ANEXO

Programa de pruebas necesario para comprobar el logro del objetivo de la Unión para la reducción de los serotipos de salmonela pertinentes en manadas reproductoras adultas de Gallus gallus

1.   MARCO DE MUESTREO

El marco de muestreo para detectar la presencia de Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, Salmonella Hadar, Salmonella typhimurium y Salmonella Virchow («los serotipos de salmonela pertinentes») comprenderá todas las manadas reproductoras adultas de gallos y gallinas (Gallus gallus) que cuenten al menos con 250 aves («manadas reproductoras»). Se realizará sin perjuicio de las disposiciones del Reglamento (CE) no 2160/2003 y de la Directiva 2003/99/CE en lo que respecta a los requisitos de seguimiento de otras problaciones animales u otros serotipos.

2.   CONTROL DE LAS MANADAS REPRODUCTORAS

2.1.   Ubicación, frecuencia y tipo de muestreo

El muestreo de las manadas reproductoras se efectuará a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria y como parte de los controles oficiales.

2.1.1.   Muestreo a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria

El muestreo se efectuará cada dos semanas en el lugar designado por la autoridad competente de entre las dos opciones siguientes:

a)	en la incubadora-nacedora, o

b)	en la explotación.

La autoridad competente podrá decidir aplicar la opción a) o b) durante todo el programa de pruebas a todas las manadas reproductoras de pollos de engorde y una de esas opciones a las manadas reproductoras de gallinas ponedoras. Sin embargo, el muestreo de manadas reproductoras que pongan huevos para incubar destinados al comercio dentro de la Unión ha de llevarse a cabo en la explotación.

Deberá establecerse un procedimiento para garantizar que la detección de la presencia de los serotipos de salmonela pertinentes durante el muestreo a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria es notificada sin demora a la autoridad competente por el laboratorio que lleva a cabo los análisis. La notificación oportuna de la detección de la presencia de cualquiera de los serotipos de salmonela pertinentes será responsabilidad del explotador de una empresa alimentaria y del laboratorio que efectúe los análisis.

No obstante lo dispuesto en el párrafo primero del presente punto, si se ha alcanzado el objetivo de la Unión durante al menos dos años civiles consecutivos en todo el Estado miembro, la periodicidad de muestreo en la explotación podrá ampliarse a tres semanas, a discreción de la autoridad competente. Sin embargo, esta podrá decidir mantener o reimplantar la periodicidad de muestreo cada dos semanas si se detecta la presencia de los serotipos de salmonela pertinentes en una manada reproductora en la explotación o en cualquier otro caso que la autoridad competente considere apropiado.

2.1.2.   Muestreo realizado dentro de los controles oficiales

El muestreo realizado dentro de los controles oficiales consistirá en lo siguiente:

2.1.2.1.   Si el muestreo efectuado a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria tiene lugar en la incubadora-nacedora:

a)	un muestreo ordinario cada 16 semanas en la incubadora-nacedora;

b)	dos muestreos ordinarios en la explotación durante el ciclo de producción; el primero, en el plazo de cuatro semanas después de entrar en la fase de puesta o la unidad de puesta, y el segundo, hacia el final de la fase de puesta, no antes de las ocho semanas previas al fin del ciclo de producción;

c)	un muestreo de confirmación en la explotación si se detecta la presencia de los serotipos de salmonela pertinentes en el muestreo efectuado en la incubadora-nacedora.

2.1.2.2.   Si el muestreo a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria se efectúa en la explotación, se llevarán a cabo tres muestreos ordinarios durante el ciclo de producción:

a)	en el plazo de cuatro semanas después de entrar en la fase de puesta o la unidad de puesta;

b)	hacia el final de la fase de puesta, no antes de las ocho semanas previas al fin del ciclo de producción;

c)	en cualquier momento durante el ciclo de producción suficientemente separado cronológicamente de los muestreos mencionados en los puntos a) y b).

2.1.2.3.   No obstante lo dispuesto en los puntos 2.1.2.1 y 2.1.2.2 y si se ha alcanzado el objetivo de la Unión durante un mínimo de dos años civiles consecutivos en todo el Estado miembro, la autoridad competente podrá sustituir los muestreos ordinarios por:

a)	un muestreo en la explotación en cualquier momento del ciclo de producción y un muestreo al año en la incubadora-nacedora, o

b)	dos muestreos en la explotación, en dos momentos cualesquiera suficientemente separados cronológicamente durante el ciclo de producción.

Sin embargo, la autoridad competente podrá decidir mantener o reimplantar el muestreo establecido en los puntos 2.1.2.1 o 2.1.2.2 si se detecta la presencia de los serotipos de salmonela pertinentes en una manada reproductora en la explotación o en cualquier otro caso que dicha autoridad competente considere apropiado.

El muestreo realizado por la autoridad competente podrá sustituir al realizado a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria.

2.2.   Protocolo de muestreo

2.2.1.   Muestreo en la incubadora-nacedora

En cada muestreo se tomará al menos una muestra de cada manada reproductora.

El muestreo ha de organizarse un día de nacimientos en el que se disponga de muestras de todas las manadas reproductoras. Si esto no es posible, ha de velarse por que todas las muestras se recojan de cada manada al menos con la frecuencia estipulada en el punto 2.1.

Todo el material de las incubadoras-nacedoras de las que se extraigan los pollitos el día del muestreo contribuirá a la constitución de las muestras de manera proporcional.

Si hay más de 50 000 huevos en una manada reproductora en las incubadoras, se extraerá una segunda muestra de esa manada.

La muestra consistirá como mínimo en:

a)

una muestra compuesta del forro interior de las bandejas de nacimiento visiblemente manchado, tomada aleatoriamente de cinco bandejas de nacimiento separadas o de cinco puntos de la incubadora-nacedora, hasta lograr como mínimo una superficie total de muestreo de 1 m2; si los huevos incubados de una manada reproductora ocupan más de una incubadora-nacedora, se tomará una de estas muestras compuestas de cada incubadora-nacedora, hasta un total de cinco, o

b)

una muestra tomada inmediatamente después del traslado de los pollos con uno o varios hisopos de tela humedecidos en una superficie total mínima de 900 cm2 en todo el fondo de un mínimo de cinco bandejas de nacimiento, o a partir de pelusa de cinco sitios, incluido el suelo, de cada incubadora-nacedora, hasta un total de cinco, en la que hayan eclosionado los huevos de la manada, asegurándose de que se toma al menos una muestra por cada manada de procedencia de los huevos, o

c)

10 g de cáscaras de huevo rotas recogidas en un total de veinticinco bandejas de nacimiento separadas (es decir, una muestra inicial de 250 g) de hasta cinco incubadoras-nacedoras con huevos eclosionados de la manada, que se triturarán, se mezclarán y se someterán a un nuevo muestreo para obtener una submuestra de ensayo de 25 g.

El procedimiento establecido en las letras a), b) y c) se aplicará tanto a los muestreos a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria como a los muestreos realizados dentro de los controles oficiales. No obstante, no es obligatorio incluir una incubadora-nacedora con huevos de distintas manadas si al menos un 80 % de los huevos están en otras incubadoras-nacedoras muestreadas.

2.2.2.   Muestreo en la explotación

2.2.2.1.   Muestreo ordinario a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria

El muestreo consistirá fundamentalmente en la toma de muestras de materia fecal y su objetivo será detectar una prevalencia en la manada del 1 % con un límite de confianza del 95 %. A tal fin, las muestras comprenderán uno de los elementos siguientes:

a)

mezcla de heces compuesta por muestras separadas de heces frescas, cada una de ellas de un peso mínimo de 1 g, tomadas aleatoriamente en varios puntos del gallinero en el que se encuentre la manada reproductora o, cuando esta tenga libre acceso a más de un gallinero de una explotación determinada, de cada grupo de gallineros de la explotación en que se encuentre la manada reproductora. Las heces podrán mezclarse para el análisis en un mínimo de dos muestras compuestas. Número de sitios en los que deberán tomarse muestras de heces separadas para elaborar una muestra compuesta: Número de aves de la manada reproductora Número de muestras de heces que deben tomarse en la manada reproductora 250-349 200 350-449 220 450-799 250 800-999 260 1 000 o más 300

b)

muestras de calzas o polvo:   Las calzas utilizadas deberán permitir una absorción suficiente de la humedad. A tal efecto, son también aceptables «medias» de gasa tubular.   Se humedecerá la superficie de la calza con diluyentes adecuados (por ejemplo, un 0,8 % de cloruro de sodio, un 0,1 % de peptona en agua desionizada estéril, agua estéril o cualquier otro diluyente aprobado por la autoridad competente).   Las muestras se recogerán andando por la nave, siguiendo un camino que permita recoger muestras representativas de todas las partes del gallinero o del sector respectivo. Dicho camino incluirá zonas de yacija y de tablillas, a condición de que sea seguro caminar sobre las tablillas. En el muestreo se incluirán todos los corrales separados de un mismo gallinero. Una vez terminado el muestreo en el sector escogido, se retirarán con cuidado las calzas para que no se desprenda el material que llevan adherido. Las muestras consistirán en: i) cinco pares de calzas que representen, cada una de ellas, un 20 % del área del gallinero; las calzas podrán reunirse para su análisis en un mínimo de dos muestras compuestas, o ii) al menos un par de calzas que represente toda el área del gallinero y una muestra de polvo adicional recogida en múltiples lugares del gallinero, en superficies con presencia visible de polvo; esa muestra de polvo se recogerá con uno o varios hisopos de tela humedecidos de una superficie total mínima de 900 cm2;

c)

en el caso de manadas reproductoras enjauladas, el muestreo se efectuará con heces mezcladas naturalmente procedentes de cintas recolectoras de estiércol, raspadores o fosos, según el tipo de nave de que se trate. Se recogerán dos muestras de un mínimo de 150 g, que se analizarán por separado, en: i) las cintas recolectoras de estiércol, situadas debajo de cada nivel de jaulas, que se accionan a intervalos regulares y descargan su contenido en un sistema transportador, ii) el sistema de foso de estiércol situado bajo la nave en el que se raspan los deflectores que se encuentran debajo de las jaulas, iii) un sistema de foso en una nave de jaulas en batería en que las jaulas están desfasadas, de modo que las heces caigan directamente al foso. Normalmente, una nave tiene varios bloques de jaulas. En la muestra mezclada global deberá haber mezclas de heces de cada bloque. De cada manada reproductora se tomarán dos muestras mezcladas, de la manera descrita en los párrafos tercero a sexto. En los sistemas con cintas o raspadores, estos se accionarán el día del muestreo antes de llevarlo a cabo. En los sistemas con deflectores bajo las jaulas y raspadores, se recogerá la mezcla de heces acumulada en el raspador después de accionarlo. En los sistemas de jaulas escalonadas sin sistema de cinta o raspador, será preciso recoger la mezcla de heces en todo el foso. En los sistemas de cintas recolectoras de estiércol, la mezcla de materia fecal se recogerá del final de las cintas.

2.2.2.2.   Muestreo realizado dentro de los controles oficiales

a)	El muestreo ordinario se efectuará como se describe en el punto 2.2.2.1.

b)

Se efectuará un muestreo de confirmación tal como se indica en el punto 2.2.2.1 si se detectan los serotipos de salmonela pertinentes en las muestras tomadas en la cámara de incubación. Podrán recogerse muestras adicionales para posibles pruebas de antimicrobianos o inhibidores de crecimiento bacteriano del modo siguiente: se toman aves aleatoriamente en cada gallinero de la explotación, normalmente hasta cinco por gallinero, salvo que la autoridad considere necesario recoger una muestra mayor. Si no se confirma la fuente de infección, se efectuarán pruebas antimicrobianas o nuevas pruebas bacteriológicas de detección de los serotipos de salmonela pertinentes en la manada reproductora o su progenie antes de levantar las restricciones comerciales. Si se detectan antimicrobianos o inhibidores de crecimiento bacteriano, se considerará confirmada la infección por salmonela.

c)	Sospecha de que los resultados son falsos En casos excepcionales en los que la autoridad competente tenga motivos para cuestionar los resultados de las pruebas (resultados de falso positivo o falso negativo), podrá decidir que se repitan de conformidad con la letra b).

3.   EXAMEN DE LAS MUESTRAS

3.1.   Transporte y preparación de las muestras

3.1.1.   Transporte

Las muestras se enviarán en las 24 horas posteriores a la recogida, preferiblemente por correo urgente o servicio de mensajería, a los laboratorios a los que se refieren los artículos 11 y 12 del Reglamento (CE) no 2160/2003. Si no se envían en ese plazo de 24 horas, deberán almacenarse refrigeradas. El transporte puede realizarse a temperatura ambiente siempre que se eviten el calor excesivo (más de 25 °C) y la exposición a la luz del sol. En el laboratorio, las muestras se mantendrán refrigeradas hasta su examen, que comenzará en las 48 horas posteriores a su recepción y dentro de las 96 horas posteriores al muestreo.

3.1.2.   Forro de las bandejas de nacimiento

a)	Colocar la muestra en un litro de agua de peptona tamponada previamente calentada hasta temperatura ambiente y mezclar suavemente;

b)	continuar el cultivo de la muestra mediante el método de detección descrito en el punto 3.2.

3.1.3.   Muestras de calzas y polvo

a)	Manipular con cuidado el par o los pares de calzas o medias y la muestra de polvo (hisopo de tela) para que no se desprenda la materia fecal adherida o el polvo suelto y colocarlos en 225 ml de agua de peptona tamponada previamente calentada a temperatura ambiente;

b)

sumergir totalmente las calzas o medias y el hisopo de tela en agua de peptona tamponada, de manera que haya suficiente líquido libre alrededor de la muestra para que la salmonela migre desde ella, por lo que podrá añadirse agua de peptona tamponada si es necesario. Se harán preparaciones separadas de las calzas y el hisopo de tela;

c)	si se reúnen cinco pares de calzas o medias en dos muestras, colocar cada una de ellas en 225 ml de agua de peptona tamponada, o más si es necesario, de manera que queden totalmente sumergidas y haya suficiente líquido libre alrededor de la muestra para que la salmonela migre desde ella;

d)	remover la muestra hasta saturarla completamente y proceder al cultivo mediante el método de detección descrito en el punto 3.2.

3.1.4.   Otras muestras de materia fecal

a)	Juntar y mezclar homogéneamente las muestras de heces y recoger una submuestra de 25 g para su cultivo;

b)	añadir la submuestra de 25 g a 225 ml de agua de peptona tamponada previamente calentada a temperatura ambiente;

c)	continuar el cultivo de la muestra mediante el método de detección descrito en el punto 3.2.

Si se acuerdan normas ISO sobre la preparación de muestras adecuadas para la detección de salmonela, se aplicarán dichas normas en sustitución de las mencionadas en los puntos 3.1.2, 3.1.3 y 3.1.4 sobre la preparación de muestras.

3.2.   Método de detección

La detección de los serotipos de salmonela pertinentes se llevará a cabo de conformidad con la modificación 1 de la norma EN/ISO 6579-2002/Amd1:2007, denominada «Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal. Método horizontal para la detección de Salmonella spp. — Modificación 1: Anexo D: Detección de Salmonella spp. en heces de animales y en muestras ambientales en la etapa de producción primaria».

Con respecto a las muestras de calzas, de polvo y de otra materia fecal que se mencionan en el punto 3.1, se pueden mezclar los caldos de enriquecimiento de agua de peptona tamponada incubados para futuros cultivos. Para ello, se incubarán ambas muestras en agua de peptona tamponada según el procedimiento mencionado en el punto 3.1.3. Tomar 1 ml de caldo incubado de cada muestra, mezclarlos bien y, a continuación, tomar 0,1 ml de la mezcla e inocular las placas de medio semisólido Rappaport-Vassiladis modificado (MSRV).

Las muestras en agua de peptona tamponada no deben agitarse ni removerse después de la incubación porque ello liberaría partículas inhibidoras y reduciría el aislamiento resultante en el MSRV.

3.3.   Serotipado

Se procederá al tipado de, como mínimo, una cepa aislada de cada muestra positiva según el esquema de Kaufmann-White.

3.4.   Métodos alternativos

Por lo que respecta a las muestras tomadas a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria, en lugar de los métodos para la preparación de las muestras y los métodos de detección y de serotipado establecidos en los puntos 3.1, 3.2 y 3.3 del presente anexo, podrán utilizarse métodos alternativos si han sido validados conforme a la versión más reciente de la norma EN/ISO 16140.

3.5.   Almacenamiento de las cepas

Se garantizará que se almacena, como mínimo, una cepa aislada de los serotipos de salmonela pertinentes procedente del muestreo realizado dentro de los controles oficiales por nave y por año para su futuro fagotipado o para futuros antibiogramas, utilizando los métodos normales de recogida de cultivos, que deben garantizar la integridad de las cepas durante al menos dos años. Si la autoridad competente así lo decide, también se almacenarán para estos fines cepas procedentes de los muestreos realizados por los explotadores de una empresa alimentaria.

4.   RESULTADOS E INFORMES

Se considerará que una manada reproductora da un resultado positivo a los fines de comprobar el logro del objetivo de la Unión:

—	cuando se haya detectado la presencia de los serotipos de salmonela pertinentes (distintos de las cepas de las vacunas) en una o más muestras tomadas en la manada, incluso si los serotipos de salmonela pertinentes se detectan en la muestra de polvo, o

—	cuando el muestreo de confirmación realizado dentro de los controles oficiales de conformidad con el punto 2.2.2.2, letra b), no confirme la detección de los serotipos de salmonela pertinentes, pero se hayan detectado en la manada antimicrobianos o inhibidores de crecimiento bacteriano.

Esta norma no será de aplicación en los casos excepcionales descritos en el punto 2.2.2.2, letra c), si el resultado positivo inicial procedente del muestreo realizado a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria no ha sido confirmado por el muestreo realizado dentro de los controles oficiales.

Una manada reproductora que dé positivo se contará una sola vez, independientemente de la frecuencia con que se hayan detectado los serotipos de salmonela pertinentes en dicha manada durante el período de producción o si el muestreo se había llevado a cabo a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria o de la autoridad competente. Sin embargo, si el muestreo durante el período de producción se reparte entre dos años civiles, el resultado correspondiente a cada año se transmitirá por separado.

Los informes comprenderán:

a)	una descripción detallada de las opciones aplicadas en el programa de muestreo y del tipo de muestras tomadas, cuando proceda;

b)	el número total de manadas reproductoras adultas que comprendan, al menos, 250 aves, sometidas a pruebas al menos en una ocasión durante el año de referencia;

c)

los resultados de las pruebas, incluidos: i) el número total de manadas reproductoras que den un resultado positivo por cualquier tipo de salmonela en el Estado miembro, ii) el número de manadas reproductoras que den positivo por al menos uno de los serotipos de salmonela pertinentes, iii) el número de manadas reproductoras que den positivo por cualquier serotipo de salmonela o por salmonela sin especificar (cepas que no se pueden tipar o no serotipadas);

d)	el número de casos en los que la muestra positiva inicial por salmonela procedente del muestreo a iniciativa del explotador de una empresa alimentaria no se vio confirmada por el muestreo realizado dentro de los controles oficiales;

e)	explicaciones de los resultados, en particular por lo que respecta a los casos excepcionales.

Los resultados y cualquier otra información pertinente se incluirán en el informe sobre las tendencias y las fuentes establecido en el artículo 9, apartado 1, de la Directiva 2003/99/CE.