1991R2568 — ES — 09.08.2012 — 024.001

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▼B

REGLAMENTO (CEE) No 2568/91 DE LA COMISIÓN

de 11 de julio de 1991

relativo a las características de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva y sobre sus métodos de análisis

▼M20

Artículo 1

1.  Se considerarán aceites de oliva vírgenes, con arreglo a las letras a) y b) del punto 1 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, los aceites cuyas características se ajusten a las indicadas, respectivamente, en los puntos 1 y 2 del anexo I del presente Reglamento.

2.  Se considerará aceite de oliva lampante, con arreglo a la letra c) del punto 1 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 3 del anexo I del presente Reglamento.

3.  Se considerará aceite de oliva refinado, con arreglo al punto 2 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 4 del anexo I del presente Reglamento.

▼C4

4.  Se considerará aceite de oliva que contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y aceites de oliva vírgenes, con arreglo al punto 3 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 5 del anexo I del presente Reglamento.

▼M20

5.  Se considerará aceite de orujo de oliva crudo, con arreglo al punto 4 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 6 del anexo I del presente Reglamento.

6.  Se considerará aceite de orujo de oliva refinado, con arreglo al punto 5 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 7 del anexo I del presente Reglamento.

7.  Se considerará aceite de orujo de oliva, con arreglo al punto 6 del anexo del Reglamento no 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 8 del anexo I del presente Reglamento.

▼B

Artículo 2

1.  Las características de los aceites, previstas en el Anexo I, se determinarán empleando los métodos de análisis siguientes:

▼M19

▼B

▼M21

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M23

▼M19

2.  La comprobación de las características organolépticas de los aceites de oliva vírgenes por parte de las autoridades nacionales o sus representantes correrá a cargo de paneles de catadores autorizados por los Estados miembros.

Las características organolépticas del aceite de oliva mencionado en el apartado 1 se considerarán conformes a la categoría declarada si un panel de catadores autorizado por el Estado miembro interesado confirma dicha clasificación.

En caso de que el panel autorizado no confirme tal declaración en lo que respecta a las características organolépticas de la categoría de aceite de oliva declarada, las autoridades nacionales o sus representantes ordenarán que se proceda, a petición del interesado, a dos análisis contradictorios por otros paneles autorizados; al menos uno de ellos deberá ser realizado por un panel de cata autorizado por el Estado miembro productor. Las características en cuestión se considerarán conformes a las declaradas si ambos análisis contradictorios confirman la clasificación declarada. En caso contrario, los gastos generados por los análisis contradictorios, sin perjuicio de otras posibles sanciones, correrán por cuenta del interesado.

▼M17

3.  En lo tocante a la comprobación por las autoridades nacionales o sus representantes de las características de los aceites previstas en el apartado 1, la toma de muestras se efectuará de acuerdo con las normas internacionales EN ISO 661 y EN ISO 5555 relativas a la preparación de las muestras y al muestreo. Ahora bien, no obstante lo dispuesto en el punto 6.8 de la norma EN ISO 5555, respecto de los lotes compuestos por esos aceites, presentados en envases inmediatos de una capacidad igual o inferior a 100 litros, la toma de muestras se realizará de acuerdo con el anexo I bis del presente Reglamento.

▼M19

Sin perjuicio de lo dispuesto en la norma EN ISO 5555 y en el capítulo 6 de la norma EN ISO 661, las muestras deberán guardarse lo antes posible en un lugar protegido de la luz y de las elevadas temperaturas y enviarse al laboratorio para la realización de los análisis a más tardar:

▼M17

4.   ►M20  Para la comprobación prevista en el apartado 3, los análisis a que se refieren los anexos II, III, IX, X y XII, así como, en su caso, los segundos análisis previstos por las legislaciones nacionales, se efectuarán antes de la fecha de caducidad mínima. En caso de que la toma de la muestra se efectúe más de cuatro meses antes de la fecha de caducidad mínima, dichos análisis se realizarán a más tardar el cuarto mes siguiente al de la toma de la muestra. No se aplicará ningún plazo a los demás análisis previstos por el citado Reglamento. ◄

Excepto si la toma de muestras se ha efectuado menos de un mes antes de la fecha de caducidad mínima, en caso de que los resultados de los análisis no se ajusten a las características de la categoría de aceite de oliva o de orujo de oliva declarada, se notificará este extremo al interesado como muy tarde un mes antes de que finalice el plazo mencionado en el párrafo primero.

▼M19

5.  Con vistas a la determinación de las características de los aceites de oliva efectuada con arreglo a los métodos contemplados en el apartado 1, los resultados de los análisis se compararán directamente con los límites fijados en el presente Reglamento.

▼M20

Artículo 2 bis

La comprobación por las autoridades nacionales o sus representantes de la conformidad de una muestra de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva con la categoría declarada podrá efectuarse:

▼M19 —————

▼M5

Artículo ►M19  3 ◄

En caso de que se compruebe que las características organolépticas de un aceite son distintas de las correspondientes a su denominación, el Estado miembro interesado aplicará sanciones económicas administrativas, cuyo importe se determinará en función de la gravedad de la irregularidad comprobada, sin perjuicio de otras posibles sanciones.

Para la evaluación de las irregularidades se tendrá sobre todo en cuenta la evolución natural de las características del aceite de oliva conservado en condiciones normales.

Al principio de cada semestre, los Estados miembros informarán a la Comisión del número y la naturaleza de las irregularidades observadas, así como de las sanciones impuestas durante el semestre anterior.

▼M5

Artículo 4

▼M19

1.  Para la apreciación y el control de las características organolépticas por parte de las autoridades nacionales o sus representantes, los Estados miembros podrán constituir paneles de catadores autorizados.

Las condiciones de autorización serán establecidas por los Estados miembros con los objetivos siguientes:

Todos los Estados miembros comunicarán a la Comisión la lista de los paneles de catadores autorizados, así como las demás medidas adoptadas de conformidad con el presente apartado.

▼M5

2.  En caso de que un Estado miembro tenga dificultades para crear un panel de catadores en su territorio, podrá recurrir a un panel de degustadores autorizado de otro Estado miembro.

3.  Cada Estado miembro elaborará la lista de los paneles de catadores creados por organizaciones profesionales o interprofesionales en las condiciones fijadas en el apartado 1 y velará por el cumplimiento de esas condiciones.

▼M19 —————

▼B

Artículo 6

1.  El contenido en aceite de orujo de aceituna y demás residuos de la extracción del aceite de oliva (códigos NC 2306 90 11 y 2306 90 19) se determinará con arreglo al método recogido en el Anexo XV.

2.  El contenido de aceite mencionado en el apartado 1 se expresará como porcentaje del extracto seco en peso.

▼M20

Artículo 7

Serán aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de contaminantes.

En lo que respecta al contenido de disolventes halogenados, los límites para todas las categorías de aceites de oliva son los siguientes:

▼B

Artículo 8

1.  Cada Estado miembro comunicará a la Comisión las medidas adoptadas en aplicación del presente Reglamento.

2.  Cada Estado miembro comunicará a la Comisión, al inicio de cada semestre una recapitulación de los datos analíticos de las determinaciones efectuadas durante el semestre precedente.

Estos resultados serán examinados por el Comité de gestión de las materias grasas con arreglo al procedimiento previsto en el artículo 39 del Reglamento no 136/66/CEE.

Artículo 9

Queda derogado el Reglamento (CEE) no 1058/77.

Artículo 10

1.  El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.

No obstante, el método que figura en el Anexo XII se aplicará a partir del ►M1  1 de noviembre de 1992 ◄ , excepto en lo que se refiere a las operaciones relacionadas con la intervención.

▼M5

Dicho método no se aplicará a los aceites de oliva vírgenes envasados antes del 1 de noviembre de 1992.

▼B

El presente Reglamento no se aplicará a los aceites de oliva y de orujo de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento y comercializados hasta el 31 de octubre de 1992.

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.

ANEXOS

Índice

▼M23

ANEXO I

CARACTERÍSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA

▼M20

ANEXO I bis

Muestreo de aceite de oliva o aceite de orujo de oliva entregado en envases inmediatos de 100 litros como máximo

El presente método de muestreo se aplicará a las entregas de aceite de oliva o de orujo de oliva de 125 000 litros como máximo, presentados en envases inmediatos de 100 litros como máximo.

Cuando la entrega consista en más de 125 000 litros, se dividirá en lotes de cantidades iguales o inferiores a 125 000 litros. Cuando la entrega sea inferior a 125 000 litros, ésta constituirá un lote. El presente método se aplicará entonces a cada lote.

En función del tamaño del lote se determinará el número mínimo de muestras elementales, con arreglo al cuadro que figura en el punto 1.

El volumen de la muestra elemental se establecerá en función de la capacidad de los envases inmediatos, de acuerdo con el cuadro que figura en el punto 2.1.

Las definiciones contempladas en la norma EN ISO 5555 se aplicarán a «entrega», «muestra elemental» y «muestra de laboratorio».

Se entenderá por «lote» un conjunto de unidades de venta que se hayan producido, fabricado y envasado en circunstancias tales que el aceite contenido en cada una de dichas unidades de venta se considere homogéneo en lo que se refiere a sus características analíticas.

1.   NÚMERO DE MUESTRAS ELEMENTALES

El número mínimo de muestras elementales se determinará en función del tamaño del lote, con arreglo al cuadro siguiente:

Los envases inmediatos de una misma muestra elemental deberán escogerse entre envases contiguos del lote.

En caso de duda, el Estado miembro aumentará el número de muestras elementales que deban tomarse.

2.   CONTENIDO DE UNA MUESTRA ELEMENTAL

2.1   Cada muestra elemental consistirá en lo siguiente:

2.2   Las muestras elementales se mantendrán en los envases inmediatos hasta el momento de los análisis. A continuación, el aceite de las muestras elementales se subdividirá, en su caso, en tres muestras de laboratorio con el fin de efectuar:

2.3   Los envases que constituyan una muestra elemental se subdividirán de acuerdo con los procedimientos de control previstos por las legislaciones nacionales.

3.   ANÁLISIS Y RESULTADOS

▼M20

ANEXO I ter

ESQUEMA DE DECISIONES PARA LA COMPROBACIÓN DE LA CONFORMIDAD DE UNA MUESTRA DE ACEITE DE OLIVA CON LA CATEGORÍA DECLARADA

El análisis de la conformidad de un aceite de oliva o de orujo de oliva con la categoría declarada podrá efectuarse:

Los análisis relativos a los contaminantes, necesarios para comprobar la conformidad con las normas de la Comunidad Europea, se realizarán por separado.

El esquema de decisiones se aplicará a todas las categorías de aceite de oliva y de orujo de oliva. Se compone de cuadros numerados del 1 al 11, que deberán seguirse en el orden indicado en el cuadro general en función de la categoría de aceite declarada.

Para la lectura de los cuadros general a 11:

►() C4  

Cuadro general

Cuadro 1

Cuadro 2

Cuadro 3

Cuadro 4

Cuadro 5

Cuadro 6

►() C4  

Cuadro 7

Cuadro 8

Cuadro 9

Cuadro 10

Cuadro 11

Apéndice 1

Correspondencia entre los anexos del presente Reglamento y los análisis previstos en el procedimiento decisorio

Apéndice 2

Cuadro 1

Cuadro 2

Cuadro 3

Cuadro 4

Cuadro 7

Cuadro 8

Cuadro 11

▼B

ANEXO II

▼M21

DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS LIBRES, MÉTODO EN FRÍO

▼B

1.   OBJETO

Determinar los ácidos libres en los aceites de oliva. El contenido en ácidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada según el método convencional.

1.1.   Principio

Disolución de la muestra en una mezcla de disolventes y valoración de los ácidos grasos libres mediante una solución etanólica de hidróxido potásico.

1.2.   Reactivos

Todos los reactivos deben ser de calidad analítica reconocida y el agua utilizada debe ser agua destilada o de una pureza equivalente.

1.3.   Material

Material habitual de laboratorio, y en particular:

1.4.   Procedimento

1.5   Expresión de la acidez en porcentaje de ácido oleico

La acidez, expresada en porcentaje de ácido oleico es igual a:

siendo:

V : volumen en ml de la solución valorada de hidróxido potásico utilizada.

c : concentración exacta, en moles por litro, de la solución de hidróxido potásico utilizada.

M : peso molecular del ácido en que se expresa el resultado (ácido oleico = 282).

P : peso en gramos de la muestra utilizada.

Se tomará como resultado la media aritmética ►M6  de dos determinaciones ◄ .

ANEXO III

DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE PERÓXIDOS

1.   OBJETO

La presente norma describe un método para la determinación del índice de peróxidos de los aceites y grasas.

2.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

La presente norma es aplicable a los aceites y grasas animales y vegetales.

3.   DEFINICIÓN

El índice de peróxidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de oxígeno activo por kg de grasa) de peróxidos en la muestra que ocasionan la oxidación del yoduro potásico en las condiciones de trabajo descritas.

4.   PRINCIPIO

La muestra problema, disuelta en ácido acético y cloroformo, se trata con solución de yoduro potásico. El yodo liberado se valora con solución valorada de tiosulfato sódico.

5.   APARATOS

Todo el material utilizado estará exento de sustancias reductoras u oxidantes.

Nota:

No engrasar las superficies esmeriladas.

6.   REACTIVOS

7.   MUESTRA

La muestra se tomará y almacenará al abrigo de la luz, y se mantendrá refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y herméticamente cerrados con tapones de vidrio esmerilado o de corcho.

8.   PROCEDIMIENTO

El ensayo se realizará con luz natural difusa o con luz artificial. Pesar con precisión de 0,001 g en una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un matraz (5.2) una cantidad de muestra en función del índice de peróxidos que se presuponga, con arreglo al cuadro siguiente:

Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la muestra problema. Añadir 10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rápidamente la muestra problema mediante agitación. Añadir 15 ml de ácido acético (6.2) y, a continuación, 1 ml de solución de yoduro potásico (6.3). Cerrar rápidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscuridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida entre 15 y 25 °C.

Añadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solución de tiosulfato sódico (6.4) (solución 0,002 N si se presuponen valores inferiores a 12 y solución 0,01 N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando la solución de almidón (6.5) como indicador.

Efectuar dos determinaciones por muestra.

Realizar simultáneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solución de tiosulfato sódico 0,01 N (6.4), sustituir los reactivos.

9.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El índice de peróxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxígeno activo por kg de grasa se calcula mediante la fórmula siguiente:

siendo:

V : ml de solución valorada de tiosulfato sódico (6.4) empleados en el ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo en blanco.

N : normalidad exacta de la solución de tiosulfato sódico (6.4) empleada.

P : peso, en gramos de la muestra problema.

El resultado será la media artimética de las dos determinaciones efectuadas.

▼M21

ANEXO IV

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

1.   OBJETO

El presente método describe un procedimiento para la determinación del contenido de ceras en los aceites de oliva. Las ceras se separan en función del número de átomos de carbono. El método puede utilizarse, en particular, para distinguir el aceite de oliva obtenido por presión del obtenido mediante extracción (aceite de orujo de oliva).

2.   PRINCIPIO

La materia grasa, a la que se habrá añadido un patrón interno adecuado, se fracciona mediante cromatografía en columna de gel de sílice hidratado; se recupera la fracción eluida en primer lugar en las condiciones de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicéridos) y, a continuación, se analiza directamente mediante cromatografía de gases en columna capilar.

3.   MATERIAL

4.   REACTIVOS

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Preparación de la columna cromatográfica

Suspender 15 g de gel de sílice (4.1) en n-hexano (4.2) e introducirlo en la columna (3.2). Completar la sedimentación espontánea con ayuda de un vibrador eléctrico (3.5), a fin de obtener una capa cromatográfica más homogénea. Hacer pasar 30 ml de n-hexano para eliminar las posibles impurezas. Pesar exactamente con ayuda de la balanza (3.8) 500 mg de la muestra en el matraz Erlenmeyer de 25 ml (3.1) y añadir la cantidad adecuada del patrón interno (4.5), en función del contenido previsto de ceras; por ejemplo, añadir 0,1 mg de araquidato de laurilo si se trata de aceite de oliva y de 0,25 a 0,50 mg si se trata de aceite de orujo. Transferir la muestra así preparada a la columna cromatográfica, con ayuda de dos porciones, cada una de 2 ml, de n-hexano (4.2).

Dejar fluir el disolvente hasta que se sitúe a 1 mm por encima del nivel superior del absorbente, y a continuación hacer pasar 70 ml más de n-hexano para eliminar los n-alcanos presentes de forma natural. Comenzar entonces la elución cromatográfica recogiendo 180 ml de la mezcla de n-hexano/éter etílico en la proporción 99:1, manteniendo un flujo aproximado de 15 gotas cada 10 segundos. La elución de la muestra debe efectuarse a una temperatura ambiente de 22 °C ± 4 °C.

Notas:

Secar la fracción resultante en el rotavapor (3.6) hasta que se haya eliminado prácticamente todo el disolvente. Eliminar los dos últimos mililitros del disolvente con ayuda de una débil corriente de nitrógeno; añadir a continuación de 2 a 4 ml de n-heptano.

5.2.   Cromatografía de gases

5.2.1.   Operaciones preliminares

Instalar la columna en el cromatógrafo de gases (3.3), conectando el terminal de entrada al sistema en columna y el terminal de salida al detector. Efectuar los controles generales del cromatógrafo de gases (funcionamiento de los circuitos de gas, eficacia del detector y del registrador, etc.).

Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla. Hacer pasar a través de la columna una corriente ligera de gas y, a continuación, encender el cromatógrafo de gases. Calentar gradualmente hasta alcanzar, al cabo de unas 4 horas, la temperatura de 350 °C. Mantener esta temperatura durante al menos 2 horas y, a continuación, ajustar el aparato a las condiciones de trabajo [regulación del flujo del gas, encendido de la llama, conexión con el registrador electrónico (3.3.4), regulación de la temperatura del recinto para la columna, regulación del detector, etc.] y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para efectuar el análisis. La línea de base deberá ser lineal, sin picos de ningún tipo ni deriva.

Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna no son correctas; una deriva positiva indica que la columna no ha sido acondicionada adecuadamente.

5.2.2.   Elección de las condiciones de trabajo

En general, las condiciones de trabajo deben ser las siguientes:

Estas condiciones pueden modificarse en función de las características de la columna y del cromatógrafo de gases, de modo que se obtenga la separación de todas las ceras, una resolución satisfactoria de los picos (véase la figura) y un tiempo de retención del patrón interno C32 de 18 ± 3 minutos. El pico más representativo de las ceras debe haber medido al menos el 60 % del fondo de la escala.

Determinar los parámetros de integración de los picos de manera que se obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos considerados.

Nota:Ante lo elevado de la temperatura final, se admite una deriva positiva que no debe ser superior al 10 % del fondo de la escala.

5.3.   Realización del análisis

Tomar 1 μl de la solución con la microjeringa de 10 μl; sacar el émbolo de la jeringa hasta que la aguja esté vacía. Introducir la aguja en el sistema de inyección e inyectar rápidamente después de 1 o 2 segundos; dejar pasar unos 5 segundos y extraer lentamente la aguja.

Llevar a cabo el registro hasta que las ceras se hayan eluido completamente.

La línea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas.

5.4.   Identificación de los picos

Identificar los distintos picos sobre la base de los tiempos de retención, comparándolos con mezclas de ceras analizadas en las mismas condiciones y cuyos tiempos de retención sean conocidos.

La figura presenta un cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen.

5.5.   Determinación cuantitativa

Calcular con ayuda del integrador las áreas de los picos correspondientes al patrón interno y a los ésteres alifáticos de C40 a C46.

Determinar el contenido en ceras de cada uno de los ésteres, en mg/kg de materia grasa, aplicando la siguiente fórmula:

siendo:

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Indicar la suma de los contenidos de las distintas ceras de C40 a C46, en mg/kg de materia grasa (ppm).

Nota:Los componentes que se deben cuantificar hacen referencia a los picos con un número par de carbonos, comprendidos entre los ésteres C40 y C46, según el ejemplo del cromatograma de las ceras del aceite de oliva indicado en la figura siguiente. Si el éster C46 aparece dos veces, para identificarlo conviene analizar la fracción de las ceras de un aceite de orujo de oliva en que el pico C46 sea fácil de identificar por ser claramente mayoritario.

Los resultados deben expresarse con una cifra decimal.

Figura

Cromatograma de las ceras de un aceite de oliva ( 5 )

Leyenda:

Apéndice

Determinación de la velocidad lineal del gas

Inyectar de 1 a 3 μl de metano (o propano) en el cromatógrafo de gases, después de haberlo ajustado a las condiciones de trabajo normales. Cronometrar el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de su inyección hasta la aparición del pico (tM).

La velocidad lineal, en cm/s, viene dada por la fórmula L/tM, siendo L la longitud de la columna expresada en cm y tM el tiempo cronometrado en segundos.

▼B

ANEXO V

DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DEL CONTENIDO DE ESTEROLES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

1.   OBJETO

El presente método describe un procedimiento para la determinación del contenido de esteroles en las materias grasas, expresado como contenido de cada uno de los esteroles analizados y como contenido total de esteroles.

2.   PRINCIPIO

Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadio α-colestanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido potásico; a continuación, extracción del insaponificable con éter etílico.

Separación de la fracción de esteroles del insaponificable extraído mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los esteroles recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se analizan mediante cromatografía de gases con columna capilar.

3.   MATERIAL

4.   REACTIVOS

5.   PROCEDIMIENTO

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

APÉNDICE

Determinación de la velocidad lineal del gas

Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condiciones normales, de 1 a 3 μl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de la inyección hasta el momento en que aparece el pico (tM).

La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.

Figura 1

Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva bruto

Figura 2

Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva refinado

ANEXO VI

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ERITRODIOL Y UVAOL

INTRODUCCIÓN

El eritrodiol, entendido corrientemente como conjunto de los dioles eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, característico de algunos tipos de materias grasas. Su concentración es mucho más elevada en los aceites de oliva obtenidos mediante extracción que en los obtenidos mediante presión o en el aceite de pepita de uva y, por lo tanto, su determinación puede servir para comprobar la existencia de aceite de oliva obtenido mediante extracción.

1.   OBJETO

El presente método describe un procedimiento para determinar el eritrodiol en las materias grasas.

2.   PRINCIPIO

La materia grasa se saponifica con una solución etanólica de hidróxido potásico; a continuación se extrae el insaponificable con éter etílico y se purifica pasándolo por una columna de alúmina.

El fraccionamiento del insaponificable se realiza mediante cromatografía en capa fina en placa de gel de sílice y se aíslan la banda de la fracción esterólica y la del eritrodiol.

Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la placa se transforman en trimetilsililéteres y seguidamente se analiza la mezcla mediante cromatografía de gases.

El resultado se expresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto de eritrodiol + esteroles.

3.   MATERIAL Y APARATOS

4.   REACTIVOS

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Preparación del insaponificable

Se realiza tal como se indica en el apartado 5.1.2 del método del Anexo V

5.2.   Separación del eritrodiol y los esteroles

5.3.   Preparación de los trimetilsililéteres

Se realiza tal como se indica en el apartado 5.3 del método del Anexo V.

5.4.   Cromatografía de gases

Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4 del método citado. Las condiciones operativas de la cromatografía de gases deben cumplir los requisitos necesarios para analizar los esteroles y, además, permitir la separación de los TMSE del eritrodiol y del uvaol.

Una vez inyectada la muestra, dejar que se desarrolle el proceso hasta que se produzca la elución de los esteroles presentes, el eritrodiol y el uvaol; identificar los picos (el eritrodiol y el uvaol tienen tiempos de retención relativos, respecto al β-sitosterol, de alrededor de 1,45 y 1,55, respectivamente) y calcular sus áreas de la misma forma que para los esteroles.

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

siendo:

A1 : área del pico del eritrodiol,

A2 : área del pico del uvaol ►M6  ————— ◄ ,

Aesteroles : suma de las áreas de los esteroles presentes.

Los resultados deben expresarse con una cifra decimal.

▼M21

ANEXO VII

DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE MONOPALMITATO DE 2-GLICERILO

1.   OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

El presente método describe el procedimiento analítico para la determinación del porcentaje de ácido palmítico en posición 2 de los triglicéridos mediante la evaluación del monopalmitato de 2-glicerilo.

Este método es aplicable a los aceites vegetales líquidos a temperatura ambiente (20 °C).

2.   PRINCIPIO

Tras la preparación, la muestra de aceite se somete a la acción de la lipasa pancreática: la hidrólisis parcial y específica en las posiciones 1 y 3 de las moléculas de triglicéridos implica la aparición de monoglicéridos en posición 2. Se determina el porcentaje de monopalmitato de 2-glicerilo en la fracción monoglicerídica, previa sililación, mediante cromatografía de gases en columna capilar.

3.   EQUIPO Y MATERIAL HABITUAL

4.   REACTIVOS

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Preparación de la muestra

5.2.   Hidrólisis con lipasa pancreática

5.3.   Preparación de los derivados sililados y de la cromatografía de gases

5.4.   Cromatografía de gases

Las condiciones de trabajo son las siguientes:

5.4.1.   Identificación de los picos

Los distintos monoglicéridos se identifican en función de sus tiempos de retención obtenidos, comparándolos con los correspondientes a las mezclas patrón de monoglicéridos analizadas en las mismas condiciones.

5.4.2.   Determinación cuantitativa

El área de cada pico se calcula mediante un integrador electrónico.

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El porcentaje de monopalmitato de glicerilo se calcula a partir de la relación entre el área del pico correspondiente y la suma de las áreas de los picos de todos los monoglicéridos (véase la figura 2), según la fórmula siguiente:

siendo:

El resultado debe expresarse con una cifra decimal.

7.   INFORME DEL ANÁLISIS

El informe del análisis deberá especificar:

Figura 1

Cromatograma de los productos de la reacción de sililación obtenidos por acción de la lipasa en un aceite de oliva refinado con la adición de un 20 % de aceite esterificado (100 %)

Leyenda: «acides gras libres» = Ácidos grasos libres; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = Aceite de oliva refinado + 20 % aceite de oliva esterificado; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitina; «1-2 mono C18 insat.» = 1,2-mono C18 insat.; «Squalene» = Escualeno; «1-2 monopalmitoléine» = 1,2-monopalmitoleína; «Scan» = Lectura.

Figura 2

Cromatograma de:

A)

aceite de oliva no esterificado, previo tratamiento con lipasa y sililación; en estas condiciones (columna capilar de 8 a 12 m), la fracción de ceras se eluye al mismo tiempo que la fracción de diglicéridos o poco después. Tras el tratamiento con lipasa, el contenido en triglicéridos no debería superar el 15 % Leyenda: 1 = Ácidos grasos libres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-monopalmitina ** = Triglicérido C54

Cromatograma de:

B)

aceite esterificado previo tratamiento con lipasa y sililación; en estas condiciones (columna capilar de 8 a 12 m), la fracción de ceras se eluye al mismo tiempo que la fracción de diglicéridos o poco después. Tras el tratamiento con lipasa, el contenido en triglicéridos no debería superar el 15 %. Leyenda: 1 = Ácidos grasos libres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-monopalmitina ** = Triglicérido C54

8.   NOTAS

En el comercio se encuentran lipasas con una actividad satisfactoria. También es posible prepararlas en el laboratorio de la forma siguiente:

Enfriar a 0 °C 5 kg de páncreas fresco de cerdo. Retirar la grasa sólida y el tejido conjuntivo que lo rodea y triturarlo en un molino de cuchillas hasta obtener una pasta fluida. Agitar dicha pasta durante 4-6 horas con 2,5 l de acetona anhidra y después centrifugar. Extraer el residuo tres veces más con el mismo volumen de acetona anhidra, después dos veces con una mezcla de acetona/éter dietílico 1/1 (V/V), y otras dos veces con éter dietílico.

Secar el residuo durante 48 horas en vacío para obtener un polvo estable que deberá conservarse en el refrigerador y al abrigo de la humedad.

Preparar una emulsión de aceite de oliva de la forma siguiente:

Agitar en un mezclador durante 10 minutos una mezcla constituida por 165 ml de una solución de goma arábiga de 100 g/l, 15 gramos de hielo picado y 20 ml de un aceite de oliva previamente neutralizado.

Poner en un vaso de precipitados de 50 ml sucesivamente 10 ml de la emulsión anterior, 0,3 ml de una solución de colato de sodio de 0,2 g/ml y 20 ml de agua destilada.

Colocar el vaso en un termostato regulado a 37 °C; introducir en el vaso los electrodos del pH-metro y el agitador de hélice.

Por medio de una bureta, añadir gota a gota una solución de hidróxido de sodio 0,1 N hasta la obtención de un pH de 8,3.

Añadir un volumen de suspensión de polvo de lipasa en agua (0,1 g/ml de lipasa). Desde el momento en que el pH-metro indique un pH de 8,3, poner en marcha el cronómetro y añadir la solución de hidróxido de sodio gota a gota, al ritmo necesario para mantener el pH en el valor de 8,3. Anotar cada minuto el volumen de solución consumido.

Llevar los datos obtenidos a un sistema de coordenadas, poniendo en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros de solución alcalina 0,1 N consumidos para mantener el pH constante. Debe obtenerse un gráfico lineal.

La actividad de la lipasa, medida en unidades de lipasa por mg, viene dada por la fórmula siguiente:

siendo:

La unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima que libera 10 micro-equivalentes de ácido por minuto.

▼M20 —————

▼B

ANEXO IX

PRUEBA ESPECTROFOTOMÉTRICA EN EL ULTRAVIOLETA

INTRODUCCIÓN

La prueba espectrofotométrica en el ultravioleta puede proporcionar indicaciones sobre la calidad de una materia grasa, su estado de conservación y las modificaciones inducidas por los procesos tecnológicos.

Las absorciones en las longitudes de onda indicadas en el método se deben a la presencia de sistemas diénicos y triénicos ►C1  conjugados ◄ . Los valores de estas absorciones se expresan en extinción específica E1cm 1 % (extinción de una solución de la materia grasa al 1 % en el disolvente determinado, en un espesor de 1 cm) que se expresará convencionalmente como K, también denominado coeficiente de extinción.

1.   OBJETO

El método describe el procedimiento de ejecución de la prueba espectrofotométrica en el ultravioleta de las materias grasas.

2.   PRINCIPIO

La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la extinción de la solución a las longitudes de onda prescritas, respecto al disolvente puro. A partir de los valores espectrofotométricos se calculan las extinciones específicas.

3.   MATERIAL Y APARATOS

▼M6

▼B

4.   REACTIVOS

5.   PROCEDIMIENTO

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

APÉNDICE I

Preparación de la alúmina y control de su actividad

A.1.1.   Preparación de la alúmina

En un recipiente que pueda cerrarse herméticamente se echa la alúmina previamente desecada en horno a 380-400 °C durante tres horas, se añade agua destilada en una proporción de 5 ml por 100 g de alúmina, se cierra rápidamente el recipiente, se agita repetidas veces y se deja reposar durante 12 horas como mínimo antes del uso.

A.1.2.   Control de la actividad de la alúmina

Se prepara una columna para cromatografía con 30 g de alúmina. Se opera tal como se describe en el apartado 5.4. Se hace pasar a través de la columna una mezcla formada por:

Si, después del paso por la columna, la mezcla presenta una extinción específica a 268 nm mayor que 0,11, la alúmina es aceptable; en otro caso se debe aumentar el porcentaje de hidratación.

APÉNDICE II

Ajuste del espectrofotómetro

ANEXO X «A»

ANÁLISIS DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS GRASOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES

1.   OBJETO

El presente ►C1  método ◄ proporciona orientaciones generales para determinar, mediante cromatografía de gases con columna de relleno o capilar, la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos obtenidos con arreglo al Anexo X B.

El método no es aplicable a los ácidos grasos polimerizados.

2.   REACTIVOS

2.1.   Gas portador

Gas inerte (nitrógeno, helio, argón, hidrógeno, etc.), perfectamente desecado y que contenga menos de 10 mg/kg de oxígeno.

Nota 1:

El hidrógeno, que sólo se emplea como gas portador en las columnas capilares, puede duplicar la velocidad del análisis, pero es peligroso. Existen dispositivos de seguridad.

3.   APARATOS

Las normas que figuran a continuación se refieren al equipo ordinario para cromatografía de gases, utilizando columnas de relleno y/o capilares y un detector de ionización de llama. Podrá utilizarse cualquier aparato cuya eficacia y resolución se ajusten a lo dispuesto en el punto 4.1.2.

3.1.   Cromatógrafo de gases

El cromatógrafo de gases constará de los siguientes elementos:

3.1.1.   Sistema de inyección

Utilizar un sistema de inyección:

Nota 2:

En ausencia de ácidos grasos con menos de 16 átomos de carbono, podrá utilizarse un inyector de aguja móvil.

3.1.2.   Horno

El horno podrá calentar la columna a 260 °C como mínimo y mantener dicha temperatura con una oscilación máxima de 1 °C, si se emplea una columna de relleno, y de 0,1 °C, si se emplea una columna capilar. Este último requisito es especialmente importante si se utiliza una columna de sílice fundida.

Se recomienda emplear en todos los casos un sistema de calentamiento programado, sobre todo en el caso de ácidos grasos con menos de 16 átomos de carbono.

3.1.3.   Columna de relleno

3.1.4.   Columna capilar

3.2.   Jeringa

Tendrá una capacidad máxima de 10 μl y estará graduada en 0,1 μl.

3.3.   Registrador

Si se emplea la curva del registrador para calcular la composición de la mezcla analizada, se necesita un registrador electrónico de alta precisión compatible con los aparatos utilizados. El registrador deberá tener las siguientes características:

3.4.   Integrador

La utilización de un integrador electrónico permite efectuar cálculos rápidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibilidad adecuada y la corrección de la desviación de la línea de base debe ser satisfactoria.

4.   PROCEDIMIENTO

Las operaciones descritas en los puntos 4.1 a 4.3 sólo son válidas si se emplea un detector de ionización de llama.

Como alternativa puede emplearse un cromatógrafo de gases con catarómetro (cuyo funcionamiento se basa en el principio de los cambios de conductividad térmica). En ese caso, las condiciones de ensayo deberán modificarse como se indica en el punto 6.

4.1.   Condiciones de ensayo

4.1.2.

Determinación del número de platos teóricos (eficacia) y de la resolución (Véase la figura 1) Efectuar el análisis de una mezcla de estearato de metilo y de oleato de metilo (por ejemplo, ésteres metílicos de manteca de cacao) en proporciones aproximadamente equivalentes. Escoger la temperatura de la columna y el flujo del gas portador de manera que el máximo del pico del estearato de metilo se registre aproximadamente 15 minutos después del pico del disolvente. Utilizar una cantidad suficiente de la mezcla de ésteres metílicos, de manera que el pico del estearato de metilo se eleve a tres cuartos aproximadamente de la escala completa. Calcular el número «n» de platos teóricos (eficacia) mediante la siguiente fórmula: y la resolución «R» mediante la siguiente fórmula: siendo: dr1 = distancia en mm, desde el inicio del cromatograma hasta el máximo del pico del estearato de metilo, a1 y a2 = anchura, en mm, de los picos del estearato de metilo y del oleato de metilo, respectivamente, medida entre los puntos de intersección de las tangentes en los puntos de inflexión de la curva con la línea de base, Δ = distancia, en mm, entre los dos máximos de los picos del estearato de metilo y del oleato de metilo, ▼M2 y el índice de resolución «lr» mediante la siguiente fórmula: siendo: a = altura del pico más pequeño, medida a partir de la línea de base; b = altura del punto más bajo del valle comprendido entre los dos picos adyacentes, medida a partir de la línea de base. ▼B Figura 1 Cromatograma para determinar el número de platos teóricos (eficacia) y la resolución Se establecerán unas condiciones de análisis que permitan obtener al menos 2 000 platos teóricos por metro de longitud de columna para el estearato de metilo y una resolución de 1,25 como mínimo.

4.2.   Muestra problema

Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 μl a 2 μl de la solución de ésteres metílicos preparados con arreglo al Anexo X B e inyectarlos en la columna.

En el caso de ésteres no disueltos, preparar una solución de 100 mg/ml aproximadamente en heptano de calidad para cromatografía e inyectar de 0,1 μl a 1 μl de esta solución.

Si sólo se desean detectar los componentes presentes en cantidades muy pequeñas, se podrá aumentar el tamaño de la muestra (hasta 10 veces).

4.3.   Análisis

Como norma general, las condiciones de ensayo son las que se especifican en el punto 4.1.1.

No obstante, cuando se determinan ácidos con menos de 12 átomos de carbono es posible operar a menor temperatura de columna, mientras que cuando se determinan ácidos grasos con más de 20 átomos de carbono es posible operar a una temperatura mayor. A veces se puede utilizar en los dos casos anteriores un sistema de programación de temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene ésteres metílicos de ácidos grasos con menos de 12 átomos de carbono, inyectar la muestra a 100 °C (o a 50 — 60 °C si hay ácido butírico) y elevar inmediatamente la temperatura a razón de 4 — 8 °C/min hasta alcanzar el nivel deseado. En algunos casos es posible combinar ambos procedimientos.

Tras el calentamiento programado, se continúa la elución a temperatura constante hasta que todos los componentes se hayen eluido. Si el instrumento no puede efectuar un calentamiento programado, se opera a dos temperaturas fijas comprendidas entre 100 y 195 °C.

Si es necesario, se recomienda que se efectúe un análisis con dos fases fijas de diferente polaridad para comprobar la ausencia de picos «ocultos», por ejemplo en caso de presencia simultánea de C18:3 y C20:0 o C18:3 y C18:2 conjugados.

4.4.   Preparación del cromatograma y las gráficas de referencia

Analizar la mezcla patrón de referencia (2.3) aplicando las mismas condiciones de ensayo que a la muestra y medir los tiempos o las distancias de retención de los ácidos grasos que la componen. Representar gráficamente en papel semilogarítmico, para cualquier grado de insaturación, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retención en función del número de átomos de carbono. En condiciones isotérmicas, las gráficas de los ésteres de cadena lineal con el mismo grado de insaturación deben formar líneas rectas. Dichas líneas rectas deben ser aproximadamente paralelas.

Deben evitarse las condiciones que propicien la existencia de «picos ocultos», es decir, una resolución insuficiente para separar dos componentes.

5.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

5.1.   Análisis cualitativo

Identificar los picos del estearato de metilo de la muestra a partir de los gráficos citados en el punto 4.4, si es necesario por interpolación.

5.2.   Análisis cuantitativo

5.2.1.   Determinación de la composición

Salvo en casos excepcionales, utilizar el método de normalización interna, es decir, partir del principio de que todos los componentes de la muestra están representados en el cromatograma, de manera que el total de las áreas situadas debajo de cado pico representa el 100 % de los constituyentes (elución total).

Si el equipo incluye un integrador, utilizar las cifras que éste proporcione. En caso contrario, determinar el área situada debajo de cada pico multiplicando la altura del pico por el ancho a la mitad de la altura y, cuando sea necesario, tomar en consideración las atenuaciones utilizadas durante el registro.

5.2.2.   Método de cálculo

▼M2

6.   CASO ESPECIAL DE DETERMINACIÓN DE LOS ISÓMEROS TRANS

Es posible determinar el contenido de isómeros trans de los ácidos grasos con un número de átomos de carbono comprendido entre 10 y 24 por separación de los ésteres metílicos, utilizando columnas cromatográficas capilares con una polaridad especial.

▼M21

▼M2

6.4.

La identificación de los diversos ésteres metílicos se efectúa comparando los tiempos de retención con los de las mezclas de referencia (tal y como se indica en el punto 2.3). Los ésteres de los ácidos grasos trans son eluidos antes que los isómeros cis correspondientes. En la figura 2 se presenta un ejemplo de cromatograma. Figura 2 Cromatograma de gases tipo relativo a la determinación de los isómeros trans de los ácidos grasos con columna capilar

▼B

7.   CASO ESPECIAL DE UTILIZACIÓN DE UN CATARÓMETRO (FUNCIONAMIENTO BASADO EN EL PRINCIPIO DE LOS CAMBIOS DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA)

Para la determinación de la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos también podrá utilizarse un cromatógrafo de gases provisto de un detector cuyo funcionamiento se base en el principio de los cambios de conductividad térmica (catarómetro). En ese caso, las condiciones establecidas en los puntos 3 y 4 deberán modificarse como se indica en la tabla 3.

Para el análisis cuantitativo, utilizar los factores de corrección definidos en el punto 5.2.2.2.

8.   INFORME DEL ANÁLISIS

En el informe del análisis se expondrán los métodos utilizados para la preparación de los ésteres metílicos y para la realización del análisis mediante cromatografía de gases, así como los resultados obtenidos. Se mencionarán, asimismo, cualesquiera procedimientos de trabajo que no se especifiquen en la presente norma internacional o que se consideren facultativos, así como toda circunstancia que pueda haber influido en los resultados.

El informe del análisis incluirá todos los datos necesarios para la completa identificación de la muestra.

▼M19

ANEXO X «B»

PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS GRASOS DEL ACEITE DE OLIVA Y DEL ACEITE DE ORUJO DE OLIVA

Se recomiendan los dos métodos siguientes para la preparación de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva.

Método A : Transesterificación en frío con una solución metanólica de hidróxido potásico.

Método B : Metilación en caliente con una solución metanólica de metilato de sodio, seguida de esterificación en medio ácido.

Se aplicará uno u otro método según el parámetro analítico que se vaya a determinar y dependiendo de la categoría de aceite, tal como se indica a continuación:

PURIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS DE ACEITE

Cuando proceda, las muestras se purificarán pasando el aceite a través de una columna de gel de sílice, utilizando como disolvente de elución hexano/éter dietílico (87: 13, v/v) tal como se describe en el método IUPAC 2.507.

Como procedimiento alternativo puede recurrirse a la extracción en fase sólida utilizando cartuchos de gel de sílice. Se coloca un cartucho de gel de sílice (1 g, 6 ml) en un aparato de elución en vacío, se lava con 6 ml de hexano y se deja de aplicar el vacío para evitar que se seque la columna. A continuación se introduce en la columna una solución de aceite (0,12 g aproximadamente) en 0,5 ml de hexano y se aplica el vacío para que la solución se introduzca en la sílice; después se eluye con 10 ml de hexano/éter dietílico (87: 13 v/v) en vacío. Se homogeneiza la totalidad de los eluidos y se divide en dos alícuotas similares. Una alícuota se evapora hasta sequedad en un evaporador rotatorio a presión reducida y a temperatura ambiente. El residuo se disuelve en 1 ml de heptano y la solución queda lista para el análisis de ácidos grasos por CG. La segunda alícuota se evapora y el residuo se disuelve en 1 ml de acetona para el análisis de los triglicéridos mediante HPLC si es necesario.

MÉTODOS PARA LA PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS GRASOS

1.   Método A: Transesterificación en frío con una solución metanólica de hidróxido potásico

1.1.   Ámbito de aplicación

Este método rápido es aplicable a los aceites de oliva y a los aceites de orujo de oliva con un contenido en ácidos grasos libres inferior al 3,3 %. El hidróxido potásico no produce la esterificación de los ácidos grasos libres. Los ésteres etílicos de los ácidos grasos se transesterifican más lentamente que los glicéridos y puede que sólo se metilen parcialmente.

1.2.   Principio

Los ésteres metílicos se forman por transesterificación con una solución metanólica de hidróxido potásico como fase intermedia antes de que se produzca la saponificación (punto 5 del método ISO 5509: 2000, punto 5 del método IUPAC 2.301).

1.3.   Reactivos

Metanol con un contenido en agua igual o inferior al 0,5 % (m/m).

Heptano para cromatografía.

Hidróxido potásico, solución metanólica 2 N aproximadamente: disolver 11,2 g de hidróxido potásico en 100 ml de metanol.

1.4.   Material

Tubos de rosca (5 ml de volumen) con tapón provisto de junta de PTFE

Pipetas aforadas o automáticas de 2 ml y 0,2 ml.

1.5.   Procedimiento

En un tubo de rosca de 5 ml pesar aproximadamente 0,1 g de la muestra de aceite. Añadir 2 ml de heptano y agitar. Añadir 0,2 ml de la solución metanólica 2 N de hidróxido potásico, poner el tapón provisto de junta de PTFE, cerrar bien y agitar enérgicamente durante 30 segundos. Dejar reposar hasta que la parte superior de la solución quede clara. Decantar la capa superior, que es la que contiene los ésteres metílicos. La solución de heptano está lista para inyectarse en el cromatógrafo. Es aconsejable mantener la solución en el frigorífico hasta el momento de realizar el análisis cromatográfico. No se recomienda guardar la solución durante más de 12 horas.

2.   Método B: Metilación en caliente con una solución metanólica de metilato de sodio, seguida de esterificación en medio ácido

2.1.   Ámbito de aplicación

Este método es aplicable a los aceites de oliva y a los aceites de orujo de oliva con un contenido en ácidos grasos libres superior al 3,3 %.

2.2.   Principio

Neutralización de los ácidos grasos libres y metanólisis alcalina de los glicéridos, seguida de esterificación de los ácidos grasos en medio ácido (punto 4.2 del método IUPAC no 2.301).

2.3.   Reactivos

2.4.   Material

2.5.   Procedimiento

Poner 0,25 g de la muestra de aceite en un matraz aforado de 50 ml, con cuello esmerilado. Con ayuda del embudo, añadir 10 ml de la solución metanólica de metilato de sodio 0,2 N y las perlas para regular la ebullición. Acoplar el refrigerante de reflujo, agitar y llevar a ebullición. La solución debería quedar límpida al cabo de unos 10 minutos. La reacción está terminada prácticamente a los 15 minutos. Retirar el matraz de la fuente de calor, esperar hasta que pare el reflujo, quitar el refrigerante y añadir dos gotas de la solución de fenolftaleína. Añadir unos mililitros de ácido sulfúrico en solución metanólica 1 N hasta que la solución quede incolora y, a continuación, añadir un exceso de 1 ml. Colocar el refrigerante y volver a llevar a ebullición durante unos 20 minutos. Retirar el matraz de la fuente de calor y enfriarlo en chorro de agua. Quitar el refrigerante, añadir 20 ml de la solución saturada de cloruro sódico y agitar. Añadir 5 ml de heptano, tapar el matraz y agitar enérgicamente durante 15 segundos.

Dejar reposar hasta que las dos fases se separen completamente. Añadir de nuevo solución saturada de cloruro sódico hasta que la fase acuosa alcance la parte inferior del cuello del matraz. La capa superior, que se encuentra en el cuello del matraz, es la que contiene los ésteres metílicos. Esta solución está lista para inyectarse en el cromatógrafo de gases.

Precaución: La metilación con el método B debe realizarse en campana extractora.

2.6.   Alternativas a la metilación según el Método B

2.6.1.   Método C

2.6.1.1.   Principio

La materia grasa analizada se trata con solución metanólica de ácido clorhídrico, en una ampolla cerrada, a 100 °C.

2.6.1.2.   Material

2.6.1.3.   Reactivos

Solución de ácido clorhídrico en 2 % de metanol, preparada a partir de ácido clorhídrico gaseoso y metanol anhidro (nota 1).

Hexano para cromatografía.

Pueden emplearse soluciones comerciales de cloruro de hidrógeno en metanol. En el laboratorio pueden prepararse fácilmente pequeñas cantidades de ácido clorhídrico gaseoso por simple desplazamiento de la solución comercial (p = 1,18), añadiendo algunas gotas de ácido sulfúrico concentrado. Como el metanol muestra mucha avidez por el ácido clorhídrico, se aconseja tomar las precauciones necesarias para la disolución (por ejemplo, introducir el gas a través de un pequeño embudo invertido cuyo borde roce la superficie del metanol). Pueden prepararse con antelación grandes cantidades de solución metanólica de ácido clorhídrico, ya que se conserva en perfectas condiciones en la oscuridad dentro de frascos con tapones de vidrio. Este reactivo puede asimismo prepararse disolviendo cloruro de acetilo en metanol anhidro.

2.6.1.4.   Procedimiento

2.6.2.   Método D

2.6.2.1.   Principio

La materia grasa analizada se calienta a reflujo con metanol, hexano y ácido sulfúrico. Los ésteres metílicos obtenidos se extraen con éter de petróleo.

2.6.2.2.   Material

2.6.2.3.   Reactivos

2.6.2.4.   Procedimiento

Introducir 0,1 g de aceite en el tubo de 20 ml y añadir 5 ml del reactivo de metilación.

Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar al baño María en ebullición durante 30 minutos (nota 2).

Pasar cuantitativamente la mezcla a una ampolla de decantación de 50 ml con 10 ml de agua destilada y 10 ml de éter de petróleo. Agitar enérgicamente y esperar a que se produzca la separación de las fases. Separar la fase acuosa y lavar dos veces la capa etérea con 20 ml de agua destilada. Añadir a la ampolla de decantación una pequeña cantidad de sulfato sódico anhidro, agitar, dejar reposar unos minutos y filtrar, recogiendo el filtrado en un tubo de fondo cónico de 15 ml.

Evaporar el disolvente al baño María haciendo pasar una corriente de nitrógeno.

Para controlar la ebullición, introducir una varita de vidrio en el tubo y limitar la temperatura del baño María a 90 °C.

3.   Parámetros de precisión

La evaluación estadística de la precisión de los métodos A y B ha sido publicada por el Consejo Oleícola Internacional en su método COI/T.20/Doc. no 24.

RECOMENDACIONES PARA EL ANÁLISIS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES DE LOS ÉSTERES DE LOS ÁCIDOS GRASOS DEL ACEITE DE OLIVA Y DEL ACEITE DE ORUJO DE OLIVA

1.   Procedimiento

El análisis mediante cromatografía de gases de soluciones de ésteres grasos en hexano se realizará según la norma ISO 5508, utilizando una columna capilar (50 m de longitud × 0,25 o 0,32 mm de diámetro interior) impregnada con cianopropilsilicona, tal como se indica para la determinación de los isómeros trans de los ácidos grasos (COI/T.20/Doc. no 17).

En la figura 1 se presenta el perfil cromatográfico típico de un aceite de orujo de oliva que contiene ésteres metílicos y etílicos de ácidos grasos e isómeros trans de ésteres metílicos.

2.   Cálculos

2.2.

Para calcular el porcentaje de trans-C18:1 se utilizará el pico correspondiente a los ésteres metílicos de este ácido graso. Para la suma [trans-C18:2 + trans-C18:3], se sumarán todos los picos correspondientes a los isómeros trans de estos dos ácidos grasos. Para calcular el área total se tendrán en cuenta todos los picos mencionados en 2.1 (véase COI/T.20/Doc. no 17). El cálculo del porcentaje de cada ácido graso se efectuará según la siguiente fórmula: Figura 1: Perfil cromatográfico de un aceite de orujo de oliva, obtenido con el método de metilación en frío. Los picos cromatográficos corresponden a los ésteres metílicos, excepto aquellos en que se indica otra cosa.

▼B

ANEXO XI

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ►C1  DISOLVENTES ◄ HALOGENADOS VOLÁTILES EN EL ACEITE DE OLIVA

1.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

Análisis por cromatografía en fase gaseosa según la técnica del espacio de cabeza (head space).

2.   EQUIPO

3.   REACTIVOS

►C1  Disolventes ◄ halogenados con una pureza apropiada para su uso en cromatografía en la fase gaseosa.

4.   PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS

▼M22

ANEXO XII

MÉTODO DEL CONSEJO OLEÍCOLA INTERNACIONAL PARA LA VALORACIÓN ORGANOLÉPTICA DE LOS ACEITES DE OLIVA VÍRGENES

1.   OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

El presente método se basa en la Decisión no DEC-21/95-V/2007, de 16 de noviembre de 2007, relativa al método revisado para la valoración organoléptica del aceite de oliva virgen del Consejo Oleícola Internacional. Tiene por finalidad establecer el procedimiento para evaluar las características organolépticas de los aceites de oliva vírgenes según se define en el punto 1 del anexo XVI del Reglamento (CE) no 1234/2007, y describir el método para su clasificación en función de dichas características. El método incluye, asimismo, indicaciones para un etiquetado optativo.

El método descrito solo es aplicable a los aceites de oliva vírgenes, y a su clasificación o su etiquetado en función de la intensidad de los defectos detectados, del atributo frutado y otros atributos positivos, determinados por un grupo de catadores seleccionados, entrenados y examinados, constituidos en panel.

2.   ASPECTOS GENERALES

Para el vocabulario general de base, la sala de degustación, la copa de cata de los aceites y cualquier otra cuestión vinculada al presente método, se recomienda ajustarse a las prescripciones del Consejo Oleícola Internacional, en particular la decisión no DEC-21/95-V/2007, de 16 de noviembre de 2007, relativa al método revisado para la valoración organoléptica del aceite de oliva virgen.

3.   VOCABULARIO ESPECÍFICO

3.1.   Atributos positivos

conjunto de sensaciones olfativas características del aceite, dependientes de la variedad de las aceitunas, procedentes de frutos sanos y frescos, verdes o maduros, y percibidas por vía directa y/o retronasal.

El atributo frutado se considera verde cuando las sensaciones olfativas recuerdan las de los frutos verdes, características del aceite procedente de frutos verdes.

El atributo frutado se considera maduro cuando las sensaciones olfativas recuerdan las de los frutos maduros, características del aceite procedente de frutos verdes y maduros.

Amargo : sabor elemental característico del aceite obtenido de aceitunas verdes o en envero. Se percibe en las papilas circunvaladas de la uve lingual.

Picante : sensación táctil de picor, característica de los aceites obtenidos al comienzo de la campaña, principalmente de aceitunas todavía verdes. Puede ser percibido en toda la cavidad bucal, especialmente en la garganta.

3.2.   Atributos negativos

Atrojado/borras : flavor característico del aceite obtenido de aceitunas amontonadas o almacenadas en condiciones tales que han sufrido un avanzado grado de fermentación anaerobia o del aceite que ha permanecido en contacto con los lodos de decantación, que también han sufrido un proceso de fermentación anaerobia en trujales y depósitos.

Moho-humedad : flavor característico del aceite obtenido de aceitunas en las que se han desarrollado abundantes hongos y levaduras a causa de haber permanecido amontonadas con humedad varios días.

Avinado-avinagrado/Ácido-agrio : flavor característico de algunos aceites que recuerda al vino o vinagre. Es debido fundamentalmente a un proceso fermentativo aerobio de las aceitunas o de los restos de pasta de aceitunas en capachos que no han sido limpiados adecuadamente, que da lugar a la formación de ácido acético, acetato de etilo y etanol.

Metálico : flavor que recuerda a los metales. Es característico del aceite que ha permanecido en contacto, durante tiempo prolongado, con superficies metálicas, durante los procesos de molienda, batido, prensado o almacenamiento.

Rancio : flavor de los aceites que han sufrido un proceso oxidativo intenso.

Cocido o quemado : flavor característico del aceite originado por un excesivo y/o prolongado calentamiento durante su obtención, muy particularmente durante el termo-batido de la pasta, si este se realiza en condiciones térmicas inadecuadas.

Heno-madera : flavor característico de algunos aceites procedentes de aceitunas secas.

Basto : sensación buco-táctil densa y pastosa producida por algunos aceites viejos.

Lubricante : flavor del aceite que recuerda al gasóleo, la grasa o al aceite mineral.

Alpechín : flavor adquirido por el aceite a causa de un contacto prolongado con las aguas de vegetación, que ya han sufrido procesos fermentativos.

Salmuera : flavor del aceite extraído de aceitunas conservadas en salmuera.

Esparto : flavor característico del aceite obtenido de aceitunas prensadas en capachos nuevos de esparto. El flavor puede ser diferente si el capacho está fabricado con esparto verde o si lo está con esparto seco.

Tierra : flavor del aceite obtenido de aceitunas recogidas con tierra, embarradas y no lavadas.

Gusano : flavor característico del aceite obtenido de aceitunas fuertemente atacadas por larvas de mosca del olivo (Bactrocera Oleae).

Pepino : flavor que se produce en el aceite durante un envasado hermético y excesivamente prolongado, particularmente en hojalata, que es atribuido a la formación de 2,6 nonadienal.

Madera húmeda : flavor característico de aceites que han sido extraídos de aceitunas que han sufrido un proceso de congelación en el árbol.

3.3.   Terminología opcional para el etiquetado

A petición expresa, el jefe de panel puede certificar que los aceites evaluados cumplen las definiciones e intervalos correspondientes a las expresiones y adjetivos siguientes en función de la intensidad y de la percepción de los atributos:

4.   PANEL DE CATADORES

El panel estará compuesto por un jefe de panel y un número de catadores comprendido entre ocho y doce.

El jefe del panel deberá haber recibido una sólida formación y ser un conocedor y un avezado experto en los diferentes tipos de aceite de oliva. Será responsable del panel, de su organización y funcionamiento y de la preparación, codificación y presentación de las muestras a los catadores, así como de la compilación de los datos y su tratamiento estadístico.

El jefe del panel seleccionará a los catadores y supervisará su entrenamiento y actuación profesional para garantizar que se mantienen en un nivel de aptitud adecuado.

Los catadores de los controles organolépticos del aceite de oliva deberán ser seleccionados y entrenados en función de su habilidad para distinguir entre muestras similares, conforme a lo establecido en la guía del Consejo Oleícola Internacional para la selección, entrenamiento y control de los catadores cualificados de aceite de oliva virgen.

Los paneles deberán comprometerse a participar en las valoraciones organolépticas que se programen en los ámbitos nacional, comunitario o internacional para el control periódico y la armonización de los criterios de percepción. Además, en el caso de los paneles autorizados con arreglo a las disposiciones del artículo 4, apartado 1, del presente Reglamento, deberán presentar anualmente al Estado miembro interesado toda la información sobre la composición del panel e indicarle el número de valoraciones que hayan realizado en calidad de panel autorizado.

5.   PROCEDIMIENTO DE VALORACIÓN ORGANOLÉPTICA Y CLASIFICACIÓN

5.1.   Utilización de la ficha de cata por el catador

En el apéndice A del presente método figura el modelo de ficha de cata que deben emplear los catadores.

Cada uno de los catadores integrantes del panel deberá oler y, acto seguido, degustar el aceite sometido a valoración. A continuación, deberá consignar en las escalas de 10 cm de la ficha de cata que se pondrá a su disposición la intensidad con la que percibe cada uno de los atributos negativos y positivos ( 6 ). En caso de percepción del carácter verde o maduro del atributo frutado, el catador marcará la casilla correspondiente de la ficha de cata.

En caso de que se perciban atributos negativos no indicados en la ficha de cata, deberán consignarse en el apartado «Otros», empleando los términos que los describan con mayor precisión de entre los definidos.

5.2.   Utilización de los datos por el jefe de panel

El jefe de panel deberá recoger las fichas de cata cumplimentadas por cada uno de los catadores, controlar las intensidades asignadas a los diferentes atributos, y, si comprueba alguna anomalía, solicitar al catador que revise su ficha de cata y, en caso necesario, que repita la prueba.

El jefe de panel puede introducir los datos de cada catador en un programa informático conforme al método de cálculo estadístico de la mediana indicado en el apéndice B. La introducción de datos para cada muestra deberá realizarse mediante una matriz compuesta de nueve columnas correspondientes a los nueve atributos sensoriales y de n líneas correspondientes a los n miembros del panel de cata.

Cuando al menos el 50 % del panel inscriba un atributo negativo en el apartado «Otros», se calculará la mediana de ese defecto y el aceite se clasificará en consecuencia.

El jefe de panel solo podrá certificar que el aceite evaluado cumple las condiciones mencionadas en el punto 3.3.a en lo que atañe a los términos «verde» y «maduro» cuando al menos el 50 % del panel haya señalado haber percibido el carácter verde o maduro del atributo frutado.

En el caso de los análisis efectuados en el marco de controles de conformidad, se realizará un ensayo. En el caso de los contra-análisis, el jefe de panel deberá proceder a la realización del análisis por duplicado. En el caso de los análisis dirimentes, la valoración deberá ser realizada por triplicado. En estos casos, la mediana de los atributos se calculará a partir de la media de las medianas. Todos los replicados de estos análisis deberán hacerse en sesiones diferentes.

5.3.   Clasificación de los aceites

El aceite se clasifica en las categorías que se indican más adelante, en función de la mediana de los defectos y de la mediana del atributo frutado. Por mediana de los defectos se entiende la mediana del defecto percibido con mayor intensidad. La mediana de los defectos y la mediana del atributo frutado se expresarán con una sola cifra decimal y el valor del coeficiente de variación sólido que los define deberá ser inferior o igual al 20 %.

La clasificación del aceite se hace comparando el valor de la mediana de los defectos y de la mediana del atributo frutado con los intervalos de referencia expuestos a continuación. Los límites de estos intervalos han sido establecidos teniendo en cuenta el error del método, por lo que son considerados como absolutos. Los programas informáticos permiten una clasificación visual en un cuadro de datos estadísticos o gráficamente.

5.4.   Casos particulares

Cuando la mediana de los atributos positivos distintos de «frutado» sea superior a 5,0, el jefe de panel consignará tal extremo en el certificado de análisis del aceite.

Apéndice A

Ficha de cata del aceite de oliva virgen

Apéndice B

MÉTODO DE CÁLCULO DE LA MEDIANA Y DE LOS INTERVALOS DE CONFIANZA

Mediana

La mediana se define como el número real Xm, caracterizado por el hecho de que la probabilidad (P) de que los valores de la distribución (X) sean inferiores a este número (Xm) es inferior o igual a 0,5 y de que, simultáneamente, la probabilidad (P) de que los valores de la distribución (X) sean inferiores o iguales a Xm es superior o igual a 0,5. Otra definición considera la mediana como el 50o percentil de una distribución de números ordenados de modo creciente. En términos más simples, la mediana representa el valor central de una serie ordenada de números impares o la media de los dos valores centrales de una serie ordenada de números pares.

Desviación típica robusta

Para obtener una estimación fiable de la variabilidad que se produce en torno a la mediana, hay que remitirse a la estimación de la desviación típica robusta de Stuart y Kendall. La fórmula siguiente indica la desviación típica asintótica, es decir, la estimación sólida de la variabilidad de los datos considerados, en la que N es el número de observaciones e IQR el intervalo intercuartil, el cual incluye exactamente el 50 % de los casos de una distribución de probabilidad cualquiera.

El cálculo del intervalo intercuartil se efectúa calculando la magnitud de la diferencia entre el 75° y el 25° percentil.

IQR = 75° percentil – 25° percentil

Siendo el percentil el valor Xpc, caracterizado por el hecho de que la probabilidad (P) de que los valores de la distribución sean inferiores a Xpc es inferior o igual a una centésima determinada y de que, simultáneamente, la probabilidad (P) de que los valores de la distribución sean inferiores o iguales a Xpc es superior o igual a dicha centésima. La centésima indica la fracción de distribución elegida. En el caso de la mediana esta es igual a 50/100.

En la práctica, el percentil es el valor de distribución que corresponde a un área determinada, trazada a partir de la curva de distribución o de densidad. Por ejemplo, el 25° percentil representa el valor de distribución correspondiente a un área igual a 0,25 o 25/100.

Coeficiente de variación robusto (en %)

El CVr% representa un número puro, es decir sin dimensión, que indica el porcentaje de variabilidad de la serie de números analizada. Por esta razón este coeficiente resulta muy útil para comprobar la fiabilidad de los miembros del panel.

Intervalos de confianza al 95 % sobre la mediana

Los intervalos de confianza al 95 % (valor del error de primer tipo igual a 0,05 o 5 %) representan el intervalo en el que el valor de la mediana podría variar si fuese posible repetir infinitas veces un experimento. En la práctica, indica el intervalo de variabilidad de la prueba en las condiciones operativas adoptadas, partiendo de la hipótesis de que pudiera repetirse varias veces. El intervalo ayuda a evaluar, como en el caso del CVr%, la fiabilidad de la prueba.

ICsup = Me + (c.S*)

ICinf = Me – (c.S*)

Donde c, en el caso del intervalo de confianza al 0,95, es igual a 1,96.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

ANEXO XV

1.   CONTENIDO EN ACEITE DE LOS ORUJOS DE ACEITUNA

1.1.   Material

1.2.   Reactivo

n-hexano técnico cuyo residuo en evaporación completa deberá ser inferior a 0,002 g para 100 ml.

2.   MODO DE OPERAR

2.1.   Preparación de la muestra para ensayo

Triturar la muestra para laboratorio, si fuera necesario, en el triturador mecánico, previamente bien limpio, para reducirla a partículas que puedan atravesar completamente la criba.

Utilizar aproximadamente una vigésima parte de la muestra para completar la limpieza del triturador, tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo, mezclarlo con cuidado y analizarlo sin demora.

2.2.   Toma de muestra

Pesar inmediatamente después del triturado, alrededor de 10 g de la muestra para ensayo con una aproximación de 0,01 g.

2.3.   Preparación del cartucho de extracción

►C1  colocar la muestra en el cartucho y taparla con el tapón ◄ de algodón hidrófilo. En caso de haber utilizado papel de filtro, envolver la muestra molida en dicho papel.

2.4.   Presecado

Cuando el orujo esté muy húmedo (contenido en agua y en materias volátiles superior al 10 %), efectuar un presecado colocando durante un tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa calentada a 80 °C como máximo, para llevar el contenido en agua y en materias volátiles por debajo del 10 %.

2.5.   Preparación del matraz

Pesar con aproximación de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de piedra pómez, previamente secado en la estufa a 103 °C ± 2 °C y después enfriado durante al menos una hora en el desecador.

2.6.   Primera extracción

Colocar en el aparato de extracción el cartucho (o el papel de filtro) que contenga la muestra. Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano. ►C1  Adaptar ◄ el matraz al aparato de extracción y colocarlo todo sobre la placa calefactora. Llevar la calefacción a tal estado que el caudal de reflujo sea al menos de tres gotas por segundo (ebullición moderada, no tumultuosa).

Después de cuatro horas de extracción, dejar enfriar. Quitar el cartucho del aparato de extracción y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la mayor parte del disolvente que lo impregna.

2.7.   Segunda extracción

Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea posible. Colocar de nuevo cuantitativamente la mezcla en el cartucho y ésta en el aparato de extracción.

Empezar de nuevo la extracción durante dos horas más, utilizando el mismo matraz conteniendo la primera extracción.

La solución obtenida en el matraz de extracción deberá ser límpida. Si no fuere así, filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer matraz y el papel de filtro con hexano. Recoger el filtrado y el disolvente en un segundo matraz previamente secado y tarado aproximadamente a 1 mg.

2.8.   Eliminación del disolvente y pesada del extracto

Eliminar en el equipo de extracción la mayor parte del disolvente. Eliminar los últimos restos de éste calentando el matraz en la estufa a 103 °C ± 2 °C durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminación, ya sea insuflando aire de vez en cuando o preferiblemente un gas inerte, o actuando bajo una presión reducida.

Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora, y pesarlo con una precisión de 1 mg aproximadamente.

Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas condiciones, dejar enfriar en el desecador y pesar.

La diferencia entre los resultados de estas dos pesadas deberá ser inferior o igual a 10 mg, si no, calentar de nuevo durante períodos de diez minutos seguidos de enfriamento y pesada, hasta que la diferencia de peso sea, a lo sumo, de 10 mg. Seleccionar la última pesada del matraz.

Efectuar dos determinaciones.

3.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

3.1.   Modo de cálculo y fórmula

3.2.   Repetitividad

La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones, efectuadas simultáneamente o rápidamente la una a continuación de la otra mediante el mismo análisis, no deberá ser superior a 0,2 g de extracto de hexano por cada 100 g de muestra.

En caso contrario, repetir sobre otras dos tomas de muestra. Si esta vez la diferencia es de nuevo superior a 0,2 g tomar como resultado la media aritmética de las cuatro determinaciones efectuadas.

ANEXO XVI

DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE YODO

1.   OBJETO

La presente norma internacional especifica un método para la determinación del índice de yodo de las grasas y aceites animales y vegetales, en lo sucesivo denominados grasas.

2.   DEFINICIÓN

A los fines de la presente norma internacional, se aplicará la definición siguiente:

3.   PRINCIPIO

Disolución de la muestra problema y adición de reactivo de Wijs. Una vez transcurrido el tiempo que se especifica, adición de solución acuosa de yoduro potásico y valoración del yodo liberado con solución de tiosulfato sódico.

4.   REACTIVOS

Todos los reactivos serán de calidad analítica reconocida.

5.   MATERIAL

Material ordinario de laboratorio y, en particular, lo siguiente:

6.   PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ►C1  PROBLEMA ◄ .

►C1  La muestra homogeneizada, se seca sobre sulfato sódico y se filtra ◄ .

7.   PROCEDIMIENTO

8.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El índice de yodo se expresa del siguiente modo:

siendo:

c : valor numérico de la concentración exacta, expresada en moles por litro, de la solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico (4.3) utilizada;

V1 : valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para el ensayo en blanco;

V2 : valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para la determinación;

p : valor numérico del peso, expresado en gramos, de la muestra problema (7.1).

Se tomará como resultado la media aritmética de las dos determinaciones, siempre que se cumpla el requisito establecido con respecto a la repetibilidad.

▼M11

ANEXO XVII

MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE ESTIGMASTADIENOS EN LOS ACEITES VEGETALES

1.   OBJETIVOS

Determinación de estigmastadienos en los aceites vegetales que presentan bajas concentraciones de dichos hidrocarburos, particularmente en el aceite de oliva virgen y en el aceite de orujo de oliva sin refinar.

2.   APLICACIÓN

Se trata de una norma aplicable a cualquier aceite de origen vegetal, teniendo en cuenta que únicamente se obtendrán medidas fiables cuando el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de 0,01 a 4,0 mg/kg. El método resulta especialmente adecuado para detectar la presencia de aceites vegetales refinados (aceites de oliva, orujo de oliva, girasol, palma, etc.) en el aceite de oliva virgen, dado que los aceites refinados contienen estigmastadienos y los aceites vírgenes no.

3.   FUNDAMENTO

Aislamiento de la materia insaponificable. Separación de la fracción de hidrocarburos esteroideos mediante cromatografia en columna de gel de sílice y análisis mediante cromatografía de gases en columna capilar.

4.   INSTRUMENTAL

5.   REACTIVOS

Salvo indicación en sentido contrario, únicamente se utilizarán reactivos de calidad para análisis. Debe emplearse agua destilada o de pureza al menos equivalente.

6.   METODOLOGÍA

6.1.   Preparación de la materia insaponificable:

6.2.   Separación de la fracción de hidrocarburos esteroideos:

6.3.   Cromatografía de gases

Figura 1

Cromatogramas procedentes del análisis de muestras de aceite de oliva en columna capilar de sílice fundida (0,25 mm de diámetro interno × 25 m) recubierta con una película de 0,25 μm de grosor de 5 %-fenilmetilsilicona.

Figura 2

Cromatograma procedente del análisis de una muestra de aceite de oliva refinado en una columna DB-5, en el que se aprecia el isómero del estigmasta-3,5-dieno.

▼M13

ANEXO XVIII

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE TRIGLICÉRIDOS CON ECN42 (DIFERENCIA ENTRE EL CONTENIDO TEÓRICO Y LOS DATOS OBTENIDOS POR HPLC)

1.   Objeto

Determinación de la composición de triglicéridos (TG) de los aceites de oliva, expresados en su número equivalente de carbonos (ECN) en función de las diferencias existentes entre el contenido teórico, calculado a partir de la composición de ácidos grasos, y los resultados analíticos obtenidos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

2.   Campo de aplicación

La presente norma es aplicable a los aceites de oliva. El método puede utilizarse para detectar la presencia de pequeñas cantidades de aceites de semillas (ricos en ácido linoleico) en todos los tipos de aceites de oliva.

3.   Principio

El contenido teórico de triglicéridos con ECN42 (calculado sobre la base de la determinación de la composición de ácidos grasos mediante GLC) y el contenido de triglicéridos con ECN42 determinado mediante HPLC se corresponden dentro de unos límites en el caso de los aceites puros. Las diferencias superiores a los valores establecidos en el Reglamento respecto a cada tipo de aceite indican que el aceite contiene aceites de semillas.

4.   Método

El método para calcular el contenido teórico de triglicéridos con ECN42 y su diferencia respecto a los datos obtenidos mediante HPLC consiste esencialmente en coordinar los datos analíticos obtenidos por otros métodos. Pueden distinguirse tres fases: determinación de la composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases en columna capilar, cálculo de la composición teórica de triglicéridos con ECN42, y determinación de los triglicéridos con ECN42 mediante HPLC.

4.1.   Aparatos

4.2.   Reactivos

Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de elución deberán desgasificarse y podrán reciclarse varias veces sin que ello afecte a las separaciones.

4.3.   Preparación de la muestra

Como pueden obtenerse falsos resultados positivos debido a la presencia de diversas sustancias que interfieren, la muestra debe someterse siempre a un proceso de purificación según el método IUPAC 2.507, relativo a la determinación de las sustancias polares en los aceites oxidados.

4.3.1.   Preparación de la columna cromatográfica

Llenar la columna (4.1.3) con aproximadamente 30 ml de disolvente de elución (4.2.3); introducir un poco de lana de vidrio (4.2.5), empujándolo hasta el fondo de la columna con la varilla de vidrio (4.1.5).

Preparar en un vaso de precipitados de 100 ml una suspensión con 25 g de gel de sílice (4.2.4) en 80 ml de la mezcla de elución (4.2.3) y transferirla a la columna con ayuda de un embudo de vidrio (4.1.6).

Para realizar la transferencia total del gel de sílice a la columna, lavar el vaso de precipitados con la mezcla de elución y pasar también los líquidos de lavado a la columna.

Abrir el grifo de la columna y dejar que salga el disolvente de ella hasta que su nivel se sitúe aproximadamente 1 cm por encima del gel de sílice.

4.3.2.   Cromatografía en columna

Pesar, con la precisión de 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g de aceite previamente filtrado, homogeneizado y, en caso necesario, deshidratado, en un matraz aforado de 50 ml (4.1.7). Disolver en 20 ml aproximadamente de disolvente de elución (4.2.3). Si es necesario, calentar ligeramente para facilitar la disolución. Enfriar a temperatura ambiente y enrasar con el disolvente de elución.

Introducir con una pipeta aforada 20 ml de solución en la columna preparada como se indica en 4.3.1, abrir el grifo y hacer eluir el disolvente hasta el nivel de la capa de gel de sílice.

Eluir con 150 ml de disolvente de elución (4.2.3), regulando el flujo de disolvente a 2 ml por minuto aproximadamente (de modo que pasen a través de la columna 150 ml en 60-70 minutos).

Recoger el eluido en un matraz redondo de 250 ml (4.1.1) previamente tarado y pesado exactamente. Eliminar el disolvente a presión reducida (Rotavapor) y pesar el residuo que se utilizará en la preparación de la solución para el análisis por HPLC y en la preparación de los ésteres metílicos.

Tras pasar por la columna, debe recuperarse como mínimo un 90 % de la muestra en el caso de aceite de oliva de las categorías extravirgen, virgen y refinado ordinario, mientras que en el de los aceites lampantes y de orujo los porcentajes de recuperación no pueden ser inferiores al 80 %.

4.4.   Análisis por HPLC

4.4.1.   Preparación de las muestras para el análisis cromatográfico

Preparar del siguiente modo una solución al 5 % de la muestra que vaya a analizarse: pesar 0,5 ± 0,001 g de la muestra en un matraz aforado de 10 ml y enrasar con el disolvente de solubilización (4.2.9).

4.4.2.   Procedimiento

Instalar el sistema cromatográfico. Bombear el disolvente de elución (4.2.8) a un ritmo de 1,5 ml/mn para purgar todo el sistema. Esperar hasta que se obtenga una línea de base estable. Inyectar 10 μl de la muestra preparada como se indica en el punto 4.3.

4.4.3.   Cálculo y expresión de los resultados

Utilizar el método de normalización interna, es decir, considerar que la suma de las superficies de los picos correspondientes a los distintos triglicéridos de ECN entre 42 y 52 es igual al 100 %. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicérido mediante la fórmula siguiente:

% de triglicérido = superficie del pico × 100 / suma de la superficies de los picos.

El resultado se expresa con, como mínimo, dos decimales.

Nota 1:

El orden de elución puede determinarse mediante el cálculo del número equivalente de carbonos, que con frecuencia viene dado por la fórmula ECN = CN-2n, siendo CN el número de carbonos y n el número de enlaces dobles; puede calcularse con mayor precisión teniendo en cuenta el origen del enlace doble. Si no, nl y nln son los números de enlaces dobles de los ácidos oleico, linoleico y linolénico, respectivamente, el número equivalente de carbonos puede calcularse mediante la fórmula siguiente:

ECN = CN - dono - dlnl - dlnnln,

siendo do, dl y dln coeficientes que pueden calcularse mediante los triglicéridos de referencia. En las condiciones que se especifican en el presente método la fórmula obtenida será similar a la siguiente:

ECN = CN - (2,60 no) - (2,35 nl) - (2,17 nln)

Nota 2:

Nota 3:

Con varios triglicéridos de referencia también es posible calcular la resolución con respecto a la trioleína:

α = TR' / TR trioleína

utilizando el tiempo de retención reducido TR' = TR - TR disolvente.

La representación gráfica del log α frente a f (número de enlaces dobles) permite determinar los valores de retención de todos los triglicéridos de los ácidos grasos contenidos en los triglicéridos de referencia (véase la figura 2).

Nota 4:

La resolución de la columna debe permitir separar claramente el pico de la trilinoleína de los picos de los triglicéridos con un tiempo de retención próximo. La elución se prosigue hasta el pico de ECN52.

Nota 5:

Para obtener un cromatograma que permita la medición correcta de las superficies de todos los picos de interés en la presente determinación, es necesario que el segundo pico correspondiente a ECN50 tenga una altura igual al 50 % de la escala completa del registrador.

4.5.   Cálculo de la composición de triglicéridos (% moles) a partir de los datos de GLC de ácidos grasos (% superficie)

4.5.1.   Determinación de la composición de ácidos grasos

La composición de ácidos grasos se determina con arreglo al método de cromatografía de gases de la CEE que figura en el Anexo X A del Reglamento (CEE) no 2568/91, utilizando columna capilar. La preparación de los ésteres metílicos se realiza según el Anexo X B (solución alcohólica de metilato sódico).

4.5.2.   Ácidos grasos considerados para el cálculo

Los glicéridos se agrupan en función de su número equivalente de carbonos (ECN), teniendo en cuenta las equivalencias que figuran a continuación entre ECN y ácidos grasos. Sólo se han considerado los ácidos grasos con 16 y 18 átomos de carbono, ya que son los únicos importantes para el aceite de oliva.

4.5.3.   Transformación del % superficie en moles para todos los ácidos grasos

moles P =% sup. PPM Pmoles S = % sup. SPM Smoles Po = % sup. PoPM Po	(1)
moles O = % sup. OPM Omoles L = % sup. LPM Lmoles Ln = % sup. LnPM Ln

4.5.4.   Normalización al 100 % de los ácidos grasos

% moles P 1,2,3 = moles P * 100moles P + S + Po + O + L + Ln	(2)
% moles S 1,2,3 = moles S * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
% moles Po1,2,3 = moles Po * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
% moles O 1,2,3 = moles O * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
% moles L1,2,3 = moles L * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
% moles Ln 1,2,3 = moles Ln * 100moles P + S + Po + O + L + Ln

El resultado proporciona el porcentaje de cada ácido graso en % moles en todas las posiciones (1, 2 y 3) de los TG.

A continuación se calculan las sumas de los ácidos grasos saturados (AGS) P y S y de los ácidos grasos insaturados (AGI) Po, O, L y Ln:

% moles AGS = % moles P + % moles S	(3)
% moles AGI = 100 - % moles AGS.

4.5.5.   Cálculo de la composición de los ácidos grasos en las posiciones 2 y 1-3 de los TG

Los ácidos grasos se distribuyen en tres grupos del siguiente modo: dos idénticos para las posiciones 1 y 3 y uno para la posición 2, con coeficientes diferentes para los ácidos saturados (P y S) y los insaturados (Po, O, L y Ln).

4.5.5.1.

Ácidos grasos saturados en la posición 2 [P(2) y S(2)] % moles P(2) = % moles P (1,2,3) * 0,06 (4) % moles S(2) = % moles S (1,2,3) * 0,06

4.5.5.2.

Ácidos grasos insaturados en la posición 2 [Po(2), O(2), L(2) y Ln(2)] % moles Po2 =% moles Po1,2,3% moles AGI* 100 - % moles P2 - % moles S2 (5) % moles O2 =% moles O1,2,3% moles AGI* 100 - % moles P2 - % moles S2 % moles L2 =% moles L1,2,3% moles AGI* 100 - % moles P2 - % moles S2 % moles Ln2 =% moles Ln1,2,3% moles AGI* 100 - % moles P2 - % moles S2

4.5.5.3.

Ácidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) y Ln(1,3)] % moles P1,3 =% moles P1,2,3 - % moles P22 + % moles P1,2,3 (6) % moles S1,3 =% moles S1,2,3 - % moles S22 + % moles S1,2,3 % moles Po1,3 =% moles Po1,2,3 - % moles Po22 + % moles Po1,2,3 % moles O1,3 =% moles O1,2,3 - % moles O22 + % moles O1,2,3 % moles L1,3 =% moles L1,2,3 - % moles L22 + % moles L1,2,3 % moles Ln1,3 =% moles Ln1,2,3 - % moles Ln22 + % moles Ln1,2,3

4.5.6.   Cálculo de los triglicéridos

4.5.6.2.

TG con dos ácidos grasos (AAB; en este caso, PoPoL, PoLL) % moles AAB = % moles A1,3 * % moles A2 * % moles B1,3* 210 000 (8) % moles ABA = % moles A1,3 * % moles B2 * % moles A1,310 000

4.5.6.3.

TG con tres ácidos grasos diferentes (ABC; en este caso, OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) % moles ABC = % moles A1,3 * % moles B2 * % moles C1,3* 210 000 (9) % moles BCA = % moles B1,3 * % moles C2 * % moles A1,3* 210 000 % moles CAB = % moles C1,3 * % moles A2 * % moles B1,3* 210 000

5.   Evaluación de los resultados

Se comparan el contenido teórico calculado y el determinado por HPLC. Si la diferencia entre los datos de HPLC y los datos teóricos es superior al valor establecido para la categoría correspondiente de aceite en el Reglamento, la muestra contiene aceite de semillas.

Nota:

Los resultados se expresan con una cifra decimal.

6.   Ejemplo (los números hacen referencia a las secciones del texto del método)

4.5.1.   Cálculo del porcentaje de moles de los ácidos grasos a partir de los datos obtenidos mediante GLC (% superficie)

Los datos siguientes de la composición de ácidos grasos se obtienen mediante GLC:

4.5.3.   Transformación del % superficie en moles para todos los ácidos grasos