1991R2568 — ES — 04.08.2016 — 029.001

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▼B

REGLAMENTO (CEE) No 2568/91 DE LA COMISIÓN

de 11 de julio de 1991

relativo a las características de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva y sobre sus métodos de análisis

▼M20

Artículo 1

1.  Se considerarán aceites de oliva vírgenes, con arreglo a las letras a) y b) del punto 1 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, los aceites cuyas características se ajusten a las indicadas, respectivamente, en los puntos 1 y 2 del anexo I del presente Reglamento.

2.  Se considerará aceite de oliva lampante, con arreglo a la letra c) del punto 1 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 3 del anexo I del presente Reglamento.

3.  Se considerará aceite de oliva refinado, con arreglo al punto 2 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 4 del anexo I del presente Reglamento.

▼C4

4.  Se considerará aceite de oliva que contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y aceites de oliva vírgenes, con arreglo al punto 3 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 5 del anexo I del presente Reglamento.

▼M20

5.  Se considerará aceite de orujo de oliva crudo, con arreglo al punto 4 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 6 del anexo I del presente Reglamento.

6.  Se considerará aceite de orujo de oliva refinado, con arreglo al punto 5 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 7 del anexo I del presente Reglamento.

7.  Se considerará aceite de orujo de oliva, con arreglo al punto 6 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 8 del anexo I del presente Reglamento.

▼M26

Artículo 2

1.  Las características de los aceites, previstas en el anexo I, se determinarán empleando los métodos de análisis siguientes:

▼M28

▼M26

▼M28

▼M26

▼M28 —————

▼M26

2.  La comprobación de las características organolépticas de los aceites de oliva vírgenes por parte de las autoridades nacionales o sus representantes correrá a cargo de paneles de catadores autorizados por los Estados miembros.

Las características organolépticas del aceite de oliva mencionado en el apartado 1 se considerarán conformes a la categoría declarada si un panel de catadores autorizado por el Estado miembro interesado confirma dicha clasificación.

►C6  En caso de que el panel autorizado no confirme tal declaración en lo que respecta a las características organolépticas, las autoridades nacionales o sus representantes ordenarán que se proceda, a petición del interesado, a realizar sin dilación dos análisis contradictorios por otros paneles autorizados; al menos uno de ellos deberá ser realizado por un panel de cata autorizado por el Estado miembro productor. ◄ Las características en cuestión se considerarán conformes a las declaradas si ambos análisis contradictorios confirman la clasificación declarada. En caso contrario, los gastos generados por los análisis contradictorios, sin perjuicio de otras posibles sanciones, correrán por cuenta del interesado.

3.  En lo tocante a la comprobación por las autoridades nacionales o sus representantes de las características de los aceites previstas en el apartado 1, la toma de muestras se efectuará de acuerdo con las normas internacionales EN ISO 661 y EN ISO 5555 relativas a la preparación de las muestras y al muestreo, respectivamente. Ahora bien, no obstante lo dispuesto en el punto 6.8 de la norma EN ISO 5555, respecto de los lotes de esos aceites presentados en envases inmediatos, la toma de muestras se realizará de acuerdo con el anexo I bis del presente Reglamento. En el caso de los aceites a granel para los que la toma de muestras no se pueda efectuar conforme a EN ISO 5555, dicha toma de muestras se realizará de conformidad con las instrucciones proporcionadas por la autoridad competente del Estado miembro.

Sin perjuicio de lo dispuesto en la norma EN ISO 5555 y en el capítulo 6 de la norma EN ISO 661, las muestras deberán guardarse lo antes posible en un lugar protegido de la luz y de las elevadas temperaturas y enviarse al laboratorio para la realización de los análisis a más tardar el quinto día hábil siguiente al de la toma de las muestras; de lo contrario, estas se deberán guardar de tal modo que no resulten deterioradas o dañadas durante el transporte o el almacenaje antes de ser enviadas al laboratorio.

4.  Para la comprobación prevista en el apartado 3, los análisis a que se refieren los anexos II, III, IX, XII y XX así como, en su caso, los análisis contradictorios previstos por las legislaciones nacionales, se efectuarán antes de la fecha de caducidad mínima en el caso de los productos envasados. En el caso de la toma de muestras de aceites a granel, los análisis deberán llevarse a cabo a más tardar seis meses después del mes en que se tomó la muestra.

No se aplicará ningún plazo a los demás análisis previstos por el presente Reglamento.

Excepto si la toma de muestras se ha efectuado menos de dos meses antes de la fecha de caducidad mínima, en caso de que los resultados de los análisis no se ajusten a las características de la categoría de aceite de oliva o de orujo de oliva declarada, se notificará este extremo al interesado como muy tarde un mes antes de que finalice el plazo mencionado en el párrafo primero.

5.  Con vistas a la determinación de las características de los aceites de oliva efectuada con arreglo a los métodos contemplados en el apartado 1, párrafo primero, los resultados de los análisis se compararán directamente con los límites fijados en el presente Reglamento.

▼M25

Artículo 2 bis

1.  A efectos del presente artículo, por «aceite de oliva comercializado» se entenderá la cantidad total de aceite de oliva y aceite de orujo de oliva de un determinado Estado miembro que se consuma en dicho Estado miembro o se exporte fuera del mismo.

2.  Los Estados miembros se cerciorarán de que los controles de conformidad se lleven a cabo de forma selectiva, sobre la base de un análisis de riesgos, y con la frecuencia apropiada, con el fin de garantizar que el aceite de oliva comercializado se ajusta a la categoría declarada.

3.  Los criterios para evaluar el riesgo podrán incluir:

4.  Los Estados miembros establecerán previamente:

Se efectuará anualmente al menos un control de conformidad por cada mil toneladas de aceite de oliva comercializado en el Estado miembro.

5.  Los Estados miembros verificarán el cumplimiento:

▼M19 —————

▼M25

Artículo 3

En caso de que se compruebe que un aceite no corresponde a la descripción de su categoría, el Estado miembro de que se trate aplicará, sin perjuicio de cualesquiera otras sanciones, sanciones efectivas, proporcionadas y disuasorias que se determinarán en función de la gravedad de la irregularidad detectada.

En caso de que en los controles se detecten irregularidades importantes, los Estados miembros aumentarán la frecuencia de los controles en relación con la etapa de comercialización, categoría de aceite, origen, u otros criterios.

▼M5

Artículo 4

▼M19

1.  Para la apreciación y el control de las características organolépticas por parte de las autoridades nacionales o sus representantes, los Estados miembros podrán constituir paneles de catadores autorizados.

Las condiciones de autorización serán establecidas por los Estados miembros con los objetivos siguientes:

Todos los Estados miembros comunicarán a la Comisión la lista de los paneles de catadores autorizados, así como las demás medidas adoptadas de conformidad con el presente apartado.

▼M5

2.  En caso de que un Estado miembro tenga dificultades para crear un panel de catadores en su territorio, podrá recurrir a un panel de degustadores autorizado de otro Estado miembro.

3.  Cada Estado miembro elaborará la lista de los paneles de catadores creados por organizaciones profesionales o interprofesionales en las condiciones fijadas en el apartado 1 y velará por el cumplimiento de esas condiciones.

▼M19 —————

▼B

Artículo 6

1.  El contenido en aceite de orujo de aceituna y demás residuos de la extracción del aceite de oliva (códigos NC 2306 90 11 y 2306 90 19 ) se determinará con arreglo al método recogido en el Anexo XV.

2.  El contenido de aceite mencionado en el apartado 1 se expresará como porcentaje del extracto seco en peso.

▼M20

Artículo 7

Serán aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de contaminantes.

En lo que respecta al contenido de disolventes halogenados, los límites para todas las categorías de aceites de oliva son los siguientes:

▼M25

Artículo 7 bis

Las personas físicas o jurídicas y las agrupaciones de personas que posean aceite de oliva y aceite de orujo de oliva desde la extracción en la almazara hasta la fase de embotellado inclusive, para cualesquiera fines profesionales o comerciales, deberán disponer de registros de entradas y salidas para cada categoría de estos aceites.

Los Estados miembros se cerciorarán de que la obligación prevista en el párrafo primero se respeta debidamente.

▼M25

Artículo 8

1.  Los Estados miembros comunicarán a la Comisión las medidas adoptadas en aplicación del presente Reglamento. Informarán a la Comisión de cualquier modificación posterior.

2.  A más tardar el 31 de mayo de cada año, los Estados miembros transmitirán a la Comisión un informe sobre la aplicación del presente Reglamento durante el año civil anterior. El informe contendrá, como mínimo, los resultados de los controles de conformidad efectuados sobre los aceites de oliva y se ajustarán a los modelos que figuran en el anexo XXI.

3.  Las notificaciones contempladas en el presente Reglamento se realizarán de conformidad con el Reglamento (CE) no 792/2009 de la Comisión ( 1 ).

▼B

Artículo 9

Queda derogado el Reglamento (CEE) no 1058/77.

Artículo 10

1.  El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.

No obstante, el método que figura en el Anexo XII se aplicará a partir del ►M1  1 de noviembre de 1992 ◄ , excepto en lo que se refiere a las operaciones relacionadas con la intervención.

▼M5

Dicho método no se aplicará a los aceites de oliva vírgenes envasados antes del 1 de noviembre de 1992.

▼B

El presente Reglamento no se aplicará a los aceites de oliva y de orujo de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento y comercializados hasta el 31 de octubre de 1992.

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.

ANEXOS

Índice

▼M27

ANEXO I

CARACTERÍSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA

Notas:

Apéndice

ÁRBOL DE DECISIONES

Árbol de decisiones del campesterol para los aceites de oliva virgen y virgen extra:

Los restantes parámetros se adaptarán a los límites que establece el presente Reglamento.

Árbol de decisiones del delta-7-estigmastenol para:

Los restantes parámetros se adaptarán a los límites que establece el presente Reglamento.

▼M26

ANEXO I BIS

▼C6

MUESTREO DE ACEITE DE OLIVA O ACEITE DE ORUJO DE OLIVA DISTRIBUIDO EN ENVASES INMEDIATOS

▼M26

Este método de muestreo se aplica a lotes de aceite de oliva o aceite de orujo de oliva que se presenten en envases inmediatos. Se aplicarán distintos métodos de muestreo, en función de si los envases inmediatos superan o no los 5 litros.

Se entenderá por «lote» un conjunto de unidades de venta que se hayan producido, fabricado y envasado en circunstancias tales que el aceite contenido en cada una de dichas unidades de venta se considere homogéneo en lo que se refiere a sus características analíticas. La individualización de un lote debe hacerse de conformidad con la Directiva 2011/91/UE del Parlamento Europeo y del Consejo ( 2 ).

Se entenderá por «porción» la cantidad de aceite que contiene un envase inmediato tomada aleatoriamente del lote.

1.   CONTENIDO DE UNA MUESTRA ELEMENTAL

1.1.    Envases inmediatos de 5 litros como máximo

Se entenderá por «muestra elemental» para los envases inmediatos de 5 litros como máximo el número de porciones tomadas de un lote y de acuerdo con el cuadro 1.

Cada Estado miembro podrá incrementar el número de envases a los que se hace referencia en el cuadro 1 que constituyan una muestra elemental, en función de sus necesidades específicas (por ejemplo, en caso de valoración organoléptica por parte de un laboratorio distinto del que llevó a cabo los análisis químicos, análisis contradictorios, etc.).

1.2.    Envases inmediatos de más de 5 litros

Se entenderá por «muestra elemental» para los envases inmediatos de más de 5 litros una parte representativa del total de porciones, obtenida mediante un proceso de reducción y de acuerdo con el cuadro 2. ►C6  La muestra elemental debe estar constituida por varios ejemplares. ◄

▼C6

Se entenderá por «ejemplar» cada uno de los envases que componen la muestra elemental.

▼M26

Con objeto de reducir el volumen del muestreo de envases inmediatos, el contenido de las porciones de muestreo es homogeneizado para preparar la muestra elemental. Las partes de las distintas porciones se pasan a un recipiente común para ser homogeneizadas mediante agitación, con el fin de evitar al máximo el contacto con el aire.

▼C6

El contenido de la muestra elemental se pasará a una serie de envases con una capacidad mínima de 1,0 litro, cada una de las cuales constituye un ejemplar de la muestra elemental.

▼M26

Cada Estado miembro puede incrementar el número de muestras elementales en función de sus necesidades específicas (por ejemplo, la valoración organoléptica por parte de un laboratorio distinto del que llevó a cabo los análisis químicos, análisis contradictorios, etc.).

Cada uno de los envases debe rellenarse de forma que se minimice la capa de aire superior, para posteriormente ser cerrado y sellado de forma que garantice que el producto es inalterable.

▼C6

Estos ejemplares deben estar etiquetados para garantizar su correcta identificación.

▼M26

2.   ANÁLISIS Y RESULTADOS

3.   VERIFICACIÓN DE LA CATEGORÍA DE LOTE

ANEXO I ter

ESQUEMA DE DECISIONES PARA LA COMPROBACIÓN DE LA CONFORMIDAD DE UNA MUESTRA DE ACEITE DE OLIVA CON LA CATEGORÍA DECLARADA

Cuadro 1

Cuadro 2

Cuadro 3

Apéndice 1

▼M29

ANEXO II

DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS LIBRES, MÉTODO EN FRÍO

1.   OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

El presente método describe la determinación de los ácidos grasos libres en los aceites de oliva y en los aceites de orujo de oliva. El contenido en ácidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada como el porcentaje de ácido oleico.

2.   PRINCIPIO

Disolución de la muestra en una mezcla de disolventes y valoración de los ácidos grasos libres mediante una solución de hidróxido potásico o hidróxido sódico.

3.   REACTIVOS

Todos los reactivos deben ser de calidad analítica reconocida y el agua utilizada debe ser agua destilada o de una pureza equivalente.

4.   MATERIAL

Material habitual de laboratorio, y en particular:

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.    Preparación de la muestra de ensayo

En caso de que la muestra esté turbia, debe filtrarse.

5.2.    Tamaño de la muestra

Tomar una muestra, en función de la acidez prevista, de acuerdo con el cuadro siguiente:

Pesar la muestra en el matraz Erlenmeyer (4.2).

5.3    Determinación

Disolver la muestra (5.2) en 50 a 100 ml de la mezcla de éter dietílico y etanol (3.1), previamente neutralizada.

Valorar, agitando, con la solución de hidróxido potásico (o de hidróxido sódico) de 0,1 M (3.2) (véase nota 4) hasta el viraje del indicador (la coloración del indicador coloreado debe permanecer al menos durante 10 segundos).

Efectuar una segunda determinación únicamente si el primer resultado es superior al límite especificado para la categoría del aceite.

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

La acidez, expresada en porcentaje de ácido oleico en peso, es igual a:

siendo:

El ácido oleico se declara como sigue:

▼B

ANEXO III

DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE PERÓXIDOS

1.   OBJETO

La presente norma describe un método para la determinación del índice de peróxidos de los aceites y grasas.

2.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

La presente norma es aplicable a los aceites y grasas animales y vegetales.

3.   DEFINICIÓN

El índice de peróxidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de oxígeno activo por kg de grasa) de peróxidos en la muestra que ocasionan la oxidación del yoduro potásico en las condiciones de trabajo descritas.

4.   PRINCIPIO

La muestra problema, disuelta en ácido acético y cloroformo, se trata con solución de yoduro potásico. El yodo liberado se valora con solución valorada de tiosulfato sódico.

5.   APARATOS

Todo el material utilizado estará exento de sustancias reductoras u oxidantes.

Nota:

No engrasar las superficies esmeriladas.

6.   REACTIVOS

7.   MUESTRA

La muestra se tomará y almacenará al abrigo de la luz, y se mantendrá refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y herméticamente cerrados con tapones de vidrio esmerilado o de corcho.

8.   PROCEDIMIENTO

El ensayo se realizará con luz natural difusa o con luz artificial. Pesar con precisión de 0,001 g en una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un matraz (5.2) una cantidad de muestra en función del índice de peróxidos que se presuponga, con arreglo al cuadro siguiente:

Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la muestra problema. Añadir 10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rápidamente la muestra problema mediante agitación. Añadir 15 ml de ácido acético (6.2) y, a continuación, 1 ml de solución de yoduro potásico (6.3). Cerrar rápidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscuridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida entre 15 y 25 °C.

Añadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solución de tiosulfato sódico (6.4) (solución 0,002 N si se presuponen valores inferiores a 12 y solución 0,01 N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando la solución de almidón (6.5) como indicador.

Efectuar dos determinaciones por muestra.

Realizar simultáneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solución de tiosulfato sódico 0,01 N (6.4), sustituir los reactivos.

9.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El índice de peróxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxígeno activo por kg de grasa se calcula mediante la fórmula siguiente:

siendo:

V : ml de solución valorada de tiosulfato sódico (6.4) empleados en el ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo en blanco.

N : normalidad exacta de la solución de tiosulfato sódico (6.4) empleada.

P : peso, en gramos de la muestra problema.

El resultado será la media artimética de las dos determinaciones efectuadas.

▼M21

ANEXO IV

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

1.   OBJETO

El presente método describe un procedimiento para la determinación del contenido de ceras en los aceites de oliva. Las ceras se separan en función del número de átomos de carbono. El método puede utilizarse, en particular, para distinguir el aceite de oliva obtenido por presión del obtenido mediante extracción (aceite de orujo de oliva).

2.   PRINCIPIO

La materia grasa, a la que se habrá añadido un patrón interno adecuado, se fracciona mediante cromatografía en columna de gel de sílice hidratado; se recupera la fracción eluida en primer lugar en las condiciones de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicéridos) y, a continuación, se analiza directamente mediante cromatografía de gases en columna capilar.

3.   MATERIAL

4.   REACTIVOS

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Preparación de la columna cromatográfica

Suspender 15 g de gel de sílice (4.1) en n-hexano (4.2) e introducirlo en la columna (3.2). Completar la sedimentación espontánea con ayuda de un vibrador eléctrico (3.5), a fin de obtener una capa cromatográfica más homogénea. Hacer pasar 30 ml de n-hexano para eliminar las posibles impurezas. Pesar exactamente con ayuda de la balanza (3.8) 500 mg de la muestra en el matraz Erlenmeyer de 25 ml (3.1) y añadir la cantidad adecuada del patrón interno (4.5), en función del contenido previsto de ceras; por ejemplo, añadir 0,1 mg de araquidato de laurilo si se trata de aceite de oliva y de 0,25 a 0,50 mg si se trata de aceite de orujo. Transferir la muestra así preparada a la columna cromatográfica, con ayuda de dos porciones, cada una de 2 ml, de n-hexano (4.2).

Dejar fluir el disolvente hasta que se sitúe a 1 mm por encima del nivel superior del absorbente, y a continuación hacer pasar 70 ml más de n-hexano para eliminar los n-alcanos presentes de forma natural. Comenzar entonces la elución cromatográfica recogiendo 180 ml de la mezcla de n-hexano/éter etílico en la proporción 99:1, manteniendo un flujo aproximado de 15 gotas cada 10 segundos. La elución de la muestra debe efectuarse a una temperatura ambiente de 22 °C ± 4 °C.

Notas:

Secar la fracción resultante en el rotavapor (3.6) hasta que se haya eliminado prácticamente todo el disolvente. Eliminar los dos últimos mililitros del disolvente con ayuda de una débil corriente de nitrógeno; añadir a continuación de 2 a 4 ml de n-heptano.

5.2.   Cromatografía de gases

5.2.1.   Operaciones preliminares

Instalar la columna en el cromatógrafo de gases (3.3), conectando el terminal de entrada al sistema en columna y el terminal de salida al detector. Efectuar los controles generales del cromatógrafo de gases (funcionamiento de los circuitos de gas, eficacia del detector y del registrador, etc.).

Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla. Hacer pasar a través de la columna una corriente ligera de gas y, a continuación, encender el cromatógrafo de gases. Calentar gradualmente hasta alcanzar, al cabo de unas 4 horas, la temperatura de 350 °C. Mantener esta temperatura durante al menos 2 horas y, a continuación, ajustar el aparato a las condiciones de trabajo [regulación del flujo del gas, encendido de la llama, conexión con el registrador electrónico (3.3.4), regulación de la temperatura del recinto para la columna, regulación del detector, etc.] y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para efectuar el análisis. La línea de base deberá ser lineal, sin picos de ningún tipo ni deriva.

Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna no son correctas; una deriva positiva indica que la columna no ha sido acondicionada adecuadamente.

5.2.2.   Elección de las condiciones de trabajo

En general, las condiciones de trabajo deben ser las siguientes:

Estas condiciones pueden modificarse en función de las características de la columna y del cromatógrafo de gases, de modo que se obtenga la separación de todas las ceras, una resolución satisfactoria de los picos (véase la figura) y un tiempo de retención del patrón interno C32 de 18 ± 3 minutos. El pico más representativo de las ceras debe haber medido al menos el 60 % del fondo de la escala.

Determinar los parámetros de integración de los picos de manera que se obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos considerados.

Nota:Ante lo elevado de la temperatura final, se admite una deriva positiva que no debe ser superior al 10 % del fondo de la escala.

5.3.   Realización del análisis

Tomar 1 μl de la solución con la microjeringa de 10 μl; sacar el émbolo de la jeringa hasta que la aguja esté vacía. Introducir la aguja en el sistema de inyección e inyectar rápidamente después de 1 o 2 segundos; dejar pasar unos 5 segundos y extraer lentamente la aguja.

Llevar a cabo el registro hasta que las ceras se hayan eluido completamente.

La línea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas.

5.4.   Identificación de los picos

Identificar los distintos picos sobre la base de los tiempos de retención, comparándolos con mezclas de ceras analizadas en las mismas condiciones y cuyos tiempos de retención sean conocidos.

La figura presenta un cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen.

5.5.   Determinación cuantitativa

Calcular con ayuda del integrador las áreas de los picos correspondientes al patrón interno y a los ésteres alifáticos de C40 a C46.

Determinar el contenido en ceras de cada uno de los ésteres, en mg/kg de materia grasa, aplicando la siguiente fórmula:

siendo:

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Indicar la suma de los contenidos de las distintas ceras de C40 a C46, en mg/kg de materia grasa (ppm).

Nota:Los componentes que se deben cuantificar hacen referencia a los picos con un número par de carbonos, comprendidos entre los ésteres C40 y C46, según el ejemplo del cromatograma de las ceras del aceite de oliva indicado en la figura siguiente. Si el éster C46 aparece dos veces, para identificarlo conviene analizar la fracción de las ceras de un aceite de orujo de oliva en que el pico C46 sea fácil de identificar por ser claramente mayoritario.

Los resultados deben expresarse con una cifra decimal.

Figura

Cromatograma de las ceras de un aceite de oliva ( 3 )

Leyenda:

Apéndice

Determinación de la velocidad lineal del gas

Inyectar de 1 a 3 μl de metano (o propano) en el cromatógrafo de gases, después de haberlo ajustado a las condiciones de trabajo normales. Cronometrar el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de su inyección hasta la aparición del pico (tM).

La velocidad lineal, en cm/s, viene dada por la fórmula L/tM, siendo L la longitud de la columna expresada en cm y tM el tiempo cronometrado en segundos.

▼M26

ANEXO V

DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DEL CONTENIDO DE ESTEROLES Y DIALCOHOLES TRIPERPÉNICOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

1.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

El método describe un procedimiento para determinar el contenido individual y total de esteroles y de dialcoholes triterpénicos de los aceites de oliva y de orujo.

2.   PRINCIPIO

Los aceites, con α-colestanol añadido como patrón interno, se saponifican con hidróxido potásico en solución etanólica y la materia insaponificable se extrae entonces con éter de etilo.

La fracción de esteroles y de dialcoholes triterpénicos se separa de la materia insaponificable mediante cromatografía en capa fina con una placa de gel de sílice básico. Las fracciones recuperadas del gel de sílice se transforman en éteres de trimetilsililo y se analizan entonces con cromatografía de gases con columna capilar.

3.   APARATOS

El equipo de laboratorio habitual y, en particular, lo siguiente:

4.   REACTIVOS

5.   PROCEDIMIENTO

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

▼M28

▼M26

Apéndice

Determinación de la velocidad lineal del gas

Inyectar en el cromatógrafo de gases, preparado para trabajar en condiciones normales, de 1 a 3 μl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de la inyección hasta el momento en que aparece el pico (tM).

La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.

Figura 1

Cromatografía de gases de la fracción de esteroles y dialcoholes triperpénicos de aceite de oliva lampante (con ayuda de patrón interno)

Figura 2

Cromatografía de gases de la fracción de esteroles y dialcoholes triperpénicos de aceite de oliva refinado (con ayuda de patrón interno)

Figura 3

Placa cromatográfica de aceite de orujo de oliva en la que se observa el área que debe rasparse para determinar el contenido de esteroles y dialcoholes triperpénicos

▼M26 —————

▼M21

ANEXO VII

DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE MONOPALMITATO DE 2-GLICERILO

1.   OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

El presente método describe el procedimiento analítico para la determinación del porcentaje de ácido palmítico en posición 2 de los triglicéridos mediante la evaluación del monopalmitato de 2-glicerilo.

Este método es aplicable a los aceites vegetales líquidos a temperatura ambiente (20 °C).

2.   PRINCIPIO

Tras la preparación, la muestra de aceite se somete a la acción de la lipasa pancreática: la hidrólisis parcial y específica en las posiciones 1 y 3 de las moléculas de triglicéridos implica la aparición de monoglicéridos en posición 2. Se determina el porcentaje de monopalmitato de 2-glicerilo en la fracción monoglicerídica, previa sililación, mediante cromatografía de gases en columna capilar.

3.   EQUIPO Y MATERIAL HABITUAL

4.   REACTIVOS

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Preparación de la muestra

5.2.   Hidrólisis con lipasa pancreática

5.3.   Preparación de los derivados sililados y de la cromatografía de gases

5.4.   Cromatografía de gases

Las condiciones de trabajo son las siguientes:

5.4.1.   Identificación de los picos

Los distintos monoglicéridos se identifican en función de sus tiempos de retención obtenidos, comparándolos con los correspondientes a las mezclas patrón de monoglicéridos analizadas en las mismas condiciones.

5.4.2.   Determinación cuantitativa

El área de cada pico se calcula mediante un integrador electrónico.

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El porcentaje de monopalmitato de glicerilo se calcula a partir de la relación entre el área del pico correspondiente y la suma de las áreas de los picos de todos los monoglicéridos (véase la figura 2), según la fórmula siguiente:

Monopalmitato de glicerilo (%):

siendo:

El resultado debe expresarse con una cifra decimal.

7.   INFORME DEL ANÁLISIS

El informe del análisis deberá especificar:

Figura 1

Cromatograma de los productos de la reacción de sililación obtenidos por acción de la lipasa en un aceite de oliva refinado con la adición de un 20 % de aceite esterificado (100 %)

Leyenda: «acides gras libres» = Ácidos grasos libres; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = Aceite de oliva refinado + 20 % aceite de oliva esterificado; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitina; «1-2 mono C18 insat.» = 1,2-mono C18 insat.; «Squalene» = Escualeno; «1-2 monopalmitoléine» = 1,2-monopalmitoleína; «Scan» = Lectura.

Figura 2

Cromatograma de:

A)

aceite de oliva no esterificado, previo tratamiento con lipasa y sililación; en estas condiciones (columna capilar de 8 a 12 m), la fracción de ceras se eluye al mismo tiempo que la fracción de diglicéridos o poco después. Tras el tratamiento con lipasa, el contenido en triglicéridos no debería superar el 15 % Leyenda: 1 = Ácidos grasos libres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-monopalmitina ** = Triglicérido C54

Cromatograma de:

B)

aceite esterificado previo tratamiento con lipasa y sililación; en estas condiciones (columna capilar de 8 a 12 m), la fracción de ceras se eluye al mismo tiempo que la fracción de diglicéridos o poco después. Tras el tratamiento con lipasa, el contenido en triglicéridos no debería superar el 15 %. Leyenda: 1 = Ácidos grasos libres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-monopalmitina ** = Triglicérido C54

8.   NOTAS

PREPARACIÓN DE LA LIPASA

En el comercio se encuentran lipasas con una actividad satisfactoria. También es posible prepararlas en el laboratorio de la forma siguiente:

Enfriar a 0 °C 5 kg de páncreas fresco de cerdo. Retirar la grasa sólida y el tejido conjuntivo que lo rodea y triturarlo en un molino de cuchillas hasta obtener una pasta fluida. Agitar dicha pasta durante 4-6 horas con 2,5 l de acetona anhidra y después centrifugar. Extraer el residuo tres veces más con el mismo volumen de acetona anhidra, después dos veces con una mezcla de acetona/éter dietílico 1/1 (V/V), y otras dos veces con éter dietílico.

Secar el residuo durante 48 horas en vacío para obtener un polvo estable que deberá conservarse en el refrigerador y al abrigo de la humedad.

CONTROL DE LA ACTIVIDAD LIPÁSICA

Preparar una emulsión de aceite de oliva de la forma siguiente:

Agitar en un mezclador durante 10 minutos una mezcla constituida por 165 ml de una solución de goma arábiga de 100 g/l, 15 gramos de hielo picado y 20 ml de un aceite de oliva previamente neutralizado.

Poner en un vaso de precipitados de 50 ml sucesivamente 10 ml de la emulsión anterior, 0,3 ml de una solución de colato de sodio de 0,2 g/ml y 20 ml de agua destilada.

Colocar el vaso en un termostato regulado a 37 °C; introducir en el vaso los electrodos del pH-metro y el agitador de hélice.

Por medio de una bureta, añadir gota a gota una solución de hidróxido de sodio 0,1 N hasta la obtención de un pH de 8,3.

Añadir un volumen de suspensión de polvo de lipasa en agua (0,1 g/ml de lipasa). Desde el momento en que el pH-metro indique un pH de 8,3, poner en marcha el cronómetro y añadir la solución de hidróxido de sodio gota a gota, al ritmo necesario para mantener el pH en el valor de 8,3. Anotar cada minuto el volumen de solución consumido.

Llevar los datos obtenidos a un sistema de coordenadas, poniendo en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros de solución alcalina 0,1 N consumidos para mantener el pH constante. Debe obtenerse un gráfico lineal.

La actividad de la lipasa, medida en unidades de lipasa por mg, viene dada por la fórmula siguiente:

siendo:

La unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima que libera 10 micro-equivalentes de ácido por minuto.

▼M20 —————

▼M28

ANEXO IX

PRUEBA ESPECTROFOTOMÉTRICA EN EL ULTRAVIOLETA

INTRODUCCIÓN

El examen espectrofotométrico en el ultravioleta puede proporcionar indicaciones sobre la calidad de una materia grasa, su estado de conservación y las modificaciones inducidas en ella por los procesos tecnológicos. Las absorciones en las longitudes de onda indicadas en el método se deben a la presencia de sistemas diénicos y triénicos conjugados que resultan de los procesos de oxidación y/o de las prácticas de refinería. Los valores de estas absorciones se expresan en extinciones específicas

(extinción de una solución de la materia grasa al 1 % en el disolvente determinado, en un espesor de 10 mm) que se expresará convencionalmente como K (también denominado «coeficiente de extinción»).

1.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este anexo describe el procedimiento de ejecución de una prueba espectrofotométrica del aceite de oliva en la región ultravioleta.

2.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

Se disuelve una muestra en el disolvente requerido y se determina la absorción de la solución a las longitudes de onda prescritas, respecto al disolvente puro.

Las extinciones específicas a 232 nm y 268 nm en isooctano o a 232 nm y 270 nm en ciclohexano se calculan para una concentración del 1 % p/v en una cubeta de 10 mm.

3.   EQUIPO

4.   REACTIVOS

Durante el análisis, a menos que se indique lo contrario, deben utilizarse únicamente reactivos de calidad analítica reconocida y agua destilada, desmineralizada o de una pureza equivalente.

Disolvente: iso-octano (2,2,4-trimetilpentano) para la medición a 232 nm y 268 nm o ciclohexano para la medición a 232 nm y 270 nm, con una absorbencia inferior a 0,12 a 232 nm e inferior a 0,05 a 270 nm frente a agua destilada, medida en una cubeta de 10 mm.

5.   PROCEDIMIENTO

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

ANEXO X

DETERMINACIÓN DE ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRASOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES

1.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este anexo ofrece orientación sobre la determinación de ácidos grasos libres y unidos mediante cromatografía de gases en las grasas y aceites vegetales tras su conversión en ésteres metílicos de ácidos grasos.

Los ácidos grasos unidos de los triglicéridos y, en función del método de esterificación, los ácidos grasos libres, se convierten en ésteres metílicos de ácidos grasos, que se determinan mediante cromatografía de gases con columna capilar.

El método descrito en el presente anexo permite determinar los ésteres metílicos de ácidos grasos de C12 a C24, incluidos los ésteres metílicos de ácidos grasos saturados, cis y trans monoinsaturados y cis y trans poliinsaturados.

2.   PRINCIPIO

La cromatografía de gases (CG) se utiliza para el análisis cuantitativo de los ésteres metílicos de ácidos grasos. Los ésteres metílicos de ácidos grasos se preparan con arreglo a la Parte A. A continuación, se inyectan y evaporan dentro del inyector. La separación de los ésteres metílicos de ácidos grasos se lleva a cabo en columnas analíticas de polaridad y longitud específicas. Para detectar los ésteres metílicos de ácidos grasos se utiliza un detector de ionización de llama (DIL). Las condiciones del análisis figuran en la Parte B.

Podrá utilizarse hidrógeno o helio como gas portador (fase móvil) en la cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos con el DIL. El hidrógeno acelera la separación y produce picos más fuertes. La fase estacionaria es una capa microscópica de una fina película líquida en una superficie sólida inerte de sílice fundida.

A medida que pasan a través de la columna capilar, los compuestos volatilizados que se analizan interactúan con la fase estacionaria recubriendo la superficie interior de la columna. Debido a la distinta interacción de los compuestos, estos se eluyen en momentos diferentes, lo que se conoce como tiempo de retención del compuesto para un conjunto determinado de parámetros de análisis. La comparación de los tiempos de retención se utiliza para identificar los diferentes compuestos.

PARTE A

PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS GRASOS DEL ACEITE DE OLIVA Y DEL ACEITE DE ORUJO DE OLIVA

1.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

Esta parte especifica la preparación de los ésteres metílicos de los ácidos grasos. Incluye los métodos para preparar ésteres metílicos de los ácidos grasos de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva.

2.   CAMPO DE APLICACIÓN

La preparación de los ésteres metílicos de ácidos grasos de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva se lleva a cabo por transesterificación con solución metanólica de hidróxido de potasio a temperatura ambiente. La necesidad de purificación de la muestra antes de la transesterificación depende del contenido de ácidos grasos libres de la muestra y del parámetro analítico que se vaya a determinar; puede elegirse en función de la tabla siguiente:

3.   METODOLOGÍA

3.1.    Transesterificación con solución metanólica de hidróxido de potasio a temperatura ambiente.

3.1.1.    Principio

Los ésteres metílicos se forman por transesterificación con una solución metanólica de hidróxido potásico como etapa intermedia antes de que se produzca la saponificación.

3.1.2.    Reactivos

3.1.3.    Equipo

3.1.4.    Purificación de las muestras de aceite

Cuando sea necesario, las muestras se purificarán pasando el aceite a través de un cartucho de gel de sílice para extracción en fase sólida. Se coloca un cartucho de gel de sílice (3.1.2.8) en un aparato de elución en vacío y se lava con 6 ml de hexano (3.1.2.2); el lavado se realiza sin vacío. A continuación, se introduce en la columna una solución de aceite (0,12 g aproximadamente) en 0,5 ml de hexano (3.1.2.2). Después se eluye con 10 ml de hexano/éter dietílico (87:13 v/v) (3.1.2.6). Se homogeneiza la totalidad de los eluidos y se divide en dos alícuotas similares. Una alícuota se evapora hasta sequedad en un evaporador rotatorio a presión reducida y a temperatura ambiente. El residuo se disuelve en 1 ml de heptano y la solución queda lista para el análisis de ácidos grasos por CG. La segunda alícuota se evapora y el residuo se disuelve en 1 ml de acetona para el análisis de los triglicéridos mediante HPLC si es necesario.

3.1.5.    Procedimiento

En un tubo de rosca de 5 ml (3.1.3.1), pesar aproximadamente 0,1 g de la muestra de aceite. Añadir 2 ml de heptano (3.1.2.2) y agitar. Añadir 0,2 ml de la solución metanólica de hidróxido potásico (3.1.2.7), poner el tapón provisto de junta de PTFE, cerrar bien y agitar enérgicamente durante 30 segundos. Dejar reposar hasta que la parte superior de la solución quede clara. Decantar la capa superior, que es la que contiene los ésteres metílicos. La solución de heptano está lista para inyectarse en el cromatógrafo. Es aconsejable mantener la solución en el frigorífico hasta el momento de realizar el análisis cromatográfico. No se recomienda guardar la solución durante más de 12 horas.

PARTE B

ANÁLISIS DE ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRASOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES

1.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

Esta parte proporciona orientaciones generales para utilizar la cromatografía de gases en columna capilar para determinar la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos obtenidos con arreglo al método especificado en la Parte A.

El método no es aplicable a los ácidos grasos polimerizados.

2.   REACTIVOS

2.1.    Gas portador

Gas inerte (helio o hidrógeno), perfectamente desecado y que contenga menos de 10 mg/kg de oxígeno.

2.2.    Gases auxiliares

2.3.    Patrón de referencia

Una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos puros, o los ésteres metílicos de una grasa de composición conocida y, preferentemente, similar a la de la materia grasa objeto de análisis. Los isómeros cis y trans de ésteres metílicos octadecenoicos, octadecadienoicos y octadecatrienoicos son útiles para la identificación de isómeros trans de ácidos insaturados.

Deberá evitarse la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.

3.   INSTRUMENTAL

Las normas que figuran a continuación se refieren al equipo ordinario para cromatografía de gases, utilizando columnas capilares y un detector de ionización de llama.

3.1.    Cromatógrafo de gases

El cromatógrafo de gases constará de los siguientes elementos:

3.1.1.    Sistema de inyección

Utilizar un sistema de inyección con columnas capilares; en este caso, el sistema de inyección deberá estar especialmente diseñado para poder operar con esa clase de columnas. Podrá utilizarse un inyector con división de flujo o un inyector en columna sin fraccionamiento.

3.1.2.    Horno

El horno podrá calentar la columna capilar a 260 °C como mínimo y mantener dicha temperatura con una oscilación máxima de 0,1 °C. Este último requisito es especialmente importante si se utiliza una columna de sílice fundida.

Se recomienda emplear en todos los casos un sistema de calentamiento programado, sobre todo en el caso de ácidos grasos con menos de 16 átomos de carbono.

3.1.3.    Columna capilar

3.1.4.    Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.

3.2.    Jeringa

Tendrá una capacidad máxima de 10 μl y estará graduada en 0,1 μl.

3.3.    Sistema de recopilación de datos

Sistema de recopilación de datos conectado en línea con los detectores y con un programa de software adecuado para la integración y normalización de los picos.

4.   PROCEDIMIENTO

Las operaciones descritas en los puntos 4.1 a 4.3 solo son válidas si se emplea un detector de ionización de llama.

4.1.    Condiciones de ensayo:

4.1.1.    Selección de las condiciones de funcionamiento óptimas para las columnas capilares

Debido a la eficacia y permeabilidad de las columnas capilares, la separación de los constituyentes y la duración del análisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la columna. Por lo tanto, será necesario optimizar las condiciones de funcionamiento mediante el ajuste de este parámetro (o la simple pérdida de carga de la columna) dependiendo de si el objetivo es mejorar la separación o la velocidad de análisis.

Las siguientes condiciones han demostrado ser adecuadas para la separación de los ésteres metílicos de ácidos grasos (C4 a C26). En el apéndice B se muestran ejemplos de cromatogramas:

4.1.2.    Determinación de la resolución (véase el apéndice A)

Calcular la resolución, R, de dos picos vecinos I y II, utilizando la fórmula:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) o R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (Farmacopea de los Estados Unidos),

O

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II)))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Farmacopea japonesa), EP (Farmacopea europea), BP (Farmacopea británica))

donde:

Si ω(I) ≈ ω(II), calcular R empleando las fórmulas siguientes:

R = (dr ( II ) – d r(I))/ω = (dr ( II ) – d r(I))/4σ

donde:

σ es la desviación estándar (consulte el apéndice A, Figura 1).

Si la distancia dr entre los dos picos d r(II) - d r(I) es igual a 4σ, el factor de resolución es R = 1.

Si dos picos no están completamente separados, las tangentes a los puntos de inflexión de los dos picos se intersecan en el punto C. Para separar completamente los dos picos, la distancia entre los dos debe ser igual a:

d r(II) - d r(I) = 6 σ siendo R = 1,5 (véase el apéndice A, figura 3).

5.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

5.1.    Análisis cualitativo

Identificar los picos de ésteres metílicos de la muestra a partir del cromatograma del apéndice B, figura 1, si es necesario por interpolación o por comparación con los de las mezclas de ésteres metílicos de referencia (tal como se indica en el punto 2.3).

5.2.    Análisis cuantitativo

5.2.1.    Determinación de la composición

Calcular el porcentaje en peso w i de cada éster metílico de ácidos grasos, expresado como un porcentaje en peso de los ésteres metílicos, de la siguiente manera:

5.2.2.    Método de cálculo

5.2.2.1.   Caso general

Calcular el contenido de un componente dado (i) (expresado como porcentaje en masa de ésteres metílicos), mediante la determinación del porcentaje que representa el área de su pico en relación con la suma de las áreas de todos los picos, aplicando la fórmula siguiente:

wi = (Ai/ΣA) × 100

donde:

Los resultados se expresan con dos cifras decimales.

5.2.2.2.   Utilización de factores de corrección

En determinados casos, por ejemplo en presencia de ácidos grasos con menos de ocho átomos de carbono o de ácidos con grupos secundarios, las superficies se corregirán con factores de corrección específicos (Fci). Estos factores se determinarán para cada uno de los instrumentos. Para ello se utilizarán materiales de referencia adecuados con composición de ácidos grasos certificada en el rango correspondiente.

La fórmula que se aplicará a la mezcla de referencia para obtener el porcentaje en peso de los ésteres metílicos de ácidos grasos i es la siguiente:

wi = (mi/Σm) × 100

donde

A partir del cromatograma de la mezcla de referencia, calcular el porcentaje en superficie de los ésteres metílicos de ácidos grasos i del siguiente modo:

wi = (Ai/ΣA) × 100

donde:

El factor de corrección Fc es entonces

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

En el caso de la muestra, el porcentaje en peso de cada éster metílico de ácidos grasos i es:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Los resultados se expresan con dos cifras decimales.

5.2.2.3.   Utilización de patrón interno

En algunos análisis (por ejemplo, cuando no se cuantifican todos los ácidos grasos por estar presentes simultáneamente ácidos de 4 y 6 átomos de carbono y ácidos de 16 y 18 átomos de carbono, o cuando es necesario determinar la cantidad absoluta de un ácido graso en la muestra) es preciso utilizar un patrón interno. Se emplean con frecuencia ácidos grasos de 5, 15 o 17 átomos de carbono. Debe determinarse, si es necesario, el factor de corrección del patrón interno.

El porcentaje en peso del componente i, expresado como ésteres metílicos, se calcula mediante esta fórmula:

wi = (mIS × Fi x Ai)/(m × FIS × AIS)

donde:

Los resultados se expresan con dos cifras decimales.

6.   INFORME DEL ENSAYO

En el informe del análisis se expondrán los métodos utilizados para la preparación de los ésteres metílicos y para la realización del análisis mediante cromatografía de gases. Se mencionarán, asimismo, cualesquiera procedimientos de trabajo que no se especifiquen en el presente método estándar o que se consideren facultativos, así como toda circunstancia que pueda haber influido en los resultados.

El informe del análisis incluirá todos los datos necesarios para la completa identificación de la muestra.

7.   PRECISIÓN

7.1.    Resultados de la prueba interlaboratorios

Los datos de la prueba interlaboratorios con respecto a la precisión del método figura en el anexo C a la norma COI/T. 20/Doc. No 33. Los valores derivados de esta prueba interlaboratorios pueden no ser aplicables a matrices y gamas de concentración distintas de las indicadas aquí.

7.2.    Repetibilidad

La diferencia absoluta entre dos resultados independientes y únicos de una prueba, obtenidos utilizando el mismo método con el mismo material de prueba, en el mismo laboratorio, por el mismo operario, con el mismo equipo, dentro de un breve plazo, no superará en más del 5 % de los casos el valor r que figura en las tablas 1 a 14 del anexo C a la norma COI/T. 20/Doc. No 33.

7.3.    Reproducibilidad

La diferencia absoluta entre dos resultados particulares de una prueba, obtenidos utilizando el mismo método con el mismo material de prueba, en distintos laboratorios, por distintos operarios, con distintos equipos, en más del 5 % de los casos no será mayor que el valor R que figura en las tablas 1 a 14 del anexo C a la norma COI/T. 20/Doc. No 33.

Apéndice A

Figura 1

con anchura ω0,5 a media altura del triángulo (ABC) y anchura b a media altura del triángulo (NPM).

Apéndice B

Figura 1

Perfil cromatográfico de un aceite de orujo de oliva, obtenido con el método de metilación en frío

Los picos cromatográficos corresponden a los ésteres metílicos, excepto aquellos en que se indica otra cosa.

▼B

ANEXO XI

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ►C1  DISOLVENTES ◄ HALOGENADOS VOLÁTILES EN EL ACEITE DE OLIVA

1.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

Análisis por cromatografía en fase gaseosa según la técnica del espacio de cabeza (head space).

2.   EQUIPO

3.   REACTIVOS

►C1  Disolventes ◄ halogenados con una pureza apropiada para su uso en cromatografía en la fase gaseosa.

4.   PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS

▼M26

ANEXO XII

MÉTODO DEL CONSEJO OLEÍCOLA INTERNACIONAL PARA LA VALORACIÓN ORGANOLÉPTICA DE LOS ACEITES DE OLIVA VÍRGENES

▼M28

1.   OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método internacional tiene por finalidad establecer el procedimiento para evaluar las características organolépticas de los aceites de oliva vírgenes según se define en el punto 1 de la Parte VIII del anexo VII del Reglamento (UE) no 1308/2013 del Parlamento Europeo y del Consejo ( 4 ) y describir el método para su clasificación en función de dichas características. El método incluye, asimismo, indicaciones para un etiquetado optativo.

El método descrito solo es aplicable a los aceites de oliva vírgenes, y a su clasificación o su etiquetado en función de la intensidad de los defectos detectados y del atributo frutado, determinados por un grupo de catadores seleccionados, entrenados y evaluados, constituidos en panel.

Las normas del COI que se mencionan en este anexo deben usarse en la versión más reciente disponible.

▼M26

2.   ANÁLISIS SENSORIAL: VOCABULARIO GENERAL BÁSICO

Remítase a la norma COI/T.20/Doc. No 4 «Análisis sensorial: vocabulario general básico».

3.   VOCABULARIO ESPECÍFICO

3.1.    Atributos negativos

▼M28

3.1.1.    Otros atributos negativos

3.2.    Atributos positivos

▼M29

3.3.    Terminología opcional para el etiquetado

A petición expresa, el jefe de panel puede certificar que los aceites evaluados cumplen las definiciones e intervalos correspondientes únicamente a los términos siguientes en función de la intensidad y de la percepción de los atributos:

Atributos positivos (frutado, amargo y picante): En función de la intensidad de la percepción:

Lista de términos en función de la intensidad de la percepción:

▼M26

4.   COPA PARA DEGUSTACIÓN DE ACEITES

Remítase a la norma COI/T.20/Doc. No 5 «Copa para la degustación de aceites».

5.   SALA DE CATA

Remítase a la norma COI/T.20/Doc. No 6 «Guía para la instalación de una sala de cata»

6.   ACCESORIOS

En cada cabina y a disposición del catador deben estar los utensilios necesarios para que éste pueda ejercer adecuadamente su cometido. Estos son:

7.   JEFE DE PANEL Y CATADORES

7.1.    El jefe del panel

El jefe del panel deberá tener una sólida formación y ser un conocedor experto de todos los tipos de aceite con los que habrá de tratar en el desempeño de su trabajo. Es la figura clave del panel y el responsable de la organización y del funcionamiento del mismo.

Su trabajo requiere la pertinente formación en análisis sensorial y las herramientas correspondientes, además de meticulosidad en la preparación de los ensayos y la organización y ejecución de estos, así como destreza y paciencia para planificar y efectuar los ensayos de forma científica.

También es de su exclusiva competencia proceder a la selección, el entrenamiento y el control de los catadores, para asegurarse de su nivel de aptitud, siendo por tanto responsable de la cualificación de estos. Dicha cualificación deberá ser en todo momento objetiva, por lo que deberá diseñar procedimientos específicos basados en ensayos y en criterios de aceptación y rechazo sólidamente fundamentados. Véase la norma COI/T.20/Doc. no 14 «Guía para la selección, el entrenamiento y el control de los catadores cualificados de aceite de oliva virgen».

►C6  Es asimismo responsable del desempeño del panel y, por consiguiente, de su evaluación, que deberá acreditar de forma fiel y objetiva. ◄ Deberá poder demostrar en todo momento que el método y los catadores están bajo control. Se recomienda llevar a cabo una calibración periódica del panel (COI/T.20/Doc. No 14, § 5).

Es el más alto responsable de los registros del panel y de la custodia de los mismos. Dichos registros deberán poder rastrearse en todo momento y ajustarse a los requisitos en materia de garantía de la calidad establecidos en las normas internacionales relativas al análisis sensorial, además de garantizar el anonimato de las muestras.

Es el responsable de los utensilios y del material necesario para el cumplimiento de las especificaciones del presente método, así como del inventario y de la perfecta limpieza y conservación de los mismos. Redactará un informe sobre todo cuanto antecede y sobre el cumplimiento de las condiciones del ensayo.

Es el responsable de la recepción y la conservación de las muestras desde su llegada al laboratorio hasta el análisis, garantizando en todo momento el anonimato de las mismas y su adecuada conservación. A tal efecto, deberá redactar procedimientos sobre todo cuanto antecede con vistas a garantizar la trazabilidad y la calidad de todo el proceso.

También es responsable de la preparación, codificación y presentación de las muestras a los catadores según el diseño experimental adecuado de acuerdo con el protocolo previamente establecido, de la recopilación de los datos de los catadores y del tratamiento estadístico de estos.

Es responsable de establecer y redactar todos los demás procedimientos que pudieran precisarse para completar la presente norma o para el adecuado funcionamiento del panel.

Deberá buscar la manera de comparar los resultados del panel con los de otros paneles de cata de aceite de oliva virgen para asegurarse de que el funcionamiento de su panel es el correcto.

Es misión del jefe de panel motivar a los componentes del grupo, fomentando entre ellos el interés, la curiosidad y el espíritu competitivo. Por este motivo se recomienda garantizar el intercambio fluido de información con los miembros del grupo, implicándolos en todas las tareas que realicen, así como en los resultados obtenidos. Debe evitar que su opinión sea conocida e impedir que los criterios de posibles líderes se impongan sobre los restantes catadores.

Convocará con tiempo suficiente a los catadores y responderá a cualquier consulta en cuanto a la realización de los ensayos, aunque se abstendrá de sugerirles ningún tipo de opinión sobre la muestra.

▼M28

7.1.1.    Jefe en funciones del grupo

El jefe del grupo podrá, por razones justificadas, ser reemplazado por un jefe en funciones que le sustituirá en el ejercicio de sus deberes en relación con la realización de los análisis. Este sustituto deberá tener todos los conocimientos especializados necesarios para el puesto de jefe de grupo.

▼M28

7.2.    Catadores

Las personas que intervengan en calidad de catadores en los ensayos organolépticos de aceites de oliva deberán hacerlo de forma voluntaria. Por este motivo, se recomienda exigir a los candidatos una petición por escrito. Los candidatos deberán ser seleccionados, formados y evaluados por el presidente de la comisión de acuerdo con su habilidad para distinguir entre muestras similares, debiéndose tener en cuenta que la precisión se mejorará con la práctica.

El catador deberá comportarse como un auténtico observador sensorial, dejando a un lado sus gustos personales para dar cuenta únicamente de las sensaciones que percibe. Por ello deberá realizar su trabajo en silencio, estar relajado y no tener prisa. Deberá prestar la máxima atención posible a la muestra que está catando.

Para la prueba se exige un número de 8 a 12 catadores, siendo conveniente disponer de algunos más en reserva, para cubrir posibles ausencias.

▼M26

8.   CONDICIONES DE ENSAYO

8.1.    Presentación de la muestra

La muestra de aceite que se vaya a analizar se presentará en las copas de degustación normalizadas con arreglo a la Norma COI/T.20/Doc. No 5 «Copa para la degustación de aceites».

La copa deberá contener 14-16 ml de aceite, o bien entre 12,8 y 14,6 g si las muestras se pesan, y estar tapada con un vidrio de reloj.

Cada copa deberá estar marcada con un código numérico o alfanumérico aleatorio. El código se aplicará mediante un sistema inodoro.

8.2.    Temperatura de la muestra y durante el ensayo

La muestra de aceite que se vaya a analizar deberá mantenerse en la copa a una temperatura de 28 °C ± 2 °C durante todo el ensayo. Se ha elegido esta temperatura porque permite detectar con mayor facilidad que a temperatura ambiente las diferencias organolépticas. Además, a temperaturas más bajas se produce una escasa volatilización de los componentes aromáticos propios de estos aceites, y a temperaturas más altas se forman componentes volátiles propios de los aceites calentados. Véase la norma COI/T.20/Doc. No 5 «Copa para la degustación de aceites» para consultar el sistema de calentamiento de las muestras que se ha de utilizar una vez que la muestra se haya introducido en la copa.

La sala de cata debe estar a una temperatura comprendida entre los 20° y los 25° C (véase COI/T.20/Doc. No 6).

8.3.    Horario del ensayo

Para la cata de aceites, las horas de trabajo óptimas son las de la mañana. Está demostrado que durante el día existen períodos de óptima percepción para el gusto y el olfato. Las comidas son precedidas de un período de incremento de la sensibilidad olfato-gustativa, seguidas de un decrecimiento de la misma.

Sin embargo, este criterio no debe ser llevado al extremo, hasta el punto de que el hambre pueda distraer a los catadores, haciendo descender en ellos su capacidad de discriminación. Por consiguiente, se recomienda que las sesiones de cata se realicen entre las 10 y las 12 de la mañana.

8.4.    Normas generales de comportamiento para catadores

Las siguientes recomendaciones se refieren al comportamiento de los catadores durante su trabajo.

Al recibir la comunicación del jefe del panel para intervenir en un ensayo organoléptico, los catadores deberán estar en condiciones de realizarlo a la hora previamente señalada, ateniéndose a las siguientes normas:

9.   PROCEDIMIENTO PARA LA EVALUACIÓN ORGANOLÉPTICA Y LA CLASIFICACIÓN DE ACEITES DE OLIVA VÍRGENES

9.1.    Técnica de cata

▼M29

▼M26

9.2.    Utilización de la ficha de cata por los catadores

La ficha de cata que deben utilizar los catadores se recoge en la figura 1 del presente anexo.

Cada uno de los catadores que componen el panel olerá y degustará ( 5 ) el aceite sometido a examen. Deben consignar en las escalas de 10 cm de la ficha de cata que se pondrá a su disposición la intensidad con la que perciben cada uno de los atributos negativos y positivos.

En caso de que los catadores perciban atributos negativos no indicados en la sección 4, deberán consignarse en el apartado «otros», empleando el término o términos que los describan con mayor precisión.

▼M28

9.3.    Utilización de los datos por los jefes de panel

El jefe del panel deberá recoger las fichas de cata cumplimentadas por cada uno de los catadores y revisar las intensidades asignadas a los diferentes atributos. De constatarse alguna anomalía, pedirá al catador que revise su ficha de cata y, si fuera necesario, que repita la prueba.

El jefe del grupo deberá introducir los datos de la valoración de cada miembro en un programa informático como el que se recoge en la norma COI/T.20/Doc. No 15, con miras al cálculo estadístico de los resultados del análisis, basados en el cálculo de la mediana. Véase el punto 9.4 y el apéndice del presente anexo. La introducción de los datos correspondientes a cada muestra se realizará con ayuda de una matriz compuesta de nueve columnas que corresponden a los nueve atributos sensoriales y n líneas que corresponden a los n miembros del panel utilizados.

En caso de que en el apartado «otros» figure un defecto percibido y señalado por al menos el 50 % del panel, el jefe del panel calculará la mediana de dicho defecto y lo clasificará en consecuencia.

El valor del coeficiente de variación robusto que define la clasificación (defecto con la mayor intensidad y el mayor atributo frutado) deberá ser inferior o igual al 20 %.

Cuando no sea así, el jefe del panel deberá repetir la evaluación de la muestra específica en otra sesión de cata.

Si esta situación se produce con frecuencia, se recomienda al jefe del grupo que imparta formación específica adicional (COI/T.20/Doc. No 14, § 5) y utilice el índice de repetibilidad y el índice de desviación para controlar el rendimiento del catador (COI/T.20/Doc. No 14, § 6).

▼M29

9.4.    Clasificación del aceite

El aceite se clasifica en las categorías que se indican más adelante, en función de la mediana de los defectos y de la mediana del atributo frutado. Por mediana de los defectos se entiende la mediana del defecto percibido con mayor intensidad. La mediana de los defectos y la mediana del atributo frutado se expresarán con una sola cifra decimal.

La clasificación del aceite se hace comparando el valor de la mediana de los defectos y de la mediana del atributo frutado con los intervalos de referencia expuestos a continuación. Los límites de estos rangos han sido establecidos teniendo en cuenta el error del método, por lo que son considerados como absolutos. Los programas informáticos permiten visualizar la clasificación en un cuadro de datos estadísticos o gráficamente.

▼M29

9.5    Criterios de aceptación y de rechazo de duplicados

Para determinar si los dos resultados de un análisis duplicado son homogéneos o estadísticamente aceptables se utilizará el error normalizado definido a continuación:

siendo Me1 y Me2 las medianas de los dos duplicados (respectivamente, primer y segundo análisis) y U1 y U2, las incertidumbres expandidas obtenidas para los dos valores, calculadas como sigue según se especifica en el apéndice:

U 1 = c × s * y

Para la incertidumbre expandida, c = 1,96; por consiguiente:

U1 = 0,0196 × CVr × Me1

siendo CVr el coeficiente de variación robusto.

Para poder afirmar que los dos valores obtenidos no son estadísticamente diferentes, En debe ser igual o inferior a 1,0.

▼M26

Apéndice

Método de cálculo de la mediana y de los intervalos de confianza

Mediana

La mediana se define como el número real Xm, caracterizado por el hecho de que la probabilidad (p) de que los valores de la distribución (X) sean inferiores a ese número (Xm) es inferior o igual a 0,5 y de que, simultáneamente, la probabilidad (p) de que los valores de la distribución (X) sean inferiores o iguales a Xm es superior o igual a 0,5. Otra definición más práctica es que la mediana es el percentil 50 de una distribución de números ordenados de modo creciente. Dicho de otro modo, representa el valor central de una serie ordenada impar o la media de los dos valores centrales de una serie ordenada par.

Desviación típica robusta

Para obtener una estimación fiable de la variabilidad que se produce en torno a la mediana, es necesario referirse a la estimación de la desviación típica robusta según Stuart y Kendall (4). La fórmula indica la desviación típica asintótica robusta, es decir, la estimación robusta de la variabilidad de los datos considerados, en la que N es el número de observaciones e IQR el intervalo intercuartil, el cual abarca exactamente el 50 % de los casos de una distribución de probabilidad cualquiera.

El cálculo del intervalo intercuartil se efectúa calculando la magnitud de la diferencia entre el percentil 75 y el 25.

Siendo el percentil el valor Xpc caracterizado por el hecho de que la probabilidad (p) de que los valores de la distribución sean inferiores a Xpc es inferior e igual a una centésima determinada y de que, simultáneamente, la probabilidad (p) de que los valores de la distribución sean inferiores o iguales a Xpc es superior e igual a dicha centésima. La centésima indica la fracción de distribución elegida. En el caso de la mediana esta es igual a 50/100.

En la práctica, el percentil es el valor de distribución que corresponde a un área determinada, trazada a partir de la curva de distribución o de densidad. Por ejemplo, el percentil 25 representa el valor de distribución correspondiente a un área igual a 0,25 o 25/100.

En este método los percentiles se computan basándose en los valores reales que figuran en la matriz de datos (procedimiento de cómputo de percentiles).

Coeficiente de variación robusto (en %)

El CVr% representa un número puro que indica el porcentaje de variabilidad de la serie de números analizada. Por esta razón este coeficiente resulta muy útil para comprobar la fiabilidad de los miembros del panel.

Intervalos de confianza al 95 % sobre la mediana

Los intervalos de confianza al 95 % (valor del error de primer tipo igual a 0,05 o 5 %) representan el intervalo en el que el valor de la mediana podría variar si fuese posible repetir infinitas veces un experimento. En la práctica, indica el intervalo de variabilidad de la prueba en las condiciones operativas adoptadas, partiendo de la hipótesis de que es posible repetirlo varias veces. El intervalo ayuda a evaluar, como en el caso del CVr%, la fiabilidad de la prueba.

donde C = 1,96 en el caso del intervalo de confianza al 95 %.

Puede encontrarse un ejemplo de la hoja de cálculo en el anexo I de la norma COI/T.20/Doc. No 15.

Bibliografía

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▼M19 —————

▼B

ANEXO XV

1.   CONTENIDO EN ACEITE DE LOS ORUJOS DE ACEITUNA

1.1.   Material

1.2.   Reactivo

n-hexano técnico cuyo residuo en evaporación completa deberá ser inferior a 0,002 g para 100 ml.

2.   MODO DE OPERAR

2.1.   Preparación de la muestra para ensayo

Triturar la muestra para laboratorio, si fuera necesario, en el triturador mecánico, previamente bien limpio, para reducirla a partículas que puedan atravesar completamente la criba.

Utilizar aproximadamente una vigésima parte de la muestra para completar la limpieza del triturador, tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo, mezclarlo con cuidado y analizarlo sin demora.

2.2.   Toma de muestra

Pesar inmediatamente después del triturado, alrededor de 10 g de la muestra para ensayo con una aproximación de 0,01 g.

2.3.   Preparación del cartucho de extracción

►C1  colocar la muestra en el cartucho y taparla con el tapón ◄ de algodón hidrófilo. En caso de haber utilizado papel de filtro, envolver la muestra molida en dicho papel.

2.4.   Presecado

Cuando el orujo esté muy húmedo (contenido en agua y en materias volátiles superior al 10 %), efectuar un presecado colocando durante un tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa calentada a 80 °C como máximo, para llevar el contenido en agua y en materias volátiles por debajo del 10 %.

2.5.   Preparación del matraz

Pesar con aproximación de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de piedra pómez, previamente secado en la estufa a 103 °C ± 2 °C y después enfriado durante al menos una hora en el desecador.

2.6.   Primera extracción

Colocar en el aparato de extracción el cartucho (o el papel de filtro) que contenga la muestra. Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano. ►C1  Adaptar ◄ el matraz al aparato de extracción y colocarlo todo sobre la placa calefactora. Llevar la calefacción a tal estado que el caudal de reflujo sea al menos de tres gotas por segundo (ebullición moderada, no tumultuosa).

Después de cuatro horas de extracción, dejar enfriar. Quitar el cartucho del aparato de extracción y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la mayor parte del disolvente que lo impregna.

2.7.   Segunda extracción

Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea posible. Colocar de nuevo cuantitativamente la mezcla en el cartucho y ésta en el aparato de extracción.

Empezar de nuevo la extracción durante dos horas más, utilizando el mismo matraz conteniendo la primera extracción.

La solución obtenida en el matraz de extracción deberá ser límpida. Si no fuere así, filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer matraz y el papel de filtro con hexano. Recoger el filtrado y el disolvente en un segundo matraz previamente secado y tarado aproximadamente a 1 mg.

2.8.   Eliminación del disolvente y pesada del extracto

Eliminar en el equipo de extracción la mayor parte del disolvente. Eliminar los últimos restos de éste calentando el matraz en la estufa a 103 °C ± 2 °C durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminación, ya sea insuflando aire de vez en cuando o preferiblemente un gas inerte, o actuando bajo una presión reducida.

Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora, y pesarlo con una precisión de 1 mg aproximadamente.

Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas condiciones, dejar enfriar en el desecador y pesar.

La diferencia entre los resultados de estas dos pesadas deberá ser inferior o igual a 10 mg, si no, calentar de nuevo durante períodos de diez minutos seguidos de enfriamento y pesada, hasta que la diferencia de peso sea, a lo sumo, de 10 mg. Seleccionar la última pesada del matraz.

Efectuar dos determinaciones.

3.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

3.1.   Modo de cálculo y fórmula

3.2.   Repetitividad

La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones, efectuadas simultáneamente o rápidamente la una a continuación de la otra mediante el mismo análisis, no deberá ser superior a 0,2 g de extracto de hexano por cada 100 g de muestra.

En caso contrario, repetir sobre otras dos tomas de muestra. Si esta vez la diferencia es de nuevo superior a 0,2 g tomar como resultado la media aritmética de las cuatro determinaciones efectuadas.

ANEXO XVI

DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE YODO

1.   OBJETO

La presente norma internacional especifica un método para la determinación del índice de yodo de las grasas y aceites animales y vegetales, en lo sucesivo denominados grasas.

2.   DEFINICIÓN

A los fines de la presente norma internacional, se aplicará la definición siguiente:

3.   PRINCIPIO

Disolución de la muestra problema y adición de reactivo de Wijs. Una vez transcurrido el tiempo que se especifica, adición de solución acuosa de yoduro potásico y valoración del yodo liberado con solución de tiosulfato sódico.

4.   REACTIVOS

Todos los reactivos serán de calidad analítica reconocida.

5.   MATERIAL

Material ordinario de laboratorio y, en particular, lo siguiente:

6.   PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ►C1  PROBLEMA ◄ .

►C1  La muestra homogeneizada, se seca sobre sulfato sódico y se filtra ◄ .

7.   PROCEDIMIENTO

8.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El índice de yodo se expresa del siguiente modo:

siendo:

c : valor numérico de la concentración exacta, expresada en moles por litro, de la solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico (4.3) utilizada;

V1 : valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para el ensayo en blanco;

V2 : valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para la determinación;

p : valor numérico del peso, expresado en gramos, de la muestra problema (7.1).

Se tomará como resultado la media aritmética de las dos determinaciones, siempre que se cumpla el requisito establecido con respecto a la repetibilidad.

▼M11

ANEXO XVII

MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE ESTIGMASTADIENOS EN LOS ACEITES VEGETALES

1.   OBJETIVOS

Determinación de estigmastadienos en los aceites vegetales que presentan bajas concentraciones de dichos hidrocarburos, particularmente en el aceite de oliva virgen y en el aceite de orujo de oliva sin refinar.

2.   APLICACIÓN

Se trata de una norma aplicable a cualquier aceite de origen vegetal, teniendo en cuenta que únicamente se obtendrán medidas fiables cuando el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de 0,01 a 4,0 mg/kg. El método resulta especialmente adecuado para detectar la presencia de aceites vegetales refinados (aceites de oliva, orujo de oliva, girasol, palma, etc.) en el aceite de oliva virgen, dado que los aceites refinados contienen estigmastadienos y los aceites vírgenes no.

3.   FUNDAMENTO

Aislamiento de la materia insaponificable. Separación de la fracción de hidrocarburos esteroideos mediante cromatografia en columna de gel de sílice y análisis mediante cromatografía de gases en columna capilar.

4.   INSTRUMENTAL

5.   REACTIVOS

Salvo indicación en sentido contrario, únicamente se utilizarán reactivos de calidad para análisis. Debe emplearse agua destilada o de pureza al menos equivalente.

6.   METODOLOGÍA

6.1.   Preparación de la materia insaponificable:

6.2.   Separación de la fracción de hidrocarburos esteroideos:

6.3.   Cromatografía de gases

Figura 1

Cromatogramas procedentes del análisis de muestras de aceite de oliva en columna capilar de sílice fundida (0,25 mm de diámetro interno × 25 m) recubierta con una película de 0,25 μm de grosor de 5 %-fenilmetilsilicona.

Figura 2

Cromatograma procedente del análisis de una muestra de aceite de oliva refinado en una columna DB-5, en el que se aprecia el isómero del estigmasta-3,5-dieno.

▼M25

ANEXO XVIII

DETERMINACIÓN DE LA DIFERENCIA ENTRE EL CONTENIDO REAL Y EL CONTENIDO TEÓRICO DE TRIGLICÉRIDOS CON ECN 42

1.   OBJETO

Determinación de la diferencia absoluta entre los valores experimentales de triglicéridos (TG) con un número equivalente de carbonos igual a 42 (ECN 42HPLC) obtenidos mediante determinación en el aceite por cromatografía de líquidos de alta resolución y el valor teórico de TG con un número equivalente de carbonos igual a 42 (ECN 42teórico) calculado a partir de la composición de los ácidos grasos.

2.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

El presente método es aplicable a los aceites de oliva. Puede utilizarse para detectar la presencia de pequeñas cantidades de aceites de semillas (ricos en ácido linoleico) en todos los tipos de aceites de oliva.

3.   PRINCIPIO

El contenido de triglicéridos con ECN 42 determinado por análisis con HPLC y el contenido teórico de triglicéridos con ECN 42 (calculado sobre la base de la determinación de la composición de ácidos grasos mediante GLC) se corresponden dentro de ciertos límites en el caso de los aceites de oliva auténticos. Una diferencia superior a los valores adoptados para cada tipo de aceite sería indicativa de que el aceite contiene aceites de semillas.

4.   MÉTODO

El método para el cálculo del contenido teórico de triglicéridos con ECN 42 y de la diferencia con respecto a los datos obtenidos con HPLC consiste esencialmente en la coordinación de los datos analíticos obtenidos por medio de otros métodos. Pueden distinguirse tres fases: determinación de la composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases con columna capilar, cálculo de la composición teórica de triglicéridos con ENC 42, determinación mediante HPLC de los triglicéridos con ECN 42.

4.1.    Instrumental

4.2.    Reactivos

Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de elución deberán desgasificarse y podrán reciclarse varias veces sin que ello afecte a las separaciones.

4.3.    Preparación de la muestra

Como hay una serie de sustancias interferentes que puede dar lugar a falsos resultados positivos, la muestra debe purificarse siempre según el método IUPAC 2507, utilizado para la determinación de compuestos polares en grasas para freír.

4.3.1.    Preparación de la columna cromatográfica

Llenar la columna (4.1.3) con aproximadamente 30 ml de disolvente de elución (4.2.3); introducir a continuación en la columna un poco de lana de vidrio (4.2.5) y empujarla hasta el fondo de la columna ayudándose con la varilla de vidrio (4.1.5).

Preparar en un vaso de precipitados de 100 ml una suspensión de 25 g de gel de sílice (4.2.4) en 80 ml de la mezcla de elución (4.2.3) y transferirla a la columna con ayuda de un embudo de vidrio (4.1.6).

Para asegurarse de la transferencia total del gel de sílice a la columna, lavar el vaso de precipitados con la mezcla de elución y pasar también los líquidos de lavado a la columna.

Abrir la llave de la columna y dejar que salga el disolvente hasta que su nivel se sitúe aproximadamente 1 cm por encima del gel de sílice.

4.3.2.    Cromatografía en columna

Pesar, con precisión de 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g de aceite previamente filtrado, homogeneizado y, en caso necesario, deshidratado, en un matraz aforado de 50 ml (4.1.7).

Disolverlos en 20 ml aproximadamente del disolvente de elución (4.2.3). En caso necesario, calentar ligeramente para facilitar la disolución. Enfriar a temperatura ambiente y enrasar con el disolvente de elución.

Introducir con una pipeta aforada 20 ml de solución en la columna preparada como se indica en 4.3.1, abrir la llave y dejar eluir el disolvente hasta el nivel de la capa de gel de sílice.

Eluir a continuación con 150 ml de disolvente de elución (4.2.3), regulando el flujo de disolvente a 2 ml/minuto aproximadamente (de modo que pasen a través de la columna 150 ml en unos 60-70 minutos).

Recoger el eluido en un matraz redondo de 250 ml (4.1.1) previamente tarado en estufa y pesarlo exactamente. Eliminar el disolvente a presión reducida en un rotavapor (4.1.9) y pesar el residuo, con el cual se preparará la solución para el análisis por HPLC y para la obtención de los ésteres metílicos.

Tras pasar por la columna, debe recuperarse como mínimo un 90 % de la muestra en el caso de las categorías virgen extra, virgen, corriente, refinado y aceite de oliva, mientras que en el de los aceites lampantes y de orujo de oliva los porcentajes de recuperación no pueden ser inferiores al 80 %.

4.3.3.    Purificación por extracción en fase sólida (SPE)

La columna de sílice de SPE se activa haciendo pasar 6 ml de hexano (4.2.3) en vacío, evitando la desecación.

Pesar, con una precisión de 0,001 g, 0,12 g en un frasco de 2 ml (4.1.15) y disolver con 0,5 ml de hexano (4.2.3).

Cargar la columna de SPE con la solución y eluir con 10 ml de mezcla hexano/éter dietílico (87:13 v/v) (4.2.3) al vacío.

La fracción recogida se evapora hasta su desecación en un rotavapor (4.1.9) a presión reducida y a temperatura ambiente. El residuo se disuelve en 2 ml de acetona (4.2.6) para realizar el análisis de triglicéridos (TG).

4.4.    Análisis por HPLC

4.4.1.    Preparación de las muestras para análisis cromatográfico

Preparar del siguiente modo una solución al 5 % de la muestra que vaya a analizarse: pesar 0,5 ± 0,001 g de la muestra en un matraz aforado de 10 ml y enrasar con el disolvente de solubilización (4.2.9).

4.4.2.    Procedimiento

Instalar el sistema cromatográfico. Bombear el disolvente de elución (4.2.8) a un flujo de 1,5 ml/min para purgar todo el sistema. Esperar hasta que se obtenga una línea de base estable.

Inyectar 10 μl de la muestra preparada como se indica en el punto 4.3.

4.4.3.    Cálculo y expresión de los resultados

Utilizar el método de normalización de áreas, es decir, considerar que la suma de las superficies de los picos correspondientes a los triglicéridos de ECN entre 42 y 52 es igual al 100 %.

Calcular el porcentaje relativo de cada triglicérido mediante la fórmula siguiente:

.

Los resultados deben expresarse como mínimo con dos decimales.

Véanse las notas 1 a 4.

4.5.    Cálculo de la composición de triglicéridos (porcentaje de moles) a partir de los datos de composición de los ácidos grasos (porcentaje de superficie)

4.5.1.    Determinación de composición de ácidos grasos

La composición de ácidos grasos se determina según la norma ISO 5508 por medio de una columna capilar. Los ésteres metílicos se preparan según el COI/T.20/Doc. no. 24.

4.5.2.    Ácidos grasos para el cálculo

Los glicéridos se agrupan en función de su número equivalente de carbonos (ECN), teniendo en cuenta las equivalencias que figuran a continuación entre ECN y ácidos grasos. Solo se han considerado los ácidos grasos con 16 y 18 átomos de carbono, ya que son los únicos importantes para el aceite de oliva. Los ácidos grasos deben normalizarse al 100 %.

4.5.3.    Conversión de los % de superficie en moles respecto a todos los ácidos grasos (1)

4.5.4.    Normalización de los moles de los ácidos grasos al 100 % (2)

El resultado proporciona el porcentaje de cada ácido graso en porcentaje de moles en todas las posiciones (1, 2 y 3) de los TG.

A continuación se calculan las sumas de los ácidos grasos saturados (AGS) P y S y de los ácidos grasos insaturados (AGI) Po, O, L y Ln (3):

4.5.5.    Cálculo de la composición de ácidos grasos en la posición 2 y en las posiciones 1 y 3 de los TG

Los ácidos grasos se distribuyen en tres grupos del siguiente modo: uno para la posición 2 y dos idénticos para las posiciones 1 y 3, con coeficientes diferentes para los ácidos saturados (P y S) y los insaturados (Po, O, L y Ln).

4.5.5.1.   Ácidos grasos saturados en la posición 2 [P(2) y S(2)] (4):

4.5.5.2.   Ácidos grasos insaturados en la posición 2 [Po(2), O(2), L(2) y Ln(2)] (5):

4.5.5.3.   Ácidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) y Ln(1,3)] (6):

4.5.6.    Cálculo de triglicéridos

4.5.6.1.   TG con un solo ácido graso (AAA, aquí, LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2.   TG con dos ácidos grasos (AAB, aquí PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3.   TG con tres ácidos grasos diferentes (ABC; en este caso, OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4.   Triglicéridos con ECN 42

Los triglicéridos con ECN 42 se calculan de acuerdo con las ecuaciones 7, 8 y 9 y se indican por orden de elución prevista en HPLC (normalmente solo tres picos).

Los triglicéridos con ECN 42 se obtienen mediante la suma de los nueve triglicéridos, incluidos sus isómeros de posición. Los resultados deben expresarse como mínimo con dos decimales.

5.   EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS

Se comparan el contenido teórico calculado y el determinado por HPLC. Si la diferencia en valor absoluto entre los datos de HPLC y los datos teóricos es superior a los valores indicados para la categoría adecuada de aceite en la norma, se concluye que la muestra contiene aceite de semillas.

Los resultados se expresan con dos decimales.

6.   EJEMPLO (LOS NÚMEROS SE REFIEREN A LAS SECCIONES DEL TEXTO DEL MÉTODO)

— 4.5.1.    Cálculo del porcentaje de moles de ácidos grasos a partir de datos de GLC (porcentaje de superficie normalizada)

Los datos siguientes de la composición de ácidos grasos se obtienen mediante GLC:

— 4.5.3    Conversión en moles de los porcentajes de superficie respecto a todos los ácidos grasos [véase la fórmula (1)]

— 4.5.4    Normalización de los moles de ácidos grasos al 100 % [véase la fórmula (2)]