---

LISA

STANDARDANALÜÜSIMEETODITE KIRJELDUS
I.	Alkoholisisalduse määramine mahuprotsentides I liide : Destillaadi valmistamine II liide : Destillaadi tiheduse mõõtmine — Meetod A= püknomeetria — Meetod B= elektrooniline densimeetria — Meetod C= densimeetria hüdrostaatilisi kaale kasutades
II.	Kuivekstrakti üldsisalduse gravimeetriline määramine
III.	Lenduvate ainete ja metanooli määramine
III.1	Üldised märkused
III.2	Lenduvad aromaatsed ühendid: aldehüüdid, kõrgemad alkoholid, etüülatsetaat ja metanool (gaasikromatograafia)
III.3	Lenduvate hapete sisaldus ►M2  ————— ◄
IV.	Vesiniktsüaniidhape (p.m.)
V.	Anetool ►M1  ————— ◄
VI.	Glütsürritsiinhape ►M1  ————— ◄
VII.	Halkoonid ►M1  ————— ◄
VIII.	Üldsuhkur ►M2  ————— ◄
IX.	Munakollane ►M1  ————— ◄
▼M2
X.	Puidust pärinevate ühendite määramine: furfuraal, 5-hüdroksümetüülfurfuraal, 5-metüülfurfuraal, vanilliin, sirelaldehüüd, koniferüülaldehüüd, sinepaldehüüd, gallushape, ellaghape, vanilliinhape, sirelhape ja skopoletiin
▼M3
XI.	14C-sisalduse määramine etanoolis
▼B

I.   PIIRITUSJOOKIDE ALKOHOLISISALDUSE MÄÄRAMINE MAHUPROTSENTIDES

Sissejuhatus

Standardmeetod sisaldab kahte liidet:

I liide

:

Destillaadi valmistamine

II liide

:

Destillaadi tiheduse mõõtmine

1.   Rakendusala

Meetod sobib piiritusjookide tegeliku alkoholisisalduse määramiseks mahuprotsentides.

2.   Viited normidele

ISO 3696:1987: Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.   Terminid ja määratlused

3.1   Standardtemperatuur

Standardtemperatuur piiritusjookide alkoholisisalduse määramiseks mahuprotsentides ning tiheduse ja suhtelise tiheduse määramiseks on 20 °C.

Märkus 1:

Väljendit “temperatuuril t °C” kasutatakse kõikide määramiste korral (tihedus või alkoholisisaldus mahuprotsentides), mida väljendatakse muul temperatuuril kui standardtemperatuur 20 °C.

3.2   Tihedus

Tihedus on piiritusjoogi mass mahuühiku kohta vaakumis 20 °C juures. Seda väljendatakse kilogrammides kuupmeetri kohta ning selle sümbol on ρ20 °C või ρ20.

3.3   Suhteline tihedus

Suhteline tihedus on 20 °C piiritusjoogi tiheduse ja samal temperatuuril oleva vee tiheduse suhe, mis on väljendatud kümnendmurruna. Seda tähistatakse sümboliga d20 °C/20 °C või d20/20, või lihtsalt d, kui ei teki arusaamatust. Mõõdetud näitaja tuleb märkida analüüsisertifikaadile, kasutades üksnes eespool esitatud sümboleid.

Märkus 2:

Suhtelist tihedust on võimalik arvutada tiheduse ρ20 põhjal 20 °C juures:

ρ 20 = 998,203 × d20/20 või d20/20 = ρ 20/998,203,

kus 998,203 on vee tihedus 20 °C juures.

3.4   Tegelik alkoholisisaldus mahuprotsentides

Piiritusjookide tegelik alkoholisisaldus mahuprotsentides võrdub etanooli liitrite arvuga 100 liitris vee ja alkoholi segus, mille tihedus on sama mis alkoholil või piiritusjoogil pärast destilleerimist. Erinevate vee ja alkoholi segude alkoholisisalduse (mahuprotsentides) või tiheduse kontrolliväärtustena 20 °C juures tuleb kasutada väärtusi, mis on esitatud Rahvusvahelise Legaalmetroloogia Organisatsiooni soovitusega nr 22 vastu võetud rahvusvahelises tabelis.

Üldvõrrand, mida kasutatakse vee ja alkoholi segu alkoholisisalduse ja tiheduse määramiseks teataval temperatuuril, on esitatud komisjoni määruse (EMÜ) nr 2676/90 (EÜT L 272, 3.10.1990, lk 1) lisa 3. peatükis “Alkoholisisaldus mahuprotsentides” leheküljel 40 või Rahvusvahelise Veiniameti analüüsimeetodite käsiraamatus (1994, lk 17).

Märkus 3:

Kuna likööride ja koorelikööride puhul on ruumala väga raske täpselt mõõta, tuleb proov kaaluda ning alkoholisisaldus arvutada kõigepealt massiprotsentides.

Ümberarvestusvalem:

alkoholisisaldus mahuprotsentides

kus ASM

=

alkoholisisaldus massiprotsentides,

ρ20 (alkohol)

=

789,24 kg/m3

4.   Põhimõte

Pärast destilleerimist määratakse destillaadi alkoholisisaldus mahuprotsentides püknomeetria või elektroonilise densimeetria abil või densimeetria abil, kasutades hüdrostaatilisi kaale.

I LIIDE: DESTILLAADI VALMISTAMINE

1.   Rakendusala

Meetod sobib selliste destillaatide valmistamiseks, mida kasutatakse piiritusjookide tegeliku alkoholisisalduse määramiseks mahuprotsentides.

2.   Põhimõte

Piiritusjook destilleeritakse etanooli ning muude lenduvate ühendite eraldamiseks ekstraktiivainest (ained, mis ei destilleeru).

3.   Reaktiivid ja materjalid

4.   Seadmed ja aparatuur

Tavalised, eelkõige järgmised laboratooriumiseadmed.

Märkus:

Eespool kirjeldatud aparaat on mõeldud vähemalt 200 ml proovi jaoks. Väiksemaid proove (100 ml) saab siiski destilleerida väiksemat destillatsioonikolbi kasutades, tingimusel et kasutatakse kaitseotsakut või mõnda muud seadet piiskade kaasahaaramise vältimiseks.

5.   Uuritavate proovide hoidmine

Enne analüüsimist säilitatakse proove toatemperatuuril.

6.   Töö käik

Sissejuhatav märkus:

6.1	Preverjanje destilacijske aparature. Aparatura mora izpolnjevati naslednje zahteve: Destilacija 200 ml vodno-alkoholne zmesi z znano koncentracijo blizu 50 vol % ne sme povzročiti izgube alkohola za več kakor 0,1 vol %.

6.2

Piiritusjoogid, mille alkoholisisaldus on alla 50 mahu % 200 ml piiritusjooki valatakse mõõtekolbi. Registreeritakse kõnealuse vedeliku temperatuur või hoitakse vedelikku standardtemperatuuril (20 °C). Proov valatakse destilleerimisaparaadi ümarkolbi ning mõõtekolb pestakse kolm korda ligikaudu 20 ml destilleeritud veega. Iga pesuvee alikvoot lisatakse destillatsioonikolbi. Märkus: Kõnealusest 60 ml lahjendusest piisab selliste piiritusjookide jaoks, mis sisaldavad alla 250 grammi kuivekstrakti liitri kohta. Muudel juhtudel peab pürolüüsi vältimiseks olema pesuvett vähemalt 70 ml, kui kuivekstrakti sisaldus on 300 g/l, 85 ml, kui kuivekstrakti sisaldus on 400 g/l, ning 100 ml, kui kuivekstrakti sisaldus on 500 g/l (teatavad puuvilja- või kooreliköörid). Kõnealuseid mahte kohandatakse võrdeliselt eri proovide mahuga. Lisatakse mõned keemistsentrid (3.1) (ja vahutamisvastast emulsiooni koorelikööride puhul). 20 ml destilleeritud vett valatakse esialgsesse 200 ml mõõtekolbi, mida kasutatakse destillaadi hoidmiseks. Kolb asetatakse seejärel külma vee vanni (4.1) (aniisimaitseliste piiritusjookide puhul 10–15 °C). Destilleeritakse, vältides piiskade kaasahaaramist ja söestumist ning segades kolvi sisu aeg-ajalt, kuni destillaadi tase on mõni millimeeter alla mõõtekolvi kalibreerimismärki. Kui destillaadi temperatuur on langenud vedeliku esialgse temperatuurini ±0,5 °C, täidetakse kolb destilleeritud veega kuni märgini ja segatakse põhjalikult. Saadud destillaati kasutatakse alkoholisisalduse määramiseks mahuprotsentides (II liide).

6.3

Piiritusjoogid, mille alkoholisisaldus on üle 50 mahu % 100 ml mõõtekolbiga mõõdetakse 100 ml piiritusjooki ja valatakse see destilleerimisaparaadi ümarkolbi. Mõõtekolb pestakse mitu korda destilleeritud veega ning pesuvesi lisatakse destillatsiooniaparaadi ümarkolbi. Kasutatakse piisavalt vett, et kolvi sisu oleks ligikaudu 230 ml. 20 ml destilleeritud vett valatakse 200 ml mõõtekolbi, mida kasutatakse destillaadi hoidmiseks. Kolb asetatakse seejärel külma vee vanni (4.1) (aniisimaitseliste piiritusjookide puhul 10–15 °C). Destilleeritakse, segades kolvi sisu aeg-ajalt, kuni destillaadi tase on mõni millimeeter alla 200 ml mõõtekolvi kalibreerimismärki. Kui destillaadi temperatuur on langenud vedeliku esialgse temperatuurini ±0,5 °C, täidetakse kolb destilleeritud veega kuni märgini ja segatakse põhjalikult. Saadud destillaati kasutatakse alkoholisisalduse määramiseks mahuprotsentides (II liide). Märkus: Piiritusjoogi alkoholisisaldus mahuprotsentides on kaks korda suurem destillaadi alkoholisisaldusest.

II LIIDE: DESTILLAADI TIHEDUSE MÕÕTMINE

MEETOD A:   PIIRITUSJOOKIDE TEGELIKU ALKOHOLISISALDUSE MÄÄRAMINE MAHUPROTSENTIDES – MÕÕTMINE PÜKNOMEETRIA ABIL

A.1   Põhimõte

Alkoholi sisaldus mahuprotsentides saadakse destillaadi tihedusest, mis mõõdetakse püknomeetria abil.

A.2   Reaktiivid ja materjalid

Kui ei ole sätestatud teisiti, kasutatakse analüüsimisel üksnes analüütiliselt puhtaid reaktiive ja vähemalt 3. klassi vett vastavalt ISO 3696:1987 standardile.

A.2.1

Naatriumkloriidi lahus (2 % w/v) Ühe liitri valmistamiseks võetakse 20 g naatriumkloriidi kaalutis ja lahustatakse vees ühe liitrini.

A.3   Seadmed ja aparatuur

Tavalised, eelkõige järgmised laboratooriumiseadmed.

A.4   Töö käik

Sissejuhatavad märkused

A.4.1   Püknomeetri kalibreerimine

Püknomeeter kalibreeritakse, määrates järgmised parameetrid:

A.4.1.1

Kalibreerimine ühe kaalukausiga kaalu kasutades Määratakse kindlaks: —  puhta, kuiva püknomeetri mass (P), —  veega täidetud püknomeetri mass t °C juures (P1), —  taarapudeli mass (T0). A.4.1.1.1 Puhas, kuiv püknomeeter kaalutakse (P). A.4.1.1.2 Püknomeeter täidetakse ettevaatlikult ümbritseva õhu temperatuuril oleva destilleeritud veega ning paigaldatakse termomeeter. Püknomeeter pühitakse ettevaatlikult kuivaks ning asetatakse soojusisolatsiooniga ümbrisesse. Segamiseks pööratakse mahutit, kuni termomeeter näitab püsivat temperatuuri. Vedeliku pind püknomeetris viiakse täpselt kohakuti külgtoru ülemise äärega. Temperatuur t °C mõõdetakse täpselt ning vajadusel korrigeeritakse ebatäpsused temperatuuriskaalal. Veega täidetud püknomeeter kaalutakse (P1). A.4.1.1.3 Taarapudel kaalutakse (T0). A.4.1.1.4 Arvutamine —  tühja püknomeetri mass = P – m, kus m = püknomeetris oleva õhu mass. m = 0,0012 × (P1 – P) Märkus 2: 0,0012 on kuiva õhu tihedus temperatuuril 20 °C ja rõhu juures 760 mm Hg. —  püknomeetri maht 20 °C juures: kus Ft on konstant temperatuuril t °C, mis on saadud määruse (EMÜ) nr 2676/90 1. peatüki “Tihedus ja suhteline tihedus” I tabelist (lk 10). V20 °C peab olema esitatud 0,001 ml täpsusega. —  vee mass püknomeetris 20 °C juures: kus 0,998203 on vee tihedus 20 °C juures. Märkus 3: Vajadusel võib kasutada õhu tiheduse väärtust 0,99715 ning arvutada alkoholisisalduse Ühendkuningriigi tolliameti tabelites esitatud vastava tiheduse põhjal õhus.

A.4.1.2

Kalibreerimine kahe kaalukausiga kaalu kasutades A.4.1.2.1  Taarapudel asetatakse vasakpoolsele ning puhas ja kuiv püknomeeter koos korgiga parempoolsele kaalukausile. Kaalukausid viiakse tasakaalu, asetades püknomeetri poolele kaaluvihte, p grammi. A.4.1.2.2  Püknomeeter täidetakse ettevaatlikult ümbritseva õhu temperatuuril oleva destilleeritud veega ning paigaldatakse termomeeter; püknomeeter pühitakse ettevaatlikult kuivaks ning asetatakse soojusisolatsiooniga ümbrisesse; segamiseks pööratakse mahutit, kuni termomeeter näitab püsivat temperatuuri. Vedeliku pind püknomeetris viiakse täpselt kohakuti külgtoru ülemise äärega. Külgtoru puhastatakse ning paigaldatakse kork; temperatuur t °C mõõdetakse täpselt ning vajadusel korrigeeritakse ebatäpsused temperatuuriskaalal. Veega täidetud püknomeeter kaalutakse, kusjuures p’ on mass grammides, mis on vajalik tasakaalu saavutamiseks. A.4.1.2.3  Arvutamine —  tühja püknomeetri mass = p + m, kus m = püknomeetris oleva õhu mass. m = 0,0012 × (p – p’) —  püknomeetri maht 20 °C juures: kus Ft on konstant temperatuuril t °C, mis on saadud määruse (EMÜ) nr 2676/90 1. peatüki “Tihedus ja suhteline tihedus” I tabelist (lk 10). V20 °C peab olema esitatud 0,001 ml täpsusega. —  vee mass püknomeetris 20 °C juures: kus 0,998203 on vee tihedus 20 °C juures.

A.4.2   Uuritava proovi alkoholisisalduse määramine

A.5   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

A.5.1   Laboritevahelise katse statistilised tulemused

Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele [1] [2] läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed.

MEETOD B:   PIIRITUSJOOKIDE TEGELIKU ALKOHOLISISALDUSE MÄÄRAMINE MAHUPROTSENTIDES – MÕÕTMINE ELEKTROONILISE DENSIMEETRIA ABIL (PROOVI RESONANTSVÕNKESAGEDUSE PÕHJAL OSTSILLATSIOONIRAKUS)

B.1   Põhimõte

Vedeliku tihedus määratakse kindlaks vibreeriva U-toru võngete elektroonilisel mõõtmisel. Kõnealuseks mõõtmiseks lisatakse proov võnkesüsteemi, mille omavõnkesagedus muutub lisatud massi mõjul.

B.2   Reaktiivid ja materjalid

Kui ei ole sätestatud teisiti, kasutatakse analüüsimisel üksnes analüütiliselt puhtaid reaktiive ja vähemalt 3. klassi vett vastavalt ISO 3696:1987 standardile.

B.3   Seadmed ja aparatuur

Tavalised, eelkõige järgmised laboratooriumiseadmed.

B.4   Töö käik

B.5   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

B.5.1

Laboritevahelise katse statistilised tulemused Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele [1] [2] läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed. Laboritevahelise katse tegemise aeg 1997 Laborite arv 16 Proovide arv 6 Proovid A B C D E F Laborite arv pärast võõrväärtuste elimineerimist 11 13 15 16 14 13 Võõrväärtuste arv (laborid) 2 3 1 – 1 2 Tunnustatud tulemuste arv 22 26 30 32 28 26 Keskväärtus (mahu%) 23,81 40,12 40,35 39,27 42,39 56,99 26,52 (*)     43,10 (*) 45,91 (*) 63,31 (*) Korratavuse standardhälve (Sr) (mahu%) 0,044 0,046 0,027 0,079 0,172 0,144 Korratavuse suhteline standardhälve (RSDr) (%) 0,17 0,12 0,07 0,19 0,39 0,24 Korratavuse piirnorm (r) (mahu%) 0,12 0,13 0,08 0,22 0,48 0,40 Reprodutseeritavuse standardhälve (SR) (mahu%) 0,054 0,069 0,083 0,141 0,197 0,205 Reprodutseeritavuse suhteline standardhälve (RSDR) (%) 0,21 0,17 0,21 0,34 0,45 0,34 Reprodutseeritavuse piirnorm (R) (mahu%) 0,15 0,19 0,23 0,40 0,55 0,58 Proovide liigid A Puuviljaliköör; jaotustase. (*) B Brändi; pime kordusproov. C Viski; pime kordusproov. D Grappa; jaotustase. (*) E Akvaviit; jaotustase. (*) F Rumm; jaotustase. (*)

MEETOD C:   PIIRITUSJOOKIDE TEGELIKU ALKOHOLISISALDUSE MÄÄRAMINE MAHUPROTSENTIDES – MÕÕTMINE DENSIMEETRIA ABIL HÜDROSTAATILISI KAALE KASUTADES

C.1   Põhimõte

Piiritusjookide alkoholisisaldust saab mõõta densimeetria abil hüdrostaatilisi kaale kasutades Archimedese seaduse põhjal, mille kohaselt vedelikku asetatud kehale mõjub vedeliku üleslükkejõud, mis on võrdne väljatõrjutud vedeliku kaaluga.

C.2   Reaktiivid ja materjalid

Kui ei ole sätestatud teisiti, kasutatakse analüüsimisel üksnes analüütiliselt puhtaid reaktiive ja vähemalt 3. klassi vett vastavalt ISO 3696:1987 standardile.

C.2.1.   Ujuki pesemislahus (naatriumkloriid, 30 % w/v)

100 ml valmistamiseks võetakse 30 g naatriumkloriidi kaalutis ja täiendatakse 96 %lise etanooliga.

C.3   Seadmed ja aparatuur

Tavalised, eelkõige järgmised laboratooriumiseadmed.

C.4   Töö käik

Ujuk ja mõõtesilinder tuleb iga mõõtmise vahepeal puhastada destilleeritud veega, kuivatada pehme tualettpaberiga, mis ei jäta kiude, ning pesta lahusega, mille tihedust määratakse. Mõõtmised tuleb teha kohe, kui aparaat on saavutanud stabiilsuse, et piirata alkoholikadu aurumisel.

C.5   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

C.5.1   Laboritevahelise katse statistilised tulemused

Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele [1] [2] läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed.

Joonis 1. Destilleerimisaparaat piiritusjookide tegeliku alkoholisisalduse määramiseks mahuprotsentides
1.Standardse sfäärilise lihvühendusega 1-liitrine ümarkolb.
2.20 cm “Vigreux” rektifikatsioonikolonn.
3.10 cm Westi tüüpi kondensaator.
4.40 cm jahutusspiraal.

II.   PIIRITUSJOOKIDE KUIVEKSTRAKTI ÜLDSISALDUSE GRAVIMEETRILINE MÄÄRAMINE

1.   Rakendusala

Määrusega (EMÜ) nr 1576/89 nähakse kõnealune meetod ette üksnes akvaviidi jaoks, mille kuivekstrakti sisaldus on kuni 15 g/l.

2.   Viited on normidele

ISO 3696:1987: Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.   Määratlus

Kuivekstrakti või kuivaine üldsisaldus hõlmab kõiki mittelenduvaid aineid teatavatel füüsikalistel tingimustel.

4.   Põhimõte

Kaalutakse jäägid, mis tekivad piiritusjoogi aurustamisel keeva vee vanni kohal ja kuivatamisel kuivatuskapis.

5.   Seadmed ja aparatuur

5.1	55 mm diameetriga lamedapõhjaline silindriline aurustuskauss

5.2	Keeva vee vann

5.3	A-klassi 25 ml pipett

5.4	Kuivatuskapp

5.5	Eksikaator

5.6	Analüütilised kaalud täpsusega 0,1 mg

6.   Proovivõtmine ja proovid

Enne analüüsimist säilitatakse proove toatemperatuuril.

7.   Töö käik

7.1

25 ml piiritusjooki, mis sisaldab alla 15 g/l kuivainet, pipetitakse eelnevalt kaalutud lamedapõhjalisse silindrilisse aurustuskaussi, mille diameeter on 55 mm. Esimese aurustamistunni jooksul asetatakse aurustuskauss keeva vee vanni kaanele nii, et vedelik ei keeks, kuna see võib põhjustada kadusid pritsimisel. Proov jäetakse veel üheks tunniks kontakti keeva vee vanni auruga.

7.2	Kuivatamiseks asetatakse aurustuskauss kaheks tunniks kuivatuskappi temperatuuril 105 °C ± 3 °C. Aurustuskausil lastakse eksikaatoris jahtuda ning aurustuskauss ja selle sisu kaalutakse.

8.   Arvutamine

Jäägi mass korrutatuna 40ga võrdub piiritusjoogis sisalduva kuivekstrakti massiga ning seda väljendatakse grammides liitri kohta ühe kümnendkohaga.

9.   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

9.1   Laboritevahelise katse statistilised tulemused

Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele [1] [2] läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed.

III.   LENDUVATE AINETE JA METANOOLI MÄÄRAMINE PIIRITUSJOOKIDES

III.1.   ÜLDISED MÄRKUSED

1.   Määratlused

Määruses (EMÜ) nr 1576/89 on sätestatud lenduvate ühendite, v.a etanooli ja metanooli miinimumsisaldused teatavates piiritusjookides (rumm, viinamarjadest valmistatud alkohoolsed joogid, puuviljaviinad jne). Üksnes nende jookide puhul loetakse kõnealused sisaldused kokkuleppeliselt võrdseks järgmiste sisalduste summaga:

Lenduvate ühendite mõõtmise tavapärased meetodid:

2.   Lenduvate ühendite gaasikromatograafiline analüüs

Muude lenduvate ühendite kui eespool nimetatud ühendite gaasikromatograafiline analüüs võib osutuda eriti huvitavaks vahendiks nii destilleerimisel kasutatava tooraine päritolu kui ka tegelike destilleerimistingimuste kindlaksmääramisel.

Mõned piiritusjoogid sisaldavad muid lenduvaid ühendeid, näiteks aromaatseid ühendeid, mis on iseloomulikud alkoholi saamisel kasutatavale toorainele, piiritusjoogi aroomile ning piiritusjoogi valmistamise omapärale. Kõnealused ühendid on olulised määruses (EMÜ) nr 1576/89 sätestatud nõuete hindamisel.

III.2.   LENDUVATE AROMAATSETE AINETE GAASIKROMATOGRAAFILINE MÄÄRAMINE: ALDEHÜÜDID, KÕRGEMAD ALKOHOLID, ETÜÜLATSETAAT JA METANOOL

1.   Rakendusala

Käesolev meetod sobib 1,1-dietoksüetaani (atsetaali), 2-metüül-1-butanooli (aktiivse amüülalkoholi), 3-metüül-1-butanooli (isoamüülalkoholi), metanooli (metüülalkoholi), etüületanoaadi (etüülatsetaadi), 1-butanooli (n-butanooli), 2-butanooli (sec-butanooli), 2-metüül-1-propanooli (isobutüülalkoholi), 1-propanooli (n-propanooli) ja etanaali (atseetaldehüüdi) määramiseks piiritusjookides gaasikromatograafia abil. Selle meetodi puhul kasutatakse sisestandardit, näiteks 3-pentanooli. Analüütide kontsentratsiooni väljendatakse grammides 100 liitri absoluutalkoholi kohta; toote alkoholisisaldus tuleb kindlaks määrata enne analüüsimist. Piiritusjoogid, mida saab käesoleva meetodiga analüüsida, on viski, brändi, rumm, veinipiiritus, puuviljaviin ja viinamarjade pressimisjääkidest valmistatud piiritusjook.

2.   Viited normidele

ISO 3696:1987: Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.   Määratlus

Aromaatsed ühendid on lenduvad ained, mis moodustavad koos etanooliga piiritusjoogi kääritamise, destilleerimise ja küpsemise ajal.

4.   Põhimõte

Aromaatsete ühendite määramiseks piiritusjookides injekteeritakse piiritusjooki või nõuetekohaselt lahjendatud piiritusjooki otse gaasikromatograafi. Enne injekteerimist lisatakse piiritusjoogile sobiv sisestandard. Aromaatsed ühendid eraldatakse temperatuuri reguleerimisega sobivas kolonnis ning määratakse kindlaks leekionisatsioonidetektori abil. Iga aromaatse ühendi kontsentratsioon määratakse kindlaks sisestandardi suhtes nende kaliibrimistegurite põhjal, mis saadakse kalibreerimisel samades kromatograafilistes tingimustes mis piiritusjoogi analüüsimisel.

5.   Reaktiivid ja materjalid

Kui ei ole sätestatud teisiti, tuleb kasutada üksnes üle 97 % puhtusastmega reaktiive, mis on ostetud ISO järgi akrediteeritud tarnijalt, kellel on puhtusetunnistus, ning mille testlahuses ei ole teisi aromaatseid ühendeid (seda on võimalik kontrollida, injekteerides üksikute aromaatsete ühendite standardeid testlahuses punktis 6.4 sätestatud gaasikromatograafia tingimustel), ning üksnes vähemalt 3. klassi vett vastavalt ISO 3696 standardile. Atsetaali ja atseetaldehüüdi tuleb säilitada pimedas temperatuuril < 5 °C; kõiki teisi reaktiive võib säilitada toatemperatuuril.

5.1	Absoluutne alkohol (CASi nr 64-17-5).

5.2	Metanool (CASi nr 67-56-1).

5.3	1-propanool (CASi nr 71-23-8).

5.4	►C1  2-metüül-1-propanool (CASi nr 78-83-1). ◄

5.5	Lubatud sisestandardid: 3-pentanool (CASi nr 584-02-1), 1-pentanool (CASi nr 71-41-0), 4-metüül-1-pentanool (CASi nr 626-89-1) või metüülnonanoaat (CASi nr 1731-84-6).

5.6	2-metüül-1-butanool (CASi nr 137-32-6).

5.7	3-metüül-1-butanool (CASi nr 123-51-3).

5.8	Etüülatsetaat (CASi nr 141-78-6).

5.9	1-butanool (CASi nr 71-36-3).

5.10	2-butanool (CASi nr 78-92-2).

5.11	Atseetaldehüüd (CASi nr 75-07-0).

5.12	Atsetaal (CASi nr 105-57-7).

5.13	40 % (v/v) etanoolilahus. 400 ml/l etanoolilahuse valmistamiseks valatakse 400 ml etanooli (5.1) üheliitrisse mõõtekolbi, täidetakse kolb destilleeritud veega kuni märgini ja segatakse.

▼M3

5.13a

Ainult põllumajandusliku päritoluga etüülalkoholi puhul: absoluutalkohol (CASi nr 64-17-5).

▼B

5.14

Standardlahuste valmistamine ja säilitamine (kinnitatud meetodi korral kasutatav menetlus). Kõiki standardlahuseid tuleb säilitada temperatuuril < 5 °C ning valmistada värskelt iga kuu. Komponentide ja lahuste massid tuleb registreerida 0,1 mg täpsusega. 5.14.1 Standardlahus – A Järgmised reaktiivid pipetitakse 100 ml mõõtekolbi, mis sisaldab ligikaudu 60 ml etanoolilahust (5.13) koostisosade aurumise minimeerimiseks, kolb täidetakse etanoolilahusega (5.13) ja segatakse hoolikalt. Registreeritakse kolvi ja iga lisatava komponendi mass ning kolvi sisu lõplik kogumass. Komponent Maht (ml) Metanool (5.2) 3,0 1-propanool (5.3) 3,0 2-metüül-1-propanool (5.4) 3,0 2-metüül-1-butanool (5.6) 3,0 3-metüül-1-butanool (5.7) 3,0 Etüülatsetaat (5.8) 3,0 1-butanool (5.9) 3,0 2-butanool (5.10) 3,0 Atseetaldehüüd (5.11) 3,0 Atsetaal (5.12) 3,0 Märkus 1: Soovitatav on lisada atsetaal ja atseetaldehüüd viimasena, et minimeerida kadusid aurumisel. ▼M3 5.14.1a Ainult põllumajandusliku päritoluga etüülalkoholi puhul: standardlahuse A valmistamiseks pipetitakse reaktiivid, milles kõrgemate alkoholide sisaldust on vähendatud, et kontsentratsioonid standardlahustes oleksid ligikaudu samad põllumajandusliku päritoluga etüülalkoholi suhtes kehtestatud piirnormidega. ▼B 5.14.2 Standardlahus – B 3 ml 3-pentanooli või muud sobivat sisestandardit (5.5) pipetitakse 100 ml mõõtekolbi, mis sisaldab ligikaudu 80 ml etanoolilahust (5.13), kolb täidetakse etanoolilahusega (5.13) ja segatakse hoolikalt. Registreeritakse kolvi, 3-pentanooli või muu lisatava sisestandardi mass ja kolvi sisu lõplik kogumass. ▼M3 5.14.2a Ainult põllumajandusliku päritoluga etüülalkoholi puhul: standardlahuse B valmistamiseks pipetitakse väiksem ruumala sobivat sisestandardit, et kontsentratsioonid standardlahustes oleksid ligikaudu samad põllumajandusliku päritoluga etüülalkoholi suhtes kehtestatud piirnormidega. ▼B 5.14.3 Standardlahus – C 1 ml lahust A (5.14.1) ja 1 ml lahust B (5.14.2) pipetitakse 100 ml mõõtekolbi, mis sisaldab ligikaudu 80 ml etanoolilahust (5.13), kolb täidetakse etanoolilahusega (5.13) ning segatakse hoolikalt. Registreeritakse kolvi ja iga lisatava komponendi mass ning kolvi sisu lõplik kogumass. 5.14.4 Standardlahus – D Analüütilise jätkuvuse säilitamiseks valmistatakse kvaliteedikontrollistandard, kasutades eelnevalt valmistatud standardlahust A (5.14.1). 1 ml lahust A (5.14.1) pipetitakse 100 ml mõõtekolbi, mis sisaldab ligikaudu 80 ml etanoolilahust (5.13), kolb täidetakse etanoolilahusega (5.13) ja segatakse hoolikalt. Registreeritakse kolvi ja iga lisatava komponendi mass ning kolvi sisu lõplik kogumass. 5.14.5 Standardlahus – E 10 ml lahust B (5.14.2) pipetitakse 100 ml mõõtekolbi, mis sisaldab ligikaudu 80 ml etanoolilahust (5.13), kolb täidetakse etanoolilahusega (5.13) ja segatakse hoolikalt. Registreeritakse kolvi ja iga lisatava komponendi mass ning kolvi sisu lõplik kogumass. 5.14.6 Leekionisatsioonidetektori näitude lineaarsuse kontrollimiseks kasutatavad standardlahused 0, 0,1, 0,5, 1,0 ja 2,0 ml lahust A (5.14.1) ja 1 ml lahust B (5.14.2) pipetitakse erinevatesse 100 ml mõõtekolbidesse, kolvid täidetakse etanoolilahusega (5.13) ja segatakse hoolikalt. Registreeritakse kolvi ja iga lisatava komponendi mass ning kolvi sisu lõplik kogumass. 5.14.7 Kvaliteedikontrollistandard 9 ml standardlahust D (5.14.4) ja 1 ml standardlahust E (5.14.5) pipetitakse kaalukausile ning segatakse hoolikalt. Registreeritakse kolvi ja iga lisatava komponendi mass ning kolvi sisu lõplik kogumass.

6.   Seadmed ja aparatuur

6.1	Seade, millega saab mõõta tihedust ja alkoholisisaldust.

6.2	Analüütilised kaalud, millega on võimalik kaaluda nelja kümnendkoha täpsusega.

6.3	Temperatuuriregulaatoriga gaasikromatograaf, millel on leekionisatsioonidetektor ja integraator või muu andmekäitlussüsteem, millega on võimalik mõõta piigipindalasid või piigikõrgusi.

6.4

Gaasikromatograafi kolonn(id), millega on võimalik eraldada analüüte nii, et minimaalne resolutsioon üksikute komponentide vahel (v.a 2-metüül-1-butanool ja 3-metüül-1-butanool) oleks vähemalt 1.3. Märkus 2: Sobivad näiteks järgmised kolonnid ja gaasikromatograafia tingimused: 1)  Retentsiooninihe 1 m × 0,32 mm (sisediameeter), mis on ühendatud CP-WAX 57 CB kolonni külge mõõtmetega 50 m × 0,32 mm (sisediameeter), statsionaarse faasi kile paksus 0,2 μm (stabiliseeritud polüetüleenglükool), millele järgneb Carbowax 400 kolonn mõõtmetega 50 m × 0,32 mm (sisediameeter), statsionaarse faasi kile paksus 0,2 μm. (Kolonnid on ühendatud hermeetiliste ühendustega.) Kandegaas ja rõhk: heelium (135 kPa) Kolonni temperatuur: 35 °C 17 minutit, 12 °C/min temperatuurini 70 °C, hoida 25 minutit temperatuuril 70 °C. Injektori temperatuur: 150 °C Detektori temperatuur: 250 °C Süstitav maht: 1 μl, jaotatud 20 kuni 100 : 1 2)  Retentsiooninihe 1 m × 0,32 mm (sisediameeter), mis on ühendatud CP-WAX 57 CB kolonni külge mõõtmetega 50 m × 0,32 mm (sisediameeter), statsionaarse faasi kile paksus 0,2 μm (stabiliseeritud polüetüleenglükool). (Retentsiooninihe on ühendatud hermeetilise ühendusega.) Kandegaas ja rõhk: heelium (65 kPa) Kolonni temperatuur: 35 °C 10 minutit, 5 °C/min temperatuurini 110 °C, 30 °C/min temperatuurini 190 °C, hoida 2 minutit temperatuuril 190 °C. Injektori temperatuur: 260 °C Detektori temperatuur: 300 °C Süstitav maht: 1 μl, jaotatud 55 : 1 3)  Täidetud kolonn (5 % CW 20 M, Carbopak B), 2 m × 2 mm (sisediameeter). Kolonni temperatuur: 65 °C 4 minutit, 10 °C/min temperatuurini 140 °C, hoida 5 minutit temperatuuril 140 °C, 5 °C/min temperatuurini 150 °C, hoida 3 minutit temperatuuril 150 °C. Injektori temperatuur: 65 °C Detektori temperatuur: 200 °C Süstitav maht: 1 μl

7.   Proovivõtmine ja proovid

7.1	Laboriproov Vastuvõtmisel mõõdetakse iga proovi alkoholisisaldus (6.1).

8.   Töö käik (kasutatakse kinnitatud meetodi puhul)

8.1

Katsekogus 8.1.1 Sobiv pitseeritud kaalukauss kaalutakse ja selle mass registreeritakse. 8.1.2 9 ml laboriproovi pipetitakse kaalukaussi ja registreeritakse mass (MPROOV). 8.1.3 Lisatakse 1 ml standardlahust E (5.14.5) ja registreeritakse mass (MIS). 8.1.4 Katsematerjali loksutatakse intensiivselt (pööratakse vähemalt 20 korda). Proove tuleb enne analüüsi säilitada temperatuuril alla 5 °C, et minimeerida lenduvate ainete kadu.

8.2

Pimekatse 8.2.1 Sobiv pitseeritud kaalukauss kaalutakse nelja kümnendkoha täpsusega kaalul (6.2) ja mass registreeritakse. 8.2.2 9 ml 400ml/l etanoolilahust (5.13) pipetitakse kaalukaussi ja registreeritakse mass. 8.2.3 Lisatakse 1 ml standardlahust E (5.14.5) ja registreeritakse mass. 8.2.4 Katsematerjali loksutatakse intensiivselt (pööratakse vähemalt 20 korda). Proove tuleb enne analüüsi säilitada temperatuuril alla 5 °C, et minimeerida lenduvate ainete kadu.

8.3	Esialgne katse Injekteeritakse standardlahust C (5.14.3), et tagada kõikide analüütide eraldumine miinimumresolutsiooniga 1,3 (v.a 2-metüül-1-butanool ja 3-metüül-1-butanool).

8.4

Kalibreerimine Kalibreerimist tuleb kontrollida järgmise menetlusega. Näitude lineaarsuse tagamiseks analüüsitakse järjest kolmes eksemplaris kõiki sisestandardit (IS) sisaldavaid lineaarsuse kontrollimiseks ettenähtud standardlahuseid (5.14.6). Iga injektsiooni puhul arvutatakse integraatori piigipindalade või piigikõrguste põhjal suhe R iga aromaatse ühendi jaoks ning koostatakse graafik, kus R on esitatud aromaatse ühendi ja sisestandardi (IS) kontsentratsioonide suhte C funktsioonina. Peaks tekkima sirgjoon, mille korrelatsioonikordaja on vähemalt 0,99.

8.5

Määramine Injekteeritakse standardlahust C (5.14.3) ja kaks kvaliteedikontrollistandardit (5.14.7). Seejärel injekteeritakse uuritavad proovid (valmistatud vastavalt punktidele 8.1 ja 8.2) ja lisatakse üks kvaliteedikontrollistandard iga 10 proovi kohta analüütilise stabiilsuse tagamiseks. Injekteeritakse üks standardlahus C (5.14.3) iga 5 proovi järel.

9.   Arvutamine

Võib kasutada automaatset andmekäitlussüsteemi, tingimusel et andmeid saab allpool toodud meetodis kirjeldatud põhimõtete abil kontrollida.

Mõõdetakse aromaatse ühendi piigi pindalad või piigi kõrgused ning sisestandardi piigid.

9.1

Kaliibrimisteguri arvutamine Standardlahuse C (5.14.3) injektsiooni kromatogrammi põhjal arvutatakse iga aromaatse ühendi kaliibrimistegur, kasutades võrrandit (1). kus: IS = sisestandard Aromaatse ühendi kontsentratsioon = aromaatse ühendi kontsentratsioon lahuses C (5.14.3) IS kontsentratsioon = sisestandardi kontsentratsioon lahuses C (5.14.3). 9.1.2 Proovi analüüs Kasutades võrrandit (2), arvutatakse iga aromaatse ühendi kontsentratsioon proovides. (2) kus: M PROOV = proovi mass (8.1.2) M IS = sisestandardi mass (8.1.3) Conc.IS = sisestandardi kontsentratsioon lahuses E (5.14.5) RF = võrrandi (1) abil arvutatud kaliibrimistegur. 9.1.3 Kvaliteedikontrollistandardi analüüs Kasutades võrrandit (3), arvutatakse iga aromaatse ühendi sihtväärtuse saagise protsent kvaliteedikontrollistandardis (5.14.7): Analüüdi kontsentratsioon kvaliteedikontrollistandardis arvutatakse eespool toodud võrrandite (1) ja (2) abil.

9.2

Tulemuste lõplik esitamine Tulemused mg-des grammi kohta arvestatakse ümber grammidesse 100 liitri absoluutalkoholi kohta proovis, kasutades võrrandit (4): (4) Kontsentratsioon (μg/g) 100 liitri alkoholi kohta = Kontsentratsioon (μg/g) x ρ x 10/(sisaldus mahu% × 1 000 ) kus ρ = tihedus kg/m3. Tulemused esitatakse kolme tüvenumbriga ning maksimaalselt ühe kümnendkohaga, nt 11,4 g 100 l absoluutalkoholi kohta.

10.   Kvaliteedi tagamine ja kontroll (kasutatakse kinnitatud meetodi puhul)

Kasutades võrrandit (2), arvutatakse iga aromaatse ühendi kontsentratsioon kvaliteedikontrollistandardis, mis on valmistatud punktides 8.1.1–8.1.4 esitatud menetlusega. Kasutades võrrandit (3), arvutatakse sihtväärtuse saagise protsent. Kui analüüsitulemused on iga aromaatse ühendi puhul vahemikus ± 10 % nende teoreetilisest väärtusest, võib analüüsi jätkata. Vastasel korral tuleks läbi viia uuring ebatäpsuste leidmiseks ning teha vajaduse korral parandused.

11.   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

Laboritevahelise katse statistilised tulemused: järgmistes tabelites on esitatud järgmiste ühendite väärtused: etanaal, etüülatsetaat, atsetaal, üldetanaal, metanool, 2-butanool, 1-propanool, 1-butanool, 2-metüül-1-propanool, 2-metüül-1-butanool, 3-metüül-1-butanool.

Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed.

▼M2

III.3.   LENDUVATE HAPETE MÄÄRAMINE PIIRITUSJOOKIDES

1.    Kohaldamisala

Käesolev meetod on valideeritud rummi, brandy, viinamarjade pressimisjääkidest valmistatud kange alkohoolse joogi ja puuviljadest valmistatud kange alkohoolse joogi laboritevahelisel katsel, kontsentratsioonivahemikus 30 mg/l kuni 641 mg/l.

2.    Viited normidele

ISO 3696:1987 Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.    Mõisted

3.1.	Lenduvate hapete sisalduse arvutamiseks lahutatakse mittelenduvate hapete sisaldus üldhappesusest.

3.2.	Üldhappesus on tiitritavate hapete summa.

3.3.	Mittelenduvad happed on pärast kange alkohoolse joogi kuivamiseni aurustamist järele jäänud jäägi happesus.

4.    Põhimõte

Üldhappesus ja mittelenduvate hapete sisaldus määratakse tiitrimisega või potentsiomeetriliselt.

5.    Reaktiivid ja materjalid

Kui ei ole öeldud teisiti, kasutatakse analüüsimisel üksnes analüütiliselt puhtaid reaktiive ja vähemalt 3. puhtusastme vett, mis vastab ISO 3696:1987 nõuetele.

5.1.	0,01 M naatriumhüdroksiidi lahus (NaOH)

5.2.	Segaindikaatorlahus: kaalutakse 0,1 grammi indigokarmiini ja 0,1 grammi fenoolpunast; lahustatakse 40 ml vees ja täidetakse etanooliga 100 ml märgini.

6.    Seadmed ja aparatuur

Tavalised laboriseadmed, gradueeritud ja A-kategooriasse kuuluvad klaasnõud ja järgmised seadmed.

7.    Proovivõtmine ja proovid

Proove hoitakse kuni analüüsimiseni toatemperatuuril.

8.    Määramise käik

8.1.   Üldhappesus

8.1.1.   Proovi ettevalmistamine

Kanget alkohoolset jooki töödeldakse ultraheliga või segatakse kaks minutit vaakumis, et eralduks süsinikdioksiid, kui seda nõutakse.

8.1.2.   Tiitrimine

25 ml piiritusjooki viiakse pipetiga 500 ml Erlenmeyeri kolbi.

Lisatakse ligikaudu 200 ml jahutatud keedetud destilleeritud vett (värske, valmistatud samal päeval) ja 2–6 tilka segaindikaatorlahust (5.2).

Tiitritakse 0,01 M naatriumhüdroksiidi lahusega (5.1), kuni värvusetu kange alkohoolse joogi puhul muutub kollakasroheline värvus lillaks ja pruuni värvusega kange alkohoolse joogi puhul kollakaspruun värvus punakaspruuniks.

Tiitrida võib ka potentsiomeetriliselt, kuni pH väärtuseni 7,5.

Loeme, et lisati n1 ml 0,01 M naatriumhüdroksiidi.

8.1.3.   Arvutamine

Üldhappesus (total acidity, TA), väljendatuna milliekvivalentides liitri kange alkohoolse joogi kohta, on 0,4 × n1.

Üldhappesus (TA′), väljendatuna äädikhappe milligrammides liitri kange alkohoolse joogi kohta, on 24 × n1.

8.2.   Mittelenduvate hapete sisaldus

8.2.1.   Proovi ettevalmistamine

25 ml kanget alkohoolset jooki aurutatakse kuivaks.

8.2.2.   Tiitrimine

Aurustamisjääk lahustatakse jahutatud keedetud destilleeritud veega (värske, valmistatud samal päeval) ja täiendatakse ligikaudu 100 milliliitrini, lisatakse 2–6 tilka segaindikaatorlahust (5.2).

Tiitritakse 0,01 M naatriumhüdroksiidi lahusega (5.1).

Tiitrida võib ka potentsiomeetriliselt, kuni pH väärtuseni 7,5.

Loeme, et lisati n2 ml 0,01 M naatriumhüdroksiidi.

8.2.3.   Arvutamine

Mittelenduvate hapete sisaldus (fixed acidity, FA), väljendatuna milliekvivalentides liitri kange alkohoolse joogi kohta, on 0,4 × n2.

Mittelenduvate hapete sisaldus (FA), väljendatuna äädikhappe milligrammides liitri kange alkohoolse joogi kohta, on 24 × n2.

9.    Lenduvate hapete sisalduse arvutamine

9.1.	Väljendatuna milliekvivalentides liitri kohta Kasutatakse järgmisi tähiseid: TA = üldhappesus milliekvivalentides liitri kohta FA = mittelenduvate hapete sisaldus milliekvivalentides liitri kohta Lenduvate hapete sisaldus (volatile acidity, VA), milliekvivalentides liitri kohta: TA – FA

9.2.	Väljendatuna äädikhappe milligrammides liitri kohta Kasutatakse järgmisi tähiseid: TA′ = üldhappesus äädikhappe milligrammides liitri kohta FA′ = mittelenduvate hapete sisaldus äädikhappe milligrammides liitri kohta Lenduvate hapete sisaldus, VA, äädikhappe milligrammides liitri kohta on: TA′ – FA′

9.3.	Väljendatuna äädikhappe grammides ühe hektoliitri 100-mahuprotsendilise puhta alkoholi kohta: kus A on piiritusjoogi alkoholisisaldus mahuprotsentides.

10.    Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

10.1.   Laboritevahelise katse statistilised tulemused

Vastavalt rahvusvaheliselt kokku lepitud eeskirjadele [1] [2] tehtud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uuringu põhjal saadi järgmised andmed.

Proovide liigid:

A	Ploomidest valmistatud kange alkohoolne jook; jaotustase *

B	Rumm I; tühikatse kordusproovid

C	Rumm II; jaotustase *

D	Slivovitz; tühikatse kordusproovid

E	Brandy; tühikatse kordusproovid

F	Viinamarjade pressimisjääkidest valmistatud kange alkohoolne jook; tühikatse kordusproovid

▼M1

V.   ANETOOL. TRANS-ANETOOLI MÄÄRAMINE PIIRITUSJOOKIDES GAASIKROMATOGRAAFIA ABIL

1.   Reguleerimisala

Käesolev meetod sobib trans-anetooli määramiseks aniisimaitselistes piiritusjookides kapillaargaasikromatograafia abil.

2.   Viited normidele

ISO 3696: 1987 Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.   Põhimõte

Piiritusjoogi trans-anetooli kontsentratsioon määratakse kindlaks gaasikromatograafia abil. Kui uuritavas proovis ei leidu estragooli looduslikul kujul, lisatakse proovile ja teadaoleva kontsentratsiooniga trans-anetooli võrdluslahusele sama kogus sisestandardit, nt 4-allüülanisooli (estragooli), lahjendatakse mõlemad lahused 45 % etanoolilahusega ja süstitakse otse gaasikromatograafi. Suures koguses suhkrut sisaldavad liköörid tuleb enne proovide ettevalmistamist ja analüüsimist ekstraheerida.

4.   Reaktiivid ja materjalid

Analüüsil tuleb kasutada üksnes vähemalt 98 % puhtusega reaktiive. Kasutada tuleb vähemalt 3. klassi vett vastavalt ISO 3696 standardile.

Võrdlusaineid tuleks säilitada külmas (4 °C), valguse eest kaitstult, alumiiniumist anumates või toonitud (merevaigukollasest) klaasist reaktiivipudelites. Korgid peaksid soovitavalt olema alumiiniumtihendiga. Trans-anetool tuleb enne kasutamist “sulatada” kristallilisest olekust, kuid temperatuur ei tohi kunagi ületada 35 °C.

4.1.	96mahuprotsendiline etanool (CAS 64-17-5)

4.2.	1-metoksü-4-(1-propenüül)benseen; (trans-anetool) (CAS 4180-23-8)

4.3.	4-allüülanisool (estragool) (CAS 140-67-0), soovitatav sisestandard

4.4	45mahuprotsendiline etanool 378 g 96mahuprotsendilisele etanoolile lisatakse 560 g destilleeritud vett.

4.5.

Standardlahuste valmistamine Kõiki standardlahused tuleks säilitada toatemperatuuril (15–35 °C), valguse eest kaitstult, alumiiniumist anumates või toonitud (merevaigukollasest) klaasist reaktiivipudelites. Kork peaks soovitavalt olema alumiiniumtihendiga. Trans-anetool ja 4-allüülanisool on vees praktiliselt lahustumatud ning tuleb seepärast enne 45protsendilise etanooli (4.4) lisamist lahustada 96protsendilises etanoolis (4.1). Põhilahused tuleb valmistada värskelt iga nädal. 4.5.1.   Standardlahus A Trans-anetooli põhilahus (kontsentratsioon: 2 g/l) 40 mg trans-anetooli (4.2) kaalutakse 20 ml mõõtekolbi (või 400 mg 200 ml mõõtekolbi jne). Lisatakse veidi 96protsendilist etanooli (4.1) ja täiendatakse kuni märgini 45protsendilise etanooliga (4.4) ning segatakse hoolikalt. 4.5.2.   Sisestandardi lahus B Sisestandardi põhilahus, näiteks estragool (kontsentratsioon: 2 g/l) 40 mg estragooli (4.3) kaalutakse 20 ml mõõtekolbi (või 400 mg 200 ml mõõtekolbi jne). Lisatakse veidi 96protsendilist etanooli (4.1) ja täiendatakse kuni märgini 45protsendilise etanooliga (4.4) ning segatakse hoolikalt. 4.5.3.   Leekionisatsioonidetektori näitude lineaarsuse kontrollimiseks kasutatavad lahused Leekionisatsioonidetektori näitude lineaarsust tuleb analüüsi jaoks kontrollida piiritusjookide trans-anetooli kontsentratsiooni vahemikus 0–2,5 g/l. Analüüsimisel lahjendatakse piiritusjookide uuritavaid proove 10 korda. Meetodis kirjeldatud analüüsitingimusteks vajalikud põhilahused, mis vastavad uuritava proovi trans-anetooli kontsentratsioonile 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 ja 0,25 g/l, valmistatakse ette järgmiselt: võetakse 0,5, 1, 1,5, 2 ja 2,5 ml põhilahust A (4.5.1) ja pipetitakse eraldi 20 ml mõõtekolbidesse; igasse kolbi pipetitakse 2 ml sisestandardi lahust B (4.5.2) ja täiendatakse kuni märgini 45protsendilise etanooliga (4.4) ning segatakse hoolikalt. Pimelahust (8.4) kasutatakse 0 g/l lahusena. 4.5.4.   Standardlahus C 20 ml mõõtekolbi pipetitakse 2 ml standardlahust A (4.5.1), lisatakse 2 ml sisestandardi lahust B (4.5.2) ja täiendatakse kuni märgini 45protsendilise etanooliga (4.4) ning segatakse hoolikalt.

5.   Seadmed ja aparatuur

5.1.	Kapillaargaasikromatograaf, millel on leekionisatsioonidetektor ja integraator või muu andmekäitlussüsteem, millega on võimalik mõõta piigikõrgusi või piigipindalasid, ja automaatne proovivõtuvahend või vajalikud seadmed proovi sisestamiseks süstlaga.

5.2.	Jaotatud/jaotamata vooluga injektor

5.3.	Kapillaarkolonn, näiteks: pikkus: 50 m siseläbimõõt: 0,32 mm statsionaarse faasi kile paksus: 0,2 μm statsionaarne faas: FFAP – muundatud TPA-polüetüleenglükooli võrkstruktuuriga poorne polümeer.

5.4.	Tavapärased laboriseadmed: A-täpsusklassiga klaasist mõõtekolvid (täpsus: ± 0,1 mg).

6.   Kromatograafia tingimused

Kolonni tüüp ja mõõtmed ning gaasikromatograafia tingimused peaksid olema sellised, et anetool ja sisestandard on eraldatud teineteisest ja kõikidest määramist segavatest ainetest. Punktis 5.3 näidisena esitatud kolonni tüüpilised tingimused on järgmised.

6.1.	Kandegaas: heelium, analüütiliselt puhas

6.2.	Voolukiirus: 2 ml/min

6.3.	Injektori temperatuur: 250 °C

6.4.	Detektori temperatuur: 250 °C

6.5.	Ahju temperatuuri tingimused: isotermiline, 180 °C, läbijooksuaeg 10 minutit

6.6.	Süstitav maht: 1 μl, jaotatud 1: 40.

7.   Proovid

Proove tuleks hoida toatemperatuuril, valguse ja külma eest varjatult.

8.   Menetlus

8.1.   Estragooli esinemise uurimine proovis

Tagamaks, et proovis ei esine estragooli loomulikul kujul, tuleks teha pimekatse ilma sisestandardit lisamata. Kui proovis esineb estragooli loomulikul kujul, tuleb valida mõni teine sisestandard (näiteks mentool).

2 ml proovi pipetitakse 20 ml mõõtekolbi ja täiendatakse kuni märgini 45protsendilise etanooliga (4.4) ning segatakse hoolikalt.

8.2.   Uuritavate proovide ettevalmistamine

2 ml proovi pipetitakse 20 ml mõõtekolbi, lisatakse 2 ml sisestandardi lahust B (4.5.2) ja täiendatakse kuni märgini 45protsendilise etanooliga (4.4) ning segatakse hoolikalt.

8.3   Pimekatse

2 ml sisestandardi lahust B (4.5.2) pipetitakse 20 ml mõõtekolbi ja täiendatakse kuni märgini 45protsendilise etanooliga (4.4) ning segatakse hoolikalt.

8.4.   Lineaarsuse kontroll

Enne analüüsi alustamist tuleks kontrollida leekionisatsioonidetektori näitude lineaarsust, analüüsides iga lineaarsuse standardlahust (4.5.3) järjest kolm korda.

Iga injektsiooni puhul koostatakse integraatori piigipindalade või piigikõrguste põhjal graafik, mis väljendab emalahuse kontsentratsiooni (g/l) ja suhtarvu R suhet.

R trans-anetooli piigikõrgus või pindala jagatud estragooli piigikõrguse või pindalaga.

Peaks tekkima sirgjoon.

8.5.   Määramine

Süstitakse pimelahus (8.3), seejärel standardlahus C (4.5.4), üks lineaarsuse standardlahus (4.5.3), mis toimib kvaliteedikontrolli proovina (selle võib valida uuritava proovi tõenäolise trans-anetooli kontsentratsiooni alusel), ja viis uuritavat lahust (8.2); analüütilise stabiilsuse tagamiseks süstitakse lineaarsuse (kvaliteedikontrolli) standard iga 5 uuritava proovi järel.

9.   Kaliibrimisteguri arvutamine

Mõõdetakse trans-anetooli ja sisestandardi piikide pindala (integraatori või muu andmekäitlussüsteemi abil) või piikide kõrgus (käsitsi integreerimise teel).

9.1.   Kaliibrimisteguri (RFi) arvutamine

Kaliibrimistegur arvutatakse järgmiselt:

RFi = (Ci/pindala või kõrgusi)*(pindala või kõrgusiš/Ciš)

kus

Ci	on trans-anetooli kontsentratsioon standardlahuses A (4.5.1)

Cis	on sisestandardi kontsentratsioon standardlahuses B (4.5.2)

pindalai

on trans-anetooli piigi pindala (või kõrgus)

pindalais

on sisestandardi piigi pindala (või kõrgus)

RFi arvutatakse viie lahuse C (4.5.4) proovi põhjal.

9.2.   Lineaarsuse kontrollimise lahuste analüüs

Süstitakse lineaarsuse kontrollimise lahus (4.5.3).

9.3.   Proovi analüüs

Süstitakse uuritava proovi lahus (8.2).

10.   Tulemuste arvutamine

Trans-anetooli kontsentratsiooni arvutamise valem on järgmine:

ci= Ciš * (pindala või kõrgusi/pindala või kõrgusiš)*RFi

kus

ci	on uuritav trans-anetooli kontsentratsioon

Ciš	on sisestandardi kontsentratsioon uuritavas lahuses (4.5.2)

Pindala või kõrgusi

on trans-anetooli piigi pindala või kõrgus

Pindala või kõrgusiš

on sisestandardi piigi pindala või kõrgus

RFi	on kaliibrimistegur (arvutatud vastavalt punktile 9.1)

Trans-anetooli kontsentratsioon väljendatakse grammides liitri kohta ühe kümnendkoha täpsusega.

11.   Kvaliteedi tagamine ja kontroll

Kromatogrammid peaksid olema sellised, et anetool ja sisestandard on eraldatud teineteisest ning kõikidest määramist segavatest ainetest. RFi väärtus arvutatakse lahuse C (4.5.4) viie süstimise tulemuste põhjal. Kui variatsioonikordaja (CV % = (standardhälve/keskmine)*100)) on vahemikus ± 1 %, on RFi keskmine väärtus aktsepteeritav.

Eespool esitatud arvutust tuleks kasutada trans-anetooli kontsentratsiooni arvutamisel lineaarsuse kontrollimise lahustest (4.5.3) kvaliteedikontrolliks valitud proovis.

Kui sisemise kvaliteedikontrolli prooviks valitud lineaarsuslahuse analüüsi tulemuste keskmine jääb ± 2,5 % piiresse nende teoreetilisest väärtusest, on uuritavade proovide tulemused aktsepteeritavad.

12.   Suures koguses suhkrut sisaldava piiritusjoogiproovi ja likööriproovi töötlemine enne gaasikromatograafiaanalüüsi

Alkoholi ekstraheerimine suures koguses suhkrut sisaldavast piiritusjoogist, et määrata kindlaks trans-anetooli sisaldus kapillaargaasikromatograafia abil.

12.1.   Põhimõte

Võetakse likööriproovi alikvoot ja lisatakse sellele sisestandardit, mille kontsentratsioon sarnaneb analüüdi (trans-anetool) kontsentratsioonile likööris. Lisatakse naatriumfosfaatdodekahüdraati ja veevaba ammooniumsulfaati. Saadud segu loksutatakse hoolikalt ning jahutatakse, misjärel moodustub kaks kihti; ülemine alkoholikiht eemaldatakse. Võetakse selle alkoholikihi alikvoot ja lahjendatakse 45protsendilise etanoolilahusega (4.4) (Märkus: selles etapis ei lisata sisestandardit, kuna see on juba lisatud). Saadud lahust analüüsitakse gaasikromatograafia abil.

12.2.   Reaktiivid ja materjalid

Ekstraheerimise ajal tuleb kasutada üksnes vähemalt 99 % puhtusega reaktiive.

12.2.1.

Ammooniumsulfaat, veevaba (CAS 7783-20-2).

12.2.2.

Naatriumfosfaat, kahealuseline, dodekahüdraat (CAS 10039-32-4).

12.3.   Seadmed ja aparatuur

Erlenmeyeri kolvid, jaotuskolvid, külmik.

12.4.   Menetlus

12.4.1.   Estragooli esinemise uurimine proovis

Tagamaks, et proovis ei esine estragooli loomulikul kujul, tuleks teha pimeekstraheerimine (12.6.2) ja katse ilma sisestandardit lisamata. Kui proovis esineb estragooli loomulikul kujul, tuleb valida mõni teine sisestandard.

12.4.2.   Ekstraheerimine

5 ml 96 % etanooli (4.1) pipetitakse Erlenmeyeri kolbi, kuhu kaalutakse seejärel 50 mg sisestandardit (4.3) ja lisatakse 50 ml proovi. Lisatakse 12 g veevaba ammooniumsulfaati (12.2.1) ja 8,6 g kahealuselist naatriumfosfaatdodekahüdraati (12.2.2). Kolb suletakse korgiga.

Kolbi loksutatakse vähemalt 30 minutit. Kasutada võib mehaanilist loksutit, kuid mitte tefloniga kaetud magnetseguri varrast, kuna teflon absorbeerib osa analüüdist. Tuleb arvesse võtta, et lisatud soolad ei lahustu täielikult.

Korgiga suletud kolb asetatakse vähemalt kaheks tunniks külmikusse (T < 5 °C).

Selle aja möödudes peaks olema tekkinud kaks selgelt eristuvat vedelikukihti ja tahke jääk. Alkoholikiht peaks olema selge; kui see nii ei ole, asetatakse kolb tagasi külmikusse, kuni tekib selgelt eristuv kiht.

Kui alkoholikiht on selge, eemaldatakse alikvoot (nt 10 ml) ettevaatlikult ilma veekihti segamata, asetatakse merevaigukollasesse pudelisse ja suletakse kindlalt.

12.4.3.   Uuritava ekstraheeritud proovi ettevalmistamine

Ekstraktil (12.4.2) lastakse soojeneda toatemperatuurini.

Võetakse 2 ml toatemperatuurini viidud ekstraheeritud proovi alkoholikihti ja pipetitakse 20 ml mõõtekolbi, täiendatakse kuni märgini 45 % etanooliga (4.4) ja segatakse hoolikalt.

12.5.   Määramine

Järgitakse punktis 8.5 kirjeldatud menetlust.

12.6.   Tulemuste arvutamine

Tulemuste arvutamiseks kasutatakse järgmist valemit:

Ci = (miš/V)* (pindalai/pindalaiš) *RFi

kus

miš	on kasutatud (12.4.2) sisestandardi (4.3) mass (milligrammides)

V	on uuritava proovi ruumala (50 ml)

RFi	on kaliibrimistegur (9.1)

pindalai

on trans-anetooli piigi pindala

pindalaiš

on sisestandardi piigi pindala

Tulemused väljendatakse grammides liitri kohta ühe kümnendkoha täpsusega.

12.7.   Kvaliteedi kontroll ja tagamine

Järgitakse eespool punktis 11 kirjeldatud menetlust.

13.   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

Laboritevahelise katse statistilised tulemused:

järgmistes tabelites on esitatud anetooli väärtused.

Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed.

Proovide liigid:

A	pastis, pimedad kordusproovid

B	pastis, pimedad kordusproovid

C	pastis, pimedad kordusproovid

D	pastis, pimedad kordusproovid

E	pastis, üksikud kordusproovid

F	pastis, üksikud kordusproovid

Proovide liigid:

G	ouzo, jaotustase (*)

H	anis, pimedad kordusproovid

I	aniisimaitseline liköör, kordusproovid

J	aniisimaitseline liköör, kordusproovid

VI.   GLÜTSÜRRITSIINHAPE. GLÜTSÜRRITSIINHAPPE MÄÄRAMINE KÕRGEFEKTIIVSE VEDELIKKROMATOGRAAFIA ABIL

1.   Reguleerimisala

Käesolev meetod sobib glütsürritsiinhappe määramiseks aniisimaitselistes piiritusjookides kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil. Määruses (EMÜ) nr 1576/89 täpsustatakse, et aniisimaitseline piiritusjook nimetusega “ pastis ” peab sisaldama 0,05–0,5 g glütsürritsiinhapet liitri kohta.

2.   Viited normidele

ISO 3696: 1987 Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.   Põhimõte

Glütsürritsiinhappe kontsentratsioon määratakse kindlaks kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil UV-detektoriga. Standardlahus ja uuritav proov filtreeritakse ning süstitakse eraldi otse HPLC-süsteemi.

4.   Reaktiivid ja materjalid

Analüüsimisel kasutatakse ainult HPLC-puhtaid reaktiive, absoluutset alkoholi ja 3. klassi vett vastavalt ISO 3696 standardile.

4.1.	96mahuprotsendiline etanool (CAS 64-17-5).

4.2	Ammooniumglütsürritsinaat, C42H62O16.NH3 (glütsürritsiinhappe ammooniumsool) (molekulmass 839,98) (CAS 53956-04-0): puhtus vähemalt 90 % (glütsürritsiinhappe molekulmass 822,94).

4.3.	Jää-äädikas, CH3COOH, (CAS 64-19-7).

4.4.	Metanool, CH3OH (CAS 67-56-1).

4.5.	50mahuprotsendiline etanool 1 000  ml saamiseks temperatuuril 20 °C: —  96mahuprotsendilist etanooli (4.1): 521 ml —  vett (2.0): 511 ml.

4.6.

HPLC eluentide valmistamine 4.6.1.   Eluent A (näide) 80 mahuosa vett (2.0) 20 mahuosa äädikhapet (4.3). Eluenti degaseeritakse viis minutit. Märkus: kui kasutatavat vett ei ole mikrofiltreeritud, on soovitatav valmistatud eluenti filtreerida orgaaniliste lahustite filtriga, mille poori suurus on kuni 0,45 μm. 4.6.2.   Eluent B Metanool (4.4).

4.7.

Standardlahuste valmistamine Kõik standardlahused tuleb valmistada värskelt iga kahe kuu järel. 4.7.1.   Võrdluslahus C 25 mg ammooniumglütsürritsinaati (4.2) kaalutakse 0,1 mg täpsusega 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse veidi 50protsendilist etanooli (4.5) ja ammooniumglütsürritsinaat lahustatakse. Kui see on lahustunud, täiendatakse kuni märgini 50protsendilise etanooliga (4.5). Filtreeritakse läbi orgaaniliste lahustite filtri. 4.7.2.   Mõõteriistade näitude lineaarsuse kontrollimiseks kasutatavad standardlahused Valmistatakse 1,0 g/l põhilahus, kaaludes 100 mg ammooniumglütsürritsinaati 0,1 mg täpsusega 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse veidi 50protsendilist etanooli (4.5) ja ammooniumglütsürritsinaat lahustatakse. Kui see on lahustunud, täiendatakse kuni märgini 50protsendilise etanooliga (4.5). Valmistatakse veel vähemalt neli lahust, mis vastavad 0,05, 0,1, 0,25 ja 0,5 g ammooniumglütsürritsinaadile liitri kohta, pipettides vastavalt 5, 10, 25 ja 50 ml 1,0 g/l põhilahust eraldi 100 ml mõõtekolbidesse. Täiendatakse kuni märgini 50protsendilise etanooliga (4.5) ja segatakse hoolikalt. Kõik lahused filtreeritakse läbi orgaaniliste lahustite filtri.

5.   Seadmed ja aparatuur

5.1.   Lahutamissüsteem

5.1.1.

Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia

5.1.2.

Pumbasüsteem, mis võimaldab saavutada ja säilitada püsivat või programmeeritud voolukiirust suure täpsusega.

5.1.3.

UV spektrofotomeetriline detektorsüsteem: seadistatakse väärtusele 254 nm.

5.1.4.

Lahusti degaseerimise süsteem.

5.2.	Arvutisüsteem või meerik, mille funktsioonivõime on kooskõlas ülejäänud süsteemiga.

5.3.	Kolonn (näide) Materjal: roostevaba teras või klaas Siseläbimõõt: 4–5 mm Pikkus: 100–250 mm Statsionaarne faas: võrkstruktuuriga ränidioksiid (soovitavalt sfäärilise) oktadetsüüli funktsionaalrühmaga (C18), osakeste maksimumsuurus: 5 μm.

5.4.	Laboriseadmed 5.4.1. Analüütilised kaalud 0,1 mg täpsusega 5.4.2. A-täpsusklassiga klaasist mõõtekolvid 5.4.3. Mikromembraanfiltreerimisseade väikeste koguste jaoks.

6.   Kromatograafia tingimused

6.1.	Elutsiooninäitajad: (näide) —  voolukiirus: 1 ml/min, —  lahusti A = 30 %, —  lahusti B = 70 %.

6.2.	Määramine: —  UV = 254 nm

7.   Menetlus

7.1.   Alkohoolse joogi proovi ettevalmistamine

Vajaduse korral filtreeritakse läbi orgaaniliste lahustite filtri (poori läbimõõt 0,45 μm)

7.2.   Määramine

Pärast kromatograafia tingimuste stabiliseerumist

kus

c	on glütsürritsiinhappe kontsentratsioon uuritavas alkohoolses joogis (g/l)

C	on ammooniumglütsürritsinaadi kontsentratsioon võrdluslahuses (g/l)

h	on uuritava alkohoolse joogi glütsürritsiinhappe piigi pindala (või kõrgus)

H	on võrdluslahuse glütsürritsiinhappe piigi pindala (või kõrgus)

P	on võrdlusainena kasutatava ammooniumglütsürritsinaadi puhtusaste ( %)

823	on glütsürritsiinhappe molaarmass

840	on ammooniumglütsürritsinaadi molaarmass.

8.   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

Laboritevahelise katse statistilised tulemused:

järgmises tabelis on esitatud glütsürritsiinhappe väärtused.

Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed.

Proovide liigid

A	pastis, pimedad kordusproovid

B	pastis, jaotustase (*)

C	pastis, pimedad kordusproovid

D	pastis, pimedad kordusproovid

E	pastis, pimedad kordusproovid

VII.   HALKOONID. HALKOONIDE ESINEMISE KONTROLL PASTISES KÕRGEFEKTIIVSE VEDELIKKROMATOGRAAFIA ABIL

1.   Reguleerimisala

Käesolev meetod sobib halkoonide esinemise kontrollimiseks aniisimaitselistes piiritusejookides. Halkoonid on flavonoidide perekonda kuuluvad looduslikud värvained, mis esinevad lagritsajuures (Glyxyrrhiza glabra).

Selleks, et aniisimaitselist alkohoolset jooki võiks nimetada “ pastiseks ”, peab see sisaldama halkoone (määrus (EMÜ) nr 1576/89).

2.   Viited normidele

ISO 3696: 1987, Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.   Põhimõte

Valmistatakse lagritsaekstrakti võrdluslahus. Halkoonide esinemine tehakse kindlaks kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil UV-detektoriga.

4.   Reaktiivid ja materjalid

Analüüsimisel kasutatakse ainult HPLC-puhtaid reaktiive. Etanool peaks olema 96protsendiline. Kasutada tohib üksnes 3. klassi vett vastavalt ISO 3696 standardile.

4.1.	96mahuprotsendiline etanool (CAS 64-17-5)

4.2.	Atsetonitriil, CH3CN (CAS 75-05-8)

4.3.	Võrdlusmaterjal: Glycyrrhiza glabra: lagrits, magusjuur Jämedalt jahvatud lagritsajuur (Glycyrrhiza glabra). Pulgakujuliste osakeste keskmised mõõtmed: pikkus: 10–15 mm, paksus: 1–3 mm.

4.4.	Naatriumatsetaat, CH3COONa (CAS 127-09-3)

4.5.	Jää-äädikas, CH3COOH (CAS 64-19-7)

4.6.

Lahuste valmistamine 4.6.1.   50mahuprotsendiline etanool 1 000  ml saamiseks temperatuuril 20 °C: —  96mahuprotsendilist etanooli (4.1): 521 ml, —  vett (2.0): 511 ml 4.6.2.   Lahusti A: atsetonitriil Atsetonitriil (4.2) HPLC analüütilise puhtusega. Degaseeritakse. 4.6.3.   Lahusti B: 0,1 M naatriumatsetaadi puhverlahus, pH 4,66. Mõõtekolbi kaalutakse 8,203 g naatriumatsetaati (4.4), lisatakse 6,005 g jää-äädikat (4.5) ning täiendatakse veega (2) 1 000  ml lahuse saamiseni.

5.   Võrdlusekstrakti valmistamine Glycyrrhiza glabra’st (4.3)

5.1.	Ümarapõhjalisse destillatsioonikolbi kaalutakse 10 g peenestatud lagritsajuurt (Glycyrrhiza glabra) (4.3). —  Lisatakse 100 ml 50mahuprotsendilist etanooli (4.6.1). —  Keedetakse püstjahutiga kolvis üks tund. —  Filtreeritakse. —  Filtraat säilitatakse hilisemaks kasutamiseks.

5.2.	Lagritsaekstrakt võetakse filtrist välja. —  Ekstrakt pannakse ümarapõhjalisse destillatsioonikolbi. —  Lisatakse 100 ml 50mahuprotsendilist etanooli (4.6.1). —  Keedetakse püstjahutiga kolvis üks tund. —  Filtreeritakse. Filtraat säilitatakse hilisemaks kasutamiseks.

5.3.	Lagritsajuure ekstraheerimine tuleb läbi viia kolm korda järjest.

5.4.	Kolm filtraati valatakse kokku.

5.5.	Lahusti faas (5.4) aurustatakse vaakumpöördaurustil.

5.6.	Jääkekstrakt (5.5) valatakse üle 100 ml 50mahuprotsendilise etanooliga (4.6.1).

6.   Seadmed ja aparatuur

6.1.   Lahutamissüsteem.

6.1.1.

Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia.

6.1.2.

Pumbasüsteem, mis võimaldab saavutada ja säilitada püsivat või programmeeritud voolukiirust kõrgel rõhul.

6.1.3.

UV/nähtava kiirguse spektrofotomeetriline detektorsüsteem, mida on võimalik seadistada 254 ja 370 nm-le.

6.1.4.

Lahusti degaseerimise süsteem.

6.1.5.

Kolonnahi, mida on võimalik seadistada temperatuurile 40 ± 0,1 °C.

6.2.	Arvutisüsteem või meerik, mille töönäitajad on kooskõlas ülejäänud lahutamissüsteemiga.

6.3.	Kolonn Materjal: roostevaba teras või klaas Siseläbimõõt: 4–5 mm Statsionaarne faas: võrkstruktuuriga ränidioksiid (soovitavalt sfäärilise) oktadetsüüli funktsionaalrühmaga (C18), osakeste suurus: kuni 5 μm (vorkstruktuuriga faas).

6.4.

Tavapärased laboriseadmed, sealhulgas: 6.4.1. Analüütilised kaalud. (täpsus: ± 0,1 mg). 6.4.2. püstjahutiga destilleerimisaparaat, mis koosneb näiteks järgmistest osadest: —  standardse klaasist lihvkorgiga 250 ml ümarkolb, —  30 cm püstjahuti, ja —  soojusallikas (ekstraktiivaine põhjakõrbemist tuleb asjakohasel viisil vältida). 6.4.3. Pöördaurusti. 6.4.4. Filtreerimisseade (st Büchneri lehter).

6.5.

Kromatograafia tingimused (näide). 6.5.1. Lahustite A (4.6.2) ja B (4.6.3) elutsiooninäitajad: —  gradiendi muutus väärtuselt 20/80 (v/v) väärtusele 50/50 (v/v) 15 minuti jooksul, —  gradiendi muutus väärtuselt 50/50 (v/v) väärtusele 75/25 (v/v) viie minuti jooksul, —  võrdne tugevus väärtusel 75/25 (v/v) viie minuti jooksul, —  kolonn stabiliseeritakse süstide vahelisel ajal, —  võrdne tugevus väärtusel 20/80 (v/v) viie minuti jooksul. 6.5.2. Voolukiirus: 1 milliliiter minutis. 6.5.3. UV-detektori seaded: halkoonide esinemise kindlakstegemiseks peaks detektor olema reguleeritud 370 nm-le ja glütsürritsiinhappe kindlakstegemiseks 254 nm-le. Märkus: lainepikkus tuleb muuta (370 nm-lt 254 nm-le) 30 sekundit enne glütsürritsiinhappe elueerimise piigi algust.

7.   Menetlus

7.1.   Alkohoolse joogi proovi ettevalmistamine

Vajaduse korral filtreeritakse läbi orgaaniliste lahustite filtri (poori läbimõõt: 0,45 μm).

7.2.   Lagritsaekstrakti (5.6) jääkekstrakti ettevalmistamine

Enne analüüsi valmistatakse lahjendus 50mahuprotsendilise etanooliga (4.6.1) suhtes 1: 10.

7.3.   Määramine

7.3.1.

Süstitakse 20 μl ettevalmistatud lagritsaekstrakti (7.2). Analüüsitakse, kasutades eespool kirjeldatud kromatograafia tingimusi (6.5).

7.3.2.

Süstitakse 20 μl proovi (7.1) (aniisimaitselise alkohoolse joogi proov). Analüüsitakse, kasutades eespool kirjeldatud kromatograafia tingimusi (6.5).

7.3.3.

Võrreldakse kahte kromatogrammi. Halkoonide väljumispiirkonnas peavad kaks kromatogrammi olema väga sarnased (määramisel 370 nm juures eespool kirjeldatud analüüsitingimustel) (vt joonis 1).

8.    Pastise tüüpiline kromatogramm

Joonis 1

Eespool kirjeldatud meetodil saadud kromatogramm, mis näitab halkoonide esinemist pastises. Piigid 1–8 on halkoonid, piik 9 on glütsürritsiinhape.

9.   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

Laboritevahelise katse tulemused:

järgmises tabelis on esitatud tulemuslikkuse näitajad halkoonide esinemise või puudumise määramisel pastises ja aniisimaitselistes piiritusjookides.

Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed.

Proovide liigid:

A	pastis, pimedad kordusproovid

B	pastis, üksikproov

C	pastis, üksikproov

D	“pastis” (ei sisalda halkoone), pimedad kordusproovid

E	“pastis” (ei sisalda halkoone), pimedad kordusproovid

F	aniisimaitseline liköör (ei sisalda halkoone), pimedad kordusproovid

G	aniisimaitseline liköör (ei sisalda halkoone), pimedad kordusproovid

H	ouzo (ei sisalda halkoone), üksikproov

I	ouzo (ei sisalda halkoone), üksikproov

J	anis (ei sisalda halkoone), pimedad kordusproovid

K	“pastis” (ei sisalda halkoone), pimedad kordusproovid.

▼M2

VIII.   KOGUSUHKUR

1.    Kohaldamisala

HPLC-RI meetodit kasutatakse kogusuhkru (väljendatuna invertsuhkruna) määramiseks piiritusjookides, välja arvatud muna ja piimatooteid sisaldavad liköörid.

Meetod on valideeritud pastis'i, destilleeritud anis'i, kirsilikööri, crème de (millele järgneb kasutatud puuvilja või tooraine nimetus) ja Crème de Cassis'i laboritevahelisel katsel, kontsentratsioonivahemikus 10,86–509,7 g/l. Seadme näidu lineaarsust kontrolliti kontsentratsioonivahemikus 2,5–20,0 g/l.

Kõnealune meetod ei ole ette nähtud suhkru vähese sisalduse määramiseks.

2.    Viited normidele

ISO 3696:1987 Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.    Põhimõte

Suhkrulahuseid analüüsitakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil, et määrata kindlaks nende glükoosi, fruktoosi, sahharoosi, maltoosi ja laktoosi kontsentratsioon.

Osutatud meetod on esitatud näitena; selle puhul kasutatakse statsionaarset alküülamiinifaasi ja diferentsiaalrefraktomeetrilist detektorit. Statsionaarse faasina oleks samuti võimalik kasutada anioonivahetusvaiku.

4.    Reaktiivid ja materjalid

4.1.	Glükoos (CAS 50-99-7), puhtusega vähemalt 99 %.

4.2.	Fruktoos (CAS 57-48-7), puhtusega vähemalt 99 %.

4.3.	Sahharoos (CAS 57-50-1), puhtusega vähemalt 99 %.

4.4.	Laktoos (CAS 5965-66-2), puhtusega vähemalt 99 %.

4.5.	Maltoosmonohüdraat (CAS 6363-53-7), puhtusega vähemalt 99 %.

4.6.	Puhas atsetonitriil (CAS 75-05-8) HPLC analüüsi jaoks.

4.7.	Destilleeritud või demineraliseeritud vesi, eelistatavalt mikrofiltritud.

4.8.

Lahustid (näide) Eluendi koostis on järgmine: 75 mahuosa atsetonitriili (4.6), 25 mahuosa destilleeritud vett (4.7). Enne kasutamist eluent degaseeritakse; selleks juhitakse eluendist aeglase vooluna 5–10 minuti jooksul läbi heeliumi. Kui kasutatavat vett ei ole mikrofiltritud, tuleks eluent filtrida orgaaniliste lahustite filtriga, mille poori suurus on kuni 0,45 μm.

4.9.	Absoluutne etanool (CAS 64-17-5)

4.10.

Etanoolilahus (5 %, v/v).

4.11.

Standardpõhilahuse (20 g/l) valmistamine Kaalutakse 2 g analüüsitavat suhkrut (4.1–4.5) ja viiakse ilma kadudeta üle 100 ml mõõtekolbi. (NB! 2 g maltoosile vastab 2,11 g maltoosmonohüdraati.) Täiendatakse kuni 100 ml-ni 5-mahuprotsendilise alkoholilahusega (4.10), loksutatakse ja säilitatakse temperatuuril üle + 4 °C. Uus põhilahus valmistatakse kord nädalas.

4.12.

Standardtöölahuste (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 ja 20,0 g/l) valmistamine Põhilahust (20 g/l) lahjendatakse sobivas vahekorras 5-mahuprotsendilise alkoholilahusega (4.10), et saada viis standardtöölahust (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 ja 20,0 g/l). Filtritakse filtriga, mille poori suurus on kuni 0,45 μm (5.3).

5.    Seadmed ja aparatuur

5.1.   Kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) süsteem, mille abil on võimalik saavutada kõikide suhkrute lahutumist kuni nulljooneni.

5.1.1.

Kõrgefektiivne vedelikkromatograaf, millel on kuuekäiguline injektsiooniventiil, mille sisestussilmus on 10 μl, või mis tahes muu automaatne või manuaalne seade mikrokoguste täpseks sissesüstimiseks.

5.1.2.

Pumbasüsteem, mis võimaldab saavutada ja hoida püsivat või programmeeritud voolukiirust suure täpsusega.

5.1.3.

Diferentsiaalrefraktomeeter.

5.1.4.

Integreeriv arvutisüsteem või isekirjutaja, mille tase vastab ülejäänud seadmete tasemele.

5.1.5.

Eelkolonn Analüütilisele kolonnile soovitatakse lisada sobiv eelkolonn.

5.1.6.

Kolonn (näide): Materjal: roostevaba teras või klaas Siseläbimõõt: 2–5 mm. Pikkus: 100–250 mm (sõltuvalt pakendi osakeste suurusest), näiteks 250 mm, kui osakeste läbimõõt on 5 μm. Statsionaarne faas: ränidioksiidiga seotud alküülamiinfunktsionaalrühmad, osakeste suurus kuni 5 μm.

5.1.7.

Kromatografeerimistingimused (näide): Eluent (4.8), voolukiirus: 1 milliliiter minutis. Tuvastamine: diferentsiaalrefraktomeetria. Detektori täieliku stabiilsuse tagamiseks tuleks see sisse lülitada paar tundi enne kasutamist. Võrdlusküvett tuleb täita eluendiga.

5.2.	Analüütilised kaalud täpsusega 0,1 mg.

5.3.	Seade väikeste lahusekoguste filtrimiseks, milles kasutatakse mikromembraane 0,45 μm.

6.    Proovi säilitamine

Pärast kättesaamist säilitatakse proove kuni analüüsimiseni toatemperatuuril.

7.    Määramise käik

7.1.   A OSA: proovi ettevalmistamine

7.1.1.

Proovi loksutatakse.

7.1.2.

Proov filtritakse läbi filtri, mille poori suurus on kuni 0,45 μm (5.3).

7.2.   B OSA: HPLC

7.2.1.   Määramine

Kolonni süstitakse 10 μl standardlahuseid (4.12) ja proove (7.1.2). Tehakse analüüs sobivatel kromatograafilistel tingimustel, näiteks nagu eespool kirjeldatud.

7.2.2.

Kui proovi mõne piigi pindala (või kõrgus) on suurem kui vastava piigi kõige kontsentreeritum standard, tuleb proovi lahjendada destilleeritud veega ja teha kordusanalüüs.

8.    Arvutamine

Võrreldakse kaht kromatogrammi, mis on saadud standardlahuse ja kange alkohoolse joogiga. Piigid määratakse nende retentsiooniaja järgi. Mõõdetakse iga piigi pindala (või kõrgus) ja arvutatakse välisstandardi meetodi abil suhkru kontsentratsioon. Arvesse võetakse proovi kõiki lahjendamisi.

Lõpptulemuseks on sahharoosi, maltoosi, laktoosi, glükoosi ja fruktoosi summa, väljendatuna invertsuhkruna (g/l).

Invertsuhkrusisaldus arvutatakse proovis sisalduvate monosahhariidide ja taandavate disahhariidide summana, millele lisatakse glükoosi ja fruktoosi stöhhiomeetrilised kogused, mis arvutatakse olemasolevast sahharoosisisaldusest.

Invertsuhkur (g/l)

=

glükoos (g/l) + fruktoos (g/l) + maltoos (g/l) + laktoos (g/l) + (sahharoos (g/l) × 1,05)

1,05

=

(fruktoosi molekulmass + glükoosi molekulmass) / sahharoosi molekulmass

9.    Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

9.1.   Laboritevahelise katse statistilised tulemused

Vastavalt rahvusvaheliselt kokku lepitud eeskirjadele [1] [2] tehtud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uuringu põhjal saadi järgmised andmed.

▼M1

IX.   MUNAREBU. MUNAREBU KONTSENTRATSIOONI KINDLAKSMÄÄRAMINE PIIRITUSJOOKIDES – FOTOMEETRILINE MEETOD

1.   Reguleerimisala

Käesolev meetod sobib munarebu kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks vahemikus 40–250 g/l munaliköörides ja munasisaldusega liköörides.

2.   Viited normidele

ISO 3696:1897 Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid.

3.   Põhimõte

Munarebus sisalduvad etanoolis lahustuvad fosforiühendid ekstraheeritakse ja määratakse fotomeetriliselt fosformolübdaatkompleksina.

4.   Reaktiivid ja materjalid

4.1.	Bidestilleeritud vesi

4.2.	Kobediatomiit

4.3.	96mahuprotsendiline etanool (CAS 64-17-5)

4.4.	15 % magneesiumatsetaadi (CAS 16674-78-5) lahus

4.5.	10 % väävelhape (CAS 7664-93-9)

4.6.	1 N väävelhape.

4.7.	0,16 g/l kaaliumdivesinikfosfaadi (CAS 778-77-0), KH2PO4 lahus

4.8.

Reaktiiv fosfaadi määramiseks: 20 g ammooniummolübdaati (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24•4H20 lahustakse 400 ml vees temperatuuril 50 °C; teises anumas lahustatakse 1 g ammooniumvandaati (CAS 7803-55-6), NH4VO3 300  ml kuumas vees, lastakse jahtuda ja lisatakse 140 ml kontsentreeritud lämmastikhapet (CAS 7697-37-2). Jahutatud lahused valatakse kokku 1 000  ml mõõtekolbi ning täiendatakse kuni 1 000  ml märgini.

5.   Seadmed ja aparatuur

5.1.	100 ml Erlenmeyeri kolb

5.2.	Ultrahelivann (või magnetsegur)

5.3.	100 ml mõõtekolb

5.4.	20 °C veevann

5.5.	Filter (Whatman nr 4 või samaväärne)

5.6.	Portselan- (või plaatina-) tiigel

5.7.	Keeva vee vann

5.8.	Kuumutusplaat

5.9.

Muhvelahi

5.10.

50 ml mõõtekolb

5.11.

20 ml mõõtekolb

5.12.

Spektrofotomeeter, mis on reguleeritud 420 nm-le

5.13.

1 cm küvett.

6.   Proovid

Enne analüüsimist säilitatakse proove toatemperatuuril.

7.   Menetlus

7.1.   Proovide ettevalmistamine

7.1.1.

100 ml Erlenmeyeri kolbi (5.1) kaalutakse 10 g proovi.

7.1.2.

Järk-järgult lisatakse väikeste kogustena 70 ml etanooli (4.3), loksutatakse pärast iga lisamist ja asetatakse 15 minutiks ultrahelivanni (5.2) (või segatakse segu 10 minutit magnetseguriga (5.2) toatemperatuuril).

7.1.3.

Kolbi sisu viiakse 100 ml mõõtekolbi (5.3) ja lisatakse loputamiseks kasutatud etanool (4.3). Täiendatakse etanooliga (4.3) kuni kalibreerimismärgini ja asetatakse kolvid 20 °C veevanni (5.4). Temperatuuril 20 °C täiendatakse kuni kalibreerimismärgini.

7.1.4.

Lisatakse väike kogus kobediatomiiti (4.2) ja filtreeritakse (5.5), esimesed 20 ml visatakse ära.

7.1.5.

25 ml filtraati viiakse portselanist (või plaatinast) tiiglisse (5.6). Seejärel tuleb filtraat kontsentreerida kerge aurustamise teel keeva vee vannis (5.7), lisades 5 ml 15 % magneesiumatsetaadi lahust (4.4).

7.1.6.

Tiiglid asetatakse kuumutusplaadile (5.8) ja kuumutatakse täpselt kuivaks.

7.1.7.

Jääk tuhastatakse muhvelahjus (5.9) temperatuuril 600 °C kuumutamisel hõõgumiseni, kuni tuhk on valge, vähemalt poolteist tundi, kuid selle võib jätta ahju ka ööseks.

7.1.8.

Tuhk lahustatakse 10 ml 10 % väävelhappes (4.5), viiakse 50 ml mõõtekolbi (5.10) koos loputamiseks kasutatud destilleeritud veega (4.1) ja täiendatakse toatemperatuuril destilleeritud veega (4.1) kuni märgini. Selle tuhalahuse 5 ml alikvooti kasutatakse proovilahuse valmistamiseks fosfaadi fotomeetriliseks määramiseks.

7.2.   Fosfaadi fotomeetriline määramine

7.2.1.   Võrdluslahus

7.2.1.1.

10 ml 10 % väävelhapet (4.5) viiakse 50 ml mõõtekolbi (5.10) ja täiendatakse destilleeritud veega kuni märgini (4.1).

7.2.1.2.

5 ml selle lahuse alikvooti (7.2.1.1) viiakse 20 ml mõõtekolbi (5.11), lisatakse 1 ml 1 N väävelhapet (4.6) ja 2 ml fosfaadi reaktiivi (4.8) ning täiendatakse destilleeritud veega (4.1) kuni 20 ml-ni.

7.2.1.3.

Kolb korgitakse kergelt, seda loksutatakse ja kuumutatakse keeva vee vannis (5.7) 10 minutit, seejärel jahutatakse 20 °C veevannis (5.4) 20 minutit.

7.2.1.4.

1 cm küvett (5.13) täidetakse selle võrdluslahusega.

7.2.2.   Uuritav lahus

7.2.2.1.

5 ml tuhalahuse alikvooti (7.1.8) viiakse 20 ml mõõtekolbi (5.11), lisatakse 1 ml 1 N väävelhapet (4.6) ja 2 ml fosfaadi reaktiivi (4.8) ning täiendatakse destilleeritud veega (4.1) kuni 20 ml-ni.

7.2.2.2.

Kolb korgitakse kergelt, seda loksutatakse ja kuumutatakse keeva vee vannis (5.7) 10 minutit, seejärel jahutatakse 20 °C veevannis (5.4) 20 minutit.

7.2.2.3.

Tekkinud kollast lahust analüüsitakse kohe spektrofotomeetriliselt (5.12) 1 cm küvetis (5.13) 420 nm juures võrdluslahuse (7.2.1.4) taustal.

7.2.3.   Kalibreerimiskõver

7.2.3.1.

Kalibreerimiskõvera koostamiseks lisatakse 2 ml fosfaadi reaktiivi (4.8) alikvooti 20 ml mõõtekolbidesse (5.11), millest igaüks sisaldab 1 ml 1 N väävelhapet (4.6) ja vastavalt 0, 2, 4, 6, 8 ja 10 ml kaaliumdivesinikfosfaadi lahust (4.7) ning täiendatakse destilleeritud veega (4.1) kuni 20 ml märgini.

7.2.3.2.

Kolvid korgitakse kergelt, neid loksutatakse ja kuumutatakse keeva vee vannis (5.7) 10 minutit, seejärel jahutatakse 20 °C veevannis (5.4) 20 minutit ja analüüsitakse spektrofotomeetriliselt (5.12) 1 cm küvetis (5.13) 420 nm juures võrdluslahuse (7.2.1.4) taustal.

7.2.3.3.

Kalibreerimiskõvera koostamine: divesinikfosfaadi lahus (ml) 0 2 4 6 8 10 P2O5 (mg) 0 0,167 0,334 0,501 0,668 0,835

8.   Tulemuste esitamine

Munarebusisaldus g/l arvutatakse järgmise valemi abil:

kus

110	100 g munarebus sisalduva P2O5 (grammides) ümberarvestuskoefitsient

P2O5 mg

kalibreerimiskõvera alusel määratud väärtus

tihedus

munalikööri mass ruumalaühiku kohta (g/ml) temperatuuril 20 °C

E	munalikööri mass grammides

40	5 ml tuhalahuse alikvoodi lahjendusaste.

9.   Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus)

Laboritevahelise katse statistilised tulemused:

järgmises tabelis on esitatud väärtused munarebu puhul.

Vastavalt rahvusvaheliselt kokkulepitud menetlustele läbi viidud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uurimuse põhjal saadi järgmised andmed.

Proovide liigid

A	munaliköör, pimedad kordusproovid

B	munaliköör, pimedad kordusproovid

C	munaliköör, pimedad kordusproovid

D	munaliköör (lahjendatud), jaotustase (*)

E	munaliköör, pimedad kordusproovid

▼M2

X.   PIIRITUSJOOKIDES KÕRGEFEKTIIVSE VEDELIKKROMATOGRAAFIA (HPLC) ABIL JÄRGMISTE PUIDUST PÄRINEVATE ÜHENDITE MÄÄRAMINE: FURFURAAL, 5-HÜDROKSÜMETÜÜLFURFURAAL, 5-METÜÜLFURFURAAL, VANILLIIN, SIRELALDEHÜÜD, KONIFERÜÜLALDEHÜÜD, SINEPALDEHÜÜD, GALLUSHAPE, ELLAGHAPE, VANILLIINHAPE, SIRELHAPE JA SKOPOLETIIN

1.    Kohaldamisala

Kõnealune meetod on ette nähtud furfuraali, 5-hüdroksümetüülfurfuraali, 5-metüülfurfuraali, vanilliini, sirelaldehüüdi, koniferüülaldehüüdi, sinepaldehüüdi; gallushappe, ellaghappe, vanilliinhappe, sirelhappe ja skopoletiini määramiseks kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil.

2.    Viited normidele

Analüüsimeetod, mida on tunnustatud Rahvusvahelise Viinamarja- ja Veiniorganisatsiooni (OIV) peaassamblee ja mis on avaldatud Rahvusvahelise Viinamarja- ja Veiniorganisatsiooni poolt viite OIV-MA-BS-16: R2009 all.

3.    Põhimõte

Määramine kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, piikide tuvastamiseks kasutatakse UV-spektrofotomeetriat mitmel lainepikkusel ja spektrofluorimeetriat.

4.    Reagendid

Reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Kasutada tuleb destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett. Soovitatav on kasutada mikrofiltritud vett, mille eritakistus on 18,2 M Ω. cm.

4.1.	96-mahuprotsendiline alkohol.

4.2.	HPLC-kvaliteediga metanool (lahusti B).

4.3.	0,5 mahuprotsendini lahjendatud äädikhape (lahusti A).

4.4.	Liikuvad faasid: (esitatud vaid näitena). Lahusti A (0,5 % äädikhape) ja lahusti B (puhas metanool). Filtritakse läbi membraanfiltri (0,45 μm). Degaseeritakse vajaduse korral ultrahelivannis.

4.5.	Võrdlusstandardid, puhtus vähemalt 99 %: furfuraal, 5-hüdroksümetüülfurfuraal, 5-metüülfurfuraal, vanilliin, sirelaldehüüd, koniferüülaldehüüd, sinepaldehüüd; gallushape, ellaghape, vanilliinhape, sirelhape ja skopoletiin

4.6.

Võrdluslahus: standardained lahustatakse 50-mahuprotsendilises vee-alkoholi lahuses. Lõplik kontsentratsioon võrdluslahuses peaks olema järgmine: furfuraal: 5 mg/l; 5-hüdroksümetüülfurfuraal 10 mg/l; 5-metüülfurfuraal 2 mg/l; vanilliin; 5 mg/l; sirelaldehüüd: 10 mg/l; koniferüülaldehüüd: 5 mg/l; sinepaldehüüd: 5 mg/l; gallushape: 10 mg/l; ellaghape: 10 mg/l; vanilliinhape: 5 mg/l; sirelhape: 5 mg/l; skopoletiin: 0,5 mg/l.

5.    Seadmed

Tavalised laboriseadmed.

5.1.

Kõrgefektiivne vedelikkromatograaf, mille puhul saab kasutada kahekomponendilist gradienti ja mis on varustatud järgmisega: 5.1.1.  spektrofotomeetriline detektor, mis võimaldab mõõta lainepikkustel 260–340 nm. Piikide puhtuse kinnitamiseks soovitatakse siiski kasutada mitmel lainepikkusel töötavat detektorit koos dioodirea või samaväärse seadmega. 5.1.2.  Spektrofluoromeetriline detektor – ergastamise lainepikkus 354 nm, emissioonspektri lainepikkus 446 nm (skopoletiinijälgede kindlaksmääramiseks; neid saab tuvastada ka spektrofotomeetriliselt 313 nm juures). 5.1.3.  Sissesüstimisseade, millega on võimalik sisestada 10 või 20 μl (näiteks) uuritavat proovi. 5.1.4.  Kõrgefektiivse vedelikkromatograafia kolonn, tüüp RP C18, osakeste maksimumsuurusega 5 μm.

5.2.	Süstlad HPLC jaoks.

5.3.	Seade väikeste koguste membraanfiltrimiseks.

5.4.	Integreeriv arvutisüsteem või isekirjutaja, mis sobib ülejäänud seadmetega ja millel peab eelkõige olema mitu sisendkanalit.

6.    Määramise käik

6.1.   Süstitava lahuse valmistamine

Võrdluslahus ja piiritusjook filtritakse vajaduse korral läbi membraani, mille pooride läbimõõt on 0,45 μm.

6.2.

Kromatograafia tingimused: analüüs tehakse toatemperatuuril punktis 5.1 kirjeldatud seadmetega, kasutatakse liikuvaid faase (4.4) ja voolukiirust ligikaudu 0,6 ml minutis ning allpool esitatud gradienti (esitatud vaid näitena). Aeg: 0 min, 50 min, 70 min, 90 min Lahusti A (vesi/hape): 100 %, 60 %, 100 %, 100 % Lahusti B: (metanool): 0 %, 40 %, 0 %, 0 % Tuleb märkida, et teatavatel juhtudel tuleb osutatud gradienti muuta, et piigid ei elueeruks koos.

6.3.

Määramine 6.3.1. Võrdlusstandardid süstitakse eraldi ja seejärel süstitakse seguna. Töötingimusi kohandatakse selliselt, et iga ühendi piigi lahutusnäitaja on vähemalt 1. 6.3.2. Punkti 6.1 kohaselt ettevalmistatud proov süstitakse kolonni. 6.3.3. Mõõdetakse piikide pindalad võrdluslahuses ja piiritusjoogis ning arvutatakse kontsentratsioonid.

7.    Tulemuste esitamine

Iga komponendi kontsentratsioon väljendatakse ühikutes mg/l.

8.    Meetodi tulemuslikkuse näitajad (täpsus)

Järgmised andmed saadi 2009. aastal tehtud meetodi suutlikkuse rahvusvahelisest uuringust, mis tehti eri piiritusjookidega vastavalt rahvusvaheliselt heaks kiidetud korrale [1], [2].

8.1.   Furfuraal

8.2.   5-hüdroksümetüülfurfuraal

8.3.   5-metüülfurfuraal

8.4.   Vanilliin

8.5.   Sirelaldehüüd

8.6.   Koniferüülaldehüüd

8.7.   Sinepaldehüüd

8.8.   Gallushape

8.9.   Ellaghape

8.10.   Vanilliinhape

8.11.   Sirelhape

8.12.   Skopoletiin

▼M3

XI.    14C-SISALDUSE MÄÄRAMINE ETANOOLIS

1.    Sissejuhatus

14C-sisalduse määramine etanoolis võimaldab eristada fossiilsest toorainest saadud alkoholi (sünteesitud alkohol) ja värskest toorainest saadud alkoholi (käärimisel tekkinud alkohol).

2.    Määratlus

Etanooli 14C-sisaldusena käsitatakse käesolevas peatükis või standardi EN 16640 meetodi C all kirjeldatud meetodiga määratud 14C-sisaldust.

Elavate taimede poolt assimileeritav atmosfääri looduslik 14C-sisaldus (kontrollväärtus) ei ole püsiv väärtus. Seepärast määratakse kontrollväärtus etanooli põhjal, mis on saadud kõige viimase kasvuperioodi toorainest. See iga-aastane kontrollväärtus määratakse standardi EN 16640 kohaselt. Vastuvõetav on ka mõni muu kontrollväärtus, kui selle on sertifitseerinud akrediteeritud asutus.

3.    Põhimõte

14C-sisaldus määratakse alkoholiproovide puhul, mille etanoolisisaldus on vähemalt 85 massiprotsenti, otseselt vedelikus toimuvate stsintillatsioonide loendamise teel.

4.    Reaktiivid

4.1.   Tolueenstsintillaator

5,0 g 2,5-difenüüloksasool (PPO)

0,5 g p-bis-(4-metüül-5-fenüüloksasool-2-üül)-benseen (dimetüül-POPOP) 1 liitris analüüsipuhtas tolueenis

Samuti võib kasutada kaubanduslikke kasutusvalmis tolueenstsintillaatoreid, millel on niisugune koostis.

4.2.    14C-standardaine

14C-n-heksadekaan, mille aktiivsus on umbes 1 × 106 dpm/g (umbes 1,67 × 106 cBq/g) ja määratud aktiivsuse tagatud täpsus ± 2 suhtprotsenti.

4.3.    14C-vaba etanool

Fooni määramiseks kasutatakse fossiilsest toorainest sünteesitud alkoholi, mille etanoolisisaldus on vähemalt 85 massiprotsenti.

5.    Aparatuur

6.    Töö käik

6.1.   Seadmete reguleerimine

Seadmed reguleeritakse vastavalt tootja juhendile. Mõõtmistingimused on optimaalsed, kui näitaja E2/B (kvaliteediindeks) on maksimaalne.

E = efektiivsus

B = foon

Optimeeritakse üksnes kaks mõõtekanalit. Kolmas jäetakse kontrolli otstarbel täiesti avatuks.

6.2.   Küvettide valik

Vajaminevast suurem hulk küvette täidetakse 10 ml 14C-vaba sünteesitud etanooliga ja 10 ml tolueenstsintillaatoriga. Igat küvetti mõõdetakse vähemalt nelja 100-minutise tsükli jooksul. Küvetid, mille foon erineb keskmisest rohkem kui ± 1 suhtprotsendi võrra, jäetakse kõrvale. Kasutada võib üksnes vabrikust tulnud uusi ja samasse partiisse kuuluvaid küvette.

6.3.   Välisstandardi ja kanali suhte (VSKS) määramine

Punkti 6.1 kohase kanalite reguleerimise ajal määratakse VSKS, kasutades efektiivsuse määramiseks asjakohast arvutiprogrammi. Välisstandardina tuleb kasutada 137tseesiumi, mille tootja on juba sisse ehitanud.

6.4.   Proovi ettevalmistamine

Mõõtmiseks kasutatakse proove, mille etanoolisisaldus on vähemalt 85 massiprotsenti ja milles ei esine lisandeid ning milles toimub neeldumine lainepikkustel alla 450 nm. Väikestel estrite ja aldehüüdide jääkidel ei ole segavat mõju. Proovi alkoholisisaldus määratakse eelnevalt 0,1 % täpsusega.

7.    Proovide mõõtmine välisstandardite abil

7.2.   Mõõtmine

Pipettida valitud küvetti, mille foon on kontrollitud, igast punkti 6.4 kohaselt valmistatud proovist 10 ml ja lisada automaatdosaatori abil 10 ml tolueenstsintillatorit. Küvettides olevad proovid homogeenitakse ringliigutustega; vedelik ei tohi teha märjaks keermega korgi sisekülje polüetüleenkaitset. Valmistada samal viisil fossiilset 14C-vaba etanooli sisaldav küvett fooni mõõtmiseks. Asjakohase aastase 14C-näitaja kontrollimiseks valmistatakse viimase kasvuperioodi etanoolist duplikaat, segades küveti sisu sisestandardiga punkti 8 kohaselt.

Kontrollproov ja fooni proovid asetatakse kuni kümmet analüüsitavat proovi sisaldava mõõteseeria algusesse. Mõõtmise koguaeg proovi kohta on vähemalt 2 × 100 minutit ja üksikud proovid mõõdetakse 100-minutiste etappide kaupa, nii et on võimalik avastada vahendite mis tahes kõrvalekalle või muu rike. (Seepärast vastab üks tsükkel 100-minutisele mõõtmisajale proovi kohta.)

Fooni proovid ja kontrollproovid valmistatakse iga nelja nädala tagant uuesti.

Nõrga neeldumisega proovide (VSKS umbes 1,8) efektiivsust mõjutab kõnealuse näitaja muutumine üksnes veidi. Kui muutus ei ületa 5 suhtprotsenti, võib arvestada sama efektiivsusega. Tugevama neeldumisega proovide, nagu denatureeritud alkoholi efektiivsuse võib kindlaks teha neeldumise parandusgraafiku põhjal. Kui asjakohane arvutiprogramm ei ole kättesaadav, tuleb kasutada sisestandardit, mis annab ühetähendusliku tulemuse.

8.    Proovide mõõtmine sisestandardi 14C-heksadekaani abil

8.1.   Töö käik

Kõiki kontrollproove ja fooni proove (viimase kasvuperioodi toorainest saadud ja fossiilne etanool) ning tundmatut materjali mõõdetakse duplikaatidena. Üks duplikaadi proov valmistatakse valikuta võetud küvetis, kuhu on sisestandardina lisatud täpselt doseeritud kogus (30 μl) 14C-heksadekaani (lisaaktiivsus umbes 26 269  dpm/gC – umbes 43 782  cBq/gC). Muude proovide valmistamine ja mõõtmisaeg on esitatud punktis 7.2, kuid sisestandardiga proovide mõõtmisaega võib loenduri ettevaliku seadmisega 105 impulsile vähendada kuni viie minutini. Iga mõõteseeria jaoks kasutatakse fooni proovi ja kontrollproovi duplikaati, mis asetatakse mõõteseeria algusesse.

8.2.   Sisestandardi ja küvettide kasutamine

Vältimaks saastamist sisestandardiga mõõtmisel, säilitatakse ja käsitletakse neid standardeid mujal kui analüüsimiseks ettenähtud proovide valmistamis- ja mõõtmiskohas. Pärast mõõtmist võib kontrollitud fooniga küvette uuesti kasutada. Keermega korgid ja sisestandardit sisaldavad küvetid hävitatakse.

9.    Tulemuste esitamine

9.1.   Radioaktiivse aine aktiivsusühik on bekrell; 1 Bq = 1 tuuma lagunemine/s.

Eriradioaktiivsust väljendatakse bekrellides ühe grammi süsiniku kohta – Bq/gC.

Praktikas rakendatavate tulemuste saamiseks tuleks need väljendada sentibekrellides – cBq/gC.

Samuti võib kasutada erialakirjandusest leitavaid kirjeldusi ja valemeid, kus kasutatavaks ühikuks on dpm (lagunemine/min). Selleks et saada vastavad arvud sentibekrellides (cBq), tuleb dpm arvuline väärtus korrutada arvuga 100/60.

9.2.   Välisstandardi abil saadud tulemuste väljendamine

9.3.   Sisestandardi abil saadud tulemuste väljendamine

9.4.   Lühendid

cpmpr

=

proovi keskmine loendussagedus kogu mõõtmisaja jooksul

cpmNE

=

samal viisil arvutatud fooni keskmine impulsisagedus

cpmIS

=

proovide loendussagedus sisestandardiga.

dpmIS

=

lisatud sisestandardi kogus (standardradioaktiivsus dpm)

V

=

kasutatud proovi maht milliliitrites

F

=

puhta alkoholi sisaldus g/ml vastavalt selle kontsentratsioonile

Z

=

efektiivsus vastavalt VSKS näitajale

1,918

=

alkoholi grammide arv süsiniku grammide kohta

10.    Meetodi usaldusväärsus

10.1.   Korratavus (r)

r = 0,632 cBq/g C; S(r) = ± 0,223 cBq/g C

10.2.   Reprodutseeritavus (R)

R = 0,821 cBq/g C; S(R) = ± 0,290 cBq/g C.