millega rakendatakse nõukogu direktiivi 2006/88/EÜ seoses suurte hiidaustrite (Crassostrea gigas) suurenenud suremuse tõrjeks võetavate meetmetega ja austrite herpesviiruse 1 μvar (OsHV-1 μvar) avastamisega

võttes arvesse nõukogu 24. oktoobri 2006. aasta direktiivi 2006/88/EÜ vesiviljelusloomade ja vesiviljelustoodete loomatervishoiunõuete ning teatavate veeloomadel esinevate taudide ennetamise ja tõrje kohta, (1) eriti selle artikli 41 lõiget 3 ja artikli 61 lõiget 3,

Käesoleva määruse kohaldamisel tähendab viirus OsHV-1 μvar austrite herpesviiruse-1 (OsHV-1) genotüüpi, milles osalise nukleotiidijärjestuse andmete põhjal deletsiooni tagajärjel süstemaatiliselt puuduvad 12 aluspaari genoomi osas ORF 4, võrreldes viirusega OsHV-1 (GenBank # AY509253).

1. Kui täheldatakse suurte hiidaustrite (Crassostrea gigas) (edaspidi „suured hiidaustrid”) suurenenud suremust, on pädev asutus kohustatud:

2. Kui lõike 1 punkti b kohaste testide tulemused kinnitavad viiruse OsHV-1 μvar esinemist, peab pädev asutus kehtestama isoleeritud ala. Kõnealuse ala loomisel analüüsitakse iga juhtumit eraldi, võttes arvesse I lisa C osas loetletud tegureid, mis võivad mõjutada taudi leviku ohtu.

3. Liikmesriigid teatavad komisjonile ja teistele liikmesriikidele viivitamata esimese isoleeritud ala kehtestamisest oma territooriumil 2010. aastal.

Artiklis 2 osutatud isoleeritud aladelt pärit suurte hiidaustrite turuleviimise nõuded

1. Artikli 2 lõike 2 kohaselt kehtestatud isoleeritud aladelt pärit suuri hiidaustreid ei tohi nimetatud alalt välja viia.

2. Erandina lõikest 1 võib suurte hiidaustrite saadetisi isoleeritud alalt välja viia järgmistel juhtudel:

3. Lõike 2 punktides a ja b osutatud saadetistele, mis on ette nähtud kasvanduste või ülekandekeskuste jaoks, peab olema lisatud veterinaarsertifikaat, mis on täidetud vastavalt käesoleva määruse II lisas esitatud näidisele ning määruse (EÜ) nr 1251/2008 V lisa selgitustele.

Pädev asutus võib tühistada isoleeritud alade suhtes artikli 2 lõike 2 kohaselt võetud kontrollimeetmed ja austrite turuleviimise suhtes artikli 3 kohaselt seatud piirangud pärast seda, kui 15päevase intervalliga tehtud kaks järjestikust kontrolli kinnitavad, et suremus enam ei suurene.

Selliste suurte hiidaustrite turuleviimise nõuded, mis on pärit piirkondadest, mille suhtes on kehtestatud kontrollimeetmed viirusest OsHV-1 μvar põhjustatud suurte hiidaustrite suremuse suurenemise tõttu

1. Turule viidavad suured hiidaustrid, mis on pärit piirkondadest, kus kas 2009. või 2010. aastal kohaldati ohutusmeetmeid seoses suurte hiidaustrite suurenenud suremusega, mida põhjustas viirus OsHV-1 μvar, peavad vastama järgmistele tingimustele:

2. Lõike 1 punkti a alapunktis I osutatud kava viiruse OsHV-1 μvar varajaseks avastamiseks peab vastama järgmistele nõuetele:

3. Lõiget 1 hakatakse kohaldama üks nädal pärast toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee koosolekut, mille käigus teatati lõike 1 punkti a alapunktis i osutatud kavast.

1. Liikmesriigid teevad komisjonile ja teistele liikmesriikidele kättesaadavaks:

2. Lõike 1 kohane teave peab olema ajakohastatud ja tehtud kättesaadavaks Interneti-põhistel teabelehtedel, mis on loodud kooskõlas komisjoni otsuse 2009/177/EÜ artikliga 10.

Liikmesriigid peavad esitama komisjonile aruande artikli 5 lõike 2 kohaselt teatatud kavade kohta hiljemalt 1. oktoobriks 2010.

Käesolev määrus jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

I LISA

A OSA

Proovide võtmine

1. Artikliga 2 ette nähtud proovide võtmine

Artiklis 2 osutatud proovid peavad sisaldama vähemalt 12 suure hiidaustri isendit. Loomade valikul võetakse prooviks nõrku, avanenud poolmetega või äsja surnud (mitte veel lagunenud) isendeid ning neid kogutakse piirkondadest, kus on täheldatud suremust.

2. Artikli 3 lõike 2 punktiga b, artikli 5 lõike 1 punktiga b ja artikli 5 lõikega 2 ettenähtud proovide võtmine

Artikli 3 lõike 2 punktis b osutatud proovid peavad sisaldama järgmist:

i)	vastsete puhul: viis vähemalt 50 mg koondproovi, mis sisaldavad terviklikke loomi 4–8 päeva pärast viljastamist, iga saadetis peab sisaldama ka austrikarpi;

ii)	vastsete puhul, mille pikkus on alla 6 mm: 30 proovi à 300 mg terviklikest loomadest, iga saadetis peab sisaldama ka austrikarpi;

iii)	austrite puhul, mis on pikemad kui 6 mm: 150 isendit saadetise kohta.

Loomade valikul peavad kõik saadetise osad olema proovis esindatud proportsionaalselt. Kui leitakse nõrku, avanenud poolmetega või äsja surnud (mitte veel lagunenud) loomi, võetakse valimisse eelkõige selliseid loomi.

Artikli 5 lõike 2 kohaselt võetud proovid peavad sisaldama vähemalt 150 suurt hiidaustrit iga proovivõtu koha kohta. Proovid tuleb võtta kõikidest liikmesriigis või piirkonnas asuvatest kasvandustest või asjaomase kavaga hõlmatud kasvatuspiirkondadest.

Artikli 5 lõike 1 punkti b kohaselt võetud proovid peavad sisaldama vähemalt 150 suurt hiidaustrit iga piirkonna kohta.

Loomade valikul tuleb arvesse võtta järgmist:

—	kui leitakse nõrku, avanenud poolmetega või äsja surnud (mitte veel lagunenud) loomi, võetakse valimisse eelkõige neid. Kui selliseid loomi ei esine, peab valim sisaldama alla aasta vanuseid terviklikke molluskeid;

—	kui proove võetakse kasvandustest, kus tootmisprotsessis kasutatakse mitut veeallikat, peavad proovid sisaldama kõikidest veeallikatest pärit loomi, nii et kasvanduse kõik osad oleksid proovides esindatud proportsionaalselt;

—

kui proove võetakse molluskikasvatuspiirkonnast, peavad need sisaldama loomi piisavast arvust (vähemalt kolm) proovivõtukohtadest, nii et molluskikasvatuspiirkonna kõik osad, sealhulgas molluskikasvatuspiirkonna looduslikud jõesängid, oleksid proovides esindatud proportsionaalselt. Proovivõtukohtade valikul tuleb arvesse võtta järgmisi olulisi tegureid: viiruse OsHV-1 μvar varasem esinemine piirkonnas, austrite tihedus, veevool, põhjareljeef ja tootmistavad.

Artikli 5 lõike 2 kohased proovid tuleb võtta sellel aastaajal, millal viiruse OsHV-1 μvar esinemissagedus liikmesriikides või piirkondades on teadaolevalt kõige suurem. Juhul kui sellised andmed puuduvad, tuleb proovid võtta kohe pärast seda, kui veetemperatuur tõuseb üle 16 °C, või aastaajal, millal veetemperatuur saavutab tavaliselt iga-aastase maksimumi.

Artikli 5 lõike 1 punkti b kohased proovid tuleb soovitavalt võtta punktis c kirjeldatud aastaajal. Kui proove ei võeta nimetatud aastaajal, tuleb austreid enne testimist hoida tingimustes, mis on sarnased punktis c kirjeldatud aastaaja tingimustega ning sobilikud viiruse OsHV-1 μvar diagnoosimiseks.

B OSA

Viiruse OsHV-1 μvar avastamise diagnoosimeetodid

1. Kohaldamisala

Käesolev menetlus hõlmab standardsete diagnoosimeetodite kirjeldust viiruse OsHV-1 μvar avastamiseks ja kindlaksmääramiseks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodil. Kõnealune meetod võimaldab eristada viirust OsHV-1 viirusest OsHV-1 μvar.

Selleks et optimeerida reaktsiooni tingimusi ning sobitada labori seadmeid ja tingimusi, võivad laborid vajaduse korral kohandada käesolevas lisas kirjeldatud meetodeid, tingimusel et saab tõendada samaväärset tundlikkust ja spetsiifilisust.

2. Mõisted

Viiruse OsHV-1 μvar määratlus on esitatud käesoleva määruse artiklis 1.

3. Seadmed ja keskkonnatingimused

Diagnostilisteks uuringuteks viiruse OsHV-1 μvar tuvastamiseks ja kindlaksmääramiseks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodil on vaja järgmisi keskkonnatingimusi ja vahendeid, mida kasutatakse tavaliselt PCR-katsete puhul:

—	suletud kate, mis on varustatud UV-kiirgust tootva süsteemiga, et vältida võimalikku saastumist PCR-segu valmistamisel;

—	kaks täiskomplekti pipette (2 μl; 20 μl; 200 μl ja 1 000 μl), esimene DNA ekstraheerimiseks ja teine PCR-segu ettevalmistamiseks;

—	kolm pipetti: esimene (2 μl) PCR-segu doseerimiseks, teine (20 μl) EB-proovide võtmiseks ja kolmas (20 μl) PCR-saaduste ülekandmiseks agaroosgeelile;

—	filtriga pipetiotsikud (2 μl; 20 μl; 200 μl ja 1 000 μl) DNA ekstraheerimiseks, PCR-segu ettevalmistamiseks ja proovide võtmiseks;

—	pipetiotsikud (20 μl) EB-proovide võtmiseks ja amplifikatsioonisaaduste ülekandmiseks agaroosgeelile;

—	termotsükler amplifitseerimiseks;

—	horisontaalne elektroforeesisüsteem PCR-saaduste elektroforeesimiseks;

—	UV-lambi alusplaat, et jälgida PCR-saadusi pärast agaroosgeeli elektroforeesimist;

—	geelil tekkinud kujutiste visualiseerimise süsteem.

Kõikide eespool kirjeldatud toimingute ajal peab laborant kandma kitlit ja kindaid. Kitlit ja kindaid on soovitav vahetada pärast iga olulisemat toimingut – DNA ekstraheerimist, PCR-segu valmistamist, proovide võtmist, amplifitseerimist ja saaduste ülekandmist geelile.

Nimetatud toimingud on soovitav teha eri ruumides. Eelkõige peaksid eri ruumides toimuma amplifitseerimine ja geelile ülekandmine/elektroforees ning DNA ekstraheerimine, PCR-segu valmistamine ja DNA määramine.

4. Menetlus

4.1. Proovi ettevalmistamine

Elusalt või äsja surnud (mitte veel lagunenud) külmutatud austrilt ekstraheeritakse DNA.

Proove käsitletakse vastavalt nende suurusele:

a)	vastsete puhul: terviklikke loomi (sh austrikarpi) sisaldavatele 50 mg proovidele lisatakse 200 μl destilleeritud vett, segu purustatakse ja tsentrifuugitakse 1 000 g juures 1 minuti jooksul;

b)	vastsete puhul, mille pikkus on kuni 6 mm: terviklikke loomi (sh austrikarpi) sisaldavatele 300 mg proovidele lisatakse 1 200 μl destilleeritud vett, segu purustatakse ja tsentrifuugitakse 1 000 g juures 1 minuti jooksul;

c)	vastsete puhul, mille pikkus on 6–15 mm, purustatakse eraldi iga isend koos kõikide pehmete kudedega;

d)	üle 15 mm pikkuste loomade puhul eraldatakse lõpused ja mantel.

DNA ekstraheerimisel kasutatakse komplekti QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) ja järgitakse kudede testimise eeskirja.

Seejärel valmistatakse proovid ette järgmises järjekorras.

1.	Punktides a ja b kirjeldatud näidiste puhul asetatakse 100 μl supernatanti ning punktides c ja d kirjeldatud näidiste puhul 10–50 mg kudesid mikrotsentrifuugi 1,5 ml katsutisse ning lisatakse 180 μl puhvrit ATL.

Lisatakse 20 μl proteinaasi K, segatakse pöörissegajas ja inkubeeritakse temperatuuril 56 °C, kuni koed on täielikult lüüsunud (üleöö). Vajaduse korral, kui proovi on vaja ühtlustada, segatakse seda inkubeerimise ajal pöörissegajas. Mikrotsentrifuugi 1,5 ml katsutit tsentrifuugitakse lühidalt, et eraldada korgilt tilgad.

3.	Proovile lisatakse 200 μl puhvrit AL, segatakse pulseerivas pöörissegajas 15 sekundit ja inkubeeritakse 10 minuti jooksul temperatuuril 70 °C. Mikrotsentrifuugi 1,5 ml katsutit tsentrifuugitakse lühidalt, et eraldada korgilt tilgad.

4.	Proovile lisatakse 200 μl etanooli (96–100 %) ja segatakse pulseerivas pöörissegajas 15 sekundit. Mikrotsentrifuugi 1,5 ml katsutit tsentrifuugitakse lühidalt, et eraldada korgilt tilgad.

Pärast 4. etappi saadud segu asetatakse ettevaatlikult komplekti QIAamp tsentrifuugitavasse kolonni (asub 2 ml katsutis) ilma kolonni servi niisutamata. Kork suletakse ja proovi tsentrifuugitakse 10 000 p/min 1 minuti jooksul. QIAamp tsentrifuugitav kolonn asetatakse puhtasse 2 ml katsutisse (komplektis) ja filtraati sisaldav katsuti visatakse ära.

QIAamp tsentrifuugitav kolonn avatakse ettevaatlikult ja lisatakse 500 μl puhvrit AW1 ilma kolonni servi niisutamata. Kork suletakse ja proovi tsentrifuugitakse 10 000 p/min 1 minuti jooksul. QIAamp tsentrifuugitav kolonn asetatakse puhtasse 2 ml katsutisse (komplektis) ja filtraati sisaldav katsuti visatakse ära.

7.	QIAamp tsentrifuugitav kolonn avatakse ettevaatlikult ja lisatakse 500 μl puhvrit AW2 ilma tsentrifuugikatsuti servi niisutamata. Kork suletakse ja proovi tsentrifuugitakse täiskiirusel 14 000 p/min 3 minuti jooksul.

8.	(Vajaduse korral) QIAamp tsentrifuugitav kolonn asetatakse puhtasse 2 ml katsutisse (ei ole komplektis) ja filtraati sisaldav katsuti visatakse ära. Proovi tsentrifuugitakse täiskiirusel 14 000 p/min 1 minuti jooksul.

QIAamp tsentrifuugitav kolonn asetatakse mikrotsentrifuugi puhtasse 1,5 ml katsutisse (komplektis) ja filtraati sisaldav katsuti visatakse ära. QIAamp tsentrifuugitav kolonn avatakse ettevaatlikult ja lisatakse 100 μl destilleeritud vett. Proovi inkubeeritakse 5 minutit toatemperatuuril ja tsentrifuugitakse seejärel 10 000 p/min 1 minuti jooksul.

10.	Kontrollitakse ekstraheerimise kvaliteeti ja tõhusust (näiteks mõõdetakse OD [260 nm] spektrofotomeetriga või pärast elektroforeesi agaroosgeelil).

11.	Proovi lahjendatakse, et DNA lõppkontsentratsioon oleks 50–100 ng/μl.

12.	Kuni PCR-analüüsi tulemuste saamiseni hoitakse DNA lahust temperatuuril 4 °C.

DNA ekstraheerimiseks võib kasutada ka teisi müügil olevaid komplekte, kui on tõendatud, et need annavad samasuguse tulemuse.

4.2. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

4.2.1. Reaktiivid:

—	10 X reaktsioonipuhver (Taq DNA polümeraasi komplektis);

—	MgCl2 (DNA polümeraasi komplektis) (25 mM);

—	Taq DNA polümeraas (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl;

—	dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM) tuleb lahjendada 10 korda (2 mM) enne kasutamist;

—	d H2O (DNA- ja RNA-vaba destilleeritud vesi).

4.2.2. Praimerid

Kasutada tuleb järgmisi praimereid (1):

CF (10 μM);

CR (10 μM).

4.2.3. PCR-segu

PCR-segu kõikide katsutite jaoks on järgmine:

	Katsuti maht	Lõppkontsentratsioon
Reaktsioonipuhver (10 X)	5 μl	1 X
MgCl2 (25 mM)	5 μl	2,5 mM
dNTP (2 mM)	5 μl	0,2 mM
CF (10 μM)	1 μl	0,2 μM
CR (10 μM)	1 μl	0,2 μM
Taq-polümeraas (5 U/μl)	0,5 μl	2,5 U
dH2O	31,5 μl

—	Igasse katsutisse lisatakse 49 μl kõnealust PCR-segu.

—	Igasse katsutisse lisatakse 1 μl ekstraheeritud DNAd (50–100 ng/μl).

4.2.4. Kontrollimine

Kasutatakse kaht tüüpi kontrollimist.

—	Negatiivne kontroll sisaldab dH2O (1 μl dH2O; 49 μl PCR-segu). Negatiivse kontrolli eesmärk on tuvastada töökeskkonna võimalikku saastatust reaktiividega. Negatiivne kontroll tuleb teha iga 10 proovi järel või iga proovide partii järel.

—	Positiivne kontroll sisaldab plasmiidset DNAd, mis sisaldab viiruse OsHV-1 teatavat järjestust CF-CR. Kontrolli eesmärk on kontrollida PCR-reaktsiooni tõhusust. Iga PCR-analüüsi kohta tuleb teha üks positiivne kontroll. Positiivseid kontrolle saab ühenduse referentlaboritest.

4.2.5. Amplifitseerimine

Amplifitseerimiseks kasutatakse termotsüklerit.

—	Esialgne denaturatsioon: 2 minutit temperatuuril 94 °C.

—	Amplifitseerimine: 35 tsüklit (1 minut 94 °C, 1 minut 50 °C ja 1 minut 72 °C).

—	Lõplik elongatsioon: 5 minutit temperatuuril 72 °C.

4.3. Elektroforees

4.3.1. Reaktiivid:

—

50 X TAE (selle võib osta kasutusvalmina):

—	Tris-alus (40 mM) 242 g;

—	Jää-äädikhape (40 mM) 57,1 ml;

—	Na2EDTA·2H2O (1 mM) 18,61 g;

—	d H2O 1 liitri lahuse valmistamiseks;

—	Lahuse pH viiakse väärtuseni 8.

—	Agaroosgeel 2,5 % 1 X TAE: Etiidiumbromiid (0,5 μg/ml), lisatakse pärast geeli jahutamist.

—

Sinine puhver:

—	Bromofenoolsinine 0,25 %;

—	Ksüleen-tsüanool FF 0,25 %;

—	Sahharoos 40 %.

—	Säilitatakse temperatuuril 4 °C.

—	Kasutatakse kuuekordselt lahustatuna (2 μl sinist proovipuhvrit 10 μl PCR-saaduse kohta).

—	Molekulmassi marker: SmartLadder SF (Eurogentec): kasutusvalmis molekulmassi marker, mis koosneb 9 korrapäraste vahedega rajast pikkusega 100 – 1 000 aluspaari.

4.3.2. Agaroosgeeli valmistamine

1.	Kaalutakse 2,5 g agaroosi, lisatakse 100 ml 1 X TAE ja kuumutatakse kuni segu sulamiseni.

2.	Pärast lahuse jahutamist lisatakse 5 μl etiidiumbromiidi 100 ml agaroosgeeli kohta, seejärel valatakse lahus kammidega varustatud alusplaadile (taskute vormimiseks).

3.	Kui geel on tardunud, eemaldatakse kammid ja geel asetatakse horisontaalsesse elektroforeesisüsteemi, milles on piisavalt reaktsioonipuhvrit 1 X TAE, et see kataks agaroosgeeli täielikult.

4.	10 μl PCR-saadust segatakse 2 μl sinise puhvriga (6 X), mis on varem taskutesse pipeteeritud.

5.	Üks tasku on ette nähtud molekulmassi markeri jaoks (5 μl).

6.	Sõltuvalt geeliplaadi suurusest ja paksusest kasutatakse foreesimisel pinget 50–150 volti ning forees kestab 30 minutit kuni 1 tund.

7.	Geeli vaadeldakse UV-lambi all.

4.4. Tõlgendamine

Viiruse OsHV-1 μvar olemasolule proovis osutab vastava pikkusega riba (kui 157 aluspaari asemel on 173 aluspaari, osutab see viiruse OsHV-1 esinemisele) 2,5 % agaroosgeelil, kui kõikide negatiivsete kontrollide vastused on negatiivsed ja kõikide positiivsete kontrollide vastused on positiivsed.

C OSA

Isoleeritud ala kindlaksmääramine

Artikli 2 lõikes 2 osutatud isoleeritud ala kindlaksmääramisel tuleb arvesse võtta järgmisi tegureid, mis mõjutavad taudi leviku ohtu:

a)	nakatunud molluskite arv, osatähtsus ja jaotus kasvandustes või molluskikasvatuspiirkondades;

b)	lähima kasvanduse või kasvatuspiirkonna kaugus ja kasvanduste tihedus;

c)	kaugus töötlevatest ettevõtetest; kokkupuude muude kasvanduste või kasvatuspiirkondadega;

d)	kasvandustes või kasvatuspiirkondades kasvatatavad liigid;

e)	nakatunud ja lähedal asuvates kasvandustes ja kasvatuspiirkondades kohaldatavad tootmisviisid ning

f)	hüdrodünaamilised tingimused ja muud identifitseeritud epidemioloogilise tähtsusega faktorid.

(1) Kõnealuseid praimereid või nende kirjeldusi saab molluskihaiguste tuvastamise ühenduse referentlaborist (LGP-Ifremer, av de Mus de Loup, 17390 La Tremblade, Prantsusmaa).