02008R0440 — ET — 18.05.2017 — 007.001


Käesolev tekst on üksnes dokumenteerimisvahend ning sel ei ole mingit õiguslikku mõju. Liidu institutsioonid ei vastuta selle teksti sisu eest. Asjakohaste õigusaktide autentsed versioonid, sealhulgas nende preambulid, on avaldatud Euroopa Liidu Teatajas ning on kättesaadavad EUR-Lexi veebisaidil. Need ametlikud tekstid on vahetult kättesaadavad käesolevasse dokumenti lisatud linkide kaudu

►B

KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 440/2008,

30. mai 2008,

millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)

(EMPs kohaldatav tekst)

(ELT L 142 31.5.2008, lk 1)

Muudetud:

 

 

Euroopa Liidu Teataja

  nr

lehekülg

kuupäev

►M1

KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 761/2009, 23. juuli 2009,

  L 220

1

24.8.2009

 M2

KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 1152/2010, 8. detsember 2010,

  L 324

13

9.12.2010

►M3

KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 640/2012, 6. juuli 2012,

  L 193

1

20.7.2012

►M4

KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 260/2014, 24. jaanuar 2014,

  L 81

1

19.3.2014

►M5

KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 900/2014, 15. juuli 2014,

  L 247

1

21.8.2014

►M6

KOMISJONI MÄÄRUS (EL) 2016/266, 7. detsember 2015,

  L 54

1

1.3.2016

►M7

KOMISJONI MÄÄRUS (EL) 2017/735, 14. veebruar 2017,

  L 112

1

28.4.2017




▼B

KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 440/2008,

30. mai 2008,

millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)

(EMPs kohaldatav tekst)



Artikkel 1

Määruse (EÜ) nr 1907/2006 rakendamisel kasutatavad katsemeetodid on esitatud käesoleva määruse lisas.

Artikkel 2

Komisjon vaatab käesolevas määruses esitatud katsemeetodeid vajaduse korral läbi, et asendada, vähendada ja täiustada selgroogsetega tehtavaid katseid.

Artikkel 3

Viiteid direktiivi 67/548/EMÜ V lisale tõlgendatakse viidetena käesolevale määrusele.

Artikkel 4

Käesolev määrus jõustub järgmisel päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolevat määrust kohaldatakse alates 1. juunist 2008.




LISA

▼M6

Märkus

Kui ükskõik millise allpool kirjeldatud katsemeetodi puhul ei ole määratletud selle sobivust segude, mitut koostisosa sisaldavate ainete (multi-constituent substance, MCS) või tundmatu või muutuva koostisega ainete, komplekssete reaktsioonisaaduste või bioloogilist päritolu materjalide (UVCB) analüüsimiseks, tuleb enne meetodi kasutamist segu, mitut koostisosa sisaldava aine või UVCB analüüsimiseks kaaluda, kas asjaomane meetod on taotletavat regulatiivset eesmärki silmas pidades sobiv.

Kui asjaomast katsemeetodit kasutatakse segu, mitut koostisosa sisaldava aine või UVCB analüüsimiseks, tuleks teha kättesaadavaks piisav ja võimalikult ammendav teave sellise segu või aine koostise kohta, nt selle koostisosade keemilise määratluse, kvantitatiivse sisalduse ja asjakohaste omaduste kohta.

▼B




A OSA: FÜÜSIKALIS-KEEMILISTE OMADUSTE MÄÄRAMISE MEETODID

SISUKORD

A.1.

SULAMIS-/KÜLMUMISTEMPERATUUR

A.2.

KEEMISTEMPERATUUR

A.3.

SUHTELINE TIHEDUS

A.4.

AURURÕHK

A.5.

PINDPINEVUS

A.6.

LAHUSTUVUS VEES

A.8.

JAOTUSTEGUR

A.9.

LEEKPUNKT

A.10.

SÜTTIVUS (TAHKED AINED)

A.11.

SÜTTIVUS (GAASID)

A.12.

SÜTTIVUS (KOKKUPUUTEL VEEGA)

A.13.

TAHKETE AINETE JA VEDELIKE ISESÜTTIVUS

A.14.

PLAHVATUSOHTLIKKUS

A.15.

ISESÜTTIMISTEMPERATUUR (VEDELIKUD JA GAASID)

A.16.

TAHKETE AINETE SUHTELINE ISESÜTTIMISTEMPERATUUR

A.17.

OKSÜDEERIVAD OMADUSED (TAHKED AINED)

A.18.

POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA MOLEKULMASSIDE JAOTUS

A.19.

MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS POLÜMEERIS

A.20.

POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITUMINE VEES

A.21.

OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD)

A.22.

KIUDUDE PIKKUSE JÄRGI KAALUTUD GEOMEETRILINE KESKMINE DIAMEETER

A.23.

JAOTUSKOEFITSIENT (SÜSTEEMIS 1-OKTANOOL-VESI): AEGLASE SEGAMISE MEETOD

А.24.

JAOTUSKOEFITSIENT (N-OKTANOOL/VESI): KÕRGEFEKTIIVSE VEDELIKKROMATOGRAAFIA (HPLC) MEETOD

A.25.

DISSOTSIATSIOONIKONSTANDID VEES (TIITRIMISMEETOD, SPEKTROFOTOMEETRILINE MEETOD, KONDUKTOMEETRILINE MEETOD)

A.1.   SULAMIS-/KÜLMUMISTEMPERATUUR

1.   MEETOD

Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.

1.1.   SISSEJUHATUS

Kirjeldatud meetodid ja seadmed on ette nähtud ainete sulamistemperatuuri määramiseks olenemata nende puhtusastmest.

Meetodi valik sõltub analüüsitava aine iseloomust. Määravaks teguriks on see, kas aine on kergesti või raskesti või üldse mitte peenestatav.

Mõnede ainete puhul on kohasem määrata külmumis- või tahkumistemperatuur ning meetod sisaldab ka nende määramise standardeid.

Kui aine teatavate omaduste tõttu ei ole otstarbekohane määrata ühtki eespool toodud parameetrit, võib otstarbekas olla määrata hangumistemperatuur.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Sulamistemperatuuri defineeritakse temperatuurina, mille juures aine läheb tahkest olekust vedelasse, ja ideaalis vastab see temperatuur külmumistemperatuurile.

Kuna paljude ainete puhul toimub faasisiire mingis temperatuurivahemikus, nimetatakse seda sageli sulamisvahemikuks.

Ühikute teisendamine (K oC-ks)

t = T – 273,15

t

:

temperatuur Celsiuse skaalal, Celsiuse kraadides ( oC)

T

:

termodünaamiline temperatuur, kelvinites (K)

1.3.   VÕRDLUSAINED

Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

Mõned kaliibrimisained on loetletud viites 4.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Määratakse temperatuur (temperatuurivahemik), mille juures toimub faasisiire tahkest olekust vedelasse või vedelast olekust tahkesse. Praktikas määratakse testaine proovi atmosfäärirõhul kuumutamisel/jahutamisel sulamise/külmumise alg- ja lõppfaasi temperatuurid. Kirjeldatud viit tüüpi meetodeid, nimelt kapillaartorumeetodit, kuumlaua meetodeid, külmumistemperatuuri määramisi, termoanalüüsimeetodeid ja (naftaõlide jaoks välja töötatud) hangumistemperatuuri määramist.

Teatud juhtudel võib olla otstarbekas määrata külmumistemperatuuri asemel sulamistemperatuur.

1.4.1.   Kapillaartorumeetod

1.4.1.1.   Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks

Väike kogus peenestatud ainet viiakse kapillaartorusse ja surutakse tihedalt kokku. Kapillaartoru kuumutatakse koos termomeetriga, reguleerides temperatuuri tõusu nii, et tegeliku sulamisprotsessi ajal tõuseb temperatuur kiirusega umbes alla 1 K/min. Määratakse sulamise alg- ja lõpptemperatuur.

1.4.1.2.   Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks

Põhimõttelt analoogsed punktis 1.4.1.1 kirjeldatuga, kuid kapillaartoru ja termomeeter asuvad kuumutatavas metallplokis ning on vaadeldavad plokis olevate vaatlusavade kaudu.

1.4.1.3.   Määramine fotoraku abil

Kapillaartorus asuvat proovi kuumutatakse automaatrežiimil metallsilindris. Silindris oleva ava kaudu juhitakse läbi aine täppiskaliibritud fotorakule suunatud valguskiir. Enamiku ainete optilised omadused muutuvad sulades läbipaistmatust läbipaistvaks. Fotorakuni jõudva valguse intensiivsus suureneb ja saadab kuumkambris asuva plaatina-takistustermomeetri temperatuuri digitaalnäidikule stoppsignaali. Mõnede tugeva värvusega ainete jaoks see meetod ei sobi.

1.4.2.   Kuumlauad

1.4.2.1   Kofleri sulavuslaud

Kofleri sulavuslaud koosneb kahest erineva soojusjuhtivusega elektriliselt kuumutatavast metallosast, kusjuures laud on valmistatud selliselt, et temperatuurigradient on kogu selle pikkuses peaaegu lineaarne. Sulavuslaua temperatuur võib varieeruda piirides 283–573 K ning sellel on spetsiaalne temperatuurinäidik antud lauale kohandatud skaala, osuti ja jooksikuga. Sulamistemperatuuri määramiseks kantakse aine õhukese kihina otse sulavuslaua pinnale. Mõne sekundi jooksul kujuneb välja terav eraldusjoon vedela ja tahke faasi vahel. Temperatuuri eraldusjoonel loetakse osuti viimisega eraldusjoonele.

1.4.2.2.   Sulavusmikroskoop

Väga väikeste materjalikoguste sulamistemperatuuri määramisel kasutatakse mitmesuguste kuumlaudadega mikroskoope. Enamiku kuumlaudade puhul mõõdetakse temperatuuri tundliku termopaari abil, vahel kasutatakse aga elavhõbetermomeetrit. Tüüpilises sulavusmikroskoobi kuumlauas on kuumkamber, milles olevale metallalusele asetatakse objektiklaasil olev proov. Metallaluse keskel on ava, mille kaudu siseneb mikroskoobi valguspeeglist lähtuv valgus. Kasutamise ajal suletakse kamber klaasplaadiga, mis takistab õhu juurdepääsu proovile.

Proovi kuumutamist reguleeritakse reostaadiga. Väga täpseteks mõõtmisteks optiliselt anisotroopsete ainetega võib kasutada polariseeritud valgust.

1.4.2.3.   Meniskimeetod

Seda meetodit kasutatakse eelkõige polüamiidide puhul.

Temperatuur, mille juures kuumlaua ja polüamiid-katseobjektile toetuva katteklaasi vahele paigutatud silikoonõli menisk nihkub, määratakse visuaalselt.

1.4.3.   Külmumistemperatuuri määramise meetod

Proov asetatakse spetsiaalsesse katseklaasi ja paigutatakse külmumistemperatuuri määramiseks seadmesse. Jahutamise ajal segatakse proovi pidevalt kergelt ja mõõdetakse sobivate vaheaegade tagant temperatuuri. Niipea, kui temperatuur paari mõõtmise kestel püsima jääb, registreeritakse see temperatuur külmumistemperatuurina (arvestades ka termomeetri viga).

Vältida tuleb allajahutamist, säilitades tahke ja vedela faasi vahel tasakaalu.

1.4.4.   Termoanalüüs

1.4.4.1   Diferentsiaaltermoanalüüs (DTA)

Registreeritakse ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride erinevuse sõltuvus temperatuurist. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (sulamine) või eksotermilise (külmumine) kõrvalekaldena temperatuurikõvera nulljoonest.

1.4.4.2   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria (SDK)

Registreeritakse neelduva energia koguse sõltuvus temperatuurist ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritavas aines ja võrdlusmaterjalis. Neelduv energia kulutatakse uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride ühtlustamisele. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (sulamine) või eksotermilise (külmumine) kõrvalekaldena soojusbilansi kõvera nulljoonest.

1.4.5.   Hangumistemperatuur

Meetod on välja töötatud naftaõlide jaoks ja sobib kasutamiseks madala sulamistemperatuuriga õlitaoliste ainete puhul.

Pärast algset kuumutamist jahutatakse proovi kindla kiirusega ja jälgitakse iga 3 K tagant selle voolavust. Madalaim temperatuur, mille juures aine liikumist täheldatakse, registreeritakse hangumistemperatuurina.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Erinevate sulamistemperatuuri/sulamisvahemiku määramise meetodite kohaldatavust ja täpsust kirjeldatakse järgmises tabelis.

TABEL: MEETODITE KOHALDATAVUS



A.  Kapillaartorumeetodid

Mõõtmismeetod

Peenestatavad ained

Raskesti peenestatavad ained

Temperatuurivahemik

Hinnanguline täpsus (1)

Olemasolev standard

Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks

jah

Ainult mõnede puhul

273–573 K

± 0,3 K

JIS K 0064

Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks

jah

Ainult mõnede puhul

293 kuni > 573 K

± 0,5 K

ISO 1218 (E)

Määramine fotoraku abil

jah

Lisaseadmete abil paljude puhul

253–573 K

± 0,5 K

 

(1)   Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.



B.  Kuumlauad ja külmutamismeetodid

Mõõtmismeetod

Peenestatavad ained

Raskesti peenestatavad ained

Temperatuurivahemik

Hinnanguline täpsus (1)

Olemasolev standard

Kofleri sulavuslaud

jah

ei

283 kuni > 573 K

± 1,0 K

ANSI/ASTM D 3451-76

Sulavusmikroskoop

jah

Ainult mõnede puhul

273 kuni > 573 K

± 0,5 K

DIN 53736

Meniskimeetod

ei

Eelkõige polüamiidide puhul

293 kuni > 573 K

± 0,5 K

ISO 1218 (E)

Külmumistemperatuuri meetodid

jah

jah

223–573 K

± 0,5 K

nt BS 4695

(1)   Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.



C.  Termoanalüüs

Mõõtmismeetod

Peenestatavad ained

Raskesti peenestatavad ained

Temperatuurivahemik

Hinnanguline täpsus (1)

Olemasolev standard

Diferentsiaaltermoanalüüs

jah

jah

173 – 1 273 K

kuni 600 K ± 0,5 K kuni 1 273 K ± 2,0 K

ASTM E 537-76

Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria

jah

jah

173 – 1 273 K

kuni 600 K ± 0,5 K kuni 1 273 K ± 2,0 K

ASTM E 537-76

(1)   Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.



D.  Hangumistemperatuur

Mõõtmismeetod

Peenestatavad ained

Raskesti peenestatavad ained

Temperatuurivahemik

Hinnanguline täpsus (1)

Olemasolev standard

Hangumistemperatuur

Naftaõlide ja õlitaoliste ainete jaoks

Naftaõlide ja õlitaoliste ainete jaoks

223–323 K

± 3,0 K

ASTM D 97-66

(1)   Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.

1.6.   MEETODITE KIRJELDUS

Peaaegu kõigi katsemeetodite kirjeldus on ära toodud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites (vt liidet 1).

1.6.1.   Kapillaartorumeetodid

Temperatuuri aeglasel tõstmisel ilmnevad peenestatud ainete puhul tavaliselt joonisel 1 näidatud sulamisetapid.

Joonis 1

image

Sulamistemperatuuri määramisel registreeritakse temperatuur nii sulamise alg- kui ka lõppfaasis.

1.6.1.1.   Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks

Joonisel 2 on näidatud standarditud klaasist sulamistemperatuuri määramise seadet (JIS K 0064); kõik mõõdud on millimeetrites.

image

Valida tuleks sobiv vedelik. Vedeliku valik sõltub määratavast sulamistemperatuurist, nt sobib parafiinõli sulamistemperatuuridele kuni 473 K, silikoonõli sulamistemperatuuridele kuni 573 K.

523 K ületavate sulamistemperatuuride puhul võib kasutada segu kolmest osast väävelhappest ja kahest osast (massisuhtes) kaaliumsulfaadist. Seesuguste segude kasutamisel tuleb rakendada kohaseid ettevaatusabinõusid.

Kasutada tuleks ainult järgmiste või nendega võrdväärsete standardite nõuetele vastavaid termomeetreid:

ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Kuiv aine peenestatakse uhmris ja viiakse ühest otsast kinnisesse kapillaartorusse nii, et pärast kokkusurumist täidab aine kapillaartoru 3 mm ulatuses. Ühtlaselt tihendatud proovi saamiseks tuleks kapillaartorul lasta klaastorus umbes 700 mm kõrguselt vertikaalselt vastu kellaklaasi kukkuda.

Täidetud kapillaartoru paigutatakse vanni nii, et termomeetri elavhõbedareservuaari keskosa puutub kapillaartoruga kokku kohas, kus asub proov. Tavaliselt asetatakse kapillaartoru seadmesse temperatuuril umbes 10 K alla sulamistemperatuuri.

Vannivedelikku soojendatakse nii, et temperatuur tõuseb umbes 3 K/min. Soovitatav on vedelikku segada. Umbes 10 K enne eeldatava sulamistemperatuurini jõudmist vähendatakse temperatuuri tõusu kiiruseni mitte üle 1 K/min.

Sulamistemperatuur arvutatakse järgmiselt:

T = TD+ 0,00016 (TD – TE) n

kus:

T

=

parandatud sulamistemperatuur (K)

TD

=

termomeetri D temperatuurinäit (K)

TE

=

termomeetri E temperatuurinäit (K)

n

=

skaalajaotuste arv termomeetri D elavhõbedasamba väljaulatuval osal

1.6.1.2.   Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks

Koosneb:

 silindrilisest metallplokist, mille ülaosa on õõnes ja moodustab kambri (vt joonist 3);

 metallkorgist ühe või kahe avaga, mis võimaldavad metallplokki torusid paigaldada;

 metallploki kütteseadmest, mis võib olla lahendatud näiteks elektritakistusena plokis;

 reostaadist võimsuse reguleerimiseks juhul, kui kasutatakse elektrilist kütteseadet;

 neljast üksteise suhtes täisnurga all paiknevast kuumuskindla klaasiga aknast kambri külgseintel. Ühe sellise akna ette on paigaldatud okulaar kapillaartoru jälgimiseks. Kolme ülejäänud akent kasutatakse sisemuse valgustamiseks lampide abil;

 ühest otsast kinnisest kuumuskindlast klaasist kapillaartorust (vt 1.6.1.1).

Vt punktis 1.6.1.1 nimetatud standardeid. Sobivad ka võrreldava täpsusega termoelektrilised mõõteseadmed.

image

1.6.1.3.   Määramine fotoraku abil

Seade ja katse käik

Seade koosneb automaatse küttesüsteemiga metallkambrist. Kolm kapillaartoru täidetakse vastavalt punktile 1.6.1.1 ja paigutatakse ahju.

Seadme kaliibrimiseks on võimalik kasutada mitmesuguseid lineaarseid temperatuuritõuse; sobivat temperatuuritõusu reguleeritakse elektriliselt vastavalt seadistatud konstantsele lineaarsele tõusukiirusele. Meerikud näitavad ahju tegelikku temperatuuri ja kapillaartorus oleva aine temperatuuri.

1.6.2.   Kuumlauad

1.6.2.1.   Kofleri sulavuslaud

Vt liidet.

1.6.2.2.   Sulavusmikroskoop

Vt liidet.

1.6.2.3.   Meniskimeetod (polüamiididele)

Vt liidet.

Sulamistemperatuuri vahemikus ei tohiks temperatuur tõusta kiiremini kui 1 K/min.

1.6.3.   Külmumistemperatuuri määramise meetodid

Vt liidet.

1.6.4.   Termoanalüüs

1.6.4.1.   Diferentsiaaltermoanalüüs

Vt liidet.

1.6.4.2.   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria

Vt liidet.

1.6.5.   Hangumistemperatuuri määramine

Vt liidet.

2.   ANDMED

Mõningatel juhtudel on termomeetri näitusid vaja korrigeerida.

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 kasutatud meetodit;

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);

 hinnangulist täpsust.

Sulamistemperatuurina registreeritakse vähemalt kahe hinnangulise täpsuse piiridesse (vt tabeleid) jääva mõõtetulemuse keskmine.

Kui sulamise alg- ja lõppfaasi temperatuuride vahe jääb meetodi hinnangulise täpsuse piiridesse, registreeritakse sulamistemperatuurina sulamise lõppfaasi temperatuur; vastasel juhul registreeritakse mõlemad väärtused.

Kui aine enne sulamistemperatuurini jõudmist laguneb või sublimeerub, registreeritakse temperatuur, mille juures see aset leiab.

Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.

4.   VIITED

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.

2. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.

3. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

4. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.

Liide

Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.

1.   Kapillaartoru meetodid

1.1.   Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks



ASTM E 324-69

Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

BS 4634

Method for the determination of melting point and/or melting range

DIN 53181

Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren

JIS K 00-64

Testing methods for melting point of chemical products

1.2.   Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks



DIN 53736

Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

ISO 1218 (E)

Plastics – polyamides – determination of „melting point”

2.   Kuumlauad

2.1.   Kofleri sulavuslaud



ANSI/ASTM D 3451

76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2.   Sulavusmikroskoop



DIN 53736

Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3.   Meniskimeetod (polüamiididele)



ISO 1218 (E)

Plastics – polyamides – determination of „melting point”

ANSI/ASTM D 2133-66

Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

NF T 51-050

Résines de polyamides. Determination du „point de fusion” Methode du ménisque

3.   Külmumistemperatuuri määramise meetodid



BS 4633

Method for the determination of crystallizing point

BS 4695

Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)

DIN 51421

Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen

ISO 2207

Cires de pétrole: détermination de la température de figeage

DIN 53175

Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren

NF T 60-114

Point de fusion des paraffines

NF T 20-051

Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)

ISO 1392

Method for the determination of the freezing point

4.   Termoanalüüs

4.1.   Diferentsiaaltermoanalüüs



ASTM E 537-76

Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86

Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005

Thermisches Analyse, Begriffe

4.2.   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria



ASTM E 537-76

Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86

Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005

Thermisches Analyse, Begriffe

5.   Hangumistemperatuuri määramine



NBN 52014

Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt

ASTM D 97-66

Standard test method for pour point of petroleum oils

ISO 3016

Petroleum oils – Determination of pour point.

A.2.   KEEMISTEMPERATUUR

1.   MEETOD

Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.

1.1.   SISSEJUHATUS

Siin kirjeldatud meetodeid ja seadmeid saab kasutada vedelate ja madala sulamistemperatuuriga ainete korral eeldusel, et nendega ei toimu allpool keemistemperatuuri mingeid keemilisi reaktsioone (näiteks autooksüdatsiooni, ümberasetust, lagunemist jne). Meetodid sobivad kohaldamiseks nii puhastele kui ka lisanditega vedelikele.

Põhirõhk on pandud fotorakk-detektorit või termoanalüüsi kasutavatele meetoditele, kuna need sobivad nii sulamis- kui ka keemistemperatuuri määramiseks. Lisaks on mõõtmised automatiseeritavad.

„Dünaamilise meetodi” eelis on sobivus ka aururõhu määramiseks ning puudub vajadus parandada keemistemperatuuri normaalrõhule (101,325 kPa), kuna rõhku on mõõtmise käigus võimalik manostaadi abil normaalrõhule reguleerida.

Märkused

Lisandite mõju keemistemperatuuri määramisele sõltub olulisel määral lisandi iseloomust. Kui proov sisaldab tulemust mõjutada võivaid lenduvaid lisandeid, võib seda puhastada.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Keemistemperatuur normaalrõhul defineeritakse temperatuurina, mille juures vedeliku aururõhk on 101,325 kPa.

Kui keemistemperatuuri ei määrata normaalrõhul, kirjeldab aururõhu sõltuvust temperatuurist Clausiuse-Clapeyroni võrrand:

image

kus:

P

=

aine aururõhk paskalites

ΔHV

=

aine aurustumissoojus (J mol-1)

R

=

universaalne gaasikonstant = 8,314 (J mol-1 K-1)

T

=

termodünaamiline temperatuur (K)

Keemistemperatuur registreeritakse mõõtmisaegse õhurõhu suhtes.

Teisendused

Rõhk (ühikud: kPa)

100 kPa

=

1bar = 0,1 MPa

(ühik „bar” on lubatud, kuid ei ole soovitatav)

133 Pa

=

1mm Hg=1 Torr

(ühikud „mm Hg” ja „Torr” ei ole lubatud)

1 atm

=

normaalatmosfäär = 101 325 Pa

(ühik „atm” ei ole lubatud)

Temperatuur (ühikud: K)

t = T - 273,15

t

:

temperatuur Celsiuse skaalal, Celsiuse kraadides ( oC)

T

:

termodünaamiline temperatuur, kelvinites (K)

1.3.   VÕRDLUSAINED

Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

Mõned kaliibrimisained on ära toodud liites loetletud meetodites.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Viis meetodit keemistemperatuuri (keemistemperatuuri vahemiku) määramiseks põhinevad keemistemperatuuri mõõtmisel, ülejäänud kaks termoanalüüsil.

1.4.1.   Määramine ebulliomeetri abil

Ebulliomeetrid töötati algselt välja molaarmassi määramiseks keemistemperatuuri tõusu järgi, kuid nad sobivad ka keemistemperatuuri täpseks mõõtmiseks. Väga lihtsat seadet kirjeldatakse ASTM D 1120-72 (vt liidet). Selles seadmes kuumutatakse vedelikku atmosfäärirõhul tasakaalutingimustes kuni keemiseni.

1.4.2.   Dünaamiline meetod

Selle meetodi kohaselt mõõdetakse keemise ajal tagasijooksus sobiva termomeetri abil auru kondensatsioonitemperatuur. Meetod võimaldab rõhku varieerida.

1.4.3.   Destillatsioonimeetod keemistemperatuuri määramiseks

Selle meetodi kohaselt mõõdetakse vedeliku destillatsioonil auru kondensatsioonitemperatuur ja destillaadi kogus.

1.4.4.   Siwoloboffi meetod

Proovi kuumutatakse katseklaasis vedelikuvannil. Katseklaasi paigutatakse alt kinni joodetud kapillaartoru, mille alumises osas on õhumull.

1.4.5.   Määramine fotoraku abil

Mõõtmine tehakse eralduvate mullide põhjal automaatselt ja fotoelektriliselt, järgides Siwoloboffi meetodit.

1.4.6.   Diferentsiaaltermoanalüüs

Registreeritakse ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride erinevuse sõltuvus temperatuurist. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (keemine) kõrvalekaldena temperatuurikõvera nulljoonest.

1.4.7.   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria

Registreeritakse neelduva energia koguse sõltuvus temperatuurist ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritavas aines ja võrdlusmaterjalis. Neelduv energia kulutatakse uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride ühtlustamisele. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (keemine) kõrvalekaldena soojusbilansi kõvera nulljoonest.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Erinevate keemistemperatuuri/keemistemperatuuri vahemiku määramise meetodite kohaldatavust ja täpsust kirjeldatakse tabelis 1.



Tabel 1.

Meetodite võrdlus

Mõõtmismeetod

Hinnanguline täpsus

Olemasolev standard

Ebulliomeeter

± 1,4 K (kuni 373 K) (1)(2)

± 2,5 K (kuni 600 K) (1)(2)

ASTM D 1120-72 (1)

Dünaamiline meetod

± 0,5 K (kuni 600 K) (2)

 

Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik)

± 0,5 K (kuni 600 K)

ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71

Siwoloboffi meetod

± 2 K (kuni 600 K) (2)

 

Määramine fotoraku abil

± 0,3 K (373 K juures) (2)

 

Diferentsiaaltermoanalüüs

± 0,5 K (kuni 600 K)

± 2,0 K (kuni 1 273 K)

ASTM E 537-76

Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria

± 0,5 K (kuni 600 K)

± 2,0 K (kuni 1 273 K)

ASTM E 537-76

(1)   See täpsus kehtib ainult lihtsa, näiteks ASTM D 1120-72 kirjeldusele vastava seadme puhul; keerukamate ebulliomeetrite abil on täpsust võimalik suurendada.

(2)   Kehtib ainult puhaste ainete puhul. Muudel juhtudel kasutamist tuleb põhjendada.

1.6.   MEETODITE KIRJELDUS

Osade katsemeetodite kirjeldus on ära toodud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites (vt liidet).

1.6.1.   Ebulliomeeter

Vt liidet.

1.6.2.   Dünaamiline meetod

Vt katsemeetodit A.4 aururõhu määramiseks.

Registreeritakse 101 325 kPA avaldatavale rõhule vastav keemistemperatuur.

1.6.3.   Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik)

Vt liidet.

1.6.4.   Siwoloboffi meetod

Ligikaudu 5 mm läbimõõduga katseklaasis olevat proovi kuumutatakse sulamistemperatuuri määramise seadmes (joonis 1).

Joonisel 1 on näidatud standarditud klaasist sulamis- ja keemistemperatuuri määramise seade (JIS K 0064) (kõik mõõdud on millimeetrites).

Joonis 1

image

Katseklaasi paigutatakse alumisest otsast ligikaudu 1 cm kauguselt kinni joodetud kapillaartoru (keedukapillaar). Lisatava testaine kogus valitakse selline, et kapillaartoru kinnijoodetud osa jääb allapoole vedeliku pinda. Keedukapillaariga katseklaas seotakse kas kummipaelaga termomeetri külge või kinnitatakse külgtoega (vt joonist 2).



Joonis 2

Siwoloboffi meetod

Joonis 3

Muudetud meetod

image

image

Vedelikuvannis kuumutamisel kasutatav vedelik valitakse keemistemperatuuri järgi. Temperatuuridel kuni 573 K võib kasutada silikoonõli. Parafiinõli võib kasutada maksimaalselt temperatuurini 473 K. Vannivedelikku soojendatakse nii, et temperatuur tõuseb umbes 3 K/min. Vannivedelikku tuleb segada. Umbes 10 K enne eeldatava keemistemperatuurini jõudmist vähendatakse soojendamist nii, et temperatuur tõuseb kiirusega alla 1 K/min. Keemistemperatuuri lähenedes hakkab keedukapillaarist kiiresti mulle eralduma.

Keemistemperatuur on selline temperatuur, mille juures mullide voog kiirel jahutamisel katkeb ning vedelikunivoo kapillaartorus hakkab järsult tõusma. Termomeetri vastav näit ongi aine keemistemperatuur.

Muudetud meetodi (joonis 3) kohaselt määratakse keemistemperatuur sulamistemperatuuri määramisel kasutatavas kapillaartorus. Selle ots tõmmatakse umbes 2 cm pikkuses peeneks (a) ja kapillaartorusse imetakse väike kogus proovi. Kapillaartoru avatud ots joodetakse kinni, nii et tippu jääb väike õhumull. Kuumutamisel sulamistemperatuuri määramise seadmes (b) õhumull paisub. Keemistemperatuur vastab temperatuurile, mille juures ainekork tõuseb vannivedeliku pinna tasemeni (c).

1.6.5.   Määramine fotoraku abil

Kapillaartorus olevat proovi kuumutatakse soojendatavas metallplokis.

Plokis olevate vastavate avade kaudu juhitakse läbi aine täppiskaliibritud fotorakule suunatud valguskiir.

Proovi temperatuuri tõusmisel hakkab keedukapillaarist üksikuid mulle eralduma. Keemistemperatuurile lähenedes kasvab eralduvate mullide arv märgatavalt. Selle tulemusel fotorakus registreeritava valguse intensiivsus suureneb ja saadab plokis asuva plaatinatakistustermomeetri temperatuuri näidikule stoppsignaali.

Meetod on väga mugav, kuna võimaldab ilma seadet muutmata mõõta keemistemperatuuri ka allpool toatemperatuuri kuni 253,15 K (–20 oC). Selleks tuleb seade lihtsalt jahutusvanni paigutada.

1.6.6.   Termoanalüüs

1.6.6.1.   Diferentsiaaltermoanalüüs

Vt liidet.

1.6.6.2.   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria

Vt liidet.

2.   ANDMED

Väikestel lahknevustel normaalrõhust (kuni ± 5 kPa) normaliseeritakse keemistemperatuuri väärtused keemistemperatuurile normaalrõhul (Tn) järgmise Sidney Youngi arvväärtus-võrrandi abil:

Tn = T + (fT × Δp)

kus:

Δp

=

(101,325 – p) (vt märki)

p

=

mõõdetud rõhk (kPa)

fT

=

keemistemperatuuri muutuse sõltuvus rõhust (K/kPa)

T

=

mõõdetud keemistemperatuur (K)

Tn

=

normaalrõhule parandatud keemistemperatuur (K)

Paljude ainete temperatuuriparandustegurid (fT) ning valemid nende ligikaudseks arvutamiseks on ära toodud eespool nimetatud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites.

Näiteks toob DIN 53171 ära järgmised ligikaudsed parandustegurid värvides kasutatavatele lahustitele:



Tabel 2.

Temperatuuriparandustegurid fT

Temperatuur T (K)

Parandustegur fT (K/kPa)

323,15

0,26

348,15

0,28

373,15

0,31

398,15

0,33

423,15

0,35

448,15

0,37

473,15

0,39

498,15

0,41

523,15

0,4

548,15

0,45

573,15

0,47

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 kasutatud meetodit;

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);

 hinnangulist täpsust.

Keemistemperatuurina registreeritakse vähemalt kahe hinnangulise täpsuse piiridesse (vt tabel 1) jääva mõõtetulemuse keskmine.

Ära tuuakse nii mõõdetud keemistemperatuurid kui ka nende keskmine; rõhud, mille juures mõõtmised tehti, registreeritakse kilopaskalites (kPa). Eelistatavalt peaks rõhk olema lähedane normaalrõhule.

Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.

4.   VIITED

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.

2. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II.

3. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

Liide

Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.

1.   Ebulliomeeter

1.1. Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks



ASTM D 1120-72

Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2.   Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik)



ISO/R 918

Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)

BS 4349/68

Method for determination of distillation of petroleum products

BS 4591/71

Method for the determination of distillation characteristics

DIN 53171

Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes

NF T 20-608

Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3.   Diferentsiaaltermoanalüüs ja skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria



ASTM E 537-76

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86

Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005

Thermische Analyse, Begriffe

A.3.   SUHTELINE TIHEDUS

1.   MEETOD

Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõte on ära toodud viites (2).

1.1.   SISSEJUHATUS

Kirjeldatud suhtelise tiheduse määramise meetodid sobivad kohaldamiseks nii tahketele kui vedelatele ainetele, olenemata nende puhtusastmest. Tabelis 1 on ära toodud mitmesugused meetodid.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Tahkete ainete ja vedelike suhteline tihedus D20 4 on 20 oC juures määratud kindla mahuga aine massi ja 4 oC juures määratud sama mahuga veekoguse massi suhe. Suhtelisel tihedusel puudub ühik.

Aine tihedus (p) on tema massi (m) ja mahu (v) suhe.

Tihedus (p) esitatakse SI-ühikutes (kg/m3).

1.3.   VÕRDLUSAINED (1, 3)

Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Kasutatakse nelja tüüpi meetodeid.

1.4.1.   Ujuvusmeetodid

1.4.1.1.   Hüdromeeter (vedelike jaoks)

Küllalt täpselt ja kiiresti saab tihedust määrata ujukhüdromeetrite abil, mille skaalajaotised võimaldavad vedeliku tiheduse määrata sukeldunud osa pikkuse põhjal.

1.4.1.2.   Hüdrostaatilised kaalud (vedelike ja tahkete ainete jaoks)

Proovi tihedust on võimalik määrata selle õhus ja sobivas vedelikus (nt vees) mõõdetud masside vahe põhjal.

Tahkete ainete puhul iseloomustab leitud tihedus ainult konkreetset proovi. Vedelike tiheduse määramiseks kaalutakse teadaoleva ruumalaga (v) keha kõigepealt õhus ja siis vedelikus.

1.4.1.3.   Sukeldatud keha meetod (vedelike jaoks) (4)

Selle meetodi kohaselt määratakse vedeliku tihedus vedeliku kaalumisel enne ja pärast teadaoleva ruumalaga keha sukeldamist uuritavasse vedelikku saadud masside vahe põhjal.

1.4.2.   Püknomeetrit rakendavad meetodid

Meetodid sobivad nii tahketele ainetele kui ka vedelikele, võimalik on kasutada erineva kujuga ja kindla ruumalaga püknomeetreid. Tihedus arvutatakse täis ja tühja püknomeetri masside vahe ja püknomeetri teadaoleva ruumala põhjal.

1.4.3.   Õhkvõrdluspüknomeeter (tahkete ainete jaoks)

Gaasvõrdluspüknomeetri abil on toatemperatuuril võimalik määrata mis tahes kujul oleva tahke aine tihedust. Aine ruumala mõõdetakse õhu või inertgaasiga täidetud muutuva kaliibritud mahuga silindris. Tiheduse arvutamiseks määratakse pärast ruumala mõõtmist aine mass.

1.4.4.   Resonantstihedusmõõtur (5, 6, 7)

Vedeliku tihedust on võimalik määrata resonantstihedusmõõturi abil. U-toruna konstrueeritud mehaaniline ostsillaator pannakse vibreerima ostsillaatori massist sõltuval resonantssagedusel. Proovi viimine U-torru muudab ostsillaatori resonantssagedust. Seade tuleb kaliibrida kahe vedelikuga, mille tihedus on teada. Vedelike valimisel tuleks eelistada selliseid, mille tihedused hõlmavad mõõdetavat vahemikku.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Erinevate suhtelise tiheduse määramise meetodite kohaldatavust kirjeldatakse allpool olevas tabelis.

1.6.   MEETODITE KIRJELDUS

Liites on täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks esitatud näidetena standardeid.

Katsed tuleb läbi viia 20 oC juures ja teha tuleb vähemalt kaks mõõtmist.

2.   ANDMED

Vt standardeid.

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 kasutatud meetodit;

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud).

Suhteline tihedus

image

registreeritakse vastavalt punkti 1.2 definitsioonile koos analüüsitava aine füüsikalise olekuga.

Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.



Tabel.

Meetodite rakendatavus

Mõõtmismeetod

Tihedus

Maksimaalne võimalik dünaamiline viskoossus

Olemasolevad standardid

tahke aine

vedelik

1.4.1.1.  Hüdromeeter

 

jah

5 Pa· s

ISO 387

ISO 649-2

NF T 20-050

1.4.1.2.  Hüdrostaatilised kaalud

 

 

 

 

a)  tahked ained

jah

 

 

ISO 1183 (A)

b)  vedelikud

 

jah

5 Pa· s

ISO 901 ja 758

1.4.1.3.  Sukeldatud keha meetod

 

jah

20 Pa· s

DIN 53217

1.4.2.  Püknomeeter

 

 

 

ISO 3507

a)  tahked ained

jah

 

 

ISO1183(B)

NF T 20-053

b)  vedelikud

 

jah

500 Pa· s

ISO 758

1.4.3.  Õhkvõrdluspüknomeeter

jah

 

 

DIN 55990 Teil 3,

DIN 53243

1.4.4.  Resonantstihedusmõõtur

 

jah

5 Pa· s

 

4.   VIITED

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

2. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.

3. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.

4. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11,427–430.

5. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302.

6. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.

7. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.

Liide

Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.

1.   Ujuvusmeetodid

1.1.   Hüdromeeter



DIN 12790, ISO 387

Hydrometer; general instructions

DIN 12791

Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use

Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation

Part III: Use and test

ISO 649-2

Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose

NF T 20-050

Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method

DIN 12793

Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2.   Hüdrostaatilised kaalud

Tahkete ainete jaoks



ISO 1183

Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

NF T 20-049

Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method

ASTM-D-792

Specific gravity and density of plastics by displacement

DIN 53479

Testing of plastics and elastomers; determination of density

Vedelike jaoks



ISO 901

ISO 758

DIN 51757

Testing of mineral oils and related materials; determination of density

ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ja ASTM D 1481-62

ASTM D 1298

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

BS 4714

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3.   Sukeldatud keha meetod



DIN 53217

Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2.   Püknomeetrit rakendavad meetodid

2.1.   Vedelike jaoks



ISO 3507

Pycnometers

ISO 758

Liquid chemical products; determination of density at 20 oC

DIN 12797

Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)

DIN 12798

Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00.10-6 m2 s-1 at 15 oC)

DIN 12800

Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)

DIN 12801

Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC)

DIN 12806

Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)

DIN 12807

Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)

DIN 12808

Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture)

DIN 12809

Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)

DIN 53217

Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer

DIN 51757

Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density

ASTM D 297

Section 15: Rubber products – chemical analysis

ASTM D 2111

Method C: Halogenated organic compounds

BS 4699

Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)

BS 5903

Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary- stoppered pycnometer method

NF T 20-053

Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2.   Tahkete ainete jaoks



ISO 1183

Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

NF T 20-053

Chemical products for industrial use -Determination of density of solids in powder and liquids -Pyknometric method

DIN 19683

Determination of the density of soils

3.   Õhkvõrdluspüknomeeter



DIN 55990

Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte

DIN 53243

Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

▼M1

A.4.   AURURÕHK

1.   METOODIKA

Käesolev metoodika on samaväärne standardiga OECD TG 104 (2004).

1.1.   SISSEJUHATUS

Käesolevas metoodika A.4(1) uuesti läbi vaadatud versioonis on esitatud üks täiendav mõõtemeetod, „Efusioonmeetod: isotermiline termogravimeetria”; see on välja töötatud väga madala aururõhuga (kuni 10–10 Pa) ainete jaoks. Arvestades vajadust meetodite järele, mis võimaldavad mõõta eeskätt madala aururõhuga ainete aururõhku, on ümber hinnatud ka käesoleva metoodika muude mõõtemeetodite rakenduspiirid.

Termodünaamilise tasakaalu tingimustes sõltub puhta aine aururõhk ainult temperatuurist. Asjaomased põhimõtted on esitatud mujal (2, 3).

Ükski mõõtmismeetod ei ole rakendatav kogu aururõhkude vahemikus – vähem kui 10–10 Pa kuni 105 Pa. Sellepärast esitatakse käesolevas kirjelduses kaheksa aururõhu mõõtmise meetodit, mis on rakendatavad erinevates aururõhu vahemikes. Tabelis 1 on võrreldud nende meetodite rakendatavust ja mõõtevahemikke. Neid meetodeid saab kasutada üksnes ainete puhul, mis mõõtmistingimustes ei lagune. Juhul kui tehnilistel põhjustel eksperimentaalseid meetodeid ei saa kasutada, võib aururõhku ka hinnata; soovitatav hindamismeetod on esitatud liites.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Aine aururõhk on tema küllastatud auru rõhk vedelas või tahkes faasis oleva aine kohal.

Tuleb kasutada rahvusvahelise mõõtühikute süsteemi (SI) rõhuühikut, milleks on paskal (Pa). Varem kasutusel olnud rõhuühikud ja nende teisendustegurid on järgmised:



1 torr

=

1 mm Hg

=

1,333 × 102 Pa

1 atmosfäär

=

1,013 × 105 Pa

 

 

1 baar

=

105 Pa

 

 

SI temperatuuriühik on kelvin (K). Celsiuse kraadid teisendatakse kelviniteks järgmise valemi abil:

T = t + 273,15

kus T on kelvinites väljendatud termodünaamiline temperatuur ja t on temperatuur Celsiuse kraadides.



Tabel 1

Mõõtmismeetod

Aine

Hinnanguline korratavus

Hinnanguline reprodutseeritavus

Soovitatav mõõtevahemik

Tahke

Vedelik

Dünaamiline meetod

Kergsulav

Jah

kuni 25 %

1–5 %

kuni 25 %

1–5 %

103 Pa kuni 2 × 103 Pa,

2 × 103 Pa kuni 105 Pa

Staatiline meetod

Jah

Jah

5–10 %

5–10 %

10 Pa kuni 105 Pa,

10–2 Pa kuni 105 Pa (1)

Isoteniskoopiline meetod

Jah

Jah

5–10 %

5–10 %

102 Pa kuni105 Pa

Efusioonmeetod: aururõhukaalud

Jah

Jah

5–20 %

kuni 50 %

10–3 kuni 1 Pa

Efusioonmeetod: Knudseni rakk

Jah

Jah

10–30 %

10–10 kuni 1 Pa

Efusioonmeetod: isotermiline termogravimeetria

Jah

Jah

5–30 %

kuni 50 %

10–10 kuni 1 Pa

Gaasiküllastusmeetod

Jah

Jah

10–30 %

kuni 50 %

10–10 kuni 103 Pa

Pöörleva kuuli meetod

Jah

Jah

10–20 %

10–4 kuni 0,5 Pa

(1)   Mahtuvusmanomeetri kasutamise korral.

1.3.   MÕÕTMISE PÕHIMÕTE

Üldiselt määratakse aururõhku erinevatel temperatuuridel. Kitsas temperatuurivahemikus sõltub puhta aine aururõhu logaritm lineaarselt termodünaamilisest temperatuurist vastavalt lihtsustatud Clapeyron-Clausiuse võrrandile:

image

kus:

p

=

aururõhk, Pa,

ΔHv

=

aurustumissoojus, Jmol–1,

R

=

universaalne gaasikonstant, 8,314 Jmol–1K–1,

T

=

temperatuur, K.

1.4.   STANDARDAINED

Standardaineid ei ole tingimata vaja kasutada. Neid on vaja eeskätt selleks, et aeg-ajalt kontrollida meetodi suutlikkust ja võrrelda eri meetodite abil saadud tulemusi.

1.5.   MEETODITE KIRJELDUS

1.5.1.   Dünaamiline meetod (Cottrelli meetod)

1.5.1.1.   Põhimõte

Aururõhu määramiseks mõõdetakse aine keemistemperatuur erinevatel teadaolevatel rõhkudel ligikaudu 103–105 Pa vahemikus. Seda meetodit soovitatakse ka keemistemperatuuri määramiseks. Selleks saab kõnesolevat meetodit kasutada kuni temperatuurini 600 K. Vedelikusamba hüdrostaatilise rõhu tõttu on vedeliku keemistemperatuur 3–4 cm sügavusel ligikaudu 0,1 °C kõrgem kui vedeliku pinnal. Cottrelli meetodi (4) puhul asetatakse termomeeter aurudesse vedeliku pinna kohal ja keeval vedelikul lastakse pidevalt voolata üle termomeetri reservuaari. Termomeetri reservuaar on pidevalt kaetud õhukese vedelikukihiga, mis on tasakaalus atmosfäärirõhul oleva auruga. Seega vastab termomeetri näit tõelisele keemistemperatuurile, kusjuures mõõtmistulemus ei sisalda ülekuumenemisest või hüdrostaatilisest rõhust tingitud viga. Cottrelli poolt algselt kasutatud pump on kujutatud joonisel 1. Katseklaasis A on keev vedelik. Põhja külge joodetud plaatinatraat soodustab ühtlast keemist. Külgtoru C on ühendatud püstjahutiga; pritsmekaitse D ei lase termomeetril E puutuda kokku külma kondensaadiga. Kui vedelik katseklaasis A keeb, tõusevad lehtrisse sattunud mullid ja vedelik üles ning suunatakse pumba F kahte haru pidi termomeetri reservuaarile.



Joonis 1 image

Joonis 2 image

Cottrelli pump (4)

A: termopaar

B: anum vaakumi stabiliseerimiseks

C: manomeeter

D: vaakumpump

E: mõõtmispunkt

F: kütteelement, ligikaudu 150 W

1.5.1.2.   Mõõteseade

Joonisel 2 on kujutatud suurt täpsust võimaldav mõõteseade, milles on kasutatud Cottrelli põhimõtet. See kujutab endast toru, mille alumises osas keeb vedelik, keskmine osa kujutab endast jahutit ning ülemises osas on väljumisava ja äärik. Cottrelli pump asub keemissektsioonis, mida kütab elektriline padrunkuumuti. Temperatuuri mõõdetakse kaetud termopaari või takistustermomeetri abil, mis on viidud torusse ülevalt läbi äärikliite. Väljumisava on ühendatud rõhu reguleerimise süsteemiga. See hõlmab vaakumpumpa, anumat vaakumi stabiliseerimiseks, manostaati, millest lastakse seadmesse rõhu reguleerimiseks vajalikku lämmastikku, ja manomeetrit.

1.5.1.3.   Mõõtmise käik

Aine viiakse keemissektsiooni. Kui tahke aine ei ole pulbri kujul, võib seejuures esineda raskusi, mille puhul mõnikord aitab jahutussärgi kuumutamine. Seade suletakse äärikliitega ja ainest eemaldatakse gaasid. Vahutavate ainete aururõhku ei saa selle meetodiga mõõta.

Seade reguleeritakse kõige madalamale vajalikule rõhule ja lülitatakse sisse küte. Samal ajal ühendatakse temperatuuriandur registreerimisseadmega.

Kui püsival rõhul registreeritakse püsiv keemistemperatuur, on saavutatud tasakaal. Eriti tuleb jälgida, et keemine ei oleks tõukeline. Lisaks sellele peab jälgima, et kondenseerumine jahutis oleks täielik. Kui määratakse kergsulava tahke aine aururõhku, tuleb jälgida, et jahuti ei ummistuks.

Pärast tasakaalupunkti registreerimist reguleeritakse seade kõrgemale rõhule. Mõõtmisi jätkatakse samal viisil, kuni saavutatakse rõhk 105 Pa (aururõhk mõõdetakse kokku ligikaudu 5–10 tasakaalupunktis). Kontrolliks korratakse mõõtmist tasakaalupunktides alaneva rõhu järjekorras.

1.5.2.   Staatiline meetod

1.5.2.1.   Põhimõte

Staatilise meetodi (5) puhul määratakse termodünaamilisele tasakaalule vastav aururõhk kindlaksmääratud temperatuuril. See meetod sobib individuaalsete ainete ning mitmekomponendiliste vedelike ja tahkete ainete segude puhul rõhuvahemikus 10–1 kuni 105 Pa ja, kui rakendatakse ettevaatusabinõusid, ka rõhuvahemikus 1–10 Pa.

1.5.2.2.   Mõõteseade

Mõõteseade koosneb termostateeritud vannist (täpsus ± 0,2 K), vaakumsüsteemiga ühendatud proovinõust, manomeetrist ja rõhu reguleerimise süsteemist. Proovinõu (joonis 3a) ühendatakse kraani ja nullindikaatorina kasutatava diferentsiaalmanomeetri (sobiva manomeetrivedelikuga U-toru) kaudu vaakumsüsteemiga. Olenevalt rõhuvahemikust ja uuritava aine keemilistest omadustest võib diferentsiaalmanomeetris kasutada elavhõbedat, silikoonõlisid või ftalaate. Keskkonnakaitse kaalutlustel tuleks elavhõbeda kasutamisest võimaluse korral hoiduda. Uuritav aine ei tohi U-torus olevas vedelikus märgatavalt lahustuda või sellega reageerida. U-toru asemel võib kasutada ka mõnda muud rõhumõõturit (joonis 3b). Normaalrõhust kuni rõhuni 102 Pa võib manomeetrivedelikuna kasutada elavhõbedat; kui rõhk on vahemikus 10–102 Pa, võib kasutada silikoonõlisid ja ftalaate. Rõhul alla 102 Pa võib kasutada ka muid rõhumõõtureid; kuumutatava membraaniga mahtuvusmanomeetrit võib kasutada isegi rõhul alla 10–1 Pa. Temperatuuri mõõdetakse kas proovinõu seina välisküljel või proovinõus.

1.5.2.3.   Mõõtmise käik

Kui kasutatakse joonisel 3a kujutatud mõõteseadet, täidetakse U-toru selleks valitud vedelikuga, mis tuleb enne näidu registreerimist gaasidest kõrgendatud temperatuuri abil vabastada. Uuritav aine viiakse mõõteseadmesse ja vabastatakse gaasidest madalal temperatuuril. Kui tegemist on mitmekomponendilise prooviga, peab temperatuur olema piisavalt madal, et seejuures ei muutuks materjali koostis. Tasakaalu kiiremaks saavutamiseks võib proovi segada. Proovi võib jahutada vedela lämmastiku või kuiva jääga, kuid seejuures tuleb jälgida, et õhk ja väljapumbatav gaas ei kondenseeruks. Proovinõu kohal oleva kraani avamisega ühendatakse nõu mõneks minutiks vaakuumsüsteemiga, et eemaldada õhk. Vajaduse puhul korratakse gaaside eemaldamist mitu korda.



Joonis 3a image

Joonis 3b image

Kui proovi kuumutamise ajal on kraan suletud, siis aururõhk tõuseb. See muudab U-torus oleva vedeliku tasakaaluasendit. Selle kompenseerimiseks lastakse seadmesse lämmastikku või õhku, kuni diferentsiaalrõhu indikaator on uuesti nullasendis. Selleks vajalik rõhk loetakse manomeetrilt või suurema täpsusega mõõteriistalt. See rõhk vastab aine aururõhule mõõtmistemperatuuril. Kui kasutatakse joonisel 3b kujutatud mõõteseadet, võib aururõhu näidu lugeda otse seadmelt.

Aururõhk määratakse piisavalt väikeste temperatuurivahemike tagant kuni vajaliku kõrgeima temperatuurini (aururõhk mõõdetakse kokku umbes 5–10 tasakaalupunktis).

Kontrolliks korratakse näitude registreerimist madalal temperatuuril. Kui kordamisel saadud väärtused ei lange kokku temperatuuri tõstmisel saadud kõveraga, võib põhjuseks olla üks järgmistest asjaoludest:

i) proov sisaldab ikka veel õhku (nt suure viskoossusega materjalide puhul) või kuumutamisel eraldunud madala keemistemperatuuriga aineid;

ii) uuritavas temperatuurivahemikus toimub ainega keemiline reaktsioon (nt lagunemine või polümerisatsioon).

1.5.3.   Isoteniskoopiline meetod

1.5.3.1.   Põhimõte

Isoteniskoop (6) töötab staatilise meetodi põhimõttel. Proov viiakse termostateeritud kolbi, mis on ühendatud manomeetri ja vaakumpumbaga. Uuritavast ainest kergemini lenduvad lisandid eemaldatakse degaseerimisega alarõhul. Proovi aururõhk valitud temperatuuril tasakaalustatakse inertse gaasi rõhuga, mille väärtus on teada. Isoteniskoop töötati välja teatavate vedelate süsivesinike aururõhu määramiseks, kuid ta sobib ka tahkete ainete uurimiseks. Harilikult ei sobi kõnesolev meetod mitmekomponendiliste süsteemide puhul kasutamiseks. Mittelenduvaid lisandeid sisaldavate proovide korral on mõõtmistulemuste viga väike. Soovitatav määramisvahemik on 102–105 Pa.

1.5.3.2.   Mõõteseade

Mõõteseadme näidis on esitatud joonisel 4. Seadme täielik kirjeldus on standardis ASTM D 2879–86 (6).

1.5.3.3.   Mõõtmise käik

Vedelate ainete puhul on diferentsiaalmanomeetri vedelikuks uuritav aine ise. Isoteniskoopi viiakse vedelikukogus, mis on küllaldane reservuaari ja manomeetri lühikese haru täitmiseks. Isoteniskoop ühendatakse vaakumsüsteemiga, sellest eemaldatakse õhk ning see täidetakse seejärel lämmastikuga. Süsteemist gaasi väljapumpamist ja süsteemi täitmist lämmastikuga korratakse kaks korda, et eemaldada kogu hapnik. Täidetud isoteniskoop asetatakse horisontaalselt, nii et proov valgub õhukese kihina reservuaaris ja manomeetris laiali. Rõhk süsteemis langetatakse 133 paskalini ja proovi kuumutatakse ettevaatlikult, kuni see hakkab keema (seda tehakse lahustunud gaaside kõrvaldamiseks). Isoteniskoop asetatakse seejärel nii, et proov voolab tagasi reservuaari ja täidab manomeetri lühikese haru. Rõhku hoitakse 133 Pa juures. Proovireservuaari väljavenitatud tippu kuumutatakse väikesel leegil, kuni proovi aurud küllaldaselt paisuvad ning suruvad osa proovist reservuaari ülaosast ja manomeetri lühikesest harust manomeetri ülejäänud ossa, nii et tekib auruga täidetud lämmastikuvaba ruum. Isoteniskoop paigutatakse seejärel termostateeritud vanni ja lämmastiku rõhk võrdsustatakse proovipoolse ruumi rõhuga. Tasakaaluolekus on lämmastiku rõhk võrdne aine aururõhuga.

image

Tahkete ainete puhul kasutatakse rõhust ja temperatuurivahemikust olenevalt selliseid manomeetrivedelikke, nagu silikoonõlid ja ftalaadid. Gaasidest vabastatud manomeetrivedelik viiakse isoteniskoobi pikal harul olevasse laiemasse ossa. Uuritav tahke aine pannakse proovikolbi ja vabastatakse gaasidest kõrgendatud temperatuuril. Seejärel kallutatakse isoteniskoopi nii, et manomeetrivedelik voolab U-torusse.

1.5.4.   Efusioonmeetod: aururõhukaalud (7)

1.5.4.1.   Põhimõte

Uuritava aine proovi kuumutatakse väikeses ahjus ja asetatakse vakumeeritud klaaskupli alla. Ahi on kaetud kaanega, milles on väikesed teadaoleva läbimõõduga avad. Ühest avast väljuv aine aur juhitakse sama vakumeeritud klaaskupli all asuva kõrgtundliku kaalu kausile. Mõne seadmetüübi puhul asub kaalukauss külmkambris, mis tagab soojuse hajumise väljapoole soojusjuhtivuse teel; kaalukauss jahtub soojuskiirguse arvel ja avast väljuv aur kondenseerub kaalukausil. Aurujoa impulss toimib kaalukausile mõjuva jõuna. Aururõhu võib arvutada kahel viisil: kas otse kaalukausile mõjuva jõu põhjal või aurustumiskiiruse alusel, kasutades Hertz-Knudseni valemit (2):

image

kus:

G

=

aurustumiskiirus (kgs–1m–2),

M

=

molaarmass (gmol–1),

T

=

temperatuur (K),

R

=

universaalne gaasikonstant (Jmol–1K–1),

p

=

aururõhk (Pa).

Soovitatav määramisvahemik on 10–3 kuni 1 Pa.

1.5.4.2.   Mõõteseade

Seadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 5.

image



A:

alusplaat

F:

külmkamber ja jahutuslatt

B:

magnetelektriline seade

G

aurustusahi

C:

klaaskuppel

H:

Dewari anum vedela lämmastikuga

D:

kaalud ja kaalukauss

I:

proovi temperatuuri mõõtur

E:

vaakumimõõtur

J:

uuritav proov

1.5.5.   Efusioonmeetod: Knudseni rakk

1.5.5.1.   Põhimõte

Meetodi aluseks on kõrgvaakumi tingimustes Knudseni raku (8) mikroavast ajaühikus auruna väljuva uuritava aine massi määramine. Väljavoolanud auru massi võib leida kas raku massi vähenemise määramise kaudu või auru madalal temperatuuril kondenseerimise ja lendunud ainekoguse kromatograafilise määramisega. Aururõhk arvutatakse Hertz-Knudseni võrrandi abil (vt punkt 1.5.4.1), kasutades seadme parameetritest sõltuvat parandustegurit (9). Soovitatav aururõhu vahemik on 10–10 kuni 1 Pa (10, 11, 12, 13, 14).

1.5.5.2.   Mõõteseade

Seadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 6.

image



1:

ühendus vaakumsüsteemiga

7:

keermega kaas

2:

pesad plaatina-takistustermomeetri või temperatuuri mõõtmise ja reguleerimise seadme jaoks

8:

liblikmutrid

3:

vaakummahuti kaas

9:

poldid

4:

O-rõngas

10:

roostevabast terasest efusioonirakud

5:

alumiiniumist vaakummahuti

11:

padrunkuumuti

6:

efusioonirakkude paigaldamise ja eemaldamise seade

 

 

1.5.6.   Efusioonmeetod: isotermiline termogravimeetria

1.5.6.1.   Põhimõte

Meetod põhineb uuritava aine kiirenenud aurustumise määramisel kõrgendatud temperatuuril ja normaalrõhul termogravimeetria abil (10, 15, 16, 17, 18, 19, (20). Aurustumiskiiruse vT määramiseks hoitakse uuritavat ainet aeglaselt voolava inertgaasi atmosfääris kindlaksmääratud isotermilisel temperatuuril T (kelvinites) ja jälgitakse vajaliku ajavahemiku jooksul, kuidas väheneb ainekoguse mass. Aururõhud pT arvutatakse vT väärtuste põhjal, kasutades aururõhu logaritmi ja aurustumiskiiruse logaritmi lineaarset seost. Vajaduse korral võib tulemused ekstrapoleerida temperatuuridele 20 ja 25 °C, rakendades regressioonanalüüsi koordinaatides log pT vs. 1/T. See meetod sobib ainete puhul, mille aururõhk on 10–10 Pa (10–12 mbar) ja puhtusaste on võimalikult lähedane 100 protsendile, et vältida mõõdetava massi vähenemise ekslikku tõlgendamist.

1.5.6.2.   Mõõteseade

Mõõteseadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 7.

image

Proov kandeplaadil, mis ripub mikrokaalul reguleeritava temperatuuriga kambris, asub kuiva lämmastiku voolus, mis kannab uuritava aine aurustunud molekulid ära. Kambrist väljuv gaas puhastatakse sorptsiooniseadmes.

1.5.6.3.   Mõõtmise käik

Uuritav aine kantakse ühtlase kihina karestatud klaasplaadi pinnale. Tahke aine puhul niisutatakse plaat ühtlaselt aine lahusega sobivas lahustis ja kuivatatakse inertgaasi atmosfääris. Ainekihiga klaasplaat riputatakse mõõtmiste tegemiseks termogravimeetrilisse analüsaatorisse ja mõõdetakse pidevalt klaasplaadi massi vähenemist ajas.

Aurustumiskiirus vT kindlaksmääratud temperatuuril arvutatakse proovi massi vähenemise Δm alusel järgmise valemi abil:

image

kus F on klaasplaati katva aine pindala (tavaliselt võrdne klaasplaadi pindalaga) ja t on aeg, mille jooksul mass vähenes.

Aururõhk pT arvutatakse aurustumiskiirust vT väljendava funktsiooni alusel:

log pT = C + D log vT

kus C ja D on katseseadet iseloomustavad konstandid, mis olenevad mõõtekambri läbimõõdust ja gaasivoo kiirusest. Need konstandid määratakse üks kord, mõõtes teadaoleva aururõhuga ainete seeria aurustumiskiirused ja kasutades regressioonanalüüsi log pT vs. log vT (11, 21, 22).

Aururõhu pT ja kelvinites väljendatud temperatuuri T vahelist seost kajastab võrrand

log pT = A + B 1/T

kus A ja B on regressioonseosest log pT vs. 1/T saadud konstandid. Selle võrrandi alusel saab arvutada aururõhu mis tahes muu temperatuuri juures ekstrapoleerimise teel.

1.5.7.   Gaasiküllastusmeetod (23)

1.5.7.1.   Põhimõte

Üle või läbi uuritava aine proovi voolutatakse toatemperatuuril inertgaasi teadaoleva piisavalt väikese kiirusega, mis tagab gaasi küllastumise. Gaasifaasi küllastamine on väga tähtis. Kaasa kandunud aine kogutakse, kasutades püüdurina enamasti sorbenti, ja määratakse selle kogus. Auru püüdmise ja edasise analüüsi alternatiivina võib kaasa kandunud materjali koguse määramiseks kasutada ka järjestikku ühendatud analüüsiseadet, näiteks gaasikromatograafi. Aururõhu arvutamisel eeldatakse, et süsteem järgib ideaalse gaasi olekuvõrrandit ja gaasisegu üldrõhk on võrdne komponentgaaside rõhkude summaga. Uuritava aine partsiaalrõhu ehk aururõhu arvutamisel lähtutakse teadaolevast gaasi ruumalast ja kaasa kantud materjali massist.

Gaasiküllastusmeetod on rakendatav nii tahkete kui ka vedelate ainete korral. Seda võib kasutada ka madalal rõhul kuni 10–10 Pa (10, 11, 12, 13, 14). Kõnesolev meetod on kõige usaldusväärsem aururõhul alla 103 Pa. Aururõhul üle 103 Pa saadakse tavaliselt õigetest suuremad väärtused, mis on tõenäoliselt tingitud aerosooli tekkimisest. Kuna aururõhu mõõtmised tehakse toatemperatuuril, ei ole vaja ekstrapoleerida kõrgetel temperatuuridel saadud andmeid; sellega välditakse sageli tõsiseid vigu põhjustavat ekstrapoleerimist kõrgetelt temperatuuridelt.

1.5.7.2.   Mõõteseade

Mõõtmiseks on vaja konstantse temperatuuriga kambrit. Joonisel 8 oleval skeemil on kamber, milles on kolm hoidlit tahketele proovidele ja kolm hoidlit vedelatele proovidele; see võimaldab teha tahke või vedela prooviga kolm analüüsi. Temperatuuri reguleeritakse ± 0,5 °C või suurema täpsusega.

image

Üldiselt kasutatakse inertse kandegaasina lämmastikku, kuid mõnikord on vaja kasutada ka muid gaase (24). Kandegaas peab olema kuiv. Gaasivoog jaotatakse kuueks vooks, mida reguleeritakse nõelventiilide abil (ava läbimõõt ligikaudu 0,79 mm); need vood juhitakse 3,8 mm siseläbimõõduga vasktorude kaudu kambrisse. Pärast temperatuuri tasakaalustumist läbib gaas proovi ja sorbentpüünise ning väljub kambrist.

Tahke proov asetatakse 5-millimeetrise siseläbimõõduga klaastorusse klaasvillast korkide vahele (vt joonis 9). Joonisel 10 on näidatud vedela proovi hoidel ja sorptsioonisõlm. Vedeliku aururõhu mõõtmised on kõige paremini reprodutseeritavad, kui vedelik kantakse klaashelmestele või mõnele muule inertsele sorbendile, nagu ränidioksiid, ning hoidel täidetakse selliselt kaetud helmestega. Alternatiivina võib kandegaasi voolutada läbi jämeda friti või barboteerida uuritava vedelikuga täidetud kolonni kandegaasiga.



Joonis 9 image

Joonis 10 image

Sorptsioonisõlmes on eel- ja järeladsorptsiooni sektsioon. Väga madala aururõhu puhul võib olla tõsiseks probleemiks adsorptsioon proovi ning adsorbendi vahel oleval klaasvillal ja klaastorudel, kusjuures sorbendile jääb ainult väike kogus uuritavat ainet.

Tõhus viis aurustunud materjali kogumiseks on kasutada süsihappelumega jahutatavat püüdurit. Selline püüdur ei avalda vasturõhku küllastuskolonnile ja sellest on kerge püütud materjali kvantitatiivselt eemaldada.

1.5.7.3.   Mõõtmise käik

Kandegaasi voolukiirust mõõdetakse toatemperatuuril. Voolukiirust kontrollitakse katse ajal sageli, et tagada kandegaasi üldmahu õige määramine. Parem on seda massivoolumõõturi abil pidevalt mõõta. Gaasifaasi küllastumiseks peab kokkupuuteaeg olema küllalt pikk ja gaasivoolu kiirus väike (25).

Katse lõpus analüüsitakse eel- ja järeladsorptsiooni sektsiooni eraldi. Kummastki sektsioonist desorbeeritakse uuritav aine lahusti abil. Saadud lahuseid analüüsitakse kvantitatiivselt kummastki sektsioonist desorbeeritud massi määramiseks. Analüüsimeetodi (ja ka sorbendi ja desorbeeriva lahusti) valik oleneb uuritavast ainest. Desorptsiooni täielikkuse määramiseks kantakse teadaolev kogus uuritavat proovi sorbendile, desorbeeritakse, ja määratakse aine saagis. Desorptsiooni tõhusust on vaja kontrollida samal või ligikaudu samal uuritava proovi kontsentratsioonil, mis esineb mõõtmise puhul.

Tagamaks, et kandegaas on uuritava ainega küllastunud, kasutatakse kolme erinevat gaasivoolu kiirust. Kui arvutatud aururõhk ei olene voolukiirusest, peetakse kandegaasi küllastunuks.

Aururõhk arvutatakse järgmise valemi abil:

image

kus:

p

=

aururõhk (Pa),

W

=

aurustunud uuritava aine mass (g),

V

=

küllastunud kandegaasi maht (m3),

R

=

universaalne gaasikonstant, 8,314 (Jmol–1K–1),

T

=

temperatuur (K),

M

=

uuritava aine molaarmass (gmol–1).

Mõõdetud mahu väärtusi on vaja parandada, et arvestada rõhu ja temperatuuri erinevusi voolumõõturis ja küllastuskolonnis.

1.5.8.   Pöörleva kuuli meetod

1.5.8.1.   Põhimõte

Selle meetodi puhul kasutatakse pöörleva kuuli põhimõttel töötavat viskoossusmõõturit, mille mõõteelement on magnetväljas hõljuv väike teraskuul, mis pannakse pöörlevate magnetväljade abil pöörlema (26, 27, 28). Kuuli pöörlemiskiirust saab mõõta andurmähiste abil. Kui kuul on jõudnud ettenähtud pöörlemiskiiruseni (tavaliselt umbes 400 pööret sekundis), lõpetatakse edasine kiirendamine ja kuuli pöörlemine hakkab hõõrdumise tõttu gaasikeskkonnas aeglustuma. Mõõdetakse pöörlemiskiiruse vähenemise sõltuvust ajast. Aururõhk tuletatakse teraskuulikese pöörlemiskiiruse vähenemisest, mis oleneb rõhust. Soovitatav määramisvahemik on 10–4 kuni 0,5 Pa.

1.5.8.2.   Mõõteseade

Katseseadme skeem on esitatud joonisel 11. Mõõtepea asetatakse 0,1 °C täpsusega termostateeritavasse kambrisse. Proovinõu paigutatakse 0,1 °C täpsusega termostateeritud eraldi kambrisse ning seadme kõiki ülejäänud osi hoitakse kondensatsiooni vältimiseks kõrgemal temperatuuril. Kogu seade on ühendatud kõrgvaakumsüsteemiga.

image

2.   MÕÕTMISANDMED JA MÕÕTMISPROTOKOLLI KOOSTAMINE

2.1.   MÕÕTMISANDMED

Mis tahes eespool kirjeldatud meetodi kasutamise puhul määratakse aururõhk vähemalt kahel temperatuuril. Aururõhu sõltuvuse lineaarsuse kontrollimiseks tuleks eelistada aururõhu määramist kolmel või enamal temperatuuril vahemikus 0–50 °C. Efusioonmeetodite (Knudseni rakk ja isotermiline termogravimeetria) ning gaasiküllastusmeetodi korral on temperatuurivahemiku 0–50 °C asemel soovitatav mõõta aururõhud vahemikus 120–150 °C.

2.2.   MÕÕTMISPROTOKOLL

Mõõtmisprotokollis esitatakse järgmine teave:

 kasutatud meetod;

 aine täpne iseloomustus (identifitseerimiseks vajalikud andmed, lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldus (kui ainet puhastati);

 vähemalt kaks, parem aga kolm või enam aururõhu ja temperatuuri väärtust vahemikus 0–50 °C (või 120–150 °C);

 kui see valitud meetodi puhul on tehniliselt võimalik, peaks vähemalt üks temperatuur olema 25 °C või madalam;

 kõik originaalandmed;

 kõver log p versus 1/T;

 hinnanguline aururõhu väärtus 20 või 25 °C juures.

Kui esineb aine oleku muutusi (agregaatoleku muutumine, lagunemine), märgitakse järgmine teave:

 muutuse laad;

 atmosfäärirõhule vastav temperatuur, mille juures muutus toimub;

 aururõhk 10 ja 20 °C allpool olekumuutuse temperatuuri ning 10 ja 20 °C ülalpool seda temperatuuri (välja arvatud juhtum, kui agregaatolek muutub tahkest gaasiliseks).

Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad andmed ja tähelepanekud, eriti sellised, mis käsitlevad lisandeid ja aine füüsikalist olekut.

3.   KIRJANDUS

1) Official Journal of the European Communities L 383 A, 26–47 (1992).

2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.

3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.

4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York.

5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa – Static method.

6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use –Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.

8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593.

9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173.

10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521–532.

11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000).

12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22–28.

13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269–278.

14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122.

15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147.

16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393–400.

17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168.

18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27–31.

19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310.

20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512–20.

21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range –25 °C to 150 °C.

22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002).

23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal Register, Washington DC

24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.

25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.

26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.

27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642.

28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.

Liide

Hindamismeetod

SISSEJUHATUS

Hinnangulisi aururõhu väärtusi võib kasutada järgmistel juhtudel:

 sobiva katsemeetodi valimiseks;

 hinnangu või piirväärtuse andmiseks juhtudel, kui tehnilistel põhjustel ei saa mõõtmismeetodeid rakendada.

HINDAMISMEETOD

Vedelike ja tahkete ainete aururõhu hindamiseks võib kasutada teisendatud Watsoni korrelatsiooni (a). Ainus selleks vajalik eksperimentaalselt määratav väärtus on keemistemperatuur normaalrõhul. Meetod on rakendatav rõhuvahemikus 105 kuni 10–5 Pa.

Meetodi üksikasjalik kirjeldus on esitatud väljaandes „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b). Vt ka OECD Environmental Monograph No. 67 (c).

ARVUTUSKÄIK

Aururõhk arvutatakse järgmise valemi abil:

image

kus:

T

=

aururõhu hindamise temperatuur,

Tb

=

keemistemperatuur normaalrõhul,

Pvp

=

aururõhk temperatuuril T,

ΔHvb

=

aurustumissoojus,

ΔZb

=

kokkusurutavustegur (hinnanguliselt 0,97),

m

=

empiiriline konstant, mis oleneb aine füüsikalisest olekust aururõhu hindamise temperatuuril.

Kasutatakse ka valemit

image

kus KF on aine polaarsust arvestav empiiriline tegur. Rea ühendiklasside KF-tegurid on esitatud publikatsioonis (b).

Sageli on olemas andmed keemistemperatuuri kohta madalamal rõhul. Sellisel juhul arvutatakse aururõhk järgmiselt:

image

kus T1 on keemistemperatuur madalamal rõhul P1.

PROTOKOLLI KOOSTAMINE

Kui kasutatakse hindamismeetodit, tuleb protokollis esitada täielik arvutuskäik.

KIRJANDUS

a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.

b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill.

c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

▼B

A.5.   PINDPINEVUS

1.   MEETOD

Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viites 2.

1.1.   SISSEJUHATUS

Kirjeldatud meetodid on ette nähtud vesilahuste pindpinevuse mõõtmiseks.

Katse tegemiseks on kasulik teada aine lahustuvust vees, selle struktuuri, hüdrolüüsuvust ja mitsellitekke lävikontsentratsiooni.

Järgmised meetodid sobivad kohaldamiseks enamikule keemilistele ainetele, olenemata nende puhtusastmest.

Pindpinevust saab mõõta rõnga lahtirebimise meetodi abil ainult vesilahuste puhul, mille dünaamiline viskoossus on alla ca. 200 mPa s.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Pindpinevusena käsitatakse pinna vabaentalpiat pinnaühiku kohta.

Pindpinevust väljendatakse järgmistes ühikutes:

N/m (SI ühik) või

mN/m (SI alamühik)

1N/m = 103 dyn/cm

1 mN/m = 1 dyn/cm (aegunud CGS-süsteemis)

1.3.   VÕRDLUSAINED

Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

Viidetes 1 ja 3 on ära toodud laia pindpinevuste vahemikku hõlmavad võrdlusained.

1.4.   KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE

Meetodite kohaselt mõõdetakse maksimaalne jõud, mida on vaja püstsuunas rakendada mõõtenõus oleva uuritava vedeliku pinnaga kokkupuutes olevale loogale või rõngale selle lahtirebimiseks pinnalt või pinnaga kokkupuutes oleva plaadi servale tekkinud kile ülestõmbamiseks.

Aineid, mille lahustuvus vees on vähemalt 1 mg/l, analüüsitakse vesilahuses ainult ühel kontsentratsioonil.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Nende meetodite täpsus ületab tõenäolised vajadused keskkonnaohtlikkuse hindamisel.

1.6.   MEETODITE KIRJELDUS

Valmistatakse aine lahus destilleeritud vees. Lahuse kontsentratsioon peaks olema 90 % aine küllastuskontsentratsioonist vees; kui kontsentratsioon ületab 1 g/l, kasutatakse katses kontsentratsiooni 1 g/l. Aineid, mille lahustuvus vees on alla 1 mg/l, pole vaja testida.

1.6.1.   Plaadimeetod

Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.2.   Loogameetod

Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.3.   Rõngameetod

Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.4.   OECD ühtlustatud rõngameetod

1.6.4.1.   Seade

Mõõtmiseks sobivad müügil olevad tensiomeetrid. Need koosnevad järgmistest osadest:

 liikuvast proovialusest;

 dünamomeetrist;

 mõõtekehast (rõngast);

 mõõtmisnõust.

1.6.4.1.1.    Liikuv proovialus

Liikuvale proovialusele asetatakse uuritavat vedelikku sisaldav termostateeritud mõõtmisnõu. Alus kinnitatakse koos dünamomeetriga statiivile.

1.6.4.1.2.    Dünamomeeter

Dünamomeeter (vt joonist) paikneb proovialuse kohal. Viga jõu mõõtmisel ei tohi ületada ± 10-6 N, mis vastab veapiirile ± 0,1 mg massi mõõtmisel. Enamikul juhtudel on müügil olevate tensiomeetrite mõõteskaala kaliibritud mN/m skaalas, nii et pindpinevuse saab skaalalt lugeda otse millinjuutonites meetri kohta täpsusega 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3.    Mõõtekeha (rõngas)

Rõngas on tavaliselt valmistatud 0,4 mm jämedusest plaatina-iriidiumtraadist ja selle keskmine ümbermõõt on 60 mm. Rõngas ripub horisontaalselt metallvarda ja looga otsas, mille kaudu ta on ühendatud dünamomeetriga (vt joonist).

(Kõik mõõdud on millimeetrites)

image

1.6.4.1.4.    Mõõtmisnõu

Katselahust sisaldava mõõtmisnõuna kasutatakse termostateeritud klaasnõud. Nõu ehitus peab olema selline, et katselahuse ja selle kohal oleva gaasifaasi temperatuurid jäävad katse kestel konstantseks ning proov ei aurustu. Mõõtmisnõuks sobivad silindrilised klaasnõud sisediameetriga vähemalt 45 mm.

1.6.4.2.   Seadme ettevalmistamine

1.6.4.2.1.    Puhastamine

Klaasnõud puhastatakse hoolikalt. Vajaduse korral pestakse neid kuuma kroomseguga ja seejärel kontsentreeritud fosforhappega (83–98 % H3PO4 (massi järgi)), loputatakse põhjalikult kraaniveega, pestakse lõpuks bidestilleeritud veega neutraalse reaktsiooni saavutamiseni ja seejärel kuivatatakse või loputatakse osaga mõõdetavast vedelikuproovist.

Rõngast loputatakse kõigepealt põhjalikult veega, et eemaldada vees lahustuvad ained, kastetakse seejärel lühikeseks ajaks kroomsegusse, pestakse siis bidestilleeritud veega neutraalse reaktsiooni saavutamiseni ja kuumutatakse lõpuks lühikest aega metanoolileegi kohal.

Märkus

Kroomsegus ja fosforhappes mittelahustuvad saasteained, nt silikoonid, eemaldatakse sobiva orgaanilise lahustiga.

1.6.4.2.2.    Seadme kaliibrimine

Seadme kontrollimiseks kontrollitakse nullpunkti ja reguleeritakse seda nii, et seade võimaldab täpset mõõtmist mN/m skaalas.

Seade looditakse tensiomeetri aluse reguleerimiskruvide abil (näiteks alusel oleva loodinäidiku järgi).

Pärast rõnga kinnitamist aparaadile ja enne selle vedelikku kastmist reguleeritakse tensiomeetri näit nulli ja kontrollitakse, kas rõngas on vedeliku pinnaga paralleelne. Selleks võib vedelikupinda kasutada peeglina.

Seadme kaliibrimiseks võib kasutada üht kahest järgmisest meetodist.

a) Raskuste abil: kasutatakse rõngale asetatavaid kindla massiga (0,1 –1,0 g) raskusi. Kaliibrimistegur Φa, millega kõiki seadme näitusid tuleb korrutada, leitakse võrrandi 1 abil:



image

(1)

kus:

image

(mN/m)

m

=

raskuse mass (g)

g

=

raskuskiirendus (merepinnal 981 cm s–2)

b

=

rõnga keskmine ümbermõõt (cm)

σa

=

tensiomeetri näit pärast raskuse asetamist rõngale (mN/m).

b) Vee abil: kasutatakse puhast vett, mille pindpinevus on näiteks 23 oC juures 72,3 mN/m.

Selle meetodi kohaselt toimub kaliibrimine kiiremini kui massi abil, kuid alati eksisteerib oht, et vee pindpinevust mõjutavad pindaktiivsed lisandid. Kaliibrimistegur Φb, millega kõiki seadme näitusid tuleb korrutada, leitakse võrrandi 2 abil:



image

(2)

kus:

σo

=

vee pindpinevus (mN/m) kirjanduse andmetel

σg

=

mõõtmisel leitud vee pindpinevus (mN/m) mõlemad samal temperatuuril.

1.6.4.3.   Proovide ettevalmistamine

Uuritavatest ainetest valmistatakse vajaliku kontsentratsiooniga vesilahused, kuhu ei tohi jääda lahustumatut jääki.

Lahust hoitakse püsival temperatuuril (± 0,5 oC). Kuna mõõtmisnõus oleva lahuse pindpinevus muutub aja jooksul, tehakse erinevatel aegadel mitu mõõtmist ja koostatakse kõver pindpinevuse muutumise kohta ajas. Kui pindpinevus enam ei muutu, on saavutatud tasakaal.

Mõõtmistulemusi mõjutavad tolm ja gaasilised lisandid. Seetõttu tuleb katsed teha suletud kambris.

1.6.5.   Katsetingimused

Mõõtmised tehakse ligikaudu 20 oC juures ja temperatuuri reguleeritakse ± 0,5 oC täpsusega.

1.6.6.   Katse tegemine

Mõõdetavad lahused viiakse põhjalikult puhastatud mõõtmisnõusse, vältides hoolikalt vahutamist, ja mõõtmisnõu paigutatakse katseseadmesse proovialusele. Proovialust mõõtmisnõuga tõstetakse, kuni rõngas on allpool mõõdetava lahuse pinda. Seejärel lastakse proovialust järk-järgult ühtlaselt allapoole (kiirusega ligikaudu 0,5 cm/min), eemaldades rõngast pinnast kuni maksimaalse tõmbejõu saavutamiseni. Rõnga külge kinnitunud vedelikukiht ei tohi sellest eralduda. Pärast mõõtmiste lõppu viiakse rõngas jälle allapoole vedeliku pinda ja korratakse mõõtmisi, kuni jõutakse konstantsete pindpinevuse väärtusteni. Iga mõõtmise juures registreeritakse lahuse mõõtmisnõusse viimisest möödunud aeg. Näidud võetakse rõnga vedelikupinnast lahtirebimiseks vajaliku maksimaalse jõu juures.

2.   ANDMED

Pindpinevuse arvutamiseks tuleb seadme näit (mN/m) korrutada kaliibrimisteguriga Φa või Φb (sõltuvalt kasutatud kaliibrimismeetodist). Nii saadakse väärtus, mis on ainult ligikaudne ja vajab seega korrigeerimist.

Harkins ja Jordan (4) on empiiriliselt kindlaks määranud rõngameetodi abil määratud pindpinevuse väärtuste parandustegurid, mis sõltuvad rõnga mõõtmetest, vedeliku tihedusest ja pindpinevusest.

Kuna Harkinsi ja Jordani tabelitest iga mõõtmise jaoks eraldi parandustegurite leidmine vesilahuste pindpinevuse arvutamiseks on väga töömahukas, võib kasutada lihtsustatud meetodit, kus parandatud pindpinevuse väärtused loetakse otse tabelist. (Tabeliväärtuste vahele jäävate näitude puhul kasutatakse interpolatsiooni).



Tabel:

mõõdetud pindpinevuste parandused

Ainult vesilahuste jaoks, ρ = 1 g/cm3

R

= 9,55 mm (rõnga keskmine raadius)

r

= 0,185 mm (rõngatraadi raadius)



Katseliselt mõõdetud väärtus (mN/m)

Parandatud väärtus (mN/m)

Kaliibrimine raskustega (vt 1.6.4.2.2a)

Kaliibrimine veega (vt 1.6.4.2.2b)

20

16,9

18,1

22

18,7

20,1

24

20,6

22,1

26

22,4

24,1

28

24,3

26,1

30

26,2

28,1

32

28,1

30,1

34

29,9

32,1

36

31,8

34,1

38

33,7

36,1

40

35,6

38,2

42

37,6

40,3

44

39,5

42,3

46

41,4

44,4

48

43,4

46,5

50

45,3

48,6

52

47,3

50,7

54

49,3

52,8

56

51,2

54,9

58

53,2

57,0

60

55,2

59,1

62

57,2

61,3

64

59,2

63,4

66

61,2

65,5

68

63,2

67,7

70

65,2

69,9

72

67,2

72,0

74

69,2

76

71,2

78

73,2

Tabel on koostatud Harkinsi-Jordani paranduste põhjal. Tabel on sarnane DIN standardi (DIN 53914) tabeliga vee ja vesilahuste jaoks (tihedus ρ = 1 g/cm3 ja kehtib müügil olevate rõngaste kohta mõõtmetega R = 9,55 mm (rõnga keskmine raadius) ja r = 0,185 mm (rõngatraadi raadius). Tabelis on esitatud pärast raskuste või veega kaliibrimist mõõdetud pindpinevuse väärtuste ka parandatud väärtused.

Pindpinevuse võib arvutada ka ilma eelneva kaliibrimiseta, kasutades järgmist valemit:

image

kus:

F

=

dünamomeetriga kile katkemisel mõõdetud jõud

R

=

rõnga raadius

f

=

parandustegur (1)

3.   ARUANDLUS

3.1.   KATSEARUANNE

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 kasutatud meetodit;

 kasutatud vee või lahuse iseloomu;

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

 mõõtmistulemusi: pindpinevuse väärtused, sh kõik üksiktulemused ja nende aritmeetiline keskmine ning parandatud keskmine (mis arvestab nii seadmetest tulenevat parandustegurit kui ka parandustabelit);

 lahuse kontsentratsiooni;

 katsetemperatuuri;

 lahuse vanust, st aega lahuse valmistamise ja mõõtmise vahel;

 pindpinevuse sõltuvust lahuse mõõtmisnõusse viimisest möödunud ajast;

 registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.

3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE

Arvestades, et destilleeritud vee pindpinevus on 20 oC juures 72,75 mN/m, tuleks ained, mille pindpinevus käesoleva meetodi abil mõõtes on alla 60 mN/m, lugeda pindaktiivseteks aineteks.

4.   VIITED

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

2. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.

3. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.

4. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.

▼M4

A.6.   LAHUSTUVUS VEES

SISSEJUHATUS

1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 105 (1995). Käesolev katsemeetod on 1981. aastal vastu võetud esialgse meetodi TG 105 läbivaadatud versioon. Käesoleva versiooni ja 1981. aasta versiooni vahel ei ole sisulist erinevust, muudetud on peamiselt vormi. Läbivaadatud versioon põhineb ELi katsemeetodil „Lahustuvus vees” (1).

LÄHTEKAALUTLUSED

2. Uuritava aine lahustuvus vees võib lisandite mõjul oluliselt muutuda. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatakse, kuidas määrata sellise aine lahustuvust vees, mis on praktiliselt puhas, vees püsiv ja ei lendu. Enne vees lahustuvuse määramist on kasulik omada uuritava aine kohta mõningast eelteavet, nagu struktuurvalem, aururõhk, dissotsiatsioonikonstant ja hüdrolüüs sõltuvalt pH väärtusest.

3. Käesolevas katsemeetodis on kirjeldatud kahte meetodit: kolonn-elueerimismeetod ja kolvimeetod, millega on kaetud lahustuvuse vahemikud vastavalt kuni 10–2 g/l ja alates kontsentratsioonist 10–2 g/l. Kirjeldatud on ka lihtsat eeluuringut. Eeluuringuga saab määrata uuritava proovi ligikaudse sobiva koguse, mida tuleb kasutada lõplikus katses, samuti küllastumise saavutamiseks vajaliku aja.

MÕISTED JA ÜHIKUD

4. Aine lahustuvus vees on selle küllastav massikontsentratsioon vees antud temperatuuril.

5. Lahustuvust vees väljendatakse lahustunud aine massina lahuse ruumala kohta. Lahustuvuse SI-ühik on kg/m3; võib kasutada ka ühikut g/l.

VÕRDLUSKEMIKAALID

6. Uuritava aine lahustuvuse määramisel ei ole vaja kasutada võrdluskemikaale.

MEETODITE KIRJELDUS

Katsetingimused

7. Eelistatav katsetemperatuur on 20 ± 0,5 °C. Valitud temperatuur tuleks seadme kõigis olulistes osades hoida konstantsena.

Eeluuring

8. Astmelise meetodi kasutamisel lisatakse toatemperatuuril 10-milliliitrises klaaskorgiga mõõtesilindris üha suuremaid veekoguseid umbes 0,1 grammile uuritavale ainele (tahke uuritav aine peab olema peenestatud). Pärast iga veekoguse lisamist loksutatakse segu kümme minutit ja kontrollitakse visuaalselt lahustumata proovijääkide olemasolu. Kui proov või osa sellest jääb pärast 10 ml vee lisamist lahustumata, jätkatakse katset 100 ml mõõtesilindris. Ligikaudne lahustuvus on esitatud tabelis 1 lisatud vee mahulise koguse all, mille juures proov täielikult lahustub. Kui lahustuvus on väike, võib uuritava aine lahustamiseks kuluda palju aega ja katseks tuleb ette näha vähemalt 24 tundi. Kui 24 tunni möödumisel on osa uuritavast ainest ikka veel lahustumata, tuleb lahustamiseks näha ette rohkem aega (kuni 96 tundi) või kasutada suuremat lahjendust, et teha kindlaks, kas tuleb kasutada kolonn-elueerimis- või kolvimeetodit.



Tabel 1

Vee milliliitreid 0,1 g soluudi kohta

0,1

0,5

1

2

10

100

> 100

Ligikaudne lahustuvus (g/l)

> 1 000

1 000 – 200

200–100

100–50

50–10

10–1

< 1

Kolonn-elueerimismeetod

Põhimõte

9. Meetodi aluseks on uuritava aine veega elueerimine mikrokolonnist, mis on täidetud inertse tugimaterjaliga, mis on eelnevalt kaetud uuritava aine liiaga (2). Lahustuvus vees leitakse eluaadi massikontsentratsioonist, kui eluaadi kontsentratsioon jõuab teatava aja järel platoole.

Seadmed

10. Seadmestik koosneb mikrokolonnist (joonis 1), mida hoitakse konstantse temperatuuri juures. Mikrokolonn on ühendatud kas tsirkulatsioonpumbaga (joonis 2) või ühtlustava anumaga (joonis 3). Mikrokolonn sisaldab inertset kandjat, mida hoiab paigal väike klaasvatikork, mis toimib ühtlasi ka osakeste filtrina. Võimalikud inertse kandjana kasutatavad materjalid on klaashelmed, diatomiit või muud inertsed materjalid.

11. Joonisel 1 kujutatud mikrokolonn sobib töötamiseks koos tsirkulatsioonpumbaga. Kolonnil on tühi ülaosa, mille maht on viis statsionaarse faasi mahtu (mis visatakse ära eksperimendi alguses) ja viis proovi ruumala (mis võetakse analüüsimiseks katse käigus). Seda vaba ruumi võib ka vähendada, kui lisandite kõrvaldamiseks kasutatava viie statsionaarse faasi mahu eluaadi asemele saab katse ajal lisada süsteemi vett. Kolonn on inertsest materjalist toru abil ühendatud tsirkulatsioonpumbaga, mille pumpamiskiirus on ligikaudu 25 ml/h. Tsirkulatsioonpump võib olla näiteks peristaltiline või membraanpump. Tuleb jälgida, et toru materjal ei põhjustaks saastumist ega adsorptsiooni.

12. Joonisel 3 on skemaatiliselt kujutatud tüüpiline ühtlustava anumaga süsteem. Selles süsteemis on mikrokolonn varustatud ühekäigukraaniga. Ühendamiseks ühtlustava anumaga on kasutatud klaaslihvühendust ja inertsest materjalist valmistatud voolikut. Lahuse ühtlustavast anumast välja voolamise kiirus peaks olema ligikaudu 25 ml/h.

Joonis 1

image

Mõõtmed millimeetrites

A. Lihvmuhv lihvühenduse jaoks

B. Vaba ruum kolonni peas

C. Sisediameeter 5 mm

D. Välisdiameeter 19 mm

E. Klaasvatist kork

F. Kraan

Joonis 2

image

A. Tasakaalustamine atmosfäärirõhuga

B. Voolumõõtur

C. Mikrokolonn

D. Termostateeritud tsirkulatsioonpump

E. Tsirkulatsioonpump

F. Kahekäigukraan proovide võtmiseks

Joonis 3

image

A. Ühtlustav anum (nt 2,5 l kolb)

B. Kolonn

C. Fraktsioonikoguja

D. Termostaat

E. Teflonvoolik

F. Klaaslihvühendus

G. Veevoolik termostaadi ja kolonni vahel (sisediameeter ligikaudu 8 mm)

13. Ligikaudu 600 mg tugimaterjali kantakse 50 ml ümarkolbi. Sobiv kogus uuritavat ainet lahustatakse kergesti lenduvas analüüsireaktiivi puhtusklassiga lahustis ja sobiv kogus seda lahust lisatakse tugimaterjalile. Selleks et vältida jaotumist tugiaine pinnal ja saavutada elueerimisetapil tugiaine küllastumine veega, eemaldatakse lahusti täielikult, näiteks pöördaurusti kasutamisega. Kaetud tugimaterjali lastakse kaks tundi seista ligikaudu 5 ml vees ja seejärel viiakse suspensioon mikrokolonni. Teise võimalusena võib kuiva kaetud tugimaterjali kallata veega täidetud mikrokolonni ja lasta sel kaks tundi tasakaalustuda.

14. Tugimaterjali katmine uuritava ainega võib tekitada probleeme, mille tõttu saadakse valed tulemused, näiteks kui uuritav aine sadestub tugiainele õlina. Selliseid probleeme tuleks uurida ja katseprotokollis tuleks esitada üksikasjad.

Mõõtmine tsirkulatsioonpumba kasutamisega

15. Kolonni hakatakse voolutama. Soovitatav on kasutada ligikaudset voolukiirust 25 ml/h, mis kirjeldatud kolonni puhul tähendab kümmet kolonni statsionaarse faasi mahtu tunnis. Vähemalt esimesed viis statsionaarse faasi mahtu visatakse ära, et eemaldada voolutamisega vees lahustuvad lisandid. Seejärel lastakse tsirkulatsioonpumbal töötada tasakaalu saabumiseni, st senikaua, kuni viie järjestikuse proovi kontsentratsioonide erinevused on juhuslikud ega ületa ±30 %. Nende proovide vahelised ajavahemikud peaksid vastama ajale, mis kulub vähemalt kümne statsionaarse faasi mahu eluendi voolamiseks läbi kolonni. Analüüsimeetodist olenevalt võib olla parem koostada graafik kontsentratsiooni sõltuvuse kohta ajast, millelt on näha tasakaalu saabumist.

Määramine ühtlustava anuma kasutamisega

16. Tuleks koguda järjestikuseid eluaadifraktsioone ja analüüsida neid valitud meetodi abil. Aine lahustuvus vees määratakse eluaadi keskjooksust nende fraktsioonide põhjal, mille kontsentratsioonid jäävad vähemalt viie järjestikuse proovi kestel konstantseks ((±30 %).

17. Eelistatud voolutuskeskkond on bidestilleeritud vesi. Kasutada võib ka deioniseeritud vett, mille takistus on üle 10 megaoomi/cm ja orgaanilise süsiniku sisaldus alla 0,01 %.

18. Kummagi meetodi puhul tehakse teine voolutamine poole väiksema voolukiirusega kui esimene. Kui kahe voolutamise tulemused on kooskõlas, on katse tehtud rahuldavalt. Kui väiksema voolukiiruse juures on mõõdetud lahustuvus suurem, tuleb voolukiiruse poole võrra vähendamist jätkata seni, kui kahe järjestikuse voolutamisega saadakse ühesugune lahustuvus.

19. Mõlema meetodi puhul tuleb Tyndalli efekti kasutamisega kontrollida, et fraktsioonid ei sisaldaks kolloidset ainet. Kolloidosakeste olemasolu korral katse tulemusi ei arvestata ja katset korratakse kolonniga, mille filtrivad omadused on paremad.

20. Tuleb mõõta iga proovi pH, eelistatult spetsiaalse indikaatorpabeririba abil.

Kolvimeetod

Põhimõte

21. Aine (tahke aine peab olema peenestatud) lahustatakse vees katsetemperatuurist mõnevõrra kõrgemal temperatuuril. Küllastumise saavutamisel segu jahutatakse ja hoitakse katsetemperatuuril. Mõõtmist võib alustada ka kohe katsetemperatuuril, kui sobivate proovide võtmisega on näidatud, et küllastustasakaal on saavutatud. Seejärel määratakse sobiva analüüsimeetodi (3) abil aine massikontsentratsioon vesilahuses, mis ei tohi sisaldada lahustumata osakesi.

Seadmed

22. Vaja on järgmisi materjale:

 tavalised labori klaasnõud ja seadmed;

 seade lahuse segamiseks konstantsel termostaaditemperatuuril;

 emulsiooni korral võib vaja minna tsentrifuugi (eelistatult termostateeritud), ning

 analüüsiseadmed.

Katse läbiviimise kord

23. Soovitud ruumala vee küllastamiseks vajalik uuritava aine kogus hinnatakse eeluuringu abil. Võetakse kolm klaaskorgiga klaasnõu (nt tsentrifuugiklaasid või kolvid) ja kaalutakse igaühte umbes viiekordne eespool osutatud ainekogus. Igasse nõusse lisatakse teatav kogus vett; veekogus valitakse vastavalt analüüsimeetodile ja lahustuvuse vahemikule. Nõud suletakse tihedalt korgiga ja seejärel segatakse temperatuuril 30 °C. Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat, nt magnetsegajat termostateeritud veevanniga. Ühe päeva pärast võetakse üks nõu ja tasakaalustatakse seda 24 h katsetemperatuuril aeg-ajalt loksutades. Nõu sisu tsentrifuugitakse seejärel katsetemperatuuril ja määratakse siis sobiva analüüsimeetodi abil uuritava aine kontsentratsioon selges veefaasis. Sama korratakse ülejäänud kahe nõuga vastavalt kahe- ja kolmepäevase 30 °C juures eelneva tasakaalustamise järel. Kui vähemalt kahes viimases nõus määratud kontsentratsioonid ei erine rohkem kui 15 %, on katse tehtud rahuldavalt. Kui esimese, teise ja kolmanda nõu mõõtmisel saadud tulemustes ilmneb kasvutendents, tuleb katset korrata pikemate tasakaalustamisaegadega.

24. Katse võib teha ka ilma eelneva inkubeerimiseta 30 °C juures. Küllastumistasakaalu saavutamise kiiruse hindamiseks võetakse proove senikaua, kuni mõõdetav kontsentratsioon enam ei sõltu segamise ajast.

25. Tuleb mõõta iga proovi pH, eelistatult spetsiaalse indikaatorpabeririba abil.

Analüütilised määramised

26. Määramisel eelistatakse spetsiifilisi uuritava aine määramise meetodeid, kuna juba väike lisandikogus võib mõõdetud lahustuvuse väärtuses põhjustada suure vea. Sellised meetodid on näiteks gaas- või vedelikkromatograafia, tiitrimine, fotomeetria, voltameetria.

ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE

Andmed

Kolonn-elueerimismeetod

27. Iga katse puhul tuleks välja arvutada vähemalt viie järjestikuse küllastusplatool võetud proovi keskmine väärtus ja standardhälve. Eri voolukiiruste juures tehtud kahe katse keskmised väärtused ei tohiks erineda rohkem kui 30 %.

Kolvimeetod

28. Kolme kolvi määramisel saadud üksiktulemused, mis ei tohiks erineda üle 15 %, keskmistatakse.

Katseprotokoll

Kolonn-elueerimismeetod

29. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave:

 eeluuringu tulemused;

 aine keemiline määratlus ja lisandid (eelnevad puhastamisetapid, kui ainet puhastati);

 iga proovi kontsentratsioon, voolukiirus ja pH;

 iga katse kohta vähemalt viie küllastusplatool võetud proovi keskväärtus ja standardhälve;

 vähemalt kahe järjestikuse katse keskmine väärtus;

 vee temperatuur küllastamise ajal;

 analüüsimeetod;

 kasutatud tugimaterjal;

 tugimaterjali katmisega seotud andmed;

 kasutatud lahusti;

 andmed aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse tingimustes;

 kogu muu asjakohane teave, eriti lisandite ja aine füüsikalise oleku kohta, mis võib mõjutada tulemuste tõlgendamist.

Kolvimeetod

30. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave:

 eeluuringu tulemused;

 aine keemiline määratlus ja lisandid (eelnevad puhastamisetapid, kui ainet puhastati);

 iga üksiku analüüsi tulemus ja tulemuste keskmine, kui ühe kolvi kohta tehti mitu mõõtmist;

 iga proovi pH väärtus;

 eri kolbidega saadud kooskõlaliste tulemuste keskväärtused;

 katsetemperatuur;

 analüüsimeetod;

 andmed aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse tingimustes;

 kogu muu asjakohane teave, eriti lisandite ja aine füüsikalise oleku kohta, mis võib mõjutada tulemuste tõlgendamist.

KIRJANDUS

1) Komisjoni direktiiv 92/69/EMÜ, 31. juuli 1992, millega seitsmeteistkümnendat korda kohandatakse tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta (EÜT L 383, 29.12.1992, lk 113).

2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.

3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

▼B

A.8.   JAOTUSTEGUR

1.   MEETOD

Kirjeldatud „loksutamismeetod” põhineb OECD katsesuunisel (1).

1.1.   SISSEJUHATUS

Katse tegemiseks on kasulik teada aine struktuuri ja dissotsiatsioonikonstanti, lahustuvust vees, hüdrolüüsuvust, lahustuvust oktanoolis ja pindpinevust.

Sooli moodustavate ainete puhul tuleks mõõtmisi teha ainult vabas olekus ainega (vabal happel või vabal alusel), mis saadakse sobiva puhverlahuse kasutamisel pH-ga vähemalt ühe ühiku võrra alla (vaba happe saamiseks) või üle (vaba aluse saamiseks) vastava pK.

Katsemeetod sisaldab kaht eraldi protseduuri: loksutamismeetodit ja kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafiat (HPLC). Esimest meetodit kasutatakse ainetel log Pow (mõisteid vt allpool) väärtusega vahemikus –2 kuni 4, viimast ainetel log Pow väärtusega vahemikus 0 kuni 6. Enne kummagi katseprotseduuri rakendamist tuleks varem kindlaks teha jaotusteguri hinnanguline väärtus.

Loksutamismeetodit saab kasutada ainult puhaste, vees ja oktanoolis lahustuvate ainete puhul. Seda ei saa kasutada pindaktiivsete ainete korral (viimaste puhul tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees).

HPLC meetodit ei saa kasutada tugevate hapete ega aluste, metallikomplekside, pindaktiivsete ainete ega eluendiga reageerivate ainete puhul. Nende ainete korral tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees).

HPLC meetod on katseühendis olevate lisandite suhtes vähem tundlik kui loksutamismeetod. Sellele vaatamata võivad lisandid tulemuste tõlgendamise keeruliseks muuta, kuna piike ei saa enam kindlalt identifitseerida. Eristamatute piikidega segude puhul tuleks esitada log P ülemine ja alumine piir.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Jaotustegur (P) on määratletud lahustunud aine tasakaalukontsentratsioonide (ci) suhtena kahest praktiliselt segunematust lahustist koosnevas kahefaasilises süsteemis. Oktanooli ja vee puhul:

image

Jaotustegur (P) on seega kahe kontsentratsiooni suhe ja seda väljendatakse harilikult kümnendlogaritmina (log P).

1.3.   VÕRDLUSAINED

Loksutamismeetod

Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

HPLC meetod

Ühendi HPLC mõõtmistulemuste ja tema P väärtuse vastavuse leidmiseks tuleb koostada vähemalt kuue punktiga kaliibrimiskõver telgedes log P vs. HPLC mõõtmistulemused. Sobivad võrdlusained peab valima analüüsi sooritaja. Võimaluse korral peaks üks võrdlusühend olema testainest kõrgema ja üks madalama POW väärtusega. Log P väärtustel alla 4 piisab kaliibrimiseks loksutamismeetodil saadud andmetest. Log P väärtustel üle 4 võib kaliibrimiseks kasutada kirjanduses esitatud andmeid, kui need on kooskõlas arvutuslikult leitud väärtustega. Suurema täpsuse huvides on eelistatav kasutada testainele struktuuriliselt lähedasi võrdlusühendeid.

Kirjandusest on paljude ainerühmade kohta võimalik leida ulatuslikke andmekogumeid log POW väärtustega (2, 3). Kui samalaadse struktuuriga ühendite jaotustegurite kohta andmed puuduvad, võib kasutada vähem spetsiifilist kaliibrimist muude võrdlusühenditega.

Liites 2 esitatakse soovitatavate võrdlusainete ja nende POW väärtuste nimekiri.

1.4.   KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE

1.4.1.   Loksutamismeetod

Jaotusteguri määramiseks tuleb saavutada kõigi süsteemi vastastiktoimes olevate komponentide tasakaal ja määrata siis kummaski faasis lahustunud ainete kontsentratsioonid. Selleteemalise kirjanduse põhjal on selleks võimalik kasutada mitmeid erinevaid meetodeid; nt kaks faasi segatakse põhjalikult ja eraldatakse seejärel uuritava aine tasakaalukontsentratsiooni määramiseks.

1.4.2.   HPLC meetod

HPLC jaoks kasutatakse müügil olevaid analüütilisi kolonne, mille täidiseks on pikkade (nt C8, C18) silikageeliga seotud süsivesinikahelatega tahke faas. Seesugusesse kolonni süstitud kemikaalid liiguvad selles erinevate kiirustega, kuna jaotuvad liikuva faasi ja statsionaarse süsivesinikfaasi vahel erinevalt. Kemikaalide segud elueeruvad oma hüdrofoobsuse järjekorras – vees lahustuvad kemikaalid elueeruvad esimesena ja rasvlahustuvad viimasena, olenevalt oma süsivesiniku-vee jaotustegurist. Nii on retentsiooniaega sellises (pöördfaasilises) kolonnis võimalik seostada oktanooli/vee jaotusteguriga. Jaotustegur leitakse mahtuvustegurist k, mille valem on järgmine:

image

kus tr = testaine retentsiooniaeg ja t0 = keskmine aeg, mille jooksul lahustimolekul läbib kolonni (surnud aeg).

Kvantitatiivne analüüs pole vajalik, määrata tuleb ainult retentsiooniajad.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

1.5.1.   Korratavus

Loksutamismeetod

Leitava jaotusteguri täpsuse tagamiseks tehakse kordusmõõtmised kolmedel erinevatel katsetingimustel, erineva ainekoguse ja erineva lahustite mahu suhtega. Korduskatsetel määratud jaotusteguri väärtused peaksid logaritmina väljendatuna ± 0,3 ühiku täpsusega kokku langema.

HPLC meetod

Mõõtmistulemuste usaldusväärsuse parandamiseks tuleks teha kordusmõõtmised. Üksikutel mõõtmistel määratud log P väärtused peaksid ± 0,1 ühiku täpsusega kokku langema.

1.5.2.   Tundlikkus

Loksutamismeetod

Meetodi mõõtepiirkonna määrab kasutatava analüüsimeetodi avastamispiir. See peaks võimaldama määrata log POW väärtused vahemikus –2 kuni 4 (mõningatel tingimustel võib ülemist piiri nihutada kuni log POW väärtuseni 5) eeldusel, et lahustunud aine kontsentratsioon kummaski faasis ei ületa 0,01 mooli liitris.

HPLC meetod

HPLC meetod võimaldab määrata jaotusteguri log POW vahemikus 0–6.

Üldjuhul langeb selle meetodi abil määratud jaotusteguri logaritmiline väärtus ± 1 ühiku täpsusega kokku loksutamismeetodi abil leitud väärtusega. Tüüpilisi vastavusi võib leida kirjandusest (4, 5, 6, 7, 8). Suurem täpsus on tavaliselt saavutatav samalaadse struktuuriga võrdlusühendite kasutamisel (9).

1.5.3.   Spetsiifilisus

Loksutamismeetod

Nernsti jaotusseadus kehtib ainult konstantsel temperatuuril, rõhul ja pH-l ning ainult lahjendatud lahustes. See kehtib ainult puhta, kahe puhta lahusti vahel dispergeeritud aine puhul. Kui ühes või mõlemas faasis on samal ajal mitu lahustunud ainet, võib see tulemusi mõjutada.

Lahustunud molekulide dissotsieerumise või assotsieerumisega kaasnevad samuti kõrvalekalded Nernsti jaotusseadusest. Kõrvalekalded väljenduvad sõltuvuse tekkes jaotusteguri ja lahuse kontsentratsiooni vahel.

Paljude tulemust mõjutavate tasakaalude tõttu ei tohiks seda katsemeetodit dissotsieeruvatel ühenditel vastava paranduseta kasutada. Selliste ühendite puhul tuleks kaaluda puhverlahuse kasutamist vee asemel; puhvri pH peaks vähemalt ühe ühiku võrra erinema aine pKa väärtusest ja arvesse tuleks võtta selle pH mõju antud keskkonnale.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Jaotusteguri esialgne hindamine

Jaotustegurit on eelistatav hinnata arvutuslikult (vt liidet 1) või testaine lahustuvuse suhte põhjal puhastes lahustites (10).

1.6.2.   Loksutamismeetod

1.6.2.1.   Lahustite ettevalmistamine

Oktanool: jaotusteguri määramisel tuleks kasutada analüüsipuhast lahustit.

Vesi: kasutada tuleks vett, mis on bidestilleeritud klaas- või kvartsseadmes. Dissotsieeruvate ühendite puhul tuleks vee asemel kasutada puhverlahuseid, juhul kui see on õigustatud.

Märkus

Otse ioonvahetist pärinevat vett kasutada ei tohi.

1.6.2.1.1.    Lahustite eelküllastamine

Enne jaotustegur määramist tuleks lahustitesüsteemi faasid katsetemperatuuril loksutades üksteise suhtes küllastada. Praktiline lahendus selleks on panna analüüsipuhas oktanool ja vesi kumbki suures pudelis piisava koguse teise lahustiga 24 tunniks mehaanilisele loksutile ja lasta neil seejärel seista faaside eraldumise ja küllastumiseni.

1.6.2.1.2.    Katseks valmistumine

Kahefaasilise süsteemi kogumaht peaks katseanuma peaaegu täielikult täitma. See aitab vältida kadusid lendumise kaudu. Kasutatavate mahtude suhe ja ainekogused sõltuvad järgmistest asjaoludest:

 esialgsest hinnangulisest jaotusteguri väärtusest (vt eespool);

 analüüsiks vajalikust minimaalsest testaine kogusest ning

 kontsentratsioonipiirangust 0,01 mol/l kummaski faasis.

Sooritatakse kolm katset. Esimeses kasutatakse arvutatud oktanooli-vee suhet, teises jagatakse see suhe kahega ja kolmandas korrutatakse see suhe kahega (nt 1:1, 1:2, 2:1).

1.6.2.1.3.    Testaine

Valmistatakse põhilahus veega eelküllastatud oktanoolis. Põhilahuse kontsentratsioon tuleks enne selle jaotusteguri mõõtmisel kasutamist täpselt kindlaks määrata. Lahust tuleks säilitada tingimustes, mis tagavad selle stabiilsuse.

1.6.2.2.   Katsetingimused

Katsetemperatuuri tuleks hoida konstantsena (± 1 oC) ja see peaks jääma vahemikku 20–25 oC.

1.6.2.3.   Mõõtmisprotseduur

1.6.2.3.1.    Jaotustasakaalu saavutamine

Kõigi katsetingimuste jaoks tuleks kahes eksemplaris ette valmistada vajalikud mõlema lahusti kaalutised koos vajaliku koguse põhilahusega.

Oktanoolifaase tuleks mõõta mahu järgi. Katseanumaid tuleks loksutada kas sobival loksutil või käsitsi. Tsentrifuugiklaasi kasutamisel on seda soovitatav kiiresti 180o ümber oma risttelje pöörata, nii et sissejäänud õhk tõuseb läbi mõlema faasi. Kogemused on näidanud, et tavaliselt piisab jaotustasakaalu saavutamiseks 50 sellisest pöördest. Kindluse mõttes on soovitatav rakendada 100 pööret viie minuti jooksul.

1.6.2.3.2.    Faaside eraldamine

Vajaduse korral tuleks segu faaside eraldamiseks tsentrifuugida. Seda tuleks teha toatemperatuuril hoitavas laboritsentrifuugis; mittetermostateeritava tsentrifuugi kasutamisel tuleks tsentrifuugiküvette enne analüüsi vähemalt tund aega tasakaalustada.

1.6.2.4.   Analüüs

Jaotusteguri määramiseks tuleb määrata testaine kontsentratsioonid mõlemas faasis. Selleks võib võtta kindla koguse lahust iga katsenõu mõlemast faasist ja analüüsida neid vastavalt valitud meetodile. Arvutada tuleks mõlemas faasis oleva aine koguhulka ja võrrelda seda alguses süsteemi viidud kogusega.

Proovide võtmisel veefaasist tuleks kasutada meetodit, mille puhul oktanoolifaasi jälgede proovi sattumise oht on minimaalne, näiteks klaassüstlalt eemaldatava nõelaga. Süstal peaks algul olema osaliselt õhuga täidetud. Nõela viimisel läbi oktanoolikihi tuleks õhk õrnalt välja suruda. Küllaldane kogus veefaasi tõmmatakse süstlasse. Süstal tõmmatakse kiirelt lahusest välja ja nõel eemaldatakse. Süstla sisu võib seejärel veefaasi proovina kasutada. Kontsentratsioonid eraldatud faasides tuleks eelistatavalt määrata spetsiifiliste määramismeetodite abil. Sobida võivad näiteks järgmised analüüsimeetodid:

 fotomeetrilised meetodid;

 gaaskromatograafia;

 kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafia.

1.6.3.   HPLC meetod

1.6.3.1.   Ettevalmistused

Vajalik on pulseerimisvaba pumba ja sobiva detektoriga vedelikkromatograaf. Soovitatav on kasutada silmusega sisestamisklappi. Polaarsete rühmade esinemine statsionaarses faasis võib HPLC kolonni efektiivsust oluliselt vähendada. Seetõttu peaks polaarsete rühmade sisaldus statsionaarses faasis olema minimaalne (11). Kasutada võib müügil olevaid mikrogranulaarseid pöördfaasilisi täidiseid või valmiskolonne. Sisestamissüsteemi ja analüüsikolonni vahel võib olla kaitsekolonn.

Elueerimislahusti valmistatakse HPLC-puhtast metanoolist ja HPLC-puhtast veest ning see degaseeritakse enne kasutamist. Kasutada tuleks isokraatilist elueerimist. Veesisaldus metanooli-vee liikuvfaasides peaks olema vähemalt 25 %. Tavaliselt piisab ühendite, mille log P = 6, elueerimiseks ühe tunni jooksul 1 ml/min voolukiiruse juures metanooli-vee suhtest 3:1 (mahu järgi). Kõrge log P-ga ühendite (ja võrdlusühendite) puhul võib olla vaja retentsiooniaega lühendada, vähendades selleks liikuva faasi polaarsust või kolonni pikkust.

Oktanoolis väga madala lahustuvusega ühenditel kaldub HPLC meetodi kohaselt leitud log POW väärtus olema ebaharilikult madal; selliste ühendite piigid elueeruvad vahel koos lahusti frondiga. See on tõenäoliselt tingitud asjaolust, et jaotumisprotsess on liiga aeglane, saavutamaks normaalse kestusega HPLC eraldamise jooksul tasakaalu. Usaldusväärse väärtuse saamiseks võib sellisel juhul abi olla voolukiiruse vähendamisest ja/või metanooli-vee suhte alandamisest.

Katse- ja võrdlusühendite lahustuvus liikuvas faasis peab olema küllaldane nende tuvastamiseks. Metanooli-vee segus võib lisandeid kasutada ainult erandjuhtudel, kuna lisandid muudavad kolonni omadusi. Lisanditega kromatogrammide tegemisel tuleb kasutada teist sama tüüpi kolonni. Kui metanooli-vee eluent ei sobi, võib kasutada muid orgaanilise lahusti ja vee segusid, nt etanooli-vee või atsetonitriili-vee segu.

Dissotsieeruvate ühendite puhul on eluendi pH kriitilise tähtsusega. See peaks jääma kolonni töövahemikku, mis on tavaliselt 2–8. Soovitatav on kasutada puhverlahust. Hoolikalt tuleks vältida soolade sadestumist ja kolonni omaduste halvenemist, mida tuleb ette mõningate orgaanilise faasi/puhverlahuse segude puhul. HPLC määramisi ei ole silikageelil põhinevate statsionaarsete faasidega pH väärtustel üle 8 soovitatav teha, kuna aluseline liikuv faas võib kolonni omadusi järsult halvendada.

Võrdlusühendid peaksid olema võimalikult kõrge puhtusastmega. Uuritavad ja kaliibrimisel kasutatavad ühendid lahustatakse võimaluse korral liikuvas faasis.

Temperatuur ei tohiks mõõtmiste käigus kõikuda rohkem kui ± 2 K.

1.6.3.2.    Mõõtmine

Surnud aega t0 võib määrata kas homoloogilise rea (nt alküülmetüülketoonid) või kolonnis mittepeetuvate orgaaniliste ühendite (nt tiouurea, formamiid) abil. Surnud aja arvutamiseks homoloogilise rea abil süstitakse kolonni vähemalt seitse homoloogilise rea liiget ja määratakse vastavad retentsiooniajad. Töötlemata retentsiooniaja väärtused tr (n c + 1) esitatakse tr (n c) funktsioonina ja leitakse järgmise regressioonivõrrandi lõikepunkt a ja tõus b:

tr(nc + 1) = a + b tr(nc)

(nc = süsinikuaatomite arv). Surnud aeg t0 leitakse seejärel järgmisest valemist:

t0 = a/(1-b)

Järgmise etapina koostatakse sobivate võrdlusühendite log k versus log P korrelatsioonikõver. Praktikas süstitakse ühel ajal 5–10 võrdlusühendit, mille log P jääb eeldatavasse log P vahemikku, ja määratakse retentsiooniajad, eelistatavalt detektorsüsteemiga ühendatud meerikuga integraatori abil. Arvutatakse vastavad logaritmilised mahtuvustegurite väärtused log k ja esitatakse graafiliselt nende sõltuvus loksutamismeetodil leitud log P väärtustest. Kaliibrimine tehakse regulaarsete ajavahemike tagant, vähemalt kord päevas, et võtta arvesse võimalikke kolonni efektiivsuse muutusi.

Testaine süstitakse võimalikult väikese liikuvfaasi kogusega. Määratakse retentsiooniaeg (soovitatavalt kahe paralleelmääramisena), võimaldades nii arvutada mahtuvustegurit k. Seejärel saab võrdlusühendite korrelatsioonigraafiku põhjal interpoleerida testaine jaotusteguri. Väga kõrgete ja väga madalate jaotustegurite korral tuleb väärtus ekstrapoleerida. Sellisel juhul tuleb hoolikalt silmas pidada regressioonisirge usalduspiiri.

2.   ANDMED

Loksutamismeetod

Määratud log P väärtuste usaldatavust saab kontrollida topeltmääramiste tulemuste keskmise võrdlemisel üldise keskmisega.

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

 kui kumbki meetod ei ole kohaldatav (nt pindaktiivsete ainete puhul), tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees);

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmeid ja märkusi.

Loksutamismeetodi puhul:

 esialgse hinnangulise määramise tulemust, kui see leiti;

 määramistemperatuuri;

 kontsentratsioonide määramisel kasutatud analüüsiprotseduuride andmeid;

 tsentrifuugimise kestust ja kiirust, kui seda kasutati;

 mõlemas faasis igal määramisel leitud kontsentratsioone (st kokku 12 kontsentratsiooni väärtust);

 testaine massi, mõlema faasi mahtu igas katseanumas ja pärast tasakaalustamist kummaski faasis oleva testaine summaarset arvutuslikku kogust;

 iga katsetingimuste kogumi kohta tuleks esitada jaotusteguri (P) arvutuslikult leitud väärtused ning nende keskmine, samuti kõigi määramiste keskmine. Kui on märke jaotusteguri kontsentratsioonisõltuvusest, tuleks see aruandes ära märkida;

 esitada tuleks üksikute P väärtuste standardhälve nende keskväärtusest;

 kõigi määramiste keskmine P väärtus tuleks esitada ka kümnendlogaritmina;

 arvutuslikku teoreetilist POW väärtust, kui selline väärtus määrati või kui mõõdetud väärtus on suurem kui 104;

 katses kasutatud vee ja veefaasi pH-d;

 puhvrite kasutamisel nende vee asemel kasutamise põhjendust, nende koostist, kontsentratsiooni ja pH väärtust ning veefaasi pH väärtust enne ja pärast katset.

HPLC meetodi puhul:

 esialgse hinnangulise määramise tulemust, kui see leiti;

 test- ja võrdlusaineid ja nende puhtust;

 määramiste temperatuurivahemikku;

 pH-d, mille juures määramised tehti;

 andmeid analüüsi- ja kaitsekolonni, liikuva faasi ja kasutatud detektori kohta;

 kaliibrimisel kasutatud võrdlusühendite retentsiooniandmeid ja kirjanduses esitatud log P väärtusi;

 sobitatud regressioonisirge (log k versus log P) andmeid;

 katseühendi keskmisi retentsiooniandmeid ja interpoleeritud log P väärtust;

 seadmete ja töötingimuste kirjeldust;

 elueerimisprofiile;

 kolonni viidud test- ja võrdlusainete koguseid;

 surnud aega ja selle määramise meetodit.

4.   VIITED

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

2. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.

3. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

4. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.

5. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981).

6. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.

7. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.

8. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.

9. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787.

10. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.

11. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.

12. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

13. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.

14. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.

15. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 459.

16. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

17. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16,1 207.

18. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1 113.

19. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382.

20. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

21. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984,

22. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel 1978.

23. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

1. liide

Arvutus-/hindamismeetodid

SISSEJUHATUS

Üldise arvutusmeetodite tutvustuse, vastavaid andmeid ja näiteid võib leida raamatust „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (a).

Arvutuslikke POW väärtusi saab kasutada

 sobiva katsemeetodi valikul (loksutamismeetod: log POW vahemikus –2 kuni 4, HPLC meetod: log POW vahemikus 0–6);

 sobivate katsetingimuste valikul (näiteks võrdlusainete valikul HPLC protseduurideks, oktanooli/vee suhte valikul loksutamismeetodi puhul);

 labori sisekontrollimeetodina võimalike katsevigade avastamiseks;

 hinnangulise POW väärtuse saamiseks juhtudel, mille puhul katsemeetodeid tehnilistel põhjustel rakendada ei saa.

HINDAMISMEETOD

Jaotusteguri esialgne hindamine Jaotusteguri hinnangulise väärtuse võib leida testaine lahustuvuse põhjal puhastes lahustites.

Selleks:

image

ARVUTUSMEETODID

Arvutusmeetodite põhimõte

Kõigi arvutusmeetodite kohaselt jagatakse molekul sobivateks alamstruktuurideks, mille kohta on olemas usaldusväärsed log POW osaväärtused. Seejärel arvutatakse terve molekuli log POW, liites kokku funktsionaalrühmadele vastavad osaväärtused ja sisemolekulaarseid vastasmõjusid arvestavad parandusliikmed.

Rühmakonstantide ja parandusliikmete väärtusi võib leida toodud allikatest (b, c, d, e). Mõnda allikat ajakohastatakse regulaarselt (b).

Kvaliteedinõuded

Üldjuhul arvutusmeetodi usaldusväärsus väheneb uuritava ühendi keerukuse kasvades. Madala molaarmassiga lihtsate, ühe või kahe funktsionaalrühmaga molekulide puhul on eeldatav vahe erinevate, funktsionaalrühmade osaväärtusi arvestavate meetodite abil leitud ning mõõdetavate log POW väärtuste vahel 0,1 –0,3 ühikut. Keerukamate molekulide puhul võib veapiir olla suurem. See sõltub nii saadaval olevate rühmakonstantide usaldusväärsusest kui ka oskusest hinnata sisemolekulaarseid vastasmõjusid (nt vesiniksidemeid) ja kasutada vastavaid parandusliikmeid (viimane probleem ei ole arvutitarkvara CLOGP-3 kasutamisel eriti oluline) (b). Dissotsieeruvate ühendite puhul on oluline arvestada õigesti dissotsiatsiooniastet ja vastava iooni laengut.

Arvutuskäik

Hanschi π-meetod

Algne hüdrofoobse asendaja konstant π, mille võtsid kasutusele Fujita jt (f), määratletakse järgmiselt:

πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH)

kus POW (PhX) on aromaatse derivaadi jaotustegur ja POW (PhH) lähteaine jaotustegur.

(e.g. πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71 ).

Vastavalt määratlusele on π-meetod kohaldatav peamiselt aromaatsetele asendussaadustele. Paljude asendajate π-väärtused on esitatud koondtabelitena (b, c, d). Neid kasutatakse aromaatsete molekulide või alamstruktuuride log POW arvutamisel.

Rekkeri meetod

Rekkeri (g) järgi arvutatakse log POW väärtus järgmiselt:

image

kus fi tähistab erinevaid rühmakonstante ja ai nende esinemissagedust uuritavas molekulis. Parandusliikmed võib väljendada summaarselt konstandi Cm (nn maagilise konstandi) korrutisena. Rühmakonstandid fi ja Cm leiti mitme muutujaga regressioonianalüüsi abil 825 ühendi 1 054 eksperimentaalse POW väärtuse põhjal (c, h). Vastasmõju arvestavad liikmed määratakse vastavalt kirjanduses toodud eeskirjadele (e, h, i).

Hanschi-Leo meetod

Hanschi ja Leo (c) järgi arvutatakse log POW väärtus järgmiselt:

image

kus fi tähistab erinevaid rühmakonstante, Fj parandusliikmeid ja ai, bj vastavaid esinemissagedusi. Paljude eksperimentaalsete POW väärtuste põhjal koostati katse-eksituse meetodil aatomite ja funktsionaalrühmade osaväärtuste ning parandusliikmete Fj (nn faktorite) nimekiri. Parandusliikmed on jagatud mitmesse eri klassi (a, c). Kõigi reeglite ja parandusliikmete arvestamine on suhteliselt keerukas ja aeganõudev. Selleks otstarbeks on välja töötatud vastavad tarkvarapaketid (b).

Kombineeritud meetod

Keerukate molekulide log POW arvutamise täpsust on oluliselt võimalik suurendada, kui jagada molekul suuremateks alamstruktuurideks, mille kohta on olemas usaldusväärsed log POW väärtused kas tabelites (b), (c) või on need saadud isiklikel mõõtmistel. Selliseid fragmente (nt heterotsükleid, antrakinooni, asobenseeni) võib seejärel kombineerida Hanschi π-väärtuste või Rekkeri või Leo rühmakonstantidega.

Märkused

i) Osaliselt või täielikult dissotsieerunud ühenditele saab arvutusmeetodeid kohaldada ainult juhul, kui on võimalik arvestada vajalikke parandustegureid.

ii) Kui võib eeldada sisemolekulaarsete vesiniksidemete olemasolu, tuleb vastavad parandusliikmed liita (ligikaudu + 0,6 kuni + 1,0 log POW ühikut) (a). Viiteid selliste sidemete olemasolu kohta võib leida molekuli ruumilistest mudelitest või spektroskoopilistest andmetest.

iii) Kui võimalik on mitu tautomeerset vormi, kasutatakse arvutustes kõige suurema tõenäosusega vormi.

iv) Hoolikalt tuleks jälgida muudatusi rühmakonstantide tabelites.

Aruanne

Arvutus-/hindamismeetodite kasutamisel peaks katsearuanne võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:

 aine kirjeldust (segu, lisandid jne);

 märkeid võimalike sisemolekulaarsete vesiniksidemete, dissotsiatsiooni, laengu ja mis tahes muude ebaharilike nähtuste kohta (nt tautomeeria);

 arvutusmeetodi kirjeldust;

 märget kasutatud andmebaasi kohta või andmebaasi ennast;

 lahknevusi tavapärasest fragmentide valikust;

 põhjalikku arvutusdokumentatsiooni.

KIRJANDUS

a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 1979, vol. 14,479.

f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.

i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

2.liide

Soovitatavad võrdlusained HPLC meetodi puhul



Nr

Võrdlusaine

log POW

pKa

1

2-butanoon

0,3

 

2

4-atsetüülpüridiin

0,5

 

3

Aniliin

0,9

 

4

Atseetaniliid

1,0

 

5

Bensüülalkohol

1,1

 

6

p-metoksüfenool

1,3

pKa = 10,26

7

Fenoksüäädikhape

1,4

pKa = 3,12

8

Fenool

1,5

pKa = 9,92

9

2,4-dinitrofenool

1,5

pKa = 3,96

10

Bensonitriil

1,6

 

11

Fenüülatsetonitriil

1,6

 

12

4-metüülbensüülalkohol

1,6

 

13

Atsetofenoon

1,7

 

14

2-nitrofenool

1,8

pKa = 7,17

15

3-nitrobensoehape

1,8

pKa = 3,47

16

4-kloroaniliin

1,8

pKa = 4,15

17

Nitrobenseen

1,9

 

18

Kaneelalkohol

1,9

 

19

Bensoehape

1,9

pKa = 4,19

20

p-kresool

1,9

pKa = 10,17

21

Kaneelhape

2,1

pKa = 3,89 cis 4,44 trans

22

Anisool

2,1

 

23

Metüülbensoaat

2,1

 

24

Benseen

2,1

 

25

3-metüülbensoehape

2,4

pKa = 4,27

26

4-klorofenool

2,4

pKa = 9,1

27

Trikloroetüleen

2,4

 

28

Atrasiin

2,6

 

29

Etüülbensoaat

2,6

 

30

2,6-diklorobensonitriil

2,6

 

31

3-klorobensoehape

2,7

pKa = 3,82

32

Tolueen

2,7

 

33

1-naftool

2,7

pKa = 9,34

34

2,3-dikloroaniliin

2,8

 

35

Klorobenseen

2,8

 

36

Allüülfenüüleeter

2,9

 

37

Bromobenseen

3,0

 

38

Etüülbenseen

3,2

 

39

Bensofenoon

3,2

 

40

4-fenüülfenool

3,2

pKa = 9,54

41

Tümool

3,3

 

42

1,4-diklorobenseen

3,4

 

43

Difenüülamiin

3,4

pKa = 0,79

44

Naftaleen

3,6

 

45

Fenüülbensoaat

3,6

 

46

Isopropüülbenseen

3,7

 

47

2,4,6-triklorofenool

3,7

pKa = 6

48

Bifenüül

4,0

 

49

Bensüülbensoaat

4,0

 

50

2,4-dinitro-6-sec-butüülfenool

4,1

 

51

1,2,4-triklorobenseen

4,2

 

S2

Dodekaanhape

4,2

 

53

Difenüüleeter

4,2

 

54

Butüülbenseen

4,5

 

55

Fenantreen

4,5

 

56

Fluoranteen

4,7

 

57

Dibensüül

4,8

 

58

2,6-difenüülpüridiin

4,9

 

59

Trifenüülamiin

5,7

 

60

DDT

6,2

 

Muud madala log POW väärtusega võrdlusained

1

Nikotiinhape

- 0,07

 

A.9.   LEEKPUNKT

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Katse tegemiseks on kasulik teada aine süttivust. Katsemeetod sobib vedelikele, mille aurud võivad süüteallika abil süttida. Siintoodud katsemeetodid annavad usaldusväärseid tulemusi ainult iga meetodi puhul märgitud leekpunkti vahemikus.

Kasutatava meetodi valikul tuleks arvestada keemiliste reaktsioonide võimalusega aine ja proovianuma vahel.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Leekpunkt on madalaim, normaalrõhule 101,325 kPa normaliseeritud temperatuur, mille juures eraldub vedelikust katsemeetodis määratletud tingimustel aure sellises koguses, et katseanumas tekib süttiv auru/õhu segu.

Ühikud: oC

t = T – 273,15

(t ( oC) ja T (K))

1.3.   VÕRDLUSAINED

Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Aine viiakse katseanumasse ja soojendatakse või jahutatakse iga meetodi puhul kirjeldatud protseduuri kohaselt katsetemperatuurini. Veendumaks, kas proov katsetemperatuuril süttib või mitte, tehakse süütamiskatsed.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

1.5.1.   Korratavus

Korratavus varieerub vastavalt leekpunkti vahemikule ja kasutatavale katsemeetodile; maksimum on 2 oC.

1.5.2.   Tundlikkus

Tundlikkus sõltub kasutatavast katsemeetodist.

1.5.3.   Spetsiifilisus

Osade katsemeetodite spetsiifilisus piirdub kindlate leekpunkti vahemikega ja sõltub ainespetsiifilistest omadustest (nt kõrge viskoossus).

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Ettevalmistused

Testaine proov viiakse punktidele 1.6.3.1 ja/või 1.6.3.2 vastavasse katseseadmesse.

Ohutuse huvides on kõrge siseenergiaga või mürgiste ainete puhul soovitatav kasutada väikest proovikogust, u 2 cm3, kasutavaid meetodeid.

1.6.2.   Katsetingimused

Kui see ei ole vastuolus ohutusnõuetega, tuleks katseseade paigaldada tõmbevabasse asukohta.

1.6.3.   Katse tegemine

1.6.3.1.   Tasakaaluline meetod

Vt ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2.   Mittetasakaaluline meetod

Vt BS 2000, 170. osa, NF M07-011, NF T66-009.

Vt EN 57, DIN 51755, 1. osa (temperatuuridele 5–65 oC), DIN 51755, 2. osa (temperatuuridele alla 5 oC), NF M07-036.

Vt ASTM D 56.

Vt ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Kui mittetasakaalulise meetodiga (1.6.3.2) määratud leekpunkt on 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC või 55 ± 2 oC, tuleb saadud tulemust kinnitada sama seadmega ja tasakaalulise meetodi abil.

Teavitamiseks võib kasutada ainult meetodeid, mille abil saab määrata leekpunkti temperatuuri.

Viskoossete, lahusteid sisaldavate vedelike (värvid, kummid jms) leekpunkti määramiseks võib kasutada ainult viskoossete vedelike leekpunkti määramiseks ette nähtud seadmeid ja katsemeetodeid.

Vt ISO 3679, ISO 368O, ISO 1523, DIN 53213, 1. osa.

2.  ANDMED

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

 kasutatud meetodit ja võimalikke kõrvalekaldeid sellest;

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid andmeid ja lisamärkusi.

4.   VIITED

Puuduvad.

A.10.   SÜTTIVUS (TAHKED AINED)

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Katse tegemiseks on kasulik teada aine võimalikku plahvatusohtlikkust.

Käesolevat katset tuleks kasutada ainult pulbriliste, teraliste või pastataoliste ainete puhul.

Et mitte hõlmata kõiki süttivaid aineid, vaid ainult kiiresti põlevaid või eriti ohtlike põlemisomadustega aineid, loetakse väga tuleohtlikuks ainult neid aineid, mille põlemiskiirus ületab teatava piirväärtuse.

Eriti ohtlik võib olla hõõgumise levik läbi metallipuru, kuna see raskendab tule kustutamist. Metallipulbrid tuleks lugeda väga tuleohtlikuks, kui hõõgumisprotsess levib teatava aja jooksul läbi kogu pulbri massi.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Põlemisaeg sekundites.

1.3.   VÕRDLUSAINED

Nimetamata.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Ainest moodustatakse umbes 250 mm pikkune katkestusteta pulbririba ja tehakse esialgne sõelkatse kontrollimaks, kas gaasileegiga süütamisel levib põlemisprotsess leegi või hõõgumisena edasi. Kui põlemisprotsess levib kindlaksmääratud aja jooksul läbi 200 mm riba, viiakse põlemiskiiruse määramiseks läbi täiemahuline katseprogramm.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Täpsustamata.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Esialgne sõelkatse

Ainest moodustatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile umbes 250 mm pikkune, 20 mm laiune ja 10 mm kõrgune katkestusteta pulbririba. Pulbririba ühele otsale suunatakse pulbri süttimiseni või kuni kaheks minutiks (metallide või metallisulamite pulbrite puhul viieks minutiks) vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti leek. Tehakse kindlaks, kas põlemisprotsess läbib neljaminutilise (metallipulbrite puhul 40minutilise) katseaja jooksul 200 mm ribaosa. Kui pulber ei sütti või põlemisprotsess (leek või hõõgumine) ei läbi neljaminutilise (või 40minutilise) katseaja jooksul 200 mm pulbririba, ei loeta ainet väga tuleohtlikuks ja rohkem katseid sellega ei tehta. Kui põlemisprotsess läbib 200 mm pulbririba vähem kui nelja minutiga või metallipulbrite puhul vähem kui 40 minutiga, viiakse läbi allpool kirjeldatud protseduur (punkt 1.6.2 ja järgmised punktid).

1.6.2.   Põlemiskiiruse katse

1.6.2.1.   Ettevalmistused

250 mm pikk, kolmnurkse läbilõikega, 10 mm sisemise kõrguse ja 20 mm sisemise laiusega vorm täidetakse tihendamata pulbrilise või teralise ainega. Vormi kummalegi küljele paigaldatakse pikisuunas külgpiiranguteks kaks metallplaati, mis ulatuvad 2 mm üle kolmnurkse vao ülaääre (vt joonist). Vorm kukutatakse seejärel kolm korda 2 cm kõrguselt kõvale aluspinnale. Vajaduse korral täidetakse vorm seejärel uuesti. Külgmised piirangud eemaldatakse ja liigne aine kaabitakse ära. Vormi peale paigaldatakse seejärel mittesüttiv, mittepoorne ja madala soojusjuhtivusega alusplaat, keeratakse vorm koos plaadiga ümber ja eemaldatakse vorm.

Pastataolistest ainetest moodustatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile 250 mm pikkune, umbes 1 cm2 läbilõikepindalaga riba.

1.6.2.2.   Katsetingimused

Niiskustundlike ainete puhul tehakse katse võimalikult kiiresti pärast aine hoiunõust eemaldamist.

1.6.2.3.   Katse tegemine

Riba paigutatakse tõmbekapi alla õhu liikumise suunaga risti.

Õhu liikumise kiirus peab olema piisav, takistamaks suitsu levikut laborisse, ning seda tuleb katse jooksul konstantsena hoida. Seadme ümber tuleks paigaldada tõmbevari.

Riba üks ots süüdatakse vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti leegi abil. Kui riba on 80 mm ulatuses põlenud, mõõdetakse järgneva 100 mm kestel põlemiskiirus.

Katset korratakse kuus korda, iga kord puhta jaheda alusplaadiga, välja arvatud juhul, kui ühel katsel on juba saadud positiivne tulemus.

2.   ANDMED

Hindamisel on vajalikud esialgse sõelkatse (1.6.1) põlemisaeg ja kuni kuuel põhikatsel (1.6.2.3) leitud lühim põlemisaeg.

3.   ARUANDLUS

3.1.   KATSEARUANNE

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

 katseaine kirjeldust, füüsikalist olekut ja niiskusesisaldust;

 esialgse sõelkatse ja põlemiskiiruse katse tulemusi (kui see tehti);

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE

Pulbrilised, teralised või pastataolised ained loetakse väga tuleohtlikuks, kui nende põlemisaeg punktis 1.6.2 kirjeldatud mis tahes katseprotseduuris on alla 45 sekundi. Metallide või metallisulamite pulbrid loetakse väga tuleohtlikuks juhul, kui need süttivad ja leek või reaktsioonivöönd levib kümne minutiga või kiiremini üle kogu proovi.

4.   VIITED

1. NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Liide

Joonis

Põlemisriba valmistamise vorm ja abivahendid

(Kõik mõõdud on millimeetrites)

image

A.11.   SÜTTIVUS (GAASID)

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

See meetod võimaldab määrata õhuga segunenud gaaside süttivust toatemperatuuril (u 20 oC) ja atmosfäärirõhul ning süttivate gaaside puhul kontsentratsioonivahemikku, milles nad süttivad. Järjest suurenevate kontsentratsioonidega katsegaasi-õhu segudes tekitatakse elektrisäde ja jälgitakse, kas gaas süttib.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Süttimispiirkond on kontsentratsioonivahemik alumise ja ülemise plahvatuspiiri vahel. Alumine ja ülemine plahvatuspiir on piirkontsentratsioonid, mille puhul leek õhuga segatud gaasis ei levi.

1.3.   VÕRDLUSAINED

Nimetamata.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Gaasi kontsentratsiooni õhus suurendatakse järk-järgult ja igas etapis tekitatakse segus elektrisäde.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Täpsustamata.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Seade

Katseanumaks on kummuli klaassilinder sisediameetriga vähemalt 50 mm ja kõrgusega vähemalt 300 mm. 3–5 mm vahekaugusega süüteelektroodid paigutatakse 60 mm kõrgusele silindri põhjast. Silindril on survepääsuklapiga ava. Plahvatuskahjustuste vältimiseks tuleb seade varjestada.

Süüteallikana kasutatakse püsivat 0,5 s kestusega induktsioonsädet, mis tekitatakse 10–15 kV väljundpingega kõrgepingetrafo (maksimaalne sisendvõimsus 300 W) abil. Sobivat seadet on näiteks kirjeldatud viites 2.

1.6.2.   Katsetingimused

Katse viiakse läbi toatemperatuuril (u 20 oC).

1.6.3.   Katse tegemine

Doseerpumpade abil viiakse klaassilindrisse kindla kontsentratsiooniga gaasi-õhu segu. Segus tekitatakse säde ja jälgitakse, kas süüteallikast eraldub leek ja levib gaasis iseseisvalt. Gaasikontsentratsiooni muudetakse 1 % kaupa kuni eespool kirjeldatud süttimise toimumiseni.

Kui gaasi keemiline struktuur viitab mittesüttivusele ja on võimalik välja arvutada stöhhiomeetrilise gaasiõhu segu koostis, siis kontrollitakse selliste 1 % astmetega ainult segusid kontsentratsioonivahemikus 10 % alla ja 10 % üle stöhhiomeetrilise kontsentratsiooni.

2.   ANDMED

Ainus selle omaduse määramisel oluline teave on leegi levimine.

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

 kasutatud seadme kirjeldust koos mõõtmetega;

 katsetemperatuuri;

 katsekontsentratsioone ja saadud tulemusi;

 katse tulemust: mittesüttiv gaas või väga tuleohtlik gaas;

 kui järeldatakse, et gaas on mittesüttiv, tuleks ära märkida kontsentratsioonivahemik, milles seda 1 % sammude kaupa testiti;

 registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamisega seonduvad andmed ja märkused.

4.   VIITED

1. NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

2. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol 56, 2, 126-127.

A.12.   SÜTTIVUS (KOKKUPUUTEL VEEGA)

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Meetodi abil saab kontrollida, kas aine reaktsioonil vee või niiske õhuga tekib ohtlikus koguses gaasi või gaase, mis võivad olla väga tuleohtlikud.

Katsemeetod on kohaldatav nii tahketele kui ka vedelatele ainetele. Meetod ei ole kohaldatav ainetele, mis kokkupuutel õhuga iseeneslikult süttivad.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Väga tuleohtlik: ained, mis kokkupuutel vee või niiske õhuga eraldavad ohtlikus koguses väga tuleohtlikke gaase kiirusega vähemalt 1 liiter/kg kohta tunnis.

1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Ainet kontrollitakse vastavalt allpool esitatud etapiviisilisele eeskirjale; kui mis tahes etapis leiab aset süttimine, pole edasine kontrollimine vajalik. Kui on teada, et aine veega ägedalt ei reageeri, jätkatakse 4. etapiga (1.3.4).

1.3.1.   1. etapp

Testaine viiakse 20 oC destilleeritud vett sisaldavasse süvendisse ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib.

1.3.2.   2. etapp

Testaine kantakse 20 oC destilleeritud vett sisaldavas tassis ujuvale filterpaberile ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib. Filterpaberi ainus ülesanne on ainet koos hoida ja süttimise tõenäosust suurendada.

1.3.3.   3. etapp

Testainest moodustatakse ligikaudu 2 cm kõrgune ja 3 cm läbimõõduga kuhi. Kuhjale lisatakse mõned tilgad vett ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib.

1.3.4.   4. etapp

Testaine segatakse 20 oC destilleeritud veega ja mõõdetakse seitsme tunni jooksul ühetunniste vahedega gaasi eraldumise kiirust. Kui gaas eraldub ebaühtlase kiirusega või kiirus kasvab veel seitsme tunni pärast, pikendatakse mõõtmisaega kuni viie päevani. Kui kiirus ületab mis tahes ajahetkel 1 liitri/kg kohta tunnis, võib katse peatada.

1.4.   VÕRDLUSAINED

Nimetamata.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Täpsustamata.

1.6.   MEETODITE KIRJELDUS

1.6.1.   1. etapp

1.6.1.1.   Katsetingimused

Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).

1.6.1.2.   Katse tegemine

Väike (ligikaudu 2 mm läbimõõduga) kogus testainet viiakse destilleeritud vett sisaldavasse süvendisse. Kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.

1.6.2.   2. etapp

1.6.2.1.   Seade

Mis tahes sobivas nõus, näiteks 100 mm läbimõõduga aurustuskausis, asetatakse destilleeritud vee pinnale filterpaber.

1.6.2.2.   Katsetingimused

Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).

1.6.2.3.   Katse tegemine

Väike (ligikaudu 2 mm läbimõõduga) kogus testainet kantakse filterpaberi keskkohta. Kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.

1.6.3.   3. etapp

1.6.3.1.   Katsetingimused

Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).

1.6.3.2.   Katse tegemine

Testainest moodustatakse ligikaudu 2 cm kõrgune ja 3 cm läbimõõduga kuhi süvendiga tipus. Auku lisatakse mõned tilgad vett ja kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.

1.6.4.   4. etapp

1.6.4.1.   Seade

Katseseade valmistatakse vastavalt joonisele.

1.6.4.2.   Katsetingimused

Kontrollida, kas testaine hoiuanumas leidub < 500 μm suuruseid osakesi sisaldavat pulbrit. Kui sellise pulbri sisaldus koguhulgas on üle 1 % mahu järgi või kui materjal on pude, tuleks kogu aine enne katsetusi pulbriks jahvatada, et arvestada osakeste suuruse vähenemisega ladustamisel ja käitlemisel; vastasel juhul uuritakse ainet töötlemata kujul. Katse tuleks teha toatemperatuuril (u 20 oC) ja atmosfäärirõhul.

1.6.4.3.   Katse tegemine

Seadme tilklehtrisse viiakse 10–20 ml vett ja seadme koonilisse kolbi viiakse 10 g ainet. Eralduva gaasi ruumala mõõdetakse mis tahes sobiva meetodiga. Tilklehtri kraan avatakse, nii et vesi pääseb koonilisse kolbi, ja käivitatakse stopper. Gaasi eraldumise kiirust mõõdetakse seitsme tunni jooksul ühetunniste vahedega. Kui gaasi eraldumise kiirus on selle aja kestel ebaühtlane või kasvab veel selle ajavahemiku lõpus, pikendatakse mõõtmisaega kuni viie päevani. Kui gaasi eraldumise kiirus ületab mis tahes ajahetkel 1 liitri/kg kohta tunnis, võib katse peatada. Tuleks teha kolm paralleelkatset.

Kui ei ole teada, mis gaasiga on tegemist, tuleks seda analüüsida. Kui gaas sisaldab väga tuleohtlikke komponente ja ei ole teada, kas summaarne segu on väga tuleohtlik, tuleb valmistada sama koostisega segu ja kontrollida seda vastavalt meetodile A.11.

2.   ANDMED

Aine loetakse ohtlikuks kui

 mis tahes katseetapis leiab aset iseeneslik süttimine

 või

 eraldub tuleohtlikke gaase kiirusega vähemalt 1 liiter/kg aine kohta tunnis.

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

 testaine ettevalmistamise andmeid;

 katsete tulemusi (1., 2., 3. ja 4. etapp);

 eralduva gaasi keemilist koostist;

 4. etapi (1.6.4) käigus gaasi eraldumise kiirust;

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

4.   VIITED

1. Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

2. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Liide

Joonis

Seade

image

A.13.   TAHKETE AINETE JA VEDELIKE ISESÜTTIVUS

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Katsemeetod on kohaldatav tahketele ja vedelatele ainetele, mis väikestes kogustes toatemperatuuril (u 20 oC) õhuga kokku puutudes lühikese aja jooksul iseeneslikult süttivad.

Katsemeetod ei hõlma aineid, mis peavad iseeneslikuks süttimiseks toatemperatuuril või kõrgemal temperatuuril õhuga kokku puutuma mitu tundi või päeva.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Ained loetakse isesüttivateks, kui need süttivad või söestuvad punktis 1.6 kirjeldatud tingimustel.

Vedelike isesüttivust võib vaja olla kontrollida ka meetodi A.15 „Isesüttimistemperatuur (vedelikud ja gaasid)” kohaselt.

1.3.   VÕRDLUSAINED

Nimetamata.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Tahke aine või vedelik kantakse inertsele tugiainele ja viiakse toatemperatuuril viieks minutiks kokkupuutesse õhuga. Kui vedelik sellistes tingimustes ei sütti, imetakse see filterpaberisse ja viiakse toatemperatuuril (u 20 oC) viieks minutiks kokkupuutesse õhuga. Kui tahke aine või vedelik süttib või kui vedelik süütab või söestab filterpaberi, loetakse aine isesüttivaks.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Korratavus: kuna ohutus on oluline, loetakse aine isesüttivaks juba siis, kui üks tulemus on positiivne.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Seade

Umbes 10 cm läbimõõduga portselantass täidetakse toatemperatuuril (u 20 oC) umbes 5 mm kõrguselt diatomiitmullaga.

Märkus

Diatomiitmulla või mis tahes muu saadaval oleva võrreldava inertse ainega simuleeritakse mulda, millesse testaine õnnetusjuhtumi korral võib voolata.

Inertsel kandjal õhuga kokku puutudes mittesüttivate vedelike testimiseks on vaja filterpaberit.

1.6.2.   Katse tegemine

a)   Pulbrilised tahked ained

1–2 cm3 uuritavat pulbrit valatakse u 1 m kõrguselt mittesüttivale pinnale ja jälgitakse, kas aine süttib kukkumisel või mahalangemisest viie minuti jooksul.

Katset korratakse kuus korda, kui aine enne ei sütti.

b)   Vedelikud

U 5 cm3 uuritavat vedelikku valatakse ette valmistatud portselantassi ja jälgitakse, kas aine süttib viie minuti jooksul.

Kui aine kuue katse jooksul ei sütti, tuleb teha järgmised katsed:

0,5 ml testaine proov viiakse süstla abil sälgustatud filterpaberile ja jälgitakse, kas filterpaber süttib või söestub viie minuti jooksul vedeliku lisamisest. Katset korratakse kolm korda, kui paber enne ei sütti ega söestu.

2.   ANDMED

2.1.   TULEMUSTE KÄSITLEMINE

Katsed võib peatada kohe pärast positiivse tulemuse saamist mis tahes katses.

2.2.   HINDAMINE

Kui aine süttib viie minuti jooksul pärast inertsele tugiainele kandmist ja õhu kätte viimist või kui vedelik süütab või söestab filterpaberi viie minuti jooksul pärast lisamist ja õhu kätte viimist, loetakse aine isesüttivaks.

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 aine täpset kirjeldust (koostist ja lisandeid);

 katsete tulemusi;

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

4.   VIITED

1. NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

2. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14.   PLAHVATUSOHTLIKKUS

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Meetod näeb ette katseskeemi, mille abil kontrollitakse, kas tahke või pastataoline aine on plahvatusohtlik kokkupuutel leegiga (termiline tundlikkus), löögi või hõõrdumise mõjul (mehaaniline tundlikkus) ja kas vedelik on leegi või löögi mõjul plahvatusohtlik.

Meetod koosneb kolmest osast:

a) termilise tundlikkuse katse (1);

b) mehaanilise tundlikkuse katse löögi suhtes (1);

c) mehaanilise tundlikkuse katse hõõrdumise suhtes (1).

Meetodi abil saadakse andmeid teatavate tavapäraste mõjuritega seotud plahvatusohu hindamiseks. Meetod ei ole mõeldud aine plahvatusohtlikkuse kontrollimiseks mis tahes tingimustes.

Meetod sobib ainega seotud plahvatusohu (termilise ja mehaanilise tundlikkuse) määramiseks konkreetsetel direktiivis täpsustatud tingimustel. Meetodi puhul kasutatakse mitut tüüpi katseseadmeid, mis on laias rahvusvahelises kasutuses (1) ja mis annavad tavaliselt usaldusväärseid tulemusi. On selge, et meetod ei ole ammendav. Kirjeldatud seadmete asemel võib kasutada muid seadmeid eeldusel, et need on rahvusvaheliselt tunnustatud ja tulemused on piisavalt sarnased kirjeldatud seadmetel saadavate tulemustega.

Katseid ei ole vaja teha juhul, kui saadaval olevad termodünaamilised andmed (nt tekkesoojus, lagunemissoojus) ja/või teatavate funktsionaalrühmade (2) puudumine struktuurivalemis tõestavad põhjendatud kahtluseta, et toimeaine ei lagune kiirelt gaaside või soojuse eraldumisega (st materjal ei ole plahvatusohtlik). Mehaanilise tundlikkuse katse hõõrdumise suhtes ei ole vedelike puhul nõutav.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Lõhkeaine

Ained, mis võivad leegi mõjul plahvatada või on kirjeldatud seadmes löögi- või hõõrdetundlikud (või on muus seadmes suurema mehaanilise tundlikkusega kui 1,3 -dinitrobenseen).

1.3.   VÕRDLUSAINED

1,3-dinitrobenseen, tehniline kristalne saadus, läbib 0,5 mm sõela, hõõrdumis- ja löögimeetoditele.

Perhüdro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triasiin (RDX, heksogeen, tsükloniit, CAS-i nr 121-82-4), kristallitud tsükloheksanooni vesilahusest, märgsõelutud läbi 250 μm sõela ja kinni peetud 150 μm sõelal, kuivatatud neli tundi 103 ± 2 oC juures, hõõrdumis- ja löögikatsete teise seeria jaoks.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Eelkatsed on vajalikud kolme tundlikkuskatse tarvis ohutute tingimuste määramiseks.

1.4.1.   Käsitlemisohutuse katsed (3)

Ohutuse huvides rakendatakse väga väikestele proovidele (u 10 mg) enne põhikatsete tegemist kuumutamist gaasileegis vabas õhus, lööke mis tahes tavapärastes seadmetes ja hõõrdumist vasara ja alasi vahel või mis tahes muus hõõrdumisseadmes. Selle eesmärk on kontrollida, kas aine on nii tundlik ja plahvatusohtlik, et ettenähtud tundlikkuskatsetel, eriti termilise tundlikkuse katsetel, tuleb katse tegija vigastamise vältimiseks kasutada erilisi ettevaatusabinõusid.

1.4.2.   Termiline tundlikkus

Meetodi puhul kuumutatakse ainet erinevas läbimõõdus düüsidega plaatidega suletud terashülsis, et kontrollida, kas aine võib tugeva kuumuse ja piiratud ruumala tingimustes plahvatada.

1.4.3.   Mehaaniline tundlikkus (löögitundlikkus)

Meetodi puhul antakse ainele kindlalt kõrguselt kukutatud kindla massiga löök.

1.4.4.   Mehaaniline tundlikkus (hõõrdetundlikkus)

Meetodi puhul mõjutatakse tahkeid ja pastataolisi aineid standardsel pinnal määratud koormuse ja suhtelise liikumise abil tekitatud hõõrdumisega.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Täpsustamata.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Termiline tundlikkus (leegi mõju)

1.6.1.1.   Seade

Seade koosneb ühekordselt kasutatavast terashülsist korduvkasutatava sulguriga (joonis 1), mis on paigutatud kaitsvasse kuumutusseadmesse. Kõik hülsid on valmistatud sügavtõmbamisel lehtterasest (vt liidet) ja on 24 mm sisediameetriga, 75 mm pikad ja 0,5 mm paksuse seinaga. Hülssidel on avatud otsas äärik hülsi sulgemiseks düüsiga plaadiga sulgurseadme abil. Sulgur koosneb keskel asuva düüsiga survekindlast plaadist, mis kaheosalise keermega liitmiku (mutter ja keermega võru) abil kindlalt hülsi külge kinnitatakse. Mutter ja keermega võru on valmistatud kroom-mangaanterasest (vt liidet), mis on sädemevaba kuni temperatuurini 800 oC. Düüsiga plaadid on 6 mm paksud, valmistatud kuumuskindlast terasest (vt liidet) ja neid on mitmesuguse avasuurusega.

1.6.1.2.   Katsetingimused

Tavaliselt uuritakse ainet töötlemata kujul, kuid mõningatel juhtudel, nt kui see on kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud, võib olla vaja see enne katsetusi purustada.

Tahkete ainete puhul määratakse katsetes kasutatav ainekogus kaheetapilisel proovitäitmisel. Kaalutud hülss täidetakse 9 cm3 ainega ja tambitakse kogu hülsi ristlõike ulatuses avaldatava 80 N jõuga kokku. Ohutuse huvides või juhtudel, kus proovi füüsikaline olek võib surve mõjul muutuda, võib kasutada muid täitmismeetodeid; nt väga hõõrdetundliku aine puhul ei saa tampimist kasutada. Kui ainet on võimalik kokku suruda, lisatakse veel ainet ja jätkatakse tampimist, kuni hülss on täidetud 55 mm kauguseni ülaäärest. Määratakse hülsi 55 mm tasemeni täitmiseks vajalik ainekogus ja lisatakse veel kaks lisakogust, mis kumbki 80 N jõuga tampimisel tihendatakse. Seejärel ainet vastavalt vajadusele kas lisatakse ja tambitakse või eemaldatakse, nii et hülss täitub 15 mm kõrguseni ülaäärest. Järgmiseks tehakse teine proovitäitmine, alustades tambitud ainekogusega, mis moodustab kolmandiku esimesel proovitäitmisel leitud kogumassist. Lisatakse veel kaks lisakogust, mis 80 N jõuga tampimisel tihendatakse, ja ainekogus reguleeritakse lisamisel või eemaldamisel 15 mm kõrguseni ülaäärest. Teisel proovitäitmisel leitud ainekogust kasutatakse edasistes katsetes, täites hülsi kolmes võrdses osas, mis surutakse kokku ruumalani 9 cm3 mis tahes selleks vajaliku jõuga. (Selleks võib abivahendina kasutada vaherõngaid).

Vedelikud ja geelid viiakse hülssi 60 mm kõrguseni, vältides geelide puhul hoolikalt õhuvahede teket. Keermega võru libistatakse altpoolt hülsi peale, paigaldatakse sobiv düüsiga plaat ja keeratakse mutter pärast molübdeendisulfiidmäärde lisamist kinni. Väga oluline on kontrollida, et ainet ei jääks ääriku ja plaadi või keermete vahele.

Kuumutamisel kasutatakse propaani rõhuregulaatori (60–70 mbar) ja voolumõõturiga tööstuslikust balloonist, millest gaas jagatakse jaotustoru kaudu ühtlaselt (kontrollitakse visuaalselt põletite leekide järgi) nelja põleti vahel. Põletid asetsevad ringikujuliselt ümber katsekambri, nagu on näidatud joonisel 1. Kolme põleti kogukulu on umbes 3,2 liitrit propaani minutis. Kasutada võib muid küttegaase ja põleteid, kuid kuumutamise kiirus peab vastama joonisel 3 täpsustatule. Kõigi seadmete puhul tuleb kuumutamise kiirust regulaarselt kontrollida, kasutades selleks dibutüülftalaadiga täidetud hülsse, nagu on näidatud joonisel 3.

1.6.1.3.   Katsete tegemine

Iga katset sooritatakse hülsi purunemiseni või viie minuti möödumiseni kuumutamise algusest. Plahvatusega lõppenuks loetakse katse, mille tulemusel hülss puruneb kolmeks või enamaks tükiks, mis võivad omavahel olla kitsaste metalliribadega ühendatud, nagu on näha jooniselt 2. Väiksema arvu tükkidega või purunemiseta lõppenud katset plahvatusega lõppenuks ei loeta.

Alguses tehakse kolm katset 6,0 mm düüsiga plaadiga ja kui plahvatust ei toimu, tehakse teine kolmene katseseeria 2,0 mm düüsiga plaadiga. Kui kummaski katseseerias plahvatust ei toimu, pole edasised katsed vajalikud.

1.6.1.4.   Hindamine

Katse loetakse positiivseks, kui kummaski eespool nimetatud katseseerias toimub plahvatus.

1.6.2.   Mehaaniline tundlikkus (löögitundlikkus)

1.6.2.1.   Seade (joonis 4)

Tüüpilise kukkuva vasaraga seadme põhiosa on valuterasest plokk aluse, alasi, posti, juhtrööbaste, kukkuvate raskuste, päästiku ja proovianumaga. 100 mm (läbimõõt) × 70 mm (kõrgus) terasalasi on kruvitud 230 mm (pikkus) × 250 mm (laius) × 200 mm (kõrgus) terasplokile valatud 450 mm (pikkus) × 450 mm (laius) × 60 mm (kõrgus) alusele. Tõmmatud terastorust liitekohtadeta post on kinnitatud terasploki tagaküljel olevasse fiksaatorisse. Seade on nelja kruviga ankurdatud monoliitsele 60 × 60 × 60 cm betoonplokile nii, et juhtrööpad on täiesti püstsuunalised ja kukkuv raskus langeb vabalt. Kasutada saab nii 5 kg kui ka 10 kg monoliitsest terasest raskusi. Iga raskuse löökpea on valmistatud karastatud terasest, HRC 60–63, ja selle miinimumläbimõõt on 25 mm.

Uuritav proov on suletud löögiseadmesse, mis koosneb kahest koaksiaalsest, üksteise kohal paiknevast monoliitsest terassilindrist õõnsas silindrilises terasjuhtvõrus. Monoliitsed terassilindrid peaksid olema läbimõõduga 10 (– 0,003 , – 0,005 ) mm ja kõrgusega 10 mm ning poleeritud pinna, ümarate nurkadega (kõverusraadius 0,5 mm) ja kõvadusega HRC 58–65. Õõnessilindril peab olema 16 mm välisdiameeter, poleeritud 10 (+ 0,005 , + 0,010 ) mm sisediameeter ja 13 mm kõrgus. Vahealasile (läbimõõt 26 mm ja kõrgus 26 mm) on paigaldatud terasest löögiseade, mille keskosas on tekkivaid gaase läbi laskva perforatsiooniga rõngas.

1.6.2.2.   Katsetingimused

Proov peaks olema mahuga 40 mm3 või muule seadmele sobiva mahuga. Tahkeid aineid tuleks uurida kuivana ja need ette valmistada järgmiselt:

a) pulbrilised ained sõelutakse (sõela ava 0,5 mm) ja katses kasutatakse kogu sõela läbinud osa;

b) kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud materjalid purustatakse väiksemateks tükkideks ja sõelutakse; katses kasutatakse sõelumisel saadud fraktsiooni osakeste läbimõõduga 0,5 –1 mm ja see fraktsioon peab esindama töötlemata algainet.

Tavaliselt pastadena tarnitavaid materjale tuleks võimaluse korral uurida kuivana või vähemalt eemaldada eelnevalt võimalikult suur osa lahjendist. Vedelikke testitakse 1 mm vahega alumise ja ülemise terassilindri vahel.

1.6.2.3.   Katsete tegemine

Tehakse kuuest katsest koosnev katseseeria, kukutades 10 kg raskust 0,40 m kõrguselt (40 J). Kui kuue katse jooksul 40 J juures toimub plahvatus, tuleb teha järgmine kuue katsega katseseeria, kukutades 5 kg raskust 0,15 m kõrguselt (7,5 J). Muudes seadmetes võrreldakse proovi tunnustatud meetodi (nt üles-alla tehnika jne) abil valitud võrdlusainega.

1.6.2.4.   Hindamine

Katse tulemus loetakse positiivseks, kui vähemalt ühel korral toimub kirjeldatud katseseadmetega mis tahes katses plahvatus (põlema lahvatamine ja/või paugatused on plahvatusega samaväärsed) või kui proov osutub muus löögikatses tundlikumaks kui 1,3-dinitrobenseen või RDX.

1.6.3.   Mehaaniline tundlikkus (hõõrdetundlikkus)

1.6.3.1.   Seade (joonis 5)

Hõõrdeseade koosneb valatud terasest alusplaadist, millele on paigaldatud hõõrdeseade. Viimane koosneb fikseeritud portselanpulgast ja liikuvast portselanplaadist. Portselanplaat asub kahel juhtrööpal jooksval kelgul. Kelk on ühendusvarda, ekstsentrilise nuki ja sobiva ülekande abil ühendatud elektrimootoriga nii, et portselanplaati liigutatakse portselanpulga all ainult üks kord 10 mm ulatuses edasi-tagasi. Portselanpulgale rakendatav jõud võib olla 120–360 N.

Tasased portselanplaadid on valmistatud valgest tehnilisest portselanist (jämedusega 9–32 μm) ja nende mõõtmed on 25 mm (pikkus) × 25 mm (laius) × 5 mm (kõrgus). Silindriline portselanpulk on samuti valmistatud valgest tehnilisest portselanist ja on 15 mm pikk, 10 mm läbimõõduga ja karestatud ümarate otsapindadega, mille kõverusraadius on 10 mm.

1.6.3.2.   Katsetingimused

Proov peaks olema mahuga 10 mm3 või muule seadmele sobiva mahuga.

Tahkeid aineid uuritakse kuivana ja nad valmistatakse ette järgmiselt:

a) pulbrilised ained sõelutakse (sõela ava 0,5 mm) ja katses kasutatakse kogu sõela läbinud osa;

b) kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud materjalid purustatakse väiksemateks tükkideks ja sõelutakse; katses kasutatakse sõelumisel saadud fraktsiooni osakeste läbimõõduga < 0,5 mm.

Tavaliselt pastadena tarnitavaid materjale tuleks võimaluse korral uurida kuivana. Kui pastast ei ole kuiva ainet võimalik valmistada, testitakse pastat (eemaldades eelnevalt võimalikult suur osa lahjendist) 0,5 mm paksuse, 2 mm laiuse ja 10 mm pikkuse, šablooni abil tekitatud kihina.

1.6.3.3.   Katsete tegemine

Portselanpulk viiakse uuritava proovi kohale ja rakendatakse koormus. Katse ajal peavad karedad jooned portselanplaadil olema liikumissuunaga risti. Tuleb jälgida, et pulk toetuks proovile, et pulga all oleks küllaldane kogus testainet ja et plaat pulga all õigesti liiguks. Pastataolised ained kantakse plaadile 0,5 mm paksuse, 2 × 10 mm avaga šablooni abil. Portselanplaat peab portselanpulga all 0,44 sekundi jooksul 10 mm edasi ja tagasi liikuma. Iga plaadi ja pulga pinna osa võib kasutada ainult ühe korra; pulga mõlemat otsa võib kasutada kaheks katseks ja plaadi kumbagi külge kolmeks katseks.

360 N koormusega tehakse kuuest katsest koosnev katseseeria. Kui nende kuue katse käigus saadakse positiivne tulemus, tehakse 120 N koormusega veel üks kuuest katsest koosnev katseseeria. Muudes seadmetes võrreldakse proovi tunnustatud meetodi (nt üles-alla tehnika jne) abil valitud võrdlusainega.

1.6.3.4.   Hindamine

Katse tulemus loetakse positiivseks, kui vähemalt ühel korral toimub kirjeldatud katseseadmetega mis tahes katses plahvatus (pragin ja/või paugatused või põlema lahvatamine on plahvatusega samaväärsed) või kui proov vastab muus hõõrdekatses võrdväärsetele tingimustele.

2.   ANDMED

Aine loetakse direktiivi mõistes plahvatusohtlikuks juhul, kui termilise, löögi- või hõõrdetundlikkuse katses saadakse positiivne tulemus.

3.   ARUANDLUS

3.1.   KATSEARUANNE

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 testaine tunnusandmeid, koostist, puhtusastet, niiskusesisaldust jne;

 proovi füüsikalist olekut ja seda, kas seda on purustatud ja/või sõelutud;

 termilise tundlikkuse katsetes tehtud tähelepanekuid (nt proovi massi, kildude arvu jne);

 mehaanilise tundlikkuse katsetes tehtud tähelepanekuid (nt suure suitsukoguse teke või täielik lagunemine ilma paugatuste, leekide, sädemete, pragina jne esinemiseta);

 igat tüüpi katsete tulemusi;

 kui kasutatud on muid seadmeid, tuleb esitada teaduslik põhjendus ning tõendid tulemuste vastavuse kohta kirjeldatud seadmetel saadud tulemustega;

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid kommentaare, nagu viiteid katsetele analoogsete ainetega;

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE JA HINDAMINE

Katsearuandes tuleb ära märkida kõik tulemused, mis loeti valeks, anomaalseks või mitterepresentatiivseks. Kui mõnda tulemust ei arvestata, tuleb selle kohta lisada selgitus ja muude või täiendavate katsete tulemused. Kui anomaalsele tulemusele ei leidu seletust, tuleb seda arvestada täisväärtusliku tulemusena ja kasutada aine vastaval liigitamisel.

4.   VIITED

1. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

2. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750- 60103-5,1990.

3. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42.

4. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

Liide

Näitlik materjalide spetsifikatsioon termilise tundlikkuse katseks (vt DIN 1623)

1) Hülss: materjalispetsifikatsioon nr 1.0336 505 g

2) Düüsiga plaat: materjalispetsifikatsioon nr 1.4873

3) Keermega võru ja mutter: materjalispetsifikatsioon nr 1.3817

Joonis 1

Termilise tundlikkuse katseseade

(Kõik mõõdud on millimeetrites)

image

Joonis 2

Termilise tundlikkuse katse

(purunemise näited)

image

Joonis 3

Kuumutamiskiiruse kaliibrimine termilise tundlikkuse katseks

image

Temperatuuri/aja graafik 27 cm3 dibutüülftalaadi kuumutamisel suletud (1,5 mm düüsiga plaadiga) hülsis propaani voolukiirusel 3,2 l/min. Temperatuur määratakse 1 mm läbimõõduga roostevabast terasest kattega kromellist/alumellist termopaariga, mis on paigutatud mõõteseadme keskele 43 mm allapoole hülsi serva. Kuumutamise kiirus temperatuurivahemikus 135-285 oC peats olema 185-215 K/min.

Joonis 4

Löögikatse seade

(Kõik mõõdud on millimeetrites)

image

Joonis 4

Jätk

image

Joonis 5

Hõõrdetundlikkuse katseseade

image

A.15.   ISESÜTTIMISTEMPERATUUR (VEDELIKUD JA GAASID)

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Lõhkeaineid ja tavalisel temperatuuril õhuga kokkupuutel süttivaid aineid ei tohiks selles katses uurida. Katsemeetod on kohaldatav gaasidele, vedelikele ja aurudele, mis õhu juuresolekul kuuma pinnaga kokku puutudes süttivad.

Katalüütilised lisandid, pinnamaterjal või katseanuma suurem maht võivad isesüttimistemperatuuri oluliselt alandada.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Isesüttivuse määra väljendatakse isesüttimistemperatuurina. Isesüttimistemperatuur on madalaim temperatuur, mille juures testaine katsemeetodis määratletud tingimustel õhuga segatuna süttib.

1.3.   VÕRDLUSAINED

Võrdlusained on loetletud standardites (vt 1.6.3). Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Meetodi kohaselt määratakse kambri siseseina minimaalne temperatuur, mis põhjustab kambrisse süstitud gaasi, auru või vedeliku süttimise.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Korratavus varieerub vastavalt isesüttimistemperatuuri vahemikule ja kasutatavale katsemeetodile.

Tundlikkus ja spetsiifilisus sõltuvad kasutatavast katsemeetodist.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Seade

Katseseadet kirjeldatakse punktis 1.6.3 viidatud meetodis.

1.6.2.   Katsetingimused

Testaine proovi uuritakse punktis 1.6.3 viidatud meetodi kohaselt.

1.6.3.   Katse tegemine

Vt IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2.   ANDMED

Registreerige katsetemperatuur, atmosfäärirõhk, kasutatud proovikogus ja ajavahemik süttimiseni.

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

 kasutatud proovikogust ja atmosfäärirõhku;

 kasutatud katseseadet;

 mõõtmistulemusi (katsetemperatuure, süttimistulemusi ja süttimiseni kulunud ajavahemikke);

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

4.   VIITED

Puuduvad.

A.16.   TAHKETE AINETE SUHTELINE ISESÜTTIMISTEMPERATUUR

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Lõhkeaineid ja tavalisel temperatuuril õhuga kokkupuutel süttivad aineid ei tohiks selles katses uurida.

Katse annab eelteavet tahkete ainete isesüttivuse kohta kõrgematel temperatuuridel.

Kui aine reaktsioonil hapnikuga või eksotermilisel lagunemisel tekkiv soojus ei haju küllalt kiiresti keskkonda, leiab aset isesüttimiseni viiv isekuumenemine. Seega leiab isesüttimine aset siis, kui soojuse tekkekiirus ületab soojuskao kiiruse.

Katse on kasutatav tahkete ainete esialgse sõelkatsena. Arvestades tahkete ainete süttimis- ja põlemisprotsesside keerukust, tuleks selle katsemeetodi abil leitud isesüttimistemperatuuri kasutada ainult võrdlemiseks.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Selle meetodi abil leitud isesüttimistemperatuur on madalaim temperatuur ( oC), mille juures kindel ainekogus määratletud tingimustel süttib.

1.3.   VÕRDLUSAINE

Puudub.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Uuritava aine kindlaksmääratud kogus viiakse toatemperatuuril ahju ja registreeritakse temperatuuri/aja kõver proovi keskosas ahju temperatuuri tõstmisel kiirusega 0,5 oC/min temperatuurini 400 oC või aine sulamistemperatuurini, kui viimane on madalam. Käesoleva katse kohaselt loetakse isesüttimistemperatuuriks ahju temperatuur, mille juures proovi temperatuur isekuumenemise tulemusel 400 oCni jõuab.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Puuduvad.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Seade

1.6.1.1.   Ahi

Juhitava temperatuuriga laboriahi (mahuga umbes 2 liitrit), millel on loomulik õhuvahetus ja plahvatuskaitseklapp. Vältimaks võimalikku plahvatusohtu, ei tohi eralduvaid lagunemisgaase lasta elektrikütteseadmetega kokku puutuda.

1.6.1.2.   Traatvõrgust kuubik

Tükk roostevabast terasest traatvõrku 0,045 mm võrgusilmaga lõigatakse välja vastavalt joonisel 1 toodud skeemile. Võrk volditakse kokku ja kinnitatakse traadiga nii, et tekib avatud ülaosaga kuubik.

1.6.1.3.   Termopaarid

Kasutatakse sobivaid termopaare.

1.6.1.4.   Meerik

Sobib mis tahes kahe kanaliga meerik, mis on kaliibritud temperatuurivahemikus 0–600 oC või vastavas pingevahemikus.

1.6.2.   Katsetingimused

Aineid uuritakse töötlemata kujul.

1.6.3.   Katse tegemine

Kuubik täidetakse uuritava ainega ja koputatakse õrnalt, misjärel lisatakse veel ainet, kuni kuubik on täielikult täidetud. Kuubik riputatakse seejärel toatemperatuuril oleva ahju keskele. Temperatuuri registreerimiseks paigutatakse üks termopaar kuubiku keskele ning teine kuubiku ja ahjuseina vahele.

Ahju ja proovi temperatuur registreeritakse pidevalt ahju temperatuuri tõstmisel kiirusega 0,5 oC/min temperatuurini 400 oC või aine sulamistemperatuurini, kui viimane on madalam.

Aine süttimisel näitab proovis olev termopaar temperatuuri järsku tõusu üle ahju temperatuuri.

2.   ANDMED

Hindamisel on oluline ahju temperatuur, mille juures jõuab proovi temperatuur isekuumenemise tulemusena 400 oCni (vt joonist 2).

3.   ARUANDLUS

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 uuritava aine kirjeldust;

 mõõtmistulemusi, sh temperatuuri/aja kõverat;

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

4.   VIITED

NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

Joonis 1

20 mm katsekuubiku skeem

image

Joonis 2

Tüüpiline temperatuuri/aja kõver

image

A.17.   OKSÜDEERIVAD OMADUSED (TAHKED AINED)

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Katse tegemiseks on kasulik teada aine võimalikku plahvatusohtlikkust.

Katset ei saa kasutada vedelike, gaaside, plahvatusohtlike või väga tuleohtlike ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul.

Katset ei ole vaja teha juhul, kui toimeaine struktuurivalemi kontrollimisel ei jää põhjendatud kahtlust, et toimeaine reageerib põleva materjaliga eksotermiliselt.

Kontrollimaks, kas katse tegemisel tuleks kasutada erilisi ettevaatusabinõusid, tuleks teha eelkatse.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Põlemisaeg: reaktsiooniaeg (sekundites), mis kulub reaktsioonivööndi levikuks piki kuhilat vastavalt punktis 1.6 kirjeldatud protseduurile.

Põlemiskiirus: väljendatakse millimeetrites sekundi kohta.

Suurim põlemiskiirus: suurim põlemiskiiruse väärtus, mis on mõõdetud 10–90 % oksüdeerijasisaldusega (massi järgi) segudes.

1.3.   VÕRDLUSAINE

Võrdlusainena kasutatakse nii katses kui ka eelkatses analüüsipuhast baariumnitraati.

Võrdlussegu on selline punkti 1.6 kohaselt valmistatud baariumnitraadi ja pulbertselluloosi segu, millega saavutatakse suurim põlemiskiirus (tavaliselt 60 % baariumnitraadi sisaldusega (massi järgi) segu).

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Ohutuse huvides tehakse eelkatse. Kui eelkatse näitab selgelt, et testainel on oksüdeerivad omadused, pole edasine kontrollimine vajalik. Vastupidisel juhul tehakse aine kohta täiemahuline katseprogramm.

Täiemahulises katseprogrammis segatakse uuritavast ainest ja kindlaksmääratud põlevast ainest mitmesugustes vahekordades segusid. Igast segust tehakse seejärel kuhi ja süüdatakse see ühest otsast. Leitud suurimat põlemiskiirust võrreldakse võrdlussegu suurima põlemiskiirusega.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Vajaduse korral võib kasutada mis tahes peenestamis- ja segamismeetodeid eeldusel, et kuues eraldi katses määratud suurimad põlemiskiirused ei erine aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 10 %.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Ettevalmistused

1.6.1.1.   Testaine

Uuritava proovi osakeste suurust vähendatakse järgmisel meetodil alla 0,125 mm: testaine sõelutakse, seejärel peenestatakse sõelale jäänud osa ja korratakse protseduuri senikaua, kuni kogu proov on sõela läbinud.

Kasutada võib kvaliteedinõuetele vastavaid mis tahes peenestamis- ja sõelumismeetodeid.

Enne segu valmistamist kuivatatakse ainet 105 oC juures konstantse massi saavutamiseni. Kui uuritava aine lagunemistemperatuur on alla 105 oC, kuivatatakse aine sobival madalamal temperatuuril.

1.6.1.2.   Põlevaine

Põlevainena kasutatakse pulbertselluloosi. Tselluloos peaks olema õhukese kihi kromatograafias või kolonnkromatograafias kasutatavat tüüpi. Sobivaks on osutunud tselluloositüüp, mille kiupikkused jäävad 85 % ulatuses vahemikku 0,020 –0,075 mm. Tselluloosipulber sõelutakse läbi 0,125 mm avasuurusega sõela. Kogu katse kestel tuleb kasutada samast partiist pärit tselluloosi.

Enne segu valmistamist kuivatatakse pulbertselluloosi 105 oC juures konstantse massi saavutamiseni.

Kui eelkatses kasutatakse puidutolmu, valmistatakse okaspuu puidutolm ette järgmiselt: kogutakse fraktsioon, mis läbib 1,6 mm avasuurusega sõela, segatakse tolm põhjalikult ja kuivatatakse seda neli tundi 105 oC juures kõige rohkem 25 mm paksuses kihis. Tolm jahutatakse ja suletakse kuni kasutamiseni õhukindlalt võimalikult täis mahutisse; soovitatav on tolmu kasutada 24 tunni jooksul kuivatamisest.

1.6.1.3.   Süüteallikas

Süüteallikana tuleks kasutada vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti kuuma leeki. Muu süüteallika kasutamisel (nt katse tegemisel inertses atmosfääris) tuleks esitada selle kirjeldus ja kasutamise põhjendus.

1.6.2.   Katse tegemine

Märkus

Oksüdeerijate segusid tselluloosi või puidutolmuga tuleb vaadelda potentsiaalselt plahvatusohtlikuna ja käsitleda nõutava ettevaatusega.

1.6.2.1.   Eelkatse

Kuivatatud aine segatakse hoolikalt kuivatatud tselluloosi või puidutolmuga vahekorras kaks osa testainet ühe osa tselluloosi või puidutolmu kohta ja tehakse segust väike koonusekujuline kuhi mõõtudega 3,5 cm (aluse läbimõõt) × 2,5 cm (kõrgus), täites selleks ilma tampimata koonusekujulise vormi (nt suletud põhjaga laborilehtri).

Kuhi asetatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile. Katse tehakse tõmbekapis vastavalt kirjeldusele punktis 1.6.2.2.

Süüteallikas viiakse vastu kuhilat. Jälgitakse järgneva reaktsiooni tugevust ja kestust ning see registreeritakse.

Kui reaktsioon on tugev, loetakse aine oksüdeerivaks.

Kui tulemused on kaheldavad, tehakse allpool kirjeldatud täiemahuline katseprogramm põlemisribaga.

1.6.2.2.   Põlemisribakatse

Valmistatakse 10 % kaupa kasvava oksüdeerijasisaldusega oksüdeerija/tselluloosi segud, mis sisaldavad 10–90 % oksüdeerijat (massi järgi). Piiripealsetel juhtudel tuleks suurima põlemiskiiruse täpsemaks mõõtmiseks kasutada vahepealsete kontsentratsioonidega oksüdeerija/tselluloosi segusid.

Kuhi tekitatakse vormi abil. Vorm on metallist, 250 mm pikk ja kolmnurkse läbilõikega, 10 mm sisemise kõrguse ja 20 mm sisemise laiusega. Vormi kummalegi küljele paigaldatakse pikisuunas külgpiireteks kaks metallplaati, mis ulatuvad 2 mm üle kolmnurkse vao ülemise ääre (vt joonist). Seade täidetakse mõningases liias seguga, ilma seda tihendamata. Vorm kukutatakse seejärel 2 cm kõrguselt tugevale aluspinnale ja allesjäänud üleliigne aine tõmmatakse viltuse paberilehega pealt ära. Külgmised piirded eemaldatakse ja allesjäänud pulbrit silutakse rulliga. Vormi peale paigaldatakse seejärel mittesüttiv, mittepoorne ja madala soojusjuhtivusega alusplaat, keeratakse vorm koos plaadiga ümber ja vorm eemaldatakse.

Riba paigutatakse tõmbekapi alla õhu liikumise suunaga risti.

Õhu liikumiskiirus peab olema piisav, et takistada suitsu levikut laborisse, ning seda tuleb katse jooksul konstantsena hoida. Seadme ümber tuleks paigaldada tõmbevari.

Tselluloosi ja mõnede uuritavate ainete hügroskoopsuse tõttu tuleb katse teha võimalikult kiiresti.

Riba üks ots süüdatakse leegi abil.

Pärast seda, kui reaktsioonivöönd on levinud esimesed 30 mm, mõõdetakse järgneva 200 mm ulatuses reaktsiooni leviku aeg.

Katse tehakse võrdlusainega ja vähemalt korra kõigi testaine/tselluloosi segudega.

Kui leitav suurim põlemiskiirus ületab oluliselt võrdlussegu põlemiskiirust, võib katse peatada; muul juhul korratakse katset viis korda, kasutades kolme suurima põlemiskiirusega segu.

Kui arvatakse, et positiivne tulemus on ekslik, korratakse katset sama suurte osakestega inertse ainega, näiteks diatomiidiga tselluloosi asemel. Katset võib korrata ka kõrgeima põlemiskiirusega testaine/tselluloosi seguga inertses atmosfääris (hapnikusisaldus < 2 % mahu järgi).

2.   ANDMED

Ohutuse huvides loetakse uuritava aine oksüdeerivaid omadusi iseloomustavaks suuruseks suurim põlemiskiirus, mitte selle keskmine väärtus.

Hindamise seisukohast on oluline antud seguga kuuest katsest koosnevas seerias saadud suurim põlemiskiiruse väärtus.

Koostatakse graafik, mis näitab iga segu põlemiskiiruse suurima väärtuse sõltuvust oksüdeerija kontsentratsioonist. Graafikult loetakse suurim põlemiskiirus.

Kuus ühes katses suurima põlemiskiirusega segu mõõtmisel saadud põlemiskiiruse väärtust ei tohi aritmeetilisest keskmisest erineda rohkem kui 10 %, vastasel korral tuleb peenestamis- ja segamismeetodeid täiustada.

Leitud suurimat põlemiskiirust võrreldakse võrdlussegu suurima põlemiskiirusega (vt 1.3).

Kui katse tehakse inertses atmosfääris, võrreldakse suurimat reaktsioonikiirust võrdlussegu vastava näitajaga inertses atmosfääris.

3.   ARUANNE

3.1.   KATSEARUANNE

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 testaine tunnusandmeid, koostist, puhtusastet, niiskusesisaldust jne;

 proovi mis tahes käitlemist (nt peenestamist, kuivatamist jne);

 katsetes kasutatud süüteallikat;

 mõõtmiste tulemusi;

 reaktsiooni tüüpi (nt kiire põlemine pinnal, põlemine kogu massis, mis tahes andmeid põlemissaaduste kohta jne);

 kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid märkusi, sh eelkatses test- ja võrdlusainega tekkinud reaktsiooni tugevuse kohta (leegiga, sädemetega, suitsuga, hõõgumisega reaktsioon jne) ning nii test- kui ka võrdlusaine puhul eelkatses/sõelkatses kulunud aega;

 inertse ainega tehtud katsete tulemusi, kui neid tehti;

 inertses atmosfääris tehtud katsete tulemusi, kui neid tehti.

3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE

Aine loetakse oksüdeerivaks, kui

a) eelkatses ilmneb tugev reaktsioon;

b) uuritavate segude suurim täiemahulises katseprogrammis leitud põlemiskiirus on suurem tselluloosist ja baariumnitraadist valmistatud võrdlussegu suurimast põlemiskiirusest või sellega võrdne.

Ekslike positiivsete tulemuste vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta ka aine inertse materjaliga segamisel ja/või inertses atmosfääris tehtud katsete tulemusi.

4.   VIITED

NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

Liide

Joonis

Vorm ja abivahendid põlemisriba valmistamiseks

(Kõik mõõdud on millimeetrites)

image

A.18.   POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA MOLEKULMASSIDE JAOTUS

1.   MEETOD

Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 118 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisateave on toodud kirjandusviites 1.

1.1.   SISSEJUHATUS

Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mis kirjeldaks täpselt eraldamis- ja analüüsitingimusi, mis kataks kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja olukordi. Eelkõige on keeruliste polümeerisegude lahutamine geelkromatograafia abil sageli võimatu. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.

Kirjeldatav meetod põhineb standardil DIN 55672 (1). Üksikasjalik teave katsete tegemiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajalikuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Muude standardite kasutamisel peab nende jaoks andma täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstüreeni proove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsimiseks võib osutuda vajalikuks meetodis muudatuste tegemine.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid:



image

image

kus

Hi on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retentsiooniruumala Vi jaoks,

Mi on retentsiooniruumalale Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass ja

n on mõõtepunktide arv.

Molekulmassi jaotuse ulatus, mis iseloomustab segu disperssust, leitakse Mw/Mn suhtest.

1.3.   VÕRDLUSAINED

Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenistandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ning molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud ühesuguselt.

Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi.

Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse „polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks”. See tähendab, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid, näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüül metakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Geelkromatograafia abil võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui ka keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2).

Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja elueeruvad viimastena.

Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2).

Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega, näiteks erinevad polüstüreenistandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse nõutav analüüsikorratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised:



Mp < 2 000

Mw/Mn < 1,20

2 000 ≤ Mp ≤ 106

Mw/Mn < 1,05

Mp > 106

Mw/Mn < 1,20

(Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Polüstüreeni standardlahuste valmistamine

Polüstüreenistandardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootja soovitusi.

Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest, näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe.

1.6.2.   Proovilahuse valmistamine

Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõudsed ka proovilahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm.

Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus aruandes, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul.

1.6.3.   Seadmed

 mahuti lahustile;

 degaseerija (vajaduse korral);

 pump;

 pulsatsioonisummuti (vajaduse korral);

 injektsioonisüsteem;

 kromatograafilised kolonnid;

 detektor;

 kulumõõtja (vajaduse korral);

 andmesalvesti ja -töötleja;

 nõu jääkide jaoks.

Enne peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare).

1.6.4.   Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem

Proovilahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaks määratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min.

1.6.5.   Kolonn

Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri analüüsiks kas ühte lihtsat kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1, 2, 3).

1.6.6.   Teoreetilised taldrikud

Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järgmiste valemite põhjal:



image

või

image

kus

N

=

teoreetiliste taldrikute arv

Ve

=

piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala

W

=

piigi laius baasjoonel

W1/2

=

piigi laius poolel piigi kõrgusel

1.6.7.   Lahutamise efektiivsus

Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutamisefektiivsus saadakse järgmisest valemist:

image

kus

Ve, Mx

=

polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala

Ve,(10.Mx )

=

kümme korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala

Süsteemi lahutusvõime defineeritakse tavaliselt järgmiselt:

image

kus

Ve1, Ve2

=

kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil

W1, W2

=

piigi laiused baasjoonel

M1, M2

=

piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema kümme korda)

Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).

1.6.8.   Lahustid

Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahusti mahuti (vajaduse korral paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.

1.6.9.   Temperatuurikontroll

Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile.

1.6.10.   Detektor

Detektori eesmärk on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detekteerimiseks kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muid detektsioonimeetodeid, näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid jms.

2.   ANDMED JA ARUANDLUS

2.1.   ANDMED

Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjaliste nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1).

Iga proovi jaoks peab tegema kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima.

Iga mõõtmise tulemused peavad hõlmama Mn, Mw, Mw/Mn ja Mp väärtusi. Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega.

Pärast retentsiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibreerimiseks kasutatava standardi piigi maksimum) ühe eeltoodud suuruse funktsioonina. Molekulmassi dekaadi (kümnekordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp-punkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Arvkeskmised ja masskeskmised molekulmassid arvutatakse tavaliselt elektroonilise andmetöötlusega, mis põhineb punktis 1.2 toodud valemitel. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3).

Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.

2.2.   ARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

2.2.1.   Katsetatav aine

 Olemasolev teave analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused).

 Proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.

2.2.2.   Seadmed

 Eluendi mahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused.

 Pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem.

 Lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord).

 Kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime).

 Andmed piikide sümmeetria kohta.

 Kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik.

 Detektor (mõõtmise põhimõte, tüüp, küveti ruumala).

 Kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõtmispõhimõte).

 Andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).

2.2.3.   Süsteemi kalibreerimine

 Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus.

 Andmed selle meetodi kvaliteedikriteeriumite kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms).

 Andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus;

 Kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat teavet:

 

 proovi nimetus;

 proovi tootja;

 tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused koos määramismeetodi üksikasjadega;

 süsteruumala ja -kontsentratsioon;

 kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus;

 piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retentsiooniaeg;

 piigi maksimumile arvutatud Mp;

 arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.

2.2.4.   Hindamine

1) Aja põhjal hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms).

2) Teave selle kohta, kas hindamine viidi läbi elutsiooniruumala või retentsiooniaja põhjal.

3) Teave hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud.

4) Silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati.

5) Proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid.

6) Lahustumatute osakeste olemasolu.

7) Süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml).

8) Tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist.

9) Kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus.

 Veapiiride üksikasjalikud andmed.

 Mis tahes muu teave ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist.

3.   VIITED

1. DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

2. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

3. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

4. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Liide

Näited muudest meetoditest, mida kasutatakse polümeeride arvkeskmise molekulmassi (Mn) määramisel

Geelkromatograafia (GPC) on eelistatud meetod Mn määramiseks, eriti juhul, kui kättesaadav on standardite kogum, mille struktuur on võrreldav uuritava polümeeri struktuuriga. Kui geelkromatograafia kasutamisel on praktilist laadi raskused või olemasolevate andmete põhjal võib eeldada, et uuritav aine ei vasta esitatavatele Mn kriteeriumitele (vajab eelnevalt kinnitamist), siis on võimalik kasutada alternatiivseid meetodeid, näiteks järgmisi.

1.   Kolligatiivsete omaduste kasutamine

1.1. Ebullioskoopia/krüoskoopia

Hõlmab lahusti keemistemperatuuri tõusu (ebullioskoopia) või külmumistemperatuuri alanemise (krüoskoopia) mõõtmist pärast polümeeri lisamist. Meetod põhineb sellel, et lahustunud polümeeri mõju keemis- või külmumistemperatuurile sõltub polümeeri molekulmassist (1, 2).

Rakendatavus: Mn < 20 000 .

1.2. Aururõhu alandamine

Hõlmab valitud võrdlusvedeliku aururõhu mõõtmist enne ja pärast teadaoleva koguse polümeeri lisamist (1, 2).

Rakendatavus: Mn < 20 000 (teoreetiliselt; praktikas siiski piiratud).

1.3. Membraanosmomeetria

Põhineb osmoosi põhimõttel, st tasakaalu saavutamiseks läbivad lahusti molekulid poolläbilaskvat membraani lahjemast lahusest kontsentreeritumasse lahusesse. Katses kasutatav lahja lahus on nullkontsentratsiooniga ja kontsentreeritud lahus sisaldab polümeeri. Läbi membraani tungiv lahusti tekitab rõhkude erinevuse, mis sõltub polümeeri kontsentratsioonist ja molekulmassist (1, 3, 4).

Rakendatavus: Mn vahemikus 20 000 – 200 000 .

1.4. Aurufaasi osmomeetria

Hõlmab puhta lahusti aerosooli aurustumiskiiruse võrdlemist vähemalt kolme aerosooliga, mis sisaldavad uuritava polümeeri erinevaid kontsentratsioone (1, 2, 4).

Rakendatavus: Mn < 20 000 .

2.   Lõpprühma alüüs

Selle meetodi kasutamiseks on vajalik teada nii polümeeri üldist struktuuri kui ka ahela otsmiste rühmade keemilist koostist (mis peab olema eristatav põhiahelast näiteks NMR või tiitrimise/derivatiseerimise abil). Polümeeris esinevate otsmiste rühmade molekulaarse kontsentratsiooni määramise kaudu saab leida molekulmassi (7, 8, 9).

Rakendatavus: Mn kuni 50 000 (kahaneva usaldusväärsusega).

3.   Viited

1. Billmeyer, F. W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.

2. Glover, C. A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

3. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determinition of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Menbrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

4. Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.

5. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

6. Morris, C. E. M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

7. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.

8. Garmon, R. G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

9. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

A.19.   MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS POLÜMEERIS

1.   MEETOD

Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 119 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisateave on toodud kirjandusviidetes.

1.1.   SISSEJUHATUS

Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mille lahutamis- ja analüüsitingimused katavad kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja iseärasusi. Sageli ei ole keeruliste polümeerisegude koostisosadeks lahutamine geelkromatograafiaga võimalik. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.

Kirjeldatav meetod põhineb standardil DIN 55672 (1). Üksikasjalik teave katsete tegemiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajalikuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Kasutada võib ka muid standardeid, kui neile antakse täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstüreenproove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsil võib osutuda vajalikuks meetodi muutmine.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Madal molekulmass on kokkuleppeliselt molekulmass, mis on väiksem kui 1 000 daltonit.

Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid:



image

image

kus

Hi

=

on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retentsioonimahu Vi jaoks

Mi

=

on retentsioonimahule Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass ja n on mõõtepunktide arv

Molekulmassi jaotuse laius, mis iseloomustab segu disperssust, saadakse Mw/Mn suhtest.

1.3.   VÕRDLUSAINED

Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenstandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ja molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud ühtviisi.

Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi.

Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse „polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks”. See tähendab, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid, näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüülmetakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.

1.4.   KATSE MEETODI PÕHIMÕTE

Geelkromatograafiaga võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui ka keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2).

Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja elueeruvad viimastena.

Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2).

Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega, näiteks erinevad polüstüreenstandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass.

Nimetatud kõveralt saadakse madalmolekulaarsete ainete sisaldus. Arvutused saavad olla täpsed vaid siis, kui madala molekulmassiga ühendid annavad massi alusel detektorile samase signaali kui kogu polümeer.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse analüüsi nõutav korratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised:



Mp < 2 000

Mw/Mn < 1,20

2 000 ≤ Mp ≤ 106

Mw/Mn < 1,05

Mp > 106

Mw/Mn < 1,20

(Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Polüstüreeni standardlahuste valmistamine

Polüstüreeni standardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootja soovitusi.

Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest, näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe.

1.6.2.   Proovilahuse valmistamine

Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõuded ka proovilahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm.

Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus aruandes, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul.

1.6.3.   Parandused ebapuhtuste ja lisandite sisalduse jaoks

Tavaliselt on vajalik molekulmassiga M < 1 000 ühendite sisalduse korrigeerimine, mis on tingitud mittepolümeersetest komponentidest (näiteks ebapuhtused ja/või lisandid), välja arvatud juhul, kui nende ühendite mõõdetud sisaldus on niigi < 1 %. Selleks analüüsitakse otse polümeerilahust või geelkromatograafi eluaati.

Kui eluaat on pärast kolonni läbimist liiga lahja edasiseks analüüsiks, siis peab seda kontsentreerima. Vajalik võib olla eluaadi kuivaks aurutamine ja saadud jäägi uuesti lahustamine. Eluaati peab kontsentreerima tingimustel, mis ei põhjusta eluaadis muutusi. Geelkromatograafi eluaadi töötlemine sõltub kvantitatiivseks määramiseks kasutatavast analüütilisest meetodist.

1.6.4.   Seadmed

Geelkromatograafia seadmed sisaldavad järgmisi komponente:

 mahuti lahustile;

 degaseerija (vajaduse korral);

 pump;

 pulsatsioonisummuti (vajaduse korral);

 injektsioonisüsteem;

 kromatograafilised kolonnid;

 detektor;

 kulumõõtja (vajaduse korral);

 andmesalvesti ja-töötleja;

 nõu jääkide jaoks.

Enne peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare).

1.6.5.   Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem

Proovilahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaks määratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min.

1.6.6.   Kolonn

Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri iseloomustamiseks kas ühte kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1, 2, 3).

1.6.7.   Teoreetilised taldrikud

Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järgmiste valemite põhjal:



image

või

image

kus

N

=

on teoreetiliste taldrikute arv

Ve

=

on piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala

W

=

on piigi laius baasjoonel

W1/2

=

on piigi laius poolel piigi kõrgusel

1.6.8.   Lahutamise efektiivsus

Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutuse efektiivsus saadakse järgmisest seosest:

image

kus

Ve, Mx

=

on polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala

Ve,(10.Mx

=

on kümme korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala

Süsteemi lahutusvõimet defineeritakse tavaliselt järgmiselt:

image

kus

Ve1, Ve2

=

on kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil

W1, W2

=

on piigi laiused baasjoonel

M1, M2

=

on piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema kümme korda)

Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).

1.6.9.   Lahustid

Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahustimahuti (vajaduse korral paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.

1.6.10.   Temperatuurikontroll

Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile.

1.6.11.   Detektor

Detektori eesmärk on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detektorina kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muud tüüpi detektsioonimeetodeid, näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid jms.

2.   ANDMED JA ARUANDLUS

2.1.   ANDMED

Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjalike nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1).

Iga proovi jaoks peab tegema kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima. Kõikidel juhtudel on oluline arvestada ka pimekatse andmeid, mis on tehtud prooviga samadel katsetingimustel.

Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega.

Pärast retentsiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibratsioonistandardi piigi maksimum) ühe järgnevalt toodud suuruse funktsioonina: Mn, Mw või Mw/Mn. Molekulmassi dekaadi (kümnekordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpppunkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Kõvera osa, mis vastab molekulmassidele alla 1 000 , analüüsitakse ja parandatakse ebapuhtuste ja lisandite suhtes. Elutsioonikõveraid analüüsitakse tavaliselt elektrooniliste andmetöötluse vahenditega. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3).

Juhul, kui mis tahes lahustumatu polümeer jääb kolonni, siis on selle molekulmass tõenäoliselt suurem kui mis tahes komponendi oma lahustuvas fraktsioonis ja selle arvesse võtmata jätmisel hinnatakse üle madala molekulmassiga komponentide sisaldust. Madala molekulmassiga komponentide sisalduse määramise parandusjuhised lahustumatu polümeeri jaoks on toodud lisas.

Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.

2.2.   KATSEARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

2.2.1.   Katsetatav aine

 Olemasolev teave analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused).

 Proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.

2.2.2.   Seadmed

 Eluendimahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused.

 Pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem.

 Lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord).

 Kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime).

 Andmed piikide sümmeetria kohta.

 Kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik.

 Detektor (mõõtmispõhimõte, tüüp, küveti ruumala).

 Kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõtmispõhimõte).

 Andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).

2.2.3.   Süsteemi kalibreerimine

 Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus.

 Andmed selle meetodi kvaliteedinõuete kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms).

 Andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus.

 Kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat teavet:

 

 proovi nimetus;

 proovi tootja;

 tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused, koos määramismeetodi üksikasjadega;

 süsteruumala ja -kontsentratsioon;

 kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus;

 piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retentsiooniaeg;

 piigi maksimumile arvutatud Mp;

 arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.

2.2.4.   Andmed madalamolekulaarse polümeeri sisalduse kohta

 Analüüsimeetodite kirjeldus ja katsete tegemise viis.

 Madalamolekulaarsete komponentide protsentuaalne sisaldus (massi järgi) võrreldes kogu prooviga.

 Andmed ebapuhtuste, lisandite ja muude mittepolümeersete komponentide kohta massiprotsendina kogu proovist.

2.2.5.   Hindamine

 Retentsiooniaja järgi hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms).

 Teave selle kohta, kas hinnati elutsiooniruumala või retentsiooniaja põhjal.

 Teave hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud.

 Silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati.

 Proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid.

 Lahustumatute osakeste olemasolu.

 Süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml).

 Tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist.

 Kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus.

 Veapiiride üksikasjalikud andmed.

 Mis tahes muu teave ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist.

3.   VIITED

1. DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

2. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

3. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

4. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Liide

Madala molekulmassiga komponentide sisalduse parandamise juhised lahustumatu polümeeri olemasolul

Proovis sisalduv lahustumatu polümeer põhjustab massikadu geelkromatograafilises analüüsis. Lahustumatu polümeer jääb pöördumatult kolonni või proovi ettevalmistamisel kasutatud filtrile, kuid proovi lahustuv osa läbib kolonni. Kui polümeeri refraktsiooniindeksi juurdekasvu (dn/dc) saab hinnata või mõõta, siis on võimalik hinnata proovi massikadu kolonnis. Sellisel juhul kasutatakse paranduse tegemiseks välist kalibreerimist teadaoleva kontsentratsiooniga ja dn/dc väärtusega standardainetega, et kalibreerida refraktomeetri signaali. Järgnevas näites kasutatakse polü(metüülmetakrülaat) (pMMA) standardit.

Akrüülpolümeeride analüüsil välise kalibreerimise saamiseks viiakse geelkromatograafi teadaoleva kontsentratsiooniga pMMA standardi lahus tetrahüdrofuraanis ja saadud andmeid kasutatakse refraktomeetri konstandi leidmiseks järgmise valemi põhjal:

K = R/(C×V× dn/dc)

kus

K

=

refraktomeetri konstant (mikrovoltsekund/ml)

R

=

pMMA standardi signaal (mikrovolt/sekund)

C

=

pMMA standardi kontsentratsioon (mg/ml)

V

=

süsteruumala (ml) ja dn/dc pMMA lahuse tetrahüdrofuraanis refraktsiooniindeksi juurdekasv (ml/mg)

Järgmised andmed on tüüpilised pMMA standardi jaoks:

R

=

2 937 891

C

=

1,07 mg/ml

V

=

0,1 ml

dn/dc

=

9 × 10-5 ml/mg

Saadavat K väärtust, 3,05 × 10, kasutatakse teoreetilise detektori signaali arvutamiseks, kui 100 % süstitud polümeerist elueerus läbi detektori.

A.20.   POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITUMINE VEES

1.   MEETOD

Kirjeldatav meetod on OECD katsejuhendi nr 120 (1997) parandatud versiooni koopia. Täpsem tehniline lisateave on toodud kirjandusviites (1).

1.1.   SISSEJUHATUS

Osade polümeeride, nagu emulsioonipolümeerid, korral on vajalik eeltöötlus enne allkirjeldatud meetodi kasutamist. Meetod ei ole kasutatav vedelate polümeeride ja katsetingimustel veega reageerivate polümeeride jaoks.

Kui meetod ei ole otstarbekohane või võimalik, siis võib polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist uurida muude meetodite abil. Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.

1.2.   VÕRDLUSAINED

Puuduvad.

1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses uuritakse muudatustega kolvimeetodil (vt A.6 „Vees lahustuvus”, „Kolvimeetod”), mida on alljärgnevalt kirjeldatud.

1.4.   KVALITEEDINÕUDED

Puuduvad.

1.5.   MEETODI KIRJELDUS

1.5.1.   Seadmed

Meetodi jaoks on vajalikud järgmised seadmed:

 purustamisseade, näiteks jahvatusmasin, kindla suurusega osakeste valmistamiseks;

 seade loksutamiseks, temperatuurikontrolli võimalusega;

 membraanfiltratsiooni süsteem;

 asjakohased analüütilised seadmed;

 standardsed sõelad.

1.5.2.   Proovi ettevalmistus

Esindusliku proovi peab esmalt vähendama osakeste suuruseni 0,125 kuni 0,25 mm, kasutades vastavaid sõelu. Proovi stabiilsuse tagamiseks või jahvatamiseks võib vajalik olla jahutamine. Kummilaadseid materjale saab purustada vedela lämmastiku temperatuuril (1).

Kui osakeste soovitud suurusega fraktsioon ei ole saavutatav, peab vähendama osakeste suurust nii palju kui võimalik ja saadud tulemused protokollima. Protokollis peab täpselt ära näitama, mil viisil säilitati purustatud proovi enne katset.

1.5.3.   Protseduur

Katsetatava aine kolm proovi (igaüks 10 g) kaalutakse vastavalt kolme klaaskorgiga varustatud nõusse ja igaühte lisatakse 1 000 ml vett. Kui polümeeri koguses 10 g ei ole võimalik käsitleda, siis peab kasutama suurimat kogust, mille käsitlemine on veel võimalik, ja muutma vastavalt sellele ka vee kogust.

Nõud suletakse tihedalt ja seejärel loksutatakse temperatuuril 20 oC. Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat. 24 tunni pärast tsentrifuugitakse või filtritakse iga nõu sisu ja selges veefaasis määratakse polümeeri kontsentratsioon sobiva analüüsimeetodiga. Kui veefaasi jaoks puudub sobiv analüüsimeetod, siis võib summaarset lahustuvust/ekstraktiivsust hinnata filtril oleva jäägi või tsentrifuugimise sademe kuivkaalu põhjal.

Tavaliselt on vajalik ebapuhtuste ja lisandite ning madala molekulmassiga komponentide kvantitatiivne eristamine. Gravimeetrilise analüüsi korral on tähtis sooritada ka pimekatse ilma testaineta, et hinnata katseprotseduurist tingitud jääkide kogust.

Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses temperatuuril 37 oC ning pH 2 ja pH 9 juures võib määrata samal viisil, nagu kirjeldati katse tegemist temperatuuril 20 oC. Vastava pH väärtuse saavutamiseks võib lisada kas sobivaid puhvreid, happeid või aluseid, nagu vesinikkloriidhape, etaanhape, analüütilise puhtusega naatrium- või kaaliumhüdroksiid või ammoniaak.

Sõltuvalt analüüsimeetodist peaks tegema ühe või kaks katset. Kui polümeeri vesilahuse otsese analüüsi jaoks on olemas piisavalt spetsiifilised meetodid, siis piisab ühest eelnevalt kirjeldatud katsest. Kui sellised meetodid ei ole kättesaadavad ja polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumise määramine piirdub vaid kaudse analüüsiga, kus määratakse veefaasi kogu orgaanilise süsiniku sisaldus (TOC), peab tegema lisakatse. Lisakatse hõlmab samuti kolme paralleelkatset, milles kasutatakse kümme korda väiksemat polümeerikogust ja sama veekogust, mida kasutati esimeses katses.

1.5.4.   Analüüs

1.5.4.1.   Ühe proovi suurusega tehtud katse

Polümeeri komponentide otseseks analüüsiks veefaasis võib olla sobivaid meetodeid. Alternatiivina saab kasutada lahustunud või ekstraheerunud polümeeri komponentide kaudset analüüsi, millega määratakse lahustuvate komponentide üldine sisaldus ning tehakse parandusi polümeerile mittespetsiifiliste komponentide osas.

Kõikide polümeeri komponentide analüüs veefaasis on võimalik kas piisavalt tundliku meetodiga, näiteks

kogu orgaanilise süsiniku määramine (TOC), kasutades persulfaadi või dikromaadiga lagundamist, tekkiva süsinikdioksiidi koguse määramiseks kasutatakse infrapunaspektroskoopiat või keemilisi analüüsimeetodeid;

 aatomabsorptsioonspektromeetria (AAS) või induktiivsidestunud plasma (ICP) emissioonspektromeetria, kui polümeer sisaldab räni või metalle;

 UV-absorptsioon või spektrofluoromeetria arüülpolümeeride jaoks;

 vedelikkromatograafia – mass-spektromeetria (LC-MS) madala molekulmassiga proovide jaoks,

 või aurutades vee ekstrakti kuivjäägini ja analüüsides saadud jääki spektroskoopiliselt (IR, UV jms) või AAS/ICP abil.

Kui veefaasi analüüs ei ole teostatav, siis peaks vesiekstrakti ekstraheerima vees segunematu orgaanilise lahustiga, näiteks klorosüsivesinikega. Lahusti aurutatakse ja saadud jäägis analüüsitakse ülalnimetatud polümeeri sisaldust. Selles jäägis sisalduvad ebapuhtusena või lisanditena identifitseeritud komponendid lahutatakse tulemusest, et määrata polümeeri lahustumis- või ekstraheerumisastet.

Kui proov sisaldab suhteliselt palju sellist materjali, siis võib jääki analüüsida vedelikkromatograafia (HPLC) või gaaskromatograafia (GC) abil, et eraldada ebapuhtused monomeeridest ja monomeeridest pärinevatest komponentidest nii, et saab määrata monomeeride tegeliku koguse.

Osadel juhtudel on piisav orgaanilise lahusti aurutamine kuivjäägini ja saadud jäägi kaalumine.

1.5.4.2.   Kahe erineva proovi suurusega tehtud katse

Kõikides vesiekstraktides analüüsitakse kogu orgaanilist süsinikku (TOC).

Proovi lahustumatut või ekstraheerumatut osa analüüsitakse gravimeetriliselt. Kui pärast iga nõu sisu tsentrifuugimist või filtrimist on nõu seintel polümeeri jääke, siis peab nõud loputama filtraadiga, kuni selle seintel ei ole jääke näha. Seejärel filtritakse või tsentrifuugitakse filtraati uuesti. Filtril või tsentrifuugiklaasis olevat jääki kuivatatakse temperatuuril 40 oC vaakumis ning kaalutakse. Kuivatamist jätkatakse kuni konstantse kaalu saavutamiseni.

2.   ANDMED

2.1.   ÜHE PROOVI SUURUSEGA TEHTUD KATSE

Kõigi kolme kolvikatse tulemused ja keskmised väärtused peab esitama ja tulemused tuleb väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta (tüüpiliselt mg/l) või massiühikutes polümeeri proovi massi kohta (tüüpiliselt mg/g). Lisaks tuleb esitada proovi massikadu (arvutatakse soluudi massi jagamisel esialgse proovi massiga). Katsete puhul tuleks arvutada ka suhteline standardhälve (RSD). Kogu proovi (polümeer + olulised lisandid jms) ja ainult polümeeri (pärast selliste lisandite mõju lahutamist) kohta peab esitama eraldi tulemused.

2.2.   KAHE ERINEVA PROOVI SUURUSEGA TEHTUD KATSE

Kahest kolme paralleelkatsega eksperimendist saadud TOC väärtused ja iga eksperimendi keskmine tuleb esitada massiühikuna lahuse ruumala kohta (tavaliselt mgC/l) ja massiühikuna proovi massi kohta (tavaliselt mgC/g).

Kõrge ja madala proovi/vee suhtega katsetulemuste vahelise erinevuse puudumine viitab sellele, et kõik ekstraheeruvad komponendid on ekstraheerunud. Sellistel juhtudel ei ole tavaliselt otsene analüüs vajalik.

Jääkide massid peab esitama ja tulemused tuleb väljendada protsendina proovi esialgsest massist. Iga katse jaoks peab arvutama keskmise. Erinevused 100 % ja leitud protsendi vahel esitavad lahustuva ja ekstraheeruva materjali protsendilist sisaldust esialgses proovis.

3.   ARUANDLUS

3.1.   ARUANNE

Katsetulemused peavad sisaldama järgmist teavet.

3.1.1.   Katsetatav aine

 Olemasolev teave analüüsitava ühendi kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused, madala molekulmassiga komponentide sisaldus).

3.1.2.   Katse tingimused

 Kasutatud protseduuride kirjeldus ja katse tingimused.

 Analüütiliste ja määramismeetodite kirjeldus.

3.1.3.   Tulemused

 Lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/l); erinevates lahustes tehtud ekstraktsioonikatsete üksikud ja keskmised väärtused, lagunenud polümeeri sisaldus, ebapuhtused, lisandid jms.

 Polümeeri lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/g).

 Kui mõõdeti, siis vee ekstraktide TOC tulemused, soluudi mass ja arvutatud protsendid.

 Iga proovi pH väärtus.

 Pimekatsete tulemused.

 Kus vajalik, peab viitama katsetatava ühendi keemilisele ebastabiilsusele nii katse kui ka analüütilise protsessi käigus.

 Kogu teave, mis on oluline tulemuste tõlgendamisel.

4.   VIITED

1. DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21.   OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD)

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et mõõta vedeliku võimet suurendada põleva materjali põlemiskiirust või põlemisintensiivsust või moodustada segu tuleohtliku ainega, mis süttib iseeneslikult juhul, kui need kaks ainet segatakse omavahel põhjalikult. See põhineb oksüdeerivate vedelike (1) ÜRO katsel ja on sellega samaväärne. Kuna käesolev meetod A.21 on algselt ette nähtud vastama määruse (EÜ) nr 1907/2006 nõuetele, on vaja teha võrdlus üksnes ühe võrdlusainega. Katsete tegemine ja võrdlemine täiendava võrdlusainega võib olla vajalik juhul, kui eeldatakse, et katse tulemusi kasutatakse muudel eesmärkidel ( 1 ).

Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui struktuurivalemi uurimine teeb kahtlusteta kindlaks, et aine ei reageeri tuleohtliku materjaliga eksotermiliselt.

On kasulik teada enne katsetamist, kas aine võib plahvatada.

Käesolev katse ei ole kasutatav tahkete ainete, gaaside, plahvatusohtlike või kergestisüttivate ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul.

Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui oksüdeerivaid vedelikke (1) käsitlevas ÜRO katses on tulemused uuritava katseaine kohta juba olemas.

1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD

Keskmine rõhutõusuaeg on katse käigus manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le kulunud aegade keskmine.

1.3.   VÕRDLUSAINE

Võrdlusainena kasutatakse 65 %list (massiprotsent) lämmastikhappe vesilahust (analüütiliselt puhas) ( 2 ).

Kui katse tegija näeb ette, et katse tulemusi võib lõpuks kasutada muudel eesmärkidel, ( 3 ) võib soovi korral samuti osutuda vajalikuks katse tegemine täiendavate võrdlusainetega ( 4 ).

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Uuritav vedelik segatakse kiudtselluloosiga massisuhtes 1:1 ja pannakse surveanumasse. Kui segamisel või anuma täitmisel ilmneb isesüttimine, ei ole vaja katsete tegemist jätkata.

Kui isesüttimist ei toimu, tehakse kogu katse. Segu kuumutatakse surveanumas ja määratakse kindlaks keskmine aeg, mis kulub manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le. Seda võrreldakse sellise keskmise ajaga, mis kulub võrdlusaine(te) ja tselluloosi 1:1 segu korral rõhu suurenemiseks.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Ühe ainega tehtud viiest katsest koosnevas seerias ei tohi ükski tulemus erineda aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 30 %. Tulemused, mis erinevad keskmisest rohkem kui 30 %, jäetakse kõrvale, täiustatakse segamis- ja täitmismenetlust ning korratakse katset.

1.6.   MEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Ettevalmistus

1.6.1.1.   Põlev aine

Põleva ainena kasutatakse kuivatatud kiudtselluloosi, mille kiu pikkus on 50–250 μm ja keskmine läbimõõt on 25 μm ( 5 ). Seda kuivatakse konstantse kaaluni kuni 25 mm paksuses kihis 105 oC juures neli tundi ja hoitakse eksikaatoris koos desikandiga kuni jahtumise ja kasutamiseni. Kuivatatud tselluloosi niiskusesisaldus peaks olema alla 0,5 % kuivmassist ( 6 ). Vajaduse korral peaks selle tagamiseks kuivatamisaega pikendama ( 7 ). Tselluloosi sama partiid kasutatakse kogu uuringu vältel.

1.6.1.2.   Seadmed

1.6.1.2.1.    Surveanum

Vaja läheb surveanumat. Anumaks on silindriline terasest anum, mille pikkus on 89 mm ja välisläbimõõt on 60 mm (vt joonist 1). Vastaskülgedel paikneb kaks tasapinnalist süvendit (millega on anuma sisemist vaba ruumi vähendatud 50 mm-ni) süüteküünla ja väljalaskeava korgi paigaldamise hõlbustamiseks. Anumas oleva 20 mm siseläbimõõduga kanali mõlemas otsas on 19 mm astmetaoline laiend, mis on keermestatud vastavalt Briti standardsele 1" torukeermele (British Standard Pipe – BSP) või samaväärsele meeterkeermele. Surveanuma kumerasse külgpinda on ühest otsast 35 mm kaugusele kruvitud külgharu, mis paikneb tasapinnaliste süvenditega 90o nurga all ning mis on ette nähtud ühendamiseks rõhuanduriga. Külgharu pesa moodustab 12 mm sügavune puuritud ava, mis on keermestatud vastavalt külgharu otsas oleva 1/2" BSP keermega (või samaväärse meeterkeermega). Vajaduse korral paigaldatakse inertne tihend, mis tagab hermeetilise ühenduskoha. Külgharu ulatub 55 mm surveanuma korpusest väljapoole ja sellesse on puuritud kanal siseläbimõõduga 6 mm. Külgharu otsas on astmetaoline keermestatud süvend, mis on ette nähtud ühendamiseks membraani tüüpi rõhuanduriga. Kasutada võib mis tahes rõhumõõturit, tingimusel et seda ei mõjuta kuumad gaasid või lagunemissaadused ning et see on võimeline reageerima rõhutõusudele 690 – 2 070 kPa vähem kui 5 ms jooksul.

Surveanuma külgharust kaugemal asuv ots on suletud süüteküünlaga, milles on kaks elektroodi –üks on isoleeritud küünla korpusest ja teine on sellega ühendatud (maandatud). Surveanuma teine ots on suletud puruneva membraaniga (purunemissurve ligikaudu 2 200 kPa), mida hoiab paigal 20 mm läbimõõduga puuritud avaga kork. Vajaduse korral kasutatakse ühenduskoha hermeetilisuse tagamiseks inertset tihendit. Tugiraam (joonis 2) hoiab komplekti kasutamise ajal õiges asendis. Tugiraam koosneb tavaliselt pehmest rauast alusplaadist, mille mõõtmed on 235 mm × 184 mm × 6 mm, ja 185 mm pikkusest õõnsusega ruudukujulisest sektsioonist (S.H.S.) mõõtmetega 70 mm × 70 mm × 4 mm.

Õõnsusega ruudukujulise sektsiooni ühe otsa kaks vastaskülge on maha lõigatud selliselt, et moodustub kahest tasapinnalise küljega jalast struktuur, mille otsas paikneb 86 mm pikkune terviklik karbikujuline osa. Nende tasapinnaliste külgedega jalgade otsad on lõigatud horisontaalsuuna suhtes 60o all ning on keevitatud alusplaadi külge. Põhisektsiooni ülaosa ühes küljes paikneb pilu laiusega 22 mm ja sügavusega 46 mm nii, et kui rõhuanuma komplekt lastakse allapoole, süüteküünlaga ots ees, siis satub külgharu pilusse. Karbikujulise osa alumise sisepinna külge keevitatakse terasest 30 mm laiune ja 6 mm paksune detail, mis toimib eraldajana. Kaks vastasküljel olevat 7 mm pitskruvi hoiavad surveanumat kindlalt paigal. Kaks 12 mm laiust ja 6 mm paksust terasriba, mis on keevitatud karbikujulise sektsiooni põhjale toetuvate külgmiste elementide külge, toetavad surveanumat altpoolt.

1.6.1.2.2.    Süütesüsteem

Süütesüsteem koosneb 25 cm pikkusest Ni/Cr traadist, mille läbimõõt on 0,6 mm ja takistus on 3,85 oom/m. Traat on keritud spiraalina 5 mm läbimõõduga varda abil ja kinnitatud süüteküünla elektroodide külge. Spiraali kuju peaks vastama joonisel 3 toodule. Anuma põhja ja süütespiraali alakülje vaheline kaugus peaks olema 20 mm. Kui elektroode ei saa reguleerida, tuleks süütespiraali ja anuma põhja vahel olevad traadi otsad isoleerida keraamilise kestaga. Traati kuumutatakse püsivoolutoiteallikaga, mis suudab tagada vähemalt 10 A voolutugevuse.

1.6.2.   Katse tegemine ( 8 )

Seade, mis on komplekteeritud rõhuanduri ja kuumutussüsteemiga, kuid kuhu ei ole paigaldatud purunevat membraani, toetub altpoolt süüteküünlale. 2,5 g uuritavat vedelikku segatakse keeduklaasis 2,5 g kuivatatud tselluloosiga, kasutades klaasist segamispulka ( 9 ). Ohutuse tagamiseks on tegija ja segu vahel segamise ajal kaitseekraan. Kui segu süttib segamise või anuma täitmise ajal, ei ole vaja katsetamist jätkata. Segu lisatakse tilkhaaval väikeste portsjonitena surveanumasse, tagades segu paiknemise ümber süütespiraali ja sellega hea kontakti. On oluline, et spiraal ei deformeeru anuma täitmise ajal, kuna see võib põhjustada väärasid tulemusi ( 10 ). Purunev membraan asetatakse kohale ja lukustav kork keeratakse kõvasti kinni. Täidetud anum asetatakse tugiraamile nii, et purunev membraan jääb ülespoole. Tugiraam asetatakse sobivasse armeeritud tõmbekappi või põlemiskambrisse. Toiteallikas ühendatakse süüteküünla välimiste klemmidega ja lülitatakse sisse 10 A vool. Aeg segamise alustamisest kuni voolu sisselülitamiseni ei tohiks ületada kümmet minutit.

Rõhuanduri signaal registreeritakse sobiva süsteemi abil, mis võimaldab nii signaali hindamist kui ka rõhu ajalise sõltuvuse pidevat registreerimist (nt graafilise isekirjutiga ühendatud siirdeprotsesside registraator). Segu kuumutatakse kuni puruneva membraani rebestumiseni või vähemalt 60 s. Kui purunev membraan ei rebestu, tuleks lasta segul jahtuda enne seadme hoolikat lahtimonteerimist, vältides seejuures võimalikku hermeetilisuse kadumist. Uuritava aine ja võrdlusaine(te)ga tehakse viis katset. Fikseeritakse aeg, mis kulub manomeeterrõhu tõusuks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le. Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg.

Mõnedel juhtudel võivad ained tekitada rõhutõusu (liiga suurt või liiga väikest), mille põhjuseks on keemilised reaktsioonid, mis ei ole seotud aine oksüdeerimisvõimega. Neil juhtudel võib osutuda vajalikuks katse kordamine tselluloosi asemel inertse ainega, nt diatomiidiga (kobediatomiit), et selgitada reaktsiooni olemust.

2.   ANDMED

Rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) puhul. Rõhutõusuajad inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud).

2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE

Arvutatakse keskmised rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) kohta.

Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud).

Mõned näited tulemuste kohta on toodud tabelis 1.



Tabel 1

Näiteid tulemustest ()

Aine ()

Keskmine rõhutõusu aeg (ms) 1:1 tselluloosisegu puhul

Ammooniumdikromaat, küllastunud vesilahus

20 800

Kaltsiumnitraat, küllastunud vesilahus

6 700

Raud(III)nitraat, küllastunud vesilahus

4 133

Liitiumperkloraat, küllastunud vesilahus

1 686

Magneesiumperkloraat, küllastunud vesilahus

777

Nikkelnitraat, küllastunud vesilahus

6 250

Lämmastikhape, 65 %

4 767  ()

Perkloorhape, 50 %

121 ()

Perkloorhape, 55 %

59

Kaaliumnitraat, 30 % vesilahus

26 690

Hõbenitraat, küllastunud vesilahus

— ()

Naatriumkloraat, 40 % vesilahus

2 555  ()

Naatriumkloraat, 45 % vesilahus

4 133

Inertne aine

 

Vesi: tselluloos

— ()

(1)   Vt viidet 1 ÜRO transpordieeskirjade kohase klassifitseerimise kohta.

(2)   Küllastunud lahused tuleks valmistada 20 oC juures.

(3)   Laboritevaheliste võrdluskatsete keskmine väärtus.

(4)   Suurimat rõhku 2 070 kPa ei ole saavutatud.

3.   ARUANDLUS

3.1.   ARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet:

 uuritud aine nimetus, koostis, puhtus jne;

 uuritava aine kontsentratsioon;

 tselluloosi kuivatusmenetlus;

 tselluloosi niiskusesisaldus;

 mõõtetulemused;

 inertse ainega tehtud katsete tulemused, kui need on olemas;

 arvutatud keskmised rõhutõusuajad;

 võimalikud kõrvalekalded nimetatud meetodist ja nende põhjused;

 kogu täiendav teave või märkused, mis on vajalikud tulemuste tõlgendamiseks.

3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE ( 11 )

Katsetulemusi hinnatakse

a) selle põhjal, kas uuritava aine ja tselluloosi segu süttib ise, ja

b) rõhutõusule (690 kPa-lt 2 070 kPa-le) kulunud keskmise aja võrdlemisel võrdlusaine(te) korral selleks kulunud ajaga.

Vedelikku käsitatakse oksüdeerijana juhul, kui

a) uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) süttib iseeneslikult või

b) uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral on keskmine rõhutõusuaeg väiksem 65 massiprotsendilise lämmastikhappe (vesilahus) ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral saadud keskmisest rõhutõusuajast või on sellega võrdne.

Valepositiivse tulemuse vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta ka tulemusi, mis on saadud aine katsetamisel koos inertse materjaliga.

4.   VIITED

1. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3. täiendatud väljaanne. ÜRO väljaanne nr: ST/SG/AC.10/ll/Rev. 3, 1999, lk 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

Joonis 1

Surveanum

image

Joonis 2

Tugiraam

image

Joonis 3

Süütesüsteem

image

Märkus: toodud kujutistest võib kasutada emba-kumba.

▼M1

A.22.   KIUDUDE PIKKUSE JÄRGI KAALUTUD GEOMEETRILINE KESKMINE DIAMEETER

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

See meetod kirjeldab protseduuri lahtiste keemiliste mineraalkiudude (MMMF, Man Made Mineral Fibres) pikkuse järgi kaalutud geomeetrilise keskmise diameetri (LWGMD, Length Weighted Geometric Mean Diameter) mõõtmiseks. Kuna kogumi LWGMD on 95 % tõenäosusega proovi 95 % usalduspiiride vahel (LWGMD ± kaks standardviga), asub esitatud väärtus (testväärtus) proovi madalamal 95 % usalduspiiril (st LWGMD – kaks standardviga). Meetod põhineb 1994. aasta juunis uuendatud HSE tööstusprotseduuri kavandil, mis kooskõlastati ECFIA ja HSE kohtumisel Chesteris 26. septembril 1993 ja mida arendati edasi teise laboritevahelise katse jaoks ja selle põhjal (1, 2). Seda mõõtmismeetodit saab kasutada selliste lahtiste ainete või toodete kiudiameetri iseloomustamiseks, mis sisaldavad MMMFisid, kaasa arvatud tulekindlad keraamilised kiud (RCF, refractory ceramic fibres), keemilised klaaskiud (MMVF, man-made vitreous fibres), kristallilised ja polükristallilised kiud.

Pikkuse järgi kaalumine on viis kompenseerida diameetri jaotumist, mida põhjustab pikkade kiudude murdumine materjalist proovi võtmisel või materjali käsitsemisel. Geomeetrilist statistikat (geomeetrilist keskmist) kasutatakse MMMFide diameetri suuruse järgi jaotumise mõõtmiseks, kuna nende diameetrite jaotus suuruse järgi on tavaliselt lähedane logaritmilisele normaaljaotusele.

Nii pikkuse kui diameetri mõõtmine on tüütu ja aeganõudev, aga kui mõõdetakse vaid neid kiudusid, mis puudutavad lõpmatult peenikest riba skaneeriva elektronmikroskoobi (SEM) vaateväljas, siis on antud kiu valimise tõenäosus võrdeline selle pikkusega. Kuna sellega võetakse arvesse pikkust pikkuse järgi kaalumise arvutustes, on ainus nõutav mõõtmine diameetri mõõtmine ja „LWGMD – kaks standardviga” võib arvutada kirjeldatud viisil.

1.2.   MÕISTED

Partikkel – objekt, mille pikkuse-laiuse suhe on vähem kui 3:1.

Kiud – objekt, mille pikkuse-laiuse suhe (formaadisuhe) on vähemalt 3:1.

1.3.   RAKENDUSALA JA PIIRANGUD

Meetod on mõeldud vaatlemaks diameetri jaotumisi, keskmise diameetriga alates 0,5 μm kuni 6 μm. Suuremaid diameetreid võib mõõta, kasutades väiksemaid SEMi suurendusi, kuid meetodi täpsus väheneb peenemate kiudude jaotuste puhul ja kui keskmine diameeter on alla 0,5 μm, soovitatakse mõõtmist TEMiga (transmissiooni elektronmikroskoop).

1.4.   Katsemeetodi põhimõte

Kiu kihist või lahtisest kiumassist võetakse mitu representatiivset südamikuproovi. Lahtiste kiudude pikkust vähendatakse purustava protseduuri abil ja representatiivne osaproov hajutatakse vees. Eraldatakse alikvoodid ja filtreeritakse need läbi 0,2 μm poorisuurusega polükarbonaadifiltri ja valmistatakse ette uurimiseks SEMi tehnikate abil. Kiu diameeter mõõdetakse 10 000 -kordse või suurema ekraanisuurendusega, ( 12 ) kasutades erapooletu keskmise diameetri hinnangu andmiseks liini katkestamise meetodit. Arvutatakse madalam 95 % usaldusvahemik (mis põhineb ühepoolsel testil), et anda hinnang materjali kiudiameetri geomeetrilise keskmise väikseima väärtuse kohta.

1.5.   Katsemeetodi kirjeldus

1.5.1.   Turvalisus/ettevaatusabinõud

Isiklikku kokkupuudet õhus sisalduvate kiududega tuleks minimeerida ja kuivkiudude käsitsemisel tuleks kasutada tõmbekappi või laminaarboksi. Kontrollmeetodite tõhususe kindlaksmääramiseks tuleks läbi viia korrapärast isikliku kokkupuute seiret. MMMFide käsitsemisel tuleb nahaärrituse vähendamiseks ja ristsaastumise ärahoidmiseks kanda ühekordselt kasutatavaid kindaid.

1.5.2.   Seadmed/vahendid

 Press ja pressvormid (võimelised tekitama 10 MPa).

 0,2 μm poorisuurusega polükarbonaat-kapillaarfiltrid (25 mm diameetriga).

 5 μm poorisuurusega tselluloos-ester membraanifilter tugifiltrina kasutamiseks.

 Klaasist filtreermisseadmed (või ühekordselt kasutatavad filtreerimissüsteemid) 25 mm diameetriga filtritele (nt Millipore’i klaasist mikroanalüüsikomplekt, tüüp nr XX10 025 00).

 Värskelt destilleeritud vesi, mis on mikroorganismide eemaldamiseks lastud läbi 0,2 μm poorisuurusega filtri.

 Pihusti kuld- või kuld/pallaadiumotsaga.

 Skaneeriv elektronmikroskoop lahutamisvõimega kuni 10 nm ja 10 000 -kordse suurendusega.

 Muu: spaatlid, tüüp 24, skalpellitera, pintsetid, SEMi torud, süsinikliim või süsinikteip, kolloidhõbe.

 Ultrahelisond või lauale asetatav ultrahelivann.

 Südamiku proovivõtuvahend või korgipuur südamikuproovide võtmiseks MMMFide kihist.

1.5.3.   Katsemenetlus

1.5.3.1.   Proovivõtmine

Mineraalvilla ja villaku puhul kasutatakse ristlõikest proovide võtmisel 25 mm südamikuproovide võtmise vahendit või korgipuuri. Proovid peaksid olema võrdselt jaotatud kihi laiuse ulatuses või võetud suvalistest kohtadest, kui käepärast on pikki kihte. Samade vahendite abil on võimalik eraldada juhuslikke proove lahtisest kiust. Võimaluse korral tuleks ruumiliste variatsioonide peegeldamiseks lahtises materjalis võtta kuus proovi.

Kuus südamikuproovi purustatakse 50 mm läbimõõduga vormis 10 MPa juures. Materjal segatakse spaatliga ja pressitakse uuesti 10 MPa juures. Seejärel võetakse materjal vormist välja ja säilitatakse seda suletud klaaspudelis.

1.5.3.2.   Proovi ettevalmistamine

Orgaanilist sideainet saab vajaduse korral eemaldada, asetades kiu umbes tunniks 450 °C sulatusahju.

Proovi jaotamiseks vormitakse see koonuseks ja lõigatakse see neljaks (seda tuleks teha tolmukapis).

Spaatli abil lisatakse väike hulk (< 0,5 g) proovist 100 ml värskelt destilleeritud veele, mis on lastud läbi 0,2 μm membraaniga filtri (alternatiivina võib kasutada ultrapuhast vett muudest allikatest, kui need vastavad nõuetele). Proov hajutatakse põhjalikult ultrahelisondi abil 100 W võimsuse juures ja seda pööratakse nii, et tekiks kavitatsioon. (Kui sondi pole käepärast, kasutada järgmist meetodit: proovi raputatakse ja pööratakse korduvalt ümber 30 sekundi jooksul; hoitakse viis minutit lauale asetatavas ultrahelivannis; seejärel raputatakse ja pööratakse korduvalt veel 30 sekundi jooksul).

Kohe pärast kiu hajutamist eemaldatakse teatud arv alikvoote (näit kolm 3, 6 ja 10 ml alikvooti), kasutades laiasuulist pipetti (2–5 ml mahutavusega).

Iga alikvoot vaakumfiltreeritakse läbi 0,2 μm polükarbonaatfiltri, mida toetab 5 μm poorisuurusega MEC-tugifilter, kasutades 25 mm klaasist filterlehtrit silindrilise mahutiga. Umbkaudu 5 ml filtreeritud destilleeritud veest tuleks asetada lehtrisse ja alikvoot aeglaselt vette pipettida, hoides pipetiotsa allpool meniskit. Peale pipettimist tuleb pipett ja veemahuti põhjalikult läbi loputada, kuna peenikesed kiud kipuvad jääma pinnale.

Filter eemaldatakse hoolikalt ja eraldatakse see tugifiltrist enne mahutisse kuivama asetamist.

Filtreeritud osast lõigatakse veerand või pool tüüp 24 skalpelliga edasi-tagasi liigutuste abil. Lõigatud osa kinnitatakse ettevaatlikult SEMi esemelaua külge süsinikteibi või süsinikliimi abil. Kolloidhõbedat tuleks lisada vähemalt kolme kohta, et parandada elektrilist kontakti filtri ja esemelaua äärtel. Kui liim/kolloidhõbe on kuiv, pihustada proovi pinnale umbes 50 nm kulla või kulla/pallaadiumi kiht.

1.5.3.3.   SEMi kalibreerimine ja kasutamine

1.5.3.3.1.   Kalibreerimine

SEMi kalibreerimist tuleks kontrollida vähemalt kord nädalas (ideaaljuhul kord päevas), kasutades sertifitseeritud kalibreerimisvõret. Kalibreerimist tuleks kontrollida sertifitseeritud standardi alusel ja kui mõõdetud väärtus (SEM) ei jää ± 2 % sisse sertifitseeritud väärtusest, siis tuleb SEM-kalibreerimist kohandada ja uuesti kontrollida.

SEM peaks olema võimeline lahendama vähemalt minimaalselt nähtava diameetri 0,2 μm, kasutades tegelikku proovimaatriksit, 2 000 -kordse suurendusega.

1.5.3.3.2.   Kasutamine

SEM peaks töötama 10 000 -kordse suurenduse ( 13 ) juures tingimustel, mis annavad hea lahutusvõime lubatava kujutise aeglasel skaneerimiskiirusel, näiteks 5 sekundit kaadri kohta. Kuigi erinevate SEMide kasutamisnõuded võivad varieeruda, tuleks suhteliselt väikese aatommassiga materjalide korral üldiselt parima nähtavuse ja resolutsiooni saavutamiseks kasutada kiirendavat pinget 5–10 keV, väikest laotuspunkti seadistust ja lühikest töökaugust. Lineaarse skaneerimise puhul tuleb kasutada 0o kallet, et minimeerida refokuseerimine, või kui SEMil on võimalik kohaldada kõrgust, tuleks kasutada kohaldatud kõrgusega töökaugust. Võib kasutada väiksemat suurendust, kui materjal ei sisalda väikseid (väikese diameetriga) kiude ja kiudude diameeter on suur (> 5 μm).

1.5.3.4.   Suuruse järgi sorteerimine

1.5.3.4.1.   Väikese suurendusega uurimine proovi hindamiseks

Algselt tuleks proovi uurida väikese suurendusega, et otsida tõendust suurte kiudude pundarde kohta ning hinnata kiutihedust. Juhul kui moodustub liiga palju puntraid, on soovitatav ette valmistada uus proov.

Statistilise täpsuse jaoks on vaja mõõta miinimumarv kiude ja suur kiutihedus võib tunduda soovitav, kuna tühjade väljade uurimine on aeganõudev ega oma analüüsi jaoks väärtust. Kui aga filter on üle koormatud, muutub kõigi mõõdetavate kiudude mõõtmine siiski raskeks, ja kuna väikesed kiud võivad jääda suuremate varju, võivad need jääda kahe silma vahele.

Kalduvus LWGMD ülehindamisele võib tuleneda kiutihedustest enam kui 150 kiudu millimeetri kohta lineaarse sammu puhul. Teisest küljest pikendab väike kiukontsentratsioon analüüsi aega ja sageli on mõistlikum valmistada ette proov, mille kiutihendus on lähedasem optimaalsele, kui jätkata madala kontsentratsiooniga filtrite loendamist. Optimaalne kiutihedus peaks andma keskmiselt üks või kaks loendatavat kiudu vaatevälja kohta 5 000 -kordse suurendusega. Siiski sõltub optimaalne tihedus kiudude suurusest (diameetrist), nii et on vajalik, et operaator kasutaks teatavat eksperdihinnangut otsustamaks, kas kiu tihedus on optimaalse lähedane või mitte.

1.5.3.4.2.   Kiu diameetri kaalumine pikkuse järgi

Loendatakse vaid kiude, mis puudutavad (lõpmatult) peenikest SEMi ekraanile tõmmatud joont (või lõikuvad sellega). Selleks on ekraani keskele tõmmatud horisontaalne (või vertikaalne) joon.

Alternatiivina võib ekraani keskele asetada üksiku punkti ja alustada pidevat skaneeringut ühes suunas üle filtri. Mõõdetakse ja salvestatakse iga sellise kiu diameeter, mille formaadisuhe on suurem kui 3:1 ja mis puudutab või ületab seda punkti.

1.5.3.4.3.   Kiudude sorteerimine suuruse järgi

Soovitav on mõõta minimaalselt 300 kiudu. Iga kiudu mõõdetakse ainult korra ja selles punktis, kus ta lõikub kujutisele paigutatud joone või punktiga (või lõikumiskoha lähedal, kui kiu servad on hägused). Kui leidub ebaühtlase põiklõikega kiude, tuleks kasutada mõõtmist, mis vastab kiu keskmisele diameetrile. Hoolikas tuleb olla kiuservade määratlemisel ja nendevahelise lühima kauguse mõõtmisel. Sorteerimist võib läbi viia on-line või off-line salvestatud kujutistel või fotodel. Soovitatav on kasutada poolautomatiseeritud kujutise mõõtmise süsteeme, mis laadivad andmed otse arvutustabelisse, kuna need säästavad aega ja välistavad ümberkirjutusvead ning arvutusi on võimalik automatiseerida.

Pikkade kiudude otsi tuleks kontrollida väikese suurendusega, et välistada nende tagasikeerdumine mõõtmise vaatevälja ja tagada, et neid mõõdetakse ainult üks kord.

2.   ANDMED

2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE

Kiudiameetritel ei esine tavaliselt normaaljaotust. Siiski on logaritmteisenduse abil võimalik saavutada normaaljaotusele lähenev jaotus.

Arvutatakse n kiudiameetri (D) naturaallogaritmide (lnD) aritmeetiline keskmine (keskmine lnD) ja standardhälve (SDlnD).



image

(1)

image

(2)

Standardhälve jagatakse mõõtmiste arvu (n) ruutjuurega, et saada standardviga (SElnD).



image

(3)

Keskmisest lahutatakse kahekordne standardviga ja arvutatakse selle väärtuse eksponent (keskmine miinus kaks standardviga), et saada geomeetriline keskmine miinus kaks geomeetrilist standardviga.



image

(4)

3.   ARUANDMINE

KATSEARUANNE

Katsearuanne peaks sisaldama vähemalt järgmist teavet:

 avaldise LWGMD – 2SE väärtus;

 mis tahes hälbed ja eriti need, mis võivad avaldada mõju tulemuste täpsusele, koos piisavate põhjendustega.

4.   VIITED

1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. Veebruar 1999.

2) G. Burdett ja G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.

▼M4

A.23   JAOTUSKOEFITSIENT (SÜSTEEMIS 1-OKTANOOL-VESI): AEGLASE SEGAMISE MEETOD

SISSEJUHATUS

1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 123 (2006). Aeglase segamise meetodiga saab täpselt määrata jaotuskoefitsiente süsteemis 1-oktanool-vesi (POW) kuni log POW väärtuseni 8,2 (1). Sellepärast sobib see meetod väga hüdrofoobsete ainete POW otseseks katseliseks määramiseks.

2. Muud meetodid jaotuskoefitsientide määramiseks süsteemis 1-oktanool-vesi (POW) on loksutatava kolvi meetod (2) ja POW määramine pööratud faasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia retentsiooniaja andmetest (3). Loksutatava kolvi meetod võib anda aga vale tulemuse, kuna veefaasi kanduvad üle mikroskoopilised oktanooli piisakesed. Mida suurem on POW väärtus, seda rohkem kiputakse veefaasis olevate oktanooli mikropiiskade tõttu ülehindama uuritava aine kontsentratsiooni vees. Sellepärast võib loksutatava kolvi meetodit kasutada ainult ainete puhul, mille log POW < 4. Teine meetod põhineb otse määratud usaldusväärsetel POW väärtustel, mida kasutatakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia retentsiooniaja ja mõõdetud POW väärtuste vahelise seose kaliibrimiseks. Mõnda aega oli kättesaadav OECD katsejuhendi kavand (4) ioniseeruvate ainete jaotuskoefitsientide määramiseks süsteemis 1-oktanool-vesi, kuid seda meetodit enam ei kasutata.

3. Käesolev katsemeetod on välja töötatud Madalmaades. Siin kirjeldatud meetodite täpsust on kontrollitud ja optimeeritud laboritevaheliste võrdluskatsete uuringuga, milles osales 15 laborit (5).

LÄHTEKAALUTLUSED

Olulisus ja kasutamine

4. On kindlaks tehtud, et inertsete orgaaniliste ainete bioakumulatsioon kalades korreleerub väga tugevasti nende ainete jaotuskoefitsiendiga süsteemis 1-oktanool-vesi (POW). Lisaks on näidatud, et POW korreleerub kemikaalide toksilise mõjuga kaladele ning seostumisega tahkete ainetega, nagu pinnas ja setted. Ulatuslik ülevaade nendest seostest on esitatud publikatsioonis 6.

5. On kindlaks tehtud, et aine 1-oktanool-vee-süsteemi jaotuskoefitsiendi ja muude omaduste vahel on palju keskkonnatoksikoloogia ja -keemia seisukohast olulisi seoseid. Sellepärast on jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool-vesi saanud tähtsaks parameetriks, mille abil hinnatakse kemikaalide keskkonnaohtlikkust ja ennustatakse nende käitumist keskkonnas.

Kasutusala

6. Aeglane segamine peaks vähendama 1-oktanooli mikropiisakeste moodustumist veefaasis olevatest 1-oktanooli tilkadest. Sellega välditakse aine kontsentratsiooni ülehindamist veefaasis mikropiiskades leiduvate uuritava aine molekulide tõttu. Seepärast on aeglase segamise meetod eriti sobiv POW määramiseks ainetel, mille eeldatav log POW väärtus on 5 või suurem ja mille puhul loksutatava kolvi meetod (2) võib anda vale tulemuse.

MÕISTED JA ÜHIKUD

7. Aine jaotuskoefitsient vee ja lipofiilse lahusti (1-oktanool) vahel iseloomustab kemikaali tasakaalulist jaotumist kahe faasi vahel. Aine jaotuskoefitsient vee ja lipofiilse lahusti (1-oktanool) vahel (POW) on suhe, mis saadakse veega küllastunud 1-oktanooli faasis oleva uuritava aine tasakaalulise kontsentratsiooni (CO) jagamisel 1-oktanooliga küllastunud veefaasis oleva uuritava aine tasakaalulise kontsentratsiooniga (CW).

image

Kuna jaotustegur on kontsentratsioonide suhe, on see mõõtühikuta suurus. Enamasti väljendatakse seda kümnendlogaritmi kujul (log POW). POW sõltub temperatuurist, sellepärast tuleb andmete esitamisel märkida ka mõõtmistemperatuur.

MEETODI PÕHIMÕTE

8. Jaotuskoefitsiendi määramiseks tasakaalustatakse püsival temperatuuril omavahel vesi, 1-oktanool ja uuritav aine. Seejärel määratakse uuritava aine kontsentratsioon mõlemas faasis.

9. Siin kirjeldatavas aeglase segamise katses on võimalik vähendada eksperimentaalseid raskusi, mida loksutatava kolvi katses põhjustab mikropiiskade tekkimine. Aeglase segamise katses tasakaalustatakse vesi, 1-oktanool ja uuritav aine termostateeritavas ja segajaga varustatud katsenõus. Aine jaotumist faaside vahel kiirendab segamine. Segamine tekitab piiratud turbulentsi, mis kiirendab jaotumist 1-oktanooli ja vee vahel, kuid seejuures ei teki mikropiisku (1).

KATSE RAKENDATAVUS

10. Kuna lisandid võivad mõjutada uuritava aine aktiivsuskoefitsienti, määratakse jaotuskoefitsient ainult puhta aine jaoks. 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise uurimisel tuleb kasutada müügilolevaid kõrgeima puhtusastmega kemikaale.

11. Käesolev meetod on rakendatav puhta aine korral, mis ei dissotsieeru, assotsieeru ega ole märkimisväärselt pindaktiivne. Meetodit võib kasutada selliste ainete ja nende segude 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise suhte määramiseks. Kui meetodit kasutatakse segu puhul, on määratav 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise suhe tinglik ja oleneb uuritava segu ning veefaasina kasutatava elektrolüüdi keemilisest koostisest. Täiendavate abinõude rakendamisel võib seda meetodit kasutada ka dissotsieeruvate või assotsieeruvate ühendite puhul (vt punkt 12).

12. Kuna dissotsieeruvate ainete, nagu orgaanilised happed, fenoolid, orgaanilised alused ja metallorgaanilised ühendid, jaotumisel 1-oktanooli ja vee vahel kujuneb vees ja 1-oktanoolis mitmeastmeline tasakaal, on jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool-vesi tinglik konstant, mis sõltub tugevasti elektrolüüdi koostisest (7, 8). Seega eeldab jaotuskoefitsiendi määramine süsteemis 1-oktanool-vesi, et katse jooksul kontrollitakse pH väärtust ja elektrolüüdi koostist ning esitatakse need andmed. Nende jaotuskoefitsientide hinnangulise väärtuse saamiseks kasutatakse eksperdihindamist. Dissotsiatsioonikonstandi (-konstantide) alusel valitakse sobivad pH väärtused, et määrata iga ionisatsiooniastme jaotuskoefitsient. Metallorgaaniliste ühendite jaotumise uurimisel kasutatakse puhvreid, mis ei moodusta komplekse (8). Arvestades vesilahuste keemia andmeid (komplekside moodustumise tasakaalukonstandid, dissotsiatsioonikonstandid), valitakse katsetingimused nii, et oleks võimalik hinnata, millises vormis on uuritav aine veefaasis. Kõikide katsete puhul luuakse taustelektrolüüdi abil ühesugune ioonne jõud.

13. Vees vähe lahustuvate või suure POW väärtusega ainete jaotuskoefitsiendi määramist võib raskendada see, et aine väikest kontsentratsiooni vees on raske täpselt määrata. Käesolevas metoodikas antakse juhendeid, kuidas seda probleemi lahendada.

ANDMED UURITAVA AINE KOHTA

14. Keemilised reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad või veelgi kõrgema puhtusastmega. Uuritava ainena soovitatakse kasutada teadaoleva keemilise koostisega vähemalt 99-protsendilise puhtusastmega radioaktiivse märgiseta aineid või teadaoleva keemilise koostise ja radiokeemilise puhtusastmega radioaktiivselt märgistatud aineid. Kui märgise poolestusaeg on lühike, tehakse isotoobi lagunemist arvestav parand. Radioaktiivse märgisega uuritava aine puhul tuleb ainespetsiifilise analüüsimeetodiga tõendada, et mõõdetav radioaktiivsus on otse seotud uuritava ainega.

15. log POW hinnangu saamiseks võib kasutada müügilolevat log POW hindamiseks ette nähtud tarkvara või kasutada kummaski lahustis lahustuvuste suhet.

16. Enne aeglase segamise katse korraldamist POW määramiseks peaks uuritava aine kohta teadma järgmist:

a) struktuurivalem,

b) analüüsimeetodid, mis sobivad uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks vees ja 1-oktanoolis,

c) ioniseeruva aine dissotsiatsioonikonstandid (OECD juhis 112 (9)),

d) lahustuvus vees (10),

e) abiootiline hüdrolüüs (11),

f) kiire biolagunduvus (12),

g) aururõhk (13).

MEETODI KIRJELDUS

Seadmed ja aparatuur

17. Vaja on harilikku laborivarustust, eeskätt järgmisi vahendeid:

 magnetsegajad ja tefloniga kaetud segamispulgad, mida kasutatakse veefaasi segamiseks;

 analüüsiseadmed, mis võimaldavad määrata uuritava aine eeldatavaid kontsentratsiooni väärtusi;

 katsenõu, mille põhja juures on kraan. Olenevalt log POW hinnangulisest väärtusest ja uuritava aine avastamise lävest tuleb vajaduse korral kasutada suuremat kui üheliitrise mahuga, kuid samasuguse kujuga katsenõu, et saaks võtta piisava koguse vett uuritava aine keemiliseks eraldamiseks ja määramiseks. Nii saadakse aine veest eraldamisel suurema sisaldusega kontsentraat ja usaldusväärsem analüüsi tulemus. 1. liite tabelis on esitatud vajaliku minimaalse mahu hinnangud, uuritava aine avastamise läved, hinnangulised log POW väärtused ja lahustuvused vees. Tabel põhineb Pinsuwani jt (14) esitatud seosel ühelt poolt log POW ning teiselt poolt oktanoolis ja vees lahustuvuse (S) suhte vahel:

 
image

 kus

 
image (väljendatud molaarsustes),

 ning Lymani (15) esitatud valemil, mis võimaldab ennustada vesilahustuvust. 1. liites esitatud valemi abil arvutatud vesilahustuvust tuleb käsitada esialgse hinnanguna. Tuleb märkida, et käesoleva meetodi kasutaja võib hinnata vesilahustuvust ka mis tahes muu valemi abil, kui ta arvab, et see kajastab hüdrofoobsuse ja lahustuvuse seost paremini. Näiteks tahkete ühendite puhul on soovitatav lahustuvuse hindamisel arvestada ka sulamistemperatuuri. Kui kasutatakse modifitseeritud valemit, tuleb kontrollida, kas valem lahustuvuse arvutamiseks oktanoolis ikkagi kehtib. 2. liites on skemaatiliselt kujutatud klaasist veesärgiga katsenõu mahuga umbes üks liiter. 2. liites kujutatud nõu proportsioonid on osutunud sobivaks ja muu mahuga nõu peaks olema samasuguse kujuga;

 oluline on sellise seadme olemasolu, mis hoiab aeglase segamise katse jooksul püsivat temperatuuri.

18. Nõud peavad olema valmistatud inertsest materjalist, et adsorptsioon nõu pinnale oleks tähtsusetu.

Katselahuste valmistamine

19. POW määramiseks kasutatakse müügilolevat suurima puhtusastmega (vähemalt üle 99 %) 1-oktanooli. 1-oktanool soovitatakse puhastada happe, aluse ja veega ekstraheerimise abil ning seejärel kuivatada. Lisaks sellele võib 1-oktanooli puhastada destilleerimisega. Puhastatud 1-oktanooli kasutatakse uuritava aine standardlahuste valmistamiseks. POW määramiseks kasutatav vesi peab olema destilleeritud klaas- või kvartsklaasist seadme abil, saadud puhastussüsteemist või olema kõrgefektiivse vedelikkromatograafia puhul nõutava puhtusega. Destilleeritud vesi filtritakse läbi filtri, mille poori suurus on 0,22 μm, ja tehakse pimekatsed, millega kontrollitakse, et kontsentreeritud ekstraktis ei oleks uuritava aine käitumist mõjutavaid lisandeid. Klaaskiudfiltri kasutamisel puhastatakse see eelnevalt kuumutamisega vähemalt kolme tunni jooksul 400 °C juures.

20. Enne katset küllastatakse mõlemad lahustid vastastikku, tasakaalustades neid piisavalt suures nõus. Selleks segatakse kahefaasilist süsteemi aeglaselt kahe ööpäeva jooksul.

21. Valitakse vajalik uuritava aine kontsentratsioon ja aine lahustatakse veega küllastunud 1-oktanoolis. Jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool-vesi tuleb määrata lahja 1-oktanool- ja vesilahuse jaoks. Sellepärast ei tohi uuritava aine kontsentratsioon ületada 70 % selle lahustuvusest kummaski faasis ega olla suurem kui 0,1 (1). Katses kasutatavas 1-oktanooli lahuses ei tohi olla uuritava aine hõljuvaid tahkeid osakesi.

22. Vajalik kogus uuritavat ainet lahustatakse veega küllastunud 1-oktanoolis. Kui võib arvata, et log POW väärtus on suurem kui viis, tuleb hoolikalt jälgida, et katses kasutatavad 1-oktanooli lahused ei sisaldaks uuritava aine hõljuvaid tahkeid osakesi. Nende ainete puhul, mille log POW > 5, toimitakse seepärast järgmisel viisil:

 uuritav aine lahustatakse veega küllastunud 1-oktanoolis;

 lahusel lastakse piisavalt kaua seista, et hõljuv aine sadestuks. Sadestumise ajal jälgitakse uuritava aine kontsentratsiooni;

 kui 1-oktanooli lahuses mõõdetav kontsentratsioon on saavutanud püsiva väärtuse, lahjendatakse põhilahus vajaliku mahu 1-oktanooli lisamisega;

 mõõdetakse lahjendatud põhilahuse kontsentratsioon. Lahjendatud põhilahust võib aeglase segamise katses kasutada, kui mõõdetud kontsentratsiooni väärtus vastab lahjendusele.

Proovide ekstraheerimine ja analüüsimine

23. Uuritava aine määramiseks kasutatakse valideeritud analüüsimeetodit. Uurija peab esitama tõendid, et katses kasutatavad uuritava aine kontsentratsioonid veega küllastunud 1-oktanoolis ja 1-oktanooliga küllastunud vees on suuremad kui kasutatava analüüsimeetodi mõõtmislävi. Kui on vaja kasutada ekstraheerimismeetodit, tuleb enne katset kindlaks teha vee faasis ja 1-oktanooli faasis oleva uuritava aine analüütilise määramise saagis. Analüüsiks kasutatava signaali tugevus peab olema parandatud pimekatses saadud signaali arvestamiseks; hoolikalt jälgitakse, et analüüsitavat ainet ei kantaks üle ühest proovist teise.

24. Kuna hüdrofoobse uuritava aine kontsentratsioon vee faasis on väike, on vee faasi enne analüüsi tõenäoliselt vaja ekstraheerida orgaanilise lahustiga ja ekstrakti kontsentreerida. Samal põhjusel on vaja kontsentreerida võimalikke pimekatseid. Selleks tuleb kasutada kõrgpuhtaid lahusteid, eelistatavalt selliseid, mis sobivad kasutamiseks jääkide analüüsis. Töötamine hoolikalt puhastatud (lahustiga pestud või kõrgel temperatuuril kuumutatud) klaasnõudega aitab vältida ühe proovi saastamist teise prooviga.

25. log POW hinnangulise väärtuse saamiseks võib kasutada hindamisprogrammi või eksperdihindamist. Kui hinnangu järgi on väärtus suurem kui kuus, tuleb pimekatse parandite arvestamisel ja analüüsitava aine võimaliku ülekande vältimisel olla eriti hoolikas. Kui hinnanguline log POW on suurem kui kuus, tuleb määramise saagist arvestava parandi saamiseks kasutada asendavat standardainet, nii et oleks võimalik saavutada suurt eelkontsentreerimistegurit. Müügil on mitu POW hindamiseks ette nähtud tarkvaraprogrammi, ( 14 ) nt Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) ja ACD log P (19). Hindamisviise on kirjeldatud publikatsioonides 20–22.

26. Tunnustatud meetodite abil tehakse kindlaks uuritava aine mõõtmisläve väärtused 1-oktanoolis ja vees. Rusikareeglina võib meetodi mõõtmisläve määratleda kui uuritava aine sellist kontsentratsiooni vees või 1-oktanoolis, mille puhul signaali ja müra taseme suhe on kümme. Valitakse sobiv ekstraheerimise ja eelkontsentreerimise meetod ning leitakse analüütilise määramise saagis. Analüütiliseks määramiseks vajaliku tugevusega signaali saamiseks valitakse sobiv eelkontsentreerimistegur.

27. Analüüsimeetodi parameetrite ja oodatavate kontsentratsioonide alusel määratakse kindlaks ligikaudne proovi maht, mis on vajalik uuritava aine täpseks määramiseks. Tuleb vältida liiga väikeste veeproovide kasutamist, mis ei anna piisavalt tugevat analüütilist signaali. Tuleb hoiduda ka ülemäära suurte veeproovide võtmisest, kuna sel juhul võib vett mitte jätkuda nõutava minimaalse arvu (n = 5) analüüside tegemiseks. 1. liites on esitatud proovi väikseima mahu sõltuvus nõu mahust, uuritava aine avastamise lävest ja lahustuvusest.

28. Uuritava aine sisaldus mõõdetakse selle aine kaliibrimiskõveraga võrdlemise teel. Standardproovide kontsentratsioonivahemik peab ulatuma uuritava proovi kontsentratsioonist mõlemale poole.

29. Kui uuritava aine hinnanguline log POW väärtus on suurem kui kuus, tuleb enne ekstraheerimist lisada veeproovile asendavat standardainet, et osata arvesse võtta kadusid veeproovi ekstraheerimisel ja eelkontsentreerimisel. Määramise saagist arvestava parandi õige väärtuse saamiseks peavad asendava standardaine omadused olema uuritava aine omadustega väga sarnased või identsed. Selleks kasutatakse eelistatavalt (stabiilsete) isotoopidega (nt deuteerium või 13C) märgistatud uuritava aine analooge. Kui stabiilsete isotoopidega (nt deuteerium või 13C) märgistatud analooge kasutada ei saa, tuleb usaldusväärsete kirjandusandmete põhjal näidata, et asendava standardaine füüsikalis-keemilised omadused on väga sarnased uuritava aine omadustega. Vee faasi ekstraheerimisel lahustiga võib moodustuda emulsioon. Emulsiooni vähendamiseks võib lisada soola ja lasta faasidel eralduda järgmise päevani. Ekstraheerimiseks ja proovide eelkontsentreerimiseks kasutatud meetodid märgitakse katseprotokolli.

30. Vajaduse korral võib enne analüüsi 1-oktanooli faasist võetud proovi lahjendada sobiva lahustiga. Asendava standardaine lisamine saagist arvestava parandi saamiseks on soovitatav ka siis, kui uuritava aine saagisekatsete tulemused on väga varieeruvad (suhteline standardhälve > 10 %).

31. Analüüsimeetodi üksikasjad märgitakse katseprotokolli. Nende hulka kuuluvad ekstraheerimismeetod, eelkontsentreerimis- ja lahjendustegur, analüüsiseadme parameetrid, kaliibrimismeetod, kaliibrimise kontsentratsioonivahemik, vee faasis oleva uuritava aine määramise saagis, asendava standardaine lisamine saagist arvestava parandi saamiseks, fooni tase, avastamislävi ja mõõtmislävi.

Katse läbiviimine

Optimaalne 1-oktanooli ja vee mahu suhe

32. Vee ja 1-oktanooli mahtude valimisel tuleb arvestada mõõtmisläve väärtust 1-oktanoolis ja vees, veeproovide puhul kasutatavaid eelkontsentreerimistegureid, 1-oktanooli ja vee prooviks võetavaid koguseid ja eeldatavaid kontsentratsioone. Tehnilistel põhjustel valitakse 1-oktanooli maht aeglaselt segatavas süsteemis selliselt, et 1-oktanooli kiht oleks küllalt paks (üle 0,5 cm), nii et 1-oktanooli faasist saaks võtta proovi seda faasi häirimata.

33. Ühendite puhul, mille log POW on 4,5 või suurem, kasutatakse tavaliselt järgmist faaside suhet: üheliitrisse nõusse pannakse 950–980 ml vett ja 20–50 ml 1-oktanooli.

Katsetingimused

34. Katse ajal termostateeritakse katsenõu nii, et temperatuurikõikumised on väiksemad kui 1 °C. Katse tuleb teha 25 °C juures.

35. Katsesüsteemi kaitsmiseks päevavalguse eest tehakse katse pimedas ruumis või kaetakse katsenõu alumiiniumfooliumiga.

36. Katse tehakse võimalikult tolmuvabas keskkonnas.

37. 1-oktanooli ja vee süsteemi segatakse tasakaalu saabumiseni. Tasakaalustamisaja hindamiseks tehakse eeluuring, mille jooksul süsteemi segatakse aeglaselt ning võetakse perioodiliselt 1-oktanoolist ja veest proove. Proove võetakse mitte sagedamini kui viie tunni tagant.

38. Iga POW määramiseks tehakse vähemalt kolm sõltumatut aeglase segamise katset.

Tasakaalustamisaja määramine

39. Eeldatakse, et tasakaal on saabunud, kui 1-oktanooli faasi ja veefaasi kontsentratsioonide suhte ja aja regressioonisirge tõus nelja järjestikuse proovivõtu ulatuses ei erine oluliselt nullist usaldusnivool 0,05. Enne proovivõtu alustamist tasakaalustatakse süsteemi vähemalt üks ööpäev. Kogemused näitavad, et kui aine hinnanguline log POW väärtus on alla viie, saab proovid võtta teisel ja kolmandal päeval. Hüdrofoobsemate ühendite puhul võib tasakaalustamine kesta kauem. Ühendi puhul, mille log POW väärtus on 8,23 (dekaklorobifenüül), oli piisav tasakaalustamisaeg 144 tundi. Tasakaalu hindamiseks võetakse korduvalt proove ühest nõust.

Katse alustamine

40. Katse alguses täidetakse katsenõu veega, mis on küllastunud 1-oktanooliga. Püsiva temperatuuri saavutamiseks termostateeritakse katsenõu piisava aja jooksul.

41. Katsenõusse lisatakse ettevaatlikult vajalik kogus uuritavat ainet, mis on eelnevalt lahustatud sobivas mahus veega küllastunud 1-oktanoolis. See etapp on väga oluline, kuna siin tuleb vältida kahe faasi turbulentset segunemist. Selleks võib 1-oktanooli faasi lisada aeglaselt pipetiga, hoides pipetti vastu katsenõu seina veefaasi pinna läheduses. 1-oktanooli faas voolab mööda klaasseina, moodustades veefaasi peale kihi. Mingil juhul ei tohi 1-oktanooli kallata otse katsenõusse; 1-oktanooli tilgad ei tohi kukkuda otse vette.

42. Pärast segamise alustamist tõstetakse segamise kiirust aeglaselt. Kui segaja mootorit ei saa vajalikul määral reguleerida, tuleb kasutada trafot. Segamise kiirus reguleeritakse selliseks, et vee ja 1-oktanooli piirpinnal tekiks 0,5–2,5 cm sügavune keeris. Kui keerise sügavus ületab 2,5 cm, tuleb segamise kiirust vähendada; vastasel korral võivad 1-oktanooli tilkadest veefaasis tekkida mikropiisakesed, mille tagajärjel uuritava aine kontsentratsiooni vees hinnatakse tegelikust suuremaks. Maksimaalselt 2,5 cm sügavusele keerisele vastavat segamiskiirust soovitatakse laboritevaheliste võrdluskatsete tulemuste alusel (5). See on kompromiss, mis võimaldab 1-oktanooli mikropiiskade tekke piiramisega samal ajal süsteemi kiiresti tasakaalustada.

Proovi võtmine ja ettevalmistamine

43. Enne proovi võtmist peatatakse segaja ja oodatakse, kuni vedelike liikumine lakkab. Kui proovid on võetud, pannakse segaja uuesti aeglaselt tööle, nagu eespool kirjeldatud, ja seejärel suurendatakse järk-järgult segamise kiirust.

44. Vee proove võetakse katsenõu alumises osas oleva kraani kaudu. Kraani sees olev tasakaalustamata veekogus visatakse alati ära (2. liites kujutatud nõu puhul on selle maht umbes 5 ml). Kraani sees olev vesi ei segune ülejäänud faasiga ega ole sellepärast tasakaalus. Registreeritakse veeproovide mahud ja jälgitakse, et massibilansi koostamisel võetaks arvesse ka äravisatud vees leiduv uuritava aine kogus. Aurumiskao vähendamiseks lastakse veel rahulikult voolata jaotuslehtrisse, nii et vee- ja 1-oktanoolikihi olekut ei häiritaks.

45. 1-oktanooli proove võetakse 1-oktanooli kihist väikeste alikvootide (umbes 100 μl) kaupa 100-mikroliitrise tervenisti klaasist ja metallist süstla abil. Seejuures jälgitakse, et ei häiritaks faasidevahelist piirpinda. Registreeritakse proovide mahud. Väiksest alikvoodist piisab, kuna 1-oktanooli proovi lahjendatakse.

46. Tuleb vältida asjatuid proovi ülekandmisi. Seepärast määratakse proovi maht gravimeetriliselt. Veeproovi puhul saab seda teha nii, et proov võetakse jaotuslehtrisse, millesse on enne pandud vajalik kogus lahustit.

KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE

47. Käesoleva katsemetoodika kohaselt tehakse POW määramiseks uuritava ainega ühesugustes tingimustes kolm aeglase segamise katset (kolm paralleelkatset). Tasakaalu saavutamist näitav regressioonikõver peab põhinema CO/CW määramisel vähemalt neljas järjestikuses eri aegadel võetud proovis. See võimaldab arvutada dispersiooni, mis iseloomustab paralleelkatsetest leitud keskväärtuse määramatust.

48. POW väärtust võib iseloomustada igast paralleelkatsest saadud andmete dispersiooni abil. Neid andmeid kasutatakse kaalutud keskmise POW väärtuse arvutamiseks üksikute paralleelkatsete tulemuste alusel. Selleks kasutatakse statistilise kaaluna paralleelkatsete tulemuste dispersiooni pöördväärtust. Suure hajuvusega (suure dispersiooniga) ja seega vähem usaldatavad andmed mõjutavad kaalutud keskmist tulemust vähem kui väiksema dispersiooniga andmed.

49. Samal viisil arvutatakse ka kaalutud standardhälve. See iseloomustab POW määramise korratavust. Kaalutud standardhälbe väike väärtus näitab, et POW määramise tulemus on ühes ja samas laboratooriumis hästi korratav. Järgnevalt on kirjeldatud katseandmete formaalstatistilist analüüsi.

Tulemuste töötlemine

Tasakaalu saavutamise näitamine

50. Iga proovivõtuhetke jaoks arvutatakse 1-oktanoolis ja vees määratud uuritava aine kontsentratsioonide suhte logaritm (log CO/CW). Tasakaalu saavutamise näitamiseks ehitatakse graafik, mis kajastab selle suhte sõltuvust ajast. Kui vähemalt nelja proovi tulemused moodustavad graafikul platoo, tähendab see, et tasakaal on saavutatud ja uuritav aine on 1-oktanoolis tõesti lahustunud. Kui kõnesolevat platood ei ole, jätkatakse katset, kuni nelja järjestikuse proovi tulemused annavad tõusu, mis ei erine oluliselt 0-st usaldusnivool 0,05, näidates, et log CO/CW ei sõltu ajast.

Log POW arvutamine

51. Iga paralleelkatse log POW saamiseks arvutatakse kaalutud keskmine log CO/CW väärtus kõvera log CO/CW vs. aeg tasakaaluolekule vastaval osal. Kaalutud keskmise arvutamisel kaalutakse katseandmeid dispersiooni pöördväärtusega; selle tulemusena on katseandmete mõju lõpptulemusele pöördvõrdeline nende määramatusega.

Keskmine log POW

52. log POW keskväärtuse arvutamiseks eri paralleelkatsete keskväärtustest leitakse vastavate dispersioonidega kaalutud paralleelkatsete tulemuste keskmine.

Arvutused tehakse järgmiselt:

image

kus

log POW,i

=

on paralleelkatses i leitud log POW väärtus,

log POW,Av

=

on üksikutes paralleelkatsetes määratud log POW väärtuste kaalutud keskmine,

wi

=

on paralleelkatses i log POW väärtusele omistatud statistiline kaal.

Statistilise kaaluna wi kasutatakse log POW,i dispersiooni pöördväärtust (
image ).

53. log POW keskväärtuse viga hinnatakse tasakaaluolekus üksikutes paralleelkatsetes määratud log CO/CW väärtuste korratavuse järgi. See väljendatakse log POW,Av kaalutud standardhälbena (σlog Pow,Av), mis omakorda on log POW,Av väärtusega seotud vea mõõt. Kaalutud standardhälbe võib arvutada kaalutud dispersioonist (varlog Pow,Av) järgmisel viisil:

image

image

n on paralleelkatsete arvu tähis.

Katseprotokoll

54. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.

Uuritav aine:

 tavanimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem (mis näitab märgistuse asukohta, kui kasutatakse radioaktiivselt märgistatud ainet) ja olulised füüsikalis-keemilised omadused (vt punkt 17);

 uuritava aine puhtusaste (lisandid);

 märgistatud kemikaali märgise puhtus ja molaarne aktiivsus (vajaduse korral);

 log POW esialgne hinnanguline väärtus ja selle tuletusviis.

Katsetingimused:

 uuringu kuupäevad;

 katsetemperatuur;

 1-oktanooli ja vee maht katse alguses;

 võetud 1-oktanooli ja vee proovide maht;

 pärast proovide võtmist katsenõusse jäänud 1-oktanooli ja vee maht;

 katsenõu ja segamistingimuste kirjeldus (segamispulga ja katsenõu ehitus, keerise sügavus millimeetrites ja segamiskiirus, kui see on teada);

 uuritava aine määramiseks kasutatud analüüsimeetod ja selle meetodi mõõtmislävi;

 proovivõtuajad;

 vee faasi ja kasutatud puhvrite pH (kui ioniseeruvate molekulide tõttu reguleeriti pH väärtust);

 paralleelkatsete arv.

Tulemused:

 kasutatud analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkus;

 1-oktanoolis ja vees määratud uuritava aine kontsentratsioonide sõltuvus ajast;

 massibilansi kontroll;

 katsetemperatuur ja selle standardhälve või katsetemperatuuri vahemik;

 kontsentratsioonide suhte ja aja seost kajastav regressioonikõver;

 keskväärtus log POW,Av ja selle standardhälve;

 tulemuste arutelu ja tõlgendus;

 representatiivse analüüsi originaalarvandmete näidis (hea laboritava kohaselt säilitatakse kõik originaalandmed), kaasa arvatud asendavate standardainete saagised, kaliibrimisel kasutatud kontsentratsioonide arv (koos kaliibrimiskõvera korrelatsioonikordaja kriteeriumidega) ning kvaliteedi tagamise ja/või kontrolli tulemused;

 kui on olemas, siis: mõõtmismeetodi valideerimisaruanne (esitatakse kirjandusviitena).

KIRJANDUS

1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring” method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499–512.

2) Käesoleva lisa peatükk A.8. Jaotuskoefitsient.

3) Käesoleva lisa peatükk A.8. Jaotuskoefitsient.

4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.

5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.

6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596–2602.

9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.

10) Käesoleva lisa peatükk A.6. Lahustuvus vees.

11) Käesoleva lisa peatükk C.7. Lagunemine – abiootiline lagunemine hüdrolüüsi teel sõltuvalt pH-st.

12) Käesoleva lisa peatükk C.4, II–VII osa (meetodid A–F). Kiire biolagunevuse määramine.

13) Käesoleva lisa peatükk A.4. Aururõhk.

14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623–626.

15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2–1 to 2–52.

16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.

17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.

18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.

19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.

20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.

21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479–488.

22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386–390.

1. liide

Eri log POW väärtusega uuritavate ainete veefaasis määramiseks vajalike vee miinimumkoguste arvutamise tabel

Eeldused

 Ühe alikvoodi maksimaalne maht on 10 % üldmahust, 5 alikvooti on 50 % üldmahust.

 Uuritava aine kontsentratsioon on 70 % lahustuvusest kummaski faasis. Väiksema kontsentratsiooni puhul on vaja kasutada veel suuremat mahtu.

 Avastamisläve juures määramiseks vajalik maht on 100 ml.

 Uuritavatel ainetel on mõistlikud log Pow vs. log Sw ja log Pow vs. SR (Soct/Sw) sõltuvused.

Sw hindamine



log Pow

Võrrand

log Sw

Sw (mg/l)

4

image

0,496

3,133E+00

4,5

image

0,035

1,084E+00

5

image

–0,426

3,750E–01

5,5

image

–0,887

1,297E–01

6

image

–1,348

4,487E–02

6,5

image

–1,809

1,552E–02

7

image

–2,270

5,370E–03

7,5

image

–2,731

1,858E–03

8

image

–3,192

6,427E–04

Soct hindamine



log Pow

Võrrand

Soct (mg/l)

4

image

3,763E+04

4,5

image

4,816E+04

5

image

6,165E+04

5,5

image

7,890E+04

6

image

1,010E+05

6,5

image

1,293E+05

7

image

1,654E+05

7,5

image

2,117E+05

8

image

2,710E+05



Uuritava aine üldmass

(mg)

Massoct/MassH2O

MassH2O

(mg)

KontsH2O

(mg/l)

Massoct

(mg)

Kontsoct

(mg/l)

1 319

526

2,5017

2,6333

1 317

26 333

1 686

1 664

1,0127

1,0660

1 685

33 709

2 158

5 263

0,4099

0,4315

2 157

43 149

2 762

16 644

0,1659

0,1747

2 762

55 230

3 535

52 632

0,0672

0,0707

3 535

70 691

4 524

1664 36

0,0272

0,0286

4 524

90 480

5 790

5263 16

0,0110

0,0116

5 790

115 807

7 411

1 664 357

0,0045

0,0047

7 411

148 223

9 486

5 263 158

0,0018

0,0019

9 486

189 713

Mahtude arvutamine



Veefaasi väikseim vajalik maht avastamisläve eri väärtuste korral

log Kow

Avastamislävi (mikrogramm/l)

0,001

0,01

0,10

1,00

10

4

 

0,04

0,38

3,80

38

380

4,5

 

0,09

0,94

9,38

94

938

5

 

0,23

2,32

23,18

232

2 318

5,5

 

0,57

5,73

57,26

573

5 726

6

 

1,41

14,15

141

1 415

14 146

6,5

 

3,50

34,95

350

3 495

34 950

7

 

8,64

86,35

864

8 635

86 351

7,5

 

21,33

213

2 133

21 335

213 346

8

 

52,71

527

5 271

52 711

527 111

Avastamisläve juures määramiseks vajalik maht (l)

0,1

 

 

 

 

 

Selgitused arvutuste kohta

Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 1-liitrine katsenõu tasakaalustamiseks.

Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 2-liitrine katsenõu tasakaalustamiseks.

Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 5-liitrine katsenõu tasakaalustamiseks.

Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 10-liitrine katsenõu tasakaalustamiseks.

Ületab 10 % isegi 10-liitrise katsenõu mahust.



Vajaliku mahu sõltuvus lahustuvusest vees ja log POW väärtusest

Veefaasi väikseim vajalik maht avastamisläve eri väärtuste korral (ml)

log Pow

Sw (mg/l)

Avastamislävi (mikrogramm/l) →

0,001

0,01

0,10

1,00

10

4

10

 

0,01

0,12

1,19

11,90

118,99

 

5

 

0,02

0,24

2,38

23,80

237,97

 

3

 

0,04

0,40

3,97

39,66

396,62

 

1

 

0,12

1,19

11,90

118,99

1 189,86

4,5

5

 

0,02

0,20

2,03

20,34

203,37

 

2

 

0,05

0,51

5,08

50,84

508,42

 

1

 

0,10

1,02

10,17

101,68

1 016,83

 

0,5

 

0,20

2,03

20,34

203,37

2 033,67

5

1

 

0,09

0,87

8,69

86,90

869,01

 

0,5

 

0,17

1,74

17,38

173,80

1 738,02

 

0,375

 

0,23

2,32

23,18

231,75

2 317,53

 

0,2

 

0,43

4,35

43,45

434,51

4 345,05

5,5

0,4

 

0,19

1,86

18,57

185,68

1 856,79

 

0,2

 

0,37

3,71

37,14

371,36

3 713,59

 

0,1

 

0,74

7,43

74,27

742,72

7 427,17

 

0,05

 

1,49

14,85

148,54

1 485,43

14 854,35

6

0,1

 

0,63

6,35

63,48

634,80

6 347,95

 

0,05

 

1,27

12,70

126,96

1 269,59

12 695,91

 

0,025

 

2,54

25,39

253,92

2 539,18

25 391,82

 

0,0125

 

5,08

50,78

507,84

5 078,36

50 783,64

6,5

0,025

 

2,17

21,70

217,02

2 170,25

21 702,46

 

0,0125

 

4,34

43,40

434,05

4 340,49

43 404,93

 

0,006

 

9,04

90,43

904,27

9 042,69

90 426,93

 

0,003

 

18,09

180,85

1 808,54

18 085,39

180 853,86

7

0,006

 

7,73

77,29

772,89

7 728,85

77 288,50

 

0,003

 

15,46

154,58

1 545,77

15 457,70

154 577,01

 

0,0015

 

23,19

231,87

2 318,66

23 186,55

231 865,51

 

0,001

 

46,37

463,73

4 637,31

46 373,10

463 731,03

7,5

0,002

 

19,82

198,18

1 981,77

19 817,73

198 177,33

 

0,001

 

39,64

396,35

3 963,55

39 635,47

396 354,66

 

0,0005

 

79,27

792,71

7 927,09

79 270,93

792 709,32

 

0,00025

 

158,54

1 585,42

15 854,19

158 541,86

1 585 418,63

8

0,001

 

33,88

338,77

3 387,68

33 876,77

338 767,72

 

0,0005

 

67,75

677,54

6 775,35

67 753,54

677 535,44

 

0,00025

 

135,51

1 355,07

13 550,71

135 507,09

1 355 070,89

 

0,000125

 

271,01

2 710,14

27 101,42

271 014,18

2 710 141,77

Avastamisläve juures määramiseks vajalik maht (l) on

0,1

 

 

 

 

 

2. liide

Klaasist veesärgiga katsenõu POW määramiseks aeglase segamise katse abil

image

▼M6

A.24.   JAOTUSKOEFITSIENT (N-OKTANOOL/VESI): KÕRGEFEKTIIVSE VEDELIKKROMATOGRAAFIA (HPLC) MEETOD

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 117 (2004).

1. Jaotuskoefitsient (P) on määratletud kui kahest omavahel praktiliselt segunematust lahustist koosnevas kahefaasilises süsteemis lahustunud aine tasakaalukontsentratsioonide suhe. Lahustite n-oktanooli ja vee puhul:

image

.

Kuna jaotuskoefitsient on kahe kontsentratsiooni suhtarv, puudub sellel mõõtühik ning seda väljendatakse tavaliselt suhtarvu kümnendlogaritmina.

2. Pow on oluline näitaja, mille abil kirjeldatakse keemiliste ainete käitumist keskkonnas. On tõendatud, et esineb väga tugev seos ainete ioniseerimata vormi Pow ja nende ainete kalades bioakumuleerumise vahel. Samuti on leitud, et Pow on kasulik näitaja ainete pinnases ja setetes adsorbeerumise ennustamiseks ning ainete struktuuri ja toime vahelise kvantitatiivse seose kindlakstegemiseks paljude erinevate bioloogilise mõju viiside puhul.

3. Algne ettepanek selle katsemeetodi kasutamiseks põhineb C. V. Eadsforthi ja P. Moseri artiklil (1). Katsemeetodi väljatöötamist ja OECD laboritevahelise võrdlusuuringu tegemist kooskõlastas 1986. aastal Saksamaa Liitvabariigi asutus Umweltbundesamt (2).

LÄHTEKAALUTLUSED

4. Log Pow väärtused vahemikus – 2 kuni 4 (vahel kuni 5 või rohkem) ( 15 ) saab eksperimentaalselt kindlaks teha loksutamismeetodil (käesoleva lisa peatükk A.8, OECD katsejuhend nr 107). HPLC-meetod võimaldab määrata log Pow väärtusi vahemikus 0–6 (1, 2, 3, 4, 5). Selle meetodi puhul võib olla vaja hinnata Pow väärtust, et valida sobivad võrdlusained ja toetada saadavate katsetulemuste põhjal tehtavaid järeldusi. Arvutusmeetodeid kirjeldatakse lühidalt selle katsemeetodi liites. Kasutatakse isokraatilist HPLC töörežiimi.

5. Pow väärtus sõltub keskkonnatingimustest, näiteks temperatuurist, pH-st, ioonsest jõust jne, ning need katsetingimused tuleks kindlaks määrata, et Pow andmeid oleks võimalik õigesti tõlgendada. Ioniseeritavate ainete puhul võib kasutusele tulla teinegi meetod (nt kavandatav OECD juhend pH mõõtmisel põhineva meetodi kohta ioniseeritud ainete jaoks (6)), mida saaks kasutada alternatiivmeetodina. Ehkki kõnealune kavandatav OECD juhend võib sobida selliste ioniseeritavate ainete Pow määramiseks, on mõnel juhul asjakohasem kasutada HPLC-meetodit, mille puhul lähtutakse keskkonnas esinevatest pH väärtustest (vt punkt 9).

MEETODI PÕHIMÕTE

6. Pöördfaasilise HPLC jaoks kasutatakse analüütilisi kolonne, mis on täidetud müügiloleva tahke täidisega, mis sisaldab ränidioksiidiga kovalentselt seotud pikki süsivesinikuahelaid (nt C8, C18).

7. Sellisesse kolonni süstitud kemikaal jaotub liikuvas faasis piki kolonni edasikandumisel liikuva lahustifaasi ja liikumatu süsivesinikufaasi vahel. Ainete jaotumine toimub proportsionaalselt nende jaotuskoefitsiendiga süsteemis süsivesinik/vesi ning sellest tulenevalt elueeritakse hüdrofiilsed ained esimesena ja lipofiilsed ained viimasena. Retentsiooniaega kirjeldab mahtuvustegur k, mis arvutatakse järgmise võrrandiga:

image

,

kus tR on uuritava aine retentsiooniaeg ja t0 on surnud aeg, st keskmine aeg, mille jooksul lahustimolekul läbib kolonni. Kvantitatiivsete analüüsimeetodite kasutamine ei ole vajalik, tuleb kindlaks teha üksnes retentsiooniaeg.

8. Uuritava aine jaotuskoefitsiendi arvutamiseks süsteemis oktanool/vesi määratakse katseliselt mahtuvustegur k ning sisestatakse see siis järgmisse võrrandisse:

image

,

kus

a ja b on lineaarse regressiooni kordajad.

Selle võrrandi lahendamiseks leitakse regressioonanalüüsi teel lineaarne seos süsteemis oktanool/vesi täheldatava võrdlusainete jaotuskoefitsiendi logaritmi ja nende võrdlusainete mahtuvusteguri logaritmi vahel.

9. Pöördfaasilisel HPLC-l põhinev meetod võimaldab määrata jaotuskoefitsiendi Pow logaritmitud väärtusi vahemikus 0–6, ent meetodi ulatust on erandjuhul võimalik laiendada kuni log Pow vahemikuni 6–10. Sel juhul võib olla vaja modifitseerida liikuvat faasi (3). Kõnealune meetod ei ole kasutatav tugevate hapete ja aluste, metallikomplekside, elueerimiseks kasutatava lahusega reageerivate ainete või pindaktiivsete ainete puhul. Ioniseeritavate ainete puhul saab mõõta nende ioniseerimata vormi (vaba hape või vaba alus) üksnes juhul, kui kasutatakse sobivat puhvrit, mille pH on väiksem kui vaba happe pKa või suurem kui vaba aluse pKa. Ioniseeritavate ainete analüüsimiseks võib kasutusele tulla ka pH mõõtmisel põhinev meetod (6), mida saaks kasutada alternatiivmeetodina (6). Kui log Pow väärtus määratakse keskkonnaohtlikkuse alusel klassifitseerimiseks või keskkonnaohu hindamiseks, tuleks katse teha pH väärtuste vahemikus, mis vastab looduskeskkonnas esinevatele pH väärtustele, st vahemikus 5,0–9,0.

10. Mõnel juhul võivad lisandid raskendada tulemuste tõlgendamist, kuna piike ei saa enam üheselt identifitseerida. Lahutamata jäänud piikidega segu puhul tuleks esitada log Pow ülem- ja alampiir ning igale log Pow väärtusele vastava piigi protsentuaalne pindala. Homoloogsete ainete rühmast koosneva segu puhul tuleks märkida ka kaalutud keskmine log Pow (7), mis on arvutatud iga üksiku Pow väärtuse ja sellele vastava piigi protsentuaalse pindala põhjal (8). Arvutustes tuleks arvesse võtta kõiki piike, mille pindala on vähemalt 5 % piikide kogupindalast (9):

image

.

Kaalutud keskmine log Pow kehtib üksnes homoloogidest (nt alkaanidest) koosneva aine või segu (nt tallõli) kohta. Segu mõõtmisel võib mõtestatud tulemusi saada juhul, kui kasutatava analüütilise detektori tundlikkus on kõikide segus sisalduvate ainete suhtes ühesugune ja neid aineid on võimalik üksteisest piisavalt lahutada.

TEAVE UURITAVA AINE KOHTA

11. Enne meetodi kasutamist peaks olema teada aine dissotsiatsioonikonstant, struktuurivalem ja lahustuvus liikuvas faasis. Peale selle oleks abiks teave aine hüdrolüüsi kohta.

KVALITEEDIKRITEERIUMID

12. Mõõtmistulemuste usaldusväärsuse suurendamiseks tuleb iga mõõtmist teha kaks korda.

 Korratavus: identsetes katsetingimustes ja sama võrdlusainete rühmaga tehtud korduvmõõtmistel saadud log Pow väärtused ei tohiks logaritmskaalal erineda rohkem kui ± 0,1 ühikut.

 Reprodutseeritavus: mõõtmiste kordamisel erineva võrdlusainete rühmaga võidakse saada erinevad tulemused. Tavaliselt on log k ja log Pow vahelist seost väljendava korrelatsioonikordaja R väärtus katses kasutatavate ainete rühma puhul umbes 0,9, mis vastab oktanool-vee jaotuskoefitsiendi log Pow varieeruvusele ± 0,5 logaritmilist ühikut.

13. Laboritevahelisest võrdlusuuringust on selgunud, et HPLC-meetodiga saadud log Pow väärtused erinevad loksutamismeetodiga saadud väärtustest kuni ± 0,5 ühikut (2). Kirjandusest võib leida ka muid võrdlusandmeid (4, 5, 10, 11, 12). Kõige täpsemad tulemused saadakse struktuurilt lähedastel võrdlusainetel põhinevate korrelatsioonigraafikute kasutamisel (13).

VÕRDLUSAINED

14. Aine mõõdetud mahtuvusteguri k korreleerimiseks aine Pow-ga tuleb koostada vähemalt kuuest punktist koosnev kaliibrimisgraafik (vt punkt 24). Katse tegija valib ise sobivad võrdlusained. Võrdlusainete log Pow väärtused peaksid üldjuhul moodustama vahemiku, mis hõlmab uuritava aine log Pow väärtust, st vähemalt ühe võrdlusaine Pow peaks olema suurem kui uuritaval ainel ja vähemalt ühe võrdlusaine Pow peaks olema uuritava aine omast väiksem. Ekstrapoleerimist tuleks kasutada ainult erandjuhul. Sellised võrdlusained peaksid eelistatult olema oma struktuurilt uuritava ainega sarnased. Kaliibrimiseks kasutatavad võrdlusainete log Pow väärtused peaksid põhinema usaldusväärsetel katseandmetel. Ainete puhul, mille log Pow väärtus on suur (tavaliselt üle 4), võib usaldusväärsete katseandmete puudumisel kasutada siiski ka arvutatud väärtusi. Ekstrapoleeritud väärtuste kasutamisel tuleks märkida ülempiir.

15. On olemas log Pow väärtuste ulatuslikud loetelud paljude kemikaalirühmade kohta (14, 15). Kui struktuurilt sarnaste ainete jaotuskoefitsiente käsitlevad andmed ei ole kättesaadavad, võib kasutada muudel võrdlusainetel põhinevat üldisemat kaliibrimist. Soovitatavad võrdlusained ja nende Pow väärtused on loetletud tabelis 1. Ioniseeritavate ainete kohta esitatud väärtused kehtivad ioniseerimata vormi puhul. Esitatud väärtuste usaldusväärsust ja kvaliteeti on kontrollitud laboritevahelise võrdlusuuringu käigus.



Tabel 1.

Soovitatavad võrdlusained.

 

CASi number

Võrdlusaine

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanoon

(metüületüülketoon)

0,3

 

2

1122-54-9

4-atsetüülpüridiin

0,5

 

3

62-53-3

Aniliin

0,9

 

4

103-84-4

Atseetaniliid

1,0

 

5

100-51-6

Bensüülalkohol

1,1

 

6

150-76-5

4-metoksüfenool

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Fenoksüäädikhape

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenool

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenool

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Bensonitriil

1,6

 

11

140-29-4

Fenüülatsetonitriil

1,6

 

12

589-18-4

4-metüülbensüülalkohol

1,6

 

13

98-86-2

Atsetofenoon

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenool

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-nitrobensoehape

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-kloroaniliin

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobenseen

1,9

 

18

104-54-1

Tsinnamüülalkohol

(kaneelalkohol)

1,9

 

19

65-85-0

Bensoehape

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-kresool

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Kaneelhape

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anisool

2,1

 

23

93-58-3

Metüülbensoaat

2,1

 

24

71-43-2

Benseen

2,1

 

25

99-04-7

3-metüülbensoehape

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-klorofenool

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Trikloroetüleen

2,4

 

28

1912-24-9

Atrasiin

2,6

 

29

93-89-0

Etüülbensoaat

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-diklorobensonitriil

2,6

 

31

535-80-8

3-klorobensoehape

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Tolueen

2,7

 

33

90-15-3

1-naftool

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dikloroaniliin

2,8

 

35

108-90-7

Klorobenseen

2,8

 

36

1746-13-0

Allüülfenüüleeter

2,9

 

37

108-86-1

Bromobenseen

3,0

 

38

100-41-4

Etüülbenseen

3,2

 

39

119-61-9

Bensofenoon

3,2

 

40

92-69-3

4-fenüülfenool

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Tümool

3,3

 

42

106-46-7

1,4-diklorobenseen

3,4

 

43

122-39-4

Difenüülamiin

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftaleen

3,6

 

45

93-99-2

Fenüülbensoaat

3,6

 

46

98-82-8

Isopropüülbenseen

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-triklorofenool

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenüül

4,0

 

49

120-51-4

Bensüülbensoaat

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sec-butüülfenool

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-triklorobenseen

4,2

 

52

143-07-7

Dodekaanhape

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenüüleeter

4,2

 

54

85-01-8

Fenantreen

4,5

 

55

104-51-8

n-butüülbenseen

4,6

 

56

103-29-7

Dibensüül

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenüülpüridiin

4,9

 

58

206-44-0

Fluoranteen

5,1

 

59

603-34-9

Trifenüülamiin

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

MEETODI KIRJELDUS

Jaotuskoefitsiendi esialgne hindamine

16. Vajaduse korral võib uuritava aine jaotuskoefitsienti hinnata, kasutades soovitatavalt kas arvutusmeetodit (vt liide) või kui see on asjakohane, siis suhtarvu, mis iseloomustab aine lahustuvust puhastes lahustites.

Seadmed

17. Läheb vaja vähepulseeriva pumba ja sobiva tuvastamissüsteemiga vedelikukromatograafi. Paljude keemiliste rühmade tuvastamiseks sobib UV-detektor, mis töötab lainepikkusel 210 nm, või murdumisnäitaja detektor. Polaarsete rühmade esinemine liikumatus faasis võib HPLC-kolonni efektiivsust oluliselt vähendada. Seepärast peaks polaarsete rühmade sisaldus liikumatus faasis olema võimalikult väike (16). Võib kasutada müügilolevaid pöördfaasilisi mikrograanultäidiseid või valmiskolonne. Sisestamissüsteemi ja analüütilise kolonni vahele võib paigaldada kaitsekolonni.

Liikuv faas

18. Elueerimislahuse valmistamiseks kasutatakse HPLC jaoks piisava puhtusega metanooli ja destilleeritud või deioniseeritud vett ning enne kasutamist lahus degaseeritakse. Tuleks kasutada isokraatilist elueerimist. Metanooli ja vee suhe peaks olema selline, et lahuse veesisaldus on vähemalt 25 %. Tavaliselt piisab ainete puhul, mille log P on 6, elueerimisest ühe tunni jooksul voolukiirusel 1 ml/min seguga, milles metanooli ja vee ruumalasuhe on 3:1. Ainete puhul, mille log P on üle 6, võib olla vaja uuritava aine ja võrdlusainete elueerimisaega lühendada; selleks vähendatakse liikuva faasi polaarsust või kolonni pikkust.

19. Uuritav aine ja võrdlusained peavad olema liikuvas faasis piisaval määral lahustuvad, et võimaldada nende tuvastamist. Lisaaineid võib metanooli ja vee segus kasutada üksnes erandjuhul, kuna need muudavad kolonni omadusi. Sellisel juhul tuleb kontrollida, et lisaaine ei mõjuta uuritava aine ja võrdlusainete retentsiooniaega. Metanooli ja vee segu sobimatuse korral võib kasutada muid orgaanilise lahusti ja vee segusid, nt etanooli ja vee, atsetonitriili ja vee või isopropüülalkoholi (2-propanooli) ja vee segu.

20. Ioniseeritavate ainete puhul on oluline eluendi pH. See peaks jääma kolonni töövahemikku, mis on tavaliselt 2–8. Soovitatav on kasutada puhverlahust. Tuleks ära hoida soolade väljasadenemist ja kolonni omaduste halvenemist, mis võib juhtuda mõne orgaanilise lahusti ja puhverlahuse segu puhul. Ränidioksiidil põhineva liikumatu faasi kasutamisel ei ole soovitatav teha HPLC-analüüsi pH väärtustel üle 8, kuna leeliseline liikuv faas võib kolonni omadusi järsult halvendada.

Lahustatavad ained

21. Uuritav aine ja võrdlusained peavad olema piisavalt puhtad, et võimaldada igale ainele vastava piigi tuvastamist kromatogrammil. Võimaluse korral lahustatakse uuritavad ja kaliibrimiseks kasutatavad ained liikuvas faasis. Kui uuritava aine ja võrdlusainete lahustamiseks kasutatakse liikuva faasi lahusest erinevat lahustit, tuleks enne ainete süstimist kasutada lõpplahjenduse tegemiseks liikuva faasi lahust.

Katsetingimused

22. Temperatuur ei tohiks mõõtmiste käigus kõikuda rohkem kui ± 1 °C.

Surnud aja t0 määramine

23. Surnud aja t0 mõõtmiseks võib kasutada kolonnis mittepeetuvaid orgaanilisi aineid (nt tiokarbamiid või formamiid). Täpsema surnud aja saamiseks võib määrata homoloogsete ainete (nt n-alküülmetüülketoonid) seeriasse kuuluva umbes seitsme aine retentsiooniaja (17). Koostatakse graafik retentsiooniaegade tR(nC + 1) ja tR(nC) vahelise sõltuvuse kohta; nC tähistab süsinikuaatomite arvu. Saadakse sirge tR(nC + 1) = A × tR(nC) + (1 – A) × t0, kus A väljendab suhet k(nC + 1)/k(nC) ja on konstantne. Surnud aeg t0 leitakse algordinaadi (1 – A) × t0 ja tõusu A väärtuste alusel.

Regressioonivõrrand

24. Järgmise sammuna koostatakse log k ja log P vahelist sõltuvust väljendav graafik sobivate võrdlusainete kohta, mille log P väärtused on sarnased uuritava aine eeldatava log P väärtusega. Praktikas süstitakse seadmesse üheaegselt kuus kuni kümme võrdlusainet. Määratakse retentsiooniajad, soovitatavalt meerikuga integraatori abil, mis on ühendatud tuvastamissüsteemiga. Vastavad mahtuvusteguri k logaritmitud väärtused esitatakse graafikul log P funktsioonina. Regressioonivõrrandit kontrollitakse korrapäraste ajavahemike järel, vähemalt kord päevas, et võtta arvesse võimalikke muutusi kolonni efektiivsuses.

UURITAVA AINE POW MÄÄRAMINE

25. Uuritav aine süstitakse seadmesse väikseimas tuvastatavas koguses. Retentsiooniaeg määratakse kahes korduses. Uuritava aine jaotuskoefitsient saadakse arvutatud mahtuvusteguri interpoleerimisel kaliibrimisgraafiku abil. Väga väikeste ja väga suurte jaotuskoefitsiendi väärtuste korral tuleb kasutada ekstrapoleerimist. Sel juhul tuleb pöörata erilist tähelepanu regressioonisirge usaldusvahemikule. Kui proovi retentsiooniaeg on võrdlusainete retentsiooniaegade vahemikust väljaspool, tuleks märkida asjaomane ülem- või alampiir.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Katseprotokoll

26. Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:

 esialgse hindamise kohane jaotuskoefitsiendi väärtus, kui see on määratud, ning kasutatud meetod; arvutusmeetodi kasutamisel selle täielik kirjeldus, sealhulgas andmed kasutatud andmebaasi kohta ja üksikasjalik teave fragmentide valimise kohta;

 uuritava aine ja võrdlusainete puhtus, struktuurivalem ja CASi number;

 seadmete ja katsetingimuste kirjeldus: analüütiline kolonn, kaitsekolonn,

 liikuv faas, määramismeetod, temperatuurivahemik, pH;

 elueerimisprofiilid (kromatogrammid);

 surnud aeg ja selle määramise meetod;

 kaliibrimisel kasutatud võrdlusainete retentsiooniandmed ja nende log Pow väärtused kirjanduse andmeil;

 andmed sobitatud regressioonisirge (log k versus log Pow) ja vastava korrelatsioonikordaja kohta, sealhulgas usaldusvahemik;

 uuritava aine keskmine retentsiooniaeg ja interpoleeritud log Pow väärtus;

 segu puhul elueerimisprofiili kromatogramm, kus on märgitud piikide piirid;

 log Pow väärtused võrrelduna neile vastavate piikide protsentuaalse pindalaga;

 regressioonisirge põhjal tehtud arvutused;

 vajaduse korral arvutatud kaalutud keskmine log Pow väärtus.

KIRJANDUS

(1) Eadsforth, C. V., ja Moser, P. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere 12: 1459.

(2) Klein, W. Kördel, W., Weiss, M., ja Poremski, H. J. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere 17: 361.

(3) Eadsforth, C. V. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pestic. Sci. 17: 311.

(4) Ellgehausen, H., D'Hondt, C., ja Fuerer, R. (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pestic. Sci. 12: 219.

(5) McDuffie, B. (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere 10: 73.

(6) OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Juhendi kavand, november 2000.

(7) OSPAR (1995). „Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995”, 10. lisa. Merereostuse ärahoidmise Oslo ja Pariisi konventsioonide programmide ja meetmete komitee, Oviedo, 20.–24. veebruar 1995.

(8) Thatcher, M., Robinson, M., Henriquez, L. R., ja Karman, C. C. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Versioon 1.0, 3. august.

(9) Vik, E. A., Bakke, S., ja Bansal, K. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environ. Model. Software 13: 529–537.

(10) Renberg, L. O., Sundstroem, S. G., ja Sundh-Nygård, K. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere 9: 683.

(11) Hammers, W. E., Meurs, G. J., ja De-Ligny, C. L. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chrom. 247: 1.

(12) Haky, J. E., ja Young, A. M. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromat. 7: 675.

(13) Fujisawa, S., ja Masuhara, E. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. J. Biomed. Mater. Res. 15: 787.

(14) Hansch, C., ja Leo, A. J. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York.

(15) Hansch, C., esimees; Leo, A. J., dir. (1982). „Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity” – kättesaadav järgmisel aadressil: Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16) Rekker, R. F., ja de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14: 479.

(17) Berendsen, G. E., Schoenmakers, P. J., de Galan, L., Vigh, G., Varga-Puchony, Z., ja Inczédy J. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromat. 3: 1669.

Liide

POW arvutamise meetodid

SISSEJUHATUS

1. Käesolevas liites tutvustatakse lühidalt Pow arvutamist. Lisateave on kättesaadav käsiraamatutes (1, 2).

2. Pow arvutatud väärtusi kasutatakse:

 katsemeetodi valimiseks: log Pow väärtuste vahemiku –2 kuni 4 puhul loksutamismeetod ja log Pow väärtuste vahemiku 0–6 puhul HPLC-meetod;

 HPLC kasutustingimuste (võrdlusained, metanooli ja vee suhe) valimiseks;

 katseliselt saadud väärtuste usaldusväärsuse kontrollimiseks;

 hinnangulise väärtusena, kui katsemeetodeid ei saa kasutada.

Arvutusmeetodite põhimõte

3. Allpool kirjeldatud arvutusmeetodid põhinevad molekuli teoreetilisel jagamisel sobivateks alaosadeks, mille kohta on teada usaldusväärsed log Pow osaväärtused. Log Pow saamiseks liidetakse alaosade log Pow osaväärtused ja molekulisiseseid vastasmõjusid arvestavad parandustegurid. Alaosade konstandid ja parandustegurid on loetletud mitmes allikas (1, 2, 3, 4, 5, 6). Mõnda allikat ajakohastatakse korrapäraselt (3).

Arvutatud väärtuste usaldusväärsus

4. Üldjuhul on arvutusmeetodite usaldusväärsus seda väiksem, mida keerukam on uuritav aine. Väikese molekulmassiga lihtsate, ühe või kahe funktsionaalrühmaga molekulide puhul on eeldatav vahe erinevate osadeks jagamise meetodite abil leitud ja mõõdetud log Pow väärtuste vahel 0,1–0,3 ühikut. Veamäär sõltub kasutatud alaosade konstantide usaldusväärsusest, oskusest võtta arvesse molekulisiseseid vastasmõjusid (nt vesiniksidemed) ja parandustegurite õigest kasutamisest. Ioniseeruvate ainete puhul tuleb arvesse võtta laengut ja ioniseerituse ulatust (10).

Fujita-Hanschi π-meetod

5. Hüdrofoobse asendaja konstant π, mille algselt võtsid kasutusele Fujita et al. (7), on määratletud järgmiselt:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH),

kus PhX aromaatne derivaat on ja PhH on lähteaine.



Nt:

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

π-meetodit kasutatakse eelkõige aromaatsete ainete puhul. π väärtused on kättesaadavad paljude asendajate kohta (4, 5).

Rekkeri meetod

6. Rekkeri meetodi (8) kohaselt arvutatakse log Pow väärtus järgmiselt:

image

,

kus ai on arv, mis näitab, mitu korda konkreetne alaosa molekulis esineb, ja fi on selle alaosa log Pow osaväärtus. Vastasmõjutegurid on summaarselt väljendatavad konstandi Cm (nn maagiline konstant) kordsena. Alaosade konstandid fi ja konstant Cm on määratud 825 aine 1 054 katseliselt saadud Pow väärtuse põhjal, kasutades mitme muutujaga regressioonanalüüsi (6, 8). Vastasmõjutegurite määramine toimub kindlate eeskirjade kohaselt (6, 8, 9).

Hanschi-Leo meetod

7. Hanschi-Leo meetodi (4) kohaselt arvutatakse log Pow väärtus järgmiselt:

image

,

kus fi on alaosa konstant, Fj on parandustegur ning ai ja bj on vastavad esinemissagedused. Aatomite ja funktsionaalrühmade konstantide ja parandustegurite Fj loetelud on koostatud katse-eksituse meetodil katseliselt saadud Pow väärtuste alusel. Parandustegurid on jagatud mitmesse eri klassi (1, 4). Kõikide eeskirjade ja parandustegurite arvessevõtmiseks on välja töötatud tarkvarapaketid (3).

KOMBINEERITUD MEETOD

8. Keerukate molekulide log Pow arvutamise täpsust on võimalik oluliselt suurendada, kui molekul jagatakse suuremateks alaosadeks, mille kohta on olemas tabelites esitatud (3, 4) või mõõtmiste teel saadud usaldusväärsed log Pow väärtused. Selliste alaosade (nt heterotsüklid, antrakinoon, asobenseen) osaväärtused saab seejärel kombineerida Hanschi π väärtustega või Rekkeri või Leo meetodi puhul kasutatavate alaosa konstantidega.

Märkused

i) Need arvutusmeetodid on osaliselt või täielikult ioniseeritud ainete puhul kasutatavad üksnes juhul, kui võetakse arvesse vajalikke parandustegureid.

ii) Kui võib eeldada molekulisiseste vesiniksidemete olemasolu, tuleb lisada vastavad parandustegurid (umbes + 0,6 kuni + 1,0 log Pow ühikut) (1). Viiteid selliste sidemete olemasolule saab stereomudelitest ja spektroskoopiaandmetest.

iii) Mitme tautomeerse vormi võimaliku esinemise korral lähtutakse arvutustes kõige tõenäolisemast vormist.

iv) Tuleks hoolikalt jälgida alaosade konstantide loeteludes tehtavaid muudatusi.

ARVUTUSMEETODEID KÄSITLEV KIRJANDUS

(1) Lyman, W. J., Reehl, W. F., ja Rosenblatt, D. H. (toim.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. McGraw-Hill, New York (1982).

(2) Lyman, W. J., Block, J. H., ja Pearlman, R. S. (toim.). Partition Coefficient, Determination and Estimation. Pergamon Press, Elmsford (New York) ja Oxford (1986).

(3) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA. Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4) Hansch, C., ja Leo, A. J. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York (1979).

(5) Leo, A., Hansch, C., ja Elkins, D. (1971). Partition coefficients and their uses. Chem. Rev. 71: 525.

(6) Rekker, R. F., ja de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14: 479.

(7) Fujita, T., Iwasa, J., ja Hansch, C. (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients J. Amer. Chem. Soc. 86: 5175.

(8) Rekker, R. F. The Hydrophobic Fragmental Constant. Pharmacochemistry Library, 1. köide, Elsevier, New York (1977).

(9) Eadsforth, C. V., ja Moser, P. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere 12: 1459.

(10) Scherrer, R. A. ACS – Symposium Series 255, lk 225. American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

▼M7

A.25.   DISSOTSIATSIOONIKONSTANDID VEES (TIITRIMISMEETOD, SPEKTROFOTOMEETRILINE MEETOD, KONDUKTOMEETRILINE MEETOD)

SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 112 (1981).

Eeltingimused

 Sobiv analüüsimeetod

 Lahustuvus vees

Juhendteave

 Struktuurivalem

 Konduktomeetrilise meetodi puhul elektrijuhtivus

Erinõuded

 Kõigi katsemeetodite puhul tuleb kasutada puhtaid või kaubandusliku puhtusklassiga aineid. Tuleb kaaluda, millist mõju võivad tulemustele avaldada lisandid.

 Tiitrimismeetod ei sobi vähelahustuva uuritava aine puhul (vt allpool, katselahused).

 Spektrofotomeetriline meetod on kohaldatav ainult juhul, kui aine dissotsieerunud ja dissotsieerumata vormi UV või nähtava valguse neeldumisspektrid on oluliselt erinevad. See meetod võib samuti sobida vähese lahustuvusega ainete ja muu kui happe-aluse dissotsiatsiooni, st kompleksimoodustumise puhul.

 Kui Onsageri võrrand kehtib, võib konduktomeetrilist meetodit kasutada isegi mõõdukalt väikse kontsentratsioon ja isegi muu kui happe-aluse tasakaalu puhul.

Alusdokumendid

Käesolev katsemeetod põhineb meetoditel, mis on esitatud osas „Kirjandus“ loetletud dokumentides, samuti 18. augusti 1978. a EPA tootmiseelse teatise suuniste esialgsel kavandil (Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA).

MEETOD: SISSEJUHATUS, EESMÄRK, KASUTUSALA, ASJAKOHASUS, KASUTAMINE JA KATSEMEETODI PIIRANGUD

Aine keskkonnamõju hindamisel on oluline teada tema dissotsieerumist vees. Dissotsieerumisest oleneb, millisel kujul aine esineb; see omakorda määrab aine käitumise ja edasikandumise. See võib mõjutada kemikaali adsorptsiooni pinnasel ja setetes, samuti neeldumist rakkudes.

Mõisted ja mõõtühikud

Dissotsieerumine on pöörduv jagunemine kaheks või enamaks keemiliseks üksuseks, mis võivad olla ioonsed. Seda protsessi kirjeldatakse üldiselt võrrandiga

RXR ++ X

ning kontsentratsioonide kaudu väljendatud reaktsiooni tasakaaluolekut kirjeldab tasakaalukonstant

image

Näiteks erijuhul, kui R on vesinik (aine on hape), kirjeldab konstanti võrrand

image

või

image

Võrdlusained

Järgmisi võrdlusaineid ei ole uue aine uurimisel alati vaja kasutada. Need on esitatud peamiselt selleks, et kaliibrida aeg-ajalt meetodit ja võimaldada tulemuste võrdlemist muu meetodi abil saadud tulemusega.



 

pKa (1)

Temperatuur, °C

p-nitrofenool

7,15

25 (1)

Bensoehape

4,12

20

p-kloroaniliin

3,93

20

(1)   Väärtus 20 °C juures ei ole teada, kuid võib eeldada, et mõõtmistulemuste varieeruvus on suurem kui eeldatav temperatuurisõltuvus.

Kasulik oleks kasutada ainet, millel on mitu pK-d, nagu on näidatud allpool meetodi põhimõtte selgitamisel. Selline aine saaks olla:



sidrunhape

pKa (8)

Temperatuur, °C

 

1) 3,14

20

 

2) 4,77

20

 

3) 6,39

20

Katsemeetodi põhimõte

Kirjeldatav keemiline protsess sõltub keskkonnatemperatuurile vastavas vahemikus üldiselt vaid vähe temperatuurist. Dissotsiatsioonikonstandi määramiseks on vaja mõõta kemikaali dissotsieerunud ja dissotsieerumata vormi kontsentratsioonid. Teades eespool mõistete ja mõõtühikute osas kirjeldatud stöhhiomeetriat, saab määrata asjakohase konstandi. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud erijuhtumi korral käitub aine happe või alusena ja määramist on kõige parem teha aine ioniseeritud ja ioniseerimata vormi suhteliste kontsentratsioonide ja lahuse pH määramisega. Nende terminite vaheline seos on esitatud pKa valemiga, vt eespool osa „Mõisted ja mõõtühikud“. Mõnel ainel on rohkem kui üks dissotsiatsioonikonstant ja nende jaoks saab tuletada sarnased valemid. Mõned kirjeldatud meetoditest sobivad kasutamiseks ka muu kui happe-aluse dissotsiatsiooni puhul.

Kvaliteedinõuded

Korduvus

Dissotsiatsioonikonstandi väärtused (vähemalt kolmest paralleelmääramisest) peavad olema vahemikus ± 0,1 logaritmilist ühikut.

KATSEMEETODI KIRJELDUS

pKa määramisele on kaks peamist lähenemisviisi. Ühe meetodi puhul tiitritakse aine teadaolevat kogust vastavalt vajadusele happe või aluse standardlahusega; teise meetodi puhul määratakse ioniseeritud ja ioniseerimata vormide suhteline kontsentratsioon ja selle pH-sõltuvus.

Ettevalmistused

Neile põhimõtetele tuginevad meetodid võib jaotada tiitrimiseks, spektrofotomeetriliseks ja konduktomeetriliseks määramiseks.

Katselahused

Tiitrimismeetodi ja konduktomeetrilise meetodi kasutamiseks tuleb kemikaal lahustada destilleeritud vees. Spektrofotomeetrilise meetodi ja muude meetodite puhul kasutatakse puhverlahuseid. Uuritava aine kontsentratsioon ei tohi ületada väiksemat järgmistest – 0,01 M või pool küllastuskontsentratsiooni – ning lahuste valmistamiseks tuleks kasutada aine kõige puhtamat kättesaadavat vormi. Kui aine on vees halvasti lahustuv, võib selle lahustada väheses koguses veega segunevas lahustis enne eespool osutatud kontsentratsioonide saavutamiseks vajaliku koguse lisamist.

Lahuseid tuleb kontrollida emulsiooni esinemise suhtes; selleks kasutatakse Tyndalli efekti; see on eriti oluline siis, kui lahustuvuse suurendamiseks lisati kaaslahustit. Puhverlahuse kasutamise korral ei tohi puhvri kontsentratsioon ületada 0,05 M.

Katsetingimused

Temperatuur

Temperatuuri tuleb reguleerida täpsusega vähemalt ± 1 °C. Mõõtmised tuleks eelistatult teha 20 °C juures.

Kui kahtlustatakse tugevat sõltuvust temperatuurist, tuleb määramised teha veel vähemalt kahel temperatuuril. Sellisel juhul peaksid temperatuuri intervallid olema 10 °C ja temperatuuri reguleerimise täpsus ± 0,1 °C.

Analüüsid

Meetodi valimine sõltub uuritava aine omadustest. Meetod peab olema piisavalt tundlik, et võimaldada aine eri vormide määramist igal uuritava lahuse kontsentratsioonil.

Katse käik

Tiitrimismeetod

Uuritavat lahust tiitritakse, vastavalt vajadusele kas aluse või happe standardlahusega, ning pH määratakse pärast iga titrandikoguse lisamist. Enne ekvivalentsuspunkti saavutamist tuleb lisada vähemalt 10 titrandikogust. Kui tasakaal saavutatakse piisavalt kiiresti, võib kasutada registreerivat potentsiomeetrit. Selle meetodi puhul peavad nii aine üldkogus kui ka kontsentratsioon olema täpselt teada. Tuleb kasutada ettevaatusabinõusid, et välistada süsinikdioksiidi juurdepääs. Katse läbiviimise üksikasjad, ettevaatusabinõud ja arvutused on esitatud standardkatsete kirjeldustes (vt näiteks viited 1–4).

Spektrofotomeetriline meetod

Määratakse lainepikkus, mille juures ioniseeritud ja ioniseerimata vormi ekstinktsioonikoefitsiendid on märgatavalt erinevad. Määratakse muutumatu kontsentratsiooniga lahuste UV- või nähtava valguse neeldumisspekter pH eri väärtustel, millel aine on peamiselt ioniseerimata, on täielikult ioniseeritud, ning veel mitmel vahepealsel pH väärtusel. Seda võib teha kas kontsentreeritud happe (aluse) väikeste ruumalaliste koguste lisamisega uuritava aine lahuse suhteliselt suurele ruumalalisele kogusele paljukomponendilises puhvris, mis on algul väikese (suure) pH-ga (viide 5), või uuritava aine põhilahuse (nt vees, metanoolis) võrdses ruumalas lisamisega muutumatu ruumalaga eri puhverlahustele, mille pH väärtused katavad kogu soovitud pH-vahemiku. pH väärtustest ja neeldumise väärtustest valitud lainepikkusel arvutatakse piisav arv pKa väärtusi, kasutades andmeid, mis on saadud vähemalt viiel pH väärtusel, millel aine on vähemalt 10 % ja vähem kui 90 % ioniseeritud. Katse täiendavad üksikasjad ja arvutamismeetod on esitatud viites 1.

Konduktomeetriline meetod

Kasutades väikese ja teadaoleva konstandiga juhtivusandurit, mõõdetakse konduktomeetriaks sobivas vees lahustatud uuritava aine ligikaudu 0,1 M lahuse juhtivus. Mõõdetakse ka rea sellest lahusest täpselt valmistatud lahjenduste juhtivuse väärtused. Iga lahjendusega vähendatakse kontsentratsiooni poole võrra ja seeria peaks hõlmama vähemalt üht kontsentratsiooni suurusjärku. Määratakse ka juhtivuse piirväärtus lõpmatul lahjendusel; selleks tehakse samasugune katse naatriumisoolaga ja ekstrapoleeritakse. Seejärel võib iga lahuse juhtivusest arvutada Onsageri võrrandi abil dissotsiatsiooniastme ja selle alusel arvutada Ostwaldi lahjendusseaduse abil dissotsiatsioonikonstandi K = α2C/(1 – α), kus C on molaarne kontsentratsioon (mol/l) ja α on aine dissotsieerunud fraktsioon. Tuleb kasutada ettevaatusabinõusid, et välistada CO2 juurdepääs. Täiendavad katse üksikasjad ja arvutamismeetod on esitatud alustekstides ning viidetes 1, 6 ja 7.

ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE

Tulemuste töötlemine

Tiitrimismeetod

pKa arvutatakse tiitrimiskõvera 10 mõõdetud punkti järgi. Arvutatakse selliste pKa-de keskväärtus ja standardhälve. Andmed esitatakse tabelina ja koostatakse graafik pH sõltuvuse kohta aluse või happe standardlahuse lisatud ruumalast.

Spektrofotomeetrilised meetodid

Iga spektri kohta esitatakse tabelis neelduvus ja pH. Arvutatakse vähemalt viis väärtust pKa jaoks vahepealsetest spektriandmepunktidest; nendest väärtustest arvutatakse veel keskväärtus ja standardhälve.

Konduktomeetriline meetod

Arvutatakse ekvivalentjuhtivus Λ happe iga kontsentratsiooni jaoks ja sellise segu iga kontsentratsiooni jaoks, mille saamiseks segatakse üks ekvivalent hapet ja 0,98 ekvivalenti karbonaadivaba naatriumhüdroksiidi. Hape on liias, et vältida hüdrolüüsi tõttu tekkivat OH liiga. Tehakse graafik teljestikus 1/Λ ja Ö_C ning soola Λo saab sellest leida ekstrapoleerimisega kontsentratsioonile 0.

Happe Λo saab arvutada kirjanduses esitatud H+ and Na+ väärtustest. pKa saab arvutada tulemustest α = Λio ja iga kontsentratsiooni Ka = α2C/(1 – α). Ka täpsemad väärtused saadakse siis, kui viiakse sisse ka liikuvust ja aktiivsust arvestavad parandid. Tuleb arvutada ka pKa väärtuste keskväärtus ja standardhälve.

Katseprotokoll

Kõik saadud töötlemata andmed ja arvutatud pKa väärtused tuleb esitada koos arvutamismeetodiga eelistatult tabelina, nagu on soovitatud viites 1, samuti tuleb esitada eespool kirjeldatud statistilised parameetrid. Tiitrimismeetodite puhul tuleb esitada titrantide standardimise üksikasjad.

Spektrofotomeetrilise meetodi puhul tuleb esitada kõik spektrid. Konduktomeetrilise meetodi puhul tuleb esitada konduktomeetri konstandi määramise üksikasjalik kirjeldus. Esitada tuleb ka kasutatud meetodit, analüüsimeetodeid ja kõiki kasutatud puhvreid käsitlev teave.

Tuleb esitada katse temperatuur(id).

KIRJANDUS

(1) Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.

(2) Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).

(3) ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(4) Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.

(5) Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).

(6) ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(7) Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (vt eespool (4)).

(8)  Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).

▼B




B OSA: MÜRGISUSE JA MUUDE TERVISEMÕJUDE MÄÄRAMISE MEETODID

SISUKORD

ÜLDINE SISSEJUHATUS

B.1a.

ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE PROTSEDUUR

B.1b.

ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISUSASTME MEETOD

B.2.

ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL

B.3.

ÄGE MÜRGISUS (NAHAKAUDNE)

B.4.

ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS

B.5.

SILMADE ÄGE ÄRRITUS/SÖÖVITUS

B.6.

NAHA SENSIBILISEERIMINE

B.7.

SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 28-PÄEVANE UURING NÄRILISTEL

B.8.

SUBAKUUTNE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL: 28-PÄEVANE UURING

B.9.

KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, NAHAKAUDNE)

B.10.

IN VITRO KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE IMETAJARAKKUDEGA

B.11.

KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE IMETAJATE LUUÜDIGA

B.12.

MIKROTUUMADE TEKKE KATSE IMETAJATE ERÜTROTSÜÜTIDEGA

B.13/14.

MUTAGEENSUS – BAKTERITE PÖÖRDMUTATSIOONKATSE

B.17.

MUTAGEENSUS – IN VITRO IMETAJATE RAKKUDE GEENMUTATSIOONKATSE

B.21.

IMETAJARAKU TRANSFORMATSIOONITESTID IN VITRO

B.22.

NÄRILISTE DOMINANTSE LETAALSUSE TEST

B.23.

IMETAJATE SPERMATOGOONIDE KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE

B.25.

HIIRE PÄRILIK TRANSLOKATSIOON

B.26.

SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE UURING NÄRILISTEL

B.27.

SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE UURING MITTENÄRILISTEL

B.28.

SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST NAHAKAUDSEL MANUSTAMISEL 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE NAHAKAUDSE MANUSTAMISE UURING NÄRILISTE LIIKIDEL

B.29.

SUBKROONILINE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL: 90-PÄEVANE UURING

B.30.

KROONILISE MÜRGISUSE UURINGUD

B.31.

SÜNNIEELSE ARENGU MÜRGISUSE UURIMUS

B.32.

KANTSEROGEENSUSE UURINGUD

B.33.

KOMBINEERITUD KROONILISE TOKSILISUSE – KANTSEROGEENSUSE UURING

B.34.

ÜHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONITOKSILISUSE UURING

B.35.

KAHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONI TOKSILISUSE UURING

B.36.

TOKSIKOKINEETIKA

B.37.

FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUS PÄRAST ÄGEDAT KOKKUPUUTUMIST

B.38.

FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUSE 28PÄEVANE KORDUSDOOSI UURING

B.39.

PLAANIVÄLISE DNA SÜNTEESI (UDS) KATSE IMETAJATE MAKSARAKKUDEGA IN VIVO

B.40.

NAHASÖÖVITUSKATSE IN VITR0: TRANSKUTAANSE ELEKTRITAKISTUSE (TER) MÕÕTMINE

B.40a.

NAHASÖÖVITUS IN VITRO: KATSE INIMNAHA MUDELIGA

B.41.

IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOKSILISUSE KATSE

B.42.

NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕLMEDE KATSE

B.43.

NEUROTOKSILISUSE UURING NÄRILISTEL

B.44.

NAHAKAUDNE IMENDUMINE: IN VIVO MEETOD

B.45.

NAHAKAUDNE IMENDUMINE: IN VITRO MEETOD

B.46.

IN VITRO NAHAÄRRITUSKATSE: REKONSTRUEERITUD INIMEPIDERMISE MUDELI KATSEMEETOD

B.47.

VEISE SARVKESTA HÄGUSUSE JA LÄBILASKVUSE KATSEMEETOD SELLISTE KEMIKAALIDE KINDLAKSTEGEMISEKS, I) MIS TEKITAVAD RASKEID SILMAKAHJUSTUSI, JA II) MIDA EI OLE VAJA KLASSIFITSEERIDA SEOSES SILMADE ÄRRITUSE VÕI RASKE SILMAKAHJUSTUSEGA

B.48.

ISOLEERITUD KANASILMA KATSEMEETOD SELLISTE KEMIKAALIDE KINDLAKSTEGEMISEKS, I) MIS TEKITAVAD RASKEID SILMAKAHJUSTUSI, JA II) MIDA EI OLE VAJA KLASSIFITSEERIDA SEOSES SILMADE ÄRRITUSE VÕI RASKE SILMAKAHJUSTUSEGA

B.49.

MIKROTUUMADE TEKKE IN VITRO KATSE IMETAJARAKKUDEGA

B.50.

NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕLMEDE KATSE: DA

B.51.

NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕLMEDE KATSE: BRDU-ELISA

B.52.

ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL – ÄGEDA MÜRGISUSE KLASSI MÄÄRAMISE MEETOD

B.53.

ARENGUHÄIREID PÕHJUSTAVA NEUROTOKSILISUSE UURING

B.54.

UTEROTROOFNE BIOKATSE NÄRILISTEL: KIIRE SÕELKATSE ÖSTROGEENSETE OMADUSTE VÄLJASELGITAMISEKS

B.55.

HERSHBERGERI BIOKATSE ROTTIDEL: KIIRE SÕELKATSE (ANTI)ANDROGEENSETE OMADUSTE VÄLJASELGITAMISEKS

B.56.

LAIENDATUD ÜHE PÕLVKONNA REPRODUKTIIVTOKSILISUSE UURING

B.57.

H295R STEROIDOGENEESI KATSE

B.58.

TRANSGEENSE NÄRILISE SOMAATILISTE JA SUGURAKKUDE GEENIDE MUTATSIOONI KATSE

B.59.

NAHA SENSIBILISEERIMINE IN CHEMICO: OTSENE REAKTSIOONIVÕIME KATSE PEPTIIDIDEGA (DIRECT PEPTIDE REACTIVITY ASSAY, DPRA)

B.60.

NAHA SENSIBILISEERIMINE IN VITRO: ARE-NRF2 LUTSIFERAASI KATSEMEETOD

B.61.

FLUORESTSEIINI LEKKE KATSEMEETOD SILMI SÖÖVITAVATE JA TUGEVALT ÄRRITAVATE KEMIKAALIDE TUVASTAMISEKS

B.62.

LEELISELINE IN VIVO KOMEEDIKATSE IMETAJARAKKUDEGA

ÜLDINE SISSEJUHATUS

A.   UURITAVA AINE ISELOOMUSTUS

Uuritava aine koostis, sealhulgas peamised lisandid ja selle vastavad füüsikalis-keemilised omadused (sealhulgas stabiilsus), peaksid olema teada enne toksilisuse uuringu alustamist.

Uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused annavad olulist teavet manustamisviisi valimise, iga konkreetse uuringu kavandamise ning uuritava aine käitlemise ja säilitamise jaoks.

Doseeritavas aines ja bioloogilises materjalis oleva uuritava aine (sealhulgas võimaluse korral peamiste lisandite) kindlakstegemiseks kasutatav kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüsimeetod tuleks välja töötada enne uuringu alustamist.

Katsearuanne peaks hõlmama kogu teavet uuritava aine identifitseerimise, selle füüsikalis-keemiliste omaduste, selle puhtuse ja käitumise kohta.

B.   LOOMADE HOOLDAMINE

Toksilisuse uurimisel on oluline keskkonnatingimuste range kontroll ja õiged loomade hooldamise viisid.

i)   Pidamistingimused

Katsealuste loomade ruumide või piirdeaedade keskkonnatingimused peaksid olema katseliikide jaoks sobivad. Rottide, hiirte ja merisigade puhul on sobiv toatemperatuur 22 ± 3 oC ning suhteline õhuniiskus peaks olema 30–70 %; küülikute puhul peaks temperatuur olema 20 ± 3 oC ning suhteline õhuniiskus 30–70 %.

Mõned uurimismeetodid on temperatuuri suhtes eriti tundlikud ning sellistel puhkudel on sobivate temperatuuritingimuste üksikasjad lisatud uurimismeetodi kirjeldusse. Kõikide toksilise toime uuringute puhul tuleks jälgida temperatuuri ja niiskust, samuti tuleks need andmed registreerida ning uuringu lõpparuandesse lisada.

Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valget ja 12 tundi pimedat aega. Valgustustsükli üksikasjad tuleks registreerida ja märkida uuringu lõpparuandesse.

Kui meetodis ei ole teisiti sätestatud, võib loomi pidada üksikult või väikeste rühmadena, kus emas- ja isasloomad on eraldi; kui puuris on mitu looma, ei tohiks koos olla rohkem kui viis looma.

Loomkatsete aruannetes on oluline ära märkida, millist tüüpi puure kasutati ning mitu looma igas puuris nii keemilise ainega kokkupuutumise kui ka järgneva vaatlusperioodi jooksul oli.

ii)   Söötmistingimused

Toiduvalik peaks vastama kõikidele katses kasutatava liigi toitainevajadustele. Kui uuritavat ainet manustatakse loomadele toidu kaudu, võib toidu toiteväärtust vähendada vastava uuritava aine ja toidukomponendi võrra. Sellise reaktsiooni võimalikkust tuleks katse tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta. Kasutada võib ka tavapärast katseloomadele mõeldud toitu ning joogivee hulk peab olema piiramatu. Toidu valikut võib mõjutada vajadus tagada sobiv segu, mis võimaldab uuritava aine manustamist koos toiduga.

Toksilisust mõjutavaid toidu saasteaineid ei tohiks olla sellises kontsentratsioonis, et see segaks katse tegemist.

C.   ALTERNATIIVSED KATSED

Euroopa Liit püüab edendada alternatiivmeetodite väljatöötamist ja kinnitamist, mis annaksid loomkatsetest saadud teabega tasemelt samaväärset teavet, kuid kus kasutataks vähem loomi ja mis põhjustaksid vähem kannatusi või milles välditakse üldse loomade kasutamist.

Selliste meetodite olemasolu korral tuleb neid kasutada igal võimalusel ohu kirjeldamisel ja seejärel loomuomase ohtlikkuse liigitamisel ja märgistamisel.

D.   HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE

Katsete hindamisel ja tõlgendamisel tuleb arvesse võtta seda, millisel määral on loomkatsete ja in vitro uuringute tulemusi võimalik ekstrapoleerida vahetult inimesele, ning seetõttu võib võimaluse korral kasutada katse tulemuste kinnitamiseks tõendeid kahjulikust toimest inimese tervisele.

E.   VIITED KIRJANDUSELE

Enamik nendest meetoditest on töötatud välja OECD programmi „Testing Guidelines” raames ning neid tuleks kasutada kooskõlas heade laboritavadega, et tagada võimalikult laialdane „andmete vastastikune heakskiitmine”.

Lisateavet võib leida OECD suunistes olevatest viidetest ja muust asjakohasest kirjandusest.

B.1a.   ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE PROTSEDUUR

1.   MEETOD

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 420ga (2001).

1.1.   SISSEJUHATUS

Traditsioonilised ägeda mürgisuse hindamise meetodid kasutavad loomade surma lõpetamiskriteeriumina. 1984. aastal soovitas British Toxicology Society uut lähenemist ägeda mürgisuse katsetamisele, mis põhineb aine manustamisel kindla annusemääraga seeriana (1). See lähenemine vältis loomade surma kasutamist lõpetamiskriteeriumina ja tugines selle asemel selgete mürgisuse nähtude vaatlemisele ühel seeriast valitud kindlal annusemääral. Protseduur kiideti katsemeetodina heaks 1992. aastal Ühendkuningriigi (2) ja rahvusvaheliste (3) in vivo valideerimiste põhjal. Seejärel hinnati kindla annuse protseduuri statistilisi omadusi matemaatiliste mudelite abil mitmetes uuringutes (4, 5, 6). In vivo ja mudeluuringud on tõestanud, et protseduur on korratav, et selles kasutatakse vähe loomi ja et see põhjustab vähem kannatusi kui traditsioonilised meetodid ning et selle abil saab klassifitseerida ained nii nagu muude ägeda mürgisuse katsemeetoditega.

Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katsete juhisdokumendist („Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing” (7)). Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti lisateavet katsemeetodi B.1a kasutamise ja tõlgendamise kohta.

Meetodi põhimõte on, et põhiuuringus kasutatakse üksnes mõõdukalt mürgiseid annuseid ja et tõenäoliselt surmavate annuste manustamist tuleks vältida. Samuti ei tohiks manustada annuseid, mis teatavasti põhjustavad märkimisväärset valu või kannatusi sööbivate või tõsiselt ärritavate mõjude tõttu. Suremas loomad või loomad, kes ilmselt on valus või kellel on tugeva ja kestva kannatuse tunnused, surmatakse humaanselt ning need võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu loomi, kes surid katse käigus. Eraldi juhisdokumendis (8) on esitatud kriteeriumid, mille põhjal tehakse otsus suremas või raskelt kannatavate loomade surmamiseks, ja juhised prognoositava või ähvardava surma kindlakstegemiseks.

Meetod annab teavet ohtlike omaduste kohta ning võimaldab reastada ja klassifitseerida ainet ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimiseks vastavalt globaalselt harmoneeritud süsteemile (Globally Harmonised System – GHS (9)).

Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri, selle füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi, struktuurilt samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat lähteannust.

1.2.   MÕISTED

Äge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.

Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14päevase jälgimisperioodi jooksul.

Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).

Ilmne mürgisus – üldine mõiste, mis kirjeldab katseaine manustamise järel ilmnenud selgeid mürgisuse tunnuseid (vt näiteid viitest 3). Suuruselt järgmine kindel annus võib põhjustada enamikul loomadest tõenäoliselt kas tugevat valu ja kestva tugeva kannatuse tunnuseid, surmaeelset seisundit (kriteeriumid on toodud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)) või tõenäoliselt surma.

GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC).

Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).

LD 50 (surmava annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %-l loomadest. LD 50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).

Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2 000 või 5 000 mg/kg).

Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).

Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja möödumisel enne katse kavandatavat lõppu, näiteks suutmatus tarbida vett või toitu (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).

1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Ühesooliste loomade rühmadele annustatakse katseainet järk-järgult 5, 50, 300 ja 2 000 mg/kg kindlate annustena (erandkorras võidakse kasutada 5 000 mg/kg kindlat lisaannust, vt punkti 1.6.2). Esialgne annusemäär valitakse eelkatse põhjal annusena, mis eeldatavasti põhjustab mõningaid mürgisuse nähte, kuid ei põhjusta tõsiseid toksilisi mõjusid või suremust. Valu, kannatuse ja ähvardava surmaga seotud kliinilisi tunnuseid ja tingimusi kirjeldatakse üksikasjalikult OECD juhisdokumendis (8). Järgnevatele loomarühmadele võib annustada kaitseaine suuremaid või väiksemaid kindlaid annuseid sõltuvalt sellest, kas neil on olemas või puuduvad märgid mürgisuse või suremuse kohta. Käesolevat protseduuri jätkatakse seni, kuni on kindlaks tehtud tõenäoliselt mürgisust põhjustav annus või surmajuhtum, või kui suurim annus ei avalda mõju või kui väikseim annus põhjustab surma.

1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.1.   Loomaliikide valik

Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (7). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui erinevusi on täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (10). Kui struktuurselt samalaadsete kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse sooritatakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.

Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enim kasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8–12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.

1.4.2.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused

Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, peaks eesmärk olema hoida seda vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.

1.4.3.   Loomade ettevalmistamine

Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.

1.4.4.   Annuste valmistamine

Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil. See on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Kummalgi juhul ei tohi manustamisel ületada annuse suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.

1.5.   PROTSEDUUR

1.5.1.   Annuste manustamine

Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.

Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseaine. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena teatud ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.

1.5.2.   Eelkatse

Eelkatse eesmärk on võimaldada valida põhiuuringu tarbeks sobiv lähteannus. Katseainet manustatakse üksikutele loomadele järk-järgult lisas 1 toodud vooskeemide kohaselt. Eelkatse on lõpetatud siis, kui saab langetada otsuse põhikatse lähteannuse kohta (või kui tuvastatakse surm madalaima kindla annuse puhul).

Eelkatse lähteannus valitakse kindlate annusmäärade 5, 50, 300 ja 2 000 mg/kg hulgast annusena, mis eeldatavasti põhjustab ilmset mürgisust, mis võimaluse korral põhineb sama kemikaali või struktuurselt sarnaste kemikaalidega sooritatud in vivo ja in vitro katsete andmetel. Sellise teabe puudumise korral on lähteannuseks 300 mg/kg.

Iga looma korral on manustamiste vahel vähemalt 24tunnine vahemik. Kõiki loomi jälgitakse vähemalt 14 päeva.

Maksimaalset kindla annuse määra 5 000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras või siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt 3. lisa). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS 5. kategooria (2 000 –5 000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmiseks.

Juhul kui loom, kelle peal katsetati madalaimat kindla annuse määra (5 mg/kg), eelkatse käigus sureb, on tavapäraseks toiminguks uuringu peatamine ja aine klassifitseerimine GHS 1. kategooriasse (nagu on näidatud 1. lisas). Kui on siiski nõutav klassifitseerimise täiendav kinnitamine, võib teha järgmise valikulise lisaprotseduuri. Teisele loomale manustatakse annus 5 mg/kg. Kui teine loom sureb, siis kinnitab see GHS 1. kategooriat ja katse lõpetatakse kohe. Kui teine loom jääb ellu, siis manustatakse maksimaalselt kolmele täiendavale loomale annus 5 mg/kg. Kuna suremuse risk on suur, tuleb ainet manustada kõnealustele loomadele ükshaaval, et tagada nende heaolu. Ajavahemik igale loomale annuse manustamise vahel peab olema piisav selleks, et eelmine loom jääks tõenäoliselt ellu. Kui teine loom sureb, lõpetatakse viivitamata annustamine ja rohkematele loomadele doose ei manustata. Kuna teise surma juhtum (olenemata uuritud loomade arvust katse lõpetamise hetkel) kuulub tulemuse kategooriasse A (kaks või enam surma), järgitakse 5 mg/kg fikseeritud annuse puhul 2. lisas toodud klassifitseerimisreeglit (1. kategooria, kui on kaks või enam surmajuhtumit, või 2. kategooria, kui on vaid üks surmajuhtum). Lisaks sellele antakse 4. lisas juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHSi kasutuselevõttu.

1.5.3.   Põhiuuring

1.5.3.1.   Loomade arv ja annusemäärad

Lähteannuse tasemel katsete tegemise järel võetavad meetmed on esitatud 2. lisas toodud vooskeemides. Üks kolmest meetmest on nõutav; kas katse peatamine või sobiva ohuklassi määramine, katse sooritamine suurema kindla annusega või väiksema kindla annusega. Loomade kaitsmiseks ei kasutata põhiuuringus uuesti eelkatses surma põhjustanud annusemäära (vt 2. lisa). Kogemused on näidanud, et kõige tõenäolisem tulemus läheannuse tasemel on see, et ainet on võimalik klassifitseerida ja täiendavaid katseid ei ole vaja teha.

Igal uuritava annusemäära korral kasutatakse tavaliselt kokku viit ühest soost looma. Nende viie looma hulka kuulub üks loom eelkatsest, kellele manustati valitud annusemäärale vastav annus, ja veel neli looma (v.a harvaesineval juhul, kui põhiuuringus kasutatav annusemäär ei sisaldunud eelkatses).

Annustamistevaheline ajavahemik iga annusemäära korral määratakse kindlaks mürgisuse tunnuste ilmnemise, kestuse ja ägeduse järgi. Järgmise annuse manustamist tuleb edasi lükata, kuni juba doosi saanud loomade ellujäämine on kindel. Vajaduse korral soovitatakse annustamistevaheliseks ajaks jätta iga annusemäära puhul 3 või 4 päeva, et võimaldada jälgida viivitunud mürgisust. Ajavahemikku võib vajaduse korral korrigeerida, nt ebaselge vastuse puhul.

Kui kasutatakse kõrgeimat kindlat annust 5 000 mg/kg, tuleks järgida 3. lisas esitatud protseduuri (vt ka punkti 1.6.2).

1.5.3.2.   Piirsisalduskatse

Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus katse tegijal on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada samalaadseid uuritud ühendeid või segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või mil katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.

Käesoleva juhise kohase piirkatsena võidakse tavalist protseduuri kasutades kasutada eelkatset, mille lähteannus on 2 000 mg/kg (või erandkorras 5 000 mg/kg), mille järel manustatakse veel neljale loomale sama annus.

1.6.   VAATLUSED

Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese 4 tunni jooksul ja seejärel iga päev, kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt nende heaolu pärast või kui loomad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seega vajaduse korral pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (11). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.

Täiendavad vaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskriteeriumide juhisdokumendis esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (8). Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.

1.6.1.   Kehamass

Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellujäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.

1.6.2.   Patoloogia

Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.

2.   ANDMED

Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.

3.   ARUANDLUS

3.1.   KATSEARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama vastavalt vajadusele järgmist teavet.

Katseaine:

 füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine);

 identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.

Kandeaine (vajaduse korral):

 kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.

Katseloomad:

 kasutatud liigid/tüved;

 loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;

 loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel);

 päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.

Katsetingimused:

 katseaine valmistamise üksikasjalikud andmed, sh üksikasjalikud andmed manustatava aine füüsilise oleku kohta;

 katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg;

 üksikasjalikud andmed toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);

 põhjendus lähteannuse valikuks.

Tulemused:

 tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgistustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta;

 tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta;

 iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel;

 surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist;

 iga looma korral mürgistusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine;

 iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.

Tulemuste arutelu ja tõlgendamine.

Järeldused.

4.   VIITED

1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85–92.

2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279–291.

3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Felling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469–482.

4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313–324.

5) Stallard, N. and Whitehead, A. (199 5). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196.

7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Pariis

8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.Org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P, Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, JA. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231.

11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

1. LISA

EELKATSE VOOSKEEM

image

image

2. LISA

PÕHIUURINGU VOOSKEEM

image

image

3. Lisa

KRITEERIUMID SELLISTE KATSEAINETE KLASSIFITSEERIMISE JAOKS, MILLE KORRAL OODATAVAD LD50 VÄÄRTUSED ÜLETAVAD 2 000 MG/KG JA MIDA EI OLE VAJA UURIDA

Ohukategooriat 5 käsitlevad kriteeriumid on ette nähtud selliste katseainete identifitseerimiseks, mille korral on ägeda mürgisuse oht suhteliselt madal, kuid mis teatud tingimustel võivad ohustada tundlikke populatsioone. Nimetatud ainete LD50 väärtused on oodatavalt vahemikus 2 000 –5 000 mg/kg suu- või nahakaudsel manustamisel või samaväärsete annustena muude manustamisviiside korral. Katseained võidakse klassifitseerida ohukategooriasse, mis on määratletud tingimusega: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (GHS-kategooria 5), järgmistel juhtudel:

a) kui on suunatud nimetatud kategooriasse lisas 2 toodud mis tahes katsekava korral, mis põhineb surmajuhtumitel;

b) kui on juba olemas usaldusväärsed tõendid, mis näitavad, et LD50 väärtus asub kategooriale 5 vastavas vahemikus, või muud loomauuringud või toksilised mõjud inimestel osutavad sellele, et ainel on vahetu mõju inimese tervisele;

c) andmete ekstrapoleerimise, hindamise või mõõtmise alusel, kui määramine ohtlikumasse kategooriasse ei ole põhjendatud, ja

 usaldusväärse teabe olemasolul oluliste toksiliste mõjude kohta inimestele või

 kui täheldatakse suremust suukaudse manustamisega katsetes kuni kategooriale 4 vastavate väärtusteni või

 kui eksperdiarvamus kinnitab mürgisuse olulisi kliinilisi tunnuseid katsetamisel kuni kategooriale 4 vastavate väärtusteni, välja arvatud kõhulahtisus, piloerektsioon või hoolitsemata välimus, või

 kui eksperdiarvamus kinnitab usaldusväärset teavet võimalike märkimisväärsete ägedate mõjude kohta muude loomauuringute põhjal.

KATSETAMINE 2 000 MG/KG ÜLETAVATE ANNUSTEGA

Maksimaalset kindlat annust 5 000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras või siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega. Tunnistades vajadust kaitsta loomade heaolu, ei kiideta katsetamist annustega 5 000 mg/kg heaks ja seda kasutatakse üksnes siis, kui on suur tõenäosus, et sellise katse tulemused oleks otseselt seotud loomade või inimeste tervise kaitsega (9).

Eeluuring

1. lisas esitatud järjestamist reguleerivate otsuste eeskirju laiendatakse annusemäära 5 000 mg/kg kohta. Seetõttu, kui kasutatakse eeluuringus lähteannusena 5 000 mg/kg, eeldab tulemus A (surm) teise looma korral katse tegemist annusega 2 000 mg/kg; tulemused B ja C (ilmne mürgisus või ei esine mürgisust) lubavad valida põhiuuringus lähteannuseks 5 000 mg/kg. Analoogiliselt, kui lähteannusena kasutatakse 5 000 mg/kg erinevat annust, jätkatakse katset kuni annuseni 5 000 mg/kg sellisel juhul, kui annusega 2 000 mg/kg on tulemus B või C. Kui annusega 5 000 mg/kg on tulemuseks A, on põhiuuringus lähteannuseks 2 000 mg/kg. Kui tulemuseks saadaks B ja C, on põhiuuringus algdoosiks lähteannuseks 5 000 mg/kg.

Põhiuuring

2. lisas esitatud järjestamist reguleerivate otsuste eeskirju laiendatakse annusemäära 5 000 mg/kg kohta. Seetõttu, kui kasutatakse põhiuuringus lähteannusena 5 000 mg/kg, eeldab tulemus A (≥2 surma) teise rühmaga katse tegemist annusega 2 000 mg/kg; tulemuste B (ilmne mürgisus ja/või ≤1 surm) või C (ei esine mürgisust) puhul on tulemuseks see, et ainet ei klassifitseerita vastavalt GHSile. Analoogiliselt, kui lähteannusena kasutatakse 5 000 mg/kg erinevat annust, jätkatakse katset kuni annuseni 5 000 mg/kg sellisel juhul, kui annusega 2 000 mg/kg on tulemus C. Kui annusega 5 000 mg/kg on tulemuseks A, klassifitseeritakse aine GHS 5. kategooriasse. Tulemuste B või C puhul jääb aine klassifitseerimata.

Lisa 4

KATSEMEETOD B.1a

EÜ süsteemi kohased klassifitseerimisjuhised, mida kasutatakse üleminekuperiodil kuni globaalselt harmoneeritud süsteemi (GHS) täieliku rakendamiseni (viites (8))

image

image

B.1b.   ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISUSASTME MEETOD

1.   MEETOD

See katsemeetod on samaväärne OECD TG 423ga (2001).

1.1.   SISSEJUHATUS

Käesolevas katses sätestatud ägeda mürgisusastme meetod (1) on astmeline meetod, mille igal etapil kasutatakse kolme samast soost looma. Olenevalt loomade suremusest ja/või sellest, kas loomad on suremas, on katseaine ägeda mürgisuse hindamiseks vaja keskmiselt 2–4 etappi. Käesolev protseduur on korratav, selles kasutatakse väga vähe loomi. Selle abil võidakse järjestada ained nii nagu muude ägeda mürgisuse katsemeetodite puhul. Ägeda mürgisusastme meetod põhineb biomeetrilistel hindamistel (2, 3, 4, 5), kus kasutatakse kindlaid annuseid, mis on üksteisest piisavalt eraldatud aine klassifitseerimise eesmärgil ja ohu hindamiseks. 1996. aastal vastuvõetud meetodit valideeriti ulatuslikult in vivo, võrreldes kirjandusest saadud LD50 väärtusi käsitlevaid andmeid nii riiklikul (6) kui ka rahvusvahelisel tasandil (7).

Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katseid käsitlevast (8) juhisdokumendist. Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti lisateavet B.1b katsemeetodi rakendamise ja tõlgendamise kohta.

Katseaineid ei ole vaja manustada annustes, mis teadaolevalt põhjustavad märkimisväärset valu ja kannatusi sööbiva või tugeva ärritava toime tõttu. Suremas olevad loomad ja loomad, kes kannatavad ilmselgelt valu või kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks surmata humaanselt; need loomad võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu katse käigus surnud loomi. Eraldi juhisdokumendis (9) on esitatud kriteeriumid, mille alusel tehakse otsus suremas olevate või tõsiselt kannatavate loomade surmamise kohta, ning juhised prognoositava või ähvardava surma äratundmiseks.

Meetod kasutab kindlaks määratud annuseid ja tulemused võimaldavad aineid järjestada ja klassifitseerida vastavalt ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimist käsitlevale globaalselt harmoneeritud süsteemile (10).

Põhimõtteliselt ei ole meetod ette nähtud võimaldama arvutada täpset LD50 annust, kuid võimaldab kindlaks määrata määratletud kokkupuutevahemikku, kus suremus on eeldatav, kuna käesoleva katse põhipunkt on endiselt see, et osa loomi sureb. Meetod võimaldab kindlaks määrata LD50 väärtuse üksnes siis, kui vähemalt kaks annust põhjustavad suremuse, mis on 0 %st suurem ja 100 %st väiksem. Tänu kindlaksmääratud annuste valikule sõltumata katseainest, ja klassifitseerimise selgelt väljendatud seosele erinevas seisundis täheldatud loomade arvuga on laborite aruanded järjepidevamad ja korratavamad.

Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri, selle füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainetega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi, struktuurilt sarnaste ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks ja aitab valida sobivat lähteannust.

1.2.   MÕISTED

Äge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.

Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14päevase jälgimisperioodi jooksul.

Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).

GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC).

Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).

LD 50 (surmava suukaudse annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %l loomadest. LD50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).

Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2 000 või 5 000 mg/kg).

Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).

Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja pärast enne katse kavandatavat lõppu; näiteks suutmatus tarbida vett või toitu (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).

1.3.   KATSE PÕHIMÕTE

Tuginedes protseduurile, mille kohaselt kasutatakse igal etapil minimaalset arvu loomi, on katse põhimõtteks saada aine klassifitseerimiseks piisavalt teavet katseaine ägeda mürgisuse kohta. Ainet manustatakse katseloomade rühmale suukaudselt ühe kindlaksmääratud doosina. Ainet katsetatakse etapiviisiliselt, igal etapil kasutatakse kolme ühest soost looma (tavaliselt emaslooma). Ühendiga seotud suremuse puudumine või esinemine loomadel, kellele ühel etapil annustati ainet, määrab kindlaks järgmise etapi, s.t:

 lisakatseid ei ole vaja;

 aine sama annus manustatakse veel kolmele loomale;

 ainet manustatakse vastavalt vahetult järgmisele või eelmisele annusemäärale veel kolmele loomale.

Katseprotseduuri üksikasju on kirjeldatud 1. lisas. Meetod võimaldab langetada otsuse seoses katseaine klassifitseerimisega ühte mürgisuse kategooriasse, mis on määratletud kindlaksmääratud LD50 piirväärtuse põhjal.

1.4.   MEETODI KIRJELDUS

1.4.1.   Loomaliikide valik

Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (9). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui on erinevusi täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (11). Kui struktuurselt sarnaste kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse tehakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.

Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enim kasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8–12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.

1.4.2.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused

Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise aja, peaks seda hoidma vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.

1.4.3.   Loomade ettevalmistamine

Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise jaoks ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.

1.4.4.   Annuste valmistamine

Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil, ja see on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Kummalgi juhul ei tohi ületada manustamisel annuste suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus järgmine: lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.

1.5.   PROTSEDUUR

1.5.1.   Annuste manustamine

Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates kogustes kuni 24 tunni jooksul.

Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseainet. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena teatud ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.

1.5.2.   Loomade arv ja annusemäärad

Igal etapil kasutatakse kolme looma. Lähteannusena kasutatav annusemäär valitakse üks neljast kindlast suurusest – 5, 50, 300 ja 2 000 mg/kehamassi kg. Lähteannuse määr peaks olema sellise väärtusega, mis kutsub suurima tõenäosusega esile suremust mõnede loomade hulgas, kellele ainet manustati. 1. lisas toodud vooskeemid kirjeldavad protseduure, mida tuleks järgida iga lähteannuse puhul. Lisaks sellele antakse 4. lisas juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHSi kasutuselevõttu.

Kui olemasolev teave kinnitab, et suremus on ebatõenäoline suurima algdoosi taseme juures (2 000 mg/kg kehamassi kohta), tuleks teha piirkatse. Kui puudub teave uuritava aine kohta, soovitatakse loomade heaolu tagamiseks kasutada algdoosina 300 mg/kg kehamassi kohta.

Katserühmadele annustamiste ajavahemik määratakse kindlaks mürgisustunnuste algushetke, kestuse ja raskuse abil. Järgmise annuse manustamist loomadele tuleb edasi lükata hetkeni, kuni juba annuse saanud loomade ellujäämine on kindel.

Maksimaalset kindla annuse määra 5 000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras ja ainult siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt 2. lisa). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS 5. kategooria (2 000 – 5 000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmisel.

1.5.3.   Piirkatse

Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus eksperimentaatoril on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada samalaadseid uuritud ühendeid, segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või kui katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.

Piirkatse võidakse teha ühel annusemääral (2 000 mg/kg kehamassi kohta) kuue loomaga (kolm looma igal etapil). Erandkorras võib piirkatse teha ühel annusemääral (5 000 mg/kg) kolme loomaga (vt 2. lisa). Kui esineb katseainega seotud suremust, võib sooritada lisakatseid astme võrra madalama annusemääraga.

1.6.   VAATLUSED

Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese nelja tunni jooksul ja seejärel iga päev kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt loomade heaolu pärast või kui nad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seepärast vajaduse korral pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (12). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.

Lisavaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9) esitatud põhimõtteid ja kriteeriume. Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.

1.6.1.   Kehamass

Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellu jäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.

1.6.2.   Patoloogia

Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.

2.   ANDMED

Andmed esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.

3.   ARUANDLUS

3.1.   KATSEARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.

Katseaine:

 füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine);

 identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.

Kandeaine (vajaduse korral):

 kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.

Katseloomad:

 kasutatud liigid/tüved;

 loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;

 loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel);

 päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.

Katsetingimused:

 katseaine valmistamise üksikasjad, sh üksikasjad manustatava aine füüsilise oleku kohta;

 katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg;

 üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);

 põhjendus lähteannuse valikuks.

Tulemused:

 tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgisustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta;

 tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta;

 iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel;

 surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist;

 iga looma korral mürgisusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine;

 iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.

Tulemuste arutlus ja tõlgendamine.

Järeldused.

4.   VIITED

1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.

2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341.

3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610.

4) Diener W., Mischke U, Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734.

5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134.

6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.

7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670.

8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

11) Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer J.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231.

12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

1. LISA

PROTSEDUUR, MIDA JÄRGITAKSE IGA LÄHTEANNUSE PUHUL

ÜLDISED MÄRKUSED

Selles lisas toodud vastavad katsekavad selgitavad protseduuri, mida tuleb järgida iga lähteannuse puhul.

 1a lisa: lähteannus on 5 mg kg kehamassi kohta

 1b lisa: lähteannus on 50 mg kg kehamassi kohta

 1c lisa: lähteannus on 300 mg kg kehamassi kohta

 1d lisa: lähteannus on 2 000 mg kg kehamassi kohta

Humaanselt surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katseprotseduuris vastavalt nooltega näidatud suunale.

1a LISA

KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 5 MG/KEHAMASSI KG KORRAL

image

1b LISA

KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 50 MG/KEHAMASSI KG KORRAL

image

1C Lisa

KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 300 MG/KEHAMASSI KG KORRAL

image

1d LISA

KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 2 000 MG/KEHAMASSI KG KORRAL

image

2. LISA

KLASSIFITSEERIMISKRITEERIUMID SELLISTE KATSEAINETE KORRAL, MILLE OODATAVAD LD50 VÄÄRTUSED ÜLETAVAD 2 000 MG/KG JA MIDA EI OLE VAJA TESTIDA

Ohukategooriat 5 käsitlevad kriteeriumid on ette nähtud selliste katseainete identifitseerimiseks, mille korral on ägeda mürgisuse oht suhteliselt väike, kuid mis teatud tingimustel võivad ohustada tundlikke populatsioone. Nimetatud ainete korral on LD50 väärtused oodatavalt vahemikus 2 000 –5 000 mg/kg suu- või nahakaudsel manustamisel või samaväärsete annustena muude manustamisviiside puhul. Katseaine võidakse klassifitseerida ohukategooriasse, mis on määratletud tingimusega: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (GHS 5. kategooria), järgmistel juhtudel:

a) kui on suunatud nimetatud kategooriasse lisades 1a–1d toodud katsete tegemise mis tahes katsekava poolt, mis põhineb surmajuhtumitel;

b) kui on juba olemas usaldusväärsed tõendid, mis näitavad, et LD50 väärtus asub 5. kategooriale vastavas vahemikus, või muud loomauuringud või toksilised mõjud inimestel osutavad sellele, et ainel on vahetu mõju inimese tervisele;

c) andmete ekstrapoleerimise, hindamise või mõõtmise alusel, kui määramine ohtlikumasse kategooriasse ei ole põhjendatud, ja

 usaldusväärse teabe olemasolul oluliste toksiliste mõjude kohta inimestele või

 kui täheldatakse suremust suukaudse manustamisega katsetes kuni 4. kategooriale vastavate väärtusteni või

 kui eksperdiarvamus kinnitab mürgisuse olulisi kliinilisi tunnuseid katsetamisel kuni 4. kategooriale vastavate väärtusteni, välja arvatud kõhulahtisus, piloerektsioon või hoolitsemata välimus, või

 kui eksperdiarvamus kinnitab usaldusväärset teavet võimalike märkimisväärsete ägedate mõjude kohta muude loomauuringute põhjal.

KATSETAMINE 2 000 MG/KG ÜLETAVATE ANNUSTEGA

Tunnistades vajadust kaitsta loomade heaolu, ei kiideta heaks loomkatsete tegemist 5. kategooriale vastavas vahemikus (5 000 mg/kg annustega) ja seda kasutatakse üksnes siis, kui on suur tõenäosus, et sellise katse tulemused oleks otseselt seotud loomade või inimeste tervise kaitsega (10). Lisakatseid kõrgemate annusemääradega ei ole vaja teha.

Kui katse tegemine annusega 5 000 mg/kg on nõutav, vajatakse vaid ühte etappi (st kolme looma). Kui esimese annuse saanud loom sureb, jätkatakse 2 000 mg/kg doosi manustamist vastavalt 1. lisas toodud vooskeemidele. Kui esimene loom jääb ellu, manustatakse doos ka kahele järgmisele loomale. Kui sureb vaid üks kolmest loomast, siis ületab LD50 väärtus eeldatavalt 5 000 mg/kg. Kui mõlemad loomad surevad, jätkatakse manustamist annusega 2 000 mg/kg.

Lisa 3

KATSEMEETOD B.1 b: EÜ süsteemi kohased klassifitseerimisjuhised, mida kasutatakse üleminekuperioodil kuni globaalselt harmoneeritud süsteemi (GHS) täieliku rakendamiseni (viite (8) alusel)

image

image

image

image

▼M4

B.2.   ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL

SISSEJUHATUS

1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 403 (2009) (1). Esialgne sissehingamisel avalduvat ägedat mürgisust käsitlev katsejuhend nr 403 võeti vastu 1981. aastal. Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.2 (mis on samaväärne katsejuhendi nr 403 läbivaadatud versiooniga) on koostatud suurema paindlikkuse tagamiseks, loomade kasutamise vähendamiseks ja regulatiivsete vajaduste täitmiseks. Läbivaadatud katsemeetod hõlmab kahte järgmist uuringu tüüpi: tavaline LC50 määramise eeskiri ja C × t (kontsentratsioon × aeg) määramise eeskiri. Käesoleva katsemeetodi peamised omadused on järgmised: meetod võimaldab määrata mõju sõltuvust kontsentratsioonist alates mitteletaalsest kuni letaalse mõjuni, et leida letaalne mediaankontsentratsioon (LC50), mitteletaalse kontsentratsiooni läviväärtus (näiteks LC01) ja kõvera tõus, ning määrata kindlaks mõju võimalik sõltuvus soost. C × t määramise eeskirja tuleks kasutada konkreetse regulatiivse või teadusliku vajaduse puhul, kui on vaja teha mitmesuguse kestusega loomkatsed, näiteks hädaolukorrale reageerimise kavandamiseks (nt akuutse kokkupuute näidistasemete (Acute Exposure Guideline Levels, AEGL) leidmine, hädaolukorras toimimise juhendite (Emergency Response Planning Guidelines, ERPG) kavandamine või akuutse kokkupuute läviväärtuste (Acute Exposure Threshold Levels, AETL) leidmine) või maakasutuse planeerimiseks.

2. Käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemise ja tõlgendamise juhendid on esitatud sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse katse juhenddokumendis (juhenddokument nr 39) (2).

3. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 39 (2).

4. Käesolev katsemeetod võimaldab iseloomustada uuritavat kemikaali, hinnata kvantitatiivselt riski ning määruse (EÜ) nr 1272/2008 (3) kohaselt järjestada ja klassifitseerida uuritavat kemikaali. Juhenddokumendis nr 39 (2) on esitatud juhendid ägeda mürgisuse uurimiseks sobiva katsemeetodi valimiseks. Kui soovitakse saada ainult klassifitseerimiseks ja märgistamiseks vajalikku teavet, soovitatakse üldiselt kasutada käesoleva lisa peatükis B.52 esitatud meetodit (4) (vt juhenddokument nr 39 (2)). Käesolev katsemeetod B.2 ei ole spetsiaalselt ette nähtud erimaterjalide, nagu vähe lahustuvad isomeetrilised või kiudmaterjalid või toodetud nanomaterjalid, uurimiseks.

LÄHTEKAALUTLUSED

5. Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, sh tehtud uuringud (näiteks käesoleva lisa peatükk B.52 (4)), mille andmete abil oleks võimalik täiendava katse tegemisest loobuda, et minimeerida loomade kasutust. Teave, mis võib aidata valida katseks kõige sobivama liigi, liini, soo, kokkupuuteviisi ja sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes in vitro või in vivo mürgisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta (vt juhenddokument nr 39 (2)).

6. Võimaluste piires tuleks vältida söövitava ja/või ärritava kemikaali katsetamist kontsentratsioonil, mis eeldatavasti põhjustab suurt valu ja/või kannatusi. Söövitava/ärritava mõju võimalust tuleks hinnata eksperdihindamise abil, kasutades selliseid tõendeid nagu inimeste kogemused ja varasemad loomkatsete andmed (näiteks korduvdoosi uuringutest, mis on tehtud mittesöövitava/-ärritava kontsentratsiooniga), olemasolevad in vitro andmed (näiteks käesoleva lisa peatükid B.40 (5) ja B.40a (6) või OECD katsejuhend nr 435 (7)), pH-väärtused, teave samalaadsete ainete kohta või iga muu asjakohane teave, et hinnata, kas täiendavast katsetamisest on võimalik loobuda. Konkreetse regulatiivse vajaduse jaoks (näiteks hädaolukorras tegutsemise kava koostamiseks) võidakse käesolevat katsemeetodit kasutada, et viia loomad kokkupuutesse kõnealuste materjalidega, kuna sellega saab uuringu juht või peamine uurija kontrollida sihtkontsentratsioonide valimise õigsust. Sihtkontsentratsioon ei tohiks siiski põhjustada tugevat ärritavat/söövitavat mõju, kuid peaks olema piisav, et pikendada kontsentratsiooni-mõju kõver tasemeni, millega saavutatakse katse regulatiivne ja teaduslik eesmärk. Kõnealused kontsentratsioonid tuleks valida juhtumipõhiselt ja seda valikut tuleks põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)).

KATSE PÕHIMÕTE

7. Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.2 on koostatud selleks, et saada piisavalt teavet uuritava kemikaali ägeda mürgisuse kohta, et kemikaal klassifitseerida ja saada letaalsuse andmed (näiteks LC50, LC01 ja kõvera tõus) ühe või mõlema soo kohta, mida vajatakse riski kvantitatiivseks hindamiseks. Käesolev katsemeetod hõlmab kahte meetodit. Esimene meetod on tavaline määramiseeskiri, mille puhul loomade rühmad viiakse kokkupuutesse piirkontsentratsiooniga (piirsisalduskatse) või astmeliselt mitme eri kontsentratsiooniga eelnevalt kindlaks määratud aja jooksul, mis tavaliselt on neli tundi. Konkreetse regulatiivse eesmärgi jaoks võib kasutada muid kokkupuute ajavahemikke. Teine meetod on C × t määramise eeskiri, mille puhul loomade rühmad viiakse kokkupuutesse ühe (piir)kontsentratsiooniga või mitme eri kontsentratsiooniga mitme ajavahemiku jooksul.

8. Suremas loomad või loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel ilmnevad raskete ja kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil surmata; selliseid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse samamoodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille põhjal tehakse suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise otsus, ja juhised prognoositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas OECD juhenddokumendis nr 19 (8).

MEETODI KIRJELDUS

Loomaliigi valimine

9. Tuleks kasutada katseloomade enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud isendeid. Eelistatav loomaliik on rott; muude liikide kasutamise korral tuleks seda põhjendada.

Loomade ettevalmistamine

10. Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kokkupuute päeval peaksid loomad olema 8 kuni 12 nädala vanused noored täiskasvanud, kelle kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ±20 % selliste samas vanuses ja samast soost loomade keskmisest kehamassist, keda kasutati varasemates kemikaaliga kokkupuute katsetes. Loomad valitakse juhuslikult ja märgistatakse individuaalselt. Loomi hoitakse oma puuris vähemalt viis päeva enne katse algust, et võimaldada neil laboritingimustega kohaneda. Loomad peaksid olema enne katset ka katseseadmetega lühikese aja vältel kohanenud, kuna sel viisil vähendatakse uude keskkonda viimisest põhjustatud stressi.

Pidamistingimused

11. Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi olla võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmitatuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitlemise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjustada loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsioloogilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise minutimahtu. Kui kättesaadavad on üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, siis ei ole eelnev hoiutoruga kohanemine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokku puutuvaid loomi tuleks kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja sertifitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust.

Inhalatsioonikambrid

12. Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi ja katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaerosooli ja aerosooliks kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasutamise korral keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade kogumaht ületada 5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudujääke on kirjeldatud juhenddokumendis nr 39 (2).

KOKKUPUUTETINGIMUSED

Kontsentratsioonide manustamine

13. Kokkupuude ainult nina kaudu võib rottidel kesta kuni kuus tundi. Kui hiirtel kasutatakse ainult nina kaudu kokkupuudet, siis ei tohiks kokkupuude tavaliselt ületada nelja tundi. Kui vajatakse pikema kestusega uuringuid, siis tuleks seda põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kogukehakambris aerosoolidega kokku puutuvad loomad tuleks eraldi paigutada, et vältida puurikaaslaste karvkatte korrastamise tõttu uuritava kemikaali suukaudset manustamist. Kokkupuute ajal ei tohiks loomi sööta. Loomadele võib kogu keha kaudu toimuva kokkupuute ajal vett anda.

14. Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitsemise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuritavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ettevaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist.

Osakeste jaotus suuruse järgi

15. Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hingamisteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–4 μm ning geomeetriline standardhälve (σg) on 1,5–3,0 (2, 9, 10). Kõnealuse standardi järgimiseks tuleks teha mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed võivad olla kõnealusest normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed, kiud ja hügroskoopsed materjalid (mille suurus hingamisteede niiskes keskkonnas suureneb) võivad olla suuremad.

Uuritava kemikaali preparaat kandeaines

16. Selleks et tagada uuritava kemikaali vajalik kontsentratsioon õhus ja osakeste suurus, võib olla vaja kasutada kandeainet. Eelistatult tuleks kasutada vett. Aineosakesi võib töödelda mehaaniliselt, et saavutada osakeste soovitud suurusjaotus, kuid tuleks olla hoolikas, et uuritavat kemikaali mitte lagundada ega muuta. Kui mehaaniline töötlus (näiteks tugeval jahvatamisel hõõrdumisest tekkinud kõrge temperatuur) võib olla uuritava kemikaali koostist muutnud, siis tuleks uuritava kemikaali koostist analüüsiga kontrollida. Tuleks olla hoolikas, et vältida uuritava kemikaali saastamist. Ei ole vaja katsetada raskesti peenestuvat teralist materjali, mis on sihipäraselt valmistatud nii, et seda ei saa sisse hingata. Materjali hõõrumisega tuleks tõendada, et teralise materjali käsitsemisel ei teki sissehingatavaid osakesi. Kui hõõrumiskatsel tekib sissehingatavaid osakesi, tuleks teha sissehingamisel mürgisust näitav katse.

Loomade kontrollrühm

17. Samaaegne negatiivne (puhtas õhus peetavate) loomade kontrollrühm ei ole vajalik. Kui katsekeskkonna loomiseks kasutatakse muud kandeainet kui vesi, siis tuleks kandeaine kontrollrühma kasutada ainult juhul, kui varasemad sissehingamisel avalduva mürgisuse andmed ei ole kättesaadavad. Kui kandeaines sisalduva uuritava kemikaali mürgisuse uuringuga mürgisust ei leita, siis võib järeldada, et kandeaine ei ole katsetatud kontsentratsioonil mürgine, seega ei ole kandeaine kontrollrühm vajalik.

KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE

Kambri õhuvarustus

18. Igas kokkupuutekatses tuleks kambri õhuvarustust hoolikalt kontrollida, pidevalt seirata ning andmed vähemalt kord tunnis registreerida. Keskkonnas oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (või selle stabiilsuse) seire on kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab endast kaudset vahendit keskkonna tekitamise kõigi asjakohaste dünaamiliste parameetrite kontrollimiseks. Eraldi tuleks jälgida, et ainult nina kaudu kokkupuute uurimise kambris ei hingataks väljahingatud õhku uuesti sisse, kuna kokkupuutesüsteemi õhuvarustus ei ole piisav uuritavat kemikaali sisaldava õhu dünaamilise voo tagamiseks. On olemas metoodika, mille abil saab tõendada, et valitud katsetingimustes ei hingata väljahingatud õhku uuesti sisse (2, 11). Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisisaldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõnealuseid nõudeid ei ole võimalik täita, siis tuleks hapniku- ja süsinikdioksiidisisaldust mõõta.

Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus

19. Kambri temperatuuri tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamistsooni suhtelist õhuniiskust tuleks nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu kokkupuute katsetes seirata ja registreerida vähemalt kolm korda kuni neljatunnise katse jooksul ning iga tund lühema katse puhul. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju tõttu (näiteks veepõhise segu uurimisel) ei pruugi see olla saavutatav või mõõdetav.

Uuritav kemikaal: nimikontsentratsioon

20. Kui see on võimalik, siis tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon alati arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda lisatud uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku kontsentratsiooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning seega saab seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avastamiseks.

Uuritav kemikaal: tegelik kontsentratsioon

21. Tegelik kontsentratsioon on inhalatsioonikambris loomade hingamistsoonist võetud proovist määratud uuritava kemikaali kontsentratsioon. Tegelikke kontsentratsioone on võimalik määrata spetsiifiliste meetodite abil (näiteks otsene proovivõtt, adsorptsiooni- või keemilise reaktsiooni meetodid ning järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimeetriline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud ainult ühest koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vedeliku aerosooli korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud konkreetse kemikaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulberaerosooli kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada gravimeetrilist analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus oleva materjali koostis sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuritava kemikaali (eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. Aerosoolainete puhul, mis võivad aurustuda või sublimeeruda, tuleks näidata, et valitud meetodiga koguti kõiki faase. Katseprotokollis tuleks esitada siht-, nimi- ja tegelikud kontsentratsioonid, kuid letaalse kontsentratsiooni arvutamiseks kasutatakse statistilises analüüsis ainult tegelikke kontsentratsioone.

22. Võimaluse korral tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte partiid ning uuritavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib selle puhtus, homogeensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks uuritavat kemikaali, sh selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, tuleb keemiliselt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning määrata nende kogused. Seda on võimalik tõendada muu hulgas järgmiste andmete alusel: retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, molekulmass massispektroskoopia või gaaskromatograafia analüüsidest või muud hinnangud. Kuigi uurimislabor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemilise määratlemise eest, võib uurimislaboril olla mõttekas kinnitada tellija iseloomustust vähemalt piiratud ulatuses (näiteks värv, füüsikalised omadused jne).

23. Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna ja seiratakse pidevalt ja/või pisteliselt, olenevalt analüüsimeetodist. Kui kasutatakse pistelist proovivõttu, tuleks neljatunnise uuringu vältel võtta kambrikeskkonnast proove vähemalt kaks korda. Kui see ei ole piiratud õhuvarustuse või väikeste kontsentratsioonide tõttu võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi kohta võtta ühe proovi. Kui proovide analüüsimisel saadakse oluliselt erinevad tulemused, tuleks järgmiste uuritavate kontsentratsioonide puhul võtta kokkupuute kohta neli proovi. Kambrist võetud proovide üksikud kontsentratsioonid ei tohiks keskmisest kontsentratsioonist erineda rohkem kui ±10 % gaaside ja aurude puhul või ±20 % vedelik- või pulberaerosoolide korral. Tuleks arvutada kambri tasakaaluoleku saavutamise aeg (t95) ja see registreerida. Kokkupuute kestus on aeg, mille vältel lisatakse uuritavat kemikaali ja seejuures arvestatakse t95 saavutamiseks vajalikku ajavahemikku. Juhendid t95 hindamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).

24. Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest (näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda inhalatsioonikambris erinevalt, nii et tuleks valida vähemalt üks uuritav aine (mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, iga faasi (gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, siis tuleks kirja panna segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toimeaine või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisateave tegelike kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).

Uuritav kemikaal: osakeste suurusjaotus

25. Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt kaks korda iga neljatunnise kokkupuute ajal, kasutades kaskaadimpaktorit või alternatiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on võimalik tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud tulemuste võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alternatiivset seadet. Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada teist seadet, näiteks gravimeetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veenduda peamise seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu saadud massikontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kui uuringu varajases etapis on võimalik tõendada võrdväärsust, siis võib loobuda täiendavatest kinnitavatest mõõtmistest. Loomade heaolu silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik kokkupuudet korrata. Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on võimalik, et auru kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool või kui auru keskkonnas tuvastatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside seguga (vt punkt 15).

KATSE KÄIK

26. Allpool on kirjeldatud kahte järgmist uuringutüüpi: tavaline määramiseeskiri ja C × t määramise eeskiri. Mõlemad eeskirjad võivad hõlmata eeluuringut, põhiuuringut ja/või piirsisalduskatset (tavaline määramiseeskiri) või katsetamist piirkontsentratsiooni juures (C × t). Kui mõju on teadaolevalt suurem ühele soole, võib uuringu juht otsustada, et uuringus kasutatakse ainult tundlikuma soo isendeid. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Enne alustamist tuleks loomade kasutamise minimeerimiseks võtta arvesse kõik kättesaadavad andmed. Näiteks käesoleva lisa peatüki B.52 (4) kohaselt saadud andmed võivad muuta eeluuringu tarbetuks ja näidata, kas mõju sõltub looma soost (vt juhenddokument nr 39 (2)).

TAVALINE MÄÄRAMISEESKIRI

Üldised põhimõtted: tavaline määramiseeskiri

27. Tavalise uuringu puhul viiakse loomarühmad kokkupuutesse uuritava kemikaaliga kindla ajavahemiku jooksul (tavaliselt neli tundi) kas ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldavas või kogukehakambris. Loomad viiakse kokkupuutesse kas piirkontsentratsiooniga (piirsisalduskatse) või vähemalt kolme kontsentratsiooniga astmelises protseduuris (põhiuuring). Põhiuuringule võib eelneda eeluuring, v.a juhul, kui uuritava kemikaali kohta on mingil määral teavet juba olemas, näiteks eelnevalt tehtud uuring B.52 (vt juhenddokument nr 39 (2)).

Eeluuring: tavaline määramiseeskiri

28. Eeluuringut kasutatakse uuritava kemikaali mõju prognoosimiseks, mõju sooliste erinevuste kindlaksmääramiseks ning põhiuuringu või piirsisalduskatse jaoks kokkupuute kontsentratsioonide valimisel abistamiseks. Eeluuringu kontsentratsioonide valimisel tuleks kasutada kogu kättesaadavat teavet, sh olemasolevaid (kvantitatiivse) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuse ((Q)SAR) andmeid ja andmeid samalaadsete kemikaalide kohta. Iga kontsentratsiooniga ei tohiks puutuda kokku rohkem kui kolm isast ja kolm emast isendit (soolise erinevuse kindlaksmääramiseks võidakse vajada kolme looma kummagi soo kohta). Eeluuringus võib kasutada ühte kontsentratsiooni, aga vajaduse korral võib kasutada ka rohkem kui ühte kontsentratsiooni. Eeluuringus ei tuleks katsetada nii palju loomi ja kontsentratsioone, et see sarnaneks juba põhiuuringuga. Eeluuringu asemel võib kasutada varem tehtud uuringut B.52 (4) (vt juhenddokument nr 39 (2)).

Piirsisalduskatse: tavaline määramiseeskiri

29. Piirsisalduskatset kasutatakse, kui uuritav kemikaal ei ole teadaolevalt või eeldatavalt mürgine, s.o mürgistus tekib ainult regulatiivse piirkontsentratsiooni ületamise puhul. Piirsisalduskatses viiakse uuritava kemikaaliga piirkontsentratsiooni juures kokkupuutesse üks kolmest isasest ja kolmest emasest koosnev loomarühm. Teavet uuritava kemikaali mürgisuse kohta võib saada varem katsetatud samalaadseid kemikaale käsitlevatest andmetest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisainete keemilist laadi ja sisaldust. Kui teavet mürgisuse kohta on vähe või ei ole üldse või kui uuritav kemikaal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.

30. Piirkontsentratsiooni valimine sõltub tavaliselt regulatiivsetest nõuetest. Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaasi, auru ja aerosooli piirkontsentratsioon vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l (või suurim saavutatav kontsentratsioon) (3). Mõne uuritava kemikaali, eelkõige auru või aerosooli piirkontsentratsiooni saavutamine võib olla tehniliselt keeruline. Aerosooli katsetamisel peaks olema peamine eesmärk saavutada sissehingamiseks sobiv osakeste suurus (MMAD 1–4 μm). See on enamiku uuritavate kemikaalide puhul võimalik kontsentratsioonil 2 mg/l. Aerosooli katsetamist rohkem kui 2 mg/l juures tuleks proovida ainult juhul, kui on võimalik saavutada sissehingamiseks sobiv osakeste suurus (vt juhenddokument nr 39 (2)). Määruses (EÜ) nr 1272/2008 ei soovitata loomade heaolu kaalutlustel kasutada katses piirkontsentratsiooni ületavat kontsentratsiooni (3). Piirkontsentratsiooni kasutamist tuleks kaaluda ainult siis, kui on suur tõenäosus, et kõnealuse katse tulemustest võib otseselt sõltuda inimeste tervise kaitse (3), ja seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Plahvatusohtliku uuritava kemikaali puhul tuleks olla hoolikas, et vältida plahvatust võimaldavaid tingimusi. Loomade tarbetu kasutamise vältimiseks tuleks enne piirsisalduskatset teha proovikatse ilma loomadeta, et tagada piirsisalduskatse jaoks vajalike kambritingimuste saavutamine.

31. Kui piirkontsentratsiooni juures täheldatakse, et loomad surevad või on suremas, siis võib piirsisalduskatse tulemusi kasutada eeluuringuna muudel kontsentratsioonidel edasiseks katsetamiseks (vt põhiuuring). Kui uuritava kemikaali füüsikalised või keemilised omadused muudavad piirkontsentratsiooni saavutamise võimatuks, siis tuleks katsetada suurimat saavutatavat kontsentratsiooni. Kui suurim saavutatav kontsentratsioon põhjustab alla 50 % suremuse, siis ei ole edasine katsetamine vajalik. Kui piirkontsentratsiooni ei ole võimalik saavutada, siis tuleks katseprotokollis esitada selgitus ja täiendavad andmed. Kui auruga saavutatav suurim kontsentratsioon ei ole mürgine, siis võib olla vajalik lisada uuritavat kemikaali vedelikaerosoolina.

Põhiuuring: tavaline määramiseeskiri

32. Põhiuuring tehakse tavaliselt vähemalt kolme kontsentratsiooniga, kasutades viit isas- ja viit emaslooma (või kui on teada, kummast soost isendid on tundlikumad, siis viit sellest soost looma) igal kontsentratsioonil. Usaldusväärse statistilise analüüsi tagamiseks tuleks kasutada piisavalt suuri kontsentratsioone. Ajavahemik katserühmade kokkupuutekatsete vahel määratakse kindlaks mürgistusnähtude alguse, kestuse ja raskuse järgi. Loomade kokkupuude järgmise kontsentratsiooniga tuleks edasi lükata seni, kuni eelmises katses kasutatud loomade ellujäämises võib olla mõistlikkuse piires veendunud. See võimaldab uuringu juhil kohandada järgmise kokkupuuterühma sihtkontsentratsiooni. Kuna katses kasutatakse keerukat tehnoloogiat, ei pruugi see inhalatsiooniuuringute puhul alati olla praktiline. Sellisel juhul peaks loomade kokkupuude järgmise kontsentratsiooniga põhinema varasemal kogemusel ja teaduslikul hinnangul. Segu katsetamisel tuleks tugineda juhenddokumendile nr 39 (2).

C × T (KONTSENTRATSIOON × AEG) MÄÄRAMISE EESKIRI

Üldised põhimõtted: C × t määramise eeskiri

33. Sissehingamisel avalduva mürgisuse hindamisel võidakse tavalise määramiseeskirja alternatiivina kaaluda astmelist C × t määramise eeskirja (12, 13, 14). Selle lähenemisviisi puhul võivad loomad puutuda uuritava kemikaaliga kokku mitmel kontsentratsioonil ja mitme ajavahemiku vältel. Kõik katsed tehakse ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldavas kambris (kogukehakambrid ei ole selle määramiseeskirja jaoks praktilised). Seda eeskirja on kirjeldatud 1. liite toimimisskeemiga. Simulatsioonianalüüsiga on näidatud, et tavaline määramiseeskiri ja C × t määramise eeskiri võivad mõlemad anda kindlaid LC50 väärtusi, kuid C × t määramise eeskiri annab tavaliselt kindlamaid LC01 ja LC10 väärtusi (15).

34. Simulatsioonianalüüs on näidanud, et C × t intervalli kohta kahe looma kasutamine (üks loom kummastki soost mõlema soo kasutamise korral või kaks looma sellest soost, kummale on suurem mõju) võib tavaliselt olla piisav põhiuuringus nelja kontsentratsiooni ja viie kokkupuute ajavahemiku katsetamise korral. Mõnel juhul võib uuringu juht otsustada kasutada kummagi soo puhul kahte rotti C × t intervalli kohta (15). Kummastki soost kahe looma kasutamine kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta võib vähendada andmete kallutatust ja hinnangute hajumist, suurendada ennustuste täpsust ja hälvete kirjeldatavust usaldusvahemikuga. Kui andmete kooskõla ei ole hindamiseks piisav (kui kasutatakse ühte looma kummastki soost või kahte looma soost, millele on suurem mõju), siis võib piisata viienda kokkupuutekontsentratsiooni kasutamisest. Täiendavad juhendid C × t uuringus kasutatavate loomade arvu ja kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).

Eeluuring: C × t määramise eeskiri

35. Uuritava kemikaali mõju hindamiseks ja põhiuuringu kokkupuutekontsentratsioonide valimiseks kasutatakse eeluuringut. Vajalik võib olla eeluuring, milles kasutatakse kuni kolme looma soo ja kontsentratsiooni kohta (vt lähemalt juhenddokumendi nr 39 (2) III liide), et valida põhiuuringu jaoks sobiv algkontsentratsioon ja minimeerida kasutatavate loomade arvu. Soolise erinevuse kindlaksmääramiseks võib olla vajalik kasutada kolme looma soo kohta. Need loomad peaksid puutuma ainega kokku katse ühe ajavahemiku jooksul, tavaliselt 240 minutit. Asjakohaste katsekeskkondade loomise võimalikkust tuleks hinnata ilma loomadeta tehtavate tehniliste proovikatsete ajal. Eeluuringu tegemine ei ole tavaliselt vajalik, kui suremuse andmed on kättesaadavad B.52 kohasest uuringust (4). B.2 kohase uuringu lähtesihtkontsentratsiooni valides peaks uuringu juht arvesse võtma kõiki olemasolevaid B.52 kohastes uuringutes (4) mõlema soo ja kõigi katsetatud kontsentratsioonide kohta saadud suremuse andmeid (vt juhenddokument nr 39 (2)).

Lähtekontsentratsioon: C × t määramise eeskiri

36. Lähtekontsentratsioon (I kokkupuude) (1. liide) on kas piirkontsentratsioon või uuringu juhi poolt eeluuringu alusel valitud kontsentratsioon. Kahest loomast (üks kummagi soo kohta) koosnevad rühmad viiakse kokkupuutesse kõnealuse kontsentratsiooniga mitme ajavahemiku vältel (näiteks 15, 30, 60, 120 või 240 minutit), mis teeb kokku kümme looma (I kokkupuude) (1. liide).

37. Piirkontsentratsiooni valimine sõltub tavaliselt regulatiivsetest nõuetest. Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaaside, aurude ja aerosoolide piirkontsentratsioonid vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l (või suurim saavutatav kontsentratsioon) (3). Mõne uuritava kemikaali, eelkõige auru või aerosooli piirkontsentratsiooni tekitamine võib olla tehniliselt keeruline. Aerosooli katsetamisel peaks eesmärk olema saavutada sissehingamiseks sobiv osakeste suurus (st MMAD 1–4 μm) piirkontsentratsioonil 2 mg/l. See on enamiku uuritavate kemikaalide puhul võimalik. Aerosooli katsetamist rohkem kui 2 mg/l juures tuleks proovida ainult juhul, kui sissehingamiseks sobiv osakeste suurus on võimalik saavutada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Määruses (EÜ) nr 1272/2008 ei soovitata loomade heaolu kaalutlustel piirkontsentratsiooni ületava kontsentratsiooniga katsetamist (3). Piirkontsentratsiooni ületava kontsentratsiooni katsetamist tuleks kaaluda ainult juhul, kui on suur tõenäosus, et kõnealuse katse tulemustel on otsene mõju inimeste tervise kaitsele (3), ja katseprotokollis tuleks seda põhjendada. Plahvatusohtliku uuritava kemikaali puhul tuleks olla hoolikas, et vältida plahvatust võimaldavaid tingimusi. Loomade ebavajaliku kasutamise vältimiseks tuleks enne katset lähtekontsentratsiooniga teha proovikatse ilma loomadeta, et tagada kõnealuse kontsentratsiooni jaoks vajalike kambritingimuste saavutatavus.

38. Kui lähtekontsentratsiooni juures täheldatakse, et loomad surevad või on suremas, võib kõnealuse kontsentratsiooniga saadud tulemusi kasutada lähtepunktina edasiseks katsetamiseks muude kontsentratsioonidega (vt põhiuuring). Kui uuritava kemikaali füüsikalised või keemilised omadused muudavad piirkontsentratsiooni saavutamise võimatuks, tuleks katsetada suurimat saavutatavat kontsentratsiooni. Kui suurim saavutatav kontsentratsioon põhjustab alla 50 % suremuse, ei ole edasine katsetamine vajalik. Kui piirkontsentratsiooni ei ole võimalik saavutada, tuleks katseprotokollis esitada selgitus ja seda toetavad andmed. Kui auru suurim saavutatav kontsentratsioon ei ole mürgine, siis võib olla vajalik lisada uuritavat kemikaali vedelikaerosoolina.

Põhiuuring: C × t määramise eeskiri

39. Põhiuuringus katsetatav lähtekontsentratsioon (I kokkupuude) (1. liide) on kas piirkontsentratsioon või uuringu juhi poolt eeluuringu alusel valitud kontsentratsioon. Kui I kokkupuute ajal või selle järel täheldatakse loomade suremist, võetakse suremist põhjustav minimaalne kokkupuude (C × t) aluseks II kokkupuute kontsentratsiooni ja ajavahemike kindlaksmääramisel. Iga edasine kokkupuude oleneb eelnevast kokkupuutest (vt 1. liide).

40. Paljude uuritavate kemikaalide puhul on lähtekontsentratsiooniga saadud tulemused koos kolme lühema täiendava kokkupuutega (kokkupuute ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille järjestikuste ajavahemike erinevust näitab progressiooni kordaja, tavaliselt √2) piisav C × t suremuse suhte kindlaksmääramiseks (15), kuid otstarbekas võib olla viienda kokkupuutekontsentratsiooni kasutamine (vt 1. liide ja juhenddokument nr 39 (2)). C × t protokolli tulemuste matemaatiline käsitlus on esitatud 1. liites.

VAATLUSED

41. Loomi tuleks kokkupuute ajal sageli kliiniliselt jälgida. Pärast kokkupuudet tuleks kliinilised vaatlused korraldada vähemalt kaks korda kokkupuutepäeva jooksul või, kui loomade reageerimine kokkupuutele seda nõuab, ka sagedamini, ja seejärel vähemalt kord päevas kokku 14 päeva jooksul. Vaatlemise ajavahemiku kestus ei ole kindlaks määratud; see tuleks määrata kliiniliste nähtude laadi, tekkimisaja ja taastumisperioodi pikkuse alusel. Mürgistusnähtude ilmumise ja kadumise aeg on oluline eelkõige juhul, kui mürgistusnähtudel on kalduvus avalduda viitmõjuna. Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed. Suremas olevad loomad ja loomad, kellel esinevad tugeva valu ja/või püsivad suurte kannatuste tunnused, tuleks loomade heaolu kaalutlustel humaansel viisil surmata. Mürgistuse kliiniliste nähtude vaatluste tegemisel tuleks olla hoolikas, et mitte pidada kokkupuutekatsest põhjustatud esialgset kehva välimust ja ajutisi hingamismuutusi uuritava kemikaaliga seotud mürgistuseks, mis nõuaks loomade enneaegset surmamist. Tuleks võtta arvesse humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (nr 19) esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (7). Kui loomad surmatakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.

42. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, hingamise, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Võimaluse korral tuleks eristada lokaalset ja süsteemset mõju ja need registreerida. Tuleb pöörata tähelepanu värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma esinemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib anda lisaandmeid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüpertermia kohta, mis on seotud kokkupuute või vangistusega.

Kehamass

43. Iga looma kehamass tuleks registreerida üks kord kohanemise perioodi vältel, kokkupuute päeval enne kokkupuudet (päev 0) ning vähemalt päevadel 1, 3 ja 7 (ning seejärel iga nädal) ja surma või eutanaasia korral, kui see toimub pärast päeva 1. Kehamass on teatavasti mürgistuse oluline näitaja ja seega tuleks täpselt jälgida loomi, kelle kehamass väheneb püsivalt ≥ 20 % võrreldes uuringueelsete näitajatega. Ellujäänud loomad kaalutakse ja surmatakse humaansel viisil kokkupuutejärgsel ajavahemikul.

Patoloogia

44. Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kes surmati eutanaasiaga või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse täielikult. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leidmist ei ole võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloogilised muutused tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede mis tahes muutustele.

45. Uuringu tõlgendusväärtuse laiendamiseks võidakse kaaluda kavandis eelnevalt ette nähtud täiendavaid uuringuid, näiteks ellujäänud rottide kopsude massi mõõtmine ja/või hingamisteede ärrituse tõendamine hingamisteede mikroskoobiga vaatlemise alusel. Uurida võib ka organeid, milles 24 tundi või kauem elanud loomadel esineb patoloogilisi muutusi, samuti organeid, mis teadaolevalt või eeldatavasti võivad olla kahjustatud. Kogu hingamistee mikroskoobiuuring võib anda kasulikku teavet veega reageeriva uuritava kemikaali, näiteks happe või hügroskoopse kemikaali kohta.

ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE

Andmed

46. Tuleks esitada andmed iga üksiku looma kehamassi ja lahkamistulemuste kohta. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete mürgistusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud.

Katseprotokoll

47. Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.

Katseloomad ja pidamistingimused

 Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline niiskus, valgustusperiood ja sööt.

 Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus.

 Loomade arv, vanus ja sugu.

 Randomiseerimismeetod.

 Sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda tüüp/päritolu, vee päritolu).

 Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karantiin ja haiguste ravi.

Uuritav kemikaal

 Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).

 Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi nr, kui see on teada.

Kandeaine

 Kandeaine kasutamise põhjendus ja valiku põhjendus (kui kandeainena ei kasutata vett).

 Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta uuringu tulemusi.

Inhalatsioonikamber

 Inhalatsioonikambri, sh selle mõõtmete ja mahu kirjeldus.

 Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.

 Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni mõõtmise seadmed.

 Õhuallikas ja kambrisse suunatud / kambrist välja lastud õhu töötlemine ning konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.

 Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud meetodid.

 Rõhuerinevus (positiivne või negatiivne).

 Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude); loomade paiknemine süsteemis (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).

 Katsekeskkonna ajaline homogeensus/stabiilsus.

 Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonnast proovide võtmine kambris.

 Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).

 Teave hapniku ja süsinikdioksiidi sisalduse mõõtmiseks kasutatud seadmete kohta, vajaduse korral.

 Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t95).

 Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.

 Mõõteseadmed (vajaduse korral).

Andmed kokkupuute kohta

 Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.

 Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemikaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).

 Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoonist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, aur, aerosool) puhul võidakse iga faasi eraldi analüüsida.

 Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutes (näiteks mg/l, mg/m3 jne); sulgudes võib lisada ka ruumalaühikud (näiteks ppm, ppb jne).

 Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve (σg) ning nende arvutamise meetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.

Katsetingimused

 Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh andmed mis tahes meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste suuruse vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks. Kui mehaanilised protsessid võivad olla muutnud uuritava kemikaali koostist, tuleb lisada nende analüüside tulemused, mille abil kontrolliti uuritava kemikaali koostist.

 Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkonnaga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).

 Andmed kasutatud keemilise analüüsi meetodi kohta ja meetodi valideerimise kohta (sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukeskkonna analüüsil).

 Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.

Tulemused

 Tabelid katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu kohta.

 Tabelid kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni andmete kohta.

 Tabelid osakeste suurusjaotuse kohta, sh analüüsiproovide võtmise andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σg arvutamine.

 Tabelid iga looma reageerimise ja kontsentratsioonide kohta (st mürgistusnähtudega loomad, kaasa arvatud surnud loomad, mõjude laad, raskus, ilmumise aeg ja mõju kestus).

 Uuringul registreeritud konkreetse looma kehamass; surmakuupäev ja -aeg, kui loom sureb enne plaanijärgset eutanaasiat, mürgistusnähtude tekke aeg ja pöörduvus konkreetse looma puhul.

 Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.

 Suremuse hinnangud (näiteks LC50, LD01), sh 95 % usalduspiirid ja kõvera tõus (kui see hindamismeetodi alusel esitatakse).

 Statistiline seos, sh eksponendi n hinnang (C × t määramise eeskiri). Tuleks esitada kasutatud statistikatarkvara nimetus.

Tulemuste arutelu ja tõlgendamine

 Eritähelepanu tuleks pöörata nende meetodite kirjeldamisele, mida kasutati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piirkontsentratsioon või osakeste suurus.

 Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda osakeste sissehingamiseks sobivat suurust, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei olnud võimalik täita.

 Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (8) sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis tuleks esitada selgitus.

 Kui katsetamine käesoleva lisa peatüki B.52 (4) alusel katkestati käesoleva katsemeetodi B.2 rakendamiseks, siis tuleks seda põhjendada.

 Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioonide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tegeliku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.

 Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist toimeviisi (süsteemne või lokaalne).

KIRJANDUS

1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.

2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.

3) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).

4) Käesoleva lisa peatükk B.52 „Äge mürgisus sissehingamisel – ägeda mürgisuse klassi määramise meetod”.

5) Käesoleva lisa peatükk B.40 „Nahasöövituskatse in vitro: transkutaanse elektritakistuse (TER) mõõtmine”.

6) Käesoleva lisa peatükk B.40a „Nahasöövituskatse in vitro: katse inimnaha mudeliga”.

7) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.

8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.

9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.

10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.

11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167.

12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290.

13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.

14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.

15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.

16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.

MÕISTE

Uuritav kemikaal : iga aine või segu, mida uuritakse/uuriti käesoleva katsemeetodi abil.

1. liide

C × t määramise eeskiri

1. Sissehingamisel avalduva mürgisuse hindamisel võib tavalise määramiseeskirja alternatiivina kaaluda astmelist C × t (kontsentratsioon × aeg) määramise eeskirja (12, 13, 14). Seda tuleks kasutada eelistatavalt juhul, kui konkreetne regulatiivne või teaduslik vajadus nõuab loomade katsetamist mitme ajavahemiku vältel, näiteks hädaolukorrale reageerimise või maakasutuse kavandamiseks. Sel juhul alustatakse tavaliselt piirkontsentratsioonil katsetamisest (I kokkupuude), mille puhul loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga viie ajavahemiku jooksul (näiteks 15, 30, 60, 120 ja 240 min), nii et ühe kokkupuute ajal püütakse saada andmed mitme ajavahemiku kohta (vt joonis 1). Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaasi, auru ja aerosooli piirkontsentratsioon vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l. Neid tasemeid võib ületada ainult juhul, kui kõnealustel tasemetel katsetamiseks on regulatiivne või teaduslik vajadus (vt B.2 põhiteksti punkt 37).

2. Kui uuritava kemikaali mürgisuse kohta on vähe teavet või seda ei ole üldse, tuleks teha eeluuring, mille vältel loomarühmad, milles on kuni kolm looma kummastki soost, viiakse tavaliselt 240 minuti vältel kokkupuutesse uuringu juhi valitud sihtkontsentratsiooniga.

3. Kui I kokkupuute ajal katsetatakse piirkontsentratsiooni ja täheldatakse suremust alla 50 %, ei ole täiendav katsetamine vajalik. Kui on regulatiivne või teaduslik vajadus määrata kontsentratsiooni/aja/mõju vaheline seos piirkontsentratsioonist suuremal kontsentratsioonil, tuleks järgmine kokkupuude teha kõrgema tasemega, näiteks piirkontsentratsioonist kaks korda suurema kontsentratsiooniga (s.o 2L joonisel 1).

4. Kui piirkontsentratsiooni juures täheldatakse mürgisust, on vaja teha täiendav uuring (põhiuuring). Kõnealused täiendavad kokkupuuted tehakse kas väiksema kontsentratsiooniga (joonisel 1: II, III või IV’ kokkupuude) või suurema kontsentratsiooniga, kasutades lühemaid ajavahemikke (joonisel 1: IV kokkupuude), mis on kohandatud ja mille vahed ei ole nii suured.

5. Katse (esialgne kontsentratsioon ja täiendavad kontsentratsioonid) tehakse, kasutades iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta kas ühte looma kummastki soost või kahte looma sellest soost, kumb on tundlikum. Mõnel juhul võib uuringu juht otsustada, et iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta kasutatakse kahte rotti kummastki soost (või nelja looma tundlikumast soost) (15). Kui kirjeldatud määramiseeskirja puhul kasutatakse iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta kahte looma kummastki soost, väheneb tavaliselt andmete kallutatus ja hinnangute muutlikkus, suureneb hinnangute täpsus ja paraneb hälvete kirjeldatavus usaldusvahemikuga. Täpsemad üksikasjad on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).

6. Ideaaljuhul tehakse iga kokkupuude ühel päeval. See võimaldab viivitada järgmise kokkupuutega, kuni võib olla mõistlikult kindel, et loomad jäävad ellu, ja see võimaldab uuringu juhil kohandada järgmise kokkupuute jaoks sihtkontsentratsiooni ja ajavahemikku. Iga kokkupuudet soovitatakse alustada rühmaga, kelle kokkupuute kestus on kõige pikem, näiteks 240-minutilise kokkupuutega rühm, seejärel 120-minutilise kokkupuutega rühm jne. Kui näiteks loomad 240 minuti rühmas 90 minuti möödudes surevad või neil täheldatakse raske mürgistuse nähte (näiteks hingamisrütmi äärmuslikud muutused, nagu raske hingamine), ei ole mõistlik rühmale 120 minuti pikkust kokkupuudet korraldada, kuna suremus oleks tõenäoliselt 100 %. Seega peaks uuringu juht valima kõnealuse kontsentratsiooni jaoks lühemad kokkupuute ajavahemikud (näiteks 90, 65, 45, 33 ja 25 minutit).

7. Kambrikontsentratsiooni tuleks mõõta sageli, et määrata kindlaks ajaga kaalutud keskmine kontsentratsioon kokkupuute iga ajavahemiku kohta. Alati kui on võimalik, tuleks statistilise analüüsi jaoks kasutada iga looma surmaaega (kokkupuute kestuse asemel).

8. Esimese nelja kokkupuute tulemusi tuleks uurida, et määrata kindlaks kontsentratsiooni ja aja kõvera andmelüngad (vt joonis 1). Kui kooskõla ei ole piisav, võib korraldada täiendava kokkupuute (5. kontsentratsioon). 5. kokkupuutekontsentratsioon ja ajavahemikud tuleks valida nii, et kõrvaldatakse kõnealune andmelünk.

9. Kõiki kokkupuuteid (sh esimest kokkupuudet) kasutatakse statistilise analüüsi alusel kontsentratsiooni, aja ja mõju vahelise seose arvutamiseks (16). Kui see on iga C × t intervalli puhul võimalik, siis tuleks kasutada ajaga kaalutud keskmist kontsentratsiooni ja kokkupuute kestust surmani (kui loom sureb kokkupuute ajal).

Joonis 1
Hüpoteetiline joonis kontsentratsiooni, aja ja suremuse vahelise seose kohta rottidel image
Valged sümbolid = ellujäänud; mustad sümbolid = surnud loomad
Kolmnurgad = emased; ringid = isased
Katkematu joon = LC50 väärtused (vahemik 7,5–240 min) kõigi n = 1 isaste puhul
Katkendjoon = LC50 väärtused (vahemik 7,5–240 min) kõigi n = 1 emaste puhul
Punktiirjooned = hüpoteetilised LC50 väärtused isaste ja emaste puhul, kui n oleks olnud 2 (12).
Mõisted
kontsentratsioon
kokkupuute aeg
piir

10. Allpool on esitatud astmelise toimimiskäigu näide.

I kokkupuude.    Katse piirkontsentratsioonil (vt joonis 1)

 Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma ( 16 )

 Sihtkontsentratsioon ( 17 ) = piirkontsentratsioon.

 Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga kõnealusel sihtkontsentratsioonil vastavalt 15, 30, 60, 120 ja 240 minutiks.

II kokkupuude ( 18 ).    Põhiuuring

 Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma.

 Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal kontsentratsioonil ( 19 ) (1/2L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahemikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).

III kokkupuude.    Põhiuuring

 Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma.

 Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal kontsentratsioonil ()  (1/4L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahemikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).

IV’ kokkupuude.    Põhiuuring

 Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma.

 Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal kontsentratsioonil ()  (1/8L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahemikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).

↓ või

IV kokkupuude.    Põhiuuring

 Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma.

 Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga suuremal kontsentratsioonil ( 20 ) (2L) mõnevõrra lühemateks kokkupuute ajavahemikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).

C × t määramise eeskirja tulemuste matemaatiline tõlgendamine

11. Nelja või viie kokkupuutekontsentratsiooniga ja viie ajavahemikuga C × t määramise eeskiri annab tulemuseks vastavalt 20 või 25 andmepunkti. Kõnealuste andmepunktide põhjal on võimalik arvutada C × t seos statistilise analüüsi abil (16).

Võrrand 1:

image

kus C = kontsentratsioon; t = kokkupuute kestus, või

võrrand 2:

image

kus

image

Võrrandi 1 abil on võimalik arvutada LC50 väärtus konkreetse ajavahemiku jaoks (näiteks 4 tundi, 1 tund, 30 minutit või muu ajavahemik katsetatud ajavahemike piires), kasutades väärtust P = 5 (50 % vastus). Pange tähele, et Haberi seadus on kohaldatav ainult juhul, kui n = 1. LC01 saab arvutada P = 2,67 alusel.

▼B

B.3.   ÄGE MÜRGISUS (NAHAKAUDNE)

1.   MEETOD

1.1.   SISSEJUHATUS

Vt B osa üldist sissejuhatust (A).

1.2.   MÕISTED

Vt B osa üldist sissejuhatust (B).

1.3.   VÕRDLUSAINED

Puuduvad.

1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Testaine kantakse astmeliste annustena mitme rühma katseloomade nahale nii, et üks rühm saab ühesuguse annuse. Järgnevalt jälgitakse mõju ja surmajuhtumite esinemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.

Tõsistele ja kestvatele kannatustele ja valule viitavate märkidega loomad võib vaja olla humaanselt surmata. Testaineid pole vaja annustada moel, mis teadaolevalt tekitab märgatavat söövitavatest või ärritavatest omadustest tingitud valu ja kannatusi.

1.5.   KVALITEEDINÕUDED

Puuduvad.

1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.6.1.   Ettevalmistused

Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsepuurides katsele vastavatel pidamis- ja söötmistingimustel. Täiskasvanud noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse katserühmadesse. Ligikaudu 24 tundi enne katset eemaldatakse pügamise või raseerimise teel katseloomade keha seljaosalt karvkate. Karvkatte pügamisel või raseerimisel tuleb vältida naha marrastamist, kuna see võib mõjutada naha läbilaskvust. Testaine nahale kandmiseks tuleb vabastada vähemalt 10 % kehapinnast. Tahkete, vajaduse korral peenestatud ainete puhul tuleks testainet nahaga hea kokkupuute saavutamiseks niisutada piisava koguse vee või sobiva kandjaga. Kandja kasutamisel tuleb arvestada selle mõjuga testaine nahaläbimisvõimele. Vedelaid testaineid kasutatakse üldjuhul lahjendamata kujul.

1.6.2.   Katsetingimused

1.6.2.1.   Katseloomad

Kasutada võib täiskasvanud rotte või küülikuid. Kasutada võib ka muid liike, kuid seda tuleb põhjendada. Kasutada tuleks tavapäraseid laboritöös kasutatavaid liine. Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses kummagi soo puhul eraldi ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.

1.6.2.2.   Katseloomade arv ja sugu

Iga annuse taseme kohta tuleb kasutada vähemalt viit katselooma. Nad peaksid olema samast soost. Emasloomade kasutamisel ei tohiks nad olla poeginud ega tiined. Kui on andmeid selle kohta, et ühe soo esindajad on märgatavalt tundlikumad, tuleks kasutada sellest soost loomi.

Märkus: ägeda mürgisuse katsetes närilistest kõrgemate loomadega tuleks kaaluda väiksema arvu loomade kasutamist. Annused tuleks valida hoolikalt ja vältida tuleks mõõdukalt mürgiste annuste ületamist. Testaine surmavate annuste manustamist tuleks sellistes katsetes vältida.

1.6.2.3.   Annused

Erinevaid annusemäärasid peaks olema küllaldaselt, vähemalt kolm, ja nende vahed peaksid olema sellised, et saadakse erinevate mürgistusnähtude ja suremusega katserühmad. Annusemäärade valikul tuleks arvesse võtta mis tahes võimalikku ärritavat või söövitavat mõju. Andmeid peaks olema küllaldaselt annuse/reaktsioonikõvera koostamiseks ja võimalusel LD50 nõuetekohaseks määramiseks.

1.6.2.4.   Piirsisalduskatse

Eespool kirjeldatud meetodi kohaselt võib teha piirsisalduskatse viiest isas- ja viiest emasloomast koosnevas rühmas annusega vähemalt 2 000 mg/kg kehakaalu kohta. Kui katses esineb ühendiga seotud suremust, võib kaaluda täiemahulise uuringu tegemist.

1.6.2.5.   Vaatlusperiood

Vaatlusperioodi kestus peaks olema vähemalt 14 päeva. Vaatlemise kestust ei tohiks siiski jäigalt fikseerida. See peaks sõltuma mürgistusnähtudest, nende ilmnemise kiirusest ja paranemisperioodi pikkusest; seega võib seda vajadusel pikendada. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise aeg, nende kestus ja surma aeg on väga olulised, eriti kui surm saabub sageli hiljem.

1.6.3.   Katse käik

Loomi tuleks puurides pidada ühekaupa. Testaine tuleks kanda ühtlaselt alale, mis moodustab ligikaudu 10 % kogu kehapinnast. Väga mürgiste ainete puhul võib katta väiksema osa kehapinnast, kuid võimalikult suur osa pinnast tuleks katta võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga.

Testainet tuleks 24tunnise kokkupuuteperioodi jooksul poorse marlisideme ja mitteärritava kleeplindi abil naha vastas hoida. Manustamiskoht tuleks veel lisaks sobival moel kinni katta, et hoida marlisidet ja testainet paigal ja vältida testaine allaneelamist katselooma poolt. Et vältida testaine allaneelamist, võib kasutada looma liikuvust piiravaid vahendeid, kuid looma täielikku fikseerimist ei soovitata.

Kokkupuuteperioodi lõpus tuleks testaine jääk nahalt võimaluse korral veega või muu sobiva puhastusmeetodi abil eemaldada.

Vaatlustulemused tuleks vaatluse käigus süstemaatiliselt registreerida. Iga looma kohta tuleb pidada eraldi arvestust. Esimesel päeval tuleks loomi vaadelda tavapärasest sagedamini. Vähemalt kord tööpäevas tuleks läbi viia põhjalik kliiniline uuring; muid vaatlusi tuleks teha iga päev, rakendades sobivaid abinõusid loomade kao piiramiseks uuringus, nt surnuna leitud loomad lahata või külmutada ja nõrgad või surevad loomad eraldada või surmata.

Vaadelda tuleks muutusi nii karvkattes, testainega töödeldud nahas, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses aktiivsuses ja käitumises. Erilist tähelepanu tuleks pöörata värinatele, krampidele, süljeeritusele, kõhulahtisusele, letargiale, unele ja koomale. Surmahetk tuleb registreerida võimalikult täpselt. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad. Registreerida tuleks kõik makropatoloogilised muutused. Vastaval näidustusel tuleks võtta koeproove histopatoloogilisteks uuringuteks.

Mürgisuse hindamine teisel sool

Uuringute lõpetamisel ühest soost katseloomadega annustatakse vähemalt viiest vastassoost loomast koosnevale rühmale, et kontrollida, ega selle soo esindajad testaine suhtes märgatavalt tundlikumad pole. Üksikjuhtudel võib olla õigustatud väiksema arvu loomade kasutamine. Kui on küllalt andmeid selle kohta, et uuritavast soost loomad on märgatavalt tundlikumad, võib katsetest vastassoost loomadega loobuda.

2.   ANDMED

Andmed tuleks esitada kokkuvõtliku tabelina, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul, iga looma surma aega, muude mürgistusnähtudega loomade arvu, mürgistusnähtude kirjeldust ja lahkamistulemusi. Kõik loomad kaalutakse ja mass registreeritakse vahetult enne testaine manustamist, seejärel igal nädalal ning surmahetkel; kui looma elumus katses ületab ühe päeva, tuleks arvutada ja registreerida tema massimuutused. Ühendiga seotud kannatuste ja valu tõttu humaanselt surmatud loomad registreeritakse ühendiga seotud suremusena. Tunnustatud meetodi kohaselt määratakse LD50.

Andmetele hinnangu andmisel tuleks arvesse võtta kõigi kõrvalekallete, sealhulgas käitumuslike ja kliiniliste kõrvalekallete, makropatoloogiliste kahjustuste, kehamassi muutuste, suremuse ja mis tahes muude mürgistusnähtude mis tahes võimalikku sõltuvust kokkupuutest testainega ning nende esinemissagedust ja tõsidust.

3.   ARUANDLUS

3.1.   KATSEARUANNE

Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

 liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne;

 katsetingimusi (sealhulgas naha puhastamise meetodit ja sideme tüüpi: oklusiivside või tavaline side);

 annuseid (kandja kasutamisel koos kandjaga ja kontsentratsioone);

 katseloomade sugu;

 tabelit reaktsiooni andmetega soo ja annuse määra järgi (st katse käigus surnud või surmatud loomade arvu, mürgistusnähtudega loomade arvu, kokkupuutes olnud loomade arvu);

 surma aega, arvestatuna annuse saamise ajast loomade humaanse surmamise põhjusi ja seejuures rakendatud kriteeriume;

 kõiki vaatlusandmeid;

 täiemahulises uuringus kasutatud soo 14 päeva kestel määratud LD50 väärtust (märkega määramismeetodi kohta);

 leitud LD50 väärtuse 95 % usaldusvahemikku (kui seda on võimalik esitada);

 annuse/suremuse kõverat ja selle tõusu (kui määramismeetod seda võimaldab);

 lahkamistulemusi;

 kõiki histopatoloogilisi leide;

 kõiki katsetulemusi teisest soost loomade puhul;

 tulemuste analüüsi (erilist tähelepanu tuleks pöörata katse ajal tehtud viidud humaanse surmamise võimalikule mõjule arvutatud LD50 väärtusele);

 tulemuste tõlgendust.

3.2.   HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE

Vt B osa üldist sissejuhatust (D).

4.   VIITED

Vt B osa üldist sissejuhatust (E).

B.4.   ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS

1.   MEETOD

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 404ga (2002).

1.1.   SISSEJUHATUS

Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, aine söövitavust ja ärritavust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu. Kui saadaolevad andmed on ebapiisavad, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (1). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele soovitatakse vastavalt olukorrale, et in vivo algkatses kohaldatakse looma suhtes kolme katselappi järjestikku, mitte korraga.

Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava katseaine võimalikku naha söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uurimustest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (2, 3) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tulemused (4, 5, 5a). Käesolev analüüs peaks vähendama vajadust teha in vivo katseid selliste ainetega, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta on muudest uurimustest juba piisavalt tõendeid saadud.

Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (6), millest osavõtjad seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsestrateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt harmoneeritud süsteemis (GHS) (7). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsetamisstrateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.

Kui söövitavust või ärritavust ei saa kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt osakaalu analüüsimise abil, tuleks kaaluda in vivo katset (vt lisa).

1.2.   MÕISTED

Nahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine kuni neli tunni jooksul pärast katseaine manustamist.

Nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse, s.t nähtava marrasknahast pärisnahani ulatuva nekroosi tekkimine kuni nelja tunni jooksul pärast katseaine manustamist. Tüüpilised söövitusreaktsioonid on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14päevase jälgimisperioodi lõpus naha heledaks muutumise tõttu värvimuutus, täielik karvakadu ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogiat.

1.3   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma nahale, katselooma töötlemata kehapinnad toimivad kontrollina. Ärritavuse/söövitavuse astet konstateeritakse ja märgitakse täpsustatud intervallid ning seda astet kirjeldatakse mõjude hindamise täiendamiseks. Uurimus kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata.

Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites 8.

1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.1.    In vivo katse ettevalmistamine

1.4.1.1.   Loomaliikide valik

Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide kasutamist tuleks põhjendada.

1.4.1.2.   Loomade ettevalmistamine

Ligikaudu 24 tunni jooksul enne katset lõigatakse loomade seljaosa karvad lühikeseks. Tuleks vältida naha marrastamist ning kasutama peaks üksnes terveid, terve nahaga loomi.

Mõnedel küüliku liinidel esineb tihedaid karvalaike, mis on silmatorkavamad teatavatel aastaaegadel. Selliseid tiheda karvastikuga kehapindasid ei tohiks kasutada katsetamise kohana.

1.4.1.3.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused

Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, peaks seda hoidma vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.

1.4.2.   Katsemenetlus

1.4.2.1.   Katseaine manustamine

Katseainet tuleks panna väikesele nahapinnale (ligikaudu 6 cm2) ja see kaetakse marlilapiga, mis kinnitatakse nahka mitteärritava teibiga. Kui ainet ei ole võimalik otse peale kanda (nt vedelikud või mõned pastad), kantakse katseaine esmalt marlilapile, mis seejärel asetatakse nahale. Lappi hoitakse õrnalt vastu nahka sobiva, pooltihke sideme abil kogu mõjuaja. Kui katseaine kantakse lapile, tuleks see lapp kinnitada nahale selliselt, et aine puutuks nahaga hästi kokku ja leviks nahal ühtlaselt. Tuleks tõkestada looma ligipääsu lapile ja katseaine allaneelamist või sissehingamist.

Vedalaid katseaineid kasutatakse üldiselt lahjendamata kujul. Tehes katseid tahkete ainetega (mida võib vajaduse korral pulbristada), tuleks katseainet niisutada väikese koguse veega (või vajaduse korral muu sobiva kandeainega), et tagada hea kokkupuude nahaga. Kui kasutatakse muid kandeaineid kui vesi, on kandeaine võimalik mõju katseaine põhjustatud nahaärritusele minimaalne või olematu.

Mõjuaja lõpus, mis kestab tavaliselt neli tundi, allesjäänud katseaine eemaldatakse võimaluse korral vee või sobiva lahustiga, muutmata marrasknaha olemasolevat reaktsiooni või puutumatust.

1.4.2.2.   Annusmäär

Uuritavale pinnale kantakse 0,5 ml vedelat või 0,5 g tahket ainet või pastat.

1.4.2.3.   Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus-/-söövitavuskatse)

On eriti soovitav, et algselt tehtaks in vivo katse ühe loomaga, eriti juhul, kui aine võib tõenäoliselt olla söövitav. See on kooskõlas järjestikuste katsete tegemise strateegiaga (vt 1. lisa).

Kui osakaalu analüüsi põhjal on tõendatud, et aine on söövitav, ei ole vaja loomadega katseid jätkata. Enamiku võimalike söövitavate ainete puhul ei ole tavaliselt täiendava in vivo katse tegemine vajalik. Juhul, kui lisateavet peetakse vajalikuks puudulike tõendite tõttu, võidakse sooritada piiratud loomkatse, kasutades järgmist lähenemist: Loomale pannakse üksteise järel kuni kolm katselappi. Esimene lapp eemaldatakse kolme minuti pärast. Kui ei täheldata tõsist nahareaktsiooni, asetatakse teine lapp ja eemaldatakse tunni aja pärast. Kui vaatlus antud etapil viitab sellele, et mõjutamist võib humaanselt pikendada nelja tunnini, pannakse peale kolmas lapp ja see eemaldatakse nelja tunni pärast, misjärel reaktsiooni hinnatakse.

Kui sööbiv mõju on vaadeldav pärast ükskõik millist kolmest järjestikusest mõjutamisest, lõpetatakse katse kohe. Kui sööbiv mõju ei ole vaadeldav pärast viimase lapi eemaldamist, jälgitakse looma 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui söövitus ei teki varem.

Kui katseaine ei tekita söövitust, kuid võib olla ärritav, asetatakse üks lapp ühele loomale neljaks tunniks.

1.4.2.4.   Kinnitav katse (in vivo nahaärritust käsitlev katse täiendavate loomadega)

Kui söövitavat toimet ei ole algkatses jälgitud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil neljatunnisel mõjuperioodil. Kui algkatses on jälgitud ärritavat mõju, tuleks seejärel sooritada kinnitav katse või mõjutada kahte muud looma korraga. Erandkorras, kui algkatset ei ole tehtud, võib kahele või kolmele loomale asetada ühe lapi, mis eemaldatakse nelja tunni pärast. Kui kasutatakse kahte looma, ei ole vaja lisakatset teha, kui mõlematel esineb sama reaktsioon. Muul juhul tehakse katse ka kolmanda loomaga. Ebaselgeid reaktsioone on vaja hinnata, tehes katseid muude loomadega.

1.4.2.5.   Jälgimisperiood

Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused. Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi kuni 14 päeva pärast lapi eemaldamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 14 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.

1.4.2.6.   Kliinilised vaatlused ja naha reaktsioonide hindamine

Kõikidel loomadel uuritakse nahapunetuse ja turse nähte, reaktsioone hinnatakse 60 minuti pärast, seejärel 24, 48 ja 72 tundi pärast lapi eemaldamist. Ühe loomaga algkatses uuritakse uuritavat pinda samuti vahetult pärast lapi eemaldamist. Nahareaktsioone hinnatakse ja registreeritakse vastavalt allpool tabelis toodud hinnetele. Kui nahal on kahjustus, mida ei suudeta tuvastada ärrituse või söövitusena 72 tunni jooksul, võib olla vajalik jälgida kuni 14. päevani, et kindlaks määrata mõjude pöörduvus. Lisaks ärrituse jälgimisele tuleks täielikult kirjeldada ja registreerida kõik sellised paiksed toksilised mõjud nagu naha rasva lahustumine ja mis tahes organismi kahjulikud mõjud (nt mõjud mürgisuse kliinilistele tunnustele ja kehakaalule). Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uurimine.

Naha reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Naha reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabelit allpool). Illustreeritud juhis nahaärrituse või