Komisjoni otsus,

15. juuli 1994,

loomatervishoiunõuete ja veterinaarsertifikaatide kohta veisesperma importimisel kolmandatest riikidest

(94/577/EÜ)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 14. juuni 1988. aasta direktiivi 88/407/EMÜ, millega nähakse ette koduveiste sperma ühendusesisese kaubanduse ning impordi suhtes kohaldatavad loomatervishoiu nõuded, [1] viimati muudetud direktiiviga 93/60/EMÜ, [2] eriti selle artikleid 10 ja 11,

ning arvestades, et:

nende kolmandate riikide loetelu, millest liikmesriigid lubavad importida koduveiste spermat (edaspidi "kolmandate riikide loetelu"), on kehtestatud komisjoni otsusega 90/14/EMÜ, [3] viimati muudetud otsusega 91/276/EMÜ; [4]

haigusolukorra tõttu Iisraelis kehtestati komisjoni otsusega 91/277/EMÜ [5] impordikeeld kõnealusest riigist;

komisjoni otsustega 91/479/EMÜ, [6] 91/549/EMÜ, [7] 92/123/EMÜ, [8] 92/124/EMÜ, [9] 92/125/EMÜ, [10] 92/126/EMÜ, [11] 92/127/EMÜ, [12] 92/128/EMÜ, [13] 92/386/EMÜ, [14] 92/387/EMÜ [15] ja 92/445/EMÜ [16] on ette nähtud loomatervishoiu nõuded ja veterinaarsertifikaadid koduveiste sperma importimiseks vastavalt Ameerika Ühendriikidest, Kanadast, Poolast, Soomest, Uus-Meremaalt, Austriast, Šveitsist, Rootsist, Ungarist, Norrast ja Tšehhoslovakkiast;

direktiiviga 93/60/EMÜ, mis tuleb liikmesriikides rakendada hiljemalt enne 1. juulit 1994, muudetakse direktiivi 88/407/EMÜ, mistõttu on vaja muuta eespool nimetatud otsust kolmandate riikide loetelu kohta; ühenduse õigusaktide lihtsamaks ja selgemaks tegemiseks kõnealuses valdkonnas on vaja eespool nimetatud otsused rühmitada ning tunnistada iga üksiku riigi puhul jõus olevad otsused kehtetuks;

Euroopa Majanduspiirkonna lepingu sätteid silmas pidades ei ole enam vaja veterinaartõendit veisesperma importimiseks Austriast, Soomest, Norrast ja Rootsist;

vastavalt veterinaaria teaduskomitee arvamusele nõutakse täiendavat proovi episootilise hemorraagia suhtes;

Kanada on ainus riik, kus kõnealuse haiguse suhtes tehakse enne sperma varumist korrapäraseid teste iga kuue kuu järel; seetõttu tuleb võimaldada käesoleva otsuse rakendamiseks Kanada puhul üleminekuaeg, et Kanada veterinaarasutustel oleks piisavalt aega võtta uus test kasutusele oma korrapärases programmis;

lisaks sellele võib pärast viimaseid edusamme lammaste katarraalse palaviku epidemioloogias nüüd lubada veisesperma importi Austraaliast;

on ilmnenud, et loomade tervislik seisund kolmandate riikide loetellu kuuluvates riikides on hea ning seda kontrollivad hästi struktureeritud ja organiseeritud veterinaarteenistused, eelkõige sperma kaudu edasikanduvate haiguste puhul;

kolmandate riikide vastutavad riiklikud veterinaarasutused on kohustunud teavitama komisjoni ja liikmesriike teleksi või faksi teel 24 tunni jooksul rahvusvahelise episootiaameti A-nimekirjas loetletud nakkushaiguste tõestatud esinemisest või muudatustest kõnealuste haiguste vastu vaktsineerimise põhimõtetes, või piisava ajavahemiku jooksul teavitama rahvusvahelise episootiaameti B-nimekirjas loetletud haiguste esinemisest ning muudatusettepanekutest koduloomade või nende sperma või embrüote impordieeskirjades;

kolmandate riikide loetellu kuuluvate riikide vastutavad veterinaarasutused on kohustunud kontrollima ametlikult käesoleva otsuse kohaste sertifikaatide väljaandmist ja tagama, et sertifikaadi väljaandmise aluseks olevad dokumendid, erandid ja laboriuuringute tulemused säilitatakse ametlikus arhiivis vähemalt 12 kuud pärast asjaomase sperma lähetamist;

kolmandate riikide loetellu kuuluvate riikide vastutavad veterinaarasutused on kohustunud direktiivi 88/407/EMÜ artikli 9 kohaselt ametlikult heaks kiitma seemendusjaamu, kellel on lubatud eksportida veisespermat Euroopa Majandusühendusse;

loomatervishoiu nõudeid ja veterinaarsertifikaate kohandatakse vastavalt loomade tervislikule seisundile asjaomases kolmandas riigis;

käesoleva otsusega ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise veterinaarkomitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA OTSUSE:

Artikkel 1

Liikmesriigid lubavad importida A, B, C ja D lisa 1. osas esitatud sertifikaatides sätestatud tingimustele vastavat veisespermat üksnes vastavalt A, B, C ja D lisa 2. osas nimetatud riikidest.

Liikmesriigid lubavad otsuse 91/549/EMÜ kohaselt varutud ja töödeldud veisespermat importida Kanadast kuni 31. detsembrini 1994.

Artikkel 2

Otsused 91/479/EMÜ, 92/123/EMÜ, 92/124/EMÜ, 92/125/EMÜ, 92/126/EMÜ, 92/127/EMÜ, 92/128/EMÜ, 92/386/EMÜ, 92/387/EMÜ ja 92/445/EMÜ tunnistatakse kehtetuks.

Otsus 91/549/EMÜ tunnistatakse kehtetuks alates 1. jaanuarist 1995.

Artikkel 3

Artikli 1 esimeses lõigus osutatud sätteid Kanada suhtes kohaldatakse alates 1. jaanuarist 1995.

Artikkel 4

Käesolev otsus on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 15. juuli 1994

Komisjoni nimel

komisjoni liige

René Steichen

[1] EÜT L 194, 22.7.1988, lk 10.

[2] EÜT L 186, 28.7.1993, lk 28.

[3] EÜT L 8, 11.1.1990, lk 71.

[4] EÜT L 135, 30.5.1991, lk 58.

[5] EÜT L 135, 30.5.1991, lk 60.

[6] EÜT L 258, 16.9.1991, lk 1.

[7] EÜT L 298, 29.10.1991, lk 6.

[8] EÜT L 48, 22.2.1992, lk 1.

[9] EÜT L 48, 22.2.1992, lk 10.

[10] EÜT L 48, 22.2.1992, lk 19.

[11] EÜT L 48, 22.2.1992, lk 28.

[12] EÜT L 48, 22.2.1992, lk 37.

[13] EÜT L 48, 22.2.1992, lk 46.

[14] EÜT L 204, 21.7.1992, lk 13.

[15] EÜT L 204, 21.7.1992, lk 22.

[16] EÜT L 247, 27.8.1992, lk 1.

--------------------------------------------------

A LISA

1. OSA

VETERINAARSERTIFIKAAT

Veisesperma importimiseks

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2. OSA

Loetelu riikidest, kellel on lubatud kasutada A lisa 1. osas esitatud veterinaarsertifikaadi näidist

TŠEHHI VABARIIK

UNGARI

UUS-MEREMAA

POOLA

RUMEENIA

ŠVEITS

SLOVAKI VABARIIK

--------------------------------------------------

B LISA

1. OSA

VETERINAARSERTIFIKAAT

Veisesperma importimiseks ameerika ühendriikidest

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2. OSA

Loetelu riikidest, kellel on lubatud kasutada B lisa 1. osas esitatud veterinaarsertifikaadi näidist

AMEERIKA ÜHENDRIIGID

--------------------------------------------------

C LISA

1. OSA

VETERINAARSERTIFIKAAT

Veisesperma importimiseks

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2. OSA

Loetelu riikidest, kellel on lubatud kasutada C lisa 1. osas esitatud veterinaarsertifikaadi näidist

KANADA: välja arvatud Okanaga oru piirkond Briti Columbias, mida määratletakse kui ala, mis on piiratud joonega, mis algab Kanada/USA piirilt asuvast punktist 120o 15' läänepikkust ja 49o põhjalaiust, suundub põhja poole punkti 119o 35' läänepikkust ja 50o 30' põhjalaiust, sealt kirdesse punkti 119o läänepikkust ja 50o 45' põhjalaiust ning sealt lõuna poole Kanada/USA piiril asuvasse punkti 118o 15' läänepikkust ja 49o põhjalaiust.

--------------------------------------------------

D LISA

1. OSA

VETERINAARSERTIFIKAAT

Veisesperma importimiseks

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2. OSA

Loetelu kolmandatest riikidest, kellel on lubatud kasutada D lisa 1. osas esitatud veterinaarsertifikaadi näidist

AUSTRAALIA

--------------------------------------------------

E LISA

Protokoll võistleva ELISA jaoks (ensüümne immunosorbenttest), mille puhul kasutatakse lammaste katarraalse palaviku viiruse antikehade määramiseks grupispetsiifilist monoklonaalset antikeha

LAMMASTE KATARRAALSE PALAVIKU VÕISTLEV ELISA, MILLE PUHUL KASUTATAKSE MONOKLONAALSET ANTIKEHA 3–17-A3

Test võimaldab määrata lammaste katarraalse palaviku viiruse (BTV, bluetongue virus) kõikide teadaolevate serotüüpide antikehi.

Testi põhimõte on BTV antigeeni ja grupispetsiifilise monoklonaalse antikeha (3–17-A3) vahelise reaktsiooni katkemine uuritavate seerumite lahjendatud lahuste lisamisel. Uuritavates seerumites olevad BTV antikehad blokeerivad monoklonaalse antikeha (MAK) seondumise ning selle tulemusena väheneb ensüümi substraadi lisamisel tekkiva värvusreaktsiooni intensiivsus.

MATERJALID JA REAKTIIVID

1. Lamedapõhjalised mikrotiiterplaadid.

2. Antigeen: valmistatakse allpool kirjeldatud viisil.

3. Blokeeriv puhver: 5 % (w/v) Marvel'i kuivatatud piimapulbrit ja 0,1 % (v/v) Tween-20 (polüoksüetüleensorbitoonmonolauraatsiirupina) fosfaadiga puhverdatud soolalahuses (PBS).

4. Monoklonaalne antikeha: 3–17-A3 (hübridoomi rakukultuuri supernatandina), säilitatakse - 20 °C juures või lüofiliseeritakse, enne kasutamist lahjendatakse blokeeriva puhvriga vahekorras 1:50, suunatakse grupispetsiifilise polüpeptiidi p7 vastu.

5. Konjugaat: küüliku hiirevastane globuliin (absorbeeritud ja elueeritud), mida on konjugeeritud mädarõika peroksüdaasiga ja hoitud pimedas 4 °C juures.

6. Substraat ja kromogeen: 0,2 g ortofenüleendiamiini (OPD) on lahustatud puhvris, mis sisaldab 2,553 g sidrunhapet ja 4,574 g dinaatriumvesinikortofosfaati ning millele on lisatud destilleeritud vett 500 ml-ni ja mis on jaotatud 25 ml kogusteks ja hoitud pimedas - 20 °C juures, vahetult enne kasutamist lisatakse 12 μl/25 ml vesinikperoksiidi (30 % w/v).

ETTEVAATUST OPD-GA TÖÖTAMISEL — KANDA KUMMIKINDAID — OLETATAV MUTAGEEN.

7. 1 M väävelhape: 26,6 ml hapet on lisatud 473,4 ml destilleeritud veele.

PIDADA MEELES — ALATI LISATAKSE HAPET VEELE, MITTE KUNAGI VETT HAPPELE.

8. Orbitaalsegisti.

9. ELISA plaadilugeja (testi tulemusi võib lugeda ka visuaalselt).

TESTI TÖÖPLAAN

+++++ TIFF +++++

TESTI PROTOKOLL

Pimekontroll

Rea 1 augud A — H on pimekontrolli augud, mis sisaldavad BTV antigeeni ja konjugaati. Seda rida võib kasutada pimereana ELISA plaadilugeja jaoks.

MAKi kontroll

Rea 2 augud A — H on monoklonaalse antikeha kontrolliks ja sisaldavad BTV antigeeni, monoklonaalset antikeha ja konjugaati. See rida on negatiivse kontrolli rida. Selle kontrollrea optilise tiheduse näitude keskmine väärtus vastab 0 % inhibitsiooniväärtusele.

Positiivne kontroll

Rea 3 augud A — H on positiivse kontrolli augud. Need sisaldavad BTV antigeeni, BTV positiivse antiseerumi lahjendatud lahuseid, MAKi ja konjugaati. See rida on indikaatoriks, et test töötab korralikult, ning inhibitsioonitase peaks püsima testist testi sama.

Uuritavad seerumid

Eespool kirjeldatud testi tööplaani korral on võimalik uurida 18 seerumit lahjendustes 1/2, 1/4, 1/8 ja 1/16. See annab teatava ettekujutuse uuritavate seerumite antikeha-tiitrist. Seerumi lõplike lahjenduste saamiseks võib lahjenduste rida pikendada. Alternatiivina võib suuremahuliste seroloogiliste uuringute puhul uurida seerumeid ühes (1/4) või kahes (1/2 ja 1/4) lahjenduses seire kiirtestina.

TÖÖ KÄIK

1. BTV antigeen lahjendatakse PBS-s varem tiitritud kontsentratsioonini, töödeldakse lühidalt ultraheliga agregeerunud viiruse hajutamiseks (sonikaatori puudumisel pipetitakse tugevalt) ning lisatakse 50 μl kõikidesse ELISA plaadi aukudesse. Antigeeni ühtlaseks jaotumiseks koputatakse plaadi servadele.

2. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 60 minutit. Plaadid pestakse, täites ja tühjendades auke kolm korda mittesteriilse PBSga, ning kuivatatakse kuivatuspaberiga.

3. Igasse auku lisatakse 50 μl blokeerivat puhvrit. Asjaomastesse aukudesse lisatakse uuritavad seerumid ja positiivne seerum ning lahjendatakse plaadil mitmekanalilise pipeti abil. Seerumeid ei lisata pimekontrolli ega MAK-kontrolli aukudesse.

4. Kohe pärast uuritavate seerumite lisamist lahjendatakse MAK blokeerivas puhvris (varem tiitritud kontsentratsioonini) ja lisatakse 50 μl plaadi igasse auku, välja arvatud pimekontrolli augud.

5. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 60 minutit. Pestakse kolm korda PBSga ja kuivatatakse kuivatuspaberiga.

6. Küüliku hiirevastase globuliini kontsentraat lahjendatakse 1/5000 blokeerivas puhvris ja lisatakse 50 μl plaadi igasse auku.

7. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 60 minutit. Pestakse kolm korda PBSga ja kuivatatakse kuivatuspaberiga.

8. OPD sulatatakse ja vahetult enne kasutamist lisatakse sellele 12 μl 30 % vesinikperoksiidi iga 25 ml OPD kohta. Lisatakse plaadi igasse auku 50 μl. Lastakse värvusel tekkida umbes 10 minutit ja peatatakse reaktsioon 1 M väävelhappega (50 μl augu kohta). Värvumine peaks toimuma MAK kontrollaukudes ja selliste seerumitega täidetud aukudes, mis ei sisalda BTV antikehi.

9. Plaate uuritakse ja tulemused protokollitakse visuaalselt või spektrofotomeetri abil.

TULEMUSTE ANALÜÜS

MAK-kontrollide alusel arvutatakse keskmine OD väärtus. See vastab 0 % inhibitsiooniväärtusele. Uuritavate seerumite optilise tiheduse näidud väljendatakse inhibitsiooni protsendimäärana järgmise valemi abil:

Inhibitsiooniprotsent = 100 –

× 100

Inhibitsiooniväärtused üle 40 % seerumi lahjenduse 1/4 juures loetakse positiivseks. Tulemuse visuaalne lugemine on võimalik, kuna 40 % inhibitsioon on madalaim silmaga kergesti eristatav väärtus.

BTV ELISA ANITGEENI VALMISTAMINE

1. 10 ühtlaselt BHK-21 rakkudega täitunud Roux' anumat pestakse kolm korda seerumivaba Eagle'i söötmega ja nakatatakse BTV serotüüp 1-ga seerumivabas Eagle'i söötmes.

2. Inkubeeritakse 37 °C juures ja jälgitakse iga päev tsütopaatilise efekti (TPE) teket.

3. Kui TPE on hõlmanud 80-90 % iga Roux' anuma rakukihist, kogutakse viirus kokku, raputades veel kinnitunud rakud klaasi küljest lahti.

4. Tsentrifuugitakse kiirusel 2000 — 3000 pööret minutis rakkude sadestamiseks.

5. Supernatant kõrvaldatakse ja rakud resuspendeeritakse umbes 30 ml PBS-s, mis sisaldab 1 % Sarkosüüli ja 2 ml fenoolmetüülsulfonüülfluoriidi (lüüsipuhver). Selle tulemusena võivad rakud moodustada geeli, efekti vähendamiseks võib lisada lüüsipuhvrit.

MÄRKUS:

fenoolmetüülsulfonüülfluoriid on ohtlik — käsitleda äärmiselt ettevaatlikult.

6. Rakke lõhustatakse 60 sekundit, kasutades ultrahelisondi amplituudil 30 mikronit.

7. Tsentrifuugitakse 10 minutit kiirusel 10000 pööret minutis.

8. Supernatant säilitatakse + 4 °C juures ja järelejäänud rakukogum resuspendeeritakse 10–20 ml lüüsipuhvris.

9. Töödeldakse ultraheliga ja selitatakse kolm korda, säilitades iga etapi supernatandi.

10. Supernatandid pannakse kokku ja tsentrifuugitakse 120 minutit kiirusel 24000 pööret minutis + 4 °C juures 5 ml 40 % sahharoosi padjal (w/v PBS-s), kasutades Beckmanni 30 ml tsentrifuugitopse ja SW 28 rootorit.

11. Supernatant kõrvaldatakse, vedelik eemaldatakse topsidest täielikult ning sade resuspendeeritakse PBS-s ultrahelitöötusega. Antigeen säilitatakse alikvootides – 70 °C juures.

BTV ELISA ANTIGEENI TIITRIMINE

BTV ELISA antigeen tiitritakse kaudse ELISAga. Antigeeni kahekordsed lahjendused tiitritakse, kasutades monoklonaalse antikeha 3–17-A3 konstantset lahjendust (1/50). Protokoll on järgmine:

TÖÖ KÄIK

1. BTV antigeen lahjendatakse mikrotiiterplaadil kahekordsete lahjendustena (50 μl augu kohta), kasutades mitmekanalilist pipetti.

2. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund.

3. Plaadid pestakse kolm korda PBSga.

4. Mikrotiiterplaadi igasse auku lisatakse 50 μl monoklonaalset antikeha 3–17-A3 (lahjenduses 1/50).

5. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund.

6. Plaadid pestakse kolm korda PBS-ga.

7. Mikrotiiterplaadi igasse auku lisatakse 50 μl küüliku hiirevastast globuliini, mis on konjugeeritud mädarõika peroksüdaasiga ja lahjendatud varem tiitritud optimaalse kontsentratsioonini.

8. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund.

9. Lisatakse substraat ja kromogeen, nagu eespool kirjeldatud. Reaktsioon peatatakse 10 minuti pärast, lisades 1 M väävelhapet (50 μl augu kohta).

Võistleva testi puhul tuleb monoklonaalset antikeha võtta liiaga, seetõttu valitakse antigeeni lahjendus, mis langeb tiitrimiskõverale (mitte platoole) ning mis annab 10 minuti jooksul OD väärtuseks umbes 0,8.

Protokoll agar-geeli immuundifusioontesti jaoks episootilise hemorraagia antikehade avastamiseks

Agar-geeli immuundifusioontest tehakse vastavalt järgmisele protokollile:

MATERJALID JA REAKTIIVID

1. Antigeen

Pretsipiteeriv antigeen valmistatakse mis tahes rakukultuuris, mis võimaldab episootilise hemorraagia viiruse vastava serotüübi/vastavate serotüüpide kiiret paljunemist. Soovitatakse BHK või Vero rakke. Antigeen on viiruse kasvu lõppedes supernatandis olemas, kuid tõhususe tagamiseks peab selle kontsentratsioon olema 50–100kordne. Seda on võimalik saavutada mis tahes standardse proteiini kontsentreerimise meetodiga; antigeenis oleva viiruse võib inaktiveerida 0,3 % (v/v) beetapropiolaktooni lisamisega.

2. Teadaolev positiivne kontrollseerum

Rahvusvahelist võrdlusseerumit ja antigeeni kasutades valmistatakse riiklik standardseerum, mis on optimaalses vahekorra saavutamiseks standarditud rahvusvahelise võrdlusseerumi suhtes, lüofiliseeritakse see ning kasutatakse teadaoleva kontrollseerumina kõikides testides.

3. Uuritav seerum.

TÖÖ KÄIK

1. Üheprotsendiline boraat- või naatriumbarbitoolpuhvris valmistatud agaroos pH väärtusega 8,5-9,0 valatakse Petri tassi vähemalt 3,0 mm kihina.

2. Agarisse lõigatakse seitse niiskusvaba auku, igaühe läbimõõt 5,0 mm. Keskel on üks auk ja selle ümber 3 mm kaugusel ringis kuus auku.

+++++ TIFF +++++

3. Keskmine auk täidetakse standardantigeeniga. Äärmised augud 2, 4 ja 6 täidetakse teadaoleva positiivse seerumiga, augud 1, 3 ja 5 täidetakse uuritavate seerumitega.

4. Testi inkubeeritakse kuni 72 tundi suletud niiskes kambris toatemperatuuril.

TÕLGENDAMINE

Uuritav seerum on positiivne, kui see moodustab antigeeniga spetsiifilise pretsipitatsioonijoone, mis on täielikult identne kontrollseerumi joonega. Uuritav seerum on negatiivne, kui see ei moodusta antigeeniga erilist pretsipitatsioonijoont ega kõverda kontrollseerumi joont. Petri tasse tuleks uurida tumedal taustal kaudse valgustusega.

--------------------------------------------------