I LISA

SEIRE- JA TÕRJEMEETODID

I.   Sissejuhatus

Käesolevas lisas sätestatakse:

a)	direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 44 ette nähtud likvideerimis- ja seireprogrammide suhtes kohaldatavad nõuded ning proovivõtu- ja diagnostikameetodid, mida tuleb kasutada, et tunnistada liikmesriik või selle tsoon või piirkond kõnealuse direktiivi VII peatüki sätete kohaselt taudivabaks;

b)	proovivõtu- ja diagnostikameetodid, mida tuleb kasutada laboriuuringutes direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud mitteeksootilise taudi („loetletud taud”) kahtluse korral ja sellise taudi esinemise kinnitamiseks vastavalt nimetatud direktiivi artikli 28 punktile a ja artikli 57 punktile b;

c)	loetletud taudi kinnitatud esinemise korral võetavad direktiivi 2006/88/EÜ artikli 39 kohased isoleerimismeetmed ning meetmed, mis tuleb võtta, et V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale saaks anda III kategooria tervisealase staatuse.

Käesolevas lisas sätestatud nõuded hõlmavad järgmisi loetletud taude:

1.	viiruslik hemorraagiline septitseemia (VHS)	1. osa
2.	nakkuslik vereloomenekroos (IHN)	1. osa
3.	karpkalade herpesviirus (KHV)	2. osa
4.	lõhede infektsioosne aneemia (ISA)	3. osa
5.	Marteilia refringens'i nakkus	4. osa
6.	Bonamia ostreae nakkus	5. osa
7.	viiruslik valgelaiksus	6. osa.

II.   Mõisted

I ja II lisas kasutatakse järgmisi mõisteid:

a)   maismaapiirkond– ühe või mitme liikmesriigi maismaaosas asuv(ad) üks kasvandus (või mitu kasvandust), mida hõlmab ühine bioturvalisuse süsteem ja mille veeloomade populatsioonil on konkreetse taudi suhtes kindel tervisealane staatus;

b)   maismaakasvandus– ühe liikmesriigi territooriumi maismaaosas asuv kasvandus, kus kasvatatakse vesiviljelusloomi;

c)   maismaatsoon– ühe või mitme liikmesriigi maismaaosas asuv geograafiliselt täpselt piiritletud ala homogeense hüdroloogilise süsteemiga, mis koosneb valgala osadest alates allika(te)st kuni loodusliku või kunstliku tõkkeni, mis takistab veeloomade rännet valgala allavoolu jäävatest lõikudest ülesvoolu, või tervest valgalast alates selle allika(te)st kuni suudmeni või mitmest valgalast koos nende suudmetega, kui valgalad on suudme kaudu epidemioloogiliselt seotud.

d)   ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandus– veeloomade kasvandus, kus pädev asutus on vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artikli 28 punktile a, artiklile 29 ja artikli 57 punktile b kinnitanud ühe või mitme loetletud taudi esinemist;

e)   nakkusega kokkupuutunud kasvandus– veeloomakasvandus, mille kohta on tõendeid või mille puhul on tõsine kahtlus, et see on saastunud ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandusest pärit nakkusohtliku materjaliga.

1. OSA

SEIRE- JA TÕRJEMEETODID VIIRUSLIKU HEMORRAAGILISE SEPTITSEEMIA (VHS) JA NAKKUSLIKU VERELOOMENEKROOSI (IHN) PUHUL

I.   Nõuded, mida kohaldatakse seire- ja likvideerimisprogrammide suhtes, et saada VHSi ja IHNi suhtes taudivaba staatus ja seda säilitada, ning nende loetletud taudide puhul võetavad isoleerimismeetmed

I.1.   VHSi ja IHNi tuvastamiseks tehtava tervisekontrolli ja proovivõtmise üldnõuded:

a)	tervisekontroll ja vajaduse korral proovivõtmine viiakse läbi perioodil, mil veetemperatuur on alla 14 °C või mil see saavutab eeldatavalt aasta madalaima taseme;

b)

kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, määratakse proovivõtukohtade arv ja geograafiline jaotus kindlaks nii, et saavutataks liikmesriigi, tsooni või piirkonna piisav kaetus. Proovivõtukohad peavad olema taudile vastuvõtlike liikide looduslike populatsioonide elupaigaks olevate eri ökosüsteemide suhtes representatiivsed;

c)

kui kasvanduses või looduslikus populatsioonis tehakse tervisekontrolli või võetakse proove üle ühe korra aastas, peab tervisekontrollide vaheline ja proovivõttude vaheline ajavahemik olema vähemalt neli kuud ja nii pikk kui võimalik; seejuures tuleb arvesse võtta alapunktis a sätestatud temperatuurinõudeid;

d)	kõikides tootmisüksustes, näiteks tiikides, basseinides ja sumpades kontrollitakse surnud, nõrkade või ebatavaliselt käituvate kalade olemasolu. Eelkõige pööratakse tähelepanu vee väljavoolukohtadele, kuhu nõrgad kalad kipuvad veevoolust tingituna kogunema;

e)

taudile vastuvõtlike liikide kalad valitakse proovivõtmise eesmärgil järgmiselt: i) vikerforelli olemasolu korral valitakse proovivõtmiseks üksnes selle liigi kalad, välja arvatud juhul, kui esineb ka muid vastuvõtlikke liike, kellel täheldatakse tüüpilisi VHSi või IHNi sümptomeid; vikerforelli puudumisel peavad valimis olema esindatud kõik muud olemasolevad vastuvõtlikud liigid; ii) kui leitakse nõrku, ebatavaliselt käituvaid või äsja surnud, kuid mitte veel lagunenud kalu, võetakse valimisse sellised kalad; kui kalade kasvatamiseks kasutatakse mitut veeallikat, peab valim hõlmama kalu kõikidest veeallikatest; iii) kalad tuleb valida nii, et valimis oleksid proportsionaalselt esindatud kõik kasvanduse osad ja kõik põlvkonnad.

I.2.   Erinõuded VHSi ja IHNi suhtes taudivaba (I kategooria) staatuse saamiseks

I.2.1.   Seireprogrammid

a)

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv direktiivi 2006/88/EÜ III lisa B osas osutatud III kategooria tervisealane staatus, võib kõnealuste loetletud taudide suhtes anda I kategooria tervisealase staatuse, kui kõik asjaomases liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvad kasvandused, kus kasvatatakse nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, vastavad selle direktiivi V lisas sätestatud nõuetele ning kui kõikides sellistes kasvandustes ja vajaduse korral kõnealuse direktiivi V lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt nõutavates ja nimetatud osa kohaselt looduslikes populatsioonides valitud proovivõtukohtades on rakendatud ühte järgmistest seireprogrammidest: i) mudel A – kaheaastane seireprogramm: asjaomastes kasvandustes ja proovivõtukohtades peab olema tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt kahe järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud II jao tabelis 1.A. Selle kaheaastase perioodi jooksul peavad kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid olema andnud VHSi ja/või IHNi suhtes negatiivse tulemuse ning VHSi ja/või IHNi esinemise kahtlus peab olema punktis II.3 sätestatud proovivõtu- ja diagnostikameetoditega ümber lükatud; ii) mudel B – väiksema valimiga nelja-aastane seireprogramm: asjaomastes kasvandustes ja proovivõtukohtades peab olema tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt nelja järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud II jao tabelis 1.B. Selle nelja-aastase perioodi jooksul peavad kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid olema andnud VHSi ja/või IHNi suhtes negatiivse tulemuse ning VHSi ja/või IHNi esinemise kahtlus peab olema punktis II.3 sätestatud proovivõtu- ja diagnostikameetoditega ümber lükatud.

b)

Kui alapunktis a osutatud seireprogrammi rakendamise käigus leiab kinnitust VHSi ja/või IHNi esinemine selle seireprogrammiga hõlmatud kasvanduses ja asjaomase kasvanduse II kategooria tervisealane staatus on seetõttu tühistatud, võib selline kasvandus saada viivitamata taas II kategooria tervisealase staatuse ja jätkata seireprogrammi rakendamist taudivaba staatuse saamiseks punktis I.2.2 sätestatud likvideerimisprogrammi rakendamata, kui kõnealune kasvandus vastab järgmistele tingimustele: i) tegemist on maismaakasvandusega, mille tervisealane staatus seoses VHSi ja/või IHNiga ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude veeloomapopulatsioonide tervisealasest staatusest seoses kõnealuste loetletud taudidega, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3; ii) kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat; iii) kasvandus taasasustatakse kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

I.2.2.   Likvideerimisprogrammid

I.2.2.1.   Üldnõuded

VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiva V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale võib seoses kõnealuste loetletud taudidega anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud likvideerimisprogrammi, mis vastab alapunktide a–e nõuetele:

a)

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 4. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid peab olema tõhusalt kohaldatud ning ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e ümber peab olema loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni. Sellise isoleeritud ala kindlaksmääramisel peab olema lähtutud konkreetse juhu analüüsist ning võetud seejuures muu hulgas arvesse järgmisi riskitegureid, mis mõjutavad kõnealuste loetletud taudide levimist kasvatatavatele ja looduslikele kaladele: VHSi ja/või IHNiga nakatunud kasvandus(t)es surnud kalade arv, osakaal ja jaotus; naabruses asuvate kasvanduste kaugus ja arv; tapamajade lähedus; nakkusega kokkupuutunud muud kasvandused; kasvandus(t)es olevad liigid; nakatunud kasvandus(t)es ja naabruses asuvates kasvandustes kohaldatavad kasvatustavad; hüdrodünaamilised tingimused ja muud tuvastatud epidemioloogiliselt olulised tegurid. Kaitse- ja seiretsoonide kehtestamisel järgitakse nende tsoonide geograafilisel piiritlemisel järgmisi miinimumnõudeid: i) kaitsetsoon kehtestatakse ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvanduse vahetus läheduses ja see vastab: 1) rannikul: sellise ringi sees olevale alale, mille raadius on vähemalt üks loodete horisontaalne ulatus või vähemalt viis kilomeetrit (olenevalt sellest, kumb on suurem) ja mille keskpunktis on ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest; 2) sisemaal: kogu valgalale, millel paikneb ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus; pädev asutus võib vähendada tsooni ulatust nii, et see hõlmaks osa valgalast või kasvanduse ala, kui sellega ei ohustata VHSi ja/või IHNi leviku tõkestamist; ii) pädev asutus kehtestab kaitsetsoonist väljaspool seiretsooni, mis vastab: 1) rannikul: kaitsetsooni ümbritsevale alale, mis hõlmab kattuvaid loodete horisontaalse ulatuse tsoone, või kaitsetsooni ümbritsevale sellise ringi sees olevale alale, mille raadius kaitsetsooni keskpunktist on 10 km, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest; 2) sisemaal: kehtestatud kaitsetsoonist väljaspool asuvale laiemale alale;

b)

kõikides kaitsetsoonis asuvates kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike ja mis ei ole ametlikult tunnistatud VHNi ja/või IHNiga nakatunuks, tehakse ametlik uuring, mis hõlmab vähemalt järgmist: i) proovivõtmine 10 kala analüüsimiseks, kui täheldatakse VHSi ja/või IHNi nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid, või vähemalt 30 kala analüüsimiseks, kui kõnealuseid kliinilisi sümptomeid ega surmajärgseid ilminguid ei täheldata; ii) üks tervisekontroll; kasvandustes, kus jaotises i osutatud analüüside tulemused on negatiivsed, jätkatakse tervisekontrolli tegemist kord kuus ajavahemiku vältel, mil veetemperatuur on alla 14 °C (välja arvatud ajal, mil kalatiigid või sumbad on jääga kaetud), kuni kaitsetsoon vastavalt punkti I.2.2.1 alapunktile c tühistatakse;

c)

kõik ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandused tühjendatakse, puhastatakse ja desinfitseeritakse ning nende tegevus katkestatakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt kuus nädalat. Kõikide samas kaitsetsoonis asuvate ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste tühjendamise järel peab nende tegevus olema üheaegselt katkestatud vähemalt kolme nädala vältel. Käesolevat lõiku kohaldatakse ka uute kasvanduste suhtes, mis on likvideerimisprogrammi rakendamise käigus ametlikult nakatunuks tunnistatud. Pärast ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist muudetakse kaitsetsoon seiretsooniks. Pädev asutus võib nõuda asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvate muude kasvanduste tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende tegevuse katkestamist. Selliste muude kasvanduste puhul määrab pädev asutus katkestusperioodi kestuse kindlaks konkreetse juhuga seotud riskihinnangu alusel;

d)

kõik ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandused ja alapunktis c osutatud kõik kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad muud kasvandused, mille tegevus katkestatakse, taasasustatakse kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv taudivaba (I kategooria) staatus. Taasasustamine toimub üksnes pärast kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste punkti I.2.2.1 alapunkti c kohast tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist;

e)

likvideerimisprogrammiga hõlmatud liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvates kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, ning looduslikes populatsioonides seire tegemise vajaduse korral ka punkti I.1 kohaselt valitud proovivõtukohtades rakendatakse edaspidi punktis I.2.1 sätestatud seireprogrammi.

I.2.2.2.   Nõuded taudivaba staatuse taastamiseks maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust varem IHNi- ja/või VHSi-vabaks tunnistatud kasvandust

Ühtainust varem IHNi- ja/või VHSi-vabaks tunnistatud kasvandust hõlmavas maismaapiirkonnas, mille tervisealane staatus seoses kõnealuste loetletud taudidega ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude omast, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3, ja mille I kategooria tervisealane staatus on tühistatud kooskõlas nimetatud direktiivi artikli 53 lõikega 3, võib I kategooria tervisealase staatuse taastada kohe pärast seda, kui pädev asutus on kinnitanud vastavust järgmistele tingimustele:

a)	asjaomane ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

b)	asjaomane ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

I.3.   Erinõuded VHSi ja/või IHNi suhtes taudivaba (I kategooria) staatuse säilitamiseks

Kui I kategooria tervisealase staatuse säilitamiseks vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 52 on nõutav suunatud seire, tehakse asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, tervisekontrolli ja võetakse kalade hulgast proove vastavalt käesoleva osa II jaos esitatud tabelile 1.C; seejuures võetakse arvesse VHSi ja/või IHNiga nakatumise riski asjaomases kasvanduses.

Sellises maismaapiirkonnas, kus VHSi ja/või IHNi suhtes on kehtestatud I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus seoses VHSi ja/või IHNiga sõltub ümbritsevate looduslike veekogude veeloomapopulatsioonide tervisealasest staatusest, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 2, tuleb tervisekontrolli sageduse kindlaksmääramisel pidada VHSi ja/või IHNiga nakatumise riski suureks.

Taudivaba staatus säilib üksnes juhul, kui kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid annavad VHSi ja/või IHNi suhtes negatiivse tulemuse ning VHSi ja/või IHNi esinemise kahtlus lükatakse punktis II.3 sätestatud diagnostikameetoditega ümber.

I.4.   Nõuded direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 39 sätestatud isoleerimismeetmete kohaldamise lõpetamiseks: V kategooria tervisealase staatuse muutmine III kategooria staatuseks

VHSi ja/või IHNi suhtes V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale võib seoses kõnealuste loetletud taudidega anda III kategooria tervisealase staatuse, kui:

a)	punkti I.2.2.1 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse IHNi ja/või VHSi viiruste hävimine kasvanduses;

b)

kõik kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja muud kasvandused, mille tegevus on katkestatud või kus on kohaldatud alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

c)	taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid.

II.   Diagnostika- ja proovivõtumeetodid

II.1.   Proovivõtuks kasutatavad elundid

Uuritav koematerjal on põrn, neeru esiosa ja kas süda või peaaju. Sugukarjast proovi võtmisel võib uurida ka ovariaal- või seemnevedelikku.

Väikeste kalavastsete puhul võib alla 4 cm pikkused terved kalad tükeldada steriilsete kääride või skalpelliga pärast seda, kui pärakust tahapoole jääv keha osa on eemaldatud. Kui proov koosneb tervetest kaladest pikkusega 4–6 cm, kogutakse sisikond koos neerudega.

Kuni 10 kalalt pärit elunditükid võib ühte koondada.

II.2.   VHSi ja/või IHNi suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks kasutatavad diagnostikameetodid

VHSi ja/või IHNi suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks kasutatakse vastavalt II lisa 1. osa I jaos sätestatud heakskiidetud diagnostikameetoditele ja nende kohaldamise korrale ühte järgmistest diagnostikameetoditest:

a)	viiruse eraldamine rakukultuuris ja selle tuvastamine ensüümimmuunsorptsioonanalüüsi (ELISA), kaudse immunofluorestsentsanalüüsi, viiruse neutraliseerimise meetodi või pöördtranskriptsiooniga reaalajas jälgitava polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-qPCR) abil;

b)

RT-qPCR.

II.3.   Proovivõtu- ja diagnostikameetodid VHSi ja/või IHNi esinemise või puudumise kinnitamiseks

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 28 on vaja VHSi ja/või IHNi kahtlust kinnitada või ümber lükata, järgitakse järgmist kontrolli-, proovivõtu- ja katsekorda:

a)

kahtlusaluses kasvanduses tehakse vähemalt üks tervisekontroll ja võetakse vähemalt üks proov, mis hõlmab 10 kala, kui täheldatakse VHSi ja/või IHNi nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid, või vähemalt 30 kala, kui kõnealuseid kliinilisi sümptomeid ega surmajärgseid ilminguid ei täheldata. Vastavalt II lisa 1. osa II jaos sätestatud üksikasjalikele diagnostikameetoditele ja nende kohaldamise korrale kasutatakse proovide analüüsimiseks ühte või mitut jaotistes i ja ii sätestatud diagnostikameetoditest: i) tavapärane viiruse eraldamine rakukultuuris ja sellele järgnev viiruse immunokeemiline või molekulaarne tuvastamine; ii) viiruse tuvastamine RT-qPCRi abil; iii) muud tõendatult sama tõhusalt töötavad diagnostikameetodid, näiteks kaudne immunofluorestsentsanalüüs, ensüümimmuunsorptsioonanalüüs (ELISA), RT-PCR ja immunohistokeemiline analüüs;

b)

VHSi esinemine loetakse kinnitatuks, kui ühe või mitme nimetatud diagnostikameetodiga saadakse VHSi viiruse suhtes positiivne tulemus. IHNi esinemine loetakse kinnitatuks, kui ühe või mitme nimetatud diagnostikameetodiga saadakse IHNi viiruse suhtes positiivne tulemus. VHSi või IHNi esmajuhu esinemist liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas, kus varem nakkust ei olnud, kinnitatakse viiruse tavapärase rakukultuuris eraldamise või RT-qPCR teel;

c)	VHSi ja/või IHNi viiruse esinemise kahtluse võib ümber lükata, kui rakkude kultiveerimisel või RT-qPCRi abil ei leita tõendeid VHSi ja/või IHNi viiruse esinemise kohta.

Tabel 1.A

Seirekava tsoonis või piirkonnas VHSi ja/või IHNi suhtes taudivaba staatuse saamisele eelneva, punkti I.2.1 alapunkti a jaotises i osutatud kaheaastase seireperioodi jooksul

Kasvanduse liik	Tervisekontrollide arv aastas (kaheaastane seire)	Proovivõttude arv aastas (kaheaastane seire)	Kalade arv valimis (1)
			Kasvatatavate kalade arv	Sugukarja kalade arv (2)
a) Sugukarjaga kasvandused	2	2	50 (esimene kontroll) 75 (teine kontroll)	30 (esimene või teine kontroll) 0 (esimene või teine kontroll)
b) Üksnes sugukarjaga kasvandused	2	1	0	75 (esimene või teine kontroll)
c) Sugukarjata kasvandused	2	2	75 (3) (esimene ja teine kontroll)	0
Kalade maksimaalne arv koondproovis: 10

Tabel 1.B

Väiksemal valimil põhinev seirekava VHSi või IHNi suhtes taudivaba staatuse saamisele eelneva, punkti I.2.1 alapunkti a jaotises ii osutatud nelja-aastase seireperioodi jooksul

Kasvanduse liik	Tervisekontrollide arv aastas	Proovivõttude arv aastas	Kalade arv valimis (4)
			Kasvatatavate kalade arv	Sugukarja kalade arv (5)
Seireperioodi esimesed kaks aastat
a) Sugukarjaga kasvandused	2	1	0 (esimene kontroll) 30 (teine kontroll)	0 (esimene kontroll) 0 (teine kontroll)
b) Üksnes sugukarjaga kasvandused	2	1	0	30 (esimene või teine kontroll)
c) Sugukarjata kasvandused	2	1	30 (6) (esimene või teine kontroll)	0
Seireperioodi viimased kaks aastat
a) Sugukarjaga kasvandused	2	2	30 (esimene kontroll) 0 (teine kontroll)	0 (esimene kontroll) 30 (teine kontroll)
b) Üksnes sugukarjaga kasvandused	2	2		30 (esimene ja teine kontroll)
c) Sugukarjata kasvandused	2	2	30 (6) (esimene ja teine kontroll)
Kalade maksimaalne arv koondproovis: 10

Tabel 1.C

Seirekavad tsoonis või piirkonnas VHSi või IHNi suhtes taudivaba staatuse säilitamiseks, nagu on osutatud punktis I.3

Ohutase	Tervisekontrollide arv	Kalade arv valimis (9)
Kõrge	2 korda aastas	30 (7)  (8)
Keskmine	1 kord aastas	30 (7)
Madal	Kord 2 aasta jooksul	30 (7)
Kalade maksimaalne arv koondproovis: 10

2. OSA

SEIRE- JA TÕRJEMEETODID KARPKALADE HERPESVIIRUSE (KHV) PUHUL

I.   Nõuded, mida kohaldatakse seire- ja likvideerimisprogrammide suhtes, et saada KHV nakkuse suhtes taudivaba staatus ja seda säilitada ning tõkestada KHV nakkuse levikut

I.1.   Üldnõuded

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, määratakse proovivõtukohtade arv ja geograafiline jaotus kindlaks nii, et saavutataks liikmesriigi, tsooni või piirkonna piisav kaetus. Proovivõtukohad peavad ühtlasi olema representatiivsed taudile vastuvõtlike looduslike populatsioonide elupaigaks olevate eri ökosüsteemide, st asjaomaste jõgikondade ja järvede suhtes.

Suunatud seire põhineb vastuvõtlike liikide elupaikade korrapärasel seirel. Kõnealustes kohtades tehakse seiret ajal, mil veetemperatuur on tõusnud haiguse teket võimaldavale tasemele (> 15 °C), kuid mitte enne kahe nädala möödumist kuupäevast, mil selline temperatuur saavutatakse. Kõikidelt kõnealustes kohtades leitud haigetelt või ebatavaliselt käituvatelt kaladelt võetakse proovid ja neid analüüsitakse.

Võimaluse korral tuleks proovid võtta kaladelt, keda on pikemat aega – kaks kuni kolm nädalat – hoitud viirusega nakatumist võimaldavas temperatuurivahemikus 15–26 °C. Siiski on vastuvõetav ka järgmine lähenemisviis:

a)	kalade alampopulatsioon kogutakse kalade üleviimisel talvitustiigist suvetiiki ning seda hoitakse suvetiigi vees seni, kuni temperatuuri miinimumnõuded on täidetud, või

b)	proovid kogutakse kasvanduse tavapärase tegevuse käigus kalade väljapüüdmise või muu käitlemistoimingu ajal. Võimaluse korral kogutakse proovid 24–72 tundi pärast kõnealust käitlemistoimingut, et suurendada KHV tuvastamise tõenäosust.

Kui kasvanduses või looduslikus populatsioonis tuleb teha tervisekontrolli või võtta proove üle ühe korra aastas, peab tervisekontrollide ja proovivõttude vaheline ajavahemik olema nii pikk kui võimalik ja mahtuma perioodi, mil veetemperatuur saavutab eeldatavalt aasta kõrgeima taseme, ületamata seejuures ülempiiri 28 °C.

Kõikides tootmisüksustes, näiteks tiikides ja basseinides tuleb teha tervisekontrolli surnud, nõrkade või ebatavaliselt käituvate kalade tuvastamiseks.

Kui kasvanduses esineb liiki Cyprinus carpio või selle hübriide, näiteks hübriidi Cyprinus carpio × Carassius auratus, võetakse valimisse nimetatud kalad.

Proovivõtmise eesmärgil kogutavad kalad valitakse järgmiselt:

i)	kui leitakse nõrku, ebatavaliselt käituvaid või äsja surnud, kuid mitte veel lagunenud kalu, võetakse valimisse sellised kalad;

ii)	kui kalade kasvatamiseks kasutatakse mitut veeallikat, peab valim hõlmama kalu kõikidest veeallikatest;

iii)	kalad tuleb valida nii, et proovis oleksid proportsionaalselt esindatud kõik kasvanduse osad ja kõik põlvkonnad.

I.2.   Erinõuded KHV nakkuse suhtes taudivaba (I kategooria) staatuse saamiseks

I.2.1.   Seireprogrammid

a)

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv III kategooria tervisealane staatus, võib anda I kategooria tervisealase staatuse, kui kõik asjaomases liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvad kasvandused, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, vastavad taudivaba staatuse saamise nõuetele, mis on sätestatud selle direktiivi V lisas, ning kui kõikides sellistes kasvandustes ja vajaduse korral kõnealuse lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt nõutavates ja nimetatud osa kohaselt looduslikes populatsioonides valitud proovivõtukohtades on rakendatud ühte järgmistest seireprogrammidest: i) mudel A – kaheaastane seireprogramm: asjaomastes kasvandustes ja proovivõtukohtades peab olema tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt kahe järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud III jao tabelis 2.A. Selle kaheaastase perioodi jooksul peavad kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid olema andnud KHV suhtes negatiivse tulemuse ning KHV nakkuse esinemise kahtlus peab olema punktis III.2 sätestatud diagnostikameetoditega ümber lükatud; ii) mudel B – väiksema valimiga nelja-aastane seireprogramm: asjaomastes kasvandustes ja proovivõtukohtades peab olema tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt nelja järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud III jao tabelis 2.B. Selle nelja-aastase perioodi jooksul peavad kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid olema andnud KHV suhtes negatiivse tulemuse ning KHV nakkuse esinemise kahtlus peab olema punktis III.2 sätestatud diagnostikameetoditega ümber lükatud.

b)

Kui alapunktis a osutatud nelja-aastase seireprogrammi rakendamise käigus leiab kinnitust KHV nakkuse esinemine selle seireprogrammiga hõlmatud kasvanduses ja asjaomase kasvanduse II kategooria tervisealane staatus on seetõttu tühistatud, võib selline kasvandus saada viivitamata taas II kategooria tervisealase staatuse ja jätkata seireprogrammi rakendamist taudivaba staatuse saamiseks punktis I.2.2 kirjeldatud likvideerimisprogrammi rakendamata, kui kõnealune kasvandus vastab järgmistele tingimustele: i) tegemist on maismaakasvandusega, mille tervisealane staatus seoses KHV nakkusega ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude veeloomapopulatsioonide tervisealasest staatusest seoses kõnealuse loetletud taudiga, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3; ii) kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat; iii) kasvandus on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

I.2.2.   Likvideerimisprogrammid

I.2.2.1.   Üldnõuded

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist likvideerimisprogrammi:

a)

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 4. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid on tõhusalt kohaldatud ning ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e ümber on loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni. Sellise isoleeritud ala kindlaksmääramisel peab olema lähtutud konkreetse juhu analüüsist ning võetud seejuures muu hulgas arvesse järgmisi riskitegureid, mis mõjutavad KHV nakkuse levimist kasvatatavatele ja looduslikele kaladele: KHVga nakatunud kasvandus(t)es surnud kalade arv, osakaal ja jaotus; naabruses asuvate kasvanduste kaugus ja arv; tapamajade lähedus; nakkusega kokkupuutunud kasvandus; kasvandus(t)es olevad liigid; nakatunud kasvandus(t)es ja naabruses asuvates kasvandustes kohaldatavad kasvatustavad; hüdrodünaamilised tingimused ja muud tuvastatud epidemioloogiliselt olulised tegurid. Kaitse- ja seiretsoonide kehtestamisel järgitakse nende tsoonide geograafilisel piiritlemisel järgmisi miinimumnõudeid: i) kaitsetsoon kehtestatakse ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvanduse vahetus läheduses ja see vastab kogu valgalale, millel paikneb ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvandus; pädev asutus võib vähendada tsooni ulatust nii, et see hõlmaks osa valgalast, kui sellega ei ohustata KHV nakkuse leviku tõkestamist; ii) kaitsetsoonist väljaspool kehtestatakse seiretsoon, mis vastab kehtestatud kaitsetsooni ümbritsevale laiemale alale;

b)

kõikides kaitsetsoonis asuvates kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike ja mis ei ole ametlikult tunnistatud KHVga nakatunuks, tehakse ametlik uuring, mis hõlmab vähemalt järgmist: i) proovivõtmine 10 kala analüüsimiseks, kui täheldatakse KHVga nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid, või 30 kala analüüsimiseks, kui kõnealuseid kliinilisi sümptomeid ega surmajärgseid ilminguid ei täheldata; ii) üks tervisekontroll; kasvandustes, kus punktis III.2 osutatud analüüside tulemused on negatiivsed, jätkatakse tervisekontrolli tegemist kord kuus ajavahemiku vältel, mil veetemperatuur on eeldatavalt > 15 °C, kuni kaitsetsoon vastavalt punkti I.2.2.1 alapunktile c tühistatakse;

c)

kõik ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvandused tühjendatakse, puhastatakse ja desinfitseeritakse ning nende tegevus katkestatakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt kuus nädalat. Kõikide samas kaitsetsoonis asuvate ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste tühjendamise järel peab nende tegevus olema üheaegselt katkestatud vähemalt kolme nädala vältel. Käesolevat lõiku kohaldatakse ka uute kasvanduste suhtes, mis on likvideerimisprogrammi rakendamise käigus ametlikult nakatunuks tunnistatud. Pärast ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist muudetakse kaitsetsoon seiretsooniks. Pädev asutus võib nõuda asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvate muude kasvanduste tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende tegevuse katkestamist. Sellisel juhul määrab pädev asutus katkestusperioodi kestuse kindlaks konkreetse juhuga seotud riskihinnangu alusel;

d)

kõik ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvandused ja kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad muud kasvandused, mille tegevus katkestatakse, taasasustatakse: i) kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus, või ii) 31. detsembrini 2020 kehtiva üleminekuperioodi vältel kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, kus KHV nakkuse tuvastamiseks rakendatakse heakskiidetud seireprogrammi. Taasasustamine toimub üksnes pärast kõikide ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvanduste punkti I.2.2.1 alapunkti c kohast tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist;

e)

likvideerimisprogrammiga hõlmatud liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvates kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, ning looduslikes populatsioonides seire tegemise vajaduse korral ka punkti I.1 kohaselt valitud proovivõtukohtades rakendatakse edaspidi vähemalt punktis I.2.1 sätestatud seireprogrammi.

I.2.2.2.   Nõuded taudivaba staatuse taastamiseks maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust varem KHV nakkusest vabaks tunnistatud kasvandust

Maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust kasvandust, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus seoses KHV nakkusega ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude omast, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3, ning mille I kategooria tervisealane staatus on tühistatud kooskõlas nimetatud direktiivi artikli 53 lõikega 3, võib I kategooria tervisealase staatuse seoses KHV nakkusega taastada kohe pärast seda, kui pädev asutus on kinnitanud, et asjaomane kasvandus vastab järgmistele tingimustele:

a)	kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

b)	kasvandus on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on I kategooria tervisealane staatus, või piirkonnast, kus KHV nakkuse tuvastamiseks rakendatakse II kategooria tervisealase staatuse kohast heakskiidetud seireprogrammi.

I.3.   Erinõuded KHV nakkuse suhtes kehtiva I kategooria staatuse säilitamiseks

Kui I kategooria tervisealase staatuse säilitamiseks vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 52 on nõutav suunatud seire, tehakse asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, tervisekontrolli ja võetakse proove vastavalt käesoleva osa III jaos esitatud tabelile 2.B; seejuures võetakse arvesse KHVga nakatumise riski asjaomases kasvanduses.

Sellises maismaapiirkonnas, kus KHV nakkuse suhtes on kehtestatud I kategooria tervisealane staatus ja mis hõlmab ühte või mitut kasvandust, mille tervisealane staatus seoses KHV nakkusega sõltub ümbritsevate looduslike veekogude tervisealasest staatusest seoses selle loetletud taudiga, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 2, tehakse tervisekontrolli sagedusega, mis vastab eespool nimetatud tabelis 2.C kõrge ohutaseme jaoks sätestatud kontrollide arvule.

Liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas, kus kasvanduste arv on piiratud ja nende suunatud seire ei võimalda saada piisaval hulgal epidemioloogilisi andmeid, hõlmab taudivaba staatuse säilitamiseks rakendatav seireprogramm proovivõtukohti, mis valitakse vastavalt punktis I.1 sätestatud nõuetele.

Kõnealustes proovivõtukohtades tehakse tervisekontrolli ja võetakse proove rotatsiooni korras nii, et igal aastal kasutatakse 50 % proovivõtukohtadest. Proovivõtmine toimub vastavalt III jao tabelile 2.C. Proovid valitakse ja valmistatakse ette ning neid analüüsitakse II jaos kirjeldatud viisil ning laborianalüüside tulemused peavad olema KHV esinemise suhtes negatiivsed.

Taudivaba staatus säilib üksnes juhul, kui kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid annavad KHV nakkuse suhtes negatiivse tulemuse ning KHV nakkuse esinemise kahtlus lükatakse punktis III.2 sätestatud diagnostikameetoditega ümber.

I.4.   Erinõuded direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 39 sätestatud isoleerimismeetmete kohaldamise lõpetamiseks eesmärgiga anda KHV nakkuse suhtes V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale III kategooria tervisealane staatus

KHV nakkuse suhtes V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda III kategooria tervisealase staatuse, kui:

a)	punkti I.2.2.1 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse KHV hävimine kasvanduses;

b)

kõik kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja muud kasvandused, mille tegevus on katkestatud või kus on kohaldatud alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

c)	taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid.

II.   Seire puhul kohaldatavad diagnostika- ja proovivõtumeetodid KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks

II.1.   Proovid

Uuritav koematerjal on lõpuse- ja neerutükid. Kuni kahelt kalalt pärit elunditükid võib ühte koondada.

II.2.   Seire puhul kohaldatavad diagnostikameetodid KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks

Vastavalt II lisa 2. osa II jaos sätestatud üksikasjalikele diagnostikameetoditele ja nende kohaldamise korrale on KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks kasutatav diagnostikameetod reaalajas jälgitav PCR (qPCR).

III.   Ametliku uuringu puhul kohaldatavad diagnostika- ja proovivõtumeetodid KHV nakkuse kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks

III.1.   Proovid

Uuritav koematerjal on lõpuse- ja neerutükid. Kuni kahelt kalalt pärit elunditükid võib ühte koondada.

III.2.   Ametlik uuring ja diagnostikameetodid KHV nakkuse esinemise või puudumise kinnitamiseks

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 28 on vaja KHV nakkuse kahtlust kinnitada või ümber lükata, järgitakse järgmist kontrolli-, proovivõtu- ja katsekorda:

a)

ametliku uuringu käigus tehakse vähemalt üks tervisekontroll ja võetakse vähemalt üks proov, mis hõlmab 10 kala, kui täheldatakse KHVga nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid, või 30 kala, kui kõnealuseid kliinilisi sümptomeid ega surmajärgseid ilminguid ei täheldata. Vastavalt II lisa 2. osa II jaos sätestatud üksikasjalikele diagnostikameetoditele ja nende kohaldamise korrale kasutatakse proovide analüüsimiseks alapunktis b sätestatud diagnostikameetodit;

b)	KHV nakkuse esinemine loetakse kinnitatuks, kui KHV tuvastatakse PCRi abil; KHV nakkuse kahtluse võib ümber lükata, kui kõnealuse analüüsi käigus ei leita tõendeid KHV esinemise kohta.

Tabel 2.A

Seirekava tsoonis või piirkonnas KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamisele eelneva, punktis I.2.1 osutatud kaheaastase seireperioodi jooksul

		Tervisekontrollide arv aastas (kaheaastane seire)	Laborianalüüside arv aastas (kaheaastane seire)	Kalade arv valimis
Kasvandused/proovivõtukohad	Seireperioodi esimesed kaks aastat	2	2	75 (10)
	Kalade maksimaalne arv koondproovis: 2

Tabel 2.B

Seirekava tsoonis või piirkonnas KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamisele eelneva, punktis I.2.1 osutatud nelja-aastase seireperioodi jooksul

		Tervisekontrollide arv aastas	Laborianalüüside arv aastas	Kalade arv valimis
Kasvandused/proovivõtukohad	Seireperioodi esimesed kaks aastat	1	1	30
Kasvandused/proovivõtukohad	Seireperioodi viimased kaks aastat	2	2	30
	Kalade maksimaalne arv koondproovis: 2

Tabel 2.C

Seirekavad tsoonis või piirkonnas KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse säilitamiseks, nagu on osutatud punktis I.3

Ohutase	Tervisekontrollide arv	Kalade arv valimis
Kõrge	2 korda aastas	30
Keskmine	1 kord aastas	30
Madal	Kord 2 aasta jooksul	30
Kalade maksimaalne arv koondproovis: 2

Tabel 2.D

Seirekava KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse säilitamiseks liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas, kus kasvanduste arv on piiratud ja nende suunatud seire ei võimalda saada piisaval hulgal epidemioloogilisi andmeid, nagu on osutatud punktis I.3

	Tervisekontrollide arv aastas	Laborianalüüside arv aastas	Kalade arv valimis
Proovivõtukohad	Kord 2 aasta jooksul	Kord 2 aasta jooksul	30
Kalade maksimaalne arv koondproovis: 2

3. OSA

SEIRE- JA TÕRJEMEETODID LÕHEDE INFEKTSIOOSSE ANEEMIA (ISA) PUHUL

I.   Nõuded, mida kohaldatakse seire- ja likvideerimisprogrammide suhtes, et saada ISA suhtes taudivaba staatus ja seda säilitada ning tõkestada sellise ISA viiruse levikut, mille HPRis esineb deletsioon

I.1.   Üldnõuded

Kui kasvanduses tuleb direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohast tervisekontrolli ja proovivõtmist teha üle ühe korra aastas, peab tervisekontrollide ja proovivõttude vaheline ajavahemik olema nii pikk kui võimalik.

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, määratakse proovivõtukohtade arv ja geograafiline jaotus kindlaks nii, et saavutataks liikmesriigi, tsooni või piirkonna piisav kaetus. Proovivõtukohad peavad ühtlasi olema representatiivsed taudile vastuvõtlike looduslike populatsioonide elupaigaks olevate eri ökosüsteemide suhtes.

Tervisekontrolli surnud, nõrkade või ebatavaliselt käituvate kalade tuvastamiseks tehakse kõikides tootmisüksustes, näiteks tiikides, basseinides ja sumpades. Eelkõige pööratakse tähelepanu vee väljavoolukohtadele, kuhu nõrgad kalad kipuvad veevoolust tingituna kogunema.

Proovivõtmise eesmärgil kogutavad kalad valitakse järgmiselt:

a)	valitakse üksnes surmaeelses seisundis või äsja surnud, kuid mitte lagunenud kalad; eelkõige kogutakse kalad, kellel täheldatakse aneemiat, veritsust või muid vereringehäirele viitavaid kliinilisi sümptomeid;

b)	kui proovivõtukohas esineb taudile vastuvõtlike liikide hulgas atlandi lõhet, võetakse valimisse eelkõige atlandi lõhe. Kui asjaomases kasvanduses ei esine atlandi lõhet, tuleb valimisse võtta muud taudile vastuvõtlikud liigid;

c)	kui kalade kasvatamiseks kasutatakse mitut veeallikat, peab valim hõlmama kalu kõikidest veeallikatest;

d)	kalad tuleb valida nii, et valimis oleksid proportsionaalselt esindatud kõik kasvanduse tootmisüksused, näiteks sumbad, basseinid ja tiigid, ning kõik põlvkonnad.

I.2.   Erinõuded ISA suhtes I kategooria tervisealase staatuse saamiseks

I.2.1.   Seireprogrammid

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on ISA suhtes kehtiv direktiivi 2006/88/EÜ III lisa B osa kohane III kategooria tervisealane staatus, võib kõnealuse loetletud taudi suhtes anda I kategooria tervisealase staatuse, kui kõik asjaomases liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvad kasvandused, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, vastavad selle direktiivi V lisas sätestatud asjakohastele nõuetele ning kui kõikides sellistes kasvandustes ja vajaduse korral kõnealuse V lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt nõutavates ja nimetatud punkti kohaselt looduslikes populatsioonides valitud proovivõtukohtades on rakendatud järgmist seireprogrammi:

a)	asjaomastes kasvandustes ja proovivõtukohtades on tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt kahe järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud II jao tabelis 3.A;

b)	selle kaheaastase perioodi jooksul peavad kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid olema andnud HPRis esineva deletsiooniga ISA viiruse suhtes negatiivse tulemuse ning ISA esinemise kahtlus peab olema punktis II.3 sätestatud diagnostikameetoditega ümber lükatud;

c)	kui seireprogrammi rakendamise käigus leiab kinnitust ISA esinemine selle seireprogrammiga hõlmatud kasvanduses ja asjaomase kasvanduse II kategooria tervisealane staatus on seetõttu tühistatud, peab seal olema läbi viidud punkti I.2.2 kohane likvideerimisprogramm.

I.2.2.   Likvideerimisprogrammid

I.2.2.1.   Üldnõuded

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on ISA suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud likvideerimisprogrammi, mis vastab alapunktide a–e nõuetele:

a)

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 3. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid on tõhusalt kohaldatud ning eelkõige on sellis(t)e kasvandus(t)e ümber, mis on ametlikult tunnistatud HPRis oleva deletsiooniga ISA viirusega nakatunuks või milles ISA esinemine on ametlikult kinnitatud, loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni. Sellise isoleeritud ala kindlaksmääramisel peab olema lähtutud konkreetse juhu analüüsist ning võetud seejuures muu hulgas arvesse järgmisi riskitegureid, mis mõjutavad ISA levimist kasvatatavatele või looduslikele kaladele: surnud kalade arv, osakaal ja jaotus kasvandus(t)es, mis on nakatunud HPRis oleva deletsiooniga ISA viirusega või milles ISA esinemine on kinnitust leidnud; naabruses asuvate kasvanduste kaugus ja arv; tapamajade lähedus; nakkusega kokkupuutunud kasvandused; kasvandus(t)es olevad liigid; nakatunud kasvandus(t)es ja naabruses asuvates kasvandustes kohaldatavad kasvatustavad; hüdrodünaamilised tingimused ja muud tuvastatud epidemioloogiliselt olulised tegurid. Kaitse- ja seiretsoonide kehtestamisel järgitakse nende tsoonide geograafilisel piiritlemisel järgmisi miinimumnõudeid: i) kaitsetsoon kehtestatakse ametlikult ISAga nakatunuks tunnistatud kasvanduse vahetus läheduses ja see vastab: 1) rannikul: sellise ringi sees olevale alale, mille raadius on vähemalt üks loodete horisontaalne ulatus või vähemalt viis kilomeetrit (olenevalt sellest, kumb on suurem) ja mille keskpunktis on ametlikult ISAga nakatunuks tunnistatud kasvandus, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest; 2) sisemaal: kogu valgalale, millel paikneb ametlikult ISAga nakatunuks tunnistatud kasvandus; pädev asutus võib vähendada tsooni ulatust nii, et see hõlmaks osa valgalast, kui sellega ei ohustata ISA leviku tõkestamist; ii) kaitsetsoonist väljaspool kehtestatakse seiretsoon, mis vastab: 1) rannikul: kaitsetsooni ümbritsevale alale, mis hõlmab kattuvaid loodete horisontaalse ulatuse tsoone, või kaitsetsooni ümbritsevale sellise ringi sees olevale alale, mille raadius kaitsetsooni keskpunktist on 10 km, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest; 2) sisemaal: kehtestatud kaitsetsoonist väljaspool asuvale laiemale alale;

b)

kõikides kaitsetsoonis asuvates kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike ja mis ei ole ametlikult tunnistatud ISAga nakatunuks, tehakse ametlik uuring, mis hõlmab vähemalt järgmist: i) proovivõtmine vähemalt 10 surmaeelses seisundis kala analüüsimiseks, kui täheldatakse ISAga nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid, või vähemalt 30 kala analüüsimiseks, kui kõnealuseid kliinilisi sümptomeid ega surmajärgseid ilminguid ei täheldata; ii) üks tervisekontroll; kasvandustes, kus jaotises i osutatud analüüside tulemused on negatiivsed, jätkatakse tervisekontrolli tegemist kord kuus, kuni kaitsetsoon vastavalt punkti I.2.2.1 alapunktile c tühistatakse;

c)

kõik kasvandused, mis on ametlikult tunnistatud HPRis oleva deletsiooniga ISA viirusega nakatunuks või kus ISA esinemine on ametlikult kinnitatud, tühjendatakse, puhastatakse ja desinfitseeritakse ning nende tegevus katkestatakse vähemalt kolmeks kuuks. Kaitse- ja seiretsooni võib tühistada, kui kõik kaitsetsoonis olevad kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende tegevus on olnud üheaegselt katkestatud vähemalt kuue nädala vältel. Pärast ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist muudetakse kaitsetsoon seiretsooniks. Pädev asutus võib nõuda asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvate muude kasvanduste tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende tegevuse katkestamist. Selliste muude kasvanduste puhul määrab pädev asutus katkestusperioodi kestuse kindlaks konkreetse juhuga seotud riskihinnangu alusel;

d)

kõik kasvandused, mis on ametlikult tunnistatud HPRis oleva deletsiooniga ISA viirusega nakatunuks või kus ISA esinemine on ametlikult kinnitatud, ja kõik muud asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad kasvandused, mille suhtes kohaldatakse katkestusperioodi, taasasustatakse kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on ISA suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus. Taasasustamine toimub üksnes pärast kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste punkti I.2.2.1 alapunkti c kohast tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist;

e)

likvideerimisprogrammiga hõlmatud liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvates kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, ning looduslikes populatsioonides seire tegemise vajaduse korral ka punkti I.1 kohaselt valitud proovivõtukohtades rakendatakse edaspidi punktis I.2.1 sätestatud seireprogrammi.

I.2.2.2.   Nõuded taudivaba staatuse taastamiseks maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust varem I kategooria tervisealase staatuse saanud kasvandust

Maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust kasvandust, millel on ISA suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude omast, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3, ning mille I kategooria tervisealane staatus on tühistatud kooskõlas nimetatud direktiivi artikli 53 lõikega 3, võib nimetatud staatuse taastada kohe pärast seda, kui pädev asutus on kinnitanud, et asjaomane kasvandus vastab järgmistele tingimustele:

a)	kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

b)	kasvandus on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on ISA suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

I.3.   Minimaalsed tõrjemeetmed ISA suhtes kehtiva I kategooria staatuse säilitamiseks

Kui I kategooria tervisealase staatuse säilitamiseks vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 52 on nõutav suunatud seire, tehakse asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, tervisekontrolli ja võetakse proove vastavalt käesoleva osa II jaos esitatud tabelile 3.B; (11) seejuures võetakse arvesse ISAga nakatumise riski asjaomases kasvanduses.

Sellises maismaapiirkonnas, kus ISA suhtes on kehtestatud I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus seoses ISAga sõltub atlandi lõhe (Salmo salar) elupaigaks olevate ümbritsevate looduslike veekogude tervisealasest staatusest, tuleb tervisekontrolli sageduse kindlaksmääramisel pidada ISAga nakatumise riski suureks.

ISA suhtes taudivaba staatus säilib üksnes juhul, kui kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid annavad HPRis esineva deletsiooniga ISA viiruse suhtes negatiivse tulemuse ning ISA esinemise kahtlus lükatakse punktis II.3 sätestatud diagnostikameetoditega ümber.

I.4.   Erinõuded HPRis esineva deletsiooniga ISA viiruse suhtes III kategooria tervisealase staatuse andmiseks liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on V kategooria tervisealane staatus

ISA suhtes V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale võib anda III kategooria tervisealase staatuse, kui:

a)	punkti I.2.2.1 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse ISA viiruse hävimine kasvanduses;

b)

kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad muud kasvandused, mille tegevus on katkestatud või kus on kohaldatud alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on ISA suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

c)	taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid;

d)

alapunktides a, b ja c osutatud meetmete kohaldamise lõpetamisele järgneva kaheaastase perioodi jooksul ei ole HPRis oleva deletsiooniga ISA viiruse esinemine ühelgi korral kinnitust leidnud ja sellekohased kahtlused on nimetatud perioodi jooksul punktis II.3 sätestatud korra kohaselt ümber lükatud.

II.   Diagnostikameetodid ja ametlikud uuringud

II.1.   Proovid

Uuritav koematerjal on järgmine:

a)	histoloogiline analüüs: pronefros, maks, süda, kõhunääre, sool, põrn ja lõpused;

b)	immunohistokeemiline analüüs: neeru keskosa ja süda koos klappide ja arterioossibulaga;

c)	RT-qPCRil põhinev analüüs: neeru keskosa ja süda;

d)	viiruse kultiveerimine: neeru keskosa, süda, maks ja põrn.

Kuni viielt kalalt pärit elunditükid võib ühte koondada.

II.2.   Diagnostikameetodid ISA suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks

Vastavalt II lisa 3. osas sätestatud üksikasjalikele meetoditele ja nende kohaldamise korrale on punktide I.2 ja I.3 kohaseks ISA suhtes taudivaba staatuse saamiseks või säilitamiseks kasutatav diagnostikameetod RT-qPCR, millele järgneb positiivsete proovide sekveneerimine.

Kui RT-qPCRiga saadakse positiivne tulemus, analüüsitakse enne direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 28 ette nähtud esmaste tõrjemeetmete rakendamist veel proove.

Vastavalt II lisa 3. osas sätestatud üksikasjalikele meetoditele ja nende kohaldamise korrale analüüsitakse kõnealuseid proove järgmiselt:

a)	proovide sõelanalüüs RT-qPCR abil, sealhulgas hemaglutiniini esteraasi (HE) geeni sekveneerimine, et kinnitada deletsiooni esinemist HPRis, ning

b)	koepreparaatide analüüs ISA viiruse vastaste spetsiifiliste antikehade abil (st fikseeritud koelõikude immunohistokeemiline analüüs või koejäljendite kaudne immunofluorestsentsanalüüs) või

c)	ISA viiruse eraldamine ja tuvastamine rakukultuuris vähemalt ühest proovist, mis on võetud ükskõik milliselt kasvandusest kogutud kalalt.

II.3.   Ametlik uuring ja diagnostikameetodid ISA esinemise või puudumise kinnitamiseks

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 28 on vaja ISA kahtlust kinnitada või ümber lükata, järgitakse järgmist kontrolli-, proovivõtu- ja katsekorda:

a)

ametlik uuring, mis hõlmab vähemalt ühte tervisekontrolli ja ühte proovivõtmist 10 surmaeelses seisundis kala analüüsimiseks, kui täheldatakse ISAga nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid. Kui ISAga nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid ega surmajärgseid ilminguid ei täheldata, järgneb tervisekontrollile plaaniline proovivõtt kooskõlas punktiga I.1 vähemalt 30 surmaeelses seisundis või äsja surnud tavapärase välimusega kala analüüsimiseks. Proove analüüsitakse alapunktis b sätestatud diagnostikameetodite kohaselt;

b)

kui RT-qPCRiga saadakse positiivne tulemus HPRis esineva deletsiooniga ISA viiruse suhtes, analüüsitakse enne direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 28 ette nähtud esmaste tõrjemeetmete rakendamist veel proove. ISAga nakatumise kahtluse korral kinnitatakse ISA esinemist vastavalt II lisa 3. osas sätestatud üksikasjalikele meetoditele ja nende kohaldamise korrale kooskõlas järgmiste kriteeriumidega: i) ISA viiruse tuvastamine RT-qPCR abil, sealhulgas HE geeni sekveneerimine, et kinnitada deletsiooni esinemist HPRis, ning ISA viiruse tuvastamine koepreparaatides ISA viiruse vastaste spetsiifiliste antikehade abil (st fikseeritud koelõikude immunohistokeemiline analüüs või koejäljendite kaudne immunofluorestsentsanalüüs) või ii) ISA viiruse tuvastamine RT-qPCR abil, sealhulgas HE geeni sekveneerimine, et kinnitada deletsiooni esinemist HPRis, ning ISA viiruse eraldamine ja tuvastamine rakukultuuris vähemalt ühest proovist, mis on võetud ükskõik milliselt kasvandusest kogutud kalalt;

c)

kui täheldatakse ISAga nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid, makropatoloogilisi muutusi või histopatoloogilisi leide, tuleb nakatumise kahtluse kinnitamiseks kasutada vastavalt II lisa 3. osale viiruse tuvastamiseks kahte teineteisest sõltumatu tuvastuspõhimõttega diagnostikameetodit, näiteks RT-qPCRi ja immunohistokeemilist analüüsi. ISA kahtluse võib ümber lükata, kui kahtluse tekkimise päevale järgneva 12 kuu jooksul tehtavate analüüside ja kontrollide käigus ei leita tõendeid ISA esinemise kohta.

Tabel 3.A

Seirekava tsoonis või piirkonnas ISA suhtes taudivaba staatuse saamisele eelneva, punktis I.2.1 osutatud kaheaastase seireperioodi jooksul

Seireaasta	Tervisekontrollide arv aastas (kaheaastane seire)	Laborianalüüside arv aastas (kaheaastane seire)	Proovivõtuks kogutavate kalade arv aastas
1. aasta	6	2 (12)	2 * 75 (13)
2. aasta	6	2 (12)	2 * 75 (13)

Tabel 3.B

Seirekavad tsoonis või piirkonnas ISA suhtes taudivaba staatuse säilitamiseks, nagu on osutatud punktis I.3  (15)

Ohutase	Tervisekontrollide arv aastas	Laborianalüüside arv aastas	Proovivõtuks kogutavate kalade arv aastas
Kõrge	2	2 (14)	2 * 30
Keskmine	1	1 (14)	30
Madal	Kord 2 aasta jooksul	Kord 2 aasta jooksul	30 kala 2 aasta jooksul

4. OSA

SEIRE- JA TÕRJEMEETODID MARTEILIA REFRINGENS'I NAKKUSE PUHUL

I.   Nõuded, mida kohaldatakse seire- ja likvideerimisprogrammide suhtes, et saada Marteilia refringens'i nakkuse suhtes taudivaba staatus ja seda säilitada

I.1.   Üldnõuded

Tervisekontrollid ja vajaduse korral proovivõtmised laborianalüüsi jaoks viiakse läbi aasta sel perioodil, mil kõnealuse parasiidi levimus liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas on teadaolevalt suurim. Kui sellised andmed ei ole kättesaadavad, viiakse proovivõtmine läbi vahetult pärast seda, kui veetemperatuur on tõusnud üle 17 °C.

Kui proovivõtmiseks on vaja koguda molluskeid vastavalt 4. osas sätestatud nõuetele, kohaldatakse järgmisi kriteeriume:

a)

kui tootmisüksustes või tootmisalal esineb Ostrea spp. ja Mytilus spp. isendeid, võetakse valimisse võrdsel hulgal kummagi perekonna esindajaid. Ainult ühe nimetatud perekonna isendite esinemise korral võetakse valimisse asjaomase perekonna esindajad. Kui ei esine ei perekonna Ostrea ega perekonna Mytilus esindajaid, peab valim olema representatiivne kõikide muude olemasolevate taudile vastuvõtlike liikide suhtes;

b)	kui tootmisüksustes esineb nõrku, avatud kojapoolmetega või äsja surnud, kuid mitte lagunenud molluskeid, võetakse valimisse eelkõige sellised molluskid. Kui selliseid molluskeid ei esine, peab valim hõlmama vanimaid terveid molluskeid;

c)	kui proove võetakse molluskikasvandusest, kus tootmisprotsessis kasutatakse mitut veeallikat, peab valim sisaldama kõikidest veeallikatest pärit molluskeid, nii et selles oleksid proportsionaalselt esindatud kasvanduse kõik osad;

d)

kui proove võetakse molluskikasvatusalalt, võetakse valimisse molluskeid piisavast arvust proovivõtukohtadest, nii et valimis oleksid proportsionaalselt esindatud molluskikasvatusala kõik osad. Selliste proovivõtukohtade valimisel võetakse peamiste teguritena arvesse seda, millistes varasemates proovivõtukohtades on tuvastatud Marteilia refringens'it, samuti asustustihedust, veevoolu, vastuvõtlike liikide ja vektorliikide esinemist, batümeetrilisi andmeid ja kasvatustavasid. Proove võetakse ka looduslikest kasvukohtadest.

I.2.   Erinõuded Marteilia refringens'i nakkuse suhtes I kategooria tervisealase staatuse saamiseks

I.2.1.   Seireprogrammid

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes kehtiv III kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes ja kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist seireprogrammi, mis hõlmab tervisekontrolle ja analüüsimiseks proovide kogumist.

Kaheaastane seireprogramm:

a)	asjaomastes kasvandustes ja asjaomastel molluskikasvatusaladel peab olema tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt kahe järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud II jao tabelis 4.A;

b)	selle kaheaastase perioodi jooksul peavad kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid olema andnud Marteilia refringens'i suhtes negatiivse tulemuse ning Marteilia refringens'i esinemise kahtlus peab olema punktis II.3 sätestatud diagnostikameetoditega ümber lükatud;

c)

kui valimisse võetakse I kategooria tervisealase staatusega liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast pärit Ostrea edulis, Mytilus edulis või Mytilus galloprovincialis, peab asjaomane liik olema toodud kasvandusse või molluskikasvatusalale hiljemalt seireprogrammi rakendamisperioodile vahetult eelneval kevadel.

I.2.2.   Likvideerimisprogrammid

Marteilia refringens'i likvideerimist peetakse enamikul juhtudest võimatuks, kuid kui liikmesriigi hinnangul on otstarbekas rakendada likvideerimisprogrammi, kohaldatakse seda järgmise mudeli alusel.

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes või kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist likvideerimisprogrammi:

a)

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 3. jaos sätestatud meetmeid on tõhusalt kohaldatud ning eelkõige on ametlikult Marteilia refringens'iga nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e või molluskikasvatusala(de) ümber loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni. Sellise isoleeritud ala kindlaksmääramisel peab olema lähtutud konkreetse juhu analüüsist ning võetud seejuures muu hulgas arvesse järgmisi riskitegureid, mis mõjutavad Marteilia refringens'i levimist: surnud molluskite arv, vanus osakaal ja jaotus Marteilia refringens'iga nakatunud kasvandus(t)es või molluskikasvatusala(de)l, kus esineb looduses vabalt elavaid molluskeid; looduses vabalt elavaid molluskeid sisaldavate naabruses asuvate kasvanduste või molluskikasvatusalade kaugus ja arv; kaugus töötlemisettevõtetest, nakkusega kokkupuutunud kasvandustest või molluskikasvatusaladest; asjaomastes kasvandustes või molluskikasvatusaladel esinevad liigid, eelkõige taudile vastuvõtlikud liigid ja vektorliigid; nakatunud kasvandus(t)es ja naabruses asuvates kasvandustes või molluskikasvatusaladel kohaldatavad kasvatustavad; hüdrodünaamilised tingimused ja muud tuvastatud epidemioloogiliselt olulised tegurid. Kaitse- ja seiretsoonide kehtestamisel järgitakse järgmisi miinimumnõudeid: i) ametlikult Marteilia refringens'iga nakatunuks tunnistatud kasvanduse või molluskikasvatusala vahetus läheduses kehtestatakse kaitsetsoon, mis vastab asjakohaste hüdrodünaamiliste ja epidemioloogiliste andmete põhjal kindlaks määratud alale; ii) väljaspool kaitsetsooni kehtestatakse seiretsoon, mis vastab kaitsetsooni ümbritsevale asjakohaste hüdrodünaamiliste ja epidemioloogiliste andmete põhjal kindlaks määratud alale;

b)

kaitsetsooni kõikides kasvandustes ja kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike ja mis ei ole ametlikult tunnistatud Marteilia refringens'iga nakatunuks, tehakse ametlik uuring, mis hõlmab vähemalt proovide kogumist 150 molluski analüüsimiseks pärast Marteilia refringens'iga nakatumise perioodi algust. Kui kõnealune nakatumisperiood ei ole teada, alustatakse proovivõtmist pärast seda, kui veetemperatuur on tõusnud üle 17 °C

c)

kõik ametlikult Marteilia refringens'iga nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad tühjendatakse, sealne tegevus katkestatakse ning võimaluse korral need puhastatakse ja desinfitseeritakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt: i) kaks kuud kasvanduste ja molluskikasvatusalade puhul, mille ühendus ümbritsevate veekogudega, mis hõlmavad näiteks munemis- või kasvualasid, on piiratud; ii) kaks kuud kasvanduste ja molluskikasvatusalade puhul, mille ühendus ümbritsevate veekogudega ei ole piiratud, kui taudile vastuvõtliku liigi nakatunud molluskid ja nakatunud kasvanduse või molluskikasvatusalaga epidemioloogiliselt seotud molluskid taudile vastuvõtlikust liigist on ära korjatud või eemaldatud enne aasta seda perioodi, mil Marteilia refringens'i levimus on teadaolevalt suurim, või kui see periood ei ole teada, siis enne perioodi, mil veetemperatuur tõuseb üle 17 °C; iii) neliteist kuud kasvanduste ja molluskikasvatusalade puhul, mille ühendus ümbritsevate veekogudega ei ole piiratud, kui taudile vastuvõtliku liigi nakatunud molluskid ja nakatunud kasvanduse või molluskikasvatusalaga epidemioloogiliselt seotud molluskid taudile vastuvõtlikust liigist ei ole ära korjatud või eemaldatud enne aasta seda perioodi, mil Marteilia refringens'i levimus on teadaolevalt suurim, või kui sellised andmed ei ole kättesaadavad, siis enne perioodi, mil veetemperatuur tõuseb üle 17 °C. Kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste ja molluskikasvatusalade tühjendamise järel peab sealne tegevus olema üheaegselt katkestatud vähemalt nelja nädala vältel. Pädev asutus võib vajaduse korral nõuda asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvate muude kasvanduste või molluskikasvatusalade tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende tegevuse katkestamist. Sellisel juhul määrab pädev asutus katkestusperioodi kestuse kindlaks konkreetse juhuga seotud riskihinnangu alusel;

d)

kõik asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad ning kõik muud kasvandused ja molluskikasvatusalad, mille suhtes kohaldatakse katkestusperioodi, taasasustatakse molluskitega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus. Taasasustamine toimub üksnes pärast kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste punkti I.2.2 alapunkti c kohast tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist;

e)

likvideerimisprogrammiga hõlmatud liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvates kõikides kasvandustes ja kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, rakendatakse edaspidi käesoleva osa punktis I.2.1 sätestatud seireprogrammi.

I.3.   Erinõuded Marteilia refringens'i nakkuse suhtes taudivaba (I kategooria) staatuse säilitamiseks

Kui I kategooria tervisealase staatuse säilitamiseks vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 52 on nõutav suunatud seire, tehakse asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes ja kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, tervisekontrolli ja võetakse proove vastavalt II jaos esitatud tabelile 4.B; seejuures võetakse arvesse Marteilia refringens'iga nakatumise riski asjaomases kasvanduses või asjaomasel molluskikasvatusalal.

Taudivaba staatus säilib üksnes juhul, kui kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid annavad Marteilia refringens'i suhtes negatiivse tulemuse ning Marteilia refringens'i esinemise kahtlus lükatakse punktis II.3 sätestatud diagnostikameetoditega ümber.

I.4.   Nõuded direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 39 sätestatud isoleerimismeetmete kohaldamise lõpetamiseks seoses Marteilia refringens'i nakkusega (V kategooria tervisealase staatuse muutmine III kategooria staatuseks)

Marteilia refringens'i nakkuse suhtes V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda III kategooria tervisealase staatuse, kui:

a)	punkti I.2.2 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse Marteilia refringens'i hävimine kasvanduses;

b)

kõik asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad ning kõik muud kasvandused ja molluskikasvatusalad, mille suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud molluskitega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

c)	taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid;

d)	alapunktides a, b ja c osutatud meetmete kohaldamise lõpetamisele järgneva kaheaastase perioodi jooksul ei ole Marteilia refringens'i nakkuse esinemine ühelgi korral kinnitust leidnud ja sellekohased kahtlused on nimetatud perioodi jooksul punktis II.3 sätestatud korra kohaselt ümber lükatud.

II.   Diagnostikameetodid ja ametlikud uuringud

II.1.   Proovid

Laborisse saadetakse punktides II.2 ja II.3 ette nähtud diagnostikameetoditega analüüsimiseks terve loom.

II.2.   Diagnostikameetodid Marteilia refringens'i nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks

Vastavalt II lisa 4. osas sätestatud üksikasjalikele diagnostikameetoditele ja nende kohaldamise korrale on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks või säilitamiseks kasutatavad diagnostikameetodid histopatoloogiline analüüs, koejäljendite analüüs või PCR.

II.3.   Ametlik uuring ja diagnostikameetodid Marteilia refringens'iga nakatumise kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 28 on vaja Marteilia refringens'iga nakatumise kahtlust kinnitada või ümber lükata, järgitakse järgmist kontrolli-, proovivõtu- ja katsekorda:

a)

ametlik uuring hõlmab vähemalt ühte proovivõtmist taudile vastuvõtlikku liiki kuuluva 30 molluski analüüsimiseks, kui kahtlus põhineb surmajuhtumit käsitleval teatel, või vastasel juhul taudile vastuvõtlikku liiki kuuluva 150 molluski analüüsimiseks pärast Marteilia refringens'iga nakatumise perioodi algust. Kui kõnealune nakatumisperiood ei ole teada, alustatakse proovivõtmist pärast seda, kui veetemperatuur on tõusnud üle 17 °C;

b)

vastavalt II lisa 4. osa I jaos sätestatud üksikasjalikele diagnostikameetoditele ja nende kohaldamise korrale kasutatakse proovide analüüsimiseks jaotises i sätestatud diagnostikameetodeid: i) Marteilia refringens'i esinemine loetakse kinnitatuks, kui histopatoloogilise analüüsi, koejäljendite analüüsi või in situ hübridiseerimise positiivseid tulemusi toetavad PCRi ja sekveneerimise positiivsed tulemused; ii) Marteilia refringens'iga nakatumise kahtluse võib ümber lükata, kui jaotises i osutatud meetoditega ei leita tõendeid Marteilia refringens'i esinemise kohta.

Tabel 4.A

Seirekava liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas Marteilia refringens’i nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamisele eelneva, punktis I.2.1 osutatud seireperioodi jooksul

	Tervisekontrollide arv aastas	Laborianalüüside arv aastas	Molluskite arv valimis
Kasvandused/molluskikasvatusalad	1	1	150

Tabel 4.B

Seirekavad liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas Marteilia refringens’i nakkuse suhtes taudivaba staatuse säilitamiseks, nagu on osutatud punktis I.3

Ohutase	Tervisekontrollide arv	Laborianalüüside arv	Molluskite arv valimis
Kõrge	1 kord aastas	1 kord 2 aasta jooksul	150
Keskmine	1 kord 2 aasta jooksul	1 kord 2 aasta jooksul	150
Madal	1 kord 2 aasta jooksul	1 kord 4 aasta jooksul	150

5. OSA

SEIRE- JA TÕRJEMEETODID BONAMIA OSTREAE NAKKUSE PUHUL

I.   Nõuded, mida kohaldatakse seire- ja likvideerimisprogrammide suhtes, et saada Bonamia ostreae nakkuse suhtes taudivaba staatus ja seda säilitada

I.1.   Üldnõuded

Tervisekontrollid ja vajaduse korral proovivõtmised tootmisüksustest viiakse läbi aasta sel perioodil, mil Bonamia ostreae levimus liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas on teadaolevalt suurim. Kui sellised andmed ei ole kättesaadavad, viiakse proovivõtmine läbi talvel või kevade algul.

Kui proovivõtmiseks on vaja koguda molluskeid vastavalt 5. osas sätestatud nõuetele, kohaldatakse järgmisi kriteeriume:

a)	Ostrea edulis'e esinemise korral valitakse proovivõtmiseks ainult selle liigi austrid. Ostrea edulis'e puudumisel peavad valimis olema esindatud kõik muud olemasolevad vastuvõtlikud liigid;

b)	kui esineb nõrku, avatud kojapoolmetega või äsja surnud, kuid mitte lagunenud molluskeid, võetakse valimisse eelkõige sellised molluskid. Kui selliseid molluskeid ei esine, peab valim hõlmama vanimaid terveid molluskeid;

c)	kui proove võetakse kasvandusest, kus tootmisprotsessis kasutatakse mitut veeallikat, peab valim sisaldama kõikidest veeallikatest pärit molluskeid, nii et selles oleksid proportsionaalselt esindatud kasvanduse kõik osad;

d)

molluskikasvatusalalt proovide võtmisel peab valim sisaldama piisavast arvust proovivõtukohtadest kogutud molluskeid. Selliste proovivõtukohtade valimisel võetakse peamiste teguritena arvesse seda, millistes varasemates proovivõtukohtades on tuvastatud Bonamia ostreae't, samuti asustustihedust, veevoolu, vastuvõtlike liikide ja vektorliikide esinemist, batümeetrilisi andmeid ja kasvatustavasid. Proove võetakse ka molluskikasvatusalal või selle kõrval asuvatest looduslikest kasvukohtadest.

I.2.   Erinõuded Bonamia ostreae nakkuse suhtes I kategooria tervisealase staatuse saamiseks

I.2.1.   Seireprogrammid

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on Bonamia ostreae nakkuse suhtes kehtiv III kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist seireprogrammi, mis hõlmab tervisekontrolle ja analüüsimiseks proovide kogumist.

Kaheaastane seireprogramm:

a)	asjaomastes kasvandustes ja asjaomastel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, peab olema tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt kahe järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud käesoleva osa tabelis 5.A;

b)	selle kaheaastase perioodi jooksul peavad kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid olema andnud Bonamia ostreae suhtes negatiivse tulemuse ning Bonamia ostreae esinemise kahtlus peab olema punktis II.3 sätestatud diagnostikameetoditega ümber lükatud;

c)	kui valimisse võetakse I kategooria tervisealase staatusega liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast pärit Ostrea edulis, peab see liik olema toodud asjaomasesse kasvandusse või molluskikasvatusalale hiljemalt seireprogrammi rakendamisperioodile vahetult eelneval sügisel.

I.2.2.   Likvideerimisprogrammid

Bonamia ostreae likvideerimist peetakse enamikul juhtudest võimatuks, kuid kui liikmesriigi hinnangul on otstarbekas rakendada likvideerimisprogrammi, kohaldatakse seda järgmise mudeli alusel.

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on Bonamia ostreae nakkuse suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes või kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist likvideerimisprogrammi:

a)

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 3. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid on tõhusalt kohaldatud ning eelkõige on ametlikult Bonamia ostreae'ga nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e või molluskikasvatusala(de) ümber loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni. Sellise isoleeritud ala kindlaksmääramisel peab olema lähtutud konkreetse juhu analüüsist ning võetud seejuures muu hulgas arvesse järgmisi riskitegureid, mis mõjutavad kõnealuse loetletud taudi levimist: surnud molluskite arv, osakaal, vanus ja jaotus Bonamia ostreae'ga nakatunud kasvandus(t)es või molluskikasvatusala(de)l, kus esineb looduses vabalt elavaid molluskeid; looduses vabalt elavaid molluskeid sisaldavate naabruses asuvate kasvanduste või molluskikasvatusalade kaugus ja arv; kaugus töötlemisettevõtetest, nakkusega kokkupuutunud kasvandustest või molluskikasvatusaladest; asjaomastes kasvandustes või asjaomastel molluskikasvatusaladel esinevad liigid, eelkõige taudile vastuvõtlikud liigid ja vektorliigid; nakatunud kasvandus(t)es ja naabruses asuvates kasvandustes või molluskikasvatusaladel kohaldatavad kasvatustavad; hüdrodünaamilised tingimused ja muud tuvastatud epidemioloogiliselt olulised tegurid. Kaitse- ja seiretsoonide kehtestamisel järgitakse järgmisi miinimumnõudeid: i) ametlikult Bonamia ostreae'ga nakatunuks tunnistatud kasvanduse või molluskikasvatusala vahetus läheduses kehtestatakse kaitsetsoon, mis vastab asjakohaste hüdrodünaamiliste ja epidemioloogiliste andmete põhjal kindlaks määratud alale; ii) väljaspool kaitsetsooni kehtestatakse seiretsoon, mis vastab kaitsetsooni ümbritsevale asjakohaste hüdrodünaamiliste ja epidemioloogiliste andmete põhjal kindlaks määratud alale;

b)

kaitsetsooni kõikides kasvandustes ja kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike ja mis ei ole ametlikult tunnistatud Bonamia ostreae'ga nakatunuks, tehakse ametlik uuring, mis hõlmab vähemalt proovide kogumist taudile vastuvõtlikku liiki kuuluva 150 molluski analüüsimiseks pärast Bonamia ostreae'ga nakatumise perioodi algust. Kui kõnealune nakatumisperiood ei ole teada, alustatakse proovivõtmist talvel või kevade algul;

c)

kõik ametlikult Bonamia ostreae'ga nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad tühjendatakse, sealne tegevus katkestatakse ning võimaluse korral need puhastatakse ja desinfitseeritakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt kuus kuud. Kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste ja molluskikasvatusalade tühjendamise järel peab sealne tegevus olema üheaegselt katkestatud vähemalt nelja nädala vältel. Pädev asutus võib vajaduse korral nõuda asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvate muude kasvanduste või molluskikasvatusalade tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende tegevuse katkestamist. Sellisel juhul määrab pädev asutus katkestusperioodi kestuse kindlaks konkreetse juhuga seotud riskihinnangu alusel;

d)

kõik asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad ning kõik muud kasvandused ja molluskikasvatusalad, mille suhtes kohaldatakse katkestusperioodi, taasasustatakse molluskitega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on Bonamia ostreae nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus. Taasasustamine toimub üksnes pärast kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste punkti I.2.2 alapunkti c kohast tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist;

e)	likvideerimisprogrammiga hõlmatud liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes ja kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, rakendatakse edaspidi punktis I.2 sätestatud seireprogrammi.

I.3.   Erinõuded Bonamia ostreae nakkuse suhtes taudivaba (I kategooria) staatuse säilitamiseks

Kui I kategooria tervisealase staatuse säilitamiseks vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 52 on nõutav suunatud seire, tehakse asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes ja kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, tervisekontrolli ja võetakse proove vastavalt käesoleva osa II jaos esitatud tabelile 5.B; seejuures võetakse arvesse Bonamia ostreae'ga nakatumise riski asjaomases kasvanduses või asjaomasel molluskikasvatusalal.

Bonamia ostreae nakkuse suhtes taudivaba staatus säilib üksnes juhul, kui kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid annavad Bonamia ostreae suhtes negatiivse tulemuse ning Bonamia ostreae esinemise kahtlus lükatakse punktis II.3 sätestatud diagnostikameetoditega ümber.

I.4.   Nõuded direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 39 sätestatud isoleerimismeetmete kohaldamise lõpetamiseks seoses Bonamia ostreae nakkusega (V kategooria tervisealase staatuse muutmine III kategooria staatuseks)

Bonamia ostreae nakkuse suhtes V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale võib seoses kõnealuse taudiga anda III kategooria tervisealase staatuse, kui:

a)	punkti I.2.2 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse Bonamia ostreae hävimine kasvanduses;

b)

kõik asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad ning kõik muud kasvandused ja molluskikasvatusalad, mille suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud molluskitega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on Bonamia ostreae nakkuse suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

c)	taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid;

d)	alapunktides a, b ja c osutatud meetmete kohaldamise lõpetamisele järgneva kaheaastase perioodi jooksul ei ole Bonamia ostreae nakkuse esinemine ühelgi korral kinnitust leidnud ja sellekohased kahtlused on nimetatud perioodi jooksul punktis II.3 sätestatud korra kohaselt ümber lükatud.

II.   Diagnostikameetodid ja diagnostilised kriteeriumid

II.1.   Proovid

Laborisse saadetakse punktides II.2 ja II.3 ette nähtud diagnostikameetoditega analüüsimiseks terve loom.

II.2.   Diagnostikameetodid Bonamia ostreae nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks

Bonamia ostreae nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks või säilitamiseks kasutatavad diagnostikameetodid on histopatoloogiline analüüs, koejäljendite analüüs või PCR. Nimetatud diagnostikameetodite kohaldamisel tuleb järgida II lisa 5. osas sätestatud asjaomaseid üksikasjalikke meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.3.   Diagnostilised kriteeriumid Bonamia ostreae nakkuse kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 28 on vaja Bonamia ostreae'ga nakatumise kahtlust kinnitada või ümber lükata, järgitakse järgmist kontrolli-, proovivõtu- ja katsekorda.

Ametlik uuring hõlmab vähemalt ühte proovivõtmist taudile vastuvõtlikku liiki kuuluva 30 molluski analüüsimiseks, kui kahtlus põhineb surmajuhtumeid käsitleval teatel, või vastasel juhul taudile vastuvõtlikku liiki kuuluva 150 molluski analüüsimiseks pärast Bonamia ostreae'ga nakatumise perioodi algust. Kui kõnealune nakatumisperiood ei ole teada, alustatakse proovivõtmist talvel või kevade algul. Vastavalt II lisa 5. osa I jaos sätestatud üksikasjalikele diagnostikameetoditele ja nende kohaldamise korrale kasutatakse proovide analüüsimiseks jaotises i sätestatud diagnostikameetodeid:

i)	Bonamia ostreae esinemine loetakse kinnitatuks, kui II lisa 5. osas sätestatud heakskiidetud meetodite ja korra kohaselt tehtud histopatoloogilise analüüsi, koejäljendite analüüsi või in situ hübridiseerimise positiivseid tulemusi toetavad PCRi ja sekveneerimise positiivsed tulemused;

ii)	Bonamia ostreae'ga nakatumise kahtlus loetakse ümberlükatuks, kui nimetatud meetoditega ei leita tõendeid Bonamia ostreae esinemise kohta.

Tabel 5.A

Seirekava liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas Bonamia ostreae nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamisele eelneva, punktis I.2.1 osutatud seireperioodi jooksul

	Tervisekontrollide arv aastas	Laborianalüüside arv aastas	Molluskite arv valimis
Kasvandused/molluskikasvatusalad	1	1	150

Tabel 5.B

Seirekavad liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas Bonamia ostreae nakkuse suhtes taudivaba staatuse säilitamiseks, nagu on osutatud punktis I.3

Ohutase	Tervisekontrollide arv	Laborianalüüside arv	Molluskite arv valimis
Kõrge	1 kord aastas	1 kord 2 aasta jooksul	150
Keskmine	1 kord 2 aasta jooksul	1 kord 2 aasta jooksul	150
Madal	1 kord 2 aasta jooksul	1 kord 4 aasta jooksul	150

6. OSA

SEIRE- JA TÕRJEMEETODID VIIRUSLIKU VALGELAIKSUSE PUHUL

I.   Nõuded, mida kohaldatakse seire- ja likvideerimisprogrammide suhtes, et saada viirusliku valgelaiksuse suhtes taudivaba staatus ja seda säilitada ning tõkestada valgelaiksust tekitava viiruse levikut

I.1.   Tervisekontrolli ja proovivõtmise üldnõuded

Koorikloomade proovid võetakse laborianalüüsi tegemiseks ajal, mil veetemperatuur saavutab eeldatavalt aasta kõrgeima taseme. Seda veetemperatuuri käsitlevat nõuet kohaldatakse ka tervisekontrollide puhul, kui nende tegemine on otstarbekas ja asjakohane.

Kui proovivõtmiseks on vaja koguda kasvatatavaid koorikloomi vastavalt käesolevas osas sätestatud nõuetele, kohaldatakse järgmisi kriteeriume:

a)

kui tootmisüksustes esineb nõrku või surmaeelses seisundis koorikloomi, võetakse valimisse eelkõige sellised koorikloomad. Selliste koorikloomade puudumisel hõlmab valim taudile vastuvõtlike koorikloomaliikide eri mõõdus isendeid, nimelt noorloomi ja täiskasvanud isendeid, kes peavad olema valimis esindatud proportsionaalselt;

b)	kui koorikloomade kasvatamiseks kasutatakse mitut veeallikat, peab valim hõlmama taudile vastuvõtlikke koorikloomi kõikidest veeallikatest.

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, määratakse proovivõtukohtade arv ja geograafiline jaotus kindlaks nii, et saavutataks liikmesriigi, tsooni või piirkonna piisav kaetus. Proovivõtukohad peavad ühtlasi olema representatiivsed taudile vastuvõtlike liikide looduslike populatsioonide elupaigaks olevate eri ökosüsteemide, st asjaomaste mereökosüsteemide, suudmealade, jõgikondade ja järvistute suhtes.

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, võetakse koorikloomad valimisse järgmisel viisil:

i)

mereökosüsteemides ja suudmealadel võetakse valimisse üks või mitu järgmistest liikidest: Carcinus maenas, Cancer pagurus, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depurator, Liocarcinus puber, Crangon crangon, Homarus gammarus, Palaemon adspersus ja viburhännaklaste liigid, täpsemalt Penaeus japonicus, Penaeus kerathurus ja Penaeus semisulcatus. Nimetatud liikide puudumisel peavad valimis olema esindatud muud olemasolevad taudile vastuvõtlikud kümnejalaliste seltsi liigid. Taudile vastuvõtlike peremeesliikide suurest arvust tulenevalt võib peremeesorganismid valida kümnejalaliste seltsi perekonnast või sugukonnast, kus vastuvõtlikkus taudi suhtes on katseliselt või looduslikes tingimustes tõendatud;

ii)

jõgikondades ja järvistutes võetakse valimisse üks või mitu järgmistest liikidest: Pacifastacus leniusculus, Astacus leptodactylus, Austropotamobius pallipes ja Orconectes limosus. Nimetatud liikide puudumisel peavad valimis olema esindatud muud olemasolevad taudile vastuvõtlikud kümnejalaliste seltsi liigid. Taudile vastuvõtlike peremeesliikide suurest arvust tulenevalt võib peremeesorganismid valida kümnejalaliste seltsi perekonnast või sugukonnast, kus vastuvõtlikkus taudi suhtes on katseliselt või looduslikes tingimustes tõendatud;

iii)

kui esineb nõrku või surmaeelses seisundis koorikloomi, võetakse valimisse eelkõige sellised koorikloomad. Selliste koorikloomade puudumisel hõlmab valim taudile vastuvõtlike koorikloomaliikide eri mõõdus isendeid, nimelt noorloomi ja täiskasvanud isendeid, kes peavad olema valimis esindatud proportsionaalselt.

I.2.   Erinõuded viirusliku valgelaiksuse suhtes I kategooria tervisealase staatuse saamiseks

I.2.1.   Seireprogrammid

a)

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv direktiivi 2006/88/EÜ III lisa B osa kohane III kategooria tervisealane staatus, võib kõnealuse loetletud taudi suhtes anda I kategooria tervisealase staatuse, kui kõik asjaomases liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvad kasvandused, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, vastavad selle direktiivi V lisas sätestatud asjakohastele nõuetele ning kui kõikides sellistes kasvandustes ja vajaduse korral direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt nõutavates ja nimetatud punkti kohaselt looduslikes populatsioonides valitud proovivõtukohtades on rakendatud järgmist kaheaastast seireprogrammi, mis hõlmab tervisekontrolle ja analüüsimiseks proovide võtmist. Asjaomastes kasvandustes ja proovivõtukohtades on tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt kahe järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud II jao tabelis 6.A. Selle kaheaastase perioodi jooksul peavad kõik punktis II.2 sätestatud diagnostikameetoditega analüüsitud proovid olema andnud viirusliku valgelaiksuse suhtes negatiivse tulemuse ning viirusliku valgelaiksuse esinemise kahtlus peab olema punktis II.3 sätestatud diagnostikameetoditega ümber lükatud.

b)

Kui alapunktis a osutatud seireprogrammi rakendamise käigus leiab kinnitust valgelaiksust tekitava viiruse esinemine selle seireprogrammiga hõlmatud kasvanduses ja asjaomase kasvanduse II kategooria tervisealane staatus on seetõttu tühistatud, võib selline kasvandus saada viivitamata taas II kategooria tervisealase staatuse ja jätkata seireprogrammi rakendamist taudivaba staatuse saamiseks punktis I.2.2 sätestatud likvideerimisprogrammi rakendamata, kui: i) tegemist on maismaakasvandusega, mille tervisealane staatus seoses viirusliku valgelaiksusega ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude tervisealasest staatusest seoses kõnealuse loetletud taudiga, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3; ii) kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat; iii) kasvandus on taasasustatud koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

I.2.2.   Likvideerimisprogrammid

I.2.2.1.   Üldnõuded

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist likvideerimisprogrammi:

a)

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 4. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid on tõhusalt kohaldatud ning ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e ümber on loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni. Sellise isoleeritud ala kindlaksmääramisel peab olema lähtutud konkreetse juhu analüüsist ning võetud seejuures muu hulgas arvesse järgmisi riskitegureid, mis mõjutavad viirusliku valgelaiksuse levimist kasvatatavatele ja looduslikele koorikloomadele: viirusliku valgelaiksusega nakatunud kasvandus(t)es surnud koorikloomade arv, osakaal ja jaotus; naabruses asuvate kasvanduste kaugus ja arv; nakkusega kokkupuutunud kasvandused; kasvandus(t)es olevad liigid; nakatunud kasvandus(t)es ja naabruses asuvates kasvandustes kohaldatavad kasvatustavad; hüdrodünaamilised tingimused ja muud tuvastatud epidemioloogiliselt olulised tegurid. Kaitse- ja seiretsoonide kehtestamisel järgitakse järgmisi miinimumnõudeid: i) kaitsetsoon kehtestatakse ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvanduse vahetus läheduses ja see vastab: 1) mere- ja suudmealal: sellise ringi sees olevale alale, mille raadius on vähemalt üks loodete horisontaalne ulatus või vähemalt viis kilomeetrit (olenevalt sellest, kumb on suurem) ja mille keskpunktis on ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandus, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest; või 2) mageveekogude puhul: kogu valgalale, millel paikneb ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandus; pädev asutus võib vähendada tsooni ulatust nii, et see hõlmaks osa valgalast, kui sellega ei ohustata viirusliku valgelaiksuse leviku tõkestamist; ii) kaitsetsoonist väljaspool kehtestatakse seiretsoon, mis vastab: 1) merealal: kaitsetsooni ümbritsevale alale, mis hõlmab kattuvaid loodete horisontaalse ulatuse tsoone, või kaitsetsooni ümbritsevale sellise ringi sees olevale alale, mille raadius kaitsetsooni keskpunktist on 10 km, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest; või 2) mageveekogude puhul: kehtestatud kaitsetsoonist väljaspool asuvale laiemale alale;

b)

kõikides kaitsetsoonis asuvates kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike ja mis ei ole ametlikult tunnistatud viirusliku valgelaiksusega nakatunuks, tehakse ametlik uuring, mis hõlmab vähemalt järgmist: i) proovivõtmine 10 kooriklooma analüüsimiseks, kui täheldatakse viirusliku valgelaiksusega nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid, või 150 kooriklooma analüüsimiseks, kui kõnealuseid kliinilisi sümptomeid ega surmajärgseid ilminguid ei täheldata; ning ii) üks tervisekontroll; kasvandustes, kus jaotises i osutatud analüüside tulemused on negatiivsed, jätkatakse tervisekontrolli tegemist kord kuus perioodi vältel, mil veetemperatuur saavutab eeldatavalt aasta kõrgeima taseme, kuni kaitsetsoon vastavalt punkti I.2.2.1 alapunktile c tühistatakse;

c)

kõik ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandused tühjendatakse, puhastatakse ja desinfitseeritakse ning nende tegevus katkestatakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt kuus nädalat. Kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste tühjendamise järel peab nende tegevus olema üheaegselt katkestatud vähemalt kolme nädala vältel. Käesolevat lõiku kohaldatakse ka uute kasvanduste suhtes, mis on likvideerimisprogrammi rakendamise käigus ametlikult nakatunuks tunnistatud. Pärast ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist muudetakse kaitsetsoon seiretsooniks. Pädev asutus võib nõuda asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvate muude kasvanduste tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende tegevuse katkestamist. Sellisel juhul määrab pädev asutus katkestusperioodi kestuse kindlaks konkreetse juhuga seotud riskihinnangu alusel;

d)

kõik ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandused ja kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad muud kasvandused, mille tegevus katkestatakse, taasasustatakse: i) koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus, või ii) 31. detsembrini 2020 kehtiva üleminekuperioodi vältel koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, kus viirusliku valgelaiksuse tuvastamiseks rakendatakse heakskiidetud seireprogrammi. Taasasustamine toimub üksnes pärast kõikide ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvanduste punkti I.2.2.1 alapunkti c kohast tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist;

e)

likvideerimisprogrammiga hõlmatud liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvates kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, ning looduslikes populatsioonides seire tegemise vajaduse korral ka nimetatud direktiivi V lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt valitud proovivõtukohtades rakendatakse edaspidi vähemalt punktis I.2.1 sätestatud programmi.

I.2.2.2.   Nõuded viirusliku valgelaiksuse suhtes taudivaba staatuse taastamiseks maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust varem viiruslikust valgelaiksusest vabaks tunnistatud kasvandust

Maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust kasvandust, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus seoses kõnealuse loetletud taudiga ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude omast, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3, ning mille I kategooria tervisealane staatus on tühistatud kooskõlas nimetatud direktiivi artikli 53 lõikega 3, võib I kategooria tervisealase staatuse taastada kohe pärast seda, kui pädev asutus on kinnitanud, et asjaomane kasvandus vastab järgmistele tingimustele:

a)	viirusliku valgelaiksusega nakatunud kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

b)	viirusliku valgelaiksusega nakatunud kasvandus on taasasustatud koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

I.3.   Erinõuded viirusliku valgelaiksuse suhtes taudivaba (I kategooria) staatuse säilitamiseks

Kui I kategooria tervisealase staatuse säilitamiseks vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 52 on nõutav suunatud seire, tehakse asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, tervisekontrolli ja võetakse proove vastavalt II jaos esitatud tabelile 6.B; seejuures võetakse arvesse viirusliku valgelaiksusega nakatumise riski asjaomases kasvanduses.

Liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas, kus kasvanduste arv on piiratud ja nende suunatud seire ei võimalda saada piisaval hulgal epidemioloogilisi andmeid, hõlmab taudivaba staatuse säilitamiseks rakendatav seireprogramm proovivõtukohti, mis valitakse vastavalt punktis I.1 sätestatud nõuetele.

Kõnealustes proovivõtukohtades tehakse tervisekontrolli ja võetakse proove rotatsiooni korras nii, et igal aastal kasutatakse 50 % proovivõtukohtadest. Proovivõtmine toimub vastavalt II jao tabelile 6.B. Proovid valitakse ja valmistatakse ette ning neid analüüsitakse II jaos sätestatud diagnostika- ja proovivõtumeetodite kohaselt ning laborianalüüside tulemused peavad olema viirusliku valgelaiksuse tekitaja suhtes negatiivsed.

Taudivaba staatus säilib üksnes juhul, kui kõik punktis II.2 sätestatud diagnostika- ja proovivõtumeetoditega analüüsitud proovid annavad viirusliku valgelaiksuse suhtes negatiivse tulemuse ning viirusliku valgelaiksuse esinemise kahtlus lükatakse punktis II.3 sätestatud ametliku uuringu ja diagnostikameetoditega ümber.

I.4.   Nõuded direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 39 sätestatud isoleerimismeetmete kohaldamise lõpetamiseks seoses viirusliku valgelaiksusega (V kategooria tervisealase staatuse muutmine III kategooria staatuseks)

Viirusliku valgelaiksuse suhtes V kategooria tervisealase staatusega liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda III kategooria tervisealase staatuse, kui:

a)	punkti I.2.2.1 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse valgelaiksust tekitava viiruse hävimine kasvanduses;

b)

kõik kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandused ja muud kasvandused, mille tegevus on katkestatud või kus on kohaldatud alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

c)	taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid;

d)	alapunktides a ja b sätestatud meetmete kohaldamise lõpetamisele järgneva kaheaastase perioodi jooksul ei ole viiruslikku valgelaiksust kordagi tuvastatud ja sellekohased kahtlused on nimetatud perioodi jooksul punktis II.3 sätestatud korra kohaselt ümber lükatud.

II.   Diagnostika- ja proovivõtumeetodid

II.1.   Proovid

Enne proovide ettevalmistamist kaheetapiliseks PCRiks fikseeritakse katselooma integumendi eraldatud või käimisjalgadel, ujujalgadel, lõugjalgadel või lõpustel olev epidermis 95 % etanoolis.

PCRi teel saadud diagnostiliste tulemuste kinnitamiseks võib koguda ka muid proove, mis fikseeritakse histoloogiliseks ja transmissioonelektronmikroskoobi abil analüüsimiseks.

II.2.   Diagnostikameetodid viirusliku valgelaiksuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks ja säilitamiseks

Vastavalt II lisa 6. osas sätestatud üksikasjalikele meetoditele ja nende kohaldamise korrale on viirusliku valgelaiksuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks või säilitamiseks kasutatav diagnostikameetod kaheetapiline PCR.

Kaheetapilise PCRi positiivsete tulemuste korral viiakse enne direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 28 sätestatud esmaste tõrjemeetmete rakendamist läbi tulemuste kinnitamiseks vajalik amplikoni sekveneerimine ja kui see on praktilistes tingimustes teostatav, siis valitud vastuvõtlikel peremeesorganismidel esinevate patognoomsete viirusliku valgelaiksuse sümptomite tuvastamine histoloogilise analüüsi ja transmissioonelektronmikroskoopia abil.

II.3.   Ametlik uuring ja diagnostikameetodid viirusliku valgelaiksuse esinemise või puudumise kinnitamiseks

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ artiklile 28 on vaja viirusliku valgelaiksuse esinemist kinnitada või selle taudi kahtlust ümber lükata, järgitakse järgmist kontrolli-, proovivõtu- ja katsekorda:

a)

ametliku uuringu käigus tehakse vähemalt üks tervisekontroll ja võetakse vähemalt üks proov, mis hõlmab 10 kooriklooma, kui täheldatakse viirusliku valgelaiksusega nakatumisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid, või 150 kooriklooma, kui kõnealuseid kliinilisi sümptomeid ega surmajärgseid ilminguid ei täheldata. Proove analüüsitakse punktis II.2 sätestatud diagnostikameetodiga (kaheetapiline PCR);

b)

viirusliku valgelaiksuse esinemine loetakse kinnitatuks, kui II lisa 6. osas sätestatud üksikasjalike meetodite ja nende rakendamise korra kohase kaheetapilise PCR ja sellele järgneva sekveneerimise tulemused on valgelaiksust tekitava viiruse suhtes positiivsed ning valitud peremeesorganismidel tuvastatakse patognoomseid viirusliku valgelaiksuse sümptomeid. Viirusliku valgelaiksuse kahtluse võib ümber lükata, kui kõnealuse analüüsi käigus ei leita tõendeid viirusliku valgelaiksuse esinemise kohta.

Tabel 6.A

Seirekava liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas viirusliku valgelaiksuse suhtes taudivaba staatuse saamisele eelneva, punktis I.2.1 osutatud kaheaastase seireperioodi jooksul

	Tervisekontrollide arv aastas	Laborianalüüside arv aastas	Koorikloomade arv valimis
Kasvandused/proovivõtukohad	1	1	150

Tabel 6.B

Seirekavad liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas viirusliku valgelaiksuse suhtes taudivaba staatuse säilitamiseks, nagu on osutatud punktis I.3

Ohutase	Tervisekontrollide arv	Laborianalüüside arv	Koorikloomade arv valimis
Kõrge	1 kord aastas	1 kord 2 aasta jooksul	150
Keskmine	1 kord 2 aasta jooksul	1 kord 2 aasta jooksul	150
Madal	1 kord 2 aasta jooksul	1 kord 4 aasta jooksul	150

---

(1)  Proovid kogutakse kõige varem kolm nädalat pärast kalade viimist mageveest soolasesse vette.

(2)  Sugukarja ovariaal- või seemnevedelik kogutakse kudemisperioodil marja või niisa lüpsmise ajal.

(3)  Proovid tuleb võtta selliselt arvult kaladelt, millega tagatakse VHSi või IHNi viiruse tuvastamine usaldusväärsusega 95 %, kui kontroll-levimus on 5 %.

(4)  Proovid kogutakse kõige varem kolm nädalat pärast kalade viimist mageveest soolasesse vette.

(5)  Sugukarja ovariaal- või seemnevedelik kogutakse kudemisperioodil marja või niisa lüpsmise ajal.

(6)  Proovid tuleb võtta selliselt arvult kaladelt, millega tagatakse VHSi või IHNi viiruse tuvastamine usaldusväärsusega 95 %, kui kontroll-levimus on 10 %.

(7)  Proovid kogutakse kõige varem kolm nädalat pärast kalade viimist mageveest soolasesse vette.

(8)  Proovid tuleb võtta selliselt arvult kaladelt, millega tagatakse VHSi või IHNi viiruse tuvastamine usaldusväärsusega 95 %, kui kontroll-levimus on 10 %.

(9)  Iga tervisekontrolli ajal võetakse vähemalt üks kalade proov.

(10)  Proovid tuleb võtta selliselt arvult kaladelt, millega tagatakse KHV tuvastamine usaldusväärsusega 95 %, kui kontroll-levimus on 5 %.

(11)  Ei kohaldata kasvanduste puhul, kus kasvatatakse üksnes vikerforelli (Onchorhynchus mykiss) ja/või meriforelli (Salmo trutta) ning mida varustatakse veega üksnes mageveeallikatest, kus ei esine atlandi lõhet (Salmo salar).

(12)  Proovid kogutakse ning neid säilitatakse ja analüüsitakse igal aastal kahe ühekuise analüüsiperioodi vältel (kevadel ja sügisel) või praktilistest kaalutlustest tuleneval muul sobival ajal.

(13)  Kalade maksimaalne arv koondproovis: 5.

(14)  Proovid kogutakse ja neid analüüsitakse igal aastal kahe ühekuise analüüsiperioodi vältel (kevadel ja sügisel) või praktilistest kaalutlustest tuleneval muul sobival ajal.

(15)  Ei kohaldata kasvanduste puhul, kus kasvatatakse üksnes vikerforelli (Onchorhynchus mykiss) ja/või meriforelli (Salmo trutta) ning mida varustatakse veega üksnes mageveeallikatest, kus ei esine atlandi lõhet (Salmo salar).

II LISA

ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I.   Sissejuhatus

Käesolevas lisas nähakse ette üksikasjalik kord selliste diagnostikameetodite kohaldamiseks, mida tuleb kasutada käesoleva rakendusotsuse I lisas sätestatud likvideerimis- ja seireprogrammide raames tehtavates laboriuuringutes, et direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaselt kinnitada nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud järgmiste mitteeksootiliste taudide (edaspidi „loetletud taudid”) esinemise kahtlust või sellist kahtlust ümber lükata:

1.	viiruslik hemorraagiline septitseemia (VHS)	1. osa
2.	nakkuslik vereloomenekroos (IHN)	1. osa
3.	karpkalade herpesviirus (KHV)	2. osa
4.	lõhede infektsioosne aneemia (ISA)	3. osa
5.	Marteilia refringens'i nakkus	4. osa
6.	Bonamia ostreae nakkus	5. osa
7.	viiruslik valgelaiksus	6. osa.

II.   Mõisted

Käesolevas lisas kasutatakse järgmist mõistet:

transpordisööde– rakukultuurisööde, mis sisaldab 10 % vasikaseerumit ning 200 RÜ penitsilliini, 200 μg streptomütsiini ja 200 μg kanamütsiini milliliitri kohta või muid tõendatud tõhususega antibiootikume.

1. OSA

IHNi JA VHSi SEIREKS JA NENDE ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I.   VHSi ja IHNi seireks kasutatavad diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Proovivõtmisel ja laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 1. osa punktides II.1 ja II.2 sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 1. osa I jao kohaseks IHNi või VHSi suhtes taudivaba staatuse saamiseks või säilitamiseks järgmisi punktides I.1–I.6 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

I.1.   Kaladelt proovide võtmine ja proovide saatmine

I.1.1.   Koed viroloogiliseks analüüsiks rakukultuuris

Enne laborisse saatmist või edastamist eemaldatakse steriilsete lahkamisriistade abil kaladelt uuritavate elundite tükid ja pannakse need transpordisöödet sisaldavasse steriilsesse plastkatsutisse.

Rakukultuuris tehtavaks viroloogiliseks analüüsiks ja RT-qPCRi jaoks võetava materjali kogus sõltub kala suurusest. Kogutavad koed on vastsete puhul (kehapikkus < 4 cm) terve vastne, 4–6 cm pikkuste kalade puhul sisikond koos neerudega ning suuremate kalade puhul neerud, põrn, süda ja/või peaaju ja kudemisajal sugukalade ovariaalvedelik.

Ühte steriilsesse katsutisse, mis sisaldab vähemalt 4 ml transpordisöödet, võib koguda kuni 10 kala ovariaal- või seemnevedeliku või elunditükid, mis moodustavad ühe koondproovi. Koe mass igas proovis on vähemalt 0,5 grammi.

Viroloogilist analüüsi rakukultuuris alustatakse niipea kui võimalik ning hiljemalt 48 tundi pärast proovide kogumist. Erandjuhul võib viroloogilist analüüsi alustada hiljemalt 72 tundi pärast materjali kogumist, kui uuritavat materjali kaitseb transpordisööde ja transpordi ajal on võimalik järgida asjaomaseid temperatuurinõudeid.

I.1.2.   Proovid pöördtranskriptsiooniga polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR või RT-qPCR) abil analüüsimiseks

Kaladelt võetakse proovid steriilse instrumendiga vastavalt punktis I.1.1 kirjeldatud korrale ja pannakse transpordisöödet sisaldavasse steriilsesse plastkatsutisse. Ühte katsutisse võib koguda 10 kalalt võetud koeproovid, mis moodustavad ühe koondproovi. Kui inokulumi maht on väike, võib siiski koondada vaid kuni viielt kalalt võetud koeproovid. Teise võimalusena võib proovid koguda RNAd stabiliseerivasse lahusesse nii, et koematerjali sisaldus lahuses oleks tootja soovituse kohaselt 0,2 g/ml; sel juhul käideldakse iga kala koematerjali eraldi ja eri kalade kudesid ei koondata, kuna eraldamiseks kasutatava materjali kogus on väike.

Laborisse võib saata ka terveid kalu.

I.2.   Kaladelt võetud proovide saatmine

Transpordisöötmega katsutid, mis sisaldavad rakukultuuris või RT-PCRi või RT-qPCRi abil analüüsimiseks ette nähtud kalakudesid, pannakse soojusisolatsiooniga konteinerisse, näiteks paksuseinalisse polüstüreenkasti koos piisava koguse jääga või muu sarnase jahutava toimega jahutusainega, et tagada laborisse transportimise ajal proovi püsimine jahutatuna. Samas on vaja ära hoida proovi külmumist. Proovi temperatuur ei tohi transpordi ajal hetkekski tõusta üle 10 °C ning saadetise vastuvõtmise ajal peab transpordikastis veel jääd olema või peab vähemalt üks jahutusplokk olema vähemalt osaliselt külmunud.

Laborisse võib saata terveid kalu, kui transpordi ajal on võimalik järgida esimeses lõigus osutatud temperatuurinõudeid. Terved kalad mähitakse imavasse paberisse ning need saadetakse teele plastkotis. Võib saata ka elusaid kalu.

I.3.   Täiendava diagnostilise materjali kogumine

Asjaomase diagnostikalabori heakskiidul võib täiendavateks uuringuteks koguda ja ette valmistada ka muid kalakudesid.

I.4.   Proovide ettevalmistamine rakukultuuris analüüsimiseks ja RT-qPCRi jaoks

I.4.1.   Külmutamine erandjuhul

Praktiliste raskuste korral, mis teevad proovi käitlemise kalakudede kogumisele järgneva 48 tunni jooksul võimatuks, võib olla vastuvõetav külmutada koeproov transpordisöötmes – 20 °C juures või madalamal temperatuuril ning teha viroloogiline analüüs 14 päeva jooksul. Kalakude külmutatakse ja sulatatakse enne analüüsimist vaid korra. Kalade koeproovide iga külmutamine registreeritakse koos sellekohase üksikasjaliku põhjendusega.

I.4.2.   Elundite homogeniseerimine

Katsutis olev kude homogeniseeritakse laboris täielikult stomahheri, segisti või uhmri, nuia ja steriilse liivaga ning suspendeeritakse seejärel algses transpordisöötmes.

Kui proov koosneb alla 4 cm pikkustest tervetest kaladest, tükeldatakse need steriilsete kääride või skalpelliga pärast seda, kui pärakust tahapoole jääv keha osa on eemaldatud. Kui proov koosneb tervetest kaladest pikkusega 4–6 cm, kogutakse sisikond koos neerudega. Kui proov koosneb üle 6 cm pikkustest tervetest kaladest, kogutakse koematerjal punktis I.1 kirjeldatud viisil. Koematerjal tükeldatakse steriilsete kääride või skalpelliga, homogeniseeritakse käesoleva punkti esimeses lõigus kirjeldatud viisil ja suspendeeritakse transpordisöötmes.

Koematerjali ja transpordisöötme vahekorda reguleeritakse laboris nii, et nende lõplik suhe oleks 1:10.

I.4.3.   Homogenaadi tsentrifuugimine

Homogenaati tsentrifuugitakse 15 minutit jahutatud tsentrifuugis temperatuuril 2–5 °C kiirendusel 2 000–4 000 g, kogutakse supernatant ja töödeldakse seda vajaduse korral antibiootikumidega neli tundi temperatuuril 15 °C või öö läbi temperatuuril 4–8 °C. Kui proovi transporditakse transpordisöötmes, võib supernatandi töötlemise antibiootikumidega ära jätta.

Kui ilmnevad praktilised raskused, näiteks inkubaatoririke või probleemid rakukultuuridega, mistõttu rakkude nakatamine 48 tunni jooksul pärast kaladelt koeproovide kogumist ei ole võimalik, võib supernatandi külmutada temperatuuril – 80 °C ning teha viroloogilise analüüsi 14 päeva jooksul.

Kui kogutud supernatant külmutatakse 48 tunni jooksul pärast proovivõtmist temperatuuril – 80 °C, võib seda viroloogiliseks analüüsiks uuesti kasutada vaid ühe korra.

Enne rakkude nakatamist segatakse supernatant võrdse osa nakkusliku pankrease nekroosi (IPN) viiruse kohalike serotüüpide vastaste antiseerumite sobivalt lahjendatud koondprooviga ning segu inkubeeritakse vähemalt tund aega 15 °C juures või maksimaalselt 18 tundi 4 °C juures. Antiseerumi tiiter peab 50 % plaagide neutraliseerimise katse kohaselt olema vähemalt 1/2 000.

Kõiki inokulume töödeldakse IPNi viiruse vastase antiseerumiga selleks, et hoida ära IPNi viirusest põhjustatud tsütopaatilise efekti ilmnemist inokulumiga nakatatud rakukultuurides. Sellega lühendatakse viroloogilise analüüsi kestust ja vähendatakse nende juhtude arvu, mille puhul tsütopaatilise efekti ilmnemist tuleb pidada VHSi või IHNi viiruse võimaliku esinemise märgiks.

Kui proovid on pärit tootmisüksusest, mida peetakse IPNi-vabaks, võib inokulumide töötlemise IPNi viiruse vastase antiseerumiga ära jätta.

I.4.4.   Proovide ettevalmistamine RT-PCRil või RT-qPCRil põhinevate seireprogrammide puhul

Kui proovid on kogutud transpordisöötmesse, viiakse läbi punktides I.4.2 ja I.4.3 ette nähtud toimingud. Pärast tsentrifuugimist kogutakse supernatant ja eraldatakse RNA. Kui edasine analüüs ei toimu kohe pärast tsentrifuugimist, külmutatakse proovid viivitamata – 20 °C juures või madalamal temperatuuril.

RNAd stabiliseerivas lahuses olevate kalakudede analüüsimisel tehakse edasised toimingud proovide säilitustemperatuurist olenevalt järgmise ajavahemiku jooksul:

37 °C juures säilitatavad proovid: ühe päeva jooksul;

25 °C juures säilitatavad proovid: ühe nädala jooksul;

4 °C juures säilitatavad proovid: ühe kuu jooksul;

– 20 °C juures säilitatavad proovid: mis tahes ajal.

RNAd stabiliseerivas lahuses olevat koondproovi käsitatakse kui RNAd stabiliseerivas lahuses olevat üksikproovi. RNAd stabiliseerivas lahuses oleva koondproovi maht ei tohi ületada RNA eraldamise komplekti tootja, näiteks RNeasy Mini komplekti tootja (Qiagen) soovituse kohast mahtu. Suurema mahuga proovide koondamisel tuleb kasutatava eraldamiskomplekti või -meetodi puhul arvesse võtta koondproovi mahtu.

RNAd stabiliseerivasse lahusesse kogutud proove ei kasutata rakukultuuris.

I.4.5.   Proovide koondamine RT-qPCRi jaoks

Kuna esitatud RT-qPCRi meetodite tundlikkus on rakukultuuri meetoditega võrreldes sarnane või suurem, võib olla vastuvõetav kasutada PCRi jaoks kuni 10 kalalt võetud elundite koondproovist pärit homogeniseeritud koematerjalist saadud supernatanti. Kuna PCRi jaoks kasutatav inokulum on rakukultuuris kasutatavaga võrreldes palju väiksem, tuleb kõik kalakoed enne eraldamiseks võetava materjali koondamist hoolikalt homogeniseerida.

Seda põhimõtet kohaldatakse ka RNAd stabiliseerivasse lahusesse kogutavate proovide suhtes. Sel juhul on sageli siiski raske koguda kuni 10 kalalt võetud representatiivne koematerjal ühte katsutisse ja seepärast vähendatakse koondproovis esindatud kalade arvu 2–5 kalani.

I.5.   Viroloogiline analüüs rakukultuuris

I.5.1.   Rakukultuurid ja söötmed

Päikeseahvena Lepomis macrochirus vastsete rakuliini BF-2 ja vikerforelli sugunäärmerakkude liini RTG-2 ning rakuliini Epithelioma papulosum cyprini (EPC) või pakspea-lepamaimu rakuliini FHM kasvatatakse 20–30 °C juures sobivas söötmes, täpsemalt Eagle'i minimaalsöötmes (MEM) või selle modifikatsioonis, kuhu on lisatud 10 % veiselooteseerumit ja tavapärases kontsentratsioonis antibiootikume.

Kui rakke kasvatatakse suletud pudelites, puhverdatakse söödet vesinikkarbonaadiga. Lahtistes nõudes rakkude kasvatamiseks kasutatavat söödet võib puhverdada tris(hüdroksümetüül)aminometaanvesinikkloriidi (Tris-HCl) (23 mM) ja naatriumvesinikkarbonaadiga (6 mM). Söötme pH peab olema 7,6 ± 0,2.

Kaladelt saadud koematerjaliga nakatamiseks kasutatav rakukultuur peab võimaluse korral olema noor, üldjuhul ühe päeva vanune ühekihiline kultuur; vastuvõetav kultuuri vanus võib siiski olla 4–48 tundi. Rakud peavad nakatamise ajal aktiivselt kasvama.

I.5.2.   Rakukultuuride nakatamine

Rakukultuuride nakatamisel antibiootikumidega töödeldud elundisuspensiooniga kasutatakse homoloogilise interferentsi ärahoidmiseks kahte lahjendusastet: esmast lahjendust ja selle 1:10 lahjendamisel saadud täiendavat lahjendust, nii et koematerjali lõpplahjendus rakukultuurisöötmes on vastavalt 1:100 ja 1:1 000. Nakatamiseks kasutatakse vähemalt kahte punktis I.5.1 osutatud rakuliini. Inokulumi mahu ja rakukultuurisöötme ruumala suhe peab olema umbes 1:10.

Iga lahjenduse ja iga rakuliini kohta kasutatakse vähemalt 2 cm2 suurust rakkudega kaetud ala, mis vastab 24-kannulise rakukultuuriplaadi ühe kannu põhjapindalale. Võimaluse korral kasutatakse rakukultuuriplaate.

I.5.3.   Rakukultuuride inkubeerimine

Nakatatud rakukultuure inkubeeritakse 7–10 päeva 15 °C juures. Kui rakukultuurisöötme värv muutub punasest kollaseks, mis on märk söötme hapestumisest, reguleeritakse pH-d steriilse vesinikkarbonaadi lahusega või samaväärse ainega, et tagada rakkude vastuvõtlikkus viirusnakkusele.

Vähemalt iga kuue kuu järel või kui kahtlustatakse rakkude vastuvõtlikkuse vähenemist, kontrollitakse rakukultuuride vastuvõtlikkust nakkusele VHSi ja IHNi viiruse külmutatud põhilahuse tiitrimise teel. Võimaluse korral kohaldatakse III jaos sätestatud korda.

I.5.4.   Mikroskoopia

Nakatatud rakukultuure kontrollitakse korrapäraselt vähemalt kolm korda nädalas tsütopaatilise efekti esinemise suhtes 40- kuni 150-kordsel suurendusel. Kui täheldatakse ilmset tsütopaatilist efekti, alustatakse viivitamata viiruse tuvastamist vastavalt punktile I.6.

I.5.5.   Subkultuuride loomine

Kui 7–10 päeva kestnud esimese inkubeerimise järel ei ole ilmnenud tsütopaatilist efekti, luuakse subkultuurid värsketest rakukultuuridest, mida kasvatatakse primaarkultuuri kasvupinnaga sarnase suurusega alal.

Kõikides primaarkultuuri sisaldavates kultuurides või kannudes olevatest söötme (supernatandi) alikvootidest moodustatakse 7–10 päeva pärast nakatamist iga rakuliini puhul koondproov. Saadud koondprooviga nakatatakse homoloogilisi rakukultuure proovi eelnevalt lahjendamata ja 1:10 lahjendatuna (supernatandi lõpplahjendus vastavalt 1:10 ja 1:100), nagu on kirjeldatud punktis I.5.2. Teise võimalusena viiakse primaarkultuuri söötme 10 % suurune alikvoot otse värsket rakukultuuri sisaldavasse kannu (subkultuuri loomine kannust kannu tõstmisega). Enne nakatamist võib lahuseid eelnevalt inkubeerida IPNi viiruse vastase sobivalt lahjendatud antiseerumiga, nagu on kirjeldatud punktis I.4.3.

Seejärel inkubeeritakse nakatatud kultuure 7–10 päeva 15 °C juures ja neid jälgitakse punkti I.5.4 kohaselt.

Kui toksiline tsütopaatiline efekt ilmneb inkubeerimise esimese kolme päeva jooksul, luuakse subkultuur juba sel ajal, kuid sellisel juhul inkubeeritakse rakke seitse päeva ja pärast seda luuakse uus subkultuur, mida inkubeeritakse veel seitse päeva. Kui toksiline tsütopaatiline efekt ilmneb pärast kolme päeva möödumist, vahetatakse rakke ühe korra ja inkubeerimine kestab esimesest nakatamisest alates kokku 14 päeva. Inkubeerimise viimase seitsme päeva jooksul ei tohi toksilisust ilmneda.

Kui kultuur saastub bakteritega antibiootikumidega töötlemisest hoolimata, tsentrifuugitakse supernatanti enne subkultuuri loomist 15–30 minutit 2 000–4 000 g juures temperatuuril 2–5 °C ja/või filtritakse see läbi 0,45 μm suuruste pooridega filtri, mille membraan seob vähe valke. Peale selle järgitakse subkultuuri loomisel käesoleva punkti neljandas lõigus seoses toksilise tsütopaatilise efektiga kirjeldatud korda.

Kui tsütopaatilist efekti ei täheldata, võib katsetulemuse lugeda negatiivseks.

I.6.   Viiruse tuvastamine

Kui rakukultuuris täheldatakse tsütopaatilist efekti, kogutakse sööde (supernatant) kokku ja selle analüüsimiseks kasutatakse ühte või mitut järgmistest meetoditest: ensüümimmuunsorptsioonanalüüs (ELISA), immunofluorestsentsanalüüs, neutraliseerimine, RT-PCR ja RT-qPCR. Kui kõnealuste meetoditega ei ole ühe nädala jooksul suudetud viirust kindlalt tuvastada, saadetakse supernatant viiruse koheseks tuvastamiseks kalahaigustega tegelevasse direktiivi 2006/88/EÜ VI lisas osutatud riiklikku referentlaborisse või ELi referentlaborisse.

I.6.1.   ELISA

Viiruse isolaadi tuvastamiseks tehakse kihttehnikal põhinev kahe antikehaga ELISA. Mikrotiiterplaadi pind kaetakse IHNi või VHSi viiruse vastasest küüliku antiseerumist proteiin A abil puhastatud tõendatud kvaliteediga immunoglobuliinidega, mis on lahjendatud naatriumasiidi kontsentratsioonis 15 mM sisaldavas karbonaatpuhvris (pH 9,6) nii, et igasse kannu lisatakse 0,9 pg antikehi 50 μl lahuses, ning plaati inkubeeritakse 4 °C juures 18 tundi kuni 2 nädalat.

Igast proovist, mis sisaldab 1 % Triton X-100, ja positiivsetest kontrollidest tehakse lahjendusplaadil puhverlahuses PBS-T-BSA (fosfaadiga puhverdatud soolalahus (PBS), mis sisaldab 1 % veise seerumi albumiini (BSA)) neljakordsed lahjendused: lahjendamata, 1:4, 1:16 ja 1:64. ELISA plaati pestakse PBSiga, mis sisaldab 0,05 % Tween-20 (PBS-T), ning antikehadega kaetud ja pestud ELISA plaadile kantakse lahjendusplaadilt igast lahjendusest 50 μl.

ELISA plaati inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures. Seejärel plaati pestakse ja seda inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 37 °C spetsiifilise monoklonaalse antikehaga (VHSi viiruse tuvastamiseks monoklonaalse antikehaga IP5B11 ja IHNi viiruse tuvastamiseks Hyb 136–3). ELISA plaadile kantakse 50 μl hiire antikehade vastaste mädarõika peroksüdaasiga (HRP) konjugeeritud küüliku antikehade lahust, mis on valmistatud PBS-T-BSAs lahjendusel 1:1 000.

Lõpuks lisatakse pärast uuesti pesemist värvusreaktsiooni esilekutsumiseks 50 μl o-fenüleendiamiini (OPD) lahust kannu kohta. ELISA plaati inkubeeritakse 20 minutit pimedas toatemperatuuril ja reaktsiooni peatamiseks lisatakse 100 μl 0,5 M H2SO4 kannu kohta.

Neeldumist mõõdetakse ELISA plaadilugejas lainepikkustel 492 ja 620 nm. Proov loetakse positiivseks või negatiivseks pärast katsetulemuste võrdlemist positiivse ja negatiivse kontrolli neeldumisnäitajatega. Proov, mille lahjendamata materjali puhul on summaarne neelduvus (A) < 0,5, loetakse üldjuhul negatiivseks, proov, mille puhul A on vahemikus 0,5–1,0, loetakse kahtlustäratavaks ning proov, mille puhul A > 1,0, loetakse positiivseks.

Käesolevas punktis kirjeldatud meetodi asemel võib kasutada mõnda muud tõendatud tõhususega ELISA meetodit.

I.6.2.   Immunofluorestsentsanalüüs

Loetletud patogeenide hulka kuuluvate VHSi viiruse ja IHNi viiruse tuvastamiseks nakatatakse musta värvi 96-kannulisel plaadil, tavalisel 24-kannulisel plaadil või 24-kannulisse plaati asetatud katteklaasil kasvatatavaid rakke. Kui IHNi viiruse ja/või VHSi viiruse tuvastamiseks nakatatakse rakke katteklaasil, kohaldatakse järgmist meetodit:

a)

katteklaasile viiakse selline kogus rakke, et pärast 24 tunni pikkust kultiveerimist oleks rakukiht 60–90 % ulatuses konfluentne. Selleks otstarbeks kasutatakse võimaluse korral EPC rakke, sest need kinnituvad tugevalt klaaspinnale, kuid võib kasutada ka mõnda muud rakuliini, näiteks BF-2, RTG-2 või FHMi. Ühe päeva vanuse ühekihilise rakukultuuri nakatamiseks lisatakse kahe paralleelproovina 150 μl rakukultuuri supernatanti kahes eri lahjenduses (1:10 ja 1:1 000) ning rakke inkubeeritakse 24 tundi 15 °C juures;

b)

seejärel eemaldatakse rakukultuurisööde ja nakatatud ühekihilise kultuuri rakud fikseeritakse 0,5 ml jääkülma atsetooni vesilahusega (80-mahuprotsendiline). Fikseerimine toimub tõmbekapis toatemperatuuril 15 minuti vältel; seejärel atsetoonilahus eemaldatakse ja katteklaasil lastakse vähemalt 30 minutit õhu käes kuivada. Selle etapi järel jätkatakse kohe rakkude töötlemist või külmutatakse need – 20 °C juures hilisemaks analüüsimiseks;

c)

spetsiifiline monoklonaalne antikeha (VHSi viiruse tuvastamisel IP5B11 ja IHNi viiruse tuvastamisel Hyb 136–3) lahjendatakse 0,01 M PBSis, mis sisaldab 0,05 % Tween-20 (PBS-T) ja mille pH on 7,2; seejuures kasutatakse asjaomase antikeha tarnija soovitatavat lahjendust. Fikseeritud ühekihilisele kultuurile lisatakse 50–100 μl antikehalahust ja plaati inkubeeritakse niiskes kambris tund aega 37 °C juures;

d)

katteklaasi pestakse ettevaatlikult kolm korda PBS-T-ga ja pärast viimast loputamist eemaldatakse puhverlahus täielikult. Seejärel inkubeeritakse rakke tund aega temperatuuril 37 °C primaarse antikehana kasutatud hiire immunoglobuliini vastase, tarnija juhiste kohaselt lahjendatud antikehaga, mis on konjugeeritud fluorestseiinisotiotsüanaadi (FITC) või tetrametüülrodamiin-5-(ja 6-)isotiotsüanaadiga (TRITC), ning rakke pestakse taas PBS-T-ga ja neil lastakse kuivada. Sel viisil värvitud kultuur asetatakse glütserooli sisaldava soolalahuse abil alusklaasile ja seda analüüsitakse kaldnurga all saabuvas ultraviolettkiirguses. Kasutatakse 10- või 12-kordse suurendusega okulaare ja 25- või 40-kordse suurendusega objektiivi, mille numbriline apertuur on vastavalt > 0,7 või > 1,3.

Eespool kirjeldatu asemel võib rakukultuuride, fikseerimise ja standardkvaliteediga antikehadega seoses kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega immunofluorestsentsanalüüsi meetodit.

I.6.3.   Neutraliseerimine

Kogutud supernatandist eraldatakse rakud tsentrifuugimise teel (2 000–4 000 g) või filtrimisega läbi membraani (0,45 μm), mis seob vähe valke, ning supernatandist tehakse rakukultuurisöötmes lahjendused 1:100 ja 1:10 000.

Supernatandi vähemalt kahe lahjenduse alikvoot segatakse eraldi võrdse osa allpool loetletud reaktiividega ja segu inkubeeritakse 60 minutit 15 °C juures:

a)	ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud seerum, mis sisaldab rühmaspetsiifilist VHSi viiruse vastast antikeha;

b)	ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud seerum, mis sisaldab rühmaspetsiifilist IHNi viiruse vastast antikeha;

c)	ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud segu IPNi viiruse kohalike serotüüpide vastastest antiseerumitest;

d)	ainult sööde (positiivne kontroll).

Viirust sisaldava supernatandi ja seerumi iga seguga nakatatakse vähemalt kaks rakukultuuri igale kultuurile 50 μl segu lisamise teel ning kultuure inkubeeritakse 15 °C juures. Tsütopaatilise efekti ilmnemist kontrollitakse punktis I.5.4 kirjeldatud viisil.

Sellised VHSi viiruse tüved ja isolaadid, mis neutraliseerimiskatses antikehaga ei reageeri, tuvastatakse immunofluorestsentsanalüüsi või ELISA abil.

Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega neutraliseerimismeetodit.

I.6.4.   RT-PCR ja RT-qPCR

I.6.4.1.   Viiruse RNA eraldamine

Kõik toimingud RNA eraldamiseks tehakse jääl ja kinnastega.

RNA eraldamiseks kasutatakse fenooli ja kloroformiga ekstraheerimise meetodit või tsentrifuugitavat RNA afiinsuskolonni vastavalt tootja juhistele. Võib kasutada turul kättesaadavat RNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse kvaliteetne RNA, mida on võimalik kasutada allpool olevates punktides kirjeldatud RT-PCRi meetodite puhul.

Eraldatud RNA lahustatakse ribonukleaasivabas destilleeritud vees (täpsemalt 0,1 % dietüülpürokarbonaadiga töödeldud vees) või sobivas elueerimispuhvris.

I.6.4.2.   RT-PCR

IHNi viiruse tuvastamiseks kasutatakse järgmisi praimereid:

päripidine praimer: 5′-AGAGATCCCTACACCAGAGAC-3′;

äraspidine praimer: 5′-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAA-3′.

Kasutatakse järgmisi tsükleid (üheetapiline RT-PCR): 1 tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; 1 tsükkel: 2 minutit 95 °C juures; 30 tsüklit: 30 sekundit 95 °C juures, 30 sekundit 50 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; 1 tsükkel: 7 minutit 72 °C juures ja jahutamine temperatuurini 4 °C.

VHSi viiruse tuvastamiseks kasutatakse järgmisi praimereid:

päripidine praimer: 5′-ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG-3′;

äraspidine praimer: 5′-GCGGTGAAGTGCTGCAGTTCCC-3′.

Kasutatakse järgmisi tsükleid (üheetapiline RT-PCR): 30 minutit 50 °C juures; 15 minutit 95 °C juures; 35 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 68 °C juures. Seejärel inkubeeritakse reaktsioonisegu 7 minutit 68 °C juures.

RT-PCRi spetsiifilisuse ja reaktsioonisaaduse koguse hindamiseks kasutatakse geelelektroforeesi etiidiumbromiidi sisaldavas 1,5 % agaroosgeelis, mida analüüsitakse läbivas ultraviolettkiirguses. IHNi viiruse puhul võib täheldada 693 aluspaari (bp) pikkuse PCRi amplikoni esinemist. VHSi viiruse puhul on amplikoni pikkus 505 bp.

PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Seepärast tuleb mis tahes kahtluste ärahoidmiseks kasutada asjakohaseid positiivseid ja negatiivseid kontrolle ja amplikone. VHSi viiruse jaoks ette nähtud praimerite puhul tuleb BF-2 rakkude kasutamisel olla eriti ettevaatlik, sest need praimerid võivad seonduda selle rakuliini DNAga/RNAga ja anda sarnase pikkusega amplikonide tekkimise tõttu valepositiivseid tulemusi. BF-2 rakkude kultuurist saadud supernatandi analüüsimisel sekveneeritakse kõik PCRi käigus amplifitseeritud fragmendid.

I.6.4.3.   VHSi viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR

VHSi viiruse puhul kasutatakse amplifitseerimiseks järgmisi praimereid ja sondi:

päripidine praimer: 5′-AAACTCGCAGGATGTGTGCGTCC-3′;

äraspidine praimer: 5′-TCTGCGATCTCAGTCAGGATGAA-3′;

sond: 5′-FAM-TAGAGGGCCTTGGTGATCTTCTG-BHQ1-3′.

Üheetapiline RT-qPCR

Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Tsükleerimistingimused: 30 minutit 50 °C juures; 15 minutit 95 °C juures; 40 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures, 40 sekundit 60 °C juures ja 20 sekundit 72 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse. Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.

I.6.4.4.   IHNi viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR

IHNi viiruse puhul kasutatakse amplifitseerimiseks järgmisi praimereid ja sondi:

päripidine praimer: 5′-AGAGCCAAGGCACTGTGCG-3′;

äraspidine praimer: 5′-TTCTTTGCGGCTTGGTTGA-3′;

sond: 5′-6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB-3′.

Kaheetapiline RT-qPCR

Kuna allpool kirjeldatud meetod põhineb kaheetapilisel amplifitseerimisel, tuleb olla eriti hoolikas, et hoida ära saastumist katsutite käsitsemisel ühelt reaktsioonilt teisele üleminekul.

Tsükleerimistingimused (pärast RT-etappi): 2 minutit 50 °C juures; 10 minutit 95 °C juures; seejärel 40 tsüklit: 15 sekundit 95 °C juures ja 1 minut 60 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse.

Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.

II.   Üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord VHSi ja/või IHNi kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks haiguspuhangu kahtluse korral

Kui IHNi ja/või VHSi esinemise või puudumise kinnitamiseks on vaja teha direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohane laborianalüüs, mille puhul kasutatakse I lisa 1. osa punktis II.3 sätestatud diagnostikameetodeid, järgitakse järgmisi üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda:

a)	tavapärane viiruse eraldamine ja sellele järgnev viiruse immunokeemiline, molekulaarne või seerumiga neutraliseerimise teel tuvastamine;

b)	viiruse tuvastamine RT-PCRi või RT-qPCRi abil;

c)	muu diagnostikameetod, näiteks kaudne immunofluorestsentsanalüüs, ELISA, RT-PCR või immunohistokeemiline analüüs.

II.1.   Tavapärane viiruse eraldamine ja sellele järgnev viiruse tuvastamine

II.1.1.   Valimi moodustamine

Analüüsimiseks valitakse vähemalt 10 kala, kellel täheldatakse tüüpilisi IHNi või VHSi sümptomeid.

II.1.2.   Kaladelt võetud proovide ettevalmistamine ja proovide saatmine

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse proovide ettevalmistamisel ja saatmisel punktis I.2 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.3.   Täiendava diagnostilise materjali kogumine

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse täiendava diagnostilise materjali kogumisel punktis I.3 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.4.   Proovide ettevalmistamine rakukultuuris analüüsimiseks

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse rakukultuuris analüüsimiseks ette nähtud proovide ettevalmistamisel punktis I.4 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.5.   Viroloogiline analüüs rakukultuuris

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse viroloogilise analüüsi tegemisel punktis I.5 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.6.   Viiruse tuvastamine

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse viiruse tuvastamisel punktis I.6 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.   Viiruse tuvastamine RT-qPCRi abil

II.2.1.   Proovide võtmine

RT-qPCRi abil viiruse tuvastamise puhul järgitakse proovide võtmisel punktis I.1.2 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.2.   Kaladelt võetud proovide ettevalmistamine ja proovide saatmine

RT-qPCRi abil viiruse tuvastamise puhul järgitakse proovide ettevalmistamisel ja saatmisel punktis I.2 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.3.   Täiendava diagnostilise materjali kogumine

RT-qPCRi abil viiruse tuvastamise puhul järgitakse täiendava diagnostilise materjali kogumisel punktis I.3 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.4.   Proovide ettevalmistamine RT-qPCRi jaoks

RT-qPCRi abil viiruse tuvastamise puhul järgitakse proovide ettevalmistamisel punktis I.6.4.1 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.5.   RT-qPCR

Viiruse tuvastamisel RT-qPCRi abil järgitakse punktides I.6.4.1, I.6.4.3 ja I.6.4.4 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.3.   Muud diagnostikameetodid

Punktis I.4.3 kirjeldatud viisil saadud supernatanti võib kooskõlas punktidega I.6.1, I.6.2 ja I.6.4 kasutada vastavalt ELISA, kaudse immunofluorestsentsanalüüsi või RT-PCRi jaoks. Koematerjali puhul võib kasutada muid diagnostikameetodeid, näiteks külmutatud koe lõikude kaudset immunofluorestsentsanalüüsi või formaliinis fikseeritud koematerjali immunohistokeemilist analüüsi. Lisaks kõnealustele kiirmeetoditele tuleb 48 tunni jooksul pärast proovide võtmist teha viroloogiline analüüs kooskõlas II jao alapunktiga a või b, kui:

a)	saadakse negatiivne tulemus või

b)	saadakse positiivne tulemus materjaliga, mille puhul on tegu IHNi või VHSi esmajuhuga.

III.   Tiitrimismeetod rakukultuuride nakkusele vastuvõtlikkuse kontrollimiseks

Punktis I.5.3 osutatud tiitrimise puhul, millega kontrollitakse rakukultuuride vastuvõtlikkust nakkusele, järgitakse käesoleva jao allpool esitatud lõikudes sätestatud korda.

Kasutatakse vähemalt kahte VHSi viiruse isolaati ja ühte IHNi viiruse isolaati. Isolaadid peavad esindama peamisi Euroopa Liidus levinud viiruserühmi: VHSi viiruse puhul kasutatakse ühte vikerforellist eraldatud magevees levivat patogeenset isolaati ja ühte harilikust kammeljast eraldatud meres levivat patogeenset isolaati ning IHNi viiruse puhul ühte Euroopa Liidus vikerforellil esinevat patogeenset tüve. Kasutatakse liikmesriikides põhjalikult kirjeldatud isolaate. Viirusepartiisid kasvatatakse rakukultuuripudelites väikese passaažide arvuga rakukultuurides: VHSi viiruse puhul kasutatakse BF-2 või RTG-2 rakke ja IHNi viiruse puhul EPC või FHMi rakke. Kasutatakse rakukultuurisöödet, mille seerumisisaldus on vähemalt 10 %. Nakatamisel kasutatakse väikest nakatamiskordajat (MOI < 1).

Viiruse kogumiseks pärast täieulatusliku tsütopaatilise efekti ilmnemist tsentrifuugitakse rakukultuuri supernatanti 15 minutit 2 000 g juures, filtritakse see steriliseerimiseks läbi 0,45 μm suuruste pooridega membraanfiltri ja jaotatakse märgistatud krüokatsutitesse. Viirust säilitatakse – 80 °C juures.

Üks nädal pärast külmutamist sulatatakse külma vee all kolm iga viiruse paralleelproovi ja tiitritakse neid sobiva rakuliini kultuuris. Vähemalt iga kuue kuu järel või kui kahtlustatakse konkreetse rakuliini vastuvõtlikkuse vähenemist, sulatatakse iga viirusisolaat ja tiitritakse seda.

Tiitrimismeetodit tuleb üksikasjalikult kirjeldada ja iga kord tuleb kasutada sama meetodit.

Kui tiitrimine lõpp-punkti määramiseks toimub lahjendamise teel, kasutatakse igal lahjendusastmel vähemalt kuut paralleeli. Tiitreid võrreldakse varem saadud tiitritega. Kui kolmest viirusisolaadist ükskõik millise tiiter langeb algtiitriga võrreldes 2 suurusjärgu võrra või rohkem, ei kasutata asjaomast rakuliini enam seire tegemisel.

Kui laboris kasvatatakse eri rakuliine, analüüsitakse iga rakuliini eraldi.

Andmeid säilitatakse vähemalt 10 aastat.

2. OSA

KHV NAKKUSE SEIREKS JA NAKKUSE ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I.   KHV nakkuse kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks kasutatavad üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Kui KHV esinemise või puudumise kinnitamiseks on vaja teha direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohane laborianalüüs, mille puhul kasutatakse I lisa 2. osa III jaos sätestatud diagnostikameetodeid, järgitakse käesoleva osa punktides I.1–I.2 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

I.1.   Kaladelt proovide võtmine

Diagnostiliseks analüüsiks võib PCRil või qPCRil põhinevate tavapäraste meetoditega analüüsimiseks kasutada kas kalu (mis on saadetud elusana või surmatuna, aga sel juhul eraldi aseptilisse suletud nõusse pakitult) või külmutatud elundeid või elunditükke, mida säilitatakse 80 %lises kuni absoluutses etanoolis või viiruste transportimise söötmes (neid tuleb analüüsida 48 tunni jooksul pärast proovide kogumist).

KHV tuvastamiseks kogutakse lõpused ja neerud; peale selle võib eraldi proovina koguda põrna, peaaju ja soole. Ägeda haiguspuhangu korral võib koondada kuni viielt kalalt saadud koematerjali.

Peale selle võib teatud juhtudel kasutada proove, mille võtmiseks kalu ei surmata, näiteks verd, lõpusekaabet, lõpusebiopsiat või limakaabet (KHV esinemise kahtlus võib hõlmata väga väärtuslikke kalu).

I.1.1.   DNA eraldamine

DNA eraldamiseks kasutatakse standardmeetodit.

Võib kasutada turul kättesaadavat DNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse kvaliteetne DNA, mida on võimalik kasutada punktis I.2 osutatud PCRi meetodite puhul.

I.2.   Haigusetekitaja tuvastamine ja määramine polümeraasi ahelreaktsioonil (PCR) põhinevate meetoditega

I.2.1.   KHV tuvastamiseks kasutatav qPCR

KHV tuvastamiseks qPCRi abil kasutatakse järgmist qPCRi meetodit.

Päripidine praimer (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′;

äraspidine praimer (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′;

sond (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.

Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 15 minutit 95 °C juures; seejärel 40 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures ja 60 sekundit 60 °C juures. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega qPCRi meetodit.

I.2.2.   KHV tuvastamiseks kasutatav tavapärane PCR

Kasutatakse käesolevas punktis kirjeldatud meetodit, mille puhul sihtjärjestus on KHV tümidiini kinaasi (TK) geen. Kirjeldatud meetodi asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tundlikkuse ja spetsiifilisusega PCRi meetodit.

Päripidine praimer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTACGAG-3′;

äraspidine praimer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTATGC-3′.

Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 5 minutit 95 °C juures; seejärel 35 tsüklit: 30 sekundit 95 °C juures, 30 sekundit 52 °C juures ja 1 minut 72 °C juures; üks tsükkel: 10 minutit 72 °C juures. Saadava fragmendi eeldatav pikkus on 409 bp.

PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega PCRi meetodit.

Konkreetses piirkonnas esmajuhu tuvastamise korral tehakse tulemuste kinnitamiseks sekveneerimine või saadetakse proovid kalahaigustega tegelevasse direktiivi 2006/88/EÜ VI lisas osutatud riiklikku referentlaborisse või ELi referentlaborisse.

II.   KHV nakkuse seireks kasutatavad üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Proovivõtmisel ja laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 2. osa II või III jaos sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 2. osa I jao kohaseks KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks või säilitamiseks järgmisi käesoleva osa punktides II.1 ja II.2 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.   Kaladelt proovide võtmine

Võimaluse korral tuleks proovid võtta kaladelt, keda on pikemat aega – kaks kuni kolm nädalat – hoitud viirusega nakatumist võimaldavas temperatuurivahemikus 15–26 °C. KHV tuvastamise tõenäosuse suurendamiseks kogutakse proovid võimaluse korral 24 tundi, kuid mitte hiljem kui 72 tundi pärast käitlemistoimingut, millega võib kaasneda viiruse taasaktiveerumine viirusekandja staatusega kalades, näiteks pärast võrguga väljapüüdmist või transporti.

KHV nakkuse seireks võib PCRil põhinevate meetoditega analüüsimiseks kasutada kas kalu (mis on saadetud elusana või surmatuna, aga sel juhul eraldi aseptilisse suletud nõusse pakitult) või külmutatud elundeid või elunditükke, mida säilitatakse 80–100 % alkoholis või viiruste transportimise söötmes (neid tuleb analüüsida 48 tunni jooksul pärast proovide kogumist). KHV nakkuse seireks kogutakse lõpuse- ja neerukude.

KHV nakkuse seire puhul hoidutakse võimaluse korral proovide koondamisest. Kui koondproovi moodustamine on vajalik, võib ühte koondada kuni kahelt kalalt saadud koematerjali. Suuremad proovid homogeniseeritakse uhmri ja nuia või stomahheri abil ning enne homogenaadi selgimist võetakse neist osaproovid DNA eraldamiseks. Teise võimalusena võib osaproovina koguda iga proovis sisalduva koe ja panna selle lüüsimiseks ette nähtud katsutisse.

II.1.1.   DNA eraldamine

DNA eraldamiseks kasutatakse standardmeetodit. Võib kasutada turul kättesaadavat DNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse kvaliteetne DNA, mida on võimalik kasutada punktis II.2 sätestatud PCRi meetodite puhul.

Vastuvõetav koe massi ja söötme mahu suhe on 1:9. Analüüsiks võetakse 20–25 mg koematerjali.

II.2.   KHV nakkuse seire PCRil põhinevate meetoditega

KHV nakkuse seireks kasutatakse qPCRi. Kui piirkonnas, kus varem ei ole saadud nakkust kinnitavat positiivset tulemust, leitakse positiivne proov, kinnitatakse katsetulemusi ühel viisil järgmistest:

a)	proovist amplifitseeritud PCRi või mitmeetapilise PCRi saadus sekveneeritakse. Saadud lõplik konsensusjärjestus peab kattuma olemasolevate võrdlusjärjestustega vähemalt 98 % ulatuses;

b)	proov saadetakse tulemuste kinnitamiseks riiklikku referentlaborisse.

II.2.1.   KHV tuvastamiseks kasutatav qPCR

Kasutatakse järgmist qPCRi meetodit.

Päripidine praimer (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′;

äraspidine praimer (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′;

sond (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.

Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 15 minutit 95 °C juures; seejärel 50 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures ja 60 sekundit 60 °C juures.

Kõnealuse qPCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega qPCRi meetodit.

II.2.2.   KHV tuvastamiseks kasutatav tavapärane PCR

KHV nakkuse kinnitamiseks kasutatakse allpool tabelis 2.1 kirjeldatud üldkasutatavat mitmeetapilist PCRi ja sellele järgnevat amplifitseeritud fragmendi sekveneerimist.

Tabel 2.1

Karpkalalaste kõikide herpesviiruste (CyHV-1, CyHV-2 ja CyHV-3) tuvastamiseks ette nähtud mitmeetapilise PCRi puhul kasutatavad praimerid ja tingimused

Praimeri nimi	Järjestus	Tsükleerimistingimused	Amplikoni pikkus
CyHVpol-päripidine	5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′	PCRi esimene etapp 1 tsükkel: 2 minutit 95 °C juures 40 tsüklit:   30 sekundit 95 °C juures   30 sekundit 55 °C juures   45 sekundit 72 °C juures 1 tsükkel: 10 minutit 72 °C juures	362 bp
CyHVpol-äraspidine	5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′
CyHVpol-sisemine-päripidine	5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′	PCRi teine etapp 1 tsükkel: 2 minutit 95 °C juures 40 tsüklit:   30 sekundit 95 °C juures   30 sekundit 55 °C juures   45 sekundit 72 °C juures 1 tsükkel: 10 minutit 72 °C juures	339 bp
CyHVpol-sisemine-äraspidine	5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega PCRi meetodit.

Sekveneerimine võib toimuda asjaomases laboris või sekveneerimisele spetsialiseerunud välises ettevõttes. Sekveneerimistulemuste analüüsimiseks võrreldakse saadud järjestusi teadaolevate KHV võrdlusjärjestustega, mis vastavad GenBanki registreerimisnumbritele AP008984, DQ657948 ja DQ177346. Saadud lõplik konsensusjärjestus peab kattuma kõnealuste võrdlusjärjestustega vähemalt 98 % ulatuses.

3. OSA

LÕHEDE INFEKTSIOOSSE ANEEMIA (ISA) SEIREKS JA SELLE TAUDI ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I.   ISA seireks ja tõrjeks kasutatavad proovivõtumeetodid

Proovide võtmisel ja laborianalüüside tegemisel I lisa 3. osas sätestatud seire- ja likvideerimisprogrammide kohaldamiseks või selleks, et kinnitada direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaselt ISA esinemist või puudumist, järgitakse käesoleva jao punktides I.1, I.2 ja I.3 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

I.1.   Kaladelt proovide võtmine

ISA esinemise kontrollimiseks tehtava laborianalüüsi jaoks võetavaid kalaproove võimaluse korral ühte ei koondata. ISA seire puhul on siiski vastuvõetav 2–5 kala proovide koondamine.

Kõikidelt proovivõtmiseks valitud kaladelt võetakse proovid pöördtranskriptsiooniga polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) abil analüüsimiseks. Kalalt eemaldatakse steriilse instrumendiga neeru keskosa tükk ja pannakse mikrokatsutisse, mis sisaldab 1 ml tõendatud tõhususega RNA säilituslahust. Ühte transpordilahusega katsutisse võib koguda kuni viielt kalalt võetud koed, mis moodustavad ühe koondproovi. Koematerjali kaal ühes proovis peab olema 0,5 g. Kui kalad on vajaliku kaaluga proovi saamiseks liiga väikesed, võib proovi kaalu viimiseks 0,5 grammini eemaldada kalalt neeru, südame, põrna, maksa või umbsoole tükid nimetatud eelistusjärjekorras.

Histoloogiliseks analüüsiks kasutatav kude võetakse üksnes äsja surmatud tavapärase välimusega kaladelt, kellel täheldatakse ISA esinemisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid. Proov võetakse kõikidest välistest ja sisemistest kahjustatud kudedest ning igalt kalalt võetakse skalpelli abil eraldi proov neeru keskosast, südamest, maksast, kõhunäärmest, soolestikust, lõpustest ja põrnast ning pannakse 8–10 mahuprotsenti formaldehüüdi sisaldavasse puhverdatud soolalahusesse. Kudede rahuldava säilimise tagamiseks peab fikseerimislahuse ja koematerjali suhe olema vähemalt 20:1. Immunohistokeemiliseks analüüsiks võetakse proov neeru keskosast ja südamest.

Kõikidelt proovivõtmiseks valitud kaladelt võetakse koed viroloogiliseks analüüsiks rakukultuuris. Kalalt eemaldatakse steriilse instrumendiga maksa, neeru esi- või keskosa, südame ja põrna tükid ning pannakse plastkatsutisse, mis sisaldab 9 ml transpordisöödet. Ühte transpordilahusega katsutisse võib koguda kuni viielt kalalt võetud koed, mis moodustavad ühe koondproovi. Koematerjali kaal ühes proovis peab olema 1,0 ± 0,5 g.

I.2.   Kaladelt võetud proovide saatmine

Laborisse võib saata terveid kalu, kui transpordi ajal on võimalik järgida käesoleva punkti kolmandas lõigus kirjeldatud temperatuurinõudeid. Terved kalad mähitakse imavasse paberisse ning saadetakse teele plastkotis ja nimetatud lõigu kohaselt jahutatuna.

Võib saata ka elusaid kalu, kuid üksnes kalahaiguste riikliku referentlabori järelevalve all ja juhul, kui võetakse arvesse elusate kalade transportimisega seotud täiendavaid desinfitseerimise ja bioturvalisuse küsimusi.

Vereproovid ja viroloogiliseks analüüsiks või RT-PCRi abil analüüsimiseks ette nähtud kalakudesid sisaldavad katsutid pannakse soojusisolatsiooniga konteinerisse, näiteks paksuseinalisse polüstüreenkasti koos piisava koguse jää või piisava arvu jahutusplokkidega, et tagada laborisse transportimise ajal proovi püsimine jahutatuna. Tuleb vältida proovi külmumist ning saadetise vastuvõtmise ajal peab transpordikastis veel jääd olema või peab vähemalt üks jahutusplokk olema vähemalt osaliselt külmunud. Erandjuhul võib RT-PCRi jaoks või viroloogiliseks analüüsiks ette nähtud proovi kiirkülmutada ja transportida selle laborisse – 20 °C juures või madalamal temperatuuril.

Lahuses RNAlater säilitatavate kudede analüüsimisel RT-PCRi abil toimub RNA eraldamine proovide säilitustemperatuurist olenevalt järgmise ajavahemiku jooksul:

37 °C juures säilitatavad proovid: ühe päeva jooksul;

25 °C juures säilitatavad proovid: ühe nädala jooksul;

4 °C juures säilitatavad proovid: ühe kuu jooksul;

– 20 °C juures säilitatavad proovid: mis tahes ajal.

Kui kalakudesid transporditakse histoloogilise analüüsi jaoks fikseerimislahuses, kasutatakse nende saatmiseks lekkekindlat katsutit, mis paigutatakse löögikindlasse konteinerisse. Tuleb ära hoida selliste proovide külmumist.

Viroloogilist analüüsi rakukultuuris alustatakse niipea kui võimalik ning hiljemalt 48 tundi pärast proovide kogumist. Erandjuhul võib viroloogilist analüüsi alustada hiljemalt 72 tundi pärast materjali kogumist, kui uuritavat materjali kaitseb transpordisööde ja transpordi ajal on võimalik järgida asjaomaseid temperatuurinõudeid.

I.3.   Täiendava diagnostilise materjali kogumine

Asjaomase diagnostikalabori heakskiidul võib täiendavateks uuringuteks koguda ja ette valmistada ka punktis I.1 nimetamata kalakudesid.

II.   ISA kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks ja ISA seireks kasutatavad üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 3. osa II jaos sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 1. osa I jao kohaseks ISA suhtes teatud kindla staatuse saamiseks või säilitamiseks ja direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaseks ISA kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks järgmisi allpool punktides II.1–II.5 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.   Proovide analüüsimine RT-PCRi abil

ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav diagnostikameetod on RT-qPCR. Kuna RT-qPCRi tulemused võivad kasutatud reaktsioonitingimustest sõltuvalt varieeruda, kasutatakse mis tahes kahtluste ärahoidmiseks sobivaid positiivseid ja negatiivseid kontrolle ja amplikone.

II.1.1.   Kogu RNA eraldamine

Kõik toimingud RNA eraldamiseks tehakse jääl ja kinnastega.

Kogu RNA eraldamiseks kasutatakse fenooli ja kloroformiga ekstraheerimise meetodit või tsentrifuugitavat RNA afiinsuskolonni vastavalt tootja juhistele.

Eraldatud RNA lahustatakse ribonukleaasivabas destilleeritud vees (täpsemalt 0,1 % dietüülpürokarbonaadiga töödeldud vees).

Eraldatud RNA kontsentratsiooni ja puhtuse hindamiseks kasutatakse optilise tiheduse mõõtmist lainepikkustel 260 ja 280 nm. Teise võimalusena võib kasutada viiruse genoomis leiduvale sihtjärjestusele vastavat sisemist kontrolli, nagu on märgitud punktis II.1.3.

II.1.2.   ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-PCR

ISA viiruse genoomi amplifitseerimiseks võib kasutada mitut RT-PCRi meetodit. Võib kasutada kaheetapilist RT-PCRi, mille puhul RT ja PCRi etapid viiakse läbi kahes eri katsutis. Võib järgida ka üheetapilist meetodit, mille puhul kõnealused kaks reaktsiooni viiakse läbi samas katsutis. Võimaluse korral kasutatakse üheetapilist meetodit, sest katse läbiviimisega ühes katsutis vähendatakse ristsaastumise ohtu, kuna katsuti sisu ei pea teise katsutisse üle viima, ning selle meetodi tundlikkust peetakse võrdseks kaheetapilise meetodi tundlikkusega.

Kasutatakse käesolevas punktis kirjeldatud meetodit ning praimeritest ILA1 ja ILA2 koosnevat praimeripaari, mille sihtjärjestus asub 8. segmendis ja mis on leitud olevat sobiv ISA viiruse tuvastamiseks taudipuhangute ja viirusekandjate kalade puhul. Äraspidine praimer ILA2 ei seondu Põhja-Ameerikas esinevate isolaatidega ning sellisel juhul kasutatakse mõnda muud praimeripaari.

Päripidine praimer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

äraspidine praimer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 94 °C juures; 40 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; üks tsükkel: 5 minutit 72 °C juures. Fragmendi pikkus on 155 bp.

PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi meetodit.

II.1.3.   ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR

RT-qPCRi kasutamine võib suurendada spetsiifilisust ja suurendab tõenäoliselt ka tundlikkust. See meetod võimaldab saada tulemused kiiremini, kuna elektroforeesietapp ei ole vajalik, samuti väheneb ristsaastumise oht, sest viiruse genoomse RNA kogust on võimalik hinnata proovi sisaldavas katsutis. RT-qPCRi meetodi ühe puudusena ei ole sageli võimalik amplifitseeritud fragmenti sekveneerida. Kui tekib kahtlus fragmendi amplifitseerimise spetsiifilisuse suhtes, tuleb tulemuste kontrollimiseks viia läbi mõni muu ISA viiruse spetsiifilise tuvastamise katse.

Kasutatakse käesolevas punktis kirjeldatud meetodit, mille puhul sihtjärjestus asub 8. segmendis. Kõnealuse meetodiga tuvastatakse Euroopa Liidus, Euroopa Vabakaubanduse Assotsiatsiooni liikmesriikides ja Põhja-Ameerikas esinevaid isolaate. Võimaluse korral kasutatakse üheetapilist meetodit, kuna ühes katsutis toimuva katse puhul on ristsaastumise oht minimeeritud.

Päripidine praimer: 5′-CTACACAGCAGGATGCAGATGT-3′;

äraspidine praimer: 5′-CAGGATGCCGGAAGTCGAT-3′;

sond: 5′-FAM-CATCGTCGCTGCAGTTC-MGBNFQ-3′.

Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 95 °C juures; 40 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures ja 60 sekundit 60 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse. Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.

II.1.4.   PCRi amplifitseerimissaaduste sekveneerimine

Päripidine praimer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA-3′;

äraspidine praimer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA-3′.

Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Tsükleerimistingimused (üheetapiline RT-PCR): üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 94 °C juures; 40 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; üks tsükkel: 5 minutit 72 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse. Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.

Teise võimalusena võib kasutada järgmist meetodit 6. segmendis paikneva HPRi sekveneerimiseks:

päripidine praimer: 5′-GACCAGACAAGCTTAGGTAACACAGA-3′;

äraspidine praimer: 5′-GATGGTGGAATTCTACCTCTAGACTTGTA-3′.

Fragmendi pikkus: variandi HPR0 puhul 304 nukleotiidi.

Käesolevas punktis kirjeldatud meetodi asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tundlikkuse ja spetsiifilisusega RT-PCRi meetodit.

RT-PCRi amplifitseerimissaaduse puhtust kontrollitakse enne sekveneerimist geelelektroforeesi teel. Üheainsa puhta fragmendi esinemise korral puhastatakse see otse PCRi segust. Mitme amplifitseeritud fragmendi olemasolu korral puhastatakse huvipakkuv fragment geelelektroforeesi abil. PCRi fragmentide puhastamiseks lahusest või agaroosgeelist kasutatakse tsentrifuugitavaid PCRi fragmentide afiinsuskolonne vastavalt tootja juhistele.

Sekveneerimiseks kasutatakse amplifitseerimispraimereid ja see toimub sekveneerimisele spetsialiseerunud välises ettevõttes. Sekveneerimistulemusi analüüsitakse programmi BLAST abil ja nukleotiidijärjestusi võrreldakse USA riikliku biotehnoloogiateabe keskuse (NCBI) nukleotiidijärjestuste andmebaasis olevate teiste teadaolevate järjestustega.

Sekveneerimistulemus peab olema selline, mille puhul ei jää mingit kahtlust RT-PCRi saaduse amplifitseerimise spetsiifilisuse suhtes.

II.2.   ISA viiruse eraldamine rakukultuuris kasutamiseks

II.2.1.   Proovide ettevalmistamine

Koematerjali võib säilitada – 80 °C juures. See külmutatakse ja sulatatakse enne analüüsimist vaid korra. Seire ja tõrje tegemisel viiakse analüüs läbi nii kiiresti kui võimalik.

Iga proov (kudede koondproov transpordisöötmes) homogeniseeritakse valideeritud homogenisaatoriga täielikult, proovi tsentrifuugitakse 15 minutit 2 000–4 000 g juures temperatuuril 0–6 °C, supernatant filtritakse (0,45 μm) ja seda inkubeeritakse võrdse osa IPNi viiruse kohalike serotüüpide vastaste antiseerumite sobivalt lahjendatud koondprooviga. Antiseerumi tiiter peab 50 % plaagide neutraliseerimise katse kohaselt olema vähemalt 1/2 000. Segu inkubeeritakse üks tund 15 °C juures. Saadakse inokulum.

Mõnes Euroopa osas 50 % kalaproovides esineva IPNi viiruse vastase antiseerumiga töödeldakse kõiki inokulume selleks, et hoida ära IPNi viirusest põhjustatud tsütopaatilise efekti ilmnemist inokulumiga nakatatud rakukultuurides. Kõnealuse töötluse võib läbi viia selleks, et lühendada viroloogilise analüüsi kestust ja vähendada nende juhtude arvu, mille puhul tsütopaatilise efekti ilmnemist tuleb pidada ISA viiruse võimaliku esinemise märgiks. Kui proovid on pärit tootmisüksusest, mida peetakse IPNi-vabaks, võib inokulumide töötlemise IPNi viiruse vastase antiseerumiga ära jätta.

II.2.2.   Rakukultuuride nakatamine

ISA viiruse algseks eraldamiseks kasutatakse atlandi lõhe neeru (ASK) rakke. Võib kasutada ka muid rakuliine, mille puhul ISA viiruse eraldamise tõhusus ja rakuliini tundlikkus on tõendatud; seejuures võetakse arvesse tüvede varieeruvust ja eri tüvede võimet eri rakuliinides paljuneda. Näib, et ASK rakud võimaldavad eraldada ja kasvatada praeguseks teada olevaid viirusisolaate, juhul kui kasutatakse väikese passaažide arvuga kultuuri. ASK rakkude puhul võib tsütopaatiline efekt väljenduda selgemini kui muude vastuvõtlike rakuliinide, näiteks SHK-1 (Salmon head kidney-1) puhul.

ASK rakke (passaažide arv kuni 65) kasvatatakse mitmekannulisel plaadil söötmes L-15, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, 2 mahuprotsenti 200 mM L-glutamiini ja 0,08 mahuprotsenti 50 mM 2-merkaptoetanooli. Noor aktiivselt kasvav rakukultuur nakatatakse antiseerumiga töödeldud elundisuspensiooniga nii, et koematerjali lõpplahjendus rakukultuurisöötmes oleks 1:1 000. Iga elundisuspensiooni puhul lisatakse ühte kannu, mis sisaldab 2 ml rakukultuurisöödet, 40 μl inokulumi. Ristsaastumise ohu minimeerimiseks kasutatakse kalakasvanduse eri kohtadest pärit proovide jaoks eri 12- või 24-kannulisi plaate.

Üks negatiivse kontrollina kasutatav plaat jäetakse nakatamata. Üks positiivse kontrollina kasutatav eraldi plaat nakatatakse ISA viiruse võrdlusisolaadiga järgmiselt. Esimesse kannu lisatakse 100 μl ISA viiruse põhilahust, mille tiiter on vähemalt 107 TCID50 (viiruse hulk, mille puhul tsütopaatilise efekti ulatus nakatatud koekultuuris on 50 %) milliliitri kohta, ning segatakse söötmega. Osa saadud segust viiakse esimesest kannust teise nii, et saadakse lahjendus 1:10, ning segatakse söötmega. Seda toimingut korratakse kogu plaadi ulatuses, et saada kuus 10-kordset lahjendust. ISA viiruse põhilahust võib säilitada – 80 °C juures vähemalt kaks aastat, kuid pärast sulatamist tuleb see kolme päeva jooksul ära kasutada. Tuleb olla ettevaatlik, et hoida ära proovi sisaldavate plaatide ristsaastumist positiivse kontrolli materjaliga. Sellise ohu ärahoidmiseks toimub positiivse kontrolli ettevalmistamine ja käsitsemine proovi sisaldavatest plaatidest eraldi. Iga nakatamise puhul positiivse kontrolli kasutamise asemel võib iga kuue kuu järel määrata ASK rakkude tundlikkuse ISA viiruse isolaatide suhtes.

Proovi inkubeeritakse kuni 15 päeva temperatuuril 15 ± 2 °C. Rakukultuuri analüüsitakse tsütopaatilise efekti esinemise suhtes mikroskoobi abil kaks korda: ajavahemikul 5–7 ja 12–14 päeva pärast nakatamist. Kui ükskõik millise koondproovi puhul täheldatakse tsütopaatilist efekti, alustatakse viivitamata punkti II.2.4 kohast viiruse tuvastamist. Kui tsütopaatilist efekti ei ole 14 päeva jooksul ilmnenud, viiakse läbi kaudne immunofluorestsentsanalüüs, hemadsorptsioonanalüüs või RT-PCR.

II.2.3.   Subkultuuride loomine

Subkultuuri loomine toimub 13.–15. päeval. Rakukultuuri supernatant lisatakse mitmekannulisel plaadil aktiivselt kasvavat värsket rakukultuuri sisaldavasse kannu, et saada sobiv lahjendus (1:10), ning plaati inkubeeritakse kuni 18 päeva temperatuuril 14 ± 2 °C. Rakukultuuri analüüsitakse tsütopaatilise efekti esinemise suhtes mikroskoobi abil kaks korda: ajavahemikul 5–7 ja 14–18 päeva pärast nakatamist. Kui ükskõik millise koondproovi puhul täheldatakse tsütopaatilist efekti, alustatakse viivitamata punkti II.2.4 kohast viiruse tuvastamist. Kui tsütopaatilist efekti ei ole 14–18 päeva jooksul ilmnenud, viiakse läbi hemadsorptsioonanalüüs või RT-PCR.

Kui tsütotoksilisus ilmneb inkubeerimise esimese seitsme päeva jooksul, luuakse subkultuur juba sel ajal ning rakke inkubeeritakse 14–18 päeva ja pärast seda luuakse uus subkultuur, mida inkubeeritakse veel 14–18 päeva. Kui tsütotoksilisus ilmneb pärast seitsme päeva möödumist, luuakse subkultuur ühel korral ja rakke inkubeeritakse esimesest nakatamisest alates kokku 28–36 päeva.

Kui primaarkultuur saastub bakteritega, alustatakse katset – 80 °C juures säilitatava koehomogenaadiga uuesti. Enne nakatamist tsentrifuugitakse koehomogenaati 15–30 minutit 4 000 g juures temperatuuril 0–6 °C ja supernatant filtritakse läbi 0,22 μm suuruste pooridega filtri. Kui bakteriaalne saastus ilmneb subkultuuri kasvatamise ajal, filtritakse supernatant läbi 0,22 μm suuruste pooridega filtri ja sellega nakatatakse värsket rakukultuuri, mida inkubeeritakse veel 14–18 päeva.

II.2.4.   Viiruse tuvastamise meetodid

Kui mis tahes etapis täheldatakse tsütopaatilist efekti või hemadsorptsioonanalüüsi tulemus on positiivne, viiakse läbi viiruse tuvastamine. ISA viiruse tuvastamiseks sobivad meetodid on punkti II.1 kohane RT-PCR ja punkti II.2.6 kohane immunofluorestsentsanalüüs. Kui kahtlustatakse muude viiruste esinemist, viiakse läbi täiendavad viiruse tuvastamise katsed. Kui kõnealuste meetoditega ei ole ühe nädala jooksul suudetud viirust kindlalt tuvastada, saadetakse supernatant viiruse koheseks tuvastamiseks:

a)	Maailma Loomatervise Organisatsiooni ISA referentlaborisse või

b)	kalahaigustega tegelevasse direktiivi 2006/88/EÜ VI lisas osutatud riiklikku referentlaborisse või ELi referentlaborisse.

II.2.5.   Hemadsorptsioonanalüüs

Kuna ISA viiruse paljunemisega rakukultuuris ei kaasne alati tsütopaatilist efekti, viiakse iga kannu puhul läbi RT-PCR, käesoleva punkti kohane hemadsorptsioonanalüüs või punkti II.2.6 kohane immunofluorestsentsanalüüs.

Kõikidest kannudest, sealhulgas positiivse ja negatiivse kontrolliga kannust eemaldatakse rakukultuurisööde ja viiakse märgistatud steriilsesse katsutisse. Igasse kannu lisatakse 500 μl 0,2 mahuprotsendilist küüliku või hobuse pestud erütrotsüütide suspensiooni või 0,05 mahuprotsendilist vikerforelli või atlandi lõhe pestud erütrotsüütide suspensiooni ja plaati inkubeeritakse 45 minutit toatemperatuuril. Erütrotsüüdid eemaldatakse ja iga kannu pestakse kaks korda söötmega L-15. Iga kannu analüüsitakse mikroskoobi all.

ASK rakkude pinnale kinnitunud erütrotsüütide kogumite olemasolu annab märku eeldatavast ortomüksoviirusega nakatumisest. Kui hemadsorptsioonanalüüsi tulemus on positiivne, alustatakse viivitamata punkti II.2.4 kohast viiruse tuvastamist.

II.2.6.   Immunofluorestsentsanalüüs

ASK rakke (passaažide arv kuni 65) kasvatatakse mitmekannulisel plaadil söötmes L-15, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, 2 mahuprotsenti 200 mM L-glutamiini ja 0,08 mahuprotsenti 50 mM 2-merkaptoetanooli, ning nende kasutamisel peab rakukiht olema enam kui 50 % ulatuses konfluentne. Võib kasutada ka mõnda muud tõendatud tõhususega rakuliini või söödet. Kahte kannu lisatakse kummassegi 225 μl eeldatavalt viirusega nakatunud kultuuri supernatanti, segatakse söötmega ja saadud segust viiakse 225 μl järgmisse kahte kannu, et saada 1:5 lahjendus. Kaks järgmist kannu jäetakse nakatamata ja neid kasutatakse kontrollina. Kalakasvanduse eri kohtadest pärit proove ja viirusega kontrolli käsitsetakse eri plaatidel. Viirusega kontrollis kasutatakse ISA viiruse võrdlusisolaati.

Plaate inkubeeritakse temperatuuril 14 ± 2 °C ja analüüsitakse mikroskoobi all kuni 7 päeva jooksul. Kui täheldatakse varajast tsütopaatilist efekti või kui tsütopaatilist efekti ei täheldata seitsme päeva jooksul, järgneb rakkude fikseerimine. Kanne pestakse fosfaadiga puhverdatud soolalahusega (PBS) ja rakkude fikseerimiseks inkubeeritakse neid 80 % atsetoonis 20 minutit toatemperatuuril. Plaadil lastakse õhu käes kuivada ja rakud värvitakse kohe või pärast kuni 24 tunni pikkust seismist 0–6 °C juures.

Paralleelkannude rakkude värvimiseks lisatakse ISA viiruse vastaste monoklonaalsete antikehade 3H6F8 ja 1OC9F5 segu või mõni muu tõendatud tõhususe ja spetsiifilisusega monoklonaalne antikeha, mis on lahjendatud PBSis, ning plaati inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 37 ± 4 °C. Monoklonaalne antikeha eemaldatakse ja plaati pestakse kolm korda PBSiga, mis sisaldab 0,05 % Tween 20. Igasse kannu lisatakse hiire IgG vastane PBSis lahjendatud fluorestseiinisotiotsüanaadiga (FITC) konjugeeritud antikeha ja plaati inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 37 ± 4 °C. Monoklonaalse antikeha ja FITCga konjugeeritud antikeha eri partiide optimaalne lahjendus määratakse igas laboris eraldi kindlaks. Antikeha eemaldatakse ja plaati pestakse kolm korda PBSiga, mis sisaldab 0,05 % Tween 20.

Kanne kontrollitakse viivitamata fluorestsentsanalüüsi võimaldava invertmikroskoobi all, mis on varustatud FITCi ergastamiseks sobiva filtriga. Fluorestseeruvate rakkude esinemise korral loetakse analüüsi tulemus positiivseks. Analüüsi tulemus on kehtiv, kui positiivsed kontrollid on positiivsed ja negatiivsed kontrollid on negatiivsed.

II.3.   Muude kudede analüüs

Punktis II.2.6 osutatud meetodit võib kohaldada muude kalakudede, näiteks maksa, põrna ja südame puhul, kui katteklaasile on võimalik kanda piisav kogus endoteelirakke, leukotsüüte või lümfotsüüte. Värvimismeetod on kõikide kudede puhul sama, ehkki mõne koe puhul võib olla soovitatav propiidiumjodiidiga värvimine ära jätta ja kasutada koejäljendis esindatud rakutüüpide kindlaksmääramiseks faasikontrasti meetodit.

II.4.   Histoloogiline analüüs

Koematerjalist lõigatakse 5 μm paksused parafiinlõigud ning värvitakse need hematoksüliini ja eosiiniga.

Kliiniliste haigustunnustega atlandi lõhel täheldatavad histoloogilised muutused varieeruvad, kuid võivad hõlmata järgmist:

a)	suur arv erütrotsüüte venoosses kesksiinuses ja lõpuseliistakute kapillaarides, kus võivad tekkida ka erütrotsüütide trombid;

b)	maksas esinevad suurematest veresoontest eemale jäävad multifokaalsed või kokkuvalgunud täppverevalumid ja/või hepatotsüütide nekroos; erütrotsüütide multifokaalne kogum laienenud maksasinusoidides;

c)	erütrotsüütide kogunemine soole limaskesta päriskihi veresoontes ja sellele järgnev limaskesta päriskihi hemorraagia;

d)	põrna strooma laienemine erütrotsüütide kogunemise tõttu;

e)	kerge multifokaalne kuni ulatuslik difuusne interstitsiaalne verejooks koos tubulaarse nekroosiga hemorraagilises piirkonnas, erütrotsüütide kogunemine neerupäsmakestes;

f)	erütrotsüütide fagotsüteerimine põrnas ning sekundaarne verejooks maksas ja neerus.

II.5.   Immunohistokeemiline analüüs

Formaliinis fikseeritud koe parafiinlõike analüüsitakse ISA viiruse nukleoproteiini vastase polüklonaalse antikeha abil. Uuritavad elundid on neeru keskosa ja süda (kõiki kolme kambrit ja kõiki klappe hõlmav piirkond). Haigustunnustel põhineva taudikahtluse korral tehakse immunohistokeemiline analüüs, mille positiivne tulemus kinnitab taudi esinemist. Histoloogilised koelõigud valmistatakse standardmeetodil.

1)

Koelõikude valmistamine Koe fikseerimiseks standardmeetodil hoitakse seda vähemalt üks päev neutraalses fosfaadiga puhverdatud 10 % formaliinilahuses, veetustatakse reas eri kontsentratsiooniga etanoolilahustes, pestakse ksüleenis ja sulundatakse parafiini. Koelõike paksusega umbes 5 μm (paigutatud immunohistokeemiliseks analüüsiks polü-L-lüsiiniga kaetud alusklaasile) kuumutatakse 20 minutit 56–58 °C (maksimaalselt 60 °C) juures, lõigud deparafiinitakse ksüleenis, rehüdreeritakse reas eri kontsentratsiooniga etanoolilahustes ning värvitakse patomorfoloogilise ja immunohistokeemilise analüüsi tegemiseks hematoksüliini ja eosiiniga vastavalt jaotisele 2.

2)

Värvimine immunohistokeemiliseks analüüsiks Kui käesolevas rakendusotsuses ei ole ette nähtud teisiti, tehakse kõik inkubeerimised toatemperatuuril plaatloksutil: a) antigeeni kättesaadavaks tegemiseks keedetakse lõike 2 × 6 minutit 0,1 M tsitraatpuhvris, mille pH on 6,0, ning inkubeeritakse blokeerimiseks 20 minutit 50 mM TBSis (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6), mis sisaldab 5 % rasvata piimapulbrit ja 2 % kitseseerumit; b) seejärel inkubeeritakse lõike öö läbi primaarse antikehaga (ISA viiruse nukleoproteiini vastane monospetsiifiline küüliku antikeha), mis on lahjendatud 1 % rasvata piimapulbrit sisaldavas TBSis, ning lõike pestakse kolm korda TBSis, mis sisaldab 0,1 % Tween 20; c) seondunud antikeha tuvastamiseks inkubeeritakse lõike 60 minutit küüliku IgG vastase antikehaga, mis on konjugeeritud aluselise fosfataasiga. Pärast viimast pesu lisatakse 0,1 M TBSis (pH 8,2) lahjendatud Fast Red (1 mg/ml), naftool-AS-MX-fosfaat (0,2 mg/ml) ja levamisool (1 mM) ning lõike inkubeeritakse 20 minutit. Seejärel pestakse lõike kraaniveega, tehakse kontrastvärvimine Harrise hematoksüliiniga ja lõigud kaetakse veepõhise kattevedelikuga. Iga analüüsi puhul kasutatakse ka ISA viiruse suhtes positiivseid ja ISA viiruse suhtes negatiivseid koelõike.

3)

Immunohistokeemilise analüüsi tulemuste tõlgendamine Immunohistokeemilise analüüsi tulemusi tõlgendatakse alapunktides a ja b sätestatud viisil: a) kontroll-lõik loetakse positiivseks, kui selles on endokardi veresoonte endoteelirakkude tsütoplasma ja tuum selgesti nähtavalt punaseks (punakaks) värvunud. Uuritav koeproov loetakse positiivseks üksnes juhul, kui selline tuumasisene värvumine on endoteelirakkudes selgesti nähtav; b) kontroll-lõik loetakse negatiivseks, kui see ei ole märkimisväärselt värvunud. Kuna kõnealusele ortomüksoviirusele on replikatsioonietapis iseloomulik viiruse nukleoproteiini paiknemine tuumas, ent sageli on domineeriv tsütoplasma samaaegne värvumine, loetakse tsütoplasma ja muude rakuosade värvumist ilma tuumasisese värvumiseta mittespetsiifiliseks või ebaveenvaks. Kõige tugevamat positiivset värvusreaktsiooni täheldatakse tavaliselt südame ja neeru endoteelirakkudes. Väga ulatuslike hemorraagiliste kahjustuste puhul võib endoteel nõrgalt või üldse mitte värvuda, ilmselt seetõttu, et nakatunud endoteelirakud on lüüsunud.

4. OSA

MARTEILIA REFRINGENS'I NAKKUSE SEIREKS JA NAKKUSE ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I.    Marteilia refringens'i nakkuse üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Proovivõtmisel ja laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 4. osa II jaos sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 4. osa I jao kohaseks Marteilia refringens'i nakkuse suhtes teatud kindla staatuse saamiseks või säilitamiseks ja direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaseks kõnealuse loetletud taudi esinemise või puudumise kinnitamiseks käesoleva osa punktides I.1, I.2 ja I.3 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

I.1.   Proovivõtmine

Nakatunud loomade leidmise tõenäosuse suurendamiseks valitakse proovivõtmiseks eelkõige avatud kojapoolmetega või äsja surnud üksikud molluskid.

Valitud austreid või rannakarpe hoitakse nende andmeid ja päritoluteavet sisaldava märgisega kilekotis jahutatult 4 °C juures või jääl kuni 24 tundi, kui valim hõlmab avatud kojapoolmetega molluskeid, või muul juhul kuni 72 tundi. Avatud kojapoolmetega ja äsja surnud molluskeid hoitakse teistest molluskitest eraldi.

Marteilia refringens'i nakkuse diagnoosimisel kasutatakse histoloogiliseks analüüsiks muu hulgas lõpustest ja südamest saadud 3–5 mm paksust koelõiku. Mõne uuringu, sealhulgas koejäljendite analüüsi ja polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) jaoks kasutatakse seedenäärme tükki.

I.2.   Mikroskoopiameetodid

I.2.1.   Koejäljendite tsütoloogiline analüüs

Pärast seedenäärme kudede kuivatamist imava paberiga tehakse neist alusklaasile mitu jäljendit. Alusklaasil lastakse õhu käes kuivada, koed fikseeritakse metanooli või absoluutse etanooliga ning värvitakse turul kättesaadava vererakkude värvimise komplekti, näiteks komplekti Diff-Quik® või Hemacolor® abil vastavalt tootja juhistele. Pärast alusklaasi kraaniveega loputamist ja kuivatamist paigutatakse sellele sobiva sünteetilise vaigu abil katteklaas. Alusklaasi vaadeldakse esmalt 200-kordsel suurendusel ja seejärel õliimmersiooniga 1 000-kordsel suurendusel.

Tulemus on positiivne, kui leitakse rakke suurusega kuni 30–40 μm. Nende tsütoplasma värvub basofiilselt, tuum aga eosinofiilselt. Suurte tugevalt värvunud (valgust murdvate) graanulite ümber täheldatakse heledat valgusrõngast ja suuremate rakkude sees on näha väiksemaid rakke.

See parasiidi tuvastamise meetod ei ole liigispetsiifiline.

I.2.2.   Histoloogiline analüüs

Muu hulgas lõpustest, seedenäärmest, mantlist ja gonaadist saadud koelõikude fikseerimiseks hoitakse neid vähemalt 24 tundi Davidsoni fikseerimislahuses ning töödeldakse seejärel tavapärasel viisil parafiinlõikude histoloogiliseks analüüsimiseks ja värvimiseks näiteks hematoksüliini ja eosiiniga. Lõike vaadeldakse järk-järgult suuremaks muudetaval kuni 1 000-kordsel suurendusel.

Tulemus on positiivne, kui leitakse rakke suurusega 4–40 μm. Nakkuse varajases staadiumis on rakud mitmetuumalised ning nende kuju varieerub kerakujulisest piklikuni. Neid leidub peamiselt söögitoru ja mao ning mõnikord ka huulejätkete epiteelis. Spoorid moodustuvad suurema raku sees asuvate rakkude jagunemise teel ning see leiab aset seedenäärme kanalites ja juhades. Spooride moodustumise käigus tekivad valgust murdvad graanulid, kuid nakkuse varajases staadiumis neid ei täheldata. Nakkuse hilises staadiumis täheldatakse vabade sporangiumide esinemist seedekulgla valendikus. Nende tsütoplasma värvub basofiilselt, tuum aga eosinofiilselt. Graanulite värvus võib varieeruda sügavoranžist sügavpunaseni.

See parasiidi tuvastamise meetod ei ole liigispetsiifiline.

I.3.   Molekulaarsed meetodid

I.3.1.   DNA eraldamine

DNA eraldamiseks kasutatakse standardmeetodit.

Võib kasutada turul kättesaadavat DNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse tavaliselt kvaliteetne DNA, mida on võimalik kasutada punktis I.3.2 kirjeldatud PCRi meetodite puhul.

I.3.2.   Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

Välja on töötatud mitu avaldatud PCRi meetodit.

Kasutatakse PCRi praimereid, mille sihtjärjestus on sisemine transkribeeritav vahejärjestus ITS1, kuna need võimaldavad amplifitseerida üksnes M. refringens'i DNAd.

PCR viiakse läbi ruumalas 50 μl. PCRi segu sisaldab puhvrit (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 9,0 temperatuuril 25 °C) ja 1 % Triton X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP-de segu, päripidist ja äraspidist praimerit kontsentratsioonis 1 μM, Taq DNA polümeraasi kontsentratsioonis 0,02 ühikut mikroliitri kohta ning 10–100 ng eraldatud DNAd. Pärast DNA denatureerimist viie minuti jooksul 94 °C juures viiakse läbi 30 tsüklit järgmistes tingimustes: denatureerimine – üks minut 94 °C juures; anniilimine – üks minut 55 °C juures; elongatsioon – üks minut tuhande aluspaari kohta 72 °C juures. Sellele järgneb viimane elongatsioonietapp – 10 minutit 72 °C juures. M. refringens'i tuvastamiseks kasutatakse PCRi praimereid, mille sihtjärjestus on ITS1 (5′-CCGCACACGTTCTTCACTCC-3′ ja 5′-CTCGCGAGTTTCGACAGACG-3′).

Positiivse kontrollina kasutatakse raskelt nakatunud peremeesorganismist pärit genoomset DNAd või sihtjärjestust hõlmavat plasmiidi DNAd.

Negatiivsete kontrollidena kasutatakse nakatumata peremeesorganismist pärit genoomset DNAd ja PCRi segu, millest on välja jäetud sihtjärjestust sisaldav DNA.

Tulemus on positiivne, kui PCRi abil saadakse eeldatava pikkusega amplikon (412 bp) ning kõik negatiivsed kontrollid on negatiivsed ja positiivsed kontrollid on positiivsed.

I.3.3.   In situ hübridiseerimine

Välja on töötatud mitu avaldatud in situ hübridiseerimise meetodit.

Kasutatakse sondi, mille sihtjärjestus on rRNA geenide klastris asuv ribosoomi väikese subühiku rRNA geen, kuna kõnealune sond on histoloogilise analüüsiga valideeritud.

Muu hulgas lõpustest ja seedenäärmest saadud koelõikude fikseerimiseks hoitakse neid vähemalt 24 tundi Davidsoni fikseerimislahuses ning töödeldakse seejärel parafiinlõikude histoloogilises analüüsis tavapäraselt kasutataval viisil. Lõigatakse 5 μm paksused lõigud ja pannakse need aminoalküülsilaaniga kaetud alusklaasile, mida soojendatakse seejärel öö läbi 40 °C juures. Lõikude deparafiinimiseks inkubeeritakse neid 10 minutit ksüleenis. Seda etappi korratakse üks kord ning lahusti eemaldamiseks hoitakse lõike järjest kahes absoluutse etanooli vannis, kummaski 10 minutit. Seejärel lõigud veetustatakse reas eri kontsentratsiooniga etanoolilahustes. Lõike töödeldakse proteinaasiga K (100 μg/ml) puhvris TE (50 mM Tris, 10 mM EDTA) 30 minutit 37 °C juures. Lõigud veetustatakse reas eri kontsentratsiooniga etanoolilahustes ja neil lastakse õhu käes kuivada. Seejärel inkubeeritakse lõike 100 μl hübridiseerimispuhvris (4 × SSC (standardne naatriumtsitraadi lahus), 50 % formamiidi, 1 × Denhardti lahus, 250 μg/ml pärmi tRNA-d, 10 % dekstraansulfaati), mis sisaldab 10 ng digoksigeniiniga märgistatud sondi (1 μl punktis I.3.2 kirjeldatu kohaselt valmistatud PCRi regente, kasutades praimereid 5′-CCGGTGCCAGGTATATCTCG-3′ ja 5′-TTCGGGTGGTCTTGAAAGGC-3′). Lõigud kaetakse in situ hübridiseerimiseks ette nähtud plastist katteklaasiga ja pannakse viieks minutiks kuumutusplokile temperatuuriga 95 °C. Alusklaas pannakse jahutamiseks üheks minutiks jääle ja seejärel hoitakse lõike hübridiseerimiseks öö läbi niiskes kambris 42 °C juures. Lõike pestakse kaks korda toatemperatuuril lahuses 2 × SSC, kummalgi korral 5 minutit, ning üks kord 10 minutit lahuses 0,4 × SSC temperatuuril 42 °C. Sondi tuvastamine viiakse läbi vastavalt tootja juhistele. Seejärel loputatakse alusklaasi steriilse destilleeritud veega (dH2O). Lõikudele tehakse kontrastvärvimine kollase Bismarcki pruuniga, alusklaasi loputatakse dH2O-ga ning lõigud kaetakse veepõhise kattevedeliku abil katteklaasiga.

Positiivse ja negatiivse kontrollina kasutatakse lõike, mis on saadud teadaolevalt vastavalt nakatunud ja nakatumata peremeesorganismilt.

Tulemus on positiivne, kui teadaolevas sihtkoes täheldatakse lillakasmustaks värvunud M. refringens'i rakke ning kõik negatiivsed kontrollid on negatiivsed ja kõik positiivsed kontrollid on positiivsed.

I.3.4.   Sekveneerimine

Ühena viimastest diagnoosi kinnitamise etappidest viiakse läbi sekveneerimine. Sihtjärjestused on ribosoomi väikese subühiku rRNA geen (SSU rDNA) ja ITS1.

II.    Marteilia refringens'i nakkuse seire ja nakkuse esinemise kinnitamise üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Marteilia refringens 'it hõlmavate seireprogrammide puhul ja kõnealuse loetletud taudi esinemise kinnitamiseks või sellekohase kahtluse ümberlükkamiseks vastavalt I lisa 4. osa II jaos sätestatud nõuetele kasutatakse diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda, mis on kooskõlas järgmiste tabelis 4.1 esitatud juhistega.

Tabel 4.1

Juhised Marteilia refringens'i nakkuse seire programmide raames ja nakkuse esinemise või puudumise kinnitamiseks kasutatavate diagnostikameetodite kohaldamiseks

Meetod	Suunatud seire	Eeldatav diagnoos	Kinnitav diagnoos
Seedenäärme koejäljendid	X	X	X või
Histopatoloogiline analüüs	X		X või
In situ hübridiseerimine			X ja
PCR	X	X	X ja
Sekveneerimine			X

5. OSA

BONAMIA OSTREAE NAKKUSE SEIREKS JA NAKKUSE ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I.    Bonamia ostreae nakkuse diagnoosimise kord

Proovivõtmisel ja laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 5. osa II jaos sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 5. osa I jao kohaseks Bonamia ostreae nakkuse suhtes teatud kindla staatuse saamiseks või säilitamiseks ja direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaseks kõnealuse loetletud taudi esinemise või puudumise kinnitamiseks järgmisi punktides I.1, I.2 ja I.3 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

I.1.   Proovivõtmine

Nakatunud loomade leidmise tõenäosuse suurendamiseks valitakse proovivõtmiseks eelkõige avatud kojapoolmetega või äsja surnud üksikud molluskid.

Valitud austreid hoitakse nende andmeid ja päritoluteavet sisaldava märgisega kilekotis jahutatult 4 °C juures või jääl kuni 24 tundi, kui valim hõlmab avatud kojapoolmetega molluskeid, või muul juhul kuni 72 tundi. Avatud kojapoolmetega ja äsja surnud molluskeid hoitakse teistest molluskitest eraldi.

Bonamia ostreae nakkuse diagnoosimisel kasutatakse histoloogiliseks analüüsiks muu hulgas lõpustest ja südamest saadud 3–5 mm paksust koelõiku. Mõne uuringu, sealhulgas koejäljendite analüüsi ja polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) jaoks kasutatakse seedenäärme tükki.

I.2.   Mikroskoopiameetodid

I.2.1.   Koejäljendite tsütoloogiline analüüs

Pärast lõpuse- või südamekudede kuivatamist imava paberiga tehakse neist alusklaasile mitu jäljendit. Alusklaasil lastakse õhu käes kuivada, koed fikseeritakse metanooli või absoluutse etanooliga ning värvitakse turul kättesaadava vererakkude värvimise komplekti, näiteks komplekti Diff-Quik® või Hemacolor® abil vastavalt tootja juhistele. Pärast alusklaasi kraaniveega loputamist ja kuivatamist paigutatakse sellele sobiva sünteetilise vaigu abil katteklaas. Alusklaasi vaadeldakse esmalt 200-kordsel suurendusel ja seejärel õliimmersiooniga 1 000-kordsel suurendusel.

Tulemus on positiivne, kui hemotsüütides leitakse väikseid kera- või munakujulisi organisme laiusega 2–5 μm. Kõnealust parasiiti võib leiduda ka rakkudest väljaspool. Nende organismide tsütoplasma on basofiilne ja tuum eosinofiilne (värvus võib kasutatavast värvainest olenevalt varieeruda) ning alusklaasil lamenemisest tingituna võivad need koejäljendis näha välja laiemad kui histoloogilise analüüsi puhul. Võidakse täheldada mitmetuumalisi rakke. See parasiidi tuvastamise meetod ei ole liigispetsiifiline.

I.2.2.   Histoloogiline analüüs

Muu hulgas lõpustest ja seedenäärmest saadud koelõikude fikseerimiseks hoitakse neid vähemalt 24 tundi Davidsoni fikseerimislahuses ning töödeldakse seejärel tavapärasel viisil parafiinlõikude histoloogiliseks analüüsimiseks ja värvimiseks näiteks hematoksüliini ja eosiiniga. Lõike vaadeldakse järk-järgult suuremaks muudetaval kuni 1 000-kordsel suurendusel.

Tulemus on positiivne, kui hemotsüütides või rakkudest väljaspool sidekoes või lõpuste, soole ja mantli epiteeli siinustes täheldatakse kõnealuse parasiidi väga väikseid rakke laiusega 2–5 μm; sellega kaasneb tihti äge põletikureaktsioon. Mis tahes kahtluste ärahoidmiseks peab parasiit positiivse diagnoosi määramiseks olema nähtav hemotsüütide sees. See parasiidi tuvastamise meetod ei ole liigispetsiifiline.

I.3.   Molekulaarsed meetodid

I.3.1.   DNA eraldamine

DNA eraldamiseks kasutatakse standardmeetodit.

Võib kasutada turul kättesaadavat DNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse tavaliselt kvaliteetne DNA, mida on võimalik kasutada allpool kirjeldatud PCRi meetodite puhul.

I.3.2.   Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

Välja on töötatud mitu avaldatud PCRi meetodit.

Võib kasutada kahte PCRi meetodit, mille puhul sihtjärjestus on SSU rDNA:

a)

esimene neist hõlmab tavapärast PCRi, mis võimaldab amplifitseerida hõimkonna Haplosporidia mitme esindaja, sealhulgas Bonamia spp. DNAd. Kasutatakse praimereid nimega Bo ja Boas, mille järjestus on vastavalt 5′-CATTTAATTGGTCGGGCCGC-3′ ja 5′-CTGATCGTCTTCGATCCCCC-3′ ning millega saadakse amplikon pikkusega 300 bp. PCRi segu üldmahuga 50 μl sisaldab puhvrit (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 9,0 temperatuuril 25 °C) ja 1 % Triton X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP-de segu, päripidist ja äraspidist praimerit kontsentratsioonis 1 μM, Taq DNA polümeraasi kontsentratsioonis 0,02 ühikut mikroliitri kohta ning matriits-DNAd kontsentratsioonis 0,2 ng/μl. Proov denatureeritakse termotsükleris viie minuti jooksul 94 °C juures ning sellega tehakse 30 PCRi tsüklit (üks minut 94 °C juures, üks minut 55 °C juures ja üks minut 72 °C juures), millele järgneb viimane elongatsioonietapp – 10 minutit 72 °C juures. Positiivse kontrollina kasutatakse raskelt nakatunud peremeesorganismist pärit genoomset DNAd või sihtjärjestust hõlmavat plasmiidi DNAd. Negatiivsete kontrollidena kasutatakse nakatumata peremeesorganismist pärit genoomset DNAd ja PCRi segu, millest on välja jäetud sihtjärjestust sisaldav DNA. Tulemus on positiivne, kui PCRi abil saadakse eeldatava pikkusega amplikon (300 bp) ning kõik negatiivsed kontrollid on negatiivsed ja positiivsed kontrollid on positiivsed;

b)

teine PCRi meetod on värvainel SYBR® Green põhinev reaalajas jälgitav PCR. See meetod võimaldab spetsiifiliselt tuvastada B. ostreae't (kirjeldatud allpool) ja seda võib kasutada koos B. exitiosa spetsiifilist tuvastamist võimaldava värvainel SYBR® Green põhineva reaalajas jälgitava PCRiga (Ramilo et al., 2013). Praimeritega BOSTRE-F (5′-TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) ja BOSTRE-R (5′-TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplifitseeritakse fragment pikkusega 208 bp. PCRi segu sisaldab lahust SYBR® Green Master Mix (1 X), päripidist ja äraspidist praimerit kontsentratsioonis 0,3 μM ning 200 ng eraldatud DNAd. Proov denatureeritakse reaalajas jälgimise süsteemis 10 minuti jooksul 95 °C juures ning sellega tehakse 35 PCRi tsüklit (30 sekundit 95 °C juures, 45 sekundit 55 °C juures ja üks minut 72 °C juures). Viiakse läbi sulamistemperatuuri kõvera analüüs, mille puhul temperatuuri tõstetakse astmeliselt kiirusega 0,5 °C/s algväärtuselt 55 °C lõppväärtuseni 95 °C ning iga temperatuurimuutuse puhul registreeritakse fluorestsentssignaal. Positiivse kontrollina kasutatakse raskelt nakatunud peremeesorganismist pärit genoomset DNAd või sihtjärjestust hõlmavat plasmiidi DNAd. Negatiivsete kontrollidena kasutatakse nakatumata peremeesorganismist pärit genoomset DNAd ja PCRi segu, millest on välja jäetud sihtjärjestust sisaldav DNA. Tulemus on positiivne, kui PCRi abil amplifitseerimisel täheldatakse spetsiifilist sulamistemperatuuri piiki (Ramilo et al. (2013) avaldatud tingimustes 78,25 ± 0,25 °C) ning kõik negatiivsed kontrollid on negatiivsed ja positiivsed kontrollid on positiivsed.

I.3.3.   In situ hübridiseerimine

Välja on töötatud mitu avaldatud in situ hübridiseerimise meetodit.

Kasutatakse sondi, mille sihtjärjestus on rDNA geenide klastris asuv SSU rDNA, ehkki on tõendatud, et see sond ristreageerib hõimkonna Haplosporidia teatavate teiste esindajate DNAga.

Muu hulgas lõpustest ja seedenäärmest saadud koelõikude fikseerimiseks hoitakse neid vähemalt 24 tundi Davidsoni fikseerimislahuses ning töödeldakse seejärel parafiinlõikude histoloogilises analüüsis tavapäraselt kasutataval viisil. Lõigatakse 5 μm paksused lõigud ja pannakse need aminoalküülsilaaniga kaetud alusklaasile, mida soojendatakse seejärel öö läbi 40 °C juures. Lõikude deparafiinimiseks inkubeeritakse neid 10 minutit ksüleenis. Seda etappi korratakse üks kord ning lahusti eemaldamiseks hoitakse lõike järjest kahes absoluutse etanooli vannis, kummaski 10 minutit. Seejärel lõigud rehüdreeritakse reas eri kontsentratsiooniga etanoolilahustes. Lõike töödeldakse proteinaasiga K (100 μg/ml) puhvris TE (50 mM Tris, 10 mM EDTA) 30 minutit 37 °C juures. Lõigud veetustatakse reas eri kontsentratsiooniga etanoolilahustes ja neil lastakse õhu käes kuivada. Seejärel inkubeeritakse lõike 100 μl hübridiseerimispuhvris (4 × SSC (standardne naatriumtsitraadi lahus), 50 % formamiidi, 1 × Denhardti lahus, 250 μg/ml pärmi tRNA-d, 10 % dekstraansulfaati), mis sisaldab 20 ng digoksigeniiniga märgistatud sondi (2 μl punktis I.3.2. kirjeldatu kohaselt praimeritega Bo ja Boas läbi viidud PCRi segu). Lõigud kaetakse in situ hübridiseerimiseks ette nähtud plastist katteklaasiga ja pannakse viieks minutiks kuumutusplokile temperatuuriga 95 °C. Alusklaas pannakse jahutamiseks üheks minutiks jääle ja seejärel hoitakse lõike hübridiseerimiseks öö läbi niiskes kambris 42 °C juures. Lõike pestakse kaks korda toatemperatuuril lahuses 2 × SSC, kummalgi korral 5 minutit, ning üks kord 10 minutit lahuses 0,4 × SSC temperatuuril 42 °C. Sondi tuvastamine viiakse läbi vastavalt tootja juhistele. Seejärel loputatakse alusklaasi steriilse destilleeritud veega (dH2O). Lõikudele tehakse kontrastvärvimine kollase Bismarcki pruuniga, alusklaasi loputatakse dH2O-ga ning lõigud kaetakse veepõhise kattevedeliku abil katteklaasiga.

Positiivse ja negatiivse kontrollina kasutatakse lõike, mis on saadud teadaolevalt vastavalt nakatunud ja nakatumata peremeesorganismilt.

Tulemus on positiivne, kui hemotsüütides täheldatakse märgistatud parasiite ning kõik negatiivsed kontrollid on negatiivsed ja positiivsed kontrollid on positiivsed.

I.3.4.   Sekveneerimine

Ühena viimastest diagnoosi kinnitamise etappidest viiakse läbi sekveneerimine. Sihtjärjestused on SSU rDNA ja ITS1.

II.    Bonamia ostreae nakkuse seire ja nakkuse esinemise kinnitamise kord

Bonamia ostreae nakkuse seireks ja nakkuse esinemise kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks vastavalt I lisa 5. osa II jaos sätestatud nõuetele kasutatakse diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda, mis on kooskõlas järgmiste tabelis 5.1 esitatud juhistega.

Tabel 5.1

Juhised Bonamia ostreae nakkuse seire programmide raames ja nakkuse esinemise või puudumise kinnitamiseks kasutatavate diagnostikameetodite kohaldamiseks

Meetod	Suunatud seire	Eeldatav diagnoos	Kinnitav diagnoos
Südame või lõpuste koejäljendid	X	X	X või
Histopatoloogiline analüüs	X		X või
In situ hübridiseerimine			X ja
PCR	X	X	X ja
Sekveneerimine			X

6. OSA

VIIRUSLIKU VALGELAIKSUSE SEIREKS JA SELLE TAUDI ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

1.   Diagnostikameetodid valgelaiksust tekitava viiruse tuvastamiseks

Proovivõtmisel ja laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 6. osa II jaos sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 6. osa I jao kohaste seire- ja likvideerimisprogrammide puhul ning direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaseks valgelaiksust tekitava viiruse esinemise kinnitamiseks või sellekohase kahtluse ümberlükkamiseks käesoleva osa punktides 2–7 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

II lisa käesolevas osas kirjeldatud meetodid ja nende kohaldamise kord põhinevad koorikloomade haiguste Euroopa Liidu referentlaboris kasutataval standardi ISO 17025 kohaselt akrediteeritud meetodil. Võib kasutada ka muid meetodeid, mille puhul kasutatakse samaväärseid tingimusi või muu tootja valmistatud komplekte, kui selliste meetoditega tagatakse käesolevas osas kirjeldatuga samaväärne tundlikkus ja spetsiifilisus. Valgelaiksust tekitava viiruse identiteedi kinnitamiseks viiakse kõikidel juhtudel läbi PCRi abil amplifitseeritud fragmendi sekveneerimine.

2.   Proovide töötlemine

Valgelaiksust tekitavat viirust sisaldav koorikloomadelt saadud kude (ujujalad ja lõpused) võib säilitada etanoolis või lahuses RNAlater või selle võib kiirkülmutada – 80 °C juures. Valgelaiksust tekitava viiruse tuvastamiseks koeproovides on vaja läbi viia järgmised etapid: koe homogeniseerimine, DNA eraldamine, valgelaiksust tekitava viiruse DNA spetsiifiline amplifitseerimine PCRi abil, amplifitseerimissaaduse visualiseerimine geelis, DNA puhastamine ja sekveneerimine kõnealuse patogeeni identiteedi kinnitamiseks.

3.   Koe homogeniseerimine

Koe purustamiseks ja homogenaadi valmistamiseks sobivas puhvris kasutatakse homogenisaatorit Fast Prep ja lüüsimaatriksit A sisaldavaid katsuteid (MP Biomedicals). Kude kaalutakse, pannakse lüüsimaatriksit A sisaldavasse katsutisse, lahjendatakse vastavalt tootja juhistele sobivas puhvris (Qiageni komplekti DNA Tissue kasutamisel puhver G2 koos 10 μl proteinaasiga K) suhtes 1 massiühik 10 mahuühiku kohta ja homogeniseeritakse kahe minuti vältel seadmega Fast Prep 24. Homogeniseeritud proovi inkubeeritakse vähemalt neli tundi või öö läbi 56 °C juures. Pärast proovi segamist keerissegisti abil tsentrifuugitakse seda kaks minutit pöörlemiskiirusel 9 000 rpm, seejärel viiakse 50 μl või selline kogus supernatanti, mis vastab 5 milligrammile koele (eraldamiskomplekti puhul optimaalne koe kaal), proovi jaoks ette nähtud DNA eraldamise katsutisse ja lahuse ruumala viiakse puhvri G2 abil 200 mikroliitrini.

4.   DNA eraldamine

Kogu DNA eraldamiseks kasutatakse koest DNA eraldamise komplekti ja biorobotit EZ1 Advanced XL (Qiagen) vastavalt tootja juhistele. Iga proovide partii puhul kasutatakse eraldamiskontrolli (vasika harknäärme DNA) ja negatiivset kontrolli (puhver G2). DNA elueeritakse 50 μl lahuses. Eraldamise edukuse kontrollimiseks määratakse seadme NanoDrop abil DNA kontsentratsioon kõikides proovides ja kontrollides. Kui eraldatud DNAd ei kasutata kohe, külmutatakse see – 20 °C juures.

5.   Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) valgelaiksust tekitava viiruse tuvastamiseks

Valgelaiksust tekitava viiruse tuvastamise meetodina kasutatakse allpool esitatud lõikudes sätestatud mitmeetapilist PCRi, mille puhul PCRi esimeses ja teises etapis amplifitseeritakse 18S rRNA geeni amplikon pikkusega vastavalt 1 447 bp ja 848 bp.

PCRi esimeses etapis on lahuse maht 50 μl ja selle koostisainete lõppsisaldus on järgmine: 1 × puhver GoTaq (Promega), 5 mM MgCl2, 1 pmol/μl praimerit WSSV 146 F1, 1pmol/μl praimerit WSSV 146 R1 (tabel 1), 0,25 mM dNTP-de segu, 1,25 U Taq polümeraasi ja 2,5 μl DNAd. Iga proovi puhul kasutatakse kahte paralleeli koos negatiivse eraldamiskontrolli, PCRi negatiivse kontrolli (DNA asemel 2,5 μl vett) ja positiivse kontrolliga. Positiivse kontrollina kasutatakse valgelaiksust tekitava viiruse DNAd sisaldavat lahjendatud plasmiidi, mis on asutusesiseselt loodud ja kasutamiseks valideeritud (saadaval ELi referentlaboris).

Valgelaiksust tekitava viiruse tuvastamiseks kasutatava PCRi teine etapp viiakse läbi samal viisil kui esimene etapp, kuid praimeritena kasutatakse paari WSSV 146 F2/R2 ja kasutusele võetakse täiendav positiivne kontroll, mis võimaldab veenduda, et PCRi see etapp on läbi viidud edukalt.

Praimer	Järjestus
WSSV 146 F1	ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG
WSSV 146 R1	TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA
WSSV 146 F2	GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA
WSSV 146 R2	TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT

Nii PCRi esimeses kui ka teises etapis kasutatakse seadet DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler või sellega samaväärset seadet ning järgmisi tsükleerimistingimusi. Algne denatureerimisetapp: kaks minutit 94 °C juures; seejärel 30 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 62 °C juures ja 30 sekundit 72 °C juures; seejärel kahe minuti pikkune elongatsioonietapp 72 °C juures ja proovi hoidmine temperatuuril 4 °C.

6.   Geelelektroforees

PCRi amplifitseerimissaadused nii esimesest kui ka teisest PCRi etapist visualiseeritakse 2 % agaroosgeelis, mis on valmistatud puhvriga TAE. Igast proovist võetakse 15 μl suurune alikvoot, seda elektroforeesitakse 120 voldi juures umbes 20 minutit ning geeli analüüsitakse ultraviolettkiirguses. Positiivses proovis on PCRi esimese etapi puhul näha 1 447 bp pikkusele fragmendile vastav vööt ja teise etapi puhul 848 bp pikkusele fragmendile vastav vööt. Sellise pikkusega fragmendid lõigatakse välja ja pannakse 1,5 milliliitrisesse mikrokatsutisse. Saadud geelitükkides sisalduv DNA puhastatakse Promega komplektiga Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System vastavalt tootja juhistele. Puhastatud DNA kontsentratsiooni hinnatakse seadmega NanoDrop. Kui eraldatud DNAd ei kasutata kohe, võib selle külmutada – 20 °C juures.

7.   PCRi saaduste sekveneerimine

DNA sekveneerimiseks kasutatakse komplekti BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Iga reaktsiooni üldmaht on 20 μl ja koostisainete lõppsisaldus on järgmine: 1 × reaktsioonisegu BigDye Terminator, 1 × sekveneerimispuhver, 10 pmol/μl päripidist või äraspidist praimerit ja 10 μl puhastatud DNAd (lahjendatud kontsentratsioonini umbes 10 ng/μl). Reaktsioon viiakse läbi seadmes DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler või sellega samaväärses seadmes ning järgmistes tsükleerimistingimustes: 30 sekundit 94 °C juures; seejärel 30 tsüklit: 10 sekundit 96 °C juures, 10 sekundit 50 °C juures ja neli minutit 60 °C juures.

Sekveneerimiseks tehtava PCRi saadused sadestatakse naatriumatsetaadi meetodil, mille puhul 10 μl naatriumatsetaadile, 70 μl veele ja 250 μl etanoolile lisatakse 20 μl DNAd, lahus segatakse keerissegistil, seda tsentrifuugitakse 20 minutit pöörlemiskiirusel 13 000 rpm, supernatant eemaldatakse, sadet pestakse 200 μl absoluutse etanooliga ja tsentrifuugitakse viis minutit pöörlemiskiirusel 13 000 rpm. Sadet kuivatatakse viis minutit 37 °C juures. Sademele lisatakse 25 μl põhjalikult deioniseeritud formamiidi, lahust kuumutatakse kaks minutit 95 °C juures ja see segatakse keerissegistil korralikult. Proov sekveneeritakse seadmega ABI-3130xl Avant Genetic Analyzer vastavalt tootja juhistele. Sekveneerimistulemuste analüüsimiseks kasutatakse tarkvaraprogrammi Sequencher ning saadud järjestusi võrreldakse programmi BLAST abil NCBI andmebaasis olevate järjestustega.