EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 02017R0735-20170428

Consolidated text: A Bizottság (EU) 2017/735 rendelete ( 2017. február 14. ) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendelet mellékletének a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról (EGT-vonatkozású szöveg)

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2017/735/2017-04-28

  The document is unavailable in your User interface language.

02017R0735 — HU — 28.04.2017 — 000.001


Ez a dokumentum kizárólag tájékoztató jellegű és nem vált ki joghatást. Az EU intézményei semmiféle felelősséget nem vállalnak a tartalmáért. A jogi aktusoknak – ideértve azok bevezető hivatkozásait és preambulumbekezdéseit is – az Európai Unió Hivatalos Lapjában közzétett és az EUR-Lex portálon megtalálható változatai tekintendők hitelesnek. Az említett hivatalos szövegváltozatok közvetlenül elérhetők az ebben a dokumentumban elhelyezett linkeken keresztül

►B

A BIZOTTSÁG (EU) 2017/735 RENDELETE

(2017. február 14.)

►C1  a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendelet mellékletének a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról ◄

(EGT-vonatkozású szöveg)

(HL L 112, 2017.4.28., 1. o)


Helyesbítette:

►C1

Helyesbítés, HL L 119, 15.5.2018, o 41  (735/2017)




▼B

A BIZOTTSÁG (EU) 2017/735 RENDELETE

(2017. február 14.)

▼C1

a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról szóló 440/2008/EK rendelet mellékletének a műszaki fejlődéshez való hozzáigazítás céljából történő módosításáról

▼B

(EGT-vonatkozású szöveg)



1. cikk

A 440/2008/EK rendelet melléklete e rendelet mellékletének megfelelően módosul.

2. cikk

Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.




MELLÉKLET

A 440/2008/EK rendelet melléklete a következőképpen módosul:

(1) Az A. rész a következő fejezettel egészül ki:

„A.25.    DISSZOCIÁCIÓS ÁLLANDÓK A VÍZBEN (TITRÁLÁSI MÓDSZER – SPEKTROFOTOMETRIÁS MÓDSZER – KONDUKTOMETRIÁS MÓDSZER)

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 112. vizsgálati iránymutatásában (1981) leírt módszerrel.

Előfeltételek

 Megfelelő analitikai módszer

 Vízoldékonyság

Tájékoztató jellegű információk

 Szerkezeti képlet

 Elektromos vezetőképesség a konduktometriás módszer esetében

Minősítő állítások

 Valamennyi vizsgálati módszer végrehajtható tiszta vagy kereskedelmi tisztaságú anyagokon. A szennyeződések által az eredményekre kifejtett lehetséges hatásokat figyelembe kell venni.

 A titrálási módszer nem alkalmas az alacsony vízoldékonyságú anyagok esetében (lásd alább a Vizsgálati oldatok címsor alatt).

 A spektrofotometriás módszer csak azokra az anyagokra alkalmazandó, amelyeknek észrevehetően eltér az UV/VIS abszorpciós spektruma a disszociált és a nem disszociált forma esetében. Ez a módszer alkalmas lehet az alacsony vízoldékonyságú anyagok és a nem sav–bázis disszociációk, például a komplexképződés esetében.

 Az Onsager-egyenlet érvényességi körébe tartozó esetekben a konduktometriás módszer még viszonylag alacsony koncentráció mellett, sőt nem sav–bázis egyensúly eseteiben is alkalmazható.

Standard dokumentumok

Ez a vizsgálati módszer a »Szakirodalom« című szakaszban felsorolt hivatkozásokban megadott módszereken és a »Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA« című, 1978. augusztus 18-i kiadványon alapul.

MÓDSZER – BEVEZETÉS A VIZSGÁLATBA, A VIZSGÁLAT CÉLJA, ALKALMAZÁSI KÖRE, RELEVANCIÁJA, ALKALMAZÁSA ÉS KORLÁTAI

Valamely anyag vízben történő disszociációja jelentőséggel bír a környezetre kifejtett hatásának értékelése során. A vízben történő disszociáció határozza meg az anyag formáját, amely viszont meghatározza a viselkedését és a szállítását. Befolyásolhatja a vegyi anyag talajon vagy üledéken történő adszorpcióját és a biológiai sejtekbe irányuló abszorpcióját.

Fogalommeghatározások és mértékegységek

A disszociáció a két vagy több, esetenként ionos kémiai anyaggá történő reverzibilis bomlás. A folyamatot általában a következő képlet jelöli:

RXR ++ X

a reakcióra irányadó koncentrációs egyensúlyi állandó pedig a következő:

image

Például abban a sajátos esetben, ha az R hidrogén (az anyag sav), az állandó:

image

vagy

image

Referenciaanyagok

Az alábbi referenciaanyagokat az új anyagok vizsgálata során nem kell minden esetben alkalmazni. Elsősorban azért vannak megadva, hogy időnként el lehessen végezni a módszer kalibrálását, valamint azért, hogy másik módszer alkalmazása esetén lehetőséget nyújtsanak az eredmények összehasonlítására.



 

pKa (1)

Hőmérséklet °C-ban

p-nitrofenol

7,15

25 (1)

Benzoesav

4,12

20

p-klóranilin

3,93

20

(1)   20 °C hőmérséklethez nem áll rendelkezésre érték, de feltételezhető, hogy a mérési eredmények variabilitása nagyobb mértékű, mint a várható hőmérséklet-függőség.

Célszerű lenne több pK-értékkel rendelkező anyag alkalmazása, ahogyan az alább „A módszer elve” című részben szerepel. Ilyen anyag lehetne a következő:



Citromsav

pKa (8)

Hőmérséklet °C-ban

 

1) 3,14

20

 

2) 4,77

20

 

3) 6,39

20

A vizsgálati módszer elve

Az ismertetett kémiai folyamat általában csak kismértékben hőmérsékletfüggő a környezeti szempontból releváns hőmérséklet-tartományban. A disszociációs állandó meghatározása szükségessé teszi a vegyi anyag disszociált és nem disszociált formája koncentrációjának mérését. A fenti „Fogalommeghatározások és mértékegységek” című részben szereplő disszociációs reakció sztöchiometriájának ismerete alapján a megfelelő állandó meghatározható. Az e vizsgálati módszerben ismertetett konkrét esetben az anyag savként vagy bázisként viselkedik, és a disszociációs állandó meghatározása a legmegfelelőbben az anyag ionizált és nem ionizált formája relatív koncentrációjának és az oldat pH-értékének meghatározásával történik. A szóban forgó kifejezések közötti kapcsolatot a fenti „Fogalommeghatározások és mértékegységek” című részben szereplő pKa értékhez tartozó egyenlet adja meg. Egyes anyagok esetében egynél több disszociációs állandó van és hasonló egyenletek állíthatók fel. Az itt ismertetett módszerek közül néhány a nem sav–bázis disszociációra is alkalmazható.

Minőségi kritériumok

Megismételhetőség

A disszociációs állandó mérését legalább három alkalommal meg kell ismételni, és az értékeknek ± 0,1 log egységen belül kell elhelyezkedniük.

A VIZSGÁLATI ELJÁRÁSOK LEÍRÁSA

A pKa érték meghatározásának két alapvető megközelítése van. Az egyik az anyag ismert mennyiségének – szükség szerint – standard savval vagy bázissal történő titrálását, a másik az ionizált és a nem ionizált forma relatív koncentrációjának és pH-függőségének meghatározását foglalja magában.

Előkészületek

Az említett elveken alapuló módszerek titrálási, spektrofotometriás és konduktometriás eljárásként sorolhatók be.

Vizsgálati oldatok

A titrálási módszer és a konduktometriás módszer esetében a vegyi anyagot desztillált vízben kell feloldani. A spektrofotometriás módszer és más módszerek esetében pufferoldatok használatosak. A vizsgálati anyag koncentrációja nem haladhatja meg a 0,01 M, illetve a telítettségi koncentráció fele közül az alacsonyabb értéket, és az oldatok elkészítésekor az anyag legtisztább rendelkezésre álló formáját kell alkalmazni. Ha az anyag csak alig oldható, a fent feltüntetett koncentrációkhoz történő hozzáadását megelőzően feloldható kis mennyiségű, vízzel elegyedő oldószerben.

Az oldatokat Tyndall-sugár segítségével meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy előfordulnak-e bennük emulziók, különösen akkor, ha társoldószert használtak az oldékonyság javítására. Pufferoldatok használata esetén a puffer koncentrációja nem haladhatja meg a 0,05 M-t.

Vizsgálati körülmények

Hőmérséklet

A hőmérsékletet legalább ± 1 °C-ra kell szabályozni. A meghatározást lehetőleg 20 °C-on kell elvégezni.

Ha jelentős hőmérséklet-függőség gyanúja merül fel, a meghatározást legalább két másik hőmérsékleten is el kell végezni. A hőmérsékletközöknek ebben az esetben 10 °C-nak, a hőmérséklet-szabályozásnak pedig ± 0,1 °C-nak kell lennie.

Elemzések

A módszert a vizsgált anyag jellege határozza meg. A módszernek kellően érzékenynek kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a különböző kémiai anyagok meghatározását a vizsgálati oldat egyes koncentrációinál.

A vizsgálat végrehajtása

Titrálási módszer

A vizsgálati oldat meghatározása – szükség szerint – a standard bázikus vagy savas oldattal történő titrálással történik, melynek során a pH-értéket a titrálószer minden egyes hozzáadása után megmérik. Az egyenértékpont elérése előtt legalább 10 további hozzáadást kell végezni. Az egyensúly megfelelően gyors elérése esetén regisztráló potenciométer használható. Ehhez a módszerhez az anyag teljes mennyiségét és koncentrációját is pontosan ismerni kell. A szén-dioxid kizárása érdekében óvintézkedéseket kell tenni. Az eljárás, az óvintézkedések és a számítás részletei standard vizsgálatokban, például az (1), (2), (3), (4) hivatkozásban szerepelnek.

Spektrofotometriás módszer

Megállapítanak egy olyan hullámhosszot, ahol az anyag ionizált és nem ionizált formájának észrevehetően eltérő az extinkciós együtthatója. Az UV/VIS abszorpciós spektrumot állandó koncentrációjú oldatokból határozzák meg olyan pH-feltételek mellett, amelyeknél az anyag lényegében nem ionizált és amelyeknél teljesen ionizált, továbbá több köztes pH-érték mellett. Ez elvégezhető úgy, hogy további koncentrált savat (bázist) adnak hozzá egy, az anyagot egy többkomponensű pufferben tartalmazó, viszonylag nagy mennyiségű, kezdetben magas (alacsony) pH-értékű ((5) hivatkozás) oldathoz, vagy oly módon, hogy az anyagot például vízben, metanolban tartalmazó, ugyanolyan mennyiségű törzsoldatot adnak állandó mennyiségű, a kívánt pH-tartományt lefedő különféle pufferoldatokhoz. A kiválasztott hullámhosszon mért pH- és abszorbancia-érték alapján elegendő számú értéket kell kiszámítani a pKa értékhez legalább öt olyan pH-értéken alapuló adatok segítségével, amelyeknél az anyag legalább 10 százalékban, de 90 százaléknál kisebb mértékben ionizált. A kísérletek további részletezése és a számítási módszer az (1) hivatkozásban szerepel.

Konduktometriás módszer

Az anyagot tartalmazó, megközelítőleg 0,1 M koncentrációjú oldat vezetőképességét vezetőképes vízben, egy alacsony, ismert cellaállandójú cella segítségével megmérik. Ezen oldat több, pontosan elkészített hígításának vezetőképességét is megmérik. A koncentrációt minden egyes alkalommal megfelezik, és a sorozatnak a koncentráció tekintetében legalább egy nagyságrend-terjedelmet le kell fednie. Végtelen hígításnál a vezetőképesség határát nátriumsóval és extrapolálással végzett hasonló kísérlettel kell megállapítani. A disszociációfok ezt követően az egyes oldatok vezetőképessége alapján az Onsager-egyenlet segítségével számítható ki, és így az Ostwald-féle hígítási törvény segítségével a disszociációs állandó a következőképpen kapható meg: K = α2C/(1 – α), ahol C a mol/literben kifejezett koncentráció, α pedig a disszociált frakció. A CO2 kizárása érdekében óvintézkedéseket kell tenni. A kísérletek további részletezése és a számítási módszer a standard szövegekben, valamint az (1), (6) és (7) hivatkozásban szerepel.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények feldolgozása

Titrálási módszer

A pKa értéket a titrálási görbe 10 mért pontjához ki kell számítani. Az ilyen pKa értékek átlagát és szórását ki kell számítani. A módszernek tartalmaznia kell a standard bázis vagy sav mennyiségéhez viszonyított pH görbéjét, valamint táblázatos bemutatását.

Spektrofotometriás módszerek

Az egyes spektrumok esetén kapott abszorbancia- és pH-értékeket táblázatba kell foglalni. A pKa-ra legalább öt értéket kell kiszámítani a közbenső spektrumok adatpontjaiból, és ezen eredmények átlagát és szórását is meg kell határozni.

Konduktometriás módszer

Az ekvivalens vezetőképességet (Λ) minden egyes savkoncentrációhoz, továbbá egy savegyenérték és 0,98 egyenérték karbonátmentes nátrium-hidroxid keverékének minden egyes koncentrációjához ki kell számítani. A sav túlsúlyban van, hogy megelőzhető legyen a hidrolízis miatti OH túlsúly. Az 1/Λ-t Ö_C függvényében kell ábrázolni, és a só Λo értéke a nulla koncentrációra történő extrapolációval megtalálható.

A sav Λo értéke a H+ és a Na+ szakirodalmi értékei segítségével számítható ki. A pKa minden egyes koncentráció esetén az α = Λio és a Ka = α2C/(1 – α) képletből számítható ki. A Ka-ra jobb értékek kaphatók a mobilitásra és az aktivitásra tekintettel történő korrekcióval. A pKa értékek átlagát és szórását ki kell számítani.

Vizsgálati jegyzőkönyv

Valamennyi nyers adatot és pKa értéket, valamint a számítási módszert (az (1) hivatkozásban javasoltak szerint lehetőleg táblázatos formában) be kell mutatni, csakúgy, mint a fent ismertetett statisztikai paramétereket. A titrálási módszerek esetében részletezni kell a titrálószerek standardizálását.

A spektrofotometriás módszer esetében minden spektrumot be kell mutatni. A konduktometriás módszer esetében a cellaállandó meghatározásának részleteit dokumentálni kell. Az alkalmazott eljárásra, az analitikai módszerekre és bármely felhasznált puffer jellegére vonatkozó információkat meg kell adni.

A vizsgálati hőmérséklet(ek)et dokumentálni kell.

SZAKIRODALOM

(1) Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.

(2) Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).

(3) ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(4) Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.

(5) Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).

(6) ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(7) Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (lásd fent (4)).

(8)  Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).”

(2) A B. részben a B.5. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.5.    AKUT SZEMIRRITÁCIÓ/SZEMKORRÓZIÓ

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 405. vizsgálati iránymutatásában (2012) leírt módszerrel. A vegyi anyagok vizsgálatára vonatkozó OECD-iránymutatás rendszeres időközönként felülvizsgálat tárgyát képezi annak biztosítása érdekében, hogy tükrözze a rendelkezésre álló legjobb tudományos ismereteket. E vizsgálati iránymutatás korábbi felülvizsgálatai során különleges figyelmet fordítottak a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó összes információ értékelésével történő lehetséges javításokra, hogy elkerülhető legyen a laboratóriumi állatokon történő szükségtelen kísérletezés, és ezáltal tiszteletben lehessen tartani az állatjóléti szempontokat. A(z 1981-ben elfogadott és 1987-ben, 2002-ben és 2012-ben frissített) 405. vizsgálati iránymutatásban szerepel az az ajánlás, hogy az akut szemirritáció/szemkorrózió vizsgálatára előírt in vivo vizsgálat elvégzése előtt el kell végezni a rendelkezésre álló adatok bizonyító erejének elemzését (1). Ha nem áll rendelkezésre elegendő adat, azok mennyiségét ajánlott lépcsőzetes vizsgálatok alkalmazásával növelni (2) (3). A vizsgálati stratégia részét képezi validált és elfogadott in vitro vizsgálatok végzése, amelyek e vizsgálati módszer kiegészítésében kerülnek ismertetésre. A vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK rendelet ( 1 ) alkalmazásában integrált vizsgálati stratégia is szerepel a vonatkozó ECHA-iránymutatásban (21). Állatkísérletek csak akkor végezhetők, ha a rendelkezésre álló alternatív módszerek figyelembevételét, valamint a megfelelőnek ítélt módszerek alkalmazását követően megállapítást nyert a szükségességük. E frissített vizsgálati módszer szövegezésekor vannak olyan esetek, amikor e vizsgálati módszer alkalmazása továbbra is szükséges, vagy azt egyes szabályozási keretek előírják.

A legutóbbi frissítés elsősorban a fájdalomcsillapítók és az érzéstelenítők használatára összpontosított, azonban nem befolyásolta a vizsgálati iránymutatás alapvető koncepcióját és felépítését. Az ICCVAM ( 2 ) és egy független nemzetközi szakértői értékelő testület felülvizsgálta a helyi fájdalomcsillapítók, a szisztémás hatású érzéstelenítők és a kíméletes végpontok rutinszerű alkalmazásának hasznosságát és korlátozásait a szemirritáció in vivo biztonsági vizsgálata során (12). A felülvizsgálat megállapította, hogy a helyi fájdalomcsillapítók és a szisztémás hatású érzéstelenítők alkalmazásával a vizsgálat kimenetelének befolyásolása nélkül kiküszöbölhető a fájdalom és a szorongás nagy része vagy egésze, és azt javasolta, hogy ezeket az anyagokat mindig használják. Ez a vizsgálati módszer figyelembe veszi ezt a felülvizsgálatot. A helyi fájdalomcsillapítókat, a szisztémás hatású érzéstelenítőket és a kíméletes végpontokat rutinszerűen kell alkalmazni az akut szemirritáció és -korrózió in vivo vizsgálata során. Az alkalmazásuk alóli kivételeket meg kell indokolni. Az e módszer keretében ismertetett pontosítások lényegesen csökkenteni fogják, illetve kiküszöbölik az állatok fájdalmát és szorongását a legtöbb olyan vizsgálati helyzetben, amelyben az in vivo szembiztonsági vizsgálat továbbra is szükséges.

A kiegyensúlyozott előzetes fájdalomcsillapításnak magában kell foglalnia i. egy helyi fájdalomcsillapítóval (például proparakainnal vagy tetrakainnal) és egy szisztémás hatású érzéstelenítővel (például buprenorfinnal) végzett rutinszerű előkezelést, ii. (például buprenorfinnal és meloxicammal kiváltott) szisztémás fájdalomcsillapítás rutinszerű utókezelési ütemtervét, iii. az állatoknál esetlegesen jelentkező fájdalom és/vagy szorongás klinikai tüneteinek tervezett megfigyelését, nyomon követését és rögzítését, továbbá iv. valamennyi szemlézió jellegének, súlyosságának és alakulásának tervezett megfigyelését, nyomon követését és rögzítését. További részletek az alábbiakban ismertetett frissített eljárásokban találhatók. A vizsgálat zavarásának elkerülése érdekében a vizsgálati vegyi anyag beadását követően további helyi fájdalomcsillapítók vagy érzéstelenítők nem alkalmazhatók. Gyulladásgátló hatású fájdalomcsillapítók (például meloxicam) nem alkalmazhatók helyileg, és a szisztémásan alkalmazott dózisok nem zavarhatják a szemre gyakorolt hatásokat.

A fogalommeghatározások a vizsgálati módszer függelékében szerepelnek.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

A tudományos ésszerűség és az állatok kímélete érdekében nem szabad in vivo vizsgálatokat végezni mindaddig, amíg a vegyi anyag potenciális szemkorróziós/szemirritáló hatására vonatkozó összes rendelkezésre álló adatra vonatkozóan el nem végezték az adatok bizonyító erejének elemzését. Ilyen adatok az embereken és/vagy laboratóriumi állatokon elvégzett vizsgálatok eredményei, egy vagy több, szerkezetileg rokon anyag vagy keverékeik szemkorróziós/szemirritáló hatásaival kapcsolatos bizonyítékok, a vegyi anyag nagymértékű savasságát vagy lúgosságát igazoló adatok (4) (5), valamint a bőrkorrózióra és szemkorrózióra/-irritációra irányuló validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo vizsgálatokból kapott eredmények (6) (13) (14) (15) (16) (17). Előfordulhat, hogy a vizsgálatokat már az adatok bizonyító erejének elemzése előtt elvégezték, vagy éppen annak eredményeként végzik el.

Bizonyos vegyi anyagok esetében az ilyen elemzés annak szükségességét jelezheti, hogy el kell végezni a vegyi anyag szemkorróziós/szemirritációs potenciáljának in vivo vizsgálatát. Minden ilyen esetben az in vivo szemvizsgálat alkalmazásának tervbevétele előtt először lehetőleg a vegyi anyag in vitro és/vagy in vivo bőrkorróziós hatásainak vizsgálatát kell elvégezni, és azt a B.4. vizsgálati módszeren belüli lépcsőzetes vizsgálati stratégiának (7) vagy az ECHA-iránymutatásban ismertetett integrált vizsgálati stratégiának (21) megfelelően kell kiértékelni.

A lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amely magában foglalja validált in vitro vagy ex vivo szemkorróziós/szemirritációs vizsgálatok elvégzését is, e vizsgálati módszer kiegészítésében és – a REACH alkalmazásában – az ECHA-iránymutatásban (21) kerül ismertetésre. Az in vivo vizsgálatok elvégzése előtt ilyen vizsgálati stratégia követése javasolt. Új vegyi anyagok esetében lépcsőzetes vizsgálati megközelítés javasolt a vegyi anyag korróziós/irritáló hatásaira vonatkozó, tudományos szempontból megfelelő adatok gyűjtésére. Ismert vegyi anyagok esetében, ha nem áll rendelkezésre elegendő adat a bőrkorróziós/bőrirritáló és szemkorróziós/szemirritáló hatásokról, e stratégia alkalmazásával pótolhatók a hiányzó adatok. Megfelelően meg kell indokolni, ha ettől eltérő vizsgálati stratégiát vagy eljárást alkalmaznak, vagy ha úgy döntenek, hogy nem használják a lépcsőzetes vizsgálati megközelítést.

AZ IN VIVO VIZSGÁLAT ELVE

Szisztémás hatású fájdalomcsillapítóval történő előkezelést és megfelelő helyi érzéstelenítők alkalmazását követően a vizsgálandó vegyi anyagot egyetlen dózisban kell alkalmazni a kísérleti állat egyik szemén; a nem kezelt szem szolgál kontrollként. A szemirritáció/szemkorrózió mértékét meghatározott időközönként a kötőhártya, a szaruhártya és a szivárványhártya lézióinak pontozásával kell kiértékelni. A hatások teljes kiértékelése érdekében részletesen ismertetni kell a szemre gyakorolt egyéb hatásokat és a káros szisztémás hatásokat is. A vizsgálat időtartamának elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy meg lehessen határozni a hatások visszafordíthatóságát vagy visszafordíthatatlanságát.

A vizsgálat bármely fázisában súlyos szorongás és/vagy fájdalom vagy az e vizsgálati módszerben (lásd a 26. pontot) ismertetett kíméletes végpontoknak megfelelő léziók jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani, és a vegyi anyagot ennek megfelelően kell értékelni. Az elhullás közelében lévő és súlyosan szenvedő állatok humánus módon történő elpusztításáról szóló döntéssel kapcsolatos kritériumok OECD-iránymutatás (8) tárgyát képezik.

AZ IN VIVO VIZSGÁLAT ELŐKÉSZÍTÉSE

A fajok kiválasztása

A preferált laboratóriumi állatfaj az albínó nyúl, és egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni. Más törzsek vagy fajok alkalmazását megfelelően meg kell indokolni.

Az állatok előkészítése

A vizsgálat megkezdése előtti 24 órában a vizsgálatra ideiglenesen kiválasztott kísérleti állat mindkét szemét meg kell vizsgálni. Szemirritációt, szemhibákat vagy korábban szerzett szaruhártya-sérülést mutató állatokat nem szabad használni.

Tartási és etetési körülmények

Az állatokat egyenként kell elhelyezni. Nyulak esetében a kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérsékletének 20 °C (± 3 °C)-nak kell lennie. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot; a célérték az 50–60 %. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. A túlzott fényerősség kerülendő. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett.

VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

Helyi érzéstelenítők és szisztémás hatású fájdalomcsillapítók alkalmazása

A szembiztonsági vizsgálatok során jelentkező fájdalom és szorongás elkerülése, illetve minimálisra csökkentése érdekében az alábbi eljárások javasoltak. Más, helyettesítő eljárások is választhatók, amennyiben bizonyítottan ugyanolyan hatékonyan vagy hatékonyabban biztosítják a fájdalom és a szorongás elkerülését vagy enyhítését.

 A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása előtt hatvan perccel szubkután injekcióval 0,01 mg/kg buprenorfint kell beadni a szisztémás fájdalomcsillapítás terápiás szintjének biztosítása érdekében. A szisztémásan beadott buprenorfin és más hasonló, szisztémásan beadott ópiumtartalmú fájdalomcsillapítók esetében nem ismert, illetve nem várható, hogy megváltoztatják a szemreakciókat (12).

 A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása előtt öt perccel mindkét szemre egy vagy két csepp helyi érzéstelenítőt (pl. 0,5 % proparakain-hidrokloridot vagy 0,5 % tetrakain-hidrokloridot) kell alkalmazni. A vizsgálat esetleges zavarásának elkerülése érdekében tartósítószert nem tartalmazó helyi érzéstelenítő javasolt. A vizsgálati vegyi anyaggal nem, de helyi érzéstelenítővel kezelt állatok szeme szolgál kontrollként. Ha a vizsgálati vegyi anyag előreláthatólag jelentős fájdalmat és szorongást okoz, azt szokásosan nem szabad in vivo vizsgálni. Kétség felmerülése vagy a vizsgálat szükségessége esetén azonban mérlegelni kell a helyi érzéstelenítőnek a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása előtti ötperces időközönkénti további alkalmazását. A felhasználóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a helyi érzéstelenítők többszöri alkalmazása kismértékben növelheti a vegyi anyagok okozta léziók súlyosságát és/vagy az e léziók megszűnéséhez szükséges időt.

 A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után nyolc órával szubkután injekcióval 0,01 mg/kg buprenorfint és 0,5 mg/kg meloxicamot kell beadni a szisztémás fájdalomcsillapítás terápiás szintjének fenntartása érdekében. Bár nincsenek arra utaló adatok, hogy a meloxicam napi egyszeri szubkután beadása gyulladásgátló hatást fejtene ki a szemre, a vizsgálat esetleges zavarásának elkerülése érdekében meloxicam a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után legalább 8 óráig nem adható be (12).

 A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása utáni első 8 órás kezelést követően 12 óránként szubkután injekcióval 0,01 mg/kg buprenorfint, ezzel együtt 24 óránként szubkután injekcióval 0,5 mg/kg meloxicamot kell beadni, amíg a szemléziók be nem gyógyulnak, továbbá fájdalom és szorongás klinikai tünetei nem jelentkeznek. Rendelkezésre állnak olyan retard fájdalomcsillapító készítmények, amelyek használatát mérlegelni lehet a fájdalomcsillapító beadása gyakoriságának csökkentése érdekében.

 A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után azonnal »mentő« fájdalomcsillapítást kell végezni, ha az előzetes fájdalomcsillapítás és a helyi érzéstelenítés nem megfelelő. Ha a vizsgálat során az állatok fájdalom és szorongás jeleit mutatják, a szubkután injekcióval 12 óránként beadott 0,01 mg/kg helyett szubkután injekcióval 0,03 mg/kg »mentő« buprenorfin-dózist kell azonnal beadni, és ezt szükség esetén 8 óránként meg kell ismételni. A »mentő« buprenorfin-dózissal együtt 24 óránként, szubkután injekcióval 0,5 mg/kg meloxicamot kell beadni, amely azonban a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után legalább 8 órán át nem adható be.

A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása

A vizsgálati vegyi anyagot az alsó szemhéj óvatos elhúzása után az állat egyik szemének kötőhártyazsákjába kell bejuttatni. Ezt követően körülbelül egy másodpercig óvatosan össze kell fogni a szemhéjakat, hogy az anyag ki ne essen vagy ki ne folyjon. A másik, nem kezelt szem kontrollként szolgál.

Öblögetés

A kísérleti állatok szemét a vizsgálati vegyi anyag becseppentése után legalább 24 órán át nem szabad kimosni, kivéve szilárd anyagok alkalmazása esetén (lásd a 18. pontot), illetve ha azonnali korróziós vagy irritáló hatások tapasztalhatók. Ha szükségesnek tűnik, 24 óra múlva ki lehet mosni az állatok szemét.

Nem javasolt kísérőcsoport alkalmazása a mosás hatásának vizsgálatára, kivéve, ha az tudományosan indokolt. Ha kísérőcsoport szükséges, akkor ehhez két nyulat kell használni. A mosás körülményeit, pl. a mosás időpontját, a mosóoldat összetételét és hőmérsékletét, a mosás időtartamát és sebességét, valamint az alkalmazott térfogatot részletesen dokumentálni kell.

Dózisszintek

(1)    Folyadékok vizsgálata

Folyadékok vizsgálata esetén 0,1 ml-es dózist kell alkalmazni. Pumpás spray-ket nem szabad a vegyi anyag közvetlenül a szembe való permetezésére használni. A spray-t ki kell fújni, és tartalmát egy edényben össze kell gyűjteni, mielőtt 0,1 ml-t az állat szemébe cseppentenének.

(2)    Szilárd anyagok vizsgálata

Szilárd anyagok, masszák és szemcsés vegyi anyagok vizsgálata esetén az alkalmazott mennyiségnek 0,1 ml térfogatúnak kell lennie, illetve tömege nem haladhatja meg a 100 mg-ot. A vizsgálati vegyi anyagot finom porrá kell őrölni. Térfogatmérés előtt óvatosan össze kell tömöríteni, pl. a mérőedény megkocogtatásával. Amennyiben az első megfigyelési időpontban, azaz a kezelés után 1 órával azt tapasztalják, hogy a szilárd vizsgálati vegyi anyagot a fiziológiai mechanizmusok nem távolították el a kísérleti állat szeméből, a szemet sóoldattal vagy desztillált vízzel ki lehet öblögetni.

(3)    Aeroszolok vizsgálata

A szembe cseppentés előtt ajánlatos minden pumpás spray tartalmát és aeroszolt összegyűjteni. Az egyetlen kivételt ez alól a túlnyomásos aeroszolos flakonokban lévő vegyi anyagok képezik, amelyeket a párolgás miatt nem lehet összegyűjteni. Ilyen esetekben az állat szemét nyitva kell tartani, és a vizsgálati vegyi anyagot úgy kell a szembe juttatni, hogy a flakont 10 cm távolságban közvetlenül a szem előtt tartva és körülbelül egy másodpercig működtetve egyszer belefújnak az állat szemébe. A spray nyomásától és tartalmától függően a távolság ettől eltérő is lehet. Vigyázni kell arra, hogy a spray nyomása ne okozzon szemkárosodást. Megfelelő esetekben szükség lehet a spray ereje okozta »mechanikai« szemkárosodás lehetőségének figyelembevételére.

Az aeroszol dózisa a vizsgálat következő módon végzett szimulációjával becsülhető meg: a vegyi anyagot mérőpapírra kell permetezni egy olyan, közvetlenül a papír elé helyezett nyíláson keresztül, amelynek mérete megegyezik a nyúl szemének méretével. A szembe permetezett mennyiség közelítő becslésére a papír tömegének növekedése használatos. Illékony vegyi anyagok esetében a dózist úgy lehet megbecsülni, hogy a vizsgálati vegyi anyag eltávolítása előtt és után is megmérik a befogadó edény tömegét.

Kiindulási vizsgálat (egy állat alkalmazásával végzett in vivo szemirritációs/szemkorróziós vizsgálat)

Kifejezetten javasolt, hogy az in vivo vizsgálatra először egy állat alkalmazásával kerüljön sor (lásd e vizsgálati módszer kiegészítését: Lépcsőzetes vizsgálati stratégia szemirritáció és szemkorróziós hatás vizsgálatához). A megfigyeléseknek lehetővé kell tenniük a súlyosság és a visszafordíthatóság meghatározását, mielőtt egy második állaton végzett megerősítő vizsgálatra kerülne sor.

Ha e vizsgálat eredményei szerint az ismertetett eljárás alkalmazásával a vegyi anyag korróziós hatású vagy súlyosan irritálja a szemet, nem szabad további szemirritációs vizsgálatokat végezni.

Megerősítő vizsgálat (további állatok alkalmazásával végzett in vivo szemirritációs vizsgálat)

Ha a kiindulási vizsgálat során nem figyelhető meg korróziós vagy súlyos irritáló hatás, legfeljebb további két állat alkalmazásával ellenőrizni kell az irritációs vagy negatív válaszreakciókat. Ha a kiindulási vizsgálat során irritációs válasz tapasztalható, a megerősítő vizsgálatot ajánlatos lépcsőzetesen, egyszerre egy állaton elvégezni a két további állat egyszerre történő expozíciója helyett. Ha a második állat korróziós vagy súlyos irritáló hatásokat mutat, a vizsgálatot nem szabad folytatni. Ha a második állat eredményei elegendőek a veszélyességi osztály meghatározásához, akkor további vizsgálatokat nem szabad folytatni.

Megfigyelési időszak

A megfigyelési időszak hosszát úgy kell megválasztani, hogy elegendő legyen a megfigyelt hatások mértékének és visszafordíthatóságának teljes kiértékelésére. A kísérletet azonban azonnal be kell fejezni, ha az állat súlyos fájdalom vagy szorongás jeleit mutatja (8). A hatások visszafordíthatóságának meghatározásához az állatokat általában a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után 21 napig kell megfigyelni. Ha a visszafordíthatóság a 21 napos időszak vége előtt bebizonyosodik, a kísérletet ekkor be kell fejezni.

Klinikai megfigyelések és a szemreakciók értékelése

A szemeket érintően a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után egy órával átfogó értékelést kell végezni arra nézve, hogy előfordulnak-e szemléziók vagy sem; ezt napi szintű értékelések követik. Az állatokat az első három napon naponta többször ki kell értékelni annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálat befejezésére vonatkozó döntések meghozatalára időben sor kerüljön. A kísérleti állatokon a vizsgálat teljes időtartama alatt legalább naponta kétszer, minimum 6 órás intervallumokkal, vagy szükség esetén gyakrabban kell rutinszerű értékelést végezni a fájdalom és/vagy szorongás klinikai tünetei szempontjából (pl. a szem többszöri tapogatása vagy dörzsölése, túlzott pislogás, túlzott könnyezés) (9) (10) (11). Az állatokat i. megfelelően meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy van-e fájdalomra vagy szorongásra utaló bizonyíték, annak érdekében, hogy megalapozott döntéseket lehessen hozni a fájdalomcsillapító-adagolás növelésének szükségességéről, valamint ii. abból a szempontból, hogy van-e megállapított kíméletes végpontokra utaló bizonyíték, annak érdekében, hogy megalapozott döntéseket lehessen hozni arról, hogy helyénvaló-e az állatokon humánus módon eutanáziát végrehajtani, továbbá biztosítani lehessen, hogy e döntések meghozatalára időben sor kerüljön. Fluoreszcein festést rutinszerűen kell alkalmazni, és megfelelőnek ítélt esetben a szemkárosodás kimutatására és mérése szolgáló segédeszközként, valamint a humánus eutanázia tekintetében megállapított végpont-kritériumok teljesülésének értékelésére réslámpás biomikroszkópot kell használni (pl. szaruhártya-fekélyesedés fennállása esetén megvizsgálva a sérülés mélységét). A megfigyelt léziókról készült digitális fényképek gyűjthetők referenciaként, valamint a szemkárosodási mérték tartós rögzítésének biztosítása érdekében. Ha már megvan a döntő információ, az állatokat nem szabad a szükségesnél hosszabb ideig a kísérletben tartani. A súlyos fájdalmat vagy szorongást mutató állatokat haladéktalanul és humánus módon el kell pusztítani, és a vegyi anyagot ennek megfelelően kell értékelni.

A becseppentés után az alábbi szemléziókat mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani (a léziók fokozatait lásd az 1. táblázatban): szaruhártya-perforálódás vagy jelentős mértékű szaruhártya-fekélyesedés, ezen belül staphyloma (a szaruhártya rendellenes kidomborodása); vér jelenléte a szem elülső szemzugában; negyedfokú szaruhártya-homály; a fényreflex 72 órán át tartó hiánya (másodfokú szivárványhártya-válaszreakció); a kötőhártya fekélyesedése; a kötőhártyában vagy a pislogóhártyában jelentkező szövetelhalás; vagy leválás. Erre azért van szükség, mert az ilyen léziók általában nem visszafordíthatók. Javasolt továbbá, hogy a vizsgálatoknak a tervezett 21 napos megfigyelési időszak vége előtti befejezéséhez az alábbi szemléziókat használják kíméletes végpontokként. Ezek a léziók súlyosan irritáló vagy korróziós hatású sérülések, valamint olyan sérülések előrejelzésének minősülnek, amelyek várhatóan nem fordulnak vissza teljesen a 21 napos megfigyelési időszak végéig: a sérülés súlyos mélysége (pl. a stroma felületi rétegein túlra kiterjedő szaruhártya-fekélyesedés), a szaruhártyaszél 50 %-osnál nagyobb mértékű rongálódása (ahogyan azt az alsó szemhéj szöveteinek elfehéredése bizonyítja), valamint súlyos szemfertőzés (gennyes váladék). A következők kombinációja: a szaruhártya felületének vaszkularizációja (azaz pannus); a fluoreszceinnel megfestett terület a naponta végzett értékelés alapján az idő múlásával nem csökken; és/vagy a vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után öt nappal elmarad az újrahámosodás, szintén a vizsgálat korai befejezésére vonatkozó klinikai döntést potenciálisan befolyásoló, hasznos kritériumnak minősül. E megállapítások azonban önmagukban nem elegendőek a vizsgálat korai befejezésére vonatkozó döntés indokolásához. A szemre gyakorolt súlyos hatások meghatározását követően laboratóriumi állatokat kezelő állatorvossal vagy ilyen állatokra szakosodott állatorvossal, illetve a klinikai léziók azonosítására képesítéssel rendelkező személyzettel kell konzultálni annak meghatározására szolgáló klinikai vizsgálat érdekében, hogy e hatások kombinációja indokolja-e a vizsgálat korai befejezését. A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása után 1, 24, 48 és 72 óra elteltével meg kell mérni és rögzíteni kell a szemreakciókat (kötőhártya-, szaruhártya- és szivárványhártya-reakciók) (1. táblázat). A szemléziókat nem mutató állatokat legkorábban a becseppentés után 3 nappal lehet elpusztítani. A nem súlyos szemléziókat mutató állatokat legalább addig megfigyelés alatt kell tartani, amíg a léziók meg nem szűnnek, vagy legfeljebb 21 napig, amikor a vizsgálat befejeződik. A léziók állapotának és visszafordíthatóságának vagy visszafordíthatatlanságának meghatározása érdekében legalább az 1., a 24. a 48., a 72. órában, a 7., a 14. és a 21. napon kell megfigyelést végezni, és azt dokumentálni kell. Gyakrabban kell megfigyeléseket végezni, ha az szükséges annak meghatározásához, hogy a kísérleti állaton humánus megfontolásból eutanáziát kell-e végrehajtani, vagy negatív eredmények miatt el kell-e azokat távolítani a vizsgálatból.

A szemléziók mértékét (1. táblázat) minden egyes vizsgálatkor fel kell jegyezni. A szem bármely egyéb lézióját (pl. pannus, elszíneződés, elülső szemzug elváltozásai) vagy a káros szisztémás hatásokat szintén dokumentálni kell.

A reakciók vizsgálatát megkönnyítheti egy binokuláris kézi nagyító, egy kézi réslámpa, egy biomikroszkóp vagy bármely más megfelelő eszköz alkalmazása. A 24 óra után tett megfigyelések rögzítését követően a szemek még fluoreszcein segítségével is megvizsgálhatók.

A szemreakciók értékelése elkerülhetetlenül szubjektív. A szemreakciók értékelésének harmonizálása és a vizsgáló laboratóriumok, illetve a megfigyelésekben és azok értékelésében részt vevők segítése érdekében a megfigyeléseket végző személyzetet megfelelően ki kell képezni az alkalmazott értékelési rendszer használatára.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények értékelése

A szemirritációs pontszámokat a léziók jellegével és súlyosságával, illetve visszafordíthatóságukkal vagy visszafordíthatatlanságukkal összefüggésben kell meghatározni. Az egyes pontszámok nem jelentenek abszolút normát a vegyi anyagok irritációs tulajdonságai tekintetében, mivel a vizsgálati vegyi anyag egyéb hatásai is értékelés tárgyát képezik. Az egyes pontszámokat ehelyett referenciaértékeknek kell tekinteni, amelyeknek csak akkor van jelentőségük, ha az összes megfigyelés ismertetése és értékelése alátámasztja ezeket.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Az in vivo vizsgálatok indokolása: a korábban rendelkezésre álló vizsgálati adatok, ezen belül a lépcsőzetes vizsgálati stratégia során nyert adatok bizonyító erejének elemzése:

 a korábbi vizsgálatokból rendelkezésre álló, vonatkozó adatok ismertetése;

 a vizsgálati stratégia egyes szakaszaiban nyert adatok;

 az elvégzett in vitro vizsgálatok, ezen belül az eljárások, illetve a vizsgálati/referenciaanyagokkal kapott eredmények részleteinek ismertetése;

 az elvégzett in vivo bőrirritációs/bőrkorróziós vizsgálatok és a kapott eredmények ismertetése;

 az adatok bizonyító erejének elemzése az in vivo vizsgálat elvégzéséhez.

Vizsgálati vegyi anyag:

 azonosító adatok (pl. kémiai név, és a CAS-szám, amennyiben rendelkezésre áll; tisztaság; ismert szennyeződések; forrás; tételszám);

 fizikai megjelenés és fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. pH, illékonyság, oldhatóság, stabilitás, vízzel való reakcióképesség);

 keverék esetén azonosítandók a komponensek, többek között közlendők az azokat alkotó anyagok azonosító adatai (pl. kémiai név és a CAS-szám, amennyiben rendelkezésre áll) és a koncentrációjuk;

 az alkalmazott dózisok.

Vivőanyag:

 név, (adott esetben) koncentráció, alkalmazott térfogat;

 a vivőanyag megválasztásának indoklása.

Kísérleti állatok:

 az alkalmazott faj/törzs, adott esetben az albínó nyúltól eltérő faj alkalmazásának indoklása;

 az egyes állatok életkora a vizsgálat kezdetén;

 az állatok száma ivaronként a vizsgálati és kontrollcsoportokban (ha szükséges);

 az egyes állatok testtömege a vizsgálat előtt és végén;

 származás, tartási körülmények, takarmány stb.

Érzéstelenítők és fájdalomcsillapítók

 a helyi érzéstelenítők és a szisztémás hatású fájdalomcsillapítók beadásának dózisai és időpontjai;

 helyi érzéstelenítő alkalmazása esetén a szer neve, tisztasága, típusa, valamint a vizsgálati vegyi anyaggal való esetleges kölcsönhatása.

Eredmények:

 az irritáció értékelésére az egyes megfigyelési időpontokban alkalmazott módszer (pl. kézi réslámpa, biomikroszkóp, fluoreszcein) ismertetése;

 az irritációs/korróziós válaszreakció-adatok táblázatos megjelenítése mindegyik állatra vonatkozóan mindegyik megfigyelési időpontban egészen az állatoknak a vizsgálatból való kivételéig;

 a megfigyelt irritáció vagy korrózió jellegének és mértékének leíró jellegű ismertetése,

 a szemben megfigyelt bármely egyéb lézió (pl. vaszkularizáció, pannusképződés, összetapadások, elszíneződés) ismertetése;

 a szemen kívül jelentkező káros lokális és szisztémás hatások ismertetése, a fájdalom és a szorongás klinikai tüneteinek rögzítése, digitális fényképek, valamint adott esetben a kórszövettani eredmények ismertetése.

Az eredmények tárgyalása

Az eredmények kiértékelése

A laboratóriumi állatokon végzett szemirritációs vizsgálatok eredményeinek emberre extrapolálása csak korlátozott érvényességű. Az albínó nyúl sok esetben érzékenyebb a szemirritáló vagy -korróziós anyagokra, mint az ember.

Ügyelni kell arra, hogy az adatok kiértékelése során kizárják a másodlagos fertőzés eredményeként jelentkező irritációt.

SZAKIRODALOM

(1) Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410–429.

(2) de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159–164.

(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

(4) Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.

(5) Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.

(6) Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp. 483–524.

(7) E melléklet B.4., Akut bőrirritáció/bőrkorrózió című fejezete.

(8) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9) Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20–36.

(10) National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(11) National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(12) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.

http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm

(13) E melléklet B.40., In vitro bőrkorrózió: transzkután elektromos rezisztencia vizsgálat (TER) című fejezete.

(14) E melléklet B.40A., In vitro bőrkorrózió: emberi bőrmodellen végzett vizsgálat című fejezete.

(15) OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(16) E melléklet B.47., Szarvasmarha-szaruhártya opacitásának és permeabilitásának mérésén alapuló vizsgálati módszer i. a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok és ii. a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására című fejezete.

(17) E melléklet B.48., Izolált csirkeszem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszer i. a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok és ii. a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására című fejezete.

(18) U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.

(19) UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications.

(20) EK (2008), Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatályon kívül helyezéséről, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról. (HL L 353., 2008.12.31., 1. o.)

(21) ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance.

http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf



1. táblázat

A szemléziók osztályozása

Szaruhártya

Fokozat

Homályosság: a homályosság mértéke (az érték megállapításához a legsűrűbb területet kell venni) (1)

 

Nem észlelhető fekélyesedés vagy homályosság

0

Szórványos vagy diffúz homályos területek (a megszokott csillogás enyhe tompulásán kívül), a szivárványhártya részletei tisztán láthatók

1

Könnyen kivehető áttetsző terület; a szivárványhártya részletei kissé elhomályosodottak

2

Gyöngyházfényű terület; a szivárványhártya semmilyen részlete nem látható; a pupilla mérete alig észlelhető

3

Nem átlátszó szaruhártya; a szivárványhártya egyáltalán nem látható

4

Lehetséges maximum: 4

 

Szivárványhártya

 

Normális

0

Észrevehetően mélyebb redők, vérbőség, duzzanat, mérsékelt vérbőség a szaruhártya körül; vagy belövelltség; a szivárványhártya fényre reagál (a lassú reakció is pozitív)

1

Vérzés, nagymérvű roncsolódás, vagy nem reagál a fényre

2

Lehetséges maximum: 2

 

Kötőhártya

 

Vörösödés (a szemhéjak és a szemgolyó kötőhártyájára vonatkozik; kivéve a szaruhártyát és a szivárványhártyát)

 

Normális

0

Egyes vérerek vérteltek (belövelltek)

1

Diffúz, bíborvörös szín; az egyes vérerek nehezen kivehetők

2

Diffúz erőteljes vörös

3

Lehetséges maximum: 3

 

Kötőhártya-vizenyő (chemosis)

 

Duzzanat (a szemhéjak és/vagy a pislogóhártyák esetében)

 

Normális

0

A normálisnál kissé duzzadtabb

1

Nyilvánvaló duzzanat, a szemhéjak részleges kifordulásával

2

Duzzanat, nagyjából félig zárt szemhéjakkal

3

Duzzanat, és a szemhéjak több mint félig zárva vannak

4

Lehetséges maximum: 4

 

(*1)   A szaruhártya homályos területének nagyságát fel kell jegyezni

Függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Sav-/alkálitartalék : savas készítmények esetében a nátrium-hidroxid meghatározott pH kialakításához szükséges, a készítmény 100 grammjára vetített (grammban kifejezett) mennyisége. Lúgos készítmények esetében a nátrium-hidroxid meghatározott pH kialakításához szükséges, a készítmény 100 grammjára vetített, grammban kifejezett kénsav mennyiségével egyenértékű (grammban kifejezett) mennyisége (Young et al. 1988).

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Szemirritációt nem okozó anyag : a szemirritációt okozó anyagok EPA szerinti I., II. vagy III., a GHS szerinti 1., 2., 2A. vagy 2B., illetve az EU szerinti 1. vagy 2. kategóriájába nem tartozó anyag (17) (18) (19).

Szemkorróziót okozó anyag : a) a szemben visszafordíthatatlan szövetkárosodást okozó anyag; b) a GHS szerinti 1., az EPA szerinti I., illetve az EU szerinti 1. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó vegyi anyag (17) (18) (19).

Szemirritációt okozó anyag : a) olyan vegyi anyag, amely visszafordítható elváltozást okoz a szemben; b) az EPA szerinti II. vagy III., a GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B, illetve az EU szerinti 2. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó vegyi anyag (17) (18) (19).

Súlyos szemirritációt okozó anyag : a) olyan vegyi anyag, amely 21 napon belül meg nem szűnő szövetkárosodást vagy a fizikai látóképesség súlyos romlását okozza; b) a GHS szerinti 1., az EPA szerinti I. vagy az EU szerinti 1. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó anyag (17) (18) (19).

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Lépcsőzetes megközelítés : olyan lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben áttekintik, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének elemzésével meghatározzák, hogy a következő szintre való továbblépés előtt a veszélyességi osztályozásra vonatkozó döntéshez elegendő információ áll-e rendelkezésre. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megállapítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcsőben egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelmű besorolás meg nem állapítható.

Az adatok bizonyító erejének mérlegelése (mérlegelési folyamata) : Az egyes adatok alapján nem feltétlenül nyilvánvaló következtetést megalapozó, az összegyűjtött információkra vonatkozó érvek és ellenérvek alkalmazása.

A B.5. VIZSGÁLATI MÓDSZER KIEGÉSZÍTÉSE ( 3 )

LÉPCSŐZETES VIZSGÁLATI STRATÉGIA SZEMIRRITÁCIÓ ÉS SZEMKORRÓZIÓS HATÁS VIZSGÁLATÁHOZ

Általános megfontolások

A tudományos ésszerűség és az állatok kímélete érdekében fontos, hogy elkerülhető legyen az állatokkal való szükségtelen kísérletezés, illetve minimálisra lehessen csökkenteni azoknak a vizsgálatoknak a számát, amelyek valószínűleg súlyos válaszreakciókat váltanak ki a kísérleti állatokban. Az in vivo vizsgálatok fontolóra vétele előtt minden, a vegyi anyag potenciális szemirritáló/szemkorróziós hatásával összefüggő információt ki kell értékelni. Előfordulhat, hogy már elegendő bizonyíték létezik a vizsgálati vegyi anyag szemirritációs vagy szemkorróziós potenciál szempontjából történő besorolására anélkül, hogy laboratóriumi állatokon kísérleteket kellene végezni. Az adatok bizonyító erejének elemzésével és a lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával tehát minimálisra csökkenthető az in vivo vizsgálatok szükségszerűsége, különösen, ha a vegyi anyag valószínűsíthetően súlyos reakciókat okoz.

A vegyi anyagok szemirritáló és szemkorróziós hatásával kapcsolatban rendelkezésre álló információk értékelésre javasolt elvégezni az adatok bizonyító erejének elemzését annak meghatározása érdekében, hogy az in vivo szemvizsgálatokon kívül szükség van-e egyéb vizsgálatokra az irritáló/korróziós potenciál jellemzéséhez. Ha további vizsgálatokra van szükség, a vonatkozó kísérleti adatok összegyűjtéséhez a lépcsőzetes vizsgálati stratégiát javasolt alkalmazni. Az olyan anyagok esetében, amelyeket korábban nem vizsgáltak, az anyag szemkorróziós/szemirritációs potenciáljának értékeléséhez szükséges adatsor előállításához a lépcsőzetes vizsgálati stratégiát kell alkalmazni. Az e kiegészítésben ismertetett kiindulási vizsgálati stratégiát egy OECD-munkaértekezleten (1) dolgozták ki, majd később a vegyi anyagok humán egészségügyi és környezeti hatásainak osztályozására szolgáló harmonizált integrált veszélyosztályozási rendszer keretében 1998 novemberében a Vegyi Anyag Bizottság és a Vegyi Anyag Munkacsoport 28. együttes ülésén jóváhagyták és kibővítették (2), és azt 2011-ben egy OECD-szakértői csoport naprakésszé tette.

Bár ez a vizsgálati stratégia nem képezi a B5. vizsgálati módszer szerves részét, kifejezésre juttatja a szemirritációs/szemkorróziós tulajdonságok meghatározására ajánlott megközelítést. Ez a megközelítés jelenti a bevált gyakorlatot, és etikai szempontból is irányadó az in vivo szemirritációs/szemkorróziós vizsgálatokhoz. A vizsgálati módszer útmutatást ad az in vivo vizsgálatok elvégzéséhez, és összefoglalja azokat a tényezőket, amelyekre az ilyen vizsgálatok mérlegelése előtt ki kell térni. A lépcsőzetes vizsgálati stratégia az adatok bizonyító erején alapuló megközelítést biztosít a vegyi anyagok szemirritációs/szemkorróziós tulajdonságaival kapcsolatos meglévő adatok értékeléséhez, valamint lépcsőzetes megközelítést biztosít azon vegyi anyagok vonatkozó adatainak összegyűjtéséhez, amelyekhez további vizsgálatokra van szükség, vagy amelyeket korábban egyáltalán nem vizsgáltak. A stratégia magában foglalja továbbá, hogy először validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo vizsgálatokat kell végezni, majd meghatározott körülmények mellett a B.4. vizsgálati módszerrel további vizsgálatokat (3) (4) kell lefolytatni.

A lépcsőzetes vizsgalati stratégia ismertetése

A vizsgálatoknak a lépcsőzetes vizsgálati stratégia (ábra) keretében történő elvégzése előtt minden rendelkezésre álló információt ki kell értékelni annak meghatározása érdekében, hogy szükség van-e in vivo szemvizsgálatokra. Bár egy-egy paraméter (pl. szélsőséges pH-érték) vizsgálatából is jelentős mennyiségű információ nyerhető ki, az összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell venni. A kérdéses vegyi anyag vagy szerkezeti analógjai hatásaival kapcsolatos összes vonatkozó adatot értékelni kell az adatok bizonyító erejéről való döntés meghozatalakor, és meg is kell indokolni ezt a döntést. Elsődleges hangsúlyt kell fektetni a vegyi anyaggal kapcsolatban rendelkezésre álló humán és állatkísérletek adataira, ezt követően az in vitro vagy ex vivo vizsgálatok eredményére. Lehetőség szerint kerülni kell korróziós hatású vegyi anyagok in vivo vizsgálatát. A vizsgálati stratégia során figyelembe veendő tényezők többek között a következők:

Validált és nemzetközileg elfogadott módszerekből nyert, humán és/vagy állatokra vonatkozó és/vagy in vitro adatok (1. lépés).

Először is a rendelkezésre álló humán adatokat, pl. klinikai vagy munkaegészségügyi vizsgálatokat, valamint esettanulmányokat és/vagy állatokon végzett szemvizsgálatok adatait és/vagy a szemirritációra/szemkorrózióra vonatkozó, validált és nemzetközileg elfogadott módszerekből nyert, in vitro adatokat kell kiértékelni, mivel ezek a szemre gyakorolt hatásokkal közvetlenül összefüggő információkat szolgáltatnak. Ezt követően a rendelkezésre álló bőrkorróziós/bőrirritációs humán és/vagy állatkísérletek adatait és/vagy a bőrkorrózióra vonatkozó, validált és nemzetközileg elfogadott módszerek alapján rendelkezésre álló adatokat kell kiértékelni. Az ismerten szemkorróziós hatású vagy súlyosan szemirritáló vegyi anyagokat nem szabad állatok szemébe cseppenteni, ahogyan a bőrkorróziós és a súlyosan bőrirritáló hatású vegyi anyagokat sem; az ilyen vegyi anyagokat úgy kell tekinteni, hogy egyúttal szemkorróziós és/vagy szemirritáló hatásúak is. Nem szabad in vivo szemvizsgálatokat végezni olyan vegyi anyagokkal sem, amelyek esetében korábbi szemvizsgálatok alapján elegendő bizonyíték van az ilyen hatások hiányára.

A szerkezet-aktivitási összefüggések (SAR) elemzése (2. lépés).

Meg kell fontolni szerkezetileg rokon anyagok vizsgálatának eredményeit, ha rendelkezésre állnak ilyen eredmények. Ha a szerkezetileg rokon anyagokkal vagy keverékeikkel kapcsolatban elegendő olyan humán és/vagy állatkísérleti adat áll rendelkezésre, amely valószínűsíti a szemkorróziós/szemirritációs potenciált, feltételezhető, hogy a vizsgálati vegyi anyag ugyanilyen válaszreakciókat vált ki. Ilyen esetekben a vegyi anyagot nem feltétlenül kell megvizsgálni. A lépcsőzetes vizsgálati stratégia értelmében a szerkezetileg rokon anyagok vagy keverékeik vizsgálatából származó negatív adatok nem jelentenek elegendő bizonyítékot arra, hogy a vegyi anyag nem korróziós hatású vagy nem irritáló. A bőrre és a szemre gyakorolt hatások vonatkozásában is validált és elfogadott SAR-megközelítéseket kell alkalmazni a korróziós és irritáló potenciál meghatározására.

Fizikai-kémiai tulajdonságok és kémiai reakcióképesség (3. lépés).

A szélsőséges pH-értékű, például ≤2,0 vagy ≥11,5 kémhatású vegyi anyagok erőteljes lokális hatást gyakorolhatnak. Ha a szélsőséges pH-érték az alapja annak, hogy egy vegyi anyagot szemkorróziós vagy szemirritáló hatásúnak minősítsenek, akkor figyelembe lehet venni az anyag sav-/alkálitartalékát (pufferkapacitását) is (5)(6)(7). Ha a pufferkapacitás alapján valószínűsíthető, hogy a vegyi anyag nem lehet szemkorróziós hatású (azaz szélsőséges pH-értékű és alacsony sav-/alkálitartalékkal rendelkező vegyi anyag), akkor ennek megerősítésére további vizsgálatokat kell végezni, lehetőleg validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo vizsgálatok alkalmazásával (lásd a 10. pontot).

Más meglévő információk fontolóra vétele (4. lépés)

Ebben a fázisban a dermális alkalmazás esetén jelentkező szisztémás toxicitással kapcsolatban rendelkezésre álló összes információt ki kell értékelni. A vizsgálati vegyi anyag akut dermális toxicitását is fontolóra kell venni. Ha kimutatható, hogy a vizsgálati vegyi anyag dermális alkalmazás esetén erősen mérgező, előfordulhat, hogy nem kell a szemben megvizsgálni. Bár nem feltétlenül van összefüggés az akut dermális toxicitás és a szemirritáció/szemkorrózió között, fel kell tételezni, hogy ha egy szer dermálisan alkalmazva erősen mérgező, a szembe cseppentve is erősen mérgező lesz. Az ilyen adatokat a 2. és a 3. lépés között is figyelembe lehet venni.

A vegyi anyag bőrkorróziós hatásának értékelése, ha ezt szabályozási célból is előírják (5. lépés).

Először a bőrkorróziós és a súlyos irritációs potenciált kell értékelni a B.4. vizsgálati módszernek (4) és az azt kísérő kiegészítésnek (8) megfelelően, melynek során ki kell térni többek között a validált és nemzetközileg elfogadott in vitro bőrkorróziós vizsgálati módszerek alkalmazására (9) (10) (11). Ha kimutatható, hogy a vegyi anyag bőrkorróziót vagy súlyos bőrirritációt okoz, szemkorróziós vagy súlyosan szemirritáló hatású vegyi anyagnak is tekinthető. Ezért további vizsgálatra nem lenne szükség. Ha a vegyi anyag nem bőrkorróziós vagy nem súlyosan bőrirritáló hatású, in vitro vagy ex vivo szemvizsgálatot kell végezni.

In vitro vagy ex vivo vizsgálatok eredményei (6. lépés).

Nem kell állatokon kísérletezni olyan vegyi anyagokkal, amelyek validált és kimondottan a szem vagy a bőr korróziójának/irritációjának értékelésére nemzetközileg elfogadott módszerekkel végzett in vitro vagy ex vivo vizsgálatokban (12) (13) korróziós vagy súlyos irritáló hatást mutattak. Feltételezhető, hogy az ilyen vegyi anyagok in vivo is hasonlóan súlyos hatásokat váltanak ki. Ha nem állnak rendelkezésre validált és elfogadott in vitro/ex vivo vizsgálatok, át kell ugrani a 6. lépést és közvetlenül a 7. lépésre kell áttérni.

Nyulakon végzett in vivo vizsgálat (7. és 8. lépés).

Az in vivo szemvizsgálatokat egyetlen állatot alkalmazó kiindulási vizsgálattal kell kezdeni. Ha ennek eredményei szerint a vegyi anyag súlyosan szemirritáló vagy szemkorróziós hatású, nem szabad további vizsgálatokat végezni. Ha a kiindulási vizsgálat nem mutat ki semmilyen korróziós vagy súlyosan irritáló hatást, két további állat alkalmazásával megerősítő vizsgálatot kell végezni. A megerősítő vizsgálat eredményeitől függően további vizsgálatokra lehet szükség. [lásd a B.5. vizsgálati módszert]

VONATKOZÓ VIZSGÁLATI ÉS KIÉRTÉKELÉSI STRATÉGIA SZEMIRRITÁCIÓ, ILLETVE SZEMKORRÓZIÓS HATÁS VIZSGÁLATÁHOZ



 

Tevékenység

Eredmény

Következtetés

1

Szemre gyakorolt hatásokat kimutató, rendelkezésre álló humán és/vagy állatkísérleti adatok és/vagy validált és nemzetközileg elfogadott módszerek in vitro adatai

Súlyos szemkárosodás

Apikális végpont; szemkorróziós hatásúnak kell tekinteni. Nincs szükség vizsgálatokra.

Szemirritáló hatású

Apikális végpont; szemirritáló hatásúnak kell tekinteni. Nincs szükség vizsgálatokra.

Nem szemkorróziós, illetve nem szemirritáló hatású

Apikális végpont; nem szemkorróziós és nem szemirritáló hatásúnak kell tekinteni. Nincs szükség vizsgálatokra.

Bőrkorróziós hatásokat kimutató, rendelkezésre álló humán és/vagy állatkísérleti adatok és/vagy validált és nemzetközileg elfogadott módszerek in vitro adatai

Bőrkorróziós hatású

Szemkorróziós hatást kell feltételezni. Nincs szükség vizsgálatokra.

Súlyos bőrirritáló hatásokat kimutató, rendelkezésre álló humán és/vagy állatkísérleti adatok és/vagy validált és nemzetközileg elfogadott módszerek in vitro adatai

Súlyosan bőrirritáló

Szemirritáló hatást kell feltételezni. Nincs szükség vizsgálatokra.

 

 

nem áll rendelkezésre információ, illetve a rendelkezésre álló információk nem meggyőzőek

 

 

 

 

2

SAR-értékelést kell végezni a szemkorrózióra / szemirritációra vonatkozóan

Súlyos szemkárosodást jelez előre

Szemkorróziós hatást kell feltételezni. Nincs szükség vizsgálatokra.

Szemirritációt jelez előre

Szemirritáló hatást kell feltételezni. Nincs szükség vizsgálatokra.

SAR-értékelést kell mérlegelni a bőrkorrózióra vonatkozóan

Bőrkorróziót jelez előre

Szemkorróziós hatást kell feltételezni. Nincs szükség vizsgálatokra.

 

 

Nem lehet előrejelzést tenni, vagy az előrejelzések nem meggyőzőek vagy negatívak

 

 

 

 

3

Meg kell mérni a pH-t (adott esetben figyelembe kell venni a pufferkapacitást is)

pH ≤ 2 vagy ≥ 11,5 (nagy pufferkapacitással, amennyiben lényeges)

Szemkorróziós hatást kell feltételezni. Nincs szükség vizsgálatokra.

 

 

2 < pH < 11,5, vagy pH ≤ 2,0 vagy pH ≥ 11,5 alacsony vagy nulla pufferkapacitással, amennyiben lényeges

 

 

 

 

4

Figyelembe kell venni a dermális alkalmazás esetén fellépő szisztémás toxicitásra vonatkozó adatokat

Erősen mérgező olyan koncentrációknál, amelyeket a szemben vizsgálnának.

A vegyi anyag túlzottan mérgező ahhoz, hogy vizsgálni lehessen. Nincs szükség vizsgálatokra.

 

 

Nem áll rendelkezésre ilyen információ, vagy a vegyi anyag nem erősen mérgező

 

 

 

 

5

A bőrkorróziós potenciál e melléklet B.4. fejezetében található vizsgálati stratégiának megfelelően, kísérleti úton történő értékelése, ha szabályozási célra is szükséges

Korróziós hatás vagy súlyos irritációs hatás

Szemkorróziós hatásúnak kell feltételezni. Nincs szükség további vizsgálatokra.

 

 

A vegyi anyag nem bőrkorróziós hatású vagy nem súlyosan bőrirritáló

 

 

 

 

6

Validált in vitro vagy ex vivo szemkorróziós vizsgálato(k) elvégzése

Korróziós hatás vagy súlyos irritációs válasz

Szemkorróziós hatásúnak vagy súlyosan szemirritálónak kell feltételezni, amennyiben az elvégzett vizsgálat alkalmazható a korróziós hatású, illetve súlyosan irritáló vegyi anyagok azonosítására, és amennyiben a vegyi anyag a vizsgálat alkalmazási körébe tartozik. Nincs szükség további vizsgálatokra.

Irritációs hatás

Szemirritálónak kell feltételezni, amennyiben az elvégzett vizsgálat(ok) alkalmazható(k) a korróziós hatású, a súlyosan irritáló és az irritáló vegyi anyagok megfelelő azonosítására, és amennyiben a vegyi anyag a vizsgálat(ok) alkalmazási körébe tartozik. Nincs szükség további vizsgálatokra.

Nincs irritációs hatás

Nem szemirritálónak kell feltételezni, amennyiben az elvégzett vizsgálat(ok) alkalmazható(k) a nem irritáló vegyi anyagok megfelelő azonosítására, e vegyi anyagoknak a szemirritáló, súlyosan szemirritáló vagy szemkorróziós hatású vegyi anyagoktól való megfelelő megkülönböztetésére, és amennyiben a vegyi anyag a vizsgálat(ok) alkalmazási körébe tartozik. Nincs szükség további vizsgálatokra.

 

 

A validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo szemvizsgálat(ok) nem alkalmazható(k) következtetés levonására

 

 

 

 

7

Egyetlen nyúlon el kell végezni a kiindulási in vivo szemvizsgálatot.

Súlyos szemkárosodás

Szemkorróziós hatásúnak kell tekinteni. Nincs szükség további vizsgálatokra.

 

 

Nincs súlyos károsodás vagy nincs válaszreakció

 

 

 

 

8

Egy vagy két további állaton el kell végezni a megerősítő vizsgálatot.

Korróziós vagy irritáló hatású

Szemkorróziós vagy szemirritáló hatásúnak kell tekinteni. Nincs szükség további vizsgálatokra.

Nem korróziós vagy irritáló hatású

Nem szemkorróziós és nem szemirritáló hatásúnak kell tekinteni. Nincs szükség további vizsgálatokra.

SZAKIRODALOM

(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161–177.

(4) E melléklet B.4., Akut bőrirritáció/bőrkorrózió című fejezete.

(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp. 483 – 524.

(7) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.

(8) E melléklet B.4. fejezetének kiegészítése: Lépcsőzetes vizsgálati stratégia bőrirritációhoz és bőrkorrózióhoz

(9) E melléklet B.40., In vitro bőrkorrózió: transzkután elektromos rezisztencia vizsgálat (TER) című fejezete.

(10) E melléklet B.40a., In vitro bőrkorrózió: Emberi bőrmodellen végzett vizsgálat című fejezete.

(11) OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(12) E melléklet B.47., Szarvasmarha-szaruhártya opacitásának és permeabilitásának mérésén alapuló vizsgálati módszer i. a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok és ii. a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására című fejezete.

(13) E melléklet B.48., Izolált csirkeszem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszer i. a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok és ii. a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására című fejezete.”

(3) A B. részben a B.10. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.10.    Kromoszóma-rendellenességek in vitro vizsgálata emlősökön

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 473. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (1).

A kromoszóma-rendellenességek in vitro vizsgálatának célja a tenyésztett emlősállatsejtekben szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket okozó vegyi anyagok azonosítása (2) (3) (4). A szerkezeti rendellenességek kétféle típusúak lehetnek: kromoszóma vagy kromatid típusú rendellenességek. Poliploidia (többek között endoreduplikáció) felléphet a kromoszóma-rendellenességek in vitro vizsgálata során. Míg az aneugének kiválthatnak poliploidiát, a poliploidia önmagában nem jelez aneugén potenciált, egyszerűen sejtcikluszavarra vagy citotoxicitásra (5) utalhat. E vizsgálatnak nem az aneuploidia mérése a célja. Az aneuploidia kimutatására in vitro mikronukleusz-vizsgálat (6) lenne ajánlott.

A kromoszóma-rendellenesség in vitro vizsgálata során emberek vagy rágcsálók megállapodott sejtvonalaiból származó tenyészetek vagy primer sejtkultúrák alkalmazhatók. A felhasznált sejteket a tenyészetben való növekedési képesség, a kariotípus stabilitása (többek között a kromoszómaszám) és a kromoszóma-rendellenességek spontán gyakorisága alapján kell kiválasztani (7). A rendelkezésre álló adatok jelenleg nem teszik lehetővé határozott ajánlások megfogalmazását, azonban arra utalnak, hogy a kémiai veszélyek értékelése során fontos figyelembe venni a vizsgálat céljára kiválasztott sejtek p53 státuszát, genetikai (kariotípus-) stabilitását, DNS-reparációs képességét és eredetét (rágcsáló-, illetve emberi sejtek). E vizsgálati módszer alkalmazóinak tehát érdemes figyelembe venniük a sejtek szóban forgó és egyéb tulajdonságainak a sejtvonalak teljesítményére kifejtett hatását a kromoszóma-rendellenességek indukálásának kimutatása során, mivel a tudomány fejlődik ezen a területen.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Az in vitro végrehajtott vizsgálatok rendszerint szükségessé teszik a metabolikus aktiválás valamilyen exogén forrásának használatát, kivéve, ha a sejtek metabolizálják a vizsgálati vegyi anyagokat. Az exogén metabolikus aktivációs rendszer nem utánozza teljes egészében az in vivo körülményeket. Ügyelni kell arra, hogy ne álljanak elő olyan körülmények, amelyek hamis pozitív eredményekhez – például nem a vizsgálati vegyi anyagok és a kromoszómák közvetlen kölcsönhatása okozta kromoszóma-károsodáshoz – vezethetnek; ilyen körülmény többek között a pH-érték vagy az ozmolalitás változása (8) (9) (10), a közeg összetevőivel való kölcsönhatás (11) (12) vagy a túlzott mértékű citotoxicitás (13) (14) (15) (16).

Ez a vizsgálati módszer azon kromoszóma-rendellenességek kimutatására használatos, amelyek klasztogén hatásokból fakadhatnak. A kromoszóma-rendellenességek indukálását metafázisban lévő sejtek segítségével kell elemezni. Így elengedhetetlen, hogy a sejtek a kezelt és a nem kezelt tenyészetekben is elérjék a mitózist. A mesterséges nanoanyagok esetében e vizsgálati módszer egyedi adaptálására lehet szükség, amelyet azonban ez a vizsgálati módszer nem ismertet.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLAT ELVE

Az emberből vagy más emlősből származó sejttenyészeteket exogén metabolikus aktiválási forrással vagy anélkül is kezelni kell a vizsgálati vegyi anyaggal, kivéve megfelelő metabolizáló képességű sejtek használata esetén (lásd a 13. pontot). A sejttenyészetek vizsgálati vegyi anyagnak való expozíciója megkezdését követően a sejteket megfelelő, előre meghatározott időközönként metafázis-blokkoló szerrel (például kolcemiddel vagy kolchicinnel) kell kezelni, majd az összegyűjtött, megfestett és metafázisban lévő sejteket mikroszkóp segítségével elemezni kell a kromatid típusú és kromoszóma típusú rendellenesség vizsgálata érdekében.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Sejtek

Különféle sejtvonalak (például kínaihörcsög-petefészek CHO), kínaihörcsögtüdő V79-es sejtvonal, kínaihörcsögtüdő (CHL)/IU, TK6-os sejtvonal) vagy primer sejtkultúrák, többek között ember vagy más emlős perifériás limfocitái használhatók (7). A használt sejtvonalaknak tudományosan indokoltnak kell lenniük. Primer sejtek használatakor állatjóléti okok miatt meg kell fontolni emberi eredetű primer sejtek használatát – amennyiben megvalósítható –, és azokból a humán etikai elveknek és a vonatkozó szabályozásoknak megfelelően kell mintát venni. Az emberi perifériás limfocitákat olyan fiatal (kb. 18–35 éves), nem dohányzó egyénektől kell venni, akik ismert betegséggel nem rendelkeznek, illetve a közelmúltban genotoxikus szereknek (például vegyi anyagoknak, ionizáló sugárzásnak) nem voltak kitéve olyan mértékben, amely fokozná a kromoszóma-rendellenességek háttérbeli előfordulását. Ez biztosítaná, hogy a kromoszóma-rendellenességek háttérbeli előfordulása alacsony és egységes legyen. A kromoszóma-rendellenességek alapesetbeli előfordulása az életkor előrehaladtával nő, és ez a tendencia a nőknél jellemzőbb, mint a férfiaknál (17) (18). Amennyiben több donortól származó sejteket együtt használnak fel, akkor a donorok számát meg kell adni. Igazolni kell, hogy a sejtek a vizsgálati vegyi anyaggal való kezelés kezdetétől a sejtekből történő mintavételig osztódtak. A sejttenyészeteket exponenciális sejtnövekedési fázisban (sejtvonalakban) kell tartani vagy osztódásra kell késztetni (primer limfocita-tenyészetek) a sejteknek a sejtciklus különböző szakaszaiban történő expozíciója érdekében, mivel a sejtfázisoknak a vizsgálati vegyi anyagokra való érzékenysége nem feltétlenül lehet ismert. Azok a primer sejtek, amelyeket az osztódás érdekében mitogén szerekkel kell stimulálni, a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció során általában már nem szinkronizáltak (például az emberi limfociták 48 órás mitogén stimulációt követően). Szinkronizált sejtek használata nem javasolt a kezelés során, indokolt esetben azonban elfogadható.

Tenyészközegek és tenyésztési körülmények

A tenyészetek fenntartására megfelelő tenyészközeget és inkubációs feltételeket (tenyésztőedények, megfelelő esetben 5 %-os CO2-koncentrációjú párás légkör, 37 °C-os inkubációs hőmérséklet) kell alkalmazni. A sejtvonalakat rutinszerűen ellenőrizni kell a modális kromoszómaszám stabilitása és a mikoplazma-fertőzés hiánya szempontjából (7) (19), és a sejtek nem használhatók fel, ha fertőzöttek, vagy ha a modális kromoszómaszám megváltozott. A vizsgálólaboratóriumban használt sejtvonalak, illetve primer sejtkultúrák rendes sejtciklusidejét meg kell állapítani, és annak összhangban kell lennie a közzétett sejtjellemzőkkel (20).

A tenyészetek előkészítése

Sejtvonalak: a sejteket törzstenyészetekből fel kell szaporítani, majd tenyészközegbe kell leoltani olyan sejtszámmal, hogy a sejtek a szuszpenziókban vagy a monolayer tenyészetekben továbbra is exponenciálisan növekedjenek a begyűjtés idejéig (a monolayer tenyészetekben növő sejtek esetében például kerülendő a konfluencia).

Limfociták: alvadásgátlóval (például heparinnal) kezelt teljes vért vagy szeparált limfocitákat kell tenyészteni (például emberi limfociták esetében 48 óráig) mitogén szer [emberi limfociták esetében például phytohaemagglutinin (PHA)] jelenlétében, annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció előtt sejtosztódást váltsanak ki.

Metabolikus aktiválás

A nem megfelelő endogén metabolikus képességű sejtek használata esetén exogén metabolikus aktivációs rendszereket kell alkalmazni. Amennyiben az ettől való eltérés nem indokolt, az alapértelmezetten ajánlott, legáltalánosabban használt rendszer a rágcsálók (általában patkányok) enziminduktorral (ilyen például az Aroclor 1254 (21) (22) (23) vagy fenobarbitál és ß-naftoflavon kombinációjával (24) (25) (26) (27) (28) (29)) kezelt májából preparált, kofaktor-kiegészítésű posztmitokondriális frakció (S9). Ez utóbbi kombináció nem ütközik a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyező anyagokról szóló stockholmi egyezménnyel (30), és kiderült róla, hogy olyan hatékony, mint az Aroclor 1254 a vegyes funkciójú oxidáz indukálásához (24) (25) (26) (28). Az S9 frakció jellemzően 1–2 térfogatszázalék koncentrációban használatos, de a végső vizsgálati közegben 10 térfogatszázalékra növelhető. A mitotikus indexet csökkentő termékek, különösen a kalcium-komplexáló termékek (31) használata kerülendő a kezelés során. Az alkalmazott exogén metabolikus aktivációs rendszer vagy metabolikus induktor típusának és koncentrációjának megválasztását befolyásolhatja a vizsgált anyagok osztálya.

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése

A szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat a sejtek kezelése előtt megfelelő oldószerben elő kell készíteni, és szükség esetén hígítani kell (lásd a 23. pontot). A folyékony halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül hozzáadhatók a vizsgálati rendszerhez és/vagy hígíthatók a vizsgálati rendszer kezelése előtt. A gáz halmazállapotú vagy illékony vizsgálati vegyi anyagokat a standard protokollok megfelelő módosításával, például légmentesen lezárt tenyésztőedényekben történő kezeléssel kell vizsgálni (32) (33) (34). A vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó készítményeket pontosan a kezelés előtt kell előállítani, kivéve, ha a stabilitásra vonatkozó adatok a tárolás elfogadhatóságát bizonyítják.

Vizsgálati körülmények

Oldószerek

Az oldószert oly módon kell kiválasztani, hogy optimalizálja a vegyi anyag oldhatóságát, ugyanakkor ne befolyásolja hátrányosan a vizsgálat lebonyolítását, vagyis ne változtassa meg a sejtek növekedését, ne érintse a vizsgálati vegyi anyag integritását, ne lépjen reakcióba a tenyésztőedényekkel, és ne károsítsa a metabolikus aktivációs rendszert. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer (vagy tenyészközeg) használatát érdemes megfontolni. Jól bevált oldószer például a víz vagy a dimetil-szulfoxid. A végleges kezelési közegben a szerves oldószerek általában nem haladhatják meg az 1 térfogatszázalékot, a vizes oldószerek (sós lé vagy víz) pedig a 10 térfogatszázalékot. Ha nem jól bevált szerves oldószereket (például etanolt vagy acetont) használnak, a használatukat a vizsgálati vegyi anyaggal és a vizsgálati rendszerrel való összeegyeztethetőségükre utaló, valamint azt jelző adatokkal kell alátámasztani, hogy a használt koncentrációnál nem genotoxikusak. Alátámasztó adatok hiányában fontos nem kezelt kontrollok (lásd az 1. függeléket) alkalmazása annak bizonyítására, hogy a kiválasztott oldószer nem vált ki ártalmas vagy klasztogén hatást.

A sejtproliferáció és a citotoxicitás mérése, valamint a kezelési koncentrációk kiválasztása

A vizsgálati vegyi anyag legmagasabb koncentrációjának meghatározása során kerülendő az olyan koncentráció, amely hamis pozitív válaszreakciókat válthat ki, ilyen a túlzott citotoxicitást okozó koncentráció (lásd a 22. pontot), a tenyésztőközegben való kicsapódást okozó koncentráció (lásd a 23. pontot), illetve a pH vagy az ozmolalitás jelentős változását okozó koncentráció (lásd az 5. pontot). Ha a vizsgálati vegyi anyag a hozzáadásakor jelentős változást okoz a tenyészközeg pH-jában, a pH a kezelésre szolgáló végleges tenyészközeg pufferelésével kiigazítható, hogy elkerülhetők legyenek a hamis pozitív eredmények és megfelelő tenyésztési feltételeket lehessen fenntartani.

Mérni kell a sejtproliferációt annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálat során elegendő számú kezelt sejt elérje a mitózist, és hogy a kezelésekre megfelelő szintű citotoxicitás mellett kerüljön sor (lásd a 18. és a 22. pontot). A citotoxicitást a fő kísérletben metabolikus aktiválással és anélkül is meg kell határozni a sejtelhalás és a sejtnövekedés megfelelő mutatóinak használatával. Bár egy kiindulási vizsgálat során hasznos lehet a citotoxicitás értékelése a fő kísérletben alkalmazandó koncentrációk jobb meghatározásához, a kiindulási vizsgálat nem kötelező. Végrehajtása esetén nem helyettesítheti a citotoxicitás fő kísérlet során történő mérését.

A relatív populációduplázódás (RPD) vagy a sejtszám relatív növekedése (RICC) megfelelő módszer a citotoxicitás citogenetikai vizsgálatok során történő értékelésére (13) (15) (35) (36) (55) (a képletekért lásd a 2. függeléket). Hosszú távú kezelés és a kezelés kezdetétől számított 1,5 normál sejtciklusidőn túli mintavétel esetén (azaz összesen 3 sejtciklusidőnél hosszabb idő elteltével) az RPD alulbecsülheti a citotoxicitást (37). Ilyen körülmények között az RICC jobb mértékegység lehet, illetve a citotoxicitás 1,5 normál sejtciklusidő utáni, RPD alkalmazásával történő értékelése hasznos becslést ad.

Ami a primer sejtkultúrákban lévő limfocitákat illeti, bár a mitotikus index (MI) a citotoxikus /citosztatikus hatások mérésére szolgál, azt befolyásolja, hogy a kezelés után mikor mérik, továbbá a használt mitogén és a sejtciklus esetleges megszakadása. Az MI azonban azért elfogadható, mert a citotoxicitás egyéb mérése nehézkes és kivitelezhetetlen lehet, és nem feltétlenül vonatkozik a PHA-stimulációra válaszreakcióként szaporodó limfociták célpopulációjára.

Bár a sejtvonalak esetében az RPD és az RICC, valamint a primer limfocita-tenyészet esetében az MI az ajánlott citotoxicitási paraméter, más mutatók (például a sejtintegritás, az apoptózis, a nekrózis, a sejtciklus) további hasznos információval szolgálhatnak.

Az elfogadhatósági kritériumokat (megfelelő citotoxicitás, sejtszám stb.) teljesítő, (az oldószeres és a pozitív kontrollokat nem tartalmazó) legalább három vizsgálati koncentrációt kell értékelni. A sejtek típusától (limfocita-sejtvonalak vagy primer limfocita-tenyészetek) függetlenül, minden egyes vizsgált koncentrációnál párhuzamos vagy szimpla kezelt tenyészetek használhatók. Bár két párhuzamos tenyészet használata ajánlatos, a szimpla tenyészetek is elfogadhatóak, amennyiben a szimpla vagy a párhuzamos tenyészetek esetében megegyezik az összességében értékelt sejtek száma. A szimpla tenyészetek használata különösen releváns, ha több mint három koncentráció értékelésére kerül sor (lásd a 31. pontot). A független párhuzamos tenyészetekben adott koncentráció mellett kapott eredmények összevonhatók az adatelemzéshez (38). Az alacsony citotoxicitást vagy a citotoxicitás hiányát mutató vizsgálati vegyi anyagok esetében rendszerint megközelítőleg kétszeres-háromszoros koncentrációs intervallumok helyénvalóak. Citotoxicitás fellépése esetén a vizsgálati koncentrációknak le kell fedniük a 22. pontban ismertetett, citotoxicitást okozó koncentrációtól azokig a koncentrációkig terjedő tartományt, ahol mérsékelt vagy alacsony a citotoxicitás, illetve nem jelentkezik citotoxicitás. Számos vizsgálati vegyi anyagnak meredek a koncentráció-válasz görbéje, és annak érdekében, hogy alacsony és mérsékelt citotoxicitásnál adatokat lehessen nyerni, vagy részletesen meg lehessen vizsgálni a dózis-válasz összefüggést, egymáshoz közelebbi koncentrációkat és/vagy háromnál több koncentrációt (szimpla tenyészeteket vagy párhuzamos tenyészeteket) kell használni, különösen olyan helyzetekben, ahol megismételt kísérlet szükséges (lásd a 47. pontot).

Ha a legmagasabb koncentráció a citotoxicitáson alapul, a legmagasabb koncentrációval 55 ± 5 %-os citotoxicitást kell megcélozni a citotoxicitás ajánlott paramétereinek alkalmazásával (azaz a sejtvonalak RICC és RPD mutatójának, illetve a primer limfocita-tenyészetek esetében az MI mutatónak a párhuzamos negatív kontroll 45 ± 5 %-ára csökkenésével). Az 55 ± 5 %-os citotoxicitási tartománynak csak a magasabb részén megtalálható pozitív eredmények értelmezése során körültekintően kell eljárni (13).

A legalacsonyabb oldhatatlan koncentrációnál alacsonyabb koncentrációk mellett nem citotoxikus, kevéssé oldható vegyi anyagok esetében a legmagasabb analizált koncentrációnak a vizsgálati vegyi anyaggal történő kezelés végén szemmel vagy inverz mikroszkóp segítségével látható zavarosságot vagy kicsapódást kell okoznia. Még abban az esetben is, ha citotoxicitás a legalacsonyabb oldhatatlan koncentráció felett jön létre, ajánlatos egyetlen egy, zavarosságot vagy látható kicsapódást okozó koncentrációt vizsgálni, mivel a kicsapódás fals hatásokat eredményezhet. A kicsapódást okozó koncentrációnál ügyelni kell annak biztosítására, hogy a kicsapódás ne zavarja a vizsgálat lebonyolítását (például a megfestést vagy az értékelést). Hasznos lehet a tenyészközegben való oldhatóság meghatározása a kísérlet előtt.

Ha nem figyelhető meg kicsapódás vagy korlátozó citotoxicitás, a legmagasabb vizsgálati koncentrációnak 10 mM-nek, 2 mg/ml-nek vagy 2 μl/ml-nek kell megfelelnie, melyek közül a legalacsonyabb a mérvadó (39) (40) (41). Ha a vizsgálati vegyi anyag nem meghatározott összetételű, például ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyag (UVCB) (42), környezeti extraktum stb., előfordulhat, hogy kellő citotoxicitás hiányában a legmagasabb koncentrációnak magasabbnak (például 5 mg/ml-nek) kell lennie ahhoz, hogy növekedjen az egyes összetevők koncentrációja. Megjegyzendő azonban, hogy ezek a követelmények eltérőek lehetnek a humán gyógyszerek esetében (43).

Kontrollok

Minden begyűjtés alkalmával párhuzamos negatív kontrollokat kell használni (lásd a 15. pontot), amelyeknél csak oldószert alkalmaznak a kezelt közegben, és a kezelésük ugyanolyan módon történik, mint a kezelt tenyészeteké.

Párhuzamos pozitív kontrollok szükségesek annak igazolására, hogy a laboratórium képes az alkalmazott vizsgálati protokoll feltételei mellett klasztogének azonosítására, valamint adott esetben az exogén metabolikus aktivációs rendszer eredményességének igazolása érdekében. Pozitív kontrollokra vonatkozó példák az alábbi 1. táblázatban találhatók. Indokolt esetben pozitív kontrollként alternatív vegyi anyagok használhatók. Mivel az emlőssejtek genetikai toxicitás szempontjából végzett in vitro vizsgálatai kellően szabványosítottak, a pozitív kontrollok használata a metabolikus aktiválást igénylő klasztogénekre korlátozódhat. Amennyiben erre a nem aktivált vizsgálattal egyidejűleg, azonos időtartamú kezelés mellett kerül sor, ezen egyetlen pozitív kontroll válaszreakciója a metabolikus aktivációs rendszer aktivitását és a vizsgálati rendszer reagálóképességét is bizonyítani fogja. A(z S9 nélküli) hosszú távú kezelésnek azonban kell, hogy legyen saját pozitív kontrollja, mivel a kezelés időtartama eltér a metabolikus aktiválás alkalmazása mellett végzett vizsgálatétól. Mindegyik pozitív kontrollt egy vagy több olyan koncentrációban kell alkalmazni, amely a háttérértékekben reprodukálható és kimutatható növekedést okoz, hogy bizonyítani lehessen a vizsgálati rendszer érzékenységét (azaz a hatások egyértelműek, de az értékelést végző személy nem tudja beazonosítani azonnal a kódolt tárgylemezt), és a választ nem veszélyeztetheti a vizsgálati módszerben meghatározott határértékeket meghaladó citotoxicitás.



1. táblázat

A laboratóriumok jártasságának értékeléséhez és a pozitív kontrollok kiválasztásához ajánlott referenciaanyagok.

Kategória

Vegyi anyag

CASRN

1.  Metabolikus aktiválás nélkül is aktív klasztogének

 

Metil-metánszulfonát

66-27-3

 

Mitomicin-C

50-07-7

 

4-Nitro-kinolin-N-oxid

56-57-5

 

Citozin-arabinozid

147-94-4

2.  Metabolikus aktiválást igénylő klasztogének

 

Benzo(a)pirén

50-32-8

 

Ciklofoszfamid

50-18-0

ELJÁRÁS

Kezelés a vizsgálati vegyi anyaggal

A proliferáló sejteket metabolikus aktivációs rendszer jelenlétében és hiányában kezelik a vizsgálati vegyi anyaggal.

Tenyészetbegyűjtési idő

A negatív eredmény megállapításához szükséges alapos értékeléshez mindhárom alábbi kísérleti körülményt meg kell teremteni, metabolikus aktiválással és anélkül végzett rövid távú kezeléssel, valamint metabolikus aktiválás nélküli hosszú távú kezeléssel (lásd a 43., 44. és 45. pontot):

 a sejteket metabolikus aktiválás nélkül 3–6 órára ki kell tenni a vizsgálati vegyi anyag hatásának, és azokból a kezelés megkezdése után kb. 1,5 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban mintát kell venni (18),

 a sejteket metabolikus aktiválással 3–6 órára ki kell tenni a vizsgálati vegyi anyag hatásának, és azokból a kezelés megkezdése után kb. 1,5 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban mintát kell venni (18),

 a sejteket a kezelés megkezdése után kb. 1,5 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban történő mintavételig metabolikus aktiválás nélkül folyamatosan ki kell tenni a vizsgálati vegyi anyagnak. Előfordulhat, hogy bizonyos vegyi anyagok (például a nukleozidanalógok) könnyebben észlelhetők 1,5 normál sejtciklusidőnél hosszabb kezelési/mintavételi idő alkalmazása esetén (24).

Abban az esetben, ha a fenti kísérleti körülmények pozitív válaszreakciót eredményeznek, a többi kezelési eljárás vizsgálata nem feltétlenül szükséges.

Kromoszómapreparálás

A sejttenyészeteket a begyűjtésük előtt rendszerint 1–3 órán át kolcemiddel vagy kolchicinnel kell kezelni. Minden sejttenyészetet külön kell begyűjteni és feldolgozni a kromoszómapreparátumok készítéséhez. A kromoszómapreparátumok készítése a sejtek hipotóniás kezelését, fixálását és megfestését foglalja magában. A monolayer tenyészetekben a 3–6 órás kezelés végén mitotikus sejtek (ismertetőjegyük, hogy alakjuk kerek, és leválnak a felszínről) lehetnek jelen. Mivel ezek a mitotikus sejtek könnyen leválnak, a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó közeg eltávolításakor elveszhetnek. Ha bizonyíték van arra, hogy a mitotikus sejtek száma a kontrollokéhoz képest jelentősen megnő, valószínűsíthető mitotikus leállást jelezve, a sejteket centrifugálással be kell gyűjteni és vissza kell tenni a tenyészetekbe, annak elkerülése érdekében, hogy a begyűjtéskor elvesszenek a mitózisban lévő sejtek, valamint azok a sejtek, amelyeknél kromoszóma-rendellenesség kockázata áll fenn.

Elemzés

A kromoszóma-rendellenességek vizsgálatára irányuló mikroszkópos elemzés előtt minden tárgylemezt, a pozitív és negatív kontrollokét is ideértve, önálló kódolással kell ellátni. Mivel gyakori, hogy a fixálási eljárások bizonyos arányban olyan metafázisban lévő sejteket eredményeznek, amelyek kromoszómkat veszítettek, ezért az értékelt sejteknek a modális kromoszómaszám ± 2-vel egyenlő számú centromérát kell tartalmazniuk.

Koncentrációnként legalább 300, jól szétterült metafázist kell értékelni és ellenőrizni annak megállapításához, hogy valamely vizsgálati vegyo anyag egyértelműen negatív (lásd a 45. pontot). Párhuzamos tenyészetek használata esetén a 300 sejtet egyenlő mértékben kell elosztani a párhuzamosok között. Koncentrációnként egy tenyészet alkalmazása esetén (lásd a 21. pontot) legalább 300, jól szétterült metafázist kell értékelni ebben az egy tenyészetben. 300 sejt értékelésének az az előnye, hogy fokozza a vizsgálat statisztikai erejét, és ráadásul a nulla értékek megfigyelése ritkán (várhatóan mindössze 5 %-os gyakorisággal) fog előfordulni (44). Az értékelt metafázisok száma csökkenthető, ha sok kromoszóma-rendellenességgel rendelkező sejt figyelhető meg és a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül.

Az egy vagy több szerkezeti kromoszóma-rendellenességgel rendelkező sejteket a gapek figyelembevételével és figyelmen kívül hagyásával is értékelni kell. A törések és a gapek (45), (46) irodalom szerinti fogalommeghatározása az 1. függelékben található. A kromatid és a kromoszóma típusú rendellenességeket külön-külön kell feljegyezni és altípusonként (törések, kicserélődések) kell besorolni. A laboratóriumban alkalmazott eljárásoknak biztosítaniuk kell, hogy a kromoszóma-rendellenességeket jól képzett értékelők elemezzék, és adott esetben szakértők értékeljék.

Bár a vizsgálat célja a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek kimutatása, fontos a poliploidia és az endoreduplikáció gyakoriságának feljegyzése, amennyiben ezek láthatók (lásd a (2) pontot).

A laboratórium jártassága

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti elegendő tapasztalat igazolása érdekében kísérletsorozatot kell végrehajtaniuk referenciaként szolgáló, más-más mechanizmusú pozitív vegyi anyagokkal, továbbá (különböző oldószerek/vivőanyagok segítségével) különféle negatív kontrollokkal. E pozitív és negatív kontrollok válaszreakcióinak összhangban kell lenniük a szakirodalommal. Ez nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll a 37. pontban meghatározott történeti adatbázis.

A pozitív kontrollként szolgáló, kiválasztott vegyi anyagokat (lásd a 26. pont 1. táblázatát) metabolikus aktiválás nélkül végzett rövid és hosszú kezeléssel, továbbá metabolikus aktiválás jelenlétében végzett rövid kezeléssel is meg kell vizsgálni a laboratórium klasztogén hatású vegyi anyagok kimutatásában, valamint a metabolikus aktiváló rendszer eredményességének meghatározásában való jártasságának bizonyítása érdekében. A vizsgálati rendszer érzékenységének és dinamikus tartományának bizonyítása érdekében a kiválasztott vegyi anyagok koncentrációtartományát úgy kell megválasztani, hogy reprodukálható és koncentrációval összefüggő növekedést biztosítson a háttérértékekhez viszonyítva.

Történeti kontrolladatok

A laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

 a pozitív kontrollok történeti tartománya és eloszlása,

 a negatív (nem kezelt, oldószeres) kontrollok történeti tartománya és eloszlása.

A negatív kontrollok történeti eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal, amennyiben léteznek. Amint több kísérleti adat adódik a kontrollok eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (44) (47). A laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisát első lépésként legalább 10 kísérlettel kell kiépíteni, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (48)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy a pozitív és a negatív kontrollokra vonatkozó adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll (44). A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (47).

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy összhangban van-e a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisaival. Jelentősebb következetlenségek fennállása esetén új történeti kontrolladatbázist kell létrehozni.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatok az egy tenyészetből vagy párhuzamos tenyészetek összességéből származó, kromoszóma-rendellenességekkel rendelkező sejtek előfordulását mutatják, ahogyan az a 21. pontban szerepel. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (44) (47). Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, amennyiben ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer »ellenőrzés alatt áll« (lásd a 37. pontot), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények ismertetése

Az egy vagy több szerkezeti kromoszóma-rendellenességgel rendelkező sejtek százalékos arányát értékelni kell. Az altípusonként (törések, kicserélődések) besorolt, kromatid és kromoszóma típusú rendellenességeket külön-külön kell felsorolni, megadva a számukat és a gyakoriságukat a kísérleti és a kontrolltenyészetek esetében. A gapeket külön-külön kell feljegyezni és jelenteni, de azokat nem kell beleszámolni a rendellenességek összgyakoriságba. A poliploidia és/vagy az endoreduplikált sejtek százalékos arányát észlelés esetén a jelentésbe kell foglalni.

A citotoxicitás egyidejű mérését a rendellenességek megállapítására irányuló fő kísérlet(ek)ben minden kezelt, negatív és pozitív kontrolltenyészet esetében fel kell jegyezni.

Az egyes tenyészetekhez tartozó adatokat meg kell adni. Ezenkívül minden adatot táblázat formájában kell összefoglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Egy-egy vizsgálat elfogadása az alábbi kritériumokon alapul:

 A párhuzamos negatív kontroll a 39. pont szerint belefoglalható a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisába.

 A párhuzamos pozitív kontrolloknak (lásd a 26. pontot) a pozitív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisban generált válaszokkal összeegyeztethető válaszokat, valamint a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva statisztikailag szignifikáns növekedést kell előidézniük.

 Az oldószeres kontrollban teljesülniük kell a sejtproliferáció kritériumainak (17. és 18. pont).

 Mindhárom kísérleti körülmény vizsgálatára sor került, kivéve, ha az egyik pozitív eredményeket hozott (lásd a 28. pontot).

 Megfelelő számú sejt és koncentráció elemezhető (31. és 21. pont).

 A legmagasabb koncentráció kiválasztására vonatkozó kritériumok összhangban vannak a 22., 23. és 24. pontban ismertetett legmagasabb koncentrációkkal.

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha a vizsgált kísérleti körülmények bármelyikében (lásd a 28. pontot):

a) legalább az egyik vizsgálati koncentráció statisztikailag szignifikáns növekedést mutat a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva,

b) a megfelelő trendpróbával történő értékelés arra utal, hogy a növekedés a dózissal összefügg,

c) az eredmények bármelyike a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken; lásd a 39. pontot) kívül esik.

Mindezen kritériumok teljesülése esetén úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben kromoszóma-rendellenességeket képes előidézni a tenyésztett emlőssejtekben. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (49) (50) (51).

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény mellett (lásd a 28. pontot):

a) a vizsgálati koncentrációk egyike sem mutat statisztikailag szignifikáns növekedést a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva,

b) a megfelelő trendpróbával végzett értékelés nem mutat koncentrációval összefüggő növekedést,

c) valamennyi eredmény a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken; lásd a 39. pontot) belül van.

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben nem képes kromoszóma-rendellenességeket előidézni a tenyésztett emlőssejtekben.

Az egyértelműen pozitív vagy negatív válasz igazolása nem követelmény.

Amennyiben a reakció nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, ahogyan az a fentiekben szerepel, illetve egy adott eredmény biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy további vizsgálatokkal kell értékelni. Hasznos lehet további sejtek értékelése (adott esetben) vagy – megismételt kísérlet lehetőleg módosított kísérleti körülmények (például a koncentrációk távolsága, más (S9-es koncentráció vagy S9 eredetű) metabolikus aktiválási feltételek) melletti – elvégzése.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatkészlet eleve kizárja a pozitív vagy negatív eredményekre vonatkozó következtetést, és ezért az lesz a következtetés, hogy a vizsgálati vegyi anyagra adott reakció kétértelmű.

A poliploid sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan gátolhatja a mitotikus folyamatokat és számszerű kromoszóma-rendellenességet idézhet elő (52). Az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan gátolhatja a sejtciklus végbemenetelét (53) (54) (lásd a 2. pontot). Ezért a poliploid sejtek és az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek előfordulását külön-külön kell feljegyezni.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Vizsgálati vegyi anyag:

 eredet, tételszám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll;

 a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert;

 a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben, ha ismert;

 adott esetben a pH-érték, az ozmolalitás és a kicsapódás mérése abban a tenyészközegben, amelyhez a vizsgálati vegyi anyagot hozzáadták.

Egy összetevőből álló anyag:

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonossága stb.

Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek:

 amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai jellemzik.

Oldószer:

 az oldószer kiválasztásának indoklása;

 az oldószernek a végleges tenyészközegen belüli aránya szintén feltüntetendő.

Sejtek:

 a sejtek típusa és eredete;

 a felhasznált sejttípus kariotípus jellemzői és alkalmassága;

 sejtvonalak esetében a mikoplazma hiánya;

 sejtvonalak esetében a sejtciklus hosszúságára, a megkettőződési időre vagy a proliferációs indexre vonatkozó információk;

 a vérdonorok ivara, életkora, valamint a donorra, a teljes vérre vagy az elkülönített limfocitákra, a használt mitogénre vonatkozó bármely releváns információ;

 sejtvonalak esetében a passzálások száma, ha rendelkezésre áll;

 sejtvonalak esetében a sejttenyészetek fenntartásának módszerei;

 sejtvonalak esetében a modális kromoszómaszám.

Vizsgálati körülmények:

 a metafázis-blokkoló vegyi anyag megnevezése, koncentrációja és a sejtek expozíciójának időtartama;

 a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja a tenyészközegen belüli végleges koncentrációjaként kifejezve (például μg, mg/a tenyészközeg mL-e vagy mM-ja);

 a koncentrációk kiválasztásának és a tenyészetek számának indoklása, beleértve például a citotoxicitási adatokat és az oldhatóságra vonatkozó korlátokat;

 a közeg összetétele, CO2-koncentráció, amennyiben alkalmazandó, nedvességtartalom;

 a tenyészközeghez adott oldószer és vizsgálati vegyi anyag koncentrációja (és/vagy térfogata);

 inkubációs hőmérséklet;

 inkubációs idő;

 a kezelés időtartama;

 a kezelés utáni begyűjtés időpontja;

 adott esetben a sejtszám a leoltáskor;

 a metabolikus aktivációs rendszer típusa és összetétele (az S9 eredete, az S9 keverék elkészítési módszerei, az S9 keverék és az S9 koncentrációja vagy térfogata a végleges tenyészközegben, az S9 minőségellenőrzése);

 pozitív és negatív kontrollként szolgáló vegyi anyagok, végleges koncentráció az egyes kezelési körülmények esetén;

 az alkalmazott tárgylemez-preparálási módszer és festési technika;

 a vizsgálatok elfogadhatósági kritériumai;

 a rendellenességek értékelésének kritériumai;

 az elemzett metafázisok száma;

 a citotoxicitás mérésére alkalmazott módszerek;

 a citotoxicitás és az alkalmazott módszer szempontjából lényeges kiegészítő információk;

 azok a kritériumok, amelyek meghatározzák, hogy a vizsgálatok pozitívnak, negatívnak vagy többféleképpen értelmezhetőnek tekintendők-e;

 a pH-érték, az ozmolalitás és a kicsapódás meghatározására alkalmazott módszerek.

Eredmények:

 sejtvonalak alkalmazásakor az egyes tenyészetek esetében kezelt sejtek száma és begyűjtött sejtek száma;

 a citotoxicitás mérése, például RPD, RICC, MI, egyéb megfigyelések, ha vannak ilyenek;

 sejtvonalak esetében a sejtciklus hosszúságára, a megkettőződési időre vagy a proliferációs indexre vonatkozó információk;

 a kicsapódás jelei és a meghatározás időpontja;

 a rendellenességek, többek között a gapek meghatározása;

 az értékelt sejtek száma, a kromoszóma-rendellenességeket mutató sejtek száma és a kromoszóma-rendellenességek típusa, minden egyes kezelt és kontrolltenyészet esetében külön-külön megadva, a gapek figyelembevételével és figyelmen kívül hagyásával;

 a ploidia változásai (poliploid sejtek és endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejtek, külön-külön megadva), ha láthatóak;

 amennyiben lehetséges, a koncentráció-válasz összefüggés;

 a párhuzamos negatív (oldószeres) és pozitív kontrollokra vonatkozó adatok (koncentrációk és oldószerek);

 történeti negatív (oldószeres) és pozitív kontrollokra vonatkozó adatok, a tartományok, az átlagok, a szórás, valamint az eloszlás esetében a 95 %-os ellenőrzési határértékek megadásával, továbbá az adatok száma;

 statisztikai elemzések, p-értékek, ha vannak.

Az eredmények tárgyalása.

Következtetések.

SZAKIRODALOM

(1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2) Evans, H.J. (1976), “Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens”, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp. 1-29

(3) Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), “The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture” in Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, pp. 427-432.

(4) Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.

(5) Muehlbauer, P.A. et al. (2008), “Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods”, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, pp. 318-327.

(6) E melléklet B.49., In vitro celluláris mikronukleusz-vizsgálat emlősökön című fejezete.

(7) ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.

(8) Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 257/2, pp. 147-204.

(9) Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, pp. 297-305.

(10) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.

(11) Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.

(12) Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, pp. 439-452.

(13) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 191-201.

(14) Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, pp. 1–256.

(15) Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, pp. 36–44.

(16) Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, pp. 316–326.

(17) Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, pp. 305-309.

(18) Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, pp. 95-106.

(19) Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, pp. 261-287.

(20) Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, pp.163-167.

(21) Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, pp. 347-363.

(22) Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.

(23) Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, pp. 83-90.

(24) Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, pp. 277-290.

(25) Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.

(26) Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, pp. 175-177.

(27) Matsushima, T. et al. (1976), “A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems”, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(28) Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 241-261.

(29) Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, pp. 51-59.

(30) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Elérhető a következő internetcímen: http://www.pops.int/.

(31) Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, pp. 225-8.

(32) Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), “CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids”, in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.

(33) Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.

(34) Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.

(35) Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.

(36) Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 77-83.

(37) Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1-2, pp. 86-87.

(38) Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(39) OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. Kérésre beszerezhető.

(40) Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1-2, pp. 32-56.

(41) Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.

(42) EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.

(43) USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Elérhető a következő internetcímen: https://federalregister.gov/a/2012-13774.

(44) OECD (2014), “Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS)”, Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(45) ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.

(46) Scott, D. et al. (1990), “Metaphase chromosome aberration assays in vitro”, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62-86.

(47) Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(48) Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.

(49) Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.

(50) Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.

(51) Richardson, C. et al. (1989), “Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(52) Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 29-46.

(53) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, pp. 403-413.

(54) Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, pp. 1362-1364.

(55) Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, pp. 139-149.




1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Aneuploidia : a normális diploid (vagy haploid) kromoszómaszámtól egyetlen kromoszómával vagy egynél több, szám feletti kromoszómával, de nem teljes kromoszómakészlettel (kromoszómakészletekkel) (poliploidia) való bármely eltérés.

Apoptózis : programozott sejthalál olyan lépések során keresztül, amelyek a sejt membránhoz kötött részecskékre történő szétesését eredményezik; a részecskék ezután fagocitózissal vagy sejtfelszínről történő leválással kerülnek eltávolításra.

Sejtproliferáció : a sejtek számának növekedése mitotikus sejtosztódással.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Kromatidtörés : egyetlen kromatid megszakadása, amit az egyik kromatid egyértelmű átrendeződése jelez.

Kromatid gap : egyetlen kromatid meg nem festődő régiója (akromatikus sérülése), ahol minimális a kromatid átrendeződése.

Kromatid típusú rendellenesség : olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a különálló kromatidok törésében vagy a kromatidok közötti törésben és újraegyesülésben nyilvánul meg.

Kromoszóma típusú rendellenesség : olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a két kromatid azonos helyén történt törésében, vagy törésében és újraegyesülésében nyilvánul meg.

Klasztogén : bármely olyan vegyi anyag, amely sejtek vagy eukarióta szervezetek populációjában szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket okoz.

Koncentrációk : a vizsgálati vegyi anyagnak a tenyészközegen belüli végleges koncentrációira utalnak.

Citotoxicitás : az e vizsgálati módszerbe tartozó, sejtvonalak segítségével végzett vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek relatív populációduplázódásában (RPD) vagy a számuk relatív növekedésében (RICC) bekövetkezett csökkenés a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd a 17. pontot és a 2. függeléket). Az e vizsgálati módszerbe tartozó, primer limfocita-tenyészetek segítségével végzett vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek mitotikus indexének (MI) csökkenése a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd a 18. pontot és a 2. függeléket).

Endoreduplikáció : az a folyamat, amely során valamely DNS-replikáció S fázisát követően a sejtmag nem lép be a mitózis fázisába, hanem egy másik S fázist indít. Az eredmény 4, 8, 16, … kromatiddal rendelkező kromoszómák létrejötte.

Genotoxikus : olyan általános kifejezés, amely magában foglalja a DNS- vagy kromoszómakárosodás valamennyi típusát, köztük a töréseket, a deléciókat, az adduktok képződését, a nukleotidok módosulását és kapcsolódását, az átrendeződéseket, a génmutációkat, a kromoszóma-rendellenességeket és az aneuploidiát. A genotoxikus hatás nem minden típusa eredményez mutációkat vagy stabil kromoszómakárosodást.

Mitotikus index (MI) : a metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya; e populáció proliferációja mértékének jelzése.

Mitózis : a sejtmag osztódása, amely általában profázisra, prometafázisra, metafázisra, anafázisra és telofázisra osztható fel.

Mutagén : örökletes elváltozást idéz elő a génekben lévő DNS-bázispár szekvenciában/szekvenciákban vagy a kromoszómák szerkezetében (kromoszóma-rendellenességek).

Számszerű rendellenesség : a kromoszómák számának eltérése a felhasznált sejtekre jellemző normál számértéktől.

Poliploidia : ellentétben a csak egyetlen kromoszómát vagy bizonyos kromoszómákat érintő számszerű rendellenességekkel (aneuploidia), teljes kromoszómakészlet(ek) sejtekben és organizmusokban jelentkező számszerű rendellenessége.

p53 státusz : A p53 fehérje vesz részt a sejtciklus-szabályozásban, az apoptózisban és a DNS-reparációban. Azoknak a sejteknek, amelyeknél hiányzik funkcionális p53 fehérje, nem képesek apoptózis útján vagy a DNS-károsodásra reagáló p53 funkciókkal összefüggő egyéb mechanizmusok útján (például DNS-reparáció kiváltásával) leállítani a sejtciklust vagy eltávolítani a károsodott sejteket, elméletileg hajlamosabbnak kell lenniük génmutációkra vagy kromoszóma-rendellenességekre.

A sejtszám relatív növekedése (RICC) : a kémiai expozíciónak kitett tenyészetekben tapasztalható sejtszámnövekedés a nem kezelt tenyészetekben tapasztalható növekedéshez viszonyítva; százalékos arányként kifejezett viszonyszám.

Relatív populációduplázódás (RPD) : a populációduplázódások számának növekedése a kémiai expozíciónak kitett tenyészetekben, a nem kezelt tenyészetekben tapasztalható növekedéshez viszonyítva; százalékos arányként kifejezett viszonyszám.

S9 májfrakció : 9 000  g centrifugálás utáni májhomogenátum felülúszója, azaz a nyers májextraktum.

S9 keverék : az S9 májfrakció és a metabolikus enzimaktivitáshoz szükséges kofaktorok keveréke.

Oldószeres kontroll : a csak a vizsgálati vegyi anyag feloldására használatos oldószert befogadó kontrolltenyészetek meghatározására szolgáló általános kifejezés.

Szerkezeti rendellenesség : a sejtosztódás metafázisának mikroszkopikus vizsgálata során – deléciókként és fragmensekként, kromoszómán belüli vagy a kromoszómák közötti átrendeződésként – észlelhető változás a kromoszóma szerkezetében.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Nem kezelt kontrollok : nem kezelt (azaz sem a vizsgálati vegyi anyaggal, sem oldószerrel nem kezelt), de a vizsgálati vegyi anyagot befogadó tenyészetekkel párhuzamosan, azonos módon feldolgozott tenyészetek.




2. függelék

A CITOTOXICITÁS ÉRTÉKELÉSÉRE SZOLGÁLÓ KÉPLETEK

Mitotikus index (MI):

image

A sejtszám relatív növekedése (RICC) vagy a relatív populációduplázódás (RPD) ajánlott, mivel mindkét módszer figyelembe veszi az osztódott sejtpopuláció arányát.

image

image

ahol:

Populációduplázódás = [log (kezelés utáni sejtszám ÷ kiindulási sejtszám)] ÷ log 2

Például 53 %-os RICC vagy RPD 47 %-os citotoxicitást/citosztázist jelez, az MI segítségével mért 55 %-os citotoxicitás/citosztázis pedig azt jelenti, hogy a tényleges MI a kontroll 45 %-a.

A kezelés előtti sejtszámot minden esetben meg kell mérni, és annak meg kell egyeznie a kezelt és a negatív kontrolltenyészetek esetében.

Míg az RCC (azaz a kezelt tenyészeteken belüli sejtszám és a kontrolltenyészeteken belüli sejtszám hányadosa) a múltban citotoxicitási paraméterként volt használatos, a továbbiakban már nem javasolt, mivel alulbecsülheti a citotoxicitást.

A negatív kontrolltenyészetekben a populációduplázódásnak összeegyeztethetőnek kell lennie azzal a követelménnyel, hogy a sejtekből a kezelés után körülbelül 1,5 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban kell mintát venni, valamint a mitotikus indexnek kellően magasnak kell lennie ahhoz, hogy elegendő számú, mitózisban lévő sejtet lehessen kapni és megbízhatóan ki lehessen számítani egy 50 %-os csökkenést.

(4) A B. részben a B.11. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.11.    Kromoszóma-rendellenességek vizsgálata emlősök csontvelőjében

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 475. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (1).

A kromoszóma-rendellenességeknek az emlősök csontvelőjében végzett in vivo vizsgálata azért különösen releváns a genotoxicitás értékelése szempontjából, mert az in vivo metabolizmus tényezői, a farmakokinetikai és a DNS-reparációs folyamatok – bár fajonként változhatnak – aktívak és hozzájárulnak a reakciókhoz. Az in vivo vizsgálat valamely in vitro rendszer által kimutatott genotoxicitás további vizsgálatához is hasznos.

A kromoszóma-rendellenességek emlősökön végzett in vivo vizsgálata a vizsgálati vegyi anyag által az állatok – rendszerint rágcsálók – csontvelősejtjeiben előidézett szerkezeti kromoszóma-rendellenességek kimutatására használatos (2), (3), (4), (5). A szerkezeti kromoszóma-rendellenességek kétféle típusúak lehetnek: kromoszóma vagy kromatid típusú rendellenességek. Bár a genotoxikus vegyi anyagok többsége által előidézett rendellenességek többsége kromatid típusú, kromoszóma típusú rendellenességek is előfordulnak. A kromoszómakárosodás és az ehhez kapcsolódó események számos emberi genetikai betegséget okoznak, és érdemi bizonyíték van arra, hogy amikor ezek a léziók és a kapcsolódó események az onkogénekben és a tumorszuppresszor génekben okoznak elváltozásokat, szerepet játszanak az emberekben és a kísérleti rendszerekben kialakuló rákban. Poliploidia (többek között endoreduplikáció) felléphet a kromoszóma-rendellenességek in vivo vizsgálata során. A poliploidia fokozódása azonban önmagában nem jelez aneugén potenciált, egyszerűen sejtcikluszavarra vagy citotoxicitásra utalhat. E vizsgálatnak nem az aneuploidia mérése a célja. Az in vivo emlős eritrocita mikronukleusz-vizsgálat (e melléklet B.12. fejezete) vagy az emlősökön végzett in vitro celluláris mikronukleusz-vizsgálat (e melléklet B.49. fejezete) lenne az aneuploidia kimutatására ajánlott in vivo, illetve in vitro vizsgálat.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

E vizsgálatban rendszerint rágcsálók használatosak, de egyes esetekben – amennyiben tudományosan indokolt – más fajok is megfelelőek lehetnek. E vizsgálatban a csontvelő a célszövet, mivel egy gazdagon vaszkularizált szövet, és olyan gyorsan szaporodó sejtek populációját tartalmazza, amelyek könnyen izolálhatók és preparálhatók. Patkányoktól és egerektől eltérő fajok használatának tudományos indokolását közölni kell a jelentésben. Rágcsálóktól eltérő fajok használata esetén a csontvelő kromoszóma-rendellenességének mérését ajánlatos integrálni egy másik megfelelő toxicitásvizsgálatba.

Ha létezik arra vonatkozó bizonyíték, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok), vagy annak (azoknak) a metabolitja(i) nem éri(k) el a célszövetet, e vizsgálat alkalmazása nem feltétlenül megfelelő.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

Az állatokat a megfelelő expozíciós úton kell kitenni a vizsgálati vegyi anyagnak, majd a kezelés után megfelelő időpontban humánus módon eutanáziát kell azokon végrehajtani. Az eutanázia előtt az állatokat metafázis-blokkoló szerrel (például kolchicinnel vagy kolcemiddel) kell kezelni. Ezután kromoszóma-preparálást kell végezni a csontvelősejtekből és azokat meg kell festeni, majd elemezni kell a metafázisban lévő sejteket kromoszóma-rendellenességek megállapítása céljából.

A LABORATÓRIUM JÁRTASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA

A jártasság vizsgálata

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti, a vizsgálat lefolytatásával kapcsolatos elegendő tapasztalat igazolása érdekében bizonyítottan képesnek kell lenniük a közzétett (például (6) irodalom), a kromoszóma-rendellenességek gyakoriságára vonatkozó adatok alapján várható eredmények reprodukálására legalább két, pozitív kontrollként szolgáló – például az 1. táblázatban felsorolt – vegyi anyaggal (ideértve az alacsony dózisban adagolt pozitív kontrollok által kiváltott gyenge reakciókat is) és kompatibilis vivőanyagos/oldószeres kontrollokkal (lásd a 22. pontot). E kísérletek során olyan dózisokat kell alkalmazni, amelyek reprodukálható és dózissal összefüggő növekedést biztosítanak, továbbá bizonyítják a vizsgálati rendszer érzékenységét és dinamikus tartományát az érintett szövetben (a csontvelőben), a laboratóriumon belül alkalmazandó értékelési módszer használatával. Ez a követelmény nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll 10–14. pontban meghatározott történeti adatbázis.

Történeti kontrolladatok

A jártassági vizsgálatok során a laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

 a pozitív kontrollok történeti tartománya és eloszlása, valamint

 a negatív kontrollok történeti tartománya és eloszlása.

A negatív kontrollok történeti eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal, amennyiben léteznek. Amint több kísérleti adat adódik a kontrollok történeti eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük. A laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisának statisztikailag megbízhatónak kell lennie annak garantálása érdekében, hogy a laboratórium képes legyen ellenőrizni a negatív kontrollra vonatkozó adatok eloszlását. A szakirodalom szerint legalább 10 kísérletre lehet szükség, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (7)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy a pozitív és a negatív kontrollokra vonatkozó adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll. A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (8).

Amennyiben a laboratórium nem végez elegendő számú kísérletet a negatív kontrollok statisztikailag megbízható eloszlásának megállapítására (lásd a 11. pontot) a (9. pontban ismertetett) jártassági vizsgálatok során, elfogadható, hogy az eloszlást az első rutinszerű vizsgálatok során határozzák meg. Ennek a megközelítésnek a (8) hivatkozásban foglalt ajánlásokat kell követnie, és az e kísérletek során kapott negatív kontrolleredményeknek továbbra is összhangban kell lenniük a negatív kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal.

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy milyen hatást gyakorol a létrejött adatoknak a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisával való összhangjára. Csak jelentősebb következetlenségek fennállása esetén kell új történeti kontrolladatbázist létrehozni, amennyiben szakértői vélemény megállapítja az adatok korábbi eloszlástól való eltérését (lásd a 11. pontot). Az újbóli létrehozás során nem feltétlenül van szükség negatív kontrollokat tartalmazó teljes adatbázisra egy tényleges vizsgálat lebonyolításához, amennyiben a laboratórium bizonyítani tudja, hogy a párhuzamos negatív kontrolljainak értékei továbbra is összhangban lesznek a korábbi adatbázisával vagy a kapcsolódó, közzétett adatokkal.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatok a (gapeken kívüli) szerkezeti kromoszóma-rendellenességek egyes állatokban történő előfordulását mutatják. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük. Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, amennyiben ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer »ellenőrzés alatt áll« (lásd a 11. pontot), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Az állatfaj kiválasztása

Egészséges, fiatal, ivarérett, általánosan használt laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. A patkányok általánosan használtak, bár az egerek is megfelelőek lehetnek. Bármely egyéb megfelelő emlősfaj használható, ha a jelentésben szerepel tudományos indokolás.

Az állatok tartásának és etetésének körülményei

Rágcsálók esetében a kísérleti helyiség hőmérsékletének 22 °C (±3 °C)-nak kell lennie. Bár ideális esetben a helyiség relatív páratartalmának 50–60 %-nak kell lennie, legyen legalább 40 %, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés szükségessége is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyag beadása ilyen módon történik. Ha agresszív viselkedés nem várható, a rágcsálókat azonos ivarú és azonos kezelt csoporthoz tartozó kis csoportokban, lehetőleg szilárd aljú, megfelelő környezetgazdagítással ellátott ketrecekben kell tartani (ketrecenként legfeljebb öt egyed tartható). Az állatok kizárólag tudományosan indokolt esetben tarthatók egyenként.

Az állatok előkészítése

Szokásosan egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni (rágcsálók esetén ideális esetben a kezelés kezdetén 6–10 hetes állatokat, bár valamivel idősebb állatok is elfogadhatóak), és azokat véletlenszerűen kontroll- és kezelt csoportokba kell osztani. Az egyes állatokat humánus, minimálisan invazív módszerrel (például gyűrűzéssel, címkézéssel, mikrocsip beültetésével vagy biometrikus azonosítással, de a fül vagy a lábujj kilyukasztása nélkül) egyedi azonosítóval kell ellátni, és legalább öt napig szoktatni kell a laboratóriumi körülményekhez. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek a ketrec elhelyezéséből adódó esetleges hatások. A pozitív kontrollal és a vizsgálati vegyi anyaggal való keresztszennyeződés kerülendő. A vizsgálat kezdetén az állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg az ivaronkénti átlag ± 20 %-át.

A dózisok előkészítése

Az állatoknak történő adagolás előtt a szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni kell megfelelő oldószerekben vagy vivőanyagokban, vagy bele kell keverni a takarmányba vagy az ivóvízbe. A folyékony vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül adagolhatók vagy az adagolás előtt hígíthatók. Belélegzéses expozíció esetén a vizsgálati vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függően gáz, gőz vagy szilárd/folyadék aeroszol formában adagolhatók. A vizsgálati vegyi anyagból mindig friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve akkor, ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát és meghatározzák a megfelelő tárolási feltételeket.

Oldószer/Vivőanyag

Az oldószer/vivőanyag nem okozhat toxikus hatásokat az alkalmazott dózisok mellett, és nem alkalmazható olyan oldószer/vivőanyag, amelyről feltehető, hogy kémiai reakcióba fog lépni a vizsgálati vegyi anyagokkal. Jól ismert oldószerektől eltérő oldószerek/vivőanyagok alkalmazása esetén azok használatát alá kell támasztani a kompatibilitásukat jelző referenciaadatokkal. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer/vivőanyag használatát ajánlatos megfontolni. Általánosan használt, kompatibilis oldószer/vivőanyag például többek között a víz, a fiziológiás sóoldat, a metilcellulóz oldat, a karboximetil-cellulóz-nátriumsó oldat, az olívaolaj és a kukoricaolaj. Azt igazoló történeti vagy közzétett adatok hiányában, hogy a választott atipikus oldószer/vivőanyag nem idéz elő szerkezeti rendellenességet vagy más ártalmas hatást, kiindulási vizsgálatot kell lebonyolítani az oldószeres/vivőanyagos kontroll elfogadhatóságának megállapítása érdekében.

Kontrollok

Pozitív kontrollok

Általában minden vizsgálat során alkalmazni kell olyan állatcsoportot, amelyet pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyaggal kezeltek. Ettől el lehet tekinteni, ha a vizsgálólaboratórium bizonyítja a vizsgálat lebonyolításában való jártasságát és megállapítja a pozitív kontrollok történeti tartományát. Párhuzamos pozitív kontrollcsoport hiányában minden egyes kísérletben értékelési kontrollokat (fixált és megfestetlen tárgylemezeket) kell alkalmazni. Ezek oly módon kaphatók meg, hogy a vizsgálat értékelésébe beszámítanak a vizsgálat lebonyolítása szerinti laboratóriumban rendszeres időközönként (például 6–18 hónaponként) – például a jártasság vizsgálata során, vagy szükség esetén azt követően rendszeresen – pozitív kontrollokkal végzett különálló kísérlettel létrejött és tárolt megfelelő referenciamintákat.

A pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagoknak megbízható módon ki kell váltaniuk a szerkezeti kromoszóma-rendellenességekkel rendelkező sejtek spontán szinthez képest kimutathatóan gyakoribbá válását. A pozitív kontrollok dózisát úgy kell megválasztani, hogy a hatások egyértelműek legyenek, de az értékelő ne tudja beazonosítani azonnal a kódolt mintákat. Elfogadható, hogy a pozitív kontroll beadása a vizsgálati vegyi anyagétól eltérő módon, más kezelési ütemtervvel történjen, és hogy mintavételre csak egyetlen időpontban kerüljön sor. Ezen túlmenően, adott esetben megfontolható a vegyi anyagokkal azonos kémiai osztályba tartozó pozitív kontrollok használata. A pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagokra az 1. táblázat tartalmaz példákat.



1. táblázat

Példák pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagokra

Vegyi anyag

CASRN

Etil-metánszulfonát

62-50-0

Metil-metánszulfonát

66-27-3

N-etil-N-nitrozo-karbamid

759-73-9

Mitomicin-C

50-07-7

Ciklofoszfamid monohidrát

50-18-0 (6055-19-2)

Trietilén-melamin

51-18-3

Negatív kontrollok

A negatív kontrollcsoport állatait minden mintavételi időpontban figyelembe kell venni, és azokat egyébként a kezelt csoportokkal azonos bánásmódban kell részesíteni, kivéve, hogy nem kapnak kezelést a vizsgálati vegyi anyaggal. Ha a vizsgálati vegyi anyag beadása során oldószert/vivőanyagot alkalmaznak, a kontrollcsoportnak meg kell kapnia ezt az oldószert/vivőanyagot. Ha azonban a vizsgálólaboratórium történeti adatai azt igazolják, hogy a negatív kontrollból származó, kromoszóma-rendellenességeket mutató sejtek állatok közötti sokfélesége és gyakorisága állandó minden mintavételi időpontban, a negatív kontrollokból elegendő lehet csak egyetlen mintavétel is. Amennyiben a negatív kontrollokhoz egyetlen mintavételt alkalmaznak, azt a vizsgálat során alkalmazott első mintavételi időpontban kell elvégezni.

ELJÁRÁS

Az állatok száma és ivara

A mikronukleusz-válasz általában hasonló a hím- és a nőivarú állatok körében (9), és ez várhatóan érvényes lesz a szerkezeti kromoszóma-rendellenességekre is; ezért a vizsgálatok többségét bármelyik ivarnál el lehet végezni. A hímek és a nőstények közötti lényeges eltéréseket (például a szisztémás toxicitás, a metabolizmus, a biológiai hasznosíthatóság, a csontvelő-toxicitás stb. többek között dózisbehatároló vizsgálattal megállapított eltéréseit) bizonyító adatok mindkét ivar használatát ösztönöznék. Ebben az esetben helyénvaló lehet mindkét ivarnál vizsgálatot végezni, például ismételt dózisú toxicitási vizsgálat keretében. Mindkét ivar használata esetén helyénvaló lehet a faktoriális kísérlettervezés alkalmazása. Az e kísérlettervezés segítségével végzendő adatelemzés részletei a 2. függelékben találhatók.

A vizsgálat megkezdésekor a csoportok méretét úgy kell megállapítani, hogy csoportonként legalább öt azonos ivarú – illetve mindkét ivar használata esetén mindkét ivarból öt – elemezhető állat legyen. Amennyiben a vegyi anyagoknak való emberi expozíció szexspecifikus lehet, mint például egyes gyógyszerek esetében, a vizsgálatot a megfelelő ivarú állatokkal kell elvégezni. Útmutatás az állatok maximális számára vonatkozó tipikus követelményhez: a három dóziscsoporttal és egy párhuzamos negatív kontrollcsoporttal, továbbá egy pozitív kontrollcsoporttal (melyek mindegyike öt, egy ivarhoz tartozó állatból áll) két mintavételi időpontban végzett csontvelővizsgálathoz 45 állatra lenne szükség.

Dózisszintek

Ha előzetes dózisbehatároló vizsgálatra kerül sor amiatt, hogy már nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok a dózisok kiválasztásának segítéséhez, azt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon fajok, törzsek, ivarok és kezelési eljárások alkalmazásával kell végrehajtani, mint amelyek a fő vizsgálatban alkalmazandóak (10). A vizsgálatnak a maximális tolerálható dózis (MTD) meghatározására kell irányulnia, amely anélkül, hogy vizsgálatkorlátozó toxicitást mutatna, a legmagasabb tolerált dózis a vizsgálati időszak tartamához viszonyítva (például testtömeg-csökkenést vagy vérképző rendszeri citotoxicitást vált ki), de elhullást, illetve humánus eutanáziát igénylő, bizonyított fájdalmat, szenvedést vagy szorongást nem idéz elő (11).

A legmagasabb dózis a csontvelőben toxicitásra utaló jeleket kiváltó dózisként is meghatározható.

Azok a vegyi anyagok, amelyek a toxikokinetikai tulajdonságok telítődését mutatják, vagy olyan detoxifikációs folyamatokat idéznek elő, amelyek hosszú távú kezelés után az expozíció csökkenéséhez vezethetnek, kivételek lehetnek a dózisbeállítási kritériumok alól, és azokat eseti alapon kell értékelni.

Annak érdekében, hogy dózis-válasz adatokat lehessen szerezni, a teljes vizsgálatnak egy negatív kontrollcsoportot, valamint legalább három dózisszintet kell tartalmaznia, ahol a dózisszintek közötti szorzótényező általában 2, de legfeljebb 4. Ha a vizsgálati vegyi anyag nem okoz toxicitást a dózisbehatároló vizsgálatban vagy meglévő adatok alapján, egyetlen beadás esetén a legmagasabb dózisnak 2 000 mg/testtömegkilogrammnak kell lennie. Ha azonban a vizsgálati vegyi anyag toxicitást okoz, az MTD-nek a beadott legmagasabb dózisnak kell lennie, és a használt dózisszintek lehetőleg fedjék le a maximálistól az alacsony mértékű toxicitást okozó vagy toxicitást egyáltalán nem okozó dózisig terjedő tartományt. Ha a célszövet (csontvelő) toxicitása valamennyi vizsgált dózisszintnél megfigyelhető, érdemes nem toxikus dózisoknál további vizsgálatot végezni. A mennyiségi dózis-válasz adatok teljesebb körű jellemzését célzó vizsgálatok további dóziscsoportokat tehetnek szükségessé. Ezek a határértékek a vizsgálati vegyi anyagok bizonyos, külön követelmények hatálya alá tartozó típusai (például a humán gyógyszerek) esetében változóak lehetnek.

Határérték-vizsgálat

Ha a dózisbehatároló kísérletek vagy a rokon állattörzsekből származó meglévő adatok azt jelzik, hogy a legalább a határdózist tartalmazó (az alábbiakban ismertetett) kezelési eljárás semmilyen megfigyelhető toxikus hatást nem vált ki, (többek között nem váltja ki a csontvelősejtek proliferációjának visszaesését vagy a célszövet citotoxicitásának más bizonyítékát), és ha nem várható genotoxicitás az in vitro genotoxicitási vizsgálatok alapján vagy a szerkezetileg rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján, akkor nem feltétlenül tekintendő szükségesnek három dózis használatával végrehajtott teljes vizsgálat, amennyiben bizonyítást nyert, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok) eléri(k) a célszövetet (a csontvelőt). Ilyen esetekben a határdózisnál alkalmazott egyetlen dózisszint elegendő lehet. 14 napot meghaladó beadási időszak esetén a határdózis 1 000  mg/testtömeg kg/nap. A legfeljebb 14 napig tartó beadási időszak esetén a határdózis 2 000  mg/testtömeg kg/nap.

A dózisok beadása

Az emberi expozíció várható útját figyelembe kell venni a vizsgálat tervezése során. Ezért az egyéb expozíciós utak (például takarmány, ivóvíz, helyi szubkután, intravénás, orális (gyomorszondával), inhalációs, intratracheális vagy implantáció) is kiválaszthatók indokoltként. Az utat mindenesetre úgy kell kiválasztani, hogy biztosítsa a célszövet(ek) megfelelő expozícióját. A hasüregbe adott injekció nem ajánlott, mivel az nem tervezett emberi expozíciós út, és kizárólag tudományos indokolással alkalmazható. Ha a vizsgálati vegyi anyagot a takarmányba vagy ivóvízbe keverik, különösen egyszeri adagolás esetén ügyelni kell arra, hogy a táplálék és a víz fogyasztása és a mintavétel közötti idő elegendő legyen a hatások kimutathatóságához (lásd a 33–34. pontot). A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretétől függ. A térfogata rendszerint nem haladhatja meg az 1 ml/100 testtömeggramm mennyiséget, kivéve vizes oldatok esetén, amelyeknél legfeljebb 2 ml/100 testtömeggramm használható. Ennél nagyobb mennyiségek használatát meg kell indokolni. A magasabb koncentrációértékeknél rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró vizsgálati vegyi anyagok kivételével, a koncentráció megfelelő beállításával minimálisra kell csökkenteni a vizsgálati vegyi anyag mennyiségének eltéréseit, hogy valamennyi dózisszinten a testtömeghez viszonyítva konstans mennyiséget lehessen beadni a kísérleti állatoknak.

A kezelés ütemterve

A vizsgálati vegyi anyag beadása rendszerint egyszeri dózissal történik, nagy mennyiségű anyag beadásának megkönnyítése érdekében azonban kettéosztott dózissal is beadható (például ugyanazon a napon két vagy több alkalommal, legfeljebb 2–3 órás időközzel). Ilyen körülmények között, vagy amikor a vizsgálati vegyi anyag beadása inhaláció útján történik, a mintavétel időpontját az utolsó dózis beadásának vagy az expozíció végének időpontja alapján kell ütemezni.

Ehhez a vizsgálathoz kevés adat áll rendelkezésre az ismételt dózisú protokoll megfelelőségére vonatkozóan. Olyan körülmények között azonban, amikor érdemes kiegészíteni ezt a vizsgálatot ismételt dózisú toxicitási vizsgálattal, ügyelni kell a károsodott kromoszómájú mikotikus sejtek toxikus dózisoknál esetlegesen előforduló elveszítésének elkerülésére. Ez a kiegészítés elfogadható, amikor a legmagasabb dózis meghaladja a határdózist vagy megegyezik azzal (lásd a 29. pontot), és egy dóziscsoport a kezelési időszak során mindvégig megkapja a határdózist. A mikronukleusz-vizsgálat (a B.12. vizsgálati módszer) a kromoszóma-rendellenességek esetén első választásnak minősülő in vivo vizsgálatnak tekintendő, ha más vizsgálatokkal való integráció célszerű.

A csontvelőből két külön időpontban kell mintát venni az egyszeri dózissal végzett kezeléseket követően. Rágcsálók esetében az első mintavételi időköznek 1,5 normál sejtciklusidőhöz szükséges időnek kell lennie (ez utóbbi rendszerint a kezelési időszak utáni 12–18 órát jelenti). Mivel a vizsgálati vegyi anyag(ok) felvételéhez és anyagcseréjéhez szükséges idő, valamint annak a sejtciklus-kinetikára gyakorolt hatása befolyásolhatja a kromoszóma-rendellenesség kimutatásának optimális időpontját, az első mintavételi időpont után 24 órával ajánlott egy későbbi mintavétel. Az első mintavételi időpontban minden dóziscsoportot kezelni kell, és azokból elemzés céljára mintát kell gyűjteni, a későbbi mintavételi időpont(ok)ban azonban csak a legmagasabb dózist kell beadni. Ha tudományos indokolás alapján egy napnál hosszabb adagolási eljárást alkalmaznak, a mintavételt általában az utolsó kezelést követő legfeljebb kb. 1,5 normál sejtciklusidő elteltekor kell elvégezni.

A kezelést követően és a mintavétel előtt az állatokba hasüregbe adva megfelelő dózisú metafázis-blokkoló szert (például kolcemidet vagy kolchicint) kell befecskendezni, és ezt követően megfelelő idő elteltével mintát kell venni. Egerek esetében ez a megfelelő idő körülbelül 3–5 óra, patkányok esetében pedig 2–5 óra. A sejteket ki kell nyerni a csontvelőből, meg kell duzzasztani, fixálni kell és meg kell festeni, majd elemezni kell azokat a kromoszóma-rendellenességek szempontjából (12).

Megfigyelések

A kísérleti állatok esetében általános klinikai megfigyeléseket kell tenni, és a klinikai tüneteket legalább naponta egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban rögzíteni kell, továbbá figyelembe kell venni az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Az adagolási időszakban naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot megbetegedés és elhullás szempontjából. Minden állat tömegét le kell mérni a vizsgálat megkezdésekor, az ismételt dózisú vizsgálatok esetén hetente legalább egyszer, valamint az állatok leölésekor. A legalább egy hétig tartó vizsgálatok során a felvett táplálék mennyiségét legalább heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgálati vegyi anyag beadására az ivóvízzel együtt kerül sor, a vízfogyasztást minden vízcsere alkalmával és legalább hetente le kell mérni. A túlzott toxicitás nem halálos jeleit mutató állatokon a vizsgálati időszak befejeződése előtt humánus módon eutanáziát kell végrehajtani (11).

A célszövet expozíciója

Amennyiben indokolt, és amennyiben más expozíciós adatok nem léteznek (lásd a 44. pontot), megfelelő időpont(ok)ban vérmintát kell venni annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyagok plazmában lévő szintjét meg lehessen vizsgálni annak bizonyítása céljából, hogy a csontvelő expozíciója megtörtént.

Csontvelő- és kromoszóma-preparátumok

Közvetlenül a humánus módon végrehajtott eutanáziát követően az állatok combcsontjából vagy sípcsontjából csontvelősejteket kell venni, azokat hipotonizálni, majd fixálni kell. A metafázisban lévő sejteket tárgylemezeken szét kell teríteni és bevált módszerek segítségével meg kell festeni (lásd a (3) és a (12) hivatkozást).

Elemzés

Az elemzés előtt minden tárgylemezt, a pozitív és negatív kontrollokét is ideértve, önálló kódolással kell ellátni, és azokat véletlenszerűen kell elrendezni, hogy az értékelést végző személy ne ismerje a kezelés körülményeit.

Minden kezelt állat (a pozitív kontrollállatokat is ideértve), továbbá a nem kezelt, vagy a vivőanyaggal/oldószerrel kezelt negatív kontrollba beosztott minden állat esetében állatonként legalább 1 000 sejtben meg kell határozni a mitiotikus indexet a citotoxicitás mérőszámaként.

Minden egyes állat esetében legalább 200 metafázist kell elemezni a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek szempontjából, a gapek figyelembevételével és figyelmen kívül hagyásával is (6). Ha azonban a negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázis szerint a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek gyakoriságának átlagos háttérértéke 1 %-nál kevesebb a vizsgálólaboratóriumban, meg kell fontolni további sejtek értékelését. A kromatid és a kromoszóma típusú rendellenességeket külön-külön kell feljegyezni és altípusonként (törések, kicserélődések) kell besorolni. A laboratóriumban alkalmazott eljárásoknak biztosítaniuk kell, hogy a kromoszóma-rendellenességeket jól képzett értékelők elemezzék, és adott esetben szakértők értékeljék. Elismerve, hogy a tárgylemezek előkészítésére szolgáló eljárások következtében gyakran megszakad a metafázisok bizonyos aránya, ami kromoszómaveszteséggel jár, a kiértékelt sejteknek ezért legalább 22 számú centromérát kell tartalmazniuk, ahol n az adott faj esetében a haploid kromoszómaszám.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények feldolgozása

Az egyes állatok adatait táblázat formájában kell megadni. Minden egyes állat esetében értékelni kell a mitotikus indexet, a kiértékelt, metafázisban lévő sejtek számát, a metafázisban lévő sejtenkénti rendellenességek számát és a szerkezeti kromoszóma-rendellenessége(ke)t mutató sejtek százalékos arányát. Fel kell sorolni a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek különböző típusait a számukkal és gyakoriságukkal együtt, kezelt és kontrollcsoportonként. A gapeket, valamint a poliploid sejteket és az endoreduplikált kromoszómákkal rendelkező sejteket külön-külön kell feljegyezni. A gapek gyakoriságát a jelentésbe kell foglalni, de általában nem kell szerepeltetni az összes szerkezeti rendellenesség gyakoriságának elemzésében. Ha nincs bizonyíték arra, hogy a két ivar másként reagál, az adatok statisztikai elemzés céljából összevonhatók. Az állati toxicitásra és a klinikai tünetekre vonatkozó adatokat szintén a jelentésbe kell foglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Az alábbi kritériumok határozzák meg a vizsgálat elfogadhatóságát:

a) A párhuzamos negatív kontrollok adatai bevihetők a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisába (lásd a 11–14. pontot).

b) A párhuzamos pozitív kontrolloknak vagy értékelési kontrolloknak a pozitív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisban generált válaszokkal összeegyeztethető válaszokat, valamint a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva statisztikailag szignifikáns növekedést kell előidézniük (lásd a 20–21. pontot).

c) A megfelelő számú dózis és sejt elemzésére sor került.

d) A legmagasabb dózis kiválasztására vonatkozó kritériumok összhangban vannak a 25-28. pontban ismertetett kritériumokkal.

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha:

a) legalább az egyik kezelt csoport statisztikailag szignifikáns növekedést mutat a (gapeken kívüli) szerkezeti kromoszóma-rendellenességekkel rendelkező sejtek gyakoriságában a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva,

b) a megfelelő trendpróbával történő értékelés arra utal, hogy a növekedés a dózissal összefügg, legalább egy mintavételi időpontban; és

c) ezen eredmények bármelyike a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken) kívül esik.

Ha egy adott mintavételi időpontban csak a legmagasabb dózis vizsgálatára kerül sor, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha statisztikailag szignifikáns növekedés tapasztalható a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva, és az eredmények a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken) kívül esnek. A megfelelő statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (13). Dózis-válasz elemzéskor legalább három kezelt dóziscsoportot kell elemezni. A statisztikai vizsgálatoknak az állatot kell kísérleti egységként alkalmazniuk. A kromoszóma-rendellenességek vizsgálatának pozitív eredményei arra utalnak, hogy egy vizsgálati vegyi anyag szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket idéz elő a vizsgált faj csontvelőjében.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény esetén:

a) a kezelt csoportok egyike sem mutat statisztikailag szignifikáns növekedést a (gapeken kívüli) szerkezeti kromoszóma-rendellenességek gyakorisága tekintetében a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva,

b) a megfelelő trendpróbával történő értékelés arra utal, hogy egyetlen mintavételi időpontban sincs dózissal összefüggő növekedés,

c) valamennyi eredmény a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken) belül van, valamint

d) a csontvelő vizsgálati vegyi anyag(ok)nak való expozíciója megtörtént.

A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (13). A csontvelő vizsgálati vegyi anyag(ok)nak való expozíciójára vonatkozó bizonyíték lehet többek között a mitotikus index csökkenése vagy a vizsgálati vegyi anyag(ok) plazmában vagy vérben való előfordulásának mérése. Intravénás beadás esetén az expozícióra vonatkozó bizonyíték nem szükséges. Alternatív esetben az azonos expozíciós út és azonos faj alkalmazásával végzett független vizsgálat során kapott ADME-adatok használhatók a csontvelő-expozíció bizonyítására. A negatív eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati körülmények mellett a vizsgálati vegyi anyag nem idéz elő szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket a vizsgált fajok csontvelőjében.

Az egyértelműen pozitív vagy egyértelműen negatív válasz igazolása nem követelmény.

Olyan esetekben, ha a válasz nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, illetve egy adott eredmény (például kismértékű vagy határesethez közelítő növekedés) biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy a már lefolytatott kísérletek további vizsgálataival kell értékelni. Egyes esetekben hasznos lehet több sejt elemzése vagy módosított kísérleti körülmények mellett megismételt kísérlet végrehajtása.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatok eleve kizárják azt a következtetést, hogy a vizsgálati vegyi anyag pozitív vagy negatív eredményeket hoz, ezért a végkövetkeztetés szerint a vizsgálat kétértelmű lesz.

A poliploid sejteknek és az endoreduplikált metafázisú sejteknek az összes metafázis közötti gyakoriságát külön-külön kell feljegyezni. A poliploid/endoreduplikált sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan gátolhatja a mitotikus folyamatokat vagy a sejtciklus előrehaladását (lásd a 3. pontot).

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Összegzés

Vizsgálati vegyi anyag:

 eredet, tételszám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll;

 a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert;

Egy összetevőből álló anyag:

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonossága stb.

Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek:

 amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai jellemzik.

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése:

 a vivőanyag megválasztásának indoklása;

 a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/vivőanyagban, ha ismert;

 a takarmány-, ivóvíz- vagy inhalációs készítmények előkészítése;

 a készítmények analitikai meghatározásai (pl. stabilitás, homogenitás, névleges koncentráció), ha végeznek ilyen meghatározásokat.

Kísérleti állatok:

 a felhasznált faj/törzs és a felhasználásuk indokolása;

 az állatok száma, kora és ivara;

 az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.;

 az állatok egyedi azonosítására szolgáló módszerek;

 rövid távú vizsgálatok esetében: az egyes állatok tömege a vizsgálat kezdetén és végén; egy hétnél hosszabb vizsgálatok esetében: az egyes állatok testtömege a vizsgálat során és a táplálékfelvételük. A testtömegtartományt, az átlagot és a szórást minden egyes csoportnál meg kell adni.

Vizsgálati körülmények:

 pozitív és negatív (oldószeres/vivőanyagos) kontrollok;

 a dózisbehatároló vizsgálatból kapott adatok, ha történt ilyen vizsgálat;

 a dózisszintek kiválasztásának indoklása;

 a vizsgálati vegyi anyag előkészítésére vonatkozó részletek;

 a vizsgálati vegyi anyag beadására vonatkozó részletek;

 a beadási út és időtartam indoklása;

 annak ellenőrzésére szolgáló módszerek, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok) elérte-e (elérték-e) az általános keringési rendszert vagy a csontvelőt;

 tényleges dózis (mg/testtömeg kg/nap) a vizsgálati vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjából (ppm) és a fogyasztásból számítva, ha alkalmazható;

 a táplálék és víz minőségére vonatkozó részletek;

 az eutanázia módja;

 a fájdalomcsillapítás módja (amennyiben alkalmaznak ilyet);

 a kezelési és mintavételi ütemtervek részletes leírása és kiválasztásuk indokolása;

 a tárgylemez preparálásának módszerei;

 a toxicitás mérésére szolgáló módszerek;

 a metafázis-blokkoló vegyi anyag összetétele, koncentrációja, dózisa és a mintavétel előtti beadásának időpontja;

 a minták izolálására és tartósítására alkalmazott eljárások;

 a rendellenességek értékelésének kritériumai;

 az állatonként elemzett, metafázisban lévő sejtek száma, valamint a mitotikus index meghatározása céljából elemzett sejtek száma;

 a vizsgálat elfogadhatóságának kritériumai;

 azok a kritériumok, amelyek meghatározzák, hogy a vizsgálatok pozitívnak, negatívnak vagy nem meggyőzőnek tekintendők-e.

Eredmények:

 az állatok állapota a vizsgálati időszak előtt és alatt, beleértve a toxicitás jeleit;

 a mitotikus index minden állat esetében külön-külön megadva;

 a rendellenességek és a rendellenességet mutató sejtek típusa és száma, minden egyes állat esetében külön-külön megadva;

 a rendellenességek csoportonkénti száma összesen, átlagokkal és szórással;

 a rendellenességeket mutató sejtek csoportonkénti száma átlagokkal és szórással;

 a ploidia változásai, ha észlelhetők, beleértve a poliploid és/vagy endoreduplikált sejtek gyakoriságát;

 a dózis-válasz összefüggés, ahol lehetséges;

 az alkalmazott statisztikai elemzések és módszer;

 a csontvelő expozícióját alátámasztó adatok;

 a párhuzamos negatív és pozitív kontrollokra vonatkozó adatok, a tartományok, az átlag és a szórás megadásával;

 a történeti negatív és pozitív kontrolladatok, a tartományok, az átlagok és a szórás, az eloszlásra vonatkozó 95 %-os ellenőrzési határértékek, valamint a tárgyidőszak és a megfigyelések számának megadásával;

 a pozitív vagy a negatív válasz esetén teljesített kritériumok.

Az eredmények tárgyalása.

Következtetés.

Hivatkozások.

SZAKIRODALOM

(1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2) Adler, I.D. (1984), “Cytogenetic Tests in Mammals”, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275-306.

(3) Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157-165.

(4) Richold, M. et al. (1990), “In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.

(5) Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305-312.

(6) Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19-30.

(7) Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(8) Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(9) Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.

(10) Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.

(11) OECD (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, N°19, OECD Publishing, Paris.

(12) Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163.

(13) Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.




1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Aneuploidia : a normális diploid (vagy haploid) kromoszómaszámtól egyetlen kromoszómával vagy egynél több, szám feletti kromoszómával, de nem teljes kromoszómakészlet(ek) többszöröződésével (lásd a poliploidiát) való bármely eltérés.

Centroméra : olyan kromoszóma-régió(k), amely(ek)hez a sejtosztódás során orsórostok kötődnek, lehetővé téve a leánykromoszómáknak az utódsejtek pólusai felé irányuló szabályos mozgását.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Kromatid típusú rendellenesség : olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a különálló kromatidok törésében vagy a kromatidok törésében és újraegyesülésében nyilvánul meg.

Kromoszóma típusú rendellenesség : olyan szerkezeti kromoszómakárosodás, amely a két kromatid azonos helyén történt törésében, vagy törésben és újraegyesülésben nyilvánul meg.

Endoreduplikáció : az a folyamat, amely során valamely DNS-replikáció S fázisát követően a sejtmag nem lép be a mitózis fázisába, hanem egy másik S fázist indít. Az eredmény 4, 8, 16, … kromatiddal rendelkező kromoszómák létrejötte.

Gap : egyetlen kromatid szélességénél kisebb és a kromatidok minimális átrendeződését okozó akromatikus sérülés.

Mitotikus index : a mitózisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya, amely az adott sejtpopuláció proliferációs állapotának mérőszáma.

Számszerű rendellenesség : a kromoszómák számának eltérése a felhasznált állatokra jellemző normál számértéktől (aneuploidia).

Poliploidia : ellentétben a kromoszómakészlet egy részében jelentkező számszerű változással (lásd az aneuploidiát), a teljes kromoszómakészlet kromoszómaszámának változásával járó számszerű kromoszóma-rendellenesség.

Szerkezeti kromoszóma-rendellenesség : a sejtosztódás metafázisának mikroszkopikus vizsgálata során – deléciókként és fragmensekként, kromoszómán belüli vagy a kromoszómák közötti átrendeződésként – észlelhető változás a kromoszóma szerkezetében.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.




2. függelék

AZ IVAROK KÖZÖTTI ELTÉRÉSEK KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉGEK IN VIVO VIZSGÁLATA SORÁN TÖRTÉNŐ MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ FAKTORIÁLIS KÍSÉRLETTERVEZÉS

A faktoriális kísérlettervezés és annak elemzése

Ebben a kísérlettervezésben legalább 5 hím és 5 nőstény vizsgálatára kerül sor mindegyik koncentrációszintnél, ami legalább 40 állat (20 hím és 20 nőstény, valamint a releváns pozitív kontrollok) felhasználását eredményezi.

A kísérlettervezés, amely az egyszerűbb faktoriális kísérlettervezések egyike, kétirányú varianciaanalízissel egyenértékű, ahol a fő tényezők az ivar és a koncentrációszintek. Az adatok számos standard statisztikai szoftvercsomag, például az SPSS, az SAS, a STATA, a Genstat, valamint az R használatával elemezhetők.

Az analízis az adatkészleten belül a variabilitást az ivarok közötti variabilitásra, a koncentrációk közötti variabilitásra, valamint az ivarok és a koncentrációk közötti kölcsönhatáshoz kapcsolódó variabilitásra osztja. Az egyes feltételeket ugyanazon koncentrációnak kitett, az azonos ivarú állatok csoportjain belüli párhuzamos állatok közötti variabilitás becsült értékéhez viszonyítva kell megvizsgálni. A mögöttes módszertanra vonatkozó kimerítő részletek számos statisztikai tankönyvben (lásd a hivatkozásokat) és a statisztikai szoftvercsomagokkal együtt biztosított súgófájlokban is megtalálhatók.

Az analízis az ivar x koncentráció kölcsönhatási feltételnek az ANOVA-táblázatban ( 4 ) való vizsgálatával folytatódik. Szignifikáns kölcsönhatás hiányában az egyes ivarok vagy az egyes koncentrációszintek közötti értékek kombinálásával érvényes statisztikai vizsgálat végezhető a szintek között, az ANOVA szerinti, csoporton belül összesített variabilitási feltétel alapján.

Az analízis a becsült koncentrációk közötti variabilitás kontrasztokká osztásával folytatódik, ami lehetővé teszi a válaszok lineáris és kvadratikus kontrasztjainak megállapítását valamennyi koncentrációszintnél. Ha az ivar x koncentráció kölcsönhatás szignifikáns, ez a feltétel lineáris x ivar és kvadratikus x ivar kölcsönhatására vonatkozó kontrasztokká osztható. E feltételek arra vonatkozó vizsgálatokat biztosítanak, hogy a koncentráció-válaszok párhuzamosak-e a két ivar esetében, illetve hogy a két ivar különböző választ ad-e.

A csoporton belül összesített variabilitásra vonatkozó becslés felhasználható az átlagok közötti eltérés páronkénti vizsgálatához. Ezek az összehasonlítások elvégezhetők a két ivarra vonatkozó átlagok között és a különböző koncentrációszintekre vonatkozó átlagok között; ilyen például a negatív kontrollok szintjével való összehasonlítás. Amennyiben szignifikáns kölcsönhatás tapasztalható, összehasonlítható a különböző koncentrációk adott ivaron belüli átlaga vagy az ivarok azonos koncentrációnál számított átlaga.

Hivatkozások

Számos olyan statisztikai tankönyv létezik, amely a faktoriális kísérlettervezések elméletét, kialakítását, módszertanát, elemzését és értelmezését tárgyalja, a legegyszerűbb kétfaktoros elemzéstől a kísérlettervezés módszertanában alkalmazott bonyolultabb formákig. Az alábbi nem kimerítő lista. Egyes könyvekben összehasonlítható kísérlettervezésekre vonatkozó kidolgozott példák találhatók, esetenként az analízisek különféle szoftvercsomagok segítségével történő lefuttatásához szükséges kóddal együtt.

Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

(5) A B. részben a B.12. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.12    Emlős eritrocita mikronukleusz-vizsgálat

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 474. vizsgálati iránymutatásában (2014) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (1).

Az emlősökön végzett in vivo mikronukleusz-vizsgálat azért különösen releváns a genotoxicitás értékelése szempontjából, mert az in vivo metabolizmus tényezői, a farmakokinetikai és a DNS-reparációs folyamatok – jóllehet fajonként eltérnek – aktívak és hozzájárulnak a reakciókhoz. Az in vivo vizsgálat valamely in vitro rendszer által kimutatott genotoxicitás további vizsgálatához is hasznos.

Az emlősökön végzett in vivo mikronukleusz-vizsgálat a vizsgálati vegyi anyag által a kromoszómákban vagy az eritroblasztok mitiotikus rendszerében előidézett károsodás kimutatására használatos. A vizsgálat az állatok, rendszerint rágcsálók csontvelőjéből vagy perifériás vérsejtjeiből vett mintákban található eritrocitákon belüli mikronukleusz-képződést értékeli.

A mikronukleusz-vizsgálat célja a visszamaradó kromoszómatöredékeket vagy egész kromoszómákat tartalmazó mikronukleuszok kialakulását eredményező citogenetikai károsodást okozó vegyi anyagok meghatározása.

Amikor a csontvelői eritroblasztból éretlen eritrocita (néha más néven polikromáziás eritrocita vagy retikulocita) fejlődik ki, a fő sejtmag kilökődik, a már esetlegesen létrejött mikronukleuszok hátramaradhatnak a citoplazmában. E sejtekben a fő sejtmag hiánya miatt könnyebb a mikronukleuszok láthatóvá tétele vagy kimutatása. A kezelt állatokban a mikronukleált éretlen eritrociták gyakoriságának növekedése az előidézett szerkezeti vagy számszerű kromoszóma-rendelleneségekre utal.

Az újonnan kialakult mikronukleált eritrociták azonosítására és számszerűsítésére megfestéssel kerül sor, melyet mikroszkóp segítségével végzett vizuális értékelés vagy automatizált elemzés követ. Az ivarérett állatok perifériás vérében vagy csontvelőjében lévő elegendő éretlen eritrocita megszámlálását jelentős mértékben megkönnyíti az automatizált értékelési platformok használata. Ezek a platformok a kézi értékelés elfogadható alternatívái (2). Összehasonlító tanulmányokból kiderült, hogy e módszerek a megfelelő kalibráló standardok használatával együtt a kézi mikroszkópos értékelésnél jobb laboratóriumközi és laboratóriumon belüli reprodukálhatóságot és érzékenységet biztosíthatnak (3) (4). A mikronukleált eritrociták gyakoriságának mérésére alkalmas automatizált rendszerek többek között, de nem kizárólag a következők: áramlási citométerek (5), képelemző platformok (6) (7) és lézerszkenneléses citométerek (8).

Bár a vizsgálat keretében általában erre nem kerül sor, a kromoszómatöredékek számos kritérium mentén megkülönböztethetők az egész kromoszómáktól. Ilyen többek között a kinetokor vagy centromer DNS jelenlétének vagy hiányának megállapítása, melyek mindegyike az intakt kromoszómákra jellemző. A kinetokor vagy a centromer DNS hiánya arra utal, hogy a mikronukleusz csak kromoszómatöredékeket tartalmaz, míg a jelenlétük kromoszómaveszteséget jelez.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

Ebben a vizsgálatban a genetikai károsodás vizsgálata szempontjából a fiatal, ivarérett rágcsálók csontvelője a célszövet, mivel az eritrociták ebben a szövetben termelődnek. A perifériás vérben található éretlen eritrocitákban lévő mikronukleuszok mérése elfogadható más olyan emlősfajokban, amelyek esetében az e sejtekben szerkezeti vagy számszerű kromoszóma-rendellenességeket okozó vegyi anyagok kimutatására való megfelelő érzékenység (mikronukleuszok éretlen eritrocitákban való indukciójával) bizonyítást nyert, és amennyiben e választást tudományosan megindokolták. A fő végpont a mikronukleált éretlen eritrociták gyakoriságának meghatározása. A mikronukleuszt tartalmazó érett eritrociták perifériás vérbeli gyakorisága is használható végpontként olyan fajoknál, amelyeknek a lépe nem végez erőteljes kiválasztást a mikronukleált sejtekkel szemben, valamint abban az esetben, ha az állatok folyamatos kezelése az alkalmazott fajokban előforduló eritrocita élettartamát meghaladó ideig tart (pl. egereknél 4 hétig vagy tovább).

Ha létezik arra vonatkozó bizonyíték, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok), vagy annak (azoknak) a metabolitja(i) nem éri(k) el a célszövetet, e vizsgálat alkalmazása nem feltétlenül megfelelő.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

Az állatokat megfelelő módon kell a vizsgálati vegyi anyagnak kitenni. Csontvelő használata esetén az állatokon a kezelés után megfelelő időpont(ok)ban humánus módon eutanáziát kell végrehajtani, a csontvelőt ki kell vonni, preparálni kell és meg kell festeni (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15). Perifériás vér használatakor a vért a kezelés után megfelelő időpont(ok)ban össze kell gyűjteni és preparátumokat kell létrehozni, majd meg kell festeni azokat (12), (16), (17), (18). Akut kezelés esetén fontos, hogy a csontvelő vagy a vér összegyűjtésére olyan időpontban kerüljön sor, amikor a mikronukleált éretlen eritrociták kezeléssel összefüggő megjelenése kimutatható. Perifériás vérből történő mintavétel esetén az is követelmény, hogy elegendő idő teljen el ahhoz, hogy ezek a jelenségek előforduljanak a keringő vérben. A preparátumokat mikroszkóp, képelemzés, áramlási citometria vagy lézerszkenneléses citometria segítségével végzett megjelenítéssel kell elemezni a mikronukleuszok jelenléte szempontjából.

A LABORATÓRIUM JÁRTASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA

A jártasság vizsgálata

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti, a vizsgálat lefolytatásával kapcsolatos elegendő tapasztalat igazolása érdekében bizonyítottan képesnek kell lenniük a közzétett (például (17) (19) (20) (21) (22) irodalom), a mikronukleusz gyakoriságára vonatkozó adatok alapján várható eredmények reprodukálására legalább két, pozitív kontrollként szolgáló – például az 1. táblázatban felsorolt – vegyi anyaggal (ideértve az alacsony dózisban adagolt pozitív kontrollok által kiváltott gyenge reakciókat is) és kompatibilis vivőanyagos/oldószeres kontrollokkal (lásd a 26. pontot). E kísérletek során olyan dózisokat kell alkalmazni, amelyek reprodukálható és dózissal összefüggő növekedést biztosítanak, továbbá bizonyítják a vizsgálati rendszer érzékenységét és dinamikus tartományát az érintett szövetben (a csontvelőben vagy a perifériás vérben), a laboratóriumon belül alkalmazandó értékelési módszer használatával. Ez a követelmény nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll 14–18. pontban meghatározott történeti adatbázis.

Történeti kontrolladatok

A jártassági vizsgálatok során a laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

 a pozitív kontrollok történeti tartománya és eloszlása, valamint

 a negatív kontrollok történeti tartománya és eloszlása.

A negatív kontrollok történeti eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal, amennyiben léteznek. Amint több kísérleti adat adódik a kontrollok történeti eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük. A laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisának statisztikailag megbízhatónak kell lennie annak garantálása érdekében, hogy a laboratórium képes legyen ellenőrizni a negatív kontrollra vonatkozó adatok eloszlását. A szakirodalom szerint legalább 10 kísérletre lehet szükség, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (23)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll. A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (24).

Amennyiben a laboratórium nem végez elegendő számú kísérletet a negatív kontrollok statisztikailag megbízható eloszlásának megállapítására (lásd a 15. pontot) a (13. pontban ismertetett) jártassági vizsgálatok során, elfogadható, hogy az eloszlást az első rutinszerű vizsgálatok során határozzák meg. Ennek a megközelítésnek a (24) szakirodalomban foglalt ajánlásokat kell követnie, és az e kísérletek során kapott negatív kontrolleredményeknek továbbra is összhangban kell lenniük a negatív kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal.

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy milyen hatást gyakorol a létrejött adatoknak a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisával való összhangjára. Csak jelentősebb következetlenségek fennállása esetén kell új történeti kontrolladatbázist létrehozni, amennyiben szakértői vélemény megállapítja az adatok korábbi eloszlástól való eltérését (lásd a 15. pontot). Az újbóli létrehozás során nem feltétlenül van szükség negatív kontrollokat tartalmazó teljes adatbázisra egy tényleges vizsgálat lebonyolításához, amennyiben a laboratórium bizonyítani tudja, hogy a párhuzamos negatív kontrolljainak értékei továbbra is összhangban lesznek a korábbi adatbázisával vagy a kapcsolódó, közzétett adatokkal.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatok a mikronukleált éretlen eritrociták egyes állatokban történő előfordulását jelzik. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük. Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, amennyiben ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer »ellenőrzés alatt áll« (lásd a 15. pontot), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Előkészületek

Az állatfaj kiválasztása

Egészséges, fiatal, ivarérett, általánosan használt laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. Egerek, patkányok vagy más megfelelő emlősfajok használhatók. Perifériás vér használata esetén meg kell állapítani, hogy a mikronukleált sejteknek a lép általi eltávolítása nem veszélyezteti a kiválasztott fajokban indukált mikronukleuszok kimutatását. Ez az egerek és a patkányok perifériás vére tekintetében egyértelműen bizonyítást nyert (2). Patkányoktól és egerektől eltérő fajok használatának tudományos indokolását közölni kell a jelentésben. Rágcsálóktól eltérő fajok használata esetén az indukált mikronukleuszok mérését ajánlatos integrálni egy másik megfelelő toxicitásvizsgálatba.

Az állatok tartásának és etetésének körülményei

Rágcsálók esetében a kísérleti helyiség hőmérsékletének 22 °C (±3 °C)-nak kell lennie. Bár ideális esetben a helyiség relatív páratartalmának 50–60 %-nak kell lennie, legyen legalább 40 %, és a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés szükségessége is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyag beadása ilyen módon történik. Ha agresszív viselkedés nem várható, a rágcsálókat azonos ivarú és azonos kezelt csoporthoz tartozó kis csoportokban, lehetőleg szilárd aljú, megfelelő környezetgazdagítással ellátott ketrecekben kell tartani (ketrecenként legfeljebb öt egyed tartható). Az állatok kizárólag tudományosan indokolt esetben tarthatók egyenként.

Az állatok előkészítése

Szokásosan egészséges, fiatal, ivarérett állatokat kell alkalmazni (rágcsálók esetén ideális esetben a kezelés kezdetén 6–10 hetes állatokat, bár valamivel idősebb állatok is elfogadhatóak), és azokat véletlenszerűen kontroll- és kezelt csoportokba kell osztani. Az egyes állatokat humánus, minimálisan invazív módszerrel (például gyűrűzéssel, címkézéssel, mikrocsip beültetésével vagy biometrikus azonosítással, de a fül vagy a lábujj kilyukasztása nélkül) egyedi azonosítóval kell ellátni, és legalább öt napig szoktatni kell a laboratóriumi körülményekhez. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek a ketrec elhelyezéséből adódó esetleges hatások. A pozitív kontrollal és a vizsgálati vegyi anyaggal való keresztszennyeződés kerülendő. A vizsgálat kezdetén az állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg az ivaronkénti átlag ± 20 %-át.

A dózisok előkészítése

Az állatoknak történő adagolás előtt a szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni kell megfelelő oldószerekben vagy vivőanyagokban, vagy bele kell keverni a takarmányba vagy az ivóvízbe. A folyékony vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül adagolhatók vagy az adagolás előtt hígíthatók. Belélegzéses expozíció esetén a vizsgálati vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függően gáz, gőz vagy szilárd/folyadék aeroszol formában adagolhatók. A vizsgálati vegyi anyagból mindig friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve akkor, ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát és meghatározzák a megfelelő tárolási feltételeket.

Vizsgálati körülmények

Oldószer/Vivőanyag

Az oldószer/vivőanyag nem okozhat toxikus hatásokat az alkalmazott dózisok mellett, és nem alkalmazható olyan oldószer/vivőanyag, amely képes kémiai reakcióba lépni a vizsgálati vegyi anyagokkal. Jól ismert oldószerektől eltérő oldószerek/vivőanyagok alkalmazása esetén azok használatát alá kell támasztani a kompatibilitásukat jelző referenciaadatokkal. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer/vivőanyag használatát ajánlatos megfontolni. Általánosan használt, kompatibilis oldószer/vivőanyag például többek között a víz, a fiziológiás sóoldat, a metilcellulóz oldat, a karboximetil-cellulóz-nátriumsó oldat, az olívaolaj és a kukoricaolaj. Azt igazoló történeti vagy közzétett adatok hiányában, hogy a választott atipikus oldószer/vivőanyag nem idéz elő mikronukleuszokat vagy más ártalmas hatást, kiindulási vizsgálatot kell lebonyolítani az oldószeres/vivőanyagos kontroll elfogadhatóságának megállapítása érdekében.

Kontrollok

Pozitív kontrollok

Általában minden vizsgálat során alkalmazni kell olyan állatcsoportot, amelyet pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyaggal kezeltek. Ettől el lehet tekinteni, ha a vizsgálólaboratórium bizonyítja a vizsgálat lebonyolításában való jártasságát és megállapítja a pozitív kontrollok történeti tartományát. Párhuzamos pozitív kontrollcsoport hiányában minden egyes kísérletben értékelési kontrollokat (az értékelési módszertől függően megfelelő, fixált és megfestetlen tárgylemezeket vagy sejtszuszpenzió-mintákat) kell alkalmazni. Ezek oly módon kaphatók meg, hogy a vizsgálat értékelésébe beszámítanak a rendszeres időközönként (például 6–18 hónaponként) – például a jártasság vizsgálata során, vagy szükség esetén azt követően rendszeresen – pozitív kontrollokkal végzett különálló kísérlettel létrejött és tárolt megfelelő referenciamintákat.

A pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagoknak megbízható módon ki kell váltaniuk a mikronukleuszok spontán szinthez képest kimutathatóan gyakoribbá válását. Mikroszkóppal végzett kézi értékelés alkalmazásakor a pozitív kontrollok dózisát úgy kell megválasztani, hogy a hatások egyértelműek legyenek, de az értékelő ne tudja beazonosítani azonnal a kódolt mintákat. Elfogadható, hogy a pozitív kontroll beadása a vizsgálati vegyi anyagétól eltérő módon, más kezelési ütemtervvel történjen, és hogy mintavételre csak egyetlen időpontban kerüljön sor. Ezen túlmenően, adott esetben megfontolható a vegyi anyagokkal azonos kémiai osztályba tartozó pozitív kontrollok használata. A pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagokra az 1. táblázat tartalmaz példákat.

1. táblázat

Példák pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagokra

Etil-metánszulfonát [CASRN 62-50-0]

Metil-metánszulfonát [CASRN 66-27-3]

N-etil-N-nitrozo-karbamid [CASRN 759-73-9]

Mitomicin C [CASRN 50-07-7]

Ciklofoszfamid monohidrát [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Trietilén-melamin [CASRN 51-18-3]

Kolchicin [CASRN 64-86-8] vagy vinblasztin[CASRN 865-21-4] – mint aneugének

Negatív kontrollok

A negatív kontrollcsoport állatait minden mintavételi időpontban figyelembe kell venni, és azokat egyébként a kezelt csoportokkal azonos bánásmódban kell részesíteni, kivéve, hogy nem kapnak kezelést a vizsgálati vegyi anyaggal. Ha a vizsgálati vegyi anyag beadása során oldószert/vivőanyagot alkalmaznak, a kontrollcsoportnak meg kell kapnia ezt az oldószert/vivőanyagot. Ha azonban a vizsgálólaboratórium történeti adatai azt igazolják, hogy a negatív kontrollból származó, mikronukleált sejtek állatok közötti sokfélesége és gyakorisága állandó minden mintavételi időpontban, a negatív kontrollokból elegendő lehet csak egyetlen mintavétel is. Amennyiben a negatív kontrollokhoz egyetlen mintavételt alkalmaznak, azt a vizsgálat során alkalmazott első mintavételi időpontban kell elvégezni.

Perifériás vér használata esetén a rövid távú vizsgálatoknál a párhuzamos negatív kontroll helyett elfogadható egy kezelés előtti minta, ha a létrejött adatok összhangban vannak a vizsgálólaboratórium történeti kontrolladatbázisával. Patkányok vonatkozásában beigazolódott, hogy a kezelés előtti kis mennyiségű (például naponta 100 μl-nél kevesebb) mintavétel csekély mértékben befolyásolja a mikronukleusz-háttérgyakoriságot (25).

ELJÁRÁS

Az állatok száma és ivara

A mikronukleusz-válasz általában hasonló a hím- és a nőivarú állatok körében, és ezért a vizsgálatok többsége bármelyik nemnél elvégezhető (26). A hímek és a nőstények közötti lényeges eltéréseket (például a szisztémás toxicitás, a metabolizmus, a biológiai hasznosíthatóság, a csontvelő-toxicitás stb. például többek között dózisbehatároló vizsgálattal megállapított eltéréseit) bizonyító adatok mindkét ivar használatát ösztönöznék. Ebben az esetben helyénvaló lehet mindkét ivarnál vizsgálatot végezni, például ismételt dózisú toxicitási vizsgálat keretében. Mindkét ivar használata esetén helyénvaló lehet a faktoriális kísérlettervezés alkalmazása. Az e kísérlettervezés segítségével végzendő adatelemzés részletei a 2. függelékben találhatók.

A vizsgálat megkezdésekor a csoportok méretét úgy kell megállapítani, hogy csoportonként legalább öt azonos ivarú – illetve mindkét ivar használata esetén mindkét ivarból öt – elemezhető állat legyen. Amennyiben a vegyi anyagoknak való emberi expozíció szexspecifikus lehet, mint például egyes gyógyszerek esetében, a vizsgálatot a megfelelő ivarú állatokkal kell elvégezni. Útmutatás az állatok maximális számára vonatkozó tipikus követelményhez: a 37. pontban megállapított paraméterek szerint, három dóziscsoporttal, valamint párhuzamos negatív és pozitív kontrollcsoportokkal (melyek mindegyike öt, egy ivarhoz tartozó állatból áll) végzett csontvelővizsgálathoz 25-35 állatra lenne szükség.

Dózisszintek

Ha előzetes dózisbehatároló vizsgálatra kerül sor amiatt, hogy már nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok a dózisok kiválasztásának segítéséhez, azt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon fajok, törzsek, ivarok és kezelési eljárások alkalmazásával kell végrehajtani, mint amelyek a fő vizsgálatban alkalmazandóak (27). A vizsgálatnak a maximális tolerálható dózis (MTD) meghatározására kell irányulnia, amely anélkül, hogy vizsgálatkorlátozó toxicitást mutatna, a legmagasabb tolerált dózis a vizsgálati időszak tartamához viszonyítva (például testtömeg-csökkenést vagy vérképző rendszeri citotoxicitást vált ki, de elhullást, illetve humánus eutanáziát igénylő, bizonyított fájdalmat, szenvedést vagy szorongást nem idéz elő (28)).

A legmagasabb dózis olyan dózisként is definiálható, amely toxicitást okoz a csontvelőben (például a csontvelőben vagy a perifériás vérben az összes eritrocita között az éretlen eritrociták arányának több mint 50 %-os csökkenését, amely arány ugyanakkor nem lehet kevesebb, mint a kontrollérték 20 %-a). A perifériás vérkeringésben előforduló CD71-pozitív sejtek (például áramlási citometriával végzett) elemzésekor azonban az éretlen eritrociták e nagyon fiatal frakciója gyorsabban reagál a toxikus kihívásokra, mint az éretlen eritrociták nagyobb RNS-pozitív kohorsza. Ezért a toxicitás magasabbnak tűnhet a CD71-pozitív éretlen eritrociták frakcióját vizsgáló akut expozíciós tervek mellett, mint az akut expozíció azon terve szerint, amelynek során az RNS-tartalom alapján történik az éretlen eritrociták azonosítása. Ennélfogva abban az esetben, ha a kísérletek során öt vagy kevesebb kezelési napot alkalmaznak, a toxicitást okozó vizsgálati vegyi anyagok esetében a legmagasabb dózisszint azon dózisként definiálható, amely statisztikailag szignifikáns – a kontrollérték 5 %-ánál alacsonyabbra azonban vissza nem eső – csökkenést okoz a CD71-pozitív éretlen eritrociták összes eritrocitához viszonyított arányában (29).

Azok a vegyi anyagok, amelyek a toxikokinetikai tulajdonságok telítődését mutatják, vagy olyan detoxifikációs folyamatokat idéznek elő, amelyek hosszú távú beadás után az expozíció csökkenéséhez vezethetnek, kivételek lehetnek a dózisbeállítási kritériumok alól, és azokat eseti alapon kell értékelni.

Annak érdekében, hogy dózis-válasz adatokat lehessen szerezni, a teljes vizsgálatnak egy negatív kontrollcsoportot, valamint legalább három dózisszintet kell tartalmaznia, ahol a dózisszintek közötti szorzótényező általában 2, de legfeljebb 4. Ha a vizsgálati vegyi anyag nem okoz toxicitást a dózisbehatároló vizsgálat során vagy meglévő adatok alapján, legalább 14 napig tartó beadási időszak esetén a legmagasabb dózisnak 1 000  mg/testtömeg kg/napnak, 14 napnál rövidebb beadási időszak esetében pedig 2 000  mg/testtömeg kg/napnak kell lennie Ha azonban a vizsgálati vegyi anyag toxicitást okoz, az MTD-nek a beadott legmagasabb dózisnak kell lennie, és a használt dózisszintek lehetőleg fedjék le a maximálistól az alacsony mértékű toxicitást okozó vagy toxicitást egyáltalán nem okozó dózisig terjedő tartományt. Ha a célszövet (csontvelő) toxicitása valamennyi vizsgált dózisszintnél megfigyelhető, érdemes nem toxikus dózisoknál további vizsgálatot végezni. A mennyiségi dózis-válasz adatok teljesebb körű jellemzését célzó vizsgálatok további dóziscsoportokat tehetnek szükségessé. Ezek a határértékek a vizsgálati vegyi anyagok bizonyos, külön követelmények hatálya alá tartozó típusai (például a humán gyógyszerek) esetében változóak lehetnek.

Határérték-vizsgálat

Ha a dózisbehatároló kísérletek vagy a rokon állattörzsekből származó meglévő adatok azt jelzik, hogy a legalább a határdózist tartalmazó (az alábbiakban ismertetett) kezelési eljárás semmilyen megfigyelhető toxikus hatást nem vált ki, (többek között nem váltja ki a csontvelősejtek proliferációjának visszaesését vagy a célszövet citotoxicitásának más bizonyítékát), és ha nem várható genotoxicitás az in vitro genotoxicitási vizsgálatok alapján vagy a szerkezetileg rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján, akkor nem feltétlenül tekintendő szükségesnek három dózis használatával végrehajtott teljes vizsgálat, amennyiben bizonyítást nyert, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok) eléri(k) a célszövetet (a csontvelőt). Ilyen esetekben a határdózisnál alkalmazott egyetlen dózisszint elegendő lehet. Legalább 14 napig tartó beadási időszak esetén a határdózis 1 000  mg/testtömeg kg/nap. 14 napnál rövidebb beadási időszak esetén a határdózis 2 000  mg/testtömeg kg/nap.

A dózisok beadása

Az emberi expozíció várható útját figyelembe kell venni a vizsgálat tervezése során. Ezért az egyéb expozíciós utak (például takarmány, ivóvíz, helyi szubkután, intravénás, orális (gyomorszondával), inhalációs, intratracheális vagy implantáció) is kiválaszthatók indokoltként. Az utat mindenesetre úgy kell kiválasztani, hogy biztosítsa a célszövet(ek) megfelelő expozícióját. A hasüregbe adott injekció nem ajánlott, mivel az nem tervezett emberi expozíciós út, és kizárólag tudományos indokolással alkalmazható. Ha a vizsgálati vegyi anyagot a takarmányba vagy ivóvízbe keverik, különösen egyszeri adagolás esetén ügyelni kell arra, hogy a táplálék és a víz fogyasztása és a mintavétel közötti idő elegendő legyen a hatások kimutathatóságához (lásd a 37. pontot). A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretétől függ. A térfogata rendszerint nem haladhatja meg az 1 ml/100 testtömeggramm mennyiséget, kivéve vizes oldatok esetén, amelyeknél legfeljebb 2 ml/100 testtömeggramm használható. Ennél nagyobb mennyiségek használatát meg kell indokolni. A magasabb koncentrációértékeknél rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró vizsgálati vegyi anyagok kivételével, a koncentráció megfelelő beállításával minimálisra kell csökkenteni a vizsgálati vegyi anyag mennyiségének eltéréseit, hogy valamennyi dózisszinten a testtömeghez viszonyítva konstans mennyiséget lehessen beadni a kísérleti állatoknak.

A kezelés ütemterve

Lehetőleg 2 vagy több kezelést kell 24 órás időközönként végezni, különösen e vizsgálat más toxicitásvizsgálatokba való beépítésekor. Alternatív esetben egyetlen kezelés végezhető, amennyiben tudományosan indokolt (például a vizsgálati vegyi anyagok közismerten blokkolják a sejtciklust). A vizsgálati vegyi anyagok több dózisra osztva is beadhatók, például nagy mennyiségű anyag beadásának megkönnyítése érdekében ugyanazon a napon két vagy több, legfeljebb 2–3 órás időközönként végzett kezeléssel. Ilyen körülmények között, vagy amikor a vizsgálati vegyi anyag beadása inhaláció útján történik, a mintavétel időpontját az utolsó dózis beadásának vagy az expozíció végének időpontja alapján kell ütemezni.

A vizsgálat egereken vagy patkányokon végezhető el az alábbi háromféle mód egyikén:

a. Az állatokat egyszer kell kezelni a vizsgálati vegyi anyaggal. Legalább kétszer kell csontvelőmintákat venni (független állatcsoportokból), a kezelés után 24 óránál nem korábban, de a kezelés utáni 48 órát nem meghaladó időpontban, a minták közötti megfelelő időközzel (időközökkel), kivéve, ha a vegyi anyagról ismert, hogy rendkívül hosszú a felezési ideje. A kezelés utáni 24 óránál korábbi mintavételi idők alkalmazását meg kell indokolni. Legalább kétszer kell perifériás vérmintákat venni (ugyanabból az állatcsoportból), a kezelés utáni 36 óránál nem korábban kezdve, az első mintát követő megfelelő időközzel vagy időközökkel, de 72 órát nem meghaladó időpontban. Az első mintavételi időpontban minden dóziscsoportot kezelni kell, és azokból elemzés céljára mintát kell gyűjteni, a későbbi mintavételi időpont(ok)ban azonban csak a legmagasabb dózist kell beadni. Ha egy mintavétel alkalmával pozitív reakció mutatható ki, további mintavétel nem követelmény, kivéve, ha a dózis-válasz összefüggésre vonatkozó mennyiségi adatokra van szükség. Az ismertetett begyűjtési időpontok a mikronukleuszok e szóban forgó két szövetkamrán belüli megjelenési és eltűnési kinetikájából következnek.

b. Két kezelés(például 24 órás időközzel történő két kezelés) alkalmazása esetén egyszer kell mintákat gyűjteni az utolsó kezelést követő 18 és 24 óra között a csontvelő, és egyszer az utolsó kezelést követő 36 és 48 óra között a perifériás vér vizsgálata esetében (30). Az ismertetett begyűjtési időpontok a mikronukleuszok e szóban forgó két szövetkamrán belüli megjelenési és eltűnési kinetikájából következnek.

c. Három vagy több kezelés (például megközelítőleg 24 órás időközönként három vagy több kezelés) alkalmazása esetén csontvelőmintákat az utolsó kezelés után legkésőbb 24 órával kell venni, a perifériás vért pedig az utolsó kezelés után legkésőbb 40 órával kell begyűjteni (31). Ez a kezelési lehetőség az üstökösvizsgálat (például az utolsó kezelés utáni 2–6 órával történő mintavétel) és a mikronukleusz-vizsgálat ötvözését, valamint a mikronuleusz-vizsgálat és az ismételt dózisú toxicitási vizsgálat ötvözését foglalja magában. Összesített adatok szerint a mikronukleuszok létrejötte ezekben a hosszabb időközökben három vagy több beadást követően figyelhető meg (15).

Releváns és tudományosan indokolt esetben, valamint más toxicitási vizsgálatokba való integráció megkönnyítése érdekében más adagolási vagy mintavételi eljárások is alkalmazhatók.

Megfigyelések

A kísérleti állatok esetében általános klinikai megfigyeléseket kell tenni, és a klinikai tüneteket legalább naponta egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban rögzíteni kell, továbbá figyelembe kell venni az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Az adagolási időszakban naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot megbetegedés és elhullás szempontjából. Minden állat tömegét le kell mérni a vizsgálat megkezdésekor, az ismételt dózisú vizsgálatok esetén hetente legalább egyszer, valamint az állatok leölésekor. A legalább egy hétig tartó vizsgálatok során a felvett táplálék mennyiségét legalább heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgálati vegyi anyag beadására az ivóvízzel együtt kerül sor, a vízfogyasztást minden vízcsere alkalmával és legalább hetente le kell mérni. A túlzott toxicitás nem halálos jeleit mutató állatokon a vizsgálati időszak befejeződése előtt humánus módon eutanáziát kell végrehajtani (28). Bizonyos körülmények között az állatok testhőmérsékletét nyomon lehet követni, ugyanis a kezelés által előidézett hiper- és hipotermia közrejátszik a fals eredmények létrejöttében (32) (33) (34).

A célszövet expozíciója

Amennyiben indokolt, és amennyiben más expozíciós adatok nem léteznek (lásd a 48. pontot), megfelelő időpont(ok)ban vérmintát kell venni annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyagok plazmában lévő szintjét meg lehessen vizsgálni annak bizonyítása céljából, hogy a csontvelő expozíciója megtörtént.

Csontvelő/vér preparálása

A csontvelősejteket rendszerint az állatok combcsontjából vagy sípcsontjából kell venni közvetlenül a humánus eutanáziát követően. A sejteket általában el kell távolítani, preparálni kell és meg kell festeni bevált módszerek segítségével. Megfelelő állatjóléti előírások szerint kis mennyiségű perifériás vér vehető a kísérleti állat túlélését lehetővé tevő módszer segítségével, például a farokvénából vagy más megfelelő érből történő vérvétellel, szívpunkcióval, vagy az állaton végzett eutanázia alkalmával egy nagy érből történő mintavétellel. Mind a csontvelőből származó eritrociták, mind a perifériás vérből származó eritrociták esetében érvényes, hogy a sejteket – az elemzési módszertől függően – azonnal meg lehet festeni szupravitálisan (16) (17) (18), azokból kenetpreparátumokat kell létrehozni, majd azokat mikroszkópos vizsgálat céljából meg kell festeni, vagy áramlási citometriás elemzés céljából fixálni kell és megfelelően meg kell festeni. A DNS-specifikus festékek (például akridinnarancs (35) vagy Hoechst 33258 plusz pironin-Y (36)) használata kiküszöbölhet néhányat a DNS-re nem jellemző festőanyag használatával mesterségesen előidézett változás közül. Ez az előny nem zárja eleve ki a hagyományos festékek (például mikroszkópos elemzéshez Giemsa) használatát. További rendszerek (például a magvas sejtek eltávolítására szolgáló cellulózoszlopok (37) (38)) is használhatók, feltéve, hogy már bebizonyosodott e rendszerekről, hogy kompatibilisek a laboratóriumi mintapreparálással.

Amennyiben e módszerek alkalmazandóak, kinetokor elleni antitestek (39), fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) végzett pancentromérás DNS-próbák (40), vagy pancentroméra-specifikus primerekkel végzett in situ jelölés megfelelő DNS-kontrasztfestéssel (41) alkalmazható a mikronukleuszok jellegének (kromoszóma/kromoszómatöredék) azonosítására annak meghatározásához, hogy a mikronukleusz-indukálási mechanizmus klasztogén vagy aneugén aktivitásnak tudható-e be. A klasztogén és aneugén hatású anyagok megkülönböztetésére egyéb, korábban hatékonynak bizonyult módszerek is alkalmazhatók.

Elemzés (kézi és automatizált)

Az elemzésre szánt összes tárgylemezt és mintát, beleértve a pozitív és a negatív kontrollokét is, egyedi kódolással kell ellátni, és azokat véletlenszerűen kell kiválasztani bármilyen elemzés előtt, hogy a kézi értékelést végző személy ne ismerje a kezelés körülményeit; ilyen kódolás a nem szemrevételezéses vizsgálaton alapuló és a kezelő személy általi torzítással nem érintett automatizált értékelési rendszerek használatakor nem szükséges. Minden egyes állatnál meg kell határozni az összes (éretlen + érett) eritrocitához viszonyítottan az éretlenek arányát, csontvelő esetében összesen legalább 500 eritrocita, perifériás vér esetében pedig legalább 2 000 eritrocita megszámlálásával (42). Állatonként legalább 4 000 éretlen eritrocitát kell pontozni a mikronukleált éretlen eritrociták előfordulásának megállapítása céljából (43). Ha a negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázis szerint a mikronukleált éretlen eritrociták gyakoriságának átlagos háttérértéke 0,1 %-nál kevesebb a vizsgálólaboratóriumban, meg kell fontolni további sejtek értékelését. A minták elemzésekor mikroszkópos vizsgálattal végzett értékelés esetén a kezelt állatokban az éretlen eritrociták összes eritrocitához viszonyított aránya nem lehet kevesebb a vivőanyagos/oldószeres kontrollok arányának 20 %-ánál, CD71+ éretlen eritrociták citometriás módszerekkel végzett értékeléskor pedig nem lehet kevesebb a vivőanyagos/oldószeres kontrollok arányának kb. 5 %-ánál (lásd a 31. pontot) (29). Például a mikroszkóppal értékelt csontvelővizsgálatnál, ha az éretlen eritrociták kontrollaránya 50 % a csontvelőben, a toxicitás felső határértéke az éretlen eritrociták 10 %-os aránya lenne.

Mivel a patkánylép elkülöníti és megsemmisíti a mikronukleált eritrocitákat, a patkányok perifériás vérének elemzése során a vizsgálat magas érzékenységének fenntartása érdekében a mikronukleált éretlen eritrociták elemzését érdemes a legfiatalabb frakcióra korlátozni. Automatizált elemzési módszerek alkalmazásakor ezek a legéretlenebb eritrociták az RNS-tartalmuk alapján, vagy a felületükön megjelenő transzferrin receptorok (CD71+) magas szintje alapján határozhatók meg (31). A különböző festési módszerekkel végzett közvetlen összehasonlításból azonban kiderült, hogy kielégítő eredmények kaphatók különféle módszerekkel, beleértve az akridinnaranccsal végzett festést is (3) (4).

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények feldolgozása

Az egyes állatok adatait táblázat formájában kell megadni. Minden egyes állat esetében külön-külön kell feljegyezni a pontozott éretlen eritrociták számát, a mikronukleált éretlen eritrociták számát és az éretlen eritrociták összes eritrocitához viszonyított arányát. Ha egereket kezelnek folyamatosan legalább négy hétig, a mikronukleált érett eritrociták számát és arányát meg kell adni, ha gyűjtöttek ilyen eritrocitákat. Az állati toxicitásra és a klinikai tünetekre vonatkozó adatokat szintén a jelentésbe kell foglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Az alábbi kritériumok határozzák meg a vizsgálat elfogadhatóságát:

a. A párhuzamos negatív kontrollok adatai bevihetők a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisába (lásd a 15–18. pontot).

b. A párhuzamos pozitív kontrolloknak vagy értékelési kontrolloknak a pozitív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisban generált válaszokkal összeegyeztethető válaszokat, valamint a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva statisztikailag szignifikáns növekedést kell előidézniük (lásd a 24–25. pontot).

c. A megfelelő számú dózis és sejt elemzésére sor került.

d. A legmagasabb dózis kiválasztására vonatkozó kritériumok összhangban vannak a 30-33. pontban ismertetett kritériumokkal.

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha:

a. legalább az egyik kezelt csoport statisztikailag szignifikáns növekedést mutat a mikronukleált éretlen eritrocitákkal rendelkező sejtek gyakoriságában a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva,

b. a megfelelő trendpróbával történő értékelés arra utal, hogy a növekedés a dózissal összefügg, legalább egy mintavételi időpontban; és

c. ezen eredmények bármelyike a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken) kívül esik.

Ha egy adott mintavételi időpontban csak a legmagasabb dózis vizsgálatára kerül sor, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha statisztikailag szignifikáns növekedés tapasztalható a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva, és az eredmények a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken) kívül esnek. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (44) (45) (46) (47). Dózis-válasz elemzéskor legalább három kezelt dóziscsoportot kell elemezni. A statisztikai vizsgálatoknak az állatot kell kísérleti egységként alkalmazniuk. A mikronukleusz-vizsgálat pozitív eredményei azt jelzik, hogy a vizsgálati vegyi anyag hatására kialakulnak olyan mikronukleuszok, amelyek a vizsgált fajok eritroblasztjain belüli kromoszómák károsodásának vagy a mitotikus rendszer károsodásának eredményeként jönnek létre. Amennyiben a vizsgálatot a mikronukleuszokon belüli centromérák kimutatása céljával végezték, a centromérát tartalmazó mikronukleuszok (teljes kromoszóma-veszteségre utaló centromer DNS vagy kinetokor) létrejötte azt bizonyítja, hogy a vizsgálati vegyi anyag aneugén.

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény esetén:

a. a kezelt csoportok egyike sem mutat statisztikailag szignifikáns növekedést a mikronukleált éretlen eritrociták gyakorisága tekintetében a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva,

b. a megfelelő trendpróbával történő értékelés arra utal, hogy egyetlen mintavételi időpontban sincs dózissal összefüggő növekedés,

c. valamennyi eredmény a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken) belül van, valamint

d. a csontvelő vizsgálati vegyi anyag(ok)nak való expozíciója megtörtént.

A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (44) (45) (46) (47). A csontvelő vizsgálati vegyi anyag(ok)nak való expozíciójára vonatkozó bizonyíték lehet többek között az éretlen eritrociták érett eritrocitákhoz viszonyított arányának csökkenése vagy a vizsgálati vegyi anyag(ok) plazmában vagy vérben való előfordulásának mérése. Intravénás beadás esetén az expozícióra vonatkozó bizonyíték nem szükséges. Alternatív esetben az azonos expozíciós út és azonos faj alkalmazásával végzett független vizsgálat során kapott ADME-adatok használhatók a csontvelő-expozíció bizonyítására. A negatív eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati körülmények között a vizsgálati vegyi anyag nem idéz elő mikronukleuszokat a vizsgált fajok éretlen eritrocitáiban.

Az egyértelműen pozitív vagy egyértelműen negatív válasz igazolása nem követelmény.

Olyan esetekben, ha a válasz nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, illetve egy adott eredmény (például kismértékű vagy határesethez közelítő növekedés) biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy a már lefolytatott kísérletek további vizsgálataival kell értékelni. Egyes esetekben hasznos lehet több sejt elemzése vagy módosított kísérleti körülmények mellett megismételt kísérlet végrehajtása.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatok eleve kizárják azt a következtetést, hogy a vizsgálati vegyi anyag pozitív vagy negatív eredményeket hoz, ezért a végkövetkeztetés szerint a vizsgálat kétértelmű lesz.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Összegzés

Vizsgálati vegyi anyag:

 eredet, tételszám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll;

 a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert;

Egy összetevőből álló anyag:

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonossága stb.

Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek:

 amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai jellemzik.

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése:

 a vivőanyag megválasztásának indoklása;

 a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/vivőanyagban, ha ismert;

 a takarmány-, ivóvíz- vagy inhalációs készítmények előkészítése;

 a készítmények analitikai meghatározásai (pl. stabilitás, homogenitás, névleges koncentráció), ha végeztek ilyen meghatározásokat.

Kísérleti állatok:

 a felhasznált faj/törzs és a felhasználásuk indokolása;

 az állatok száma, kora és ivara;

 az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.;

 az állatok egyedi azonosítására szolgáló módszerek;

 rövid távú vizsgálatok esetében: az egyes állatok tömege a vizsgálat kezdetén; egy hétnél hosszabb vizsgálatok esetében: az egyes állatok testtömege a vizsgálat során és a táplálékfelvételük. A testtömegtartományt, az átlagot és a szórást minden egyes csoportnál meg kell adni.

Vizsgálati körülmények:

 a pozitív és negatív (vivőanyagos/oldószeres) kontrollok adatai;

 a dózisbehatároló vizsgálatból kapott adatok, ha történt ilyen vizsgálat;

 a dózisszintek kiválasztásának indoklása;

 a vizsgálati vegyi anyag előkészítésére vonatkozó részletek;

 a vizsgálati vegyi anyag beadására vonatkozó részletek;

 a beadási út és időtartam indoklása;

 annak ellenőrzésére szolgáló módszerek, hogy a vizsgálati vegyi anyag(ok) elérte-e (elérték-e) az általános keringési rendszert vagy a célszövetet;

 tényleges dózis (mg/testtömeg kg/nap) a vizsgálati vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjából (ppm) és a fogyasztásból számítva, ha alkalmazható;

 a táplálék és víz minőségére vonatkozó részletek;

 az eutanázia módja;

 a fájdalomcsillapítás módja (amennyiben alkalmaznak ilyet);

 a kezelési és mintavételi ütemtervek részletes leírása és kiválasztásuk indoklása;

 a tárgylemez preparálásának módszerei;

 a minták izolálására és tartósítására alkalmazott eljárások;

 a toxicitás mérésére szolgáló módszerek;

 a mikronukleált éretlen eritrociták értékelésének kritériumai;

 az állatonként elemzett sejtek száma a mikronukleált éretlen eritrociták gyakoriságának meghatározása során, valamint az éretlen eritrociták érett eritrocitákhoz viszonyított arányának megállapítása céljából;

 a vizsgálat elfogadhatóságának kritériumai;

 adott esetben annak meghatározására szolgáló módszerek (például kinetokor elleni antitestek vagy centroméra-specifikus DNS-próbák alkalmazása), hogy a mikronukleuszok teljes kromoszómákat vagy kromoszómatöredékeket tartalmaznak-e.

Eredmények:

 az állatok állapota a vizsgálati időszak előtt és alatt, beleértve a toxicitás jeleit;

 az éretlen eritrociták összes eritrocitához viszonyított aránya;

 a mikronukleált éretlen eritrociták száma, minden egyes állat tekintetében külön megadva;

 csoportonként a mikronukleált éretlen eritrociták átlaga ± szórás;

 a dózis-válasz összefüggés, ahol lehetséges;

 statisztikai elemzések és alkalmazott módszerek;

 az egyidejű negatív és pozitív kontrollokra vonatkozó adatok, a tartományok, az átlagok és a szórás megadásával;

 a történeti negatív és pozitív kontrolladatok, a tartományok, az átlagok és a szórás, az eloszlásra vonatkozó 95 %-os ellenőrzési határértékek, valamint a tárgyidőszak és az adatpontok számának megadásával;

 a csontvelő expozícióját alátámasztó adatok;

 adott esetben azok a jellemzésre szolgáló adatok, amelyek jelzik, hogy a mikronukleuszok teljes kromoszómákat vagy kromoszómatöredékeket tartalmaznak-e;

 a pozitív vagy a negatív válasz esetén teljesített kritériumok.

Az eredmények tárgyalása.

Következtetés.

Hivatkozások.

SZAKIRODALOM

(1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2) Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 10-30.

(3) MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, pp. 92-107.

(4) Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, pp. 83-91.

(5) Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, pp. 139-145.

(6) Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, pp. 65-73.

(7) Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, pp. 149-154.

(8) Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, pp. 153-155.

(9) Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 187-190.

(10) Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, pp. 9-15.

(11) Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, pp. 61-118.

(12) Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, pp. 29-80.

(13) MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, pp. 555-558.

(14) MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, pp. 103-112.

(15) MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, pp. 513-522.

(16) Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, pp. 245-249.

(17) CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, pp. 83-98.

(18) CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, pp. 153-159.

(19) Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, pp. 239-273.

(20) Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, pp. 45-50.

(21) Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, pp. 419-424.

(22) Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, pp. 84-100.

(23) Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(24) Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(25) Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-120.

(26) Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.

(27) Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.

(28) OECD (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.

(29) LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, pp. 222-228.

(30) Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/- 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, pp. 313-319.

(31) Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 234-252.

(32) Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, pp. 79-83.

(33) Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, pp. 7-14.

(34) Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, pp. 120-127.

(35) Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, pp. 241-247.

(36) MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.

(37) Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, pp. 91-104.

(38) Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, pp. 121-126.

(39) Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, pp. 411-415.

(40) Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.

(41) Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, pp. 99-104.

(42) Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, pp. 97-99.

(43) OECD (2014), “Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(44) Richold, M. et al. (1990), “In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.

(45) Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.

(46) Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, pp. 49-52.

(47) Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, pp. 233-241.




1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Centroméra : olyan kromoszóma-régió(k), amely(ek)hez a sejtosztódás során orsórostok kötődnek, lehetővé téve a leánykromoszómáknak az utódsejtek pólusai felé irányuló szabályos mozgását.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Eritroblaszt : az eritrocita fejlődésének az éretlen eritrocitát közvetlenül megelőző korai szakasza, amikor a sejt még tartalmaz magot.

Kinetokor : az eukarióta sejtek centroméráján kialakuló fehérjeszerkezet, amely a mitózis és a meiózis során összeköti a kromoszómát a mitotikus orsó mikrocsöves polimerjeivel, és amely a sejtosztódás során a testvérkromatidok szétválasztására szolgál.

Mikronukleusz : a sejtek fő magjától elkülönült kis járulékos mag, amelyet a mitózis (meiózis) telofázisa során hoznak létre visszamaradó kromoszómatöredékek vagy teljes kromoszómák.

Normokromáziás vagy érett eritrocita : olyan teljesen érett eritrocita, amely elveszítette az enukleációt követően megmaradó reziduális RNS-ét és/vagy más rövid életű sejtmarkereit, amelyek jellemzően eltűnnek az enukleáció után az utolsó eritroblaszt-osztódást követően.

Polikromáziás vagy éretlen eritrocita : köztes fejlődési szakaszban lévő, újonnan kialakult eritrocita, amely például a Wright–Giemsa elnevezésű klasszikus vérfesték kék és vörös komponenseivel egyaránt megfestődik az újonnan kialakult sejtben lévő reziduális RNS jelenléte miatt. Ezek az újonnan kialakult sejtek nagyjából azonosak a retikulocitákkal, vitális festék segítségével jelenítődnek meg, amelynek hatására a reziduális RNS retikulummá tömörül. Más módszerek, többek között az RNS fluoreszcens festékekkel történő monokróm festése vagy a CD71-hez hasonló, rövid életű felületi markerek fluoreszcens antitestekkel történő megjelölése jelenleg gyakran használatosak az újonnan kialakult vörösvérsejt azonosítására. A polikromáziás eritrociták, a retikulociták és a CD71-pozitív eritrociták mind éretlen eritrociták, bár mindegyiknek némileg eltérő az életkori eloszlása.

Retikulocita : a reziduális sejt-RNS jellegzetes retikulummá tömörülését okozó vitális festékkel megfestett, újonnan kialakult eritrocita. A retikulociták és a polikromáziás eritrociták egymáshoz nagyon közel álló fejlődési szakaszban vannak.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.




2. függelék

AZ IVAROK KÖZÖTTI ELTÉRÉSEK MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ FAKTORIÁLIS KÍSÉRLETTERVEZÉS AZ IN VIVO MIKRONUKLEUSZ-VIZSGÁLAT SORÁN

A faktoriális kísérlettervezés és annak elemzése

Ebben a kísérlettervezésben legalább 5 hím és 5 nőstény vizsgálatára kerül sor mindegyik koncentrációszintnél, ami legalább 40 állat (20 hím és 20 nőstény, valamint a releváns pozitív kontrollok) felhasználását eredményezi.

A kísérlettervezés, amely az egyszerűbb faktoriális kísérlettervezések egyike, kétirányú varianciaanalízissel egyenértékű, ahol a fő tényezők az ivar és a koncentrációszintek. Az adatok számos standard statisztikai szoftvercsomag, például az SPSS, az SAS, a STATA, a Genstat, valamint az R használatával elemezhetők.

Az analízis az adatkészleten belül a variabilitást az ivarok közötti variabilitásra, a koncentrációk közötti variabilitásra, valamint az ivarok és a koncentrációk közötti kölcsönhatáshoz kapcsolódó variabilitásra osztja. Az egyes feltételeket ugyanazon koncentrációnak kitett, az azonos ivarú állatok csoportjain belüli párhuzamos állatok közötti variabilitás becsült értékéhez viszonyítva kell megvizsgálni. A mögöttes módszertanra vonatkozó kimerítő részletek számos statisztikai tankönyvben (lásd a hivatkozásokat) és a statisztikai szoftvercsomagokkal együtt biztosított súgófájlokban is megtalálhatók.

Az analízis az ivar x koncentráció kölcsönhatási feltételnek az ANOVA-táblázatban ( 5 ) való vizsgálatával folytatódik. Szignifikáns kölcsönhatás hiányában az egyes ivarok vagy az egyes koncentrációszintek közötti értékek kombinálásával érvényes statisztikai vizsgálat végezhető a szintek között, az ANOVA szerinti, csoporton belül összesített variabilitási feltétel alapján.

Az analízis a becsült koncentrációk közötti variabilitás kontrasztokká osztásával folytatódik, ami lehetővé teszi a válaszok lineáris és kvadratikus kontrasztjainak megállapítását valamennyi koncentrációszintnél. Ha az ivar x koncentráció kölcsönhatás szignifikáns, ez a feltétel lineáris x ivar és kvadratikus x ivar kölcsönhatására vonatkozó kontrasztokká osztható. E feltételek arra vonatkozó vizsgálatokat biztosítanak, hogy a koncentráció-válaszok párhuzamosak-e a két ivar esetében, illetve hogy a két ivar különböző választ ad-e.

A csoporton belül összesített variabilitásra vonatkozó becslés felhasználható az átlagok közötti eltérés páronkénti vizsgálatához. Ezek az összehasonlítások elvégezhetők a két ivarra vonatkozó átlagok között és a különböző koncentrációszintekre vonatkozó átlagok között; ilyen például a negatív kontrollok szintjével való összehasonlítás. Amennyiben szignifikáns kölcsönhatás tapasztalható, összehasonlítható a különböző koncentrációk adott ivaron belüli átlaga vagy az ivarok azonos koncentrációnál számított átlaga.

Hivatkozások

Számos olyan statisztikai tankönyv létezik, amely a faktoriális kísérlettervezések elméletét, kialakítását, módszertanát, elemzését és értelmezését tárgyalja, a legegyszerűbb kétfaktoros elemzéstől a kísérlettervezés módszertanában alkalmazott bonyolultabb formákig. Az alábbi nem kimerítő lista. Egyes könyvekben összehasonlítható kísérlettervezésekre vonatkozó kidolgozott példák találhatók, esetenként az analízisek különféle szoftvercsomagok segítségével történő lefuttatásához szükséges kóddal együtt.

Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

(6) A B. részben a B.15. fejezetet el kell hagyni.

(7) A B. részben a B.16. fejezetet el kell hagyni.

(8) A B. részben a B.18. fejezetet el kell hagyni.

(9) A B. részben a B.19. fejezetet el kell hagyni.

(10) A B. részben a B.20. fejezetet el kell hagyni.

(11) A B. részben a B.24. fejezetet el kell hagyni.

(12) A B. részben a B.47. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.47.    A szarvasmarha-szaruhártya opacitásának és permeabilitásának mérésén alapuló vizsgálati módszer i. a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok és ii. a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 437. vizsgálati iránymutatásában (2013) leírt módszerrel. A szarvasmarha-szaruhártya opacitásának és permeabilitásának mérésén alapuló vizsgálati módszert (a továbbiakban: BCOP vizsgálati módszer) az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központtal (ECVAM) és az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Japán Központtal (JaCVAM) együtt értékelte 2006-ban és 2010-ben (1) (2). Az első értékelés során abból a szempontból értékelték a BCOP vizsgálati módszert, hogy mennyire hasznos a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok (anyagok és keverékek) (1) azonosításához. A második értékelés során abból a szempontból értékelték a BCOP vizsgálati módszert, hogy mennyire hasznos a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolt vegyi anyagok (anyagok és keverékek) (2) azonosításához. A BCOP validációs adatbázis összesen 113 anyagot és 100 keveréket tartalmazott (2) (3). Ezen értékelések és szakmai vizsgálatuk alapján megállapítást nyert, hogy a vizsgálati módszer helyesen tudja azonosítani a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszerének (GHS) (4), illetve az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendeletnek ( 6 ) (CLP-rendelet) a meghatározása szerint súlyos szemkárosodást okozó (1. kategóriába tartozó) vegyi anyagokat (anyagokat és keverékeket egyaránt), továbbá szemirritáció vagy súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagokat, ezért azt tudományosan megalapozottként elfogadták mindkét célra. Súlyos szemkárosodás a vizsgálati vegyi anyagnak a szem elülső felszínén történő alkalmazását követően megjelenő és az alkalmazástól számított 21 napon belül nem teljes mértékben visszafordítható szövetkárosodás a szemben, vagy a látóképesség súlyos fizikai romlása. A súlyos szemkárosodást okozó vizsgálati vegyi anyagok az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandók be. A szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében be nem sorolt vegyi anyagok olyan vegyi anyagok, amelyek nem tesznek eleget az ENSZ-GHS szerinti 1. vagy 2. (2A. vagy 2B.) kategóriába való besorolás követelményeinek, vagyis azokra az ENSZ-GHS szerint kategória nélküliként történik hivatkozás. Ez a vizsgálati módszer a BCOP vizsgálati módszer ajánlott alkalmazását és korlátait tartalmazza a módszer értékelései alapján. Az OECD vizsgálati iránymutatásának eredeti, 2009-es változata és frissített, 2013-as változata közötti legfőbb eltérések többek között, de nem kizárólag a következők: a BCOP vizsgálati módszer ENSZ-GHS szerint besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazása (2. és 7. pont); a BCOP vizsgálati módszer alkoholok, ketonok és szilárd anyagok vizsgálatára (6. és 7. pont), valamint anyagok és keverékek vizsgálatára (8. pont) való alkalmazhatóságával kapcsolatos pontosítások; a felületaktív anyagok és a felületaktív anyagokat tartalmazó keverékek vizsgálatának módjával kapcsolatos pontosítások (28. pont); a pozitív kontrollokra vonatkozó frissítések és pontosítások (39. és 40. pont); a BCOP vizsgálati módszerrel kapcsolatos döntés kritériumainak frissítése (47. pont); a vizsgálat elfogadhatósági kritériumainak frissítése (48. pont); a Vizsgálati jegyzőkönyv elemeinek frissítése (49. pont); a fogalommeghatározásokat tartalmazó 1. függelék frissítése; a 2. függelék beillesztése a BCOP vizsgálati módszer különféle osztályozási rendszerek szerinti prediktív értéke tekintetében; a jártassági tesztanyagok jegyzékét tartalmazó 3. függelék frissítése, valamint a BCOP vizsgálathoz alkalmazott szaruhártyatartóról (1. pont) és az opaciméterről (2. és 3. pont) szóló 4. függelék frissítése.

Jelenleg általánosan elfogadott, hogy az előre látható jövőben egyetlen in vitro szemirritációs vizsgálat sem tudja majd helyettesíteni a Draize-féle in vivo szemvizsgálatot a különböző kémiai osztályoknál felmerülő irritáció teljes skálájának előrejelzésére. Előfordulhat azonban, hogy egy-egy (többszintű) vizsgálati stratégián belüli több alternatív vizsgálati módszer stratégiai kombinációja helyettesíteni tudja a Draize-féle szemvizsgálatot (5). A felülről építkező megközelítés (5) akkor alkalmazandó, ha a meglévő információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan rendkívül irritáló hatású lehet, míg az alulról építkező megközelítés (5) akkor alkalmazandó, ha a meglévő információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan nem okoz a besorolás szükségességéhez elegendő szemirritációt. A BCOP vizsgálati módszer bizonyos körülmények között és meghatározott korlátokkal a vegyi anyagok szemet érintő veszélyességükre tekintettel történő osztályozására és címkézésére alkalmazható in vitro vizsgálati módszer. Bár a BCOP vizsgálati módszer nem minősül a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatot önállóan helyettesítő vizsgálati módszernek, első lépésként ajánlott a Scott és társai (5) által javasolt felülről építkező megközelítéshez hasonló vizsgálati stratégia keretében a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok, azaz a további vizsgálat nélkül az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandó vegyi anyagok (4) azonosítására. A BCOP vizsgálati módszer ajánlott az ENSZ-GHS-ben meghatározott, a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (az ENSZ-GHS szerinti kategória nélküli) vegyi anyagok (4) olyan vizsgálati stratégia keretében történő azonosítására, mint az alulról építkező megközelítés (5). Azonban az a vegyi anyag, amely a BCOP vizsgálati módszerrel előreláthatólag nem okoz súlyos szemkárosodást vagy nem tartozik a szemirritáció/súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolt anyagok közé, további (in vitro és/vagy in vivo) vizsgálatot tenne szükségessé a végleges osztály megállapításához.

E vizsgálati módszer célja a vizsgálati vegyi anyag szemet érintő veszélyességi potenciáljának értékelésére használt eljárások ismertetése annak alapján, hogy az anyag izolált szarvasmarha-szaruhártyában kivált-e opacitást és fokozott permeabilitást. A szaruhártyára gyakorolt toxikus hatások jellemzése i. a csökkent fényátbocsátás (opacitás) és ii. a fluoreszcein-nátrium festékanyag fokozott áthatolása (permeabilitás) mérésével történik. A szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követően megállapítható opacitásból és permeabilitásból együttesen kell származtatni az ún. in vitro irritációs pontszámot (In Vitro Irritancy Score, a továbbiakban: IVIS), amely a vizsgálati vegyi anyag irritáció szempontjából való osztályba sorolására szolgál.

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Ez a vizsgálati módszer az ICCVAM BCOP vizsgálati módszerről szóló protokollján (6) (7) alapul, amelynek kidolgozása eredetileg az Institute for in vitro Sciences (In Vitro Tudományok Intézete; IIVS) protokolljából és a 124. INVITTOX-protokollból (8) származó információk alapján történt. Ez utóbbi az Európai Közösség által támogatott, 1997–1998-ban végzett elővalidációs vizsgálathoz használt protokoll. Mindkét protokoll alapja az a BCOP vizsgálati módszer volt, amelyről elsőként Gautheron és társai (9) számoltak be.

A BCOP vizsgálati módszer alkalmazható az ENSZ-GHS-ben meghatározott, súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok, azaz az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába (4) sorolandó vegyi anyagok azonosítására. Erre a célra történő alkalmazásakor a BCOP vizsgálati módszer általános pontossága 79 % (150/191), hamis pozitív aránya 25 % (32/126), hamis negatív aránya pedig 14 % (9/65) a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálati módszer ENSZ-GHS osztályozási rendszer szerint besorolt adataival való összevetéskor (3) (lásd a 2. függelék 1. táblázatát). Amikor bizonyos kémiai osztályokba (például alkoholok, ketonok) vagy fizikai osztályokba (például szilárd anyagok) tartozó vizsgálati vegyi anyagok nem szerepelnek az adatbázisban, a BCOP vizsgálati módszer általános pontossága 85 % (111/131), hamis pozitív aránya 20 % (16/81), hamis negatív aránya pedig 8 % (4/50) az ENSZ-GHS osztályozási rendszer vonatkozásában (3). A BCOP vizsgálati módszernek a súlyos szemkárosodást okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolt) vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazásakor felmerülő hiányosságai a validációs adatbázisban az alkoholok és a ketonok esetében tapasztalt magas hamis pozitív arányokon és a szilárd anyagok esetében tapasztalt magas hamis negatív arányon alapulnak (1) (2) (3). Mivel azonban a BCOP vizsgálati módszerrel nem minden alkohol és keton előrejelzése túlzó, és a módszer egyes alkoholokat és ketonokat helyesen jelez előre az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként, ez a két szerves funkciós csoport nem tekintendő a vizsgálati módszer alkalmazási területén kívül esőnek. A vizsgálati módszer alkalmazójának kell eldöntenie azt, hogy valamely alkohol vagy keton túlzó előrejelzése elfogadható-e, illetve azt, hogy kell-e további vizsgálatot végezni az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés keretében. A szilárd anyagok esetében tapasztalt hamis negatív arányok tekintetében megjegyzendő, hogy változó és szélsőséges expozíciós körülményekhez vezethetnek a Draize-féle in vivo szemirritációs vizsgálat során, ami a tényleges irritációs hatásukra (10) vonatkozó irreleváns előrejelzéseket eredményezhet. Megjegyzendő az is, hogy a súlyos szemkárosodást okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó) vegyi anyagok azonosításával összefüggésben az ICCVAM validációs adatbázisában (2) (3) meghatározott hamis negatív arányok következtében az IVIS értéke egyik esetben sem lett ≤ 3, amely érték az ENSZ-GHS szerint a nem besorolt vegyi anyagok azonosítására használt kritérium. Ezen túlmenően a BCOP szerinti hamis negatív arányok ebben az összefüggésben nem kritikus jelentőségűek, mivel minden 3-nál nagyobb, de legfeljebb 55 IVIS értékű vizsgálati vegyi anyag vizsgálatára sor kerülne más, megfelelően validált in vitro vizsgálatokkal, vagy – a szabályozási követelményektől függően, az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés keretébe tartozó lépcsőzetes vizsgálati stratégia segítségével – utolsó lehetőségként nyulakon végzett vizsgálatokkal. Mivel a BCOP vizsgálati módszer egyes szilárd vegyi anyagokat helyesen jelez előre az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként, ez a halmazállapot szintén nem minősül a vizsgálati módszer alkalmazási területén kívül esőnek. A vizsgálók valamennyi típusú vegyi anyag esetében mérlegelhetik e vizsgálati módszer alkalmazását, amellyel 55-nél magasabb IVIS értéket további vizsgálat nélkül az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandó súlyos szemkárosodást okozó reakcióra utaló jelként kell elfogadni. Ahogyan azonban már említésre került, az alkoholok és a ketonok esetében a kapott pozitív eredményeket az esetlegesen túlzó előrejelzés kockázata miatt óvatosan kell értelmezni.

A BCOP vizsgálati módszer az ENSZ-GHS osztályozási rendszer (4) szerint a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására is alkalmazható. Erre a célra történő alkalmazásakor a BCOP vizsgálati módszer általános pontossága 69 % (135/196) hamis pozitív aránya 69 % (61/89), hamis negatív aránya pedig 0 % (0/107) a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálati módszer ENSZ-GHS osztályozási rendszer szerint besorolt adataival való összevetéskor (3) (lásd a 2. függelék 2. táblázatát). A kapott hamis pozitív arány (a 3-nál magasabb IVIS értéket mutató, az ENSZ-GHS szerint kategória nélküli vegyi anyagok in vivo vizsgálata, lásd a 47. pontot) rendkívül magas, de ebben az összefüggésben nem kritikus jelentőségű, mivel a minden 3-nál nagyobb, de legfeljebb 55 IVIS értékű vegyi anyagot ezután más, megfelelően validált in vitro vizsgálatoknak vetnek alá, vagy utolsó lehetőségként – a szabályozási követelményektől függően, az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés keretébe tartozó lépcsőzetes vizsgálati stratégia segítségével – nyulakon is megvizsgálják. A BCOP vizsgálati módszer nem mutat hiányosságokat az alkoholok, a ketonok és a szilárd anyagok vizsgálata tekintetében, amikor a cél a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (az ENSZ-GHS szerint kategória nélküli) vegyi anyagok azonosítása (3). A vizsgálók valamennyi típusú vegyi anyag esetében mérlegelhetik e vizsgálati módszer alkalmazását, amellyel a negatív eredményt (IVIS ≤ 3) arra utaló jelzésként kell elfogadni, hogy besorolás nem szükséges (az ENSZ-GHS szerint kategória nélküli). Mivel a BCOP vizsgálati módszer a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagoknak csak a 31 %-át tudja helyesen azonosítani, nem lehet első választási lehetőség az alulról építkező megközelítés (5) megkezdéséhez, ha rendelkezésre állnak más validált és elfogadott, hasonló érzékenységű, de specifikusabb in vitro módszerek.

A BCOP validációs adatbázis összesen 113 anyagot és 100 keveréket tartalmazott (2) (3). A BCOP vizsgálati módszer ezért az anyagok és a keverékek vizsgálatára egyaránt alkalmazhatónak tekintendő.

Az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó, az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába alulosztályozott vegyi anyagok, valamint az ENSZ-GHS szerinti nem besorolt kategóriába tartozó, az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába felülosztályozott vegyi anyagok jelentős száma miatt a BCOP vizsgálati módszer nem ajánlott olyan vizsgálati vegyi anyagok azonosítására, amelyeket szemirritáló hatásúként (azaz az ENSZ-GHS szerinti 2. vagy 2A. kategóriába tartozóként) kell besorolni, illetve olyan vizsgálati vegyi anyagok azonosítására, amelyeket enyhén szemirritáló hatásúként (az ENSZ-GHS szerinti 2B. kategóriába tartozóként) kell besorolni (2) (3). E célból egy másik megfelelő módszerrel végzett további vizsgálatra lehet szükség.

A szarvasmarhaszemmel és a szarvasmarha-szaruhártyával végzett valamennyi eljárás során be kell tartani a vizsgáló intézménynek az állati eredetű anyagok – ideértve többek között, de nem kizárólag a szöveteket és a szöveti folyadékokat – kezelésére vonatkozó rendelkezéseit és eljárásait. Ajánlott továbbá követni az általános laboratóriumi óvintézkedéseket is (11).

Bár a BCOP vizsgálati módszer nem veszi figyelembe a kötőhártya- és az íriszsérüléseket, foglalkozik a szaruhártyára kifejtett hatásokkal, amelyek leginkább befolyásolják az in vivo besorolást az ENSZ-GHS osztályozás alkalmazásában. Önmagában a BCOP vizsgálati módszerrel nem értékelhető a szaruhártya-léziók visszafordíthatósága. Nyulakon végzett szemvizsgálatok alapján korábban azt javasolták, hogy a szaruhártya-sérülés kezdeti mélységének értékelése alkalmazható a visszafordíthatatlan hatások bizonyos típusainak azonosítására (12). További tudományos ismeretekre van azonban szükség annak megértéséhez, hogy a kezdeti nagyon súlyos sérüléssel össze nem függő visszafordíthatatlan hatások hogyan következnek be. Végezetül a BCOP vizsgálati módszer nem alkalmas a szembe kerülés következtében fellépő szisztémás toxicitási potenciál megítélésére.

Ez a vizsgálati módszer rendszeres időközönkénti frissítés tárgyát fogja képezni az új információk és adatok figyelembevételekor. Például kórszövettani vizsgálatok esetlegesen hasznosak lehetnek, ha a szaruhártya-károsodás teljesebb körű jellemzésére van szükség. Ahogyan a 160. OECD-iránymutatásban (13) vázlatosan szerepel, a felhasználóknak érdemes tartósítaniuk a szaruhártyákat és azokból kórszövettani mintákat preparálniuk, amelyek felhasználhatóak a vizsgálati módszer pontosságát esetlegesen tovább javító adatbázis fejlesztéséhez és döntési kritériumok kidolgozásához.

Minden olyan laboratóriumnak, amely először alkalmazza ezt a vizsgálati módszert, a 3. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagokat kell használnia. Mielőtt a laboratórium a BCOP vizsgálati módszer adatait a szabályozási követelmények szerinti veszélyességi osztályozás céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonstrálhatja a BCOP vizsgálati módszer végrehajtásában való szakmai jártasságát.

A VIZSGÁLAT ELVE

A BCOP vizsgálati módszer olyan organotipikus módszer, amely rövid távon in vitro fenntartja a szarvasmarhák izolált szaruhártyájának normál fiziológiai és biokémiai működését. E vizsgálati módszerrel a vizsgálati vegyi anyag által okozott károsodás értékelése a szaruhártya opacitásváltozásának opaciméterrel, illetőleg permeabilitásváltozásának látható fényes spektrofotométerrel való kvantitatív mérése útján történik. Mindkét mérés az IVIS értékének kiszámítására használatos, amely a vizsgálati vegyi anyag in vivo szemirritációs potenciáljának előrejelzését megalapozó in vitro irritációs veszélyességi osztályozási kategória megállapítására szolgál (lásd a 48. pontban található döntési kritériumokat).

A BCOP vizsgálati módszer frissen levágott szarvasmarhából izolált szaruhártyákat használ fel. A szaruhártya opacitásának mérése kvantitatív módon, a szaruhártyán átbocsátott fény mennyiségének mérésével történik. A permeabilitás mérése ugyancsak kvantitatív módon, a szaruhártya teljes vastagságán áthatoló és a hátsó kamrában található közegben kimutatható fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérésével történik. A vizsgálati vegyi anyagoknak a szaruhártya felhámjának felületére történő felvitele a szaruhártyatartó elülső kamrájába történő bevitellel történik. A 4. függelék tartalmazza a BCOP vizsgálati módszer során felhasznált szaruhártyatartó leírását és ábráját. A szaruhártyatartó a kereskedelmi forgalomban különféle forrásokból beszerezhető, vagy saját használatra megépíthető.

A szarvasmarhaszemek származása és életkora, valamint az állatfaj kiválasztása

A vágóhídon a szarvasmarhákat jellemzően emberi fogyasztás céljából vagy más kereskedelmi felhasználás céljából ölik le. A BCOP vizsgálati módszer keretében felhasználandó szaruhártyák csak az emberi élelmiszerláncba való bekerülésre alkalmasnak minősülő, egészséges állatokból vehetők. Mivel a szarvasmarhák tömege fajtától, életkortól és nemtől függőn jelentős mértékben eltérhet, a vágásra kerülő állatok tekintetében nincs ajánlott tömeg.

Különböző életkorú állatokból származó szemek esetén a szaruhártya mérete változó lehet. A 30,5 mm vízszintes átmérőt meghaladó és legalább 1 100  μm középponti vastagságú szaruhártyák általában nyolcévesnél idősebb, a 28,5 mm átmérő és 900 μm középponti vastagság alatti szaruhártyák általában ötévesnél fiatalabb szarvasmarhából származnak (14). Emiatt nem szokás 60 hónaposnál idősebb szarvasmarhákból származó szaruhártyákat felhasználni. Hagyományosan nem szokás 12 hónaposnál fiatalabb szarvasmarhákból származó szemeket sem felhasználni, mivel ebben az életkorban a szemek még fejlődésben vannak, és a szaruhártya vastagsága és átmérője lényegesen kisebb a kifejlett szarvasmarhából származó szaruhártyákon mért értékeknél. Előnyeikre való tekintettel ugyanakkor megengedhető a fiatal (6 és 12 hónap közötti életkorú) állatokból származó szaruhártyák használata is, mivel ezek nagyobb mennyiségben állnak rendelkezésre, szűkebb az életkori tartományuk, és ez esetben kisebb a személyzet szarvasmarhák szivacsos agyvelőbántalmával szembeni esetleges kitettsége is (15). Mivel a szaruhártya méretének vagy vastagságának a korróziót és az irritációt okozó vegyi anyagokkal szembeni reagálási képességre gyakorolt hatásával kapcsolatban hasznos lenne további értékelést végezni, a felhasználóknak célszerű beszámolniuk az egyes vizsgálatokban felhasznált szaruhártyákat adó állatok becsült életkoráról és/vagy tömegéről.

A szemek begyűjtése és beszállítása a laboratóriumba

A szemeket a vágóhíd alkalmazottai gyűjtik be. A mechanikai és egyéb károsodásnak a lehető legkisebb mértékűre való csökkentése érdekében a szemeket a halál bekövetkezése után mihamarabb el kell távolítani, és az eltávolítás után azonnal, illetve szállítás közben le kell hűteni. A szemek potenciálisan irritatív vegyi anyagokkal szembeni expozíciójának megelőzése érdekében a vágóhíd alkalmazottai az állat fejének leöblítésekor nem használhatnak mosószert.

A szemeket megfelelő méretű edénybe öntött, hűtött, Hank-féle kiegyenlített sóoldatba (HBBS-oldat) kell helyezni oly módon, hogy az oldat a szemeket teljesen ellepje, és azokat a laboratóriumba oly módon kell beszállítani, hogy a lehető legkisebb legyen a károsodás és/vagy a bakteriális fertőzés esélye. Mivel a szemek begyűjtése a vágás során történik, azok vérrel és más biológiai anyagokkal – többek között baktériumokkal és más mikroorganizmusokkal – érintkezhetnek. Ezért fontos annak biztosítása, hogy a kontamináció veszélye a lehető legkisebb legyen (például a szemeket tartalmazó edény nedves jégen tárolásával a begyűjtés és a szállítás során, a szemek szállítás közbeni tárolására használt HBSS-oldathoz antibiotikumok [például 100 IU/ml koncentrációban penicillin és 100 mg/ml koncentrációban sztreptomicin] hozzáadásával).

A szemek begyűjtése és a szaruhártyák BCOP vizsgálati módszer közbeni felhasználása között eltelt időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie (a begyűjtésnek és a felhasználásnak jellemzően ugyanazon a napon meg kell történnie), és igazolni kell, hogy ez az idő nem befolyásolja a vizsgálat eredményeit. Ezek az eredmények a szemek kiválasztási kritériumain, valamint a pozitív és a negatív kontrollok reakcióin alapulnak. A vizsgálatban felhasznált valamennyi szemnek egy meghatározott napon begyűjtött szemállományból kell származnia.

A BCOP vizsgálati módszer során felhasznált szemek kiválasztási kritériumai

A szemek épségét a laboratóriumba való beérkezést követően gondosan meg kell vizsgálni a sérülések – többek között a fokozott opacitás, a karcolások és a rendellenes érburjánzás (neovaszkularizáció) – szempontjából. A vizsgálat céljára csak ép szemekből származó szaruhártyák használhatók fel.

Az egyes szaruhártyák minőségét a vizsgálat során később is kell értékelni. Azokat a szaruhártyákat, amelyek opacitása a kezdeti egyórás kiegyenlítődési időszak elteltével hét opacitásegységnél nagyobb vagy opaciméterrel azzal egyenértékű, valamint a felhasznált szaruhártyatartókat ki kell dobni (MEGJEGYZÉS: az opacimétert az opacitási egységek meghatározásához használt opacitás-etalonnal kell kalibrálni, lásd a 4. függeléket).

Minden kezelt csoportnak (a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt csoportnak, a párhuzamos negatív és pozitív kontrolloknak) legalább három szemből kell állnia. A BCOP vizsgálati módszer során a negatív kontroll céljára három szaruhártyát kell felhasználni. Mivel minden szaruhártya a teljes szemgolyóból kivágással kerül eltávolításra, majd pedig rögzítésre kerül a szaruhártyakamrában, előfordulhat, hogy a kezelés mesterségesen befolyásolja az egyes szaruhártyák (a negatív kontrollt is ideértve) opacitás- és permeabilitásértékét. Ezenfelül, az IVIS számítása során a negatív kontrollal kezelt szaruhártyák opacitás- és permeabilitásértékeinek felhasználásával korrigálják a vizsgálati vegyi anyaggal és a pozitív kontrollal kezelt szaruhártyák opacitás- és permeabilitásértékeit.

ELJÁRÁS

A szemek előkészítése

Az ép szaruhártyákat a későbbi kezelés elősegítése érdekében oly módon kell preparálni, hogy az ínhártyából 2–3 mm-es perem maradjon, ügyelve arra, hogy a szaruhártya fel- és belhámja ne sérüljön. Az izolált szaruhártyákat fel kell erősíteni a külön erre a célra kialakított, a szaruhártya felhámjával érintkező elülső, illetve belhámjával érintkező hátsó kamrából álló szaruhártyatartókra. Mindkét kamrát (a hátsó kamrával kezdve) teljesen fel kell tölteni előmelegített, fenolvörösmentes Eagle-féle tápfolyadékkal (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM), ügyelve a buborékképződés megelőzésére. A berendezést ezt követően 32 ± 1 °C-on legalább egy órán át ekvilibrálni kell annak érdekében, hogy a szaruhártyák a közeggel kiegyenlítődjenek, és lehetőség szerint elérjék normális metabolikus aktivitásukat (a szaruhártya felületének hőmérséklete in vivo kb. 32 °C).

A kiegyenlítődési időszak eltelte után mindét kamrát friss, előmelegített, fenolvörösmentes Eagle-féle tápfolyadékkal fel kell tölteni, és minden egyes szaruhártyán le kell olvasni a kiindulási opacitásértéket. A makroszkopikus szöveti károsodást (például karcolásokat, elszíneződést, rendellenes érburjánzást) mutató, illetve a hétnél nagyobb vagy opaciméterrel azzal egyenértékű opacitású szaruhártyákat és a felhasznált szaruhártyatartókat el kell dobni. Legalább három szaruhártyát kell kiválasztani negatív (vagy oldószeres) kontrollként szolgáló szaruhártyaként. A megmaradó szaruhártyákat ezt követően kezelt csoportra és pozitív kontrollcsoportra kell osztani.

Mivel a víz fajhője nagyobb, mint a levegőé, a víz stabilabb hőmérsékleti viszonyokat biztosít az inkubáláshoz. Ezért a szaruhártyatartó és tartalmának 32 ± 1 °C hőmérsékleten való tartására vízfürdő használata ajánlott. A hőmérséklet állandóságának biztosítását szolgáló óvintézkedések (például a tartók és a közeg előmelegítése) mellett azonban használható levegős inkubátor is.

A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása

Két eltérő kezelési protokoll használatos, az egyik a folyadékok és a szilárd és folyékony felületaktív anyagok, a másik pedig a nem felületaktív szilárd anyagok esetében.

A folyadékok vizsgálata hígítatlan állapotban történik. A félszilárd anyagok, krémek és gyanták vizsgálata rendszerint a folyadékokra vonatkozó protokoll szerint történik. A felületaktív anyagok vizsgálata 10 vegyesszázalék (m/V) koncentrációban, 0,9 %-os nátrium-klorid oldattal, desztillált vízzel vagy más olyan oldószerrel készített oldatban történik, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálati rendszerre. Ha a hígítás koncentrációja ettől eltérő, akkor azt megfelelően meg kell indokolni. A felületaktív anyagokat tartalmazó keverékek hígítatlan állapotban vagy megfelelő koncentrációjúra hígított állapotban vizsgálhatók, a megfelelő in vivo expozíciós forgatókönyvtől függően. A vizsgált koncentrációt megfelelően meg kell indokolni. A szaruhártyákat a folyadéknak vagy felületaktív anyagnak 10 percig kell kitenni. Ettől eltérő expozíciós idő alkalmazását tudományos szempontból megfelelően meg kell indokolni. A felületaktív anyag és a felületaktív anyagot tartalmazó keverék fogalommeghatározását lásd az 1. függelékben.

A nem felületaktív szilárd anyagok jellemző vizsgálata 20 vegyesszázalék (m/V) koncentrációban, 0,9 %-os nátrium-klorid-oldattal, desztillált vízzel vagy más olyan oldószerrel készült oldat vagy szuszpenzió formájában történik, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálati rendszerre. A szilárd anyagok bizonyos körülmények között és megfelelő tudományos indokolással hígítatlanul, a szaruhártya felületére a nyitott kamrás módszerrel (lásd a 32. pontot) való közvetlen felvitellel is vizsgálhatók. A szaruhártyát a szilárd anyagnak négy órán át kell kitenni, de a folyadékok és a felületaktív anyagok esetéhez hasonlóan – tudományos szempontú megfelelő indokolással – más expozíciós idő is alkalmazható.

A vizsgálati vegyi anyag fizikai jellegétől és kémiai tulajdonságaitól (például szilárd anyag vagy folyadék, viszkózus vagy nem viszkózus folyadék) függően más felviteli módok is alkalmazhatók. A legfontosabb annak biztosítása, hogy a vizsgálati vegyi anyag megfelelően beborítsa a felhám felületét, valamint az, hogy az öblítési lépések során megfelelően eltávolítsák. A nem és a kissé viszkózus, folyékony vizsgálati vegyi anyagok esetében jellemzően a zárt kamrás, míg a közepes és a nagy viszkozitású folyékony vizsgálati vegyi anyagok, illetve a tiszta szilárd anyagok esetében jellemzően a nyitott kamrás módszer használatos.

A zárt kamrás módszer esetében az elülső kamrába a szaruhártya felhámjának befedéséhez elegendő mennyiségű (750 μl) vizsgálati vegyi anyagot kell a kamra tetején található adagolónyílásokon keresztül bevinni, majd az expozíció idejére a nyílásokat a kamradugaszokkal le kell zárni. Fontos annak biztosítása, hogy valamennyi szaruhártya megfelelő időközig legyen kitéve a vizsgálati vegyi anyagnak.

A nyitott kamrás módszer esetében a kezelés előtt el kell távolítani az elülső kamra ablakzáró gyűrűjét és az ablaknyílás üvegét. A kontrollként szolgáló vagy a vizsgálati vegyi anyagot (750 μl vagy a szaruhártya teljes befedéséhez elegendő mennyiségben) mikropipettával közvetlenül a szaruhártya felhámjának felületére kell felvinni. Ha a vizsgálati vegyi anyagot nehezen lehet pipettába felszívni, az az adagolás elősegítése érdekében finnpipettába pumpálható. A finnpipetta hegyét bele kell helyezni a fecskendő adagolójába, hogy az anyagot nyomás alatt lehessen betölteni a hegybe. A fecskendő dugattyúját a pipetta szelepének felfelé húzásával egyidejűleg be kell nyomni. Ha a pipetta hegyében légbuborékok jelennek meg, a vizsgálati vegyi anyagot el kell távolítani (ki kell nyomni) és a műveletet mindaddig ismételni kell, amíg a pipetta hegye légbuborékok nélkül feltelik. Szükség esetén normál fecskendő is használható (tű nélkül), mivel lehetővé teszi a vizsgálati vegyi anyag mennyiségének pontos mérését és a szaruhártya felhámjának felületére való könnyebb felvitelét. Az adagolást követően a zárt rendszer visszaállítása érdekében az ablaknyílás üvegét vissza kell szerelni az elülső kamrára.

Inkubáció az expozíciót követően

Az expozíciós idő elteltével a vizsgálati vegyi anyagot, a negatív kontrollként vagy pozitív kontrollként szolgáló vegyi anyagot el kell távolítani az elülső kamrából, és a felhámot legalább háromszor (vagy mindaddig, amíg észlelhetőek a vizsgálati vegyi anyag látható nyomai) fenolvörös indikátort tartalmazó Eagle-féle tápfolyadékkal át kell mosni. Az öblítéshez azért kell fenolvörös indikátort tartalmazó közeget használni, mert a fenolvörös indikátor színváltozásának megfigyelésével ellenőrizhető a savas és a lúgos vizsgálati vegyi anyagok leöblítésének eredményessége. A szaruhártyát háromnál többször is le kell mosni, ha a fenolvörös indikátor még mindig elszíneződik (sárgára vagy lilára) vagy ha a vizsgálati vegyi anyag még mindig látható. A közeg vizsgálati vegyi anyagtól való megtisztítását követően a szaruhártyákat utoljára át kell öblíteni (fenolvörös indikátort nem tartalmazó) Eagle-féle tápfolyadékkal. Az utolsó öblítéshez azért kell (fenolvörös indikátort nem tartalmazó) Eagle-féle tápfolyadékot használni, mert így biztosítható az opacitásmérés előtt a fenolvörös indikátornak az elülső kamrából való eltávolítása. Ezt követően az elülső kamrát – fenolvörös indikátor bekeverése nélkül – ismételten fel kell tölteni friss Eagle-féle tápfolyadékkal.

Folyadékok és felületaktív anyagok esetében a szaruhártyákat az öblítést követően legalább további két órán át 32 ± 1 °C hőmérsékleten inkubálni kell. Bizonyos körülmények között hasznos lehet hosszabb utóexpozíciós időt alkalmazni, amiről eseti alapon kell dönteni. A szilárd anyagokkal kezelt szaruhártyákat a négyórás expozíciós idő végén alaposan le kell öblíteni, utóinkubáció azonban nem szükséges.

Folyadékok és felületaktív anyagok esetében az expozíciót követő inkubáció végén, nem felületaktív szilárd anyagok esetében a négyórás expozciós idő elteltével minden egyes szaruhártya opacitását és permeabilitását fel kell jegyezni. Egyben minden szaruhártyát szemrevételezéssel is meg kell vizsgálni, és a releváns észrevételeket (pl. szövetleválás, vizsgálati vegyi anyag maradéka, egyenetlen fényáteresztési minták) fel kell jegyezni. Ezek a megfigyelések fontosak lehetnek, mivel azok megjelenhetnek az opaciméteren leolvasott értékek eltéréseiben is.

Kontrollként szolgáló vegyi anyagok

Minden vizsgálatban párhuzamos negatív vagy oldószeres/vivőanyagos kontrollt és pozitív kontrollt is kell alkalmazni.

Hígítatlan folyékony anyagok vizsgálatakor a vizsgálati rendszer esetleges nem jellemző változásainak kimutatása és a vizsgálat végpontjaiban figyelembe veendő kiindulási értékek meghatározása céljából a BCOP vizsgálati módszerben párhuzamos negatív kontrollt (például 0,9 %-os nátrium-klorid oldatot vagy desztillált vizet) kell alkalmazni. Az egyidejű negatív kontroll alkalmazása egyben azt is biztosítja, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek nem kívánt irritatív hatást.

Hígított folyadékok, felületaktív anyagok és szilárd anyagok vizsgálatakor a vizsgálati rendszer esetleges nem jellemző változásainak észlelése és a vizsgálat végpontjaiban figyelembe veendő kiindulási értékek meghatározása céljából a BCOP vizsgálati módszerben párhuzamos oldószeres/vivőanyagos kontrollt kell alkalmazni. Csak olyan oldószer, illetőleg vivőanyag alkalmazható, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálati rendszerre.

Az a vegyi anyag, amelyről ismert, hogy pozitív hatást vált ki, minden vizsgálatban párhuzamos pozitív kontrollként szerepel a vizsgálati rendszer integritásának és helyes működtetésének igazolása érdekében. Annak érdekében azonban, hogy a pozitív kontrollnál jelentkező hatás időbeli változása is megfigyelhető legyen, az irritatív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Folyékony vizsgálati vegyi anyagok esetében pozitív kontrollként például 100 %-os etanol vagy 100 %-os dimetil-formamid alkalmazható. Szilárd vizsgálati vegyi anyagok esetében pozitív kontrollként például 0,9 %-os nátrium-klorid-oldathoz 20 vegyesszázalék (m/V) koncentrációban adagolt imidazol alkalmazható.

A referencia-vegyianyagok jól használhatók egy adott kémiai vagy termékosztályba tartozó ismeretlen vegyi anyagok szemirritációs hatásának értékelésére vagy valamely szemirritációs anyag relatív irritatív hatásának az irritatív hatás egy adott tartományán belüli értékelésére.

Mért végpontok

Az opacitást a szaruhártyán átbocsátott fény mennyiségének mérésével kell meghatározni. A szaruhártya opacitásának kvantitatív mérése opaciméterrel történik, amely a mért opacitásértéket folyamatos skálán mutatja.

A permeabilitást a szaruhártya összes sejtrétegén (azaz a szaruhártya külső felületén a felhámtól a szaruhártya belső felületén a belhámig) áthatoló fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérésével kell meghatározni. A szaruhártyatartónak a felhámmal érintkező elülső kamráját 1 ml (folyadék vagy felületaktív anyag vizsgálata esetében 4 mg/ml, nem felületaktív szilárd anyag vizsgálata esetében 5 mg/ml) fluoreszcein-nátrium-oldattal, a belhámmal érintkező hátsó kamrát pedig friss EMEM oldattal kell feltölteni. A tartót ezt követően vízszintes helyzetben 90 ± 5 percig 32 ± 1 °C hőmérsékleten inkubálni kell. A hátsó kamrába áthatoló fluoreszcein-nátrium mennyiségének mérése ultraibolya- és látható fényes fényspektroszkópiás eljárással történik. Az eljárás keretében folyamatos skálán meg kell határozni és fel kell jegyezni a 490 nm-hez tartozó optikai sűrűségek (OD490) vagy abszorbanciák értékét. A fluoreszcein permeabilitásának értékeit szabványos 1 cm-es fényút alkalmazásával, a látható fényes spektrofotométerrel mért OD490 értékek alapján kell meghatározni.

Az előzőekben leírt módszer alternatívájaképpen 96 lyukú mikrotiterlemez-olvasó is alkalmazható azzal a feltétellel, hogy i. a fluoreszceines OD490 értékek meghatározásához megállapítható a lemezolvasó lineáris tartománya, és ii. a 96 lyukú lemezen annyi fluoreszceinmintát használnak, amennyi ahhoz szükséges, hogy az így meghatározott OD490 értékek megegyezzenek a szabványos 1 cm-es fényúttal mért értékekkel (ehhez teljesen [általában 360 μl-rel] feltöltött lyukak lehetnek szükségesek).

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az adatok kiértékelése

Azt követően, hogy az opacitás- és az átlagos permeabilitásértékeket (OD490) a háttéropacitás, illetve a negatív kontroll OD490 permeabilitásértékeinek figyelembevételével korrigálták, az egyes kezelt csoportok átlagos opacitás- és átlagos OD490 permabilitásértékeit egy kísérleti úton származtatott összefüggés segítségével kezelt csoportonként egyetlen jelzőszámmá, az in vitro irritációs pontszámmá (IVIS) kell alakítani:

IVIS = átlagopacitás + (15 × OD490 átlagpermeabilitás).

Sina és társai (16) szerint ezt a képletet belső és laboratóriumközi vizsgálatok keretében dolgozták ki. Egy több laboratóriumban 36 vegyületen elvégzett vizsgálatsorozat adatain többváltozós analízist hajtottak végre azon egyenlet meghatározása végett, amely az in vivo és az in vitro adatok között a legjobb illeszkedést biztosítja. Két különböző társaság tudományos szakemberei elvégezték ezt az analízist és közel azonos egyenleteket származtattak.

Az opacitás- és a permeabilitásértékeket egymástól függetlenül is ki kell értékelni annak meghatározására, hogy a vizsgálati vegyi anyag a korróziót vagy a súlyos irritációt nem csak a két végpont egyikében váltotta-e ki (lásd a döntési kritériumokat).

Döntési kritériumok

A vizsgálati vegyi anyagok súlyos szemkárosodást okozóként (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként), valamint a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (az ENSZ-GHS szerint kategória nélküli) vegyi anyagokként történő meghatározására szolgáló IVIS-határértékek az alábbiakban szerepelnek:



IVIS

ENSZ-GHS

≤ 3

Kategória nélküli

> 3; ≤ 55

Előrejelzés nem végezhető

> 55

1. kategória

A vizsgálat elfogadhatósági kritériumai

A vizsgálat akkor minősül elfogadhatónak, ha a pozitív kontrollhoz tartozó IVIS érték az aktuális (legalább háromhavonta, illetőleg az ilyen vizsgálatot rendszertelenül, azaz havi egy alkalomnál ritkábban végző laboratóriumok esetében minden elfogadható vizsgálat után aktualizált) történeti átlag körüli két szórás intervalluma közé esik. A negatív vagy az oldószeres/vivőanyagos kontrollon tapasztalható hatásokhoz tartozó opacitás- és permeabilitásértékeknek kisebbnek kell lenniük az adott negatív kontrollal vagy oldószerrel/vivőanyaggal kezelt szarvasmarha-szaruhártya háttéropacitására és háttérpermeabilitására megállapított felső határnál. Ha a létrejött besorolás egyértelmű, akkor legalább három szaruhártya vizsgálatából álló egyszeri vizsgálatmenetnek elegendőnek kell lennie az adott vizsgálati vegyi anyag esetében. Az első vizsgálatmenet határesethez közeli eredményei esetében azonban fontolóra kell venni egy második vizsgálatmenetet (ez azonban nem feltétlenül szükséges), valamint egy harmadik vizsgálatmenetet is, ha az első két vizsgálatmenetnél nem egyezik meg az IVIS eredmények átlaga. Ebben az összefüggésben az első vizsgálatmenet eredménye akkor minősül határesethez közelinek, ha a három szaruhártyán alapuló előrejelzések nem egyeztek meg, például:

 a három szaruhártyából kettő eltérő előrejelzést adott a mindhárom szaruhártya átlagához viszonyítva, VAGY

 a három szaruhártyából egy a mindhárom szaruhártya átlagától eltérő előrejelzést adott, ÉS az eltérő eredmény 10-nél nagyobb IVIS-egység volt a küszöbértékhez (55) viszonyítva.

 Ha a megismételt vizsgálatmenet megerősíti az első vizsgálatmenet előrejelzését (az IVIS érték átlaga alapján), akkor további vizsgálat nélkül végleges döntést lehet hozni. Ha a megismételt vizsgálatmenet eltérő eredményt hoz az első vizsgálatmenethez képest (az IVIS érték átlaga alapján), akkor egy harmadik vizsgálatmenetet kell lefolytatni a kétértelmű előrejelzések eldöntése és a vizsgálati vegyi anyag osztályozása érdekében. Megengedhető lehet az osztályozás és a címkézés céljával végzendő további vizsgálatok elengedése, ha bármelyik vizsgálatmenet az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriát eredményez.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia, amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:

Vizsgálati vegyi anyagok és kontrollként szolgáló vegyi anyagok

 kémiai név (nevek): a Chemical Abstracts Service (CAS) szerinti szerkezeti név, ezt követően az egyéb ismert nevek, a CAS nyilvántartási szám, ha ismertek;

 a vizsgálati, illetve a kontrollként szolgáló vegyi anyag tisztasága és összetétele (tömegszázalékban), amennyiben ezek az információk rendelkezésre állnak;

 fizikai-kémiai tulajdonságok: halmazállapot, illékonyság, pH, stabilitás, kémiai osztály, vízoldékonyság, ha a vizsgálat szempontjából relevánsak;

 a vizsgálati, illetve a kontrollként szolgáló vegyi anyagok vizsgálatot megelőző kezelése, ha történt ilyen (például melegítés, porítás);

 stabilitás, ha ismert.

A megbízó és a vizsgálatot végző laboratórium adatai

 A megbízó, a vizsgálatot végző laboratórium és a vizsgálatvezető neve és címe.

A vizsgálati módszer körülményei

 az alkalmazott opaciméter (például modell és leírás) és a műszer beállításai;

 az opacitás és a permeabilitás mérésére használt műszerek (pl. opaciméter és spektrofotométer) kalibrálási adatai a mérések linearitásának biztosítása érdekében;

 a használt szaruhártyatartók típusa (például modell és leírás);

 az egyéb berendezések leírása;

 a vizsgálati módszer időbeli integritásának (például pontosságának és megbízhatóságának) biztosítására alkalmazott módszer (például a jártassági tesztanyagok rendszeres időközönkénti vizsgálata).

A vizsgálat elfogadhatóságának kritériumai

 a párhuzamos pozitív és negatív kontrollokra vonatkozó elfogadható tartományok a történeti adatok alapján;

 adott esetben az elfogadható párhuzamos referencia-kontrolltartományok a történeti adatok alapján.

A szemek begyűjtése és preparálása

 a szemek beszerzési helyének (azaz a begyűjtési létesítményük) megjelölése;

 a szaruhártya átmérője, amellyel a donorállat életkora és a vizsgálatra való alkalmassága mérhető;

 a szemek tárolásának és szállításának körülményei (például a szemek begyűjtésének dátuma és időpontja, a vizsgálat megkezdéséig eltelt idő, a szállítóeszköz és a hőmérsékleti viszonyok, az alkalmazott antibiotikumok);

 a szarvasmarha-szaruhártyák preparálása és tárgylemezre helyezése, többek között a minőségükre, a szaruhártyatartók hőmérsékletére, valamint a vizsgálathoz felhasznált szaruhártyák kiválasztási kritériumaira vonatkozó megjegyzések.

Vizsgálati eljárás

 az alkalmazott párhuzamosok száma;

 az alkalmazott negatív és pozitív kontrollok meghatározása (adott esetben az oldószeres és a referenciakontrolloké is);

 a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja (koncentrációi), alkalmazása, expozíciós ideje és az expozíciót követő inkubáció ideje;

 az alkalmazott értékelési és döntési kritériumok leírása;

 az alkalmazott vizsgálat-elfogadhatósági kritériumok leírása;

 a vizsgálati eljárás bármilyen változtatásának leírása;

 az alkalmazott döntési kritériumok leírása.

Eredmények

 minden egyes vizsgált minta adatainak táblázatos formába foglalása (például a vizsgálati vegyi anyag, a pozitív, a negatív és a referenciakontrollok [ha voltak ilyenek] opacitás-, OD490 és kiszámított IVIS értékei táblázatos formában, ideértve adott esetben a megismételt párhuzamos kísérletek adatait, valamint az egyes kísérletek esetében az átlag ± a szórás megadásával);

 a megfigyelt egyéb hatások leírása;

 a származtatott in vitro ENSZ-GHS besorolás, amennyiben alkalmazandó.

Az eredmények tárgyalása

Következtetés

SZAKIRODALOM

(1) ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Elérhető az alábbi címen: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(2) ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC:National Institute of Environmental Health Sciences. Elérhető az alábbi címen: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(3) OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.

(4) UN (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. Elérhető az alábbi címen: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.

(5) Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., and Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in Vitro 24:1-9.

(6) ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Elérhető az alábbi címen: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(7) ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Elérhető az alábbi címen: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(8) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(9) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(10) Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78-81.

(11) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Elérhető az alábbi címen: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(12) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(13) OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.

(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on – Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.

(17) E melléklet B.5., akut toxicitás: szemirritáció/szemkorróziós hatás című fejezete.

(18) ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Elérhető az alábbi címen: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].

(19) OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).

Elérhető a következő címen: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html




1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességének mértékét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálati módszer milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket.

Referencia-vegyianyag : a vizsgálati vegyi anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként használt vegyi anyag. A referencia-vegyianyagnak a következő tulajdonságokkal kell rendelkeznie: i. állandó és megbízható forrás(ok)ból kell származnia; ii. a vizsgálati vegyi anyagok osztályához hasonló szerkezettel és funkcionalitással kell rendelkeznie; iii. ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendelkeznie; iv. rendelkezésre kell állnia az ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és v. a kívánt hatástartományban ismert hatásúnak kell lennie.

Alulról építkező megközelítés : a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében feltehetőleg besorolást nem igénylő vegyi anyag esetén alkalmazott lépcsőzetes megközelítés, amely a besorolást nem igénylő vegyi anyagok (negatív eredmény) más vegyi anyagokhoz (pozitív eredmény) viszonyított meghatározásával kezdődik.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Szaruhártya : a szemgolyó elülső részén az íriszt és a pupillát fedő és a szem belsejébe a fényt bevezető, áttetsző rész.

Szaruhártya opacitása : a szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követő átlátszatlanság mértékét leíró jellemző. Az opacitás megnövekedése a szaruhártya károsodását jelzi. Az opacitás értékelése történhet szubjektív módon (mint például a nyulakon végzett Draize-féle szemvizsgálatban) vagy objektív módszerrel (műszerrel, például opaciméterrel).

Szaruhártya permeabilitása : a szaruhártya felhámjának károsodását leíró számadat; meghatározása a szaruhártya összes sejtrétegén áthatoló fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérése alapján történik.

Szemirritáció : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem elülső felszínén történő alkalmazását követően megjelenő és az alkalmazástól számított 21 napon belül teljes mértékben visszafordítható szemelváltozások. Megfelel a »Reverzibilis szemkárosodás« fogalmának és az »ENSZ-GHS szerinti 2. kategóriának« (4).

Hamis negatív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen negatívnak minősített pozitív vegyi anyagok részaránya. A hamis negatív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Hamis pozitív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen pozitívnak minősített negatív vegyi anyagok részaránya. A hamis pozitív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon velejáró sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni egy élő szervezetet, egy rendszert vagy egy (al)populációt érintő expozíciója esetén.

In vitro irritációs pontszám (IVIS) : a BCOP vizsgálati módszer során alkalmazott, kísérleti úton származtatott összefüggés, amely az egyes kezelt csoportok opacitásának és permeabilitásának átlagértékeit minden egyes kezelt csoportra egyetlen in vitro pontszám formájában fejezi ki. IVIS = átlagopacitás + (15 x átlagpermeabilitás).

Irreverzibilis szemkárosodás : lásd: »Súlyos szemkárosodás«.

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba (4).

Negatív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó kezeletlen replikátum. Ezt a mintát a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt dolgozzák fel annak megállapítása érdekében, hogy az oldószer kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Nem besorolt : a szemirritáció tekintetében (az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába tartozóként) nem besorolt vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként) nem besorolt vegyi anyagok. Megfeleltethető az ENSZ-GHS szerinti »kategória nélküli« vegyi anyagoknak.

Opaciméter : a szaruhártya fényátbocsátását kvantitatív módon értékelő, a szaruhártya opacitásának mérésére alkalmazott műszer. Rendszerint két kamrából áll, amelyek mindegyike saját fényforrással és fotocellával van ellátva. Az egyik kamrában helyezkedik el a kezelt szaruhártya, míg a másik a műszer kalibrálására és alaphelyzetbe állítására szolgál. Egy kontrollrekeszt (folyadékkal nem töltött üres kamra ablakok nélkül) halogénlámpa fényével átvilágítanak, a fényt fotocellával érzékelik, és ezt összevetik a szaruhártyát tartalmazó kamrát magában foglaló vizsgálati rekeszen átvezetett, fotocellával érzékelt fénnyel. A fotocellák segítségével mért fényátbocsátás eltérését összevetik, és az ebből adódó számszerű opacitásérték digitális kijelzőn jelenik meg.

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó vegyi anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollválaszban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Reverzibilis szemkárosodás : lásd: »Szemirritáció«.

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik.

Súlyos szemkárosodás : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem külső felületére való juttatását követő olyan szövetkárosodás kialakulása, vagy a látás olyan súlyos fizikai romlása, amely a behatást követő 21 napon belül nem fordítható vissza teljes mértékben. Megfeleltethető az »Irreverzibilis szemkárosodás« fogalmának és az »ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriának« (4).

Oldószeres/vivőanyagos kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét az oldószerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmazó kezeletlen minta, amelyet hozzáadnak a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákhoz és más kontrollmintákhoz, és ennek alapján megállapíthatók az ugyanazon oldószerben oldott vagy vivőanyaggal felvitt vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták kiindulási értékei. A minta párhuzamos negatív kontrollal elvégzett vizsgálatával az is megállapítható, hogy az oldószer vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Anyag : természetes állapotban előforduló vagy ipari termelőfolyamatból származó kémiai elemek és azok vegyületei, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők (4).

Felületaktív anyag : olyan anyag (például mosószer), amely képes csökkenteni a folyadékok felületi feszültségét, és így lehetővé tenni azok habképződését vagy szilárd anyagokba történő bejutását.

Felületaktív anyagot tartalmazó keverék : e vizsgálati módszer összefüggésében olyan keverék, amely egy vagy több felületaktív anyagot tartalmaz, 5 %-nál magasabb végső koncentrációban.

Felülről építkező megközelítés : a feltehetőleg súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyag esetén alkalmazott lépcsőzetes megközelítés, amely a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok (pozitív eredmény) más vegyi anyagokhoz (negatív eredmény) viszonyított meghatározásával kezdődik.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Többszintű vizsgálati stratégia : olyan lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben áttekintik, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének elemzésével meghatározzák, hogy a következő szintre való továbblépés előtt a veszélyességi osztályozásra vonatkozó döntéshez elegendő információ áll-e rendelkezésre. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megállapítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcsőben egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelmű besorolás meg nem állapítható.

A vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (4).

ENSZ-GHS szerinti 1. kategória : lásd: »Súlyos szemkárosodás«.

ENSZ-GHS szerinti 2. kategória : lásd: »Szemirritáció«.

ENSZ-GHS szerinti nem besorolt : az ENSZ-GHS szerinti 1. vagy 2. (2A. vagy 2B.) kategóriába való besorolás követelményeinek nem megfelelő vegyi anyagok. Megfelelnek a »Kategória nélküli« vegyi anyagoknak.

Validált vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amelynek az adott céllal kapcsolatos relevanciája (pontosságát is ideértve) és megbízhatósága validálási vizsgálatok alapján megállapítást nyert. Fontos megjegyezni, hogy a validált vizsgálati módszer a javasolt felhasználási célra nem feltétlenül kínál megfelelő pontosságú és megbízhatóságú elfogadható eljárást.

Az adatok bizonyító erejének mérlegelése : a rendelkezésre álló különféle érvek és ellenérvek mérlegelésének folyamata az adott vegyi anyag veszélyességével kapcsolatban a megfelelő következtetés levonása és alátámasztása céljából.




2. függelék

A BCOP VIZSGÁLATI MÓDSZER PREDIKTÍV ÉRTÉKE



1. táblázat

A BCOP vizsgálatnak a súlyos szemkárosodást okozó [ENSZ-GHS/ CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába, illetve nem 1. kategóriába (2. kategóriába tartozó + kategória nélküli); US EPA szerinti I. kategóriába, illetve nem I. kategóriába (II. + III. + IV. kategóriába) tartozó] vegyi anyagok azonosításával kapcsolatos prediktív értéke

Osztályozási rendszer

Szám

Pontosság

Érzékenység

Hamis negatív arányok

Specifikusság

Hamis pozitív arányok

%

Szám

%

Szám

%

Szám

%

Szám

%

Szám

ENSZ-GHS

CLP-rendelet

191

78,53

150/191

86,15

56/65

13,85

9/65

74,60

94/126

25,40

32/126

US EPA

190

78,95

150/190

85,71

54/63

14,29

9/63

75,59

96/127

24,41

31/127



2. táblázat

A BCOP vizsgálatnak a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (»szemirrtációt nem okozó«) [az ENSZ-GHS/a CLP-rendelet szerint be nem sorolt, illetve nem »nem besorolt« (1. + 2. kategóriába tartozó); US EPA szerinti IV. kategóriába, illetve nem IV. kategóriába (I. + II. + III. kategóriába) tartozó] vegyi anyagok azonosításával kapcsolatos prediktív értéke

Osztályozási rendszer

Szám

Pontosság

Érzékenység

Hamis negatív arányok

Specifikusság

Hamis pozitív arányok

%

Szám

%

Szám

%

Szám

%

Szám

%

Szám

ENSZ-GHS

CLP-rendelet

196

68,88

135/196

100

107/107

0

0/107

31,46

28/89

68,54

61/89

US EPA

190

82,11

156/190

93,15

136/146

6,85

10/146

45,45

20/44

54,55

24/44




3. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK A BCOP VIZSGÁLATI MÓDSZERHEZ

E vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak az 1. táblázatban ajánlott 13 vegyi anyag szemet érintő veszélyességi osztályozásának helyes meghatározásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat. E vegyi anyagok kiválasztása úgy történt, hogy a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálat (405. vizsgálati iránymutatás) (17) eredményei és az ENSZ-GHS osztályozási rendszer (azaz az 1., 2A., 2B. vagy nem besorolt) alapján a szemet érintő veszélyek hatástartománya szempontjából reprezentatívak legyenek (4). A kiválasztás másik kritériuma az volt, hogy a vegyi anyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok álljanak rendelkezésre, és a BCOP vizsgálati módszer alapján kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre. A referenciaadatok az ésszerűsített összefoglaló dokumentumban (3) és a BCOP vizsgálati módszer felülvizsgálatára vonatkozó ICCVAM-háttérdokumentumban (2) (18) találhatók.



1. táblázat

A BCOP vizsgálati módszerben való szakmai jártasság ellenőrzéséhez ajánlott vegyi anyagok

Vegyi anyag

CASRN

Kémiai osztály (1)

Halmazállapot

In Vivo besorolás (2)

BCOP szerinti besorolás

Benzalkónium-klorid (5 %)

8001-54-5

Óniumvegyület

Folyadék

1. kategória

1. kategória

Klórhexidin

55-56-1

Amin, amidin

Szilárd

1. kategória

1. kategória

Dibenzoil-L-borkősav

2743-38-6

Karbonsav, észter

Szilárd

1. kategória

1. kategória

Imidazol

288-32-4

Heterociklikus

Szilárd

1. kategória

1. kategória

Triklór-ecetsav (30 %)

76-03-9

Karbonsav

Folyadék

1. kategória

1. kategória

2,6-Diklór-benzoilklorid

4659-45-4

Savhalogenid

Folyadék

2A. kategória

Pontos/megbízható előrejelzés nem végezhető

Etil-2-metilaceto-acetát

609-14-3

Keton, észter

Folyadék

2B. kategória

Pontos/megbízható előrejelzés nem végezhető

Ammónium-nitrát

6484-52-2

Szervetlen só

Szilárd

2. kategória (3)

Pontos/megbízható előrejelzés nem végezhető

EDTA, dikálium-só

25102-12-9

Amin, karbonsav (só)

Szilárd

Nincs besorolás

Nincs besorolás

Tween 20

9005-64-5

Észter, poliéter

Folyadék

Nincs besorolás

Nincs besorolás

2-merkatopirimidin

1450-85-7

Savhalogenid

Szilárd

Nincs besorolás

Nincs besorolás

Fenilbutazon

50-33-9

Heterociklikus

Szilárd

Nincs besorolás

Nincs besorolás

Polioxietilén-23 lauril éter (BRIJ-35) (10 %)

9002-92-0

Alkohol

Folyadék

Nincs besorolás

Nincs besorolás

(1)   Az egyes vegyi anyagok kémiai osztályának meghatározása standard osztályozási rendszer alkalmazásával, a National Library of Medicine »Medical Subject Headings« (MeSH) elnevezésű osztályozási rendszere (elérhető a következő címen: http//www.nlm.nih.gov/mesh) alapján történt.

(2)   A nyulakon végzett in vivo szemvizsgálat (az OECD 405. vizsgálati iránymutatása) (17) eredményei alapján és az ENSZ-GHS (4) felhasználásával.

(3)   A 2A. vagy 2B. kategóriába sorolás az ENSZ-GHS rendszerének a két kategória megkülönböztetésére szolgáló kritériuma értelmezésétől függ, azaz három állatból egynél, illetve három állatból kettőnél a hetedik napon jelentkező hatások szükségesek a 2A. kategóriába soroláshoz. Az in vivo vizsgálatot három állaton végezték. Egy állaton a kötőhártya vörösségétől eltekintve minden végpont begyógyul, nulla pontos lesz a hetedik napra vagy korábban. Annak az egy állatnak, amely nem gyógyult meg teljesen a hetedik napra, a kötőhártya vörösségét értékelő pontszáma 1 volt (a hetedik napon), majd a 10. napon teljesen meggyógyult.

Rövidítések: CASRN = a Chemical Abstracts Service (CAS) szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám).




4. függelék

SZARUHÁRTYATARTÓ A BCOP VIZSGÁLATHOZ

A BCOP vizsgálathoz alkalmazott szaruhártyatartó inert anyagból (például polipropilénből) készül. A tartó két részből (elülső és hátsó kamrából) áll, és két, egymáshoz hasonló hengeres belső kamrával rendelkezik. Mindkét kamra kb. 5 ml-nyi mennyiség befogadására alkalmas és üvegablakban végződik, amelyen keresztül az opacitás mérését rögzítik. Mindkét belső kamra átmérője 1,7 cm, mélysége 2,2 cm. ( 7 ) A szivárgás megelőzésére a hátsó kamrában tömítőgyűrű található. A szaruhártyákat a belhámi oldalukkal lefelé kell a hátsó kamra tömítőgyűrűjére fektetni, majd az elülső kamrákat a szaruhártyák felhámi oldalára kell elhelyezni. A kamrákat a kamrák külső peremén található három, rozsdamentes acélból készült csavar rögzíti. Az egyes kamraházak végén üvegablak található, amely a szaruhártyához való könnyebb hozzáférés érdekében eltávolítható. A szivárgás megelőzésére az üvegablak és a kamra között is van egy tömítőgyűrű. Mindegyik kamra tetején két nyílás található, amelyen keresztül betölthető és üríthető a közeg és a vizsgálati vegyi anyagok. A kezelési és az inkubációs időszak alatt ezeket a nyílásokat gumikupak zárja le. A szaruhártyatartókon keresztüli fényátbocsátás megváltozhat, mivel a belső kamra lyukainak vagy az üvegablakoknak a kopása vagy elhasználódása vagy a felületükön egyes kémiai maradékanyagok felhalmozódása befolyásolhatja a fényszóródást vagy -visszaverődést. Ez a szaruhártyatartókon keresztüli kiindulási fényátbocsátás (és ennek megfelelően a leolvasott kiindulási opacitésértékek) növekedését vagy csökkenését idézheti elő, és az egyes kamrákban mért szaruhártya-opacitás várható kiindulási értékében bekövetkezett jelentős változásban nyilvánulhat meg (azaz a szaruhártya-opacitás kezdeti értékei az egyes szaruhártyatartókban szokásosan 2 vagy 3 opacitásegységgel eltérhetnek a várt kiindulási értékektől). A vizsgálati vegyi anyagok jellegétől és a kamrák használatának gyakoriságától függően minden laboratóriumnak meg kell fontolnia a szaruhártyatartókon keresztüli fényátbocsátás változásainak értékelésére vonatkozó program kialakítását. A kiindulási értékek meghatározásához a szaruhártyatartók a rutinszerű használat előtt a teljes közeggel töltött, szaruhártyát nem tartalmazó kamrák kiindulási opacitásértékeinek (vagy fényátbocsátásának) mérésével ellenőrizhetők. A szaruhártyatartókat ezt követően rendszeresen ellenőrizni kell a használati ideje alatti fényátbocsátás változása szempontjából. A vizsgálati vegyi anyagok, a használatuk gyakorisága és a szaruhártya-opacitás kiindulási értékei változásának megfigyelése alapján minden laboratórium megállapíthatja a szaruhártyatartók ellenőrzésének gyakoriságát. Ha a szaruhártyatartókon keresztüli fényátbocsátás jelentős változása figyelhető meg, mérlegelni kell a szaruhártyatartók belső felületének megfelelő takarítását és/vagy tisztítását, illetve a szaruhártyatartók cseréjét.

Szaruhártyatartó: bontott diagram

image




5. függelék

AZ OPACIMÉTER

Az opaciméter a fényátbocsátás mérésére szolgáló műszer. Például az Electro Design (Riom, Franciaország) által gyártott, a BCOP vizsgálati módszer validálása során használt OP-KIT berendezés esetében egy halogénlámpa fényét kontrollrekeszen (ablaktalan, illetve folyadékkal nem töltött üres kamrán) keresztül egy fotocellához juttatják és összevetik a szaruhártyát tartalmazó kamrát magában foglaló vizsgálati rekeszen átvezetett, a fotocellával érzékelt fénnyel. A fotocellák segítségével mért fényátbocsátás eltérését összevetik, és az ebből adódó számszerű opacitásérték digitális kijelzőn jelenik meg. Ennek alapján történik az opacitásegységek megállapítása. Ettől eltérő beállítású (például a kontroll- és a kísérleti kamra párhuzamos mérését nem igénylő) opaciméter-típusok használhatók, ha bizonyítottan a validált berendezéséhez hasonló eredményeket adnak.

Az opaciméternek az előrejelző modellben leírt különféle besorolásokhoz tartozó határértékek által kijelölt tartományokban (vagyis a szemkorróziót, illetve a súlyos irritatív hatást meghatározó határértékig) lineáris viselkedést kell tanúsítania. Annak érdekében, hogy a leolvasások 75–80 opacitásegységig lineárisak és pontosak legyenek, az opacimétert több kalibrátorral kell kalibrálni. A kalibrátorokat a kalibrációs kamrába (a kalibrátorok tartására átalakított szaruhártyakamrába) kell helyezni, és leolvasást kell végezni az opaciméteren. A kalibrációs kamrákat úgy kell kialakítani, hogy a kalibrátorok a fényforrástól és a fotocellától ugyanolyan távolságra helyezkedjenek el, mint a szaruhártyák az opacitásmérés során. A referenciaértékek és a kezdeti beállított pont a használt berendezés típusától függ. Az opacitásmérés linearitását megfelelő (műszerspecifikus) eljárásokkal kell biztosítani. Az Electro Design (Riom, Franciaország) által gyártott OP-KIT berendezés esetében például az opacimétert először 0 opacitásegységre kalibrálják oly módon, hogy a kalibrációs kamrát használják, kalibrátort nem. Ezt követően három különböző kalibrátort kell egyenként a kalibrációs kamrába helyezni, és mérni kell az opacitást. Az első, a második és a harmadik kalibrátor behelyezésekor rendre az előre beállított 75, 150 és 225 (± 5 % tűrés) opacitásegységet kell tudni leolvasni.

(13) A B. részben a B.48. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.48    Izolált csirkeszem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszer i. a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok és ii. a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 438. vizsgálati iránymutatásában (2013) leírt módszerrel. Az izolált csirkeszem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszert (a továbbiakban: ICE vizsgálati módszer) az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központtal (ECVAM) és az Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Japán Központtal (JaCVAM) együtt értékelte 2006-ban és 2010-ben (1) (2) (3). Az első értékelés során az ICE vizsgálati módszert a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszerében (GHS) (1) (2) (4), illetve az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendeletben ( 8 ) (CLP-rendelet) meghatározott, súlyos szemkárosodást okozó (1. kategóriába tartozó) vegyi anyagok (anyagok és keverékek) azonosítására szolgáló szűrővizsgálatkénti használatra tudományosan megalapozott vizsgálati módszerként támogatták. A második értékelés során abból a szempontból értékelték az ICE vizsgálati módszert, hogy mennyire hasznos az ENSZ-GHS-ben meghatározott, a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolt vegyi anyagok (3) (4) azonosításához. A validálási vizsgálat eredményei és a szakértői értékelő testület ajánlásai megtartották az ICE vizsgálati módszernek a súlyos szemkárosodást okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó) vegyi anyagok besorolásához történő alkalmazására vonatkozó eredeti ajánlást, mivel a rendelkezésre álló adatbázis nem változott az ICCVAM általi eredeti validálás óta. Ebben a szakaszban az ICE vizsgálati módszer alkalmazási területének más kategóriákkal való bővítésére vonatkozó további ajánlásokat nem fogalmaztak meg. A validációs vizsgálatban használt in vitro és in vivo adatkészlet ismételt értékelése során arra helyeződött a hangsúly, hogy az ICE vizsgálati módszer mennyire hasznos a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosításában (5). Ez az ismételt értékelés azt állapította meg, hogy az ICE vizsgálati módszer az ENSZ-GHS-ben meghatározott, a szemirritáció és a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására is alkalmazható (4) (5). Ez a vizsgálati módszer az ICE vizsgálati módszer ajánlott alkalmazásait és korlátait ezen értékelések alapján tartalmazza. Az OECD vizsgálati iránymutatásának eredeti, 2009-es változata és frissített, 2013-as változata közötti legfőbb eltérések többek között, de nem kizárólag a következők: az ICE vizsgálati módszernek az ENSZ-GHS osztályozási rendszer szerint besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazása, a Vizsgálati jegyzőkönyv elemeinek frissítése, a fogalommeghatározásokat tartalmazó 1. függelék frissítése és a jártassági tesztanyagokról szóló 2. függelék frissítése.

Jelenleg általánosan elfogadott, hogy az előre látható jövőben egyetlen in vitro szemirritációs vizsgálat sem tudja majd helyettesíteni a Draize-féle in vivo szemvizsgálatot a különböző kémiai osztályoknál felmerülő irritáció teljes skálájának előrejelzésére. Előfordulhat azonban, hogy egy-egy (többszintű) vizsgálati stratégián belüli több alternatív vizsgálati módszer stratégiai kombinációja helyettesíteni tudja a Draize-féle in vivo szemvizsgálatot (6). A felülről építkező megközelítés (7) akkor alkalmazandó, ha a meglévő információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan rendkívül irritáló hatású lehet, míg az alulról építkező megközelítés (7) akkor alkalmazandó, ha a meglévő információk alapján valamely vegyi anyag várhatóan nem okoz a besorolás szükségességéhez elegendő szemirritációt. Az ICE vizsgálati módszer bizonyos körülmények között és a 8–10. pontban meghatározott korlátokkal a vegyi anyagok szemet érintő veszélyességükre tekintettel történő osztályozására és címkézésére alkalmazható in vitro vizsgálati módszer. Bár az ICE vizsgálati módszer nem minősül a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatot önállóan helyettesítő vizsgálati módszernek, első lépésként ajánlott a Scott és társai (7) által javasolt felülről építkező megközelítéshez hasonló vizsgálati stratégia keretében a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok, azaz a további vizsgálat nélkül az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandó vegyi anyagok (4) azonosítására. Az ICE vizsgálati módszer ajánlott az ENSZ-GHS-ben meghatározott, a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő (az ENSZ-GHS szerinti nem besorolt) vegyi anyagok azonosítására (4), ezért első lépésként használható az alulról építkező megközelítésben (7). Azonban az a vegyi anyag, amely az ICE vizsgálati módszerrel előreláthatólag nem okoz súlyos szemkárosodást vagy nem tartozik a szemirritáció/súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolt anyagok közé, további (in vitro és/vagy in vivo) vizsgálatot tenne szükségessé a végleges osztály megállapításához. Ezenfelül az ICE vizsgálati módszernek az ENSZ-GHS-től eltérő osztályozási rendszeren belüli, alulról építkező megközelítés keretében történő alkalmazásáról egyeztetni kell a megfelelő szabályozó hatóságokkal.

E vizsgálati módszer célja a vizsgálati vegyi anyag szemet érintő veszélyességi potenciáljának értékelésére alkalmazott eljárások ismertetése annak alapján, hogy a csirkéből eltávolított csirkeszemben képes-e toxicitást kiváltani. A szaruhártyára gyakorolt toxikus hatások jellemzése i. az opacitás kvalitatív értékelésével, ii. a szembe juttatott fluoreszcein következtében bekövetkező felhámkárosodás (fluoreszcein-visszatartás) kvalitatív értékelésével, iii. a megvastagodás (felduzzadás) kvantitatív mérésével és iv. a felület makroszkopikus morfológiai károsodásának kvalitatív értékelésével történik. A szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követően megállapítható szaruhártya-opacitás, felduzzadás és károsodás értékelését külön-külön kell végezni, majd ezekből a jellemzőkből együttesen kell származtatni az ún. szemirritációs osztályt.

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Ez a vizsgálati módszer a 160. OECD-iránymutatásban (8) javasolt protokollon alapul, melynek kidolgozására az alternatív módszerek validálásával foglalkozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) nemzetközi validálási vizsgálatát (1) (3) (9) követően, az alternatív módszerek validálásával foglalkozó európai, illetve japán központ (ECVAM, JaCVAM), valamint a hollandiai TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology kutatószervezet részvételével került sor. A protokoll alapját publikált protokollokból származó információk, valamint a TNO által használt jelenlegi protokoll képezik (10) (11) (12) (13) (14).

A vizsgálati módszer alapjául szolgáló validálás során igen sokféle vegyi anyag vizsgálatára sor került, és a validálási vizsgálat empirikus adatbázisa összesen 152 vegyi anyagot, ezen belül 72 anyagot és 80 keveréket tartalmazott (5). A vizsgálati módszer szilárd anyagokra, folyadékokra, emulziókra és gélekre alkalmazandó. A folyadékok lehetnek vizesek vagy nem vizesek; a szilárd anyagok lehetnek vízben oldódóak vagy oldhatatlanok. Gázokat és aeroszolokat validálási vizsgálat keretében még nem vizsgáltak.

Az ICE vizsgálati módszer alkalmazható a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok, azaz az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába (4) sorolandó vegyi anyagok azonosítására. Erre a célra történő alkalmazásakor az ICE vizsgálati módszer azonosított korlátai az alkoholok esetében tapasztalt hamis pozitív arányokon, valamint a szilárd és a felületaktív anyagok esetében tapasztalt hamis negatív arányon alapulnak (1) (3) (9). Ebben az összefüggésben azonban a hamis negatív arányok (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriának nem az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriakénti azonosítása) nem kritikus jelentőségűek, mivel minden negatív eredményű vizsgálati vegyi anyag vizsgálatára sor kerülne más, megfelelően validált in vitro vizsgálattal (vizsgálatokkal), vagy utolsó lehetőségként – a szabályozási követelményektől függően, az adatok bizonyító erejének mérlegelésén alapuló megközelítés keretébe tartozó lépcsőzetes vizsgálati stratégia segítségével – nyulakon végzett vizsgálatokkal. Megjegyzendő, hogy a szilárd anyagok változó és szélsőséges expozíciós körülményekhez vezethetnek a Draize-féle in vivo szemirritációs vizsgálat során, ami a tényleges irritációs hatásukra (15) vonatkozó irreleváns előrejelzéseket eredményezhet. A vizsgálók valamennyi típusú vegyi anyag esetében mérlegelhetik e vizsgálati módszer alkalmazását, amellyel a pozitív eredményt súlyos szemkárosodásra utaló jelként, azaz további vizsgálat nélkül az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába sorolandóként kell elfogadni. Az alkoholok esetében azonban a kapott pozitív eredményeket a túlzó előrejelzés kockázata miatt óvatosan kell értelmezni.

A súlyos szemkárosodást okozó (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó) vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazásakor az ICE vizsgálati módszer általános pontossága 86 % (120/140), hamis pozitív aránya 6 % (7/113), hamis negatív aránya pedig 48 % (13/27) a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálati módszer ENSZ-GHS osztályozási rendszer (4) (5) szerint besorolt adataival való összevetéskor.

Az ICE vizsgálati módszer az ENSZ-GHS osztályozási rendszer (4) szerint a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására is alkalmazható. Az ICE vizsgálati módszernek az ENSZ-GHS-től eltérő osztályozási rendszeren belüli, alulról építkező megközelítés keretében történő alkalmazásáról egyeztetni kell a megfelelő szabályozó hatóságokkal. Ez a vizsgálati módszer valamennyi típusú vegyi anyagra alkalmazható, amellyel a negatív eredményt a szemirritáció és a súlyos szemkárosodás tekintetében nem besorolandóként kell elfogadni. A validációs adatbázisból származó egy eredmény alapján azonban előfordulhat, hogy a rothadásgátló szerves oldószert tartalmazó festékek előrejelzése nem megfelelő (5).

A szemirritáció vagy súlyos szemkárosodás tekintetében besorolást nem igénylő vegyi anyagok azonosítására történő alkalmazásakor az ICE vizsgálati módszer általános pontossága 82 % (125/152), hamis pozitív aránya 33 % (26/79), hamis negatív aránya pedig 1 % (1/73) a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálati módszer ENSZ-GHS osztályozási rendszer szerint besorolt adataival való összevetéskor (4) (5). Amikor bizonyos kémiai osztályokba tartozó vizsgálati vegyi anyagok (például rothadásgátló szerves oldószert tartalmazó festékek) nem szerepelnek az adatbázisban, az ICE vizsgálati módszer pontossága 83 % (123/149), hamis pozitív aránya 33 % (26/78), hamis negatív aránya pedig 0 % (0/71) az ENSZ-GHS osztályozási rendszer vonatkozásában (4) (5).

Az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozó, az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába alulosztályozott vegyi anyagok, valamint az ENSZ-GHS szerint be nem sorolt kategóriába tartozó, az ENSZ-GHS szerinti 2., 2A. vagy 2B. kategóriába felülosztályozott vegyi anyagok jelentős száma miatt az ICE vizsgálati módszer nem ajánlott olyan vizsgálati vegyi anyagok azonosítására, amelyeket szemirritáló hatásúként (azaz az ENSZ-GHS szerinti 2. vagy 2A. kategóriába tartozóként) kell besorolni, illetve olyan vizsgálati vegyi anyagok azonosítására, amelyeket enyhén szemirritáló hatásúként (az ENSZ-GHS szerinti 2B. kategóriába tartozóként) kell besorolni. E célból egy másik megfelelő módszerrel végzett további vizsgálatra lehet szükség.

A csirkeszemmel végzett valamennyi eljárás során be kell tartani a vizsgáló intézménynek az emberi és az állati eredetű anyagok – ideértve többek között, de nem kizárólag a szöveteket és a szöveti folyadékokat – kezelésére vonatkozó rendelkezéseit és eljárásait. Ajánlott továbbá követni az általános laboratóriumi óvintézkedéseket is (16).

Bár az ICE vizsgálati módszer nem veszi figyelembe a nyulakon végzett szemirritációs vizsgálatban értékelt kötőhártya- és íriszsérüléseket, foglalkozik a szaruhártyára kifejtett hatásokkal, amelyek leginkább befolyásolják az in vivo besorolást az ENSZ-GHS osztályozás alkalmazásában. Másrészről, noha maga az ICE vizsgálat nem alkalmas a szaruhártya-léziók visszafordíthatóságának értékelésére, nyulakon végzett szemvizsgálatok alapján korábban javasolták, hogy a szaruhártya-sérülés kezdeti mélységének értékelése alkalmas lehet a visszafordíthatatlan hatások bizonyos típusainak azonosítására (17). Különösen további tudományos ismeretekre van szükség annak megértésére, hogy a kezdeti nagyon súlyos sérüléssel össze nem függő visszafordíthatatlan hatások hogyan következnek be. Végezetül az ICE vizsgálat nem alkalmas a szembe kerülés következtében fellépő szisztémás toxicitási potenciál megítélésére.

Ez a vizsgálati módszer rendszeres időközönkénti frissítés tárgyát fogja képezni az új információk és adatok figyelembevételekor. Például kórszövettani vizsgálatok esetlegesen hasznosak lehetnek, ha a szaruhártya-károsodás teljesebb körű jellemzésére van szükség. E lehetőség értékelése érdekében a felhasználóknak érdemes tartósítaniuk a szaruhártyákat és azokból kórszövettani mintákat preparálniuk, amelyek felhasználhatóak a vizsgálati módszer pontosságát esetlegesen tovább javító adatbázis fejlesztéséhez és döntési kritériumok kidolgozásához. Az OECD kidolgozott egy in vitro szemtoxicitás-vizsgálati módszerekről szóló útmutatót, amely a kórszövettani minták gyűjtésére vonatkozó részletes eljárásokat, valamint arra vonatkozó információkat tartalmaz, hogy hová kell benyújtani a mintákat és/vagy a kórszövettani adatokat (8).

Minden olyan laboratóriumnak, amely a vizsgálatot először alkalmazza, a 2. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagok felhasználásával ajánlatos meggyőződnie felkészültségéről. Mielőtt a laboratórium az ICE vizsgálat adatait a szabályozói követelmények szerinti veszélyességi osztályozás céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonstrálhatja az ICE vizsgálati módszer végrehajtásában való szakmai jártasságát.

A VIZSGÁLAT ELVE

Az ICE vizsgálat olyan organotipikus módszer, amely rövid távon in vitro fenntartja a csirkeszem működését. A módszerrel a vizsgálati vegyi anyag által okozott károsodás jellemzése a szaruhártya felduzzadásának, opacitásának és fluoreszcein-visszatartásának értékelése útján történik. Míg e két utóbbi paraméter kvalitatív értékelést igényel, a szaruhártya felduzzadásának elemzése kvantitatív módszerrel történik. A mérési eredményeket az általános irritációs index kiszámításához használatos kvantitatív pontszámmá vagy a szemet in vitro érintő veszélyesség osztályozásához használatos kvalitatív kategóriává, azaz az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriává vagy az ENSZ-GHS szerinti nem besorolttá kell alakítani. Ezt követően ezen eredmények bármelyike felhasználható a vizsgálati vegyi anyag potenciálisan súlyos in vivo szemkárosodást okozó hatásának vagy annak előrejelzésére, hogy az anyagot nem kell a szemet érintő veszélyességi osztályozás szerint besorolni (lásd a döntési kritériumokat). Nem sorolhatók be azonban az ICE vizsgálati módszer előrejelzései szerint súlyos szemkárosodást nem okozó, illetve nem besorolt vegyi anyagok (lásd a 11. pontot).

A csirkeszemek származása és életkora

A múltban a vizsgálathoz vágóhídról beszerzett, emberi fogyasztás céljából leölt csirkékből nyert szemeket használtak, ami biztosította, hogy nem kellett laboratóriumi állatokat tartani. Csak az emberi élelmiszerláncba való bekerülésre alkalmas, egészséges állatokból nyert szemek használhatóak fel.

Bár a csirkék optimális életkorának felmérése céljából nem végeztek ellenőrzött vizsgálatot, a vizsgálat céljára igénybe vett csirkék életkora és tömege a hagyományosan vágóhídra kerülő vágócsirkék életkorának és tömegének felel meg (azaz kb. 7 hetes, 1,5-2,5 kg tömegű csirkék).

A szemek begyűjtése és beszállítása a laboratóriumba

A csirke elkábítását (mely rendszerint elektromos sokkal történik) és a nyak kivéreztetési célú bemetszését követően a fejet azonnal el kell távolítani. Annak érdekében, hogy a csirkefejeket a vágóhídról a károsodás és/vagy bakteriális fertőzés megelőzéséhez szükséges gyorsasággal a laboratóriumba lehessen szállítani, célszerű a laboratórium közelében helyi beszerzési forrást találni. A vizsgálat elfogadhatósági kritériumai betartásának biztosítása érdekében a csirkefejek begyűjtése és a szemek enukleáció utáni szuperfúziós kamrába helyezése közötti időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie (ennek jellemzően két órán belül meg kell történnie). A vizsgálatban felhasznált valamennyi szemnek egy meghatározott napon begyűjtött szemállományból kell származnia.

Mivel a szemeknek a fejből való kimetszése a laboratóriumban történik, az egész fejeket szobahőmérsékleten (jellemzően 18 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten), fiziológiás sóoldattal nedvesített kendőkkel párásított műanyag dobozokban kell a vágóhídról a laboratóriumba szállítani.

Az ICE vizsgálatban felhasznált szemek kiválasztási kritériumai és a szemek száma

A vizsgálatból ki kell zárni azokat a szemeket, amelyek esetében a kivételt követően nagy (0,5-nél nagyobb) a fluoreszceines foltosodás kiindulási értéke vagy a szaruhártya-opacitási pontszám.

Minden kezelt csoportnak és a párhuzamos pozitív kontrollcsoportnak legalább három szemből kell állnia. A negatív, illetve – ha az oldószer nem sóoldat – az oldószeres kontrollcsoportnak legalább egy szemből kell állnia.

A GHS szerint nem besorolt eredményhez vezető szilárd anyagok esetében ajánlott három szemmel egy második vizsgálatmenetet is végrehajtani a negatív eredmény megerősítése vagy elvetése érdekében.

ELJÁRÁS

A szemek előkészítése

A szemhéjat óvatosan be kell metszeni, ügyelve a szaruhártya sérülésének elkerülésére. Ezután a szaruhártya épségét a szaruhártya felületére néhány másodpercre felvitt, majd izotóniás sóoldattal leöblített, egy cseppnyi 2 vegyesszázalékos (m/V) nátrium-fluoreszcein alkalmazásával mielőbb értékelni kell. A fluoreszceinnel kezelt szemeket ezután réslámpás mikroszkóppal meg kell vizsgálni, és ellenőrizni kell, hogy a szaruhártya nem sérült-e meg (vagyis a fluoreszcein-visszatartási és a szaruhártya-opacitási pontszám legfeljebb 0,5 lehet).

Ha a szem sérüléstől mentes, akkor el kell távolítani a koponyából, ügyelve a szaruhártya sérülésének elkerülésére. A szemgolyót – a pislogóhártyát sebészeti csipesszel feszesen tartva – ki kell húzni a szemüregből, és a szemizmokat tompa hegyű hajlított ollóval át kell vágni. A szaruhártya túlzott nyomás miatti károsodásának (azaz a nyomásos mesterséges szövetelváltozásnak) a kerülése fontos.

A szemnek a szemüregből való eltávolításakor a szemidegből egy szabad szemmel is jól látható részt rajta kell hagyni. A szemet a szemüregből való eltávolítást követően nedvszívó párnára kell helyezni, majd le kell vágni róla a pislogóhártyát és az egyéb kötőszöveteket.

A kivett szemet korrózióálló acél csíptetőre kell erősíteni oly módon, hogy a szaruhártya függőleges helyzetben legyen. A csíptetőt ezt követően be kell helyezni a szuperfúziós készülék egyik kamrájába (18). A csíptetőt a szuperfúziós készülékben úgy kell elhelyezni, hogy az izotóniás sóoldat cseppjei (percenként 3–4 csepp, illetve percenként 0,1–0,15 ml) a teljes szaruhártyát érjék. A szuperfúziós készülék kamráinak hőmérsékletét 32 ± 1,5 °C-on kell tartani. A 3. függelék bemutatja a szuperfúziós készülék jellemző kialakítását és a szemcsíptetőket; ezek az eszközök kereskedelmi forgalomban is kaphatók, de saját használatra is megépíthetők. A készülék az egyes laboratóriumok igényeinek (például a vizsgálandó szemek számának) megfelelően módosítható.

A szemeket a szuperfúziós készülékbe való behelyezés után ismét meg kell vizsgálni réslámpás mikroszkóppal annak ellenőrzésére, hogy az előkészítés során nem sérültek-e meg. A réslámpás mikroszkóp mélységmérőjével ekkor a szaruhártya csúcsán meg kell mérni a szaruhártya vastagságát is. Ki kell cserélni azokat a szemeket, i. amelyeknek fluoreszcein-visszatartási pontszáma 0,5-nél nagyobb, ii. amelyeknek szaruhártya-opacitása 0,5-nél nagyobb, valamint iii. amelyek a károsodás bármely további jelét mutatják. Az e szempontok alapján ki nem zárt szemek közül ki kell zárni mindazokat, amelyek szaruhártya-vastagsága az összes szem átlagától 10 %-kal nagyobb mértékben eltér. A felhasználóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a réslámpás mikroszkópok különböző résbeállítás esetén eltérő szaruhártya-vastagságot adhatnak. A résszélességet 0,095 mm-re kell állítani.

Valamennyi szem megvizsgálása és jóváhagyása után a szemeket körülbelül 45–60 percig inkubálni kell annak érdekében, hogy a vizsgálandó anyag felvitele előtt a vizsgálati rendszerrel ekvilibrálódjanak. A kiegyenlítődési idő eltelte után fel kell jegyezni a kiindulási (azaz a nulla időpillanatban érvényes) szaruhártya-vastagságot és opacitást. E végpont tekintetében az előkészítéskor meghatározott fluoreszcein-pontszámot kell kiindulási értékként használni.

A vizsgálati vegyi anyag alkalmazása

A kiindulási referenciamérések után a szemeket (tartójukkal együtt) azonnal ki kell venni a szuperfúziós készülékből, vízszintes helyzetbe kell hozni, majd fel kell vinni a vizsgálati vegyi anyagot a szaruhártyára.

A folyékony vizsgálati vegyi anyagokat általában hígítatlan állapotban kell vizsgálni, de szükség esetén (például ha a vizsgálati terv így rendelkezik) hígítás is alkalmazható. Hígított vizsgálati vegyi anyagok esetén lehetőleg fiziológiás sóoldatot kell alkalmazni. Ellenőrzött körülmények között másféle oldószer is használható, a fiziológiás sóoldattól eltérő oldószerek megfelelőségét azonban külön igazolni kell.

A folyékony vizsgálati vegyi anyagokat oly módon kell felvinni a szaruhártya felületére, hogy a szaruhártya teljes felületét egyenletesen befedje. A szabványos mennyiség 0,03 ml.

A szilárd vegyi anyagokat lehetőleg dörzscsészében, mozsárban vagy hasonló őrlőeszközben a lehető legfinomabbra kell őrölni. A port oly módon kell felvinni a szaruhártya felületére, hogy azt a vizsgálati vegyi anyag egyenletesen befedje; a szabványos mennyiség 0,03 g.

A (folyékony vagy szilárd) vizsgálati vegyi anyagot 10 másodpercig hatni kell hagyni, majd szobahőmérsékleten le kell öblíteni (kb. 20 ml) izotóniás sóoldattal. Ezt követően a szemet (tartójával együtt) az eredeti függőleges helyzetben vissza kell helyezni a szuperfúziós készülékbe. Szükség esetén a 10 másodperces felvitelt követően és későbbi időpontokban (például a vizsgálati vegyi anyag maradványainak a szaruhártyán való felfedezésekor) további öblítés alkalmazható. Az öblítéshez kiegészítőként használt sóoldat mennyisége általában nem kritikus jelentőségű, a vegyi anyag szaruhártyához tapadásának észlelése azonban fontos.

Kontrollként szolgáló vegyi anyagok

Minden vizsgálatban párhuzamos negatív vagy oldószeres/vivőanyagos kontrollt és pozitív kontrollt is kell alkalmazni.

Hígítatlan folyadékok és szilárd anyagok vizsgálatakor a vizsgálati rendszer esetleges nem jellemző változásainak észlelése céljából és annak biztosítására, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást, az ICE vizsgálatban párhuzamos negatív kontrollként fiziológiás sóoldatot kell alkalmazni.

Hígított folyadékok vizsgálatakor a vizsgálati rendszer esetleges nem jellemző változásainak kimutatása céljából és annak biztosítására, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást, az ICE vizsgálatban párhuzamos oldószeres/vivőanyagos kontrollt kell alkalmazni. A 31. pontban foglaltaknak megfelelően csak olyan oldószer, illetőleg vivőanyag alkalmazható, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálati rendszerre.

Annak ellenőrzése érdekében, hogy a kiváltott hatás megfelelő-e, minden egyes kísérletben ismerten szemirritációt okozó anyagot is vizsgálni kell párhuzamos pozitív kontrollként. Mivel az ICE vizsgálat célja a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása, a pozitív kontrollnak olyan referencia-vegyianyagnak kell lennie, amely ebben a vizsgálati módszerben súlyos hatást vált ki. Annak érdekében azonban, hogy a pozitív kontrollnál jelentkező hatás időbeli változása is megfigyelhető legyen, a súlyos hatás nem lehet túlságosan erőteljes. A pozitív kontrollra vonatkozóan megfelelő mennyiségű in vitro adatot kell generálni oly módon, hogy kiszámítható legyen a pozitív kontroll statisztikailag meghatározott elfogadható tartománya. Ha egy adott pozitív kontrollra vonatkozóan nincs elegendő korábbi adat az ICE vizsgálati módszer alkalmazásából, akkor ezen adatok előállításához külön vizsgálatok lehetnek szükségesek.

Folyékony vizsgálati vegyi anyagok esetében pozitív kontrollként például 10 %-os ecetsav vagy 5 %-os benzalkónium-klorid, szilárd vizsgálati vegyi anyagok esetében pedig például nátrium-hidroxid vagy imidazol alkalmazható.

A referencia-vegyianyagok jól használhatók egy adott kémiai vagy termékosztályba tartozó ismeretlen vegyi anyagok szemirritációs hatásának értékelésére vagy valamely szemirritációs anyag relatív irritatív hatásának az irritatív hatás egy adott tartományán belüli értékelésére.

Mért végpontok

A kezelt szaruhártyákat a kezelés előtt, majd a kezelést követő leöblítés után 30, 75, 120, 180 és 240 perc (± 5 perc) elteltével kell értékelni. Ezek az időpontok a négyórás kezelési időn belül megfelelő mennyiségű mérést adnak, miközben a mérések között elegendő idő marad valamennyi szem szükséges megfigyelésének elvégzésére.

Az értékelt végpontok: a szaruhártya opacitása, felduzzadása, fluoreszcein-visszatartása és morfológiai elváltozásai (például a felhám benyomódása vagy fellazulása). A fluoreszcein-visszatartás kivételével (amelyet csak a kezelés előtt és a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció után 30 perccel kell meghatározni) minden végpontot valamennyi fenti időpontban meg kell határozni.

A szaruhártya opacitásának, fluoreszcein-visszatartásának, morfológiai elváltozásainak és – lebonyolítás esetén – kórszövettani vizsgálatának dokumentálására ajánlott fényképeket készíteni.

A négy óra elteltével végrehajtott utolsó vizsgálatot követően ajánlatos a szemeket az esetleges kórszövettani vizsgálathoz megfelelő fixálóban (például semleges pufferolt formalinban) tartani (a részletekért lásd a 14. pontot és a (8) hivatkozást.

A szaruhártya felduzzadását a réslámpás mikroszkóp optikai pachométerével végzett szaruhártyavastagság-mérésekből kell meghatározni. A felduzzadást százalékos arányként kell kifejezni, és a következő képletből, a mért szaruhártya-vastagságok felhasználásával kell kiszámítani:

image

Minden megfigyelési időpontban meg kell határozni az összes vizsgált szem szaruhártya-felduzzadásának átlagos százalékos arányát. A bármely időpontban megfigyelt szaruhártya-felduzzadás átlagértékének maximuma alapján minden vizsgálati vegyi anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot kell rendelni (lásd az 51. pontot).

Az 1. táblázatban szemléltetett szaruhártya-opacitási pontszámot a szaruhártya legsűrűbben opálos területe alapján kell megállapítani. Minden megfigyelési időpontban meg kell határozni az összes vizsgált szem szaruhártya-opacitásának átlagát. A bármely időpontban megfigyelt szaruhártya-opacitási pontszámok átlagának maximuma alapján minden vizsgálati vegyi anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot kell rendelni (lásd az 51. pontot).



1. táblázat

Szaruhártya-opacitási pontszámok

Pontérték

Észrevétel

0

Nincs opálosodás

0,5

Nagyon halvány opálosodás

1

Szórt vagy zavaros területek; az írisz részletei tisztán kivehetőek

2

Könnyen észrevehető áttetsző terület; az írisz részletei kissé elmosódottak

3

Súlyos szaruhártya-opacitás; az írisznek egyetlen részlete sem vehető ki, a pupilla mérete alig érzékelhető

4

A szaruhártya teljes opálosodása; az írisz nem látható

A fluoreszcein-visszatartást kizárólag a 30 perc elteltével végzett megfigyelési időpontban kell értékelni a 2. táblázatban foglaltak szerint. A 30 perc elteltével végzett megfigyelés időpontjában meg kell határozni az összes vizsgált szem fluoreszcein-visszatartásának átlagát, és ennek alapján minden vizsgálati vegyi anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot kell rendelni (lásd az 51. pontot).



2. táblázat

Fluoreszcein-visszatartási pontszámok

Pontérték

Észrevétel

0

Nincs fluoreszcein-visszatartás

0,5

Igen csekély mértékű, egysejtes foltosodás

1

Egysejtes foltosodás elszórtan a szaruhártya kezelt felületén

2

Fokális vagy egybefüggő, sűrű egysejtes foltosodás

3

A szaruhártya nagy egybefüggő területei tartanak vissza fluoreszceint

A morfológiai elváltozások között megemlítendő a szaruhártya felhámsejtjeinek »benyomódása«, a felhám »fellazulása«, a szaruhártya felületének »érdesedése« és a vizsgálati vegyi anyag »feltapadása« a szaruhártya felületére. Ezek a megfigyelések különböző súlyosságúak lehetnek, és egyidejűleg is előfordulhatnak. E megállapítások besorolása a vizsgáló szubjektív megítélésétől függ.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az adatok kiértékelése

A szaruhártya opacitását, felduzzadását és fluoreszcein-visszatartását külön-külön kell értékelni, és az egyes végpontokhoz külön-külön ICE-osztályt kell megállapítani. Ezt követően az egyes végpontokhoz tartozó ICE-osztályok együttes figyelembevételével meg kell határozni az egyes vizsgálati vegyi anyagok irritációs besorolását.

Döntési kritériumok

Az egyes végpontok értékelését követően az ICE-osztályok megállapítását előre meghatározott tartományok alapján kell elvégezni. A szaruhártya-felduzzadás (3. táblázat), a szaruhártya-opacitás (4. táblázat) és a fluoreszcein-visszatartás (5. táblázat) jellemzése az alábbiakban bemutatott skálákon, négy ICE-osztály alkalmazásával történik. Fontos megjegyezni, hogy a 3. táblázatban feltüntetett szaruhártya-felduzzadási pontszámok csak akkor érvényesek, ha a vastagság mérése (például Haag-Streit BP900 típusú) 1. számú mélységmérő tartozékkal felszerelt és 9

image

-re (0,095 mm) állított résszélességű réslámpás mikroszkóppal történik. A felhasználóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a réslámpás mikroszkópok különböző résbeállítás esetén eltérő szaruhártya-vastagságot adhatnak.



3. táblázat

A szaruhártya-felduzzadás besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban

Szaruhártya-felduzzadás átlaga (%) (1)

ICE-osztály

0-tól 5-ig

I.

5-nél nagyobb, 12-ig

II.

12-nél nagyobb, 18-ig (a kezelés után több mint 75 perccel)

II.

12-nél nagyobb, 18-ig (a kezelés után legfeljebb 75 perccel)

III.

18-nál nagyobb, 26-ig

III.

26-nál nagyobb, 32-ig (a kezelés után több mint 75 perccel)

III.

26-nál nagyobb, 32-ig (a kezelés után legfeljebb 75 perccel)

IV.

32-nél nagyobb

IV.

(*1)   Bármely időpontban megfigyelt legmagasabb átlag.



4. táblázat

Az opacitás besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban.

Opacitás maximális átlaga (1)

ICE-osztály

0,0–0,5

I.

0,6–1,5

II.

1,6–2,5

III.

2,6–4,0

IV.

(*1)   Bármely időpontban megfigyelt pontszámok legmagasabb átlaga (az 1. táblázatban meghatározott opacitási pontszámok alapján)



5. táblázat

A fluoreszcein-visszatartás átlagának besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban

Fluoreszcein-visszatartás átlaga a kezelés után 30 perccel (1)

ICE-osztály

0,0–0,5

I.

0,6–1,5

II.

1,6–2,5

III.

2,6–3,0

IV.

(*1)   A 2. táblázatban meghatározott pontszámok alapján.

A vizsgálati vegyi anyag in vitro irritációs besorolását a szaruhártya opacitása, felduzzadása és a 6. táblázatban ismertetett fluoreszcein-visszatartása alapján meghatározott kategóriák kombinációjának megfelelő GHS-osztályozás leolvasásával kell értékelni.



6. táblázat

Összesített in vitro besorolás

ENSZ-GHS osztályozás

A három végpont kombinációi

Kategória nélküli

3 × I

2 × I, 1 × II

Előrejelzés nem végezhető

Egyéb kombinációk

1. kategória

3 × IV

2 × IV, 1 × III

2 × IV, 1 × II (1)

2 × IV, 1 × I (1)

30 percnél a szaruhártya opacitása legalább 3 (legalább két szem esetében)

Bármely időpontban a szaruhártya opacitása 4 (legalább két szem esetében)

A felhám súlyos fellazulása (legalább egy szem esetében)

(*1)   Kevésbé valószínű kombinációk.

A vizsgálat elfogadhatósági kritériumai

A vizsgálat akkor minősül elfogadhatónak, ha a párhuzamos negatív vagy vivőanyagos/oldószeres kontrollokat a GHS szerint nem besorolt anyagként, a párhuzamos pozitív kontrollokat pedig a GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként azonosítják.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia, amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:

Vizsgálati vegyi anyag és kontrollként szolgáló vegyi anyagok

 kémiai név (nevek): a Chemical Abstracts Service (CAS) szerinti szerkezeti név, ezt követően az egyéb ismert nevek, ha vannak;

 a CAS szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám), ha ismert;

 a vizsgálati, illetve a kontrollként szolgáló vegyi anyagok tisztasága és összetétele (tömegszázalékban), amennyiben ezek az információk rendelkezésre állnak;

 fizikai-kémiai tulajdonságok: halmazállapot, illékonyság, pH, stabilitás, kémiai osztály, vízoldékonyság, ha a vizsgálat szempontjából relevánsak;

 a vizsgálati, illetve a kontrollként szolgáló vegyi anyagok vizsgálatot megelőző kezelése, ha történt ilyen (például melegítés, porítás);

 stabilitás, ha ismert.

A megbízó és a vizsgálatot végző laboratórium adatai

 a megbízó, a vizsgálatot végző laboratórium és a vizsgálatvezető neve és címe;

 a szemek beszerzési helyének (pl. a begyűjtési létesítményük) megjelölése.

A vizsgálati módszer körülményei

 az alkalmazott vizsgálati rendszer leírása;

 az alkalmazott réslámpás mikroszkóp (például modell) és annak műszerbeállításai;

 a történeti negatív és pozitív kontrollok eredményeire való hivatkozás, valamint adott esetben az elfogadható párhuzamos referencia-kontrolltartományokat igazoló történeti adatok;

 a vizsgálati módszer időbeli integritásának (például pontosságának, megbízhatóságának) biztosítására alkalmazott módszer (például jártassági tesztanyagok rendszeres időközönkénti vizsgálata).

A szemek begyűjtése és preparálása

 a donorállat életkora és tömege, valamint adott esetben egyéb sajátosságai (például ivara, törzse), ha rendelkezésre állnak;

 a szemek tárolásának és szállításának körülményei (például a szemek begyűjtésének dátuma és időpontja, a csirkefejek begyűjtése és az eltávolított szemek szuperfúziós kamrába helyezése között eltelt idő);

 a szemek preparálása és tárgylemezre helyezése, többek között a minőségükre, a szemtartó kamrák hőmérsékletére, valamint a vizsgálathoz felhasznált szemek kiválasztási kritériumaira vonatkozó kijelentések.

Vizsgálati eljárás

 az alkalmazott párhuzamosok száma;

 az alkalmazott negatív és pozitív kontrollok meghatározása (adott esetben az oldószeres és a referenciakontrolloké is);

 a vizsgálati vegyi anyag dózisa, alkalmazása és expozíciós ideje;

 megfigyelési időpontok (a kezelés előtt és után);

 az alkalmazott értékelési és döntési kritériumok leírása;

 az alkalmazott vizsgálat-elfogadhatósági kritériumok leírása;

 a vizsgálati eljárás bármilyen változtatásának leírása.

Eredmények

 az egyes szemek esetében az egyes megfigyelési időpontokban kapott szaruhártya-felduzzadási, -opacitási és fluoreszcein-visszatartási pontszámok táblázatos formába foglalása, feltüntetve az összes vizsgált szem minden egyes megfigyelési időpontjában kapott átlagát is;

 a megfigyelt szaruhártya-felduzzadási, -opacitási és fluoreszcein-visszatartási átlagok maximuma (bármely időpontban) és a kapcsolódó ICE-osztály;

 minden más megfigyelt hatás leírása;

 a származtatott in vitro GHS osztályozás;

 a szemekről készült fényképek (ha vannak).

Az eredmények tárgyalása

Következtetés

SZAKIRODALOM

(1) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Elérhető az alábbi címen: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(2) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Elérhető az alábbi címen: http://ecvam.jrc.it/index.htm

(3) ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Elérhető az alábbi címen: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(4) United Nations (UN) (2011). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, UN New York and Geneva, 2011. Elérhető a következő címen: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.

(5) Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment no. 188 (Part 1 and Part 2), OECD, Paris.

(6) E melléklet B.5., akut toxicitás: szemirritáció/szemkorróziós hatás című fejezete.

(7) Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1-9.

(8) OECD (2011) Guidance Document on “The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants”. Series on Testing and Assessment no. 160, OECD, Paris.

(9) ICCVAM. (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Elérhető a következő címen: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm.

(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11) DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13pp. Elérhető az alábbi címen: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.

(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15) Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20, 78-81.

(16) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Elérhető az alábbi címen: http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf.

(17) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(18) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.




1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálati módszer milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket.

Referencia-vegyianyag : a vizsgálati vegyi anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként használt vegyi anyag. A referencia-vegyianyagnak a következő tulajdonságokkal kell rendelkeznie: i. állandó és megbízható forrás(ok)ból kell származnia; ii. a vizsgálati vegyi anyagok osztályához hasonló szerkezettel és funkcionalitással kell rendelkeznie; iii. ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendelkeznie; iv. rendelkezésre kell állnia az ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és v. a kívánt hatástartományban ismert hatásúnak kell lennie.

Alulról építkező megközelítés : a szemirritáció vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében feltehetőleg besorolást nem igénylő vegyi anyag esetén alkalmazott lépcsőzetes megközelítés, amely a besorolást nem igénylő vegyi anyagok (negatív eredmény) más vegyi anyagokhoz (pozitív eredmény) viszonyított meghatározásával kezdődik.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Szaruhártya : a szemgolyó elülső részén az íriszt és a pupillát fedő és a szem belsejébe a fényt bevezető, áttetsző rész.

Szaruhártya opacitása : a szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követő átlátszatlanság mértékét leíró jellemző. Az opacitás megnövekedése a szaruhártya károsodását jelzi.

Szaruhártya felduzzadása : az ICE vizsgálatban a szaruhártya vizsgálati vegyi anyagnak való expozícióját követő felpuffadása mértékét objektív módon jellemző érték. Százalékos arányként kell kifejezni, és a szaruhártya-vastagság kiindulási (a vizsgálati vegyi anyag felvitele előtti) értékéből és az ICE vizsgálat során vizsgált vizsgálati vegyi anyagnak való expozíciót követően rendszeres időközönként végzett mérésekből kell kiszámítani. A szaruhártya felduzzadásának foka jelzi a szaruhártya károsodásának mértékét.

Szemirritáció : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem elülső felszínén történő alkalmazását követően megjelenő és az alkalmazástól számított 21 napon belül teljes mértékben visszafordítható szemelváltozások. Megfelel a »Reverzibilis szemkárosodás« fogalmának és az »ENSZ-GHS szerinti 2. kategóriának« (4).

Hamis negatív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen negatívnak minősített pozitív vegyi anyagok részaránya. A hamis negatív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Hamis pozitív arány : a vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen pozitívnak minősített negatív vegyi anyagok részaránya. A hamis pozitív arány a vizsgálati módszer teljesítőképességének egyik mutatója.

Fluoreszcein-visszatartás : az ICE vizsgálatban a szaruhártya felhámsejtjeiben a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíciót követően visszatartott fluoreszcein-nátrium mennyiségét szubjektív módon jellemző adat. A fluoreszcein-visszatartás foka utal a szaruhártyafelhám károsodásának mértékére.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni az élő szervezet, rendszer vagy (al)populáció anyagnak való expozíciójakor.

Irreverzibilis szemkárosodás : lásd: »Súlyos szemkárosodás« és »ENSZ-GHS szerinti 1. kategória«.

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba (4).

Negatív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó kezeletlen replikátum. Ezt a mintát a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt kell feldolgozni annak megállapításához, hogy az oldószer kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Nem besorolt : a szemirritáció tekintetében (az ENSZ-GHS szerinti 2. kategóriába tartozóként) nem besorolt vagy a súlyos szemkárosodás tekintetében (az ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriába tartozóként) nem besorolt vegyi anyagok. Megfelelnek az »ENSZ-GHS szerinti nem besorolt« vegyi anyagoknak.

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó vegyi anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a súlyos hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik.

Reverzibilis szemkárosodás : lásd: »Súlyos szemkárosodás« és »ENSZ-GHS szerinti 2. kategória«.

Súlyos szemkárosodás : a vizsgálati vegyi anyagnak a szem külső felületére való juttatását követően olyan szövetkárosodás kialakulása vagy a látás olyan súlyos fizikai romlása, amely a beadást követően 21 napon belül nem fordítható vissza teljes mértékben. Megfelel az »Irreverzibilis szemkárosodás« fogalmának és az »ENSZ-GHS szerinti 1. kategóriának« (4).

Réslámpás mikroszkóp : a szem binokuláris mikroszkóp nagyítása alatti, álló sztereoszkópiás kép alkotásával történő közvetlen vizsgálatára alkalmazott műszer. Az ICE vizsgálatban a műszer a csirkeszem elülső szerkezeteinek, illetve a mélységmérő tartozékkal a szaruhártya vastagságának objektív mérésére használatos.

Oldószeres/vivőanyagos kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét az oldószerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmazó nem kezelt minta, amelyet a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt kell feldolgozni az ugyanazon oldószerben feloldott vagy ugyanazon vivőanyaggal felvitt vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták kiindulási értékeinek megállapítása érdekében. Párhuzamos negatív kontrollal elvégzett vizsgálata esetén ez a minta azt is bizonyítja, hogy az oldószer vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Anyag : természetes állapotban előforduló vagy termelőfolyamatból származó kémiai elemek és azok vegyületei, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők (4).

Felületaktív anyag : olyan anyag (például mosószer), amely csökkentheti a folyadékok felületi feszültségét, és így lehetővé teszi, hogy habozzanak vagy áthatoljanak szilárd anyagokon; nedvesítőszerként is ismert.

Felülről építkező megközelítés : a feltehetőleg súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyag esetén alkalmazott lépcsőzetes megközelítés, amely a súlyos szemkárosodást okozó vegyi anyagok (pozitív eredmény) más vegyi anyagokhoz (negatív eredmény) viszonyított meghatározásával kezdődik.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Többszintű vizsgálati stratégia : olyan lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben áttekintik, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének elemzésével meghatározzák, hogy a következő szintre való továbblépés előtt a veszélyességi osztályozásra vonatkozó döntéshez elegendő információ áll-e rendelkezésre. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megállapítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgálati vegyi anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcsőben egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelmű besorolás meg nem állapítható.

A vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (4).

ENSZ-GHS szerinti 1. kategória : lásd: »Súlyos szemkárosodás« és/vagy »Irreverzibilis szemkárosodás«.

ENSZ-GHS szerinti 2. kategória : lásd: »Szemirritáció« és/vagy »Reverzibilis szemkárosodás«.

ENSZ-GHS szerinti »nem besorolt« : az ENSZ-GHS szerinti 1. vagy 2. (2A. vagy 2B.) kategóriába való besorolás követelményeinek nem megfelelő vegyi anyagok. Megfelelnek a »Nem besorolt« vegyi anyagoknak.

Validált vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amelynek az adott céllal kapcsolatos relevanciája (pontosságát is ideértve) és megbízhatósága validálási vizsgálatok alapján megállapítást nyert. Fontos megjegyezni, hogy a validált vizsgálati módszer a javasolt felhasználási célra nem feltétlenül kínál megfelelő pontosságú és megbízhatóságú elfogadható eljárást.

Az adatok bizonyító erejének mérlegelése : a rendelkezésre álló különféle érvek és ellenérvek mérlegelésének folyamata az adott vegyi anyag veszélyességével kapcsolatban a megfelelő következtetés levonása és alátámasztása céljából.




2. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK AZ ICE VIZSGÁLATI MÓDSZERHEZ

Az e vizsgálati módszerre támaszkodó vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak az 1. táblázatban ajánlott 13 vegyi anyag szemet érintő veszélyességi osztályozásának helyes meghatározásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat. E vegyi anyagok kiválasztása úgy történt, hogy a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálat (405. vizsgálati iránymutatás) eredményei és az ENSZ-GHS osztályozási rendszer (azaz az 1., 2A., 2B. vagy kategória nélküli) alapján a szemet érintő veszélyek hatástartománya szempontjából reprezentatívak legyenek (4) (6). A kiválasztás másik kritériuma az volt, hogy a vegyi anyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok álljanak rendelkezésre, és az ICE vizsgálati módszer alapján kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre. A referenciaadatok az ésszerűsített összefoglaló dokumentumban (5) és az ICE vizsgálati módszer felülvizsgálatára vonatkozó ICCVAM-háttérdokumentumban (9) találhatók.



1. táblázat

Az ICE vizsgálati módszerben való szakmai jártasság ellenőrzéséhez ajánlott vegyi anyagok

Vegyi anyag

CASRN

Kémiai osztály (1)

Halmazállapot

In Vivo besorolás (2)

In Vitro besorolás (3)

Benzalkónium-klorid (5 %)

8001-54-5

Óniumvegyület

Folyadék

1. kategória

1. kategória

Klórhexidin

55-56-1

Amin, amidin

Szilárd

1. kategória

1. kategória

Dibenzoil-L-borkősav

2743-38-6

Karbonsav, észter

Szilárd

1. kategória

1. kategória

Imidazol

288-32-4

Heterociklikus

Szilárd

1. kategória

1. kategória

Triklór-ecetsav (30 %)

76-03-9

Karbonsav

Folyadék

1. kategória

1. kategória

2,6-Diklórbenzoil-klorid

4659-45-4

Savhalogenid

Folyadék

2A. kategória

Előrejelzés nem végezhető (4)

Ammónium-nitrát

6484-52-2

Szervetlen só

Szilárd

2A. kategória (5)

Előrejelzés nem végezhető (4)

Etil-2-metilaceto-acetát

609-14-3

Keton, észter

Folyadék

2B. kategória

Előrejelzés nem végezhető (4)

Dimetil-szulfoxid

67-68-5

Szerves kénvegyület

Folyadék

Kategória nélküli

Kategória nélküli

Glicerin

56-81-5

Alkohol

Folyadék

Kategória nélküli

Kategória nélküli (határeset)

Metil-ciklopentán

96-37-7

Szénhidrogének (ciklikus)

Folyadék

Kategória nélküli

Kategória nélküli

n-Hexán

110-54-3

Szénhidrogén (aciklikus)

Folyadék

Kategória nélküli

Kategória nélküli

Triacetin

102-76-1

Lipid

Folyadék

Nem osztályozott

Kategória nélküli

(1)   Az egyes vegyi anyagok kémiai osztályának meghatározása standard osztályozási rendszer alkalmazásával, a National Library of Medicine »Medical Subject Headings« (MeSH) elnevezésű osztályozási rendszere (elérhető a következő címen: http//www.nlm.nih.gov/mesh) alapján történt.

(2)   A nyulakon végzett in vivo szemvizsgálat (az OECD 405. vizsgálati iránymutatása) eredményei alapján és az ENSZ-GHS (4) (6) felhasználásával.

(3)   Az ICE vizsgálat 6. táblázatban ismertetett eredményei alapján.

(4)   A 6. táblázatban a GHS szerint nem besorolt és a GHS szerinti 1. kategóriába tartozó vegyi anyagokra vonatkozóan ismertetett ICE-pontszámoktól eltérő ICE-pontszámok kombinációja (lásd a 6. táblázatot).

(5)   A 2A. vagy 2B. kategóriába sorolás az ENSZ-GHS rendszerének a két kategória megkülönböztetésére szolgáló kritériuma értelmezésétől függ, azaz három állatból egynél, illetve három állatból kettőnél a hetedik napon jelentkező hatások szükségesek a 2A. kategóriába soroláshoz. Az in vivo vizsgálatot három állaton végezték. Egy állaton a kötőhártya vörösségétől eltekintve minden végpont begyógyul, nulla pontos lesz a hetedik napra vagy korábban. Annak az egy állatnak, amely nem gyógyult meg teljesen a hetedik napra, a kötőhártya vörösségét értékelő pontszáma 1 volt (a hetedik napon), majd a 10. napon teljesen meggyógyult.

Rövidítések: CASRN = a Chemical Abstracts Service (CAS) szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám).




3. függelék

AZ ICE VIZSGÁLATHOZ SZUPERFÚZIÓS KÉSZÜLÉKET ÉS SZEMCSÍPTETŐKET SZEMLÉLTETŐ ÁBRÁK

(A szuperfúziós készülék és a szemcsíptető további általános leírását lásd: Burton et al. (18))

image



Tétel

Megnevezés

Tétel

Megnevezés

1

melegvíz-kifolyónyílás

9

kamra

2

csúszóajtó

10

szemtartó

3

szuperfúziós készülék

11

csirkeszem

4

optikai mérőműszer

12

sóoldat-kifolyónyílás

5

melegvíz-befolyónyílás

13

állítócsavar

6

sóoldat

14

állítható felső kar

7

meleg víz

15

rögzített alsó kar

8

sóoldat-befolyónyílás

 

(14) A B. részben a B.49. fejezet helyébe a következő szöveg lép:

„B.49    In vitro celluláris mikronukleusz-vizsgálat emlősökön

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 487. vizsgálati iránymutatásával (2016). Ez a vizsgálati módszer a genetikai toxikológiai vizsgálati módszerek sorozatának részét képezi. Kidolgozásra került egy, a genetikai toxikológiai vizsgálatokról tömör tájékoztatást nyújtó, a vizsgálati iránymutatások közelmúltbeli változásait áttekintő OECD-dokumentum (1).

Az in vitro mikronukleusz-vizsgálat (a továbbiakban: MNvit vizsgálat) interfázisban lévő sejtek citoplazmájában mikronukleuszok (MN) kimutatására szolgáló genotoxicitási vizsgálat. A mikronukleuszok acentrikus (vagyis centromérával nem rendelkező) kromoszómatöredékekből vagy olyan ép kromoszómákból származhatnak, amelyek a sejtosztódás anafázisa során nem képesek a sejtpólusokra vándorolni. Ezért az MNvit vizsgálat olyan in vitro módszer, amely átfogó alapot szolgáltat a kromoszóma-károsító potenciál in vitro vizsgálatához, ugyanis a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció során vagy után sejtosztódáson átesett sejtekben aneugének és klasztogének egyaránt kimutathatók (2) (3) (további részletekért lásd a 13. pontot). A mikronukleuszok olyan károsodást jeleznek, amely átkerült az utódsejtekbe, míg a metafázisban lévő sejtekben értékelt kromoszóma-rendellenességek nem feltétlenül öröklődnek. A változások egyik esetben sem feltétlenül egyeztethetők össze a sejtek túlélésével.

Ez a vizsgálati módszer egyaránt lehetővé teszi az aktin-polimerizációt gátló citokalazin-B-t (a továbbiakban: citoB) tartalmazó és nélkülöző protokollok használatát. A citoB mitózist megelőző hozzáadása kétmagvú sejteket eredményez, és ennélfogva kizárólag a mitózison átesett sejtek esetében teszi lehetővé a mikronukleuszok azonosítását és analízisét (4) (5). Ez a vizsgálati módszer a citokinezis-gátlást nem alkalmazó protokollok használatát is lehetővé teszi, feltéve, hogy a vizsgált sejtpopuláció mitózisa bizonyítható.

Amellett, hogy MNvit vizsgálat alkalmazható a mikronukleuszokat indukáló vegyi anyagok azonosítására, a kinetokorok immunkémiai jelölése, illetve a centroméra/teloméra-próbák hibridizációja (fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)) arról is további információkat biztosíthat, hogy milyen mechanizmussal történt a kromoszómasérülés és a mikronukleusz-képződés (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Az említett jelölési és a hibridizációs technikákat akkor lehet alkalmazni, ha fokozódik a mikronukleusz-képződés, és a vizsgáló szeretné megállapítani, hogy ez a fokozódás klasztogén és/vagy aneugén hatásra jött-e létre.

Mivel az interfázisos sejtekben lévő mikronukleuszok viszonylag objektív módon vizsgálhatók, a laboratóriumi személyzetnek csak a citoB használata esetén előforduló kétmagvú sejtek számát, valamint a mikronukleált sejtek összes esetbeli előfordulását kell meghatároznia. Ennek következtében a tárgylemezek viszonylag gyorsan értékelhetők, és az elemzés automatizálható. Ez a gyakorlatban kezelésenként több száz helyett több ezer sejt értékelését teszi lehetővé, növelve a vizsgálat erejét. Végül megállapítható, hogy mivel a mikronukleuszok visszamaradó kromoszómákból keletkezhetnek, lehetséges olyan aneuploidiát indukáló anyagok azonosítása, amelyek a kromoszóma-rendellenességek hagyományos vizsgálatával, például e melléklet B.10. fejezete (18) szerint nehezen tanulmányozhatók. Az e vizsgálati módszerben ismertetett MNvit vizsgálat ugyanakkor speciális technikák, például a 4. pontban említett FISH alkalmazása nélkül nem teszi lehetővé a kromoszómaszám változását és/vagy ploidiát okozó és a klasztogén hatású vegyi anyagok megkülönböztetését.

Az MNvit vizsgálat számos különféle sejttípus esetében, valamint citoB jelenlétében és hiányában is megbízhatóan lebonyolítható. Az MNvit vizsgálat hitelességét különböző sejttípusok (sejtvonal-tenyészetek vagy primer sejtkultúrák) alkalmazásával nyert nagy mennyiségű adat támasztja alá (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Ezek közé tartoznak különösen a Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) által koordinált nemzetközi validálási vizsgálatok (19) (20) (21) (22) (23) és a genotoxicitás vizsgálatával foglalkozó nemzetközi műhely (International Workshop on Genotoxicity Testing) jelentései (5) (17). A rendelkezésre álló adatokat az Európai Bizottság Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központja (ECVAM) is újraértékelte egy, az adatok bizonyító erejét mérlegelő retrospektív validálási vizsgálatban, és a vizsgálati módszert az ECVAM tudományos tanácsadó bizottsága (ESAC) tudományosan megalapozott módszerként jóváhagyta (37) (38) (39).

Az emlőssejtek MNvit vizsgálata során emberekből vagy rágcsálókból származó sejtvonal-tenyészetek vagy primer sejtkultúrák alkalmazhatók. Mivel a mikronukleusz-képződés háttérgyakorisága befolyásolja a vizsgálat érzékenységét, ezért stabil és meghatározott mikronukleusz-képződési háttérgyakorisággal rendelkező sejttípusok alkalmazása javasolt. A felhasznált sejteket a tenyészetben való megfelelő növekedési képesség, a kariotípusuk stabilitása (többek között a kromoszómaszám) és a mikronukleuszok spontán gyakorisága alapján kell kiválasztani (40). A rendelkezésre álló adatok jelenleg nem teszik lehetővé határozott ajánlások megfogalmazását, azonban arra utalnak, hogy a kémiai veszélyek értékelése során fontos figyelembe venni a vizsgálat céljára kiválasztott sejtek p53 státuszát, genetikai (kariotípus-) stabilitását, DNS-reparációs képességét és eredetét (rágcsáló-, illetve emberi sejtek). E vizsgálati módszer alkalmazóinak tehát érdemes figyelembe venniük a sejtek szóban forgó és egyéb tulajdonságainak a sejtvonalak teljesítményére kifejtett hatását a mikronukleuszok indukálásának kimutatása során, mivel a tudomány fejlődik ezen a területen.

A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

Az in vitro végrehajtott vizsgálatok rendszerint szükségessé teszik a metabolikus aktiválás valamilyen exogén forrásának használatát, kivéve, ha a sejtek metabolizálják a vizsgálati vegyi anyagokat. Az exogén metabolikus aktivációs rendszer nem utánozza teljesen az in vivo körülményeket. Ügyelni kell arra, hogy ne álljanak elő olyan körülmények, amelyek a vizsgálati vegyi anyagok genotoxicitását nem tükröző, hamis pozitív eredményekhez vezethetnek. Ilyen körülmény többek között a pH (41) (42) (43) vagy az ozmolalitás változása, a sejttenyésztő közeggel fellépő kölcsönhatás (44) (45) vagy a túlzott mértékű citotoxicitás (lásd a 29. pontot).

A mikronukleuszok indukálásának vizsgálatához elengedhetetlen, hogy a kezelt és a nem kezelt tenyészetekben egyaránt végbemenjen mitózis. A mikronukleuszok értékeléséhez az a szakasz szolgáltatja a legtöbb információt, amelyben a sejt a vizsgálati vegyi anyaggal végzett kezelés során vagy után egy mitózison esett át. A gyártott nanoanyagok esetében e vizsgálati módszer egyedi adaptálására van szükség, amelyet azonban ez a vizsgálati módszer nem ismertet.

A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény.

A VIZSGÁLAT ELVE

Az emberből vagy más emlősből származó sejttenyészeteket exogén metabolikus aktiválási forrással vagy anélkül is kezelni kell a vizsgálati vegyi anyaggal, kivéve megfelelő metabolizáló képességű sejtek használata esetén (lásd a 19. pontot).

A vizsgálati vegyi anyaggal történt expozíció során vagy után a sejteket elegendő ideig kell tenyészteni ahhoz, hogy kromoszómakárosodás vagy a sejtciklusra/sejtosztódásra kifejtett egyéb hatás jöhessen létre, és ez az interfázisban lévő sejtekben mikronukleuszok képződéséhez vezessen. Az aneuploidia indukálásához a vizsgálati vegyi anyagnak általában jelen kell lennie a mitózis során. A mikronukleuszok jelenlétét a begyűjtött és megfestett, interfázisban lévő sejtekben vizsgálják. Ideális esetben a mikronukleuszokat csak azokban a sejtekben kell megszámolni, amelyek a vizsgálati vegyi anyaggal történt expozíció során vagy – ha van ilyen – a kezelés utáni időszakban estek át mitózison. A citokinezis-gátlóval kezelt tenyészetekben ez könnyen megvalósítható csupán a kétmagvú sejtek értékelésével. Citokinézis-gátló hiányában fontos annak bizonyítása, hogy a vizsgált sejtek – a sejtpopuláció növekedése alapján – valószínűleg sejtosztódáson estek át a vizsgálati vegyi anyaggal történt expozíció során vagy után. Minden protokoll esetében fontos bizonyítani, hogy a sejtproliferáció a kontroll- és a kezelt tenyészetekben egyaránt végbement, és a mikronukleuszok értékeléséhez használt összes tenyészetben meg kell állapítani a vizsgálati vegyi anyag által kiváltott citotoxicitás vagy citosztázis mértékét.

A MÓDSZER LEÍRÁSA

Sejtek

Emberek vagy más emlősök perifériás véréből származó tenyésztett primer limfociták (7) (20) (46) (47) és bizonyos rágcsáló sejtvonalak, például a CHO, V79, CHL/IU és L5178Y sejtek vagy humán sejtvonalak, például TK6 sejtvonal alkalmazhatók (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (lásd a 6. pontot). Eddig egyéb sejtvonalak, például HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), HepG2 sejtek (52) (53), A549 és szíriai hörcsögembrióból származó primer sejtek (54) voltak használatosak mikronukleusz-vizsgálathoz, ezúttal azonban nem volt teljes a validálásuk. E sejtvonalak és sejttípusok alkalmazását a vizsgálat során mutatott teljesítményük alapján, az »Elfogadhatósági kritériumok« című részben leírtak szerint kell indokolni. Beszámolók szerint a citoB potenciálisan befolyásolhatja az L5178Y sejtek növekedését, ezért nem ajánlott ezzel a sejtvonallal (23). Primer sejtek használatakor állatjóléti okok miatt meg kell fontolni emberi eredetű sejtek használatát – amennyiben megvalósítható –, és azokból a humán etikai elveknek és a vonatkozó szabályozásoknak megfelelően kell mintát venni.

Az emberi perifériás limfocitákat olyan fiatal (kb. 18–35 éves), nem dohányzó egyénektől kell venni, akik ismert betegséggel nem rendelkeznek, illetve a közelmúltban genotoxikus szereknek (például vegyi anyagoknak, ionizáló sugárzásnak) nem voltak kitéve olyan mértékben, amely fokozná a mikronukleált sejtek háttérbeli előfordulását. Ez biztosítaná, hogy a mikronukleált sejtek háttérbeli előfordulása alacsony és egységes legyen. A mikronukleált sejtek alapesetbeli előfordulása az életkor előrehaladtával nő, és ez a tendencia a nőknél jellemzőbb, mint a férfiaknál (55). Amennyiben több donortól származó sejteket együtt használnak fel, akkor a donorok számát meg kell adni. Igazolni kell, hogy a sejtek a vizsgálati vegyi anyaggal való kezelés kezdetétől a sejtekből történő mintavételig osztódtak. A sejttenyészeteket exponenciális növekedési fázisban (sejtvonalakban) kell tartani vagy osztódásra kell késztetni (primer limfocita-tenyészetek) a sejteknek a sejtciklus különböző szakaszaiban történő expozíciója érdekében, mivel a sejtfázisoknak a vizsgálati vegyi anyagokra való érzékenysége nem feltétlenül lehet ismert. Azok a primer sejtek, amelyeket az osztódás érdekében mitogén szerekkel kell stimulálni, a vizsgálati vegyi anyagnak való expozíció során általában már nem szinkronizáltak (például az emberi limfociták 48 órás mitogén stimulációt követően). Szinkronizált sejtek használata nem javasolt a vizsgálati vegyi anyaggal való kezelés során, indokolt esetben azonban elfogadható.

Tenyészközegek és tenyésztési körülmények

A tenyészetek fenntartására megfelelő tenyészközeget és inkubációs feltételeket (tenyésztőedények, megfelelő esetben 5 %-os CO2-koncentrációjú párás légkör, 37 °C-os hőmérséklet) kell alkalmazni. A sejtvonalakat rutinszerűen ellenőrizni kell a modális kromoszómaszám stabilitása és a mikoplazma-fertőzés hiánya szempontjából, és a sejtek nem használhatók fel, ha fertőzöttek, vagy ha a modális kromoszómaszám megváltozott. A vizsgálólaboratóriumban használt sejtvonalak, illetve primer sejtkultúrák rendes sejtciklusidejét meg kell állapítani, és annak összhangban kell lennie a közzétett sejtjellemzőkkel.

A tenyészetek előkészítése

Sejtvonalak: a sejteket törzstenyészetekből fel kell szaporítani, majd tenyészközegbe kell leoltani olyan sejtszámmal, hogy a sejtek a szuszpenziókban vagy a monolayer tenyészetekben továbbra is exponenciálisan növekedjenek a begyűjtés idejéig (a monolayer tenyészetekben növő sejtek esetében például kerülendő a konfluencia).

Limfociták: alvadásgátlóval (például heparinnal) kezelt teljes vért vagy szeparált limfocitákat kell tenyészteni (például emberi limfociták esetében 48 óráig) mitogén szer [emberi limfociták esetében például phytohaemagglutinin (PHA)] jelenlétében, annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyagnak és a citoB-nek való expozíció előtt sejtosztódást váltsanak ki.

Metabolikus aktiválás

Megfelelő endogén metabolikus kapacitással nem rendelkező sejtek használata esetén exogén metabolizáló rendszereket kell alkalmazni. Amennyiben másik rendszer nem indokolt, az alapértelmezetten ajánlott, legáltalánosabban használt rendszer a rágcsálók (általában patkányok) enziminducerrel (ilyen például az Aroclor 1254 (56) (57) vagy fenobarbitál és b-naftoflavon kombinációjával (58) (59) (60)) kezelt májából preparált, kofaktor-kiegészítésű posztmitokondriális frakció (S9). Ez utóbbi kombináció nem ütközik a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyező anyagokról szóló stockholmi egyezménnyel (61), és kiderült róla, hogy olyan hatékony, mint az Aroclor 1254 a vegyes funkciójú oxidáz indukálásához (58) (59) (60). Az S9 frakció jellemzően 1–2 térfogatszázalék koncentrációban használatos, de a végső vizsgálati közegben 10 térfogatszázalékra növelhető. A mitotikus indexet csökkentő termékek, különösen a kalcium-komplexáló termékek (62) használata kerülendő a kezelés során. Az alkalmazott exogén metabolikus aktivációs rendszer vagy metabolikus induktor típusának és koncentrációjának megválasztását befolyásolhatja a vizsgált anyagok osztálya.

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése

A szilárd halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagokat a sejtek kezelése előtt megfelelő oldószerben elő kell készíteni, és szükség esetén hígítani kell. A folyékony halmazállapotú vizsgálati vegyi anyagok közvetlenül hozzáadhatók a vizsgálati rendszerhez és/vagy hígíthatók a vizsgálati rendszer kezelése előtt. A gáz halmazállapotú vagy illékony vizsgálati vegyi anyagokat a standard protokollok megfelelő módosításával, például légmentesen lezárt edényekben történő kezeléssel kell vizsgálni (63) (64) (65). A vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó készítményeket pontosan a kezelés előtt kell előállítani, kivéve, ha a stabilitásra vonatkozó adatok a tárolás elfogadhatóságát bizonyítják.

Vizsgálati körülmények

Oldószerek

Az oldószert oly módon kell kiválasztani, hogy optimalizálja a vegyi anyag oldhatóságát, ugyanakkor ne befolyásolja hátrányosan a vizsgálat lebonyolítását, vagyis ne változtassa meg a sejtek növekedését, ne érintse a vizsgálati vegyi anyag integritását, ne lépjen reakcióba a tenyésztőedényekkel, és ne károsítsa a metabolikus aktivációs rendszert. Amennyiben lehetséges, először valamilyen vizes oldószer (vagy tenyészközeg) használatát érdemes megfontolni. Jól bevált oldószer a víz vagy a dimetil-szulfoxid (DMSO). A szerves oldószerek mennyisége nem haladhatja meg az 1 térfogatszázalékot. CitoB DMSO-ban történő feloldása esetén a vizsgálati vegyi anyaghoz és a citoB-hez felhasznált szerves oldószer teljes mennyisége sem haladhatja meg az 1 térfogatszázalékot; annak biztosítása érdekében, hogy a szerves oldószer százalékos aránya ne fejtsen ki káros hatást, nem kezelt kontrollokat kell használni. A végleges kezelési közegben a vizes oldószerek (sós lé vagy víz) nem haladhatják meg a 10 térfogatszázalékot. Ha jól bevált szerves oldószerektől eltérő oldószereket (például etanolt vagy acetont) használnak, a használatukat a vizsgálati vegyi anyaggal és a vizsgálati rendszerrel való összeegyeztethetőségükre utaló, valamint azt jelző adatokkal kell alátámasztani, hogy a használt koncentrációnál nem genotoxikusak. Alátámasztó adatok hiányában fontos nem kezelt kontrollok (lásd az 1. függeléket), valamint oldószeres kontrollok alkalmazása annak bizonyítására, hogy a kiválasztott oldószer nem vált ki ártalmas vagy kromoszómakárosító hatást (például aneuploidiát vagy klasztogén hatást).

CitoB alkalmazása citokinezis-gátlóként

Az MNvit vizsgálat teljesítményét illetően az egyik legfőbb szempont annak biztosítása, hogy az értékelt sejtek a kezelés során vagy – ha volt ilyen – a kezelés utáni inkubációs periódusban mitózison essenek át. A mikronukleuszok értékelése ezért azokra a sejtekre korlátozandó, amelyek a kezelés során vagy után átestek mitózison. A citokinezis gátlására a legelterjedtebben alkalmazott szer a citoB, mivel gátolja az aktin kapcsolódását, ezzel megakadályozza az utódsejtek mitózis utáni szétválását, ami kétmagvú sejtek képződéséhez vezet (6) (66) (67). A vizsgálati vegyi anyag által a sejtproliferáció kinetikájára gyakorolt hatás citoB használata esetén párhuzamosan mérhető. Humán limfociták alkalmazása esetén a citoB citokinezis-gátlóként alkalmazandó, mivel a sejtciklusidők változóak lesznek a donorok körében, és mivel nem az összes limfocita fog reagálni a PHA-stimulációra. A citoB nem kötelező más sejttípusok esetén, ha megállapítható, hogy sejtosztódáson mentek át, ahogyan a 27. pontban szerepel. A citoB továbbá nem általánosan használatos, ha a mintákat áramlási citometriás módszerekkel értékelik a mikronukleuszok szempontjából.

A citoB megfelelő koncentrációját az egyes sejttípusokra vonatkozóan a laboratóriumnak kell meghatároznia annak érdekében, hogy az oldószeres kontrolltenyészetekben optimális gyakorisággal alakuljanak ki kétmagvú sejtek, továbbá be kell igazolódnia annak, hogy az értékeléshez megfelelő számú kétmagvú sejtet hoz létre. A citoB megfelelő koncentrációja általában 3–6 μg/ml (19).

A sejtproliferáció és a citotoxicitás mérése, valamint a kezelési koncentrációk kiválasztása

A vizsgálati vegyi anyag legmagasabb koncentrációjának meghatározása során kerülendő az olyan koncentráció, amely hamis pozitív válaszreakciókat válthat ki, ilyen a túlzott citotoxicitást okozó koncentráció (lásd a 29. pontot), a tenyészközegben való kicsapódást okozó koncentráció (lásd a 30. pontot), illetve a pH vagy az ozmolalitás jelentős változását okozó koncentráció (lásd az 9. pontot). Ha a vizsgálati vegyi anyag a hozzáadásakor jelentős változást okoz a tenyészközeg pH-jában, a pH a kezelésre szolgáló végleges tenyészközeg pufferelésével kiigazítható, hogy elkerülhetők legyenek a hamis pozitív eredmények és megfelelő tenyésztési feltételeket lehessen fenntartani.

Mérni kell a sejtproliferációt annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálat során elegendő kezelt sejt átessen a mitózison, és hogy a kezelésekre megfelelő szintű citotoxicitás mellett kerüljön sor (lásd a 29. pontot). A citotoxicitást a fő kísérletben metabolikus aktiválással és anélkül is kell meghatározni a sejtelhalás és a sejtnövekedés megfelelő mutatóinak használatával (lásd a 26. és a 27. pontot). Bár egy kiindulási előzetes vizsgálat során hasznos lehet a citotoxicitás értékelése a fő kísérletben alkalmazandó koncentrációk jobb meghatározásához, a kiindulási vizsgálat nem kötelező. Végrehajtása esetén nem helyettesítheti a citotoxicitás fő kísérlet során történő mérését.

A tenyészetek citoB-vel történő kezelése, valamint a tenyészetben található egymagvú, kétmagvú és többmagvú sejtek relatív gyakoriságainak mérése pontos módszer a kezelés sejtproliferációt előidéző és citotoxikus vagy citosztatikus hatásának mennyiségi meghatározására (6), valamint biztosítja, hogy csak a kezelés során vagy után osztódott sejtek kerüljenek értékelésre. A tenyészetenként legalább 500 sejtből számított citokinezis-gátlási proliferációs index (CBPI) (6) (27) (68) vagy replikációs index (RI) (a képletekért lásd a 2. függeléket) ajánlott egy-egy kezelés citotoxikus vagy citosztatikus aktivitásának a kezelt és a kontrolltenyészetekben kapott értékek összevetésével történő becsléséhez. A citotoxicitás egyéb mutatóinak (például a sejtek egybefüggősége, apoptózis, nekrózis, metafázis-számolás, sejtciklus) értékelése hasznos információval szolgálhat, de azokat a CBPI vagy az RI helyett kell használni.

A citoB nélkül végzett vizsgálatokban igazolni kell, hogy a tenyészeten belüli sejtek osztódtak, annak érdekében, hogy a vizsgálati vegyi anyaggal végzett kezelés alatt vagy az után az értékelt sejtek jelentős hányada átessen az osztódáson, ellenkező esetben hamis negatív válaszreakciók alakulhatnak ki. Egy-egy kezelés citotoxikus és citosztatikus aktivitásának becslésére (17) (68) (69) (70) (71) a relatív populációduplázódásnak (RPD) vagy a sejtszám relatív növekedésének (RICC) a mérése ajánlott (a képletekért lásd a 2. függeléket). Meghosszabbított mintavételi idők esetén (például 1,5–2 normál sejtciklusideig tartó kezelés és további 1,5–2 normál sejtciklusidő eltelte utáni begyűjtés, ami összesen a 38. és 39. pontban foglalt 3–4 normál sejtciklusidőnél hosszabb mintavételi időket eredményez) az RPD alulbecsülheti a citotoxicitást (71). Ilyen körülmények között az RICC jobb mértékegység lehet, illetve a citotoxicitás 1,5–2 normál sejtciklusidő utáni értékelése hasznos becslés lehet. A citotoxicitás, illetve a citosztázis egyéb markereinek (például a sejtek egybefüggősége, apoptózis, nekrózis, metafázis-számolás, proliferációs index (PI), sejtciklus, nukleoplazmikus hidak vagy sejtmag-kidudorodások) értékelése további hasznos információkkal szolgálhat, azonban nem alkalmazható sem az RPD, sem az RICC helyett.

Az elfogadhatósági kritériumokat (megfelelő citotoxicitás, sejtszám stb.) teljesítő, (az oldószeres és a pozitív kontrollokat nem tartalmazó) legalább három vizsgálati koncentrációt kell értékelni. A sejtek típusától (limfocita-sejtvonalak vagy primer limfocita-tenyészetek) függetlenül, minden egyes vizsgált koncentrációnál párhuzamos vagy szimpla kezelt tenyészetek használhatók. Bár két párhuzamos tenyészet használata ajánlatos, a szimpla tenyészetek is elfogadhatóak, amennyiben a szimpla vagy a párhuzamos tenyészetek esetében megegyezik az összességében értékelt sejtek száma. A szimpla tenyészetek használata különösen releváns, ha több mint három koncentráció értékelésére kerül sor (lásd a 44–45. pontot). A független párhuzamos tenyészetekből adott koncentráció mellett kapott eredmények összevonhatók az adatelemzéshez. Az alacsony citotoxicitást vagy a citotoxicitás hiányát mutató vizsgálati vegyi anyagok esetében rendszerint megközelítőleg kétszeres-háromszoros koncentrációs intervallumok helyénvalóak. Citotoxicitás fellépése esetén a vizsgálati koncentrációknak le kell fedniük a 29. pontban ismertetett, citotoxicitást okozó koncentrációtól azokig a koncentrációkig terjedő tartományt, ahol mérsékelt vagy alacsony a citotoxicitás, illetve nem jelentkezik citotoxicitás. Számos vizsgálati vegyi anyagnak meredek a koncentráció-válasz görbéje, és annak érdekében, hogy alacsony és mérsékelt citotoxicitásnál adatokat lehessen nyerni, vagy részletesen meg lehessen vizsgálni a dózis-válasz összefüggést, egymáshoz közelebbi koncentrációkat és/vagy háromnál több koncentrációt (szimpla tenyészeteket vagy párhuzamos tenyészeteket) kell használni, különösen olyan helyzetekben, ahol megismételt kísérlet szükséges (lásd a 60. pontot).

Ha a legmagasabb koncentráció a citotoxicitáson alapul, a legmagasabb koncentrációval 55 ± 5 %-os citotoxicitást kell megcélozni a citotoxicitás ajánlott paramétereinek alkalmazásával (azaz citoB használatának hiányában a sejtvonalak RICC és RPD mutatójának, illetve citoB használata esetén a CBPI vagy RI mutatónak a párhuzamos negatív kontroll 45± 5 %-ára csökkentésével) (72). Az 55 ± 5 %-os citotoxicitási tartománynak csak a magasabb részén megtalálható pozitív eredmények értelmezése során körültekintően kell eljárni (71).

A legalacsonyabb oldhatatlan koncentrációnál alacsonyabb koncentrációk mellett nem citotoxikus, kevéssé oldható vegyi anyagok esetében a legmagasabb analizált koncentrációnak a vizsgálati vegyi anyaggal történő kezelés végén szemmel vagy inverz mikroszkóp segítségével látható zavarosságot vagy kicsapódást kell okoznia. Még abban az esetben is, ha citotoxicitás a legalacsonyabb oldhatatlan koncentráció felett jön létre, ajánlatos egyetlen egy, zavarosságot vagy látható kicsapódást okozó koncentrációt vizsgálni, mivel a kicsapódás álhatásokat eredményezhet. A kicsapódást okozó koncentrációnál ügyelni kell annak biztosítására, hogy a kicsapódás ne zavarja a vizsgálat lebonyolítását (például a megfestést vagy az értékelést). Hasznos lehet a tenyészközegben való oldhatóság meghatározása a kísérlet előtt.

Ha nem figyelhető meg kicsapódás vagy korlátozó citotoxicitás, a legmagasabb vizsgálati koncentrációnak 10 mM-nek, 2 mg/ml-nek vagy 2 μ/ml-nek kell megfelelnie, melyek közül a legalacsonyabb a mérvadó (73) (74) (75). Ha a vizsgálati vegyi anyag nem meghatározott összetételű, például ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyag (UVCB) (76), környezeti extraktum stb., előfordulhat, hogy kellő citotoxicitás hiányában a legmagasabb koncentrációnak magasabbnak (például 5 mg/ml-nek) kell lennie ahhoz, hogy növekedjen az egyes összetevők koncentrációja. Megjegyzendő azonban, hogy ezek a követelmények eltérőek lehetnek a humán gyógyszerek esetében (93).

Kontrollok

Minden begyűjtés alkalmával párhuzamos negatív kontrollokat kell használni (lásd a 21. pontot), amelyeknél csak oldószert alkalmaznak a kezelt közegben, és a feldolgozásuk ugyanolyan módon történik, mint a kezelt tenyészeteké.

Párhuzamos pozitív kontrollok szükségesek annak igazolására, hogy a laboratórium képes az alkalmazott vizsgálati protokoll feltételei mellett klasztogének és aneugének azonosítására, valamint adott esetben az exogén metabolikus aktivációs rendszer eredményességének igazolása érdekében. Pozitív kontrollokra vonatkozó példák az alábbi 1. táblázatban találhatók. Indokolt esetben pozitív kontrollként alternatív vegyi anyagok használhatók.

Jelenleg nem ismert olyan aneugén hatású anyag, amely genotoxikus aktivitásához metabolikus aktiválást igényelne (17). Mivel az emlőssejtek genetikai toxicitás szempontjából végzett in vitro vizsgálatai a metabolikus aktiválással és anélkül, ugyanannyi ideig egyidejűleg végzett rövid távú kezelések esetében kellően szabványosítottak, a pozitív kontrollok használata a metabolikus aktiválást igénylő klasztogénekre korlátozódhat. Ebben az esetben egyetlen klasztogén pozitív kontroll válaszreakciója a metabolikus aktivációs rendszer aktivitását és a vizsgálati rendszer reagálóképességét is bizonyítani fogja. A(z S9 nélküli) hosszú távú kezelésnek azonban kell, hogy legyen saját pozitív kontrollja, mivel a kezelés időtartama eltér a metabolikus aktiválás alkalmazása mellett végzett vizsgálatétól. Ha metabolikus aktiválással és anélkül végzett rövid távú kezeléshez klasztogént választanak ki egyetlen pozitív kontrollként, a metabolikus aktiválás nélküli hosszú távú kezeléshez aneugént kell kiválasztani. Az S9 preparátumot nem igénylő, metabolikusan megfelelő sejtekben a klasztogén és az aneugén hatás vizsgálatához egyaránt szükséges pozitív kontrollt alkalmazni.

Mindegyik pozitív kontrollt egy vagy több olyan koncentrációban kell alkalmazni, amely a háttérértékekben reprodukálható és kimutatható növekedést okoz, hogy bizonyítani lehessen a vizsgálati rendszer érzékenységét (azaz a hatások egyértelműek, de értékelést végző személy nem tudja beazonosítani azonnal a kódolt tárgylemezt), és a választ nem veszélyeztetheti a vizsgálati módszerben meghatározott határértékeket meghaladó citotoxicitás.



1. táblázat

A laboratóriumok jártasságának értékeléséhez és a pozitív kontrollok kiválasztásához ajánlott referenciaanyagok

Kategória

Vegyi anyag

CASRN

1.  Metabolikus aktiválás nélkül is aktív klasztogének

 

Metil-metánszulfonát

66-27-3

 

Mitomicin-C

50-07-7

 

4-Nitro-kinolin-N-oxid

56-57-5

 

Citozin-arabinozid

147-94-4

2.  Metabolikus aktiválást igénylő klasztogének

 

Benzo(a)pirén

50-32-8

 

Ciklofoszfamid

50-18-0

3.  Aneugén anyagok

 

Kolchicin

64-86-8

 

Vinblasztin

143-67-9

ELJÁRÁS

A kezelés ütemterve

A sejtciklus meghatározott fázisában ható aneugén, illetve klasztogén anyagok azonosítási valószínűségének maximalizálása érdekében fontos, hogy a sejtek összes különböző ciklusát képviselő elegendő számú sejt kezelésére kerüljön sor a vizsgálati vegyi anyaggal. Minden kezelésnek a sejtek exponenciális növekedése alatt kell kezdődnie és befejeződnie, és a sejteknek a mintavétel időpontjáig tovább kell növekedniük. A kezelés ütemterve a sejtvonalak és primer sejtkultúrák esetében ezért valamelyest eltérhet a limfocitákétól, amelyek mitogén stimulációt igényelnek ahhoz, hogy megkezdődjön a sejtciklusuk (17). Limfociták esetében a leghatékonyabb módszer, ha a vizsgálati vegyi anyaggal végzett kezelés a PHA-stimuláció után 44–48 órával kezdődik, amikorra a sejtek aszinkron módon fognak osztódni (6).

A közzétett adatokból (19) az derül ki, hogy a legtöbb aneugén és klasztogén anyag kimutatása rövid, 3–6 órás kezelési időszak alkalmazásával – S9 jelenlétében vagy hiányában – történik, amelyet a vizsgálati vegyi anyag eltávolítása, majd – a kezelés megkezdése után kb. 1,5–2,0 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban történő –mintavétel követ (7).

A negatív eredmény megállapításához szükséges alapos értékeléshez ugyanakkor mindhárom alábbi kísérleti körülményt meg kell teremteni, metabolikus aktiválással és anélkül végzett rövid távú kezeléssel, valamint metabolikus aktiválás nélküli hosszú távú kezeléssel (lásd az 56., 57. és 58. pontot):

 a sejteket metabolikus aktiválás nélkül 3–6 órára ki kell tenni a vizsgálati vegyi anyag hatásának, és azokból a kezelés megkezdése után kb. 1,5–2,0 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban mintát kell venni (19),

 a sejteket metabolikus aktiválással 3–6 órára ki kell tenni a vizsgálati vegyi anyag hatásának, és azokból a kezelés megkezdése után kb. 1,5–2,0 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban mintát kell venni (19),

 a sejteket a kezelés megkezdése után kb. 1,5–2,0 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban történő mintavételig metabolikus aktiválás nélkül folyamatosan ki kell tenni a vizsgálati vegyi anyagnak.

Abban az esetben, ha a fenti kísérleti körülmények pozitív válaszreakciót eredményeznek, a többi kezelési eljárás vizsgálata nem feltétlenül szükséges.

Amennyiben ismert vagy feltehető, hogy a vizsgálati vegyi anyag befolyásolja a sejtciklusidőt (például nukleozidanalógok vizsgálatakor), különösen a p53 státusz meghatározására alkalmas sejtek esetében (35) (36) (77), a mintavételi vagy visszanyerési idők legfeljebb további 1,5–2,0 normál sejtciklusidővel (azaz a rövid távú és a hosszú távú kezelés megkezdése után összesen 3,0–4,0 sejtciklusidőre) meghosszabbíthatók. Ezeknek a választási lehetőségeknek azokban a helyzetekben van jelentőségük, amikor problémát jelenthet a vizsgálati vegyi anyag és a citoB lehetséges kölcsönhatása. Meghosszabbított mintavételi idők (azaz összesen 3,0–4,0 sejtciklusidőnyi tenyésztési idő) alkalmazásakor ügyelni kell annak biztosítására, hogy a sejtek még mindig aktívan osztódjanak. Limfociták esetében például az exponenciális növekedés a stimuláció utáni 96 óra elteltével csökkenhet és a sejtek monolayer tenyészetei konfluenssé válhatnak.

A sejtek kezelésének javasolt ütemtervét az 2. táblázat foglalja össze. Ezek az általános kezelési ütemtervek a vizsgálati vegyi anyag stabilitásától és reaktivitásától, illetve az alkalmazott sejtek konkrét szaporodási jellemzőitől függően módosíthatóak (és indokolandóak).



2. táblázat

A sejtek kezelésének és begyűjtésének ideje az MNvit vizsgálat esetében

CitoB-vel kezelt limfociták, primer sejtek és sejtvonalak

+ S9

Rövid kezelés

A sejteket 3–6 órán át S9 jelenlétében kell kezelni;

el kell távolítani az S9-et és a kezelési közeget;

friss közeget és citoB-t kell hozzáadni;

a kezelés megkezdése után 1,5–2,0 normál sejtciklusidő elteltével kell begyűjteni.

– S9

Rövid kezelés

A sejteket 3–6 órán át kell kezelni;

el kell távolítani a kezelési közeget;

friss közeget és citoB-t kell hozzáadni;

a kezelés megkezdése után 1,5–2,0 normál sejtciklusidő elteltével kell begyűjteni.

– S9

Meghosszabbított kezelés

A sejteket 1,5–2,0 normál sejtciklusidőnek megfelelő ideig citoB jelenlétében kell kezelni;

a kezelési időszak végén be kell gyűjteni a sejteket.

CitoB nélkül kezelt sejtvonalak

(Megegyezik a fentebb ismertetett kezelési ütemtervvel, azzal a kivétellel, hogy citoB hozzáadására nem kerül sor)

A monolayer tenyészetekben a 3–6 órás kezelés végén mitotikus sejtek (ismertetőjegyük, hogy alakjuk kerek, és leválnak a felszínről) lehetnek jelen. Mivel ezek a mitotikus sejtek könnyen leválnak, a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó közeg eltávolításakor elveszhetnek. Ha bizonyíték van arra, hogy a mitotikus sejtek száma a kontrollokéhoz képest jelentősen megnő, valószínűsíthető mitotikus leállást jelezve, a sejteket centrifugálással be kell gyűjteni és vissza kell tenni a tenyészetbe, annak elkerülése érdekében, hogy a begyűjtéskor elvesszenek a mitózisban lévő sejtek, valamint azok a sejtek, amelyeknél mikronukleuszok/kromoszóma-rendellenesség kockázata áll fenn.

A sejtek begyűjtése és a tárgylemez preparálása

A begyűjtést és a feldolgozást minden tenyészetnél külön kell végezni. A sejtek előkészítéséhez hozzátartozhat a hipotóniás kezelés, ez a lépés azonban nem szükséges, ha a sejtek megfelelő szétterítése egyéb módon is elérhető. A tárgylemez preparálása során különböző technikák alkalmazhatók, amennyiben ezek az értékeléshez jó minőségű sejtpreparátumokat eredményeznek. Az érintetlen sejtmembránú és citoplazmájú sejteket meg kell tartani, hogy ki lehessen mutatni a mikronukleuszokat és (a citokinezis-gátlási módszer esetén) megbízhatóan azonosítani lehessen a kétmagvú sejteket.

A tárgylemezek különböző módszerekkel festhetők meg, például Giemsa vagy fluoreszkáló DNS-specifikus festékekkel. A megfelelő fluoreszcens festékek (például akridinnarancs (78) vagy Hoechst 33258 plusz pironin-Y (79)) használata kiküszöbölhet néhányat a DNS-re nem jellemző festőanyag használatával mesterségesen előidézett változás közül. A mikronukleuszok tartalmának azonosítására kinetokor elleni antitestek, FISH módszerrel végzett pancentromérás DNS-próbák vagy pancentromer-specifikus primerekkel végzett in situ jelölés megfelelő DNS-kontrasztfestéssel alkalmazható (az egész kromoszómák megfestődnek, míg az acentrikus kromoszómatöredékek nem), amennyiben a mikronukleuszok keletkezésének mechanizmusára vonatkozó információkra van szükség (16)(17). A klasztogén és aneugén hatású anyagok megkülönböztetésére egyéb, korábban hatékonynak bizonyult és validált módszerek is alkalmazhatók. Egyes sejtvonalak esetében például a szub-2N sejtmagok képelemzéshez, lézerszkenneléses citometriához vagy áramlási citometriához hasonló eljárásokkal hipodiploid eseményekként történő mérése szintén szolgáltathat hasznos információt (80) (81) (82). A sejtmagok morfológiai megfigyelései ugyancsak utalhatnak lehetséges aneuploidiára. Ezenfelül a metafázisban lévő sejtek kromoszóma-rendellenességeinek lehetőleg ugyanazon sejttípuson és hasonló érzékenységű protokollal történő vizsgálata is hasznos lehet annak meghatározásához, hogy a mikronukleuszok kromoszómatörésnek tudhatók-e be (annak ismeretében, hogy a kromoszómaveszteség kimutatására nem kerülne sor a kromoszóma-rendellenességek vizsgálata során).

Elemzés

A mikronukleuszok gyakoriságának vizsgálatára irányuló mikroszkópos elemzés előtt minden tárgylemezt, az oldószeres és a nem kezelt (ha használnak ilyeneket), valamint a pozitív kontrollokét is ideértve, önálló kódolással kell ellátni. Megfelelő eljárásokat kell alkalmazni az automatizált értékelési rendszer, például áramlási citometria, lézerszkenneléses citometria vagy képelemzés alkalmazásakor esetlegesen felmerülő elfogultság vagy részrehajlás szabályozása érdekében. Függetlenül attól, hogy milyen automatizált platform használatos a mikronukleuszok számolására, a CBPI, az RI, az RPD, illetve az RICC mutatót egyidejűleg vizsgálni kell.

A citoB-vel kezelt tenyészetekben a mikronukleuszok gyakoriságát koncentrációnként és kontrollonként legalább 2 000 kétmagvú sejtben elemezni kell (83), amelyeknek párhuzamosok alkalmazása esetén egyenlően kell megoszlaniuk a párhuzamosok között. Dózisonként egy tenyészet esetén (lásd a 28. pontot) tenyészetenként legalább 2 000  kétmagvú sejtet (83) kell értékelni ebben az egy tenyészetben. Ha (párhuzamos tenyészetek esetén) az egyes koncentrációkban tenyészetenként 1 000 -nél vagy (egy tenyészet alkalmazása esetén) 2 000 -nél jelentősen kevesebb kétmagvú sejt áll rendelkezésre értékelés céljára, és nem mutatható ki a mikronukleuszok számának jelentős növekedése, akkor vizsgálatot adott esetben több sejt vagy kevésbé citotoxikus koncentrációk alkalmazásával meg kell ismételni. Ügyelni kell arra, hogy ne kerüljenek értékelésre olyan kétmagvú sejtek, amelyek szabálytalan alakúak vagy amelyeknél a két mag mérete jelentősen eltér. Ezen túlmenően a kétmagvú sejtek nem tévesztendők össze a rosszul szétterített többmagvú sejtekkel. A kettőnél több fő magot tartalmazó sejteknél nem szabad vizsgálni a mikronukleuszokat, mivel ezekben a sejtekben magasabb lehet a mikronukleusz-képződés háttérgyakorisága (84). Egymagvú sejtek értékelése elfogadható, amennyiben a vizsgálati vegyi anyagról bebizonyosodott, hogy interferál a citoB aktivitásával. Ilyen esetekben a citoB nélkül megismételt vizsgálat hasznos lehet. A kétmagvú sejtek mellett az egymagvú sejtek értékelése hasznos információval szolgálhat (85) (86), de nem kötelező.

A citoB-vel végzett kezelés nélkül vizsgált sejtvonalakban vizsgálati koncentrációnként és kontrollonként legalább 2 000 sejtben (83) kell értékelni a mikronukleuszokat, amely sejteknek párhuzamosok alkalmazása esetén egyenlően kell megoszlaniuk a párhuzamosok között. Koncentrációnként egy tenyészet alkalmazása esetén (lásd a 28. pontot) legalább 2 000 sejtet kell értékelni ebben az egy tenyészetben. Ha (párhuzamos tenyészetek esetén) az egyes koncentrációkban tenyészetenként 1 000 -nél vagy (egy tenyészet alkalmazása esetén) 2 000 -nél jelentősen kevesebb sejt áll rendelkezésre értékelés céljára, és nem mutatható ki a mikronukleuszok számának jelentős növekedése, akkor vizsgálatot adott esetben több sejt vagy kevésbé citotoxikus koncentrációk alkalmazásával meg kell ismételni.

CitoB alkalmazása esetén a sejtproliferáció értékelése érdekében tenyészetenként legalább 500 sejtből meg kell határozni a CBPI-t vagy az RI-t (lásd a 2. függeléket). Amennyiben a kezeléseket citoB hiányában végzik, a 24–28. pontban foglaltaknak megfelelően elengedhetetlen annak bizonyítása, hogy a tenyészetben lévő sejtek osztódtak.

A laboratórium jártassága

A laboratóriumoknak a vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtti elegendő tapasztalat igazolása érdekében kísérletsorozatot kell végrehajtaniuk referenciaként szolgáló, más-más mechanizmusú pozitív vegyi anyagokkal (legalább egy metabolikus aktiválással és legalább egy metabolikus aktiválás nélkül ható, valamint egy aneugén mechanizmus útján ható, az 1. táblázatban felsoroltak közül kiválasztott vegyi anyaggal), és különféle negatív kontrollokkal (többek között nem kezelt tenyészetek és különböző oldószerek/vivőanyagok). E pozitív és negatív kontrollok válaszreakcióinak összhangban kell lenniük a szakirodalommal. Ez nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek tapasztalattal rendelkeznek, azaz amelyeknek a rendelkezésére áll a 49–52. pontban meghatározott történeti adatbázis.

A pozitív kontrollként szolgáló, kiválasztott vegyi anyagokat (lásd az 1. táblázatot) metabolikus aktiválás nélkül végzett rövid és hosszú kezeléssel, továbbá metabolikus aktiválás jelenlétében végzett rövid kezeléssel is meg kell vizsgálni a laboratórium klasztogén és aneugén hatású vegyi anyagok kimutatásában való jártasságának bizonyítása, a metabolikus aktivációs rendszer eredményességének meghatározása, valamint az értékelési eljárások (mikroszkóppal végzett vizuális elemzés, áramlási citometria, lézerszkenneléses citometria vagy képelemzés) megfelelőségének bizonyítása érdekében. A vizsgálati rendszer érzékenységének és dinamikus tartományának bizonyítása érdekében a kiválasztott vegyi anyagok koncentrációtartományát úgy kell megválasztani, hogy reprodukálható és koncentrációval összefüggő növekedést biztosítson a háttérértékekhez viszonyítva.

Történeti kontrolladatok

A laboratóriumnak meg kell állapítania a következőket:

 a pozitív kontrollok történeti tartománya és eloszlása,

 a negatív (nem kezelt, oldószeres) kontrollok történeti tartománya és eloszlása.

A negatív kontrollok történeti eloszlásához kapcsolódó első adatgyűjtés során a párhuzamos negatív kontrolloknak összhangban kell lenniük a negatív kontrollokra vonatkozóan közzétett adatokkal, amennyiben léteznek. Amint több kísérleti adat adódik a kontrollok eloszlásához, a párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben az eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (87) (88). A laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisát első lépésként legalább 10 kísérlettel kell kiépíteni, de az adatbázisnak lehetőség szerint legalább 20, összehasonlítható kísérleti körülmények között végzett kísérletet kell tartalmaznia. A laboratóriumoknak minőségellenőrzési módszereket, például ellenőrzési diagramokat (C-diagramokat vagy X-bar diagramokat (88)) kell alkalmazniuk annak meghatározására, hogy a pozitív és a negatív kontrollokra vonatkozó adataik mennyire változóak, valamint annak bizonyítására, hogy náluk a módszertan »ellenőrzés alatt« áll (83). A történeti adatok összeállításának és felhasználásának módjára (azaz az adatok történeti adatokhoz számításának és azok közül való kizárásának kritériumaira, valamint egy adott kísérlet elfogadhatósági kritériumaira) vonatkozó további ajánlások megtalálhatók a szakirodalomban (87).

A kísérleti protokoll bármely módosítását meg kell vizsgálni abból a szempontból, hogy az adatok összhangban vannak-e a laboratórium meglévő történeti kontrolladatbázisaival. Jelentősebb következetlenségek fennállása esetén új történeti kontrolladatbázist kell létrehozni.

A negatív kontrollokra vonatkozó adatok az egy tenyészetből vagy párhuzamos tenyészetek összességéből származó mikronukleált sejtek előfordulását mutatják, ahogyan az a 28. pontban szerepel. A párhuzamos negatív kontrolloknak ideális esetben a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisa szerinti eloszlás 95 %-os ellenőrzési határértékén belül kell lenniük (87) (88). Amennyiben a párhuzamos negatív kontrollokra vonatkozó adatok a 95 %-os ellenőrzési határértéken kívül esnek, akkor számíthatók be a kontrollok történeti eloszlásába, amennyiben ezek az adatok nem szélsőségesen kiugró értékek, továbbá bizonyíték van arra, hogy a vizsgálati rendszer »ellenőrzés alatt áll« (lásd az 50. pontot), valamint arra, hogy nem áll fenn szakmai vagy emberi mulasztás.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az eredmények ismertetése

A citokinezis-gátlási módszer alkalmazása esetén a mikronuleusz-képződés indukciójának értékelése során (a mikronukleuszok sejtenkénti számától függetlenül) csak a mikronukleuszokkal rendelkező kétmagvú sejtek gyakoriságát kell felhasználni. Az egy, két vagy több mikronukleusszal rendelkező sejtek értékelése külön-külön jelentésbe foglalható és hasznos információval szolgálhat, de nem kötelező.

Egyidejűleg az összes kezelt tenyészet, negatív és pozitív kontrolltenyészet esetében el kell végezni a citotoxicitás és/vagy a citosztázis méréseit (16). A citokinezis-gátlási módszer alkalmazása esetén a kezelt és kontrolltenyészetek esetében a sejtciklus késésének mutatójaként ki kell számolni a CBPI-t vagy az RI-t. CitoB nélkül végzett vizsgálatoknál az RPD-t vagy az RICC-t kell alkalmazni (lásd a 2. függeléket).

Az egyes tenyészetekhez tartozó adatokat meg kell adni. Ezenkívül minden adatot táblázat formájában kell összefoglalni.

Elfogadhatósági kritériumok

Egy-egy vizsgálat elfogadása az alábbi kritériumokon alapul:

 A párhuzamos negatív kontroll az 50. pont szerint belefoglalható a laboratórium negatív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisába.

 A párhuzamos pozitív kontrolloknak (lásd az 50. pontot) a laboratórium pozitív kontrollokat tartalmazó történeti adatbázisában generált válaszokkal összeegyeztethető válaszokat, valamint a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva statisztikailag szignifikáns növekedést kell előidézniük.

 Az oldószeres kontrollban teljesülniük kell a sejtproliferáció kritériumainak (25-27. pont).

 Valamennyi kísérleti körülmény vizsgálatára sor került, kivéve, ha az egyik pozitív eredményeket hozott (36–40. pont).

 Megfelelő számú sejt és koncentráció elemezhető (28. és 44–46. pont).

 A legmagasabb koncentráció kiválasztására vonatkozó kritériumok összhangban vannak a 24–31. pontban ismertetett legmagasabb koncentrációkkal.

Az eredmények értékelése és értelmezése

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen pozitívnak minősül, ha a vizsgált kísérleti körülmények bármelyikében (lásd a 36–39. pontot):

 legalább az egyik vizsgálati koncentráció statisztikailag szignifikáns növekedést mutat a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva (89),

 a megfelelő trendpróbával történő értékelés arra utal, hogy a növekedés legalább egy kísérleti körülménynél a dózissal összefügg (lásd a 28. pontot),

 az eredmények bármelyike a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken; lásd az 52. pontot) kívül esik.

Mindezen kritériumok teljesülése esetén úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben kromoszómatöréseket és/vagy szám feletti kromoszómákat vagy kromoszómaveszteséget képes előidézni. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások a szakirodalomban is megtalálhatók (90) (91) (92).

Amennyiben valamennyi elfogadhatósági kritérium teljesül, a vizsgálati vegyi anyag egyértelműen negatívnak minősül, ha valamennyi vizsgált kísérleti körülmény mellett (lásd a 36–39. pontot):

 a vizsgálati koncentrációk egyike sem mutat statisztikailag szignifikáns növekedést a párhuzamos negatív kontrollhoz viszonyítva,

 a megfelelő trendpróbával végzett értékelés nem mutat koncentrációval összefüggő növekedést,

 valamennyi eredmény a történeti negatív kontrolladatok eloszlásán (például Poisson-eloszlású 95 %-os ellenőrzési határértékeken; lásd az 52. pontot) belül van.

Ezt követően úgy tekintendő, hogy a vizsgálati vegyi anyag ebben a vizsgálati rendszerben nem képes kromoszómatöréseket és/vagy szám feletti kromoszómákat vagy kromoszómaveszteséget előidézni. A legmegfelelőbb statisztikai módszerekre vonatkozó ajánlások a szakirodalomban is megtalálhatók (90) (91) (92).

Az egyértelműen pozitív vagy egyértelműen negatív válasz igazolása nem követelmény.

Amennyiben a reakció nem egyértelműen negatív és nem is egyértelműen pozitív, ahogyan az a fentiekben szerepel, illetve egy adott eredmény biológiai relevanciája megállapításának segítése érdekében az adatokat szakértői véleménnyel és/vagy további vizsgálatokkal kell értékelni. Hasznos lehet további sejtek értékelése (adott esetben) vagy megismételt kísérlet lehetőleg módosított kísérleti körülmények (például a koncentrációk távolsága, más [S9-es koncentráció vagy S9 eredetű] metabolikus aktiválási feltételek) melletti elvégzése.

Ritka esetekben, még további vizsgálatok után is, az adatkészlet nem teszi lehetővé a pozitív vagy negatív reakcióra vonatkozó következtetést, ezért kétértelmű reakció lesz a következtetés.

Az MNvit vizsgálatban a mikronukleusz-képződést indukáló vizsgálati vegyi anyagok azért válthatnak ki ilyen hatást, mert kromoszómatörést, kromoszómaveszteséget vagy a kettő együttesét idézik elő. Annak vizsgálatára, hogy a mikronukleusz-képződés indukciója klasztogén és/vagy aneugén hatás eredménye-e, kinetokor elleni antitestekkel, centroméraspecifikus in situ próbákkal vagy egyéb módszerekkel végzett további elemzések alkalmazhatók.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Vizsgálati vegyi anyag:

 eredet, tételszám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll;

 a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert;

 a vizsgálati vegyi anyag reaktivitása az oldószerrel/vivőanyaggal vagy a sejttenyészethez alkalmazott tenyészközegekkel;

 a vizsgálati vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben, ha ismert;

 adott esetben a pH-érték, az ozmolalitás és a kicsapódás mérése abban a tenyészközegben, amelyhez a vizsgálati vegyi anyagot hozzáadták.

Egy összetevőből álló anyag:

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok;

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonossága stb.

Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek:

 amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai jellemzik.

Oldószer:

 az oldószer kiválasztásának indoklása;

 az oldószernek a végleges tenyészközegen belüli aránya.

Sejtek:

 az alkalmazott sejtek típusa és eredete,

 az alkalmazott sejttípus alkalmassága,

 sejtvonalak esetében a mikoplazma hiánya;

 sejtvonalak esetében a sejtciklus hosszúságára vagy a proliferációs indexre vonatkozó információk;

 limfociták használata esetén a vérdonorok ivara, életkora, valamint a donorra, a teljes vérre vagy az elkülönített limfocitákra, a használt mitogénre vonatkozó bármely releváns információ;

 a normál (negatív kontroll) sejtciklusidő,

 sejtvonalak esetében a passzálások száma, ha rendelkezésre áll;

 sejtvonalak esetében a sejttenyészetek fenntartásának módszerei;

 sejtvonalak esetében a modális kromoszómaszám.

Vizsgálati körülmények:

 amennyiben alkalmaznak citokinezis-gátló anyagot, annak megnevezése (például citoB), illetve koncentrációja és a sejtek expozíciójának időtartama;

 a vizsgálati vegyi anyag koncentrációja a tenyészközegen belüli végleges koncentrációjaként kifejezve (például μg, mg/a tenyészközeg mL-e vagy mM-ja);

 a koncentrációk kiválasztásának és a tenyészetek számának indoklása, beleértve a citotoxicitási adatokat és az oldhatóságra vonatkozó korlátokat;

 a közeg összetétele, CO2-koncentráció, amennyiben alkalmazandó, nedvességtartalom;

 a tenyészközeghez adott oldószer és vizsgálati vegyi anyag koncentrációja (és/vagy térfogata);

 inkubációs hőmérséklet és idő;

 a kezelés időtartama;

 a kezelés utáni begyűjtés időpontja;

 adott esetben a sejtszám a leoltáskor;

 a metabolikus aktivációs rendszer típusa és összetétele (az S9 eredete, az S9 keverék elkészítési módszerei, az S9 keverék koncentrációja vagy térfogata és az S9 a végleges tenyészközegben, az S9 minőségellenőrzése, például az enzimaktivitásra, a sterilitásra, a metabolikus képességre kiterjedően);

 pozitív és negatív kontrollként szolgáló vegyi anyagok, végleges koncentrációk, a kezelés körülményei és időtartama, valamint a visszanyerési idők;

 az alkalmazott tárgylemez-preparálási módszer és festési technika;

 a mikronukleált sejtek értékelésének kritériumai (az elemezhető sejtek kiválasztása és a mikronukleusz azonosítása);

 a vizsgált sejtek száma;

 a citotoxicitás mérésére alkalmazott módszerek;

 a citotoxicitás és az alkalmazott módszer szempontjából lényeges kiegészítő információk;

 a pozitív, negatív és kétes vizsgálati eredmény kritériumai;

 az alkalmazott statisztikai elemzési módszer(ek);

 adott esetben annak meghatározására alkalmazott módszerek (például kinetokor elleni antitest vagy pancentromérás próbák), hogy a mikronukleuszok teljes kromoszómákat vagy csak kromoszómatöredékeket tartalmaznak;

 a pH-érték, az ozmolalitás és a kicsapódás meghatározására alkalmazott módszerek.

Eredmények:

 az elemzéshez elfogadható sejtek meghatározása;

 citoB hiányában, sejtvonalaknál az egyes tenyészetek esetében kezelt sejtek száma és begyűjtött sejtek száma;

 a citokinezis-gátlási módszer esetében az alkalmazott citotoxicitás mérése, például CBPI vagy RI meghatározásával; citokinezis-gátlási módszerek alkalmazása nélkül az RICC vagy az RPD meghatározása; egyéb megfigyelések, ha vannak, például a sejtek egybefüggősége, apoptózis, nekrózis, metafázis-számolás, kétmagvú sejtek előfordulási gyakorisága;

 a kicsapódás jelei és a meghatározás időpontja;

 a kezelési közeg pH-jára és ozmolalitására vonatkozó adatok, amennyiben meghatározásra kerültek,

 az egymagvú, kétmagvú és többmagvú sejtek megoszlása, amennyiben citokinezis-gátlási módszer használatos;

 a mikronukleuszokkal rendelkező sejtek száma minden kezelt és kontrolltenyészetre megadva, valamint adott esetben annak meghatározása, hogy kétmagvú vagy egymagvú sejtben találhatók-e;

 amennyiben lehetséges, a koncentráció-válasz összefüggés;

 a párhuzamos negatív (oldószeres) és pozitív kontrollokra vonatkozó adatok (koncentrációk és oldószerek);

 történeti negatív (oldószeres) és pozitív kontrollokra vonatkozó adatok, a tartományok, az átlagok, a szórás, valamint az eloszlás esetében a 95 %-os ellenőrzési határértékek megadásával, továbbá az adatok száma;

 statisztikai elemzés; p-értékek, ha meghatározásra kerültek.

Az eredmények tárgyalása.

Következtetések.

SZAKIRODALOM

(1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2) Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 1-4.

(3) Parry, J.M., A. Sors (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 3-15.

(4) Fenech, M., A.A. Morley (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios, Vol. 43/172-173, pp. 233-246.

(5) Kirsch-Volders, M. et al. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 167-172.

(6) Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols, Vol. 2/5, pp. 1084-1104.

(7) Fenech, M., A.A. Morley (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Research, Vol. 161/2, pp. 193-198.

(8) Eastmond, D.A., J.D. Tucker (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 13/1, pp. 34-43.

(9) Eastmond, D.A., D. Pinkel (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probe. Mutation Research, Vol. 234/5, pp. 9-20.

(10) Miller, B.M. et al. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.

(11) Farooqi, Z., F. Darroudi, A. T. Natarajan (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis, Vol. 8/4, pp. 329-334.

(12) Migliore, L. et al. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Research, Vol. 319/3, pp. 205-213.

(13) Norppa, H., L. Renzi, C. Lindholm (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 519-525.

(14) Eastmond, D.A, D.S. Rupa, L.S. Hasegawa (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Research, Vol. 322/1, pp. 9-20.

(15) Marshall, R.R. et al. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Research, Vol. 372/2, pp. 233-245.

(16) Zijno, P. et al. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 372/2, 211-219.

(17) Kirsch-Volders et al. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research, Vol. 540/2, pp. 153-163.

(18) E melléklet B.10., Mutagenitás – kromoszóma-rendellenességek in vitro vizsgálata emlősökön című fejezete.

(19) Lorge, E. et al. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 13-36.

(20) Clare, G. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 37-60.

(21) Aardema, M.J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 61-87.

(22) Wakata, A. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 88-124.

(23) Oliver, J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 125-152.

(24) Albertini, S. et al. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 187-208.

(25) Miller, B. et al. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 45-59.

(26) Miller, B. et al. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Research, Vol. 410, pp. 81-116.

(27) Kalweit, S. et al. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches. Mutation Research, Vol. 439/2, pp. 183-190.

(28) Kersten, B. et al. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Research, Vol. 445/1, pp. 55-71.

(29) von der Hude, W. et al. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells – results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Research, Vol. 468/2, pp. 137-163.

(30) Garriott, M.L., J.B. Phelps, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 123-134.

(31) Matsushima, T. et al. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis, Vol. 14/6, pp. 569-580.

(32) Elhajouji, A., E. Lorge (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 1-152.

(33) Kirkland, D. (2010). Evaluation of different cytotoxic and cytostatic measures for the in vitromicronucleus test (MNVit): Introduction to the collaborative trial. Mutation Research, Vol. 702/2, pp. 139-147.

(34) Hashimoto K. et al. (2011). Comparison of four different treatment conditions of extended exposure in the in vitro micronucleus assay using TK6 lymphoblastoid cells. Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 59/1, pp. 28-36.

(35) Honma, M., M. Hayashi (2011). Comparison of in vitro micronucleus and gene mutation assay results for p53-competent versus p53-deficient human lymphoblastoid cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 373-384.

(36) Zhang, L.S. et al. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Research Letters, Vol. 347/3-4, pp. 105-115.

(37) ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November 2006, Elérhető a következő címen: http://ecvam.jrc.it/index.htm.

(38) ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Elérhető a következő címen: http://ecvam.jrc.it/index.htm.

(39) Corvi, R. et al. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis, Vol 23/4, pp. 271-283.

(40) ILSI paper (draft). Lorge, E., M.M. Moore, J. Clements, M. O'Donovan, M. Honma, A. Kohara, J. van Benthem, S. Galloway, M.J. Armstrong, A. Sutter, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Young-Tannir. Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. Mutation Research.

(41) Scott, D. et al. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Research, Vol. 257/2, pp. 147-205.

(42) Morita, T. et al. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Research, Vol. 268/2, pp. 297-305.

(43) Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environmental Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.

(44) Long, L.H. et al. (2007). Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium. Mutation Research, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.

(45) Nesslany, F. et al. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environmental and Molecular Mutation., Vol. 49, pp. 439-452.

(46) Fenech, M., A.A. Morley (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Research, Vol. 147/1-2, pp. 29-36.

(47) Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Research, Vol. 392, pp. 11-18.

(48) Payne, C.M. et al. (2010). Hydrophobic bile acid-induced micronuclei formation, mitotic perturbations, and decreases in spindle checkpoint proteins: relevance to genomic instability in colon carcinogenesis. Nutrition and Cancer, Vol. 62/6, pp. 825-840.

(49) Bazin, E. et al. (2010). Genotoxicity of a Freshwater Cyanotoxin,Cylindrospermopsin, in Two Human Cell Lines: Caco-2 and HepaRG. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 51/3, pp. 251-259.

(50) Le Hegarat, L. et al. (2010). Assessment of the genotoxic potential of indirect chemical mutagens in HepaRG cellsby the comet and the cytokinesis-block micronucleus assays. Mutagenesis, Vol. 25/6, pp. 555-560.

(51) Josse, R. et al. (2012). An adaptation of the human HepaRG cells to the in vitro micronucleus assay. Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 295-304.

(52) Ehrlich, V. et al. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis, Vol. 17/3, pp. 257-260.

(53) Knasmüller, S. et al. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicology, Vol. 198/1-3, pp. 315-328.

(54) Gibson, D.P. et al. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 61-70.

(55) Bonassi, S. et al. (2001). HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 37/1, pp. 31-45.

(56) Maron, D.M., B.N. Ames (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.

(57) Ong, T.-m. et al. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.

(58) Elliott, B.M. et al. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, Vol. 7, pp. 175-177.

(59) Matsushima, T. et al. (1976). “A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems”, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. de Serres, F.J. et al. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(60) Johnson, T.E., D. R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28, pp. 51-59.

(61) UNEP (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Elérhető a következő címen: http://www.pops.int/

(62) Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987). Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes. Mutation Research, Vol.190/3, pp. 225-8.

(63) Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982). “CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids”, in Genotoxic Effects of Airborne Agents. Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.

(64) Zamora, P.O. et al. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environmental Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.

(65) Asakura, M. et al. (2008). An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay. Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.

(66) Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Research, Vol. 285/1, pp. 35-44.

(67) Phelps, J.B., M.L. Garriott, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 521/1-2, pp. 103-112.

(68) Kirsch-Volders, M. et al. (2004). Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”. Mutation Research, 564, 97-100.

(69) Lorge, E. et al. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Research, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.

(70) Surralles, J. et al. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 341/3, pp. 169-184.

(71) Honma, M. (2011). Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test. Mutation Research, Vol. 724, pp. 86-87.

(72) Pfuhler, S. et al. (2011). In vitro genotoxicity test approaches with better predictivity: Summary of an IWGT workshop. Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 101-107.

(73) OECD (2014). Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). ENV/JM/TG(2014)17. Kérésre beszerezhető.

(74) Morita T., M. Honma, K. Morikawa (2012). Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity. Mutation Research, Vol. 741, pp. 32-56.

(75) Brookmire L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the in vitro Chromosome Aberrations Assay. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.

(76) EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances. http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.

(77) Sobol, Z. et al. (2012). Development and validation of an in vitro micronucleus assay platform in TK6 cells. Mutation Research, Vol.746/1, pp. 29-34.

(78) Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 241-247.

(79) MacGregor, J. T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.

(80) Bryce, S.M. et al. (2011). Miniaturized flow cytometry-based CHO-K1 micronucleus assay discriminates aneugenic and clastogenic modes of action. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/4, pp. 280–286.

(81) Nicolette, J. et al. (2011). in vitro micronucleus screening of pharmaceutical candidates by flow cytometry in Chinese hamster V79 cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 355–362.

(82) Shi, J., R. Bezabhie, A. Szkudlinska (2010). Further evaluation of a flow cytometric in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells: a reliable platform that detects micronuclei and discriminates apoptotic bodies. Mutagenesis, Vol. 25/1, pp. 33-40.

(83) OECD (2014). Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on testing and assessment, No.198, OECD Publishing, Paris.

(84) Fenech, M. et al. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 534/1-2, pp. 65-75.

(85) Elhajouji, A., M. Cunha, M. Kirsch-Volders (1998). Spindle poisons can induce polyploidy by mitotic slippage and micronucleate mononucleates in the cytokinesis-block assay. Mutagenesis, Vol. 13/2, pp. 193-8.

(86) Kirsch-Volders, M. et al. (2011). The in vitro MN assay in 2011: origin and fate, biological significance, protocols, high throughput methodologies and toxicological relevance. Archives of Toxicology, Vol. 85/8, pp. 873-99.

(87) Hayashi, M. et al. (2010). Compilation and use of genetic toxicity historical control Data. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol.723/2, pp. 87-90.

(88) Ryan, T. P. (2000). Statistical Methods for Quality Improvement. 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(89) Hoffman, W.P., M.L. Garriott, C. Lee (2003). “In vitro micronucleus test’, in Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2nd ed. Chow, S. (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, pp. 463-467.

(90) Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed. John Wiley & Sons, New York.

(91) Galloway, S.M. et al. (1987). Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.

(92) Richardson, C. et al. (1989). Analysis of Data from in vitro Cytogenetic Assays. in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(93) International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use.




1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Aneugén : olyan vegyi anyag vagy folyamat, amely a mitózissal vagy meiózissal történő sejtosztódási ciklus elemeivel kölcsönhatásba lépve a sejtek vagy organizmusok aneuploidiáját eredményezi.

Aneuploidia : a normális diploid (vagy haploid) kromoszómaszámtól egyetlen kromoszómával vagy egynél több, szám feletti kromoszómával, de nem teljes kromoszómakészlettel (kromoszómakészletekkel) (poliploidia) való bármely eltérés.

Apoptózis : programozott sejthalál olyan lépések során keresztül, amelyek a sejt membránhoz kötött részecskékre történő szétesését eredményezik; a részecskék ezután fagocitózissal vagy sejtfelszínről történő leválással kerülnek eltávolításra.

Sejtproliferáció : a sejtek számának növekedése mitotikus sejtosztódással.

Centroméra : a kromoszóma azon DNS-régiója, ahol a két kromatida összeér, és amelyhez a két kinetokor oldalirányban kapcsolódik.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Koncentrációk : a vizsgálati vegyi anyagnak a tenyészközegen belüli végleges koncentrációira utalnak.

Klasztogén : bármely olyan vegyi anyag vagy hatás, amely sejtek vagy eukarióta szervezetek populációjában szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket okoz.

Citokinezis : a mitózist közvetlenül követő sejtosztódási folyamat, amelynek eredményeként két utódsejt képződik egy-egy sejtmaggal.

Citokinezis-gátlási proliferációs index (CBPI) : a kezelt populációban tapasztalható másodszor osztódó sejtek aránya a nem kezelt kontrollhoz képest (a képletet lásd a 2. függelékben).

Citosztázis : a sejtszaporodás gátlása (a képletet lásd a 2. függelékben).

Citotoxicitás :
az e vizsgálati módszerbe tartozó, citokalazin-B jelenlétében végzett vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek citokinezis-gátlási proliferációs indexének (CBPI) vagy replikációs indexének (RI) csökkenése a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd a 26. pontot és a 2. függeléket).
Az e vizsgálati módszerbe tartozó, citokalazin-B nélkül végzett vizsgálatok esetében a citotoxicitás a kezelt sejtek relatív populációduplázódásának (RPD) vagy a relatív sejtszám-növekedésnek (RICC) a csökkenése a negatív kontrollhoz viszonyítva (lásd a 27. pontot és a 2. függeléket):

Genotoxikus : olyan általános kifejezés, amely magában foglalja a DNS- vagy kromoszómakárosodás valamennyi típusát, köztük a töréseket, a deléciókat, az adduktok képződését, a nukleotidok módosulását és kapcsolódását, az átrendeződéseket, a génmutációkat, a kromoszóma-rendellenességeket és az aneuploidiát. A genotoxikus hatás nem minden típusa eredményez mutációkat vagy stabil kromoszómakárosodást.

Interfázisban lévő sejtek : azok a sejtek, amelyek nincsenek a mitózis fázisában.

Kinetokor : protein tartalmú struktúra, amely a kromoszóma centroméra részén épül fel, és amelyhez a sejtosztódás során orsórostok kötődnek, lehetővé téve a leánykromoszómáknak az utódsejtek pólusai felé irányuló szabályos mozgását.

Mikronukleusz : a sejtek fő magjától elkülönült kis járulékos mag, amelyet a mitózis (meiózis) telofázisa során hoznak létre visszamaradó kromoszómatöredékek vagy teljes kromoszómák.

Mitózis : a sejtmag osztódása, amely általában profázisra, prometafázisra, metafázisra, anafázisra és telofázisra osztható fel.

Mitotikus index : a metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya; e populáció sejtproliferációja mértékének jelzése.

Mutagén : örökletes elváltozást idéz elő a génekben lévő DNS-bázispár szekvenciában/szekvenciákban vagy a kromoszómák szerkezetében (kromoszóma-rendellenességek).

Nondiszjunkció : a kromatidpárok nem válnak szét, és különülnek el a kifejlődő utódsejtekbe, rendellenes kromoszómaszámmal rendelkező utódsejteket eredményezve.

p53 státusz : A p53 fehérje vesz részt a sejtciklus-szabályozásban, az apoptózisban és a DNS-reparációban. Azok a sejtek, amelyeknél hiányzik funkcionális p53 fehérje, nem képesek apoptózis útján vagy a DNS-károsodásra reagáló p53 funkciókkal összefüggő egyéb mechanizmusok útján (például DNS-reparáció kiváltásával) leállítani a sejtciklust vagy eltávolítani a károsodott sejteket, elméletileg hajlamosabbnak kell lenniük génmutációkra vagy kromoszóma-rendellenességekre.

Poliploidia : ellentétben a csak egyetlen kromoszómát vagy bizonyos kromoszómákat érintő számszerű rendellenességekkel (aneuploidia), teljes kromoszómakészlet(ek) sejtekben és organizmusokban jelentkező számszerű rendellenessége.

Proliferációs index (PI) : a citotoxicitás mérésére használható módszer olyan esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 2. függelékben).

A sejtszám relatív növekedése (RICC) : a citotoxicitás mérésére használható módszer olyan esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 2. függelékben).

Relatív populációduplázódás (RPD) : a citotoxicitás mérésére használható módszer olyan esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 2. függelékben).

Replikációs index (RI) : a kezelt tenyészetben tapasztalható sejtosztódási ciklusok aránya a nem kezelt kontrollhoz képest, az expozíciós időszakban és a visszanyerés időszakában (a képletet lásd a 2. függelékben).

S9 májfrakció : 9 000 g centrifugálás utáni májhomogenátum felülúszója, azaz a nyers májextraktum.

S9 keverék : az S9 májfrakció és a metabolikus enzimaktivitáshoz szükséges kofaktorok keveréke.

Oldószeres kontroll : a csak a vizsgálati vegyi anyag feloldására használatos oldószert befogadó kontrolltenyészetek meghatározására szolgáló általános kifejezés.

Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

Nem kezelt kontroll : nem kezelt (azaz sem a vizsgálati vegyi anyaggal, sem oldószerrel nem kezelt), de a vizsgálati vegyi anyagot befogadó tenyészetekkel párhuzamosan, azonos módon feldolgozott tenyészetek.




2. függelék

A CITOTOXICITÁS ÉRTÉKELÉSÉRE SZOLGÁLÓ KÉPLETEK

CitoB alkalmazása esetén a citotoxicitás értékelését a citokinezis-gátlási proliferációs index (CBPI) vagy a replikációs index (RI) alapján kell végezni (17) (69). A CBPI a sejtenkénti sejtmagok átlagos számát mutatja meg, így alkalmazható a sejtproliferáció kiszámítására. Az RI a citoB-expozíció időszaka alatt megmutatja a kezelt tenyészeteken belüli sejtenkénti sejtciklusok relatív számát a kontrolltenyészetekhez viszonyítva, így alkalmazható a %-os citosztázis kiszámítására.

%-os citosztázis = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}

valamint:

T

=

a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt tenyészet

C

=

kontrolltenyészet

ahol:

image

Tehát az 1-es CBPI (az összes sejt egymagvú) 100 %-os citosztázisnak felel meg.

Citosztázis = 100 – RI

image

T

=

kezelt tenyészetek

C

=

kontrolltenyészetek

Tehát az 53 %-os RI azt jelenti, hogy a kontrolltenyészetben kétmagvú és többmagvú sejtekké osztódott sejtek számához képest a kezelt tenyészetben ennek csak 53 %-a osztódott, vagyis a citosztázis 47 %-os.

Amennyiben citoB-t nem alkalmaznak , a citotoxicitás értékelésére a sejtszám relatív növekedése (RICC) vagy a relatív populációduplázódás (RPD) ajánlott (69), mivel mindkét módszer figyelembe veszi az osztódott sejtpopuláció arányát.

image

image

ahol:

Populációduplázódás = [log (kezelés utáni sejtszám ÷ kiindulási sejtszám)] ÷ log 2

Tehát az 53 %-os RICC vagy RPD 47 %-os citotoxicitást/citosztázist jelez.

Proliferációs index (PI) alkalmazásával a citotoxicitás az 1 sejtből (cl1), 2 sejtből (cl2), 3-4 sejtből (cl4) és 5–8 sejtből (cl8) álló telepek megszámlálásával határozható meg.

image

A PI a citotoxicitás értékes és megbízható paramétereként használatos a citoB nélkül in vitro tenyésztett sejtvonalak esetében is (35) (36) (37) (38), és hasznos további paraméternek tekinthető.

A kezelés előtti sejtszámnak minden esetben meg kell egyeznie a kezelt tenyészetek és a negatív kontrolltenyészetek esetében.

Míg az RCC (azaz a kezelt tenyészeteken belüli sejtszám és a kontrolltenyészeteken belüli sejtszám hányadosa) a múltban citotoxicitási paraméterként volt használatos, a továbbiakban már nem javasolt, mivel alulbecsülheti a citotoxicitást.

Automatizált értékelési rendszerek, például áramlási citometria, lézerszkenneléses citometria vagy képelemzés alkalmazása esetén a képletben a sejtszám helyettesíthető a sejtmagok számával.

A negatív kontrolltenyészetekben a populációduplázódásnak vagy a replikációs indexnek összeegyeztethetőnek kell lennie azzal a követelménnyel, hogy a sejtekből a kezelés után kb. 1,5–2,0 normál sejtciklusidőnek megfelelő időpontban kell mintát venni.

(15) A B. rész a következő fejezetekkel egészül ki:

„B.59.    In chemico bőrszenzibilizáció: közvetlen peptidreaktivitási vizsgálat

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 442C. vizsgálati iránymutatásában (2015) leírt módszerrel. A bőrszenzibilizáló anyag a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) (1) és az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendelet ( 9 ) (CLP-rendelet) szerint olyan anyag, amely a bőrrel való érintkezést követően allergiás reakciót vált ki. Ez a vizsgálati módszer olyan in chemico eljárást (közvetlen peptidreaktivitási vizsgálat, a továbbiakban: DPRA) tesz lehetővé, amellyel elősegíti a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetését az ENSZ-GHS-nek és a CLP-rendeletnek megfelelően.

A bőrszenzibilizációt előidéző főbb biológiai eseményeket illetően általános egyetértés van. A bőrszenzibilizációhoz kapcsolódó kémiai és biológiai mechanizmusokról már rendelkezésre álló ismereteket úgynevezett káros kimeneti út (Adverse Outcome Pathway, AOP) (2) foglalja össze a molekuláris kiváltó eseménytől a köztes eseményeken át a káros hatásig, amely embereknél allergiás kontakt bőrgyulladás, rágcsálóknál pedig kontakt túlérzékenység. A bőrszenzibilizációs káros kimeneti út esetében a molekuláris kiváltó esemény az elektrofil anyagok és a bőrben lévő fehérjék nukleofil centrumai között létrejövő kovalens kötés.

A bőrszenzibilizáció vizsgálata jellemzően kísérleti állatokon történő vizsgálatot foglal magában. A tengerimalacokon alkalmazott klasszikus módszerek, vagyis a Magnusson–Kligman-féle tengerimalac-maximizációs vizsgálat és a Bühler-féle vizsgálat (B.6. vizsgálati módszer (3)) egyaránt a bőrszenzibilizáció indukciós és kiváltási fázisával foglalkozik. Az egereken alkalmazott lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (LLNA, B.42. vizsgálati módszer (4)) és két nem radioaktív változata, az LLNA: DA (B.50. vizsgálati módszer (5)) és az LLNA: BrdU-ELISA (B.51. vizsgálati módszer (6)), amely mind csak az indukciós reakciót vizsgálja, szintén elfogadottá vált, mivel állatjólét szempontjából előnyösebbek, mint a tengerimalacon végzett vizsgálatok, és objektív mérést tesznek lehetővé a bőrszenzibilizáció indukciós fázisában.

Újabban a mechanisztikus alapú in chemico és in vitro vizsgálati módszerek a vegyi anyagok bőrszenzibilizációs veszélyének értékelése szempontjából tudományosan megalapozottnak tekinthetőek. Szükség lesz azonban nem állatokon alkalmazott módszerek (in silico, in chemico, in vitro) integrált vizsgálati és értékelési megközelítésen belüli kombinációira a jelenleg alkalmazott állatkísérletek teljes felváltásához, mivel a jelenleg rendelkezésre álló, nem állatokon alkalmazott vizsgálati módszerekre a káros kimeneti út mechanisztikus szempontjai csak korlátozott mértékben terjednek ki (2) (7).

A bőrszenzibilizációs káros kimeneti út molekuláris kiváltó eseményét, vagyis a fehérjereaktivitást illetően a DPRA alkalmazása javasolt, amelynek keretében a vizsgálati vegyi anyagok reaktivitását a lizint vagy ciszteint tartalmazó szintetikus peptidmodellekhez viszonyítva kell számszerűsíteni (8). Ezt követően a cisztein és a lizin százalékos peptidkiürülési értékei alapján az anyag besorolható a négy reaktivitási osztály egyikébe, amivel támogatható a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetése (9).

A DPRA-t az állatkísérletek alternatív módszereinek uniós referencialaboratóriuma (EURL ECVAM) által irányított validálási vizsgálatban értékelték, az EURL ECVAM tudományos tanácsadó bizottsága (ESAC) pedig független szakértői értékelésnek vetette alá; mindezek alapján megállapítást nyert, hogy a DPRA tudományosan megalapozott (10) ahhoz, hogy integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetésének támogatására lehessen felhasználni veszélyességi osztályozás és címkézés céljából. A DPRA-ból származó adatok és más információk együttes használatára fellelhetők példák a szakirodalomban (11) (12) (13) (14).

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK, ALKALMAZHATÓSÁG ÉS KORLÁTOK

A fehérjereaktivitás és a bőrszenzibilizáló potenciál közötti összefüggés jól ismert (15) (16) (17). Mindazonáltal, mivel a fehérjekötés csak egy kulcsfontosságú esemény, jóllehet a bőrszenzibilizációs káros kimeneti út molekuláris kiváltó eseménye, a fehérjereaktivitásról vizsgálati és vizsgálat nélküli módszerekkel előállított információk önmagukban nem feltétlenül elegendőek ahhoz, hogy megállapítható legyen a vegyi anyagok bőrszenzibilizáló potenciáljának hiánya. Ezért az e vizsgálati módszerrel kapott adatokat integrált megközelítés, például integrált vizsgálati és értékelési megközelítés összefüggésében kell mérlegelni olyan egyéb, kiegészítő információkkal együtt, mint a bőrszenzibilizációs káros kimeneti út más kulcsfontosságú eseményeivel foglalkozó in vitro vizsgálatok eredményei, valamint a vizsgálat nélküli módszerekkel, köztük a kémiai analógokból kereszthivatkozással kapott adatok.

Ez a vizsgálati módszer az integrált vizsgálati és értékelési megközelítéssel összefüggésben egyéb, kiegészítő információkkal együtt alkalmazva felhasználható a bőrszenzibilizáló (vagyis az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozó) és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetésének támogatására. Ez a vizsgálati módszer nem alkalmazható önmagában sem a bőrszenzibilizáló anyagoknak az ENSZ-GHS-ben/a CLP-rendeletben meghatározott 1A. és 1B. alkategóriába sorolására, sem a hatáserősség előrejelzésére a biztonsági értékeléssel kapcsolatos döntések esetén. A szabályozási kerettől függően azonban a DPRA pozitív eredménye önmagában is felhasználható a vegyi anyagok ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába sorolására.

A DPRA vizsgálati módszerről bebizonyosodott, hogy áthelyezhető a nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiával (HPLC) végzett elemzés területén tapasztalattal rendelkező laboratóriumokba. A vizsgálati módszertől várható előrejelzések reprodukálhatóságának mértéke a laboratóriumokon belül 85 %, a laboratóriumok között pedig 80 % (10). A validálási vizsgálatban (18) és a közzétett tanulmányokban (19) kapott eredmények összességében azt jelzik, hogy a DPRA a szenzibilizáló (azaz az ENSZ-GHS/a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozó) anyagokat az LLNA vizsgálati módszer eredményeihez képest 80 %-os (N=157) pontossággal különbözteti meg a nem szenzibilizáló anyagoktól, 80 % az érzékenysége (88/109), a specifikussága pedig 77 % (37/48). A DPRA nagyobb valószínűséggel jelez előre alacsonyabb értékeket olyan vegyi anyagoknál, amelyeknek alacsonytól mérsékeltig terjedő a szenzibilizáló hatása (azaz az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1B. alkategóriába tartozó anyagoknál), mint a rendkívül bőrszenzibilizáló hatást mutató vegyi anyagoknál (azaz az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1A. alkategóriába tartozó anyagoknál) (18) (19). A DPRA mint önálló vizsgálati módszer esetében itt megadott pontossági értékek azonban csak irányadóak, ugyanis a vizsgálati módszert az integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében más információforrásokkal együtt és a fenti 9. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni. Ezen túlmenően a bőrszenzibilizáció nem állatokon alkalmazott módszereinek értékelésekor nem szabad megfeledkezni arról, hogy az LLNA vizsgálat, valamint más állatkísérletek nem feltétlenül tükrözik teljes egészében az érintett fajnál, például az embernél fennálló helyzetet. Az összes rendelkezésre álló adat alapján a DPRA-ról bebizonyosodott, hogy különféle szerves funkciós csoportokat, reakciómechanizmusokat, (in vivo vizsgálatok során meghatározott) bőrszenzibilizáló hatásokat és fizikai-kémiai tulajdonságokat képviselő vizsgálati vegyi anyagokra alkalmazható (8) (9) (10) (19). Ezek az információk összességében azt jelzik, hogy a DPRA érdemben hozzájárul a bőrszenzibilizáció veszélyének azonosításához.

E vizsgálati módszer esetében a »vizsgálati vegyi anyag« kifejezés a vizsgálat tárgyát képező vegyi anyagra vonatkozik, nem a DPRA anyagok és/vagy keverékek vizsgálatára való alkalmazhatóságához kapcsolódik. Ez a vizsgálati módszer fémvegyületek vizsgálatára nem alkalmazandó, mivel ismert, hogy azok kovalens kötéstől elérő mechanizmusok útján lépnek reakcióba a fehérjékkel. A vizsgálati vegyi anyagnak 100 mM végső koncentrációjú, megfelelő oldószerben oldhatónak kell lennie (lásd a 18. pontot). Az említett koncentrációnál nem oldható vizsgálati vegyi anyagok azonban alacsonyabb oldható koncentrációkban még vizsgálhatók. Ilyen esetben a pozitív eredmény továbbra is felhasználható a vizsgálati vegyi anyag bőrszenzibilizáló hatásúként történő azonosítására, a negatív eredmény alapján azonban nem szabad a reakcióképesség hiányára következtetni. Jelenleg kevés információ áll rendelkezésre a DPRA ismert összetételű keverékekre való alkalmazhatóságával kapcsolatban (18) (19). A DPRA mindazonáltal technikailag alkalmazandónak tekinthető az ismert összetételű, több összetevőből álló anyagok és keverékek vizsgálatára (lásd a 18. bekezdést). E vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény. A jelenlegi előrejelzési modell a vizsgálati vegyi anyag és a peptid meghatározott mólaránya miatt nem alkalmazható ismeretlen összetételű, összetett keverékekre, ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyagokra (azaz az UVCB anyagokra). E célból új, gravimetriás megközelítésen alapuló előrejelzési megközelítést kell kidolgozni. Olyan esetekben, ha bizonyítékkal igazolható, hogy a vizsgálati módszer nem alkalmazható más, konkrét vegyianyag-kategóriákra, a vizsgálati módszert nem szabad e vegyianyag-kategóriákra alkalmazni.

Ez a vizsgálati módszer a metabolikus rendszert nem érintő in chemico módszer. E vizsgálati módszerrel nem mutathatók ki olyan vegyi anyagok, amelyek enzimatikus bioaktivációt igényelnek a bőrszenzibilizáló potenciáljuk kifejtéséhez (azaz a pro-hapténok). Beszámolók szerint az abiotikus átalakulást követően szenzibilizálóvá váló vegyi anyagok (azaz a pre-hapténok) egyes esetekben megfelelően kimutathatók ezzel a vizsgálati módszerrel (18). A fentiek fényében: a vizsgálati módszerrel kapott negatív eredményeket a közölt korlátokra tekintettel és az integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretébe tartozó egyéb információforrásokkal összefüggésben kell értelmezni. A peptidhez nem kovalens kötéssel kapcsolódó, de az oxidációjához (cisztein-dimerizációval) hozzájáruló vizsgálati vegyi anyagok a peptidkiürülés esetleges túlbecsléséhez vezethetnek, esetlegesen hamis pozitív előrejelzéseket és/vagy magasabb reaktivitási osztályba sorolást eredményezve (lásd a 29. és a 30. pontot).

A fentieknek megfelelően a DPRA a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetését támogatja. Hozzájárulhat azonban a szenzibilizáló hatás értékeléséhez is (11), ha az integrált vizsgálati és értékelési megközelítéshez hasonló integrált megközelítések keretében alkalmazzák. Lehetőleg humán adatokon alapuló további munkára van azonban szükség annak meghatározásához, hogy a DPRA eredményei hogyan járulhatnak hozzá a hatáserősség vizsgálatához.

A VIZSGÁLAT ELVE

A DPRA a cisztein- vagy lizintartalmú peptidek vizsgálati vegyi anyaggal 25±2,5 °C-on 24 óráig végzett inkubációt követően megmaradó koncentrációját számszerűsítő in chemico módszer. A szintetikus peptidek a kimutatás elősegítése érdekében fenilalanint tartalmaznak. A relatív peptidkoncentráció mérése gradiens elúcióval és 220 nm hullámhosszon UV-detektálással végzett nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiával (HPLC) történik. A cisztein- és a lizintartalmú peptidek százalékos kiürülési értékeit ezt követően ki kell számítani és előrejelzési modellben kell alkalmazni (lásd a 29. pontot), ami lehetővé teszi a vizsgálati vegyi anyagnak a szenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok közötti különbségtétel alátámasztására használt négy reaktivitási osztály egyikébe sorolását.

Az e vizsgálati módszerben ismertetett módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak a 2. függelékben felsorolt tíz jártassági tesztanyag felhasználásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat.

ELJÁRÁS

Ez a vizsgálati módszer a DPRA-ra vonatkozó 154. sz. DB-ALM protokollon (20) alapul, amely az EURL ECVAM által koordinált validálási vizsgálathoz használt protokoll. A módszer laboratóriumi végrehajtása és alkalmazása során e protokoll alkalmazása ajánlott. Az alábbiakban a DPRA főbb összetevőinek és eljárásainak leírása található. Alternatív HPLC-beállítás alkalmazása esetén annak DB-ALM protokollban ismertetett, validált rendszerrel való egyenértékűségét bizonyítani kell (például a 2. függelékben található jártassági tesztanyagok vizsgálatával).

A cisztein- illetve a lizintartalmú peptidek előkészítése

A ciszteintartalmú (Ac-RFAACAA-COOH) és lizintartalmú (Ac-RFAAKAA-COOH), 85 %-osnál nagyobb és lehetőleg 90–95 %-os tisztaságú szintetikus peptideket tartalmazó törzsoldatokat frissen kell elkészíteni, közvetlenül a vizsgálati vegyi anyaggal való inkubálásukat megelőzően. A ciszteintartalmú peptidek végső koncentrációjának 7,5 pH-jú foszfátpufferben 0,667 mM-nek, míg a lizintartalmú peptidek végső koncentrációjának 10,2 pH-jú ammónium-acetát pufferben 0,667 mM-nek kell lennie. A HPLC-vizsgálatmenet sorozatát úgy kell beállítani, hogy a HPLC-elemzés ideje 30 óránál rövidebb maradjon. A validálási vizsgálatban használt és az e vizsgálati módszerben ismertetett HPLC-rendszerhez egyetlen HPLC-vizsgálatmenetben legfeljebb 26 elemzési minta alkalmazható (amelyek magukban foglalják a vizsgálati vegyi anyagot, a pozitív kontrollt és a megfelelő számú oldószeres kontrollokat a vizsgálat során használt oldószerek száma alapján; minden mintát három példányban kell vizsgálni). Az ugyanazon vizsgálatmenetben elemzett összes párhuzamoshoz ugyanazokat a cisztein- és lizintartalmú peptideket tartalmazó törzsoldatokat kell felhasználni. Az egyes gyártási sorozatokból származó peptidek esetében a felhasználás előtt ajánlott bebizonyítani a megfelelő oldhatóságukat.

A vizsgálati vegyi anyag előkészítése

A vizsgálati vegyi anyag megfelelő oldószerben való oldhatóságát a DPRA DB-ALM protokolljában (20) ismertetett szolubilizációs eljárás utáni vizsgálat végrehajtása előtt kell vizsgálni. Egy megfelelő oldószer teljes egészében feloldja a vizsgálati vegyi anyagot. Mivel a DPRA során a vizsgálati vegyi anyag inkubálása túlnyomórészt a cisztein- vagy lizintartalmú peptidekkel történik, az áttetsző oldat képződésének szemrevételezéses ellenőrzése elegendőnek tekintendő annak megállapításához, hogy a vizsgálati vegyi anyag (és több összetevőből álló anyag vagy keverék vizsgálata esetén a vizsgálati vegyi anyag valamennyi összetevője) feloldódik. Megfelelő oldószer az acetonitril, a víz, illetve a víz és az acetonitril 1:1 arányú keveréke, az izopropanol, az aceton vagy az aceton és az acetonitril 1:1 arányú keveréke. Más oldószerek akkor alkalmazhatók, ha nem fejtenek ki hatást a peptid C. referenciakontrollokkal (azaz a megfelelő oldószerben feloldott, csak peptidből álló mintákkal; lásd a 3. függeléket) nyomon követett stabilitására. Utolsó lehetőségként, ha a vizsgálati vegyi anyag nem oldható ezen oldószerek egyikében sem, kísérletet kell tenni 300 μL dimetil-szulfoxidban való szolubilizálására, a keletkezett oldatot pedig 2 700 μL acetonitrillel kell hígítani, és ha a vizsgálati vegyi anyag nem oldható ebben a keverékben, kísérletet kell tenni ugyanakkora mennyiségű vizsgálati vegyi anyag 1 500 μL dimetil-szulfoxidban való szolubilizálására, a keletkezett oldatot pedig 1 500 μL acetonitrillel kell hígítani. 100 mM koncentrációjú oldat elkészítéséhez a vizsgálati vegyi anyagot előzetesen ki kell mérni üvegfiolákba és közvetlenül a vizsgálata előtt megfelelő oldószerben fel kell oldani. Ismert összetételű keverékek és több összetevőből álló anyagok esetében az összetevők (a víz kivételével) arányának összegzésével egyetlen tisztaságot kell meghatározni, továbbá a keverék minden egyes összetevője (a víz kivételével) molekulatömegének és azok egyedi arányának figyelembevételével egyetlen látszólagos molekulatömeget kell meghatározni. Ezt követően a kapott tisztaságot és látszólagos molekulatömeget kell felhasználni a vizsgálati vegyi anyag 100 mM koncentrációjú oldat elkészítéséhez szükséges tömegének kiszámításához. Olyan polimerek esetében, amelyeknél a domináns molekulatömeg nem határozható meg, 100 mM koncentrációjú oldat elkészítéséhez figyelembe vehető a monomer molekulatömege (vagy polimert alkotó különféle monomerek látszólagos molekulatömege). Ismert összetételű keverékek, több összetevőből álló anyagok vagy polimerek vizsgálata során azonban mérlegelni kell a tiszta vegyi anyag vizsgálatát is. Folyadékok esetében a tiszta vegyi anyagot önmagában, előzetes hígítás nélkül, a ciszteintartalmú peptidekkel 1:10, illetve a lizintartalmú peptidekkel 1:50 mólarányban végzett inkubálással kell vizsgálni. Szilárd anyagok esetében a vizsgálati vegyi anyagot a látszólagos 100 mM koncentrációjú oldat elkészítéséhez használt oldószerrel megegyező oldószerben, maximális oldható koncentrációjában kell feloldani. Ezt követően önmagában, további hígítás nélkül, a ciszteintartalmú peptidekkel 1:10, illetve a lizintartalmú peptidekkel 1:50 arányban végzett inkubálással kell vizsgálni. A látszólagos 100 mM koncentrációjú oldat és a tiszta vegyi anyag egyező eredményeinek (reaktív vagy nem reaktív) az eredményre vonatkozó határozott következtetést kell lehetővé tenniük.

A pozitív kontroll, a referenciakontrollok és a koelúciós kontrollok elkészítése

Pozitív kontrollként acetonitrilben oldott, 100 mM koncentrációjú fahéjaldehidet (CAS-szám: 104-55-2; ≥95 %-os élelmiszer-minőségű tisztaság) kell alkalmazni. Alkalmazhatók más, lehetőleg középtartományba eső kiürülési értékeket biztosító, megfelelő pozitív kontrollok is, ha rendelkezésre állnak történeti adatok hasonló vizsgálatmenet-elfogadhatósági kritériumok származtatásához. A HPLC-vizsgálatmenet sorozatának ezenfelül referenciakontrollokat (azaz mindössze a megfelelő oldószerben feloldott peptidet tartalmazó mintákat) is tartalmaznia kell, amelyek a HPLC rendszer alkalmasságának a vizsgálat előtti ellenőrzésére (A. referenciakontrollok), a referenciakontrollok időbeli stabilitásának ellenőrzésére (B. referenciakontrollok), valamint annak ellenőrzésére használatosak, hogy a vizsgálati vegyi anyag feloldására alkalmazott oldószer nincs hatással a százalékos peptidkiürülésre (C. referenciakontrollok) (lásd a 3. függeléket). Az egyes vegyi anyagok tekintetében a megfelelő referenciakontroll használatos az adott vegyi anyagok százalékos peptidkiürülésének kiszámításához (lásd a 26. pontot). Ezenfelül a vizsgálatmenet-sorozatnak minden egyes elemzett vizsgálati vegyi anyag esetében kizárólag a vizsgálati vegyi anyaggal alkotott koelúciós kontrollt kell tartalmaznia a vizsgálati vegyi anyag lizintartalmú vagy ciszteintartalmú peptidekkel való lehetséges koelúciójának kimutatására.

A vizsgálati vegyi anyag ciszteintartalmú és lizintartalmú peptideket tartalmazó oldatokkal való inkubálása

A ciszteintartalmú peptideket tartalmazó oldatokat 1:10 arányban, a lizintartalmú peptideket tartalmazó oldatokat pedig 1:50 arányban kell automata mintaadagoló üvegfiolákban inkubálni a vizsgálati vegyi anyaggal. Ha a vizsgálati vegyi anyag alacsony vízoldékonysága miatt a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó oldat peptidoldathoz történő hozzáadásakor azonnal kicsapódás figyelhető meg, ebben az esetben nem lehet megbizonyosodni arról, hogy a vizsgálati vegyi anyagból mennyi maradt az oldatban ahhoz, hogy a peptiddel reakcióba lépjen. Ezért ilyen esetben a pozitív eredmények még felhasználhatóak, a negatív eredmények azonban bizonytalanok és kellő körültekintéssel értelmezendőek (a 100 mM koncentrációig nem oldható vegyi anyagok vizsgálatához lásd még a 11. pont rendelkezéseit). A reakcióoldatot a HPLC-elemzés lefuttatása előtt 24±2 óráig 25±2,5 °C-on, sötétben kell hagyni. Minden egyes vizsgálati vegyi anyagot mindkét peptid esetében három példányban kell elemezni. A HPLC-elemzés előtt a mintákat szemrevételezéssel kell ellenőrizni. Ha kicsapódás vagy fázisszétválás figyelhető meg, a mintákat elővigyázatosságból alacsony sebességen (100–400xg) centrifugálni lehet, hogy a kicsapódás a fiola aljára kerüljön, ugyanis a nagy mennyiségű kicsapódás eltömítheti a HPLC-csöveket vagy -oszlopokat. Ha az inkubációs időszak után kicsapódás vagy fázisszétválás figyelhető meg, a peptidkiürülés esetlegesen alulbecsülhető, és a reaktivitás hiányra vonatkozó következtetés nem vonható le kellő bizonyossággal negatív eredmény esetén.

A HPLC standard kalibrációs görbe elkészítése

A ciszteintartalmú és a lizintartalmú peptidekhez is standard kalibrációs görbét kell létrehozni. A peptidstandardokat 20 %-os vagy 25 %-os acetonitril-oldatban kell előkészíteni: a ciszteintartalmú peptidek esetében (7,5 pH-jú) foszfátpufferrel, a lizintartalmú peptidek esetében pedig (10,2 pH-jú) ammónium-acetát pufferrel előállított pufferben. A (0,667 mM koncentrációjú) peptid-törzsoldat sorozathígítási standardjainak alkalmazásával 6 kalibráló oldatot kell készíteni a 0,534–0,0167 mM közötti tartomány lefedése érdekében. A standard kalibrációs görbén a hígítópuffer vakpróbáját is fel kell tüntetni. Megfelelő kalibrációs görbék esetén r2 > 0,99.

A HPLC előkészítése és HPLC-elemzés

A HPLC-rendszer megfelelőségét ellenőrizni kell az elemzés elvégzése előtt. A peptidkiürülést UV-detektorral (fotodiódasoros detektorral vagy 220 nm-en küldött jellel működő hullámhossz-abszorbancia-detektorral) ellátott HPLC segítségével kell nyomon követni. A megfelelő oszlopot telepíteni kell a HPLC-rendszerbe. A validált protokollban ismertetett HPLC-beállítás előnyben részesített oszlopként Zorbax SB-C-18 típusú, 2,1 mm x 100 mm x 3,5 mikron méretű oszlopot alkalmaz. Az egész rendszert a működtetése előtt legalább két órán keresztül ezzel a fordított fázisú HPLC-oszloppal kell 30 °C-on 50 % A. fázissal (0,1 térfogatszázalék trifluoracetát-sav vízben) és 50 % B. fázissal (0,0,85 térfogatszázalék trifuloracetát-sav acetonitrilben) ekvilibrálni. A HPLC-elemzést 0,35 ml/perc áramlási sebesség mellett, lineáris gradiensként 10 percen keresztül 10–25 %-os acetonitrilt alkalmazva kell elvégezni oly módon, hogy ezután az egyéb anyagok eltávolítása érdekében gyorsan 90 %-osra kell növelni az acetonitrilt. Az egyes standardokból, mintákból és kontrollokból egyenlő mennyiséget kell befecskendezni. Az oszlopot a befecskendezések között hét percig az eredeti körülmények között újra ekvilibrálni kell. Eltérő fordított fázisú HPLC alkalmazása esetén a fent ismertetett beállítási paramétereket esetlegesen ki kell igazítani a cisztein- és a lizintartalmú peptidek megfelelő elúciójának és integrációjának biztosítása érdekében, esetlegesen ki kell igazítani a befecskendezett mennyiséget is, amely az alkalmazott rendszertől függően változhat (jellemzően 3–10 μl tartományban mozoghat). Fontos, hogy alternatív HPLC-beállítás alkalmazása esetén a fent ismertetett, validált beállítással való egyenértékűségét bizonyítani kell (például a 2. függelékben található jártassági tesztanyagok vizsgálatával). Az abszorbanciát 220 nm hullámhosszon kell nyomon követni. Fotodiódasoros detektor használata esetén a 258 nm-en mért abszorbanciát is rögzíteni kell. Megjegyzendő, hogy egyes acetonitril-szállítmányok negatív hatást fejthetnek ki a peptidek stabilitására, és ezt figyelembe kell venni az új gyártási sorozatból származó acetonitril használatakor. A 220-as csúcsterület és a 258-as csúcsterület aránya a koelúció mutatójaként használható. Az egyes minták esetében a 90 % <kontrollminták területi mutatójának átlaga ( 10 )<100 % közötti tartományba eső mutató megbízhatóan jelezheti, hogy nem következett be koelúció.

Egyes vizsgálati vegyi anyagok kiválthatják a ciszteintartalmú peptid oxidációját. A dimerizált ciszteintartalmú peptid csúcsa szemrevételezéssel ellenőrizhető. Ha úgy tűnik, hogy a dimerizáció bekövetkezett, ezt fel kell jegyezni, mivel a százalékos peptidkiürülés túlbecsülhető, ami hamis pozitív előrejelzésekhez és/vagy magasabb reaktivitási osztályba soroláshoz vezethet (lásd a 29. és 30. pontot).

A cisztein- és a lizintartalmú peptidek esetében a HPLC-elemzés egyidejűleg (ha két HPLC-rendszer áll rendelkezésre) vagy különböző napokon is elvégezhető. Ha az elemzésre különböző napokon kerül sor, mindkét napon frissen kell elkészíteni a vizsgálati vegyi anyagokat tartalmazó összes oldatot. Az elemzést úgy kell időzíteni, hogy biztosítható legyen az, hogy az első minta injektálása 22–26 órával a vizsgálati vegyi anyag peptidoldattal való elegyítését követően kezdődjön meg. A HPLC-vizsgálatmenet sorozatát úgy kell beállítani, hogy a HPLC-elemzés ideje 30 óránál rövidebb maradjon. A validálási vizsgálatban használt és az e vizsgálati módszerben ismertetett HPLC-beállítás legfeljebb 26 elemzési mintához alkalmazható egyetlen HPLC-vizsgálatmenetben (lásd még a 17. pontot). A HPLC-elemzési sorozat egy példája a 3. függelékben található.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az adatok kiértékelése

A cisztein- és a lizintartalmú peptid koncentrációját minden egyes mintában 220 nm-en kell fotometrikusan meghatározni a megfelelő csúcsok csúcsterületének (görbe alatti terület, AUC) mérésével és a peptid koncentrációjának a standardokból származtatott lineáris kalibrációs görbe segítségével történő kiszámításával.

A százalékos peptidkiürülést minden egyes mintában a csúcsterület mérésével, majd ennek a releváns C. referenciakontrollok (lásd a 3. függeléket) csúcsterület-átlagával, az alább ismertetett képlet szerint kell meghatározni.

image

Elfogadhatósági kritériumok

Ahhoz, hogy a vizsgálatmenet érvényesnek minősüljön, az alábbi kritériumoknak kell teljesülniük:

a. a standard kalibrációs görbe esetén r2 > 0,99,

b. a pozitív kontrollként szolgáló fahéjaldehid három párhuzamosa százalékos peptidkiürülési átlaga a ciszteintartalmú peptid esetében 60,8 % és 100 % között, a lizintartalmú peptid esetében pedig 40,2 % és 69,0 % között legyen, a pozitív kontrollként szolgáló párhuzamosoknál a maximális szórás 14,9 %-nál kisebb legyen a százalékos ciszteinkiürülés esetében és 11,6 %-nál kisebb legyen a százalékos lizinkiürülés esetében, továbbá

c. az A. referenciakontrollok peptidkoncentráció-átlagának 0,50±0,05 mM értékűnek kell lennie, az acetonitrilben lévő kilenc B. és C. referenciakontroll peptid-csúcsterülete variációs koefficiensének 15,0 %-nál alacsonyabbnak kell lennie.

Ha e kritériumok közül egy vagy több nem teljesül, a vizsgálatmenetet meg kell ismételni.

Ahhoz, hogy a vizsgálati vegyi anyag eredményei érvényesnek minősüljenek, az alábbi kritériumoknak kell teljesülniük:

a. a vizsgálati vegyi anyag párhuzamosai maximális szórásának a százalékos ciszteinkiürülés esetében 14,9 %-nál alacsonyabbnak, a százalékos lizinkiürülésnek pedig 11,6 %-nál alacsonyabbnak kell lennie,

b. a megfelelő oldószerben lévő három C. referenciakontroll peptidkoncentrációja átlagának 0,50±0,05 mM-nek kell lennie. E kritériumok teljesülésének hiányában az adatokat el kell vetni, és az adott vizsgálati vegyi anyag esetében a vizsgálatmenetet meg kell ismételni.

Előrejelző modell

A százalékos cisztein- és lizinkiürülés átlagát minden egyes vegyi anyagnál ki kell számítani. A negatív kiürülés »0«-nak tekintendő az átlag kiszámítása során. Az 1. táblázatban szemléltetett, 1:10 arányban ciszteint, 1:50 arányban lizint alkalmazó előrejelzési modell alkalmazásával a 6,38 %-os átlagos peptidkiürülési küszöbértéket kell használni a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében történő megkülönböztetésének alátámasztására. Az előrejelzési modellnek a vizsgálati vegyi anyagok adott reaktivitási osztályba (alacsony, mérsékelt és magas reaktivitás) sorolásához történő alkalmazása talán hasznosnak bizonyulhat egy integrált vizsgálati és értékelési megközelítésen belüli hatáserősség-vizsgálat szempontjából.



1. táblázat

1:10 arányban ciszteint, 1:50 arányban lizint alkalmazó előrejelzési modell (1)

A százalékos cisztein- és lizinkiürülés átlaga

Reaktivitási osztály

DPRA-val végzett előrejelzés (2)

0 % ≤ %-os kiürülés átlaga ≤ 6,38 %

Reaktivitás hiánya vagy minimális reaktivitás

Negatív

6,38 % < %-os kiürülés átlaga ≤ 22,62 %

Alacsony reaktivitás

Pozitív

22,62 % < %-os kiürülés átlaga ≤ 42,47 %

Mérsékelt reaktivitás

42,47 % < %-os kiürülés átlaga ≤ 100 %

Magas reaktivitás

(1)   A számok statisztikailag generált küszöbértékekre vonatkoznak, és nem függnek össze a mérés pontosságával.

(2)   A DPRA-val végzett előrejelzést integrált értékelési és vizsgálati megközelítés keretében, valamint a 9. és 12. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni.

Előfordulhatnak olyan esetek, amikor a vizsgálati vegyi anyag (az anyag, illetve valamely több összetevőből álló anyag vagy keverék egy vagy több összetevője) jelentős mértékben abszorbeálódik 220 nm-en, és retenciós ideje megegyezik a peptidével (koelúció). A vizsgálati vegyi anyag és a peptid elúciós idejének további szétválasztása érdekében a koelúció megoldható a HPLC-beállítás kismértékű kiigazításával. Ha a koelúció megoldására alternatív HPLC-beállítás használatos, a validált beállítással való egyenértékűségét be kell bizonyítani (például a 2. függelékben található jártassági tesztanyagok vizsgálatával). Koelúció bekövetkezésekor a peptid csúcsa nem integrálható és a százalékos peptidkiürülés kiszámítása nem lehetséges. Ha az ilyen vizsgálati vegyi anyagok koelúciója a cisztein- és a lizintartalmú peptidekkel is bekövetkezik, az elemzésről »nem meggyőző«-ként kell beszámolni. Olyan esetekben, ha a koelúció csak a lizintartalmú peptiddel következik be, a 2. táblázatban közölt, 1:10 arányban ciszteint alkalmazó előrejelzési modell alkalmazható.



2. táblázat

1:10 arányban ciszteint alkalmazó előrejelzési modell (1)

Százalékos ciszteinkiürülés

Reaktivitási osztály

DPRA-val végzett előrejelzés (2)

0 % ≤ %-os ciszteinkiürülés ≤ 13,89 %

Reaktivitás hiánya vagy minimális reaktivitás

Negatív

13,89 % < %-os ciszteinkiürülés ≤ 23,09 %

Alacsony reaktivitás

Pozitív

23,09 % < %-os ciszteinkiürülés ≤ 98,24 %

Mérsékelt reaktivitás

98,24 % < %-os ciszteinkiürülés ≤ 100 %

Magas reaktivitás

(1)   A számok statisztikailag generált küszöbértékekre vonatkoznak, és nem függnek össze a mérés pontosságával.

(2)   A DPRA-val végzett előrejelzést integrált értékelési és vizsgálati megközelítés keretében, valamint a 9. és 12. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni.

Előfordulhatnak egyéb olyan esetek, amikor a vizsgálati vegyi anyag vagy bármelyik peptid retenciós ideje közötti átfedés nem teljes. Ilyen esetekben a százalékos peptidkiürülési értékeket meg lehet becsülni és fel lehet használni az 1:10 arányban ciszteint, illetve az 1:50 arányban lizint alkalmazó előrejelzési modellben, a vizsgálati vegyi anyag reaktivitási osztályba sorolása ugyanakkor nem végezhető el pontosan.

A vizsgálati vegyi anyag esetében a cisztein- és a lizintartalmú peptideknél is elegendőnek kell lennie egyetlen HPLC-elemzésnek, ha az eredmény nem egyértelmű. A pozitív és a negatív eredmények megkülönböztetéséhez használt küszöbértékhez közeli eredmények (vagyis határesethez közeli eredmények) esetében további vizsgálatokra lehet szükség. Ha a százalékos kiürülés átlaga az 1:10 arányban ciszteint/1:50 arányban lizint alkalmazó előrejelzési modell esetén 3–10 % közé esik, vagy ha a százalékos ciszteinkiürülés az 1:10 arányban ciszteint alkalmazó előrejelzési modell esetén 9–17 % közé esik, mérlegelni kell egy második vizsgálatmenetet, valamint az első két vizsgálatmenet nem egyező eredményei esetén egy harmadik vizsgálatmenetet.

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Vizsgálati vegyi anyag

 Egy összetevőből álló anyag:

 

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név (nevek), CAS-szám(ok), SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet és/vagy más azonosítók;

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság, molekulatömeg, valamint további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok, amennyiben rendelkezésre állnak;

 tisztaság, adott és a gyakorlatban megvalósítható esetben a szennyeződések kémiai azonossága stb.;

 vizsgálat előtti kezelés, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

 vizsgált koncentráció(k);

 tárolási feltételek és stabilitás, amennyiben rendelkezésre állnak.

 Több összetevőből álló anyagok, UVCB-k és keverékek:

 

 amennyiben lehetséges, az összetevőknek például a kémiai azonosítója (lásd fent), tisztasága, mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai (lásd fent) jellemzik, amennyiben rendelkezésre állnak;

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok, amennyiben rendelkezésre állnak;

 molekulatömeg vagy látszólagos molekulatömeg ismert összetételű keverékek/polimerek esetén, vagy a vizsgálat lebonyolítása szempontjából releváns egyéb információ;

 vizsgálat előtti kezelés, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

 vizsgált koncentráció(k);

 tárolási feltételek és stabilitás, amennyiben rendelkezésre állnak.

Kontrollok

 Pozitív kontroll

 

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név (nevek), CAS-szám(ok), SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet és/vagy más azonosítók;

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság, molekulatömeg, valamint további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok, amennyiben rendelkezésre állnak;

 tisztaság, adott és a gyakorlatban megvalósítható esetben a szennyeződések kémiai azonossága stb.;

 vizsgálat előtti kezelés, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

 vizsgált koncentráció(k);

 tárolási feltételek és stabilitás, amennyiben rendelkezésre állnak;

 adott esetben a pozitív kontrolloknak a vizsgálatmenet elfogadhatósági kritériumoknak való megfelelőségét bizonyító korábbi eredményei.

 Oldószer/Vivőanyag

 

 az alkalmazott oldószer/vivőanyag és adott esetben az összetevőinek aránya;

 kémiai azonosítás(ok), például IUPAC- vagy CAS-név (nevek), CAS-szám(ok) és/vagy más azonosítók;

 tisztaság, adott és a gyakorlatban megvalósítható esetben a szennyeződések kémiai azonossága stb.;

 fizikai megjelenés, molekulatömeg, valamint további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok, amennyiben a vizsgálati módszerben említett oldószerektől/vivőanyagoktól eltérő oldószerek/vivőanyagok használatosak, és amennyiben rendelkezésre állnak;

 tárolási feltételek és stabilitás, amennyiben rendelkezésre állnak;

 az oldószer kiválasztásának indoklása minden egyes vizsgálati vegyi anyag esetében;

 az acetonitril esetében a peptid stabilitására kifejtett hatás vizsgálatának eredményei.

A peptidek, a pozitív kontroll és a vizsgálati vegyi anyag előkészítése

 a peptidoldatok jellemzése (a peptid beszállítója, tétele, pontos tömege, a törzsoldathoz adott mennyisége);

 a pozitív kontrollt tartalmazó oldatok jellemzése (a pozitív kontrollanyag pontos tömege, a vizsgálati oldathoz adott mennyisége);

 a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó oldatok jellemzése (a vizsgálati vegyi anyag pontos tömege, a vizsgálati oldathoz adott mennyisége)

A HPLC-műszer beállítása és az azzal végzett elemzés

 a HPLC-műszer, a HPLC- és az előtétoszlopok, a detektor, az automata mintaadagoló típusa;

 a HPLC-elemzés szempontjából releváns paraméterek, például az oszlop hőmérséklete, a befecskendezett térfogat, az áramlási sebesség és a gradiens.

A rendszer alkalmassága

 valamennyi standard és párhuzamos A. referenciakontroll peptid-csúcsterülete 220 nm-en;

 a grafikusan ábrázolt lineáris kalibrációs görbe és a bejelentett r2;

 az egyes párhuzamos A. referenciakontrollok peptidkoncentrációja;

 a három A. referenciakontroll peptidkoncentrációjának (mM) átlaga, szórása és variációs koefficiense;

 az A. és C. referenciakontrollok peptidkoncentrációja.

Elemzéssorozat

 A referenciakontrollok esetében:

 

 mindegyik párhuzamos B. és C. referenciakontroll peptid-csúcsterülete 220 nm-en;

 az acetonitrilben lévő kilenc B. és C. referenciakontroll 220 nm-en számított peptid-csúcsterületének átlaga, szórása és variációs koefficiense (a referenciakontrollok elemzési idő alatti stabilitásához);

 mindegyik használt oldószer esetében a három megfelelő C. referenciakontroll 220 nm-en számított peptid-csúcsterületének átlaga (a százalékos peptidkiürülés számításához);

 mindegyik használt oldószer esetében a három megfelelő C. referenciakontroll peptidkoncentrációja (mM);

 mindegyik használt oldószer esetében a három megfelelő C. referenciakontroll peptidkoncentrációjának (mM) átlaga, szórása és variációs koefficiense.

 A pozitív kontroll esetében:

 

 mindegyik párhuzamos kontroll 220 nm-en számított peptid-csúcsterülete;

 mindegyik párhuzamos kontroll százalékos peptidkiürülése;

 mindhárom párhuzamos kontroll százalékos peptidkiürülésének átlaga, szórása és variációs koefficiense.

 Minden egyes vizsgálati vegyi anyag esetében:

 

 kicsapódás megjelenése a reakciókeverékben az inkubációs idő végén, ha megfigyelték; a kicsapódást újra feloldották-e vagy centrifugálták-e;

 koelúció jelenléte;

 adott esetben bármely egyéb releváns észrevétel leírása;

 mindegyik párhuzamos kontroll 220 nm-en számított peptid-csúcsterülete;

 mindegyik párhuzamos kontroll százalékos peptidkiürülése;

 a három párhuzamos kontroll százalékos peptidkiürülésének átlaga, szórása és variációs koefficiense;

 a százalékos cisztein- és a százalékos lizinkiürülési értékek átlaga;

 az alkalmazott előrejelzési modell és a DPRA-val végzett előrejelzés.

Jártassági vizsgálat

 Adott esetben a vizsgálati módszer végrehajtásában való laboratóriumi jártasság igazolására alkalmazott eljárás (például jártassági tesztanyagok vizsgálatával) vagy a vizsgálati módszer idővel reprodukálható végrehajtásának igazolására alkalmazott eljárás.

Az eredmények tárgyalása

 a DPRA-val kapott eredmények tárgyalása;

 a vizsgálati módszer eredményeinek integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében történő tárgyalása, amennyiben rendelkezésre állnak más releváns információk.

Következtetés

SZAKIRODALOM

(1) Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Elérhető a következő címen: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html

(2) OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris.

(3) E melléklet B.6., Bőrszenzibilizáció című fejezete.

(4) E melléklet B.42., Lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer című fejezete

(5) E melléklet B.50., Bőrszenzibilizáció: Lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (LLNA): DA című fejezete.

(6) E melléklet B.51., Bőrszenzibilizáció: Lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer: BrdU-ELISA című fejezete

(7) Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85:367-485.

(8) Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81:332-343.

(9) Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97:417-427.

(10) EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing. Elérhető a következő címen: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra

(11) Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. Journal of Applied Toxicology, published online, 14 May 2013, DOI: 10.1002/jat.2869.

(12) Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489-504.

(13) Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618.

(14) Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389-400.

(15) Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625-639.

(16) Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc.

(17) Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin.

(18) EC EURL ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Accessible at: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra

(19) Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI:10.1002/jat.2868.

(20) DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Elérhető a következő címen: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/

(21) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France.

(22) FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Elérhető a következő címen: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf – 138

(23) ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).




1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálat milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket (21).

Káros kimeneti út (Adverse Outcome Pathway, AOP) : valamely megcélzott vegyi anyag vagy hasonló vegyi anyagok csoportjának kémiai szerkezetéből kiinduló, a molekuláris kiváltó eseményen keresztül az érintett in vivo eredményig végbemenő eseménysorozat (2).

Kalibrációs görbe : valamely ismert anyag kísérleti válaszértéke és analitikai koncentrációja közötti összefüggés (más néven: standard görbe).

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Variációs koefficiens : a variabilitás mértékegysége, amelyet a párhuzamos adatcsoportok esetében a szórás és az átlag hányadosaként kell kiszámítani. Százalékos arányként történő kifejezéséhez 100-zal megszorozható.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni az élő szervezet, rendszer vagy (al)populáció anyagnak való expozíciójakor.

Integrált vizsgálati és értékelési megközelítés : valamely vegyi anyag vagy vegyianyag-csoport veszélyeinek azonosításához (potenciál), jellemzéséhez (hatáserősség) és/vagy biztonsági értékeléséhez (potenciál, hatáserősség és expozíció) alkalmazott strukturált megközelítés, amely stratégiai szempontból beépít és mérlegel minden olyan releváns adatot, amely hozzájárul a lehetséges veszélyre és/vagy kockázatra és/vagy a további célirányos és ezért minimális vizsgálat szükségességére vonatkozó szabályozói döntéshozatalhoz.

Molekuláris kiváltó esemény : valamely biológiai rendszer vegyi anyag által, molekuláris szinten kiváltott zavara, amely a káros kimeneti útban a kezdőeseményként határozandó meg.

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba (1).

Egy összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben az egyik fő összetevő legalább 80 tömegszázalékban van jelen.

Több összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben egynél több fő összetevő legalább 10 tömegszázalékban, de 80 tömegszázalékot nem meghaladó koncentrációban van jelen. A több összetevőből álló anyag gyártási folyamat eredménye. A keverék és a több összetevőből álló anyag között az a különbség, hogy a keverék két vagy több anyag összekeverésével, kémiai reakció nélkül jön létre. A több összetevőből álló anyag kémiai reakció eredménye.

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Referenciakontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét az oldószerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmazó nem kezelt minta, amelyet a vizsgálati vegyi anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollmintákkal együtt kell feldolgozni az ugyanazon oldószerben feloldott vagy ugyanazon vivőanyaggal felvitt vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták kiindulási értékeinek megállapítása érdekében. Párhuzamos negatív kontrollal elvégzett vizsgálata esetén ez a minta azt is bizonyítja, hogy az oldószer vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati rendszerrel.

Relevancia : a vizsgálat és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt tükrözi, hogy a vizsgálat mennyire pontosan méri vagy jelzi előre a vizsgált biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontosságát (az eredmények egyezését) figyelembe kell venni (21).

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik (21).

Reprodukálhatóság : ugyanazon vegyi anyag ugyanazon vizsgálati protokollal végzett vizsgálata során kapott eredmények egyezése (lásd: megbízhatóság) (21).

Érzékenység : az összes olyan pozitív/aktív vegyi anyag aránya, amelyet a vizsgálati módszer helyesen sorolt be. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (21).

Specifikusság : a vizsgálati módszerrel helyesen besorolt összes negatív/inaktív vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (21).

Anyag : természetes állapotban előforduló vagy ipari termelőfolyamatból származó kémiai elemek és azok vegyületei, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők (1).

A rendszer alkalmassága : a műszer teljesítményének (például érzékenységének) az analitikai programcsomag lefuttatása előtt, referenciastandard segítségével végzett elemzésével történő meghatározása (22).

Vizsgálati vegyi anyag : a »vizsgálati vegyi anyag« kifejezés a vizsgálat tárgyát képező anyagra való hivatkozáshoz használatos.

A vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (1).

UVCB : Ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyagok.

Érvényes vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amely kellően relevánsnak és megbízhatónak minősül egy adott célra, és amely tudományosan megalapozott elveken alapul. Egy-egy vizsgálati módszer abszolút értelemben soha nem érvényes, kizárólag meghatározott céllal összefüggésben az (21).




2. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK

In chemico bőrszenzibilizáció: közvetlen peptidreaktivitási vizsgálat

E vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak oly módon kell igazolniuk szakmai jártasságukat, hogy az 1. táblázatban javasolt 10 jártassági tesztanyagra vonatkozóan a közvetlen peptidreaktivitási vizsgálattal a várható előrejelzést helyesen állapítják meg, továbbá az egyes peptidek tekintetében a 10 jártassági tesztanyag közül 8 esetében a referenciatartományba eső cisztein- és lizinkiürülési értékeket kapják meg. E jártassági tesztanyagok kiválasztása oly módon történt, hogy a bőrszenzibilizáció veszélye esetén bekövetkező különféle válaszreakciókat képviseljék. További kiválasztási kritérium volt, hogy a jártassági tesztanyagok kereskedelmi forgalomban kaphatóak legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok és a közvetlen peptidreaktivitási vizsgálattal generált, kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre, és azokat az EURL ECVAM által koordinált validálási vizsgálatban felhasználják a vizsgálati módszernek a vizsgálatban részt vevő laboratóriumokban történő sikeres végrehajtásának bizonyítása érdekében.



1. táblázat

A közvetlen peptidreaktivitási vizsgálatban való szakmai jártasság bizonyításához ajánlott anyagok

Jártassági tesztanyagok

CASRN

Halmazállapot

In vivo előrejelzés (1)

DPRA-val végzett előrejelzés (2)

A ciszteintartalmú peptid százalékos kiürülésének tartománya (3)

A lizintartalmú peptid százalékos kiürülésének tartománya (3)

2,4-dinitro-klór-benzol

97-00-7

Szilárd

Szenzibilizáló

(szélsőségesen)

Pozitív

90–100

15-45

Oxazolon

15646-46-5

Szilárd

Szenzibilizáló

(szélsőségesen)

Pozitív

60–80

10–55

Formaldehid

50-00-0

Folyadék

Szenzibilizáló

(erősen)

Pozitív

30–60

0–24

Benzilidén-aceton

122-57-6

Szilárd

Szenzibilizáló

(mérsékelten)

Pozitív

80–100

0–7

Farnezal

19317-11-4

Folyadék

Szenzibilizáló

(enyhén)

Pozitív

15–55

0-25

2,3-butándion

431-03-8

Folyadék

Szenzibilizáló

(enyhén)

Pozitív

60–100

10–45

1-butanol

71-36-3

Folyadék

Nem szenzibilizáló

Negatív

0–7

0–5,5

6-metil-kumarin

92-48-8

Szilárd

Nem szenzibilizáló

Negatív

0–7

0–5,5

Tejsav

50-21-5

Folyadék

Nem szenzibilizáló

Negatív

0–7

0–5,5

4-metoxi-acetofenon

100-06-1

Szilárd

Nem szenzibilizáló

Negatív

0–7

0–5,5

(1)   Az in vivo veszélyekre és (a hatáserősségre vonatkozó) előrejelzések LLNA-adatokon alapulnak (19). Az in vivo hatáserősség levezetése az ECETOC által javasolt kritériumok segítségével történik (23).

(2)   A DPRA-val végzett előrejelzést integrált értékelési és vizsgálati megközelítés keretében, valamint a 9. és 11. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni.

(3)   6 független laboratórium által előállított, legalább 10 kiürülési érték alapján meghatározott tartományok.




3. függelék

ELEMZÉSSOROZATRA VONATKOZÓ PÉLDÁK



Kalibráló standardok és referenciakontrollok

STD1

STD2

STD3

STD4

STD5

STD6

Hígítópuffer

A. referenciakontroll, 1. párhuzamos

A. referenciakontroll, 2. párhuzamos

A. referenciakontroll, 3. párhuzamos

Koelúciós kontrollok

Az 1. vizsgálati vegyi anyaghoz tartozó 1. koelúciós kontroll

Az 2. vizsgálati vegyi anyaghoz tartozó 2. koelúciós kontroll

Referenciakontrollok

B. referenciakontroll, 1. párhuzamos

B. referenciakontroll, 2. párhuzamos

B. referenciakontroll, 3. párhuzamos

Párhuzamosok első sorozata

C. referenciakontroll, 1. párhuzamos

Fahéjaldehid, 1. párhuzamos

1. minta, 1. párhuzamos

2. minta, 1. párhuzamos

Párhuzamosok második sorozata

C. referenciakontroll, 2. párhuzamos

Fahéjaldehid, 2. párhuzamos

1. minta, 2. párhuzamos

2. minta, 2. párhuzamos

Párhuzamosok harmadik sorozata

C. referenciakontroll, 3. párhuzamos

Fahéjaldehid, 3. párhuzamos

1. minta, 3. párhuzamos

2. minta, 3. párhuzamos

Referenciakontrollok

B. referenciakontroll, 4. párhuzamos

B. referenciakontroll, 5. párhuzamos

B. referenciakontroll, 6. párhuzamos

Három referenciakontroll-sorozatot (azaz mindössze a megfelelő oldószerben feloldott peptidből álló mintákat) kell az elemzéssorozatban alkalmazni:

A. referenciakontroll: a HPLC-rendszer alkalmasságának ellenőrzésére használatos.

B. referenciakontroll: az elemzéssorozat elején és végén alkalmazzák a referenciakontrollok elemzési idő alatti stabilitásának ellenőrzéséhez.

C. referenciakontroll: annak ellenőrzése érdekében alkalmazzák az elemzéssorozatban, hogy a vizsgálati vegyi anyag feloldására használt oldószer nem befolyásolja-e a százalékos peptidkiürülést.

B.60.    In vitro bőrszenzibilizáció: ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer

BEVEZETÉS

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 442D. vizsgálati iránymutatásában (2015) leírt módszerrel. A bőrszenzibilizáló anyag a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete (ENSZ) által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) (1) és az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézéséről és csomagolásáról szóló 1272/2008/EK rendelet ( 11 ) (CLP-rendelet) szerint olyan anyag, amely a bőrrel való érintkezést követően allergiás reakciót vált ki. Ez a vizsgálati módszer olyan in vitro eljárást (ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat) tesz lehetővé, amellyel támogatható a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetése az ENSZ-GHS-nek (1) és a CLP-rendeletnek megfelelően.

A bőrszenzibilizációt előidéző főbb biológiai eseményeket illetően általános egyetértés van. A bőrszenzibilizációhoz kapcsolódó kémiai és biológiai mechanizmusokról már rendelkezésre álló ismereteket úgynevezett káros kimeneti út (Adverse Outcome Pathway, AOP) (2) foglalja össze a molekuláris kiváltó eseménytől a köztes eseményeken át a káros hatásig, amely embereknél allergiás kontakt bőrgyulladás, rágcsálóknál pedig kontakt túlérzékenység (2) (3). A molekuláris kiváltó esemény az elektrofil anyagok és a bőrben lévő fehérjék nukleofil centrumai között létrejövő kovalens kötés. E káros kimeneti úton a második kulcsfontosságú esemény a keratinsejtekben következik be, többek között gyulladást okozó reakciók, valamint konkrét sejtjelző útvonalakhoz, például az antioxidáns/elektrofil válaszelemtől (ARE) függő útvonalakhoz kapcsolódó génexpresszió formájában. A harmadik kulcsfontosságú esemény a dendritikus sejtek aktivációja, melynek értékelése jellemzően konkrét sejtfelületi markerek, kemokinek és citokinek expressziója alapján történik. A negyedik kulcsfontosságú esemény a T-sejtek proliferációja, melynek közvetett értékelése az egereken alkalmazott lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (4) keretében történik.

A bőrszenzibilizáció vizsgálata jellemzően kísérleti állatokon történő vizsgálatot foglal magában. A tengerimalacokon alkalmazott klasszikus módszerek, vagyis a Magnusson–Kligman-féle tengerimalac-maximizációs vizsgálat és a Bühler-féle vizsgálat (B.6. vizsgálati módszer (5)) egyaránt a bőrszenzibilizáció indukciós és kiváltási fázisával foglalkozik. Az egereken alkalmazott lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (LLNA, B.42. vizsgálati módszer (4)) és két nem radioaktív változata, az LLNA: DA (B.50. vizsgálati módszer (6)) és az LLNA: BrdU-ELISA (B.51. vizsgálati módszer (7)), amely mind csak az indukciós reakciót vizsgálja, szintén elfogadottá vált, mivel állatjólét szempontjából előnyösebbek, mint a tengerimalacon végzett vizsgálatok, és objektív mérést tesznek lehetővé a bőrszenzibilizáció indukciós fázisában.

Újabban a mechanisztikus alapú in chemico és in vitro vizsgálati módszerek a vegyi anyagok bőrszenzibilizációs veszélyének értékelése szempontjából tudományosan megalapozottnak tekinthetőek. Szükség lesz azonban nem állatokon alkalmazott módszerek (in silico, in chemico, in vitro) integrált vizsgálati és értékelési megközelítésen belüli kombinációira a jelenleg alkalmazott állatkísérletek teljes felváltásához, mivel a jelenleg rendelkezésre álló, nem állatokon alkalmazott vizsgálati módszerekre a káros kimeneti út mechanisztikus szempontjai csak korlátozott mértékben terjednek ki (2) (3).

Ez a vizsgálati módszer (ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat) a 2. pontban kifejtett második kulcsfontosságú esemény tárgyalására javasolt. Beszámolók szerint a bőrszenzibilizáló anyagok antioxidáns válaszelemmel (ARE) szabályozott géneket idéznek elő (8) (9). A bőrszenzibilizáló anyagokhoz hasonló, kisméretű elektrofil anyagok kifejthetnek hatást a Keap1 szenzorfehérjére (Kelch-like ECH-associated protein 1) például cisztein-maradékának kovalens módosításával, ami az Nrf2 transzkripciós faktortól (nukleáris faktor-eritroid 2-kapcsolt faktor 2) való különválását eredményezi. A disszociált Nrf2 ezt követően aktiválhat ARE-függő géneket, például a II. fázisban ható detoxifikáló enzimeket kódoló géneket (8) (10) (11).

Jelenleg az e vizsgálati módszer keretébe tartozó in vitro ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat csak a KeratinoSensTM vizsgálat, amelyre vonatkozóan validálási vizsgálatokat bonyolítottak (9) (12) (13), és azokat az állatkísérletek alternatív módszereinek uniós referencialaboratóriuma (EURL ECVAM) által végzett független szakértői értékelés (14) követte. A KeratinoSensTM vizsgálat egy integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében történő alkalmazásra, a veszélyességi osztályozás és címkézés céljából a bőrszenzibilizáló és nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetésének alátámasztására tudományosan megalapozottnak minősült (14). A vizsgálati módszert bevezetni kívánó laboratóriumok a KeratinoSensTM vizsgálat során használt rekombináns sejtvonalat a vizsgálati módszer kifejlesztőjével kötött licenciamegállapodással szerezhetik meg (15).

A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK, ALKALMAZHATÓSÁG ÉS KORLÁTOK

Mivel a Keap1-Nrf2-ARE útvonal aktiválása a bőrszenzibilizációs káros kimeneti útnak csak a második kulcsfontosságú eseményét érinti, nem valószínű, hogy a vizsgálati módszerekből származó, ezen útvonal aktiválásán alapuló információk önmagukban elegendőek a vegyi anyagok bőrszenzibilizáló hatásának megállapításához. Ezért az e vizsgálati módszerrel kapott adatokat integrált megközelítés, például integrált vizsgálati és értékelési megközelítés összefüggésében kell mérlegelni olyan egyéb, kiegészítő információkkal együtt, mint a bőrszenzibilizációs káros kimeneti út más kulcsfontosságú eseményeivel foglalkozó in vitro vizsgálatok eredményei, valamint a vizsgálat nélküli módszerekkel, köztük a kémiai analógokból kereszthivatkozással kapott adatok. Az ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer alkalmazására vonatkozó példák egyéb információkkal együtt a szakirodalomban szerepelnek (13) (16) (17) (18) (19).

Ez a vizsgálati módszer az integrált vizsgálati és értékelési megközelítéssel összefüggésben felhasználható a bőrszenzibilizáló (vagyis az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozó) és a nem szenzibilizáló anyagok megkülönböztetésének támogatására. Ez a vizsgálati módszer nem alkalmazható önmagában sem a bőrszenzibilizáló anyagoknak az ENSZ-GHS-ben/a CLP-rendeletben meghatározott 1A. és 1B. alkategóriába sorolására, sem a hatáserősség előrejelzésére a biztonsági értékeléssel kapcsolatos döntések esetén. A szabályozási kerettől függően azonban a pozitív eredmények önmagukban is felhasználhatók a vegyi anyagok ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába sorolására.

A validálási vizsgálat adatkészlete és a vizsgálati módszer független szakértői értékeléséhez használt házon belüli vizsgálatok alapján a KeratinoSensTM vizsgálatról bebizonyosodott, hogy áthelyezhető a sejttenyésztés területén tapasztalattal rendelkező laboratóriumokba. A vizsgálati módszertől várható előrejelzések reprodukálhatóságának mértéke a laboratóriumokon belül és között mintegy 85 % (14). A KeratinoSensTM vizsgálatnak a bőrszenzibilizáló (azaz az ENSZ-GHS/a CLP-rendelet szerinti 1. kategóriába tartozó) anyagok nem szenzibilizáló anyagoktól való megkülönböztetése tekintetében érvényes, az LLNA vizsgálati módszer eredményéhez viszonyított pontossága, (77 % – 155/201), érzékenysége (78 % – 71/91) és specifikussága (76 % – 84/110) a vizsgálati módszer értékelése és szakértői értékelése céljából az EURL ECVAM-hoz benyújtott összes adat figyelembevételével került kiszámításra (14). Ezek a számadatok hasonlóak a mintegy 145 anyag (77 %-os pontosság, 79 %-os érzékenység, 72 %-os specifikusság) házon belüli vizsgálata alapján nemrég közzétett számadatokhoz (13). A KeratinoSensTM vizsgálat nagyobb valószínűséggel jelez előre alacsonyabb értékeket olyan vegyi anyagoknál, amelyeknek alacsonytól mérsékeltig terjedő a szenzibilizáló hatása (azaz az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti 1B. alkategóriába tartozó anyagoknál), mint a rendkívül bőrszenzibilizáló hatást mutató vegyi anyagoknál (azaz az ENSZ-GHS/a CLP-rendelet szerinti 1A. alkategóriába tartozó anyagoknál) (13) (14). Ezek az információk összességében azt jelzik, hogy a KeratinoSensTM vizsgálat érdemben hozzájárul a bőrszenzibilizáció veszélyének azonosításához. A KeratinoSensTM vizsgálat mint önálló vizsgálati módszer esetében itt megadott pontossági értékek azonban csak irányadóak, ugyanis a vizsgálati módszert az integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében más információforrásokkal együtt és a fenti 9. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni. Ezen túlmenően a bőrszenzibilizáció nem állatokon alkalmazott módszereinek értékelésekor nem szabad megfeledkezni arról, hogy az LLNA vizsgálat, valamint más állatkísérletek nem feltétlenül tükrözik teljes egészében az érintett fajnál, például az embernél fennálló helyzetet.

E vizsgálati módszer esetében a »vizsgálati vegyi anyag« kifejezés a vizsgálat tárgyát képező vegyi anyagra vonatkozik, nem az ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat anyagok és/vagy keverékek vizsgálatára való alkalmazhatóságához kapcsolódik. A jelenleg rendelkezésre álló adatok alapján a KeratinoSensTM vizsgálatról bebizonyosodott, hogy különféle szerves funkciós csoportokat, reakciómechanizmusokat, (in vivo vizsgálatok során meghatározott) bőrszenzibilizáló hatásokat és fizikai-kémiai tulajdonságokat képviselő vizsgálati vegyi anyagokra alkalmazandó (9) (12) (13) (14). Elsősorban egy összetevőből álló anyagok vizsgálatára került sor, bár a keverékek vizsgálatára vonatkozóan is rendelkezésre áll korlátozott mennyiségű információ (20). A vizsgálati módszer mindazonáltal a több összetevőből álló anyagok és keverékek vizsgálatára technikailag alkalmazható. E vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt azonban meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény. Ezenfelül a több összetevőből álló anyagok vagy keverékek vizsgálata során figyelembe kell venni a citotoxikus összetevőknek a megfigyelt válaszreakciókkal való lehetséges kölcsönhatását. A vizsgálati módszer olyan vizsgálati vegyi anyagokra alkalmazandó, amelyek a vízben vagy dimetil-szulfoxidban oldhatók vagy azokkal stabil diszperziót (azaz olyan kolloidot vagy szuszpenziót, amelyben a vizsgálati vegyi anyag nem ülepedik le, illetve nem válik szét az oldószertől különböző fázisokra) alkotnak (több összetevőből álló anyag vagy keverék vizsgálata esetén ez a vizsgálati vegyi anyag összes összetevőjére igaz). Azok a vizsgálati vegyi anyagok, amelyek a legmagasabb előírt végleges koncentrációnál (2 000 μM) nem teljesítik ezeket a feltételeket (lásd a 22. pontot), alacsonyabb koncentrációknál továbbra is vizsgálhatók. Ilyen esetben a pozitivitás 39. pontban ismertetett kritériumainak megfelelő eredmények továbbra is felhasználhatók a vizsgálati vegyi anyag bőrszenzibilizálóként történő azonosítására, míg az 1 000 μM koncentrációnál alacsonyabb koncentrációk alkalmazásával kapott negatív eredmény nem meggyőzőnek tekintendő (lásd a 39. pontban lévő előrejelzési modellt). Az 5-nél nem magasabb LogP értékű anyagok vizsgálata általában sikeres, míg a 7-nél magasabb LogP értékű, rendkívül hidrofób anyagok a vizsgálati módszert ismert alkalmazhatóságán kívül esnek (14). Az 5 és 7 közötti LogP értékű anyagokra vonatkozóan csak kevés információ áll rendelkezésre.

A negatív eredményeket óvatosan kell értelmezni, mivel a kizárólagosan a lizinmaradékok felé reaktivitást mutató anyagokat a vizsgálati módszer negatívként mutathatja ki. Ezen túlmenően az alkalmazott sejtvonal korlátozott metabolikus képessége (21) és a kísérleti körülmények miatt különösen a lassú oxidációs rátájú pro-hapténok (azaz például a P450 enzim közreműködésével enzimatikus aktivációt igénylő vegyi anyagok) és pre-hapténok (azaz az automatikus oxidációval aktiválódó vegyi anyagok) is adhatnak negatív eredményeket. Másrészt a nem szenzibilizálóként ható, de ennek ellenére kémiai stresszorként fellépő vizsgálati vegyi anyagok hamis pozitív eredményekhez vezetnek (14). Ezenfelül a rendkívül citotoxikus vizsgálati vegyi anyagok nem mindig értékelhetők megbízhatóan. Végezetül a luciferáz enzimmel kölcsönhatásba lépő vizsgálati vegyi anyagok megzavarhatják a luciferáz hatását a sejtes tesztekben, látszólagos gátlást vagy megnövekedett lumineszcenciát okozva (22). Beszámoltak például arról, hogy az 1 μM-nél magasabb fitoösztrogén-koncentráció a luciferáz riportergén túlzott aktiválása miatt zavarja a lumineszcencia jeleit más, luciferáz alapú riportergén-vizsgálatokban (23). Következésképp a magas fitoösztrogén-koncentráció mellett vagy feltehetőleg a luciferáz riportergént a fitoösztrogénhez hasonlóan túlzottan aktiváló hasonló vegyi anyagok magas koncentrációja mellett kapott luciferáz-expressziót körültekintően meg kell vizsgálni (23). Olyan esetekben, ha bizonyítékkal igazolható, hogy a vizsgálati módszer nem alkalmazható más, konkrét vegyianyag-kategóriákra, a vizsgálati módszert nem szabad e vegyianyag-kategóriákra alkalmazni.

A KeratinoSensTM vizsgálat – amellett, hogy alátámasztja a bőrszenzibilizáló és a nem szenzibilizáló anyagok közötti különbségtételt – olyan koncentráció-válasz információval is szolgál, amely hozzájárulhat a szenzibilizáló hatáserősség értékeléséhez is, ha az integrált értékelési és vizsgálati megközelítéshez hasonló integrált megközelítés keretében használják (19). Szükség van azonban további, lehetőleg megbízható humán adatokon alapuló kutatásra annak meghatározása érdekében, hogy a KeratinoSensTM vizsgálat eredményei hogyan járulnak hozzá a hatáserősség értékeléséhez (24) és a szenzibilizáló anyagoknak az ENSZ-GHS/CLP-rendelet szerinti alkategóriákba sorolásához.

A VIZSGÁLAT ELVE

Az ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer a szelektálható plazmiddal stabilan transzfektált HaCaT emberi keratinocitákból származó immortalizált adherens sejtvonalakat használ. A sejtvonal az azt alkotó promóter, valamint a bőrszenzibilizáló anyagokkal közismerten felülszabályozott génből származó antioxidáns válaszelem fúziójának transzkripciós szabályozása mellett tartalmazza a luciferáz gént (25) (26). A luciferáz jel az endogén Nrf2-függő gének szenzibilizáló anyagokkal való aktiválását tükrözi, és a rekombináns sejtvonalon belüli luciferáz jelnek az Nrf2 transzkripciós faktortól való függősége bizonyítást nyert (27). Ez lehetővé teszi a luciferázgén-indukció (lumineszcencia-detektálással történő) kvantitatív mérését, mégpedig az Nfr2 transzkripciós faktor elektrofil anyagoknak való expozíciót követő, sejteken belüli aktivitásának mutatójaként jól bevált fénytermelő luciferáz szubsztrátok segítségével.

A KeratinoSens™ vizsgálatban a vizsgálati vegyi anyagok akkor minősülnek pozitívnak, ha egy adott küszöbérték felett a luciferáz-aktivitás statisztikailag szignifikáns (azaz 1,5-szeresnél nagyobb vagy 50 %-os) indukcióját idézik elő egy olyan meghatározott koncentráció alatt, amely nem befolyásolja jelentősen a sejtéletképességet (azaz 1 000 μM alatti és olyan koncentráció mellett, amelynél a sejtéletképesség 70 % feletti (9) (12)). E célból az oldószeres (negatív) kontrollal szembeni luciferáz-aktivitás valahányszoros indukciójának maximális értékét (Imax) meg kell határozni. Ezen túlmenően, mivel a sejteket a vizsgálati vegyi anyag több koncentrációjának kell kitenni, a luciferáz-aktivitás küszöbérték (azaz EC1,5 érték) feletti, statisztikailag szignifikáns indukciójához szükséges koncentrációt a dózis-válasz görbéből kell interpolálni (a számításokért lásd a 32. pontot). Végezetül citotoxicitás-méréseket kell végezni annak értékeléséhez, hogy a luciferáz-aktivitás indukciójának szintje a citotoxikus koncentrációknál alacsonyabb koncentráció mellett bekövetkezik-e.

Az e vizsgálati módszerhez kapcsolódó, ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálat rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak a 2. függelékben felsorolt tíz jártassági tesztanyag felhasználásával kell igazolniuk szakmai jártasságukat.

A KeratinoSens™ vizsgálathoz hasonló ARE-Nrf2 luciferáz alapú, új vagy módosított in vitro vizsgálati módszerek validálásának megkönnyítéséhez rendelkezésre állnak teljesítményszabványok (28), amelyek lehetővé teszik e vizsgálati iránymutatás időben történő módosítását az új módszerek e vizsgálati iránymutatásba való beépítéséhez. Az adatok OECD-megállapodás szerinti kölcsönös elfogadása csak a teljesítményszabványoknak megfelelően validált vizsgálati módszerek esetében lesz garantált, ha e vizsgálati módszereket az OECD felülvizsgálta és belefoglalta a megfelelő vizsgálati iránymutatásba.

ELJÁRÁS

Az e vizsgálati iránymutatás keretébe tartozó egyetlen módszer jelenleg a tudományosan megalapozott KeratinoSensTM vizsgálat (9) (12) (13) (14). A KeratinoSensTM vizsgálathoz rendelkezésre állnak a standard műveleti eljárások, amelyeket alkalmazni kell e vizsgálati módszer laboratóriumi végrehajtása és igénybevétele során (15). A vizsgálati módszert bevezetni kívánó laboratóriumok a KeratinoSensTM vizsgálat során használt rekombináns sejtvonalat a vizsgálati módszer kifejlesztőjével kötött licenciamegállapodással szerezhetik meg. A következő pontok ismertetik az ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer főbb összetevőit és eljárásait.

A keratinocita-tenyészetek előkészítése

A luciferáz riportergént az ARE-elem szabályozása mellett stabilan beillesztő transzgénikus sejtvonalat kell használni (például a KeratinoSens™ sejtvonalat). A sejteket a beérkezésüket követően (például 2–4 passzálással) szaporítani kell, és homogén állományként fagyasztva kell tárolni. Az ebből az eredeti állományból származó sejtek maximális számú passzálással szaporíthatók (ez a KeratinoSensTM esetében 25), és megfelelő fenntartó közeg használatával (a KeratinoSensTM esetében ez szérumot és Geneticint tartalmazó DMEM) rutinszerű vizsgálat céljára alkalmazhatók.

A sejteknek a vizsgálathoz 80–90 %-ban konfluensnek kell lenniük, és ügyelni kell annak biztosítására, hogy a sejtek soha ne növekedjenek a teljes konfluencia eléréséig. A vizsgálat előtt egy nappal a sejteket be kell gyűjteni, és azokat 96-lyukú lemezeken szét kell oszlatni (a KeratinoSensTM esetében lyukanként 10 000 sejt lehet). Annak biztosítása érdekében, hogy az egyes lyukak között homogén legyen a sejtszám eloszlása, ügyelni kell annak elkerülésére, hogy a leoltás alatt a sejtek leülepedjenek. Eltérő esetben e lépés következtében nagymértékű lehet a lyukankénti variabilitás. Minden megismételt kísérlet esetében a luciferáz-aktivitás méréséhez három párhuzamost, a sejtéletképesség-vizsgálathoz pedig egy párhuzamost kell alkalmazni.

A vizsgálati vegyi anyag és a kontrollanyagok előkészítése

A vizsgálati vegyi anyagot és a kontrollanyagokat a vizsgálat napján kell előkészíteni. A KeratinoSensTM vizsgálathoz a vizsgálati vegyi anyagokat dimetil-szulfoxidban (DMSO) kell a kívánt végső koncentrációra (például 200 mM) feloldani. A DMSO-oldatok önsterilizálónak tekinthetők, ezért csíramentesítő szűrésre nincs szükség. A DMSO-ban nem oldható vizsgálati vegyi anyagot csíramentes vízben vagy tenyészközegben kell feloldani, és az oldatokat például szűréssel kell csíramentesíteni. A meghatározott molekulatömeggel nem rendelkező vizsgálati vegyi anyaghoz a KeratinoSensTM vizsgálatban alapértelmezett koncentrációjú (40 mg/mL vagy 4 vegyesszázalékos) törzsoldatot kell készíteni. A DMSO-tól, a víztől vagy a tenyészközegtől eltérő oldószerek használata esetén kellő mértékű tudományos indokolást kell adni.

A vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó DMSO-törzsoldatok alapján a vizsgálandó vegyi anyag 12 (a KeratinoSensTM vizsgálatban 0,098 mM és 200 mM közötti) törzskoncentrációjának előállításához DMSO-val kell oldatsorozatot készíteni. A DMSO-ban nem oldható vizsgálati vegyi anyagok esetében a törzskoncentráció előállításához szükséges hígításokat csíramentes vízzel vagy csíramentes tenyészközeggel kell elvégezni. A használt oldószertől függetlenül a törzskoncentrációkat ezt követően szérumot tartalmazó tenyészközegben 25-szörösükre tovább kell hígítani, végül pedig további 4-szeres hígítási tényezővel kell kezeléshez felhasználni, hogy a vizsgálati vegyi anyag végső koncentrációja a KeratinoSensTM vizsgálatban 0,98 és 2 000 μM közötti tartományba essen. Indokolt esetben más koncentrációk is alkalmazhatók (például citotoxicitás vagy gyenge oldhatóság esetén).

A KeratinoSensTM vizsgálatban alkalmazott negatív (oldószeres) kontroll a DMSO (CAS-szám: 67-68-5, ≥ 99 %-os tisztaság), amelyhez lemezenként hat lyukat kell előkészíteni. Ahhoz, hogy a végső negatív (oldószeres) kontroll koncentrációja 1 % legyen, a 22. pontban a törzskoncentrációkra vonatkozóan leírtakkal megegyező módon kell hígítani; e koncentrációról ismeretes, hogy nem befolyásolja a sejtéletképességet, emellett ugyanazon DMSO-koncentrációnak felel meg, mint a vizsgálati vegyi anyagban és a pozitív kontrollban található DMSO-koncentráció. DMSO-ban nem oldható, vízzel hígított vizsgálati vegyi anyag esetében a DMSO szintjét a végső vizsgálati oldatot tartalmazó összes lyukban 1 %-ra kell kiigazítani, csakúgy, mint a többi vizsgálati vegyi anyag és kontrollanyag esetében.

A KeratinoSensTM vizsgálatban alkalmazott pozitív kontroll a fahéjaldehid (CAS-szám: 14371-10-9, ≥ 98 %-os tisztaság), amelyhez (6,4 mM koncentrációjú törzsoldatból) öt, 0,4–6,4 mM közötti törzskoncentráció-sorozatot kell készíteni DMSO-ban, és a 22. pontban a törzskoncentrációkra vonatkozóan leírtakkal megegyező módon kell hígítani, hogy a pozitív kontroll végső koncentrációja 4–64 μM között legyen. Alkalmazhatók más, megfelelő, lehetőleg középtartományban lévő EC1,5 értékeket adó pozitív kontrollok is, ha rendelkezésre állnak történeti adatok hasonló vizsgálatmenet elfogadhatósági kritériumainak származtatásához.

A vizsgálati vegyi anyag és a kontrollanyagok alkalmazása

Minden egyes vizsgálati vegyi anyag és pozitív kontrollanyag esetében egy kísérletre van szükség a (pozitív vagy negatív) előrejelzéshez, amely kísérlet három-három párhuzamost tartalmazó, legalább két független ismétlésből áll (azaz n=6). A két független ismétlés nem egyező eredményei esetén három párhuzamost tartalmazó harmadik ismétlést kell végezni (azaz n=9). Mindegyik független ismétlést más-más napon, a vizsgálati vegyi anyagot és az egymástól függetlenül begyűjtött sejteket tartalmazó friss törzsoldattal kell elvégezni. A sejtek azonban származhatnak ugyanabból a passzálásból.

A 20. pontban ismertetett leoltást követően a sejteket 24 órán át 96-lyukú mikrotiterlemezeken kell növeszteni. A közeget ezt követően el kell távolítani és friss tenyészközeggel (a KeratinoSensTM vizsgálat esetén 150 μl mennyiségű, szérumot igen, de Geneticint nem tartalmazó tenyészközeggel) kell felváltani, amelyhez a 25-szörös hígítású vizsgálati vegyi anyagból és a kontrollanyagokból 50 μl-t kell adni. A háttérértékek megállapítása érdekében lemezenként legalább egy lyukat üresen (sejt és kezelés nélkül) kell hagyni.

A KeratinoSensTM vizsgálatban a kezelt lemezeket ezt követően kb. 48 óráig 37±1 °C-on 5 % CO2 jelenlétében inkubálni kell. Ügyelni kell az illékony vizsgálati vegyi anyagok elpárolgásának elkerülésére, valamint a lyukak vizsgálati vegyi anyagokkal való keresztszennyeződésének elkerülésére, például a lemezek vizsgálati vegyi anyagokkal való inkubálás előtt fóliával való befedésével.

A luciferáz-aktivitás mérése

A megfelelő lumineszcencia-leolvasások biztosításához három tényező kulcsfontosságú:

 érzékeny luminométer választása,

 a fény-keresztszennyeződés elkerülése érdekében kellő magasságú lemezformátum használata, valamint

 a kellő szenzitivitás és az alacsony variabilitás biztosításához kellő fénykimenetű luciferáz szubsztrát használata.

E három tényező teljesülésének biztosítása érdekében a vizsgálat előtt a 3. függelékben ismertetett beállítással kontrollkísérletet kell végezni.

A KeratinoSensTM vizsgálatban a vizsgálati vegyi anyaggal és a kontrollanyagokkal alkalmazott 48 órás expozíciós idő elteltével a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal kell átmosni, és a lumineszcencia-leolvasásokhoz tartozó megfelelő lízispuffert 20 percig szobahőmérsékleten az egyes lyukakba kell adagolni.

A sejtlizátumokat tartalmazó lemezeket ezt követően leolvasás céljából a luminométerbe kell helyezni, amelyet a KeratinoSensTM vizsgálatban a következőkre programoznak be: i. a luciferáz szubsztrát hozzáadása az egyes lyukakhoz (például 50 μl), ii. 1 másodperces várakozás, és iii. a luciferáz-aktivitás integrálása 2 másodpercig. Alternatív beállítások használata esetén, például az alkalmazott luminométer-modelltől függően ezeket meg kell indokolni. Ezenfelül fénylő szubsztrát is alkalmazható azzal a feltétellel, hogy a 3. függelék szerinti minőség-ellenőrzési kísérlet teljesül.

Citotoxicitás-vizsgálat

A KeratinoSensTM sejtéletképesség-vizsgálathoz a közeget a 48 órás expozíciós idő elteltével az MTT-t (3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5- difenil-tetrazólium-bromid, Tiazolil kék tetrazólium-bromid; CAS-szám: 298-93-1) tartalmazó friss közeggel kell felváltani, és a sejteket 4 órán keresztül 37 °C-on 5 % CO2 jelenlétében inkubálni kell. Az MTT-közeget ezt követően el kell távolítani és a sejteket egy éjszakán át lizálni kell (például az egyes lyukakba adagolt 10 %-os SDS-oldattal). A felrázás után az abszorpciót például 600 nm-en meg kell mérni fotométerrel.

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Az adatok kiértékelése

A KeratinoSensTM vizsgálatban az alábbi paramétereket kell kiszámítani:

 a luciferáz-aktivitás valahányszoros indukciójának a vizsgálati vegyi anyag és a pozitív kontrollanyag bármely koncentrációjánál megfigyelt legmagasabb átlagértéke (Imax);

 az EC1,5 érték, azaz az a koncentráció, amelynél a luciferáz-aktivitás 1,5-szeres küszöbértéket meghaladó indukciója (azaz az 50 %-kal erősebb luciferáz-aktivitás) létrejött; valamint

 a sejtéletképesség 50 %-os, illetve 30 %-os csökkenésének megfelelő IC50 illetve IC30 koncentráció-értékek.

 A luciferáz-aktivitás valahányszoros indukcióját az 1. egyenlettel, az általában legmagasabb valahányszoros indukciót (Imax) pedig az egyes megismételt kísérletek átlagaként kell kiszámítani:

1. egyenlet:

image

ahol:

Lminta

a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó lyukban leolvasott lumineszcencia-érték

Lvakpróba

a sejtek és kezelés nélküli vakpróbalyukban leolvasott lumineszcencia-érték

Loldószer

a sejteket és az oldószeres (negatív) kontrollt tartalmazó lyukakban leolvasott átlagos lumineszcencia-érték

Az EC1,5 értéket a 2. egyenlet szerinti lineáris interpolációval, az általános EC1,5 értéket pedig az egyes ismétlések mértani középértékeként kell kiszámítani.

2. egyenlet:

image

ahol:

Ca

a μM-ben kifejezett legalacsonyabb koncentráció 1,5-szeres indukciónál magasabb indukció mellett

Cb

a μM-ben kifejezett legmagasabb koncentráció 1,5-szeres indukciónál alacsonyabb indukció mellett

Ia

a 1,5-szeres indukciónál magasabb indukció melletti legalacsonyabb koncentrációnál mért valahányszoros indukció (három párhuzamos lyuk átlaga)

Ib

a 1,5-szeres indukciónál alacsonyabb indukció melletti legmagasabb koncentrációnál mért valahányszoros indukció (három párhuzamos lyuk átlaga)

Az életképességet a 3. egyenlettel kell kiszámítani:

3. egyenlet:

image

ahol:

Vminta

a vizsgálati vegyi anyagot tartalmazó lyukban leolvasott MTT-abszorbanciaérték

Vvakpróba

a sejtek és kezelés nélküli vakpróbalyukban leolvasott MTT-abszorbanciaérték

Voldószer

a sejteket és az oldószeres (negatív) kontrollt tartalmazó lyukakban leolvasott átlagos MTT-abszorbanciaérték

Az IC50 és az IC30 értéket a 4. egyenlet szerinti lineáris interpolációval, az általános IC50 és IC30 értéket pedig az egyes ismétlések mértani középértékeként kell kiszámítani.

4. egyenlet:

image

ahol:

X

a kiszámítandó %-os csökkenés az adott koncentrációnál (50, illetve 30 az IC50 és az IC30 esetén)

Ca

a μM-ben kifejezett legalacsonyabb koncentráció x %-ot meghaladó életképesség-csökkenés mellett

Cb

a μM-ben kifejezett legmagasabb koncentráció x %-ot el nem érő életképesség-csökkenés mellett

Va

az x %-ot meghaladó életképesség-csökkenés melletti legalacsonyabb koncentrációnál várható %-os életképesség

Vb

az x %-ot el nem érő életképesség-csökkenés melletti legmagasabb koncentrációnál várható %-os életképesség

A 1,5-szeresnél magasabb luciferáz-aktivitás indukciót mutató koncentrációknál oly módon kell kiszámítani a statisztikai szignifikanciát (például kétvégű Student-féle t-próbával), hogy a három párhuzamos minta lumineszcencia-értékeit össze kell vetni az oldószeres (negatív) kontrollként szolgáló lyukakban leolvasott lumineszcencia-értékekkel annak meghatározásához, hogy a luciferáz-aktivitás indukciója statisztikailag szignifikáns-e (p <0 ,05). A 1,5-szeresnél magasabb luciferáz-aktivitás indukció melletti legalacsonyabb koncentráció az EC1,5 értéket meghatározó érték. Minden esetben ellenőrizni kell, hogy ez az érték az IC30 érték alatt van-e, ami arra utal, hogy az EC1,5 értéket meghatározó koncentráció mellett 30 %-nál kisebb mértékű a sejtéletképesség csökkenése.

Az adatokat ajánlott szemrevételezéssel ellenőrizni grafikonok segítségével. Ha nem figyelhető meg egyértelmű dózis-válasz görbe, vagy ha a kapott dózis-válasz görbe kétfázisú (azaz kétszer lépi túl a másfélszeres küszöbértéket), a kísérletet meg kell ismételni annak ellenőrzése érdekében, hogy ez a vizsgálati vegyi anyagra jellemző-e vagy kísérleti műhibának tulajdonítható-e. Abban az esetben, ha a kétfázisú válasz független kísérletben reprodukálható, az alacsonyabb EC1,5 értéket (a 1,5-szeres küszöbérték első átlépésének időpontjában megfigyelt koncentrációt) kell jelentésbe foglalni.

Azon ritka esetekben, ha 1,5-szeres küszöbérték feletti, statisztikailag nem szignifikáns indukció figyelhető meg, majd statisztikailag szignifikáns indukció magasabb koncentráció mellett, ezen ismétlések eredményei csak akkor minősülnek érvényesnek és pozitívnak, ha a 1,5-szeres küszöbérték feletti statisztikailag nem szignifikáns indukció nem citotoxikus koncentráció esetén következett be.

Végezetül azon vizsgálati vegyi anyagok esetében, amelyek már a 0,98 μM legalacsonyabb vizsgálati koncentrációnál 1,5-szeres vagy magasabb indukciót idéznek elő, a 0,98-nál kisebb EC1,5 értéket a dózis-válasz görbe szemrevételezéses ellenőrzése alapján kell meghatározni.

Elfogadhatósági kritériumok

A KeratinoSensTM vizsgálat alkalmazásakor az alábbi elfogadhatósági kritériumoknak kell teljesülniük. Először is a pozitív kontrollanyaggal, a fahéjaldehiddel elért luciferáz-aktivitás indukciónak a 1,5-szeres küszöbérték felett statisztikailag szignifikánsnak kell lennie (például t-próba alkalmazásával) legalább a vizsgált koncentrációk egyikében (4-64 μM között).

Másodszor, az EC1,5 értéknek a vizsgálatot végző létesítmény történeti átlagát magában foglaló két szórás intervallumában kell lennie (például a validációs adatkészlet alapján 7 μM és 30 μM közötti értéknek), amit rendszeresen frissíteni kell. Ezen túlmenően a fahéjaldehidre vonatkozó három párhuzamosban az átlagos indukciónak 64 μM koncentráció mellett 2 és 8 között kell lennie. Ha az utóbbi kritérium nem teljesül, a fahéjaldehid dózis-válaszát körültekintően kell ellenőrizni, és a vizsgálatok kizárólag akkor elfogadhatóak, ha a luciferáz-aktivitás indukció és a pozitív kontrollanyag koncentrációja együttes növekedése mellett egyértelmű dózis-válasz van.

Végezetül a negatív (oldószeres) DMSO-tartalmú kontroll esetében leolvasott lumineszcencia-értékek átlagos variációs koefficiensének minden ismétlésben (három példányban vizsgált 6 lyukban) 20 %-nál alacsonyabbnak kell lennie. Ha magasabb a variabilitás, az eredményeket el kell vetni.

Az eredmények értelmezése és az előrejelzési modell

A KeratinoSensTM előrejelzés akkor minősül pozitívnak, ha két ismétlésből kettőben vagy három ismétlésből ugyanabban a kettőben mind a négy alábbi feltétel teljesül, egyéb esetben a KeratinoSensTM előrejelzés negatívnak minősül (1. ábra):

1. az Imax érték több mint (>) 1,5-szeres és statisztikailag szignifikáns az oldószeres (negatív) kontrollhoz viszonyítva (kétvégű, páratlan, Student-féle t-próbával meghatározott érték);

2. a sejtéletképesség meghaladja a (>) 70 %-ot a 1,5-szerest meghaladó luciferáz-aktivitás indukció melletti legalacsonyabb koncentrációnál (azaz az EC1,5 értéket adó koncentrációnál);

3. az EC1,5 érték kisebb, mint (<) 1 000 μM (vagy < 200 μg/ml a nem meghatározott MW értékű vizsgálati vegyi anyagok esetében);

4. látszólag általános dózis-válasz figyelhető meg a luciferáz-indukció esetében (vagy a 33. pontban foglaltak szerinti kétfázisú válasz).

Ha egy adott ismétlésen belül az első három feltétel mindegyike teljesül, de nem figyelhető meg egyértelmű dózis-válasz a luciferáz-indukció esetében, akkor ezen ismétlés eredményét nem meggyőzőnek kell tekinteni és további vizsgálatokra lehet szükség (1. ábra). Ezenfelül az 1 000 μM-nál kisebb (vagy a nem meghatározott MW értékű vizsgálati vegyi anyagok esetében 200 μg/ml-nél kisebb) koncentráció mellett kapott negatív eredményt szintén nem meggyőzőnek kell tekinteni (lásd a 11. pontot).

1. ábra

A KeratinoSensTM vizsgálatban alkalmazott előrejelzési modell. A KeratinoSensTM előrejelzést integrált értékelési és vizsgálati megközelítés keretében, valamint a 9. és 11. pont rendelkezéseivel összhangban kell figyelembe venni.

image

Ritka esetekben a citotoxikus szintekhez nagyon közel luciferáz-aktivitást indukáló vizsgálati vegyi anyagok egyes ismétlésekben és nem citotoxikus szinteknél pozitívak lehetnek (azaz az EC1,5 értéket meghatározó koncentráció alacsonyabb, mint (<) az IC30 érték), más ismétlésekben pedig csak a citotoxikus szinteknél (azaz az EC1,5 értéket meghatározó koncentráció magasabb, mint (>) az IC30 érték). Az ilyen vizsgálati vegyi anyagokat szűkebb körű dózis-válasz elemzéssel és alacsonyabb hígítási tényezővel (például 1,33-szoros vagy Ö2 (=1,41)-szeres hígítással a lyukak között) újra meg kell vizsgálni annak meghatározásához, hogy az indukció citotoxikus szinten történt-e vagy sem (9).

Vizsgálati jegyzőkönyv

A Vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Vizsgálati vegyi anyag

 Egy összetevőből álló anyag:

 

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név (nevek), CAS-szám(ok), SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet és/vagy más azonosítók;

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság, DMSO-ban való oldhatóság, molekulatömeg, valamint további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok, amennyiben rendelkezésre állnak;

 tisztaság, adott és a gyakorlatban megvalósítható esetben a szennyeződések kémiai azonossága stb.;

 vizsgálat előtti kezelés, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

 vizsgált koncentráció(k);

 tárolási feltételek és stabilitás, amennyiben rendelkezésre állnak.

 Több összetevőből álló anyagok, UVCB-k és keverékek:

 

 amennyiben lehetséges, az összetevőknek például a kémiai azonosítója (lásd fent), tisztasága, mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai (lásd fent) jellemzik, amennyiben rendelkezésre állnak;

 fizikai megjelenés, vízoldékonyság, DMSO-ban való oldhatóság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok, amennyiben rendelkezésre állnak;

 molekulatömeg vagy látszólagos molekulatömeg ismert összetételű keverékek/polimerek esetén, vagy a vizsgálat lebonyolítása szempontjából releváns egyéb információ;

 vizsgálat előtti kezelés, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

 vizsgált koncentráció(k);

 tárolási feltételek és stabilitás, amennyiben rendelkezésre állnak.

Kontrollok

 Pozitív kontroll:

 

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név (nevek), CAS-szám(ok), SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet és/vagy más azonosítók;

 Fizikai megjelenés, vízoldékonyság, DSMO-ban való oldhatóság, molekulatömeg, valamint további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok, amennyiben rendelkezésre állnak és szükség szerint;

 tisztaság, adott és a gyakorlatban megvalósítható esetben a szennyeződések kémiai azonossága stb.;

 vizsgálat előtti kezelés, ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés);

 vizsgált koncentráció(k);

 tárolási feltételek és stabilitás, amennyiben rendelkezésre állnak;

 adott esetben a pozitív kontrolloknak a vizsgálatmenet elfogadhatósági kritériumoknak való megfelelőségét bizonyító korábbi eredményei.

 Negatív (vivőanyagos) kontroll:

 

 kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név (nevek), CAS-szám(ok) és/vagy más azonosítók;

 tisztaság, adott és a gyakorlatban megvalósítható esetben a szennyeződések kémiai azonossága stb.;

 fizikai megjelenés, molekulatömeg, valamint további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok, amennyiben a vizsgálati módszerben említett negatív kontrolloktól eltérő negatív kontrollok használatosak, és amennyiben rendelkezésre állnak;

 tárolási feltételek és stabilitás, amennyiben rendelkezésre állnak;

 az oldószer kiválasztásának indoklása minden egyes vizsgálati vegyi anyag esetében.

A vizsgálati módszer körülményei

 a megbízó, a vizsgálatot végző laboratórium és a vizsgálatvezető neve és címe;

 az alkalmazott vizsgálati módszer leírása;

 használt sejtvonal, tárolási feltételei és eredete (például az a létesítmény, ahonnan azt beszerezték);

 a vizsgálathoz használt sejtek passzálásának száma és konfluenciájának szintje;

 a vizsgálat előtt a leoltáshoz alkalmazott sejtszámlálási módszer és a homogén sejtszám-eloszlás biztosítása érdekében hozott intézkedések (lásd a 20. pontot);

 az alkalmazott luminométer (például modell), beleértve a műszer beállításait, a használt luciferáz szubsztrátot, valamint a megfelelő lumineszcencia-mérések szemléltetése a 3. függelékben ismertetett kontrollvizsgálat alapján;

 a vizsgálati módszer végrehajtásában való laboratóriumi jártasság bizonyítására alkalmazott eljárás (például jártassági tesztanyagok vizsgálatával) vagy a vizsgálati módszer idővel reprodukálható végrehajtásának bizonyítására alkalmazott eljárás.

Vizsgálati eljárás

 az alkalmazott ismétlések és párhuzamosok száma;

 a vizsgálati vegyi anyag koncentrációi, alkalmazási eljárása és az igénybe vett expozíciós idő (ha eltér az ajánlottól);

 az alkalmazott értékelési és döntési kritériumok leírása;

 az alkalmazott vizsgálat-elfogadhatósági kritériumok leírása;

 a vizsgálati eljárás bármilyen változtatásának leírása.

Eredmények

 minden ismétlésben a vizsgálati vegyi anyag és a pozitív kontroll esetében kapott Imax, EC1,5 értékek és életképességre vonatkozó értékek (azaz az IC50, IC30 értékek), valamint átlagok (Imax: átlagérték; EC1,5 és az életképességre vonatkozó értékek: mértani középérték), továbbá az összes ismétlésből származó adatok felhasználásával kiszámított szórás és a vizsgálati vegyi anyagnak az előrejelzési modell szerinti minősítése;

 az egyes kísérleteknél a negatív kontroll esetében leolvasott lumineszcencia-értékekkel kapott variációs koefficiens;

 a luciferáz-aktivitás indukciójára és az életképességre vonatkozó dózis-válasz görbéket ábrázoló grafikon;

 adott esetben bármely más releváns észrevétel leírása.

Az eredmények tárgyalása

 a KeratinoSensTM vizsgálattal kapott eredmények tárgyalása;

 a vizsgálati módszer eredményeinek integrált vizsgálati és értékelési megközelítés keretében történő tárgyalása, amennyiben rendelkezésre állnak más releváns információk.

Következtetés

SZAKIRODALOM

(1) United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Elérhető a következő címen: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

(2) OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paris.

(3) Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85, 367-485.

(4) E melléklet B.42. fejezete: Bőrszenzibilizáció: Lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer.

(5) E melléklet B.6. fejezete: Bőrszenzibilizáció.

(6) E melléklet B.50. fejezete: Bőrszenzibilizáció: Lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (LLNA): DA.

(7) E melléklet B.51. fejezete: Bőrszenzibilizáció: Lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (LLNA): BrdU-ELISA.

(8) Natsch A. (2010). The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers. Toxicological Sciences 113, 284-292.

(9) Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281-290.

(10) Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005). The role of Keap1 in cellular protective responses. Chem. Res. Toxicol. 18, 1779-1791.

(11) Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013). The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol. 1(1), 45-49.

(12) Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 25, 733-744.

(13) Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, 33, 1337-1352.

(14) EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing, 42 pp. Available at: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.

(15) DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSensTM., 17 pp. Elérhető az alábbi címen: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index

(16) Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009). Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing. Toxicol. Sci. 107, 106-121.

(17) Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389-400.

(18) Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potentials. Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489-504.

(19) Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. J Appl Toxicol. 33, 1353-1364.

(20) Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013). The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study. Toxicology In Vitro 27, 1220-1225.

(21) Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1683-1969.

(22) Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17, 646-657.

(23) OECD (2012). BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457. OECD, Paris.

(24) ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).

(25) Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006). Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing. J. Invest. Dermatol., 126, 1813-1822.

(26) Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004). Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen. Toxicol. Lett. 150, 301-316.

(27) Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013). Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events. Toxicol. in vitro 27, 2225-2232.

(28) OECD (2015). Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment N0 213, OECD, Paris.

(29) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No.34. OECD, Paris, France.

(30) NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides – (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf




1. függelék

FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Pontosság : a vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referenciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítőképességét mutatja, és relevanciájának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az »egyezés« szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálat milyen arányban szolgáltat helyes eredményeket (29).

Káros kimeneti út (Adverse Outcome Pathway, AOP) : valamely megcélzott vegyi anyag vagy hasonló vegyi anyagok csoportjának kémiai szerkezetéből kiinduló, a molekuláris kiváltó eseményen keresztül az érintett in vivo eredményig végbemenő eseménysorozat (2).

ARE : antioxidáns válaszelem (más néven: EpRE, elektrofil válaszelem), számos citoprotektív és II. fázisú gén felfelé irányuló promóter régiójában megtalálható válaszelem. Ha Nfr2 aktiválja, e gének transzkripciós indukcióját közvetíti.

Vegyi anyag : anyag vagy keverék.

Variációs koefficiens : a variabilitás mértékegysége, amelyet a párhuzamos adatcsoportok esetében a szórás és az átlag hányadosaként kell kiszámítani. Százalékos arányként történő kifejezéséhez 100-zal megszorozható.

EC1,5 : 1,5-szeres luciferáz-indukció esetén interpolált koncentráció.

IC30 : a sejtéletképesség 30 %-os csökkenését kiváltó koncentráció.

IC50 : a sejtéletképesség 50 %-os csökkenését kiváltó koncentráció.

Veszély : valamely anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy káros hatásokat képes előidézni az élő szervezet, rendszer vagy (al)populáció anyagnak való expozíciójakor.

Integrált vizsgálati és értékelési megközelítés : valamely vegyi anyag vagy vegyianyag-csoport veszélyeinek azonosításához (potenciál), jellemzéséhez (hatáserősség) és/vagy biztonsági értékeléséhez (potenciál, hatáserősség és expozíció) alkalmazott strukturált megközelítés, amely stratégiai szempontból beépít és mérlegel minden olyan releváns adatot, amely hozzájárul a lehetséges veszélyre és/vagy kockázatra és/vagy a további célirányos és ezért minimális vizsgálat szükségességére vonatkozó szabályozói döntéshozatalhoz.

Imax : a luciferáz-aktivitásnak az oldószeres (negatív) kontrollhoz viszonyított maximális indukciós tényezője, amelyet a vizsgálati vegyi anyag bármely koncentrációjánál mérnek.

Keap1 : Kelch-like ECH-associated protein 1, az Nrf2-aktivitást szabályozó szenzorfehérje. Nem indukált feltételek mellett a Keap1 szenzorfehérje az Nrf2 transzkripciós faktort célozza meg a proteaszómán belüli ubikvitináció és fehérjebomlás céljából. A Keap1 reaktív ciszteinmaradékainak kis molekulákkal végbemenő kovalens módosítása az Nrf2 transzkripciós faktornak a Keap1 szenzorfehérjétől való szétválásához vezethet (8) (10) (11).

Keverék : két vagy több anyagból álló keverék vagy oldat, amelyben az anyagok nem lépnek egymással reakcióba (1).

Egy összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben az egyik fő összetevő legalább 80 tömegszázalékban van jelen.

Több összetevőből álló anyag : olyan, a mennyiségi összetétele alapján meghatározott anyag, amelyben egynél több fő összetevő legalább 10 tömegszázalékban, de 80 tömegszázalékot nem meghaladó koncentrációban van jelen. A több összetevőből álló anyag gyártási folyamat eredménye. A keverék és a több összetevőből álló anyag között az a különbség, hogy a keverék két vagy több anyag összekeverésével, kémiai reakció nélkül jön létre. A több összetevőből álló anyag kémiai reakció eredménye.

Nrf2 : Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, az antioxidáns válaszelem útvonalában érintett transzkripciós faktor. Ha az Nrf2-ben nem megy végbe ubikvitináció, felépíti a citoplazmát és transzlokálódik a sejtmagba, ahol számos citoprotektív gén felfelé tartó promóter régiójában kapcsolódik az ARE válaszelemhez, elindítva e gének transzkripcióját (8) (10) (11).

Pozitív kontroll : a vizsgálati rendszer valamennyi alkotóelemét tartalmazó, ismert pozitív hatást kiváltó anyaggal kezelt replikátum. Annak biztosítása érdekében, hogy a pozitív kontrollban jelentkező hatás időbeli változását fel lehessen mérni, a pozitív hatás nem lehet túlságosan erőteljes.

Relevancia : a vizsgálat és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt tükrözi, hogy a vizsgálat mennyire pontosan méri vagy jelzi előre a vizsgált biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontosságát (az eredmények egyezését) figyelembe kell venni (29).

Megbízhatóság : a vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti időbeli reprodukálhatóságának mértéke ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megállapítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumon belüli megismételhetőség kiszámításával történik (29).

Reprodukálhatóság : ugyanazon vegyi anyag ugyanazon vizsgálati protokollal végzett vizsgálata során kapott eredmények egyezése (lásd: megbízhatóság) (29).

Érzékenység : az összes olyan pozitív/aktív vegyi anyag aránya, amelyet a vizsgálati módszer helyesen sorolt be. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (29).

Oldószeres/vivőanyagos kontroll : valamely vizsgálati rendszernek a vizsgálati vegyi anyagon kívüli összes összetevőjét tartalmazó párhuzamos, amely azonban magában foglalja az alkalmazott oldószert. Az ugyanabban az oldószerben feloldott vizsgálati vegyi anyaggal kezelt minták esetében a kiindulási érték létrehozásához használatos.

Specifikusság : a vizsgálati módszerrel helyesen besorolt összes negatív/inaktív vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek relevanciájának megítélésében (29).

Anyag : természetes állapotban előforduló vagy ipari termelőfolyamatból származó kémiai elemek és azok vegyületei, amelyek a termék stabilitásának megőrzéséhez szükséges adalékanyagokat és az alkalmazott folyamatból származó szennyeződéseket is tartalmazhatnak, de nem tartalmaznak olyan oldószereket, amelyek az anyag stabilitásának befolyásolása vagy összetételének megváltozása nélkül elkülöníthetők (1).

Vizsgálati vegyi anyag : a »vizsgálati vegyi anyag« kifejezés a vizsgálat tárgyát képező anyagra való hivatkozáshoz használatos.

A vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének az Egyesült Nemzetek Szervezete által globálisan harmonizált rendszere (ENSZ-GHS) : a vegyi anyagoknak (anyagoknak és keverékeknek) a fizikai, egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztető mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkáltatók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürgősségi segélyszolgálatok) és a környezet megóvása érdekében egységesítse a vegyi anyagok káros hatásaira vonatkozó információk továbbítását (1).

UVCB : Ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyagok.

Érvényes vizsgálati módszer : olyan vizsgálati módszer, amely kellően relevánsnak és megbízhatónak minősül egy adott célra, és amely tudományosan megalapozott elveken alapul. Egy-egy vizsgálati módszer abszolút értelemben soha nem érvényes, kizárólag meghatározott céllal összefüggésben az (29).




2. függelék

JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK

In vitro bőrszenzibilizáció: ARE-Nrf2 luciferáz alapú vizsgálati módszer

E vizsgálati módszer rutinszerű alkalmazása előtt a laboratóriumoknak igazolniuk kell szakmai jártasságukat oly módon, hogy az 1. táblázatban javasolt 10 jártassági tesztanyagra vonatkozóan a KeratinoSens™ vizsgálattal várható előrejelzést helyesen kapják meg, továbbá a 10 jártassági tesztanyag közül 8 esetében a referenciatartományba eső EC1,5 és IC50 értékeket kapják meg. E jártassági tesztanyagok kiválasztása oly módon történt, hogy az a bőrszenzibilizáció veszélye esetén bekövetkező különféle válaszreakciók tartományát illetően reprezentatív legyen. További kiválasztási kritérium volt, hogy a jártassági tesztanyagok kereskedelmi forgalomban kaphatóak legyenek, azokra vonatkozóan kiváló minőségű in vivo referenciaadatok és a KeratinoSensTM vizsgálatból származó, kiváló minőségű in vitro adatok álljanak rendelkezésre.



1. táblázat

A KeratinoSensTM vizsgálatban való szakmai jártasság bizonyításához ajánlott anyagok

Jártassági tesztanyagok

CASRN

Halmazállapot

In vivo előrejelzés (1)

KeratinoSensTM előrejelzés (2)

EC1,5 (μM) referenciatartomány (3)

IC50 (μM) referenciatartomány (3)

Izopropanol

67-63-0

Folyadék

Nem szenzibilizáló

Negatív

> 1 000

> 1 000

Szalicilsav

69-72-7

Szilárd

Nem szenzibilizáló

Negatív

> 1 000

> 1 000

Tejsav

50-21-5

Folyadék

Nem szenzibilizáló

Negatív

> 1 000

> 1 000

Glicerin

56-81-5

Folyadék

Nem szenzibilizáló

Negatív

> 1 000

> 1 000

Fahéjalkohol

104-54-1

Szilárd

Szenzibilizáló (enyhén)

Pozitív

25–175

> 1 000

Etilén-glikol-dimetakrilát

97-90-5

Folyadék

Szenzibilizáló (enyhén)

Pozitív

5–125

> 500

2-Merkapto-benzotiazol

149-30-4

Szilárd

Szenzibilizáló (mérsékelten)

Pozitív

25–250

> 500

Metil-dibróm-glutár-nitril

35691-65-7

Szilárd

Szenzibilizáló (erősen)

Pozitív

< 20

20–100

4-metil-amino-fenol-szulfát

55-55-0

Szilárd

Szenzibilizáló (erősen)

Pozitív

< 12,5

20–200

2,4-dinitro-klórbenzol

97-00-7