaali nominaalne sisaldus on erinev (vt koostisainete koguste näited tabelis 1). pH tuleks vajaduse korral reguleerida tasemele 7,5 ± 0,5, segusid tuleks veega lahjendada ja lisada inokulum, et saada nõudes võrdse lõppruumalaga lahused, ning seejärel alustada aereerimist.

Võrdlussegud

33.

Võrdlussegud (FR) tuleks valmistada samal viisil kui katsesegud, lisades uuritava kemikaali asemel võrdluskemikaali, nt 3,5-diklorofenooli.

Kemikaalita kontrollproovid

34.

Katsetes, kus katsenõudega alustatakse katset järgemööda teatava intervalliga, tuleks kemikaalita kontrollproovid (FB) valmistada kokkupuuteperioodi alguses ja lõpus. Katsetes, kus kasutatakse hapnikutarbimise üheaegset mõõtmist võimaldavaid seadmeid, tuleks iga üheaegselt analüüsitava partii puhul kasutada vähemalt kahte kemikaalita kontrollproovi. Kemikaalita kontrollproovid sisaldavad muude segudega samas koguses aktiivmuda ja kunstlikku reovett, kuid ei sisalda uuritavat ega võrdluskemikaali. Proovid tuleks lahjendada veega sama ruumalani kui katse- ja võrdlussegud.

Abiootilised kontrollproovid

35.

Vajaduse korral, näiteks kui on teada või kahtlustatakse, et uuritav kemikaal on tugeva redutseerija omadustega, tuleks abiootilise hapnikutarbimise mõõtmiseks valmistada segu FA. See segu peaks sisaldama katseseguga samas koguses uuritavat kemikaali ja kunstlikku reovett ning olema sama ruumalaga, kuid mitte sisaldama aktiivmuda.

Katse üldine käik ja mõõtmised

36.

Katse- ja võrdlussegusid ning kemikaalita ja abiootilisi kontrollproove inkubeeritakse katsetemperatuuril sundaereerimise tingimustes (0,5–1 l/min), et hoida lahustunud hapniku sisaldust tasemel, mis vastab vähemalt 60–70 protsendile küllastuskontsentratsioonist, ja tagada mudahelveste püsimine suspensioonis. Mudahelveste suspensioonis hoidmiseks on vaja kultuure ka segada. Inkubeerimise algushetkeks loetakse hetke, mil aktiivmuda inokulum puutub esmakordselt kokku lõppsegu muude koostisainetega. Inkubeerimise lõppedes – tavaliselt on ettenähtud kokkupuuteaeg kolm tundi – võetakse lahustest proovid, et mõõta lahustunud hapniku sisalduse vähenemist selleks otstarbeks ette nähtud kambris (3. liide, joonis 2) või täielikult täidetud BHT pudelis. Inkubeerimise alustamise viis sõltub ka hapnikutarbimise kiiruse mõõtmiseks kasutatava seadme läbilaskevõimest. Kui kasutatakse näiteks ühte hapnikuandurit, tehakse mõõtmised üksteise järel. Sellisel juhul tuleks valmistada erinevad katseks vajalikud kunstliku reoveega segud, kuid jätta välja inokulum; vajalik kogus muda tuleks lisada igasse katseseeria nõusse eraldi. Seejärel tuleks alustada ükshaaval inkubeerimist sobiva intervalliga, näiteks iga 10–15 minuti järel. Teisel juhul võib mõõtesüsteem koosneda mitmest andurist, mis võimaldavad teha üheaegselt mitu mõõtmist; sel juhul võib lisada inokulumi asjaomaste rühmade nõudesse üheaegselt.

37.

Aktiivmuda hõljuvaine nominaalne sisaldus kõigis katse- ja võrdlussegudes ning kemikaalita segudes (kuid mitte abiootilistes kontrollsegudes) on 1,5 g/l. Hapnikutarbimist tuleks mõõta kolme tunni pikkuse kokkupuuteperioodi järel. Vajaduse korral tuleks mõõtmised teha lisaks ka 30 minuti pikkuse kokkupuuteperioodi järel, nagu on kirjeldatud eespool punktis 5.

Muda nitrifitseerimisvõime

38.

Et kindlaks teha, kas ja millise kiirusega on muda võimeline nitrifitseerima, tuleks valmistada kemikaalita kontrollsegud (FB) ja täiendavad kontrollsegud (FN), mis sisaldavad lisaks N-allüültiokarbamiidi kontsentratsioonis 11,6 mg/l. Segusid tuleks aereerida ja inkubeerida temperatuuril 20 ± 2 °C kolm tundi. Seejärel tuleks mõõta hapniku sidumise kiirus ja arvutada nitrifitseerimisest tuleneva hapnikusidumise kiirus.

Katsete kavandamine

Kontsentratsioonivahemiku leidmise katse

39.

Vajaduse korral tehakse eelkatse, et leida uuritava kemikaali kontsentratsioonide vahemik, mida saaks kasutada lõplikus katses hapnikutarbimist pärssiva mõju kindlakstegemiseks. Kui uuritav kemikaal ei pärsi eelkatses hapnikutarbimist, võib see tähendada, et lõpliku katse tegemine ei ole vajalik, kuid sel juhul peaks eelkatse hõlmama suurima kasutatud kontsentratsiooni puhul (tavaliselt 1 000 mg/l, kuid see oleneb andmenõuetest) kolme paralleelproovi.

Tabel 1.

Eelkatses kasutatavate segude näited.

Reaktiiv

Algkontsentratsioon

Uuritava kemikaali põhilahus

10 g/l

Kunstliku söötme põhilahus

Vt punkt 16

Aktiivmuda põhisuspensioon

Hõljuvaine sisaldus 3 g/l

Segude koostisained

Katsenõudesse lisatavad kogused (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Uuritava kemikaali põhilahus (ml)

(punktid 19–21)

0,5

5

50

0

50

Kunstliku reovee põhilahus (ml)

(punkt 16)

16

16

16

16

16

Aktiivmuda suspensioon (ml)

(punktid 26–29)

250

250

250

250

0

Vesi

(punkt 15)

233,5

229

184

234

434

Segude lõppruumala

500

500

500

500

500

Kontsentratsioonid segudes

 

 

 

 

 

Uuritav suspensioon (mg/l)

Aktiivmuda

10

100

1 000

0

1 000

(hõljuvaine) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Katses kasutatakse uuritavat kemikaali vähemalt kolmes kontsentratsioonis, näiteks 10, 100 ja 1 000 mg/l, samuti kemikaalita kontrollproove ja vajaduse korral ka vähemalt kolme abiootilist kontrollproovi, mis sisaldavad uuritavat kemikaali suurimas kasutatavas kontsentratsioonis (vt näide tabelis 1). Eelistatavalt ei tohiks kemikaal avaldada väikseimal kontsentratsioonil mingit mõju hapnikutarbimisele. Tuleks arvutada hapniku sidumise ja vajaduse korral ka nitrifitseerimise kiirus ning seejärel pärssumise määr protsentides. Olenevalt katse eesmärgist on võimalik määrata ka üksnes mürgisus piirkontsentratsioonil (nt 1 000 mg/l). Kui sel kontsentratsioonil ei täheldata statistiliselt olulist mürgist mõju, ei ole edasine testimine suuremal ega väiksemal kontsentratsioonil vajalik. Tuleks silmas pidada, et vees raskesti lahustuva aine, adsorbeeruva aine ja sellise segu puhul, mille koostisained on erineva vees lahustuvusega, tuleks vajalik kogus kaaluda otse katsenõusse. Sellisel juhul tuleks lisada uuritava aine põhilahuse jaoks jäetud ruumala ulatuses lahjendusvett.

Lõplik katse

Üldise hapnikusidumise pärssumine

41.

Katses tuleks kasutada eelkatse põhjal kindlaks määratud kontsentratsioonivahemikku. Et leida nii NOEC kui ka ECx (nt EC50), on enamikul juhtudel soovitatav kasutada kuut kontrollproovi ning viit uuritava kemikaali kontsentratsiooni geomeetrilises jadas, sealjuures iga kontsentratsiooni puhul viit paralleelproovi. Kui eelkatses ei tuvastatud hapniku sidumist, ei ole abiootilist kontrollproovi vaja uuesti kasutada, kuid hapniku märkimisväärse sidumise korral tuleks kasutada abiootilisi kontrollproove uuritava kemikaali igal kontsentratsioonil. Muda tundlikkuse kontrollimiseks tuleks kasutada võrdluskemikaali 3,5-diklorofenooli. Kuna on teada, et muda tundlikkus on muutuv, tuleks kontrollida tundlikkust iga katseseeria puhul. Kõikidel juhtudel võetakse katsenõudest 3 tunni pärast ja vajaduse korral ka 30 minuti pärast proovid, et mõõta hapniku sidumise kiirust hapnikuelektroodiga kambris. Kogutud andmete põhjal arvutatakse hingamise erikiirus kontroll- ja katsesegudes ning seejärel leitakse allpool esitatud võrrandi 7 abil pärssumise määr protsentides.

Heterotroofsele hingamisele ja nitrifitseerimisele avalduva pärssiva mõju eristamine

42.

Spetsiifiliselt nitrifitseerimist pärssiva inhibiitori N-allüültiokarbamiidi kasutamine võimaldab vahetult hinnata uuritava kemikaali pärssivat mõju heterotroofsele oksüdeerimisele ning kui lahutada üldise hapnikusidumise kiirusest (N-allüültiokarbamiidi puudumisel) hapnikusidumise kiirus N-allüültiokarbamiidi juuresolekul, saab kindlaks teha ka mõju nitrifitseerimise kiirusele. Vastavalt katseplaanile tuleks valmistada kaks rühma reaktsioonisegusid, et määrata kooskõlas punktis 41 kirjeldatuga ECx või NOEC, kuid lisaks tuleks ühe rühma igasse segusse lisada N-allüültiokarbamiidi, et saavutada inhibiitori lõppkontsentratsioon 11,6 mg/l, mille puhul on tõendatud nitrifitseerimise täielik pärssumine mudas, mille hõljuvaine sisaldus on kuni 3 000 mg/l (4). Hapniku sidumise kiirust tuleks mõõta kokkupuuteperioodi lõpus; see vahetult mõõdetav väärtus iseloomustab üksnes heterotroofset hingamist ning selle näitaja ja üldise hingamise kiiruse erinevus väljendab nitrifitseerimise kiirust. Seejärel arvutatakse pärssumise määrad.

Mõõtmised

43.

Pärast kokkupuuteperioodi lõppu tuleks esimesest aereerimisnõust võetud proov viia hapnikuelektroodiga kambrisse (2. liide, joonis 1) ja viivitamata mõõta lahustunud hapniku sisaldus proovis. Kui mõõtesüsteem on mitme elektroodiga, võib mõõtmisi teha üheaegselt. On oluline segada proovi kaetud magneti abil samal kiirusel, mida kasutatakse elektroodi kaliibrimiseks, et tagada anduri reageerimine muutuvale hapnikusisaldusele minimaalse viivitusega ja võimaldada teha mõõtenõus korrapäraseid ja reprodutseeritavaid mõõtmisi. Mõnele hapnikuelektroodile lisatud segistisüsteem on tavaliselt selleks piisav. Kambrit tuleks mõõtmiste vahel veega loputada. Teise võimalusena võib võetud prooviga täita BHT pudeli (3. liide, joonis 2), mis on varustatud magnetsegistiga. Seejärel tuleks paigaldada pudelisuule koonusüleminek hapnikuanduriga ning panna magnetsegisti tööle. Mõlemal juhul tuleks pidevalt mõõta lahustunud hapniku sisaldust ja salvestada andmeid teatava perioodi vältel, tavaliselt 5–10 minuti jooksul või kuni hapnikusisaldus langeb alla 2 mg/l. Elektrood tuleks eemaldada, segu tuleks viia tagasi aereerimisnõusse ning aereerimist ja segamist tuleks jätkata, kui on vaja teha veel mõõtmisi pikema kokkupuuteperioodi järel.

Uuritava kemikaali sisalduse kontrollimine

44.

Mõnel juhul võib olla vaja mõõta uuritava kemikaali kontsentratsiooni katsenõus. Tuleks silmas pidada, et kui kasutatakse:

vees raskesti lahustuva aine põhilahust,

sellise segu põhilahust, mille koostisained on erineva vees lahustuvusega, või

vees hästi lahustuva aine põhilahust, milles aine sisaldus on lähedal vees lahustuvuse piirkontsentratsioonile,

ei ole lahustunud fraktsiooni osakaal teada ja seega ei ole teada ka katsenõusse viidava uuritava kemikaali tegelik kontsentratsioon. Kokkupuute iseloomustamiseks on vaja analüütiliselt hinnata uuritava kemikaali kontsentratsiooni katsenõus. Hindamise lihtsustamiseks tuleks analüüs teha enne inokulumi lisamist. Kuna katsenõusse viiakse üksnes lahustunud fraktsioon, võib mõõdetav kontsentratsioon olla väga väike.

45.

Aeganõudva ja kuluka analüüsi asemel soovitatakse lihtsalt kaaluda uuritava kemikaali kogus otse katsenõusse ja lähtuda järgnevates arvutustes kaalutud kogusele vastavast nominaalsest algsisaldusest. Uuritava kemikaali lahustunud, lahustumata ja adsorbeerunud fraktsiooni eristamine ei ole vajalik, sest kõik need fraktsioonid esinevad ka reoveepuhastis valitsevates reaalsetes tingimustes ning nende osakaal võib sõltuvalt reovee koostisest varieeruda. Käesoleva katsemeetodi eesmärk on hinnata realistlikult kontsentratsiooni, mille juures pärssiv mõju puudub, ning sellega ei saa üksikasjalikult uurida, millised fraktsioonid aktiivmuda organisme pärsivad. Adsorbeeruvad ained tuleks samuti kaaluda otse katsenõusse ja nõu peaks olema adsorbeerumisest tuleneva kao minimeerimiseks silaanitud.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Hapniku sidumise kiiruse arvutamine

46.

Hapniku sidumise kiirus tuleks arvutada lähtuvalt mõõdetud väärtuste keskmisest, kasutades näiteks hapnikusisalduse ajas muutumise kõvera lineaarset osa ja piirdudes arvutustes hapnikusisalduse väärtuste vahemikuga 2,0–7,0 mg/l, kuna neist väärtustest suurem või väiksem sisaldus võib juba ise mõjutada hapnikutarbimise kiirust. Kummalegi poole nimetatud vahemikku jäävate kontsentratsioonivahemike kasutamine on mõnikord siiski vältimatu ja vajalik, näiteks juhul, kui hingamine on tugevalt pärsitud ja seega väga aeglane või kui mõne konkreetse aktiivmuda hingamine on väga kiire. See on vastuvõetav juhul, kui sidumiskõvera asjaomased pikendatud lõigud on sirged ja nende tõus ei muutu hapnikusisalduse vahemiku 2,0–7,0 mg/l piirest väljumisel. Mis tahes kõver lõik graafikul osutab mõõtesüsteemi stabiliseerumisele või hapniku sidumise kiiruse muutumisele ning sellist lõiku ei tohiks hingamiskiiruse arvutamisel kasutada. Hapniku sidumise kiirust tuleks väljendada milligrammides liitri kohta tunnis (mg/lh) või milligrammides kuiva muda grammi kohta tunnis (mg/gh). Hapnikutarbimise kiiruse R (mg/lh) võib arvutada või interpoleerida hapnikusisalduse vähenemise graafiku lineaarse osa põhjal vastavalt võrrandile 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1),

kus

Q1

on hapnikusisaldus lineaarse faasi valitud lõigu alguspunktis (mg/l),

Q2

on hapnikusisaldus lineaarse faasi valitud lõigu lõpp-punktis (mg/l) ja

Δt

on kahe kõnealuse mõõtmise vaheline ajavahemik (min).

47.

Hingamise erikiirust (Rs) väljendatakse tarbitud hapniku kogusena muda kuivmassi grammi kohta tunnis (mg/gh) vastavalt võrrandile 2:

Rs = R / SS

(2),

kus SS on hõljuvaine sisaldus katsesegus (g/l).

48.

Hapnikutarbimise kiiruse R eri indeksid, mida võib kasutada koos, on järgmised:

S

erikiirus,

T

üldine hingamiskiirus,

N

nitrifitseerimisega seotud hingamise kiirus,

H

heterotroofse hingamise kiirus,

A

abiootiliste protsessidega seotud hapnikutarbimise kiirus,

B

hapnikutarbimise kiirus kemikaalita kontrollproovides (keskmine).

Nitrifitseerimisest tuleneva hapnikusidumise kiiruse arvutamine

49.

Üldise hingamiskiiruse (RT), nitrifitseerimisega seotud hingamise kiiruse (RN) ja heterotroofse hingamise kiiruse (RH) seost väljendab võrrand 3:

RN = RT – RH

(3),

kus

RN

on nitrifitseerimisest tuleneva hapnikusidumise kiirus (mg/lh),

RT

on mõõdetud hapnikusidumise kiirus kemikaalita kontrollproovis, kuhu ei ole lisatud N-allüültiokarbamiidi (FB) (mg/lh) ja

RH

on mõõdetud hapnikusidumise kiirus kemikaalita kontrollproovis, kuhu on lisatud N-allüültiokarbamiidi (FN) (mg/lh).

50.

See seos kehtib kemikaalita kontrollproovide (RNB, RTB, RHB), abiootiliste kontrollproovide (RNA, RTA, RHA) ja uuritava kemikaaliga proovide (RNS, RTS, RHS) (mg/gh) puhul. Hingamise erikiirus arvutatakse järgmiselt:

RNS = RN / SS

(4);

RTS = RT / SS

(5);

RHS = RH / SS

(6).

51.

Kui RN osakaal on eelkatses piisavalt väike (nt < 5 % RT väärtusest kemikaalita kontrollproovides), võib lähtuda eeldusest, et heterotroofne hapnikusidumine on võrdne üldise hapnikusidumisega ja nitrifitseerimist ei toimu. Kui katsetega soovitakse hinnata mõju heterotroofsetele ja nitrifitseerivatele mikroorganismidele, tuleks kasutada mõnest muust allikast pärit aktiivmuda. Lõplik katse tehakse juhul, kui uuritava kemikaali eri kontsentratsioonidel täheldatakse hapnikusidumise kiiruse vähenemist.

Hapnikutarbimise pärssumise protsendilise määra arvutamine

52.

Üldise hapnikutarbimise pärssumise protsentuaalne määr IT uuritava kemikaali igal kontsentratsioonil leitakse vastavalt võrrandile 7:

IT = [1 – (RT – RTA) / RTB] × 100 %

(7).

53.

Heterotroofse hapnikusidumise pärssumise protsentuaalne määr IH uuritava kemikaali igal kontsentratsioonil leitakse samal viisil vastavalt võrrandile 8:

IH = [1 – (RH – RHA) / RHB] × 100 %

(8).

54.

Nitrifitseerimisest tuleneva hapnikusidumise pärssumise määr IN igal kontsentratsioonil leitakse vastavalt võrrandile 9:

IN = [1 – (RT – RH) / (RTB – RHB)] × 100 %

(9).

55.

Tuleks koostada graafik, mis väljendab hapnikusidumise pärssumise protsentuaalse määra sõltuvust uuritava kemikaali sisaldusest (pärssumiskõver; vt 4. liide, joonis 3). Pärssumiskõver koostatakse iga kolmetunnise ja vajaduse korral ka 30 minuti pikkuse aereerimisperioodi kohta. Tuleks arvutada või graafiku põhjal interpoleerida uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures hapnikusidumine väheneb 50 % võrra (EC50). Sobivate andmete olemasolu korral võib arvutada või interpoleerida EC50 usalduspiirid usaldusnivool 95 %, kõvera tõusu ning pärssimisvahemiku algust (nt EC10 või EC20) ja lõppu (nt EC80 või EC90) tähistavad asjakohased väärtused.

56.

Tuleks silmas pidada, et sageli täheldatavat tulemuste varieeruvust arvestades võib paljudel juhtudel piisata tulemuste täiendavast väljendamisest suurusjärgu põhiselt, näiteks järgmiselt:

EC50

< 1 mg/l;

EC50

1–10 mg/l;

EC50

10–100 mg/l;

EC50

> 100 mg/l.

Tulemuste tõlgendamine

ECx

57.

ECx väärtused ning nende alumised ja ülemised usalduspiirid usaldusnivool 95 % arvutatakse asjakohaste statistiliste meetoditega (nt probitanalüüs, logistiline või Weibulli funktsioon, kohandatud Spearmani-Kärberi meetod või lihtne interpoleerimine (11)). ECx leidmiseks sisestatakse kasutatavasse võrrandisse kontrollproovide keskväärtusest x % moodustav väärtus. EC50 või mõne muu ECx arvutamiseks tuleks kasutatud kontsentratsioonidele vastavate keskmiste väärtuste (x) suhtes kohaldada regressioonanalüüsi.

NOEC hindamine

58.

Kui statistilise analüüsi eesmärk on teha kindlaks NOEC, on vaja statistilisi andmeid iga nõu kohta (eraldi nõusid käsitletakse paralleelproovidena). Tuleks kasutada asjakohaseid statistilisi meetodeid kooskõlas OECD dokumendiga „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application” („Praegused meetodid ökotoksilisuse andmete statistiliseks analüüsiks: rakendamissuunised”) (11). Uuritava kemikaali pärssiva mõju hindamiseks kontrollrühmaga võrreldes kasutatakse üldjuhul hüpoteesi ühepoolset (väiksemamahulist) kontrollimist p väärtusel ≤ 0,05.

Katseprotokoll

59.

Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.

 

Uuritav kemikaal:

tavanimetus, keemiline nimetus, CASi number, puhtus;

uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised omadused (nt log Kow, lahustuvus vees, aururõhk, Henry konstant (H) ja võimalik teave kemikaali käitumise, nt aktiivmudale adsorbeerumise kohta).

 

Katsesüsteem:

päritolu, reoveepuhasti käitamistingimused, puhastisse sissevoolu allikas ning aktiivmuda kontsentratsioon, eeltöötlus ja säilitamine.

 

Katsetingimused:

katsetemperatuur, pH katse ajal ja kokkupuuteperioodi(de) kestus.

 

Tulemused:

hapnikutarbimise erikiirus kontrollproovides (milligrammi O2 muda grammi kohta tunnis);

kõik mõõteandmed, pärssumiskõver(ad) ja EC50 arvutamise meetod;

EC50 ja võimaluse korral selle usalduspiirid usaldusnivool 95 %, samuti võimaluse korral EC20 ja EC80; kui EC50 ei ole võimalik kindlaks teha, siis NOEC ja kasutatud statistilised meetodid;

andmed hingamise üldise pärssumise ning vajaduse korral heterotroofse ja nitrifitseerimisega seotud hingamise pärssumise kohta;

abiootiline hapnikusidumine füüsikalis-keemiliste omaduste hindamiseks ette nähtud kontrollproovides (kui neid kasutatakse);

võrdluskemikaali nimetus ja selle kemikaaliga saadud tulemused;

kõik tulemusi mõjutada võivate asjaoludega seotud tähelepanekud ja kõrvalekalded standardmeetodist.

KIRJANDUS

(1)

Brown, D., Hitz, H. R., ja Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10: 245–261.

(2)

King, E. F., ja Painter, H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxic. Assess. 1: 27–39.

(3)

OECD (1984). Activated sludge, Respiration inhibition test. Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals. OECD, Pariis.

(4)

Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (2007). ISO 8192: Water Quality – Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Dokument ISO/TC147/WGI/N.183, Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon.

(6)

Painter, H. A., ja Jones, K. (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-organisms. J. Appl. Bacteriol. 26: 471–483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxic. Assess. 1: 515–524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117: 80.

(9)

Fiebig, S., ja Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresen. Environ. Bull. 13: 1556–1557.

(10)

Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1995). ISO 10634: Water quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18. OECD, Pariis.

1. liide

Mõisted

Käesoleva katsemeetodi puhul kasutatakse järgmisi mõisteid.

Kemikaal – aine või segu.

ECx (kontsentratsioon, mille puhul mõju ulatus on x %) – kontsentratsioon, mille juures teatava kokkupuuteperioodi vältel katseorganismidele avalduva mõju ulatus on x % kontrollrühma asjaomase näitaja väärtusest. Näiteks EC50 on kontsentratsioon, mille puhul kindlaksmääratud kokkupuuteperioodi vältel avaldub kemikaali mõju katses uuritavale näitajale 50 protsendil kemikaaliga kokku puutuvast populatsioonist.

NOEC (täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon) – uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures ei täheldata mingit mõju. Käesoleva katsemeetodi puhul ei täheldata sellisel kontsentratsioonil teatava kokkupuuteperioodi vältel kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

2. liide

Joonis 1.   Mõõtesüsteemi näide.

Image

Selgitus:

1

aktiivmuda

2

kunstlik sööde

3

uuritav kemikaal

4

õhk

5

segamisnõu

6

magnetsegisti

7

hapnikusisalduse mõõtmise kamber

8

hapnikuelektrood

9

hapnikusisalduse mõõtmise seade

10

salvestusseade

3. liide

Joonis 2.   BHT pudelil põhineva mõõtesüsteemi näide.

Image

Selgitus:

1

katsenõu

2

hapnikuelektrood

3

hapnikusisalduse mõõtmise seade

4. liide

Joonis 3.   Pärssumiskõverate näide.

Image

Selgitus:

X

3,5-diklorofenooli sisaldus (mg/l)

Y

pärssumine ( %)

Image

heterotroofse hingamise pärssumine nitrifitseeriva muda kasutamisel

Image

nitrifitseerimise pärssumine nitrifitseeriva muda kasutamisel

5)

Peatükk C.26 asendatakse järgmisega:

C.26.   PEREKONNA LEMNA TAIMEDE KASVU PIDURDUMISE KATSE

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 221 (2006). Meetod on ette nähtud kemikaalide mürgisuse hindamiseks perekonna Lemna (lemmel) mageveetaimedel. See põhineb olemasolevatel meetoditel (1, 2, 3, 4, 5, 6), kuid hõlmab neis tehtud muudatusi, mis kajastavad viimaste teadusuuringute ja mitut põhiküsimust käsitleva arutelu tulemusi. Käesolev katsemeetod on valideeritud rahvusvahelise võrdlusuuringuga (7).

2.

Meetodis kirjeldatakse mürgisuse hindamist liikidel Lemna gibba ja Lemna minor, mida on põhjalikult uuritud ja mida kasutatakse eespool osutatud standardite kohaste katseobjektidena. Suurest fenotüübilisest varieeruvusest tulenevalt on Lemna liikide taksonoomia keeruline. Ehkki Lemna puhul võib täheldada geneetilist varieeruvust taimede tundlikkuses mürgistele kemikaalidele, ei ole selle varieeruvuse kohta praegu piisavalt andmeid, et soovitada kasutada käesoleva meetodi puhul mõnda konkreetset klooni. Tuleks silmas pidada, et katses ei kasutata puhaskultuuri, kuid eri katseetappides võetakse meetmeid muude organismidega saastumise minimeerimiseks.

3.

Meetodis kirjeldatakse katse üksikasju uuendatava katselahuse (poolstaatiline või läbivoolurežiim) ja mitteuuendatava katselahuse (staatiline režiim) kasutamisel. Olenevalt katse eesmärgist ja regulatiivsetest nõuetest on soovitatav kaaluda poolstaatilise või läbivoolurežiimi kasutamist näiteks selliste kemikaalide puhul, mis kaovad lahusest kiiresti lendumise, fotolagunemise, sadenemise või biolagunemise tõttu. Täiendavad juhised on esitatud allikas 8.

4.

Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.

KATSE PÕHIMÕTE

5.

Perekonna Lemna taimede eksponentsiaalselt kasvavatel monokultuuridel lastakse seitsme ööpäeva jooksul kokku puutuda eri kontsentratsioonides esineva uuritava kemikaaliga. Katse eesmärk on kirjeldada valitud mõõdetava muutuja alusel kvantitatiivselt kemikaali mõju vegetatiivsele kasvule nimetatud perioodi jooksul. Peamine mõõdetav muutuja on tallusjate võsude arv. Kuna mõni kemikaal võib mõjutada muid mõõdetavaid muutujaid palju rohkem kui tallusjate võsude arvu, hinnatakse peale selle veel vähemalt ühte mõõdetavat muutujat (tallusjate võsude üldpindala, kuivmass või märgmass). Kemikaali mõju kvantitatiivseks hindamiseks võrreldakse kasvu katselahuses kasvuga kontrollrühmas ning tehakse kindlaks kontsentratsioon, mille juures kasv pidurdub teatud kindla protsendi x (nt 50 %) võrra; seda kontsentratsiooni väljendatakse kujul ECx (nt EC50).

6.

Katse lõppnäitaja on kasvu pidurdumine, kusjuures kasvu väljendatakse mõõdetava muutuja logaritmitud väärtuse suurenemisena kokkupuuteaja jooksul (keskmine kasvu erikiirus). Katselahuste seerias määratud keskmiste kasvu erikiiruste põhjal tehakse kindlaks kontsentratsioon, mille puhul kasvukiirus väheneb teatud kindla protsendi x (nt 50 %) võrra; seda kontsentratsiooni väljendatakse kujul ErCx (nt ErC50).

7.

Käesoleva meetodi puhul kasutatakse süsteemi vastust iseloomustava muutujana ka saagist, mille määramine võib olla vajalik mõnes riigis kehtivate regulatiivsete erinõuete täitmiseks. Saagis on määratletud kui kokkupuuteperioodi lõpus ja alguses määratud mõõdetavate muutujate väärtuste vahe. Katselahuste seerias määratud saagiste põhjal arvutatakse kontsentratsioon, mille puhul saagis väheneb teatud kindla protsendi x (nt 50 %) võrra; seda kontsentratsiooni väljendatakse kujul EyCx (nt EyC50).

8.

Peale selle võib statistiliselt kindlaks teha vähima täheldatavat toimet avaldava kontsentratsiooni (LOEC) ja täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni (NOEC).

TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA

9.

Analüüsimeetod uuritava kemikaali sisalduse määramiseks katsesöötmes peaks olema piisava tundlikkusega.

10.

Katsetingimuste kindlaksmääramiseks võib uuritava kemikaali kohta olla kasulik teada muu hulgas järgmisi andmeid: struktuurivalem, puhtus, lahustuvus vees, püsivus vees ja valguse käes, pKa, Kow, aururõhk ja biolagunduvus. Vees lahustuvuse ja aururõhu põhjal võib arvutada Henry konstandi, mis võimaldab hinnata, kas uuritava kemikaali märkimisväärne kadu katse ajal on tõenäoline. See aitab kindlaks teha, kas sellise kao ärahoidmiseks tuleks võtta konkreetseid meetmeid. Kui puuduvad kindlad andmed uuritava kemikaali lahustuvuse ja püsivuse kohta, soovitatakse hinnata neid omadusi katses kasutatavates tingimustes, st samas söötmes ning sama temperatuuri ja valgusrežiimi juures.

11.

Kui katsesöötme pH hoidmine on eriti tähtis, nt kui uuritakse metalle või kergesti hüdrolüüsuvaid kemikaale, soovitatakse lisada söötmese puhverainet (vt punkt 21). Täiendavad juhised selliste kemikaalide mõju hindamiseks, mille füüsikalis-keemilised omadused raskendavad nende uurimist, on esitatud allikas 8.

KATSE NÕUETEKOHASUS

12.

Katse on nõuetekohane, kui tallusjate võsude arvu kahekordistumise aeg kontrollrühmas on lühem kui 2,5 ööpäeva (60 tundi), mis vastab võsude arvu umbes seitsmekordsele suurenemisele seitsme ööpäeva jooksul ja keskmisele kasvu erikiirusele 0,275 ööpäeva kohta. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud söötmete ja katsetingimuste kasutamisel on see kriteerium staatilise katserežiimi puhul täidetav (5). Seda kriteeriumi on eeldatavalt võimalik täita ka poolstaatilise ja läbivoolurežiimi puhul. Kahekordistumisaeg arvutatakse punkti 49 kohaselt.

VÕRDLUSKEMIKAAL

13.

Katsemeetodi kontrollimiseks võib kasutada rahvusvahelises võrdlusuuringus (7) kasutatud võrdluskemikaale, näiteks 3,5-diklorofenooli. Võrdluskemikaaliga kontrollimist soovitatakse teha vähemalt kaks korda aastas või kui katseid tehakse harvem, siis uuritava kemikaali mürgisuse määramisega samaaegselt.

MEETODI KIRJELDUS

Seadmed

14.

Kõik katsesöötmega kokku puutuvad seadmed peaksid olema klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. Kultuuride kasvatamiseks ja katseteks kasutatavad klaasnõud peaksid olema steriilsed ja katsesöötmesse leostuda võivatest keemilistest saasteainetest puhastatud. Katsenõud peaksid olema piisavalt laiad, et kontrollnõudes kasvavad eri kolooniate tallusjad võsud ei ulatuks katse lõpus üksteise peale. Ei ole tähtis, kas juured puudutavad katsenõu põhja, kuid on soovitatav, et lahuse sügavus igas nõus oleks vähemalt 20 mm ja lahuse maht vähemalt 100 ml. Kui need nõuded on täidetud, ei ole valitud katsenõu tüüp eriti oluline. Sobivaks on osutunud nii nõuetekohaste mõõtmetega keeduklaasid, kristalliseerimisnõud kui ka klaasist Petri tassid. Katsenõud peavad olema kaetud, et vähendada aurumist ja juhuslikku saastumist, kuid samal ajal peab olema tagatud vajalik õhuvahetus. Sobivad katsenõud ja eriti nende katted ei tohi varjata valgust ega muuta selle spektrit.

15.

Kultuure ja katsenõusid ei tohiks hoida samas kohas. Seepärast on kõige parem kasutada eraldi kasvukambreid, inkubaatoreid või ruume. Valgustustihedus ja temperatuur peavad olema reguleeritavad ja neid hoitakse konstantsena (vt punktid 35–36).

Katseorganism

16.

Käesoleva meetodi kohases katses kasutatakse katseorganismina lemmelt Lemna gibba või Lemna minor. Mürgisuse hindamise katsetes kasutatud lemleliikide lühikirjeldus on esitatud 2. liites. Taimne materjal võib pärineda kultuuride kollektsioonist, teisest laborist või loodusest. Loodusest kogutud taimi tuleks enne kasutamist kultiveerida vähemalt kaheksa nädalat katses kasutatavas söötmes. Loodusliku lähtekultuuri kogumiskohas ei tohi esineda ilmseid saasteallikaid. Teisest laborist või kultuuride kollektsioonist saadud taimi tuleks enne kasutamist kultiveerida samal viisil vähemalt kolm nädalat. Taimse materjali päritolu ning katses kasutatud liik ja kloon (kui see on teada) tuleks alati märkida katseprotokolli.

17.

Tuleks kasutada monokultuure, mis ei ole nähtavalt saastunud muude organismide, näiteks vetikate või algloomadega. Lemle L. minor terved taimed moodustavad 2–5 tallusjast võsust koosneva koloonia; L. gibba tervete taimede koloonia võib koosneda kuni seitsmest tallusjast võsust.

18.

Katses kasutatavate taimede kvaliteet ja ühetaolisus mõjutavad märkimisväärselt katsetulemust ning seepärast tuleks taimi hoolikalt valida. Tuleks kasutada kiirelt kasvavaid noori taimi, millel pole nähtavaid kahjustusi ega värvimuutusi (kloroos). Kvaliteetses kultuuris on palju vähemalt kahest tallusjast võsust koosnevaid kolooniaid. Ühekaupa esinevate tallusjate võsude rohkus osutab keskkonnastressile, nt toitainevaegusele; sellisest kultuurist saadud taimset materjali ei tohiks katses kasutada.

Kultiveerimine

19.

Kultuuride hooldamissageduse vähendamiseks (nt kui teatava aja jooksul ei kavandata katseid lemlega) võib kultuure hoida vähendatud valgustustiheduse ja madalama temperatuuri (4–10 °C) juures. Kultiveerimist kirjeldatakse üksikasjalikult 3. liites. Vetikate või muude organismidega saastumise tunnuste ilmnemisel võib olla vaja lemle tallusjate võsude osaproov pindsteriliseerida ja seejärel värskesse söötmesse üle viia (vt 3. liide). Ülejäänud saastunud kultuur tuleks sellisel juhul kõrvaldada.

20.

Vähemalt seitse päeva enne katset viiakse piisav arv kolooniaid aseptiliselt värskesse steriilsesse söötmesse ja kolooniaid kasvatatakse katsetingimustes 7–10 ööpäeva.

Katsesööde

21.

Liikide Lemna minor ja Lemna gibba puhul soovitatakse kasutada allpool kirjeldatud eri söötmeid. Tuleks hoolikalt kaaluda, kas lisada katsesöötmesse pH puhvrit (liigi L. minor puhul MOPS (4-morfoliinpropaansulfoonhape, CASi nr 1132-61-2) ja L. gibba puhul NaHCO3), kui on kahtlus, et see võib reageerida uuritava kemikaaliga ja mõjutada kemikaali mürgisuse avaldumist. Võib kasutada ka Steinbergi söödet (9), kui järgitakse nõuetele vastavuse kriteeriume.

22.

Liigi L. minor taimede kultiveerimiseks ja nendega katsete tegemiseks soovitatakse kasutada Rootsi Standardiinstituudi (SIS) lemlesöödet modifitseeritud kujul. Selle söötme koostis on esitatud 4. liites.

23.

L. gibba kultiveerimiseks ja sellega katsete tegemiseks soovitatakse kasutada 4. liites kirjeldatud söödet 20X-AAP.

24.

Liigi L. minor puhul ja ka L. gibba puhul võib nõuetele vastavuse kriteeriumide järgimise korral kasutada ka 4. liites kirjeldatud Steinbergi söödet.

Katselahused

25.

Katselahused valmistatakse tavaliselt põhilahuse lahjendamise teel. Uuritava kemikaali põhilahuse valmistamiseks lahustatakse kemikaal tavaliselt söötmes.

26.

Üldjuhul ei tohiks uuritava kemikaali suurim kasutatav kontsentratsioon ületada kemikaali vees lahustuvust katsetingimustes. Sama ajal tuleks silmas pidada, et lemleliikide taimed ujuvad pinnal ja võivad kokku puutuda ka vee ja õhu piirpinnale koguneva kemikaaliga (nt vees raskesti lahustuv, hüdrofoobne või pindaktiivne kemikaal). Sellisel juhul puutuvad taimed kokku ka muu kui lahuses oleva materjaliga ning olenevalt uuritava kemikaali omadustest võib kemikaali kokkupuutekontsentratsioon olla suurem kui selle vees lahustuvus. Vees raskesti lahustuva kemikaali puhul võib olla vaja kasutada selle kemikaali kontsentreeritud põhilahuse või dispersiooni valmistamiseks orgaanilist lahustit või dispergeerivat ainet, et hõlbustada uuritava kemikaali täpse koguse lisamist katsesöötmesse ja soodustada kemikaali lahustumist või dispergeerumist. Tuleks teha kõik selleks, et selliseid aineid ei oleks vaja kasutada. Lisatav lahusti või dispergeeriv aine ei tohiks olla fütotoksiline. Tavaliselt kasutatavad lahustid, mis kuni kontsentratsioonini 100 μl/l ei ole fütotoksilised, on näiteks atsetoon ja dimetüülformamiid. Lahusti või dispergeeriva aine kasutamisel peaks selle lõppsisaldus olema võimalikult väike (≤ 100 μl/l) ja tuleks märkida katseprotokolli ning kõigi katse- ja kontrollkultuuride puhul tuleks kasutada lahusti või dispergeeriva aine ühesugust kontsentratsiooni. Täiendavad juhised dispergeeriva aine kasutamise kohta on esitatud allikas 8.

Katse- ja kontrollrühmad

27.

Uuritava kemikaali sobivate kontsentratsioonide valimine on hõlpsam, kui kemikaali mürgisus lemlele on eelnevalt näiteks kontsentratsioonivahemiku leidmise katsega kindlaks tehtud. Mürgisuse hindamise lõplikus katses tuleks üldjuhul kasutada vähemalt viit uuritava kemikaali kontsentratsiooni geomeetrilises jadas. Kasutatavate kontsentratsioonide jada tegur ei tohiks üldjuhul olla suurem kui 3,2, kuid kontsentratsiooni ja mõju vahelise nõrga sõltuvuse puhul võib siiski kasutada suuremat tegurit. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleks seda põhjendada. Uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul tuleks kasutada vähemalt kolme paralleelkultuuri.

28.

Kasutatavate kontsentratsioonide valimisel kontsentratsioonivahemiku leidmise katse ja/või mürgisuse hindamise lõpliku katse jaoks tuleks arvestada järgmist.

ECx määramisel peaks ECx väärtus jääma kasutatavasse kontsentratsioonivahemikku, et tagada tulemuste piisav usaldusväärsus. Näiteks peaks EC50 määramisel suurim kasutatav kontsentratsioon olema suurem kui EC50 väärtus. Kui EC50 väärtus jääb kasutatavast kontsentratsioonivahemikust väljapoole, on asjaomane usaldusvahemik lai ja lähendatud mudeli sobivust katseandmetega ei pruugi olla võimalik statistiliselt hinnata.

Kui eesmärk on leida LOEC või NOEC, peaks väikseim kasutatav kontsentratsioon olema piisavalt väike, et kasv ei oleks selle kontsentratsiooni juures oluliselt aeglasem kui kontrollrühmas. Peale selle peaks suurim kasutatav kontsentratsioon olema piisavalt suur, et kasv oleks selle kontsentratsiooni juures oluliselt aeglasem kui kontrollrühmas. Vastasel juhul tuleb katset korrata, kasutades teistsugust kontsentratsioonivahemikku (kui suurim kasutatav kontsentratsioon ei ole juba võrdne lahustuvuse piirkontsentratsiooniga või suurima nõutava kontsentratsiooniga, näiteks 100 mgl/1).

29.

Igas katses kasutatakse ka kontrollkultuure, mille puhul sööde, tallusjate võsude ja kolooniate arv, keskkonnatingimused ja katsemeetodid on samad kui uuritava kemikaaliga kultuuride puhul, kuid mis ei sisalda uuritavat kemikaali. Lahusti või dispergeeriva aine kasutamise korral tuleks lisaks valmistada kontrollkultuur, milles lahusti või dispergeeriva aine kontsentratsioon on sama kui uuritavat kemikaali sisaldavates nõudes. Paralleelsete kontrollnõude ja vajaduse korral lahustiga kontrollnõude arv peab olema vähemalt võrdne uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul kasutatavate nõude arvuga ning soovitatavalt sellest kaks korda suurem.

30.

Kui ei ole vaja määrata NOEC väärtust, võib katseplaani muuta nii, et suurendatakse uuritava kemikaali kontsentratsioonide arvu ja vähendatakse paralleelkultuuride arvu iga kontsentratsiooni kohta. Paralleelseid kontrollkultuure peab siiski olema vähemalt kolm.

Kokkupuude

31.

Inokulum-kultuurist viiakse 2–4 nähtavast tallusjast võsust koosnevad kolooniad aseptilistes tingimustes juhuvaliku alusel üle katsenõudesse. Igas katsenõus peaks olema kokku 9–12 tallusjat võsu. Tallusjate võsude ja kolooniate arv peaks kõikides katsenõudes olema võrdne. Käesoleva meetodi rakendamisel saadud kogemustest ja võrdlusuuringu andmetest nähtub, et kui kasutada iga kontsentratsiooni kohta kolme paralleelkultuuri, millest igaühes on algselt 9–12 tallusjat võsu, on see piisav, et teha kindlaks eri kontsentratsioonidel täheldatav kasvukiiruse muutumine umbes 4–7 % võrra (saagise vähenemine 10–15 % võrra) (7).

32.

Katsenõude paigutus inkubaatoris peab olema juhuslik, et vähendada asukohast tingitud temperatuuri ja valgustustiheduse erinevuste mõju. Samuti on vaja katsenõud mõõtmiste tegemise ajal või suurema sagedusega kas kindla skeemi alusel või juhuslikult ümber paigutada.

33.

Kui püsivuse määramise eelkatsest nähtub, et uuritava kemikaali kontsentratsiooni ei ole võimalik katse vältel (7 ööpäeva jooksul) püsivana hoida, st kemikaali mõõdetud sisaldus langeb alla 80 % mõõdetud algsisaldusest, soovitatakse kasutada poolstaatilist katserežiimi. Sel juhul tuleks kolooniad katse jooksul vähemalt kahel korral (nt kolmandal ja viiendal katsepäeval) üle viia värskelt valmistatud katse- ja kontroll-lahustesse. Värskesse söötmesse üleviimise sagedus sõltub uuritavast kemikaalist; väga ebapüsiva või lenduva kemikaali puhul võib selle sisalduse peaaegu püsivana hoidmiseks olla vaja tagada sagedasem üleviimine värskesse söötmesse. Mõnel juhul võib olla vaja kasutada läbivoolumeetodit (8, 10).

34.

Käesolevas katsemeetodis ei käsitleta kokkupuudet taimelehtedele pritsimise teel; selle meetodi puhul vt allikas 11.

Inkubeerimistingimused

35.

Tuleks kasutada päevavalguse spektriga või külmvalget pidevat fluorestsentsvalgust, mille intensiivsus jääb vahemikku 85–135 μE m– 2s– 1 (vastab 6 500–10 000 luksile), mõõdetuna fotosünteesiks sobivas lainepikkuste vahemikus 400–700 nm punktides, mis on valgusallikast sama kaugel kui Lemna tallusjad võsud. Valgustustihedus ei tohiks katsepinna üheski punktis erineda valitud väärtusest üle 15 %. Valgustustiheduse mõõdetav väärtus sõltub mõõtmismeetodist ja eelkõige anduri tüübist. Ühest suunast saabuvale valgusele reageeriva anduri asemel soovitatakse kasutada kerakujulist andurit, mis reageerib nii ülalt- kui ka altpoolt mõõtetasapinda mis tahes nurga all saabuvale valgusele, või koosinusandurit, mis reageerib ülaltpoolt mõõtetasapinda mis tahes nurga all saabuvale valgusele; sellise anduriga saadakse käesolevas meetodis kirjeldatud mitmepunktilise valgusallika puhul suuremad väärtused.

36.

Temperatuur katsenõudes peaks olema 24 ± 2 °C. Kontrollsöötme pH ei tohiks katse ajal tõusta rohkem kui 1,5 ühikut. Kui pH tõuseb üle 1,5 ühiku, ei loeta katset siiski nõuetele mittevastavaks, kui on võimalik tõendada, et nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud. Erijuhul, nt ebapüsiva kemikaali või metalli mõju uurimisel tuleb pH muutumisele pöörata erilist tähelepanu. Täiendavad juhised on esitatud allikas 8.

Kestus

37.

Katse lõpetatakse, kui taimede viimisest katsenõudesse on möödunud seitse ööpäeva.

Mõõtmised ja analüüsid

38.

Katse alguses loendatakse ja registreeritakse tallusjate võsude arv katsenõudes, jälgides, et arvesse võetakse kõik väljaulatuvad selgesti nähtavad tallusjad võsud. Normaalse või ebanormaalse välimusega tallusjate võsude arv määratakse katse alguses, vähemalt iga kolme ööpäeva järel (st vähemalt kaks korda 7-päevase katse jooksul) ja katse lõpus. Tuleks registreerida muutused taimede arengus, nt tallusjate võsude suuruses ja välimuses, nekroosi, kloroosi või puhetumise ilmingud, kolooniate lagunemine või ujuvuse vähenemine ning muutused juurte pikkuses ja välimuses. Samuti tuleks registreerida olulised muutused katsesöötmes (nt lahustumatu aine esinemine, vetikate kasv katsenõus).

39.

Lisaks tallusjate võsude arvu määramisele katse jooksul hinnatakse ka uuritava kemikaali mõju ühele või mitmele järgmistest mõõdetavatest muutujatest:

i)

tallusjate võsude üldpindala,

ii)

kuivmass,

iii)

märgmass.

40.

Tallusjate võsude üldpindala määramise eelis on asjaolu, et seda saab teha igas katse- ja kontrollnõus katse alguses, kestel ja lõpus. Kuiv- või märgmass tuleks määrata katse alguses inokulum-kultuuri representatiivse proovi alusel ning katse lõpus igast katse- ja kontrollnõust saadud taimse materjali alusel. Kui tallusjate võsude üldpindala ei mõõdeta, eelistatakse märgmassi määramisele kuivmassi määramist.

41.

Tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi ja märgmassi võib määrata järgmiselt.

i)

Tallusjate võsude üldpindala: kõigi kolooniate tallusjate võsude üldpindala võib määrata pildianalüüsi abil. Katsenõu ja taimede silueti võib jäädvustada videokaameraga (nt asetades nõu valguskastile) ja saadud kujutise digiteerida. Seejärel võib määrata tallusjate võsude üldpindala katsenõus, kasutades kalibreerimiseks teadaoleva pindalaga tasapinnalisi kujundeid. Tuleks jälgida, et katsenõu servast tingitud interferents ei segaks määramist. Teine, töömahukam meetod on teha katsenõust ja taimedest fotokoopia, lõigata välja kolooniate siluett ja määrata kolooniate pindala lehepindala analüsaatori või millimeetripaberi abil. Võib kasutada ka muid määramismeetodeid (nt kolooniate silueti pindalale ja pindalaühikule vastavate paberi kaalude suhte määramine).

ii)

Kuivmass: igast katsenõust kogutakse kõik kolooniad ja neid loputatakse destilleeritud või deioniseeritud veega. Kolooniatelt eemaldatakse kuivatuspaberiga liigne vesi ja seejärel kuivatatakse neid 60 °C juures, kuni nende kaal enam ei muutu. Kuivmassi määramisel võetakse arvesse kõik juuretükid. Kuivmassi väljendatakse täpsusega vähemalt 0,1 mg.

iii)

Märgmass: kõik kolooniad viiakse eelnevalt kaalutud polüstüreenist (või muust inertsest materjalist) katseklaasidesse, mille ümaras põhjas on väikesed avad läbimõõduga 1 mm. Katseklaase tsentrifuugitakse 10 minutit toatemperatuuril kiirusel 3 000 pööret minutis. Sel viisil kuivatatud kolooniaid sisaldavad katseklaasid kaalutakse uuesti ning märgmassi leidmiseks lahutatakse saadud tulemusest tühja katseklaasi mass.

Mõõtmiste ja analüüside sagedus

42.

Staatilise katserežiimi puhul tuleks mõõta pH igas katsenõus katse alguses ja lõpus. Poolstaatilise katserežiimi puhul tuleks mõõta värske katselahuse pH enne iga lahusevahetust ja määrata ka iga äratarvitatud lahuse pH.

43.

Valgustustihedust tuleks mõõta kasvukambri, inkubaatori või ruumi punktides, mis on valgusallikast samal kaugusel kui Lemna tallusjad võsud. Valgustustihedust tuleks katse jooksul mõõta vähemalt üks kord. Söötme temperatuur kasvukambris, inkubaatoris või ruumis samades tingimustes hoitavas jäljendusnõus tuleks registreerida vähemalt üks kord päevas.

44.

Uuritava kemikaali sisaldus määratakse katse ajal sobiva ajavahemiku tagant. Staatilise katse puhul tuleb uuritava kemikaali sisaldus määrata vähemalt katse alguses ja lõpus.

45.

Poolstaatilise katse puhul, kus uuritava kemikaali sisaldus ei püsi eeldatavalt 20 % piires nominaalväärtusest, tuleb selle sisaldus määrata kõigis värskelt valmistatud katselahustes ja samades lahustes nende väljavahetamise ajal (vt punkt 33). Kui uuritava kemikaali mõõdetud algsisaldus erineb nominaalväärtusest enam kui 20 % võrra, kuid on olemas piisavad tõendid selle kohta, et algsisaldus on korratav ja püsiv (st jääb vahemikku 80–120 % algsisaldusest), võib kemikaali sisalduse määrata ainult suurimal ja väikseimal katses kasutataval kontsentratsioonil. Kõigil juhtudel on uuritava kemikaali sisaldus igal katses kasutataval kontsentratsioonil vaja enne katselahuse väljavahetamist määrata ainult ühes paralleelkultuuri nõus (või paralleelkultuuridest moodustatud koondproovis).

46.

Läbivoolukatse puhul kasutatakse sama proovivõturežiimi kui poolstaatilises katses, sealhulgas määramist katse alguses, kestel ja lõpus, kuid sel juhul ei ole äratarvitatud lahuse analüüsimine asjakohane. Sellises katses tuleks iga päev kontrollida lahjenduslahuse ja uuritava kemikaali või uuritavat kemikaali sisaldava põhilahuse voolukiirust.

47.

Kui on tõendatud, et uuritava kemikaali sisaldus ei kõigu katse vältel nominaalväärtuse või mõõdetud algväärtusega võrreldes rohkem kui ± 20 %, võib tulemuste analüüsimisel võtta aluseks nominaalväärtuse või mõõdetud algväärtuse. Kui kõrvalekalle sisalduse nominaalväärtusest või mõõdetud algväärtusest on suurem kui ± 20 %, tuleks tulemuste analüüsimisel võtta aluseks katse vältel esinevate väärtuste geomeetriline keskmine või mõni uuritava kemikaali sisalduse vähenemist kirjeldav mudel (8).

Piirsisalduskatse

48.

Teatavatel juhtudel, näiteks kui eelkatsest selgub, et uuritav kemikaal ei avalda kontsentratsioonil kuni 100 mg/l või katsesöötmes lahustuvuse piirkontsentratsioonil (olenevalt sellest, kumb on väiksem) mürgist mõju, võib teha piirsisalduskatse, milles võrreldakse kasvu kontrollrühmas ja ühes katserühmas, kus kemikaal esineb kontsentratsioonis 100 mg/l või lahustuvuse piirkontsentratsioonis. Piirsisalduskatse tegemisel soovitatakse tungivalt määrata ka kokkupuutekontsentratsioon. Piirsisalduskatse puhul kohaldatakse kõiki eespool kirjeldatud katsetingimusi ja nõuetele vastavuse kriteeriume; ainsa erandina nähakse ette, et uuritava kemikaaliga paralleelkultuure peaks olema kaks korda rohkem. Kasvu analüüsimiseks kontroll- ja katserühmas võib keskväärtusi võrrelda statistilise testi (nt Studenti t-testi) abil.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Tallusjate võsude arvu kahekordistumise aeg

49.

Tallusjate võsude arvu kahekordistumise aja Td leidmiseks ja katse nõuetele vastavuse sellekohase kriteeriumi täitmise kindlakstegemiseks (punkt 12) kasutatakse kontrollkultuuridest saadud andmeid ja järgmist valemit:

Td = ln 2/μ,

kus μ on punktides 54–55 kirjeldatud viisil määratud keskmine kasvu erikiirus.

Uuritavad muutujad

50.

Katse eesmärk on teha kindlaks uuritava kemikaali mõju Lemna vegetatiivsele kasvule. Kuna eelistused ja regulatiivsed vajadused eri jurisdiktsioonides on erinevad, kirjeldatakse käesolevas katsemeetodis kahte uuritavat muutujat. Et tagada katsetulemuste vastuvõetavus kõikides jurisdiktsioonides, tuleks vaadeldava mõju hindamisel kasutada mõlemat allpool kirjeldatud muutujat (a ja b).

a)

Keskmine kasvu erikiirus: see uuritav muutuja arvutatakse lähtuvalt tallusjate võsude arvu logaritmi ja veel ühe uuritava muutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või märgmassi) logaritmitud väärtuse ööpäevasest muutusest kontrollkultuurides ja igas uuritava kemikaaliga rühmas. Seda nimetatakse mõnikord ka suhteliseks kasvukiiruseks (12).

b)

Saagis: see uuritav muutuja arvutatakse lähtuvalt katse lõpuks toimunud tallusjate võsude arvu ja veel ühe uuritava muutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või märgmassi) väärtuse muutusest kontrollkultuurides ja igas uuritava kemikaaliga rühmas.

51.

Tuleks silmas pidada, et nende kahe uuritava muutuja abil arvutatud mürgisuse väärtused ei ole võrreldavad, ning seda erinevust tuleb katsetulemuste kasutamisel arvesse võtta. Käesolevas katsemeetodis sätestatud tingimuste kohase katse puhul on keskmisel kasvu erikiirusel põhinevad ECx väärtused (ErCx) üldjuhul suuremad kui saagisel põhinevad väärtused (EyCx), kuna asjaomaste lähenemisviiside matemaatiline alus on erinev. Seda erinevust ei tohiks tõlgendada kahe kõnealuse uuritava muutuja tundlikkuse erinevusena; asjaomased väärtused on lihtsalt matemaatiliselt erinevad. Keskmise kasvu erikiiruse määratlus põhineb lemle üldisel piiramata eksponentsiaalsel kasvul kultuuris, kusjuures mürgisust hinnatakse kasvukiirusele avalduva mõju alusel ja see ei olene kontrollkultuuri absoluutsest kasvu erikiirusest, kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera tõusust ega katse kestusest. Kui uuritav muutuja on aga saagis, sõltuvad tulemused kõikidest eespool nimetatud lisamuutujatest. EyCx väärtus sõltub katses kasutatud lemleliigi kasvu erikiirusest ja maksimaalsest kasvu erikiirusest, mis võib eri lemleliikidel ja isegi sama liigi eri kloonidel olla erinev. Seda uuritavat muutujat ei tohiks kasutada, kui võrreldakse lemleliikide või eri kloonide tundlikkust mürgiste kemikaalide suhtes. Ehkki keskmise kasvu erikiiruse kasutamine mürgisuse hindamiseks on teaduslikult paremini põhjendatud, käsitletakse käesolevas katsemeetodis mõnes jurisdiktsioonis kehtivate regulatiivsete nõuete järgimise võimaldamiseks ka saagisel põhinevat mürgisuse hindamist.

52.

Mürgisuse hindamisel tuleks lähtuda tallusjate võsude arvust ja veel ühest mõõdetavast muutujast (tallusjate võsude üldpindala, kuivmass või märgmass), sest mõned kemikaalid võivad mõjutada muid mõõdetavaid muutujaid palju enam kui tallusjate võsude arvu. Ainult tallusjate võsude arvu kasutamisel jääks selline mõju avastamata.

53.

Tallusjate võsude arv ja täiendavalt määratud mõõdetava muutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või märgmassi) väärtus kantakse iga mõõtmise puhul koos uuritava kemikaali kontsentratsiooni väärtusega tabelisse. Järgneval andmeanalüüsil, mille eesmärk on leida LOEC, NOEC või ECx, kasutatakse igast üksikust paralleelkultuurist saadud väärtusi, mitte katserühma kohta arvutatud keskmisi väärtusi.

Keskmine kasvu erikiirus

54.

Iga kontrollkultuuri ja uuritava kemikaaliga kultuuri puhul arvutatakse teatava ajavahemiku keskmine kasvu erikiirus kasvu iseloomustavate muutujate – tallusjate võsude arvu ja veel ühe mõõdetava muutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või märgmassi) – logaritmitud väärtuse suurenemise alusel järgmise valemi abil:

Formula,

kus

μi–j

on keskmine kasvu erikiirus ajavahemikul i–j,

Ni

on mõõdetava muutuja väärtus katse- või kontrollnõus ajahetkel i,

Nj

on mõõdetava muutuja väärtus katse- või kontrollnõus ajahetkel j,

t

on ajavahemik i–j.

Kontrollrühma ja iga katserühma puhul arvutatakse kasvukiiruse keskmine väärtus ja tulemuste hajuvus.

55.

Keskmine kasvu erikiirus tuleks arvutada kogu katseaja kohta (eespool esitatud valemis tähistab katse algust ajahetk i ja katse lõppu ajahetk j). Kontrollrühma ja uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul arvutatakse keskmise kasvu erikiiruse keskväärtus ja tulemuste hajuvus. Peale selle hinnatakse kasvukiirust ka ajavahemike kaupa, näiteks logaritmitud kasvukõverate uurimise teel, et hinnata uuritava kemikaali mõju kokkupuuteaja jooksul. Ajavahemike kaupa arvutatud kasvukiiruste ja keskmise kasvukiiruse vahelised olulised erinevused osutavad pidevast eksponentsiaalsest kasvust kõrvalekaldumisele ning sel juhul on vaja kasvukõveraid üksikasjalikult uurida. Vastavalt konservatiivsele lähenemisviisile tuleks sel juhul võrrelda uuritava kemikaaliga kultuurides kasvu maksimaalse pidurdumiseni kulunud aja jooksul täheldatud kasvu erikiirust samal ajavahemikul kontrollkultuurides täheldatud kasvu erikiirusega.

56.

Iga katses kasutatava kontsentratsiooni (katserühma) puhul arvutatakse kasvukiiruse vähenemine Ir protsentides järgmise valemi abil:

Formula,

kus

:

% Ir

:

on keskmise kasvu erikiiruse vähenemise määr protsentides,

:

μC

:

on μ keskväärtus kontrollrühmas,

:

μT

:

on μ keskväärtus katserühmas.

Saagis

57.

Kemikaali mõju saagisele määratakse lähtuvalt kahe mõõdetava muutuja – tallusjate võsude arvu ja veel ühe mõõdetava muutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või märgmassi) – väärtusest, mis mõõdetakse igas katsekultuuris katse alguses ja lõpus. Kuivmassi või märgmassi algväärtus määratakse tallusjate võsude proovist, mis võetakse katsenõude inokuleerimiseks kasutatavast kultuurist (vt punkt 20). Kontrollrühmas ja uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul arvutatakse keskmine saagis ning tulemuste hajuvus. Saagise vähenemise määra protsentides ( % Iy) võib iga katserühma puhul arvutada järgmiselt:

Formula,

kus

% Iy

on saagise vähenemise määr protsentides,

bC

on biomassi lõppväärtuse ja algväärtuse vahe kontrollrühmas,

bT

on biomassi lõppväärtuse ja algväärtuse vahe katserühmas.

Kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõverate koostamine

58.

Tuleks koostada kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõverad, mis väljendavad uuritava muutuja väärtuse vähenemise keskmise protsentuaalse määra (punkti 56 või 57 kohaselt arvutatud % Ir või % Iy) sõltuvust uuritava kemikaali kontsentratsiooni logaritmitud väärtusest.

ECx leidmine

59.

ECx (nt EC50) hinnanguliste väärtuste leidmisel tuleks lähtuda nii keskmisest kasvu erikiirusest (ErCx) kui ka saagisest (EyCx), mis peaksid kumbki omakorda põhinema tallusjate võsude arvul ja ühel täiendaval mõõdetaval muutujal (tallusjate võsude üldpindalal, kuivmassil või märgmassil). Selle põhjuseks on asjaolu, et teatavad uuritavad kemikaalid mõjutavad tallusjate võsude arvu ja muid mõõdetavaid muutujaid erinevalt. Määratavad mürgisuse näitajad igal arvutataval kasvu pidurdumise tasemel x on seega neli ECx väärtust: ErCx (tallusjate võsude arv), ErCx (tallusjate võsude üldpindala, kuivmass või märgmass), EyCx (tallusjate võsude arv) ja EyCx (tallusjate võsude üldpindala, kuivmass või märgmass).

Statistilised meetodid

60.

Eesmärk on leida regressioonanalüüsi abil kvantitatiivne seos kontsentratsiooni ja mõju vahel. On võimalik kasutada kaalutud lineaarset regressiooni pärast mõjuandmete lineariseerivat teisendamist näiteks probit-, logit- või Weibulli jaotuse kujule (13), kuid tuleks siiski eelistada mittelineaarse regressiooni meetodeid, mis sobivad paremini vältimatute andmevigade ja sujuvast jaotusest kõrvalekallete puhul. Kasvu täielikule pidurdumisele või pidurdumise täielikule puudumisele lähedases olukorras võib kõnealune teisendamine andmevigu võimendada ja analüüsi segada (13). Tuleks silmas pidada, et probit-, logit- või Weibulli teisendusel põhinevad standardsed analüüsimeetodid on ette nähtud binaarsete tunnuste (nt suremus või elulemus) analüüsimiseks ning neid tuleb kasvukiiruse või saagise andmete analüüsimiseks kohandada. Konkreetsed meetodid ECx väärtuste leidmiseks pidevate andmete alusel on esitatud allikates 14, 15 ja 16.

61.

Kummagi uuritava muutuja puhul arvutatakse kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera põhjal ECx hinnangulised väärtused. Võimaluse korral tuleks määrata iga hinnangulise väärtuse usalduspiirid usaldusnivool 95 %. Mõjuandmete sobivust regressioonimudeliga tuleks hinnata graafiliselt või statistiliselt. Regressioonanalüüsi tegemisel tuleks kasutada mitte katserühmade andmete keskväärtusi, vaid igas üksikus paralleelkultuuris saadud väärtusi.

62.

Kui olemasolevad regressioonimudelid ja -meetodid ei ole katseandmete jaoks sobivad, võib EC50 hinnangulise väärtuse ja usalduspiiride leidmiseks kasutada ka lineaarset interpoleerimist koos andmete usaldusväärsuse iteratiivse kontrollimisega (bootstrapping) (17).

63.

Et teha kindlaks LOEC ja selle alusel ka NOEC, on vaja võrrelda katserühmade keskväärtusi dispersioonanalüüsi (ANOVA) meetoditega. Iga kontsentratsiooni puhul leitud keskväärtust võrreldakse seejärel kontrollrühmas saadud keskväärtusega, kasutades sobivat mitmese võrdluse või trenditesti meetodit. Selleks võib sobida Dunnetti või Williamsi test (18, 19, 20, 21). Tuleb hinnata, kas kehtib ANOVA eeldus, et hajuvus on homogeenne. Seda võib teha graafiku alusel või formaalse testi (22), näiteks Levene'i või Bartletti testi abil. Kui hajuvuse homogeensuse eeldus ei kehti, võib mõnikord homogeensuse saavutada andmete logaritmilise teisendamisega. Kui hajuvuse heterogeensus on väga suur ja seda ei saa teisendamisega korrigeerida, tuleks kaaluda mõne muu meetodi, näiteks muutujate sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere'i trenditesti kasutamist. Lisajuhised NOEC määramiseks on esitatud allikas 16.

64.

Uute teadussaavutuste põhjal on soovitatud loobuda NOEC mõistest ja asendada see regressiooni teel leitud hinnangulise näitajaga ECx. Kõnealuse lemmeldega tehtava katse jaoks ei ole sobivat x väärtust veel kindlaks määratud. Sobiv väärtuste vahemik näib olevat 10–20 % (olenevalt uuritavast muutujast) ning soovitatavalt tuleks esitada nii EC10 kui ka EC20.

Katseprotokoll

65.

Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.

 

Uuritav kemikaal:

füüsikaline iseloomustus ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, sealhulgas vees lahustuvuse piirkontsentratsioon;

kemikaali identifitseerimisandmed (nt CASi number) ja puhtus (lisandid).

 

Katseliik:

teaduslik nimetus, kloon (kui see on teada) ja päritolu.

 

Katsetingimused:

kasutatud katserežiim (staatiline, poolstaatiline või läbivoolurežiim);

katse alustamise kuupäev ja kestus;

katsesööde;

katseplaani kirjeldus: katsenõud ja nende katted, lahuste maht, kolooniate ja tallusjate võsude arv katsenõu kohta katse alguses;

kasutatud kontsentratsioonid (nominaalne ja asjakohane mõõdetud sisaldus) ja paralleelkultuuride arv kontsentratsiooni kohta;

põhi- ja katselahuste valmistamise meetodid, sh lahustite või dispergeerivate ainete kasutamise kirjeldus;

katsetemperatuur;

valgusallikas, valgustustihedus ja valguse ühtlus;

katse- ja kontrollsöötmete pH väärtused;

uuritava kemikaali kontsentratsioonid ning kasutatud analüüsimeetod ja asjakohased kvaliteedihindamise andmed (valideerimisuuringud, analüüsiandmete standardhälbed või usalduspiirid);

tallusjate võsude arvu ja muude mõõdetavate muutujate – kuivmassi, märgmassi või tallusjate võsude pindala – määramise meetodid;

kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist.

 

Tulemused:

töötlemata andmed: tallusjate võsude arv ja muude mõõdetavate muutujate väärtus igas uuritava kemikaaliga kultuuris ja kontrollkultuuris iga vaatluse ja analüüsi puhul;

iga mõõdetava muutuja keskväärtus ja standardhälve;

igale kontsentratsioonile vastav kasvukõver (soovitatakse koostada mõõdetava muutuja logaritmitud väärtuste põhjal, vt punkt 55);

tallusjate võsude arvu kahekordistumise aeg või kasvukiirus kontrollkultuuris;

uuritavate muutujate arvutatud väärtused igas uuritava kemikaaliga paralleelkultuuris ning paralleelkultuuride andmete keskväärtused ja variatsioonikordajad;

kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse graafik;

uuritavate muutujate kaudu määratud mürgisuse lõppnäitajad – nt EC50, EC10, EC20 – ja vastavad usaldusvahemikud; asjaomaste andmete olemasolu korral LOEC ja/või NOEC ning nende määramiseks kasutatud statistilised meetodid;

dispersioonanalüüsi (ANOVA) kasutamise korral mõju määr, mida on võimalik tuvastada (nt väikseim oluline erinevus);

katserühma mis tahes kultuuris täheldatud stimuleeriv mõju kasvule;

nähtavad fütotoksilisuse ilmingud ja tähelepanekud katselahuste kohta;

tulemuste arutelu, milles muu hulgas käsitletakse võimaliku käesolevast katsemeetodist kõrvalekaldumise mõju katsetulemustele.

KIRJANDUS

(1)

ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (uuesti kinnitatud 1998. aastal), lk 733–742. Väljaandes: Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. USA Materjalide Katsetamise Ühing, West Conshohocken, PA.

(2)

USA Keskkonnakaitseamet (1996). OPPTS 850.4400: Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp. (Avalik kavand.) EPA 712–C–96–156. 8 lk.

(3)

Association Française de Normalisation (AFNOR) (1996). XP T 90–337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 lk.

(4)

Swedish Standards Institute (SIS) (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) of Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 lk (rootsi keeles).

(5)

Environment Canada (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – 120 lk.

(6)

Environment Canada (1993). Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims, I., Whitehouse, P., ja Lacey, R. (1999). The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(9)

Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon. ISO/DIS 20079: Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge, C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. USA Keskkonnakaitseameti aruanne nr EPA–600/3–77 108, september 1977.

(11)

Lockhart, W. L., Billeck, B. N., ja Baron, C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia 118/119: 353–359.

(12)

Huebert, D. B., ja Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. Chem. 12: 481–483.

(13)

Christensen, E. R., ja Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Environ. Sci. Technol. 19: 713–718.

(14)

Nyholm, N., Sørensen, P. S., Kusk, K. O., ja Christensen, E. R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157–167.

(15)

Bruce, R. D., ja Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.

(16)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(17)

Norberg-King, T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. USA Keskkonnakaitseamet, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Am. Stat. Assoc. 50: 1096–1121.

(19)

Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(20)

Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.

(21)

Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.

(22)

Brain, P., ja Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Res. 29: 93–96.

1. liide

Mõisted

Käesoleva katsemeetodi puhul kasutatakse järgmisi mõisteid ja lühendeid.

Biomass – populatsiooni elusaine kuivmass. Kuna käesoleva meetodi puhul mõõdetakse tavaliselt biomassi asendusparameetreid, näiteks tallusjate võsude arvu või pindala, tähistatakse mõistega „biomass” ka kõnealuseid asendusparameetreid.

Kemikaal – aine või segu.

Kloroos – tallusja võsu koe kolletumine.

Kloon – organism või rakk, mis on tekkinud ühest organismist mittesugulise paljunemise tulemusena. Samast kloonist pärit isendid on seega geneetiliselt identsed.

Koloonia – üksteisega ühendatud tallusjate ema- ja tütarvõsude kogum (tavaliselt 2–4 võsu). Mõnikord nimetatakse kolooniat ka taimeks.

ECx – katsesöötmes lahustatud uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille puhul Lemna kasv pidurdub x % (nt 50 %) võrra kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul (kui kokkupuuteaeg erineb katse tavapärasest või täiskestusest, tuleb täpselt märkida selle kestus). Kasvukiiruse või saagise alusel arvutatava EC väärtuse üheselt arusaadavaks tähistamiseks kasutatakse kasvukiiruse puhul tähist „ErC” ja saagise puhul tähist „EyC”, mille järel märgitakse kasutatud mõõdetav muutuja, nt ErC (tallusjate võsude arv).

Läbivoolukatse – katse, mille käigus katselahus pidevalt vahetub.

Tallusjas võsu – lemle lehetaoline üksikosa. See on väikseim paljunemisvõimeline osis, st isend.

Puhetumine – tallusja võsu küürdumine või tursumine.

Kasv – mõõdetava muutuja (nt tallusjate võsude arv, kuivmass, märgmass, tallusjate võsude pindala) väärtuse suurenemine katse kestel.

Kasvukiirus (keskmine kasvu erikiirus)– biomassi logaritmiline suurenemine kokkupuuteperioodi jooksul.

Vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) – väikseim kasutatud kontsentratsioon, mille puhul kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul täheldatakse kemikaali statistiliselt olulist (p < 0,05) kasvu pidurdavat mõju võrdluses kontrolliga. Kemikaal peab kõikidel kõnealusest kontsentratsioonist suurematel kontsentratsioonidel avaldama vähemalt sama tugevat kahjulikku mõju kui kõnealusel kontsentratsioonil avalduv kahjulik mõju. Kui nimetatud kahte tingimust ei ole võimalik täita, tuleb lisada ammendav selgitus, kuidas kõnealune kontsentratsioon LOEC (ja sellest lähtuvalt ka NOEC) on valitud.

Mõõdetav muutuja – mis tahes liiki muutuja, mida mõõdetakse katse lõppnäitaja väljendamiseks ühe või mitme eri uuritava muutuja kaudu. Käesoleva meetodi puhul on mõõdetavad muutujad tallusjate võsude arv, tallusjate võsude pindala, märgmass ja kuivmass.

Monokultuur – ühe liigi taimede kultuur.

Nekroos – protsess, mille tagajärjel tekib tallusja võsu surnud (st valge või hügrofaanne) kude.

Täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) – kontsentratsioon, mis on kasutatud kontsentratsioonide jadas vahetult allpool LOEC väärtust.

Fenotüüp – organismi vaadeldavate tunnuste kogum, mis on määratud organismi geenide ja keskkonna vastasmõjuga.

Uuritav muutuja – mürgisuse hindamiseks kasutatav muutuja, mis on tuletatud biomassi kirjeldava mis tahes mõõdetava muutuja põhjal vastavalt asjakohasele arvutusmeetodile. Käesoleva katsemeetodi puhul on uuritavad muutujad kasvukiirus ja saagis, mis tuletatakse sellistest mõõdetavatest muutujatest nagu tallusjate võsude arv või pindala, märgmass või kuivmass.

Poolstaatiline (lahusevahetusega) katse – katse, mille käigus katselahus teatava ajavahemiku järel perioodiliselt välja vahetatakse.

Staatiline katse – katse, mille käigus katselahust ei uuendata.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

Katse lõppnäitaja – katse eesmärgile vastav üldine näitaja, mis muutub uuritava kemikaali mõjul kontrollrühma asjaomase näitajaga võrreldes. Käesoleva katsemeetodi puhul on katse lõppnäitaja kasvu pidurdumine, mida võib väljendada ühel või mitmel mõõdetaval muutujal põhinevate uuritavate muutujate abil.

Katsesööde – täielik sünteetiline kasvukeskkond, mille pinnal katsetaimi kasvatatakse uuritava kemikaaliga kokkupuutumise ajal. Tavaliselt lahustatakse uuritav kemikaal katsesöötmes.

Saagis – kokkupuuteperioodi lõpus ja alguses määratud mõõdetava muutuja väärtuste vahe, mis väljendab biomassi suurenemist katse vältel.

2. liide

Lemleliikide kirjeldus

Veetaimed üldnimetusega lemled (Lemna spp.) kuuluvad lemleliste (Lemnaceae) sugukonda, mis hõlmab paljusid ülemaailmse levikuga liike neljast perekonnast. Nende morfoloogilisi erinevusi ja taksonoomiat on ammendavalt kirjeldatud (1, 2). Mürgisuse hindamise katsetes kasutatakse tavaliselt parasvöötmele iseloomulikke liike Lemna gibba ja Lemna minor. Mõlemal liigil on veepinnal või vees ujuv litrikujuline vars (tallusjas võsu) ja iga tallusja võsu alakülje keskkohale kinnitub väga peenike juur. Lemled õitsevad harva ja paljunevad peamiselt vegetatiivselt uute tallusjate võsude moodustamise teel (3). Noored taimed on vanemate taimedega võrreldes heledamad, lühema juurega ja koosnevad kahest või kolmest eri suurusega tallusjast võsust. Tänu lemle väiksusele, lihtsale ehitusele, mittesugulisele paljunemisele ja lühikesele generatsiooniajale sobivad selle perekonna taimed väga hästi laboratoorseteks katseteks (4, 5).

Kuna tundlikkus uuritava kemikaali suhtes on tõenäoliselt liigiti erinev, saab tundlikkust eri kemikaalide suhtes võrrelda ainult ühe liigi piires.

Näited lemleliikide kasutamise kohta katsetes: viited liigiti

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Filosoofialitsensiaadi väitekiri 1996:2. Stockholmi Ülikooli süsteemiökoloogia instituut.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. Phys. Chem. 29: 935–941.

 

Lemna minor : USA Keskkonnakaitseamet (1996). OPPTS 850.4400: Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp. (Avalik kavand.) EPA 712–C–96–156. 8 lk.

Association Française de Normalisation (AFNOR) (1996). XP T 90–337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 lk.

Swedish Standards Institute (SIS) (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) of Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 lk (rootsi keeles).

 

Lemna gibba : ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (uuesti kinnitatud 1998. aastal), lk 733–742.

USA Keskkonnakaitseamet (1996). OPPTS 850.4400: Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp. (Avalik kavand.) EPA 712–C–96–156. 8 lk.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., ja Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Con. Tox. 10: 1959–1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R., et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotox. Environ. Safe. 5: 87–96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., ja Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. Chem. 12: 481–483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., ja Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh. Int. Ver. Limnol. 19: 2102–2111.

Lemleliikide kollektsioonid

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Kanada, M5S 3 B2

Tel: +1 416 978 3641

Faks: +1 416 978 5878

E-post: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695–8002

USA

Tel: +1 919 515 7572

astomp@unity.ncsu.edu

Department of Applied Environmental Science (ITM), Stockholm University

SE-106 91

STOCKHOLM

ROOTSI

Tel: +46 8 674 7240

Faks: +46 8 674 7636

Umweltbundesamt (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berliin

Saksamaa

E-post: lemna@uba.de

KIRJANDUS

(1)

Hillman, W. S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. Bot. Rev. 27: 221–287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). 2. kd. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Šveits.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environ. Pollut. B 11: 1–14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ. Res. 52: 7–22.

3. liide

Tüvikultuuri säilitamine

Tüvikultuure võib säilitada pikemat aega madalal temperatuuril (4–10 °C), ilma et neid oleks vaja uuendada. Lemle tüvikultuuride sööde võib olla sama, mida kasutatakse katsetes, kuid võib kasutada ka muid toitainerikkaid söötmeid.

Teatav arv noori helerohelisi taimi viiakse kindla ajavahemiku järel aseptiliselt üle uude värske söötmega kultiveerimisnõusse. Subkultuuride inokuleerimise vaheaeg võib käesolevas liites soovitatud madala temperatuuri korral olla kuni kolm kuud.

Tuleks kasutada keemiliselt puhtaid (happega pestud) steriilseid klaasist kultiveerimisnõusid ja aseptilisi käitlemismeetodeid. Tüvikultuuri saastumisel näiteks vetikate või seentega tuleb võtta meetmed saastavate organismide kõrvaldamiseks. Vetikate ja enamiku muude saastavate organismide puhul võib selleks kasutada pindsteriliseerimist. Saastunud taimsest materjalist võetakse proov ja lõigatakse ära taimede juured. Pärast seda loksutatakse taimset materjali tugevalt puhtas vees ja asetatakse 30 sekundiks kuni 5 minutiks 0,5-mahuprotsendilisse naatriumhüpokloriti lahusesse. Seejärel loputatakse taimset materjali steriilse veega ja viiakse see mitmes osas üle värske söötmega kultiveerimisnõudesse. Sellise töötlemise tagajärjel surevad paljud tallusjad võsud, eriti kui töötlemisaeg on pikem, kuid mõni ellujäänud tallusjas võsu on tavaliselt saastavatest organismidest vaba. Selliseid tallusjaid võsusid saab kasutada uute kultuuride inokuleerimiseks.

4. liide

Söötmed

Liikide L. minor ja L. gibba jaoks soovitatakse kasutada eri söötmeid. Liigi L. minor puhul soovitatakse kasutada Rootsi Standardiinstituudi (SIS) söödet modifitseeritud kujul, samas kui liigi L. gibba puhul soovitatakse kasutada söödet 20X-AAP. Allpool on esitatud kummagi söötme koostis. Nende söötmete valmistamisel tuleks kasutada analüütilise või reaktiivi puhtusastmega kemikaale ja deioniseeritud vett.

Rootsi Standardiinstituudi (SIS) lemlesööde

Põhilahused I–V steriliseeritakse autoklaavimise (120 °C, 15 minutit) või membraanfiltrimise (poori läbimõõt umbes 0,2 μm) teel.

VI põhilahus ja vajaduse korral valmistatav VII põhilahus steriliseeritakse membraanfiltrimise teel; neid lahuseid ei tohiks autoklaavida.

Steriilseid põhilahuseid tuleks hoida jahedas ja valguse eest kaitstult. Põhilahused I–V tuleks kõrvaldada kuus kuud pärast valmistamist; VI põhilahuse ja vajaduse korral valmistatava VII põhilahuse säilivusaeg on üks kuu.

Põhilahuse nr

Aine

Sisaldus põhilahuses

(g/l)

Sisaldus valmissöötmes

(mg/l)

Valmissööde

 

 

 

 

Element

Sisaldus

(mg/l)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,3

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2EDTA · 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (puhver)

490

490

Ühe liitri SISi söötme saamiseks lisatakse 900 ml deioniseeritud veele järgmised komponendid:

10 ml I põhilahust,

5 ml II põhilahust,

5 ml III põhilahust,

5 ml IV põhilahust,

1 ml V põhilahust,

5 ml VI põhilahust,

1 ml VII põhilahust (vajaduse korral).

Märkus:Täiendav VII põhilahus (MOPSi puhverlahus) võib olla vajalik teatavate uuritavate kemikaalide puhul (vt punkt 11).

Söötme pH reguleeritakse 0,1 või 1 M HCl või NaOH lisamisega väärtusele 6,5 ± 0,2 ja lahuse ruumala viiakse deioniseeritud veega ühe liitrini.

Sööde 20X-AAP

Põhilahuste valmistamiseks kasutatakse steriilset destilleeritud või deioniseeritud vett.

Steriilseid põhilahuseid tuleks hoida jahedas ja valguse eest kaitstult. Nendes tingimustes on põhilahuste säilivusaeg vähemalt 6–8 nädalat.

Söötme 20X-AAP viie toitainete põhilahuse (A1, A2, A3, B ja C) valmistamiseks kasutatakse reaktiivi puhtusastmega kemikaale. Söötme valmistamiseks lisatakse umbes 850 ml deioniseeritud veele 20 ml iga toitainete põhilahust. Söötme pH reguleeritakse 0,1 või 1 M HCl või NaOH lisamisega väärtusele 7,5 ± 0,1 ja lahuse ruumala viiakse deioniseeritud veega ühe liitrini. Seejärel filtritakse sööde läbi umbes 0,2 μm suuruste pooridega membraanfiltri steriilsesse nõusse.

Katses kasutamiseks ette nähtud sööde tehakse valmis 1–2 päeva enne kasutamist, et pH saaks stabiliseeruda. Enne kasutamist kontrollitakse söötme pH-d ja reguleeritakse seda vajaduse korral uuesti 0,1 või 1 M NaOH või HCl lisamisega, nagu on kirjeldatud eespool.

Põhilahuse nr

Aine

Sisaldus põhilahuses

(g/l) (7)

Sisaldus valmissöötmes

(mg/l) (7)

Valmissööde

 

 

 

 

Element

Sisaldus

(mg/l) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na; N

190; 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2O

1,4

30

K; P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7, μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,4 μg/l

Cu

0,80 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na; C

220; 43

Steinbergi sööde (vastavalt standardile ISO 20079)

Koostisainete sisaldus ja põhilahused

Standardi ISO 20079 puhul kasutatakse modifitseeritud Steinbergi söödet üksnes Lemna minor'i jaoks (kuna selle standardi puhul on lubatud kasutada ainult Lemna minor'it), kuid katsetest ilmneb, et selle söötmega võib saada häid tulemusi ka Lemna gibba puhul.

Söötme valmistamisel tuleks kasutada analüütilise või reaktiivi puhtusastmega kemikaale ja deioniseeritud vett.

Söötme valmistamiseks kasutatakse põhilahuseid või 10 korda kontsentreeritumat söödet (see on suurim kontsentratsioon, mille puhul sadenemist veel ei toimu).

Tabel 1.

Stabiliseeritud pH-ga Steinbergi sööde (modifitseeritud Altenburgeri järgi).

Koostisaine

Sööde

Makrotoitained

Molekulmass

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Makrotoitained

Molekulmass

mg/l

mmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

Na2EDTA · 2H2O

372,24

1 500,00

4,03


Tabel 2.

Põhilahused (makrotoitained).

1.

Makrotoitained (50 korda kontsentreeritumad)

g/l

Põhilahus 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Põhilahus 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Põhilahus 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Tabel 3.

Põhilahused (mikrotoitained).

2.

Mikrotoitained (1 000 korda kontsentreeritumad)

mg/l

Põhilahus 4:

H3BO3

120,0

Põhilahus 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Põhilahus 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Põhilahus 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Põhilahus 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

Na2EDTA · 2H2O

1 500,00

Põhilahused 2 ja 3 võib omavahel kokku segada, samuti võib omavahel kokku segada põhilahused 4–7 (võttes arvesse vajalikke kontsentratsioone).

Säilivusaja pikendamiseks autoklaavitakse põhilahused 121 °C juures 20 minuti jooksul või steriliseeritakse filtrimise teel (0,2 μm). Põhilahus 8 soovitatakse tungivalt steriliseerida filtrimise teel (0,2 μm).

Vajaliku lõppkontsentratsiooniga modifitseeritud Steinbergi söötme valmistamine

Umbes 900 ml deioniseeritud veele lisatakse sadenemist ära hoides 20 ml iga põhilahust 1, 2 ja 3 (vt tabel 2).

Lisatakse 1,0 ml iga põhilahust 4, 5, 6, 7 ja 8 (vt tabel 3).

Söötme pH peaks olema 5,5 ± 0,2 (pH reguleerimiseks lisatakse väikseim vajalik kogus NaOH või HCl lahust).

Lahuse ruumala viiakse veega 1 000 milliliitrini.

Kui põhilahused on steriilsed ja kasutatakse nõuetekohast vett, ei ole söödet vaja täiendavalt steriliseerida. Valmissöötme steriliseerimise korral lisatakse põhilahus 8 pärast autoklaavimist (20 minutit temperatuuril 121 °C).

Pikemaajaliseks säilitamiseks ette nähtud 10 korda kontsentreerituma modifitseeritud Steinbergi söötme valmistamine

Umbes 30 ml veele lisatakse sadenemist ära hoides 20 ml iga põhilahust 1, 2 ja 3 (vt tabel 2).

Lisatakse 1,0 ml iga põhilahust 4, 5, 6, 7 ja 8 (vt tabel 3). Lahuse ruumala viiakse veega 100 milliliitrini.

Kui põhilahused on steriilsed ja kasutatakse nõuetekohast vett, ei ole söödet vaja täiendavalt steriliseerida. Valmissöötme steriliseerimise korral lisatakse põhilahus 8 pärast autoklaavimist (20 minutit temperatuuril 121 °C).

Söötme pH peaks lõppkontsentratsiooni juures olema 5,5 ± 0,2.

6)

Lisatakse järgmised peatükid C.31–C.46:

C.31.   KATSE MAISMAATAIMEDEGA: TÄRKAMINE JA SEEMIKU KASV

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 208 (2006). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut ja kaaluda nende kasutatavust regulatiivsete vajaduste rahuldamiseks. Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi abil hinnatakse kemikaalide võimalikku mõju seemikute tärkamisele ja kasvule. Meetod ei hõlma kroonilist mõju ega mõju paljunemisvõimele (st seemnete valmimisele, õitsemisele, viljade küpsemisele). Et tagada sobiva katsemeetodi kasutamine, tuleb arvesse võtta uuritava kemikaali omadusi ja kokkupuutetingimusi (näiteks tuleks metallide/metalliühendite puhul arvesse võtta nendega seotud vastasioonide ja pH mõju) (1). Käesolev katsemeetod ei hõlma taimede kokkupuudet kemikaaliaurudega. Meetod on kasutatav üldotstarbeliste kemikaalide, biotsiidide ja taimekaitsevahendite (pestitsiidide) mõju hindamiseks. See on välja töötatud olemasolevate meetodite põhjal (2, 3, 4, 5, 6, 7). Samuti võeti arvesse taimedega tehtavaid katseid käsitlevaid muid allikaid (8, 9, 10). Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.

KATSE PÕHIMÕTE

2.

Katsega hinnatakse kõrgemate taimede seemikute tärkamisele ja varajasele kasvule avalduvat mõju kokkupuutel mullas (või muus sobiva koostisega pinnases) esineva uuritava kemikaaliga. Seemned viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga töödeldud pinnasega ja neile avalduvat mõju hinnatakse tavaliselt 14–21 päeva jooksul pärast 50 % seemikute tärkamist kontrollrühmas. Katses mõõdetavad näitajad on silmaga hinnatav tärkamine, võrsete kuivmass (või märgmass) ja teatud juhtudel võrsete kõrgus, samuti silmaga hinnatav kahjulik mõju taime eri osadele. Neid mõõtmistulemusi ja vaatlusi võrreldakse kemikaaliga mitte kokku puutunud kontrolltaimede vastavate näitajatega.

3.

Olenevalt eeldatavast kokkupuuteviisist viiakse uuritav kemikaal mulda (või kunstlikku pinnasesse) või töödeldakse sellega mullapinda, vastavalt sellele, kumb kemikaaliga kokkupuutumise viis peegeldab võimalikku tegelikku olukorda. Mulda viimise korral töödeldakse kogu mulda korraga. Pärast töötlemist jaotatakse muld pottidesse ja seejärel pannakse asjaomase taimeliigi seemned mulda. Kui kemikaaliga töödeldakse mullapinda, tehakse seda pottides oleva mullaga pärast seemnete muldapanekut. Seejärel tagatakse katseüksustele (kontrollid ja töödeldud muld koos seemnetega) sobivad tingimused seemnete idanemise ja taimede kasvu võimaldamiseks.

4.

Katse eesmärgist sõltuvalt võib selle läbi viia koguse ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera saamiseks või piirsisalduskatsena, milles kasutatakse ühte kindlat kontsentratsiooni või koguselist määra. Kui ühel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhineva katse tulemustest nähtub, et mürgisus ületab teatud taseme (nt täheldatakse suuremat mõju kui x %), tehakse mürgisuse ülem- ja alampiiri määramiseks kogusevahemiku leidmise katse ja seejärel mitmel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse koguse ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera koostamiseks. Sobiva statistilise analüüsimeetodiga leitakse kõige tundlikuma(te) vaadeldava(te) näitaja(te) alusel efektiivne kontsentratsioon ECx või efektiivne kogus ERx (nt EC25, ER25, EC50, ER50). Kõnealuse katsega saab kindlaks teha ka täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni (NOEC) ja vähima täheldatavat toimet avaldava kontsentratsiooni (LOEC).

TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA

5.

Kemikaaliga kokkupuutumise eeldatava viisi kindlakstegemisel ja katseplaani koostamisel on kasu järgmisest teabest: struktuurivalem, puhtus, lahustuvus vees, lahustuvus orgaanilistes lahustites, jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool/vesi, aururõhk, sorbeeruvus pinnases, keemiline püsivus vees ja valguse käes ning biolagunduvus.

KATSE NÕUETEKOHASUS

6.

Katse loetakse nõuetekohaseks, kui kontrollrühmas on täidetud järgmised kriteeriumid:

seemikute tärkamine on vähemalt 70 %;

seemikutel ei täheldata nähtavaid fütotoksilisuse ilminguid (nt kloroos, nekroos, närbumine, varre või lehtede moondumine) ning varieeruvus taimede kasvus ja morfoloogias jääb konkreetsele liigile iseloomulikku vahemikku;

tärganud seemikute keskmine ellujäämise määr katse vältel on kontrollrühmas vähemalt 90 %;

keskkonnatingimused on konkreetse liigi puhul ühesugused ning kasvukeskkond sisaldab ühesuguses koguses ja samast allikast pärit mulda, kasvu toetavaid koostisosi või substraati.

VÕRDLUSKEMIKAAL

7.

Võrdluskemikaali abil võib korrapäraselt kontrollida, kas katsetulemused, konkreetsete katsetaimede reaktsioon ja katsetingimused on aja jooksul üldjoontes samaks jäänud. Teise võimalusena võib kasutada varasemaid kontrolltaimede biomassi- või kasvuandmeid, mis võimaldavad teha laboritevahelist kvaliteedikontrolli ja hinnata katsesüsteemi usaldusväärsust konkreetses laboris.

MEETODI KIRJELDUS

Looduslik muld ja kunstlik substraat

8.

Taimi võib kasvatada pottides, kasutades liivsavimulda või kerget või keskmist saviliivmulda, mis sisaldab kuni 1,5 % orgaanilist süsinikku (umbes 3 % orgaanilist ainet). Võib kasutada ka müügilolevat potimulda või sünteetilist mullasegu, mis sisaldab kuni 1,5 % orgaanilist süsinikku. Savimuldasid ei tohiks kasutada, kui on teada, et uuritava kemikaali afiinsus savi suhtes on suur. Põllumuld tuleks homogeensuse tagamiseks ja suurte osakeste kõrvaldamiseks selliselt läbi sõeluda, et osakeste suurus ei oleks üle 2 mm. Tuleks esitada kasutusvalmis mulla tüüp ja lõimis, orgaanilise süsiniku protsentuaalne sisaldus, pH ja soolasisaldust kajastav elektrijuhtivus. Muld tuleks klassifitseerida vastavalt standardsele klassifitseerimissüsteemile (11). Mulla patogeenide mõju vähendamiseks võib mulla pastöriseerida või seda kuumtöödelda.

9.

Loodusliku mulla puhul võib selle füüsikalis-keemiliste omaduste ja mikroobipopulatsioonide varieeruvuse tõttu olla tulemuste varieeruvus suurem ja nende tõlgendamine raskem. Need muutujad mõjutavad omakorda mulla niiskusmahtuvust, kemikaalide sidumise võimet, aereeritust ning toitainete ja mikroelementide sisaldust. Lisaks nimetatud füüsikalistele teguritele varieeruvad ka mulla keemilised omadused, näiteks pH ja redokspotentsiaal, mis võivad mõjutada uuritava kemikaali biokättesaadavust (12, 13, 14).

10.

Taimekaitsevahendite mõju hindamisel ei kasutata tavaliselt kunstlikke substraate, kuid neist võib olla kasu üldotstarbeliste kemikaalide mõju hindamisel või juhul, kui soovitakse minimeerida loodusliku mulla varieeruvust ja parandada katsetulemuste võrreldavust. Kasutatavad substraadid peaksid koosnema inertsest materjalist, mille puhul vastasmõju uuritava kemikaali, kasutatava lahusti või mõlemaga on minimaalne. On leitud, et sobivad inertsed materjalid, mis absorbeerivad uuritavat kemikaali minimaalselt ja mille puhul on tagatud kemikaali maksimaalne kättesaadavus seemikule juurte kaudu, on happega pestud kvartsliiv, mineraalvill ja klaashelmed (nt läbimõõduga 0,35–0,85 mm). Sobimatud substraadid on näiteks vermikuliit, perliit ja muud tugevalt absorbeerivad materjalid. Tuleks tagada taimekasvu soodustavate toitainete olemasolu, et taimedel ei tekiks toitainevaegusest tingitud stressi, ning võimaluse korral tuleks selle hindamiseks teha kontrolltaimedele keemiline analüüs või neid visuaalselt hinnata.

Katseliigi valimise kriteeriumid

11.

Valitavad liigid peaksid esindama piisavalt laia spektrit, näiteks lähtuvalt nende taksonoomilisest kuuluvusest taimeriigis, nende levikust, arvukusest, elutsükliga seotud liigispetsiifilistest omadustest ja looduslikust levialast, et oleks võimalik vaadelda rida eri reaktsioone uuritavale kemikaalile (8, 10, 16, 17, 18, 19, 20). Võimaliku katseliigi valimisel tuleks arvesse võtta järgmisi kriteeriume:

asjaomase liigi seemned on ühetaolised ja usaldusväärsest standardsest seemnepangast hõlpsalt kättesaadavad ning nende puhul on tagatud järjepidev, kindel ja ühtlane seemnete idanemine ja seemikute ühetaoline kasv;

asjaomased taimed sobivad laborikatsetes kasutamiseks ning nendega saadavad tulemused on usaldusväärsed ja nii ühes uurimislaboris kui ka eri laborites reprodutseeritavad;

katseliigi tundlikkus peaks vastama keskkonnas kemikaaliga kokku puutuvate taimede puhul täheldatavale tundlikkusele;

asjaomaseid taimi on teataval määral kasutatud varasemates mürgisuse hindamise katsetes ja nende kasutamisel näiteks herbitsiididega tehtavates biokatsetes, raskmetallide mõju või soolsusest või mineraalainetest tingitud stressi hindamise katsetes või allelopaatiauuringutes on täheldatud tundlikkust paljude stressiallikate suhtes;

käesoleva katsemeetodi puhul kasutatavad kasvutingimused on asjaomastele taimedele sobivad;

asjaomased taimed vastavad katse nõuetekohasuse kriteeriumidele.

Mõned varem kõige sagedamini kasutatud katseliigid on loetletud 2. liites ja võimalikud põllumajanduskultuuride hulka mittekuuluvad liigid 3. liites.

12.

Katses kasutatavate liikide arv sõltub asjakohastest õiguslikest nõuetest ja seepärast seda käesolevas katsemeetodis ei määratleta.

Uuritava kemikaaliga töötlemine

13.

Kemikaaliga töötlemiseks tuleks kasutada sobivat kandeainet (nt vesi, atsetoon, etanool, polüetüleenglükool, kummiaraabik, liiv). Katses võib kasutada ka segusid (kindlaksmääratud koostisega tooted või valmistised), mis sisaldavad toimeaineid ja eri abiaineid.

Kemikaali viimine mulda või kunstlikku substraati

14.

Vees lahustuvad või vees suspensiooni moodustavad kemikaalid võib lisada veele ja seejärel segada saadud lahuse sobiva segamisseadme abil mullaga. Sellist tüüpi katse võib olla sobiv juhul, kui kokkupuude kemikaaliga toimub mulla või mullapoorides oleva vee kaudu ja soovitakse hinnata kemikaali omastamist juurte kaudu. Uuritava kemikaali lisamisel ei tohiks vedeliku kogus ületada mulla veemahutavust. Lisatav veekogus peaks olema iga katses kasutatava kontsentratsiooni puhul sama ning piiratud, et hoida ära mullaosakeste kokkukleepumist.

15.

Vees raskesti lahustuvad kemikaalid tuleks lahustada sobivas lenduvas lahustis (nt atsetoon või etanool) ja segada liivaga. Seejärel saab lahusti liivast õhujoa abil kõrvaldada, segades liiva samal ajal pidevalt. Töödeldud liiv segatakse katses kasutatava mullaga. Täiendava kontrollina kasutatakse mulda, millele lisatakse üksnes lahustiga töödeldud liiva. Täiendava kontrolli ja iga kasutatava kontsentratsiooni puhul lisatakse ühesugune kogus liiva, mis on lahustiga segatud ja millest lahusti on kõrvaldatud. Kui uuritav tahke kemikaal on lahustumatu, segatakse see sobiva segamisseadme abil kuiva mullaga. Seejärel viiakse muld pottidesse ja sellesse külvatakse viivitamata seemned.

16.

Kui mulla asemel kasutatakse kunstlikku substraati, võib vees lahustuva kemikaali lahustada vahetult enne katse algust toitainelahuses. Kui kemikaal on vees lahustumatu, kuid seda on võimalik lahusti abil vees suspendeerida, tuleks see lisada toitainelahusesse koos lahustiga. Vees lahustumatu kemikaal, mille jaoks ei ole mittemürgist vees lahustuvat lahustit, tuleks lahustada sobivas lenduvas lahustis. Lahus segatakse liiva või klaashelmestega, segu pannakse vaakumpöördaurustisse, lahustil lastakse aurustuda ning selle tulemusena saadakse ühtlaselt kemikaaliga kaetud liiv või helmed. Enne pottide täitmist tuleks kemikaal teatava koguse kaalutud helmeste pinnalt sama orgaanilise lahustiga ekstraheerida ja seda analüüsida.

Mullapinna töötlemine

17.

Taimekaitsevahendite puhul kasutatakse uuritava kemikaaliga töötlemiseks sageli katselahuse pihustamist mullapinnale. Kõnealuste katsete tegemiseks kasutatavad seadmed, sealhulgas uuritava kemikaali lahuse valmistamiseks ja mullapinnale kandmiseks kasutatavad seadmed, peaksid olema sellise ehituse ja töökindlusega, et nende abil saaks teha täpseid katseid, mille puhul oleks tagatud katvuse reprodutseeritavus. Katvus peaks olema kõikjal mullapinnal ühtlane. Tuleks hoolikalt jälgida, et kemikaal ei adsorbeeruks seadmetele (nt plasttorud, lipofiilsed kemikaalid või terasosad ja -detailid) ega reageeriks nendega. Uuritavat kemikaali pihustatakse mullapinnale viisil, millega jäljendatakse tüüpilist töötlemist pihustusseadme abil. Üldjuhul peaks pihustatavad kogused jääma põllumajanduses tavapäraselt kasutatavasse vahemikku ning asjaomased kogused (vee hulk jne) tuleks märkida katseprotokolli. Tuleks valida sellist tüüpi otsik, mille puhul mullapind saaks ühtlaselt kaetud. Lahusti või kandeaine kasutamise korral tuleks moodustada täiendav rühm kontrolltaimi, mille puhul lisatakse üksnes lahustit/kandeainet. Kindlaksmääratud koostisega taimekaitsevahendite puhul ei ole see vajalik.

Uuritava kemikaali sisalduse või koguselise määra kontrollimine

18.

Kasutatavaid kontsentratsioone või koguselisi määru tuleb asjakohase analüüsi teel kontrollida. Lahustuva kemikaali puhul võib kõikide katses kasutatavate kontsentratsioonide või koguseliste määrade kontrollimiseks analüüsida suurima kontsentratsiooniga katselahust ja dokumenteerida järgnevad lahjendused ning kasutada kemikaaliga töötlemiseks kaliibritud seadmeid (nt klaasist kaliibritud analüüsinõud, kaliibritud pihustusseadmed). Lahustumatu kemikaali puhul tuleb selle sisalduse tõendamiseks registreerida mullale lisatavad uuritava kemikaali kaalutud kogused. Kui on vaja tõendada homogeensust, võib olla vaja mulda analüüsida.

KATSE KÄIK

Katseplaan

19.

Sama taimeliigi seemned külvatakse pottidesse. Seemnete arv poti kohta sõltub liigist, poti suurusest ja katse kestusest. Taimede arv potis peaks olema selline, et katse vältel oleksid tagatud sobivad kasvutingimused ja taimi ei oleks liiga palju. Maksimaalne tihedus peaks olenevalt seemnete suurusest olema 3–10 seemet 100 cm2 kohta. Näiteks on taimede soovitatav tihedus 15-sentimeetrise läbimõõduga potis maisi, sojaoa, tomati, kurgi ja suhkrupeedi puhul 1–2 taime, rapsi ja herne puhul 3 taime ning sibula, nisu ja muude väikese seemnega taimede puhul 5–10 taime. Seemnete ja paralleelpottide arv (paralleelüksusena käsitatakse potti, seepärast ei ole samas potis kasvavad taimed vaadeldavad paralleelidena) peaks olema optimaalse statistilise analüüsi jaoks piisav (21). Tuleks tähele panna, et katseliikidel, mille puhul kasutatakse väiksemat arvu suuri seemneid poti (paralleelüksuse) kohta, on varieeruvus suurem kui katseliikidel, mille puhul on võimalik kasutada suuremat arvu väikseid seemneid poti kohta. Sellist varieeruvust saab minimeerida igasse potti võrdse arvu seemnete külvamisega.

20.

Et veenduda, et täheldatav mõju tuleneb üksnes kokkupuutest uuritava kemikaaliga või on üksnes sellega seotud, kasutatakse kontrollrühmi. Sobiv kontrollrühm peaks olema katserühmaga identne kõiges muus peale uuritava kemikaaliga kokkupuute. Kõik samas katses kasutatavad katsetaimed, sealhulgas kontrolltaimed, peaksid pärinema samast allikast. Ebavõrdse jaotuse ärahoidmiseks tuleb katse- ja kontrollpotid määrata juhuslikult.

21.

Tuleks hoiduda insektitsiidi või fungitsiidiga kaetud seemnete (st puhitud seemnete) kasutamisest. Mõni reguleeriv asutus lubab siiski kasutada teatud mittesüsteemseid kontaktfungitsiide (nt kaptaan, tiraam) (22). Kui muret teevad seemnetega levivad patogeenid, võib seemneid hoida lühikest aega lahjas, viieprotsendilises hüpokloriti lahuses ning seejärel neid voolava veega korralikult loputada ja need kuivatada. Töötlemine mõne muu taimekaitsevahendiga ei ole lubatud.

Katsetingimused

22.

Katsetingimused peaksid üldjoontes vastama tingimustele, mis on vajalikud katses kasutatavatesse liikidesse ja sortidesse kuuluvate taimede tavapäraseks kasvuks (katsetingimuste näited on esitatud 4. liites). Tärkavaid taimi tuleks kasvatada kontrollitava keskkonnaga kambris, fütotronis või kasvuhoones kooskõlas hea aiandustavaga. Taimekasvatuseks ette nähtud ruumi kasutamisel hõlmab see tava harilikult temperatuuri, õhuniiskuse, süsihappegaasi sisalduse, valguse (valgustustiheduse, lainepikkuse, fotosünteesiks sobiva kiirguse), valgustusperioodi, kastmisviisi jmt reguleerimist ja piisavalt sagedast (nt igapäevast) registreerimist, et tagada hea taimekasv, mida hinnatakse asjaomase liigi kontrolltaimede kasvu alusel. Kasvuhoones tuleks temperatuuri reguleerida ventilatsiooni-, kütte- ja/või jahutussüsteemi abil. Kasvuhoones tehtava katse puhul soovitatakse üldjuhul kasutada järgmisi tingimusi:

temperatuur: 22 ± 10 °C;

õhuniiskus: 70 ± 25 %;

valgustusperiood: vähemalt 16 tundi;

valgustustihedus: 350 ± 50 μE m– 2 s– 1. Kui valgustustihedus lainepikkuste vahemikus 400–700 nm langeb alla 200 μE m– 2 s– 1, võib olla vaja kasutada lisavalgustust, välja arvatud teatud liikide puhul, mille valgusevajadus on väiksem.

Keskkonnatingimusi tuleks katse vältel jälgida ja need registreerida. Taimi tuleks kasvatada mittepoorsetes plast- või glasuuritud pottides, mille alla on paigutatud kandik või alustass. Potte võib korrapäraselt ümber paigutada, et minimeerida kasvukeskkonna tingimuste erinevustest tulenevat varieeruvust taimede kasvus. Potid peavad olema tavapärase kasvu võimaldamiseks piisava suurusega.

23.

Taimede elujõulisuse tagamiseks võib mullale lisada toitaineid. Lisatoitainetega varustamise vajaduse ja sageduse üle saab otsustada kontrolltaimede vaatlemise põhjal. Soovitatakse kasutada katsenõude altkastmist (nt klaaskiudnööri abil). Alguses võib siiski kasutada ülaltkastmist, et aidata kaasa seemnete idanemisele ja hõlbustada mullapinna töötlemise puhul kemikaali kandumist mulda.

24.

Konkreetsed kasvutingimused peaksid olema katses kasutatava liigi ja uuritava kemikaali jaoks sobivad. Kontrolltaimi ja kemikaaliga kokku puutuvaid taimi tuleks kasvatada samades keskkonnatingimustes, kuid tuleks võtta asjakohased meetmed, et takistada uuritava kemikaali (nt lenduva kemikaali) ülekandumist ühest katserühmast teise ja katserühmast kontrollrühma.

Ühel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse

25.

Ühel kemikaali kontsentratsioonil või koguselisel määral põhineva katse (piirsisalduskatse) jaoks sobiva kontsentratsiooni või koguselise määra kindlaksmääramisel tuleb arvesse võtta mitut tegurit. Üldotstarbeliste kemikaalide puhul hõlmab see kemikaali füüsikalis-keemilisi omadusi. Taimekaitsevahendite puhul tuleb arvesse võtta uuritava kemikaali füüsikalis-keemilisi omadusi ja kasutusrežiimi, selle maksimaalset kontsentratsiooni või töötlemisel kasutatavat kogust, töötlemiskordade arvu hooaja kohta ja/või kemikaali püsivust. Et teha kindlaks, kas üldotstarbeline kemikaal on fütotoksiline, võib olla asjakohane teha katse maksimaalsel sisaldusel 1 000 mg kuiva mulla kilogrammi kohta.

Kogusevahemiku leidmise katse

26.

Vajaduse korral võib teha kogusevahemiku leidmise katse, et leida lõplikus koguse ja mõju vahelise sõltuvuse uuringus kasutamiseks sobivad kontsentratsioonid või koguselised määrad. Kogusevahemiku leidmise katses kasutatavad kontsentratsioonid või koguselised määrad tuleks valida suure intervalliga (nt 0,1, 1,0, 10, 100 ja 1 000 mg kuiva mulla kilogrammi kohta). Taimekaitsevahendite puhul võib kontsentratsioonide või koguseliste määrade valimisel lähtuda soovitatavast või maksimaalsest kontsentratsioonist või töötlemisel kasutatavast kogusest ning kasutada sellest näiteks 1/100, 1/10 ja 1/1.

Mitmel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse

27.

Mitmel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhineva katse eesmärk on teha kindlaks koguse ja mõju vaheline sõltuvus ja määrata vastavalt reguleerivate asutuste nõuetele ECx või ERx väärtus taimede tärkamise, biomassi ja/või visuaalselt hinnatava mõju puhul, kasutades võrdlusalusena kemikaaliga mitte kokku puutuvaid kontrolltaimi.

28.

Kontsentratsioonide või koguste arv ja intervall peaks olema piisav, et võimaldada usaldusväärselt hinnata koguse ja mõju vahelist sõltuvust, koostada regressioonivõrrand ja arvutada hinnanguline ECx või ERx väärtus. Valitud kontsentratsioonid või koguselised määrad peaksid hõlmama määratavaid ECx või ERx väärtusi. Kui on näiteks vaja leida EC50 väärtus, on soovitatav kasutada katses koguseid, mille puhul mõju ulatus on 20–80 %. Selle saavutamiseks soovitatakse kasutada lisaks kemikaaliga töötlemata kontrollile vähemalt viit kontsentratsiooni või koguselist määra geomeetrilises jadas, mille tegur ei ole suurem kui kolm. Paralleelpottide arv igas katse- ja kontrollrühmas peaks olema vähemalt neli ja seemnete üldarv vähemalt 20. Teatud taimede puhul, mille seemnete idanevuse määr on väike või mille kasv tavapäraselt varieerub, võib olla vaja kasutada katse statistilise usaldusväärsuse tõstmiseks suuremat arvu paralleelpotte. Kui katses kasutatakse suuremat arvu kontsentratsioone või koguselisi määru, võib paralleelpottide arvu vähendada. Kui soovitakse leida täheldatavat toimet mitteavaldavat kontsentratsiooni, võib olla vaja kasutada vajaliku statistilise usaldusväärsuse saavutamiseks suuremat arvu paralleelpotte (23).

Vaatlused

29.

Vaatlusperioodi vältel, st 14–21 päeva jooksul pärast 50 % kontrolltaimede (vajaduse korral ka lahustiga kokku puutuvate kontrolltaimede) tärkamist vaadeldakse taimi sageli (vähemalt kord nädalas ja võimaluse korral iga päev) ning jälgitakse tärkamist, visuaalselt hinnatavaid fütotoksilisuse ilminguid ja suremust. Katse lõpus tuleks registreerida tärganud taimede protsentuaalne osakaal ja ellujäänud taimede biomass, samuti silmaga nähtav kahjulik mõju taime eri osadele. See kahjulik mõju hõlmab tärganud seemikute ebanormaalset välimust, kasvu kängumist, kloroosi, värvusemuutusi, suremist ja mõju taimede arengule. Lõpliku biomassi mõõtmiseks võib kasutada ellujäänud taimede võrse lõplikku keskmist kuivmassi; selleks lõigatakse võrse mullapinna tasandilt ära ja kuivatatakse seda 60 °C juures, kuni selle kaal enam ei muutu. Teise võimalusena võib lõpliku biomassi määramiseks kasutada võrse märgmassi. Kui reguleerivad asutused seda nõuavad, võib mõõdetav näitaja olla ka võrse kõrgus. Vaadeldava toksilise mõju määramiseks tuleks kasutada ühtset silmaga nähtavate kahjustuste hindamise süsteemi. Näited kvalitatiivse ja kvantitatiivse visuaalse hindamise kohta on esitatud allikates 23 ja 24.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Statistiline analüüs

Ühel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse

30.

Iga taimeliigi kohta saadud andmete analüüsimiseks tuleks kasutada sobivat statistilist meetodit (21). Tuleks esitada katses kasutatud kontsentratsiooni või koguselise määra puhul täheldatava toime määr või teave selle kohta, et toime jääb allapoole teatavat määra (nt kontsentratsiooni või koguselise määra y puhul täheldatav mõju on < x %).

Mitmel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse

31.

Koostatakse koguse ja mõju vahelist sõltuvust väljendav regressioonivõrrand. Võib kasutada eri mudeleid: näiteks võib binaarse muutujana käsitletava tärkamise puhul sobida ECx või ERx (nt EC25, ER25, EC50, ER50) väärtuse ja asjaomaste usalduspiiride leidmiseks logit-, probit-, Weibulli, Spearmani-Kärberi või kohandatud Spearmani-Kärberi meetod. Seemikute kasvu (kaalu ja kõrguse) kui lõppnäitajana hinnatava pideva muutuja puhul võib ECx või ERx väärtuse ja vastavate usalduspiiride määramiseks kasutada sobivat regressioonanalüüsi (nt Bruce'i-Versteegi mittelineaarset regressiooni (25)). Võimaluse korral peaks R2 olema kõige tundlikuma liigi puhul alati 0,7 või suurem ja mõju ulatus katses kasutatavate kontsentratsioonide või koguseliste määrade juures hõlmama vahemikku 20–80 %. Kui soovitakse määrata täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon, tuleks eelistada suure usaldusväärsusega statistilisi mudeleid, mille valimisel tuleks lähtuda andmete jaotusest (21, 26).

Katseprotokoll

32.

Katseprotokollis tuleks esitada katsetulemused koos katsetingimuste üksikasjaliku kirjelduse, tulemusi käsitleva põhjaliku arutelu, andmeanalüüsi tulemuste ja nende põhjal tehtud järeldustega. Tuleks esitada tulemusi käsitlev kokkuvõtlik tabel ja lühikokkuvõte. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.

 

Uuritav kemikaal:

uuritava kemikaali identifitseerimisandmed ja asjakohased omadused (nt log Pow, lahustuvus vees, aururõhk ning võimaluse korral säilivus ja käitumine keskkonnas);

üksikasjad katselahuse valmistamise ja punkti 18 kohase kasutatavate kontsentratsioonide kontrollimise kohta.

 

Katseliik:

üksikasjalikud andmed katseorganismi kohta: liik/sort, sugukond, teaduslik nimetus ja tavanimetus, võimalikult üksikasjalik teave seemnete päritolu kohta (st tarnija nimi, idanemise protsentuaalne määr, seemnete suurusklass, partii number, seemnete kogumise aasta või kasvuperiood, idanemise hindamise kuupäev), elujõulisus jne;

katses kasutatud ühe- ja kaheiduleheliste liikide arv;

liikide valimise põhjendus;

seemnete hoiustamise, töötlemise ja säilitamise kirjeldus.

 

Katsetingimused:

katseruum (nt kasvukamber, fütotron või kasvuhoone);

katsesüsteemi kirjeldus (nt poti mõõtmed, poti materjal ja mulla kogus);

mulla omadused (mulla lõimis või tüüp: mullaosakeste jaotus ja liigitus, füüsikalised ja keemilised omadused, sealhulgas orgaanilise aine protsentuaalne sisaldus, orgaanilise süsiniku protsentuaalne sisaldus ja pH);

mulla/substraadi (nt muld, kunstlik pinnas, liiv jm) ettevalmistamine enne katset;

toitainete lisamise korral nende kirjeldus;

uuritava kemikaaliga töötlemine: töötlemismeetodi kirjeldus, seadmete, kokkupuutemäärade ja asjaomaste koguste, sealhulgas kemikaalisisalduse kontrollimise kirjeldus, kaliibrimismeetodi kirjeldus ja töötlemise ajal valitsenud keskkonnatingimuste kirjeldus;

kasvutingimused: valgustustihedus (nt fotosünteesiks sobiva kiirguse puhul), valgustusperiood, maksimaalne ja minimaalne temperatuur, kastmisrežiim ja -meetod, väetamine;

seemnete arv poti kohta, taimede arv kemikaali iga koguse puhul, paralleelpottide arv iga kokkupuutemäära puhul;

kontrollide tüüp ja arv (negatiivsed ja/või positiivsed kontrollid, vajaduse korral lahustiga kontrollid);

katse kestus.

 

Tulemused:

tabel, mis sisaldab kõiki lõppnäitajaid iga paralleelpoti, kasutatud kontsentratsiooni või koguselise määra ja liigi kohta;

tärganud taimede arv ja protsentuaalne määr võrreldes kontrollrühma näitajaga;

taimede mõõdetud biomassi (võrsete kuivmass või märgmass) protsentuaalne määr võrreldes kontrollrühma näitajaga;

kui mõõdeti võrsete kõrgust, siis selle protsentuaalne määr võrreldes kontrollrühma näitajaga;

uuritava kemikaali põhjustatud visuaalselt hinnatavate kahjustuste protsentuaalne määr võrreldes kontrollrühmaga ning selliste kahjustuste kvalitatiivne ja kvantitatiivne kirjeldus (kloroos, nekroos, närbumine, varre või lehtede moondumine, samuti sellise mõju puudumine);

kui visuaalselt hinnatavate kahjustuste puhul kasutatakse hindamisskaalat, siis sellise skaala kirjeldus;

ühel kogusel põhineva katse puhul tuleks märkida kahjustuste protsentuaalne määr;

ECx või ERx (nt EC50, ER50, EC25, ER25) väärtus ja asjaomased usalduspiirid. Regressioonanalüüsi tegemise korral esitatakse regressioonivõrrandiga seotud standardviga ja konkreetsete parameetrite (nt tõus, algordinaat) hinnangulise väärtuse standardviga;

täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (ja vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon), kui see on teada;

kasutatud statistiliste meetodite ja eelduste kirjeldus;

graafik eespool kirjeldatud andmete ning koguse ja mõju vahelise sõltuvuse kohta katses kasutatud liigi puhul.

Kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist ja kõik katse ajal täheldatavad ebatavalised ilmingud.

KIRJANDUS

(1)

Schrader, G., Metge, K., ja Bahadir, M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Appl. Soil Ecol. 7: 189–193.

(2)

Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1993). ISO 11269-1: Soil Quality – Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth.

(3)

Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1995). ISO 11269-2: Soil Quality – Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants.

(4)

USA Materjalide Katsetamise Ühing (ASTM) (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests.

(5)

USA Keskkonnakaitseamet (1982). FIFRA, 40CFR, osa 158.540. Alajaotis J, osad 122-1 ja 123-1.

(6)

USA Keskkonnakaitseamet (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:

850.4000: Background – Non-target Plant Testing;

850.4025: Target Area Phytotoxicity;

850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence);

850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test;

850.4225: Seedling Emergence, Tier II;

850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.

(7)

AFNOR X31-201 (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1 (1993). Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines.

(8)

Boutin, C., Freemark, K. E., ja Keddy, C. J. (1993). Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Technical Report Series No. 145. Canadian Wildlife Service (peakorter), Environment Canada, Hull, Québec, Kanada.

(9)

Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., ja Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 48.

(10)

Hale, B., Hall, J. C., Solomon, K., ja Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario, Kanada.

(11)

Mulla lõimise klassifitseerimine (USA põllumajandusministeeriumi ja ÜRO Toidu- ja Põllumajandusorganisatsiooni süsteemid): Weed Sci. 33, Suppl. 1 (1985) ja Soil Sci. Soc. Am. Proc. 26: 305 (1962).

(12)

Audus, L. J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. Väljaandes: Audus, L. J. (toim.), The Physiology and Biochemistry of Herbicides. London, New York, Academic Press, NY, 5. peatükk, lk 163–206.

(13)

Beall, M. L., Jr., ja Nash, R. G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil. J. Agro. 61: 571–575.

(14)

Beetsman, G. D., Kenney, D. R., ja Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties. J. Agro. 61: 247–250.

(15)

USA Toidu- ja Ravimiamet (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 lk, USA Toidu- ja Ravimiamet, Washington, DC.

(16)

McKelvey, R. A., Wright, J. P., Honegger, J. L., ja Warren, L. W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Manag. Sci. 58: 1161–1174.

(17)

Boutin, C., Elmegaard, N., ja Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology 13: 349–369.

(18)

Boutin, C., ja Rogers, C. A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology 9: 255–271.

(19)

Boutin, C., ja Harper, J. L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9: 155–271.

(20)

Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T. E., Batchelor, S. P., ja Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2532–2541.

(21)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(22)

Hatzios, K. K., ja Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1: 1–63.

(23)

Hamill, P. B., Marriage, P. B., ja Friesen, G. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Sci. 25: 386–389.

(24)

Frans, R. E., ja Talbert, R. E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. Väljaandes: Truelove, B. (toim.), Research Methods in Weed Science, 2. väljaanne. Southern Weed Science Society, Auburn, lk 15–23.

(25)

Bruce, R. D., ja Versteeg, D. J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1492.

(26)

Käesoleva lisa peatükk C.33 „Vihmausside (Eisenia fetida / Eisenia andrei) sigivuse katse”.

1. liide

Mõisted

Toimeaine – aine, millel on ettenähtud spetsiifiline bioloogiline mõju (nt putukatõrje, taimehaiguste tõrje või umbrohutõrje töödeldaval alal); tuntud ka kui tehnilise puhtusastmega toimeaine.

Kemikaal – aine või segu.

Taimekaitsevahend või pestitsiid – spetsiifilise bioloogilise mõjuga materjal, mida kasutatakse eesmärgiga kaitsta taimi kahjurite (nt seenhaigused, putukad ja konkureerivad taimed) eest.

ECx või ERx (vastavalt kontsentratsioon või kogus, mille puhul mõju ulatus on x %)– kontsentratsioon või kogus, mille juures katse lõppnäitajale avalduva ebasoodsa mõju ulatus on x % kontrollrühma asjaomase näitaja väärtusest (nt EC25/ER25 ja EC50/ER50 tähistavad kontsentratsiooni või koguselist määra, mille puhul seemikute tärkamise määr, võrsete kaal või ellujäänud taimede lõpparv väheneb või visuaalselt hinnatavate kahjustuste määr suureneb vastavalt 25 % ja 50 % võrra).

Tärkamine – koleoptiili või idulehe ilmumine mullapinnale.

Valmistis – asjaomast toimeainet sisaldav kaubanduslik valmistoode, tuntud ka kui lõppvalmistis (8) ja tüüpiline lõpptoode.

Vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) – uuritava kemikaali väikseim kontsentratsioon, mille juures täheldatakse teatavat mõju. Käesoleva katsemeetodi puhul täheldatakse sellisel kontsentratsioonil teatava kokkupuuteperioodi vältel kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju ning selline kontsentratsioon on suurem kui täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon.

Muud kui sihttaimed – taimed, mis paiknevad väljaspool sihttaimede ala. Taimekaitsevahendite puhul tähistatakse selle mõistega tavaliselt taimi, mis paiknevad väljaspool kemikaaliga töötlemise ala.

Täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) – uuritava kemikaali suurim kontsentratsioon, mille juures ei täheldata mingit mõju. Käesoleva katsemeetodi puhul ei täheldata sellisel kontsentratsioonil teatava kokkupuuteperioodi vältel kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju.

Fütotoksilisus – asjaomase kemikaali toimel ilmnevad kahjulikud kõrvalekalded taimede tavapärasest välimusest ja kasvust, mida mõõdetakse ja hinnatakse visuaalselt.

Paralleelüksus – kontrollrühma ja/või katserühma esindav katseüksus. Käesoleva katsemeetodi puhul on paralleelüksusena määratletud pott.

Visuaalne hindamine – silmaga nähtavate kahjustuste hindamine taimede väliskuju, elujõulisuse, väärarengute, kloroosi, nekroosi ja üldise välimuse põhjal võrdluses kontrolltaimedega.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

2. liide

Taimekatsetes varem kasutatud liikide loetelu

Sugukond

Liik

Tavanimetus

DICOTYLEDONAE

Apiaceae (Umbelliferae)

Daucus carota

Porgand

Asteraceae (Compositae)

Helianthus annuus

Päevalill

Asteraceae (Compositae)

Lactuca sativa

Aedsalat

Brassicaceae (Cruciferae)

Sinapis alba

Valge sinep

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica campestris var. chinensis

Hiina kapsas

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica napus

Raps

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica oleracea var. capitata

Peakapsas

Brassicaceae (Cruciferae)

Brassica rapa

Naeris

Brassicaceae (Cruciferae)

Lepidium sativum

Salatkress

Brassicaceae (Cruciferae)

Raphanus sativus

Redis

Chenopodiaceae

Beta vulgaris

Suhkrupeet

Cucurbitaceae

Cucumis sativus

Kurk

Fabaceae (Leguminosae)

Glycine max (G. soja)

Sojauba

Fabaceae (Leguminosae)

Phaseolus aureus

Munguba

Fabaceae (Leguminosae)

Phaseolus vulgaris

Põõsasuba, lattuba, harilik aeduba

Fabaceae (Leguminosae)

Pisum sativum

Hernes

Fabaceae (Leguminosae)

Trigonella foenum-graecum

Põld-lambalääts

Fabaceae (Leguminosae)

Lotus corniculatus

Harilik nõiahammas

Fabaceae (Leguminosae)

Trifolium pratense

Aasristik

Fabaceae (Leguminosae)

Vicia sativa

Vikk

Linaceae

Linum usitatissimum

Lina

Polygonaceae

Fagopyrum esculentum

Harilik tatar

Solanaceae

Solanum lycopersicon

Tomat

MONOCOTYLEDONAE

Liliaceae (Amarylladaceae)

Allium cepa

Harilik sibul

Poaceae (Gramineae)

Avena sativa

Harilik kaer

Poaceae (Gramineae)

Hordeum vulgare

Harilik oder

Poaceae (Gramineae)

Lolium perenne

Karjamaa-raihein

Poaceae (Gramineae)

Oryza sativa

Harilik riis

Poaceae (Gramineae)

Secale cereale

Harilik rukis

Poaceae (Gramineae)

Sorghum bicolor

Terasorgo, sudaani sorgo

Poaceae (Gramineae)

Triticum aestivum

Harilik nisu

Poaceae (Gramineae)

Zea mays

Harilik mais

3. liide

Põllumajanduskultuuride hulka mittekuuluvate võimalike liikide loetelu

Võimalike fütotoksilisuse hindamiseks sobivate liikide OECD loetelu

Märkus: allpool esitatud tabel sisaldab teavet 52 põllumajanduskultuuride hulka mittekuuluva liigi kohta (allikaviited on märgitud iga kande puhul sulgudes). Seemikute tärkamise määrad on esitatud avaldatud kirjanduse põhjal ja üksnes üldise ettekujutuse loomiseks. Konkreetsed katsetulemused võivad sõltuvalt seemnete päritolust ja muudest teguritest varieeruda.

SUGUKOND Liigi botaaniline nimetus

(eestikeelne tavanimetus)

Eluiga (9) ja elupaik

Seemne kaal

(mg)

Idanemiseks või kasvuks vajalik valgustusperiood (10)

Külvamissügavus

(mm) (11)

Idanemiseks vajalik aeg

(päeva) (12)

Eritöötlus (13)

Mürgisuse hindamise katse (14)

Seemnete tarnijad (15)

Muud allikaviited (16)

APIACEAE

Torilis japonica

(jaapani harjasputk)

Ü, K; häiritud kooslusega alad, hekid, karjamaad (16, 19)

1,7–1,9 (14, 19)

V = P (14)

0

(1, 19)

5 (50 %) (19)

Külmtöötlus (7, 14, 18, 19); küpsemine võib olla vajalik (19); pimedus pärsib idanemist (1, 19); eritöötluseta (5)

PÄRAST (5)

 

 

ASTERACEAE

Bellis perennis

(harilik kirikakar)

M;

rohumaad, haritavad põllud, rohukamar (16, 19)

0,09–0,17 (4, 19)

V = P (14)

0

(4)

3 (50 %) (19);

11 (100 %) (18)

Kiirgus ei mõjuta idanemist (18, 19); eritöötluseta (4, 14)

PÄRAST (4)

A, D, F

7

Centaurea cyanus

(rukkilill)

Ü;

põllud, teeperved, lagealad (16)

4,1–4,9 (4, 14)

V = P (14)

0–3 (2, 4, 14)

14–21 (100 %) (14)

Eritöötluseta (2, 4)

PÄRAST (2,4)

A, D, E, F

7

Centaurea nigra

(must jumikas)

M;

põllud, teeperved, lagealad (16, 19)

2,4–2,6 (14, 19)

V = P (14)

0 (19)

3 (50 %) (19);

4 (97 %) (18)

Küpsemine võib olla vajalik (18, 19); pimedus pärsib idanemist (19); eritöötluseta (5, 14, 26)

PÄRAST (5, 22, 26)

A

 

Inula helenium

(aedvaak)

M;

häiritud kooslusega niisked alad

(16)

1–1,3 (4, 14, 29)

 

0

(4, 29)

 

Eritöötluseta (4)

PÄRAST (4)

A, F

 

Leontodon hispidus

(kare seanupp)

M;

põllud, teeperved, häiritud kooslusega alad (16, 19)

0,85–1,2 (14, 19)

V = P (14)

0 (19)

4 (50 %) (19);

7 (80 %) (18)

Pimedus pärsib idanemist (17, 18, 19); eritöötluseta (5, 23)

PÄRAST (5, 22, 23)

 

 

Rudbeckia hirta

(karvane päevakübar)

K, M; häiritud kooslusega alad

(16)

0,3 (4, 14)

V = P (14)

0

(4, 33)

< 10 (100 %) (33)

Eritöötluseta

(4, 14, 33)

PÄRAST (4, 33)

C, D, E, F

 

Solidago canadensis

(kanada kuldvits)

M;

karjamaad, lagendikud (16)

0,06–0,08 (4, 14)

V = P (11)

0

(4)

14–21

(11)

Segatakse võrdse koguse liivaga ja hoitakse 24 tundi giberelliinhappe lahuses kontsentratsiooniga 500 ppm (11); eritöötluseta (4)

PÄRAST (4)

E, F

 

Xanthium pensylvanicum

(pensilvaania väärtakjas)

Ü;

põllud, lagealad (16)

25–61 (14, 29)

 

0 (1);

5 (29)

 

Pimedus võib idanemist pärssida (1); hoitakse 12 tundi soojas vees (29)

ENNE ja PÄRAST (31)

A

 

Xanthium spinosum

(astel-väärtakjas)

Ü;

lagealad (16)

200 (14)

V = P (14);

V > P (6)

10

(6)

 

Skarifitseerimine (14); eritöötluseta (6)

ENNE ja PÄRAST (6)

A

 

Xanthium strumarium

(kallas-väärtakjas)

Ü;

põllud, lagealad (16)

67,4 (14)

V = P (14)

10–20 (6, 21)

 

Eritöötluseta

(6, 14, 21)

ENNE ja PÄRAST (6, 21, 28, 31)

A

 

BRASSICACEAE

Cardamine pratensis

(aas-jürilill)

M;

põllud, teeperved, rohukamar (16, 19)

0,6 (14, 19)

V = P (14)

0 (19)

5 (50 %) (19);

15 (98 %) (18)

Pimedus pärsib idanemist (18, 19); eritöötluseta (5, 14, 22)

PÄRAST (5, 22)

F

 

CARYOPHYLLACEAE

Lychnis flos-cuculi

(harilik käokann)

M

(16)

0,21 (14)

V = P (14)

 

< 14 (100 %) (14, 25)

Küpsemine võib olla vajalik (18); eritöötluseta (5, 14, 15, 22–26)

PÄRAST (5, 15, 22–26)

F

 

CHENOPODIACEAE

Chenopodium album

(valge hanemalts)

Ü;

põlluservad, häiritud kooslusega alad (16, 19)

0,7–1,5 (14, 19, 34)

V = P (14)

0

(1, 19)

2 (50 %) (19)

Töötlemisviis sõltub seemnete värvusest (19); puhkeperiood kuivladustamisel (19); pimedus pärsib idanemist (1, 18, 19); külmtöötlus (18); eritöötluseta (14, 34)

ENNE ja PÄRAST (28, 31, 34)

A

32

CLUSIACEAE

Hypericum perforatum

(liht-naistepuna)

M;

põllud, haritavad maad, lagealad (16, 19)

0,1–0,23

(14, 19)

V = P

(14)

0

(1, 19)

3 (19);

11 (90 %) (18)

Pimedus pärsib idanemist (1, 18, 19);

eritöötluseta (5, 14, 15, 25, 27)

PÄRAST

(5, 15, 25, 27)

A, E, F

 

CONVOLVULACEAE

Ipomoea hederacea

(luuderohi-lehtertapp)

Ü;

teeperved, lagealad, viljapõllud (16)

28,2

(14)

V > P

(6, 10)

10–20

(6, 10, 21)

4 (100 %)

(10)

Kiirgus ei mõjuta idanemist (1);

eritöötluseta (6, 21)

ENNE ja PÄRAST

(6, 12, 21, 28)

A

 

CYPERACEAE

Cyperus rotundus

(visa lõikhein)

M;

haritavad maad, karjamaad, teeperved (16, 30)

0,2

(14)

V = P

(14)

0 (1);

10–20 (6, 10)

12 (91 %)

(10)

Pimedus pärsib idanemist (1);

eritöötluseta (6, 10, 14)

ENNE ja PÄRAST

(6, 28, 31)

B

7

FABACEAE

Lotus corniculatus

(harilik nõiahammas)

M;

rohualad, teeperved, lagealad (16, 19)

1–1,67

(14, 19)

V = P (14)

 

1 (50 %)

(19)