02009R0152 — ET — 26.04.2017 — 005.001

Käesolev tekst on üksnes dokumenteerimisvahend ning sel ei ole mingit õiguslikku mõju. Liidu institutsioonid ei vastuta selle teksti sisu eest. Asjakohaste õigusaktide autentsed versioonid, sealhulgas nende preambulid, on avaldatud Euroopa Liidu Teatajas ning on kättesaadavad EUR-Lexi veebisaidil. Need ametlikud tekstid on vahetult kättesaadavad käesolevasse dokumenti lisatud linkide kaudu

Muudetud:

▼B

KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 152/2009,

27. jaanuar 2009,

milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks

(EMPs kohaldatav tekst)

▼M3

Artikkel 1

Proovide võtmine sööda ametlikuks kontrollimiseks, eriti sööda koostisosade määramiseks, sealhulgas geneetiliselt muundatud organisme (GMO) sisaldavate või neist toodetud koostisosade, Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruses (EÜ) nr 1831/2003 ( 1 ) määratletud söödalisandite ning Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivis 2002/32/EÜ ( 2 ) määratletud soovimatute ainete määramiseks tuleb teha I lisas sätestatud meetoditega.

I lisas sätestatud proovivõtumeetodit kasutatakse sööda kontrollimiseks, et määrata Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruses (EÜ) nr 396/2005 ( 3 ) määratletud pestitsiidijääke ning kontrollida sööda vastavust määrusele (EL) nr 619/2011.

▼B

Artikkel 2

Proovide analüüsiks ettevalmistamine ja tulemuste esitamine toimub kooskõlas II lisas sätestatud meetoditega.

Artikkel 3

Analüüse sööda ametlikuks kontrolliks tehakse vastavalt III lisas (Analüüsimeetodid söödatooraine ja segajõusööda koostise kontrollimiseks), IV lisas (Analüüsimeetodid lubatud söödalisandite taseme kontrollimiseks söödas), V lisas (Analüüsimeetodid soovimatute ainete sisalduse kontrollimiseks söödas) ja VI lisas (Analüüsimeetodid loomse päritoluga komponentide määramiseks sööda ametlikul kontrollimisel) sätestatud meetoditele.

Artikkel 4

Kodulindude segasööda energiasisaldus arvutatakse vastavalt VII lisale.

Artikkel 5

Analüüsimeetodeid selliste VIII lisas sätestatud lisandite ebaseadusliku sisalduse kontrollimiseks, mida ei ole enam lubatud söödas kasutada, kasutatakse kinnituse saamiseks.

Artikkel 6

Direktiivid 71/250/EMÜ, 71/393/EMÜ, 72/199/EMÜ, 73/46/EMÜ, 76/371/EMÜ, 76/372/EMÜ, 78/633/EMÜ, 81/715/EMÜ, 84/425/EMÜ, 86/174/EMÜ, 93/70/EMÜ, 93/117/EÜ, 98/64/EÜ, 1999/27/EÜ, 1999/76/EÜ, 2000/45/EÜ, 2002/70/EÜ ja 2003/126/EÜ tunnistatakse kehtetuks.

Viiteid kehtetuks tunnistatud direktiividele käsitatakse viidetena käesolevale määrusele ja loetakse vastavalt XI lisa vastavustabelitele.

Artikkel 7

Käesolev määrus jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolevat määrust kohaldatakse alates 26. augustist 2009.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.

▼M3

I LISA

PROOVIVÕTUMEETODID

1.   EESMÄRK JA REGULEERIMISALA

Sööda ametlikuks kontrolliks ettenähtud proovid võetakse allpool kirjeldatud meetodite kohaselt. Selliselt saadud proove käsitatakse proovipartii esindusliku proovina.

Esindusliku proovi võtmise eesmärk saada partiist väike osa nii, et iga selle osa konkreetne näitaja kujutaks endast partii näitajate keskmist väärtust. Partii eri kohtadest võetakse korduvalt üksikproove. Üksikproovide kokkusegamisega saadakse koondproov, millest võetakse esindusliku jagamise teel esinduslikud lõpp-proovid.

Kui vaatlusel ilmneb, et osa samast söödapartiist on erineva kvaliteediga, eraldatakse sellised osad ja neid käsitletakse kui alampartiisid. Kui söödapartiid ei ole võimalik jagada alampartiideks, tuleb seda käsitada ühe partiina, kuid selle kohta tuleb teha märkus proovivõtuaruandesse.

Kui tehakse kindlaks, et käesoleva määruse sätete kohaselt võetud söödaproov ei vasta ELi nõuetele ja kui tegemist on sama tooteklassi või -liigi söödapartii osaga, siis tuleb eeldada, et kogu selle partii sööt ei vasta nõuetele, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

2.   MÕISTED

3.   ÜLDSÄTTED

4.   SEADMED

5.   ÜKSIKPROOVIDE ARVU NÕUDED

5.1.    Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimiseks võetavate üksikproovide arvu nõuded

5.1.1.    Lahtine tahke sööt

5.1.2.    Lahtine vedel sööt

5.1.3.    Pakendatud sööt

Sööt (tahke ja vedel) võib olla pakendatud kottidesse, kanistritesse, mahutitesse jne, millele tabelis viidatakse kui pakkeühikutele. Suurtest pakkeühikutest (≥ 500 kg või liitrit) tuleb võtta proove lahtise sööda kohta kehtivate sätete kohaselt (vt punktid 5.1.1. ja 5.1.2.)

5.1.4.    Söödabriketid ja lakukivid

Proov võetakse vähemalt ühest briketist või kivist 25 pakkeühikust koosneva proovipartii kohta, kuid mitte rohkem kui neljast briketist või kivist.

Kui iga briketi või lakukivi kaal on kuni 1 kg, loetakse üksikprooviks ühe kivi või briketi sisu.

5.1.5.    Koresööt

5.2.    Üksikproovide arvu nõuded juhul, kui kontrollitavad koostisosad või ained on söödas tõenäoliselt ebaühtlaselt jaotunud

Kõnealused üksikproovide proovide arvu nõuded kehtivad järgmistel kontrollijuhtudel:

Kui kontrollival asutusel on tugev kahtlus, et selline ebaühtlane jaotumine esineb segasööda koostisosa või aine ristsaastumise korral, võib võtta proove järgmises tabelis esitatud arvul.

5.3.    Proovide arvu nõuded väga suurte partiide üksikproovide korral

Väga suurte proovipartiide korral (proovipartii > 500 tonni) on võetavate üksikproovide arv 40 üksikproovi + √ tonnide arv, kui ained või tooted on ühtlaselt jaotunud kogu söödas, või 100 üksikproovi + √ tonnide arv, kui koostisosad või ained on ebaühtlaselt jaotunud kogu söödamaterjalis.

6.   KOONDPROOVI KOGUSELISED NÕUDED

7.   LÕPP-PROOVI KOGUSELISED NÕUDED

Lõpp-proovid

Analüüsida tuleb vähemalt üht lõpp-proovi. Analüüsitavas lõpp-proovis sisalduv kogus ei tohi olla väiksem järgmistest näitajatest:

8.   PROOVIVÕTUMEETOD VÄGA SUURTE PARTIIDE JAOKS JA SELLISTE PARTIIDE JAOKS, MIDA LADUSTATAKSE VÕI TRANSPODITAKSE NII, ET KOGU PARTII ULATUSES EI OLE VÕIMALIK PROOVE VÕTTA

8.1.    Üldpõhimõtted

Kui partii ladustamine või transportimine ei võimalda võtta üksikproove kogu partiist, tuleks eelistatult võtta sellisest partiist proove laadimise ajal.

Suurtesse sööda hoidmiseks ettenähtud ladudesse tuleks soovitada söödakäitlejatel paigaldada (automaatsed) proovivõtuseadmed, millega on võimalik võtta proove kogu ladustatud partiist.

Kui proove võetakse 8. peatükis sätestatud viisil, tuleb söödakäitlejat või tema esindajat teavitada proovivõtumenetlusest. Kui söödakäitleja või tema esindaja seab kahtluse alla kõnealuse proovivõtumeetodi, peab söödakäitleja või tema esindaja lubama pädeval asutusel võtta proove kogu partiist ja katma kulud.

8.2.    Laevaga transporditavad suured partiid

8.2.1.    Laevaga transporditavast partiist liikuvast tootest proovide võtmine

Suurtest partiidest, mida transporditakse laevaga, võetakse eelistatult proove laadimise ajal (kui toode on liikuv).

Proove võetakse igast lastiruumiosast (osast, mida on võimalik füüsiliselt eraldada) Kuna lastiruumi osi tühjendatakse eraldi, kaob lattu laadimise käigus osade füüsiline eraldatus. Proove võib võtta kas algse füüsilise eraldatuse olukorras või pärast lattu viimist.

Laeva lossimine võib kesta mitu päeva. Proove tuleks tavaliselt võtta korrapäraste ajavahemike järel kogu lossimise ajal. Alati ei ole aga mõistlik ega asjakohane, et ametlik inspektor on proovivõtuks kohal kogu lossimise ajal. Seepärast on lubatud proove võtta kogu partii ühest osast (proovipartiist). Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele.

Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu selle partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

Ka siis, kui ametlikud proovid võetakse automaatselt, on inspektori kohalolek vajalik. Kui proovid võetakse automaatselt ja vastavalt eelnevalt kindlaks määratud näitajatele, mida ei saa muuta proovide võtmise ajal, ning kui üksikproovid kogutakse pitseeritavasse anumasse, nii et sedasi hoitakse ära igasugused pettused, peab inspektor olema kohal ainult proovivõtu alguses, iga kord, kui proovianumat vahetatakse, ja proovivõtu lõpus.

8.2.2.    Laevaga transporditavast partiist liikumatust tootest proovide võtmine

Kui proove võetakse liikumatust tootest, tuleb kasutada sama menetlust, mis on ette nähtud ülalt ligipääsetavatest ladudest (sööda tornhoidlatest) proovide võtmiseks (vt punkti 8.4.1).

Proove tuleb võtta partii (lastiruumi) ligipääsetavast osast (ülalt). Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.3.    Proovide võtmine laos hoitavast suurest partiist

Proove tuleb võtta partii ligipääsetavast osast. Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.4.    Proovide võtmine hoidlatest (sööda tornhoidlatest)

8.4.1.    Proovide võtmine ülalt (kergesti) ligipääsetavatest mahutitest

Proove tuleb võtta partii ligipääsetavast osast. Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.4.2.    Proovide võtmine hoidlatest, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid)

8.4.2.1.    Hoidlad, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid), mahuga > 100 tonni

Sellistest mahutitest ei ole võimalik paigalseisvast söödast proove võtta. Kui on vaja proove võtta mahutis olevast söödast, mida ei saa liigutada, tuleb käitlejaga kokku leppida, et ta teatab, kui mahutist hakatakse sööta välja laadima, et siis söödast proove võtta.

8.4.2.2.    Hoidlad, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid), mahuga < 100 tonni

Proovivõtuks tuleb anumasse võtta 50–100 kg toodet ja proove tuleb võtta sellest kogusest. Koondproovi suurus sõltub kogu partii suurusest ning üksikproovide arv sõltub proovivõtuks anumasse võetud toote kogusest. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.5.    Proovide võtmine suurtes suletud mahutites olevast lahtisest söödast

Sellistest partiidest saab sageli proove võtta alles siis, kui toode on välja laaditud. Mõnikord ei ole võimalik toodet välja laadida impordi- või kontrollipunktis ja proove tuleb võtta väljalaadimiskohas.

9.   PROOVIDE VÕTMISE, ETTEVALMISTAMISE JA PAKENDAMISE JUHISED

9.1.    Üldkirjeldus

Proovid tuleb võtta ja ette valmistada liigse viivituseta ning võtta toote muutumise ja saastumise vältimiseks vajalikud ettevaatusabinõud. Töövahendid ja -pinnad ning proovide hoidmiseks ettenähtud anumad peavad olema puhtad ja kuivad.

9.2.    Üksikproovid

Üksikproove võetakse pisteliselt kogu proovipartii ulatuses ja need peavad olema ligikaudu võrdse suurusega.

Üksikproov peab olema vähemalt 100 g või kerge koresööda puhul 25 g.

Kui punktis 8 sätestatud proovivõtueeskirjade kohaselt tuleb võtta vähem kui 40 üksikproovi, määratakse üksikproovi suurus vastavalt nõutava koondproovi suurusele (vt punkti 6).

Kui proove võetakse väikestest pakendatud sööda partiidest, mille puhul on vaja võtta väike arv üksikproove, peab üksikproov olema ühe originaalpakkeühiku sisu, kui pakkeühik ei ole suurem kui 1 kg või 1 l.

Kui söödapakendid on väikesed (nt < 250 g), sõltub üksikproovi suurus pakendi suurusest.

9.2.1.    Lahtine sööt

Vajaduse korral võib proove võtta partii liikumise (peale- või mahalaadimise) ajal.

9.2.2.    Pakendatud sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv pakendeid välja valitud, võetakse puuri või kühvli abil osa iga pakendi sisust. Vajaduse korral võetakse proovid pärast seda, kui pakendid on ükshaaval tühjendatud.

9.2.3.    Homogeenne või homogeenitav vedel või poolvedel sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on punkti 5. peatüki kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, homogeenitakse vajaduse korral nende sisu ja võetakse vajalik kogus igast mahutist.

Üksikproove võib võtta mahutite tühjendamise ajal.

9.2.4.    Mittehomogeenitav vedel või poolvedel sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, võetakse proovid eri tasemetelt.

Proove võib võtta ka mahutite tühjendamise ajal, kuid mitte esimestest kihtidest.

Mõlemal juhul peab võetav kogus olema vähemalt 10 liitrit.

9.2.5.    Söödabriketid ja lakukivid

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv brikette või kive välja valitud, võetakse osa igast briketist või kivist. Kui on kahtlusi, et kivi või brikett ei ole ühtlase koostisega, võetakse prooviks kogu brikett või kivi.

Kui iga briketi või lakukivi kaal on kuni 1 kg, loetakse üksikprooviks ühe kivi või briketi sisu.

9.3.    Koondproovide ettevalmistamine

Ühtne koondproov saadakse üksikproovide kokkusegamise abil.

9.4.    Lõpp-proovide ettevalmistamine

Koondproovi materjal segatakse hoolega ( 4 ).

9.5.    Proovi pakendamine

Mahutid ja pakendid peavad olema pitseeritud niimoodi, et ilma pitserit lõhkumata ei oleks võimalik neid avada. Pitser peab hõlmama kogu märgist.

9.6.    Proovide saatmine laboratooriumi

Proov koos analüüsiks vajaliku teabega tuleb viivitamata saata kindlaksmääratud laboratooriumi analüüsimiseks.

10.   PROOVIVÕTUARUANNE

Iga proovivõtu kohta tuleb teha aruanne, mis võimaldab iga proovipartiid ja selle suurust üheselt kindlaks teha.

Aruandesse tuleb kanda ka kõik kõrvalekalded käesolevas määruses sätestatud proovivõtumenetlusest.

Aruanne tuleb teha kättesaadavaks nii ametlikule kontrollilaboratooriumile kui ka söödakäitlejale ja/või söödakäitleja määratud laboratooriumile.

II LISA

SÖÖDA ANALÜÜSIMEETODITE ÜLDSÄTTED

A.   PROOVIDE ETTEVALMISTAMINE ANALÜÜSIKS

1.    Eesmärk

Allpool kirjeldatud menetlused on ette nähtud kontrollilaboratooriumidesse saadetud proovide ettevalmistamiseks analüüsiks pärast proovi võtmist I lisa sätete kohaselt.

Laboratoorsed proovid tuleb ette valmistada nii, et analüüsimeetodites sätestatud viisil kaalutud kogused oleksid ühtlased ja esindaksid lõpp-proove.

2.    Ettevaatusabinõud

Proovide ettevalmistamine sõltub kasutatavatest analüüsimeetoditest ning koostisosadest ja ainetest, mida on vaja uurida. Seepärast on väga oluline tagada, et proov valmistataks ette vastavalt kasutatavale analüüsimeetodile ning koostisosadele ja ainetele, mida on vaja uurida.

Kõik vajalikud toimingud tuleb teha nii, et vältida proovi saastumist ja selle koostise muutumist.

Jahvatada, segada ja sõeluda tuleb viivitamata, et proovi kokkupuude õhu ja valgusega oleks minimaalne. Kasutada ei tohi veskeid ega jahvatajaid, mis proovi märgatavalt kuumendavad.

Kuumuse suhtes eriti tundlikku sööta soovitatakse jahvatada käsitsi. Samuti tuleb tagada, et seadmed ise ei oleks saastumisallikaks.

Kui proovi ei ole võimalik ette valmistada nii, et selle niiskusesisalduses oluliselt ei muutu, määratakse niiskusesisaldus enne ja pärast ettevalmistamist III lisa A osas sätestatud meetodil.

3.    Menetlus

3.1.    Üldmenetlus

Uuritav kogus võetakse lõpp-proovist. Jagamiseks ei soovitata koonusekujulist proovijagajat ega nn jagamisristi, s o neljaks jagamise (kvarteerimise) meetodit, sest sellega võib kaasneda alamproovide jaotuses suur viga.

3.1.1.    Sööt, mida saab kohe jahvatada

3.1.2.    Sööt, mida saab jahvatada pärast kuivatamist

3.1.3.    Vedel või poolvedel sööt

3.1.4.    Muu sööt

3.2.    Erimenetlus uurimiseks vaatluse teel või mikroskoobiga või juhul, kui kogu koondproov on homogeenitud

4.    Proovide hoidmine

Proove tuleb hoida temperatuuril, mis ei muuda nende koostist. Vitamiinide või eriti valgustundlike ainete analüüsiks ettenähtud proove tuleb hoida nii, et valgus proove ei kahjustaks.

B.   SÄTTED ANALÜÜSIMEETODITES KASUTATAVATE REAKTIIVIDE JA SEADMETE KOHTA

C.   ANALÜÜSIMEETODITE KASUTAMINE JA TULEMUSTE ESITAMINE

1.    Ekstraktsioonimenetlus

Mitmete meetodite puhul on määratud eraldi ekstraktsioonimenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi ekstraktsioonimenetlusi kasutada juhul, kui on tõendatud, et kasutatav ekstraktsioonimenetlus on põhiaine analüüsiks sama tõhus kui meetodis nimetatud menetlus.

2.    Puhastusmenetlus

Mitme meetodi puhul on määratud eraldi puhastusmenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi puhastusmenetlusi kasutada juhul, kui on tõendatud, et kasutatav puhastusmenetlus annab uuritava aine analüüsimisel meetodis nimetatud menetlusega samaväärsed analüüsitulemused.

3.    Määramiste arv

Kui soovimatute ainete analüüsimisel on esimese määramise tulemus oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitavas tootekirjelduses, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi. Muudel juhtudel on vajalik kordusanalüüs (teistkordne määramine), et välistada sisemise ristsaastumise ja juhusliku proovide segunemise võimalust. Mõõtemääramatust arvesse võttes kasutatakse nõuetele vastavuse hindamisel kahe analüüsi keskmist.

Kui aine või koostisosa deklareeritud sisalduse kontrollimisel kinnitab esimese määramise tulemus deklareeritud sisaldust, st analüüsitulemus jääb deklareeritud sisalduse lubatud kõrvalekalde piiresse, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi. Muudel juhtudel on vajalik kordusanalüüs (teistkordne määramine), et välistada sisemise ristsaastumise ja juhusliku proovide segunemise võimalust. Mõõtemääramatust arvesse võttes kasutatakse nõuetele vastavuse hindamisel kahe analüüsi keskmist.

Teatavatel juhtudel on lubatud kõrvalekalde vahemik kindlaks määratud õigusaktis, näiteks Euroopa Parlamendi ja nõukogu 13. juuli 2009. aasta määruses (EÜ) nr 767/2009 sööda turuleviimise ja kasutamise kohta, millega muudetakse Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrust (EÜ) nr 1831/2003 ning tunnistatakse kehtetuks nõukogu direktiivid 79/373/EMÜ, 82/471/EMÜ, 83/228/EMÜ, 93/74/EMÜ, 93/113/EÜ ja 96/25/EÜ, komisjoni direktiiv 80/511/EMÜ ning komisjoni otsus 2004/217/EÜ ( 7 ).

4.    Kasutatavast analüüsimeetodist teatamine

Analüüsiaruandes peab olema nimetatud, millist analüüsimeetodit kasutatakse.

5.    Aruandlus analüüsitulemuste kohta

Analüüsitulemused esitatakse analüüsimeetodis kehtestatud viisil sobiva arvu tüvenumbritega ja vajaduse korral parandatakse seda vastavalt lõpp-proovi niiskusesisaldusele enne ettevalmistamist.

6.    Mõõtemääramatus ja saagis soovimatute ainete analüüsil

Silmas pidades Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivi 2002/32/EÜ tähenduses soovimatuid aineid, loetakse söödaks ettenähtud tooted kehtestatud piirnormile mittevastavaks, kui niiskusesisaldusele 12 % vastav analüüsitulemus ületab piirmäära, võttes arvesse laiendmääramatust ja saagise parandit. Vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud ja saagise parandiga parandatud sisaldust, millest on lahutatud laiendmääramatus. Seda menetlust võib kasutada vaid juhul, kui analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagise parandit (nt ei ole see võimalik mikroskoopilise analüüsi puhul).

Analüüsitulemus esitatakse järgmiselt (kuivõrd kasutatud analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagist):

Kui analüüsi tulemus on oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitava näitaja väärtus ja kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi ning analüüsi eesmärk on vaid kontrollida vastavust õigusnormidele, ei ole analüüsitulemuses vaja esitada saagise parandit ning saagise ja mõõtemääramatuse võib sel juhul ära jätta.

▼B

III LISA

SÖÖDATOORAINE JA SEGAJÕUSÖÖDA KOOSTISE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A.   NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata sööda niiskusesisaldust. Lenduvaid aineid, näiteks orgaanilisi happeid sisaldava sööda puhul tuleb jälgida, et koos niiskusesisaldusega määrataks ka oluline osa lenduvatest ainetest.

See ei hõlma piimatoodete kui söödatooraine analüüsi, mineraalainete ja peamiselt mineraalainetest koosnevate segude analüüsi, loomsete ja taimsete rasvade ja õlide analüüsi ega õliseemnete ja õliviljade analüüsi.

2.   Põhimõte

Proov kuivatatakse kindlaksmääratud tingimustel, mis varieeruvad sõltuvalt sööda laadist. Massikadu määratakse kaalumise teel. Suure niiskusesisaldusega tahket sööta tuleb eelnevalt kuivatada.

3.   Seadmed

4.   Töö käik

4.1.   Ettevalmistus

4.1.1.    Muu sööt kui punktides 4.1.2 ja 4.1.3 nimetatud sööt

Võetakse vähemalt 50 g proovi. Vajaduse korral proov purustatakse või tehakse tükkideks, et vältida niiskusesisalduse kõikumist (vt punkt 6).

4.1.2.    Teravili ja tangud

Võetakse vähemalt 50 g proovi. Proov jahvatatakse osakesteks, millest vähemalt 50 % pudeneb läbi sõela, mille avade suurus on 0,5  mm, ja sõelale, mille ümmarguste avade suurus on 1 mm, ei jää rohkem kui 10 %.

4.1.3.    Vedel või pastataoline sööt, peamiselt õlidest ja rasvadest koosnev sööt

Võetakse umbes 25 g proovi, kaalutakse see 10 mg täpsusega, lisatakse vajalik kogus 10 mg täpsusega kaalutud veevaba liiva ja segatakse kuni ühtlase toote saamiseni.

4.2.   Kuivatamine

4.2.1.    Muu sööt kui punktides 4.2.2 ja 4.2.3 nimetatud sööt

Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 1 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 103 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada neli tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 103 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega.

Peamiselt õlidest ja rasvadest koosneva sööda puhul kuivatatakse proovi kuivatuskapis temperatuuril 130 oC täiendavalt 30 minutit. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1  % niiskust.

4.2.2.    Teravili, jahu, tangud ja manna

Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g peenestatud proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 130 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada kaks tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 130 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega.

Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 80–85 oC kuumutatud vaakumkuivatuskappi (3.5). Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist.

Rõhk tõstetakse 100 torrini ja proovil lastakse sellise rõhu all kas kuuma ja kuiva õhu voolus või kuivatusaine juuresolekul (umbes 300 g 20 proovi kohta) umbes neli tundi kuivada. Kui kasutatakse kuivatusainet, ühendatakse vaakumpump pärast ettenähtud rõhu saavutamist lahti. Kuivamisaega arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 80–85 oC. Ettevaatlikult taastatakse kuivatuskapis atmosfäärirõhk. Kuivatuskapp avatakse, kaas asetatakse kohe anumale, anum võetakse kapist välja, lastakse jahtuda eksikaatoris (3.6) 30–45 minutit ja kaalutakse 1 mg täpsusega. Kuivatatakse veel 30 minutit vaakumkuivatuskapis temperatuuril 80–85 oC ning kaalutakse uuesti. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1  % niiskust.

4.3.   Eelkuivatamine

4.3.1.    Muu sööt kui punktis 4.3.2 nimetatud sööt

Tahket sööta, mille purustamist suur niiskusesisaldus raskendab, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada:

50 g purustamata proovi (pressitud või aglomeeritud sööda võib vajaduse korral tükkideks teha) kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5  cm serv). Lastakse kuivatuskapis temperatuuril 60–70 oC kuivada, kuni niiskusesisaldus on 8–12 %. Anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis üks tund ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Purustatakse viivitamata punkti 4.1.1 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.1 või 4.2.3 kohaselt vastavalt sööda laadile.

4.3.2.    Teravili

Terasid, mille niiskusesisaldus on üle 17 %, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada:

50 g jahvatamata teri kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5  cm serv). Lastakse 5–7 minutit kuivatuskapis temperatuuril 130 oC kuivada. Võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis kaks tundi ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Jahvatatakse viivitamata punkti 4.1.2 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.2 kohaselt.

5.   Tulemuste arvutamine

Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmiste valemite abil.

5.1.   Kuivatamine ilma eelkuivatamiseta

kus:

5.2.   Kuivatamine koos eelkuivatamisega

kus:

5.3.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2  % niiskuse absoluutväärtusest.

6.   Tähelepanek

Kui purustamine osutub vajalikuks ja kui sellega muutub toote niiskusesisaldus, tuleb sööda koostisosade analüüside tulemusi korrigeerida esialgsel kujul proovi niiskusesisalduse põhjal.

B.   LOOMSETE JA TAIMSETE RASVADE JA ÕLIDE NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata loomsete ja taimsete rasvade ja õlide veesisaldust ja lenduvate ainete sisaldust.

2.   Põhimõte

Proov kuivatatakse temperatuuril 103 oC püsimassini (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle). Massikadu määratakse kaalumise teel.

3.   Seadmed

4.   Töö käik

1 mg täpsusega kaalutud umbes 20 g homogeenitud proovi pannakse kuiva kaalutud anumasse (3.1), milles on termomeeter (3.2). Kuumutatakse liivavannil või kuumutusplaadil (3.3) termomeetriga pidevalt segades, nii et temperatuur tõuseb umbes 7 minutiga 90 oC-ni.

Kuumust vähendatakse, jälgides anuma põhjast kerkivate mullide sagedust. Temperatuur ei tohi tõusta üle 105 oC. Segamist jätkatakse anuma põhja kaapides, kuni mullide tekkimine lõpeb.

Niiskuse täielikuks kõrvaldamiseks kuumutatakse proovi mitu korda temperatuurini 103 ± 2 oC, jahutades kuumutamiste vahel proovi temperatuurini 93 oC. Lastakse jahtuda eksikaatoris (3.4) toatemperatuurini ja kaalutakse. Protseduuri korratakse, kuni massikadu kahel järjestikusel kaalumisel ei ole üle 2 mg.

5.   Tulemuste arvutamine

Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

kus:

Tulemused, mis on väiksemad kui 0,05  %, tuleb registreerida kujul „alla 0,05  %”.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahel paralleelsel määramisel saadud niiskusesisalduste erinevus ei tohi ületada absoluutväärtuses 0,05  %.

C.   TOORVALGUSISALDUSE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab määrata toorvalgusisaldust söödas lämmastikusisalduse alusel, mis määratakse Kjeldahli meetodiga.

2.   Põhimõte

Proov lagundatakse väävelhappega katalüsaatori manulusel. Happelahus leelistatakse naatriumhüdroksiidi lahusega. Ammoniaak destilleeritakse ja kogutakse mõõdetud väävelhappekogusesse, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi standardlahusega.

Teise võimalusena destilleeritakse vabanenud ammoniaak boorhappe lahuse ülejääki, millele järgneb tiitrimine soolhappe või väävelhappe lahusega.

3.   Reaktiivid

Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, tuleb metüülpunase ja bromokresoolrohelise indikaatorid lisada boorhappe lahustesse. Kui 1 liiter boorhappe lahust on ette valmistatud, tuleb enne vajaliku mahuni korrigeerimist lisada 7 ml metüülpunase indikaatorlahust (3.16) ja 10 ml bromokresoolrohelise lahust (3.17).

Olenevalt sellest, millist vett kasutatakse, võib boorhappe lahuse pH-tase olla eri partiides erinev. Sageli on positiivse tulemuse saamiseks vaja korrigeerida väikse leelisekogusega.

4.   Seadmed

Seadmed, mis sobivad Kjeldahli meetodis ettenähtud lagundamise, destilleerimise ja tiitrimise läbiviimiseks.

5.   Töö käik

5.1.   Lagundamine

1 g proovi kaalutakse 0,001  g täpsusega ja pannakse see mineraliseerimisaparaadi kolbi. Lisatakse 15 g kaaliumsulfaati (3.1), sobiv kogus katalüsaatorit (3.2) (0,3 –0,4  g vask(II)oksiidi või 0,9 –1,2  g vask(II)sulfaadi pentahüdraati), 25 ml väävelhapet (3.4) ja vajadusel mõned pimsskivigraanulid (3.12) ning segatakse.

Kolbi kuumutatakse esialgu mõõdukalt, aeg-ajalt loksutades, kuni mass on söestunud ja vaht kadunud; seejärel kuumutatakse intensiivsemalt vedeliku püsiva keemiseni. Kuumutamine on küllaldane, kui keev hape kondenseerub kolvi seinale. Tuleb vältida seinte liigset kuumutamist ja orgaanilise aine kleepumist seintele.

Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkatakse keetmist veel kahe tunni jooksul, seejärel jahutatakse.

5.2.   Destilleerimine

Lisatakse ettevaatlikult piisav kogus vett, et tagada sulfaatide täielik lahustumine. Lastakse jahtuda ja seejärel lisatakse vajadusel mõned graanulid tsinki (3.3). Edasi toimida vastavalt punktile 5.2.1 või 5.2.2.

5.2.1.    Destilleerimine väävelhappeks

Destilleerimisaparaadi kogumiskolbi pannakse täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet (3.5) või (3.7), sõltuvalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisatakse mõni tilk metüülpunast indikaatorit (3.8).

Mineraliseerimiskolb ühendatakse destilleerimisaparaadi jahutiga ja jahuti ots viiakse kogumiskolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vt tähelepanek 8.3). Mineraliseerimiskolbi valatakse aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.9), vältides ammoniaagi kadu (vt tähelepanek 8.1). Kolbi kuumutatakse, kuni ammoniaak on üle destilleeritud.

5.2.2.    Destilleerimine boorhappeks

Kui destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimine toimub käsitsi, siis rakendatakse allpool nimetatud menetlust. Kui destilleerimisseade on täisautomaatne ning hõlmab ka destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimist, siis järgitakse tootja koostatud destilleerimisseadme kasutusjuhendit.

Kogumiskolb, mis sisaldab 25–30 ml boorhappe lahust (3.18), pannakse jahuti väljalaskeava alla selliselt, et sissevoolutoru jääb allapoole boorhappe lahuse ülejäägi pinda. Destilleerimisseade korrigeeritakse 50 ml naatriumhüdroksiidi lahuse (3.9) väljastamiseks. Destilleerimisseadet kasutatakse vastavalt tootja kasutusjuhendile ja destilleeritakse naatriumhüdroksiidi lahuse lisamisel vabanenud ammoniaak välja. Destillaat kogutakse boorhappe vastuvõtulahusesse. Destillaadi kogus (veeaurdestillatsiooni aeg) sõltub proovis sisalduva lämmastiku hulgast. Järgitakse tootja kasutusjuhendit.

5.3.   Tiitrimine

Toimida vastavalt punktile 5.3.1 või 5.3.2.

5.3.1.    Väävelhape

Väävelhappe ülejääk tiitritakse kogumiskolvis naatriumhüdroksiidi lahusega (3.10 või 3.11), sõltuvalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt.

5.3.2.    Boorhape

Kogumiskolvi sisu tiitritakse soolhappe standardse tiitrimislahusega (3.19) või väävelhappe standardse tiitrimislahusega (3.6), kasutades büretti, ning loetakse kokku kasutatud titrandi kogus.

Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, on lõpp-punkt saavutatud, kui ainesse ilmuvad esimesed roosa värvi jäljed. Büreti näitu hinnatakse 0,05 ml täpsusega. Lõpp-punkti nähtavust võib parandada valgustatud magnetseguri plaadi või valgusmõõturi abil.

Seda võib teha automaatselt, kasutades automaatselt tiitrivat veeaurdestillaatorit.

Eri destillaatori või destillaatori/titraatori kasutamisel järgitakse tootja kasutusjuhendeid.

5.4.   Pimekatse

Et kontrollida, kas reaktiivid on lämmastikuvabad, viiakse läbi pimekatse (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine), kasutades proovi asemel 1 g sahharoosi (3.14).

6.   Tulemuste arvutamine

Arvutused tehakse vastavalt punktile 6.1 või 6.2.

6.1.   Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.1

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

6.2.   Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.2

6.2.1.    Tiitrimine soolhappega

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

6.2.2.    Tiitrimine väävelhappega

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

7.   Meetodi kontrollimine

7.1.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

7.2.   Täpsus

Analüüs (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine) viiakse läbi 1,5 –2,0  g atseetaniliidiga (3.13) 1 g sahharoosi (3.14) manulusel; 1 g atseetaniliidi tarbib 14,80 ml väävelhapet (3.5). Saagis peab olema vähemalt 99 %.

8.   Tähelepanekud

D.   KARBAMIIDI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata karbamiidi taset söödas.

2.   Põhimõte

Proov suspendeeritakse vees selitava ainega. Suspensioon filtreeritakse. Filtraadi karbamiidisisaldus määratakse pärast 4-dimetüülaminobensaldehüüdi (4-DMAB) lisamist optilise tiheduse mõõtmise teel lainepikkusel 420 nm.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Proovi analüüs

1 mg täpsusega kaalutud 2 g proovi pannakse 1 g aktiivsöega (3.4) 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett ja 5 ml Carrezi lahust I (3.2), segatakse umbes 30 sekundit ja lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.3). Segatakse trumlis 30 minutit. Täidetakse veega kuni märgini, loksutatakse ja filtreeritakse.

Eemaldatakse 5 ml läbipaistvat värvitut filtraati, pannakse see lihvkorgiga katseklaasidesse, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1) ja segatakse. Katseklaasid asetatakse 20 oC (+/- 4 oC) veetemperatuuriga veevanni. Viieteistkümne minuti pärast mõõdetakse proovilahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga lainepikkusel 420 nm. Võrreldakse reaktiivide kontroll-lahustega.

5.2.   Kalibreerimiskõver

Võetakse 1, 2, 4, 5 ja 10 ml kogused karbamiidilahust (3.5), pannakse 100 ml mõõtekolbidesse ja täidetakse veega kuni märgini. Igast lahusest võetakse ära 5 ml, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1), homogeenitakse ja mõõdetakse eespool kirjeldatud viisil optiline tihedus võrrelduna kontroll-lahusega, mis sisaldab 5 ml 4-DMAB lahust ja 5 ml karbamiidivaba vett. Koostatakse kalibreerimiskõver.

6.   Tulemuste arvutamine

Proovis sisalduv karbamiidikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Tähelepanekud

E.   LENDUVATE LÄMMASTIKALUSTE MÄÄRAMINE

I.   MIKRODIFUSIOON

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust söödas.

2.   Põhimõte

Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse kaaliumkarbonaadi lahust kasutades mikrodifusiooni abil, kogutakse boorhappe lahusesse ja tiitritakse väävelhappega.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri.

Pipetti kasutades viiakse 1 ml boorhappe lahust (3.3) Conway anuma keskmisse ossa ja 1 ml filtraati anuma välimisse ossa. Kaetakse osaliselt rasvatatud kaanega. Välimisse osasse tilgutatakse kiiresti 1 ml kaaliumkarbonaadi küllastunud lahust (3.4) ja kaas suletakse õhukindlalt. Anumat pööratakse hoolikalt horisontaaltasandis nii, et kaks reaktiivi segunevad. Lastakse haududa kas vähemalt neli tundi toatemperatuuril või üks tund temperatuuril 40 oC.

Mikrobüretti (4.3) kasutades tiitritakse lenduvad lämmastikalused boorhappe lahuses väävelhappe (3.5) abil.

Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita.

6.   Tulemuste arvutamine

1 ml H2SO40,01 mol/l vastab 0,34 mg ammoniaagile.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

7.   Tähelepanek

Kui proovi ammoniaagisisaldus on suurem kui 0,6  %, lahjendatakse esialgset lahust.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   DESTILLEERIMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust peaaegu karbamiidivabas kalajahus. Meetodit kohaldatakse üksnes juhul, kui ammoniaagisisaldus on väiksem kui 0,25  %.

2.   Põhimõte

Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse keemistemperatuuril magneesiumoksiidi lisamise teel ja kogutakse teatava koguse väävelhappega, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi lahuse abil tagasi.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri.

Vastavalt lenduvate lämmastikaluste eeldatavale sisaldusele võetakse vajalik kogus selget filtraati (tavaliselt 100 ml). Lahjendatakse 200 milliliitrini ning lisatakse 2 g magneesiumoksiidi (3.2) ja mõned tilgad vahutamisvastast emulsiooni (3.3). Lahus peaks olema lakmuspaberi abil määratuna aluseline, vastasel korral lisatakse veidi magneesiumoksiidi (3.2). Edasi toimitakse vastavalt toorvalgu sisalduse määramise analüüsi meetodi punktidele 5.2 ja 5.3 (käesoleva lisa C osa).

Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita.

6.   Tulemuste arvutamine

1 ml H2SO40,05 mol/l vastab 1,7 mg ammoniaagile.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 10 % ammoniaagi massist suhtelise väärtusena väljendatult.

F.   AMINOHAPETE (VÄLJA ARVATUD TRIPTOFAANI) MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab aminohappeanalüsaatoriga määrata söödas vabu aminohappeid (sünteetilisi ja looduslikke) ning üldaminohappeid (peptiidsidemetega ja vabu). Meetodit saab kasutada järgmiste aminohapete puhul: tsüst(e)iin, metioniin, lüsiin, treoniin, alaniin, arginiin, asparagiinhape, glutamiinhape, glütsiin, histidiin, isoleutsiin, leutsiin, fenüülalaniin, proliin, seriin, türosiin ja valiin.

Meetod ei erista aminohapete sooli ega aminohapete D- ja L-vorme. See ei sobi trüptofaani ega aminohapete hüdroksüanaloogide määramiseks.

2.   Põhimõte

2.1.   Vabad aminohapped

Vabad aminohapped ekstraheeritakse lahjendatud soolhappega. Kaasa ekstraheerunud lämmastikku sisaldavad makromolekulid sadestatakse sulfosalitsüülhappega ning eemaldatakse filtreerides. Filtreeritud lahuse pH korrigeeritakse 2,20 -le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetrilise määramise teel reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm.

2.2.   Üldaminohapped

Valitav protseduur sõltub uuritavatest aminohapetest. Tsüst(e)iin ja metioniin tuleb enne hüdrolüüsi oksüdeerida vastavalt tsüsteiinhappeks ja metioniinsulfooniks. Türosiin tuleb määrata oksüdeerimata proovide hüdrolüsaatides. Kõiki teisi punktis 1 osutatud aminohappeid saab määrata kas oksüdeeritud või oksüdeerimata proovides.

Oksüdeerimine viiakse läbi persipelghappe ja fenooli seguga 0 oC juures. Ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse naatriumdisulfitiga. Oksüdeeritud või oksüdeerimata proovi hüdrolüüsitakse soolhappega (3.20) 23 tundi. Hüdrolüsaadi pH korrigeeritakse 2,20 -le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetriliselt reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm (proliini puhul 440 nm).

3.   Reaktiivid

Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS).

300 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

40 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

889 g sipelghapet (3.2) segatakse 111 g veega ja lisatakse 4,73  g fenooli (3.3).

1 g fenooli (3.3) lisatakse 492 milliliitrile HCl-le (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

60 g 5-sulfosalitsüülhapet (3.6) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

0,5 ml vesinikperoksiidi (3.1) segatakse 4,5 ml sipelghappe ja fenooli lahusega (3.19) väikses keeduklaasis. Inkubeeritakse 20–30 oC juures ühe tunni jooksul, et moodustuks persipelghape, seejärel jahutatakse jääveevanni kohal (15 min) enne proovile lisamist.

Ettevaatust: vältida kokkupuudet nahaga ja kanda kaitserõivaid.

19,61  g naatriumtsitraati (3.8), 5 ml tiodiglükooli (3.9), 1 g fenooli (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) lahustatakse umbes 800 ml vees. pH korrigeeritakse 2,20 -le. Täidetakse veega 1 liitrini.

c = 2,5 μmol/ml iga lahuse kohta soolhappes.

On võimalik osta.

0,2115  g tsüsteiinhapet (3.16.2) ja 0,2265  g metioniinsulfooni (3.16.3) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) üheliitrises mõõtekolbis ning täidetakse kolb tsitraatpuhvriga märgini. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 12 kuu. Seda lahust ei kasutata, kui põhistandardlahus (3.27.1) sisaldab tsüsteiinhapet ja metioniinsulfooni.

0,6560  g norleutsiini (3.13) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) mõõtekolbis ning kolb täidetakse tsitraatpuhvriga 250 ml-ni. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle kuue kuu.

Kallatakse kvantitatiivselt 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) kuni märgini ja segatakse.

Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu.

Vaata ka punkti 9.1 tähelepanekut.

Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu.

4.   Seadmed

Kolonn täidetakse sulfoneeritud polüstüreenvaikudega, mis on võimelised eraldama aminohappeid üksteisest ja teistest ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Puhvri ja ninhüdriini jadas tekitatakse vool pumpadega, mille vooluühtlus on ±0,5  % nii standardkalibreerimise kui proovi analüüsi ajal.

Mõnede aminohapete analüsaatoritega võib kasutada hüdrolüüsimenetlusi, mille puhul on hüdrolüsaadi naatriumikontsentratsioon c = 0,8 mol/l ja mis sisaldab oksüdatsioonietapi kõiki sipelghappe jääke. Teised analüsaatorid ei võimalda teatavaid aminohappeid rahuldaval määral eraldada, kui hüdrolüsaat sisaldab liigselt sipelghapet ja/või kui naatriumioonide kontsentratsioon on kõrge. Sellisel juhul vähendatakse pärast hüdrolüüsi ja enne pH korrigeerimist happe mahtu aurustamisega kuni umbes 5 milliliitrini. Aurustamine peab toimuma vaakumitingimustes temperatuuril kuni 40 oC.

5.   Töö käik

5.1.   Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.12).

5.2.   Vabade aminohapete määramine söödas ja eelsegudes

Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 0,2 mg täpsusega koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml ekstraheerimissegu (3.21). Segu raputatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.8). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle 100 ml keeduklaasi.

Lisatakse loksutades 5,0 ml sulfosalitsüülhappe lahust (3.22) ning jätkatakse loksutamist 5 min vältel, kasutades magnetsegurit. Supernatant filtreeritakse või tsentrifuugitakse sademe eemaldamiseks. 10,0 ml saadud lahust pannakse 100 ml keeduklaasi ja korrigeeritakse pH-taset 2,20 -ni, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.18), sobiv kogus valatakse tsitraatpuhvri (3.24) abil mõõtekolbi ja kolb täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini.

Kui kasutatakse sisestandardit, lisatakse 1,00 ml sisestandardit (3.27.3) igasse 100 ml valmis lahusesse ja täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini.

Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Kui ekstrakte ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC.

5.3.   Üldaminohapete määramine

5.3.1.    Oksüdeerimine

0,2 mg täpsusega kaalutakse 0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1):

Kaalutud proovi lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg ja niiskusesisaldus kuni 100 mg.

Kolb/pudel asetatakse jääveevanni ja jahutatakse kuni temperatuurini 0 oC, lisatakse 5 ml oksüdatsiooniegu (3.23) ning segatakse painutatud otsaga klaasspaatli abil. Spaatlit sisaldav kolb/pudel pitseeritakse õhukindla kilega, pitseeritud nõud sisaldav jääveevann asetatakse 16 tunniks külmikusse temperatuuril 0 oC. 16 tunni möödudes võetakse see külmikust välja ja ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse, lisades 0,84  g naatriumdisulfitit (3.4).

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.1.

5.3.2.    Hüdrolüüs

5.3.2.1.    Oksüdeeritud proovide hüdrolüüs

Vastavalt punktile 5.3.1 valmistatud oksüdeeritud proovile lisatakse 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20), pestes hoolikalt maha anuma ja spaatli külge kleepunud proovijäägid.

Olenevalt sellest, millist hüdrolüüsimenetlust kasutatakse, jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Oksüdeerimata proovide hüdrolüüs

100 ml või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1) või 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (4.2) kaalutakse 0,2 mg täpsusega 0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse hoolikalt 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20) ja segatakse prooviga. Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Lahtine hüdrolüüs

Kolbis olevale segule (mis on valmistatud vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2) lisatakse 3 klaashelmest ja keedetakse püstjahutiga kolvis 23 tundi pideval mullidega keemisel. Pärast hüdrolüüsi teostamist pestakse jahuti maha 5 ml tsitraatpuhvriga (3.24). Kolb võetakse lahti ja jahutatakse jäävannis.

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.

5.3.2.4.    Kinnine hüdrolüüs

Vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2 valmistatud segu sisaldav pudel asetatakse kuivatuskappi (4.3) temperatuuril 110 oC. Et vältida rõhu suurenemist (gaasiliste ainete tekkimise tõttu) ja ära hoida plahvatust, asetatakse esimeseks tunniks surveanuma peale keermestatud kork. Surveanumat ei tohi korgiga sulgeda. Ühe tunni möödudes suletakse surveanum korgiga ja jäetakse 23 tunniks kuivatuskappi (4.3). Pärast hüdrolüüsi lõpuleviimist võetakse pudel kuivatuskapist välja, avatakse ettevaatlikult pudelikork ja asetatakse pudel jääveevanni. Jahutatakse.

Olenevalt sellest, millist pH korrigeerimise menetlust (5.3.3) kasutatakse, valatakse pudeli sisu kvantitatiivselt 250 ml keeduklaasi või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi, kasutades tsitraatpuhvrit (3.24).

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.

5.3.3.    pH korrigeerimine

Olenevalt aminohappe analüsaatori (4.9) naatriumitaluvusest toimitakse pH korrigeerimisel vastavalt punktile 5.3.3.1 või 5.3.3.2.

5.3.3.1.    Kromatograafilised süsteemid (4.9), mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus

Soovitatav on kasutada sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3), juhul kui kasutatakse aminohappe analüsaatorit, mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus (kui happe kogust tuleb vähendada).

Sellisel juhul lisatakse enne aurustamist hüdrolüsaadile 2,00 ml sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3).

Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadile lisatakse 2 tilka 1-oktanooli (3.15).

Hüdrolüsaadi kogust vähendatakse vaakumpöördaurusti (4.7) abil 5–10 milliliitrini vaakumitingimustes temperatuuril 40 oC. Kui kogust vähendatakse kogemata vähem kui 5 milliliitrini, tuleb hüdrolüsaat välja praakida ja analüüsi tuleb uuesti alustada.

pH-taset korrigeeritakse 2,20 -ni naatriumhüdroksiidi lahusega (3.18) ja jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.

5.3.3.2.    Kõik teised aminohappe analüsaatorid (4.9)

Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadid neutraliseeritakse osaliselt, lisades hoolikalt loksutades 17 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.17), jälgides, et temperatuur püsiks allpool 40 oC.

pH korrigeeritakse 2,20 -ni toatemperatuuril, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.17) ja lõpuks naatriumhüdroksiidi lahust (3.18). Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.

5.3.4.    Proovilahus kromatograafia jaoks

Korrigeeritud pH-tasemega hüdrolüsaat (5.3.3.1 või 5.3.3.2) kallatakse kvantitatiivselt koos tsitraatpuhvriga (3.24) 200 ml mõõtekolbi ja täidetakse puhvriga (3.24) märgini.

Kui sisestandardit ei ole veel kasutatud, lisatakse 2,00 ml sisestandardit (3.27.3) ja täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) märgini. Segatakse hoolikalt.

Seejärel alustatakse kromotograafiat (5.4).

Kui proovilahuseid ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC.

5.4.   Kromatograafia

Enne kromotograafiat viiakse ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3.4) toatemperatuurile. Segu loksutatakse ja filtreeritakse sobiv kogus läbi 0,22 μm membraanfiltri (4.5). Saadud selge lahusega tehakse ioonvahetuskromatograafia, kasutades aminohappe analüsaatorit (4.9).

Sissesüstimist võib teostada käsitsi või automaatselt. On oluline, et standardite ja proovide analüüsiks lisataks kolonni sama kogus lahust ± 0,5  %, välja arvatud sisestandardi kasutamisel, ning et naatriumi ja aminohapete vahekord standard- ja proovilahustes oleks võimalikult sarnane.

Üldiselt sõltub kalibreerimiskatsete sagedus ninhüdriini reaktiivi stabiilsusest ja analüütilisest süsteemist. Standard või proov lahjendatakse tsitraapuhvriga (3.24), et saavutada standardi piigipindalaks 30–200 % proovi aminohappe piigipindalast.

Aminohapete kromatograafia varieerub kergelt vastavalt sellele, millist tüüpi analüsaatorit ja millist vaiku kasutatakse. Valitud süsteem peab suutma eraldada aminohapped üksteisest ja ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma lineaarselt kolonni lisatud aminohapete muutustest.

Kromatograafia etapil kehtivad (määratavate aminohapete) ekvimolaarlahuse analüüsimisel allpool esitatud miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekorrad. Ekvimolaarlahus peab sisaldama vähemalt 30 % iga aminohappe maksimumkogusest, mida on võimalik täpselt mõõta aminohappe analüüsisüsteemi (4.9) abil.

Treoniini-seriini eraldamiseks ei tohi kahest kattuvast aminohappest madalama aminohappe miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekord kromatogrammil ületada suhet 2:10. (Kui määratakse vaid tsüst(e)iini, metioniini, treoniini ja lüsiini, kahjustab nende määramist ebapiisav eraldamine külgnevatest piikidest.). Kõigi teiste aminohapete puhul peab eraldatus olema parem kui suhe 1:10.

Süsteem peab tagama lüsiini eraldamise „lüsiini artefaktidest” ja ornitiinist.

6.   Tulemuste arvutamine

Proovi ja standardi piikide pindala mõõdetakse iga üksiku aminohappe kohta ning arvutatakse kogus (X) ühes grammis aminohappes proovi kilo kohta.

Kui kasutatakse sisestandardit, korrutatakse tulemus liikmega

Tsüstiin ja tsüsteiin määratakse mõlemad tsüsteiinhappena oksüdeeritud proovide hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse tsüstiiniks (C6H12N2O4S2, M 240,30  g/mol), kasutades M väärtust 120,15  g/mol (= 0,5 × 240,30  g/mol).

Metioniin määratakse metioniinsulfoonina oksüdeeritud proovi hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse metioniinina, kasutades metioniini M väärtust: 149,21  g/mol.

Lisatud vaba metioniin määratakse pärast ekstraheerimist metioniinina, arvutamisel kasutatakse sama M väärtust.

7.   Meetodi hindamine

Meetodit on katsetatud rahvusvahelises võrdluskatses 1990. aastal, kasutades nelja erinevat sööta (sigade segasööt, broilerite segasööt, valgukontsentraat, eelsegu). Tulemuste keskväärtused ja standardhälbed pärast võõrväärtuste elimineerimist on esitatud käesoleva punkti tabelis.

7.1.   Korratavus

Eespool nimetatud võrdluskatse korratavus on väljendatud laborisisese standardhälbena ja esitatud järgmistes tabelites.

7.2.   Reprodutseeritavus

Eespool nimetatud võrdluskatse laboritevahelise standardhälbe tulemused on esitatud järgmises tabelis:

8.   Etalonainete kasutamine

Meetodi õige rakendamise kontrollimiseks tehakse korduvaid mõõtmisi sertifitseeritud etalonainetega, kui need ained on kättesaadavad. Soovitatav on kalibreerida aminohapete sertifitseeritud kalibreerimislahusega.

9.   Tähelepanekud

Kõigi aminohapete puhul tuleb kontrollida aparatuuri lineaarse ala vahemikku.

Standardlahus lahjendatakse tsitraatpuhvriga, et piigialad oleksid vahemiku keskel.

G.   TRÜPTOFAANI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata trüptofaani üldsisaldust ja vaba trüptofaani sisaldust söödas. Meetod ei erista D- ja L-vormi.

2.   Põhimõte

Trüptofaani üldsisalduse määramiseks hüdrolüüsitakse proovi leeliselises keskkonnas küllastunud baariumhüdroksiidi lahusega ja kuumutatakse 110 oC juures 20 tundi. Pärast hüdrolüüsimist lisatakse sisestandard.

Vaba trüptofaani määramiseks ekstraheeritakse proovi nõrgalt happelistes tingimustes sisestandardi juuresolekul.

Trüptofaan ja sisestandard määratakse hüdrolüsaadis või ekstraktis HPLC-ga fluorestsentsdetektori abil.

3.   Reaktiivid

40,0  g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini.

Võetakse 492 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

Võetakse 82 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

Võetakse 8,2 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

Võetakse 34 ml ortofosforhapet (3.6) ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini.

500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2553  g trüptofaani (3.2) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat.

500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2728  g α-metüültrüptofaani (3.3) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat.

Võetakse 2,00 ml trüptofaani kontsentreeritud lahust (3.15) ja 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Lahjendatakse veega (3.1) ja metanooliga (3.8) umbes sama ruumalani ja umbes sama metanooli kontsentratsioonini (10–30 %), nagu on valmis hüdrolüsaadil.

Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

Valmistamise ajal vältida otsest päikesevalgust.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Proovide ettevalmistamine

Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.9).

5.2.   Vaba trüptofaani määramine (ekstrakt)

Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml soolhapet (3.13), c = 0,1 mol/l, ja 5,00 ml kontsentreeritud sisestandardlahust (3.16). Raputatakse või segatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.7). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle keeduklaasi. Lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Naatriumhüdroksiidi (3.10) abil korrigeeritakse pH 3-le. Lisatakse piisavalt metanooli (3.8), et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 protsendini. Lahus viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kuni kromatograafiaks sobiva koguseni (umbes sama kogus kui kalibreerimisstandardlahusel (3.17)).

Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Standardlahust ja ekstrakte tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui ekstrakte ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva.

5.3.   Trüptofaani üldsisalduse määramine (hüdrolüsaat).

0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1) kaalutakse 0,2 mg täpsusega polüropüleenkolbi (4.4). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse 8,4  g baariumhüdroksiidi oktahüdraati (3.4) ja 10 ml vett. Segatakse pöörissegajaga (4.8) või magnetseguriga (4.7). Tefloniga kaetud magnet jäetakse segusse. Nõu seinad loputatakse üle 4 ml veega. Keeratav kork pannakse peale ja kolb suletakse lõdvalt. Kolb pannakse autoklaavi (4.6) ja kuumutatakse keevas vees ja aurus 30–60 minutit. Autoklaav suletakse ja kuumutatakse 20 tundi 110 (±2) oC juures.

Enne autoklaavi avamist langetatakse temperatuur natuke alla 100 oC kraadi. Ba(OH)2 .8 H2O kristalliseerumise vältimiseks lisatakse soojale segule 30 ml toatemperatuuril olevat vett. Raputatakse või segatakse kergelt. Lisatakse 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Nõusid jahutatakse vee-/jäävannis 15 minutit.

Seejärel lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Nõu hoitakse jahutusvannis ja neutraliseeritakse segamisel HCl-iga (3.11) ning pH korrigeeritakse 3,0 -ni HCl (3.12) abil. Lisatakse piisavalt metanooli, et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 %ni. Viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kindla, kromatograafiaks sobiva ruumalani (näiteks 100 ml). Metanooli lisamine ei tohi tekitada sadenemist.

Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Standardlahust ja hüdrolüsaate tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui hüdrolüsaate ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva.

5.4.   HPLC määramine

Soovitatakse juhinduda järgmistest isokraatilise elueerimise tingimustest. Muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused (vt ka tähelepanekuid 9.1 ja 9.2):

6.   Tulemuste arvutamine

Arvutatakse trüptofaani (X) kogus grammides 100 g proovi kohta.

7.   Korratavus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10 % suuremast tulemusest.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühendusesisene ühisuurimine (neljas võrdlusuuring), mille käigus kuni 12 laborit analüüsisid hüdrolüüsimeetodi sertifitseerimiseks kolme proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

Teise ühendusesisese ühisuurimise (kolmanda võrdlusuuringu) käigus analüüsisid kuni 13 laborit vaba trüptofaani ekstraheerimise meetodi sertifitseerimiseks kahte proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

Veel ühe ühendusesisese võrdlusuuringu käigus analüüsisid kuni seitse laborit trüptofaani hüdrolüüsi sertifitseerimise eesmärgiga nelja proovi. Tulemused on esitatud allpool. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5).

9.   Tähelepanekud

Isokraatiline elueerimine, millele järgneb kolonni gradientpuhastus:

Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma kontsentratsioonist lineaarselt. Tulemuste lineaarsust tuleks kontrollida sisestandardi konstantsel (normaalsel) kontsentratsioonil erinevate trüptofaani kontsentratsioonidega. On oluline, et nii trüptofaani kui ka sisestandardi piigid oleksid HPLC-/fluorestsentssüsteemi lineaarses alas. Kui trüptofaani või sisestandardi piigid on liiga väikesed või liiga suured, siis tuleks analüüsi korrata teistsuguse proovi suurusega ja/või teistsuguse lõppruumalaga.

Baariumhüdroksiidi lahustamine raskeneb baariumhüdroksiidi vananemisel. Selle tulemusel saadakse HPLC-ga määramiseks hägune lahus, mis võib vähendada trüptofaani määramisel saadavaid tulemusi.

H.   TOORÕLI JA -RASVA MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab määrata toorõli ja -rasva sisaldust söödas. See ei hõlma õliseemnete ja õliviljade analüüsi.

Allpool kirjeldatud kahe meetodi kasutamine sõltub sööda laadist ja koostisest ning analüüsi tegemise põhjusest.

1.1.   Meetod A – otse ekstraheeritav toorõli ja -rasv

Seda meetodit kohaldatakse taimsete söödatoorainete puhul, välja arvatud meetodiga B hõlmatud ainete puhul.

1.2.   Meetod B – kogu toorõli ja -rasv

Seda meetodit kohaldatakse loomsete söödatoorainete ja kõigi segajõusöötade puhul. Seda kasutatakse kõigi ainete puhul, millest ei ole ilma eelneva hüdrolüüsita võimalik õli ja rasva ekstraheerida (nt gluteenid, pärm, kartulivalgud ning tooted, mille puhul kasutatakse muu hulgas pressimist, helvestamist või kuumutamist).

1.3.   Tulemuste tõlgendamine

Kõigil juhtudel, kui meetodiga B saadakse suurem tulemus kui meetodiga A, loetakse meetodiga B saadud tulemus õigeks väärtuseks.

2.   Põhimõte

2.1.   Meetod A

Proov ekstraheeritakse petrooleetriga. Solvent destilleeritakse välja ning jääk kuivatatakse ja kaalutakse.

2.2.   Meetod B

Proovi töödeldakse kuumalt soolhappega. Segu jahutatakse ja filtreeritakse. Jääk pestakse, kuivatatakse ja määratakse vastavalt meetodile A.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Meetod A (vt punkt 8.1)

5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse ekstraheerimishülssi (4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga.

Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (4.1) ja ekstraheeritakse petrooleetriga (3.1) kuus tundi. Petrooleetri ekstrakt kogutakse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid ( 9 ).

Solvent destilleeritakse välja. Jääk koos kolviga asetatakse poolteiseks tunniks kuivatuskappi (4.3) kuivama. Lastakse eksikaatoris jahtuda ning kaalutakse. Kuivatatakse veel 30 minutit, et veenduda, et õli ja rasva mass jääb samaks (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle).

5.2.   Meetod B

2,5  g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega (vt punkt 8.2), pannakse 400 ml keeduklaasi või 300 ml Erlenmeyeri kolbi ning lisatakse 100 ml soolhapet (3.3) ja pimsskivitükke. Keeduklaas kaetakse kellaklaasiga või pannakse Erlenmeyeri kolbi külge püstjahuti. Segu kuumutatakse madala leegi või kuumutusplaadi kohal keemiseni ja keedetakse nõrgalt tund aega. Tuleb vältida toote sadestumist nõu seinte külge.

Jahutatakse ja lisatakse selline kogus filterainet (3.4), mis on piisav õli- ja rasvakao vältimiseks filtreerimisel. Lahus filtreeritakse läbi niisutatud rasvavaba kahekordse filterpaberi. Jääki pestakse külmas vees kuni filtraadi neutraalse reaktsioonini. Kontrollitakse, et filtraat ei sisalda õli ega rasva. Kui filtraat sisaldab õli või rasva, tuleb proov enne hüdrolüüsi petrooleetriga ekstraheerida, kasutades meetodit A.

Kahekordne filterpaber koos jäägiga asetatakse kellaklaasile ja kuivatatakse poolteist tundi ventileeritavas kuivatuskapis (4.3) 100 ± 3 oC juures.

Kahekordne filterpaber koos kuivjäägiga asetatakse ekstraheerimishülssi (4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga. Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (4.1) ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule.

6.   Tulemuste väljendamine

Jäägi mass väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Korratavus

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

8.   Tähelepanekud

20 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja segatakse vähemalt 10 g veevaba naatriumsulfaadiga (3.2). Segu ekstraheeritakse petrooleetriga (3.1) vastavalt punktile 5.1. Saadud ekstrakti täidetakse petrooleetriga (3.1) 500 ml-ni ja segatakse. 50 ml lahust pannakse väiksesse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid (1). Solvent destilleeritakse välja, segu kuivatatakse ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 viimasele lõigule.

Hülssi jäänud ekstraheerimisjäägist eemaldatakse solvent, peenestatakse jääk 1 mm osakesteks, pannakse see tagasi ekstraheerimishülssi (ilma naatriumsulfaati lisamata) ning jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule.

Õli- ja rasvasisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

(10m1 + m2) × 5

kus:

I.   KOGUKIU MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata söödas happelises ja leeliselises keskkonnas lahustumatuid rasvavabu orgaanilisi aineid, mida harilikult nimetatakse kogukiuks.

2.   Põhimõte

Proovi, mis on vajaduse korral rasvatustatud, töödeldakse mitu korda järjest teatava kontsentratsiooniga väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi keevate lahustega. Jääk eraldatakse filtreerimise abil paagutatud klaasfiltril ning pestakse, kuivatatakse, kaalutakse ja tuhastatakse temperatuuril vahemikus 475–500 oC. Tuhastamisest tulenev massikadu vastab uuritavas proovis sisalduvale kogukiule.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

1 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse see tiiglisse (4.2) (vt tähelepanekud 8.1, 8.2 ja 8.3) ning lisatakse 1 g filterainet (3.3).

Kuumutusseade (4.1) ja filtertiigel (4.2) ühendatakse ning seejärel kinnitatakse silinder (4.3) tiigli külge. 150 ml keevat väävelhapet (3.1) valatakse ühendatud silindrisse ja tiiglisse ning vajadusel lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (3.2).

Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit.

Väljalasketoru (4.1) klapp avatakse, väävelhape filtreeritakse vaakumitingimustel läbi filtertiigli ning jääki pestakse kolm korda järjest 30 ml keeva veega, tagades, et pärast iga pesemist filtreeritakse jääk kuivaks.

Äravooluklapp suletakse ning ühendatud silindrisse ja tiiglisse valatakse 150 ml keevat kaaliumhüdroksiidi lahust (3.7) ning lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (3.2). Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit. Filtreeritakse ja korratakse pesemisprotseduuri, mida kasutati väävelhappe juures.

Pärast lõplikku pesemist ja kuivatamist ühendatakse tiigel ja selle sisu lahti ning ühendatakse see külmekstraheerimisseadmega (4.6). Jääki pestakse tiiglis vaakumitingimustel kolm korda järjest 25 ml atsetooniga (3.4), tagades, et pärast iga pesemist filtreeritakse jääk kuivaks.

Tiigel kuivatakse püsikaaluni kuivatuskapis temperatuuril 130 oC. Pärast iga kuivatamist jahutatakse tiiglit eksikaatoris ja kaalutakse kiiresti. Tiigel asetatakse muhvelahju ja tuhastatakse püsikaaluni (massikadu peab kahe järjestikuse kaalumise vahel olema 2 mg või alla selle) temperatuuril 475 oC kuni 500 oC vähemalt 30 minutit.

Pärast iga kuumutamist jahutatakse tiiglit enne kaalumist kõigepealt ahjus ja seejärel eksikaatoris.

Teostatakse ilma proovita pimekatse. Tuhastamisest tingitud massikadu ei tohi olla üle 4 mg.

6.   Tulemuste arvutamine

Kogu kiu sisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

kus:

7.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

8.   Tähelepanekud

J.   SUHKRU MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata redutseerivate suhkrute hulka ja pärast inversiooni üldsuhkru hulka, väljendatuna glükoosina või sõltuvalt olukorrast sahharoosina, kasutades ümberarvestustegurit 0,95 . Seda meetodit kasutatakse segajõusöötade puhul. Muude söötade puhul on sätestatud erimeetodid. Vajaduse korral tuleb laktoosi hulk mõõta eraldi ja tulemuste arvutamisel seda arvesse võtta.

2.   Põhimõte

Suhkrud ekstraheeritakse lahjendatud etanoolis; lahus selitatakse Carrezi lahustega I ja II. Pärast etanooli eemaldamist määratakse kogused enne ja pärast inversiooni Luff-Schoorli meetodi abil.

3.   Reaktiivid

Ettevaatlikult segades valatakse sidrunhappe lahus (3.8.2) naatriumkarbonaadi lahusesse (3.8.3). Lisatakse vasksulfaadi lahus (3.8.1) ja ja täidetakse veega 1 liitrini. Lastakse öö läbi settida ja filtreeritakse.

Selliselt saadud reaktiivi kontsentratsioooni (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l) kontrollitakse, vt punkti 5.4 viimast lõiku. Lahuse pH on umbes 9,4 .

4.   Seadmed

Segisti (trummel): umbes 35 kuni 40 p/min.

5.   Töö käik

5.1.   Proovi ekstraheerimine

2,5  g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 250 ml mõõtekolbi. Lisatakse 200 ml etanooli (3.1) ning segatakse trumlis tund aega. Lisatakse 5 ml Carrezi lahust I (3.2) ja segatakse umbes 30 sekundit. Lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.3) ja segatakse veel üks minut. Täidetakse etanooliga (3.1) märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse. Eemaldatakse 200 ml filtraati ja aurustatakse ligikaudu poole mahuni, et vabaneda enamikust etanoolist. Aurustamise jääk kantakse sooja vett kasutades kvantitatiivselt 200 ml mõõtekolbi, jahutatakse, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja vajaduse korral filtreeritakse. Seda lahust kasutatakse redutseerivate suhkrute hulga ja pärast inversiooni üldsuhkru hulga määramiseks.

5.2.   Redutseerivate suhkrute määramine

Pipetiga eemaldatakse kuni 25 ml lahust, mis sisaldab alla 60 mg redutseerivaid suhkruid, mis on väljendatud glükoosina. Vajaduse korral täidetakse destilleeritud veega 25 ml-ni ja määratakse redutseerivate suhkrute hulk Luff-Schoorli meetodi abil. Tulemus väljendatakse glükoosisisalduse protsendimäärana proovist.

5.3.   Üldsuhkru määramine pärast inversiooni

Pipetiga võetakse 50 ml lahust ja kantakse see 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse mõni tilk metüüloranži lahust (3.4) ning seejärel lisatakse hoolikalt ja samal ajal pidevalt segades soolhapet (3.5), kuni vedelik värvub selgelt punaseks. Lisatakse 15 ml soolhapet (3.6), asetatakse kolb tugevalt keeva veega vanni ning hoitakse seal 30 minutit. Jahutatakse kiiresti umbes 20 oC-ni ja lisatakse 15 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.7). Täidetakse veega 100 ml-ni ja homogeenitakse. Eemaldatakse kuni 25 ml lahust, mis sisaldab alla 60 mg redutseerivaid suhkruid, mis on väljendatud glükoosina. Vajaduse korral täidetakse destilleeritud veega 25 ml-ni ja määratakse redutseerivate suhkrute hulk Luff-Schoorli meetodi abil. Tulemus väljendatakse glükoosi protsendimäärana või sõltuvalt olukorrast sahharoosi protsendimäärana, korrutades tulemuse teguriga 0,95 .

5.4.   Tiitrimine Luff-Schoorli meetodi järgi

Pipetiga võetakse 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.8) ja kantakse see 300 ml Erlenmeyeri kolbi; lisatakse täpselt 25 ml selitatud suhkrulahust. Lisatakse 2 pimsskivigraanulit (3.13), kuumutatakse käsitsi segades keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja segu kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Erlenmeyeri kolb asetatakse viivitamatult asbestkattega traatvõrgule, milles on umbes 6 cm läbimõõduga auk ning mille all on eelnevalt süüdatud leek. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutataks üksnes Erlenmeyeri kolvi põhja. Erlenmeyeri kolvi külge pannakse püstjahuti. Keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitritakse järgmiselt.

Lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.12) ja kohe seejärel lisatakse (intensiivse vahutamise ohu tõttu ettevaatlikult) 25 ml väävelhapet (3.11). Tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (3.9) kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, lisatakse tärkliseindikaator (3.10) ja viiakse tiitrimine lõpule.

Sama tiitrimine ilma keetmata tehakse seguga, milles on täpselt mõõdetud 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.8) ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.12) ja 25 ml väävelhapet (3.11).

6.   Tulemuste arvutamine

Tabeli abil määratakse glükoosi hulk milligrammides, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel väljendatuna naatriumtiosulfaadi milligrammides (0,1 mol/l). Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Erimenetlused

Homogeenitakse ja filtreeritakse. Etanool eemaldatakse punkti 5.1 kohaselt. Kui dekstriinitud tärklist ei ole, täidetakse destilleeritud veega kuni märgini.

8.   Tähelepanekud

Mõlemal juhul määratakse proovis sisalduv suhkur Luff-Schoorli meetodi abil ja arvutatakse glükoosi milligrammideks. Üks väärtus lahutatakse teisest ja vahe väljendatakse protsendimäärana proovist.

Näide

Võetud kogused vastavad mõlema määramise puhul 250 mg massiga proovile.

Esimesel juhul tarbitakse 17 ml naatriumtiosulfaadi lahust (0,1 mol/l), mis vastab 44,2 mg glükoosile; teisel juhul tarbitakse 11 ml, mis vastab 27,6 mg glükoosile.

Vahe on 16,6 mg glükoosi.

Redutseerivate suhkrute (v.a laktoosi) sisaldus glükoosiks arvutatuna on seega:

K.   LAKTOOSI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata laktoosi taset söödas, mis sisaldab laktoosi üle 0,5  %.

2.   Põhimõte

Suhkrud lahustatakse vees. Lahus kääritatakse Saccharomyces cerevisiae pärmiga, mis jätab laktoosi esialgsele kujule. Pärast selitamist ja filtreerimist määratakse filtraadi laktoosisisaldus Luff-Schoorli meetodi abil.

3.   Reaktiivid

Ettevaatlikult segades valatakse sidrunhappe lahus (3.4.2) naatriumkarbonaadi lahusesse (3.4.3). Lisatakse vasksulfaadi lahus (3.4.1) ja täidetakse veega 1 liitrini. Lastakse öö läbi settida ja filtreeritakse. Selliselt saadud reaktiivi kontsentratsioooni (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 2 mol/l). Lahuse pH on umbes 9,4 .

4.   Seadmed

Temperatuurile 38–40 oC seatud termostaadiga veevann.

5.   Töö käik

1 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse selline kogus proovi 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25–30 ml vett. Kolb asetatakse kolmekümneks minutiks keeva vee vanni ning jahutatakse seejärel umbes 35 oC-ni. Lisatakse 5 ml pärmisuspensiooni (3.1) ja homogeenitakse. Lastakse kolvil seista kaks tundi veevannis temperatuuril 38–40 oC. Jahutatakse umbes 20 oC-ni.

Lisatakse 2,5 ml Carrezi lahust I (3.2) ja segatakse 30 sekundit, seejärel lisatakse 2,5 ml Carrezi lahust II (3.3) ja segatakse veel 30 sekundit. Täidetakse veega 100 milliliitrini, segatakse ja filtreeritakse. Pipetiga eemaldatakse filtraadikogus, mis ei ületa 25 ml ja mis soovitavalt sisaldab 40–80 mg laktoosi, ning kantakse see 300 ml Erlenmeyeri kolbi. Vajaduse korral täidetakse veega 25 ml-ni.

5 ml pärmisuspensiooniga (3.1) tehakse samal viisil pimekatse. Laktoosisisaldus määratakse Luff-Schoorli meetodi abil järgmiselt: lisatakse täpselt 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.4) ja kaks pimsskivigraanulit (3.5). Segatakse käsitsi keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja segu kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Erlenmeyeri kolb asetatakse viivitamatult asbestkattega traatvõrgule, milles on umbes 6 cm läbimõõduga auk ning mille all on eelnevalt süüdatud leek. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutataks üksnes Erlenmeyeri kolvi põhja. Erlenmeyeri kolvi külge pannakse püstjahuti. Keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitritakse järgmiselt.

Lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.6) ja kohe seejärel lisatakse (intensiivse vahutamise ohu tõttu ettevaatlikult) 25 ml väävelhapet (3.7). Tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (3.8) kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, lisatakse tärkliseindikaator (3.9) ja viiakse tiitrimine lõpule.

Sama tiitrimine ilma keetmata tehakse seguga, milles on täpselt mõõdetud 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.4) ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.6) ja 25 ml väävelhapet (3.7).

6.   Tulemuste arvutamine

Juuresoleva tabeli abil määratakse laktoosi hulk milligrammides, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel väljendatuna naatriumtiosulfaadi milligrammides (0,1 mol/l).

Veevabale laktoosile vastav tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Tähelepanek

Toodete puhul, mis sisaldavad üle 40 % fermenteeritavat suhkrut, kasutatakse rohkem kui 5 ml pärmisuspensiooni (3.1).

L.   TÄRKLISE MÄÄRAMINE

POLARIMEETRILINE MEETOD

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodi abil on võimalik kindlaks määrata tärklise ja suure molekulmassiga tärklise lagunemisproduktide taset söödas, et kontrollida deklareeritud energiasisalduse (VII lisa sätted) ja nõukogu direktiivi 96/25/EÜ ( 10 ) järgimist.

2.   Põhimõte

Meetod hõlmab kahte määramist. Esimese puhul töödeldakse proovi lahjendatud soolhappega. Pärast selitamist ja filtreerimist mõõdetakse polarimeetrilisel teel lahuse optiline pöörang.

Teise määramise puhul ekstraheeritakse proovi 40 % etanooliga. Pärast filtraadi hapestamist soolhappega, selitamist ja filtreerimist mõõdetakse lahuse optiline pöörang esimese määramisega analoogsel viisil.

Proovi tärklisesisaldus saadakse nimetatud kahe määramise vahe korrutamisel teadaoleva koefitsiendiga.

3.   Reaktiivid

Kontsentratsiooni tuleb kontrollida tiitrimise teel, kasutades 0,1 mol/l naatriumhüdroksiidi lahust koos 0,1  % (w/v) metüülpunasega 94 % etanoolis (v/v). 10 ml neutraliseerimiseks on vaja 30,94 ml NaOH (0,1 mol/l).

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Proovi ettevalmistamine

Peenestada proov nii, et see läbib täielikult 0,5  mm ümaravadega sõela.

5.2.   Polarisatsioonitasandi optilise kogupöörangu (P või S) määramine (vt tähelepanek 7.1)

2,5  g peenestatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ning pannakse see 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25 ml soolhapet (3.2), loksutatakse proovi ühtlase jaotumise saavutamiseks ning lisatakse veel 25 ml soolhapet (3.2). Kolb asetatakse keeva vee vanni, loksutades seda esimesed kolm minutit tugevasti ja ühtlaselt, et vältida klompide teket. Vannis peab olema piisavalt vett, et vesi säilitaks kolvi vanni asetamisel keemistemperatuuri. Kolbi ei tohi loksutamise ajal vannist välja võtta. Täpselt 15 minuti möödudes võetakse kolb vannist välja, lisatakse 30 ml külma vett ja jahutatakse otsekohe temperatuurini 20 oC.

Lisatakse 5 ml Carrezi lahust I (3.3) ja loksutatakse umbes 30 sekundit. Seejärel lisatakse 5 ml Carrezi II lahust (3.4) ja jätkatakse loksutamist veel 30 sekundi jooksul. Täidetakse veega märgini, segatakse ja filtreeritakse. Kui filtraat ei ole täiesti selge (seda juhtub harva), korratakse määramist, kasutades rohkem Carrezi I ja II lahust (näiteks 10 ml).

Lahuse optiline pöörang mõõdetakse 200 mm torus polarimeetri või sahharimeetri abil.

5.3.   4 % etanoolis lahustuvate ainete optilise pöörangu (P' või S') määramine

5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse see 100 ml mõõtekolbi ning lisatakse umbes 80 ml etanooli (3.5) (vt tähelepanek 7.2). Kolb jäetakse üheks tunniks toatemperatuurile seisma; selle aja jooksul loksutatakse kolbi kuus korda tugevasti, nii et proov seguneks põhjalikult etanooliga. Täidetakse etanooliga (3.5) märgini, segatakse ja filtreeritakse.

50 ml filtraati (vastab 2,5  g proovile) pipetitakse 250 ml Erlenmeyeri kolbi, lisatakse 2,1 ml soolhapet (3.1) ja loksutatakse tugevasti. Püstjahuti ühendatakse Erlenmeyeri kolviga ja kolb asetatakse keeva vee vanni. Täpselt 15 minuti möödudes eemaldatakse Erlenmeyeri kolb vannist, viiakse selle sisu 100 ml mõõtekolbi, loputatakse vähese külma veega ja jahutatakse temperatuurini 20 oC.

Selitatakse Carrezi I (3.3) ja II (3.4) lahuse abil, täidetakse veega märgini, segatakse, filtreeritakse ja mõõdetakse optiline pöörang punkti 5.2 teises ja kolmandas lõigus kirjeldatud viisil.

6.   Tulemuste arvutamine

Tärklisesisaldus (%) arvutatakse järgmiselt:

6.1.   Mõõtmine polarimeetriga

6.2.   Mõõtmine sahharimeetriga

6.3.   Korratavus

Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevuse absoluutväärtus ei tohi alla 40 % tärklisesisalduse puhul ületada 0,4 ning suhteline erinevus 40 % või suurema tärklisesisalduse puhul 1 %.

7.   Tähelepanekud

M.   KOGUTUHA MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata sööda kogutuha sisaldust.

2.   Põhimõte

Proov tuhastatakse 550 oC juures; jääk kaalutakse.

3.   Reaktiivid

Ammooniumnitraadi 20 % lahus (w/v)

4.   Seadmed

5.   Töö käik

Umbes 5 g proovi (toodete puhul, millel on kalduvus paisuda, 2,5  g) kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse tuhastamistiiglisse, mis on eelnevalt kuumutatud temperatuurini 550 oC, maha jahutatud ja tareeritud. Tiigel asetatakse kuumutusplaadile ja kuumutatakse järk-järgult kuni aine söestumiseni. Tuhastatakse vastavalt punktile 5.1 või 5.2.

6.   Tulemuste arvutamine

Jäägi massi arvutamiseks lahutatakse nõu mass.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Tähelepanekud

N.   SOOLHAPPES LAHUSTUMATU TUHA MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata soolhappes lahustumatute mineraalainete taset söödas. Proovi laadist sõltuvalt võib kasutada kahte meetodit.

2.   Põhimõte

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Meetod A

Proov tuhastatakse kogutuha määramiseks ettenähtud meetodi järgi. Kasutada võib ka kõnealusel analüüsil saadud tuhka.

Tuhk pannakse 250–400 ml keeduklaasi, kasutades 75 ml soolhapet (3.1). Segu aetakse aeglaselt keema ja keedetakse vaikselt 15 minutit. Soe lahus filtreeritakse läbi tuhavaba filterpaberi ja jääk pestakse sooja veega, kuni happe reaktsioon ei ole enam nähtav. Filter jäägiga kuivatatakse ja tuhastatakse tareeritud tiiglis temperatuuril mitte alla 550 oC ja mitte üle 700 oC. Jahutatakse eksikaatoris ja kaalutakse.

5.2.   Meetod B

Umbes 5 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 250–400 ml keeduklaasi. Lisatakse üksteise järel 25 ml vett ja 25 ml soolhapet (3.1), segatakse ning oodatakse, kuni kihisemine on lõppenud. Lisatakse veel 50 ml soolhapet (3.1). Oodatakse gaaside eraldumise lõppemiseni, seejärel asetatakse keeduklaas keeva vee vanni ja hoitakse seal kolmkümmend minutit või vajaduse korral kauem lahuses sisalduva tärklise täielikuks hüdrolüüsiks. Filtreeritakse soojalt läbi tuhavaba filtri ning filter pestakse 50 ml soojas vees (vt tähelepanek 7). Filter jäägiga asetatakse tuhastamiseks ettenähtud tiiglisse, kuivatatakse ja tuhastatakse temperatuuril mitte alla 550 oC ja mitte üle 700 oC. Tuhk pannakse 250–400 ml keeduklaasi, kasutades 75 ml soolhapet (3.1); jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele lõigule.

6.   Tulemuste arvutamine

Jäägi massi arvutamiseks lahutatakse nõu mass. Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Tähelepanek

Kui filtreerimine osutub raskeks, tehakse analüüs uuesti, sealjuures asendatakse 50 ml soolhapet (3.1) 50 ml 20 % trikloroäädikhappega (3.2) ja pestakse filter soojas 1 % trikloroäädikhappe lahuses (3.3).

O.   KARBONAATIDE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata harilikult kaltsiumkarbonaadina väljendatavate karbonaatide sisaldust enamikus söötades.

Teatavatel juhtudel (näiteks raudkarbonaadi puhul) tuleb kasutada erimeetodit.

2.   Põhimõte

Karbonaadid lagundatakse soolhappes; tekkiv süsinikdioksiid kogutakse büretti ja gaasi ruumala võrreldakse ruumalaga, mis tekib samadel tingimustel teadaolevast kogusest kaltsiumkarbonaadist.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

Scheibler-Dietrichi aparaat (vt joonis) või samaväärne aparaat.

5.   Töö käik

Sõltuvalt proovi karbonaadisisaldusest, kaalutakse järgmine osa proovist:

Proovi osa pannakse aparaadi spetsiaalsesse kolbi (4), mille küljes on väike purunematust materjalist toru ja mis sisaldab 10 ml soolhapet (3.1), ning kolb ühendatakse aparaadiga. Kraan (5) keeratakse nii, et toru (1) oleks ühenduses välisõhuga. Kasutades tõstetavat toru (2), mis on täidetud värvitud väävelhappega (3.3) ja ühendatud büreti (1) külge, viiakse vedeliku tase nullmärgini. Torude (1) ja (3) ühendamiseks keeratakse kraani (5) ning kontrollitakse, et vedeliku tase on nullis.

Soolhape (3.1) juhitakse kolbi (4) kallutades aeglaselt proovi osa peale. Rõhu võrdsustamiseks langetatakse toru (2). Kolbi (4) raputatakse, kuni süsinikdioksiidi eraldumine on täielikult lõppenud.

Rõhu taastamiseks viiakse vedelik torudes (1) ja (2) samale tasemele. Mõne minuti möödudes, kui gaasi hulk on konstantne, loetakse tulemus.

Samades tingimustes tehakse kontrollkatse 0,5  g kaltsiumkarbonaadiga (3.2).

6.   Tulemuste arvutamine

Kaltsiumkarbonaadina väljendatud karbonaatide sisaldus arvutatakse järgmise valemi abil:

kus:

7.   Tähelepanekud

P.   ÜLDFOSFORI MÄÄRAMINE

FOTOMEETRILINE MEETOD

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata üldfosfori sisaldust söötades. See sobib eriti hästi väikese fosforisisaldusega toodete analüüsimiseks. Teatavatel juhtudel (suure fosforisisaldusega toodete puhul) võib kasutada gravimeetrilist meetodit.

2.   Põhimõte

Proov mineraliseeritakse kas kuivtuhastamise (orgaanilise sööda puhul) või märgtuhastamise (mineraalsete ühendite ja vedelsööda puhul) teel ja pannakse happelahusesse. Lahust töödeldakse molübdovanadaatreaktiiviga. Sel viisil saadud kollase lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Lahuse valmistamine

Sõltuvalt proovi laadist valmistatakse lahus punkti 5.1.1 või 5.1.2 kohaselt.

5.1.1.    Tavaline menetlus

1 g või rohkem proovi kaalutakse täpsusega 1 mg. Uuritav proov pannakse Kjeldahli kolbi, lisatakse 20 ml väävelhapet (3.5), raputatakse, et aine seguneks täielikult happega ja et see ei sadestuks kolvi seinte külge, kuumutatakse ja hoitakse 10 minutit keemistemperatuuril. Lastakse veidi jahtuda, lisatakse 2 ml lämmastikhapet (3.4), kuumutatakse kergelt, lastakse veidi jahtuda, lisatakse veel veidi lämmastikhapet (3.4) ja viiakse tagasi keemistemperatuurile. Menetlust korratakse värvusetu lahuse saamiseni. Jahutatakse, lisatakse veidi vett, vedelik dekanteeritakse 500 ml mõõtekolbi, loputades Kjeldahli kolbi sooja veega. Lastakse jahtuda, täidetakse kuni märgini veega, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.1.2.    Proovid, mis sisaldavad orgaanilisi aineid ja milles ei leidu kaltsiumdivesinikfosfaati ega magneesiumdivesinikfosfaati

Tuhastustiiglisse pannakse umbes 2,5  g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega. Uuritavat proovi segatakse, kuni see on täielikult segunenud 1g kaltsiumkarbonaadiga (3.1). Tuhastatakse temperatuurile 550 oC seatud kuivatuskapis kuni valge või halli tuha saamiseni (võib sisaldada veidi sütt). Tuhk pannakse 250 ml keeduklaasi. Lisatakse 20 ml vett ja soolhapet (3.2) kuni kihisemise lakkamiseni. Lisatakse veel 10 ml soolhapet (3.2). Keeduklaas pannakse liivavannile ja aurustatakse kuivaks, et silikaadid muutuksid lahustumatuks. Jääk lahustatakse uuesti 10 ml lämmastikhappes (3.3) ja keedetakse liivavannil või kuumutusplaadil 5 minutit, ilma et see kuivaks aurustuks. Vedelik dekanteeritakse 500 ml mõõtekolbi, loputades keeduklaasi mitu korda kuuma veega. Lastakse jahtuda, täidetakse kuni märgini veega, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.2.   Värvuse arendamine ja optilise tiheduse mõõtmine

Punkti 5.1.1 või 5.1.2 kohaselt saadud filtraadi alikvoot lahjendatakse nii, et fosfori kontsentratsioon oleks kuni 40 μg/ml. 10 ml seda lahust pannakse katseklaasi (4.6) ja lisatakse 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6). Homogeenitakse ja lastakse seista temperatuuril 20 oC vähemalt 10 minutit. Saadud lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm, lisades 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6) 10 ml veele.

5.3.   Kalibreerimiskõver

Standardlahusest (3.7) valmistatakse lahused, mis sisaldavad 1 ml kohta 5, 10, 20, 30 ja 40 μg fosforit. Igast lahusest võetakse 10 ml ja lisatakse sellele 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6). Homogeenitakse ja lastakse seista temperatuuril 20 oC vähemalt 10 minutit. Optiline tihedus mõõdetakse punkti 5.2 kohaselt. Optiliste tiheduste ja vastavate fosforikoguste põhjal joonestatakse kalibreerimiskõver. Kontsentratsioonide puhul, mis jäävad vahemikku 0–40 μg/ml, on kõver lineaarne.

6.   Tulemuste arvutamine

Uuritavas proovis sisalduv fosforikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

Q.   KLORIIDIDEST PÄRIT KLOORI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata kloori kogust vees lahustuvates kloriidides, mida harilikult väljendatakse naatriumkloriidina. Meetodit kasutatakse kõigi söötade puhul.

2.   Põhimõte

Kloriidid lahustatakse vees. Kui toode sisaldab orgaanilisi aineid, see selitatakse. Lahus hapestatakse kergelt lämmastikhappega ja kloriidid sadestatakse hõbekloriidina hõbenitraadilahuse abil. Hõbenitraadi ülekogus tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega, kasutades Volhardi meetodit.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

Segisti (trummel): umbes 35 kuni 40 p/min.

5.   Töö käik

5.1.   Lahuse valmistamine

Sõltuvalt proovi laadist valmistatakse lahus punkti 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kohaselt.

Samal ajal tehakse pimekatse, jättes välja analüüsitava proovi.

5.1.1.    Proovid, mis ei sisalda orgaanilisi aineid

Alla 10 g proovi, mis ei sisalda kloriididena rohkem kui 3 g kloori, kaalutakse täpsusega 1 mg. See pannakse 400 ml veega 500 ml mõõtekolbi temperatuuril ligikaudu 20 oC. Segatakse trumlis 30 minutit, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.1.2.    Orgaanilist ainet sisaldavad proovid, välja arvatud punktis 5.1.3 loetletud tooted

Umbes 5 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 1 g aktiivsöega 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett temperatuuriga ligikaudu 20 oC ja 5 ml Carrezi lahust I (3.7), segatakse ning lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.8). Segatakse trumlis 30 minutit, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.1.3.    Kuumtöödeldud söödad, linakoogid ja -jahu, linajahurikkad tooted ja muud taimeliimi- või kolloidaineterikkad tooted (näiteks dekstriinitud tärklis)

Lahus valmistatakse punkti 5.1.2 kohaselt, kuid seda ei filtreerita. Dekanteeritakse (vajaduse korral tsentrifuugitakse), eemaldatakse 100 ml supernatanti ja kantakse 200 ml mõõtekolbi. Segatakse atsetooniga (3.6), täidetakse lahustiga kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.2.   Tiitrimine

Sõltuvalt arvatavast kloorisisaldusest kantakse pipeti abil Erlenmeyeri kolbi 25–100 ml punkti 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kohaselt saadud filtraati. Alikvoot ei tohi sisaldada rohkem kui 150 mg kloori (Cl). Vajaduse korral lahjendatakse vähemalt 50 ml veega, lisatakse 5 ml lämmastikhapet (3.4), 20 ml ammooniumraudsulfaadi küllastunud lahust (3.3) ja nullmärgini täidetud büreti abil kaks tilka ammooniumtiotsüanaadi lahust (3.1). Büreti abil lisatakse hõbenitraadi lahust (3.2), nii et saadakse ülekogus 5 ml. Lisatakse 5 ml dietüüleetrit (3.5) ja loksutatakse tugevalt sademe koaguleerimiseks. Hõbenitraadi ülekogus tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega (3.1), kuni punakaspruun värvus püsib ühe minuti.

6.   Tulemuste arvutamine

Koriini (X) kogus, väljendatuna protsendimäärana naatriumkloriidist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

Kui pimekatse näitab 0,1 mol/l hõbenitraadi lahuse tarbimist, lahutatakse see väärtus kogusest (V1 – V2).

7.   Tähelepanekud

IV LISA

SÖÖDAS LUBATUD SÖÖDALISANDITE TASEME KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A.   A-VITAMIINI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata A-vitamiini (retinooli) kogust söödas ja eelsegudes. A-vitamiini all mõistetakse täielikult trans-konfiguratsioonis retinüülalkoholi ja selle cis-isomeere, nii nagu need määratakse käesoleva meetodiga. A-vitamiini sisaldust väljendatakse rahvusvahelistes ühikutes (RÜ) kilogrammi kohta. Üks RÜ vastab 0,300 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkoholi või 0,344 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaadi või 0,550 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaadi aktiivsusele.

Kvantifikatsiooni piir on 2 000 RÜ A-vitamiini kilogrammi kohta.

2.   Põhimõte

Proov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja A-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. A-vitamiini sisaldus määratakse pööratud faasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit. Kromatograafilised parameetrid valitakse nii, et täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkohol ja selle cis-isomeerid jääksid lahutamata.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1 mm avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda A-vitamiini kadusid.

5.2.   Seebistamine

500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) kaalutakse 1 mg täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt A-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (3.1), umbes 100 mg BHT (3.13), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (3.6). Kolvi otsa ühendatakse tagasivoolujahuti (4.3) ja kolb pannakse magnetseguriga veevanni (4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.

5.3.   Ekstraheerimine

Seebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (3.1) ja 100 ml petrooleetriga (3.2) ja viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peab olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.

5.3.1.    Ekstraheerimine jaotuslehtriga (4.2.3)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (3.2).

Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergelt loksutades (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100 ml veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100 ml veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtreeritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (4.4) 500 ml mõõtekolbi (4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (3.2), täidetakse petrooleetriga (3.2) märgini ja segatakse hästi.

5.3.2.    Ekstraheerimine ekstraktsiooniseadmega (4.8)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), pannakse klaassilindri (4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (3.2), siis kaks korda 50 ml petrooleetri (3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.

Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.

5.4.   Proovilahuse valmistamine HPLC jaoks

Petrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250 ml pirnkolbi (4.2.4). Vaakumpöördaurustiga (4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks veevanni temperatuuril mitte üle 40 oC. Kolbi lastakse lämmastik (3,10 ) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumpöördaurustist. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.10) voolutades ja jääk lahustatakse kohe teadaoleva koguse (10–100 ml) metanooliga (3.3) (A-vitamiini kontsentratsioon peab jääma vahemikku 5–30 RÜ/ml).

5.5.   Määramine HPLC-ga

A-vitamiin eraldatakse C18 pöördfaaskolonnil (4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon UV-detektori (325 nm) või fluorestsentsdetektori (ergastamine: 325 nm, emissioon: 475 nm) (4.5.2) abil.

Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (3.9). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kalibreerimislahuste (5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).

HPLC tingimused

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).

5.6.   Kalibreerimine

5.6.1.    Standardtöölahuste ettevalmistamine

20 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (3.11.1) või 20 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (3.12.1) pipetitakse 500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktile 5.2, kuid ilma BHT-d lisamata. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (3.2) vastavalt punktile 5.3 ja täidetakse kuni 500 ml-ni petrooleetriga (3.2). 100 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumpöördaurustil (vt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3,10 ) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 10,0 ml metanooliga (3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 560 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.3. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

2,0 ml kõnealust standardtöölahust pipetitakse 20 ml mõõtekolbi, täidetakse metanooliga (3.3) kuni märgini ja segatakse. Selle lahjendatud standardtöölahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini ml kohta.

5.6.2.    Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0 , 2,0 , 5,0 ja 10,0 ml lahjendatud standardtöölahust viiakse üle 20 ml mõõtekolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,8 , 5,6 , 14,0 ja 28,0 RÜ A-vitamiini ml kohta.

Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid) ja arvestades UV-kontrolli (5.6.3.3) tulemusi.

5.6.3.    Standardlahuste UV-standardiseerimine

5.6.3.1.    A-vitamiini atsetaadi põhilahus

2,0 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (3.11.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. 3,0 ml A-vitamiini atsetaadi lahjendatud lahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E326 × 19,0

(

A-vitamiini atsetaadi puhul = 1 530 lainepikkusel 326 nm 2-propanoolis)

5.6.3.2.    A-vitamiini palmitaadi põhilahus

2,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (3.12.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. 3,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E326 × 19,0

(

 A-vitamiini palmitaadi puhul = 957 lainepikkusel 326 nm 2-propanoolis)

5.6.3.3.    A-vitamiini standardtöölahus

3,0 ml A-vitamiini lahjendamata standardtöölahust, mis on valmistatud vastavalt punktile 5.6.1, pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. 5,0 ml seda lahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E325 × 18,3

(

 A-vitamiini alkoholi puhul = 1 821 lainepikkusel 325 nm 2-propanoolis)

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse A-vitamiini piigi keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kalibreerimisgraafiku (5.6.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon RÜ-des milliliitri kohta.

Proovi A-vitamiini sisaldus w RÜ-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:

 [mg/kg]

kus:

7.   Tähelepanekud

Et kontrollida rakendatud analüüsimeetodi tulemuste usaldusväärsust kõnealuse spetsiifilise põhiaine (piimaasendaja) puhul, tuleb täiendava kaalutisega teha saagisekatse. Kui saagise määr on alla 80 %, esitatakse analüüsi tulemus saagisekorrektsiooniga.

8.   Korratavus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % suuremast tulemusest.

9.   Ühisuuringu tulemused ( 11 )

B.   E-VITAMIINI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata E-vitamiini kogust söödas ja eelsegudes. E-vitamiini sisaldust väljendatakse DL-α-tokoferoolatsetaadi milligrammides kilogrammi kohta. 1 mg DL-α-tokoferoolatsetaati vastab 0,91 mg DL-α-tokoferoolile (E-vitamiin).

Kvantifitseerimispiir on 2 mg E-vitamiini kilogrammi kohta. See kvantifitseerimispiir on saavutatav vaid fluorestsentsdetektoriga. UV-detektoriga on kvantifitseerimispiir 10 mg/kg.

2.   Põhimõte

Proov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja E-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. E-vitamiini sisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1 mm avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda E-vitamiini kadusid.

5.2.   Seebistamine

500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) kaalutakse 0,01  g täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt E-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (3.1), umbes 100 mg BHT (3.12), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (3.6). Kolvi otsa ühendatakse jahuti (4.3) ja kolb pannakse magnetseguriga veevanni (4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.

5.3.   Ekstraheerimine

Seebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (3.1) ja 100 ml petrooleetriga (3.2) ja viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peab olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.

5.3.1.    Ekstraheerimine jaotuslehtriga (4.2.3)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (3.2).

Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergelt loksutades (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100 ml veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100 ml veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtreeritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (4.4) 500 ml mõõtekolbi (4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (3.2), täidetakse petrooleetriga (3.2) märgini ja segatakse hästi.

5.3.2.    Ekstraheerimine ekstraktsiooniseadmega (4.8)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), pannakse klaassilindri (4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (3.2), siis kaks korda 50 ml petrooleetri (3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.

Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.

5.4.   Proovilahuse valmistamine HPLC jaoks

Petrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250 ml pirnkolbi (4.2.4). Vaakumpöördaurustiga (4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks veevanni temperatuuril mitte üle 40 oC. Kolbi lastakse lämmastik (3.9) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumpöördaurustist. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.9) voolutades ja jääk lahustatakse kohe teadaoleva koguse (10–100 ml) metanooliga (3.3) (DL-α-tokoferooli kontsentratsioon peab jääma vahemikku 5–30 μg/ml).

5.5.   Määramine HPLC-ga

E-vitamiin eraldatakse C18 pöördfaasikolonnil (4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon fluorestsentsdetektori (ergastamine: 295 nm, emissioon: 330 nm) (4.5.2) abil või UV-detektoriga (292 nm) (4.5.2).

Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (3.8). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kalibreerimislahuste (5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).

HPLC tingimused

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).

5.6.   Kalibreerimine (DL-α-tokoferoolatsetaat või DL-α-tokoferool)

5.6.1.    DL-α-tokoferoolatsetaadi standard

5.6.1.1.    Standardtöölahuse valmistamine

25 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.10.1) viiakse pipetiga 500-milliliitrisesse lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktis 5.2 kirjeldatule. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (3.2) vastavalt punktis 5.3 kirjeldatule ja täidetakse petrooleetriga 500 milliliitrini. 25 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumpöördaurustil (vt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.9) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 25,0 ml metanooliga (3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 45,5 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 50 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

5.6.1.2.    Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0 , 2,0 , 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20-milliliitristesse mõõtkolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,5 , 5,0 , 10,0 ja 25,0 μg/ml DL-α-tokoferoolatsetaati, s.o 2,28 , 4,55 , 9,10 ja 22,8 μg/ml DL-α-tokoferooli.

Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid), koostatakse kalibreerimisgraafik.

5.6.1.3.    DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahuse (3.10.1) UV-standardiseerimine

5,0 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.10.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (3.1) suhtes.

Neeldumismaksimum peaks olema 284 nm:

 = 43,6 etanoolis 284 nm juures

Sellisel lahjendusel peaks ekstinktsiooni väärtus olema vahemikus 0,84 –0,88 .

5.6.2.    DL-α-tokoferooli standard

5.6.2.1.    Standardtöölahuse valmistamine

2 ml DL-α-tokoferooli põhilahust (3.11.1) viiakse pipetiga 50 ml mõõtekolbi, lahustatakse metanoolis (3.3) ja täidetakse metanooliga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 40 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 44,0 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

5.6.2.2.    Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0 , 2,0 , 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20-milliliitristesse mõõtkolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,0 , 4,0 , 8,0 ja 20,0 μg/ml DL-α-tokoferooli, s.o 2,20 , 4,40 , 8,79 ja 22,0 μg/ml DL-α-tokoferoolatsetaati.

Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid), koostatakse kalibreerimisgraafik.

5.6.2.3.    DL-α-tokoferooli põhilahuse (3.11.1) UV-standardiseerimine

2,0 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.11.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (3.1) suhtes. Neeldumismaksimum peaks olema 292 nm:

 = 75,8 etanoolis 292 nm juures

Sellisel lahjendusel peab ekstinktsiooni väärtus olema 0,6 .

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse E-vitamiini piikide keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kalibreerimisgraafiku (5.6.1.2 või 5.6.2.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon μg-des milliliitri kohta (arvutatuna α-tokoferoolatsetaadina).

Proovi E-vitamiini sisaldus w mg-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:

 [mg/kg]

kus:

7.   Tähelepanekud

8.   Korratavus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % suuremast tulemusest.

9.   Ühisuuringu tulemused ( 12 )

C.   MIKROELEMENTIDE RAUA, VASE, MANGAANI JA TSINGI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata söödas mikroelemente: rauda, vaske, mangaani ja tsinki. Kvantifikatsioonipiirid on:

2.   Põhimõte

Proov lahustatakse soolhappes pärast võimaliku orgaanilise aine hävitamist. Elemendid raud, vask, mangaan ja tsink määratakse aatomabsorptsioonspektromeetriaga pärast asjakohast lahjendamist.

3.   Reaktiivid

Sissejuhatavad märkused

Reaktiivide ja analüütiliste lahuste ettevalmistamiseks kasutatakse katioonivaba vett, mis on saadud kas vee bidestilleerimisel borosilikaat- või kvartsklaasist destillaatoris või kahekordsel töötlemisel ioonvahetusvaikudega.

Reaktiivid peavad olema vähemalt analüütiliselt puhtad. Määratava elemendi puudumist tuleb kontrollida pimekatse abil. Vajaduse korral tuleb reaktiive täiendavalt puhastada.

Allpool kirjeldatud standardlahuste asemel võib kasutada müügil olevaid standardlahuseid, tingimusel, et neil on garantii ning neid on enne kasutamist kontrollitud.

4.   Seadmed

5.   Töö käik ( 13 )

5.1.   Orgaanilist ainet sisaldavad proovid

5.1.1.    Tuhastamine ja lahuse analüüsiks ettevalmistamine ( 14 )

Tuhka niisutatakse veega ja viiakse üle 250 ml keelduklaasi. Tiigel pestakse ligikaudu 5 ml soolhappega (3.1) ning soolhape lisatakse aeglaselt ja ettevaatlikult keeduklaasi (CO2 moodustumise tõttu võib tekkida tugev reaktsioon). Soolhape (3.1) lisatakse tilkhaaval ja loksutades kuni kihisemise lakkamiseni. Aurustatakse kuivaks, aeg-ajalt klaaspulgaga segades.

Järgmisena lisatakse jäägile 15 ml 6 mol/l soolhapet (3.2) ning ligikaudu 120 ml vett. Segatakse klaaspulgaga, mis jäetakse keeduklaasi, ning keeduklaas kaetakse kellaklaasiga. Segu lastakse aeglaselt keema ning hoitakse keemistemperatuuril, kuni lahustuvat tuhka ei ole enam näha. Filtreeritakse läbi tuhavaba filterpaberi ning filtraat kogutakse 250 ml mõõtekolbi. Keeduklaas ja filter pestakse 5 ml kuuma 6 mol/l soolhappega (3.2) ning kaks korda keeva veega. Mõõtekolb täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 mol/l).

Märkused

Üldise saastamisohu vähendamiseks tuleb töötada tolmuvabas keskkonnas hoolikalt puhastatud vahendite ja korralikult pestud klaasnõudega. Tsingi määramine on eriti tundlik mitmete saasteallikate suhtes, nt klaasnõud, reaktiivid, tolm jne.

5.1.2.    Spektrofotomeetriline määramine

5.1.2.1.    Kalibreerimislahuste valmistamine

Iga määratava elemendi jaoks valmistatakse punktides 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.10.1 osutatud standardtöölahustest kalibreerimislahused, millest iga lahuse HCl kontsentratsioon on ligikaudu 0,5 mol/l ning (raua, mangaani ja tsingi korral) lantaankloriidi kontsentratsioon on samaväärne 0,1  % lantaaniga (w/v).

Valitud mikroelementide kontsentratsioonid peavad jääma kasutatava spektrofotomeetri tundlikkuse piiresse. Järgmistes tabelites on näitena esitatud tavapäraste kalibreerimislahuste koostised, kuid sõltuvalt kasutatava spektrofotomeetri tüübist ja tundlikkusest võib osutuda vajalikuks valida muud kontsentratsioonid.

5.1.2.2.    Lahuse ettevalmistamine analüüsiks

Vase määramiseks saab vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahust tavaliselt kohe kasutada. Kui lahuse kontsentratsioon on vaja viia kalibreerimislahuste piiresse, võib lahuse alikvoodi pipettida 100 ml mõõtekolbi ning täita märgini 0,5 mol/l soolhappega (3.3).

Raua, mangaani ja tsingi määramiseks pipetitakse vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahuse alikvoot 100 ml mõõtekolbi, lisatakse 10 ml lantaankloriidilahust (3.11) ning täidetakse märgini 0,5 mol/l soolhappega (3.3) (vt ka punkt 8 „Tähelepanekud”).

5.1.2.3.    Pimekatse

Pimekatse peab hõlmama kõiki protseduuri ettenähtud etappe, välja arvatud see, et proovimaterjal jäetakse välja. Pimekatsel ei tohi kasutada kalibreerimislahust 0.

5.1.2.4.    Aatomabsorptsiooni mõõtmine

Kalibreerimislahuste ja analüüsitava lahuse aatomabsorptsiooni mõõdetakse oksüdeerivat õhk-atsetüleenleeki kasutades järgmistel lainepikkustel:

Iga mõõtmist tuleb teha neli korda.

5.2.   Mineraalsööt

Kui proov ei sisalda orgaanilist ainet, ei ole eelnev tuhastamine vajalik. Toimitakse vastavalt punkti 5.1.1.1, alustades teisest lõigust. Vesinikfluoriidhappega aurustamise võib ära jätta.

6.   Tulemuste arvutamine

Mikroelementide kontsentratsioon analüüsitavas lahuses arvutatakse kalibreerimiskõverat kasutades ning tulemus väljendatakse mikroelementide milligrammides ühe kilogrammi proovi kohta (miljondikkudes).

7.   Korratavus

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

8.   Tähelepanekud

Suure koguse fosfaadi sisaldus võib takistada raua, mangaani ja tsingi määramist. See takistus tuleb kõrvaldada, lisades proovi lantaankloriidilahust (3.11). Kuid kui proovis on massi vahekord Ca + Mg/P > 2, siis võib lantaankloriidilahuse (3.11) lisamise analüüsitavale lahusele ja kalibreerimislahusele ära jätta.

D.   HALOFUGINOONI MÄÄRAMINE

DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hüdroksü-2-piperidüül)atsetonüül]-kinasoliin-4-(3H)-oon-vesinikbromiid

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata halofuginooni kogust söödas. Määramispiir on 1 mg/kg.

2.   Põhimõte

Pärast kuuma veega töötlemist ekstraheeritakse halofuginoon vaba alusena etüülatsetaati ning eraldatakse hüdrokloriidina happe vesilahusesse. Ekstrakt puhastatakse ioonvahetuskromatograafia abil. Halofuginoonisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3.   Reaktiivid

50 mg halofuginooni (3.6) kaalutakse 0,1 mg täpsusega 500 ml mõõtekolbi, lahustatakse ammooniumatsetaadi puhverlahuses (3.18), täidetakse kuni märgini puhverlahusega ja segatakse. See lahus säilib pimedas 5 oC juures kolm nädalat.

100 ml mõõtekolbidesse kantakse 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ja 6,0 ml põhistandardlahust (3.6.1). Täidetakse kuni märgini liikuva faasiga (3,21 ) ja segatakse. Nende lahuste halofuginoonikontsentratsioonid on vastavalt 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ja 6,0 μg/ml. 8,0 ja 10,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

50 g naatriumkarbonaati (3.11) lahustatakse vees, lahjendatakse 1 liitrini ja lisatakse kuni lahuse küllastumiseni naatriumkloriidi (3.12).

10 ml soolhapet (3.7) lahjendatakse kuni 1 liitrini veega.

19,3  g ammooniumatsetaati (3.3) ja 30 ml äädikhapet (3.5) lahustatakse vees (3.14) ja lahjendatakse kuni 1 liitrini.

Asjakohane kogus Amberlite'i (3.2) pestakse veega, kuni äravalatud vesifaasile tehtud hõbenitraadi (3.20) test näitab, et kõik klooriioonid on eemaldatud. Vaiku pestakse 50 ml metanooliga (3.8), metanool valatakse ära ja vaik säilitatakse värskes metanoolis.

0,17  g hõbenitraati (3.9) lahustatakse 10 ml vees.

500 ml atsetonitriili (3.1) segatakse 300 ml ammooniumatsetaadi puhverlahusega (3.18) ja 1 200 ml veega (3.14). Äädikhappe (3.5) abil korrigeeritakse pH 4,3 -le. Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4,8 ) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit). See lahus säilib suletud mahutis pimedas hoituna üks kuu.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Üldsätted

5.2.   Ekstraheerimine

10 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,1  g täpsusega 200 ml tsentrifuugiküvetti, lisatakse 0,5  g naatriumaskorbaati (3.10), 0,5  g EDTAd (3.13) ja 20 ml vett ning segatakse. Küvett asetatakse 5 minutiks veevanni (80 oC). Pärast toatemperatuurini jahutamist lisatakse 20 ml naatriumkarbonaadi lahust (3.15) ja segatakse. Lisatakse kohe 100 ml etüülatsetaati (3.4) ja loksutatakse käes tugevalt 15 sekundit. Küvett asetatakse kolmeks minutiks ultrahelivanni (4.1) ning avatakse kork. Tsentrifuugitakse kaks minutit ja dekanteeritakse etüülatsetaadi faas läbi klaaskiudfiltri (4.6) 500 ml jaotuslehtrisse. Proovi ekstraheerimist korratakse teise 100 ml etüülatsetaadi kogusega. Kogutud ekstrakte pestakse üks minut 50 ml naatriumkloriidiga küllastatud naatriumkarbonaadi lahusega (3.16) ja veekiht valatakse ära.

Orgaanilist kihti ekstraheeritakse 1 minut 50 ml soolhappega (3.17). Alumine happekiht kallatakse 250 ml jaotuslehtrisse. Orgaanilist kihti ekstraheeritakse uuesti 1,5 minutit täiendava 50 ml soolhappega ja lisatakse esimesele ekstraktile. Kogutud happeekstrakte pestakse 10 ml etüülatsetaadiga (3.4) loksutades umbes 10 sekundit.

Veekiht kantakse kvantitatiivselt 250 ml ümarkolbi ja orgaaniline faas valatakse ära. Happelahusest aurustatakse filter-pöördaurusti (4,2 ) abil kogu allesjäänud etüülatsetaat. Veevanni temperatuur ei tohi olla üle 40 oC. Umbes 25-millibaarises vaakumis eemaldatakse 5 minutiga temperatuuril 38 oC kogu allesjäänud etüülatsetaat.

5.3.   Puhastamine

5.3.1.    Amberlite'i kolonni ettevalmistamine

XAD-2 kolonn valmistatakse ette eraldi iga proovi ekstrakti jaoks. 10 g valmistatud Amberlite'i (3.19) kantakse metanooliga (3.8) klaaskolonni (4.5). Vaigukihi peale pannakse väike klaasvillatropp. Metanool kallatakse kolonnist välja ja vaiku pestakse 100 ml veega, peatades voolu, kui vedelik jõuab vaigukihi ülemise piirini. Kolonnil lastakse enne kasutamist 10 minutit tasakaalustuda. Kolonni ei tohi kunagi lasta ära kuivada.

5.3.2.    Proovi puhastamine

Ekstrakt (5.2) kantakse kvantitatiivselt ettevalmistatud Amberlite'i kolonni (5.3.1), elueeritakse, valades eluaadi ära. Elueerimiskiirus ei tohi ületada 20 ml/min. Ümarkolb loputatakse 20 ml soolhappega (3.17) ja seda lahust kasutatakse vaigukolonni pesemiseks. Allesjäänud happelahus kõrvaldatakse õhuvoolu abil. Pesulahused valatakse ära. Kolonni lisatakse 100 ml metanooli (3.8) ja lastakse elueerida 5–10 ml, kogudes eluaadi 250 ml ümarkolbi. Allesjäänud metanoolil lastakse 10 minutit vaiguga tasakaalustuda ja jätkatakse elueerimist kiirusel kuni 20 ml/min, kogudes eluaadi samasse ümarkolbi. Metanool aurustatakse filter-pöördaurusti (4.2) abil, veevanni temperatuur ei tohi olla üle 40 oC. Jääk kantakse liikuva faasi (3.21) abil kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Täidetakse liikuva faasiga kuni märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.7). See lahus hoitakse HPLC määramise (5.4) jaoks.

5.4.   HPLC määramine

5.4.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):

Vedelikkromatograafia kolonn (4.4.1)

HPLC liikuv faas (3.21)

Voolukiirus: 1,5 –2 ml/min.

Avastamise lainepikkus: 243 nm

Sissesüstitav ruumala: 40 kuni 100 μl.

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides korduvalt kalibreerimislahust (3.6.2) kontsentratsiooniga 3,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused (pindalad) ja retentsiooniajad.

5.4.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.6.2) süstitakse korduvalt ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.4.3.    Proovilahus

Prooviekstrakti (5.3.2) süstitakse mitu korda samas mahus kui kalibreerimislahuste puhul ja määratakse halofuginoonipiikide keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse halofuginoonipiikide keskmise kõrguse (pindala) alusel määratakse kalibreerimisgraafiku (5.4.2) abil proovilahuse kontsentratsioon (μg/ml).

Halofuginoonisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6,0 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.6.2) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.6.2). Lisatud halofuginoonikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud halofuginoonikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes halofuginoonipiigi kõrgus. Piigi laius poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti halofuginoonipiigi laiusest.

7.1.2.    Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi kuni 3 mg/kg suuruste halofuginoonisisalduste puhul ületada 0,5 mg/kg.

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühisuuring, ( 15 ) mille käigus kaheksas laboratooriumis analüüsiti kolme proovi.

E.   ROBENIDIINI MÄÄRAMINE

1,3-bis[(p-klorobensülideen)amino]guanidiinhüdrokloriid

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata robenidiini kogust söödas. Määramispiir on 5 mg/kg.

2.   Põhimõte

Proov ekstraheeritakse hapestatud metanooliga. Ekstrakt kuivatatakse ja selle alikvootne osa puhastatakse alumiiniumoksiidi kolonnis. Robenidiin elueeritakse kolonnist metanooliga, kontsentreeritakse ja viiakse liikuva faasiga sobiva mahuni. Robenidiinisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3.   Reaktiivid

4,0 ml soolhapet (ρ20 = 1,18  g/ml) viiakse 500 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse kuni märgini metanooliga (3.1) ja segatakse. See lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

Tüüp 3A, 8–12 mešši (1,6 –2,5  mm osakesed, kristalne alumosilikaat, pooride läbimõõt 0,3  mm)

100 g alumiiniumoksiidi viiakse sobivasse anumasse ja lisatakse 2,0 ml vett. Suletakse ja loksutatakse ligikaudu 20 minutit. Hoitakse korralikult suletud anumas.

1 000 ml mõõtekolvis lahustatakse 3,40  g kaaliumdivesinikfosfaati vees (HPLC-puhtusastmega), kolb täidetakse märgini ja segatakse.

Üheliitrises mõõtekolvis lahustatakse 3,55  g veevaba dinaatriumvesinikfosfaati (või 4,45  g dihüdraati või 8,95  g dodekahüdraati) vees (HPLC-puhtusastmega), kolb täidetakse märgini veega ja segatakse.

Segada järgmised reaktiivid:

Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4.6) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit).

Puhas robenidiin: 1,3 -bis[(p-klorobensülideen) amino]guanidiinhüdrokloriid.

30 mg robenidiini standardainet (3.9) kaalutakse 0,1 mg täpsusega. Lahustatakse hapestatud metanooliga 100 ml mõõtekolvis (3.2), täidetakse kolb märgini sama lahustiga ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja hoitakse pimedas kohas.

Valatakse 10,0 ml põhistandardlahust (3.9.1) 250 ml mõõtekolbi, täidetakse see liikuva faasiga (3.8) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja hoitakse pimedas kohas.

50 ml mõõtekolbidesse viiakse 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 ja 25,0 ml vahestandardlahust (3.9.2). Täidetakse kuni märgini liikuva faasiga (3.8) ja segatakse. Lahuste robenidiinisisaldused on vastavalt 1,2 ; 2,4 ; 3,6 ; 4,8 ja 6,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

4.   Seadmed

Valmistatud tumedast klaasist, korkkraaniga, ligikaudu 150 ml reservuaariga, sisemine läbimõõt 10–15 mm, kõrgus 250 mm.

5.   Töö käik

5.1.   Üldsätted

5.2.   Ekstraheerimine

Umbes 15 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,01  g täpsusega. Proov pannakse 250 ml koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml hapestatud metanooli (3.2), kolb suletakse ja loksutatakse üks tund loksutil (4.2). Lahus filtreeritakse läbi klaaskiudfilterpaberi (4.5) ja kogu filtraat kogutakse 150 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 7,5  g molekulaarsõela (3.4), suletakse ja loksutatakse viis minutit. Filtreeritakse kohe läbi klaaskiudfilterpaberi. See lahus säilitatakse puhastamiseks (5.3).

5.3.   Puhastamine

5.3.1.    Alumiiniumoksiidi kolonni ettevalmistamine

Klaaskolonni (4.1) põhja asetatakse väike klaasvatist tropp ja surutakse see klaaspulka kasutades kokku. Kaalutakse 11,0  g ettevalmistatud alumiiniumoksiidi (3.5) ja pannakse kolonni. Tuleb jälgida, et kokkupuutumine õhuga oleks selles etapis minimaalne. Koputatakse kergelt vastu kolonni alumist otsa, et alumiiniumoksiid paigutuks ühtlaselt.

5.3.2.    Proovi puhastamine

Kolonni pipetitakse 5,0 ml vastavalt punktile 5.2 ettevalmistatud prooviekstrakti. Pipeti ots asetatakse tihedalt kolonni seina vastu ja lastakse lahusel absorbeeruda alumiiniumoksiidi. Robenidiin elueeritakse kolonnist, kasutades 100 ml metanooli (3.1) voolukiirusel 2–3 ml/min, ja eluaat kogutakse 250 ml ümarkolbi. Metanoolilahus aurustatakse filter-pöördaurusti (4.3) abil kuivaks vähendatud rõhul, temperatuuril 40 oC. Jääk lahustatakse uuesti 3–4 ml liikuvas faasis (3.8) ja viiakse kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Kolbi loputatakse mitme 1–2 ml koguse liikuva faasiga ja pannakse need loputusvedelikud mõõtekolbi. Kolb täidetakse sama lahustiga märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtreeritakse läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.7). Seda lahust hoitakse HPLC määramiseks (5.4).

5.4.   HPLC määramine

5.4.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need annavad samaväärsed tulemused):

Vedelikkromatograafia kolonn (4.4.1)

HPLC liikuv faas (3.8)

Voolukiirus: 1,5 –2 ml/min

Detektori lainepikkus: 317 nm,

Sissesüstitav ruumala: 20–50 μl.

Kromatograafilise süsteemi stabiilsust kontrollitakse, süstides 3,6 μg/ml sisaldavat kalibreerimislahust (3.9.3) mitu korda, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused ja retentsiooniajad.

5.4.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.9.3) süstitakse korduvalt ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimiskõver, kasutades kalibreerimislahuste keskmisi piigi kõrgusi või pindalasid ordinaatidena ja vastavaid kontsentratsioone μg/ml abstsissidena.

5.4.3.    Proovilahus

Prooviekstrakti (5.3.2) süstitakse mitu korda, kasutades sama mahtu nagu kalibreerimislahuste puhul, ja määratakse robenidiini piikide keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse robenidiini piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi määratakse proovilahuse kontsentratsioon μg/ml, kasutades kalibreerimisgraafikut (5.4.2).

Robenidiini sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.9.3) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.9.3). Lisatav robenidiinikogus peab olema ligikaudu võrdne prooviekstrakti analüüsimisel leitud robenidiini kogusega.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma ainult robenidiinipiigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti robenidiinipiigi laiusest.

7.1.2.    Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Robenidiinisisalduse puhul, mis on suurem kui 15 mg/kg, ei tohi sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ületada 10 % suuremast tulemusest.

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 85 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühenduse ühisuuring, milles 12 laboratooriumi analüüsisid nelja kodulindude ja küülikute söödajahu või -graanulite proovi. Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi. Tulemused on esitatud järgmises tabelis: