1.

Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse katse (Bovine Corneal Opacity and Permeability – BCOP) on in vitro-katsemeetod, mida võib teatavatel asjaoludel ja teatavate piirangutega kasutada, et klassifitseerida aineid ja segusid silma söövitavaks ja tugevasti ärritavaks (1), (2), (3). Käesoleva katsemeetodi puhul määratletakse tugevasti ärritava toimega aineks või seguks sellised, mis tekitavad küülikul pärast pealekandmist vähemalt 21 päeva püsiva silmakahjustuse. Katsemeetodit ei peeta küüliku silma in vivo-katse täieliku asendamise jaoks kõlblikuks; BCOP-meetodit soovitatakse kasutada astmelise katsetamise strateegia osana õigusliku klassifitseerimise ja märgistamise jaoks konkreetses kasutusvaldkonnas (4), (5). Uuritavad ained ja segud (6) võib klassifitseerida silma söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks ilma edasise katsetamiseta küülikutel. Negatiivse tulemuse andnud ainet on vaja katsetada küülikul, kasutades järjestikuste katsete strateegiat, mis on esitatud OECD katsesuunises 405 (7) (käesoleva lisa B.5 peatükk).

2.

Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada menetlusi, mida kasutatakse uuritava aine silma söövitava või tugevasti ärritava toime hindamiseks, tuginedes aine omadusele põhjustada veise isoleeritud sarvkesta hägustumist ja suurendada selle läbilaskvust. Toksilist mõju sarvkestale mõõdetakse: i) valguse läbilaskvuse vähenemise (hägususe tekke) ja ii) naatriumfluorestseiini läbilaskvuse suurenemise järgi. Uuritava aine klassifitseerimiseks silma ärritava toime järgi kasutatakse nn in vitro-ärritavuse hinnet (In Vitro Irritancy Score, IVIS), mille arvutamiseks kombineeritakse pärast uuritava ainega kokkupuudet toimunud sarvkesta hägustumise ja läbilaskvuse suurenemise hinnangud.

3.

BCOP-meetodiga on uuritud ka silmaärritajaid, mille tekitatud kahjustused paranevad vähem kui 21 päevaga, samuti aineid, mis silmi ei ärrita. Kuid sellistesse kategooriatesse kuuluvate ainete puhul ei ole BCOP-meetodi täpsust ja usaldusväärsust ametlikult hinnatud.

4.

Mõisted on esitatud 1. liites.

5.

Käesolev katsemeetod põhineb alternatiivmeetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomitee (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) BCOP-meetodi eeskirjal (8), mis töötati välja rahvusvahelise valideerimisuuringu alusel (4), (5), (9), millesse andsid oma panuse alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskus (ECVAM) ja alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskus (JaCVAM). Eeskiri põhineb In Vitro Teaduste Instituudis (IIVS) saadud teabel ja INVITTOXi eeskirjal 124 (10), mida kasutati Euroopa Ühenduse rahastatud BCOP-meetodi eelvalideerimisuuringus 1997–1998. Mõlemad eeskirjad põhinevad BCOP-katse eeskirjal, mille esimesena avaldasid Gautheron ja kaasautorid (11).

6.

Käesoleva katsemeetodi puhul kindlaks tehtud piirangud on seotud valepositiivsete tulemuste kõrge osakaaluga alkoholide ja ketoonide puhul ning valenegatiivsete tulemuste kõrge osakaaluga tahkete ainete puhul, mida täheldati valideerimisandmebaasi puhul (vt punkt 44) (5). Kui osutatud kemikaaliklassidesse ja füüsikalistesse aineklassidesse kuuluvad ained andmebaasist välja jätta, suureneb BCOP-meetodi täpsus ELi ja USA keskkonnaameti (EPA) klassifitseerimissüsteemi ning ka ülemaailmselt ühtlustatud klassifitseerimissüsteemi (GHS) järgi oluliselt (5). Pidades silmas kõnealuse katse eesmärki (teha üksnes kindlaks silmi söövitavad või tugevasti ärritavad ained), ei ole valenegatiivsed tulemused väga olulised, kuna selliseid aineid uuritakse reguleerivate asutuste nõuetest olenevalt edasi küülikutel või muudes korralikult valideeritud in vitro-katsetes, kasutades järjestikuste katsete strateegiat ja tõendite kaalukuse lähenemisviisi. Lisaks ei võimaldanud senine valideerimisandmebaas õigesti hinnata mõnesid kemikaali- või tooteklasse (näiteks segusid). Kuid teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist kõigi uuritava materjali tüüpide, kaasa arvatud segude puhul, kusjuures positiivse tulemuse võiks lugeda tõendiks, et tegemist on silma söövitava või tugevasti ärritava toimega. Alkoholide ja ketoonidega saadud positiivseid tulemusi tuleks võtta ettevaatusega, kuna nende puhul on oht mõju ülehinnata.

7.

Veiste silmade ja sarvkestadega tehtavate toimingute puhul tuleks alati järgida katselaboris kohaldatavaid loomadelt saadud materjalide, kaasa arvatud kudede ja koevedelike jne käsitsemise eeskirju ja korda. Soovitatakse kasutada üldisi laborite ettevaatusmeetmeid (12).

8.

Katsemeetodi kasutatavust piirab asjaolu, et kuigi selle puhul võetakse arvesse mõnesid silmaga seotud mõjusid, mida on hinnatud küüliku silma ärritavuse katses, ja mingil määral ka mõjude tugevust, ei peegelda katse silma sidekesta ja vikerkesta kahjustusi. Kuigi BCOP-katsega ei saa põhimõtteliselt hinnata sarvkestakahjustuste pöörduvust, on küüliku silma uuringute alusel soovitatud kasutada sarvkestakahjustuse esialgset sügavust pöördumatu ja pöörduva mõju eristamiseks (13). Lõpuks ei võimalda BCOP-katse hinnata ainete silmasattumisega kaasneva süsteemse toksilisuse võimalust.

9.

Jätkatakse uuringuid BCOP-katse kasulikkuse ja piirangute edasiseks iseloomustamiseks ainete puhul, millel ei ole silma tugevasti ärritavat või ärritavat toimet (vt ka punkt 45). Meetodi kasutajatel palutakse valideerimisorganisatsioonidele saata näidiseid ja/või andmeid, et ametlikult hinnata BCOP-katse võimalikku muud tulevast kasutust, sealhulgas ka ainete puhul, millel ei ole silma tugevasti ärritavat või ärritavat toimet.

10.

Iga labor, kes alustab katsemeetodi kasutamist, peaks oma taseme kontrollimiseks kasutama 2. liites esitatud kemikaale. Labor võib osutatud kemikaale kasutada selleks, et tõendada oma tehnilist pädevust BCOP-katse läbiviimisel, enne kui ta esitab BCOP-katsega saadud andmed regulatiivseks ohu klassifitseerimiseks.

11.

BCOP-meetod on organotüüpne mudel, mille abil on lühiajaliselt võimalik in vitro säilitada veise sarvkesta normaalseid füsioloogilisi ja biokeemilisi funktsioone. Katsemeetodis hinnatakse uuritava aine põhjustatud kahjustust sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse muutuste mõõtmisega hägususmõõtja ja nähtava valguse spektromeetri abil. Nende kahe mõõdetud suuruse järgi arvutatakse IVIS, mille alusel uuritavale ainele omistatakse in vitro määratud ärritavuse klassifikatsioonikategooria, et ennustada aine võimet ärritada silma in vivo (vt otsustamise kriteeriumid).

12.

BCOP-meetodi puhul kasutatakse värskelt tapetud veise silmast eraldatud sarvkesta. Sarvkesta hägusust mõõdetakse sarvkesta läbinud valgushulga mõõtmisega. Läbilaskvuse mõõtmiseks mõõdetakse värvaine naatriumfluorestseiini kogus, mis on läbinud kogu sarvkesta paksuse ja jõudnud sarvkestataguses kambris olevasse lahusesse. Uuritavad ained kantakse sarvkesta epiteliaalsele pinnale sel teel, et need lisatakse sarvkestahoidja eespoolsesse kambrisse. 3. liites on esitatud BCOP-katses kasutatava sarvkestahoidja kirjeldus ja skeem. Sarvkestahoidjaid võib osta mitmelt firmalt või ehitada ise.

13.

Tapamajja saadetavad loomad tapetakse harilikult kas inimtoiduks või muul kaubanduslikul eesmärgil. BCOP-katseks sobib üksnes sarvkest, mis on võetud tervelt loomalt, keda peetakse sobivaks inimtoidus kasutamiseks. Kuna tapetavad loomad on tõust, vanusest ja soost olenevalt väga erineva kaaluga, ei ole looma soovitatavat kaalu tapmise ajal määratletud.

14.

Eri vanuses loomade silmade kasutamise korral võivad sarvkesta mõõtmed olla erinevad. Sarvkestad, mille horisontaalläbimõõt on üle 30,5 mm ja paksus keskosas vähemalt 1 100 μm, saadakse tavaliselt üle kaheksa aasta vanustelt loomadelt, samas kui sarvkestad horisontaalläbimõõduga alla 28,5 mm ja paksusega keskosas alla 900 μm saadakse tavaliselt loomadelt, kelle vanus on alla viie aasta (14). Seepärast kasutatakse tavaliselt silmi, mis on saadud kuni 60 kuu vanustelt loomadelt. Alla 12 kuu vanuste loomade silmi ei ole tavaliselt kasutatud, kuna selliste loomade silmad alles arenevad ning sarvkesta paksus ja läbimõõt on oluliselt väiksemad kui täiskasvanud loomade silmades. Noorte loomade (vanus 6–12 kuud) sarvkestade kasutamine on siiski lubatav, kuna neil on ka eeliseid, nagu parem kättesaadavus, kitsas vanusevahemik ja väiksem oht, et töötajad võivad kokku puutuda veiste spongiformse entsefalopaatiaga (15). Kuna oleks kasulik hinnata söövitavate või ärritavate ühendite suhtes avalduva sarvkesta tundlikkuse sõltuvust sarvkesta suurusest või paksusest, palutakse kasutajatel teatada, millises vanuses või millise kaaluga loomadelt pärinesid uuringus kasutatud sarvkestad.

15.

Silmad kogutakse tapamaja töötajate poolt. Mehaaniliste ja muude kahjustuste miinimumini viimiseks tuleks silmad silmakoopast eemaldada võimalikult kiiresti pärast looma surma. Et vältida silmade kokkupuudet ärritust põhjustavate ainetega, ei tohiks tapamaja töötajad looma pea loputamisel kasutada detergente.

16.

Silmad tuleks paigutada sobiva suurusega anumasse nii, et need oleksid üleni kaetud Hanksi tasakaalustatud soolalahusega (Hanks’ Balanced Salt Solution, HBSS), ja toimetada laborisse viisil, mille puhul nende kahjustuse või bakteriaalse saastuse oht oleks minimaalne. Kuna silmi kogutakse tapmisprotsessi ajal, võivad need kokku puutuda vere ja muude bioloogiliste ainetega, sealhulgas bakterite ja muude mikroorganismidega. Seepärast on oluline viia saastuse oht miinimumini (näiteks silmi sisaldava anuma hoidmisega jää peal ning silmade säilitamiseks ja transportimiseks kasutatavale Hanksi lahusele antibiootikumide lisamisega (näiteks 100 RÜ/ml penitsilliini ja 100 mg/ml streptomütsiini)).

17.

Ajavahemik silmade kogumise ja sarvkestade BCOP-katses kasutamise vahel peaks olema võimalikult lühike (tavaliselt kogutakse ja kasutatakse samal päeval), kusjuures tuleks tõendada, et katsetulemused ei sõltu konkreetsest ajavahemikust. Tulemuste aluseks on silmade valimise kriteeriumid ning positiivse ja negatiivse kontrolli katsetes saadud tulemused. Kõik katses kasutatud silmad peavad pärinema ühest ja samast silmade rühmast, mis on kogutud ühel konkreetsel päeval.

18.

Silmi kontrollitakse peale laborisse saabumist hoolikalt, et neil ei esineks defekte, sealhulgas suurenenud hägusust, kriimustusi ja neovaskularisatsiooni. Kasutatakse ainult sellistest silmadest pärit sarvkesti, milles osutatud defekte ei ole.

19.

Iga sarvkesta kvaliteeti hinnatakse ka katse hilisematel etappidel. Katses ei kasutata sarvkesti, mille hägusus pärast esialgset ühetunnilist tasakaalustumist on üle 7 hägususühiku (märkus: hägususmõõtja kaliibritakse hägususstandarditega, mida kasutatakse hägususühikute määramiseks, vt 3. liide).

20.

Igas katserühmas (uuritav aine, sellega paralleelselt läbiviidavad positiivse ja negatiivse kontrolli katsed) kasutatakse vähemalt kolme silma. BCOP-katses kasutatakse negatiivse kontrolli katses kolme sarvkesta. Kuna kõik sarvkestad eemaldatakse tervelt silmamunalt ja paigutatakse sarvkestakambrisse, võivad üksiku sarvkesta, sealhulgas negatiivse kontrolli katses kasutatud sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse väärtusi mõjutada käsitsemisest tekkinud artefaktid. Lisaks kasutatakse negatiivse kontrolli katses saadud hägususe ja läbilaskvuse väärtusi in vitro-ärritavuse hinnet (IVIS) arvutamisel uuritava ainega ja positiivse kontrolli katsetes saadud vastavate väärtuste parandamiseks.

21.

Defektidest vabad sarvkestad lõigatakse välja koos 2–3 mm laiuse kõvakestaäärega, mis hõlbustab edasist käsitsemist, kusjuures tuleb vältida sarvkesta epiteeli ja endoteeli kahjustamist. Isoleeritud sarvkest kinnitatakse spetsiaalsesse sarvkestahoidjasse, millel on eespoolne kamber – selle poole on sarvkesta epiteliaalne külg –, ja tagapoolne kamber, mille poole on endoteliaalne külg. Mõlemad kambrid täidetakse kuni ülevoolamiseni eelsoojendatud EMEM-lahusega (Eagle’s Minimum Essential Medium), alustades tagapoolsest kambrist ja hoolitsedes, et kambris ei tekiks mulle. Seadet tasakaalustatakse seejärel temperatuuril 32 ± 1 °C vähemalt üks tund, et sarvkest saavutaks tasakaalu ümbritseva keskkonnaga ja saavutaks normaalse metaboolse aktiivsuse (sarvkesta pinna ligikaudne temperatuur in vivo on 32 °C).

22.

Pärast tasakaalustumisperioodi lisatakse mõlemasse kambrisse värsket eelsoojendatud EMEM-lahust ja registreeritakse iga sarvkesta hägususe nullväärtus. Sarvkestad, millel on makroskoopilisi koekahjustusi (näiteks kriimustused, pigmentatsioon, neovaskularisatsioon) või mille hägusus on suurem kui 7 hägususühikut, jäetakse kõrvale. Arvutatakse kõigi tasakaalustatud sarvkestade keskmine hägusus. Negatiivse (või lahusti-) kontrolli katseteks valitakse vähemalt kolm sarvkesta, mille hägususe väärtused on kõigi sarvkestade hägususe keskväärtuse lähedal. Ülejäänud sarvkestad jagatakse seejärel kahte rühma: uuritava ainega töödeldavad ja positiivse kontrolli katse sarvkestad.

23.

Kuna vee soojusmahtuvus on suurem kui õhul, on inkubeerimise ajal võimalik veega saavutada püsivamaid temperatuuritingimusi. Seepärast soovitatakse täidetud sarvkestahoidjate termostateerimiseks temperatuuril 32 ± 1 °C kasutada vesivanni. Kuid kasutada võib ka õhktermostaate, võttes vajalikud meetmed temperatuuri stabiilsuse tagamiseks (näiteks hoidjate ja lahuste eelsoojendamine).

24.

Kasutatakse kaht pealekandmismeetodit, millest üks on vedelike ja (tahkete või vedelate) pindaktiivsete ainete jaoks ning teine on selliste tahkete ainete jaoks, millel ei ole pindaktiivseid omadusi.

25.

Vedelikke katsetatakse lahjendamata kujul ning pindaktiivseid aineid katsetatakse kontsentratsioonis 10 massiprotsenti 0,9 % naatriumkloriidi lahuses, destilleeritud vees või muus lahustis, mille kohta on tõendatud, et see ei avalda kahjustavat mõju katsesüsteemile. Püdelaid aineid, kreeme ja vahasid uuritakse tavaliselt nagu vedelikke. Muu lahjenduskontsentratsiooni kasutamist tuleb veenvalt põhjendada. Sarvkestal lastakse vedelike ja pindaktiivsete ainetega kokku puutuda 10 minutit. Muu kokkupuuteaja kasutamise korral tuleb esitada veenev teaduslik põhjendus.

26.

Tahkeid aineid, millel ei ole pindaktiivseid omadusi, katsetatakse lahuse või suspensioonina kontsentratsioonis 20 massiprotsenti 0,9 % naatriumkloriidi lahuses, destilleeritud vees või muus lahustis, mille kohta on tõendatud, et see ei avalda kahjustavat mõju katsesüsteemile. Teatavatel puhkudel ja veenva teadusliku põhjendusega võib tahkeid aineid katsetada ka puhtal kujul, kus uuritav aine kantakse otse sarvkesta pinnale, kasutades lahtise kambri meetodit (vt punkt 29). Sarvkest jäetakse tahke ainega kokkupuutesse neljaks tunniks, kuid nagu vedelike ja pindaktiivsete ainete puhulgi võib veenva teadusliku põhjendusega kasutada ka muid kokkupuuteaegu.

27.

Pealekandmiseks võib kasutada mitmesuguseid meetodeid, olenevalt uuritava aine füüsikalisest olekust ja keemilistest omadustest (näiteks tahke aine, vedelik, viskoosne või mitteviskoosne vedelik). Oluline on tagada, et uuritav aine korralikult kataks epiteliaalse pinna ja täielikult eemaldataks loputamistega. Mitteviskoosse või väheviskoosse uuritava vedeliku puhul kasutatakse tavaliselt suletud kambri meetodit; poolviskoosse ja viskoosse vedeliku või tahke puhta aine uurimiseks kasutatakse tavaliselt lahtise kambri meetodit.

28.

Suletud kambri meetodi kasutamise korral viiakse eespoolsesse kambrisse kambri ülaosas asuvate pealekandmisavade kaudu piisav kogus uuritavat ainet (750 μl), et see kataks sarvkesta epiteliaalse külje; seejärel avad suletakse kokkupuuteajaks korkidega. Oluline on tagada, et iga sarvkest oleks uuritava ainega kokkupuutes vajaliku ajavahemiku jooksul.

29.

Lahtise kambri meetodi kasutamisel võetakse eespoolse kambri akent hoidev rõngas ja klaasaken enne pealekandmist ära. Kontrollaine või uuritav aine (750 μl või sarvkesta täielikuks katmiseks piisav kogus) kantakse mikropipetiga otse sarvkesta epiteliaalsele pinnale. Kui uuritavat ainet on raske pipeteerida, võib pealekandmise hõlbustamiseks viia uuritava aine surve all kolbpipetti. Kolbpipeti otsik viiakse tihedalt süstla dosaatorotsikusse, nii et ainet saab rõhu all viia kolbpipeti otsikusse. Samaaegselt pipetikolvi tagasitõmbamisega lastakse süstla kolb vabaks. Kui pipetiotsikusse ilmuvad õhumullid, surutakse uuritav aine välja ja võtet korratakse, kuni otsik on täidetud ja selles ei ole õhumulle. Vajaduse korral võib kasutada tavalist (ilma nõelata) süstalt, kuna sellega saab uuritava aine ruumala täpselt mõõta, samuti on sellega võimalik ainet hõlpsamini kanda sarvkesta epiteliaalsele pinnale. Pärast uuritava aine pealekandmist pannakse eespoolse kambri klaasaken tagasi, et taas tekiks suletud süsteem.

30.

Pärast kokkupuuteaja lõppu eemaldatakse uuritav aine, negatiivse kontrolli või positiivse kontrolli aine eespoolsest kambrist ja epiteeli pestakse vähemalt kolm korda (või nii kaua, kuni aine jääke ei ole enam võimalik näha) EMEM-lahusega (millesse on lisatud fenoolpunast). Loputamiseks kasutatakse fenoolpunast sisaldavat lahust, kuna fenoolpunase värvusemuutust võib kasutada happeliste või aluseliste materjalide väljapesemise täielikkuse hindamiseks. Sarvkesti pestakse rohkem kui kolm korda, kui fenoolpunane muudab veel oma värvi (kollane või punakaslilla) või kuni uuritavat ainet on veel näha. Kui keskkond on uuritavast ainest puhas, loputatakse sarvkesti viimast korda (fenoolpunast mittesisaldava) EMEM-lahusega. Fenoolpunast mittesisaldavat EMEM-lahust kasutatakse viimaseks loputuseks, et kindlustada fenoolpunase eemaldamine eespoolsest kambrist enne hägususe mõõtmist. Seejärel täidetakse eespoolne kamber värske (fenoolpunast mittesisaldava) EMEM-lahusega.

31.

Vedelike ja pindaktiivsete ainete puhul inkubeeritakse sarvkesti pärast loputamist veel kaks tundi temperatuuril 32 ± 1 °C. Mõnes olukorras on pikem ajavahemik pärast kokkupuudet kasulik ja seda tuleks iga kord kaaluda. Tahke ainega töödeldud sarvkesti loputatakse põhjalikult pärast neljatunnilist kokkupuuteaega, kuid täiendavat inkubeerimist ei ole nende puhul vaja.

32.

Vedeliku ja pindaktiivse aine puhul kokkupuutejärgse inkubatsiooniaja lõpus ning tahke, pindaktiivsete omadusteta aine puhul neljatunnise kokkupuuteaja lõpus registreeritakse iga sarvkesta hägusus ja läbilaskvus. Samuti vaadeldakse iga sarvkesta visuaalselt ja märgitakse üles kõik asjakohased tähelepanekud (näiteks koe lahtikoordumine, uuritava aine jäägid, ebaühtlaselt jaotunud hägusus). Sellised tähelepanekud võivad olla olulised, kuna osutatud muutused võivad mõjutada hägususmõõtja näitu.

33.

Igas katses tehakse paralleelseid mõõtmisi ka negatiivse või lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli ja positiivse kontrolli ainetega.

34.

BCOP-katse läbiviimisel 100-protsendilise vedela ainega tehakse paralleelselt negatiivse kontrolli katse (näiteks 0,9 % naatriumkloriidi lahuse või destilleeritud veega), et kindlaks teha mittespetsiifiliste muutuste esinemine testsüsteemis ja saada võrdlusväärtused katse tulemusnäitajate jaoks. Sellega tõendatakse ka, et katsetingimused ise ei põhjusta muutusi, mida ekslikult võiks ärrituseks pidada.

35.

BCOP-katse läbiviimisel lahjendatud vedeliku, pindaktiivse aine või tahke ainega tehakse paralleelselt lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli katse, et kindlaks teha mittespetsiifiliste muutuste esinemine testsüsteemis ja saada võrdlusväärtus katse tulemusnäitaja jaoks. Katses võib kasutada ainult sellist lahustit/pealekandmisvahendit, mille kohta on tõendatud, et see ei avalda negatiivset mõju katsesüsteemile.

36.

Igas eksperimendis tehakse paralleelselt ka positiivse kontrolli katse silmi teadaolevalt ärritava ainega, et tõendada positiivse tulemuse saamist. Kuna käesolevas katsemeetodis kasutatakse BCOP-katset söövitavate või tugevasti ärritavate ainete kindlakstegemiseks, peaks positiivse kontrolli aine soovitatavalt olema kontrollaine, mis selle katsemeetodi puhul põhjustab tugeva mõju. Kuid selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli aine mõju sõltuvust ajast, ei tohiks ärritav mõju olla ülemäära suur.

37.

Vedela uuritava aine korral on positiivse kontrolli aineks näiteks dimetüülformamiid või 1 % naatriumhüdroksiid. Tahke uuritava aine korral on positiivse kontrolli aineks näiteks 20 % (mass/ruumala) imidasool 0,9 % naatriumkloriidi lahuses.

38.

Võrdlusained võimaldavad hinnata teatava kemikaali- või tooteklassi uurimata kemikaali omadust põhjustada silmade ärritust või hinnata teatava silmi ärritava aine mõju tugevust teatavas ärritava toime vahemikus.

39.

Hägusus määratakse sarvkesta läbinud valgushulga mõõtmisega. Sarvkesta hägusust mõõdetakse hägususmõõtja abil, millega saadakse hägususe väärtused pidevas skaalas.

40.

Läbilaskvust määratakse värvaine naatriumfluorestseiini hulga järgi, mis tungib läbi kõigi sarvkesta kihtide (st sarvkesta välispinnal asuvast epiteelist kuni sisepinnal asuva endoteelini). Sarvkestahoidja eespoolsesse kambrisse, mille poole on sarvkesta epiteliaalne külg, lisatakse 1 ml naatriumfluorestseiini lahust (4 mg/ml, kui uuritav aine on vedelik või pindaktiivne aine, ja 5 mg/ml, kui see on pindaktiivsete omadusteta tahke aine), samas kui tagapoolne kamber, mille poole on endoteliaalne külg, täidetakse värske EMEM-lahusega. Seejärel inkubeeritakse sarvkestahoidjat horisontaalasendis 90 ± 5 minutit 32 ± 1 °C juures. UV/VIS-spektrofotomeetriliselt mõõdetakse tagapoolsesse kambrisse tunginud naatriumfluorestseiini kogus. 490 nm juures läbiviidavate spektrofotomeetriliste mõõtmiste tulemused registreeritakse optilise tiheduse (OD490) või valguse neeldumise ühikutes pidevas skaalas. Fluorestseiini läbilaskvuse väärtused määratakse OD490 väärtustest, mis määratakse nähtava valguse spektrofotomeetriga, kasutades standardseid küvette optilise tee pikkusega 1 cm.

41.

Selle asemel võib kasutada 96-augulise mikrotiiterplaadi lugejat, kui: i) on võimalik näidata, et fluorestseiini määramisel on OD490 väärtused plaadilugeja lineaarses piirkonnas, ja ii) 96-augulisel mikrotiiterplaadil kasutatakse õiget fluorestseiiniproovi ruumala, nii et saadakse samad OD490 väärtused kui tavalise 1 cm küvetiga mõõtmisel (selleks tuleb auk (tavaliselt 360 ml) täita võib-olla ääreni).

42.

Kui hägususe ja keskmise läbilaskvuse (OD490) väärtused on parandatud tausthägususe ja negatiivse kontrolli läbilaskvuse OD490 väärtustega, tuleks iga katserühma keskmised hägususe ja läbilaskvuse OD490 väärtused asendada empiiriliselt tuletatud võrrandisse, et arvutada in vitro-ärritavuse hinne (IVIS) iga katserühma jaoks:

IVIS = keskmine hägususe väärtus + (15 × keskmine läbilaskvuse OD490 väärtus)

Sina jt (16) teatavad, et selline võrrand tuletati laborisiseste ja laboritevaheliste uuringutega. 36 ainega läbiviidud laboritevahelise uuringu andmeid töödeldi mitmese korrelatsioonanalüüsi meetodiga, et leida in vivo ja in vitro saadud tulemuste seost kõige paremini kirjeldav võrrand. Kõnealuse analüüsi viisid läbi kahe ettevõtte teadlased, kes said peaaegu identsed võrrandid.

43.

Hägususe ja läbilaskvuse väärtusi tuleks ka sõltumatult hinnata, et määrata kindlaks, kas uuritav aine põhjustas söövitust või tugevat ärritust ainult ühe kaudu kahest tulemusnäitajast (vt otsustamise kriteeriumid).

44.

Aine, mille IVIS ≥ 55,1, tunnistatakse söövitavaks või tugevat ärritust põhjustavaks aineks. Nagu öeldud punktis 1, kui uuritavat ainet ei klassifitseerita silma söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks, tuleks aine klassifitseerimiseks ja etiketile kantava teabe saamiseks teha täiendavaid katseid. BCOP-katse üldine täpsus on 79 % (113/143) kuni 81 % (119/147), valepositiivsete tulemuste määr on 19 % (20/103) kuni 21 % (22/103) ja valenegatiivsete tulemuste määr 16 % (7/43) kuni 25 % (10/40), kui tulemusi võrrelda küüliku silma in vivo-katse tulemustega, mis on klassifitseeritud vastavalt EPA (1), ELi (2) või GHSi (3) klassifitseerimissüsteemidele. Kui teatavatesse kemikaaliklassidesse (alkoholid, ketoonid) või füüsikalisse klassi (tahked ained) kuuluvad ained andmebaasist kõrvale jätta, on ELi, EPA ja GHSi klassifitseerimissüsteemide kohaselt BCOP-katse täpsus 87 % (72/83) kuni 92 % (78/85), valepositiivsete tulemuste määr on 12 % (7/58) kuni 16 % (9/56) ja valenegatiivsete tulemuste määr on 0 % (0/27) kuni 12 % (3/26).

45.

Isegi kui uuritavat ainet ei klassifitseerita silma söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks, võib BCOP-katse siiski olla kasulik koos andmetega, mis saadakse küüliku silma in vivo-katsega või muu korralikult valideeritud in vitro-katsega, kuna see aitab paremini hinnata BCOP-katse meetodi kasulikkust ja puudusi selliste ainete kindlakstegemisel, millel ei ole tugevasti ärritavat või ärritavat toimet (töötatakse välja suunisdokumenti silma suhtes toksilisuse määramise in vitro-katsemeetodite kohta).

46.

Katse loetakse nõuetekohaseks, kui positiivne kontroll annab IVIS-väärtuse, mis asub kuni kahe standardhälbe kaugusel varasemate uuringute jooksvast keskmisest, mida ajakohastatakse vähemalt iga kolme kuu järel või iga nõuetekohase katse läbiviimise järel laboris, kus katseid tehakse harva (harvem kui kord kuus). Negatiivse kontrolli või lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli katses saadud hägususe ja läbilaskvuse väärtused peavad olema madalamad kui tausthägususe ja läbilaskvuse väärtuse ülempiirid, mis on varem kindlaks tehtud veise sarvkestade puhul, mida on töödeldud negatiivse kontrolli või lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli ainetega.

47.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave, kui see on uuringu läbiviimise seisukohast asjakohane:

Uuritavad ained ja kontrollained:

Teave sponsori ja uurimisasutuse kohta:

Kasutatud meetodi ja katse-eeskirja põhjendus

Katsemeetodi õigsus:

kasutatud katsemeetodi ajast sõltumatu õigsuse (st täpsuse ja usaldusväärsuse) tagamise meetod (s.o ained, millega katse läbiviimise oskust teatava ajavahemiku järel kontrollitakse, varasemate negatiivse ja positiivse kontrolli andmete kasutamine).

Katse kõlblikkuse kriteeriumid:

Katse tingimused:

Tulemused:

Tulemuste arutelu

Kokkuvõte

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006. ELT L 353, 31.12.2008, lk 1.

(3)

UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Vt

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Vt

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(5)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No. 07-4517. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(6)

Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1907/2006, 18. detsember 2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ. ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Vt

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(11)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(12)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Vt

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(13)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

(17)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

1.

Isoleeritud kanasilma meetod (Isolated Chicken Eye, ICE) on in vitro-katsemeetod, mida võib teatavatel asjaoludel ja teatavate piirangutega kasutada, et klassifitseerida aineid ja segusid silma söövitavaks ja tugevasti ärritavaks (1), (2), (3). Käesolevas katse-meetodis on tugevasti ärritava toimega aineks või seguks määratletud sellised, mis tekitavad küülikul pärast pealekandmist vähemalt 21 päeva püsiva silmakahjustuse. Katsemeetodit ei peeta küüliku silma in vivo-katse täieliku asendamise jaoks kõlblikuks; ICE-meetodit soovitatakse kasutada korrastatud astmelise katsetamise strateegia osana õigusliku klassifitseerimise ja märgistamise jaoks konkreetses kasutusvaldkonnas (4), (5). Käesoleva katse kohaselt positiivseid uuritavaid aineid ja segusid (6) võib klassifitseerida silma söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks ilma edasise katsetamiseta küülikutel. Negatiivse tulemuse andnud ainet on vaja katsetada küülikul, kasutades järjestikuste katsete strateegiat, mis on esitatud OECD katsesuunises 405 (7) (käesoleva lisa B.5 peatükk).

2.

Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada menetlusi, mida kasutatakse uuritava aine võimaliku silma söövitava või tugevasti ärritava toime hindamiseks, tuginedes aine omadusele mõjuda toksiliselt värskelt eraldatud kanasilmale. Toksilist mõju sarvkestale mõõdetakse: i) hägususe kvalitatiivse hindamisega, ii) epiteelikahjustuse kvalitatiivse hindamisega, kasutades fluorestseiini kandmist silma (fluorestseiini peetumine silmas), iii) sarvkesta paksuse suurenemise (turse) mõõtmisega ja iv) makroskoopilise morfoloogilise pinnakahjustuse kvalitatiivse hindamisega. Sarvkesta hägusust, turset ja kahjustust hinnatakse pärast uuritava ainega kokkupuutumist individuaalselt ja seejärel andmed koondatakse silma ärritava toime klassifitseerimiseks.

3.

ICE-meetodiga on uuritud ka silmaärritajaid, mille tekitatud kahjustused paranevad vähem kui 21 päevaga, samuti aineid, mis silmi ei ärrita. Kuid sellistesse kategooriatesse kuuluvate ainete puhul ei ole ICE-meetodi täpsust ja usaldusväärsust ametlikult hinnatud.

4.

Mõisted on esitatud 1. liites.

5.

Käesolev katsemeetod põhineb alternatiivmeetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomitee (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) ICE-meetodi eeskirjal (8), mis töötati välja rahvusvahelise valideerimisuuringu alusel (4), (5), (9), millesse andsid oma panuse alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskus (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM), alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskus (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) ja Madalmaade uurimisinstituudi TNO toksikoloogia ja rakendusfarmakoloogia elukvaliteedi osakond. Eeskirja aluseks on avaldatud andmetest saadud teave, samuti TNOs praegu kasutatav eeskiri (10), (11), (12), (13), (14).

6.

Käesoleva meetodi kindlakstehtud piirangud on seotud alkoholide valepositiivsete tulemuste ning tahkete ainete ja pindaktiivsete ainete valenegatiivsete tulemuste määraga (vt punkt 47) (4). Kui osutatud kemikaaliklassidesse ja füüsikalistesse aineklassidesse kuuluvad ained andmebaasist välja jätta, suureneb ICE-meetodi täpsus ELi ja USA keskkonnaameti (EPA) klassifitseerimissüsteemi ning ka ülemaailmselt ühtlustatud klassifitseerimissüsteemi (GHS) järgi oluliselt (4). Pidades silmas kõnealuse katse eesmärki (teha üksnes kindlaks silmi söövitavad või tugevasti ärritavad ained), ei ole valenegatiivsed tulemused väga olulised, kuna selliseid aineid uuritakse reguleerivate asutuste nõuetest olenevalt edasi küülikutel või muudes korralikult valideeritud in vitro-katsetes, kasutades järjestikuste katsete strateegiat ja tõendite kaalukuse lähenemisviisi. Lisaks ei võimaldanud senine valideerimisandmebaas õigesti hinnata mõnesid kemikaali- või tooteklasse (näiteks segusid). Kuid teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist kõigi uuritava materjali tüüpide, kaasa arvatud segude puhul, kusjuures positiivse tulemuse võiks lugeda tõendiks, et tegemist on silma söövitava või tugevasti ärritava toimega. Alkoholidega saadud positiivseid tulemusi tuleks võtta ettevaatusega, kuna nende puhul on oht mõju üle hinnata.

7.

Kanasilmadega tehtavate toimingute puhul tuleks alati järgida katselaboris kohaldatavaid inimestelt ja loomadelt saadud materjalide, kaasa arvatud kudede ja koevedelike jne käsitsemise eeskirju ja korda. Soovitatakse kasutada üldisi laborite ettevaatusmeetmeid (15).

8.

Katsemeetodi kasutatavust piirab asjaolu, et kuigi selle puhul võetakse arvesse mõnesid silmaga seotud mõjusid, mida on hinnatud küüliku silma ärritavuse katses, ja mingil määral ka mõjude tugevust, ei peegelda katse silma sidekesta ja vikerkesta kahjustusi. Kuigi ICE-katsega ei saa põhimõtteliselt hinnata sarvkestakahjustuste pöörduvust, on küüliku silma uuringute alusel soovitatud kasutada sarvkestakahjustuse esialgset sügavust pöördumatu ja pöörduva mõju eristamiseks (16). Lõpuks ei võimalda ICE-katse hinnata ainete silmasattumisega kaasneva süsteemse toksilisuse võimalust.

9.

Jätkatakse uuringuid ICE-katse kasulikkuse ja piirangute edasiseks iseloomustamiseks ainete puhul, millel ei ole silma tugevasti ärritavat või ärritavat toimet (vt ka punkt 48). Meetodi kasutajatel palutakse valideerimisorganisatsioonidele saata näidiseid ja/või andmeid, et ametlikult hinnata ICE-katse võimalikku muud tulevast kasutust, sealhulgas ka ainete puhul, millel ei ole silma tugevasti ärritavat või ärritavat toimet.

10.

Iga labor, kes alustab katsemeetodi kasutamist, peaks oma taseme kontrollimiseks kasutama 2. liites esitatud kemikaale. Labor võib osutatud kemikaale kasutada selleks, et tõendada oma tehnilist pädevust ICE-katse läbiviimisel, enne kui ta esitab ICE-katsega saadud andmed regulatiivseks ohu klassifitseerimiseks.

11.

ICE-meetod on organotüüpne mudel, mille abil on lühiajaliselt võimalik säilitada kanasilma in vitro. Katsemeetodis hinnatakse uuritava aine põhjustatud kahjustust sarvkesta turse, hägususe tekkimise ja fluorestseiini peetumise mõõtmisega. Viimase kahe näitaja puhul on tegemist kvalitatiivse hindamisega, sarvkesta turse analüüsi puhul on ette nähtud kvantitatiivne hindamine. Iga mõõtmise tulemus teisendatakse kas kvantitatiivseks punktisummaks (hindeks), mida kasutatakse üldise ärritavusnäitaja arvutamiseks, või omistatakse sellele kvalitatiivne kategooria, mida kasutatakse silma söövitava ja tugevasti ärritava toime in vitro-klassifikatsiooni omistamiseks. Kumbagi neist tulemustest võib kasutada selleks, et ennustada aine võimet söövitada või tugevasti ärritada silma in vivo (vt otsustamise kriteeriumid).

12.

Kõnealuseks katseks on kasutatud silmi, mis on kogutud kanadelt tapamajas, kus need tapetakse inimtoiduks; see kõrvaldab katseloomade kasutamise vajaduse. Kasutatakse üksnes silmi, mis on võetud tervetelt lindudelt, keda peetakse sobivaks inimtoidus kasutamiseks.

13.

Kuigi kanade sobivaima vanuse hindamiseks ei ole läbi viidud kontrollitud uuringut, on tavaliselt kasutatud kõnealuseks katseks tapamajas tapetud kevadisi kanu (st vanus umbes 7 nädalat, kaal 1,5–2,5 kg).

14.

Pead tuleks kõrvaldada kohe pärast kanade uimastamist, tavaliselt elektrilöögiga, ja kõri läbilõikamist, et veri välja lasta. Labor peaks olema kohaliku tapamaja lähedal, nii et kanade pead saaks kiiresti toimetada tapamajast laborisse, et viia miinimumini lagunemisest ja/või bakteritega saastumisest tingitud kahjustused. Ajavahemik kanapeade kogumise ja silmade ICE-katses kasutamise vahel peaks olema võimalikult lühike (tavaliselt kuni kaks tundi), kusjuures tuleks tõendada, et katsetulemused ei sõltu konkreetsest ajavahemikust. Tulemuste aluseks on silmade valimise kriteeriumid ning positiivse ja negatiivse kontrolli katsetes saadud tulemused. Kõik katses kasutatud silmad peavad pärinema ühest ja samast silmade rühmast, mis on kogutud ühel konkreetsel päeval.

15.

Kuna silmad eraldatakse laboris, veetakse kanade pead tervelt tapamajast laborisse toatemperatuuril plastkastides, milles niiskuse suurendamiseks on isotoonilise keedusoolalahusega niisutatud käterätid.

16.

Silmad, millel kohe peale silmakoopast väljavõtmist on kõrge fluorestseiiniga värvumise näitaja (üle 0,5) või sarvkesta hägususe hinne (üle 0,5), jäetakse kõrvale.

17.

Igas katserühmas ja paralleelselt läbiviidavas positiivse kontrolli katses kasutatakse vähemalt kolme silma. Negatiivse kontrolli rühmas või lahusti kontrollis (kui kasutatakse muud lahustit kui keedusoolalahust) kasutatakse vähemalt ühte silma.

18.

Silmalaud lõigatakse hoolikalt ära, vältides sarvkesta vigastamist. Sarvkesta kvaliteeti kontrollitakse kiiresti ühe tilga 2 % (mass/ruumala) naatriumfluorestseiini lahusega, mis kantakse sarvkesta pinnale mõneks sekundiks ja loputatakse siis maha isotoonilise keedusoolalahusega. Fluorestseiiniga töödeldud silmi vaadeldakse siis pilulamp-mikroskoobiga, et teha kindlaks, et sarvkest on vigastamata (st fluorestseiini peetumine ja sarvkesta hägususe hinne on ≤ 0,5).

19.

Kui sarvkest on vigastamata, jätkatakse silma väljalõikamist silmakoopast, vältides sarvkesta vigastamist. Silmamuna tõmmatakse silmakoopast välja, hoides pilkekilet kindlalt kirurgitangidega, ja silmalihased lõigatakse läbi painutatud nüriotsaliste kääridega. Oluline on vältida sarvkesta vigastust liigse rõhu tõttu (st kokkusurumisest tingitud artefakte).

20.

Kui silm on silmakoopast välja tõmmatud, tuleb silmamuna külge jätta nähtav osa silmanärvi. Kui silm on silmakoopast välja võetud, pannakse see filterpaberile ning lõigatakse ära pilkekile ja muud sidekoelised osad.

21.

Väljavõetud silm paigutatakse roostevabast terasest silmahoidja klambri vahele, nii et sarvkest on vertikaalasendis. Silmahoidja pannakse seejärel tilgutusaparaadi (superfusiooniaparaadi) kambrisse (16). Silmahoidjad tuleb tilgutusaparaadis paigutada nii, et isotooniline keedusoolalahus niisutaks kogu sarvkesta. Tilgutusaparaadi kambrites tuleks hoida temperatuuri 32 ± 1,5 °C. 3. liites on esitatud tüüpilise tilgutusaparaadi ja silmahoidjate skeem; sellise aparaadi võib osta või valmistada ise. Aparaati võib muuta vastavalt iga labori vajadustele (näiteks vajaliku arvu silmade paigutamiseks aparaati).

22.

Pärast tilgutusaparaati paigutamist kontrollitakse silmi uuesti pilulamp-mikroskoobiga, et nende hulgas ei oleks väljavõtmisega vigastatud silmi. Samal ajal mõõdetakse sarvkesta tipus sarvkesta paksus, kasutades pilulamp-mikroskoobi sügavusmõõtmisseadet. Asendatakse kõik järgmiste tunnustega silmad: i) fluorestseiini peetumise hinne üle 0,5, ii) sarvkesta hägusus üle 0,5 või iii) omavad muid kahjustuse tunnuseid. Osutatud kriteeriumide põhjal kõrvaldamata jäetud silmade hulgast kõrvaldatakse veel silmad, mille sarvkesta paksus kaldub üle 10 % kõrvale kõikide silmade kohta arvutatud keskväärtusest. Töötajad peaksid arvestama, et pilu erineva laiuse korral võib pilulamp-mikroskoop anda tulemuseks erinevaid sarvkesta paksuse väärtusi. Pilu laiuseks tuleb seada 0,095 mm.

23.

Kui kõik silmad on üle vaadatud ja kõlblikuks tunnistatud, inkubeeritakse neid umbes 45–60 minutit, et need saavutaksid katsesüsteemiga tasakaalu, enne kui neile uuritav aine peale kantakse. Pärast tasakaalustumist mõõdetakse sarvkesta paksuse ja hägususe võrdlustase (0-tase), mis jääb baasjooneks (väärtused ajahetkel 0). Väljalõikamise ajal määratud fluorestseiini peetumise hinnet kasutatakse kõnealuse tulemusnäitaja baasjoonena.

24.

Kohe peale võrdlustaseme (0-taseme) mõõtmist võetakse silm (koos silmahoidjaga) tilgutusaparaadist välja, pannakse horisontaalasendisse ja uuritav aine kantakse sarvkestale.

25.

Vedelaid uuritavaid aineid mõõdetakse tavaliselt lahjendamata kujul, kuid neid võib ka lahjendada, kui seda peetakse vajalikuks (näiteks kui see on osa katse korraldusest). Eelistatud lahusti ainete lahjendamiseks on füsioloogiline keedusoolalahus. Kontrollitud tingimustes võib kasutada ka muid lahusteid, kuid muude lahustite kui füsioloogilise keedusoolalahuse sobivust on vaja tõendada.

26.

Vedelad uuritavad ained kantakse sarvkestale nii, et kogu sarvkesta pind on uuritava ainega ühtlaselt kaetud; tavaline ruumala on 0,03 ml.

27.

Tahked ained tuleks jahvatada võimalikult peeneks uhmris uhmrinuiaga või muu peenestamisvahendiga. Pulber kantakse sarvkestale niimoodi, et pind oleks uuritava ainega ühtlaselt kaetud; tavaline kogus on 0,03 g.

28.

Uuritav (vedel või tahke) aine kantakse 10 sekundiks peale ja loputatakse siis silma pealt maha toatemperatuuril oleva isotoonilise keedusoolalahusega (umbes 20 ml). Silm (koos silmahoidjaga) pannakse seejärel tagasi tilgutusaparaati esialgsesse vertikaalasendisse.

29.

Igas katses tuleks teha paralleelseid mõõtmisi ka negatiivse või lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli ja positiivse kontrolli ainetega.

30.

100-protsendilise vedeliku või tahke aine uurimise korral kasutatakse ICE-katses paralleelse negatiivse kontrollina füsioloogilist keedusoolalahust, et teha kindlaks katsesüsteemi mittespetsiifilisi muutusi ning tõendada, et katsetingimused ise ei tekita ekslikult ärritusnähtusid.

31.

Lahjendatud vedeliku uurimise korral tehakse ICE-katses paralleelselt lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli katse, et teha kindlaks katsesüsteemi mittespetsiifilisi muutusi ning tõendada, et katsetingimused ise ei tekita ekslikult ärritusnähtusid. Nagu öeldud punktis 25, võib katses kasutada ainult sellist lahustit/pealekandmisvahendit, mille kohta on tõendatud, et see ei avalda negatiivset mõju katsesüsteemile.

32.

Igas eksperimendis tehakse paralleelselt ka positiivse kontrolli katse silmi teadaolevalt ärritava ainega, et tõendada positiivse tulemuse saamist. Kuna käesolevas katsemeetodis kasutatakse ICE-katset söövitavate või tugevasti ärritavate ainete kindlakstegemiseks, peaks positiivse kontrolli aine olema võrdlusaine, mis selle katsemeetodi puhul põhjustab tugeva mõju. Kuid selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli aine mõju sõltuvust ajast, ei tohiks mõju olla ülemäära suur. Positiivse kontrolli kohta tuleks saada piisaval hulgal in vitro-andmeid, nii et saaks arvutada positiivse kontrolli väärtuste statistiliselt määratletud vahemiku. Kui konkreetse positiivse kontrolli jaoks ei ole piisavalt varasemaid täpseid ICE-katse andmeid, võib sellise teabe saamiseks olla vaja korraldada eraldi uuringuid.

33.

Vedelate uuritavate ainete positiivse kontrolli näideteks on 10 % äädikhape või 5 % bensalkooniumkloriid; tahkete uuritavate ainete positiivse kontrolli näideteks on naatriumhüdroksiid või imidasool.

34.

Võrdlusained võimaldavad hinnata teatavasse kemikaali- või tooteklassi kuuluva uurimata kemikaali omadust põhjustada silmade ärritust või hinnata teatava silmi ärritava aine mõju tugevust teatavas ärritava toime vahemikus.

35.

Sarvkesti hinnatakse enne uuritava ainega töötlemist ning 30, 75, 120, 180 ja 240 minutit (± 5 minutit) pärast töötlemisejärgset loputamist. Sellised mõõtmiste ajad annavad vajaliku hulga mõõtmisi töötlemisele järgneva neljatunnilise ajavahemiku jooksul; samas jääb mõõtmiste vahele piisavalt aega, et nõutavad vaatlused saaks teha kõikide silmadega.

36.

Mõõdetakse järgmisi tulemusnäitajaid: sarvkesta hägusus, turse, fluorestseiini peetumine ja morfoloogilised muutused (näiteks epiteeli augustumine või lahtikoorumine). Kõiki tulemusnäitajaid peale fluorestseiini peetumise (mida määratakse ainult enne töötlemist ja 30 minutit pärast kokkupuudet uuritava ainega) määratakse igal eespool osutatud ajahetkel.

37.

Sarvkesta hägususe, fluorestseiini peetumise, morfoloogiliste muutuste ja histopatoloogia (kui seda uuritakse) muutusi on soovitatav dokumenteerida fotodega.

38.

Peale viimast vaatlust nelja tunni pärast on soovitatav silmad konserveerida sobiva fiksaatoriga (näiteks puhverdatud neutraalse formaliiniga), et seda oleks võimalik histopatoloogiliselt uurida.

39.

Sarvkesta turse määratakse sarvkesta paksuse mõõtmisega, kasutades pilulamp-mikroskoobile lisatud optilist paksusemõõtjat. Sarvkesta turse väljendatakse protsendina ja arvutatakse sarvkesta paksuse mõõtmisandmetest järgmise valemiga:

40.

Arvutatakse kõikide katses kasutatud silmade keskmine sarvkesta turse protsent iga uuritud ajahetke jaoks. Igal ajahetkel registreeritud kõige kõrgema keskmise sarvkestaturse hinde põhjal omistatakse igale uuritavale ainele üldine kategooriahinne.

41.

Sarvkesta hägusus arvutatakse, kasutades hindamiseks kõige rohkem hägustunud sarvkestaosa pindala. Arvutatakse kõikide katses kasutatud silmade keskmine sarvkesta hägususe väärtus iga uuritud ajahetke jaoks. Igal ajahetkel registreeritud kõige kõrgema keskmise sarvkesta hägususe hinde põhjal omistatakse igale uuritavale ainele üldine kategooriahinne (tabel 1).

Tabel 1.

Sarvkesta hägususe hinne

42.

Keskmine fluorestseiini peetumise väärtus arvutatakse kõikide katses kasutatavate silmade jaoks ainult ajahetke 30 minutit jaoks; osutatud väärtust kasutatakse igale uuritavale ainele üldise kategooriahinde omistamisel (tabel 2).

Tabel 2.

Fluorestseiini peetumise hinne

43.

Morfoloogiline mõju hõlmab järgmist: „auklikud” sarvkesta epiteelirakud, lahtikoorunud epiteel, sarvkesta pinna karedaks muutumine ning uuritava aine „kleepumine” sarvkestale. Sellised nähtused võivad olla erineva raskusastmega ja esineda samaaegselt. Nende nähtuste klassifitseerimine on subjektiivne ja sõltub uurija tõlgendusest.

44.

Sarvkesta hägususe ja turse ning fluorestseiini peetumise tulemusi tuleb hinnata eraldi, et leida ICE-klass iga tulemusnäitaja jaoks. Iga tulemusnäitaja ICE-klassid koondatakse seejärel iga uuritava aine ärritavuse klassifikatsiooni saamiseks.

45.

Kui iga tulemusnäitaja on hinnatud, saab eelnevalt määratud vahemike alusel omistada ICE-klassid. Sarvkesta paksuse (tabel 3), hägususe (tabel 4) ja fluorestseiini peetumise (tabel 5) tõlgendamine nelja ICE-klassi kasutamisega toimub järgnevate skaalaastmete alusel:

Tabel 3.

Sarvkesta turse ICE-klassifitseerimise kriteeriumid

Tabel 4.

Sarvkesta hägususe ICE-klassifitseerimise kriteeriumid

Tabel 5.

Fluorestseiini peetumise ICE-klassifitseerimise kriteeriumid

46.

Uuritava aine üldine in vitro-ärritavuse klassifikatsioon hinnatakse ärritavusnäitajate kategooriate kombineerimisega, võttes arvesse sarvkesta turse, sarvkesta hägususe ja fluorestseiiini peetumise kategooriaid ning kasutades tabelis 6 esitatud skeemi.

Tabel 6.

Üldise in vitro-ärritavuse klassifikatsiooni määramine

47.

Nagu öeldud punktis 1, kui uuritavat ainet ei klassifitseerita silma söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks, tuleks aine klassifitseerimiseks ja etiketile kantava teabe saamiseks teha täiendavaid katseid. Silma söövitavate ja tugevasti ärritavate ainete kindlakstegemisel on ICE-katse üldine täpsus 83 % (120/144) kuni 87 % (134/154), valepositiivsete tulemuste määr on 6 % (7/116) kuni 8 % (9/116) ja valenegatiivsete tulemuste määr 41 % (13/32) kuni 50 % (15/30), kui tulemusi võrrelda küüliku silma in vivo-katse tulemustega, mis on klassifitseeritud vastavalt EPA (1), ELi (2) või GHSi (3) klassifitseerimissüsteemidele. Kui teatavatesse kemikaaliklassidesse (alkoholid ja pindaktiivsed ained) või füüsikalisse klassi (tahked ained) kuuluvad ained andmebaasist kõrvale jätta, on ELi, EPA ja GHSi klassifitseerimissüsteemide kohaselt ICE-katse täpsus 91 % (75/82) kuni 92 % (69/75), valepositiivsete tulemuste määr on 5 % (4/73) kuni 6 % (4/70) ja valenegatiivsete tulemuste määr on 29 % (2/7) kuni 33 % (3/9) (4).

48.

Isegi kui uuritavat ainet ei klassifitseerita silma söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks, võib ICE-katse siiski olla kasulik koos andmetega, mis saadakse küüliku silma in vivo-katsega või muu korralikult valideeritud in vitro-katsega, kuna see aitab paremini hinnata ICE-katse meetodi kasulikkust ja puudusi selliste ainete kindlakstegemiseks, millel ei ole tugevasti ärritavat või ärritavat toimet (töötatakse välja suunisdokumenti silma toksilisuse in vitro-katsemeetodite kasutamise kohta).

49.

Katse loetakse nõuetekohaseks, kui paralleelselt läbiviidud negatiivse kontrolli või pealekandmisvahendi / lahusti kontrolli katsed ja positiivse kontrolli katsed annavad ärritavuse klassifikatsiooni tulemused, mille kohaselt esimesel juhul on tegemist silma mitteärritavate ja teisel juhul silma tugevasti ärritavate / söövitavate ainetega.

50.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave, kui see on uuringu läbiviimise seisukohast asjakohane:

Uuritavad ained ja kontrollained

Teave sponsori ja uurimisasutuse kohta

Kasutatud meetodi ja katse-eeskirja põhjendus

Katsemeetodi õigsus

Kasutatud katsemeetodi ajast sõltumatu õigsuse (st täpsuse ja usaldusväärsuse) tagamise meetod (s.o ained, millega katse läbiviimise oskust teatava ajavahemiku järel kontrollitakse, varasemate negatiivse ja positiivse kontrolli andmete kasutamine).

Katse kõlblikkuse kriteeriumid

võimaluse korral varasematel andmetel põhinevad kõlblike paralleelsete võrdlustulemuste vahemikud.

Katse tingimused

Tulemused

Tulemuste arutelu

Kokkuvõte

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006. ELT L 353, 31.12.2008, lk 1.

(3)

United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Vt

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No. 07-4517. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Vt

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(6)

Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1907/2006, 18. detsember 2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ. ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Vt

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). Vt

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Vt

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(17)

Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(19)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Vt

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]