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Document 32019R1390

Reglamento (UE) 2019/1390 de la Comisión, de 31 de julio de 2019, que modifica, con vistas a su adaptación al progreso técnico, el anexo del Reglamento (CE) n.o 440/2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH) (Texto pertinente a efectos del EEE)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

ES

Diario Oficial de la Unión Europea

L 247/1


REGLAMENTO (UE) 2019/1390 DE LA COMISIÓN

de 31 de julio de 2019

que modifica, con vistas a su adaptación al progreso técnico, el anexo del Reglamento (CE) n.o 440/2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH)

(Texto pertinente a efectos del EEE)

LA COMISIÓN EUROPEA,

Visto el Tratado de Funcionamiento de la Unión Europea,

Visto el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Mezclas Químicas, se modifica la Directiva 1999/45/CE y se derogan el Reglamento (CEE) n.o 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) n.o 1488/94 de la Comisión, así como la Directiva 76/769/CEE del Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la Comisión (1), y en particular su artículo 13, apartado 2,

Considerando lo siguiente:

(1)

El Reglamento (CE) n.o 440/2008 de la Comisión (2) incluye los métodos de ensayo para la determinación de las propiedades fisicoquímicas, la toxicidad y la ecotoxicidad de las sustancias y mezclas químicas, que deben aplicarse a efectos del Reglamento (CE) n.o 1907/2006.

(2)

La Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) elabora directrices de ensayo armonizadas y acordadas a nivel internacional para los ensayos de sustancias y mezclas químicas con fines normativos. La OCDE publica periódicamente directrices de ensayos nuevas y revisadas, teniendo en cuenta el progreso científico en este ámbito.

(3)

A fin de tener en cuenta el progreso técnico y, siempre que sea posible, para reducir el número de animales utilizados con fines experimentales de conformidad con el artículo 13, apartado 2, del Reglamento (CE) n.o 1907/2006, a raíz de la adopción de las correspondientes directrices de ensayo de la OCDE, deben establecerse dos métodos de ensayo nuevos para la evaluación de la ecotoxicidad y nueve métodos de ensayo nuevos para la determinación de la toxicidad para la salud humana, y deben actualizarse siete métodos de ensayo. Once de esos métodos de ensayo se refieren a los ensayos in vitro de irritación/corrosión cutánea y ocular, sensibilización cutánea, genotoxicidad y los efectos endocrinos. Se ha consultado a los interesados sobre la modificación propuesta.

(4)

Procede, por tanto, modificar el Reglamento (CE) n.o 440/2008 en consecuencia.

(5)

Las medidas previstas en el presente Reglamento se ajustan al dictamen del Comité establecido en virtud del artículo 133 del Reglamento (CE) n.o 1907/2006.

HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:

Artículo 1

El anexo del Reglamento (CE) n.o 440/2008 queda modificado con arreglo a lo dispuesto en el anexo del presente Reglamento.

Artículo 2

El presente Reglamento entrará en vigor a los veinte días de su publicación en el Diario Oficial de la Unión Europea.

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.

Hecho en Bruselas, el 31 de julio de 2019.

Por la Comisión

El Presidente

Jean-Claude JUNCKER


(1)  DO L 396 de 30.12.2006, p. 1.

(2)  Reglamento (CE) n.o 440/2008 de la Comisión, de 30 de mayo de 2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH) (DO L 142 de 31.5.2008, p. 1).


ANEXO

El anexo del Reglamento (CE) n.o 440/2008 queda modificado como sigue:

1)

En la parte B, el capítulo B.4 se sustituye por el texto siguiente:

«B.4   TOXICIDAD AGUDA: IRRITACIÓN/CORROSIÓN CUTÁNEA

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) 404 de la OCDE (2015). Las directrices de ensayo de la OCDE para los ensayos de productos se revisan periódicamente a fin de garantizar que reflejan los mejores conocimientos científicos disponibles. En la revisión de las TG 404 de la OCDE, se ha prestado atención especial a las posibles mejoras en relación con las cuestiones del bienestar de los animales y con la evaluación de toda la información existente sobre el producto problema, para no someter a los animales de laboratorio a pruebas innecesarias. La versión actualizada de las TG 404 de la OCDE (adoptadas originalmente en 1981, revisadas en 1992, 2002 y 2015) incluye una referencia al documento de orientación sobre los enfoques integrados de ensayos y evaluación (IATA, Integrated Approaches to Testing and Assessment) en relación con la irritación/corrosión cutánea (1), que propone un enfoque modular para el ensayo de la irritación cutánea y de la corrosión cutánea. Los IATA describen varios módulos que agrupan las fuentes de información y herramientas de análisis, y i) aportan orientaciones sobre cómo integrar y utilizar los datos disponibles, tanto de ensayo como no experimentales, para la evaluación de la capacidad de irritación cutánea y de corrosión cutánea de los productos químicos, y ii) proponen un enfoque cuando se precisan más ensayos (1). Además, en caso necesario, se recomienda en dicho documento la aplicación sucesiva, y no simultánea, de los tres parches de ensayo a los animales en el ensayo in vivo inicial.

2.

Las definiciones de irritación y corrosión cutánea se indican en el apéndice del presente método de ensayo.

CONSIDERACIONES INICIALES

3.

En aras tanto del rigor científico como del bienestar de los animales, no debe considerarse la realización de ensayos in vivo hasta que se hayan evaluado todos los datos disponibles relativos a la capacidad de corrosión/irritación ocular del producto problema mediante un análisis de ponderación de las pruebas, como se indica en el documento de orientación sobre los enfoques integrados de ensayos y evaluación en relación con la irritación/corrosión cutánea, a saber, en las tres partes de este documento y sus módulos correspondientes (1). En resumen, con arreglo a la parte 1, los datos disponibles se tratan a lo largo de siete módulos relativos a los datos obtenidos con seres humanos, datos in vivo, datos in vitro, datos sobre propiedades físico-químicas (p. ej., pH, en particular acidez o alcalinidad fuertes) y métodos no experimentales. Con arreglo a la parte 2, se realiza un análisis de ponderación de las pruebas. Si esta ponderación de las pruebas sigue sin ser concluyente, debe aplicarse la parte 3, con ensayos adicionales, empezando con métodos in vitro y utilizando los métodos in vivo solo como último recurso. Por tanto, este análisis debe reducir la necesidad de realizar ensayos in vivo de la corrosión/irritación cutánea de los productos problema de los que ya se disponga de pruebas suficientes obtenidas con otros estudios efectuados sobre esos dos criterios de valoración.

PRINCIPIO DEL ENSAYO IN VIVO

4.

El producto problema se aplica en una sola dosis a la piel de un animal de experimentación; sirven de control las zonas sin tratar de la piel del animal de ensayo. Se observa y puntúa el grado de irritación/corrosión a intervalos determinados, y luego se describe para la completa evaluación de los efectos. La duración del estudio ha de ser suficiente para evaluar la reversibilidad o irreversibilidad de los efectos observados.

5.

Los animales que muestren signos continuados de deterioro o dolor graves en cualquier fase del ensayo deben ser sacrificados de forma compasiva, con la consiguiente evaluación del producto problema. Los criterios para tomar la decisión de sacrificar de forma compasiva los animales moribundos y que sufren intensamente son objeto de otro documento de orientación de la OCDE (2).

PREPARACIÓN DEL ENSAYO IN VIVO

Selección de la especie animal

6.

El animal de laboratorio que se prefiere es el conejo albino; se utilizan adultos jóvenes sanos. Si se utilizan otras especies será necesario justificarlo.

Preparación de los animales

7.

Aproximadamente 24 horas antes del ensayo se afeita el pelo apurando bien en la zona dorsal del tronco de los animales. Se ha de tener cuidado para no erosionar la piel, y solo se deben utilizar animales con piel sana e intacta.

8.

Algunas razas de conejo tienen densas placas de pelo que son más prominentes en determinadas épocas del año. Dichas zonas no deben utilizarse para realizar los ensayos.

Condiciones de alojamiento y alimentación

9.

Los animales deben alojarse de manera individual. La temperatura de los animalarios debe ser de 20 °C (± 3 °C) para los conejos. Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo, y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber.

PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

Aplicación del producto problema

10.

El producto problema debe aplicarse a una pequeña zona de piel (de unos 6 cm2), que se cubrirá con una gasa, la cual se sujetará con esparadrapo no irritante. Cuando no sea posible la aplicación directa (por ejemplo, líquidos o algunas pastas), el producto problema se aplicará primero a la gasa, que se aplicará a continuación a la piel. La gasa debe mantenerse en contacto con la piel, sin apretar, por medio de un apósito semioclusivo apropiado durante todo el período de exposición. Si se aplica el producto problema a la gasa, esta debe sujetarse a la piel de forma que el contacto sea bueno y el producto problema se distribuya de manera uniforme sobre la piel. Se evitará que el animal tenga acceso a la gasa y que pueda comerse o inhalar el producto problema.

11.

Los productos problema líquidos se emplean por lo general sin diluir. En caso de que sea sólido (que se podrá pulverizar si se considera necesario), el producto problema se humedecerá con el mínimo de agua (u otro vehículo adecuado, si se considera necesario), que garantice un buen contacto con la piel. Si se utilizan vehículos distintos del agua, ha de ser mínima o nula la posible influencia del vehículo sobre la irritación cutánea debida al producto problema.

12.

Finalizado el período de exposición, que normalmente es de 4 horas, se eliminarán los residuos del producto problema cuando ello sea posible, con agua o con un disolvente adecuado que no altere la respuesta producida ni la integridad de la epidermis.

Posología

13.

Se pondrá una dosis de 0,5 ml de líquido o de 0,5 g de sólido o pasta en el punto de aplicación.

Ensayo inicial (ensayo de irritación/corrosión cutánea in vivo con un solo animal)

14.

En los casos en que un producto problema se haya considerado corrosivo, irritante o no clasificado sobre la base de análisis de ponderación de las pruebas o de ensayos previos in vitro, normalmente no es necesario efectuar más ensayos in vivo. No obstante, en los casos en que se piense que está justificado obtener datos adicionales, se realizará el ensayo in vivo utilizando inicialmente un solo animal y aplicando el siguiente planteamiento. Se utilizan secuencialmente hasta tres parches de ensayo con el animal. El primero se retira a los tres minutos. Si no se observa ninguna reacción cutánea grave, se utiliza un segundo parche en un lugar diferente y se retira al cabo de una hora. Si en este momento las observaciones indican que desde un punto de vista humanitario se puede aumentar la exposición hasta cuatro horas, se aplica un tercer parche que se retira al cabo de cuatro horas, y se clasifica la respuesta.

15.

Si tras alguna de las tres exposiciones secuenciales se observa un efecto corrosivo, se suspende el ensayo inmediatamente. Si una vez retirado el último parche no se observa efecto corrosivo, se somete a observación al animal durante 14 días, a menos que aparezca corrosión antes.

16.

En los casos en que no esté previsto que el producto problema sea corrosivo pero sí pueda ser irritante, se pondrá un solo parche a un solo animal durante cuatro horas.

Ensayo de confirmación (ensayo de irritación cutánea in vivo con animales adicionales)

17.

Si en el ensayo inicial no se observa efecto corrosivo, se confirmará la respuesta irritante o negativa con un máximo de dos animales más, cada uno con un parche, durante un período de exposición de cuatro horas. Si se observa efecto irritante en el ensayo inicial, el ensayo de confirmación puede hacerse de forma secuencial, o exponiendo a otros dos animales a la vez. En el caso excepcional de que no se realice el ensayo inicial, se podrán tratar dos o tres animales con un solo parche, que se retirará al cabo de cuatro horas. Cuando se utilicen dos animales, no será necesario realizar más ensayos si ambos muestran la misma respuesta. En caso contrario, se someterá a ensayo el tercer animal. Si la respuesta es dudosa, puede ser necesario evaluarla utilizando más animales.

Período de observación

18.

La duración del período de observación debe ser suficiente para evaluar por completo la reversibilidad de los efectos observados. No obstante, se dará por finalizado el experimento si en cualquier momento el animal presenta signos continuados de dolor o malestar intensos. Para determinar la reversibilidad de los efectos los animales serán sometidos a observación durante hasta 14 días a partir de la retirada de los parches. Si se observa la irreversibilidad antes de 14 días, el experimento debe finalizar en ese momento.

Observaciones clínicas y graduación de las reacciones cutáneas

19.

En todos los animales se examinarán los signos de eritema y edema, puntuándose las repuestas al cabo de 60 minutos, y de 24, 48 y 72 horas de la retirada del parche. En cuanto al ensayo inicial con un solo animal, la zona de ensayo también se examina inmediatamente después de retirar el parche. Las reacciones cutáneas se clasifican y registran conforme a los grados del cuadro siguiente. Si al cabo de 72 horas hay una lesión cutánea que no se puede considerar como irritación o corrosión, quizá sea necesario observarla hasta el día 14 para determinar la reversibilidad de los efectos. Además de observar la irritación, se debe realizar una descripción completa y el registro de todos los efectos tóxicos locales, como la destrucción de la grasa de la piel, y de cualquier efecto adverso sistémico (por ejemplo, los efectos sobre los signos clínicos de toxicidad y el peso corporal). Debe considerarse la realización de un examen histopatológico para aclarar respuestas dudosas.

20.

La clasificación de las respuestas cutáneas es subjetiva necesariamente. Para armonizar tal clasificación y ayudar a los laboratorios y a quienes efectúan e interpretan las observaciones, el personal encargado de estas recibirá formación adecuada sobre el sistema de puntuación utilizado (véase el cuadro siguiente). Puede ser útil disponer de una guía ilustrada para clasificar la irritación cutánea y otras lesiones (3).

DATOS E INFORME

21.

Los resultados del estudio se resumirán en tablas en el informe final y deben incluir todos los aspectos enumerados en el punto 24.

Evaluación de los resultados

22.

Deben evaluarse las puntuaciones de la irritación cutánea, junto con la naturaleza y la gravedad de las lesiones, así como su reversibilidad o irreversibilidad. Las puntuaciones individuales no constituyen una medida absoluta de las propiedades irritativas del material, pues también se evalúan otros efectos del material problema. En cambio, las puntuaciones individuales deben considerarse como valores de referencia, que han de evaluarse en combinación con todas las demás observaciones del estudio.

23.

Para evaluar las respuestas irritativas hay que tener en cuenta la reversibilidad de las lesiones cutáneas. Si se producen respuestas como alopecia (zona limitada), hiperqueratosis, hiperplasia y descamación, y persisten al final del período de observación de 14 días, se considerará que el producto problema es un irritante.

Informe del ensayo

24.

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

 

Justificación del ensayo in vivo:

Análisis de ponderación de las pruebas correspondientes a los datos de ensayos anteriores, incluidos los resultados de la estrategia de evaluación secuencial;

Descripción de datos relevantes disponibles de ensayos realizados anteriormente;

Datos obtenidos en cada fase de la estrategia de evaluación;

Descripción de los ensayos in vitro realizados, con detalles de los procedimientos y los resultados obtenidos con las sustancias analizadas / de referencia;

Análisis de ponderación de las pruebas para realizar el estudio in vivo.

 

Producto problema:

Sustancias de un solo componente: identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, notación SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas si procede y es viable en la práctica, etc.;

Sustancias de componentes múltiples, mezclas y sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción y materiales biológicos (UVCB): deben caracterizarse en la medida de lo posible por la identidad química (véase el guion anterior), la cantidad en que están presentes y las propiedades fisicoquímicas pertinentes de sus componentes;

Aspecto físico, hidrosolubilidad y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes;

Origen; número de lote, si está disponible;

Tratamiento del producto problema / sustancia de control antes del ensayo, en su caso (p. ej., calentamiento, trituración);

Estabilidad del producto problema, fecha límite de utilización, o fecha para nuevo análisis, si se conoce;

Condiciones de conservación.

 

Vehículo:

Identificación, concentración (en su caso), volumen utilizado;

Motivación de la elección del vehículo.

 

Animales de ensayo:

Especie/cepa utilizada, justificación del uso de animales que no sean conejos albinos;

Número de animales de cada sexo;

Peso de cada animal al principio y al final del ensayo;

Edad al inicio del estudio;

Origen de los animales, condiciones de alojamiento, dieta, etc.

 

Condiciones del ensayo:

Técnica de preparación del lugar de la aplicación del parche:

Datos de los materiales del parche y técnica de la aplicación;

Detalles de la preparación, aplicación y retirada del producto problema.

 

Resultados:

Tabulación de las puntuaciones de las respuestas de irritación/corrosión de cada animal en todos los puntos temporales medidos;

Descripciones de todas las lesiones observadas;

Descripción narrativa de la naturaleza y grado de irritación o de corrosión observado, y eventuales observaciones histopatológicas;

Descripción de otros efectos adversos locales (por ejemplo, destrucción de la grasa de la piel) y sistémicos, además de la irritación o corrosión cutánea.

 

Discusión de los resultados

 

Conclusiones

BIBLIOGRAFÍA

(1)

OCDE (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico, París.

(2)

OCDE (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, Noviembre de1998.

(3)

OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos, París.

Cuadro

Clasificación de las reacciones cutáneas

Sin eritema…

0

Eritema muy leve (apenas perceptible)…

1

Eritema bien definido…

2

Eritema de moderado a intenso…

3

Eritema intenso (enrojecimiento de color carne) o formación de escaras que impide clasificar el eritema…

4

Máximo posible: 4

Sin edema…

0

Edema muy leve (apenas perceptible)…

1

Edema leve (bordes de la zona bien definidos por una elevación clara)…

2

Edema moderado (elevación de 1 mm aproximadamente)…

3

Edema intenso (se eleva más de 1 mm y se extiende más allá de la zona de exposición)…

4

Máximo posible: 4

Puede realizarse un examen histopatológico para aclarar respuestas dudosas.

Apéndice

DEFINICIONES

Producto: Sustancia o mezcla.

Irritación cutánea: Producción de una lesión reversible de la piel tras la aplicación de un producto problema durante hasta cuatro horas.

Corrosión cutánea: Producción de una lesión irreversible de la piel; en particular, necrosis visible a través de la epidermis y en la dermis, tras la aplicación de un producto problema durante hasta cuatro horas. Las reacciones corrosivas se caracterizan por úlceras, sangrado, costras sanguinolentas y, hacia el final del período de observación de catorce días, por decoloración debida al blanqueo de la piel, zonas completas de alopecia y cicatrices. Debe considerarse la realización de un examen histopatológico para evaluar las lesiones dudosas.

Producto problema: Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

»

2)

En la parte B, el capítulo B.17 se sustituye por el texto siguiente:

«B.17   ENSAYO DE MUTACIÓN GÉNICA DE CÉLULAS DE MAMÍFERO IN VITRO UTILIZANDO LOS GENES HPRT Y XPRT

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) 476 de la OCDE (2016). Los métodos de ensayo se revisan periódicamente a la luz del progreso científico, los cambios en las necesidades normativas y el bienestar animal. La presente versión actualizada del método de ensayo B.17 refleja casi treinta años de experiencia con este ensayo y también es resultado del desarrollo de una nuevo método aparte dedicado a los ensayos de mutación génica de células de mamífero in vitro utilizando el gen de la timidina-cinasa. El método B.17 forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. La OCDE ha elaborado un documento que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a las directrices de ensayo de la OCDE sobre toxicidad genética (1).

2.

El objetivo del ensayo de mutación génica de células de mamífero es detectar las mutaciones génicas inducidas por los productos. Las líneas celulares utilizadas en estos ensayos miden las mutaciones directas de genes marcadores, en concreto el gen endógeno de la hipoxantina-guanina-fosfo-ribosil-transferasa (Hprt en células de roedor, HPRT en células humanas; denominado colectivamente gen Hprt y ensayo HPRT en el presente método de ensayo) y el transgén de la xantina-guanina-fosfo-ribosil-transferasa (gpt) (denominado ensayo XPRT). Los ensayos de mutación HPRT y XPRT detectan diversos espectros de fenómenos genéticos. Además de los fenómenos mutacionales detectados por el ensayo HPRT (p. ej., sustituciones de pares de bases, desplazamientos del marco de lectura, pequeñas supresiones e inserciones), la localización autosómica del transgén gpt puede permitir la detección de mutaciones resultantes de grandes supresiones y recombinaciones posiblemente mitóticas no detectadas por el ensayo HPRT porque el gen Hprt se encuentra en el cromosoma X (2) (3) (4) (5) (6) (7). El ensayo XPRT se utiliza actualmente con menor frecuencia que el ensayo HPRT con fines normativos.

3.

En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

4.

Los ensayos efectuados in vitro requieren generalmente el uso de una fuente exógena de activación metabólica. El sistema exógeno de activación metabólica no reproduce completamente las condiciones in vivo.

5.

Hay que procurar evitar las condiciones que lleven a la producción de resultados positivos que sean artefactos (es decir, debidos a la posible interacción con el sistema de ensayo), no causados por la interacción directa entre los productos problema y el material genético de la célula; pueden mencionarse entre tales condiciones los cambios de pH o de osmolalidad (8) (9) (10), la interacción con los componentes del medio (11) (12), o unos niveles excesivos de citotoxicidad (13). Se considera excesiva para el ensayo HPRT la citotoxicidad que supere los niveles máximos recomendados de citotoxicidad que se definen en el punto 19.

6.

Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines normativos, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la normativa impone el ensayo de la mezcla.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

7.

Las células mutantes deficientes en actividad de la enzima Hprt en el ensayo HPRT o de la enzima xprt en el ensayo XPRT son resistentes a los efectos citostáticos de la 6-tioguanina (TG), análogo de la purina. Las células capaces de producir Hprt (en el ensayo HPRT) o gpt (en el ensayo XPRT) son sensibles a la TG, que provoca la inhibición del metabolismo celular y detiene la división celular. Así pues, las células mutantes son capaces de proliferar en presencia de TG, mientras que no lo son las células normales, que contienen la enzima Hprt (en el ensayo HPRT) o gpt (en el ensayo XPRT).

8.

Se exponen al producto problema células en suspensión o en cultivos monocapa, tanto en presencia como en ausencia de una fuente exógena de activación metabólica (véase el punto14), durante un plazo adecuado (3-6 horas), y después se subcultivan para determinar la citotoxicidad y permitir la expresión fenotípica antes de la selección de los mutantes (14) (15) (16) (17). La citotoxicidad se determina mediante la supervivencia relativa, es decir, la eficiencia de clonación medida inmediatamente después del tratamiento y ajustada para tener en cuenta la eventual pérdida de células durante el tratamiento respecto al testigo negativo (punto 18 y apéndice 2). Los cultivos tratados se mantienen en un medio de crecimiento durante un plazo suficiente, específico para cada tipo celular, de manera que la expresión fenotípica de las mutaciones inducidas sea casi óptima (normalmente un mínimo de 7-9 días). Tras la expresión fenotípica, la frecuencia de mutantes se determina sembrando un número conocido de células en un medio con el agente selectivo para detectar las colonias de mutantes, y en otro medio sin dicho agente para determinar la eficiencia de clonación (viabilidad). Tras un período de incubación adecuado, se cuentan las colonias. La frecuencia de mutantes se calcula en función del número de colonias de mutantes, corregido para tener en cuenta la eficiencia de clonación, en el momento de la selección de los mutantes.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Preparaciones

Células

9.

Las células utilizadas en los ensayos HPRT y XPRT deben haber demostrado su sensibilidad a los mutágenos químicos, una elevada eficiencia de clonación, un cariotipo estable, y una frecuencia estable de mutantes espontáneos. Entre las células utilizadas con mayor frecuencia para el ensayo HPRT se incluyen las líneas CHO, CHL y V79 de hámster chino, las células de linfoma de ratón L5178Y, y las células linfoblastoides humanas TK6 (18) (19). Para el ensayo XPRT se utilizan células AS52 derivadas de CHO con el transgén gpt (y de las que se ha suprimido el gen Hprt) (20) (21); el ensayo HPRT no puede realizarse con células AS52 porque en ellas se ha suprimido el gen Hprt. Debe justificarse y validarse el eventual uso de otras líneas celulares.

10.

Las líneas celulares deben examinarse sistemáticamente para comprobar la estabilidad del número modal de cromosomas y la ausencia de contaminación por Mycoplasma (22) (23), y no deben utilizarse las células que estén contaminadas o que presenten un cambio en el número modal de cromosomas. Debe determinarse la duración del ciclo celular normal utilizada en el laboratorio de ensayo, la cual debe ser coherente con las características celulares publicadas. También ha de comprobarse la frecuencia de mutantes espontáneos en el cultivo celular madre, y este no debe utilizarse si la frecuencia de mutantes no es aceptable.

11.

Antes de emplear un cultivo en este ensayo, es necesario limpiarlo de células mutantes preexistentes, p. ej. cultivándolo en medio HAT en caso de ensayo HPRT y en MPA en caso de ensayo XPRT (5) (24) (véase el apéndice 1). Las células limpiadas pueden crioconservarse y después descongelarse para utilizarse como cultivos de trabajo. Los cultivos de trabajo recién descongelados pueden utilizarse para el ensayo después de que se consigan tiempos normales de duplicación. Al efectuar el ensayo XPRT, el cultivo sistemático de las células AS52 debe hacerse en unas condiciones que garanticen el mantenimiento del transgén gpt (20).

Medios y condiciones de cultivo

12.

Para el mantenimiento de los cultivos deben utilizarse medios de cultivo y condiciones de incubación adecuados (recipientes de cultivo, atmósfera humidificada con 5 % de CO2, y temperatura de incubación de 37 °C). Los cultivos celulares deben mantenerse siempre en condiciones que garanticen que se encuentran en la fase logarítmica de crecimiento. Es especialmente importante elegir medios y condiciones de cultivo que garanticen un crecimiento celular óptimo durante el período de expresión y una eficiencia de clonación óptima de las células, tanto mutantes como no mutantes.

Preparación de los cultivos

13.

Las líneas celulares se propagan a partir de cultivos madre, y se siembran en medio de cultivo a una densidad tal que las células en suspensión o en monocapas sigan creciendo exponencialmente a lo largo del tratamiento y del período de expresión (p. ej., debe evitarse la confluencia de las células que crecen en monocapas).

Activación metabólica

14.

Se debe recurrir a sistemas exógenos de metabolización cuando se utilicen células con una capacidad metabólica endógena inadecuada. El sistema utilizado con más frecuencia que se recomienda por defecto, salvo en casos justificados, es una fracción postmitocondrial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene a partir del hígado de roedores (generalmente ratas) tratados con inductores enzimáticos como el aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) o una combinación de fenobarbital y β-naftoflavona (29) (30) (31) (32). Esta última combinación no infringe el Convenio de Estocolmo sobre contaminantes orgánicos persistentes (33), y se ha visto que es tan efectiva como el aroclor 1254 para inducir oxidasas de función mixta (29) (31). La fracción S9 se utiliza normalmente a concentraciones que varían entre el 1 y el 2 % (v/v), pero pueden aumentarse hasta el 10 % (v/v) en el medio de ensayo final. La elección del tipo y de la concentración del sistema exógeno de activación metabólica o del inductor metabólico utilizado puede estar influida por la clase de las sustancias que se someten al ensayo (34) (35) (36).

Preparación del producto problema

15.

Los productos problema sólidos deben prepararse en disolventes adecuados y, si es conveniente, diluirse antes de tratar las células (véase el punto 16). Los productos problema líquidos pueden añadirse directamente al sistema de ensayo o diluirse antes del tratamiento del sistema de ensayo. Los productos problema gaseosos o volátiles deben someterse a ensayo aplicando modificaciones adecuadas a los protocolos normales, tales como el tratamiento en recipientes de cultivo sellados (37) (38). La preparación del producto problema debe hacerse justo antes del tratamiento, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación.

CONDICIONES DE ENSAYO

Disolventes

16.

El disolvente debe elegirse para optimizar la solubilidad de los productos problema sin tener un impacto negativo en la realización del ensayo, por ejemplo por cambiar el crecimiento celular, afectar a la integridad del producto problema, reaccionar con los recipientes de cultivo o interferir con el sistema de activación metabólica. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente (o medio de cultivo) acuoso. Son ejemplos de disolventes bien establecidos el agua y el dimetilsulfóxido. En general, los disolventes orgánicos no deben exceder del 1 % (v/v) y los disolventes acuosos (solución salina o agua) no deben superar el 10 % (v/v) en el medio de tratamiento final. Si los disolventes utilizados no están bien establecidos (por ejemplo, etanol o acetona), debe disponerse de datos justificativos que indiquen su compatibilidad con el sistema de ensayo y los productos problema, así como su ausencia de toxicidad genética a la concentración utilizada. En ausencia de estos datos justificativos, es importante añadir testigos sin tratar (véase el apéndice 1) para demostrar que el disolvente elegido no es nocivo ni induce efectos mutagénicos.

Medición de la citotoxicidad y selección de las concentraciones de exposición

17.

Al determinar la concentración máxima de producto problema, debe evitarse llegar a concentraciones que puedan producir respuestas positivas que sean artefactos, tales como las que provocan una citotoxicidad excesiva (véase el punto 20), precipitación en el medio de cultivo (véase el punto 21), o cambios marcados del pH o de la osmolalidad (véase el punto 5). Si el producto problema provoca un cambio marcado en el pH del medio en el momento de su adición, el pH puede ajustarse amortiguando el medio de tratamiento final para evitar resultados positivos que sean artefactos y mantener unas condiciones de cultivo adecuadas.

18.

La selección de las concentraciones se basa en la citotoxicidad y en otras consideraciones (véanse los puntos 20-22). Si bien la evaluación de la citotoxicidad en un ensayo inicial puede ser útil para definir mejor las concentraciones que deben utilizarse en el experimento principal, no es obligatorio efectuar ese ensayo inicial. Incluso aunque se realice una evaluación inicial de la citotoxicidad, sigue siendo necesario medir la citotoxicidad en cada cultivo del experimento principal, La citotoxicidad debe evaluarse utilizando la supervivencia relativa, es decir, la eficiencia de clonación de las células sembradas inmediatamente después del tratamiento, ajustada para tener en cuenta las eventuales pérdidas de células durante el tratamiento, sobre la base del recuento celular, frente a la eficiencia de clonación ajustada de los testigos negativos (a los que se asigna una supervivencia del 100 %) (véase la fórmula en el apéndice 2).

19.

Deben evaluarse al menos cuatro concentraciones de ensayo (sin incluir los testigos positivos y de disolvente) que cumplan los criterios de aceptabilidad (citotoxicidad apropiada, número de células, etc.). Si bien es aconsejable utilizar cultivos duplicados, a cada concentración estudiada podrán utilizarse cultivos tratados bien replicados o bien únicos. Los resultados obtenidos en los cultivos replicados independientes a una concentración determinada deben comunicarse por separado, pero pueden agruparse para el análisis de datos (17). En el caso de productos problema que muestren escasa o nula citotoxicidad, normalmente serán adecuados los intervalos de concentración de aproximadamente el doble o el triple. Si se produce citotoxicidad, las concentraciones de ensayo seleccionadas deben abarcar una gama de concentraciones desde la que produce citotoxicidad hasta aquellas a las que la citotoxicidad es moderada y pequeña o nula. Muchos productos problema presentan curvas concentración-respuesta de elevada pendiente y, a fin de abarcar todo el intervalo de citotoxicidad o de estudiar la relación concentración-respuesta en detalle, puede ser necesario utilizar concentraciones más próximas entre sí y en un número superior a cuatro, en particular en situaciones en las que se requiera repetir un experimento (véase el punto 43). La utilización de más de cuatro concentraciones puede ser especialmente importante si se utilizan cultivos únicos.

20.

Si la concentración máxima se basa en la citotoxicidad, la concentración más elevada debe intentar conseguir una supervivencia relativa de entre el 20 y el 10 %. Hay que tener cuidado al interpretar los resultados positivos que solo se encuentren con una supervivencia relativa inferior o igual al 10 % (punto 43).

21.

Con productos problema poco solubles que no son citotóxicos a concentraciones inferiores a la concentración mínima insoluble, la mayor concentración analizada debe producir turbidez o precipitado visibles a simple vista o con ayuda de un microscopio invertido al final del tratamiento con el producto problema. Incluso si se produce citotoxicidad por encima de la concentración mínima insoluble, es aconsejable hacer el ensayo a una única concentración que produzca turbidez o precipitado visible porque este puede provocar efectos que sean artefactos. A la concentración a la que se produzca un precipitado, hay que tener cuidado para que el precipitado no interfiera con la realización del ensayo. Puede ser útil determinar la solubilidad en el medio de cultivo antes de efectuar el experimento.

22.

Si no se observa precipitado ni citotoxicidad limitante, la concentración de ensayo más elevada debe corresponder a la más baja de las siguientes: 10 mM, 2 mg/ml o 2 μl/ml (39) (40). Cuando el producto problema no tenga una composición definida y se trate, p. ej., de una sustancia de composición desconocida o variable, de productos complejos de reacción o de materiales biológicos [es decir, sustancias de composición desconocida o variable (UVCB)] (41), extractos medioambientales, etc., es posible que la concentración superior tenga que ser mayor (p. ej., 5 mg/ml), en ausencia de citotoxicidad suficiente, para aumentar la concentración de cada uno de los componentes. Conviene señalar, no obstante, que estos requisitos pueden variar en caso de medicamentos de uso humano (42).

Testigos

23.

Se incluirán, para cada condición experimental, testigos negativos en paralelo (véase el punto 16), consistentes en el disolvente solo en el medio de tratamiento y manipulados de la misma manera que los cultivos tratados.

24.

Es necesario disponer de testigos positivos en paralelo a fin de demostrar la capacidad del laboratorio para detectar mutágenos en las condiciones establecidas en el protocolo de ensayo utilizado y la efectividad del sistema exógeno de activación metabólica, si procede. En el cuadro 1 a continuación se encuentran ejemplos de testigos positivos. Es posible utilizar como testigos positivos otras sustancias, si se justifica. Dado que los ensayos de toxicidad genética con células de mamífero in vitro están suficientemente normalizados, es posible realizar ensayos que utilicen tratamientos con y sin activación metabólica exógena empleando únicamente un testigo positivo que requiera activación metabólica. En este caso, una respuesta de este único testigo positivo demostrará tanto la actividad del sistema de activación metabólica como la sensibilidad del sistema de ensayo. Cada testigo positivo debe utilizarse a una o varias concentraciones de las que se espera que den un aumento reproducible y detectable respecto al nivel de fondo, a fin de demostrar la sensibilidad del sistema de ensayo, y la respuesta no debe ponerse en peligro por una citotoxicidad que supere los límites especificados en el presente método de ensayo (véase el punto 20).

Cuadro 1

Sustancias de referencia recomendadas para evaluar la competencia del laboratorio y parala selección de los testigos positivos

Activación metabólica

Locus

Sustancia y n.o CAS

Ausencia de activación metabólica exógena

Hprt

Metanosulfonato de etilo [n.o CAS 62-50-0] Etilnitrosourea [n.o CAS 759-73-9] 1-óxido de 4-nitroquinolina [n.o CAS 56-57-5]

 

xprt

Estreptonigrina [n.o CAS 3930-19-6] Mitomicina C [n.o CAS 50-07-7]

Presencia de activación metabólica exógena

Hprt

3-Metilcolantreno [n.o CAS 56-49-5] 7,12-Dimetilbenzantraceno [n.o CAS 57-97-6] Benzo[a]pireno [n.o CAS 50-32-8]

 

xprt

Benzo[a]pireno [n.o CAS 50-32-8]

PROCEDIMIENTO

Tratamiento con el producto problema

25.

Se tratan células en crecimiento con el producto problema en presencia y en ausencia de un sistema de activación metabólica. La exposición debe durar un plazo de tiempo adecuado (generalmente de 3 a 6 horas).

26.

El número mínimo de células utilizadas para cada cultivo de ensayo (testigo y tratado) en cada fase del ensayo debe basarse en la frecuencia de mutantes espontáneos. Como guía general, hay que tratar y cultivar células suficientes como para mantener 10 mutantes espontáneos en cada cultivo en todas las fases del ensayo (17). La frecuencia de mutantes espontáneos suele estar entre 5 y 20 × 10-6. Con una frecuencia de mutantes espontáneos de 5 × 10-6 y para mantener un número suficiente de mutantes espontáneos (10 o más), incluso en el caso de los cultivos tratados a concentraciones que den lugar a una citotoxicidad del 90 % durante el tratamiento (10 % supervivencia relativa), sería necesario tratar al menos 20 × 106 células. Además, debe cultivarse durante el período de expresión un número suficiente de células (pero nunca menos de 2 × 106), y sembrarse para la selección de mutantes (17).

Período de expresión fenotípica y medición de la frecuencia de mutantes

27.

Tras el período de tratamiento, las células se cultivan para que se pueda expresar el fenotipo mutante. Un mínimo de 7 a 9 días es, en general, suficiente para permitir una expresión fenotípica casi óptima de los mutantes Hprt y xprt recién inducidos (43) (44). Durante este período, las células se subcultivan periódicamente para mantenerlas en crecimiento exponencial. Después de la expresión fenotípica, las células se vuelven a sembrar en medio con y sin agente selectivo (6-tioguanina) para determinar el número de mutantes y la eficiencia de clonación en el momento de la selección, respectivamente. Esta siembra se puede llevar a cabo utilizando placas Petri para cultivos monocapa o placas de micropocillos para células en suspensión. Para la selección de mutantes, las células deben sembrarse a una densidad que garantice la recuperación óptima de los mutantes (es decir, evitar la cooperación metabólica) (17). Las placas se incuban durante el tiempo adecuado para lograr un crecimiento óptimo de las colonias (por ejemplo, 7-12 días) y después se cuentan estas. La frecuencia de mutantes se calcula a partir del número de colonias mutantes corregido según la eficiencia de clonación en el momento de la selección de mutantes (véanse las fórmulas en el apéndice 2).

Competencia del laboratorio

28.

Con el fin de conseguir la suficiente experiencia con el ensayo antes de su uso para los ensayos sistemáticos, el laboratorio debe haber efectuado una serie de experimentos con sustancias positivas de referencia que actúen a través de mecanismos diferentes (como mínimo, una activa con activación metabólica y otra activa sin ella, seleccionadas de entre las sustancias enumeradas en el cuadro 1) y con diversos testigos negativos (utilizando diferentes disolventes o vehículos). Las respuestas obtenidas con estos testigos positivos y negativos deben ser coherentes con la bibliografía. Esto no es aplicable a los laboratorios que tienen experiencia, esto es, que disponen de una base de datos históricos, según se define en los puntos 30 a 33.

29.

Debe investigarse una selección de sustancias testigo positivo (véase el cuadro 1 del punto 25) en ausencia y en presencia de activación metabólica, para demostrar su capacidad de detectar productos mutágenos, para determinar la efectividad del sistema de activación metabólica y para demostrar la adecuación de las condiciones de crecimiento celular durante el tratamiento, la expresión fenotípica y la selección de mutantes, así como la adecuación de los procedimientos de examen. La gama de concentraciones de las sustancias seleccionadas debe elegirse de forma que produzcan aumentos sobre el nivel de fondo relacionados con la concentración y reproducibles, para demostrar la sensibilidad y el intervalo dinámico del sistema de ensayo.

Datos sobre testigos históricos

30.

El laboratorio debe determinar:

un intervalo y una distribución de los testigos positivos históricos,

un intervalo y una distribución de los testigos negativos (sin tratar, disolventes) históricos.

31.

Cuando se obtengan datos por primera vez en relación con una distribución de testigos negativos históricos, los testigos negativos en paralelo deben ser coherentes con los datos publicados de los testigos (22). Según se añadan más datos experimentales sobre la distribución de los testigos, los testigos negativos en paralelo deben situarse idealmente dentro de los límites de control del 95 % de dicha distribución (17) (45) (46).

32.

La base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio debe constituirse en un principio con un mínimo de 10 experimentos, pero preferiblemente con al menos 20 experimentos realizados en condiciones experimentales comparables. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control [por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (47)], con el fin de determinar la variabilidad de sus datos sobre los testigos positivos y negativos, y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio (46). En la bibliografía pueden encontrarse más recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (45).

33.

Los datos de los testigos negativos deben consistir en frecuencias de mutantes procedentes de cultivos únicos o preferiblemente replicados, tal como se describe en el punto 23. Lo ideal sería que los testigos negativos en paralelo estuvieran dentro de los límites de control del 95 % de la distribución de la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio (17) (45) (46). Cuando hay datos de los testigos negativos en paralelo que quedan fuera del límite de control del 95 %, su inclusión en la distribución de testigos históricos puede ser aceptable en la medida en que dichos datos no sean valores atípicos extremos y haya pruebas de que el sistema de ensayo está «controlado» (véase más arriba) y pruebas de la ausencia de fallos técnicos o humanos.

34.

Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de su coherencia con las bases de datos de testigos históricos existentes del laboratorio. Cualquier incoherencia importante debería dar lugar a la creación de una nueva base de datos de testigos históricos.

DATOS E INFORME

Presentación de los resultados

35.

La presentación de los resultados debe incluir todos los datos necesarios para calcular la citotoxicidad (expresada como supervivencia relativa). Los datos, tanto los relativos a los cultivos tratados como a los testigos, deben incluir el número de células al final del tratamiento, el número de células sembradas inmediatamente después del tratamiento y los recuentos de colonias (o el número de pocillos sin colonias en el método de micropocillos). La supervivencia relativa de cada cultivo debe expresarse como porcentaje en relación con el control del disolvente en paralelo (véanse las definiciones del apéndice 1).

36.

La presentación de los resultados debe incluir también todos los datos necesarios para calcular la frecuencia de mutantes. Los datos, tanto de los cultivos tratados como de los cultivos testigo, deben incluir: 1) el número de células sembradas con y sin agente selectivo (en el momento en que las células se siembran para la selección de mutantes), y 2) el número de colonias contadas (o el número de pocillos sin colonias en el método de micropocillos) en las placas con y sin agente selectivo. La frecuencia de mutantes se calcula a partir del número de colonias mutantes (en las placas con agente selectivo) corregido según la eficiencia de clonación (de las placas sin agente selectivo). La frecuencia de mutantes debe expresarse como número de células mutantes por millón de células viables (véanse las definiciones del apéndice 1).

37.

Deben proporcionarse datos de cada cultivo. Además, se resumirán todos los datos en forma de cuadro.

Criterios de aceptabilidad

38.

La aceptabilidad de un ensayo se basa en los criterios siguientes:

El testigo negativo en paralelo se considera aceptable para añadirse a la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio de acuerdo con lo descrito en el punto 33.

Los testigos positivos en paralelo (véase el punto 24) deben inducir respuestas compatibles con las obtenidas en la base de datos de testigos positivos históricos y producir un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo.

Se someten a ensayo dos condiciones experimentales (es decir, con y sin activación metabólica), salvo cuando ya en una se produce un resultado positivo (véase el punto 25).

Son analizables números y concentraciones apropiados de células (puntos 25, 26 y 19).

Los criterios de selección de la concentración superior son coherentes con los descritos en los puntos 20, 21 y 22.

Evaluación e interpretación de los resultados

39.

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si, en alguna de las condiciones experimentales examinadas:

al menos una de las concentraciones de ensayo muestra un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo,

el aumento está relacionado con la concentración cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,

alguno de estos resultados está fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límite de control del 95 % según la distribución de Poisson; véase el punto 33).

Cuando se cumplen todos estos criterios, el producto problema se considera capaz de inducir mutaciones génicas en las células de mamífero cultivadas en este sistema de ensayo. En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (46) (48).

40.

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si, en todas las condiciones experimentales examinadas, también se cumple lo siguiente:

ninguna de las concentraciones de ensayo muestra un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo,

no hay ningún aumento relacionado con la concentración cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,

todos los resultados están dentro de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límite de control del 95 % según la distribución de Poisson; véase el punto 33).

El producto problema se considera entonces incapaz de inducir mutaciones génicas en las células de mamífero cultivadas en este sistema de ensayo.

41.

No se requiere ninguna verificación de una respuesta claramente positiva o negativa.

42.

En los casos en que la respuesta no sea ni claramente positiva ni claramente negativa como se describe más arriba, o a fin de ayudar a determinar la relevancia biológica de un resultado, los datos deben ser evaluados por expertos o mediante más investigaciones. Puede ser útil repetir un experimento, quizá con alguna modificación de las condiciones experimentales [por ejemplo, separación entre las concentraciones, otras condiciones de activación metabólica (es decir, concentración u origen de la fracción S9)].

43.

En casos raros, incluso después de hacer más investigaciones, el conjunto de datos no permite que se extraiga una conclusión de resultado positivo o negativo. Por lo tanto, debe concluirse que la respuesta del producto problema es dudosa (lo que se interpreta como que resulta igualmente probable que sea positiva o negativa).

Informe del ensayo

44.

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

 

Producto problema:

origen, número de lote, fecha límite de utilización, si se dispone de ellos;

estabilidad del producto problema en sí, si se conoce;

solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente, si se conocen;

medición del pH, osmolalidad y precipitado en el medio de cultivo al que se ha añadido el producto problema, según proceda.

 

Sustancias de un solo componente:

aspecto físico, hidrosolubilidad y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes;

identificación química, como nomenclatura IUPAC o CAS, número CAS, notación SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas si procede y es viable en la práctica.

 

Sustancias de componentes múltiples, UVCB y mezclas:

deben caracterizarse en la medida de lo posible por la identidad química (véase el párrafo anterior), la cantidad en que están presentes y las propiedades fisicoquímicas pertinentes de sus componentes.

 

Disolvente:

justificación de la elección del disolvente;

porcentaje de disolvente en el medio de cultivo final.

 

Células:

 

En el caso de cultivos madre de laboratorio:

tipo, fuente de las líneas celulares;

número de pases, si se conoce, e historial en el laboratorio;

características del cariotipo y/o número modal de los cromosomas;

métodos de mantenimiento de los cultivos celulares;

ausencia de micoplasmas;

tiempos de duplicación de las células.

 

Condiciones del ensayo:

fundamento de la selección de las concentraciones y del número de cultivos con inclusión, p. ej., de datos relativos a la citotoxicidad y límites de solubilidad;

composición de los medios, concentración de CO2, nivel de humedad;

concentración del producto problema, expresada como concentración final en el medio de cultivo (por ejemplo, mM, o μg o mg/ml de medio de cultivo);

concentración (o volumen) del disolvente y del producto problema añadidos al medio de cultivo;

temperatura de incubación;

tiempo de incubación;

duración del tratamiento;

densidad celular durante el tratamiento;

tipo y composición del sistema de activación metabólica (origen de la fracción S9, método de preparación de la mezcla S9, concentración o volumen de mezcla S9 y de fracción S9 en el medio de cultivo final, controles de calidad de la fracción S9);

sustancias testigo positivo y negativo, concentraciones finales en cada una de las condiciones de tratamiento;

duración del período de expresión (con el número de células sembradas, subcultivos y pautas de nutrición, si procede);

identidad del agente selectivo y su concentración;

criterios de aceptabilidad de los ensayos;

métodos empleados para contar las células viables y las mutantes;

métodos utilizados para medir la citotoxicidad;

cualquier información adicional relativa a la citotoxicidad y método utilizado;

duración de la incubación después de la siembra;

criterios empleados para considerar si los estudios son positivos, negativos o dudosos;

métodos utilizados para determinar el pH, la osmolalidad y la precipitación.

 

Resultados:

número de células tratadas y número de células subcultivadas por cada cultivo;

mediciones de la citotoxicidad y otras observaciones, en su caso;

signos de precipitación y momento de la determinación;

número de células sembradas en medio selectivo y no selectivo;

número de colonias en medio no selectivo y número de colonias resistentes en medio selectivo, y frecuencias de mutantes correspondientes;

relación concentración-respuesta, cuando sea posible;

datos de los testigos negativos (disolvente) y positivos (concentraciones y disolventes) en paralelo;

datos históricos de los testigos negativos (disolvente) y positivos, con intervalos, medias y desviaciones típicas e intervalo de confianza (p. ej., 95 %), así como número de datos;

análisis estadísticos (correspondientes a los cultivos individuales y a las réplicas combinadas, en su caso), y valores p, en su caso.

 

Discusión de los resultados

 

Conclusión

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Apéndice 1

DEFINICIONES

Mutágenos por sustitución de pares de bases: Productos que provocan la sustitución de pares de bases en el ADN.

Producto: Sustancia o mezcla.

Eficiencia de clonación: Porcentaje de células sembradas a baja densidad que pueden crecer para formar una colonia que puede contarse.

Concentraciones: Concentraciones finales del producto problema en el medio de cultivo.

Citotoxicidad: En relación con los ensayos incluidos en este método de ensayo, la citotoxicidad se identifica como una reducción en la supervivencia relativa de las células tratadas en comparación con el testigo negativo (véase el punto específico).

Mutación directa: Mutación génica del tipo parental a la forma mutante, que da lugar a una alteración o pérdida de la actividad enzimática o de la función de la proteína codificada.

Mutágenos por desplazamiento del marco de lectura: Productos que provocan la adición o supresión de uno o varios pares de bases en la molécula de ADN.

Genotoxicidad: Término general que engloba todos los tipos de lesión del ADN o del cromosoma, con inclusión de roturas de ADN, aductos, reorganizaciones, mutaciones, aberraciones cromosómicas y aneuploidía. No todos los tipos de efectos genotóxicos resultan en mutaciones o en lesiones cromosómicas estables.

Medio HAT: Medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina, utilizado para la limpieza de mutantes Hprt.

Recombinación mitótica: Durante la mitosis, recombinación entre cromátidas homólogas que puede dar lugar a la inducción de roturas de la doble cadena de ADN, o a una pérdida de heterocigosis.

Medio MPA: Medio que contiene xantina, adenina, tiamidina, aminopterina y ácido micofenólico, utilizado para la limpieza de mutantes Xprt.

Mutágeno: Agente que provoca un cambio hereditario en una o varias secuencias de pares de bases del ADN en los genes o en la estructura de los cromosomas (aberraciones cromosómicas).

Frecuencia de mutantes: Número de colonias mutantes dividido por el número de células sembradas en medio selectivo, corregido para tener en cuenta la eficiencia de clonación (o viabilidad) en el momento de la selección.

Período de expresión fenotípica: Tiempo después del tratamiento en el que la alteración genética se fija en el genoma y los eventuales productos génicos preexistentes se agotan hasta que se modifica el rasgo fenotípico.

Supervivencia relativa: Se utiliza como medida de la citotoxicidad relacionada con el tratamiento. La supervivencia relativa es la eficiencia de clonación de las células sembradas inmediatamente después del tratamiento, ajustada para tener en cuenta la eventual pérdida de células durante el tratamiento en comparación con la eficiencia de clonación en los testigos negativos (a los que se asigna una supervivencia del 100 %).

Fracciones hepáticas S9: Sobrenadante de homogeneizado de hígado después de centrifugación a 9000 g, es decir, extracto de hígado crudo.

Mezcla S9: Mezcla de la fracción hepática S9 y de cofactores necesarios para la actividad metabólica de las enzimas.

Control del disolvente: Término general para definir los cultivos testigo que reciben solo el disolvente utilizado para disolver el producto problema.

Producto problema: Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

Testigo sin tratar: Cultivo que no recibe tratamiento (es decir, ni producto problema ni disolvente), pero que se somete en paralelo al mismo proceso que los cultivos que reciben el producto problema.

UVCB: Sustancias químicas de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción y materiales biológicos.

Apéndice 2

FÓRMULAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD Y LA FRECUENCIA DE MUTANTES

La citotoxicidad se evalúa mediante la supervivencia relativa (SR), es decir, la eficiencia de clonación (EC) de las células sembradas inmediatamente después del tratamiento, ajustada para tener en cuenta la eventual pérdida de células durante el tratamiento en comparación con la eficiencia de clonación ajustada en los testigos negativos (a los que se asigna una supervivencia del 100 %) (véase más abajo la fórmula de la SR).

La EC ajustada correspondiente a un cultivo tratado con un producto problema se calcula de la siguiente manera:

Formula

La SR correspondiente a un cultivo tratado con un producto problema se calcula de la siguiente manera:

Formula

La frecuencia de mutantes es la eficiencia de clonación de las colonias mutantes en el medio selectivo dividida por la eficiencia de clonación en el medio no selectivo en relación con el mismo cultivo en el momento de la selección.

Formula

Cuando se utilizan placas para determinar la eficiencia de clonación:

EC = Número de colonias / Número de células sembradas.

Cuando se utilizan placas de micropocillos para determinar la eficiencia de clonación:

El número de colonias por pocillo en las placas de micropocillos sigue una distribución de Poisson.

Eficiencia de clonación = -Ln P(0) / Número de células sembradas por pocillo

donde -Ln P(0) es el número probable de pocillos vacíos de entre los pocillos sembrados y se describe mediante la fórmula siguiente:

Ln P(0) = -Ln (número de pocillos vacíos / número de pocillos sembrados).

»

3)

En la parte B, el capítulo B.22 se sustituye por el texto siguiente:

«B.22   ENSAYO DE LETALIDAD DOMINANTE EN ROEDORES

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) 478 de la OCDE (2016). Los métodos de ensayo se revisan periódicamente a la luz del progreso científico, los cambios en las necesidades normativas y las consideraciones relativas al bienestar animal. Esta versión modificada del método de ensayo refleja más de treinta años de experiencia con este ensayo y la posibilidad de integrarlo o combinarlo con otros ensayos de toxicidad, tales como estudios de desarrollo, toxicidad para la reproducción o genotoxicidad; sin embargo, debido a sus limitaciones y al uso de un gran número de animales, este ensayo no se destina a utilizarse como método primario, sino más bien como método de ensayo complementario que solo puede utilizarse cuando no existen alternativas para cumplir los requisitos normativos. La combinación de ensayos de toxicidad ofrece la posibilidad de no tener que utilizar un gran número de animales en tales ensayos. La OCDE ha elaborado un documento que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a las directrices de ensayo de la OCDE sobre toxicidad genética (1).

2.

El objetivo del ensayo de letalidad dominante (LD) es investigar si los productos provocan mutaciones derivadas de aberraciones cromosómicas en células germinales. Además, el ensayo de letalidad dominante es pertinente para evaluar la genotoxicidad porque, aunque pueden variar entre las especies, los factores del metabolismo in vivo, de la farmacocinética y de los procesos de reparación del ADN están activos y contribuyen a la respuesta. La inducción de una mutación LD después de la exposición a un producto problema indica que este ha afectado al tejido germinal del animal de ensayo.

3.

Las mutaciones LD provocan la muerte del embrión o del feto. La inducción de mutaciones LD tras la exposición a un producto problema indica que este ha afectado a las células germinales del animal de ensayo.

4.

Un ensayo LD es útil para confirmar los resultados positivos de los ensayos utilizando criterios de valoración somáticos in vivo, y constituye un criterio pertinente para la predicción del peligro para el hombre y del riesgo de enfermedades genéticas transmitidas a través de la estirpe germinal. Sin embargo, este ensayo requiere un gran número de animales y mucho trabajo; como consecuencia de ello, su realización es muy cara y lenta. Puesto que la frecuencia espontánea de mutaciones letales dominantes es bastante elevada, es generalmente limitada la sensibilidad del ensayo para la detección de pequeños aumentos en la frecuencia de mutaciones.

5.

Las definiciones de los términos clave figuran en el apéndice 1.

CONSIDERACIONES INICIALES

6.

La prueba se lleva a cabo con mayor frecuencia con ratones (2) (3) (4), pero en algunos casos puede ser adecuado realizarla con otras especies, como las ratas (5) (6) (7) (8), si está científicamente justificado. En términos generales, las mutaciones LD consisten en grandes aberraciones cromosómicas (anomalías estructurales y numéricas) (9) (10) (11), pero no pueden excluirse las mutaciones génicas. Una mutación LD es una mutación que se produce en una célula germinal de por sí, o se fija en el embrión incipiente después de la fertilización, que no provoca disfunciones en el gameto, pero que es letal para el óvulo fecundado o el embrión en desarrollo.

7.

Los distintos machos se aparean secuencialmente con hembras vírgenes a intervalos apropiados. El número de apareamientos después del tratamiento depende del propósito final del estudio LD (punto 23) y debe garantizar que se evalúen en cuanto a las mutaciones LD todas las fases de maduración de las células germinales de los machos (12).

8.

No procede utilizar este ensayo si hay pruebas de que el producto problema, o sus metabolitos, no llegan a los testículos.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

9.

Generalmente, los machos se exponen a un producto problema por una vía de exposición adecuada y se aparean con hembras vírgenes no tratadas. Pueden someterse a ensayo diferentes tipos de células germinales mediante la utilización de intervalos de apareamiento secuenciales. Tras el apareamiento, las hembras se sacrifican al cabo de un período de tiempo adecuado, y se examinan sus úteros para determinar el número de implantes y de embriones vivos y muertos. La letalidad dominante de un producto problema se determina comparando el número de implantes vivos por hembra del grupo tratado con el número de implantes vivos por hembra del grupo de control del vehículo/disolvente. El aumento del número de implantes muertos por hembra del grupo tratado respecto al número de implantes muertos por hembra del grupo testigo refleja las pérdidas tras la implantación inducidas por el producto problema. Las pérdidas tras la implantación se calculan comparando la relación entre implantes muertos e implantes totales en el grupo tratado, con la relación entre implantes muertos e implantes totales en el grupo testigo. Las pérdidas previas a la implantación pueden calcularse comparando el número de cuerpos lúteos menos el de implantes totales o el número de implantes totales por hembra en los grupos tratado y testigo.

VERIFICACIÓN DE LA COMPETENCIA DEL LABORATORIO

10.

La competencia en este ensayo debe establecerse demostrando la capacidad de reproducir las frecuencias de mutaciones letales dominantes obtenidas de datos publicados [p. ej., (13) (14) (15) (16) (17) (18)] con sustancias testigo positivo (incluidas respuestas débiles) como las que figuran en el cuadro 1, y con controles de vehículo, y obteniendo con los testigos negativos unas frecuencias concordantes con un intervalo aceptable de datos (véanse las referencias anteriores) o con la distribución histórica de testigos del laboratorio, si se dispone de ella.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Preparaciones

Selección de la especie animal

11.

Deben emplearse animales sexualmente maduros, sanos, de cepas de laboratorio de uso corriente. Se utilizan habitualmente ratones, pero también puede ser adecuado recurrir a las ratas. Puede utilizarse cualquier otra especie apropiada de mamíferos, si se facilita la justificación científica en el informe.

Condiciones de alojamiento y alimentación de los animales

12.

En el caso de los roedores, la temperatura en el local de los animales debe ser de 22 °C (± 3 °C). La humedad relativa debe ser idealmente del 50-60 %, como mínimo del 40 % y preferiblemente no superior al 70 %, salvo durante la limpieza del local. La iluminación debe ser artificial, con una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La elección de la dieta puede verse influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente del producto problema si se administra por esta vía. Antes de proceder al tratamiento o al apareamiento, hay que alojar a los roedores en pequeños grupos (no más de cinco animales) del mismo sexo si no se esperan ni se observan comportamientos agresivos, preferiblemente en jaulas sólidas con un enriquecimiento ambiental adecuado. Los animales pueden alojarse individualmente si está científicamente justificado.

Preparación de los animales

13.

Los animales adultos, sanos y sexualmente maduros, tanto machos como hembras, se reparten al azar entre los grupos tratado y testigo. Los animales se identifican individualmente utilizando un método compasivo y mínimamente invasivo (por ejemplo, mediante anillamiento, marcado, implantación de un microchip o identificación biométrica, pero no grapado a las orejas o los dedos), y se deja que se acostumbren a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días. Las jaulas se deben disponer de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Debe evitarse la contaminación cruzada con el testigo positivo y el producto problema. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder del ± 20 % del peso medio de cada sexo.

Preparación de las dosis

14.

Los productos problema sólidos deben disolverse o suspenderse en disolventes o vehículos adecuados, o mezclarse con la dieta o con el agua de bebida, antes de su administración a los animales. Los productos problema líquidos pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administración. En caso de exposición por inhalación, los productos problema pueden administrarse en forma de gas, vapor o aerosol sólido/líquido, dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas. Deben utilizarse preparaciones recientes del producto problema, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación y definan las condiciones adecuadas de esta.

Condiciones de ensayo

Disolvente o vehículo

15.

El disolvente o vehículo no debe producir efectos tóxicos a los volúmenes de dosis empleados, y no ha de sospecharse que reaccione químicamente con el producto problema. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información de referencia que avale su compatibilidad. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso. Pueden citarse como ejemplos comúnmente utilizados de disolventes o vehículos compatibles el agua, el suero fisiológico, la solución de metilcelulosa, la solución de sal sódica de carboximetilcelulosa, el aceite de oliva y el aceite de maíz.

Testigos positivos

16.

Deben utilizarse siempre animales testigo positivo en paralelo, a menos que el laboratorio haya demostrado su competencia en la realización del ensayo y haya utilizado el ensayo de forma sistemática en los últimos años (por ejemplo, en los últimos 5 años). Sin embargo, no es necesario tratar a los animales testigo positivo por la misma vía que a los animales que reciben el producto problema, ni tomar muestras a todos los intervalos de apareamiento. De las sustancias testigo positivo debe saberse que producen letalidad dominante en las condiciones utilizadas en el ensayo. Excepto en lo relativo al tratamiento, los animales de los grupos testigo deben someterse al mismo procedimiento que los de los grupos tratados.

17.

Las dosis de las sustancias testigo positivo deben seleccionarse de manera que se produzcan efectos débiles o moderados que sirvan para evaluar críticamente el comportamiento y la sensibilidad del ensayo, pero también de manera que se produzcan sistemáticamente efectos positivos de mortalidad dominante. En el cuadro 1 se incluyen ejemplos de sustancias testigo positivo y dosis apropiadas.

Cuadro 1

Ejemplos de sustancias testigo positivo

Sustancia [n.o CAS]

(n.o de referencia)

Intervalo efectivo de dosis (mg/kg)

(especie de roedores)

Tiempo de administración (días)

Trietilenomelamina [51-18-3] (15)

0,25 (ratones)

1

Ciclofosfamida [50-18-0] (19)

50-150 (ratones)

5

Ciclofosfamida [50-18-0] (5)

25-100 (ratas)

1

Metanosulfonato de etilo [62-50-0] (13)

100-300 (ratones)

5

Acrilamida monomérica [79-06-1] (17)

50 (ratones)

5

Clorambucilo [305-03-3] (14)

25 (ratones)

1

Testigos negativos

18.

Respecto a cada tiempo de muestreo deben incluirse animales testigo negativo, tratados únicamente con el disolvente o vehículo, y sometidos en lo demás a lo mismo que los grupos de tratamiento (20). Si no se tienen datos de testigos, históricos o publicados, que indiquen que el disolvente/vehículo elegido no induce ninguna mutación letal dominante ni otros efectos nocivos, deben incluirse también para cada momento de muestreo animales testigo sin tratar, a fin de establecer que es aceptable el control del vehículo.

PROCEDIMIENTO

Número de animales

19.

Cada macho se aparea secuencialmente a intervalos adecuados predeterminados (por ejemplo, intervalos semanales, puntos 21 y 23) de preferencia con una sola hembra virgen. El número de machos por grupo debe establecerse de antemano para que sea suficiente (en combinación con el número de hembras apareadas a cada intervalo de apareamiento) a fin de proporcionar la potencia estadística necesaria para detectar al menos una duplicación de la frecuencia de mutaciones LD (punto 44).

20.

El número de hembras por intervalo de apareamiento también debe predeterminarse mediante cálculos de la potencia estadística para permitir la detección de al menos una duplicación en la frecuencia de mutaciones LD (es decir, una cantidad suficiente de hembras gestantes para proporcionar al menos 400 implantes totales) (20) (21) (22) (23) y que se prevea al menos un implante muerto por unidad de análisis (es decir, grupo de apareamiento por dosis) (24).

Intervalos entre períodos de administración y apareamientos

21.

El número de intervalos de apareamiento tras el tratamiento se rige por el programa de tratamiento, y debe garantizar que todas las fases de maduración de las células germinales de los machos se evalúan en cuanto a la inducción de mutaciones LD (12) (25). En caso de un único tratamiento y hasta cinco administraciones diarias de dosis, debe haber 8 (con ratones) o 10 (con ratas) apareamientos efectuados a intervalos semanales tras el último tratamiento. En caso de administraciones de dosis múltiples, el número de intervalos de apareamiento puede reducirse proporcionalmente al aumento del tiempo del período de administración, pero manteniendo el objetivo de evaluar todas las fases de la espermatogénesis (p. ej., tras una exposición de 28 días, solo 4 apareamientos semanales son suficientes para evaluar todas las fases de la espermatogénesis en el ratón). Todos los programas de tratamiento y apareamiento deben justificarse científicamente.

22.

Las hembras deben permanecer con los machos durante al menos un ciclo estral (p. ej., una semana cubre un ciclo estral tanto en ratones como en ratas). Las hembras que no se hayan apareado durante el intervalo de una semana pueden utilizarse para un intervalo de apareamiento posterior. Otra posibilidad es hasta que se haya producido el apareamiento, determinado por la presencia de esperma en la vagina o por la presencia de un tapón vaginal.

23.

El régimen seguido de exposición y apareamiento depende del objetivo final del estudio de LD. Si se trata de determinar si un producto químico dado induce per se mutaciones LD, el método aceptado sería exponer toda una ronda de espermatogénesis (p. ej., 7 semanas en el ratón, 5-7 tratamientos por semana) y aparear una vez al final. Sin embargo, si se trata de identificar el tipo de células germinales sensibles a la inducción de mutaciones LD, es preferible una exposición única o de 5 días seguida de apareamiento semanal.

Dosis

24.

Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación del intervalo de dosis porque no se dispone aún de datos adecuados para ayudar en la selección de las dosis, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y régimen de tratamiento que se vayan a utilizar en el estudio principal (26). El estudio debe tratar de determinar la dosis máxima tolerada (DMT), es decir, la dosis más alta que se tolera sin signos de toxicidad que limite el estudio, en relación con la duración del período de estudio (por ejemplo, comportamiento o reacciones anormales, reducción del peso corporal o citotoxicidad para el sistema hematopoyético), pero sin llegar a la muerte ni presentar signos de dolor, sufrimiento o angustia que requieran el sacrificio compasivo (27).

25.

La DMT tampoco debe afectar negativamente al éxito del apareamiento (21).

26.

Los productos que tienen actividades biológicas específicas a dosis bajas no tóxicas (tales como las hormonas y los mitógenos) y los productos que presentan saturación de las propiedades toxicocinéticas pueden constituir excepciones de los criterios de establecimiento de las dosis y deben evaluarse caso por caso.

27.

A fin de obtener información sobre la relación dosis-respuesta, los estudios completos deben incluir un grupo testigo negativo y un mínimo de tres dosis separadas por un factor que será en general de 2 y nunca superior a 4. Si el producto problema no produce toxicidad en un estudio de determinación del intervalo o según los datos disponibles, la dosis más alta para una administración única debe ser de 2 000 mg/kg de peso corporal. No obstante, si el producto problema provoca toxicidad, la DMT debe ser la mayor dosis administrada y las dosis deben abarcar preferentemente el intervalo desde la dosis máxima hasta una dosis que provoque toxicidad escasa o nula. En el caso de productos no tóxicos, la dosis límite para un período de administración de 14 días o más es de 1 000 mg/kg de peso corporal/día y, si se trata de períodos de administración de menos de 14 días, la dosis límite será de 2 000 mg/kg peso corporal/día.

Administración de las dosis

28.

A la hora de diseñar el ensayo, debe tenerse en cuenta la vía prevista de exposición humana. Por lo tanto, en casos justificados pueden elegirse vías de exposición tales como los alimentos, el agua de bebida, la subcutánea, la intravenosa, la tópica, la inhalación, la oral forzada o la implantación. En cualquier caso, la vía debe elegirse de forma que se garantice una exposición adecuada del tejido o tejidos diana. Normalmente no se recomienda la inyección intraperitoneal, ya que no es una vía de exposición humana prevista, y debe utilizarse solo en casos que tengan justificación científica específica. Si el producto problema se mezcla con los alimentos o el agua de bebida, en particular en caso de administración única, debe procurarse que el plazo entre el consumo de los alimentos o el agua y el apareamiento sea suficiente para permitir la detección de los efectos (véase el punto 31). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez por vía oral forzada o por inyección depende del tamaño del animal utilizado. Dicho volumen no debe superar normalmente 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a un máximo de 2 ml/100 g. Si se utilizan volúmenes superiores a estos (en caso de que lo permita la legislación sobre bienestar animal), debe justificarse. La variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concentración, para garantizar un volumen constante en relación con el peso corporal en todas las dosis.

Observaciones

29.

Deben hacerse observaciones clínicas generales de los animales de ensayo y registrarse los signos clínicos al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora u horas cada día y teniendo en cuenta el período de mayor intensidad de los efectos previstos tras la administración. Al menos dos veces al día durante el periodo de administración, se debe observar la posible morbilidad y mortalidad de todos los animales. Deben pesarse todos los animales al principio del estudio, y al menos una vez por semana durante los estudios de administración continuada, y en el momento del sacrificio. El consumo de alimentos debe medirse al menos semanalmente. Si el producto problema se administra con el agua de bebida, debe medirse el consumo de agua cada vez que se cambie esta y al menos una vez por semana. Los animales que presenten signos de toxicidad excesiva pero no letal deben sacrificarse antes de que termine el período del ensayo (27).

Recogida y preparación de los tejidos

30.

Las hembras son sacrificadas en la segunda mitad de la gestación, el día 13 de esta en el caso de los ratones y el día 14-15 en el caso de las ratas. Se examinan los úteros con respecto a los efectos letales dominantes para determinar el número de implantes, embriones vivos y muertos, y cuerpos amarillos.

31.

Se exponen las trompas uterinas y los ovarios para efectuar el recuento de cuerpos amarillos, y los fetos se retiran, se cuentan y se pesan. Hay que tener cuidado en examinar los úteros en cuanto a la presencia de reabsorciones oscurecidas por fetos vivos y en asegurarse de que se tienen en cuenta todas las reabsorciones. Se registra la mortalidad fetal. Se registran también el número de hembras fecundadas con éxito y el número total de implantes, las pérdidas previas a la implantación y la mortalidad tras la implantación (incluidas las reabsorciones precoces y tardías). Además, los fetos visibles pueden conservarse en el fijador de Bouin durante al menos 2 semanas, y después someterse a examen para detectar las principales malformaciones externas (28), con el fin de proporcionar información adicional en cuanto a los efectos del agente problema sobre la reproducción y sobre el desarrollo.

DATOS E INFORME

Tratamiento de los resultados

32.

Los resultados se presentarán en forma de tablas en las que aparezcan el número de machos apareados, el de hembras gestantes y el de hembras no gestantes. Se facilitarán por separado los resultados de cada apareamiento, incluida la identidad de cada macho y hembra. Deben enumerarse respecto a cada hembra el intervalo de apareamiento, la dosis recibida por los machos tratados y el número de implantes vivos y de implantes muertos.

33.

Las pérdidas tras la implantación se calculan determinando la relación entre los implantes muertos y los implantes totales del grupo tratado en comparación con la relación entre los implantes muertos y los implantes totales del grupo de control del vehículo/disolvente.

34.

Las pérdidas previas a la implantación se calculan como la diferencia entre el número de cuerpos amarillos y el número de implantes, o como una reducción del número medio de implantes por hembra en comparación con los apareamientos testigo. Cuando se calculen las pérdidas previas a la implantación, deberán indicarse.

35.

El factor de letalidad dominante se calcula de la siguiente manera: (muertes tras la implantación / implantes totales por hembra) × 100.

36.

Deben indicarse los datos sobre toxicidad y signos clínicos (según el punto 29).

Criterios de aceptabilidad

37.

Los siguientes criterios determinan la aceptabilidad de un ensayo:

El testigo negativo en paralelo es coherente con los niveles publicados de los datos históricos de los testigos negativos, y con los datos de testigos históricos del laboratorio, si estos están disponibles (véanse los puntos 10 y 18).

Los testigos positivos en paralelo inducen respuestas coherentes con los niveles publicados de los datos históricos de los testigos positivos, o con la base de datos de testigos históricos positivos del laboratorio, si están disponibles, y producen un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo (véanse los puntos 17 y 18).

Se han analizado números adecuados de implantes totales y dosis (punto 20).

Los criterios para la selección de la dosis más elevada son coherentes con los descritos en los puntos 24 y 27.

Evaluación e interpretación de los resultados

38.

Deben analizarse al menos tres grupos tratados con el producto problema a fin de obtener datos suficientes para el análisis de la relación dosis-respuesta.

39.

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si:

al menos una de las dosis de ensayo produce un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo;

el aumento está relacionado con la dosis en al menos una condición experimental (p. ej., un intervalo de apareamiento semanal) cuando se evalúa con un ensayo adecuado; y

alguno de los resultados está fuera del intervalo aceptable de los datos de los testigos negativos, o de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos del laboratorio (p. ej., límite del control del 95 % según la distribución de Poisson), si están disponibles.

El producto problema se considera entonces capaz de inducir mutaciones letales dominantes en las células germinales de los animales de ensayo. Las recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados se describen en el punto 44; también pueden encontrarse en la bibliografía otros enfoques estadísticos recomendados (20) (21) (22) (24) (29). Las pruebas estadísticas utilizadas deben considerar como unidad experimental al animal.

40.

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si:

ninguna de las dosis de ensayo presenta un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo;

no hay ningún aumento relacionado con la dosis en ninguna de las condiciones experimentales; y

todos los resultados están dentro del intervalo aceptable de los datos de los testigos negativos, o de los datos históricos de los testigos negativos del laboratorio (p. ej., límite del control del 95 % según la distribución de Poisson), si están disponibles.

El producto problema se considera entonces incapaz de inducir mutaciones letales dominantes en las células germinales de los animales de ensayo.

41.

No se requiere ninguna verificación de una respuesta claramente positiva o claramente negativa.

42.

Si la respuesta no es claramente negativa o positiva, y para ayudar a determinar la pertinencia biológica de un resultado (p. ej., un incremento débil o dudoso), los datos deben ser evaluados por expertos o mediante otras investigaciones utilizando los datos experimentales existentes, como la consideración de si el resultado positivo se encuentra fuera del intervalo aceptable de datos de los testigos negativos o de los datos históricos de los testigos negativos del laboratorio (30).

43.

En casos raros, incluso después de hacer más investigaciones, el conjunto de datos puede no permitir que se extraiga una conclusión de resultado positivo o negativo, por lo que se considerará dudoso.

44.

Las pruebas estadísticas utilizadas deben considerar como unidad experimental al animal macho. Si bien es posible que los datos de recuento (p. ej., el número de implantes por hembra) se ajusten a una distribución de Poisson y/o las proporciones (p, ej., la proporción de implantes muertos) puedan tener una distribución binomial, es frecuente que estos datos estén sobredispersados (31). Por consiguiente, el análisis estadístico debe basarse en primer lugar en un ensayo de sobredispersión o de subdispersión utilizando pruebas de varianza como, por ejemplo, la prueba de varianza binomial de Cochran (32) o la prueba C(α) de Tarone de la sobredispersión binomial (31) (33). Si no se detecta desviación de la dispersión binomial, las tendencias en las proporciones entre las distintas dosis pueden comprobarse utilizando la prueba de tendencia de Cochran-Armitage (34) y las comparaciones de pares con el grupo testigo pueden probarse mediante la prueba exacta de Fisher (35). De la misma manera, si no se detecta desviación de la dispersión de Poisson, pueden comprobarse las tendencias en los recuentos utilizando la regresión de Poisson (36) y las comparaciones de pares con el grupo testigo pueden comprobarse en el contexto del modelo de Poisson, utilizando contrastes de pares (36). Si se detecta una sobredispersión o una subdispersión, se recomienda utilizar métodos no paramétricos (23) (31). Entre estos se incluyen pruebas basadas en la posición, como la prueba de Jonckheere-Terpstra sobre la tendencia (37) y las pruebas de Mann-Whitney (38), sobre comparaciones de pares con el grupo de control del vehículo/disolvente, así como pruebas de permutación, remuestreo o bootstrap sobre tendencias y comparaciones de pares con el grupo testigo (31) (39).

45.

Un ensayo LD positivo aporta la prueba de la genotoxicidad del producto problema para las células germinales del macho tratado de la especie sometida a ensayo.

46.

Para la evaluación de la significación biológica de la respuesta puede servir de orientación considerar si los valores observados se encuentran dentro o fuera del intervalo de los testigos históricos (40).

Informe del ensayo

47.

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

Resumen.

 

Producto problema:

origen, número de lote, fecha límite de utilización, si se conocen;

estabilidad del producto problema en sí, si se conoce;

solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente, si se conocen;

medición del pH, osmolalidad y precipitado en el medio de cultivo al que se ha añadido el producto problema, según proceda.

 

Sustancias de un solo componente:

aspecto físico, hidrosolubilidad y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes;

identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, notación SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas si procede y es viable en la práctica, etc.

 

Sustancias de componentes múltiples, UVCB y mezclas:

deben caracterizarse en la medida de lo posible por la identidad química (véase más arriba), la cantidad en que están presentes y las propiedades fisicoquímicas pertinentes de sus componentes.

 

Preparación del producto problema:

justificación de la elección del vehículo;

solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente o vehículo, si se conocen;

preparación de formulaciones para la administración con los alimentos, con el agua de bebida o por inhalación;

determinaciones analíticas de las formulaciones (por ejemplo, estabilidad, homogeneidad, concentraciones nominales) si se realizan.

 

Animales de ensayo:

especie y cepa utilizadas y justificación de la elección;

número, edad y sexo de los animales;

origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc.;

método de identificación individual de los animales;

en el caso de estudios a corto plazo: peso corporal individual de los machos al inicio y al final del ensayo; para estudios de duración superior a una semana: pesos corporales individuales durante el estudio y consumo de alimentos. Deben incluirse el intervalo, la media y la desviación típica de los pesos corporales de cada grupo.

 

Condiciones del ensayo:

datos de los testigos positivos y negativos (vehículo o disolvente);

datos del estudio de determinación del intervalo de dosis;

justificación de la selección de las dosis;

datos de la preparación del producto problema;

datos sobre la administración del producto problema;

justificación de la elección de la vía de administración;

métodos de determinación de la toxicidad para los animales, incluidos los eventuales análisis histopatológicos o hematológicos, y frecuencia con que se han medido los pesos corporales y se han realizado las observaciones de los animales;

métodos de comprobación de que el producto problema ha alcanzado el tejido diana, o la circulación general, si se obtienen resultados negativos;

dosis reales (mg/kg peso corporal/día) calculadas a partir del consumo y de la concentración (ppm) del producto problema en los alimentos o en el agua de bebida, en su caso;

datos de la calidad de los alimentos y el agua;

datos sobre el enriquecimiento ambiental de las jaulas;

descripción detallada de las pautas de tratamiento y muestreo y justificación de las decisiones;

método de analgesia;

método de sacrificio;

procedimientos de aislamiento y conservación de los tejidos;

origen y números de lote de todos los juegos y reactivos (si procede);

métodos para el recuento de las mutaciones LD;

programa de apareamiento;

métodos utilizados para determinar que ha tenido lugar el apareamiento;

momento del sacrificio;

criterios de examen de los efectos LD, incluidos los cuerpos lúteos, los implantes, las reabsorciones y las pérdidas previas a la implantación, los implantes vivos y los implantes muertos.

 

Resultados:

estado de los animales antes del ensayo y a lo largo de este, incluidos los signos de toxicidad;

peso corporal de los machos durante el tratamiento y los períodos de apareamiento;

número de hembras apareadas;

relación dosis-respuesta, cuando sea posible;

datos sobre los testigos negativos en paralelo e históricos, con intervalos, medias y desviaciones típicas;

datos sobre los testigos positivos en paralelo;

datos tabulados sobre cada madre, incluyendo: número de cuerpos amarillos por madre; número de implantes por madre; número de reabsorciones y pérdidas previas a la implantación por madre; número de implantes vivos por madre; número de implantes muertos por madre; peso de los fetos;

los datos anteriores resumidos, respecto a cada período de apareamiento y dosis, con las frecuencias de mutaciones letales dominantes;

análisis estadísticos y métodos aplicados.

 

Discusión de los resultados.

 

Conclusión.

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Apéndice 1

DEFINICIONES

Producto: Sustancia o mezcla.

Cuerpo lúteo: Estructura secretora de hormonas formada en el ovario en el lugar en que un folículo ha liberado un óvulo. El número de cuerpos lúteos en los ovarios corresponde al número de óvulos que se han desprendido.

Mutación letal dominante: Mutación que se produce en una célula germinal, o se fija tras la fertilización, que provoca la muerte del embrión o del feto.

Tasa de fertilidad: Número de hembras apareadas gestantes respecto al número total de hembras apareadas.

Intervalo de apareamiento: Tiempo transcurrido entre el final de la exposición y el apareamiento de los machos tratados. Mediante el control de este intervalo pueden evaluarse los efectos del producto sobre los diferentes tipos de células germinales. En los ratones, el apareamiento durante las semanas número 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 después de la finalización de las medidas de exposición afecta al esperma, espermátides condensadas, espermátides redondas, espermatocitos en paquiteno, espermatocitos en fase temprana, espermatogonios diferenciados, espermatogonios en fase de diferenciación, y espermatogonios de células precursoras.

Pérdidas previas a la implantación: Diferencia entre el número de implantes y el número de cuerpos amarillos. También puede estimarse comparando los implantes totales por hembra en los grupos tratado y testigo.

Pérdidas tras la implantación: Relación del número de implantes muertos en el grupo tratado comparada con la relación entre los implantes muertos y el total de implantes del grupo testigo.

Producto problema: Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

UVCB: Sustancias químicas de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción y materiales biológicos.

Apéndice 2

CRONOLOGÍA DE LA ESPERMATOGÉNESIS EN LOS MAMÍFEROS

Image 1

Figura 1 Comparación de la duración (en días) de desarrollo de las células germinales masculinas en ratones, ratas y hombres. Durante los períodos indicados con sombreado no se produce reparación del ADN.

Arriba se muestra un esquema de la espermatogénesis en ratones, ratas y hombres (tomado de Adler, 1996). Entre los espermatogonios sin diferenciar se incluyen los espermatogonios de tipo A sencillos; de tipo A emparejados; y de tipo A alineados (Hess & de Franca, 2008). Los espermatogonios de tipo A sencillos se consideran como las verdaderas células precursoras; por tanto, para evaluar los efectos en las células precursoras, deben pasar al menos 49 días (en el ratón) entre la última inyección de la sustancia problema y el apareamiento.

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»

4)

En la parte B, el capítulo B.23 se sustituye por el texto siguiente:

«B.23   ENSAYO DE ABERRACIONES CROMOSÓMICAS EN ESPERMATOGONIOS DE MAMÍFERO

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) 483 de la OCDE (2016). Los métodos de ensayo se revisan periódicamente a la luz del progreso científico, los cambios en las necesidades normativas y las consideraciones relativas al bienestar animal. La presente versión modificada del método de ensayo refleja muchos años de experiencia con este ensayo y la posibilidad de integrar o combinar este ensayo con otros ensayos de toxicidad o genotoxicidad. La combinación de estudios de toxicidad tiene la posibilidad de reducir el número de animales utilizados en los ensayos de toxicidad. El presente método forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. La OCDE ha elaborado un documento que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a las directrices de ensayo de la OCDE sobre toxicidad genética (1).

2.

El ensayo de aberraciones cromosómicas en espermatogonios de mamífero in vivo tiene por objeto detectar los productos que provocan aberraciones cromosómicas estructurales en espermatogonios de mamífero (2) (3) (4). Además, este ensayo es pertinente para evaluar la genotoxicidad porque, aunque pueden variar entre las especies, los factores del metabolismo in vivo, de la farmacocinética y de los procesos de reparación del ADN están activos y contribuyen a la respuesta. El presente método de ensayo no está diseñado para medir las anomalías numéricas; el ensayo no se utiliza normalmente con este objetivo.

3.

Este ensayo mide las aberraciones cromosómicas estructurales (tanto de tipo cromosoma como de tipo cromátida) en los espermatogonios en fase de división, por lo que se espera que sirva para predecir la inducción de mutaciones hereditarias en estas células germinales.

4.

Las definiciones de los términos clave figuran en el apéndice.

CONSIDERACIONES INICIALES

5.

En este ensayo se utilizan habitualmente roedores, pero en algunos casos pueden ser adecuadas otras especies, si está justificado científicamente. Las preparaciones citogenéticas normales de testículos de roedor generan metafases mitóticas (espermatogonios) y meióticas (espermatocitos). Las metafases mitóticas y meióticas se identifican sobre la base de la morfología de los cromosomas (4). Este ensayo citogenético in vivo detecta las aberraciones cromosómicas en las mitosis de los espermatogonios. El presente método de ensayo no se refiere a otras células diana.

6.

Para detectar las aberraciones de tipo cromátida en espermatogonios, hay que examinar la primera división celular mitótica tras el tratamiento, antes de que estas aberraciones se conviertan en aberraciones de tipo cromosoma en las divisiones celulares posteriores. Puede obtenerse información adicional de los espermatocitos tratados, mediante análisis cromosómico meiótico, en relación con las aberraciones estructurales cromosómicas en diacinesia-metafase I y metafase II.

7.

Existen varias generaciones de espermatogonios presentes en el testículo (5), y estos distintos tipos de células germinales pueden tener todo un espectro de sensibilidad al tratamiento con el producto. Por lo tanto, las aberraciones detectadas representan una respuesta global de las poblaciones de espermatogonios tratados. La mayoría de las células mitóticas presentes en las preparaciones de los testículos son espermatogonios B, que tienen un ciclo celular de 26 horas aproximadamente (3).

8.

No procede utilizar este ensayo si hay pruebas de que el producto problema, o sus metabolitos, no llegan a los testículos.

PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO

9.

En general, los animales se exponen al producto problema por una vía adecuada y se sacrifican de forma compasiva, en momentos adecuados después del tratamiento. Antes de sacrificarlos, se tratan con un agente que detenga la división celular en la metafase (por ejemplo, colchicina o Colcemid®). A continuación, se realizan preparaciones de cromosomas de células germinales y se tiñen, tras lo cual se analizan las células en metafase para detectar aberraciones cromosómicas.

VERIFICACIÓN DE LA COMPETENCIA DEL LABORATORIO

10.

La competencia en este ensayo debe establecerse demostrando la capacidad de reproducir los resultados previstos en cuanto a las frecuencias de las aberraciones cromosómicas estructurales en espermatogonios con sustancias testigo positivo (incluidas las respuestas débiles), como las que figuran en el cuadro 1, y obteniendo frecuencias con testigos negativos compatibles con un intervalo aceptable de datos de testigos en la bibliografía publicada [p. ej., (2) (3) (6) (7) (8) (9) (10)] o con la distribución histórica de testigos del laboratorio, si se dispone de ella.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Preparaciones

Selección de la especie animal

11.

Deben usarse animales adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. Se utilizan normalmente ratones macho; no obstante, pueden utilizarse machos de otras especies adecuadas de mamíferos cuando esté científicamente justificado y para permitir que este ensayo se lleve a cabo conjuntamente con otro método de ensayo. Debe facilitarse en el informe la justificación científica de la utilización de especies distintas de las de roedores.

Condiciones de alojamiento y alimentación de los animales

12.

En el caso de los roedores, la temperatura en el local de los animales debe ser de 22 °C (± 3 °C). La humedad relativa debe ser idealmente del 50-60 %, como mínimo del 40 % y preferentemente no superior al 70 %, salvo durante la limpieza del local. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La elección de la dieta puede verse influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente del producto problema si se administra por esta vía. Hay que alojar a los roedores en grupos pequeños (no más de cinco animales por jaula) si no se esperan comportamientos agresivos, preferiblemente en jaulas de suelo continuo con un enriquecimiento ambiental adecuado. Los animales pueden alojarse individualmente si está científicamente justificado.

Preparación de los animales

13.

Se utilizan normalmente animales machos sanos, adultos jóvenes (8-12 semanas de edad al inicio del tratamiento) y se asignan aleatoriamente a los grupos testigo y de tratamiento. Los animales se identifican individualmente utilizando un método compasivo y mínimamente invasivo (por ejemplo, mediante anillamiento, marcado, implantación de un microchip o identificación biométrica, pero no grapado a las orejas o los dedos), y se deja que se acostumbren a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días. Las jaulas se deben disponer de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Debe evitarse la contaminación cruzada con el testigo positivo y el producto problema. Al empezar el estudio, la variación de peso entre los distintos animales ha de ser mínima y no debe exceder del ± 20 %.

Preparación de las dosis

14.

Los productos problema sólidos deben disolverse o suspenderse en disolventes o vehículos adecuados, o mezclarse con la dieta o con el agua de bebida, antes de su administración a los animales. Los productos problema líquidos pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administración. En caso de exposición por inhalación, los productos problema pueden administrarse en forma de gas, vapor o aerosol sólido/líquido, dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas. Deben utilizarse preparaciones recientes del producto problema, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación y definan las condiciones adecuadas de esta.

Condiciones de ensayo — disolvente/vehículo

15.

El disolvente o vehículo no debe producir efectos tóxicos a las dosis empleadas, y no debe ser capaz de reaccionar químicamente con los productos problema. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información de referencia que avale su compatibilidad. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso. Pueden citarse como ejemplos comúnmente utilizados de disolventes o vehículos compatibles el agua, el suero fisiológico, la solución de metilcelulosa, la solución de sal sódica de carboximetilcelulosa, el aceite de oliva y el aceite de maíz. A falta de información histórica o publicada sobre testigos que demuestre que un disolvente o vehículo elegido atípico no induce ninguna aberración cromosómica estructural ni otro tipo de efectos nocivos, debe realizarse un estudio inicial a fin de establecer la aceptabilidad del control del disolvente/vehículo.

Testigos positivos

16.

Deben utilizarse siempre animales testigo positivo en paralelo, a menos que el laboratorio haya demostrado su competencia en la realización del ensayo y haya utilizado este de forma sistemática en los últimos años (por ejemplo, en los últimos 5 años). Si no se incluye un grupo testigo positivo en paralelo, debe contarse en cada experimento con testigos de examen (portaobjetos fijados y sin teñir). Esto puede conseguirse incluyendo en el examen del estudio muestras de referencias adecuadas que se hayan obtenido y conservado a partir de un experimento con testigo positivo aparte realizado periódicamente (por ejemplo, cada 6 o 18 meses) en el laboratorio donde se realiza el ensayo; por ejemplo, durante las pruebas de competencia y, a continuación, con carácter periódico, en caso necesario.

17.

Las sustancias utilizadas como testigo positivo deben provocar con fiabilidad un aumento detectable en las frecuencias de aparición de células con aberraciones cromosómicas estructurales respecto al nivel espontáneo. Las dosis del testigo positivo deben elegirse de tal forma que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al examinador la identidad de las muestras codificadas. En el cuadro 1 se incluyen ejemplos de sustancias válidas como testigo positivo.

Cuadro 1

Ejemplos de sustancias testigo positivo

Sustancias [N.o CAS] (n.o de referencia)

Ciclofosfamida (monohidrato) [n.o CAS 50-18-0 (n.o CAS 6055-19-2)] (9)

Ciclohexilamina [n.o CAS 108-91-8] (7)

Mitomicina C [n.o CAS 50-07-7] (6)

Acrilamida monomérica [n.o CAS 79-06-1] (10)

Trietilenomelamina [n.o CAS 51-18-3] (8)

Testigos negativos

18.

Respecto a cada tiempo de muestreo deben incluirse animales testigo negativo, tratados únicamente con el disolvente o vehículo, y tratados en lo demás de la misma manera que los grupos de tratamiento. Si no se tienen datos de testigos, históricos o publicados, que indiquen que el disolvente/vehículo elegido no induce ninguna aberración cromosómica ni otros efectos nocivos, deben incluirse también respecto a cada momento de muestreo animales testigo sin tratar, a fin de establecer que es aceptable el control del vehículo.

PROCEDIMIENTO

Número de animales

19.

Los tamaños de los grupos en el momento del inicio del estudio deben establecerse con el objetivo de proporcionar un mínimo de 5 machos por grupo. Se considera que este número de animales por grupo es suficiente para proporcionar una potencia estadística adecuada (es decir, que puede detectarse en general, como mínimo, una duplicación de la frecuencia de las aberraciones cromosómicas cuando el nivel del testigo negativo es igual o superior al 1,0 % con una probabilidad del 80 %, con un nivel de significación de 0,05) (3) (11). Como orientación sobre las necesidades máximas típicas de animales, un estudio con dos momentos de muestreo con tres grupos tratados y un grupo testigo negativo en paralelo, más un grupo testigo positivo (cada grupo compuesto por cinco animales), requeriría 45 animales.

Pauta de tratamiento

20.

Los productos problema suelen administrarse una sola vez (es decir, como un único tratamiento); pueden utilizarse otras posologías, siempre que estén científicamente justificadas.

21.

En el lote al que se ha administrado la dosis máxima se toman muestras en dos momentos tras el tratamiento. Dado que el tiempo necesario para que el producto o productos problema se absorban y se metabolicen, así como su efecto sobre la cinética del ciclo celular, pueden modificar el momento óptimo para detectar aberraciones cromosómicas, se recomienda un momento de muestreo temprano y otro tardío, a las 24 y 48 horas después del tratamiento. En relación con dosis distintas de la dosis más alta, debe hacerse un muestreo temprano a las 24 horas después del tratamiento (menos o igual que el tiempo del ciclo celular de los espermatogonios B, optimizando así la probabilidad de examinar las primeras metafases posteriores al tratamiento), a menos que se sepa que otro momento de muestreo es más adecuado y está justificado.

22.

Pueden utilizarse otros momentos de muestreo. Por ejemplo, en el caso de productos que ejercen efectos independientes de la fase S, pueden ser adecuados momentos de muestreo anteriores (es decir, inferiores a 24 horas).

23.

Puede utilizarse una pauta de administración repetida, por ejemplo en conjunción con un ensayo sobre otro parámetro que utilice un período de administración de 28 días (p. ej., el método B.58); sin embargo, se necesitarían grupos adicionales de animales para aplicar los diferentes tiempos de muestreo. Por consiguiente, la idoneidad de dicha pauta debe justificarse científicamente caso por caso.

24.

Antes de sacrificar los animales, se les inyecta por vía intraperitoneal una dosis adecuada de una sustancia que detenga la división celular en la metafase (por ejemplo, Colcemid® o colchicina). Se toman posteriormente muestras de los animales, a un intervalo adecuado. En el caso de los ratones y las ratas, este intervalo es de 3 a 5 horas aproximadamente.

Dosis

25.

Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación del intervalo porque no se dispone antes de datos adecuados para ayudar en la selección de las dosis, dicho estudio ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y pauta de tratamiento que se vayan a utilizar en el estudio principal, según las recomendaciones para la realización de estudios de determinación del intervalo (12). Este estudio debe tratar de determinar la dosis máxima tolerada (DMT), definida como la dosis que induce efectos ligeramente tóxicos con respecto a la duración del período de estudio (por ejemplo, comportamiento o reacciones de tipo anormal, pequeña pérdida de peso corporal o citotoxicidad para el sistema hematopoyético), pero sin llegar a provocar la muerte ni signos de dolor, sufrimiento o angustia que hagan necesaria la eutanasia (13).

26.

La dosis máxima también puede definirse como la dosis que produce algún signo de toxicidad en los espermatogonios (por ejemplo, disminución de la proporción entre el número de mitosis de los espermatogonios y el número de metafases meióticas primera y segunda); la disminución no ha de ser superior al 50 %.

27.

Los productos que tienen actividades biológicas específicas a dosis bajas no tóxicas (tales como las hormonas y los mitógenos) y los productos que presentan saturación de las propiedades toxicocinéticas pueden constituir excepciones de los criterios de establecimiento de las dosis y deben evaluarse caso por caso.

28.

A fin de obtener información sobre la relación dosis-respuesta, los estudios completos deben incluir un grupo testigo negativo (punto 18) y un mínimo de tres dosis separadas por un factor que será en general de 2 y nunca superior a 4. Si el producto problema no produce toxicidad en un estudio de determinación del intervalo o según los datos disponibles, la dosis más alta para una administración única debe ser de 2 000 mg/kg de peso corporal. No obstante, si el producto problema provoca toxicidad, la DMT debe ser la mayor dosis administrada y las dosis deben abarcar preferentemente el intervalo desde la dosis máxima hasta una dosis que provoque toxicidad escasa o nula. Si se observa toxicidad para el tejido diana (es decir, el testículo) a todas las dosis utilizadas en el ensayo, se recomienda hacer otro estudio a dosis no tóxicas. Unos estudios destinados a caracterizar de forma más completa la relación cuantitativa dosis-respuesta pueden necesitar más grupos de dosis. Estos límites pueden variar con determinados tipos de productos problema (por ejemplo, productos farmacéuticos de uso humano) a los que se apliquen requisitos específicos. Si el producto problema produce toxicidad, debe seleccionarse la dosis límite más dos dosis más bajas (según lo descrito anteriormente). La dosis límite para un período de administración de 14 días o más es de 1 000 mg/kg de peso corporal/día y, si se trata de períodos de administración de menos de 14 días, la dosis límite será de 2 000 mg/kg peso corporal/día.

Administración de las dosis

29.

A la hora de diseñar el ensayo, debe tenerse en cuenta la vía prevista de exposición humana. Por lo tanto, cuando esté justificado, podrán elegirse vías de exposición como los alimentos, el agua de bebida, la tópica, la subcutánea, la intravenosa, la oral forzada (por sonda), la inhalación o la implantación. En cualquier caso, la vía debe elegirse de forma que se garantice una exposición adecuada del tejido diana. Normalmente, no se recomienda la inyección intraperitoneal, a no ser que esté justificada científicamente, ya que, por lo general, no se trata de una vía fisiológicamente pertinente de exposición humana. Si el producto problema se mezcla con los alimentos o el agua de bebida, en particular en caso de administración única, debe procurarse que el plazo entre el consumo de los alimentos o el agua y el muestreo sea suficiente para permitir la detección de los efectos (véase el punto 33). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez por vía oral forzada o por inyección depende del tamaño del animal utilizado. Dicho volumen no debe superar normalmente 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a un máximo de 2 ml/100 g de peso corporal. Si se utilizan volúmenes superiores a estos (en caso de que lo permita la legislación sobre bienestar animal), debe justificarse. La variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concentración, para garantizar un volumen constante en relación con el peso corporal en todas las dosis.

Observaciones

30.

Deben hacerse observaciones clínicas generales de los animales de ensayo y registrarse los signos clínicos al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora u horas cada día y teniendo en cuenta el período de mayor intensidad de los efectos previstos tras la administración. Al menos dos veces al día, se debe observar la posible morbilidad y mortalidad de todos los animales. Deben pesarse todos los animales al principio del estudio, al menos una vez por semana durante los estudios de administración continuada, y en el momento del sacrificio. En los estudios de al menos una semana de duración, el consumo de alimentos debe medirse al menos semanalmente. Si el producto problema se administra con el agua de bebida, debe medirse el consumo de agua cada vez que se cambie esta y al menos una vez por semana. Los animales que presenten signos de toxicidad excesiva pero no letal deben sacrificarse antes de que termine el período del ensayo (13).

Preparación de los cromosomas

31.

Inmediatamente después del sacrificio, se obtienen suspensiones de células germinales de uno o de ambos testículos, se exponen a una solución hipotónica y se fijan según protocolos establecidos [p. ej., (2) (14) (15)]. A continuación, se extienden las células en portaobjetos y se tiñen (16) (17). Todos los portaobjetos se codifican de manera que el examinador no conozca su identidad.

Examen

32.

Deben examinarse al menos 200 metafases bien extendidas de cada animal (3) (11). Si la frecuencia histórica de los testigos negativos es < 1 %, debe evaluarse más de 200 células/animal para aumentar la potencia estadística (3). Deben utilizarse métodos de tinción que permitan la identificación del centrómero.

33.

Las aberraciones de tipo cromosoma y de tipo cromátida deben registrarse por separado y clasificarse en subtipos (roturas, intercambios). Las separaciones se registrarán, pero no se tendrán en cuenta para determinar si un producto induce un aumento significativo de la incidencia de células con aberraciones cromosómicas. Los procedimientos utilizados en el laboratorio deben garantizar que el análisis de las aberraciones cromosómicas es realizado por examinadores bien formados. Reconociendo que los métodos de preparación de los portaobjetos provocan con frecuencia la rotura de células en metafase y la consiguiente pérdida de cromosomas, las células examinadas deben, por tanto, contener un número de centrómeros no inferior a 2n ± 2, donde n es el número de cromosomas haploides de la especie.

34.

Aunque la finalidad del ensayo es detectar aberraciones cromosómicas estructurales, es importante registrar las frecuencias de las células poliploides y las células con cromosomas endorreduplicados cuando se observan estos hechos (véase el punto 44).

DATOS E INFORME

Tratamiento de los resultados

35.

Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de cuadro. Se determinará respecto a cada animal el número de células con aberraciones cromosómicas estructurales y el número de aberraciones cromosómicas por célula. Las aberraciones de tipo cromosoma y de tipo cromátida, clasificadas por subtipos (roturas, intercambios), deben enumerarse por separado con su número y frecuencia en relación con los grupos experimentales y testigos. Las separaciones (gaps) se registran por separado. La frecuencia de las separaciones se recoge en el informe, pero por lo general no se incluye en el análisis de la frecuencia total de aberraciones cromosómicas estructurales. Se recoge en el informe el porcentaje de poliploidía y de células con cromosomas endorreduplicados, cuando se observan.

36.

Deben indicarse los datos sobre toxicidad y signos clínicos (según el punto 30).

Criterios de aceptabilidad

37.

Los siguientes criterios determinan la aceptabilidad de un ensayo.

El testigo negativo en paralelo es coherente con los niveles publicados de los datos históricos de los testigos negativos, de los que generalmente se espera que presenten una proporción de células que hayan sufrido aberraciones cromosómicas > 0 % y ≤ 1,5 %, y con los datos de testigos históricos del laboratorio, si estos están disponibles (véanse los puntos 10 y 18).

Los testigos positivos en paralelo inducen respuestas coherentes con las normas publicadas sobre los datos históricos de los testigos positivos, o con la base de datos de testigos históricos positivos del laboratorio, si estos están disponibles, y producen un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo (véanse los puntos 17 y 18).

Se han analizado números apropiados de células y de dosis (véanse los puntos 28 y 32).

Los criterios para la selección de la dosis más elevada son coherentes con los descritos en los puntos 25 y 26.

38.

Si se observan tanto mitosis como meiosis, debe determinarse la proporción entre las mitosis de los espermatogonios y las metafases meióticas primera y segunda, como medida de la citotoxicidad para todos los animales tratados y testigo negativo, en una muestra total de 100 células en división por animal. Si se observan mitosis únicamente, se determinará el índice mitótico al menos en 1 000 células por animal.

Evaluación e interpretación de los resultados

39.

Deben analizarse al menos tres grupos tratados con el producto problema a fin de obtener datos suficientes para el análisis de la relación dosis-respuesta.

40.

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si:

al menos una de las dosis de ensayo produce un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo;

el aumento está relacionado con la dosis al menos en un momento de muestreo; y

alguno de los resultados está fuera del intervalo aceptable de los datos de los testigos negativos, o de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos del laboratorio (p. ej., límite del control del 95 % según la distribución de Poisson), si están disponibles.

El producto problema se considera entonces capaz de inducir aberraciones cromosómicas en los espermatogonios de los animales de ensayo. En la bibliografía se encuentran también recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (11) (18). Las pruebas estadísticas utilizadas deben considerar como unidad experimental al animal.

41.

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si:

ninguna de las dosis de ensayo presenta un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo;

no hay ningún aumento relacionado con la dosis en ninguna de las condiciones experimentales; y

todos los resultados están dentro del intervalo aceptable de los datos de los testigos negativos, o de los datos históricos de los testigos negativos del laboratorio (p. ej., límite del control del 95 % según la distribución de Poisson), si están disponibles.

El producto problema se considera entonces incapaz de inducir aberraciones cromosómicas en los espermatogonios de los animales de ensayo. En la bibliografía se encuentran también recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (11) (18). Un resultado negativo no excluye la posibilidad de que el producto pueda inducir aberraciones cromosómicas en fases de desarrollo posteriores no estudiadas, o mutaciones génicas.

42.

No se requiere ninguna verificación de una respuesta positiva clara o negativa clara.

43.

Si la respuesta no es claramente negativa o positiva, y para ayudar a determinar la pertinencia biológica de un resultado (p. ej., un incremento débil o dudoso), los datos deben ser evaluados por expertos o mediante otras investigaciones utilizando los datos experimentales existentes, como la consideración de si el resultado positivo se encuentra fuera del intervalo aceptable de datos de los testigos negativos o de los datos históricos de los testigos negativos del laboratorio (19).

44.

En casos raros, incluso después de hacer más investigaciones, el conjunto de datos puede no permitir que se extraiga una conclusión de resultado positivo o negativo, por lo que se considerará dudoso.

45.

El aumento del número de células poliploides puede indicar que el producto problema es capaz de inhibir procesos mitóticos y de inducir aberraciones cromosómicas numéricas (20). Un aumento del número de células con cromosomas endorreduplicados puede indicar que el producto problema es capaz de inhibir el progreso del ciclo celular (21) (22), que es un mecanismo de inducir alteraciones cromosómicas numéricas diferente de la inhibición de procesos mitóticos (véase el punto 2). Por consiguiente, deben consignarse por separado la incidencia de células poliploides y de células con cromosomas endorreduplicados.

Informe del ensayo

46.

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

 

Resumen.

 

Producto problema:

origen, número de lote, fecha límite de utilización, si se conocen;

estabilidad del producto problema en sí, si se conoce;

solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente, si se conocen;

medición del pH, osmolalidad y precipitado en el medio de cultivo al que se ha añadido el producto problema, según proceda.

 

Sustancias de un solo componente:

aspecto físico, hidrosolubilidad y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes;

identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, notación SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas si procede y es viable en la práctica, etc.

 

Sustancias de componentes múltiples, UVCB y mezclas:

deben caracterizarse en la medida de lo posible por la identidad química (véase más arriba), la cantidad en que están presentes y las propiedades fisicoquímicas pertinentes de sus componentes.

 

Preparación del producto problema:

justificación de la elección del vehículo;

solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente o vehículo.

preparación de formulaciones para la administración con los alimentos, con el agua de bebida o por inhalación;

determinaciones analíticas de las formulaciones (por ejemplo, estabilidad, homogeneidad, concentraciones nominales) si se realizan.

 

Animales de ensayo:

especie y cepa utilizadas y justificación de su utilización;

número y edad de los animales;

origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc.;

método para la identificación individual de los animales;

en el caso de estudios a corto plazo: peso individual de los animales al inicio y al final del ensayo; en el caso de estudios de duración superior a una semana: pesos corporales individuales durante el estudio y consumo de alimentos. Deben incluirse el intervalo, la media y la desviación típica de los pesos corporales de cada grupo.

 

Condiciones del ensayo:

datos de los testigos positivos y negativos (vehículo o disolvente);

datos del estudio de determinación del intervalo, si se ha llevado a cabo;

justificación de la selección de las dosis;

justificación de la elección de la vía de administración;

datos de la preparación del producto problema;

datos sobre la administración del producto problema;

fundamento de la elección del momento del sacrificio;

métodos de determinación de la toxicidad para los animales, incluidos los eventuales análisis histopatológicos o hematológicos, y frecuencia con que se han medido los pesos corporales y se han realizado las observaciones de los animales;

métodos de comprobación de que el producto problema ha alcanzado el tejido diana, o la circulación general, si se obtienen resultados negativos;

dosis reales (mg/kg peso corporal/día) calculadas a partir del consumo y de la concentración (ppm) del producto problema en los alimentos o en el agua de bebida, en su caso;

datos de la calidad de los alimentos y el agua;

descripción detallada de las pautas de tratamiento y muestreo y justificación de las decisiones;

método de sacrificio;

método de analgesia (en su caso);

procedimientos para aislar los tejidos;

identidad del producto que detiene la división celular en la metafase, concentración empleada y duración del tratamiento,

métodos de preparación de los portaobjetos;

criterios de examen de las aberraciones;

número de células analizadas por animal;

criterios empleados para considerar que los estudios son positivos, negativos o dudosos.

 

Resultados:

estado de los animales antes del ensayo y a lo largo de este, incluidos los signos de toxicidad;

peso corporal y de los órganos en el momento del sacrificio (si se emplean varios tratamientos, pesos corporales tomados durante la pauta de tratamiento);

signos de toxicidad;

índice mitótico;

relación entre el número de espermatogonios con mitosis y el número de metafases meióticas primera y segunda, u otras pruebas de exposición del tejido diana;

tipo y número de aberraciones observadas en cada animal por separado;

número total de aberraciones por grupo, con medias y desviaciones típicas;

número de células con aberraciones por grupo, con medias y desviaciones típicas;

relación dosis-respuesta, cuando sea posible;

análisis estadísticos y métodos aplicados;

datos de los testigos negativos en paralelo;

datos históricos de testigos negativos, con intervalos, medias, desviaciones típicas y un intervalo de confianza del 95 % (en su caso), o datos históricos de los testigos negativos históricos publicados utilizados para determinar la aceptabilidad de los resultados de los ensayos;

datos sobre los testigos positivos en paralelo;

variaciones de la ploidía, en su caso, incluidas las frecuencias de poliploidía y/o de células endorreduplicadas.

 

Discusión de los resultados

 

Conclusión

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Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Apéndice

DEFINICIONES

Aneuploidía: Desviación respecto al número diploide (o haploide) normal de cromosomas que afecta a uno o varios cromosomas, pero no a dotaciones completas de cromosomas (poliploidía).

Centrómero: Región o regiones de un cromosoma con las que se asocian las fibras del huso acromático durante la división celular para permitir el movimiento ordenado de los cromosomas hijos hacia los polos de las células hijas.

Producto: Sustancia o mezcla.

Diversidad de los cromosomas: Diversidad de las formas (p. ej., metacéntricos, acrocéntricos, etc.) y tamaños de los cromosomas.

Aberración de tipo cromátida: Lesión cromosómica estructural que consiste en la rotura de cromátidas solas o en la rotura y reunión entre cromátidas.

Aberración de tipo cromosoma: Lesión cromosómica estructural que consiste en la rotura, o en la rotura y reunión, de ambas cromátidas en el mismo sitio.

Clastógeno: Producto que provoca aberraciones cromosómicas estructurales en poblaciones de células u organismos.

Separación (gap): Lesión acromática más estrecha que la anchura de una cromátida, y con alteración mínima de la alineación de las cromátidas.

Genotoxicidad: Término general que engloba todos los tipos de lesión del ADN o de los cromosomas, con inclusión de roturas, deleciones, aductos, modificaciones y uniones de nucleótidos, reorganizaciones, mutaciones, aberraciones cromosómicas y aneuploidía. No todos los tipos de efectos genotóxicos resultan en mutaciones o en lesiones cromosómicas estables.

Índice mitótico (IM): Relación entre el número de células en metafase y el número total de células observadas en una población celular; indica el grado de proliferación de dicha población.

Mitosis: División del núcleo celular, generalmente compuesta por profase, prometafase, metafase, anafase y telofase.

Mutágeno: Agente que provoca un cambio hereditario en una o varias secuencias de pares de bases del ADN en los genes o en la estructura de los cromosomas (aberraciones cromosómicas).

Anomalía numérica: Cambio del número de cromosomas respecto al número normal característico de los animales empleados.

Poliploidía: Múltiplo del número cromosómico haploide (n) superior al diploide (3n, 4n, etc.).

Aberración estructural: Cambio de la estructura cromosómica detectable mediante examen microscópico de la metafase de la división celular, observado como deleciones y fragmentos, intercambios.

Producto problema: Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

UVCB: Sustancias químicas de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción y materiales biológicos.

»

5)

En la parte B, el capítulo B.40 se sustituye por el texto siguiente:

«B.40   CORROSIÓN CUTÁNEA IN VITRO: MÉTODO DE ENSAYO DE RESISTENCIA ELÉCTRICA TRANSCUTÁNEA (RET)

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) 430 de la OCDE (2015). La corrosión cutánea se refiere a la producción de una lesión irreversible en la piel, que se manifiesta como necrosis visible a través de la epidermis y que llega a la dermis, tras la aplicación de un producto problema [según la definición del Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos (SGA) de las Naciones Unidas (1) y del Reglamento (UE) n.o 1272/2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (CLP) de la Unión Europea (1)]. El presente método de ensayo B.40 actualizado establece un procedimiento in vitro que permite la identificación de sustancias y mezclas no corrosivas y corrosivas con arreglo al SGA de las Naciones Unidas (1) y al CLP.

2.

La evaluación de la corrosividad cutánea suele implicar el uso de animales de laboratorio (método B.4, equivalente a las directrices de ensayo TG 404 de la OCDE, adoptadas originalmente en 1981 y revisadas en 1992, 2002 y 2015) (2). Además del presente método de ensayo B.40, se han validado otros métodos de ensayo in vitro para detectar el potencial de corrosión cutánea de los productos químicos, y se han adoptado como método de ensayo B.40 bis (equivalente a las directrices de ensayo TG 431 de la OCDE) (3) y método de ensayo B.65 (equivalente a las directrices de ensayo TG 435 de la OCDE) (4), que también pueden identificar subcategorías de productos químicos corrosivos cuando sea necesario. Varios métodos de ensayo in vitro validados se han adoptado como método de ensayo B.46 (equivalente a las directrices de ensayo TG 439 de la OCDE) (5), para utilizarlo en el ensayo de irritación cutánea. Un documento de orientación sobre los enfoques integrados de ensayos y evaluación (IATA, Integrated Approaches to Testing and Assessment) describe varios módulos que agrupan diversas fuentes de información y herramientas de análisis, y i) aporta orientaciones sobre cómo integrar y utilizar los datos disponibles, tanto de ensayo como no experimentales, para la evaluación de la capacidad de irritación cutánea y de corrosión cutánea de los productos químicos, y ii) propone un enfoque cuando se precisan más ensayos (6).

3.

El presente método de ensayo se refiere al parámetro de salud humana denominado irritación cutánea. Se basa en el método de ensayo de la resistencia eléctrica transcutánea en piel de rata (RET), que utiliza discos de piel para detectar sustancias corrosivas por su capacidad de provocar una pérdida de la integridad y de la función de barrera del estrato córneo normal. Las directrices de ensayo correspondientes de la OCDE se adoptaron originalmente en 2004 y se actualizaron en 2015 para referirse al documento de orientación sobre los IATA.

4.

Para evaluar los ensayos de corrosión cutánea in vitro con fines normativos, se llevaron a cabo estudios de prevalidación (7), seguidos de un estudio formal de validación del método de ensayo RET con piel de rata para evaluar la corrosión cutánea (8) (9) (10) (11). El resultado de estos estudios llevó a la recomendación de que el método de ensayo RET (designado como el método de referencia validado, MRV) podía utilizarse con fines normativos para la evaluación de la corrosividad cutánea in vivo (12) (13) (14).

5.

Antes de que pueda utilizarse con fines normativos para evaluar la corrosión cutánea un método de ensayo RET in vitro similar o modificado distinto del MRV, deben determinarse su fiabilidad, pertinencia (exactitud) y limitaciones para el uso propuesto, a fin de garantizar su similitud con el MRV, de acuerdo con los requisitos de las normas de comportamiento (15). La aceptación mutua de datos por la OCDE solo se garantizará tras la revisión y la inclusión en las directrices de ensayo correspondientes de la OCDE de cualquier método de ensayo nuevo o actualizado propuesto.

DEFINICIONES

6.

En el apéndice se dan las definiciones utilizadas.

CONSIDERACIONES INICIALES

7.

Un estudio de validación (10) y otros estudios publicados (16) (17) han comunicado que el método de ensayo RET con piel de rata puede discriminar entre agentes conocidos corrosivos y no corrosivos para la piel, con una sensibilidad global del 94 % (51/54) y una especificidad del 71 % (48/68) en relación con una base de datos de 122 sustancias.

8.

El presente método de ensayo aborda la corrosión cutánea in vitro. Permite la identificación de productos problema no corrosivos y corrosivos, de conformidad con el SGA de las Naciones Unidas y del CLP. Una limitación de este método de ensayo, demostrada por los estudios de validación (8) (9) (10) (11), es que no permite la subcategorización de sustancias y mezclas corrosivas de acuerdo con el SGA de las Naciones Unidas y el CLP. El marco normativo aplicable determinará cómo se utilizará el presente método de ensayo. Aunque este no proporciona información adecuada sobre la irritación cutánea, cabe señalar que el método de ensayo B.46 aborda específicamente el aspecto de la irritación cutánea in vitro (5). Para una evaluación completa de los efectos cutáneos locales tras una exposición cutánea única, debe consultarse el documento de orientación de la OCDE sobre los IATA (6).

9.

Durante la validación en que se basa el presente método se ha sometido a ensayo una amplia variedad de productos químicos que representan principalmente sustancias, y la base de datos empíricos del estudio de validación contaba con 60 sustancias que cubrían una amplia gama de clases químicas (8) (9). Sobre la base del conjunto de datos disponibles, el método de ensayo es aplicable a una amplia gama de clases químicas y estados físicos, incluidos líquidos, semisólidos, sólidos y ceras. Sin embargo, dado que para ciertos estados físicos específicos no se dispone fácilmente de productos de ensayo con datos de referencia adecuados, hay que señalar que durante la validación se evaluó un número relativamente pequeño de ceras y de sólidos corrosivos. Los líquidos pueden ser acuosos o no acuosos; los sólidos pueden ser solubles o insolubles en agua. En los casos en que haya pruebas sobre la inaplicabilidad del método de ensayo a una determinada categoría de sustancias, el método no deberá utilizarse con tal categoría específica de sustancias. Además, se supone que este método de ensayo es aplicable a las mezclas como una extensión de su aplicabilidad a las sustancias. Sin embargo, debido al hecho de que las mezclas abarcan un amplio espectro de categorías y composiciones, y que actualmente se dispone de información solo limitada sobre los ensayos de mezclas, en los casos en los que pueda demostrarse la inaplicabilidad del método de ensayo a una determinada categoría de mezclas (por ejemplo, a raíz de una estrategia como la propuesta por Eskes et al., 2012) (18), el método no deberá utilizarse con tal categoría específica de mezclas. Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines normativos, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Dichas consideraciones no son necesarias cuando los requisitos normativos estipulan que la mezcla debe someterse a ensayo. Aún no se han efectuado estudios de validación de gases y aerosoles (8) (9). Aunque no hay que descartar que estos tipos de productos puedan estudiarse utilizando el método de ensayo RET, el método actual no permite ensayar gases ni aerosoles.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

10.

El producto problema se aplica durante un máximo de 24 horas en la superficie epidérmica de discos de piel en un sistema de ensayo bicompartimental, donde los discos hacen de separación entre los compartimentos. Los discos de piel se toman de ratas, sacrificadas de forma compasiva a los 28 o 30 días de edad. Las sustancias corrosivas se caracterizan por su capacidad de producir una pérdida de la integridad y de la función de barrera del estrato córneo normal, pérdida que se mide como reducción de la RET por debajo de un umbral (32). En relación con la RET de ratas, se ha elegido un valor límite de 5 kΩ basándose en muchos datos sobre una amplia gama de sustancias, de las que la gran mayoría presentaba unos valores claramente bien por encima (a menudo > 10 kΩ) o bien por debajo (a menudo < 3 kΩ) de este valor (16). Generalmente, los productos problema que no son corrosivos para los animales, tanto si son irritantes como si no, no reducen el valor de la RET por debajo de este límite. Por otra parte, el uso de otros preparados de piel o de otros equipos puede alterar el valor límite, lo que haría necesaria otra validación.

11.

Se incorpora al procedimiento una fase de fijación de colorante para confirmar los resultados positivos con la RET, incluidos los casos de valores próximos a 5 kΩ. La fase de fijación del colorante determina si el aumento de la permeabilidad iónica se debe a la destrucción física del estrato córneo. Se ha visto que el método RET con piel de rata sirve para predecir el valor de la corrosividad del conejo in vivo, evaluada según el método de ensayo B.4 (2).

DEMOSTRACIÓN DE LA COMPETENCIA

12.

Antes de proceder al uso sistemático del método de ensayo RET con piel de rata, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica mediante la correcta clasificación de las doce sustancias para la prueba de la competencia recomendadas en el cuadro 1. Cuando una sustancia de la lista no esté disponible o en casos justificados, podrá utilizarse otra sustancia sobre la que se disponga de datos adecuados de referencia in vivo e in vitro [por ejemplo, de la lista de productos de referencia (16)] siempre que se apliquen los mismos criterios de selección que los descritos en el cuadro 1.

Cuadro 1

Lista de sustancias para la prueba de la competencia  (2)

Sustancia

N.o CAS

Clase química (3)

Cat. según el SGA de las Naciones Unidas y del CLP basada en resultados in vivo  (4)

Cat. según los resultados del MRV in vitro  (4)

Estado físico

pH (5)

Corrosivos in vivo

N,N’-Dimetil-dipropilentriamina

10563-29-8

Base orgánica

1A

6 × C

L

8,3

1,2-Diaminopropano

78-90-0

Base orgánica

1A

6 × C

L

8,3

Ácido sulfúrico (10 %)

7664-93-9

Ácido inorgánico

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NC

L

1,2

Hidróxido de potasio (ac. al 10 %)

1310-58-3

Base inorgánica

(1A/)1B/1C

6 × C

L

13,2

Ácido octanoico (caprílico)

124-07-2

Ácido orgánico

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,6

2-terc-Butilfenol

88-18-6

Fenol

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,9

No corrosivos in vivo

Ácido isoesteárico

2724-58-5

Ácido orgánico

NC

6 × NC

L

3,6

4-Amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Base orgánica

NC

6 × NC

S

5,5

Bromuro de fenetilo

103-63-9

Electrófilo

NC

6 × NC

L

3,6

4-(Metiltio)-benzaldehído

3446-89-7

Electrófilo

NC

6 × NC

L

6,8

1,9-Decadieno

1647-16-1

Orgánico neutro

NC

6 × NC

L

3,9

Tetracloroetileno

127-18-4

Orgánico neutro

NC

6 × NC

L

4,5

Abreviaturas: ac = solución acuosa; N.o CAS = número de registro del Chemical Abstracts Service; MRV = método de referencia validado; C = corrosivo; NC = no corrosivo.

PROCEDIMIENTO

13.

Se dispone de procedimientos normalizados de trabajo (PNT) para el método de ensayo de corrosión cutánea RET con piel de rata (19). Los métodos de ensayo RET con piel de rata contemplados en el presente método de ensayo deben cumplir las condiciones siguientes:

Animales

14.

Deben utilizarse ratas porque la sensibilidad de su piel a las sustancias consideradas en el presente método de ensayo se ha demostrado previamente (12) y es la única fuente de piel que se ha validado oficialmente (8) (9). La edad (en el momento de tomar la piel) y la cepa de la rata son especialmente importantes para conseguir que los folículos pilosos estén en fase latente antes de que se inicie el crecimiento del pelo de los adultos.

15.

Se quita cuidadosamente con maquinilla pequeña el pelo dorsal y lateral de ratas jóvenes, de unos 22 días de edad, machos o hembras, de una cepa derivada de la Wistar o de otra comparable. A continuación se lavan los animales frotándolos cuidadosamente al mismo tiempo que se cubre la zona pelada con una solución antibiótica (que contenga, por ejemplo, estreptomicina, penicilina, cloranfenicol y anfotericina en concentraciones que sean eficaces para inhibir el crecimiento bacteriano). Los animales se vuelven a lavar con antibióticos al tercer o cuarto día después del primer lavado y se utilizan en el plazo de 3 días desde el segundo lavado, cuando el estrato córneo se ha recuperado de la eliminación del pelo.

Preparación de los discos de piel

16.

Los animales se sacrifican de forma compasiva cuando tienen entre 28 y 30 días de edad; esta edad es crítica. A continuación se retira la piel dorsolateral de cada animal y se le quita el exceso de grasa subcutánea, separando esta cuidadosamente de la piel. Se toman discos de piel de un diámetro aproximado de 20 mm. Puede guardarse la piel antes de utilizar los discos si se demuestra que los datos obtenidos con controles positivos y negativos son equivalentes a los obtenidos con piel fresca.

17.

Cada disco de piel se coloca sobre uno de los extremos de un tubo de PTFE (politetrafluoroetileno), comprobando que la superficie epidérmica esté en contacto con el mismo. Se coloca a presión un anillo de goma en el extremo del tubo para mantener la piel en su sitio y se recorta el tejido sobrante. Después se sella con cuidado el anillo de goma al extremo del tubo de PTFE con vaselina. El tubo se sujeta mediante una pinza de muelle dentro de una cámara receptora que contiene una solución de MgSO4 (154 mM) (figura 1). El disco de piel debe quedar totalmente sumergido en la solución de MgSO4. De la piel de una sola rata pueden obtenerse hasta 10 o 15 discos de piel. En la figura 2 se dan las dimensiones del anillo y del tubo.

18.

Antes del inicio de las pruebas, se mide la RET de dos discos de piel, como procedimiento de control de calidad de la piel de cada animal. El valor de la resistencia de ambos discos debe ser superior a 10 kΩ para que los discos restantes puedan utilizarse en el método de ensayo. Si el valor de la resistencia es inferior a 10 kΩ, hay que desechar los discos restantes de la misma piel.

Aplicación del producto problema y de las sustancias testigo

19.

En cada tanda (experimento) deben utilizarse a la vez testigos positivos y negativos para garantizar el comportamiento adecuado del modelo experimental. Deben utilizarse en cada tanda (experimento) discos de piel procedentes de un solo animal. Las sustancias testigo positivo y negativo que se proponen son ácido clorhídrico 10 M y agua destilada, respectivamente.

20.

En el caso de los productos problema líquidos, se aplican uniformemente a la superficie epidérmica dentro del tubo 150 μl. Cuando se prueban materias sólidas, se aplica uniformemente al disco una cantidad suficiente del sólido de tal manera que quede cubierta toda la superficie de la epidermis. A continuación se vierte encima del sólido agua desionizada (150 μl) y se agita suavemente el tubo. A fin de conseguir el contacto máximo con la piel, es posible que los sólidos deban calentarse a 30 °C para fundir o reblandecer el producto problema, o bien molerse para obtener polvo o material granuloso.

21.

Se utilizan tres discos de piel para cada producto problema y sustancia testigo en cada tanda (experimento) del ensayo. Los productos problema se aplican durante 24 horas a 20-23 °C. El producto problema se elimina lavando con un chorro de agua del grifo a temperatura ambiente hasta que no pueda eliminarse más material.

Mediciones de la RET

22.

La impedancia de la piel se mide como RET utilizando un puente de Wheatstone de baja tensión y de corriente alterna (18). Las especificaciones generales del puente son una tensión de funcionamiento de 1-3 V, una corriente alterna de forma sinusoidal o rectangular de 50 - 1 000 Hz, y un intervalo de medición como mínimo de 0,1 a -30 kΩ. El puente utilizado en el estudio de validación medía valores de inductancia, capacitancia y resistencia de hasta 2 000 H, 2 000 μF, y 2 MΩ, respectivamente, a frecuencias de 100 Hz o 1 kHz, utilizando montajes en serie o en paralelo. A efectos de la RET, las mediciones del ensayo de corrosividad se registran como resistencia, a la frecuencia de 100 Hz y utilizando montajes en serie. Antes de medir la resistencia eléctrica, se reduce la tensión superficial de la piel añadiendo un volumen de etanol al 70 % suficiente para cubrir la epidermis. Tras unos segundos se retira el etanol del tubo y después se hidrata el tejido aplicando 3 ml de una solución de MgSO4 (154 mM). Los electrodos del puente se colocan a ambos lados del disco de piel para medir la resistencia en kΩ/disco de piel (figura 1). En la figura 2 se dan las dimensiones de los electrodos y la longitud del electrodo expuesta por debajo de las pinzas de cocodrilo. La pinza que sujeta el electrodo interior se apoya encima del tubo de PTFE durante la medición de la resistencia para asegurarse de que es constante la longitud del electrodo que queda sumergida en la solución de MgSO4. El electrodo exterior se coloca dentro de la cámara receptora de manera que se apoye en el fondo de la misma. La distancia entre la pinza de muelle y el fondo del tubo de PTFE se ha de mantener constante (figura 2), ya que afecta al valor de la resistencia obtenido. Por tanto, la distancia entre el electrodo interior y el disco de piel debe ser constante y mínima (1-2 mm).

23.

Si el valor medido de la resistencia es superior a 20 kΩ, puede deberse a que haya restos del producto problema recubriendo la superficie epidérmica del disco de piel. Puede intentarse mejorar la eliminación de este recubrimiento, por ejemplo sellando el tubo de PTFE con el pulgar cubierto de un guante y agitándolo aproximadamente diez segundos; se descarta la solución de MgSO4 y se repite la medición de la resistencia con nuevo MgSO4.

24.

Las propiedades y dimensiones del instrumental y el procedimiento experimental utilizado pueden influir en los valores obtenidos de RET. El umbral de corrosión de 5 kΩ se ha determinado a partir de datos obtenidos con el instrumental y el procedimiento concretos descritos en el presente método. Si se modifican las condiciones del ensayo o se utiliza un instrumental diferente, es posible que deban aplicarse diferentes valores umbral y de los testigos. Por tanto, es necesario calibrar el método y los valores umbral de resistencia sometiendo a ensayo una serie de sustancias para la prueba de la competencia elegidas de entre las sustancias utilizadas en el estudio de validación (8) (9) o de clases químicas similares a las sustancias problema. En el cuadro 1 se indica una serie de sustancias adecuadas para la prueba de la competencia.

Métodos de fijación de colorante

25.

La exposición a determinados materiales no corrosivos puede dar lugar a una reducción de la resistencia por debajo del umbral de 5 kΩ por permitir el paso de iones a través del estrato córneo, reduciendo así la resistencia eléctrica (9). Por ejemplo, las sustancias orgánicas neutras y las que tienen propiedades tensoactivas (incluidos los detergentes, emulgentes y otros agentes tensoactivos) pueden eliminar lípidos cutáneos, lo que aumenta la permeabilidad de la barrera a los iones. Así pues, si los valores de RET obtenidos con tales productos están por debajo o cerca de 5 kΩ, sin que visualmente se aprecien lesiones en los discos de piel, deberá efectuarse una evaluación de la penetración de colorante en los tejidos tratado y testigo, a fin de determinar si los valores de RET obtenidos son resultado de un aumento de la permeabilidad de la piel o bien de la corrosión de esta (7) (9). En este último caso, si el estrato córneo está erosionado, el colorante sulforrodamina B aplicado a la superficie de la piel penetra rápidamente en el tejido subyacente y lo tiñe. Este colorante en particular es estable ante una amplia gama de sustancias y no se ve afectado por el procedimiento de extracción que se describe más abajo.

Aplicación y eliminación del colorante sulforrodamina B

26.

Tras la evaluación de la RET, se retira el sulfato de magnesio del tubo y se examina cuidadosamente la piel para detectar la presencia de lesiones evidentes. Si no hay ninguna lesión importante evidente (p. ej., una perforación), se aplican durante 2 horas en la superficie epidérmica de cada disco de piel 150 μl de una disolución al 10 % (p/v) en agua destilada del colorante sulforrodamina B (Acid Red 52; C.I. 45100; n.o CAS 3520-42-1). Después se lavan estos discos de piel con agua del grifo, durante unos 10 segundos y a temperatura no superior a la ambiente, para eliminar el exceso de colorante no fijado. Cada disco de piel se retira cuidadosamente del tubo de PTFE y se coloca en un frasco (por ejemplo, un frasco de cristal de centelleo de 20 ml) con agua desionizada (8 ml). Los frascos se agitan suavemente durante 5 minutos para eliminar los eventuales restos de colorante no fijado. Este procedimiento de aclarado se repite a continuación, después de lo cual se retiran losdiscos cutáneos y se colocan en frascos que contengan 5 ml de dodecilsulfato sódico (DSS) al 30 % (p/v) en agua destilada y se dejan incubar una noche a 60 °C.

27.

Después de la incubación, se retiran y desechan los discos de piel y la solución restante se centrifuga durante 8 minutos a 21 °C (fuerza centrífuga relativa ~175 × g). Luego, se diluye de 1 a 5 (v/v) [es decir, 1 ml + 4 ml] una alícuota de 1 ml del sobrenadante con dodecilsulfato sódico al 30 % (p/v) en agua destilada. Se mide la densidad óptica (DO) de la solución a 565 nm.

Cálculo del contenido de colorante

28.

El contenido en colorante sulforrodamina B por disco se calcula a partir de los valores de DO (9) (coeficiente de extinción molar del colorante sulforrodamina B a 565 nm = 8,7 × l04; peso molecular = 580). Se determina el contenido de colorante de cada disco de piel utilizando una curva de calibración adecuada, y después se calcula la media del contenido de colorante de las muestras paralelas.

Criterios de aceptabilidad

29.

Los resultados medios de la RET se aceptan a condición de que los valores de los testigos positivos y negativos correspondientes queden dentro de los intervalos aceptables para el método en el laboratorio de ensayo. Los intervalos aceptables de resistencia con el método y con el instrumental antes descritos se indican en el cuadro siguiente:

Testigo

Sustancia

Intervalo de resistencia (kΩ)

Positivo

Ácido clorhídrico 10 M

0,5 - 1,0

Negativo

Agua destilada

10 - 25

30.

Los resultados medios de fijación del colorante se aceptan a condición de que los valores de los testigos correspondientes queden dentro de los intervalos aceptables para el método. En el cuadro siguiente se dan los intervalos de contenido de colorante aceptables que se proponen para las sustancias testigo con el método y el instrumental antes descritos:

Testigo

Sustancia

Intervalo del contenido de colorante (μg/disco)

Positivo

Ácido clorhídrico 10 M

40 - 100

Negativo

Agua destilada

15 - 35

Interpretación de los resultados

31.

El valor límite de la RET que separa los productos corrosivos de los no corrosivos se estableció durante la optimización del método de ensayo, se sometió a prueba durante una fase de validación previa y se confirmó en un estudio formal de validación.

32.

A continuación se recoge el modelo de predicción del método de ensayo RET de corrosión cutánea con piel de rata (9) (19), asociado al sistema de clasificación SGA de las Naciones Unidas y del CLP:

Se considera que el producto problema no es corrosivo para la piel:

i)

si el valor medio de RET que se ha obtenido con el producto problema es superior a (>) 5 kΩ, o

ii)

si el valor medio de RET que se ha obtenido con el producto problema es inferior o igual a (≤) 5 kΩ, y

los discos de piel no presentan lesiones evidentes (por ejemplo, una perforación), y

el contenido medio de colorante del disco es inferior (<) al contenido medio de colorante del disco del testigo positivo de HCl 10 M obtenido en paralelo (véase el punto 30 respecto a los valores de los testigos positivos).

Se considera que el producto problema es corrosivo para la piel:

i)

si el valor medio de RET que se ha obtenido con el producto problema es inferior o igual a (≤) 5 kΩ y los discos de piel tienen lesiones evidentes (p. ej., están perforados), o

ii)

si el valor medio de RET que se ha obtenido con el producto problema es inferior o igual a (≤) 5 kΩ, y

los discos de piel no presentan lesiones evidentes (p. ej., una perforación), pero

el contenido medio de colorante del disco es superior o igual (≥) al contenido medio de colorante del disco del testigo positivo de HCl 10 M obtenido en paralelo (véase el punto 30 respecto a los valores de los testigos positivos).

33.

Una sola tanda (experimento) del ensayo, formada por al menos tres réplicas de discos de piel, debería ser suficiente para un producto problema, si la clasificación es clara. Sin embargo, en caso de resultados dudosos, como el de mediciones no concordantes de las réplicas o el de una RET media igual a 5 ± 0,5 kΩ, debe plantearse la conveniencia de efectuar una segunda tanda (experimento), así como una tercera en caso de resultados discordantes entre las dos primeras tandas (experimentos).

DATOS E INFORME

Datos

34.

Deben indicarse en un cuadro los valores de resistencia (kΩ) y los valores de contenido de colorante (μg/disco), en su caso, correspondientes al producto problema, así como a los testigos positivos y negativos, incluyendo los datos de cada réplica de los discos en cada tanda (experimento) del ensayo y los valores medios ± DT. Deben recogerse en el informe todos los experimentos repetidos. Se deben notificar las lesiones observadas en los discos de piel en relación con cada producto problema.

Informe del ensayo

35.

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

 

Producto problema y sustancias testigo:

Sustancias de un solo componente: identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, notación SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas si procede y es viable en la práctica, etc.;

Sustancias de componentes múltiples, sustancias UVCB y mezclas: deben caracterizarse en la medida de lo posible por la identidad química (véase el guion anterior), la cantidad en que están presentes y las propiedades fisicoquímicas pertinentes de sus componentes;

Aspecto físico, hidrosolubilidad y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes;

Origen; número de lote, si está disponible;

Tratamiento del producto problema / sustancia testigo antes del ensayo, en su caso (p. ej., calentamiento, trituración);

Estabilidad del producto problema, fecha límite de utilización, o fecha para nuevo análisis, si se conoce;

Condiciones de conservación.

 

Animales de ensayo:

Cepa y sexo utilizados;

Edad de los animales cuando se utilizan como donantes;

Origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc.;

Datos de la preparación de la piel.

 

Condiciones de ensayo:

Curvas de calibración del instrumental del ensayo;

Curvas de calibración sobre el comportamiento del ensayo de fijación de colorante, ancho de banda utilizado para medir los valores de DO, e intervalo de linealidad de la DO del dispositivo de medición (p. ej., espectrofotómetro), si procede;

Datos del procedimiento utilizado para las mediciones de la RET;

Datos del procedimiento utilizado para la evaluación de la fijación de colorante, en su caso;

Dosis utilizadas en el ensayo, duración del período o períodos de exposición y temperatura o temperaturas de exposición;

Datos sobre el procedimiento de lavado utilizado después del período de exposición;

Número de réplicas de los discos de piel utilizadas por producto problema y testigos (testigos positivo y negativo);

Descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento del ensayo;

Referencia a datos históricos del modelo. Aquí deben incluirse, entre otras cosas:

i)

Aceptabilidad de los valores de la RET de los testigos positivo y negativo (en kΩ) con referencia a los intervalos de resistencia de los testigos positivo y negativo;

ii)

Aceptabilidad de los valores del contenido en colorantes de los testigos positivo y negativo (en μg/disco) con referencia a los intervalos de contenido en colorantes de los testigos positivo y negativo;

iii)

Aceptabilidad de los resultados de los ensayos con referencia a la variabilidad histórica de las réplicas de discos de piel;

Descripción de los criterios de decisión / modelo de predicción aplicados.

 

Resultados:

Cuadro de datos de los ensayos RET y de unión de colorante (si procede) en relación con distintos productos problema y testigos, respecto a cada tanda (experimento) del ensayo y cada réplica de disco de piel (cada animal y cada muestra de piel), promedios, desviaciones típicas y coeficientes de variación;

Descripción de los eventuales efectos observados;

Clasificación derivada con referencia al modelo de predicción y/o a los criterios de decisión utilizados.

 

Discusión de los resultados

 

Conclusiones

BIBLIOGRAFÍA

(1)

Naciones Unidas (2013). Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (SGA), quinta edición revisada, Naciones Unidas, Nueva York y Ginebra, 2013. Disponible en: [http://www.unece.org/es/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_s.html].

(2)

Capítulo B.4 del presente anexo, Toxicidad aguda: irritación/corrosión cutánea.

(3)

Capítulo B.40 bis del presente anexo, Corrosión cutánea in vitro.

(4)

Capítulo B.65 del presente anexo, Método de ensayo con barrera de membrana in vitro.

(5)

Capítulo B.46 del presente anexo, Irritación cutánea in vitro: Método de ensayo con epidermis humana reconstruida.

(6)

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Figura 1

Instrumental Para El Ensayo De La Ret En Piel De Rata

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Figura 2

Dimensiones Del Tubo De Politetrafluoretileno (Ptfe), De La Cámara Receptora Y De Los Electrodos Usados

Image 3

Factores críticos del instrumental mostrado arriba:

El diámetro interior del tubo de PTFE,

La longitud de los electrodos respecto al tubo de PTFE y a la cámara receptora, de forma que el disco de piel no toque los electrodos y que haya en contacto con la solución de MgSO4 una longitud fijada de electrodo,

La cantidad de solución de MgSO4 presente en la cámara receptora debe hacer que el líquido tenga cierta profundidad respecto al nivel dentro del tubo de PTFE, como se indica en la figura 1,

El disco de piel debe fijarse bien al tubo de PTFE, de forma que la resistencia eléctrica sea una medida fiel de las propiedades de la piel.

Apéndice

DEFINICIONES

Exactitud : Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del comportamiento del método de ensayo y es un aspecto de su pertinencia. Este término y el de “concordancia” se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo (20).

C : Corrosivo.

Producto : Sustancia o mezcla.

Concordancia : Se trata de una medida del comportamiento del método de ensayo que da un resultado categórico, y es un aspecto de su pertinencia. Este término y el de “exactitud” se pueden usar indistintamente, y se define como la proporción de todos los productos estudiados que se clasifican correctamente como positivos o negativos. La concordancia depende en gran medida de la prevalencia de positivos en los tipos de producto problema que se están examinando (20).

SGA (Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos) de las Naciones Unidas : Sistema que propone la clasificación de los productos (sustancias y mezclas) según tipos y niveles normalizados de peligros físicos, sanitarios y ambientales, y que hace referencia a los elementos correspondientes de comunicación, como pictogramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a la población (incluidos empresarios, trabajadores, transportistas, consumidores y personal de protección civil) y al medio ambiente (1).

IATA : Enfoque integrado de pruebas y evaluación (Integrated Approach to Testing and Assessment).

Mezcla : Mezcla o solución compuesta de dos o más sustancias.

Sustancia de un solo componente : Sustancia, definida por su composición cuantitativa, en la que un solo componente principal representa al menos el 80 % (p/p).

Sustancia de componentes múltiples : Sustancia, definida por su composición cuantitativa, en la que hay varios componentes principales presentes a una concentración ≥ 10 % (p/p) y < 80 % (p/p). Una sustancia de componentes múltiples es el resultado de un proceso de fabricación. La diferencia entre mezcla y sustancia de componentes múltiples es que una mezcla se obtiene mezclando dos o más sustancias sin reacción química. Una sustancia de componentes múltiples es el resultado de una reacción química.

NC : No corrosivo.

DO : Densidad óptica.

TP : Testigo positivo, réplica que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo y que se trata con una sustancia de la que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la magnitud de la respuesta positiva.

Normas de comportamiento : Normas, basadas en un método de referencia validado, que proporcionan la base para evaluar la comparabilidad de un método de ensayo propuesto que es similar desde el punto de vista mecánico y funcional. Se incluyen aquí: i) los componentes fundamentales del método de ensayo; ii) una lista mínima de productos de referencia seleccionados de entre los productos utilizados para demostrar el comportamiento aceptable del método de ensayo validado; y iii) los niveles similares de fiabilidad y exactitud, basados en lo obtenido con el método de ensayo validado, que el método de ensayo propuesto debe presentar cuando se evalúa con la lista mínima de productos de referencia.

Pertinencia : Descripción de la relación del método de ensayo con el efecto de interés y de si es significativo y útil para un objetivo concreto. Es el grado en que el método de ensayo mide o predice correctamente el efecto biológico de interés. La pertinencia incorpora la consideración de la exactitud (concordancia) de un método de ensayo (20).

Fiabilidad : Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproducibilidad intra e interlaboratorios (20).

Sensibilidad : Proporción de todos los productos activos/positivos que se clasifican correctamente mediante el método de ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categoriales, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (20).

Corrosión cutánea in vitro : Producción de una lesión irreversible de la piel; en particular, necrosis visible a través de la epidermis y que llega a la dermis, tras la aplicación de un producto problema durante hasta cuatro horas. Las reacciones corrosivas se caracterizan por úlceras, sangrado, costras sanguinolentas y, hacia el final del período de observación de catorce días, por decoloración debida al blanqueo de la piel, zonas completas de alopecia y cicatrices. Debe considerarse la realización de un examen histopatológico para evaluar las lesiones dudosas.

Especificidad : Proporción de todos los productos inactivos/negativos que se clasifican correctamente mediante el método de ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categoriales, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (20).

Sustancia : Elemento químico y sus compuestos naturales u obtenidos mediante algún proceso de producción, incluidos los eventuales aditivos necesarios para mantener su estabilidad y las eventuales impurezas que se produzcan en el proceso, con exclusión de los eventuales disolventes que puedan separarse sin afectar a la estabilidad de la sustancia ni modificar su composición.

Tanda (del ensayo) : Un solo producto problema sometido a ensayo al mismo tiempo con un mínimo de tres réplicas de discos de piel.

Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

Resistencia eléctrica transcutánea (RET) : Medida de la impedancia eléctrica de la piel, como valor de la resistencia en kiloohmios. Un método simple y sólido para evaluar la función de barrera consiste en registrar el paso de iones a través de la piel mediante el uso de un puente de Wheatstone.

UVCB : Sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos.

»

6)

En la parte B, el capítulo B.40 bis se sustituye por el texto siguiente:

«B.40bis.   CORROSIÓN CUTÁNEA IN VITRO: MÉTODO DE ENSAYO CON EPIDERMIS HUMANA RECONSTRUIDA (EHR)

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) 431 de la OCDE (2016). La corrosión cutánea se refiere a la producción de una lesión irreversible en la piel, que se manifiesta como necrosis visible a través de la epidermis y que llega a la dermis, como consecuencia de la aplicación de un producto problema [según la definición del Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos (SGA) de las Naciones Unidas (1) y del Reglamento (CE) n.o 1272/2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (CLP) de la Unión Europea (6)]. El presente método de ensayo B.40 bis actualizado establece un procedimiento in vitro que permite la identificación de sustancias y mezclas no corrosivas y corrosivas con arreglo al SGA de las Naciones Unidas y al CLP. También permite una subcategorización parcial de los productos corrosivos.

2.

La evaluación del potencial de corrosión cutánea de los productos químicos ha supuesto normalmente la utilización de animales de laboratorio (método de ensayo B.4 equivalente a las directrices de ensayo TG 404 de la OCDE); aprobada originalmente en 1981 y revisada en 1992, 2002 y 2015) (2). Además del presente método de ensayo B.40 bis, se han validado otros dos métodos de ensayo in vitro para detectar el potencial de corrosión de los productos químicos, y se han adoptado como método de ensayo B.40 (equivalente a las directrices de ensayo TG 430 de la OCDE) (3) y método de ensayo B.65 (equivalente a las directrices de ensayo TG 435 de la OCDE) (4). Además, se ha adoptado el método de ensayo in vitro B.46 (equivalente a las directrices de ensayo TG 439 de la OCDE) (5) para comprobar el potencial de irritación cutánea. Un documento de orientación sobre los enfoques integrados de ensayos y evaluación (IATA, Integrated Approaches to Testing and Assessment) describe varios módulos que agrupan diversas fuentes de información y herramientas de análisis, y i) aporta orientaciones sobre cómo integrar y utilizar los datos disponibles, tanto de ensayo como no experimentales, para la evaluación de la capacidad de irritación cutánea y de corrosión cutánea de los productos químicos, y ii) propone un enfoque cuando se precisan más ensayos (6).

3.

El presente método de ensayo se refiere al parámetro de salud humana denominado corrosión cutánea. Este método hace uso de la epidermis humana reconstruida (EHR) (obtenida a partir de queratinocitos epidérmicos no transformados, obtenidos de seres humanos) que imita bien las propiedades histológicas, morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de las partes superiores de la piel humana, es decir, la epidermis. Las directrices de ensayo correspondientes de la OCDE se adoptaron originalmente en 2004 y se actualizaron en 2013 para incluir métodos de ensayo adicionales que utilizan los modelos de EHR y la posibilidad de utilizar los métodos para apoyar la subcategorización de los productos corrosivos, y se actualizaron de nuevo en 2015 para hacer referencia al documento de orientación sobre los IATA e introducir el uso de un procedimiento alternativo de medición de la viabilidad.

4.

En este método de ensayo se incluyen cuatro modelos EHR validados disponibles comercialmente. Se han efectuado estudios de prevalidación (7), seguidos de un estudio formal de validación para evaluar la corrosión cutánea (8) (9) (10) (11) (12), de dos de estos modelos de ensayo disponibles en el mercado, a saber, EpiSkin™ Standard Model (SM) y EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (denominados en lo sucesivo «métodos de referencia validados», MRV). El resultado de estos estudios llevó a la recomendación de que los dos MRV mencionados podrían utilizarse con fines normativos para distinguir las sustancias corrosivas (C) de las sustancias no corrosivas (NC), y que EpiSkin™ podría utilizarse, además, para apoyar la subcategorización de las sustancias corrosivas (13) (14) (15). Otros dos modelos EHR de ensayo de la corrosión cutánea in vitro, disponibles en el mercado, han dado resultados similares al MRV de EpiDerm™ de acuerdo con una validación basada en normas de comportamiento (16) (17) (18). Se trata de SkinEthic™ RHE (7) y de epiCS® (anteriormente denominado EST-1000) que también pueden utilizarse con fines normativos para distinguir sustancias corrosivas de sustancias no corrosivas (19) (20). Unos estudios tras la validación, efectuados por los productores del modelo EHR en los años 2012 a 2014 con un protocolo perfeccionado que corrige interferencias de la reducción inespecífica del MTT por los productos problema, mejoraron el comportamiento tanto en cuanto a la discriminación de productos C/NC como en cuanto al apoyo a la subcategorízación de los agentes corrosivos (21) (22). Se han llevado a cabo más análisis estadísticos de los datos obtenidos tras la validación con EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE y epiCS®, con el fin de encontrar modelos predictivos alternativos que mejoren la capacidad de asignación para la subcategorización (23).

5.

Antes de que pueda utilizarse con fines normativos un método de ensayo EHR in vitro similar o modificado para evaluar la corrosión cutánea distinto de los MRV, deben determinarse su fiabilidad, pertinencia (exactitud) y limitaciones para el uso propuesto, a fin de garantizar su similitud con los MRV, de acuerdo con los requisitos de las normas de comportamiento (24) establecidas según los principios del documento de orientación de la OCDE n.o 34 (25). La aceptación mutua de datos solo se garantizará después de que se haya revisado e incluido en las directrices de ensayo correspondientes el eventual método de ensayo nuevo o actualizado propuesto que cumpla las normas de comportamiento. Los modelos de ensayo incluidos en esas directrices de ensayo pueden utilizarse para cumplir los requisitos de los países en cuanto a los resultados de los ensayos sobre el método de ensayo in vitro para detectar la corrosión cutánea, al tiempo que se benefician de la aceptación mutua de datos.

DEFINICIONES

6.

En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

CONSIDERACIONES INICIALES

7.

El presente método de ensayo permite la identificación de sustancias y mezclas no corrosivas y corrosivas con arreglo al SGA de las Naciones Unidas y al CLP. Este método de ensayo facilita, además, la subcategorización de las sustancias y mezclas corrosivas en la subcategoría optativa 1A, de acuerdo con el SGA de las Naciones Unidas (1), así como una combinación de las subcategorías 1B y 1C (21) (22) (23). Una limitación de este método de ensayo es que no permite discriminar entre las subcategorías de corrosivos cutáneos 1B y la 1C, de conformidad con el SGA de las Naciones Unidas y el CLP, debido a lo limitado del conjunto de grupos de productos corrosivos in vivo de la subcategoría 1C. Los modelos de ensayo EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE y epiCS® permiten la subcategorización (es decir, 1A frente a 1B-y-1C y frente a NC)

8.

En la validación en apoyo de los modelos de ensayo incluidos en el presente método de ensayo, cuando se utilizan para la identificación de agentes no corrosivos y corrosivos, se ha analizado una amplia gama de productos químicos que representan principalmente sustancias individuales; la base de datos empíricos del estudio de validación ascendió a 60 productos que abarcaban una amplia gama de clases químicas (8) (9) (10). Los ensayos para demostrar la sensibilidad, la especificidad, la exactitud y la reproducibilidad intralaboratorios del ensayo para la subcategorización fueron realizados por los diseñadores del método de ensayo y sus resultados fueron revisados por la OCDE (21) (22) (23). Sobre la base del conjunto de datos disponibles, el método de ensayo es aplicable a una amplia gama de clases químicas y estados físicos, incluidos líquidos, semisólidos, sólidos y ceras. Los líquidos pueden ser acuosos o no acuosos; los sólidos pueden ser solubles o insolubles en agua. Siempre que sea posible, los sólidos deben molerse hasta convertirse en polvo fino antes de su aplicación; no se requiere ningún otro tratamiento previo de la muestra. En los casos en que haya pruebas de que los modelos de ensayo incluidos en este método de ensayo no son aplicables a una categoría específica de productos problema, los modelos no deberán utilizarse con tal categoría específica de productos problema. Además, se supone que este método de ensayo es aplicable a las mezclas como una extensión de su aplicabilidad a las sustancias. Sin embargo, debido al hecho de que las mezclas abarcan un amplio espectro de categorías y composiciones, y que actualmente se dispone de información solo limitada sobre los ensayos de mezclas, en los casos en los que pueda demostrarse la inaplicabilidad del método de ensayo a una determinada categoría de mezclas [por ejemplo, a raíz de una estrategia como la propuesta en (26)], el método no deberá utilizarse con tal categoría específica de mezclas. Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines normativos, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tales fines y, en caso afirmativo, por qué. Dichas consideraciones no son necesarias cuando los requisitos normativos estipulan que la mezcla debe someterse a ensayo. Aún no se han efectuado estudios de validación de gases y aerosoles (8) (9) (10). Aunque no hay que descartar que los gases y aerosoles puedan estudiarse utilizando la tecnología de EHR, el actual método de ensayo no permite hacerlo.

9.

Los productos problema que absorben la luz en el mismo intervalo que el formazano de MTT y los productos problema capaces de reducir directamente el colorante vital MTT (a formazano de MTT) pueden interferir con las mediciones de la viabilidad tisular y hacen necesario el uso de testigos adaptados para efectuar las correcciones oportunas. El tipo de testigos adaptados que puede ser necesario varía en función del tipo de interferencia producida por el producto problema y del procedimiento utilizado para medir el formazano de MTT (véanse los puntos 25-31).

10.

Aunque este método de ensayo no proporciona información adecuada sobre la irritación cutánea, cabe señalar que el método de ensayo B.46 aborda específicamente el efecto sanitario de la irritación cutánea in vitro (5) y está basado en el mismo sistema de ensayo de EHR, aunque utiliza un protocolo distinto (5). Para una evaluación completa de los efectos cutáneos locales tras una exposición cutánea única, debe consultarse el documento de orientación de la OCDE sobre los enfoques integrados de ensayos y evaluación (6). Este enfoque IATA incluye la realización de ensayos in vitro de corrosión cutánea (como los descritos en el presente método) y de irritación cutánea antes de considerar las pruebas con animales vivos. Se reconoce que el uso de piel humana está sujeto a condiciones y consideraciones éticas tanto nacionales como internacionales.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

11.

El producto problema se aplica tópicamente a un modelo de EHR tridimensional, formado por queratinocitos epidérmicos no transformados, obtenidos de seres humanos, que se han cultivado para formar un modelo de la epidermis humana bien diferenciado en varias capas. Consiste en las capas basal, espinosa y granulosa organizadas, y en un estrato córneo con varias capas intercelulares laminares de lípidos, que representan las principales clases de lípidos análogas a las que se encuentran in vivo.

12.

El método de ensayo con EHR se basa en la premisa de que los productos corrosivos pueden penetrar en el estrato córneo por difusión o erosión, y son citotóxicos para las células de las capas subyacentes. La viabilidad celular se mide mediante la conversión enzimática del colorante vital MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, bromuro de tetrazolio de azul de tiazolilo; número CAS 298-93-1] en una sal de formazano azul que se mide cuantitativamente tras su extracción de los tejidos (27). Los productos corrosivos se identifican por su capacidad de reducir la viabilidad celular por debajo de unos umbrales definidos (véanse los puntos 35 y 36). El método de ensayo de corrosión cutánea basado en la EHR ha demostrado su valor para la asignación de los efectos de corrosión cutánea in vivo evaluados en conejos según el método de ensayo B.4 (2).

DEMOSTRACIÓN DE LA COMPETENCIA

13.

Antes de proceder al uso sistemático de cualquiera de los cuatro modelos de ensayo EHR validados que se ajustan al presente método de ensayo, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica mediante la correcta clasificación de las doce sustancias para la prueba de la competencia recogidas en el cuadro 1. En caso de que se utilice un método de subclasificación, deberá demostrarse que también es correcta la subcategorización. Cuando una sustancia de la lista no esté disponible o en casos justificados, podrá utilizarse otra sustancia sobre la que se disponga de datos adecuados de referencia in vivo e in vitro [por ejemplo, de la lista de productos de referencia (24)] siempre que se apliquen los mismos criterios de selección que los descritos en el cuadro 1.

Cuadro 1

Lista de sustancias para la prueba de la competencia  (8)

Sustancia

N.o CAS

Clase química (9)

Cat. según el SGA de las Naciones Unidas y del CLP sobre la base de resultados in vivo  (10)

Cat. según los resultados obtenidos con MRV in vitro  (11)

Reductor de MTT (12)

Estado físico

Corrosivos in vivo de subcategoría 1A

Ácido bromoacético

79-08-3

Ácido orgánico

1A

(3) 1A

S

Trifluoruro de boro dihidratado

13319-75-0

Ácido inorgánico

1A

(3) 1A

L

Fenol

108-95-2

Fenol

1A

(3) 1A

S

Cloruro de dicloroacetilo

79-36-7

Electrófilo

1A

(3) 1A

L

Corrosivos in vivo de subcategorías 1B y 1C combinadas

Ácido glioxílico monohidratado

563-96-2

Ácido orgánico

1B y 1C

(3) 1B y 1C

S

Ácido láctico

598-82-3

Ácido orgánico

1B y 1C

(3) 1B y 1C

L

Etanolamina

141-43-5

Base orgánica

1B

(3) 1B y 1C

Viscoso

Ácido clorhídrico (14,4 %)

7647-01-0

Ácido inorgánico

1B y 1C

(3) 1B y 1C

L

No corrosivos in vivo

Bromuro de fenetilo

103-63-9

Electrófilo

NC

(3) NC

L

4-Amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Base orgánica

NC

(3) NC

S

4-(Metiltio)-benzaldehído

3446-89-7

Electrófilo

NC

(3) NC

L

Ácido láurico

143-07-7

Ácido orgánico

NC

(3) NC

S

Abreviaturas: N.o CAS = número de registro del Chemical Abstracts Service; MRV = método de referencia validado; NC = no corrosivo; S = sólido; L = líquido.

14.

Como parte del ejercicio de demostración de la competencia, se recomienda que el usuario verifique las propiedades de barrera de los tejidos tras su recepción, siguiendo las especificaciones del fabricante del modelo de EHR. Este aspecto es particularmente importante si el envío de los tejidos implica grandes distancias o largos plazos. Una vez se haya establecido con éxito un método de ensayo y se haya demostrado la competencia para su uso, no será necesario efectuar esta verificación de forma sistemática. Sin embargo, cuando se utilice sistemáticamente un método de ensayo, se recomienda seguir evaluando las propiedades de barrera a intervalos periódicos.

PROCEDIMIENTO

15.

A continuación se describen de forma genérica los componentes y procedimientos de los modelos de ensayo de EHR para la evaluación de la corrosión cutánea objeto del presente método de ensayo. Los modelos de EHR aprobados para usarse en este método de ensayo, es decir, los modelos EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE y epiCS® (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33), pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales. Los procedimientos normalizados de trabajo (PNT) de estos cuatro modelos de EHR están disponibles (34) (35) (36) (37), y los principales componentes de su método de ensayo se resumen en el apéndice 2. Se recomienda consultar el PNT correspondiente a la hora de aplicar y utilizar uno de estos modelos en el laboratorio. El ensayo con los cuatro modelos de ensayo EHR que corresponden al presente método de ensayo debe cumplir las condiciones siguientes:

COMPONENTES DEL MÉTODO DE ENSAYO EHR

Condiciones generales

16.

Para reconstruir el epitelio deben utilizarse queratinocitos humanos no transformados. Bajo un estrato córneo funcional, deben encontrarse varias capas de células epiteliales viables (estrato basal, estrato espinoso, estrato granuloso). El estrato córneo debe constar de varias capas con el perfil lipídico necesario para constituir una barrera funcional con la suficiente resistencia contra la penetración rápida de los productos citotóxicos de referencia como, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (DSS) o tritón X-100. La existencia de la función de barrera debe demostrarse, y puede evaluarse determinando la concentración a la que el producto de referencia reduce la viabilidad de los tejidos en un 50 % (CI50) tras un tiempo fijo de exposición, o bien determinando el tiempo de exposición necesario para reducir la viabilidad celular en un 50 % (TE50) tras la aplicación del producto de referencia a una concentración fija especificada (véase el punto18). Las propiedades de aislamiento del modelo de EHR deben evitar que pase material del estrato córneo al tejido viable, lo que reduciría la calidad del modelo en cuanto a la exposición de la piel. El modelo de EHR debe estar exento de contaminación por bacterias, virus, micoplasmas u hongos.

Condiciones funcionales

Viabilidad

17.

El ensayo utilizado para cuantificar la viabilidad tisular es el ensayo de MTT (27). Las células viables de la construcción tisular de EHR reducen el colorante vital MTT a un precipitado azul de formazano de MTT, que se extrae del tejido utilizando isopropanol (o un disolvente similar). La densidad óptica (DO) del disolvente de extracción solo debe ser suficientemente baja, es decir, DO < 0,1. El formazano de MTT extraído puede cuantificarse utilizando una medición normal de la absorbancia (DO) o un procedimiento de espectrofotometría con HPLC/UPLC (38). Los usuarios del modelo de EHR deben asegurarse de que cada lote utilizado de este modelo cumple los criterios definidos en relación con el testigo negativo. El diseñador o proveedor del modelo de EHR debe establecer un intervalo de aceptabilidad (límite superior e inferior) de los valores de DO de los testigos negativos. En el cuadro 2 figuran los intervalos de aceptabilidad de los valores de DO de los testigos negativos correspondientes a los cuatro modelos de ensayo de EHR validados que se incluyen en el presente método de ensayo. Como criterio de aceptación del testigo negativo, los usuarios de la espectrofotometría con HPLC/UPLC deben utilizar las bandas de DO del testigo negativo que figuran en el cuadro 2. Hay que demostrar documentalmente que los tejidos tratados con el testigo negativo son estables en cultivo (proporcionan unas mediciones similares de la DO) durante todo el tiempo de exposición.

Cuadro 2

Intervalos de aceptabilidad de los valores de DO del testigo negativo para controlar la calidad del lote

 

Límite inferior de aceptación

Límite superior de aceptación

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Función de barrera

18.

El estrato córneo y su composición lipídica deben ser suficientes para impedir la penetración rápida de determinados productos citotóxicos de referencia (por ejemplo, DSS o tritón X-100), evaluada mediante la CI50 o el TE50 (véase el cuadro 3). La función de barrera de cada modelo de EHR utilizado debe estar demostrada por el diseñador o vendedor del modelo de EHR en el momento del suministro de los tejidos al usuario final (véase el punto 21).

Morfología

19.

Debe realizarse un examen histológico del modelo de EHR que demuestre una estructura de varias capas similar a la epidermis humana, con estrato basal, estrato espinoso, estrato granuloso y estrato córneo, y con un perfil lipídico similar al perfil lipídico de la epidermis humana. El diseñador o vendedor del modelo de EHR debe aportar, en el momento del suministro de los tejidos al usuario final, un examen histológico de cada lote del modelo de EHR utilizado en el que se demuestre la morfología adecuada de los tejidos (véase el punto 21).

Reproducibilidad

20.

Los usuarios del método de ensayo deben demostrar la reproducibilidad de este a lo largo del tiempo con testigos positivos y negativos. Además, el método de ensayo solo debe utilizarse si el diseñador o proveedor del modelo de EHR proporciona datos que demuestran la reproducibilidad a lo largo del tiempo con productos corrosivos y no corrosivos de, por ejemplo, la lista de sustancias para la prueba de la competencia (cuadro 1). En caso de que se utilice un método de ensayo para la subcategorización, también debe demostrarse la reproducibilidad respecto a esta.

Control de calidad (CC)

21.

El modelo de EHR solo debe utilizarse si el diseñador o proveedor demuestra que cada lote del modelo utilizado cumple los criterios definidos de aprobación de la producción, los más importantes de los cuales son los relativos a la viabilidad (punto 17), a la función de barrera (punto 18) y a la morfología (punto 19). Estos datos deben proporcionarse a los usuarios del método de ensayo, de manera que puedan incluirlos en el informe del ensayo. Para conseguir una asignación fiable de la clasificación en cuanto al efecto corrosivo, solo pueden aceptarse los resultados obtenidos con lotes de tejidos aprobados en el CC. El diseñador o proveedor del modelo de EHR debe establecer un intervalo de aceptabilidad (límite superior e inferior) de los valores de CI50 o TE50. En el cuadro 3 figuran los intervalos de aceptabilidad de los cuatro modelos de ensayo validados.

Cuadro 3

Criterios de control de calidad para la aprobación de los lotes