Kaheksas komisjoni direktiiv,

15. juuni 1978,

millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks

(78/633/EMÜ)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 20. juuli 1970. aasta direktiivi 70/373/EMÜ söötade ametlikuks kontrollimiseks ettenähtud ühenduse proovivõtmis- ja analüüsimeetodite kehtestamise kohta, [1] viimati muudetud ühinemisaktiga, eriti selle artiklit 2,

ning arvestades, et:

kõnealuses direktiivis on ette nähtud, et söötade ametlik kontrollimine söötade kvaliteeti ja koostist reguleerivate õigus- ja haldusnormide nõuetele vastavuse kindlakstegemiseks peab toimuma ühenduse proovivõtmis- ja analüüsimeetodite abil;

komisjoni 15. juuni 1971. aasta direktiiviga 71/250/EMÜ, [2] 18. novembri 1971. aasta direktiiviga 71/393/EMÜ, [3] 27. aprilli 1972. aasta direktiiviga 72/199/EMÜ, [4] 5. detsembri 1972. aasta direktiiviga 73/46/EMÜ, [5] 25. märtsi 1974. aasta direktiiviga 74/203/EMÜ, [6] 20. detsembri 1974. aasta direktiiviga 75/84/EMÜ [7] ja 1. märtsi 1976. aasta direktiiviga 76/372/EMÜ [8] on juba kehtestatud mitmed ühenduse analüüsimeetodid; võttes arvesse edusamme pärast kõnealuste direktiivide vastuvõtmist tehtud töös, on soovitatav võtta vastu kaheksas rühm meetodeid;

käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise söödakomitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

1. Liikmesriigid nõuavad, et söötade ametlikuks kontrolliks ettenähtud analüüsid tsinkbatsitratsiini, flavofosfolipooli, raua, vase, mangaani ja tsingi sisalduse määramiseks tehakse käesoleva direktiivi lisas kirjeldatud meetodite kohaselt.

2. Käesoleva direktiivi lisas kirjeldatud meetodite suhtes kohaldatakse esimese direktiivi 71/250/EMÜ lisa 1. osa ("Sissejuhatus") üldsätteid, v.a analüüsitava proovi ettevalmistamist käsitlevad sätted.

Artikkel 2

Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid 1. jaanuariks 1979. Nad teatavad sellest viivitamata komisjonile.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 15. juuni 1978

Komisjoni nimel

asepresident

Finn Gundelach

[1] EÜT L 170, 3.8.1970, lk 2.

[2] EÜT L 155, 12.7.1971, lk 13.

[3] EÜT L 279, 20.12.1971, lk 7.

[4] EÜT L 123, 29.5.1972, lk 6.

[5] EÜT L 83, 30.3.1973, lk 21.

[6] EÜT L 108, 22.4.1974, lk 7.

[7] EÜT L 32, 5.2.1975, lk 26.

[8] EÜT L 102, 15.4.1976, lk 8.

--------------------------------------------------

LISA

1. TSINKBATSITRATSIINI MÄÄRAMINE AGARSÖÖTMEL DIFUSIOONI TEEL

1. EESMÄRK JA RAKENDUSALA

Käesolev meetod on tsinkbatsitratsiini määramiseks söötades, kontsentraatides ja eelsegudes. Alumine määramispiir on 5 mg/kg (5 miljondikku). [1] Meetodit ei saa kasutada segavate ainete, eelkõige suures koguses vase ja askorbiinhappe esinemisel.

2. PÕHIMÕTE

Proov ekstraheeritakse pH 2 juures metanooli, vee ja soolhappe seguga. Ekstrakti pH viiakse tasemeni 6,5, kontsentreeritakse (vajaduse korral) ja lahjendatakse. Ekstrakti antibiootilise aktiivsuse määramiseks mõõdetakse tsinkbatsitratsiini difusioon Micrococcus luteus’ega (Syn. M. flavus) nakatatud agarsöötmel. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõtu käsitatakse otseselt võrdelisena antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga kasutatud antibiootikumi kontsentratsioonide vahemikus.

3. MIKROORGANISM: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240

3.1. Tüvikultuuri säilitamine

Längagari sööde (4.1) nakatatakse Micrococcus luteus’ega. Inkubeeritakse 24 tundi 30–37 °C juures, hoitakse külmikus umbes 4 °C juures ning längagar nakatatakse uuesti iga kahe nädala järel.

3.2. Baktersuspensiooni ettevalmistamine [2]

Hiljuti valmistatud längagarilt (3.1) kogutakse kasv 2–3 ml naatriumkloriidi lahuse (4.3) abil. Saadud suspensioon nakatatakse 250 ml söötmega (4.1) Roux’ pudelis ning inkubeeritakse 18–20 tundi 30–37 °C juures. Kasv kogutakse 25 ml naatriumkloriidi lahusesse (4.3) ja segatakse. Suspensioon lahjendatakse vahekorras 1 : 10 naatriumkloriidi lahusega (4.3). Suspensiooni valgusläbilaskvus peab olema ligikaudu 75 % naatriumkloriidi lahuse läbilaskvusest, mõõdetuna lainepikkusel 650 nm 1sentimeetrises küvetis (4.3).

4. SÖÖTMED JA REAKTIIVID

4.1. Sööde [3]

Lihapeptoon | 6,0 g |

Trüptoon | 4,0 g |

Pärmiekstrakt | 3,0 g |

Lihaekstrakt | 1,5 g |

Glükoos | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Vesi | 1000 ml |

pH 6,5–6,6 (pärast steriliseerimist) | |

4.2. Analüüsi sööde [4]

Trüptoon | 10,0 g |

Pärmiekstrakt | 3,0 g |

Lihaekstrakt | 1,5 g |

Glükoos | 1,0 g |

Agar | 20,0 g |

Tween 80 | 1 ml |

Vesi | 1000 ml |

pH 6,5 (pärast steriliseerimist) | |

4.3. 0,8(massi/mahu)protsendiline naatriumkloriidi lahus: 8 g analüütiliselt puhast naatriumkloriidi lahustatakse vees ja lahjendatakse 1000 milliliitrini; steriliseeritakse.

4.4. Puhta metanooli, vee ja soolhappe segu, analüütiliselt puhas (tihedus: 1,18–1,19): mahuvahekorras 80/17,5/2,5.

4.5. Fosfaatpuhver, pH 6,5

Kaaliumvesinikfosfaat K2HPO4, analüütiliselt puhas (22,15 g).

Kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4, analüütiliselt puhas (27,85 g).

Vett 1000 ml lahuse saamiseni.

4.6. Soolhape, analüütiliselt puhas (tihedus: 1,18–1,19).

4.7. Soolhape, analüütiliselt puhas (0,1 N).

4.8. 1 N naatriumhüdroksiidi lahus, analüütiliselt puhas.

4.9. Bromokresoolpurpuri lahus 0,04 (massi/mahu)protsenti: 0,1 g bromokresoolpurpurit lahustatakse 18,5 ml 0,01 N naatriumhüdroksiidi lahuses. Täiendatakse veega 250 ml lahuse saamiseni ja segatakse.

4.10. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega tsinkbatsitratsiin (rahvusvahelistes ühikutes).

5. STANDARDLAHUSED

Võetakse standardse tsinkbatsitratsiini kaalutis (4.10), mis vastab 1050 rahvusvahelisele ühikule (vastavalt osutatud aktiivsusele). Lisatakse 5 ml 0,1 N soolhapet (4.7) ning lastakse 15 minutit seista. Lisatakse 30 ml vett, fosfaatpuhvri abil pH tasemega 6,5 (4.5) (umbes 4 ml) reguleeritakse pH tasemeni 4,5, täiendatakse veega 50 ml lahuse saamiseni ja segatakse hoolikalt (1 ml = 21 rahvusvahelist ühikut).

Kõnealusest lahusest valmistatakse puhvriga pH tasemega 6,5 (4.5) järjest lahjendades järgmised lahused:

S8 | 0,42 | RÜ/ml |

S4 | 0,21 | RÜ/ml |

S2 | 0,105 | RÜ/ml |

S1 | 0,0525 | RÜ/ml |

6. EKSTRAKTI VALMISTAMINE

6.1. Ekstraheerimine

6.1.1. Kontsentraadid, eelsegud ja mineraalsöödad

Võetakse proovi 2,0–5,0 g kaalutis, lisatakse 30 ml segu (4.4) ja loksutatakse kergelt. Kontrollitakse, et pH tase oleks ligikaudu 2. Loksutatakse 10 minutit, lisatakse 30 ml fosfaatpuhvrit pH tasemega 6,5 (4.5) ja loksutatakse 15 minutit. Soovitud tsinkbatsitratsiinisisalduse, 0,42 RÜ/ml (= U8) saamiseks lahjendatakse fosfaatpuhvriga (4.5).

6.1.2. Valgukontsentraadid

Võetakse proovi 10,0 g kaalutis, lisatakse 50 ml segu (4.4) ja loksutatakse kergelt. Kontrollitakse, et pH tase oleks ligikaudu 2. Loksutatakse 10 minutit, lisatakse 50 ml fosfaatpuhvrit pH tasemega 6,5 (4.5) ja loksutatakse 15 minutit. Soovitud tsinkbatsitratsiinisisalduse, 0,42 RÜ/ml (= U8) saamiseks lahjendatakse fosfaatpuhvriga (4.5).

6.1.3. Muud söödad

Võetakse proovi 10,0 g kaalutis (20,0 g soovitud tsinkbatsitratsiinisisalduse, 5 mg/kg saamiseks), lisatakse 25 ml segu (4.4) ja homogeniseeritakse ligikaudu 10 minutit. Lisatakse 25 ml fosfaatpuhvrit pH tasemega 6,5 (4.5), loksutatakse 15 minutit ja tsentrifuugitakse. Võetakse 20 ml supernatantlahust ja 1 N naatriumhüdroksiidilahusega reguleeritakse pH tase 6,5ni (4.8), kasutades indikaatorina bromokresoolpurpuri lahust (4.9). Aurutatakse vaakumpöördaurustis 4 ml lahuse saamiseni temperatuuril kuni 35 °C. Soovitud tsinkbatsitratsiinisisalduse, 0,42 RÜ/ml (= U8) saamiseks lahjendatakse jääk veega.

6.2. Testlahused

Lahusest U8 valmistatakse fosfaatpuhvriga (4.5) järjest lahjendades (1 : 1) lahused U4 (eeldatav sisaldus 0,21 RÜ/ml), U2 (eeldatav sisaldus 0,105 RÜ/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,0525 RÜ/ml).

7. ANALÜÜSI KÄIK

7.1. Analüüsi söötme nakatamine

Analüüsi sööde (4.2) nakatatakse baktersuspensiooniga (3.2) ligikaudu 50 °C juures. Eelkatsete abil analüüsi söötmega (4.2) plaatidel määratakse kindlaks baktersuspensiooni kogus, mis on vajalik suurimate ja selgeimate inhibitsioonitsoonide saamiseks tsinkbatsitratsiini eri kontsentratsioonide juures.

7.2. Plaatide ettevalmistamine

Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel nelja kontsentratsiooniga standardlahusega (S8, S4, S2 ja S1) ja nelja kontsentratsiooniga testlahusega (U8, U4, U2 ja U1). Need neli ekstrakti ja standardlahust tuleb tingimata panna igale plaadile. Selleks valitakse plaadid, mis on piisavalt suured, et agarsöötmesse oleks võimalik teha vähemalt kaheksa üksteisest vähemalt 30 mm kaugusel asetsevat auku läbimõõduga 10–13 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, millele on pandud alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm.

Plaatidele valatakse teatav kogus söödet (4.2), mis on nakatatud vastavalt punktile 7.1, nii et tekiks ligikaudu 2 mm paksune kiht (50 ml 200 mm läbimõõduga plaadi puhul). Söötmel lastakse tasanduda, tehakse sellesse augud ning pannakse nendesse täpselt mõõdetud test- ja standardlahuste kogused (0,10–0,15 ml augu kohta sõltuvalt läbimõõdust).

Iga kontsentratsiooni kasutatakse vähemalt neli korda, et iga määramisega oleks võimalik hinnata 32 inhibitsioonitsooni.

7.3. Inkubeerimine

Plaate inkubeeritakse 28–30 °C juures 16–18 tundi.

8. HINDAMINE

Inhibitsioonitsoonide läbimõõt mõõdetakse 0,1 mm täpsusega. Iga kontsentratsiooni puhul leitakse keskmised väärtused poollogaritmilisel millimeetripaberil, kus oleks näha kontsentratsioonide logaritmi ja inhibitsioonitsoonide läbimõõdu vaheline seos. Nii standardlahuse kui ka ekstrakti jaoks visandatakse "kõige sobivamad" jooned, näiteks nagu on kirjeldatud allpool.

Standardlahuse madalaima taseme (SL) jaoks määratakse "kõige sobivam" punkt, kasutades järgmist valemit:

SL =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

810

Standardlahuse kõrgeima taseme (SH) jaoks määratakse "kõige sobivam" punkt, kasutades järgmist valemit:

SH =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

110

Samamoodi arvutatakse "kõige sobivamad" punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades S1, S2, S4 ja S8 eespool esitatud valemis U1, U2, U4 ja U8-ga.

Arvutatud SL ja SH väärtused märgitakse samale millimeetripaberile ja nende ühendamisel saadakse standardlahuse "kõige sobivam" joon. Samamoodi märgitakse UL ja UH ning nende ühendamisel saadakse ekstrakti "kõige sobivam" joon.

Segavate mõjude puudumisel peaksid saadud jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni käsitada paralleelsetena, kui väärtused (SH–SL) ja (UH–UL) ei erine oma keskmisest väärtusest rohkem kui 10 %.

Kui jooned ei ole paralleelsed, võib ära jätta kas U1 ja S1 või U8 ja S8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH järgmiste valemite abil, et saada alternatiivsed "kõige sobivamad" jooned:

SL =

5 S

+ 2 S

- S

6

SH =

5 S

+ 2 S

- S

6

ning samamoodi UL ja UH puhul. Sarnaselt eespool kirjeldatuga tuleb kontrollida alternatiivsete "kõige sobivamate" joonte paralleelsust. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme kontsentratsiooni põhjal, tuleb märkida lõpparuandesse.

Kui jooni käsitatakse paralleelsetena, arvutatakse suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) ühe järgmise valemi abil:

Nelja kontsentratsiooni puhul:

log A =

× 0,602

U

+ U

+ S

+ S

- U

- U

- S

- S

2

Kolme kontsentratsiooni puhul:

log A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

1

või

log A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

2

Tegelik aktiivsus = oletatav aktiivsus × suhteline aktiivsus.

Kui jooni ei saa käsitada paralleelsetena, korratakse määramist. Kui ka siis ei saada paralleelseid jooni, arvutatakse valemiga c suhtelise aktiivsuse logaritm (log A). Saadud tulemust tuleb siiski käsitada ligikaudsena ning see tuleks märkida lõpparuandesse.

9. KORRATAVUS

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

20 % suurimast väärtusest, kui tsinkbatsitratsiini sisaldus on 5–25 mg/kg;

absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui tsinkbatsitratsiini sisaldus on 25–50 mg/kg;

10 % suurimast väärtusest, kui tsinkbatsiratsiini sisaldus on suurem kui 50 mg/kg.

2. FLAVOFOSFOLIPOOLI MÄÄRAMINE AGARSÖÖTMEL DIFUSIOONI TEEL

1. EESMÄRK JA RAKENDUSALA

Käesolev meetod on flavofosfolipooli määramiseks söötades, kontsentraatides ja eelsegudes. Alumine määramispiir on 1 mg/kg (1 miljondik).

2. PÕHIMÕTE

Proov ekstraheeritakse lahjendatud metanoolis püstjahutiga kolvis kuumutades. Pärast tsentrifuugimist ekstrakt puhastatakse (vajaduse korral), töödeldes seda ioonivahetusvaikudega, ning lahjendatakse. Antibiootilise aktiivsuse määramiseks mõõdetakse flavofosfolipooli difusioon Staphylococcus aureus’ega nakatatud agarsöötmel. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõtu käsitatakse otseselt võrdelisena antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga kasutatud antibiootikumikontsentratsioonide vahemikus.

3. MIKROORGANISM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1. Tüvikultuuri säilitamine

Längagari sööde (4.1) nakatatakse Staphylococcus aureus’ega. Inkubeeritakse 24 tundi 37 °C juures, hoitakse külmikus umbes 4 °C juures ning längagar nakatatakse uuesti iga kuu.

3.2. Baktersuspensiooni valmistamine [5]

Kaks katseklaasi tüvikultuuriga (3.1) asetatakse kõrvale ning neid nakatatakse iga nädal uuesti. Inkubeeritakse 24 tundi 37 °C juures, hoitakse külmikus umbes 4 °C juures

24 tundi enne analüüsi nakatatakse kõnealuse kasvuga kaks kuni neli söödet sisaldavat längagariga (4.1) katseklaasi. Inkubeeritakse 16–18 tundi 37 °C juures. Naatriumkloriidi lahuses (4.3) valmistatakse kasvu suspensioon. Suspensiooni valguse läbilaskvus peab olema ligikaudu 40 % naatriumkloriidi lahuse läbilaskvusest, mõõdetuna lainepikkusel 578 nm 1sentimeetrises küvetis (4.3).

4. SÖÖTMED JA REAKTIIVID

4.1. Sööde [6]

Lihapeptoon | 6,0 g |

Trüptoon | 4,0 g |

Pärmiekstrakt | 3,0 g |

Lihaekstrakt | 1,5 g |

Glükoos | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Vesi | 1000 ml |

pH 6,5 (pärast steriliseerimist) | |

4.2. Analüüsi sööde

4.2.1. Aluskiht [7]

Lihapeptoon | 6,0 g |

Pärmiekstrakt | 3,0 g |

Lihaekstrakt | 1,5 g |

Agar | 10,0 g |

Vesi | 1000 ml |

pH 6,5 (pärast steriliseerimist) | |

4.2.2. Külvikiht

Punkti 4.1 korral lisatakse 2,0 g vahutamisvastast silikoonemulsiooni [8].

4.3. 0,4(massi/mahu)protsendiline naatriumkloriidi lahus: 4 g analüütiliselt puhast naatriumkloriidi lahustatakse vees ja lahjendatakse 1000 milliliitrini; steriliseeritakse.

4.4. Puhas metanool.

4.5. 50(mahu)protsendiline metanool: 500 ml metanooli (4.4) lahjendatakse 500 ml veega.

4.6. 80(mahu)protsendiline metanool: 800 ml metanooli (4.4) lahjendatakse 200 ml veega.

4.7. Analüütiliselt puhas tris(hüdroksümetüül)aminometaan.

4.8. 1,5(massi/mahu)protsendiline kaaliumkloriidi metanoolilahus: 1,5 g analüütiliselt puhast kaaliumkloriidi lahustatakse 20 ml vees, täiendatakse metanooliga (4.4) 100 ml lahuse saamiseni.

4.9. Kationiit: Dowex 50 W × 8, 20 kuni 50 mešši, Na-vorm (kat. Serva nr 41600) või samaväärne.

4.10. Anioniit: Dowex 1 × 2, 50 kuni 100 mešši, Cl-vorm (kat. Serva nr 41010) või samaväärne. Enne kasutamist hoida 12–14 tundi 80protsendilises metanoolis (4.6).

4.11. Klaasvill.

4.12. pH indikaatorpaber (pH 6,6–8,1).

4.13. Askorbiinhape.

4.14. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega flavofosfolipool.

5. VAHENDID

5.1. Klaastoru kromatograafia jaoks, siseläbimõõt 9 mm, pikkus 150–200 mm, korkkraaniga alumise otsa kitsenenud osas ja lihvühendusega (lehtriga (5.2) ühendamiseks) ülemises osas.

5.2. Korkkraaniga ja lihvühendusega 250 ml lehter.

5.3. Lihvühendusega 250 ml Erlenmeyeri kolb.

5.4. Lihvühendusega püstjahuti.

6. STANDARDLAHUSED

Standardaine (4.14) täpne kaalutis lahustatakse 50protsendilises metanoolis (4.5) ja lahjendatakse, kuni saadakse põhilahus, mis sisaldab 100 μg flavofosfolipooli milliliitri kohta. See lahus säilib suletud kolvis 4 °C juures kuni kaks kuud.

Kõnealusest põhilahusest valmistatakse 50protsendilise metanooliga (4.5) järjest lahjendades järgmised lahused:

S8 | 0,2 | μg/ml |

S4 | 0,1 | μg/ml |

S2 | 0,05 | μg/ml |

S1 | 0,025 | μg/ml |

7. EKSTRAKTI VALMISTAMINE

7.1. Ekstraheerimine

7.1.1. Kontsentraadid, eelsegud ja mineraalsöödad

Võetakse proovi 2,0–5,0 g kaalutis, lisatakse ligikaudu 150 mg askorbiinhapet (4.13). Homogeniseeritakse 150 ml 50protsendilise metanooliga (4.5) Erlenmeyeri kolvis (5.3) ning pH tase reguleeritakse 8,1–8,2ni umbes 400 mg tris(hüdroksümetüül)aminometaaniga (4.7). Indikaatorpaberiga (4.12) kontrollitakse pH taset. Lastakse seista 15 minutit, siis reguleeritakse uuesti tris(hüdroksümetüül)aminometaaniga (4.7) pH tasemeni 8,1–8,2 ning keedetakse 10 minutit püstjahutiga kolvis (5.4) pidevalt segades. Lastakse jahtuda, segu tsentrifuugitakse ja ekstrakt dekanteeritakse.

7.1.2. Muud söödad

Võetakse proovi 5,0–30,0 g kaalutis, mis sisaldab vähemalt 30 μg flavofosfolipooli. Homogeniseeritakse 150 ml 50protsendilise metanooliga (4.5) Erlenmeyeri kolvis (5.3) ning reguleeritakse pH tasemeni 8,1–8,2 umbes 400 mg tris(hüdroksümetüül)aminometaaniga (4.7). Indikaatorpaberiga (4.12) kontrollitakse pH taset. Lastakse seista 15 minutit, siis reguleeritakse uuesti tris(hüdroksümetüül)aminometaaniga (4.7) pH tasemeni 8,1–8,2 ning keedetakse 10 minutit püstjahuti all (5.4) pidevalt segades. Lastakse jahtuda, segu tsentrifuugitakse ja ekstrakt dekanteeritakse.

7.2. Puhastamine (selle etapi võib kontsentraatide, eelsegude ja mineraalsöötade korral ära jätta)

110 ml ekstrakti segatakse 11 g kationiidiga (4.9), keedetakse pidevalt segades üks minut püstjahuti all (5.4). Kationiit eraldatakse tsentrifuugimise või filtreerimisega. 100 ml ekstrakti segatakse 150 ml metanooliga (4.4) ning lahust hoitakse 12–15 tundi 4 °C juures. Helbeline mass filtreeritakse külmana.

Klaasvilla tropp (4.11) asetatakse klaastoru (5.1) alumisse otsa, torusse valatakse 5 ml anioniiti (4.10) ning kolonn pestakse 100 ml 80protsendilise metanooliga (4.6). Lehtrit (5.2) kasutades pannakse kolonni vähemalt 100 ml filtraati, mis eeldatavasti sisaldab 16 μg flavofosfolipooli (200 ml 30 g söödaproovi kohta 1 miljondikuna). Vajaduse korral lahjendatakse filtraati enne kolonni panemist 80protsendilise metanooliga (4.6), et saada soovitud flavofosfolipooli sisaldus 16 μg/100 ml. Voolukiirus reguleeritakse 2 ml/min. Väljavoolanud vedelik visatakse ära. Seejärel pestakse kolonni 50 ml 80protsendilise metanooliga (4.6) ning väljavoolanud vedelik visatakse ära.

Flavofosfolipool elueeritakse kaaliumkloriidi (4.8) metanoolilahusega voolukiirusel 2 ml/min. 50 ml eluaati kogutakse mõõtekolbi, lisatakse 30 ml vett ning segatakse. Saadud lahuse flavofosfolipooli sisaldus peaks olema 0,2 μg/ml (= U8).

7.3. Testlahused

Vajaduse korral (nt kui puhastamine on ära jäetud) lahjendatakse saadud ekstrakti 50protsendilise metanooliga (4.5) vastavalt punktile 7.1.1, et saada soovitud flavofosfolipooli sisaldus 0,2 μg/ml (= U8).

Lahusest U8 valmistatakse lahused U4 (eeldatav sisaldus 0,1 μg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 0,05 μg/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,025 μg/ml) 50protsendilise metanooliga (4.5) järjest lahjendades (1 : 1).

8. ANALÜÜSI KÄIK

8.1. Analüüsi söötme nakatamine

Analüüsi sööde (4.2.2) nakatatakse baktersuspensiooniga (3.2) ligikaudu 50 °C juures. Analüüsi söötmega (4.2.2) plaatidel määratakse eelkatsete abil kindlaks baktersuspensiooni kogus, mis on vajalik suurimate ja selgeimate inhibitsioonitsoonide saamiseks flavofosfolipooli eri kontsentratsioonide juures (ligikaudu 30 ml/l).

8.2. Plaatide ettevalmistamine

Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel nelja kontsentratsiooniga standardlahusega (S8, S4, S2 ja S1) ja nelja kontsentratsiooniga testlahusega (U8, U4, U2 ja U1). Need neli ekstrakti ja standardlahust tuleb tingimata panna igale plaadile. Selleks valitakse plaadid, mis on piisavalt suured, et agarsöötmesse oleks võimalik teha vähemalt kaheksa üksteisest vähemalt 30 mm kaugusel asetsevat auku läbimõõduga 10–13 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, millele on pandud alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm.

Plaatidele valatakse teatav kogus söödet (4.2.1), nii et tekiks ligikaudu 1,5 mm paksune kiht (45 ml 200 mm läbimõõduga plaadi puhul). Söötmel lastakse tasanduda ning seejärel valatakse üle teatava koguse söötmega (4.2.2), mida on nakatatud vastavalt punktile 8.1, nii et tekiks 1 mm paksune kiht (30 ml 200 mm läbimõõduga plaadi puhul). Söötmel lastakse tasanduda, tehakse sellesse augud ning pannakse nendesse täpselt mõõdetud test- ja standardlahuste kogused (0,10–0,15 ml augu kohta, sõltuvalt läbimõõdust).

Iga kontsentratsiooni kasutatakse vähemalt neli korda, et iga määramisega oleks võimalik hinnata 32 inhibitsioonitsooni.

8.3. Inkubeerimine

Plaate inkubeeritakse 28–30 °C juures 16–18 tundi.

9. HINDAMINE

Inhibitsioonitsoonide läbimõõt mõõdetakse 0,1 mm täpsusega. Iga kontsentratsiooni puhul leitakse keskmised väärtused poollogaritmilisel millimeetripaberil, kus oleks näha kontsentratsioonide logaritmi ja inhibitsioonitsoonide läbimõõdu vaheline seos. Nii standardlahuse kui ekstrakti jaoks visandatakse "kõige sobivamad" jooned, näiteks nagu on kirjeldatud allpool.

Standardlahuse madalaima taseme (SL) jaoks määratakse "kõige sobivam" punkt, kasutades järgmist valemit:

SL =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

810

SH =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

110

Samamoodi arvutatakse "kõige sobivamad" punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades S1, S2, S4 ja S8 eespool toodud valemis U1, U2, U4 ja U8-ga.

Arvutatud SL ja SH väärtused märgitakse samale millimeetripaberile ja nende ühendamisel saadakse standardlahuse "kõige sobivam" joon. Samamoodi märgitakse UL ja UH ning nende ühendamisel saadakse ekstrakti "kõige sobivam" joon.

Segavate mõjude puudumisel peaksid saadud jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni käsitada paralleelsetena, kui väärtused (SH–SL) ja (UH–UL) ei erine võrra oma keskmisest väärtusest rohkem kui 10 %.

Kui jooned ei ole paralleelsed, võib ära jätta kas U1 ja S1 või U8 ja S8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH järgmiste valemite abil, et saada alternatiivsed "kõige sobivamad" jooned:

SL =

5 S

+ 2 S

- S

6

SH =

5 S

+ 2 S

- S

6

ning samamoodi UL ja UH puhul. Sarnaselt eespool kirjeldatule tuleb kontrollida alternatiivsete "kõige sobivamate" joonte paralleelsust. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme kontsentratsiooni põhjal, tuleb märkida lõpparuandesse.

Kui jooni käsitatakse paralleelsetena, arvutatakse suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) ühe järgmise valemi abil.

Nelja kontsentratsiooni puhul:

log A =

× 0,602

U

+ U

+ S

+ S

- U

- U

- S

- S

2

Kolme kontsentratsiooni puhul:

log A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

1

või

log A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

2

Tegelik aktiivsus = oletatav aktiivsus × suhteline aktiivsus.

Kui jooni ei saa käsitada paralleelsetena, korratakse määramist. Kui ka siis ei saada paralleelseid jooni, arvutatakse valemiga c suhtelise aktiivsuse logaritm (log A). Saadud tulemust tuleb siiski käsitada ligikaudsena ning see tuleks märkida lõpparuandesse.

10. KORRATAVUS

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

absoluutväärtusena väljendatult 0,5 mg/kg, kui flavofosfolipooli sisaldus on 1–2 mg/kg;

25 % suurimast väärtusest, kui flavofosfolipooli sisaldus on suurem kui 2 ja kuni 10 mg/kg;

20 % suurimast väärtusest, kui flavofosfolipooli sisaldus on suurem kui 10 ja kuni 25 mg/kg;

absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui flavofosfolipooli sisaldus on suurem kui 25 ja kuni 50 mg/kg;

10 % suurimast väärtusest, kui flavofosfolipooli sisaldus on suurem kui 50 mg/kg.

3. MIKROELEMENTIDE RAUA, VASE, MANGAANI JA TSINGI MÄÄRAMINE

1. EESMÄRK JA RAKENDUSALA

Meetodi abil saab kindlaks määrata söötades mikroelemente: rauda, vaske, mangaani ja tsinki. Alumised määramispiirid on:

raud (Fe) 20 mg/kg,

vask (Cu) 10 mg/kg,

mangaan (Mn) 20 mg/kg,

tsink (Zn) 20 mg/kg.

2. PÕHIMÕTE

Proov lahustatakse soolhappes pärast võimaliku orgaanilise aine hävitamist. Elemendid raud, vask, mangaan ja tsink määratakse aatomabsorptsioonispektomeetriaga pärast asjakohast lahjendamist.

3. REAKTIIVID

Sissejuhatus

Reaktiivide ja analüütiliste lahuste ettevalmistamiseks kasutatakse katioonivaba vett, mis on saadud kas bidestilleerimisel borosilikaat- või kvartsklaasist destillaatoris või kahekordsel töötlemisel ioonivahetusvaikudega.

Reaktiivid peavad olema vähemalt analüütiliselt puhtad. Määratava elemendi puudumist tuleb kontrollida pimekatse abil. Vajaduse korral tuleb reaktiive veel puhastada.

Allpool kirjeldatud standardlahuste asemel võib kasutada müügiks ettenähtud standardlahuseid, tingimusel et neil on garantii ning neid on enne kasutamist kontrollitud.

3.1. Soolhape, analüütiliselt puhas (tihedus 1,19).

3.2. Soolhape, analüütiliselt puhas (6 N).

3.3. Soolhape, analüütiliselt puhas (0,5 N).

3.4. 38–40(mahu)protsendiline vesinikfluoriidhape, mille rauasisaldus on alla 1 mg Fe/l ning jääk pärast aurutamist alla 10 mg/l (sulfaadina).

3.5. Väävelhape, analüütiliselt puhas (tihedus 1,84).

3.6. Vesinikperoksiid, analüütiliselt puhas (ligikaudu 100 mahuosa hapnikku (30 massiprotsenti)).

3.7. Raua standardlahus (1000 μg Fe/ml), mis on valmistatud järgmiselt: 1 g analüütiliselt puhast raudtraati lahustatakse 200 ml 6 N soolhappes (3.2), lisatakse 16 ml vesinikperoksiidi (3.6) ning täiendatakse veega ühe liitrini.

3.7.1. Raua tööstandardlahus (100 μ μg Fe/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.7) veega vahekorras 1 : 9.

3.8. Vase standardlahus (1000 μg Cu/ml), mis on valmistatud järgmiselt: 1 g vasepulbrit (analüütiliselt puhas) lahustatakse 25 ml 6 N soolhappes (3.2), lisatakse 5 ml vesinikperoksiidi (3.6) ning täiendatakse veega ühe liitrini.

3.8.1. Vase tööstandardlahus (10 μg Cu/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahuse (3.8) veega vahekorras 1 : 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1 : 9.

3.9. Mangaani standardlahus (1000 μg Mn/ml), mis on valmistatud järgmiselt: 1 g analüütiliselt puhast mangaanipulbrit lahustatakse 25 ml 6 N soolhappes (3.2) ning täiendatakse veega ühe liitrini.

3.9.1. Mangaani tööstandardlahus (10 μg Mn/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.9) veega vahekorras 1 : 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1 : 9.

3.10. Tsingi standardlahus (1000 μg Zn/ml), mis on valmistatud järgmiselt: 1 g analüütiliselt puhast riba- või lehttsinki lahustatakse 25 ml 6 N soolhappes (3.2) ning täiendatakse veega ühe liitrini.

3.10.1. Tsingi tööstandardlahus (10 μg Zn/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.10) veega vahekorras 1 : 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1 : 9.

3.11. Lantaankloriidi lahus, mis on valmistatud järgmiselt: 12 g lantaanoksiidi lahustatakse 150 ml vees, lisatakse 100 ml 6 N soolhapet (3.2) ning täiendatakse veega ühe liitrini.

4. VAHENDID

4.1. Temperatuuriregulaatori ja salvestiga muhvelahi.

4.2. Klaasist nõud peavad olema vastupidavast borosilikaatklaasist ning on soovitav kasutada vahendeid, mida kasutatakse üksnes mikroelementide määramiseks.

4.3. Plaatinatiigel ja (vabatahtlik) kvartstiigel.

4.4. Aatomabsorptsioonispektrofotomeeter, mis vastab kasutatava meetodi nõuetele, võttes arvesse tundlikkust ning täpsust nõutud ulatuses.

5. ANALÜÜSI KÄIK

5.1. Orgaanilist ainet sisaldavad proovid

5.1.1. Tuhastamine ja lahuse analüüsiks ettevalmistamine [9]

i) 5–10 g 0,2 mg täpsusega kaalutud proovi kaalutis asetatakse kvarts- või plaatinatiiglisse (4.3) (vaata märkus b), kuivatatakse ahjus 105 °C juures ning tiigel asetatakse külma muhvelahju (4.1). Ahi suletakse (vaata märkus c) ning järk-järgult tõstetakse ligikaudu 90 minuti jooksul temperatuur 450–475 °Cni. Kõnealust temperatuuri hoitakse 4–16 tundi (nt öö jooksul), et eemaldada söeosakesed, ning seejärel ahi avatakse ning lastakse jahtuda (vaata märkus d).

Tiigel pestakse ligikaudu 5 ml soolhappega (3.1) ning soolhape lisatakse aeglaselt ja ettevaatlikult keeduklaasi (CO2 moodustumise tõttu võib tekkida tugev reaktsioon). Soolhape (3.1) lisatakse tilkhaaval ja loksutades kuni kihisemise lakkamiseni. Aurutatakse kuivaks, aeg-ajalt klaaspulgaga segades.

Järgmisena lisatakse jäägile 15 ml 6 N soolhapet (3.2) ning ligikaudu 120 ml vett. Segatakse klaaspulgaga, mis tuleks jätta keeduklaasi, ning keeduklaas kaetakse klaaskaanega. Segu lastakse aeglaselt keema ning hoitakse keemistemperatuuril, kuni ei eraldu enam tuhka. Filtreeritakse läbi tuhavaba filterpaberi ning filtraat kogutakse 250 ml mõõtekolbi. Keeduklaas pestakse ning filtreeritakse 5 ml kuuma 6 N soolhappega (3.2) ning kaks korda keeva veega. Mõõtekolb täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 N).

ii) Kui filtris olev jääk on must (süsinik), pannakse see tagasi ahju ning tuhastatakse uuesti 450–475 °C juures. Kõnealune tuhastamine, mis võtab aega mõne tunni (3–5 tundi), on lõppenud, kui tuhk on valge või peaaegu valge. Jääk lahustatakse ligikaudu 2 ml soolhappega (3.1), aurutatakse kuivaks ning sellele lisatakse 5 ml 6 N soolhapet (3.2). Segu kuumutatakse, lahus filtreeritakse mõõtekolbi ning täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 N).

Märkused:

a) Mikroelementide määramisel on oluline teada saastamisohtu, eriti tsingi, vase ja raua puhul. Seetõttu ei tohi proovide ettevalmistamisel kasutatavad vahendid sisaldada kõnealuseid metalle.

Üldise saastamisohu vähendamiseks tuleb töötada tolmuvabas keskkonnas hoolikalt puhastatud vahendite ja korralikult pestud klaasnõudega. Tsingi määramine on eriti tundlik mitmete saasteallikate suhtes, nt klaasnõud, reaktiivid, tolm jne.

b) Tuhastatava proovi mass arvutatakse sööda ligikaudse mikroelemendisisalduse põhjal vastavalt kasutatava spektrofotomeetri tundlikkusele. Teatavate väikese mikroelementide sisaldusega söötade korral alustatakse 10–20 g proovist, mille lõpplahus täiendatakse vaid kuni 100 ml lahuse saamiseni.

c) Tuhastamine peab toimuma suletud ahjus õhu või hapniku juurdepääsuta.

d) Püromeetri temperatuuri näit ei tohi ületada 475 °C.

5.1.2. Spektrofotomeetriline määramine

5.1.2.1. Kaliibrimislahuste valmistamine

Iga määratava elemendi jaoks valmistatakse punktides 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.10.1 osutatud tööstandardlahustest kaliibrimislahused, millest iga lahuse HCl kontsentratsioon on ligikaudu 0,5 N ning (raua, mangaani ja tsingi korral) lantaankloriidi kontsentratsioon on samaväärne 0,1 (massi/mahu) protsendi La-ga. Valitud mikroelementide kontsentratsioonid peavad jääma kasutatava spektrofotomeetri tundlikkuse piiresse. Järgmistes tabelites on näitena esitatud tavapäraste kaliibrimislahuste koostised; kuna koostised sõltuvad siiski kasutatava spektrofotomeetri tundlikkusest, võib osutuda vajalikuks valida muud kontsentratsioonid.

Raud

μg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

ml tööstandardlahust (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11), mida täiendatakse veega 100 ml lahuse saamiseni. |

Vask

μg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |

ml tööstandardlahust (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

+ ml 6 N HCl (3.2) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |

Täiendatakse veega kuni 100 ml lahuse saamiseni. |

Mangaan

μg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |

ml tööstandardlahust (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11), mida täiendatakse veega 100 ml lahuse saamiseni. |

Tsink

μg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 |

ml tööstandardlahust (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 |

+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11), mida täiendatakse veega 100 ml lahuse saamiseni. |

5.1.2.2. Lahuse analüüsiks ettevalmistamine

Vase määramiseks saab vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahust tavaliselt kohe kasutada. Kui lahuse kontsentratsioon on vaja viia kaliibrimislahuste piiresse, võib lahuse alikvoodi pipettida 100 ml mõõtekolbi ning täita märgini 0,5 N soolhappega (3.3).

Raua, mangaani ja tsingi määramiseks pipetitakse vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahuse alikvoot 100 ml mõõtekolbi, lisatakse 10 ml lantaankloriidilahust (3.11) ning täidetakse märgini 0,5 N soolhappega (3.3) (vaata ka punkt 8 "Märkus").

5.1.2.3. Pimekatse

Pimekatse peab hõlmama kõiki protseduuri ettenähtud etappe, välja arvatud see, et proovimaterjal jäetakse välja.

Pimekatsel ei tohi kasutada kaliibrimislahust 0.

5.1.2.4. Aatomabsorptsiooni mõõtmine

Kaliibrimislahuste ja analüüsitava lahuse aatomabsorptsiooni mõõdetakse oksüdeerivat õhk-atsetüleenleeki kasutades järgmistel lainepikkustel:

Fe 248,3 nm,

Cu 324,8 nm,

Mn 279,5 nm,

Zn 213,8 nm.

Iga mõõtmist tuleb teha neli korda.

5.2. Mineraalsöödad

Kui proov ei sisalda orgaanilist ainet, ei ole eelnev tuhastamine vajalik. Toimitakse vastavalt punkti 5.1.1 alapunktile i, alustades teisest lõigust. Vesinikfluoriidhappega aurutamise võib ära jätta.

6. TULEMUSTE ARVUTAMINE

Mikroelementide kontsentratsioon analüüsitavas lahuses arvutatakse kalibreerimiskõverat kasutades ning tulemus väljendatakse mikroelementide milligrammides ühe kilogrammi proovi kohta (miljondikkudes).

7. KORRATAVUS

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

- absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on kuni 50 mg/kg,

- 10 % suuremast tulemusest, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on 50–100 mg/kg,

- absoluutväärtusena väljendatult 10 mg/kg, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on 100–200 mg/kg,

- 5 % suuremast tulemusest, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on üle 200 mg/kg.

8. MÄRKUS

P

· 2, võib lantaankloriidi lahuse (3.11) jätta analüüsilahusesse ja kaliibrimislahusesse lisamata.

[1] 1 mg tsinkbatsitratsiini söödas vastab 42 rahvusvahelisele ühikule (RÜ).

[2] Kasutada võib ka teisi meetodeid, kui on kindlaks tehtud, et nendega saadakse samalaadsed baktersuspensioonid.

[3] Kasutada võib müügiks ettenähtud söödet, mis on samasuguse koostisega ning millega saadakse samad tulemused.

[4] Kasutada võib müügiks ettenähtud söödet, mis on samasuguse koostisega ning millega saadakse samad tulemused.

[5] Kasutada võib ka teisi meetodeid, kui on kindlaks tehtud, et nendega saadakse samalaadsed baktersuspensioonid.

[6] Kasutada võib müügiks ettenähtud söödet, mis on samasuguse koostisega ning millega saadakse samad tulemused, nt Oxoidi antibiootiline sööde 1 (CM 327) Oxoidi agari nr 3 (L 13) lisandiga.

[7] Kasutada võib müügiks ettenähtud söödet, mis on samasuguse koostisega ning millega saadakse samad tulemused, nt Oxoidi antibiootiline sööde 2 (CM 335) Oxoidi agari nr 3 (L 13) lisandiga.

[8] nt SE 2, Wacker Chemie GmbH, München.

[9] Haljassööt (värske või kuivatatud) võib sisaldada suurel hulgal taimset räni, mis võib hoida kinni mikroelemente ning tuleb eemaldada. Kõnealuse sööda proovide korral tuleb seega järgida järgmist muudetud menetlust.Sooritada punkti 5.1.1 alapunktis i osutatud toiming kuni filtreerimiseni. Lahustumatut jääki sisaldav filterpaber pestakse kaks korda keeva veega ning asetatakse plaatinatiiglisse (4.3). Põletatakse muhvelahjus (4.1) temperatuuril alla 550 °C kuni kõik söeosakesed on täielikult kadunud. Lastakse jahtuda, lisatakse mõned tilgad vett ning 10–15 ml vesinikfluoriidhapet (3.4) ning aurutatakse kuivaks ligikaudu 150 °C juures. Kui jääkides on siiski räni, lahustatakse see uuesti paaris milliliitris vesinikfluoriidhappes (3.4) ning aurutatakse kuivaks. Lisatakse viis tilka väävelhapet (3.5) ning kuumutatakse, kuni enam ei eraldu valget auru. Pärast 5 ml 6 N soolhappe (3.2) ja ligikaudu 30 ml vee lisamist kuumutatakse, lahus filtreeritakse 250 ml mõõtekolbi ning täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 N). Mikroelementide määramist jätkatakse punktist 5.1.3.

--------------------------------------------------