1991R2568 — ET — 01.01.2014 — 025.001

Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest

►B	KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 2568/91, 11. juuli 1991, oliiviõlide ja pressimisjääkide omaduste ja asjakohaste analüüsimeetodite kohta (ELT L 248 5.9.1991, lk 1)

Muudetud:

		Euroopa Liidu Teataja
		No	page	date
►M1	KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 3682/91, 17. detsember 1991,	L 349	36	18.12.1991
►M2	KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 1429/92, 26. mai 1992,	L 150	17	2.6.1992
M3	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 3288/92, 12. november 1992,	L 327	28	13.11.1992
►M6	KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 183/93, 29. jaanuar 1993,	L 22	58	30.1.1993
M8	COMMISSION REGULATION (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
M9	KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 177/94, 28. jaanuar 1994,	L 24	33	29.1.1994
M10	COMMISSION REGULATION (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 656/95, 28. märts 1995,	L 69	1	29.3.1995
M12	COMMISSION REGULATION (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
►M13	COMMISSION REGULATION (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
M14	KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 282/98, 3. veebruar 1998,	L 28	5	4.2.1998
M15	COMMISSION REGULATION (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 379/1999, 19. veebruar 1999,	L 46	15	20.2.1999
►M17	COMMISSION REGULATION (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	COMMISSION REGULATION (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	COMMISSION REGULATION (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 1989/2003, 6. november 2003,	L 295	57	13.11.2003
►M21	KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 702/2007, 21. juuni 2007,	L 161	11	22.6.2007
►M22	KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 640/2008, 4. juuli 2008,	L 178	11	5.7.2008
►M23	KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 61/2011, 24. jaanuar 2011,	L 23	1	27.1.2011
M24	KOMISJONI RAKENDUSMÄÄRUS (EL) nr 661/2012, 19. juuli 2012,	L 192	3	20.7.2012
►M25	KOMISJONI RAKENDUSMÄÄRUS (EL) nr 299/2013, 26. märts 2013,	L 90	52	28.3.2013

(*)	Käesolevat akti ei ole eesti keeles avaldatud.

▼B

KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 2568/91,

11. juuli 1991,

oliiviõlide ja pressimisjääkide omaduste ja asjakohaste analüüsimeetodite kohta

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 22. septembri 1966. aasta määrust nr 136/66/EMÜ õli- ja rasvaturu ühise korralduse kehtestamise kohta, ( 1 ) viimati muudetud määrusega (EMÜ) nr 3577/90, ( 2 ) eriti selle artiklit 35a,

ning arvestades, et:

määruse nr 136/66/EMÜ lisas on kirjeldatud kõigis liikmesriikides turustatud ning liikmesriikide vahel, ühendusesiseses ja kolmandate riikidega peetava kaubavahetuse objektiks olevate oliiviõlide ja pressjääkoliiviõlide kirjeldused ja määratlused;

ilma et see piiraks olemasolevate sätete kohaldamist, tuleks erinevat liiki õlide eristamiseks iga õli füüsikalised ja keemilised omadused ning neitsioliiviõli organoleptilised omadused määratleda asjaomaste toodete puhtuse ja kvaliteedi tagamiseks;

erinevat liiki õlide omadused tuleks kogu ühenduses kindlaks määrata ühtsetel alustel; selleks tuleks kehtestada ühenduse keemilise analüüsi ja organoleptilise hindamise meetodid; üleminekuajal tuleks lubada kasutada ka teisi liikmesriikides kohaldatavaid analüüsimeetodeid tingimusel, et erinevate tulemuste korral on otsustavaks ühenduse meetodil saadud tulemused;

seoses oliiviõli füüsikaliste ja keemiliste omaduste määratluse ja analüüsimeetoditega tuleb kaupade koondnomenklatuuri grupi 15 lisamärkusi muuta;

neitsioliiviõli organoleptiliste omaduste hindamismeetod näeb ette valitud ja koolitatud degustaatorite hindamiskomisjonide loomise; seetõttu tuleks kindlaks määrata sellise struktuuri loomiseks vajalik ajavahemik; võttes arvesse raskusi, millega mõned liikmesriigid degustaatorite hindamiskomisjonide koostamisel kokku puutuvad, tuleks lubada ka teiste liikmesriikide hindamiskomisjonide kasutamist;

oliiviõli pressimisjääkide impordi suhtes kohaldatava impordimaksusüsteemi nõuetekohase toimimise tagamiseks tuleks sätestada nende toodete õlisisalduse kindlaksmääramise ühtne meetod;

selleks, et vältida kaubandushäireid, tuleks sätestada enne käesoleva määruse jõustumist pakendatud õli müümine teatud aja jooksul;

komisjoni määrust (EMÜ) nr 1058/77, ( 3 ) viimati muudetud määrusega (EMÜ) nr 1858/88, ( 4 ) on asjakohane muuta;

õli- ja rasvaturu korralduskomitee ei ole oma eesistuja määratud tähtaja jooksul arvamust esitanud,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:

▼M20

Artikkel 1

1. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktides 1 ja 2 sätestatutele, käsitatakse neitsioliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 1 alapunktide a ja b tähenduses.

2. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 3 sätestatutele, käsitatakse lambiõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 1 alapunkti c tähenduses.

3. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 4 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 2 tähenduses.

4. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 5 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliiviõlist ja neitsioliiviõlist koosnevaks oliiviõliks määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 3 tähenduses.

5. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 6 sätestatutele, käsitatakse töötlemata oliivijääkõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 4 tähenduses.

6. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 7 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliivijääk- õlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 5 tähenduses.

7. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 8 sätestatutele, käsitatakse oliivijääkõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 6 tähenduses.

▼B

Artikkel 2

1. I lisas sätestatud õlide omadused määratakse kindlaks järgmiste analüüsimeetoditega:

— oleiinhappe protsendina väljendatud vabad rasvhapped määratakse kindlaks II lisas sätestatud meetodil,

— peroksiidarv määratakse kindlaks III lisas sätestatud meetodil,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— steroolisisaldus määratakse kindlaks V lisas sätestatud meetodil,

— erütrodiool ja uvalool määratakse kindlaks VI lisas sätestatud meetodil,

▼M21

— 2-glütserüülmonopalmitaadi protsendiline sisaldus määratakse kindlaks VII lisas sätestatud meetodil.

▼M20 —————

▼B

— spektrofotomeetriline analüüs tehakse IX lisas sätestatud meetodil,

— rasvhapete koostis määratakse kindlaks X A ja X B lisas sätestatud meetodil,

— halogeenitud lenduvad lahustid määratakse kindlaks XI lisas sätestatud meetodil,

— neitsioliiviõli organoleptilisi omadusi hinnatakse XII lisas sätestatud meetodil,

▼M20 —————

▼M11

— stigmastadieenide määramise korral meetod, mis on määratletud XVII lisas,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX,

▼M23

— vahade, rasvhapete metüülestrite ja etüülestrite sisaldus määratakse kindlaks gaasikromatograafiliselt XX lisas sätestatud meetodil.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Lõikes 3 osutatud kontrollimiste läbiviimiseks viiakse II, III, IX, X ja XII lisas osutatud analüüsid ja vajaduse korral kõik siseriiklike seadustega nõutavad kontrollanalüüsid läbi enne minimaalse säilimisaja tähtpäeva. Kui proovid võetakse rohkem kui neli kuud enne minimaalse säilimisaja tähtpäeva, viiakse analüüsid läbi hiljemalt proovivõtmise kuule järgneva nelja kuu jooksul. Teiste nimetatud määruses sätestatud analüüside puhul ei kohaldata mingit tähtaega. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M25

Artikkel 2a

1. Käesolevas artiklis tähendab asjaomase liikmesriigi „turustatav oliiviõli” oliiviõli ja oliivijääkõli summaarset kogust, mis tarbitakse kõnealuses liikmesriigis või eksporditakse kõnealusest liikmesriigist.

2. Liikmesriik tagab, et vastavuskontrolle tehakse valikuliselt, toetudes riskianalüüsile, ja piisavalt sageli tagamaks, et turustatav oliiviõli vastab deklareeritud kategooriale.

3. Riski hindamise kriteeriumid võivad olla muu hulgas:

a) õli kategooria, tootmise ajavahemik, õli hind muude taimeõlidega võrreldes, segamis- ja pakkimistoimingud, hoidmisvõimalused ja -tingimused, päritoluriik, sihtkohariik, transpordivahend või partii maht;

b) käitaja asukoht turustamisahelas, tema turustatava õli kogus ja/või väärtus, tema turustatavate õlikategooriate sortiment, äritegevuse tüüp, nagu pressimine, säilitamine, rafineerimine, segamine, pakkimine või jaemüük;

c) eelmiste kontrollide tulemused, sealhulgas leitud vigade arv ja liik, turustatavate õlide tavapärane kvaliteet, kasutatavat tehnilist varustust iseloomustavad näitajad;

d) käitajate kasutatava turustamisstandarditele vastavuse alase kvaliteeditagamise süsteemi või enesekontrolli süsteemi usaldusväärsus;

e) kontrolli teostamise koht, eriti kui see on Euroopa Liitu esmase sisenemise koht, Euroopa Liidust väljumise viimane punkt või koht, kus õlisid toodetakse, pakitakse, laaditakse või müüakse lõpptarbijale;

f) mis tahes muu teave, mis võib viidata standarditele mittevastavuse ohule.

4. Liikmesriigid sätestavad eelnevalt järgmist:

a) partiide standarditele mittevastavuse ohu hindamise kriteeriumid;

b) iga riskikategooria riskianalüüsi põhjal minimaalne arv ettevõtjaid või partiisid ja/või koguseid, mille vastavust tuleb kontrollida.

Liikmesriigis turustatava oliiviõli iga tuhande tonni kohta tuleb teha vähemalt üks vastavuse kontroll aastas.

5. Liikmesriik kontrollib vastavust järgmiselt:

a) viies selleks ükskõik millises järjekorras läbi I lisas sätestatud analüüsid või

b) Ib lisa otsustamisskeemil sätestatud järjekorras, kuni saavutatakse mõni otsustamisskeemil nimetatud otsustest.

▼M19 —————

▼M25

Artikkel 3

Kui selgub, et õli ei vasta oma kategooria kirjeldusele, kohaldab asjaomane liikmesriik tõhusaid, proportsionaalseid ja hoiatavaid rahalisi karistusi, mis määratakse kindlaks eeskirjade eiramise raskusastet arvesse võttes, ilma et see piiraks muude karistuste kohaldamist.

Kui kontrolli tulemusel ilmnevad märkimisväärsed eeskirjade eiramised, suurendab liikmesriik turustamisstaadiumi, õli kategooria, päritolu või muude kriteeriumide alusel kontrollimise sagedust.

▼M5

Artikkel 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Kui liikmesriikidel on raskusi degusteerimiskomisjonide loomisega, võivad nad kasutada mõnes teises liikmesriigis heakskiidetud komisjoni.

3. Iga liikmesriik koostab kutseorganisatsioonide või kutsealadevaheliste organisatsioonide loodud degusteerimiskomisjonide loetelu vastavalt lõikes 1 sätestatud tingimustele ning tagab kõnealuste tingimuste järgimise.

▼M19 —————

▼B

Artikkel 6

1. Oliiviõli ekstraheerimisest tulenev õlikoogi ja muude jääkide õlisisaldus (CN-koodid 2306 90 11 ja 2306 90 19 ) määratakse kindlaks XV lisas sätestatud meetodil.

2. Lõikes 1 osutatud õlisisaldus väljendatakse õli massiprotsendina kuivaine massist.

▼M20

Artikkel 7

Kohaldatakse ühenduse sätteid, mis käsitlevad saasteainete olemasolu.

Halogeenitud lahustite puhul on kõikide oliiviõli kategooriate puhul piirmäärad järgmised:

— iga tuvastatud halogeenitud lahusti maksimaalne sisaldus: 0,1 mg/kg,

— iga tuvastatud halogeenitud lahusti maksimaalne üldsisaldus: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artikkel 7a

Füüsilised või juriidilised isikud või isikute rühmad, kes omavad oliiviõli või oliivijääkõli alates eraldamisest pressimiskäitises kuni villimisetapini (kaasa arvatud) mis tahes kutseliseks või äriliseks otstarbeks, on kohustatud pidama iga sellise kategooria õli saamise ja väljaandmise registrit.

Liikmesriik tagab, et esimeses lõigus sätestatud kohustust korralikult täidetaks.

▼M25

Artikkel 8

1. Liikmesriik teatab komisjonile käesoleva määruse rakendamiseks võetud meetmed. Ta teavitab komisjoni kõigist hilisematest muudatustest.

▼B

2. Liikmesriigid saadavad komisjonile iga poolaasta alguses aruande eelmise poolaasta jooksul tehtud katsete analüütiliste andmete kohta.

Õli- ja rasvaturu korralduskomitee võtab tulemusi arvesse määruse nr 136/66/EMÜ artiklis 39 sätestatud korras.

▼M25

3. Käesolevas määruses osutatud teatised edastatakse vastavalt komisjoni määrusele (EÜ) nr 792/2009 ( 5 ).

▼B

Artikkel 9

Määrus (EMÜ) nr 1058/77 tunnistatakse kehtetuks.

Artikkel 10

1. Käesolev määrus jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas.

XII lisas sätestatud meetodit kohaldatakse siiski ►M1 1. november 1992 ◄ , välja arvatud sekkumissüsteemiga seotud toimingute puhul.

▼M5

Kõnealust meetodit ei kohaldata enne 1. novembrit 1992 pakendatud neitsioliiviõli suhtes.

▼B

2. Käesolevat määrust ei kohaldata enne käesoleva määruse jõustumist pakendatud ja kuni 31. oktoobrini 1992 turustatava oliiviõli ja oliivijääkõli suhtes.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.

LISAD

Kokkuvõte

I lisa:	Oliiviõlide omadused
I A lisa:	Kuni 100 l väikepakendites tarnitavast oliiviõlist või pressjääkoliiviõlist proovide võtmine
I B lisa:	Otsustamisskeem
II lisa:	►M21 Vabade rasvhapete määramine külmmeetodil ◄
III lisa:	Peroksiidarvu määramine
IV lisa:	►M6 Vahasisalduse määramine kapillaargaasikromatograafia abil ◄
V lisa:	Steroolide koostise ja sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga
VI lisa:	Erütrodiooli ja uvalooli määramine
VII lisa:	►M21 2-glütserüülmonopalmitaadi protsendilise sisalduse määramine ◄
▼M20 —————
▼B
IX lisa:	Spektrofotomeetriline analüüs ultraviolettpiirkonnas
X A lisa:	Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline analüüs
Annex X B:	Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil
XI lisa:	Oliiviõli halogeenitud lenduvate lahustite määramine
Annex XII:	Organoleptic assessment of virgin olive oils
▼M20 —————
▼M19 —————
▼B
XV lisa:	Oliiviõli pressimisjääkide õlisisaldus
XVI lisa:	Joodiarvu määramine
XVII lisa:	Stigmastadieenide määramine taimeõlides
XVIII lisa:	ECN 42-Triatsüülglütseroolide tegeliku ja teoreetiliselt arvutatud sisalduse vahe määramine
Annex XIX:	Method for determining aliphatic alcohol content
▼M23
XX lisa:	Meetod vahade, rasvhapete metüülestrite ja etüülestrite sisalduse määramiseks kapillaargaasikromatograafiaga
▼M25
ХХI lisa:	Oliiviõlide vastavuse artikli 8 lõikes 2 osutatud kontrollimise tulemused

▼M23

I LISA

OLIIVIÕLIDE OMADUSED

Kategooria

Rasvhapete metüülestrid (FAME) ja etüülestrid (FAEE)

Happelisus

(%)

(*)

Peroksiidid

mekv O2 /kg

(*)

Vahad

mg/kg

(**)

2-glütserüülmonopalmitaat

(%)

Stigmastadieen

mg/kg (1)

ECN42 (HPLC) ja teoreetilise (arvutatud) ECN42 vahe

K232 (*)

K270 (*)

Δ-K (*)

Organoleptiline hindamine

puuduse mediaan (Md) (*)

Organoleptiline hindamine

viljale iseloomulikkuse mediaan (Mf) (*)

1. Ekstra neitsioliiviõli

Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg või 75 mg/kg < Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg ja (FAEE/FAME) ≤ 1,5

≤ 0,8

≤ 20

≤ 250

≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14%

≤ 0,10

≤ 0,2

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Md = 0

Mf > 0

≤ 1,0 kui palmitiinhappe % kokku > 14 %

2. Neitsioliiviõli

—

≤ 2,0

≤ 20

≤ 250

≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 %

≤ 0,10

≤ 0,2

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Md ≤ 3,5

Mf > 0

≤ 1,0 kui palmitiinhappe % kokku > 14 %

3. Lambiõli

—

> 2,0

—

≤ 300 (3)

≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ 0,3

—

Md > 3,5 (2)

—

≤ 1,1 kui palmitiinhappe % kokku > 14 %

4. Rafineeritud oliiviõli

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 350

≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 %

—

≤ 0,3

—

≤ 1,10

≤ 0,16

—

≤ 1,1 kui palmitiinhappe % kokku > 14 %

5. Rafineeritud oliiviõlidest ja neitsioliiviõlidest koosnev oliiviõlisegu

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 350

≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 %

—

≤ 0,3

—

≤ 0,90

≤ 0,15

—

≤ 1,0 kui palmitiinhappe % kokku > 14 %

6. Töötlemata oliivijääkõli oliiviõlisegu

—

> 350 (4)

≤ 1,4

—

≤ 0,6

—

7. Rafineeritud oliivijääkõli

—

≤ 0,3

≤ 5

> 350

≤ 1,4

—

≤ 0,5

—

≤ 2,00

≤ 0,20

—

8. Oliivijääkõli

—

≤ 1,0

≤ 15

> 350

≤ 1,2

—

≤ 0,5

—

≤ 1,70

≤ 0,18

—

Kategooria

Hapete sisaldus (1)

Oleiinhappe transisomeeride summa

(%)

Linoolja linoleenhappe transisomeeride summa

(%)

Teerolide Koostis

Steroolid kokku

(mg/kg)

Erütrodiool ja uvaool

(%) (**)

Müristiinhape

(%)

Linoleenhape

(%)

Arahiinhape

(%)

Eikoseenhape

(%)

Beheenhape

(%)

Lignotseriinhape

(%)

Kolesterool

(%)

Brassikasterool

(%)

Kampesterool

(%)

Stigmasterool

(%)

β-sitosterool

(%) (2)

Δ7- stigma- stenool

(%)

1. Ekstra neitsioliiviõli

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Neitsioliiviõli

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Lambiõli

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (3)

4. Rafineeritud oliiviõli

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Rafineeritud oliiviõlidest ja neitsioliiviõlidest koosnev oliiviõlisegu

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Töötlemata oliivijääkõli

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (4)

7. Rafineeritud oliivijääkõli

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Oliivijääkõli

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

▼M20

I A LISA

KUNI 100 L VÄIKEPAKENDITES TARNITAVAST OLIIVIÕLIST VÕI PRESSJÄÄKOLIIVIÕLIST PROOVIDE VÕTMINE

Seda proovivõtumeetodit kohaldatakse kuni 125 000 liitri suuruste oliiviõli või pressjääkoliiviõli tarnete suhtes, mille puhul on kontaktpakend kuni 100 liitrit.

Kui tarnitav kogus on üle 125 000 liitri, jagatakse see kuni 125 000 liitristesse partiidesse. Kui tarnitav kogus on vähem kui 125 000 liitrit, moodustab see ühe partii. Seda meetodit kohaldatakse seejärel iga partii suhtes.

Võetavate üksikproovide minimaalne arv määratakse kindlaks partii suuruse alusel vastavalt punktis 1 esitatud tabelile.

Üksikproovi suurus määratakse kindlaks kontaktpakendi mahu alusel vastavalt punktis 2.1 esitatud tabelile.

Tarne, üksikproov ja laboriproov hõlmavad standardis EN ISO 5555 esitatud määratlusi.

Partii on hulk kaubaüksuseid, mis toodetakse, valmistatakse ja pakitakse sellistes tingimustes, et igas kaubaüksuses olev õli on kõikide analüütiliste omaduste osas homogeenne.

1. VÕETAVATE ÜKSIKPROOVIDE ARV

Võetavate üksikproovide minimaalne arv määratakse kindlaks partii suuruse alusel vastavalt punktis 1 esitatud tabelile:

Partiide suurus (liitrites) väiksem kui	Minimaalne üksikproovide arv
7 500	2
25 000	3
75 000	4
125 000	5

Üksikproovide hulgast valitud kontaktpakendid peavad partiis üksteise kõrval olema.

Kahtluse korral suurendavad liikmesriigid võetavate üksikproovide arvu.

2. ÜKSIKPROOVIDE SISALDUS

2.1.

Üksikproovid peavad koosnema järgmisest:

Kui kontaktpakendi maht on:	Üksikproovis sisaldab õli:
a) 5 l või rohkem	a) 3 kontaktpakendist
b) 3 liitrit või rohkem, kuid vähem kui 5 liitrit	b) 3 kontaktpakendist
c) 2 liitrit või rohkem, kuid vähem kui 3 liitrit	c) 3 kontaktpakendist
d) 1 liitrit või rohkem, kuid vähem kui 2 liitrit	d) 6 kontaktpakendist
e) 0,75 liitrit või rohkem, kuid vähem kui 1 liiter	e) 6 kontaktpakendist
f) vähem kui 0,75 liitrit	f) kolmekordse koguse õli miinimumarv pakenditest, mille üldmaht on rohkem kui 1,5 liitrit

2.2	Üksikproovid peavad olema kontaktpakendites kuni analüüsimise ajani. Üksikproovides olev õli jagatakse seejärel vajaduse korral kolmeks laboriprooviks, et viia läbi: a) II, III, IX ja X lisas nimetatud analüüsid, b) XII lisas osutatud analüüsid, c) muud analüüsid.

2.3	Pakendid, mis moodustavad üksikproovi, jagatakse kooskõlas siseriikliku seadusega sätestatud kontrollimenetlusega.

3. ANALÜÜSID JA TULEMUSED

a) Iga punktis 1 osutatud üksikproov jagatakse laboriproovideks kooskõlas standardi EN ISO 5555 punktiga 2.5 ja analüüsitakse järgmiselt:

— määratakse kindlaks vabad rasvhapped, nagu artikli 2 lõike 1 esimeses taandes osutatud,

— määratakse kindlaks peroksiidarv, nagu artikli 2 lõike 1 teises taandes osutatud,

— viiakse läbi spektrofotomeetriline analüüs, nagu artikli 2 lõike 1 kaheksandas taandes osutatud,

— määratakse kindlaks vabade rasvhapete koostis, nagu artikli 2 lõike 1 esimeses taandes osutatud.

b) Kui üks punktis a osutatud analüüside tulemustest ei vasta vähemalt ühe samast partiist võetud üksikproovi osas deklareeritud õli kategooriale, loetakse kogu asjaomane partii mittevastavaks.

Kui punktis a osutatud analüüside tulemused ei ole ühest partiist võetud kõikide üksikproovide osas ühtlased, võttes arvesse asjaomaste meetodite korratavuse iseärasusi, loetakse kogu partii mittevastavaks ja iga üksikproovi osas viiakse läbi teine nõutav analüüs. Vastasel juhul tuleb nõutav analüüs läbi viia ühe selle partii proovi osas.

c) Kui üks punkti b teises taandes osutatud analüüside tulemustest ei vasta deklareeritud õli kategooria omadustele, loetakse kogu asjaomane partii mittevastavaks.

Kui kõik punkti b teises taandes osutatud analüüside tulemused vastavad deklareeritud õli kategooria omadustele, loetakse kogu asjaomane partii vastavaks.

▼M20

I B LISA

OTSUSTAMISKAVA, ET KONTROLLIDA KAS OLIIVIÕLIPROOV VASTAB DEKLAREERITUD KATEGOORIALE

Analüüsi selleks, et kontorollida, kas oliiviõli või oliivijääkõli vastab deklareeritud kategooriale, võib läbi viia:

a) I lisas täpsustatud omadustele vastavuse kontrollimiseks kavandatud analüüsid juhuslikus järjekorras; või

b) otsustamiskavas täpsustatud analüüsid nimetatud kavas esitatud järjekorras, kuni üks otsustamiskavas esitatud otsus on saavutatud.

Eraldi tuleb läbi viia saasteainete analüüsid, mis on vajalikud selleks, et kontrollida vastavust Euroopa Ühenduse standarditele.

Otsustamiskava kohaldatakse kõikide oliiviõli ja oliivijääkõli kategooriate suhtes. See koosneb tabelitest 1–11, mida tuleb kasutada asjaomase õli osas deklareeritud kategooria alusel üldtabelis sätestatud järjekorras.

Tabelit 11 tõlgendatakse järgmiselt:

— võrdusmärk (=) osutab skeemile, mida järgitakse eelmises kastis täpsustatud kriteeriumitele vastavuse korral (positiivne vastus). Punktiir (…) osutab alternatiivsele skeemile, mida järgitakse mittevastavuse korral,

— tabelite 1–11 kastide pealkirjad osutavad käesolevas määruses sätestatud analüüsidele käesoleva lisa 1 liites sätestatud vastavustabeli alusel,

— tabelite 1–11 eitava vastuse ringides sulgudes olevad tähed ristviitavad käesoleva lisa 2. liites esitatud suunavale teabele. Tähed ise ei sisalda analüüsi läbiviimise kohustust ega sea kahtluse alla märgitud oletuse õigsust.

1. liide

Käesoleva määruse lisade ja otsustamiskavas täpsustatud analüüside vastavustabel

▼M21
– Happelisus	II lisa	Vabade rasvhapete määramine külmmeetodil
▼M20
– Peroksiidarv	III lisa	Peroksiidarvu määramine
– UV spektromeetria	IX lisa	Spektrofotomeetriline analüüs
– Organoleptiline hindamine	XII lisa	Neitsioliiviõli organoleptiline hindamine
– 3,5-stigmastadieenid	XVII lisa	Taimeõlides stigmastadieenide määramise meetod
– Rasvhapete trans-isomeerid	Xa lisa ja	Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline analüüs
– Rasvhapete trans-isomeerid	Xb lisa	Rasvhapete metüülestrite ettevalmistamine
– Rasvhapete sisaldus	Xa lisa ja	Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline analüüs
– Rasvhapete sisaldus	Xb lisa	Rasvhapete metüülestrite ettevalmistamine
– ΔECN42	XVIII lisa	HPLC-meetodiga triglütseriidide koostise määramine (erinevus HPLC-meetodiga määratud sisalduse ja teoreetilise sisalduse vahel)
– Steroolide koostis ja üldsisaldus	V lisa	Steroolide koostise ja sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga
– Erütrodiool ja uvalool	VI lisa	Erütrodiooli ja uvalooli määramine
– Vahad	IV lisa	Vahasisalduse määramine kapillaargaasikromatograafia abil
– Alifaatsed alkoholid	XIX lisa	Alifaatsete alkoholide sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga
▼M21
– Küllastunud rasvhapped 2. positsioonis	VII lisa	2-glütserüülmonopalmitaadi protsendilise sisalduse määramine
▼M20

2. liide

Tabel 1

a) Vt neitsioliiviõli või lambiõli (Kvaliteedikriteeriumid tabel 2, või Kvaliteedi ja puhtuse kriteeriumid tabel 4)

b) Vt lambiõli (Kvaliteedi ja puhtuse kriteeriumid tabel 4)

Tabel 2

a) Vt lambiõli (Kvaliteedi ja puhtuse kriteeriumid tabel 4)

b) Vaata ekstra neitsioliiviõli (Kvaliteedikriteeriumid tabel 1)

Tabel 3

a) Rafineeritud õli (oliiviõli või muu õli) sisaldus

b) Oliivijääkõli sisaldus

Tabel 4

a) Vt ekstra neitsioliiviõli ja neitsioliiviõli (Kvaliteedikriteeriumid tabel 1 ja tabel 2)

b) Rafineeritud õli (oliiviõli või muu õli) sisaldus

c) Oliivijääkõli sisaldus

d) Esterdatud õlide sisaldus

Tabel 7

a) Oliivijääkõli sisaldus

b) Esterdatud õlide sisaldus

Tabel 8

a) Rafineeritud õli (oliiviõli või muu õli) sisaldus

b) Vt lambiõli (Kvaliteedi ja puhtuse kriteeriumid tabel 4)

c) Esterdatud õlide sisaldus

Tabel 11

a) Esterdatud õlide sisaldus

▼B

II LISA

▼M21

VABADE RASVHAPETE MÄÄRAMINE KÜLMMEETODIL

▼B

1. HAPPESUSE MÄÄRAMINE

Vabade rasvhapete määramine oliiviõlis. Vabade rasvhapete sisaldust väljendatakse tavapärasel viisil arvutatud happesusena.

1.1. Põhimõte

Proov lahustatakse lahustite segus ja vabad rasvhapped tiitritakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahuses.

1.2. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peaksid olema tunnustatud analüütilise kvaliteediga ja vesi peaks olema kas destilleeritud või samaväärse puhtusega.

1.2.1.

Dietüüleetri ja 95 % etanooli (V/V) segu võrdsetes osades.

Märkus:

Dietüüleeter on väga kergesti süttiv ning võib moodustada plahvatusohtlikke peroksiide. Selle kasutamisel tuleks olla ettevaatlik.

Segu neutraliseeritakse kasutamise hetkel kaaliumhüdroksiidi lahusega (1.2.2) lisades 100 ml segu kohta 0,3 ml fenoolftaleiini lahust (1.2.3).

Märkus:

Kui dietüüleetrit ei ole võimalik kasutada, võib kasutada etanooli ja tolueeni sisaldavate lahustite segu. Vajaduse korral võib etanooli asendada 2-propanool.

1.2.2.

Kaaliumhüdroksiid, tiitritud etanoolilahusena, c(KOH) 0,1 mol/l või vajaduse korral c(KOH) 0,5 mol/l.

Kaaliumhüdroksiidi etanoolilahuse täpne kontsentratsioon peab olema teada ning seda tuleb enne kasutamist vahetult kontrollida. Kasutatakse lahust, mis on valmistatud vähemalt viis päeva enne kasutamist, ning see dekanteeritakse kummist punniga tumedasse klaaspudelisse. Lahus peaks olema värvitu või helekollast värvi.

Märkus:

Kaaliumhüdroksiidi stabiilset värvusetut lahust saab valmistada järgmiselt: 1 000 ml etanooli lastakse koos 8 g kaaliumhüdroksiidi ja 0,5 g alumiiniumilaastudega keema ning keedetakse püstjahutiga kolvis tund aega. Destilleeritakse kohe. Destillaadis lahustatakse vajalik kogus kaaliumhüdroksiidi. Lahus jäetakse mitmeks päevaks seisma ja kaaliumkarbonaadi sademest dekanteeritakse selge supernatant.

Lahuse võib valmistada ilma destilleerimiseta järgmiselt: 1 000 ml etanoolile lisatakse 4 ml alumiiniumbutülaati ja segu jäetakse mitmeks päevaks seisma. Supernatant dekanteeritakse ja selles lahustatakse vajalik kogus kaaliumhüdroksiidi. Lahus on kasutamisvalmis.

1.2.3.

Fenoolftaleiin, 10 g/l lahus 95–96 % etanoolis (V/V) või alkalisinises, (väga tugeva värviga rasvade puhul) 20 g/l lahus 95–96 % etanoolis (V/V).

1.3. Seadmed

Tavalised laboriseadmed, sealhulgas:

1.3.1.

analüütilised kaalud;

1.3.2.

250 ml Erlenmeyeri kolb;

1.3.3.

10 ml bürett, mõõtskaala ühikutega 0,05 ml.

1.4. Menetlus

1.4.1.

Proovi ettevalmistamine analüüsiks

(Katse tehakse filtreeritud prooviga. Kui niiskus ja lisandid on kokku alla 1 %, kasutatakse proovi ilma täiendava töötlemiseta; kui need on üle 1 %, tuleks proov filtreerida.)

1.4.2.

Proovi võtmine

Proov võetakse sõltuvalt eeldatavast happearvust järgmise tabeli alusel:

Hinnanguline happearv	Proovi mass (g)	Kaalumistäpsus (g)
< 1	20	0,05
1–4	10	0,02
4–15	2,5	0,01
15–75	0,5	0,001
> 75	0,1	0,0002

Proov kaalutakse Erlenmeyeri kolvis (1.3.2).

1.4.3.

Määramine

Proov (1.4.2) lahustatakse 50–150 ml dietüüleetri ja etanooli (1.2.1) varem neutraliseeritud segus.

Lahus tiitritakse, segades sellesse kaaliumhüdroksiidi 0,1 mol/l lahusega (1.2.2) (vt märkus 2), kuni indikaator muutub (fenoolftaleiini roosa värvus püsib vähemalt 10 sekundit).

Märkus 1.

Kaaliumhüdroksiidi tiitritud etanoolilahuse (1.2.2) võib asendada kaalium- või naatriumhüdroksiidi vesilahusega tingimusel, et lisatud vee maht ei põhjusta faaside eraldumist.

Märkus 2.Kui 0,1 mol/l kaaliumhüdroksiidilahust on vaja rohkem kui 10 ml, kasutatakse 0,5 mol/l lahust.

Märkus 3.

Kui lahus muutub tiitrimise ajal häguseks, tuleb lisada nii palju lahustit (1.2.1) kui on vaja selge lahuse saamiseks.

1.5. Happesus: väljendatud oleiinhappe protsendina

Happesus massiprotsendina on võrdne:

kus:

V	on kasutatud tiitritud kaaliumhüdroksiidi maht milliliitrites;

c	on täpne kontsentratsioon moolides kasutatud kaaliumhüdroksiidi tiitritud lahuse liitri kohta;

M	on molaarmass grammides tulemuse väljendamiseks (282) kasutatud happe mooli kohta;

m	on proovi mass grammides.

Tulemus ►M6 kahe arvutuse ◄ aritmeetiline keskmine.

III LISA

PEROKSIIDARVU MÄÄRAMINE

1. KOHALDAMISALA

Käesolevas standardis kirjeldatakse õlide ja rasvade peroksiidarvu määramise meetodit.

2. KASUTUSVALDKOND

Standardit kohaldatakse loomsete ja taimsete õlide ja rasvade suhtes.

3. MÄÄRATLUS

Peroksiidarv on nende proovis olevate ainete kogus aktiivse hapniku milliekvivalendina kilogrammi kohta, mis kirjeldatud töötamistingimustel kaaliumjodiidi oksüdeerivad.

4. PÕHIMÕTE

Katsekogust töödeldakse äädikhappe ja kloroformi lahuses kaaliumjodiidi lahusega. Eraldunud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi standardlahusega.

5. SEADMED

Seadmetel ei tohi olla redutseerivaid või oksüdeerivaid aineid.

Märkus: Lihvitud pindu ei tohi määrdeainega määrida.

5.1.	3 ml klaasist kühvel.

5.2.	Lihvitud kaela ja punniga 250 ml mahuga kolvid, enne kuivatatud ja täidetud puhta kuiva väärisgaasiga (lämmastik või soovitatavalt süsinikdioksiid).

5.3.	25 või 50 ml bürett, jaotatud 0,1 ml ühikuteks.

6. REAKTIIVID

6.1.	Analüütiliselt puhta reaktiivi kvaliteediga kloroform, millest hapnik on vabastatud puhta, kuiva inertgaasi barboteerimisel.

6.2.	Analüütiliselt puhta kvaliteediga jää-äädikas, millest hapnik on vabastatud puhta, kuiva inertgaasi voolu barboteerimisel.

6.3.	Kaaliumjodiidi küllastunud vesilahus, vahetult ette valmistatud ning joodi ja jodaatideta.

6.4.	Naatriumtiosulfaat, 0,01 või 0,002 Mol/L täpsusega vahetult enne kasutamist standarditud vesilahust.

6.5.	Tärklise lahus, 10 g/l vesilahus, värskelt looduslikust lahustuvast tärklisest valmistatud.

7. PROOV

Tagatakse proovi võtmine ja selle säilitamine varjus, jahedas ja täielikult täidetud klaasmahutites, mis on hermeetiliselt lihvkorgi või korgist punniga suletud.

8. TÖÖ KÄIK

Katsed tehakse hämara päevavalguse või kunstliku valgustusega. Klaasist kühvlisse (5.1) või selle puudumise korral kolbi (5.2) kaalutakse 0,001 g täpsusega järgmisele tabelile vastava massiga proov, mille aluseks on eeldatav peroksiidarv:

Hinnanguline peroksiidarv (meq)	Katsekoguse mass (g)
0–12	5,0 –2,0
12–20	2,0 –1,2
20–30	1,2 –0,8
30–50	0,8 –0,5
50–90	0,5 –0,3

Kolvilt (5.2) eemaldatakse punn ning sellesse pannakse klaasist kühvel, millel on katsekogus. Lisatakse 10 ml kloroformi (6.1). Katsekogus lahustatakse kiiresti segamise teel. Lisatakse 15 ml äädikhapet (6.2) ja seejärel 1 ml kaaliumjodiidi lahust (6.3). Kolvile pannakse kiiresti punn, loksutatakse üks minut ja jäetakse siis viieks minutiks temperatuurile 15–25 °C varju seisma.

Lisatakse umbes 75 ml destilleeritud vett. Vabastatud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (6.4) (0,002 Mol/L lahus eeldatava väärtuse < 12 puhul ja 0,01 Mol/L eeldatava väärtuse >12 puhul), loksutatakse kõvasti, kasutades indikaatorina tärklise lahust (6.5).

Ühe ja sama prooviga tehakse 2 määramist.

Samal ajal tuleb teha ka pimekatse. Kui pimekatse tulemus on suurem kui 0,05 ml 0,01 Mol/L naatriumtiosulfaadi lahust (6.4), asendatakse puhastamata reaktiivid.

9. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Peroksiidarv aktiivse hapniku milliekvivalentidena kilogrammi kohta saadakse valemiga:

kus

V	on katses kasutatud naatriumtiosulfaadi standardlahuse (6.4) milliliitrite arv, mida on pimekatse arvesse võtmiseks parandatud;

T	on kasutatud naatriumtiosulfaadi lahuse (6.4) täpne molaarsus;

m	on katsekoguse mass grammides.

Tulemus on kahe määramise aritmeetiline keskmine.

▼M21

IV LISA

VAHADE SISALDUSE MÄÄRAMINE KAPILLAARGAASIKROMATOGRAAFIA ABIL

1. EESMÄRK

Käesoleva meetodiga määratakse vahade sisaldust oliiviõlides. Vahade eraldamine toimub süsinikuaatomite arvu alusel. Meetodit võib eeskätt kasutada pressimisega saadud oliiviõlide eristamiseks ekstraheerimisega saadud õlidest (oliivijääkõlidest).

2. PÕHIMÕTE

Rasvainele lisatakse sobivat sisestandardit, seejärel fraktsioneeritakse kromatograafiliselt, kasutades hüdrateeritud silikageelkolonni; katse tingimustes esimesena elueeritav fraktsioon ainetega, mis on triglütseriididest vähem polaarsed, eraldatakse ning seda analüüsitakse kapillaargaasikromatograafia abil.

3. SEADMED

3.1.	25milliliitrine Erlenmeyeri kolb.

3.2.	Klaasist gaasikromatograafiakolonn sisediameeteriga 15,0 mm ja pikkusega 30–40 cm, mis on varustatud kraaniga.

3.3.

Sobiv kapillaarkolonniga gaasikromatograaf, mis on varustatud süsteemiga, mis võimaldab otse kolonni süstimist ja koosneb järgmistest osadest:

3.3.1.

programmeeritava temperatuuriga termostaatkapp kolonnide jaoks;

3.3.2.

külminjektor proovi viimiseks otse kolonni;

3.3.3.

leekionisatsioondetektor ja muundurvõimend;

3.3.4.

integraatormeerik, mida saab kasutada koos muundurvõimendiga (3.3.3), mille reageerimisaeg on alla 1 sekundi ning mille paberi kiirust saab muuta; (võib kasutada ka infotehnoloogiasüsteeme, milles gaasikromatograafia andmed edastatakse arvuti vahendusel);

3.3.5.

klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn pikkusega 8–12 m ja sisediameetriga 0,25–0,32 mm, mis on seestpoolt kaetud jaotusvedelikuga, mille kihi paksus on ühtlaselt 0,10–0,30 mm (võib kasutada müügilolevaid SE 52 või SE 54 tüüpi jaotusvedelikke).

3.4.	10mikroliitrine mikrosüstal otse kolonni süstimiseks, mille nõelal on tugevdatud pinnakiht.

3.5.	Elektriline vibraator.

3.6.	Pöördaurusti.

3.7.	Muhvelahi.

3.8.	Analüütiline kaal, kaalumistäpsus ± 0,1 mg.

3.9.	Tavalised klaasist laborinõud.

4. REAKTIIVID

4.1.	Silikageel, tera suurus 60–200 μm. Geel pannakse vähemalt neljaks tunniks ahju temperatuuriga 500 °C. Lastakse jahtuda, seejärel lisatakse vett koguses, mis vastab 2 %le silikageeli massist. Segatakse korralikult ühtlase massi saamiseni. Hoitakse pimedas vähemalt 12 tundi enne kasutamist.

4.2.	n-heksaan, kromatograafias kasutamiseks.

4.3.	Etüüleeter, kromatograafias kasutamiseks.

4.4.	n-heptaan, kromatograafias kasutamiseks.

4.5.

Laurüülarahidaadi 0,1 % (m/V) standardlahus heksaanis (sisestandard) (võib kasutada ka palmitüülpalmitaati või müristüülstearaati).

4.5.1.

Sudaan 1 (1-fenüül-aso-2-naftool).

4.6.	Kandegaas: puhas vesinik või heelium, gaasikromatograafias kasutamiseks.

4.7.	Abigaasid: — puhas vesinik, gaasikromatograafias kasutamiseks; — puhas õhk, gaasikromatograafias kasutamiseks.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Kromatograafiakolonni valmistamine

n-heksaanis (4.2) suspendeeritakse 15 g silikageeli (4.1) ning viiakse kolonni (3.2). Lastakse settida. Homogeensema kromatograafilise kolonni saamiseks töödeldakse settinud kolonni elektrilise vibraatoriga (3.5) ja lisandite eemaldamiseks voolutatakse kolonni 30 ml n-heksaaniga. 25 milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) kaalutakse täpselt kaalu (3.8) abil 500 mg proovi ning lisatakse sobiv kogus sisestandardit (4.5), arvestades eeldatavat vahasisaldust; nt oliiviõli puhul lisatakse 0,1 mg ja oliivijääkõli puhul 0,25–0,5 mg laurüülarahidaati. Eelkirjeldatud viisil ettevalmistatud proov kantakse kromatograafiakolonni, kasutades kahte n-heksaani (4.2) kogust mahuga à 2 ml.

Lahustil lastakse voolata, kuni absorbendi ülemise pinna kohale jääb 1 mm vedelikku, seejärel voolutatakse kolonni veel 70 ml n-heksaaniga, et eemaldada proovis tavaliselt sisalduvad n-alkaanid. Seejärel alustatakse voolutamist; kogutakse 180 ml n-heksaani-etüüleetri segu (vahekorras 99:1) voolukiirusel umbes 15 tilka 10 sekundi jooksul. Proovi elueerimine toimub toatemperatuuril 22 ± 4 °C.

NB:

— n-heksaani-dietüüleetri segu (99:1) tuleb valmistada igal päeval uuesti.

— Vahade nõuetekohase elueerimise visuaalseks kontrollimiseks võib proovi lahusele lisada 100 μl 1 % sudaani lahust elueerimissegus. Värvaine retentsiooniaeg on vahade ja triglütseriidide retentsiooniaegade vahel; kui värvaine jõuab kromatograafiakolonni põhjani, tuleb elueerimine peatada, sest kõik vahad on elueeritud.

Niimoodi saadud fraktsiooni aurustatakse pöördaurustis (3.6), kuni peaaegu kogu lahusti on eemaldatud. Viimased 2 ml lahustit eemaldatakse nõrga lämmastikuvoolu abil, seejärel lisatakse 2–4 ml n-heptaani.

5.2. Gaasikromatograafiline analüüs

5.2.1. Ettevalmistustööd

Kolonn pannakse gaasikromatograafi (3.3); sisselaskekoht ühendatakse on-column-süsteemiga ja väljalaskekoht detektoriga. Kontrollitakse, et gaasikromatograafiaseade oleks töökorras (gaasijuhtmete lekkekindlus, detektori tundlikkus, meerik jne).

Kui kolonni kasutatakse esimest korda, on soovitatav see tasakaalustada. Läbi kolonni hakatakse nõrga joana juhtima gaasi, seejärel lülitatakse gaasikromatograafiaseade sisse. Järk-järgult, 4 tunni jooksul, tõstetakse temperatuur 350 °C-ni. Sellist temperatuuri hoitakse vähemalt kaks tundi, seejärel reguleeritakse seade töörežiimile (reguleeritakse gaasivoolu kiirust, leegi süüdet, ühendatakse elektrilise meerikuga (3.3.4), reguleeritakse kolonni termostaatkapi temperatuuri, detektorit jne). Registreeritakse signaal vähemalt kaks korda suuremal tundlikkusel, kui on vaja analüüsi läbiviimiseks. Saadav nulljoon peaks olema sirge, ilma igasuguste piikideta, ning see ei tohiks kummalegi poole triivida.

Negatiivne sirge triiv näitab, et kolonn ei ole korralikult ühendatud; positiivne triiv osutab kolonni puudulikule tasakaalustamisele.

5.2.2. Töötingimuste valimine

Töötingimused on reeglina järgmised:

— kolonni temperatuur:

—

20 °C/min

5 °C/min

20 °C/min

algul 80 °C

(1′)

→

240 °C

→

325 °C

(6′)

→

340 °C

(10′)

— detektori temperatuur: 350 °C;

— sisestatava aine kogus: 1 μl lahust n-heptaanis (2–4 ml);

— kandegaas: heelium või vesinik asjaomase gaasi optimaalsel voolukiirusel (vt liide);

— seadme tundlikkus peab vastama järgmistele tingimustele:

Olenevalt kolonni ja gaasikromatograafi omadustest võib tingimusi muuta, et saavutada kõikide vahade eraldumine, piikide rahuldav lahutus (vt joonis) ja et C32 sisestandardi retentsiooniaeg oleks 18 ± 3 minutit. Vaha kõige tüüpilisem piik peab olema vähemalt 60 % täisskaalast.

Piigi integreerimisparameetrid määratakse kindlaks nii, et uuritavate piikide pindalasid oleks võimalik õigesti hinnata.

NB:Arvesse võttes kõrget lõpptemperatuuri, on lubatav positiivne triiv, mis ei tohi ületada 10 % skaala ulatusest.

5.3. Analüüsi läbiviimine

10mikroliitrisesse mikrosüstlasse võetakse 1 μl lahust; kolb tõmmatakse tagasi, kuni nõel on tühi. Nõel viiakse injektsioonisüsteemi ning 1–2 sekundi pärast tehakse kiire süst. Umbes 5 sekundi pärast tõmmatakse nõel ettevaatlikult välja.

Detektori signaali registreeritakse seni, kuni vahad on täielikult elueeritud.

Nulljoon peab kogu aeg vastama nõuetele.

5.4. Piikide määramine

Piigid määratakse retentsiooniaja põhjal, võrdlusest samadel tingimustel analüüsitud teadaoleva retentsiooniajaga vahade segudega.

Joonisel on esitatud neitsioliiviõli vahade kromatogramm.

5.5. Kvantitatiivne hindamine

Sisestandardile ja alifaatsetele estritele C40–C46vastavate piikide pindalad arvutatakse integraatori abil.

Iga estri vahasisaldus milligrammides rasvaine kilogrammi kohta arvutatakse järgmiselt:

kus:

iga estri piigi pindala ruutmillimeetrites;

sisestandardi piigi pindala ruutmillimeetrites;

lisatud sisestandardi mass milligrammides;

määramisel kasutatud proovi mass grammides.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Märgitakse erinevate C40- kuni C46-vahade sisalduste summa milligrammides rasva kilogrammi kohta (ppm).

NB. Määratavate koostisosade puhul osutatakse vahade piikidele, mis paiknevad paarisarvulise süsinikuaatomite arvuga estrite C40 ja C46 vahel, vastavalt järgneval joonisel esitatud oliiviõli vahade kromatogrammile. Kui ester C46 esineb kahekordsena, on soovitatav selle identifitseerimiseks analüüsida pressimisjääkide õli vahafraktsiooni, kus C46 piiki on kerge ära tunda, sest see on oluliselt suurem.

Tulemused väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

Joonis

Oliiviõli vahade kromatogramm ( 6 )

Tähistused:

I.S.

laurüülarahidaat

diterpeenestrid

2 + 2′

estrid C40

3 + 3′

estrid C42

4 + 4′

estrid C44

estrid C46

steroolestrid ja triterpeenalkoholid.

Liide

Gaasi voolukiiruse määramine

Kui gaasikromatograaf on viidud tavapärasesse töörežiimi, süstitakse kolonni 1–3 μl metaani või propaani ning mõõdetakse stopperiga aeg süstimise hetkest kuni piigi alguseni (tM); selle ajaga läks metaan või propaan läbi kolonni.

Voolukiirus (cm/s) määratakse valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on stopperiga mõõdetud aeg sekundites.

▼B

V LISA

STEROOLIDE KOOSTISE JA SISALDUSE GAASIKROMATOGRAAFILINE MÄÄRAMINE KAPILLAARKOLONNIGA

1. KOHALDAMISALA

Meetod kirjeldab rasvainete steroolide individuaalse ja üldsisalduse määramist.

2. PÕHIMÕTE

Rasvaine, millele on sisestandardina lisatud β-kolestanooli, seebistatakse kaaliumhüdroksiidiga etanoolilahuses ja seebistumatud komponendid ekstraheeritakse dietüüleetriga.

Steroolifraktsioon eraldatakse seebistamatust ekstraktist kromatograafiaga aluselise silikageeli plaadi põhjal. Silikageelist saadud steroolid töödeldakse trimetüülsilüüleetriteks ja neid analüüsitakse gaasikromatograafiliselt kapillaarkolonniga.

3. SEADMED

3.1.	Püstjahutiga varustatud lihvühendustega 250 ml kolb.

3.2.	500 ml jaotuslehtrid.

3.3.	250 ml kolvid.

3.4.	Täielikud seadmed planaarkromatograafiaga analüüsimiseks, kasutades 20 × 20 cm klaasplaate.

3.5.	Ultraviolettlamp lainepikkusega 366 või 254 nm.

3.6.	100 ja 500 μl mikrosüstlad.

3.7.	Silindriline filterlehter, mille poorne septum on G3 (15–40 μm), diameeter ligikaudu 2 cm ja sügavus 5 cm ning milles on vaakumfiltreerimiseks sobiv liide ja 12/21 lihvkern.

3.8.	50 ml vaakumkolb 12/21 lihvmuhviga, mida on võimalik paigaldada filterlehtrisse (3.7).

3.9.	10 ml katseklaas koonusekujulise põhja ja tihenduskitiga.

3.10.

Gaasikromatograaf, mis võimaldab kasutada kapillaarkolonni ja on varustatud järgmistest seadistest koostatud jaotussüsteemiga:

3.10.1.

termostateeritav kolonnikamber, mis hoiab nõutavat temperatuuri täpsusega ±1 °C;

3.10.2.

reguleeritava temperatuuriga aurustamisseade, millel on silaniseeritud klaasist aurustaja;

3.10.3.

leekionisatsioonidetektor ja muundurvõimendi;

3.10.4.

meerikuga integraator, mida saab kasutada koos muundurvõimendiga (3.10.3), mille reageerimisaeg on kuni 1 sekund ning mille paberikiirust on võimalik muuta.

3.11.

Klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn, mille pikkus on 20–30 m, sisediameeter 0,251–0,32 mm, üleni ühtlase 0,10–0,30 μm kihina kaetud SE-52 või SE-54 vedeliku või samaväärse vedelikuga.

3.12.

l0 μl karastatud nõelaga gaasikromatograafias kasutatav mikrosüstal.

4. REAKTIIVID

4.1.	Kaaliumhüdroksiid, umbes 2 mol/L etanoolilahus. 130 g kaaliumhüdroksiidi (väikseim kontsentratsioon 85 %) lahustatakse 85 % destilleeritud vees samal ajal jahutades ning täiendatakse kuni 1 liitri märgini etanooliga. Lahust tuleb hoida õhukindlalt suletud tumedates klaaspudelites.

4.2.	Dietüüleeter, analüütiliselt puhas.

4.3.	Veevaba naatriumsulfaat, analüütiliselt puhas.

4.4.	Silikageeliga kaetud klaasplaadid, fluorestsentsindikaatorita, paksusega 0,25 mm (müügil kasutusvalmina).

4.5.	Kaaliumhüdroksiid, 0,2 mol/L etanoolilahus. 13 g kaaliumhüdroksiidi lahustatakse 20 ml destilleeritud vees ning täiendatakse kuni 1 liitri märgini etanooliga.

4.6.	Benseen, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2)

4.7.	Atsetoon, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2)

4.8.	Heksaan, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2)

4.9.	Dietüüleeter, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2)

4.10.

Kloroform, analüütiliselt puhas. (Vt. 5.2.2)

4.11.

Planaarkromatograafia võrdluslahus: kolesterool või fütosteroolid, ►M6 2 % ◄ kloroformilahus.

4.12.

2,7-diklorofluorestseiin, 0,2 % etanoolilahus. Muudetakse kergelt aluseliseks mõne tilga 2 mol/L alkohoolse kaaliumhüdroksiidilahuse lisamisega.

4.13.

Veevaba püridiin, kromatograafia jaoks.

4.14.

Heksametüül disilasaan.

4.15.

Trimetüülklorosilaan.

4.16.

Sterooltrimetüülsilüüleetrite võrdluslahused. Valmistatakse kasutamise ajal puhastest steroolidest või steroole sisaldavatest õlidest saadud steroolisegudest.

4.17.

β-kolestanool, 0,2 % kloroformilahus (m/V) (sisestandard).

4.18.

Kandegaas: lämmastik või heelium, gaasikromatograafiliselt puhas.

4.19.

Abigaasid:

— vesinik, gaasikromatograafiliselt puhas,

— õhk, gaasikromatograafiliselt puhas.

5. TÖÖ KÄIK

5.1.

Mitteseebistuvate komponentide ettevalmistamine.

5.1.1.

250 ml kolbi viiakse 500 μl mikrosüstlaga selline kogus 0,2 % β-kolestanooli kloroformilahust (4.17), milles sisalduv kolestanooli kogus on umbes 10 % kolbis määratava alikvoodi steroolisisaldusest. Näiteks lisatakse 5grammise oliiviõli proovi puhul 500 μl 0,2protsendilist β-kolestanooli lahust ja ►M6 ————— ◄ oliivijääkõli proovi puhul 1 500 μl.

Proov aurustatakse lämmastikuvoolus kuivaks ning samasse kolbi kaalutakse 5 grammi kuiva filtreeritud proovi.

►M6 Õlid ◄ puhul, mis sisaldavad palju kolesterooli, võib tekkida piik, mille peetumisaeg on sama kui kolestanooli peetumisaeg. Sellisel juhul tuleb steroolifraktsiooni analüüsida kaks korda, sisestandardiga ja ilma ►M6 või tuleb kolestanooli asemel kasutada betulinooli ◄ .

5.1.2.

Lisatakse 50 ml 2 mol/L kaaliumhüdroksiidi etanoolilahust, käivitatakse püstjahuti ning kuumutatakse pidevalt kiiresti segades veevannil tasase keemiseni kuni seebistumiseni (lahus muutub selgeks). Kuumutatakse veel 20 minutit, seejärel lisatakse kondensaatori ülaosasse 50 ml destilleeritud vett, eemaldatakse püstjahuti ning kolb jahutatakse ligikaudu temperatuurini 30 oC.

5.1.3.

Kolvi sisu valatakse kvantitatiivselt 500 ml jaotuslehtrisse ning seda loputatakse mitu korda kokku 50 ml destilleeritud veega. Lisatakse ligikaudu 80 ml dietüüleetrit, loksutatakse tugevasti umbes 30 sekundit ning jäetakse seisma (märkus 1).

Põhjas olev veefaas kogutakse teise jaotuslehtrisse. Veefaasi ekstraheeritakse samal viisil veel kaks korda, kasutades selleks mõlemal korral 60–70 ml dietüüleetrit.

Märkus 1. Võimalikku emulsiooni on võimalik eemaldada väikse koguse etanooli või metanooli sissepritsimisega.

5.1.4.

Etüüleetri ekstraktid koondatakse jaotuslehtrisse ja pestakse destilleeritud veega (50 ml korraga), kuni pesuvesi annab neutraalse reaktsiooni.

Kui pesuvesi on eemaldatud, kuivatatakse veevaba naatriumsulfaadiga ja filtreeritakse veevabal naatriumsulfaadil enne kaalutud 250 ml kolbi, pestes lehtrit ja filtrit väikse koguse dietüüleetriga.

5.1.5.

Eeter destilleeritakse selliselt, et seda on vaid mõni ml, ning seejärel kuivatakse seda kerges vaakumis või lämmastikuvoolus ning lõpuks umbes veerand tundi ahjus temperatuuril 100 oC ning seejärel kaalutakse pärast jahutamist eksikaatoris.

5.2.

Steroolifraktsiooni eraldamine.

5.2.1.

Aluseliste plaatide ettevalmistamine. Silikageeli plaadid (4.4) kastetakse 10 sekundiks täielikult 0,2 mol/L kaaliumhüdroksiid etanoolilahusesse (4.5), lastakse kaks tundi tõmbekapis kuivada ning lõpuks asetatakse üheks tunniks ahju temperatuurile 100 oC.

Seejärel võetakse silikageeli plaadid ahjust ning neid hoitakse kuni kasutamiseni kaltsiumkloriidi eksikaatoris (selliselt töödeldud plaadid tuleb kasutada 15 päeva jooksul).

Märkus 2.

Kui aluselisi silikageeli plaate kasutatakse steroolfraktsiooni eraldamiseks, ei ole mitteseebistuvaid komponente vaja alumiiniumoksiidiga töödelda. Selliselt jäävad kõik happelised ühendid (rasvhapped ja muud) lähtejoonele ja steroolivöönd eraldub selgelt alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide vööndist.

5.2.2.

95 (V/V) benseeni/atsetooni segu pannakse plaatide ilmutusnõusse umbes 1 cm sügavusele. Kasutada võib ka 65/35 (V/V) heksaani/etüüleetri segu. Ilmutusnõu suletakse nõuetekohase kaanega ning jäetakse umbes pooleks tunniks seisma, et tekiks vedeliku ja auru tasakaal. Ilmutusnõu siseseintele võib kinnitada filterpaberi ribad, mis ulatuvad eluendini. See vähendab ilmutusaega ligikaudu kolmandiku võrra ning komponentide elueerumine on ühtlasem ja korrapärasem.

Märkus 3.Täielikult korratavate elueerimistingimuste saavutamiseks tuleb igaks katseks võtta uus ilmutussegu.

5.2.3.

Valmistatakse umbes 5 % seebistumatute komponentide kloroformilahus (5.1.5) ning 100 μl mikrosüstlaga tõmmatakse 300 μl kromatograafiaplaadile (5.2.1) umbes 2 cm kaugusele plaadi servast võimalikult õhuke ja ühtlane viir. 2–3 μl sterooli võrdluslahust (4.11) asetatakse samale joonele plaadi ühte serva nii, et steroolivööndit oleks võimalik pärast ilmutamist identifitseerida.

5.2.4.

Vastavalt punktile 5.2.2 ettevalmistatud plaat asetatakse ilmutusnõusse. Temperatuuri tuleks hoida vahemikus 15–20 oC. Ilmutusnõu suletakse kohe kaanega ning plaadil lastakse elueeruda, kuni lahusti serv ulatub umbes 1 cm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse ilmutusnõust välja ning lahusti aurustatakse kuuma õhu voolus või jättes selle lühikeseks ajaks ilma katteta.

5.2.5.

Plaati pritsitakse kergelt ja ühtlaselt 2,7-diklorofluorestseiini lahusega. Kui plaati vaadeldakse ultraviolettvalguses, on sterooli vööndit võimalik identifitseerida selliselt, et see on samas kohas kui võrdluslahuse vöönd. Vööndi piirid märgitakse musta pliiatsiga mööda fluorestsentsi servi.

5.2.6.

Metallspaatliga kraabitakse märgistatud alalt maha silikageel. Eemaldamisel saadav hästi peenestatud materjal pannakse filterlehtrisse (3.7). Lisatakse 10 ml kuuma kloroformi, segatakse hoolikalt metallist spaatliga ning filtreeritakse vaakumi all, seejärel kogutakse filtraat filterlehtriga ühendatud Erlenmeyeri kolbi (3.8).

Jääki pestakse lehtris kolm korda dietüüleetriga (iga kord umbes 10 ml) ning filtraat kogutakse samasse lehtriga ühendatud kolbi. Filtraat aurustatakse ligikaudu 4–5 ml mahuni ning jääklahus valatakse enne kaalutud 10 ml katseklaasi (3.9), seejärel aurustatakse madala kuumutamise teel õrna lämmastiku voolu all kuivaks, täidetakse uuesti paari tilga atsetooniga, aurustatakse taas kuivaks ning asetatakse umbes 10 minutiks ahju temperatuurile 105 oC, lastakse eksikaatoris jahtuda ning kaalutakse.

Katseklaasis olev jääk koosneb sterooli fraktsioonist.

5.3.

Trimetüülsilüüleetrite ettevalmistamine.

5.3.1.

Katseklaasis olevale steroolifraktsioonile lisatakse 50 μl igas katseklaasis oleva sterooli milligrammi kohta silüüliv reagent, mis koosneb mahus 9: 3: 1 (V/V/V) püridiini, heksametüüldisilasaani ja trimetüülklorosilaani segust (märkus 4), selliselt, et niiskus ei pääseks ligi (märkus 5).

Märkus 4.

Müügil on kasutusvalmid lahused. Müügil on ka muud silüülivad reagendid, näiteks bis-trimetüülsilüültrifluoratsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaan, mida tuleb lahjendada sama mahu veevaba püridiiniga.

5.3.2.

Katseklaas suletakse punniga, loksutatakse hoolikalt (ilma et see ümber läheks), kuni steroolid on täielikult lahustunud. Lastakse ümbritseva õhu temperatuuril vähemalt 15 minutit seista ning seejärel tsentrifuugitakse paar minutit. Selge lahus on gaasikromatograafiliseks analüüsiks valmis.

Märkus 5.

Kerge opalestsentsi tekkimine on tavaline ning ei sega. Valge helbelise massi tekkimine või roosa värvuse ilmumine on niiskuse esinemise või reaktiivi halvenemise märgiks. Nende esinemise korral tuleb katset korrata.

5.4.

Gaasikromatograafiline analüüs.

5.4.1.

Eeltoimingud, kolonnide täitmine.

5.4.1.1.

Kolonn pannakse gaasikromatograafi, sisselaskepunkt ühendatakse aurustiga, mis on seotud jaotussüsteemiga, ning väljalaskepunkt ühendatakse detektoriga.

Tehakse gaasikromatograafi üldine kontroll (lekked gaasiliidetes, detektori, jaotussüsteemi ja registreerimissüsteemi toimimine jne).

5.4.1.2.

Kui kolonni kasutatakse esimest korda, on soovitav see ette valmistada. Kolonni lastakse kerge gaasivool, seejärel lülitatakse tööle gaasikromatograaf ning alustatakse järkjärgulist kuumutamist temperatuurini, mis on vähemalt 20 oC võrra kõrgem kui töötemperatuur (märkus 6). Seda temperatuuri hoitakse vähemalt kaks tundi, seejärel pannakse terve seade tööasendisse (gaasi juurdevoolu ja jaotumise reguleerimine, leegi süütamine, elektrilise meerikuga ühendamine, kolonnahju, detektori ja injektori temperatuuri kohandamine jne) ning signaali tundlikkus reguleeritakse vähemalt kaks korda suuremaks, kui analüüsiks tegemiseks kavandatud. Tekkiv nulljoon peab olema lineaarne, ilma igasuguste piikideta, ja see ei tohi triivida.

Negatiivne sirgjooneline triiv osutab lekkele kolonniühendustes. Positiivne triiv osutab kolonni puudulikule ettevalmistamisele.

Märkus 6.

Ettevalmistamisel on temperatuur kasutatava vedelfaasi maksimaalsest temperatuurist vähemalt 20 oC madalam.

5.4.2.

Töötingimuste valik.

5.4.2.1.

Töö põhitingimused on järgmised:

— kolonni temperatuur: 260 ± 5 oC,

— aurusti temperatuur: 280 oC,

— detektori temperatuur: 290 oC,

— kandegaasi voolukiirus: heelium 20–35 cm/s, vesinik 30–50 cm/s,

— jaotussuhe: 1: 50 — 1: 100,

— seadme tundlikkus: 4–16-kordne minimaalne sumbumine,

— registreerimise tundlikkus: 1–2 mV fs,

— paberi kiirus: 30–60 cm/h,

— süstitava aine kogus 0,5–1 μl TMSE lahust.

Olenevalt kolonni ja gaasikromatograafi karakteristikutest võib neid tingimusi muuta, nii et kromatogrammid vastaksid järgmistele nõuetele:

— β-sitosterooli peetumisaeg peaks olema 20 ± 5 minutit,

— kampesterooli piik peaks olema: oliiviõli puhul (keskmine sisaldus 3 %) 15 ± 5 % kogu mõõtepiirkonnast; sojaõli puhul (keskmine sisaldus 20 %) 80 ± 10 % kogu mõõtepiirkonnast,

— kõik olemasolevad steroolid peavad olema eraldatud. Lisaks sellele peavad piigid olema ka täielikult eraldunud, see tähendab, et piigi jälg peab enne järgmise piigi juurde liikumist minema tagasi piigi nulljoonele. Puudulik resolutsioon on siiski lubatud tingimusel, et piiki on TRR 1,02 juures võimalik mõõta risti.

5.4.3.

Analüüsi käik.

5.4.3.1.

10 μl mikrosüstlaga tõmmatakse 1 μl heksaani, seejärel 0,5 μl õhku ning lõpuks 0,5–1 μl proovilahust. Nõela kolbi tõstetakse veelgi nii, et nõel tühjendatakse. Nõel surutakse läbi injektorseadme kesta ning ühe või kahe sekundi pärast süstitakse kiiresti, seejärel tõmmatakse nõel umbes 5 sekundi pärast aeglaselt välja.

5.4.3.2.

Jätkatakse registreerimist, kuni olemasolevate steroolide TMSE on täielikult elueeritud.

Nulljoon peab vastama nõuetele (5.4.1.2).

5.4.4.

Piigi määramine.

Piigid määratakse peetumisaja põhjal ning samadel tingimusel analüüsitud steroolide TMSE segudega võrdlemise teel.

Steroolid elueeritakse sellises järjekorras: kolesterool, brassikasterool, 24-metüleenkolesterool, kampesterool, kampestanool, stigmasterool, Δ-7-kampesterool, Δ-5,23-stigmastadienool, klerosterool, β-sitosterool, sitostanool, Δ-5-avenasterool, Δ-5,24-stigmastadienool, Δ-7-stigmastenool, Δ-7-avenasterool.

Sitosterooli peetumisajad SE-52 ja SE-54 kolonnide puhul on esitatud tabelis 1.

Joonised 1 ja 2 kirjeldavad mõnede õlide tüüpilisi kromatogramme.

5.4.5.

Kvantitatiivne hindamine.

5.4.5.1.

β-kolestanooli ja steroolipiikide pindala arvutatakse integraatoriga. Välja tuleb jätta nende ühendite piigid, mida ei ole tabelis 1 loetletud. β-kolestanooli kalibreerimistegur peab olema 1.

5.4.5.2.

Iga sterooli kontsentratsioon milligrammides 100 g rasvaine kohta arvutatakse järgmiselt:

kus

sterooli x piigipindala ►M6 ————— ◄ ;

α-kolestanooli piigipindala ►M6 ————— ◄ ;

lisatud α-kolestanooli mass (mg);

määramisel kasutatud proovi mass grammides.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

6.1	Registreeritakse sterooli kontsentratsioonid milligrammides 100 g rasvaine kohta ning nende summa steroolide üldsisaldusena.

Iga sterooli protsent arvutakse vastava piigipindala ja steroolide piikide kogupindala suhtena.

kus

x'i piigi pindala;

ΣA

steroolide piigipindala kokku.

LIIDE

Gaasi voolukiiruse määramine

Normaalsetel töötingimustel gaasikromatograafi süstitakse 1–3 ml metaani (või propaani) ja mõõdetakse aeg, mis kulub gaasi voolamiseks läbi kolonni alates süstimisest kuni piigi ilmumiseni (tM).

Voolukiirus cm/S on esitatud valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on mõõdetud aeg sekundites.

Tabel 1

Steroolide suhtelised peetumisajad

Piik	Identifitseerimine		Suhteline peetumisaeg
Piik	Identifitseerimine		SE 54 kolonn	SE 52 kolonn
1	kolesterool	Δ-5-kolesteen-3β-ool	0,67	0,63
2	kolestanool	5α-kolestaan-3β-ool	0,68	0,64
3	brassikasterool	[24S]-24-metüül-Δ- 5,22-kolestadieen-3β-ool	0,73	0,71
4	24-metüleen-kolesterool	24-metüleen-Δ-5,24-kolesteen-3β-ool	0,82	0,80
5	kampesterool	[24R]-24-metüül-Δ-5-kolestadieen-3β-ool	0,83	0,81
6	kampestanool	[24R]-24-metüül-kolestaan-3β-ool	0,85	0,82
7	stigmasterool	[24R]-24-etüül-Δ-5,22-kolestadieen-3β-ool	0,88	0,87
8	Δ-7-kampesterool	[24R]-24-metüül-Δ-7-kolesteen-3β-ool	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stitmastadienool	[24S, R]-24-etüül-Δ-5,23-kolestadieen-3β-ool	0,95	0,95
10	klerosterool	[24S]-24-etüül-Δ-5,25-kolestadieen-3β-ool	0,96	0,96
11	β-sitosterool	[24R]-24-etüül-Δ-5-kolestaan-3β-ool	1,00	1,00
12	sitostanool	24-etüül-kolestaan-3β-ool	1,02	1,02
13	Δ-5-avenasterool	[24R]-24-etülideen-5-kolesteen-3β-ool	1,03	1,03
14	Δ-5,24-stitmastadienool	[24R, S]-24-etüül-Δ-5,24-kolestadieen-3β-ool	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmastenool	[24R, S]-24-etüül-Δ-7,24-kolestadieen-3β-ool	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterool	[24Z]-24-etülideen-Δ-7-kolesteen-3β-ool	1,16	1,16

Joonis 1 Rafineerimata oliiviõli sterooli fraktsiooni gaasikromatogramm

Joonis 2 Rafineeritud oliiviõli sterooli fraktsiooni gaasikromatogramm

VI LISA

ERÜTRODIOOLI JA UVALOOLI MÄÄRAMINE

SISSEJUHATUS

Erütrodiool (üldiselt mõeldakse selle all koos glükoole erütrodiool ja uvalool) on mõnele rasvainele iseloomulik seebistumatu fraktsiooni komponent. Erütrodiooli leidub ekstraheeritud oliiviõlis märkimisväärselt suuremas kontsentratsioonis kui teistes erütrodiooli sisalduvates õlides (pressitud oliiviõli ja viinamarjaseemneõli, jne) ning seetõttu võib selle esinemine osutada sellele, et lisatud on ekstraheeritud oliiviõli.

1. KOHALDAMISALA

Käesolev meetod kirjeldab erütrodiooli määramist rasvainetes.

2. PÕHIMÕTE

Rasvaine seebistatakse etanoolilahuses kaaliumhüdroksiidiga. Mitteseebistuvad fraktsioonid ekstraheeritakse dietüüleetriga ja puhastatakse läbi alumiiniumoksiidi kolonni juhtimise teel.

Seebistumatutele komponentidele tehakse silikageeli plaadil planaarkromatograafia, kuni sterooli ja erütrodiooli fraktsioonide vööndid on eraldunud. Plaadilt saadud steroolid ja erütrodiool muundatakse trimetüülsilüüleetriteks ning seda segu analüüsitakse gaasikromatograafiliselt.

Tulemus väljendatakse erütrodiooli protsendina erütrodiooli ja steroolide segus.

3. SEADMED

3.1.	V lisas (steroolide sisalduse määramine) kirjeldatud seadmed.

4. REAKTIIVID

4.1.	V lisas (steroolide sisalduse määramine) kirjeldatud reaktiivid.

4.2.	Erütrodiooli standardlahus, 0,5 % lahus kloroformis.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Mitteseebistuvate komponentide ettevalmistamine.

Nagu V lisa lõikes 5.1.2 kirjeldatud.

5.2. Erütrodiooli ja steroolide eraldamine.

5.2.1.

Vaata V lisa lõiget 5.2.1.

5.2.2.

Vaata V lisa lõiget 5.2.2.

5.2.3.

Valmistatakse seebistumatute komponentide 5 % kloroformilahus.

0,1 ml mikrosüstlaga tõmmatakse 0,3 ml kromatograafiaplaadile umbes 1,5 cm kaugusele plaadi alumisest servast võimalikult õhuke ja ühtlane viir.

Ühele plaadiservale pannakse võrdluseks mõned mikroliitrid kolesterooli ja erütrodiooli lahust.

5.2.4.

Vastavalt punktile 5.2.1 ette valmistatud plaat pannakse ilmutusnõusse. Ümbritseva õhu temperatuur peaks olema umbes 20 oC. Ilmutusnõu suletakse kohe kaanega ning plaadil lastakse elueerida, kuni lahusti serv ulatub umbes 1 cm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse ilmutusnõust välja ning lahusti aurustatakse kuuma õhu voolus.

5.2.5.

Plaati pritsitakse kergelt ja ühtlaselt 2,7-diklorofluorestseiini lahusega. Kui plaati vaadeldakse ultraviolettvalguses, on sterooli ja erütrodiooli vööndit võimalik identifitseerida selliselt, et see on samas kohas kui võrdluslahuste vööndid. See vöönd tähistatakse täpiga vahetult fluorestsentsi piiridest väljapool.

5.2.6.

Metallspaatliga kraabitakse märgistatud alalt maha silikageel. Plaadilt saadud materjal pannakse 50 ml kolbi. Lisatakse 15 ml kuuma kloroformi, loksutatakse hoolikalt ning filtreeritakse läbi lehtri, millel on paagutatud klaasketas nii, et silikageel jääb filtrisse. Pestakse kolm korda kuuma kloroformiga (iga kord 10 ml) ning filtraat kogutakse 100 ml kolbi. Filtraat aurustatakse ligikaudu 4–5 ml mahuni ning valatakse 10 ml tsentrifuugiküvetti, seejärel kuivatatakse õrna lämmastiku voolu all ning kaalutakse.

5.3. Trimetüülsilüülestrite valmistamine

Nagu V lisa lõikes 5.3 kirjeldatud.

5.4. Gaasikromatograafiline analüüs

Nagu V lisa punktis 5.4 kirjeldatud. Gaasikromatograafilise analüüsi tegemise tingimused peavad olema sellised, et need võimaldavad läbi viia sterooli analüüsi ning eraldada TMSE erütrodioolist ja uvaloolist.

Kui proov on injekteeritud, jätkatakse registreerimist, kuni proovis olevad steroolid, erütrodiool ja uvalool on elueeritud. Seejärel tehakse kindlaks piigid (erütrodiooli ja uvalooli peetumisajad on suhtes β-sitosterooliga vastavalt 1,45 ja 1,55) ning piigipindala arvutatakse nagu steroolide puhul.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

kus

erütrodiooli piigipindala ►M6 ————— ◄ ;

uvalooli piigipindala ►M6 ————— ◄ ;

Σ Asteroolid

steroolide piigipindala kokku ►M6 ————— ◄ .

Tulemus väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

▼M21

VII LISA

2-GLÜTSERÜÜLMONOPALMITAADI PROTSENDILISE SISALDUSE MÄÄRAMINE

1. EESMÄRK JA RAKENDAMISALA

Käesoleva meetodiga määratakse triglütseriidide 2. positsioonis oleva palmitiinhappe protsendilist sisaldust 2-glütserüülmonopalmitaadi hindamise abil.

Seda meetodit saab kasutada toatemperatuuril (20 °C) vedelate taimeõlide puhul.

2. PÕHIMÕTE

Pärast õliproovi ettevalmistamist lastakse proovil reageerida pankrease lipaasiga – toimub triglütseriidi molekuli spetsiifiline osaline hüdrolüüs 1. ja 3. positsioonis, mille tulemusena tekivad 2-monoglütseriidid. 2-glütserüülmonopalmitaadi sisaldus monoglütseriidi fraktsioonis määratakse pärast silaanimist kapillaarkolonn-gaasikromatograafia abil.

3. KASUTATAVAD SEADMED JA MATERJALID

3.1.	25milliliitrine Erlenmeyeri kolb

3.2.	100-, 250- ja 300milliliitrised keeduklaasid

3.3.	Klaasist kromatograafiakolonn sisediameetriga 21–23 mm ja pikkusega 400 mm, mis on varustatud klaasfilterketta ja kraaniga

3.4.	Gradueeritud 10-, 50-, 100- ja 200milliliitrised mõõtesilindrid

3.5.	100- ja 250milliliitrised ümarkolvid

3.6.	Pöördaurusti

3.7.	10milliliitrised lihvkorgiga tsentrifuugitopsid, millel on kooniline põhi

3.8.	Tsentrifuug tööks 10- ja 100milliliitriste tsentrifuugitopsidega

3.9.	Termostaat, mis võimaldab hoida temperatuuri 40 ± 0,5 °C

3.10.

Gradueeritud 1- ja 2milliliitrised pipetid

3.11.

1milliliitrine hüpodermiline süstal

3.12.

100mikroliitrine mikrosüstal

3.13.

1 000 milliliitrine jaotuslehter

3.14.

Kapillaarkolonniga gaasikromatograaf, mis on varustatud süsteemiga, mis võimaldab proovi otse külmalt kolonni süstimist, ja ahjuga, mis hoiab soovitud temperatuuri 1 °C täpsusega

3.15.

Külminjektor proovi viimiseks otse kolonni

3.16.

Leekionisatsioondetektor ja elektromeeter

3.17.

Koos elektromeetriga kasutatav integraatormeerik, mille reageerimisaeg on kuni 1 sekund ning mille paberi kiirust saab muuta

3.18.

Klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn pikkusega 8–12 m ja sisediameetriga 0,25–0,32 mm, mis sobib tööks kuni 370 °C juures ja mis on seestpoolt kaetud 5 % metüülpolüsiloksaani või fenüül-metüülpolüsiloksaani kihiga, mille paksus on 0,10–0,30 μm

3.19.

Vähemalt 7,5 cm pikkune 10mikroliitrine mikrosüstal otse kolonni süstimiseks, mille nõelal on tugevdatud pinnakiht

4. REAKTIIVID

4.1.

Silikageel tera suurusega 0,063–0,200 mm (sõelaava 70–280), mis on ette valmistatud järgmisel viisil. Silikageel pannakse portselankaussi, kuivatatakse kuivatuskapis 160 °C juures 4 tundi, lastakse eksikaatoris jahtuda toatemperatuurini. Lisatakse vett koguses, mis vastab 5 % le silikageeli massist, tehes seda järgmisel viisil: 500milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi kaalutakse 152 g silikageeli ja lisatakse 8 g destilleeritud vett, suletakse korgiga ja segatakse ettevaatlikult, et tagada vee ühtlane jaotumine. Enne kasutamist lastakse seista vähemalt 12 tundi.

4.2.	n-heksaan, kromatograafias kasutamiseks

4.3.	Isopropanool

4.4.	Isopropanooli vesilahus (mahusuhe 1:1)

4.5.	Pankrease lipaas. Kasutatava lipaasi aktiivsus peab olema vahemikus 2,0–10 lipaasiühikut mg kohta (müügilolevate lipaaside aktiivsus on 2–10 ühikut ensüümi mg kohta)

4.6.	Puhverlahus: 1 M tris-hüdroksümetüülaminometaani lahuse pH reguleeritakse potentsiomeetriga kontrollides väärtusele 8, lisades selleks kontsentreeritud soolhapet (mahusuhe 1:1)

4.7.	Naatriumkolaat, ensüümikvaliteediga, 0,1 % vesilahus (lahus tuleb ära kasutada 15 päeva jooksul pärast valmistamist)

4.8.	Kaltsiumkloriid, 22 % vesilahus

4.9.	Dietüüleeter, kromatograafias kasutamiseks

4.10.

Elueerimislahus: n-heksaani ja dietüüleetri segu (mahusuhe 87:13)

4.11.

Naatriumhüdroksiid, 12massiprotsendiline lahus

4.12.

Fenoolftaleiin, 1 % lahus etanoolis

4.13.

Kandegaas: vesinik või heelium gaasikromatograafias kasutamiseks

4.14.

Abigaasid: kuiv vesinik, vähemalt 99 % puhtusega, ei tohi sisaldada orgaanilisi aineid; õhk kromatograafias kasutamiseks, sama puhtusastmega

4.15.

Silaanimisreaktiiv: püridiini, heksametüüldisilasaani ja trimetüülklorosilaani segu (mahusuhe 9:3:1). (Müügil on vastavad valmissegud. Kasutada võib ka muid silaanimisreaktiive, näiteks bistrimetüülsilüültrifluoroatsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaani, mis on lahustatud samas koguses veevabas püridiinis.)

4.16.

Standardproovid: puhtad monoglütseriidid või proovile sarnaste mahusuhetega monoglütseriidide segud, mille teadaolevad mahusuhted on samad kui proovil.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Proovi ettevalmistamine

5.1.1.

Õlisid, milles vabade hapete sisaldus on alla 3 %, ei ole vaja neutraliseerida enne kromatografeerimist silikageelkolonnis. Õlid, mille vabade hapete sisaldus on suurem kui 3 %, tuleb neutraliseerida vastavalt punktile 5.1.1.1.

5.1.1.1.

1 000 milliliitrisesse jaotuslehtrisse (3.13) kallatakse 50 g õli ja 200 ml n-heksaani. Lisatakse 100 ml isopropanooli ja selline kogus 12 % naatriumhüdroksiidi (4.11), mis on 5 % suurem kui vabade hapete kogus õlis. Loksutatakse tugevasti 1 minuti jooksul. Lisatakse 100 ml destilleeritud vett, loksutatakse uuesti ja lastakse seista.

Pärast kihistumist eemaldatakse alumine kiht, mis sisaldab seepe. Eemaldatakse ka võimalikud vahepealsed kihid (lima ja mittelahustuvad ained). Neutraliseeritud õli lahust heksaanis pestakse järjestikuste 50–60milliliitriste isopropanooli vesilahuse (mahusuhe 1:1) (4.4) kogustega kuni fenoolftaleiini roosa värvuse kadumiseni.

Vaakumdestilleerimisega (näiteks pöördaurusti abil) eemaldatakse suurem osa heksaanist ja õli kantakse üle 100milliliitrisesse ümarkolbi (3.5). Õli kuivatatakse vaakumis kuni lahusti täieliku eemaldamiseni.

Selle toimingu tulemusena peab õli happelisus jääma alla 0,5 %.

5.1.2.

1,0 g eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud õli pannakse 25milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) ja lahustatakse 10 ml elueerimislahuses (4.10). Enne kromatografeerimist silikageelkolonnis lastakse lahusel vähemalt 15 minutit seista.

Kui lahus on hägune, tsentrifuugitakse see, et luua optimaalsed tingimused kromatograafia jaoks. (On lubatud kasutada müügilolevaid valmis SPE silikageelipadruneid (500 mg)).

5.1.3.

Kromatograafiakolonni valmistamine

Kolonni (3.3) kallatakse ligikaudu 30 ml elueerimislahust (4.10), kolonni alumisse otsa viiakse klaaspulga abil vatitükk ja pressitakse seda õhu eemaldamiseks.

Keeduklaasis valmistatakse suspensioon 25 g silikageelist (4.1) ja ligikaudu 80 ml elueerimislahusest; suspensioon kallatakse lehtri abil kolonni.

Kontrollitakse, et kogu silikageel oleks viidud kolonni, loputatakse seda elueerimislahusega (4.10), avatakse kraan ja lastakse vedelikul voolata, kuni silikageeli kohale jääb ligikaudu 2 mm vedelikku.

5.1.4.

Kolonnkromatograafia

25 milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) kaalutakse täpselt 1,0 g punkti 5.1 kohaselt ettevalmistatud proovi.

Proov lahustatakse 10 ml elueerimislahuses (4.10). Lahus kantakse üle punkti 5.1.3 kohaselt valmistatud kromatograafiakolonni. Tuleb vältida kolonnitäidise pinna liigutamist.

Avatakse kraan ja proovi lahusel lastakse välja voolata seni, kuni tase jõuab silikageeli tasemeni. Elueeritakse 150 ml elueerimislahusega. Elueerimislahust lisatakse kiirusega 2 ml/min (150 ml lisamine kolonni võtab aega ligikaudu 60–70 min).

Eluaat kogutakse eelnevalt kaalutud 250milliliitrisesse ümarkolbi. Lahusti aurustatakse vaakumis, viimased lahusti jäljed eemaldatakse lämmastikuvoolus.

Ümarkolb kaalutakse ja arvutatakse eraldatud aine kogus.

(Juhul kui kasutatakse müügilolevaid valmis SPE silikageelipadruneid, toimitakse järgmiselt: 1 ml lahust (5.1.2) viiakse padrunitesse, mis on eelnevalt ette valmistatud 3 ml n-heksaaniga.

Pärast lahuse nõrgumist kolonni elueeritakse 4 ml n-heksaani-dietüüleetri lahusega (mahusuhe 9:1).

Eluaat kogutakse 10milliliitrisesse katseklaasi ja aurustatakse lämmastikuvoolus kuivaks.

Kuivaine hüdrolüüsitakse pankrease lipaasiga (5.2). Oluline on kontrollida rasvainete sisaldust enne ja pärast SPE-padruni kasutamist).

5.2. Hüdrolüüs pankrease lipaasiga

5.2.1.

Tsentrifuugitopsi kaalutakse 0,1 g punkti 5.1 kohaselt ettevalmistatud proovi. Lisatakse 2 ml puhverlahust (4.6), 0,5 ml naatriumkolaadi lahust (4.7) ja 0,2 ml kaltsiumkloriidi lahust; pärast iga lahuse lisamist segatakse hoolikalt. Tops suletakse lihvkorgiga ja asetatakse termostaati temperatuuriga 40 + 0,5 °C.

5.2.2.

Lisatakse 20 mg lipaasi, segatakse hoolikalt (vältides korgi kokkupuutumist lahusega) ning asetatakse tops täpselt 2 minutiks termostaati, seejärel võetakse see termostaadist välja, loksutatakse tugevasti täpselt ühe minuti jooksul ning lastakse jahtuda.

5.2.3.

Lisatakse 1 ml dietüüleetrit, suletakse tops korgiga ja loksutatakse tugevasti, seejärel segu tsentrifuugitakse ning eetrilahus kantakse mikrosüstla abil puhtasse ja kuiva topsi.

5.3. Silaanitud ühendite valmistamine ja gaasikromatograafia

5.3.1.

Mikrosüstla abil viiakse 100 μl lahust (5.2.3) 10milliliitrisesse koonilise põhjaga topsi.

5.3.2.

Lahusti eemaldatakse nõrga lämmastikuvoolu all, lisatakse 200 μl silaanimisreaktiivi (4.15), tops suletakse korgiga ja lastakse seista 20 minuti jooksul.

5.3.3.

20 minuti pärast lisatakse 1–5 ml n-heksaani (sõltuvalt kromatograafia läbiviimise tingimustest) – saadav lahus on valmis gaasikromatograafia läbiviimiseks.

5.4. Gaasikromatograafia

Töö põhitingimused on järgmised:

— injektori (on-column-injektor) temperatuur on madalam lahusti keemistemperatuurist (68 °C);

— detektori temperatuur: 350 °C;

— kolonni temperatuur: ahju temperatuuri muudetakse järgmise programmi kohaselt: 60 °C 1 minuti jooksul, temperatuuri tõstetakse 15 °C minutis kuni temperatuurini 180 °C, seejärel 5 °C minutis kuni temperatuurini 340 °C, 340 °C 13 minuti jooksul;

— kandegaas: vesinik või heelium, mille lineaarkiirust reguleeritakse nii, et saada joonisel 1 kujutatud lahutus; triglütseriidi C54 retentsiooniaeg peab olema 40 + 5 minutit (vt joonis 2); (Need töö põhitingimused on ligikaudsed. Töö teostaja peab neid soovitud tulemuste saamiseks kohandama. 2-glütserüülmonopalmitaadi piigi kõrgus peab olema vähemalt 10 % registreerimisseadme skaala ulatusest.);

— kolonni süstitava aine kogus on 0,5–1 μl n-heksaani lahust (5 ml) (5.3.3).

5.4.1. Piikide määramine

Piigid määratakse retentsiooniaja põhjal, võrdlusest samadel tingimusel analüüsitud monoglütseriidide standardsegude puhul saadud tulemustega.

5.4.2. Kvantitatiivne hindamine

Elektroonilise integraatori abil leitakse iga piigi pindala.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Glütserüülmonopalmitaadi protsendiline sisaldus arvutatakse vastava piigi pindala ja monoglütseriidide piikide kogupindala suhtena (vt joonis 2) vastavalt järgmisele valemile:

Gycéril monopalmitate (%):

kus:

glütserüülmonopalmitaadi piigi pindala;

ΣA

monoglütseriidide piikide kogupindala.

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

7. ANALÜÜSI PROTOKOLL

Analüüsi protokollis tuleb esitada järgmine teave:

— viide käesolevale meetodile;

— kogu teave, mis on vajalik proovi täielikuks identifitseerimiseks;

— analüüsi tulemus;

— kõik kõrvalekaldumised käesolevast meetodist, kas asjaomaste poolte kokkuleppe tõttu või muudel põhjustel;

— andmed laboratooriumi kohta, analüüsi läbiviimise kuupäev ja analüüsi läbiviimise eest vastutavate isikute allkirjad.

Joonis 1

Silaanimisreaktsiooni saaduste kromatogramm (rafineeritud oliiviõlile on lisatud 20 % täielikult esterdatud õli, segu on töödeldud lipaasiga ja reaktsioonisaadused on silaanitud)

Kirjad joonisel: Acides gras libres = vabad rasvhapped Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = rafineeritud oliiviõli + 20 % esterdatud õli 1–2 monopalmitoléine = 1–2 monopalmitoleiin 1–2 monopalmitine = 1–2 monopalmitiin 1–2 monoC18 insat. = 1–2 monoC18 küllastamata Squalene = skvaleen]

Joonis 2

Kromatogramm:

esterdamata oliiviõli pärast lipaasiga töötlemist; pärast silüülimist; kõnealuste tingimuste juures (kapillaarkolonni pikkus 8–12 m) elueeritakse vahafraktsioon samaaegselt diglütseriidi fraktsiooniga või veidi hiljem.

Pärast lipaasiga töötlemist ei tohi triglütseriidide sisaldus ületada 15 %.

Tähistused:

vabad rasvhapped

monoglütseriidid

diglütseriidid

triglütseriidid

2-monopalmitiin

triglütseriid C54

Kromatogramm:

esterdatud õli pärast lipaasiga töötlemist; pärast silaanimist; kõnealuste tingimuste juures (kapillaarkolonni pikkus 8–12 m) elueeritakse vahafraktsioon samaaegselt diglütseriidi fraktsiooniga või veidi hiljem.

Pärast lipaasiga töötlemist ei tohi triglütseriidide sisaldus ületada 15 %.

Tähistused:

vabad rasvhapped

monoglütseriidid

diglütseriidid

triglütseriidid

2-monopalmitiin

triglütseriid C54

8. MÄRKUSED

LIPAASI VALMISTAMINE

Müügil on rahuldava aktiivsusega lipaase. Lipaasi saab valmistada ka laboris järgmisel viisil:

5 kg värsket seapankreast jahutatakse temperatuurini 0 °C. Eemaldatakse tahke rasvkude ja seda ümbritsev sidekude ning pankreas peenestatakse lõikenugadega peenestajas kuni ühtlase vedela massi saamiseni. Saadud massi segatakse 4–6 tunni jooksul 2,5 liitri veevaba atsetooniga, seejärel tsentrifuugitakse. Saadud jääki ekstraheeritakse veel kolm korda sama koguse veevaba atsetooniga, seejärel kaks korda sama koguse atsetooni/dietüüleetri seguga (mahusuhe 1:1) ning veel kaks korda dietüüleetriga.

Saadud jääki kuivatatakse 48 tunni jooksul vaakumis; tulemusena saadakse stabiilne pulber, mida on võimalik külmkapis kuivas pikemaajaliselt hoida.

LIPAASI AKTIIVSUSE KONTROLLIMINE

Valmistatakse oliiviõli emulsioon järgmisel viisil:

Mikseris segatakse 10 minuti jooksul järgmist segu: 165 ml kummiaraabiku lahust kontsentratsiooniga 100 g/l, 15 g purustatud jääd ja 20 ml eelnevalt neutraliseeritud oliiviõli.

50milliliitrisesse keeduklaasi viiakse 10 ml saadud emulsiooni, seejärel 0,3 ml naatriumkolaadi lahust kontsentratsiooniga 0,2 g/ml ja 20 ml destilleeritud vett.

Keeduklaas asetatakse termostaati temperatuuriga 37 °C, lahusesse viiakse pH-meetri elektroodid ja spiraalsegaja.

Büreti abil lisatakse tilkhaaval naatriumhüdroksiidi 0,1 N lahust, kuni pH saavutab väärtuse 8,3.

Lisatakse teatav kogus lipaasi suspensiooni vees (0,1 g/ml lipaasi). Kui pH-meeter näitab pH väärtust 8,3, käivitatakse stopper ja hakatakse tilkhaaval lisama naatriumhüdroksiidi lahust sellise kiirusega, et hoida pH-d väärtusel 8,3. Iga minuti möödudes märgitakse üles selleks kulunud lahuse kogus.

Andmed kantakse graafikule, võttes abstsissteljeks ajatelje ja kandes ordinaatteljele 0,1 N leelise lahuse kogused milliliitrites, mis on kulunud pH väärtuse hoidmiseks konstantsena. Graafik peab olema lineaarne.

Lipaasi aktiivsus, mida väljendatakse lipaasi ühikutes mg kohta, arvutatakse järgmise valemi abil:

kus:

A	aktiivsus lipaasi ühikutes mg kohta;

V	0,1 N naatriumhüdroksiidi lahuse kulu milliliitrites minuti kohta (arvutatud graafiku alusel);

N	naatriumhüdroksiidi lahuse normaalsus;

m	prooviks võetud lipaasi mass, mg.

Lipaasi ühik on määratletud kui ensüümi kogus, mis vabastab 10 mikroekvivalenti hapet ühe minuti jooksul.

▼M20 —————

▼M25

IX LISA

SPEKTROFOTOMEETRILINE ANALÜÜS ULTRAVIOLETTPIIRKONNAS

EESSÕNA

Spektrofotomeetriline analüüs ultraviolettpiirkonnas võib anda teavet rasva kvaliteedi, säilivusseisundi ja tehnoloogilistest protsessidest tulenenud muutuste kohta.

Käesolevas meetodis osutatud lainepikkustel esinev neeldumine on tingitud konjugeeritud dieen- ja trieensüsteemide olemasolust. Need neeldumised on väljendatud eriekstinktsioonina E 1 % 1 cm (teatavas lahustis valmistatud 1 % rasvalahuse 1 cm paksuse kihi ekstinktsioon), mida tavaliselt väljendatakse tähisega K (tuntud ka ekstinktsioonikoefitsiendina).

1. KÄSITLUSALA

Käesolevas meetodis kirjeldatakse oliiviõli ultraviolettpiirkonna spektrofotomeetrilise analüüsi (kirjeldus vt liide) läbiviimist.

2. MEETODI PÕHIMÕTE

Rasv lahustatakse ettenähtud lahustis ja lahuse ekstinktsioon määratakse kindlaks teataval lainepikkusel, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit. Eriekstinktsioonid arvutatakse spektrofotomeetri lugemite põhjal. Arvutatakse eriekstinktsioon 232 nm ja 268 nm juures isooktaanis või 232 nm ja 270 nm juures tsükloheksaanis kontsentratsioonil 1 g 100 ml kohta küvetis läbimõõduga 10 mm.

3. SEADMED

3.1.

Spektrofotomeeter ekstinktsiooni mõõtmiseks ultraviolettpiirkonnas 220–360 nm vahel, mis võimaldaks tulemusi lugeda ühe nanomeetri täpsusega. Enne kasutamist soovitatakse kontrollida spektrofotomeetri lainepikkuse ja neeldumise skaalat vastavalt järgmisele eeskirjale.

3.1.1. Lainepikkuse skaala. Selle kontrollimiseks võib kasutada võrdlusmaterjali, milleks on holmiumoksiidi sisaldavast optilisest klaasist filter, millel on selged neeldumisribad. Osutatud võrdlusmaterjal on ette nähtud selliste nähtava ja ultraviolettvalguse spektrofotomeetrite lainepikkuse skaala kontrollimiseks ja kaliibrimiseks, mille spektririba nimilaius on 5 nm või väiksem. Holmiumklaasfiltrit mõõdetakse neeldumisrežiimis, kasutades võrdluseks õhku, lainepikkuse vahemikus 640–240 nm. Iga spektriribalaiuse (0,10 – 0,25 – 0,50 – 1,00 – 1,50 – 2,00 ja 3,00) jaoks tehakse tühja küvetihoidjaga 0-joone parandus. Spektriribalaiuste lainepikkused on loetletud võrdlusmaterjali sertifikaadis standardis ISO 3656.

3.1.2. Neelduvuse skaala. Seda võib kontrollida võrdlusmaterjali kasutamisega; võrdlusmaterjalina kasutatakse nelja kaaliumdikromaadi lahust perkloorhappes, mis on pandud nelja UV-piirkonnas töötamiseks ettenähtud kvartsküvetti; küvetid on suletud ja nendega mõõdetakse UV-piirkonnas skaala lineaarsust ja määramise fotomeetrilist täpsust. Kaaliumdikromaadi lahustega küvettide (40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml and 100 mg/ml) mõõtmisel kasutatakse võrdluslahusena perkloorhapet. Neelduvuse väärtused on loetletud võrdlusmaterjali sertifikaadis standardis ISO 3656.

3.2.	Risttahukakujulised korgiga kvartsküvetid optilise tee pikkusega 1 cm. Vee või mõne muu sobiva lahustiga täitmise korral ei tohiks küvettide tulemuste erinevus olla suurem kui 0,01 ekstinktsiooniühikut.

3.3.	25 ml mõõtekolvid.

3.4.	Analüütiline kaal, millelt saab andmeid lugeda täpsusega 0,0001 g.

4. REAGENDID

Kui ei ole öeldud teisiti, kasutatakse ainult tunnustatud analüütiliselt puhtaid reaktiive.

Lahusti: isooktaan (2,2,4-trimetüülpentaan) mõõtmiseks 232 nm ja 268 nm juures või tsükloheksaan mõõtmiseks 232 nm ja 270 nm juures, mille neelduvus 10 mm küvetis 232 nm juures on väiksem kui 0,12 ja neelduvus 250 nm juures destilleeritud vee vastu mõõtmisel on väiksem kui 0,05.

5. TÖÖ KÄIK

5.1.	Kõnealune proov peab olema täiesti homogeenne ja heljuvate lisanditeta. Toatemperatuuril vedelad õlid filtritakse läbi paberi temperatuuril ligikaudu 30 °C, tahked rasvad homogeenitakse ja filtritakse temperatuuril, mis võib olla rasva sulamistemperatuurist kuni 10 °C kõrgem.

5.2.	25 ml mõõtekolbi kaalutakse ligikaudu 0,25 g (täpsusega 1 mg) eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud proovi, täidetakse ettenähtud lahustiga kuni märgini ning homogeenitakse. Tekkiv lahus peab olema täiesti selge. Opalestsentsi või hägususe korral tuleb proov kiiresti läbi paberi filtreerida.

5.3.

Kvartsküvett täidetakse saadud lahusega ning ekstinktsioonid mõõdetakse nõutavatel lainepikkustel vahemikus 232 ja 276 nm, võttes võrdluseks kasutatud lahusti.

Registreeritud ekstinktsiooniväärtused peavad jääma vahemikku 0,1–0,8. Vastasel korral tuleb mõõtmisi korrata ja kasutada vajaduse korral vähem või rohkem lahjendatud lahuseid.

MÄRKUS: neelduvuse mõõtmine kogu lainepikkuse vahemikus ei tarvitse olla vajalik.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

6.1.

Registreeritakse eriekstinktsioonid (ekstinktsioonikoefitsiendid) eri lainepikkustel, mis arvutatakse järgmise võrrandi alusel:

kus:

Κλ

on eriekstinktsioon lainepikkusel λ;

Ελ

on ekstinktsioon lainepikkusel λ;

on lahuse kontsentratsioon g/100 ml;

on lahusekihi paksus ehk kvartsküveti läbimõõt (cm).

Tulemused väljendatakse kahe kümnendikkoha täpsusega.

6.2.

Eriekstinktsiooni variatsioon (ΔΚ)

ELi ametliku meetodi kohasel oliiviõli spektrofotomeetrilisel analüüsil määratakse ka eriekstinktsiooni absoluutväärtuse variatsioon (ΔΚ), mis arvutatakse järgmiselt:

kus Km on eriekstinktsioon lainepikkusel m; maksimaalse neeldumise lainepikkus sõltub kasutatavast lahustist: 270 tsükloheksaani puhul ja 268 isooktaani puhul.

Liide

OLIIVIÕLI NÄITAJAD

Kategooria

Rasvhapete metüülestrid (FAME) ja rasvhapete etüülestrid (FAEE)

Happelisus (%) (*)

Peroksiid- indeks mekv O2 / kg (*)

Vahad mg/kg (**)

2-glütserüülmonopalmitaat (%)

Stigmasta- dieen mg/kg (1)

Vahe: ECN42 (HPLC) ECN42 (teoreetiliselt arvutatud)

K232 (*)

K270 (*) „K 270 või K 268 (5)”

Delta-K (*) (5)

Organoleptiline hindamine Puuduse mediaan (Md) (*)

Organoleptiline hindamine Viljale iseloomulikkuse mediaan (Mf)(*)

Ekstra-neitsioliiviõli

Σ FAME + FAEE ≤75 mg/kg või 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤150 mg/kg ja (FAEE/FAME) ≤1,5

≤ 0,8

≤ 20

≤ 250

≤ 0,9 kui palmitiinhappe üldsisaldus % ≤ 14 %

≤ 0,10

≤ 0,2

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Md = 0

Mf > 0

1,0 kui palmitiinhappe üldsisaldus % > 14%

Neitsioliiviõli

—

≤ 2,0

≤ 20

≤ 250

≤ 0,9 kui palmitiinhappe üldsisaldus % ≤ 14%

≤ 0,10

≤ 0,2

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Md ≤ 3,5

Mf > 0

≤ 1,0 kui palmitiinhappe üldsisaldus % > 14%

Lambiõli

—

> 2,0

—

≤ 300 (3)

≤ 0,9 kui palmitiinhappe üldsisaldus % ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ 0,3

—

Md > 3,5 (2)

—

≤ 1,1 kui palmitiinhappe üldsisaldus % > 14%

Rafineeritud oliiviõli

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 350

≤ 0,9 kui palmitiinhappe üldsisaldus % ≤ 14 %

—

≤ 0,3

—

≤ 1,10

≤ 0,16

—

≤ 1,1 kui palmitiinhappe üldsisaldus % > 14%

Rafineeritud ja neitsioliiviõlist koosnev oliiviõli

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 350

≤ 0,9 kui palmitiinhappe üldsisaldus % ≤ 14 %

—

≤ 0,3

—

≤ 0,90

≤ 0,15

—

≤ 1,0 kui palmitiinhappe üldsisaldus % > 14%

Töötlemata oliivijääkõli

—

> 350 (4)

≤ 1,4

—

≤ 0,6

—

Rafineeritud oliivijääkõli

—

≤ 0,3

≤ 5

> 350

≤ 1,4

—

≤ 0,5

—

≤ 2,00

≤ 0,20

—

Oliivijääkõli

≤ 1,0

≤ 15

> 350

≤ 1,2

—

≤ 0,5

—

≤ 1,70

≤ 0,18

—

(1) Kokku isomeere, mis õnnestus (mida ei õnnestunud) lahutada kapillaarkolonniga.

(2) Või kui puuduse mediaan on 3,5 või väiksem ja viljale iseloomulikkuse mediaan on 0.

(3) Õlisid vahasisaldusega 300–350 mg/kg käsitatakse lambiõlidena, kui alifaatsete alkoholide üldsisaldus on 350 mg/kg või väiksem või kui erütrodiooli ja uvaooli sisaldus on 3,5 % või väiksem.

(4) Õlisid vahasisaldusega 300–350 mg/kg käsitatakse töötlemata oliivijääkõlidena, kui alifaatsete alkoholide üldsisaldus on üle 350 mg/kg ning kui erütrodiooli ja uvaooli sisaldus on suurem kui 3,5 %.

(5) K 270, kui lahusti on tsükloheksaan, K 268, kui lahusti on isooktaan.

▼B

X A LISA

RASVHAPETE METÜÜLESTRITE GAASIKROMATOGRAAFILINE ANALÜÜS

1. KOHALDAMISALA

Käesoleva meetodiga antakse üldjuhised täidetud või kapillaarkolonniga gaaskromatograafia kohaldamiseks kooskõlas X B lisaga saadud rasvhapete metüülestrite segu kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise kindlakstegemisel.

Seda meetodit ei kohaldata polümeriseeritud rasvhapete suhtes.

2. REAKTIIVID

2.1. Kandegaas

Inertgaas (lämmastik, heelium, argoon, vesinik), põhjalikult kuivatatud ja hapnikusisaldusega kuni 10 mg/kg.

Märkus 1.

Vesinik, mida kasutatakse kandegaasina ainult kapilaarkolonnidega, võib analüüsi kiirust kahekordistada, kuid on ohtlik. Saadaval on ohutusseadmed.

2.2. Abigaasid

2.2.1.

Lämmastik (puhtus ≥ 99,9 %), orgaaniliste lisanditeta.

2.2.2.

Õhk või hapnik, orgaaniliste lisanditeta.

2.3. Võrdlusstandard

Puhaste rasvhapete metüülestrite segu või teadaoleva, eelistatult analüüsitava rasvainega sarnase koostisega rasva metüülestrid.

Tuleb tagada, et polüküllastumata rasvhapped ei oksüdeeruks.

3. SEADMED

Juhendid käsitlevad tavapäraseid gaasikromatograafia seadmeid, rakendades täidetud ja/või kapillaarkolonne ja leekionisatsioonidetektorit. Sobivad kõik punktis 4.1.2 nimetatud efektiivsuse ja resolutsiooniga seadmed.

3.1. Gaasikromatograaf

Gaasikromatograaf koosneb järgmistest elementidest.

3.1.1. Sissepritsesüsteem

Kasutatakse sissepritsesüsteemi, millel on:

a) täidetud kolonnid, väikseima võimaliku tühimahuga (sellisel juhul peab sissepritsesüsteemi olema võimalik kuumutada 20–50 oC kuumemaks kui kolonni); või

b) kapillaarkolonnid, sellisel juhul peab sissepritsesüsteem olema spetsiaalselt vastavaks otstarbeks kavandatud. See võib olla jaotatud või jaotamata vooluga injektor.

Märkus 2.Vähem kui 16 süsinikuaatomiga rasvhapete puudumise korral võib kasutada liikuva nõelaga injektorit.

3.1.2. Ahi

Kolonni peab olema võimalik ahjus kuumutada vähemalt temperatuurini 260 °C ning ahi peab soovitud temperatuuri hoidma täidetud kolonniga 1°C ja kapillaarkolonniga 0,1 °C täpsusega. Viimane nõue on eriti oluline juhul, kui kasutatakse kvartsklaasist kolonni.

Temperatuuriregulaatoriga kuumutamine on kõikidel juhtudel soovitav, eelkõige rasvhapete puhul, millel on vähem kui 16 süsinikuaatomit.

3.1.3. Täidetud kolonn

3.1.3.1.

Kolonn, analüüsitava ainega inertsest materjalist (klaasist või roostevabast terasest), millel on järgmised mõõtmed.

a) pikkus: 1–3 m. Kui esineb pikaahelalisi rasvhappeid (üle C20), tuleks kasutada suhteliselt lühikest kolonni. 4–6 süsinikuaatomiga hapete analüüsimisel on soovitav kasutada 2 m pikkust kolonni;

b) sisediameeter: 2–4 mm.

Märkus 3.

Kui esineb rohkem kui kolme kaksiksidemega polüküllastumata komponente, võib need lagundada roostevabast terasest kolonnis.

Märkus 4. Kasutada võib kahe täidetud kolonniga süsteemi.

3.1.3.2.

Täitmine, kasutatakse järgmisi komponente:

a) tugiaine: happega pestud ja silaanitud kobediatomiit või muu sobiv inertne kandegaas, millel on kitsas terasuuruste väärtus (25 μm ulatus 125–200 μm) ning tera keskmine suurus on seotud kolonni sisediameetri ja pikkusega;

b) statsionaarne faas: polüestri tüüpi polaarne vedelik (nt detüleen-glükool-polüsuktsinaat, butanediool-polüsuktsinaat, etüleenglükool-polüadipaat jne), tsüanosilikoonid või mõni muu vedeldi, mis võimaldab vajaliku kromatograafilist eraldamist (vt punkt 4). Statsionaarse faasi osakaal peaks kolonni täitmisest moodustama 5–20 %. Teatavate eraldamiste puhul võib kasutada ka mittepolaarset statsionaarset faasi.

3.1.3.3.

Kolonni tasakaalustamine

Kui kolonn on võimaluse korral detektorist eraldatud, kuumutatakse ahju järk-järgult temperatuurini 185 °C ning vahetult ettevalmistatud kolonni lastakse sellel temperatuuril vähemalt 16 tunni jooksul inertgaasi vool kiirusega 20–60 ml/min ja täiendavalt 2 tunni jooksul temperatuuril 195 °C.

3.1.4. Kapillaarkolonn

3.1.4.1.

Katseklaas, mis on valmistatud analüüsitava ainega inertsest materjalist (tavaliselt klaas või kvartsklaas). Sisediameeter on 0,2–0,8 mm. Sisekülge tuleb enne statsionaarse faasi kihiga katmist nõuetekohaselt töödelda (nt pinna ettevalmistamine, inaktiveerimine). Enamikul juhtudel on piisavaks pikkuseks 25 mm.

3.1.4.2.

Statsionaarne faas, tavaliselt polüglükooli (polü(etüleenglükool)20 000 ), polüestri (butanediool-polüsuktsinaat) või polaar-polüsiloksaani (tsüanosilikoonide) tüüpi. Sobivad seotud (võrkstruktuuriga) kolonnid.

Märkus 5.Polaar-polüsiloksaanid võivad raskendada linoleenhappe ja C20 hapete identifitseerimist ja eraldamist.

Kiht peab olema õhuke, st 0,1–0,2 μm.

3.1.4.3.

Kolonni monteerimine ja tasakaalustamine

Järgitakse kapillaarkolonnide tavapäraseid ettevaatusabinõusid: kolonni asetus ahjus (tugirajatised), liitekohtade valik ja paigaldus (lekkekindlus), kolonni otste asetus injektoris ja detektoris (võimalikult vähe tühja ruumi). Läbi kolonni juhitakse kandegaas (nt 0,3 baari (30 kPa) läbi 25 mm pikkuse ja 0,3 mm sisediameetriga kolonni).

Kolonn tasakaalustatakse ahju reguleerides selliselt, et temperatuur tõuseb ümbritseva õhu temperatuurilt 3 °C minutis, saavutades sellise temperatuuri, mis on 10 °C madalam kui statsionaarse faasi hajumistemperatuur. Ahju hoitakse sellisel temperatuuril tund aega, kuni nulljoon stabiliseerub. Temperatuuri alandatakse taas tagasi 180 oC-le ja katset jätkatakse isotermilistel tingimustel.

Märkus 6. Nõuetekohaselt tasakaalustatud kolonnid on müügil.

3.1.5.

Detektor, mida on soovitavalt võimalik kuumutada temperatuurini, mis on kolonni omast kõrgem.

3.2. Süstal

Süstla ülemine mõõtepiir on 10 ml ning mõõtskaala jagatud 0,1-milliliitristeks ühikuteks.

3.3. Meerik

Kui meeriku kõverat kasutatakse analüüsitava segu koostise arvutamiseks, on vaja väga täpset elektrimeerikut, mis sobib kokku kasutatavate seadmetega. Meerikul peavad olema järgmised omadused:

a) vastamisaeg alla 1,5 s, soovitavalt 1 s (vastamisaeg on aeg, mis kulub meeriku nõelal liikumiseks vahemikus 0–90 % pärast seda kui ootamatult antakse 100 % signaal;

b) paberi laius, vähemalt 20 cm;

c) paberi kiirus, mida on võimalik kohandada kiiruseni 0,4–2,5 cm/min.

3.4. Integraator

Elektroonilise integraatoriga on võimalik kiiresti ja täpselt arvutada. Elektroonilise integraatoriga on võimalik saavutada piisava tundlikkusega lineaarne vastus ning nulljoone kõrvalekalde korrektsioon on rahuldav.

4. TÖÖ KÄIK

Punktides 4.1–4.3 kirjeldatud toimingud käsitlevad leekionisatsioonidetektori kasutamist.

Kasutada võib ka gaasikromatograafi, milles on kataromeeter (töötab soojusjuhtivuse põhimõttel). Töötingimusi kohandatakse, nagu punktis 6 kirjeldatud.

4.1. Katsetingimused

4.1.1.

Optimaalsete töötingimuste valik

4.1.1.1.

Täidetud kolonn

Katsetingimuste valimisel tuleks arvesse võtta järgmisi muutujaid:

a) kolonni pikkus ja diameeter;

b) statsionaarse faasi laad ja kogus;

c) kolonni temperatuur;

d) kandegaasi vool;

e) nõutav resolutsioon;

f) katsekoguse suurus, mis on valitud selliselt, et detektor ja elektromeeter annavad lineaarse tulemuse;

g) analüüsi kestus.

Tavaliselt annavad tabelis 1 ja 2 esitatud väärtused soovitud tulemuse, st vähemalt 2 000 teoreetilist plaati ühe kolonnimeetri kohta metüülstearaadile selle elueerimiseks 15 minutiga.

Kui seadmed võimaldavad, peaks injektor olema temperatuuril ligikaudu 200 °C ja detektor kolonni temperatuuriga võrdsel või kõrgemal temperatuuril.

Sõltuvalt kolonni diameetrist on leekionisatsioonidetektorisse suunatud lämmastiku voolukiiruse suhe võrreldes kandegaasi omaga reeglina 1: 2 kuni 1: 1. Hapniku voolukiirus on umbes 5–10 korda vesiniku omast kiirem.

Tabel 1

Kolonni sisediameeter mm	Kandegaasi voolukiirus ml/min
2	15–25
3	20–40
4	40–60

Tabel 2

Statsionaarse faasi kontsentratsioon % (m/m)	Kolonni temperatuur °C
5	175
10	180
15	185
20	185

4.1.1.2.

Kapillaarkolonn

Kapillaarkolonni tõhusus- ja täituvusomadused tingivad selle, et koostisosade eraldamine ja analüüsi kestvus sõltuvad suuresti kandegaasi voolukiirusest kolonnis. Seetõttu on vaja töötingimusi optimeerida, muutes seda parameetrit (ehk kolonni survekadu) sõltuvalt sellest, kas soovitakse tõsta eraldamise kvaliteeti või muuta analüüsid kiiremaks.

4.1.2.

Teoreetiliste plaatide arvu (tõhususe) ja resolutsiooni määramine (vt joonis 1).

Tehakse võrdsetes kogustes oleva metüülstearaadi ja metüüloleaadi segu analüüs (näiteks kakaovõis olevad metüülestrid).

Kolonni temperatuur ja kandegaasi voolukiirus valitakse selliselt, et umbes 15 minutit pärast lahusti piigi registreerimist registreeritakse võimalikult suur metüülstearaadi piik. Kasutada tuleb piisavat kogust metüülestrite segu, mis võimaldab metüülstearaadi piigil moodustada ¾ kogu skaalast.

Arvutatakse teoreetiliste plaatide arv, n (tõhusus), kasutades järgmist valemit:

ja resolutsioon, R, kasutades valemit:

kus

dr1	on peetumisdistants millimeetrites, kromatogrammi algusest kuni metüülstearaadi piigi maksimumini;

ω1 ja ω2

on vastavalt metüülstearaadi ja metüüloleaadi piigilaiused millimeetrites, mis mõõdetakse kohas, kus piigikõvera lõikepunktid lõikuvad nulljoonega;

Δ	on metüülstearaadi ja metüüloleaadi piigimaksimumide distants millimeetrites;

▼M2

ja lahutusindeks lr, kasutades valemit:

kus

on väikseima piigi kõrgus, mõõdetuna põhijoonelt;

on kahe külgneva piigi vahelise miinimumi madalaima punkti kõrgus, mõõdetuna põhijoonelt.

▼B

Joonis 1 Kromatogramm teoreetiliste plaatide arvu (tõhususe) ja resolutsiooni määramiseks.

Töötingimused tuleb valida selliselt, et metüülstearaadi jaoks saadakse vähemalt 2 000 teoreetilist plaati kolonnimeetri kohta ning resolutsioon on vähemalt 1,25.

4.2. Katsekogus

Süstlaga (3.2) võetakse 0,1–2 μl metüülestrite lahust, mis on valmistatud kooskõlas X B lisaga, ning süstitakse kolonni.

Kui estrid ei ole lahusena, valmistatakse ligikaudu 100 mg/ml kromatograafilise kvaliteediga heptaanilahust ja süstitakse seda lahust 0,1–1 ml.

Kui analüüsi käigus määratakse koostisosi, mida on vähe, võib katsekogust suurendada (kuni kümnekordseks).

4.3. Analüüs

Üldjuhul on töötingimused sellised, nagu punktis 4.1.1 kirjeldatud.

Siiski on võimalik töötada ka madalama kolonnitemperatuuriga juhul, kui on vaja määrata rasvhappeid, millel on vähem kui 12 süsinikuaatomit, või kõrgemal temperatuuril, kui on vaja määrata rasvhappeid, millel on rohkem kui 20 süsinikuaatomit. Nendel juhtudel on võimalik kasutada temperatuuri programmeerimist. Näiteks kui proov sisaldab rasvhapete metüülestreid, millel on vähem kui 12 süsinikuaatomit, süstitakse proov temperatuuril 100 °C (või 50–60 °C võihapet) ja tõstetakse kohe temperatuuri 4–8 °C võrra minutis, kuni saavutatakse optimaalne temperatuur. Teatavatel juhtudel on neid kahte meetodit võimalik ühendada.

Pärast programmeeritud kuumutamist jätkatakse elueerimist püsival temperatuuril, kuni kõik komponendid on elueeritud. Kui seade ei võimalda programmeeritud kuumutamist, kasutatakse kahte 100–195 °C vahel olevat kindlaksmääratud temperatuuri.

Vajaduse korral soovitatakse teha analüüs kahel erineva polaarsusega kindlaksmääratud faasil, et kontrollida varjatud piigi puudumist, näiteks kui proovis on üheaegselt konjugeeritud C18:3 ja C20:0, või C18:3 ja C18:2.

4.4. Võrdluskromatogrammi ja -graafikute ettevalmistamine

Analüüsitakse võrdlusstandardi lahust (2.3), kasutades selleks samu töötingimusi nagu proovi puhul, ning mõõdetakse lahuse rasvhapete peetumisajad või peetumisdistantsid. Iga küllastamatusmäära kohta konstrueeritakse poollogaritmilisel paberil graafikud, kus oleks süsinikuaatomite arvu funktsioonina näha peetumisaja või -distantsi logaritm. Isotermilistel tingimustel peaksid sama küllastamatusmääraga hargnemata ahelaga hapete graafikuteks olema sirgjooned. Need jooned peaksid olema enam-vähem paralleelsed.

Tuleks vältida tingimusi, milles võib esineda varjatud piike, st kus resolutsioon ei ole kahe koostisosa eraldamiseks piisav.

5. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

5.1. Kvalitatiivne analüüs

Proovi metüülestripiigid määratakse proovis punktis 4.4 koostatud graafikutega, vajaduse korral interpolatsiooni abil.

5.2. Kvantitatiivne analüüs

5.2.1. Koostise määramine

Välja arvatud erandjuhud, kasutatakse sisemise normaliseerimise meetodit, st oletatakse, et kromatogrammil on kõik proovi koostisosad ja kogu piigi pindala vastab koostisosadele 100protsendiliselt (täielik elueerumine).

Kui seadmed sisaldavad ka integraatoreid, kasutatakse integraatoriga saadud tulemusi. Kui integraator puudub, määratakse konkreetsed piigipindalad piigi kõrguse korrutamisega piigi laiusega kõrguse keskkohas, vajaduse korral võetakse arvesse erinevaid registreerimise ajal kasutatud sumbumisi.

5.2.2. Arvutamine

5.2.2.1.

Üldjuhul

Teatava komponendi i sisaldus väljendatuna metüülestrite massiprotsendina arvutatakse selliselt, et määratakse piigipindala suhteline osa kõikide piikide pindalast järgmise valemi alusel.

kus

Ai	on komponendi i piigipindala;

ΣA	on piikide pindala summa.

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

Märkus 7:

Üldjuhul põhineb arvutustulemus sellel, et suhtelised pindalad vastavad massi protsentuaalsetele suhtetele. Kui seda üldistust ei saa kohaldada, vaadata punkti 5.2.2.2.

5.2.2.2.

Parandustegurite kasutamine

Teatavatel juhtudel, näiteks kui rasvhapetes on vähem kui kaheksa süsinikuaatomit või kui happes on sekundaarsed rühmad, või kui kasutatakse soojusjuhtivuse detektorit või kui on vaja maksimaalset täpsust, tuleks kasutada parandustegurit, et arvestada piigipindalade protsent ümber komponentide massiprotsentideks.

Parandustegur määratakse kindlaks kromatogrammiga, mis saadakse teadaoleva koostisega metüülestrite võrdlussegu analüüsimisel proovi töötingimustega samadel töötingimustel.

Selle võrdlussegu komponendi i massiprotsent määratakse järgmise valemiga:

kus

mi	on komponendi i massi võrdlussegus;

Σm	on võrdlussegu erinevate komponentide üldmass.

Võrdlussegu (4.4) kromatogrammi alusel arvutatakse komponendi i protsent (pindala/pindala) järgmiselt:

kus

Ai	on komponendi i piigipindala;

ΣA	on piikide pindalade summa.

Parandustegur arvutatakse järgmiselt:

Tavaliselt väljendatakse parandustegureid suhtes KC16–ga, nii et parandustegurid on järgmised:

Proovi iga komponendi i määr metüülestrite massiprotsendina on järgmine:

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

5.2.2.3.

Sisestandardi kasutamine

Teatavate analüüside puhul (nt kui kõikide rasvhapete määr ei ole teada, juhul kui nelja ja kuue süsinikuga hapete kõrval esinevad ka 16 ja 18 süsinikuga happed, või kui on vaja määrata proovis olevate rasvhapete absoluutsumma) on vaja kasutada sisestandardit. Sageli kasutatakse viie, 15 või 16 süsinikuga rasvhappeid. Tuleks kindlaks määrata sisestandardi parandustegur (juhul kui see on vajalik).

Komponendi i massiprotsent väljendatuna metüülestritena arvutatakse valemiga:

kus

Ai	on komponendi i piigipindala;

As	on sisestandardi piigipindala;

K′i	on komponendi i parandustegur (suhtes KC16–ga);

K′i	on sisestandardi parandustegur (suhtes KC16–ga);

m	on katsekoguse mass (mg);

ms	on sisestandardi mass (mg).

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

▼M2

6. ERIJUHT — TRANS-ISOMEERIDE MÄÄRAMINE

Trans-isomeeride sisaldust on võimalik 10–24 süsiniku aatomiga rasvhapetes määrata metüülestrite eraldamise teel konkreetse polaarsusega gaasikromatograafia kolonnide abil.

6.1.	Ränidioksiidist kapilaarkolonn sisediameetriga 0,25–0,32 mm, pikkusega 50 m, kaetud 0,1–0,3 μm paksuse tsüanopropüsilikoonikihiga (tüüp SP 2380, C.P. sil 88, silor 88 ja sarnased tüübid).

▼M21

6.2.	Metüülestrid valmistatakse XB lisas kirjeldatud meetodi B kohaselt. Rasvained, milles vaba happe sisaldus on suurem kui 3 %, tuleb eelnevalt neutraliseerida VII lisa punkti 5.1.1 kohaselt

▼M2

6.3.

Gaasikromatograafi töötingimused on järgmised:

— kolonni temperatuur programmeeritud vahemikus 150–230 °C (näiteks 15 minutit 165 °C, seejärel tõstetakse 5 °C võrra minutis kuni temperatuurini 200 °C),

— injektori temperatuur: 250 °C jaotussüsteemi kasutamise korral või kolonni algtemperatuur, juhul kui kasutatakse on-column süsteemi,

— detektori temperatuur: 260 °C,

— kandegaasi voolukiirus (heelium ja vesinik): 1,2 ml minutis.

Süstitav kogus peab olema selline, et kasutataval tundlikkusel on arahiinhappe metüülestrile vastava piigi kõrgus vähemalt 20 % skaala alumisest osast.

6.4.

Eri metüülestrid määratakse peetumisaegade põhjal, mida võrreldakse võrdlussegude peetumisaegadega (nagu märgitud punktis 2.3).

Transrasvhapete estrid elueeritakse enne vastavaid cis-isomeere. Kromatogrammi näide on esitatud joonisel 2.

Joonis 2: Rasvhapete trans-isomeeride gaasikromatogramm kapillaarkolonni abil

6.5.	Vastavalt punktile 4.1.2 kindlaksmääratud kolonni tõhusus peab võimaldama teatavate kriitiliste paaride eraldamist, näiteks trans-oleiinhappe ja oleiinhappe piigi massiiviga tekkiv paar, trans C 18:1/cis C 18:1, resolutsiooniindeksiga üle 2.

6.6.

Erinevate transrasvhapete protsent arvutatakse asjakohase piigi pindala ja kõikide piikide pindalade summade suhte põhjal.

Arvesse võetakse järgmiste hapete protsente:

— trans-oktadekeenhapped (T 18:1), mis on esitatud käesoleva määruse I lisas trans-oleiinhappe isomeeride kogusummana,

— cis-trans ja trans-cis oktadekadieenhapped [(CT/TC) 18:2], mis on esitatud käesoleva määruse I lisas trans-linoolhappe isomeeride kogusummana,

— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, oktadekatrieenhapped [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], mis on esitatud käesoleva määruse I lisas translinoolhappe isomeeride

kogusummana.

Märkus 8:Käesoleva meetodi eriomadusi silmas pidades tuleb tulemused esitada 2 kümnendkoha täpsusega.

▼B

7. ERIJUHT — KATAROMEETRI KASUTAMINE (SOOJUSJUHTIVUSE MUUTUSTE PÕHIMÕTTEL)

Rasvhappe metüülestrite segu kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise määramisel võib kasutada gaasikromatograafi, milles on soojusjuhtivuse muutuste põhimõttel töötav detektor (kataromeeter). Kataromeetri kasutamisel tuleb lõike 3 ja 4 tingimusi tabeli 3 alusel kohandada.

Kvantitatiivse analüüsi puhul tuleb kasutada punktis 5.2.2.2 määratletud parandustegureid.

Tabel 3

Muutujad	Väärtus/tingimus
Kolonn	Pikkus: 2–4 m Sisediameeter: 4 mm
Tugiaine	Tera suurus 160–200 μm
Statsionaarse faasi kontsentratsioon	15–25 % (m/m)
Kandegaas	Heelium või selle puudumisel vesinik, võimalikult madala hapnikusisaldusega
Abigaasid	Puuduvad
Injektori temperatuur	4–60 oC kolonni temperatuurist kõrgem
Kolonni temperatuur	180–200 oC
Kandegaasi vool	Tavaliselt 60–80 ml/min
Süstitava katsekoguse suurus	Tavaliselt 0,5–2 μl

8. KATSEPROTOKOLL

Katseprotokolli märgitakse metüülestrite valmistamisel ja gaasikromatograafilisel analüüsimisel kasutatud meetodid ning saadud tulemused. Selles märgitakse samuti kõik üksikasjad, mida ei ole nimetatud käesolevas rahvusvahelises standardis või mis on valikulised, samuti üksikasjad tulemust mõjutada võinud asjaolude kohta.

Analüüsiprotokoll sisaldab kõiki proovi täielikuks tuvastamiseks vajalikke andmeid.

▼M19

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A

Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B

Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

(a) determination of difference between actual and theoretical content of triglycerides with ECN42 (ΔECN42):

— method A will be applied to samples of all the oil categories after purification of the oil by passing it through a silica gel column;

(b) determination of the fatty acid composition:

— method A will be applied directly to samples of the following oil categories:

—

— virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %,

— refined olive oil,

— olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil),

— refined olive-pomace oil,

— olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace oil);

— method B will be applied directly to samples of the following oil categories:

—

— virgin olive oil with an acidity of more than 3,3 %,

— crude olive-pomace oil;

— method A will be applied directly to samples of the following oil categories:

—

— virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %,

— refined olive oil,

— olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil),

— refined olive-pomace oil,

— olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace oil);

— method A will be applied to the following categories of oils after purification of the oil by passing it through a silica gel column:

—

— virgin olive oil with an acidity of more than 3,3 %,

— crude olive-pomace oil.

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1. Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1. Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2. Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3. Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4. Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5. Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2. Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1. Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2. Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3. Reagents

— heptane, chromatographic quality,

— methanol containing not more than 0,05 % (m/m) water,

— sodium methylate, 0,2 N methanolic solution: dissolve 5 g of sodium in 1 000 ml of methanol (this may be prepared from commercial solutions),

— phenolphthalein, 0,2 % methanolic solution,

— sulphuric acid, 1 N in methanolic solution: add 3 ml of 96 % sulphuric acid to 100 ml of methanol,

— saturated solution of sodium chloride in water.

2.4. Apparatus

— 50 ml flat-bottomed volumetric flask with long, narrow, ground neck,

— reflux condenser: air condenser (1 m long) with ground joint appropriate to the neck of the flask,

— boiling chips,

— glass funnel.

2.5. Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6. Alternatives to methylation Method B

2.6.1. Method C

2.6.1.1. Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2. Apparatus

— Strong glass vial of a capacity of about 5 ml (height 40 to 45 mm, diameter 14 to 16 mm).

— 1 and 2 ml graduated pipettes.

2.6.1.3. Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4. Procedure

— Place in the glass vial 0,2 g of the fatty matter, which has previously been dried out on sodium sulphate and filtered, and 2 ml of hydrochloric acid-methanol solution. Heat seal the vial.

— Immerse the vial at 100 °C for 40 minutes.

— Cool the vial under running water, open, add 2 ml of distilled water and 1 ml of hexane.

— Centrifuge and remove the hexane phase, which is ready for use.

2.6.2. Method D

2.6.2.1. Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2. Apparatus

— Test tube of a capacity of about 20 ml, fitted with an air reflux condenser approximately 1 m in length, with ground glass joints.

— 5 ml graduated pipette.

— 50 ml separating funnel.

— 10 ml and 25 ml measuring beakers.

— 15 ml test tube with conical base.

2.6.2.3. Reagents

— Methylation reagent: anhydrous methanol-hexane-concentrated sulphuric acid (p = 1,84) in the ratio 75:25:1 (V/V/V).

— 40 to 60 °C petroleum ether.

— Anhydrous sodium sulphate.

2.6.2.4. Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

Note 2: To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3. Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1. Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2. Calculations

2.1.

For the calculation of the fatty acid composition and ΔECN42, all the following fatty acids will be taken into account:

Myristic (C14:0).

Palmitic (C16:0). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters.

Palmitoleic (C16:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester.

Margaric (C17:0).

Margaroleic (C17:1).

Stearic (C18:0).

Oleic (C18:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester, ethyl ester, and trans-isomers of the methyl ester.

Linoleic (C18:2). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters, and the trans-isomers of the methyl ester.

Arachidic (C20:0).

Linolenic (C18:3). Sum of the areas of the methyl ester and the trans-isomers of the methyl ester.

Eicosenoic (C20:1).

Behenic (C22:0).

Lignoceric (C24:0).

Squalene will not be taken into account for the calculation of the total area.

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17).

The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula:

Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

XI LISA

OLIIVIÕLI HALOGEENITUD LENDUVATE LAHUSTITE MÄÄRAMINE

1. MEETOD

Gaasikromatograafiline aurufaasi analüüs.

2. VAHENDID

2.1.	Gaasikromatograafia seade, milles on elektronihaarde detektor (EHD).

2.2.	Aurufaasi analüüsimise seade.

2.3.	Klaasist gaasikromatograafia kolonn, pikkus 2 m ja läbimõõt 2 mm, statsionaarne faas. OV101 10 % või samaväärne, kaltsineeritud, happega pestud ja silaanitud kobediatomiiti immutatud, osakeste suurus 80–100 mesh’i.

2.4.	Kande- ja abigaas: lämmastik gaasikromatograafia jaoks, sobiv elektronihaardedetektorile.

2.5.	10- kuni 15-milliliitrised klaaspudelid, teflonpinna ja alumiiniumpunniga, milles on koht nõela sisseviimise jaoks.

2.6.	Klambrid hermeetiliseks sulgemiseks.

2.7.	Gaasisüstal, 0,5- kuni 2-milliliitrine.

3. REAKTIIVID

Standard: halogeenitud lahustid, mille puhtusaste on gaasikromatograafia jaoks sobiv.

4. TÖÖ KÄIK

4.1.

Klaaskolbi (ühekordselt kasutatav) kaalutakse umbes 3 g õli; suletakse hermeetiliselt. Pannakse termostaati temperatuurile 70 oC üheks tunniks. Süstlaga eemaldatakse ettevaatlikult 0,2–0,5 ml aurufaasi. See injekteeritakse järgmiselt reguleeritud gaasikromatograafiaseadme kolonni:

— injektori temperatuur: 150 oC,

— kolonni temperatuur: 70–80 oC,

— detektori temperatuur: 200–250 oC.

Kasutada võib ka teisi temperatuure tingimusel, et tulemused jäävad samaks.

4.2.	Võrdluslahused: valmistatakse ette standardlahused, kasutades rafineeritud oliiviõli, milles ei ole 0,05–1 ppm (mg/kg) kontsentratsiooniga lahusteid, ja mis vastab proovi eeldatavale sisaldusele. Halogeenitud lahustid võib pentaaniga lahjendada.

4.3.

Kvantitatiivne hindamine: võrreldakse proovi ja eeldatavalt kõige sarnasema kontsentratsiooniga standardlahuse piikide pindalasid või kõrgusi. Kui kõrvalekalle on suurem kui 10 %, tuleb analüüsi korrata mõne teise standardlahusega võrreldes, kuni kõrvalekalle jääb 10 % piiresse. Sisaldus määratakse kindlaks üksikute injekteerimiste keskmise põhjal.

4.4.	Tulemuste esitamine: ppm (mg/kg). Meetodi avastamispiir on 0,01 mg/kg.

▼M22

XII LISA

RAHVUSVAHELISE OLIIVIÕLINÕUKOGU MEETOD NEITSIOLIIVIÕLIDE ORGANOLEPTILISEKS HINDAMISEKS

1. EESMÄRK JA KOHALDAMISALA

Kõnealune meetod põhineb rahvusvahelise oliiviõlinõukogu 16. novembri 2007. aasta otsusel nr DEC-21/95-V/2007, milles käsitletakse neitsioliiviõli organoleptilise hindamise läbivaadatud meetodit. Meetodi eesmärk on kehtestada menetlus neitsioliiviõlide organoleptiliste omaduste hindamiseks määruse (EÜ) nr 1234/2007 XVI lisa punkti 1 tähenduses ning määrata kindlaks nendel omadustel põhinev oliiviõlide liigitamise metoodika. Metoodika hõlmab ühtlasi juhiseid valikuliseks märgistamiseks.

Kirjeldatud meetodit kohaldatakse ainult neitsioliiviõlide puhul, nende liigitamisel või märgistamisel, võttes arvesse täheldatud puuduste intensiivsust, puuviljalisust ja muid positiivseid omadusi, mille on kindlaks määranud valitud, koolitatud ja testitud degustaatorite rühm, kes moodustab hindamiskomisjoni.

2. ÜLDOSA

Üldise põhisõnavara, degusteerimisruumi, õlide degusteerimisklaaside ning muu kõnealuse metoodikaga seotud küsimuste puhul tuleks lähtuda rahvusvahelise oliiviõlinõukogu eeskirjadest, eriti 16. novembri 2007. aasta otsusest nr DEC-21/95-V/2007, milles käsitletakse neitsioliiviõli organoleptilise hindamise läbivaadatud meetodit.

3. ERIALANE SÕNAVARA

3.1. Positiivsed tunnused

Puuviljaline :

otse või retronasaalselt tajutav lõhnaaistingute kogum, mis on omane tervetest ja värsketest, oliivisordist olenevalt rohelistest või küpsetest viljadest toodetud õlile.

Tunnust puuviljaline iseloomustatakse sõnaga roheline, kui õli lõhn meenutab rohelisi vilju; see on iseloomulik rohelistest viljadest saadud õlile.

Tunnust puuviljaline iseloomustatakse sõnaga küps, kui õli lõhn meenutab küpseid vilju; see on iseloomulik küpsetest viljadest saadud õlile.

Mõru : keele tagaosas olevate keelenäsade maitsmispungadega tuntav algmaitse õlide puhul, mis on valmistatud rohelistest oliividest või oliividest, mis hakkavad muutma värvi.

Terav : kogu suulael ja eriti kurgus tuntav torkavusaisting õlide puhul, mis on toodetud turustusaasta alguses peamiselt veel rohelistest oliividest.

3.2. Negatiivsed tunnused

Kopitanud/settene : iseloomulik maitse ja lõhn õlide puhul, mis on saadud kuhjas või ebakohastes tingimustes hoitud anaeroobse käärimise protsessis olevatest oliivides, või õlide puhul, mis on jäänud vaatides ja paakides settega seisma ja milles samuti on toimunud anaeroobne käärimine.

Hallitanud-niiske : iseloomulik maitse ja lõhn õlide puhul, mis on saadud viljadest, millel on niisketes tingimustes mitu päeva kestnud ladustamise tulemusena palju hallitusseeni ja pärmseeni.

Veinine-äädikane/hapu-kibehapu : teatavatele õlidele iseloomulik maitse ja lõhn, mis meenutab veini või äädikat. Tingitud eelkõige oliivide või korralikult pesemata mattide külge jäänud oliivimassi aeroobsest käärimisest, mille tulemusel tekivad äädikhape, etüülatsetaat ja etanool.

Metalline : maitse ja lõhn, mis meenutab metalli. Iseloomulik õlidele, mis on olnud purustamise, segamise, pressimise või ladustamise ajal ülemäära kokkupuutes metallpindadega.

Räästunud : iseloomulik maitse ja lõhn õlide puhul, milles on toimunud intensiivne oksüdatsioon.

Kuumutatud või põlenud : iseloomulik maitse ja lõhn, mille põhjuseks on ülemäärane ja/või pikaajaline kuumutamine tootmise ajal, eelkõige pasta kuumsegamisel ebasobival temperatuuril.

Heinane-puune : iseloomulik maitse ja lõhn kuivadest oliividest toodetud õlide puhul.

Tihke : teatavate vanade õlide puhul suus tekkiv paks, pastat meenutav puuteaisting.

Määrdeainene : diislikütust, määret või mineraalõli meenutav maitse ja lõhn.

Taimemahlane : iseloomulik maitse ja lõhn õlide puhul, mis on olnud kaua kokkupuutes viljadest pressimisel eraldunud käärinud taimemahlaga.

Soolveene : soolvees säilitatud oliividest toodetud õlide maitse ja lõhn.

Espartone : iseloomulik maitse ja lõhn õlide puhul, mis on saadud uutes espartomattides pressitud oliividest. Maitse võib erineda sõltuvalt sellest, kas matid on valmistatud haljast või kuivatatud espartost.

Mullane : mullastena või mudastena korjatud ja pesemata oliividest saadud õlidele iseloomulik maitse ja lõhn.

Tõugune : oliivikärbse (Bactrocera Oleae) tõukude poolt tugevasti kahjustatud oliividest saadud õlidele iseloomulik maitse ja lõhn.

Kurgine : iseloomulik maitse ja lõhn õlide puhul, mis on liiga kaua olnud hermeetiliselt pakendatud (eriti plekkpurkides), see maitse tuleneb 2,6-nonadienaali tekkimisest.

Niiske puune : puu otsas külma saanud oliividest saadud õlidele iseloomulik maitse ja lõhn.

3.3. Märgistamiseks vajalik valikuline terminoloogia

Nõudmise korral võib hindamiskomisjoni esimees tõendada, et hinnatud õlid vastavad mõistetele ja väljendites esitatud vahemikele ning tunnuste intensiivsuste ja nende tajumist märkivatele omadussõnadele:

a) kõik punktis 3.1 osutatud positiivsed tunnused (puuviljaline, vajadusel iseloomustatud kui roheline või küps, terav ja mõru):

i) terminit „intensiivne” võib kasutada, kui asjaomase tunnuse mediaan on suurem kui 6;

ii) terminit „keskmine” võib kasutada, kui asjaomase tunnuse mediaan on vahemikus 3 kuni 6;

iii) terminit „kerge” võib kasutada, kui asjaomase tunnuse mediaan on vähem kui 3;

iv) asjaomaseid tunnuseid võib kasutada ilma punktides i, ii ja iii osutatud omadussõnadele viitamata, kui asjaomase tunnuse mediaan on 3 või rohkem;

b) terminit „tasakaalus” võib kasutada õli puhul, mis ei ole tasakaalust väljas. Tasakaalust väljas olevaks loetakse sellist õli, mille maitse-, lõhna- ja puuteaistingu puhul on tunnuse mõru ja/või tunnuse terav mediaan kahe punkti võrra suurem kui tunnuse puuviljaline mediaan;

c) väljendit „mahe õli” võib kasutada õli puhul, mille tunnuse mõru ja tunnuse terav mediaan on 2 või väiksem.

4. HINDAMISKOMISJON

Hindamiskomisjon koosneb hindamiskomisjoni juhatajast ja kaheksast kuni kaheteistkümnest degustaatorist.

Hindamiskomisjoni juhataja peab olema läbinud põhjaliku koolituse ning tundma eksperdina üksikasjalikult erinevaid õlisorte. Ta vastutab hindamiskomisjoni, selle töökorralduse ja toimimise, proovide ettevalmistamise, kodeerimise ja degustaatoritele esitamise ning andmete kogumise ja nende statistilise töötlemise eest.

Hindamiskomisjoni juhataja valib välja degustaatorid ning jälgib nende koolitust ja teadmiste kontrolli, et kindlustada pidevalt nende oskuste piisav tase.

Vastavalt rahvusvahelise oliiviõli nõukogu juhendile neitsioliiviõli kvalifitseeritud degustaatorite valimise, koolitamise ja kontrolli kohta tuleb oliiviõli organoleptilise kontrolliga tegelevad degustaatorid valida ja koolitada, võttes arvesse nende oskust eristada sarnaseid näidiseid.

Hindamiskomisjonid peavad kohustuma võtma osa riigi, ühenduse või rahvusvahelisel tasandil ette nähtud organoleptilistest hindamistest, et korrapäraselt kontrollida ja ühtlustada tajumiskriteeriume. Lisaks kohustuvad käesoleva määruse artikli 4 lõike 1 kohaselt heaks kiidetud hindamiskomisjonid esitama asjaomasele liikmesriigile igal aastal kõik andmed oma koosseisu ja heaks kiidetud hindamiskomisjonina läbi viidud hindamiste arvu kohta.

5. ORGANOLEPTILISE HINDAMISE JA LIIGITAMISE MENETLUS

5.1. Profiililehe kasutamine degustaatori poolt

Degustaatori kasutatav profiilileht on esitatud käesoleva meetodi A liites.

Hindamiskomisjoni liikmena peab iga degustaator uurimiseks esitatud õli nuusutama ja siis maitsma. Seejärel märgib ta täidetaval profiililehel 10sentimeetrisel skaalal tema tajutud negatiivsete ja positiivsete tunnuste intensiivsuse. ( 7 ) Kui degustaator leiab, et tunnus puuviljaline on rohelise või küpse iseloomuga, teeb ta profiililehe vastavasse ruutu risti.

Juhul kui degustaator tajub negatiivseid omadusi, mis ei ole profiililehele märgitud, tuleb need kanda rubriiki „Muud”, kasutades selleks kindlaksmääratud terminite hulgast kõige täpsemaid.

5.2. Andmete kasutamine hindamiskomisjoni juhataja poolt

Hindamiskomisjoni juhataja peab kokku koguma kõigi degustaatorite täidetud profiililehed ja kontrollima erinevatele tunnustele omistatud intensiivsusastmeid. Kõrvalekalde tuvastamisel palub juhataja degustaatoril oma profiilileht üle vaadata ning vajadusel hindamist korrata.

Hindamiskomisjoni juhataja võib iga degustaatori andmed sisestada elektroonilisse süsteemi, mis arvutab B liites kirjeldatud statistilise arvutamismeetodi järgi mediaani. Näidise andmete sisestamine toimub maatriksi abil, mis koosneb üheksast veerust, mis vastavad üheksale organoleptilisele omadusele, ja n reast, kus on hindamiskomisjoni kuuluvate degustaatorite arv.

Kui mingi negatiivne tunnus kantakse rubriiki „Muud” vähemalt 50 % komisjoniliikmete poolt, arvutatakse osutatud puuduse mediaan ja õli liigitatakse vastavalt.

Hindamiskomisjoni juhataja saab anda kinnituse, et hinnatud õli vastab punkti 3 alapunkti 3 alapunktis a osutatud nõuetele termini „roheline” ja „küps” osas üksnes juhul, kui vähemalt 50 % hindamiskomisjonist on märkinud, et tunnus puuviljaline oli rohelise või küpse iseloomuga.

Vastavuse kontrollimiste raames teostatud analüüside puhul tehakse proov. Vasturääkivustega analüüside puhul korraldab hindamiskomisjoni juhataja õli organoleptilise hindamise kaks korda. Välistava analüüsi puhul tuleb teha kolm hindamist. Kõnealustel juhtudel arvutatakse tunnuste mediaan mediaanide keskmise alusel. Kõik paralleelsed analüüsid tuleb teha erinevate seansside jooksul.

5.3. Õlide liigitamine

Õli liigitatakse järgnevalt esitatud kategooriatesse, lähtudes puuduse mediaanist ja tunnuse puuviljaline mediaanist. Puuduse mediaani käsitatakse suurima intensiivsusega tajutud puuduse mediaanina. Puuduse mediaani ja tunnuse puuviljaline mediaani väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega ja neid määrava robustse variatsioonikordaja väärtus peab olema 20 % või sellest väiksem.

Õli liigitamisel võrreldakse puuduse mediaani ja tunnuse puuviljaline mediaani väärtust järgnevalt osutatud etalonvahemike suhtes. Kõnealuste vahemike piirid on kindlaks määratud meetodi viga arvesse võttes ning neid loetakse absoluutseteks. Arvutitarkvara võimaldab liigitust esitada statistilise andmetabelina või graafiliselt.

a)	Ekstra-neitsioliiviõli : puuduse mediaan on 0 ja puuviljalisuse mediaan on suurem kui 0.

b)	Neitsioliiviõli : puuduse mediaan on 0 kuni 3,5 ja puuviljalisuse mediaan on suurem kui 0.

c)	Lambiõli : puuduse mediaan on suurem kui 3,5; või puuduse mediaan on kuni 3,5 ja puuviljalisuse mediaan on 0.

5.4. Erijuhud

Kui mõne positiivse tunnuse (v.a puuviljalisus) mediaan on suurem kui 5,0, teeb hindamiskomisjoni juhataja selle kohta märke õli analüüsi tõendile.

A liide

Neitsioliiviõli profiilileht

B liide

MEDIAANI JA USALDUSVAHEMIKU ARVUTAMISE MEETOD

Mediaan

Mediaan on reaalarv Xm, mille puhul tõenäosus (P), et jaotusväärtused (X) on väiksemad kui Xm, on väiksemad kui 0,5 või sellega võrdsed, ning samal ajal tõenäosus (P), et jaotusväärtused (X) on väiksemad kui Xm või sellega võrdsed, on suurem kui 0,5 või sellega võrdsed. Teise definitsiooni kohaselt on mediaan 50-protsentiil kasvu järgi reastatud arvude jaotusest. Lihtsamalt öeldes on mediaan paaritute arvude korrastatud järjekorra keskel asuv väärtus või paarisarvude korrastatud järjekorras kahe keskel asuva väärtuse keskmine.

Robustne standardhälve

Mediaani ümbruse varieeruvuse usaldusväärseks hindamiseks tuleb kasutada Stuarti ja Kendalli meetodit robustse standardhälbe arvutamiseks. Järgmine valem tähistab asümptootilist standardhälvet st asjaomaste andmete varieeruvuse robustset hinnangulist väärtust, milles N on vaatluste arv ja IQR on kvartiilhaare, mis hõlmab täpselt 50 % mingi jaotuse juhtudest.

Kvartiilhaarde leidmiseks arvutatakse 75-protsentiili ja 25-protsentiili vahe suurus.

IQR = 75-protsentiil – 25-protsentiil

Protsentiil on väärtus Xpc, mille puhul tõenäosus (P), et jaotusväärtused on väiksemad kui Xpc, on väiksem kui kõnealune protsentiil või sellega võrdne, ja et samal ajal tõenäosus (P), et jaotusväärtused on väiksemad kui Xpc või sellega võrdsed, on suurem kui kõnealune protsentiil või sellega võrdne. Protsendimäär näitab jaotuse hõlmatud osa. Mediaani puhul on see võrdne 50/100ga.

Tegelikkuses on protsentiil jaotusväärtus, mis määrab kindlaks vastava suurusega osa jaotus-või tiheduskõveraga piiratud pindalast. Näiteks 25-protsentiil on jaotusväärtus, mis määrab kindlaks 0,25 või 25/100 sellest alast.

Robustse variatsioonikordaja (%) väärtus

Robustse variatsioonikordaja (%) on dimensioonita arv, mis näitab analüüsitava arvjada muutuvuse protsenti. Seepärast on kõnealune koefitsient väga kasulik hindamiskomisjoni liikmete usaldusväärsuse kontrollimiseks.

Mediaani 95 %line usaldusvahemik

95 %line usaldusvahemik (esimest liiki vea väärtus on 0,05 või 5 %) on vahemik, milles mediaan võiks varieeruda, kui katset oleks võimalik lõpmatult korrata. Tegelikkuses näitab see vahemik katse tulemuse muutumist kindlaksmääratud katsetingimuste puhul, eeldusel, et katset korratakse mitu korda. Nagu CVr %, aitab see vahemik hinnata katse usaldusväärsust.

Usaldusvahemiku ülempiir = Me + (c.S*)

Usaldusvahemiku alampiir = Me – (c.S*)

95 %lise usaldusvahemiku puhul on c võrdne 1,96-ga.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

XV LISA

1. OLIIVIÕLI PRESSIMISJÄÄKIDE ÕLISISALDUS

1.1. Seadmed

— nõuetekohane ekstraheerimisaparaat, milles on 200–250 ml ümarapõhjalised kolvid,

— elektriline vann (näiteks liivavann, veevann) või pliit,

— analüütilised kaalud,

— ahi, mida on võimalik reguleerida kuni 80 kraadini,

— elektriahi, milles on 103 ± 2 kraadini reguleeritav termostaat ja kuhu on võimalik suunata õhuvool või millega on võimalik töötada alandatud rõhu all,

— mehaaniline veski, mida on lihtne puhastada ja mis võimaldab oliiviõli pressimisjääke jahvatada ilma, et nende temperatuur tõuseks või nende niiskuse, lenduvate ainete või heksaaniga ekstraheeruvate ainete sisaldus märkimisväärselt muutuks,

— ekstraheerimishülss ja vatt või filterpaber, millest on heksaaniga ekstraheeruvad ained juba eemaldatud,

— eksikaator,

— sõel, mille avade diameeter on 1 mm,

— enne kuivatatud pimsskivi väikesed terakesed.

1.2. Reaktiiv

Tehniline n-heksaan, millest jääb täielikul aurustamisel 100 ml kohta kuni 0,002 g suurune jääk.

2. TÖÖ KÄIK

2.1. Uuritava proovi ettevalmistamine

Selleks et laboriproovi osakesed mahuksid täielikult läbi sõela, kasutatakse proovi jahvatamiseks vajaduse korral enne korralikult puhastatud mehaanilist veskit.

1/20 proovist kasutatakse veski puhastamiseks, jahvatamisel tekkiv aine visatakse ära, jahvatatakse ülejäänud osa proovist ning seejärel kogutakse see kokku, segatakse hoolikalt ning analüüsitakse kohe.

2.2. Katsekogus

Pärast jahvatamist kaalutakse katse tegemiseks 10 g proovi 0,01 g täpsusega.

2.3. Ekstraheerimishülsi ettevalmistamine

Katsekogus asetatakse hülssi ning suletakse vatitropiga. Filterpaberi kasutamise korral tuleb katsekogus sellesse keerata.

2.4. Eelnev kuivatamine

Kui oliiviõli pressimisjäägid on väga niisked (näiteks kui niiskusesisaldus ja lenduvate ainete sisaldus on üle 10 %), kuivatatakse nad enne, et niiskuse- ja lenduvate ainete sisaldust vähendada, milleks asetatakse laetud hülss (või filterpaber) ettenähtud aja jooksul kuni 80 oC kraadini kuumutatud ahju.

2.5. Ümarapõhjalise kolvi ettevalmistamine

Kolb, milles on üks või kaks ahjus 103 ± 2 oC juures enne kuivatatud pimsskivitera, kaalutakse 1 mg täpsusega ning seda jahutatakse eksikaatoris vähemalt üks tund.

2.6. Esimene ekstraheerimine

Ekstraheerimisaparaati pannakse hülss (või filterpaber), milles on katsekogus. Kolbi valatakse vajalik kogus heksaani. Kolb pannakse ekstraheerimisaparaati ning ekstraheerimisaparaat asetatakse elektriga kuumutatavasse vanni. Kuumutamise kiirust kohandatakse selliselt, et tagasivoolu kiirus oleks vähemalt kolm tilka sekundis (mõõdukas, mitte tugev keemine). Pärast neljatunnist ekstraheerimist lastakse jahtuda. Hülss võetakse ekstraheerimisaparaadist ning asetatakse õhuvoolu, selleks et kõrvaldada suurem osa immutuslahustist.

2.7. Teine ekstraheerimine

Hülsi sisu pannakse mikrojahvatamisaparaati ja see jahvatatakse võimalikult peeneks. Jahvatatud segu pannakse kohe hülssi tagasi ning hülss pannakse tagasi ekstraheerimisaparaati.

Ekstraheerimist jätkatakse täiendavalt kahe tunni jooksul, kasutades sedasama ümarapõhjalist kolbi, milles on esialgne ekstrakt.

Ekstraheerimiskolbis tekkiv lahus peab olema selge. Kui lahus ei ole selge, tuleb seda läbi filterpaberi filtreerida ning pesta algset kolbi ja filterpaberit mitu korda heksaaniga. Filtraat ja pesulahus kogutakse teise ümarapõhjalisse kolvi, mis on kuivatatud ning tareeritud 1 mg täpsusega.

2.8. Lahusti eemaldamine ja ekstrakti kaalumine

Suurem osa lahustist eemaldatakse elektrilisel vannil destilleerimisega. Viimased lahustijäägid eemaldatakse kolvi kuumutamisel 20 minutit ahjus temperatuuril 103 ± 2 oC. Eemaldamisel kasutatakse abivahendina teatud ajavahemike järel õhuvoolu, inertgaasi või alandatud rõhku.

Kolb jäetakse vähemalt üheks tunniks eksikaatorisse jahtuma ning kaalutakse 1 mg täpsusega.

Kuumutatakse uuesti 10 minutit samadel tingimustel, jahutatakse eksikaatoris ning kaalutakse uuesti.

Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 10 mg. Kui erinevus on suurem, kuumutatakse kolbi 10 minutit, jahutatakse see ja kaalutakse ning seda korratakse seni, kuni erinevus on 10 mg või väiksem. Kolvi viimane kaal märgitakse üles.

Tehakse uuritava proovi dubleeriv määramine.

3. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

3.1. Arvutamismeetod ja valem

a) Ekstrakt saadud toote massiprotsendina on:

kus:	S on saadud toote ekstrakti massiprotsent; mo on katsekoguse mass grammides; m1 on kuiva ekstrakti mass grammides.

Tulemuseks loetakse kahe määramise aritmeetiline keskmine tingimusel, et korratavuse tingimused on täidetud.

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

b) Ekstrakt on väljendatud kuivainena järgmise valemi alusel:

kus:

S = on saadud toote ekstrakti protsent (vt punkt a),

U = on selle niiskuse- ja lenduvate ainete sisaldus.

3.2. Korratavus

Ühel ja samal ajal või kohe üksteise järel sama analüüsija poolt tehtud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2 g heksaaniekstrakti 100 g proovi kohta.

Kui see tingimus ei ole täidetud, korratakse analüüsi kahe teise katsekogusega. Kui ka nende puhul ületab erinevus 0,2 g, loetakse tulemuseks nelja määramise aritmeetiline keskmine.

XVI LISA

JOODIARVU MÄÄRAMINE

1. KOHALDAMISALA

Käesolev rahvusvaheline standard täpsustab loomsete ja taimsete rasvade ja õlide (edaspidi rasvade) joodiarvu määramise meetodi.

2. MÄÄRATLUS

Käesolevas rahvusvahelises standardis kasutatakse järgmist mõistet:

2.1.	joodiarv. Joodiarv on proovis neeldunud joodi mass käesolevas rahvusvahelises standardis täpsustatud töötingimustel. Joodiarvu väljendatakse joodi grammides 100 g proovi kohta.

3. PÕHIMÕTE

Katsekogus lahustatakse lahustis ja sellele lisatakse wijsi reaktiiv. pärast kindlaksmääratud aega lisatakse kaaliumjodiidi lahus ja vesi ning eraldunud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega.

4. REAKTIIVID

Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad:

4.1.	vesi, mis vastab 3. klassi nõuetele vastavalt ISO 3696 standardile.

4.2.	kaaliumjodiid, 100 g/l lahus, mis ei sisalda jodaati ega vaba joodi.

4.3.	tärklis, lahus. 5 g lahustuvat tärklist segatakse 30 ml vees, seejärel lisatakse see segu 1 000 ml keevale veele, keedetakse 3 minutit ning lastakse jahtuda.

4.4.	naatriumtiosulfaat, standardne tiitrimislahus c (Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l, standarditud kuni 7 päeva enne kasutamist.

4.5.	lahusti, valmistatud võrdses mahus tsükloheksaanist ja äädikhappest.

4.6.	Wijsi reaktiiv, mis sisaldab joodmonokloriidi äädikhappes. Kasutatakse müügilolevat Wijsi reaktiivi.

5. SEADMED

Tavalised, eelkõige järgmised laboratooriumiseadmed:

5.1.	klaasist kaalumiskühvlid, mis sobivad katsekoguse kaalumiseks ja kolbidesse (6.2) kandmiseks.

5.2.	500 ml Erlenmeyeri kolvid, lihvkorgiga ja täiesti kuivad .

6. UURITAVA PROOVI ETTEVALMISTAMINE

Homogeniseeritud proov kuivatatakse naatriumsulfaadi kohal ja filtreeritakse.

7. TÖÖ KÄIK

7.1.

Katsekogus

Katsekoguse mass on tabelis 1 esitatud hinnanguliste joodiarvude puhul erinev.

Tabel 1

Hinnanguline joodiarv	Katsekoguse mass (g)
vähem kui 5	3,00
5–20	1,00
21–50	0,40
51–100	0,20
101–150	0,13
151–200	0,10

Katsekogus kaalutakse klaasist kaalumiskühvlis (5.1) 0,1 mg täpsusega.

7.2.

Määramine

Katsekogus asetatakse 500milliliitrisesse kolbi (5.2). Rasva lahustamiseks lisatakse 20 ml lahustit (4.5). Lisatakse täpselt 25 ml Wijsi reaktiivi (4.6), suletakse punniga, segatakse ning seejärel asetatakse kolb pimedasse. Wijsi reaktiivi ei tohi pipeteerida suuga.

Samal viisi valmistatakse lahusti ja reaktiiviga pimelahus, kuhu ei lisata katsekogust.

Proovide puhul, mille joodiarv on alla 150, jäetakse kolvid pimedasse üheks tunniks; proovide puhul, mille joodiarv on üle 150, ja polümeriseeritud toodete või teatud määrani oksüdeeritud toodete puhul jäetakse kolvid pimedasse kaheks tunniks.

Nimetatud aja möödudes lisatakse mõlemasse kolbi 20 ml kaaliumjodiidi lahust (4.2) ja 150 ml vett (4.1).

Seejärel tiitritakse standardse naatriumtiosulfaadi tiitrimislahusega (4.4) kuni joodist tulenev kollane värv on peaaegu kadunud. Lisatakse paar tilka tärkliselahust (4.3) ja jätkatakse tiitrimist kuni sinine värv pärast väga tugevat loksutamist ära kaob.

Märkus: Lubatud on lõpp-punkti potentsiomeetriline määramine.

7.3.	Määramiste arv Ühe ja sama prooviga tehakse 2 määramist.

8. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Joodiarv arvutatakse järgmise valemiga:

kus

on kasutatud standardse naatriumtiosulfaadi tiitrimislahuse (4.4) täpse kontsentratsiooni arvväärtus moolides liitri kohta;

on pimekatses kasutatud standardse naatriumtiosulfaadi tiitrimislahuse (4.4) mahu arvväärtus milliliitrites;

on määramisel kasutatud standardse naatriumtiosulfaadi tiitrimislahuse (4.4) mahu arvväärtus milliliitrites;

on katsekoguse (7.1) massi arvväärtus grammides.

Tulemuseks loetakse kahe määramise aritmeetiline keskmine tingimusel, et korratavuse nõue on täidetud.

▼M11

XVII LISA

MEETOD STIGMASTADIEENIDE MÄÄRAMISEKS TAIMEÕLIDES

1. EESMÄRK

Stigmastadieenide määramine taimeõlides, mis sisaldavad neid süsivesinikke väikeses kontsentratsioonis, eeskätt esmases oliiviõlis ja oliivijääkidest saadud toorõlis.

2. RAKENDUSALA

Käesolevat standardmeetodit võib rakendada kõigi taimeõlide analüüsimisel, kuid mõõtmistulemused on usaldatavad ainult juhul, kui stigmastadieenide sisaldus on 0,01-4,0 mg/kg. Kuna rafineeritud õlid sisaldavad stigmastadieene, esmased õlid aga neid ei sisalda, sobib see meetod eriti hästi rafineeritud taimeõlide (oliiviõli, oliivijääkidest saadud õli, päevalilleõli, palmiõli jms) kindlakstegemiseks esmases oliiviõlis.

3. PÕHIMÕTE

Isoleeritakse mitteseebistuvad ained. Silikageel-kolonnkromatograafia abil eraldatakse steroidsete süsivesinike fraktsioon ning analüüsitakse seda kapillaargaasikromatograafiliselt.

4. SEADMED

4.1.	250 ml kolvid, mida saab kasutada püstjahutiga.

4.2.	500 ml jaotuslehtrid.

4.3.	100 ml ümarkolvid.

4.4.	Pöördauruti.

4.5.

Klaasist kromatograafiakolonn (sisediameeter 1,5-2,0 cm; pikkus 50 cm), millel on teflonkraan ja põhjas klaasvillakork või klaasfilter. Silikageelkolonni ettevalmistamiseks valatakse kromatograafiakolonni heksaani umbes 5 cm kõrguseni ja seejärel täidetakse kolonn silikageeli suspensiooniga heksaanis (15 g silikageeli 40 ml heksaani kohta), kandes seda kolonni väikeste heksaaniportsjonite abil. Suspensioonil lastakse settida, rakendades settimise lõpus kerget vibratsiooni. Kolonni lisatakse umbes 0,5 cm paksune kiht veevaba naatriumsulfaati ja lastakse liigsel heksaanil välja voolata.

4.6.	Gaasikromatograaf, mis on varustatud leekionisatsioonidetektoriga, voolujaotusega või kolonnile kinnitatud külma injektoriga ning täpsusega ± 1 °C programmeeritava ahjuga.

4.7.	Sulatatud ränidioksiidist gaasikromatograafiline kapillaarkolonn (sisediameeter 0,25 või 0,32 mm, pikkus 25 m, kaetud 0,25 μm paksuse 5 % fenüülmetüülsilikoonfaasi kihiga). Märkus 1: Võib kasutada ka muid samasuguse või väiksema polaarsusega kolonne.

4.8.	Integreeriv isekirjuti, mis võimaldab integreerida miinimumist miinimumini.

4.9.	Liimitud nõelaga 5-10 μl gaasikromatograafiline mikrosüstal.

4.10.

Elektriline soojendussärk või termokamber.

5. REAKTIIVID

Kui ei ole ette nähtud teisiti, peavad kõik reaktiivid olema analüüsipuhtad. Kasutatakse destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett.

5.1.	Heksaan või alkaanide segu keemisvahemikuga 65-70° C, destilleeritud läbi rektifitseerimiskolonni. Märkus 2: Solvent destilleeritakse lisandite eemaldamiseks.

5.2.	Etanool mahuprotsendiga 96.

5.3.	Veevaba naatriumsulfaat.

5.4.

10 % kaaliumhüdroksiidi lahus alkoholis. 50 g kaaliumhüdroksiidile lisatakse 10 ml vett, segatakse ja täiendatakse segu maht etanooliga 500 milliliitrini.

Märkus 3:

Kaaliumhüdroksiidi alkoholilahus muutub seismisel pruuniks. See valmistatakse iga päeva uuesti ja seda hoitakse hästi suletud tumedas pudelis.

5.5.

Gaasikromatograafiline silikageel 60, 70-230 mešši (Merck, Art. Nr. 7734 vms).

Märkus 4:

Tavaliselt võib pakendist võetud silikageeli kasutada eelneva töötlemiseta. Mõned silikageeli partiid on aga madala aktiivsusega, mis põhjustab halba kromatograafilist lahutamist. Sellist silikageeli tuleb töödelda järgmiselt. Silikageel aktiveeritakse, kuumutades vähemalt 4 tundi 550 °C juures. Seejärel jahutatakse silikageel eksikaatoris ja pannakse korgiga suletavasse kolbi. Lisatakse 2 % vett ja raputatakse, kuni klombid pudenevad laiali ja pulber voolab vabalt.

Selline töötlemine on vajalik juhul, kui teatava silikageeli partii kasutamisel saadakse halvasti eraldunud piigid. Teine võimalus on kasutada eriti puhast silikageeli 60 (Merck, Art. Nr. 7754).

5.6.	Kolesta-3, 5-dieeni (Sigma, puhtusaste 99 %) põhilahus heksaanis kontsentratsiooniga 200 miljondikku (10 mg kolesta-3, 5-dieeni 50 ml-s lahuses).

5.7.	Kolesta-3, 5-dieeni standardlahus heksaanis kontsentratsiooniga 20 miljondikku; saadakse põhilahuse lahjendamisel. Märkus 5: Kui lahuseid 5.6 ja 5.7 säilitatakse madalamal temperatuuril kui 4 °C, püsivad need stabiilsena vähemalt 4 kuud.

5.8.	n-nonakosaani lahus heksaanis kontsentratsiooniga ligikaudu 100 miljondikku.

5.9.	Kromatograafiline kandegaas: heelium või vesinik, puhtusaste 99,9990 %.

5.10.

Leekionisatsioonidetektori töögaasid: 99,9990 % puhtusastmega vesinik ja puhastatud õhk.

6. ANALÜÜSI KÄIK

6.1. Mitteseebistuva materjali ettevalmistamine

6.1.1.

250 ml kolvis (4.1) kaalutakse 20 ± 0, 1 g õli, lisatakse 1 ml kolesta-3, 5-dieeni standardlahust (20 μg kolesta-3, 5-dieeni) ja 75 ml 10 % kaaliumhüdroksiidi alkoholilahust, kolb ühendatakse püstjahutiga ja keedetakse segu nõrgalt 30 minutit. Seejärel lastakse kolvil pisut jahtuda (palju jahutada ei tohi, sest proov võib sadeneda). Lisatakse 100 ml vett ja kantakse lahus 100 ml heksaani abil jaotuslehtrisse (4.2). Segu loksutatakse energiliselt 30 sekundit ja lastakse faasidel eralduda.

Märkus 6:

Kui tekib kaua püsiv emulsioon, lisatakse väike kogus etanooli.

6.1.2.

Alla kogunenud veefaas kantakse teise jaotuslehtrisse ja ekstraheeritakse veel kord 100 ml heksaaniga. Alumine faas lastakse uuesti välja, valatakse heksaaniekstraktid kokku eraldi jaotuslehtrisse ning pestakse kolm korda 100 ml etanooli ja vee seguga (1:1), nii et pH muutub neutraalseks.

6.1.3.

Heksaanilahus filtritakse läbi 50 g veevaba naatriumsulfaadi, pestakse 20 ml heksaaniga ja aurutatakse heksaan välja pöördaurutis alandatud rõhul 30 °C juures.

6.2. Steroidsete süsivesinike fraktsiooni eraldamine

6.2.1.

Jääk kantakse kahe ühemilliliitrise heksaaniportsjoni abil fraktsioneerimiskolonni, lastakse proovil voolata kolonni, kuni lahuse tase on alanenud naatriumsulfaadikihi ülemise servani, ja alustatakse kromatograafilist aeglast elueerimist heksaaniga kiirusega ligikaudu 1 ml/min. Esimesed 25-30 ml eluaati visatakse ära ja kogutakse seejärel 40 ml fraktsioon. See fraktsioon valatakse 100 ml ümarkolbi (4.3).

Märkus 7:

Esimene fraktsioon sisaldab küllastunud süsivesinikke (joonis 1a) ja teine steroidseid süsivesinikke. Edasisel elueerimisel väljuvad skvaleen ja selle analoogid. Küllastunud süsivesinike ja steroidsete süsivesinike hea lahknemise saavutamiseks on vaja optimeerida fraktsioonide mahud. Selleks tuleb esimese fraktsiooni maht valida nii, et teise fraktsiooni analüüsimisel osutuksid küllastunud süsivesinikele vastavad piigid madalaks (vt joonis 1c); kui need piigid ei ilmne üldse ja standardpiik on madal, tuleb esimese fraktsiooni mahtu vähendada. Esimese ja teise fraktsiooni komponendid ei pea olema siiski täielikult lahknenud, sest kui gaasikromatograafilise analüüsi tingimused on välja reguleeritud 6.3.1 kohaselt, siis gaasikromatograafilise analüüsi piigid ei kattu. Teise fraktsiooni mahu optimeerimine ei ole üldiselt vajalik, sest lahknemine hiljem väljuvatest komponentidest on hea. Kui siiski ilmub suur piik, mille peetumisaeg on ligikaudu 1,5 minutit väiksem kui standardi peetumisaeg, näitab see halba lahutamist.

6.2.2.

Teisest fraktsioonist aurutatakse heksaan välja pöördaurutis alandatud rõhul 30 °C juures ja jääk lahustatakse kohe 0,2 ml heksaanis. Lahust hoitakse kuni analüüsini külmikus.

Märkus 8:

Jääke 6.1.3 ja 6.2.2 ei tohi hoida toatemperatuuril kuivalt. Niipea kui need jäägid saadakse, tuleb neile lisada solvent ning säilitada lahust külmikus.

6.3. Gaasikromatograafia

6.3.1.

Töötingimused voolujaotusega injektsiooni korral:

— injektori temperatuur: 300 °C,

— detektori temperatuur: 320 °C,

— integreeriv isekirjuti: integreerimise parameetrid tuleb kindlaks määrata nii, et pindalade hindamine annaks õigeid tulemusi. Soovitav on kasutada miinimumist miinimumini integreerimise meetodit,

— tundlikkus: 16-kordne miinimumkustumine,

— süstitav kogus: 1 μl,

— ahju temperatuuri programmeerimine: esimese 6 minuti jooksul 235 °C, seejärel tõstetakse kiirusega 2 °C/min väärtuseni 285 °C,

— injektor: voolujaotusega 1:15,

— kandegaas: heelium või vesinik umbes 120 kPa rõhul.

Neid tingimusi võib reguleerida vastavalt kromatograafi ja kolonni karakteristikutele, nii et kromatogrammid vastaksid järgmistele tingimustele: sisestandardi piigi peetumisaeg peab vastama punktis 6.3.2 märgitud ajale umbes 5 minuti täpsusega; sisestandardi piigi kõrgus peab olema vähemalt 80 % kogu skaala kõrgusest.

Gaasikromatograafilise süsteemi kontrollimiseks süstitakse kolestadieeni (5.6) ja n-nonakosaani (5.8) põhilahuste segu. Kolesta-3, 5-dieeni piik peab ilmuma enne n-nonakosaani piiki (joonis 1c); kui see ei toimu, võib kasutada kahte abinõu: alandada ahju temperatuuri ja/või kasutada vähem polaarset kolonni.

6.3.2.

Piikide identifitseerimine

Sisestandardi piik ilmub umbes 19. minutil; 3,5-stigmastadieeni suhteline peetumisaeg on umbes 1,29 (vt joonis 1b). 3,5-stigmastadieen esineb koos väikese isomeerilisandiga ja need elueeruvad tavaliselt koos, andes ühe kromatograafilise piigi. Juhul kui kolonn on liiga polaarne või kõrge lahutusvõimega, võib isomeer siiski väljuda väikese piigina enne stigmasta-3, 5-dieeni selle lähedal (vt joonis 2). Selle tagamiseks, et stigmastadieenid elueeruksid ühe piigina, on soovitav kasutada kas väiksema polaarsusega või suurema sisediameetriga kolonni.

Märkus 9:

Võrdlemiseks võib stigmastadieenide piigi saada rafineeritud taimeõli analüüsi teel, kasutades väiksemat proovi kogust (1-2 g). Stigmastadieenid annavad silmatorkava kergesti äratuntava piigi.

6.3.3.

Kvantitatiivne analüüs

Stigmastadieenide sisaldus määratakse järgmise valemi abil:

stigmastadieenid (mg/kg) =

kus:	As = stigmastadieenide piigi pindala (kui piik lahkneb kahele isomeerile vastavaks piigiks, siis kahe piigi pindalade summa), Ac = sisestandardi (kolestadieeni) piigi pindala, Mc = lisatud standardi mass mikrogrammides, Mo = võetud õli mass grammides.

Meetodi piirtundlikkus: ligikaudu 0,01 mg/kg.

Joonis 1.

Gaasikromatogrammid, mis on saadud katsetes oliiviõli proovidega sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonnis (sisediameeter 0,25 mm, pikkus 25 m, kaetud 0,25 μm paksuse 5 % fenüülmetüülsilikooni kihiga).

a) Esmase õli esimene fraktsioon (30 ml), millele on lisatud standardit.

b) Oliiviõli teine fraktsioon (40 ml), mis sisaldab 0,10 mg/kg stigmastadieene.

c) Teine fraktsioon (40 ml), mis sisaldab väikese koguse esimest fraktsiooni.

Joonis 2.

DB-5-kolonni abil analüüsitud rafineeritud oliiviõliproovi kromatogramm, millel on näha 3,5-stigmastadieeni isomeer.

▼M25

XVIII LISA

ECN 42-TRIATSÜÜLGLÜTSEROOLIDE TEGELIKU JA TEOREETILISELT ARVUTATUD SISALDUSE VAHE MÄÄRAMINE

1. KASUTUSALA

Kõrgefektiivse vedelikkromatograafiaga (HPLC) määratud ekvivalentse süsinikuarvuga 42 (ECN42HPLC) triatsüülglütseroolide eksperimentaalsete väärtuste ja rasvhappekoostisest arvutatud ekvivalentse süsinikuarvuga 42 (ECN42teoreetiline) triatsüülglütseroolide teoreetiliste väärtuste absoluutarvulise vahe määramine.

2. KOHALDAMISALA

Käesolevat normi kohaldatakse oliiviõlidele. Meetodit võib kasutada (linoolhapperikka) seemneõli väikeste koguste avastamiseks iga kategooria oliiviõlides.

3. PÕHIMÕTE

HPLC-analüüsiga määratud ECN42-triatsüülglütseroolide sisaldus ja ECN42-triatsüülglütseroolide teoreetiline sisaldus (mis on arvutatud gaas-vedelik-kromatograafiaga määratud rasvhappekoostise põhjal) on ehtsate oliiviõlide puhul omavahel teataval määral kooskõlas. Nende vahe, mis on suurem iga õlitüübi jaoks heakskiidetud väärtusest, osutab sellele, et õli sisaldab seemneõlisid.

4. MEETOD

ECN42-triatsüülglütseroolide teoreetilise sisalduse arvutamine ja HPLC-andmetega võrdlemisest vahe leidmine toimub peamiselt muude meetoditega saadud analüüsiandmetega kooskõlastamise kaudu. Selles on võimalik eristada kolme etappi: rasvhappekoostise määramine kapillaargaasikromatograafiaga, ECN42-triatsüülglütseroolide teoreetilise sisalduse arvutamine, ECN42-triatsüülglütseroolide määramine HPLC meetodiga.

4.1. Seadmed

4.1.1.

250 ml ja 500 ml ümarapõhjalised kolvid.

4.1.2.

100 ml keeduklaasid.

4.1.3.

Klaasist kromatograafiakolonn sisediameetriga 21 mm ja pikkusega 450 mm, varustatud kraaniga ja ülaosas normaallihvmuhviga.

4.1.4.

250 ml jaotuslehtrid, normaallihvkerniga alumises osas, mis sobib ühendamiseks kolonni ülemise otsaga.

4.1.5.

600 mm pikkune klaaspulk.

4.1.6.

Klaaslehter läbimõõduga 80 mm.

4.1.7.

50 ml mõõtkolvid.

4.1.8.

20 ml mõõtkolvid.

4.1.9.

Pöördauruti.

4.1.10.

Kõrgefektiivne vedelikkromatograaf, mille kolonni temperatuuri on võimalik hoida etteantud väärtuse juures.

4.1.11.

Sissesüstimissüsteem, millesse on võimalik süstida 10 μl proove.

4.1.12.

Detektorina kasutatakse diferentsiaalrefraktomeetrit. Kogu mõõtepiirkonna ulatuses peaks tundlikkus olema vähemalt 10–4 murdumisnäitaja ühikut.

4.1.13.

Kolonn: roostevabast terasest toru pikkusega 250 mm ja sisediameetriga 4,5 mm, täidiseks on ränidioksiidiosakesed läbimõõduga 5 μm; täidis sisaldab 22–23 % süsinikku oktadetsüülsilaani kujul.

4.1.14.

Andmetöötlustarkvara.

4.1.15.

Umbes 2 ml ruumalaga viaalid, millel on keeratavad korgid ja teflontihendid.

4.2. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peaksid olema puhtusastmega „analüütiliselt puhas”. Elueerimislahustid peaksid olema gaasivabad ja neid võib korduvalt kasutada, ilma et see mõjutaks lahutust.

4.2.1.

Kromatograafiliselt puhas petrooleeter keemistemperatuuriga 40–60 °C või heksaan.

4.2.2.

Värskelt destilleeritud peroksiidivaba dietüüleeter.

4.2.3.

Elueerimislahusti õli puhastamiseks kolonnkromatograafia abil: petrooleetri ja etüüleetri segu komponentide suhtega 87/13 (v/v).

4.2.4.

Silikageel, mešš 70–230, tüüp Merck 7734, veesisaldus standarditud 5 massiprotsendile.

4.2.5.

Klaasvatt.

4.2.6.

Atsetoon HPLC jaoks.

4.2.7.

Atsetonitriil või propionitriil HPLC jaoks.

4.2.8.

HPLC-elueerimislahusti: atsetonitriil + atsetoon (vahekorda tuleb soovitud lahutuse saamiseks kohandada; alustada tuleks seguga 50:50) või propionitriil.

4.2.9.

Solubiliseerimislahusti: atsetoon.

4.2.10.

Võrdlustriglütseriidid: võib kasutada müügil olevaid triglütseriide (tripalmitiin, trioleiin, jne); nende retentsiooniajad kantakse graafikule funktsioonina ekvivalentsest süsinikuaatomite arvust; samuti võib kasutada võrdluskromatogramme, mis on saadud sojaõliga, seguga sojaõli-oliiviõli 30:70 ja puhta oliiviõliga (vt märkused 1 ja 2 ning joonised 1–4).

4.2.11.

Tahke faasi ekstraktsiooni kolonn mahuga 6 ml, sisaldab 1 g ränidioksiidi.

4.3. Proovi ettevalmistamine

Kuna mitmed segavad ained võivad anda valepositiivseid tulemusi, tuleb proov alati puhastada vastavalt IUPACi meetodile 2.507, mida kasutatakse polaarsete ühendite määramiseks praadimisõlides.

4.3.1. Kromatograafilise kolonni ettevalmistamine.

Kolonni (4.1.3) valatakse umbes 30 ml elueerimislahustit (4.2.3), seejärel pannakse kolonni veidi klaasvatti (4.2.5) ja lükatakse see klaaspulga (4.1.5) abil kolonni põhja.

100 ml keeduklaasis suspendeeritakse 25 g silikageeli (4.2.4) 80 ml elueerimissegus (4.2.3), seejärel kallatakse suspensioon klaaslehtri (4.1.6) abil kolonni.

Silikageeli täielikuks ülekandmiseks kolonni loputatakse keeduklaasi elueerimisseguga ja kantakse ka loputamiseks kasutatud vedelikukogused kolonni.

Avatakse kraan ja lastakse lahustil kolonnist läbi voolata, kuni lahusti nivoo jääb umbes 1 cm kõrgusele silikageeli pinnast.

4.3.2. Kolonnkromatograafia

50 ml mõõtkolbi (4.1.7) kaalutakse täpsusega 0,001 g 2,5 ± 0,1 g õli, mis on eelnevalt filtritud, homogeenitud ja vajaduse korral muudetud veevabaks.

Õli lahustatakse umbes 20 ml elueerimislahustis (4.2.3). Vajaduse korral soojendatakse veidi, et hõlbustada lahustumist. Jahutatakse toatemperatuurini ja täiendatakse elueerimislahustiga märgini.

Mõõtpipetiga viiakse 20 ml lahust punkti 4.3.1 kohaselt ettevalmistatud kolonni, avatakse kraan ja lastakse lahustil voolata, kuni nivoo kolonnis jõuab silikageelikihi pinnani.

Seejärel elueeritakse 150 ml elueerimislahustiga (4.2.3), seades lahusti voolukiiruseks umbes 2 ml/min (150 ml lahusti voolamiseks läbi kolonni kulub umbes 60–70 minutit).

Eluaat kogutakse 250 ml ümarkolbi (4.1.1), mis on eelnevalt ahjus kuumutatud konstantse kaaluni ja täpselt kaalutud. Lahus aurutatakse pöördaurutil (4.1.9) vaakumis lahustist kuivaks ja kaalutakse jääk, mida kasutatakse HPLC-analüüsi ja metüülestrite sünteesimiseks kasutatavate lahuste valmistamiseks.

Proovist peab pärast kolonni olema võimalik taastuvastada vähemalt 90 % ekstraneitsiõli, neitsiõli, tavalise rafineeritud oliiviõli ja oliiviõli eri kategooriate puhul ning vähemalt 80 % lambiõli ja oliivijääkõli puhul.

4.3.3. Puhastamine tahke faasi ekstraktsiooniga

Ränidioksiidi sisaldav tahke faasi ekstraktsiooni kolonn aktiveeritakse, milleks sellest lastakse vaakumis läbi 6 ml heksaani (4.2.3), kuid välditakse kolonni kuivaks jäämist.

Kaalutakse 0,12 g täpsusega 0,001 g 2 ml viaali (4.1.15) ja lahustatakse 0,5 ml heksaanis (4.2.3).

Lahus kantakse tahke faasi ekstraktsiooni kolonni ja voolutatakse siis vaakumit kasutades 10 ml heksaani-dietüüleetri seguga vahekorras 87:13 mahuosa (4.2.3).

Kogutud fraktsioon aurutatakse rotaatoril (4.1.9) vaakumis toatemperatuuril kuivaks. Jääk lahustatakse 2 ml atsetoonis (4.2.6) triatsüülglütseroolide analüüsiks.

4.4. HPLC-analüüs

4.4.1. Proovide ettevalmistamine kromatograafilise analüüsi jaoks

Valmistatakse uuritava proovi 5 % lahus, milleks kaalutakse 10 ml mõõtkolbi 0,5 ± 0,001 g proovi ja katseklaas täidetakse solubiliseerimislahustiga (4.2.9) kuni 10 ml märgini.

4.4.2. Analüüsi käik

Koostatakse kromatograafiasüsteem. Kogu süsteemi läbipesemiseks pumbatakse sellest läbi elueerimislahustit (4.2.8) kiirusega 1,5 ml/min. Oodatakse, kuni tekib stabiilne nulljoon.

Kolonni süstitakse 10 μl proovi, mis on ette valmistatud vastavalt punktile 4.3.

4.4.3. Arvutuskäik ja tulemuste esitamine

Kasutatakse pindalade normeerimise meetodit, mille puhul eeldatakse, et ekvivalentse süsinikuaatomite arvuga 42 kuni 52 triatsüülglütseroolide piikide pindalade summa on 100 %.

Iga triglütserooli suhteline protsendiline sisaldus arvutatakse järgmise võrrandiga:

Tulemused esitatakse vähemalt kahe kümnendikkoha täpsusega.

Vt joonealused märkused 1–4.

4.5. Triatsüülglütseroolse koostise (moolprotsent) arvutamine rasvhappekoostise andmetest (pindalaprotsent)

4.5.1. Rasvhappekoostise määramine

Rasvhappekoostis määratakse meetodiga ISO 5508 kapillaarkolonni abil. Metüülestrid valmistatakse vastavalt dokumendis COI/T.20/Doc. No 24 esitatud eeskirjale.

4.5.2. Arvutustes kasutatavad rasvhapped

Glütseroolid rühmitatakse nende ekvivalentse süsinikuaatomite arvu (ECN) järgi, võttes arvesse ECNi ja rasvhapete järgmisi ekvivalentsusi. Arvestatakse üksnes rasvhappeid süsinikuaatomite arvuga 16 ja 18, kuna üksnes nimetatud rasvhapped on oliiviõli puhul olulised. Rasvhapped tuleks normeerida 100 %-le.

Rasvhape	Lühend	Molekulmass (MW)	ECN
Palmitiinhape	P	256,4	16
Palmitoleiinhape	Po	254,4	14
Steariinhape	S	284,5	18
Oleiinhape	O	282,5	16
Linoolhape	L	280,4	14
Linoleenhape	Ln	278,4	12

4.5.3. Pindalaprotsentide (area %) teisendamine kõikide rasvhapete moolideks (1) (area % X on rasvhappe X pindalaprotsent ja MW X on rasvhappe X molekulmass)

4.5.4. Rasvhapete moolide normeerimine 100 %-le (2)

Tulemuseks saadakse iga rasvhappe moolprotsendiline osa 1,2,3-asendatud triatsüülglütseroolides.

Seejärel arvutatakse küllastunud rasvhapete (saturated fatty acids, SFA) P ja S ning küllastumata rasvhapete (unsaturated fatty acids, UFA) Po, O, L ja Ln summad (3):

4.5.5. Triatsüülglütseroolide 2- ja 1,3-asendis olevate rasvhapete koostise arvutamine

Rasvhapped jagatakse järgmisel viisil kolme rühma: üks rühm, milles rasvhape on 2-asendis, ning kaks identset rühma, milles rasvhape on 1- ja 3-asendis, kusjuures küllastunud (P ja S) ning küllastumata (Po, O, L ja Ln) hapete koefitsiendid on erinevad.

4.5.5.1. Küllastunud rasvhapped 2-asendis [P(2) ja S(2)] (4)

4.5.5.2. Küllastumata rasvhapped 2-asendis [Po(2), O(2), L(2) ja Ln(2)] (5):

4.5.5.3. Rasvhapped 1,3-asendis [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (6)

4.5.6. Triatsüülglütseroolide arvutamine

4.5.6.1. Ühe rasvhappe triatsüülglütseroolid (tähis AAA, siin: LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2. Kahe rasvhappe triatsüülglütseroolid (tähis AAB, siin: PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3. Kolme erineva rasvhappe triatsüülglütseroolid (tähis ABC, siin: OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4. Triatsüülglütseroolid ekvivalentse süsinikuaatomite arvuga 42 (ECN42)

ECN42-triatsüülglütseroolid arvutatakse võrranditega 7, 8 ja 9 ning need on esitatud vastavalt nende oodatavale elueerumisele HPLCga määramisel (tavaliselt ainult kolm piiki).

LLL

PoLL ja asendiisomeer LPoL

OLLn ning asendiisomeerid OLnL ja LnOL

PoPoL ja asendiisomeer PoLPo

PoOLn ning asendiisomeerid OPoLn ja OLnPo

PLLn ning asendiisomeerid LLnP ja LnPL

PoPoPo

SLnLn ja asendiisomeer LnSLn

PPoLn ning asendiisomeerid PLnPo ja PoPLn

ECN42-triatsüülglütseroolid esitatakse üheksa triatsüülglütserooli ja nende asendiisomeeride summana. Tulemused esitatakse vähemalt kahe kümnendikkoha täpsusega.

5. TULEMUSTE HINDAMINE

Arvutusega määratud teoreetilist sisaldust võrreldakse HPLC-analüüsi abil määratud sisaldusega. Kui HPLC-andmetest määratud sisalduse ja teoreetiliselt arvutatud sisalduse vahe absoluutväärtus on suurem väärtusest, mis on asjaomase õlikategooria jaoks esitatud standardis, sisaldab proov seemneõli.

Tulemused esitatakse kahe kümnendikkoha täpsusega.

6. NÄIDE (NUMBRITEGA ON VIIDATUD MEETODI KIRJELDUSE PUNKTIDELE)

— 4.5.1. Rasvhapete moolprotsendi arvutamine gaas-vedelik-kromatograafia andmetest (normeeritud pindalaprotsent)

Gaas-vedelik-kromatograafia abil on rasvhappekoostise kohta saadud järgmised andmed:

FA	P	S	Po	O	L	Ln
MW	256,4	284,5	254,4	282,5	280,4	278,4
Pindalaprotsent	10,0	3,0	1,0	75,0	10,0	1,0

— 4.5.3. Pindalaprotsentide teisendamine kõikide rasvhapete moolideks (vt võrrand 1)

P moole

S moole

Po moole

O moole

L moole

Ln moole

Kokku

0,35821 mooli triatsüülglütseroole

— 4.5.4. Rasvhapete moolide normeerimine 100 %-le (vt võrrand 2)

P(1,2,3) mool %

S(1,2,3) mool %

Po(1,2,3) mool %

O(1,2,3) mool %

L(1,2,3) mool %

Ln(1,2,3) mool %

Kokku moolprotsente

100 %

Triatsüülglütseroolide 1,2,3-asendis olevate küllastunud ja küllastumata rasvhapete summa (vt võrrand 3):

— 4.5.5. Triatsüülglütseroolide 2- ja 1,3-asendis olevate rasvhapete koostise arvutamine

— 4.5.5.1. Küllastunud rasvhapped 2-asendis [P(2) ja S(2)] (vt võrrand 4)

— 4.5.5.2. Küllastumata rasvhapped 2-asendis [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (vt võrrand 5)

— 4.5.5.3. Rasvhapped 1,3-asendis [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (vt võrrand 6)

— 4.5.6. Triatsüülglütseroolide arvutamine

Arvutatud stereokeemilise numeratsiooni kohaselt 2- ja 1,3-asendis olevate rasvhapete koostisest:

Rasvhape	1,3-asendis	2-asendis
P	16,004 %	0,653 %
S	4,325 %	0,177 %
Po	1,015 %	1,262 %
O	68,526 %	85,296 %
L	9,204 %	11,457 %
Ln	0,927 %	1,153 %
Summa	100,0 %	100,0 %

arvutatakse järgmised triatsüülglütseroolid:

LLL

PoPoPo

PoLL ühe asendiisomeeriga

SLnLn ühe asendiisomeeriga

PoPoL ühe asendiisomeeriga

PPoLn kahe asendiisomeeriga

OLLn kahe asendiisomeeriga

PLLn kahe asendiisomeeriga

PoOLn kahe asendiisomeeriga

— 4.5.6.1. Ühe rasvhappega triatsüülglütseroolid (LLL, Po,Po,Po) (vt võrrand 7)

= 0,09706 LLL mooli

— 4.5.6.2. Kahe rasvhappega triatsüülglütseroolid (PoLL, SLnLn, PoPoL) (vt võrrand 8)

0,03210 PoLL mooli

0,00094 SLnLn mooli

0,00354 PoPoL mooli

— 4.5.6.3. Kolme erineva rasvhappe triatsüülglütseroolid (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) (vt võrrand 9)

0,00761 PPoLn mooli

0,43655 OLLn mooli

0,06907 PLLn mooli

0,04812 PoOLn mooli

ECN42-triatsüülglütseroole = 0,69512 mooli

Märkus 1: elueerumisjärjekorda võib määrata ekvivalentse süsinikuarvu arvutamise teel, mida väljendab sageli seos , kus CN on süsinikuaatomite arv ja n on kaksiksidemete arv; kaksiksideme päritolu arvesse võttes on seda võimalik täpsemalt arvutada. Kui no, nl ja nln on vastavalt oleiinhappele, linoolhappele ja linoleenhappele omistatud kaksiksidemete arvud, on ekvivalentset süsinikuaatomite arvu võimalik arvutada järgmise valemiga:

milles koefitsiente do, d1 ja d1n on võimalik arvutada võrdlustriglütseriidide andmetest. Käesolevas meetodis täpsustatud tingimustel on võrrand ligikaudu järgmine:

Märkus 2: mitme võrdlustriglütseriidi abil on võimalik arvutada trioleiini lahutus:

trioleiinkasutades taandatud retentsiooniaega

log α ja kaksiksidemete arvu f vahelise sõltuvuse graafiku järgi saab määrata kindlaks kõikide võrdlustrigütseriidides sisalduvate rasvhapete triglütseriidide retentsiooniajad (vt joonis 1).

Märkus 3: kolonni lahutusvõime peab võimaldama trilinoleiini piigi selget eristumist lähedase retentsiooniajaga triglütseriidide piikidest. Voolutamist jätkatakse kuni ECN52 piigini.

Märkus 4: kõikide kõnealuse analüüsi seisukohast huvipakkuvate piikide pindalade õige määramine on tagatud juhul, kui ECN50-le vastava teise piigi kõrgus on 50 % meeriku täisskaalast.

Joonis 1

Graafik: log α sõltuvus kaksiksidemete arvust f

Kaksiksidemete arv

La: lauriinhape; My: müristiinhape; P: palmitiinhape; S: steariinhape; O: oleiinhape; L: linoolhape; Ln: linoleenhape.

Joonis 2

Vähese linoolhappesisaldusega oliiviõli

Lahusti: atsetoon/atsetonitriil.

Kromatogramm a: kromatograafiliste piikide peamised komponendid: ECN42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS.

Lahusti: propionitriil

Kromatogramm b: kromatograafiliste piikide peamised komponendid: ECN42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS.

Joonis 3

Suure linoolhappesisaldusega oliiviõli

Lahusti: atsetoon/atsetonitriil (50:50).

Kromatogramm a: kromatograafiliste piikide peamised komponendid: ECN42: (1’) LLL + PoLL; (2’) OLLn + PoOLn; (3’) PLLn; ECN44: (4’) OLL + PoOL; (5’) OOLn + PLL; (6’) POLn + PPoPo; ECN46: (7’) OOL + PoOO; (8’) PLO + SLL + PoOP; (9’) PLP + PoPP; ECN48: (10’) OOO; (11’) POO + SLL + PPoO; (12’) POP + PLS; ECN50: (13’) SOO; (14’) POS + SLS.

Lahusti: propionitriil.

Kromatogramm b: kromatograafiliste piikide peamised komponendid: ECN42: (1) LLL; (2 + 2’) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN52: (19) AOO.

▼M19

ANNEX XIX

DETERMINATION OF ALIPHATIC ALCOHOLS CONTENT BY CAPILLARY GAS CHROMATOGRAPHY

1. OBJECT

The procedure describes a method for the determination of aliphatic alcohols content in oils and fats.

2. PRINCIPLE OF THE METHOD

The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is saponified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethylsilyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.

3. EQUIPMENT

3.1. 250 ml round-bottomed flask fitted with a reflux condenser having ground-glass joints.

3.2. 500 ml separating funnel.

3.3. 250 ml round-bottomed flasks.

3.4. Chromatographic tank for thin-layer chromatographic analysis, for glass plates of dimensions 20 x 20 cm.

3.5. Ultraviolet lamp having a wavelength of 366 or 254 nm.

3.6. 100 μl and 500 μl microsyringes.

3.7. A cylindrical filter funnel with a G3 porous septum (porosity 15 to 40 μm) of diameter approximately 2 cm and a depth of some 5 cm, with an attachment suitable for filtration under vacuum and a 12/21 male ground glass joint.

3.8. 50 ml vacuum conical flask with a 12/21 ground-glass female joint which can be fitted to the filter funnel (3.7).

3.9. A 10 ml test tube with a tapering bottom and a sealing stopper.

3.10. Gas chromatograph for use with a capillary column, and provided with a splitting system composed of:

3.10.1. Thermostatic chamber for columns (column oven) to hold the temperature desired with a precision of ± 1 °C.

3.10.2. A temperature-adjustable injection unit with a persilanised glass vaporising element.

3.10.3. A flame ionisation detector and converter-amplifier.

3.10.4. Recorder-integrator for operation with the converter-amplifier (3.10.3), with response time not exceeding one second and with variable paper-speed.

3.11. Glass or fused silica capillary column, of length 20 to 30 m, internal diameter 0,25 to 0,32 mm, with SE-52 or SE-54 liquid phase or equivalent, with a film thickness between 0,10 and 0,30 μm.

3.12. Microsyringe for gas chromatography, of 10 μl capacity with hardened needle.

3.13. Analytical balance sensitive to 1 mg (with 0,1 mg display).

4. REAGENTS

4.1. Potassium hydroxide, approximately 2 N ethanolic solution: 130 g potassium hydroxide (minimum concentration 85 %) is dissolved, with cooling, in 200 ml distilled water and then made up to one litre with ethanol. The solution should be stored in a well-stoppered opaque glass bottle.

4.2. Ethyl ether, pure for analysis.

4.3. Anhydrous sodium sulphate, analytical purity.

4.4. Glass plates coated with silica gel, without fluorescence indicator, thickness 0,25 mm (commercially available ready for use).

4.5. Potassium hydroxide, approximately 0,2 N ethanolic solution; 13 g of potassium hydroxide are dissolved in 20 ml of distilled water and made up to one litre with ethanol.

4.6. Benzene, for chromatography (see 5.2.2).

4.7. Acetone, for chromatography (See 5.2.2).

4.8. Hexane, for chromatography (see 5.2.2).

4.9. Ethyl ether, for chromatography (see 5.2.2).

4.10. Chloroform, for chromatography.

4.11. Reference solution for thin-layer chromatography: cholesterol or phytosterols, 5 % solution in chloroform.

4.12. 0,2 % solution of 2', 7'-dichlorofluorescein in ethanol. Make slightly basic by adding a few drops of 2 N alcoholic potassium hydroxide solution.

4.13. Anhydrous pyridine, for chromatography.

4.14. Hexamethyl disilazane.

4.15. Trimethylchlorosilane.

4.16. Standard solutions of trimethylsilyl ethers of aliphatic alcohols from C20 to C28. They may be prepared from mixtures of pure alcohols at the time they are required for use.

4.17. A 0,1 % (m/v) solution of 1-eicosanol in chloroform (internal standard).

4.18. Carrier gas: hydrogen or helium, gas-chromatographic purity.

4.19. Auxiliary gas: nitrogen, gas-chromatographic purity.

5. PROCEDURE

5.1. Preparation of the unsaponifiables

5.1.1.

Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil.

Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 5 g of the dry filtered sample into the same flask.

5.1.2.

Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to approximately 30 °C.

5.1.3.

The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle (Note 1).

Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether.

Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.

5.1.4.

The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives a neutral reaction.

Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed beforehand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl ether which are added to the total.

5.1.5.

Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling in a desiccator.

5.2. Separation of alcoholic fractions

5.2.1.

Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally placed in an oven at 100 °C for one hour.

Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until required for use (plates treated in this way must be used within 15 days).

Note 2:

When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic fraction there is no need to treat the unsaponifiables with alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated distinctly from the sterol band.

5.2.2.

Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-developing chamber to a depth of approximately 1 cm ( 8 ).

Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components.

Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in order to obtain reproducible developing conditions.

5.2.3.

An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chloroform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution (4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.

5.2.4.

Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Immediately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate.

The plate is then removed from the development chamber and the solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.

5.2.5.

The plate is sprayed lightly and evenly with the solution of 2', 7'-dichlorofluorescein when the plate is observed under ultra violet light. The aliphatic alcohols band can be identified through being aligned with the stain obtained from the reference solution: mark the limits of the band with a black pencil; outlining the band of aliphatic alcohols and the band immediately above that, which is the terpenic alcohols band, together.

Note 4:

The aliphatic alcohols band and the terpenic alcohols band are to be grouped together in view of the possible migration of some aliphatic alcohols into the triterpenic alcohols band.

5.2.6.

Using a metal spatula scrape off the silica gel in the marked area. Place the finely comminuted material removed into the filter funnel (3.7). Add 10 ml of hot chloroform, mix carefully with the metal spatula and filter under vacuum, collecting the filtrate in the conical flask (3.8) attached to the filter funnel.

Wash the pomace in the flask three times with ethyl ether (approximately 10 ml each time) collecting the filtrate in the same flask attached to the funnel. Evaporate the filtrate to a volume of 4 to 5 ml, transfer the residual solution to the previously weighed 10 ml test tube (3.9), evaporate to dryness by mild heating in a gentle flow of nitrogen, make up again using a few drops of acetone, evaporate again to dryness, place in an oven at 105 °C for approximately 10 minutes and then allow to cool in a desiccator and weigh.

The pomace inside the test tube is composed of the alcoholic fraction.

5.3. Preparation of the trimethylsilyl ethers

5.3.1.

The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume (Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption of moisture (Note 6).

Note 5:

Solutions which are ready for use are available commercially. Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethylsilyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available.

Note 6:

The slight opalescence which may form is normal and does not cause any interference. The formation of a white floc or the appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.

5.3.2.

Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.

5.4. Gas chromatography analysis

5.4.1. Preliminary operations, column packing

5.4.1.1.

Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly (tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the splitting system and of the recording system, etc.).

5.4.1.2.

If the column is being used for the first time it is recommended that it should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through the capillary column and then the gas chromatography assembly is switched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That temperature is held for not less than two hours and then the assembly is brought to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connections; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column.

Note 7:

The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than the maximum temperature contemplated for the liquid phase employed.

5.4.2. Choice of operating conditions

5.4.2.1. The guideline operating conditions are as follows:

— column temperature: the initial isotherm is set at 180 °C for eight minutes and then programmed at 5 °C/minute to 260 °C and a further 15 minutes at 260 °C,

— temperature of evaporator: 280 °C,

— temperature of detector: 290 °C,

— linear velocity of carrier gas: helium 20 to 35 cm/s, hydrogen 30 to 50 cm/s,

— splitting ratio: 1:50 to 1:100,

— sensitivity of instrument: 4 to 16 times the minimum attenuation,

— sensitivity of recording: 1 to 2 mV fs,

— paper speed: 30 to 60 cm/h,

— quantity of substance injected: 0,5 to 1 μl of TMSE solution.

The above conditions may be modified according to the characteristics of the column and of the gas chromatograph to obtain chromatograms satisfying the following conditions:

— alcohol C26 retention time shall be 18 ± 5 minutes,

— the alcohol C22 peak shall be 80 ± 20 % of the full scale value for olive oil and 40 ± 20 % of the full scale value for seed oil.

5.4.2.2. The above requirements are checked by repeated injection of the standard TMSE mixture of alcohols and the operating conditions are adjusted to yield the best possible results.

5.4.2.3. The parameters for the integration of peaks shall be set so that a correct appraisal of the areas of the peaks considered is obtained.

5.4.3. Analytical procedure

5.4.3.1. Using the microsyringe of 10 μl capacity draw in 1 μl of hexane followed by 0,5 μl of air and subsequently 0,5 to 1 μl of the sample solution; raise the plunger of the syringe further so the needle is emptied. Push the needle through the membrane of the injection unit and after one to two seconds inject rapidly, then slowly remove the needle after some five seconds.

5.4.3.2. Recording is effected until the TMSE of the aliphatic alcohols present have been eluted completely. The base line shall always correspond to the requirements of 5.4.1.2.

5.4.4. Peak identification

The identification of individual peaks is effected according to the retention times and by comparison with the standard TMSE mixture, analysed under the same conditions.

A chromatogram of the alcoholic fraction of a virgin olive oil is shown in Figure 1.

5.4.5. Quantitative evaluation

5.4.5.1. The peak areas of 1-eicosanol and of the aliphatic alcohols C22, C24, C26 and C28 are calculated by electronic integration.

5.4.5.2. The contents of each aliphatic alcohol, expressed in mg/1 000 g fatty substance, are calculated as follows:

where:

area of the alcohol peak x

area of 1-eicosanol

mass of 1-eicosanol in milligrams

mass of sample drawn for determination, in grams.

6. EXPRESSION OF THE RESULTS

The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty substance and the sum of the „total aliphatic alcohols” are reported.

APPENDIX

Determination of the linear velocity of the gas

1 to 3 μl of methane or propane are injected into the gas chromatograph set at normal operating conditions and the time taken for the methane or propane to flow through the column from the instant of injection to the instant the peak elutes (tM) is measured using a stop clock.

The linear velocity in cm/s is given by L/tM, where L is the length of the column in centimetres and tM is the measured time in seconds.

Figure 1 — Chromatogram of the alcoholic fraction of virgin oil

Eicosanol

Decosanol

Tricosanol

Tetracosanol

Pentacosanol

Hexacosanol

Heptacosanol

Octacosanol

▼M23

XX LISA

Meetod vahade, rasvhapete metüülestrite ja etüülestrite sisalduse määramiseks kapillaargaasikromatograafiaga

1. EESMÄRK

Käesolev meetod on ette nähtud vahade ning rasvhapete metüül- ja etüülestrite määramiseks oliiviõlides. Üksikud vahad ja alküülestrid eraldatakse üksteisest vastavalt süsinikuaatomite arvule. Meetodit soovitatakse vahendina, mis võimaldab eristada oliiviõli ja oliivijääkõli, samuti on see meetod ekstra neitsioliiviõli kvaliteedinäitaja, mis võimaldab kindlaks teha võltsinguid, milles ekstra neitsioliiviõlisid on segatud madalamakvaliteediliste õlidega – neitsiõlide, lambiõlide või ka mõne lõhnatustatud õliga.

2. PÕHIMÕTE

Rasvainele lisatakse sobivaid sisestandardeid ja seejärel fraktsioneeritakse rasvaine kromatograafiliselt, kasutades hüdrateeritud silikageelkolonni. Katsetingimustel elueeritud fraktsioon, mille polaarsus on väiksem kui triatsüülglütseriididel, eraldatakse ning seda analüüsitakse kapillaargaasikromatograafia abil.

3. VAHENDID

3.1.	25-milliliitrine Erlenmeyeri kolb

3.2.	Klaasist vedelikkromatograafiakolonn sisediameeteriga 15 mm ja pikkusega 30–40 cm, mis on varustatud sobiva kraaniga

3.3.

Sobiv kapillaarkolonniga gaasikromatograaf, mis on varustatud süsteemiga, mis võimaldab otse kolonni süstimist ja koosneb järgmistest osadest:

3.3.1.

Termostaadiga ahi, mille temperatuuri saab muuta vastavalt programmile

3.3.2.

Külminjektor proovi viimiseks otse kolonni

3.3.3.

Leekionisatsioondetektor ja muundurvõimendi

3.3.4.

Meerikuga integraator (vt märkus 1), mida saab kasutada koos muundurvõimendiga (punkt 3.3.3), mille reageerimisaeg on kuni 1 sekund ning mille paberikiirust on võimalik muuta

Märkus 1. Võib kasutada ka arvutiga ühendatud süsteeme, kus gaasikromatograafia andmed sisestatakse personaalarvuti kaudu.

3.3.5.

Sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn vahade ning rasvhapete metüül- ja etüülestrite analüüsiks, pikkus 8–12 m, sisediameeter 0,25–0,32 mm, mis on seestpoolt kaetud vedelfaasiga (vt märkus 2), mille kihi paksus on ühtlaselt 0,10–0,30 μm

Märkus 2. Müügil on selleks otstarbeks sobivad vedelfaasid, nagu SE52, SE54 jne.

3.4.	Mikrosüstal, 10 μl, otse kolonni süstimiseks, mille nõelal on tugevdatud pinnakiht

3.5.	Elektriline vibraator

3.6.	Pöördauruti

3.7.

Muhvelahi

3.8.	Analüütiline kaal, mis võimaldab kaaluda täpsusega ± 0,1 mg

3.9.	Harilikud laboratoorsed klaasnõud

4. REAKTIIVID

4.1.

Silikageel, terasuurus 60–200 μm. Silikageel pannakse vähemalt neljaks tunniks muhvelahju temperatuuriga 500 °C. Lastakse jahtuda, seejärel lisatakse vett koguses, mis vastab 2 %-le silikageeli massist. Loksutatakse korralikult ühtlase suspensiooni saamiseks ja hoitakse enne kasutamist eksikaatoris vähemalt 12 tundi.

4.2.

n-heksaan, kromatograafia jaoks või jäägivaba (puhtust on vaja kontrollida)

ETTEVAATUST! Aur on süttimisohtlik! Hoidke eemal soojusallikatest, sädemetest ja lahtisest leegist. Jälgige, et pudel oleks alati kindlalt suletud. Kasutamise ajal peab ruumis olema korralik ventilatsioon. Vältige aurude kogunemist ja eemaldage kõik tuleohu allikad, nagu soojendusriistad või elektriaparaadid, mis ei ole süttimisohutust materjalist. Sissehingamisel kahjulik, kuna võib kahjustada närvirakke. Vältige aurude sissehingamist. Vajaduse korral kasutage sobivat respiraatorit. Vältige sattumist nahale või silma.

4.3.

Dietüüleeter kromatograafia jaoks

ETTEVAATUST! Väga tuleohtlik ja mõõdukalt mürgine. Ärritab nahka. Sissehingamisel kahjulik. Võib kahjustada silmi. Toime võib avalduda alles hiljem. Võib moodustada plahvatusohtlikke peroksiide. Aur on süttimisohtlik. Hoidke eemal soojusallikatest, sädemetest ja lahtisest leegist. Jälgige, et pudel oleks alati kindlalt suletud. Kasutamise ajal peab ruumis olema korralik ventilatsioon. Vältige aurude kogunemist ja eemaldage kõik tuleohu allikad, nagu soojendusriistad või elektriaparaadid, mis ei ole süttimisohutust materjalist. Ärge aurutage kuivaks või peaaegu kuivaks. Vee või sobiva taandava reagendi lisamine võib vähendada peroksiidide moodustumist. Mitte juua. Vältige aurude sissehingamist. Vältige kestvat või korduvat kokkupuudet nahaga.

4.4.

n-heptaan kromatograafias kasutamiseks või isooktaan

ETTEVAATUST! Tuleohtlik. Sissehingamisel kahjulik. Hoidke eemal soojusallikatest, sädemetest ja lahtisest leegist. Jälgige, et pudel oleks alati kindlalt suletud. Kasutamise ajal peab ruumis olema korralik ventilatsioon. Vältige aurude sissehingamist. Vältige kestvat või korduvat kokkupuudet nahaga.

4.5.	Laurüülarahidaadi (vt märkus 3) standardlahus 0,05 % (m/V) heptaanis (vahade sisestandard) Märkus 3. Võib kasutada ka palmitüülpalmitaati, müristüülstearaati või arahidüüllauraati.

4.6.	Metüülheptadekanaadi standardlahus 0,02 % (m/V) heptaanis (metüül- ja etüülestrite sisestandard)

4.7.	Sudaan 1 (1-fenüülaso-2-naftool)

4.8.

Kandegaas: vesinik või heelium gaasikromatograafias kasutamiseks

HOIATUS

Vesinik. Väga tuleohtlik, kokkusurutud gaas. Hoidke eemal soojusallikatest, sädemetest, lahtisest leegist ja elektriaparaatidest, mis ei ole süttimisohutust materjalist. Jälgige, et balloonikraan oleks suletud, kui vesinikku ei kasutata. Kasutage alati rõhureduktorit. Enne balloonikraani avamist vabastage reduktori vedru pinge alt. Ärge seiske ballooniava ees kraani avamise ajal. Kasutamise ajal peab ruumis olema korralik ventilatsioon. Ärge kandke vesinikku üle ühest balloonist teise. Ärge segage gaase balloonis. Kinnitage balloon, et seda ei saaks ümber ajada. Hoidke balloonid eemal päiksevalgusest ja soojusallikatest. Hoidke balloone keskkonnas, kus need ei puutu kokku söövitavate ainetega. Ärge kasutage kahjustatud või etiketita balloone.

Heelium. Kokkusurutud gaas kõrge rõhu all. Heelium vähendab sissehingamisel kättesaadava hapniku hulka. Jälgige, et balloon oleks suletud. Kasutamise ajal peab ruumis olema korralik ventilatsioon. Ärge sisenege gaasiballoonide hoidmise ruumi, kui seal ei ole korralikku ventilatsiooni. Kasutage alati rõhureduktorit. Enne balloonikraani avamist vabastage reduktori vedru pinge alt. Ärge kandke gaasi üle ühest balloonist teise. Kinnitage balloon, et seda ei saaks ümber ajada. Ärge seiske ballooniava ees kraani avamise ajal. Hoidke balloonid eemal päiksevalgusest ja soojusallikatest. Hoidke balloone keskkonnas, kus need ei puutu kokku söövitavate ainetega. Ärge kasutage kahjustatud või etiketita balloone. Ärge hingake gaasi sisse. Kasutage ainult tehniliseks otstarbeks.

4.9.

Abigaasid:

— vesinik, puhas, gaasikromatograafias kasutamiseks;

— õhk, puhas, gaasikromatograafias kasutamiseks.

HOIATUS

Õhk. Kokkusurutud gaas kõrge rõhu all. Olge ettevaatlik, kui kasutate põlevate ainete juuresolekul, kuna enamiku orgaaniliste ainete isesüttimistemperatuur õhus on kõrgel rõhul oluliselt madalam. Jälgige, et balloonikraan oleks suletud, kui ballooni ei kasutata. Kasutage alati rõhureduktorit. Enne balloonikraani avamist vabastage reduktori vedru pinge alt. Ärge seiske ballooniava ees kraani avamise ajal. Ärge kandke gaasi üle ühest balloonist teise. Ärge segage gaase balloonis. Kinnitage balloon, et seda ei saaks ümber ajada. Hoidke balloonid eemal päiksevalgusest ja soojusallikatest. Hoidke balloone keskkonnas, kus need ei puutu kokku söövitavate ainetega. Ärge kasutage kahjustatud või etiketita balloone. Tehniliseks otstarbeks ettenähtud õhku ei kohi kasutada sissehingamiseks või hingamisaparaatides.

5. MÄÄRAMISE KÄIK

5.1. Kromatograafiakolonni valmistamine

n-heksaanis (4.2) suspendeeritakse 15 g silikageeli (4.1) ning viiakse kolonni (3.2). Lastakse settida. Ühtlasema kromatograafiakolonni saamiseks töödeldakse kolonni pärast spontaanse settimise lõppu elektrilise vibraatoriga. Lisandite eemaldamiseks voolutatakse kolonni 30 ml n-heksaaniga. Analüütilise kaaluga (3.8) kaalutakse 25 ml kolbi (3.1) täpselt ligikaudu 500 mg proovi ning lisatakse sobiv kogus sisestandardit (4.5), olenevalt eeldatavast vahasisaldustest, nt oliiviõli puhul lisatakse 0,1 mg ja oliivijääkõli puhul 0,25–0,5 mg laurüülarahidaati ja oliiviõlide puhul 0,05 mg metüülheptadekanaati (4.6).

Ettevalmistatud proov kantakse kahe 2 ml n-heksaanikoguse (4.2) abil kromatograafiakolonni.

Lahustil lastakse voolata, kuni absorbendi pinna kohale jääb 1 mm kiht vedelikku. Kolonni voolutatakse täiendavalt n-heksaani-dietüüleetri seguga (99:1) kiirusel umbes 15 tilka 10 sekundi kohta ja kogutakse 220 ml lahust. (See fraktsioon sisaldab metüül- ja etüülestreid ning vahasid). (Vt märkused 4 ja 5.)

Märkus 4. n-heksaani-dietüüleetri segu (99:1) tuleb valmistada igal päeval uuesti.

Märkus 5. Vahade elueerimise täielikkuse visuaalseks kontrollimiseks võib proovi lahusele lisada 100 μl värvaine sudaan I 1-protsendilist lahust elueerimissegus.

Sudaan I retentsiooniaeg on vahade ja triatsüülglütseriidide vahel. Kui värvaine jõuab kolonni põhjani, tuleb elueerimine peatada, kuna selleks ajaks on kõik vahad kolonnist väljunud.

Tekkinud fraktsioone aurustatakse vaakumpöördaurutis, kuni peaaegu kogu lahusti on eemaldatud. Viimased 2 ml eemaldatakse nõrga lämmastikuvoolu läbijuhtimisel. Metüül- ja etüülestreid sisaldav fraktsioon viiakse lahusesse 2–4 ml n-heptaani või isooktaaniga.

5.2. Gaasikromatograafiline analüüs

5.2.1. Ettevalmistus

Kolonn pannakse gaasikromatograafi (3.3), sisselaskekoht ühendatakse on-column-süsteemiga ja väljalaskekoht detektoriga. Kontrollitakse gaasikromatograafiaseadet (gaasijuhtmete tööd, detektori ja meeriku toimimist jne).

Kui kolonni kasutatakse esimest korda, on soovitav see tasakaalustada. Kolonni juhitakse nõrk gaasivool, seejärel lülitatakse gaasikromatograafiaseade sisse. Umbes 4 tunniga tõstetakse temperatuur järk-järgult kuni 350 °C-ni.

Sellist temperatuuri hoitakse vähemalt 2 tundi, seejärel reguleeritakse seadet, kuni jõutakse töötingimusteni (reguleeritakse gaasi juurdevoolu, süüdatakse leek, ühendatakse elektrilise meerikuga (3.3.4), reguleeritakse kolonniahju temperatuuri, detektorit jne). Registreeritakse signaal vähemalt kaks korda suuremal tundlikkusel, kui on analüüsi läbiviimiseks nõutud. Tekkiv nulljoon peaks olema lineaarne, ilma piikideta ega tohi triivida.

Sirgjooneline negatiivne triiv näitab, et kolonni ühendused ei ole korras, samas kui positiivne triiv näitab, et kolonn ei ole korralikult töökorda viidud.

5.2.2. Töötingimuste valimine vahade ning metüül- ja etüülestrite määramiseks (märkus 6)

Töötingimused on reeglina järgmised:

—	kolonni temperatuur : 20 °C/min 5 °C/min alguses 80 °C (1’) 140 °C 335 °C (20);

—	detektori temperatuur : 350 °C;

—	süstitav ainekogus : 1 μl lahust n-heptaanis (2–4 ml);

—	kandegaas : heelium või vesinik asjaomase gaasi optimaalsel voolukiirusel (vt liide A);

—	seadme tundlikkus : piisav eespoolnimetatud tingimuste täitmiseks.

Märkus 6. Kõrge lõpptemperatuuri tõttu on lubatud positiivne triiv, kuid see ei tohi olla suurem kui 10 % täisskaalast.

Neid tingimusi võib muuta kolonni ja gaasikromatograafi omaduste arvessevõtmiseks, et eraldada kõik vahad ja rasvhapete metüül- ja etüülestrid ning saavutada rahuldav piikide lahutus (vt joonised 2, 3 ja 4) ning sisestandardi laurüülarahidaadi retentsiooniaeg 18 ± 3 minutit. Kõige suurem vahade piik peab olema üle 60 % koguskaalast ning metüül- ja etüülestrite sisestandardi metüülheptadekanaadi piik peab ulatuma skaala lõpuni.

Piigi integreerimisparameetrid tuleks määrata kindlaks nii, et uuritavaid piigipindalasid oleks võimalik õigesti hinnata.

5.3. Analüüsi läbiviimine

Võetakse 10 μl mikrosüstlaga kuni 10 μl lahust ja tõmmatakse kolb tagasi, kuni süstla nõel on tühi. Nõel viiakse injektsioonisüsteemi ning 1–2 sekundi pärast süstitakse kiiresti. Umbes 5 sekundi pärast tõmmatakse nõel ettevaatlikult välja.

Tulemusi registreeritakse seni, kuni vahad või stigmastadieenid on täielikult elueeritud, olenevalt analüüsitavast fraktsioonist.

Nulljoon peab kogu aeg vastama nõuetele.

5.4. Piikide määramine

Piigid määratakse retsentsiooniaegade põhjal, võrreldes samadel tingimusel analüüsitud vahasegudega, mille retentsiooniajad on teada. Alküülestrid määratakse oliiviõlides esinevate peamiste rasvhapete (palmitiin- ja oleiinhape) metüül- ja etüülestrite segust.

Joonisel 1 on esitatud neitsioliiviõli vahade kromatogramm. Joonistel 2 ja 3 on näidatud kahe jaemüügis oleva ekstra neitsioliiviõli kromatogrammid, neist üks on metüül- ja etüülestritega ja teine ilma. Joonisel 4 on väga kvaliteetse ekstra neitsioliiviõli kromatogramm ja sellise segu kromatogramm, milles samale õlile on lisatud 20 % lõhnatustatud õli.

5.5. Vahade kvantitatiivne määramine

Sisestandardile laurüülarahidaadile ja alifaatsetele estritele C40–C46 vastavate piikide pindala arvutatakse integraatori abil.

Kõigi üksikute vahade sisalduse (mg rasva kg kohta) liitmisega määratakse vahade summaarne sisaldus järgmise valemiga:

kus:

igale üksikule estrile vastava piigi pindala, leitud arvutiga;

sisestandardile laurüülarahidaadile vastava piigi pindala, leitud arvutiga;

lisatud sisestandardi laurüülarahidaadi mass milligrammides;

määramisel kasutatud proovi mass (g).

5.5.1. Metüül- ja etüülestrite kvantitatiivne määramine

Integraatori abil määratakse sisestandardile metüülheptadekanaadile vastava piigi ning C16- ja C18-rasvhapete metüül- ja etüülestritele vastavate piikide pindalad.

Iga alküülestri sisaldus (mg rasva kg kohta) määratakse järgmise valemiga:

kus:

igale üksikule C16- ja C18-estrile vastava piigi pindala, leitud arvutiga;

sisestandardile metüülheptadekanaadile vastava piigi pindala, leitud arvutiga;

lisatud sisestandardi metüülheptadekanaadi mass milligrammides;

määramisel kasutatud proovi mass (g).

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Esitatakse eri vahade (C40–C46 (vt märkus 7)) sisalduste summa milligrammides rasva kilogrammi kohta.

Esitatakse metüül- ja etüülestrite (C16–C18) sisalduste summa ja kahe kõnealuse väärtuse kogusumma.

Tulemused ühikutes mg/kg ümardatakse lähima täisarvuni.

Märkus 7. Koguseliselt määratavate komponentide sisaldus leitakse paarisarvulise süsinikuarvuga C40- kuni C46-estrite piikidest, vastavalt juurdelisatud joonisel esitatud oliiviõli vahade näidiskromatogrammile. Kui C46-estri piik on lõhestunud, soovitatakse komponentide kindlakstegemiseks analüüsida oliivijääkõli vahade fraktsiooni, milles C46 piik on eristatav, kuna see on selgelt suurem.

Esitatakse etüülestrite ja metüülestrite suhtarv.

Joonis 1

Oliiviõli vahafraktsiooni gaasikromatogrammi näide ( 9 )

Rasvhapete metüül- ja etüülestrite piigid retentsiooniajaga 5–8 minutit:

Selgitus:

I.S.

laurüülarahidaat (sisestandard)

diterpeenestrid

2+2′

C40-estrid

3+3′

C42-estrid

4+4′

C44-estrid

C46-estrid

steroolestrid ja triterpeenalkoholid

Joonis 2

Neitsioliiviõli metüülestrid, etüülestrid ja vahad

Selgitus:

–

metüül-C16

–

etüül-C16

–

metüülheptadekanaat (sisestandard)

–

metüül-C18

–

etüül-C18

–

skvaleen

–

laurüülarahidaat (sisestandard)

–

diterpeenestrid

–

vahad

–

steroolestrid ja triterpeenestrid

Joonis 3

Ekstra neitsioliiviõli metüülestrid, etüülestrid ja vahad

Selgitus:

–

metüülheptadekanaat (sisestandard)

–

metüül-C18

–

etüül-C18

–

skvaleen

–

laurüülarahidaat (sisestandard)

–

diterpeenestrid

–

vahad

–

steroolestrid ja triterpeenestrid

Joonis 4

Osa ekstra neitsioliiviõli kromatogrammist ja sellise segu kromatogrammist, milles samale õlile on lisatud lõhnatustatud õli

Selgitus:

–

metüülmüristaat (sisestandard)

–

metüülpalmitaat

–

etüülpalmitaat

–

metüülheptadekanaat (sisestandard)

–

metüüllinoleaat

–

metüüloleaat

–

metüülstearaat

–

etüüllinoleaat

–

etüüloleaat

–

etüülstearaat

Liide A

Gaasi voolukiiruse määramine

Pärast gaasikromatograafi viimist tavapärastele töötingimustele süstitakse sellesse 1–3 μl metaani (või propaani). Mõõdetakse aeg, mis kulub gaasi voolamiseks läbi kolonni alates süstimisest kuni piigi ilmumiseni (tM).

Voolukiirus cm/s avaldub valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on mõõdetud aeg sekundites.

▼M25

XXI LISA

Oliiviõlide vastavuse artikli 8 lõikes 2 osutatud kontrollimise tulemused

Märgistamine

Keemilised näitajad

Organoleptilised omadused (4)

Lõppjäreldus

Proov

Kategooria

Päritoluriik

Kontrollimise koht (1)

Ametlik nimi

Päritolu-nimetus

Säilitustingimused

Vigane teave

Loetavus

V/EV (3)

Näitajate kõrvalekalded on üle piiri

Jah/Ei

Kui „jah”, siis millised (2)

V/EV (3)

Puuduse mediaan

Puuviljasuse mediaan

V/EV (3)

Vajalik meede

Karistused

(1) Siseturg (tootmiskäitis, villimiskäitis, jaemüügietapp), eksport, import.

(2) Igale I lisas esitatud oliiviõli näitajale on omistatud kood.

(3) Vastab / Ei vasta.

(4) Ei nõuta oliiviõli ja oliivijääkõli puhul.

( 1 ) EÜT 172, 30.9.1966, lk 3025/66.

( 2 ) EÜT L 353, 17.12.1990, lk 23

( 3 ) EÜT L 128, 24.5.1977, lk 6.

( 4 ) EÜT L 166, 1.7.1988, lk 10.

( 5 ) ELT L 228, 1.9.2009, lk 3.

( 6 ) Pärast steroolestrite väljumist ei tohi kromatogrammil enam ilmuda märkimisväärseid piike (triglütseriide).

( 7 ) Ta võib õli maitsmisest loobuda, kui ta tajub otsese haistmismeelega äärmiselt intensiivseid negatiivseid omadusi. Sel juhul märgib ta kõnealuse erandliku asjaolu profiililehele.

( 8 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be used to obtain distinct band separation.

( 9 ) Pärast steroolestrite väljumist ei tohi kromatogrammil enam ilmuda märkimisväärseid piike (triatsüülglütseriide).