This document is an excerpt from the EUR-Lex website
Document 02009R0152-20170524
Commission Regulation (EC) No 152/2009 of 27 January 2009 laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed (Text with EEA relevance)
Consolidated text: Komisjoni määrus (EÜ) nr 152/2009, 27. jaanuar 2009 , milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks (EMPs kohaldatav tekst)
Komisjoni määrus (EÜ) nr 152/2009, 27. jaanuar 2009 , milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks (EMPs kohaldatav tekst)
02009R0152 — ET — 24.05.2017 — 006.001
Käesolev tekst on üksnes dokumenteerimisvahend ning sel ei ole mingit õiguslikku mõju. Liidu institutsioonid ei vastuta selle teksti sisu eest. Asjakohaste õigusaktide autentsed versioonid, sealhulgas nende preambulid, on avaldatud Euroopa Liidu Teatajas ning on kättesaadavad EUR-Lexi veebisaidil. Need ametlikud tekstid on vahetult kättesaadavad käesolevasse dokumenti lisatud linkide kaudu
KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 152/2009, 27. jaanuar 2009, milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks (ELT L 054 26.2.2009, lk 1) |
Muudetud:
|
|
Euroopa Liidu Teataja |
||
nr |
lehekülg |
kuupäev |
||
L 91 |
8 |
29.3.2012 |
||
L 20 |
33 |
23.1.2013 |
||
L 197 |
1 |
20.7.2013 |
||
L 188 |
1 |
27.6.2014 |
||
L 92 |
35 |
6.4.2017 |
||
L 115 |
22 |
4.5.2017 |
KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 152/2009,
27. jaanuar 2009,
milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks
(EMPs kohaldatav tekst)
Artikkel 1
Proovide võtmine sööda ametlikuks kontrollimiseks, eriti sööda koostisosade määramiseks, sealhulgas geneetiliselt muundatud organisme (GMO) sisaldavate või neist toodetud koostisosade, Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruses (EÜ) nr 1831/2003 ( 1 ) määratletud söödalisandite ning Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivis 2002/32/EÜ ( 2 ) määratletud soovimatute ainete määramiseks tuleb teha I lisas sätestatud meetoditega.
I lisas sätestatud proovivõtumeetodit kasutatakse sööda kontrollimiseks, et määrata Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruses (EÜ) nr 396/2005 ( 3 ) määratletud pestitsiidijääke ning kontrollida sööda vastavust määrusele (EL) nr 619/2011.
Artikkel 2
Proovide analüüsiks ettevalmistamine ja tulemuste esitamine toimub kooskõlas II lisas sätestatud meetoditega.
Artikkel 3
Analüüse sööda ametlikuks kontrolliks tehakse vastavalt III lisas (Analüüsimeetodid söödatooraine ja segajõusööda koostise kontrollimiseks), IV lisas (Analüüsimeetodid lubatud söödalisandite taseme kontrollimiseks söödas), V lisas (Analüüsimeetodid soovimatute ainete sisalduse kontrollimiseks söödas) ja VI lisas (Analüüsimeetodid loomse päritoluga komponentide määramiseks sööda ametlikul kontrollimisel) sätestatud meetoditele.
Artikkel 4
Kodulindude segasööda energiasisaldus arvutatakse vastavalt VII lisale.
Artikkel 5
Analüüsimeetodeid selliste VIII lisas sätestatud lisandite ebaseadusliku sisalduse kontrollimiseks, mida ei ole enam lubatud söödas kasutada, kasutatakse kinnituse saamiseks.
Artikkel 6
Direktiivid 71/250/EMÜ, 71/393/EMÜ, 72/199/EMÜ, 73/46/EMÜ, 76/371/EMÜ, 76/372/EMÜ, 78/633/EMÜ, 81/715/EMÜ, 84/425/EMÜ, 86/174/EMÜ, 93/70/EMÜ, 93/117/EÜ, 98/64/EÜ, 1999/27/EÜ, 1999/76/EÜ, 2000/45/EÜ, 2002/70/EÜ ja 2003/126/EÜ tunnistatakse kehtetuks.
Viiteid kehtetuks tunnistatud direktiividele käsitatakse viidetena käesolevale määrusele ja loetakse vastavalt XI lisa vastavustabelitele.
Artikkel 7
Käesolev määrus jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.
Käesolevat määrust kohaldatakse alates 26. augustist 2009.
Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.
I LISA
PROOVIVÕTUMEETODID
1. EESMÄRK JA REGULEERIMISALA
Sööda ametlikuks kontrolliks ettenähtud proovid võetakse allpool kirjeldatud meetodite kohaselt. Selliselt saadud proove käsitatakse proovipartii esindusliku proovina.
Esindusliku proovi võtmise eesmärk saada partiist väike osa nii, et iga selle osa konkreetne näitaja kujutaks endast partii näitajate keskmist väärtust. Partii eri kohtadest võetakse korduvalt üksikproove. Üksikproovide kokkusegamisega saadakse koondproov, millest võetakse esindusliku jagamise teel esinduslikud lõpp-proovid.
Kui vaatlusel ilmneb, et osa samast söödapartiist on erineva kvaliteediga, eraldatakse sellised osad ja neid käsitletakse kui alampartiisid. Kui söödapartiid ei ole võimalik jagada alampartiideks, tuleb seda käsitada ühe partiina, kuid selle kohta tuleb teha märkus proovivõtuaruandesse.
Kui tehakse kindlaks, et käesoleva määruse sätete kohaselt võetud söödaproov ei vasta ELi nõuetele ja kui tegemist on sama tooteklassi või -liigi söödapartii osaga, siis tuleb eeldada, et kogu selle partii sööt ei vasta nõuetele, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.
2. MÕISTED
— |
Partii : identifitseeritav söödakogus, millel on ühised tunnused näiteks päritolu, sort, pakendi tüüp, pakendaja, kaubasaatja või märgistus; tootmisprotsessi kontekstis on partii toodanguühik, mida toodetakse samas ettevõttes ühesuguseid tootmisparameetreid järgides, või mitu sellist ühikut, kui need on toodetud järjest ja koos ladustatud. |
— |
Proovipartii : partii või identifitseeritav osa partiist või alampartiist. |
— |
Pitseeritud proov : proov, mis on pitseeritud niimoodi, et on välistatud juurdepääs proovile ilma pitserit purustamata või eemaldamata. |
— |
Üksikproov : proovipartii ühest punktist võetud kogus. |
— |
Koondproov : ühe ja sama proovipartii üksikproovidest kogutud proov. |
— |
Vähendatud proov : koondproovi osa, mis on saadud koondproovi esindusliku vähendamise teel. |
— |
Lõpp-proov : vähendatud proovi või homogeenitud koondproovi osa. |
— |
Laboratoorne proov : laboratooriumis kasutamiseks ettenähtud proov (mis on toimetatud laboratooriumi), mis võib olla lõpp-proov, vähendatud proov või koondproov. |
3. ÜLDSÄTTED
— Proovivõtupersonal: proove peavad võtma isikud, keda on selleks volitanud pädev asutus.
— Proov tuleb pitseerida niimoodi, et oleks välistatud juurdepääs proovile ilma pitserit purustamata või eemaldamata. Pitser peab olema selgelt identifitseeritav ja hästi nähtav. Teine võimalus on, et pitser pannakse sellisesse anumasse või mahutisse, mille saab sulgeda nii, et seda ei ole võimalik purustamata avada, ja millega välditakse mahuti/anuma korduvat kasutamist.
— Proovi tunnusandmed: proov tuleb kustumatult märgistada ja niimoodi identifitseerida, et see oleks selgelt seostatav proovivõtuaruandega.
— Igast koondproovist tuleb võtta vähemalt kaks lõpp-proovi: vähemalt üks proov kontrollimiseks (täitemenetluseks) ja üks söödakäitlejale (apellatsiooniks). Ühe lõpp-proovi võib võtta võrdlusprooviks. Kui kogu koondproov homogeenitakse, võetakse lõpp-proovid homogeenitud koondproovist, välja arvatud juhul, kui see on vastuolus liikmesriikides söödakäitleja õiguste kohta kehtivate eeskirjadega.
4. SEADMED
4.1. |
Proovivõtuseadmed peavad olema materjalist, mis ei saasta tooteid, millest proove võetakse. Korduvaks kasutamiseks ettenähtud seadmed peavad olema kergesti puhastatavad, et hoida ära ristsaastumist. |
4.2. |
Soovitatavad seadmed proovide võtmiseks tahkest söödast
4.2.1. Käsitsi proovivõtmine 4.2.1.1. Lamedapõhjaline püstiste servadega kühvel.
4.2.2. Mehaaniline proovivõtmine Laaditavast söödast proovide võtmiseks võib kasutada asjakohaseid mehaanilisi proovivõtuseadmeid. Asjakohane tähendab seda, et proove võetakse kogu söödavoo läbilõikest. Suure kiirusega liikuvast söödast võib proove võtta automaatse seadmega. 4.2.3. Jagaja Esinduslikult vähendatud proovide valmistamiseks tuleks võimaluse ja vajaduse korral kasutada seadet, millega jagatakse proov ligikaudu võrdseteks osadeks. |
5. ÜKSIKPROOVIDE ARVU NÕUDED
— Punktides 5.1 ja 5.2 üksikproovide arvu kohta kehtestatud nõudeid kohaldatakse selliste kuni 500-tonniste proovipartiide suhtes, millest on võimalik võtta esinduslikke proove. Kirjeldatud proovivõtumenetlus kehtib ka osutatud suurimast proovipartiist suuremate koguste puhul, kui ei järgita järgmises tabelis esitatud suurimat üksikproovide arvu, vaid üksikproovide arv määratakse ruutjuurevalemiga, mis on esitatud menetluse kirjelduse asjaomases kohas (vt punkti 5.3), ning vähima koondproovi suurust suurendatakse võrdeliselt. See ei takista suurte partiide jagamist väiksemateks alampartiideks, nii et igast alampartiist võetakse proove punktides 5.1 ja 5.2 kirjeldatud menetluse kohaselt.
— Proovipartii suurus peab olema selline, et proove oleks võimalik võtta kõikidest proovipartii osadest.
— Väga suurte partiide ja alampartiide korral (> 500 tonni) ja partiide korral, mida transporditakse või ladustatakse nii, et proove ei ole võimalik võtta käesoleva peatüki punktides 5.1 ja 5.2 kirjeldatud viisil, tuleb proove võtta punktis 5.3 kirjeldatud viisil.
— Kui söödakäitleja peab kehtivate õigusaktide kohaselt täitma käesoleva määruse nõudeid seoses kohustusliku seirega, võib ta kalduda kõrvale käesolevas peatükis esitatud koguselistest nõuetest, et võtta arvesse tegevuse iseloomulikke näitajaid, tingimusel et söödakäitleja on pädevale asutusele rahuldavalt tõendanud, et kõnealune proovivõtumenetlus on sama esinduslik, ja kui ta on saanud pädevalt asutuselt sellekohase loa.
— Kui koguselisi nõudeid silmas pidades ei ole võimalik kasutada kirjeldatud proovivõtumeetodit, kuna partii kahjustamise tõttu kaasneksid sellega vastuvõetamatud kaubanduslikud tagajärjed (seoses pakkimisviisiga, veovahendiga, ladustamisviisiga vms), võib erandjuhul kohaldada teistsugust proovivõtumeetodit, kui see on sama esinduslik ning kui kogu menetlust täpselt kirjeldatakse ja dokumenteeritakse.
5.1. Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimiseks võetavate üksikproovide arvu nõuded
5.1.1. Lahtine tahke sööt
Proovipartii suurus |
Vähim üksikproovide arv |
≤ 2,5 tonni |
7 |
> 2,5 tonni |
√ 20 korda proovipartii suurus tonnides (1), kuid kuni 40 üksikproovi |
(*1) Kui saadud arv on murdarv, ümardatakse see järgmise täisarvuni. |
5.1.2. Lahtine vedel sööt
Proovipartii suurus |
Vähim üksikproovide arv |
≤ 2,5 tonni või ≤ 2 500 liitrit |
4 (1) |
> 2,5 tonni või > 2 500 liitrit |
7 (1) |
(*1) Kui vedelikku ei saa homogeenida, tuleb võtta rohkem üksikproove. |
5.1.3. Pakendatud sööt
Sööt (tahke ja vedel) võib olla pakendatud kottidesse, kanistritesse, mahutitesse jne, millele tabelis viidatakse kui pakkeühikutele. Suurtest pakkeühikutest (≥ 500 kg või liitrit) tuleb võtta proove lahtise sööda kohta kehtivate sätete kohaselt (vt punktid 5.1.1. ja 5.1.2.)
Proovipartii suurus |
Vähim pakkeühikute arv, millest tuleb võtta (vähemalt) üks üksikproov (1) |
1–20 pakkeühikut |
1 pakkeühik (2) |
21–150 pakkeühikut |
3 pakkeühikut (2) |
151–400 pakkeühikut |
5 pakkeühikut (2) |
> 400 pakkeühikut |
¼ korda √ proovipartii moodustavate pakkeühikute arv (3), kuid kuni 40 pakkeühikut |
(*1) Kui pakkeühiku avamine võib analüüsi tulemust mõjutada (nt riknevad vedelad söödad), loetakse avamata ühik üheks üksikprooviks. (*2) Kui pakkeühiku netomass on kuni 1 kg või 1 liiter, loetakse üksikprooviks ühe originaalühiku sisu. (*3) Kui saadud arv on murdarv, ümardatakse see täisarvuni. |
5.1.4. Söödabriketid ja lakukivid
Proov võetakse vähemalt ühest briketist või kivist 25 pakkeühikust koosneva proovipartii kohta, kuid mitte rohkem kui neljast briketist või kivist.
Kui iga briketi või lakukivi kaal on kuni 1 kg, loetakse üksikprooviks ühe kivi või briketi sisu.
5.1.5. Koresööt
Proovipartii suurus |
Vähim üksikproovide arv (1) |
≤ 5 tonni |
5 |
> 5 tonni |
√ 5 korda proovipartii mass tonnides (2), kuid kuni 40 üksikproovi |
(*1) Märgitakse, et teatavatel juhtudel (nt silo korral) ei ole võimalik võtta nõutavat arvu üksikproove, ilma et sellega ei tekitataks partiile vastuvõetamatut kahju. Sel juhul võib kasutada muud proovivõtumeetodit ning proovivõtujuhised sellisteks juhtudeks töötatakse välja enne käesoleva määruse jõustumist. (*2) Kui saadud arv on murdarv, ümardatakse see täisarvuni. |
5.2. Üksikproovide arvu nõuded juhul, kui kontrollitavad koostisosad või ained on söödas tõenäoliselt ebaühtlaselt jaotunud
Kõnealused üksikproovide proovide arvu nõuded kehtivad järgmistel kontrollijuhtudel:
— aflatoksiinide, hariliku tungaltera ning muude mükotoksiinide ja ohtlike botaaniliste lisandite sisaldus söödamaterjalis;
— ristsaastumine, mille on põhjustanud koostisosa, sealhulgas geneetiliselt muundatud materjal, või aine, mis eeldatavasti võib olla söödas ebaühtlaselt jaotunud.
Kui kontrollival asutusel on tugev kahtlus, et selline ebaühtlane jaotumine esineb segasööda koostisosa või aine ristsaastumise korral, võib võtta proove järgmises tabelis esitatud arvul.
Proovipartii suurus |
Vähim üksikproovide arv |
< 80 tonni |
Vt arvulised nõuded punktis 5.1. Üksikproovide arv tuleb korrutada 2,5-ga. |
≥ 80 tonni |
100 |
5.3. Proovide arvu nõuded väga suurte partiide üksikproovide korral
Väga suurte proovipartiide korral (proovipartii > 500 tonni) on võetavate üksikproovide arv 40 üksikproovi + √ tonnide arv, kui ained või tooted on ühtlaselt jaotunud kogu söödas, või 100 üksikproovi + √ tonnide arv, kui koostisosad või ained on ebaühtlaselt jaotunud kogu söödamaterjalis.
6. KOONDPROOVI KOGUSELISED NÕUDED
Nõutav on üks koondproov proovipartii kohta. |
||
|
Sööda liik |
|
6.1. |
Lahtine sööt |
4 kg; |
6.2. |
Pakendatud sööt: |
4 kg (3) |
6.3. |
Vedel või poolvedel sööt: |
4 liitrit |
6.4. |
Söödabriketid või lakukivid: |
|
6.4.1. |
igaüks kaaluga üle 1 kg |
4 kg |
6.4.2. |
igaüks kaaluga kuni 1 kg |
Nelja originaalbriketi või -kivi kaal |
6.5. |
Koresööt/kuivsööt |
4 kg (4) |
(*1) Kui sööt, millest võetakse proove, on väga väärtuslik, võib võtta väiksema arvu koondproove, tingimusel, et see on proovivõtuaruandes kirjeldatud ja dokumenteeritud. (*2) Vastavalt komisjoni 24. juuni 2011. aasta määrusele (EL) nr 619/2011, milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks sätetele seoses sellise geneetiliselt muundatud materjali olemasoluga, mille loa taotlemine on menetlemisel või mille luba on aegunud (ELT L 166, 25.6.2011, lk 9), peab geneetiliselt muundatud materjali leidumise kontrollimise koondproovis sisalduma vähemalt 35 000 seemet/tera. Seega peab maisi puhul olema koondproov vähemalt 10,5 kg ja sojaoa puhul 7 kg. Teiste seemnete ja terade puhul, nagu oder, hirss, kaer, riis, nisu ja raps, on koondproov 4 kg ja sisaldab rohkem kui 35 000 seemet. (*3) Pakendatud sööda puhul, sõltuvalt pakkeühikute suurusest, ei tarvitse olla võimalik saada 4 kg suurust koondproovi. (*4) Kerge koresööda (nt hein, põhk) puhul ei tohi koondproov olla väiksem kui 1 kg. |
7. LÕPP-PROOVI KOGUSELISED NÕUDED
Lõpp-proovid
Analüüsida tuleb vähemalt üht lõpp-proovi. Analüüsitavas lõpp-proovis sisalduv kogus ei tohi olla väiksem järgmistest näitajatest:
Tahke sööt |
|
Vedel või poolvedel sööt |
500 ml (1) |
(*1) Vastavalt määrusele (EL) nr 619/2011 peab geneetiliselt muundatud materjali olemasolu kontrollimiseks võetav lõpp-proov sisaldama vähemalt 10 000 seemet/tera. Seega peab maisi puhul olema lõpp-proov vähemalt 3 000 g ja sojaoa puhul 2 000 g. Teiste seemnete ja terade puhul, nagu oder, hirss, kaer, riis, nisu ja raps, sisaldab 500 g lõpp-proov rohkem kui 10 000 seemet. (*2) Kui koondproov on märksa väiksem kui 4 kg või liitrit (vt punkti 6 allmärkus), võib võtta ka väiksema lõpp-proovi, tingimusel, et seda kirjeldatakse ja see dokumenteeritakse proovivõtuaruandes. (*3) Pestitsiidijääkide määramiseks kaunviljas, teraviljas ja pähklipuu viljades peab lõpp-proovi miinimumkogus olema komisjoni direktiivi 2002/63/EÜ (ELT L 187, 16.7.2002, lk 30) sätete kohaselt 1 kg. |
8. PROOVIVÕTUMEETOD VÄGA SUURTE PARTIIDE JAOKS JA SELLISTE PARTIIDE JAOKS, MIDA LADUSTATAKSE VÕI TRANSPODITAKSE NII, ET KOGU PARTII ULATUSES EI OLE VÕIMALIK PROOVE VÕTTA
8.1. Üldpõhimõtted
Kui partii ladustamine või transportimine ei võimalda võtta üksikproove kogu partiist, tuleks eelistatult võtta sellisest partiist proove laadimise ajal.
Suurtesse sööda hoidmiseks ettenähtud ladudesse tuleks soovitada söödakäitlejatel paigaldada (automaatsed) proovivõtuseadmed, millega on võimalik võtta proove kogu ladustatud partiist.
Kui proove võetakse 8. peatükis sätestatud viisil, tuleb söödakäitlejat või tema esindajat teavitada proovivõtumenetlusest. Kui söödakäitleja või tema esindaja seab kahtluse alla kõnealuse proovivõtumeetodi, peab söödakäitleja või tema esindaja lubama pädeval asutusel võtta proove kogu partiist ja katma kulud.
8.2. Laevaga transporditavad suured partiid
8.2.1. Laevaga transporditavast partiist liikuvast tootest proovide võtmine
Suurtest partiidest, mida transporditakse laevaga, võetakse eelistatult proove laadimise ajal (kui toode on liikuv).
Proove võetakse igast lastiruumiosast (osast, mida on võimalik füüsiliselt eraldada) Kuna lastiruumi osi tühjendatakse eraldi, kaob lattu laadimise käigus osade füüsiline eraldatus. Proove võib võtta kas algse füüsilise eraldatuse olukorras või pärast lattu viimist.
Laeva lossimine võib kesta mitu päeva. Proove tuleks tavaliselt võtta korrapäraste ajavahemike järel kogu lossimise ajal. Alati ei ole aga mõistlik ega asjakohane, et ametlik inspektor on proovivõtuks kohal kogu lossimise ajal. Seepärast on lubatud proove võtta kogu partii ühest osast (proovipartiist). Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele.
Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu selle partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.
Ka siis, kui ametlikud proovid võetakse automaatselt, on inspektori kohalolek vajalik. Kui proovid võetakse automaatselt ja vastavalt eelnevalt kindlaks määratud näitajatele, mida ei saa muuta proovide võtmise ajal, ning kui üksikproovid kogutakse pitseeritavasse anumasse, nii et sedasi hoitakse ära igasugused pettused, peab inspektor olema kohal ainult proovivõtu alguses, iga kord, kui proovianumat vahetatakse, ja proovivõtu lõpus.
8.2.2. Laevaga transporditavast partiist liikumatust tootest proovide võtmine
Kui proove võetakse liikumatust tootest, tuleb kasutada sama menetlust, mis on ette nähtud ülalt ligipääsetavatest ladudest (sööda tornhoidlatest) proovide võtmiseks (vt punkti 8.4.1).
Proove tuleb võtta partii (lastiruumi) ligipääsetavast osast (ülalt). Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.
8.3. Proovide võtmine laos hoitavast suurest partiist
Proove tuleb võtta partii ligipääsetavast osast. Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.
8.4. Proovide võtmine hoidlatest (sööda tornhoidlatest)
8.4.1. Proovide võtmine ülalt (kergesti) ligipääsetavatest mahutitest
Proove tuleb võtta partii ligipääsetavast osast. Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.
8.4.2. Proovide võtmine hoidlatest, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid)
8.4.2.1.
Sellistest mahutitest ei ole võimalik paigalseisvast söödast proove võtta. Kui on vaja proove võtta mahutis olevast söödast, mida ei saa liigutada, tuleb käitlejaga kokku leppida, et ta teatab, kui mahutist hakatakse sööta välja laadima, et siis söödast proove võtta.
8.4.2.2.
Proovivõtuks tuleb anumasse võtta 50–100 kg toodet ja proove tuleb võtta sellest kogusest. Koondproovi suurus sõltub kogu partii suurusest ning üksikproovide arv sõltub proovivõtuks anumasse võetud toote kogusest. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.
8.5. Proovide võtmine suurtes suletud mahutites olevast lahtisest söödast
Sellistest partiidest saab sageli proove võtta alles siis, kui toode on välja laaditud. Mõnikord ei ole võimalik toodet välja laadida impordi- või kontrollipunktis ja proove tuleb võtta väljalaadimiskohas.
9. PROOVIDE VÕTMISE, ETTEVALMISTAMISE JA PAKENDAMISE JUHISED
9.1. Üldkirjeldus
Proovid tuleb võtta ja ette valmistada liigse viivituseta ning võtta toote muutumise ja saastumise vältimiseks vajalikud ettevaatusabinõud. Töövahendid ja -pinnad ning proovide hoidmiseks ettenähtud anumad peavad olema puhtad ja kuivad.
9.2. Üksikproovid
Üksikproove võetakse pisteliselt kogu proovipartii ulatuses ja need peavad olema ligikaudu võrdse suurusega.
Üksikproov peab olema vähemalt 100 g või kerge koresööda puhul 25 g.
Kui punktis 8 sätestatud proovivõtueeskirjade kohaselt tuleb võtta vähem kui 40 üksikproovi, määratakse üksikproovi suurus vastavalt nõutava koondproovi suurusele (vt punkti 6).
Kui proove võetakse väikestest pakendatud sööda partiidest, mille puhul on vaja võtta väike arv üksikproove, peab üksikproov olema ühe originaalpakkeühiku sisu, kui pakkeühik ei ole suurem kui 1 kg või 1 l.
Kui söödapakendid on väikesed (nt < 250 g), sõltub üksikproovi suurus pakendi suurusest.
9.2.1. Lahtine sööt
Vajaduse korral võib proove võtta partii liikumise (peale- või mahalaadimise) ajal.
9.2.2. Pakendatud sööt
Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv pakendeid välja valitud, võetakse puuri või kühvli abil osa iga pakendi sisust. Vajaduse korral võetakse proovid pärast seda, kui pakendid on ükshaaval tühjendatud.
9.2.3. Homogeenne või homogeenitav vedel või poolvedel sööt
Pärast seda, kui proovivõtmiseks on punkti 5. peatüki kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, homogeenitakse vajaduse korral nende sisu ja võetakse vajalik kogus igast mahutist.
Üksikproove võib võtta mahutite tühjendamise ajal.
9.2.4. Mittehomogeenitav vedel või poolvedel sööt
Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, võetakse proovid eri tasemetelt.
Proove võib võtta ka mahutite tühjendamise ajal, kuid mitte esimestest kihtidest.
Mõlemal juhul peab võetav kogus olema vähemalt 10 liitrit.
9.2.5. Söödabriketid ja lakukivid
Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv brikette või kive välja valitud, võetakse osa igast briketist või kivist. Kui on kahtlusi, et kivi või brikett ei ole ühtlase koostisega, võetakse prooviks kogu brikett või kivi.
Kui iga briketi või lakukivi kaal on kuni 1 kg, loetakse üksikprooviks ühe kivi või briketi sisu.
9.3. Koondproovide ettevalmistamine
Ühtne koondproov saadakse üksikproovide kokkusegamise abil.
9.4. Lõpp-proovide ettevalmistamine
Koondproovi materjal segatakse hoolega ( 4 ).
— Iga proov pannakse sobivasse mahutisse/anumasse. Tuleb võtta kõik vajalikud ettevaatusabinõud, et vältida muutusi proovi koostises, saastumist või võltsimist, mis võivad tekkida transportimise või ladustamise ajal.
— Kui kontrollitakse sööta, milles koostisosad või ained on ühtlaselt jaotunud, võib koguda esindusliku vähendatud koondproovi, mille suurus on vähemalt 2,0 kg või 2,0 l (vähendatud proov), ( 5 ) kasutades eelistatult mehaanilist või automaatset jagajat. Et kontrollida pestitsiidide jääke kaunviljades, teravilja terades ja pähklipuu viljades, peab vähendatud proovi suurus olema vähemalt 3 kg. Kui sööda olemus ei võimalda kasutada jagajat või kui jagajat ei ole, tuleb proovi vähendada kvarteerimismeetodil. Vähendatud proovidest valmistatakse enam-vähem ühesuurused ja 7. peatüki koguselistele nõuetele vastavad lõpp-proovid (kontrollproov, apellatsiooniproov ja võrdlusproov). Kui kontrollitakse koostisosi, sealhulgas geneetiliselt muundatud materjali, või aineid, mis võivad tõenäoliselt olla ebaühtlaselt jaotunud söödamaterjalis, peab koondproov olema:
—
— täiesti homogeenitud ja seejärel lõpp-proovideks jagatud või
— vähendatud suuruseni vähemalt 2 kg või 2 l ( 6 ) mehaanilise või automaatse jagajaga; kui sööda olemuse tõttu ei ole võimalik jagajat kasutada, võib proovi vähendada ka kvarteerimismeetodil. Et kindlaks teha geneetiliselt muundatud materjali olemasolu vastavalt määrusele (EL) nr 619/2011, peab vähendatud proovis olema vähemalt 35 000 seemet/terist, et sellest saaks vähemalt 10 000 seemet sisaldava kontrollproovi, apellatsiooniproovi ja võrdlusproovi (vt 6. peatüki allmärkus (**) ja 7. peatüki allmärkus (*)).
9.5. Proovi pakendamine
Mahutid ja pakendid peavad olema pitseeritud niimoodi, et ilma pitserit lõhkumata ei oleks võimalik neid avada. Pitser peab hõlmama kogu märgist.
9.6. Proovide saatmine laboratooriumi
Proov koos analüüsiks vajaliku teabega tuleb viivitamata saata kindlaksmääratud laboratooriumi analüüsimiseks.
10. PROOVIVÕTUARUANNE
Iga proovivõtu kohta tuleb teha aruanne, mis võimaldab iga proovipartiid ja selle suurust üheselt kindlaks teha.
Aruandesse tuleb kanda ka kõik kõrvalekalded käesolevas määruses sätestatud proovivõtumenetlusest.
Aruanne tuleb teha kättesaadavaks nii ametlikule kontrollilaboratooriumile kui ka söödakäitlejale ja/või söödakäitleja määratud laboratooriumile.
II LISA
SÖÖDA ANALÜÜSIMEETODITE ÜLDSÄTTED
A. PROOVIDE ETTEVALMISTAMINE ANALÜÜSIKS
1. Eesmärk
Allpool kirjeldatud menetlused on ette nähtud kontrollilaboratooriumidesse saadetud proovide ettevalmistamiseks analüüsiks pärast proovi võtmist I lisa sätete kohaselt.
Laboratoorsed proovid tuleb ette valmistada nii, et analüüsimeetodites sätestatud viisil kaalutud kogused oleksid ühtlased ja esindaksid lõpp-proove.
2. Ettevaatusabinõud
Proovide ettevalmistamine sõltub kasutatavatest analüüsimeetoditest ning koostisosadest ja ainetest, mida on vaja uurida. Seepärast on väga oluline tagada, et proov valmistataks ette vastavalt kasutatavale analüüsimeetodile ning koostisosadele ja ainetele, mida on vaja uurida.
Kõik vajalikud toimingud tuleb teha nii, et vältida proovi saastumist ja selle koostise muutumist.
Jahvatada, segada ja sõeluda tuleb viivitamata, et proovi kokkupuude õhu ja valgusega oleks minimaalne. Kasutada ei tohi veskeid ega jahvatajaid, mis proovi märgatavalt kuumendavad.
Kuumuse suhtes eriti tundlikku sööta soovitatakse jahvatada käsitsi. Samuti tuleb tagada, et seadmed ise ei oleks saastumisallikaks.
Kui proovi ei ole võimalik ette valmistada nii, et selle niiskusesisalduses oluliselt ei muutu, määratakse niiskusesisaldus enne ja pärast ettevalmistamist III lisa A osas sätestatud meetodil.
3. Menetlus
3.1. Üldmenetlus
Uuritav kogus võetakse lõpp-proovist. Jagamiseks ei soovitata koonusekujulist proovijagajat ega nn jagamisristi, s o neljaks jagamise (kvarteerimise) meetodit, sest sellega võib kaasneda alamproovide jaotuses suur viga.
3.1.1.
— Sõelutud lõpp-proov segatakse ja kogutakse sobivasse puhtasse ja kuiva õhukindlalt suletavasse nõusse. Täielikuks homogeenimiseks tuleb proovi vahetult enne analüüsikoguse väljakaalumist veel kord segada (uuritav kaalutis).
3.1.2.
— Kui analüüsimeetodites ei ole teisiti ette nähtud, tuleb lõpp-proovi kuivatada vastavalt III lisa A osas nimetatud niiskusmääramismeetodi punktis 4.3 kirjeldatud eelkuivatamisele niiskusesisalduseni 8–12 %. Jätkatakse punktis 3.1.1 kirjeldatud viisil.
3.1.3.
— Lõpp-proov kogutakse sobivasse puhtasse ja kuiva õhukindlalt suletavasse nõusse. Täielikuks homogeenimiseks tuleb proovi vahetult enne analüüsikoguse väljakaalumist põhjalikult segada (uuritav kaalutis).
3.1.4.
— Selliseid lõpp-proove, mida ei saa ette valmistada mõnel eespool nimetatud viisil, tuleb töödelda mis tahes muul viisil, mis tagab, et analüüsiks kaalutud kogused (uuritav kaalutis) on homogeensed ja esindavad lõpp-proove.
3.2. Erimenetlus uurimiseks vaatluse teel või mikroskoobiga või juhul, kui kogu koondproov on homogeenitud
— Vaatluse teel (kui ei kasutata mikroskoopi) uuritakse kogu laboratoorset proovi.
— Mikroskoobiga uurimiseks võib laboratoorium vähendada koondproovi või vähendatud proovi. Lõpp-proovid apellatsiooniks ja vajaduse korral võrdluseks võetakse sama menetlusega kui lõpp-proov kontrollimiseks.
— Kui homogeenitakse kogu koondproov, võetakse lõpp-proovid homogeenitud koondproovist.
4. Proovide hoidmine
Proove tuleb hoida temperatuuril, mis ei muuda nende koostist. Vitamiinide või eriti valgustundlike ainete analüüsiks ettenähtud proove tuleb hoida nii, et valgus proove ei kahjustaks.
B. SÄTTED ANALÜÜSIMEETODITES KASUTATAVATE REAKTIIVIDE JA SEADMETE KOHTA
1. Kui analüüsimeetodites ei ole teisiti sätestatud, peavad kõik analüütilised reaktiivid olema analüütilise puhtusega (a.p.). Mikroelementide määramisel tuleb reaktiivide puhtust kontrollida pimekatsega. Sõltuvalt saadud tulemustest võib olla vaja reaktiive täiendavalt puhastada.
2. Iga lahuste valmistamise, lahjendamise, loputamise või pesemise toiming, mida on analüüsimeetodites nimetatud ilma kasutatava lahusti või lahjendi laadile viitamata, eeldab vee kasutamist. Üldjuhul peab vesi olema demineraliseeritud või destilleeritud. Teatavatel juhtudel, millele analüüsimeetodites viidatakse, tuleb veega teha erilised puhastusprotseduurid.
3. Kontrollilaboratooriumides tavaliselt leiduvaid seadmeid silmas pidades viidatakse analüüsimeetodites ainult nendele instrumentidele ja vahenditele, mis on erilised või nõuavad erilist kasutamisviisi. Seadmed peavad olema puhtad, eriti väga väikeste ainekoguste määramisel.
C. ANALÜÜSIMEETODITE KASUTAMINE JA TULEMUSTE ESITAMINE
1. Ekstraktsioonimenetlus
Mitmete meetodite puhul on määratud eraldi ekstraktsioonimenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi ekstraktsioonimenetlusi kasutada juhul, kui on tõendatud, et kasutatav ekstraktsioonimenetlus on põhiaine analüüsiks sama tõhus kui meetodis nimetatud menetlus.
2. Puhastusmenetlus
Mitme meetodi puhul on määratud eraldi puhastusmenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi puhastusmenetlusi kasutada juhul, kui on tõendatud, et kasutatav puhastusmenetlus annab uuritava aine analüüsimisel meetodis nimetatud menetlusega samaväärsed analüüsitulemused.
3. Määramiste arv
Kui soovimatute ainete analüüsimisel on esimese määramise tulemus oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitavas tootekirjelduses, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi. Muudel juhtudel on vajalik kordusanalüüs (teistkordne määramine), et välistada sisemise ristsaastumise ja juhusliku proovide segunemise võimalust. Mõõtemääramatust arvesse võttes kasutatakse nõuetele vastavuse hindamisel kahe analüüsi keskmist.
Kui aine või koostisosa deklareeritud sisalduse kontrollimisel kinnitab esimese määramise tulemus deklareeritud sisaldust, st analüüsitulemus jääb deklareeritud sisalduse lubatud kõrvalekalde piiresse, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi. Muudel juhtudel on vajalik kordusanalüüs (teistkordne määramine), et välistada sisemise ristsaastumise ja juhusliku proovide segunemise võimalust. Mõõtemääramatust arvesse võttes kasutatakse nõuetele vastavuse hindamisel kahe analüüsi keskmist.
Teatavatel juhtudel on lubatud kõrvalekalde vahemik kindlaks määratud õigusaktis, näiteks Euroopa Parlamendi ja nõukogu 13. juuli 2009. aasta määruses (EÜ) nr 767/2009 sööda turuleviimise ja kasutamise kohta, millega muudetakse Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrust (EÜ) nr 1831/2003 ning tunnistatakse kehtetuks nõukogu direktiivid 79/373/EMÜ, 82/471/EMÜ, 83/228/EMÜ, 93/74/EMÜ, 93/113/EÜ ja 96/25/EÜ, komisjoni direktiiv 80/511/EMÜ ning komisjoni otsus 2004/217/EÜ ( 7 ).
4. Kasutatavast analüüsimeetodist teatamine
Analüüsiaruandes peab olema nimetatud, millist analüüsimeetodit kasutatakse.
5. Aruandlus analüüsitulemuste kohta
Analüüsitulemused esitatakse analüüsimeetodis kehtestatud viisil sobiva arvu tüvenumbritega ja vajaduse korral parandatakse seda vastavalt lõpp-proovi niiskusesisaldusele enne ettevalmistamist.
6. Mõõtemääramatus ja saagis soovimatute ainete analüüsil
Silmas pidades Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivi 2002/32/EÜ tähenduses soovimatuid aineid, loetakse söödaks ettenähtud tooted kehtestatud piirnormile mittevastavaks, kui niiskusesisaldusele 12 % vastav analüüsitulemus ületab piirmäära, võttes arvesse laiendmääramatust ja saagise parandit. Vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud ja saagise parandiga parandatud sisaldust, millest on lahutatud laiendmääramatus. Seda menetlust võib kasutada vaid juhul, kui analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagise parandit (nt ei ole see võimalik mikroskoopilise analüüsi puhul).
Analüüsitulemus esitatakse järgmiselt (kuivõrd kasutatud analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagist):
a) saagisega parandatult, saagis peab olema märgitud. Saagise parandit ei ole vaja, kui saagis on 90–110 %;
b) kujul „x ± U”, kus x on analüüsitulemus ja U on laiendmääramatus, kui kasutatakse kattetegurit 2, millele vastab usaldusväärsuse tase 95 %.
Kui analüüsi tulemus on oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitava näitaja väärtus ja kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi ning analüüsi eesmärk on vaid kontrollida vastavust õigusnormidele, ei ole analüüsitulemuses vaja esitada saagise parandit ning saagise ja mõõtemääramatuse võib sel juhul ära jätta.
III LISA
SÖÖDATOORAINE JA SEGAJÕUSÖÖDA KOOSTISE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID
A. NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata sööda niiskusesisaldust. Lenduvaid aineid, näiteks orgaanilisi happeid sisaldava sööda puhul tuleb jälgida, et koos niiskusesisaldusega määrataks ka oluline osa lenduvatest ainetest.
See ei hõlma piimatoodete kui söödatooraine analüüsi, mineraalainete ja peamiselt mineraalainetest koosnevate segude analüüsi, loomsete ja taimsete rasvade ja õlide analüüsi ega õliseemnete ja õliviljade analüüsi.
2. Põhimõte
Proov kuivatatakse kindlaksmääratud tingimustel, mis varieeruvad sõltuvalt sööda laadist. Massikadu määratakse kaalumise teel. Suure niiskusesisaldusega tahket sööta tuleb eelnevalt kuivatada.
3. Seadmed
3.1. Niiskust mitteneelavast materjalist purusti, mis vastab punktides 4.1.1 ja 4.1.2 sätestatud nõuetele, mida on lihtne puhastada ning millega on võimalik kiiresti ja ühtlaselt purustada nii, et ei tekiks märgatavat kuumenemist ja et proov puutuks võimalikult vähe kokku väliskeskkonnaga (nt vasarpurustaja või vesijahutusega mikropurustaja, kokkupandav koonusveski, aeglustatud liikumisega purustaja või hammasratastega purustaja).
3.2. Analüütilised kaalud täpsusega 1 mg.
3.3. Õhukindlalt suletavad roostevabast metallist või klaasist kuivad anumad põhjaga, millele saab analüüsitavat proovi laotada tihedusega 0,3 g/cm2.
3.4. Reguleeritava temperatuuriga (± 2 oC) elektriline kuivatuskapp, mis on nõuetekohaselt ventileeritav ja võimaldab temperatuuri kiiresti reguleerida ( 8 ).
3.5. Reguleeritava temperatuuriga elektriline vaakumkuivatuskapp, mis on varustatud õlipumbaga ning kuhu saab juhtida kuuma ja kuiva õhku või kuhu pannakse kuivatusainet (nt kaltsiumoksiidi).
3.6. Eksikaator, millel on paks avadega metall- või portselanalus ning mis sisaldab tõhusat kuivatusainet.
4. Töö käik
NB |
! |
Käesolevas punktis kirjeldatud toimingud tuleb teha kohe pärast proovi sisaldavate pakendite avamist. Tuleb teha vähemalt kaks analüüsi. |
4.1. Ettevalmistus
4.1.1.
Võetakse vähemalt 50 g proovi. Vajaduse korral proov purustatakse või tehakse tükkideks, et vältida niiskusesisalduse kõikumist (vt punkt 6).
4.1.2.
Võetakse vähemalt 50 g proovi. Proov jahvatatakse osakesteks, millest vähemalt 50 % pudeneb läbi sõela, mille avade suurus on 0,5 mm, ja sõelale, mille ümmarguste avade suurus on 1 mm, ei jää rohkem kui 10 %.
4.1.3.
Võetakse umbes 25 g proovi, kaalutakse see 10 mg täpsusega, lisatakse vajalik kogus 10 mg täpsusega kaalutud veevaba liiva ja segatakse kuni ühtlase toote saamiseni.
4.2. Kuivatamine
4.2.1.
Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 1 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 103 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada neli tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 103 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega.
Peamiselt õlidest ja rasvadest koosneva sööda puhul kuivatatakse proovi kuivatuskapis temperatuuril 130 oC täiendavalt 30 minutit. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust.
4.2.2.
Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g peenestatud proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 130 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada kaks tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 130 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega.
4.2.3. Segajõusööt, mis sisaldab üle 4 % sahharoosi või laktoosi: söödatooraine, nt jaanikaunad, hüdrolüüsitud teraviljasaadused, linnaseseemned, kuivatatud peediliistakud, kalast ja suhkrust valmistatud lahustuvsööt; segajõusööt, mis sisaldab rohkem kui 25 % mineraalsooli, sh kristallisatsioonivesi.
Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 80–85 oC kuumutatud vaakumkuivatuskappi (3.5). Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist.
Rõhk tõstetakse 100 torrini ja proovil lastakse sellise rõhu all kas kuuma ja kuiva õhu voolus või kuivatusaine juuresolekul (umbes 300 g 20 proovi kohta) umbes neli tundi kuivada. Kui kasutatakse kuivatusainet, ühendatakse vaakumpump pärast ettenähtud rõhu saavutamist lahti. Kuivamisaega arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 80–85 oC. Ettevaatlikult taastatakse kuivatuskapis atmosfäärirõhk. Kuivatuskapp avatakse, kaas asetatakse kohe anumale, anum võetakse kapist välja, lastakse jahtuda eksikaatoris (3.6) 30–45 minutit ja kaalutakse 1 mg täpsusega. Kuivatatakse veel 30 minutit vaakumkuivatuskapis temperatuuril 80–85 oC ning kaalutakse uuesti. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust.
4.3. Eelkuivatamine
4.3.1.
Tahket sööta, mille purustamist suur niiskusesisaldus raskendab, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada:
50 g purustamata proovi (pressitud või aglomeeritud sööda võib vajaduse korral tükkideks teha) kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5 cm serv). Lastakse kuivatuskapis temperatuuril 60–70 oC kuivada, kuni niiskusesisaldus on 8–12 %. Anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis üks tund ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Purustatakse viivitamata punkti 4.1.1 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.1 või 4.2.3 kohaselt vastavalt sööda laadile.
4.3.2.
Terasid, mille niiskusesisaldus on üle 17 %, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada:
50 g jahvatamata teri kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5 cm serv). Lastakse 5–7 minutit kuivatuskapis temperatuuril 130 oC kuivada. Võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis kaks tundi ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Jahvatatakse viivitamata punkti 4.1.2 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.2 kohaselt.
5. Tulemuste arvutamine
Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmiste valemite abil.
5.1. Kuivatamine ilma eelkuivatamiseta
kus:
m |
= |
analüüsitava proovi esialgne mass grammides, |
m0 |
= |
kuiva analüüsitava proovi mass grammides. |
5.2. Kuivatamine koos eelkuivatamisega
kus:
m |
= |
analüüsitava proovi esialgne mass grammides, |
m1 |
= |
analüüsitava proovi mass grammides pärast eelkuivatamist, |
m2 |
= |
analüüsitava proovi mass grammides pärast purustamist või jahvatamist, |
m0 |
= |
kuiva analüüsitava proovi mass grammides. |
5.3. Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2 % niiskuse absoluutväärtusest.
6. Tähelepanek
Kui purustamine osutub vajalikuks ja kui sellega muutub toote niiskusesisaldus, tuleb sööda koostisosade analüüside tulemusi korrigeerida esialgsel kujul proovi niiskusesisalduse põhjal.
B. LOOMSETE JA TAIMSETE RASVADE JA ÕLIDE NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata loomsete ja taimsete rasvade ja õlide veesisaldust ja lenduvate ainete sisaldust.
2. Põhimõte
Proov kuivatatakse temperatuuril 103 oC püsimassini (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle). Massikadu määratakse kaalumise teel.
3. Seadmed
3.1. Korrosioonikindlast materjalist lamedapõhjaline anum, mille diameeter on 8–9 cm ja kõrgus umbes 3 cm.
3.2. Tugevdatud kolviga termomeeter, mille ülaosas on paisumistoru, mis on gradueeritud vahemikus umbes 80 oC kuni vähemalt 110 oC ja mis on umbes 10 cm pikkune.
3.3. Liivavann või elektriline kuumutusplaat.
3.4. Tõhusat kuivatusainet sisaldav eksikaator.
3.5. Analüütilised kaalud.
4. Töö käik
1 mg täpsusega kaalutud umbes 20 g homogeenitud proovi pannakse kuiva kaalutud anumasse (3.1), milles on termomeeter (3.2). Kuumutatakse liivavannil või kuumutusplaadil (3.3) termomeetriga pidevalt segades, nii et temperatuur tõuseb umbes 7 minutiga 90 oC-ni.
Kuumust vähendatakse, jälgides anuma põhjast kerkivate mullide sagedust. Temperatuur ei tohi tõusta üle 105 oC. Segamist jätkatakse anuma põhja kaapides, kuni mullide tekkimine lõpeb.
Niiskuse täielikuks kõrvaldamiseks kuumutatakse proovi mitu korda temperatuurini 103 ± 2 oC, jahutades kuumutamiste vahel proovi temperatuurini 93 oC. Lastakse jahtuda eksikaatoris (3.4) toatemperatuurini ja kaalutakse. Protseduuri korratakse, kuni massikadu kahel järjestikusel kaalumisel ei ole üle 2 mg.
NB |
! |
Proovi massi suurenemine pärast korduvat kuumutamist viitab rasva oksüdeerumisele, sel juhul arvutatakse tulemus enne massi suurenemist tehtud kaalumisel. |
5. Tulemuste arvutamine
Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:
kus:
m |
= |
analüüsitava proovi mass grammides; |
m1 |
= |
anuma ja selle sisu mass grammides enne kuumutamist; |
m2 |
= |
anuma ja selle sisu mass grammides pärast kuumutamist. |
Tulemused, mis on väiksemad kui 0,05 %, tuleb registreerida kujul „alla 0,05 %”.
Korratavus
Sama prooviga tehtud kahel paralleelsel määramisel saadud niiskusesisalduste erinevus ei tohi ületada absoluutväärtuses 0,05 %.
C. TOORVALGUSISALDUSE MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
See meetod võimaldab määrata toorvalgusisaldust söödas lämmastikusisalduse alusel, mis määratakse Kjeldahli meetodiga.
2. Põhimõte
Proov lagundatakse väävelhappega katalüsaatori manulusel. Happelahus leelistatakse naatriumhüdroksiidi lahusega. Ammoniaak destilleeritakse ja kogutakse mõõdetud väävelhappekogusesse, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi standardlahusega.
Teise võimalusena destilleeritakse vabanenud ammoniaak boorhappe lahuse ülejääki, millele järgneb tiitrimine soolhappe või väävelhappe lahusega.
3. Reaktiivid
3.1. Kaaliumsulfaat.
3.2. Katalüsaator: vask(II)oksiid CuO või vask(II)sulfaatpentahüdraat CuSO4 5H2O.
3.3. Granuleeritud tsink.
3.4. Väävelhape, ρ20 = 1,84 g/ml.
3.5. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.
3.6. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.
3.7. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.
3.8. Metüülpunane indikaator: 300 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml etanoolis, σ = 95–96 % (v/v).
3.9. Naatriumhüdroksiidi lahus (võib kasutada tehnilise puhtusega reaktiivi) β = 40 g / 100 ml (m/v: 40 %).
3.10. Naatriumhüdroksiid, standardne tiitrimislahus, c(NaOH) = 0,25 mol/l.
3.11. Naatriumhüdroksiid, standardne tiitrimislahus, c(NaOH) = 0,10 mol/l.
3.12. Soolhappes pestud ja läbikuumutatud pimsskivigraanulid.
3.13. Atseetaniliid (sulamistemperatuur = 114 oC; N = 10,36 %).
3.14. Sahharoos (lämmastikuvaba).
3.15. Boorhape (H3BO3).
3.16. Metüülpunase indikaatorlahus: 100 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml etanoolis või metanoolis.
3.17. Bromokresoolrohelise lahus: 100 mg bromokresoolrohelist lahustatakse 100 ml etanoolis või metanoolis.
3.18. Boorhappe lahus (10 g/l kuni 40 g/l olenevalt kasutatavatest vahenditest).
Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, tuleb metüülpunase ja bromokresoolrohelise indikaatorid lisada boorhappe lahustesse. Kui 1 liiter boorhappe lahust on ette valmistatud, tuleb enne vajaliku mahuni korrigeerimist lisada 7 ml metüülpunase indikaatorlahust (3.16) ja 10 ml bromokresoolrohelise lahust (3.17).
Olenevalt sellest, millist vett kasutatakse, võib boorhappe lahuse pH-tase olla eri partiides erinev. Sageli on positiivse tulemuse saamiseks vaja korrigeerida väikse leelisekogusega.
MÄRKUS |
: |
umbes 3–4 ml NaOH (3.11) lisamine 1 liitrisse 10 g/l boorhappesse annab tavaliselt häid tulemusi. Lahust tuleb hoida toatemperatuuril ja kaitsta valguse ning ammoniaagiaurude eest. |
3.19. Soolhape, standardne tiitrimislahus c(HCl) = 0,10 mol/l.
MÄRKUS |
: |
kasutada võib ka teisi tiitrimislahuste (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, ja 3.19) kontsentratsioone, kui arvutustes tehakse vastavad parandused. Kontsentratsioonid tuleb alati esitada nelja kümnendkoha täpsusega. |
4. Seadmed
Seadmed, mis sobivad Kjeldahli meetodis ettenähtud lagundamise, destilleerimise ja tiitrimise läbiviimiseks.
5. Töö käik
5.1. Lagundamine
1 g proovi kaalutakse 0,001 g täpsusega ja pannakse see mineraliseerimisaparaadi kolbi. Lisatakse 15 g kaaliumsulfaati (3.1), sobiv kogus katalüsaatorit (3.2) (0,3 –0,4 g vask(II)oksiidi või 0,9 –1,2 g vask(II)sulfaadi pentahüdraati), 25 ml väävelhapet (3.4) ja vajadusel mõned pimsskivigraanulid (3.12) ning segatakse.
Kolbi kuumutatakse esialgu mõõdukalt, aeg-ajalt loksutades, kuni mass on söestunud ja vaht kadunud; seejärel kuumutatakse intensiivsemalt vedeliku püsiva keemiseni. Kuumutamine on küllaldane, kui keev hape kondenseerub kolvi seinale. Tuleb vältida seinte liigset kuumutamist ja orgaanilise aine kleepumist seintele.
Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkatakse keetmist veel kahe tunni jooksul, seejärel jahutatakse.
5.2. Destilleerimine
Lisatakse ettevaatlikult piisav kogus vett, et tagada sulfaatide täielik lahustumine. Lastakse jahtuda ja seejärel lisatakse vajadusel mõned graanulid tsinki (3.3). Edasi toimida vastavalt punktile 5.2.1 või 5.2.2.
5.2.1.
Destilleerimisaparaadi kogumiskolbi pannakse täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet (3.5) või (3.7), sõltuvalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisatakse mõni tilk metüülpunast indikaatorit (3.8).
Mineraliseerimiskolb ühendatakse destilleerimisaparaadi jahutiga ja jahuti ots viiakse kogumiskolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vt tähelepanek 8.3). Mineraliseerimiskolbi valatakse aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.9), vältides ammoniaagi kadu (vt tähelepanek 8.1). Kolbi kuumutatakse, kuni ammoniaak on üle destilleeritud.
5.2.2.
Kui destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimine toimub käsitsi, siis rakendatakse allpool nimetatud menetlust. Kui destilleerimisseade on täisautomaatne ning hõlmab ka destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimist, siis järgitakse tootja koostatud destilleerimisseadme kasutusjuhendit.
Kogumiskolb, mis sisaldab 25–30 ml boorhappe lahust (3.18), pannakse jahuti väljalaskeava alla selliselt, et sissevoolutoru jääb allapoole boorhappe lahuse ülejäägi pinda. Destilleerimisseade korrigeeritakse 50 ml naatriumhüdroksiidi lahuse (3.9) väljastamiseks. Destilleerimisseadet kasutatakse vastavalt tootja kasutusjuhendile ja destilleeritakse naatriumhüdroksiidi lahuse lisamisel vabanenud ammoniaak välja. Destillaat kogutakse boorhappe vastuvõtulahusesse. Destillaadi kogus (veeaurdestillatsiooni aeg) sõltub proovis sisalduva lämmastiku hulgast. Järgitakse tootja kasutusjuhendit.
MÄRKUS |
: |
poolautomaatses destilleerimisseadmes toimuvad naatriumhüdroksiidi ülejäägi lisamine ja veeaurdestillatsioon automaatselt. |
5.3. Tiitrimine
Toimida vastavalt punktile 5.3.1 või 5.3.2.
5.3.1.
Väävelhappe ülejääk tiitritakse kogumiskolvis naatriumhüdroksiidi lahusega (3.10 või 3.11), sõltuvalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt.
5.3.2.
Kogumiskolvi sisu tiitritakse soolhappe standardse tiitrimislahusega (3.19) või väävelhappe standardse tiitrimislahusega (3.6), kasutades büretti, ning loetakse kokku kasutatud titrandi kogus.
Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, on lõpp-punkt saavutatud, kui ainesse ilmuvad esimesed roosa värvi jäljed. Büreti näitu hinnatakse 0,05 ml täpsusega. Lõpp-punkti nähtavust võib parandada valgustatud magnetseguri plaadi või valgusmõõturi abil.
Seda võib teha automaatselt, kasutades automaatselt tiitrivat veeaurdestillaatorit.
Eri destillaatori või destillaatori/titraatori kasutamisel järgitakse tootja kasutusjuhendeid.
MÄRKUS |
: |
kui kasutatakse automaatset tiitrimissüsteemi, algab tiitrimine vahetult pärast destilleerimise algust ja kasutatakse 1 % boorhappe lahust (3.18). Kui kasutatakse täisautomaatset destilleerimisseadet, võib ammoniaagi automaatset tiitrimist läbi viia ka lõpp-punkti määramisega, kasutades potentsiomeetrilist pH-süsteemi. Sel juhul kasutatakse pH mõõtjaga automaatset titraatorit. PH-meeter tuleb korralikult kalibreerida vahemikus pH 4 kuni pH 7, järgides tavapärast laboratoorset pH kalibreerimise menetlust. Tiitrimise pH lõpp-punkt saavutatakse pH 4,6 juures, mis on titreerimiskõvera kõige järsem punkt (murdepunkt). |
5.4. Pimekatse
Et kontrollida, kas reaktiivid on lämmastikuvabad, viiakse läbi pimekatse (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine), kasutades proovi asemel 1 g sahharoosi (3.14).
6. Tulemuste arvutamine
Arvutused tehakse vastavalt punktile 6.1 või 6.2.
6.1. Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.1
Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:
kus:
Vo |
= |
pimekatses kasutatud NaOH (3.10 või 3.11) maht (ml), |
V1 |
= |
proovi tiitrimisel kasutatud NaOH (3.10 või 3.11) maht (ml), |
c |
= |
naatriumhüdroksiidi (3.10 või 3.11) kontsentratsioon (mol/l), |
m |
= |
proovi mass (g). |
6.2. Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.2
6.2.1.
Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:
kus:
m |
= |
kaalutise mass grammides, |
c |
= |
soolhappe (3.19) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l), |
V0 |
= |
pimekatses kasutatud soolhappe maht (ml), |
V1 |
= |
kaalutises kasutatud soolhappe maht (ml). |
6.2.2.
Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:
kus:
m |
= |
kaalutise mass grammides, |
c |
= |
väävelhappe (3.6) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l), |
V0 |
= |
pimekatses kasutatud väävelhappe (3.6) maht (ml), |
V1 |
= |
kaalutises kasutatud väävelhappe (3.6) maht (ml). |
7. Meetodi kontrollimine
7.1. Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— absoluutväärtusena väljendatult 0,2 %, kui toorvalgusisaldus on väiksem kui 20 %;
— 1,0 % suuremast väärtusest, kui toorvalgusisaldus on 20–40 %;
— absoluutväärtusena väljendatult 0,4 %, kui toorvalgusisaldus on suurem kui 40 %.
7.2. Täpsus
Analüüs (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine) viiakse läbi 1,5 –2,0 g atseetaniliidiga (3.13) 1 g sahharoosi (3.14) manulusel; 1 g atseetaniliidi tarbib 14,80 ml väävelhapet (3.5). Saagis peab olema vähemalt 99 %.
8. Tähelepanekud
8.1. Seade võib olla manuaalset, poolautomaatset või automaatset tüüpi. Kui seade nõuab proovi ülekandmist lagundamise ja destilleerimise vahel, tuleb see ülekandmine teostada ilma kadudeta. Kui destillatsiooniaparaadi kolb ei ole varustatud tilklehtriga, lisatakse naatriumhüdroksiid vahetult enne kolvi ühendamist jahutiga, valades vedelikku aeglaselt mööda kolvi külge.
8.2. Kui proov lagundamisel tahkestub, alustatakse määramist uuesti, kasutades eespool näidatust suuremat kogust väävelhapet (3.4).
8.3. Väikese lämmastikusisaldusega toodete puhul võib kogumiskolbi viidava väävelhappe (3.7) mahtu vajadusel vähendada 10–15 ml-ni ja täiendada veega 25 ml-ni.
8.4. Tavapäraste analüüside käigus võib toorvalgu määramiseks kasutada alternatiivseid analüüsimeetodeid, kuid standardmeetodiks on käesoleva lisa C osas kirjeldatud Kjeldahli meetod. Alternatiivmeetodi (nt DUMAS) abil saadud tulemuste samaväärsust standardmeetodiga võrreldes tuleb tõestada iga põhiaine kohta eraldi. Et alternatiivmeetodiga saadud tulemused võivad isegi pärast samaväärsuse kontrolli veidi erineda standardmeetodiga saadud tulemustest, tuleb analüüsiaruandes märkida, millist analüüsimeetodit on toorvalgu määramiseks kasutatud.
D. KARBAMIIDI MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata karbamiidi taset söödas.
2. Põhimõte
Proov suspendeeritakse vees selitava ainega. Suspensioon filtreeritakse. Filtraadi karbamiidisisaldus määratakse pärast 4-dimetüülaminobensaldehüüdi (4-DMAB) lisamist optilise tiheduse mõõtmise teel lainepikkusel 420 nm.
3. Reaktiivid
3.1. 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahus: 1,6 g 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahustatakse 100 ml 96 % etanoolis ja lisatakse 10 ml soolhapet (ρ20 = 1,19 g/ml). See reaktiiv säilib maksimaalselt kaks nädalat.
3.2. Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikat. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.3. Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4 Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.4. Karbamiidi mitte absorbeeriv aktiivsüsi (kontrollida).
3.5. Karbamiidi 0,1 % lahus (w/v).
4. Seadmed
4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min.
4.2. Lihvkorgiga katseklaasid: 160 × 16 mm.
4.3. Spektrofotomeeter.
5. Töö käik
5.1. Proovi analüüs
1 mg täpsusega kaalutud 2 g proovi pannakse 1 g aktiivsöega (3.4) 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett ja 5 ml Carrezi lahust I (3.2), segatakse umbes 30 sekundit ja lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.3). Segatakse trumlis 30 minutit. Täidetakse veega kuni märgini, loksutatakse ja filtreeritakse.
Eemaldatakse 5 ml läbipaistvat värvitut filtraati, pannakse see lihvkorgiga katseklaasidesse, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1) ja segatakse. Katseklaasid asetatakse 20 oC (+/- 4 oC) veetemperatuuriga veevanni. Viieteistkümne minuti pärast mõõdetakse proovilahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga lainepikkusel 420 nm. Võrreldakse reaktiivide kontroll-lahustega.
5.2. Kalibreerimiskõver
Võetakse 1, 2, 4, 5 ja 10 ml kogused karbamiidilahust (3.5), pannakse 100 ml mõõtekolbidesse ja täidetakse veega kuni märgini. Igast lahusest võetakse ära 5 ml, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1), homogeenitakse ja mõõdetakse eespool kirjeldatud viisil optiline tihedus võrrelduna kontroll-lahusega, mis sisaldab 5 ml 4-DMAB lahust ja 5 ml karbamiidivaba vett. Koostatakse kalibreerimiskõver.
6. Tulemuste arvutamine
Proovis sisalduv karbamiidikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.
Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.
7. Tähelepanekud
7.1. Üle 3 % karbamiidisisalduse puhul vähendatakse proovi 1 grammini või lahjendatakse esialgset lahust, nii et 500 ml-s ei oleks karbamiidi üle 50 mg.
7.2. Väikese karbamiidisisalduse puhul võetakse suurem proov, tingimusel et filtraat jääb läbipaistvaks ja värvituks.
7.3. Kui proov sisaldab lihtsaid lämmastikuühendeid, nagu näiteks aminohappeid, tuleb optilist tihedust mõõta lainepikkusel 435 nm.
E. LENDUVATE LÄMMASTIKALUSTE MÄÄRAMINE
I. MIKRODIFUSIOON
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust söödas.
2. Põhimõte
Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse kaaliumkarbonaadi lahust kasutades mikrodifusiooni abil, kogutakse boorhappe lahusesse ja tiitritakse väävelhappega.
3. Reaktiivid
3.1. Trikloroäädikhappe 20 % lahus (w/v).
3.2. Indikaator: 33 mg bromokresoolrohelist ja 65 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml 95–96 % etanoolis (v/v).
3.3. Boorhappe lahus: üheliitrises mõõtekolvis lahustatakse 200 ml 95–96 % etanoolis (v/v) ja 700 ml vees 10 g boorhapet. Lisatakse 10 ml indikaatorit (3.2). Segatakse ja vajaduse korral muudetakse lahuse värv helepunaseks, lisades naatriumhüdroksiidi lahust. 1 ml lahust seob kuni 300 μg NH3.
3.4. Kaaliumkarbonaadi küllastunud lahus: 100 g kaaliumkarbonaati lahustatakse 100 ml keevas vees. Lastakse jahtuda, filtreeritakse.
3.5. Väävelhape, 0,01 mol/l
4. Seadmed
4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min.
4.2. Klaasist või plastist Conway anumad (vt joonis).
4.3. 1/100 ml gradeeritud mikrobüretid.
5. Töö käik
10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri.
Pipetti kasutades viiakse 1 ml boorhappe lahust (3.3) Conway anuma keskmisse ossa ja 1 ml filtraati anuma välimisse ossa. Kaetakse osaliselt rasvatatud kaanega. Välimisse osasse tilgutatakse kiiresti 1 ml kaaliumkarbonaadi küllastunud lahust (3.4) ja kaas suletakse õhukindlalt. Anumat pööratakse hoolikalt horisontaaltasandis nii, et kaks reaktiivi segunevad. Lastakse haududa kas vähemalt neli tundi toatemperatuuril või üks tund temperatuuril 40 oC.
Mikrobüretti (4.3) kasutades tiitritakse lenduvad lämmastikalused boorhappe lahuses väävelhappe (3.5) abil.
Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita.
6. Tulemuste arvutamine
1 ml H2SO40,01 mol/l vastab 0,34 mg ammoniaagile.
Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.
Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— suhtelise väärtusena väljendatult 10 % ammoniaagisisalduse puhul, mis on väiksem kui 1,0 %;
— absoluutväärtusena väljendatult 0,1 % ammoniaagisisalduse puhul, mis on vähemalt 1,0 %.
7. Tähelepanek
Kui proovi ammoniaagisisaldus on suurem kui 0,6 %, lahjendatakse esialgset lahust.
CONWAY CELL
Scale 1/1
II. DESTILLEERIMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust peaaegu karbamiidivabas kalajahus. Meetodit kohaldatakse üksnes juhul, kui ammoniaagisisaldus on väiksem kui 0,25 %.
2. Põhimõte
Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse keemistemperatuuril magneesiumoksiidi lisamise teel ja kogutakse teatava koguse väävelhappega, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi lahuse abil tagasi.
3. Reaktiivid
3.1. Trikloroäädikhappe 20 % lahus (w/v)
3.2. Magneesiumoksiid
3.3. Vahutamisvastane emulsioon (nt silikoon)
3.4. Väävelhape, 0,05 mol/l
3.5. Naatriumhüdroksiidi lahus, 0,1 mol/l
3.6. Metüülpunase 0,3 % lahus 95–96 % etanoolis (v/v)
4. Seadmed
4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min
4.2. Kjeldahli destilleerimisaparaat
5. Töö käik
10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri.
Vastavalt lenduvate lämmastikaluste eeldatavale sisaldusele võetakse vajalik kogus selget filtraati (tavaliselt 100 ml). Lahjendatakse 200 milliliitrini ning lisatakse 2 g magneesiumoksiidi (3.2) ja mõned tilgad vahutamisvastast emulsiooni (3.3). Lahus peaks olema lakmuspaberi abil määratuna aluseline, vastasel korral lisatakse veidi magneesiumoksiidi (3.2). Edasi toimitakse vastavalt toorvalgu sisalduse määramise analüüsi meetodi punktidele 5.2 ja 5.3 (käesoleva lisa C osa).
Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita.
6. Tulemuste arvutamine
1 ml H2SO40,05 mol/l vastab 1,7 mg ammoniaagile.
Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.
Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 10 % ammoniaagi massist suhtelise väärtusena väljendatult.
F. AMINOHAPETE (VÄLJA ARVATUD TRIPTOFAANI) MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
See meetod võimaldab aminohappeanalüsaatoriga määrata söödas vabu aminohappeid (sünteetilisi ja looduslikke) ning üldaminohappeid (peptiidsidemetega ja vabu). Meetodit saab kasutada järgmiste aminohapete puhul: tsüst(e)iin, metioniin, lüsiin, treoniin, alaniin, arginiin, asparagiinhape, glutamiinhape, glütsiin, histidiin, isoleutsiin, leutsiin, fenüülalaniin, proliin, seriin, türosiin ja valiin.
Meetod ei erista aminohapete sooli ega aminohapete D- ja L-vorme. See ei sobi trüptofaani ega aminohapete hüdroksüanaloogide määramiseks.
2. Põhimõte
2.1. Vabad aminohapped
Vabad aminohapped ekstraheeritakse lahjendatud soolhappega. Kaasa ekstraheerunud lämmastikku sisaldavad makromolekulid sadestatakse sulfosalitsüülhappega ning eemaldatakse filtreerides. Filtreeritud lahuse pH korrigeeritakse 2,20 -le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetrilise määramise teel reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm.
2.2. Üldaminohapped
Valitav protseduur sõltub uuritavatest aminohapetest. Tsüst(e)iin ja metioniin tuleb enne hüdrolüüsi oksüdeerida vastavalt tsüsteiinhappeks ja metioniinsulfooniks. Türosiin tuleb määrata oksüdeerimata proovide hüdrolüsaatides. Kõiki teisi punktis 1 osutatud aminohappeid saab määrata kas oksüdeeritud või oksüdeerimata proovides.
Oksüdeerimine viiakse läbi persipelghappe ja fenooli seguga 0 oC juures. Ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse naatriumdisulfitiga. Oksüdeeritud või oksüdeerimata proovi hüdrolüüsitakse soolhappega (3.20) 23 tundi. Hüdrolüsaadi pH korrigeeritakse 2,20 -le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetriliselt reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm (proliini puhul 440 nm).
3. Reaktiivid
Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS).
3.1. Vesinikperoksiid, w (w/w) = 30 %
3.2. Äädikhape, w (w/w) = 98–100 %
3.3. Fenool
3.4. Naatriumdisulfit
3.5. Naatriumhüdroksiid
3.6. 5-sulfosalitsüülhappe dihüdraat
3.7. Soolhape (tihedus umbes 1,18 g/ml)
3.8. Trinaatriumtsitraadi dihüdraat
3.9. 2,2 '- tiodietanool (tiodiglükool)
3.10. Naatriumkloriid
3.11. Ninhüdriin
3.12. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC
3.13. Norleutsiin või muu sisestandardina kasutamiseks sobiv ühend
3.14. Gaasiline lämmastik (< 10 ppm hapnikku)
3.15. 1-oktanool
3.16. Aminohapped:
3.16.1. Punktis 1 loetletud standardained. Kristallisatsioonivett mitte sisaldavad puhtad ühendid. Kuivatakse vaakumis P2O5 või H2SO4 kohal ühe nädala jooksul enne kasutamist.
3.16.2. Tsüsteiinhape
3.16.3. Metioniinsulfoon
3.17. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 7,5 mol/l:
300 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.
3.18. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l:
40 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.
3.19. Sipelghappe-fenoolilahus:
889 g sipelghapet (3.2) segatakse 111 g veega ja lisatakse 4,73 g fenooli (3.3).
3.20. Hüdrolüüsisegu, c = 6 mol HCl/l, mis sisaldab 1 g fenooli/l:
1 g fenooli (3.3) lisatakse 492 milliliitrile HCl-le (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.
3.21. Ekstraheerimissegu, c = 0,1 mol HCl/l, mis sisaldab 2 % tiodiglükooli. Võetakse 8,2 ml HCl (3.,7), lahjendatakse umbes 900 ml veega, lisatakse 20 ml tiodiglükooli (3.9) ja täidetakse veega 1 liitrini (3.7 ja 3.9 mitte segada otse omavahel).
3.22. 5-sulfosalitsüülhape, ß = 6 %:
60 g 5-sulfosalitsüülhapet (3.6) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.
3.23. Oksüdatsioonisegu (persipelghape – fenool):
0,5 ml vesinikperoksiidi (3.1) segatakse 4,5 ml sipelghappe ja fenooli lahusega (3.19) väikses keeduklaasis. Inkubeeritakse 20–30 oC juures ühe tunni jooksul, et moodustuks persipelghape, seejärel jahutatakse jääveevanni kohal (15 min) enne proovile lisamist.
Ettevaatust: vältida kokkupuudet nahaga ja kanda kaitserõivaid.
3.24. Tsitraatpuhver, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 :
19,61 g naatriumtsitraati (3.8), 5 ml tiodiglükooli (3.9), 1 g fenooli (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) lahustatakse umbes 800 ml vees. pH korrigeeritakse 2,20 -le. Täidetakse veega 1 liitrini.
3.25. Elutsioonipuhvrid, mis on valmistatud vastavalt kasutatud analüsaatori tingimustele (4.9).
3.26. Ninhüdriini reaktiiv, mis on valmistatud vastavalt kasutatud analüsaatori tingimustele (4.9).
3.27. Aminohapete standardlahused. Neid lahuseid tuleks hoida temperatuuril alla 5 oC.
3.27.1. Aminohapete põhistandardlahus (3.16.1).
c = 2,5 μmol/ml iga lahuse kohta soolhappes.
On võimalik osta.
3.27.2. Tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni põhistandardlahus, c = 1,25 μmol/ml.
0,2115 g tsüsteiinhapet (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinsulfooni (3.16.3) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) üheliitrises mõõtekolbis ning täidetakse kolb tsitraatpuhvriga märgini. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 12 kuu. Seda lahust ei kasutata, kui põhistandardlahus (3.27.1) sisaldab tsüsteiinhapet ja metioniinsulfooni.
3.27.3. Sisetandardi põhistandardlahus, nt norleutsiin, c = 20 μmol/ml.
0,6560 g norleutsiini (3.13) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) mõõtekolbis ning kolb täidetakse tsitraatpuhvriga 250 ml-ni. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle kuue kuu.
3.27.4. Standardaminohapete kalibreerimislahus, mis on mõeldud kasutamiseks hüdrolüsaatidega, tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni c = 5 nmol/50 μl ja teiste aminohapete c = 10 nmol/50 μl. 2,2 g naatriumkloriidi (3.10) lahustatakse 100 ml keeduklaasis 30 ml tsitraatpuhvriga (3.24). Lisatakse 4,00 ml aminohapete põhistandardlahust (3.27.1), 4,00 ml tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni põhistandardlahust (3.27.2) ja 0,50 ml sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3), kui seda kasutatakse. Naatriumhüdroksiidi (3.18) abil korrigeeritakse pH 2,20 -le.
Kallatakse kvantitatiivselt 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) kuni märgini ja segatakse.
Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu.
Vaata ka punkti 9.1 tähelepanekut.
3.27.5. Standardaminohapete kalibreerimislahus, mis on mõeldud kasutamiseks vastavalt punktile 5.3.3.1 valmistatud hüdrolüsaatidega ja ekstraktidega (5.2). Kalibreerimislahus valmistatakse vastavalt punktile 3.27.4, jättes välja naatriumkloriidi.
Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu.
4. Seadmed
4.1. 100 või 250 ml ümarapõhjaline püstjahutiga varustatud kolb
4.2. 100 ml boorsilikaatklaasist pudel kummist/teflonist tihendiga keermestatud korgiga (nt Duran, Schott) kuivatuskapis kasutamiseks
4.3. Sundventilatsiooniga ja termoregulaatoriga kuivatuskapp, mille täpsus on parem kui ± 2 oC
4.4. pH-meeter (kolme kümnendkoha täpsusega)
4.5. Membraanfilter (0,22 μm)
4.6. Tsentrifuug
4.7. Vaakumpöördaurusti
4.8. Mehaaniline loksuti või magnetsegur
4.9. Aminohappe analüsaator või HPLC-seade ioonvahetuskolonni, ninhüdriini kolonnijärgse derivatiseerimise seadme ja valgusmõõturiga.
Kolonn täidetakse sulfoneeritud polüstüreenvaikudega, mis on võimelised eraldama aminohappeid üksteisest ja teistest ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Puhvri ja ninhüdriini jadas tekitatakse vool pumpadega, mille vooluühtlus on ±0,5 % nii standardkalibreerimise kui proovi analüüsi ajal.
Mõnede aminohapete analüsaatoritega võib kasutada hüdrolüüsimenetlusi, mille puhul on hüdrolüsaadi naatriumikontsentratsioon c = 0,8 mol/l ja mis sisaldab oksüdatsioonietapi kõiki sipelghappe jääke. Teised analüsaatorid ei võimalda teatavaid aminohappeid rahuldaval määral eraldada, kui hüdrolüsaat sisaldab liigselt sipelghapet ja/või kui naatriumioonide kontsentratsioon on kõrge. Sellisel juhul vähendatakse pärast hüdrolüüsi ja enne pH korrigeerimist happe mahtu aurustamisega kuni umbes 5 milliliitrini. Aurustamine peab toimuma vaakumitingimustes temperatuuril kuni 40 oC.
5. Töö käik
5.1. Proovi ettevalmistamine
Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.12).
5.2. Vabade aminohapete määramine söödas ja eelsegudes
Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 0,2 mg täpsusega koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml ekstraheerimissegu (3.21). Segu raputatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.8). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle 100 ml keeduklaasi.
Lisatakse loksutades 5,0 ml sulfosalitsüülhappe lahust (3.22) ning jätkatakse loksutamist 5 min vältel, kasutades magnetsegurit. Supernatant filtreeritakse või tsentrifuugitakse sademe eemaldamiseks. 10,0 ml saadud lahust pannakse 100 ml keeduklaasi ja korrigeeritakse pH-taset 2,20 -ni, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.18), sobiv kogus valatakse tsitraatpuhvri (3.24) abil mõõtekolbi ja kolb täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini.
Kui kasutatakse sisestandardit, lisatakse 1,00 ml sisestandardit (3.27.3) igasse 100 ml valmis lahusesse ja täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini.
Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.
Kui ekstrakte ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC.
5.3. Üldaminohapete määramine
5.3.1.
0,2 mg täpsusega kaalutakse 0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1):
— 100 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1) lahtise hüdrolüüsi (5.3.2.3) puhul või
— 250 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1), kui on nõutav madal naatriumikontsentratsioon (5.3.3.1), või
— 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (4.2) (suletud hüdrolüüsi 5.3.2.4 puhul).
Kaalutud proovi lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg ja niiskusesisaldus kuni 100 mg.
Kolb/pudel asetatakse jääveevanni ja jahutatakse kuni temperatuurini 0 oC, lisatakse 5 ml oksüdatsiooniegu (3.23) ning segatakse painutatud otsaga klaasspaatli abil. Spaatlit sisaldav kolb/pudel pitseeritakse õhukindla kilega, pitseeritud nõud sisaldav jääveevann asetatakse 16 tunniks külmikusse temperatuuril 0 oC. 16 tunni möödudes võetakse see külmikust välja ja ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse, lisades 0,84 g naatriumdisulfitit (3.4).
Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.1.
5.3.2.
5.3.2.1.
Vastavalt punktile 5.3.1 valmistatud oksüdeeritud proovile lisatakse 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20), pestes hoolikalt maha anuma ja spaatli külge kleepunud proovijäägid.
Olenevalt sellest, millist hüdrolüüsimenetlust kasutatakse, jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.
5.3.2.2.
100 ml või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1) või 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (4.2) kaalutakse 0,2 mg täpsusega 0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse hoolikalt 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20) ja segatakse prooviga. Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.
5.3.2.3.
Kolbis olevale segule (mis on valmistatud vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2) lisatakse 3 klaashelmest ja keedetakse püstjahutiga kolvis 23 tundi pideval mullidega keemisel. Pärast hüdrolüüsi teostamist pestakse jahuti maha 5 ml tsitraatpuhvriga (3.24). Kolb võetakse lahti ja jahutatakse jäävannis.
Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.
5.3.2.4.
Vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2 valmistatud segu sisaldav pudel asetatakse kuivatuskappi (4.3) temperatuuril 110 oC. Et vältida rõhu suurenemist (gaasiliste ainete tekkimise tõttu) ja ära hoida plahvatust, asetatakse esimeseks tunniks surveanuma peale keermestatud kork. Surveanumat ei tohi korgiga sulgeda. Ühe tunni möödudes suletakse surveanum korgiga ja jäetakse 23 tunniks kuivatuskappi (4.3). Pärast hüdrolüüsi lõpuleviimist võetakse pudel kuivatuskapist välja, avatakse ettevaatlikult pudelikork ja asetatakse pudel jääveevanni. Jahutatakse.
Olenevalt sellest, millist pH korrigeerimise menetlust (5.3.3) kasutatakse, valatakse pudeli sisu kvantitatiivselt 250 ml keeduklaasi või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi, kasutades tsitraatpuhvrit (3.24).
Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.
5.3.3.
Olenevalt aminohappe analüsaatori (4.9) naatriumitaluvusest toimitakse pH korrigeerimisel vastavalt punktile 5.3.3.1 või 5.3.3.2.
5.3.3.1.
Soovitatav on kasutada sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3), juhul kui kasutatakse aminohappe analüsaatorit, mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus (kui happe kogust tuleb vähendada).
Sellisel juhul lisatakse enne aurustamist hüdrolüsaadile 2,00 ml sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3).
Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadile lisatakse 2 tilka 1-oktanooli (3.15).
Hüdrolüsaadi kogust vähendatakse vaakumpöördaurusti (4.7) abil 5–10 milliliitrini vaakumitingimustes temperatuuril 40 oC. Kui kogust vähendatakse kogemata vähem kui 5 milliliitrini, tuleb hüdrolüsaat välja praakida ja analüüsi tuleb uuesti alustada.
pH-taset korrigeeritakse 2,20 -ni naatriumhüdroksiidi lahusega (3.18) ja jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.
5.3.3.2.
Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadid neutraliseeritakse osaliselt, lisades hoolikalt loksutades 17 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.17), jälgides, et temperatuur püsiks allpool 40 oC.
pH korrigeeritakse 2,20 -ni toatemperatuuril, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.17) ja lõpuks naatriumhüdroksiidi lahust (3.18). Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.
5.3.4.
Korrigeeritud pH-tasemega hüdrolüsaat (5.3.3.1 või 5.3.3.2) kallatakse kvantitatiivselt koos tsitraatpuhvriga (3.24) 200 ml mõõtekolbi ja täidetakse puhvriga (3.24) märgini.
Kui sisestandardit ei ole veel kasutatud, lisatakse 2,00 ml sisestandardit (3.27.3) ja täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) märgini. Segatakse hoolikalt.
Seejärel alustatakse kromotograafiat (5.4).
Kui proovilahuseid ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC.
5.4. Kromatograafia
Enne kromotograafiat viiakse ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3.4) toatemperatuurile. Segu loksutatakse ja filtreeritakse sobiv kogus läbi 0,22 μm membraanfiltri (4.5). Saadud selge lahusega tehakse ioonvahetuskromatograafia, kasutades aminohappe analüsaatorit (4.9).
Sissesüstimist võib teostada käsitsi või automaatselt. On oluline, et standardite ja proovide analüüsiks lisataks kolonni sama kogus lahust ± 0,5 %, välja arvatud sisestandardi kasutamisel, ning et naatriumi ja aminohapete vahekord standard- ja proovilahustes oleks võimalikult sarnane.
Üldiselt sõltub kalibreerimiskatsete sagedus ninhüdriini reaktiivi stabiilsusest ja analüütilisest süsteemist. Standard või proov lahjendatakse tsitraapuhvriga (3.24), et saavutada standardi piigipindalaks 30–200 % proovi aminohappe piigipindalast.
Aminohapete kromatograafia varieerub kergelt vastavalt sellele, millist tüüpi analüsaatorit ja millist vaiku kasutatakse. Valitud süsteem peab suutma eraldada aminohapped üksteisest ja ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma lineaarselt kolonni lisatud aminohapete muutustest.
Kromatograafia etapil kehtivad (määratavate aminohapete) ekvimolaarlahuse analüüsimisel allpool esitatud miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekorrad. Ekvimolaarlahus peab sisaldama vähemalt 30 % iga aminohappe maksimumkogusest, mida on võimalik täpselt mõõta aminohappe analüüsisüsteemi (4.9) abil.
Treoniini-seriini eraldamiseks ei tohi kahest kattuvast aminohappest madalama aminohappe miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekord kromatogrammil ületada suhet 2:10. (Kui määratakse vaid tsüst(e)iini, metioniini, treoniini ja lüsiini, kahjustab nende määramist ebapiisav eraldamine külgnevatest piikidest.). Kõigi teiste aminohapete puhul peab eraldatus olema parem kui suhe 1:10.
Süsteem peab tagama lüsiini eraldamise „lüsiini artefaktidest” ja ornitiinist.
6. Tulemuste arvutamine
Proovi ja standardi piikide pindala mõõdetakse iga üksiku aminohappe kohta ning arvutatakse kogus (X) ühes grammis aminohappes proovi kilo kohta.
Kui kasutatakse sisestandardit, korrutatakse tulemus liikmega
A |
= |
piigipindala, hüdrolüsaat või ekstrakt |
B |
= |
piigipindala, kalibreerimisstandardlahus |
C |
= |
piigipindala, sisestandard hüdrolüsaadis või ekstraktis |
D |
= |
piigipindala, sisestandard, kalibreerimisstandardlahus |
M |
= |
määratava aminohappe molaarmass |
c |
= |
standardi kontsentratsioon μmol/ml |
m |
= |
proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud) |
V |
= |
hüdrolüsaat (5.3.4) kokku milliliitrites või ekstrakti (6.1) lahjenduse koguruumala milliliitrites |
Tsüstiin ja tsüsteiin määratakse mõlemad tsüsteiinhappena oksüdeeritud proovide hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse tsüstiiniks (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), kasutades M väärtust 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).
Metioniin määratakse metioniinsulfoonina oksüdeeritud proovi hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse metioniinina, kasutades metioniini M väärtust: 149,21 g/mol.
Lisatud vaba metioniin määratakse pärast ekstraheerimist metioniinina, arvutamisel kasutatakse sama M väärtust.
6.1. Ekstraktide lahjenduse koguruumala (F) vabade aminohapete (5.2) määramiseks arvutatakse järgmiselt:
V |
= |
lõppekstrakti ruumala |
7. Meetodi hindamine
Meetodit on katsetatud rahvusvahelises võrdluskatses 1990. aastal, kasutades nelja erinevat sööta (sigade segasööt, broilerite segasööt, valgukontsentraat, eelsegu). Tulemuste keskväärtused ja standardhälbed pärast võõrväärtuste elimineerimist on esitatud käesoleva punkti tabelis.
Keskväärtused g/kg
Etalonaine |
Aminohape |
|||
Treoniin |
Tsüst(e)iin |
Metioniin |
Lüsiin |
|
Sigade segasööt |
6,94 n = 15 |
3,01 n = 17 |
3,27 N = 17 |
9,55 n = 13 |
Broilerite segasööt |
9,31 n = 16 |
3,92 n = 18 |
5,08 N = 18 |
13,93 n = 16 |
Valgukontsentraat |
22,32 n = 16 |
5,06 n = 17 |
12,01 N = 17 |
47,74 n = 15 |
Eelsegu |
58,42 n = 16 |
— |
90,21 N = 16 |
98,03 n = 16 |
n = osalenud laborite arv |
7.1. Korratavus
Eespool nimetatud võrdluskatse korratavus on väljendatud laborisisese standardhälbena ja esitatud järgmistes tabelites.
Laborisisesed standardhälbed (Sr) g/kg
Etalonaine |
Aminohape |
|||
Treoniin |
Tsüst(e)iin |
Metioniin |
Lüsiin |
|
Sigade segasööt |
0,13 n = 15 |
0,10 n = 17 |
0,11 n = 17 |
0,26 n = 13 |
Broilerite segasööt |
0,20 n = 16 |
0,11 n = 18 |
0,16 n = 18 |
0,28 n = 16 |
Valgukontsentraat |
0,48 n = 16 |
0,13 n = 17 |
0,27 n = 17 |
0,99 n = 15 |
Eelsegu |
1,30 n = 16 |
— |
2,19 n = 16 |
2,06 n = 16 |
n = osalenud laborite arv |
Laborisisese standardhälbe (Sr) variatsioonikordaja (%)
Etalonaine |
Aminohape |
|||
Treoniin |
Tsüst(e)iin |
Metioniin |
Lüsiin |
|
Sigade segasööt |
1,9 n = 15 |
3,3 n = 17 |
3,4 n = 17 |
2,8 n = 13 |
Broilerite segasööt |
2,1 n = 16 |
2,8 n = 18 |
3,1 n = 18 |
2,1 n = 16 |
Valgukontsentraat |
2,7 n = 16 |
2,6 n = 17 |
2,2 n = 17 |
2,4 n = 15 |
Eelsegu |
2,2 n = 16 |
— |
2,4 n = 16 |
2,1 n = 16 |
n = osalenud laborite arv |
7.2. Reprodutseeritavus
Eespool nimetatud võrdluskatse laboritevahelise standardhälbe tulemused on esitatud järgmises tabelis:
Laboritevaheline standardhälve (SR) g/kg
Etalonaine |
Aminohape |
|||
Treoniin |
Tsüst(e)iin |
Metioniin |
Lüsiin |
|
Sigade segasööt |
0,28 n = 15 |
0,30 n = 17 |
0,23 n = 17 |
0,30 n = 13 |
Broilerite segasööt |
0,48 n = 16 |
0,34 n = 18 |
0,55 n = 18 |
0,75 n = 16 |
Valgukontsentraat |
0,85 n = 16 |
0,62 n = 17 |
1,57 n = 17 |
1,24 n = 15 |
Eelsegu |
2,49 n = 16 |
— |
6,20 n = 16 |
6,62 n = 16 |
n = osalenud laborite arv |
Laboritevahelise standardhälbe (SR) variatsioonikordaja (%)
Etalonaine |
Aminohape |
|||
Treoniin |
Tsüst(e)iin |
Metioniin |
Lüsiin |
|
Sigade segasööt |
4,1 n = 15 |
9,9 n = 17 |
7,0 n = 17 |
3,2 n = 13 |
Broilerite segasööt |
5,2 n = 16 |
8,8 n = 18 |
10,9 n = 18 |
5,4 n = 16 |
Valgukontsentraat |
3,8 n = 16 |
12,3 n = 17 |
13,0 n = 17 |
3,0 n = 15 |
Eelsegu |
4,3 n = 16 |
— |
6,9 n = 16 |
6,7 n = 16 |
n = osalenud laborite arv |
8. Etalonainete kasutamine
Meetodi õige rakendamise kontrollimiseks tehakse korduvaid mõõtmisi sertifitseeritud etalonainetega, kui need ained on kättesaadavad. Soovitatav on kalibreerida aminohapete sertifitseeritud kalibreerimislahusega.
9. Tähelepanekud
9.1. Aminohappeanalüsaatorite erinevustest tingituna tuleb standardaminohapete kalibreerimislahuste (vt 3.27.4 ja 3.27.5) ja hüdrolüsaadi (vt 5.3.4) lõppkontsentratsioone vaadelda suunistena.
Kõigi aminohapete puhul tuleb kontrollida aparatuuri lineaarse ala vahemikku.
Standardlahus lahjendatakse tsitraatpuhvriga, et piigialad oleksid vahemiku keskel.
9.2. Kui hüdrolüsaatide analüüsiks kasutatakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia aparatuuri, tuleb katsetingimused optimeerida vastavalt tootja soovitustele.
9.3. Meetodi rakendamisel sööda suhtes, mille kloriidisisaldus on suurem kui 1 % (kontsentraadid, mineraalsöödad, täiendsöödad), võib analüüs näidata tegelikust väiksemat metioniinisisaldust ning tuleb kasutada erimeetodit.
G. TRÜPTOFAANI MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata trüptofaani üldsisaldust ja vaba trüptofaani sisaldust söödas. Meetod ei erista D- ja L-vormi.
2. Põhimõte
Trüptofaani üldsisalduse määramiseks hüdrolüüsitakse proovi leeliselises keskkonnas küllastunud baariumhüdroksiidi lahusega ja kuumutatakse 110 oC juures 20 tundi. Pärast hüdrolüüsimist lisatakse sisestandard.
Vaba trüptofaani määramiseks ekstraheeritakse proovi nõrgalt happelistes tingimustes sisestandardi juuresolekul.
Trüptofaan ja sisestandard määratakse hüdrolüsaadis või ekstraktis HPLC-ga fluorestsentsdetektori abil.
3. Reaktiivid
3.1. Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS/cm).
3.2. Standardaine: trüptofaan (puhtus/sisaldus ≥ 99 %), mis on kuivatatud vaakumis fosforpentoksiidi kohal.
3.3. Sisestandardaine: α-metüültrüptofaan (puhtus/sisaldus ≥ 99 %), mis on kuivatatud vaakumis fosforpentoksiidi kohal.
3.4. Baariumhüdroksiidi oktahüdraat (vältida Ba(OH)2 .8 H2O ülemäärast kontakti õhuga, kuna see võib viia BaCO3 moodustumiseni, mis võib määramist segada) (vt tähelepanek 9.3).
3.5. Naatriumhüdroksiid
3.6. Ortofosforhape, w (w/w) = 85 %
3.7. Soolhape, ρ20 = 1,19 g/ml.
3.8. Metanool, samaväärne kui HPLC-puhas.
3.9. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC
3.10. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l:
40,0 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini.
3.11. Soolhape, c = 6 mol/l:
Võetakse 492 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.
3.12. Soolhape, c = 1 mol/l:
Võetakse 82 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.
3.13. Soolhape, c = 0,1 mol/l:
Võetakse 8,2 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.
3.14. Ortofosforhape, c = 0,5 mol/l:
Võetakse 34 ml ortofosforhapet (3.6) ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini.
3.15. Trüptofaani (3.2) kontsentreeritud lahus, c = 2,50 μmol/ml:
500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2553 g trüptofaani (3.2) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat.
3.16. Sisestandardi kontsentreeritud lahus, c = 2,50 μmol/ml:
500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2728 g α-metüültrüptofaani (3.3) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat.
3.17. Trüptofaani ja sisestandardi kalibreerimisstandardlahus:
Võetakse 2,00 ml trüptofaani kontsentreeritud lahust (3.15) ja 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Lahjendatakse veega (3.1) ja metanooliga (3.8) umbes sama ruumalani ja umbes sama metanooli kontsentratsioonini (10–30 %), nagu on valmis hüdrolüsaadil.
Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
Valmistamise ajal vältida otsest päikesevalgust.
3.18. Äädikhape
3.19. 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanool
3.20. Etanoolamiin w (w/w) > 98 %
3.21. 1 grammi 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahus 100 ml metanoolis (3.8).
3.22. HPLC liikuv faas: 3,00 g äädikhapet (3.18) + 900 ml vett (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahust (3.21) 1g/100 ml metanoolis (3.8). Etanoolamiini (3.20) abil korrigeeritakse pH 5,00 -le. Täidetakse veega (3.1) 1 000 ml-ni.
4. Seadmed
4.1. HPLC-seadmed spektrofluorimeetrilise detektoriga
4.2. Vedelikkromatograafia kolonn, 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm, või samaväärne
4.3. pH-meeter
4.4. Laia kaela ja keeratava korgiga polüpropüleenkolb, maht 125 ml
4.5. Membraanfilter (0,45 μm)
4.6. Autoklaav, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1 ) bar
4.7. Mehaaniline loksuti või magnetsegur
4.8. Pöörissegaja
5. Töö käik
5.1. Proovide ettevalmistamine
Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.9).
5.2. Vaba trüptofaani määramine (ekstrakt)
Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml soolhapet (3.13), c = 0,1 mol/l, ja 5,00 ml kontsentreeritud sisestandardlahust (3.16). Raputatakse või segatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.7). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle keeduklaasi. Lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Naatriumhüdroksiidi (3.10) abil korrigeeritakse pH 3-le. Lisatakse piisavalt metanooli (3.8), et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 protsendini. Lahus viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kuni kromatograafiaks sobiva koguseni (umbes sama kogus kui kalibreerimisstandardlahusel (3.17)).
Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.
Standardlahust ja ekstrakte tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui ekstrakte ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva.
5.3. Trüptofaani üldsisalduse määramine (hüdrolüsaat).
0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1) kaalutakse 0,2 mg täpsusega polüropüleenkolbi (4.4). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse 8,4 g baariumhüdroksiidi oktahüdraati (3.4) ja 10 ml vett. Segatakse pöörissegajaga (4.8) või magnetseguriga (4.7). Tefloniga kaetud magnet jäetakse segusse. Nõu seinad loputatakse üle 4 ml veega. Keeratav kork pannakse peale ja kolb suletakse lõdvalt. Kolb pannakse autoklaavi (4.6) ja kuumutatakse keevas vees ja aurus 30–60 minutit. Autoklaav suletakse ja kuumutatakse 20 tundi 110 (±2) oC juures.
Enne autoklaavi avamist langetatakse temperatuur natuke alla 100 oC kraadi. Ba(OH)2 .8 H2O kristalliseerumise vältimiseks lisatakse soojale segule 30 ml toatemperatuuril olevat vett. Raputatakse või segatakse kergelt. Lisatakse 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Nõusid jahutatakse vee-/jäävannis 15 minutit.
Seejärel lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Nõu hoitakse jahutusvannis ja neutraliseeritakse segamisel HCl-iga (3.11) ning pH korrigeeritakse 3,0 -ni HCl (3.12) abil. Lisatakse piisavalt metanooli, et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 %ni. Viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kindla, kromatograafiaks sobiva ruumalani (näiteks 100 ml). Metanooli lisamine ei tohi tekitada sadenemist.
Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.
Standardlahust ja hüdrolüsaate tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui hüdrolüsaate ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva.
5.4. HPLC määramine
Soovitatakse juhinduda järgmistest isokraatilise elueerimise tingimustest. Muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused (vt ka tähelepanekuid 9.1 ja 9.2):
Vedelikkromatograafia kolonn (4.2): |
125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm või samaväärne |
Kolonni temperatuur: |
Ruumitemperatuur |
Liikuv faas (3.22): |
3,00 g äädikhapet (3.18) + 900 ml vett (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahust metanoolis (3.8) (1g/100ml). pH korrigeeritakse 5,00 -le etanoolamiini (3.20) abil. Täidetakse veega (3.1) 1 000 ml-ni. |
Voolukiirus: |
1 ml/min |
Summaarne voolutamisaeg: |
umbes 34 min |
Avastamise lainepikkus: |
ergastamine: 280 nm, emissioon: 356 nm. |
Sissesüstitav ruumala |
20 μl |
6. Tulemuste arvutamine
Arvutatakse trüptofaani (X) kogus grammides 100 g proovi kohta.
A |
= |
sisestandardi piipindala, kalibreerimisstandardlahus (3.17) |
B |
= |
trüptofaani piigipindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3) |
V1 |
= |
kalibreerimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kogus milliliitrites (2 ml) |
c |
= |
kalibreerimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kontsentratsioon, μmol/ml (= 2,50 ) |
V2 |
= |
kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites, mis on lisatud ekstraheerimisel (5.2) (= 5,00 ml) või hüdrolüsaadile (5.3) (= 2,00 ml) |
C |
= |
sisestandardi piigipindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3) |
D |
= |
trüptofaani piigipindala, kalibreerimisstandardlahus (3.17) |
V3 |
= |
kalibreerimisstandardlahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites (= 2,00 ml) |
m |
= |
proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud) |
M |
= |
trüptofaani molaarmass (= 204,23 g/mol) |
7. Korratavus
Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10 % suuremast tulemusest.
8. Ühisuuringu tulemused
Korraldati ühendusesisene ühisuurimine (neljas võrdlusuuring), mille käigus kuni 12 laborit analüüsisid hüdrolüüsimeetodi sertifitseerimiseks kolme proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:
|
Proov 1 Seasööt |
Proov 2 L-trüptofaaniga rikastatud seasööt |
Proov 3 Seasöödakontsentraat |
L |
12 |
12 |
12 |
n |
50 |
55 |
50 |
Keskmine g/kg |
2,42 |
3,40 |
4,22 |
sr [g/kg] |
0,05 |
0,05 |
0,08 |
r [g/kg] |
0,14 |
0,14 |
0,22 |
CVr [ %] |
1,9 |
1,6 |
1,9 |
SR [g/kg] |
0,15 |
0,20 |
0,09 |
R [g/kg] |
0,42 |
0,56 |
0,25 |
CVR [ %] |
6,3 |
6,0 |
2,2 |
L |
= |
tulemused esitanud laborite arv |
n |
= |
üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel) |
sr |
= |
korratavust iseloomustav standardhälve |
SR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
r |
= |
korratavus |
R |
= |
reprodutseeritavus |
CVr |
= |
korratavuse variatsioonikordaja, % |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, % |
Teise ühendusesisese ühisuurimise (kolmanda võrdlusuuringu) käigus analüüsisid kuni 13 laborit vaba trüptofaani ekstraheerimise meetodi sertifitseerimiseks kahte proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:
|
Proov 4 Nisu ja soja segu |
Proov 5 Nisu ja soja segu (= proov 4), millele on lisatud trüptofaani (0,457 g/kg) |
L |
12 |
12 |
n |
55 |
60 |
Keskväärtus g/kg |
0,391 |
0,931 |
sr [g/kg] |
0,005 |
0,012 |
r [g/kg] |
0,014 |
0,034 |
CVr [ %] |
1,34 |
1,34 |
SR [g/kg] |
0,018 |
0,048 |
R [g/kg] |
0,050 |
0,134 |
CVR [ %] |
4,71 |
5,11 |
L |
= |
tulemused esitanud laborite arv |
n |
= |
üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel) |
sr |
= |
korratavust iseloomustav standardhälve |
SR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
r |
= |
korratavus |
R |
= |
reprodutseeritavus |
CVr |
= |
korratavuse variatsioonikordaja, % |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, % |
Veel ühe ühendusesisese võrdlusuuringu käigus analüüsisid kuni seitse laborit trüptofaani hüdrolüüsi sertifitseerimise eesmärgiga nelja proovi. Tulemused on esitatud allpool. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5).
|
Proov 1 Sigade söödasegu (CRM 117) |
Proov 2 Väikese rasvasisaldusega kalajahu (CRM 118) |
Proov 3 Sojajahu (CRM 119) |
Proov 4 Lõssipulber (CRM 120) |
L |
7 |
7 |
7 |
7 |
n |
25 |
30 |
30 |
30 |
Keskväärtus g/kg |
2,064 |
8,801 |
6,882 |
5,236 |
sr [g/kg] |
0,021 |
0,101 |
0,089 |
0,040 |
r [g/kg] |
0,059 |
0,283 |
0,249 |
0,112 |
CVr [ %] |
1,04 |
1,15 |
1,30 |
0,76 |
SR [g/kg] |
0,031 |
0,413 |
0,283 |
0,221 |
R [g/kg] |
0,087 |
1,156 |
0,792 |
0,619 |
CVR [ %] |
1,48 |
4,69 |
4,11 |
4,22 |
L |
= |
tulemused esitanud laborite arv |
n |
= |
üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel) |
sr |
= |
korratavust iseloomustav standardhälve |
SR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
r |
= |
korratavus |
R |
= |
reprodutseeritavus |
CVr |
= |
korratavuse variatsioonikordaja, % |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, % |
9. Tähelepanekud
9.1. Järgmised kromatograafia eritingimused võivad tagada trüptofaani ja α-metüültrüptofaani parema eraldumise teineteisest.
Isokraatiline elueerimine, millele järgneb kolonni gradientpuhastus:
Vedelikkromatograafia kolonn: |
125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 μm või samaväärne |
||
Kolonni temperatuur: |
32 oC |
||
Liikuv faas: |
A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanool, 95+5 (V+V). B: Metanool |
||
Gradientprogramm: |
0 min |
100 % A |
0 % B |
|
15 min |
100 % A |
0 % B |
|
17 min |
60 % A |
40 % B |
|
19 min |
60 % A |
40 % B |
|
21 min |
100 % A |
0 % B |
|
33 min |
100 % A |
0 % B |
Voolukiirus: |
1,2 ml/min |
||
Summaarne voolutamisaeg: |
umbes 33 min |
9.2. Kromatograafiline määramine oleneb HPLC tüübist ja kasutatavast kolonnitäidisest. Valitud süsteem peab tagama trüptofaani ja sisestandardi piikide täieliku eraldumise (kuni alusjooneni). Lisaks sellele on oluline, et lagunemisproduktid eralduksid hästi trüptofaanist ja sisestandardist. Kolonni tuleb süstida hüdrolüsaate ilma sisestandardita, kontrollimaks, et sisestandardi piigi kohal ei moonutaks alusjoont lisandite väljumine. On oluline, et voolutamisaeg oleks piisavalt pikk kõigi lagunemisproduktide elueerimiseks, vastasel juhul võivad hiljem elueeruvad piigid segada järgnevaid kromatograafilisi määramisi.
Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma kontsentratsioonist lineaarselt. Tulemuste lineaarsust tuleks kontrollida sisestandardi konstantsel (normaalsel) kontsentratsioonil erinevate trüptofaani kontsentratsioonidega. On oluline, et nii trüptofaani kui ka sisestandardi piigid oleksid HPLC-/fluorestsentssüsteemi lineaarses alas. Kui trüptofaani või sisestandardi piigid on liiga väikesed või liiga suured, siis tuleks analüüsi korrata teistsuguse proovi suurusega ja/või teistsuguse lõppruumalaga.
9.3. Baariumhüdroksiid
Baariumhüdroksiidi lahustamine raskeneb baariumhüdroksiidi vananemisel. Selle tulemusel saadakse HPLC-ga määramiseks hägune lahus, mis võib vähendada trüptofaani määramisel saadavaid tulemusi.
H. TOORÕLI JA -RASVA MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
See meetod võimaldab määrata toorõli ja -rasva sisaldust söödas. See ei hõlma õliseemnete ja õliviljade analüüsi.
Allpool kirjeldatud kahe meetodi kasutamine sõltub sööda laadist ja koostisest ning analüüsi tegemise põhjusest.
1.1. Meetod A – otse ekstraheeritav toorõli ja -rasv
Seda meetodit kohaldatakse taimsete söödatoorainete puhul, välja arvatud meetodiga B hõlmatud ainete puhul.
1.2. Meetod B – kogu toorõli ja -rasv
Seda meetodit kohaldatakse loomsete söödatoorainete ja kõigi segajõusöötade puhul. Seda kasutatakse kõigi ainete puhul, millest ei ole ilma eelneva hüdrolüüsita võimalik õli ja rasva ekstraheerida (nt gluteenid, pärm, kartulivalgud ning tooted, mille puhul kasutatakse muu hulgas pressimist, helvestamist või kuumutamist).
1.3. Tulemuste tõlgendamine
Kõigil juhtudel, kui meetodiga B saadakse suurem tulemus kui meetodiga A, loetakse meetodiga B saadud tulemus õigeks väärtuseks.
2. Põhimõte
2.1. Meetod A
Proov ekstraheeritakse petrooleetriga. Solvent destilleeritakse välja ning jääk kuivatatakse ja kaalutakse.
2.2. Meetod B
Proovi töödeldakse kuumalt soolhappega. Segu jahutatakse ja filtreeritakse. Jääk pestakse, kuivatatakse ja määratakse vastavalt meetodile A.
3. Reaktiivid
3.1. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC. Broomiarv peab olema väiksem kui 1 ja aurustamise jääk alla 2 mg/100 ml.
3.2. Veevaba naatriumsulfaat.
3.3. Soolhape, c = 3 mol/l
3.4. Filteraine, nt Kieselguhr, Hyflo-supercel.
4. Seadmed
4.1. Ekstraheerimisaparaat. Kui see on varustatud sifooniga (Soxhleti aparaat), siis peab tagasivoolu kiirus olema selline, et tekiks umbes 10 tsüklit tunnis; kui aparaat on ilma sifoonita, siis peab tagasivoolu kiirus olema ligikaudu 10 ml minutis.
4.2. Ekstraheerimishülsid, milles ei ole petrooleetris lahustuvaid aineid ning mille poorsus vastab punkti 4.1 nõuetele.
4.3. Kuivatuskapp: kas vaakumkuivatuskapp, mis on seatud temperatuurile 75 ± 3 oC, või õhkkuivatuskapp, mis on seatud temperatuurile 100 ± 3 oC.
5. Töö käik
5.1. Meetod A (vt punkt 8.1)
5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse ekstraheerimishülssi (4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga.
Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (4.1) ja ekstraheeritakse petrooleetriga (3.1) kuus tundi. Petrooleetri ekstrakt kogutakse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid ( 9 ).
Solvent destilleeritakse välja. Jääk koos kolviga asetatakse poolteiseks tunniks kuivatuskappi (4.3) kuivama. Lastakse eksikaatoris jahtuda ning kaalutakse. Kuivatatakse veel 30 minutit, et veenduda, et õli ja rasva mass jääb samaks (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle).
5.2. Meetod B
2,5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega (vt punkt 8.2), pannakse 400 ml keeduklaasi või 300 ml Erlenmeyeri kolbi ning lisatakse 100 ml soolhapet (3.3) ja pimsskivitükke. Keeduklaas kaetakse kellaklaasiga või pannakse Erlenmeyeri kolbi külge püstjahuti. Segu kuumutatakse madala leegi või kuumutusplaadi kohal keemiseni ja keedetakse nõrgalt tund aega. Tuleb vältida toote sadestumist nõu seinte külge.
Jahutatakse ja lisatakse selline kogus filterainet (3.4), mis on piisav õli- ja rasvakao vältimiseks filtreerimisel. Lahus filtreeritakse läbi niisutatud rasvavaba kahekordse filterpaberi. Jääki pestakse külmas vees kuni filtraadi neutraalse reaktsioonini. Kontrollitakse, et filtraat ei sisalda õli ega rasva. Kui filtraat sisaldab õli või rasva, tuleb proov enne hüdrolüüsi petrooleetriga ekstraheerida, kasutades meetodit A.
Kahekordne filterpaber koos jäägiga asetatakse kellaklaasile ja kuivatatakse poolteist tundi ventileeritavas kuivatuskapis (4.3) 100 ± 3 oC juures.
Kahekordne filterpaber koos kuivjäägiga asetatakse ekstraheerimishülssi (4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga. Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (4.1) ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule.
6. Tulemuste väljendamine
Jäägi mass väljendatakse protsendimäärana proovist.
7. Korratavus
Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— absoluutväärtusena väljendatult 0,2 %, kui õli ja rasva üldsisaldus on alla 5 %;
— 4,0 % suuremast tulemusest, kui toorõli ja -rasva sisaldus on 5–10 %;
— absoluutväärtusena väljendatult 0,4 %, kui toorõli ja -rasva sisaldus on üle 10 %.
8. Tähelepanekud
8.1. Suure õli- ja rasvasisaldusega toodete puhul, mida on keeruline peenestada või millest ei saa võtta homogeenset vähendatud proovi, toimitakse järgmiselt.
20 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja segatakse vähemalt 10 g veevaba naatriumsulfaadiga (3.2). Segu ekstraheeritakse petrooleetriga (3.1) vastavalt punktile 5.1. Saadud ekstrakti täidetakse petrooleetriga (3.1) 500 ml-ni ja segatakse. 50 ml lahust pannakse väiksesse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid (1). Solvent destilleeritakse välja, segu kuivatatakse ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 viimasele lõigule.
Hülssi jäänud ekstraheerimisjäägist eemaldatakse solvent, peenestatakse jääk 1 mm osakesteks, pannakse see tagasi ekstraheerimishülssi (ilma naatriumsulfaati lisamata) ning jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule.
Õli- ja rasvasisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:
(10m1 + m2) × 5
kus:
m1 |
= |
jäägi mass grammides pärast esimest ekstraheerimist (alikvootne osa ekstraktist), |
m2 |
= |
jäägi mass grammides pärast teist ekstraheerimist. |
8.2. Väikese õli- ja rasvasisaldusega toodete puhul võib uuritava proovi massi suurendada 5 grammini.
8.3. Suure veesisaldusega lemmikloomatoite võib olla vaja segada veevaba naatriumsulfaadiga enne hüdrolüüsi ja ekstraheerimist vastavalt meetodile B.
8.4. Punktis 5.2 võib olla tõhusam kasutada jäägi pesemiseks pärast filtreerimist külma vee asemel sooja vett.
8.5. Mõne sööda puhul võib olla vaja pikendada 1,5tunnist kuivamisaega. Tuleb vältida liigset kuivatamist, kuna see võib põhjustada madalaid tulemusi. Kasutada võib ka mikrolaineahju.
8.6. Kui toorõli ja -rasva sisaldus on üle 15 %, on soovitatav proov enne hüdrolüüsi ekstraheerida meetodi A järgi ning uuesti ekstraheerida meetodi B järgi. Mingil määral sõltub see sööda ja selles leiduva õli ning rasva laadist.
I. KOGUKIU MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata söödas happelises ja leeliselises keskkonnas lahustumatuid rasvavabu orgaanilisi aineid, mida harilikult nimetatakse kogukiuks.
2. Põhimõte
Proovi, mis on vajaduse korral rasvatustatud, töödeldakse mitu korda järjest teatava kontsentratsiooniga väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi keevate lahustega. Jääk eraldatakse filtreerimise abil paagutatud klaasfiltril ning pestakse, kuivatatakse, kaalutakse ja tuhastatakse temperatuuril vahemikus 475–500 oC. Tuhastamisest tulenev massikadu vastab uuritavas proovis sisalduvale kogukiule.
3. Reaktiivid
3.1. Väävelhape, c = 0,13 mol/l
3.2. Vahutamisvastane aine (nt n-oktanool)
3.3. Filteraine (Celite 545 või samaväärne toode), mida soojendatakse temperatuuril 500 oC neli tundi (8.6)
3.4. Atsetoon
3.5. Petrooleeter, keemistemperatuur 40–60 oC
3.6. Soolhape, c = 0,5 mol/l
3.7. Kaaliumhüdroksiidi lahus, c = 0,23 mol/l
4. Seadmed
4.1. Väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi lahusega lagundamiseks mõeldud kuumutusseade, mis on varustatud filtertiigli (4.2) toe ja äravoolutoruga, millel on klapp vedeliku väljavoolu peatamiseks ja võimaluse korral suruõhuga tekitatud vaakum. Iga päev eelkuumutatakse seadet enne kasutamist keeva veega viis minutit.
4.2. Paagutatud kvartsklaasist filterplaadiga klaasist filtertiigel, poori suurus 40–90 μm. Enne esimest kasutamist kuumutatakse mõni minut kuni temperatuurini 500 oC ja jahutatakse (8.6).
4.3. Püstjahutiga vähemalt 270 ml silinder, mis sobib keetmiseks.
4.4. Termostaadiga kuivatuskapp.
4.5. Termostaadiga muhvelahi.
4.6. Ekstraheerimisseade, mis koosneb filtertiigli (4.2) tugiplaadist ja väljalasketorust, millel on klapp vaakumi ja vedeliku väljavoolu peatamiseks.
4.7. Ühendusrõngad kuumutusseadme (4.1), tiigli (4.2) ja silindri (4.3) ühendamiseks ning külmekstraheerimisseadme (4.6) ja tiigli ühendamiseks.
5. Töö käik
1 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse see tiiglisse (4.2) (vt tähelepanekud 8.1, 8.2 ja 8.3) ning lisatakse 1 g filterainet (3.3).
Kuumutusseade (4.1) ja filtertiigel (4.2) ühendatakse ning seejärel kinnitatakse silinder (4.3) tiigli külge. 150 ml keevat väävelhapet (3.1) valatakse ühendatud silindrisse ja tiiglisse ning vajadusel lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (3.2).
Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit.
Väljalasketoru (4.1) klapp avatakse, väävelhape filtreeritakse vaakumitingimustel läbi filtertiigli ning jääki pestakse kolm korda järjest 30 ml keeva veega, tagades, et pärast iga pesemist filtreeritakse jääk kuivaks.
Äravooluklapp suletakse ning ühendatud silindrisse ja tiiglisse valatakse 150 ml keevat kaaliumhüdroksiidi lahust (3.7) ning lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (3.2). Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit. Filtreeritakse ja korratakse pesemisprotseduuri, mida kasutati väävelhappe juures.
Pärast lõplikku pesemist ja kuivatamist ühendatakse tiigel ja selle sisu lahti ning ühendatakse see külmekstraheerimisseadmega (4.6). Jääki pestakse tiiglis vaakumitingimustel kolm korda järjest 25 ml atsetooniga (3.4), tagades, et pärast iga pesemist filtreeritakse jääk kuivaks.
Tiigel kuivatakse püsikaaluni kuivatuskapis temperatuuril 130 oC. Pärast iga kuivatamist jahutatakse tiiglit eksikaatoris ja kaalutakse kiiresti. Tiigel asetatakse muhvelahju ja tuhastatakse püsikaaluni (massikadu peab kahe järjestikuse kaalumise vahel olema 2 mg või alla selle) temperatuuril 475 oC kuni 500 oC vähemalt 30 minutit.
Pärast iga kuumutamist jahutatakse tiiglit enne kaalumist kõigepealt ahjus ja seejärel eksikaatoris.
Teostatakse ilma proovita pimekatse. Tuhastamisest tingitud massikadu ei tohi olla üle 4 mg.
6. Tulemuste arvutamine
Kogu kiu sisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:
kus:
m |
= |
proovi mass grammides; |
m0 |
= |
massikadu pärast tuhastamist määramise ajal, grammides; |
m1 |
= |
massikadu pärast tuhastamist pimekatse ajal, grammides. |
7. Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— absoluutväärtuses väljendatult 0,6 %, kui kogukiu sisaldus on alla 10 %;
— 6 % suuremast tulemusest, kui kogukiu sisaldus on 10 % või suurem.
8. Tähelepanekud
8.1. Sööt, mis sisaldab üle 10 % rasva, tuleb enne analüüsimist petrooleetriga (3.5) rasvatustada. Filtertiigel (4.2) ja selle sisu ühendatakse külmekstraheerimisseadmega (4.6) ja pestakse jääki vaakumitingimustel kolm korda järjest 30 ml petrooleetriga, tagades, et jääk oleks kuiv. Tiigel ja selle sisu ühendatakse kuumutusseadmega (4.1) ja jätkatakse vastavalt punktile 5.
8.2. Sööt, mis sisaldab rasva ja mida ei saa ekstraheerida petrooleetriga (3.5) otse, tuleb rasvatustada vastavalt punktile 8.1 ja rasvatustada veel üks kord pärast happega keetmist. Pärast happega keetmist ja järgnevat pesemist ühendatakse tiigel ja selle sisu külmekstraheerimisseadmega (4.6) ja pestakse jääki kolm korda järjest 30 ml atsetooniga ning seejärel veel kolm korda 30 ml petrooleetriga. Filtreeritakse vaakumitingimustel kuivaks ja jätkatakse analüüsi vastavalt punktile 5, alustades töötlemisest kaaliumhüdroksiidiga.
8.3. Kui sööt sisaldab üle 5 % karbonaati, mis on väljendatud kaltsiumkarbonaadina, ühendatakse tiigel (4.2) kaalutud prooviga kuumutusseadme (4.1) külge. Proovi pestakse kolm korda 30 ml soolhappega (3.6). Pärast iga lisamist lastakse proovil seista umbes üks minut enne filtreerimist. Pestakse üks kord 30 ml veega ja jätkatakse seejärel vastavalt punktile 5.
8.4. Kui kasutatakse statiivitaolist seadet (mitu tiiglit on kinnitatud sama kuumutusseadme külge), ei või sama analüüsitava proovi suhtes teostada kahte üksikut määramist samas sarjas.
8.5. Kui pärast keetmist on raske filtreerida happelisi ja aluselisi lahuseid, kasutatakse kuumutusseadme väljalasketoru kaudu lastavat suruõhku ja jätkatakse seejärel filtreerimist.
8.6. Tuhastamistemperatuur ei tohi olla üle 500 oC, et pikendada klaasfiltertiiglite eluaega. Tuleb jälgida, et kuumutus- ja jahutustsüklite ajal ei tekiks liigset termolööki.
J. SUHKRU MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata redutseerivate suhkrute hulka ja pärast inversiooni üldsuhkru hulka, väljendatuna glükoosina või sõltuvalt olukorrast sahharoosina, kasutades ümberarvestustegurit 0,95 . Seda meetodit kasutatakse segajõusöötade puhul. Muude söötade puhul on sätestatud erimeetodid. Vajaduse korral tuleb laktoosi hulk mõõta eraldi ja tulemuste arvutamisel seda arvesse võtta.
2. Põhimõte
Suhkrud ekstraheeritakse lahjendatud etanoolis; lahus selitatakse Carrezi lahustega I ja II. Pärast etanooli eemaldamist määratakse kogused enne ja pärast inversiooni Luff-Schoorli meetodi abil.
3. Reaktiivid
3.1. 40 % etanoolilahuse (v/v) tihedus: 0,948 g/ml 20 oC juures, fenoolftaleiini suhtes neutraalne
3.2. Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn (CH3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikat. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.3. Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.4. Metüüloranž, 0,1 % lahus (w/v)
3.5. Soolhape, 4 mol/l
3.6. Soolhape, 0,1 mol/l.
3.7. Naatriumhüdroksiidi lahus, 0,1 mol/l
3.8. Luff-Schoorli reaktiiv
Ettevaatlikult segades valatakse sidrunhappe lahus (3.8.2) naatriumkarbonaadi lahusesse (3.8.3). Lisatakse vasksulfaadi lahus (3.8.1) ja ja täidetakse veega 1 liitrini. Lastakse öö läbi settida ja filtreeritakse.
Selliselt saadud reaktiivi kontsentratsioooni (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l) kontrollitakse, vt punkti 5.4 viimast lõiku. Lahuse pH on umbes 9,4 .
3.8.1. Vasksulfaadi lahus: 25 g rauavaba vasksulfaati (Cu SO4 5H2O) lahustatakse 100 ml vees.
3.8.2. Sidrunhappe lahus: 50 g sidrunhapet (C6H8O7 · H2O) lahustatakse 50 ml vees.
3.8.3. Naatriumkarbonaadi lahus: 143,8 g veevaba naatriumkarbonaati lahustatakse umbes 300 ml soojas vees. Jahutatakse.
3.9. Naatriumtiosulfaadilahus, 0,1 mol/l
3.10. Tärkliselahus: 1 liitrile keevale veele lisatakse 5 g lahustuva tärklise ja 30 ml vee segu. Keedetakse kolm minutit, lastakse jahtuda ja vajaduse korral lisatakse säilitusainena 10 mg elavhõbejodiidi.
3.11. Väävelhape, 3 mol/l
3.12. Kaaliumjodiidi lahus, 30 % (w/v)
3.13. Pimsskivigraanulid, mis on keedetud soolhappes, pestud vees ning kuivatatud
3.14. 3-metüülbutaan-1-ool
4. Seadmed
Segisti (trummel): umbes 35 kuni 40 p/min.
5. Töö käik
5.1. Proovi ekstraheerimine
2,5 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 250 ml mõõtekolbi. Lisatakse 200 ml etanooli (3.1) ning segatakse trumlis tund aega. Lisatakse 5 ml Carrezi lahust I (3.2) ja segatakse umbes 30 sekundit. Lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.3) ja segatakse veel üks minut. Täidetakse etanooliga (3.1) märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse. Eemaldatakse 200 ml filtraati ja aurustatakse ligikaudu poole mahuni, et vabaneda enamikust etanoolist. Aurustamise jääk kantakse sooja vett kasutades kvantitatiivselt 200 ml mõõtekolbi, jahutatakse, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja vajaduse korral filtreeritakse. Seda lahust kasutatakse redutseerivate suhkrute hulga ja pärast inversiooni üldsuhkru hulga määramiseks.
5.2. Redutseerivate suhkrute määramine
Pipetiga eemaldatakse kuni 25 ml lahust, mis sisaldab alla 60 mg redutseerivaid suhkruid, mis on väljendatud glükoosina. Vajaduse korral täidetakse destilleeritud veega 25 ml-ni ja määratakse redutseerivate suhkrute hulk Luff-Schoorli meetodi abil. Tulemus väljendatakse glükoosisisalduse protsendimäärana proovist.
5.3. Üldsuhkru määramine pärast inversiooni
Pipetiga võetakse 50 ml lahust ja kantakse see 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse mõni tilk metüüloranži lahust (3.4) ning seejärel lisatakse hoolikalt ja samal ajal pidevalt segades soolhapet (3.5), kuni vedelik värvub selgelt punaseks. Lisatakse 15 ml soolhapet (3.6), asetatakse kolb tugevalt keeva veega vanni ning hoitakse seal 30 minutit. Jahutatakse kiiresti umbes 20 oC-ni ja lisatakse 15 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.7). Täidetakse veega 100 ml-ni ja homogeenitakse. Eemaldatakse kuni 25 ml lahust, mis sisaldab alla 60 mg redutseerivaid suhkruid, mis on väljendatud glükoosina. Vajaduse korral täidetakse destilleeritud veega 25 ml-ni ja määratakse redutseerivate suhkrute hulk Luff-Schoorli meetodi abil. Tulemus väljendatakse glükoosi protsendimäärana või sõltuvalt olukorrast sahharoosi protsendimäärana, korrutades tulemuse teguriga 0,95 .
5.4. Tiitrimine Luff-Schoorli meetodi järgi
Pipetiga võetakse 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.8) ja kantakse see 300 ml Erlenmeyeri kolbi; lisatakse täpselt 25 ml selitatud suhkrulahust. Lisatakse 2 pimsskivigraanulit (3.13), kuumutatakse käsitsi segades keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja segu kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Erlenmeyeri kolb asetatakse viivitamatult asbestkattega traatvõrgule, milles on umbes 6 cm läbimõõduga auk ning mille all on eelnevalt süüdatud leek. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutataks üksnes Erlenmeyeri kolvi põhja. Erlenmeyeri kolvi külge pannakse püstjahuti. Keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitritakse järgmiselt.
Lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.12) ja kohe seejärel lisatakse (intensiivse vahutamise ohu tõttu ettevaatlikult) 25 ml väävelhapet (3.11). Tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (3.9) kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, lisatakse tärkliseindikaator (3.10) ja viiakse tiitrimine lõpule.
Sama tiitrimine ilma keetmata tehakse seguga, milles on täpselt mõõdetud 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.8) ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.12) ja 25 ml väävelhapet (3.11).
6. Tulemuste arvutamine
Tabeli abil määratakse glükoosi hulk milligrammides, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel väljendatuna naatriumtiosulfaadi milligrammides (0,1 mol/l). Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.
7. Erimenetlused
7.1. Melassirikaste söötade ja muude mitte eriti homogeensete söötade puhul kaalutakse 20 g proovi ja pannakse see 500 ml veega üheliitrisse mõõtekolbi. Segatakse trumlis tund aega. Selitatakse Carrezi lahustega I (3.2) ja II (3.3) punkti 5.1 kohaselt, kasutades sealjuures iga reaktiivi neljakordset kogust. Täidetakse kuni märgini 80 % etanooliga (v/v).
Homogeenitakse ja filtreeritakse. Etanool eemaldatakse punkti 5.1 kohaselt. Kui dekstriinitud tärklist ei ole, täidetakse destilleeritud veega kuni märgini.
7.2. Suhkrurikaste, kuid praktiliselt tärklisevabade melasside ja söödatoorainete puhul (jaanikaunad, kuivatatud peedipealsed jne) kaalutakse 5 g proovi, pannakse see 250 ml mõõtekolbi, lisatakse 200 ml destilleeritud vett ja segatakse trumlis tund aega või vajaduse korral kauem. Selitatakse Carrezi lahustega I (3.2) ja II (3.3) punkti 5.1 kohaselt. Täidetakse külma veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse. Üldsuhkru hulga määramiseks jätkatakse vastavalt punktile 5.3.
8. Tähelepanekud
8.1. Vahutamise vältimiseks on soovitatav lisada (proovi kogusest sõltumatult) umbes 1 ml 3-metüülbutaan-1-ooli (3.14) enne keetmist Luff-Schoorli reaktiiviga.
8.2. Sahharoosisisalduse protsendimäär on glükoosina väljendatud inversioonijärgse üldsuhkrute sisalduse ja glükoosina väljendatud redutseerivate suhkrute sisalduse vahe, mis on korrutatud 0,95 -ga.
8.3. Redutseerivate suhkrute (v.a laktoosi) sisalduse määramiseks võib kasutada kahte meetodit:
8.3.1. Ligikaudseks arvutamiseks korrutatakse muu meetodi abil saadud laktoosisisaldus 0,675 ga ja lahutatakse saadud tulemus redutseerivate suhkrute sisaldusest.
8.3.2. Redutseerivate suhkrute (v.a laktoosi) täpseks arvutamiseks tuleb sama prooviga teha kaks lõplikku määramist. Üks analüüs tehakse punkti 5.1 kohaselt saadud lahuse ühe osaga, teine analüüs sellise lahuse ühe osaga, mis on saadud laktoosi määramise käigus selleks ettenähtud meetodiga (pärast muude suhkruliikide fermenteerimist ja selitamist).
Mõlemal juhul määratakse proovis sisalduv suhkur Luff-Schoorli meetodi abil ja arvutatakse glükoosi milligrammideks. Üks väärtus lahutatakse teisest ja vahe väljendatakse protsendimäärana proovist.
Näide
Võetud kogused vastavad mõlema määramise puhul 250 mg massiga proovile.
Esimesel juhul tarbitakse 17 ml naatriumtiosulfaadi lahust (0,1 mol/l), mis vastab 44,2 mg glükoosile; teisel juhul tarbitakse 11 ml, mis vastab 27,6 mg glükoosile.
Vahe on 16,6 mg glükoosi.
Redutseerivate suhkrute (v.a laktoosi) sisaldus glükoosiks arvutatuna on seega:
Väärtuste tabel 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi jaoks
ml Na2 S2 O3 (0,1 mol/l) pärast kahte minutit kuumutamist ja 10 minutit keetmist
Na2 S2 O3 0,1 mol/l |
Glükoos, fruktoos invertsuhkrud C6 H12 O6 |
Laktoos C12 H22 O11 |
Maltoos C12 H22 O11 |
Na2 S2 O3 0,1 mol/l |
|||
ml |
mg |
vahe |
mg |
vahe |
mg |
vahe |
ml |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 |
2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 |
2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 |
3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 |
3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 |
3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6 |
3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6 |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 |
K. LAKTOOSI MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata laktoosi taset söödas, mis sisaldab laktoosi üle 0,5 %.
2. Põhimõte
Suhkrud lahustatakse vees. Lahus kääritatakse Saccharomyces cerevisiae pärmiga, mis jätab laktoosi esialgsele kujule. Pärast selitamist ja filtreerimist määratakse filtraadi laktoosisisaldus Luff-Schoorli meetodi abil.
3. Reaktiivid
3.1. Saccharomyces cerevisiae suspensioon: 25 g värsket pärmi suspendeeritakse 100 ml vees. Suspensioon säilib külmikus kõige rohkem ühe nädala.
3.2. Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3 COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikat. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.3. Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.4. Luff-Schoorli reaktiiv
Ettevaatlikult segades valatakse sidrunhappe lahus (3.4.2) naatriumkarbonaadi lahusesse (3.4.3). Lisatakse vasksulfaadi lahus (3.4.1) ja täidetakse veega 1 liitrini. Lastakse öö läbi settida ja filtreeritakse. Selliselt saadud reaktiivi kontsentratsioooni (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 2 mol/l). Lahuse pH on umbes 9,4 .
3.4.1. Vasksulfaadi lahus: 25 g rauavaba vasksulfaati (Cu SO4 5H2O) lahustatakse 100 ml vees.
3.4.2. Sidrunhappe lahus: 50 g sidrunhapet (C6H8O7 · H2O) lahustatakse 50 ml vees.
3.4.3. Naatriumkarbonaadi lahus: 143,8 g veevaba naatriumkarbonaati lahustatakse umbes 300 ml soojas vees. Jahutatakse.
3.5. Pimsskivigraanulid, mis on keedetud soolhappes, pestud vees ning kuivatatud.
3.6. Kaaliumjodiidi lahus, 30 % (w/v)
3.7. Väävelhape, 3 mol/l.
3.8. Naatriumtiosulfaadi lahus, 0,1 mol/l.
3.9. Tärkliselahus: 1 liitrile keevale veele lisatakse 5 g lahustuva tärklise ja 30 ml vee segu. Keedetakse kolm minutit, lastakse jahtuda ja vajaduse korral lisatakse säilitusainena 10 mg elavhõbejodiidi.
4. Seadmed
Temperatuurile 38–40 oC seatud termostaadiga veevann.
5. Töö käik
1 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse selline kogus proovi 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25–30 ml vett. Kolb asetatakse kolmekümneks minutiks keeva vee vanni ning jahutatakse seejärel umbes 35 oC-ni. Lisatakse 5 ml pärmisuspensiooni (3.1) ja homogeenitakse. Lastakse kolvil seista kaks tundi veevannis temperatuuril 38–40 oC. Jahutatakse umbes 20 oC-ni.
Lisatakse 2,5 ml Carrezi lahust I (3.2) ja segatakse 30 sekundit, seejärel lisatakse 2,5 ml Carrezi lahust II (3.3) ja segatakse veel 30 sekundit. Täidetakse veega 100 milliliitrini, segatakse ja filtreeritakse. Pipetiga eemaldatakse filtraadikogus, mis ei ületa 25 ml ja mis soovitavalt sisaldab 40–80 mg laktoosi, ning kantakse see 300 ml Erlenmeyeri kolbi. Vajaduse korral täidetakse veega 25 ml-ni.
5 ml pärmisuspensiooniga (3.1) tehakse samal viisil pimekatse. Laktoosisisaldus määratakse Luff-Schoorli meetodi abil järgmiselt: lisatakse täpselt 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.4) ja kaks pimsskivigraanulit (3.5). Segatakse käsitsi keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja segu kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Erlenmeyeri kolb asetatakse viivitamatult asbestkattega traatvõrgule, milles on umbes 6 cm läbimõõduga auk ning mille all on eelnevalt süüdatud leek. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutataks üksnes Erlenmeyeri kolvi põhja. Erlenmeyeri kolvi külge pannakse püstjahuti. Keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitritakse järgmiselt.
Lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.6) ja kohe seejärel lisatakse (intensiivse vahutamise ohu tõttu ettevaatlikult) 25 ml väävelhapet (3.7). Tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (3.8) kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, lisatakse tärkliseindikaator (3.9) ja viiakse tiitrimine lõpule.
Sama tiitrimine ilma keetmata tehakse seguga, milles on täpselt mõõdetud 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.4) ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.6) ja 25 ml väävelhapet (3.7).
6. Tulemuste arvutamine
Juuresoleva tabeli abil määratakse laktoosi hulk milligrammides, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel väljendatuna naatriumtiosulfaadi milligrammides (0,1 mol/l).
Veevabale laktoosile vastav tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.
7. Tähelepanek
Toodete puhul, mis sisaldavad üle 40 % fermenteeritavat suhkrut, kasutatakse rohkem kui 5 ml pärmisuspensiooni (3.1).
Väärtuste tabel 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi jaoks
ml Na2 S2 O3 (0,1 mol/l) pärast kahte minutit kuumutamist ja 10 minutit keetmist
Na2 S2 O3 0,1 mol/l |
Glükoos, fruktoos invertsuhkrud C6 H12 O6 |
Laktoos C12 H22 O11 |
Maltoos C12 H22 O11 |
Na2 S2 O3 0,1 mol/l |
|||
ml |
mg |
vahe |
mg |
vahe |
mg |
vahe |
ml |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 |
2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 |
2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 |
3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 |
3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 |
3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6 |
3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6 |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 |
L. TÄRKLISE MÄÄRAMINE
POLARIMEETRILINE MEETOD
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodi abil on võimalik kindlaks määrata tärklise ja suure molekulmassiga tärklise lagunemisproduktide taset söödas, et kontrollida deklareeritud energiasisalduse (VII lisa sätted) ja nõukogu direktiivi 96/25/EÜ ( 10 ) järgimist.
2. Põhimõte
Meetod hõlmab kahte määramist. Esimese puhul töödeldakse proovi lahjendatud soolhappega. Pärast selitamist ja filtreerimist mõõdetakse polarimeetrilisel teel lahuse optiline pöörang.
Teise määramise puhul ekstraheeritakse proovi 40 % etanooliga. Pärast filtraadi hapestamist soolhappega, selitamist ja filtreerimist mõõdetakse lahuse optiline pöörang esimese määramisega analoogsel viisil.
Proovi tärklisesisaldus saadakse nimetatud kahe määramise vahe korrutamisel teadaoleva koefitsiendiga.
3. Reaktiivid
3.1. Soolhappe 25 % lahus (w/w), tihedus: 1,126 g/ml
3.2. Soolhappe 1,13 % lahus, (w/v)
Kontsentratsiooni tuleb kontrollida tiitrimise teel, kasutades 0,1 mol/l naatriumhüdroksiidi lahust koos 0,1 % (w/v) metüülpunasega 94 % etanoolis (v/v). 10 ml neutraliseerimiseks on vaja 30,94 ml NaOH (0,1 mol/l).
3.3. Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikat. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.4. Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4 Fe(CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.5. Etanooli 40 % lahus (v/v), tihedus: 0,948 g/ml 20 oC juures
4. Seadmed
4.1. Standardse lihvühenduse ja püstjahutiga 250 ml Erlenmeyeri kolb.
4.2. Polarimeeter või sahharimeeter.
5. Töö käik
5.1. Proovi ettevalmistamine
Peenestada proov nii, et see läbib täielikult 0,5 mm ümaravadega sõela.
5.2. Polarisatsioonitasandi optilise kogupöörangu (P või S) määramine (vt tähelepanek 7.1)
2,5 g peenestatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ning pannakse see 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25 ml soolhapet (3.2), loksutatakse proovi ühtlase jaotumise saavutamiseks ning lisatakse veel 25 ml soolhapet (3.2). Kolb asetatakse keeva vee vanni, loksutades seda esimesed kolm minutit tugevasti ja ühtlaselt, et vältida klompide teket. Vannis peab olema piisavalt vett, et vesi säilitaks kolvi vanni asetamisel keemistemperatuuri. Kolbi ei tohi loksutamise ajal vannist välja võtta. Täpselt 15 minuti möödudes võetakse kolb vannist välja, lisatakse 30 ml külma vett ja jahutatakse otsekohe temperatuurini 20 oC.
Lisatakse 5 ml Carrezi lahust I (3.3) ja loksutatakse umbes 30 sekundit. Seejärel lisatakse 5 ml Carrezi II lahust (3.4) ja jätkatakse loksutamist veel 30 sekundi jooksul. Täidetakse veega märgini, segatakse ja filtreeritakse. Kui filtraat ei ole täiesti selge (seda juhtub harva), korratakse määramist, kasutades rohkem Carrezi I ja II lahust (näiteks 10 ml).
Lahuse optiline pöörang mõõdetakse 200 mm torus polarimeetri või sahharimeetri abil.
5.3. 4 % etanoolis lahustuvate ainete optilise pöörangu (P' või S') määramine
5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse see 100 ml mõõtekolbi ning lisatakse umbes 80 ml etanooli (3.5) (vt tähelepanek 7.2). Kolb jäetakse üheks tunniks toatemperatuurile seisma; selle aja jooksul loksutatakse kolbi kuus korda tugevasti, nii et proov seguneks põhjalikult etanooliga. Täidetakse etanooliga (3.5) märgini, segatakse ja filtreeritakse.
50 ml filtraati (vastab 2,5 g proovile) pipetitakse 250 ml Erlenmeyeri kolbi, lisatakse 2,1 ml soolhapet (3.1) ja loksutatakse tugevasti. Püstjahuti ühendatakse Erlenmeyeri kolviga ja kolb asetatakse keeva vee vanni. Täpselt 15 minuti möödudes eemaldatakse Erlenmeyeri kolb vannist, viiakse selle sisu 100 ml mõõtekolbi, loputatakse vähese külma veega ja jahutatakse temperatuurini 20 oC.
Selitatakse Carrezi I (3.3) ja II (3.4) lahuse abil, täidetakse veega märgini, segatakse, filtreeritakse ja mõõdetakse optiline pöörang punkti 5.2 teises ja kolmandas lõigus kirjeldatud viisil.
6. Tulemuste arvutamine
Tärklisesisaldus (%) arvutatakse järgmiselt:
6.1. Mõõtmine polarimeetriga
P |
= |
optiline kogupöörang kraadides |
P’ |
= |
40 % etanoolis (v/v) lahustuvate ainete optiline pöörang kraadides; |
|
= |
puhta tärklise optiline eripöörang. Selle teguri puhul tavaliselt aktsepteeritavad arvulised väärtused on järgmised:
|
6.2. Mõõtmine sahharimeetriga
S |
= |
optiline kogupöörang sahharimeetri kraadides |
S' |
= |
40 % etanoolis (v/v) lahustuvate ainete optiline pöörang sahharimeetri kraadides |
N |
= |
sahharoosi mass (grammides) 100 ml vees, mis annab optiliseks pööranguks 100 sahharimeetri kraadi, kui mõõtmisel kasutatakse 200 mm toru: 16,29 g prantsuse sahharimeetrite puhul; 26,00 g saksa sahharimeetrite puhul; 20,00 g muude sahharimeetrite puhul; = puhta tärklise optiline eripöörang (vt punkt 6.1). |
6.3. Korratavus
Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevuse absoluutväärtus ei tohi alla 40 % tärklisesisalduse puhul ületada 0,4 ning suhteline erinevus 40 % või suurema tärklisesisalduse puhul 1 %.
7. Tähelepanekud
7.1. Kui proov sisaldab üle 6 % karbonaate, arvutatuna kaltsiumkarbonaadina, tuleb need enne optilise kogupöörangu määramist täpselt sobiva koguse lahjendatud väävelhappega töödeldes lagundada.
7.2. Suure laktoosisisaldusega toodete, näiteks pulbrilise piimavadaku või lõssipulbri puhul tuleb pärast 80 ml etanooli (3.5) lisamist toimida järgmiselt. Kolviga ühendatakse püstjahuti ning kolb asetatakse 30 minutiks 50 oC veevanni. Lastakse maha jahtuda ja jätkatakse analüüsi punktis 5.3 kirjeldatud viisil.
7.3. Järgmised söödatoorained võivad juhul, kui neid sisaldub loomasöödas märkimisväärses koguses, polarimeetrilise meetodiga tärklisesisalduse määramisel esile kutsuda häireid, mis võivad viia ebaõigetele tulemustele:
— (suhkru)peedisaadused, näiteks (suhkru)peedipulp, (suhkru)peedimelass, melasseeritud (suhkru)peedipulp, (suhkru)peedimelassi raba, (peedi)suhkur;
— tsitruspulp;
— linaseeme; linakook; linasrott;
— rapsiseeme; rapsikook; rapsisrott; rapsiseemnekestad;
— päevalilleseemned; päevalillesrott; osaliselt kooritud päevalillesrott;
— koprakook; koprasrott;
— kartulipulp;
— veetustatud pärm;
— inuliinirikkad tooted (nt maapirniliistakud või -jahu);
— rasvakõrned
M. KOGUTUHA MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata sööda kogutuha sisaldust.
2. Põhimõte
Proov tuhastatakse 550 oC juures; jääk kaalutakse.
3. Reaktiivid
Ammooniumnitraadi 20 % lahus (w/v)
4. Seadmed
4.1. Kuumutusplaat.
4.2. Elektriline termostaadiga muhvelahi.
4.3. Nelinurksed (umbes 60 × 40 × 25 mm) või ümmargused (läbimõõt: 60–75 mm, kõrgus: 20–40 mm) kvarts-, portselan- või plaatinatiiglid tuhastamiseks.
5. Töö käik
Umbes 5 g proovi (toodete puhul, millel on kalduvus paisuda, 2,5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse tuhastamistiiglisse, mis on eelnevalt kuumutatud temperatuurini 550 oC, maha jahutatud ja tareeritud. Tiigel asetatakse kuumutusplaadile ja kuumutatakse järk-järgult kuni aine söestumiseni. Tuhastatakse vastavalt punktile 5.1 või 5.2.
5.1. Tiigel asetatakse taadeldud muhvelahju, mis on seatud temperatuurile 550 oC. Tiiglit hoitakse sel temperatuuril, kuni tekib valge, helehall või punakas tuhk, milles ei paista söeosakesi. Tiigel asetatakse eksikaatorisse, lastakse jahtuda ning kaalutakse viivitamata.
5.2. Tiigel asetatakse taadeldud muhvelahju, mis on seatud temperatuurile 550 oC. Tuhastatakse 3 tundi. Tiigel asetatakse eksikaatorisse, lastakse jahtuda ning kaalutakse viivitamata. Tuhastatakse veel 30 minutit, et veenduda, et tuha mass jääb samaks (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema väiksem kui 1 mg).
6. Tulemuste arvutamine
Jäägi massi arvutamiseks lahutatakse nõu mass.
Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.
7. Tähelepanekud
7.1. Raskesti tuhastatavate ainete tuhka tuleb eelnevalt tuhastada vähemalt kolm tundi, seejärel jahutada ja lisada mõned tilgad 20 % ammooniumnitraadi lahust või vett (ettevaatlikult, et vältida tuha hajumist ja tompude tekkimist). Pärast kuivatuskapis kuivatamist jätkatakse kaltsineerimist. Korratakse seni, kuni aine on täielikult tuhastunud.
7.2. Ainete puhul, mille puhul punktis 7.1 kirjeldatud meetod ei anna tulemust, toimitakse järgmiselt: pärast kolmetunnilist tuhastamist pannakse tuhk sooja vette ja filtreeritakse läbi väikese tuhavaba filtri. Filter ja selle sisu tuhastatakse esialgses tiiglis. Filtraat pannakse jahtunud tiiglisse, aurustatakse kuivaks, tuhastatakse ja kaalutakse.
7.3. Õlide ja rasvade puhul pannakse sobiva suurusega tiiglisse 25 g suurune täpselt kaalutud proov. Aine süüdatakse tuhavaba filterpaberi ribaga ja söestatakse. Pärast põlemist niisutatakse võimalikult vähese veega. Kuivatatakse ja tuhastatakse punkti 5 kohaselt.
N. SOOLHAPPES LAHUSTUMATU TUHA MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata soolhappes lahustumatute mineraalainete taset söödas. Proovi laadist sõltuvalt võib kasutada kahte meetodit.
1.1. Meetod A: kasutatakse orgaanilise söödatooraine ja enamuse segajõusöötade puhul.
1.2. Meetod B: kasutatakse mineraalsöötade ja söödasegude puhul ning selliste segasöötade puhul, kus soolhappes lahustumatute ainete sisaldus, mis määratakse meetodiga A, on üle 1 %.
2. Põhimõte
2.1. Meetod A: proov tuhastatakse, tuhk keedetakse soolhappes ning lahustumatu jääk filtreeritakse ja kaalutakse.
2.2. Meetod B: proovi töödeldakse soolhappega. Lahus filtreeritakse, jääk tuhastatakse ja selliselt saadud tuhk töödeldakse meetodi A järgi.
3. Reaktiivid
3.1. Soolhape, 3 mol/l.
3.2. Trikloroäädikhappe 20 % lahus (w/v).
3.3. Trikloroäädikhappe 1 % lahus (w/v).
4. Seadmed
4.1. Kuumutusplaat.
4.2. Elektriline termostaadiga muhvelahi.
4.3. Nelinurksed (umbes 60 × 40 × 25 mm) või ümmargused (läbimõõt: 60–75 mm, kõrgus: 20–40 mm) kvarts-, portselan- või plaatinatiiglid tuhastamiseks.
5. Töö käik
5.1. Meetod A
Proov tuhastatakse kogutuha määramiseks ettenähtud meetodi järgi. Kasutada võib ka kõnealusel analüüsil saadud tuhka.
Tuhk pannakse 250–400 ml keeduklaasi, kasutades 75 ml soolhapet (3.1). Segu aetakse aeglaselt keema ja keedetakse vaikselt 15 minutit. Soe lahus filtreeritakse läbi tuhavaba filterpaberi ja jääk pestakse sooja veega, kuni happe reaktsioon ei ole enam nähtav. Filter jäägiga kuivatatakse ja tuhastatakse tareeritud tiiglis temperatuuril mitte alla 550 oC ja mitte üle 700 oC. Jahutatakse eksikaatoris ja kaalutakse.
5.2. Meetod B
Umbes 5 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 250–400 ml keeduklaasi. Lisatakse üksteise järel 25 ml vett ja 25 ml soolhapet (3.1), segatakse ning oodatakse, kuni kihisemine on lõppenud. Lisatakse veel 50 ml soolhapet (3.1). Oodatakse gaaside eraldumise lõppemiseni, seejärel asetatakse keeduklaas keeva vee vanni ja hoitakse seal kolmkümmend minutit või vajaduse korral kauem lahuses sisalduva tärklise täielikuks hüdrolüüsiks. Filtreeritakse soojalt läbi tuhavaba filtri ning filter pestakse 50 ml soojas vees (vt tähelepanek 7). Filter jäägiga asetatakse tuhastamiseks ettenähtud tiiglisse, kuivatatakse ja tuhastatakse temperatuuril mitte alla 550 oC ja mitte üle 700 oC. Tuhk pannakse 250–400 ml keeduklaasi, kasutades 75 ml soolhapet (3.1); jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele lõigule.
6. Tulemuste arvutamine
Jäägi massi arvutamiseks lahutatakse nõu mass. Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.
7. Tähelepanek
Kui filtreerimine osutub raskeks, tehakse analüüs uuesti, sealjuures asendatakse 50 ml soolhapet (3.1) 50 ml 20 % trikloroäädikhappega (3.2) ja pestakse filter soojas 1 % trikloroäädikhappe lahuses (3.3).
O. KARBONAATIDE MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata harilikult kaltsiumkarbonaadina väljendatavate karbonaatide sisaldust enamikus söötades.
Teatavatel juhtudel (näiteks raudkarbonaadi puhul) tuleb kasutada erimeetodit.
2. Põhimõte
Karbonaadid lagundatakse soolhappes; tekkiv süsinikdioksiid kogutakse büretti ja gaasi ruumala võrreldakse ruumalaga, mis tekib samadel tingimustel teadaolevast kogusest kaltsiumkarbonaadist.
3. Reaktiivid
3.1. Soolhape, tihedus 1,10 g/ml.
3.2. Kaltsiumkarbonaat.
3.3. Väävelhape, umbes 0,05 mol/l, värvitud metüülpunasega.
4. Seadmed
Scheibler-Dietrichi aparaat (vt joonis) või samaväärne aparaat.
5. Töö käik
Sõltuvalt proovi karbonaadisisaldusest, kaalutakse järgmine osa proovist:
— 0,5 g toodete puhul, mis sisaldavad 50–100 % kaltsiumkarbonaadina väljendatud karbonaate;
— 1 g toodete puhul, mis sisaldavad 40–50 % kaltsiumkarbonaadina väljendatud karbonaate;
— 2–3 g muude toodete puhul.
Proovi osa pannakse aparaadi spetsiaalsesse kolbi (4), mille küljes on väike purunematust materjalist toru ja mis sisaldab 10 ml soolhapet (3.1), ning kolb ühendatakse aparaadiga. Kraan (5) keeratakse nii, et toru (1) oleks ühenduses välisõhuga. Kasutades tõstetavat toru (2), mis on täidetud värvitud väävelhappega (3.3) ja ühendatud büreti (1) külge, viiakse vedeliku tase nullmärgini. Torude (1) ja (3) ühendamiseks keeratakse kraani (5) ning kontrollitakse, et vedeliku tase on nullis.
Soolhape (3.1) juhitakse kolbi (4) kallutades aeglaselt proovi osa peale. Rõhu võrdsustamiseks langetatakse toru (2). Kolbi (4) raputatakse, kuni süsinikdioksiidi eraldumine on täielikult lõppenud.
Rõhu taastamiseks viiakse vedelik torudes (1) ja (2) samale tasemele. Mõne minuti möödudes, kui gaasi hulk on konstantne, loetakse tulemus.
Samades tingimustes tehakse kontrollkatse 0,5 g kaltsiumkarbonaadiga (3.2).
6. Tulemuste arvutamine
Kaltsiumkarbonaadina väljendatud karbonaatide sisaldus arvutatakse järgmise valemi abil:
kus:
X |
= |
kaltsiumkarbonaadina väljendatud karbonaatide protsendimäär (w/w) proovis; |
V |
= |
proovi osast saadud CO2 milliliitrites; |
V1 |
= |
0,5 g CaCO3-st saadud CO2 milliliitrites; |
m |
= |
proovi osa mass grammides. |
7. Tähelepanekud
7.1. Kui proovi osa kaalub üle 2 g, lisatakse enne katset kolbi (4) 15 ml destilleeritud vett ja segatakse. Kontrollkatse jaoks võetakse sama kogus vett.
7.2. Kui kasutatava aparaadi maht erineb Scheibler-Dietrichi aparaadi mahust, tuleb proovist ja kontrollainest võetud osasid ning tulemuste arvutamist vastavalt kohandada.
P. ÜLDFOSFORI MÄÄRAMINE
FOTOMEETRILINE MEETOD
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata üldfosfori sisaldust söötades. See sobib eriti hästi väikese fosforisisaldusega toodete analüüsimiseks. Teatavatel juhtudel (suure fosforisisaldusega toodete puhul) võib kasutada gravimeetrilist meetodit.
2. Põhimõte
Proov mineraliseeritakse kas kuivtuhastamise (orgaanilise sööda puhul) või märgtuhastamise (mineraalsete ühendite ja vedelsööda puhul) teel ja pannakse happelahusesse. Lahust töödeldakse molübdovanadaatreaktiiviga. Sel viisil saadud kollase lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm.
3. Reaktiivid
3.1. Kaltsiumkarbonaat.
3.2. Soolhape, ρ20 = 1,10 g/ml (umbes 6 mol/l).
3.3. Lämmastikhape, ρ20 = 1,045 g/ml.
3.4. Lämmastikhape, ρ20 = 1,38 –1,42 g/ml.
3.5. Väävelhape, ρ20 = 1,84 g/ml.
3.6. Molübdovanadaatreaktiiv: liitrises mõõtekolvis segatakse 200 ml ammooniumheptamolübdaadi lahust (3.6.1), 200 ml ammooniummonovanadaadi lahust (3.6.2) ja 134 ml lämmastikhapet (3.4). Kolb täidetakse veega märgini.
3.6.1. Ammooniumheptamolübdaadi lahus: 100 g ammooniumheptamolübdaati (NH4) 6Mo7O24.4H2O lahustatakse soojas vees. Lisatakse 10 ml ammooniumhüdroksiidi (tihedus: 0,91 g/ml) ja täidetakse veega kuni 1 liitrini.
3.6.2. Ammooniummonovanadaadi lahus: 2,35 g ammooniummonovanadaati NH4VO3 lahustatakse 400 ml kuumas vees. Pidevalt segades lisatakse aeglaselt 20 ml lahjendatud lämmastikhapet (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) ja täidetakse veega kuni 1 liitrini.
3.7. Fosfori standardlahus, 1 mg/ml: vees lahustatakse 4,387 grammi kaaliumdivesinikfosfaati KH2PO4. Täidetakse veega 1 liitrini.
4. Seadmed
4.1. Kvarts-, portselan- või plaatinatiiglid tuhastamiseks.
4.2. Temperatuurile 550 oC seatud termostaadiga elektriline muhvelahi.
4.3. 250 ml Kjeldahli kolb.
4.4. Mõõtelkolvid ja gradueeritud pipetid.
4.5. Spektrofotomeeter.
4.6. 16 mm diameetriga katseklaasid, millel on 14,5 mm diameetriga korgid; maht: 25–30 ml.
5. Töö käik
5.1. Lahuse valmistamine
Sõltuvalt proovi laadist valmistatakse lahus punkti 5.1.1 või 5.1.2 kohaselt.
5.1.1.
1 g või rohkem proovi kaalutakse täpsusega 1 mg. Uuritav proov pannakse Kjeldahli kolbi, lisatakse 20 ml väävelhapet (3.5), raputatakse, et aine seguneks täielikult happega ja et see ei sadestuks kolvi seinte külge, kuumutatakse ja hoitakse 10 minutit keemistemperatuuril. Lastakse veidi jahtuda, lisatakse 2 ml lämmastikhapet (3.4), kuumutatakse kergelt, lastakse veidi jahtuda, lisatakse veel veidi lämmastikhapet (3.4) ja viiakse tagasi keemistemperatuurile. Menetlust korratakse värvusetu lahuse saamiseni. Jahutatakse, lisatakse veidi vett, vedelik dekanteeritakse 500 ml mõõtekolbi, loputades Kjeldahli kolbi sooja veega. Lastakse jahtuda, täidetakse kuni märgini veega, homogeenitakse ja filtreeritakse.
5.1.2.
Tuhastustiiglisse pannakse umbes 2,5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega. Uuritavat proovi segatakse, kuni see on täielikult segunenud 1g kaltsiumkarbonaadiga (3.1). Tuhastatakse temperatuurile 550 oC seatud kuivatuskapis kuni valge või halli tuha saamiseni (võib sisaldada veidi sütt). Tuhk pannakse 250 ml keeduklaasi. Lisatakse 20 ml vett ja soolhapet (3.2) kuni kihisemise lakkamiseni. Lisatakse veel 10 ml soolhapet (3.2). Keeduklaas pannakse liivavannile ja aurustatakse kuivaks, et silikaadid muutuksid lahustumatuks. Jääk lahustatakse uuesti 10 ml lämmastikhappes (3.3) ja keedetakse liivavannil või kuumutusplaadil 5 minutit, ilma et see kuivaks aurustuks. Vedelik dekanteeritakse 500 ml mõõtekolbi, loputades keeduklaasi mitu korda kuuma veega. Lastakse jahtuda, täidetakse kuni märgini veega, homogeenitakse ja filtreeritakse.
5.2. Värvuse arendamine ja optilise tiheduse mõõtmine
Punkti 5.1.1 või 5.1.2 kohaselt saadud filtraadi alikvoot lahjendatakse nii, et fosfori kontsentratsioon oleks kuni 40 μg/ml. 10 ml seda lahust pannakse katseklaasi (4.6) ja lisatakse 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6). Homogeenitakse ja lastakse seista temperatuuril 20 oC vähemalt 10 minutit. Saadud lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm, lisades 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6) 10 ml veele.
5.3. Kalibreerimiskõver
Standardlahusest (3.7) valmistatakse lahused, mis sisaldavad 1 ml kohta 5, 10, 20, 30 ja 40 μg fosforit. Igast lahusest võetakse 10 ml ja lisatakse sellele 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6). Homogeenitakse ja lastakse seista temperatuuril 20 oC vähemalt 10 minutit. Optiline tihedus mõõdetakse punkti 5.2 kohaselt. Optiliste tiheduste ja vastavate fosforikoguste põhjal joonestatakse kalibreerimiskõver. Kontsentratsioonide puhul, mis jäävad vahemikku 0–40 μg/ml, on kõver lineaarne.
6. Tulemuste arvutamine
Uuritavas proovis sisalduv fosforikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.
Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.
Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— 3 % suuremast väärtusest fosforisisalduse puhul, mis on väiksem kui 5 %;
— absoluutväärtusena väljendatult 0,15 % fosforisisalduse puhul, mis on vähemalt 5 %.
Q. KLORIIDIDEST PÄRIT KLOORI MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata kloori kogust vees lahustuvates kloriidides, mida harilikult väljendatakse naatriumkloriidina. Meetodit kasutatakse kõigi söötade puhul.
2. Põhimõte
Kloriidid lahustatakse vees. Kui toode sisaldab orgaanilisi aineid, see selitatakse. Lahus hapestatakse kergelt lämmastikhappega ja kloriidid sadestatakse hõbekloriidina hõbenitraadilahuse abil. Hõbenitraadi ülekogus tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega, kasutades Volhardi meetodit.
3. Reaktiivid
3.1. Ammooniumtiotsüanaadi lahus, 0,1 mol/l.
3.2. Hõbenitraadi lahus, 0,1 mol/l.
3.3. Ammooniumraudsulfaadi (NH4)Fe(SO4)2 küllastunud lahus.
3.4. Lämmastikhape, tihedus: 1,38 g/ml.
3.5. Dietüüleeter.
3.6. Atsetoon.
3.7. Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn (CH3COO)2·2H2O ja 3 g jää-äädikat. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.8. Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.
3.9. Kloriidivaba ja kloriide mitte absorbeeriv aktiivsüsi.
4. Seadmed
Segisti (trummel): umbes 35 kuni 40 p/min.
5. Töö käik
5.1. Lahuse valmistamine
Sõltuvalt proovi laadist valmistatakse lahus punkti 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kohaselt.
Samal ajal tehakse pimekatse, jättes välja analüüsitava proovi.
5.1.1.
Alla 10 g proovi, mis ei sisalda kloriididena rohkem kui 3 g kloori, kaalutakse täpsusega 1 mg. See pannakse 400 ml veega 500 ml mõõtekolbi temperatuuril ligikaudu 20 oC. Segatakse trumlis 30 minutit, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.
5.1.2.
Umbes 5 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 1 g aktiivsöega 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett temperatuuriga ligikaudu 20 oC ja 5 ml Carrezi lahust I (3.7), segatakse ning lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.8). Segatakse trumlis 30 minutit, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.
5.1.3.
Lahus valmistatakse punkti 5.1.2 kohaselt, kuid seda ei filtreerita. Dekanteeritakse (vajaduse korral tsentrifuugitakse), eemaldatakse 100 ml supernatanti ja kantakse 200 ml mõõtekolbi. Segatakse atsetooniga (3.6), täidetakse lahustiga kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.
5.2. Tiitrimine
Sõltuvalt arvatavast kloorisisaldusest kantakse pipeti abil Erlenmeyeri kolbi 25–100 ml punkti 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kohaselt saadud filtraati. Alikvoot ei tohi sisaldada rohkem kui 150 mg kloori (Cl). Vajaduse korral lahjendatakse vähemalt 50 ml veega, lisatakse 5 ml lämmastikhapet (3.4), 20 ml ammooniumraudsulfaadi küllastunud lahust (3.3) ja nullmärgini täidetud büreti abil kaks tilka ammooniumtiotsüanaadi lahust (3.1). Büreti abil lisatakse hõbenitraadi lahust (3.2), nii et saadakse ülekogus 5 ml. Lisatakse 5 ml dietüüleetrit (3.5) ja loksutatakse tugevalt sademe koaguleerimiseks. Hõbenitraadi ülekogus tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega (3.1), kuni punakaspruun värvus püsib ühe minuti.
6. Tulemuste arvutamine
Koriini (X) kogus, väljendatuna protsendimäärana naatriumkloriidist, arvutatakse järgmise valemi järgi:
kus:
V1 |
= |
lisatud 0,1 mol/l hõbenitraadi lahuse kogus milliliitrites; |
V2 |
= |
tiitrimiseks kasutatud 0,1 mol/l ammooniumtiotsüanaadi lahuse kogus milliliitrites; |
m |
= |
proovi mass. |
Kui pimekatse näitab 0,1 mol/l hõbenitraadi lahuse tarbimist, lahutatakse see väärtus kogusest (V1 – V2).
7. Tähelepanekud
7.1. Tiitrida võib ka potentsiomeetriliselt.
7.2. Väga õli- ja rasvarikaste toodete puhul rasvatustatakse proov eelnevalt dietüüleetri või petrooleetriga.
7.3. Kalajahu puhul võib tiitrida Mohri meetodi abil.
IV LISA
SÖÖDAS LUBATUD SÖÖDALISANDITE TASEME KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID
A. A-VITAMIINI MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata A-vitamiini (retinooli) kogust söödas ja eelsegudes. A-vitamiini all mõistetakse täielikult trans-konfiguratsioonis retinüülalkoholi ja selle cis-isomeere, nii nagu need määratakse käesoleva meetodiga. A-vitamiini sisaldust väljendatakse rahvusvahelistes ühikutes (RÜ) kilogrammi kohta. Üks RÜ vastab 0,300 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkoholi või 0,344 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaadi või 0,550 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaadi aktiivsusele.
Kvantifikatsiooni piir on 2 000 RÜ A-vitamiini kilogrammi kohta.
2. Põhimõte
Proov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja A-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. A-vitamiini sisaldus määratakse pööratud faasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit. Kromatograafilised parameetrid valitakse nii, et täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkohol ja selle cis-isomeerid jääksid lahutamata.
3. Reaktiivid
3.1. Etanool, σ = 96 %
3.2. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC
3.3. Metanool
3.4. Kaaliumhüdroksiidi lahus, c = 50 g/100 ml
3.5. Naatriumaskorbaadi lahus, c = 10 g/100 ml (vt tähelepanek 7.7)
3.6. Naatriumsulfiid, Na2S· x H2O (x = 7 – 9)
3.6.1. Naatriumsulfiidi lahus, c = 0,5 mol/l glütseroolis, ß = 120 g/l (kui x = 9) (vt tähelepanek 7.8)
3.7. Fenoolftaleiini lahus, c = 2 g/100 ml etanoolis (3.1)
3.8. 2-propanool
3.9. HPLC liikuv faas: metanooli (3,3 ) ja vee segu, nt 980 + 20 (v+v). Täpne vahekord määratakse kasutatava kolonni parameetrite järgi.
3.10. Hapnikuvaba lämmastik
3.11. Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega, nt 2,80 ×106 RÜ/g
3.11.1. Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaadi põhilahus: 50 mg A-vitamiini atsetaati (3.11) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja pannakse see 100 ml mõõtekolbi. Lahustatakse 2-propanoolis (3.8) ja täidetakse sama lahustiga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 1 400 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.1.
3.12. Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega, nt 1,80 × 106 RÜ/g
3.12.1. Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaadi põhilahus: 80 mg A-vitamiini palmitaati (3.12) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja pannakse 100 ml mõõtekolbi. Lahustatakse 2-propanoolis (3.8) ja täidetakse sama lahustiga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 1 400 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.2.
3.13. 2,6-di-tert-butüül-4-metüülfenool (BHT) (vt tähelepanek 7.5).
4. Seadmed
4.1. Vaakumpöördaurusti
4.2. Tumedast klaasist nõud
4.2.1. Lihvavaga lamedapõhjalised või koonilised kolvid, 500 ml
4.2.2. Lihvkorgiga kitsakaelalised mõõtkolvid 10, 25, 100 ja 500 ml
4.2.3. Lihvkorgiga koonilised jaotuslehtrid, 1 000 ml
4.2.4. Lihvavaga pirnkolvid, 250 ml
4.3. Lihvühendusega Allihni tagasivoolujahuti, ümbrise pikkus 300 mm, gaasitoru adapteriga
4.4. Kurdfilterpaber faaside eraldamiseks, diameeter 185 mm (nt Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)
4.5. HPLC-seadmed sissepritsesüsteemiga
4.5.1. Vedelikkromatograafia kolonn, 250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm, või samaväärne (lahutuskriteerium: ainult üks piik kõigi retinooli isomeeride jaoks antud HPLC tingimustel)
4.5.2. Muudetava lainepikkusega UV- või fluorestsentsdetektor
4.6. Spektrofotomeeter 10 mm kvartsküvettidega
4.7. Magnetseguriga veevann
4.8. Ekstraktsiooniseade (vt joonis 1), mis koosneb:
4.8.1. 1-liitrisest lihvava ja lihvkorgiga klaassilindrist;
4.8.2. lihviga klaasotsakust, mis on varustatud kõrvaltoruga ja keskelt läbi mineva üles-alla nihutatava toruga. Nihutataval torul peab olema U-kujuline alumine ots ja teises otsas düüs, nii et silindris oleva vedeliku ülemist kihti oleks võimalik viia üle jaotuslehtrisse.
5. Töö käik
Märkus: |
A-vitamiin on tundlik (UV-) valguse ja oksüdeerumise suhtes. Kõik toimingud tuleb teostada valguse ja hapniku juurdepääsuta (kasutades tumedast klaasist või alumiiniumfooliumiga kaetud nõusid ja voolutades lämmastikuga). Ekstraheerimise ajal tuleb vedeliku kohal olev õhk asendada lämmastikuga (ülerõhu vältimiseks tuleb korki aeg-ajalt kergitada). |
5.1. Proovi ettevalmistamine
Proov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1 mm avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda A-vitamiini kadusid.
5.2. Seebistamine
500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) kaalutakse 1 mg täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt A-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (3.1), umbes 100 mg BHT (3.13), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (3.6). Kolvi otsa ühendatakse tagasivoolujahuti (4.3) ja kolb pannakse magnetseguriga veevanni (4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.
5.3. Ekstraheerimine
Seebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (3.1) ja 100 ml petrooleetriga (3.2) ja viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peab olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.
5.3.1.
Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (3.2).
Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergelt loksutades (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100 ml veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100 ml veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtreeritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (4.4) 500 ml mõõtekolbi (4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (3.2), täidetakse petrooleetriga (3.2) märgini ja segatakse hästi.
5.3.2.
Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), pannakse klaassilindri (4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (3.2), siis kaks korda 50 ml petrooleetri (3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.
Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.
5.4. Proovilahuse valmistamine HPLC jaoks
Petrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250 ml pirnkolbi (4.2.4). Vaakumpöördaurustiga (4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks veevanni temperatuuril mitte üle 40 oC. Kolbi lastakse lämmastik (3,10 ) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumpöördaurustist. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.10) voolutades ja jääk lahustatakse kohe teadaoleva koguse (10–100 ml) metanooliga (3.3) (A-vitamiini kontsentratsioon peab jääma vahemikku 5–30 RÜ/ml).
5.5. Määramine HPLC-ga
A-vitamiin eraldatakse C18 pöördfaaskolonnil (4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon UV-detektori (325 nm) või fluorestsentsdetektori (ergastamine: 325 nm, emissioon: 475 nm) (4.5.2) abil.
Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (3.9). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kalibreerimislahuste (5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).
Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).
Vedelikkromatograafia kolonn (4.5.1): |
250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne |
Liikuv faas (3.9): |
Metanooli (3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v). |
Voolukiirus: |
1–2 ml/min |
Detektor (4.5.2): |
UV-detektor (325 nm) või fluorestsentsdetektor (ergastamine: 325 nm/emissioon: 475 nm) |
5.6. Kalibreerimine
5.6.1.
20 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (3.11.1) või 20 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (3.12.1) pipetitakse 500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktile 5.2, kuid ilma BHT-d lisamata. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (3.2) vastavalt punktile 5.3 ja täidetakse kuni 500 ml-ni petrooleetriga (3.2). 100 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumpöördaurustil (vt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3,10 ) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 10,0 ml metanooliga (3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 560 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.3. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
2,0 ml kõnealust standardtöölahust pipetitakse 20 ml mõõtekolbi, täidetakse metanooliga (3.3) kuni märgini ja segatakse. Selle lahjendatud standardtöölahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini ml kohta.
5.6.2.
1,0 , 2,0 , 5,0 ja 10,0 ml lahjendatud standardtöölahust viiakse üle 20 ml mõõtekolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,8 , 5,6 , 14,0 ja 28,0 RÜ A-vitamiini ml kohta.
Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid) ja arvestades UV-kontrolli (5.6.3.3) tulemusi.
5.6.3.
5.6.3.1.
2,0 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (3.11.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. 3,0 ml A-vitamiini atsetaadi lahjendatud lahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.
A-vitamiini sisalduse arvutamine:
RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E326 × 19,0
(
A-vitamiini atsetaadi puhul = 1 530 lainepikkusel 326 nm 2-propanoolis)
5.6.3.2.
2,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (3.12.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. 3,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.
A-vitamiini sisalduse arvutamine:
RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E326 × 19,0
(
A-vitamiini palmitaadi puhul = 957 lainepikkusel 326 nm 2-propanoolis)
5.6.3.3.
3,0 ml A-vitamiini lahjendamata standardtöölahust, mis on valmistatud vastavalt punktile 5.6.1, pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. 5,0 ml seda lahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.
A-vitamiini sisalduse arvutamine:
RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E325 × 18,3
(
A-vitamiini alkoholi puhul = 1 821 lainepikkusel 325 nm 2-propanoolis)
6. Tulemuste arvutamine
Proovilahuse A-vitamiini piigi keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kalibreerimisgraafiku (5.6.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon RÜ-des milliliitri kohta.
Proovi A-vitamiini sisaldus w RÜ-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:
[mg/kg]
kus:
c |
= |
A-vitamiini kontsentratsioon proovilahuses (5.4) RÜ/ml; |
V1 |
= |
proovilahuse (5.4) kogus milliliitrites; |
V2 |
= |
vastavalt punktile 5.4 võetud alikvoodi kogus milliliitrites; |
m |
= |
kaalutise mass grammides. |
7. Tähelepanekud
7.1. Madala A-vitamiini kontsentratsiooniga proovides võib olla kasulik ühendada kahe seebistamiseks võetud koguse (kaalutud kogus: 25 g) petrooleetri ekstraktid üheks proovilahuseks, mida määratakse HPLC-ga.
7.2. Analüüsiks võetud proov ei tohi sisaldada üle 2 g rasva.
7.3. Faaside halva eraldumise puhul lisatakse emulsiooni lõhkumiseks umbes 10 ml etanooli (3.1).
7.4. Kalamaksaõli ja muude puhaste rasvade puhul tuleb seebistamise aega pikendada 45–60 minutini.
7.5. BHT asemel võib kasutada hüdrokinooni.
7.6. Normaalfaasikolonni kasutamisel on võimalik retinooli isomeeride eraldumine. Kuid sel juhul tuleb arvutustes kõigi cis- ja trans-isomeeride piigi kõrgused (pindalad) summeerida.
7.7. Naatriumaskorbaadi lahuse asemel võib kasutada umbes 150 mg askorbiinhapet.
7.8. Naatriumsulfiidi lahuse asemel võib kasutada umbes 50 mg etüleendiamiintetraatsetaati.
7.9. A-vitamiini analüüsimisel piimaasendajates tuleb erilist tähelepanu pöörata
— seebistamisele (5.2): tulenevalt proovi rasvasisaldusest võib olla vaja suurendada kaaliumhüdroksiidi lahuse kogust (3.4);
— ekstraheerimisele (5.3): tulenevalt emulsioonide sisaldusele võib olla vajalik muuta vee ja etanooli vahekorda 2:1.
Et kontrollida rakendatud analüüsimeetodi tulemuste usaldusväärsust kõnealuse spetsiifilise põhiaine (piimaasendaja) puhul, tuleb täiendava kaalutisega teha saagisekatse. Kui saagise määr on alla 80 %, esitatakse analüüsi tulemus saagisekorrektsiooniga.
8. Korratavus
Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % suuremast tulemusest.
9. Ühisuuringu tulemused ( 11 )
|
Eelsegu |
Sööda eelsegu |
Mineraalkontsentraat |
Valgurikas sööt |
Põrsasööt |
L |
13 |
12 |
13 |
12 |
13 |
n |
48 |
45 |
47 |
46 |
49 |
keskmine [RÜ/kg] |
17,02 x 106 |
1,21 x 106 |
537 100 |
151 800 |
18 070 |
sr [IU/kg] |
0,51 x 106 |
0,039 x 106 |
22 080 |
12 280 |
682 |
r [IU/kg] |
1,43 x 106 |
0,109 x 106 |
61 824 |
34 384 |
1 910 |
CVr [ %] |
3,0 |
3,5 |
4,1 |
8,1 |
3,8 |
SR [IU/kg] |
1,36 x 106 |
0,069 x 106 |
46 300 |
23 060 |
3 614 |
R [IU/kg] |
3,81 x 106 |
0,193 x 106 |
129 640 |
64 568 |
10 119 |
CVR [ %] |
8,0 |
6,2 |
8,6 |
15 |
20 |
L |
= |
laboratooriumide arv |
n |
= |
üksikmääramiste arv |
sr |
= |
korratavust iseloomustav standardhälve |
SR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
r |
= |
korratavus |
R |
= |
reprodutseeritavus |
CVr |
= |
korratavuse variatsioonikordaja |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja |
B. E-VITAMIINI MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata E-vitamiini kogust söödas ja eelsegudes. E-vitamiini sisaldust väljendatakse DL-α-tokoferoolatsetaadi milligrammides kilogrammi kohta. 1 mg DL-α-tokoferoolatsetaati vastab 0,91 mg DL-α-tokoferoolile (E-vitamiin).
Kvantifitseerimispiir on 2 mg E-vitamiini kilogrammi kohta. See kvantifitseerimispiir on saavutatav vaid fluorestsentsdetektoriga. UV-detektoriga on kvantifitseerimispiir 10 mg/kg.
2. Põhimõte
Proov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja E-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. E-vitamiini sisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit.
3. Reaktiivid
3.1. Etanool, σ = 96 %
3.2. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC
3.3. Metanool
3.4. Kaaliumhüdroksiidi lahus, c = 50 g/100 ml
3.5. Naatriumaskorbaadi lahus, c = 10 g/100 ml (vt tähelepanek 7.7)
3.6. Naatriumsulfiid, Na2S· x H2O (x = 7 – 9)
3.6.1. Naatriumsulfiidi lahus, c = 0,5 mol/l glütseroolis, β = 120 g/l (kui x = 9) (vt tähelepanek 7.8)
3.7. Fenoolftaleiini lahus, c = 2 g/100 ml etanoolis (3.1)
3.8. HPLC liikuv faas: metanooli (3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v+v). Täpne vahekord määratakse kasutatava kolonni parameetrite järgi.
3.9. Hapnikuvaba lämmastik
3.10. DL-α-tokoferoolatsetaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega
3.10.1. DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahus: 100 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,1 mg täpsusega 100 mg DL-α-tokoferoolatsetaati (3.10). Lahustatakse etanoolis (3.1) ja täidetakse sama lahustiga märgini. 1 ml seda lahust sisaldab 1 mg DL-α-tokoferoolatsetaati. (UV-kontrolli kohta vt 5.6.1.3; stabiliseerimise kohta vt tähelepanek 7.4).
3.11. DL-α-tokoferool, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega
3.11.1. DL-α-tokoferooli põhilahus: 100 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,1 mg täpsusega 100 mg DL-α-tokoferooli (3.11). Lahustatakse etanoolis (3.1) ja täidetakse sama lahustiga märgini. 1 ml seda lahust sisaldab 1 mg DL-α-tokoferooli. (UV-kontrolli kohta vt 5.6.2.3; stabiliseerimise kohta vt tähelepanek 7.4).
3.12. 2,6-di-tert-butüül-4-metüülfenool (BHT) (vt tähelepanek 7.5).
4. Seadmed
4.1. Filter-pöördaurusti
4.2. Tumedast klaasist nõud
4.2.1. Lihvavaga lamedapõhjalised või koonilised kolvid, 500 ml
4.2.2. Lihvkorgiga kitsakaelalised mõõtkolvid 10, 25, 100 ja 500 ml
4.2.3. Lihvkorgiga koonilised jaotuslehtrid, 1 000 ml
4.2.4. Lihvavaga pirnkolvid, 250 ml
4.3. Lihvühendusega Allihni tagasivoolujahuti, ümbrise pikkus 300 mm, gaasitoru adapteriga
4.4. Kurdfilterpaber faaside eraldamiseks, diameeter 185 mm (nt Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)
4.5. HPLC-seadmed sissepritsesüsteemiga
4.5.1. Vedelikkromatograafia kolonn, 250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne
4.5.2. Muudetava lainepikkusega UV- või fluorestsentsdetektor
4.6. Spektrofotomeeter 10 mm kvartsküvettidega
4.7. Magnetseguriga veevann
4.8. Ekstraktsiooniseade (vt joonis 1), mis koosneb:
4.8.1. 1-liitrisest lihvava ja lihvkorgiga klaassilindrist;
4.8.2. lihviga klaasotsakust, mis on varustatud kõrvaltoruga ja keskelt läbi mineva üles-alla nihutatava toruga. Nihutataval torul peab olema U-kujuline alumine ots ja teises otsas düüs, nii et silindris oleva vedeliku ülemist kihti oleks võimalik viia üle jaotuslehtrisse.
5. Töö käik
Märkus: |
E-vitamiin on tundlik (UV-) valguse ja oksüdeerumise suhtes. Kõik toimingud tuleb teostada valguse ja hapniku juurdepääsuta (kasutades tumedast klaasist või alumiiniumfooliumiga kaetud nõusid ja voolutades lämmastikuga). Ekstraheerimise ajal tuleb vedeliku kohal olev õhk asendada lämmastikuga (ülerõhu vältimiseks tuleb korki aeg-ajalt kergitada). |
5.1. Proovi ettevalmistamine
Proov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1 mm avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda E-vitamiini kadusid.
5.2. Seebistamine
500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) kaalutakse 0,01 g täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt E-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (3.1), umbes 100 mg BHT (3.12), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (3.6). Kolvi otsa ühendatakse jahuti (4.3) ja kolb pannakse magnetseguriga veevanni (4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.
5.3. Ekstraheerimine
Seebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (3.1) ja 100 ml petrooleetriga (3.2) ja viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peab olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.
5.3.1.
Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (3.2).
Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergelt loksutades (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100 ml veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100 ml veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtreeritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (4.4) 500 ml mõõtekolbi (4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (3.2), täidetakse petrooleetriga (3.2) märgini ja segatakse hästi.
5.3.2.
Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), pannakse klaassilindri (4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (3.2), siis kaks korda 50 ml petrooleetri (3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.
Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.
5.4. Proovilahuse valmistamine HPLC jaoks
Petrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250 ml pirnkolbi (4.2.4). Vaakumpöördaurustiga (4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks veevanni temperatuuril mitte üle 40 oC. Kolbi lastakse lämmastik (3.9) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumpöördaurustist. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.9) voolutades ja jääk lahustatakse kohe teadaoleva koguse (10–100 ml) metanooliga (3.3) (DL-α-tokoferooli kontsentratsioon peab jääma vahemikku 5–30 μg/ml).
5.5. Määramine HPLC-ga
E-vitamiin eraldatakse C18 pöördfaasikolonnil (4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon fluorestsentsdetektori (ergastamine: 295 nm, emissioon: 330 nm) (4.5.2) abil või UV-detektoriga (292 nm) (4.5.2).
Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (3.8). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kalibreerimislahuste (5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).
Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).
Vedelikkromatograafia kolonn (4.5.1): |
250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne |
Liikuv faas (3.8): |
Metanooli (3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v). |
Voolukiirus: |
1–2 ml/min |
Detektor (4.5.2): |
Fluorestsentsdetektor (ergastamine: 295 nm/emissioon: 330 nm) või UV-detektor (292 nm) |
5.6. Kalibreerimine (DL-α-tokoferoolatsetaat või DL-α-tokoferool)
5.6.1.
5.6.1.1.
25 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.10.1) viiakse pipetiga 500-milliliitrisesse lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktis 5.2 kirjeldatule. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (3.2) vastavalt punktis 5.3 kirjeldatule ja täidetakse petrooleetriga 500 milliliitrini. 25 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumpöördaurustil (vt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.9) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 25,0 ml metanooliga (3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 45,5 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 50 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
5.6.1.2.
1,0 , 2,0 , 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20-milliliitristesse mõõtkolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,5 , 5,0 , 10,0 ja 25,0 μg/ml DL-α-tokoferoolatsetaati, s.o 2,28 , 4,55 , 9,10 ja 22,8 μg/ml DL-α-tokoferooli.
Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid), koostatakse kalibreerimisgraafik.
5.6.1.3.
5,0 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.10.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (3.1) suhtes.
Neeldumismaksimum peaks olema 284 nm:
= 43,6 etanoolis 284 nm juures
Sellisel lahjendusel peaks ekstinktsiooni väärtus olema vahemikus 0,84 –0,88 .
5.6.2.
5.6.2.1.
2 ml DL-α-tokoferooli põhilahust (3.11.1) viiakse pipetiga 50 ml mõõtekolbi, lahustatakse metanoolis (3.3) ja täidetakse metanooliga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 40 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 44,0 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
5.6.2.2.
1,0 , 2,0 , 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20-milliliitristesse mõõtkolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,0 , 4,0 , 8,0 ja 20,0 μg/ml DL-α-tokoferooli, s.o 2,20 , 4,40 , 8,79 ja 22,0 μg/ml DL-α-tokoferoolatsetaati.
Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid), koostatakse kalibreerimisgraafik.
5.6.2.3.
2,0 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.11.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (3.1) suhtes. Neeldumismaksimum peaks olema 292 nm:
= 75,8 etanoolis 292 nm juures
Sellisel lahjendusel peab ekstinktsiooni väärtus olema 0,6 .
6. Tulemuste arvutamine
Proovilahuse E-vitamiini piikide keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kalibreerimisgraafiku (5.6.1.2 või 5.6.2.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon μg-des milliliitri kohta (arvutatuna α-tokoferoolatsetaadina).
Proovi E-vitamiini sisaldus w mg-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:
[mg/kg]
kus:
c |
= |
E-vitamiini kontsentratsioon (α-tokoferoolatsetaadina) μg-des milliliitri kohta proovilahuses (5.4); |
V1 |
= |
proovilahuse (5.4) kogus milliliitrites; |
V2 |
= |
punktis 5.4 võetud alikvoodi ruumala milliliitrites; |
m |
= |
kaalutise mass grammides. |
7. Tähelepanekud
7.1. Madala E-vitamiini kontsentratsiooniga proovides võib olla kasulik ühendada kahe seebistamiseks võetud koguse (kaalutud kogus: 25 g) petrooleetri ekstraktid üheks proovilahuseks, mida määratakse HPLC-ga.
7.2. Analüüsiks võetud proov ei tohi sisaldada üle 2 g rasva.
7.3. Faaside halva eraldumise puhul lisatakse emulsiooni lõhkumiseks umbes 10 ml etanooli (3.1).
7.4. Pärast DL-α-tokoferoolatsetaadi või DL-α-tokoferooli lahuste spektrofotomeetrilist mõõtmist vastavalt punktile 5.6.1.3 või 5.6.2.3 lisatakse lahusele (3.10.1 või 3.10.2) umbes 10 mg BHT-d (3.12) ja hoitakse lahust külmkapis (kõlblikkusaeg maksimaalselt neli nädalat).
7.5. BHT asemel võib kasutada hüdrokinooni.
7.6. Normaalfaasikolonni kasutamisel on võimalik α-, β-, γ- ja δ-tokoferooli eraldumine.
7.7. Naatriumaskorbaadi lahuse asemel võib kasutada umbes 150 mg askorbiinhapet.
7.8. Naatriumsulfiidi lahuse asemel võib kasutada umbes 50 mg etüleendiamiintetraatsetaati.
7.9. E-vitamiini atsetaat hüdrolüüsub aluselises keskkonnas väga kiiresti ning on seepärast väga tundlik oksüdeerumise suhtes, eriti selliste mikrolementide nagu raua ja vase olemasolul. Kui eelsegudes määratud E-vitamiini kogus on suurem kui 5 000 mg/kg, võib selle tagajärjeks olla E-vitamiini lagunemine. Seepärast soovitatakse kindluse mõttes kasutada HPLC meetodit, mis hõlmab E-vitamiini vormi ensümaatilist mineraliseerimist ilma aluselise seebistamise sammuta.
8. Korratavus
Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % suuremast tulemusest.
9. Ühisuuringu tulemused ( 12 )
|
Eelsegu |
Sööda eelsegu |
Mineraal-kontsentraat |
Valgurikas sööt |
Põrsasööt |
L |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
n |
48 |
48 |
48 |
48 |
48 |
keskmine [mg/kg] |
17 380 |
1 187 |
926 |
315 |
61,3 |
sr [mg/kg] |
384 |
45,3 |
25,2 |
13,0 |
2,3 |
r [mg/kg] |
1 075 |
126,8 |
70,6 |
36,4 |
6,4 |
CVr [ %] |
2,2 |
3,8 |
2,7 |
4,1 |
3,8 |
SR mg/kg] |
830 |
65,0 |
55,5 |
18,9 |
7,8 |
R [mg/kg] |
2 324 |
182,0 |
155,4 |
52,9 |
21,8 |
CVR [ %] |
4,8 |
5,5 |
6,0 |
6,0 |
12,7 |
L |
= |
laboratooriumide arv |
n |
= |
üksikmääramiste arv |
sr |
= |
korratavust iseloomustav standardhälve |
sR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
r |
= |
korratavus |
R |
= |
reprodutseeritavus |
CVr |
= |
korratavuse variatsioonikordaja |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja |
C. MIKROELEMENTIDE RAUA, VASE, MANGAANI JA TSINGI MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata söödas mikroelemente: rauda, vaske, mangaani ja tsinki. Kvantifikatsioonipiirid on:
— raud (Fe): 20 mg/kg;
— vask (Cu): 10 mg/kg;
— mangaan (Mn): 20 mg/kg;
— tsink (Zn): 20 mg/kg.
2. Põhimõte
Proov lahustatakse soolhappes pärast võimaliku orgaanilise aine hävitamist. Elemendid raud, vask, mangaan ja tsink määratakse aatomabsorptsioonspektromeetriaga pärast asjakohast lahjendamist.
3. Reaktiivid
Sissejuhatavad märkused
Reaktiivide ja analüütiliste lahuste ettevalmistamiseks kasutatakse katioonivaba vett, mis on saadud kas vee bidestilleerimisel borosilikaat- või kvartsklaasist destillaatoris või kahekordsel töötlemisel ioonvahetusvaikudega.
Reaktiivid peavad olema vähemalt analüütiliselt puhtad. Määratava elemendi puudumist tuleb kontrollida pimekatse abil. Vajaduse korral tuleb reaktiive täiendavalt puhastada.
Allpool kirjeldatud standardlahuste asemel võib kasutada müügil olevaid standardlahuseid, tingimusel, et neil on garantii ning neid on enne kasutamist kontrollitud.
3.1. Soolhape (d: 1,19 g/ml).
3.2. Soolhape (6 mol/l).
3.3. Soolhape (0,5 mol/l).
3.4. 38–40 % vesinikfluoriidhape (v/v), mille raua (Fe) sisaldus on alla 1 mg/l ning jääk pärast aurustamist alla 10 mg/l (sulfaadina).
3.5. Väävelhape (d: 1,84 g/ml).
3.6. Vesinikperoksiid (ligikaudu 100 mahuosa hapnikku (30 massiprotsenti)).
3.7. Raua standardlahus (1 000 μg Fe/ml), mis on valmistatud järgmiselt (või kasutatakse samaväärset müügil olevat lahust): 1 g raudtraati lahustatakse 200 ml 6 mol/l soolhappes (3.2), lisatakse 16 ml vesinikperoksiidi (3.6) ning täidetakse veega ühe liitrini.
3.7.1. Raua standardtöölahus (100 μg Fe/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.7) veega vahekorras 1:9.
3.8. Vase standardlahus (1 000 μg Cu/ml), mis on valmistatud järgmiselt (või kasutatakse samaväärset müügil olevat lahust):
— 1 g vasepulbrit lahustatakse 25 ml 6 mol/l soolhappes (3.2), lisatakse 5 ml vesinikperoksiidi (3.6) ning täidetakse veega ühe liitrini.
3.8.1. Vase standardtöölahus (10 μg Cu/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.8) veega vahekorras 1:9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1:9.
3.9. Mangaani standardlahus (1 000 μg Mn/ml), mis on valmistatud järgmiselt (või kasutatakse samaväärset müügil olevat lahust):
— 1 g mangaanipulbrit lahustatakse 25 ml 6 mol/l soolhappes (3.2) ning täidetakse veega ühe liitrini.
3.9.1. Mangaani standardtöölahus (10 μg Mn/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.9) veega vahekorras 1:9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1:9.
3.10. Tsingi standardlahus (1 000 μg Zn/ml), mis on valmistatud järgmiselt (või kasutatakse samaväärset müügil olevat lahust):
— 1 g riba- või lehttsinki lahustatakse 25 ml 6 mol/l soolhappes (3.2) ning täidetakse veega ühe liitrini.
3.10.1. Tsingi standardtöölahus (10 μg Zn/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.10) veega vahekorras 1:9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1:9.
3.11. Lantaankloriidi lahus: 12 g lantaanoksiidi lahustatakse 150 ml vees, lisatakse 100 ml 6 mol/l soolhapet (3.2) ning täidetakse veega ühe liitrini.
4. Seadmed
4.1. Temperatuuriregulaatori ja võimalusel salvestiga muhvelahi.
4.2. Klaasnõud peavad olema vastupidavast borosilikaatklaasist ning on soovitav kasutada vahendeid, mida kasutatakse üksnes mikroelementide määramiseks.
4.3. Aatomabsorptsioonispektrofotomeeter, mis vastab kasutatava meetodi nõuetele, võttes arvesse tundlikkust ning täpsust nõutud ulatuses.
5. Töö käik ( 13 )
5.1. Orgaanilist ainet sisaldavad proovid
5.1.1. 14 ) (
5.1.1.1. 5–10 g proovi kaalutakse 0,2 mg täpsusega, asetatakse kvarts- või plaatinatiiglisse (vt märkus b), kuivatatakse kuivatuskapis 105 oC juures ning tiigel asetatakse külma muhvelahju (4.1). Ahi suletakse (vt märkus c) ning järk-järgult tõstetakse ligikaudu 90 minuti jooksul temperatuur 450–475 oC-ni. Kõnealust temperatuuri hoitakse 4–16 tundi (nt öö jooksul), et eemaldada söeosakesed, ning seejärel ahi avatakse ning lastakse jahtuda (vt märkus d).
Tuhka niisutatakse veega ja viiakse üle 250 ml keelduklaasi. Tiigel pestakse ligikaudu 5 ml soolhappega (3.1) ning soolhape lisatakse aeglaselt ja ettevaatlikult keeduklaasi (CO2 moodustumise tõttu võib tekkida tugev reaktsioon). Soolhape (3.1) lisatakse tilkhaaval ja loksutades kuni kihisemise lakkamiseni. Aurustatakse kuivaks, aeg-ajalt klaaspulgaga segades.
Järgmisena lisatakse jäägile 15 ml 6 mol/l soolhapet (3.2) ning ligikaudu 120 ml vett. Segatakse klaaspulgaga, mis jäetakse keeduklaasi, ning keeduklaas kaetakse kellaklaasiga. Segu lastakse aeglaselt keema ning hoitakse keemistemperatuuril, kuni lahustuvat tuhka ei ole enam näha. Filtreeritakse läbi tuhavaba filterpaberi ning filtraat kogutakse 250 ml mõõtekolbi. Keeduklaas ja filter pestakse 5 ml kuuma 6 mol/l soolhappega (3.2) ning kaks korda keeva veega. Mõõtekolb täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 mol/l).
5.1.1.2. Kui filtris olev jääk on must (süsinik), pannakse see tagasi ahju ning tuhastatakse uuesti 450–475 oC juures. Kõnealune tuhastamine, mis võtab aega vaid mõne tunni (3–5 tundi), on lõppenud, kui tuhk on valge või peaaegu valge. Jääk lahustatakse ligikaudu 2 ml soolhappega (3.1), aurustatakse kuivaks ning sellele lisatakse 5 ml 6 mol/l soolhapet (3.2). Segu kuumutatakse, lahus filtreeritakse mõõtekolbi ning täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 mol/l).
Märkused
a) Mikroelementide määramisel on oluline pöörata tähelepanu saastamisohule, eriti tsingi, vase ja rauaga. Seetõttu ei tohi proovide ettevalmistamisel kasutatavad vahendid sisaldada kõnealuseid metalle.
Üldise saastamisohu vähendamiseks tuleb töötada tolmuvabas keskkonnas hoolikalt puhastatud vahendite ja korralikult pestud klaasnõudega. Tsingi määramine on eriti tundlik mitmete saasteallikate suhtes, nt klaasnõud, reaktiivid, tolm jne.
b) Tuhastatava proovi mass arvutatakse sööda ligikaudse mikroelemendisisalduse põhjal vastavalt kasutatava spektrofotomeetri tundlikkusele. Teatavate väikese mikroelementide sisaldusega söötade puhul alustatakse 10–20 g proovist, mille lõpplahus täidetakse vaid kuni 100 ml lahuse saamiseni.
c) Tuhastamine peab toimuma suletud ahjus õhu või hapniku juurdepääsuta.
d) Püromeetri temperatuuri näit ei tohi ületada 475 oC.
5.1.2.
5.1.2.1.
Iga määratava elemendi jaoks valmistatakse punktides 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.10.1 osutatud standardtöölahustest kalibreerimislahused, millest iga lahuse HCl kontsentratsioon on ligikaudu 0,5 mol/l ning (raua, mangaani ja tsingi korral) lantaankloriidi kontsentratsioon on samaväärne 0,1 % lantaaniga (w/v).
Valitud mikroelementide kontsentratsioonid peavad jääma kasutatava spektrofotomeetri tundlikkuse piiresse. Järgmistes tabelites on näitena esitatud tavapäraste kalibreerimislahuste koostised, kuid sõltuvalt kasutatava spektrofotomeetri tüübist ja tundlikkusest võib osutuda vajalikuks valida muud kontsentratsioonid.
μg Fe/ml |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
ml standardtöölahust (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
ml HCl (3.2) |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
+ 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11) ning täidetakse veega 100 ml lahuse saamiseni. |
μg Cu/ml |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
ml standardtöölahust (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) |
0 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
ml HCl (3.2) |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
μg Mn/ml |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
ml standardtöölahust (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) |
0 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
ml HCl (3.2) |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
+ 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11) ning täidetakse veega 100 ml lahuse saamiseni. |
μg Zn/ml |
0 |
0,05 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
ml standardtöölahust (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
ml HCl (3.2) |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
+ 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11) ning täidetakse veega 100 ml lahuse saamiseni. |
5.1.2.2.
Vase määramiseks saab vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahust tavaliselt kohe kasutada. Kui lahuse kontsentratsioon on vaja viia kalibreerimislahuste piiresse, võib lahuse alikvoodi pipettida 100 ml mõõtekolbi ning täita märgini 0,5 mol/l soolhappega (3.3).
Raua, mangaani ja tsingi määramiseks pipetitakse vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahuse alikvoot 100 ml mõõtekolbi, lisatakse 10 ml lantaankloriidilahust (3.11) ning täidetakse märgini 0,5 mol/l soolhappega (3.3) (vt ka punkt 8 „Tähelepanekud”).
5.1.2.3.
Pimekatse peab hõlmama kõiki protseduuri ettenähtud etappe, välja arvatud see, et proovimaterjal jäetakse välja. Pimekatsel ei tohi kasutada kalibreerimislahust 0.
5.1.2.4.
Kalibreerimislahuste ja analüüsitava lahuse aatomabsorptsiooni mõõdetakse oksüdeerivat õhk-atsetüleenleeki kasutades järgmistel lainepikkustel:
Fe: 248,3 nm
Cu: 324,8 nm
Mn: 279,5 nm
Zn: 213,8 nm
Iga mõõtmist tuleb teha neli korda.
5.2. Mineraalsööt
Kui proov ei sisalda orgaanilist ainet, ei ole eelnev tuhastamine vajalik. Toimitakse vastavalt punkti 5.1.1.1, alustades teisest lõigust. Vesinikfluoriidhappega aurustamise võib ära jätta.
6. Tulemuste arvutamine
Mikroelementide kontsentratsioon analüüsitavas lahuses arvutatakse kalibreerimiskõverat kasutades ning tulemus väljendatakse mikroelementide milligrammides ühe kilogrammi proovi kohta (miljondikkudes).
7. Korratavus
Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on kuni 50 mg/kg;
— 10 % suuremast tulemusest, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on 50–100 mg/kg;
— absoluutväärtusena väljendatult 10 mg/kg, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on 100–200 mg/kg;
— 5 % suuremast tulemusest, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on üle 200 mg/kg.
8. Tähelepanekud
Suure koguse fosfaadi sisaldus võib takistada raua, mangaani ja tsingi määramist. See takistus tuleb kõrvaldada, lisades proovi lantaankloriidilahust (3.11). Kuid kui proovis on massi vahekord Ca + Mg/P > 2, siis võib lantaankloriidilahuse (3.11) lisamise analüüsitavale lahusele ja kalibreerimislahusele ära jätta.
D. HALOFUGINOONI MÄÄRAMINE
DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hüdroksü-2-piperidüül)atsetonüül]-kinasoliin-4-(3H)-oon-vesinikbromiid
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata halofuginooni kogust söödas. Määramispiir on 1 mg/kg.
2. Põhimõte
Pärast kuuma veega töötlemist ekstraheeritakse halofuginoon vaba alusena etüülatsetaati ning eraldatakse hüdrokloriidina happe vesilahusesse. Ekstrakt puhastatakse ioonvahetuskromatograafia abil. Halofuginoonisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.
3. Reaktiivid
3.1. HPLC-puhtusastmega atsetonitriil
3.2. Amberlite XAD-2 vaik
3.3. Ammooniumatsetaat
3.4. Etüülatsetaat
3.5. Jää-äädikhape
3.6. Halofuginooni standardaine (DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hüdroksü-2-piperidüül)atsetonüül]-kinasoliin-4-(3H)-üks hüdrobromiid, E 764)
3.6.1.
50 mg halofuginooni (3.6) kaalutakse 0,1 mg täpsusega 500 ml mõõtekolbi, lahustatakse ammooniumatsetaadi puhverlahuses (3.18), täidetakse kuni märgini puhverlahusega ja segatakse. See lahus säilib pimedas 5 oC juures kolm nädalat.
3.6.2.
100 ml mõõtekolbidesse kantakse 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ja 6,0 ml põhistandardlahust (3.6.1). Täidetakse kuni märgini liikuva faasiga (3,21 ) ja segatakse. Nende lahuste halofuginoonikontsentratsioonid on vastavalt 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ja 6,0 μg/ml. 8,0 ja 10,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
3.7. Soolhape (ρ20 umbes 1,16 g/ml)
3.8. Metanool
3.9. Hõbenitraat
3.10. Naatriumaskorbaat
3.11. Naatriumkarbonaat
3.12. Naatriumkloriid
3.13. EDTA (etüleendiamiintetraäädikhape, dinaatriumsool)
3.14. HPLC-puhtusastmega vesi
3.15. Naatriumkarbonaadi lahus, c = 10 g/100 ml
3.16. Naatriumkloriidiga küllastatud naatriumkarbonaadi lahus, c = 5 g/100 ml
50 g naatriumkarbonaati (3.11) lahustatakse vees, lahjendatakse 1 liitrini ja lisatakse kuni lahuse küllastumiseni naatriumkloriidi (3.12).
3.17. Soolhape, umbes 0,1 mol/l
10 ml soolhapet (3.7) lahjendatakse kuni 1 liitrini veega.
3.18. Ammooniumatsetaadi puhverlahus, umbes 0,25 mol/l
19,3 g ammooniumatsetaati (3.3) ja 30 ml äädikhapet (3.5) lahustatakse vees (3.14) ja lahjendatakse kuni 1 liitrini.
3.19. Amberlite XAD-2 vaigu ettevalmistamine
Asjakohane kogus Amberlite'i (3.2) pestakse veega, kuni äravalatud vesifaasile tehtud hõbenitraadi (3.20) test näitab, et kõik klooriioonid on eemaldatud. Vaiku pestakse 50 ml metanooliga (3.8), metanool valatakse ära ja vaik säilitatakse värskes metanoolis.
3.20. Hõbenitraadi lahus, umbes 0,1 mol/l
0,17 g hõbenitraati (3.9) lahustatakse 10 ml vees.
3.21. HPLC liikuv faas
500 ml atsetonitriili (3.1) segatakse 300 ml ammooniumatsetaadi puhverlahusega (3.18) ja 1 200 ml veega (3.14). Äädikhappe (3.5) abil korrigeeritakse pH 4,3 -le. Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4,8 ) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit). See lahus säilib suletud mahutis pimedas hoituna üks kuu.
4. Seadmed
4.1. Ultrahelivann
4.2. Filter-pöördaurusti
4.3. Tsentrifuug
4.4. HPLC-seade muudetava lainepikkusega ultraviolett-detektoriga või dioodireadetektoriga
4.4.1. Vedelikkromatograafia kolonn, 300 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 10 μm, või samaväärne
4.5. Klaaskolonn (300 mm × 10 mm), millel on paagutatud klaasfilter ja korkkraan
4.6. Klaaskiudfiltrid diameetriga 150 mm
4.7. Membraanfiltrid 0,45 μm.
4.8. Membraanfiltrid 0,22 μm.
5. Töö käik
Märkus: |
halofuginoon on vaba alusena leelistes ja etüülatsetaadi lahustes ebastabiilne. Seda ei tohi hoida etüülatsetaadis üle 30 minuti. |
5.1. Üldsätted
5.1.1. Tuleb analüüsida võrdlussööta, veendumaks, et selles ei ole halofuginooni ega segavaid aineid.
5.1.2. Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus halofuginooni. Kontsentratsiooni 3 mg/kg saamiseks lisatakse 10 g võrdlussöödale 300 μl põhistandardlahust (3.6.1), segatakse ja oodatakse enne ekstraheerimise (5.2) alustamist 10 minutit.
Märkus: |
selle meetodi puhul peab võrdlussööt olema prooviga samalaadne ja analüüsimisel ei tohi selles leiduda halofuginooni. |
5.2. Ekstraheerimine
10 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,1 g täpsusega 200 ml tsentrifuugiküvetti, lisatakse 0,5 g naatriumaskorbaati (3.10), 0,5 g EDTAd (3.13) ja 20 ml vett ning segatakse. Küvett asetatakse 5 minutiks veevanni (80 oC). Pärast toatemperatuurini jahutamist lisatakse 20 ml naatriumkarbonaadi lahust (3.15) ja segatakse. Lisatakse kohe 100 ml etüülatsetaati (3.4) ja loksutatakse käes tugevalt 15 sekundit. Küvett asetatakse kolmeks minutiks ultrahelivanni (4.1) ning avatakse kork. Tsentrifuugitakse kaks minutit ja dekanteeritakse etüülatsetaadi faas läbi klaaskiudfiltri (4.6) 500 ml jaotuslehtrisse. Proovi ekstraheerimist korratakse teise 100 ml etüülatsetaadi kogusega. Kogutud ekstrakte pestakse üks minut 50 ml naatriumkloriidiga küllastatud naatriumkarbonaadi lahusega (3.16) ja veekiht valatakse ära.
Orgaanilist kihti ekstraheeritakse 1 minut 50 ml soolhappega (3.17). Alumine happekiht kallatakse 250 ml jaotuslehtrisse. Orgaanilist kihti ekstraheeritakse uuesti 1,5 minutit täiendava 50 ml soolhappega ja lisatakse esimesele ekstraktile. Kogutud happeekstrakte pestakse 10 ml etüülatsetaadiga (3.4) loksutades umbes 10 sekundit.
Veekiht kantakse kvantitatiivselt 250 ml ümarkolbi ja orgaaniline faas valatakse ära. Happelahusest aurustatakse filter-pöördaurusti (4,2 ) abil kogu allesjäänud etüülatsetaat. Veevanni temperatuur ei tohi olla üle 40 oC. Umbes 25-millibaarises vaakumis eemaldatakse 5 minutiga temperatuuril 38 oC kogu allesjäänud etüülatsetaat.
5.3. Puhastamine
5.3.1.
XAD-2 kolonn valmistatakse ette eraldi iga proovi ekstrakti jaoks. 10 g valmistatud Amberlite'i (3.19) kantakse metanooliga (3.8) klaaskolonni (4.5). Vaigukihi peale pannakse väike klaasvillatropp. Metanool kallatakse kolonnist välja ja vaiku pestakse 100 ml veega, peatades voolu, kui vedelik jõuab vaigukihi ülemise piirini. Kolonnil lastakse enne kasutamist 10 minutit tasakaalustuda. Kolonni ei tohi kunagi lasta ära kuivada.
5.3.2.
Ekstrakt (5.2) kantakse kvantitatiivselt ettevalmistatud Amberlite'i kolonni (5.3.1), elueeritakse, valades eluaadi ära. Elueerimiskiirus ei tohi ületada 20 ml/min. Ümarkolb loputatakse 20 ml soolhappega (3.17) ja seda lahust kasutatakse vaigukolonni pesemiseks. Allesjäänud happelahus kõrvaldatakse õhuvoolu abil. Pesulahused valatakse ära. Kolonni lisatakse 100 ml metanooli (3.8) ja lastakse elueerida 5–10 ml, kogudes eluaadi 250 ml ümarkolbi. Allesjäänud metanoolil lastakse 10 minutit vaiguga tasakaalustuda ja jätkatakse elueerimist kiirusel kuni 20 ml/min, kogudes eluaadi samasse ümarkolbi. Metanool aurustatakse filter-pöördaurusti (4.2) abil, veevanni temperatuur ei tohi olla üle 40 oC. Jääk kantakse liikuva faasi (3.21) abil kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Täidetakse liikuva faasiga kuni märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.7). See lahus hoitakse HPLC määramise (5.4) jaoks.
5.4. HPLC määramine
5.4.1.
Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):
Vedelikkromatograafia kolonn (4.4.1)
HPLC liikuv faas (3.21)
Voolukiirus: 1,5 –2 ml/min.
Avastamise lainepikkus: 243 nm
Sissesüstitav ruumala: 40 kuni 100 μl.
Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides korduvalt kalibreerimislahust (3.6.2) kontsentratsiooniga 3,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused (pindalad) ja retentsiooniajad.
5.4.2.
Iga kalibreerimislahust (3.6.2) süstitakse korduvalt ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).
5.4.3.
Prooviekstrakti (5.3.2) süstitakse mitu korda samas mahus kui kalibreerimislahuste puhul ja määratakse halofuginoonipiikide keskmine kõrgus (pindala).
6. Tulemuste arvutamine
Proovilahuse halofuginoonipiikide keskmise kõrguse (pindala) alusel määratakse kalibreerimisgraafiku (5.4.2) abil proovilahuse kontsentratsioon (μg/ml).
Halofuginoonisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:
kus:
c |
= |
proovilahuse halofuginoonikontsentratsioon (μg/ml); |
m |
= |
kaalutise mass grammides. |
7. Tulemuste kehtivuse kontroll
7.1. Identsus
Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6,0 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.6.2) spektreid.
7.1.1.
Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.6.2). Lisatud halofuginoonikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud halofuginoonikogus.
Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes halofuginoonipiigi kõrgus. Piigi laius poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti halofuginoonipiigi laiusest.
7.1.2.
Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:
(a) proovi ja standardi kromatogrammidel oleva piigi tipu spektri suurima neeldumise lainepikkused peavad analüüsiseadme lahutusvõime piires ühte langema. Dioodireadetektori lahutusvõime on tavaliselt ± 2 nm;
(b) lainepikkustel 225–300 nm ning suhtelise neeldumise vahemikus 10–100 % peavad proovi ja standardi piigi tipu spektrid kromatogrammil ühte langema. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui nimetatud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kahe spektri kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % standardainele vastavatest neeldumistest;
(c) lainepikkustel 225–300 nm ei tohi prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduvas osas, tipus ja allapoole suunduvas osas registreeritud spektrid erineda üksteisest nende spektriosade puhul, mis jäävad 10–100 % suhtelise neeldumise piirkonda. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui mainitud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % piigi tipu spektri vastavatest neeldumistest.
Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.
7.2. Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi kuni 3 mg/kg suuruste halofuginoonisisalduste puhul ületada 0,5 mg/kg.
7.3. Saagis
Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %.
8. Ühisuuringu tulemused
Korraldati ühisuuring, ( 15 ) mille käigus kaheksas laboratooriumis analüüsiti kolme proovi.
Tulemused
|
Proov A (võrdlusproov) Algul |
Proov B (jahu) |
Proov C (graanulid) |
||
|
|
Algul |
Kahe kuu pärast |
Algul |
Kahe kuu pärast |
Keskmine [mg/kg] |
ND |
2,80 |
2,42 |
2,89 |
2,45 |
SR [mg/kg] |
— |
0,45 |
0,43 |
0,40 |
0,42 |
CVR [ %] |
— |
16 |
18 |
14 |
17 |
Sg [ %] |
|
86 |
74 |
88 |
75 |
ND |
= |
allpool avastamisläve |
SR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja (%) |
Sg |
= |
saagis (%) |
E. ROBENIDIINI MÄÄRAMINE
1,3-bis[(p-klorobensülideen)amino]guanidiinhüdrokloriid
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata robenidiini kogust söödas. Määramispiir on 5 mg/kg.
2. Põhimõte
Proov ekstraheeritakse hapestatud metanooliga. Ekstrakt kuivatatakse ja selle alikvootne osa puhastatakse alumiiniumoksiidi kolonnis. Robenidiin elueeritakse kolonnist metanooliga, kontsentreeritakse ja viiakse liikuva faasiga sobiva mahuni. Robenidiinisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.
3. Reaktiivid
3.1. Metanool
3.2. Hapestatud metanool
4,0 ml soolhapet (ρ20 = 1,18 g/ml) viiakse 500 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse kuni märgini metanooliga (3.1) ja segatakse. See lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
3.3. HPLC-puhtusastmega atsetonitriil
3.4. Molekulaarsõel
Tüüp 3A, 8–12 mešši (1,6 –2,5 mm osakesed, kristalne alumosilikaat, pooride läbimõõt 0,3 mm)
3.5. Alumiiniumoksiid, happeline aktiivsusaste 1, kolonnkromatograafiajaoks
100 g alumiiniumoksiidi viiakse sobivasse anumasse ja lisatakse 2,0 ml vett. Suletakse ja loksutatakse ligikaudu 20 minutit. Hoitakse korralikult suletud anumas.
3.6. Kaaliumdivesinikfosfaadi lahus, c = 0,025 mol/l
1 000 ml mõõtekolvis lahustatakse 3,40 g kaaliumdivesinikfosfaati vees (HPLC-puhtusastmega), kolb täidetakse märgini ja segatakse.
3.7. Dinaatriumvesinikfosfaadi lahus, c = 0,025 mol/l
Üheliitrises mõõtekolvis lahustatakse 3,55 g veevaba dinaatriumvesinikfosfaati (või 4,45 g dihüdraati või 8,95 g dodekahüdraati) vees (HPLC-puhtusastmega), kolb täidetakse märgini veega ja segatakse.
3.8. HPLC liikuv faas
Segada järgmised reaktiivid:
650 ml atsetonitriili (3.3),
250 ml vett (HPLC-puhtusastmega),
50 ml kaaliumdivesinikfosfaadi lahust (3.6),
50 ml kaaliumdivesinikfosfaadi lahust (3.7).
Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4.6) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit).
3.9. Standardaine
Puhas robenidiin: 1,3 -bis[(p-klorobensülideen) amino]guanidiinhüdrokloriid.
3.9.1.
30 mg robenidiini standardainet (3.9) kaalutakse 0,1 mg täpsusega. Lahustatakse hapestatud metanooliga 100 ml mõõtekolvis (3.2), täidetakse kolb märgini sama lahustiga ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja hoitakse pimedas kohas.
3.9.2.
Valatakse 10,0 ml põhistandardlahust (3.9.1) 250 ml mõõtekolbi, täidetakse see liikuva faasiga (3.8) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja hoitakse pimedas kohas.
3.9.3.
50 ml mõõtekolbidesse viiakse 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 ja 25,0 ml vahestandardlahust (3.9.2). Täidetakse kuni märgini liikuva faasiga (3.8) ja segatakse. Lahuste robenidiinisisaldused on vastavalt 1,2 ; 2,4 ; 3,6 ; 4,8 ja 6,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
3.10. HPLC-puhtusastmega vesi
4. Seadmed
4.1. Klaaskolonn
Valmistatud tumedast klaasist, korkkraaniga, ligikaudu 150 ml reservuaariga, sisemine läbimõõt 10–15 mm, kõrgus 250 mm.
4.2. Mehaaniline loksuti või magnetsegur
4.3. Filter-pöördaurusti
4.4. HPLC-seadmed erinevatel lainepikkustel registreeriva ultraviolettdetektoriga või dioodireadetektoriga, mis töötab vahemikus 250–400 nm.
4.4.1. Vedelikkromatograafia kolonn: 300 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 10 μm või samaväärne
4.5. Klaaskiudfilterpaber (Whatman GF/A või samaväärne)
4.6. Membraanfiltrid 0,22 μm.
4.7. Membraanfiltrid 0,45 μm.
5. Töö käik
Märkus: |
robenidiin on valgustundlik. Kõikide operatsioonide puhul tuleb kasutada tumedast klaasist anumaid. |
5.1. Üldsätted
5.1.1. Tuleb analüüsida võrdlussööta, veendumaks, et selles ei ole robenidiini ega teisi segavaid aineid.
5.1.2. Tuleb teha saagisekatse, analüüsides võrdlussööta (5.1.1), mida on rikastatud ligikaudu sama koguse robenidiiniga, nagu seda sisaldab proov. Et saada kontsentratsiooni 60 mg/kg, kantakse 3,0 ml põhistandardlahust (3.9.1) 250 ml koonilisse kolbi. Lahus aurustatakse lämmastikuvoolus kuni ligikaudu 0,5 ml-ni. Lisatakse 15 g võrdlussööta, segatakse ja jäetakse enne ekstraheerima (5.2) asumist 10 minutiks seisma.
Märkus: |
selle meetodi puhul peab võrdlussööt olema prooviga samalaadne ja analüüsimisel ei tohi selles leiduda halofuginooni. |
5.2. Ekstraheerimine
Umbes 15 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega. Proov pannakse 250 ml koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml hapestatud metanooli (3.2), kolb suletakse ja loksutatakse üks tund loksutil (4.2). Lahus filtreeritakse läbi klaaskiudfilterpaberi (4.5) ja kogu filtraat kogutakse 150 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 7,5 g molekulaarsõela (3.4), suletakse ja loksutatakse viis minutit. Filtreeritakse kohe läbi klaaskiudfilterpaberi. See lahus säilitatakse puhastamiseks (5.3).
5.3. Puhastamine
5.3.1.
Klaaskolonni (4.1) põhja asetatakse väike klaasvatist tropp ja surutakse see klaaspulka kasutades kokku. Kaalutakse 11,0 g ettevalmistatud alumiiniumoksiidi (3.5) ja pannakse kolonni. Tuleb jälgida, et kokkupuutumine õhuga oleks selles etapis minimaalne. Koputatakse kergelt vastu kolonni alumist otsa, et alumiiniumoksiid paigutuks ühtlaselt.
5.3.2.
Kolonni pipetitakse 5,0 ml vastavalt punktile 5.2 ettevalmistatud prooviekstrakti. Pipeti ots asetatakse tihedalt kolonni seina vastu ja lastakse lahusel absorbeeruda alumiiniumoksiidi. Robenidiin elueeritakse kolonnist, kasutades 100 ml metanooli (3.1) voolukiirusel 2–3 ml/min, ja eluaat kogutakse 250 ml ümarkolbi. Metanoolilahus aurustatakse filter-pöördaurusti (4.3) abil kuivaks vähendatud rõhul, temperatuuril 40 oC. Jääk lahustatakse uuesti 3–4 ml liikuvas faasis (3.8) ja viiakse kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Kolbi loputatakse mitme 1–2 ml koguse liikuva faasiga ja pannakse need loputusvedelikud mõõtekolbi. Kolb täidetakse sama lahustiga märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtreeritakse läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.7). Seda lahust hoitakse HPLC määramiseks (5.4).
5.4. HPLC määramine
5.4.1.
Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need annavad samaväärsed tulemused):
Vedelikkromatograafia kolonn (4.4.1)
HPLC liikuv faas (3.8)
Voolukiirus: 1,5 –2 ml/min
Detektori lainepikkus: 317 nm,
Sissesüstitav ruumala: 20–50 μl.
Kromatograafilise süsteemi stabiilsust kontrollitakse, süstides 3,6 μg/ml sisaldavat kalibreerimislahust (3.9.3) mitu korda, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused ja retentsiooniajad.
5.4.2.
Iga kalibreerimislahust (3.9.3) süstitakse korduvalt ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimiskõver, kasutades kalibreerimislahuste keskmisi piigi kõrgusi või pindalasid ordinaatidena ja vastavaid kontsentratsioone μg/ml abstsissidena.
5.4.3.
Prooviekstrakti (5.3.2) süstitakse mitu korda, kasutades sama mahtu nagu kalibreerimislahuste puhul, ja määratakse robenidiini piikide keskmine kõrgus (pindala).
6. Tulemuste arvutamine
Proovilahuse robenidiini piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi määratakse proovilahuse kontsentratsioon μg/ml, kasutades kalibreerimisgraafikut (5.4.2).
Robenidiini sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:
kus:
c |
= |
proovilahuse robenidiinikontsentratsioon (μg/ml); |
m |
= |
kaalutise mass grammides. |
7. Tulemuste kehtivuse kontroll
7.1. Identsus
Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.9.3) spektreid.
7.1.1.
Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.9.3). Lisatav robenidiinikogus peab olema ligikaudu võrdne prooviekstrakti analüüsimisel leitud robenidiini kogusega.
Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma ainult robenidiinipiigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti robenidiinipiigi laiusest.
7.1.2.
Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:
a) proovi ja standardi kromatogrammidel oleva piigi tipu spektri suurima neeldumise lainepikkused peavad analüüsiseadme lahutusvõime piires ühte langema. Dioodireadetektori puhul on see tavaliselt ligikaudu 2 nm;
b) lainepikkustel 250–400 nm ning suhtelise neeldumise vahemikus 10–100 % peavad proovi ja standardi piigi tipu spektrid kromatogrammil ühte langema. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui nimetatud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kahe spektri kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % standardainele vastavatest neeldumistest;
c) 250 ja 400 nm vahel ei tohi prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduvas osas, tipus ja allapoole suunduvas osas registreeritud spektrid erineda üksteisest nende spektriosade puhul, mis jäävad 10–100 % suhtelise neeldumise piirkonda. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui mainitud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % piigi tipu spektri vastavatest neeldumistest.
Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.
7.2. Korratavus
Robenidiinisisalduse puhul, mis on suurem kui 15 mg/kg, ei tohi sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ületada 10 % suuremast tulemusest.
7.3. Saagis
Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 85 %.
8. Ühisuuringu tulemused
Korraldati ühenduse ühisuuring, milles 12 laboratooriumi analüüsisid nelja kodulindude ja küülikute söödajahu või -graanulite proovi. Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi. Tulemused on esitatud järgmises tabelis:
|
Kodulinnud |
Küülikud |
||
|
Jahu |
Graanulid |
Jahu |
Graanulid |
Keskmine [mg/kg] |
27,00 |
27,99 |
43,6 |
40,1 |
sr [mg/kg] |
1,46 |
1,26 |
1,44 |
1,66 |
CVr [ %] |
5,4 |
4,5 |
3,3 |
4,1 |
SR [mg/kg] |
4,36 |
3,36 |
4,61 |
3,91 |
CVR [ %] |
16,1 |
12,0 |
10,6 |
9,7 |
Saagis [ %] |
90,0 |
93,3 |
87,2 |
80,2 |
sr |
= |
korratavust iseloomustav standardhälve |
CVr |
= |
korratavuse variatsioonikordaja, % |
SR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, % |
F. DIKLASURIILI MÄÄRAMINE
(+)-4-klorofenüül [2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahüdro-3,5-diokso-1,2,4-triasiin-2-üül) fenüül] atsetonitriil
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata diklasuriili kogust söödas ja eelsegudes. Avastamispiir on 0,1 mg/kg, määramispiir 0,5 mg/kg.
2. Põhimõte
Pärast sisestandardi lisamist ekstraheeritakse proov hapestatud metanooliga. Söötade puhul puhastatakse ekstrakti alikvoot tahkefaasilises C18-ekstraktsioonihülsis. Diklasuriil elueeritakse ekstraheerimishülsist välja hapestatud metanooli ja vee seguga. Pärast lahuse aurustamist lahustatakse jääk N, N-dimetüülformamiidi vesilahuses. Eelsegude puhul aurustatakse ekstrakt kohe ja jääk lahustatakse N, N-dimetüülformamiidi vesilahuses. Diklasuriilisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades kolmekomponendilist gradienti ja UV-detektorit.
3. Reaktiivid
3.1. HPLC-puhtusastmega vesi
3.2. Ammooniumatsetaat
3.3. Tetrabutüülammooniumvesiniksulfaat (TBHS)
3.4. HPLC-puhtusastmega atsetonitriil
3.5. HPLC-puhtusastmega metanool
3.6. N, N-dimetüülformamiid (DMF).
3.7. Soolhape, ρ20 = 1,19 g/ml
3.8. Standardaine: diklasuriil II-24: garanteeritud puhtusega (+)-4-klorofenüül [2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahüdro-3,5-diokso-1,2,4-triasiin-2-üül) fenüül] atsetonitriil, E771
3.8.1.
25 mg diklasuriili standardainet (3.8) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja viiakse 50 ml mõõtekolbi. Lahustatakse N, N-dimetüülformamiidis (3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.
3.8.2.
5,00 ml põhistandardlahust (3.8.1) pannakse 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.
3.9. Sisestandardaine: 2,6-dikloro-α-(4-klorofenüül)-4-(4,5-dihüdro-3,5-diokso-1,2,4-triasiin-2(3H)-üül)-α-metüülbenseenatsetonitriil
3.9.1.
25 mg sisestandardainet (3.9) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja pannakse 50 ml mõõtekolbi. Lahustatakse N, N-dimetüülformamiidis (3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.
3.9.2.
5,00 ml sisepõhistandardlahust (3.9.1) pannakse 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.
3.9.3.
(p = diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus (mg/kg))
p/10 mg sisestandardlahust kaalutakse täpsusega 0,1 mg, pannakse 100 ml mõõtekolbi, lahustatakse ultrahelivannis (4.6) N, N-dimetüülformamiidis (3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.
3.10. Kalibreerimislahus, 2 μg/ml
2,00 ml diklasuriili standardlahust (3.8.2) ja 2,00 ml sisestandardlahust (3.9.2) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi. Lisatakse 16 ml N, N-dimetüülformamiidi (3.6), täidetakse kolb veega kuni märgini ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
3.11. Tahkefaasiline C18-ekstraktsioonihülss (nt Bond Elut), maht: 1 cm3, sorbendi mass: 100 mg
3.12. Ekstrahent: hapestatud metanool
5,0 ml soolhapet (3.7) pipetitakse 1 000 ml metanooli (3.5) ja segatakse.
3.13. HPLC liikuv faas
3.13.1. Eluent A: ammooniumatsetaadi ja tetrabutüülammooniumvesiniksulfaadi lahus.
5 g ammooniumatsetaati (3.2) ja 3,4 g tetrabutüülammooniumvesiniksulfaati (3.3) lahustatakse 1 000 ml vees (3.1) ja segatakse.
3.13.2. Eluent B: atsetonitriil (3.4)
3.13.3. Eluent C: metanool (3.5)
4. Seadmed
4.1. Mehaaniline loksuti.
4.2. HPLC seadmed, mis võimaldavad kasutada kolmekomponendilist gradienti
4.2.1. Vedelikkromatograafia kolonn 100 × 4,6 mm, täidis: Hypersil ODS, 3 μm või samaväärne
4.2.2. Muudetava lainepikkusega UV-detektor või dioodireadetektor
4.3. Filter-pöördaurusti
4.4. Membraanfilter, 0,45 μm
4.5. Vaakumkollektor
4.6. Ultrahelivann
5. Töö käik
5.1. Üldsätted
5.1.1.
Tuleb analüüsida võrdlussööta, veendumaks, et selles ei ole ei diklasuriili ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ja selles tohi leiduda diklasuriili ega segavaid aineid.
5.1.2.
Saagisekatses analüüsitakse võrdlusööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus diklasuriili. Et saada kontsentratsiooni 1 mg/kg, kantakse 50 g võrdlussöödale 0,1 ml põhistandardlahust (3.8.1), segatakse hoolikalt ja jäetakse 10 minutiks seisma, segades veel mitu korda enne katse jätkamist vastavalt punktile 5.2.
Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse analüüsitavale proovile ligikaudu sama suur diklasuriilikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.
5.2. Ekstraheerimine
5.2.1.
Umbes 50 g proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega. See pannakse 500 ml koonilisse kolbi, lisatakse 1,00 ml sisestandardlahust (3.9.2) ja 200 ml ekstrahenti (3.12) ning korgitakse kolb kinni. Segu loksutatakse öö jooksul loksutil (4.1). Lastakse 10 minutit settida. Kantakse 20 ml supernatandi alikvooti sobivasse klaasanumasse ja lahjendatakse 20 ml veega. Lahus kantakse ekstraktsioonihülsile (3.11) ja juhitakse sellest läbi vaakumi abil (4.5). Hülssi pestakse 25 ml ekstrahendi (3.12) ja vee seguga, 65 + 35 (v + v). Kogutud fraktsioonid visatakse ära ning elueeritakse ühendid, kasutades 25 ml ekstrahendi (3.12) ja vee segu 80 + 20 (v + v). Seda fraktsiooni aurustatakse 60 oC juures pöördaurustil (4.3), kuni see saab kuivaks. Jääk lahustatakse 1,0 ml N, N-dimetüülformamiidis (3.6), lisatakse 1,5 ml vett (3.1) ja segatakse. Filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.4). Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).
5.2.2.
Umbes 1 g proovi kaalutakse 0,001 g täpsusega. See pannakse 500 ml koonilisse kolbi, lisatakse 1,00 ml sisestandardlahust (3.9.3) ja 200 ml ekstrahenti (3.12) ning korgitakse kolb kinni. Segu loksutatakse öö jooksul loksutil (4.1). Lastakse 10 minutit settida. Kantakse 10 000 /p ml (p = diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus mg/kg) supernatandi alikvooti sobiva suurusega ümarkolbi. Aurustatakse pöördaurustis (4.3) alandatud rõhu ja 60 oC juures, kuni proov saab kuivaks. Jääk lahustatakse uuesti 10,0 ml N, N-dimetüülformamiidis (3.6), lisatakse 15,0 ml vett (3.1) ja segatakse. Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).
5.3. HPLC määramine
5.3.1.
Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):
Vedelikkromatograafia kolonn (4.2.1): |
100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, täidise terasuurus 3 μm või samaväärne |
|
Liikuv faas: |
Eluent A (3.13.1): |
ammooniumatsetaadi ja tetrabutüül- ammooniumvesiniksulfaadi vesilahus |
|
Eluent B (3.13.2): |
atsetonitriil |
|
Eluent C (3.13.3): |
metanool |
Elueerimisviis: |
— lineaarne gradient — algtingimused: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V) — 10 minuti pärast gradientelueerimine 30 minutit: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). Elueeritakse Bga 10 minutit |
|
Voolukiirus: |
1,5 –2 ml/min |
|
Sissesüstitav ruumala: |
20 μl |
|
Detektori lainepikkus: |
280 nm |
|
Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides mitu korda kolonni kalibreerimislahust (3.10) kontsentratsiooniga 2 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused ja retentsiooniajad.
5.3.2.
Kalibreerimislahusest (3.10) süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse diklasuriili ning sisestandardi piikide keskmine kõrgus (pindala).
5.3.3.
Proovilahusest (5.2.1 või 5.2.2) süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse diklasuriili ning sisestandardi piikide keskmine kõrgus (pindala).
6. Tulemuste arvutamine
6.1. Söödad
Diklasuriilisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:
[mg/kg]
kus:
hd, s |
= |
diklasuriili piigi kõrgus (pindala) proovilahuses (5.2.1); |
hi, s |
= |
sisestandardi piigi kõrgus (pindala) proovilahuses (5.2.1); |
hd, c |
= |
diklasuriili piigi kõrgus (pindala) kalibreerimislahuses (3.10); |
hi, c |
= |
sisestandardi piigi kõrgus (pindala) kalibreerimislahuses (3.10); |
cd, c |
= |
diklasuriili kontsentratsioon (μg/ml) kalibreerimislahuses (3.10); |
m |
= |
kaalutise mass grammides; |
V |
= |
prooviekstrakti maht vastavalt punktile 5.2.1 (s.o 2,5 ml). |
6.2. Eelsegud
Diklasuriilisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:
[mg/kg]
kus:
hd, c |
= |
diklasuriili piigi kõrgus (pindala) kalibreerimislahuses (3.10); |
hi, c |
= |
sisestandardi piigi kõrgus (pindala) kalibreerimislahuses (3.10); |
hd, s |
= |
diklasuriili piigi kõrgus (pindala) proovilahuses (5.2.2); |
hi, s |
= |
sisestandardi piigi kõrgus (pindala) proovilahuses (5.2.2); |
cd, c |
= |
diklasuriili kontsentratsioon (μg/ml) kalibreerimislahuses (3.10); |
m |
= |
kaalutise mass grammides; |
V |
= |
prooviekstrakti maht vastavalt punktile 5.2.2 (s.o 25 ml); |
p |
= |
diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus (mg/kg). |
7. Tulemuste kehtivuse kontroll
7.1. Identsus
Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti (5.2.1 või 5.2.2) ja kalibreerimislahuse (3.10) spektreid.
7.1.1.
Prooviekstraktile (5.2.1 või 5.2.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.10). Lisatud diklasuriilikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud diklasuriilikogus.
Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes diklasuriilipiigi ja sisestandardi piigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti diklasuriili piigi või sisestandardi piigi laiusest.
7.1.2.
Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt.
a) Proovi ja standardi kromatogrammidel oleva piigi tipu spektri suurima neeldumise lainepikkused peavad analüüsiseadme lahutusvõime piires ühte langema. Dioodireadetektori lahutusvõime on tavaliselt ± 2 nm.
b) Lainepikkustel 230–320 nm ning suhtelise neeldumise vahemikus 10–100 % peavad proovi ja standardi piigi tipu spektrid kromatogrammil ühte langema. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui mainitud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kahe spektri kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % standardainele vastavatest neeldumistest;
c) Lainepikkustel 230–320 nm ning suhtelise neeldumise vahemikus 10–100 % peavad prooviekstrakti piigi tõusva osa, tipu ja alaneva osa spektrid ühte langema. Seda nõuet peetakse täidetuks, kui nimetatud spektrites esinevad ühed ja samad maksimumid ning erinevused kõigis uuritud punktides ei ületa 15 % piigi tipu spektri vastavatest neeldumistest.
Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.
7.2. Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— 30 % suuremast tulemusest diklasuriilisisalduse vahemikus 0,5 –2,5 mg/kg;
— 0,75 mg/kg diklasuriilisisalduse vahemikus 2,5 –5 mg/kg;
— 15 % suuremast tulemusest, kui diklasuriilisisaldus on suurem kui 5 mg/kg.
7.3. Saagis
Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)proovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %.
8. Ühisuuringu tulemused
Korraldati ühisuuring, mille käigus 11 laboratooriumis analüüsiti 5 proovi. Proovideks olid kaks eelsegu: üht oli segatud orgaanilise maatriksiga (O 100) ja teist anorgaanilise maatriksiga (A 100). Teoreetiline diklasuriilisisaldus on 100 mg/kg. Kolm eri tootjat (NL) (L1/Z1/K1) valmistasid kolm kodulindude söödasegu. Teoreetiline diklasuriilisisaldus on 1 mg/kg. Laboratooriumidele tehti ülesandeks iga proovi üks kord või kaks korda analüüsida. (Üksikasjalikumat teavet selle ühisuuringu kohta võib leida ajakirjas Journal of AOAC International, köide 77, nr 6, 1994, lk 1359–1361.) Tulemused on esitatud järgmises tabelis.
|
Proov 1 A 100 |
Proov 2 O 100 |
Proov 3 L1 |
Proov 4 Z1 |
Proov 5 K1 |
L |
11 |
11 |
11 |
11 |
6 |
n |
19 |
18 |
19 |
19 |
12 |
Keskmine |
100,8 |
103,5 |
0,89 |
1,15 |
0,89 |
Sr (mg/kg) |
5,88 |
7,64 |
0,15 |
0,02 |
0,03 |
CVr ( %) |
5,83 |
7,38 |
17,32 |
1,92 |
3,34 |
SR (mg/kg) |
7,59 |
7,64 |
0,17 |
0,11 |
0,12 |
CVR ( %) |
7,53 |
7,38 |
18,61 |
9,67 |
13,65 |
Nominaalsisaldus mg/kg) |
100 |
100 |
1 |
1 |
1 |
L |
= |
laboratooriumide arv |
n |
= |
üksikmääramiste arv |
Sr |
= |
korratavust iseloomustav standardhälve |
CVr |
= |
korratavuse variatsioonikordaja |
SR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja |
9. Tähelepanekud
Eelnevalt peab olema näidatud, et diklasuriili piigi kõrgus (pindala) on mõõdetavas vahemikus lineaarses sõltuvuses kontsentratsioonist.
G. NAATRIUMLASALOTSIIDI MÄÄRAMINE
Polüeetermonokarboksüülhappe naatriumsool, saadud Streptomyces lasaliensis'est
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata naatriumlasalotsiidi kogust söödas ja eelsegudes. Avastamiskünnis on 5 mg/kg, määramispiir 10 mg/kg.
2. Põhimõte
Naatriumlasalotsiid ekstraheeritakse proovist hapestatud metanooliga ja määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades spektrofluoromeetrilist detektorit.
3. Reaktiivid
3.1. Kaaliumdivesinikfosfaat (KH2PO4)
3.2. Ortofosforhape, w (w/w) = 85 %
3.3. Ortofosforhappe lahus, c = 20 %
23,5 ml ortofosforhapet (3.2) lahjendatakse veega 100 milliliitrini.
3.4. 6-metüül-2-heptüülamiin ehk 1,5 -dimetüülheksüülamiin, w (w/w) = 99 %
3.5. HPLC-puhtusastmega metanool
3.6. Soolhape, tihedus = 1,19 g/ml.
3.7. Fosfaatpuhverlahus, c = 0,01 mol/l
1,36 g KH2PO4 (3.1) lahustatakse 500 ml vees (3.11), lisatakse 3,5 ml ortofosforhapet (3.2) ja 10,0 ml 6-metüül-2-heptüülamiini (3.4). pH korrigeeritakse ortofosforhappe lahusega (3.3) 4,0 -ni ja lahjendatakse veega (3.11) 1 000 milliliitrini.
3.8. Hapestatud metanool
5,0 ml soolhapet (3.6) pannakse 1 000 ml mõõtekolbi, täidetakse kolb metanooliga (3.5) kuni märgini ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
3.9. HPLC liikuv faas, fosfaatpuhverlahus + metanoolilahus: 5 + 95 (V + V)
5 ml fosfaatpuhverlahust (3.7) segatakse 95 ml metanooliga (3.5).
3.10. Garanteeritud puhtusega naatriumlasalotsiidi standardaine C34H53O8Na (polüeetermonokarboksüülhappe naatriumsool, saadud Streptomyces lasaliensis'est), E763
3.10.1.
50 mg naatriumlasalotsiidi (3.10) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja pannakse 100 ml mõõtekolbi, lahustatakse hapestatud metanoolis (3.8), täidetakse kolb sama lahustiga kuni märgini ja segatakse. See lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
3.10.2.
10,0 ml põhistandardlahust (3.10.1) pipetitakse 100 ml mõõtekolbi, täidetakse kolb hapestatud metanooliga (3.8) kuni märgini ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
3.10.3.
1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 ja 10,0 ml vahestandardlahust pannakse (3.10.2) 50 ml mõõtekolbidesse. Kolvid täidetakse hapestatud metanooliga (3.8) kuni märgini ja segatakse. Nende lahuste naatriumlasalotsiidisisaldus on vastavalt 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 ja 10,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
3.11. HPLC-puhtusastmega vesi
4. Seadmed
4.1. Temperatuuri reguleerimise seadmetega ultrahelivann (või loksutiga veevann)
4.2. Membraanfiltrid, 0,45 μm
4.3. HPLC seade koos sissepritsesüsteemiga, mis võimaldab süstida mahus 20 μl.
4.3.1. Vedelikkromatograafia kolonn 125 × 4 mm, pöördfaasiline C18-ekstraktsioonihülss, täidise terasuurus 5 μm või samaväärne
4.3.2. Spektrofluorimeeter, mis võimaldab ergastuse ja emissiooni lainepikkusi muuta.
5. Töö käik
5.1. Üldsätted
5.1.1.
Selleks, et teha saagisekatset (5.1.2), tuleb eelnevalt teha võrdlussööda analüüs, veendumaks, et selles ei ole naatriumlasalotsiidi ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ning selles ei tohi leiduda naatriumlasalotsiidi ega segavaid aineid.
5.1.2.
Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus naatriumlasalotsiidi. Et saada kontsentratsiooni 100 mg/kg, kantakse 10,0 ml põhistandardlahust (3.10.1) 250 ml koonilisse kolbi ja aurustatakse lahus ligikaudu 0,5 milliliitrini. Lisatakse 50 g võrdlussööta, segatakse põhjalikult ja jäetakse 10 minutiks seisma, segades enne ekstraheerima (5.2) asumist veel mitu korda.
Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse analüüsitavale proovile ligikaudu sama suur naatriumlasalotsiidikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.
5.2. Ekstraheerimine
5.2.1.
5–10 g proovi kaalutakse täpsusega 0,01 g ja pannakse 250 ml koonilisse korgiga kolbi. Lisatakse pipetiga 100,0 ml hapestatud metanooli (3.8). Korgitakse kinni ja raputatakse segi. Kolb pannakse 20 minutiks ligikaudu 40 oC ultrahelivanni (4.1), seejärel võetakse sealt välja ja jahutatakse toatemperatuurini. Lastakse umbes 1 tund seista, kuni heljuv aine on settinud, siis filtreeritakse alikvoot läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.2) sobivasse anumasse. Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).
5.2.2.
Umbes 2 g jahvatamata eelsegu kaalutakse täpsusega 0,001 g ja pannakse 250 ml mõõtekolbi. Lisatakse 100,0 ml hapestatud metanooli (3.8) ja raputatakse segi. Kolb koos sisuga pannakse 20 minutiks ligikaudu 40 oC ultrahelivanni (4.1), seejärel võetakse sealt välja ja jahutatakse toatemperatuurini. Lahjendatakse hapestatud metanooliga (3.8) kuni märgini ja segatakse hoolikalt. Lastakse tund aega seista, kuni heljuv aine on settinud, siis filtreeritakse alikvoot läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.2). Vajalik kogus selginud filtraati lahjendatakse hapestatud metanooliga (3.8), et saada lõplik katselahus, mis sisaldab umbes 4 μg/ml naatriumlasalotsiidi. Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).
5.3. HPLC määramine
5.3.1.
Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).
Vedelikkromatograafia kolonn (4.3.1): |
125 mm × 4 mm, pöördfaasiline C18, täidise terasuurus 5 μm, või samaväärne |
Liikuv faas (3.9): |
Fosfaatpuhverlahuse (3.7) ja metanooli (3.5) segu, 5+95 (V+V) |
Voolukiirus: |
1,2 ml/min |
Avastamise lainepikkused: |
|
Ergastamine: |
310 nm |
Emissioon: |
419 nm |
Sissesüstitav ruumala: |
20 μl |
Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides kolonni mitu korda kalibreerimislahust (3.10.3) kontsentratsiooniga 4,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused (pindalad) ja retentsiooniajad.
5.3.2.
Iga kalibreerimislahust (3.10.3) süstitakse mitu korda ja määratakse igale kontsentratsioonile vastavad keskmised piigikõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).
5.3.3.
Punktide 5.2.1 või 5.2.2 kohaselt saadud prooviekstrakte süstitakse mitu korda samas mahus, mis kalibreerimislahuse puhul, ja määratakse naatriumlasalotsiidipiikide keskmine kõrgus (pindala).
6. Tulemuste arvutamine
Proovilahuse (5.3.3) süstimisega saadud piikide keskmise kõrguse (pindala) alusel leitakse kalibreerimisgraafiku abil naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml).
6.1. Sööt
Naatriumlasalotsiidi sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:
[mg/kg]
kus:
c |
= |
naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml) proovilahuses (5.2.1); |
V1 |
= |
prooviekstrakti maht milliliitrites vastavalt punktile 5.2.1 (s.o 100); |
m |
= |
kaalutise mass grammides. |
6.2. Eelsegud
Naatriumlasalotsiidi sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:
[mg/kg]
kus:
c |
= |
naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml) proovilahuses (5.2.2); |
V2 |
= |
prooviekstrakti maht milliliitrites vastavalt punktile 5.2.2 (s.o 250); |
f |
= |
punkti 5.2.2 kohane lahjendusfaktor; |
m |
= |
kaalutise mass grammides. |
7. Tulemuste kehtivuse kontroll
7.1. Identsus
Spektrofluoromeetrilised meetodid on vähem tundlikud kõrvaliste lisandite suhtes kui UV-meetodid. Analüüsitava proovi identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil.
7.1.1.
Prooviekstraktile (5.2.1 või 5.2.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.10.3). Lisatud naatriumlasalotsiidikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud naatriumlasalotsiidi kogus. Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes naatriumlasalotsiidipiigi kõrgus. Piigi laius poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui ± 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti naatriumlasalotsiidipiigi laiusest.
7.2. Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— 15 % suuremast tulemusest, kui naatriumlasalotsiidi sisaldus on vahemikus 30–100 mg/kg;
— 15 mg/kg, kui naatriumlasalotsiidi sisaldus on vahemikus 100–200 mg/kg;
— 7,5 % suuremast tulemusest, kui naatriumlasalotsiidisisaldus on suurem kui 200 mg/kg.
7.3. Saagis
Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)söödaproovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %. Suurendatud kontsentratsiooniga eelseguproovi puhul peab saagis olema vähemalt 90 %.
8. Ühisuuringu tulemused
Korraldati ühisuuring, ( *1 ) mille käigus 12 laboratooriumis analüüsiti kahte eelsegu (proovid 1 ja 2) ja viit sööta (proovid 3–7). Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi. Tulemused on esitatud alljärgnevas tabelis:
|
Proov 1 Kanasööda eelsegu |
Proov 2 Kalkunisööda eelsegu |
Proov 3 Kalkunite graanulid |
Proov 4 Kanade kuivikupuru |
Proov 5 Kalkuni-sööt |
Proov 6 Kodulindude sööt A |
Proov 7 Kodulindude sööt B |
L |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
n |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
Keskmine [mg/kg] |
5 050 |
16 200 |
76,5 |
78,4 |
92,9 |
48,3 |
32,6 |
sr [mg/kg] |
107 |
408 |
1,71 |
2,23 |
2,27 |
1,93 |
1,75 |
CVr [ %] |
2,12 |
2,52 |
2,24 |
2,84 |
2,44 |
4,00 |
5,37 |
sR [mg/kg] |
286 |
883 |
3,85 |
7,32 |
5,29 |
3,47 |
3,49 |
CVR [ %] |
5,66 |
5,45 |
5,03 |
9,34 |
5,69 |
7,18 |
10,70 |
Nominaalsisaldus [mg/kg] |
5 000 (1) |
16 000 (1) |
80 (1) |
105 (1) |
120 (1) |
50 (2) |
35 (2) |
(*1) tootja deklareeritud sisaldus (*2) laboratooriumis valmistatud sööt |
L |
= |
laboratooriumide arv |
n |
= |
üksiktulemuste arv |
sr |
= |
korratavust iseloomustav standardhälve |
sR |
= |
reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve |
CVr |
= |
korratavuse variatsioonikordaja, % |
CVR |
= |
reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, % |
V LISA
SÖÖDAS SOOVIMATUTE AINETE SISALDUSE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID
A. VABA GOSSÜPOLI JA GOSSÜPOLI ÜLDSISALDUSE MÄÄRAMINE
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata sisaldust puuvillaseemnetes, puuvillaseemnejahus ja puuvillakoogis ning neid söödatooraineid sisaldavates segasöötades, kui need sisaldavad 20 mg/kg vaba gossüpoli, üldgossüpoli ja gossüpolile keemiliselt sarnaseid aineid.
2. Põhimõte
Gossüpol ekstraheeritakse 3-aminopropaan-1-ooli manulusel kas propaan-2-ooli ja heksaani seguga, et määrata vaba gossüpoli sisaldus, või dimetüülformamiidiga, et määrata gossüpoli üldsisaldus. Gossüpol muundatakse aniliini abil gossüpol-dianiliiniks, mille optiline tihedus mõõdetakse lainepikkusel 440 nm.
3. Reaktiivid
3.1. Propaan-2-ool-heksaani segu: segatakse 60 mahuosa analüütiliselt puhast propaan-2-ooli 40 mahuosa n-heksaaniga.
3.2. Lahusti A: liitrisesse mõõtekolbi pannakse ligikaudu 500 ml propaan-2-ooli ja heksaani segu (3.1), 2 ml 3-aminopropaan-1-ooli, 8 ml jää-äädikhapet ja 50 ml vett. Kolb täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. See lahus säilib üks nädal.
3.3. Lahusti B: 100 ml mõõtekolbi viiakse pipetiga 2 ml 3-aminopropaan-1-ooli ja 10 ml jää-äädikhapet. Jahutatakse toatemperatuurini ning täidetakse kolb N, N-dimetüülformamiidiga märgini. See lahus säilib üks nädal.
3.4. Aniliin: kui pimekatses saadud optiline tihedus ületab 0,022 , lisatakse aniliinile tsingitolmu ja destilleeritakse aniliin, visates ära esimese ja viimase 10 % destillaadist. Külmkapis säilib reaktiiv pruunis korgiga suletud klaaspudelis mitu kuud.
3.5. Gossüpoli standardlahus A: 250 ml mõõtekolbi pannakse 27,9 mg gossüpolatsetaati. Lahustatakse ja täidetakse märgini lahustiga A (3.2). 50 ml seda lahust pipetitakse 250 ml mõõtekolbi ja kolb täidetakse lahustiga A märgini. Gossüpoli kontsentratsioon lahuses on 0,02 mg/ml. Enne kasutamist lastakse üks tund toatemperatuuril seista.
3.6. Gossüpoli standardlahus B: 50-milliliitrisesse mõõtekolbi pannakse 27,9 mg gossüpolatsetaati. Lahustatakse ja täidetakse märgini lahustiga B (3.3). Gossüpoli kontsentratsioon lahuses on 0,5 mg/ml.
Valguse eest kaitstult püsivad gossüpoli standardlahused A ja B 24 tundi.
4. Seadmed
4.1. Segisti (trummel): ligikaudu 35 p/min
4.2. Spektrofotomeeter
5. Töö käik
5.1. Analüüsitav proov
Proovi kasutatav kogus sõltub proovi eeldatavast gossüpolisisaldusest. Eelistatav on töötada väikese prooviga ja filtraadi suhteliselt suure alikvootse osaga, et saada piisavalt gossüpoli täpseks fotomeetriliseks mõõtmiseks. Vaba gossüpoli määramiseks puuvillaseemnetes, puuvillaseemnejahus ja puuvillakoogis ei tohi proov olla suurem kui 1 g, segasööda puhul võib see olla kuni 5 g. Enamikul juhtudest sobib filtraadi alikvootne osa mahuga 10 ml; see peab sisaldama 50–100 μg gossüpoli. Gossüpoli üldsisalduse määramiseks peab proovi suurus olema 0,5 –5 g, et filtraadi alikvootne osa 2 ml sisaldaks 40–200 μg gossüpoli.
Analüüs tuleb läbi viia toatemperatuuril umbes 20 oC juures.
5.2. Vaba gossüpoli määramine
Proov pannakse lihvitud kaelaga 250 ml kolbi, mille põhi on kaetud purustatud klaasiga. Lisatakse pipeti abil 50 ml lahustit A (3.2), kolb suletakse korgiga ja segatakse segistis üks tund. Filtreeritakse läbi kuiva filtri ja kogutakse filtraat väiksesse lihvitud kaelaga kolbi. Filtreerimise ajal kaetakse lehter kellaklaasiga.
Pipetiga viiakse kahte 25 ml mõõtekolbi (A ja B) filtraadi ühesugused alikvootsed osad, mis sisaldavad 50–100 μg gossüpoli. Vajaduse korral täidetakse lahustiga A (3.2) 10 milliliitrini. Seejärel täidetakse kolb A propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Saadud lahust kasutatakse võrdluslahusena, mille suhtes mõõdetakse proovilahust.
Kahte teise 25 ml mõõtekolbi (C ja D) viiakse pipetiga kummassegi 10 ml lahustit A (3.2). Kolb C täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Saadud lahust kasutatakse võrdluslahusena, mille suhtes mõõdetakse pimekatse lahust.
Kolbidesse D ja B lisatakse kummassegi 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Kolvid jahutatakse toatemperatuurini, täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista
Spektrofotomeetriga määratakse sentimeetristes klaasküvettides lainepikkusel 440 nm pimekatse lahuse (D) optiline tihedus võrdluslahuse (C) suhtes ning proovi lahuse (B) optiline tihedus võrdluslahuse (A) suhtes.
Proovilahuse optilisest tihedusest lahutatakse pimekatse lahuse optiline tihedus (= korrigeeritud optiline tihedus). Selle väärtuse põhjal arvutatakse vaba gossüpoli sisaldus, nagu on näidatud punktis 6.
5.3. Gossüpoli üldsisalduse määramine
1–5 mg gossüpoli sisaldav proov pannakse 50 ml mõõtekolbi ja lisatakse 10 ml lahustit B (3.3). Samal ajal valmistatakse ette pimekatse, pannes teise 50 ml mõõtekolbi 10 ml lahustit B (3.3). Neid kahte kolbi kuumutatakse keeval veevannil 30 minutit. Jahutatakse toatemperatuurini ning täidetakse mõlemad kolvid propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Segatakse ja jäetakse 10–15 minutiks selginema, seejärel filtreeritakse ja kogutakse filtraadid lihvitud kaelaga kolbidesse.
Kahte 25 ml mõõtekolbi viiakse kummassegi pipetiga 2 ml proovi filtraati ning kahte teise 25 ml mõõtekolbi kummassegi 2 ml pimekatse filtraati. Kummagi seeria üks kolb täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) 25 milliliitrini. Saadud lahuseid kasutatakse võrdluslahustena.
Kahte teise kolbi lisatakse kummassegi 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) 25 milliliitrini, segatakse ja lastakse üks tund seista.
Määratakse optiline tihedus, nagu on kirjeldatud vaba gossüpoli määramise eeskirja punktis 5.2. Saadud väärtusest arvutatakse gossüpoli üldsisaldus vastavalt punktile 6.
6. Tulemuste arvutamine
Tulemused võib arvutada kas optilise eritiheduse (6.1) või kalibreerimiskõvera 6.2) järgi.
6.1. Optilise eritiheduse järgi
Eespool kirjeldatud tingimustel on optilised eritihedused järgmised:
Vaba gossüpol: |
|
Üldgossüpol: |
|
Vaba gossüpoli sisaldus või gossüpoli üldsisaldus proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:
kus:
E |
= |
korrigeeritud optiline tihedus, mis on määratud vastavalt punktile 5.2; |
p |
= |
proovi mass (g); |
a |
= |
filtraadi alikvootse osa ruumala (ml) |
6.2. Kalibreerimisgraafiku järgi
6.2.1.
Valmistatakse ette kaks seeriat mõõtekolbe, kummaski viis 25 ml kolbi. Mõlema seeria kolbidesse viiakse pipetiga gossüpoli standardlahuse A (3.5) alikvootsed osad 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 ja 10,0 ml. Täidetakse lahustiga A (3.5) 10 milliliitrini. Mõlemad seeriad lõpetatakse 25 ml mõõtekolviga, mis sisaldab üksnes 10 ml lahustit A (3.2) (pimekatse).
Esimese seeria kolvid (kaasa arvatud kolb pimekatsega) täidetakse 25 milliliitrini propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) (võrdlusseeria).
Teise seeria igasse kolbi (kaasa arvatud kolb pimekatsega) lisatakse 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, kolvid täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista (standardseeria).
Vastavalt punktile 5.2 määratakse standardseeria lahuste optiline tihedus vastavate võrdlusseeria lahuste suhtes. Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes sellele gossüpoli kogused μg-des ja neile vastavad optilised tihedused.
6.2.2.
Valmistatakse ette kuus 50 ml mõõtekolbi. Esimesse kolbi viiakse 10 ml lahustit B (3.3) ja teistesse vastavalt 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 ja 10,0 ml gossüpoli standardlahust B (3.6). Lahuse maht igas kolvis viiakse lahusti B (3.3) lisamisega 10 milliliitrini. Kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini ja homogeenitakse.
2,0 ml neid lahuseid pannakse kahe kuuest 25 ml mõõtekolvist koosneva seeria igasse kolbi. Esimese seeria kolvid täidetakse märgini propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) (võrdlusseeria).
Teise seeria igasse kolbi lisatakse 2 ml aniliini (3.4). Kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, kolvid täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista (standardseeria).
Vastavalt punktile 5.2 määratakse standardseeria lahuste optiline tihedus vastavate võrdlusseeria lahuste suhtes. Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes sellele gossüpoli kogused μg-des ja neile vastavad optilised tihedused.
6.3. Korratavus
Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:
— suhtelise väärtusena väljendatult 15 % , kui gossüpoli sisaldus on alla 500 mg/kg;
— absoluutväärtusena väljendatult 75 mg/kg, kui gossüpoli sisaldus on 500–750 mg/kg;
— 10 % suuremast tulemusest, kui gossüpoli sisaldus on üle 750 mg/kg.
B. DIOKSIINIDE (PCDD/PCDF) JA PCBde SISALDUSE MÄÄRAMINE
I PEATÜKK
Proovivõtumeetodid ja analüüsitulemuste tõlgendamine
1. Kohaldamisala ja mõisted
Proovid polüklorodibenso-p-dioksiinide (PCDDd), polüklorodibensofuraanide (PCDFid), dioksiinitaoliste polüklooritud bifenüülide (PCBd) ( 16 ) ja mittedioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks söödas võetakse I lisa sätete kohaselt. Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimise kvantitatiivseid nõudeid kohaldatakse, nagu on sätestatud I lisa punktis 5.1. Selliselt võetud koondproove käsitatakse selle partii või osapartii esinduslike proovidena, millest need on võetud. Direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormidele vastavust kontrollitakse laboriproovides määratud sisalduste alusel.
Käesolevas B osas kohaldatakse komisjoni otsuse 2002/657/EÜ ( 17 ) I lisas esitatud mõisteid.
Lisaks neile mõistetele kasutatakse käesolevas B osas järgmisi mõisteid.
„Sõeluuringumeetodid” on meetodid selliste proovide tuvastamiseks, mille PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisaldus ületab piirnormi või häiretaseme. Need meetodid võimaldavad kulutõhusalt analüüsida suurt arvu proove ning see suurendab võimalusi avastada uusi juhtumeid, mis on tarbijate jaoks suure kokkupuute- ja terviseriskiga. Sõeluuringumeetodid peavad põhinema bioanalüütilistel või GC-MS meetoditel. Proovide tulemusi, mis ületavad piirnormile vastavuse kontrolli läviväärtust, tuleb üle kontrollida esialgse proovi täieliku kordusanalüüsiga kinnitaval meetodil.
„Kinnitavad meetodid” on meetodid, mis annavad täielikku või täiendavat teavet, mis võimaldab PCDD/Fid ja dioksiinitaolised PCBd tuvastada ja määrata üheselt nende sisaldus piirnormile või vajaduse korral häiretasemele vastaval läviväärtusel. Nende meetodite puhul kasutatakse gaasikromatograafiat koos kõrglahutus-massispektromeetriaga (GC-HRMS) või gaasikromatograafiat koos tandemmassispektromeetriaga (GC-MS/MS).
2. Partii või osapartii vastavus piirnormile
2.1. Mittedioksiinitaoliste PCBde puhul
Partii või osapartii vastab piirnormile, kui PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 ja PCB 180 (edaspidi „mittedioksiinitaolised PCBd”) summaarse sisalduse analüüsi tulemus ei ületa direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormi, võttes arvesse mõõtmise laiendmääramatust ( 18 ). Partii või osapartii ei vasta direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormile, kui ülemise tõkke põhimõtte ( 19 ) kohase kahe analüüsitulemuse põhjal on kordusanalüüsiga ( 20 ) saadud aritmeetiline keskmine, mis ületab mõõtmise laiendmääramatust arvesse võttes kahtluseta piirnormi, st vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud kontsentratsiooni väärtust, millest on lahutatud mõõtmise laiendmääramatus.
Mõõtmise laiendmääramatuse arvutamiseks kasutatakse kattetegurit 2, millega tagatakse umbes 95 % usaldusnivoo. Partii või osapartii ei vasta nõuetele, kui mõõtmistulemuste keskväärtusest laiendmääramatuse lahutamisega saadud väärtus ületab piirnormi.
Käesoleva punkti eespool esitatud lõikudes nimetatud eeskirju kohaldatakse ametlikuks kontrolliks ette nähtud proovide analüüsitulemuste suhtes. Kaitse- või vahekohtumenetluse eesmärgil tehtud analüüside suhtes kohaldatakse siseriiklikke eeskirju.
2.2. PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde puhul
Partii või osapartii vastab piirnormile, kui ühe analüüsi tulemus,
— mis on saadud sõeluuringumeetodiga, mille valenegatiivsete tulemuste osakaal on alla 5 %, näitab, et sisaldus ei ületa asjaomast direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud PCDD/Fide piirnormi ega PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa piirnormi;
— mis on saadud kinnitava meetodiga, näitab, et sisaldus ei ületa asjaomast direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud PCDD/Fide piirnormi ega PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa piirnormi, kui võetakse arvesse mõõtmise laiendmääramatust.
Sõeluuringu puhul määratakse läviväärtus, mille alusel otsustatakse, kas proov vastab PCDD/Fide jaoks kehtestatud piirnormile või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa jaoks kehtestatud piirnormile.
Partii või osapartii ei vasta direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormile, kui ülemise tõkke põhimõtte ( 21 ) kohase kahe analüüsitulemuse põhjal on kinnitava meetodiga tehtud kordusanalüüsiga ( 22 ) saadud aritmeetiline keskmine, mis ületab mõõtmise laiendmääramatust arvesse võttes kahtluseta piirnormi, st vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud kontsentratsiooni väärtust, millest on lahutatud mõõtmise laiendmääramatus.
Mõõtmise laiendmääramatuse arvutamiseks kasutatakse kattetegurit 2, millega tagatakse umbes 95 % usaldusnivoo. Partii või osapartii ei vasta nõuetele, kui mõõtmistulemuste keskväärtusest laiendmääramatuse lahutamisega saadud väärtus ületab piirnormi.
PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa puhul tuleb kasutada PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi määramise analüüsitulemuste hinnanguliste laiendmääramatuste summat.
Käesoleva punkti eespool esitatud lõikudes nimetatud eeskirju kohaldatakse ametlikuks kontrolliks ette nähtud proovide analüüsitulemuste suhtes. Kaitse- või vahekohtumenetluse eesmärgil tehtud analüüside suhtes kohaldatakse siseriiklikke eeskirju.
3. Direktiivi 2002/32/EÜ II lisas sätestatud häiretasemeid ületavad tulemused
Häiretasemeid kasutatakse proovide valimiseks juhul, kui on vaja kindlaks teha saasteallikas ja võtta meetmeid saastumise vähendamiseks või kõrvaldamiseks. Sõeluuringumeetoditega tehakse kindlaks selliste proovide valimiseks sobivad läviväärtused. Kui saasteallika kindlakstegemiseks ja saaste vähendamiseks või kõrvaldamiseks on vaja suuri pingutusi, on asjakohane kontrollida häiretaseme ületamist kinnitaval meetodil kordusanalüüsiga ja võtta seejuures arvesse mõõtmise laiendmääramatust ( 23 ).
II PEATÜKK
Proovi ettevalmistamine ja nõuded analüüsimeetoditele, mida kasutatakse dioksiinide (PCDD/Fide) ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks söödas
1. Kohaldamisala
Käesolevas peatükis sätestatud nõudeid kohaldatakse sööda analüüsimisel 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks, samuti seoses proovide ettevalmistamise ja analüüsimisega muul regulatiivsel eesmärgil, sealhulgas kontrollide puhul, mida söödakäitlejad teevad, et tagada vastavus Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruse (EÜ) nr 183/2005 ( 24 ) sätetele.
PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde esinemist söödas võib kontrollida kaht liiki analüüsimeetoditega:
a) Sõeluuringumeetodid
Sõeluuringumeetoditega tuvastatakse sellised proovid, mille PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisaldus ületab piirnormi või häiretaseme. Sõeluuringumeetodid peavad võimaldama kulutõhusalt analüüsida suurt arvu proove ning see suurendab võimalusi avastada uusi juhtumeid, mis on tarbijate jaoks suure kokkupuute- ja terviseriskiga. Nende kasutamise eesmärk on valenegatiivsete tulemuste vältimine. Nende hulka kuulub bioanalüütilisi ja GC-MS-meetodeid.
Sõeluuringumeetoditega võrreldakse analüüsitulemusi läviväärtusega ning saadakse jaatav või eitav vastus piirnormi või häiretaseme võimaliku ületamise kohta. Piirnormile mittevastavuse kahtlusega proovides tuleb PCDD/Fide kontsentratsioon ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarne kontsentratsioon määrata või kinnitada kinnitava meetodi abil.
Peale selle võivad sõeluuringumeetod anda teavet proovis leiduvate PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse kohta. Bioanalüütiliste sõeluuringumeetodite kasutamise korral väljendatakse tulemus bioanalüütilistes ekvivalentides (BEQdes), füüsikalis-keemiliste GC-MS-meetodite kasutamise korral toksilisusekvivalentides (TEQ). Sõeluuringumeetodite numbrilised tulemused sobivad nõuetekohasuse või nõuetele mittevastavuse kahtluse või häiretaseme ületamise tõendamiseks ning kinnitavate meetoditega järelanalüüsi jaoks asjaomase kontsentratsioonivahemiku hindamiseks. Need meetodid ei sobi taustsisalduse ja söödaga saadavate annuste hindamiseks, sisalduse ajatrendide jälgimiseks ega häiretaseme ja piirnormi ümberhindamiseks.
b) Kinnitavad meetodid
Kinnitavate meetoditega on võimalik proovis leiduvaid PCDD/Fe ja dioksiinitaolisi PCBsid üheselt tuvastada ja määrata nende sisaldus ning saada nende kohta täielikud andmed analoogide tasemel. Seega saab selliste meetoditega kontrollida piirnorme ja häiretasemeid, sealhulgas kinnitada sõeluuringumeetoditega saadud tulemusi. Lisaks võib tulemusi kasutada muudel eesmärkidel, nagu sööda seires väikese taustsisalduse määramine, ajatrendide jälgimine, kokkupuute hindamine ning andmebaasi koostamine häiretasemete ja piirnormide võimalikuks ümberhindamiseks. Need meetodid on olulised ka analoogide kombinatsioonide kindlakstegemiseks, et tuvastada võimalik saasteallikas. Nende meetodite puhul kasutatakse GC-HRMSi. Piirnormile vastavuse või mittevastavuse kinnitamiseks võib kasutada ka GC-MS/MSi.
2. Taustteave
Toksilisusekvivalentides (TEQdes) väljendatud kontsentratsioonide arvutamiseks korrutatakse üksikainete kontsentratsioonid asjaomases proovis vastava toksilisusfaktoriga (TEF) (vt I peatüki allmärkus 1) ja liidetakse seejärel kokku, et saada TEQdes väljendatud dioksiinitaoliste ühendite üldkontsentratsioon.
Käesolevas B osas tähendab üksikanaloogi aktsepteeritav määramispiir väikseimat analüüdisisaldust, mida saab mõistliku statistilise usaldusväärsusega mõõta ning mis vastab määramiskriteeriumidele, mis on sätestatud rahvusvaheliselt tunnustatud standardites, nagu standard EN 16215:2012 „Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS” (Loomasööt – dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse määramine gaasikromatograafia ja kõrglahutus-massispektromeetria (GC-HRMS) abil ning indikaator-PCBde sisalduse määramine GC-HRMSi abil) ja/või EPA meetodid 1613 ja 1668 (läbivaadatud).
Üksikanaloogi määramispiiri võib määratleda järgmiselt:
a) prooviekstraktis leiduva analüüdi selline kontsentratsioon, mis annab kahe erineva jälgitava iooni puhul mõõteseadmes mõõtmistulemuse, mille puhul nõrgema töötlemata andmesignaali signaali ja müra suhe on 3: 1 või
b) väikseima kontsentratsiooni punkt kalibreerimiskõveral, mille puhul saadakse vastuvõetav (≤ 30 %) ja järjepidev (mõõdetud vähemalt proovide analüüsiseeria alguses ja lõpus) hälve keskmisest suhtelisest kalibreerimistegurist, mis on arvutatud iga prooviseeria kalibreerimiskõvera kõikide punktide järgi, kui tehnilistel põhjustel signaali ja müra suhte arvutus ei anna usaldusväärset tulemust. Määramispiir LOQ arvutatakse väikseima kontsentratsiooni järgi, võttes arvesse sisestandardite saagist ja proovikogust.
Bioanalüütilised sõeluuringumeetodid ei anna tulemusi analoogi tasemel, vaid näitavad ( 25 ) üksnes TEQ väärtust, väljendatuna BEQdes, millega võetakse arvesse asjaolu, et kõik prooviekstraktis leiduvad ühendid, mis katses vastuse annavad, ei tarvitse vastata kõikidele TEQ-põhimõtte nõuetele.
Sõeluuringu- ja kinnitavaid meetodeid võib teatavas maatriksis sisalduse kontrollimiseks kasutada vaid juhul, kui kõnealused meetodid on piisavalt tundlikud, et häiretasemele või piirnormile vastavat sisaldust usaldusväärselt määrata.
3. Kvaliteedi tagamise nõuded
3.1. |
Igas proovivõtu- ja analüüsietapis tuleb võtta meetmed ristsaastumise vältimiseks. |
3.2. |
Proove tuleb säilitada ja transportida säilitamiseks sobivates klaas-, alumiinium-, polüpropüleen- või polüetüleennõudes, mis ei mõjuta proovide PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisaldust. Paberitolmu jäägid tuleb proovinõust eemaldada. |
3.3. |
Proove tuleb säilitada ja transportida nii, et söödaproovi koostis ei muutuks. |
3.4. |
Vajaduse korral iga laboriproov jahvatatakse peeneks ja segatakse põhjalikult meetodil, mis tagab tõendatult täielikult homogeense proovi (näiteks jahvatatakse proov nii peeneks, et see läbiks 1 mm suuruste avadega sõela). Liiga suure niiskusesisaldusega proove tuleb enne jahvatamist kuivatada. |
3.5. |
Oluline on kontrollida, et reaktiivid, klaasnõud ja seadmed ei mõjutaks TEQdes või BEQdes väljendatud tulemusi. |
3.6. |
Tuleb teha tühikatse, mille puhul tehakse läbi kõik analüüsietapid ilma proovita. |
3.7. |
Bioanalüütiliste meetodite puhul tuleb kontrollida, et ükski analüüsis kasutatav klaasnõu või lahusti ei sisaldaks ühendeid, mis segavad uuritavate ühendite avastamist meetodi töövahemikus. Klaasnõu tuleb loputada lahustiga või kuumutada temperatuuril, mis sobib selle pinnalt PCDD/Fide, dioksiinitaoliste ühendite ja segavate ühendite jääkide eemaldamiseks. |
3.8. |
Ekstraheeritava proovi kogus peab olema piisav, et see vastaks nõuetele, mida kohaldatakse piisavalt väikestele kontsentratsioonidele vastavas töövahemikus, sh piirnormile ja häiretasemele vastavas kontsentratsioonide vahemikus. |
3.9. |
Uuritavatest toodetest võetud proovide ettevalmistamiseks kasutatavate konkreetsete meetodite puhul tuleb järgida rahvusvaheliselt tunnustatud suuniseid. |
4. Nõuded laboritele
4.1. |
Vastavalt määrusele (EÜ) nr 882/2004 peavad laborid olema ISO juhendi 58 kohaselt tegutseva tunnustatud asutuse poolt akrediteeritud, millega tagatakse, et laborid kohaldavad analüüsimisel kvaliteeditagamissüsteemi. Laborid tuleb akrediteerida standardi EN ISO/IEC 17025 kohaselt. Vajaduse korral järgitakse põhimõtteid, mida on kirjeldatud tehnilistes suunistes, milles käsitletakse mõõtemääramatuse ja määramispiiride hinnangulise väärtuse leidmist PCDD/Fide ja PCBde analüüsimisel ( 26 ). |
4.2. |
Labori pädevust tuleb tõendada pideva eduka osalemisega laboritevahelistes uuringutes, mida korraldatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kontsentratsiooni määramiseks asjakohastes söödamaatriksites ja kontsentratsioonivahemikes. |
4.3. |
Laborid, kus kasutatakse proovide tavakontrolliks sõeluuringumeetodeid, peavad tegema nii kvaliteedi kontrollimisel kui ka saastekahtlusega proovide analüüsitulemuste kinnitamisel tihedat koostööd kinnitavat meetodit kasutavate laboritega. |
5. Põhinõuded dioksiinide (PCDDde/PCDFide) ja dioksiinitaoliste PCBde analüüsile
5.1. Väikeste kontsentratsioonidega töövahemik ja määramispiirid
Kuna osa kõnealustest ühenditest on äärmiselt toksilised, peavad tuvastatavad PCDD/Fide kogused olema femtogrammi (10– 15 g) ülemises vahemikus. Enamiku PCBde analoogide puhul piisab nanogrammi täpsusega (10– 9 g) määramispiirist. Toksilisemate dioksiinitaoliste PCBde analoogide (eriti ortoasendamata analoogide) sisalduse määramiseks peab töövahemiku alumine osa ulatuma pikogrammi (10– 12 g) alumiste väärtusteni. Kõigi muude PCBde analoogide puhul piisab nanogrammi (10– 9 g) täpsusega määramispiirist.
5.2. Suur selektiivsus (spetsiifilisus)
5.2.1. |
PCDD/Fisid ja dioksiinitaolisi PCBsid peab olema võimalik eristada paljudest muudest kaasa ekstraheeruvatest ja segada võivatest ühenditest, mille kontsentratsioon võib olla mitu suurusjärku suurem kui uuritavate analüütide kontsentratsioon. GC-MS-meetodite korral peab olema võimalik eristada eri analooge, näiteks toksilisi analooge (nt seitseteist 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fi ning kaksteist dioksiinitaolist PCBd) muudest analoogidest. |
5.2.2. |
Bioanalüütiliste meetoditega peab olema võimalik määrata uuritavaid ühendeid PCDD/Fide ja/või dioksiinitaoliste PCBde summana. Proove tuleb puhastada, et kõrvaldada valepositiivseid tulemusi põhjustavad ühendid ja ühendid, mis võivad signaali vähendada, põhjustades valenegatiivseid tulemusi. |
5.3. Suur mõõtetäpsus (tõesus ja kordustäpsus, bioanalüüsi näiline saagis)
5.3.1. |
GC-MS-meetodite puhul peab määramine tagama kehtiva hinnangu aine tegeliku kontsentratsiooni kohta proovis. Suur mõõtetäpsus on vajalik, et vältida analüüsitulemuse tagasilükkamist määratud TEQ väärtuse vähese usaldusväärsuse tõttu. Mõõtetäpsust väljendatakse tõesuse (sertifitseeritud materjalis sisalduva analüüdi mõõdetud keskmise väärtuse ja analüüdi sertifitseeritud väärtuse erinevus protsentides) ja kordustäpsusena (RSDR on suhteline standardhälve, mis arvutatakse korratavuse tingimustes saadud tulemuste põhjal). |
5.3.2. |
Bioanalüütiliste meetodite korral määratakse bioanalüüsi näiline saagis. „Bioanalüüsi näiline saagis” tähendab BEQ väärtust, mis arvutatakse 2,3,7,8-tetraklorodibenso-p-dioksiini (TCDD) või PCB 126 kaliibrimiskõvera alusel, mida korrigeeritakse tühiprooviga ja jagatakse seejärel kinnitava meetodi abil määratud TEQ väärtusega. Sellega püütakse korrigeerida selliseid tegureid nagu PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste ühendite kadu ekstraheerimisel ja puhastamisel, kaasa ekstraheeruvad ühendid, mis suurendavad või vähendavad tulemust (agonistlik ja antagonistlik mõju), kalibreerimiskõvera sobivus ning toksilisusfaktori (TEF) ja suhtelise potentsuse (REP) väärtuste erinevused. Bioanalüüsi näiline saagis arvutatakse sobivate võrdlusproovide alusel, milles analoogide kombinatsioon on representatiivne ja nende sisaldus vastab ligikaudu huvipakkuvale sisalduste vahemikule. |
5.4. Valideerimine piirnormi vahemikus ja kvaliteedikontrolli üldmeetmed
5.4.1. |
Labor peab tõendama valideerimismenetluse ja tavaanalüüsiga meetodi tulemuslikkust piirnormi hõlmavas vahemikus, nt piirnormi 0,5-, 1- ja 2-kordsele väärtusele vastava sisalduse juures, kordusanalüüsi puhul peab variatsioonikordaja väärtus olema vastuvõetav. |
5.4.2. |
Sisemiste kvaliteedikontrolli meetmetena tuleb teha regulaarseid tühiproovidega ja rikastatud proovidega katseid või analüüsida kontrollproove (võimaluse korral tuleb eelistada sertifitseeritud etalonaineid). Tühiproovide ja rikastatud proovidega katsete ning kontrollproovide analüüsi kohta tuleb koostada kvaliteedikontrolli kaardid, mille alusel kontrollitakse, kas analüüside tulemuslikkus vastab nõuetele. |
5.5. Määramispiir
5.5.1. |
Bioanalüütilise sõeluuringumeetodi puhul ei ole määramispiiri tingimata vaja kindlaks määrata, kuid tuleb tõendada, et meetodiga on võimalik eristada tühiproovi väärtust läviväärtusest. BEQ väärtuse esitamise korral määratakse kindlaks teatamiskünnis, et oleks võimalik eristada proove, mille puhul saadud väärtus on sellest künnisest väiksem. Tuleb tõendada, et teatamiskünnis erineb tühiproovide väärtusest vähemalt kolm korda ja tulemus jääb töövahemikust allapoole. Seepärast arvutatakse see proovide alusel, mis sisaldavad uuritavaid ühendeid ligikaudu nõutud miinimumkoguses, mitte signaali-müra suhte või tühikatse põhjal. |
5.5.2. |
Kinnitava meetodi puhul peab määramispiir olema ligikaudu üks viiendik piirnormist. |
5.6. Analüüsikriteeriumid
Kinnitava meetodi või sõeluuringumeetodi abil usaldusväärsete tulemuste saamiseks peavad piirnormile vastavasse vahemikku jääva TEQ väärtuse ja vastava BEQ väärtuse puhul olema täidetud järgmised kriteeriumid, olenemata sellest, kas TEQ või BEQ määratakse summaarsena (PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarse sisalduse alusel) või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kohta eraldi.
|
Sõeluuring bioanalüütiliste või füüsikalis-keemiliste meetoditega |
Kinnitavad meetodid |
Valenegatiivsete tulemuste osakaal (1) |
< 5 % |
|
Tõesus |
|
– 20 % kuni + 20 % |
Korduvus (RSDr) |
< 20 % |
|
Vahepealne korduvustäpsus (RSD %) |
< 25 % |
< 15 % |
(1) Piirnormide puhul. |
5.7. Sõeluuringumeetodi erinõuded
5.7.1. |
Sõeluuringuks võib kasutada nii GC-MS-meetodeid kui ka bioanalüütilisi meetodeid. GC-MS-meetodite suhtes kohaldatakse punktis 6 sätestatud nõudeid. Rakupõhiste bioanalüütiliste meetodite erinõuded on sätestatud punktis 7. |
5.7.2. |
Laborid, kus proovide tavakontrolliks kasutatakse sõeluuringumeetodeid, peavad tegema tihedat koostööd kinnitavat meetodit kasutavate laboritega. |
5.7.3. |
Tavaanalüüside käigus tuleb kontrollida sõeluuringumeetodi tulemuslikkust analüüsi kvaliteedi kontrollimise ja meetodi pideva valideerimise teel. Nõuetele vastavate tulemuste kontrollimiseks peab olema kehtestatud pidev kava. |
5.7.4. |
Raku reaktsiooni võimaliku pärssimise ja tsütotoksilisuse kontroll 20 % prooviekstraktidest tuleb kontrollida tavapärase sõeluuringuga, lisades neile või jättes lisamata piirnormile või häiretasemele vastavas koguses 2,3,7,8-TCDDd, et kontrollida, kas prooviekstraktis esinevad segavad ained võivad reaktsiooni pärssida. Rikastatud proovis mõõdetud kontsentratsiooni võrreldakse rikastamata ekstraktis määratud kontsentratsiooni ja rikastamisel kasutatud kontsentratsiooni summaga. Kui kõnealune mõõdetud kontsentratsioon on arvutatud (summaarsest) kontsentratsioonist üle 25 % väiksem, viitab see signaali võimalikule pärssimisele ning asjaomast proovi tuleb analüüsida GC-HRMS-meetodil tehtava kinnitava analüüsiga. Tulemusi kontrollitakse kvaliteedikontrolli kaartide põhjal. |
5.7.5. |
Nõuetele vastavate proovide kvaliteedikontroll Ligikaudu 2–10 % nõuetele vastavate proovide tulemustest tuleb olenevalt proovi maatriksist ja labori kogemustest kinnitada GC-HRMS-meetodiga. |
5.7.6. |
Valenegatiivsete tulemuste osakaalu arvutamine kvaliteedikontrolli andmete põhjal Määratakse, kui suur on valenegatiivsete tulemuste osakaal, mis on saadud alla- ja ülespoole piirnormi või häiretaset jäävate proovide sõeluuringul. Valenegatiivsete tulemuste tegelik osakaal peab jääma alla 5 %. Kui proovi maatriksi või maatriksite rühma kohta on olemas vähemalt 20 nõuetele vastava proovi kvaliteedikontrolliga kinnitatud tulemused, arvutatakse nende andmete põhjal valenegatiivsete tulemuste osakaal. Valenegatiivsete tulemuste osakaalu hindamiseks vajaliku 20 tulemuse hulka võib arvata ka laboritevahelistes võrdluskatsetes või seoses saastamisjuhtumiga analüüsitud proovide tulemused, milles määratava aine kontsentratsioon ületab piirnormi näiteks kuni kaks korda. Proovid peavad hõlmama kõige levinumaid analoogide kombinatsioone, mis esindavad eri allikaid. Ehkki sõeluuringu esmane eesmärk on teha kindlaks häiretaset ületava sisaldusega proovid, lähtutakse valenegatiivsete tulemuste osakaalu kindlakstegemisel piirnormist ning seejuures võetakse arvesse kinnitava meetodi kohast mõõtmise laiendmääramatust. |
5.7.7. |
Sõeluuringuga tuvastatud võimalikke nõuetele mittevastavaid tulemusi tuleb alati kontrollida esialgse proovi täieliku kordusanalüüsiga, kasutades kinnitavat meetodit. Neid proove võib kasutada ka valepositiivsete tulemuste osakaalu hindamiseks. Sõeluuringumeetodite puhul on valepositiivsete tulemuste osakaal selliste tulemuste osakaal, mis tunnistatakse kinnitava analüüsiga nõuetele vastavaks, kuigi varasemal sõeluuringul on proov osutunud nõuetele mittevastavuse kahtlusega prooviks. Sõeluuringumeetodi eeliste hindamisel tuleb valepositiivse tulemuse andnud proovide arvu võrrelda kontrollitud proovide koguarvuga. See osakaal peab olema piisavalt väike, et sõeluuringumeetodit oleks mõtet kasutada. |
5.7.8. |
Bioanalüütilised meetodid peavad valideerimistingimustes võimaldama usaldusväärselt viidet TEQ võimalikule tasemele, arvutatud ja väljendatud BEQna. Ka korduvuse tingimustes kasutatavate bioanalüütiliste meetodite puhul peaks laborisisene RSDr olema üldjuhul väiksem kui korratavuse tingimustes (RSDR). |
6. GC-MS-meetodite erinõuded, mida tuleb täita sõeluuringu või kinnitava analüüsi puhul
6.1. WHO-TEQ tulemuste ülemise tõkke ja alumise tõkke vaheline vastuvõetav erinevus
Ülemise ja alumise tõkke vaheline erinevus ei tohi piirnormi ja vajaduse korral häiretaseme ületamise kinnitamiseks olla suurem kui 20 %.
6.2. Saagiste kontroll
6.2.1. |
Analüüsimeetodi valideerimiseks tuleb 13C-märgistatud 2,3,7,8-klooritud PCDD/Fide sisestandardid ja 13C-märgistatud dioksiinitaoliste PCBde sisestandardid lisada kohe analüüsi alguses, näiteks enne ekstraheerimist. Iga tetra- kuni oktaklooritud PCDD/Fide homoloogilise rühma kohta ning iga dioksiinitaoliste PCBde homoloogilise rühma kohta tuleb lisada vähemalt üks analoog (alternatiivina võib lisada vähemalt ühe analoogi iga valitud iooni massispektromeetrilise registreerimise funktsiooni kohta, mida kasutatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse kontrolliks). Kinnitavate meetodite puhul tuleb kasutada kõiki seitsetteist 13C-märgistatud 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fide sisestandardit ja kõiki kahtteist 13C-märgistatud dioksiinitaoliste PCBde sisestandardit. |
6.2.2. |
Asjakohaseid kalibreerimislahuseid kasutades tuleb määrata suhtelised kalibreerimistegurid ka neile analoogidele, mille puhul 13C-märgistatud analoogi ei lisata. |
6.2.3. |
Alla 10 % rasvasisaldusega taimse ja loomse sööda puhul tuleb sisestandardid kindlasti lisada enne ekstraheerimist. Üle 10 % rasvasisaldusega loomse sööda puhul tuleb sisestandardid lisada kas enne või pärast rasva ekstraheerimist. Ekstraheerimise tõhusus tuleb valideerida sobival viisil olenevalt sellest, millises etapis sisestandardid lisatakse. |
6.2.4. |
Enne GC-MS-analüüsi tuleb lisada 1 või 2 saagise (surrogaat)standardit. |
6.2.5. |
Saagise kogust tuleb kontrollida. Kinnitava meetodi puhul peavad individuaalsete sisestandardite saagised olema vahemikus 60–120 %. Individuaalsete analoogide, eriti mõne hepta- või oktaklooritud dibenso-p-dioksiini ja dibensofuraani puhul on lubatud väiksemad või suuremad saagised, kui nende panus TEQ väärtusesse ei ületa 10 % TEQ koguväärtusest (PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa alusel). GC-MS-sõeluuringumeetodite puhul peavad saagised olema vahemikus 30–140 %. |
6.3. Segavate ainete eemaldamine
— PCDD/Fid eraldatakse segavatest klooritud ühenditest, näiteks mittedioksiinitaolistest PCBdest ja klooritud difenüüleetritest, sobiva kromatograafilise meetodiga (eelistada tuleks florisil-, alumiiniumoksiid- ja/või süsinikkolonne).
— Isomeeride gaasikromatograafiline lahutus peab olema selline, et 1,2,3,4,7,8-HxCDFi ja 1,2,3,6,7,8-HxCDFi piikide kattuvus on alla 25 %.
6.4. Kalibreerimine standardkõveraga
Kalibreerimiskõvera vahemik peab hõlmama asjakohast piirnormi või häiretaset.
6.5. Kinnitavate meetodite erikriteeriumid
— GC-HRMSi puhul:
—
HRMSi puhul peab lahutusvõime kogu massivahemikus olema üldjuhul vähemalt 10 000 , kui piikidevahelise ala kõrgus jääb alla 10 %;
järgitakse rahvusvaheliselt tunnustatud standardites, näiteks standardis EN 16215:2012 „Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS” (Loomasööt – dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde määramine GC-HRMSiga ning indikaator-PCBde määramine GC-HRMSiga) ja/või USA Keskkonnakaitseameti meetodite 1613 ja 1668 läbivaadatud versioonides kirjeldatud tuvastamise ja kinnitamise lisakriteeriume.
— GC-MS/MSi puhul:
—
jälgitakse vähemalt 2 spetsiifilist eellasiooni, millest kummalgi on vastav spetsiifiline ülemineku-järglasioon kõikide märgistatud ja märgistamata analüütide jaoks analüüsitavas vahemikus;
valitud ülemineku-järglasioonide suhteliste signaalitugevuste suurim lubatud hälve võib olla ± 15 % võrreldes arvutatud või mõõdetud väärtustega (kaliibrimisstandardite keskmine), identsetes MS/MSi tingimustes, eelkõige põrkeenergia ja põrkegaasi rõhu osas, iga analüüdi ülemineku puhul;
iga kvadrupooli lahutusvõime peab olema võrdne ühikmassilahutusvõimega või sellest parem (ühikmassilahutusvõime: lahutusvõime, mis on piisav kahe teineteisest ühe massiühiku kaugusel asuva piigi eristamiseks), et minimeerida võimalikku segavat mõju uuritavatele analüütidele;
järgitakse rahvusvaheliselt tunnustatud standardites, näiteks standardis EN 16215:2012 „Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS” (Loomasööt – dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde määramine GC-HRMSiga ning indikaator-PCBde määramine GC-HRMSiga) ja/või USA Keskkonnakaitseameti meetodite 1613 ja 1668 muudetud versioonides kirjeldatud tuvastamise ja kinnitamise lisakriteeriume, välja arvatud kohustust kasutada GC-HRMSi.
7. Bioanalüütilistele meetoditele esitatavad erinõuded
Bioanalüütilised meetodid on bioloogilistele põhimõtetele tuginevad meetodid, nagu rakupõhine, retseptor- ja immuunanalüüs. Käesolevas punktis 7 sätestatakse bioanalüütiliste meetodite üldnõuded.
Sõeluuringumeetodiga liigitatakse proov põhimõtteliselt nõuetele vastavaks või nõuetele mittevastavuse kahtlusega prooviks. Sel otstarbel võrreldakse arvutatud BEQ väärtust läviväärtusega (vt punkt 7.3). Läviväärtusest allapoole jäävad proovid tunnistatakse nõuetele vastavaks, läviväärtusega võrdsed või seda ületavad proovid loetakse mittevastavuse kahtlusega proovideks ning neid tuleb analüüsida kinnitava meetodiga. Praktikas võib kõige sobivamaks läviväärtuseks olla BEQ väärtus, mis vastab 2/3 piirnormist, eeldusel, et on tagatud valenegatiivsete tulemuste osakaal alla 5 % ja vastuvõetav valepositiivsete tulemuste osakaal. Kui PCDD/Fide piirnorm ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa piirnorm on erinevad, on proovide nõuetele vastavuse kontrollimiseks ilma fraktsioneerimata vaja PCDD/Fide jaoks asjakohaseid bioanalüüsi läviväärtusi. Häiretaset ületavate proovide kontrollimisel on sobivaks läviväärtuseks asjakohane protsent vastavatest häiretasemetest.
Kui hinnangulist sisaldust väljendatakse BEQna, peavad proovi analüüsitulemused jääma töövahemikku ja ületama teatamiskünnise (vt punktid 7.1.1 ja 7.1.6).
7.1. Analüüsitulemuste hindamine
7.1.1.
— Kui kontsentratsioone arvutatakse TCDD kalibreerimiskõvera alusel, iseloomustab kõvera ülemise osa väärtusi suur hajuvus (variatsioonikordaja CV suur väärtus). Töövahemik on ala, kus CV on alla 15 %. Töövahemiku alumine piir (teatamiskünnis) peab olema vähemalt kolm korda suurem tühikatsete tulemusest. Töövahemiku ülemine piir esitatakse tavaliselt EC70 väärtusena (70 % suurimast efektiivsest kontsentratsioonist), kuid see on väiksem, kui CV on selles vahemikus üle 15 %. Töövahemik määratakse valideerimise käigus. Läviväärtused (vt punkt 7.3) peavad kindlalt jääma töövahemikku.
— Standardlahuste ja prooviekstraktide analüüsimisel tehakse kolm või vähemalt kaks kordusmõõtmist. Kordusanalüüsi korral annab 4–6 üle plaadi jaotatud kannus analüüsitav standardlahus või kontrollekstrakt tulemuse või kontsentratsiooni (võimalik ainult töövahemikus), mis põhineb CV-l, mis on väiksem kui 15 %.
7.1.2.
7.1.2.1. Kalibreerimine standardkõveraga
— Proovide dioksiinisisalduse hindamiseks võrreldakse analüüsitulemust TCDD (või PCB 126 või PCDD/PCDFi/dioksiinitaolise PCB standardsegu) kalibreerimiskõveraga, millest arvutatakse ekstrakti ja seejärel proovi BEQ väärtus.
— Kalibreerimiskõver peab hõlmama 8–12 kontsentratsiooni (vähemalt kahe kordusmõõtmisega), nii et kõvera alumises osas (töövahemikus) oleks piisavalt kontsentratsioonipunkte. Erilist tähelepanu tuleb pöörata kõvera sobivusele töövahemikus. Mittelineaarse regressiooni korral ei ole R2 väärtusest regressiooni sobivuse hindamisel eriti või üldse abi. Parem mudeli sobivus saavutatakse arvutatud sisalduse ja mõõdetud sisalduse vahe (nt ruuthälvete summa) minimeerimisega töövahemikule vastavas kõvera osas.
— Seejärel tuleb korrigeerida prooviekstrakti hinnangulist dioksiinisisaldust uuritava maatriksiga või lahustiga tühiproovi kohta arvutatud BEQ väärtuse põhjal (et võtta arvesse kasutatud lahustites ja kemikaalides esinevaid lisandeid) ning näilise saagise põhjal (arvutatakse sellise sobiva võrdlusproovi BEQ väärtuse alusel, mille representatiivne analoogide kombinatsioon vastab ligikaudu piirnormile või häiretasemele). Saagise korrigeerimiseks peab näiline saagis alati olema nõutavas vahemikus (vt punkt 7.1.4). Saagise korrigeerimiseks kasutatavad võrdlusproovid peavad vastama punktis 7.2 sätestatud nõuetele.
7.1.2.2. Kalibreerimine võrdlusproovide abil
Teise võimalusena võib kasutada vähemalt nelja võrdlusproovi alusel koostatud kalibreerimiskõverat (vt punkt 7.2.4): üks maatriksiga tühiproov ning kolm võrdlusproovi sisaldustega, mis võrduvad 0,5-, 1- ja 2-kordse piirnormi või häiretasemega; kui võrdlusproovide maatriksi omadused kattuvad tundmatute proovide maatriksi omadustega, ei ole vaja arvestada tühikatse ja saagise parandit. Sellisel juhul võib otse nende proovide alusel arvutada analüüsitulemuse, mis vastab 2/3 piirnormist (vt punkt 7.3), ja kasutada seda läviväärtusena. Häiretaset ületavate proovide kontrollimisel on sobivaks läviväärtuseks asjakohane protsent sellistest häiretasemetest.
7.1.3.
Ekstraktid võib jagada PCDD/Fisid ja dioksiinitaolisi PCBsid sisaldavateks fraktsioonideks, mis võimaldab eraldi määrata PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde TEQ väärtused (väljendatuna BEQna). Dioksiinitaolisi PCBsid sisaldava fraktsiooni analüüsimise tulemuste hindamiseks tuleb eelistatavalt kasutada standardiga PCB 126 saadud kalibreerimiskõverat.
7.1.4.
Bioanalüüsi näiline saagis arvutatakse sobivate võrdlusproovide alusel, mille representatiivne analoogide kombinatsioon vastab ligikaudu piirnormile või häiretasemele, ja seda väljendatakse BEQ väärtuse protsendina TEQ väärtusest. Olenevalt analüüsi liigist ja kasutatud TEFidest ( 27 ) võib dioksiinitaoliste PCBde TEF- ja REP-kordajate erinevuse tõttu dioksiinitaoliste PCBde näiline saagis olla PCDD/Fide näilise saagisega võrreldes väike. Seepärast peab PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi määramisel bioanalüüsi näiline saagis olema järgmine: dioksiinitaoliste PCBde puhul 20–60 % ja PCDD/Fide puhul 50–130 % (vahemik kehtib TCDD kalibreerimiskõvera kasutamisel). Dioksiinitaoliste PCBde osakaal PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summas võib eri maatriksite ja proovide puhul erineda; need vahemikud kajastuvad PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa bioanalüüsi näilises saagises, mis peab olema 30–130 %. Kui liidu õigusaktides muudetakse oluliselt PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde TEFide väärtusi, tuleb need vahemikud läbi vaadata.
7.1.5.
Valideerimise käigus kontrollitakse ühendite kadu puhastamisel. Analoogide seguga rikastatud tühiproov (korduskatsete arv n on vähemalt 3) puhastatakse ning saagist ja varieeruvust kontrollitakse kinnitava meetodiga. Saagis peab olema vahemikus 60–120 %, eelkõige selliste analoogide puhul, mis moodustavad eri segude TEQ väärtusest üle 10 %.
7.1.6.
BEQ väärtustest teatamisel tuleb teatamiskünnis kindlaks määrata tüüpilisi analoogide kombinatsioone sisaldavast asjakohasest maatriksist võetud proovide alusel, mitte standarditel põhineva kalibreerimiskõvera alusel, kuna kõvera alumises osas on täpsus väike. Arvestada tuleb ekstraheerimise ja puhastamise mõju. Teatamiskünnis peab olema tühikatsete tulemusest vähemalt kolm korda suurem.
7.2. Võrdlusproovide kasutamine
7.2.1. |
Võrdlusproovid peavad esindama proovi maatriksit, analoogide kombinatsioone ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kontsentratsioone vahemikus, mis vastab piirnormile või häiretasemele. |
7.2.2. |
Igas katseseerias tuleb kasutada tühikatset, eelistatavalt maatriksiga tühiproovi, ja piirnormile või häiretasemele vastava sisaldusega võrdlusproovi. Neid proove tuleb ekstraheerida ja analüüsida samal ajal ja samades tingimustes. Võrdlusprooviga saadud väärtus peab olema selgelt suurem tühiprooviga saadud väärtusest, mis tõendab katsemeetodi sobivust. Kõnealuseid proove võib kasutada tühikatset ja saagist arvestava parandi tegemisel. |
7.2.3. |
Saagist arvestava parandi tegemiseks valitud võrdlusproovid peavad olema analüüsitava proovi suhtes representatiivsed, st analoogide kombinatsioonid ei tohi põhjustada sisalduse alahindamist. |
7.2.4. |
Et tõendada analüüsi nõuetekohast tulemuslikkust huvipakkuvas sisalduste vahemikus piirnormi või häiretaseme kontrollimiseks, võib kasutada täiendavaid võrdlusproove, milles uuritava aine sisaldus vastab näiteks piirnormi või häiretaseme 0,5- ja 2-kordsele väärtusele. Üheskoos võib neid proove kasutada analüüsitavate proovide BEQ väärtuste arvutamiseks (vt punkt 7.1.2.2). |
7.3. Läviväärtuste määramine
Tuleb teha kindlaks BEQ väärtustes väljendatud bioanalüütiliste tulemuste ja TEQ väärtustes väljendatud kinnitava meetodi tulemuste vaheline seos (nt asjakohase maatriksiga tehtud kalibreerimiskatsetega, milles kasutatakse võrdlusproove, mille rikastustasemed on 0, 0,5-, 1- ja 2-kordne piirnorm, ja mida korratakse igal tasemel 6 korda (n = 24)). Selle seose alusel saab hinnata (tühiproovi ja saagise) parandeid, kuid neid tuleb kontrollida punkti 7.2.2 kohaselt.
Läviväärtused tuleb määrata selleks, et otsustada, kas proov vastab piirnormile, või vajaduse korral häiretaseme kontrollimiseks, kusjuures asjaomased piirnormid või häiretasemed on kehtestatud kas ainult PCDD/Fide või dioksiinitaoliste PCBde jaoks või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa jaoks. Läviväärtus on bioanalüüsi tulemuste (mida on parandatud tühikatse ja saagise arvestamiseks) jaotuse alumine piir, mis vastab 95 % usaldusnivooga kinnitava meetodi otsustuspiirile (eeldades, et valenegatiivsete tulemuste osakaal on < 5 % ja RSDR < 25 %). Kinnitava meetodi otsustuspiir on piirnorm, mille puhul on arvesse võetud mõõtmise laiendmääramatust.
Läviväärtuse (BEQdes) võib arvutada, kasutades üht punktides 7.3.1, 7.3.2 ja 7.3.3 sätestatud lähenemisviisidest (vt joonis 1).
7.3.1. |
95 % usaldusnivoole vastava usaldusvahemiku alumise piiri kasutamine, mis vastab kinnitava meetodi otsustuspiirile:
kus
on ruutude summa parameeter, i – kalibreerimispunkti i indeks. |
7.3.2. |
Arvutamine kinnitava meetodi otsustuspiirile vastava saastumisega proovide korduval analüüsimisel (n ≥ 6) saadud (tühikatse ja saagise arvestamiseks parandatud) bioanalüütiliste tulemuste põhjal; see on jaotuse alumine piir vastava keskmise BEQ väärtuse korral: Läviväärtus = BEQDL – 1,64 × SDR kus
|
7.3.3. |
Arvutamine 2/3 piirnormi või häiretaseme väärtusele (põhineb tähelepanekul, et kõnealune tase vastab umbkaudu punkti 7.3.1 või 7.3.2 alusel kindlaks määratud läviväärtusele) vastava saastumisega proovide korduval analüüsimisel (n ≥ 6) saadud bioanalüütiliste tulemuste (BEQdes, parandatud tühikatse ja saagise arvestamiseks) keskväärtusena: Läviväärtuste arvutamine 95 % usaldusnivoo korral eeldusel, et valenegatiivsete tulemuste osakaal on < 5 % ja RSDR < 25 %: 1) 95 % usaldusnivoole vastava usaldusvahemiku alumise piiri alusel, mis vastab kinnitava meetodi otsustuspiirile; 2) kinnitava meetodi otsustuspiirile vastava saastumisega proovide korduva analüüsimise (n ≥ 6) alusel saadud tulemuste jaotuse (joonisel kellukesekujuline kõver) alumise piiri järgi sellekohase keskmise BEQ väärtuse juures.
|
7.3.4. |
Läviväärtustele kehtestatud piirangud BEQ-põhised läviväärtused, mis on arvutatud valideerimise käigus saadud RSDR alusel, kasutades piiratud arvu proove erinevate maatriksite ja analoogide kombinatsiooniga, võivad olla suuremad kui TEQ-põhised piirnormile või häiretasemele vastavad sisaldused, kuna valideerimisel saavutatakse suurem kordustäpsus kui tavaolukorras, kus tuleb kontrollida võimalike analoogide kombinatsioonide tundmatut spektrit. Sellisel juhul võetakse läviväärtuse arvutamisel aluseks kas RSDR = 25 % või eelistatakse sisaldust, mis on 2/3 piirnormi või häiretaseme väärtusest. |
7.4. Tulemuslikkuse näitajad
7.4.1. |
Bioanalüütiliste meetodite puhul ei ole võimalik kasutada sisestandardeid, mistõttu tuleb katseseeriasisese ja katseseeriatevahelise standardhälbe kohta andmete saamiseks teha katsed bioanalüütiliste meetodite korduvuse kohta. Korduvus peab jääma alla 20 % ja laborisisene korratavus alla 25 %. See peab põhinema arvutatud BEQ väärtustel pärast tühikatse- ja saagiseparandi arvessevõtmist. |
7.4.2. |
Valideerimise käigus tõendatakse, et analüüs võimaldab eristada tühiproovi ja läviväärtusele vastavat sisaldust, mis võimaldab kindlaks teha proovid, milles asjaomane läviväärtus on ületatud (vt punkt 7.1.2). |
7.4.3. |
Määratakse uuritavad ühendid, võimalikud segavad tegurid ja tühiproovi suurimad lubatud väärtused. |
7.4.4. |
Ühe prooviekstrakti kolmekordsel analüüsimisel ei tohi protsentides väljendatud standardhälve olla suurem kui 15 % analüüsitulemusest või selle alusel arvutatud sisaldusest (võimalik üksnes töövahemikus). |
7.4.5. |
Bioanalüütilise meetodi tulemuslikkuse hindamiseks kindlas ajavahemikus kasutatakse võrdlusproovi(de) (tühiproov ning piirnormile ja häiretasemele vastava sisaldusega proov) korrigeerimata tulemusi, mis on väljendatud BEQdes. |
7.4.6. |
Tühiproovide ja iga tüüpi võrdlusproovide kohta tuleb koostada kvaliteedikontrolli kaardid ja kontrollida, kas analüüsi tulemuslikkus vastab nõuetele; eelkõige on nõutav teatava miinimumerinevuse olemasolu tühiproovide ja töövahemiku alumise piiri vahel ning võrdlusproovide puhul on nõutav laborisisene korratavus. Tühikatseid tuleb põhjalikult kontrollida, et vältida valenegatiivsete tulemuste saamist pärast tühiproovi tulemuse lahutamist. |
7.4.7. |
Nõuetele mittevastavuse kahtlusega proovide ja 2–10 % nõuetekohaste proovide (vähemalt 20 proovi iga maatriksi kohta) kinnitava meetodiga saadud tulemused tuleb koondada ning kasutada sõeluuringumeetodi tulemuslikkuse ning BEQ ja TEQ vahelise seose hindamiseks. Neid andmeid võib kasutada asjaomase valideeritud maatriksiga tavaproovide suhtes kohaldatavate läviväärtuste ümberhindamiseks. |
7.4.8. |
Meetodi tulemuslikkust võib tõendada ka laboritevahelistes võrdluskatsetes osalemisega. Võrdluskatsete käigus analüüsitud proovid hõlmavad nt kuni kahekordse piirnormini ulatuvat kontsentratsioonide vahemikku ja nende tulemusi võib kasutada valenegatiivsete tulemuste osakaalu hindamisel, kui labor suudab tõendada meetodi tulemuslikkust asjaomases laboris. Proovid peavad hõlmama kõige levinumaid analoogide kombinatsioone, mis esindavad eri allikaid. |
7.4.9. |
Saastumisjuhtumite korral võidakse läviväärtused ümber hinnata, võttes arvesse asjaomase juhtumiga seotud konkreetse maatriksi omadusi ja esinevaid analoogide kombinatsioone. |
8. Tulemuste esitamine
8.1. Kinnitavad meetodid
8.1.1. |
Analüüsitulemused peavad hõlmama iga üksiku PCDD/Fi ja dioksiinitaolise PCB analoogi sisaldusi ning TEQ väärtus tuleb esitada nii alumise ja ülemise tõkke kui ka vaheväärtuse põhisena, et tagada võimalikult suure hulga andmete olemasolu katseprotokollis ja võimaldada tulemuste tõlgendamist lähtuvalt konkreetsetest nõuetest. |
8.1.2. |
Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod. |
8.1.3. |
Üksikute sisestandardite saagised tuleb esitada juhul, kui need jäävad väljapoole punktis 6.2.5 nimetatud vahemikku ja kui on ületatud piirnorm (sellisel juhul ühe korduskatse saagised) või kui nõutakse neist teatamist. |
8.1.4. |
Kuna proovi nõuetekohasuse hindamisel tuleb arvestada mõõtmise laiendmääramatust, esitatakse ka see näitaja. Analüüsitulemused tuleb seega esitada kujul x +/– U, kus x on analüüsitulemus ja U on mõõtmise laiendmääramatus, kusjuures arvutamisel kasutatakse kattetegurit 2, mis annab ligikaudu 95 % usaldusnivoo. Kui PCDD/Fid ja dioksiinitaolised PCBd määratakse eraldi, tuleb PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa kohta kasutada PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi saadud analüüsitulemuste hinnanguliste laiendmääramatuste summat. |
8.1.5. |
Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on esitatud direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid. |
8.2. Bioanalüütilised sõeluuringumeetodid
8.2.1. |
Sõeluuringu tulemus esitatakse järgmisel kujul: nõuetele vastav või nõuetele mittevastavuse kahtlusega („kahtlane”). |
8.2.2. |
Lisaks sellele võib PCDDde/Fide ja/või dioksiinitaoliste PCBde esialgse sisalduse esitada BEQdes, mitte TEQdes. |
8.2.3. |
Allapoole teatamiskünnist jääva tulemusega proovi kohta märgitakse „allpool teatamiskünnist”. Töövahemiku ülempiirist suurema sisaldusega proovi puhul esitatakse tulemus kujul „ületab töövahemiku ülempiiri” ning märgitakse töövahemiku ülempiirile vastav BEQ väärtus. |
8.2.4. |
Katseprotokollis tuleb iga proovimaatriksi tüübi kohta esitada piirnorm või häiretase, millel hindamine põhineb. |
8.2.5. |
Protokollis esitatakse kasutatud analüüsimeetodi liik, analüüsimise aluspõhimõtted ja kalibreerimise viis. |
8.2.6. |
Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod. |
8.2.7. |
Mittevastavuse kahtlusega proovide puhul tuleb protokolli lisada märkus võetavate meetmete kohta. Suurema sisaldusega proovides tuleb PCDD/Fide kontsentratsioon ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarne kontsentratsioon määrata/kinnitada kinnitava meetodi abil. |
8.2.8. |
Esitatakse üksnes kinnitava analüüsiga saadud nõuetele mittevastavad tulemused. |
8.3. Füüsikalis-keemilised sõeluuringumeetodid
8.3.1. |
Sõeluuringu tulemus esitatakse järgmisel kujul: nõuetele vastav või nõuetele mittevastavuse kahtlusega („kahtlane”). |
8.3.2. |
Katseprotokollis tuleb iga proovimaatriksi tüübi kohta esitada piirnorm või häiretase, millel hindamine põhineb. |
8.3.3. |
Peale selle võib esitada iga üksiku PCDD/Fi ja dioksiinitaolise PCB analoogi sisalduse ning TEQ väärtuse alumise tõkke, ülemise tõkke ja vaheväärtuse järgi. Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid. |
8.3.4. |
Üksikute sisestandardite saagised tuleb esitada juhul, kui need jäävad väljapoole punktis 6.2.5 nimetatud vahemikku ja kui on ületatud piirnorm (sellisel juhul ühe korduskatse saagised) või kui nõutakse neist teatamist. |
8.3.5. |
Katseprotokollis märgitakse, millist GC-MSi meetodit kasutati. |
8.3.6. |
Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod. |
8.3.7. |
Mittevastavuse kahtlusega proovide puhul tuleb protokolli lisada märkus võetavate meetmete kohta. Suurema sisaldusega proovides tuleb PCDD/Fide kontsentratsioon ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarne kontsentratsioon määrata/kinnitada kinnitava meetodi abil. |
8.3.8. |
Otsuse nõuetele mittevastavuse kohta võib teha üksnes pärast kinnitavat analüüsi. |
III PEATÜKK
Proovi ettevalmistamine ja nõuded analüüsimeetoditele, mida kasutatakse mittedioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks söödas
1. Kohaldamisala
Käesolevas peatükis sätestatud nõudeid kohaldatakse sööda analüüsimisel mittedioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks, samuti seoses proovide ettevalmistamise ja analüüsimisega muul regulatiivsel eesmärgil, sealhulgas kontrollide puhul, mida söödakäitlejad teevad määruse (EÜ) nr 183/2005 sätetele vastavuse tagamiseks.
2. Kasutatavad tuvastamismeetodid
Gaasikromatograafia koos elektronhaarde detekteerimisega (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS või samaväärsed meetodid.
3. Uuritavate analüütide määramine ja kinnitamine
3.1. |
Suhteline retentsiooniaeg vastavalt sisestandarditele või võrdlusstandarditele (lubatud hälve +/– 0,25 %). |
3.2. |
Mittedioksiinitaoliste PCBde gaasikromatograafiline lahutamine segavatest ainetest, eelkõige nendega koos elueeruvatest PCBdest, eriti juhul, kui sisaldus proovis on ligikaudselt võrreldav kehtiva piirnormiga, ning on vaja kinnitada nõuetele mittevastavust ( 28 ). |
3.3. |
Nõuded GC-MSi meetoditele Vähemalt järgmise arvu molekulaarioonide või asjaomasesse molekulirühma kuuluvate iseloomulike ioonide jälgimine: a) HRMSi puhul kaks spetsiifilist iooni; b) LRMSi puhul kolm spetsiifilist iooni; c) MS-MSi puhul kaks spetsiifilist eellasiooni, millest kummalgi on üks neile vastav üleminekul tekkinud spetsiifiline järglasioon. Valitud massiga fragmentide isotoopsuhte suurimad lubatud hälbed: valitud massiga fragmentide isotoopsuhte suhteline hälve teoreetilisest isotoopide kogusest või uuritava iooni (kõige levinum jälgitav ioon) ja iseloomuliku iooni (iseloomulike ioonide) kalibreerimisstandardist: ± 15 %. |
3.4. |
Nõuded GC-ECD meetoditele Piirnormi ületavaid tulemusi tuleb kinnitada kahe GC-kolonniga, millel on eri polaarsusega statsionaarne faas. |
4. Meetodi tulemuslikkuse tõendamine
Meetodi tulemuslikkus valideeritakse piirnormile vastava sisalduse vahemikus (0,5- kuni 2-kordsele piirnormile vastava sisaldusega); tõendatakse, et korduvanalüüsi variatsioonikordaja on vastuvõetav (vt vahetäpsuse nõuded, punkt 9).
5. Määramispiir
Mittedioksiinitaoliste PCBde määramispiiride summa ( 29 ) ei tohi ületada ühte kolmandikku piirnormi väärtusest ( 30 ).
6. Kvaliteedikontroll
Korrapärane tühiproovide, rikastatud proovide ja kvaliteedikontrolli proovide analüüsimine, osalemine asjaomaste maatriksitega tehtavates laboritevahelistes uuringutes.
7. Saagiste kontroll
7.1. |
Kasutatakse sobivaid sisestandardeid, mille füüsikalis-keemilised omadused on võrreldavad uuritavate analüütide omadega. |
7.2. |
Sisestandardite lisamine: lisamine toodetele (enne ekstraheerimist ja puhastamist). |
7.3. |
Nõuded meetoditele, mille puhul kasutatakse kõiki kuut isotoopmärgistatud mittedioksiinitaolise PCB analoogi: a) tulemustesse viiakse sisse sisestandardite saagiseid arvestav parand; b) isotoopmärgistatud sisestandardi saagis peab olema 60–120 %; c) individuaalsetel analoogidel, mille osatähtsus mittedioksiinitaoliste PCBde summas on alla 10 %, võivad olla väiksemad või suuremad saagised. |
7.4. |
Nõuded meetoditele, mille puhul ei kasutata kõiki kuut isotoopmärgistatud sisestandardit või kasutatakse muid sisestandardeid: a) kontrollitakse iga proovi sisestandardi(te) saagist; b) sisestandardi(te) saagis peab olema 60–120 %; c) tulemustesse viiakse sisse sisestandardite saagiseid arvestav parand. |
7.5. |
Märgistamata analoogide saagiseid kontrollitakse rikastatud proovide või kvaliteedikontrolli proovidega, milles uuritava aine kontsentratsioon on piirnormi lähedane. Selliste analoogide aktsepteeritavad saagised on 60–120 %. |
8. Nõuded laboritele
Vastavalt määrusele (EÜ) nr 882/2004 peavad laborid olema ISO juhendi 58 kohaselt tegutseva tunnustatud asutuse poolt akrediteeritud, millega tagatakse, et laborid kohaldavad analüüsimisel kvaliteeditagamissüsteemi. Laborid tuleb akrediteerida standardi EN ISO/IEC 17025 kohaselt. Peale selle järgitakse vajaduse korral põhimõtteid, mida on kirjeldatud tehnilistes suunistes, milles käsitletakse mõõtemääramatuse ja määramispiiride hinnangulise väärtuse määramist PCBde analüüsimisel ( 31 ).
9. Tulemuslikkuse näitajad: piirnormile vastava mittedioksiinitaoliste PCBde summaarse sisalduse suhtes kohaldatavad kriteeriumid
|
Isotooplahjendusega massispektromeetria (1) |
Muud meetodid |
Tõesus |
– 20 kuni + 20 % |
– 30 kuni + 30 % |
Vahetäpsus (RSD %) |
≤ 15 % |
≤ 20 % |
Ülemise ja alumise tõkke erinevus |
≤ 20 % |
≤ 20 % |
(1) Nõutav on kõigi kuue 13C-ga märgistatud analoogi kasutamine sisestandardina. |
10. Tulemuste esitamine
10.1. |
Selleks et katseprotokoll sisaldaks võimalikult palju andmeid ja võimaldaks tulemuste tõlgendamist konkreetsetest nõuetest lähtuvalt, peavad analüüsitulemused hõlmama iga üksiku mittedioksiinitaolise PCB sisaldust ja nende PCB analoogide summaarset sisaldust ning olema esitatud alumise ja ülemise tõkke ning vaheväärtusena. |
10.2. |
Protokollis esitatakse PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod. |
10.3. |
Üksikute sisestandardite saagised tuleb esitada juhul, kui need jäävad väljapoole punktis 7 nimetatud vahemikku, kui on ületatud piirnorm või muudel juhtudel, kui nõutakse teatamist. |
10.4. |
Kuna proovi nõuetekohasuse hindamisel tuleb arvestada mõõtmise laiendmääramatust, esitatakse ka see näitaja. Analüüsitulemused tuleb seega esitada kujul x +/– U, kus x on analüüsitulemus ja U on mõõtmise laiendmääramatus, kusjuures arvutamisel kasutatakse kattetegurit 2, mis annab ligikaudu 95 % usaldusnivoo. |
10.5. |
Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid. |
VI LISA
ANALÜÜSIMEETODID LOOMSE PÄRITOLUGA OSAKESTE MÄÄRAMISEKS SÖÖDA AMETLIKUL KONTROLLIMISEL
1. EESMÄRK JA REGULEERIMISALA
Loomse päritoluga komponendid söödas määratakse valgusmikroskoopia või polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil vastavalt käesolevas lisas esitatud sätetele.
Nende kahe meetodi abil on võimalik tuvastada loomse päritoluga osakeste esinemist söödamaterjalides ja segajõusöödas. Nende meetodite abil ei ole siiski võimalik arvutada selliste osakeste hulka söödamaterjalides või segajõusöödas. Mõlema meetodi avastamispiir on alla 0,1 massiprotsendi.
Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodi abil on võimalik tuvastada, millisesse taksonoomilisse rühma kuuluvad söödamaterjalides ja segajõusöödas esinevad loomse päritoluga osakesed.
Neid meetodeid kasutatakse määruse (EÜ) nr 999/2001 artikli 7 lõikes 1 ja IV lisas ning määruse (EÜ) nr 1069/2009 artikli 11 lõikes 1 sätestatud keeldude kohaldamise kontrolliks.
Sõltuvalt kontrollitava sööda liigist võib neid meetodeid kasutada ühe katse-eeskirja raames kas eraldi või koos vastavalt ELi referentlabori poolt kehtestatud ja labori veebisaidil avaldatud standardsele töökorrale söödas leiduvate loomsete valkude määramiseks (EURL-AP) ( 32 ).
2. MEETODID
2.1. Valgusmikroskoopia
2.1.1. Põhimõte
Loomse päritoluga osakesed, mis võivad esineda analüüsimiseks saadetud söödamaterjalides ja segajõusöödas, tehakse kindlaks tüüpiliste mikroskoobiga nähtavate tunnuste alusel (nt lihaskiud ja muud lihaosakesed, kõhr, luu- või sarveosakesed, karvad, harjased, veri, suled, munakoored, kalaluud, soomused).
2.1.2. Reaktiivid ja seadmed
2.1.2.1. Reaktiivid
2.1.2.1.1. Kontsentreeriv aine
2.1.2.1.1.1. Tetrakloroetüleen (tihedus 1,62)
2.1.2.1.2. Värvimisreaktiiv
2.1.2.1.2.1. |
Alisariinpunase lahus (lahjendada 2,5 ml 1 M soolhapet 100 ml vees ja lisada saadud lahusele 200 mg alisariinpunast) |
2.1.2.1.3. Kinnitid
2.1.2.1.3.1. Leelis (NaOH 2,5 % w/v või KOH 2,5 % w/v)
2.1.2.1.3.2. Glütserool (lahjendamata, viskoossus: 1 490 cP)
2.1.2.1.3.3. Norland ® Optical Adhesive 65 (viskoossus: 1 200 cP) või vaik, millel on nimetatud vahendiga võrdväärsed omadused objektiklaasil püsipreparaadi valmistamiseks.
2.1.2.1.4. Värvivate omadustega kinnitid
2.1.2.1.4.1. |
Lugoli lahus (lahustada 2 g kaaliumjodiidi 100 ml vees ja lisada pidevalt loksutades 1 g joodi) |
2.1.2.1.4.2. |
Tsüstiini määramise reaktiiv (2 g pliiatsetaati, 10 g NaOH 100 ml vees) |
2.1.2.1.4.3. |
Fehlingi reaktiiv (valmistatakse enne kasutamist põhilahuste A ja B võrdsetest kogustest (1/1). Lahus A: lahustada 6,9 g vask(II)sulfaatpentahüdraati 100 ml vees. Lahus B: lahustada 34,6 g kaaliumnaatriumtartraattetrahüdraati ja 12 g NaOH 100 ml vees) |
2.1.2.1.4.4. |
Tetrametüülbensidiin/vesinikperoksiid (lahustada 1 g 3,3′,5,5′ tetrametüülbensidiini (TMB) 100 ml jää-äädikhappes ja 150 ml vees. Enne kasutamist segada 4 osa saadud TMB lahust 1 osa 3-protsendilise vesinikperoksiidiga) |
2.1.2.1.5. Loputusained
2.1.2.1.5.1. Etanool ≥ 96 % (tehniline)
2.1.2.1.5.2. Atsetoon (tehniline)
2.1.2.1.6. Pleegitav reaktiiv
2.1.2.1.6.1. Kaubanduslik naatriumhüpokloriti lahus (9–14 % aktiivkloori)
2.1.2.2. Seadmed
2.1.2.2.1. Analüütiline kaal täpsusega 0,001 g
2.1.2.2.2. Jahvatusseade: jahvatusveski või uhmer
2.1.2.2.3. 0,25 mm ja 1 mm ruudukujuliste võrguavadega sõelad
2.1.2.2.4. |
250 ml kooniline klaasist jaotuslehter, mille koonuse põhjas on teflonist või lihvklaasist korkkraan. Korkkraani ava läbimõõt peab olema ≥ 4 mm. Alternatiivina võib kasutada koonilise põhjaga selitusklaasi, kui labor on tõestanud, et tuvastatav kontsentratsioon on sama kui koonilise klaasist jaotuslehtri kasutamise puhul. |
2.1.2.2.5. |
Vähemalt 6,5–40-kordse suurendusvahemikuga stereomikroskoop |
2.1.2.2.6. |
Vähemalt 100–400-kordse suurendusvahemikuga kombineeritud mikroskoop, mida saab kasutada vaatluseks läbiva valgusega valgevälja meetodil. Lisaks võib kasutada polariseeritud valgust ja diferentsiaalset interferentskontrasti |
2.1.2.2.7. |
Tavalised klaasist laborinõud |
2.1.2.2.8. |
Vaatluspreparaadi valmistamise vahendid: tavalised mikroskoobi objektiklaasid, süvendiga objektiklaasid, katteklaasid (20 × 20 mm), pintsetid, õhuke spaatel |
2.1.3. Proovi võtmine ja ettevalmistamine
2.1.3.1. Proovi võtmine
Määramiseks kasutatakse I lisa sätete kohaselt võetud representatiivset proovi.
2.1.3.2. Ettevaatusabinõud
Laboratoorse ristsaastumise vältimiseks tuleb kõik taaskasutatavad seadmed enne kasutamist hoolikalt puhastada. Jaotuslehtri osad tuleb enne puhastamist lahti võtta. Jaotuslehtri osad ja klaasnõud pestakse kõigepealt käsitsi ja seejärel pesumasinas. Sõelu tuleb puhastada jäikade harjastega sünteetilise harjaga. Pärast rasvaste materjalide, näiteks kalajahu sõelumist on soovitav sõelu puhastada atsetooni ja suruõhuga.
2.1.3.3. Muude kui rasva- ja õliproovide ettevalmistamine
2.1.3.3.1. |
Proovide kuivatamine: proovid niiskusesisaldusega > 14 % kuivatatakse enne käitlemist. |
2.1.3.3.2. |
Proovide eelsõelumine: 1 mm granuleeritud söötasid ja seemneid on soovitav eelsõeluda ja seejärel valmistada saadud kaks fraktsiooni ette ja analüüsida eraldi proovidena. |
2.1.3.3.3. |
Osaproovide võtmine ja peenestamine: vähemalt 50 g proovist võetakse analüüsimiseks ja peenestatakse. |
2.1.3.3.4. |
Sademe ekstraheerimine ja ettevalmistamine: 10 g (täpsusega 0,01 g) suurune kogus jahvatatud osaproovist pannakse jaotuslehtrisse või koonilise põhjaga selitusklaasi ja lisatakse 50 ml tetrakloroetüleeni. Lehtrisse viidav kogus on maksimaalselt 3 g, kui tegemist on kalajahu või muu puhtalt loomse saaduse, mineraalse komponendi või eelseguga, mis tekitab rohkem kui 10 % sadet. Segu loksutatakse tugevasti vähemalt 30 sekundit ja seejärel lisatakse ettevaatlikult veel vähemalt 50 ml tetrakloroetüleeni, loputades sellega lehtri sisepinda, et eemaldada kõik sellele jäänud osakesed. Saadud segul lastakse seista vähemalt 5 minutit, enne kui sade eraldatakse korkkraani avamisega. Koonilise põhjaga selitusklaasi kasutamisel segatakse segu tugevasti vähemalt 15 sekundit ja pestakse klaasi sisepinnalt vähemalt 10 ml tetrakloroetüleeniga hoolikalt maha kõik kinni jäänud osakesed. Segul lastakse 3 minutit seista ja segatakse uuesti 15 sekundit ning pestakse klaasi sisepinnalt vähemalt 10 ml puhta tetrakloroetüleeniga hoolikalt maha kõik kinni jäänud osakesed. Saadud segul lastakse seista vähemalt 5 minutit ning seejärel vedel osa eemaldatakse ja valatakse ära hoolika dekanteerimisega, jälgides, et sade jääks täielikult alles. Sade kuivatatakse ja seejärel kaalutakse (täpsusega 0,001 g). Kui rohkem kui 5 % sademest koosneb osakestest suurusega > 0,50 mm, sõelutakse sade 0,25 mm sõelaga ja uuritakse kahte saadud fraktsiooni. |
2.1.3.3.5. |
Heljumi ekstraheerimine ja ettevalmistamine: pärast sademe eraldamist eespool kirjeldatud meetodi abil peab jaotuslehtrisse jääma kaks faasi: vedel faas, mis koosneb tetrakloroetüleenist, ja heljumist saadud tahke faas. Tahke faas on heljum ja selle saamiseks lastakse tetrakloroetüleen lehtrist täielikult välja korkkraani avamisega. Jaotuslehter pööratakse ümber ja valatakse heljum suurde Petri tassi ning kuivatatakse õhu käes tõmbe all. Kui heljumis on rohkem kui 5 % osakesi suurusega > 0,50 mm, sõelutakse see 0,25 mm sõelaga ja uuritakse mõlemat saadud fraktsiooni. |
2.1.3.3.6. |
Lähtematerjali ettevalmistamine: valmistatakse ette vähemalt 5 g suurune jahvatatud osaproov. Kui rohkem kui 5 % materjalist koosneb osakestest suurusega > 0,50 mm, sõelutakse see 0,25 mm sõelaga ja uuritakse mõlemat saadud fraktsiooni. |
2.1.3.4. Rasvast ja õlist koosnevate proovide ettevalmistamine
Rasvast ja õlist koosnevate proovide ettevalmistamiseks võib kasutada järgmist eeskirja:
— kui rasv on tahke, soojendatakse seda ahjus kuni vedeldumiseni;
— pipeti abil viiakse 40 ml rasva või õli proovi põhjast tsentrifuugitopsi;
— tsentrifuugitakse 10 minutit kiirusel 4 000 p/min;
— kui rasv on pärast tsentrifuugimist tahke, soojendatakse seda ahjus kuni vedeldumiseni;
— tsentrifuugimist korratakse 5 minutit kiirusel 4 000 p/min;
— väikese lusika või spaatli abil viiakse pool dekanteeritud lisanditest uurimiseks mikroskoobi objektiklaasile, kinnitina soovitatakse kasutada glütserooli;
— ülejäänud lisandeid kasutatakse sademe ettevalmistamiseks vastavalt punktile 2.1.3.3.
2.1.3.5. Värvimisreaktiivide kasutamine
Loomset päritolu osakeste nõuetekohase kindlakstegemise hõlbustamiseks võib katse teostaja kasutada proovide ettevalmistamisel värvimisreaktiive kooskõlas EURL-AP koostatud juhistega, mis on avaldatud labori veebisaidil.
Kui sademe värvimiseks kasutatakse alisariinpunase lahust, kasutatakse järgmist eeskirja:
— kuivatatud sade pannakse katseklaasi ja loputatakse kaks korda umbes 5 ml etanooliga (iga kord kasutatakse pöörissegajat 30 sekundit, lahustil lastakse umbes üks minut ja 30 sekundit settida ja lahusti kallatakse ära);
— sade pleegitatakse vähemalt 1 ml naatriumhüpokloriti lahuse lisamisega. Reaktsioonil lastakse kesta 10 minutit. Katseklaas täidetakse veega, sademel lastakse 2–3 minutit settida ning vesi ja suspendeeritud osakesed kallatakse ettevaatlikult ära;
— sadet loputatakse veel kaks korda umbes 10 ml veega (kummalgi korral kasutatakse pöörissegajat 30 sekundit, lastakse settida ja vesi kallatakse ära);
— lisatakse 2–10 tilka alisariinpunase lahust ja segu segatakse pöörissegajaga. Reaktsioonil lastakse kesta 30 sekundit ja värvitud sadet loputatakse kaks korda umbes 5 ml etanooliga ja seejärel üks kord atsetooniga (iga kord kasutatakse pöörissegajat 30 sekundit, lahustil lastakse umbes 1 minut selgida ja kallatakse ära);
— värvitud sade kuivatatakse.
2.1.4. Mikroskoopiline uurimine
2.1.4.1. Vaatluspreparaadi ettevalmistamine
Sademest ja katse teostaja valikul kas heljumist või lähteainest valmistatakse vaatluspreparaadid. Kui proovi ettevalmistamisel on kasutatud sõelumist, valmistatakse vaatluspreparaadid kahest saadud fraktsioonist (peenem ja jämedam fraktsioon). Objektiklaasidele määritud fraktsioonide näidised peavad olema terve fraktsiooni suhtes esindavad.
On vaja ette valmistada piisav arv vaatluspreparaate, et tagada punktis 2.1.4.2 esitatud uurimiseeskirja täies ulatuses teostamine.
Vaatluspreparaadid peavad olema kinnitatud nõuetekohaste kinnitite abil vastavalt EURL-AP standardsele töökorrale, mis on avaldatud labori veebisaidil. Vaatluspreparaadid peavad olema kaetud katteklaasidega.
2.1.4.2. Vaatluseeskirjad loomse päritoluga osakeste tuvastamiseks segajõusöödas ja söödamaterjalis
Ettevalmistatud vaatluspreparaate vaadeldakse vastavalt vaatluseeskirjadele, mis on esitatud joonisel 1 (muu segajõusööt ja söödamaterjalid kui puhas kalajahu) või joonisel 2 (kalajahu).
Sademe mikroskoobiga vaatlemiseks kasutatakse kombineeritud mikroskoopi ja katse teostaja valikust sõltuvalt uuritakse kas heljumit või lähtematerjali. Jämedama fraktsiooni uurimiseks võib peale kombineeritud mikroskoobi kasutada ka stereomikroskoopi. Kõiki vaatluspreparaate uuritakse põhjalikult, kasutades erinevaid suurendusi.
Vaatluseeskirja iga etapi jaoks kehtestatud vaatluspreparaatide miinimumarvust tuleb rangelt kinni pidada, välja arvatud juhul, kui kogu fraktsiooni materjalist ei ole võimalik saada nõutavat arvu vaatluspreparaate. Ühe määramise jaoks vaadeldakse kuni kuut vaatluspreparaati.
Katse teostaja võib osakeste laadi ja päritolu kindlakstegemise hõlbustamiseks kasutada abivahendeid, näiteks otsustamise tugisüsteeme, fotoarhiive ja etalonproove.
2.1.4.3. Määramiste arv
Kui joonistel 1 ja 2 esitatud vaatluseeskirjade kohase esimese määramise tulemusena ei tuvastata ühtki maismaaloomast või kalast saadud loomse päritoluga osakest, ei ole täiendav määramine vajalik ja analüüsi tulemus väljendatakse punktis 2.1.5.1 esitatud näidislausete abil.
Kui joonisel 1 või 2 esitatud vaatluseeskirjade kohase esimese määramise tulemusena tuvastatud (maismaaloomast või kalast saadud) osakeste arv jääb vahemikku 1–5, tehakse teine määramine uuest 50 g osaproovist. Kui teisel määramisel jääb kõnealust laadi loomse päritoluga osakeste arv vahemikku 0–5, väljendatakse analüüsi tulemus punktis 2.1.5.2 esitatud näidislausete abil või tehakse kolmas määramine uuest 50 g osaproovist. Kui pärast esimest ja teist määramist on kahe määramisega tuvastatud kõnealust laadi osakeste summa suurem kui 15, ei ole täiendavat määramist vaja teha ja analüüsi tulemus väljendatakse punktis 2.1.5.3 esitatud näidislausete abil. Kui pärast kolmandat määramist on kolme määramisega tuvastatud kõnealust laadi loomse päritoluga osakeste summa suurem kui 15, väljendatakse analüüsi tulemus punktis 2.1.5.3 esitatud näidislausete abil. Muudel juhtudel väljendatakse analüüsi tulemus punktis 2.1.5.2 esitatud näidislausete abil.
Kui joonisel 1 või 2 esitatud vaatluseeskirjade kohase esimese määramise tulemusena tuvastatakse rohkem kui 5 maismaaloomast või kalast pärinevat loomse päritoluga osakest, väljendatakse analüüsi tulemus punktis 2.1.5.3 esitatud näidislausete abil.
2.1.5. Tulemuste väljendamine
Tulemuste esitamisel teatab labor, millist tüüpi materjali analüüsiti (sade, heljum või lähteaine) ja mitu määramist tehti.
Labori aruanne peab sisaldama vähemalt teavet maismaaloomadest ja kalajahust pärinevate osakeste olemasolu kohta.
Erinevad tulemused esitatakse järgmiselt.
2.1.5.1. |
Ei tuvastatud ühtki kõnealust laadi loomse päritoluga osakest: — valgusmikroskoopia abil ei tuvastatud analüüsimiseks esitatud proovis maismaaloomadest saadud osakesi, — valgusmikroskoopia abil ei tuvastatud analüüsimiseks esitatud proovis kalast saadud osakesi. |
2.1.5.2. |
Tuvastati keskmiselt 1–5 loomse päritoluga osakest: — valgusmikroskoopia abil ei tuvastatud analüüsimiseks esitatud proovist rohkem kui viis maismaaloomadest saadud osakest ühe määramise kohta keskmiselt. Osakesed määratleti kui … [kondid, kõhr, lihaskiud, karv, sarv …]. Selline väga väike sisaldus, mis on allpool mikroskoopilise meetodi avastamispiiri, tähendab, et ei saa välistada valepositiivse tulemuse võimalust. Või, vastavalt vajadusele, — valgusmikroskoopia abil ei tuvastatud analüüsimiseks esitatud proovist rohkem kui viis kalast saadud osakest ühe määramise kohta keskmiselt. Osakesed määratleti kui … [kalaluu, kalasoomus, kõhr, lihaskiud, otoliit, lõpus …]. Selline väga väike sisaldus, mis on allpool mikroskoopilise meetodi avastamispiiri, tähendab, et ei saa välistada valepositiivse tulemuse võimalust. Proovi eelsõelumise puhul märgib labor, millises fraktsioonis (sõelutud fraktsioon, granuleeritud fraktsioon või seemned) on tuvastatud loomse päritoluga osakesi, kuna ainult sõelutud fraktsioonist tuvastatud loomse päritoluga osakesed võivad tähendada keskkonna saastumist. |
2.1.5.3. |
Tuvastati keskmiselt rohkem kui viis loomse päritoluga osakest: — valgusmikroskoopia abil tuvastati analüüsimiseks esitatud proovist rohkem kui viis maismaaloomadest saadud osakest ühe määramise kohta keskmiselt. Osakesed määratleti kui … [kondid, kõhr, lihaskiud, karv, sarv …]. Või, vastavalt vajadusele, — valgusmikroskoopia abil tuvastati analüüsimiseks esitatud proovist rohkem kui viis kalast saadud osakest ühe määramise kohta keskmiselt. Osakesed määratleti kui … [kalaluu, kalasoomus, kõhr, lihaskiud, otoliit, lõpus …]. Proovi eelsõelumise puhul märgib labor, millises fraktsioonis (sõelutud fraktsioon, granuleeritud fraktsioon või seemned) on tuvastatud loomse päritoluga osakesi, kuna ainult sõelutud fraktsioonist tuvastatud loomse päritoluga osakesed võivad tähendada keskkonna saastumist. |
2.2. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)
2.2.1. Põhimõte
Loomse päritoluga desoksüribonukleiinhappe (DNA) fragmendid, mis võivad esineda söödamaterjalides ja segajõusöödas, tuvastatakse polümeraasi ahelreaktsiooni abil geeni kordistamise meetodiga, mis on suunatud liigispetsiifilise DNA-järjestuse tuvastamisele.
PCR-meetodi puhul on kõigepealt nõutav DNA eraldamine. Selliselt saadud DNAga tehakse geeni kordistamine, et tuvastada katsega kontrollitavaid loomaliike.
2.2.2. Reaktiivid ja seadmed
2.2.2.1. Reaktiivid
2.2.2.1.1. DNA eraldamise reaktiivid
Kasutatakse ainult EURL-AP labori poolt heaks kiidetud ja labori veebisaidil avaldatud reaktiive.
2.2.2.1.2. Geeni kordistamise reaktiivid
2.2.2.1.2.1. Praimerid ja sondid
Kasutatakse ainult EURL-AP poolt valideeritud oligonukleotiidide järjestusega praimereid ja sonde ( 33 ).
2.2.2.1.2.2. Master Mix
Kasutatakse ainult neid Master Mix’i lahuseid, mis ei sisalda reaktiive, mis loomse DNA juuresoleku tõttu võivad anda vale tulemuse ( 34 ).
2.2.2.1.2.3. Saastusest puhastamise reaktiivid
2.2.2.1.2.3.1. Soolhappe lahus (0,1N).
2.2.2.1.2.3.2. Pleegitav reaktiiv (0,15 % aktiivklooriga naatriumhüpokloriti lahus)
2.2.2.1.2.3.3. Kallite seadmete, nagu analüütiliste kaalude (näiteks MP Biomedicals DNA EraseTM) saastusest puhastamiseks ettenähtud mittesöövitavad reaktiivid
2.2.2.2. Seadmed
2.2.2.2.1. Analüütilised kaalud täpsusega 0,001 g
2.2.2.2.2. Jahvatusseadmed
2.2.2.2.3. Reaalajas PCR tegemist võimaldav termotsükler
2.2.2.2.4. Mikrotsentrifuug mikrotsentrifuugitopside jaoks
2.2.2.2.5. 1 μl – 1 000 μl pipeteerimist võimaldavad mikropipetid
2.2.2.2.6. |
Standardsed plastikust molekulaarbioloogia vahendid: mikrotsentrifuugitopsid, mikropipettide filtriga plastikotsikud, termotsükleri plaadid. |
2.2.2.2.7. |
Proovide ja reaktiivide hoidmiseks ettenähtud külmikud |
2.2.3. Proovi võtmine ja proovi ettevalmistamine
2.2.3.1. Proovi võtmine
Määramiseks kasutatakse I lisa kohaselt võetud representatiivset proovi.
2.2.3.2. Proovi ettevalmistamine
Laboriproovide ettevalmistamine kuni DNA eraldamiseni teostatakse vastavalt II lisas sätestatud nõuetele. Vähemalt 50 g proovist võetakse analüüsimiseks osaproovid ja peenestatakse.
Proovi ettevalmistamine teostatakse muudes ruumides kui DNA eraldamiseks ja geeni kordistamiseks ettenähtud ruumid vastavalt standardile ISO 24276.
Ette valmistatakse kaks proovi suurusega vähemalt 100 mg.
2.2.4. DNA eraldamine
Iga proovi DNA eraldatakse vastavalt ELi referentlabori EURL-AP kehtestatud ja labori veebisaidil avaldatud standardsele töökorrale.
Iga eraldamise puhul tehakse kaks eraldamise kontrollkatset vastavalt standardile ISO 24276:
— eraldamise tühikatse,
— DNA eraldamise positiivne kontrollkatse.
2.2.5. Geeni kordistamine
Geeni kordistamine teostatakse kõikide kontrollimist vajavate liikide jaoks valideeritud meetodite abil. Need meetodid on esitatud ELi referentlabori EURL-AP poolt kehtestatud ja labori veebisaidil avaldatud standardses töökorras. Iga eraldatud DNA-proovi analüüsitakse vähemalt kahe erineva lahjendusega, et hinnata inhibeerimist.
Iga sihtliigi kohta tehakse kaks kordistamise kontrollkatset vastavalt standardis ISO 24276 kirjeldatud meetodile:
— igal plaadil või PCR-katsete seerias kasutatakse sihtliigi DNA positiivset kontrolli;
— igal plaadil või PCR-katsete seerias kasutatakse kordistusreaktiivi kontrolli (mida nimetatakse ka matriitsita kontrolliks).
2.2.6. Tulemuste tõlgendamine ja esitamine
Tulemuste esitamisel teatab labor vähemalt kasutatud proovide massi, kasutatud ekstraheerimismeetodi, teostatud määramiste arvu ja meetodi avastamispiiri.
Tulemusi ei tõlgendata ega esitata, kui DNA eraldamise positiivne kontrollproov ja DNA positiivne sihtkontrollproov ei anna katsega kontrollitava sihtliigi puhul positiivseid tulemusi, samas kui kordistamisreaktiivi kontroll on negatiivne.
Kui kahe proovi tulemused ei ole kooskõlas, korratakse vähemalt geeni kordistamist. Kui labor kahtlustab, et nimetatud lahkumineku põhjuseks võib olla DNA eraldamine, tehakse enne tulemuste tõlgendamist uus DNA eraldamine ja seejärel geeni kordistamine.
Tulemuste lõplik väljendamine peab põhinema kahe proovi tulemuste ühendamisel ja tõlgendamisel vastavalt ELi referentlabori EURL-AP poolt kehtestatud ja labori veebisaidil avaldatud standardsele töökorrale.
2.2.6.1. Negatiivne tulemus
Negatiivne tulemus esitatakse järgmiselt:
Analüüsimiseks esitatud proovis ei tuvastatud Xst pärinevat DNAd (X on katsega kontrollitav loomaliik või liikide rühm).
2.2.6.2. Positiivne tulemus
Positiivne tulemus esitatakse järgmiselt:
Analüüsimiseks esitatud proovis tuvastati Xst pärinev DNA (X on katsega kontrollitav loomaliik või liikide rühm).
VII LISA
KODULINDUDE SÖÖDA ENERGIASISALDUSE ARVUTAMISE MEETOD
1. Energiasisalduse arvutamine ja väljendamine
Kodulindude segasööda energiasisaldus tuleb arvutada teatavate söödas sisalduvate analüütiliste koostisosade protsendimäära põhjal vastavalt allpool esitatud valemile. Energiasisaldus väljendatakse ainevahetuses tekkiva energiana (ME) (lämmastiku suhtes korrigeerituna) megadžaulides (MJ) segasööda kilogrammi kohta:
Ainevahetuses tekkiv energia (MJ/kg) = 0,1551 × kogu valgu protsent + 0,3431 × kogu rasva protsent + 0,1669 × tärklise protsent + 0,1301 × sahharoosina väljendatud üldsuhkru protsent
2. Avaldatud väärtuse lubatud hälbed
Kui ametlikul kontrollimisel ilmneb erinevus (sööda energiasisaldus on suurem või väiksem) kontrollitulemuste ja avaldatud energiasisalduse vahel, on ainevahetuses tekkiva energia lubatud minimaalne hälve 0,4 MJ/kg.
3. Tulemuste väljendamine
Eespool esitatud valemit kasutades saadud tulemus tuleb esitada ühe kümnendkoha täpsusega.
4. Proovivõtu- ja analüüsimeetodid
Proovid tuleb segasöödast võtta ja arvutusmeetodis märgitud analüütiliste koostisosade sisaldus tuleb kindlaks määrata vastavalt sööda ametlikuks kontrolliks ettenähtud ühenduse proovivõtu- ja analüüsimeetoditele.
Kasutatakse järgmisi meetodeid:
— kogu rasvasisalduse määramiseks: III lisa H osas sätestatud meetod B toorõli- ja -rasvasisalduse määramiseks;
— tärklisesisalduse määramiseks: III lisa L osas sätestatud polarimeetriline meetod.
VIII LISA
SÖÖDAS MITTE ENAM LUBATUD LISANDITE EBASEADUSLIKU SISALDUSE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID
Olulised märkused
Et avastada söödas mitte enam lubatud lisandite ebaseaduslikku sisaldust, võib kasutada käesoleva lisa analüüsimeetoditest tundlikumaid analüüsimeetodeid.
Käesolevas lisas nimetatud analüüsimeetodeid kasutatakse kinnitamiseks.
A. METÜÜLBENSOKAADI MÄÄRAMINE
7-bensüüloksü-6-butüül-3-metoksükarbonüül-4-kinoloon
1. Eesmärk ja rakendusala
Selle meetodiga on võimalik määrata metüülbensokaadi taset söödas. Määramispiir on 1 mg/kg.
2. Põhimõte
Metüülbensokaat ekstraheeritakse proovist metaansulfoonhappe metanoolilahusega. Ekstrakt puhastatakse diklorometaaniga ioonvahetuskromatograafia abil ja seejärel uuesti diklorometaaniga. Metüülbensokaadi sisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.
3. Reaktiivid
3.1. Diklorometaan
3.2. HPLC-puhtusastmega metanool
3.3. HPLC liikuv faas
metanooli (3.2) ja vee (HPLC-puhtusastmega) segu 75/25 (v + v).
Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4,5 ) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit).
3.4. Metaansulfoonhappe lahus, c = 2 %
20,0 ml metaansulfoonhapet lahjendatakse metanooliga (3.2) 1 000 ml-ni.
3.5. Soolhappe lahus, c = 10 %
100 ml soolhapet (ρ20 = 1,18 g/ml) lahjendatakse veega 1 000 ml-ni.
3.6. Katioonvahetusvaik Amberlite CG-120 (Na-vormis), 100–200 mešši.
Vaiku töödeldakse enne kasutamist 100 g vaiku immutatakse 500 ml soolhappe lahusega (3.5) ja kuumutatakse kuumal plaadil pidevalt segades keemiseni. Lastakse jahtuda ja hape dekanteeritakse. Filtreeritakse läbi filterpaberi, kasutades vaakumit. Vaiku pestakse kaks korda 500 ml veeportsjonitega ja seejärel 250 ml metanooliga (3.2). Vaiku loputatakse veel 250 ml metanooliga ja kuivatatakse filtrikoogist õhku läbi lastes. Kuivatatud vaiku hoitakse korgiga suletud pudelis.
3.7. Standardaine: puhas metüülbensokaat (7-bensüüloksü-6-butüül-3-metoksükarbonüül-4-kinoloon)
3.7.1.
50 mg standardainet (3.7) kaalutakse 0,1 mg täpsusega, lahustatakse 100 ml mõõtekolbis metaansulfoonhappe lahuses (3.4), kolb täidetakse märgini ja segatakse.
3.7.2.
5,0 ml metüülbensokaadi põhistandardlahust (3.7.1) viiakse 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse metanooliga (3.2) märgini ja segatakse.
3.7.3.
Vastavalt 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ja 5,0 ml metüülbensokaadi vahestandardlahust (3.7.2) viiakse 25 ml mõõtekolbidesse. Kolvid täidetakse liikuva faasiga (3,3 ) märgini ja segatakse. Lahuste metüülbensokaadi kontsentratsioonid on vastavalt 2,0 ; 4,0 ; 6,0 ; 8,0 ja 10,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.
4. Seadmed
4.1. Laboratoorne loksuti
4.2. Filter-pöördaurusti
4.3. Klaaskolonn (250 mm × 15 mm) korkkraani ja ligikaudu 200 ml reservuaariga
4.4. HPLC-seade muudetava lainepikkusega ultraviolett-detektoriga või dioodireadetektoriga
4.4.1. Vedelikkromatograafia kolonn: 300 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 10 μm või samaväärne
4.5. Membraanfiltrid 0,22 μm.
4.6. Membraanfiltrid 0,45 μm.
5. Töö käik
5.1. Üldsätted
5.1.1. Võrdlussööta analüüsitakse, et selles ei oleks metüülbensokaati ega teisi segavaid aineid.
5.1.2. Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus metüülbensokaati. Kontsentratsiooni 15 mg/kg saamiseks lisatakse 20 g võrdlussöödale 600 μl põhistandardlahust (3.7.1), segatakse ja oodatakse enne ekstraheerimise (5.2) alustamist 10 minutit.
Märkus: selle meetodi rakendamiseks peab võrdlussööt olema tüübilt sarnane prooviga ja analüüsi tulemusena ei tohi sellest leida metüülbensokaati.
5.2. Ekstraheerimine
Umbes 20 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega ja viiakse 250 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml metaansulfoonhappe lahust (3.4) ja loksutatakse mehaaniliselt (4.1) 30 minutit. Lahus filtreeritakse läbi filterpaberi ja filtraat hoitakse vedelik-vedelik ekstraktsiooniks (5.3).
5.3. Vedelik-vedelik-ekstraktsioon
500 ml jaotuslehtrisse, mis sisaldab 100 ml soolhappe lahust (3.5), viiakse 25,0 ml punktis 5.2 saadud filtraati. Lehtrisse lisatakse 100 ml diklorometaani (3.1) ja loksutatakse üks minut. Kihtidel lastakse eralduda ning alumine (diklorometaani) kiht viiakse 500 ml ümarkolbi. Veefaasi ekstraheerimist korratakse veel kahe 40 ml portsjoni diklorometaaniga ja need ühendatakse esimese ekstraktiga ümarkolvis. Diklorometaani ekstrakt aurustatakse pöördaurusti (4.2) abil kuivaks vähendatud rõhul, temperatuuril 40 oC. Jääk lahustatakse 20–25 ml metanoolis (3.2), kolb suletakse ja kogu ekstrakt hoitakse ioonvahetuskromatograafiaks (5.4).
5.4. Ioonvahetuskromatograafia
5.4.1.
Klaasvatist tropp asetatakse klaaskolonni (4.3) põhja. 5,0 g töödeldud katioonvahetusvaiku (3.6) immutatakse 50 ml soolhappega (3.5), valatakse klaaskolonni ja lastakse settida. Liigsel happel lastakse läbi kolonni voolata, kuni happe nivoo on jõudnud vaigu ülemise pinnani, ja kolonni pestakse veega, kuni väljavoolav pesuvesi on lakmuse suhtes neutraalne. 50 ml metanooli (3.2) viiakse kolonni ja lastakse läbi kolonni voolata, kuni metanooli nivoo on jõudnud vaigu pinnani.
5.4.2.
Pipeti abil viiakse punktis 5.3 saadud ekstrakt ettevaatlikult kolonni. Ümarkolbi loputatakse kahe 5–10 ml metanooli (3.2) portsjoniga ja need pesuvedelikud viiakse