1998L0057 — ET — 30.07.2006 — 001.001


Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest

►B

NÕUKOGU DIREKTIIV 98/57/EÜ,

20. juuli 1998,

haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolli kohta

(EÜT L 235, 21.8.1998, p.1)

Muudetud:

 

 

Euroopa Liidu Teataja

  No

page

date

►M1

KOMISJONI DIREKTIIV 2006/63/EÜ, 14. juuli 2006,

  L 206

36

27.7.2006




▼B

NÕUKOGU DIREKTIIV 98/57/EÜ,

20. juuli 1998,

haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolli kohta



EUROOPA LIIDU NÕUKOGU,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, eriti selle artiklit 43,

võttes arvesse komisjoni ettepanekut, ( 1 )

võttes arvesse Euroopa Parlamendi arvamust, ( 2 )

võttes arvesse majandus- ja sotsiaalkomitee arvamust ( 3 )

ning arvestades, et:

kahjulik organism Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. oli varem tuntud nime all Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; nimi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. muutub tõenäoliselt nimetatud kahjuliku organismi üldtunnustatud nimeks; käesolevas direktiivis tuleks seda teaduslikku arengut arvesse võtta;

kartuli- ja tomatikasvatusel on ühenduse põllumajanduses oluline koht; kahjulikud organismid ohustavad pidevalt kartuli ja tomati saagikust;

kartuli- ja tomatikasvatuse kaitsmine selliste kahjulike organismide eest peaks lisaks tootmismahu säilitamisele suurendama põllumajanduse tootlikkust;

liikmesriigi territooriumile kahjulike organismide sissetoomise vastu võetavatel kaitsemeetmetel on üksnes piiratud mõju, kui selliste organismide vastu ei võidelda samal ajal ja metoodiliselt kogu ühenduses ega hoita ära nende levimist;

üks kartulile ja tomatile kahjulikke organisme on Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., mis on kartuli bakter-pruunmädaniku ning kartulite ja tomatite bakteriaalse närbumise nakkusetekitaja; selle nakkusetekitaja tekitatud haiguspuhanguid on esinenud mõnes ühenduse osas ning siiani eksisteerib mõni nakkusallikas;

kogu ühenduses on kartuli- ja tomatikasvatuse jaoks märkimisväärne oht, kui nende kultuuride puhul ei võeta tõhusaid meetmeid kõnealuse kahjuliku organismi asukoha ja leviku määramiseks, haigusjuhtude ja leviku vältimiseks ning, kui haigus avastatakse, haiguse leviku takistamiseks ja tõrjeks haiguse likvideerimise eesmärgil;

selle tagamiseks tuleb kogu ühenduses võtta teatavaid meetmeid; lisaks peavad liikmesriigid olema valmis võtma vajaduse korral lisameetmeid või rangemaid meetmeid, tingimusel et see ei takista kartulite või tomatite liikumist ühenduse piires, välja arvatud nõukogu 21. detsembri 1976. aasta direktiivis 77/93/EMÜ (taimedele või taimsetele saadustele kahjulike organismide ühendusse sissetoomise ja seal levimise vastu võetavate kaitsemeetmete kohta) ( 4 ) sätestatud ulatuses; sellistest meetmetest tuleb teatada teistele liikmesriikidele ja komisjonile;

meetmete puhul tuleb arvesse võtta, et haigusetekitaja asukoha määramiseks on vaja teha korrapäraseid ametlikke uuringuid; sellised uuringud peaksid hõlmama kontrollimenetlust ja vajaduse korral ka proovivõtu- ja katsemeetodeid, sest teatavate keskkonnatingimuste juures võib haigus olla varjatud ja märkamatu nii kasvavatel kartulitaimedel kui ladustatud kartulimugulatel; haigusetekitaja levik kasvavate kultuuride hulgas ei ole kõige olulisem tegur, kuid haigusetekitaja võib levida pinnavee ja teatavate looduslike maavitsaliste taimede kaudu ning seetõttu on kartuli- ja tomatitaimede niisutamine nakatunud veega sellistele põllukultuuridele ohtlik; haigusetekitaja võib püsida üle talve isekülvanud kartuli- ja tomatitaimedes ning see võib olla nakkusallikas ühest hooajast järgmisse; haigusetekitaja levib ka kartulite kokkupuutel nakatunud kartulitega ning nakatunud kartulitega kokku puutunud istutus-, koristus- ja käitlemisvahendite või transpordi- ja ladustusmahutitega;

haigusetekitaja levikut saab vähendada või vältida selliste esemete nakkusest puhastamise teel; seemnekartuli selline saastamine on peamine oht haigusetekitaja levikul; samuti on seemnekartuli varjatud nakatumine oluline nakkusetekitaja leviku oht ning seda on võimalik vältida, kasutades ametlikult tunnustatud programmi raames toodetud seemnekartulit, mida on kontrollitud ja mis on haigusest vabaks tunnistatud;

praegused teadmised organismi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. bioloogiast ja epidemioloogiast on Euroopa tingimustes ebatäielikud ning eeldatakse, et ettepandud meetmete läbivaatamine on vajalik mitmel hooajal; samuti eeldatakse katsemenetluse parandamist edasiste uuringute põhjal, eriti katsemeetodite tundlikkuse ja spetsiifilisuse puhul, et valida ja standardida optimaalseid võimalikke katsemeetodeid;

selliste üldmeetmete üksikasjade kindlaksmääramiseks ning haigusetekitaja leviku vältimiseks oma territooriumil liikmesriikide poolt võetavate rangemate või täiendavate meetmete jaoks on soovitav, et liikmesriigid teevad komisjoniga tihedat koostööd alalise taimetervise komitee (edaspidi “komitee”) raames,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:



Artikkel 1

Käesolevas direktiivis käsitletakse meetmeid, mida liikmesriigid peavad võtma organismi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. vastu, varem tuntud kui Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (edaspidi “organism”), et seoses I lisa 1. jaos loetletud organismi peremeestaimedega (edaspidi “loetletud taimne materjal”):

a) määrata selle asukoht ja levik;

b) vältida selle esinemist ja levikut; ning

c) haiguse avastamise korral vältida selle levikut ja tõrjuda haigust likvideerimise eesmärgil.

Artikkel 2

1.  Liikmesriigid viivad igal aastal läbi korrapäraseid ametlikke uuringuid organismi leidmiseks oma territooriumilt pärit loetletud taimses materjalis. Teiste võimalike saasteallikate määratlemiseks, mis ohustavad loetletud taimse materjali tootmist, teevad liikmesriigid riskianalüüsi ning, välja arvatud juhul, kui analüüsiga ei ole kindlaks tehtud organismi leviku ohtu, viivad loetletud taimse materjali tootmise aladel läbi ametliku sihtuuringu organismi leidmiseks muust materjalist kui loetletud taimsest materjalist, sealhulgas looduslikest maavitsalistest peremeestaimedest, samuti pinnaveest, mida kasutatakse loetletud taimse materjali niisutamiseks või sellele pihustamiseks, ning vedeljäätmetest, mis väljutatakse loetletud taimset materjali käitlevatest tööstuslikest töötlemis- või pakendamiskohtadest ja mida kasutatakse loetletud taimse materjali kastmiseks või sellele niisutamiseks. Sellise sihtuuringu ulatus määratakse kindlaks vastavalt identifitseeritud ohule. Liikmesriigid võivad teha ka ametlikke uuringuid organismi leidmiseks sellisest materjalist nagu kasvusubstraat, muld ja tööstuslikest töötlemis- või pakendamiskohtadest tulevad tahked jäätmed.

2.  Lõikes 1 osutatud ametlik uuring viiakse läbi:

a) loetletud taimsel materjalil kooskõlas I lisa II jao punktis 1 sätestatud üksikasjadega; ja

b) muudel peremeestaimedel kui loetletud taimne materjal ning veel, sealhulgas vedelatel jäätmetel, vastavalt asjakohastele meetoditele ning vajaduse korral võetakse proovid, millega tehakse ametlikke või ametliku järelevalve all laborikatseid;

c) vajaduse korral muul materjalil vastavalt asjakohastele meetoditele.

Nende uuringute jaoks määravad vastutavad ametiasutused direktiivis 77/93/EMÜ määratletud tähenduses kontrollimenetluse edasised üksikasjad ning proovide arvu, päritolu, stratifitseerimise ja võtmise aja, võttes arvesse usaldusväärseid teaduslikke ja statistilisi põhimõtteid ja organismi bioloogiat ning arvestades loetletud taimse materjali ja vajaduse korral organismi muude peremeestaimede konkreetseid tootmissüsteeme asjaomases liikmesriigis.

3.  Lõikes 1 osutatud ametlike uuringute üksikasjadest ja tulemustest teavitatakse igal aastal teisi liikmesriike ja komisjoni vastavalt I lisa II jao punkti 2 sätetele. Need teated esitatakse 1. juuniks, välja arvatud oma ettevõttes seemnekartulina kasutatavaid kartuleid käsitlevad teated, mis esitatakse 1. septembriks. Saaki käsitlevad üksikasjad ja saagi kohta saadud tulemused esitatakse eelmise aasta toodangu kohta. Selliste teadete üksikasjad võib esitada komisjonile.

4.  Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võetakse vastu järgmine säte:

 lõike 2 esimese lõigu punktis b sätestatud uuringute ja laboratoorse kontrolli asjakohased meetodid.

5.  Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võib vastu võtta järgmised sätted:

 lõike 2 esimese lõigu punktis c sätestatud uuringute asjakohased meetodid,

 lõike 2 teises lõigus sätestatud uuringute täpsemad üksikasjad, et tagada võrreldav kindlusaste liikmesriikides.

Artikkel 3

Liikmesriigid tagavad, et organismi esinemise kahtlusest või kinnitusest nende territooriumil teatatakse nende vastutavatele ametiasutustele.

Artikkel 4

1.  Haiguse esinemise kahtluse korral tagavad asjaomase liikmesriigi või asjaomaste liikmesriikide vastutavad ametiasutused, et viiakse läbi ametlikud või ametliku järelevalve all tehtud laboratoorsed katsed, kasutades loetletud taimse materjali puhul II lisas sätestatud asjakohast meetodit ning vastavalt III lisa punktis 1 määratletud tingimustele, ning kõikidel muudel juhtudel mis tahes muud ametlikult heakskiidetud meetodit, et kinnitada või lükata ümber haiguse esinemise kahtlus. Kinnitamise korral kohaldatakse III lisa punktis 2 sätestatud nõudeid.

2.  Kuni haiguse esinemise kahtluse kinnitamiseni või ümberlükkamiseni lõike 1 alusel sellistel esinemise kahtluste juhtudel, kus:

i) on nähtud organismi põhjustatud haiguse sümptomeid ning saadud II lisa I jao punktis 1 ja II jaos määratletud kiirmeetodi(te) positiivne tulemus; või

ii) on saadud II lisa I jao punktis 2 ja III jaos määratletud meetodi(te) positiivne tulemus,

siis seoses oma toodanguga:

a) keelavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused kõikidest saakidest, partiidest või saadetistest, kust proovid on võetud, pärit taimede ja mugulate liikumise, välja arvatud nende kontrolli all ja tingimusel, et on tehtud kindlaks organismi leviku identifitseeritava ohu puudumine;

b) võtavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused meetmeid kahtlustatava haiguse esinemise päritolu tuvastamiseks;

c) kehtestavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused asjakohased täiendavad ettevaatusabinõud vastavalt hinnatava ohu tasemele, eelkõige seoses loetletud taimse materjali tootmisega ja muude kui selliste punktis a osutatud seemnekartulipartiide liikumisega, mis on toodetud tootmiskohas, kust punktis a osutatud proovid on võetud, et vältida organismi levikut.

3.  Nendel haiguse esinemise kahtluse juhtudel, kus on loetletud taimse materjali või pinnavee saastumise oht teisest liikmesriigist või teise liikmesriiki, peab liikmesriik, kus on teatatud haiguse esinemise kahtlusest, teatama viivitamata vastavalt identifitseeritud ohule kõnealuse esinemise kahtluse üksikasjad teistele asjaomastele liikmesriikidele ning need liikmesriigid teevad asjakohast koostööd. Liikmesriigid, keda on teavitatud, kehtestavad ettevaatusabinõud vastavalt lõike 2 punktile c ning võtavad vastavalt vajadusele täiendavaid meetmeid vastavalt lõigetele 1 ja 2.

4.  Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võetakse vastu järgmine säte:

 lõike 2 punktis c osutatud meetmed.

Artikkel 5

1.  Kui ametlik või ametliku järelevalve all tehtud laboratoorne katse, kasutades loetletud taimse materjali puhul II lisas sätestatud meetodit või muudel juhtudel mis tahes muud ametlikult heakskiidetud meetodit, kinnitab organismi olemasolu vastavalt käesolevale direktiivile võetud proovis, siis liikmesriigi vastutavad ametiasutused, võttes arvesse usaldusväärseid teaduslikke põhimõtteid, organismi bioloogiat ning asjakohaseid organismi peremeestaimede tootmis-, turustamis- ja töötlemissüsteeme selles liikmesriigis:

a) loetletud taimse materjali korral:

i) viivad läbi uurimise, et määrata kindlaks saastumise ulatus ja esmane allikas või esmased allikad vastavalt IV lisa sätetele koos täiendavate katsetega vastavalt artikli 4 lõikele 1 vähemalt kõikide samast kloonist pärit seemnekartuli varudega, ning

ii) tunnistavad saastunuks loetletud taimse materjali, saadetise ja/või partii, kust proov on võetud, ning seadmed, sõidukid, laevad, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjali, mis on olnud kontaktis loetletud taimse materjaliga, kust proov on võetud; tunnistavad saastunuks vajaduse korral põllu(d), kasvuhoone osa(d) ja tootmiskoha(d), kust loetletud taimne materjal on koristatud ja kust proov on võetud; ning kasvuperioodil võetud proovide puhul tunnistavad saastunuks põllu(d), tootmiskoha(d) ja vajaduse korral kasvuhoone osa(d), kust proov on võetud, ning

iii) määravad kindlaks, võttes arvesse V lisa punkti 1 sätteid, tõenäolise saaste ulatuse koristamisele eelneva või järgneva kontakti kaudu või tootmise, niisutamise või pihustamise kaudu või seoses saastunuks tunnistatud taimedega samast kloonist pärinemisega, ning

iv) piiritlevad tsooni punkti ii alusel saastunuks tunnistamise, punkti iii alusel tõenäolise saastamise ulatuse määramise ja organismi võimaliku leviku põhjal vastavalt V lisa punkti 2 alapunkti i sätetele;

b) muude kui punktis a nimetatud peremeestaimede saagi korral, kui on loetletud taimse materjali tootmise identifitseeritav oht:

i) viivad läbi uurimise vastavalt punkti a alapunktile i, ja

ii) tunnistavad saastunuks organismi peremeestaimed, kust proov on võetud, ja

iii) määravad kindlaks tõenäolise saastumise ja piiritlevad tsooni vastavalt punkti a alapunktidele iii ja iv seoses loetletud taimse materjali tootmisega;

c) pinnavee korral (sealhulgas loetletud taimset materjali käitlevast tööstusliku töötlemise või pakendamise kohast pärit vedelate jäätmete korral) ning seotud looduslike maavitsaliste peremeestaimede korral, kui esineb loetletud taimse materjali identifitseeritav oht niisutamise, pihustamise või pinnavee üleujutamise kaudu:

i) viivad läbi pinnavee ja looduslike maavitsaliste peremeestaimede, kui need on olemas, proovide uurimise, mis hõlmab ametlikku uuringut asjakohastel aegadel, et määrata saastumise ulatus, ja

ii) tunnistavad vajalikus ulatuses ja punkti i alusel tehtud uurimise põhjal saastunuks pinnavee, kust proov(id) on võetud, ja

iii) määravad kindlaks tõenäolise saastumise ja piiritlevad tsooni punkti ii alusel saastunuks tunnistamise põhjal ning organismi võimaliku leviku, võttes arvesse V lisa punkti 1 ja punkti 2 alapunkti ii sätteid.

2.  Liikmesriigid teavitavad viivitamata teisi liikmesriike ja komisjoni vastavalt V lisa punkti 3 sätetele mis tahes saastumisest, mis on kindlaks määratud vastavalt lõike 1 punkti a alapunktile ii ja lõike 1 punkti c alapunktile ii, ning piiritletud tsooni üksikasjadest vastavalt vajadusele kas lõike 1 punkti a alapunkti iv või lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel. Käesoleva lõike alusel edastatud teate üksikasjad võib edastada komiteele.

Liikmesriigid edastavad samal ajal komisjonile V lisa punktis 4 sätestatud täiendava teate. Käesoleva lõigu alusel edastatud teate üksikasjad edastatakse viivitamata komitee liikmetele.

3.  Lõike 2 alusel saadetud teate ning selles nimetatud üksikasjade põhjal korraldavad teised teates nimetatud liikmesriigid vastavalt lõike 1 punkti a alapunktile i uurimise ning võtavad vajaduse korral täiendavaid meetmeid vastavalt lõigetele 1 ja 2.

Artikkel 6

1.  Liikmesriigid näevad ette, et artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud taimset materjali ei või istutada ning nende vastutavate ametiasutuste kontrolli all ja heakskiidul kohaldatakse selle suhtes ühte VI lisa punkti 1 sätet, et tagada organismi leviku identifitseeritavaohu puudumine.

2.  Liikmesriigid näevad ette, et loetletud taimset materjali, mis on artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti c alapunkti iii kohaselt tõenäoliselt saastunud, sealhulgas taimset materjali, mille puhul on identifitseeritud oht, ning mis on toodetud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii alusel tõenäoliselt saastunuks tunnistatud tootmiskohtades, ei või istutada ning see tuleb vastutavate ametiasutuste kontrolli all asjakohaselt kasutada või hävitada vastavalt VI lisa punktile 2, nii et on tagatud organismi leviku identifitseeritava ohu puudumine.

3.  Liikmesriigid näevad ette, et mis tahes seadmed, sõidukid, laevad, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjal, mis on artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel tunnistatud saastunuks või mille kohta on määratud kindlaks, et need on artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti c alapunkti iii alusel tõenäoliselt saastunud, hävitatakse või puhastatakse saastatusest, kasutades VI lisa punktis 3 määratletud asjakohaseid meetodeid. Pärast saastatusest puhastamist ei käsitata neid objekte enam saastununa.

4.  Ilma et see piiraks lõigete 1, 2 ja 3 alusel rakendatud meetmeid, näevad liikmesriigid ette, et artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv ja punkti c alapunkti iii alusel piiritletud tsoonis rakendatakse VI lisa punktides 4.1 ja 4.2 määratletud meetmeid. Nende meetmete üksikasjad teatatakse igal aastal teistele liikmesriikidele ja komisjonile. Selle teatamise üksikasjad võib esitada komisjonile.

Artikkel 7

1.  Liikmesriigid näevad ette, et seemnekartul peab vastama direktiivi 77/93/EMÜ nõuetele ning olema pärit otse ametlikult kinnitatud programmi alusel saadud materjalist, mille kohta on II lisas sätestatud meetodit kasutades ametlike või ametliku järelevalve all tehtud katsete käigus leitud, et see on organismist vaba.

Eespool nimetatud katsed viib läbi liikmesriik:

a) juhtudel, kui selle riigi seemnekartuli toodangus on kinnitatud organismi olemasolu;

i) b) tehes katseid varasema paljundusmaterjaliga, sealhulgas esmase kloonaretusega, ning tehes süstemaatilisi katseid eliitseemnekartuli kloonidega, või

ii) juhtudel, kui on tehtud kindlaks, et taimed ei ole pärit samast kloonist, tehes katseid kõikide eliitseemnekartuli kloonidega või varasema paljundusmaterjaliga, sealhulgas esmane kloonaretus; ning

b) muudel juhtudel, kas eliitseemnekartuli esmase kloonaretuse iga taimega või esindavate proovidega või varasema paljundusmaterjaliga.

2.  Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võib vastu võtta järgmised meetmed:

 lõike 1 teise lõigu punkti a üksikasjalikud rakenduseeskirjad,

 lõike 1 teise lõigu punktis b sätestatud esindavaid proove käsitlevad eeskirjad.

Artikkel 8

Liikmesriigid keelavad organismi hoidmise ja käitlemise.

Artikkel 9

Ilma et see piiraks direktiivi 77/93/EMÜ sätete kohaldamist, võivad liikmesriigid direktiivis 95/44/EÜ ( 5 ) sätestatud korras lubada erandeid käesoleva direktiivi artiklites 6 ja 8 osutatud meetmetest katsete ja teaduslike eesmärkide puhul ning sordivalikualase töö puhul.

Artikkel 10

Liikmesriigid võivad seoses oma toodanguga vastu võtta selliseid lisameetmeid või rangemaid meetmeid, mis on vajalikud organismiga võitlemiseks või selle leviku vältimiseks niivõrd, kuivõrd need on kooskõlas direktiivi 77/93/EMÜ sätetega.

Nende meetmete üksikasjad teatatakse teistele liikmesriikidele ja komisjonile. Selle teate üksikasjad võib esitada komisjonile.

Artikkel 11

Käesoleva direktiivi lisade muudatused, mis tehakse teaduse ja tehnika arengut silmas pidades, võetakse vastu direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras. Käesoleva direktiivi II lisas sätestatud meetodite ja VI lisa lõigetes 4.1 ja 4.2 sätestatud meetmete korral koostab komisjon aruande, milles ta vaatab need meetodid ja meetmed üle saadud kogemustest lähtudes, ning see aruanne esitatakse komiteele enne 1. jaanuari 2002.

Artikkel 12

1.  Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid 21. augustil 1999. Liikmesriigid teatavad neist viivitamata komisjonile.

Kui liikmesriigid need meetmed vastu võtavad, lisavad nad meetmetesse või meetmete ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

2.  Liikmesriigid edastavad viivitamata komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas vastuvõetud siseriiklike põhiliste õigusnormide teksti. Komisjon teavitab sellest teisi liikmesriike.

Artikkel 13

Käesolev direktiiv jõustub Euroopa Ühenduste Teatajas avaldamise päeval.

Artikkel 14

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.




I LISA

I JAGU

Bakteri Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al . peremeestaimede loetelu, millele on osutatud artiklis 1



Taimed (k.a mugulad), v.a botaanilised seemned, perekonnast Solanum tuberosum L.

Kartul

Taimed, v.a viljad ja seemned, perekonnast Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw.

Tomat

II JAGU

Uuringud

1.

Artikli 2 lõike 2 punktis a osutatud ametlikud uuringud peavad põhinema organismi bioloogilistel omadustel ja asjaomase liikmesriigi konkreetsetel tootmissüsteemidel ning peavad hõlmama:

i) kartuli puhul:

 kasvava kultuuri visuaalset kontrolli asjakohasel ajal ja/või proovide võtmist nii seemne- kui teistest kartulitest kasvuperioodil või laos. Ametliku kontrolli käigus tuleb läbi viia materjali visuaalne kontroll, poolitades mugulaid, ning

 seemnekartuli puhul ja vajadusel ka teiste kartulite puhul ametlikke või ametliku järelevalve all tehtud laboratoorseid katseid, kasutades II lisas esitatud meetodeid;

ii) tomati puhul:

 kasvava kultuuri visuaalset kontrolli asjakohasel ajal ning vähemalt nendel taimedel, mis on ette nähtud ümberistutamiseks nende ametialase kasvatamise eesmärgil.

2.

Artikli 2 lõikes 3 osutatud ametlike uuringute aruanne peab sisaldama:

i) kartulite uuringute puhul:

 seemne- ja muu kartuli kasvatamiseks arvestatud kogupindala hektarites,

 eristamist seemne- ja söögikartuliks ja vajaduse korral kasvatuspiirkonna järgi,

 kontrollimiseks võetud proovide arvu ja aega,

 põllul tehtud visuaalsete kontrollide arvu,

 mugulate visuaalsete kontrollide arvu (ja proovi suurusi);

ii) ametialase kasvatamise jaoks ümberistutamiseks ettenähtud tomatitaimede uuringute puhul:

 taimede hinnangulist koguarvu,

 visuaalsete kontrollide arvu;

iii) muude peremeestaimede kui kartuli ja tomati, sh maavitsaliste sugukonna metsikute peremeestaimede uuringute puhul:

 liiki,

 võetud proovide arvu ja aega,

 vastavalt vajadusele piirkonda või jõge, kust proov on võetud,

 analüüsimeetodit;

iv) tööstusliku töötlemise või pakendamise koha vee ja vedelate jäätmete uuringute puhul:

 proovide arvu ja aega,

 vastavalt vajadusele piirkonda või jõge või asukohta, kust proov on võetud,

 analüüsimeetodit.

▼M1




II LISA

HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOOSIMISE, AVASTAMISE JA KINDLAKSMÄÄRAMISE ANALÜÜSIMETOODIKA

AANALÜÜSIMETOODIA KOHALDAMISALA

Käesoleva metoodikaga kirjeldatakse eri menetlusi, mis on seotud järgmisega:

i) pruun-baktermädaniku diagnoosimisega kartulimugulates ja bakteriaalse närbumistõve diagnoosimisega kartulis ja tomatis ja mõnedes teistes peremeestaimedes;

ii) bakteri Ralstonia solanacearum avastamisega kartulimugulates, kartulis ja tomatis ning mõnedes teistes peremeestaimedes, vees ja mullas;

iii) bakteri Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) kindlaksmääramisega.

SISUKORD



 
 
 

Üldpõhimõtted

I JAGU

Analüüsimetoodika rakendamine

 

1.

Avastusmetoodika pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve (R. solanacearum) diagnoosimiseks pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomitega kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes

 

2.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

 

3.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides

II JAGU

Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamismeetodid kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes, millel on pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomid

 

1.

Sümptomid

 

2.

Kiirsõelkatsed

 

3.

Bakterite isoleerimine

 

4.

Haigusetekitaja R. solanacearum identifitseerimisanalüüsid

III JAGU

1.

Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

 
 

1.1.

Proovi ettevalmistamine

 
 

1.2.

Analüüsimine

 

2.

Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste taimede proovides

 
 

2.1.

Proovi ettevalmistamine

 
 

2.2.

Analüüsimine

IV JAGU

1.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika vees

 

2.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid vees

 
 

2.1.

Proovi ettevalmistamine

 
 

2.2.

Analüüsimine

V JAGU

1.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika mullas

 

2.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid mullas

 
 

2.1.

Proovide ettevalmistamine

 
 

2.2.

Analüüsimine

VI JAGU

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamise ja kindlaksmääramise optimeeritud protokollid

 

A.

Diagnostilised ja avastamisanalüüsid

 
 

1.

Varrelima test

 
 

2.

Polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite tuvastamine

 
 

3.

Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs

 
 

4.

Selektiivne isoleerimine

 
 
 

4.1.

Selektiivsöötmele väljakülvamine

 
 
 

4.2.

Rikastamismenetlus

 
 

5.

Immunofluorestsentstest (IF-analüüs)

 
 

6.

Polümeraasi ahelreaktsiooni test (PCR-analüüs)

 
 
 

6.1.

DNA puhastamismeetodid

 
 
 
 

a)

Pastriki (2000) meetod

 
 
 
 

b)

Muud meetodid

 
 
 

6.2.

PCR-test

 
 
 

6.3.

PCR-produkti analüüs

 
 

7.

In situ fluorestsentshübridisatsioon (FISH-analüüs)

 
 

8.

Ensüümne immunosorbenttest (ELISA-analüüs)

 
 
 

a)

Kaudne ELISA

 
 
 

b)

DASI ELISA (kaudne ELISA sandwich-meetodil)

 
 

9.

Biotest

 

B.

Identifitseerimisanalüüsid

 
 

1.

Toitumuslikud ja ensümaatilised identifitseerimisanalüüsid

 
 

2.

IF-analüüs

 
 

3.

ELISA-analüüs

 
 

4.

PCR-analüüs

 
 

5.

FISH-analüüs

 
 

6.

Rasvhapete profileerimine (FAP)

 
 

7.

Tüve iseloomustamise meetodid

 
 
 

7.1.

Biotüübi määramine

 
 
 

7.2.

Genoomse “sõrmejäljendi” võtmine

 
 
 

7.3.

PCR-meetodid

 

C.

Kinnitusanalüüs

 
 

1. liide

Protokollide optimeerimise ja valideerimisega tegelevad laborid

 
 

2. liide

Söötmed haigusetekitaja R. solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks

 
 

3. liide

A)

Müügil olevad standardiseeritud kontrollmaterjalid

 
 
 

B)

Kontrollide ettevalmistamine

 
 

4. liide

Analüüsimenetluste puhvrid

 
 

5. liide

Bakterite koguse määramine IF-ja FISH-analüüsides

 
 

6. liide

Valideeritud PCR-protokollid ja -reaktiivid

 
 

7. liide

FISH-analüüsi valideeritud reaktiivid

 
 

8. liide

Baklažaani- ja tomatikultuuride kasvatamistingimused

 
 

Viited

 

ÜLDPÕHIMÕTTED

Erinevate meetodite optimeeritud protokollid, valideeritud reaktiivid ning üksikasjad analüüsi ja kontrollainete ettevalmistuse kohta on sätestatud liidetes. 1. liites on sätestatud nende laborite nimekiri, mis tegelesid protokollide optimeerimise ja valideerimisega.

Kuna protokollid hõlmavad ohtliku organismi avastamist ja bakteri R. solanacearum elujõuliste kultuuride kasutamist kontrollmaterjalina, tuleb menetlus läbi viia sobivates karantiinitingimustes, kus on kohased jäätmete kõrvaldamise seadmed ja ametlike taimekarantiini asutuste välja antud litsentside kohased tingimused.

Analüüsiparameetrid peavad tagama bakteri R. solanacearum järjepideva ja uuesti korratava avastamise valitud meetodites sätestatud piirmäärades.

Oluline on positiivsete kontrollproovide täpne ettevalmistamine.

Analüüside tegemisel vastavalt nõutavatele piirmääradele tuleb tähelepanu pöörata ka seadmete õigele seadistusele, hooldusele ja kalibreerimisele, reaktiivide hoolikale käitlemisele ja säilitamisele ning kõigile meetmetele, mille eesmärk on vältida proovide omavahelist saastumist, s.t positiivsete kontrollproovide eraldamisele analüüsitavatest proovidest. Tuleb kohaldada kvaliteedikontrolli standardeid, et vältida halduslikke ja muid vigu, eelkõige seoses märgistamise ja dokumentidega.

Direktiivi 98/57/EÜ artikli 4 lõikes 2 osutatud haiguse esinemise kahtlus tähendab diagrammides määratletud proovi diagnostiliste või sõelkatsete positiivset tulemust. Esimese sõelkatse (IF-analüüs, PCR/FISH, selektiivne isoleerimine) positiivset tulemust tuleb kinnitada teise sõelkatsega, mis põhineb erineval bioloogilisel põhimõttel.

Kui esimese sõelkatse tulemus on positiivne, kahtlustatakse nakatumist bakteriga R. solanacearum ning tuleb teha teine sõelkatse. Kui teine sõelkatse annab positiivse tulemuse, on kahtlus leidnud kinnituse (haiguse esinemise kahtlus) ning tuleb jätkata analüüside tegemist vastavalt metoodikale. Kui teine sõelkatse annab negatiivse tulemuse, ei peeta proovi bakteriga nakatunuks.

Direktiivi 98/57/EÜ artikli 5 lõikes 1 osutatud kinnitatud organismi olemasolu tähendab bakteri R. solanacearum puhaskultuuri isoleerimist ja identifitseerimist koos patogeensuse kinnitusega.

I JAGU

ANALÜÜSIMETOODIKA RAKENDAMINE

1.   Avastusmetoodika pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve (Ralstonia solanacearum) diagnoosimiseks pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve sümptomitega kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes

Analüüsimetoodika on ette nähtud kartulimugulate ja -taimede puhul, millel esinevad tüüpilised või kahtlased pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomid. Siia kuuluvad kiiranalüüsid, saastunud juhtkoest patogeeni isoleerimine (selektiiv)söötmele ja positiivse tulemuse korral bakteri Ralstonia solanacearum kindlaksmääramine.

Kartulimugul(ad) või kartuli-, tomati- või muu(d) pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve kahtlusega peremeestaim(ed) (1)DIAGNOSTILISED KIIRANALÜÜSID (2)Tehakse vähemalt üks järgnev analüüs oletatava diagnoosi määramiseks:varre bakterilima analüüs (3),polü-β-hüdroksübutüraadi analüüs (4),seroloogiline aglutinatsiooni analüüs (5),IF-analüüs (6) / FISH-analüüs (7) / ELISA- analüüs (8) / PCR-analüüs (9).PEAMINE ISOLEERIMISANALÜÜS (10)Tüüpilise morfoloogiaga kolooniad (11)EI (12)JAHHaigusetekitajat R. solanacearum ei avastatud,proov ei ole nakatunud haigusetekitajagaPuhastatakse üldsöötmele taaskülvamisegaIDENTIFITSEERIMISANALÜÜSID (13)PATOGEENSUSANALÜÜS (14)Mõlemad analüüsid kinnitavad, et puhaskultuur on R. solanacearumEIJAHProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumProov on nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearum

(1)Sümptomite kirjeldust vt II jao punktis 1.(2)Diagnostilised kiiranalüüsid hõlbustavad oletatava diagnoosi määramist, ent ei ole otsustava tähtsusega. Negatiivne tulemus ei ole alati patogeeni puudumise garantii.(3)Varre juhtkoe bakterilima voolavuse testi kirjeldatakse VI jao punktis A.1.(4)Bakterirakkude polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.2.(5)Bakterilima või sümptomaatilise koe seroloogilisi aglutinatsioonianalüüse kirjeldatakse VI jao punktis A.3.(6)Vees suspendeeritud bakterilima või sümptomaatilise koe IF-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.5.(7)Vees suspendeeritud bakterilima või sümptomaatilise koe FISH-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.7.(8)Vees suspendeeritud bakterilima või sümptomaatilise koe ELISA-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.8.(9)Vees suspendeeritud bakterilima või sümptomaatilise koe PCR-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.6.(10)Patogeen on tavaliselt kergesti isoleeritav sümptomitega taimematerjalist lahjenduse laialikülvamise abil söötmeplaatidele (II jao punkt 3).(11)Tüüpilise koloonia morfoloogia kirjeldus esitatakse II jao punkti 3 alapunktis d.(12)Infektsiooni edasiarenenud faaside kultiveerimine võib ebaõnnestuda saprofüütbakterite konkurentsi või liigkasvu tõttu. Kui haiguse sümptomid on tüüpilised, kuid bakteri isoleerimine annab negatiivse tulemuse, tuleb isoleerimist korrata, eelistatult selektiivsöötmel.(13)Bakteri R. solanacearum eeldatava puhaskultuuri saab usaldusväärselt kindlaks määrata, kasutades VI jao punktis B kirjeldatud analüüse. Alamliigi iseloomustamine ei ole kohustuslik, kuid on soovituslik iga uue juhtumi korral.(14)Patogeensusanalüüsi kirjeldatakse VI jao punktis C.

2.   Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

Põhimõte

Analüüsimeetod on mõeldud latentsete nakkuste avastamiseks kartulimugulates. Erinevatel bioloogilistel põhimõtetel põhineva vähemalt kahe sõelkatse positiivse tulemuse korral3 tuleb patogeen isoleerida; kui isoleeritakse tüüpilised kolooniad, peab järgnema bakteri R. solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine. Ainult ühe määramismeetodi positiivsest tulemusest ei piisa selleks, et lugeda proov kahtlaseks.

Sõelkatsed ja isolatsioonianalüüsid peavad võimaldama avastada 103 kuni 104 rakku resuspenseeritud bakterisademe milliliitri kohta, mis kuuluvad positiivse kontrollina igasse analüüsiseeriasse.

Kartulimugulate proov (1)Patogeeni eraldamine ja kontsentreerimine (2)PEAMINE SÕELKATSE (3)IF-analüüs (4) / selektiivne eraldamine (5) / PCR-analüüs (6) / FISH-analüüs (7)Valikuline täiendav analüüs: ELISA (8)Esimene sõelkatse (3)Haigusetekitajat R. solanacearum ei avastatudProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumNegatiivnePositiivneTeine sõelkatse (3)Haigusetekitajat R. solanacearum ei avastatudProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumNegatiivnePositiivneSelektiivne isoleerimine (5) ja/või biotest (9)Tüüpilise morfoloogiaga kolooniad (10)Haigusetekitajat R. solanacearum ei avastatudProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumEI (11)JAHPuhastatakse üldsöötmele taaskülvamisegaIDENTIFITSEERIMISANALÜÜSID (12)PATOGEENSUSANALÜÜS (13)Mõlemad analüüsid kinnitavad, et puhaskultuur on R. solanacearum.Proov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumEIJAHProov on nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearum

(1)Standardproovi suurus on 200 mugulat, kuid meetodit saab kasutada väiksema prooviga, kui 200 mugulat ei ole.(2)Patogeeni eraldamis- ja kontsentreerimismeetodeid kirjeldatakse III jao punktis 1.1.(3)Kui vähemalt kaks erinevatel bioloogilistel põhimõtetel põhinevat analüüsi annavad positiivse tulemuse, tuleb bakter isoleerida ja kinnitada. Kasutatakse vähemalt üht sõelkatset. Kui see sõelkatse annab negatiivse tulemuse, loetakse proov negatiivseks. Kui meetod annab positiivse tulemuse, tuleb teha veel üks või mitu erinevatel bioloogilistel põhimõtetel põhinevat sõelkatset esimese positiivse tulemuse tõendamiseks. Kui teise või järgmiste sõelkatsete tulemused on negatiivsed, loetakse proov negatiivseks. Täiendavaid analüüse ei ole vaja teha.(4)IF-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.5.(5)Selektiivse eraldamise analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.4.(6)PCR-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.6.(7)FISH-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.7.(8)ELISA-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.8.(9)Biotesti kirjeldatakse VI jao punktis A.9.(10)Tüüpilise koloonia morfoloogia kirjeldus esitatakse II jao punktis 3 alapunktis d.(11)Saprofüütbakterid võivad olla konkurendiks või inhibiitoriks ja selle tõttu võib kasvatamine või biotest ebaõnnestuda. Kui sõelkatsed on andnud positiivseid tulemusi, kuid bakteri isoleerimine annab negatiivse tulemuse, korratakse isoleerimisanalüüse sama bakterisademega või võetakse lisaks sama proovi lõigatud mugulate basaalse tipu juurest juhtkude ning vajaduse korral analüüsitakse lisaproove.(12)Haigusetekitaja R. solanacearum eeldatava puhaskultuuri saab usaldusväärselt kindlaks määrata, kasutades VI jao punktis B kirjeldatud analüüse.(13)Patogeensusanalüüsi kirjeldatakse VI jao punktis C.

3.   Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides

Varreosade proov (1)Patogeeni ekstraheerimine ja kontsentreerimine (2)PEAMINE SÕELKATSE (3)Selektiivne isoleerimine (4) / IF-analüüs (5) / PCR-analüüs (6) / FISH-analüüs (7)Valikuline täiendav analüüs: ELISA (8), biotest (9)Tüüpilise morfoloogiaga kolooniad (10) pärast isoleerimistKõik tehtud analüüsidHaigusetekitajat R. solanacearum ei avastatudProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R.solanaceumEI (11)JAHPuhastatakse üldsöötmele taaskülvamisegaIDENTIFITSEERIMISANALÜÜSID (12)PATOGEENSUSANALÜÜS (13)Mõlemad analüüsid kinnitavad, et puhaskultuur on haigusetekitaja R. solanacearum puhaskultuurProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumEIJAHProov on nakatunud haigusetekitajagaR. solanacearum

(1)Soovitatavad proovide suurused on III jao punktis 2.1.(2)Patogeeni ekstraheerimis- ja kontsentreerimismeetodeid kirjeldatakse III jao punktis 2.1.(3)Kui vähemalt kaks erinevatel bioloogilistel põhimõtetel põhinevat analüüsi annavad positiivse tulemuse, tuleb bakter isoleerida ja kinnitada. Kasutatakse vähemalt üht sõelkatset. Kui see sõelkatse annab negatiivse tulemuse, loetakse proov negatiivseks. Kui meetod annab positiivse tulemuse, tuleb teha veel üks või mitu erinevatel bioloogilistel põhimõtetel põhinevat sõelkatset esimese positiivse tulemuse tõendamiseks. Kui teise või järgmiste sõelkatsete tulemused on negatiivsed, loetakse proovi negatiivseks. Täiendavaid analüüse ei ole vaja teha.(4)Selektiivse isoleerimise analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.4.(5)IF-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.5.(6)PCR-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.6.(7)FISH-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.7.(8)ELISA-analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.8.(9)Biotesti kirjeldatakse VI jao punktis A.9.(10)Tüüpilise koloonia morfoloogia kirjeldus on esitatud II jao punkti 3 alapunktis d.(11)Saprofüütbakterid võivad olla konkurendiks või inhibiitoriks ja selle tõttu võib kasvatamine või biotest ebaõnnestuda. Kui määramismeetodiga saadakse positiivseid tulemusi, kuid isoleerimiskatsed on negatiivsed, korratakse isoleerimiskatseid.(12)Bakteri R. solanacearum eeldatava puhaskultuuri saab usaldusväärselt kindlaks määrata, kasutades VI jao punktis B kirjeldatud analüüse.(13)Patogeensusanalüüsi kirjeldatakse VI jao punktis C.

II JAGU

HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM ÜKSIKASJALIKUD AVASTAMISMEETODID KARTULIMUGULATES JA KARTULIS, TOMATIS JA TEISTES PEREMEESTAIMEDES, MILLEL ON PRUUN-BAKTERMÄDANIKU VÕI BAKTERIAALSE NÄRBUMISTÕVE SÜMPTOMID

1.   Sümptomid (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Sümptomid kartulil

Kartulitaim. Infektsiooni varajast staadiumit põllul iseloomustab päevaste kõrgete temperatuuride juures närbumine alates alumistest lehtedest taime tipu suunas, kusjuures öösel taim taastub. Närbumise varajastes staadiumides jäävad lehed roheliseks, kuid hiljem muutuvad need kollaseks ja pruuniks ning kärbuvad. Esineb ka lehtede allapoole keerdumist. Ühe võrse või kogu taime närbumine muutub kiiresti pöördumatuks ning lõpeb taime kokkuvarisemise ja hukuga. Närbunud taime varre ristlõike juhtkude on tavaliselt pruuniks muutunud ning piimjas bakterilima immitseb lõikepinnalt või eritub pigistamisel. Kui läbilõigatud taimevars on asetatud vertikaalselt vette, on näha limaniitide väljavoolamist juhtkimpudest.

Kartulimugul. Kartulimugulast tuleb teha ristläbilõige basaalse (stoolonipoolse) tipu lähedalt või lõigata pikisuunaliselt üle stooloni tipu. Infektsiooni varajane staadium on äratuntav juhtkoeringi klaasistumisena ja värvusemuutusena klaasjaskollakast helepruunini ning ringist võib lõikekohal pärast mõne minuti möödumist iseeneslikult erituda kahvatu kreemjas bakteriaalne eritis. Hiljem muutub juhtkoering selgelt eristatavalt pruuniks ning kärbumine võib ulatuda põhikoeni. Edasiarenenud infektsioonifaasis võib bakterilima erituda ka basaalsest tipust või kartulisilmadest, põhjustades mullaosakeste kleepumist mugulale. Juhtkoe sisemise kokkuvajumise tõttu võivad koorel tekkida punakaspruunid sissevajunud kahjustused. Haiguse edasiarenenud faasides on tavapärane sekundaarsete seente ja bakterite põhjustatud pehmete mädanike areng.

1.2.   Sümptomid tomatil

Tomatitaim. Esimeseks nähtavaks sümptomiks on noorimate lehtede longuvajumine. Haigusetekitaja jaoks soodsate keskkonnatingimuste juures (mulla temperatuur umbes 25 °C: küllastunud niiskus) esineb lehtede allapoole keerdumine ja taime osaline või täielik närbumine, millele järgneb kogu taime kokkuvarisemine mõne päeva jooksul. Vähem soodsate tingimuste korral (mulla temperatuur alla 21 °C) esineb närbumist vähem, kuid varrel võib areneda suurel hulgal lisajuuri. Varre alaosal võib märgata vesiseid triipe, mis on juhtkoes esineva nekroosi tunnuseks. Kui varrest teha ristlõige, eritub pruuniks muutunud juhtkoest valget või kollakat bakterilima.

1.3.   Sümptomid teistel peremeestaimedel

Hariliku maavitsa Solanum dulcamara ja musta maavitsa S. nigrum taimed. Kui mulla temperatuur ei ületa 25 °C ja inokulaadi tase ei ole äärmiselt kõrge (st S. nigrum ei kasva haige kartuli- või tomatitaime kõrval), täheldatakse looduslikes tingimustes nendel umbrohtudest peremeestaimedel närbumissümptomeid harva. Kui närbumine ilmneb, on sümptomid samad mis tomatil. Mittenärbunud S. dulcamara taimedel, mille varred ja juured kasvavad vees, võib ilmneda varre ala- või veealuste osade seesmine ristlõikel nähtav juhtkudede helepruuniks muutumine. Kui läbilõigatud taimevars on asetatud vertikaalselt vette, võib läbilõigatud juhtkudedest erituda bakterilima või moodustuda limaniite, seda isegi närbumissümptomite puudumisel.

2.   Kiirsõelkatsed

Kiirmääramismmeetodid võivad hõlbustada oletatava diagnoosi määramist, ent ei ole otsustava tähtsusega. Kasutatakse üht või mitut järgmistest valideeritud analüüsidest:

2.1.   Varrelima test

(Vt VI jao punkt A.1.)

2.2.   Polü-β-hüdroksübutüraadi (PHB) graanulite tuvastamine

Haigusetekitaja R. solanacearum rakkudes esinevaid iseloomulikke polü-β-hüdroksübutüraadi (PHB) graanuleid saab nähtavaks muuta nakatunud koe bakterilima läbi leegi fikseeritud äiete värvimisel mikroskoobi alusklaasil värvainetega Niiluse sinine A ja Sudaani must B (vt V jao punkt A.2.).

2.3.   Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs

(Vt VI jao punkt A.3.)

2.4.   Muud analüüsid

Teised sobilikud kiirmääramismeetodid on IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.), FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.), ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.) ja PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6).

3.   Bakterite isoleerimine

a) Kartulimugula juhtkoeringi muutunud värvusega osast või kartuli- või tomati- või muu närbunud peremeestaime varre juhtkimpudest eemaldatakse eritist või mõned lõiked. Lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris (4. liide) ja jäetakse 5–10 minutiks seisma.

b) Suspensioonist valmistatakse rida kümnekordseid lahjendusi.

c) Suspensioonist ja selle lahjendustest mõõdetakse 50–100 µl üldsöötmele (NA, YPGA või SPA; vt 2. liide) ja/või Kelmani tetrasooliumsöötmele (2. liide) ja/või valideeritud selektiivsöötmele (nt SMSA; vt 2. liide). Kasutatakse söötmeplaadil joonkülvi tehnikat või vastava lahjenduse laiali külvamist söötmeplaadile. Vajaduse korral valmistatakse eraldi söötmeplaadid positiivse haigusetekitaja kontrolli jaoks, kasutades R. solanacearum’i biotüübi 2 tüve.

d) Plaate inkubeeritakse 28 °C juures 2–6 päeva.

 Üldsöötmel on virulentse R. solanacearum’i kolooniad kreemikasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga, fluidaalsed ning sageli iseloomulike spiraalsete keeretega keskel. R. solanacearum’i avirulentsed vormid moodustavad väikesi ümmargusi mittevedelaid võilaadseid kolooniaid, mis on täiesti kreemjasvalged.

 Kelmani tetrasoolium- või SMSA-söötmel on keerded veripunased. Ralstonia solanacearum’i avirulentsed vormid moodustavad väikesi ümmargusi mittevedelaid võilaadseid kolooniaid, mis on täiesti sügavpunased.

4.    R. solanacearum’i kindlaksmääramise analüüsid

R. solanacearum’i eeldatavad isolaadid saab kindlaks määrata VI jao punktis B esitatud analüüsidega.

III JAGU

1.   Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

1.1.   Proovi ettevalmistamine

Märkus

 Standardproovi suurus on 200 mugulat analüüsi kohta. Intensiivsem proovivõtmine eeldab rohkem analüüse, kuid proovi suurus jääb samaks. Suurem mugulate arv proovis põhjustab tulemuste inhibeerimise või nende tõlgendamise keerukuse. Siiski saab meetodit kohaldada ka alla 200 mugulaga proovi puhul, kui rohkem mugulaid ei ole.

 Kõigi allpool kirjeldatud avastamismeetodite valideerimine põhineb analüüsidel, mis on tehtud 200 mugulast koosneva prooviga.

 Allpool kirjeldatud kartuliekstrakti saab kasutada ka kartuli-ringmädaniku bakteri Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus avastamiseks.

Vabatahtlik eeltöötlemine enne proovi valmistamist

a) Proove inkubeeritakse 25–30 °C juures kuni kaks nädalat enne analüüsimist, et ergutada R. solanacearum’i populatsioonide paljunemist.

b) Mugulad pestakse. Iga proovi järel kasutatakse kohaseid desinfektsioonivahendeid (klooriühendeid, kui kasutatakse PCR-katset, et eemaldada patogeenne DNA) ja pesuaineid. Mugulad kuivatatakse õhu käes. Pesemine on eriti kasulik (kuid mitte nõutav) nende proovide puhul, millel on liiga palju mulda, ning kui tehakse PCR-analüüsi või bakterite otsest isoleerimist.

1.1.1.

Puhta ja desinfitseeritud skalpelli või juurviljanoa abil eemaldatakse koor mugula basaalse (stoolonipoolse) tipu juurest nii, et juhtkude tuleb nähtavale. Basaalse tipu juures lõigatakse väike juhtkoe südamik ettevaatlikult välja nii, et muid kudesid tuleks kaasa võimalikult vähe (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Märkus: iga pruunmädaniku kahtlase sümptomiga mugul hoitakse alles ja sellega tehakse eraldi analüüsid.

Kui basaalse tipusüdamiku eemaldamisel ilmneb pruun-baktermädaniku kahtlaseid sümptomeid, tuleks teha selle mugula visuaalne kontroll ja mugulat lõigata basaalse tipu juures. Kõiki kahtlaste sümptomitega lõigatud mugulaid tuleks hoida korgistumiseks vähemalt kaks päeva toatemperatuuril ning seejärel säilitada jahutatult (4–10 °C) kohastes karantiinitingimustes. Kõiki mugulaid, sealhulgas kahtlaste sümptomitega, tuleks säilitada vastavalt III lisale.

1.1.2.

Basaalsed tipusüdamikud kogutakse kasutamata ühekordse kasutusega mahutitesse, mida saab sulgeda ja/või pitseerida (kui mahuteid kasutatakse uuesti, tuleks need põhjalikult puhastada ja desinfitseerida, kasutades klooriühendeid). Eelistatult tuleks eemaldatud basaalseid tipusüdamikke töödelda kohe. Kui see ei ole võimalik, hoitakse neid mahutis puhvrit lisamata, jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni.

Basaalseid tipusüdamikke töödeldakse, kasutades üht järgmistest meetoditest.

a) Südamikud kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi jahutatult.

b) Südamikud homogeenitakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) kas segistis (näiteks Waring või Ultra Thurax) või purustades need suletud ühekordse kasutusega matseratsioonikotis (näiteks Stomacheri või Bioreba tugev kilekott mõõtudega 150 mm × 250 mm; kiirgussteriilne), kasutades kummivasarat või sobivat peenestusseadet (näiteks Homex).

Märkus: kui proovid homogeenitakse segistis, on suur proovide ristsaastumise oht. Tuleb võtta ettevaatusabinõusid, et vältida aerosooli tekkimist või proovi lekkimist ekstraktsiooni käigus. Tagatakse äsja steriliseeritud segistiterade ja -anumate kasutamine iga proovi korral. Kui kasutatakse PCR-analüüsi, välditakse DNA ülekandumist mahutites või peenestusseadmes. PCR-analüüsi tegemisel on soovitav purustada ühekordse kasutusega kottides ja kasutada ühekordse kasutusega katseklaase.

1.1.3.

Supernatant dekanteeritakse. Kui lahus on liiga hägune, selitatakse see madalal kiirusel tsentrifuugides (mitte üle 180 g 10 minutit jooksul temperatuuril 4–10 °C) või vaakumfiltreerimisega (40–100 µm), pestes filtrit täiendava ektraktsioonipuhvriga (10 ml).

1.1.4.

Bakterifraktsioon kontsentreeritakse, tsentrifuugides 7 000 g juures 15 minutit (või 10 000 g juures 10 minutit) temperatuuril 4–10 °C, ning supernatant eemaldatakse bakterisadet segamata.

1.1.5.

Bakterisade resuspendeeritakse 1,5 ml bakterisademe puhvris (4. liide). Haigusetekitaja R. solanacearum kontrollimise jaoks kasutatakse 500 µl, haigusetekitaja Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jaoks 500 µl ja võrdluseesmärgil 500 µl. 500 µl võrdlusalikvoodile ja ülejäänud analüüsialikvoodile lisatakse steriilset glütserooli lõppkontsentratsiooni 10–25 % (v/v) saamiseks, loksutatakse ja säilitatakse temperatuuril 16 kuni 24 °C (nädalaid) või 68 kuni 86 °C (kuid). Analüüside tegemise ajal hoitakse analüüsialikvoote 4–10 °C juures.

Korduv külmutamine ja sulatamine ei ole soovitav.

Kui ekstrakti tuleb transportida, tuleb seda teha külmkastis 24–48 tunni jooksul.

1.1.6.

Kõiki R. solanacearum’i positiivseid kontrolle ja proove tuleb käsitleda eraldi, et vältida saastumist. Seda tuleb järgida IF-objektiklaaside ja kõigi analüüside korral.

1.2.   Analüüsimine

Vaata diagramme ja analüüsikirjeldusi ning optimeeritud protokolle vastavates liidetes.

Selektiivne isoleerimine (vt VI jao punkt A.4.)

IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.)

PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6.)

FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.)

ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.)

Biotest (vt VI jao punkt A.9.)

2.   Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides

2.1.   Proovi ettevalmistamine

Märkus: haigusetekitaja R. solanacearum latentsete populatsioonide avastamiseks on soovitav kasutada liitproove. Meetodit saab mugavalt kasutada kuni 200 varreosast koosnevate liitproovide puhul. Seirete läbiviimisel peaksid seired põhinema uuritavat taimepopulatsiooni statistiliselt esindaval proovil.

2.1.1.

1–2 cm pikkused varreosad kogutakse suletud streriilsesse mahutisse järgmise proovivõtumenetluse kohaselt.

Tomatiseemikud. Iga varre alaosast, maapinna kohalt, eemaldatakse puhta desinfitseeritud noaga 1 cm pikkune osa.

Avamaal või kasvuhoones kasvatatud tomatitaimed. Puhta desinfitseeritud noaga eemaldatakse iga taime kõige madalam külgvõrse, lõigates vahetult põhivarre ühenduskoha kohal. Eemaldatakse iga külgvõrse kõige alumine 1 cm pikkune osa.

Teised peremeestaimed. Iga varre alaosast, maapinna kohalt, eemaldatakse puhta desinfitseeritud noa või oksakääridega 1 cm pikkune osa. S. dulcamara’l ja teistel vees kasvavatel peremeestaimedel eemaldatakse veealuste varte või stoolonite 1–2 cm pikkused vesijuurtega osad.

Teatavas proovivõtukohas proovi võttes on soovitav analüüsida statistiliselt esindavat proovi, milleks võetakse proovivõtukohast vähemalt 10 iga võimaliku umbrohust peremeestaime taime. Patogeeni avastamine on kõige usaldusväärsem hiliskevadel, suvel ja sügisel, vooluveekogudes kasvava mitmeaastase taime Solanum dulcamara looduslikku nakatumist saab määrata aasta ringi. Teadaolevateks peremeestaimedeks on isekülvanud kartulitaimed, harilik maavits Solanum dulcamara, must maavits S. nigrum, harilik ogaõun Datura stramonium ja teised sugukonna maavitsalised (Solanaceae) liigid. Peremeestaimedeks on ka pelargoon Pelargonium spp. ja harilik portulak Portulaca oleracea. Mõned Euroopas levinud umbrohuliigid, nagu odalehine malts Atriplex hastata, karvane ruse Bidens pilosa, kera-kadakkaer Cerastium glomeratum, valge hanemalts Chenopodium album, harilik vesikanep Eupatorium cannabinum, paljas võõrkakar Galinsoga parviflora, mürktulikas Ranunculus scleratus, kerss Rorippa spp, oblikas Rumex spp., valge põisrohi Silene alba, longus põisrohi S. nutans., paiseleht Tussilago farfara ja kõrvenõges Urtica dioica, võivad varjata teatavate keskkonnatingimuste puhul juurtes ja/või risosfääris R. solanacearum’i biotüübi 2 / rassi 3 populatsioone.

Märkus: selles etapis saab teha sisemiste sümptomite (vaskulaarne värvumine või bakterilima) visuaalse vaatluse. Iga sümptomitega varreosa pannakse kõrvale ja sellega tehakse eraldi analüüsid (vt II jagu).

2.1.2.

Varreosad desinfitseeritakse kergelt 70 % etanooliga ja kuivatakse kohe kuivatuspaberiga. Seejärel töödeldakse varreosasid, kasutades üht järgmistest meetoditest.

a) Varreosad kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi jahutatult.

b) Töödeldakse kohe, purustades osad tugevas matseratsioonikotis (näiteks Stomacher või Bioreba) koos sobiva koguse ekstratsioonipuhvriga (4. liide) kas kummivasara või kohase peenestusseadmega (näiteks Homex). Kui see ei ole võimalik, säilitatakse varreosasid jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni.

2.1.3.

Kui lahus on seisnud 15 minutit, dekanteeritakse supernatant.

2.1.4.

Ekstrakti täiendavat selitamist või bakterifraktsiooni kontsentreerimist tavaliselt ei nõuta, kuid seda võib filtreerida ja/või tsentrifuugida vastavalt III jao punktidele 1.1.3–1.1.5.

2.1.5.

Lahjendamata või kontsentreeritud proov jagatakse kahte võrdsesse ossa. Üht osa säilitatakse 4–10 °C juures katsete tegemise ajal ja teist osa 10–25 % (v/v) steriilse glütserooliga temperatuuril 16 kuni 24 °C (nädalaid) või 68 kuni 86 °C (kuid) juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid.

2.2.   Analüüsimine

Vaata diagramme ja analüüsikirjeldusi ja optimeeritud protokolle vastavates liidetes.

Selektiivne isoleerimine (vt VI jao punkt A.4.)

IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.)

PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6.)

FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.)

ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.)

Biotest (vt VI jao punkt A.9.).

IV JAGU

1.   Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika vees

Veeproov (1)Patogeeni kontsentreerimine (2)PEAMINE SÕELKATSESelektiivne eraldamine (3)Valikulised täiendavad testid: biotest (4) / rikastamis-PCR (5) / rikastamis-ELISA (6)Tüüpilise koloonia morfoloogia (7) pärast eraldamistEI (8)Haigusetekitajat R. solanacearum ei avastatudProov ei ole nakatunud haigustekitajaga R. solanacearumJAHPuhastatakse ülsöötmele taaskülvamisegaIDENTIFITSEERIMISANALÜÜSID (9)PATOGEENSUSANALÜÜS (10)Mõlemad analüüsid kinnitavad, et puhaskultuur on haigusetekitaja R. solanacearumEIProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumJAHProov on nakatunud haigustekitajaga R. solanacearum

(1)Soovitatav proovivõtumenetlus on IV jao punktis 2.1.(2)Patogeeni kontsentreerimismeetodeid kirjeldatakse IV jao punktis 2.1. Kontsentreerimine suurendab nii patogeeni kui ka võistlevate saprofüütbakterite populatsioone ning on soovitav vaid juhul, kui see ei põhjusta isoleerimisanalüüsi inhibeerimist.(3)Selektiivse eraldamise analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.4.(4)Biotesti kirjeldatakse VI jao punktis A.9.(5)PCR rikastamismeetodeid kirjeldatakse VI jao punktis A.4.2 ja VI jao punktis A.6.(6)ELISA rikastamismeetodeid kirjeldatakse VI jao punktis A.4.2 ja VI jao punktis A.8.(7)Tüüpilise koloonia morfoloogia kirjeldus esitatakse II jao punkti 3 alapunktis d.(8)Saprofüütbakterid võivad olla konkurendiks või inhibiitoriks ja selle tõttu võib kasvatamine ebaõnnestuda. Kui tekib kahtlus, et kõrged saprofüütbakterite populatsioonid võivad mõjutada eraldamise usaldusväärsust, korratakse isoleerimisanalüüsi pärast proovi lahjendamist steriilses vees.(9)Haigusetekitaja R. solanacearum eeldatava puhaskultuuri saab usaldusväärselt kindlaks määrata, kasutades VI jao punktis B. kirjeldatud analüüse.(10)Patogeensusanalüüsi kirjeldatakse VI jao punktis C.

2.   Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid vees

Põhimõte

Käesolevas jaos kirjeldatud valideeritud avastusmeetodeid kasutatakse patogeeni avastamiseks pinnavee proovides ning seda võib kohaldada ka kartulitöötlemise heitvee ja reovee proovides. Oluline on märkida, et eeldatav avastustundlikkus sõltub substraadist. Isoleerimisanalüüsi tundlikkust mõjutavad võistlevate saprofüütbakterite populatsioonid, mille sisaldus on üldiselt palju suurem kartulitöötlemisheitvees ja reovees kui pinnavees. Allpool esitatud metoodika avastab pinnavees eeldatavalt 103 rakku liitri kohta, kartulitöötlemise heitvees ja reovees on tundlikkus tõenäoliselt märgatavalt madalam. Seetõttu on soovitav analüüsida heit- ja reovett pärast puhastustoiminguid (nt sadestamist ja filtreerimist), mille käigus vähendatakse saprofüütbakterite populatsioone. Negatiivsete tulemuste usaldusväärsuse hindamisel tuleb arvesse võtta analüüsimeetodite tundlikkuspiiranguid. Käesolevat metoodikat on edukalt kasutatud pinnavees patogeeni olemasolu või puudumise kindlakstegemiseks läbi viidaval seirel, kartulitöötlemise heitvee ja reovee seirel tuleb arvestada selle piiratust.

2.1.   Proovi ettevalmistamine

Märkus

 Haigusetekitaja R. solanacearum’i avastamine pinnavees on kõige usaldusväärsem hiliskevadel, suvel ja sügisel, kui veetemperatuur on üle 15 °C.

 Korduv proovivõtt määratud proovivõtukohtades eri aegadel eespool nimetatud perioodil vähendab ilmastikutingimuste mõju ja suurendab avastamise usaldusväärsust.

 Arvesse tuleb võtta tugeva vihmasaju ja vooluveekogu geograafia mõju, et vältida patogeeni avastamist segavat ulatuslikku lahjendumist.

 Veeproove tuleb võtta peremeestaimede läheduses, kui need on olemas.

2.1.1.

Kõigis valitud proovivõtukohtades võetakse veeproove ühekordse kasutusega steriilsetesse katseklaasidesse või pudelitesse võimaluse korral sügavamalt kui 30 cm ja 2 m raadiuses kaldast. Töötlemisheitvee ja reovee proove võetakse ärajuhtimiskohas. Soovitav proovisuurus on kuni 500 ml proovivõtukoha kohta. Väiksemate proovide puhul on soovitav võtta proove proovivõtukohast vähemalt 3 korda, kusjuures iga proov koosneb 2 dubleeritud vähemalt 30 ml suurusest alaproovist. Tõhusaks seireks valitakse vähemalt 3 proovivõtukohta vooluveekogu iga 3 km kohta ning võetakse proove ka vooluveekokku suubuvatest haruveekogudest.

2.1.2.

Proove transporditakse jahedas (4–10 °C) ja pimedas ning analüüsitakse 24 tunni jooksul.

2.1.3.

Vajaduse korral võib bakterifraktsiooni kontsentreerida, kasutades üht järgmistest meetoditest.

a) Tsentrifuugitakse 30–50 ml alaproovi 10 000 g juures 10 minutit (või 7 000 g juures 15 minutit), eelistatavalt temperatuuril 4–10 °C, eemaldatakse supernatant ja bakterisade resuspendeeritakse 1 ml fosfaatpuhvris (4. liide).

b) Membraanfiltreerimine (pooride läbimõõt vähemalt 0,45 µm), mille järel pestakse filter 5–10 ml fosfaatpuhvris ja pesuvesi säilitatakse. See meetod on sobiv suurte veekoguste puhul, mis sisaldavad vähe saprofüütbaktereid.

Kontsentreerimine ei ole tavaliselt soovitav kartulitöötlemise heitvee ja reovee proovide puhul, sest võistlevate saprofüütbakterite suurenenud populatsioonid inhibeerivad Ralstonia solanacearum’i avastamist.

2.2.   Analüüsimine

Vaata diagrammi ja analüüsikirjeldusi vastavates liidetes.

V JAGU

1.   Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika mullas

Mullaproov (1)Patogeeni ekstraheerimineSÕELKATSESelektiivne isoleerimine (2)Valikuline täiendav analüüs: rikastamis-PCR (3) / biotest (4)Tüüpilise morfoloogiaga kolooniad (5) pärast isoleerimistKõik tehtud analüüsidEI (6)Haigusetekitajat R. solanacearum ei avastatudProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumJAHPuhastatakse söötmele taaskülvamisegaIDENTIFITSEERIMISANALÜÜSID (7)PATOGEENSUSANALÜÜS (8)Mõlemad analüüsid kinnitavad, et puhaskultuur on haigusetekitaja R. solanacearumEIProov ei ole nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearumJAHProov on nakatunud haigusetekitajaga R. solanacearum

(1)Soovitatav proovivõtumenetlus on V jao punktis 2.1.(2)Selektiivse isoleerimise analüüsi kirjeldatakse VI jao punktis A.4.(3)PCR rikastamismeetodeid kirjeldatakse VI jao punktis A.4.2 ja VI jao punktis A.6.(4)Biotesti kirjeldatakse VI jao punktis A.9.(5)Tüüpilise koloonia morfoloogia kirjeldus esitatakse II jao punkti 3 alapunktis d.(6)Saprofüütbakterid võivad olla konkurendiks või inhibiitoriks ja selle tõttu võib kasvatamine ebaõnnestuda. Kui tekib kahtlus, et kõrged saprofüütbakterite populatsioonid võivad mõjutada isoleerimise usaldusväärsust, korratakse isoleerimisanalüüsi pärast proovi edasist lahjendamist.(7)Haigusetekitaja R. solanacearum eeldatava puhaskultuuri saab usaldusväärselt kindlaks määrata, kasutades VI jao punktis B. kirjeldatud analüüse.(8)Patogeensusanalüüsi kirjeldatakse VI jao punktis C.

2.   Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid mullas

Põhimõtted

Käesolevas jaos kirjeldatud valideeritud avastusmeetodeid kohaldatakse patogeeni avastamiseks mullaproovides, kuid seda võib kasutada ka kartuli tahkete töötlemisjäätmete või reoveesetete proovides. Tuleb siiski märkida, et need meetodid ei ole piisavalt tundlikud, et tagada haigusetekitaja Ralstonia solanacearum madalate ja/või ebaühtlaselt hajunud populatsioonide avastamine, mis võivad esineda nende substraatide loomulikult saastunud proovides.

Negatiivsete tulemuste usaldusväärsuse hindamisel ja seire käigus patogeeni olemasolu või puudumise kindlakstegemisel mullas või setteis tuleb arvesse võtta käesoleva metoodika piiratud tundlikkust. Kõige usaldusväärsem analüüs patogeeni olemasolu kindlakstegemiseks põllumullas on vastuvõtliku peremeestaime istutamine ja selle nakatumise jälgimine, ent isegi selle meetodiga ei avastata madalat nakkustaset.

2.1.   Proovi ettevalmistamine

2.1.1.

Põllumullaproovide võtmisel tuleks järgida nematoodiproovi võtmise üldpõhimõtteid. Kogutakse 0,5–1 kg mulda proovi kohta 60 kohast 0,3 ha kohta 10–20 cm sügavuselt (või võrgustikul 7 × 7 meetrit). Kui kahtlustatakse patogeeni olemasolu, suurendatakse kogumiskohtade arvu 120ni 0,3 ha kohta. Enne analüüsimist hoitakse proove temperatuuril 12–15 °C. Kartuli töötlemis- ja reoveesetete proove võetakse kokku 1 kg kohtadest, mis esindavad analüüsitavate setete kogumahtu. Iga proov segatakse enne analüüsimist hoolikalt.

2.1.2.

10–25grammised mulla või sette alaproovid dispergeeritakse pöörleval loksutil (250 pööret minutis) kuni 2 tundi 60–150 milliliitris ekstraktsioonipuhvris (4. liide). 0,02 % Tween-20 ja 10–20 grammi steriilse kruusa lisamine võib vajaduse korral dispersiooni hõlbustada.

2.1.3.

Analüüsimise ajal hoida suspensiooni temperatuuril 4 °C.

2.2.   Analüüsimine

Vaata diagrammi ja analüüsikirjeldusi vastavates liidetes.

VI JAGU

HAIGUSETEKITAJA R. SOLANACEARUM AVASTAMISE JA KINDLAKSMÄÄRAMISE OPTIMEERITUD PROTOKOLLID

A.   DIAGNOSTILISED JA AVASTAMISANALÜÜSID

1.   Varrelima test

Haigusetekitaja R. solanacearum olemasolu närbuvates kartuli-, tomati- ja teiste peremeestaimede vartes saab määrata järgmise lihtsa eelanalüüsiga. Taimevars lõigatakse läbi kohe ülalpool mullapinda. Lõikepind suspendeeritakse puhta veega katseklaasis. Jälgitakse iseloomulikku bakterilima niitide iseeneslikku eritumist lõigatud juhtkimpudest mõne minuti pärast.

2.   Polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite tuvastamine

1. Mikroskoobi objektiklaasil valmistatakse äie YPGA- või SPA-söötmel (2. liide) kasvatatud nakatunud koe või 48tunnise kultuuri bakterilimast.

2. Valmistatakse positiivsed kontrolläiged haigusetekitaja R. solanacearum’i biotüübi 2 tüvega ning vajaduse korral negatiivne kontrolläie teadaoleva PHB negatiivse liigiga.

3. Lastakse kuivada õhu käes ja klaaside alumine pool tõmmatakse kiiresti läbi leegi, et äie fikseeruks.

4. Preparaat värvitakse kas Niiluse sinisega või Sudaani mustaga ning vaadeldakse mikroskoobis järgmiselt.

Värvimine Niiluse sinisega

a) Klaasid ujutatakse üle Niiluse sinise A 1 % vesilahusega ja inkubeeritakse 10 minutit 55 °C juures.

b) Värvilahus valatakse pealt ära. Loputatakse korraks tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga.

c) Äie ujutatakse üle äädikhappe 8 % vesilahusega ja inkubeeritakse 1 minut toatemperatuuril.

d) Loputatakse korraks tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga.

e) Niisutatakse uuesti veetilgaga ja asetatakse peale katteklaas.

f) Värvitud äiet vaadeldakse mikroskoobis, millele on sobitatud epifluorestsentsvalgusallikas, 450 nm juures ning kasutatakse õliimmersiooni 600–1 000kordsel suurendusel ja õli- või veeimmersiooni objektiivi.

g) Vaadeldakse ereoranžilt fluorestseeruvaid PHB graanuleid. Vaadeldakse ka altvalgusega valgusmikroskoobis, et olla kindel, et graanulid on rakusisesed ning et rakumorfoloogia on R. solanacearum’i bakterirakkudele tüüpiline.

Värvimine Sudaani mustaga

a) Klaasid ujutatakse üle Sudaani musta 0,3 % lahusega 70 % etanoolis ja inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril.

b) Värvilahus valatakse pealt ära ning loputatakse korraks kraanivee all, eemaldades liigse vee kuivatuspaberiga.

c) Klaasid kastetakse lühikeseks ajaks ksülooli ja kuivatatakse kuivatuspaberiga. Ettevaatust: ksülool on ohtlik aine, tuleb rakendada vajalikke ettevaatusabinõusid ja töötada tõmbekapis

d) Klaasid ujutatakse üle 0,5 % (mass/maht) safraniini vesilahusega ja jäetakse 10 sekundiks toatemperatuuril seisma. Ettevaatust: safraniin on ohtlik aine, tuleb rakendada vajalikke ettevaatusabinõusid ja töötada tõmbekapis.

e) Pestakse tasaselt voolava kraanivee all, kuivatatakse kuivatuspaberiga ning asetatakse peale katteklaas.

f) Värvitud äigeid vaadeldakse valgusmikroskoobis, millel on ülekantud valgus, ja kasutatakse õliimmersiooni 1 000kordsel suurendusel ja õliimmersiooni objektiivi.

g) Vaadeldakse kahvatupunaseks värvunud rakuseintega R. solanacearum’i rakkudes esinevaid sinakasmusta värvusega PHB graanuleid.

3.   Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs

R. solanacearum’i rakkude aglutinatsioon bakterilimas või sümptomaatilise koe ekstraktides on kõige paremini jälgitav valideeritud antikehi kasutades (vt 3. liide), mis on konjugeeritud asjakohaste värviliste märgistusainetega, nagu punased Staphylococcus aureus’e rakud või värvilised lateksiosakesed. Müügil olevaid komplekte kasutades (vt 3. liide) järgitakse tootja kasutamisjuhendeid. Muul juhul toimitakse järgnevalt:

a) konjugeeritud antikehasuspensiooni ja bakterilima tilgad (ligikaudu 5 µl kumbagi) segatakse mitmeaknaliste objektiklaaside aknaväljades;

b) valmistatakse positiivsed ja negatiivsed kontrollproovid, kasutades R. solanacearum’i biotüübi 2 suspensioone ja heteroloogset tüve;

c) pärast 15 sekundit õrna segamist jälgitakse aglutinatsiooni positiivsetes proovides.

4.   Selektiivne isoleerimine

4.1.   Selektiivsöötmele väljakülvamine

Märkus: enne selle meetodi esmakordset kasutamist tehakse eelanalüüsid, et tagada milliliitri kohta R. solanacearum’i 103 kuni 104 kolooniaid moodustavate osakeste taasavastamine, lisatuna varem negatiivsena analüüsitud proovide ekstraktidele.

Kasutatakse nõuetekohaselt valideeritud selektiivsöötmeid, nagu SMSA (muudetud Elphinstone et al., 1996; vt 2. liide).

Suurt tähelepanu nõuab haigusetekitaja R. solanacearum eristamine teistest bakteritest, mille kolooniad võivad kasvusöötmel areneda. Kui söötmeplaadid on bakteritega üleasustatud või leidub antagonistlikke baktereid, võib R. solanacearum’i kolooniatel esineda ebatüüpilist morfoloogiat. Võistlevate või antagonistlike bakterite mõju kahtluse korral tuleks proovi uuesti analüüsida, kasutades erinevat analüüsi.

See meetod on kõige tundlikum värskete prooviekstraktide kasutamisel. Meetodit saab siiski kasutada ka ekstraktidega, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril 68 kuni 86 °C.

Positiivseteks kontrollproovideks valmistatakse kümnekordne lahjendus virulentse Ralstonia solanacearum’i biotüübi 2 suspensioonist, mille sisaldus on 106 kolooniaid moodustavat rakku milliliitri kohta (nt NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Igasuguse saastumise vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollproovid analüüsitavatest proovidest täiesti eraldi.

Iga uuesti valmistatud selektiivsöötme partii kõlblikkust patogeeni kasvatamiseks tuleks enne tavaproovide analüüsimist kontrollida.

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui analüüsitavat proovi (analüüsitavaid proove).

4.1.1.

Analüüsi läbiviimiseks tehakse uuritava proovi lahjenduste väljakülv söötmeplaatidele tagamaks, et saprofüütbakterite kolooniaid moodustavad populatsioonid on välja lahjendatud. Söötmeplaadile külvatakse 50–100 µl prooviekstrakti ja igat lahjendust.

4.1.2.

Söötmeplaate inkubeeritakse temperatuuril 28 °C. Tulemused loetakse 48 tunni pärast ja seejärel iga päev kuni 6 päeva jooksul. Tüüpilised R. solanacearum’i kolooniad SMSA-söötmel on piimjasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga ja fluidaalsed ning pärast kolmepäevast inkubeerimist on nende värv keskel roosast veripunaseni, keskosas iseloomulike spiraalsete keerdudega. (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Märkus: mõnikord tekivad sellel söötmel R. solanacearum’i ebatüüpilised kolooniad. Need võivad olla väiksed, ümmargused, täiesti punast värvi ning mittefluidaalsed või vaid osaliselt fluidaalsed, mistõttu on neid raske eristada saprofüütbakterite kolooniatest.

4.1.3.

Eeldatavad R. solanacearum'i kolooniad puhastatakse pärast joonkülvi või lahjenduse laialikülvamist üldsöötmele, et saada isoleeritud kolooniad (vt 2. liide).

4.1.4.

Kultuure säilitatakse lühikest aega steriilses vees (pH 6–8, kloorivaba) toatemperatuuril ja pimedas või pikemat aega krüoprotektantses keskkonnas temperatuuril 68 kuni 86 °C või need lüofiliseeritakse.

4.1.5.

Määratakse kindlaks eeldatavad kultuurid (vt VI jao punkt B) ja tehakse patogeensusanalüüs (vt VI jao punkt C).

Selektiivsöötme analüüsi tulemus on negatiivne, kui pärast kuuepäevast inkubeerimist ei ole kasvanud ühtki bakterkolooniat või kui ei ole isoleeritud tüüpilisi R. solanacearum’i kolooniaid, tingimusel et teised võistlevad või antagonistlikud bakterkolooniad ei pärsi R. solanacearum’i kasvu ning et tüüpilised R. solanacearum’i kolooniad on kasvanud vaid positiivsetel kontrollplaatidel.

Selektiivsöötme analüüsi tulemus on positiivne, kui eraldatakse eeldatavad R. solanacearum’i kolooniad.

4.2.   Rikastamismenetlus

Kasutatakse valideeritud rikastussöödet, näiteks Wilbrinki puljongit (vt 2.liide).

Seda menetlust võib kasutada R. solanacearum’i kolooniate valikuliseks suurendamiseks prooviekstraktides ja avastustundlikkuse tõstmiseks. Samuti lahjendab see menetlus tõhusalt PCR-reaktsiooni inhibiitoreid (1:100). Tuleb siiski märkida, et R. solanacearum’i rikastamine võib ebaõnnestuda sageli samaaegselt rikastatud saprofüütsete organismide võistlemise või antagonismi tõttu. Seepärast võib olla raske R. solanacearum’i isoleerimine rikastuspuljongi kultuuridest. Lisaks on ELISA-analüüside puhul soovitav kasutada pigem mono- kui polüklonaalseid antikehi, sest seroloogiliselt seotud saprofüütbakterite populatsioonid võivad suureneda.

4.2.1.

Rikastamis-PCRi tarvis pannakse 100 µl prooviekstrakti 10 ml rikastuspuljongisse (2. liide), mille alikvoot on DNA-vabas katseklaasis või kolvis. Rikastamis-ELISA tarvis võib kasutada prooviekstrakti suuremat sisaldust (nt 100 µl ekstrakti 1,0 ml rikastuspuljongis).

4.2.2.

Inkubeeritakse 27–30 °C juures 72 tundi loksutatava või staatilise kultuurina, kusjuures kork on lõdvalt peal, et tagada õhu juurdepääs.

4.2.3.

Enne ELISA- või PCR-analüüsi tegemist segatakse hästi.

4.2.4.

Rikastuspuljongit käsitatakse samamoodi kui proove eeltoodud analüüsides.

Märkus: kui teatavate võistlevate saprofüütbakterite suurte populatsioonide tõttu võib eeldada R. solanacearum’i rikastamise inhibitsiooni, võib paremaid tulemusi anda prooviekstraktide rikastamine enne tsentrifuugimist või muid kontsentreerimisetappe.

5.   IF-analüüs

Põhimõte

IF-analüüsi tegemist peamise sõelkatsena soovitatakse sellepärast, et see annab stabiilseid tulemusi nõutavate piirväärtuste raames.

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse IF-analüüsi ja IF tulemus on positiivne, tuleb teise sõelkatsena teha PCR- või FISH-analüüs. Kui IF-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja IF tulemus on positiivne, tuleb analüüsi lõpule viimiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Märkus: kasutatakse R. solanacearum’i antikehade valideeritud allikat (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On soovitav määrata iga uue antikehapartii tiiter. Tiiter on kõrgeima kontsentratsiooniga lahus, mille juures toimub optimaalne reaktsioon, kui tehakse analüüsi suspensiooniga, mis sisaldab 105 kuni 106 bakteri R. solanacearum 2 000. Analüüside käigus tuleks kasutada antikehade töölahuseid, mis on tiitri lähedal või sellega võrdsed.

Analüüs tuleks teha värskelt tehtud prooviekstraktidega. Vajaduse korral saab seda edukalt teha ekstraktidega, mida on säilitatud 68 kuni 86 °C juures glütserooli all. Glütserooli saab proovist eemaldada nii, et lisatakse 1 ml bakterisademe puhvrit (4. liide), tsentrifuugitakse uuesti 15 minutit 7 000 g juures ja resuspendeeritakse bakterisademe puhvriga võrdesse mahtu. Seda ei ole tihti tarvis, eriti siis, kui proovid kinnitatakse objektiklaasidele leekmeetodil.

Tehakse vastavalt liitele 3B kartuliekstraktis ja soovi korral puhvris suspendeeritud bakteri R. solanacearum homoloogse tüve või mis tahes muu referenttüve eraldi positiivsed kontrollobjektiklaasid.

Võimaluse korral tuleks kasutada looduslikult nakatunud kude (mida on säilitatud lüofiliseerituna või külmutatuna 16 kuni 24 °C juures) samalaadseks kontrolliks samal objektiklaasil.

Negatiivse kontrollina võib kasutada varem bakteri R. solanacearum negatiivse tulemuse andnud proovi alikvoote.

Positiivseid ja negatiivseid standardiseeritud kontrollaineid, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liites.

Kasutatakse mitmeaknalisi mikroskoobi alusklaase, millel on eelistatult kümme vähemalt 6 mm läbimõõduga aknavälja.

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui analüüsitavat proovi (analüüsitavaid proove).

5.1.   Valmistatakse ette objektiklaasid, kasutades üht järgmistest meetoditest.

i) Bakterisademe puhul, mille tärklisesade on suhteliselt väike:

pipetitakse standardne kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 µl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) 1/100 uuesti suspendeeritud kartulisadet esimesele aknale. Seejärel pipetitakse samasugune kogus lahustamata bakterisadet (1/1) rea ülejäänud akendele. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 1.

ii) Muude bakterisademete korral:

valmistatakse uuesti suspendeeritud bakterisademest kümnekordsed lahjendused (1/10 ja 1/100) sademepuhvrisse. Pipetitakse sobiv kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 µl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) uuesti suspendeeritud bakterisadet ja iga lahjendust aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 2.

5.2.

Piisad kuivatakse ümbritseva õhu temperatuuril või neid soojendades temperatuurini 40–45 °C. Bakterirakud kinnitatakse objektiklaasile kuumutades (15 minutit 60 °C juures), leekmeetodil, 95 % etanooliga või vastavalt antikehade tarnijate konkreetsetele juhistele.

Vajaduse korral võib kinnitatud objektiklaase säilitada külmutatult kuivatusainet sisaldavas karbis võimalikult vähe aega (kuni kolm kuud) enne järgmist analüüsi.

5.3.

IF-meetod

i) Vastavalt punkti 5.1 alapunktis i kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele

Valmistatakse rida kahekordseid lahjendusi. Esimeses augus peaks olema 1/2 tiitrist (T/2), teistes 1/4 tiitrist (T/4), 1/2 tiitrist (T/2), tiiter (T) ja kahekordne tiiter (2T).

ii) Vastavalt punkti 5.1 alapunktis ii kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele

Valmistatakse antikehade töölahjendus IF-puhvris. Töölahjendus mõjutab spetsiifilisust. Joonis 1. Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 5.1



Joonis 1.  Alapunktile i ja punkti 5.3 alapunktile i.

 

Uuesti suspendeeritud bakterisademe lahjendused

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1

Uuesti suspendeeritud bakterisademe lahjendus

(T = tiiter)

T/2

T/4

T/2

T

2T

Antiseerumi/antikehade kahekordsed lahjendused

Proov 1

image

image

image

image

image

 

1

2

3

4

5

Proovi 1 duplikaat või proov 2

image

image

image

image

image

6

7

8

9

10



Joonis 2.  Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 5.1 alapunktile ii ja punkti 5.3 alapunktile ii.

 

Antiseerumi/antikehade töölahused

1/1

1/10

1/100

tühi

tühi

Uuesti suspendeeritud bakterisademe kümnendlahjendused

Proov 1

image

image

image

image

image

 
 

1

2

3

4

5

Proovi 1 duplikaat või proov 2

image

image

image

image

image

6

7

8

9

10

5.3.1.

Objektiklaasid asetatakse niiskele kuivatuspaberile. Iga aknaväli kaetakse täielikult antikehade lahjendus(t)ega. Igale aknaväljale lisatud antikehade kogus peab olema vähemalt võrdne objektiklaasile lisatud ekstrakti kogusega.

Kui antikehade tarnijalt ei ole konkreetseid juhiseid, tuleks kasutada järgmist meetodit.

5.3.2.

Objektiklaase inkubeeritakse niiskel paberil katte all 30 minutit ümbritseva õhu temperatuuril (18–25 °C).

5.3.3.

Igalt objektiklaasilt raputatakse piisad ära ja need loputatakse hoolikalt IF-puhvriga. Pestakse 5 minutit IF Tween-puhvris (4. liide) ning seejärel IF-puhvris. Tuleks vältida aerosoolide ja piiskade ülakandumist, mis võiks põhjustada ristsaastumise. Kuivatuspaberiga kergelt kuivatades eemaldatakse ettevaatlikult liigne niiskus.

5.3.4.

Objektiklaasid asetatakse niiskele paberile. Aknaväljad kaetakse FITC-konjugaadi lahjendusega, mida kasutati tiitri määramisel. Aknaväljadele lisatud konjugaadi kogus peab olema sama, mis on antikehade kogus.

5.3.5.

Objektiklaase inkubeeritakse niiskel paberil katte all 30 minutit ümbritseva õhu temperatuuril (18–25 °C).

5.3.6.

Konjugaadi tilgad raputatakse objektiklaasilt maha. Loputatakse ja pestakse nagu eespool kirjeldatud (5.3.3).

Ettevaatlikult eemaldatakse liigne niiskus.

5.3.7.

Igasse aknavälja pipetitakse 5–10 µl 0,1 M fosfaatpuhverdatud glütserooli (4. liide) või kaubanduslikult kättesaadavat pleekimisvastast kattevedelikku ning objektiklaas kaetakse katteklaasiga.

5.4.

IF-analüüsi tulemused

5.4.1.

Objektiklaase vaadeldakse mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja sobilikud filtrid tööks FITCga, ning kasutatakse õli- või vesiimmersiooni suurendusel 500–1 000 korda. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Proovide puhul, kus ei paista üldse või paistab ainult väga vähe rakke, vaadeldakse vähemalt 40 mikroskoobi vaatevälja.

Esialgu kontrollitakse positiivse tulemusega kontroll-objektiklaasi. Rakud peavad säravalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud kindlaksmääratud antikehade tiitris või töölahjenduses. Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb IF-analüüsi (VI jao punkt A.5) korrata.

5.4.2.

Vaadeldakse bakteri R. solanacearum iseloomuliku morfoloogiaga säravalt fluorestseeruvaid rakke objektiklaaside aknaväljades (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorestseerumise intensiivsus peaks olema ekvivalentne positiivse kontrolltüve omaga sama antikeha lahjenduse juures. Lõplikult värvumata või nõrgalt fluorestseeruvad rakud jäetakse kõrvale.

Mis tahes saastumiskahtluse korral tuleb analüüsi korrata. Näiteks siis, kui partii kõigil objektiklaasidel on positiivseid rakke puhvri saastumise tõttu või kui leitakse positiivseid rakke objektiklaasi pinnal (väljaspool aknavälju).

5.4.3.

Immunofluorestsentsanalüüsi spetsiifilisuse tõttu on mitmeid probleeme. Kartuli basaalse tipusüdamiku ja varre sademetes ilmuvad tõenäoliselt ebatüüpilise morfoloogiaga fluorestseerivate rakkude taustpopulatsioonid ning bakteriga R. solanacearum sarnase suuruse ja morfoloogiaga ristuvalt reageerivad saprofüütbakterid.

5.4.4.

Arvesse võetakse ainult tüüpilise suuruse ja morfoloogiaga fluorestseeruvaid rakke punktis 5.3 esitatud antikehade tiitris või töölahjenduses.

5.4.5.

IF-tulemuste tõlgendamine

i) Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv milliliitris uuesti suspendeeritud bakterisademes (5. liide).

Proovi IF-tulemus on positiivne, kui seal on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku uuesti suspendeeritud bakterisademe milliliitris. Proovi loetakse saastumiskahtlusega prooviks ning tuleb teha lisaanalüüse.

ii) Proovi IF-tulemus on negatiivne, kui seal on alla 5 × 103 rakku uuesti suspendeeritud bakterisademe milliliitris, ning proov loetakse negatiivseks. Lisaanalüüse ei ole vaja teha.

6.   PCR-analüüs

Põhimõtted

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse PCR-analüüsi ja tulemus on positiivne, tuleb teise kohustusliku sõelkatsena teha isolatsiooni- või IF-analüüs. Kui PCR-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja tulemus on positiivne, tuleb lõpliku diagnoosi panemiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Selle meetodi kasutamist peamise sõelkatsena soovitatakse ainult siis, kui on olemas eriteadmised.

Märkus: eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama taasavastada 103 kuni 104 bakteri R. solanacearum rakku milliliitris lisatuna varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele. Maksimaalse tundlikkuse ja spetsiifilisuse saavutamiseks kõigis laborites võib olla vajalik teha optimeerimisanalüüse.

Kasutatakse nõuetekohaselt valideeritud PCR-reaktiive ja protokolle (vt 6. liide). Eelistatavalt valitakse sisekontrolliga meetod.

Proovi sihtmärgi DNAga saastumise vältimiseks kasutatakse kohaseid ettevaatusabinõusid. PCR-analüüsi peaksid tegema kogenud tehnikud spetsiaalsetes molekulaarbioloogia laborites, et minimeerida sihtmärgi DNAga saastumise võimalust.

DNA ekstraheerimise ja PCR-menetluse negatiivseid kontrolle tuleks alati käsitleda menetluses viimaste proovidena, et näidata, kas on toimunud DNA ülekandmist.

PCR-analüüsi tuleks kaasata järgmised negatiivsed kontrollid:

 prooviekstrakt, mis andis varem bakteri R. solanacearum osas negatiivse tulemuse,

 kontrollpuhvrid, mida kasutati bakterite ja DNA eraldamisel proovist,

 PCR-reaktsioonisegu.

Tuleks kaasata järgmised positiivsed kontrollid:

 resuspendeeritud bakterisegude alikvoodid, millele on lisatud bakterit R. solanacearum (valmistamist vt liites 3 B),

 bakteri R. solanacearum virulentse isolaadi (näiteks NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) vesisuspensioon (106 rakku milliliitris) (vt liide 3 B),

 võimaluse korral kasutatakse PCR-analüüsis ka positiivsetest kontrollproovidest saadud DNAd.

Võimaliku saastumise vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollid analüüsitavatest proovidest eraldi keskkonnas.

Prooviekstraktid peaksid olema võimalikult mullavabad. Seepärast on teatavatel juhtudel soovitav valmistada ekstraktid pestud kartulitest, kui soovitakse kasutada PCR-protokolle.

Positiivsed ja negatiivsed standardiseeritud kontrollained, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liites.

6.1.   DNA puhastamise meetodid

Kasutatakse eespool kirjeldatud positiivseid ja negatiivseid kontrollproove (vt 3. liide).

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

Sihtmärgi DNA eraldamiseks komplekssetest prooviainetest on võimalik kasutada erinevaid meetodeid, mille käigus eemaldatakse PCRi inhibiitorid ja muud ensümaatilised reaktsioonid ning kontsentreeritakse prooviekstraktis sihtmärgi DNA. Järgmiseid meetodeid on optimeeritud 6. liites esitatud valideeritud PCR-meetoditega kasutamiseks.

a)   Pastriki (2000) meetod

1) Pipetitakse 220 µl lüüsipuhvrit (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml Eppendorfi topsi.

2) Lisatakse 100 µl prooviekstrakti ja pannakse 10 minutiks kuumutusplokile või vesivanni 95 °C juures.

3) Tops pannakse 5 minutiks jääle.

4) Lisatakse 80 µl lüsosüümi põhilahust (50 mg lüsosüümi ml kohta 10 mM Tris HCl, pH 8,0) ja inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures.

5) Lisatakse 220 µl Easy DNA® lahust A (Invitrogen), segatakse hästi segistil ja inkubeeritakse 30 minutit 65 °C juures.

6) Lisatakse 100 µl Easy DNA® lahust B (Invitrogen), segatakse tugevalt, kuni sade valgub topsis vabalt ja proov on ühtlaselt viskoosne.

7) Lisatakse 500 µl kloroformi ja segatakse segistil viskoossuse kadumiseni ja homogeense segu saamiseni.

8) Faaside eraldamiseks ja interfaasi moodustamiseks tsentrifuugitakse 15 000 g juures 20 minutit temperatuuril 4 °C.

9) Ülemine faas kantakse üle puhtasse Eppendorfi topsi.

10) Lisatakse 1 ml 100 % etanooli (20 °C), segatakse lühidalt ja inkubeeritakse jääl 10 minutit.

11) Tsentrifuugitakse 20 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C ja eemaldatakse etanool bakterisademest.

12) Lisatakse 500 µl 80 % etanooli (20 °C) ja segatakse, pöörates topsi põhjaga ülespoole.

13) Tsentrifuugitakse 10 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C, bakterisade hoitakse alles ja eemaldatakse etanool.

14) Bakterisademel lastakse kuivada õhu käes või seadmes DNA Speed Vac.

15) Bakterisade resuspendeeritakse 100 µl steriilses ultrapuhtas vees ja jäetakse toatemperatuuril seisma vähemalt 20 minutiks.

16) Säilitatakse 20 °C juures kuni PCR-analüüsi tegemiseni.

17) Igasugune valge sade tsentrifuugitakse alla ja kasutatakse 5 µl supernatanti, mis sisaldab DNAd PCR-analüüsi tarvis.

b)   Muud meetodid

Võib kasutada muid DNA eraldamise meetodeid (näiteks Qiagen DNeasy Plant Kit), eeldusel et need sama tõhusalt puhastuvad välja DNA kontrollproovidest, mis sisaldavad 103 kuni 104 patogeeni rakku milliliitris.

6.2.   PCR-analüüs

6.2.1.

Valmistatakse ette PCR-analüüsi analüüsi- ja kontrollmatriitsid vastavalt valideeritud protokollile (VI jao punkt A.6). Valmistatakse proovi DNA ekstrakti üks kümnendlahjendus (1:10 ultrapuhtas vees).

6.2.2.

Saastevabas keskkonnas valmistatakse kohane PCR-reaktsioonisegu vastavalt avaldatud protokollile (6. liide). Võimaluse korral soovitatakse kasutada mitmekordseid PCR-protokolle sisemise PCR-kontrolliga.

6.2.3.

Lisatakse 2–5 µl DNA ekstrakti 25 µl PCR-reaktsioonisegu kohta steriilsetes PCR-katseklaasides vastavalt PCR-protokollidele (vt 6. liide).

6.2.4.

Võetakse ainult PCR-reaktsioonisegu sisaldav negatiivne kontrollproov ja proovi kohta lisatakse sama ultrapuhta vee allikat, mida kasutati PCR-segus.

6.2.5.

Katseklaasid pannakse samasse termotsüklerisse, mida kasutati eelanalüüsi tegemisel, ning see pannakse tööle kohaselt optimeeritud PCR-programmis (6. liide).

6.3.   PCR-produkti analüüs

6.3.1.

PCR-amplikonid eraldatakse agaroosgeelelektroforeesi teel. Võetakse igast proovist vähemalt 12 µl paljundatud DNA reaktsioonisegu, mis on segatud 3 µl täitepuhvriga (6. liide) 2,0 %lises agaroosgeelis trisatsetaat-EDTA (TAE) puhvris (6. liide) 5-8 V/cm. Kasutatakse kohast DNA markerit, näiteks 100 aluspaari.

6.3.2.

DNA ribad tuuakse esile, värvides neid eetiumbromiidiga (0,5 mg liitris) 30–60 minutit, võttes kohaseid ettevaatusabinõusid selle mutageeni käitlemisel.

6.3.3.

Värvunud geeli vaadeldakse lühilaine ultraviolett valgustusallikaga (λ = 302 nm) oodatava suurusega amplifitseerunud PCR-produktide (6. liide) leidmiseks ja need dokumenteeritakse.

6.3.4.

Kõigi uute leidude/juhtumite korral tõendatakse PCR-amplikoni usaldatavust ülejäänud amplifitseeritud DNA proovi restriktsiooniensüümi analüüsiga, inkubeerides optimaalsel temperatuuril ja optimaalse aja jooksul kohase ensüümi ja puhvriga (vt 6. liide). Lahustunud fragmendid eraldatakse elektroforeesil agaroosgeelis nagu varem ja vaadeldakse pärast värvimist eetiumbromiidiga ultraviolett valgustusallikaga iseloomulikku restriktsioonifragmendi pilti ning võrreldakse seda lahustamata ja lahustunud positiivse kontrolliga.

PCR-analüüsi tulemuse tõlgendamine

PCR-analüüs on negatiivne, kui kõnealuses proovis ei avastata bakterile R. solanacearum spetsiifilist PCR-amplikoni, kuid see avastatakse kõigis positiivse kontrolli proovides (mitmekordse PCR-produkti puhul, millel on taimele spetsiifilised sisekontrolli praimerid: oodatava suurusega teine PCR-produkt peab amplifeeruma kõnealuse prooviga).

PCR-analüüs on positiivne, kui avastatakse oodatava suuruse ja restriktsioonipildiga (kui see on nõutav) bakterile R. solanacearum spetsiifiline PCR-amplikon, eeldusel et see ei amplifitseerunud mõnest negatiivse kontrolli proovist. Positiivse tulemuse usaldusväärse kinnituse saab ka siis, kui analüüsi korratakse teiste PCR-praimeritega (6. liide).

Märkus: PCR inhibeerumist võib kahtlustada siis, kui oodatav amplikon saadakse positiivse kontrolli proovist, mis sisaldab bakterit R. solanacearum vees, kuid negatiivseid tulemusi saadakse positiivsetest kontrollidest, mis sisaldavad bakterit R. solanacearum kartuliekstraktis. Mitmekordsetes PCR-protokollides sisemiste PCR-konrollidega viitab reaktsiooni inhibeerumisele see, kui ei saada kumbagi amplikoni.

Saastumist võib kahtlustada siis, kui oodatav amplikon saadakse ühest või mitmest negatiivsest kontrollist.

7.   FISH-analüüs

Põhimõte

Kui esimese sõelkatsena kasutatakse FISH-analüüsi ja tulemus on positiivne, tuleb teise kohustusliku sõelkatsena teha isolatsiooni- või IF-analüüs. Kui FISH-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja tulemus on positiivne, tuleb lõpliku diagnoosi panemiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Märkus: kasutatakse valideeritud bakterile R. solanacearum spetsiifilisi oligosonde (vt 7. liide). Eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama taasavastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud vähemalt 103–104 bakteri R. solanacearum rakku milliliitris.

Järgmist meetodit tuleks eelistatavalt kasutada värskelt valmistatud prooviekstraktiga, kuid seda võib edukalt kasutada ka prooviekstraktiga, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril 16 kuni 24 °C või 68 kuni 86 °C.

Negatiivse kontrollina kasutatakse sama proovi alikvoote, mis andsid varem bakteri R. solanacearum negatiivse tulemuse.

Positiivseteks kontrollideks valmistatakse 3–5 päeva vanusest bakteri R. solanacearum biotüübi 2 kultuurist (näiteks tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857, vt 3. liide) suspensioonid, mis sisaldavad 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta 0,01 M fosfaatpuhvris. Valmistatakse vastavalt liitele 3 B kartuliekstraktis suspendeeritud bakteri R. solanacearum homoloogse tüve või mis tahes muu referenttüve eraldi positiivsed kontrollobjektiklaasid.

FITC-värvainega konjugeeritud eubakteriaalsete oligoproovide kasutamine võimaldab kontrollida hübridisatsiooniprotsessi, sest see värvib kõik proovis olevad eubakterid.

Positiivne ja negatiivne standardiseeritud kontrollmaterjal, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liite punktis A.

Kontrollmaterjali analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

7.1.   Kartuliekstrakti fikseerimine

Järgmine protokoll põhineb allikal Wullings et al. (1998).

7.1.1.

Valmistatakse kinnitilahus (vt 7. liide).

7.1.2.

Igast prooviekstraktist pipetitakse 100 µl Eppendorfi topsi ja tsentrifuugitakse 7 minutit 7 000 g juures.

7.1.3.

Eemaldatakse supernatant ja bakterisade lahustatakse 200 µl kinnitis, mis valmistati kuni 24 tundi varem. Loksutatakse vorteksil ja inkubeeritakse 1 tund külmikus.

7.1.4.

Tsentrifuugitakse 7 minutit 7 000 g juures, eemaldatakse supernatant ja bakterisade resuspendeeritakse 75 µl 0,01 M fosfaatpuhvris (vt 7. liide).

7.1.5.

Fikseeritud suspensioonidest tilgutatakse 16 µl puhtale mitmeaknalisele objektiklaasile vastavalt joonisele 7.1. Igale objektiklaasile pannakse 2 erinevat lahjendamata proovi ning 10 µl kasutatakse 1:100 lahjenduse tegemiseks (0,01 M fosfaatpuhvris). Ülejäänud proovilahust (49 µl), millele on eelnevalt lisatud 1 maht 96 % etanooli, võib säilitada 20 °C juures. Juhul kui FISH-analüüsi tuleb uuesti teha, eemaldatakse etanool tsentrifugeerimise teel ja lisatakse sellega võrdne kogus 0,01 fosfaatpuhvrit (loksutakse vorteksil).



Joonis 7.1.  FISH-objektiklaasi joonis

Proov 1

Tühi

Tühi

Tühi

Proov 2

image

image

image

image

image

aknaväli 1

aknaväli 2

aknaväli 3

aknaväli 4

aknaväli 5

Proov 1

Tühi

Tühi

Tühi

Proov 2

image

image

image

image

image

aknaväli 6

aknaväli 7

aknaväli 8

aknaväli 9

aknaväli 10

Katteklaas 1

 

Katteklaas 2

7.1.6.

Objektiklaasid kuivatatakse õhu käes (või objektiklaaside kuivatis 37 °C juures) ja fikseeritakse, kuumutades klaase läbi leegi.

Selles etapis võib menetluse katkestada ja jätkata hübridiseerimist järgmisel päeval. Objektiklaase tuleb hoida tolmuvabas ja kuivas kohas toatemperatuuril.

7.2.   Hübridiseerimine

7.2.1.

Rakud veetustatakse 50 %, 80 % ja 96 % etanooli reas, igas etapis 1 minut. Objektiklaasid kuivatatakse objektiklaaside hoidikul õhu käes.

7.2.2.

Valmistatakse ette niiske inkubatsioonikamber, kattes õhukindla kasti põhja kuivatus- või filterpaberiga, mis on kastetud 1x hybmix-lahusesse (7. liide). Kast eelinkubeeritakse hübridisatsiooniahjus 45 °C juures vähemalt 10 minutit.

7.2.3.

Pannakse 10 μl hübridisatsioonilahust (7. liide) 8 aknavälja (aknaväljad 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 ja 10, vt joonis 7.1) igale objektiklaasile, jättes kaks keskmist aknavälja (3 ja 8) tühjaks.

7.2.4.

Esimesele ja viimasele neljale aknale asetatakse katteklaas (24 × 24 mm) nii, et vahele ei jää õhku. Objektiklaasid pannakse eelsoojendatud niiskesse kambrisse ja hübridiseeritakse 5 tunni jooksul ahjus 45 °C juures pimedas.

7.2.5.

Valmistatakse ette 3 keeduklaasi, mis sisaldavad 1 l Milli Q (molekulaarbioloogias kasutatava puhtusastmega) vett, 1 l 1x hybmix-lahust (334 ml 3x hybmix-lahust ja 666 ml Milli Q vett) ja 1 l 1/8x hybmix-lahust (42 ml 3x hybmix-lahust ja 958 ml molekulaarbioloogias kasutatavat vett). Iga keeduklaasi eelinkubeeritakse vesivannis 45 °C juures.

7.2.6.

Objektiklaasidelt eemaldatakse katteklaasid ja objektiklaasid asetatakse objektiklaaside hoidikule.

7.2.7.

Ülemäärane oligoproov pestakse ära, inkubeerides 15 minutit 45 °C juures keeduklaasis, milles on 1x hybmix-lahus.

7.2.8.

Objektiklaaside hoidik pannakse 1/8 hybmix-pesulahusesse ja inkubeeritakse veel 15 minutit.

7.2.9.

Objektiklaasid kastetakse lühidalt Milli Q vette ja pannakse filterpaberile. Liigne niiskus eemaldatakse, kattes pinna õrnalt filterpaberiga. Igale aknaväljale pipetitakse 5–10 μl pleekimisvastast kattevedelikku (näiteks Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA või samaväärset) ja üle terve objektiklaasi pannakse suur katteklaas (24 × 60 mm).

7.3.   FISH-analüüsi tulemused

7.3.1.

Objektiklaase vaadeldakse viivitamatult mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja kasutatakse õliimmersiooni suurendusel 630 või 1 000 korda. Fluorestseiinisotiotsüanaadile (FITC) sobiva filtriga värvuvad proovis olevad eubakterite rakud (sealhulgas enamik gramnegatiivseid rakke) fluorestseeruvroheliseks. Kasutades tetrametüülrodamiin-5-isotiotsüanaadile sobivat filtrit, paistavad bakteri R. solanacearum Cy3-ga värvunud rakud fluorestseeruvpunastena. Raku morfoloogiat võrreldakse positiivsete kontrollidega. Rakukestad peavad eredalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud. Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb FISH-analüüsi (VI jao punkt A.7) korrata. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Proovide puhul, kus ei paista üldse või paistab ainult väga vähe rakke, vaadeldakse vähemalt 40 mikroskoobi vaatevälja.

7.3.2.

Vaadeldakse bakteri R. solanacearum iseloomuliku morfoloogiaga eredalt fluorestseeruvaid rakke objektiklaaside aknaväljades (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorestseerumise intensiivsus peab olema positiivse kontrolli fluorestseerumise intensiivsusega võrdne või sellest parem. Lõplikult värvumata või nõrgalt fluorestseeruvad rakud jäetakse kõrvale.

7.3.3.

Mis tahes saastumiskahtluse korral tuleb analüüsi korrata. Näiteks siis, kui partii kõigil objektiklaasidel on positiivseid rakke puhvri saastumise tõttu või kui leitakse positiivseid rakke objektiklaasi pinnal (väljaspool aknavälju).

7.3.4.

FISH-analüüsi spetsiifilisuse tõttu on mitmeid probleeme. Kartuli basaalse tipusüdamiku ja varreosa kontsentreeritud bakterisademetes võib esineda ebatüüpilise morfoloogiaga fluorestseeruvate rakkude taustpopulatsioone ning bakteriga R. solanacearum sarnase suuruse ja morfoloogiaga ristuvalt reageerivaid saprofüütbaktereid, kuigi palju harvem kui IF-analüüsis.

7.3.5.

Arvesse võetakse üksnes tüüpilise suuruse ja morfoloogiaga fluorestseeruvaid rakke.

7.3.6.

FISH-analüüsi tulemuse tõlgendamine

i) FISH-analüüsi valiidsed tulemused saadakse siis, kui FITC-filtrit kasutades vaadeldakse bakterile R. solanacearum omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga ererohelisi fluorestseeruvaid rakke ja rodamiinfiltrit kasutades erepunaseid fluorestseeruvaid rakke kõigis positiivsetes kontrollides ja mitte üheski negatiivses kontrollis. Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv resuspendeeritud bakterisademe milliliitris (4. liide). Saastumiskahtlusega proovideks loetakse proove, milles on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitris. Tuleb teha täiendavaid analüüse. Proovid, milles on alla 5 × 103 tüüpilise raku uuesti suspendeeritud bakterisadema milliliitris, loetakse negatiivseteks.

ii) FISH-analüüs on negatiivne siis, kui rodamiinfiltrit kasutades ei vaadelda bakterile R. solanacearum omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga erepunaseid fluorestseeruvaid rakke, tingimusel et rodamiinfiltrit kasutades vaadeldakse erepunaseid fluorestseeruvaid rakke positiivsete kontrollide preparaatides.

8.   ELISA-analüüs

Põhimõte

Suhteliselt madala tundlikkuse tõttu võib ELISA-analüüsi kasutada vabatahliku lisana IF-, PCR- või FISH-analüüsile. DASI ELISA kasutamisel on rikastamine ja monokloonsete antikehade kasutamine kohustuslik (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Proovide rikastamine enne ELISA-analüüsi võib olla analüüsi tundlikkuse tõstmiseks kasulik, kuid see võib ebaõnnestuda teiste võistlevate organismide tõttu proovis.

Märkus: kasutatakse R. solanacearum'i antikehade valideeritud allikat (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On soovitav määrata iga uue antikehapartii tiiter. Tiiter on kõrgeima kontsentratsiooniga lahus, mille juures toimub optimaalne reaktsioon, kui tehakse analüüsi suspensiooniga, mis sisaldab 105 kuni 106 bakteri R. solanacearum homoloogse tüve rakku milliliitris, ja kasutatakse kohast sekundaarse antikeha konjugaati vastavalt tootja soovitustele. Analüüside käigus tuleks kasutada antikehade lahjendusi, mis on kaubandusliku valmistise tiitri lähedal või sellega võrdsed.

Määratakse antikehade tiiter, kasutades R. solanacearum’i homoloogse tüve suspensiooni sisaldusega 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta.

Negatiivsete kontrollidena kasutatakse prooviekstrakti, mis andis varem bakteri R. solanacearum osas negatiivse tulemuse, ja ristuvalt mittereageeriva bakteri suspensiooni fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS).

Positiivse kontrollina kasutatakse sama proovi alikvoote, mis andsid varem negatiivse tulemuse segatuna bakteri R. solanacearum biotüübi 2 tüvedega 103 kuni 104 rakku milliliitris (näiteks tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857, vt 2. liite punktid A ja B). Tulemuste võrdlemiseks kasutatakse kõigil söötmeplaatidel R. solanacearum’i standardlahust 105 kuni 106 rakku milliliitris fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS). Positiivsed kontrollid peavad olema mikrotiiterplaadil kindlalt eraldatud analüüsitavast proovist (analüüsitavatest proovidest).

Positiivne ja negatiivne standardiseeritud kontrollmaterjal, mida saab kasutada nende analüüside puhul on loetletud 3. liite punktis A.

Kontrollmaterjali analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

Valideeritud on kaks ELISA protokolli.

a)   Kaudne ELISA (Robinson-Smith et al., 1995)

1) Võetakse 100–200 µl prooviekstrakti alikvooti. (Kuumutamine 4 minuti jooksul temperatuuril 100 °C vesivannis või kuumutusplokil võib mõnel juhul vähendada mittespetsiifilisi tulemusi.)

2) Lisatakse samaväärne kogus kahekordset kattepuhvrit (4. liide) ja loksutatakse vorteksil.

3) Igast proovist mõõdetakse vähemalt 100 µl kahte mikrotiiterplaadi auku (nt Nunc-Polysorp või samaväärne) ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures või öö jooksul 4 °C juures.

4) Järsu löögiga raputatakse ekstrakt plaadiaukudest välja. Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide), jättes viimase pesukorra lahuse vähemalt viieks minutiks plaadiaukudesse.

5) Valmistatakse R. solanacearum’i antikehade sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse (4. liide). Valideeritud, müügil olevate antikehade puhul kasutatakse soovitatud lahjendust (tavaliselt kaks korda kontsentreeritum kui tiiter).

6) Lisatakse 100 µl igasse auku ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

7) Järsu löögiga raputatakse antikehalahus plaadiaukudest välja, auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (alapunkt 4).

8) Valmistatakse sekundaarse antikeha leeliselise fosfataaskonjugaadi sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse. Lisatakse 100 µl igasse auku ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

9) Järsu löögiga raputatakse konjugeeritud antikeha plaadiaukudest välja, auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (alapunkt 4).

10) Lisatakse 100 µl leeliselise fosfataassubstraadi lahust (4. liide) igasse auku. Inkubeeritakse pimedas toatemperatuuril ja mõõdetakse neeldumist lainepikkusel 405 nm korrapäraste ajavahemike järel 90 minuti jooksul.

b)   DASI ELISA

1) Valmistatakse R. solanacearum’i määramiseks polükloonsete antikehade sobiv lahjendus kattepuhvris pH 9,6 (4. liide). Igasse auku lisatakse 200 µl. Inkubeeritakse 4–5 tundi 37 °C juures või 16 tundi 4 °C juures.

2) Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

Lisatakse 190 µl prooviekstrakti vähemalt kahte auku. Positiivseid ja negatiivseid kontrolle lisatakse kumbagi kahte auku igal plaadil. Inkubeeritakse 16 tundi 4 °C juures.

3) Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

4) Valmistatakse R. solanacearum’i määramiseks spetsiifiliste monokloonsete antikehade sobiv lahjendus fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS) (4. liide), mis sisaldab ka 0,5 % veise albumiinseerumit (BSA), ja lisatakse 190 µl igasse auku. Inkubeeritakse 2 tundi 37 °C juures.

5) Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

6) Valmistatakse hiirevastase immunoglobuliini sobiv lahus, mis on konjugeeritud leeliselise fosfataassubstraadiga fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS). Igasse auku lisatakse 190 µl. Inkubeeritakse 2 tundi 37 °C juures.

7) Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

8) Valmistatakse leeliseline fosfataassubstraadilahus, mis sisaldab 1 mg p-nitrofenüülfosfaati substraatpuhvri milliliitri kohta (4. liide). Igasse auku lisatakse 200 µl. Inkubeeritakse pimedas toatemperatuuril ja mõõdetakse neeldumist lainepikkusel 40 nm korrapäraste ajavahemike järel 90 minuti jooksul.

ELISA-analüüsi tulemuste tõlgendamine

ELISA-analüüs on negatiivne, kui kahe proovi augu arvutatud keskmine optiline tihedus on väiksem kui negatiivse kontrolli prooviekstrakti augu kahekordse optilise tiheduse väärtus, tingimusel et kõigi positiivsete kontrollide optiline tihedus on üle 1,0 (pärast 90minutilist inkubatsiooni substraadis) ning see on suurem kui negatiivsete prooviekstraktide kahekordne optiline tihedus.

ELISA-analüüs on positiivne, kui kahe proovi augu arvutatud keskmine optiline tihedus on suurem kui negatiivse kontrolli prooviekstrakti augu kahekordse optilise tiheduse väärtus, tingimusel et kõigi negatiivse kontolli aukude optiline tihedus on väiksem kui positiivse kontrolli aukude kahekordne optiline tihedus.

ELISA-analüüsi positiivse kontrolli aukude negatiivsed näidud osutavad, et analüüs ei ole korrektselt läbi viidud või seda on inhibeeritud. ELISA-analüüsi negatiivse kontrolli aukude positiivsed näidud osutavad, et on toimunud ristsaastumine või mittespetsiifiline antikehade sidumine.

9.   Biotest

Märkus: eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud 103 kuni 104 bakteri R. solanacearum kolooniaid moodustavat üksust milliliitris (valmistamist vt 2. liites).

Suurimat avastustundlikkust võib loota siis, kui kasutatakse äsja valmistatud prooviekstrakti ja optimaalseid kasvutingimusi. Meetodit saab siiski kasutada edukalt nende ekstraktidega, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril 68 kuni 86 °C.

Järgneva protokolli aluseks on Janse (1988).

9.1.

Iga proovi kohta võetakse kümme tundliku tomatisordi (nt “Moneymaker” või sort, mille tundlikkuse on testlabor määranud olevat samaväärse) testtaime, millel on välja kasvanud 3. pärisleht. Andmed kultuuris kasvatamise kohta on 8. liites. Teise võimalusena võib kasutada baklažaani (nt sort “Black Beauty” või samasuguse tundlikkusega sort), kasutatakse ainult neid taimi, mis on 2–3 lehe faasis kuni kolmanda pärislehe täieliku väljakasvamiseni. On ilmnenud, et baklažaanil on sümptomid vähem tõsised ja arenevad aeglasemalt. Seetõttu soovitatakse võimaluse korral kasutada tomatiseemikuid.

9.2.

100 µl prooviekstrakti jagatakse testtaimede vahel.

9.2.1.   Inokulatsioon süstla abil

Taimede varsi inokuleeritakse idulehtede kohal hüpodermilise nõelaga süstlaga (vähemalt 23G). Proov jaotatakse testtaimede vahel.

9.2.2.   Inokulatsioon sisselõike kaudu

Taime kahe sõrme vahel hoides pipetitakse suspendeeritud bakterisademe tilk (ligikaudu 5–10 µl) varrele idulehtede ja esimese lehe vahele.

Steriilse skalpelliga tehakse 1 cm pikkune diagonaalne sisselõige, mille sügavus on ligikaudu 2/3 varre paksusest, alustades sisselõiget bakterisademe tilga kohast.

Sisselõige kaetakse süstla abil steriilse vaseliiniga.

9.3.

Samal viisil nakatatakse viis taime 48tunnise virulentse R. solanacearum biotüübi 2 vesisuspensiooniga 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta, mis on positiivseks kontrolliks, ning negatiivseks kontrolliks nakatatakse taimi bakterisademe puhvriga (4. liide). Positiivsed ja negatiivsed kontrolltaimed tuleb teistest taimedest isoleerida, et vältida ristnakatumist.

9.4.

Testtaimi kasvatatakse karantiiniruumides kuni neli nädalat 25–30 °C ja kõrge suhtelise niiskuse juures ja neid kastetakse nii, et ei tekiks ülekastmist või taimede närbumist veepuuduse tõttu. Saastumise vältimiseks inkubeeritakse positiivseid ja negatiivseid kontrolltaimi selgelt eraldatud lavadel kasvuhoones või kasvukambris või, kui ruumi on vähe, tagatakse rangelt eristatus töötlemiste vahel. Kui erinevate proovide taimi tuleb inkubeerida lähestikku, eraldatakse need kohaste varjetega. Väetamisel, kastmisel, kontrollimisel ja mis tahes muude tegevuste juures pööratakse suurt tähelepanu ristsaastumise vältimisele. Oluline on puhastada kasvuhooned ja kasvukambrid kõigist putukkahjureist, sest need võivad kanda bakteri ühelt taimelt teisele.

Jälgitakse närbumise, lehtede keerdumise, kloroosi ja/või kängumise tundemärke.

9.5.

Isoleeritakse haigestunud taimedest (II jao punkt 3) ja identifitseeritakse eeldatavad R. solanacearum’i puhastatud kultuurid (VI jao punkt B).

9.6.

Kui kolme nädala möödumisel sümptomeid ei ilmne, tehakse IF/PCR/isolatsioonianalüüsid liitproovist, mis koosneb igalt katsetaimelt ülalpool inokulatsioonikohta võetud 1 cm varreosadest. Kui analüüsid on positiivsed, valmistatakse lahjendused ja tehakse väljakülvid söötmeplaatidele (punkt 4.1).

9.7.

Määratakse kindlaks bakteri R. solanacearum eeldatavad puhastatud kultuurid.

Valiidsed biotesti tulemused saadakse siis, kui positiivsetel kontrolltaimedel on tüüpilised sümptomid, nendest taimedest saab uuesti isoleerida bakterid ja negatiivsetel kontrollidel ei leita sümptomeid.

Biotesti tulemus on negatiivne, kui testtaimed ei ole saastunud R. solanacearum’i kultuuriga, tingimusel et R. solanacearum on avastatud positiivsetes kontrolltaimedes. Biotest on positiivne, kui testtaimed on R. solanacearum’i kultuuriga saastunud.

B.   IDENTIFITSEERIMISANALÜÜSID

Bakteri R. solanacearum eeldatavad puhaskultuurid määratakse kindlaks, kasutades vähemalt kaht järgmistest analüüsidest, mis põhinevad erinevatel bioloogilistel põhimõtetel.

Igasse tehtavasse analüüsi kaasatakse tuntud referenttüved, kui see on asjakohane (vt 3. liide).

1.   Toitumuslikud ja ensümaatilised identifitseerimisanalüüsid

Määratakse järgmised fenotüübilised omadused, mis esinevad või puuduvad bakteril R. solanacearum, kasutades järgmistes allikates kirjeldatud meetodeid: Lelliott ja Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).



Analüüs

Oodatav tulemus

Fluorestseeruv pigment

Polü-β-hüdroksübutüraadi esinemine

+

Oksüdatsiooni/fermentatsioonianalüüs (O/F-analüüs)

O+/F–

Katalaasi aktiivsus

+

Kovaci oksüdaasianalüüs

+

Nitraatide redutseerimine

+

Tsitraadi kasutamine

+

Kasv 40 °C juures

Kasv 1 % NaCl-s

+

Kasv 2 % NaCl-s

Arginiini dihüdrolaas

Želatiini veeldamine

Tärklise hüdrolüüs

Aesuliini hüdrolüüs

Levani tootmine

2.   IF-analüüs

2.1.

Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris IF-puhvris (4. liide).

2.2.

Valmistatakse kohase antiseerumi kahekordsete lahjenduste rida (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.

Tehakse IF-analüüs (VI jao punkt A.5).

2.4.

IF-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui kultuuri IF-tiiter võrdub positiivse kontrolli tiitriga.

3.   ELISA-analüüs

Märkus: kui kasutatakse vaid kaht määramisanalüüsi, ei tohi lisaks sellele meetodile kasutada teist seroloogilist analüüsi.

3.1.

Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 108 rakku milliliitris 1X PBS-puhvris (4. liide).

3.2.

Tehakse sobiv ELISA-analüüs R. solanacearum’i spetsiifilise monoklonaalse antikehaga.

3.3.

ELISA-analüüs on positiivne, kui kultuuri ELISA-analüüsi tulemus on vähemalt pool positiivse kontrolli tulemusest.

4.   PCR-analüüs

4.1.

Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris molekulaarbioloogias kasutatava puhtusastmega steriilses vees.

4.2.

100 µl suletud katseklaasides olevat rakususpensiooni kuumutatakse kuumutusplokil või keevas veevannis 100 °C juures 4 minutit. Seejärel võib proove säilitada 16 kuni 24 °C juures, kuni neid on tarvis.

4.3.

Bakteri R. solanacearum spetsiifiliste amplikonide amplifitseerimiseks tehakse kohane PCR-analüüs (nt Seal et al. (1993, Pastrik ja Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4.

Bakterit R. solanacearum saab positiivselt kindlaks määrata siis, kui PCR-amplikonidel on positiivse kontrolli tüvega sama suurus ja neil esineb sama pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfism.

5.   FISH-analüüs

5.1.

Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris ultrapuhtas vees.

5.2.

Tehakse FISH-analüüs (VI jao punkt A.7) vähemalt kahe R. solanacearum-spetsiifilise oligoprooviga (7. liide).

5.3.

FISH-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui kultuur ja positiivne kontroll annavad samad reaktsioonid.

6.   Rasvhapete profileerimine (FAP)

6.1.

Kultuuri kasvatatakse trüptikaas-sojaagaril (Oxoid) 48 tundi temperatuuril 28 °C.

6.2.

Tehakse kohane FAP-analüüs (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.

FAP-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui eeldatava kultuuri profiil on identne positiivse kontrolli profiiliga. Tüüpiline rasvhapete esinemine on järgmine: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH ning tüüpiline on 16:0 3OH puudumine. Selline profiil osutab suure tõenäosusega bakterile Ralstonia sp.

7.   Tüve iseloomustamise meetodid

R. solanacearum’i iga uue isoleerimisjuhtumi puhul on soovitav kasutada üht järgmistest tüve iseloomustamise meetoditest.

Igasse tehtavasse analüüsi kaasatakse tuntud referenttüved, kui see on asjakohane (vt 3. liide).

7.1.   Biotüübi määramine

R. solanacearum jagatakse biotüüpidesse selle põhjal, kuidas see suudab kasutada ja/või oksüdeerida kolme disahhariidi ja kolme heksoosalkoholi (Hayward, 1964 ja Hayward et al., 1990). Biotüübi kasvusöödet kirjeldatakse 2. liites. Analüüsi saab edukalt teha, inokuleerides söödet R. solanacearum’i puhaskultuuridega ja inkubeerides 28 °C juures. Kui steriilsele 96 auguga rakukultuuri söötmeplaadile (200 µl augu kohta) jaotatud sööde muutub 72 tunni jooksul oliivrohelisest kollaseks, on analüüsi tulemus positiivne.



 

Biotüüp

 

1

2

3

4

5

Järgmiste ainete kasutamine:

 

maltoos

+

+

+

laktoos

+

+

+

D (+) tsellobioos

+

+

+

mannitool

+

+

+

sorbitool

+

+

dultsitool

+

+

Lisaanalüüsidega eristatakse biotüübi 2 alamfenotüüpe



 

Biotüüp 2A

(Levinud üle maailma)

Biotüüp 2A

(Leitud Tšiilis ja Kolumbias)

Biotüüp 2T

(Leitud troopilistel aladel)

Trehhaloosi kasutamine

+

+

Meso-inositooli kasutamine

+

+

D-riboosi kasutamine

+

Pektolüütiline aktiivsus (1)

madal

madal

kõrge

(1)   Vt Lelliott ja Stead (1987).

7.2.   Genoomse “sõrmejäljendi” võtmine

Haigusetekitaja R. solanacearum liittüvede molekulaarseks eristamiseks võib kasutada erinevaid meetodeid, sealhulgas järgmised.

7.2.1.

Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi (RFLP) analüüs (Cook et al., 1989).

7.2.2.

Korduvjärjestusega PCR, kasutades REP, BOX ja ERIC praimereid (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3.

Amplifitseeritud fragmentide pikkuse polümorfismi (AFLP) analüüs (Van der Wolf et al., 1998).

7.3.   PCR-meetodid

Eristamaks tüvesid, mis kuuluvad RFLP analüüsi (Cook et al., 1989) ja 16S rDNA järjestuse määramise (Taghavi et al., 1996) kohaselt R. solanacearum’i 1. (biotüübid 3, 4 ja 5) ja 2. rühma (biotüübid 1, 2A ja 2T), võib kasutada spetsiifilisi PCR-praimerid (Pastrik et al, 2002; vt 6. liide).

C.   KINNITUSANALÜÜS

R. solanacearum’i diagnoosi lõplikuks kinnitamiseks ning R. solanacearum’ina identifitseeritud bakterkultuuri virulentsuse hindamiseks tuleb teha patogeensusanalüüs.

1) Analüüsitava isolaadi 24–28 tunni vanusest isolaadist ja bakteri R. solanacearum kohasest positiivse kontrolli tüvest (nt NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857; vt 3. liide) tehakse inokulaat, milles on umbes 106 rakku milliliitris.

2) Inokuleeritakse 5–10 tundlikku tomati- või baklažaaniseemikut, millel on välja kasvanud kolmas pärisleht (vt VI jao punkt A.9).

3) Inkubeeritakse kuni kaks nädalat temperatuuril 25–28 °C ning kõrge suhtelise niiskuse juures ja kastetakse parajal määral, et oleks välditud ülekastmine ja kuivamine. Puhaskultuuriga taimedel peaksid tekkima tüüpilised närbumissümptomid 15 päeva jooksul. Kui selle aja jooksul ei ole sümptomeid, ei saa kultuuri pidada R. solanacearum’i patogeenseks vormiks.

4) Jälgitakse närbumise ja/või lehtede keerdumise, kloroosi ja kängumise tundemärke.

5) Isoleeritakse sümptomitega taimedest, eraldades varreosa umbes 2 cm kõrguselt inokulatsioonipunktist. Purustatakse ja lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris (4. liide). Isoleeritakse suspensioonist, lahjendused hõõrutakse spaatliga laiali või tehakse joonkülv sobival söötmel, eelistatavalt selektiivsöötmel (2. liide), inkubeeritakse 48–72 tundi temperatuuril 28 °C ja jälgitakse bakterile R. solanacearum tüüpiliste kolooniate tekkimist.




1. liide

Protokollide optimeerimise ja valideerimisega tegelevad laborid



Labor (1)

Asukoht

Riik

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Viin ja Linz

Austria

Departement Gewasbescherming

Merelbeke

Belgia

Plantedirektoratet

Lyngby

Taani

Central Science Laboratory

York

Inglismaa

Scottish Agricultural Science Agency

Edinburgh

Šotimaa

Laboratoire national de la protection des végétaux, Unité de Bactériologie

Angers

Prantsusmaa

Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre

Le Rheu

Prantsusmaa

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Saksamaa

Pflanzenschutzamt Hannover

Hannover

Saksamaa

State Laboratory

Dublin

Iirimaa

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bologna

Itaalia

Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari

Verona

Itaalia

Nederlandse Algemene Keuringsdienst

Emmeloord

Madalmaad

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Madalmaad

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Lissabon

Portugal

Centro de Diagnóstico de Aldearrubia

Salamanca

Hispaania

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Valencia

Hispaania

Swedish University of Agricultural Sciences

Uppsala

Rootsi

(1)   Kontaktteadurid – vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.




2. liide

Söötmed haigusetekitaja R. solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks

a)   Üldised kasvusöötmed

Toiteagar



Toiteagar (Difco)

23,0 g

Destilleeritud vesi

1,0 l

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Pärmiekstraktiga glükoospeptoonagar (YPGA)



Pärmiekstrakt (Difco)

5,0 g

Bacto-peptoon (Difco)

5,0 g

D(+)-glükoos (monohüdraat)

10,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Sahharoos-peptoonagar (SPA)



Sahharoos

20,0 g

Bacto-peptoon (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7H2O

0,25 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilleeritud vesi

1,0 l

pH 7,2–7,4

 

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Kelmani tetrasooliumsööde



Kasaminohapped (Difco)

1,0 g

Bacto-peptoon (Difco)

10,0 g

Dekstroos

5,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilleeritud vesi

1,0 l

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Jahutatakse temperatuurini 50 °C ning läbi steriilse filtri lisatakse 2,3,5-trifenüültetrasooliumkloriidi (Sigma) vesilahust, nii et lõplik kontsentratsioon lahuses on 50 mg/l.

b)   Valideeritud selektiivsed kasvusöötmed

SMSA-sööde (Engelbrecht, 1994, muudetud Elphinstone et al., 1996).



Põhisööde

 

Kasaminohapped (Difco)

1,0 g

Bacto-peptoon (Difco)

10,0 g

Glütserool

5,0 ml

Bacto-agar (Difco); vt Märkus 2.

15,0 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Jahutatakse temperatuurini 50 °C ning läbi steriilse filtri lisatakse järgmiste koostisosade põhivesilahust, et saada täpselt määratletud lõppkontsentratsioonid.



Kristallviolett (Sigma)

5 mg/l

Polümüksiin-B-sulfaat

(Sigma P-1004) 600 000 U (ligikaudu 100 mg)/l

Batsitratsiin (Sigma B-0125)

1 250 U (ligikaudu 25 mg)/l

Klooramfenikool (Sigma C-3175)

5 mg/l

Penitsiliin-G (Sigma P-3032)

825 U (ligikaudu 0,5 mg)/l

2,3,5-trifenüültetrasooliumkloriid (Sigma)

50 mg/l

MÄRKUS

1. Muude reaktiivide kasutamine peale ülalloetletute võib mõjutada R. solanacearum’i kasvu.

2. Bacto-agari (Difco) asemel võib kasutada Oxoid-agarit nr 1. Sel juhul on R. solanacearum’i kasv aeglasem, ehkki võib redutseeruda ka võistlevate saprofüütbakterite kasv. R. solanacearum’i tüüpilised kolooniad võivad kujuneda 1–2 päeva hiljem ning punane värvus võib olla heledam ja hajusam kui Bacto-agaril.

3. Batsitratsiini kontsentratsiooni suurendamine kuni 2 500 U/l võib vähendada võistlevate bakterite populatsioone, mõjutamata Ralstonia solanacearum’i kasvu.

Söötmeid ja antibiootikumide põhilahuseid säilitatakse temperatuuril 4 °C pimedas ja kasutatakse kuu aja jooksul.

Söötmeplaatidel pinnal ei tohi enne kasutamist olla kondenseerumist.

Välditakse söötmeplaatide liigset kuivamist.

Pärast iga uue söötmepartii valmistamist tuleb teha kvaliteedikontroll, tehes R. solanacearum’i referentskultuuri väljakülvi söötmeplaadile (vt 3. liide) ja jälgides tüüpiliste kolooniate kujunemist pärast 2–5päevast inkubeerimist temperatuuril 28 °C.

c)   Valideeritud rikastussöötmed

SMSA-puljong (Elphinstone et al., 1996)

Valmistatakse samamoodi kui SMSA-selektiivsööde, kuid jäetakse välja Bacto-agar ja 2,3,5-tetratsooliumkloriid.

Modifitseeritud Wilbrinki puljong (Caruso et al., 2002)



Sahharoos

10 g

Proteoospeptoon

5 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4

0,25 g

NaNO3

0,25 g

Destilleeritud vesi

1,0 l

Steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit ja jahutatakse maha 50 °C.

Lisatakse antibiootilised põhilahused nagu SMSA-puljongi puhul.




3. liide

A.   Müügil olevad standardiseeritud kontrollmaterjalid

a)   Bakterikolooniad

Positiivsete kontrollidena (tabel 1) või analüüside optimeerimisel (tabel 2) soovitatakse ristreaktsioonide vältimiseks kasutada standardse võrdlusmaterjalina järgmisi isoleeritud bakteritüvesid. Kõiki tüvesid saab osta järgmistest kohtadest:

1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Ühendkuningriik

2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Madalmaad

3. Collection française de bactéries phytopathogènes (CFBP), INRA – Station de phytobactériologie, Angers, Prantsusmaa



Tabel 1.  R. solanacearum’i tüvede SMT viitenumbrid

NCPPB-kood

SMT

nr

Muud koodid

Päritoluriik

Biotüüp

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

Egiptus

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS21

Türgi

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS26

Inglismaa

2

NCPPB 1584

23

CFBP 4598, EURS49

Küpros

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS50

Rootsi

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601, 502, EURS55

Belgia

2

NCPPB 4156 (1)

71 (1)

PD 2762, CFBP 3857

Madalmaad

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15.59

Prantsusmaa

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066

Portugal

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Hispaania

2

NCPPB 4161

76

B3B

Saksamaa

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL60-1, R842

USA

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Costa Rica

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

Colombia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R578, CIP312

Peruu

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R568, CIP226

Brasiilia

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

Peruu

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

Austraalia

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Sri Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filipiinid

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, HEmps2

Hiina

5

(1)   Kasutatakse R. solanacearum’i biotüübi 2 (rassi 3) standardse referenttüvena.

Märkus: eelloetletud tüvede autentsus on tagatud vaid siis, kui need saadakse autentsest kultuuride kogust.



Tabel 2.  Määramisanalüüside optimeerimisel kasutatavate seroloogiliselt võigeneetiliselt seotud bakterite SMT viitenumber.

NCPPB-kood

SMT

nr

Muu kood

Eristus

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa (1)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. marginalis (1)

NCPPB 4164

CFBP 2227

Burkholderia cepacia (2)

NCPPB 4165

CFBP 2459

Ralstonia pickettii (2)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567

CSL Pr1150

Ralstonia pickettii (1)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618

PD 2778

Ralstonia sp. (1)

NCPPB 1127

53

CFBP 3575

Burkholderia andropogonis (1)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli (1)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia (1)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae (1)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii (1)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619

IPO S339

Enterobacter sp. (1)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp. (1)

NCPPB 4170

63

CFBP 4621

IPO S306

Ochrobactrum anthropi (1) (2)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622

IPO 1693

Curtobacterium sp. (1) (2)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp. (1)

NCPPB 4173

PD 2318

Aureobacterium sp. (2)

NCPPB 4174

81

IVIA 1844.06

Flavobacterium sp. (1) (2)

(1)   Seroloogilistes analüüsides (IF ja/või ELISA) võimalik tüve ristuv reageerimine polüklonaalsete antiseerumitega.

(2)   Tüvi, millest mõnes laboris võib amplifitseerida sama suurusega PCR produkte kui spetsiifiliste praimerite OLI-1 ja Y-2 kasutamisel (vt 6. liide).

(3)   Reageerib ristuvalt tõenäoliselt enamikus analüüsides, kuid teadaolevalt esineb vaid banaanidel Indoneesias.

b)   Müügil olevad standardiseeritud kontrollmaterjalid

Järgmisi standardiseeritud kontrollmaterjale saab NCPPB kultuuride kogust.

200 terve kartulimugula kartuliekstrakti külmkuivatatud kontsentreeritud bakterisade külmutatakse kõikide analüüside negatiivseks kontrolliks.

200 terve kartulimugula kartuliekstrakti külmkuivatatud kontsentreeritud bakterisade, mis sisaldab R. solanacearum’i biotüüp 2 (tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) 103 kuni 104 ja 104 kuni 106 rakku seroloogiliste ja PCR-analüüside positiivseks kontrolliks. Kuna külmkuivatamise käigus mõjutatakse rakkude eluvõimelisust, ei sobi need isolatsiooni- ja biotesti standardkontrollideks.

Seroloogiliste analüüside positiivseteks kontrollideks on R. solanacearum’i biotüüp 2 (tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) formaliiniga fikseeritud suspensioonid 106 rakku milliliitri kohta.

B.   Positiivsete ja negatiivsete kontrollide valmistamine

Tehakse bakteri R. solanacearum’i rassi 3/biotüübi 2 virulentse tüve (nt tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) 48tunnine kultuur SMSA-põhisöötmel ja suspendeeritakse 10 mM fosfaatpuhvris, et saada rakkude tiheduseks umbes 2 × 108 kolooniaid moodustavat osakest milliliitris. See saadakse tavaliselt veidi häguses suspensioonis, mis vastab 0,15 optilisele tihedusele 600 nanomeetris.

Eemaldatakse basaalsed tipusüdamikud 200 mugulalt, mis on pärit valgekoorelise sordi saagist, mille kohta on teada, et selles ei ole bakterit R. solanacearum.

Basaalseid tipusüdamikke töödeldakse tavaliselt ja bakterisade resuspendeeritakse 10 milliliitris.

Valmistatakse 10 steriilset 1,5 ml mikroampulli 900 µl resuspendeeritud bakterisademega.

100 µl bakteri R. solanacearum suspensiooni pannakse esimesse mikroampulli. Loksutatakse vorteksil.

Saastetase määratakse lahjenduste kümnendreaga järgmises viies mikroampullis.

Kuut saastunud mikroampulli kasutatakse positiivsete kontrollidena. Nelja saastumata mikroampulli kasutatakse negatiivsete kontrollidena. Mikroampullid märgistatakse vastavalt.

Steriilsetes 1,5 ml mikroampullides valmistatakse 100 µl alikvoodid ning saadakse seega iga kontrollproovi 9 replikoni. Säilitatakse 16 kuni 24 °C juures kuni kasutamiseni.

Bakteri R. solanacearum olemasolu ja kvantifikatsioon kontrollproovides tuleks esmalt kinnitada IF-analüüsiga.

PCR-analüüsiks ekstraheeritakse DNA positiivsetest ja negatiivsetest kontrollproovidest iga katseproovide seeria puhul.

IF- ja FISH-analüüsideks analüüsitakse positiivseid ja negatiivseid kontrollproove iga analüüsitavate proovide seeria puhul.

IF-, FISH- ja PCR-analüüsides tuleb avastada bakteri R. solanacearum vähemalt 106 ja 104 rakku milliliitris positiivsetes kontrollides ning bakterit ei tohi olla üheski negatiivses kontrollis.




4. liide

Analüüsimenetluste puhvrid

ÜLDNÕUE: avamata steriilseid puhvreid võib säilitada kuni ühe aasta.

1.   Ekstraktsioonimenetluse puhvrid

1.1.   Ekstraktsioonipuhver (50 mM fosfaatpuhver, pH 7,0)

Seda puhvrit kasutatakse bakteri eraldamiseks taimekudedest homogeenimise või loksutamise teel.



Na2HPO4 (veevaba)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Võib lisada muid aineid järgmiselt.



 

Eesmärk

Kogus (liitri kohta)

Lubrol-helbed

Deflokulant (1)

0,5 g

DC-silikooniga vahutamisvastane aine

Vahutamisvastane aine (1)

1,0 ml

Tetranaatriumpürofosfaat

Antioksüdant

1,0 g

Polüvinüülpürrolidoon-40 000 (PVP-40)

PCR-inhibiitorite siduja

50 g

(1)   Kasutamiseks ekstraktsioonimenetluses homogeenimise teel.

1.2.   Bakterisademe puhver (10 mM fosfaatpuhver, pH 7,2)

Seda puhvrit kasutatakse kartulimugula basaalsete tipusüdamike ekstraktide resuspendeerimiseks pärast kontsentreerimist bakterisademeks tsentrifuugimise teel.



Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

2.   IF-analüüsi puhvrid

2.1.   IF-puhver (10 mM fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus (PBS), pH 7,2)

Seda puhvrit kasutatakse antikehade lahjendamiseks.



Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCl

8,0 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

2.2.   IF-puhver Tweeniga

Seda puhvrit kasutatakse objektiklaaside pesemiseks.

IF-puhvrile lisatakse 0,1 % Tween 20.

2.3.   Fosfaatpuhvri lisandiga glütserool, pH 7,6

Seda puhvrit kasutatakse kattevedelikuna fluorestseerumise suurendamiseks IF-objektiklaaside aknaväljades.



Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Glütserool

50 ml

Destilleeritud vesi

100 ml

Pleekimisvastased kattevedelikud on müügil, näiteks Vectashield® (Vector Laboratories) või Citifluor® (Leica).

3.   Kaudse ELISA-analüüsi puhvrid

3.1.   Kahekordne kattepuhver, pH 9,6



Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Antioksüdandina võib lisada naatriumsulfitit (0,2 %), et vältida oksüdeerunud aromaatsete ühendite tekkimist.

3.2.   10 X fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus (PBS), pH 7,4



NaCl

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4.12H2O

29,0 g

KCl

2,0 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

3.3.   PBS-Tween



10 X PBS

100 ml

10 % Tween 20

5 ml

Destilleeritud vesi

895 ml

3.4.   Blokeeriv (antikeha) puhver (puhver tuleb valmistada vahetult enne töö alustamist)



10 X PBS

10,0 ml

Polüvinüülpürrolidoon-44 000 (PVP-44)

2,0 g

10 % Tween 20

0,5 ml

Piimapulber

0,5 g

Destilleeritud vesi

Täiendatakse 100 ml-ni

3.5.   Leeliseline fosfataassubstraadi lahus, pH 9,8



Dietanoolamiin

97 ml

Destilleeritud vesi

800 ml

Segatakse ja kontsentreeritud HCl-ga reguleeritakse pH 9,8ni.

Maht täiendatakse destilleeritud veega 1 liitrini.

Lisatakse 0,2 g MgCl2.

Kaks fosfataassubstraadi 5 mg tabletti (Sigma) lahustatakse 15 ml lahuses.

4.   DASI ELISA analüüsi puhvrid

4.1.   Kattepuhver, pH 9,6



Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Destilleeritud vesi

1 000 ml

Ained lahustatakse ja kontrollitakse pH 9,6.

4.2.   10 X fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus (PBS), pH 7,2–7,4



NaCl

80,0 g

NaH2PO4.2 H2O

4,0 g

Na2HPO4.12H2O

27,0 g

Destilleeritud vesi

1 000 ml

4.3.   PBS-Tween



10 X PBS

50 ml

10 % Tween 20

5 ml

Destilleeritud vesi

950 ml

4.4.   Substraatpuhver, pH 9,8



Dietanoolamiin

100 ml

Destilleeritud vesi

900 ml

Segatakse ja kontsentreeritud HCl-ga reguleeritakse pH 9,8ni.




5. liide

Bakterite koguse määramine IF-ja FISH-analüüsides

1. Loendatakse keskmine tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv välja kohta (c).

2. Arvutatakse tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv objektiklaasi akna kohta (C).

C = c × S/s



kus

S

=

mitmekohalise objektiklaasi aknavälja pindala

ja

s

=

objektiivi pindala



s = πi2/4G2K2

kus

i

=

välja koefitisient (sõltub okulaari tüübist ja on 8-24)

 
 

K

=

toru koefitsient (1 või 1,25)

 
 

G

=

objektiivi suurendus (100 korda, 40 korda jne).

3. Arvutatakse tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv milliliitri resuspendeeritud bakterisademe kohta (N).

N = C × 1 000/y × F



kus

y

=

resuspendeeritud bakterisademe maht igas aknas

ja

F

=

resuspendeeritud bakterisademe lahjendustegur.




6. liide

Valideeritud PCR-protokollid ja -reaktiivid

Märkus: eelanalüüsid peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada vähemalt 103 kuni 104 bakteri R. solanacearum rakku prooviekstrakti milliliitris.

Eelanalüüsid ei tohiks anda valepositiivseid tulemusi valitud bakteritüvedega (vt 3. liide).

1.   PCR-protokoll, Seal et al. (1993)

1.1.   Oligonukleotiidpraimerid



Päripidine praimer OLI-1

5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′

Äraspidine praimer Y-2

5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

Bakteri R. solanacearum maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus on 288 aluspaari.

1.2.   PCR-reaktsioonisegu



Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

17,65 µl

 

10X PCR puhver (1) (15 mM MgCl2)

2,5 µl

1X (1,5 mM MgCl2)

dNTP-segu (20 mM)

0,25 µl

0,2 mM

Praimer OLI-1 (20 µM)

1,25 µl

1 µM

Praimer Y-2 (20 µM)

1,25 µl

1 µM

Taq-polümeraas (5 U/µl) (1)

0,1 µl

0,5 U

Proovi maht

2,0 µl

 

Kogumaht

25 µl

 

(1)   Meetod valideeriti, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

1.3.   PCR-reaktsiooni tingimused

Järgitakse järgmist menetlust:



1 tsükkel:

i)

2 minutit 96 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

35 tsüklit:

ii)

20 sekundit 94 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

 

iii)

20 sekundit 68 °C juures (praimerite anniilimine)

 

iv)

30 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon)

1 tsükkel:

v)

10 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon)

 

vi)

hoitakse 4 °C juures.

Märkus: see programm optimeeriti termotsükleri Perkin Elmer 9600 kasutamiseks. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii ja iv kestust.

1.4.   Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs

Bakteri R. solanacearum DNAst amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Ava II anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 37 °C juures.

2.   PCR-protokoll, Pastrik ja Maiss (2000)

2.1.   Oligonukleotiidpraimerid



Päripidine praimer Ps-1

5′- agt cga acg gca gcg ggg g -3′

Äraspidine praimer Ps-2

5′- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3′

Bakteri R. solanacearum maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus on 553 aluspaari.

2.2.   PCR-reaktsioonisegu



Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

16,025 µl

 

10X PCR puhver (1)

2,5 µl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktsioon V) (10 %)

0,25 µl

0,1 %

dNTP-segu (20 mM)

0,125 µl

0,1 mM

Praimer Ps-1 (10 µM)

0,5 µl

0,2 µM

Praimer Ps-2 (10 µM)

0,5 µl

0,2 µM

Taq-polümeraas (5 U/µl) (1)

0,1 µl

0,5 U

Proovi maht

5,0 µl

 

Kogumaht

25,0 µl

 

(1)   Meetodid valideeriti, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

Märkus: Algselt optimeeritud kasutamiseks Gibco Taq-polümeraasiga termotsükleris MJ Research PTC 200.

Kasutada võib ka Perkin Elmer AmpliTaqi ja puhvrit samades kontsentratsioonides.

2.3.   PCR-reaktsiooni tingimused

Järgitakse järgmist menetlust:



1 tsükkel:

i)

5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

35 tsüklit:

ii)

30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

 

iii)

30 sekundit 68 °C juures (praimerite anniilimine)

 

iv)

45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon)

1 tsükkel:

v)

5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon)

 

vi)

hoitakse 4 °C juures.

Märkus: programm on optimeeritud kasutamiseks termotsükleriga MJ Research PTC 200. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii ja iv kestust.

2.4.   Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs

Bakteri R. solanacearum DNAst amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Taq I anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 65 °C juures 30 minutit. Bakterile R. solanacearum tüüpilisest fragmendist saadud restriktsioonifragmentide pikkus on 457 ja 96 aluspaari.

3.   Mitmeetapiline PCR-protokoll sisemise PCR-kontrolliga (Pastrik et al., 2002)

3.1.   Oligonukleotiidpraimerid



Päripidine praimer Rs-1-F

5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′

Äraspidine praimer Rs-1-R

5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′

Päripidine praimer Ns-5-F

5′- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3′

Äraspidine praimer Ns-6-R

5′- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3′

Bakteri R. solanacearum maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus on 718 aluspaari (Rs-praimerite komplekt)

18S rRNA sisemise PCR-kontrolli eeldatav amplikonipikkus on 310 aluspaari (Ns-praimerite komplekt)

3.2.   PCR-reaktsioonisegu



Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

12,625 µl

 

10X PCR-puhver (1) (15 mM MgCl2)

2,5 µl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktsioon V) (10 %)

0,25 µl

0,1 %

dNTP-segu (20 mM)

0,125 µl

0,1 mM

Praimer Rs-1-F (10 µM)

2,0 µl

0,8 µM

Praimer Rs-1-R (10 µM)

2,0 µl

0,8 µM

Praimer Ns-5-F (10 µM) (2)

0,15 µl

0,06 µM

Praimer Ns-6-F (10 µM) (2)

0,15 µl

0,06 µM

Taq-polümeraas (5 U/µl) (1)

0,2 µl

1,0 U

Proovi maht

5,0 µl

 

Kogumaht

25,0 µl

 

(1)   Meetodid valideeriti, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

(2)   Kartuli basaalsete tipusüdamike ekstrakti puhul optimeeriti praimerite Ns-5-F ja Ns-6-R kontsentratsioonid, kasutades homogeenimismeetodit ja DNA puhastamist vastavalt Pastrikule (2000) (vt VI jao punkt A.6.1.a). Kui kasutatakse loksutamise teel DNA ekstraheerimist või muid isoleerimismeetodeid, on vaja reaktiivikontsentratsioonid uuesti optimeerida.

3.3.   PCR-reaktsiooni tingimused

Järgitakse järgmist menetlust:



1 tsükkel:

i)

5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

35 tsüklit:

ii)

30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

 

iii)

30 sekundit 58 °C juures (praimerite anniilimine)

 

iv)

45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon)

1 tsükkel:

v)

5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon)

 

vi)

hoitakse 4 °C juures

Märkus: programm on optimeeritud kasutamiseks termotsükleriga MJ Research PTC 200. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii ja iv kestust.

3.4.   Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs

Bakteri R. solanacearum DNAst amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Bsm I või isoskisomeeriga (nt Mva 1269 I) anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 65 °C juures 30 minutit.

4.    R. solanacearum′i biotüübispetsiifiline PCR-protokoll (Pastrik et al., 2001)

4.1.   Oligonukleotiidpraimerid



Päripidine praimer Rs-1-F

5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′

Äraspidine praimer Rs-1-R

5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′

Äraspidine praimer Rs-3-R

5′- TTC ACG GCA AGA TCG CTC -3′

Bakteri R. solanacearum maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus:

praimeriga Rs-1-F/Rs-1-R on 718 aluspaari

praimeriga Rs-1-F/Rs-3-R on 716 aluspaari

4.2.   PCR-reaktsioonisegu

a) Biotüübi 1/2 spetsiifiline PCR



Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

12,925 µl

 

10X PCR-puhver (1)

2,5 µl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktsioon V) (10 %)

0,25 µl

0,1 %

dNTP-segu (20 mM)

0,125 µl

0,1 mM

Praimer Rs-1-F (10 µM)

2 µl

0,8 µM

Praimer Rs-1-R (10 µM)

2 µl

0,8 µM

Taq-polümeraas (5 U/µl) (1)

0,2 µl

1 U

Proovi maht

5,0 µl

 

Kogumaht

25,0 µl

 

(1)   Meetodid on valideeritud, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

b) Biotüübi 3/4/5 spetsiifiline PCR



Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

14,925 µl

 

10X PCR puhver (1)

2,5 µl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktsioon V) (10 %)

0,25 µl

0,1 %

dNTP-segu (20 mM)

0,125 µl

0,1 mM

Praimer Rs-1-F (10 µM)

1 µl

0,4 µM

Praimer Rs-3-R (10 µM)

1 µl

0,4 µM

Taq-polümeraas (5 U/µl) (1)

0,2 µl

1 U

Proovi maht

5,0 µl

 

Kogumaht

25,0 µl

 

(1)   Meetodid on valideeritud, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

4.3.   PCR-reaktsiooni tingimused

Nii biotüübi 1/2 kui ka 3/4/5 spetsiifiliste reaktsioonide puhul järgitakse järgmist menetlust:



1 tsükkel:

i)

5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

35 tsüklit:

ii)

30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

 

iii)

30 sekundit 58 °C juures (praimerite anniilimine)

 

iv)

45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon)

1 tsükkel:

v)

5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon)

 

vi)

hoitakse 4 °C juures

Märkus: programm optimeeriti kasutamiseks termotsükleriga MJ Research PTC 200. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii ja iv kestust.

4.4.   Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs

Bakteri R. solanacearum DNAst praimeritega Rs-1-F ja Rs-1-R amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Bsm I või isoskisomeeriga (nt Mva 1269 I) anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 65 °C juures 30 minutit. Bakteri R. solanacearum DNAst praimeritega Rs-1-F ja Rs-3-R amplifitseeritud PCR-produktidel ei ole restriktsioonikohti.

5.   Täitepuhvri valmistamine

5.1.   Bromofenoolsisnine (10 % põhilahus)



Bromofenoolsinine

5 g

Kaks korda destilleeritud vesi

50 ml

5.2.   Täitepuhver



Glütserool (86 %)

3,5 ml

Bromofenoolsinine (5.1)

300 µl

Kaks korda destilleeritud vesi

6,2 ml

6.   10 X trisatsetaat EDTA puhver, pH 8,0



Tris-puhver

48,40 g

Jää-äädikas

11,42 ml

EDTA (dinaatriumsool)

3,72 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Enne kasutamist lahjendatakse üks kord.

On ka müügil (näiteks Invitrogen või samaväärne).




7. liide

FISH-analüüsi valideeritud reaktiivid

1.   Oligoproovid

R. solanacearum-spetsiifiline oligoproov OLI-1-CY3 5′- ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Mittespetsiifiline eubakteriaalne oligoproov EUB-338-FITC 5′- gct gcc tcc cgt agg agt-3′

2.   Kinnitilahus

(HOIATUS! KINNITI SISALDAB PARAFORMALDEHÜÜDI, MIS ON MÜRGINE. TULEB KANDA KINDAID, AINET EI TOHI SISSE HINGATA. ON SOOVITAV TÖÖTADA TÕMBEKAPIS.)

i) 9 ml molekulaarbioloogias kasutatavat vett (näiteks ultrapuhast vett) kuumutatakse umbes 60 °C ja lisatakse 0,4 g paraformaldehüüdi. Paraformaldehüüd lahustub pärast seda, kui on lisatud 5 tilka 1N NaOH ja segatud magnetsegajaga.

ii) pH reguleeritakse 7,0, lisades 1 ml 0,1 M fosfaatpuhvrit (PB; pH 7,0) ja 5 tilka 1N HCl. pH-d kontrollitakse indikaatorribadega ja vajaduse korral reguleeritakse HCl või NaOH-ga. (HOIATUS! PARAFORMALDEHÜÜDI LAHUSTE PUHUL EI TOHI KASUTADA PH-MEETRIT.)

iii) Lahus filtreeritakse läbi 0,22 µm membraanfiltri ja säilitatakse edasiseks kasutamiseks tolmuvabalt 4 °C juures.

3.   3 X Hybmix-lahus



NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (filter-steriliseeritud ja autoklaavitud)

15 mM

Lahjendatakse üks kord vastavalt vajadusele.

4.   Hübridisatsioonilahus



1 X Hybmix-lahus

 

Naatriumdodetsüülsulfaat

0,01 %

Formamiid

30 %

Oligoproov EUB 338

5 ng/μl

Oligoproov OLI-1 või OLI-2

5 ng/μl

Hübridisatsioonilahused valmistatakse vastavalt tabelis 1 arvutatud kogustele. Iga objektiklaasi jaoks (millel on kaks erinevat proovi kaks korda) on tarvis 90 μl hübridisatsioonilahust. TÄHTIS! FORMAMIID ON VÄGA MÜRGINE, SEETÕTTU TULEB KANDA KINDAID JA RAKENDADA VAJALIKKE ETTEVAATUSABINÕUSID!



Tabel.  Hübridisatsioonisegu valmistamiseks soovitatavad kogused

Objektiklaaside hulk

1

4

6

8

10

Steriilne ultrapuhas vesi

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

3 X Hybmix-lahus

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

1 % SDS

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formamiid

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Oligoproov EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Oligoproov OLI-1 või OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Kogumaht (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

Märkus: kõiki valgustundlikke oligoproove sisaldavaid lahuseid säilitatakse pimedas -20 °C juures.

Kasutamise ajal välditakse otsest päikese- või elektrivalgust.

5.   0,1 M fosfaatpuhver, pH 7,0



Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.




8. liide

Baklažaani- ja tomatikultuuride kasvatamistingimused

Tomati (Lycopersicon esculentum) või baklažaani (Solanum melongena) seemned külvatakse pastöriseeritud külvikomposti. Täielikult avanenud idulehtedega (10–14 päeva) seemikud istutatakse ümber pastöriseeritud istutuskomposti.

Baklažaani- või tomatitaimed peaksid olema kasvatatud kasvuhoones järgmistel keskkonnatingimustel:



päeva pikkus:

14 tundi või looduslik päevapikkus, kui see on pikem,

temperatuur:

päeval: 21–24 °C,

öösel: 14–18 °C.

Haigusele vastuvõtlik tomatisort:

“Moneymaker”

Haigusele vastuvõtlik baklažaanisort:

“Black Beauty”

Tarnijad:

vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

VIITED

1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.




III LISA

1. Iga haigusetekitaja esinemise kahtluse korral, mille kohta on saadud loetletud taimse materjali või muu materjali kohta positiivne tulemus vastavalt III lisas esitatud asjakohasele meetodile läbi viidud sõelkatse(te)s ja oodatakse tulemuste kinnitamist või ümberlükkamist, tuleb kuni eespool nimetatud meetodi lõpuleviimiseni kinni pidada ja nõuetekohaselt säilitada

 kõik mugulad, millest proov on võetud, ning võimaluse korral kõik taimed, millelt proov on võetud,

 kõik järelejäänud ekstraktid ja sõelkatse(te)ks valmistatud lisamaterjalid, nt immunofluorestsents-objektiklaasid,

 ning

 kõik asjakohased dokumendid kuni kõnealus(t)e meetodi(te) lõpuleviimiseni.

Mugulate säilitamine võimaldab teha sordikatseid, kui see on asjakohane.

2. Organismi olemasolu kinnituse puhul tuleks alles hoida ja nõuetekohaselt säilitada

 lõikes 1 määratletud materjal,

 ja

 vajaduse korral mugula- või taimeekstraktiga nakatatud tomati- või baklažaanitaime proov

 ning

 organismi isoleeritud kultuur

vähemalt ühe kuu jooksul pärast teatamist vastavalt artikli 5 lõikele 2.




IV LISA

Artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis i osutatud uurimisel võetakse vajaduse korral arvesse järgmised tegurid:

i) tootmiskohad,

 kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis pärinevad samast kloonist kui kartulid, mis on osutunud organismiga saastunuks,

 kus kasvatatakse või on kasvatatud tomateid, mis pärinevad samast algallikast kui tomatid, mis on osutunud organismiga saastunuks,

 kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid või tomateid, mis on ametliku kontrolli all organismi oletatava esinemise tõttu,

 kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis pärinevad samast kloonist kui kartulid, mis on kasvatatud organismiga saastunuks osutunud tootmiskohtades,

 kus kasvatatakse kartuleid või tomateid ja mis asetsevad saastunud tootmiskoha naabruses, k.a sellised tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi jagatakse omavahel otseselt või ühise lepingulise tööettevõtja kaudu,

 kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekohas on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist,

 kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekoht on ühises kasutuses tootmiskohtadega, kus on organismi esinemine kinnitatud või kus oletatakse organismi esinemist,

 mis on või mis on olnud üle ujutatud pinnaveega, milles on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist,

ja

ii) organismiga saastunud pinnavesi, mida on kasutatud tootmiskoha kastmiseks ja niisutamiseks või mis on üle ujutanud põllu(d) või tootmiskoha(d).




V LISA

1. Tõenäolise saastumise ulatuse kindlaksmääramiseks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel võetakse vajaduse korral arvesse järgmisi tegureid:

 artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud tootmiskohas kasvatatav loetletud taimne materjal,

 tootmiskoht või -kohad, mis mõnes tootmislülis on seotud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud loetletud taimse materjaliga, k.a tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi jagatakse omavahel otseselt või ühise lepingulise tööettevõtja kaudu,

 loetletud taimne materjal, mida kasvatati või mis oli eelmises taandes osutatud tootmiskohas või -kohtades ajavahemikul, mil esimeses taandes osutatud tootmiskohas oli vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii saastunuks tunnistatud taimne materjal,

 eelmistes taanetes osutatud tootmiskohtadest pärit loetletud taimset materjali käitlevad ettevõtted,

 mis tahes seadmed, veokid, anumad, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjal, mis on võinud olla kontaktis loetletud taimse materjaliga, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel,

 kogu loetletud taimne materjal, mida on hoitud eelmises taandes loetletud ehitiste või objektide sees või nendega kokkupuutes enne nende ehitiste või objektide puhastamist ja desinfitseerimist,

 artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti i alusel toimunud uurimise ja laboratoorse analüüsimise tulemusel artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel organismiga saastunuks tunnistatud loetletud taimse materjaliga samast kloonist pärinevad kartulimugulad või -taimed ja saastunuks tunnistatud taimse materjaliga samast allikast pärinevad tomatitaimed, mille saastumine on tõenäoline taime kloonide kaudu, kuigi analüüsi tulemused on võinud olla negatiivsed. Saastunud ja klooni kaudu seotud mugulate või taimede suguluse tõendamiseks võib teha sordikatseid,

 eelmises taandes osutatud taimse materjali tootmiskoht või -kohad,

 loetletud taimse materjali tootmiskoht või -kohad, kus kasutatakse artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud kastmis- ja niisutusvett,

 loetletud taimne materjal, mis on kasvatatud põldudel, mis on üle ujutatud saastunud pinnaveega.

2. Organismi võimaliku leviku kindlaksmääramine artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv ja artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel hõlmab

i) artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv osutatud juhtudel

 loetletud taimse materjali muude tootmiskohtade lähedust,

 seemnekartulivarude ühist tootmist ja kasutamist,

 tootmiskohti, kus kasutatakse pinnavett taimse materjali kastmiseks või niisutamiseks juhtudel, kus artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud tootmiskohas (tootmiskohtades) esineb või on esinenud pinnavee äravoolu või üleujutuse ohtu;

ii) juhtudel, mil pinnavesi on artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel tunnistatud organismiga saastunuks,

 loetletud taimse materjali tootmiskohta (tootmiskohti), mis asuvad organismiga saastunuks tunnistatud pinnavee lähedal või kus esineb üleujutusoht,

 iga eraldatud vesikonda, mis on ühenduses saastunuks tunnistatud pinnaveega,

 veekogud, mis on ühenduses saastunuks tunnistatud pinnaveega, võttes arvesse

 

 saastunuks tunnistatud vee voolusuunda ja -hulka,

 looduslike maavitsaliste peremeestaimede esinemist.

3. Artikli 5 lõike 2 esimeses lõigus osutatud teatis esitatakse järgmiselt:

 kohe pärast organismi olemasolu kinnitamist laborianalüüsidega, kasutades II lisas sätestatud meetodeid, esitades vähemalt järgmised andmed:

 

 kartulite puhul,

 

a) partii sordi nimi;

b) kasutusotstarve (söögikartul, seemnekartul jne) ja seemnekartuli kategooria, kui see on kohaldatav,

 tomatitaimede puhul partii sordi nimi ja kategooria, kui see on kohaldatav,

 ilma et see piiraks artikli 4 punkti 3 esinemise kahtluse teatamise nõudeid, peab asjaomane liikmesriik, kus saastumine on avastatud ja on olemas teisest liikmesriigist (teistest liikmesriikidest) pärit või teise liikmesriiki (teistesse liikmesriikidesse) viidava loetletud taimse materjali saastumisoht, viivitamata teatama asjassepuutuvale liikmesriigile (asjassepuutuvatele liikmesriikidele) artikli 5 lõike 3 kohaselt järgmised andmed:

 

a) kartuli- või tomatipartii sordi nimi;

b) kaubasaatja ja kaubasaaja nimi ja aadress;

c) kartuli- või tomatipartii tarnekuupäev;

d) tarnitud kartuli- või tomatipartii suurus;

e) taimepassi koopia või vähemalt taimepassi number, kui see on asjakohane, või kasvataja või turustaja registreerimisnumber, kui see on asjakohane, ja saatedokumendi koopia.

Kui sellist teavet esitatakse, teatatakse sellest viivitamata komisjonile.

4. Artikli 5 lõike 2 teises lõigus osutatud lisateave esitatakse järgmiselt:

pärast kõigi uuringute lõppu teatatakse iga juhtumi puhul järgmised andmed:

a) kuupäev, millal saastumine kinnitati;

b) lühikirjeldus tehtud uurimisest saasteallika kindlaksmääramise ja saastumise võimaliku leviku kohta, sealhulgas läbiviidud proovivõtu taseme kohta;

c) teave kindlakstehtud või oletatava(te) saasteallika(te) kohta;

d) täpne teave saastunuks tunnistamise ulatuse kohta, sealhulgas tootmiskohtade arv ja kartulite korral partiide arv koos sordi nime ja seemnekartuli puhul kategooriaga;

e) üksikasjad tsooni piiritlemise kohta, sealhulgas nende tootmiskohtade arv, mis ei ole tunnistatud saastunuks, kuid mida tsoon hõlmab;

f) üksikasjad veealade saastunuks tunnistamise kohta, sealhulgas veekogu nimi ja asukoht ning saastumuse/niisutamiskeelu ulatus;

g) saastunuks tunnistatud tomatitaimede saadetise või partii puhul direktiivi 2000/29/EÜ artikli 13 lõike 1 alapunktis ii ette nähtud sertifikaadid ning vastavalt direktiivi 2000/29/EÜ V lisa A osa I jao punktis 2.2 esitatud loetelule väljastatud taimepassi number;

h) muud teavet, mis on seotud kinnitatud haiguspuhanguga (haiguspuhangutega) ja mida komisjon võib nõuda.




VI LISA

1. Artikli 6 punktis 1 osutatud sätted on järgmised:

 loomasöödana kasutamine pärast kuumtöötlemist, nii et puudub organismi ellujäämise oht,

 või

 kõrvaldamine ametlikult heaks kiidetud jäätmekäitluskohas, kus ei teki organismi keskkonda pääsemise identifitseeritavat riski nt põllumajandusmaadesse imbumise või põllumaa kastmiseks kasutatava veega kokkupuutumise kaudu,

 või

 tuhastamine

 või

 tööstuslikuks töötlemiseks kasutamine otsese ja vahetu tarnimisega töötlevasse tehasesse, kus on ametlikult heaks kiidetud jäätmete kõrvaldamise seadmed, mille puhul on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu, ning vähemalt väljuvate sõidukite puhastamis- ja desinfitseerimissüsteem,

 või

 muud meetmed, tingimusel et on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest ja nende põhjendustest tuleb teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele.

Mis tahes muud jäätmed, mis on seotud eespool nimetatud tingimustega või mis tekivad nende tõttu, kõrvaldatakse ametlikult heaks kiidetud meetoditel vastavalt käesoleva direktiivi VII lisale.

2. Artikli 6 lõikes 2 osutatud loetletud taimse materjali asjakohane kasutamine või kõrvaldamine vastava liikmesriigi (vastavate liikmesriikide) vastutavate ametiasutuste kontrolli all koos vastutavate ametiasutuste vahelise teabevahetusega, et tagada pidev kontroll ja selle liikmesriigi vastutavate ametiasutuste heakskiit, kus kartulid pakendatakse või kus neid töödeldakse esimeses ja teises taandes osutatud jäätmete kõrvaldamise seadmete jaoks, on järgmine:

i) kartulimugulate puhul

 kasutamine toiduks ette nähtud tarbekartulina, mis on valmis pakendatud otsetarnimiseks ja kasutamiseks ümberpakendamata kohas, kus on asjakohased jäätmete kõrvaldamise seadmed. Seemnekartuliks ette nähtud kartuleid võib töödelda samas kohas ainult siis, kui seda tehakse eraldi või pärast puhastamist ja desinfitseerimist,

 või

 kasutamine tööstuslikuks töötlemiseks ette nähtud tarbekartulina, mis tuleb otse ja vahetult tarnida töötlemisettevõttesse, kus on nõuetekohased jäätmete kõrvaldamisseadmed ja vähemalt lahkuvate sõidukite puhastamis- ja desinfitseerimissüsteem,

 või

 muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu ning selle on heaks kiitnud kõnealused vastutavad ametiasutused;

ii) teiste taimeosade, k.a varre- ja leheprahi puhul,

 hävitamine

 või

 muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu; ning selle on heaks kiitnud kõnealused vastutavad ametiasutused.

3. Artikli 6 lõikes 3 osutatud objektide saastumisest puhastamise asjakohased meetodid on puhastamine ja vajaduse korral desinfitseerimine nii, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu, ning seda tehakse liikmesriikide vastutavate ametiasutuste järelevalve all.

4. Liikmesriikide rakendatavad meetmed artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv ja punkti c alapunktis iii kehtestatud ja artikli 6 lõikes 4 osutatud piiritletud tsooni(de)s on järgmised.

4.1. Nendel juhtudel, kui tootmiskohad on tunnistatud organismiga saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel

a) kaitstud tootmisalade põldudel või põlluosadel, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel

i) vähemalt nelja kasvatusaasta jooksul pärast saastunuks tunnistamise aastat,

 võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude kõrvaldamiseks

 ning

 ei panda maha, istutata ega külvata järgmist:

 

 kartulimugulaid, -taimi ega -seemneid,

 tomatitaimi ega -seemneid,

 võttes arvesse organismi bioloogiat,

 teisi organismi peremeestaimi,

 taimeliike perekonnast kapsasrohi Brassica, mille puhul on identifitseeritav organismi ellujäämise oht,

 teisi põllukultuure, millel on identifitseeritav organismi levitamise oht,

 esimesel kartuli või tomati kasvuaastal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, ja tingimusel, et põld on vähemalt kahel järjestikusel kasvuaastal enne taimede istutamist olnud ametliku kontrolli ajal vaba iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimedest ja muudest peremeestaimedest, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvatest umbrohtudest, tuleb

 

 kartuli puhul lubada vaid tarbekartuli tootmist,

 kartuli ja tomati puhul analüüsida vastavalt koristatud mugulaid või tomatitaimi II lisas esitatud menetluse kohaselt,

 hooajal, mis järgneb eelmises taandes osutatud kartuli- või tomatikasvatushooajale ja asjakohasele külvikordade tsüklile (mis seemnekartuli kasvatamise puhul on vähemalt kaks aastat), viia läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametlik kontroll,

või

ii) saastunuks tunnistamise aastale järgneva viie kasvatusaasta jooksul

 võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude kõrvaldamiseks

 ning

 tuleb esimese kolme aasta jooksul põld vastavalt identifitseeritavale ohule kas sööti jätta või külvata sinna teravilja või kasutada püsikarjamaana, mida sagedasti madalalt niidetakse või kasutatakse intensiivselt karjatamiseks, või kasutada heintaimede seemne tootmiseks ja kahe järgneva aasta jooksul järgneb muude kui organismi peremeestaimede kasvatamine, mille puhul ei ole organismi ellujäämise või leviku identifitseeritavat ohtu,

 esimesel kartuli või tomati kasvuaastal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, ja tingimusel, et põld on vähemalt kahel järjestikusel kasvuaastal enne taimede istutamist olnud ametliku kontrolli ajal vaba iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimedest ja muudest peremeestaimedest, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvatest umbrohtudest, tuleb

 

 kartuli puhul lubada seemne- või tarbekartuli tootmist,

 kartuli ja tomati puhul analüüsida vastavalt koristatud mugulaid või tomatitaimi vastavalt II lisas esitatud menetlusele;

b) kõigil muudel saastunud tootmiskoha põldudel ning tingimusel, et vastutavad ametiasutused on kindlaks teinud, et iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede, sealhulgas maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude oht on kõrvaldatud,

 tootmiskoha saastunuks tunnistamise aastale järgneval kasvatusaastal

 

 kartulimugulaid, -taimi või seemneid ega muid organismi peremeestaimi ei panda maha, istutata ega külvata,

 või

 kartulimugulate puhul tohib sertifitseeritud seemnekartulit kasutada üksnes tarbekartuli tootmiseks,

 tomatitaimede puhul võib direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest kasvatatud tomatitaimi kasutada üksnes viljade tootmiseks,

 saastunuks tunnistamise aastale järgneval teisel kasvatusaastal

 

 kartulite puhul kasutatakse seemne- või tarbekartuli tootmiseks üksnes sertifitseeritud seemnekartulit või seemnekartulit, mida on pruunmädaniku puudumise suhtes ametlikult analüüsitud ning mis on kasvatatud ametliku kontrolli all muudes kui artiklis 4.1 osutatud tootmiskohtades,

 tomatite puhul kasutatakse nii taimede kui ka viljade tootmiseks üksnes tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, toodetud niisugusest seemnest saadud taimedest ja kasvatatud ametliku kontrolli all muudes kui artiklis 4.1 osutatud tootmiskohtades,

 saastunuks tunnistamise aastale järgneval vähemalt kolmandal kasvatusaastal

 

 kartulite puhul kasutatakse nii seemne- kui ka tarbekartuli tootmiseks üksnes sertifitseeritud seemnekartulit või sertifitseeritud seemnekartulist ametliku kontrolli all kasvatatud seemnekartulit,

 tomatite puhul kasutatakse nii taimede kui ka viljade tootmiseks üksnes tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest, või niisugustest taimedest ametliku kontrolli all kasvatatud taimi,

 kõigil eelmistes taanetes viidatud kasvatusaastatel võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede kõrvaldamiseks, kui neid esineb, ning viiakse sobival ajal läbi kasvavate taimede ametlik kontroll, samuti tehakse kartuli puhul koristatud mugulate ametlik analüüsimine vastavalt II lisas esitatud menetlusele;

c) viivitamata pärast saastunuks tunnistamist vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii ning pärast esimest sellele järgnevat kasvuaastat,

 kõik tootmiskohas ja kartuli- või tomatikasvatusel kasutatud masinad ja ladustamisrajatised puhastatakse ning vajaduse korral desinfitseeritakse, kasutades nõuetekohaseid meetodeid, mida on kirjeldatud punktis 3,

 ametlikult kontrollitakse kastmis- ja niisutamiskavasid ning vajaduse korral need keelatakse, et vältida organismi levikut;

d) artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud kaitstud tootmisala osal, kus on võimalik kasvusubstraadi täielik vahetus,

 on kartulimugulate, -taimede ja -seemnete või muude organismi peremeestaimede, sh tomatitaimede ja -seemnete mahapanek, istutamine või külvamine lubatud, kui tootmisala osal on kehtestatud ametlikud järelevalvemeetmed organismi kõrvaldamiseks ja kõikide organismi peremeestaimede kõrvaldamiseks, sh täielikuks kasvusubstraadi vahetamiseks ja kõnealuse tootmisala osa ja kõikide seadmete põhjalikuks puhastamiseks ning vajaduse korral desinfitseerimiseks, ning millel seejärel on vastutavad ametiasutused lubanud toota kartuleid või tomateid,

 ning

 kasvatatakse kartuleid sertifitseeritud seemnekartulist või minimugulatest või mikrotaimedest, mis pärinevad kontrollitud allikatest,

 kasvatatakse tomateid direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, niisugusest seemnest saadud ja ametliku kontrolli all kasvatatud taimedest,

 kontrollitakse ametlikult kastmis- ja niisutamiskavasid ning vajaduse korral need keelatakse, et vältida organismi levikut.

4.2. Ilma et see piiraks punktis 4.1 määratletud meetmeid, peavad liikmesriigid piiritletud tsoonis

a) tagama, et vahetult pärast saastunuks tunnistamist kõik niisuguste kartuli- või tomatikasvatusettevõtete masinad ja ladustamisseadmed nõuetekohaselt puhastatakse ja desinfitseeritakse, kasutades punktis 3 määratletud asjakohaseid meetodeid;

b) viivitamata ja vähemalt kolme kasvatushooaja jooksul pärast saastunuks tunnistamist

ba) juhtudel, kui piiritletud tsoon on kindlaks määratud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv alusel,

 tagama oma vastutavate ametiasutuste järelevalve kartulimugulate või tomatite kasvatus-, ladustamis- või käitlemisettevõtetes ning ettevõtetes, kus kasutatakse kartuli- või tomatikasvatusseadmeid lepingu alusel,

 nõudma selles tsoonis kartuli tootmiseks ainult sertifitseeritud seemnekartuli või sellise seemnekartuli mahapanemist, mida on kasvatatud ametliku kontrolli all, ning pärast saagikoristust selle seemnekartuli analüüsimist, mis on kasvatatud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile iii alusel tõenäoliselt saastunuks tunnistatud kohtades,

 nõudma koristatud seemnekartuli varude tarbekartulist eraldi käitlemist kõikides ettevõtetes selles tsoonis või seemnekartuli ja tarbekartuli käitlemise vahel puhastamist ja vajaduse korral desinfitseerimist,

 nõudma, et kõnealuses tsoonis istutataks kogu saagi saamiseks üksnes selliseid tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, toodetud niisugusest seemnest saadud taimedest ja kasvatatud ametliku kontrolli all,

 viima läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametliku seire;

bb) juhtudel, kui pinnavesi on saastunuks tunnistatud artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel või on organismi võimaliku leviku allikaks vastavalt V lisa punktile 2,

 viima läbi iga-aastase seire asjakohasel ajal, sh proovide võtmise pinnaveest ja vastavatest organismi maavitsalistest peremeestaimedest, mis on seotud vastavate veeallikatega, ja tegema analüüsid kooskõlas II lisas sätestatud asjakohaste meetoditega loetletud taimematerjali puhul ja muudel juhtudel,

 kehtestama kastmis- ja niisutuskavade ametliku kontrolli, sh keelama saastunuks tunnistatud vee kasutamise loetletud taimse materjali ja vajaduse korral muude peremeestaimede kastmiseks ja niisutamiseks, et vältida organismi levikut. Selle keelu võib uuesti läbi vaadata, toetudes iga-aastasel seirel saadud tulemustele ning tühistamisotsustele, kui vastutavad ametiasutused leiavad, et pinnavesi ei ole enam saastunud. Keelu all olevat vett võib ametliku kontrolli all kasutada peremeestaimede kastmiseks ja niisutamiseks, kui kasutatakse ametlikult heaks kiidetud meetodeid, mis kõrvaldavad organismi ja väldivad tema levikut,

 juhtudel, kui vedelate jäätmete äravoolukohad on saastunud, tuleb kehtestada ametlik kontroll loetletud taimset materjali kasutava töötleva tööstuse või pakendamiskohtade tahkete või vedelate jäätmete kõrvaldamiseks;

c) kehtestama vajaduse korral kava kõikide seemnekartulivarude asendamiseks asjakohase ajavahemiku jooksul.




VII LISA

Ametlikult heaks kiidetud jäätmete kõrvaldamise meetodid, millele on osutatud VI lisa lõike 1 neljandas taandes, peavad organismi levikuohu vältimiseks vastama järgmistele tingimustele:

i) kartulite ja tomatite töötlemisjäätmed (sh väljapraagitud kartulid, kartulikoored ja tomatid) ning muud kartulite ja tomatitega seotud tahked jäätmed (sh pinnas, kivid ja muu prügi) tuleb kas

 kõrvaldada ametlikult heaks kiidetud jäätmekäitluskohas, kus ei teki organismi keskkonda pääsemise identifitseeritavat riski nt põllumajandusmaasse imbumise või põllumaa kastmiseks kasutatava veega kokkupuutumise kaudu. Jäätmed tuleb toimetada otse jäätmekäitluskohta sellistes isoleeritud tingimustes, et ei ole ohtu jäätmete kadumiseks,

 või

 tuhastada

 või

 kõrvaldada muid meetmeid kasutades, tingimusel et on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest ja nende põhjendustest tuleb teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele;

ii) vedelad jäätmed: enne äravoolu tuleb hõljuvaineid sisaldavad vedelad jäätmed filtreerida või setitada selliste ainete eemaldamiseks. Need ained tuleb kõrvaldada vastavalt lõigus i sätestatule.

Vedelad jäätmed tuleb seejärel kas

 enne kõrvaldamist kuumutada vähemalt temperatuurini 60 °C vähemalt 30 minuti jooksul

 või

 kõrvaldada muul ametlikult heaks kiidetud viisil ja ametliku järelevalve all, nii et ei ole identifitseeritavat riski jäätmete kokkupuuteks põllumajandusmaaga või veega, mida võidakse kasutada põllumajandusmaade kastmiseks. Nende meetmete üksikasjadest teavitatakse teisi liikmesriike ja komisjoni.

Käesolevas lisas kirjeldatud võimalusi kohaldatakse ka saastunud partiide käitlemise, kõrvaldamise ja töötlemisega seotud jäätmete suhtes.



( 1 ) EÜT C 124, 21.4.1997, lk 12 ja EÜT C 108, 7.4.1998, lk 85.

( 2 ) EÜT C 14, 19.1.1998, lk 34.

( 3 ) EÜT C 206, 7.7.1997, lk 57.

( 4 ) EÜT L 26, 31.1.1977, lk 20. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 98/2/EÜ (EÜT L 15, 21.1.1998, lk 34).

( 5 ) EÜT L 184, 3.8.1995, lk 34. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 97/46/EÜ (EÜT L 204, 31.7.1997, lk 43).