| 19.3.2014 | EN | Official Journal of the European Union | L 81/1 | 19.3.2014 | ES | Diario Oficial de la Unión Europea | L 81/1 |
| COMMISSION REGULATION (EU) No 260/2014 | REGLAMENTO (UE) N
o 260/2014 DE LA COMISIÓN |
| of 24 January 2014 | de 24 de enero de 2014 |
| amending, for the purpose of its adaptation to technical progress, Regulation (EC) No 440/2008 laying down test methods pursuant to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council on the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) | que modifica, con vistas a su adaptación al progreso técnico, el Reglamento (CE) no 440/2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) no 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH) |
| (Text with EEA relevance) | (Texto pertinente a efectos del EEE) |
| THE EUROPEAN COMMISSION, | LA COMISIÓN EUROPEA, |
| Having regard to the Treaty on the Functioning of the European Union, | Visto el Tratado de Funcionamiento de la Unión Europea, |
| Having regard to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC (1), and in particular Article 13(3) thereof, | Visto el Reglamento (CE) no 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Preparados Químicos, se modifica la Directiva 1999/45/CE y se derogan el Reglamento (CEE) no 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) no 1488/94 de la Comisión así como la Directiva 76/769/CEE del Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la Comisión (1), y, en particular, su artículo 13, apartado 3, |
| Whereas: | Considerando lo siguiente: |
| (1) | Commission Regulation (EC) No 440/2008 (2) contains the test methods for the purposes of the determination of the physico-chemical properties, toxicity and eco-toxicity of substances to be applied for the purposes of Regulation (EC) No 1907/2006. | (1) | El Reglamento (CE) no 440/2008 de la Comisión (2) incluye los métodos de ensayo para la determinación de las propiedades fisicoquímicas, toxicológicas y ecotoxicológicas de las sustancias, que deben aplicarse a efectos del Reglamento (CE) no 1907/2006. |
| (2) | It is necessary to update Regulation (EC) No 440/2008 to include with priority new and updated alternative test methods recently adopted by the OECD, in order to obtain a reduction of the number of animals to be used for experimental purposes, in accordance with Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (3) and Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes (4). | (2) | Es necesario actualizar el Reglamento (CE) no 440/2008 para incluir con prioridad los métodos alternativos de ensayo nuevos y actualizados que ha adoptado recientemente la OCDE, con el fin de obtener una reducción del número de animales necesarios para los experimentos, de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (3) y la Directiva 86/609/CEE del Consejo, de 24 de noviembre de 1986, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas de los Estados miembros respecto a la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos (4). |
| (3) | The adaptation contains two methods for the determination of physicochemical properties including an update of the water solubility test method and a new partition coefficient test method relevant for the persistent, bioaccumulative and toxic (PBT) assessment; four new and one updated method for the determination of ecotoxicity and environmental fate and behaviour; nine methods for the determination of toxicity and other health effects including four inhalation toxicity test methods, which include an update of three methods and one new method to reduce the number of animals used and to improve assessment of effects, an update of the repeat dose 28-day oral toxicity test method to include parameters for assessment of endocrine activity, an update of the toxicokinetics test method relevant for the design and understanding of toxicological studies and an update of chronic, carcinogenicity and combined chronic and carcinogenicity test methods. | (3) | La adaptación contiene dos métodos de determinación de propiedades fisicoquímicas, incluidos una actualización del método de ensayo de la hidrosolubilidad y un nuevo método de ensayo del coeficiente de reparto de relevancia para la evaluación de las sustancias persistentes, bioacumulables y tóxicas (PBT); cuatro métodos nuevos y uno actualizado para la determinación de la ecotoxicidad y el destino y comportamiento en el medio ambiente; nueve métodos para la determinación de la toxicidad y otros efectos sobre la salud, incluidos cuatro métodos de ensayo de la toxicidad por inhalación, entre los que se cuentan una actualización de tres métodos y uno nuevo para reducir el número de animales utilizados y para mejorar la evaluación de los efectos, una actualización del método de ensayo de la toxicidad oral por administración continuada durante 28 días para incluir parámetros de evaluación de la actividad endocrina, una actualización del método de ensayo de la toxicocinética de relevancia para el diseño e interpretación de los estudios toxicológicos, y una actualización de los métodos de ensayo de la toxicidad crónica, de la carcinogénesis y de la toxicidad crónica y la carcinogénesis combinadas. |
| (4) | Regulation (EC) No 440/2008 should therefore be amended accordingly. | (4) | Por tanto, es necesario modificar el Reglamento (CE) no 440/2008 en consecuencia. |
| (5) | The measures provided for in this Regulation are in accordance with the opinion of the Committee established under Article 133 of Regulation (EC) No 1907/2006, | (5) | Las disposiciones del presente Reglamento se ajustan al dictamen del Comité establecido de conformidad con el artículo 133 del Reglamento (CE) no 1907/2006. |
| HAS ADOPTED THIS REGULATION: | HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO: |
| Article 1 | Artículo 1 |
| The Annex to Regulation (EC) No 440/2008 is amended in accordance with the Annex to this Regulation. | El anexo del Reglamento (CE) no 440/2008 queda modificado de acuerdo con el anexo del presente Reglamento. |
| Article 2 | Artículo 2 |
| This Regulation shall enter into force on the third day following that of its publication in the Official Journal of the European Union. | El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de la Unión Europea. |
| This Regulation shall be binding in its entirety and directly applicable in all Member States. | El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro. |
| Done at Brussels, 24 January 2014. | Hecho en Bruselas, el 24 de enero de 2014. |
| For the Commission | Por la Comisión |
| The President | El Presidente |
| José Manuel BARROSO | José Manuel BARROSO |
| (1)
OJ L 396, 30.12.2006, p. 1. | (1)
DO L 396 de 30.12.2006, p. 1. |
| (2)
OJ L 142, 31.5.2008, p. 1. | (2)
DO L 142 de 31.5.2008, p. 1. |
| (3)
OJ L 276, 20.10.2010, p. 33. | (3)
DO L 276 de 20.10.2010, p. 33. |
| (4)
OJ L 358, 18.12.1986, p. 1. | (4)
DO L 358 de 18.12.1986, p. 1. |
| ANNEX | ANEXO |
| The Annex to Regulation (EC) No 440/2008 is amended as follows: | El anexo del Reglamento (CE) no 440/2008 queda modificado como sigue: |
| (1) | Chapter A.6 is replaced by the following: | ‘A.6. WATER SOLUBILITY | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 105 (1995). This Test Method is a revised version of the original TG 105 which was adopted in 1981. There is no difference of substance between the current version and that from 1981. Mainly the format has been changed. The revision was based on the EU Test Method “Water Solubility” (1). | INITIAL CONSIDERATIONS | 2. | The water solubility of a substance can be considerably affected by the presence of impurities. This Test Method addresses the determination of the solubility in water of essentially pure substances which are stable in water and not volatile. Before determining water solubility, it is useful to have some preliminary information on the test substance, like structural formula, vapour pressure, dissociation constant and hydrolysis as a function of pH. | 3. | Two methods, the column elution method and the flask method which cover respectively solubilities below and above 10–2 g/l are described in this Test Method. A simple preliminary test is also described. It allows the determination of approximately the appropriate amount of sample to be used in the final test, as well as the time necessary to achieve saturation. | DEFINITIONS AND UNITS | 4. | The water solubility of a substance is the saturation mass concentration of the substance in water at a given temperature. | 5. | Water solubility is expressed in mass of solute per volume of solution. The SI unit is kg/m3 but g/l may also be used. | REFERENCE CHEMICALS | 6. | Reference chemicals do not need to be employed when investigating a test substance. | DESCRIPTION OF THE METHODS | Test conditions | 7. | The test is preferably run at 20 ± 0,5 °C. The chosen temperature should be kept constant in all relevant parts of the equipment. | Preliminary test | 8. | In a stepwise procedure, increasing volumes of water are added at room temperature to approximately 0,1 g of the sample (solid test substances must be pulverized) in a 10 ml glass-stoppered measuring cylinder. After each addition of an amount of water, the mixture is shaken for 10 minutes and is visually checked for any undissolved parts of the sample. If, after addition of 10 ml of water, the sample or parts of it remain undissolved, the experiment is continued in a 100 ml measuring cylinder. The approximate solubility is given in Table 1 below under that volume of water in which complete dissolution of the sample occurs. When the solubility is low, a long time may be required to dissolve a test substance and at least 24 hours should be allowed. If, after 24 hours, the test substance is still not dissolved, more time (up to 96 hours) should be allowed or further dilution should be attempted to ascertain whether the column elution method or flask method should be used. | Table 1 | ml of water for 0,1 g soluble | 0,1 | 0,5 | 1 | 2 | 10 | 100 | > 100 | approximate solubility in g/l | > 1 000 | 1 000 to 200 | 200 to 100 | 100 to 50 | 50 to 10 | 10 to 1 | < 1 | Column elution method | Principle | 9. | This method is based on the elution of a test substance with water from a micro-column which is charged with an inert support material, previously coated with an excess of the test substance (2). The water solubility is given by the mass concentration of the eluate when this has reached a plateau as a function of time. | Apparatus | 10. | The apparatus consists of a microcolumn (Figure 1), maintained at constant temperature. It is connected either to a recirculating pump (Figure 2) or to a levelling vessel (Figure 3). The microcolumn contains an inert support held in place by a small plug of glasswool which also serves to filter out particles. Possible materials which can be employed for the support are glass beads, diatomaceous earth, or other inert materials. | 11. | The microcolumn shown in Figure 1 is suitable for the set-up with recirculating pump. It has a head space providing for five bed volumes (discarded at the start of the experiment) and the volume of five samples (withdrawn for analysis during the experiment). Alternatively, the size can be reduced if water can be added to the system during the experiment to replace the initial five bed volumes removed with impurities. The column is connected with tubing made of an inert material to the recirculating pump, capable of delivering approximately 25 ml/h. The recirculating pump can be, for example, a peristaltic or membrane pump. Care must be taken that no contamination and/or adsorption occur with the tube material. | 12. | A schematic arrangement using a levelling vessel is shown in Figure 3. In this arrangement the microcolumn is fitted with a one way stopcock. The connection to the levelling vessel consists of a ground glass joint and tubing made of an inert material. The flow rate from the levelling vessel should be approximately 25 ml/h. | Figure 1 | Figure 2 | Figure 3 | 13. | Approximately 600 mg of support material is transferred to a 50 ml round-bottom flask. A suitable amount of test substance is dissolved in a volatile solvent of analytical reagent quality and an appropriate amount of this solution is added to the support material. The solvent is completely evaporated, e.g. using a rotary evaporator, as otherwise water saturation of the support will not be achieved during the elution step because of partitioning on the surface. The loaded support material is soaked for two hours in approximately 5 ml of water and the suspension is poured into the microcolumn. Alternatively, dry loaded support material may be poured into the water-filled microcolumn and two hours are allowed for equilibrating. | 14. | The loading of the support material may cause problems, leading to erroneous results, e.g. when the test substance is deposited as an oil. These problems should be examined and the details reported. | Procedure using a recirculating pump | 15. | The flow through the column is started. It is recommended that a flow rate of approximately 25 ml/h, corresponding to 10 bed volumes per hour for the column described, be used. At least the first five bed volumes are discarded to remove water soluble impurities. Following this, the pump is allowed to run until equilibrium is established, as defined by five successive samples whose concentrations do not differ by more than ± 30 % in a random fashion. These samples should be separated from each other by time intervals corresponding to the passage of at least ten bed volumes. Depending on the analytical method used, it may be preferable to establish a concentration/time curve to show that equilibrium is reached. | Procedure using a levelling vessel | 16. | Successive eluate fractions should be collected and analysed by the chosen method. Fractions from the middle eluate range, where the concentrations are constant within ± 30 % in at least five consecutive fractions, are used to determine the solubility. | 17. | Double distilled water is the preferred eluent. Deionized water with a resistivity above 10 megohms/cm and total organic carbon content below 0,01 % can also be used. | 18. | Under both procedures, a second run is performed at half the flow rate of the first. If the results of the two runs are in agreement, the test is satisfactory. If the measured solubility is higher with the lower flow rate, then the halving of the flow rate must continue until two successive runs give the same solubility. | 19. | Under both procedures, the fractions should be checked for the presence of colloidal matter by examination of the Tyndall effect. The presence of particles invalidates the test and the test should be repeated after improvement of the filtering action of the column. | 20. | The pH of each sample should be measured, preferably by using special indicator strips. | Flask method | Principle | 21. | The test substance (solids must be pulverized) is dissolved in water at a temperature somewhat above the test temperature. When saturation is achieved, the mixture is cooled and kept at the test temperature. Alternatively, and if it is assured by appropriate sampling that the saturation equilibrium is reached, the measurement can be performed directly at the test temperature. Subsequently, the mass concentration of the test substance in the aqueous solution, which must not contain any undissolved particles, is determined by a suitable analytical method (3). | Apparatus | 22. | The following materials are needed: | — | normal laboratory glassware and instrumentation; | — | a device for the agitation of solutions under controlled constant temperature; | — | if required for emulsions, a centrifuge (preferably thermostated); and | — | analytical equipment. | Procedure | 23. | The quantity of test substance necessary to saturate the desired volume of water is estimated from the preliminary test. About five times that quantity is weighed into each of three glass vessels fitted with glass stoppers (e.g. centrifuge tubes, flasks). A volume of water, chosen in function of the analytical method and solubility range, is added to each vessel. The vessels are tightly stoppered and then agitated at 30 °C. A shaking or stirring device capable of operating at constant temperature should be used, e.g. magnetic stirring in a thermostated water bath. After one day, one of the vessels is equilibrated for 24 hours at the test temperature with occasional shaking. The contents of the vessel are then centrifuged at the test temperature and the concentration of the test substance in the clear aqueous phase is determined by a suitable analytical method. The other two flasks are treated similarly after initial equilibration at 30 °C for two and three days respectively. If the concentrations measured in at least the two last vessels do not differ by more than 15 %, the test is satisfactory. If the results from vessels 1, 2 and 3 show a tendency of increasing values, the whole test should be repeated using longer equilibration times. | 24. | The test can also be performed without pre-incubation at 30 °C. In order to estimate the rate of establishment of the saturation equilibrium, samples are taken until the stirring time no longer influences the concentrations measured. | 25. | The pH of each sample should be measured, preferably by using special indicator strips. | Analytical determinations | 26. | A substance-specific method is preferred since small amounts of soluble impurities can cause large errors in the measured solubility. Examples of such methods are: gas or liquid chromatography, titration, photometry, voltametry. | DATA AND REPORTING | Data | Column elution method | 27. | For each run, the mean value and standard deviation from at least five consecutive samples taken from the saturation plateau should be calculated. The mean values obtained from two tests with different flows should not differ by more than 30 %. | Flask method | 28. | The individual results from each of the three flasks, which should not differ by more than 15 %, are averaged. | Test Report | Column elution method | 29. | The test report must include the following information: | — | the results of the preliminary test | — | chemical identity and impurities (preliminary purification step, if any) | — | the concentrations, flow rates and pH for each sample | — | the means and standard deviations from at least five samples from the saturation plateau of each run | — | the average of at least two successive runs | — | the temperature of the water during the saturation process | — | the method of analysis | — | the nature of the support material | — | loading of the support material | — | solvent used | — | evidence of any chemical instability of the substance during the test | — | all information relevant for the interpretation of the results, in particular with regard to impurities and physical state of the test substance. | Flask method | 30. | The test report must include the following information: | — | the results of the preliminary test | — | chemical identity and impurities (preliminary purification step, if any) | — | the individual analytical determinations and the average where more than one value was determined for each flask | — | the pH of each sample | — | the average of the values for different flasks which were in agreement | — | the test temperature | — | the analytical method | — | evidence of any chemical instability of the substance during the test | — | all information relevant for the interpretation of the results, in particular with regard to impurities and physical state of the test substance. | LITERATURE: | (1) | Commission Directive 92/69/EEC of 31 July 1992 adapting to technical progress for the seventeenth time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances (OJ L 383, 29.12.1992, p. 113). | (2) | NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. | (3) | NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method’. | 1) | El capítulo A.6 se sustituye por el texto siguiente: | «A.6. HIDROSOLUBILIDAD | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 105 de la OCDE (1995). Es una versión revisada de las TG 105 original que se adoptaron en 1981. No hay diferencias esenciales entre la versión actual y la de 1981. Se ha modificado fundamentalmente el formato. La revisión está basada en el método de ensayo de la UE "Hidrosolubilidad" (1). | CONSIDERACIONES INICIALES | 2. | La hidrosolubilidad de una sustancia puede verse considerablemente afectada por la presencia de impurezas. El presente método se dirige a determinar la hidrosolubilidad de sustancias esencialmente puras que son estables en agua y no volátiles. Antes de proceder al ensayo, es conveniente disponer de información sobre la sustancia problema, como la fórmula estructural, la presión de vapor, la constante de disociación y la hidrólisis como función del pH. | 3. | En el presente documento se describen dos métodos de ensayo, el método de elución en columna y el método del frasco, que abarcan respectivamente solubilidades por debajo y por encima de 10-2 g/l. Se describe además un ensayo preliminar sencillo. Este permite determinar aproximadamente la cantidad adecuada de muestra que deberá emplearse en el ensayo final, así como el tiempo necesario para conseguir la saturación. | DEFINICIONES Y UNIDADES | 4. | La hidrosolubilidad de una sustancia es la concentración de saturación en masa de la sustancia en el agua a una temperatura determinada. | 5. | Se expresa en masa de soluto por volumen de solución. La unidad SI es el kg/m3, pero se puede utilizar también g/l. | SUSTANCIAS DE REFERENCIA | 6. | No es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que se analice una sustancia problema. | DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS | Condiciones del ensayo | 7. | El ensayo debe efectuarse, a ser posible, a 20 °C ± 0,5 °C. La temperatura elegida se mantendrá constante en todas las partes importantes del equipo. | Ensayo preliminar | 8. | De manera gradual, añadir volúmenes crecientes de agua a temperatura ambiente a alrededor de 0,1 g de muestra (las sustancias sólidas deben estar reducidas a polvo) en una probeta de 10 ml con tapón de vidrio. Después de la adición de cada cantidad de agua, agitar vigorosamente la mezcla durante 10 minutos y luego comprobar visualmente si contiene partículas de muestra no disueltas. Si después de añadir 10 ml de agua la muestra o determinadas partes de esta no se han disuelto, hay que proseguir el experimento en una probeta de 100 ml. La solubilidad aproximada se indica, en el cuadro 1, bajo el volumen de agua en que se efectúa la disolución completa de la muestra. Cuando la solubilidad es baja, puede hacer falta mucho tiempo para que se disuelva la sustancia problema, por lo que habrá que esperar como mínimo 24 horas. Si al cabo de 24 horas la sustancia problema sigue sin disolverse, hay que dejar más tiempo (96 horas como máximo) o bien proceder a una nueva dilución a fin de determinar si hay que utilizar el método de elución en columna o el método del frasco. | Cuadro 1 | ml de agua en que se disuelven 0,1 g de soluto | 0,1 | 0,5 | 1 | 2 | 10 | 100 | > 100 | Solubilidad aproximada en g/l | < 1 000 | 1 000 -200 | 200-100 | 100-50 | 50-10 | 10-1 | < 1 | Método de elución en columna | Principio | 9. | Este método se basa en la elución con agua de la sustancia problema en una microcolumna cargada con un material soporte inerte previamente cubierto con un exceso de sustancia problema (2). La hidrosolubilidad viene determinada por la concentración en masa del eluato cuando ha alcanzado una meseta en función del tiempo. | Aparato | 10. | El aparato consiste en una microcolumna (figura 1) que se mantiene a temperatura constante. Está conectado a una bomba de recirculación (figura 2) o a un recipiente de nivelación (figura 3). La microcolumna contiene un soporte inerte retenido por un pequeño tapón de lana de vidrio que servirá también para separar las partículas por filtración. Como soporte se pueden emplear bolas de cristal, tierra de diatomeas u otros materiales inertes. | 11. | La microcolumna representada en la figura 1 es idónea para funcionar con una bomba de recirculación. Tiene un espacio de cabeza correspondiente a cinco volúmenes de lecho de agua (desechados al principio del ensayo) y una capacidad para cinco muestras (tomadas para análisis durante el ensayo). No obstante, se puede reducir la dimensión si es posible añadir agua al sistema durante el ensayo para reemplazar los cinco volúmenes de lecho iniciales, eliminados con las impurezas. La columna se conectará mediante tubos de material inerte a la bomba de recirculación, que será capaz de suministrar aproximadamente 25 ml/hora. Como bomba de recirculación se podrá utilizar, por ejemplo, una bomba peristáltica o una bomba de membrana. Hay que procurar que el material del tubo no sea causa de contaminación ni adsorción. | 12. | En la figura 3 se muestra el esquema de un sistema con recipiente de nivelación. En este sistema la microcolumna lleva acoplada una llave de una vía. La conexión al recipiente de nivelación se hace mediante una junta de vidrio esmerilado y tubos de material inerte. El caudal del recipiente de nivelación deberá ser de unos 25 ml/hora. | Figura 1 | Figura 2 | Figura 3 | 13. | Pesar unos 600 mg de material soporte y pasarlos a un matraz de fondo redondo de 50 ml. Disolver una cantidad idónea de la sustancia problema en un disolvente volátil con calidad de reactivo analítico y añadir al soporte una cantidad adecuada de esta solución. El disolvente debe evaporarse por completo, por ejemplo en un rotavapor; de lo contrario, no se daría la saturación en agua del soporte durante la etapa de elución, debido al efecto de partición en la superficie. Dejar que se empape el soporte cargado de esta forma durante 2 horas en 5 ml de agua, aproximadamente, y luego pasar la suspensión a la microcolumna. También se podrá verter el soporte cargado seco en la microcolumna llena de agua y a continuación equilibrar después durante 2 horas. | 14. | La carga del soporte puede plantear dificultades que lleven a resultados erróneos, por ejemplo si la sustancia problema se deposita en forma de aceite. Las dificultades deben examinarse y han de recogerse los datos correspondientes. | Procedimiento empleado con una bomba de recirculación | 15. | Se inicia la circulación a través de la columna. El caudal recomendado es de 25 ml/hora, aproximadamente, que equivale a unos 10 volúmenes de lecho por hora para la columna arriba descrita. Se descartan como mínimo los 5 primeros volúmenes de lecho a fin de eliminar las impurezas solubles en el agua. Luego se conecta la bomba de recirculación, haciendo funcionar el aparato hasta llegar al estado de equilibrio, definido por 5 muestras sucesivas cuyas concentraciones no difieran de forma aleatoria en más del ± 30 %. Dichas muestras deben estar separadas entre sí por un intervalo de tiempo correspondiente al paso de al menos 10 volúmenes de lecho. Dependiendo del método analítico aplicado, puede ser preferible establecer una curva de concentración/tiempo para comprobar que se ha alcanzado el equilibrio. | Procedimiento empleado con un recipiente de nivelación | 16. | Se recogerán las sucesivas fracciones de eluato y se analizarán según el método elegido. Para determinar la hidrosolubilidad, se utilizarán las fracciones procedentes del intervalo medio de elución cuyas concentraciones sean constantes en el intervalo de ± 30 %, al menos en 5 fracciones consecutivas. | 17. | Como eluyente se recomienda usar agua bidestilada. También puede usarse agua desionizada con una resistividad superior a 10 megaohms/cm y un contenido de carbono orgánico total menor del 0,01 %. | 18. | Con ambos procedimientos se repetirá la operación, reduciendo el caudal a la mitad. Si los resultados de las dos operaciones concuerdan, la prueba es satisfactoria. Si se observa una solubilidad aparente más elevada con el caudal inferior, se continuará con la reducción del caudal a la mitad hasta que se obtenga la misma solubilidad en dos operaciones sucesivas. | 19. | Con ambos procedimientos se debe controlar la posible presencia de materia coloidal en las fracciones estudiando la aparición del efecto Tyndall. La presencia de partículas invalida el ensayo, y este deberá repetirse después de mejorar la eficacia de la filtración de la columna. | 20. | Se medirá el pH de cada muestra, preferiblemente con ayuda de tiras indicadoras específicas. | Método del frasco | Principio | 21. | La sustancia problema (los sólidos deben estar pulverizados) se disuelve en agua a una temperatura algo superior a la temperatura de ensayo. Cuando se alcanza la saturación, se deja enfriar la mezcla y se mantiene a la temperatura de ensayo. Otra posibilidad es realizar la medida directamente a la temperatura de ensayo siempre que, mediante un muestreo adecuado, se garantice que se ha alcanzado el equilibrio de saturación. Luego, se determina con un método analítico apropiado la concentración en masa de la sustancia problema en la solución acuosa, que no debe contener ninguna partícula sin disolver (3). | Aparato | 22. | Se necesita el siguiente instrumental: | — | material de vidrio e instrumentos de laboratorio normales, | — | un dispositivo para agitar las disoluciones a temperatura constante controlada, | — | si se precisa en el caso de las emulsiones, una centrífuga (preferiblemente termostatizada), y | — | equipo analítico. | Procedimiento | 23. | Evaluar, a partir del ensayo preliminar, la cantidad de sustancia problema necesaria para saturar el volumen de agua elegido. Pesar aproximadamente cinco veces dicha cantidad en cada uno de tres recipientes de vidrio con tapón, también de vidrio (por ejemplo, tubos de centrífuga, matraces). Añadir a cada recipiente un volumen de agua determinado en función del método analítico y del intervalo de solubilidad. Los frascos se tapan firmemente y se agitan después a 30 °C. Utilizar un dispositivo agitador o mezclador que pueda actuar a temperatura constante como, por ejemplo, un agitador magnético en baño de agua termostatizado. Un día después, tomar uno de los recipientes y equilibrar durante 24 horas a la temperatura del ensayo, agitando de vez en cuando. El contenido del recipiente se centrifuga luego a la temperatura del ensayo y se determina la concentración de la sustancia problema en la fase acuosa clara utilizando un método analítico adecuado. Los otros dos recipientes se tratan de la misma manera, después de un primer equilibrado a 30 °C durante dos y tres días, respectivamente. Si las concentraciones medidas en al menos los dos últimos recipientes no difieren en más del 15 %, la prueba es satisfactoria. Si los resultados de los recipientes 1, 2 y 3 acusan una tendencia a la progresión, repetir de nuevo todo el ensayo utilizando tiempos de equilibrado más largos. | 24. | El ensayo se puede realizar también sin preincubar a 30 °C. Para evaluar la velocidad de adquisición del equilibrio de saturación se irán tomando muestras hasta que el tiempo de agitación deje de influir en las concentraciones medidas. | 25. | Se medirá el pH de cada muestra, preferiblemente con ayuda de tiras indicadoras específicas. | Determinaciones analíticas | 26. | Es preferible utilizar un método específico de la sustancia, pues pequeñas cantidades de impurezas solubles pueden originar errores sensibles en la solubilidad medida. Pueden citarse como ejemplos los siguientes métodos: cromatografía de gases o de líquidos, valoración volumétrica, fotometría y voltametría. | DATOS E INFORME | Datos | Método de elución en columna | 27. | En cada operación debe calcularse el valor medio y la desviación típica de al menos cinco muestras consecutivas tomadas durante la meseta de saturación. Los valores medios obtenidos en dos ensayos con caudales diferentes no deberán diferir en más del 30 %. | Método del frasco | 28. | A partir de los resultados de cada uno de los tres recipientes, que no deberán diferir en más del 15 %, se calcularán las medias. | Informe del ensayo | Método de elución en columna | 29. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | — | resultados del ensayo preliminar, | — | identidad química e impurezas (etapa de purificación preliminar, en su caso), | — | concentraciones individuales, caudales y pH de cada muestra, | — | desviación típica y media de al menos cinco muestras tomadas durante la meseta de saturación de cada operación, | — | promedio de al menos dos operaciones sucesivas, | — | temperatura del agua durante el proceso de saturación, | — | método de análisis, | — | naturaleza del material de soporte, | — | carga del material de soporte, | — | disolvente utilizado, | — | cualquier signo de inestabilidad química de la sustancia durante el ensayo, | — | todas las observaciones útiles para la interpretación de los resultados, en particular lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia problema. | Método del frasco | 30. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | — | resultados del ensayo preliminar, | — | identidad química e impurezas (etapa de purificación preliminar, en su caso), | — | resultados analíticos individuales y su media cuando se determine más de un valor para un mismo recipiente, | — | pH de cada muestra, | — | media de los valores de los diferentes recipientes cuando concuerden, | — | temperatura del ensayo, | — | método analítico, | — | cualquier signo de inestabilidad química de la sustancia durante el ensayo, | — | todas las observaciones útiles para la interpretación de los resultados, en particular lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia problema. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Directiva 92/69/CEE de la Comisión, de 31 de Julio de 1992, por la que se adapta al progreso técnico, por decimoséptima vez, la Directiva 67/548/CEE del Consejo, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas (DO L 383 de 29.12.1992, p. 113). | (2) | NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. | (3) | NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.». |
| (2) | Chapter A.23 is added: | ‘A.23 PARTITION COEFFICIENT (1-OCTANOL/WATER): SLOW-STIRRING METHOD | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 123 (2006). 1-octanol/water partition coefficient (POW) values up to a log POW of 8,2 have been accurately determined by the slow-stirring method (1). Therefore it is a suitable experimental approach for the direct determination of POW of highly hydrophobic substances. | 2. | Other methods for the determination of the 1-octanol/water partition coefficient (POW) are the “shake-flask” method (2), and the determination of the POW from reversed phase HPLC-retention behaviour (3). The “shake-flask” method is prone to artifacts due to transfer of octanol micro-droplets into the aqueous phase. With increasing values of POW the presence of these droplets in the aqueous phase leads to an increasing overestimation of the concentration of the test substance in the water. Therefore, its use is limited to substances with log POW < 4. The second method relies on solid data of directly determined POW values to calibrate the relationship between HPLC-retention behaviour and measured values of POW. A draft OECD guideline was available for determining 1-octanol/water partition coefficients of ionisable substances (4) but shall no longer be used. | 3. | This Test Method has been developed in The Netherlands. The precision of the methods described here has been validated and optimized in a ring-test validation study in which 15 laboratories participated (5). | INITIAL CONSIDERATIONS | Significance and use | 4. | For inert organic substances highly significant relationships have been found between 1-octanol/water partition coefficients (POW) and their bioaccumulation in fish. Moreover, POW has been demonstrated to be correlated to fish toxicity as well as to sorption of chemicals to solids such as soils and sediments. An extensive overview of the relationships has been given in reference (6). | 5. | A wide variety of relationships between the 1-octanol/water partition coefficient and other substance properties of relevance to environmental toxicology and chemistry have been established. As a consequence, the 1-octanol/water partition coefficient has evolved as a key parameter in the assessment of the environmental risk of chemicals as well as in the prediction of fate of chemicals in the environment. | Scope | 6. | The slow-stirring experiment is thought to reduce the formation of micro-droplets from 1-octanol droplets in the water phase. As a consequence, overestimation of the aqueous concentration due to test substance molecules associated to such droplets does not occur. Therefore, the slow-stirring method is particularly suitable for the determination of POW for substances with expected log POW values of 5 and higher, for which the shake-flask method (2) is prone to yield erroneous results. | DEFINITION AND UNITS | 7. | The partition coefficient of a substance between water and a lipophilic solvent (1-octanol) characterizes the equilibrium distribution of the chemical between the two phases. The partition coefficient between water and 1-octanol (POW) is defined as the ratio of the equilibrium concentrations of the test substance in 1-octanol saturated with water (CO) and water saturated with 1-octanol (CW). | As a ratio of concentrations it is dimensionless. Most frequently it is given as the logarithm to the base 10 (log POW). POW is temperature dependent and reported data should include the temperature of the measurement. | PRINCIPLE OF THE METHOD | 8. | In order to determine the partitioning coefficient, water, 1-octanol, and the test substance are equilibrated with each other at constant temperature. Then the concentrations of the test substance in the two phases are determined. | 9. | The experimental difficulties associated with the formation of micro-droplets during the shake-flask experiment can be reduced in the slow-stirring experiment proposed here. In the slow-stirring experiment, water, 1-octanol and the test substance are equilibrated in a thermostated stirred reactor. Exchange between the phases is accelerated by stirring. The stirring introduces limited turbulence which enhances the exchange between 1-octanol and water without micro-droplets being formed (1). | APPLICABILITY OF THE TEST | 10. | Since the presence of substances other than the test substance might influence the activity coefficient of the test substance, the test substance should be tested as a pure substance. The highest purity commercially available should be employed for the 1-octanol/water partition experiment. | 11. | The present method applies to pure substances that do not dissociate or associate and that do not display significant interfacial activity. It can be applied to determine the 1-octanol/water partition ratio of such substances and of mixtures. When the method is used for mixtures, the 1-octanol/water partition ratios determined are conditional and depend on the chemical composition of the mixture tested and on the electrolyte composition employed as aqueous phase. Provided additional steps are taken, the method is also applicable to dissociating or associating compounds (paragraph 12). | 12. | Due to the multiple equilibria in water and 1-octanol involved in the 1-octanol/water partitioning of dissociating substances such as organic acids and phenols, organic bases, and organometallic substances, the 1-octanol/water partition ratio is a conditional constant strongly dependent on electrolyte composition (7)(8). Determination of the 1-octanol/water partition ratio therefore requires that pH and electrolyte composition be controlled in the experiment and reported. Expert judgement has to be employed in the evaluation of these partition ratios. Using the value of dissociation constant(s), suitable pH-values need to be selected, such that a partitioning ratio is determined for each ionization state. Non-complexing buffers must be used when testing organometallic compounds (8). Taking the existing knowledge on the aqueous chemistry (complexation constants, dissociation constants) into account, the experimental conditions should be chosen in such a manner that the speciation of the test substance in the aqueous phase can be estimated. The ionic strength should be identical in all experiments by employing a background electrolyte. | 13. | Difficulties in the test may arise in conducting the test for substances with low water solubility or high POW, due to the fact that the concentrations in the water become very low such that their accurate determination is difficult. This Test Method provides guidance on how to deal with this problem. | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 14. | Chemical reagents should be of analytical grade or of higher purity. The use of non-labelled test substances with known chemical composition and preferably at least 99 % purity, or of radiolabelled test substances with known chemical composition and radiochemical purity, is recommended. In the case of short half-life tracers, decay corrections should be applied. In the case of radiolabelled test substances, a chemical specific analytical method should be employed to ensure that the measured radioactivity is directly related to the test substance. | 15. | An estimate of log POW may be obtained by using commercially available software for estimation of log POW, or by using the ratio of the solubilities in both solvents. | 16. | Before carrying out a slow-stirring experiment for determination of POW, the following information on the test substance should be available: | (a) | structural formula | (b) | suitable analytical methods for determination of the concentration of the substance in water and 1-octanol | (c) | dissociation constant(s) of ionisable substances (OECD Guideline 112 (9)) | (d) | aqueous solubility (10) | (e) | abiotic hydrolysis (11) | (f) | ready biodegradability (12) | (g) | vapour pressure (13). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Equipment and apparatus | 17. | Standard laboratory equipment is required, in particular, the following: | — | magnetic stirrers and Teflon coated magnetic stir bars are employed to stir the water phase; | — | analytical instrumentation, suitable for determination of the concentration of the test substance at the expected concentrations; | — | stirring-vessel with a tap at the bottom. Dependent on the estimate of log POW and the Limit of Detection (LOD) of the test compound, the use of a reaction vessel of the same geometry larger than one litre has to be considered, so that a sufficient volume of water can be obtained for chemical extraction and analysis. This will result in higher concentrations in the water extract and thus a more reliable analytical determination. A table giving estimates of the minimum volume needed, the LOD of the compound, its estimated log POW and its water solubility is given in Appendix 1. The table is based on the relationship between log POW and the ratio between the solubilities in octanol and water, as presented by Pinsuwan et al. (14): | where | (in molarity); | and the relationship given by Lyman (15) for predicting water solubility. Water solubilities calculated with the equation given in Appendix 1 must be seen as a first estimate. It should be noted that the user is free to generate an estimate of water solubility by means of any relationship that is considered to better represent the relationship between hydrophobicity and solubility. For solid compounds, inclusion of melting point in the prediction of solubility is for instance recommended. In case a modified equation is used, it should be ascertained that the equation for calculation of solubility in octanol is still valid. A schematic drawing of a glass-jacketed stirring-vessel with a volume of ca. one litre is given in Appendix 2. The proportions of the vessel shown in Appendix 2 have proven favourable and should be maintained when apparatus of a different size is used; | — | a means for keeping the temperature constant during the slow-stirring experiment is essential. | 18. | Vessels should be made from inert material such that adsorption to vessel surfaces is negligible. | Preparation of the test solutions | 19. | The POW determination should be carried out with the highest purity 1-octanol that is commercially available (at least + 99 %). Purification of 1-octanol by extraction with acid, base and water and subsequent drying is recommended. In addition, distillation can be used to purify 1-octanol. Purified 1-octanol is to be used to prepare standard solutions of the test substances. Water to be used in the POW determination should be glass or quartz distilled, or obtained from a purification system, or HPLC-grade water may be used. Filtration through a 0,22 μm filter is required for distilled water, and blanks should be included to check that no impurities are in the concentrated extracts that may interfere with the test substance. If a glass fibre filter is used, it should be cleaned by baking for at least three hours at 400 °C. | 20. | Both solvents are mutually saturated prior to the experiment by equilibrating them in a sufficiently large vessel. This is accomplished by slow-stirring the two-phase system for two days. | 21. | An appropriate concentration of test substance is selected and dissolved in 1-octanol (saturated with water). The 1-octanol/water partition coefficient needs to be determined in dilute solutions in 1-octanol and water. Therefore the concentration of the test substance should not exceed 70 % of its solubility with a maximum concentration of 0,1 M in either phase (1). The 1-octanol solutions used for the experiment must be devoid of suspended solid test substance. | 22. | The appropriate amount of test substance is dissolved in 1-octanol (saturated with water). If the estimate of log POW exceeds five, care has to be taken that the 1-octanol solutions used for the experiment are devoid of suspended solid test substance. To that end, the following procedure for chemicals with an estimated value of log POW > 5 is followed: | — | the test substance is dissolved in 1-octanol (saturated with water); | — | the solution is given sufficient time for the suspended solid substance to settle out. During the settling period, the concentration of the test substance is monitored; | — | after the measured concentrations in the 1-octanol-solution have attained stable values, the stock solution is diluted with an appropriate volume of 1-octanol; | — | the concentration of the diluted stock solution is measured. If the measured concentration is consistent with the dilution, the diluted stock solution can be employed in the slow-stirring experiment. | Extraction and analysis of samples | 23. | A validated analytical method should be used for the assay of test substance. The investigators have to provide evidence that the concentrations in the water saturated 1-octanol as well as in the 1-octanol saturated water phase during the experiment are above the method limit of quantification of the analytical procedures employed. Analytical recoveries of the test substance from the water phase and from the 1-octanol phase need to be established prior to the experiment in those cases for which extraction methods are necessary. The analytical signal needs to be corrected for blanks and care should be taken that no carry-over of analyte from one sample to another can occur. | 24. | Extraction of the water phase with an organic solvent and preconcentration of extract are likely to be required prior to analysis, due to rather low concentrations of hydrophobic test substances in the water phase. For the same reason it is necessary to reduce eventual blank concentrations. To that end, it is necessary to employ high purity solvents, preferably solvents for residue analysis. Moreover, working with carefully pre-cleaned (e.g. solvent washing or baking at elevated temperature) glassware can help to avoid cross-contamination. | 25. | An estimate of log POW may be obtained from an estimation program or by expert judgment. If the value is higher than six then blank corrections and analyte carry-over need to be monitored closely. Similarly, if the estimate of log POW exceeds six, the use of a surrogate standard for recovery correction is mandatory, so that high preconcentration factors can be reached. A number of software programs for the estimation of log POW are commercially available (1), e.g. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) and ACD log P (19). Descriptions of the estimation approaches can be found in references (20-22). | 26. | The limits of quantification (LOQ) for determination of the test substance in 1-octanol and water are established using accepted methods. As a rule of thumb, the method limit of quantification can be determined as the concentration in water or 1-octanol that produces a signal to noise ratio of ten. A suitable extraction and pre-concentration method should be selected and analytical recoveries should also be specified. A suitable pre-concentration factor is selected in order to obtain a signal of the required size upon analytical determination. | 27. | On the basis of the parameters of the analytical method and the expected concentrations, an approximate sample size required for an accurate determination of the compound concentration is determined. The use of water samples that are too small to obtain a sufficient analytical signal should be avoided. Also, the use of excessively large water samples should be avoided, since otherwise there might be too little water left for the minimum number of analyses required (n = 5). In Appendix 1, the minimum sample volume is indicated as a function of the vessel volume, the LOD of the test substance and the solubility of the test substance. | 28. | Quantification of the test substances occurs by comparison with calibration curves of the respective compound. The concentrations in the samples analysed must be bracketed by concentrations of standards. | 29. | For test substances with a log POW estimate higher than six a surrogate standard has to be spiked to the water sample prior to extraction in order to register losses occurring during extraction and pre-concentration of the water samples. For accurate recovery correction, the surrogates must have properties that are very close to, or identical with, those of the test substance. Preferably, (stable) isotopically-labelled analogues of the substances of interest (for example, perdeuterated or 13C-labelled) are used for this purpose. If the use of labelled stable isotopes, i.e. 13C or 2H, is not possible it should be demonstrated from reliable data in the LITERATURE that the physical-chemical properties of the surrogate are very close to those of the test substance. During liquid-liquid extraction of the water phase emulsions can form. They can be reduced by addition of salt and allowing the emulsion to settle overnight. Methods used for extracting and pre-concentrating the samples need to be reported. | 30. | Samples withdrawn from the 1-octanol phase may, if necessary, be diluted with a suitable solvent prior to analysis. Moreover, the use of surrogate standards for recovery correction is recommended for substances for which the recovery experiments demonstrated a high degree of variation in the recovery experiments (relative standard deviation > 10 %). | 31. | The details of the analytical method need to be reported. This includes the method of extraction, pre-concentration and dilution factors, instrument parameters, calibration routine, calibration range, analytical recovery of the test substance from water, addition of surrogate standards for recovery correction, blank values, detection limits and limits of quantification. | Performance of the Test | Optimal 1-octanol/water volume ratios | 32. | When choosing the water and 1-octanol volumes, the LOQ in 1-octanol and water, the pre-concentration factors applied to the water samples, the volumes sampled in 1-octanol and water, and the expected concentrations should be considered. For experimental reasons, the volume of 1-octanol in the slow-stirring system should be chosen such that the 1-octanol layer is sufficiently thick (> 0,5 cm) in order to allow for sampling of the 1-octanol phase without disturbing it. | 33. | Typical phase ratios used for the determinations of compounds with log POW of 4,5 and higher are 20 to 50 ml of 1-octanol and 950 to 980 ml of water in a one litre vessel. | Test conditions | 34. | During the test the reaction vessel is thermostated to reduce temperature variation to below 1 °C. The assay should be performed at 25 °C. | 35. | The experimental system should be protected from daylight by either performing the experiment in a dark room or by covering the reaction vessel with aluminium foil. | 36. | The experiment should be performed in a dust-free (as far as possible) environment. | 37. | The 1-octanol-water system is stirred until equilibrium is attained. In a pilot experiment the length of the equilibration period is assessed by performing a slow-stirring experiment and sampling water and 1-octanol periodically. The sampling time points should be interspersed by a minimum period of five hours. | 38. | Each POW determination has to be performed employing at least three independent slow-stirring experiments. | Determination of the equilibration time | 39. | It is assumed that the equilibrium is achieved when a regression of the 1-octanol/water concentration ratio against time over a time span of four time points yields a slope that is not significantly different from zero at a p-level of 0,05. The minimum equilibration time is one day before sampling can be started. As a rule of thumb, sampling of substances with a log POW estimate of less than five can take place during days two and three. The equilibration might have to be extended for more hydrophobic compounds. For a compound with log POW of 8,23 (decachlorobiphenyl) 144 hours were sufficient for equilibration. Equilibrium is assessed by means of repeated sampling of a single vessel. | Starting the experiment | 40. | At the start of the experiment the reaction vessel is filled with 1-octanol-saturated water. Sufficient time should be allowed to reach the thermostated temperature. | 41. | The desired amount of test substance (dissolved in the required volume of 1-octanol saturated with water) is carefully added to the reaction vessel. This is a crucial step in the experiment, since turbulent mixing of the two phases has to be avoided. To that end, the 1-octanol phase can be pipetted slowly against the wall of the experimental vessel, close to the water surface. It will subsequently flow along the glass wall and form a film above the water phase. The decantation of 1-octanol directly into the flask should always be avoided; drops of 1-octanol should not be allowed to fall directly into the water. | 42. | After starting the stirring, the stirring rate should be increased slowly. If the stirring motors cannot be appropriately adjusted the use of a transformer should be considered. The stirring rate should be adjusted so that a vortex at the interface between water and 1-octanol of 0,5 to maximally 2,5 cm depth is created. The stirring rate should be reduced if the vortex depth of 2,5 cm is exceeded; otherwise micro-droplets may be formed from 1-octanol droplets in the water phase, leading to an overestimation of the concentration of the test substance in the water. The maximum stirring rate of 2,5 cm is recommended on the basis of the findings in the ring-test validation study (5). It is a compromise between achieving a rapid rate of equilibration, while limiting the formation of 1-octanol micro-droplets. | Sampling and Sample Treatment | 43. | The stirrer should be turned off prior to sampling and the liquids should be allowed to stop moving. After sampling is completed, the stirrer is started again slowly, as described above, and then the stirring rate is increased gradually. | 44. | The water phase is sampled from a stopcock at the bottom of the reaction vessel. Always discard the dead volume of water contained in the taps (approximately 5 ml in the vessel shown in the Appendix 2). The water in the taps is not stirred and therefore not in equilibrium with the bulk. Note the volume of the water samples, and make sure that the amount of test substance present in the discarded water is taken into account when setting up a mass balance. Evaporative losses should be minimized by allowing the water to flow quiescently into the separatory funnel, such that there is no disturbance of the water/1-octanol layer. | 45. | 1-Octanol samples are obtained by withdrawing a small aliquot (ca. 100 μl) from the 1-octanol layer with a 100 microlitre all glass-metal syringe. Care should be taken not to disturb the boundary. The volume of the sampled liquid is recorded. A small aliquot is sufficient, since the 1-octanol sample will be diluted. | 46. | Unnecessary sample transfer steps should be avoided. To that end the sample volume should be determined gravimetrically. In case of water samples this can be achieved by collecting the water sample in a separatory funnel that contains already the required volume of solvent. | DATA AND REPORTING | 47. | According to the present Test Method, POW is determined by performing three slow-stirring experiments (three experimental units) with the compound under investigation employing identical conditions. The regression used to demonstrate attainment of equilibrium should be based on the results of at least four determinations of CO/CW at consecutive time points. This allows for calculating variance as a measure of the uncertainty of the average value obtained by each experimental unit. | 48. | The POW can be characterized by the variance in the data obtained for each experimental unit. This information is employed to calculate the POW as the weighted average of the results of the individual experimental units. To do so, the inverse of the variance of the results of the experimental units is employed as weight. As a result, data with a large variation (expressed as the variance) and thus with lower reliability have less influence on the result than data with a low variance. | 49. | Analogously, the weighted standard deviation is calculated. It characterizes the repeatability of the POW measurement. A low value of the weighted standard deviation indicates that the POW determination was very repeatable within one laboratory. The formal statistical treatment of the data is outlined below. | Treatment of the results | Demonstration of attainment of equilibrium | 50. | The logarithm of the ratio of the concentration of the test substance in 1-octanol and water (log (CO/Cw)) is calculated for each sampling time. Achievement of chemical equilibrium is demonstrated by plotting this ratio against time. A plateau in this plot that is based on at least four consecutive time points indicates that equilibrium has been attained, and that the compound is truly dissolved in 1-octanol. If not, the test needs to be continued until four successive time points yield a slope that is not significantly different from 0 at a p-level of 0,05, indicating that log Co/Cw is independent of time. | Log POW-calculation | 51. | The value of log POW of the experimental unit is calculated as the weighted average value of log Co/Cw for the part of the curve of log Co/Cw vs. time, for which equilibrium has been demonstrated. The weighted average is calculated by weighting the data with the inverse of the variance so that the influence of the data on the final result is inversely proportional to the uncertainty in the data. | Average log POW | 52. | The average value of log POW of different experimental units is calculated as the average of the results of the individual experimental units weighted with their respective variances. | The calculation is performed as follows: | where: | log POW,i | = | the log POW value of the individual experimental unit i; | log POW,Av | = | the weighted average value of the individual log POW determinations; | wi | = | the statistical weight assigned to the log POW value of the experimental unit i. | The reciprocal of the variance of log POW,i is employed as wi ( | ) | 53. | The error of the average of log POW is estimated as the repeatability of log Co/Cw determined during the equilibrium phase in the individual experimental units. It is expressed as the weighted standard deviation of log POW,Av (σlog Pow,Av) which in turn is a measure of the error associated with log POW,Av. The weighted standard deviation can be computed from the weighted variance (varlog Pow,Av) as follows: | The symbol n stands for the number of experimental units. | Test Report | 54. | The test report should include the following information: | | Test substance: | — | common name, chemical name, CAS number, structural formula (indicating position of label when radiolabelled substance is used) and relevant physical-chemical properties (see paragraph 17) | — | purity (impurities) of test substance | — | label purity of labelled chemicals and molar activity (where appropriate) | — | the preliminary estimate of log Pow, as well as the method used to derive the value. | | Test conditions: | — | dates of the performance of the studies | — | temperature during the experiment | — | volumes of 1-octanol and water at the beginning of the test | — | volumes of withdrawn 1-octanol and water samples | — | volumes of 1-octanol and water remaining in the test vessels | — | description of the test vessels and stirring conditions (geometry of the stirring bar and of the test vessel, vortex height in mm, and when available: stirring rate) used | — | analytical methods used to determine the test substance and the method limit of quantification | — | sampling times | — | the aqueous phase pH and the buffers used, when pH is adjusted for ionizable molecules | — | number of replicates. | | Results: | — | repeatability and sensitivity of the analytical methods used | — | determined concentrations of the test substance in 1-octanol and water as a function of time | — | demonstration of mass balance | — | temperature and standard deviation or the range of temperature during the experiment | — | the regression of concentration ratio against time | — | the average value log Pow,Av and its standard error | — | discussion and interpretation of the results | — | examples of raw data figures of representative analysis (all raw data have to be stored in accordance with GLP standards), including recoveries of surrogates, and the number of levels used in the calibration (along with the criteria for the correlation coefficient of the calibration curve), and results of quality assurance/quality control (QA/QC) | — | when available: validation report of the assay procedure (to be indicated among references). | LITERATURE: | (1) | De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the “slow-stirring” method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512. | (2) | Chapter A.8 of this Annex, Partition Coefficient. | (3) | Chapter A.8 of this Annex, Partition Coefficient. | (4) | OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris. | (5) | Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01. | (6) | Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA. | (7) | Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. | (8) | Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602. | (9) | OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris. | (10) | Chapter A.6 of this Annex, Water Solubility. | (11) | Chapter C.7 of this Annex, Degradation – Abiotic Degradation Hydrolysis as a Function of pH. | (12) | Chapter C.4 — Part II – VII (Method A to F) of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability. | (13) | Chapter A.4 of this Annex, Vapour Pressure. | (14) | Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626. | (15) | Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52. | (16) | Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA. | (17) | Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. | (18) | Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest. | (19) | ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001. | (20) | Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C. | (21) | Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488. | (22) | Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390. | Appendix 1 | Spreadsheet for computation of minimum volumes of water required for detection of test substances of different log POW values in aqueous phase | Assumptions: | — | Maximum volume of individual aliquots = 10 % of total volume; 5 aliquots = 50 % of total volume. | — | . In case of lower concentrations, larger volumes would be required. | — | Volume used for LOD determination = 100 ml. | — | log Pow vs. log Sw and log Pow vs. SR (Soct/Sw) are reasonable representations of relationships for test substances. | Estimation of Sw | log Pow | Equation | log Sw | Sw (mg/l) | 4 | 0,496 | 3,133E+00 | 4,5 | 0,035 | 1,084E+00 | 5 | –0,426 | 3,750E-01 | 5,5 | –0,887 | 1,297E-01 | 6 | –1,348 | 4,487E-02 | 6,5 | –1,809 | 1,552E-02 | 7 | –2,270 | 5,370E-03 | 7,5 | –2,731 | 1,858E-03 | 8 | –3,192 | 6,427E-04 | Estimation of Soct | log Pow | Equation | Soct (mg/l) | 4 | 3,763E+04 | 4,5 | 4,816E+04 | 5 | 6,165E+04 | 5,5 | 7,890E+04 | 6 | 1,010E+05 | 6,5 | 1,293E+05 | 7 | 1,654E+05 | 7,5 | 2,117E+05 | 8 | 2,710E+05 | Total Mass test substance | (mg) | Massoct/Masswater | MassH2O | (mg) | ConcH2O | (mg/l) | Massoct | (mg) | Concoct | (mg/l) | 1 319 | 526 | 2,5017 | 2,6333 | 1 317 | 26 333 | 1 686 | 1 664 | 1,0127 | 1,0660 | 1 685 | 33 709 | 2 158 | 5 263 | 0,4099 | 0,4315 | 2 157 | 43 149 | 2 762 | 16 644 | 0,1659 | 0,1747 | 2 762 | 55 230 | 3 535 | 52 632 | 0,0672 | 0,0707 | 3 535 | 70 691 | 4 524 | 1664 36 | 0,0272 | 0,0286 | 4 524 | 90 480 | 5 790 | 5263 16 | 0,0110 | 0,0116 | 5 790 | 115 807 | 7 411 | 1 664 357 | 0,0045 | 0,0047 | 7 411 | 148 223 | 9 486 | 5 263 158 | 0,0018 | 0,0019 | 9 486 | 189 713 | Computation of volumes | Minimum volume required for H2O phase at each LOD concentration | log Kow | LOD (micrograms/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | | 0,04 | 0,38 | 3,80 | 38 | 380 | 4,5 | | 0,09 | 0,94 | 9,38 | 94 | 938 | 5 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 232 | 2 318 | 5,5 | | 0,57 | 5,73 | 57,26 | 573 | 5 726 | 6 | | 1,41 | 14,15 | 141 | 1 415 | 14 146 | 6,5 | | 3,50 | 34,95 | 350 | 3 495 | 34 950 | 7 | | 8,64 | 86,35 | 864 | 8 635 | 86 351 | 7,5 | | 21,33 | 213 | 2 133 | 21 335 | 213 346 | 8 | | 52,71 | 527 | 5 271 | 52 711 | 527 111 | Volume used for LOD (l) | 0,1 | | | | | | Key to Computations | Represents < 10 % of total volume of aqueous phase, 1 litre equilibration vessel. | Represents < 10 % of total volume of aqueous phase, 2 litre equilibration vessel. | Represents < 10 % of total volume of aqueous phase, 5 litre equilibration vessel. | Represents < 10 % of total volume of aqueous phase, 10 litre equilibration vessel. | Exceeds 10 % of even the 10 liter equilibration vessel. | Overview of volumes required, as a function of water solubility and Log Pow | Minimum volume required for H2O phase at each LOD concentration (ml) | log Pow | Sw (mg/l) | LOD (micrograms/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | 10 | | 0,01 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | | 5 | | 0,02 | 0,24 | 2,38 | 23,80 | 237,97 | | 3 | | 0,04 | 0,40 | 3,97 | 39,66 | 396,62 | | 1 | | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | 1 189,86 | 4,5 | 5 | | 0,02 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | | 2 | | 0,05 | 0,51 | 5,08 | 50,84 | 508,42 | | 1 | | 0,10 | 1,02 | 10,17 | 101,68 | 1 016,83 | | 0,5 | | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | 2 033,67 | 5 | 1 | | 0,09 | 0,87 | 8,69 | 86,90 | 869,01 | | 0,5 | | 0,17 | 1,74 | 17,38 | 173,80 | 1 738,02 | | 0,375 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 231,75 | 2 317,53 | | 0,2 | | 0,43 | 4,35 | 43,45 | 434,51 | 4 345,05 | 5,5 | 0,4 | | 0,19 | 1,86 | 18,57 | 185,68 | 1 856,79 | | 0,2 | | 0,37 | 3,71 | 37,14 | 371,36 | 3 713,59 | | 0,1 | | 0,74 | 7,43 | 74,27 | 742,72 | 7 427,17 | | 0,05 | | 1,49 | 14,85 | 148,54 | 1 485,43 | 14 854,35 | 6 | 0,1 | | 0,63 | 6,35 | 63,48 | 634,80 | 6 347,95 | | 0,05 | | 1,27 | 12,70 | 126,96 | 1 269,59 | 12 695,91 | | 0,025 | | 2,54 | 25,39 | 253,92 | 2 539,18 | 25 391,82 | | 0,0125 | | 5,08 | 50,78 | 507,84 | 5 078,36 | 50 783,64 | 6,5 | 0,025 | | 2,17 | 21,70 | 217,02 | 2 170,25 | 21 702,46 | | 0,0125 | | 4,34 | 43,40 | 434,05 | 4 340,49 | 43 404,93 | | 0,006 | | 9,04 | 90,43 | 904,27 | 9 042,69 | 90 426,93 | | 0,003 | | 18,09 | 180,85 | 1 808,54 | 18 085,39 | 180 853,86 | 7 | 0,006 | | 7,73 | 77,29 | 772,89 | 7 728,85 | 77 288,50 | | 0,003 | | 15,46 | 154,58 | 1 545,77 | 15 457,70 | 154 577,01 | | 0,0015 | | 23,19 | 231,87 | 2 318,66 | 23 186,55 | 231 865,51 | | 0,001 | | 46,37 | 463,73 | 4 637,31 | 46 373,10 | 463 731,03 | 7,5 | 0,002 | | 19,82 | 198,18 | 1 981,77 | 19 817,73 | 198 177,33 | | 0,001 | | 39,64 | 396,35 | 3 963,55 | 39 635,47 | 396 354,66 | | 0,0005 | | 79,27 | 792,71 | 7 927,09 | 79 270,93 | 792 709,32 | | 0,00025 | | 158,54 | 1 585,42 | 15 854,19 | 158 541,86 | 1 585 418,63 | 8 | 0,001 | | 33,88 | 338,77 | 3 387,68 | 33 876,77 | 338 767,72 | | 0,0005 | | 67,75 | 677,54 | 6 775,35 | 67 753,54 | 677 535,44 | | 0,00025 | | 135,51 | 1 355,07 | 13 550,71 | 135 507,09 | 1 355 070,89 | | 0,000125 | | 271,01 | 2 710,14 | 27 101,42 | 271 014,18 | 2 710 141,77 | Volume used for LOD (l) | 0,1 | | | | | | Appendix 2 | An example of glass-jacketed test vessel for the slow-stirring experiment for determination of POW | ’ | 2) | Se añade el capítulo A.23 siguiente: | «A.23. COEFICIENTE DE REPARTO (1-OCTANOL/AGUA): MÉTODO DE AGITACIÓN LENTA | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 123 (2006) de la OCDE. El método de agitación lenta (1) ha permitido determinar con exactitud el coeficiente de reparto 1-octanol/agua (POW) con valores de hasta un log POW de 8,2. Por lo tanto, es un enfoque experimental idóneo para la determinación directa del POW de sustancias altamente hidrófobas. | 2. | Otros métodos para determinar el coeficiente de reparto 1-octanol/agua (POW) son el método "de frasco de agitación" (2) y la determinación del POW basada en el comportamiento de retención en CLAR de fase inversa (3). El método "de frasco de agitación" es proclive a dar artefactos por la transferencia de microgotas de octanol a la fase acuosa. Al aumentar los valores de POW, la presencia de estas microgotas en la fase acuosa provoca una sobrevaloración creciente de la concentración de la sustancia problema en el agua. Por este motivo es aplicable solo a las sustancias con log POW<4. El segundo método se basa en los datos sólidos de valores de POW medidos directamente para calibrar la relación entre el comportamiento de retención en CLAR y los valores medidos de POW. Hubo un proyecto de directrices de la OCDE para determinar los coeficientes de reparto 1-octanol/agua de las sustancias ionizables (4), pero ya no está vigente. | 3. | Este método de ensayo ha sido desarrollado en los Países Bajos. La precisión de los métodos aquí descritos ha sido validada y optimizada en un estudio de validación interlaboratorios, en el que participaron quince laboratorios (5). | CONSIDERACIONES INICIALES | Fundamento y aplicación | 4. | Se ha observado una relación altamente significativa entre los coeficientes de reparto 1-octanol/agua (POW) de las sustancias orgánicas inertes y su bioacumulación en los peces. Por lo demás, se ha demostrado que el POW posee una buena correlación con la toxicidad en peces y también con la sorción de los compuestos químicos a sólidos como suelos y sedimentos. Una amplia visión general de estas relaciones se recoge en la bibliografía (6). | 5. | Se han establecido muy diversas relaciones entre el coeficiente de reparto 1-octanol/agua y otras propiedades de las sustancias relevantes para la química y toxicología medioambientales. Por esta razón, el coeficiente de reparto 1-octanol/agua se ha convertido en un parámetro clave en la evaluación del riesgo medioambiental de los compuestos químicos y de su destino final en el medio ambiente. | Ámbito de aplicación | 6. | Se considera que el ensayo de agitación lenta reduce la formación de microgotas a partir de las gotitas de 1-octanol en la fase acuosa. Por esta razón no hay riesgo de sobrevalorar la concentración acuosa debido a las moléculas de la sustancia problema asociadas a las gotitas. Así pues, el método de agitación lenta es particularmente aplicable a la determinación del POW de sustancias con valores esperados de log POW de 5 y mayores, en las que el método de frasco de agitación (2) tendería a dar resultados erróneos. | DEFINICIONES Y UNIDADES | 7. | El coeficiente de reparto de una sustancia entre el agua y un disolvente lipófilo (1-octanol) define la distribución en equilibrio del compuesto químico entre las dos fases. El coeficiente de reparto entre el agua y el 1-octanol (POW) se define como la relación de las concentraciones en equilibrio de la sustancia problema en 1-octanol saturado con agua (CO) y en agua saturada con 1-octanol (CW). | Al ser un cociente entre dos concentraciones es adimensional. Se indica generalmente en forma de su logaritmo decimal (log POW). El Pow es dependiente de la temperatura, por lo que los datos del informe incluirán la temperatura de la medición. | PRINCIPIO DEL MÉTODO | 8. | Con el fin de determinar el coeficiente de reparto, se equilibran el agua, el 1-octanol y la sustancia problema a temperatura constante. Seguidamente se determinan las concentraciones de la sustancia problema en las dos fases. | 9. | Las dificultades experimentales asociadas a la formación de microgotas durante el experimento de frasco de agitación se consiguen reducir en el ensayo de agitación lenta que proponemos aquí. En el ensayo de agitación lenta, el agua, el 1-octanol y la sustancia problema se equilibran en un reactor agitado termostatizado. El intercambio entre las fases se acelera mediante agitación. La agitación introduce una turbulencia limitada, lo que facilita el intercambio entre el 1-octanol y el agua sin que se formen microgotas (1). | APLICABILIDAD DEL ENSAYO | 10. | Dado que la presencia de otras sustancias distintas podría influir en el coeficiente de actividad de la sustancia problema, se analizará esta como sustancia pura. En el ensayo de reparto 1-octanol/agua se empleará la sustancia de máxima pureza comercialmente disponible. | 11. | El presente método es aplicable a sustancias puras que no se disocian ni asocian y que no presentan una actividad interfacial importante. Permite determinar el coeficiente de reparto 1-octanol/agua de estas sustancias y de sus mezclas. Cuando el método se aplica a las mezclas, los coeficientes de reparto 1-octanol/agua determinados son condicionales, al depender de la composición química de la mezcla analizada y de la composición de electrolitos utilizada en la fase acuosa. Siempre que se tomen medidas complementarias, el método es también aplicable a compuestos que se disocian o asocian (punto 12). | 12. | Debido a los múltiples equilibrios que intervienen en el reparto 1-octanol/agua de las sustancias que se disocian, como los ácidos orgánicos y los fenoles, las bases orgánicas y los compuestos organometálicos, el coeficiente de reparto 1-octanol/agua es una constante condicional que depende intensamente de la composición electrolítica (7) (8). Por consiguiente, para determinar el coeficiente de reparto 1-octanol/agua es necesario controlar y documentar el pH y la composición electrolítica del ensayo. La evaluación de los coeficientes de reparto ha de confiarse al juicio de un experto. A partir del valor de la(s) constante(s) de disociación se elegirán los valores de pH idóneos, a fin de determinar un coeficiente de reparto por cada estado de ionización. Cuando se analizan compuestos organometálicos deben emplearse soluciones amortiguadores que no formen complejos (8). Teniendo en cuenta los datos conocidos sobre la química en medio acuoso (constantes de complejación, constantes de disociación), se elegirán las condiciones experimentales de modo tal que permita estimar la especiación de la sustancia problema en la fase acuosa. La fuerza iónica ha de ser idéntica en todos los ensayos, para lo cual se empleará un electrolito de fondo. | 13. | Pueden surgir dificultades analíticas cuando se aplica el ensayo a sustancias con hidrosolubilidad baja o con POW elevado, pues en ese caso las concentraciones en el agua serán muy bajas, dificultando una determinación exacta. El presente método de ensayo facilita indicaciones para solventar esta dificultad. | INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA | 14. | Los reactivos químicos serán de calidad analítica o de más alta pureza. Se recomienda el uso de sustancias problema no marcadas de composición química conocida y pureza preferiblemente del 99 %, al menos, o de sustancias problema radiomarcadas de composición química y pureza radioquímica conocidas. En caso de marcadores de semivida breve, deben aplicarse correcciones para tener en cuenta su desintegración. En caso de sustancias problema radiomarcadas, deberá emplearse un método de análisis químico específico para garantizar que la radiactividad medida está en relación directa con la sustancia problema. | 15. | Puede obtenerse una estimación de log POW con ayuda de programas informáticos comerciales para tal fin, o bien aplicando la relación de solubilidades en ambos disolventes. | 16. | Antes de emprender un ensayo de agitación lenta para la determinación del POW, es preciso conocer la siguiente información acerca de la sustancia problema: | a) | fórmula estructural; | b) | métodos analíticos apropiados para determinar la concentración de la sustancia en agua y en 1-octanol; | c) | constante(s) de disociación de las sustancias ionizables [Directrices 112 de la OCDE (9)]; | d) | hidrosolubilidad (10); | e) | hidrólisis abiótica (11); | f) | biodegradabilidad fácil (12); | g) | presión de vapor (13). | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Material | 17. | Se precisa el equipo normal de laboratorio y, en particular, el siguiente: | — | agitadores magnéticos y barras de agitación magnéticas recubiertas de teflón para agitar la fase acuosa; | — | instrumental analítico adecuado para determinar la concentración de la sustancia problema a las concentraciones esperadas; | — | cubeta de agitación provista de grifo de desagüe. Dependiendo de la estimación del log POW y del límite de detección (LOD) de la sustancia problema, se ha planteado usar un recipiente de reacción de las mismas proporciones pero con capacidad mayor de un litro, con el fin de obtener un volumen de agua suficiente para el análisis y la extracción química. De este modo se obtendrán concentraciones más elevadas en el extracto acuoso y, por ende, una determinación analítica más fiable. En el apéndice 1 figura una tabla que recoge los cálculos del volumen mínimo necesario, el LOD de la sustancia, su log POW estimado y su hidrosolubilidad. La tabla se basa en la relación entre el log POW y el cociente de solubilidades en octanol y agua, tal como ha sido definida por Pinsuwan et al. (14): | donde: | (en molaridad); | y en la relación establecida por Lyman (15) para predecir la hidrosolubilidad. Los valores de hidrosolubilidad calculados según la ecuación que se indica en el apéndice 1 deben considerarse una primera estimación. Conviene señalar que el usuario tiene libertad para hacer su propia estimación de la hidrosolubilidad por medio de cualquier ecuación que a su criterio represente mejor la relación entre hidrofobicidad y solubilidad. Cuando se trata de compuestos sólidos, por ejemplo, se recomienda tener en cuenta el punto de fusión en la predicción de la solubilidad. En caso de aplicar una ecuación modificada, habrá que cerciorarse de que sigue siendo válida la ecuación para el cálculo de la solubilidad en octanol. En el apéndice 2 se ha representado esquemáticamente una cubeta de agitación con camisa de vidrio de aprox. un litro de capacidad. Las proporciones del recipiente representado en el apéndice 2 han demostrado ser adecuadas, por lo que deben mantenerse aunque se utilicen recipientes de distinto tamaño; | — | es fundamental disponer de algún medio para mantener constante la temperatura durante el ensayo de agitación lenta. | 18. | Los recipientes serán de material inerte para que la adsorción a sus paredes resulte despreciable. | Preparación de las soluciones del ensayo | 19. | La determinación del POW se efectuará con el 1-octanol de la máxima pureza comercialmente disponible (como mínimo + 99 %). Se recomienda purificar el 1-octanol por extracción con ácido, álcali y agua y posterior desecación. Se puede emplear además la destilación para purificar el 1-octanol. El 1-octanol purificado servirá para preparar soluciones patrón de las sustancias problema. En la determinación del POW se empleará agua destilada procedente de un aparato de cristal o de cuarzo o agua procedente de un sistema de purificación; también se podrá utilizar agua de calidad analítica para CLAR. El agua destilada se habrá filtrado por un filtro de 0,22 μm, y se emplearán blancos para descartar la presencia de impurezas en los extractos concentrados que pudieran interferir con la sustancia problema. Si se emplea un filtro de fibra de vidrio, se limpiará calentándolo en horno a 400 °C durante tres horas como mínimo. | 20. | Los dos disolventes se habrán saturado recíprocamente antes del ensayo, dejándolos equilibrar en un recipiente con suficiente capacidad. Esto se consigue mediante agitación lenta del sistema bifásico durante dos días. | 21. | Se tomará una cantidad adecuada de la sustancia problema y se disolverá 1-octanol (saturado con agua). El coeficiente de reparto 1-octanol/agua se ha de determinar en soluciones diluidas en estos dos elementos. Por lo tanto, la concentración de la sustancia problema no debe exceder del 70 % de su solubilidad ni rebasar un máximo de 0,1 M en cualquiera de las fases (1). Las soluciones de 1-octanol empleadas en el ensayo estarán exentas de partículas sólidas de la sustancia problema en suspensión. | 22. | Se tomará una cantidad adecuada de la sustancia problema y se disolverá en 1-octanol (saturado con agua). Si el log POW estimado es superior a 5, habrá que cerciorarse de que las soluciones de 1-octanol empleadas en el ensayo están exentas de sustancia problema sólida en suspensión. A tal fin, cuando se analicen compuestos químicos con un log POW estimado > 5 se seguirá el procedimiento siguiente: | — | disolver la sustancia problema en 1-octanol (saturado con agua), | — | dejar la solución en reposo el tiempo suficiente para que sedimente el material sólido en suspensión; durante la fase de sedimentación, comprobar la concentración de la sustancia problema, | — | cuando las concentraciones medidas en la solución de 1-octanol hayan alcanzado valores estables, diluir la solución madre con un volumen adecuado de 1-octanol, | — | determinar la concentración de la solución madre diluida. Si la concentración medida es coherente con la dilución, la solución madre diluida se podrá emplear en el ensayo de agitación lenta. | Extracción y análisis de las muestras | 23. | Para el análisis de la sustancia problema se empleará un método analítico validado. Los investigadores deberán aportar pruebas de que las concentraciones alcanzadas durante el ensayo, tanto en la fase de 1-octanol saturado con agua como en la de agua saturada con 1-octanol, están por encima del límite de cuantificación de los métodos analíticos empleados. Cuando sea necesario aplicar métodos de extracción, habrá que establecer con anterioridad al ensayo las recuperaciones analíticas de la sustancia problema a partir de la fase acuosa y de la fase de 1-octanol. La señal analítica deberá ser corregida con blancos y se extremarán las precauciones para evitar la transferencia del analito de una muestra a otra. | 24. | Es probable que antes del análisis haya que proceder a la extracción de la fase acuosa con un disolvente orgánico y a la preconcentración del extracto, por cuanto se dan concentraciones excesivamente bajas de las sustancias problema hidrófobas en la fase acuosa. Por la misma razón habrá que reducir las concentraciones que puedan resultar en el blanco. Para este fin es necesario usar disolventes de alta pureza, preferiblemente específicos para análisis de residuos. Por lo demás, el uso de material de vidrio escrupulosamente limpio(por ejemplo, mediante lavado con solvente o calentamiento en horno a alta temperatura) ayudará a evitar la contaminación cruzada. | 25. | Se puede obtener una estimación del log POW con ayuda de un programa informático o mediante la valoración de un experto. Si su valor es mayor de seis, habrá que supervisar estrechamente las correcciones con el blanco y las transferencias de analito. Además, si la estimación de log POW es superior a seis, es obligado el uso de un patrón análogo para corregir los valores de recuperación, a fin de obtener factores de preconcentración elevados. Existen varios programas informáticos comerciales (1) para la estimación de log POW, como Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) y ACD log P (19). En la bibliografía (20-22) se ofrecen descripciones de los métodos de estimación. | 26. | Los límites de cuantificación (LOQ) para la determinación de la sustancia problema en 1-octanol y agua se establecen sobre la base de métodos aceptados. Como regla general, el límite de cuantificación del método se puede determinar como la concentración en agua o 1-octanol que produce una relación señal/ruido igual a diez. Se elegirá un método adecuado de extracción y preconcentración, además de especificar las recuperaciones analíticas. Se elegirá un factor de preconcentración adecuado a fin de obtener una señal de la intensidad necesaria para la determinación analítica. | 27. | Sobre la base de los parámetros del método analítico y de las concentraciones esperadas, se determina el tamaño de muestra aproximado que hace falta para determinar con exactitud la concentración de la sustancia. Se evitará emplear muestras de agua demasiado reducidas como para obtener una señal analítica suficiente. Por otro lado, se evitará también el uso de muestras de agua excesivamente voluminosas, pues de otro modo podría quedar una cantidad insuficiente para el número mínimo de análisis que se necesitan (n = 5). En el apéndice 1 se indica el volumen mínimo de muestra en función de la capacidad del recipiente, del LOD de la sustancia problema y de su solubilidad. | 28. | La cuantificación de las sustancias problema se realiza por comparación con las curvas de calibración del compuesto correspondiente. Las concentraciones halladas en las muestras analizadas deberán estar comprendidas entre las concentraciones de los patrones. | 29. | En caso de sustancias problema con un log POW estimado superior a seis, se añadirá un patrón análogo a la muestra de agua antes de la extracción con el fin de registrar las pérdidas ocurridas durante la extracción y la preconcentración de las muestras de agua. Para poder corregir exactamente los valores de recuperación, los análogos deberán tener propiedades muy similares o idénticas a las de la sustancia problema. Con este propósito se usan preferiblemente análogos isotópicamente marcados (estables) de las sustancias de interés (por ejemplo, perdeuterados o marcados con 13C). Cuando no sea posible el uso de isótopos marcados estables, como 13C o 2H, habrá que demostrar con datos fidedignos de la bibliografía que las propiedades fisicoquímicas del análogo son muy semejantes a las de la sustancia problema. Durante la extracción líquido-líquido de la fase acuosa se pueden formar emulsiones. Es posible reducirlas añadiendo una sal y dejando que la emulsión repose hasta el día siguiente. Es preciso documentar los métodos empleados para la extracción y preconcentración de las muestras. | 30. | Las muestras extraídas de la fase de 1-octanol se pueden, en caso necesario, diluir con un disolvente apropiado antes de su análisis. Por lo demás, se recomienda usar patrones análogos para corregir los valores de recuperación de aquellas sustancias que, en los ensayos de recuperación, han mostrado un alto grado de variabilidad (desviación típica relativa > 10 %). | 31. | El método analítico se documentará detalladamente. La documentación se refiere a: método de extracción, factores de preconcentración y de dilución, parámetros instrumentales, procedimiento habitual de calibración, intervalo de calibración, recuperación analítica de la sustancia problema a partir del agua, adición de patrones análogos para corregir los valores de recuperación, valores del blanco, límites de detección y límites de cuantificación. | Realización del ensayo | Relación óptima de volúmenes 1-octanol/agua | 32. | Para decidir qué volúmenes de agua y 1-octanol se van a emplear, hay que tener en cuenta el LOQ en 1-octanol y en agua, los factores de preconcentración aplicados a las muestras acuosas, el volumen de muestreo en 1-octanol y en agua, y las concentraciones esperadas. Por razones experimentales, en el sistema de agitación lenta el volumen de 1-octanol ha de elegirse de manera que la capa de este solvente sea lo bastante espesa (> 0,5 cm) para permitir la toma de muestras de la fase de 1-octanol sin alterarla. | 33. | En el análisis de compuestos con log POW de 4,5 o superior, la proporción típica entre fases es de 20 a 50 ml de 1-octanol por 950 a 980 ml de agua en un recipiente de un litro. | Condiciones del ensayo | 34. | Durante el ensayo, el recipiente de reacción se mantiene termostatizado para reducir la variación de temperatura a menos de 1 °C. El ensayo se efectuará a 25 °C. | 35. | El sistema experimental deberá protegerse de la luz diurna, ya sea procediendo en una sala oscura, ya cubriendo el recipiente de reacción con lámina de aluminio. | 36. | El ensayo se realizará (en la medida de lo posible) en un ambiente limpio de polvo. | 37. | El sistema de 1-octanol/agua se agita hasta alcanzar el equilibrio. En un ensayo piloto, se establece la duración del período de equilibrado realizando una operación de agitación lenta y tomando periódicamente muestras de agua y 1-octanol. Los tiempos de muestreo estarán separados por un lapso de cinco horas como mínimo. | 38. | Cada determinación de POW se basará al menos en tres ensayos de agitación lenta independientes. | Determinación del tiempo de equilibrado | 39. | Se supone que se alcanza el equilibrio cuando la curva de regresión del cociente de concentraciones 1-octanol/agua en función del tiempo, representada a lo largo de cuatro momentos de muestreo, arroja una pendiente que no es significativamente diferente de cero a un nivel de p de 0,05. El tiempo de equilibrado será como mínimo un día antes de comenzar el muestreo. Como norma general, el muestreo de sustancias con un log POW estimado inferior a cinco puede efectuarse durante los días dos y tres. Los compuestos más hidrófobos pueden necesitar un equilibrado más prolongado. En el caso de una sustancia con log POW de 8,23 (decaclorobifenilo), fueron suficientes 144 horas para llegar al equilibrio. Este se establece mediante muestreo repetido a partir de un único recipiente. | Inicio del ensayo | 40. | Al iniciar el ensayo, se llena el recipiente de reacción con agua saturada de 1-octanol. Se deja tiempo suficiente hasta alcanzar la temperatura termostatizada. | 41. | Se toma la cantidad deseada de sustancia problema (disuelta en el volumen necesario de 1-octanol saturado con agua) y se añade cuidadosamente al recipiente de reacción. Este es un paso crucial del ensayo, en el que hay que evitar la mezcla turbulenta de las dos fases. A tal fin, se puede pipetear lentamente la fase de 1-octanol contra la pared del vaso experimental, cerca de la superficie del agua. Acto seguido fluirá por la pared de vidrio para formar una película sobre la fase acuosa. Se evitará en todo caso la decantación del 1-octanol directamente en el matraz; se procurará que no caigan gotas de 1-octanol directamente en el agua. | 42. | Después de comenzar la agitación, se aumenta suavemente su velocidad. Si no se pudieran ajustar debidamente los motores de agitación habría que considerar el uso de un transformador. La velocidad de agitación se ajusta de modo que se cree un vórtice en la interfase entre el agua y el 1-octanol con una profundidad de 0,5 cm a 2,5 cm como máximo. Si se sobrepasa esta profundidad de 2,5 cm, habrá que reducir la velocidad de agitación; de lo contrario pueden formarse microgotas a partir de las gotitas de 1-octanol en la fase acuosa, lo que llevaría a sobrevalorar la concentración de la sustancia problema en el agua. Esta velocidad de agitación máxima que corresponde a 2,5 cm de profundidad se recomienda teniendo en cuenta los resultados del estudio de validación interlaboratorios (5). Se trata de una solución intermedia entre conseguir un equilibrado rápido y limitar la formación de microgotas de 1-octanol. | Muestreo y tratamiento de las muestras | 43. | Antes de proceder al muestreo, se apaga el agitador y se espera a que los líquidos estén en reposo. Al finalizar el muestro se vuelve a poner en marcha el agitador a velocidad lenta, como se describe anteriormente, y después se aumenta poco a poco la velocidad. | 44. | Las muestras de la fase acuosa se toman de un grifo ubicado en el fondo del recipiente de reacción. Hay que desechar siempre el volumen muerto de agua contenido en los grifos (alrededor de 5 ml en el recipiente descrito en el apéndice 2). El agua contenida en los grifos no sufre agitación y, por lo tanto, no está en equilibrio con el resto de líquido. Se anota el volumen de las muestras de agua, verificando que la cantidad de sustancia problema presente en el agua desechada se ha tenido en cuenta al determinar el balance de masa. Las pérdidas por evaporación se reducen al mínimo dejando que el agua fluya suavemente por el embudo de decantación, evitando perturbaciones de la capa de agua/1-octanol. | 45. | Las muestras de 1-octanol se obtienen tomando una pequeña alícuota (aprox. 100 μl) de la capa de 1-octanol con una jeringa de 100 microlitros compuesta enteramente de vidrio y metal. Se procurará no perturbar la superficie de interfase. Se anota el volumen del líquido muestreado. Basta una pequeña alícuota, puesto que la muestra de 1-octanol se va a diluir. | 46. | Es conveniente evitar transferencias innecesarias de la muestra. Por esta razón el volumen de muestra debe determinarse gravimétricamente. En el caso de las muestras acuosas, esto se consigue recogiéndolas en un embudo de decantación que contenga ya el volumen necesario de disolvente. | DATOS E INFORME | 47. | En el presente método de ensayo, el POW se determina a partir de tres ensayos de agitación lenta (tres unidades experimentales) realizados con el compuesto en investigación en idénticas condiciones. La curva de regresión que sirve para demostrar que se ha alcanzado el equilibrio deberá basarse en los resultados de al menos cuatro determinaciones de Co/Cw correspondientes a momentos de muestreo consecutivos. Ello permite calcular la varianza como medida de la incertidumbre del valor medio obtenido por cada unidad experimental. | 48. | El POW queda definido por la varianza de los datos obtenidos por cada unidad experimental. Esta información sirve para calcular el POW como media ponderada de los resultados de las unidades experimentales individuales. Así, la inversa de la varianza de los resultados obtenidos por las unidades experimentales sirve como factor de ponderación. De este modo los datos con una gran variación (expresada como varianza) y, por ende, con menor fiabilidad, influyen menos en el resultado que los datos con escasa varianza. | 49. | De manera análoga se calcula la desviación típica ponderada. Refleja la repetibilidad de las mediciones de POW. Una desviación típica ponderada reducida indica que la determinación del POW tiene alta repetibilidad dentro del laboratorio. A continuación se expone el tratamiento estadístico formal de los datos. | Tratamiento de los resultados | Demostración de que se ha alcanzado el equilibrio | 50. | Por cada momento de muestreo se calcula el logaritmo del cociente de concentraciones de la sustancia problema en 1-octanol y en agua [log (CO/Cw)]. Se demuestra que se ha alcanzado el equilibrio químico llevando a una gráfica dicho cociente en función del tiempo. Una meseta en esta gráfica a lo largo de al menos cuatro momentos de medición consecutivos indica que se ha alcanzado el equilibrio, y que el compuesto se ha disuelto realmente en el 1-octanol. De no ser así, habrá que proseguir el ensayo hasta que cuatro puntos de medición consecutivos arrojen una pendiente que no difiera significativamente de cero a un nivel p de 0,05, lo que indica que log Co/Cw es independiente del tiempo. | Cálculo de log POW | 51. | El valor de log POW de la unidad experimental se calcula como la media ponderada de log Co/Cw correspondiente a la zona de la curva de log Co/Cw en función del tiempo en la que se ha demostrado el estado de equilibrio. La media ponderada se calcula ponderando los datos con la inversa de la varianza, de modo que la influencia de los datos en el resultado final sea inversamente proporcional a su incertidumbre. | Media de log POW | 52. | Se calcula el valor de log POW como la media de los resultados de las unidades experimentales individuales ponderados con sus respectivas varianzas. | El cálculo es el siguiente: | donde: | log POW,i | = | valor de log POW de la unidad experimental individual i; | log POW,Av | = | media ponderada de las determinaciones de log POW individuales; | wi | = | peso estadístico atribuido al valor de log POW de la unidad experimental i. | Como wi se toma la inversa de la varianza de log POW,i ( | ). | 53. | Se estima el error de la media de log POW como la repetibilidad de log Co/Cw determinado durante la fase de equilibrio en las unidades experimentales individuales. Este se expresa como la desviación típica ponderada de log POW,Av (σlog Pow,Av), que a su vez da una medida del error asociado a log POW,Av. La desviación típica ponderada se puede calcular a partir de la varianza ponderada (varlog Pow,Av) del modo siguiente: | Donde n representa el número de unidades experimentales. | Informe del ensayo | 54. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | nombre común, nombre químico, número CAS, fórmula estructural (indicando la posición del marcador si se usa material marcado radiactivamente) y propiedades fisicoquímicas de interés (véase el punto 17), | — | pureza (impurezas) de la sustancia problema, | — | pureza radioquímica de las sustancias marcadas y actividad molar (si procede), | — | estimación preliminar de log POW, además del método aplicado para obtener su valor. | | Condiciones del ensayo: | — | fechas de realización de los estudios, | — | temperatura durante el ensayo, | — | volúmenes de 1-octanol y agua al inicio del ensayo, | — | volúmenes de las muestras tomadas de 1-octanol y agua, | — | volúmenes de 1-octanol y agua que quedan en los recipientes de ensayo, | — | descripción de los recipientes de ensayo y las condiciones de agitación (dimensiones de la barra agitadora y del recipiente de ensayo, altura del vórtice en mm y, cuando se conozca, velocidad de agitación) empleadas, | — | procedimientos analíticos aplicados para determinar la sustancia problema y el límite de cuantificación del método, | — | tiempos de muestreo, | — | pH de la fase acuosa y soluciones amortiguadoras empleadas cuando se ajusta el pH (en caso de moléculas ionizables), | — | número de réplicas. | | Resultados: | — | repetibilidad y sensibilidad de los métodos analíticos utilizados, | — | concentraciones medidas de la sustancia problema en 1-octanol y en agua en función del tiempo, | — | demostración del balance de masa, | — | temperatura y desviación típica o intervalo de temperaturas durante el ensayo, | — | recta de regresión del cociente de concentraciones en función del tiempo, | — | valor medio de log Pow,Av y su error típico, | — | discusión e interpretación de los resultados, | — | ejemplos de datos en bruto de los análisis representativos (todos los datos en bruto tienen que almacenarse de conformidad con las normas de BPL), entre ellos los índices de recuperación de los análogos y el número de concentraciones tomadas para la calibración (además de los criterios para definir el coeficiente de correlación de la curva de calibración), y resultados de garantía de calidad/control de calidad (QA/QC), | — | cuando estén disponibles: informe de validación del método de ensayo (con indicación de su referencia bibliográfica). | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512. | (2) | Capítulo A.8 del presente anexo. Coeficiente de reparto. | (3) | Capítulo A.8 del presente anexo. Coeficiente de reparto. | (4) | OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris. | (5) | Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (POW) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01. | (6) | Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA. | (7) | Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. | (8) | Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602. | (9) | OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris. | (10) | Capítulo A.6 del presente anexo. Hidrosolubilidad. | (11) | Capítulo C.7 del presente anexo. Degradación — Degradación abiótica: hidrólisis en función del pH. | (12) | Capítulo C.4-Partes II – VII (métodos A a F) del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad "fácil". | (13) | Capítulo A.4 del presente anexo. Presión de vapor. | (14) | Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626. | (15) | Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52. | (16) | Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA. | (17) | Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. | (18) | Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest. | (19) | ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001. | (20) | Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C. | (21) | Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488. | (22) | Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390. | Apéndice 1 | Hoja para el cálculo de los volúmenes mínimos de agua necesarios para la detección de sustancias problema con diferentes valores de log POW en fase acuosa | Hipótesis: | — | Volumen máximo de las alícuotas individuales = 10 % del volumen total; 5 alícuotas = 50 % del volumen total. | — | . Si las concentraciones son más bajas, se necesitarán volúmenes mayores. | — | Volumen empleado para la determinación del LOD = 100 ml. | — | Las correspondencias entre log Pow y log Sw y entre log Pow y SR (Soct/Sw) expresan aceptablemente las relaciones que se dan en las sustancias problema. | Estimación de Sw | log Pow | Ecuación | log Sw | Sw (mg/l) | 4 | 0,496 | 3,133E+00 | 4,5 | 0,035 | 1,084E+00 | 5 | –0,426 | 3,750E-01 | 5,5 | –0,887 | 1,297E-01 | 6 | –1,348 | 4,487E-02 | 6,5 | –1,809 | 1,552E-02 | 7 | –2,270 | 5,370E-03 | 7,5 | –2,731 | 1,858E-03 | 8 | –3,192 | 6,427E-04 | Estimación de Soct | log Pow | Ecuación | Soct (mg/l) | 4 | 3,763E+04 | 4,5 | 4,816E+04 | 5 | 6,165E+04 | 5,5 | 7,890E+04 | 6 | 1,010E+05 | 6,5 | 1,293E+05 | 7 | 1,654E+05 | 7,5 | 2,117E+05 | 8 | 2,710E+05 | Masa total de sustancia problema | (mg) | Masaoct/Masaagua | MasaH2O | (mg) | ConcH2O | (mg/l) | Masaoct | (mg) | Concoct | (mg/l) | 1 319 | 526 | 2,5017 | 2,6333 | 1 317 | 26 333 | 1 686 | 1 664 | 1,0127 | 1,0660 | 1 685 | 33 709 | 2 158 | 5 263 | 0,4099 | 0,4315 | 2 157 | 43 149 | 2 762 | 16 644 | 0,1659 | 0,1747 | 2 762 | 55 230 | 3 535 | 52 632 | 0,0672 | 0,0707 | 3 535 | 70 691 | 4 524 | 1664 36 | 0,0272 | 0,0286 | 4 524 | 90 480 | 5 790 | 5263 16 | 0,0110 | 0,0116 | 5 790 | 115 807 | 7 411 | 1 664 357 | 0,0045 | 0,0047 | 7 411 | 148 223 | 9 486 | 5 263 158 | 0,0018 | 0,0019 | 9 486 | 189 713 | Cálculo de los volúmenes | Volumen mínimo de fase acuosa necesario por cada concentración límite de detección | log Kow | LOD (microgramos/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | | 0,04 | 0,38 | 3,80 | 38 | 380 | 4,5 | | 0,09 | 0,94 | 9,38 | 94 | 938 | 5 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 232 | 2 318 | 5,5 | | 0,57 | 5,73 | 57,26 | 573 | 5 726 | 6 | | 1,41 | 14,15 | 141 | 1 415 | 14 146 | 6,5 | | 3,50 | 34,95 | 350 | 3 495 | 34 950 | 7 | | 8,64 | 86,35 | 864 | 8 635 | 86 351 | 7,5 | | 21,33 | 213 | 2 133 | 21 335 | 213 346 | 8 | | 52,71 | 527 | 5 271 | 52 711 | 527 111 | Volumen empleado para determinar el LOD (litros) | 0,1 | | | | | | Leyendas de los cálculos: | Representa < 10 % del volumen total de la fase acuosa; recipiente de equilibrado de 1 litro. | Representa < 10 % del volumen total de la fase acuosa; recipiente de equilibrado de 2 litros. | Representa < 10 % del volumen total de la fase acuosa; recipiente de equilibrado de 5 litros. | Representa < 10 % del volumen total de la fase acuosa; recipiente de equilibrado de 10 litros. | Sobrepasa incluso el 10 % del recipiente de equilibrado de 10 litros. | Representación de los volúmenes necesarios en función de la hidrosolubilidad y del log Pow | Volumen mínimo de fase acuosa necesario por cada concentración límite de detección (ml) | log Pow | Sw (mg/l) | LOD (microgramos/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | 10 | | 0,01 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | | 5 | | 0,02 | 0,24 | 2,38 | 23,80 | 237,97 | | 3 | | 0,04 | 0,40 | 3,97 | 39,66 | 396,62 | | 1 | | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | 1 189,86 | 4,5 | 5 | | 0,02 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | | 2 | | 0,05 | 0,51 | 5,08 | 50,84 | 508,42 | | 1 | | 0,10 | 1,02 | 10,17 | 101,68 | 1 016,83 | | 0,5 | | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | 2 033,67 | 5 | 1 | | 0,09 | 0,87 | 8,69 | 86,90 | 869,01 | | 0,5 | | 0,17 | 1,74 | 17,38 | 173,80 | 1 738,02 | | 0,375 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 231,75 | 2 317,53 | | 0,2 | | 0,43 | 4,35 | 43,45 | 434,51 | 4 345,05 | 5,5 | 0,4 | | 0,19 | 1,86 | 18,57 | 185,68 | 1 856,79 | | 0,2 | | 0,37 | 3,71 | 37,14 | 371,36 | 3 713,59 | | 0,1 | | 0,74 | 7,43 | 74,27 | 742,72 | 7 427,17 | | 0,05 | | 1,49 | 14,85 | 148,54 | 1 485,43 | 14 854,35 | 6 | 0,1 | | 0,63 | 6,35 | 63,48 | 634,80 | 6 347,95 | | 0,05 | | 1,27 | 12,70 | 126,96 | 1 269,59 | 12 695,91 | | 0,025 | | 2,54 | 25,39 | 253,92 | 2 539,18 | 25 391,82 | | 0,0125 | | 5,08 | 50,78 | 507,84 | 5 078,36 | 50 783,64 | 6,5 | 0,025 | | 2,17 | 21,70 | 217,02 | 2 170,25 | 21 702,46 | | 0,0125 | | 4,34 | 43,40 | 434,05 | 4 340,49 | 43 404,93 | | 0,006 | | 9,04 | 90,43 | 904,27 | 9 042,69 | 90 426,93 | | 0,003 | | 18,09 | 180,85 | 1 808,54 | 18 085,39 | 180 853,86 | 7 | 0,006 | | 7,73 | 77,29 | 772,89 | 7 728,85 | 77 288,50 | | 0,003 | | 15,46 | 154,58 | 1 545,77 | 15 457,70 | 154 577,01 | | 0,0015 | | 23,19 | 231,87 | 2 318,66 | 23 186,55 | 231 865,51 | | 0,001 | | 46,37 | 463,73 | 4 637,31 | 46 373,10 | 463 731,03 | 7,5 | 0,002 | | 19,82 | 198,18 | 1 981,77 | 19 817,73 | 198 177,33 | | 0,001 | | 39,64 | 396,35 | 3 963,55 | 39 635,47 | 396 354,66 | | 0,0005 | | 79,27 | 792,71 | 7 927,09 | 79 270,93 | 792 709,32 | | 0,00025 | | 158,54 | 1 585,42 | 15 854,19 | 158 541,86 | 1 585 418,63 | 8 | 0,001 | | 33,88 | 338,77 | 3 387,68 | 33 876,77 | 338 767,72 | | 0,0005 | | 67,75 | 677,54 | 6 775,35 | 67 753,54 | 677 535,44 | | 0,00025 | | 135,51 | 1 355,07 | 13 550,71 | 135 507,09 | 1 355 070,89 | | 0,000125 | | 271,01 | 2 710,14 | 27 101,42 | 271 014,18 | 2 710 141,77 | Volumen empleado para determinar el LOD (litros) | 0,1 | | | | | | Apéndice 2 | Ejemplo de recipiente con camisa de vidrio empleado en el ensayo de agitación lenta para la determinación del Pow | » |
| (3) | Chapter B.2 is replaced by the following: | ‘B.2. ACUTE INHALATION TOXICITY | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline 403 (2009) (1). The original acute inhalation Test Guideline 403 (TG 403) was adopted in 1981. This revised Test Method B.2 (as equivalent to the revised TG 403) has been designed to be more flexible, to reduce animal usage, and to fulfil regulatory needs. The revised Test Method features two study types: a Traditional LC50 protocol and a Concentration × Time (C × t) protocol. Primary features of this Test Method are the ability to provide a concentration-response relationship ranging from non-lethal to lethal outcomes in order to derive a median lethal concentration (LC50), non-lethal threshold concentration (e.g. LC01), and slope, and to identify possible sex susceptibility. The C × t protocol should be used when there is a specific regulatory or scientific need that calls for the testing of animals over multiple time durations, such as for purposes of emergency response planning [e.g. deriving Acute Exposure Guideline Levels (AEGL), Emergency Response Planning Guidelines (ERPG), or Acute Exposure Threshold Levels (AETL) values], or for land-use planning. | 2. | Guidance on the conduct and interpretation of this Test Method studies can be found in the Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39) (2). | 3. | Definitions used in the context of this Test Method are provided at the end of this chapter and in GD 39 (2). | 4. | This Test Method enables test chemical characterisation and quantitative risk assessment, and allows test chemicals to be ranked and classified according to Regulation (EC) No 1272/2008 (3). GD 39 (2) provides guidance in the selection of the appropriate Test Method for acute testing. When information on classification and labelling only is required, chapter B.52 of this Annex (4) is generally recommended [see GD 39 (2)]. This Test Method B.2 is not specifically intended for the testing of specialised materials, such as poorly soluble isometric or fibrous materials or manufactured nanomaterials. | INITIAL CONSIDERATIONS | 5. | Before considering testing in accordance with this Test Method all available information on the test chemical, including existing studies (e.g. chapter B.52 of this Annex (4)) whose data would support not doing additional testing should be considered by the testing laboratory in order to minimise animal usage. Information that may assist in the selection of the most appropriate species, strain, sex, mode of exposure and appropriate test concentrations include the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated uses and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally related substances [see GD 39 (2)]. | 6. | Testing corrosive and/or irritating test chemicals at concentrations that are expected to cause severe pain and/or distress should be avoided to the extent possible. The corrosive/irritating potential should be evaluated by expert judgment using such evidence as human and animal experience (e.g. from repeat dose studies performed at non-corrosive/irritant concentrations), existing in vitro data (e.g. from chapters B.40, (5), B.40bis (6) of this Annex or OECD TG 435 (7)), pH values, information from similar substances or any other pertinent data, for the purpose of investigating whether further testing can be waived. For specific regulatory needs (e.g. for emergency planning purposes), this Test Method may be used for exposing animals to these materials because it provides the study director or principal investigator with control over the selection of target concentrations. However, the targeted concentrations should not induce severe irritation/corrosive effects, yet sufficient to extend the concentration-response curve to levels that reach the regulatory and scientific objective of the test. These concentrations should be selected on a case-by-case basis and justification for concentration selection should be provided [see GD 39 (2)]. | PRINCIPLE OF THE TEST | 7. | This revised Test Method B.2 has been designed to obtain sufficient information on the acute toxicity of a test chemical to enable its classification and to provide lethality data (e.g. LC50, LC01 and slope) for one or both sexes as needed for quantitative risk assessments. This Test Method offers two methods. The first method is a traditional protocol in which groups of animals are exposed to a limit concentration (limit test) or a series of concentrations in a stepwise procedure for a predetermined duration of usually 4 hours. Other durations of exposure may apply to serve specific regulatory purposes. The second method is a (C × t) protocol in which groups of animals are exposed to one (limit concentration) or a series of multiple concentrations over multiple durations. | 8. | Moribund animals or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress should be humanely killed and are considered in the interpretation of the test result in the same way as animals that died on test. Criteria for making the decision to kill moribund or severely suffering animals, and guidance on the recognition of predictable or impending death, are the subject of an OECD Guidance Document No 19 on Humane Endpoints (8). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 9. | Healthy young adult animals of commonly used laboratory strains should be used. The preferred species is the rat and justification should be provided if other species are used. | Preparation of animals | 10. | Females should be nulliparous and non-pregnant. On the exposure day, animals should be young adults 8 to 12 weeks of age, and body weights should be within ± 20 % of the mean weight for each sex of any previously exposed animals of the same age. The animals are randomly selected and marked for individual identification. The animals are kept in their cages for at least 5 days prior to the start of the test to allow for acclimatisation to laboratory conditions. Animals should also be acclimatised to the test apparatus for a short period prior to testing, as this will lessen the stress caused by introduction to the new environment. | Animal husbandry | 11. | The temperature of the experimental animal maintenance room should be 22 ± 3 °C. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, though this may not be possible when using water as a vehicle. Before and after exposures, animals generally should be caged in groups by sex and concentration, but the number of animals per cage should not interfere with clear observation of each animal and should minimise losses due to cannibalism and fighting. When animals are to be exposed nose-only, it may be necessary for them to be acclimated to the restraining tubes. The restraining tubes should not impose undue physical, thermal, or immobilisation stress on the animals. Restraint may affect physiological endpoints such as body temperature (hyperthermia) and/or respiratory minute volume. If generic data are available to show that no such changes occur to any appreciable extent, then pre-adaptation to the restraining tubes is not necessary. Animals exposed whole-body to an aerosol should be housed individually during exposure to prevent them from filtering the test aerosol through the fur of their cage mates. Conventional and certified laboratory diets may be used, except during exposure, accompanied with an unlimited supply of municipal drinking water. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light/12 hours dark. | Inhalation chambers | 12. | The nature of the test chemical and the objective of the test should be considered when selecting an inhalation chamber. The preferred mode of exposure is nose-only (which term includes head-only, nose-only or snout-only). Nose-only exposure is generally preferred for studies of liquid or solid aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. Special objectives of the study may be better achieved by using a whole-body mode of exposure, but this should be justified in the study report. To ensure atmosphere stability when using a whole-body chamber, the total volume of the test animals should not exceed 5 % of the chamber volume. Principles of the nose-only and whole body exposure techniques and their particular advantages and disadvantages are described in GD 39 (2). | EXPOSURE CONDITIONS | Administration of concentrations | 13. | Nose-only exposures may be any duration up to 6 hours in rats. If mice are exposed nose-only, exposures generally should not exceed 4 hours. Justification should be provided if longer duration studies are needed [see GD 39 (2)]. Animals exposed to aerosols in whole-body chambers should be housed individually to prevent ingestion of test chemical due to grooming of cage mates. Feed should be withheld during the exposure period. Water may be provided throughout a whole-body exposure. | 14. | Animals are exposed to the test chemical as a gas, vapour, aerosol, or a mixture thereof. The physical state to be tested depends on the physico-chemical properties of the test chemical, the selected concentration, and/or the physical form most likely present during the handling and use of the test chemical. Hygroscopic and chemically reactive test chemicals should be tested under dry air conditions. Care should be taken to avoid generating explosive concentrations. | Particle-size distribution | 15. | Particle sizing should be performed for all aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. To allow for exposure of all relevant regions of the respiratory tract, aerosols with mass median aerodynamic diameters (MMAD) ranging from 1 to 4 μm with a geometric standard deviation (σg) in the range of 1,5 to 3,0 are recommended (2) (9) (10). Although a reasonable effort should be made to meet this standard, expert judgment should be provided if it cannot be achieved. For example, metal fumes may be smaller than this standard, and charged particles, fibres, and hygroscopic materials (which increase in size in the moist environment of the respiratory tract) may exceed this standard. | Test chemical preparation in a vehicle | 16. | A vehicle may be used to generate an appropriate concentration and particle size of the test chemical in the atmosphere. As a rule, water should be given preference. Particulate material may be subjected to mechanical processes to achieve the required particle size distribution, however, care should be taken to not decompose or alter the test chemical. In cases where mechanical processes are believed to have altered test chemical composition (e.g. extreme temperatures from excessive milling due to friction), the composition of the test chemical should be verified analytically. Adequate care should be taken to not contaminate the test chemical. It is not necessary to test non-friable granular materials which are purposefully formulated to be un-inhalable. An attrition test should be used to demonstrate that respirable particles are not produced when the granular material is handled. If an attrition test produces respirable substances, an inhalation toxicity test should be performed. | Control animals | 17. | A concurrent negative (air) control group is not necessary. When a vehicle other than water is used to assist in generating the test atmosphere, a vehicle control group should only be used when historical inhalation toxicity data are not available. If a toxicity study of a test chemical formulated in a vehicle reveals no toxicity, it follows that the vehicle is non-toxic at the concentration tested; thus, there is no need for a vehicle control. | MONITORING OF EXPOSURE CONDITIONS | Chamber airflow | 18. | The flow of air through the chamber should be carefully controlled, continuously monitored, and recorded at least hourly during each exposure. The monitoring of test atmosphere concentration (or stability) is an integral measurement of all dynamic parameters and provides an indirect means to control all relevant dynamic atmosphere generation parameters. Special consideration should be given to avoiding re-breathing in nose-only chambers in cases where airflow through the exposure system are inadequate to provide dynamic flow of test chemical atmosphere. There are prescribed methodologies that can be used to demonstrate that re-breathing does not occur under the selected operation conditions (2) (11). Oxygen concentration should be at least 19 % and carbon dioxide concentration should not exceed 1 %. If there is reason to believe that these standards cannot be met, oxygen and carbon dioxide concentrations should be measured. | Chamber temperature and relative humidity | 19. | Chamber temperature should be maintained at 22 ± 3 °C. Relative humidity in the animals’ breathing zone, for both nose-only and whole-body exposures, should be monitored and recorded at least three times for durations of up to 4 hrs, and hourly for shorter durations. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, but this may either be unattainable (e.g. when testing water based mixtures) or not measurable due to test chemical interference with the test method. | Test chemical: Nominal concentration | 20. | Whenever feasible, the nominal exposure chamber concentration should be calculated and recorded. The nominal concentration is the mass of generated test chemical divided by the total volume of air passed through the chamber system. The nominal concentration is not used to characterise the animals’ exposure, but a comparison of the nominal concentration and the actual concentration gives an indication of the generation efficiency of the test system, and thus may be used to discover generation problems. | Test chemical: Actual concentration | 21. | The actual concentration is the test chemical concentration at the animals’ breathing zone in an inhalation chamber. Actual concentrations can be obtained by specific methods (e.g. direct sampling, adsorptive or chemical reactive methods, and subsequent analytical characterisation) or by non-specific methods such as gravimetric filter analysis. The use of gravimetric analysis is acceptable only for single component powder aerosols or aerosols of low volatility liquids and should be supported by appropriate pre-study test chemical-specific characterisations. Multi-component powder aerosol concentration may also be determined by gravimetric analysis. However, this requires analytical data which demonstrate that the composition of airborne material is similar to the starting material. If this information is not available, a reanalysis of the test chemical (ideally in its airborne state) at regular intervals during the course of the study may be necessary. For aerosolised agents that may evaporate or sublimate, it should be shown that all phases were collected by the method chosen. The target, nominal, and actual concentrations should be provided in the study report, but only actual concentrations are used in statistical analyses to calculate lethal concentration values. | 22. | One lot of the test chemical should be used, if possible, and the test sample should be stored under conditions that maintain its purity, homogeneity, and stability. Prior to the start of the study, there should be a characterisation of the test chemical, including its purity and, if technically feasible, the identity, and quantities of identified contaminants and impurities. This can be demonstrated by, but is not limited to, the following data: retention time and relative peak area, molecular weight from mass spectroscopy or gas chromatography analyses, or other estimates. Although the test sample’s identity is not the responsibility of the test laboratory, it may be prudent for the test laboratory to confirm the sponsor’s characterisation at least in a limited way (e.g. colour, physical nature, etc.). | 23. | The exposure atmosphere shall be held as constant as practicable and monitored continuously and/or intermittently depending on the method of analysis. When intermittent sampling is used, chamber atmosphere samples should be taken at least twice in a four hour study. If not feasible due to limited air flow rates or low concentrations, one sample may be collected over the entire exposure period. If marked sample-to-sample fluctuations occur, the next concentrations tested should use four samples per exposure. Individual chamber concentration samples should not deviate from the mean concentration by more than ± 10 % for gases and vapours or ± 20 % for liquid or solid aerosols. Time to chamber equilibration (t95) should be calculated and recorded. The duration of an exposure spans the time that the test chemical is generated and this takes into account the times required to attain t95. Guidance for estimating t95 can be found in GD 39 (2). | 24. | For very complex mixtures consisting of gases/vapours, and aerosols (e.g. combustion atmospheres and test chemicals propelled from purpose-driven end-use products/devices), each phase may behave differently in an inhalation chamber so at least one indicator substance (analyte), normally the principal active substance in the mixture, of each phase (gas/vapour and aerosol) should be selected. When the test chemical is a mixture, the analytical concentration should be reported for the mixture and not just for the active substance or the component (analyte). Additional information regarding actual concentrations can be found in GD 39 (2). | Test chemical: Particle size distribution | 25. | The particle size distribution of aerosols should be determined at least twice during each 4 hour exposure by using a cascade impactor or an alternative instrument such as an aerodynamic particle sizer. If equivalence of the results obtained by a cascade impactor or an alternative instrument can be shown, then the alternative instrument may be used throughout the study. A second device, such as a gravimetric filter or an impinger/gas bubbler, should be used in parallel to the primary instrument to confirm the collection efficiency of the primary instrument. The mass concentration obtained by particle size analysis should be within reasonable limits of the mass concentration obtained by filter analysis [see GD 39 (2)]. If equivalence can be demonstrated in the early phase of the study, then further confirmatory measurements may be omitted. For animal welfare reasons, measures should be taken to minimise inconclusive data which may lead to a need to repeat an exposure. Particle sizing should be performed for vapours if there is any possibility that vapour condensation may result in the formation of an aerosol, or if particles are detected in a vapour atmosphere with potential for mixed phases (see paragraph 15). | PROCEDURE | 26. | Two study types are described below: the Traditional protocol, and the C × t protocol. Both protocols may include a sighting study, a main study, and/or a limit test (Traditional protocol) or testing at a limit concentration (C × t). If one sex is known to be more susceptible, the study director may choose to perform these studies using only the susceptible sex. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. Before commencing, all available data should be considered in order to minimise animal usage. For example, data generated using chapter B.52 of this Annex (4) may eliminate the need for a sighting study, and may also demonstrate whether one sex is more susceptible [see GD 39 (2)]. | TRADITIONAL PROTOCOL | General considerations: Traditional protocol | 27. | In a Traditional study, groups of animals are exposed to a test chemical for a fixed period of time (generally 4 hours) in either a nose-only or whole-body exposure chamber. Animals are exposed to either a limit concentration (limit test), or to at least three concentrations in a stepwise procedure (main study). A sighting study may precede a main study unless some information about the test chemical already exists, such as a previously performed B.52 study [see GD 39 (2)]. | Sighting study: Traditional protocol | 28. | A sighting study is used to estimate test chemical potency, identify sex differences in susceptibility, and assist in selecting exposure concentration levels for the main study or limit test. When selecting concentration levels for the sighting study, all available information should be used including available (Q)SAR data and data for similar chemicals. No more than three males and three females should be exposed at each concentration (3 animals/sex may be needed to establish a sex difference). A sighting study may consist of a single concentration, but more concentrations may be tested if necessary. A sighting study should not test so many animals and concentrations that it resembles a main study. A previously performed B.52 study (4) may be used instead of a sighting study [see GD 39 (2)]. | Limit test: Traditional protocol | 29. | A limit test is used when the test chemical is known or expected to be virtually non-toxic, i.e. eliciting a toxic response only above the regulatory limit concentration. In a limit test, a single group of three males and three females is exposed to the test chemical at a limit concentration. Information about the toxicity of the test chemical can be gained from knowledge about similar tested chemicals, taking into consideration the identity and percentage of components known to be of toxicological significance. In those situations where there is little or no information about its toxicity, or the test chemical is expected to be toxic, the main test should be performed. | 30. | The selection of limit concentrations usually depends on regulatory requirements. When Regulation (EC) No 1272/2008 is used, the limit concentrations for gases, vapours, and aerosols are 20 000 ppm, 20 mg/l and 5 mg/l, respectively (or the maximum attainable concentration) (3). It can be technically challenging to generate limit concentrations of some test chemicals, especially as vapours and aerosols. When testing aerosols, the primary goal should be to achieve a respirable particle size (MMAD of 1-4 μm). This is possible with most test chemicals at a concentration of 2 mg/l. Aerosol testing at greater than 2 mg/l should only be attempted if a respirable particle size can be achieved [see GD 39 (2)]. Regulation (EC) No 1272/2008 discourages testing in excess of a limit concentration for animal welfare reasons (3). The limit concentration should only be considered when there is a strong likelihood that results of such a test would have direct relevance for protecting human health (3), and justification provided in the study report. In the case of potentially explosive test chemicals, care should be taken to avoid conditions favourable for an explosion. To avoid an unnecessary use of animals, a test run without animals should be conducted prior to the limit test to ensure that the chamber conditions for a limit test can be achieved. | 31. | If mortality or moribundity is observed at the limit concentration, the results of the limit test can serve as a sighting study for further testing at other concentrations (see main study). If a test chemical’s physical or chemical properties make it impossible to attain a limit concentration, the maximum attainable concentration should be tested. If less than 50 % lethality occurs at the maximum attainable concentration, no further testing is necessary. If the limit concentration could not be attained, the study report should provide an explanation and supportive data. If the maximum attainable concentration of a vapour does not elicit toxicity, it may be necessary to generate the test chemical as a liquid aerosol. | Main study: Traditional protocol | 32. | A main study is typically performed using five males and five females (or 5 animals of the susceptible sex, if known) per concentration level, with at least three concentration levels. Sufficient concentration levels should be used to obtain a robust statistical analysis. The time interval between exposure groups is determined by the onset, duration, and severity of toxic signs. Exposure of animals at the next concentration level should be delayed until there is reasonable confidence of survival for previously tested animals. This allows the study director to adjust the target concentration for the next exposure group. Due to the dependence on sophisticated technologies, this may not always be practical in inhalation studies, so the exposure of animals at the next concentration level should be based on previous experience and scientific judgement. GD 39 (2) should be consulted when testing mixtures. | CONCENTRATION × TIME (C × T) PROTOCOL | General considerations: C × t protocol | 33. | A step-wise C × t study may be considered as an alternative to a Traditional protocol when assessing inhalation toxicity (12) (13) (14). This approach allows animals to be exposed to a test chemical at several concentration levels and for multiple time durations. All testing is performed in a nose-only chamber (whole-body chambers are not practical for this protocol). A flow diagram in Appendix 1 illustrates this protocol. A simulation analysis has shown that the Traditional protocol and the C × t protocol are both capable of yielding robust LC50 values, but the C × t protocol is generally better at yielding robust LC01 and LC10 values (15). | 34. | A simulation analysis has demonstrated that using two animals per C × t interval (one per sex using both sexes, or two of the more susceptible sex) may generally be adequate when testing 4 concentrations and 5 exposure durations in a main study. Under some circumstances, the study director may elect to use two rats per sex per C × t interval (15). Using 2 animals per sex per concentration and time point may reduce bias and variability of the estimates, increase the estimation success rate, and improve confidence interval coverage. However, in case of an insufficient close fit to the data for estimation (when using one animal per sex or two animals of the more susceptible sex) a 5th exposure concentration may also suffice. Further guidance on the number of animals and concentrations to be used in a C × t study can be found in GD 39 (2). | Sighting study: C × t protocol | 35. | A sighting study is used to estimate test chemical potency and to assist in selecting exposure concentration levels for the main study. A sighting study using up to three animals/sex/concentration [for details see Appendix III of GD 39 (2)] may be needed to choose an appropriate starting concentration for the main study and to minimise the number of animals used. It may be necessary to use three animals per sex to establish a sex difference. These animals should be exposed for a single duration, generally 240 min. The feasibility of generating adequate test atmospheres should be assessed during technical pre-tests without animals. It is generally not necessary to perform a sighting study if mortality data are available from a B.52 study (4). When selecting the initial target concentration in a B.2 study, the study director should consider the mortality patterns observed in any available B.52 studies (4) for both sexes and for all concentrations tested [see GD 39 (2)]. | Initial Concentration: C × t protocol | 36. | The initial concentration (Exposure Session I) (Appendix 1) will either be a limit concentration or a concentration selected by the study director based on the sighting study. Groups of 1 animal/sex are exposed to this concentration for multiple durations (e.g. 15, 30, 60, 120, or 240 minutes), resulting in a total number of 10 animals (called Exposure Session I) (Appendix 1). | 37. | The selection of limit concentrations usually depends on regulatory requirements. When Regulation (EC) No 1272/2008 is used, the limit concentrations for gases, vapours, and aerosols are 20 000 ppm, 20 mg/l and 5 mg/l, respectively (or the maximum attainable concentration) (3). It can be technically challenging to generate limit concentrations of some test chemicals, especially as vapours and aerosols. When testing aerosols, the goal should be to achieve a respirable particle size (i.e. an MMAD of 1-4 μm) at a limit concentration of 2 mg/l. This is possible with most test chemicals. Aerosol testing at greater than 2 mg/l should only be attempted if a respirable particle size can be achieved [see GD 39 (2)]. Regulation (EC) No 1272/2008 discourages testing in excess of a limit concentration for animal welfare reasons (3). Testing in excess of the limit concentration should only be considered when there is a strong likelihood that results of such a test would have direct relevance for protecting human health (3), justification should be provided in the study report. In the case of potentially explosive test chemicals, care should be taken to avoid conditions favourable for an explosion. To avoid an unnecessary use of animals, a test run without animals should be conducted prior to testing at the initial concentration to ensure that the chamber conditions for this concentration can be achieved. | 38. | If mortality or moribundity is observed at the initial concentration, the results at this concentration can serve as a starting point for further testing at other concentrations (see main study). When a test chemical’s physical or chemical properties make it impossible to attain a limit concentration, the maximum attainable concentration should be tested. If less than 50 % lethality occurs at the maximum attainable concentration, no further testing is necessary. If the limit concentration could not be attained, the study report should provide an explanation and supportive data. If the maximum attainable concentration of a vapour does not elicit toxicity, it may be necessary to generate the test chemical as a liquid aerosol. | Main study: C × t protocol | 39. | The initial concentration (Exposure Session I) (Appendix 1) tested in the main study will either be a limit concentration or a concentration selected by the study director based on the sighting study. If mortality has been observed during or following Exposure Session I, the minimum exposure (C × t) which results in mortality will be taken as a guide to establish the concentration and periods of exposure for Exposure Session II. Each subsequent exposure session will depend on the previous session (see Appendix 1). | 40. | For many test chemicals the results obtained at the initial concentration, together with three additional exposure sessions with a smaller time grid (i.e. the geometric spacing of exposure periods as indicated by the factor between successive periods, generally √2), will be sufficient to establish the C × t mortality relationship (15), but there may be some benefit to using a 5th exposure concentration [see Appendix 1 and GD 39 (2)]. For mathematical treatment of results for the C × t protocol, see Appendix 1. | OBSERVATIONS | 41. | The animals should be clinically observed frequently during the exposure period. Following exposure, clinical observations should be made at least twice on the day of exposure, or more frequently when indicated by the response of the animals to treatment, and at least once daily thereafter for a total of 14 days. The length of the observation period is not fixed, but should be determined by the nature and time of onset of clinical signs and length of the recovery period. The times at which signs of toxicity appear and disappear are important, especially if there is a tendency for signs of toxicity to be delayed. All observations are systematically recorded with individual records being maintained for each animal. Animals found in a moribund condition and animals showing severe pain and/or enduring signs of severe distress should be humanely killed for animal welfare reasons. Care should be taken when conducting examinations for clinical signs of toxicity that initial poor appearance and transient respiratory changes, resulting from the exposure procedure, are not mistaken for test chemical-related toxicity that would require premature killing of the animals. The principles and criteria summarised in the Guidance Document on Humane Endpoints (GD 19) should be taken into consideration (7). When animals are killed for humane reasons or found dead, the time of death should be recorded as precisely as possible. | 42. | Cage-side observations should include changes in the skin and fur, eyes and mucous membranes, and also respiratory, circulatory, autonomic and central nervous systems, and somatomotor activity and behaviour patterns. When possible, any differentiation between local and systemic effects should be noted. Attention should be directed to observations of tremors, convulsions, salivation, diarrhoea, lethargy, sleep and coma. The measurement of rectal temperature may provide supportive evidence of reflex bradypnea or hypo/hyperthermia related to treatment or confinement. | Body weights | 43. | Individual animal weights should be recorded once during the acclimatization period, on the day of exposure prior to exposure (day 0), and at least on days 1, 3 and 7 (and weekly thereafter), and at the time of death or euthanasia if exceeding day 1. Body weight is recognised as a critical indicator of toxicity so animals exhibiting a sustained decrement of ≥ 20 %, compared to pre-study values, should be closely monitored. Surviving animals are weighed and humanely killed at the end of the post-exposure period. | Pathology | 44. | All test animals, including those which die during the test or are euthanised and removed from the study for animal welfare reasons, should be subjected to gross necropsy. If necropsy cannot be performed immediately after a dead animal is discovered, the animal should be refrigerated (not frozen) at temperatures low enough to minimise autolysis. Necropsies should be performed as soon as possible, normally within a day or two. All gross pathological changes should be recorded for each animal with particular attention to any changes in the respiratory tract. | 45. | Additional examinations included a priori by design may be considered to extend the interpretive value of the study, such as measuring lung weight of surviving rats, and/or providing evidence of irritation by microscopic examination of the respiratory tract. Examined organs may also include those showing evidence of gross pathology in animals surviving 24 or more hours, and organs known or expected to be affected. Microscopic examination of the entire respiratory tract may provide useful information for test chemicals that are reactive with water, such as acids and hygroscopic test chemicals. | DATA AND REPORTING | Data | 46. | Individual animal data on body weights and necropsy findings should be provided. Clinical observation data should be summarised in tabular form, showing for each test group the number of animals used, the number of animals displaying specific signs of toxicity, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons, time of death of individual animals, a description and time course of toxic effects and reversibility, and necropsy findings. | Test report | 47. | The test report should include the following information, as appropriate: | | Test animals and husbandry | — | Description of caging conditions, including: number (or change in number) of animals per cage, bedding material, ambient temperature and relative humidity, photoperiod, and identification of diet | — | Species/strain used and justification for using a species other than the rat | — | Number, age and sex of animals | — | Method of randomisation | — | Details of food and water quality (including diet type/source, water source) | — | Description of any pre-test conditioning including diet, quarantine, and treatment for disease; | | Test chemical | — | Physical nature, purity and, where relevant, physico-chemical properties (including isomerisation) | — | Identification data and Chemical Abstract Services (CAS) Registry Number, if known; | | Vehicle | — | Justification for use of vehicle and justification for choice of vehicle (if other than water) | — | Historical or concurrent data demonstrating that the vehicle does not interfere with the outcome of the study; | | Inhalation chamber | — | Description of the inhalation chamber including dimensions and volume | — | Source and description of equipment used for the exposure of animals as well as generation of atmosphere | — | Equipment for measuring temperature, humidity, particle-size, and actual concentration | — | Source of air and treatment of air supplied/extracted and system used for conditioning | — | Methods used for calibration of equipment to ensure a homogeneous test atmosphere | — | Pressure difference (positive or negative) | — | Exposure ports per chamber (nose-only); location of animals in the system (whole-body) | — | Temporal homogeneity/stability of test atmosphere | — | Location of temperature and humidity sensors and sampling of test atmosphere in the chamber | — | Air flow rates, air flow rate/exposure port (nose-only), or animal load/chamber (whole-body) | — | Information about the equipment used to measure oxygen and carbon dioxide, if applicable | — | Time required to reach inhalation chamber equilibrium (t95) | — | Number of volume changes per hour | — | Metering devices (if applicable); | | Exposure data | — | Rationale for target concentration selection in the main study | — | Nominal concentrations (total mass of test chemical generated into the inhalation chamber divided by the volume of air passed through the chamber) | — | Actual test chemical concentrations collected from the animals’ breathing zone; for mixtures that produce heterogeneous physical forms (gases, vapours, aerosols), each may be analysed separately | — | All air concentrations should be reported in units of mass (e.g. mg/l, mg/m3, etc.); units of volume (e.g. ppm, ppb, etc.) may also be reported parenthetically | — | Particle size distribution, mass median aerodynamic diameter (MMAD), and geometric standard deviation (σg), including their methods of calculation. Individual particle size analyses should be reported; | | Test conditions | — | Details of test chemical preparation, including details of any procedures used to reduce the particle size of solid materials or to prepare solutions of the test chemical. In cases where mechanical processes may have altered test chemical composition, include the results of analyses to verify the composition of the test chemical | — | A description (preferably including a diagram) of the equipment used to generate the test atmosphere and to expose the animals to the test atmosphere | — | Details of the chemical analytical method used and method validation (including efficiency of recovery of test chemical from the sampling medium) | — | The rationale for the selection of test concentrations; | | Results | — | Tabulation of chamber temperature, humidity, and airflow | — | Tabulation of chamber nominal and actual concentration data | — | Tabulation of particle size data including analytical sample collection data, particle size distribution and calculations of the MMAD and σg | — | Tabulation of response data and concentration level for each animal (i.e. animals showing signs of toxicity including mortality, nature, severity, time of onset and duration of effects) | — | Individual body weights of animals collected on study; date and time of death if prior to scheduled euthanasia, time course of onset of signs of toxicity and whether these were reversible for each animal | — | Necropsy findings and histopathological findings for each animal, if available | — | Lethality estimates (e.g. LC50, LD01) including 95 % confidence limits, and slope (if provided by the evaluation method) | — | Statistical relation, including estimate for the exponent n (C × t protocol). The name of the statistical software used should be provided; | | Discussion and interpretation of results | — | Particular emphasis should be made to the description of methods used to meet this Test Method’s criteria, e.g. the limit concentration or the particle size | — | The respirability of particles in light of the overall findings should be addressed, especially if the particle-size criteria could not be met | — | An explanation should be provided if there was a need to humanely sacrifice animals in pain or showing signs of severe and enduring distress, based on the criteria in the OECD Guidance Document on Humane Endpoints (8) | — | If testing with chapter B.52 of this Annex (4) was discontinued in favour of this Test Method B.2, justifications should be provided | — | The consistency of methods used to determine nominal and actual concentrations, and the relation of actual concentration to nominal concentration should be included in the overall assessment of the study | — | The likely cause of death and predominant mode of action (systemic versus local) should be addressed. | LITERATURE: | (1) | OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 403, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (3) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC and amending Regulation (EC) No 1907/2006 (OJ L 353, 31.12.2008, p. 1). | (4) | Chapter B.52 of this Annex, Acute Inhalation Toxicity — Acute Toxic Class (ATC) Method. | (5) | Chapter B.40 of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER). | (6) | Chapter B.40bis of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test. | (7) | OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (8) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (9) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. | (10) | Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. | (11) | Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167. | (12) | Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290. | (13) | Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117. | (14) | Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71. | (15) | OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (16) | Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York. | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 1 | C × t Protocol | 1. | A step-wise Concentration × Time (C × t) study may be considered as an alternative to the Traditional protocol for assessing inhalation toxicity (12) (13) (14). It should be performed preferentially when there is a specific regulatory or scientific need that calls for the testing of animals over multiple time durations such as for emergency response planning or land use planning. This approach usually begins with testing at a limit concentration (Exposure Session I) in which animals are exposed to a test chemical for five time durations (e.g. 15, 30, 60, 120 and 240 min) so that multiple durations of time will be obtained within one exposure session (see Figure 1). When Regulation (EC) No 1272/2008 is used, the limit concentrations for gases, vapours, and aerosols are 20 000 ppm, 20 mg/l, and 5 mg/l, respectively. These levels may only be exceeded if there is a regulatory or scientific need for testing at these levels (see paragraph 37 in the B.2 main text). | 2. | In situations where there is little or no information about the toxicity of a test chemical, a sighting study should be performed in which groups of no more than 3 animals per sex are exposed to target concentrations selected by the study director, generally for 240 min. | 3. | If a limit concentration is tested during Exposure Session I and less than 50 % mortality is observed, no additional testing is needed. If there is a regulatory or scientific need to establish the concentration/time/response relationship at higher levels than the indicated limit concentration, the next exposure should be carried out at a higher level such as at two times the limit concentration (i.e. 2L in Figure 1). | 4. | If toxicity is observed at the limit concentration, additional testing (main study) is necessary. These additional exposures are carried out either at lower concentrations (in Figure 1: Exposure Sessions II, III or IV') or at higher concentrations using shorter durations (in Figure 1: Exposure Session IV) using durations that are adapted and not as widely spaced. | 5. | The test (initial concentration and additional concentrations) is carried out using 1 animal/sex per concentration/time point or with 2 animals of the more susceptible sex per concentration/time point. Under some circumstances, the study director may elect to utilise 2 rats per sex per concentration/time point (or 4 animals of the susceptible sex per concentration/time point) (15). Using 2 animals per sex per concentration/time point generally reduces bias and variability of the estimates, increases the estimation success rate, and improves confidence interval coverage relative to the protocol as described here. Further details are provided in GD 39 (2). | 6. | Ideally, each exposure session is carried out on one day. This gives the opportunity to delay the next exposure until there is reasonable confidence of survival, and it allows the study director to adjust the target concentration and durations for the next exposure session. It is advised to start each exposure session with the group that will be exposed the longest, e.g. the 240-min exposure group, followed by the 120 minute exposure group, and so on. If, for example, animals in the 240 minute group are dying after 90 minutes or showing severe signs of toxicity (e.g. extreme changes in breathing pattern such as laboured breathing), it would not make sense to expose a group for 120 minutes because mortality would likely be 100 %. Thus the study director should select shorter exposure durations for that concentration (e.g. 90, 65, 45, 33 and 25 minutes). | 7. | The chamber concentration should be measured frequently to determine the time-weighted-average concentration for each exposure duration. Whenever possible, the time of death for each animal (rather than the exposure duration) should be used in the statistical analysis. | 8. | The results of the first four exposure sessions should be examined to identify a data gap in the concentration-time curve (see Figure 1). In case of an insufficient fit, an additional exposure (5th concentration) may be performed. Concentration and exposure durations for the 5th exposure should be chosen to cover this gap. | 9. | All exposure sessions (including the first Exposure Session) will be used to calculate the concentration-time-response relationship using Statistical Analysis (16). If possible, for each C × t interval, the time-weighted average concentration and the duration of exposure until death (if death occurs during the exposure) should be used. | Figure 1 | Hypothetical illustration of a concentration-time-mortality relationship in rats | Open symbols = survivors; closed symbols = dead animals | Triangles = females; circles = males | Solid line = LC50 values (range 7,5-240 min) for males with n = 1 | Dashed line = LC50 values (range 7,5-240 min) for females with n = 1 | Dotted lines = hypothetical LC50 values line for males and females if n had been equal to 2 (12). | Glossary | Concentration: | Time of exposure: | 10. | Below is an example of the stepwise procedure: | Exposure Session I — Testing at the limit concentration (see Figure 1) | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals in total (1) | — | Target concentration (2) = limit concentration. | — | Expose five groups of animals at this target concentration for durations of 15, 30, 60, 120 and 240 minutes, respectively. | ↓ | Exposure Session II (3) — Main Study | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals in total. | — | Expose five groups of animals at a lower concentration (4) (1/2L) with slightly longer exposure durations (factor √2 spaced; see Figure 1). | ↓ | Exposure Session III — Main Study | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals total. | — | Expose five groups of animals at a lower concentration (4) (1/4L) with slightly longer exposure durations (factor √2 spaced; see Figure 1). | ↓ | Exposure Session IV’ — Main Study | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals total. | — | Expose five groups of animals at a lower concentration (4) (1/8L) with slightly longer exposure durations (factor √2 spaced; see Figure 1). | ↓ or | Exposure Session IV — Main Study | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals total. | — | Expose five groups of animals at a higher concentration (5) (2L) with slightly shorter exposure durations (factor √2 spaced; see Figure 1). | Mathematical treatment of results for the C × t protocol | 11. | A C × t procedure with 4 or 5 exposure concentrations and five durations will yield 20 or 25 data points, respectively. With these data points, the C × t relationship can be calculated using statistical analysis (16): | Equation 1: | where C = concentration; t = exposure duration, or | Equation 2: | where | Using equation 1, the LC50 value can be calculated for a given time period (e.g. 4 hour, 1 hour, 30 minutes, or any time period within the range of time periods tested) using P = 5 (50 % response). Note that Haber’s rule is only applicable when n = 1. The LC01 can be calculated using P = 2,67. | ’ | 3) | El capítulo B.2 se sustituye por el texto siguiente: | «B.2. TOXICIDAD AGUDA POR INHALACIÓN | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 403 de la OCDE (2009) (1). Las directrices 403 (TG 403) original para ensayos de toxicidad aguda por inhalación fueron adoptadas en 1981. El presente método de ensayo B.2 (que se considera equivalente a las TG 403 revisadas) se ha diseñado para hacerlo más flexible, reducir el uso de animales y respetar la normativa legal. El método de ensayo revisado contempla dos tipos de estudios: un protocolo de CL50 tradicional y un protocolo de concentración × tiempo (C × t). La principal característica de este método de ensayo es su capacidad de proporcionar una relación concentración-respuesta con resultados desde no letales hasta letales que permite obtener la concentración letal mediana (CL50), la concentración umbral no letal (por ejemplo, CL01) y la pendiente, además de identificar una posible susceptibilidad ligada al sexo. Deberá emplearse un protocolo C × t cuando exista una necesidad científica o normativa específica que imponga la investigación con animales en diferentes períodos, como es el caso de la planificación de actuaciones de urgencia [por ejemplo, para obtener los niveles orientativos de la exposición aguda (Acute Exposure Guideline Levels, AEGL), (las directrices de planificación de la respuesta en situaciones de emergencia (Emergency Response Planning Guidelines ERPG), o los niveles umbral de exposición aguda (Acute Exposure Threshold Levels, AETL)] o de la planificación del uso del suelo. | 2. | Se encontrará una guía para la realización e interpretación de estudios según este método de ensayo en el "Documento de orientación sobre los ensayos de toxicidad por inhalación aguda" [Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39)] (2). | 3. | Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan al final del presente capítulo y en GD 39 (2). | 4. | Este método de ensayo permite hacer una caracterización de la sustancia química problema y una evaluación cuantitativa del riesgo, además de ordenar y clasificar los compuestos químicos con arreglo al Reglamento (CE) no 1272/2008 (3). El GD 39 (2) proporciona una orientación para seleccionar el método de ensayo adecuado a los estudios de toxicidad aguda. Cuando solamente se necesite información sobre la clasificación y el etiquetado, se recomienda de manera general consultar el capítulo B.52 de este anexo (4) [véase el GD 39 (2)]. El presente método de ensayo B.2 no ha sido concebido específicamente para el análisis de productos especializados, como materiales fibrosos o isométricos escasamente solubles o nanomateriales manufacturados. | CONSIDERACIONES INICIALES | 5. | Antes de considerar la aplicación de este método de ensayo y con el fin de minimizar el sufrimiento animal, el laboratorio de análisis deberá tener en cuenta toda la información disponible sobre la sustancia problema, sin olvidar los estudios existentes [consúltese, por ejemplo, el capítulo B.52 de este anexo (4)] cuyos datos pudieran desaconsejar la realización de nuevas investigaciones. En la selección de especie, variedad, sexo, modo de exposición y concentraciones analíticas adecuadas serán de ayuda el conocimiento de la identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, los resultados de cualesquiera ensayos de toxicidad in vitro o in vivo, los usos y la posible exposición humana previstos, los cálculos (Q)SAR y los datos toxicológicos disponibles sobre sustancias estructuralmente afines [véase el GD 39 (2)]. | 6. | En la medida de lo posible, deberá evitarse la investigación de sustancias irritantes o corrosivas que previsiblemente vayan a provocar dolor o daños intensos. Con objeto de esclarecer si es posible prescindir de nuevas investigaciones, el potencial corrosivo/irritante deberá ser evaluado por expertos sobre la base de la experiencia en hombres y animales (por ejemplo, estudios de administración continuada realizados con concentraciones no corrosivas/irritantes), los datos in vitro existentes [consúltense los capítulos B.40 (5) y B.40 bis (6) del presente anexo o las TG 435 de la OCDE (7)], los valores de pH, la información acerca de sustancias afines o cualquier otro dato pertinente. En caso de necesidades normativas específicas (por ejemplo, a los fines de planificar actuaciones de urgencia), se podrá aplicar el presente método de ensayo para exponer animales a los productos mencionados, por cuanto permite al investigador principal o al director del estudio un control sobre la selección de las concentraciones de exposición. Ahora bien, las concentraciones previstas no deberán provocar efectos de irritación/corrosión graves, pero sí suficientes para ampliar la curva de concentración-respuesta a un intervalo que cubra el objetivo normativo y científico del ensayo. Estas concentraciones se seleccionarán según cada caso y se justificará debidamente la selección [véase el GD 39 (2)]. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 7. | Este método de ensayo B.2 revisado se ha concebido para obtener una información acerca de la toxicidad aguda de la sustancia problema suficiente para permitir su clasificación, así como los datos de letalidad (por ejemplo, CL50, CL01 y pendiente) de uno o ambos sexos que se precisen para la evaluación cuantitativa del riesgo. El presente método de ensayo consta de dos métodos. El primer método es un protocolo tradicional en el que varios grupos de animales se exponen a una concentración límite (ensayo límite) o a una serie de concentraciones progresivas durante un período predeterminado que suele ser de 4 horas. Pueden aplicarse otros tiempos de exposición con fines normativos específicos. El segundo método es un protocolo de C × t en el que los grupos de animales se exponen a una sola concentración (límite) o a una serie de concentraciones durante diferentes períodos. | 8. | Los animales moribundos o que den muestras claras de dolor o de sufrimiento intenso y continuo deben ser sacrificados de forma compasiva y en la interpretación del resultado serán considerados de la misma manera que los que hayan muerto durante el ensayo. En el documento de orientación no 19 de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (8) se dan criterios para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a sufrimiento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte es previsible o inminente. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Selección de la especie animal | 9. | Hay que usar animales adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio corriente. La especie recomendada es la rata y, en caso de usar otra especie, se justificará debidamente. | Preparación de los animales | 10. | Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. El día de la exposición, los animales serán adultos jóvenes de 8 a 12 semanas de edad y la diferencia máxima de su peso corporal respecto del peso medio de su sexo calculado en animales previamente expuestos de la misma edad y sexo será del ± 20 %. Los animales se seleccionan al azar y se marcan para permitir su identificación individual. Se mantienen en las jaulas al menos cinco días antes de empezar el estudio para que se acostumbren a las condiciones de laboratorio. Deberán también aclimatarse al equipo del ensayo durante un breve período preliminar, para así reducir el estrés provocado por la introducción en un entorno nuevo. | Zootecnia | 11. | La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. La humedad relativa se mantendrá idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, si bien esto no siempre es posible cuando se usa el agua como vehículo. Antes y después de las exposiciones, los animales deberán enjaularse en principio por grupos de sexo y nivel de exposición, pero el número de animales por jaula será tal que permita la observación sin trabas de cada animal y minimice las pérdidas por agresiones y canibalismo. Cuando la exposición es solo por la nariz, puede ser necesario aclimatar a los animales a los tubos de sujeción. Estos no deberán ejercer sobre los animales de forma indebida tensiones físicas, térmicas o de inmovilización. La sujeción puede influir en parámetros fisiológicos como la temperatura corporal (hipertermia) o el volumen respiratorio por minuto. Si se dispone de datos generales en el sentido de que no se producen estos cambios en medida apreciable, se podrá prescindir de la adaptación previa a los tubos de sujeción. Los animales expuestos de cuerpo entero a un aerosol se enjaularán de manera individual durante la exposición para evitar que el aerosol en estudio se filtre por el pelo de sus compañeros de jaula. Salvo durante la exposición, se podrán administrar las dietas habituales de laboratorio certificadas, acompañadas de un suministro ilimitado de agua potable de la traída municipal. Se aplicará iluminación artificial en una secuencia de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. | Cámaras de inhalación | 12. | Para seleccionar una cámara de inhalación se tendrán en cuenta la naturaleza de la sustancia problema y la finalidad del ensayo. El modo de exposición preferible es de solo por la nariz (término que abarca los modos de exposición solo por la cabeza, solo por la nariz y solo por el hocico). Este modo de exposición es el recomendado generalmente para los estudios de aerosoles líquidos o sólidos y de vapores que pueden condensarse formando aerosoles. Determinados objetivos de la investigación se podrían alcanzan mejor utilizando el modo de exposición de cuerpo entero, pero esto debe justificarse en el informe del estudio. Para asegurar la estabilidad atmosférica cuando se emplea una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los animales experimentales no debe exceder del 5 % del volumen de la cámara. En el GD 39 (2) se describen los principios de las técnicas de exposición de cuerpo entero y de solo por la nariz y sus ventajas e inconvenientes respectivos. | CONDICIONES DE EXPOSICIÓN | Administración de las concentraciones | 13. | Las exposiciones solo por la nariz en las ratas pueden tener cualquier duración hasta un máximo de 6 horas. En los ratones, las exposiciones solo por la nariz no deben sobrepasar en principio las 4 horas. Si se requieren tiempos experimentales más prolongados deberán justificarse [véase el GD 39 (2)]. Los animales expuestos a aerosoles en cámaras de cuerpo entero se enjaularán de manera individual para evitar la ingestión de la sustancia problema debido a las conductas de limpieza de los compañeros de jaula. Se suprimirá la alimentación durante el período de exposición. Se puede suministrar agua durante todo el período de exposición de cuerpo entero. | 14. | Los animales se exponen a la sustancia problema en forma de gas, vapor, aerosol o una mezcla de estos. El estado físico que debe utilizarse dependerá de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, de la concentración seleccionada y/o de la forma física más probable que adoptará la sustancia problema durante su manipulación y administración. Las sustancias higroscópicas y químicamente reactivas deberán estudiarse en condiciones de aire seco. Se procurará evitar la acumulación de concentraciones explosivas. | Granulometría | 15. | Se controlará la granulometría de todos los aerosoles y vapores que puedan condensarse formando aerosoles. Para facilitar la exposición de todas las zonas de interés de las vías respiratorias, se recomiendan aerosoles que tengan un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) de 1 a 4 μm, con una desviación típica geométrica (σg) en el intervalo de 1,5 a 3,0 (2) (9) (10). Se procurará dentro de lo razonable ajustarse a este marco de referencia, pero si ello no es posible se consultará la opinión de expertos. Por ejemplo, los humos metálicos pueden tener un diámetro de partícula menor, mientras que las partículas con carga, las fibras y las sustancias higroscópicas (que aumentan de tamaño en el medio húmedo de las vías respiratorias) pueden sobrepasar este límite de referencia. | Preparación de la sustancia problema en un vehículo | 16. | Se puede recurrir a un vehículo para crear una concentración y un tamaño de partícula adecuados de la sustancia problema en la atmósfera. Por regla general se dará preferencia al agua. El material particulado se puede someter a tratamientos mecánicos para obtener la granulometría deseada, pero procurando no descomponer ni alterar la sustancia problema. Cuando se considere que los procesos mecánicos pueden haber alterado la composición de la sustancia problema (por ejemplo, las temperaturas extremas de una fricción excesiva por un proceso de trituración), esta se verificará analíticamente. Se pondrá especial atención para no contaminar la sustancia problema. No es necesario analizar compuestos granulados no friables que han sido intencionadamente formulados como no inhalables. Se recurrirá a una prueba de desgaste para demostrar que no se generan partículas respirables durante la manipulación del material granulado. Si en la prueba de desgaste se generan sustancias respirables, habrá que efectuar un ensayo de toxicidad por inhalación. | Animales de control | 17. | No es necesario emplear un grupo de control negativo (con aire) en paralelo. Si se usa un vehículo distinto del agua para generar la atmósfera experimental, solo será necesario recurrir a un grupo de control del vehículo cuando no se disponga de datos anteriores de toxicidad por inhalación. Si un ensayo de toxicidad de una sustancia problema formulada en un vehículo revela que no hay toxicidad, se deduce que el vehículo es atóxico a la concentración analizada; por lo tanto, no hay necesidad de controlar el vehículo. | SUPERVISIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN | Caudal de aire de la cámara | 18. | El caudal de aire de la cámara se controlará minuciosamente, se supervisará de manera continuada y se registrará como mínimo cada hora durante cada exposición. La supervisión de la concentración (o estabilidad) atmosférica del ensayo constituye una medida integral de todos los parámetros dinámicos y proporciona un medio indirecto de controlar todos los parámetros dinámicos de interés en la generación de una atmósfera. Se pondrá especial atención para evitar la reinspiración en las cámaras de exposición solo por la nariz en aquellos casos en los que el caudal de aire a través del sistema de exposición sea insuficiente para crear un flujo continuo del medio atmosférico problema. Se han prescrito metodologías capaces de demostrar que no tiene lugar la reinspiración en las condiciones operativas establecidas (2) (11). La concentración de oxígeno debe ser como mínimo del 19 %, y la de dióxido de carbono no debe superar el 1 %. Si existen razones para suponer que no se van a conseguir estos valores de referencia, habrá que determinar las concentraciones de ambos gases. | Temperatura y humedad relativa de la cámara | 19. | La temperatura de la cámara se mantendrá en 22 ± 3 °C. La humedad relativa en la zona de respiración de los animales, cuando se trate de exposiciones de solo por la nariz y de cuerpo entero, se supervisará y registrará al menos tres veces en operaciones de hasta 4 horas, y cada hora en operaciones más cortas. La humedad relativa debe mantenerse idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, pero este valor de referencia puede ser inalcanzable (por ejemplo, cuando se analizan mezclas acuosas) o imposible de medir (cuando hay interferencias de la sustancia problema en el método de ensayo). | Sustancia problema: concentración nominal | 20. | Siempre que sea factible, se calculará y registrará la concentración nominal en la cámara de exposición. La concentración nominal es la masa de sustancia problema generada dividida por el volumen total de aire que recorre el sistema de la cámara. La concentración nominal no se usa para caracterizar la exposición de los animales, pero la comparación entre la concentración nominal y la real nos da un índice de la eficiencia generadora del sistema experimental, de modo que puede servir para detectar problemas en esta generación. | Sustancia problema: concentración real | 21. | La concentración real es la concentración de sustancia problema presente en la zona de respiración de los animales en una cámara de inhalación. Las concentraciones reales se pueden calcular con métodos específicos (por ejemplo, muestreo directo, métodos de adsorción o uso de reactivos químicos y posterior caracterización analítica) o con métodos inespecíficos como la gravimetría por filtración. El análisis gravimétrico es aceptable exclusivamente para aerosoles de un único componente en polvo o de líquidos de baja volatilidad, y deberá sustentarse en caracterizaciones preliminares específicas de la sustancia problema. La concentración de los aerosoles de polvos multicomponentes se puede determinar también por gravimetría. Sin embargo, hacen falta datos analíticos que demuestren que la composición del material en el aire es afín a la del material de partida. Si no se dispone de tal información, puede ser necesario repetir el análisis de la sustancia problema (idealmente, el aire) a intervalos regulares a lo largo del ensayo. Cuando se trate de productos en forma de aerosol capaces de evaporarse o sublimarse, habrá que demostrar que el método elegido es capaz de recoger todas las fases. En el informe del estudio se harán constar las concentraciones diana, nominales y reales, pero en los análisis estadísticos destinados a calcular los valores de concentración letal se emplean solo las concentraciones reales. | 22. | Se usará, a ser posible, un solo lote de sustancia problema, y la muestra de ensayo se conservará en condiciones que preserven su pureza, homogeneidad y estabilidad. Antes de iniciar el estudio deberá hacerse una caracterización de la sustancia problema consistente en un análisis de pureza y, si es técnicamente factible, de identidad y de cuantificación de contaminantes e impurezas. Con este fin se pueden aportar, entre otros, los siguientes datos: tiempo de retención y área relativa bajo el pico, peso molecular determinado mediante espectroscopia de masas o cromatografía de gases u otras determinaciones. Aunque la identidad de la muestra problema no es responsabilidad del laboratorio de análisis, la prudencia aconseja que este confirme, aunque sea dentro de ciertos límites, la caracterización facilitada por el promotor (por ejemplo, color, naturaleza física, etc.). | 23. | La atmósfera de exposición se mantendrá constante en la medida de lo posible y bajo supervisión continua y/o intermitente, dependiendo del método analítico. Si la técnica de muestreo es intermitente, habrá que tomar muestras de la atmósfera de la cámara por lo menos dos veces en un ensayo de cuatro horas. De no ser esto posible por darse concentraciones bajas o un caudal de aire limitado, se podrá tomar una sola muestra en todo el período de exposición. Si se producen fluctuaciones importantes de una muestra a otra, para analizar las siguientes concentraciones se tomarán cuatro muestras por exposición. Las concentraciones individuales de la cámara no deben desviarse de la concentración media en más de ± 10 % cuando se trata de gases y vapores, y en más de ± 20 % en caso de aerosoles de líquidos o sólidos. Se calculará y registrará el tiempo de equilibrado de la cámara (t95). La duración de cualquier exposición abarca el tiempo que tarda en generarse la sustancia problema, y tiene en cuenta el tiempo necesario para alcanzar t95. En el documento de orientación GD 39 (2) se ofrecen indicaciones para el cálculo de t95. | 24. | Cuando se manejen mezclas muy complejas de gases/vapores y aerosoles (por ejemplo, atmósferas de combustión y sustancias problema propulsadas con dispositivos/productos de uso final con fines determinados), cada fase puede comportarse de manera diferente en una cámara de inhalación, de modo que se seleccionará como mínimo una sustancia indicadora (analito), normalmente la sustancia activa principal de la mezcla, para cada fase (gas/vapor y aerosol). Si el producto analizado es una mezcla, habrá que documentar la concentración analítica de la mezcla y no solo de la sustancia o el componente activo (analito). En el documento de orientación GD no 39 (2) se ofrece más información acerca de las concentraciones reales. | Sustancia problema: granulometría | 25. | La granulometría de los aerosoles se determinará al menos dos veces por cada período de exposición de 4 horas, empleando un impactador de cascada o un aparato alternativo como un medidor del tamaño aeorodinámico de partícula. Si se puede demostrar la equivalencia de los resultados obtenidos con el impactador de cascada y con el aparato alternativo, entonces se podrá emplear este último durante todo el estudio. Se empleará un segundo dispositivo, como un filtro gravimétrico o un sistema de burbujeo o de impacto, en paralelo con el equipo principal para confirmar la eficiencia de recogida de este último. La concentración en masa obtenida mediante análisis granulométrico tendrá unos límites de desviación razonables con respecto a la concentración de masa obtenida mediante gravimetría por filtración [véase GD 39 (2)]. Si es posible demostrar su equivalencia en la fase inicial del estudio, podrán omitirse en lo sucesivo las pruebas confirmatorias. Por razones de bienestar animal, se tomarán medidas para minimizar la obtención de datos no concluyentes que obligarían a repetir la exposición. Se controlará el tamaño de partícula en los vapores cuando exista la posibilidad de que la condensación del vapor provoque la formación de un aerosol, o cuando se detecten partículas en una atmósfera de vapor que puedan inducir la mezcla de fases (véase el punto 15). | PROCEDIMIENTO | 26. | A continuación se describen dos tipos de estudios: el protocolo tradicional y el protocolo de C × t. Ambos protocolos pueden englobar un estudio preliminar, un estudio principal y/o un ensayo límite (protocolo tradicional) o de concentración límite (C × t). Cuando se sabe que uno de los sexos presenta mayor sensibilidad, el director del estudio podrá decidir que los ensayos se realicen solo en este. Cuando se exponen con la técnica de solo por la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Antes de comenzar el ensayo, se tomarán en consideración todos los datos disponibles para minimizar el uso de animales. Así, los datos a los que se refiere el capítulo B.52 del presente anexo (4) pueden obviar la necesidad de hacer un estudio preliminar, como también demostrar la mayor sensibilidad de uno de los sexos [véase GD 39 (2)]. | PROTOCOLO TRADICIONAL | Consideraciones generales: protocolo tradicional | 27. | En un estudio tradicional, se exponen lotes de animales a una sustancia problema durante un período establecido (generalmente 4 horas) en una cámara de exposición solo por la nariz o de cuerpo entero. Los animales se exponen a una concentración límite (ensayo límite) o bien a un mínimo de tres concentraciones progresivas (estudio principal). Puede realizarse un estudio preliminar antes del estudio principal, salvo que se disponga de alguna información acerca de la sustancia problema, como un estudio efectuado antes siguiendo el método del capítulo B.52 [véase GD 39 (2)]. | Estudio preliminar: protocolo tradicional | 28. | Se recurre al estudio preliminar para calcular la potencia de la sustancia problema, identificar las diferencias de sensibilidad en función del sexo y seleccionar los niveles de exposición que se aplicarán en el estudio principal o en el ensayo límite. Para seleccionar los niveles de concentración que se aplicarán en el estudio preliminar se recurrirá a toda la información disponible, incluidos datos de (Q)SAR y los datos de sustancias afines a la estudiada. A cada concentración no se expondrán más de tres machos y tres hembras (suele ser el mínimo necesario para establecer una diferencia en función del sexo). El estudio preliminar puede versar sobre una sola concentración, pero en caso necesario se pueden analizar más concentraciones. Un estudio preliminar nunca comportará un número de animales y de concentraciones tan elevado como un estudio principal. El estudio preliminar puede sustituirse por un estudio B.52 (4) previamente realizado [véase GD 39 (2)]. | Ensayo límite: protocolo tradicional | 29. | El ensayo límite se practica cuando se sabe o supone que la sustancia problema es prácticamente atóxica, es decir, que induce una respuesta tóxica solo cuando supera la concentración límite normativa. En un ensayo límite, un único lote compuesto por tres machos y tres hembras es expuesto a la sustancia problema a una concentración límite. Puede obtenerse información acerca de la toxicidad de la sustancia estudiada a partir de los conocimientos disponibles sobre compuestos afines teniendo en cuenta cuáles son los componentes que se sabe que son importantes desde el punto de vista toxicológico y en qué porcentaje aparecen. En situaciones en que se dispone de poca o ninguna información sobre la toxicidad de la sustancia o en que se prevé que esta será tóxica, se llevará a cabo el ensayo principal. | 30. | La selección de las concentraciones límite depende generalmente de los requisitos normativos. En virtud del Reglamento (CE) no 1272/2008, las concentraciones límite de los gases, vapores y aerosoles son de 20 000 ppm, 20 mg/l y 5 mg/l, respectivamente (o la concentración máxima alcanzable) (3). Puede resultar técnicamente complicado generar concentraciones límite de algunas sustancias problema, especialmente de vapores y aerosoles. Cuando se analicen aerosoles, el objetivo principal será obtener un tamaño de partícula respirable (MMAD de 1-4 μm). Este se consigue a una concentración de 2 mg/l para la mayoría de las sustancias problema. El estudio de aerosoles a concentraciones mayores de 2 mg/l solo se emprenderá si se puede obtener un tamaño de partícula respirable [véase GD 39 (2)]. El Reglamento (CE) no 1272/2008 desaconseja los estudios que superen las concentraciones límite por razones de bienestar animal (3). El estudio de la concentración límite solo se contemplará cuando haya muchas probabilidades de que sus resultados vayan a incidir directamente en la protección de la salud humana (3), lo cual deberá justificarse en el informe del estudio. Cuando se trate de sustancias problema potencialmente explosivas, se procurará evitar las condiciones favorables a una explosión. A fin de evitar el uso innecesario de animales, se hará una operación de prueba sin animales antes del ensayo límite, para confirmar que se pueden crear en la cámara las condiciones adecuadas para dicho ensayo límite. | 31. | Si con la concentración límite se encuentran animales muertos o moribundos, los resultados del ensayo límite pueden servir de estudio preliminar para nuevos ensayos con otras concentraciones (véase el estudio principal). Si las propiedades físicas o químicas de una sustancia problema hacen imposible obtener una concentración límite, se estudiará la concentración máxima alcanzable. Si con la concentración máxima alcanzable la letalidad es inferior al 50 %, no son necesarios nuevos estudios. En caso de no obtener una concentración límite, el informe del estudio deberá facilitar una explicación respaldada con datos. Si la concentración máxima alcanzable de un vapor no induce toxicidad, puede ser necesario generar la sustancia problema en forma de aerosol líquido. | Estudio principal: protocolo tradicional | 32. | El estudio principal se realiza típicamente con cinco machos y cinco hembras (o 5 animales del sexo más sensible, si se conoce) por nivel de concentración, aplicando como mínimo tres niveles de concentración. Deben emplearse niveles de concentración suficientes para obtener un análisis estadístico sólido. El intervalo de tiempo entre los grupos de exposición se determina según la aparición, duración y gravedad de los signos tóxicos. La exposición de los animales al siguiente nivel de concentración se retrasará hasta tener una seguridad razonable de la supervivencia de los animales previamente estudiados. Ello permitirá al director del estudio ajustar la concentración diana a la que se expondrá el siguiente lote. Dada la dependencia de tecnologías sofisticadas, esto no siempre es factible en los estudios de inhalación, por lo que la exposición de los animales al siguiente nivel de concentración deberá basarse en la opinión científica y la experiencia previas. Consúltese el documento de orientación GD 39 (2) cuando se estudien mezclas. | PROTOCOLO DE CONCENTRACIÓN × TIEMPO (C × T) | Consideraciones generales: protocolo de C × t | 33. | El estudio de C × t en progresión secuencial representa una alternativa al protocolo tradicional en los ensayos de toxicidad por inhalación (12) (13) (14). Con este método los animales se pueden exponer a distintas concentraciones de una sustancia problema durante períodos variables. La totalidad del estudio tiene lugar en una cámara de exposición solo por la nariz (las cámaras de cuerpo entero no resultan prácticas en este tipo de estudios). El protocolo se ilustra en un diagrama de flujo del apéndice 1. Un análisis de simulación ha demostrado que tanto el protocolo tradicional como el de C × t son capaces de rendir valores de CL50 sólidos, pero que el protocolo de C × t proporciona en general valores más sólidos de CL01 y de CL10 (15). | 34. | Un análisis de simulación ha demostrado que el uso de dos animales por intervalo de C × t (uno de cada sexo, o bien dos del sexo más sensible) es en general adecuado cuando se analizan 4 niveles de concentración y 5 tiempos de exposición en un estudio principal. En algunas circunstancias, el director del estudio puede decidir el empleo de dos ratas por sexo y por intervalo de C × t (15). El empleo de 2 animales por sexo y por valor de concentración y tiempo puede reducir el sesgo y la variabilidad de los valores estimados, aumentar el porcentaje de éxito de la estimación y mejorar el intervalo de confianza. No obstante, si el ajuste de los datos para la estimación es insuficiente (cuando se usa un animal de cada sexo o dos animales del sexo más sensible), puede bastar con agregar un quinto nivel de exposición. En GD 39 (2) se ofrecen más orientaciones sobre el número de animales y las concentraciones que deben aplicarse en un estudio de C × t. | Estudio preliminar: protocolo de C × t | 35. | Se hace un estudio preliminar para estimar la potencia de la sustancia problema y seleccionar los niveles de exposición que se aplicarán en el estudio principal. Pueden tener que usarse hasta tres animales por sexo y concentración en el estudio preliminar [consúltense los detalles en el apéndice III del documento de orientación GD 39 (2)] para determinar la concentración inicial adecuada del estudio principal y reducir al mínimo el número de animales utilizados. Para establecer diferencias en función del sexo puede ser necesario emplear tres animales por sexo. Estos animales deberán someterse a una exposición única, por lo general de 240 minutos. La capacidad de generar una atmósfera experimental adecuada se establecerá en pruebas técnicas previas realizadas sin animales. Por lo regular, no será necesario realizar un estudio preliminar cuando existan datos de mortalidad obtenidos de un estudio previo según el capítulo B.52 (4). Al seleccionar la concentración diana inicial en un estudio B.2, el director del estudio tendrá en cuenta las pautas de mortalidad observadas en los estudios B.52 (4) previos, en relación con los sexos y con todas las concentraciones estudiadas [véase GD 39 (2)]. | Concentración inicial: protocolo de C × t | 36. | La concentración inicial (sesión de exposición I) (apéndice 1) será una concentración límite o bien una concentración seleccionada por el director del estudio sobre la base de un estudio preliminar. Lotes de 1 animal/sexo se exponen a esta concentración durante diferentes períodos (por ejemplo, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos), hasta sumar un total de 10 animales (es lo que llamamos sesión de exposición I) (apéndice 1). | 37. | La selección de las concentraciones límite depende generalmente de los requisitos normativos. En virtud del Reglamento (CE) no 1272/2008, las concentraciones límite de los gases, vapores y aerosoles son de 20 000 ppm, 20 mg/l y 5 mg/l, respectivamente (o la concentración máxima alcanzable) (3). Puede resultar técnicamente complicado generar concentraciones límite de algunas sustancias problema, especialmente de vapores y aerosoles. Cuando se analicen aerosoles, el objetivo principal será obtener un tamaño de partícula respirable (es decir, un MMAD de 1-4 μm) a una concentración límite de 2 mg/l. Esto se consigue con la mayoría de las sustancias problema. El estudio de aerosoles a concentraciones mayores de 2 mg/l solo se emprenderá si se puede obtener un tamaño de partícula respirable [véase GD 39 (2)]. El Reglamento (CE) no 1272/2008 desaconseja los estudios que superen la concentración límite por razones de bienestar animal (3). Los estudios que superen la concentración límite solo se contemplarán cuando haya muchas probabilidades de que sus resultados vayan a incidir directamente en la protección de la salud humana (3), lo cual deberá justificarse en el informe del estudio. Cuando se trate de sustancias problema potencialmente explosivas, se procurará evitar las condiciones favorables a una explosión. A fin de evitar el uso innecesario de animales, se hará una operación de prueba sin animales antes de comenzar el estudio a la concentración inicial, para confirmar que se crean en la cámara las condiciones adecuadas a esa concentración. | 38. | Si con la concentración inicial se encuentran animales muertos o moribundos, los resultados obtenidos con esta concentración pueden servir como punto de partida para nuevos ensayos con otras concentraciones (véase el estudio principal). Si las propiedades físicas o químicas de una sustancia problema hacen imposible obtener una concentración límite, se estudiará la concentración máxima alcanzable. Si con la concentración máxima alcanzable la letalidad es inferior al 50 %, no son necesarios nuevos estudios. En caso de no poder obtener una concentración límite, el informe del estudio deberá facilitar una explicación respaldada con datos. Si la concentración máxima alcanzable de un vapor no induce toxicidad, puede ser necesario generar la sustancia problema en forma de aerosol líquido. | Estudio principal: protocolo de C × t | 39. | La concentración inicial (sesión de exposición I) (apéndice 1) analizada en el estudio principal será una concentración límite o bien una concentración seleccionada por el director del estudio sobre la base de un estudio preliminar. Si en el transcurso o después de la sesión de exposición I se observa mortalidad, la exposición mínima (C × t) que genere mortalidad se tomará como guía para establecer la concentración y los tiempos de la sesión de exposición II. Cada sesión de exposición sucesiva dependerá de la sesión anterior (véase el apéndice 1). | 40. | En el caso de muchas sustancias problema, los resultados obtenidos con la concentración inicial, unidos a los de otras tres sesiones de exposición con un cuadriculado temporal más denso (es decir, el espaciado geométrico de los períodos de exposición, indicado por el factor entre los períodos sucesivos, generalmente √2), serán suficientes para establecer la relación de mortalidad C × t (15); sin embargo, puede resultar conveniente agregar un quinto nivel de exposición [véanse el apéndice 1 y el documento de orientación GD 39 (2)]. En el apéndice 1 se describe el tratamiento matemático de los resultados del protocolo C × t. | OBSERVACIONES | 41. | Los animales se someterán a observación clínica frecuente durante el período de exposición. Las observaciones clínicas se llevarán a cabo al menos dos veces el día de la exposición, o más frecuentemente si lo indica la respuesta de los animales al tratamiento, y en lo sucesivo al menos una vez al día durante un período total de 14 días. La duración del período de observación no es fija, antes bien deberá determinarse en función de la naturaleza y del tiempo de aparición de los signos clínicos y de la longitud del período de recuperación. Son importantes los momentos en que aparezcan y desaparezcan los signos de toxicidad, especialmente si hay tendencia a una aparición retardada de tales signos de toxicidad. Todas las observaciones se anotarán sistemáticamente en los registros individuales abiertos para cada animal. Por razones de bienestar animal, los animales moribundos o que den muestras de dolor fuerte o signos de sufrimiento intenso y continuo deben ser sacrificados de forma compasiva. En el momento de explorar los signos clínicos de toxicidad, se procurará que el mal aspecto inicial y los trastornos respiratorios transitorios, eventualmente derivados del procedimiento de exposición, no se confundan con signos de toxicidad química que obligarían al sacrificio prematuro de los animales. Se tendrán en cuenta los principios y criterios resumidos en el Guidance Document on Humane Endpoints (GD 19) (7). Cuando se encuentre algún animal muerto o se sacrifique por razones compasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la muerte. | 42. | Las observaciones en la jaula deberían incluir los cambios en la piel y el pelo, ojos y membranas mucosas, y también los sistemas respiratorio, circulatorio, nervioso central y autónomo, así como la actividad somatomotriz y las pautas de comportamiento. Cuando sea posible se anotarán las eventuales diferencias entre los efectos locales y los sistémicos. Debe prestarse especial atención a la observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. El registro de la temperatura rectal puede ayudar a detectar una bradipnea refleja o una hipo/hipertermia relacionadas con el tratamiento o con el confinamiento. | Pesos corporales | 43. | Los pesos corporales individuales se registrarán una vez durante el período de aclimatación, en el día previo a la exposición (día 0), y al menos en los días 1, 3 y 7 (y, en lo sucesivo, semanalmente) y en el momento de la muerte o de la eutanasia si se produce después del día 1. Se acepta que el peso corporal es un indicador crítico de la toxicidad, por lo que deberán vigilarse estrechamente los animales que muestren una reducción progresiva de peso ≥ 20 % en comparación con los valores preliminares. Los animales supervivientes se pesan y se sacrifican de forma compasiva al final del período de post-exposición. | Anatomía patológica | 44. | Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran durante su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar animal, se someterán a autopsia macroscópica. Si la autopsia no se puede practicar inmediatamente después de descubrir la muerte del animal, este será refrigerado (no congelado) a temperaturas suficientemente bajas para minimizar la autólisis. Las autopsias se practicarán lo antes posible, normalmente en el plazo de uno o dos días. Se documentarán todas las modificaciones anatomopatológicas macroscópicas observadas en cada animal, poniendo especial atención en las alteraciones de las vías respiratorias. | 45. | Se podrán contemplar otras exploraciones incluidas de antemano en el diseño para ampliar el valor interpretativo del estudio, como la medida del peso pulmonar de las ratas que sobrevivan o el examen microscópico de las vías respiratorias para aportar pruebas de irritación. La exploración de órganos puede extenderse a aquellos que muestren signos de anatomopatología macroscópica en los animales que sobreviven 24 o más horas y a los órganos que se saben o suponen afectados. El examen microscópico de la totalidad de las vías respiratorias puede proporcionar información útil en el caso de sustancias problema que son reactivas con el agua, como las de naturaleza ácida o higroscópica. | DATOS E INFORME | Datos | 46. | Se documentarán por separado los datos de peso corporal y los resultados de la autopsia de cada animal. Los resultados de la observación clínica se reunirán en un cuadro que presente, por cada grupo de ensayo, el número de animales utilizados, el número de animales que presenten signos específicos de toxicidad, el número de animales hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte de los distintos animales, la descripción y la evolución temporal de los efectos tóxicos y su reversibilidad, y los resultados de la autopsia. | Informe del ensayo | 47. | El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información siguiente: | | Animales de experimentación y zootecnia | — | Descripción de las condiciones de enjaulado, tales como: número (o variación del número) de animales por jaula, materiales de cama, temperatura ambiente y humedad relativa, fotoperíodo e identificación de la dieta. | — | Especie o variedad empleada y justificación para el uso de una especie distinta de la rata. | — | Número, edad y sexo de los animales. | — | Método de aleatorización. | — | Detalles de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo/origen de la alimentación y el origen del agua). | — | Descripción de cualquier acondicionamiento previo al estudio, incluidos alimentación, cuarentena y tratamiento de enfermedades. | | Sustancia problema | — | Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (incluida la isomerización). | — | Identificación química y número de registro del Chemical Abstracts Service (CAS), si se conoce. | | Vehículo | — | Justificación del uso de un vehículo y justificación de la elección del mismo (si es distinto del agua). | — | Datos históricos o paralelos que demuestren que el vehículo no interfiere en los resultados del estudio. | | Cámara de inhalación | — | Descripción de la cámara de inhalación, incluidos las dimensiones y el volumen. | — | Procedencia y descripción del equipo empleado para la exposición de los animales y la generación de la atmósfera. | — | Equipo empleado para medir la temperatura, la humedad, el tamaño de partícula y la concentración real. | — | Fuente de aire, tratamiento del aire suministrado/extraído y sistema de acondicionamiento. | — | Métodos de calibración del equipo para garantizar una atmósfera experimental homogénea. | — | Diferencia de presión (positiva o negativa). | — | Puertos de exposición por cámara (solo por la nariz); ubicación de los animales en el sistema (de cuerpo entero). | — | Homogeneidad/estabilidad temporal de la atmósfera experimental. | — | Localización de los sensores de temperatura y humedad, y muestreo de la atmósfera experimental en la cámara. | — | Caudales de aire, caudal del aire por puerto de exposición (solo por la nariz) o carga de animales por cámara (de cuerpo entero). | — | Descripción del equipo empleado para medir el oxígeno y el dióxido de carbono, si procede. | — | Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio (t95) en la cámara de inhalación. | — | Número de variaciones de volumen por hora. | — | Dispositivos de dosificación (si procede). | | Datos relativos a la exposición | — | Justificación de la concentración diana seleccionada en el estudio principal. | — | Concentraciones nominales (masa total de sustancia problema generada en la cámara de inhalación dividida por el volumen de aire que recorre la cámara). | — | Concentraciones reales de la sustancia problema recuperadas en la zona de respiración de los animales; en el caso de mezclas que den lugar a estados físicos heterogéneos (gases, vapores, aerosoles), se podrá analizar cada uno de ellos por separado. | — | Todas las concentraciones atmosféricas se registrarán en unidades de masa (por ejemplo, mg/l, mg/m3, etc.); se podrán indicar además las unidades de volumen (por ejemplo, ppm, ppmm, etc.) entre paréntesis. | — | Granulometría, diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) y desviación típica geométrica (σg), incluidos los correspondientes métodos de cálculo; se documentarán los análisis granulométricos individuales. | | Condiciones del ensayo | — | Descripción pormenorizada de la preparación de la sustancia problema y de cualquier método empleado para reducir el tamaño de partícula de las materias sólidas o preparar soluciones de la sustancia problema; cuando exista la posibilidad de que los procesos mecánicos hayan alterado la composición de la sustancia problema, se incluirán los resultados de los análisis realizados para verificar dicha composición. | — | Descripción (preferiblemente acompañada de un diagrama) del equipo empleado para generar la atmósfera experimental y para exponer los animales a la misma. | — | Descripción pormenorizada del método de análisis químico empleado y de la validación del método (incluida la eficacia de recuperación de la sustancia problema en el medio ambiente experimental). | — | Justificación de las concentraciones experimentales seleccionadas. | | Resultados | — | Tabulación de los valores de temperatura, humedad y caudal de aire de la cámara. | — | Tabulación de las concentraciones nominales y reales de la cámara. | — | Tabulación de los datos de tamaño de partícula, incluidos los de recogida de muestras para el análisis, granulometría y cálculos de MMAD y σg. | — | Tabulación de las respuestas y de los niveles de concentración de cada animal (es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la mortalidad y la naturaleza, gravedad, momento de aparición y duración de los efectos). | — | Pesos corporales de cada animal registrados en el estudio; fecha y hora de la muerte si se produce antes de la eutanasia programada; cronología de la aparición de los signos de toxicidad e indicación de si estos son reversibles en cada animal. | — | Resultados de la autopsia y eventuales observaciones histopatológicas de cada animal, si se dispone de ellas. | — | Estimaciones de la letalidad (por ejemplo, CL50, DL01), incluidos los límites de confianza del 95 % y la pendiente (si lo permite el método de evaluación). | — | Relación estadística, incluida la estimación del exponente n (protocolo de C × t); se indicará el nombre del paquete informático. | | Evaluación e interpretación de los resultados | — | Se hará especial hincapié en la descripción de los procedimientos empleados para cumplir los criterios del presente método de ensayo, esto es, la concentración límite o el tamaño de partícula. | — | Se tomará en consideración la respirabilidad de las partículas a la luz de los resultados globales, de manera especial si no se cumplen los criterios relativos al tamaño de partícula. | — | Se facilitará una explicación de si ha sido preciso sacrificar de forma compasiva animales con signos evidentes de dolor o de sufrimiento intenso y duradero, atendiendo a los criterios del documento de orientación de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (8). | — | Cuando se haya interrumpido algún estudio conforme al protocolo descrito en el capítulo B.52 del presente anexo (4) para reemplazarlo por el presente método de ensayo B.2, se harán las justificaciones pertinentes. | — | En la evaluación global del estudio se expondrá la coherencia de los métodos empleados para determinar las concentraciones nominales y reales y la relación entre ellas. | — | Se explicará la causa probable de muerte y el mecanismo de acción (sistémico o local) predominante. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (3) | Reglamento CE no 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) no 1907/2006 (DO L 353 de 31.12.2008, p. 1). | (4) | Capítulo B.52 del presente anexo. Toxicidad aguda por inhalación. Método de las clases de toxicidad aguda. | (5) | Capítulo B.40 del presente anexo. Corrosión cutánea in vitro: Ensayo de Resistencia eléctrica transcutánea (REI). | (6) | Capítulo B.40bis del presente anexo. Corrosión cutánea in vitro: Ensayo con modelo de piel humana. | (7) | OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (8) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (9) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. | (10) | Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. | (11) | Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167. | (12) | Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290. | (13) | Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117. | (14) | Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71. | (15) | OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (16) | Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York. | DEFINICIÓN | Sustancia problema: Toda sustancia o mezcla analizada mediante este método de ensayo. | Apéndice 1 | Protocolo de C × t | 1. | El estudio de concentración × tiempo (C × t) en progresión secuencial representa una alternativa al protocolo tradicional en los ensayos de toxicidad por inhalación (12) (13) (14). Se usará preferentemente cuando exista una necesidad científica o normativa específica que imponga la investigación con animales en diferentes períodos, como es el caso de la planificación de actuaciones de urgencia o del uso del suelo. El protocolo suele comenzar con el estudio de una concentración límite (sesión de exposición I), en el que se exponen los animales a la sustancia problema durante cinco intervalos de tiempo (por ejemplo, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos), de modo que dentro de una sesión se investigan distintos tiempos de exposición (véase la figura 1). En virtud del Reglamento (CE) no 1272/2008, las concentraciones límite de los gases, vapores y aerosoles son de 20 000 ppm, 20 mg/l y 5 mg/l, respectivamente. Estas concentraciones solo podrán rebasarse cuando exista una necesidad científica o normativa que así lo indique (véase el punto 37 del texto principal de B.2). | 2. | En los casos en que exista poca o nula información sobre la toxicidad de una sustancia problema se realizará un estudio preliminar, en el que grupos de no más de 3 animales de cada sexo se expondrán a las concentraciones diana seleccionadas por el director del estudio durante 240 minutos como norma general. | 3. | Si se analiza una concentración límite durante la sesión de exposición I y se observa una mortalidad inferior al 50 %, no hacen falta más ensayos. Si se plantea una necesidad científica o normativa de establecer una relación concentración/tiempo/respuesta a niveles más elevados que la concentración límite indicada, la siguiente exposición se establecerá a un nivel tal que suponga dos veces la concentración límite (es decir, 2L en la figura 1). | 4. | Si se observa toxicidad a la concentración límite, habrá que hacer nuevos ensayos (estudio principal). Estas exposiciones adicionales tendrán lugar, bien a concentraciones más bajas (en la figura 1: sesiones de exposición II, III o IV’), bien a concentraciones más elevadas pero durante períodos más breves (en la figura 1: sesión de exposición IV), acortando los tiempos de exposición y los intervalos entre ellos. | 5. | El ensayo (de la concentración inicial y las adicionales) se lleva a cabo empleando 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo, o bien 2 animales del sexo más sensible por valor de concentración/tiempo. En algunas circunstancias, el director del estudio puede decidir el uso de 2 ratas por sexo y por valor de concentración/tiempo (o 4 animales del sexo más sensible por valor de concentración/tiempo) (15). El empleo de 2 animales por sexo y por valor de concentración/tiempo puede reducir el sesgo y la variabilidad de los cálculos, mejorar el porcentaje de éxito de la estimación y aumentar el intervalo de confianza en comparación con el protocolo que se describe aquí. Se ofrece más información en el documento de orientación GD 39 (2). | 6. | Lo ideal es que cada sesión de exposición se efectúe en un día. Esto concede la oportunidad de retrasar la siguiente exposición hasta obtener una seguridad razonable de la supervivencia, y permite al director del estudio ajustar la concentración diana y los tiempos de la siguiente sesión de exposición. Se recomienda iniciar cada sesión de exposición con el lote que va a estar expuesto más tiempo, es decir, comenzar con el lote de 240 minutos de exposición, seguido del lote de 120 minutos, y así sucesivamente. Si, por ejemplo, los animales del lote de 240 minutos mueren ya a los 90 minutos o muestran signos graves de toxicidad (por ejemplo, alteraciones importantes de la pauta de respiración, como dificultad al respirar), carece de sentido exponer otro lote a un tiempo de 120 minutos ya que la mortalidad será probablemente del 100 %. De modo que el director del estudio seleccionará tiempos de exposición más breves para esa concentración (por ejemplo, 90, 65, 45, 33 y 25 minutos). | 7. | La concentración de la cámara se medirá con frecuencia para determinar la concentración media ponderada de cada período de exposición. Siempre que sea posible, se tomará para el análisis estadístico el momento de la muerte de cada animal (mejor que la duración de la exposición). | 8. | Los resultados de las cuatro primeras sesiones de exposición se analizarán con objeto de detectar lagunas en los datos de la curva de concentración-tiempo (véase la figura 1). En caso de ajuste insuficiente, se podrá proceder a una nueva exposición (5a concentración). En ella, la concentración y los períodos de exposición se elegirán para cubrir la laguna detectada. | 9. | Se tomarán todas las sesiones de exposición (incluida la primera) para calcular la relación concentración-tiempo-respuesta aplicando el análisis estadístico (16). En la medida de lo posible, por cada intervalo de C × t se tomarán la concentración media ponderada en función del tiempo y la duración de la exposición hasta el momento de la muerte (si esta se produce durante la exposición). | Figura 1 | Ilustración hipotética de la relación concentración-tiempo-mortalidad en la rata | Símbolos huecos = animales supervivientes; símbolos macizos = animales muertos | Triángulos = hembras; círculos = machos | Línea continua = valores de CL50 (intervalo de 7,5-240 min) de los machos, n = 1 | Línea de trazos = valores de CL50 (intervalo de 7,5-240 min) de las hembras, n = 1 | Líneas de puntos = valores hipotéticos de CL50 de machos y hembras, bajo el supuesto de n igual a 2 (12). | Glosario | Concentración: | Tiempo de exposición: | Tiempo de exposición: (min) | concentración (L = límite) | 10. | A continuación se expone un ejemplo de progresión secuencial: | Sesión de exposición I — Estudio realizado a la concentración límite (figura 1) | — | 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en total (1) | — | Concentración diana (2) = concentración límite. | — | Se exponen cinco lotes de animales a esta concentración diana durante períodos de 15, 30, 60, 120 y 240 minutos, respectivamente. | ↓ | Sesión de exposición II (3) — Estudio principal | — | 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en total. | — | Se exponen cinco lotes de animales a una concentración inferior (4) (1/2L) con tiempos de exposición algo más largos (espaciado de factor √2; véase la figura 1). | ↓ | Sesión de exposición III — Estudio principal | — | 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en total. | — | Se exponen cinco lotes de animales a una concentración inferior (4) (1/4L) con tiempos de exposición algo más largos (espaciado de factor √2; véase la figura 1). | ↓ | Sesión de exposición IV’ — Estudio principal | — | 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en total. | — | Se exponen cinco lotes de animales a una concentración inferior (4) (1/8L) con tiempos de exposición algo más largos (espaciado de factor √2; véase la figura 1). | ↓ o | Sesión de exposición IV — Estudio principal | — | 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en total. | — | Se exponen cinco lotes de animales a una concentración superior (5) (2L) con tiempos de exposición algo más cortos (espaciado de factor √2; véase la figura 1). | Tratamiento matemático de los resultados obtenidos con el protocolo de C × t | 11. | Un estudio de C × t con 4 o 5 concentraciones y cinco períodos de exposición rendirá, respectivamente 20 o 25 puntos de datos. A partir de estos puntos de datos se puede calcular la relación C × t aplicando el análisis estadístico (16): | Ecuación1: | donde C = concentración; t = período de exposición, o | Ecuación 2: | donde | Aplicando la ecuación 1, se puede calcular el valor de CL50 para un período dado (por ejemplo, 4 horas, 1 hora, 30 minutos o cualquier período dentro del intervalo de períodos estudiados) haciendo P = 5 (50 % de respuesta). Obsérvese que la regla de Haber solo es aplicable para n = 1. La CL01 se puede calcular haciendo P = 2,67. | » |
| (4) | Chapters B.7 and B.8 are replaced by the following: | ‘B.7. REPEATED DOSE 28-DAY ORAL TOXICITY STUDY IN RODENTS | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline 407 (2008). The original Test Guideline 407 was adopted in 1981. In 1995 a revised version was adopted, to obtain additional information from the animal used in the study, in particular on neurotoxicity and immunotoxicity. | 2. | In 1998, the OECD initiated a high-priority activity, to revise existing Test Guidelines and to develop new Test Guidelines for the screening and testing of potential endocrine disruptors (8). One element of the activity was to update the existing OECD guideline for “repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents” (TG 407) by parameters suitable to detect endocrine activity of test chemicals. This procedure underwent an extensive international program to test for the relevance and practicability of the additional parameters, the performance of these parameters for chemicals with (anti)oestrogenic, (anti)androgenic, and (anti)thyroid activity, the intra- and inter-laboratory reproducibility, and the interference of the new parameters with those required by the prior TG 407. The large amount of data thereby obtained has been compiled and evaluated in detail in a comprehensive OECD report (9). This updated Test Method B.7 (as equivalent to TG 407) is the outcome of the experience and results gained during the international test program. This Test Method allows certain endocrine mediated effects to be put into context with other toxicological effects. | INITIAL CONSIDERATIONS AND LIMITATIONS | 3. | In the assessment and evaluation of the toxic characteristics of a chemical, the determination of oral toxicity using repeated doses may be carried out after initial information on toxicity has been obtained by acute toxicity testing. This Test Method is intended to investigate effects on a very broad variety of potential targets of toxicity. It provides information on the possible health hazards likely to arise from repeated exposure over a relatively limited period of time, including effects on the nervous, immune and endocrine systems. Regarding these particular endpoints, it should identify chemicals with neurotoxic potential, which may warrant further in-depth investigation of this aspect, and chemicals that interfere with thyroid physiology. It may also provide data on chemicals that affect the male and/or female reproductive organs in young adult animals and may give an indication of immunological effects. | 4. | The results from this Test Method B.7 should be used for hazard identification and risk assessment. The results obtained by the endocrine related parameters should be seen in the context of the “OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (11). The method comprises the basic repeated dose toxicity study that may be used for chemicals on which a 90-day study is not warranted (e.g. when the production volume does not exceed certain limits) or as a preliminary to a long-term study. The duration of exposure should be 28 days. | 5. | The international program conducted on the validation of parameters suitable to potentially detect endocrine activity of a test chemical showed that the quality of data obtained by this Test Method B.7 will depend much on the experience of the test laboratory. This relates specifically to the histopathological determination of cyclic changes in the female reproductive organs and to the weight determination of the small hormone dependent organs which are difficult to dissect. Guidance on histopathology has been developed (19). It is available on the OECD public website on Test Guidelines. It is intended to assist pathologists in their examinations and help increase the sensitivity of the assay. A variety of parameters were found to be indicative of endocrine-related toxicity and have been incorporated in the Test Method. Parameters for which insufficient data were available to prove usefulness or which showed only weak evidence in the validation programme of their ability to help in detection of endocrine disrupters are proposed as optional endpoints (see Appendix 2). | 6. | On the basis of data generated in the validation process, it must be emphasised that the sensitivity of this assay is not sufficient to identify all substances with (anti)androgenic or (anti)oestrogenic modes of action (9). The Test Method is not performed in a life-stage that is most sensitive to endocrine disruption. The Test Method nevertheless, during the validation process identified substances weakly and strongly affecting thyroid function, and strong and moderate endocrine active substances acting through oestrogen or androgen receptors, but in most cases failed to identify endocrine active substances that weakly affect oestrogen or androgen receptors. Thus it cannot be described as a screening assay for endocrine activity. | 7. | Consequently, the lack of effects related to these modes of action can not be taken as evidence for the lack of effects on the endocrine system. Regarding endocrine mediated effects, substance characterisation should not therefore be based on the results of this Test Method alone but should be used in a weight of evidence approach incorporating all existing data on a chemical to characterise potential endocrine activity. For this reason, regulatory decision making on endocrine activity (substance characterisation) should be a broadly based approach, not solely reliant on results from application of this test method. | 8. | It is acknowledged that all animal-based procedures will conform to local standards of animal care; the descriptions of care and treatment set forth below are minimal performance standards, and will be superseded by local regulations where more stringent. Further guidance of the humane treatment of animals is given by the OECD (14). | 9. | Definitions used are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 10. | The test chemical is orally administered daily in graduated doses to several groups of experimental animals, one dose level per group for a period of 28 days. During the period of administration the animals are observed closely, each day for signs of toxicity. Animals that die or are euthanised during the test are necropsied and at the conclusion of the test surviving animals are euthanised and necropsied. A 28 day study provides information on the effects of repeated oral exposure and can indicate the need for further longer term studies. It can also provide information on the selection of concentrations for longer term studies. The data derived from using the Test Method should allow for the characterisation of the test chemical toxicity, for an indication of the dose response relationship and the determination of the No-Observed Adverse Effect Level (NOAEL). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 11. | The preferred rodent species is the rat, although other rodent species may be used. If the parameters specified within this Test Method B.7 are investigated in another rodent species a detailed justification should be given. Although it is biologically plausible that other species should respond to toxicants in a similar manner to the rat, the use of smaller species may result in increased variability due to technical challenges of dissecting smaller organs. In the international validation program for the detection of endocrine disrupters, the rat was the only species used. Young healthy adult animals of commonly used laboratory strains should be employed. Females should be nulliparous and non pregnant. Dosing should begin as soon as feasible after weaning, and, in any case, before the animals are nine weeks old. At the commencement of the study the weight variation of animals used should be minimal and not exceed ± 20 % of the mean weight of each sex. When a repeated oral dose is conducted as a preliminary to a longer-term study, it is preferable that animals from the same strain and source should be used in both studies. | Housing and feeding | 12. | All procedures should conform to local standards of laboratory animal care. The temperature in the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C). Although the relative humidity should be at least 30 % and preferably not to exceed 70 % other than during room cleaning, the aim should be 50-60 %. Lighting should be artificial, the photoperiod being 12 hours light, 12 hours dark. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. The choice of diet may be influenced by the need to ensure a suitable admixture of a test chemical when administered by this method. Animals should be group housed in small groups of the same sex; animals may be housed individually if scientifically justified. For group caging, no more than five animals should be housed per cage. | 13. | The feed should be regularly analysed for contaminants. A sample of the diet should be retained until finalisation of the report. | Preparation of animals | 14. | Healthy young adult animals are randomly assigned to the control and treatment groups. Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimised. The animals are identified uniquely and kept in their cages for at least five days prior to the start of the treatment study to allow for acclimatisation to the laboratory conditions. | Preparation of doses | 15. | The test chemical is administered by gavage or via the diet or drinking water. The method of oral administration is dependent on the purpose of the study, and the physical/chemical/toxico-kinetic properties of the test chemical. | 16. | Where necessary, the test chemical is dissolved or suspended in a suitable vehicle. It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solution/suspension be considered first, followed by consideration of a solution/suspension in oil (e.g. corn oil) and then by possible solution in other vehicles. For vehicles other than water the toxic characteristics of the vehicle must be known. The stability of the test chemical in the vehicle should be determined. | PROCEDURE | Number and sex of animals | 17. | At least 10 animals (five female and five male) should be used at each dose level. If interim euthanasia are planned, the number should be increased by the number of animals scheduled to be euthanised before the completion of the study. Consideration should be given to an additional satellite group of ten animals (five per sex) in the control and in the top dose group for observation of reversibility, persistence, or delayed occurrence of toxic effects, for at least 14 days post treatment. | Dosage | 18. | Generally, at least three test groups and a control group should be used, but if from assessment of other data, no effects would be expected at a dose of 1 000 mg/kg bw/d, a limit test may be performed. If there are no suitable data available, a range finding study (animals of the same strain and source) may be performed to aid the determination of the doses to be used. Except for treatment with the test chemical, animals in the control group should be handled in an identical manner to the test group subjects. If a vehicle is used in administering the test chemical, the control group should receive the vehicle in the highest volume used. | 19. | Dose levels should be selected taking into account any existing toxicity and (toxico-) kinetic data available for the test chemical or related chemicals. The highest dose level should be chosen with the aim of inducing toxic effects but not death or severe suffering. Thereafter, a descending sequence of dose levels should be selected with a view to demonstrating any dosage related response and no-observed-adverse effects at the lowest dose level (NOAEL). Two to four fold intervals are frequently optimal for setting the descending dose levels and addition of a fourth test group is often preferable to using very large intervals (e.g. more than a factor of 10) between dosages. | 20. | In the presence of observed general toxicity (e.g. reduced body weight, liver, heart, lung or kidney effects, etc.) or other changes that may not be toxic responses (e.g. reduced food intake, liver enlargement), observed effects on immune, neurological or endocrine sensitive endpoints should be interpreted with caution. | Limit test | 21. | If a test at one dose level of at least 1 000 mg/kg body weight/day or, for dietary or drinking water administration, an equivalent percentage in the diet, or drinking water (based upon body weight determinations), using the procedures described for this study, produces no observable toxic effects and if toxicity would not be expected based upon data from structurally related chemicals, then a full study using three dose levels may not be considered necessary. The limit test applies except when human exposure indicates the need for a higher dose level to be used. | Administration of doses | 22. | The animals are dosed with test chemical daily 7 days each week for a period of 28 days. When the test chemical is administered by gavage, this should be done in a single dose to the animals using a stomach tube or a suitable intubation cannula. The maximum volume of liquid that can be administered at one time depends on the size of the test animal. The volume should not exceed 1 ml/100 g body weight except in the case of aqueous solutions where 2 ml/100 g body weight may be used. Except for irritating or corrosive chemicals, which will normally reveal exacerbated effects with higher concentrations, variability in test volume should be minimized by adjusting the concentration to ensure a constant volume at all dose levels. | 23. | For chemicals administered via the diet or drinking water it is important to ensure that the quantities of the test chemical involved do not interfere with normal nutrition or water balance. When the test chemical is administered in the diet either a constant dietary concentration (ppm) or a constant dose level in terms of the animals’ body weight may be used; the alternative used must be specified. For a chemical administered by gavage, the dose should be given at similar times each day, and adjusted as necessary to maintain a constant dose level in terms of animal body weight. Where a repeated dose study is used as a preliminary to a long term study, a similar diet should be used in both studies. | Observations | 24. | The observation period should be 28 days. Animals in a satellite group scheduled for follow-up observations should be kept for at least 14 days without treatment to detect delayed occurrence, or persistence of, or recovery from toxic effects. | 25. | General clinical observations should be made at least once a day, preferably at the same time(s) each day and considering the peak period of anticipated effects after dosing. The health condition of the animals should be recorded. At least twice daily, all animals are observed for morbidity and mortality. | 26. | Once before the first exposure (to allow for within-subject comparisons), and at least once a week thereafter, detailed clinical observations should be made in all animals. These observations should be made outside the home cage in a standard arena and preferably at the same time of day on each occasion. They should be carefully recorded, preferably using scoring systems, explicitly defined by the testing laboratory. Effort should be made to ensure that variations in the test conditions are minimal and that observations are preferably conducted by observers unaware of the treatment. Signs noted should include, but not be limited to, changes in skin, fur, eyes, mucous membranes, occurrence of secretions and excretions and autonomic activity (e.g. lacrimation, piloerection, pupil size, unusual respiratory pattern). Changes in gait, posture and response to handling as well as the presence of clonic or tonic movements, stereotypies (e.g. excessive grooming, repetitive circling) or bizarre behaviour (e.g. self-mutilation, walking backwards) should also be recorded (2). | 27. | In the fourth exposure week sensory reactivity to stimuli of different types (2) (e.g. auditory, visual and proprioceptive stimuli) (3)(4)(5), assessment of grip strength (6) and motor activity assessment (7) should be conducted. Further details of the procedures that could be followed are given in the respective references. However, alternative procedures than those referenced could be used. | 28. | Functional observations conducted in the fourth exposure week may be omitted when the study is conducted as a preliminary study to a subsequent subchronic (90-day) study. In that case, the functional observations should be included in this follow-up study. On the other hand, the availability of data on functional observations from the repeated dose study may enhance the ability to select dose levels for a subsequent subchronic study. | 29. | As an exception, functional observations may also be omitted for groups that otherwise reveal signs of toxicity to an extent that would significantly interfere with the functional test performance. | 30. | At necropsy, the oestrus cycle of all females could be determined (optional) by taking vaginal smears. These observations will provide information regarding the stage of oestrus cycle at the time of sacrifice and assist in histological evaluation of estrogen sensitive tissues [see guidance on histopathology (19)]. | Body weight and food/water consumption | 31. | All animals should be weighed at least once a week. Measurements of food consumption should be made at least weekly. If the test chemical is administered via the drinking water, water consumption should also be measured at least weekly. | Haematology | 32. | The following haematological examinations should be made at the end of the test period: haematocrit, haemoglobin concentrations, erythrocyte count, reticulocytes, total and differential leucocyte count, platelet count and a measure of blood clotting time/potential. Other determinations that should be carried out, if the test chemical or its putative metabolites have or are suspected to have oxidising properties include methaemoglobin concentration and Heinz bodies. | 33. | Blood samples should be taken from a named site just prior to or as part of the procedure for euthanasia of the animals, and stored under appropriate conditions. Animals should be fasted overnight prior to euthanasia (2). | Clinical biochemistry | 34. | Clinical biochemistry determinations to investigate major toxic effects in tissues and, specifically, effects on kidney and liver, should be performed on blood samples obtained of all animals just prior to or as part of the procedure for euthanasia of the animals (apart from those found moribund and/or euthanised prior to the termination of the study). Investigations of plasma or serum shall include sodium, potassium, glucose, total cholesterol, urea, creatinine, total protein and albumin, at least two enzymes indicative of hepatocellular effects (such as alanin aminotransferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase, γ-glutamyl trans-peptidase and glutamate dehydrogenase), and bile acids. Measurements of additional enzymes (of hepatic or other origin) and bilirubin may provide useful information under certain circumstances. | 35. | Optionally, the following urinalysis determinations could be performed during the last week of the study using timed urine volume collection; appearance, volume, osmolality or specific gravity, pH, protein, glucose and blood/blood cells. | 36. | In addition, studies to investigate plasma or serum markers of general tissue damage should be considered. Other determinations that should be carried out, if the known properties of the test chemical may, or are suspected to, affect related metabolic profiles include calcium, phosphate, triglycerides, specific hormones, and cholinesterase. These need to be identified for chemicals in certain classes or on a case-by-case basis. | 37. | Although in the international evaluation of the endocrine related endpoints a clear advantage for the determination of thyroid hormones (T3, T4) and TSH could not be demonstrated, it may be helpful to retain plasma or serum samples to measure T3, T4 and TSH (optional) if there is an indication for an effect on the pituitary-thyroid axis. These samples may be frozen at – 20° for storage. The following factors may influence the variability and the absolute concentrations of the hormone determinations: | — | time of sacrifice because of diurnal variation of hormone concentrations | — | method of sacrifice to avoid undue stress to the animals that may affect hormone concentrations | — | test kits for hormone determinations that may differ by their standard curves. | Definitive identification of thyroid-active chemicals is more reliable by histopathological analysis rather than hormone levels. | 38. | Plasma samples specifically intended for hormone determination should be obtained at a comparable time of the day. It is recommended that consideration should be given to T3, T4 and TSH determinations triggered based upon alterations of thyroid histopathology. The numerical values obtained when analysing hormone concentrations differ with various commercial assay kits. Consequently, it may not be possible to provide performance criteria based upon uniform historical data. Alternatively, laboratories should strive to keep control coefficients of variation below 25 for T3 and T4 and below 35 for TSH. All concentrations are to be recorded in ng/ml. | 39. | If historical baseline data are inadequate, consideration should be given to determination of haematological and clinical biochemistry variables before dosing commences or preferably in a set of animals not included in the experimental groups. | PATHOLOGY | Gross necropsy | 40. | All animals in the study shall be subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. The liver, kidneys, adrenals, testes, epididymides, prostate + seminal vesicles with coagulating glands as a whole, thymus, spleen, brain and heart of all animals (apart from those found moribund and/or euthanised prior to the termination of the study) should be trimmed of any adherent tissue, as appropriate, and their wet weight taken as soon as possible after dissection to avoid drying. Care must be exercised when trimming the prostate complex to avoid puncture of the fluid filled seminal vesicles. Alternatively, seminal vesicles and prostate may be trimmed and weighed after fixation. | 41. | In addition, two other tissues could be optionally weighed as soon as possible after dissection, to avoid drying: paired ovaries (wet weight) and uterus, including cervix (guidance on removal and preparation of the uterine tissues for weight measurement is provided in OECD TG 440 (18)). | 42. | The thyroid weight (optional) could be determined after fixation. Trimming should also be done very carefully and only after fixation to avoid tissue damage. Tissue damage could compromise histopathology analysis. | 43. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (see paragraph 47): all gross lesions, brain (representative regions including cerebrum, cerebellum and pons), spinal cord, eye, stomach, small and large intestines (including Peyer’s patches), liver, kidneys, adrenals, spleen, heart, thymus, thyroid, trachea and lungs (preserved by inflation with fixative and then immersion), gonads (testis and ovaries), accessory sex organs (uterus and cervix, epididymides, prostate + seminal vesicles with coagulating glands), vagina, urinary bladder, lymph nodes [besides the most proximal draining node another lymph node should be taken according to the laboratory’s experience (15)], peripheral nerve (sciatic or tibial) preferably in close proximity to the muscle, skeletal muscle and bone, with bone marrow (section or, alternatively, a fresh mounted bone marrow aspirate). It is recommended that testes be fixed by immersion in Bouin’s or modified Davidson’s fixative (16) (17). The tunica albuginea must be gently and shallowly punctured at the both poles of the organ with a needle to permit rapid penetration of the fixative. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. | 44. | The following tissues may give valuable indication for endocrine-related effects: Gonads (ovaries and testes), accessory sex organs (uterus including cervix, epididymides, seminal vesicles with coagulation glands, dorsolateral and ventral prostate), vagina, pituitary, male mammary gland, the thyroid and adrenal gland. Changes in male mammary glands have not been sufficiently documented but this parameter may be very sensitive to substances with oestrogenic action. Observation of organs/tissues that are not listed in paragraph 43 is optional (see Appendix 2). | 45. | The Guidance on histopathology (19) details extra information on dissection, fixation, sectioning and histopathology of endocrine tissues. | 46. | In the international test program some evidence was obtained that subtle endocrine effects by chemicals with a low potency for affecting sex hormone homeostasis may be identified by disturbance of the synchronisation of the oestrus cycle in different tissues and not so much by frank histopathological alterations in female sex organs. Although no definitive proof was obtained for such effects, it is recommended that evidence of possible asynchrony of the oestrus cycle should be taken into account in interpretation of the histopathology of the ovaries (follicular, thecal, and granulosa cells), uterus, cervix and vagina. If assessed, the stage of cycle as determined by vaginal smears could be included in this comparison as well. | Histopathology | 47. | Full histopathology should be carried out on the preserved organs and tissues of all animals in the control and high dose groups. These examinations should be extended to animals of all other dosage groups, if treatment-related changes are observed in the high dose group. | 48. | All gross lesions shall be examined. | 49. | When a satellite group is used, histopathology should be performed on tissues and organs identified as showing effects in the treated groups. | DATA AND REPORTING | Data | 50. | Individual data should be provided. Additionally, all data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals at the start of the test, the number of animals found dead during the test or euthanised for humane reasons and the time of any death or euthanasia, the number showing signs of toxicity, a description of the signs of toxicity observed, including time of onset, duration, and severity of any toxic effects, the number of animals showing lesions, the type of lesions, their severity and the percentage of animals displaying each type of lesion. | 51. | When possible, numerical results should be evaluated by an appropriate and generally acceptable statistical method. Comparisons of the effect along a dose range should avoid the use of multiple t-tests. The statistical methods should be selected during the design of the study. | 52. | For quality control it is proposed that historical control data are collected and that for numerical data coefficients of variation are calculated, especially for the parameters linked with endocrine disrupter detection. These data can be used for comparison purposes when actual studies are evaluated. | Test report | 53. | The test report must include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature, purity and physicochemical properties; | — | identification data. | | Vehicle (if appropriate): | — | justification for choice of vehicle, if other than water. | | Test animals: | — | species/strain used; | — | number, age and sex of animals; | — | source, housing conditions, diet, etc.; | — | individual weights of animals at the start of the test. | — | justification for species if not rat | | Test conditions: | — | rationale for dose level selection; | — | details of test chemical formulation/diet preparation, achieved concentration, stability and homogeneity of the preparation; | — | details of the administration of the test chemical; | — | conversion from diet/drinking water test chemical concentration (ppm) to the actual dose (mg/kg body weight/day), if applicable; | — | details of food and water quality. | | Optional endpoints investigated | — | list of optional endpoints investigated | | Results: | — | body weight/body weight changes; | — | food consumption, and water consumption, if applicable; | — | toxic response data by sex and dose level, including signs of toxicity; | — | nature, severity and duration of clinical observations (whether reversible or not); | — | sensory activity, grip strength and motor activity assessments; | — | haematological tests with relevant base-line values; | — | clinical biochemistry tests with relevant base-line values; | — | body weight at euthanasia and organ weight data; | — | necropsy findings; | — | a detailed description of all histopathological findings; | — | absorption data if available; | — | statistical treatment of results, where appropriate. | | Discussion of results | | Conclusions | Appendix 1 | DEFINITIONS | Androgenicity is the capability of a chemical to act like a natural androgenic hormone (e.g. testosterone) in a mammalian organism. | Antiandrogenicity is the capability of a chemical to suppress the action of a natural androgenic hormone (e.g. testosterone) in a mammalian organism. | Antioestrogenicity is the capability of a chemical to suppress the action of a natural oestrogenic hormone (e.g. oestradiol 17ß) in a mammalian organism. | Antithyroid activity is the capability of a chemical to suppress the action of a natural thyroid hormone (e.g. T3) in a mammalian organism. | Dosage is a general term comprising of dose, its frequency and the duration of dosing. | Dose is the amount of test chemical administered. The dose is expressed as weight of test chemical per unit body weight of test animal per day (e.g. mg/kg body weight/day), or as a constant dietary concentration. | Evident toxicity is a general term describing clear signs of toxicity following administration of test chemical. These should be sufficient for hazard assessment and should be such that an increase in the dose administered can be expected to result in the development of severe toxic signs and probable mortality. | NOAEL is the abbreviation for no-observed-adverse-effect level. This is the highest dose level where no adverse treatment-related findings are observed due to treatment. | Oestrogenicity is the capability of a chemical to act like a natural oestrogenic hormone (e.g. oestradiol 17ß) in a mammalian organism. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Thyroid activity is the capability of a chemical to act like a natural thyroid hormone (e.g. T3) in a mammalian organism. | Validation is a scientific process designed to characterise the operational requirements and limitations of a test method and to demonstrate its reliability and relevance for a particular purpose. | Appendix 2 | Endpoints recommended for the detection of endocrine disrupters (EDs) in this Test Method B.7 | Mandatory endpoints | Optional endpoints | Weight | — | Testes | — | Epididymides | — | Adrenals | — | Prostate + seminal vesicles with coagulating glands | — | Ovaries | — | Uterus, including cervix | — | Thyroid | Histopathology | — | Gonads: | — | Testes and | — | Ovaries | — | Accessory sex organs: | — | Epididymides, | — | Prostate + seminal vesicle with coagulating glands | — | Uterus, including cervix | — | Adrenal | — | Thyroid | — | Vagina | — | Vaginal smears | — | Male mammary glands | — | Pituitary | Hormones measurement | | — | Circulating levels of T3, T4 | — | Circulating levels of TSH | LITERATURE: | (1) | OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity. | (2) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60. | (3) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (4) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704. | (5) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (6) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. | (7) | Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. | (8) | OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11 March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. | (9) | OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. | (10) | OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. | (11) | OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html | (12) | OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. | (13) | OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. | (14) | OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. | (15) | Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407. | (16) | Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. | (17) | Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533. | (18) | OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. | (19) | OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11. | B.8. SUBACUTE INHALATION TOXICITY: 28-DAY STUDY | SUMMARY | This revised Test Method B.8 has been designed to fully characterise test chemical toxicity by the inhalation route following repeated exposure for a limited period of time (28 days), and to provide data for quantitative inhalation risk assessments. Groups of at least 5 male and 5 female rodents are exposed 6 hours per day for 28 days to a) the test chemical at three or more concentration levels, b) filtered air (negative control), and/or c) the vehicle (vehicle control). Animals are generally exposed 5 days per week but exposure for 7 days per week is also allowed. Males and females are always tested, but they may be exposed at different concentration levels if it is known that one sex is more susceptible to a given test chemical. This method allows the study director the flexibility to include satellite (reversibility) groups, bronchoalveolar lavage (BAL), neurologic tests, and additional clinical pathology and histopathological evaluations in order to better characterise the toxicity of a test chemical. | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline 412 (2009). The original subacute inhalation Test Guideline 412 (TG 412) was adopted in 1981 (1). This Test Method B.8 (as equivalent to the revised TG 412) has been updated to reflect the state of science and to meet current and future regulatory needs. | 2. | This method enables the characterisation of adverse effects following repeated daily inhalation exposure to a test chemical for 28 days. The data derived from 28-day sub-acute inhalation toxicity studies can be used for quantitative risk assessments [if not followed by a 90-day subchronic inhalation toxicity study (Chapter B.29 of this Annex)]. The data can also provide information on the selection of concentrations for longer term studies such as the 90-day subchronic inhalation toxicity study. This test method is not specifically intended for the testing of nanomaterials. Definitions used in the context of this Test Method are provided at the end of this chapter and in the Guidance Document 39 (2). | INITIAL CONSIDERATIONS | 3. | All available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study in order to enhance the quality of the study and minimize animal usage. Information that will assist in the selection of appropriate test concentrations might include the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally related chemicals; and data derived from acute inhalation toxicity testing. If neurotoxicity is expected or is observed in the course of the study, the study director may choose to include appropriate evaluations such as a functional observational battery (FOB) and measurement of motor activity. Although the timing of exposures relative to specific examinations may be critical, the performance of these additional activities should not interfere with the basic study design. | 4. | Dilutions of corrosive or irritating test chemicals may be tested at concentrations that will yield the desired degree of toxicity [refer to GD 39 (2)]. When exposing animals to these materials, the targeted concentrations should be low enough to not cause marked pain and distress, yet sufficient to extend the concentration-response curve to levels that reach the regulatory and scientific objective of the test. These concentrations should be selected on a case-by-case basis, preferably based upon an adequately designed range-finding study that provides information regarding the critical endpoint, any irritation threshold, and the time of onset (see paragraphs 11-13). The justification for concentration selection should be provided. | 5. | Moribund animals or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress should be humanely killed. Moribund animals are considered in the same way as animals that die on test. Criteria for making the decision to kill moribund or severely suffering animals, and guidance on the recognition of predictable or impending death, are the subject of an OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of Animal Species | 6. | Healthy young adult rodents of commonly used laboratory strains should be employed. The preferred species is the rat. Justification should be provided if other species are used. | Preparation of Animals | 7. | Females should be nulliparous and non-pregnant. On the day of randomisation, animals should be young adults 7 to 9 weeks of age. Body weights should be within ± 20 % of the mean weight for each sex. The animals are randomly selected, marked for individual identification, and kept in their cages for at least 5 days prior to the start of the test to allow for acclimatisation to laboratory conditions. | Animal Husbandry | 8. | Animals should be individually identified, if possible with subcutaneous transponders, to facilitate observations and avoid confusion. The temperature of the experimental animal maintenance room should be 22 ± 3 °C. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, though this may not be possible when using water as a vehicle. Before and after exposures, animals generally should be caged in groups by sex and concentration, but the number of animals per cage should not interfere with clear observation of each animal and should minimise losses due to cannibalism and fighting. When animals are to be exposed nose-only, it may be necessary for them to be acclimated to the restraining tubes. The restraining tubes should not impose undue physical, thermal, or immobilisation stress on the animals. Restraint may affect physiological endpoints such as body temperature (hyperthermia) and/or respiratory minute volume. If generic data are available to show that no such changes occur to any appreciable extent, then pre-adaptation to the restraining tubes is not necessary. Animals exposed whole-body to an aerosol should be housed individually during exposure to prevent them from filtering the test aerosol through the fur of their cage mates. Conventional and certified laboratory diets may be used, except during exposure, accompanied with an unlimited supply of municipal drinking water. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light/12 hours dark. | Inhalation Chambers | 9. | The nature of the test chemical and the object of the test should be considered when selecting an inhalation chamber. The preferred mode of exposure is nose-only (which term includes head-only, nose-only, or snout-only). Nose-only exposure is generally preferred for studies of liquid or solid aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. Special objectives of the study may be better achieved by using a whole-body mode of exposure, but this should be justified in the study report. To ensure atmosphere stability when using a whole-body chamber, the total “volume” of the test animals should not exceed 5 % of the chamber volume. Principles of the nose-only and whole-body exposure techniques and their particular advantages and disadvantages are addressed in GD 39 (2). | TOXICITY STUDIES | Limit Concentrations | 10. | Unlike with acute studies, there are no defined limit concentrations in 28-day sub-acute inhalation toxicity studies. The maximum concentration tested should consider: (1) the maximum attainable concentration, (2) the “worst case” human exposure level, (3) the need to maintain an adequate oxygen supply, and/or (4) animal welfare considerations. In the absence of data-based limits, the acute limits of the Regulation (EC) No 1272/2008 (13) may be used (i.e. up to a maximum concentration of 5 mg/l for aerosols, 20 mg/l for vapours and 20 000 ppm for gases); refer to GD 39 (2). Justification should be provided if it is necessary to exceed these limits when testing gases or highly volatile test chemicals (e.g. refrigerants). The limit concentration should elicit unequivocal toxicity without causing undue stress to the animals or affecting their longevity (3). | Range-Finding Study | 11. | Before commencing with the main study, it may be necessary to perform a range-finding study. A range-finding study is more comprehensive than a sighting study because it is not limited to concentration selection. Knowledge learned from a range-finding study can lead to a successful main study. A range-finding study may, for example, provide technical information regarding analytical methods, particle sizing, discovery of toxic mechanisms, clinical pathology and histopathological data, and estimations of what may be NOAEL and MTC concentrations in a main study. The study director may choose to use the range-finding study to identify the threshold of respiratory tract irritation (e.g. with histopathology of the respiratory tract, pulmonary function testing, or bronchoalveolar lavage), the upper concentration which is tolerated without undue stress to the animals, and the parameters that will best characterise a test chemical’s toxicity. | 12. | A range-finding study may consist of one or more concentration levels. No more than three males and three females should be exposed at each concentration level. A range-finding study should last a minimum of 5 days and generally no more than 14 days. The rationale for the selection of concentrations for the main study should be provided in the study report. The objective of the main study is to demonstrate a concentration-response relationship based on what is anticipated to be the most sensitive endpoint. The low concentration should ideally be a no-observed-adverse effect concentration while the high concentration should elicit unequivocal toxicity without causing undue stress to the animals or affecting their longevity (3). | 13. | When selecting concentration levels for the range-finding study, all available information should be considered including structure-activity relationships and data for similar chemicals (see paragraph 3). A range-finding study may verify/refute what are considered to be the most sensitive mechanistically based endpoints, e.g. cholinesterase inhibition by organophosphates, methaemoglobin formation by erythrocytotoxic agents, thyroidal hormones (T3, T4) for thyrotoxicants, protein, LDH, or neutrophils in brochoalveolar lavage for innocuous poorly soluble particles or pulmonary irritant aerosols. | Main Study | 14. | The main sub-acute toxicity study generally consists of three concentration levels, and also concurrent negative (air) and/or vehicle controls as needed (see paragraph 17). All available data should be utilised to aid selection of appropriate exposure levels, including the results of systemic toxicity studies, metabolism and kinetics (particular emphasis should be given to avoiding high concentration levels which saturate kinetic processes). Each test group contains at least 10 rodents (5 male and 5 female) that are exposed to the test chemical for 6 hours per day on a 5 day per week basis for a period of 4 weeks (total study duration of 28 days). Animals may also be exposed 7 days per week (e.g. when testing inhaled pharmaceuticals). If one sex is known to be more susceptible to a given test chemical, the sexes may be exposed at different concentration levels in order to optimise the concentration-response as described in paragraph 15. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration less than 6 hours/day, or when it is necessary to conduct a long duration (e.g. 22 hours/day) whole-body exposure study [refer to GD 39 (2)]. Feed should be withheld during the exposure period unless exposure exceeds 6 hours. Water may be provided throughout a whole-body exposure. | 15. | The target concentrations selected should identify the target organ(s) and demonstrate a clear concentration-response: | — | The high concentration level should result in toxic effects but not cause lingering signs or lethality which would prevent a meaningful evaluation. | — | The intermediate concentration level(s) should be spaced to produce a gradation of toxic effects between that of the low and high concentration. | — | The low concentration level should produce little or no evidence of toxicity. | Satellite (Reversibility) Study | 16. | A satellite (reversibility) study may be used to observe reversibility, persistence, or delayed occurrence of toxicity for a post-treatment period of an appropriate length, but no less than 14 days. Satellite (reversibility) groups consist of five males and five females exposed contemporaneously with the experimental animals in the main study. Satellite (reversibility) study groups should be exposed to the test chemical at the highest concentration level and there should be concurrent air and/or vehicle controls as needed (see paragraph 17). | Control Animals | 17. | Concurrent negative (air) control animals should be handled in a manner identical to the test group animals except that they are exposed to filtered air rather than test chemical. When water or another substance is used to assist in generating the test atmosphere, a vehicle control group, instead of a negative (air) control group, should be included in the study. Water should be used as the vehicle whenever possible. When water is used as the vehicle, the control animals should be exposed to air with the same relative humidity as the exposed groups. The selection of a suitable vehicle should be based on an appropriately conducted pre-study or historical data. If a vehicle’s toxicity is not well known, the study director may choose to use both a negative (air) control and a vehicle control, but this is strongly discouraged. If historical data reveal that a vehicle is non-toxic, then there is no need for a negative (air) control group and only a vehicle control should be used. If a pre-study of a test chemical formulated in a vehicle reveals no toxicity, it follows that the vehicle is non-toxic at the concentration tested and this vehicle control should be used. | EXPOSURE CONDITIONS | Administration of Concentrations | 18. | Animals are exposed to the test chemical as a gas, vapour, aerosol, or a mixture thereof. The physical state to be tested depends on the physico-chemical properties of the test chemical, the selected concentration, and/or the physical form most likely present during the handling and use of the test chemical. Hygroscopic and chemically reactive test chemicals should be tested under dry air conditions. Care should be taken to avoid generating explosive concentrations. Particulate material may be subjected to mechanical processes to decrease the particle size. Further guidance is provided in GD 39 (2). | Particle-Size Distribution | 19. | Particle sizing should be performed for all aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. To allow for exposure of all relevant regions of the respiratory tract, aerosols with mass median aerodynamic diameters (MMAD) ranging from 1 to 3 μm with a geometric standard deviation (σg) in the range of 1,5 to 3,0 are recommended (4). Although a reasonable effort should be made to meet this standard, expert judgement should be provided if it cannot be achieved. For example, metal fume particles may be smaller than this standard, and charged particles and fibres may exceed it. | Test chemical Preparation in a Vehicle | 20. | Ideally, the test chemical should be tested without a vehicle. If it is necessary to use a vehicle to generate an appropriate test chemical concentration and particle size, water should be given preference. Whenever a test chemical is dissolved in a vehicle, its stability should be demonstrated. | MONITORING OF EXPOSURE CONDITIONS | Chamber Airflow | 21. | The flow of air through the exposure chamber should be carefully controlled, continuously monitored, and recorded at least hourly during each exposure. The real-time monitoring of the test atmosphere concentration (or temporal stability) is an integral measurement of all dynamic parameters and provides an indirect means to control all relevant dynamic inhalation parameters. If the concentration is monitored real-time, the frequency of measurement of air flows may be reduced to one single measurement per exposure per day. Special consideration should be given to avoiding re-breathing in nose-only chambers. Oxygen concentration should be at least 19 % and carbon dioxide concentration should not exceed 1 %. If there is reason to believe that this standard cannot be met, oxygen and carbon dioxide concentrations should be measured. If measurements on the first day of exposure show that these gases are at proper levels, no further measurements should be necessary. | Chamber Temperature and Relative Humidity | 22. | Chamber temperature should be maintained at 22 ± 3 °C. Relative humidity in the animals’ breathing zone, for both nose-only and whole-body exposures, should be monitored continuously and recorded hourly during each exposure where possible. The relative humidity should preferably be maintained in the range of 30 to 70 %, but this may either be unattainable (e.g. when testing water based mixtures) or not measurable due to test chemical interference with the Test Method. | Test chemical: Nominal Concentration | 23. | Whenever feasible, the nominal exposure chamber concentration should be calculated and recorded. The nominal concentration is the mass of generated test chemical divided by the total volume of air passed through the inhalation chamber system. The nominal concentration is not used to characterise the animals’ exposure, but a comparison of the nominal concentration and the actual concentration gives an indication of the generation efficiency of the test system, and thus may be used to discover generation problems. | Test chemical: Actual Concentration | 24. | The actual concentration is the test chemical concentration as sampled at the animals’ breathing zone in an inhalation chamber. Actual concentrations can be obtained either by specific methods (e.g. direct sampling, adsorptive or chemical reactive methods, and subsequent analytical characterisation) or by non-specific methods such as gravimetric filter analysis. The use of gravimetric analysis is acceptable only for single component powder aerosols or aerosols of low volatility liquids and should be supported by appropriate pre-study test chemical-specific characterisations. Multi-component powder aerosol concentration may also be determined by gravimetric analysis. However, this requires analytical data which demonstrate that the composition of airborne material is similar to the starting material. If this information is not available, a reanalysis of the test chemical (ideally in its airborne state) at regular intervals during the course of the study may be necessary. For aerosolised agents that may evaporate or sublimate, it should be shown that all phases were collected by the method chosen. | 25. | One lot of the test chemical should be used throughout the duration of the study, if possible, and the test sample should be stored under conditions that maintain its purity, homogeneity, and stability. Prior to the start of the study, there should be a characterisation of the test chemical including its purity and, if technically feasible, the identity, and quantities of identified contaminants and impurities. This can be demonstrated but is not limited by the following data: retention time and relative peak area, molecular weight from mass spectroscopy or gas chromatography analyses, or other estimates. Although the test sample’s identity is not the responsibility of the test laboratory, it may be prudent for the test laboratory to confirm the sponsor’s characterisation at least in a limited way (e.g. colour, physical nature, etc.). | 26. | The exposure atmosphere should be held as constant as practicable. A real-time monitoring device, such as an aerosol photometer for aerosols or a total hydrocarbon analyser for vapours may be used to demonstrate the stability of the exposure conditions. Actual chamber concentration should be measured at least 3 times during each exposure day for each exposure level. If not feasible due to limited air flow rates or low concentrations, one sample per exposure period is acceptable. Ideally, this sample should then be collected over the entire exposure period. Individual chamber concentration samples should deviate from the mean chamber concentration by no more than ± 10 % for gases and vapours, and by no more than ± 20 % for liquid or solid aerosols. Time to attain chamber equilibration (t95) should be calculated and reported. The duration of an exposure spans the time that the test chemical is generated. This takes into account the times required to attain chamber equilibration (t95) and decay. Guidance for estimating t95 can be found in GD 39 (2). | 27. | For very complex mixtures consisting of gases/vapours and aerosols (e.g. combustion atmospheres and test chemicals propelled from purpose-driven end-use products/devices), each phase may behave differently in an inhalation chamber. Therefore, at least one indicator substance (analyte), normally the principal active substance in the mixture, of each phase (gas/vapour and aerosol) should be selected. When the test chemical is a mixture, the analytical concentration should be reported for the total mixture, and not just for the active ingredient or the indicator substance (analyte). Additional information regarding actual concentrations can be found in GD 39 (2). | Test chemical: Particle Size Distribution | 28. | The particle size distribution of aerosols should be determined at least weekly for each concentration level by using a cascade impactor or an alternative instrument, such as an aerodynamic particle sizer (APS). If equivalence of the results obtained by a cascade impactor and the alternative instrument can be shown, then the alternative instrument may be used throughout the study. | 29. | A second device, such as a gravimetric filter or an impinger/gas bubbler, should be used in parallel to the primary instrument to confirm the collection efficiency of the primary instrument. The mass concentration obtained by particle size analysis should be within reasonable limits of the mass concentration obtained by filter analysis [see GD 39 (2)]. If equivalence can be demonstrated at all concentrations tested in the early phase of the study, then further confirmatory measurements may be omitted. For the sake of animal welfare, measures should be taken to minimise inconclusive data which may lead to a need to repeat a study. | 30. | Particle sizing should be performed for vapours if there is any possibility that vapour condensation may result in the formation of an aerosol, or if particles are detected in a vapour atmosphere with potential for mixed phases. | OBSERVATIONS | 31. | The animals should be clinically observed before, during and after the exposure period. More frequent observations may be indicated depending on the response of the animals during exposure. When animal observation is hindered by the use of animal restraint tubes, poorly lit whole body chambers, or opaque atmospheres, animals should be carefully observed after exposure. Observations before the next day’s exposure can assess any reversibility or exacerbation of toxic effects. | 32. | All observations are recorded with individual records being maintained for each animal. When animals are killed for humane reasons or found dead, the time of death should be recorded as precisely as possible. | 33. | Cage-side observations should include changes in the skin and fur, eyes, and mucous membranes; changes in the respiratory and circulatory systems, changes in the nervous system, and changes in somatomotor activity and behaviour patterns. Attention should be directed to observations of tremors, convulsions, salivation, diarrhoea, lethargy, sleep, and coma. The measurement of rectal temperatures may provide supportive evidence of reflex bradypnea or hypo/hyperthermia related to treatment or confinement. Additional assessments may be included in the study protocol such as kinetics, biomonitoring, lung function, retention of poorly soluble materials that accumulate in lung tissue, and behavioural changes. | BODY WEIGHTS | 34. | Individual animal weights should be recorded shortly before the first exposure (day 0), twice weekly thereafter (for example: on Fridays and Mondays to demonstrate recovery over an exposure-free weekend or at a time interval to allow assessment of systemic toxicity), and at the time of death or euthanasia. If there are no effects in the first 2 weeks, body weights may be measured weekly for the remainder of the study. Satellite (reversibility) animals (if used) should continue to be weighed weekly throughout the recovery period. At study termination, all animals should be weighed shortly before sacrifice to allow for an unbiased calculated of organ to body weight ratios. | FOOD AND WATER CONSUMPTION | 35. | Food consumption should be measured weekly. Water consumption may also be measured. | CLINICAL PATHOLOGY | 36. | Clinical pathology assessments should be made for all animals, including control and satellite (reversibility) animals, when they are sacrificed. The time interval between the end of exposure and blood collection should be recorded, particularly when the reconstitution of the addressed endpoint is rapid. Sampling following the end of exposure is indicated for those parameters with a short plasma half-time (e.g. COHb, CHE, and MetHb). | 37. | Table 1 lists the clinical pathology parameters that are generally required for all toxicology studies. Urinalysis is not required on a routine basis, but may be performed when deemed useful based on expected or observed toxicity. The study director may choose to assess additional parameters in order to better characterise a test chemical’s toxicity (e.g. cholinesterase, lipids, hormones, acid/base balance, methaemoglobin or Heinz bodies, creatine kinase, myeloid/erythroid ratio, troponins, arterial blood gases, lactate dehydrogenase, sorbitol dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, and gamma glutamyl transpeptidase). | Table 1 | Standard Clinical Pathology Parameters | Haematology | Erythrocyte count | Haematocrit | Haemoglobin concentration | Mean corpuscular haemoglobin | Mean corpuscular volume | Mean corpuscular haemoglobin concentration | Reticulocytes | Total leukocyte count | Differential leukocyte count | Platelet count | Clotting potential (select one): | — | Prothrombin time | — | Clotting time | — | Partial thromboplastin time | Clinical Chemistry | Glucose (*1) | Total cholesterol | Triglycerides | Blood urea nitrogen | Total bilirubin | Creatinine | Total protein | Albumin | Globulin | Alanine aminotransferase | Aspartate aminotransferase | Alkaline phosphatase | Potassium | Sodium | Calcium | Phosphorus | Chloride | Urinalysis (optional) | Appearance (colour and turbidity) | Volume | Specific gravity or osmolality | pH | Total protein | Glucose | Blood/blood cells | 38. | When there is evidence that the lower respiratory tract (i.e., the alveoli) is the primary site of deposition and retention, then bronchoalveolar lavage (BAL) may be the technique of choice to quantitatively analyse hypothesis-based dose-effect parameters focusing on alveolitis, pulmonary inflammation, and phospholipidosis. This allows for dose-response and time-course changes of alveolar injury to be suitably probed. The BAL fluid may be analysed for total and differential leukocyte counts, total protein, and lactate dehydrogenase. Other parameters that may be considered are those indicative of lysosomal injury, phospholipidosis, fibrosis, and irritant or allergic inflammation which may include the determination of pro-inflammatory cytokines/chemokines. BAL measurements generally complement the results from histopathology examinations but cannot replace them. Guidance on how to perform lung lavage can be found in GD 39 (2). | GROSS PATHOLOGY AND ORGAN WEIGHTS | 39. | All test animals, including those which die during the test or are removed from the study for animal welfare reasons, should be subjected to complete exsanguination (if feasible) and gross necropsy. The time between the end of each animal’s last exposure and their sacrifice should be recorded. If a necropsy cannot be performed immediately after a dead animal is discovered, the animal should be refrigerated (not frozen) at a temperature low enough to minimise autolysis. Necropsies should be performed as soon as possible, normally within a day or two. All gross pathological changes should be recorded for each animal with particular attention to any changes in the respiratory tract. | 40. | Table 2 lists the organs and tissues that should be preserved in a suitable medium during gross necropsy for histopathological examination. The preservation of the [bracketed] organs and tissues and any other organs and tissues is at the discretion of the study director. The bolded organs should be trimmed and weighed wet as soon as possible after dissection to avoid drying. The thyroid and epididymides should only be weighed if needed because trimming artefacts may hinder histopathological evaluation. Tissues and organs should be fixed in 10 % buffered formalin or another suitable fixative as soon as necropsy is performed, and no less than 24-48 hours prior to trimming depending on the fixative to be used. | Table 2 | Organs and Tissues Preserved During Gross Necropsy | Adrenals | Bone marrow (and/or fresh aspirate) | Brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | [Eyes (retina, optic nerve) and eyelids] | Heart | Kidneys | Larynx (3 levels, 1 level to include the base of the epiglottis) | Liver | Lung (all lobes at one level, including main bronchi) | Lymph nodes from the hilar region of the lung, especially for poorly soluble particulate test chemicals, For more in depth examinations and/or studies with immunological focus, additional lymph nodes may be considered, e.g. those from the mediastinal, cervical/submandibular and/or auricular regions. | Nasopharyngeal tissues (at least 4 levels; 1 level to include the nasopharyngeal duct and the Nasal Associated Lymphoid Tissue(NALT) | Oesophagus | [Olfactory bulb] | Ovaries | Seminal vesicles | Spinal cord (cervical, mid-thoracic, and lumbar) | Spleen | Stomach | Testes | Thymus | Thyroid | Trachea (at least 2 levels including 1 longitudinal section through the carina and 1 transverse section) | [Urinary bladder] | Uterus | All gross lesions | 41. | The lungs should be removed intact, weighed, and instilled with a suitable fixative at a pressure of 20-30 cm of water to ensure that lung structure is maintained (5). Sections should be collected for all lobes at one level, including main bronchi, but if lung lavage is performed, the unlavaged lobe should be sectioned at three levels (not serial sections). | 42. | At least 4 levels of the nasopharyngeal tissues should be examined, one of which should include the nasopharyngeal duct, (5, 6, 7, 8, 9) to allow adequate examination of the squamous, transitional (non-ciliated respiratory), respiratory (ciliated respiratory) and olfactory epithelium, and the draining lymphatic tissue (NALT; 10, 11). Three levels of the larynx should be examined, and one of these levels should include the base of the epiglottis (12). At least two levels of the trachea should be examined including one longitudinal section through the carina of the bifurcation of the extrapulmonary bronchi and one transverse section. | HISTOPATHOLOGY | 43. | A histopathological evaluation of all the organs and tissues listed in Table 2 should be performed for the control and high concentration groups, and for all animals which die or are sacrificed during the study. Particular attention should be paid to the respiratory tract, target organs, and gross lesions. The organs and tissues that have lesions in the high concentration group should be examined in all groups. The study director may choose to perform histopathological evaluations for additional groups to demonstrate a clear concentration response. When a satellite (reversibility) group is used, histopathological evaluation should be performed for all tissues and organs identified as showing effects in the treated groups. If there are excessive early deaths or other problems in the high exposure group that compromise the significance of the data, the next lower concentration should be examined histopathologically. An attempt should be made to correlate gross observations with microscopic findings. | DATA AND REPORTING | Data | 44. | Individual animal data on body weights, food consumption, clinical pathology, gross pathology, organ weights, and histopathology should be provided. Clinical observation data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals used, the number of animals displaying specific signs of toxicity, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons, time of death of individual animals, a description and time course of toxic effects and reversibility, and necropsy findings. All results, quantitative and incidental, should be evaluated by an appropriate statistical method. Any generally accepted statistical method may be used and the statistical methods should be selected during the design of the study. | Test Report | 45. | The test report should include the following information, as appropriate: | | Test animals and husbandry | — | Description of caging conditions, including: number (or change in number) of animals per cage, bedding material, ambient temperature and relative humidity, photoperiod, and identification of diet. | — | Species/strain used and justification for using a species other than the rat. Source and historical data may be provided, if they are from animals exposed under similar exposure, housing, and fasting conditions. | — | Number, age, and sex of animals. | — | Method of randomisation. | — | Description of any pre-test conditioning including diet, quarantine, and treatment for disease. | | Test chemical | — | Physical nature, purity, and, where relevant, physico-chemical properties (including isomerisation). | — | Identification data and Chemical Abstract Services (CAS) Registry Number, if known. | | Vehicle | — | Justification for use of vehicle and justification for choice of vehicle (if other than water). | — | Historical or concurrent data demonstrating that the vehicle does not interfere with the outcome of the study. | | Inhalation chamber | — | Detailed description of the inhalation chamber including volume and a diagram. | — | Source and description of equipment used for the exposure of animals as well as generation of the atmosphere. | — | Equipment for measuring temperature, humidity, particle-size, and actual concentration. | — | Source of air and system used for conditioning. | — | Methods used for calibration of equipment to ensure a homogeneous test atmosphere. | — | Pressure difference (positive or negative). | — | Exposure ports per chamber (nose-only); location of animals in the chamber (whole-body). | — | Stability of the test atmosphere. | — | Location of temperature and humidity sensors and sampling of test atmosphere in the chamber. | — | Treatment of air supplied/extracted. | — | Air flow rates, air flow rate/exposure port (nose-only), or animal load/chamber (whole-body). | — | Time to inhalation chamber equilibrium (t95). | — | Number of volume changes per hour. | — | Metering devices (if applicable). | | Exposure data | — | Rationale for target concentration selection in the main study. | — | Nominal concentrations (total mass of test chemical generated into the inhalation chamber divided by the volume of air passed through the chamber). | — | Actual test chemical concentrations collected from the animals’ breathing zone; for mixtures that produce heterogeneous physical forms (gases, vapours, aerosols), each may be analysed separately. | — | All air concentrations should be reported in units of mass (mg/l mg/m3, etc.) rather than in units of volume (ppm, ppb, etc.). | — | Particle size distribution, mass median aerodynamic diameter (MMAD), and geometric standard deviation (σg), including their methods of calculation. Individual particle size analyses should be reported. | | Test conditions | — | Details of test chemical preparation, including details of any procedures used to reduce the particle size of solids or to prepare solutions of the test chemical. | — | A description (preferably including a diagram) of the equipment used to generate the test atmosphere and to expose the animals to the test atmosphere. | — | Details of the equipment used to monitor chamber temperature, humidity, and chamber airflow (i.e. development of a calibration curve). | — | Details of the equipment used to collect samples for determination of chamber concentration and particle size distribution. | — | Details of the chemical analytical method used and method validation (including efficiency of recovery of test chemical from the sampling medium). | — | Method of randomisation in assigning animals to test and control groups. | — | Details of food and water quality (including diet type/source, water source). | — | The rationale for the selection of test concentrations. | | Results | — | Tabulation of chamber temperature, humidity, and airflow. | — | Tabulation of chamber nominal and actual concentration data. | — | Tabulation of particle size data including analytical sample collection data, particle size distribution, and calculations of the MMAD and σg. | — | Tabulation of response data and concentration level for each animal (i.e. animals showing signs of toxicity including mortality, nature, severity, time of onset, and duration of effects). | — | Tabulation of individual animal weights. | — | Tabulation of food consumption | — | Tabulation of clinical pathology data | — | Necropsy findings and histopathological findings for each animal, if available. | — | Tabulation of any other parameters measured | | Discussion and interpretation of results | — | Particular emphasis should be made to the description of methods used to meet the criteria of this Test Method, e.g. the limit concentration or the particle size. | — | The respirability of particles in light of the overall findings should be addressed, especially if the particle-size criteria could not be met. | — | The consistency of methods used to determine nominal and actual concentrations, and the relation of actual concentration to nominal concentration should be included in the overall assessment of the study. | — | The likely cause of death and predominant mode of action (systemic versus local) should be addressed. | — | An explanation should be provided if there was a need to humanely sacrifice animals in pain or showing signs of severe and enduring distress, based on the criteria in the OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3). | — | The target organ(s) should be identified. | — | The NOAEL and LOAEL should be determined. | LITERATURE: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (4) | Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258. | (6) | Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. | (7) | Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238. | (8) | Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. | (9) | Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. | (10) | Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. | (11) | Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. | (12) | Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428. | (13) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006 (OJ L 353, 31.12.2008, p. 1). | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | ’ | 4) | Los capítulos B.7 y B.8 se sustituyen por el texto siguiente: | «B.7. TOXICIDAD ORAL POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (28 DÍAS) EN ROEDORES | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 407 de la OCDE (2008). Las directrices de ensayo 407 originales se adoptaron en 1981. En 1995 se adoptó una versión revisada con objeto de obtener nuevos datos de los animales empleados en el estudio, en particular en materia de neurotoxicidad e inmunotoxicidad. | 2. | En 1998, la OCDE promovió una actuación de alta prioridad orientada a revisar las directrices de ensayo existentes y desarrollar otras nuevas para la selección y evaluación de los alteradores endocrinos potenciales (8). Una faceta de esta actuación consistió en actualizar las directrices de la OCDE sobre "los estudios de toxicidad oral por administración continuada (28 días) en roedores" (TG 407), introduciendo parámetros adecuados para detectar la actividad endocrina de las sustancias problema. El procedimiento se sometió a un extenso programa internacional para evaluar la pertinencia y la practicabilidad de los parámetros añadidos, la funcionalidad de estos parámetros en relación con productos químicos dotados de actividad (anti)estrogénica, (anti)androgénica y (anti)tiroidea, la reproducibilidad intra- e interlaboratorios, y la interferencia entre los nuevos parámetros y los contemplados en las TG 407 anteriores. La ingente cantidad de datos así obtenidos se ha recopilado y evaluado minuciosamente en un exhaustivo informe de la OCDE (9). El presente método de ensayo B.7 actualizado (equivalente a las directrices TG 407) es el fruto de la experiencia y de los resultados derivados del programa de investigación internacional. Este método de ensayo permite poner en relación determinados efectos de mecanismo endocrino con otros efectos toxicológicos. | CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES | 3. | Al determinar y evaluar las características tóxicas de una sustancia química, el estudio de la toxicidad oral por administración continuada puede estar indicado cuando los ensayos de toxicidad aguda hayan proporcionado información relativa a la toxicidad. El presente método de ensayo se propone investigar los efectos de toxicidad sobre una gran variedad de órganos o sistemas diana. Proporciona información acerca de los posibles riesgos para la salud derivados de la exposición continuada durante un período relativamente limitado, entre ellos los efectos sobre los sistemas nervioso, inmunitario y endocrino. En relación con estos criterios de valoración específicos, deberá identificar sustancias químicas con potencial neurotóxico que puedan justificar investigaciones futuras, o sustancias capaces de interferir en la fisiología de la glándula tiroides. También puede aportar datos sobre las sustancias químicas que afectan a los órganos reproductores masculinos o femeninos en los animales adultos jóvenes, o indicaciones sobre los efectos inmunológicos. | 4. | Los resultados de este método de ensayo B.7 se aplicarán a la identificación del peligro y a la evaluación del riesgo. Los resultados obtenidos por medio de parámetros endocrinos se valorarán en el "Marco teórico para el estudio y la evaluación de los alteradores endocrinos" (Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) de la OCDE (11). El método describe el estudio básico de toxicidad por administración continuada que puede aplicarse en el caso de sustancias para las que no está justificado un estudio de 90 días (por ejemplo, cuando el volumen de producción no supera ciertos límites), o bien como ensayo preliminar de un estudio de toxicidad a largo plazo. La duración de la exposición será de 28 días. | 5. | El programa internacional de validación de los parámetros adecuados para detectar la actividad endocrina potencial de una sustancia química demostró que la calidad de los datos obtenidos mediante este método de ensayo B.7 depende en gran medida de la experiencia del laboratorio de ensayo. Esto se refiere específicamente a la determinación histopatológica de los cambios cíclicos que se producen en los órganos reproductores femeninos, así como de la determinación del peso de órganos con dependencia hormonal que son de pequeño tamaño y difícil disección. Se han puesto a punto unas directrices de histopatología (19), a las que se puede acceder a través de la página web pública de la OCDE, sobre líneas directrices. Con ella se pretende ayudar a los anatomopatólogos en sus exploraciones y aumentar la sensibilidad del ensayo. Diversos parámetros han resultado ser indicadores de la toxicidad de mediación endocrina y se han incorporado al método de ensayo. Aquellos parámetros que, en el programa de validación, dieron lugar a datos insuficientes o poco significativos sobre su eficacia para ayudar a la detección de los alteradores endocrinos se proponen como criterios de valoración opcionales (véase el apéndice 2). | 6. | Atendiendo a los datos generados en el proceso de validación, conviene destacar que la sensibilidad del presente ensayo no es suficiente para identificar todas las sustancias con modo de acción (anti)androgénico o (anti)estrogénico (9). Este método de ensayo no se practica en la fase de la vida más sensible a la alteración endocrina. No obstante, en el proceso de validación el método de ensayo se mostró capaz de identificar sustancias que afectan débil o intensamente a la función tiroidea, así como sustancias con actividad endocrina intensa o moderada que actúan por medio de receptores estrogénicos o androgénicos, pero en la mayoría de los casos no consiguió identificar sustancias con actividad endocrina que influyen débilmente en los receptores estrogénicos o androgénicos. Por lo tanto, no podemos definirlo como un ensayo de cribado de la actividad endocrina. | 7. | Por consiguiente, el hecho de no detectar efectos relacionados con estos modos de acción no se puede interpretar como prueba de la ausencia de efectos sobre el sistema endocrino. Por lo que se refiere a los efectos de mecanismo endocrino, la caracterización de la sustancia no debe basarse exclusivamente en los resultados de este método de ensayo, sino que se sopesarán de las pruebas en relación con todos los datos existentes acerca de la sustancia química para caracterizar la actividad endocrina potencial. Por este motivo, toda decisión normativa acerca de la (o la caracterización de las sustancias con) actividad endocrina ha de tener un enfoque amplio, y no basarse solamente en los resultados de la aplicación del presente método de ensayo. | 8. | Se entiende que todos los procedimientos relacionados con los animales serán conformes a las normas locales de bienestar animal; las descripciones de cuidado y tratamiento que se facilitan a continuación constituyen requisitos de ejecución mínimos sobre los que prevalecerá la normativa local allí donde sea más estricta. La OCDE facilita también directrices sobre el tratamiento compasivo de los animales (14). | 9. | En el apéndice 1 se recogen las definiciones empleadas. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 10. | La sustancia problema se administra diariamente por vía oral en dosis graduadas a distintos lotes de animales de experimentación, a razón de una misma dosis por lote durante un período de 28 días. A lo largo del período de administración, se observa a los animales todos los días atentamente con el fin de descubrir la posible aparición de signos de toxicidad. Se practicará la autopsia de los animales que mueran o reciban la eutanasia durante el estudio, y cuando este concluya se procederá a la eutanasia y autopsia de los animales supervivientes. Un estudio de 28 días proporciona información sobre los efectos de la exposición oral continuada y permite determinar la necesidad de realizar nuevos estudios a largo plazo. También puede aportar datos para seleccionar las concentraciones que se aplicarán en los estudios más prolongados. Los datos derivados de este método de ensayo deben permitir una caracterización toxicológica de la sustancia problema que oriente sobre la relación dosis-respuesta y permita determinar la máxima concentración sin efectos adversos observados (NOAEL, No Observed Adverse Effect Level). | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Selección de la especie animal | 11. | La especie de preferencia entre los roedores es la rata, aunque pueden utilizarse otras especies de roedores. Si los parámetros especificados en el presente método de ensayo B.7 se investigan en otra especie de roedor, habrá que justificarlo minuciosamente. Si bien es biológicamente posible que otras especies respondan a los agentes tóxicos de manera afín a la rata, el uso de especies de menor tamaño conlleva una variabilidad mayor, debido a las dificultades técnicas que plantea la disección de órganos más pequeños. En el programa internacional de validación de la detección de alteradores endocrinos, la única especie utilizada fue la rata. Deben usarse animales adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. La administración ha de empezar lo antes posible tras el destete y, en cualquier caso, antes de que los animales tengan nueve semanas de edad. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo. Cuando se realice un estudio de toxicidad oral por administración continuada como fase previa de un estudio de toxicidad a largo plazo, es preferible que se utilicen en ambos estudios animales procedentes de la misma cepa y del mismo origen. | Alojamiento y alimentación de los animales | 12. | Todos los procedimientos serán conformes a las normas habituales del cuidado de los animales de laboratorio. La sala de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el ideal es el 50-60 %. La iluminación debe ser artificial, con un fotoperíodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. Si la sustancia problema se administra con los alimentos, es preciso obtener una mezcla adecuada, lo cual puede influir en la elección de la dieta. Los animales se alojarán en pequeños grupos del mismo sexo; podrán alojarse individualmente si está científicamente justificado. En caso de que se utilicen jaulas colectivas, no habrá más de 5 animales en cada jaula. | 13. | Se analizará regularmente la comida para detectar posibles contaminantes. Se conservará una muestra de la dieta hasta el momento de concluir el informe. | Preparación de los animales | 14. | Se reparten al azar animales adultos jóvenes y sanos entre los lotes tratados y los lotes de control. Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Se identifica a los animales de forma unívoca y se los mantiene en las jaulas al menos 5 días antes de empezar el tratamiento experimental para que se acostumbren a las condiciones de laboratorio. | Preparación de las dosis | 15. | La sustancia problema se administra por sonda o con el alimento o el agua de bebida. El método de administración oral depende del objetivo del estudio y de las propiedades fisicoquímicas y toxicocinéticas de la sustancia problema. | 16. | En caso necesario, se disuelve o suspende en un vehículo adecuado. Se recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, después el uso de una solución o suspensión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus características toxicológicas. Debe determinarse la estabilidad de la sustancia problema en el vehículo. | PROCEDIMIENTO | Número y sexo de los animales | 17. | Deben utilizarse por los menos 10 animales (cinco hembras y cinco machos) por cada dosis. Si está prevista la eutanasia de algunos animales durante el ensayo, debe aumentarse el número total en una cantidad igual a la que vaya a sufrir la eutanasia antes de terminar el estudio. Puede tratarse un lote satélite de 10 animales (5 de cada sexo) en los grupos de control y de dosis más elevada para observar la reversibilidad, la persistencia o la aparición retardada de efectos tóxicos, al menos durante los 14 días siguientes al tratamiento. | Posología | 18. | Generalmente, se emplean al menos tres lotes tratados y uno de control; pero si, a partir de la evaluación de otros datos, no cabe esperar ningún efecto con la dosis de 1 000 mg/kg peso corporal/día, puede realizarse un ensayo límite. Si no se dispone de datos apropiados, puede realizarse un estudio (con animales de la misma cepa y procedencia) para ayudar a determinar el intervalo de dosificación que debe emplearse. A excepción de la administración de la sustancia problema, los animales del lote de control deben ser tratados de la misma manera que los de los lotes de tratamiento. Si se utiliza un vehículo para administrar la sustancia problema, el lote de control recibirá el mayor volumen utilizado de dicho vehículo. | 19. | Las dosis deben seleccionarse teniendo en cuenta la eventual toxicidad existente y los datos cinéticos o toxicocinéticos disponibles en relación con la sustancia problema o compuestos afines. La dosis más elevada debe seleccionarse con el propósito de inducir efectos tóxicos pero sin llegar a la muerte ni a un sufrimiento intenso. A partir de ella, debe seleccionarse una secuencia descendente de dosis a fin de poner de manifiesto las posibles respuestas en función de la dosis; y como dosis más baja se escogerá la máxima dosis sin efectos adversos observados (NOAEL). Los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer los niveles descendentes y frecuentemente es preferible añadir un cuarto lote de ensayo antes que utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo con un factor superior a 10) entre dosis. | 20. | Si se observan signos de toxicidad general (por ejemplo, peso corporal reducido, efectos hepáticos, cardíacos, pulmonares o renales, etc.) u otras alteraciones que no son necesariamente respuestas tóxicas (por ejemplo, ingesta de alimentos reducida, hiperplasia hepática), habrá que interpretar con prudencia los efectos observados sobre las variables inmunitarias, neurológicas o endocrinas. | Ensayo límite | 21. | Si, en un ensayo en el que se administra un solo nivel de dosis de al menos 1 000 mg/kg peso corporal/día o, en caso de administración en la comida o en el agua de bebida, en el que se alcanza una concentración equivalente en los alimentos o el agua de bebida (según las determinaciones del peso corporal) siguiendo los procedimientos descritos en el presente estudio, no se produce ningún efecto tóxico observable y si, a partir de datos de sustancias estructuralmente afines, no debiera esperarse la aparición de toxicidad, puede considerarse innecesario realizar un estudio completo con tres dosis. El ensayo límite es válido excepto cuando la exposición humana indique la necesidad de utilizar una dosis superior. | Administración de las dosis | 22. | Las dosis de la sustancia problema se administran diariamente a los animales, 7 días por semana, durante 28 días. Si la sustancia de ensayo se administra por sonda, debe hacerse en una sola dosis y con una sonda gástrica o una cánula de intubación adecuada. El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. Dicho volumen no debe superar 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a 2 ml/100 g de peso corporal. Salvo en el caso de sustancias irritantes o corrosivas, que por lo general producen efectos exacerbados con concentraciones mayores, deberá reducirse al mínimo la variabilidad del volumen de ensayo ajustando la concentración de manera que el volumen sea el mismo en todas las dosis. | 23. | En el caso de sustancias administradas con los alimentos o el agua de bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia problema administradas no interfieren en la nutrición normal o el equilibrio hídrico. Cuando la sustancia se administre con los alimentos, puede utilizarse una concentración constante en la dieta (en ppm) o bien una dosis constante en relación con el peso corporal de los animales, pero debe indicarse qué método se ha elegido. Si la sustancia se administra por sonda, la dosis debe darse todos los días a la misma hora y ajustarse según sea necesario para mantener una dosis constante en relación con el peso corporal del animal. Si se realiza un estudio de administración continuada como fase previa de un estudio de toxicidad crónica a largo plazo, deberá utilizarse en ambos estudios una dieta similar. | Observaciones | 24. | El período de observación debe ser de 28 días. Deben mantenerse animales en un lote satélite previsto para las observaciones de seguimiento durante al menos 14 días sin tratamiento, a fin de detectar la aparición retardada, la persistencia o la recuperación de los efectos tóxicos. | 25. | Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora cada día y teniendo en cuenta el período más agudo de los efectos previstos tras la administración. Se registrará el estado de salud de los animales. Se observarán todos los animales al menos dos veces el día para detectar posibles signos de morbilidad y mortalidad. | 26. | Todos los animales deben someterse a una observación clínica exhaustiva antes de la primera exposición (para permitir realizar comparaciones con un mismo sujeto) y, después, a una por semana. Dichas observaciones han de efectuarse fuera de la jaula de alojamiento, de preferencia en un ambiente normal y siempre a la misma hora. Las observaciones se registran cuidadosamente, preferentemente mediante sistemas de puntuación definidos de forma explícita por el laboratorio de ensayo. Debe procurarse que las variaciones en las condiciones de ensayo sean mínimas y que las observaciones sean realizadas de preferencia por observadores ajenos al tratamiento. Los signos anotados deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios de la piel, pelo, ojos, membranas mucosas, presencia de secreciones y excreciones y actividad neurovegetativa (lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila y respiración anómala). Deben registrarse también los cambios en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, o estereotipados (por ejemplo, realización excesiva de movimientos de limpieza o recorridos circulares repetitivos) o comportamientos anómalos (automutilación, marcha hacia atrás, etc.) (2). | 27. | En la cuarta semana de exposición se hará una evaluación de la reactividad sensorial frente a estímulos de diferente naturaleza (2) (estímulos auditivos, visuales y propioceptivos) (3) (4) (5), así como de la fuerza prensil (6) y de la actividad motriz (7). La bibliografía respectiva recoge más información sobre los métodos que pueden seguirse, si bien es posible emplear procedimientos distintos de los ahí descritos. | 28. | Las observaciones funcionales de la cuarta semana de exposición pueden omitirse cuando el estudio se realice como fase preliminar de un estudio posterior sobre toxicidad subcrónica (de 90 días). En este caso, las observaciones funcionales deberán incluirse en este estudio de continuación. Por otra parte, la disponibilidad de datos sobre las observaciones funcionales en el estudio de administración continuada puede facilitar la selección de las dosis utilizadas en un estudio posterior sobre toxicidad subcrónica. | 29. | De forma excepcional, también pueden omitirse las observaciones funcionales en los lotes que muestren signos de toxicidad de otro tipo tales que interfieran significativamente con los resultados de las pruebas funcionales. | 30. | En la autopsia se podrá determinar (opcionalmente) el ciclo estral de todas las hembras tomando frotis vaginales. Estas observaciones permitirán establecer la fase del ciclo estral en el momento del sacrificio y serán de ayuda en la evaluación histológica de los tejidos sensibles a los estrógenos [véase el documento de orientación sobre histopatología (19)]. | Peso corporal y consumo de alimentos y agua | 31. | Al menos una vez por semana se pesarán todos los animales y se calculará el consumo de alimentos. Si la sustancia problema se administra con el agua de bebida, deberá medirse también el consumo de agua al menos semanalmente. | Hematología | 32. | Deben practicarse los siguientes exámenes hematológicos al final del período de ensayo: hematocrito, concentraciones de hemoglobina, recuento de eritrocitos y reticulocitos, recuento de leucocitos y fórmula leucocitaria, recuento de plaquetas y medida del tiempo o capacidad de coagulación sanguínea. Si se sabe o sospecha que la sustancia problema o sus metabolitos potenciales tienen propiedades oxidantes, habrá que determinar además las concentraciones de metahemoglobina y de cuerpos de Heinz. | 33. | Las muestras de sangre deben tomarse de un punto indicado, justo antes de la eutanasia de los animales (o como parte del método de eutanasia), y conservarse en condiciones adecuadas. Los animales estarán en ayunas desde el día anterior a la eutanasia (2). | Bioquímica clínica | 34. | Deben hacerse determinaciones bioquímicas para investigar efectos tóxicos importantes en los tejidos y, especialmente, en el riñón y el hígado, con muestras sanguíneas obtenidas de todos los animales justo antes de la eutanasia o como parte del método de eutanasia (aparte de los moribundos o sacrificados antes de que termine el ensayo). Los parámetros medidos en el plasma y el suero deben incluir las concentraciones de sodio, potasio, glucosa, colesterol total, urea, creatinina, proteínas totales y albúminas, al menos dos enzimas indicadoras de los efectos hepatocelulares (alanina-aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, gamma-glutamil-transpeptidasa, o glutamato-deshidrogenasa) y los ácidos biliares. La determinación de otras enzimas (de origen hepático o no) y de la bilirrubina puede proporcionar información útil en ciertas circunstancias. | 35. | Pueden realizarse, con carácter facultativo, las siguientes determinaciones en la última semana del estudio utilizando la recogida programada de orina: aspecto, volumen, osmolalidad o densidad, pH, proteínas, glucosa, sangre y células sanguíneas. | 36. | Además de ello, debe plantearse el estudio de los marcadores plasmáticos o séricos de lesiones histológicas generales. Otras determinaciones que deben realizarse si se sabe o sospecha que las propiedades conocidas de la sustancia estudiada pueden afectar a las funciones metabólicas correspondientes incluyen las concentraciones de calcio, fosfato, triglicéridos, hormonas específicas y colinesterasa. Debe valorarse la necesidad de hacer estos análisis con las sustancias químicas de determinadas clases o bien según cada caso. | 37. | Aunque durante la evaluación internacional de los parámetros de tipo endocrino no se pudo demostrar una clara ventaja a favor de la determinación de las hormonas tiroideas (T3, T4) y de la TSH, cuando se observen indicios de algún efecto sobre el eje hipófiso-tiroideo puede ser de utilidad conservar muestras de plasma o suero para hacer valoraciones de T3, T4 y TSH (opcionales). Estas muestras se congelan a – 20 °C para su conservación. Distintos factores pueden influir en la variabilidad y en el valor absoluto de las concentraciones hormonales: | — | el momento del sacrificio, debido a la variación diurna de las concentraciones hormonales, | — | el método de eutanasia, que se escogerá para evitar a los animales un sufrimiento indebido que pueda influir en las concentraciones hormonales, | — | los kits de análisis hormonal, que pueden presentar diferencias en sus curvas patrón. | El examen histopatológico es más fiable que el hormonal para llegar a una identificación definitiva de las sustancias químicos con actividad tiroidea. | 38. | Las muestras de plasma destinadas específicamente al análisis hormonal se obtendrán a la misma hora del día. Se recomienda contemplar la posibilidad de determinar los valores de T3, T4 y TSH basándose en las alteraciones histopatológicas del tiroides. Las cifras obtenidas al analizar concentraciones de hormonas varían con los kits comerciales que se usan para el análisis. En consecuencia, no siempre es posible establecer criterios de valoración basados en datos históricos uniformes. Por otro lado, los laboratorios procurarán mantener los coeficientes de variación por debajo de 25 en el caso de T3 y T4, y por debajo de 35 para la TSH. Todas las concentraciones se expresarán en ng/ml. | 39. | Si los datos de referencia previos son insuficientes, habrá que considerar la posible determinación de los parámetros hematológicos y de bioquímica clínica antes de iniciar la administración o, preferiblemente, en un grupo de animales no incluidos en los lotes experimentales. | ANATOMÍA PATOLÓGICA | Autopsia macroscópica | 40. | Debe practicarse una autopsia macroscópica completa y detallada a todos los animales empleados en el estudio, que incluya un examen detenido de la superficie corporal externa, todos los orificios y las cavidades craneana, torácica y abdominal con su contenido. El hígado, los riñones, cápsulas suprarrenales, testículos, epidídimo, próstata + vesículas seminales con las glándulas coagulantes en conjunto, timo, bazo, cerebro y corazón de todos los animales (aparte de los moribundos y/o sacrificados antes de concluir el ensayo) han de limpiarse de los tejidos adherentes, según convenga, y pesarse lo antes posible tras la disección para evitar su desecación. Al seccionar la próstata y sus anejos se procurará evitar la punción de las vesículas seminales llenas de líquido. Otra posibilidad es diseccionar y pesar las vesículas seminales y la próstata después de fijarlas. | 41. | Facultativamente, otros dos tejidos se pueden pesar lo antes posible tras la disección para evitar su desecación: los ovarios pareados (peso húmedo) y el útero y cuello del útero [se ofrecen orientaciones sobre la excisión y preparación de los tejidos uterinos para determinar su peso en las TG 440 de la OCDE (18)]. | 42. | El peso de la glándula tiroides puede determinarse (opcionalmente) después de su fijación. Su excisión se hará también de manera cuidadosa y solo después de la fijación para evitar daños tisulares, que comprometerían los resultados del examen histopatológico. | 43. | Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el medio de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse (véase el punto 47): todas las lesiones macroscópicas, encéfalo (zonas representativas, con inclusión del cerebro, cerebelo y protuberancia), médula espinal, ojos, estómago, intestino delgado y grueso(incluidas las placas de Peyer), hígado, riñones, cápsulas suprarrenales, bazo, corazón, timo, tiroides, tráquea y pulmones (conservados mediante inflado con fijador seguido de inmersión), gónadas (testículos y ovarios), órganos sexuales secundarios (útero y cuello, epidídimo, próstata + vesículas seminales y glándulas coagulantes), vagina, vejiga urinaria, ganglios linfáticos [además del ganglio más proximal debería obtenerse otro ganglio linfático, dependiendo de la experiencia del laboratorio (15)], nervios periféricos (ciático o tibial), preferentemente muy próximos al músculo, músculo esquelético y hueso con la médula ósea (una sección o médula ósea aspirada y recién montada). Se recomienda fijar los testículos mediante inmersión en fijador de Bouin o de Davidson modificado (16) (17). Con una aguja se punciona suave y superficialmente la túnica albugínea por ambos polos del órgano para permitir la rápida penetración del fijador. Las observaciones clínicas y de otro tipo pueden indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propiedades conocidas de la sustancia problema. | 44. | Los siguientes tejidos pueden proporcionar valiosas indicaciones sobre los efectos de carácter endocrino: gónadas (ovarios y testículos), órganos sexuales secundarios (útero y cuello, epidídimo, vesículas y glándulas seminales, próstata dorsolateral y ventral), vagina, hipófisis, glándula mamaria de machos, tiroides y cápsula suprarrenal. Las alteraciones de las glándulas mamarias de machos no se han documentado suficientemente, pero este parámetro puede ser muy sensible a las sustancias dotadas de actividad estrogénica. La observación de los órganos y tejidos que no se recogen en el punto 43 es opcional (véase el apéndice 2). | 45. | El documento de orientación sobre histopatología (19) proporciona más información detallada acerca de la disección, fijación, sección e histopatología de los tejidos endocrinos. | 46. | En el programa internacional de investigación se obtuvieron indicios en el sentido de que es posible identificar los efectos endocrinos sutiles de sustancias que tienen escasa potencia para afectar a la homeostasis de las hormonas sexuales detectando trastornos en la sincronización del ciclo estral de diversos tejidos, antes que las alteraciones histopatológicas evidentes en los órganos sexuales femeninos. Si bien no se ha obtenido una prueba definitiva de tales efectos, se recomienda tener en cuenta los signos de posible asincronía del ciclo estral a la hora de interpretar la histopatología de los ovarios (células foliculares, tecales y granulosas), el útero, el cuello y la vagina. Si se determina la fase del ciclo a partir de frotis vaginales, se podría incluir también en la comparación. | Examen histopatológico | 47. | Es preciso practicar un examen histopatológico completo de los órganos y tejidos conservados de todos los animales del lote expuesto a la dosis más elevada y del lote de control. En caso de que se hayan observado cambios relacionados con el tratamiento en el lote con la dosis más elevada, estos exámenes se ampliarán a animales de todos los demás lotes tratados. | 48. | Deben examinarse todas las lesiones macroscópicas. | 49. | Si se utiliza un lote satélite, debe hacerse un examen histopatológico de los órganos y tejidos que presenten efectos en los grupos tratados. | RESULTADOS E INFORME | Resultados | 50. | Deben proporcionarse datos de cada animal. Además, deben resumirse todos los datos en un cuadro que recoja, por cada lote de ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el porcentaje de animales afectado por cada tipo de lesión. | 51. | Siempre que sea posible, los resultados numéricos deberán evaluarse mediante un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. La comparación de los efectos a lo largo de un intervalo de dosis evitaría el uso de múltiples pruebas t. Los métodos estadísticos deben seleccionarse durante el diseño del estudio. | 52. | Por motivos de control de calidad, se propone recopilar los datos previos relativos a los controles y calcular coeficientes de variación de las variables numéricas, especialmente las relacionadas con la detección de alteradores endocrinos. Estos datos se pueden usar con fines de comparación al evaluar los estudios actuales. | Informe del ensayo | 53. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas. | — | Datos de identificación. | | Vehículo (si procede): | — | Justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua. | | Animales sometidos a ensayo: | — | Especie y cepa empleada. | — | Número, edad y sexo de los animales. | — | Procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, etc. | — | Peso de cada animal al inicio del ensayo. | — | Justificación de la especie si es distinta de la rata. | | Condiciones de ensayo: | — | Justificación de la selección de las dosis. | — | Datos sobre la formulación de la sustancia problema o su preparación con los alimentos, concentración obtenida, estabilidad y homogeneidad del preparado. | — | Datos de la administración de la sustancia problema. | — | Factor de conversión de la concentración (ppm) de la sustancia problema en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales (mg/kg peso corporal/día), si procede. | — | Datos de la calidad de los alimentos y el agua. | | Parámetros opcionales | — | Listado de parámetros opcionales | | Resultados: | — | Peso corporal y variaciones del mismo. | — | Consumo de alimentos y de agua, si se ha medido. | — | Datos de respuestas tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos de toxicidad. | — | Naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas (sean reversibles o no). | — | Evaluación de la actividad sensorial, fuerza de prensión y actividad motriz. | — | Pruebas hematológicas con los correspondientes valores de referencia. | — | Pruebas bioquímicas con los correspondientes valores de referencia. | — | Peso corporal en el momento de la eutanasia y datos sobre el peso de los órganos. | — | Observaciones de la autopsia. | — | Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas. | — | Datos sobre la absorción, si los hay. | — | Tratamiento estadístico de los resultados, si procede. | | Discusión de los resultados. | | Conclusiones. | Apéndice 1 | DEFINICIONES | Actividad antitiroidea: capacidad de una sustancia para inhibir la acción de una hormona tiroidea natural (por ejemplo, T3) en el organismo de un mamífero. | Actividad tiroidea: capacidad de una sustancia para actuar como una hormona tiroidea natural (por ejemplo, T3) en el organismo de un mamífero. | Androgenicidad: capacidad de una sustancia para actuar como una hormona androgénica natural (por ejemplo, testosterona) en el organismo de un mamífero. | Antiandrogenicidad: capacidad de una sustancia para inhibir la acción de una hormona androgénica natural (por ejemplo, testosterona) en el organismo de un mamífero. | Antiestrogenicidad: capacidad de una sustancia para inhibir la acción de una hormona estrogénica natural (por ejemplo, 17-beta estradiol) en el organismo de un mamífero. | Dosis: cantidad de sustancia problema administrada. Se expresa en peso de sustancia por unidad de peso del animal y por día (por ejemplo, mg/kg peso corporal/día) o en concentración constante en la dieta. | Estrogenicidad: capacidad de una sustancia química para actuar como una hormona estrogénica natural (por ejemplo, 17-beta-estradiol) en el organismo de un mamífero. | NOAEL: sigla inglesa correspondiente a la máxima dosis sin efectos adversos observados, es decir, la dosis más alta a la que no se observa ningún efecto adverso debido al tratamiento. | Posología: término general que abarca la dosis administrada, su frecuencia y duración. | Sustancia problema: cualquier sustancia o mezcla estudiada mediante este método de ensayo. | Toxicidad evidente: término general que describe los signos claros de toxicidad que aparecen tras la administración de una sustancia problema. Estos signos deben ser suficientes para la evaluación del peligro y deben ser tales que, ante un aumento de la dosis administrada, pueda esperarse la aparición de signos tóxicos graves y una mortalidad probable. | Validación: procedimiento científico diseñado para caracterizar los requisitos operativos y las limitaciones de un método de ensayo y para demostrar su fiabilidad y pertinencia en relación con un propósito determinado. | Apéndice 2 | Parámetros recomendados para la detección de los alteradores endocrinos (AE) en el presente método de ensayo B.7 | Parámetros obligatorios | Parámetros opcionales | Peso | — | Testículos | — | Epidídimo | — | Cápsulas suprarrenales | — | Próstata + vesículas seminales y glándulas coagulantes | — | Ovarios | — | Útero y cuello | — | Tiroides | Examen histopatológico | — | Gónadas: | — | Testículos y | — | Ovarios | — | Órganos sexuales secundarios: | — | Epidídimo, | — | Próstata + vesículas seminales y glándulas coagulantes | — | Útero y cuello | — | Cápsulas suprarrenales | — | Tiroides | — | Vagina | — | Frotis vaginal | — | Glándulas mamarias de machos | — | Hipófisis | Determinaciones hormonales | | — | Concentración en sangre de T3 y T4 | — | Concentración en sangre de TSH | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity. | (2) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60 | (3) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (4) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704. | (5) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (6) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. | (7) | Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. | (8) | OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. | (9) | OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. | (10) | OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. | (11) | OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html | (12) | OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. | (13) | OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. | (14) | OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. | (15) | Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407. | (16) | Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. | (17) | Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533. | (18) | OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. | (19) | OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11. | B.8. TOXICIDAD SUBAGUDA POR INHALACIÓN: ESTUDIO DE 28 DÍAS | ÍNDICE | El presente método de ensayo B.8 ha sido diseñado para caracterizar debidamente la toxicidad por inhalación de una sustancia problema después de la exposición continuada durante un período limitado (28 días), y para recabar datos que permitan hacer una evaluación cuantitativa del riesgo por inhalación. Se forman lotes de al menos 5 roedores machos y 5 hembras y se exponen 6 horas al día durante 28 días a: a) la sustancia problema a tres o más niveles de concentración; b) aire filtrado (control negativo), y/o c) el vehículo (control del vehículo). Habitualmente los animales se exponen 5 días por semana, aunque se acepta exponerlos hasta 7 días por semana. Se estudian siempre animales machos y hembras, pero pueden exponerse a diferentes niveles de concentración si se sabe que uno de los sexos es más sensible a la sustancia problema. Este método concede al director del estudio suficiente flexibilidad para incluir lotes satélite (reversibilidad), lavados broncoalveolares (BAL), pruebas neurológicas y otras evaluaciones anatomopatológicas e histopatológicas orientadas a caracterizar mejor la toxicidad de una sustancia problema. | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 412 de la OCDE (2009). Las directrices originales sobre ensayos de toxicidad subaguda por inhalación (TG 412) fueron adoptadas en 1981 (1). El presente método de ensayo B.8 (equivalente a las TG 412 revisadas) se ha actualizado para reflejar el estado actual de la ciencia y satisfacer las necesidades normativas actuales y futuras. | 2. | Este método permite caracterizar los efectos adversos que se producen después de la exposición por inhalación diaria continuada de una sustancia problema durante 28 días: Los datos derivados de los estudios de toxicidad subaguda por inhalación durante 28 días pueden servir para efectuar evaluaciones cuantitativas del riesgo [siempre que no vayan seguidos de un estudio de toxicidad subcrónica por inhalación durante 90 días (capítulo B.29 del presente anexo)]. Los mismos datos pueden además orientar en la selección de las concentraciones aplicadas en estudios más prolongados, como los de toxicidad subcrónica por inhalación durante 90 días. El presente método de ensayo no está específicamente destinado a la investigación de nanomateriales. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan al final del presente capítulo y en el documento GD 39 (2). | CONSIDERACIONES INICIALES | 3. | Antes de comenzar el estudio y con el fin de mejorar su calidad y minimizar el sufrimiento animal, el laboratorio de ensayo tendrá en cuenta toda la información disponible acerca de la sustancia problema. En la selección de las concentraciones idóneas de estudio resulta útil toda información referente a: identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, resultados de anteriores ensayos de toxicidad in vivo o in vitro, uso(s) previsto(s) y posible exposición humana, datos de (Q)SAR previos y datos toxicológicos acerca de compuestos químicos estructuralmente afines, y resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad aguda por inhalación. Si se prevé o se observa neurotoxicidad en el transcurso del estudio, el director del mismo puede decidir la incorporación de las evaluaciones pertinentes, como una batería de observación funcional (FOB) y registros de la actividad motriz: Si bien el calendario de las exposiciones en relación con las evaluaciones concretas puede ser crítico, la realización de estas actividades complementarias no debe interferir en el diseño básico del estudio. | 4. | Se pueden estudiar diluciones de sustancias corrosivas o irritantes a concentraciones capaces de inducir el grado de toxicidad esperado [véase GD 39 (2)]. Al exponer los animales a estos productos, las concentraciones diana deben ser lo bastante bajas para no provocar un dolor y sufrimiento intensos, pero suficientes para obtener una curva de concentración-respuesta que satisfaga los objetivos científicos y normativos del ensayo. Dichas concentraciones se escogerán según cada caso, preferiblemente sobre la base de estudios del intervalo analítico debidamente diseñados que arrojen información sobre el parámetro principal, el umbral de irritación y el tiempo de aparición de los síntomas (véanse los puntos 11-13). Se justificará la elección de las concentraciones. | 5. | Los animales moribundos o que presenten signos evidentes de dolor o de sufrimiento intenso y duradero deben sacrificarse de forma compasiva. Los animales moribundos se contabilizan como muertes durante el ensayo. En el documento de orientación sobre criterios de tratamiento compasivo [Guidance Document on Humane Endpoints de la OCDE (3)] se dan criterios para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a sufrimiento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte es previsible o inminente. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Selección de la especie animal | 6. | Hay que utilizar roedores adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio corriente. La especie preferida es la rata. Deberá justificarse el empleo de otra especie. | Preparación de los animales | 7. | Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. El día de la asignación aleatoria, los animales serán adultos jóvenes de entre 7 y 9 semanas de edad. Los pesos corporales se desviarán a lo sumo en ± 20 % del peso medio de cada sexo. Se seleccionan al azar los animales, se marcan para permitir su identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes de iniciar el ensayo, a fin de que se aclimaten a las condiciones del laboratorio. | Zootecnia | 8. | Los animales se identificarán de manera individual, a ser posible con transpondedores subcutáneos, a fin de facilitar la observación y evitar confusiones. La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. La humedad relativa se mantendrá idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, si bien esto no siempre es posible cuando se usa el agua como vehículo. Antes y después de las exposiciones, los animales deberán enjaularse en principio por grupos de sexo y nivel de exposición, pero el número de animales por jaula será tal que permita la observación sin trabas de cada animal y minimice las pérdidas por agresiones y canibalismo. Cuando la exposición es solo por la nariz, puede ser necesario acostumbrar a los animales a los tubos de sujeción. Estos no deberán ejercer sobre los animales tensiones físicas, térmicas o de inmovilización. La sujeción puede influir en parámetros fisiológicos como la temperatura corporal (hipertermia) o el volumen respiratorio por minuto. Si se dispone de datos generales en el sentido de que no se producen estos cambios en medida apreciable, se podrá prescindir de la adaptación previa a los tubos de sujeción. Los animales expuestos de cuerpo entero a un aerosol se enjaularán de manera individual durante la exposición para evitar que el aerosol en estudio se filtre a través del pelo de sus compañeros de jaula. Salvo durante la exposición, se podrán administrar las dietas habituales de laboratorio certificadas, acompañadas de un suministro ilimitado de agua potable de la traída municipal. La iluminación será artificial, con una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. | Cámaras de inhalación | 9. | Para seleccionar una cámara de inhalación se tendrán en cuenta la naturaleza de la sustancia problema y la finalidad del ensayo. El modo de exposición preferible es de solo la nariz (término que abarca los modos de exposición solo por la cabeza, solo por la nariz y solo por el hocico). Este modo de exposición es el recomendado generalmente para los estudios de aerosoles líquidos o sólidos y de vapores que pueden condensarse formando aerosoles. Determinados objetivos de la investigación se podrían alcanzan mejor utilizando el modo de exposición de cuerpo entero, pero esto debe justificarse en el informe del estudio. Para asegurar la estabilidad atmosférica cuando se emplea una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los animales experimentales no debe exceder del 5 % del volumen de la cámara. En el documento GD 39 (2) se describen los principios de las técnicas de exposición de cuerpo entero y de solo por la nariz y sus ventajas e inconvenientes respectivos. | ESTUDIOS DE TOXICIDAD | Concentraciones límite | 10. | A diferencia de los estudios de toxicidad aguda, en los estudios de toxicidad subaguda por inhalación durante 28 días no hay concentraciones límite definidas. La concentración máxima estudiada dependerá de: 1) la máxima concentración alcanzable, 2) el nivel de exposición humana en "el escenario más desfavorable", 3) la necesidad de mantener un suministro de oxígeno adecuado, y/o 4) la atención al bienestar de los animales. Si no se dispone de datos de concentración límite, es aplicable el Reglamento (CE) no 1272/2008 (13) [hasta una concentración máxima de 5 mg/l para los aerosoles, de 20 mg/l para los vapores y de 20 000 ppm para los gases; véase el documento GD 39 (2)]. Cuando sea preciso superar estos límites en el estudio de gases o sustancias problemas altamente volátiles (por ejemplo, refrigerantes), habrá que justificar los motivos. La concentración límite será tal que induzca una toxicidad inequívoca sin provocar un sufrimiento indebido a los animales ni afectar a su longevidad (3). | Estudio de determinación del intervalo | 11. | Antes de proceder al estudio principal, puede ser necesario realizar un estudio para determinar el intervalo analítico. Un estudio de determinación del intervalo es más completo que un estudio preliminar, por cuanto no se limita a la selección de las concentraciones. La información recabada en este tipo de estudio puede ser decisiva para el éxito del estudio principal. Un estudio de determinación del intervalo puede, por ejemplo, aportar información técnica referente a los métodos analíticos y a la granulometría, la detección de los mecanismos de toxicidad, los parámetros anatomopatológicos e histopatológicos, y las estimaciones de lo que podrán ser el NOAEL y la concentración tóxica mínima en un estudio principal. El director de la investigación decidirá si ha de basarse en el estudio de determinación del intervalo para identificar el umbral de irritación de las vías respiratorias (con la histopatología de las vías respiratorias, las pruebas de la función pulmonar o el lavado broncoalveolar), la concentración máxima tolerada sin causar un sufrimiento indebido a los animales y los parámetros que caractericen mejor la toxicidad de la sustancia problema. | 12. | Un estudio de determinación del intervalo puede hacerse con uno o más niveles de concentración. A cada nivel de concentración no deben exponerse más de tres machos y tres hembras. El estudio de determinación del intervalo tendrá una duración mínima de 5 días y máxima (generalmente) de 14 días. En el informe del estudio se justificará la selección de las concentraciones destinadas al estudio principal. La finalidad del estudio principal es demostrar una relación concentración-respuesta basada en lo que se supone el parámetro más sensible. La concentración más baja será idealmente una en la que no se observen efectos adversos, mientras que la concentración más alta será tal que induzca una toxicidad inequívoca sin provocar un sufrimiento indebido a los animales ni afectar a su longevidad (3). | 13. | A la hora de elegir los niveles de concentración para el estudio de determinación del intervalo, se tendrá en cuenta toda la información disponible, incluidos las relaciones entre estructura y actividad y los datos de sustancias afines (véase el punto 3). Un estudio de determinación del intervalo puede verificar o refutar los parámetros relacionados con los mecanismos de acción que a priori se consideran más sensibles, como la inhibición de la colinesterasa por los organofosforados, la formación de metahemoglobina por agentes eritrotóxicos, las hormonas tiroideas (T3 y T4), en el caso de tirotóxicos, y la presencia de proteínas, LDH, o neutrófilos en el lavado broncoalveolar en el caso de partículas inocuas escasamente solubles o de aerosoles que son irritantes pulmonares. | Estudio principal | 14. | El estudio principal de toxicidad subaguda comprende habitualmente tres niveles de concentración, además de lotes de control negativo (aire) y/o testigo del vehículo (véase el punto 17). Se recurrirá a todos los datos disponibles para ayudar a la selección de los niveles de exposición adecuados, incluidos los resultados de los estudios de toxicidad sistémica, metabólicos y cinéticos (poniendo especial atención para evitar niveles de concentración elevados que saturen los procesos cinéticos). Cada lote de ensayo se compone de al menos 10 roedores (5 machos y 5 hembras), que se exponen a la sustancia química estudiada 6 horas al día en un régimen de 5 días por semana durante un período de 4 semanas (la duración total del estudio es de 28 días). También se admite exponer a los animales 7 días por semana (por ejemplo, cuando se estudian productos farmacéuticos para inhalación). Si se sabe que uno de los sexos es más sensible a la sustancia problema, podrán exponerse los dos sexos a diferentes niveles de concentración con el fin de optimizar la relación concentración-respuesta, tal como se describe en el punto 15. Cuando se exponen con la técnica de solo por la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justificarán los motivos cuando el tiempo de exposición sea inferior a 6 horas/día o cuando sea necesario efectuar un estudio de exposición de cuerpo entero de larga duración (por ejemplo, 22 horas/día) [véase el documento GD 39 (2)]. Se privará de comida a los animales durante el período de exposición, a menos que este exceda de 6 horas. Se puede suministrar agua durante todo el período de exposición de cuerpo entero. | 15. | Las concentraciones diana seleccionadas deben servir para identificar el órgano o los órganos diana y para demostrar una clara relación concentración-respuesta. | — | El nivel de concentración más elevado debe inducir efectos tóxicos, pero sin provocar letalidad o daños persistentes que impidan hacer una evaluación significativa. | — | El nivel o los niveles de concentración intermedios se espaciarán para obtener una graduación o escala de los efectos tóxicos desde el nivel más bajo al más elevado. | — | La concentración más baja debe producir escasos o nulos signos de toxicidad. | Estudio satélite (de reversibilidad) | 16. | Es posible recurrir a un estudio satélite (de reversibilidad) para observar la reversibilidad, persistencia o aparición retardada de toxicidad durante un período de duración adecuada, pero nunca inferior a 14 días, después del tratamiento. Los lotes satélite (de reversibilidad) se componen de 5 machos y 5 hembras, que se exponen simultáneamente a los animales de experimentación del estudio principal. Los lotes del estudio satélite (de reversibilidad) deben exponerse a la sustancia problema al nivel de concentración más elevado y, en la medida necesaria, se emplearán simultáneamente lotes testigo con aire y/o con el vehículo (véase el punto 17). | Animales de control | 17. | Los animales de control negativo (con aire) simultáneo se tratan de manera idéntica a los animales del lote experimental, excepto en que se exponen al aire filtrado en lugar de a la sustancia problema. Cuando se utiliza agua o cualquier otra sustancia para ayudar a crear la atmósfera experimental, en el estudio debe incluirse un lote testigo del vehículo, en lugar del lote de control negativo (con aire). Como vehículo se usará agua en la medida de lo posible. Cuando se use agua como vehículo, los animales de control se expondrán a una atmósfera de aire con la misma humedad relativa que los grupos expuestos a la sustancia problema. La selección de un vehículo idóneo se basará en un ensayo preliminar debidamente realizado o bien en los datos históricos. Cuando no se conoce bien la toxicidad de un vehículo, el director del estudio puede decidir el uso de ambos lotes, el de control negativo (con aire) y el testigo del vehículo, pero no es en absoluto recomendable. Si los datos previos revelan que un vehículo es atóxico, no hay necesidad de emplear un grupo de control negativo (con aire), y solo se usará un lote testigo del vehículo. Si un ensayo preliminar de toxicidad de una sustancia problema formulada en un vehículo revela que no hay toxicidad, se deduce que el vehículo es atóxico a la concentración analizada y debe utilizarse este control del vehículo. | CONDICIONES DE EXPOSICIÓN | Administración de las concentraciones | 18. | Los animales se exponen a la sustancia problema en forma de gas, vapor, aerosol o una mezcla de estos. El estado físico investigado dependerá de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, de la concentración seleccionada y/o de la forma física más probable que adoptará dicha sustancia durante su manipulación y administración. Las sustancias higroscópicas y químicamente reactivas deberán estudiarse en condiciones de aire seco. Se procurará evitar la acumulación de concentraciones explosivas. Los materiales particulados pueden someterse a procesos mecánicos para reducir el tamaño de partícula. Se ofrecen más orientaciones en el documento de orientación GD 39 (2). | Distribución del tamaño de partícula | 19. | Se controlará la granulometría de todos los aerosoles y vapores que puedan condensarse formando aerosoles. Para facilitar la exposición de todas las zonas de interés de las vías respiratorias, se recomiendan aerosoles que tengan un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) de 1 a 3 μm, con una desviación típica geométrica (σg) en el intervalo de 1,5 a 3,0 (4). Se procurará dentro de lo razonable ajustarse a este marco de referencia, pero si ello no es posible se consultará la opinión de expertos. Así, por ejemplo, las partículas de los humos metálicos pueden tener un tamaño inferior al mencionado intervalo, mientras que las partículas con carga y las fibras pueden superarlo. | Preparación de la sustancia problema en un vehículo | 20. | En condiciones ideales, la sustancia problema debería estudiarse sin ningún vehículo. Si es necesario emplear un vehículo para generar una concentración de sustancia problema y un tamaño de partícula adecuados, se le dará preferencia al agua. Siempre que una sustancia problema se disuelva en un vehículo, debe demostrarse su estabilidad. | SUPERVISIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN | Caudal de aire de la cámara | 21. | El caudal de aire de la cámara de exposición se controlará minuciosamente, se supervisará de manera continuada y se registrará como mínimo cada hora durante cada exposición. La supervisión en tiempo real de la concentración atmosférica (o la estabilidad temporal) del ensayo constituye una medida integral de todos los parámetros dinámicos y proporciona un medio indirecto de controlar todos los parámetros dinámicos de la inhalación que resultan de interés. Si la concentración se supervisa en tiempo real, es posible reducir la frecuencia de medición del caudal de aire limitándola a una sola medición por exposición y día. Habrá que tomar especiales precauciones para evitar la reinspiración en las cámaras de exposición solo por la nariz. La concentración de oxígeno debe ser como mínimo del 19 %, y la de dióxido de carbono no debe superar el 1 %. Si existen razones para suponer que no se van a respetar estos valores de referencia, habrá que medir las concentraciones de ambos gases. Si las mediciones del primer día de exposición revelan que estos gases están presentes a las concentraciones adecuadas, no serán necesarias nuevas mediciones. | Temperatura y humedad relativa de la cámara | 22. | La temperatura de la cámara se mantendrá en 22 ± 3 °C. Siempre que sea posible, la humedad relativa presente en la zona de respiración de los animales, tanto en las exposiciones de solo por la nariz como en las de cuerpo entero, se supervisará de manera continua y se registrará cada hora durante la exposición. La humedad relativa debe mantenerse preferiblemente en el intervalo del 30 % al 70 %, pero este valor de referencia puede ser inalcanzable (por ejemplo, cuando se analizan mezclas acuosas) o imposible de medir (cuando hay interferencias de la sustancia problema con el método de ensayo). | Sustancia problema: concentración nominal | 23. | Siempre que sea factible, se calculará y registrará la concentración nominal en la cámara de exposición. La concentración nominal es la masa de sustancia problema generada dividida por el volumen total de aire que recorre el sistema de la cámara de inhalación. La concentración nominal no se usa para caracterizar la exposición de los animales, pero la comparación entre la concentración nominal y la real nos da un índice de la eficiencia generadora del sistema experimental, de modo que puede servir para detectar problemas en la generación de la atmósfera. | Sustancia problema: concentración real | 24. | La concentración real es la concentración de sustancia problema comprobada por muestreo en la zona de respiración de los animales de una cámara de inhalación. Las concentraciones reales se pueden calcular con métodos específicos (por ejemplo, muestreo directo, métodos de adsorción o uso de reactivos químicos y posterior valoración analítica) o bien con métodos inespecíficos, como la gravimetría por filtración. El análisis gravimétrico es aceptable exclusivamente para aerosoles de un único componente en polvo o de líquidos de baja volatilidad, y deberá sustentarse en caracterizaciones preliminares específicas de la sustancia problema. La concentración de los aerosoles de polvos multicomponentes se puede determinar también por gravimetría. Sin embargo, hacen falta datos analíticos que demuestren que la composición del material aerotransportado es afín a la del material de partida. Si no se dispone de tal información, puede ser necesario repetir el análisis de la sustancia problema (idealmente, en estado aerotransportado) a intervalos regulares a lo largo del ensayo. Cuando se trata de productos en forma de aerosol capaces de evaporarse o sublimarse, habrá que demostrar que el método elegido es capaz de recoger todas las fases. | 25. | Se usará, a ser posible, un solo lote de sustancia problema durante todo el estudio, lote que se conservará en condiciones que preserven su pureza, homogeneidad y estabilidad. Antes de iniciar el estudio deberá hacerse una caracterización de la sustancia problema consistente en un análisis de pureza y, si es técnicamente factible, de identidad y de cuantificación de contaminantes e impurezas. Con este fin se pueden aportar, entre otros, los siguientes datos: tiempo de retención y área relativa del pico, peso molecular determinado mediante espectroscopia de masas o cromatografía de gases y otras determinaciones. Si bien la identidad de la muestra de ensayo no es responsabilidad del laboratorio de análisis, la prudencia aconseja que este confirme, aunque sea dentro de ciertos límites, la caracterización facilitada por el promotor (por ejemplo, color, naturaleza física, etc.). | 26. | La atmósfera de exposición debe mantenerse constante en la medida de lo posible. Para demostrar la estabilidad de las condiciones de exposición se puede usar un equipo de supervisión en tiempo real, como un fotómetro de proceso para aerosoles o un analizador de hidrocarburos totales para vapores. La concentración real presente en la cámara deberá medirse al menos 3 veces por cada nivel y día de exposición. Pero si ello no es posible debido a un caudal de aire limitado o a que las concentraciones son bajas, se acepta una muestra por período de exposición. En ese caso, lo ideal es recoger la muestra durante todo el período de exposición. Las concentraciones individuales medidas en la cámara no deben desviarse de la concentración media en ± 10 % cuando se trata de gases y vapores, ni en más de ± 20 % en el caso de aerosoles de líquidos o sólidos. Se calculará y documentará el tiempo de equilibrado (t95) de la cámara. La duración de una exposición incluye el tiempo durante el cual se genera la sustancia problema. Este abarca los tiempos transcurridos hasta alcanzar el equilibrio en la cámara (t95) y hasta la extinción. Se ofrecen indicaciones para el cálculo de t95 en el documento de orientación no 39 (2). | 27. | Cuando se manejan mezclas muy complejas formadas por gases/vapores y aerosoles (por ejemplo, atmósferas de combustión y sustancias problema propulsadas con dispositivos/productos fabricados con fines determinados), cada fase puede comportarse de manera diferente en una cámara de inhalación. Por consiguiente, se seleccionará como mínimo una sustancia indicadora (analito), normalmente la sustancia activa principal de la mezcla, por cada fase (gas/vapor y aerosol). Si el producto analizado es una mezcla, habrá que documentar la concentración analítica de la mezcla total y no solo de la sustancia indicadora o del componente activo (analito). Se ofrece más información sobre las concentraciones reales en el documento de orientación no 39 (2). | Sustancia problema: granulometría | 28. | La granulometría de los aerosoles debe determinarse al menos con periodicidad semanal por cada nivel de concentración, con ayuda de un impactador de cascada o un aparato alternativo, como un cribador de partículas. Si se puede demostrar la equivalencia de los resultados obtenidos con el impactador de cascada y con el aparato alternativo, entonces se podrá emplear este último durante todo el estudio. | 29. | Se empleará un segundo dispositivo, como un filtro gravimétrico o un sistema de burbujeo o de purga, en paralelo con el equipo principal para confirmar la eficiencia de recogida de este último. La concentración en masa obtenida mediante análisis por tamaños de partícula tendrá unos límites de desviación razonables con respecto a la concentración en masa obtenida mediante gravimetría por filtración [véase el documento GD 39 (2)]. Si es posible demostrar su equivalencia para todas las concentraciones analizadas en la fase inicial del estudio, podrán omitirse en lo sucesivo las pruebas confirmatorias. Por razones de bienestar animal, se tomarán medidas para minimizar la obtención de datos no concluyentes que obligarían a repetir el ensayo. | 30. | Se controlará la granulometría en los vapores cuando exista la posibilidad de que la condensación del vapor provoque la formación de un aerosol, o cuando se detecten partículas en una atmósfera de vapor que puedan inducir la mezcla de fases. | OBSERVACIONES | 31. | Los animales se someterán a observación clínica frecuente antes, durante y después del período de exposición. Pueden estar indicadas observaciones más frecuentes, dependiendo de la respuesta de los animales durante la exposición. Cuando la observación de los animales esté dificultada por el uso de tubos de sujeción, por la escasa iluminación de las cámaras de cuerpo entero o por la opacidad ambiental, se someterán a observación minuciosa después de la exposición. Las observaciones realizadas con anterioridad a la exposición del día siguiente permiten determinar la posible reversibilidad o exacerbación de los efectos tóxicos. | 32. | Todas las observaciones se registrarán en fichas individuales de cada animal. Cuando se encuentre algún animal muerto o se sacrifique por razones compasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la muerte. | 33. | Las observaciones en la jaula deberían incluir los cambios en la piel, ojos y membranas mucosas; los cambios en los sistemas respiratorio, circulatorio y nervioso, así como la actividad somatomotriz y las pautas de comportamiento. Debe prestarse atención especial a la observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. El registro de la temperatura rectal puede ayudar a detectar una bradipnea refleja o una hipo/hipertermia relacionadas con el tratamiento o con el confinamiento. En el protocolo del estudio se pueden incluir otras evaluaciones del tipo de pruebas cinéticas, biovigilancia, pruebas de la función pulmonar, retención de materiales escasamente solubles que puedan acumularse en el tejido pulmonar y cambios comportamentales. | PESO CORPORAL | 34. | Se registrará el peso de cada animal poco antes de la primera exposición (día 0), y después dos veces por semana (por ejemplo, los viernes y lunes para demostrar la recuperación durante un fin de semana sin exposición, o en un intervalo que permita evaluar la toxicidad sistémica) y en el momento de la muerte o la eutanasia. Si no se observan efectos en las 2 primeras semanas, el peso corporal se podrá registrar semanalmente durante el resto del estudio. Si se utilizan animales satélite (reversibilidad), se seguirán pesando semanalmente durante todo el período de recuperación. Al concluir el estudio, se pesarán todos los animales poco antes del sacrificio para permitir calcular sin sesgos la relación entre el peso de los órganos y el peso corporal. | CONSUMO DE AGUA Y DE ALIMENTOS | 35. | El consumo alimentario se medirá cada semana. También se puede medir el consumo de agua. | PATOLOGÍA CLÍNICA | 36. | Deben hacerse evaluaciones de patología clínica en todos los animales, incluidos los testigo y los satélite (reversibilidad), cuando sean sacrificados. Se registrará el intervalo de tiempo transcurrido entre el final de la exposición y la toma de muestras de sangre, particularmente si la recuperación del parámetro valorado es rápida. Está indicado obtener muestras al final del período de exposición cuando se trata de parámetros con una semivida plasmática corta (por ejemplo, COHb, CHE y MetHb). | 37. | En el cuadro 1 se recogen los parámetros de patología clínica que se suelen exigir en todos los estudios toxicológicos. El análisis de orina no es necesario de forma sistemática, sino solo en caso de efectos tóxicos probables o manifiestos. El director del estudio puede decidir la evaluación de otros parámetros para caracterizar mejor la toxicidad de una sustancia problema (colinesterasa, lípidos, hormonas, equilibrio ácido-base, metahemoglobina o cuerpos de Heinz, creatina-cinasa, cociente mieloide/eritroide, troponinas, gases en sangre arterial, lactato-deshidrogenasa, sorbitol-deshidrogenasa, glutamato-deshidrogenasa y gamma-glutamil-transpeptidasa). | Cuadro 1 | Parámetros de patología clínica habituales | Hematología | Recuento de eritrocitos | Hematocrito | Concentración de hemoglobina | Hemoglobina corpuscular media | Volumen corpuscular medio | Concentración de hemoglobina corpuscular media | Reticulocitos | Recuento de leucocitos | Fórmula leucocitaria | Recuento de plaquetas | Capacidad de coagulación (seleccionar una): | — | Tiempo de protrombina | — | Tiempo de coagulación | — | Tiempo de tromboplastina parcial | Bioquímica | Glucosa (*1) | Colesterol total | Triglicéridos | Nitrógeno ureico en sangre | Bilirrubina total | Creatinina | Proteínas totales | Albúmina | Globulinas | Alanina-aminotransferasa | Aspartato-aminotransferasa | Fosfatasa alcalina | Potasio | Sodio | Calcio | Fósforo | Cloruros | Análisis de orina (opcional) | Aspecto (color y turbidez) | Volumen | Densidad y osmolalidad | pH | Proteínas totales | Glucosa | Sangre/células sanguíneas | 38. | Cuando hay indicios de que las vías respiratorias bajas (alvéolos) son el lugar principal de depósito y retención, el lavado broncoalveolar (BAL) puede ser la técnica de elección para analizar cuantitativamente los parámetros hipotéticamente dependientes de la dosis relacionados con la aparición de alveolitis, inflamación pulmonar y fosfolipidosis. Ello permite demostrar debidamente la relación dosis-respuesta y la evolución en el tiempo del daño alveolar. En el fluido BAL se puede efectuar el recuento de leucocitos y la fórmula leucocitaria, y medir las proteínas totales y la lactato deshidrogenasa. Otros parámetros dignos de tenerse en cuenta son los indicadores de daño lisosomal, fosfolipidosis, fibrosis e inflamación alérgica o irritativa, como puede ser la determinación de las citocinas o quimiocinas proinflamatorias. Generalmente, las determinaciones realizadas en el BAL son complementarias de los resultados del examen histopatológico, pero no pueden sustituirlos. En el documento GD 39 (2) se facilitan indicaciones sobre el modo de realizar un lavado pulmonar. | ANATOMÍA PATOLÓGICA MACROSCÓPICA Y PESO DE LOS ÓRGANOS | 39. | Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran durante su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar animal, se someterán a sangrado total (de ser factible) y a autopsia macroscópica. Se documentará el tiempo transcurrido entre el final de la última exposición de cada animal y su sacrificio. Si la autopsia no se puede practicar inmediatamente después de comprobar la muerte del animal, este será refrigerado (no congelado) a una temperatura suficientemente baja para minimizar la autólisis. Las autopsias se practicarán lo antes posible, normalmente en el plazo de uno o dos días. Se documentarán todas las modificaciones anatomopatológicas macroscópicas observadas en cada animal, poniendo especial atención a las alteraciones de las vías respiratorias. | 40. | En el cuadro 2 se indican los órganos y tejidos que durante la autopsia macroscópica deben conservarse en un medio idóneo para su examen histopatológico. La conservación de los órganos y tejidos entre corchetes, así como de cualquier otro órgano o tejido, se hará a criterio del director del estudio. Los órganos destacados en negrita se deben limpiar de adherencias y pesar lo antes posible después de la disección para evitar su desecación. El tiroides y los epidídimos solo se pesarán en caso necesario, porque artefactos debidos a las adherencias pueden dificultar la evaluación histopatológica. Los tejidos y órganos se fijan en formol con amortiguador al 10 % o en otro fijador apropiado inmediatamente después de la autopsia, dejando pasar un mínimo de 24-48 horas antes de la limpieza de adherencias, dependiendo del fijador empleado. | Cuadro 2 | Órganos y tejidos conservados durante la autopsia macroscópica | Cápsulas suprarrenales | Médula ósea (y/o aspirado reciente) | Encéfalo (incluidos cortes de cerebro, cerebelo, bulbo y protuberancia) | [Ojos (retina, nervio óptico) y párpados] | Corazón | Riñones | Laringe (3 secciones de corte histológico, 1 de ellas de la base de la epiglotis) | Hígado | Pulmón (todos los lóbulos en una sección de corte, incluidos los bronquios primarios) | Ganglios linfáticos de la región hiliar del pulmón, especialmente cuando se estudian sustancias problema particuladas escasamente solubles. Si se trata de exámenes más minuciosos o de carácter inmunológico, pueden tomarse en consideración otros ganglios linfáticos, por ejemplo de las regiones mediastínica, cervical/submandibular o auricular. | Tejidos nasofaríngeos [como mínimo 4 secciones; 1 sección incluirá el conducto nasofaríngeo y el tejido linfoide asociado a la nariz (Nasal Associated Lymphoid Tissue, NALT)] | Esófago | [Bulbo olfativo] | Ovarios | Vesículas seminales | Médula espinal (cervical, medio dorsal y lumbar) | Bazo | Estómago | Testículos | Timo | Tiroides | Tráquea (como mínimo 2 secciones, 1 sección longitudinal que pase por la carina traqueal y 1 sección transversal) | [Vejiga urinaria] | Útero | Todas las lesiones macroscópicas | 41. | El pulmón se debe extraer intacto, pesar e instilar con un fijador apropiado a una presión de 20-30 cm de agua para asegurar el mantenimiento de la estructura pulmonar (5). Se preparan cortes de todos los lóbulos a un solo nivel, incluyendo los bronquios primarios, pero, si se practica un lavado pulmonar, el lóbulo no lavado se seccionará a tres niveles (no en cortes seriados). | 42. | Deben examinarse como mínimo 4 secciones de los tejidos nasofaríngeos, una de los cuales incluirá el conducto nasofaríngeo (5) (6) (7) (8) (9) para permitir una observación adecuada de los epitelios escamoso, transicional (respiratorio no ciliado) y olfativo, y el tejido de drenaje linfático [NALT; (10) (11)]. Se examinarán tres secciones de la laringe, una de las cuales debe incluir la base de la epiglotis (12). Deben examinarse como mínimo 2 secciones de la tráquea, entre ellas un corte longitudinal que pase por la carina de bifurcación de los bronquios extrapulmonares y un corte transversal. | EXAMEN HISTOPATOLÓGICO | 43. | La evaluación histopatológica de todos los órganos y tejidos mencionados en el cuadro 2 se llevará a cabo en el lote de control y en el de concentración más elevada, así como en todos los animales que mueran o sean sacrificados durante el estudio. Se prestará especial atención a las vías respiratorias, los órganos diana y las lesiones macroscópicas. Aquellos órganos y tejidos que presenten lesiones en el lote de concentración más elevada se examinarán en todos los grupos. Con objeto de demostrar una clara relación concentración-respuesta, el director del estudio puede decidir la realización de evaluaciones histopatológicas en otros grupos. Si se utiliza un lote satélite (reversibilidad), debe hacerse un examen histopatológico de todos los órganos y tejidos que presenten efectos en los lotes tratados. Si en el lote de exposición elevada se producen muertes prematuras u otras contrariedades que comprometan la interpretación de los datos, se practicarán evaluaciones histopatológicas en el lote de la concentración inmediatamente inferior. Se procurará correlacionar las observaciones macroscópicas con los hallazgos microscópicos. | DATOS E INFORME | Datos | 44. | Se documentarán los datos de cada animal referentes a peso corporal, consumo de alimento, patología clínica, anatomía patológica macroscópica, peso de los órganos e histopatología. Los resultados de la observación clínica se reunirán en un cuadro que presente, por cada lote de ensayo, el número de animales utilizados, el número de animales que presenten signos específicos de toxicidad, el número de animales hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte de los distintos animales, la descripción y la evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversibilidad, y los resultados de la autopsia. Todos los resultados, cuantitativos y fortuitos, se evaluarán por un método estadístico apropiado. Puede usarse cualquier método estadístico reconocido; los métodos estadísticos aplicados deben seleccionarse durante el diseño del estudio. | Informe del ensayo | 45. | El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información siguiente: | | Animales de experimentación y zootecnia | — | Descripción de las condiciones de enjaulado, tales como: número (o variación del número) de animales por jaula, materiales de cama, temperatura ambiente y humedad relativa, fotoperíodo e identificación de la dieta. | — | Especie o variedad empleada y justificación del uso de una especie distinta de la rata. Podrán indicarse la procedencia y los datos previos, siempre que correspondan a animales sometidos a condiciones parecidas de exposición, alojamiento y alimentación. | — | Número, edad y sexo de los animales. | — | Método de asignación al azar. | — | Descripción de cualquier acondicionamiento previo al estudio, incluidos alimentación, cuarentena y tratamiento de enfermedades. | | Sustancia problema | — | Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (incluida la isomerización). | — | Identificación química y número de registro del Chemical Abstracts Service (CAS), si se conoce. | | Vehículo | — | Justificación del uso de un vehículo y justificación de la elección del mismo (si es distinto del agua). | — | Datos históricos o paralelos que demuestren que el vehículo no interfiere en los resultados del estudio. | | Cámara de inhalación | — | Descripción pormenorizada de la cámara de inhalación, incluido el volumen, y acompañada de un diagrama. | — | Procedencia y descripción del equipo empleado para la exposición de los animales y la generación de la atmósfera. | — | Instrumental empleado para medir la temperatura, la humedad, el tamaño de partícula y la concentración real. | — | Fuente del aire y sistema de acondicionamiento. | — | Métodos de calibración del instrumental para garantizar una atmósfera experimental homogénea. | — | Diferencia de presión (positiva o negativa). | — | Puertos de exposición por cámara (solo por la nariz); ubicación de los animales en la cámara (de cuerpo entero). | — | Estabilidad de la atmósfera experimental. | — | Localización de los sensores de temperatura y humedad, y muestreo de la atmósfera experimental en la cámara. | — | Tratamiento del aire suministrado/extraído. | — | Caudales de aire, caudal de aire por puerto de exposición (solo por la nariz) o carga de animales por cámara (de cuerpo entero). | — | Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio (t95) en la cámara de inhalación. | — | Número de variaciones de volumen por hora. | — | Dispositivos de dosificación (si procede). | | Datos relativos a la exposición | — | Justificación de la concentración diana seleccionada en el estudio principal. | — | Concentraciones nominales (masa total de sustancia problema generada en la cámara de inhalación dividida por el volumen de aire que recorre la cámara). | — | Concentraciones reales de la sustancia problema recuperadas en la zona de respiración de los animales; en el caso de mezclas que dan lugar a formas físicas heterogéneas (gases, vapores, aerosoles), se podrá analizar cada una de ellas por separado. | — | Todas las concentraciones atmosféricas se registrarán en unidades de masa (mg/l, mg/m3, etc.) y no en unidades de volumen (ppm, ppmm, etc.). | — | Distribución granulométrica, diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) y desviación típica geométrica (σg), incluidos los correspondientes métodos de cálculo. Se documentarán los análisis granulométricos individuales. | | Condiciones del ensayo | — | Pormenores de la preparación de la sustancia problema y de cualquier método empleado para reducir el tamaño de partícula de los sólidos o preparar soluciones de la sustancia problema. | — | Descripción (preferiblemente acompañada de un diagrama) del equipo empleado para generar la atmósfera experimental y para exponer los animales a la misma. | — | Descripción pormenorizada del instrumental empleado para controlar la temperatura, la humedad y el caudal de aire de la cámara (creación de una curva de calibración). | — | Descripción pormenorizada del equipo empleado para tomar las muestras con el fin de medir la concentración de la cámara y la distribución por tamaño de partícula. | — | Descripción pormenorizada del método de análisis químico empleado y de la validación del método (incluida la eficiencia de recuperación de la sustancia problema en el medio ambiente experimental). | — | Método aleatorio de asignación de los animales a los lotes de exposición y de control (testigo). | — | Pormenores sobre la calidad del alimento y del agua (incluido el tipo o procedencia de la alimentación y el origen del agua). | — | Justificación de las concentraciones experimentales seleccionadas. | | Resultados | — | Tabulación de los valores de temperatura, humedad y caudal de aire de la cámara. | — | Tabulación de las concentraciones nominales y reales de la cámara. | — | Tabulación de los datos de granulometría, incluidos los de recogida de muestras para el análisis, distribución granulométrica y cálculos de MMAD y σg. | — | Tabulación de las respuestas y de los niveles de concentración de cada animal (es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la mortalidad y la naturaleza, gravedad, momento de aparición y duración de los efectos). | — | Tabulación de los pesos de los animales individuales. | — | Tabulación del consumo de alimentos. | — | Tabulación de los datos de patología clínica. | — | Resultados de la autopsia y eventuales observaciones histopatológicas de cada animal, si se dispone de ellas. | — | Tabulación de cualesquiera otros parámetros analizados. | | Evaluación e interpretación de los resultados | — | Se hará especial hincapié en la descripción de los procedimientos empleados para satisfacer los criterios del presente método de ensayo como, por ejemplo, la concentración límite o el tamaño de partícula. | — | Se tomará en consideración la respirabilidad de las partículas a la luz de los resultados globales, de manera especial si no se cumplen los criterios relativos al tamaño de partícula. | — | En la evaluación global del estudio se expondrá la coherencia de los métodos empleados para determinar las concentraciones nominales y reales y la relación entre ellas. | — | Se explicará la causa probable de muerte y el mecanismo de acción (sistémico o local) predominante. | — | Se facilitará una explicación de por qué ha sido preciso sacrificar de forma compasiva los animales con signos evidentes de dolor o de sufrimiento intenso y duradero, atendiendo a los criterios del documento de orientación de la OCDE sobre parámetros de tratamiento compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (3). | — | Se identificarán el órgano o los órganos diana. | — | Se determinarán los valores de NOAEL y LOAEL. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (4) | Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258. | (6) | Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. | (7) | Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238. | (8) | Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. | (9) | Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. | (10) | Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. | (11) | Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. | (12) | Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428. | (13) | Reglamento (CE) no 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE, y se modifica el Reglamento (CE) no 1907/2006 (DO L 353 de 31.12.2008, p. 1). | Apéndice 1 | DEFINICIÓN | Sustancia problema: cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este método de ensayo. | » |
| (5) | Chapters B.29 and B.30 are replaced by the following: | ‘B.29. SUBCHRONIC INHALATION TOXICITY: 90-DAY STUDY | SUMMARY | This revised Test Method B.29 has been designed to fully characterise test chemical toxicity by the inhalation route for a subchronic duration (90 days), and to provide robust data for quantitative inhalation risk assessments. Groups of 10 male and 10 female rodents are exposed 6 hours per day during a 90 day (13 week) period to a) the test chemical at three or more concentration levels, b) filtered air (negative control), and/or c) the vehicle (vehicle control). Animals are generally exposed 5 days per week but exposure for 7 days per week is also allowed. Males and females are always tested, but they may be exposed at different concentration levels if it is known that one sex is more susceptible to a given test chemical. This method allows the study director the flexibility to include satellite (reversibility) groups, interim sacrifices, bronchoalveolar lavage (BAL), neurologic tests, and additional clinical pathology and histopathological evaluations in order to better characterise the toxicity of a test chemical. | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline 413 (2009). The original subchronic inhalation Test Guideline 413 (TG 413) was adopted in 1981 (1). This Test Method B.29 (as equivalent to the revised TG 413 (2009)) has been updated to reflect the state of the science and to meet current and future regulatory needs. | 2. | Subchronic inhalation toxicity studies are primarily used to derive regulatory concentrations for assessing worker risk in occupation settings. They are also used to assess human residential, transportation, and environmental risk. This method enables the characterisation of adverse effects following repeated daily inhalation exposure to a test chemical for 90 days (approximately 10 % of the lifespan of a rat). The data derived from subchronic inhalation toxicity studies can be used for quantitative risk assessments and for the selection of concentrations for chronic studies. This test method is not specifically intended for the testing of nanomaterials. Definitions used in the context of this Test Method are provided at the end of this chapter and in the Guidance Document (GD) 39 (2). | INITIAL CONSIDERATIONS | 3. | All available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study in order to enhance the quality of the study and minimise animal usage. Information that will assist in the selection of appropriate test concentrations might include the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally related chemicals; and data derived from other repeated exposure studies. If neurotoxicity is expected or is observed in the course of the study, the study director may choose to include appropriate evaluations such as a functional observational battery (FOB) and measurement of motor activity. Although the timing of exposures relative to specific examinations may be critical, the performance of these additional activities should not interfere with the basic study design. | 4. | Dilutions of corrosive or irritating test chemicals may be tested at concentrations that will yield the desired degree of toxicity. Please refer to GD 39 (2) for further information. When exposing animals to these materials, the targeted concentrations should be low enough to not cause marked pain and distress, yet sufficient to extend the concentration-response curve to levels that reach the regulatory and scientific objective of the test. These concentrations should be selected on a case-by-case basis, preferably based upon an adequately designed range-finding study that provides information regarding the critical endpoint, any irritation threshold, and the time of onset (see paragraphs 11-13). The justification for concentration selection should be provided. | 5. | Moribund animals or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress should be humanely killed. Moribund animals are considered in the same way as animals that die on test. Criteria for making the decision to kill moribund or severely suffering animals, and guidance on the recognition of predictable or impending death, are the subject of an OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of Animal Species | 6. | Healthy young adult rodents of commonly used laboratory strains should be employed. The preferred species is the rat. Justification should be provided if other species are used. | Preparation of Animals | 7. | Females should be nulliparous and non-pregnant. On the day of randomisation, animals should be young adults 7 to 9 weeks of age. Body weights should be within ± 20 % of the mean weight for each sex. The animals are randomly selected, marked for individual identification, and kept in their cages for at least 5 days prior to the start of the test to allow for acclimatization to laboratory conditions. | Animal Husbandry | 8. | Animals should be individually identified, preferably with subcutaneous transponders, to facilitate observations and avoid confusion. The temperature of the experimental animal maintenance room should be 22 ± 3 °C. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, though this may not be possible when using water as a vehicle. Before and after exposures, animals generally should be caged in groups by sex and concentration, but the number of animals per cage should not interfere with clear observation of each animal and should minimise losses due to cannibalism and fighting. When animals are to be exposed nose-only, it may be necessary for them to be acclimated to the restraining tubes. The restraining tubes should not impose undue physical, thermal, or immobilisation stress on the animals. Restraint may affect physiological endpoints such as body temperature (hyperthermia) and/or respiratory minute volume. If generic data are available to show that no such changes occur to any appreciable extent, then pre-adaptation to the restraining tubes is not necessary. Animals exposed whole-body to an aerosol should be housed individually during exposure to prevent them from filtering the test aerosol through the fur of their cage mates. Conventional and certified laboratory diets may be used, except during exposure, accompanied with an unlimited supply of municipal drinking water. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light/12 hours dark. | Inhalation Chambers | 9. | The nature of the test chemical and the object of the test should be considered when selecting an inhalation chamber. The preferred mode of exposure is nose-only (which term includes head-only, nose-only, or snout-only). Nose-only exposure is generally preferred for studies of liquid or solid aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. Special objectives of the study may be better achieved by using a whole-body mode of exposure, but this should be justified in the study report. To ensure atmosphere stability when using a whole-body chamber, the total volume of the test animals should not exceed 5 % of the chamber volume. Principles of the nose-only and whole body exposure techniques and their particular advantages and disadvantages are addressed in GD 39 (2). | TOXICITY STUDIES | Limit Concentrations | 10. | Unlike with acute studies, there are no defined limit concentrations in subchronic inhalation toxicity studies. The maximum concentration tested should consider: 1) the maximum attainable concentration, 2) the “worst case” human exposure level, 3) the need to maintain an adequate oxygen supply, and/or 4) animal welfare considerations. In the absence of data-based limits, the acute limits of Regulation (EC) No 1272/2008 (13) may be used (i.e. up to a maximum concentration of 5 mg/l for aerosols, 20 mg/l for vapours, and 20 000 ppm for gases); refer to GD 39 (2). Justification should be provided if it is necessary to exceed these limits when testing gases or highly volatile test chemicals (e.g. refrigerants). The limit concentration should elicit unequivocal toxicity without causing undue stress to the animals or affecting their longevity (3). | Range-Finding Study | 11. | Before commencing with the main study, it is generally necessary to perform a range-finding study. A range-finding study is more comprehensive than a sighting study because it is not limited to concentration selection. Knowledge learned from a range-finding study can lead to a successful main study. A range-finding study may, for example, provide technical information regarding analytical methods, particle sizing, discovery of toxic mechanisms, clinical pathology and histopathological data, and estimations of what may be NOAEL and MTC concentrations in a main study. The study director may choose to use the range-finding study to identify the threshold of respiratory tract irritation (e.g. with histopathology of the respiratory tract, pulmonary function testing, or bronchoalveolar lavage), the upper concentration which is tolerated without undue stress to the animals, and the parameters that will best characterise a test chemical’s toxicity. | 12. | A range-finding study may consist of one or more concentration levels. Depending on the endpoints chosen, three to six males and three to six females should be exposed at each concentration level. A range-finding study should last a minimum of 5 days and generally no more than 28 days. The rationale for the selection of concentrations for the main study should be provided in the study report. The objective of the main study is to demonstrate a concentration-response relationship based on what is anticipated to be the most sensitive endpoint. The low concentration should ideally be a no-observed-adverse effect concentration while the high concentration should elicit unequivocal toxicity without causing undue stress to the animals or affecting their longevity (3). | 13. | When selecting concentration levels for the range-finding study, all available information should be considered including structure-activity relationships and data for similar chemicals (see paragraph 3). A range-finding study may verify/refute what are considered to be the most sensitive mechanistically based endpoints, e.g. cholinesterase inhibition by organophosphates, methaemoglobin formation by erythrocytotoxic agents, thyroidal hormones (T3, T4) for thyrotoxicants, protein, LDH, or neutrophils in bronchoalveolar lavage for innocuous poorly soluble particles or pulmonary irritant aerosols. | Main Study | 14. | The main subchronic toxicity study generally consists of three concentration levels, and also concurrent negative (air) and/or vehicle controls as needed (see paragraph 18). All available data should be utilised to aid selection of appropriate exposure levels, including the results of systemic toxicity studies, metabolism and kinetics (particular emphasis should be given to avoiding high concentration levels which saturate kinetic processes). Each test group contains 10 male and 10 female rodents that are exposed to the test chemical for 6 hours per day on a 5 day per week basis for a period of 13 weeks (total study duration of at least 90 days). Animals may also be exposed 7 days per week (e.g. when testing inhaled pharmaceuticals). If one sex is known to be more susceptible to a given test chemical, the sexes may be exposed at different concentration levels in order to optimise the concentration-response as described in paragraph 15. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration less than 6 hours/day, or when it is necessary to conduct a long duration (e.g. 22 hours/day) whole-body exposure study (refer to GD 39) (2). Feed should be withheld during the exposure period unless exposure exceeds 6 hours. Water may be provided throughout a whole-body exposure. | 15. | The target concentrations selected should identify the target organ(s) and demonstrate a clear concentration-response: | — | The high concentration level should result in toxic effects but not cause lingering signs or lethality which would prevent a meaningful evaluation. | — | The intermediate concentration level(s) should be spaced to produce a gradation of toxic effects between that of the low and high concentration. | — | The low concentration level should produce little or no evidence of toxicity. | Interim Sacrifices | 16. | If interim sacrifices are planned, the number of animals at each exposure level should be increased by the number to be sacrificed before study completion. The rationale for using interim sacrifices should be provided, and statistical analyses should properly account for them. | Satellite (Reversibility) Study | 17. | A satellite (reversibility) study may be used to observe reversibility, persistence, or delayed occurrence of toxicity for a post-treatment period of an appropriate length, but no less than 14 days. Satellite (reversibility) groups consist of 10 males and 10 females exposed contemporaneously with the experimental animals in the main study. Satellite (reversibility) study groups should be exposed to the test chemical at the highest concentration level and there should be concurrent air and/or vehicle controls as needed (see paragraph 18). | Control Animals | 18. | Concurrent negative (air) control animals should be handled in a manner identical to the test group animals except that they are exposed to filtered air rather than test chemical. When water or another substance is used to assist in generating the test atmosphere, a vehicle control group, instead of a negative (air) control group, should be included in the study. Water should be used as the vehicle whenever possible. When water is used as the vehicle, the control animals should be exposed to air with the same relative humidity as the exposed groups. The selection of a suitable vehicle should be based on an appropriately conducted pre-study or historical data. If a vehicle’s toxicity is not well known, the study director may choose to use both a negative (air) control and a vehicle control, but this is strongly discouraged. If historical data reveal that a vehicle is non-toxic, then there is no need for a negative (air) control group and only a vehicle control should be used. If a pre-study of a test chemical formulated in a vehicle reveals no toxicity, it follows that the vehicle is non-toxic at the concentration tested and this vehicle control should be used. | EXPOSURE CONDITIONS | Administration of Concentrations | 19. | Animals are exposed to the test chemical as a gas, vapour, aerosol, or a mixture thereof. The physical state to be tested depends on the physico-chemical properties of the test chemical, the selected concentrations, and/or the physical form most likely present during the handling and use of the test chemical. Hygroscopic and chemically reactive test chemicals should be tested under dry air conditions. Care should be taken to avoid generating explosive concentrations. Particulate materials may be subjected to mechanical processes to decrease the particle size. Further guidance is provided in GD 39 (2). | Particle-Size Distribution | 20. | Particle sizing should be performed for all aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. To allow for exposure of all relevant regions of the respiratory tract, aerosols with mass median aerodynamic diameters (MMAD) ranging from 1 to 3 μm with a geometric standard deviation (σg) in the range of 1,5 to 3,0 are recommended (4). Although a reasonable effort should be made to meet this standard, expert judgement should be provided if it cannot be achieved. For example, metal fume particles will be smaller than this standard, and charged particles and fibres may exceed it. | Test chemical Preparation in a Vehicle | 21. | Ideally, the test chemical should be tested without a vehicle. If it is necessary to use a vehicle to generate an appropriate test chemical concentration and particle size, water should be given preference. Whenever a test chemical is dissolved in a vehicle, its stability should be demonstrated. | MONITORING OF EXPOSURE CONDITIONS | Chamber Airflow | 22. | The flow of air through the exposure chamber should be carefully controlled, continuously monitored, and recorded at least hourly during each exposure. The real-time monitoring of the test atmosphere concentration (or temporal stability) is an integral measurement of all dynamic parameters and provides an indirect means to control all relevant dynamic inhalation parameters. If the concentration is monitored real-time, the frequency of measurement of air flows may be reduced to one single measurement per exposure per day. Special consideration should be given to avoiding rebreathing in nose-only chambers. Oxygen concentration should be at least 19 % and carbon dioxide concentration should not exceed 1 %. If there is reason to believe that this standard cannot be met, oxygen and carbon dioxide concentrations should be measured. If measurements on the first day of exposure show that these gases are at proper levels, no further measurements should be necessary. | Chamber Temperature and Relative Humidity | 23. | Chamber temperature should be maintained at 22 ± 3 °C. Relative humidity in the animals’ breathing zone, for both nose-only and whole-body exposures, should be monitored continuously and recorded hourly during each exposure where possible. The relative humidity should preferably be maintained in the range of 30 to 70 %, but this may either be unattainable (e.g. when testing water based mixtures) or not measurable due to test chemical interference with the Test Method. | Test chemical: Nominal Concentration | 24. | Whenever feasible, the nominal exposure chamber concentration should be calculated and recorded. The nominal concentration is the mass of generated test chemical divided by the total volume of air passed through the inhalation chamber system. The nominal concentration is not used to characterise the animals’ exposure, but a comparison of the nominal concentration and the actual concentration gives an indication of the generation efficiency of the test system, and thus may be used to discover generation problems. | Test chemical: Actual Concentration | 25. | The actual concentration is the test chemical concentration as sampled at the animals’ breathing zone in an inhalation chamber. Actual concentrations can be obtained either by specific methods (e.g. direct sampling, adsorptive or chemical reactive methods, and subsequent analytical characterisation) or by non-specific methods such as gravimetric filter analysis. The use of gravimetric analysis is acceptable only for single component powder aerosols or aerosols of low volatility liquids and should be supported by appropriate pre-study test chemical-specific characterisations. Multi-component powder aerosol concentration may also be determined by gravimetric analysis. However, this requires analytical data which demonstrate that the composition of airborne material is similar to the starting material. If this information is not available, a reanalysis of the test chemical (ideally in its airborne state) at regular intervals during the course of the study may be necessary. For aerosolised agents that may evaporate or sublimate, it should be shown that all phases were collected by the method chosen. | 26. | One lot of the test chemical should be used throughout the duration of the study, if possible, and the test sample should be stored under conditions that maintain its purity, homogeneity, and stability. Prior to the start of the study, there should be a characterisation of the test chemical, including its purity and, if technically feasible, the identity, and quantities of identified contaminants and impurities. This can be demonstrated by, but is not limited to, the following data: retention time and relative peak area, molecular weight from mass spectroscopy or gas chromatography analyses, or other estimates. Although the test sample’s identity is not the responsibility of the test laboratory, it may be prudent for the test laboratory to confirm the sponsor’s characterisation at least in a limited way (e.g. colour, physical nature, etc.). | 27. | The exposure atmosphere should be held as constant as practicable. A real-time monitoring device, such as an aerosol photometer for aerosols or a total hydrocarbon analyser for vapours, may be used to demonstrate the stability of the exposure conditions. Actual chamber concentration should be measured at least 3 times during each exposure day for each exposure level. If not feasible due to limited air flow rates or low concentrations, one sample per exposure period is acceptable. Ideally, this sample should then be collected over the entire exposure period. Individual chamber concentration samples should deviate from the mean chamber concentration by no more than ± 10 % for gases and vapours, and by no more than ± 20 % for liquid or solid aerosols. Time to attain chamber equilibration (t95) should be calculated and reported. The duration of an exposure spans the time that the test chemical is generated. This takes into account the times required to attain chamber equilibration (t95) and decay. Guidance for estimating t95 can be found in GD 39 (2). | 28. | For very complex mixtures consisting of gases/vapours and aerosols (e.g. combustion atmospheres and test chemicals propelled from purpose-driven end-use products/devices), each phase may behave differently in an inhalation chamber. Therefore, at least one indicator substance (analyte), normally the principal active ingredient in the mixture, of each phase (gas/vapour and aerosol) should be selected. When the test chemical is a mixture, the analytical concentration should be reported for the total mixture, and not just for the active ingredient or the indicator substance (analyte). Additional information regarding actual concentrations can be found in GD 39 (2). | Test chemical: Particle Size Distribution | 29. | The particle size distribution of aerosols should be determined at least weekly for each concentration level by using a cascade impactor or an alternative instrument such as an aerodynamic particle sizer (APS). If equivalence of the results obtained by a cascade impactor and the alternative instrument can be shown, then the alternative instrument may be used throughout the study. | 30. | A second device, such as a gravimetric filter or an impinger/gas bubbler, should be used in parallel to the primary instrument to confirm the collection efficiency of the primary instrument. The mass concentration obtained by particle size analysis should be within reasonable limits of the mass concentration obtained by filter analysis [see GD 39 (2)]. If equivalence can be demonstrated at all concentrations tested in the early phase of the study, then further confirmatory measurements may be omitted. For the sake of animal welfare, measures should be taken to minimise inconclusive data which may lead to a need to repeat a study. | 31. | Particle sizing should be performed for vapours if there is any possibility that vapour condensation may result in the formation of an aerosol, or if particles are detected in a vapour atmosphere with potential for mixed phases. | OBSERVATIONS | 32. | The animals should be clinically observed before, during, and after the exposure period. More frequent observations may be indicated depending on the response of the animals during exposure. When animal observation is hindered by the use of animal restraint tubes, poorly lit whole body chambers, or opaque atmospheres, animals should be carefully observed after exposure. Observations before the next day’s exposure can assess any reversibility or exacerbation of toxic effects. | 33. | All observations are recorded with individual records being maintained for each animal. When animals are killed for humane reasons or found dead, the time of death should be recorded as precisely as possible. | 34. | Cage-side observations should include changes in the skin and fur, eyes, and mucous membranes; changes in the respiratory and circulatory systems; changes in the nervous system; and changes in somatomotor activity and behaviour patterns. Attention should be directed to observations of tremors, convulsions, salivation, diarrhoea, lethargy, sleep, and coma. The measurement of rectal temperatures may provide supportive evidence of reflex bradypnea or hypo/hyperthermia related to treatment or confinement. Additional assessments may be included in the study protocol such as kinetics, biomonitoring, lung function, retention of poorly soluble materials that accumulate in lung tissue, and behavioural changes. | BODY WEIGHTS | 35. | Individual animal weights should be recorded shortly before the first exposure (day 0), twice weekly thereafter (for example: on Fridays and Mondays to demonstrate recovery over an exposure-free weekend, or at a time interval to allow assessment of systemic toxicity), and at the time of death or euthanasia. If there are no effects in the first 4 weeks, body weights may be measured weekly for the remainder of the study. Satellite (reversibility) animals (if used) should continue to be weighed weekly throughout the recovery period. At study termination, all animals should be weighed shortly before sacrifice to allow for an unbiased calculated of organ to body weight ratios. | FOOD AND WATER CONSUMPTION | 36. | Food consumption should be measured weekly. Water consumption may also be measured. | CLINICAL PATHOLOGY | 37. | Clinical pathology assessments should be made for all animals, including controls and satellite (reversibility) animals, when they are sacrificed. The time interval between the end of exposure and blood collection should be recorded, particularly when the reconstitution of the addressed endpoint is rapid. Sampling following the end of exposure is indicated for those parameters with a short plasma half-time (e.g. COHb, CHE, and MetHb). | 38. | Table 1 lists the clinical pathology parameters that are generally required for all toxicology studies. Urinalysis is not required on a routine basis, but may be performed when deemed useful based on expected or observed toxicity. The study director may choose to assess additional parameters in order to better characterise a test chemical’s toxicity (e.g. cholinesterase, lipids, hormones, acid/base balance, methaemoglobin or Heinz bodies, creatine kinase, myeloid/erythroid ratio, troponins, arterial blood gases, lactate dehydrogenase, sorbital dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, and gamma glutamyl transpeptidase). | Table 1 | Standard Clinical Pathology Parameters | Haematology | Erythrocyte count | Haematocrit | Haemoglobin concentration | Mean corpuscular haemoglobin | Mean corpuscular volume | Mean corpuscular haemoglobin concentration | Reticulocytes | Total leukocyte count | Differential leukocyte count | Platelet count | Clotting potential (select one): | — | Prothrombin time | — | Clotting time | — | Partial thromboplastin time | Clinical Chemistry | Glucose (*2) | Total cholesterol | Triglycerides | Blood urea nitrogen | Total bilirubin | Creatinine | Total protein | Albumin | Globulin | Alanine aminotransferase | Aspartate aminotransferase | Alkaline phosphatase | Potassium | Sodium | Calcium | Phosphorus | Chloride | Urinalysis (optional) | Appearance (colour and turbidity) | Volume | Specific gravity or osmolality | pH | Total protein | Glucose | Blood/blood cells | 39. | When there is evidence that the lower respiratory tract (i.e. the alveoli) is the primary site of deposition and retention, then bronchoalveolar lavage (BAL) may be the technique of choice to quantitatively analyse hypothesis-based dose-effect parameters focusing on alveolitis, pulmonary inflammation, and phospholipidosis. This allows for dose-response and time-course changes of alveolar injury to be suitably probed. The BAL fluid may be analysed for total and differential leukocyte counts, total protein, and lactate dehydrogenase. Other parameters that may be considered are those indicative of lysosomal injury, phospholipidosis, fibrosis, and irritant or allergic inflammation which may include the determination of pro-inflammatory cytokines/chemokines. BAL measurements generally complement the results from histopathology examinations but cannot replace them. Guidance on how to perform lung lavage can be found in GD 39 (2). | OPHTHALMOLOGICAL EXAMINATION | 40. | Using an ophthalmoscope or an equivalent device, ophthalmological examinations of the fundus, refractive media, iris, and conjunctivae should be performed for all animals prior to the administration of the test chemical, and for all high concentration and control groups at termination. If changes in the eyes are detected, all animals in the other groups should be examined including the satellite (reversibility) group. | GROSS PATHOLOGY AND ORGAN WEIGHTS | 41. | All test animals, including those which die during the test or are removed from the study for animal welfare reasons, should be subjected to complete exsanguination (if feasible) and gross necropsy. The time between the end of each animal’s last exposure and its sacrifice should be recorded. If a necropsy cannot be performed immediately after a dead animal is discovered, the animal should be refrigerated (not frozen) at a temperature low enough to minimise autolysis. Necropsies should be performed as soon as possible, normally within a day or two. All gross pathological changes should be recorded for each animal with particular attention to any changes in the respiratory tract. | 42. | Table 2 lists the organs and tissues that should be preserved in a suitable medium during gross necropsy for histopathological examination. The preservation of the [bracketed] organs and tissues and any other organs and tissues is at the discretion of the study director. The bolded organs should be trimmed and weighed wet as soon as possible after dissection to avoid drying. The thyroid and epididymides should only be weighed if needed because trimming artefacts may hinder histopathological evaluation. Tissues and organs should be fixed in 10 % buffered formalin or another suitable fixative as soon as necropsy is performed, and no less than 24-48 hours prior to trimming depending on the fixative to be used. | Table 2 | Organs and Tissues Preserved During Gross Necropsy | Adrenals | Aorta | Bone marrow (and/or fresh aspirate) | Brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | Caecum | Colon | Duodenum | [Epididymides] | [Eyes (retina, optic nerve) and eyelids] | Femur and stifle joint | Gallbladder (where present) | [Harderian glands] | Heart | Ileum | Jejunum | Kidneys | [Lacrimal glands (extraorbital)] | Larynx (3 levels including the base of the epiglottis) | Liver | Lung (all lobes at one level, including main bronchi) | Lymph nodes from the hilar region of the lung, especially for poorly soluble particulate test chemicals. For more in depth examinations and/or studies with immunological focus, additional lymph nodes may be considered, e.g. those from the mediastinal, cervical/submandibular and/or auricular regions. | Lymph nodes (distal from the portal-of-entry) | Mammary gland (female) | Muscle (thigh) | Nasopharyngeal tissues (at least 4 levels; 1 level to include the nasopharyngeal duct and the Nasal Associated Lymphoid Tissue (NALT)) | Oesophagus | [Olfactory bulb] | Ovaries | Pancreas | Parathyroids | Peripheral nerve (sciatic or tibial, preferably close to muscle) | Pituitary | Prostate | Rectum | Salivary glands | Seminal vesicles | Skin | Spinal cord (cervical, mid-thoracic, and lumbar) | Spleen | Sternum | Stomach | Teeth | Testes | Thymus | Thyroids | [Tongue] | Trachea (at least 2 levels including 1 longitudinal section through the carina and 1 transverse section) | [Ureter] | [Urethra] | Urinary bladder | Uterus | Target organs | All gross lesions and masses | 43. | The lungs should be removed intact, weighed, and instilled with a suitable fixative at a pressure of 20-30 cm of water to ensure that lung structure is maintained (5). Sections should be collected for all lobes at one level, including main bronchi, but if lung lavage is performed, the unlavaged lobe should be sectioned at three levels (not serial sections). | 44. | At least 4 levels of the nasopharyngeal tissues should be examined, one of which should include the nasopharyngeal duct (5) (6) (7) (8) (9) to allow adequate examination of the squamous, transitional (non-ciliated respiratory), respiratory (ciliated respiratory) and olfactory epithelium, and the draining lymphatic tissue (NALT) (10) (11). Three levels of the larynx should be examined, and one of these levels should include the base of the epiglottis (12). At least two levels of the trachea should be examined including one longitudinal section through the carina of the bifurcation of the extrapulmonary bronchi and one transverse section. | HISTOPATHOLOGY | 45. | A histopathological evaluation of all the organs and tissues listed in Table 2 should be performed for the control and high concentration groups, and for all animals which die or are sacrificed during the study. Particular attention should be paid to the respiratory tract, target organs, and gross lesions. The organs and tissues that have lesions in the high concentration group should be examined in all groups. The study director may choose to perform histopathological evaluations for additional groups to demonstrate a clear concentration response. When a satellite (reversibility) group is used, histopathological evaluation should be performed for all tissues and organs identified as showing effects in the treated groups. If there are excessive early deaths or other problems in the high exposure group that compromise the significance of the data, the next lower concentration should be examined histopathologically. An attempt should be made to correlate gross observations with microscopic findings. | DATA AND REPORTING | Data | 46. | Individual animal data on body weights, food consumption, clinical pathology, gross pathology, organ weights, and histopathology should be provided. Clinical observation data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals used, the number of animals displaying specific signs of toxicity, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons, time of death of individual animals, a description and time course of toxic effects and reversibility, and necropsy findings. All results, quantitative and incidental, should be evaluated by an appropriate statistical method. Any generally accepted statistical method may be used and the statistical methods should be selected during the design of the study. | Test Report | 47. | The test report should include the following information, as appropriate: | | Test animals and husbandry | — | Description of caging conditions, including: number (or change in number) of animals per cage, bedding material, ambient temperature and relative humidity, photoperiod, and identification of diet. | — | Species/strain used and justification for using a species other than the rat. Source and historical data may be provided, if they are for animals exposed under similar exposure, housing, and fasting conditions. | — | Number, age, and sex of animals. | — | Method of randomisation. | — | Description of any pre-test conditioning including diet, quarantine, and treatment for disease. | | Test chemical | — | Physical nature, purity, and, where relevant, physico-chemical properties (including isomerisation). | — | Identification data and Chemical Abstract Services (CAS) Registry Number, if known. | | Vehicle | — | Justification for use of vehicle and justification for choice of vehicle (if other than water). | — | Historical or concurrent data demonstrating that the vehicle does not interfere with the outcome of the study. | | Inhalation chamber | — | Detailed description of the inhalation chamber including volume and a diagram. | — | Source and description of equipment used for the exposure of animals as well as generation of atmosphere. | — | Equipment for measuring temperature, humidity, particle-size, and actual concentration. | — | Source of air and system used for conditioning. | — | Methods used for calibration of equipment to ensure a homogeneous test atmosphere. | — | Pressure difference (positive or negative). | — | Exposure ports per chamber (nose-only); location of animals in the chamber (whole-body). | — | Stability of the test atmosphere. | — | Location of temperature and humidity sensors and sampling of test atmosphere in the chamber. | — | Treatment of air supplied/extracted. | — | Air flow rates, air flow rate/exposure port (nose-only), or animal load/chamber (whole-body). | — | Time to inhalation chamber equilibrium (t95). | — | Number of volume changes per hour. | — | Metering devices (if applicable). | | Exposure data | — | Rationale for target concentration selection in the main study. | — | Nominal concentrations (total mass of test chemical generated into the inhalation chamber divided by the volume of air passed through the chamber). | — | Actual test chemical concentrations collected from the animals’ breathing zone; for mixtures that produce heterogeneous physical forms (gases, vapours, aerosols), each may be analysed separately. | — | All air concentrations should be reported in units of mass (mg/l, mg/m3, etc.) rather than in units of volume (ppm, ppb, etc.). | — | Particle size distribution, mass median aerodynamic diameter (MMAD), and geometric standard deviation (σg), including their methods of calculation. Individual particle size analyses should be reported. | | Test conditions | — | Details of test chemical preparation, including details of any procedures used to reduce the particle size of solid materials or to prepare solutions of the test chemical. | — | A description (preferably including a diagram) of the equipment used to generate the test atmosphere and to expose the animals to the test atmosphere. | — | Details of the equipment used to monitor chamber temperature, humidity, and chamber airflow (i.e. development of a calibration curve). | — | Details of the equipment used to collect samples for determination of chamber concentration and particle size distribution. | — | Details of the chemical analytical method used and method validation (including efficiency of recovery of test chemical from the sampling medium). | — | Method of randomisation in assigning animals to test and control groups. | — | Details of food and water quality (including diet type/source, water source). | — | The rationale for the selection of test concentrations. | | Results | — | Tabulation of chamber temperature, humidity, and airflow. | — | Tabulation of chamber nominal and actual concentration data. | — | Tabulation of particle size data including analytical sample collection data, particle size distribution, and calculations of the MMAD and σg. | — | Tabulation of response data and concentration level for each animal (i.e. animals showing signs of toxicity including mortality, nature, severity, time of onset, and duration of effects). | — | Tabulation of individual animal weights. | — | Tabulation of food consumption | — | Tabulation of clinical pathology data | — | Necropsy findings and histopathological findings for each animal, if available. | | Discussion and interpretation of results | — | Particular emphasis should be made to the description of methods used to meet the criteria of this Test Method, e.g. the limit concentration or the particle size. | — | The respirability of particles in light of the overall findings should be addressed, especially if the particle-size criteria could not be met. | — | The consistency of methods used to determine nominal and actual concentrations, and the relation of actual concentration to nominal concentration should be included in the overall assessment of the study. | — | The likely cause of death and predominant mode of action (systemic versus local) should be addressed. | — | An explanation should be provided if there was a need to humanely sacrifice animals in pain or showing signs of severe and enduring distress, based on the criteria in the OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3). | — | The target organ(s) should be identified. | — | The NOAEL and LOAEL should be determined. | LITERATURE: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (4) | Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258. | (6) | Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. | (7) | Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238. | (8) | Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. | (9) | Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. | (10) | Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. | (11) | Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. | (12) | Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428. | (13) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006 (OJ L 353, 31.12.2008, p. 1). | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | B.30. CHRONIC TOXICITY STUDIES | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 452 (2009). The original TG 452 was adopted in 1981. Development of this revised Test Method B.30 was considered necessary in order to reflect recent developments in the field of animal welfare and regulatory requirements (1) (2) (3) (4). The updating of this Test Method B.30 has been carried out in parallel with revisions of Chapter B.32 of this Annex, Carcinogenicity Studies, and Chapter B.33 of this Annex, Combined Chronic Toxicity/Carcinogenicity studies, with the objective of obtaining additional information from the animals used in the study and providing further detail on dose selection. This Test Method is designed to be used in the testing of a broad range of chemicals, including pesticides and industrial chemicals. | 2. | The majority of chronic toxicity studies are carried out in rodent species, and this Test Method is intended therefore to apply primarily to studies carried out in these species. Should such studies be required in non-rodent species, the principles and procedures outlined in this Test Method, together with those outlined in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (5), may also be applied, with appropriate modifications, as outlined in the OECD Guidance Document No 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (6). | 3. | The three main routes of administration used in chronic toxicity studies are oral, dermal and inhalation. The choice of the route of administration depends on the physical and chemical characteristics of the test chemical and the predominant route of exposure of humans. Additional information on choice of route of exposure is provided in the OECD Guidance Document No 116 (6). | 4. | This Test Method focuses on exposure via the oral route, the route most commonly used in chronic toxicity studies. While long–term chronic toxicity studies involving exposure via the dermal or inhalation routes may also be necessary for human health risk assessment and/or may be required under certain regulatory regimes, both routes of exposure involve considerable technical complexity. Such studies will need to be designed on a case-by-case basis, although the Test Method outlined here for the assessment and evaluation of chronic toxicity by oral administration could form the basis of a protocol for inhalation and/or dermal studies, with respect to recommendations for treatment periods, clinical and pathology parameters, etc. OECD Guidance is available on the administration of test chemicals by the inhalation (6) (7) and dermal routes (6). Chapter B.8 of this Annex (8) and Chapter B.29 of this Annex (9), together with the OECD Guidance Document on acute inhalation testing (7), should be specifically consulted in the design of longer term studies involving exposure via the inhalation route. Chapter B.9 of this Annex (10) should be consulted in the case of testing carried out by the dermal route. | 5. | The chronic toxicity study provides information on the possible health hazards likely to arise from repeated exposure over a considerable part of the lifespan of the species used. The study will provide information on the toxic effects of the test chemical; indicate target organs and the possibility of accumulation. It can also provide an estimate of the no-observed-adverse effect level which can be used for establishing safety criteria for human exposure. The need for careful clinical observations of the animals, so as to obtain as much information as possible, is also stressed. | 6. | The objectives of studies covered by this Test Method include: | — | The identification of the chronic toxicity of a test chemical; | — | The identification of target organs; | — | Characterisation of the dose-response relationship; | — | Identification of a no-observed-adverse-effect level (NOAEL) or point of departure for establishment of a Benchmark Dose (BMD); | — | The prediction of chronic toxicity effects at human exposure levels; | — | Provision of data to test hypotheses regarding mode of action (6). | INITIAL CONSIDERATIONS | 7. | In the assessment and evaluation of the toxicological characteristics of a test chemical, all available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study, in order to focus the design of the study to more efficiently test for chronic toxicity potential and to minimize animal usage. Information that will assist in the study design includes the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; any information on the mode of action; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally-related chemicals; available toxicokinetic data (single dose and also repeat dose kinetics where available) and data derived from other repeated exposure studies. The determination of chronic toxicity should only be carried out after initial information on toxicity has been obtained from repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests. A phased testing approach to chronic toxicity testing should be considered as part of the overall assessment of the potential adverse health effects of a particular test chemical (11) (12) (13) (14). | 8. | The statistical methods most appropriate for the analysis of results, given the experimental design and objectives, should be established before commencing the study. Issues to consider include whether the statistics should include adjustment for survival and analysis in the event of premature termination of one or more groups. Guidance on the appropriate statistical analyses and key references to internationally accepted statistical methods are given in Guidance Document No 116 (6), and also in Guidance Document No 35 on the analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (15). | 9. | In conducting a chronic toxicity study, the guiding principles and considerations outlined in the OECD Guidance Document No 19 on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (16), in particular paragraph 62 thereof, should always be followed. This paragraph states that “In studies involving repeated dosing, when an animal shows clinical signs that are progressive, leading to further deterioration in condition, an informed decision as to whether or not to humanely kill the animal should be made. The decision should include consideration as to the value of the information to be gained from the continued maintenance of that animal on study relative to its overall condition. If a decision is made to leave the animal on test, the frequency of observations should be increased, as needed. It may also be possible, without adversely affecting the purpose of the test, to temporarily stop dosing if it will relieve the pain or distress, or reduce the test dose.” | 10. | Detailed guidance on and discussion of the principles of dose selection for chronic toxicity and carcinogenicity studies can be found in Guidance Document No 116 (6), as well as two International Life Sciences Institute publications (17) (18). The core dose selection strategy is dependent on the primary objective or objectives of the study (paragraph 6). In selecting appropriate dose levels, a balance should be achieved between hazard screening on the one hand and characterisation of low-dose responses and their relevance on the other. This is particularly relevant in the situation where a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex) is to be carried out (paragraph 11). | 11. | Consideration should be given to carrying out a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex), rather than separate execution of a chronic toxicity study (this Test Method B.30) and carcinogenicity study (Chapter B.32 of this Annex). The combined test provides greater efficiency in terms of time and cost compared to conducting two separate studies, without compromising the quality of the data in either the chronic phase or the carcinogenicity phase. Careful consideration should however be given to the principles of dose selection (paragraphs 9 and 20-25) when undertaking a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex), and it is also recognised that separate studies may be required under certain regulatory frameworks. | 12. | Definitions used in the context of this Test Method can be found at the end of this chapter and in the Guidance Document No 116 (6). | PRINCIPLE OF THE TEST | 13. | The test chemical is administered daily in graduated doses to several groups of experimental animals, normally for a period of 12 months, although longer or shorter durations may also be chosen depending on regulatory requirements (see paragraph 33). This duration is chosen to be sufficiently long to allow any effects of cumulative toxicity to become manifest, without the confounding effects of geriatric changes. Deviations from exposure duration of 12 months should be justified, particularly in the case of shorter durations. The test chemical is normally administered by the oral route although testing by the inhalation or dermal route may also be appropriate. The study design may also include one or more interim kills, e.g. at 3 and 6 months, and additional groups of animals may be included to accommodate this (see paragraph 19). During the period of administration the animals are observed closely for signs of toxicity. Animals which die or are killed during the test are necropsied and, at the conclusion of the test, surviving animals are killed and necropsied. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 14. | This Test Method primarily covers assessment and evaluation of chronic toxicity in rodents (see paragraph 2) although it is recognised that similar studies in non-rodents may be required under certain regulatory regimes. The choice of species should be justified. The design and conduct of chronic toxicity studies in non-rodent species, when required, should be based on the principles outlined in this Test Method together with those in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (5). Additional information on choice of species and strain is provided in Guidance Document No 116 (6). | 15. | In this Test Method, the preferred rodent species is the rat, although other rodent species, e.g. the mouse, may be used. Rats and mice have been preferred experimental models because of their relatively short life span, their widespread use in pharmacological and toxicological studies, their susceptibility to tumour induction, and the availability of sufficiently characterised strains. As a consequence of these characteristics, a large amount of information is available on their physiology and pathology. Young healthy adult animals of commonly used laboratory strains should be employed. The chronic toxicity study should be carried out in animals from the same strain and source as those used in preliminary toxicity study(ies) of shorter duration. The females should be nulliparous and non-pregnant. | Housing and feeding conditions | 16. | Animals may be housed individually, or be caged in small groups of the same sex; individual housing should be considered only if scientifically justified (19) (20) (21). Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimised. The temperature in the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C). Although the relative humidity should be at least 30 % and preferably not exceed 70 % other than during room cleaning, the aim should be 50-60 %. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light, 12 hours dark. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. The diet should meet all the nutritional requirements of the species tested and the content of dietary contaminants including but not limited to pesticide residues, persistent organic pollutants, phytoestrogens, heavy metals and mycotoxins, that might influence the outcome of the test, should be as low as possible. Analytical information on the nutrient and dietary contaminant levels should be generated periodically, at least at the beginning of the study and when there is a change in the batch used, and should be included in the final report. Analytical information on the drinking water used in the study should similarly be provided. The choice of diet may be influenced by the need to ensure a suitable admixture of a test chemical and to meet the nutritional requirements of the animals when the test chemical is administered by the dietary route. | Preparation of animals | 17. | Healthy animals, which have been acclimated to laboratory conditions for at least 7 days and have not been subjected to previous experimental procedures, should be used. In the case of rodents, dosing of the animals should begin as soon as possible after weaning and acclimatisation and preferably before the animals are 8 weeks old. The test animals should be characterised as to species, strain, source, sex, weight and age. At the commencement of the study, the weight variation for each sex of animals used should be minimal and not exceed ± 20 % of the mean weight of all the animals within the study, separately for each sex. Animals should be randomly assigned to the control and treatment groups. After randomisation, there should be no significant differences in mean body weights between groups within each sex. If there are statistically significant differences, then the randomisation step should be repeated, if possible. Each animal should be assigned a unique identification number, and permanently marked with this number by tattooing, microchip implant, or other suitable method. | PROCEDURE | Number and sex of animals | 18. | Both sexes should be used. A sufficient number of animals should be used so that at the end of the study enough animals in every group are available for thorough biological and statistical evaluation. For rodents, at least 20 animals per sex per group should normally be used at each dose level, while for non-rodents a minimum of 4 per sex per group is recommended. In studies involving mice, additional animals may be needed in each dose group to conduct all required haematological determinations. | Provision for interim kills, satellite groups and sentinel animals | 19. | The study may make provision for interim kills (at least 10 animals/sex/group), e.g. at 6 months, to provide information on progression of toxicological changes and mechanistic information, if scientifically justified. Where such information is already available from previous repeat dose toxicity studies on the test chemical, interim kills may not be scientifically justified. Satellite groups may also be included to monitor the reversibility of any toxicological changes induced by the test chemical under investigation; these will normally be restricted to the highest dose level of the study plus control. An additional group of sentinel animals (typically 5 animals per sex) may also be included for monitoring of disease status, if necessary, during the study (22). If interim kills or inclusion of satellite or sentinel groups are planned, the number of animals included in the study design should be increased by the number of animals scheduled to be killed before the completion of the study. These animals should normally undergo the same observations, including body weight, food/water consumption, haematological and clinical biochemistry measurements and pathological investigations as the animals in the chronic toxicity phase of the main study, although provision may also be made (in the interim kill groups) for measurements to be restricted to specific, key measures such as neurotoxicity or immunotoxicity. | Dose groups and dosage | 20. | Guidance on all aspects of dose selection and dose level spacing is provided in Guidance Document No 116 (6). At least three dose levels and a concurrent control should be used, except where a limit test is conducted (see paragraph 27). Dose levels will generally be based on the results of shorter-term repeated dose or range finding studies and should take into account any existing toxicological and toxicokinetic data available for the test chemical or related chemicals. | 21. | Unless limited by the physical-chemical nature or biological effects of the test chemical, the highest dose level should normally be chosen to identify the principal target organs and toxic effects while avoiding suffering, severe toxicity, morbidity, or death. While taking into account the factors outlined in paragraph 22 below, the highest dose level should be chosen to elicit evidence of toxicity, as evidenced by, for example, depression of body weight gain (approximately 10 %). | 22. | However, dependent on the objectives of the study (see paragraph 6), a top dose lower than the dose providing evidence of toxicity may be chosen, e.g. if a dose elicits an adverse effect of concern that nonetheless has little impact on lifespan or body weight. The top dose should not exceed 1 000 mg/kg body weight/day (limit dose, see paragraph 27). | 23. | Dose levels and dose level spacing may be selected to establish a dose-response and a NOAEL or other intended outcome of the study, e.g. a BMD (see paragraph 25) at the lowest dose level. Factors that should be considered in the placement of lower doses include the expected slope of the dose–response curve, the doses at which important changes may occur in metabolism or mode of toxic action, where a threshold is expected, or where a point of departure for low-dose extrapolation is expected. | 24. | The dose level spacing selected will depend on the characteristics of the test chemical, and cannot be prescribed in this Test Method, but two to four fold intervals frequently provide good test performance when used for setting the descending dose levels and addition of a fourth test group is often preferable to using very large intervals (e.g. more than a factor of about 6-10) between dosages. In general the use of factors greater than 10 should be avoided, and should be justified if used. | 25. | As outlined further in Guidance Document No 116 (6), points to be considered in dose selection include: | — | Known or suspected nonlinearities or inflection points in the dose–response; | — | Toxicokinetics, and dose ranges where metabolic induction, saturation, or nonlinearity between external and internal doses does or does not occur; | — | Precursor lesions, markers of effect, or indicators of the operation of key underlying biological processes; | — | Key (or suspected) aspects of mode of action, such as doses at which cytotoxicity begins to arise, hormone levels are perturbed, homeostatic mechanisms are overwhelmed, etc.; | — | Regions of the dose–response curve where particularly robust estimation is needed, e.g. in the range of the anticipated BMD or a suspected threshold; | — | Consideration of anticipated human exposure levels. | 26. | The control group shall be an untreated group or a vehicle-control group if a vehicle is used in administering the test chemical. Except for treatment with the test chemical, animals in the control group should be handled in an identical manner to those in the test groups. If a vehicle is used, the control group shall receive the vehicle in the highest volume used among the dose groups. If a test chemical is administered in the diet, and causes significantly reduced dietary intake due to the reduced palatability of the diet, an additional pair-fed control group may be useful, to serve as a more suitable control. | 27. | If it can be anticipated, based on information from preliminary studies, that a test at one dose level, equivalent to at least 1 000 mg/kg body weight/day, using the procedures described for this study, is unlikely to produce adverse effects and if toxicity would not be expected based upon data from structurally related chemicals, then a full study using three dose levels may not be considered necessary. A limit of 1 000 mg/kg body weight/day may apply except when human exposure indicates the need for a higher dose level to be used. | Preparation of doses and administration of test chemical | 28. | The test chemical is normally administered orally, via the diet or drinking water, or by gavage. Additional information on routes and methods of administration is provided in Guidance Document No 116 (6). The route and method of administration is dependent on the purpose of the study, the physical/chemical properties of the test chemical, its bioavailability and the predominant route and method of exposure of humans. A rationale should be provided for the chosen route and method of administration. In the interests of animal welfare, oral gavage should normally be selected only for those agents for which this route and method of administration reasonably represent potential human exposure (e.g. pharmaceuticals). For dietary or environmental chemicals including pesticides, administration is typically via the diet or drinking water. However, for some scenarios, e.g. occupational exposure, administration via other routes may be more appropriate. | 29. | Where necessary, the test chemical is dissolved or suspended in a suitable vehicle. Consideration should be given to the following characteristics of the vehicle and other additives, as appropriate: effects on the absorption, distribution, metabolism, or retention of the test chemical; effects on the chemical properties of the test chemical which may alter its toxic characteristics; and effects on the food or water consumption or the nutritional status of the animals. It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solution/suspension be considered first, followed by consideration of a solution/emulsion in oil (e.g. corn oil) and then by possible solution in other vehicles. For vehicles other than water, the toxic characteristics of the vehicle should be known. Information should be available on the stability of the test chemical and the homogeneity of dosing solutions or diets (as appropriate) under the conditions of administration (e.g. diet). | 30. | For chemicals administered via the diet or drinking water it is important to ensure that the quantities of the test chemical involved do not interfere with normal nutrition or water balance. In long-term toxicity studies using dietary administration, the concentration of the test chemical in the feed should not normally exceed an upper limit of 5 % of the total diet, in order to avoid nutritional imbalances. When the test chemical is administered in the diet, either a constant dietary concentration (mg/kg diet or ppm) or a constant dose level in terms of the animal’s body weight (mg/kg body weight), calculated on a weekly basis, may be used. The alternative used should be specified. | 31. | In the case of oral administration, the animals are dosed with the test chemical daily (seven days each week), normally for a period of 12 months (see also paragraph 33), although a longer duration may be required depending on regulatory requirements. Any other dosing regime, e.g. five days per week, needs to be justified. In the case of dermal administration, animals are normally treated with the test chemical for at least 6 hours per day, 7 days per week, as specified in Chapter B.9 of this Annex (10), for a period of 12 months. Exposure by the inhalation route is carried out for 6 hours per day, 7 days per week, but exposure for 5 days per week may also be used, if justified. The period of exposure will normally be for a period of 12 months. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration of less than 6 hours per day. See also Chapter B.8 of this Annex (8). | 32. | When the test chemical is administered by gavage to the animals this should be done using a stomach tube or a suitable intubation cannula, at similar times each day. Normally a single dose will be administered once daily, where for example a chemical is a local irritant, it may be possible to maintain the daily dose-rate by administering it as a split dose (twice a day). The maximum volume of liquid that can be administered at one time depends on the size of the test animal. The volume should be kept as low as practical, and should not normally exceed 1 ml/100 g body weight for rodents (22). Variability in test volume should be minimised by adjusting the concentration to ensure a constant volume at all dose levels. Potentially corrosive or irritant chemicals are the exception, and need to be diluted to avoid severe local effects. Testing at concentrations that are likely to be corrosive or irritant to the gastrointestinal tract should be avoided. | Duration of study | 33. | While this Test Method primarily is designed as a 12 month chronic toxicity study, the study design also allows for and can be applied to either shorter (e.g. 6 or 9 months) or longer (e.g. 18 or 24 months) duration studies, depending on the requirements of particular regulatory regimes or for specific mechanistic purposes. Deviations from an exposure duration of 12 months should be justified, particularly in the case of shorter durations. Satellite groups included to monitor the reversibility of any toxicological changes induced by the test chemical under investigation should be maintained without dosing for a period not less than 4 weeks and not more than one third of the total study duration after cessation of exposure. Further guidance, including consideration of survival in the study, is provided in Guidance Document No 116 (6). | OBSERVATIONS | 34. | All animals should be checked for morbidity or mortality, usually at the beginning and end of each day, including at weekends and holidays. General clinical observations should be made at least once a day, preferably at the same time(s) each day, taking into consideration the peak period of anticipated effects after dosing in the case of gavage administration. | 35. | Detailed clinical observations should be made on all animals at least once prior to the first exposure (to allow for within-subject comparisons), at the end of the first week of the study and monthly thereafter. The protocol for observations should be arranged such that variations between individual observers are minimised and independent of test group. These observations should be made outside the home cage, preferably in a standard arena and at similar times on each occasion. They should be carefully recorded, preferably using scoring systems, explicitly defined by the testing laboratory. Efforts should be made to ensure that variations in the observation conditions are minimal. Signs noted should include, but not be limited to, changes in skin, fur, eyes, mucous membranes, occurrence of secretions and excretions and autonomic activity (e.g. lacrimation, piloerection, pupil size, and unusual respiratory pattern). Changes in gait, posture and response to handling as well as the presence of clonic or tonic movements, stereotypies (e.g. excessive grooming, repetitive circling) or bizarre behaviour (e.g. self-mutilation, walking backwards) should also be recorded (24). | 36. | Ophthalmological examination, using an ophthalmoscope or other suitable equipment, should be carried out on all animals prior to the first administration of the test chemical. At the termination of the study, this examination should be preferably conducted in all animals but at least in the high dose and control groups. If treatment-related changes in the eyes are detected, all animals should be examined. If structural analysis or other information suggests ocular toxicity, then the frequency of ocular examination should be increased. | 37. | For chemicals where previous repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests indicated the potential to cause neurotoxic effects, sensory reactivity to stimuli of different types (24) (e.g. auditory, visual and proprioceptive stimuli) (25), (26), (27), assessment of grip strength (28) and motor activity assessment (29) may optionally be conducted before commencement of the study and at 3 month periods after study initiation up to and including 12 months, as well as at study termination (if longer than 12 months). Further details of the procedures that could be followed are given in the respective references. However, alternative procedures than those referenced could also be used. | 38. | For chemicals where previous repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests indicated the potential to cause immunotoxic effects, further investigations of this endpoint may optionally be conducted at termination. | Body weight, food/water consumption and food efficiency | 39. | All animals should be weighed at the start of treatment, at least once a week for the first 13 weeks, and at least monthly thereafter. Measurements of food consumption and food efficiency should be made at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Water consumption should be measured at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter when the chemical is administered in drinking water. Water consumption measurements should also be considered for studies in which drinking activity is altered. | Haematology and clinical biochemistry | 40. | In studies involving rodents, haematological examinations should be carried out in at least 10 male and 10 female animals per group, at 3, 6, and 12 months, as well as at study termination (if longer than 12 months), using the same animals throughout. In mice, satellite animals may be needed in order to conduct all required haematological determinations (see paragraph 18). In non-rodent studies, samples will be taken from smaller numbers of animals (e.g. 4 animals per sex and per group in dog studies), at interim sampling times and at termination as described for rodents. Measurements at 3 months, either in rodents or non-rodents, need not be conducted if no effect was seen on haematological parameters in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. Blood samples should be taken from a named site, for example by cardiac puncture or from the retro-orbital sinus, under anaesthesia. | 41. | The following list of parameters should be investigated (30): Total and differential leukocyte count, erythrocyte count, platelet count, haemoglobin concentration, haematocrit (packed cell volume), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular haemoglobin (MCH), mean corpuscular haemoglobin concentration (MCHC), prothrombin time, and activated partial thromboplastin time. Other hematology parameters such as Heinz bodies or other atypical erythrocyte morphology or methaemoglobin may be measured as appropriate depending on the toxicity of the test chemical. Overall, a flexible approach should be adopted, depending on the observed and/or expected effect from a given test chemical. If the test chemical has an effect on the haematopoietic system, reticulocyte counts and bone marrow cytology may also be indicated, although these need not be routinely conducted. | 42. | Clinical biochemistry determinations to investigate major toxic effects in tissues and, specifically, effects on kidney and liver, should be performed on blood samples obtained from at least 10 male and 10 female animals per group at the same time intervals as specified for the haematological investigations, using the same animals throughout. In mice, satellite animals may be needed in order to conduct all required clinical biochemistry determinations. In non-rodent studies, samples will be taken from smaller numbers of animals (e.g. 4 animals per sex and per group in dog studies), at interim sampling times and at termination as described for rodents. Measurements at 3 months, either in rodents or non-rodents, need not be conducted if no effect was seen on clinical biochemistry parameters in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. Overnight fasting of the animals (with the exception of mice) prior to blood sampling is recommended The following list of parameters should be investigated (30): glucose, urea (urea nitrogen), creatinine, total protein, albumin, calcium, sodium, potassium, total cholesterol, at least two appropriate tests for hepatocellular evaluation (alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, glutamate dehydrogenase, total bile acids) (31), and at least two appropriate tests for hepatobiliary evaluation (alkaline phosphatase, gamma glutamyl transferase, 5’-nucleotidase, total bilirubin, total bile acids) (31). Other clinical chemistry parameters such as fasting triglycerides, specific hormones and cholinesterase may be measured as appropriate, depending on the toxicity of the test chemical. Overall, there is a need for a flexible approach, depending on the observed and/or expected effect from a given test chemical. | 43. | Urinalysis determinations should be performed on at least 10 male and 10 female animals per group on samples collected at the same intervals as for haematology and clinical chemistry. Measurements at 3 months need not be conducted if no effect was seen on urinalysis in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. The following list of parameters was included in an expert recommendation on clinical pathology studies (30): appearance, volume, osmolality or specific gravity, pH, total protein, and glucose. Other determinations include ketone, urobilinogen, bilirubin, and occult blood. Further parameters may be employed where necessary to extend the investigation of observed effect(s). | 44. | It is generally considered that baseline haematological and clinical biochemistry variables are needed before treatment for dog studies, but need not be determined in rodent studies (30). However, if historical baseline data (see paragraph 50) are inadequate, consideration should be given to generating such data. | Pathology | Gross necropsy | 45. | All animals in the study shall normally be subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. However provision may also be made (in the interim kill or satellite groups) for measurements to be restricted to specific, key measures such as neurotoxicity or immunotoxicity (see paragraph 19). These animals need not be subjected to necropsy and the subsequent procedures described in the following paragraphs. Sentinel animals may require necropsy on a case-by-case basis, at the discretion of the study director. | 46. | Organ weights should be collected from all animals, other than those excluded by the latter part of paragraph 45. The adrenals, brain, epididymides, heart, kidneys, liver, ovaries, spleen, testes, thyroid (weighed post-fixation, with parathyroids), and uterus of all animals (apart from those found moribund and/or intercurrently killed) should be trimmed of any adherent tissue, as appropriate, and their wet weight taken as soon as possible after dissection to prevent drying. In a study using mice, weighing of the adrenal glands is optional. | 47. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (32) (tissues in square brackets are optional): | all gross lesions | heart | pancreas | stomach (forestomach, glandular stomach) | adrenal gland | ileum | parathyroid gland | [teeth] | aorta | jejunum | peripheral nerve | testis | brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | kidney | pituitary | thymus | caecum | lacrimal gland (exorbital) | prostate | thyroid | cervix | liver | rectum | [tongue] | coagulating gland | lung | salivary gland | trachea | colon | lymph nodes (both superficial and deep) | seminal vesicle | urinary bladder | duodenum | mammary gland (obligatory for females and, if visibly dissectable, from males) | skeletal muscle | uterus (including cervix) | epididymis | [upper respiratory tract, including nose, turbinates, and paranasal sinuses] | skin | [ureter] | eye (including retina) | oesophagus | spinal cord (at three levels: cervical, mid-thoracic, and lumbar) | [urethra] | [femur with joint] | [olfactory bulb] | spleen | vagina | gall bladder (for species other than rat) | ovary | [sternum], | section of bone marrow and/or a fresh bone marrow aspirate | Harderian gland | | | | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be preserved. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. In studies involving the dermal route of administration, the list of organs as set out for the oral route should be preserved, and specific sampling and preservation of the skin from the site of application is essential. In inhalation studies, the list of preserved and examined tissues from the respiratory tract should follow the recommendations of Chapters B.8 of this Annex (8) and Chapter B.29 of this Annex (9). For other organs/tissues (and in addition to the specifically preserved tissues from the respiratory tract) the list of organs as set out for the oral route should be examined. | Histopathology | 48. | Guidance is available on best practices in the conduct of toxicological pathology studies (32). The minimum histopathological examinations should be: | — | all tissues from the high dose and control groups; | — | all tissues from animals dying or killed during the study; | — | all tissues showing macroscopic abnormalities; | — | target tissues, or tissues which showed treatment-related changes in the high dose group, from all animals in all other dose groups; | — | in the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be examined. | DATA AND REPORTING | Data | 49. | Individual animal data should be provided for all parameters evaluated. Additionally, all data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals at the start of the test, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons and the time of any death or humane kill, the number showing signs of toxicity, a description of the signs of toxicity observed, including time of onset, duration, and severity of any toxic effects, the number of animals showing lesions, the type of lesions and the percentage of animals displaying each type of lesion. Summary data tables should provide the means and standard deviations (for continuous test data) of animals showing toxic effects or lesions, in addition to the grading of lesions. | 50. | Historical control data may be valuable in the interpretation of the results of the study, e.g. in the case when there are indications that the data provided by the concurrent controls are substantially out of line when compared to recent data from control animals from the same test facility/colony. Historical control data, if evaluated, should be submitted from the same laboratory and relate to animals of the same age and strain generated during the five years preceding the study in question. | 51. | When applicable, numerical results should be evaluated by an appropriate and generally acceptable statistical method. The statistical methods and the data to be analysed should be selected during the design of the study (paragraph 8). Selection should make provision for survival adjustments, if needed. | Test Report | 52. | The test report should include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature, purity, and physicochemical properties; | — | identification data; | — | source of chemical; | — | batch number; | — | certificate of chemical analysis | | Vehicle (if appropriate): | — | justification for choice of vehicle (if other than water). | | Test animals: | — | species/strain used and justification for choice made; | — | number, age, and sex of animals at start of test; | — | source, housing conditions, diet, etc.; | — | individual weights of animals at the start of the test. | | Test conditions: | — | rationale for route of administration and dose selection; | — | when applicable, the statistical methods used to analyse the data; | — | details of test chemical formulation/diet preparation; | — | analytical data on achieved concentration, stability and homogeneity of the preparation; | — | route of administration and details of the administration of the test chemical; | — | for inhalation studies, whether nose only or whole body; | — | actual doses (mg/kg body weight/day), and conversion factor from diet/drinking water test chemical concentration (mg/kg or ppm) to the actual dose, if applicable; | — | details of food and water quality. | | Results (summary tabulated data and individual animal data should be presented): | — | survival data; | — | body weight/body weight changes; | — | food consumption, calculations of food efficiency, if made, and water consumption if applicable; | — | toxic response data by sex and dose level, including signs of toxicity; | — | nature, incidence (and, if scored, severity), and duration of clinical observations ((whether transitory or permanent); | — | ophthalmological examination; | — | haematological tests; | — | clinical biochemistry tests; | — | urinalysis tests; | — | outcome of any investigations of neurotoxicity or immunotoxicity; | — | terminal body weight; | — | organ weights (and their ratios, if applicable); | — | necropsy findings; | — | a detailed description of all treatment-related histopathological findings; | — | absorption data if available; | | Statistical treatment of results, as appropriate | | Discussion of results including: | — | Dose: response relationships | — | Consideration of any mode of action information | — | Discussion of any modelling approaches | — | BMD, NOAEL or LOAEL determination | — | Historical control data | — | Relevance for humans | | Conclusions | LITERATURE: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208. | (3) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191. | (4) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. | (5) | Chapter B.27 of this Annex, Sub-chronic Oral Toxicity Test Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents. | (6) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (7) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (8) | Chapter B.8 of this Annex, Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study. | (9) | Chapter B.29 of this Annex, Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study. | (10) | Chapter B.9 of this Annex, Repeated Dose (28 Days) Toxicity (Dermal). | (11) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. | (12) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). 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A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. | (24) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60. | (25) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (26) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. | (27) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (28) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. 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TOXICIDAD SUBCRÓNICA POR INHALACIÓN: ESTUDIO DE 90 DÍAS | RESUMEN | El presente método de ensayo B.29 se ha diseñado para caracterizar debidamente la toxicidad por inhalación de una sustancia química después de una exposición subcrónica (90 días de duración), y para recabar datos robustos que permitan hacer una evaluación cuantitativa del riesgo por inhalación. Se forman lotes de al menos 10 roedores machos y 10 hembras y se exponen 6 horas al día durante un período de 90 días (13 semanas) a: a) la sustancia problema a tres o más niveles de concentración; b) aire filtrado (testigo negativo), y/o c) el vehículo (testigo del vehículo). Habitualmente los animales se exponen 5 días por semana, aunque se acepta una pauta de 7 días por semana. Se estudian siempre animales machos y hembras, pero pueden exponerse a diferentes niveles de concentración si se sabe que uno de los sexos es más sensible a la sustancia problema. Este método concede al director del estudio suficiente flexibilidad para incluir lotes satélite (reversibilidad), sacrificios durante el ensayo, lavados broncoalveolares (BAL), pruebas neurológicas y otras evaluaciones de patología clínica y de histopatología orientadas a caracterizar mejor la toxicidad de una sustancia problema. | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 413 de la OCDE (2009). Las directrices originales sobre ensayos de toxicidad subcrónica por inhalación (TG 413) fueron adoptadas en 1981 (1). El presente método de ensayo B.29 [equivalente a las TG 413 (2009) revisadas] se ha actualizado para reflejar el estado actual de la ciencia y satisfacer las necesidades normativas actuales y futuras. | 2. | Los estudios de toxicidad subcrónica por inhalación sirven fundamentalmente para establecer las concentraciones normativas que permitan evaluar el riesgo de los trabajadores en el entorno laboral. Permiten además evaluar el riesgo en la vivienda humana, el transporte y el medio ambiente. Este método permite caracterizar los efectos adversos que se producen después de la exposición por inhalación diaria continuada de una sustancia problema durante 90 días (aproximadamente el 10 % de la vida de la rata). A partir de los datos derivados de los estudios de toxicidad subcrónica por inhalación, se pueden hacer evaluaciones cuantitativas del riesgo y seleccionar las concentraciones aplicables a los estudios de toxicidad crónica. El presente método de ensayo no está específicamente destinado a la investigación de nanomateriales. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan al final del presente capítulo y en el documento de orientación no 39 (2). | CONSIDERACIONES INICIALES | 3. | Antes de comenzar el estudio y con el fin de mejorar su calidad y minimizar el sufrimiento animal, el laboratorio de ensayo tendrá en cuenta toda la información disponible acerca de la sustancia problema. En la selección de las concentraciones idóneas de estudio resulta útil toda información referente a: identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, resultados de anteriores ensayos de toxicidad in vivo o in vitro, uso(s) previsto(s) y posible exposición humana, datos de (Q)SAR previos y datos toxicológicos acerca de compuestos químicos estructuralmente afines, y resultados obtenidos en otros estudios de exposición continuada. Si se prevé o se observa neurotoxicidad en el transcurso del estudio, el director del mismo puede decidir la incorporación de las evaluaciones pertinentes, como una batería de observación funcional (FOB) y registros de la actividad motriz. Si bien el calendario de las exposiciones en relación con las evaluaciones concretas puede ser crítico, la realización de estas actividades complementarias no debe interferir en el diseño básico del estudio. | 4. | Las diluciones de sustancias problema corrosivas o irritantes se pueden estudiar a concentraciones capaces de inducir el grado de toxicidad esperado. Se ofrece más información en el documento de orientación no 39 (2). Al exponer los animales a estos productos, las concentraciones diana deben ser lo bastante bajas para no provocar un dolor y sufrimiento intensos, pero suficientes para obtener una curva de concentración-respuesta que satisfaga los objetivos científicos y normativos del ensayo. Dichas concentraciones se escogerán según cada caso, preferiblemente sobre la base de estudios del intervalo analítico debidamente diseñados que arrojen información sobre el parámetro crítico principal, el eventual umbral de irritación y el tiempo de aparición de los síntomas (véanse los puntos 11-13). Se justificará la elección de las concentraciones. | 5. | Los animales moribundos o que presenten signos evidentes de dolor o de sufrimiento intenso y duradero deben sacrificarse de forma compasiva. Los animales moribundos se contabilizan como muertes durante el ensayo. En el documento de orientación no 19 de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (3) se dan criterios para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a sufrimiento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte es previsible o inminente. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Selección de la especie animal | 6. | Hay que utilizar roedores adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio corriente. La especie preferida es la rata. Deberá justificarse el empleo de otra especie. | Preparación de los animales | 7. | Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. El día de la asignación aleatoria, los animales serán adultos jóvenes de entre 7 y 9 semanas de edad. Los pesos corporales se desviarán a lo sumo ± 20 % del peso medio de cada sexo. Se seleccionan al azar los animales, se marcan para permitir su identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes de iniciar el ensayo, a fin de que se aclimaten a las condiciones del laboratorio. | Zootecnia | 8. | Los animales se identificarán de manera individual, preferiblemente con transpondedores subcutáneos, a fin de facilitar la observación y evitar confusiones. La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. La humedad relativa se mantendrá idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, si bien esto no siempre es posible cuando se usa el agua como vehículo. Antes y después de las exposiciones, los animales deberán enjaularse en principio por lotes de sexo y nivel de exposición, pero el número de animales por jaula será tal que permita la observación sin trabas de cada animal y minimice las pérdidas por agresiones y canibalismo. Cuando la exposición es solo por la nariz, puede ser necesario aclimatar a los animales a los tubos de sujeción. Estos no deberán ejercer sobre los animales tensiones físicas, térmicas o de inmovilización. La sujeción puede influir en parámetros fisiológicos como la temperatura corporal (hipertermia) o el volumen respiratorio por minuto. Si se dispone de datos generales en el sentido de que no se producen estos cambios en medida apreciable, se podrá prescindir de la adaptación previa a los tubos de sujeción. Los animales expuestos de cuerpo entero a un aerosol se enjaularán de manera individual durante la exposición para evitar que el aerosol en estudio se filtre por el pelo de sus compañeros de jaula. Salvo durante la exposición, se podrán administrar las dietas habituales de laboratorio certificadas, acompañadas de un suministro ilimitado de agua potable de la traída municipal. La iluminación será artificial, con una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. | Cámaras de inhalación | 9. | Para seleccionar una cámara de inhalación se tendrán en cuenta la naturaleza de la sustancia problema y la finalidad del ensayo. El modo de exposición preferible es de solo la nariz (término que abarca los modos de exposición solo por la cabeza, solo por la nariz y solo por el hocico). Este modo de exposición es el recomendado generalmente para los estudios de aerosoles líquidos o sólidos y de vapores que pueden condensarse formando aerosoles. Determinados objetivos de la investigación se podrían alcanzan mejor utilizando el modo de exposición de cuerpo entero, pero esto debe justificarse en el informe del estudio. Para asegurar la estabilidad atmosférica cuando se emplea una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los animales experimentales no debe exceder del 5 % del volumen de la cámara. En el documento de orientación no 39 (2) se describen los principios de las técnicas de exposición de cuerpo entero y solo por la nariz y sus ventajas e inconvenientes respectivos. | ESTUDIOS DE TOXICIDAD | Concentraciones límite | 10. | A diferencia de los estudios de toxicidad aguda, en los estudios de toxicidad subcrónica por inhalación no hay concentraciones límite definidas. La concentración máxima estudiada dependerá de: 1) la máxima concentración alcanzable, 2) el nivel de exposición humana en el caso más desfavorable, 3) la necesidad de mantener un suministro de oxígeno adecuado, y/o 4) la atención al bienestar de los animales. Si no se dispone de datos de concentración límite, es aplicable el Reglamento (CE) no 1272/2008 (13) [hasta una concentración máxima de 5 mg/l para los aerosoles, de 20 mg/l para los vapores y de 20 000 ppm para los gases; véase el documento GD 39 (2)]. Cuando sea preciso superar estos límites en el estudio de gases o sustancias altamente volátiles (por ejemplo, refrigerantes), habrá que justificar los motivos. La concentración límite será tal que induzca una toxicidad inequívoca sin provocar un sufrimiento indebido a los animales ni afectar a su longevidad (3). | Estudio de determinación del intervalo | 11. | Antes de proceder al estudio principal, generalmente es necesario realizar un estudio para determinar el intervalo analítico. Un estudio de determinación del intervalo es más completo que un estudio preliminar, por cuanto no se limita a la selección de las concentraciones. La información recabada en este tipo de estudio puede ser decisiva para el éxito del estudio principal. Un estudio de determinación del intervalo puede, por ejemplo, aportar información técnica referente a los métodos analíticos y al tamaño de partícula, la detección de los mecanismos de toxicidad, los datos de patología clínica y de histopatología, y las estimaciones de lo que podrán ser el NOAEL y la concentración tóxica mínima en un estudio principal. El director de la investigación decidirá si basarse en el estudio de determinación del intervalo para identificar el umbral de irritación de las vías respiratorias (con la histopatología de las vías respiratorias, las pruebas de la función pulmonar o el lavado broncoalveolar), la concentración máxima tolerada sin causar un sufrimiento indebido a los animales y los parámetros que caractericen mejor la toxicidad de la sustancia problema. | 12. | Un estudio de determinación del intervalo puede hacerse con uno o más niveles de concentración. Dependiendo de los parámetros elegidos, a cada nivel de concentración se expondrán de tres a seis machos y de tres a seis hembras. El estudio de determinación del intervalo tendrá una duración mínima de 5 días y máxima (generalmente) de 28 días. En el informe del estudio se justificará la selección de las concentraciones destinadas al estudio principal. La finalidad del estudio principal es demostrar una relación concentración-respuesta basada en lo que se prevé como el parámetro más sensible. La concentración más baja será idealmente una en la que no se observen efectos adversos, mientras que la concentración más alta será tal que induzca una toxicidad inequívoca sin provocar un sufrimiento indebido a los animales ni afectar a su longevidad (3). | 13. | A la hora de elegir los niveles de concentración para el estudio de determinación del intervalo, se tendrá en cuenta toda la información disponible, incluidos las relaciones entre estructura y actividad y los datos de sustancias afines (véase el punto 3). Un estudio de determinación del intervalo puede verificar o refutar los parámetros relacionados con los mecanismos de acción que a priori se consideran más sensibles, como la inhibición de la colinesterasa por los organofosforados, la formación de metahemoglobina por agentes eritrotóxicos, las hormonas tiroideas (T3 y T4), en el caso de tirotóxicos, y la presencia de proteínas, LDH o neutrófilos en el lavado broncoalveolar en el caso de partículas inocuas escasamente solubles o de aerosoles que son irritantes pulmonares. | Estudio principal | 14. | El estudio principal de toxicidad subcrónica comprende habitualmente tres niveles de concentración, además de lotes de control negativo (aire) y/o testigo del vehículo (véase el punto 18). Se recurrirá a todos los datos disponibles para basar la selección de los niveles de exposición adecuados, incluidos los resultados de los estudios de toxicidad sistémica, metabólicos y cinéticos (poniendo especial atención para evitar niveles de concentración elevados que saturen los procesos cinéticos). Cada lote de ensayo se compone de 10 roedores machos y de 10 hembras, que se exponen a la sustancia química 6 horas al día en un régimen de 5 días por semana durante un período de 13 semanas (la duración total del estudio es de 90 días como mínimo). También se admite exponer a los animales 7 días por semana (por ejemplo, cuando se estudian productos farmacéuticos para inhalación). Si se sabe que uno de los sexos es más sensible a la sustancia problema, podrán exponerse los dos sexos a diferentes niveles de concentración con el fin de optimizar la relación concentración-respuesta, tal como se describe en el punto 15. Cuando se exponen con la técnica de solo por la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justificarán los motivos cuando el tiempo de exposición sea inferior a 6 horas/día o cuando sea necesario efectuar un estudio de exposición de cuerpo entero de larga duración (por ejemplo, 22 horas/día) [véase el documento GD 39 (2)]. Se privará de comida a los animales durante el período de exposición, a menos que este exceda de 6 horas. Se puede suministrar agua durante todo el período de exposición de cuerpo entero. | 15. | Las concentraciones diana seleccionadas deben servir para identificar el órgano o los órganos diana y para demostrar una clara relación concentración-respuesta. | — | El nivel de concentración más elevado debe inducir efectos tóxicos, pero sin provocar letalidad o daños persistentes que impidan hacer una evaluación significativa. | — | El nivel o los niveles de concentración intermedios se espaciarán para obtener una graduación o escala de los efectos tóxicos desde el nivel más bajo al más elevado. | — | La concentración más baja debe producir escasos o nulos signos de toxicidad. | Sacrificios durante el estudio | 16. | Si se proyecta hacer sacrificios durante la investigación, el número de animales incluido en cada nivel de exposición se incrementará en el número que vaya a ser sacrificado antes de que concluya el estudio. Se justificará la necesidad de hacer tales sacrificios, que se computarán oportunamente en los análisis estadísticos. | Estudio satélite (de reversibilidad) | 17. | Es posible recurrir a un estudio satélite (de reversibilidad) para observar la reversibilidad, persistencia o aparición retardada de toxicidad durante un período de duración adecuada, pero nunca inferior a 14 días, después del tratamiento. Los lotes satélite (de reversibilidad) se componen de 10 machos y 10 hembras, que se exponen simultáneamente a los animales de experimentación del estudio principal. Los lotes del estudio satélite (de reversibilidad) deben exponerse a la sustancia problema al nivel de concentración más elevado y, en la medida necesaria, se emplearán simultáneamente lotes de control con aire y/o con el vehículo (véase el punto 18). | Animales de control | 18. | Los animales de control negativo (con aire) en paralelo se tratan de manera idéntica a los animales del lote experimental, excepto en que se exponen al aire filtrado en lugar de a la sustancia problema. Cuando se utiliza agua o cualquier otra sustancia para ayudar a crear la atmósfera experimental, en el estudio debe incluirse un lote testigo del vehículo, en lugar del lote de control negativo (con aire). Como vehículo se usará agua en la medida de lo posible. Cuando se use agua como vehículo, los animales de control se expondrán a una atmósfera de aire con la misma humedad relativa que los grupos expuestos a la sustancia problema. La selección de un vehículo idóneo se basará en un ensayo preliminar debidamente realizado o bien en los datos previos. Cuando no se conoce bien la toxicidad de un vehículo, el director del estudio puede decidir el uso de ambos grupos, el de control negativo (con aire) y el testigo del vehículo, pero no es en absoluto recomendable. Si los datos previos revelan que un vehículo es atóxico, no hay necesidad de emplear un grupo de control negativo (con aire), y solo se usará un lote testigo del vehículo. Si un ensayo preliminar de toxicidad de una sustancia problema formulada en un vehículo revela que no hay toxicidad, se deduce que el vehículo es atóxico a la concentración analizada y es el que debe utilizarse como control. | CONDICIONES DE EXPOSICIÓN | Administración de las concentraciones | 19. | Los animales se exponen a la sustancia problema en forma de gas, vapor, aerosol o una mezcla de estos. El estado físico investigado dependerá de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, de las concentraciones seleccionadas y/o de la forma física más probable que adoptará la sustancia química durante su manipulación y administración. Las sustancias higroscópicas y químicamente reactivas deberán estudiarse en condiciones de aire seco. Se procurará evitar la acumulación de concentraciones explosivas. Las materias particuladas pueden someterse a procesos mecánicos para reducir el tamaño de partícula. Se ofrecen más orientaciones en el documento de orientación no 39 (2). | Distribución granulométrica | 20. | Se controlará el tamaño de partícula en todos los aerosoles y vapores que puedan condensarse formando aerosoles. Para facilitar la exposición de todas las zonas de interés de las vías respiratorias, se recomiendan aerosoles que tengan un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) de 1 a 3 μm, con una desviación típica geométrica (σg) en el intervalo de 1,5 a 3,0 (4). Se procurará dentro de lo razonable ajustarse a este marco de referencia, pero si ello no es posible se consultará la opinión de expertos. Así, por ejemplo, las partículas de los humos metálicos tienen un tamaño inferior al mencionado intervalo, mientras que las partículas con carga y las fibras pueden superarlo. | Preparación de la sustancia problema en un vehículo | 21. | En condiciones ideales, la sustancia problema debería estudiarse sin ningún vehículo. Si es necesario emplear un vehículo para generar una concentración de sustancia problema y un tamaño de partícula adecuados, se le dará preferencia al agua. Siempre que una sustancia problema se disuelva en un vehículo, debe demostrarse su estabilidad. | SUPERVISIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN | Caudal de aire de la cámara | 22. | El caudal de aire de la cámara de exposición se controlará minuciosamente, se supervisará de manera continuada y se registrará como mínimo cada hora durante cada exposición. La supervisión en tiempo real de la concentración atmosférica (o la estabilidad temporal) del ensayo constituye una medida integral de todos los parámetros dinámicos y proporciona un medio indirecto de controlar todos los parámetros dinámicos de la inhalación que resultan de interés. Si la concentración se supervisa en tiempo real, es posible reducir la frecuencia de medición del caudal de aire limitándola a una sola medición por exposición y día. Habrá que tomar especiales precauciones para evitar la reinspiración en las cámaras de solo por la nariz. La concentración de oxígeno debe ser como mínimo del 19 %, y la de dióxido de carbono no debe superar el 1 %. Si existen razones para suponer que no se van a conseguir estos valores de referencia, habrá que determinar las concentraciones de ambos gases. Si las mediciones del primer día de exposición revelan que estos gases están presentes a las concentraciones adecuadas, no serán necesarias nuevas determinaciones. | Temperatura y humedad relativa de la cámara | 23. | La temperatura de la cámara se mantendrá en 22 ± 3 °C. Siempre que sea posible, la humedad relativa presente en la zona de respiración de los animales, tanto en las exposiciones de solo por la nariz como de cuerpo entero, se supervisará de manera continua y se registrará cada hora durante la exposición. La humedad relativa debe mantenerse preferiblemente en el intervalo del 30 % al 70 %, pero este valor de referencia puede ser inalcanzable (por ejemplo, cuando se analizan mezclas acuosas) o imposible de medir (cuando hay interferencias de la sustancia con el método de ensayo). | Sustancia problema: concentración nominal | 24. | Siempre que sea factible, se calculará y registrará la concentración nominal en la cámara de exposición. La concentración nominal es la masa de sustancia problema generada dividida por el volumen total de aire que recorre el sistema de la cámara de inhalación. La concentración nominal no se usa para caracterizar la exposición de los animales, pero la comparación entre la concentración nominal y la real nos da un índice de la eficiencia generadora del sistema experimental, de modo que puede servir para detectar problemas en la generación de la atmósfera. | Sustancia problema: concentración real | 25. | La concentración real es la concentración de sustancia problema comprobada por muestreo en la zona de respiración de los animales en una cámara de inhalación. Las concentraciones reales se pueden calcular con métodos específicos (por ejemplo, muestreo directo, métodos de adsorción o uso de reactivos químicos y posterior valoración analítica) o bien con métodos inespecíficos como la gravimetría por filtración. El análisis gravimétrico es aceptable exclusivamente para aerosoles de un único componente en polvo o de líquidos de baja volatilidad, y deberá sustentarse en caracterizaciones preliminares específicas de la sustancia problema. La concentración de los aerosoles de polvos multicomponentes se puede determinar también por gravimetría. Sin embargo, hacen falta datos analíticos que demuestren que la composición del material aerotransportado es afín a la del material de partida. Si no se dispone de tal información, puede ser necesario repetir el análisis de la sustancia problema (idealmente, en estado aerotransportado) a intervalos regulares a lo largo del ensayo. Cuando se trata de productos en forma de aerosol capaces de evaporarse o sublimarse, habrá que demostrar que el método elegido es capaz de recoger todas las fases. | 26. | Se usará, a ser posible, un solo lote de sustancia problema a lo largo de todo el estudio, lote que se conservará en condiciones que preserven su pureza, homogeneidad y estabilidad. Antes de iniciar el estudio deberá hacerse una caracterización de la sustancia consistente en un análisis de pureza y, si es técnicamente factible, de identidad y de cuantificación de contaminantes e impurezas. Con este fin se pueden aportar, entre otros, los siguientes datos: tiempo de retención y área relativa del pico, peso molecular determinado mediante espectroscopia de masas o cromatografía de gases y otras determinaciones. Si bien la identidad de la muestra de ensayo no es responsabilidad del laboratorio de análisis, la prudencia aconseja que este confirme, aunque sea dentro de ciertos límites, la caracterización facilitada por el promotor (por ejemplo, color, naturaleza física, etc.). | 27. | La atmósfera de exposición debe mantenerse constante en la medida de lo posible. Para demostrar la estabilidad de las condiciones de exposición se puede usar un equipo de supervisión en tiempo real, como un fotómetro de proceso para aerosoles o un analizador de hidrocarburos totales para análisis de vapores. La concentración real presente en la cámara deberá medirse al menos 3 veces por cada nivel y día de exposición. Pero si ello no es posible debido a un caudal de aire limitado o a que las concentraciones son bajas, se acepta una muestra por período de exposición. En ese caso, lo ideal es recoger la muestra durante todo el período de exposición. Las concentraciones individuales medidas en la cámara no deben desviarse de la concentración media en más de un ± 10 % cuando se trata de gases y vapores, ni en más de un ± 20 % en el caso de aerosoles de líquidos o sólidos. Se calculará y documentará el tiempo de equilibrado (t95) de la cámara. La duración de una exposición incluye el tiempo durante el cual se genera la sustancia problema. Este abarca los tiempos transcurridos hasta alcanzar el equilibrio en la cámara (t95) y hasta la extinción. Se ofrecen indicaciones para el cálculo de t95 en el documento de orientación no 39 (2). | 28. | Cuando se manejan mezclas muy complejas formadas por gases/vapores y aerosoles (por ejemplo, atmósferas de combustión y sustancias problema propulsadas con dispositivos/productos fabricados con fines determinados), cada fase puede comportarse de manera diferente en una cámara de inhalación. Por consiguiente, se seleccionará como mínimo una sustancia indicadora (analito), normalmente el componente activo principal de la mezcla, para cada fase (gas/vapor y aerosol). Si el producto analizado es una mezcla, habrá que documentar la concentración analítica de la mezcla total y no solo de la sustancia indicadora o el componente activo (analito). Se ofrece más información sobre las concentraciones reales en el documento de orientación no 39 (2). | Sustancia problema: distribución granulométrica | 29. | La distribución granulométrica de los aerosoles debe determinarse al menos con periodicidad semanal por cada nivel de concentración, con ayuda de un impactador de cascada o un aparato alternativo, como un medidor del tamaño aeorodinámico de partícula (APS). Si se puede demostrar la equivalencia de los resultados obtenidos con el impactador de cascada y con el aparato alternativo, entonces se podrá emplear este último durante todo el estudio. | 30. | Se empleará un segundo dispositivo, como un filtro gravimétrico o un sistema de burbujeo o de purga, en paralelo con el equipo principal para confirmar la eficiencia de recogida de este último. La concentración en masa obtenida mediante análisis granulométrico tendrá unos límites de desviación razonables con respecto a la concentración en masa obtenida mediante gravimetría por filtración [véase el documento GD 39 (2)]. Si es posible demostrar su equivalencia para todas las concentraciones analizadas en la fase inicial del estudio, podrán omitirse en lo sucesivo las pruebas confirmatorias. Por razones de bienestar animal, se tomarán medidas para minimizar la obtención de datos no concluyentes que obligarían a repetir el ensayo. | 31. | Se controlará el tamaño de partícula en los vapores cuando exista la posibilidad de que la condensación del vapor provoque la formación de un aerosol, o cuando se detecten partículas en una atmósfera de vapor que puedan inducir la mezcla de fases. | OBSERVACIONES | 32. | Los animales se someterán a observación clínica frecuente antes, durante y después del período de exposición. Pueden estar indicadas observaciones más frecuentes, dependiendo de la respuesta de los animales durante la exposición. Cuando la observación de los animales esté dificultada por el uso de tubos de sujeción, por la escasa iluminación de las cámaras de cuerpo entero o por la opacidad ambiental, se someterán a observación minuciosa después de la exposición. Las observaciones realizadas con anterioridad a la exposición del día siguiente permiten determinar la posible reversibilidad o exacerbación de los efectos tóxicos. | 33. | Todas las observaciones se registrarán en fichas individuales de cada animal. Cuando se encuentre algún animal muerto o se sacrifique por razones compasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la muerte. | 34. | Las observaciones fuera de la jaula deberían incluir los cambios en la piel, pelo, ojos y membranas mucosas; los cambios en los sistemas respiratorio, circulatorio y nervioso, así como la actividad somatomotriz y las pautas de comportamiento. Debe prestarse atención especial a la observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. El registro de la temperatura rectal puede ayudar a detectar una bradipnea refleja o una hipo/hipertermia relacionadas con el tratamiento o con el confinamiento. En el protocolo del estudio se pueden incluir otras evaluaciones del tipo de pruebas cinéticas, biovigilancia, pruebas de la función pulmonar, retención de materiales escasamente solubles que puedan acumularse en el tejido pulmonar y cambios comportamentales. | PESO CORPORAL | 35. | Se registrará el peso de cada animal poco antes de la primera exposición (día 0), y después dos veces por semana (por ejemplo, los viernes y lunes para demostrar la recuperación durante un fin de semana sin exposición, o con un intervalo que permita evaluar la toxicidad sistémica) y en el momento de la muerte o la eutanasia. Si no se observan efectos en las 4 primeras semanas, el peso corporal se podrá registrar semanalmente durante el resto del estudio. Si se utilizan animales satélite (reversibilidad), se seguirán pesando semanalmente durante todo el período de recuperación. Al concluir el estudio, se pesarán todos los animales poco antes del sacrificio para permitir calcular sin sesgos la relación entre el peso de los órganos y el peso corporal. | CONSUMO DE AGUA Y DE ALIMENTOS | 36. | El consumo alimentario se medirá cada semana. También se puede medir el consumo de agua. | PATOLOGÍA CLÍNICA | 37. | Deben hacerse evaluaciones de patología clínica en todos los animales, incluidos los testigo y los satélite (reversibilidad), cuando sean sacrificados. Se registrará el intervalo de tiempo transcurrido entre el final de la exposición y la toma de muestras de sangre, particularmente si la recuperación del parámetro valorado es rápida. Está indicado obtener muestras al final del período de exposición cuando se trata de parámetros con una semivida plasmática corta (por ejemplo, COHb, CHE y MetHb). | 38. | En el cuadro 1 se recogen los parámetros de patología clínica que se suelen exigir en todos los estudios toxicológicos. El análisis de orina no es necesario hacerlo de forma sistemática, sino solo en caso de efectos tóxicos probables o manifiestos. El director del estudio puede decidir la evaluación de otros parámetros para caracterizar mejor la toxicidad de una sustancia problema (colinesterasa, lípidos, hormonas, equilibrio ácido-base, metahemoglobina o cuerpos de Heinz, creatina-cinasa, cociente mieloide/eritroide, troponinas, gases en sangre arterial, lactato-deshidrogenasa, sorbitol-deshidrogenasa, glutamato-deshidrogenasa y gamma-glutamil-transpeptidasa). | Cuadro 1 | Parámetros de patología clínica habituales | Hematología | Recuento de eritrocitos | Hematocrito | Concentración de hemoglobina | Hemoglobina corpuscular media | Volumen corpuscular medio | Concentración de hemoglobina corpuscular media | Reticulocitos | Recuento de leucocitos | Fórmula leucocitaria | Recuento de plaquetas | Capacidad de coagulación (seleccionar una): | — | Tiempo de protrombina | — | Tiempo de coagulación | — | Tiempo de tromboplastina parcial | Bioquímica clínica | Glucosa (*2) | Colesterol total | Triglicéridos | Nitrógeno ureico en sangre | Bilirrubina total | Creatinina | Proteínas totales | Albúmina | Globulinas | Alanina-aminotransferasa | Aspartato-aminotransferasa | Fosfatasa alcalina | Potasio | Sodio | Calcio | Fósforo | Cloruros | Análisis de orina (opcional) | Aspecto (color y turbidez) | Volumen | Densidad y osmolalidad | pH | Proteínas totales | Glucosa | Sangre/células sanguíneas | 39. | Cuando hay indicios de que las vías respiratorias bajas (alvéolos) son el lugar principal de depósito y retención, el lavado broncoalveolar (BAL) puede ser la técnica de elección para analizar cuantitativamente los parámetros hipotéticamente dependientes de la dosis relacionados con la aparición de alveolitis, inflamación pulmonar y fosfolipidosis. Ello permite demostrar debidamente la relación dosis-respuesta y la evolución en el tiempo del daño alveolar. En el fluido BAL se pueden analizar el recuento de leucocitos y la fórmula leucocitaria, las proteínas totales y la lactato-deshidrogenasa. Otros parámetros dignos de tenerse en cuenta son los indicadores de daño lisosomal, fosfolipidosis, fibrosis e inflamación alérgica o irritativa, como puede ser la determinación de las citocinas o quimiocinas proinflamatorias. Generalmente, las determinaciones realizadas en el BAL son complementarias de los resultados del examen histopatológico, pero no pueden sustituirlos. En el documento GD 39 (2) se facilitan indicaciones sobre el modo de realizar un lavado pulmonar. | EXAMEN OFTALMOLÓGICO | 40. | Con ayuda de un oftalmoscopio o instrumento equivalente, se realizarán exploraciones oftalmológicas del fondo de ojo, los medios refringentes, el iris y la conjuntiva de todos los animales antes de la administración de la sustancia problema, y del grupo sometido a concentración más elevada al concluir el estudio. Si se apreciaran alteraciones oculares, se examinará a todos los animales, incluidos los del lote satélite (de reversibilidad). | ANATOMÍA PATOLÓGICA MACROSCÓPICA Y PESO DE LOS ÓRGANOS | 41. | Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran durante su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar animal, se someterán a autopsia macroscópica. Se documentará el tiempo transcurrido entre el final de la última exposición de cada animal y su sacrificio. Si la autopsia no se puede practicar inmediatamente después de descubrir la muerte del animal, este será refrigerado (no congelado) a una temperatura suficientemente baja para minimizar la autólisis. Las autopsias se practicarán lo antes posible, normalmente en el plazo de uno o dos días. Se documentarán todas las modificaciones anatomopatológicas macroscópicas observadas en cada animal, poniendo especial atención en las alteraciones de las vías respiratorias. | 42. | En el cuadro 2 se indican los órganos y tejidos que durante la autopsia macroscópica deben conservarse en un medio idóneo para su examen histopatológico. La conservación de los órganos y tejidos entre corchetes, así como de cualquier otro órgano o tejido, se hará a criterio del director del estudio. Los órganos destacados en negrita se deben limpiar de adherencias y pesar lo antes posible después de la disección para evitar su desecación. El tiroides y los epidídimos solo se pesarán en caso necesario, porque los artefactos debidos a las adherencias pueden dificultar la evaluación histopatológica. Los tejidos y órganos se fijan en formol con amortiguador al 10 % o en otro fijador apropiado inmediatamente después de la autopsia, dejando pasar un mínimo de 24-48 horas antes de la limpieza de adherencias, dependiendo del fijador empleado. | Cuadro 2 | Órganos y tejidos conservados durante la autopsia macroscópica | Cápsulas suprarrenales | Aorta | Médula ósea (y/o aspirado reciente) | Encéfalo (incluidos cortes de cerebro, cerebelo, bulbo y protuberancia) | Intestino ciego | Colon | Duodeno | [Epidídimos] | [Ojos (retina, nervio óptico) y párpados] | Fémur y articulación tibiofemoral | Vesícula biliar (de estar presente) | [Glándula de Harder] | Corazón | Íleo | Yeyuno | Riñones | [Glándulas lacrimales (extraorbitarias)] | Laringe (3 secciones, incluida la base de la epiglotis) | Hígado | Pulmón (todos los lóbulos en una sección de corte, incluidos los bronquios primarios) | Ganglios linfáticos de la región hiliar del pulmón, especialmente cuando se estudian sustancias problema particuladas escasamente solubles. Si se trata de exámenes más minuciosos o de carácter inmunológico, pueden tomarse en consideración otros ganglios linfáticos, por ejemplo de las regiones mediastínica, cervical/submandibular o auricular. | Ganglios linfáticos (distales de la vía de acceso) | Glándulas mamarias (femeninas) | Músculo (muslo) | Tejidos nasofaríngeos [como mínimo 4 secciones; una sección incluirá el conducto nasofaríngeo y el tejido linfoide asociado a la nariz (Nasal Associated Lymphoid Tissue, NALT)] | Esófago | [Bulbo olfativo] | Ovarios | Páncreas | Glándulas paratiroides | Nervios periféricos (ciático o tibial, preferiblemente próximos al músculo) | Hipófisis | Próstata | Recto | Glándulas salivales | Vesículas seminales | Piel | Médula espinal (cervical, medio-dorsal y lumbar) | Bazo | Esternón | Estómago | Dientes | Testículos | Timo | Glándula tiroides | [Lengua] | Tráquea (como mínimo 2 secciones, 1 longitudinal que pase por la carina traqueal y 1 sección transversal) | [Uréteres] | [Uretra] | [Vejiga urinaria] | Útero | Órganos diana | Todas las masas y lesiones macroscópicas | 43. | El pulmón se debe extraer intacto, pesar e instilar con un fijador apropiado a una presión de 20-30 cm de agua para asegurar el mantenimiento de la estructura pulmonar (5). Se preparan cortes de todos los lóbulos a un solo nivel, incluyendo los bronquios primarios, pero, si se practica un lavado pulmonar, el lóbulo no lavado se seccionará a tres niveles (no en cortes seriados). | 44. | Deben examinarse como mínimo 4 secciones de los tejidos nasofaríngeos, una de las cuales incluirá el conducto nasofaríngeo (5) (6) (7) (8) (9) para permitir una observación adecuada de los epitelios escamoso, transicional (respiratorio no ciliado) y olfativo, y el tejido de drenaje linfático (NALT) (10) (11). Se examinarán tres secciones de la laringe, una de las cuales debe incluir la base de la epiglotis (12). Deben examinarse como mínimo 2 secciones de la tráquea, entre ellas un corte longitudinal que pase por la carina de bifurcación de los bronquios extrapulmonares y un corte transversal. | EXAMEN HISTOPATOLÓGICO | 45. | La evaluación histopatológica de todos los órganos y tejidos mencionados en el cuadro 2 se llevará a cabo en el lote de control y en el de concentración más elevada, así como en todos los animales que mueran o sean sacrificados durante el estudio. Se prestará especial atención a las vías respiratorias, los órganos diana y las lesiones macroscópicas. Aquellos órganos y tejidos que presenten lesiones en el lote de concentración más elevada se examinarán en todos los grupos. Con objeto de demostrar una clara relación concentración-respuesta, el director del estudio puede decidir la realización de evaluaciones histopatológicas en otros lotes. Si se utiliza un lote satélite (reversibilidad), debe hacerse un examen histopatológico de todos los órganos y tejidos que presenten efectos en los lotes tratados. Si en el lote de exposición elevada se producen muertes prematuras u otras dificultades que comprometan la interpretación de los datos, se practicarán evaluaciones histopatológicas en el lote de la concentración inmediatamente inferior. Se procurará correlacionar las observaciones macroscópicas con los hallazgos microscópicos. | DATOS E INFORME | Datos | 46. | Se documentarán los datos de cada animal referentes a peso corporal, consumo de alimento, patología clínica, anatomía patológica macroscópica, peso de los órganos e histopatología. Los resultados de la observación clínica se reunirán en un cuadro que presente, por cada grupo de ensayo, el número de animales utilizados, el número de animales que presenten signos específicos de toxicidad, el número de animales hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte de los distintos animales, la descripción y la evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversibilidad, y los resultados de la autopsia. Todos los resultados, cuantitativos y fortuitos, se evaluarán por un método estadístico apropiado. Puede usarse cualquier método estadístico reconocido; los métodos estadísticos aplicados deben seleccionarse durante el diseño del estudio. | Informe del ensayo | 47. | El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información siguiente: | | Animales de experimentación y zootecnia | — | Descripción de las condiciones de enjaulado, tales como: número (o variación del número) de animales por jaula, materiales de cama, temperatura ambiente y humedad relativa, fotoperíodo e identificación de la dieta. | — | Especie o variedad empleada y justificación del uso de una especie distinta de la rata. Podrán indicarse la procedencia y los datos previos, siempre que correspondan a animales sometidos a condiciones parecidas de exposición, alojamiento y alimentación. | — | Número, edad y sexo de los animales. | — | Método de asignación al azar. | — | Descripción de cualquier acondicionamiento previo al estudio, incluidos alimentación, cuarentena y tratamiento de enfermedades. | | Sustancia problema | — | Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (incluida la isomerización). | — | Identificación química y número de registro del Chemical Abstracts Service (CAS), si se conoce. | | Vehículo | — | Justificación del uso de un vehículo y justificación de la elección del mismo (si es distinto del agua). | — | Datos históricos o paralelos que demuestren que el vehículo no interfiere en los resultados del estudio. | | Cámara de inhalación | — | Descripción pormenorizada de la cámara de inhalación, incluido el volumen, y acompañada de un diagrama. | — | Procedencia y descripción del equipo empleado para la exposición de los animales y la generación de la atmósfera. | — | Instrumental empleado para medir la temperatura, la humedad, el tamaño de partícula y la concentración real. | — | Fuente del aire y sistema de acondicionamiento. | — | Métodos de calibración del instrumental para garantizar una atmósfera experimental homogénea. | — | Diferencia de presión (positiva o negativa). | — | Puertos de exposición por cámara (solo por la nariz); ubicación de los animales en la cámara (de cuerpo entero). | — | Estabilidad de la atmósfera experimental. | — | Localización de los sensores de temperatura y humedad, y muestreo de la atmósfera experimental en la cámara. | — | Tratamiento del aire suministrado/extraído. | — | Caudales de aire, caudal de aire por puerto de exposición (solo por la nariz) o carga de animales por cámara (de cuerpo entero). | — | Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio (t95) en la cámara de inhalación. | — | Número de variaciones de volumen por hora. | — | Dispositivos de dosificación (si procede). | | Datos relativos a la exposición | — | Justificación de la concentración diana seleccionada en el estudio principal. | — | Concentraciones nominales (masa total de sustancia problema generada en la cámara de inhalación dividida por el volumen de aire que recorre la cámara). | — | Concentraciones reales de la sustancia problema recuperadas en la zona de respiración de los animales; en el caso de mezclas que dan lugar a formas físicas heterogéneas (gases, vapores, aerosoles), se podrá analizar cada una de ellas por separado. | — | Todas las concentraciones atmosféricas se registrarán en unidades de masa (mg/l, mg/m3, etc.) y no en unidades de volumen (ppm, ppmm, etc.). | — | Distribución granulométrica, diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) y desviación típica geométrica (σg), incluidos los correspondientes métodos de cálculo. Se documentarán los análisis granulométricos individuales. | | Condiciones del ensayo | — | Descripción pormenorizada de la preparación de la sustancia problema y de cualquier método empleado para reducir el tamaño de partícula de las materias sólidas o preparar soluciones de la sustancia problema. | — | Descripción (preferiblemente acompañada de un diagrama) del equipo empleado para generar la atmósfera experimental y para exponer los animales a la misma. | — | Descripción pormenorizada del instrumental empleado para controlar la temperatura, la humedad y el caudal de aire de la cámara (creación de una curva de calibración). | — | Descripción pormenorizada del equipo empleado para tomar las muestras con el fin de medir la concentración de la cámara y la distribución por tamaño de partícula. | — | Descripción pormenorizada del método de análisis químico empleado y de la validación del método (incluida la eficiencia de recuperación de la sustancia problema en el medio ambiente experimental). | — | Método aleatorio de asignación de los animales a los lotes de exposición y de control (testigo). | — | Pormenores de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo/origen de la alimentación y el origen del agua. | — | Justificación de las concentraciones experimentales seleccionadas. | | Resultados | — | Tabulación de los valores de temperatura, humedad y caudal de aire de la cámara. | — | Tabulación de las concentraciones nominales y reales de la cámara. | — | Tabulación de los datos de granulometría, incluidos los de recogida de muestras para el análisis, distribución granulométrica y cálculos de MMAD y σg. | — | Tabulación de las respuestas y de los niveles de concentración de cada animal (es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la mortalidad y la naturaleza, gravedad, momento de aparición y duración de los efectos). | — | Tabulación de los pesos de los animales individuales. | — | Tabulación del consumo de alimentos. | — | Tabulación de los datos de patología clínica. | — | Resultados de la autopsia y eventuales observaciones histopatológicas de cada animal, si se dispone de ellas. | | Evaluación e interpretación de los resultados | — | Se hará especial hincapié en la descripción de los procedimientos empleados para satisfacer los criterios del presente método de ensayo como, por ejemplo, la concentración límite o el tamaño de partícula. | — | Se tomará en consideración la respirabilidad de las partículas a la luz de los resultados globales, de manera especial si no se cumplienlos criterios relativos al tamaño de partícula. | — | En la evaluación global del estudio se expondrá la coherencia de los métodos empleados para determinar las concentraciones nominales y reales y la relación entre ellas. | — | Se explicará la causa probable de muerte y el mecanismo de acción (sistémico o local) predominante. | — | Se facilitará una explicación de por qué ha sido preciso sacrificar de forma compasiva los animales con signos evidentes de dolor o de sufrimiento intenso y duradero, atendiendo a los criterios del documento de orientación de la OCDE sobre parámetros de tratamiento compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (3). | — | Se identificarán el órgano o los órganos diana. | — | Se determinarán los valores de NOAEL y LOAEL. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (4) | Whalan E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258. | (6) | Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. | (7) | Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238. | (8) | Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. | (9) | Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. | (10) | Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. | (11) | Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. | (12) | Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428. | (13) | Reglamento (CE) no 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE, y se modifica el Reglamento (CE) no 1907/2006 (DO L 353 de 31.12.2008, p. 1). | Apéndice 1 | DEFINICIÓN | Sustancia problema: cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este método de ensayo. | B.30. ENSAYO DE TOXICIDAD CRÓNICA | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 452 de la OCDE (2009). Las TG 452 originales fueron adoptadas en 1981. Se consideró necesario adaptar este método de ensayo B.30 para dar cuenta de los avances recientes en materia de bienestar animal que plantean nuevas necesidades normativas (1) (2) (3) (4). La actualización de este método de ensayo B.30 se ha realizado en paralelo con las revisiones de los capítulos del presente anexo B.32. Ensayo de carcinogénesis y B.33. Ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis, con el fin de obtener más información acerca de los animales utilizados en el estudio y recabar nuevos datos sobre la selección de las dosis. El presente método de ensayo ha sido diseñado para el estudio de una amplia gama de sustancias, incluso plaguicidas y productos químicos industriales. | 2. | La mayoría de los ensayos de toxicidad crónica se realizan con especies de roedores, por lo que este método de ensayo se ha diseñado básicamente para el estudio de dichas especies. Cuando fuere preciso realizar estos ensayos en especies no roedoras, serán así mismo de aplicación los principios y procedimientos descritos en este método de ensayo, además de los descritos en el capítulo B.27 del presente anexo, Ensayo de toxicidad oral por administración continuada (90 días) en no roedores (5), con las debidas modificaciones, tal como se especifica en el documento de orientación no 116 de la OCDE sobre diseño y realización de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis (6). | 3. | Las tres vías de administración principales que se estudian en los ensayos de toxicidad crónica son la oral, la cutánea y la inhalatoria. La elección de una de ellas dependerá de las características físicas y químicas de la sustancia estudiada y de la vía de exposición predominante en seres humanos. Se ofrece más información sobre la vía de exposición en el documento de orientación no 116 de la OCDE (6). | 4. | El presente método de ensayo centra el interés en la exposición por vía oral, la más frecuentemente usada en los estudios de toxicidad crónica. Si bien los estudios de toxicidad crónica a largo plazo que entrañan la exposición por vía cutánea o inhalatoria pueden ser igualmente necesarios en la evaluación del riesgo para la salud humana o en determinados marcos legislativos, estas dos vías de exposición plantean una complejidad técnica considerable. Tales estudios tendrán que diseñarse según cada caso; sin embargo, el método de ensayo que aquí se describe para la determinación y evaluación de la toxicidad crónica por administración oral podría sentar las bases de un protocolo para los estudios de toxicidad por inhalación o absorción dérmica en lo que se refiere a recomendación de períodos de tratamiento, parámetros clínicos e histopatológicos, etc. La OCDE dispone de documentación de orientación sobre la administración de las sustancias problema por inhalación (6) (7) y por vía cutánea (6). Para el diseño de estudios a más largo plazo que contemplen la exposición por vía inhalatoria deben consultarse específicamente los capítulos B.8 (8) y B.29 (9) del presente anexo, además del documento de orientación de la OCDE sobre estudios de toxicidad aguda por inhalación (7). Cuando se trate de estudios que contemplen la vía cutánea se consultará el capítulo B.9 (10) del presente anexo. | 5. | Un ensayo de toxicidad crónica proporciona información sobre el peligro para la salud que supone la exposición continuada de la especie estudiada durante una parte considerable de su ciclo vital. El estudio proporciona información sobre los efectos tóxicos de la sustancia problema; indica los órganos diana y la posibilidad de acumulación. Puede proporcionar además una estimación del nivel máximo sin efectos adversos observados, que puede ser útil para establecer los criterios de seguridad de la exposición humana. Cabe destacar la necesidad de realizar observaciones clínicas detenidas de los animales, a fin de obtener la máxima información posible. | 6. | Los objetivos de los estudios realizados según este método de ensayo son: | — | la identificación de la toxicidad crónica de una sustancia problema, | — | la identificación de los órganos diana, | — | la caracterización de la relación dosis-respuesta, | — | la identificación del nivel máximo sin efectos adversos observados (NOAEL), o punto de partida para determinar una dosis de referencia (Benchmark Dose, BMD), | — | la predicción de los efectos de toxicidad crónica que se producirán a los niveles de exposición humana, | — | la recopilación de datos para investigar las hipótesis referentes al mecanismo de acción (6). | CONSIDERACIONES INICIALES | 7. | En la determinación y evaluación de las características toxicológicas de una sustancia problema, el laboratorio de ensayo deberá tener en cuenta toda la información disponible acerca de la sustancia química antes de emprender el estudio, para así poder centrarse de manera más eficaz en la toxicidad crónica potencial y minimizar el uso de animales. En el diseño del estudio serán de ayuda el conocimiento de la identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema; cualquier información referente al mecanismo de acción; los resultados de cualesquiera ensayos de toxicidad in vitro o in vivo; el uso o los usos previstos y la exposición humana potencial; los datos de (Q)SAR previos y los datos toxicológicos sobre sustancias estructuralmente afines; los datos toxicocinéticos disponibles (cinética de dosis única y, en su caso, de acumulación por dosis repetidas) y los datos derivados de otros estudios de exposición continuada. La determinación de la toxicidad crónica solo debe emprenderse una vez que se ha recabado la información toxicológica inicial en los ensayos de toxicidad por administración repetida durante 28 días y/o 90 días. Se hará un planteamiento escalonado de los estudios de toxicidad crónica como parte de la evaluación global de los potenciales efectos adversos que puede tener para la salud una sustancia determinada (11) (12) (13) (14). | 8. | Antes de iniciar el estudio se establecerán los métodos estadísticos más adecuados para el análisis de los resultados, en función del diseño y de los objetivos experimentales. Una cuestión importante es si la evaluación estadística debe incorporar ajustes de la supervivencia y los análisis en caso de terminación prematura de uno o varios lotes. Se ofrecen orientaciones para realizar el análisis estadístico adecuado y referencias a los métodos estadísticos internacionalmente aceptados en el documento de orientación (GD) no 116 (6) y en el GD no 35 sobre análisis y evaluación de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis (15). | 9. | Cuando se efectúa un estudio de toxicidad crónica, son de aplicación los principios y consideraciones recogidos en el documento de orientación no 19 de la OCDE sobre el reconocimiento, la evaluación y la aplicación de los signos clínicos con criterios compasivos en los animales experimentales que se usan para evaluar la seguridad (16), en particular su punto 62. Dicho punto especifica que en los estudios de administración continuada, cuando un animal muestre signos clínicos progresivos que entrañen un deterioro creciente de su estado, habrá que decidir con conocimiento de causa si se sacrifica de forma compasiva. La decisión sopesará el valor de la información que puede obtenerse si se mantiene al animal en el estudio frente al desgaste de su estado general. Si se decide mantener al animal en el ensayo, se aumentará la frecuencia de las observaciones en la medida necesaria. Cabe también la posibilidad de, sin perjudicar a los fines de la investigación, suspender temporalmente la administración para aliviar el dolor o sufrimiento, o reducir la dosis experimental. | 10. | Se ofrecen orientaciones y comentarios detallados sobre los principios que deben orientar la selección de la dosis en los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis en el documento de orientación no 116 (6) y en dos publicaciones del International Life Sciences Institute (17) (18). El núcleo de la estrategia de selección de la dosis depende del objetivo o los objetivos principales del estudio (punto 6). Al elegir un intervalo posológico adecuado, debe buscarse un equilibrio entre el cribado de los peligros, por un lado, y la caracterización de las respuestas ante dosis bajas y su importancia, por otro. Ello tiene especial trascendencia cuando se proyecta (punto 11) un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 del presente anexo). | 11. | Se considerará la posibilidad de efectuar un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 de este anexo) en lugar de realizar por separado un ensayo de toxicidad crónica (presente método de ensayo B.30) y un ensayo de carcinogénesis (capítulo B.32 de este anexo). El ensayo combinado permite una mayor eficiencia que los estudios separados en términos de tiempo y costes, sin comprometer la calidad de los datos ni en la fase de toxicidad crónica ni en la fase de carcinogénesis. Sin embargo, cuando se emprenda un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 de este anexo) habrá que considerar detenidamente los principios de la selección de la dosis (puntos 9 y 20-25) y, por otro lado, se entiende que determinados marcos legislativos pueden imponer la realización de ensayos separados. | 12. | Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan al final del presente capítulo y en el documento GD 116 (6). | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 13. | La sustancia problema se administra diariamente en dosis escalonadas a varios lotes de animales experimentales, normalmente durante un período de 12 meses, si bien este puede reducirse o prolongarse en función de los requisitos normativos (véase el punto 33). Dicho período se ha seleccionado por ser suficientemente largo para permitir que se manifiesten los eventuales efectos de toxicidad acumulativa, pero sin que se confundan con las alteraciones geriátricas. Toda desviación de este período de exposición de 12 meses deberá justificarse, particularmente si es en el sentido de acortarlo. La sustancia problema se administra generalmente por vía oral, aunque también se aceptan las vías inhalatoria y cutánea. El diseño del estudio puede contemplar el sacrificio de uno o más animales durante el ensayo, por ejemplo a los 3 y a los 6 meses, y a tal efecto se podrán prever lotes complementarios de animales (véase el punto 19). A lo largo del período de administración, se observa atentamente a los animales por si aparecen signos de toxicidad. Se practica la autopsia a los animales que mueran o sean sacrificados durante el ensayo y, al final del mismo, se sacrifican y someten a autopsia los animales supervivientes. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Selección de la especie animal | 14. | El presente método de ensayo se destina principalmente a la evaluación de la toxicidad crónica en roedores (véase el punto 2), si bien se acepta que en determinados marcos legislativos puedan hacerse estudios parecidos en especies no roedoras. Se justificará la elección de la especie. El diseño y la realización de los estudios de toxicidad crónica en especies no roedoras, cuando proceda, se basará en los principios que se recogen en el presente método de ensayo y en el capítulo B.27 de este anexo, Toxicidad oral por administración continuada (28 días) en no roedores (5). Se ofrece más información sobre la elección de la especie y la cepa de laboratorio en el documento de orientación no 116 de la OCDE (6). | 15. | La especie recomendada en este método de ensayo es la rata, si bien pueden emplearse otras especies de roedores como el ratón. Las ratas y los ratones se prefieren como modelos experimentales debido a su ciclo vital relativamente corto, su amplia utilización en los estudios farmacológicos y toxicológicos, su sensibilidad a la inducción tumoral y la disponibilidad de cepas de laboratorio suficientemente caracterizadas. Debido a todas estas características, se ha podido hacer un gran acopio de información acerca de su fisiología y anatomopatología. Se escogerán animales adultos jóvenes y sanos de una variedad de laboratorio de uso habitual. El estudio de toxicidad crónica debe efectuarse en animales de la misma variedad y procedencia que los usados en el estudio o los estudios preliminares de toxicidad de más breve duración. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. | Condiciones de alojamiento y alimentación | 16. | Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del mismo sexo; el enjaulamiento individual se considerará solo si está científicamente justificado (19) (20) (21). Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. La sala de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el ideal es el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La dieta debe satisfacer todas las necesidades nutricionales de la especie estudiada, y se mantendrá en el mínimo posible su contenido en contaminantes alimentarios, entre otros los residuos de plaguicidas, contaminantes orgánicos persistentes, fitoestrógenos, metales pesados y micotoxinas que pudieran influir en los resultados experimentales. La información analítica sobre el contenido de nutrientes y contaminantes alimentarios se consignará de forma periódica, como mínimo al inicio del estudio y cada vez que se varíe el lote de producto empleado, y se documentará en el informe final. Así mismo se consignará la información analítica sobre el agua de bebida empleada en el estudio. Cuando la sustancia problema se administra con el alimento, la elección de la dieta se basa en la necesidad de conseguir una mezcla apropiada de la sustancia problema y de satisfacer al mismo tiempo las necesidades nutricionales de los animales. | Preparación de los animales | 17. | Deben emplearse animales sanos, que se hayan mantenido al menos 7 días en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no hayan sido sometidos a experimentos previos. En el caso de los roedores, la administración comenzará lo antes posible tras su destete y aclimatación, preferiblemente antes de que los animales cumplan 8 semanas de edad. Se caracteriza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y edad de los, animales de experimentación. La diferencia de peso entre los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo. Los animales se reparten al azar entre los lotes tratados y los de control. Después de la asignación al azar, no debe haber diferencias significativas entre los grupos en las medias de peso corporal de cada sexo. De observarse diferencias estadísticamente significativas, el proceso de asignación aleatoria a los grupos deberá repetirse en la medida de lo posible. Se asigna a cada animal un número de identificación distinto, con el que se marca de manera permanente mediante tatuaje, implante de microchip o cualquier otro medio adecuado. | PROCEDIMIENTO | Número y sexo de los animales | 18. | Se emplearán animales de ambos sexos. Se empleará un número de individuos tal que al concluir el estudio queden suficientes animales en cada grupo para permitir una exhaustiva evaluación biológica y estadística. Tratándose de roedores, se emplean al menos 20 animales por sexo y lote en cada nivel de dosificación, mientras que en el caso de no roedores se recomienda un mínimo de 4 animales por sexo y lote. En los ensayos con ratones puede hacer falta un suplemento de animales en cada grupo de dosificación para llevar a cabo todas las valoraciones hematológicas necesarias. | Provisión de animales para el sacrificio durante el ensayo, los lotes satélite y los lotes centinela | 19. | Si está científicamente justificado, se podrán hacer provisiones para el sacrificio de animales (como mínimo 10 por sexo y lote) durante el ensayo, por ejemplo a los 6 meses, a fin de obtener información sobre la progresión de las alteraciones toxicológicas y sobre el mecanismo de acción. Si tal información ha sido ya proporcionada por estudios previos de toxicidad por administración repetida realizados con la misma sustancia problema, el sacrificio de animales durante el ensayo puede no estar científicamente justificado. Cabe la posibilidad de incluir lotes satélite para controlar la reversibilidad de las eventuales alteraciones tóxicas inducidas por la sustancia problema; generalmente, se limitan al lote del nivel de dosis más elevado del estudio y al lote testigo. Se podrá incluir además un lote de animales centinela (habitualmente 5 individuos de cada sexo) para supervisar su estado en cuanto a enfermedades, en caso necesario, durante el estudio (22). Si está previsto el sacrificio de animales durante el ensayo o la inclusión de lotes satélite o centinela, el diseño experimental se incrementará en el número de animales que vaya a ser sacrificado antes de que concluya el estudio. Estos animales se someten generalmente a las mismas observaciones (peso corporal, consumo de agua y alimentos, valoraciones de hematología y bioquímica clínica e investigaciones anatomopatológicas) que los animales observados en la fase de toxicidad crónica del estudio principal, aunque se puede establecer que en los lotes que se sacrifiquen durante el ensayo, se restrinja dicha evaluación a aspectos cruciales como la neurotoxicidad o la inmunotoxicidad. | Grupos de dosis y posología | 20. | Se ofrecen indicaciones sobre todos los aspectos de la selección de la dosis y los intervalos entre las dosis en el documento de orientación no 116 (6). Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control, salvo si se lleva a cabo un ensayo límite (véase el punto 27). Los niveles de dosis se basan generalmente en los resultados de los estudios de determinación del intervalo o realizados con dosis repetidas a corto plazo, y deben tener en cuenta los datos toxicológicos y toxicocinéticos de que se disponga en relación con la sustancia problema o con sustancias afines. | 21. | Salvo limitaciones impuestas por la naturaleza fisicoquímica o los efectos biológicos de la sustancia problema, el nivel de dosis más elevado se escogerá a fin de identificar los principales órganos diana y efectos tóxicos pero evitando una toxicidad intensa, el sufrimiento, la morbilidad o la muerte de los animales. Tomando en consideración los factores que se indican en el punto 22 que sigue, el nivel de dosis más elevado será tal que provoque signos de toxicidad, por ejemplo, manifestada por una merma de la ganancia de peso corporal (aproximadamente el 10 %). | 22. | Ahora bien, dependiendo de los objetivos del estudio (véase el punto 6), se puede establecer un techo de dosis inferior al nivel que provoque signos de toxicidad, por ejemplo si una dosis induce un efecto adverso de interés que, sin embargo, tiene escasa repercusión en el período de vida o el peso corporal. La dosis más elevada no debe exceder de 1 000 mg/kg peso corporal/día (dosis límite, véase el punto 27). | 23. | Los niveles de dosis y la frecuencia de administración serán tales que permitan establecer una relación dosis-respuesta y un valor de NOAEL o cualesquiera otras determinaciones previstas, como el valor de BMD o dosis de referencia más baja (véase el punto 25). Para establecer las dosis más bajas se tendrán en cuenta factores como la pendiente esperada de la curva dosis-respuesta, así como los niveles a los que cabe esperar cambios importantes en el metabolismo o en el mecanismo de la acción tóxica, cuando se prevea un umbral o que constituyan un punto de partida para extrapolar la dosis más baja. | 24. | La frecuencia de administración de las dosis dependerá de las características de la sustancia problema y no corresponde especificarla en este método de ensayo; los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer los niveles descendentes y frecuentemente es preferible añadir un cuarto lote de ensayo antes que utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo con un factor superior a 6-10) entre dosis. En general se evitará aplicar factores superiores a 10, que en todo caso deberán justificarse. | 25. | Tal como se recoge en el documento de orientación no 116 (6), para la selección de las dosis se tendrán en cuenta los siguientes factores: | — | los intervalos supuestos o conocidos de no linealidad o puntos de inflexión en la relación dosis-respuesta, | — | la toxicocinética y los intervalos posológicos en los que pueda haber o no inducción metabólica, saturación o no linealidad entre la dosimetría externa e interna, | — | las lesiones precursoras, los marcadores de efecto o los indicadores de la intervención de los principales mecanismos biológicos subyacentes, | — | aspectos importantes (hipotéticos o comprobados) del modo de acción, como la dosis a partir de la cual se manifiesta toxicidad, los niveles hormonales que resultan afectados, los mecanismos homeostáticos que se alteran, etc., | — | aquellas regiones de la curva dosis-respuesta en las que se precisa hacer una estimación especialmente robusta, como el intervalo de la dosis de referencia prevista o el umbral hipotético, | — | los niveles de exposición humana que cabe prever. | 26. | Se emplea un lote de control en paralelo, que no recibe la sustancia problema, pero sí el vehículo de la misma en caso de que se utilice. A excepción de la administración de la sustancia problema, los animales del lote de control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de tratamiento. En su caso, el lote de control ha de recibir el mayor volumen de vehículo que se haya utilizado. Si la sustancia problema se administra con los alimentos y provoca una disminución importante de la ingesta debido a que empeoran las características organolépticas de la dieta, puede ser útil utilizar un lote de control alimentado en paralelo para conseguir una comparación más rigurosa. | 27. | Si sobre la base de los estudios preliminares es posible prever que, en un ensayo con una sola dosis equivalente, al menos, a 1 000 mg/kg peso corporal/día y siguiendo el procedimiento descrito en el presente estudio, no se produce ningún efecto adverso observable y si, a la luz de los datos de sustancias estructuralmente afines, no cabe esperar efectos tóxicos, puede considerarse innecesario realizar un estudio completo con tres dosis. Se puede establecer un límite de 1 000 mg/kg peso corporal/día, salvo si la exposición humana previsible indica la necesidad de emplear un nivel de dosis más elevado. | Preparación de las dosis y administración de la sustancia problema | 28. | La sustancia problema se administra habitualmente por vía oral, mediante sonda o con el alimento o el agua de bebida. Se ofrece más información sobre las vías y los métodos de administración en el documento de orientación no 116 de la OCDE (6). La vía y el método de administración dependerán de la finalidad del estudio, las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, su biodisponibilidad y la vía y el modo de exposición predominantes en los seres humanos. Se justificará debidamente la vía y el método de administración elegidos. Por razones de bienestar animal, la alimentación oral por sonda se elegirá solo cuando exista una posibilidad razonable de que la exposición humana a la sustancia química se vaya a producir por la misma vía y el mismo medio de administración (como es el caso de los productos farmacéuticos). Cuando se trata de sustancias alimentarias o ambientales, entre ellas los plaguicidas, la administración se efectúa habitualmente con los alimentos o el agua de bebida. Sin embargo, en otros escenarios de estudio, como la exposición ocupacional, puede ser más conveniente la administración por otras vías. | 29. | En caso necesario, la sustancia problema se disuelve o suspende en un vehículo adecuado. Debe prestarse atención a las siguientes características del vehículo u otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribución, metabolismo o retención de la sustancia problema, efectos sobre las propiedades químicas de dicha sustancia que puedan modificar su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y agua o el estado nutricional de los animales. Se recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus características tóxicas. Se recabará información acerca de la estabilidad de la sustancia problema y su homogeneidad de concentración en las disoluciones o en las dietas (en su caso) que se emplean para la administración. | 30. | Si la sustancia problema se administra con los alimentos o el agua de bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia problema administradas no interfieren con la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. En los estudios de toxicidad a largo plazo en los que la sustancia problema se administra con los alimentos, su concentración no debe superar generalmente el límite del 5 % de la ingesta total para evitar desequilibrios nutricionales. Cuando la sustancia problema se administra con los alimentos, se puede usar una concentración constante en la dieta (mg/kg de alimento o ppm) o bien una dosis constante en términos de peso corporal (mg/kg peso corporal), calculada con periodicidad semanal. Deberá indicarse qué alternativa se ha seguido. | 31. | En el caso de la administración oral, las dosis de la sustancia problema se administran diariamente a los animales (siete días por semana), en general por un período de 12 meses (véase también el punto 33), si bien los requisitos normativos pueden imponer una duración mayor. Cualquier otra pauta posológica, por ejemplo, de 5 días por semana, debe justificarse. En el caso de la administración cutánea, los animales se tratan con la sustancia problema como mínimo 6 horas al día con una pauta de 7 días por semana, según se especifica en el capítulo B.9 del presente anexo (10), durante un período de 12 meses. La exposición por vía inhalatoria se efectúa durante 6 horas al día con una pauta de 7 días por semana pero, si se justifica, es admisible una pauta de 5 días por semana. El período de exposición será habitualmente de 12 meses. Cuando se exponen con la técnica de solo la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justificará debidamente cualquier período de exposición inferior a 6 horas diarias. Véase también el capítulo B.8 del presente anexo (8). | 32. | Si la sustancia problema se administra por sonda, debe hacerse con una sonda gástrica o una cánula de intubación adecuada y todos los días a la misma hora. La dosis única se administra normalmente una vez al día; pero si la sustancia problema es un irritante local, cabe la posibilidad de mantener la dosis total diaria repartiendo la administración en dosis divididas (dos veces al día). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. El volumen se mantendrá en el mínimo posible, y en los roedores no debe exceder generalmente de 1 ml/100 g peso corporal (22). La variabilidad en el volumen utilizado debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para garantizar un volumen constante en todas las dosis. Constituyen una excepción las sustancias potencialmente corrosivas o irritantes, que deben diluirse para evitar efectos locales graves. Se evitará la administración de concentraciones que puedan ser corrosivas o irritantes del tubo digestivo gastrointestinal. | Duración del estudio | 33. | Si bien este método de ensayo ha sido diseñado principalmente como estudio de toxicidad crónica durante 12 meses, su diseño permite aplicarlo a ensayos de duración menor (6 o 9 meses) o mayor (18 o 24 meses), en función de los requisitos normativos particulares o de los mecanismos específicos que se pretenda investigar. Toda desviación de este período de exposición de 12 meses deberá justificarse, particularmente si es en el sentido de acortarlo. Concluida la exposición, los lotes satélite incluidos para comprobar la reversibilidad de las eventuales alteraciones tóxicas inducidas por la sustancia problema deben mantenerse sin administración durante un período no inferior a 4 semanas ni superior a un tercio de la duración total del estudio. Se ofrecen más indicaciones, entre otras, sobre la supervivencia en el estudio en el documento de orientación no 116 (6). | OBSERVACIONES | 34. | Se observará la morbilidad o la mortalidad en todos los animales, generalmente a primera y última hora del día, incluidos los fines de semana y festivos. Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora y teniendo en cuenta el período más agudo de los efectos previstos tras la administración cuando esta se haga por sonda. | 35. | Se someterán todos los animales a observación clínica exhaustiva como mínimo antes de la primera exposición (para permitir realizar comparaciones con un mismo sujeto), al concluir la primera semana de estudio y, en lo sucesivo, con periodicidad mensual. El protocolo de tales observaciones se organizará con el fin de minimizar las variaciones entre los observadores individuales y entre los distintos lotes experimentales. Dichas observaciones han de efectuarse fuera de la jaula de alojamiento, de preferencia en un ambiente normal y siempre a la misma hora. Las observaciones se registran cuidadosamente, preferentemente mediante sistemas de puntuación definidos de forma explícita por el laboratorio de ensayo. Debe procurarse que las variaciones en las condiciones de observación sean mínimas. Los signos anotados deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios de la piel, pelo, ojos, membranas mucosas, presencia de secreciones y excreciones y actividad neurovegetativa (lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila y respiración anómala). Deben registrarse también los cambios en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, o estereotipados (por ejemplo, realización excesiva de movimientos de limpieza o recorridos circulares repetitivos) o comportamientos anómalos (automutilación, marcha hacia atrás, etc.) (24). | 36. | Debe realizarse una exploración oftalmológica con un oftalmoscopio o equipo similar adecuado a todos los animales antes de administrar la sustancia problema. Al concluir el estudio, el mismo examen se practicará preferiblemente a todos los animales y, obligatoriamente, a los lotes de control y de dosis más elevada. Si se observan en esos animales cambios oculares relacionados con el tratamiento, deben examinarse todos los demás. Si el análisis estructural o cualquier otra información indica toxicidad oftálmica, se aumentará la frecuencia de las exploraciones oftalmológicas. | 37. | Cuando se trate de sustancias para las que estudios previos de toxicidad por administración repetida durante 28 días o 90 días hayan demostrado efectos neurotóxicos, las pruebas de reactividad sensorial a estímulos de diferentes tipos (24) [por ejemplo, auditivos, visuales y propioceptivos (25) (26) (27)], así como la evaluación de la fuerza prensil (28) y de la actividad motriz (29), podrán hacerse facultativamente antes de iniciar el estudio, a intervalos de 3 meses durante el mismo hasta un máximo de 12 meses inclusive, y a la conclusión del estudio (si dura más de 12 meses). La bibliografía respectiva recoge más información sobre los métodos que pueden seguirse, si bien es posible emplear procedimientos distintos de los ahí descritos. | 38. | Cuando los estudios previos de toxicidad por administración continuada durante 28 días o 90 días indiquen que la sustancia tiene capacidad inmunotóxica, al concluir el estudio se podrán proseguir las investigaciones de este parámetro. | Peso corporal, consumo de alimentos y agua y eficiencia alimentaria | 39. | Deben pesarse todos los animales al comenzar el tratamiento, como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Se medirán la ingesta de alimento y la eficiencia alimentaria como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Si la sustancia se administra con el agua de bebida, se medirá la ingesta de agua como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. La determinación de la ingesta de agua se contemplará así mismo en aquellos estudios en los que esté alterada la actividad de beber. | Hematología y bioquímica clínica | 40. | En las investigaciones realizadas con roedores, se practicarán exámenes hematológicos como mínimo en 10 machos y 10 hembras de cada grupo, siempre los mismos, a los 3, 6 y 12 meses y al concluir el estudio (si dura más de 12 meses). En los ensayos con ratones puede hacer falta un suplemento de animales satélite para llevar a cabo todas las valoraciones hematológicas necesarias (véase el punto 18). Cuando se trate de especies no roedoras, se tomarán muestras más pequeñas de animales (por ejemplo, 4 animales por sexo y grupo en el caso de los perros) para las valoraciones realizadas durante el ensayo y a su conclusión. Se trate de especies roedoras o no, las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los parámetros hematológicos en los estudios previos efectuados durante 90 días con dosis afines. Las muestras de sangre se extraerán de una zona que deberá indicarse, por ejemplo por punción cardiaca o del seno retro-orbital, bajo anestesia. | 41. | Se investigarán los siguientes parámetros (30): recuento de leucocitos y fórmula leucocitaria, recuento de eritrocitos y de plaquetas, concentración de hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada. Pueden determinarse además otros parámetros hematológicos como los cuerpos de Heinz, la morfología de otros eritrocitos atípicos o los valores de metahemoglobina, en función de la toxicidad de la sustancia problema. El planteamiento general ha de ser flexible, y adaptado a los efectos observados o esperados de la sustancia problema. Si esta ejerce efectos sobre el sistema hematopoyético, pueden estar indicados recuentos de reticulocitos y una citología de la médula ósea, que no son valoraciones habituales. | 42. | En los intervalos de tiempo especificados para determinar las variables hematológicas, se realizarán análisis de bioquímica clínica para investigar los principales efectos tóxicos sobre los tejidos y, específicamente, sobre los riñones y el hígado como mínimo en 10 machos y 10 hembras de cada grupo, siempre los mismos. En el caso de los ratones, pueden hacer falta animales satélite para efectuar todas las valoraciones necesarias de bioquímica clínica. Cuando se trate de especies no roedoras, se tomarán muestras de menos animales (por ejemplo, 4 animales por sexo y grupo en el caso de los perros) para las valoraciones realizadas durante el ensayo y a su conclusión. Se trate de especies roedoras o no, las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los parámetros de bioquímica clínica en los estudios previos efectuados durante 90 días con dosis afines. Se recomienda que los animales (a excepción de los ratones) guarden ayuno desde el día anterior a la extracción de las muestras de sangre. Se investigarán los siguientes parámetros (30): glucosa, urea (nitrógeno ureico), creatinina, proteínas totales, albúmina, calcio, sodio, potasio, colesterol total, al menos dos pruebas completas de la función hepatocelular (alanina-aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa, glutamato-deshidrogenasa, ácidos biliares totales) (31) y al menos dos pruebas completas de la función hepatobiliar (fosfatasa alcalina, gamma-glutamiltransferasa, 5’-nucleotidasa, bilirrubina total, ácidos biliares totales) (31). Cuando proceda y a tenor de la toxicidad de la sustancia problema, pueden hacerse otras valoraciones de bioquímica clínica como las de triglicéridos en ayunas, hormonas específicas y colinesterasa. Por lo general, debe aplicarse un enfoque flexible, en función de los efectos observados o esperados con una sustancia química determinada. | 43. | Se practicarán análisis de orina como mínimo en 10 machos y 10 hembras de cada grupo, sobre muestras recogidas respetando los mismos intervalos que en los análisis de hematología y bioquímica clínica. Las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los análisis de orina en un estudio previo efectuado durante 90 días con dosis afines. Las recomendaciones hechas por expertos acerca de los estudios de patología clínica incluyen los siguientes parámetros (30): aspecto, volumen, osmolalidad o densidad, pH, proteínas totales y glucosa. Otras valoraciones son cuerpos cetónicos, urobilinógeno, bilirrubina y sangre oculta. Si es necesario, pueden analizarse otros parámetros adicionales para profundizar el estudio de los efectos observados. | 44. | De manera general, se acepta que es necesario disponer de valores basales de hematología y bioquímica clínica antes de someter a estudio a los perros, pero no en el caso de las especies roedoras (30). Ahora bien, si los datos basales históricos (véase el punto 50) son insuficientes, se considerará la oportunidad de generar estos datos. | Anatomía patológica | Autopsia macroscópica | 45. | Como norma debe practicarse una autopsia macroscópica completa y detallada a todos los animales empleados en el estudio, que incluya un examen detenido de la superficie corporal externa, todos los orificios y las cavidades craneana, torácica y abdominal con su contenido. Sin embargo, se puede prever además la realización solo (en lotes satélite o animales sacrificados durante el ensayo) de valoraciones clave específicas, por ejemplo de neurotoxicidad o inmunotoxicidad (véase el punto 19). Estos animales no tienen que someterse a autopsia ni a las consiguientes exploraciones que se describen a continuación. La autopsia de los animales centinela se decidirá según cada caso, a criterio del director del estudio. | 46. | Se registrará el peso de los órganos de todos los animales, salvo los que quedan excluidos en la última parte del punto 45. Las cápsulas suprarrenales, encéfalo, epidídimo, corazón, riñones, hígado, ovarios, bazo, testículos, tiroides (que se pesará después de la fijación, con las paratiroides) y útero de todos los animales (aparte de los moribundos y/o sacrificados a lo largo del ensayo) han de limpiarse de los tejidos adherentes, según convenga, y se determinará el peso húmedo lo antes posible tras la disección para evitar su desecación. En los estudios con ratones, el pesaje de las cápsulas suprarrenales es opcional. | 47. | Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el medio de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse (32) (opcional en el caso de los tejidos entre corchetes): | Todas las lesiones macroscópicas | Corazón | Páncreas | Estómago (rumen, estómago glandular) | Glándulas suprarrenales | Íleo | Glándulas paratiroides | [Dientes] | Aorta | Yeyuno | Nervios periféricos | Testículos | Encéfalo (incluidos cortes de cerebro, cerebelo, bulbo y protuberancia) | Riñón | Hipófisis | Timo | Intestino ciego | Glándulas lacrimales (extraorbitales) | Próstata | Tiroides | Cuello del útero | Hígado | Recto | [Lengua] | Glándulas coagulantes | Pulmón | Glándulas salivales | Tráquea | Colon | Ganglios linfáticos (superficiales y profundos) | Vesículas seminales | Vejiga urinaria | Duodeno | Glándulas mamarias (obligatoriamente las femeninas y, sin son visiblemente diseccionables, también las masculinas) | Músculo esquelético | Útero (y cuello) | Epidídimo | [Vías respiratorias altas, incluidos nariz, cornetes y senos paranasales] | Piel | [Uréteres] | Ojos (y retina) | Esófago | Médula espinal (tres secciones: cervical, medio-dorsal y lumbar) | [Uretra] | [Fémur y articulación tibiofemoral] | [Bulbo olfativo] | Bazo | Vagina | Vesícula biliar (en especies distintas de la rata) | Ovarios | [Esternón] | Sección de médula ósea y/o aspirado reciente de médula | Glándula de Harder | | | | En el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se conservarán ambos órganos. Las observaciones clínicas y de otro tipo pueden indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propiedades conocidas de la sustancia problema. En los estudios que entrañen la vía de administración cutánea, se conservarán los mismos órganos que en el caso de la administración oral, pero además es fundamental establecer un protocolo específico para la obtención y conservación de muestras de piel de la zona de aplicación. En los estudios de inhalación, los tejidos de las vías respiratorias se conservarán y examinarán siguiendo las recomendaciones de los capítulos B.8 (8) y B.29 (9) del presente anexo. Los restantes órganos y tejidos (además de los tejidos de las vías respiratorias específicamente conservados), se examinarán igual que se ha establecido en el caso de la administración oral. | Examen histopatológico | 48. | Se puede consultar el documento de orientación sobre buenas prácticas en la realización de los estudios de toxicopatología (32). Como mínimo, el examen histopatológico debe hacerse sobre: | — | todos los tejidos de los animales de control y del grupo con dosis máxima, | — | todos los tejidos de los animales muertos o sacrificados durante el estudio, | — | todos los tejidos que presenten alteraciones macroscópicas, | — | los tejidos diana (o los tejidos que presentaban alteraciones relacionadas con el tratamiento en el grupo de dosis máxima) de todos los animales pertenecientes a los restantes grupos de dosis, | — | en el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se examinarán ambos órganos. | DATOS E INFORME | Datos | 49. | Se documentarán los datos de todos los parámetros evaluados en cada animal. Además, deben resumirse todos los datos en un cuadro que recoja, por cada lote de ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el porcentaje de animales afectado por cada tipo de lesión. Los cuadros de datos agrupados reflejarán las medias y desviaciones típicas (en el caso de variables continuas) de los animales que presenten lesiones o efectos tóxicos, además de una escala de clasificación de las lesiones. | 50. | Los datos sobre controles históricos pueden resultar de ayuda en la interpretación de los resultados del estudio, por ejemplo cuando haya indicios de que los resultados arrojados por los controles simultáneos se desvían esencialmente de los datos recientes obtenidos en animales controles del mismo animalario o colonia. De ser evaluados, los datos sobre controles históricos deben proceder del mismo laboratorio, y corresponder a animales de edades y cepas afines, y haberse generado en los cincos años precedentes al estudio en cuestión. | 51. | Siempre que sea posible, deben evaluarse los resultados numéricos mediante un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. La elección de los métodos estadísticos y de los datos que vayan a analizarse debe efectuarse en la fase de diseño del estudio (punto 8). Para ello se tendrán en cuenta los ajustes de la supervivencia, en su caso. | Informe del ensayo | 52. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas. | — | Datos de identificación. | — | Procedencia de la sustancia. | — | Número de lote. | — | Certificado de análisis químico. | | Vehículo (si procede): | — | Justificación de la elección del vehículo (si es distinto del agua). | | Animales de ensayo: | — | Especie y cepa utilizada y motivos para elegirla. | — | Número, edad y sexo de los animales al inicio del ensayo. | — | Origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc. | — | Peso de cada animal al inicio del ensayo. | | Condiciones del ensayo: | — | Fundamento de la elección de la vía de administración y la dosis. | — | Cuando proceda, métodos estadísticos aplicados al análisis de los datos. | — | Pormenores de la formulación de la sustancia o de su preparación con la comida. | — | Datos analíticos acerca de la concentración obtenida, la estabilidad y la homogeneidad de la preparación. | — | Vía y método de administración de la sustancia problema. | — | En los estudios de inhalación se indicará si es de solo por la nariz o de cuerpo entero. | — | Dosis reales (mg/kg peso corporal/día) y factor de conversión de la concentración (mg/kg o ppm) de la sustancia problema en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales, en su caso. | — | Datos de la calidad de los alimentos y el agua. | | Resultados (se presentarán cuadros de datos agrupados así como los datos de cada animal): | — | Datos de supervivencia. | — | Peso corporal y variaciones del mismo. | — | Ingesta de alimento, cálculos de la eficiencia alimentaria, si se han hecho, e ingesta de agua cuando proceda. | — | Datos de respuestas tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos de toxicidad. | — | Naturaleza, incidencia (y, si se ha clasificado, gravedad) y duración de las observaciones clínicas (reversibles o no). | — | Examen oftalmológico. | — | Pruebas hematológicas. | — | Análisis de bioquímica clínica. | — | Análisis de orina. | — | Resultados de cualesquiera investigaciones de neurotoxicidad o inmunotoxicidad. | — | Peso corporal en el momento de la muerte. | — | Pesaje de los órganos (y pesos relativos, cuando proceda). | — | Observaciones de la autopsia. | — | Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas relacionadas con el tratamiento. | — | Datos sobre la absorción, si los hay. | | Tratamiento estadístico de los resultados, según proceda. | | La discusión de los resultados comprende lo siguiente: | — | La relación dosis-respuesta. | — | Otras informaciones sobre el modo de acción. | — | La discusión de cualquier hipótesis o modelo teórico. | — | Valores de BMD, NOAEL o LOAEL. | — | Datos sobre controles históricos. | — | Relevancia para los seres humanos. | | Conclusiones | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208. | (3) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191. | (4) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. | (5) | Capítulo B.27 del presente anexo. Ensayo de toxicidad oral subcrónica. Toxicidad oral por administración continuada (90 días) en no roedores. | (6) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453-Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (7) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (8) | Capítulo B.8 del presente anexo. Toxicidad subaguda por inhalación: estudio de 28 días. | (9) | Capítulo B.29 del presente anexo. Toxicidad subcrónica por inhalación: estudio de 90 días. | (10) | Capítulo B.9 del presente anexo. Toxicidad por administración continuada (28 días) por vía cutánea. | (11) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. | (12) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (13) | Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68. | (14) | Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98. | (15) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. | (16) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (17) | Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837. | (18) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. | (19) | Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (DO L 276 de 20.10.2010, p. 33). | (20) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (21) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (22) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (23) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. | (24) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. | (25) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (26) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. | (27) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (28) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. | (29) | Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. | (30) | Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (31) | EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). | (32) | Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Apéndice 1 | DEFINICIÓN | Sustancia problema: cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este método de ensayo. | » |
| (6) | Chapters B.32 and B.33 are replaced by the following: | ‘B.32. CARCINOGENICITY STUDIES | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 451 (2009). The original TG 451 on Carcinogenicity Studies was adopted in 1981. Development of this revised Test Method B.32 was considered necessary, in order to reflect recent developments in the field of animal welfare and regulatory requirements (2) (3) (4) (5) (6). The updating of this Test Method B.32 has been carried out in parallel with revisions of Chapter B.30 of this Annex, Chronic Toxicity Studies, and Chapter B.33, of this Annex, Combined Chronic Toxicity\Carcinogenicity Studies, and with the objective of obtaining additional information from the animals used in the study and providing further detail on dose selection. This Test Method B.32 is designed to be used in the testing of a broad range of chemicals, including pesticides and industrial chemicals. It should be noted however that some details and requirements may differ for pharmaceuticals (see International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals). | 2. | The majority of carcinogenicity studies are carried out in rodent species, and this Test Method is intended therefore to apply primarily to studies carried out in these species. Should such studies be required in non-rodent species, the principles and procedures outlined in this Test Method together with those outlined in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (6), should be applied, with appropriate modifications. Further guidance is available in the OECD Guidance Document No 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7). | 3. | The three main routes of administration used in carcinogenicity studies are oral, dermal and inhalation. The choice of the route of administration depends on the physical and chemical characteristics of the test chemical and the predominant route of exposure of humans. Additional information on choice of route of exposure is provided in Guidance Document No 116 (7). | 4. | This Test Method focuses on exposure via the oral route, the route most commonly used in carcinogenicity studies. While carcinogenicity studies involving exposure via the dermal or inhalation routes may also be necessary for human health risk assessment and/or may be required under certain regulatory regimes, both routes of exposure involve considerable technical complexity. Such studies will need to be designed on a case-by-case basis, although the Test Method outlined here for the assessment and evaluation of carcinogenicity by oral administration could form the basis of a protocol for inhalation and/or dermal studies, with respect to recommendations for treatment periods, clinical and pathology parameters, etc. OECD Guidance is available on the administration of test chemicals by the dermal (7), and inhalation routes (7) (8). Chapter B.8 of this Annex (9) and Chapter B.29 of this Annex (10), together with the OECD Guidance Document on acute inhalation testing (8), should be specifically consulted in the design of longer term studies involving exposure via the inhalation route. Chapter B.9 of this Annex (11) should be consulted in the case of testing carried out by the dermal route. | 5. | The carcinogenicity study provides information on the possible health hazards likely to arise from repeated exposure for a period lasting up to the entire lifespan of the species used. The study will provide information on the toxic effects of the test chemical including potential carcinogenicity, and may indicate target organs and the possibility of accumulation. It can provide an estimate of the no-observed-adverse effect level for toxic effects and, in the case of non-genotoxic carcinogens, for tumour responses, which can be used for establishing safety criteria for human exposure. The need for careful clinical observations of the animals, so as to obtain as much information as possible, is also stressed. | 6. | The objectives of carcinogenicity studies covered by this Test Method include: | — | The identification of the carcinogenic properties of a test chemical, resulting in an increased incidence of neoplasms, increased proportion of malignant neoplasms or a reduction in the time to appearance of neoplasms, compared with concurrent control groups; | — | The identification of target organ(s) of carcinogenicity; | — | The identification of the time to appearance of neoplasms; | — | Characterisation of the tumour dose-response relationship; | — | Identification of a no-observed-adverse-effect level (NOAEL) or point of departure for establishment of a Benchmark Dose (BMD); | — | Extrapolation of carcinogenic effects to low dose human exposure levels; | — | Provision of data to test hypotheses regarding mode of action (2) (7) (12) (13) (14) (15). | INITIAL CONSIDERATIONS | 7. | In the assessment and evaluation of the potential carcinogenicity of a test chemical, all available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study, in order to focus the design of the study to more efficiently test for carcinogenic potential and to minimise animal usage. Information on, and consideration of, the mode of action of a suspected carcinogen (2) (7) (12) (13) (14) (15) is particularly important, since the optimal design may differ depending on whether the test chemical is a known or suspected genotoxic carcinogen. Further guidance on mode of action considerations can be found in Guidance Document No 116 (7). | 8. | Information that will assist in the study design includes the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests including genotoxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data, mutagenicity/genotoxicity, carcinogenicity and other toxicological data on structurally-related chemicals; available toxicokinetic data (single dose and also repeat dose kinetics where available) and data derived from other repeated exposure studies. Assessment of carcinogenicity should be carried out after initial information on toxicity has been obtained from repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests. Short-term cancer initiation-promotion tests could also provide useful information. A phased testing approach to carcinogenicity testing should be considered as part of the overall assessment of the potential adverse health effects of a particular test chemical (16) (17) (18) (19). | 9. | The statistical methods most appropriate for the analysis of results, given the experimental design and objectives, should be established before commencing the study. Issues to consider include whether the statistics should include adjustment for survival, analysis of cumulative tumour risks relative to survival duration, analysis of the time to tumour and analysis in the event of premature termination of one or more groups. Guidance on the appropriate statistical analyses and key references to internationally accepted statistical methods are given in Guidance Document No 116 (7), and also in Guidance Document No 35 on the analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (20). | 10. | In conducting a carcinogenicity study, the guiding principles and considerations outlined in the OECD Guidance Document No 19 on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (21), in particular paragraph 62 thereof, should always be followed. This paragraph states that “In studies involving repeated dosing, when an animal shows clinical signs that are progressive, leading to further deterioration in condition, an informed decision as to whether or not to humanely kill the animal should be made. The decision should include consideration as to the value of the information to be gained from the continued maintenance of that animal on study relative to its overall condition. If a decision is made to leave the animal on test, the frequency of observations should be increased, as needed. It may also be possible, without adversely affecting the purpose of the test, to temporarily stop dosing if it will relieve the pain or distress, or reduce the test dose.” | 11. | Detailed guidance on and discussion of the principles of dose selection for chronic toxicity and carcinogenicity studies can be found in Guidance Document No 116 (7) as well as two International Life Sciences Institute publications (22) (23). The core dose selection strategy is dependent on the primary objective or objectives of the study (paragraph 6). In selecting appropriate dose levels, a balance should be achieved between hazard screening on the one hand and characterisation of low-dose responses and their relevance on the other. This is particularly relevant in the situation where a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex) is to be carried out (paragraph 12). | 12. | Consideration should be given to carrying out a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex), rather than separate execution of a chronic toxicity study (Chapter B.30 of this Annex) and carcinogenicity study (this Test Method B.32). The combined test provides greater efficiency in terms of time and cost compared to conducting two separate studies, without compromising the quality of the data in either the chronic phase or the carcinogenicity phase. Careful consideration should however be given to the principles of dose selection (paragraphs 11 and 22-25) when undertaking a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex), and it is also recognised that separate studies may be required under certain regulatory frameworks. | 13. | Definitions used in the context of this Test Method can be found at the end of this chapter and in the Guidance Document No 116 (7). | PRINCIPLE OF THE TEST | 14. | The test chemical is administered daily in graduated doses to several groups of test animals for the majority of their life span, normally by the oral route. Testing by the inhalation or dermal route may also be appropriate. The animals are observed closely for signs of toxicity and for the development of neoplastic lesions. Animals which die or are killed during the test are necropsied and, at the conclusion of the test, surviving animals are killed and necropsied. | DESCRIPTION OF METHOD | Selection of animal species | 15. | This Test Method primarily covers assessment and evaluation of carcinogenicity in rodents (paragraph 2). The use of non-rodent species may be considered when available data suggest that they are more relevant for the prediction of health effects in humans. The choice of species should be justified. The preferred rodent species is the rat, although other rodent species, e.g. the mouse, may be used. Although the use of the mouse in carcinogenicity testing may have limited utility (24) (25) (26), under some current regulatory programmes carcinogenicity testing in the mouse is still required unless it is determined that such a study is not scientifically necessary. Rats and mice have been preferred experimental models because of their relatively short life span, their widespread use in pharmacological and toxicological studies, their susceptibility to tumour induction, and the availability of sufficiently characterised strains. As a consequence of these characteristics, a large amount of information is available on their physiology and pathology. Additional information on choice of species and strain is provided in Guidance Document No 116 (7). | 16. | Young healthy adult animals of commonly used laboratory strains should be employed. The carcinogenicity study should preferably be carried out in animals from the same strain and source as those used in preliminary toxicity study(ies) of shorter duration although, if animals from this strain and source are known to present problems in achieving the normally accepted criteria of survival for long-term studies [see Guidance Document No 116 (7)], consideration should be given to using a strain of animal that has an acceptable survival rate for the long-term study. The females should be nulliparous and non-pregnant. | Housing and feeding | 17. | Animals may be housed individually, or be caged in small groups of the same sex; individual housing should be considered only if scientifically justified (27) (28) (29). Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimised. The temperature in the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C). Although the relative humidity should be at least 30 % and preferably not exceed 70 % other than during room cleaning, the aim should be 50-60 %. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light, 12 hours dark. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. The diet should meet all the nutritional requirements of the species tested and the content of dietary contaminants, including but not limited to pesticide residues, persistent organic pollutants, phytoestrogens, heavy metals and mycotoxins, that might influence the outcome of the test, should be as low as possible. Analytical information on the nutrient and dietary contaminant levels should be generated periodically, at least at the beginning of the study and when there is a change in the batch used, and should be included in the final report. Analytical information on the drinking water used in the study should similarly be provided. The choice of diet may be influenced by the need to ensure a suitable admixture of a test chemical and to meet the nutritional requirements of the animals when the test chemical is administered by the dietary route. | Preparation of animals | 18. | Healthy animals, which have been acclimated to laboratory conditions for at least 7 days and have not been subjected to previous experimental procedures, should be used. In the case of rodents, dosing of the animals should begin as soon as possible after weaning and acclimatisation and preferably before the animals are 8 weeks old. The test animals should be characterised as to species, strain, source, sex, weight and age. At the commencement of the study, the weight variation for each sex of animal used should be minimal and not exceed ± 20 % of the mean weight of all the animals within the study, separately for each sex. Animals should be randomly assigned to the control and treatment groups. After randomisation, there should be no significant differences in mean body weights between groups within each sex. If there are statistically significant differences, then the randomisation step should be repeated, if possible. Each animal should be assigned a unique identification number, and permanently marked with this number by tattooing, microchip implant, or other suitable method. | PROCEDURE | Number and sex of animals | 19. | Both sexes should be used. A sufficient number of animals should be used so that a thorough biological and statistical evaluation is possible. Each dose group and concurrent control group should therefore contain at least 50 animals of each sex. Depending on the aim of the study, it may be possible to increase the statistical power of the key estimates by differentially allocating animals unequally to the various dose groups, with more than 50 animals in the low dose groups; e.g. to estimate the carcinogenic potential at low doses. However it should be recognised that a moderate increase in group size will provide relatively little increase in statistical power of the study. Further information on statistical design of the study and choice of dose levels to maximise statistical power is provided in Guidance Document No 116 (7). | Provision for interim kills and satellite (sentinel) groups | 20. | The study may make provision for interim kills, e.g. at 12 months, to provide information on progression of neoplastic changes and mechanistic information, if scientifically justified. Where such information is already available from previous repeat dose toxicity studies on the test chemical, interim kills may not be scientifically justified. If interim kills are included in the study design, the number of animals in each dose group scheduled for an interim kill will normally be 10 animals per sex, and the total number of animals included in the study design should be increased by the number of animals scheduled to be killed before the completion of the study. An additional group of sentinel animals (typically 5 animals per sex) may be included for monitoring of disease status, if necessary, during the study (30). Further guidance is provided in Guidance Document No 116 (7). | Dose groups and dosage | 21. | Guidance on all aspects of dose selection and dose level spacing is provided in Guidance Document No 116 (7). At least three dose levels and a concurrent control should be used. Dose levels will generally be based on the results of shorter-term repeated dose or range finding studies and should take into account any existing toxicological and toxicokinetic data available for the test chemical or related chemicals. | 22. | Unless limited by the physical-chemical nature or biological effects of the test chemical, the highest dose level should be chosen to identify the principal target organs and toxic effects while avoiding suffering, severe toxicity, morbidity, or death. While taking into account the factors outlined in paragraph 23 below, the highest dose level should normally be chosen to elicit evidence of toxicity, as evidenced by, for example, depression of body weight gain (approximately 10 %). However, dependent on the objectives of the study (see paragraph 6), a top dose lower than the dose providing evidence of toxicity may be chosen, e.g. if a dose elicits an adverse effect of concern that nonetheless has little impact on lifespan or body weight. | 23. | Dose levels and dose level spacing may be selected to establish a dose-response and, depending on the mode of action of the test chemical, a NOAEL or other intended outcome of the study, e.g. a BMD (see paragraph 25) at the lowest dose level. Factors that should be considered in the placement of lower doses include the expected slope of the dose–response curve, the doses at which important changes may occur in metabolism or mode of toxic action, where a threshold is expected, or where a point of departure for low-dose extrapolation is expected. | 24. | The dose level spacing selected will depend on the characteristics of the test chemical, and cannot be prescribed in this Test Method, but two to four fold intervals frequently provide good test performance for setting the descending dose levels and addition of a fourth test group is often preferable to using very large intervals (e.g. more than a factor of about 6-10) between dosages. In general, the use of factors greater than 10 should be avoided, and should be justified if used. | 25. | As discussed further in Guidance Document No 116 (7), points to be considered in dose selection include: | — | Known or suspected nonlinearities or inflection points in the dose–response; | — | Toxicokinetics, and dose ranges where metabolic induction, saturation, or nonlinearity between external and internal doses does or does not occur; | — | Precursor lesions, markers of effect, or indicators of the operation of key underlying biological processes; | — | Key (or suspected) aspects of mode of action, such as doses at which cytotoxicity begins to arise, hormone levels are perturbed, homeostatic mechanisms are overwhelmed, etc.; | — | Regions of the dose–response curve where particularly robust estimation is needed, e.g. in the range of the anticipated BMD or a suspected threshold; | — | Consideration of anticipated human exposure levels. | 26. | The control group shall be an untreated group or a vehicle-control group if a vehicle is used in administering the test chemical. Except for treatment with the test chemical, animals in the control group should be handled in an identical manner to those in the test groups. If a vehicle is used, the control group shall receive the vehicle in the highest volume used among the dose groups. If a test chemical is administered in the diet, and causes significantly reduced dietary intake due to the reduced palatability of the diet, an additional pair-fed control group may be useful, to serve as a more suitable control. | Preparation of doses and administration of test chemical | 27. | The test chemical is normally administered orally, via the diet or drinking water, or by gavage. Additional information on routes and methods of administration is provided in Guidance Document No 116 (7). The route and method of administration is dependent on the purpose of the study, the physical-chemical properties of the test chemical, its bioavailability and the predominant route and method of exposure of humans. A rationale should be provided for the chosen route and method of administration. In the interest of animal welfare, oral gavage should normally be selected only for those agents, for which this route and method of administration reasonably represent potential human exposure (e.g. pharmaceuticals). For dietary or environmental chemicals including pesticides, administration is typically via the diet or drinking water. However, for some scenarios, e.g. occupational exposure, administration via other routes may be more appropriate. | 28. | Where necessary, the test chemical is dissolved or suspended in a suitable vehicle. Consideration should be given to the following characteristics of the vehicle and other additives, as appropriate: effects on the absorption, distribution, metabolism, or retention of the test chemical; effects on the chemical properties of the test chemical which may alter its toxic characteristics; and effects on the food or water consumption or the nutritional status of the animals. It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solution/suspension be considered first, followed by consideration of a solution/emulsion in oil (e.g. corn oil) and then by possible solution in other vehicles. For vehicles other than water, the toxic characteristics of the vehicle should be known. Information should be available on the stability of the test chemical and the homogeneity of dosing solutions or diets (as appropriate) under the conditions of administration (e.g. diet). | 29. | For chemicals administered via the diet or drinking water it is important to ensure that the quantities of the test chemical involved do not interfere with normal nutrition or water balance. In long-term toxicity studies using dietary administration, the concentration of the test chemical in the feed should not normally exceed an upper limit of 5 % of the total diet, in order to avoid nutritional imbalances. When the test chemical is administered in the diet, either a constant dietary concentration (mg/kg diet or ppm) or a constant dose level in terms of the animal’s body weight (mg/kg body weight), calculated on a weekly basis, may be used. The alternative used should be specified. | 30. | In the case of oral administration, the animals are dosed with the test chemical daily (seven days per week), normally for a period of 24 months for rodents (see also paragraph 32). Any other dosing regime, e.g. five days per week, needs to be justified. In the case of dermal administration, animals are normally treated with the test chemical for at least 6 hours per day, 7 days per week, as specified in Chapter B.9 of this Annex (11), for a period of 24 months. Exposure by the inhalation route is carried out for 6 hours per day, 7 days per week, but exposure for 5 days per week may also be used, if justified. The period of exposure will normally be for a period of 24 months. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration of less than 6 hours per day. See also Chapter B.8 of this Annex (9). | 31. | When the test chemical is administered by gavage to the animals, this should be done using a stomach tube or a suitable intubation cannula, at similar times each day. Normally a single dose will be administered once daily; where for example a chemical is a local irritant, it may be possible to maintain the daily dose-rate by administering it as a split dose (twice a day). The maximum volume of liquid that can be administered at one time depends on the size of the test animal. The volume should be kept as low as practical, and should not normally exceed 1 ml/100g body weight for rodents (31). Variability in test volume should be minimised by adjusting the concentration to ensure a constant volume at all dose levels. Potentially corrosive or irritant chemicals are the exception, and need to be diluted to avoid severe local effects. Testing at concentrations that are likely to be corrosive or irritant to the gastrointestinal tract should be avoided. | Duration of study | 32. | The duration of the study will normally be 24 months for rodents, representing the majority of the normal life span of the animals to be used. Shorter or longer study durations may be used, dependent on the lifespan of the strain of the animal species in the study, but should be justified. For specific strains of mice, e.g. AKR/J, C3H/J or C57BL/6J strains a duration of 18 months may be more appropriate. The following provides some guidance on duration, termination of the study and survival; further guidance, including consideration of the acceptability of a negative carcinogenicity relative to survival in the study, is provided in the OECD Guidance Document No 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7). | — | Termination of the study should be considered when the number of survivors in the lower dose groups or the control group falls below 25 per cent. | — | In the case where only the high dose group dies prematurely due to toxicity, this should not trigger termination of the study. | — | Survival of each sex should be considered separately. | — | The study should not be extended beyond the point when the data available from the study are no longer sufficient to enable a statistically valid evaluation to be made. | OBSERVATIONS | 33. | All animals should be checked for morbidity or mortality, usually at the beginning and the end of each day, including at weekends and holidays. Animals should additionally be checked once a day for specific signs of toxicological relevance, taking into consideration the peak period of anticipated effects after dosing in the case of gavage administration. Particular attention should be paid to tumour development; and the time of tumour onset, location, dimensions, appearance, and progression of each grossly visible or palpable tumour should be recorded. | Body weight, food/water consumption and food efficiency | 34. | All animals should be weighed at the start of treatment, at least once a week for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Measurements of food consumption and food efficiency should be made at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Water consumption should be measured at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter when the test chemical is administered in drinking water. Water consumption measurements should also be considered for studies in which drinking activity is altered. | Haematology, clinical biochemistry and other measurements | 35. | In order to maximise the information obtained from the study, especially for mode of action considerations, blood samples may be taken for haematology and clinical biochemistry, and this at the discretion of the study director. Urinalysis may also be appropriate. Further guidance on the value of taking such samples as part of a carcinogenicity study is provided in Guidance Document No 116 (7). If considered appropriate, blood sampling for haematological and clinical chemistry determinations and urinalysis may be conducted as part of an interim kill (paragraph 20) and at study termination on a minimum of 10 animals per sex per group. Blood samples should be taken from a named site, for example by cardiac puncture or from the retro-orbital sinus under anaesthesia, and stored, if applicable, under appropriate conditions. Blood smears may also be prepared for examination, particularly if bone marrow appears to be the target organ, although the value of such examination for the assessment of carcinogenic/oncogenic potential has been questioned (32). | PATHOLOGY | Gross necropsy | 36. | All animals in the study except sentinel animals (see paragraph 20) and other satellite animals should be subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. Sentinel animals and other satellite animals may require necropsy on a case-by-case basis, at the discretion of the study director. Organ weights are not normally part of a carcinogenesis study, since geriatric changes and, at later stages, the development of tumours confounds the usefulness of organ weight data. They may, however, be critical to performing a weight of evidence evaluation and especially for mode of action considerations. If they are part of a satellite study, they should be collected at no later than one year after initiation of the study. | 37. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (33) (tissues in square brackets are optional): | all gross lesions | heart | pancreas | stomach (forestomach, glandular stomach) | adrenal gland | ileum | parathyroid gland | [teeth] | aorta | jejunum | peripheral nerve | testis | brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | kidney | pituitary | thymus | caecum | lacrimal gland (exorbital) | prostate | thyroid | cervix | liver | rectum | [tongue] | coagulating gland | lung | salivary gland | trachea | colon | lymph nodes (both superficial and deep) | seminal vesicle | urinary bladder | duodenum | mammary gland (obligatory for females and, if visibly dissectable, from males) | skeletal muscle | uterus (including cervix) | epididymis | [upper respiratory tract, including nose, turbinates, and paranasal sinuses] | skin | [ureter] | eye (including retina) | oesophagus | spinal cord (at three levels: cervical, mid-thoracic, and lumbar) | [urethra] | [femur with joint] | [olfactory bulb] | spleen | vagina | gall bladder (for species other than rat) | ovary | [sternum], | section of bone marrow and/or a fresh bone marrow aspirate | Harderian gland | | | | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be preserved. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also, any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. In studies involving the dermal route of administration, the list of organs as set out for the oral route should be preserved, and specific sampling and preservation of the skin from the site of application is essential. In inhalation studies, the list of preserved and examined tissues from the respiratory tract should follow the recommendations of Chapters B.8 and B.29 of this Annex. For other organs/tissues (and in addition to the specifically preserved tissues from the respiratory tract) the list of organs as set out for the oral route should be examined. | Histopathology | 38. | Guidance is available on best practices in the conduct of toxicological pathology studies (33). The minimum tissues examined should be: | — | All tissues from the high dose and control groups; | — | All tissues of animals dying or killed during the study; | — | All tissues showing macroscopic abnormalities including tumours; | — | When treatment-related histopathological changes are observed in the high dose group, those same tissues are to be examined from all animals in all other dose groups; | — | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be examined. | DATA AND REPORTING | Data | 39. | Individual animal data should be provided for all parameters evaluated. Additionally, all data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals at the start of the test, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons and the time of any death or humane kill, the number showing signs of toxicity, a description of the signs of toxicity observed, including time of onset, duration, and severity of any toxic effects, the number of animals showing lesions, the type of lesions and the percentage of animals displaying each type of lesion. Summary data tables should provide the means and standard deviations (for continuous test data) of animals showing toxic effects or lesions, in addition to the grading of lesions. | 40. | Historical control data may be valuable in the interpretation of the results of the study, e.g. in the case when there are indications that the data provided by the concurrent controls are substantially out of line when compared to recent data from control animals from the same test facility/colony. Historical control data, if evaluated, should be submitted from the same laboratory and relate to animals of the same age and strain generated during the five years preceding the study in question. | 41. | When applicable, numerical results should be evaluated by an appropriate and generally acceptable statistical method. The statistical methods and the data to be analysed should be selected during the design of the study (paragraph 9). Selection should make provision for survival adjustments, if needed. | Test report | 42. | The test report should include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature, purity, and physicochemical properties; | — | identification data; | — | source of chemical; | — | batch number; | — | certificate of chemical analysis; | | Vehicle (if appropriate): | — | justification for choice of vehicle (if other than water); | | Test animals: | — | species/strain used and justification for choice made; | — | number, age, and sex of animals at start of test; | — | source, housing conditions, diet, etc.; | — | individual weights of animals at the start of the test; | | Test conditions: | — | rationale for route of administration and dose selection; | — | when applicable, the statistical methods used to analyse the data; | — | details of test chemical formulation/diet preparation. | — | analytical data on achieved concentration, stability and homogeneity of the preparation; | — | route of administration and details of the administration of the test chemical; | — | for inhalation studies, whether nose only or whole body; | — | actual doses (mg/kg body weight/day), and conversion factor from diet/drinking water test chemical concentration (mg/kg or ppm) to the actual dose, if applicable; | — | details of food and water quality; | | Results (summary tabulated data and individual animal data should be presented) | | General | — | survival data; | — | body weight/body weight changes; | — | food consumption, calculations of food efficiency, if made, and water consumption, if applicable; | — | toxicokinetic data (if available); | — | opthalmoscopy (if available); | — | haematology (if available); | — | clinical chemistry (if available); | | Clinical findings | — | Signs of toxicity; | — | Incidence (and, if scored, severity) of any abnormality; | — | Nature, severity, and duration of clinical observations (whether transitory or permanent); | | Necropsy data | — | Terminal body weight; | — | Organ weights and their ratios, if applicable; | — | Necropsy findings; Incidence and severity of abnormalities; | | Histopathology | — | Non neoplastic histopathological findings,; | — | Neoplastic histopathological findings; | — | Correlation between gross and microscopic findings; | — | Detailed description of all treatment-related histopathological findings including severity gradings; | — | Report of any peer review of slides; | | Statistical treatment of results, as appropriate | | Discussion of results including | — | Discussion of any modelling approaches; | — | Dose-response relationships; | — | Historical control data; | — | Consideration of any mode of action information; | — | BMD, NOAEL or LOAEL determination; | — | Relevance for humans; | | Conclusions | LITERATURE: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. | (3) | Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208. | (4) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191. | (5) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. | (6) | Chapter B.27 of this Annex, Sub-chronic Oral Toxicity Test Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Chapter B.8 of this Annex, Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study. | (10) | Chapter B.29 of this Annex, Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study. | (11) | Chapter B.9 of this Annex, Repeated Dose (28 Days) Toxicity (Dermal). | (12) | Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801. | (13) | Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581-589. | (14) | Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51-56. | (15) | Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591-653. | (16) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. | (17) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (18) | Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68. | (19) | Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98. | (20) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No 35 and Series on Pesticides No 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. | (21) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (22) | Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. | (23) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. | (24) | Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214. | (25) | Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284. | (26) | Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of 10 Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203. | (27) | Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (OJ L 276, 20.10.2010, p. 33). | (28) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. | (32) | Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (33) | Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | B.33. COMBINED CHRONIC TOXICITY/CARCINOGENICITY STUDIES | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 453 (2009). The original TG 453 was adopted in 1981. Development of this updated Test Method B.33 was considered necessary, in order to reflect recent developments in the field of animal welfare and regulatory requirements (1) (2) (3) (4) (5). The updating of this Test Method B.33 has been carried out in parallel with revisions of Chapter B.32 of this Annex, Carcinogenicity Studies, and Chapter B.30 of this Annex, Chronic Toxicity Studies, with the objective of obtaining additional information from the animals used in the study and providing further detail on dose selection. This Test Method is designed to be used in the testing of a broad range of chemicals, including pesticides and industrial chemicals. It should be noted however that some details and requirements may differ for pharmaceuticals [see International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals]. | 2. | The majority of chronic toxicity and carcinogenicity studies are carried out in rodent species and this Test Method is intended therefore to apply primarily to studies carried out in these species. Should such studies be required in non-rodent species, the principles and procedures outlined may also be applied, with appropriate modifications, together with those outlined in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (6), as outlined in the OECD Guidance Document No 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7). | 3. | The three main routes of administration used in chronic toxicity/carcinogenicity studies are oral, dermal and inhalation. The choice of the route of administration depends on the physical and chemical characteristics of the test chemical and the predominant route of exposure of humans. Additional information on choice of route of exposure is provided in Guidance Document No 116 (7). | 4. | This Test Method focuses on exposure via the oral route, the route most commonly used in chronic toxicity and carcinogenicity studies. While long–term studies involving exposure via the dermal or inhalation routes may also be necessary for human health risk assessment and/or may be required under certain regulatory regimes, both routes of exposure involve considerable technical complexity. Such studies will need to be designed on a case-by-case basis, although the Test Method outlined here for the assessment and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity by oral administration could form the basis of a protocol for inhalation and/or dermal studies, with respect to recommendations for treatment periods, clinical and pathology parameters, etc. OECD Guidance is available on the administration of test chemicals by the inhalation (7) (8) and dermal routes (7). Chapter B.8 of this Annex (9) and Chapter B.29 of this Annex (10), together with the OECD Guidance Document on acute inhalation testing (8), should be specifically consulted in the design of longer term studies involving exposure via the inhalation route. Chapter B.9 of this Annex (11) should be consulted in the case of testing carried out by the dermal route. | 5. | The combined chronic toxicity/carcinogenicity study provides information on the possible health hazards likely to arise from repeated exposure for a period lasting up to the entire lifespan of the species used. The study will provide information on the toxic effects of the test chemical, including potential carcinogenicity, indicate target organs and the possibility of accumulation. It can provide an estimate of the no-observed-adverse effect level for toxic effects and, in the case of non-genotoxic carcinogens, for tumour responses, which can be used for establishing safety criteria for human exposure. The need for careful clinical observations of the animals, so as to obtain as much information as possible, is also stressed. | 6. | The objectives of chronic toxicity/carcinogenicity studies covered by this Test Method include: | — | The identification of the carcinogenic properties of a test chemical, resulting in an increased incidence of neoplasms, increased proportion of malignant neoplasms or a reduction in the time to appearance of neoplasms, compared with concurrent control groups; | — | The identification of the time to appearance of neoplasms; | — | The identification of the chronic toxicity of the test chemical; | — | The identification of target organ(s) of chronic toxicity and carcinogenicity, | — | Characterisation of the dose:response relationship, | — | Identification of a no-observed-adverse-effect level (NOAEL) or point of departure for establishment of a Benchmark Dose (BMD), | — | Extrapolation of carcinogenic effects to low dose human exposure levels, | — | Prediction of chronic toxicity effects at human exposure levels, | — | Provision of data to test hypotheses regarding mode of action (2) (7) (12) (13) (14) (15). | INITIAL CONSIDERATIONS | 7. | In the assessment and evaluation of the potential carcinogenicity and chronic toxicity of a test chemical, all available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study, in order to focus the design of the study to more efficiently test for its toxicological properties and to minimise animal usage. Information on, and consideration of, the mode of action of a suspected carcinogen (2) (7) (12) (13) (14) (15) is particularly important, since the optimal design may differ depending on whether the test chemical is a known or suspected genotoxic carcinogen. Further guidance on mode of action considerations can be found in Guidance Document No 116 (7). | 8. | Information that will assist in the study design includes the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; any information on the mode of action; results of any in vitro or in vivo toxicity tests including genotoxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data, mutagenicity/genotoxicity, carcinogenicity and other toxicological data on structurally-related chemicals; available toxicokinetic data (single dose and also repeat dose kinetics where available) and data derived from other repeated exposure studies. The determination of chronic toxicity/carcinogenicity should only be carried out after initial information on toxicity has been obtained from repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests. Short-tem cancer initiation-promotion tests could also provide useful information. A phased testing approach to carcinogenicity testing should be considered as part of the overall assessment of the potential adverse health effects of a particular test chemical (16) (17) (18) (19). | 9. | The statistical methods most appropriate for the analysis of results, given the experimental design and objectives, should be established before commencing the study. Issues to consider include whether the statistics should include adjustment for survival, analysis of cumulative tumour risks relative to survival duration, analysis of the time to tumour and analysis in the event of premature termination of one or more groups. Guidance on the appropriate statistical analyses and key references to internationally accepted statistical methods are given in Guidance Document No 116 (7), and also in Guidance Document No 35 on the analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (20). | 10. | In conducting a carcinogenicity study, the guiding principles and considerations outlined in the OECD Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (21), in particular paragraph 62 thereof, should always be followed. This paragraph states that “In studies involving repeated dosing, when an animal shows clinical signs that are progressive, leading to further deterioration in condition, an informed decision as to whether or not to humanely kill the animal should be made. The decision should include consideration as to the value of the information to be gained from the continued maintenance of that animal on study relative to its overall condition. If a decision is made to leave the animal on test, the frequency of observations should be increased, as needed. It may also be possible, without adversely affecting the purpose of the test, to temporarily stop dosing if it will relieve the pain or distress, or reduce the test dose.” | 11. | Detailed guidance on and discussion of the principles of dose selection for chronic toxicity and carcinogenicity studies can be found in Guidance Document No 116 (7), as well as two International Life Sciences Institute publications (22) (23). The core dose selection strategy is dependent on the primary objective or objectives of the study (paragraph 6). In selecting appropriate dose levels, a balance should be achieved between hazard screening on the one hand and characterisation of low-dose responses and their relevance on the other. This is particularly relevant in the case of this combined chronic toxicity and carcinogenicity study. | 12. | Consideration should be given to carrying out this combined chronic toxicity and carcinogenicity study, rather than separate execution of a chronic toxicity study (Chapter B.30 of this Annex) and carcinogenicity study (Chapter B.32 of this Annex). The combined test provides greater efficiency in terms of time and cost, and some reduction in animal use, compared to conducting two separate studies, without compromising the quality of the data in either the chronic phase or the carcinogenicity phase. Careful consideration should however be given to the principles of dose selection (paragraphs 11 and 22-26) when undertaking a combined chronic toxicity and carcinogenicity study, and it is also recognised that separate studies may be required under certain regulatory frameworks. Further guidance on the design of the combined chronic toxicity and carcinogenicity study in order to achieve maximum efficiency of the study in terms of possibilities for reduction in numbers of animals used as well as via the streamlining of the various experimental procedures can be found in Guidance Document No 116 (7). | 13. | Definitions used in the context of this Test Method can be found at the end of this chapter and in Guidance Document No 116 (7). | PRINCIPLE OF THE TEST | 14. | The study design consists of two parallel phases, a chronic phase and a carcinogenicity phase (for duration see paragraphs 34 and 35, respectively). The test chemical is normally administered by the oral route although testing by the inhalation or dermal route may also be appropriate. For the chronic phase, the test chemical is administered daily in graduated doses to several groups of test animals, one dose level per group, normally for a period of 12 months, although longer or shorter durations may also be chosen depending on regulatory requirements (see paragraph 34). This duration is chosen to be sufficiently long to allow any effects of cumulative toxicity to become manifest, without the confounding effects of geriatric changes. The study design may also include one or more interim kills, e.g. at 3 and 6 months, and additional groups of animals may be included to accommodate this (see paragraph 20). For the carcinogenicity phase, the test chemical is administered daily to several groups of test animals for a major portion of their life span. The animals in both phases are observed closely for signs of toxicity and for the development of neoplastic lesions. Animals which die or are killed during the test are necropsied and, at the conclusion of the test, surviving animals are killed and necropsied. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 15. | This Test Method primarily covers assessment and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity in rodents (paragraph 2). The use of non-rodent species may be considered when available data suggest that they are more relevant for the prediction of health effects in humans. The choice of species should be justified. The preferred rodent species is the rat, although other rodent species, e.g. the mouse, may be used. Although the use of the mouse in carcinogenicity testing may have limited utility (24) (25) (26), under some current regulatory programmes carcinogenicity testing in the mouse is still required unless it is determined that such a study is not scientifically necessary. Rats and mice have been preferred experimental models because of their relatively short life span, their widespread use in pharmacological and toxicological studies, their susceptibility to tumour induction, and the availability of sufficiently characterised strains. As a consequence of these characteristics, a large amount of information is available on their physiology and pathology. The design and conduct of chronic toxicity/carcinogenicity studies in non-rodent species, when required, should be based on the principles outlined in this Test Method together with those in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (6). Additional information on choice of species and strain is provided in Guidance Document No 116 (7). | 16. | Young healthy adult animals of commonly used laboratory strains should be employed. The combined chronic toxicity/carcinogenicity study should be carried out in animals from the same strain and source as those used in preliminary toxicity study(ies) of shorter duration, although, if animals from this strain and source are known to present problems in achieving the normally accepted criteria of survival for long-term studies [see Guidance Document No 116 (7)], consideration should be given to using a strain of animal that has a acceptable survival rate for the long-term study. The females should be nulliparous and non-pregnant. | Housing and feeding conditions | 17. | Animals may be housed individually, or be caged in small groups of the same sex; individual housing should be considered only if scientifically justified (27) (28) (29). Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimised. The temperature in the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C). Although the relative humidity should be at least 30 % and preferably not exceed 70 % other than during room cleaning, the aim should be 50-60 %. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light, 12 hours dark. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. The diet should meet all the nutritional requirements of the species tested and the content of dietary contaminants, including but not limited to pesticide residues, persistent organic pollutants, phytoestrogens, heavy metals and mycotoxins, that might influence the outcome of the test, should be as low as possible. Analytical information on the nutrient and dietary contaminant levels should be generated periodically, at least at the beginning of the study and when there is a change in the batch used, and should be included in the final report. Analytical information on the drinking water used in the study should similarly be provided. The choice of diet may be influenced by the need to ensure a suitable admixture of a test chemical and to meet the nutritional requirements of the animals when the test chemical is administered by the dietary route. | Preparation of animals | 18. | Healthy animals, which have been acclimated to laboratory conditions for at least 7 days and have not been subjected to previous experimental procedures, should be used. In the case of rodents, dosing of the animals should begin as soon as possible after weaning and acclimatisation and preferably before the animals are 8 weeks old. The test animals should be characterised as to species, strain, source, sex, weight and age. At the commencement of the study, the weight variation for each sex of animals used should be minimal and not exceed ± 20 % of the mean weight of all the animals within the study, separately for each sex. Animals should be randomly assigned to the control and treatment groups. After randomisation, there should be no significant differences in mean body weights between groups within each sex. If there are statistically significant differences, then the randomisation step should be repeated, if possible. Each animal should be assigned a unique identification number, and permanently marked with this number by tattooing, microchip implant, or other suitable method. | PROCEDURE | Number and sex of animals | 19. | Both sexes should be used. A sufficient number of animals should be used so that a thorough biological and statistical evaluation is possible. For rodents, each dose group (as outlined in paragraph 22) and concurrent control group intended for the carcinogenicity phase of the study should therefore contain at least 50 animals of each sex. Depending on the aim of the study, it may be possible to increase the statistical power of the key estimates by differentially allocating animals unequally to the various dose groups, with more than 50 animals in the low dose groups, e.g. to estimate the carcinogenic potential in low doses. However it should be recognised that a moderate increase in group size will provide relatively little increase in statistical power of the study. Each dose group (as outlined in paragraph 22) and concurrent control group intended for the chronic toxicity phase of the study should contain at least 10 animals of each sex, in the case of rodents. It should be noted that this number is lower than in the chronic toxicity study (Chapter B.30 of this Annex). The interpretation of the data from the reduced number of animals per group in the chronic toxicity phase of this combined study will however be supported by the data from the larger number of animals in the carcinogenicity phase of the study. In studies involving mice, additional animals may be needed in each dose group of the chronic toxicity phase, to conduct all required haematological determinations. Further information on statistical design of the study and choice of dose levels to maximise statistical power is provided in Guidance Document No 116 (7). | Provision for interim kills, satellite group and sentinel animals | 20. | The study may make provision for interim kills, e.g. at 6 months for the chronic toxicity phase, to provide information on progression of non-neoplastic changes and mechanistic information, if scientifically justified. Where such information is already available from previous repeat dose toxicity studies on the test chemical, interim kills may not be scientifically justified. The animals used in the chronic toxicity phase of the study, normally of 12 months duration (paragraph 34) provide interim kill data for the carcinogenicity phase of the study, thus achieving a reduction in the number of animals used overall. Satellite groups may also be included in the chronic toxicity phase of the study, to monitor the reversibility of any toxicological changes induced by the test chemical under investigation. These may be restricted to the highest dose level of the study plus control. An additional group of sentinel animals (typically 5 animals per sex) may be included for monitoring of disease status, if necessary, during the study (30). Further guidance on study design to include interim kills, satellite and sentinel animals, while minimising the number of animals used overall is provided in Guidance Document No 116 (7). | 21. | If satellite animals and/or interim kills are included in the study design, the number of animals in each dose group included for this purpose will normally be 10 animals per sex, and the total number of animals included in the study design should be increased by the number of animals scheduled to be killed before the completion of the study. Interim kill and satellite animals should normally undergo the same observations, including body weight, food/water consumption, haematological and clinical biochemistry measurements and pathological investigations as the animals in the chronic toxicity phase of the main study, although provision may also be made (in the interim kill groups) for measurements to be restricted to specific, key measures such as neurotoxicity or immunotoxicity. | Dose groups and dosage | 22. | Guidance on all aspects of dose selection and dose level spacing is provided in Guidance Document No 116 (7). At least three dose levels and a concurrent control should be used, for both the chronic and carcinogenicity phases. Dose levels will generally be based on the results of shorter-term repeated dose or range finding studies and should take into account any existing toxicological and toxicokinetic data available for the test chemical or related chemicals. | 23. | For the chronic toxicity phase of the study, a full study using three dose levels may not be considered necessary, if it can be anticipated that a test at one dose level, equivalent to at least 1 000 mg/kg body weight/day, is unlikely to produce adverse effects. This should be based on information from preliminary studies and a consideration that toxicity would not be expected, based upon data from structurally related chemicals. A limit of 1 000 mg/kg body weight/day may apply except when human exposure indicates the need for a higher dose level to be used. | 24. | Unless limited by the physical-chemical nature or biological effects of the test chemical, the highest dose level should be chosen to identify the principal target organs and toxic effects while avoiding suffering, severe toxicity, morbidity, or death. The highest dose level should be normally chosen to elicit evidence of toxicity, as evidenced by, for example, depression of body weight gain (approximately 10 %). However, dependent on the objectives of the study (see paragraph 6), a top dose lower than the dose providing evidence of toxicity may be chosen, e.g. if a dose elicits an adverse effect of concern, which nonetheless has little impact on lifespan or body weight. | 25. | Dose levels and dose level spacing may be selected to establish a dose-response and, depending on the mode of action of the test chemical, a NOAEL or other intended outcome of the study, e.g. a BMD (see paragraph 27). Factors that should be considered in the placement of lower doses include the expected slope of the dose–response curve, the doses at which important changes may occur in metabolism or mode of toxic action, where a threshold is expected, or where a point of departure for low-dose extrapolation is expected. In conducting a combined carcinogenicity/chronic toxicity study, the primary objective will be to obtain information for carcinogenicity risk assessment purposes, and information on chronic toxicity will normally be a subsidiary objective. This should be borne in mind when selecting dose levels and dose level spacing for the study. | 26. | The dose level spacing selected will depend on the objectives of the study and the characteristics of the test chemical, and cannot be prescribed in detail in this Test Method, but two to four fold intervals frequently provide good test performance when used for setting the descending dose levels and addition of a fourth test group is often preferable to using very large intervals (e.g. more than a factor of about 6-10) between dosages. In general the use of factors greater than 10 should be avoided, and should be justified if used. | 27. | As outlined further in Guidance Document No 116 (7), points to be considered in dose selection include: | — | Known or suspected nonlinearities or inflection points in the dose–response; | — | Toxicokinetics, and dose ranges where metabolic induction, saturation, or nonlinearity between external and internal doses does or does not occur; | — | Precursor lesions, markers of effect, or indicators of the operation of key underlying biological processes; | — | Key (or suspected) aspects of mode of action, such as doses at which cytotoxicity begins to arise, hormone levels are perturbed, homeostatic mechanisms are overwhelmed, etc.; | — | Regions of the dose–response curve where particularly robust estimation is needed, e.g. in the range of the anticipated BMD or a suspected threshold; | — | Consideration of anticipated human exposure levels, especially in the choice of mid and low doses. | 28. | The control group shall be an untreated group or a vehicle-control group if a vehicle is used in administering the test chemical. Except for treatment with the test chemical, animals in the control group should be handled in an identical manner to those in the test groups. If a vehicle is used, the control group shall receive the vehicle in the highest volume used among the dose groups. If a test chemical is administered in the diet, and causes significantly reduced dietary intake due to the reduced palatability of the diet, an additional pair-fed control group may be useful, to serve as a more suitable control. | Preparation of doses and administration of test chemical | 29. | The test chemical is normally administered orally, via the diet or drinking water, or by gavage. Additional information on routes and methods of administration is provided in Guidance Document No 116 (7). The route and method of administration is dependent on the purpose of the study, the physical/chemical properties of the test chemical, its bioavailability, and the predominant route and method of exposure of humans. A rationale should be provided for the chosen route and method of administration. In the interests of animal welfare, oral gavage should normally be selected only for those agents for which this route and method of administration reasonably represent potential human exposure (e.g. pharmaceuticals). For dietary or environmental chemicals including pesticides, administration is typically via the diet or drinking water. However, for some scenarios, e.g. occupational exposure, administration via other routes may be more appropriate. | 30. | Where necessary, the test chemical is dissolved or suspended in a suitable vehicle. Consideration should be given to the following characteristics of the vehicle and other additives, as appropriate: effects on the absorption, distribution, metabolism, or retention of the test chemical; effects on the chemical properties of the test chemical which may alter its toxic characteristics; and effects on the food or water consumption or the nutritional status of the animals. It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solution/suspension be considered first, followed by consideration of a solution/emulsion in oil (e.g. corn oil) and then by possible solution in other vehicles. For vehicles other than water, the toxic characteristics of the vehicle should be known. Information should be available on the stability of the test chemical and the homogeneity of dosing solutions or diets (as appropriate) under the conditions of administration (e.g. diet). | 31. | For chemicals administered via the diet or drinking water it is important to ensure that the quantities of the test chemical involved do not interfere with normal nutrition or water balance. In long-term toxicity studies using dietary administration, the concentration of the test chemical in the feed should not normally exceed an upper limit of 5 % of the total diet, in order to avoid nutritional imbalances. When the test chemical is administered in the diet, either a constant dietary concentration (mg/kg diet or ppm), or a constant dose level in terms of the animal’s body weight (mg/kg body weight), calculated on a weekly basis, may be used. The alternative used should be specified. | 32. | In the case of oral administration, the animals are dosed with the test chemical daily (seven days each week) for a period of 12 months (chronic phase) or 24 months (carcinogenicity phase), see also paragraphs 33 and 34. Any other dosing regime, e.g. five days per week, needs to be justified.. In the case of dermal administration, animals are normally treated with the test chemical for at least 6 hours per day, 7 days per week, as specified in Chapter B.9 of this Annex (11), for a period of 12 months (chronic phase) or 24 months (carcinogenicity phase). Exposure by the inhalation route is carried out for 6 hours per day, 7 days per week, but exposure for 5 days per week may also be used, if justified. The period of exposure will normally be for a period of 12 months (chronic phase) or 24 months (carcinogenicity phase). If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration of less than 6 hours per day. See also Chapter B.8 of this Annex (9). | 33. | When the test chemical is administered by gavage to the animals this should be done using a stomach tube or a suitable intubation cannula, at similar times each day. Normally a single dose will be administered once daily, where for example a chemical is a local irritant, it may be possible to maintain the daily dose-rate by administering it as a split dose (twice a day). The maximum volume of liquid that can be administered at one time depends on the size of the test animal. The volume should be kept as low as practical, and should not normally exceed 1 ml/100g body weight for rodents (31). Variability in test volume should be minimised by adjusting the concentration to ensure a constant volume at all dose levels. Potentially corrosive or irritant chemicals are the exception, and need to be diluted to avoid severe local effects. Testing at concentrations that are likely to be corrosive or irritant to the gastrointestinal tract should be avoided. | Duration of study | 34. | The period of dosing and duration of the chronic phase of this study is normally 12 months, although the study design also allows for and can be applied to either shorter (e.g. 6 or 9 months) or longer (e.g. 18 or 24 months) duration studies, depending on the requirements of particular regulatory regimes or for specific mechanistic purposes. Deviations from an exposure duration of 12 months should be justified, particularly in the case of shorter durations. All dose groups allocated to this phase will be terminated at the designated time for evaluation of chronic toxicity and non-neoplastic pathology. Satellite groups included to monitor the reversibility of any toxicological changes induced by the test chemical under investigation should be maintained without dosing for a period not less than 4 weeks and not more than one third of the total study duration after cessation of exposure. | 35. | The duration of the carcinogenicity phase of this study will normally be 24 months for rodents, representing the majority of the normal life span of the animals to be used. Shorter or longer study durations may be used, dependent on the lifespan of the strain of the animal species in the study, but should be justified. For specific strains of mice, e.g. AKR/J, C3H/J or C57BL/6J strains a duration of 18 months may be more appropriate. The following provides some guidance on duration, termination of the study and survival; further guidance, including consideration of the acceptability of a negative carcinogenicity study relative to survival in the study, is provided in Guidance Document No 116 (7): | — | Termination of the study should be considered when the number of survivors in the lower dose groups or the control group falls below 25 per cent. | — | In the case where only the high dose group dies prematurely due to toxicity, this should not trigger termination of the study. | — | Survival of each sex should be considered separately. | — | The study should not be extended beyond the point when the data available from the study are no longer sufficient to enable a statistically valid evaluation to be made. | OBSERVATIONS (CHRONIC TOXICITY PHASE) | 36. | All animals should be checked for morbidity or mortality, usually at the beginning and end of each day, including at weekends and holidays. General clinical observations should be made at least once a day, preferably at the same time(s) each day, taking into consideration the peak period of anticipated effects after dosing in the case of gavage administration. | 37. | Detailed clinical observations should be made on all animals at least once prior to the first exposure (to allow for within-subject comparisons), at the end of the first week of the study and monthly thereafter. The protocol for observations should be arranged such that variations between individual observers are minimised and independent of test group. These observations should be made outside the home cage, preferably in a standard arena and at similar times on each occasion. They should be carefully recorded, preferably using scoring systems, explicitly defined by the testing laboratory. Efforts should be made to ensure that variations in the observation conditions are minimal. Signs noted should include, but not be limited to, changes in skin, fur, eyes, mucous membranes, occurrence of secretions and excretions and autonomic activity (e.g. lacrimation, piloerection, pupil size, unusual respiratory pattern). Changes in gait, posture and response to handling as well as the presence of clonic or tonic movements, stereotypies (e.g. excessive grooming, repetitive circling) or bizarre behaviour (e.g. self-mutilation, walking backwards) should also be recorded (32). | 38. | Ophthalmological examination, using an ophthalmoscope or other suitable equipment, should be carried out on all animals prior to the first administration of the test chemical. At the termination of the study, this examination should be preferably conducted in all animals but at least in the high dose and control groups. If treatment-related changes in the eyes are detected, all animals should be examined. If structural analysis or other information suggests ocular toxicity, then the frequency of ocular examination should be increased. | 39. | For chemicals where previous repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests indicated the potential to cause neurotoxic effects, sensory reactivity to stimuli of different types (32) (e.g. auditory, visual and proprioceptive stimuli) (33) (34) (35), assessment of grip strength (36) and motor activity assessment (37) may optionally be conducted before commencement of the study and at 3 month periods after study initiation up to and including 12 months, as well as at study termination (if longer than 12 months). Further details of the procedures that could be followed are given in the respective references. However, alternative procedures than those referenced could also be used. | 40. | For chemicals where previous repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests indicated the potential to cause immunotoxic effects, further investigations of this endpoint may optionally be conducted at termination. | Body weight, food/water consumption and food efficiency | 41. | All animals should be weighed at the start of treatment, at least once a week for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Measurements of food consumption and food efficiency should be made at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Water consumption should be measured at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter when the test chemical is administered in drinking water. Water consumption measurements should also be considered for studies in which drinking activity is altered. | Haematology and clinical biochemistry | 42. | In studies involving rodents, haematological examinations should be carried out on all study animals (10 male and 10 female animals per group) at 3, 6, and 12 months, as well as at study termination (if longer than 12 months). In mice, satellite animals may be needed in order to conduct all required haematological determinations (see paragraph 19). In non-rodent studies, samples will be taken from smaller numbers of animals (e.g. 4 animals per sex and per group in dog studies), at interim sampling times and at termination as described for rodents. Measurements at 3 months, either in rodents or non-rodents, need not be conducted if no effect was seen on haematological parameters in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. Blood samples should be taken from a named site, for example by cardiac puncture or from the retro-orbital sinus, under anaesthesia. | 43. | The following list of parameters should be investigated (38): total and differential leukocyte count, erythrocyte count, platelet count, haemoglobin concentration, haematocrit (packed cell volume), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular haemoglobin (MCH), mean corpuscular haemoglobin concentration (MCHC), prothrombin time, and activated partial thromboplastin time. Other hematology parameters such as Heinz bodies or other atypical erythrocyte morphology or methaemoglobin may be measured as appropriate depending on the toxicity of the test chemical. Overall, a flexible approach should be adopted, depending on the observed and/or expected effect from a given test chemical. If the test chemical has an effect on the haematopoietic system, reticulocyte counts and bone marrow cytology may also be indicated, although these need not be routinely conducted. | 44. | Clinical biochemistry determinations to investigate major toxic effects in tissues and, specifically, effects on kidney and liver, should be performed on blood samples obtained from all study animals (10 male and 10 female animals per group), at the same time intervals as specified for the haematological investigations. In mice, satellite animals may be needed in order to conduct all required clinical biochemistry determinations. In non-rodent studies, samples will be taken from smaller numbers of animals (e.g. 4 animals per sex and per group in dog studies), at interim sampling times and at termination as described for rodents. Measurements at 3 months, either in rodents or non-rodents, need not be conducted if no effect was seen on clinical biochemistry parameters in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. Overnight fasting of the animals (with the exception of mice) prior to blood sampling is recommended (3). The following list of parameters should be investigated (38): glucose, urea (urea nitrogen), creatinine, total protein, albumin, calcium, sodium, potassium, total cholesterol, at least two appropriate tests for hepatocellular evaluation (alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, glutamate dehydrogenase, total bile acids) (39), and at least two appropriate tests for hepatobiliary evaluation (alkaline phosphatase, gamma glutamyl transferase, 5’-nucleotidase, total bilirubin, total bile acids) (39). Other clinical chemistry parameters such as fasting triglycerides, specific hormones and cholinesterase may be measured as appropriate, depending on the toxicity of the test chemical. Overall, there is a need for a flexible approach, depending on the observed and/or expected effect from a given test chemical. | 45. | Urinalysis determinations should be performed on all study animals (10 male and 10 female animals per group), on samples collected at the same intervals as for haematology and clinical chemistry. Measurements at 3 months need not be conducted if no effect was seen on urinalysis in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. The following list of parameters was included in an expert recommendation on clinical pathology studies (38): appearance, volume, osmolality or specific gravity, pH, total protein, and glucose. Other determinations include ketone, urobilinogen, bilirubin, and occult blood. Further parameters may be employed where necessary to extend the investigation of observed effect(s). | 46. | It is generally considered that baseline haematological and clinical biochemistry variables need be determined before treatment for dog studies, but need not be determined in rodent studies (38). However, if historical baseline data (see paragraph 58) are inadequate, consideration should be given to generating such data. | PATHOLOGY | Gross necropsy | 47. | All animals in the study shall be normally subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. However provision may also be made (in the interim kill or satellite groups) for measurements to be restricted to specific, key measures such as neurotoxicity or immunotoxicity (see paragraph 21). These animals need not be subjected to necropsy and the subsequent procedures described in the following paragraphs. Sentinel animals may require necropsy on a case-by-case basis, at the discretion of the study director. | 48. | Organ weights should be collected from all animals, other than those excluded by the latter part of paragraph 47. The adrenals, brain, epididymides, heart, kidneys, liver, ovaries, spleen, testes, thyroid (weighed post-fixation, with parathyroids), and uterus of all animals (apart from those found moribund and/or intercurrently killed) should be trimmed of any adherent tissue, as appropriate, and their wet weight taken as soon as possible after dissection to prevent drying. | 49. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (40) (tissues in square brackets are optional): | all gross lesions | heart | pancreas | stomach (forestomach, glandular stomach) | adrenal gland | ileum | parathyroid gland | [teeth] | aorta | jejunum | peripheral nerve | testis | brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | kidney | pituitary | thymus | caecum | lacrimal gland (exorbital) | prostate | thyroid | cervix | liver | rectum | [tongue] | coagulating gland | lung | salivary gland | trachea | colon | lymph nodes (both superficial and deep) | seminal vesicle | urinary bladder | duodenum | mammary gland (obligatory for females and, if visibly dissectable, from males) | skeletal muscle | uterus (including cervix) | epididymis | [upper respiratory tract, including nose, turbinates, and paranasal sinuses] | skin | [ureter] | eye (including retina) | oesophagus | spinal cord (at three levels: cervical, mid-thoracic, and lumbar) | [urethra] | [femur with joint] | [olfactory bulb] | spleen | vagina | gall bladder (for species other than rat) | ovary | [sternum], | section of bone marrow and/or a fresh bone marrow aspirate | Harderian gland | | | | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be preserved. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. In studies involving the dermal route of administration, the list of organs as set out for the oral route should be examined, and specific sampling and preservation of the skin from the site of application is necessary. In inhalation studies, the list of preserved and examined tissues from the respiratory tract should follow the recommendations of Chapters B.8 of this Annex (9) and Chapter B.29 of this Annex (10). For other organs/tissues (and in addition to the specifically preserved tissues from the respiratory tract) the list of organs as set out for the oral route should be examined. | Histopathology | 50. | Guidance is available on best practices in the conduct of toxicological pathology studies (40). The minimum histopathological examinations should be: | — | all tissues from the high dose and control groups; | — | all tissues from animals dying or killed during the study; | — | all tissues showing macroscopic abnormalities; | — | target tissues, or tissues which showed treatment-related changes in the high dose group, from all animals in all other dose groups, | — | in the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be examined. | OBSERVATIONS (CARCINOGENICITY PHASE) | 51. | All animals should be checked for morbidity or mortality, usually at the beginning and the end of each day, including at weekends and holidays. Animals should additionally be checked once a day for specific signs of toxicological relevance. In the case of gavage studies, animals should be checked in the period immediately following dosing. Particular attention should be paid to tumour development; and the time of tumour onset, location, dimensions, appearance, and progression of each grossly visible or palpable tumour should be recorded. | 52. | All animals should be weighed at the start of treatment, at least once a week for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Measurements of food consumption and food efficiency should be made at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Water consumption should be measured at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter when the test chemical is administered in drinking water. Water consumption measurements should also be considered for studies in which drinking activity is altered. | Haematology, clinical biochemistry and other measurements | 53. | In order to maximise the information obtained from the study, especially for mode of action considerations, blood samples may be taken for haematology and clinical biochemistry, although this is at the discretion of the study director. Urinalysis may also be appropriate. Data on the animals used in the chronic toxicity phase of the study, normally of 12 months duration (paragraph 34) will provide information on these parameters. Further guidance on the value of taking such samples as part of a carcinogenicity study is provided in Guidance Document No 116 (7). If blood samples are taken, these should be collected at the end of the test period, just prior to or as part of the procedure for killing the animals. They should be taken from a named site, for example by cardiac puncture or from the retro-orbital sinus, under anaesthesia. Blood smears may also be prepared for examination, particularly if bone marrow appears to be the target organ, although the value of such examination of blood smears in the carcinogenicity phase for the assessment of carcinogenic/oncogenic potential has been questioned (38). | PATHOLOGY | Gross necropsy | 54. | All animals in the study except sentinel animals and other satellite animals (see paragraph 20) shall be subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. Sentinel animals and other satellite animals may require necropsy on a case-by-case basis, at the discretion of the study director. Organ weights are not normally part of a carcinogenesis study, since geriatric changes and, at later stages, the development of tumours confounds the usefulness of organ weight data. They may, however, be critical to performing a weight of evidence evaluation and especially for mode of action considerations. If they are part of a satellite study, they should be collected at no later than one year after initiation of the study. | 55. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (40) (tissues in square brackets are optional): | all gross lesions | heart | pancreas | stomach (forestomach, glandular stomach) | adrenal gland | ileum | parathyroid gland | [teeth] | aorta | jejunum | peripheral nerve | testis | brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | kidney | pituitary | thymus | caecum | lacrimal gland (exorbital) | prostate | thyroid | cervix | liver | rectum | [tongue] | coagulating gland | lung | salivary gland | trachea | colon | lymph nodes (both superficial and deep) | seminal vesicle | urinary bladder | duodenum | mammary gland (obligatory for females and, if visibly dissectable, from males) | skeletal muscle | uterus (including cervix) | epididymis | [upper respiratory tract, including nose, turbinates, and paranasal sinuses] | skin | [ureter] | eye (including retina) | oesophagus | spinal cord (at three levels: cervical, mid-thoracic, and lumbar) | [urethra] | [femur with joint] | [olfactory bulb] | spleen | vagina | gall bladder (for species other than rat) | ovary | [sternum], | section of bone marrow and/or a fresh bone marrow aspirate | Harderian gland | | | | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be preserved. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also, any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. In studies involving the dermal route of administration, the list of organs as set out for the oral route should be examined, and specific sampling and preservation of the skin from the site of application is necessary. In inhalation studies, the list of preserved and examined tissues from the respiratory tract should follow the recommendations of Chapters B.8 of this Annex (8) and Chapter B.29 of this Annex (9). For other organs/tissues (and in addition to the specifically preserved tissues from the respiratory tract) the list of organs as set out for the oral route should be examined. | Histopathology | 56. | Guidance is available on best practices in the conduct of toxicological pathology studies (40). The minimum tissues examined should be: | — | All tissues from the high dose and control groups; | — | All tissues of animals dying or killed during the study; | — | All tissues showing macroscopic abnormalities including tumours; | — | When treatment-related histopathological changes are observed in the high dose group, those same tissues are to be examined from all animals in all other dose groups, | — | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be examined. | DATA AND REPORTING (CARCINOGENICITY AND CHRONIC TOXICITY) | Data | 57. | Individual animal data should be provided for all parameters evaluated. Additionally, all data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals at the start of the test, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons and the time of any death or humane kill, the number showing signs of toxicity, a description of the signs of toxicity observed, including time of onset, duration, and severity of any toxic effects, the number of animals showing lesions, the type of lesions and the percentage of animals displaying each type of lesion. Summary data tables should provide the means and standard deviations (for continuous test data) of animals showing toxic effects or lesions, in addition to the grading of lesions. | 58. | Historical control data may be valuable in the interpretation of the results of the study, e.g, in the case when there are indications that the data provided by the concurrent controls are substantially out of line when compared to recent data from control animals from the same test facility/colony. Historical control data, if evaluated, should be submitted from the same laboratory, relate to animals of the same age and strain, generated during the five years preceding the study in question. | 59. | When applicable, numerical results should be evaluated by an appropriate and generally acceptable statistical method. The statistical methods and the data to be analysed should be selected during the design of the study (paragraph 9). Selection should make provision for survival adjustments, if needed. | 60. | The test report should include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature, purity, and physicochemical properties; | — | identification data; | — | source of chemical; | — | batch number; | — | certificate of chemical analysis. | | Vehicle (if appropriate): | — | justification for choice of vehicle (if other than water). | | Test animals: | — | species/strain used and justification for choice made; | — | number, age, and sex of animals at start of test; | — | source, housing conditions, diet, etc.; | — | individual weights of animals at the start of the test. | | Test conditions: | — | rationale for route of administration and dose selection; | — | when applicable, the statistical methods used to analyse the data; | — | details of test chemical formulation/diet preparation; | — | analytical data on achieved concentration, stability and homogeneity of the preparation; | — | route of administration and details of the administration of the test chemical; | — | for inhalation studies, whether nose only or whole body; | — | actual doses (mg/kg body weight/day), and conversion factor from diet/drinking water test chemical concentration (mg/kg or ppm) to the actual dose, if applicable; | — | details of food and water quality. | | Results (summary tabulated data and individual animal data should be presented): | | General | — | Survival data; | — | Body weight/body weight changes; | — | Food consumption, calculations of food efficiency, if made, and water consumption if applicable; | — | Toxicokinetic data if available; | — | Opthalmoscopy (if available) | — | Haematology (if available) | — | Clinical chemistry (if available) | | Clinical findings | — | Signs of toxicity; | — | Incidence (and, if scored, severity) of any abnormality; | — | Nature, severity, and duration of clinical observations (whether transitory or permanent); | | Necropsy data | — | Terminal body weight; | — | Organ weights and their ratios, if applicable; | — | Necropsy findings; Incidence and severity of abnormalities. | | Histopathology | — | Non neoplastic histopathological findings, | — | Neoplastic histopathological findings, | — | Correlation between gross and microscopic findings | — | Detailed description of all treatment-related histopathological findings including severity gradings; | — | Report of any peer review of slides | | Statistical treatment of results, as appropriate | | Discussion of results including: | — | Discussion of any modelling approaches | — | Dose:response relationships | — | Historical control data | — | Consideration of any mode of action information | — | BMD, NOAEL or LOAEL determination | — | Relevance for humans | | Conclusions | LITERATURE: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. | (3) | Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208 | (4) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191 | (5) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445 | (6) | Chapter B.27 of this Annex, Sub-Chronic Oral Toxicity Test Repeated Dose 90 — Day Oral Toxicity Study In Non-Rodents. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Chapter B.8 of this Annex. Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study. | (10) | Chapter B.29 of this Annex, Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study. | (11) | Chapter B.9 of this Annex, Repeated Dose (28 Days) Toxicity (Dermal). | (12) | Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801. | (13) | Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581-589. | (14) | Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51-56. | (15) | Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591-653. | (16) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7. | (17) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35. | (18) | Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68. | (19) | Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98. | (20) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No 35 and Series on Pesticides No 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. | (21) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (22) | Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. | (23) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. | (24) | Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214. | (25) | Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284. | (26) | Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of 10 Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203. | (27) | Directive 2010/63/EU of the European parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (OJ L 276, 20.10.2010, p. 33). | (28) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21: 15-23. | (32) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60. | (33) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (34) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. | (35) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (36) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. | (37) | Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. | (38) | Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (39) | EMEA (draft) document “Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). | (40) | Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | ’ | 6) | Se sustituyen los capítulos B.32 y B.33 por el texto siguiente: | «B.32. ENSAYO DE CARCINOGÉNESIS | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 451 de la OCDE (2009). Las TG 451 originales sobre los estudios de carcinogénesis se adoptaron en 1981. Se consideró necesario adaptar este método de ensayo B.32 para dar cuenta de los avances recientes en materia de bienestar animal que plantean nuevas necesidades normativas (2) (3) (4) (5) (6). La actualización de este método de ensayo B.32 se ha realizado en paralelo con las revisiones de los capítulos del presente anexo B.30. Ensayo de toxicidad crónica y B.33. Ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis, con el fin de obtener más, información acerca de los animales utilizados en el estudio y recabar nuevos datos sobre la selección de las dosis. Este método de ensayo B.32 ha sido diseñado para el estudio de una amplia gama de sustancias, incluso plaguicidas y productos químicos industriales. Conviene señalar, no obstante, que algunos pormenores y requisitos pueden variar en el caso de los productos farmacéuticos (véase el documento de orientación S1B de la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH), para los ensayos de carcinogénesis de los productos farmacéuticos). | 2. | La mayoría de los ensayos de carcinogénesis se realizan con especies de roedores, por lo que este método de ensayo se ha diseñado básicamente para el estudio de dichas especies. Cuando fuere preciso realizar estos ensayos en especies no roedoras, serán así mismo de aplicación los principios y procedimientos descritos en este método de ensayo, además de los descritos en el capítulo B.27 del presente anexo, Ensayo de toxicidad oral por administración continuada (90 días) en no roedores (6), con las debidas modificaciones. Se ofrecen más indicaciones sobre el diseño y la realización de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7). | 3. | Las tres vías de administración principales que se estudian en los ensayos de carcinogénesis son la oral, la cutánea y la inhalatoria. La elección de una de ellas dependerá de las características físicas y químicas de la sustancia estudiada y de la vía de exposición predominante en seres humanos. Se ofrece más información sobre la elección de la vía de exposición en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7). | 4. | El presente método de ensayo centra el interés en la exposición por vía oral, la más frecuentemente usada en los estudios de carcinogénesis. Si bien los estudios de carcinogénesis que entrañan la exposición por vía cutánea o inhalatoria pueden ser igualmente necesarios en la evaluación del riesgo para la salud humana o en determinados marcos legislativos, estas dos vías de exposición plantean una complejidad técnica considerable. Tales estudios tendrán que diseñarse según cada caso; sin embargo, el método de ensayo que aquí se describe para la determinación y evaluación de la carcinogénesis por administración oral podría sentar las bases de un protocolo para los estudios de toxicidad por inhalación o absorción dérmica en lo que se refiere a recomendación de períodos de tratamiento, parámetros clínicos e histopatológicos, etc. La OCDE dispone de documentación orientativa sobre la administración de las sustancias problema por inhalación (7) (8) y por vía cutánea (7). Para el diseño de estudios a más largo plazo que contemplen la exposición por vía inhalatoria deben consultarse específicamente los capítulos B.8 (9) y B.29 (10) del presente anexo, además del documento de orientación de la OCDE sobre estudios de toxicidad aguda por inhalación (8). Cuando se trate de estudios que contemplen la vía cutánea se consultará el capítulo B.9 (11) del presente anexo. | 5. | Un estudio de carcinogénesis proporciona información sobre los factores de riesgo para la salud derivados de la exposición continuada durante un período que puede llegar a ocupar la vida entera de la especie animal investigada. El estudio proporciona información sobre los efectos tóxicos de la sustancia problema, incluida la carcinogénesis potencial, y puede ayudar a determinar los órganos diana y la posibilidad de acumulación. Puede facilitar una estimación del máximo nivel de dosis sin efectos tóxicos observados (NOAEL) y, en el caso de carcinógenos no genotóxicos, de las respuestas tumorales, que servirá para establecer los criterios de seguridad de la exposición humana. Cabe destacar la necesidad de realizar observaciones clínicas detenidas de los animales, a fin de obtener la máxima información posible. | 6. | Los objetivos de los estudios de carcinogénesis realizados según este método de ensayo son: | — | la identificación de las propiedades cancerígenas de una sustancia problema que puedan provocar una incidencia elevada de neoplasias, una mayor proporción de neoplasias malignas o una reducción del tiempo de aparición de las neoplasias, en comparación con los grupos de control, | — | la identificación del órgano o los órganos diana de la carcinogénesis, | — | la determinación del tiempo que tardan en aparecer las neoplasias, | — | la caracterización de la relación dosis-respuesta tumoral, | — | la identificación del nivel máximo sin efectos adversos observados (NOAEL), o punto de partida para determinar una dosis de referencia (Benchmark Dose, BMD), | — | la extrapolación de los efectos cancerígenos a los niveles de dosificación inferiores de la exposición humana, | — | la recopilación de datos para investigar las hipótesis referentes al mecanismo de acción (2) (7) (12) (13) (14) (15). | CONSIDERACIONES INICIALES | 7. | En la determinación y evaluación de la carcinogenicidad potencial de una sustancia problema, el laboratorio de ensayo deberá tener en cuenta toda la información disponible acerca de la sustancia estudiada antes de emprender el estudio, para así poder centrarse de manera más eficaz en la carcinogenicidad potencial y minimizar el uso de animales. La información previa y la consideración en torno al modo de acción de un supuesto cancerígeno (2) (7) (12) (13) (14) (15) reviste particular importancia, toda vez que el diseño óptimo del ensayo de una sustancia química variará según se trate o no de un cancerígeno genotóxico hipotético o conocido. Se ofrecen otras consideraciones sobre el modo de acción en el documento de orientación no 116 (7). | 8. | En el diseño del estudio serán de ayuda el conocimiento de la identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema; los resultados de cualesquiera ensayos de toxicidad in vitro o in vivo, incluidos los ensayos de genotoxicidad; el uso o usos previstos y la exposición humana potencial; los datos de (Q)SAR previos y los datos de mutagenicidad/genotoxicidad, carcinogenicidad y otros datos toxicológicos sobre sustancias estructuralmente afines; los datos toxicocinéticos disponibles (cinética de dosis única y, en su caso, de acumulación por dosis repetidas) y los datos derivados de otros estudios de exposición continuada. La evaluación de la carcinogénesis debe emprenderse una vez que se ha recabado la información inicial en los ensayos de toxicidad por administración continuada durante 28 días y/o 90 días. También pueden aportar una información valiosa los ensayos de inducción-estimulación de cáncer a corto plazo. Se hará un planteamiento secuencial de los estudios de carcinogénesis como parte de la evaluación global de los efectos adversos que puede tener para la salud una sustancia determinada (16) (17) (18) (19). | 9. | Antes de iniciar el estudio se establecerán los métodos estadísticos más adecuados para el análisis de los resultados, en función del diseño y de los objetivos experimentales. Aspectos importantes son el ajuste de la supervivencia en el análisis estadístico, el análisis de los riesgos tumorales acumulativos en relación con el tiempo de supervivencia, el análisis del tiempo que tarda en aparecer el tumor y el análisis en caso de terminación prematura de uno o más grupos. Se ofrecen orientaciones para realizar el análisis estadístico adecuado y se hace referencia a los métodos estadísticos internacionalmente aceptados en el documento de orientación (GD) no 116 (7) y en el GD no 35 sobre análisis y evaluación de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis (20). | 10. | Cuando se efectúa un estudio de carcinogénesis, son de aplicación los principios y consideraciones recogidos en el documento de orientación no 19 de la OCDE sobre el reconocimiento, la evaluación y la aplicación de signos clínicos como parámetros compasivos en los animales experimentales que se usan para evaluar la seguridad (21), en particular su punto 62. Dicho punto especifica que en los estudios de administración continuada, cuando un animal muestre signos clínicos progresivos que entrañen un deterioro creciente de su estado, habrá que decidir con conocimiento de causa si se sacrifica de forma compasiva. La decisión sopesará el valor de la información que puede obtenerse si se mantiene al animal en el estudio frente al desgaste de su estado general. Si se decide mantener al animal en el ensayo, se aumentará la frecuencia de las observaciones en la medida necesaria. Cabe también la posibilidad de, sin perjudicar a los fines de la investigación, suspender temporalmente la administración para aliviar el dolor o el sufrimiento, o reducir la dosis experimental. | 11. | Se ofrecen orientaciones y comentarios detallados sobre los principios que deben orientar la selección de la dosis en los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis en el documento de orientación no 116 (7) y en dos publicaciones del International Life Sciences Institute (22) (23). El núcleo de la estrategia de selección de la dosis depende del objetivo u objetivos principales del estudio (punto 6). Al elegir un intervalo posológico adecuado, debe buscarse un equilibrio entre el cribado de los factores de riesgo, por un lado, y la caracterización de las respuestas ante dosis bajas y de su importancia, por otro. Ello tiene especial trascendencia cuando se proyecta (punto 12) un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 del presente anexo). | 12. | Se considerará la posibilidad de efectuar un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 de este anexo) en lugar de realizar por separado un ensayo de toxicidad crónica (capítulo B.30 de este anexo) y un ensayo de carcinogénesis (presente método de ensayo B.32). El ensayo combinado permite mayor eficiencia que los estudios separados en términos de tiempo y costes, sin comprometer la calidad de los datos ni en la fase de toxicidad crónica ni en la fase de carcinogénesis. Sin embargo, cuando se emprenda un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 de este anexo) habrá que considerar detenidamente los principios de la selección de la dosis (puntos 11 y 22-25) y, por otro lado, se entiende que determinados marcos legislativos pueden imponer la realización de ensayos separados. | 13. | Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan al final del presente capítulo y en el documento de orientación no 116 (7). | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 14. | La sustancia problema se administra diariamente en dosis escalonadas, habitualmente por vía oral, a varios grupos de animales de experimentación durante la mayor parte de su existencia. También se aceptan las vías inhalatoria o cutánea. Se observa atentamente a los animales por si aparecen signos de toxicidad o lesiones neoplásicas. Se practica la autopsia a los animales que mueran o sean sacrificados durante el ensayo y, al final del mismo, se sacrifican y someten a autopsia los animales supervivientes. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Selección de la especie animal | 15. | El presente método de ensayo está diseñado fundamentalmente para la determinación y evaluación de la carcinogénesis en roedores (punto 2). Se podrá considerar el uso de especies no roedoras cuando los datos previos indiquen que son más útiles para la predicción de los efectos sobre la salud humana. Se justificará la elección de la especie. La especie idónea es la rata, si bien pueden emplearse otras especies de roedores como el ratón. Si bien el uso de ratones en los ensayos de carcinogénesis puede ser de utilidad limitada (24) (25) (26), algunas normativas en vigor siguen exigiendo que se realicen ensayos de carcinogénesis en ratones a no ser que se establezca que son científicamente innecesarios. Las ratas y los ratones se prefieren como modelos experimentales debido a su ciclo vital relativamente corto, su amplia utilización en los estudios farmacológicos y toxicológicos, su sensibilidad a la inducción tumoral y la disponibilidad de cepas de laboratorio suficientemente caracterizadas. Debido a todas estas características, se ha podido hacer un gran acopio de información acerca de su fisiología y anatomopatología. Se ofrece más información sobre la elección de la especie y la cepa de laboratorio en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7). | 16. | Se escogerán animales adultos jóvenes y sanos de una variedad de laboratorio de uso habitual. Los ensayos de carcinogénesis se efectuarán preferiblemente en animales de la misma procedencia y cepa que los empleados en los estudios preliminares de toxicidad de duración menor; ahora bien, si los animales de esa procedencia y variedad han demostrado incapacidad para cumplir los criterios de supervivencia normalmente aceptados para los estudios a largo plazo [véase el documento de orientación no 116 (7)], se planteará la posibilidad de usar una cepa que presente una tasa de supervivencia aceptable en los ensayos a largo plazo. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. | Alojamiento y alimentación de los animales | 17. | Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del mismo sexo; el enjaulamiento individual se considerará solo si está científicamente justificado (27) (28) (29). Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. La sala de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el ideal es el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La dieta debe satisfacer todas las necesidades nutricionales de la especie estudiada, y se mantendrá en el mínimo posible su contenido en contaminantes alimentarios, entre otros los residuos de plaguicidas, contaminantes orgánicos persistentes, fitoestrógenos, metales pesados y micotoxinas que pudieran influir en los resultados experimentales. La información analítica sobre el contenido de nutrientes y contaminantes alimentarios se consignará de forma periódica, como mínimo al inicio del estudio y cada vez que se varíe el lote de producto empleado, y se documentará en el informe final. Así mismo se consignará la información analítica sobre el agua de bebida empleada en el estudio. Cuando la sustancia problema se administra con el alimento, la elección de la dieta se basa en la necesidad de conseguir una mezcla apropiada de dicha sustancia y de satisfacer al mismo tiempo las necesidades nutricionales de los animales. | Preparación de los animales | 18. | Deben emplearse animales sanos, que se hayan mantenido al menos 7 días en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no hayan sido sometidos a experimentos previos. En el caso de los roedores, la administración comenzará lo antes posible tras su destete y aclimatación, preferiblemente antes de que los animales cumplan 8 semanas de edad. Se caracteriza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y edad de los, animales de experimentación. La diferencia de peso entre los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo. Los animales se reparten al azar entre los lotes tratados y los de control. Después de la asignación al azar, no debe haber diferencias significativas entre los grupos en las medias de peso corporal de cada sexo. De observarse diferencias estadísticamente significativas, el proceso de asignación aleatoria a los grupos deberá repetirse en la medida de lo posible. Se asigna a cada animal un número de identificación distinto, que se le grabará de manera permanente mediante tatuaje, implante de microchip o cualquier otro medio pertinente. | PROCEDIMIENTO | Número y sexo de los animales | 19. | Se emplearán animales de ambos sexos. Se estudiará un número de animales suficiente para permitir una exhaustiva evaluación biológica y estadística. Por consiguiente, cada grupo de dosis y de control deberá contener como mínimo 50 animales de cada sexo. Dependiendo de la finalidad del estudio, cabe la posibilidad de aumentar la potencia estadística de las estimaciones esenciales haciendo una asignación diferencial de los animales a los distintos grupos de dosis, de modo que haya más de 50 individuos en los grupos de dosis inferior; esto permite estimar el potencial carcinógeno a dosis bajas. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que un aumento moderado del tamaño del grupo incrementará relativamente poco la potencia estadística del estudio. Se ofrece más información sobre el diseño estadístico y la selección de los niveles de dosis para maximizar la potencia estadística del estudio en el documento de orientación no 116 (7). | Provisión de animales para el sacrificio durante el ensayo, los lotes satélite y los lotes centinela | 20. | Si está científicamente justificado, se puede hacer una provisión de animales para sacrificarlos durante el ensayo y así obtener datos sobre la progresión de las alteraciones neoplásicas y sobre los mecanismos de acción. Si tal información ha sido ya proporcionada por estudios previos de toxicidad por administración continuada realizados con la misma sustancia problema, el sacrificio de animales durante el ensayo puede no estar científicamente justificado. Si en el diseño experimental se incluyen animales para sacrificarlos durante el ensayo, lo habitual es que el lote sacrificado esté compuesto por 10 animales de cada sexo, y el número total de animales investigados se incrementará en esta misma medida. Se podrá incluir además un lote de animales centinela (habitualmente 5 individuos de cada sexo) para supervisar su estado en cuanto a enfermedades, en caso necesario, durante el estudio (30). Se ofrecen más indicaciones en el documento de orientación no 116 (7). | Grupos de dosis y posología | 21. | En el documento de orientación no 116 (7) se facilitan indicaciones sobre todos los aspectos de la selección de la dosis y los intervalos entre las dosis. Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control en paralelo. Los niveles de dosis se basan generalmente en los resultados de los estudios de determinación del intervalo o realizados con dosis repetidas a corto plazo, y deben tener en cuenta los datos toxicológicos y toxicocinéticos de que se disponga en relación con la sustancia problema o con sustancias afines. | 22. | Salvo limitaciones impuestas por la naturaleza fisicoquímica o los efectos biológicos de la sustancia problema, el nivel de dosis más elevado se escogerá a fin de identificar los principales órganos diana y efectos tóxicos pero evitando una toxicidad intensa, el sufrimiento, la morbilidad o la muerte de los animales. Tomando en consideración los factores que se indican en el punto 23 que sigue, normalmente el nivel de dosis más elevado será tal que provoque signos de toxicidad, por ejemplo, manifestada por una merma de la ganancia de peso corporal (aproximadamente el 10 %). Ahora bien, dependiendo de los objetivos del estudio (véase el punto 6), se puede establecer un techo de dosis inferior al nivel que provoque signos de toxicidad, por ejemplo si una dosis induce un efecto adverso de interés que, sin embargo, tiene escasa repercusión en el período de vida o el peso corporal. | 23. | Los niveles de dosis y la frecuencia de administración serán tales que permitan establecer una relación dosis-respuesta y, dependiendo del modo de acción de la sustancia problema, un valor de NOAEL o cualesquiera otras determinaciones previstas, como el valor de BMD o dosis de referencia más baja (véase el punto 25). Para establecer las dosis inferiores se tendrán en cuenta factores como la pendiente esperada de la curva dosis-respuesta, así como los niveles a los que cabe esperar cambios importantes en el metabolismo o en el mecanismo de la acción tóxica, cuando se prevea un umbral, o que constituyan un punto de partida para extrapolar la dosis más baja. | 24. | La frecuencia de administración de las dosis dependerá de las características de la sustancia y no corresponde especificarla en este método de ensayo; los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer los niveles descendentes y frecuentemente es preferible añadir un cuarto lote de ensayo antes que utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo con un factor superior a 6-10) entre dosis. En general se evitará aplicar factores superiores a 10, que en todo caso deberán justificarse. | 25. | Tal como se expone en el documento de orientación no 116 (7), para la selección de las dosis se tendrán en cuenta los siguientes factores: | — | los intervalos supuestos o conocidos de no linealidad o puntos de inflexión en la relación dosis-respuesta, | — | la toxicocinética y los intervalos posológicos en los que pueda haber o no inducción metabólica, saturación o no linealidad entre la dosimetría externa e interna, | — | las lesiones precursoras, los marcadores de efecto o los indicadores de la intervención de los principales mecanismos biológicos subyacentes, | — | aspectos importantes (hipotéticos o comprobados) del modo de acción, como la dosis a partir de la cual se manifiesta toxicidad, los niveles hormonales que resultan afectados, los mecanismos homeostáticos que se alteran, etc., | — | aquellas regiones de la curva dosis-respuesta en las que se precisa hacer una estimación especialmente robusta, como el intervalo de la dosis de referencia prevista o el umbral hipotético, | — | los niveles de exposición humana que cabe prever. | 26. | Se emplea un lote de control en paralelo, que no recibe la sustancia problema, pero sí el vehículo de la misma en caso de que se utilice. A excepción de la administración de la sustancia problema, los animales del lote de control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de tratamiento. En su caso, el lote de control ha de recibir el mayor volumen de vehículo que se haya utilizado. Si la sustancia problema se administra con los alimentos y provoca una disminución importante de la ingesta debido a que empeoran las características organolépticas de la dieta, puede ser útil utilizar un lote de control alimentado en paralelo para conseguir una comparación más rigurosa. | Preparación de las dosis y administración de la sustancia problema | 27. | La sustancia problema se administra habitualmente por vía oral, mediante sonda o con el alimento o el agua de bebida. Se ofrece más información sobre las vías y los métodos de administración en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7). La vía y el método de administración dependerán de la finalidad del estudio, las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, su biodisponibilidad y la vía y el modo de exposición predominantes en los seres humanos. Se justificará debidamente la vía y el método de administración elegidos. Por razones de bienestar animal, la alimentación oral por sonda se elegirá solo cuando exista una posibilidad razonable de que la exposición humana a la sustancia problema se vaya a producir por la misma vía y el mismo medio de administración (como es el caso de los productos farmacéuticos). Cuando se trata de sustancias alimentarias o ambientales, entre ellas los plaguicidas, la administración se efectúa habitualmente con los alimentos o el agua de bebida. Sin embargo, en otros escenarios de estudio como la exposición ocupacional, puede ser más conveniente la administración por otras vías. | 28. | En caso necesario, la sustancia problema se disuelve o suspende en un vehículo adecuado. Debe prestarse atención a las siguientes características del vehículo u otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribución, metabolismo o retención de la sustancia problema, efectos sobre las propiedades químicas de dicha sustancia que puedan modificar su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y agua o el estado nutricional de los animales. Se recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus características tóxicas. Se recabará información acerca de la estabilidad de la sustancia problema y su homogeneidad de concentración en las disoluciones o en las dietas (en su caso) que se emplean para la administración. | 29. | Si la sustancia se administra con los alimentos o el agua de bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia problema administradas no interfieren con la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. En los estudios de toxicidad a largo plazo en los que la sustancia problema se administra con los alimentos, su concentración no debe superar generalmente el límite del 5 % de la ingesta total para evitar desequilibrios nutricionales. Cuando la sustancia problema se administra con los alimentos, se puede usar una concentración constante en la dieta (mg/kg de alimento o ppm) o bien una dosis constante en términos de peso corporal (mg/kg peso corporal), calculada con periodicidad semanal. Deberá indicarse qué alternativa se ha seguido. | 30. | En los ensayos de administración oral, la sustancia problema se administra a los animales diariamente (siete días por semana), durante un período que suele ser de 24 meses en el caso de los roedores (véase también el punto 32). Cualquier otra pauta posológica, por ejemplo, de 5 días por semana, debe justificarse. En el caso de la administración cutánea, los animales se tratan con la sustancia problema como mínimo 6 horas al día con una pauta de 7 días por semana, según se especifica en el capítulo B.9 del presente anexo (11), durante un período de 24 meses. La exposición por vía inhalatoria se efectúa durante 6 horas al día con una pauta de 7 días por semana pero, si se justifica, es admisible una pauta de 5 días por semana. El período de exposición será habitualmente de 24 meses. Cuando se exponen con la técnica de solo la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justificará debidamente cualquier período de exposición inferior a 6 horas diarias. Véase también el capítulo B.8 del presente anexo (9). | 31. | Si la sustancia problema se administra por sonda, debe hacerse con una sonda gástrica o con una cánula de intubación adecuada y todos los días a la misma hora. La dosis única se administra normalmente una vez al día; pero si la sustancia es un irritante local, cabe la posibilidad de mantener la dosis total diaria repartiendo la administración en dosis divididas (dos veces al día). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. El volumen se mantendrá en el mínimo posible, y en los roedores no debe exceder generalmente de 1 ml/100 g peso corporal (31). La variabilidad en el volumen utilizado debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para garantizar un volumen constante en todas las dosis. Constituyen una excepción las sustancias potencialmente corrosivas o irritantes, que deben diluirse para evitar efectos locales graves. Se evitará la administración de concentraciones que puedan ser corrosivas o irritantes del tubo digestivo. | Duración del estudio | 32. | La duración del estudio suele ser de 24 meses en el caso de los roedores, lo que constituye la mayor parte del período de existencia de los animales investigados. Siempre que se justifique, se podrán aplicar períodos mayores o menores en función del ciclo de vida de la especie y la cepa investigadas. En el caso de determinadas cepas de ratones, como AKR/J, C3H/J o C57BL/6J, puede estar más justificada una duración de 18 meses. Seguidamente se facilitan algunas indicaciones acerca de la duración, la terminación del estudio y la supervivencia; otras consideraciones, entre ellas la aceptabilidad de un resultado de carcinogénesis negativa en función de la supervivencia observada en el estudio, se pueden consultar en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7) sobre el diseño y la realización de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis. | — | Se planteará la terminación del estudio cuando el número de supervivientes en los grupos de dosis más baja o de control sea menor del 25 por ciento. | — | Si las muertes prematuras por toxicidad se producen solo en el grupo de dosis más elevada, ello no debe motivar la terminación del estudio. | — | Se contabilizará por separado la supervivencia de cada sexo. | — | El estudio no debe prolongarse más allá del instante en que los datos derivados del mismo se muestren insuficientes para permitir una evaluación estadísticamente significativa. | OBSERVACIONES | 33. | Se observará la morbilidad o la mortalidad en todos los animales, generalmente a primera y última hora del día, incluidos los fines de semana y festivos. Debe hacerse además una observación diaria de los eventuales signos específicos de importancia toxicológica, teniendo en cuenta el período más agudo de los efectos previstos tras la administración cuando esta se haga por sonda. Se prestará especial atención al desarrollo de tumores; se registrarán el momento de aparición y localización, dimensiones, aspecto y progresión de todo tumor visible macroscópica o palpablemente. | Peso corporal, consumo de alimentos y agua y eficiencia alimentaria | 34. | Deben pesarse todos los animales al comenzar el tratamiento, como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Se medirán el consumo de alimento y la eficiencia alimentaria como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Si la sustancia problema se administra con el agua de bebida, se medirá la ingesta de agua como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. La determinación de la ingesta de agua se contemplará así mismo en aquellos estudios en los que esté alterada la actividad de beber. | Hematología, bioquímica clínica y otras valoraciones | 35. | Con el fin de maximizar la información derivada de la investigación, especialmente en lo que se refiere al modo de acción, a criterio del director del estudio se podrán tomar muestras de sangre para análisis hematológicos y de bioquímica clínica. También pueden estar indicados los análisis de orina. En el documento de orientación no 116 (7) se comenta el interés de obtener este tipo de muestras en el marco de un ensayo de carcinogénesis. Si se considera oportuno, se podrán obtener muestras de sangre para hematología y bioquímica clínica y muestras de orina para análisis, como mínimo en 10 animales de cada sexo y lote, tanto antes del sacrificio durante el ensayo (punto 20) como en el momento de su conclusión. Las muestras de sangre se extraerán de una zona que deberá indicarse, por ejemplo por punción cardiaca o del seno retro-orbital, bajo anestesia y, en su caso, se conservarán en las debidas condiciones. También se pueden preparar frotis de sangre, especialmente si se sospecha que la médula ósea es el órgano diana, aunque se ha cuestionado el valor de estas muestras para la evaluación del potencial cancerígeno u oncógeno (32). | ANATOMÍA PATOLÓGICA | Autopsia macroscópica | 36. | Todos los animales del estudio excepto los centinela (véase el punto 20) y otros animales satélite se someterán a una autopsia completa que comprenda la inspección de la superficie externa del cuerpo, todos sus orificios y las cavidades craneal, torácica y abdominal y sus contenidos. La autopsia de los animales centinela y de otros animales satélite se decidirá según cada caso, a criterio del director del estudio. El pesaje de los órganos no suele formar parte de un estudio de carcinogénesis, dado que los cambios geriátricos y, en fases más avanzadas, el desarrollo de tumores introducen confusión en la interpretación de los datos sobre el peso de los órganos. No obstante, estos datos pueden ser cruciales para sopesar las pruebas y, especialmente, las consideraciones sobre el modo de acción. Si forman parte de un estudio satélite, se recogerán a lo más tardar un año después de iniciar el estudio. | 37. | Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el medio de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse (33) (opcional en el caso de los tejidos entre corchetes): | Todas las lesiones macroscópicas | Corazón | Páncreas | Estómago (rumen, estómago glandular) | Cápsulas suprarrenales | Íleo | Glándulas paratiroides | [Dientes] | Aorta | Yeyuno | Nervios periféricos | Testículos | Encéfalo (incluidos cortes de cerebro, cerebelo, bulbo y protuberancia) | Riñón | Hipófisis | Timo | Intestino ciego | Glándulas lacrimales (extraorbitales) | Próstata | Tiroides | Cuello del útero | Hígado | Recto | [Lengua] | Glándulas coagulantes | Pulmón | Glándulas salivales | Tráquea | Colon | Ganglios linfáticos (superficiales y profundos) | Vesículas seminales | Vejiga urinaria | Duodeno | Glándulas mamarias (obligatoriamente las femeninas y, sin son visiblemente diseccionables, también las masculinas) | Músculo esquelético | Útero (y cuello) | Epidídimo | [Vías respiratorias altas, incluidos nariz, cornetes y senos paranasales] | Piel | [Uréteres] | Ojos (y retina) | Esófago | Médula espinal (tres secciones: cervical, medio-dorsal y lumbar) | [Uretra] | [Fémur y articulación tibiofemoral] | [Bulbo olfativo] | Bazo | Vagina | Vesícula biliar (en especies distintas de la rata) | Ovarios | [Esternón] | Sección de médula ósea y/o aspirado reciente de médula | Glándula de Harder | | | | En el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se conservarán ambos órganos. Las observaciones clínicas y de otro tipo pueden indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propiedades conocidas de la sustancia problema. En los estudios que entrañen la vía de administración cutánea, se conservarán los mismos órganos que en el caso de la administración oral, pero además es fundamental establecer un protocolo específico para la obtención y conservación de muestras de piel de la zona de aplicación. En los estudios de inhalación, los tejidos de las vías respiratorias se conservarán y examinarán siguiendo las recomendaciones de los capítulos B.8 y B.29 del presente anexo. Los restantes órganos y tejidos (además de los tejidos de las vías respiratorias específicamente conservados), se examinarán igual que se ha establecido en el caso de la administración oral. | Examen histopatológico | 38. | Se puede consultar el documento de orientación sobre buenas prácticas en la realización de los estudios de toxicopatología (33). Como mínimo se examinarán los siguientes tejidos: | — | todos los tejidos de los animales de control y del grupo con dosis máxima, | — | todos los tejidos de los animales muertos o sacrificados durante el estudio, | — | todos los tejidos que presenten alteraciones macroscópicas, incluidos tumores, | — | cuando se observen alteraciones histopatológicas relacionadas con el tratamiento en el grupo de dosis más elevada, los mismos tejidos afectados se examinarán en todos los animales de los restantes grupos de dosis, | — | en el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se examinarán ambos órganos. | DATOS E INFORME | Datos | 39. | Se documentarán los datos de todos los parámetros evaluados en cada animal. Además, deben resumirse todos los datos en un cuadro que recoja, por cada lote de ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el porcentaje de animales afectado por cada tipo de lesión. Los cuadros de datos agrupados reflejarán las medias y desviaciones típicas (en el caso de variables continuas) de los animales que presenten lesiones o efectos tóxicos, además de una escala de clasificación de las lesiones. | 40. | Los datos sobre controles históricos pueden resultar de ayuda en la interpretación de los resultados del estudio, por ejemplo cuando haya indicios de que los resultados arrojados por los controles simultáneos se desvían esencialmente de los datos recientes obtenidos en animales de control del mismo animalario o colonia. De ser evaluados, los datos sobre controles históricos deben proceder del mismo laboratorio, y corresponder a animales de edades y cepas afines, y haberse generado en los cincos años precedentes al estudio en cuestión. | 41. | Siempre que sea posible, deben evaluarse los resultados numéricos mediante un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. La elección de los métodos estadísticos y de los datos que vayan a analizarse debe efectuarse en la fase de diseño del estudio (punto 9). Para ello se tendrán en cuenta los ajustes de la supervivencia, en su caso. | Informe del ensayo | 42. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas. | — | Datos de identificación. | — | Procedencia de la sustancia. | — | Número de lote. | — | Certificado de análisis químico. | | Vehículo (si procede): | — | Justificación de la elección del vehículo (si es distinto del agua). | | Animales de ensayo: | — | Especie y cepa utilizada y motivos para elegirla. | — | Número, edad y sexo de los animales al inicio del ensayo. | — | Origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc. | — | Peso de cada animal al inicio del ensayo. | | Condiciones del ensayo: | — | Fundamento de la elección de la vía de administración y la dosis. | — | Cuando proceda, métodos estadísticos aplicados al análisis de los datos. | — | Pormenores de la formulación de la sustancia o de su preparación con la comida. | — | Datos analíticos acerca de la concentración obtenida, la estabilidad y la homogeneidad de la preparación. | — | Vía y método de administración de la sustancia problema. | — | En los estudios de inhalación se indicará si es de solo por la nariz o de cuerpo entero. | — | Dosis reales (mg/kg peso corporal/día) y factor de conversión de la concentración (mg/kg o ppm) de la sustancia problema en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales, en su caso. | — | Datos sobre la calidad de los alimentos y del agua. | | Resultados (se presentarán cuadros de datos agrupados así como los datos de cada animal) | | Generalidades | — | Datos de supervivencia. | — | Peso corporal y variaciones del mismo. | — | Ingesta de alimento, cálculos de la eficiencia alimentaria, si se han hecho, e ingesta de agua cuando proceda. | — | Datos toxicocinéticos (en su caso). | — | Oftalmoscopia (en su caso). | — | Hematología (en su caso). | — | Bioquímica clínica (en su caso). | | Observaciones clínicas: | — | Signos de toxicidad. | — | Incidencia (y, si se ha valorado, gravedad) de cualquier anomalía. | — | Naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas (sean reversibles o no). | | Resultados de la autopsia: | — | Peso corporal en el momento de la muerte. | — | Pesaje de los órganos (y pesos relativos, cuando proceda). | — | Observaciones de la autopsia; incidencia y gravedad de las anomalías. | | Examen histopatológico: | — | Observaciones histopatológicas de carácter no neoplásico. | — | Observaciones histopatológicas neoplásicas. | — | Correlación entre las observaciones macro y microscópicas. | — | Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas relacionadas con el tratamiento, con una clasificación de su gravedad. | — | Informes sobre las eventuales evaluaciones de las preparaciones efectuadas por otros científicos. | | Tratamiento estadístico de los resultados, según proceda. | | La discusión de los resultados comprende lo siguiente: | — | Discusión de cualquier hipótesis o modelo teórico. | — | Relación dosis-respuesta. | — | Datos sobre controles históricos. | — | Otras informaciones sobre el modo de acción. | — | Valores de BMD, NOAEL o LOAEL. | — | Relevancia para los seres humanos. | | Conclusiones | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. | (3) | Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208. | (4) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191. | (5) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. | (6) | Capítulo B.27 del presente anexo. Ensayo de toxicidad oral subcrónica. Toxicidad oral por administración continuada (90 días) en roedores. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453-Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Capítulo B.8 del presente anexo. Toxicidad subaguda por inhalación: estudio de 28 días. | (10) | Capítulo B.29 del presente anexo. Toxicidad subcrónica por inhalación: estudio de 90 días. | (11) | Capítulo B.9 del presente anexo. Toxicidad por administración continuada (28 días) por vía cutánea. | (12) | Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801. | (13) | Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589. | (14) | Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56. | (15) | Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653. | (16) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. | (17) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (18) | Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68. | (19) | Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98. | (20) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. | (21) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (22) | Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. | (23) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. | (24) | Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. 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Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. | (32) | Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (33) | Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Apéndice 1 | DEFINICIÓN | Sustancia problema: cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este método de ensayo. | B.33. ENSAYO COMBINADO DE TOXICIDAD CRÓNICA Y CARCINOGÉNESIS | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 453 de la OCDE (2009). Las TG 453 originales fueron adoptadas en 1981. Se consideró necesario adaptar este método de ensayo B.33 para dar cuenta de los avances recientes en materia de bienestar animal que plantean nuevas necesidades normativas (1) (2) (3) (4) (5). La actualización de este método de ensayo B.33 se ha realizado en paralelo con las revisiones de los capítulos del presente anexo B.32. Ensayo de carcinogénesis y B.30. Ensayo de toxicidad crónica, con el fin de obtener más información acerca de los animales utilizados en el estudio y recabar nuevos datos sobre la selección de las dosis. El presente método de ensayo ha sido diseñado para el estudio de una amplia gama de sustancias, incluso plaguicidas y productos químicos industriales. Conviene señalar, no obstante, que algunos pormenores y requisitos pueden variar en el caso de los productos farmacéuticos (véase el documento de orientación S1B de la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH), para los ensayos de carcinogénesis de los productos farmacéuticos). | 2. | La mayoría de los ensayos de toxicidad crónica y de carcinogénesis se realizan con especies de roedores, por lo que este método de ensayo se ha diseñado básicamente para el estudio de dichas especies. Cuando fuere preciso realizar estos ensayos en especies no roedoras, serán así mismo de aplicación los principios y procedimientos descritos en este método de ensayo, además de los descritos en el capítulo B.27 del presente anexo, Ensayo de toxicidad oral por administración continuada (90 días) en no roedores (6), con las debidas modificaciones, tal como se especifica en el documento de orientación no 116 de la OCDE sobre Diseño y realización de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis (7). | 3. | Las tres vías de administración principales que se estudian en los ensayos de toxicidad crónica y carcinogénesis son la oral, la cutánea y la inhalatoria. La elección de una de ellas dependerá de las características físicas y químicas de la sustancia estudiada y de la vía de exposición predominante en seres humanos. Se ofrece más información sobre la elección de la vía de exposición en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7). | 4. | El presente método de ensayo centra el interés en la exposición por vía oral, la más frecuentemente usada en los estudios de toxicidad crónica y de carcinogénesis. Si bien los estudios de toxicidad crónica a largo plazo que entrañan la exposición por vía cutánea o inhalatoria pueden ser igualmente necesarios en la evaluación del riesgo para la salud humana o en determinados marcos legislativos, estas dos vías de exposición plantean una complejidad técnica considerable. Tales estudios tendrán que diseñarse según cada caso; sin embargo, el método de ensayo que aquí se describe para la determinación y evaluación de la toxicidad crónica y de la carcinogénesis por administración oral podría sentar las bases de un protocolo para los estudios de toxicidad por inhalación o absorción dérmica en lo que se refiere a recomendación de períodos de tratamiento, variables clínicas e histopatológicas, etc. La OCDE dispone de documentación orientativa sobre la administración de las sustancias problema por inhalación (7) (8) y por vía cutánea (7). Para el diseño de estudios a más largo plazo que contemplen la exposición por vía inhalatoria deben consultarse específicamente los capítulos B.8 (9) y B.29 (10) del presente anexo, además del documento de orientación de la OCDE sobre estudios de toxicidad aguda por inhalación (8). Cuando se trate de estudios que contemplen la vía cutánea se consultará el capítulo B.9 (11) del presente anexo. | 5. | Un estudio combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis proporciona información sobre los factores de riesgo para la salud derivados de la exposición continuada durante un período que puede llegar a ocupar la vida entera de la especie animal investigada. El estudio proporciona información sobre los efectos tóxicos de la sustancia problema, incluida la carcinogénesis potencial, y puede ayudar a determinar los órganos diana y la posibilidad de acumulación. Puede facilitar una estimación del máximo nivel de dosis sin efectos tóxicos observados (NOAEL) y, en el caso de cancerígenos no genotóxicos, de las respuestas tumorales, que servirá para establecer los criterios de seguridad de la exposición humana. Cabe destacar la necesidad de realizar observaciones clínicas detenidas de los animales, a fin de obtener la máxima información posible. | 6. | Los objetivos de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis realizados según este método de ensayo son: | — | la identificación de las propiedades cancerígenas de una sustancia problema que puedan provocar una incidencia elevada de neoplasias, una mayor proporción de neoplasias malignas o una reducción del tiempo de aparición de las neoplasias, en comparación con los grupos de control, | — | la determinación del tiempo que tardan en aparecer las neoplasias, | — | la identificación de la toxicidad crónica de una sustancia problema, | — | la identificación del órgano o los órganos diana de la toxicidad crónica y de la carcinogénesis, | — | la caracterización de la relación dosis-respuesta, | — | la identificación del nivel máximo sin efectos adversos observados (NOAEL), o punto de partida para determinar una dosis de referencia (Benchmark Dose, BMD), | — | la extrapolación de los efectos cancerígenos a los niveles de dosificación inferiores de la exposición humana, | — | la predicción de los efectos de toxicidad crónica que se producirán a los niveles de exposición humana, | — | la recopilación de datos para investigar las hipótesis referentes al mecanismo de acción (2) (7) (12) (13) (14) (15). | CONSIDERACIONES INICIALES | 7. | En la determinación y evaluación del potencial de carcinogénesis y de toxicidad crónica de una sustancia, el laboratorio de ensayo deberá tener en cuenta toda la información disponible acerca de la sustancia problema antes de emprender el estudio, para así poder centrarse de manera más eficaz en sus propiedades toxicológicas y minimizar el uso de animales. La información previa y la consideración en torno al modo de acción de un supuesto cancerígeno (2) (7) (12) (13) (14) (15) reviste particular importancia, toda vez que el diseño óptimo del ensayo variará según se trate o no de un cancerígeno genotóxico hipotético o conocido. Se ofrecen otras consideraciones sobre el modo de acción en el documento de orientación no 116 (7). | 8. | En el diseño del estudio serán de ayuda el conocimiento de la identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, cualquier información referente al mecanismo de acción, los resultados de cualesquiera ensayos de toxicidad y de genotoxicidad in vitro o in vivo, el uso o usos previstos y la exposición humana potencial, los datos de (Q)SAR previos, los datos de mutagenicidad/genotoxicidad, carcinogénesis y otros datos toxicológicos sobre sustancias estructuralmente afines, los datos toxicocinéticos disponibles (cinética de dosis única y, en su caso, de acumulación por dosis repetidas) y los datos derivados de otros estudios de exposición continuada. La determinación de la toxicidad crónica y la carcinogénesis solo debe emprenderse una vez que se ha recabado la información toxicológica inicial en los ensayos de toxicidad por administración continuada durante 28 días y/o 90 días. También pueden aportar una información valiosa los ensayos de inducción-estimulación de cáncer a corto plazo. Se hará un planteamiento escalonado de los estudios de carcinogénesis como parte de la evaluación global de los potenciales efectos adversos que puede tener para la salud una sustancia determinada (16) (17) (18) (19). | 9. | Antes de iniciar el estudio se establecerán los métodos estadísticos más adecuados para el análisis de los resultados, en función del diseño y de los objetivos experimentales. Aspectos importantes son el ajuste de la supervivencia en el análisis estadístico, el análisis de los riesgos tumorales acumulativos en relación con el tiempo de supervivencia, el análisis del tiempo que tarda en aparecer el tumor y el análisis en caso de terminación prematura de uno o más grupos. Se ofrecen orientaciones para realizar el análisis estadístico adecuado y se hace referencia a los métodos estadísticos internacionalmente aceptados en el documento de orientación (GD) no 116 (7) y en el GD no 35 sobre análisis y evaluación de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis (20). | 10. | Cuando se efectúa un estudio de carcinogénesis, son de aplicación los principios y consideraciones recogidos en el documento de orientación no 19 de la OCDE sobre el reconocimiento, la evaluación y la aplicación de signos clínicos como parámetros compasivos en los animales experimentales que se usan para evaluar la seguridad (21), en particular su punto 62. Dicho punto especifica que en los estudios de administración continuada, cuando un animal muestre signos clínicos progresivos que entrañen un deterioro creciente de su estado, habrá que decidir con conocimiento de causa si se sacrifica de forma compasiva. La decisión sopesará el valor de la información que puede obtenerse si se mantiene al animal en el estudio frente al desgaste de su estado general. Si se decide mantener al animal en el ensayo, se aumentará la frecuencia de las observaciones en la medida necesaria. Cabe también la posibilidad de, sin perjudicar a los fines de la investigación, suspender temporalmente la administración para aliviar el dolor o sufrimiento, o reducir la dosis experimental. | 11. | Se ofrecen orientaciones y comentarios detallados sobre los principios que deben orientar la selección de la dosis en los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis en el documento de orientación no 116 (7) y en dos publicaciones del International Life Sciences Institute (22) (23). El núcleo de la estrategia de selección de la dosis depende del objetivo u objetivos principales del estudio (punto 6). Al elegir un intervalo posológico adecuado, debe buscarse un equilibrio entre el cribado de los factores de riesgo, por un lado, y la caracterización de las respuestas ante dosis bajas y de su relevancia, por otro. Ello reviste particular importancia en este estudio combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis. | 12. | Se considerará la posibilidad de efectuar el presente estudio combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis en lugar de realizar por separado un ensayo de toxicidad crónica (capítulo B.30 de este anexo) y un ensayo de carcinogénesis (capítulo B.32 de este anexo). El ensayo combinado permite una mayor eficiencia que los estudios separados en términos de tiempo y costes, y reduce en cierta medida el uso de animales, sin comprometer la calidad de los datos ni en la fase de toxicidad crónica ni en la fase de carcinogénesis. Sin embargo, cuando se emprenda un estudio combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis habrá que considerar detenidamente los principios de la selección de la dosis (puntos 11 y 22-26) y, por otro lado, se entiende que determinados marcos legislativos pueden imponer la realización de ensayos separados. En el documento de orientación no 116 (7) se facilitan más indicaciones sobre el diseño de los estudios combinados de toxicidad crónica y carcinogénesis dentro de los principios de máxima eficiencia para reducir el número de animales empleados y de aprovechamiento racional de los distintos métodos experimentales. | 13. | Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan al final del presente capítulo y en el documento de orientación no 116 (7). | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 14. | El diseño del estudio consta de dos fases paralelas, una de toxicidad crónica y otra de carcinogénesis (consúltense sus duraciones respectivas en los puntos 34 y 35). La sustancia problema se administra generalmente por vía oral, aunque también se aceptan las vías inhalatoria y cutánea. En la fase de toxicidad crónica, la sustancia problema se administra diariamente en dosis escalonadas a varios lotes de animales experimentales, a razón de un nivel de dosis por lote, normalmente durante un período de 12 meses, si bien este puede reducirse o prolongarse en función de los requisitos normativos (véase el punto 34). La duración del estudio será suficiente para permitir que se manifiesten los posibles efectos de toxicidad acumulativa, pero sin que se confundan con las alteraciones geriátricas. El diseño del estudio puede contemplar el sacrificio de uno o más animales durante el ensayo, por ejemplo a los 3 y a los 6 meses, y a tal efecto se podrán prever lotes complementarios de animales (véase el punto 20). En la fase de carcinogénesis, la sustancia problema se administra diariamente a varios lotes de animales experimentales durante la mayor parte de su existencia. Se observa atentamente a los animales en ambas fases por si aparecen signos de toxicidad o lesiones neoplásicas. Se practica la autopsia a los animales que mueran o sean sacrificados durante el ensayo y, al final del mismo, se sacrifican y someten a autopsia los animales supervivientes. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Selección de la especie animal | 15. | El presente método de ensayo está diseñado fundamentalmente para la determinación y evaluación de la toxicidad crónica y la carcinogénesis en roedores (punto 2). Se podrá considerar el uso de especies no roedoras cuando los datos previos indiquen que son más útiles para la predicción de los efectos sobre la salud humana. Se justificará la elección de la especie. La especie idónea es la rata, si bien pueden emplearse otras especies de roedores como el ratón. Si bien el uso de ratones en los ensayos de carcinogénesis puede ser de utilidad limitada (24) (25) (26), algunas normativas en vigor siguen exigiendo que se realicen ensayos de carcinogénesis en ratones a no ser que se establezca que son científicamente innecesarios. Las ratas y los ratones se prefieren como modelos experimentales debido a su ciclo vital relativamente corto, su amplia utilización en los estudios farmacológicos y toxicológicos, su sensibilidad a la inducción tumoral y la disponibilidad de cepas de laboratorio suficientemente caracterizadas. Debido a todas estas características, se ha podido hacer un gran acopio de información acerca de su fisiología y anatomopatología. El diseño y la realización de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis en especies no roedoras, cuando proceda, se basará en los principios que se recogen en el presente método de ensayo y en el capítulo B.27 de este anexo, Toxicidad oral por administración continuada (28 días) en no roedores (6). Se ofrece más información sobre la elección de la especie y la cepa de laboratorio en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7). | 16. | Se escogerán animales adultos jóvenes y sanos de una variedad de laboratorio de uso habitual. Los estudios combinados de toxicidad crónica y carcinogénesis se efectuarán preferiblemente en animales de la misma procedencia y cepa que los empleados en los estudios preliminares de toxicidad de duración menor; ahora bien, si los animales de esa procedencia y variedad han demostrado incapacidad para cumplir los criterios de supervivencia normalmente aceptados para los estudios a largo plazo [véase el documento de orientación no 116 (7)], se planteará la posibilidad de usar una cepa que presente una tasa de supervivencia aceptable en los ensayos a largo plazo. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. | Alojamiento y alimentación | 17. | Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del mismo sexo; el enjaulamiento individual se considerará solo si está científicamente justificado (27) (28) (29). Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. La sala de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el ideal es el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La dieta debe satisfacer todas las necesidades nutricionales de la especie estudiada, y se mantendrá en el mínimo posible su contenido en contaminantes alimentarios, entre otros los residuos de plaguicidas, contaminantes orgánicos persistentes, fitoestrógenos, metales pesados y micotoxinas que pudieran influir en los resultados experimentales. La información analítica sobre el contenido de nutrientes y contaminantes alimentarios se consignará de forma periódica, como mínimo al inicio del estudio y cada vez que se varíe el lote de producto empleado, y se documentará en el informe final. Asímismo se consignará la información analítica sobre el agua de bebida empleada en el estudio. Cuando la sustancia se administra con el alimento, la elección de la dieta se basa en la necesidad de conseguir una mezcla apropiada de la sustancia problema y de satisfacer al mismo tiempo las necesidades nutricionales de los animales. | Preparación de los animales | 18. | Deben emplearse animales sanos, que se hayan mantenido al menos 7 días en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no hayan sido sometidos a experimentos previos. En el caso de los roedores, la administración comenzará lo antes posible tras su destete y aclimatación, preferiblemente antes de que los animales cumplan 8 semanas de edad. Se caracteriza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y edad de los animales de experimentación. La diferencia de peso entre los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo. Los animales se reparten al azar entre los lotes tratados y los de control. Después de la asignación al azar, no debe haber diferencias significativas entre los grupos en las medias de peso corporal de cada sexo. De observarse diferencias estadísticamente significativas, el proceso de asignación aleatoria a los grupos deberá repetirse en la medida de lo posible. Se asigna a cada animal un número de identificación distinto, que se le grabará de manera permanente mediante tatuaje, implante de microchip o cualquier otro medio pertinente. | PROCEDIMIENTO | Número y sexo de los animales | 19. | Se emplearán animales de ambos sexos. Se empleará un número de animales suficiente para permitir una exhaustiva evaluación biológica y estadística. En el caso de los roedores, por tanto, cada grupo de dosis (como se describe en el punto 22) y de control simultáneo empleados en la fase de carcinogénesis del estudio deberá contener como mínimo 50 animales de cada sexo. Dependiendo de la finalidad del estudio, cabe la posibilidad de aumentar la potencia estadística de las estimaciones esenciales haciendo una asignación diferencial de los animales a los distintos grupos de dosis, de modo que haya más de 50 individuos en los grupos de dosis inferior; esto permite estimar el potencial carcinógeno a dosis bajas. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que un aumento moderado del tamaño del grupo incrementará relativamente poco la potencia estadística del estudio. En el caso de los roedores, cada grupo de dosis (como se describe en el punto 22) y de control simultáneo empleado en la fase de toxicidad crónica del estudio deberá contener como mínimo 10 animales de cada sexo. Conviene señalar que este número es menor que en el estudio de toxicidad crónica (capítulo B.30 del presente anexo). No obstante, la interpretación de los datos obtenidos con los lotes reducidos en la fase de toxicidad crónica de este estudio combinado estará respaldada por los datos de los lotes más numerosos empleados en la fase de carcinogénesis. En los ensayos con ratones puede hacer falta un suplemento de animales en cada grupo de dosificación de la fase de toxicidad crónica para llevar a cabo todas las valoraciones hematológicas necesarias. Se ofrece más información sobre el diseño estadístico y la selección de los niveles de dosis para maximizar la potencia estadística del estudio en el documento de orientación no 116 (7). | Provisión de animales para el sacrificio durante el ensayo, los lotes satélite y los lotes centinela | 20. | Si está científicamente justificado, se puede hacer una provisión de animales para sacrificarlos durante el ensayo, por ejemplo a los 6 meses en la fase de toxicidad crónica, y así obtener datos sobre la progresión de las alteraciones no neoplásicas y sobre los mecanismos de acción. Si tal información ha sido ya proporcionada por estudios previos de toxicidad por administración continuada realizados con la misma sustancia problema, el sacrificio de animales durante el ensayo puede no estar científicamente justificado. Los animales sacrificados en el transcurso de la fase de toxicidad crónica del estudio, normalmente de 12 meses de duración (punto 34), proporcionan datos útiles para la fase de carcinogénesis, lo que permite reducir el número global de animales estudiados. Cabe la posibilidad de incluir lotes satélite en la fase de toxicidad crónica del estudio para controlar la reversibilidad de las eventuales alteraciones tóxicas inducidas por la sustancia problema. Generalmente, estos se limitan al lote del nivel de dosis más elevado del estudio y al lote de control. Se podrá incluir además un lote de animales centinela (habitualmente 5 individuos de cada sexo) para supervisar el estado en cuanto a enfermedades, en caso necesario, durante el estudio (30). En el documento de orientación no 116 (7) se facilitan más indicaciones sobre el diseño del estudio y la provisión del mínimo número posible de animales para el sacrificio y para los lotes satélite y centinela. | 21. | Si en el diseño experimental se incluyen animales satélite y/o para sacrificarlos durante el ensayo, lo habitual es que los lotes destinados a estos fines estén compuestos por 10 animales de cada sexo, y el número total de animales investigados se incrementará en esta misma medida. Los animales satélite y los sacrificados durante el ensayo se someten generalmente a las mismas observaciones (peso corporal, consumo de agua y alimentos, valoraciones de hematología y bioquímica clínica e investigaciones anatomopatológicas) que los animales observados en la fase de toxicidad crónica del estudio principal, aunque se puede establecer que, en los lotes que se sacrifiquen durante el ensayo, se restrinja dicha evaluación a aspectos cruciales como la neurotoxicidad o la inmunotoxicidad. | Grupos de dosis y posología | 22. | En el documento de orientación no 116 (7) se facilitan indicaciones sobre todos los aspectos de la selección de la dosis y los intervalos entre las dosis. Tanto en la fase de toxicidad crónica como en la de carcinogénesis, se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control en paralelo. Los niveles de dosis se basan generalmente en los resultados de los estudios de determinación del intervalo o realizados con dosis repetidas a corto plazo, y deben tener en cuenta los datos toxicológicos y toxicocinéticos de que se disponga en relación con la sustancia problema o con sustancias afines. | 23. | En la fase de toxicidad crónica puede no ser necesario hacer un estudio completo con tres niveles de dosis, si se considera que no cabe esperar efectos adversos con un nivel de dosis equivalente como mínimo a 1 000 mg/kg peso corporal/día. Esta decisión se basará en informaciones procedentes de estudios preliminares y en la consideración de que no cabe esperar toxicidad a tenor de los datos de sustancias estructuralmente afines. Se puede establecer un límite de 1 000 mg/kg peso corporal/día, salvo si la exposición humana previsible indica la necesidad de emplear un nivel de dosis más elevado. | 24. | Salvo limitaciones impuestas por la naturaleza fisicoquímica o los efectos biológicos de la sustancia problema, el nivel de dosis más elevado se escogerá a fin de identificar los principales órganos diana y efectos tóxicos pero evitando una toxicidad intensa, el sufrimiento, la morbilidad o la muerte de los animales. Normalmente, el nivel de dosis superior se seleccionará de modo que induzca signos de toxicidad, como una merma en la ganancia de peso corporal (de aproximadamente el 10 %). Ahora bien, dependiendo de los objetivos del estudio (véase el punto 6), se puede establecer un techo de dosis inferior al nivel que provoque signos de toxicidad, por ejemplo si una dosis induce un efecto adverso de interés que, sin embargo, tiene escasa repercusión en el período de vida o el peso corporal. | 25. | Los niveles de dosis y la frecuencia de administración serán tales que permitan establecer una relación dosis-respuesta y, dependiendo del modo de acción de la sustancia problema, un valor de NOAEL o cualesquiera otras determinaciones previstas, como el valor de BMD o dosis de referencia más baja (véase el punto 27). Para establecer las dosis inferiores se tendrán en cuenta factores como la pendiente esperada de la curva dosis-respuesta, así como los niveles a los que cabe esperar cambios importantes en el metabolismo o en el mecanismo de la acción tóxica, cuando se prevea un umbral, o que constituyan un punto de partida para extrapolar la dosis más baja. Cuando se lleva a cabo un estudio combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis, la finalidad principal es obtener información que permita evaluar el riesgo de carcinogénesis y, normalmente, la información sobre la toxicidad crónica es secundaria. Habrá que tener esto en cuenta al seleccionar los niveles de dosis y los intervalos de administración. | 26. | La frecuencia de administración de las dosis dependerá de los objetivos del estudio y de las características de la sustancia problema y no corresponde especificarla en este método de ensayo; los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer los niveles descendentes y frecuentemente es preferible añadir un cuarto lote de ensayo antes que utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo con un factor superior a 6-10) entre dosis. En general se evitará aplicar factores superiores a 10, que en todo caso deberán justificarse. | 27. | Tal como se recoge en el documento de orientación no 116 (7), para la selección de las dosis se tendrán en cuenta los siguientes factores: | — | los intervalos supuestos o conocidos de no linealidad o puntos de inflexión en la ecuación dosis-respuesta, | — | la toxicocinética y los intervalos posológicos en los que pueda haber o no inducción metabólica, saturación o no linealidad entre las dosis externas e internas, | — | las lesiones precursoras, los marcadores de efecto o los indicadores de la intervención de los principales mecanismos biológicos subyacentes, | — | aspectos importantes (hipotéticos o comprobados) del modo de acción, como la dosis a partir de la cual se manifiesta toxicidad, los niveles hormonales que resultan afectados, los mecanismos homeostáticos que se alteran, etc., | — | aquellas regiones de la curva dosis-respuesta en las que se precisa hacer una estimación especialmente robusta, como el intervalo de la dosis de referencia prevista o el umbral hipotético, | — | los niveles de exposición humana que cabe prever, especialmente cuando se seleccionan las dosis intermedias y bajas. | 28. | Se emplea un lote de control en paralelo, que no recibe la sustancia problema, pero sí el vehículo de la misma en caso de que se utilice. A excepción de la administración de la sustancia problema, los animales del lote de control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de tratamiento. En su caso, el lote de control ha de recibir el mayor volumen de vehículo que se haya utilizado. Si la sustancia problema se administra con los alimentos y provoca una disminución importante de la ingesta debido a que empeoran las características organolépticas de la dieta, puede ser útil utilizar un lote de control alimentado en paralelo para conseguir una comparación más rigurosa. | Preparación de las dosis y administración de la sustancia problema | 29. | La sustancia problema se administra habitualmente por vía oral, mediante sonda o con el alimento o el agua de bebida. Se ofrece más información sobre las vías y los métodos de administración en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7). La vía y el método de administración dependerán de la finalidad del estudio, las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, su biodisponibilidad y la vía y el modo de exposición predominantes en los seres humanos. Se justificará debidamente la vía y el método de administración elegidos. Por razones de bienestar animal, la alimentación oral por sonda se elegirá solo cuando exista una posibilidad razonable de que la exposición humana a la sustancia se vaya a producir por la misma vía y el mismo medio de administración (como es el caso de los productos farmacéuticos). Cuando se trata de sustancias alimentarias o ambientales, entre ellas los plaguicidas, la administración se efectúa habitualmente con los alimentos o el agua de bebida. Sin embargo, en otros escenarios de estudio como la exposición ocupacional, puede ser más conveniente la administración por otras vías. | 30. | En caso necesario, la sustancia problema se disuelve o suspende en un vehículo adecuado. Debe prestarse atención a las siguientes características del vehículo u otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribución, metabolismo o retención de la sustancia problema, efectos sobre las propiedades químicas de dicha sustancia que puedan modificar su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y agua o el estado nutricional de los animales. Se recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus características tóxicas. Se recabará información acerca de la estabilidad de la sustancia problema y su homogeneidad de concentración en las disoluciones o en las dietas (en su caso) que se emplean para la administración. | 31. | Si la sustancia se administra con los alimentos o el agua de bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia problema administradas no interfieren con la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. En los estudios de toxicidad a largo plazo en los que la sustancia problema se administra con los alimentos, su concentración no debe superar generalmente el límite del 5 % de la ingesta total para evitar desequilibrios nutricionales. Cuando la sustancia problema se administre con los alimentos, puede utilizarse una concentración constante en la dieta (mg/kg de alimento o ppm) o bien una dosis constante en relación con el peso corporal de los animales (mg/kg peso corporal), calculada con periodicidad semanal. Deberá indicarse qué alternativa se ha seguido. | 32. | En el caso de la administración oral, las dosis de la sustancia problema se administran diariamente a los animales (7 días por semana) durante un período de 12 meses (fase de toxicidad crónica) o de 24 meses (fase de carcinogénesis); véanse también los puntos 33 y 34. Cualquier otra pauta posológica, por ejemplo, de 5 días por semana, debe justificarse. En el caso de la administración cutánea, los animales se tratan con la sustancia problema como mínimo 6 horas al día con una pauta de 7 días por semana, según se especifica en el capítulo B.9 del presente anexo (11), durante un período de 12 meses (fase de toxicidad crónica) o de 24 meses (fase de carcinogénesis). La exposición por vía inhalatoria se efectúa durante 6 horas al día con una pauta de 7 días por semana pero, si se justifica, es admisible una pauta de 5 días por semana. El período de exposición es habitualmente de 12 meses (fase de toxicidad crónica) o de 24 meses (fase de carcinogénesis). Cuando se exponen con la técnica de solo por la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justificará debidamente cualquier período de exposición inferior a 6 horas diarias. Véase también el capítulo B.8 del presente anexo (9). | 33. | Si la sustancia problema se administra por sonda, debe hacerse con una sonda gástrica o una cánula de intubación adecuada y todos los días a la misma hora. La dosis única se administra normalmente una vez al día; pero si la sustancia es un irritante local, cabe la posibilidad de mantener la dosis total diaria repartiendo la administración en dosis divididas (dos veces al día). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. El volumen se mantendrá en el mínimo posible, y en los roedores no debe exceder generalmente de 1 ml/100 g peso corporal (31). La variabilidad en el volumen utilizado debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para garantizar un volumen constante en todas las dosis. Constituyen una excepción las sustancias potencialmente corrosivas o irritantes, que deben diluirse para evitar efectos locales graves. Se evitará la administración de concentraciones que puedan ser corrosivas o irritantes del tubo digestivo. | Duración del estudio | 34. | Si bien el período de administración y la duración de la fase crónica de este estudio es normalmente de 12 meses, su diseño permite aplicarlo a ensayos de duración menor (6 o 9 meses) o mayor (18 o 24 meses), en función de los requisitos normativos particulares o de los mecanismos específicos que se pretenda investigar. Toda desviación de este período de exposición de 12 meses deberá justificarse, particularmente si es en el sentido de acortarlo. Los animales de todos los grupos de dosis asignados a esta fase serán sacrificados en el momento previsto para la evaluación de la toxicidad crónica y las alteraciones anatomopatológicas no neoplásicas. Concluida la exposición, los lotes satélite incluidos para comprobar la reversibilidad de las eventuales alteraciones tóxicas inducidas por la sustancia problema deben mantenerse sin administración durante un período no inferior a 4 semanas ni superior a un tercio de la duración total del estudio. | 35. | La duración de la fase de carcinogénesis de este estudio suele ser de 24 meses en el caso de los roedores, lo que constituye la mayor parte del período de existencia de los animales investigados. Siempre que se justifique, se podrán aplicar períodos mayores o menores en función del ciclo de vida de la especie y la cepa investigadas. En el caso de determinadas cepas de ratones, como AKR/J, C3H/J o C57BL/6J, puede estar más justificada una duración de 18 meses. Seguidamente se facilitan algunas indicaciones acerca de la duración, la terminación del estudio y la supervivencia; otras consideraciones, entre ellas la aceptabilidad de un resultado de carcinogénesis negativa en función de la supervivencia observada en el estudio, se pueden consultar en el documento de orientación no 116 de la OCDE (7). | — | Se planteará la terminación del estudio cuando el número de supervivientes en los grupos de dosis más baja o de control sea menor del 25 por ciento. | — | Si las muertes prematuras por toxicidad se producen solo en el grupo de dosis más elevada, ello no debe motivar la terminación del estudio. | — | Se contabilizará por separado la supervivencia de cada sexo. | — | El estudio no debe prolongarse más allá del instante en que los datos derivados del mismo se muestren insuficientes para permitir una evaluación estadísticamente significativa. | OBSERVACIONES (FASE DE TOXICIDAD CRÓNICA) | 36. | Se observará la morbilidad o la mortalidad en todos los animales, generalmente a primera y última hora del día, incluidos los fines de semana y festivos. Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora y teniendo en cuenta el período más agudo de los efectos previstos tras la administración cuando esta se haga por sonda. | 37. | Se someterán todos los animales a observación clínica exhaustiva como mínimo antes de la primera exposición (para permitir realizar comparaciones con un mismo sujeto), al concluir la primera semana de estudio y, en lo sucesivo, con periodicidad mensual. El protocolo de tales observaciones se organizará con el fin de minimizar las variaciones entre los observadores individuales y entre los distintos lotes experimentales. Dichas observaciones han de efectuarse fuera de la jaula de alojamiento, de preferencia en un ambiente normal y siempre a la misma hora. Las observaciones se registran cuidadosamente, preferentemente mediante sistemas de puntuación definidos de forma explícita por el laboratorio de ensayo. Debe procurarse que las variaciones en las condiciones de observación sean mínimas. Los signos anotados deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios de la piel, pelo, ojos, membranas mucosas, presencia de secreciones y excreciones y actividad neurovegetativa (lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila y respiración anómala). Deben registrarse también los cambios en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, o estereotipados (por ejemplo, realización excesiva de movimientos de limpieza o recorridos circulares repetitivos) o comportamientos anómalos (automutilación, marcha hacia atrás, etc.) (32). | 38. | Debe realizarse una exploración oftalmológica con un oftalmoscopio o equipo similar adecuado a todos los animales antes de administrar la sustancia problema. Al concluir el estudio, el mismo examen se practicará preferiblemente a todos los animales y, obligatoriamente, a los lotes de control y de dosis más elevada. Si se observan en esos animales cambios oculares relacionados con el tratamiento, deben examinarse todos los demás. Si el análisis estructural o cualquier otra información indica toxicidad oftálmica, se aumentará la frecuencia de las exploraciones oftalmológicas. | 39. | Cuando se trate de sustancias para las que estudios previos de toxicidad por administración continuada durante 28 días o 90 días hayan demostrado efectos neurotóxicos, las pruebas de reactividad sensorial a estímulos de diferentes tipos (32) [por ejemplo, auditivos, visuales y propioceptivos (33) (34) (35)], así como la evaluación de la fuerza prensil (36) y de la actividad motriz (37), podrán hacerse facultativamente antes de iniciar el estudio, a intervalos de 3 meses durante el mismo hasta un máximo de 12 meses inclusive, y a la conclusión del estudio (si dura más de 12 meses). La bibliografía respectiva recoge más información sobre los métodos que pueden seguirse, si bien es posible emplear procedimientos distintos de los ahí descritos. | 40. | Cuando los estudios previos de toxicidad por administración continuada durante 28 días o 90 días indiquen que la sustancia tiene capacidad inmunotóxica, al concluir el estudio se podrán proseguir las investigaciones de este parámetro. | Peso corporal, consumo de alimentos y agua y eficiencia alimentaria | 41. | Deben pesarse todos los animales al comenzar el tratamiento, como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Se medirán el consumo de alimento y la eficiencia alimentaria como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Si la sustancia problema se administra con el agua de bebida, se medirá la ingesta de agua como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. La determinación de la ingesta de agua se contemplará asimismo en aquellos estudios en los que esté alterada la actividad de beber. | Hematología y bioquímica clínica | 42. | En las investigaciones realizadas con roedores, se practicarán exámenes hematológicos en todos los animales de ensayo (10 machos y 10 hembras por cada grupo) a los 3, 6 y 12 meses y al concluir el estudio (si dura más de 12 meses). En los ensayos con ratones puede hacer falta un suplemento de animales satélite para llevar a cabo todas las valoraciones hematológicas necesarias (véase el punto 19). Cuando se trate de especies no roedoras, se tomarán muestras más pequeñas de animales (por ejemplo, 4 animales por sexo y grupo en el caso de los perros) para las valoraciones realizadas durante el ensayo y a su conclusión. Se trate de especies roedoras o no, las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los parámetros hematológicos en los estudios previos efectuados durante 90 días con dosis afines. Las muestras de sangre se extraerán de una zona que deberá indicarse, por ejemplo por punción cardiaca o del seno retro-orbital, bajo anestesia. | 43. | Se investigarán los siguientes parámetros (38): recuento de leucocitos y fórmula leucocitaria, recuento de eritrocitos y de plaquetas, concentración de hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada. Pueden determinarse además otros parámetros hematológicos como los cuerpos de Heinz, la morfología de otros eritrocitos atípicos o los valores de metahemoglobina, en función de la toxicidad de la sustancia problema. El planteamiento general ha de ser flexible, y adaptado a los efectos observados o esperados de la sustancia problema. Si esta ejerce efectos sobre el sistema hematopoyético, pueden estar indicados recuentos de reticulocitos y una citología de la médula ósea, que no son valoraciones habituales. | 44. | En los intervalos de tiempo especificados para determinar las variables hematológicas, se realizarán valoraciones de bioquímica clínica para investigar los principales efectos tóxicos sobre los tejidos y, específicamente, sobre los riñones y el hígado en las muestras de sangre obtenidas de todos los animales de ensayo (10 machos y 10 hembras por cada grupo). En el caso de los ratones, pueden hacer falta animales satélite para efectuar todas las valoraciones necesarias de bioquímica clínica. Cuando se trate de especies no roedoras, se tomarán muestras de menos animales (por ejemplo, 4 animales por sexo y grupo en el caso de los perros) para las valoraciones realizadas durante el ensayo y a su conclusión. Se trate de especies roedoras o no, las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los parámetros de bioquímica clínica en los estudios previos efectuados durante 90 días con dosis afines. Se recomienda que los animales (a excepción de los ratones) estén en ayunas desde el día anterior a la toma de muestras (3). Se investigarán los siguientes parámetros (38): glucosa, urea (nitrógeno ureico), creatinina, proteínas totales, albúmina, calcio, sodio, potasio, colesterol total, al menos dos pruebas completas de la función hepatocelular (alanina-aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa, glutamato-deshidrogenasa, ácidos biliares totales) (39) y al menos dos pruebas completas de la función hepatobiliar (fosfatasa alcalina, gamma-glutamiltransferasa, 5’-nucleotidasa, bilirrubina total, ácidos biliares totales) (39). Cuando proceda y a tenor de la toxicidad de la sustancia problema, pueden hacerse otras valoraciones de bioquímica clínica como las de triglicéridos en ayunas, hormonas específicas y colinesterasa. Por lo general, debe aplicarse un enfoque flexible, en función de los efectos observados o esperados con una sustancia determinada. | 45. | Se practicarán análisis de orina en todos los animales de ensayo (10 machos y 10 hembras por cada grupo), sobre muestras recogidas respetando los mismos intervalos que en los análisis de hematología y bioquímica clínica. Las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los análisis de orina en un estudio previo efectuado durante 90 días con dosis afines. Las recomendaciones hechas por expertos acerca de los estudios de patología clínica incluyen los siguientes parámetros (38): aspecto, volumen, osmolalidad o densidad, pH, proteínas totales y glucosa. Otras valoraciones son cuerpos cetónicos, urobilinógeno, bilirrubina y sangre oculta. Si es necesario, pueden analizarse otros parámetros adicionales para profundizar el estudio de los efectos observados. | 46. | De manera general, se acepta que es necesario disponer de valores basales de hematología y bioquímica clínica antes de someter a estudio a los perros, pero no en el caso de las especies roedoras (38). Ahora bien, si los datos basales históricos (véase el punto 58) son insuficientes, se considerará la oportunidad de generar estos datos. | ANATOMÍA PATOLÓGICA | Autopsia macroscópica | 47. | Como norma debe practicarse una autopsia macroscópica completa y detallada a todos los animales empleados en el estudio, que incluya un examen detenido de la superficie corporal externa, todos los orificios y las cavidades craneana, torácica y abdominal con su contenido. Sin embargo, se puede prever además la realización solo (en lotes satélite o animales sacrificados durante el ensayo) de valoraciones clave específicas, por ejemplo de neurotoxicidad o inmunotoxicidad (véase el punto 21). Estos animales no tienen que someterse a autopsia ni a las consiguientes exploraciones que se describen a continuación. La autopsia de los animales centinela se decidirá según cada caso, a criterio del director del estudio. | 48. | Se registrará el peso de los órganos de todos los animales, salvo los que quedan excluidos en la última parte del punto 47. Las cápsulas suprarrenales, encéfalo, epidídimo, corazón, riñones, hígado, ovarios, bazo, testículos, tiroides (que se pesará después de la fijación, con las paratiroides) y útero de todos los animales (aparte de los moribundos y/o sacrificados a lo largo del ensayo) han de limpiarse de los tejidos adherentes, según convenga, y se determinará el peso húmedo lo antes posible tras la disección para evitar su desecación. | 49. | Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el medio de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse (40) (opcional en el caso de los tejidos entre corchetes): | Todas las lesiones macroscópicas | Corazón | Páncreas | Estómago (rumen, estómago glandular) | Glándulas suprarrenales | Íleo | Glándulas paratiroides | [Dientes] | Aorta | Yeyuno | Nervios periféricos | Testículos | Encéfalo (incluidos cortes de cerebro, cerebelo y protuberancia) | Riñón | hipófisis | Timo | Intestino ciego | Glándulas lacrimales (extraorbitarias) | Próstata | Tiroides | Cuello del útero | Hígado | Recto | [Lengua] | Glándulas coagulantes | Pulmón | Glándulas salivales | Tráquea | Colon | Ganglios linfáticos (superficiales y profundos) | Vesículas seminales | Vejiga urinaria | Duodeno | Glándulas mamarias (obligatoriamente las femeninas y, sin son visiblemente diseccionables, también las masculinas) | Músculo esquelético | Útero (y cuello) | Epidídimo | [Vías respiratorias altas, incluidos nariz, cornetes y senos paranasales] | Piel | [Uréteres] | Ojos (y retina) | Esófago | Médula espinal (tres secciones: cervical, medio dorsal y lumbar) | [Uretra] | [Fémur y articulación tibiofemoral] | [Bulbo olfatorio] | Bazo | Vagina | Vesícula biliar (en especies distintas de la rata) | Ovarios | [Esternón] | Sección de médula ósea y/o aspirado reciente de médula | Glándula de Harder | | | | En el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se conservarán ambos órganos. Las observaciones clínicas y de otro tipo pueden indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propiedades conocidas de la sustancia problema. En los estudios que entrañen la vía de administración cutánea, se examinarán los mismos órganos que en el caso de la administración oral, pero además es fundamental establecer un protocolo específico para la obtención y conservación de muestras de piel de la zona de aplicación. En los estudios de inhalación, los tejidos de las vías respiratorias se conservarán y examinarán siguiendo las recomendaciones de los capítulos B.8 (9) y B.29 (10) del presente anexo. Los restantes órganos y tejidos (además de los tejidos de las vías respiratorias específicamente conservados), se examinarán igual que se ha establecido en el caso de la administración oral. | Examen histopatológico | 50. | Se puede consultar el documento de orientación sobre buenas prácticas en la realización de los estudios de toxicopatología (40). Como mínimo, el examen histopatológico debe hacerse sobre: | — | todos los tejidos de los animales de control y del grupo con dosis máxima, | — | todos los tejidos de los animales muertos o sacrificados durante el estudio, | — | todos los tejidos que presenten alteraciones macroscópicas, | — | los tejidos diana (o los tejidos que presenten alteraciones relacionadas con el tratamiento en el grupo de dosis máxima) de todos los animales pertenecientes a los restantes grupos de dosis, | — | en el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se examinarán ambos órganos. | OBSERVACIONES (FASE DE CARCINOGÉNESIS) | 51. | Se observará la morbilidad o la mortalidad en todos los animales, generalmente a primera y última hora del día, incluidos los fines de semana y festivos. Debe hacerse además una observación diaria de los eventuales signos específicos de importancia toxicológica. En los ensayos en que se emplee sonda, los animales se examinarán en el período inmediatamente posterior a la administración. Se prestará especial atención al desarrollo de tumores; se registrarán el momento de aparición y localización, dimensiones, aspecto y progresión de todo tumor visible macroscópica o palpablemente. | 52. | Deben pesarse todos los animales al comenzar el tratamiento, como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Se medirán el consumo de alimento y la eficiencia alimentaria como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Si la sustancia problema se administra con el agua de bebida, se medirá la ingesta de agua como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. La determinación de la ingesta de agua se contemplará así mismo en aquellos estudios en los que esté alterada la actividad de beber. | Hematología, bioquímica clínica y otras valoraciones | 53. | Con el fin de maximizar la información derivada de la investigación, especialmente en lo que se refiere al modo de acción, a criterio del director del estudio se podrán tomar muestras de sangre para análisis hematológicos y de bioquímica clínica. También pueden estar indicados los análisis de orina. Los datos de los animales empleados en la fase de toxicidad crónica del estudio, normalmente de 12 meses de duración (punto 34), proporcionarán información sobre dichos parámetros. En el documento de orientación no 116 (7) se comenta el interés de obtener este tipo de muestras en el marco de un ensayo de carcinogénesis. Si se toman muestras de sangre será al final del período de ensayo, justo antes del sacrificio de los animales o como parte del método de sacrificio. Las muestras de sangre se extraerán de una zona que deberá indicarse, por ejemplo por punción cardiaca o del seno retro-orbital, bajo anestesia. También se pueden preparar frotis de sangre, especialmente si se sospecha que la médula ósea es el órgano diana, aunque se ha cuestionado el valor de obtener estas muestras en la fase de carcinogénesis para la evaluación del potencial cancerígeno u oncógeno (38). | ANATOMÍA PATOLÓGICA | Autopsia macroscópica | 54. | Todos los animales del estudio excepto los centinela y otros animales satélite (véase el punto 20) se someterán a una autopsia completa que comprenda la inspección de la superficie externa del cuerpo, todos sus orificios y las cavidades craneal, torácica y abdominal y sus contenidos. La autopsia de los animales centinela y de otros animales satélite se decidirá según cada caso, a criterio del director del estudio. El pesaje de los órganos no suele formar parte de un estudio de carcinogénesis, dado que los cambios geriátricos y, en fases más avanzadas, el desarrollo de tumores introducen confusión en la interpretación de los datos sobre el peso de los órganos. No obstante, estos datos pueden ser cruciales para sopesar las pruebas y, especialmente, las consideraciones sobre el modo de acción. Si forman parte de un estudio satélite, se recogerán a lo más tardar un año después de iniciar el estudio. | 55. | Los tejidos que se mencionan a continuación deben conservarse en el medio de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse (40) (opcional en el caso de los tejidos entre corchetes): | Todas las lesiones macroscópicas | Corazón | Páncreas | Estómago (rumen, estómago glandular) | Cápsulas suprarrenales | Íleo | Glándulas paratiroides | [Dientes] | Aorta | Yeyuno | Nervios periféricos | Testículos | Encéfalo (incluidos cortes de cerebro, cerebelo, bulbo y protuberancia) | Riñón | Hipófisis | Timo | Intestino ciego | Glándulas lacrimales (extraorbitales) | Próstata | Tiroides | Cuello del útero | Hígado | Recto | [Lengua] | Glándulas coagulantes | Pulmón | Glándulas salivales | Tráquea | Colon | Ganglios linfáticos (superficiales y profundos) | Vesículas seminales | Vejiga urinaria | Duodeno | Glándulas mamarias (obligatoriamente las femeninas y, sin son visiblemente diseccionables, también las masculinas) | Músculo esquelético | Útero (y cuello) | Epidídimo | [Vías respiratorias altas, incluidos nariz, cornetes y senos paranasales] | Piel | [Uréteres] | Ojos (y retina) | Esófago | Médula espinal (tres secciones: cervical, medio-dorsal y lumbar) | [Uretra] | [Fémur y articulación tibiofemoral] | [Bulbo olfativo] | Bazo | Vagina | Vesícula biliar (en especies distintas de la rata) | Ovarios | [Esternón] | Sección de médula ósea y/o aspirado reciente de médula | Glándula de Harder | | | | En el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se conservarán ambos órganos. Las observaciones clínicas y de otro tipo pueden indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propiedades conocidas de la sustancia problema. En los estudios que entrañen la vía de administración cutánea, se examinarán los mismos órganos que en el caso de la administración oral, pero además es fundamental establecer un protocolo específico para la obtención y conservación de muestras de piel de la zona de aplicación. En los estudios de inhalación, los tejidos de las vías respiratorias se conservarán y examinarán siguiendo las recomendaciones de los capítulos B.8 (8) y B.29 (9) del presente anexo. Los restantes órganos y tejidos (además de los tejidos de las vías respiratorias específicamente conservados), se examinarán igual que se ha establecido en el caso de la administración oral. | Examen histopatológico | 56. | Se puede consultar el documento de orientación sobre buenas prácticas en la realización de los estudios de toxicopatología (40). Como mínimo se examinarán los siguientes tejidos: | — | todos los tejidos de los animales de control y del grupo con dosis máxima, | — | todos los tejidos de los animales muertos o sacrificados durante el estudio, | — | todos los tejidos que presenten alteraciones macroscópicas, incluidos tumores, | — | cuando se observen alteraciones histopatológicas relacionadas con el tratamiento en el grupo de dosis más elevada, los mismos tejidos afectados se examinarán en todos los animales de los restantes grupos de dosis, | — | en el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se examinarán ambos órganos. | DATOS E INFORME (TOXICIDAD CRÓNICA Y CARCINOGÉNESIS) | Datos | 57. | Se documentarán los datos de todos los parámetros evaluados en cada animal. Además, deben resumirse todos los datos en un cuadro que recoja, por cada lote de ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el porcentaje de animales afectado por cada tipo de lesión. Los cuadros de datos agrupados reflejarán las medias y desviaciones típicas (en el caso de variables continuas) de los animales que presenten lesiones o efectos tóxicos, además de una escala de clasificación de las lesiones. | 58. | Los datos sobre controles históricos pueden resultar de ayuda en la interpretación de los resultados del estudio, por ejemplo cuando haya indicios de que los resultados arrojados por los controles simultáneos se desvían esencialmente de los datos recientes obtenidos en animales de control del mismo animalario o colonia. De ser evaluados, los datos sobre controles históricos deben proceder del mismo laboratorio, y corresponder a animales de edades y cepas afines que hayan sido analizados en los cincos años precedentes al estudio en cuestión. | 59. | Siempre que sea posible, deben evaluarse los resultados numéricos mediante un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. La elección de los métodos estadísticos y de los datos que vayan a analizarse debe efectuarse en la fase de diseño del estudio (punto 9). Para ello se tendrán en cuenta los ajustes de la supervivencia, en su caso. | 60. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas. | — | Datos de identificación. | — | Procedencia de la sustancia. | — | Número de lote. | — | Certificado de análisis químico. | | Vehículo (si procede): | — | Justificación de la elección del vehículo (si es distinto del agua). | | Animales de ensayo: | — | Especie y cepa utilizada y motivos para elegirla. | — | Número, edad y sexo de los animales al inicio del ensayo. | — | Origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc. | — | Peso de cada animal al inicio del ensayo. | | Condiciones del ensayo: | — | Fundamento de la elección de la vía de administración y la dosis. | — | Cuando proceda, métodos estadísticos aplicados al análisis de los datos. | — | Pormenores de la formulación de la sustancia o de su preparación con la comida. | — | Datos analíticos acerca de la concentración obtenida, la estabilidad y la homogeneidad de la preparación. | — | Vía y método de administración de la sustancia problema. | — | En los estudios de inhalación se indicará si es de solo por la nariz o de cuerpo entero. | — | Dosis reales (mg/kg peso corporal/día) y factor de conversión de la concentración (mg/kg o ppm) de la sustancia problema en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales, en su caso. | — | Datos de la calidad de los alimentos y el agua. | | Resultados (se presentarán cuadros de datos agrupados así como los datos de cada animal). | | Generalidades: | — | Datos de supervivencia. | — | Peso corporal y variaciones del mismo. | — | Ingesta de alimento, cálculos de la eficiencia alimentaria, si se han hecho, e ingesta de agua cuando proceda. | — | Datos toxicocinéticos, si los hay. | — | Oftalmoscopia (en su caso). | — | Hematología (en su caso). | — | Bioquímica clínica (en su caso). | | Observaciones clínicas: | — | Signos de toxicidad. | — | Incidencia (y, si se ha valorado, gravedad) de cualquier anomalía. | — | Naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas (sean reversibles o no). | | Resultados de la autopsia: | — | Peso corporal en el momento de la muerte. | — | Pesaje de los órganos (y pesos relativos, cuando proceda). | — | Observaciones de la autopsia; incidencia y gravedad de las anomalías. | | Examen histopatológico: | — | Observaciones histopatológicas de carácter no neoplásico. | — | Observaciones histopatológicas neoplásicas. | — | Correlación entre las observaciones macro y microscópicas. | — | Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas relacionadas con el tratamiento, con una escala de clasificación de su gravedad. | — | Informes sobre las eventuales evaluaciones de las preparaciones efectuadas por otros científicos. | | Tratamiento estadístico de los resultados, según proceda. | | Discusión de los resultados: | — | Discusión de cualquier hipótesis o modelo teórico. | — | Relación dosis-respuesta. | — | Datos sobre controles históricos. | — | Otras informaciones sobre el modo de acción. | — | Valores de BMD, NOAEL o LOAEL. | — | Relevancia para los seres humanos. | | Conclusiones | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | OECD (1995). 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Toxicidad oral por administración continuada (90 días) en no roedores. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453-Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Capítulo B.8 del presente anexo. Toxicidad subaguda por inhalación: estudio de 28 días. | (10) | Capítulo B.29 del presente anexo. Toxicidad subcrónica por inhalación: estudio de 90 días. | (11) | Capítulo B.9 del presente anexo. Toxicidad por administración continuada (28 días) por vía cutánea. | (12) | Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). 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Exp. 40: 999-1003. | (34) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. | (35) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (36) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. | (37) | Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. | (38) | Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (39) | EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). | (40) | Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Apéndice 1 | DEFINICIÓN | Sustancia problema: cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este método de ensayo. | » |
| (7) | Chapter B.36 is replaced by the following: | ‘B.36. TOXICOKINETICS | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD TG 417 (2010). Studies examining the toxicokinetics (TK) of a test chemical are conducted to obtain adequate information on its absorption, distribution, biotransformation (i.e. metabolism) and excretion, to aid in relating concentration or dose to the observed toxicity, and to aid in understanding its mechanism of toxicity. TK may help to understand the toxicology studies by demonstrating that the test animals are systemically exposed to the test chemical and by revealing which are the circulating moieties (parent chemical/metabolites). Basic TK parameters determined from these studies will also provide information on the potential for accumulation of the test chemical in tissues and/or organs and the potential for induction of biotransformation as a result of exposure to the test chemical. | 2. | TK data can contribute to the assessment of the adequacy and relevance of animal toxicity data for extrapolation to human hazard and/or risk assessment. Additionally, toxicokinetic studies may provide useful information for determining dose levels for toxicity studies (linear vs. non-linear kinetics), route of administration effects, bioavailability, and issues related to study design. Certain types of TK data can be used in physiologically based toxicokinetic (PBTK) model development. | 3. | There are important uses for metabolite/TK data such as suggesting possible toxicities and modes of action and their relation to dose level and route of exposure. In addition, metabolism data can provide information useful for assessing the toxicological significance of exposures to exogenously produced metabolites of the test chemical. | 4. | Adequate toxicokinetic data will be helpful to support the further acceptability and applicability of quantitative structure-activity relationships, read-across or grouping approaches in the safety evaluation of chemicals. Kinetics data may also be used to evaluate the toxicological relevance of other studies (e.g. in vivo/in vitro). | 5. | Unless another route of administration is mentioned (see in particular paragraphs 74-78), this Test Method is applicable to oral administration of the test chemical. | INITIAL CONSIDERATIONS | 6. | Regulatory systems have different requirements and needs regarding the measurement of endpoints and parameters related to toxicokinetics for different classes of chemicals (e.g. pesticides, biocides, industrial chemicals). Unlike most Test Methods this Test Method describes toxicokinetics testing, which involves multiple measurements and endpoints. In the future, several new Test Methods, and/or guidance document(s), may be developed to describe each endpoint separately and in more detail. In the case of this Test Method, which tests or assessments are conducted is specified by the requirements and/or needs of each regulatory system. | 7. | There are numerous studies that might be performed to evaluate the TK behaviour of a test chemical for regulatory purposes. However, depending on particular regulatory needs or situations, not all of these possible studies may be necessary for the evaluation of a test chemical. Flexibility, taking into consideration the characteristics of the test chemical being investigated, is needed in the design of toxicokinetic studies. In some cases, only a certain set of questions may need to be explored in order to address test chemical-associated hazard and risk concerns. In some situations, TK data can be collected as part of the evaluation in other toxicology studies. For other situations, additional and/or more extensive TK studies may be necessary, depending on regulatory needs and/or if new questions arise as part of test chemical evaluation. | 8. | All available information on the test chemical and relevant metabolites and analogues should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study in order to enhance study quality and avoid unnecessary animal use. This could include data from other relevant Test Methods (in vivo studies, in vitro studies, and/or in silico evaluations). Physicochemical properties, such as octanol-water partition coefficient (expressed as log POW), pKa, water solubility, vapour pressure, and molecular weight of a chemical may be useful for study planning and interpretation of results. They can be determined using appropriate methods as described in the relevant Test Methods. | LIMITATIONS | 9. | This Test Method is not designed to address special circumstances, such as the pregnant or lactating animal and offspring, or to evaluate potential residues in exposed food-producing animals. However, the data obtained from a B.36 study can provide background information to guide the design of specific studies for these investigations. This Test Method is not intended for the testing of nanomaterials. A report on preliminary review of OECD Test Guidelines for their applicability to nanomaterials indicates that TG 417 (equivalent to this Test Method B.36) may not apply to nanomaterials (1). | DEFINITIONS | 10. | Definitions used for the purpose of this Test Method are provided in Appendix. | ANIMAL WELFARE CONSIDERATIONS | 11. | Guidance on humane treatment of animals is available in OECD Guidance Document (GD) 19 (2). It is recommended that OECD GD 19 be consulted for all in vivo and in vitro studies described in this Test Method. | DESCRIPTION OF THE METHODS | Pilot Studies | 12. | The use of pilot studies is recommended and encouraged for the selection of experimental parameters for the toxicokinetics studies (e.g. metabolism, mass balance, analytical procedures, dose-finding, exhalation of CO2, etc.). Characterisation of some of these parameters may not necessitate the use of radiolabelled chemicals. | Animal Selection | Species | 13. | The animal species (and strain) used for TK testing should preferably be the same as that used in other toxicological studies performed with the test chemical of interest. Normally, the rat should be used as it has been used extensively for toxicological studies. The use of other or additional species may be warranted if critical toxicology studies demonstrate evidence of significant toxicity in these species or if their toxicity/toxicokinetics is shown to be more relevant to humans. Justification should be provided for the selection of the animal species and its strain. | 14. | Unless mentioned otherwise, this Test Method refers to the rat as the test species. Certain aspects of the method might have to be modified for the use of other test species. | Age and Strain | 15. | Young healthy adult animals (normally 6-12 weeks at the time of dosing) should be used (see also paragraphs 13 and 14). Justification should be provided for the use of animals that are not young adults. All animals should be of similar age at the outset of the study. The weight variation of individual animals should not exceed ± 20 % of the mean weight of the test group. Ideally, the strain used should be the same as that used in deriving the toxicological database for the test chemical. | Number and Sex of Animals | 16. | A minimum of four animals of one sex should be used for each dose tested. Justification should be provided for the sex of the animals used. The use of both sexes (four males and four females) should be considered if there is evidence to support significant sex-related differences in toxicity. | Housing and feeding conditions | 17. | Animals should generally be housed individually during the testing period. Group housing might be justified in special circumstances. Lighting should be artificial, the sequence being 12 h light/12 h dark. The temperature of the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C) and the relative humidity 30-70 %. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. | Test Chemical | 18. | A radiolabelled test chemical using 14C should be used for all mass balance and metabolite identification aspects of the study; however, if it can be demonstrated that: | — | mass balance and metabolite identification can be adequately evaluated using the unlabelled test chemical, | — | the analytical specificity and sensitivity of the method used with non-radioactive test chemical is equal to or greater than that which could be obtained with the radiolabelled test chemical, | then a radiolabelled test chemical does not need to be used. Furthermore, other radioactive and stable isotopes may be used, particularly if the element is responsible for or is a part of the toxic portion of the test chemical. If possible, the radiolabel should be located in a core portion of the molecule which is metabolically stable (it is not exchangeable, is not removed metabolically as CO2, and does not become part of the one-carbon pool of the organism). Labelling of multiple sites or specific regions of the molecule may be necessary to follow the metabolic fate of the test chemical. | 19. | The radiolabelled and non-radiolabelled test chemicals should be analysed using appropriate methods to establish purity and identity. The radio-purity of the radioactive test chemical should be the highest attainable for a particular test chemical (ideally it should be greater than 95 %) and reasonable effort should be made to identify impurities present at or above 2 %. The purity, along with the identity and proportion of any impurities which have been identified, should be reported. Individual regulatory programmes may choose to provide additional guidance to assist in the definition and specifications of test chemicals composed of mixtures and methods for determination of purity. | Dose Selection | Pilot Study | 20. | Usually a single oral dose is sufficient for the pilot study. The dose should be non-toxic, but high enough to allow for metabolite identification in excreta (and plasma, if appropriate) as well as to meet the stated purpose of the pilot study as noted in paragraph 12 of this Test Method. | Main Studies | 21. | For the main studies, a minimum of two doses is preferred since information gathered from at least two dose groups may aid in dose setting in other toxicity studies, and help in the dose-response assessment of already available toxicity tests. | 22. | Where two doses are administered, both doses should be high enough to allow for metabolite identification in excreta (and plasma, if appropriate). Information from available toxicity data should be considered for dose selection. If information is not available (e.g. from acute oral toxicity studies recording clinical signs of toxicity, or from repeated dose toxicity studies) a value for the higher dose that is below the LD50 (oral and dermal routes) or LC50 (inhalation route) estimate or below the lower value of the acute toxicity range estimate may be considered. The lower dose should be some fraction of the higher dose. | 23. | If only one dose level is investigated, ideally the dose should be high enough to allow for metabolite identification in excreta (and plasma, if appropriate), while not producing apparent toxicity. A rationale should be provided as to why no second dose level has been included. | 24. | If the effect of dose on kinetic processes needs to be established, two doses may not be sufficient and at least one dose should be high enough so as to saturate these processes. If the area under the plasma concentration-time curve (AUC) is not linear between two dose levels used in the main study, this is a strong indication that saturation of one or more of the kinetic processes is occurring somewhere between the two dose levels. | 25. | For test chemicals of low toxicity, a maximum dose of 1 000 mg/kg body weight (oral and dermal routes) should be used (if administration is by the inhalation route, refer to Chapter B.2 of this Annex for guidance; typically this dose would not exceed 2 mg/l). Chemical-specific considerations may necessitate a higher dose depending on regulatory needs. Dose selection should always be justified. | 26. | Single dose toxicokinetic and tissue distribution data may be adequate to determine the potential for accumulation and/or persistence. However in some circumstances repeated dose administration may be needed (i) to address more fully the potential for accumulation and/or persistence or changes in TK (i.e. for instance, enzyme induction and inhibition), or (ii) as required by the applicable regulatory system. In studies involving repeated dosing, while repeated low dose administration is usually sufficient, under certain circumstances repeated high dose administration may also be necessary (see also paragraph 57). | Administration of Test Chemical | 27. | The test chemical should be dissolved or suspended homogeneously in the same vehicle employed for the other oral gavage toxicity studies performed with the test chemical, if such vehicle information is available. Rationale for the choice of vehicle should be provided. The choice of the vehicle and the volume of dosing should be considered in the design of the study. The customary method of administration is by gavage; however, administration by gelatine capsule or as a dietary mixture may be advantageous in specific situations (in both cases, justification should be given). Verification of the actual dose administered to each animal should be provided. | 28. | The maximum volume of liquid to be administered by oral gavage at one time depends on the size of the test animals, the type of dose vehicle, and whether or not feed is withheld prior to administration of the test chemical. The rationale for administering or restricting food prior to dosing should be provided. Normally the volume should be kept as low as practical for either aqueous or non-aqueous vehicles. Dose volumes should not normally exceed 10 ml/kg body weight for rodents. Volumes of vehicles used for more lipophilic test chemicals might start at 4 ml/kg body weight. For repeated dosing, when daily fasting would be contraindicated, lower dose volumes (e.g. 2-4 ml/kg body weight) should be considered. Where possible, consideration may be given to the use of a dose volume consistent with that administered in other oral gavage studies for a test chemical. | 29. | Intravenous (IV) administration of the test chemical and measurement of the test chemical in blood and/or excreta may be used to establish bioavailability or relative oral absorption. For the IV study, a single dose (usually equivalent to but not to exceed the lower oral dose – see dose selection) of test chemical is administered using an appropriate vehicle. This material should be administered in a suitable volume (e.g. 1 ml/kg bw) at the chosen site of administration to at least four animals of the appropriate sex (both sexes might be used, if warranted, see paragraph 16). A fully dissolved or suspended dose preparation is necessary for IV administration of the test chemical. The vehicle for IV administration should not interfere with blood integrity or blood flow. If the test chemical is infused, the infusion rate should be reported and standardised between animals, provided an infusion pump is used. Anaesthesia should be used if one cannulates the jugular vein (for administration of test chemical and/or collection of blood) or if one uses the femoral artery for administration. Due consideration should be given to the type of anaesthesia as it may have effects on toxicokinetics. Animals should be allowed to recover adequately before administration of the test chemical plus the vehicle. | 30. | Other routes of administration, such as dermal and inhalation, (see paragraphs 74-78) may be applicable for certain test chemicals, considering their physico-chemical properties and the expected human use or exposure. | Measurements | Mass Balance | 31. | Mass balance is determined by summation of the percent of the administered (radioactive) dose excreted in urine, faeces, and expired air, and the percent present in tissues, residual carcass, and cage wash (see paragraph 46). Generally, total recoveries of administered test chemical (radioactivity) in the order of > 90 % are considered to be adequate. | Absorption | 32. | An initial estimation of absorption can be achieved by excluding the percentage of dose in the gastro-intestinal (GI) tract and/or faeces from the mass balance determination. For the calculation of percent absorption, see paragraph 33. For investigation of excreta, see paragraphs 44-49. If the exact extent of absorption following oral dosing cannot be established from mass balance studies (e.g. where greater than 20 % of the administered dose is present in faeces), further investigations might be necessary. These studies could comprise either 1) oral administration of test chemical and measurement of test chemical in bile or 2) oral and IV administration of test chemical and measurement of net test chemical present in urine plus expired air plus carcass by each of the two routes. In either study design, measurement of radioactivity is conducted as a surrogate method for chemical-specific analysis of test chemical plus metabolites. | 33. | If a biliary excretion study is undertaken, the oral route of administration is typically used. In this study, the bile ducts of at least four animals of the appropriate sex (or of both sexes, if warranted) should be cannulated and a single dose of the test chemical should be administered. Following administration of the test chemical, excretion of radioactivity/test chemical in bile should be monitored as long as necessary to estimate the percentage of the administered dose that is excreted via this route, which can be used to directly calculate the extent of oral absorption, as follows: | 34. | With some classes of test chemical, direct secretion of the absorbed dose can occur across intestinal membranes. In such cases the measurement of % dose in faeces following an oral dose in the bile duct cannulated rat is not considered to be representative of the unabsorbed dose. It is recommended that where intestinal secretion is thought to occur then the % dose absorbed be based on the absorption calculated from a comparison of the excretion following the oral versus IV route (intact or bile duct cannulated rat) (see paragraph 35). It is also recommended that where quantification of the intestinal secretion is considered necessary, excretion in the bile duct cannulated rat following IV dose administration be measured. | Bioavailability | 35. | Bioavailability can be determined from plasma/blood kinetics of the oral and IV groups, as described in paragraphs 50-52, by specific chemical analysis of the test chemical and/or relevant metabolite(s), therefore not requiring radiolabelled test chemical. The calculation of bioavailability (F) of the test chemical or relevant metabolite(s) can then be made as follows: | where AUC is the area under the plasma concentration-time curve, and exp is the experimental route (oral, dermal or via inhalation). | 36. | For use in risk assessment of systemic effects, bioavailability of the toxic component is in general preferred over the percent absorption when comparing systemic concentrations from animal studies with analogous biomonitoring data from worker exposure studies. The situation may become more complex if doses are in the non-linear range so it is important that toxicokinetic screening determines doses in the linear range. | Tissue Distribution | 37. | Knowledge of tissue distribution of a test chemical and/or its metabolites is important for the identification of target tissues, and understanding of the underlying mechanisms of toxicity, and in order to get information on the potential for test chemical and metabolite accumulation and persistence. The percent of the total (radioactive) dose in tissues as well as residual carcass should at a minimum be measured at the termination of the excretion experiment (e.g. typically up to 7 days post dose or less depending on test chemical specific behaviour). When no test chemical is detected in tissues at study termination (e.g. because the test chemical might have been eliminated before study termination due to a short half-life), care should be taken in order to prevent misinterpretation of the data. In this type of situation, tissue distribution should be investigated at the time of test chemical (and/or metabolite) peak plasma/blood concentration (Tmax) or peak rate of urinary excretion, as appropriate (see paragraph 38). Furthermore, tissue collection at additional time points may be needed to determine tissue distribution of the test chemical and/or its metabolites, to evaluate time dependency (if appropriate), to aid in establishing mass balance, and/or as required by a competent authority. Tissues that should be collected include liver, fat, GI tract, kidney, spleen, whole blood, residual carcass, target organ tissues and any other tissues (e.g. thyroid, erythrocytes, reproductive organs, skin, eye (particularly in pigmented animals) of potential significance in the toxicological evaluation of the test chemical. Analysis of additional tissues at the same time points should be considered to maximise utilisation of animals and in the event that target organ toxicity is observed in sub-chronic or chronic toxicity studies. The (radioactive) residue concentration and tissue-to-plasma (blood) ratios should also be reported. | 38. | The evaluation of tissue distribution at additional time points such as the time of peak plasma/blood concentration (e.g. Tmax) or the peak rate of urinary excretion, obtained from the respective plasma/blood kinetic or excretion experiments, may also be needed or required by a competent authority. This information can be useful for understanding toxicity and the potential for test chemical and metabolite accumulation and persistence. Justification for sample selection should be provided; samples for analysis generally should be the same as those above (see paragraph 37). | 39. | Quantification of radioactivity for tissue distribution studies can be performed using organ dissection, homogenisation, combustion and/or solubilisation, followed by liquid scintillation counting (LSC) of trapped residues. Certain techniques, currently at various stages of development, e.g. Quantitative whole-body autoradiography and receptor microscopic autoradiography, may prove useful in determining the distribution of a test chemical in organs and/or tissues (3) (4). | 40. | For routes of exposure other than oral, specific tissues should be collected and analysed, such as lungs in inhalation studies and skin in dermal studies. See paragraphs 74-78. | Metabolism | 41. | Excreta (and plasma, if appropriate) should be collected for identification and quantitation of unchanged test chemical and metabolites as described under paragraphs 44-49. Pooling of excreta to facilitate metabolite identification within a given dose group is acceptable. Profiling of metabolites from each time period is recommended. However, if lack of sample and/or radioactivity precludes this, pooling of urine and faeces across several time points is acceptable but pooling across sexes or doses is not acceptable. Appropriate qualitative and quantitative methods should be used to assay urine, faeces, expired radioactivity from treated animals, and bile if appropriate. | 42. | Reasonable efforts should be made to identify all metabolites present at 5 % or greater of the administered dose and to provide a metabolic scheme for the test chemical. Test chemicals which have been characterised in excreta as comprising 5 % or greater of the administered dose should be identified. Identification refers to the exact structural determination of components. Typically, identification is accomplished either by co-chromatography of the metabolite with known standards using two dissimilar systems or by techniques capable of positive structural identification such as mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR), etc. In the case of co-chromatography, chromatographic techniques utilising the same stationary phase with two different solvent systems are not considered to be an adequate two-method verification of metabolite identity, since the methods are not independent. Identification by co-chromatography should be obtained using two dissimilar, analytically independent systems such as reverse and normal phase thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Provided that the chromatographic separation is of suitable quality, then additional confirmation by spectroscopic means is not necessary. Alternatively, unambiguous identification can also be obtained using methods providing structural information such as: liquid chromatography/mass spectrometry (LC-MS), or liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gas chromatography/mass spectrometry (GC-MS), and NMR spectrometry. | 43. | If identification of metabolites at 5 % or greater of the administered dose is not possible, a justification/explanation should be provided in the final report. It might be appropriate to identify metabolites representing less than 5 % of the administered dose to gain a better understanding of the metabolic pathway for hazard and/or risk assessment of the test chemical. Structural confirmation should be provided whenever possible. This may include profiling in plasma or blood or other tissues. | Excretion | 44. | The rate and extent of excretion of the administered dose should be determined by measuring the percent recovered (radioactive) dose from urine, faeces and expired air. These data will also assist in establishing mass balance. The quantities of test chemical (radioactivity) eliminated in the urine, faeces, and expired air should be determined at appropriate time intervals (see paragraphs 47-49). Repeated dose experiments should be properly designed to allow for collection of excretion data to meet the objectives described in the paragraph 26. This will allow for comparison to single dose experiments. | 45. | If a pilot study has shown that no significant amount of test chemical (radioactivity) (according to paragraph 49) is excreted in expired air, then expired air does not need to be collected in the definitive study. | 46. | Each animal is to be placed in a separate metabolic unit for collection of excreta (urine, faeces and expired air). At the end of each collection period (see paragraphs 47-49), the metabolic units should be rinsed with appropriate solvent (this is known as the “cage wash”) to ensure maximum recovery of the test chemical (radioactivity). Collection of excreta should be terminated at 7 days, or after at least 90 % of the administered dose has been recovered, whichever occurs first. | 47. | The total quantities of test chemical (radioactivity) in urine are to be determined for at least two time points on day 1 of collection, one of which should be at 24 h post dosing, and daily thereafter until study termination. The selection of more than two sampling points on day one (e.g. at 6, 12 and 24 h) is encouraged. The results of pilot studies should be analysed for information on alternate or additional time points for collection. A rationale should be provided for the collection schedules. | 48. | The total quantities of test chemical (radioactivity) in faeces should be determined on a daily basis beginning at 24 h post-dosing until study termination, unless pilot studies suggest alternate or additional time points for collection. A rationale should be provided for alternative collection schedules. | 49. | The collection of expired CO2 and other volatile materials may be discontinued in a given study experiment when less than 1 % of the administered dose is found in the exhaled air during a 24-h collection period. | Time Course Studies | Plasma/Blood Kinetics | 50. | The purpose of these studies is to obtain estimates of basic TK parameters [e.g. Cmax, Tmax, half-life (t1/2), AUC] for the test chemical. These studies may be conducted at one dose or, more likely, at two or more doses. Dose setting should be determined by the nature of the experiment and/or the issue being addressed. Kinetic data may be needed to resolve issues such as test chemical bioavailability and/or to clarify the effect of dose on clearance (e.g. to clarify whether clearance is saturated in a dose-dependent fashion). | 51. | For these studies a minimum of four animals of one sex per dose group should be used. Justification should be provided for the sex of the animals used. The use of both sexes (four males and four females) should be considered if there is evidence to support significant sex-related differences in toxicity. | 52. | Following administration of the test chemical (radiolabelled), blood samples should be obtained from each animal at suitable time points using appropriate sampling methodology. The volume and number of blood samples which can be obtained per animal might be limited by potential effects of repeated sampling on animal health/physiology and/or the sensitivity of the analytical method. Samples should be analysed for each individual animal. In some circumstances (e.g. metabolite characterisation), it might be necessary to pool samples from more than one animal. Pooled samples should be clearly identified and an explanation for pooling provided. If a radiolabelled test chemical is used, analysis of total radioactivity present might be adequate. If so, total radioactivity should be analyzed in whole blood and plasma or plasma and red blood cells to allow calculation of the blood/plasma ratio. In other circumstances, more specific investigations requiring the identification of parent compound and/or metabolites, or to assess protein binding might be necessary. | Other Tissue Kinetics | 53. | The purpose of these studies is to obtain time course information to address questions related to issues such as toxic mode of action, bioaccumulation and bio-persistence via determination of levels of test chemical in various tissues. The selection of tissues and the number of time points evaluated will depend on the issue to be addressed and the toxicological database for the test chemical. The design of these additional tissue kinetics studies should take into account information gathered as described in paragraphs 37-40. These studies might involve single or repeated dosing. A detailed rationale for the approach used should be provided. | 54. | Reasons for performing other tissue kinetic studies might include: | — | Evidence of extended blood half-life, suggesting possible accumulation of test chemical in various tissues, or | — | interest in seeing if a steady state level has been achieved in specific tissues (e.g. in repeated dosing studies, even though an apparent blood steady state level of test chemical may have been achieved, there may be interest in ascertaining that a steady state level has also been attained in target tissues). | 55. | For these types of time-course studies, an appropriate oral dose of test chemical should be administered to a minimum of four animals per dose per time point and the time course of distribution monitored in selected tissues. Only one sex may be used, unless gender specific toxicity is observed. Whether total radioactivity or parent chemical and/or metabolites are analysed will also depend on the issue being addressed. Assessment of tissue distribution should be made using appropriate techniques. | Enzyme Induction/Inhibition | 56. | Studies addressing the possible effects of enzyme induction/inhibition or biotransformation of test chemical under study may be needed under one or more of the following cases: | (1) | Available evidence indicates a relationship between biotransformation of test chemical and enhanced toxicity; | (2) | The available toxicity data indicate a non-linear relationship between dose and metabolism; | (3) | The results of metabolite identification studies show identification of a potentially toxic metabolite that might have been produced by an enzyme pathway induced by the test chemical; | (4) | In explaining effects which are postulated to be linked to enzyme induction phenomena; | (5) | If toxicologically significant alterations in the metabolic profile of the test chemical are observed through either in vitro or in vivo experiments with different species or conditions, characterisation of the enzyme(s) involved may be needed (e.g. Phase I enzymes such as isoenzymes of the Cytochrome P450-dependent mono-oxygenase system, Phase II enzymes such as isoenzymes of sulfotransferase or uridine diphosphate glucuronosyl transferase, or any other relevant enzymes). This information might be used to evaluate the pertinence of species to species extrapolations. | 57. | Appropriate study protocols to evaluate test chemical related changes in TK, suitably validated and justified should be used. Example study designs consist of repeated dosing with unlabelled test chemical, followed by a single radiolabelled dose on day 14, or repeated dosing with radiolabelled test chemical and sampling at days 1, 7 and 14 for determination of metabolite profiles. Repeated dosing with radiolabelled test chemical may also provide information on bioaccumulation (see paragraph 26). | SUPPLEMENTAL APPROACHES | 58. | Supplemental approaches beyond the in vivo experiments described in this Test Method may provide useful information on the absorption, distribution, metabolism or elimination of a test chemical in certain species. | Use of in vitro information | 59. | Several questions concerning the metabolism of the test chemical may be addressed in in vitro studies using appropriate test systems. Freshly isolated or cultured hepatocytes and subcellular fractions (e.g. microsomes and cytosol or S9 fraction) from liver may be used to study possible metabolites. Local metabolism in the target organ, e.g. lung, may be of interest for risk assessment. For these purposes, microsomal fractions of target tissues may be useful. Studies with microsomes may be useful to address potential gender and life-stage differences and characterise enzyme parameters (Km and Vmax) which can aid in the assessment of dose dependency of metabolism in relation to exposure levels. In addition microsomes may be useful to identify the specific microsomal enzymes involved in the metabolism of the test chemical which can be relevant in species extrapolation (see also paragraph 56). The potential for induction of biotransformation can also be examined by using liver subcellular fractions (e.g. microsomes and cytosol) of animals pre-treated with the test chemical of interest, in vitro via hepatocyte induction studies or from specific cell lines expressing relevant enzymes. In certain circumstances and under appropriate conditions, subcellular fractions coming from human tissues might be considered for use in determining potential species differences in biotransformation. The results from in vitro investigations may also have utility in the development of PBTK models (5). | 60. | In vitro dermal absorption studies may provide supplemental information to characterise absorption (6). | 61. | Primary cell cultures from liver cells and fresh tissue slices may be used to address similar questions as with liver microsomes. In certain cases, it may be possible to answer specific questions using cell lines with defined expression of the relevant enzyme or engineered cell lines. In certain cases, it may be useful to study the inhibition and induction of specific cytochrome P450 isozymes (e.g. CYP1A1, 2E1, 1A2, and others) and/or phase II enzymes by the parent compound using in vitro studies. Information obtained may have utility for similarly structured compounds. | Use of Toxicokinetic Data from Toxicity Studies as Complementary Information | 62. | Analysis of blood, tissue and/or excreta samples obtained during the conduct of any other toxicity studies can provide data on bioavailability, changes in plasma concentration in time (AUC, Cmax), bioaccumulation potential, clearance rates, and gender or life-stage changes in metabolism and kinetics. | 63. | Consideration of the study design can be used to answer questions relating to: saturation of absorption, biotransformation or excretion pathways at higher dose levels; the operation of new metabolic pathways at higher doses and the limitation of toxic metabolites to higher doses. | 64. | Other hazard assessment considerations could include issues such as: | — | Age-related sensitivity due to differences in the status of the blood-brain barrier, the kidney and/or detoxification capacities; | — | Sub-population sensitivity due to differences in biotransformation capacities or other TK differences; | — | Extent of exposure of the foetus by transplacental transfer of chemicals or of the newborn through lactation. | Use of Toxicokinetic Modelling | 65. | Toxicokinetic models may have utility for various aspects of hazard and risk assessment as for example in the prediction of systemic exposure and internal tissue dose. Furthermore specific questions on mode of action may be addressed, and these models can provide a basis for extrapolation across species, routes of exposure, dosing patterns, and for human risk assessment. Data useful for developing PBTK models for a test chemical in any given species include (1) partition coefficients, (2) biochemical constants and physiological parameters, (3) route-specific absorption parameters and 4) in vivo kinetic data for model evaluation [e.g. clearance parameters for relevant (> 10 %) excretion pathways, Km and Vmax for metabolism]. The experimental data used in model development should be generated with scientifically sound methods and the model results validated. Test chemical- and species-specific parameters such as absorption rates, blood-tissue partitioning and metabolic rate constants are often determined to facilitate development of non-compartmental or physiologically-based models (7). | DATA AND REPORTING | 66. | It is recommended that the study report include a table of contents. | Body of the Report | 67. | The body of the report should include information covered by this Test Method organised into sections and paragraphs as follows: | Summary | 68. | This section of the study report should include a summary of the study design and a description of methods used. It should also highlight the key findings regarding mass balance, the nature and magnitude of metabolites, tissue residue, rate of clearance, bioaccumulation potential, sex differences, etc. The summary should be presented in sufficient detail to permit evaluation of the findings. | Introduction | 69. | This section of the report should include the study objectives, rationale and design, as well as, appropriate references and any background history. | Materials and Methods | 70. | This section of the report should include detailed descriptions of all pertinent information including: | (a) | Test Chemical | This subsection should include identification of the test chemical: chemical name, molecular structure, qualitative and quantitative determination of its chemical composition, chemical purity and whenever possible, type and quantities of any impurities. It should also include information on physical/chemical properties including physical state, colour, gross solubility and/or partition coefficient, stability, and if appropriate, corrosivity. If applicable, information on isomers should be provided. If the test chemical is radiolabelled, information on the following should be included in this subsection: the type of radionuclide, position of label, specific activity, and radiochemical purity. | The type or description of any vehicle, diluents, suspending agents, and emulsifiers or other materials used in administering the test chemical should be stated. | (b) | Test Animals | This subsection should include information on the test animals, including selection and justification for species, strain, and age at study initiation, sex as well as body weight, health status, and animal husbandry. | (c) | Methods | This subsection should include details of the study design and methodology used. It should include a description of: | (1) | Justification for any modification of route of exposure and exposure conditions, if applicable; | (2) | Justification for selection of dose levels; | (3) | Description of pilot studies used in the experimental design of the follow-up studies, if applicable. Pilot study supporting data should be submitted; | (4) | How the dosing solution was prepared and the type of solvent or vehicle, if any, used; | (5) | Number of treatment groups and number of animals per group; | (6) | Dosage levels and volume (and specific activity of the dose when radioactivity is used); | (7) | Route(s) and methods of administration; | (8) | Frequency of dosing; | (9) | Fasting period (if used); | (10) | Total radioactivity per animal; | (11) | Animal handling; | (12) | Sample collection and handling; | (13) | Analytical methods used for separation, quantitation and identification of metabolites; | (14) | Limit of detection for the employed methods; | (15) | Other experimental measurements and procedures employed (including validation of methods for metabolite analysis). | (d) | Statistical Analysis | If statistical analysis is used to analyse the study findings, then sufficient information on the method of analysis and the computer program employed should be included, so that an independent reviewer/statistician can re-evaluate and reconstruct the analysis. | In the case of systems modelling studies such as PBTK, presentation of models should include a full description of the model to allow independent reconstruction and validation of the model (see paragraph 65 and Appendix: Definitions). | Results | 71. | All data should be summarised and tabulated with appropriate statistical evaluation and described in the text of this section. Radioactivity counting data should be summarised and presented as appropriate for the study, typically as microgram or milligram equivalents per mass of sample, although other units may be used. This section should include graphic illustrations of the findings, reproduction of representative chromatographic and spectrometric data, metabolite identification/quantification and proposed metabolic pathways including molecular structure of metabolites. In addition the following information is to be included in this section, if applicable: | (1) | Quantity and percent recovery of radioactivity in urine, faeces, expired air, and urine and faeces cage wash. | — | For dermal studies, also include data on test chemical recovery from treated skin, skin washes, and residual radioactivity in the skin covering apparatus and metabolic unit as well as results of the dermal washing study. For further discussion, see paragraphs 74-77. | — | For inhalation studies, also include data on recovery of test chemical from lungs and nasal tissues (8). For further discussion, see paragraph 78. | (2) | Tissue distribution reported as percent of administered dose and concentration (microgram equivalents per gram of tissue), and tissue-to-blood or tissue-to-plasma ratios; | (3) | Material balance developed from each study involving the assay of body tissues and excreta; | (4) | Plasma concentrations and toxicokinetic parameters (bioavailability, AUC, Cmax, Tmax, clearance, half-life) after administration by the relevant route(s) of exposure; | (5) | Rate and extent of absorption of the test chemical after administration by the relevant route(s) of exposure; | (6) | Quantities of the test chemical and metabolites (reported as percent of the administered dose) collected in excreta; | (7) | Reference to appendix data which contain individual animal data for all measurement endpoints (e.g. dose administration, percent recovery, concentrations, TK parameters, etc.); | (8) | A figure with the proposed metabolic pathways and the molecular structures of the metabolites. | Discussion and Conclusions | 72. | In this section the author(s) should: | (1) | Provide a proposed metabolic pathway based on the results of the metabolism and disposition of the test chemical; | (2) | Discuss any potential species and sex differences regarding the disposition and/or biotransformation of the test chemical; | (3) | Tabulate and discuss the identification and magnitude of metabolites, rates of clearance, bioaccumulation potential, and level of tissue residues of parent, and/or metabolite(s), as well as possible dose-dependent changes in TK parameters, as appropriate; | (4) | Integrate into this section any relevant TK data obtained in the course of conducting toxicity studies; | (5) | Provide a concise conclusion that can be supported by the findings of the study; | (6) | Add Sections (as needed or appropriate). | 73. | Additional sections should be used to include supporting bibliographic information, tables, figures, appendices, etc. | ALTERNATIVE ROUTES OF EXPOSURE | Dermal | Dermal Treatment | 74. | This section provides specific information on the investigation of the toxicokinetics of the test chemical by the dermal route. For dermal absorption, chapter B.44 of this Annex [Skin absorption: in vivo method (9)] should be consulted. For other endpoints such as distribution and metabolism, this Test Method B.36 can be used. One or more dose levels for the test chemical should be used in the dermal treatment. The test chemical (e.g. neat, diluted or formulated material containing the test chemical which is applied to the skin) should be the same (or a realistic surrogate) as that to which humans or other potential target species might be exposed. The dose level(s) should be selected in accordance with paragraphs 20-26 of this Test Method. Factors that could be taken into consideration in dermal dose selection include expected human exposure and/or doses at which toxicity was observed in other dermal toxicity studies. The dermal dose(s) should be dissolved, if necessary, in a suitable vehicle and applied in a volume adequate to deliver the doses. Shortly before testing, fur should be clipped from the dorsal area of the trunk of the test animals. Shaving may be employed, but it should be carried out approximately 24 h before the test. When clipping or shaving the fur, care should be taken to avoid abrading the skin, which could alter its permeability. Approximately 10 % of the body surface should be cleared for application of the test chemical. With highly toxic chemicals, the surface area covered may be less than approximately 10 %, but as much of the area as possible is to be covered with a thin and uniform film. The same treatment surface area should be used for all dermal test groups. The dosed areas are to be protected with a suitable covering which is secured in place. The animals should be housed separately. | 75. | A dermal washing study should be conducted to assess the amount of the applied dose of the test chemical that may be removed from the skin by washing the treated skin area with a mild soap and water. This study can also aid in establishing mass balance when the test chemical is administered by the dermal route. For this dermal washing study, a single dose of the test chemical should be applied to two animals. Dose level selection is in accordance with paragraph 23 of this Test Method (also see paragraph 76 for discussion of skin contact time). The amounts of test chemical recovered in the washes should be determined to assess the effectiveness of removal of the test chemical by the washing procedure. | 76. | Unless precluded by corrosiveness, the test chemical should be applied and kept on the skin for a minimum of 6 h. At the time of removal of the covering, the treated area should be washed following the procedure as outlined in the dermal washing study (see paragraph 75). Both covering and the washes should be analysed for residual test chemical. At the termination of the studies, each animal should be humanely killed in accordance with (2), and the treated skin removed. An appropriate section of treated skin should be analysed to determine residual test chemical (radioactivity). | 77. | For the toxicokinetic assessment of pharmaceuticals, different procedures, in accordance with the appropriate regulatory system, may be needed. | Inhalation | 78. | A single concentration (or more if needed) of test chemical should be used. The concentration(s) should be selected in accordance with paragraphs 20-26 of this Test Method. Inhalation treatments are to be conducted using a “nose-cone” or “head-only” apparatus to prevent absorption by alternate routes of exposure (8). If other inhalation exposure conditions are used, justification for the modification should be documented. The duration of exposure by inhalation should be defined; a typical exposure is 4-6 h. | LITERATURE: | (1) | OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris. | (2) | OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris. | (3) | Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81. | (4) | Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40. | (5) | Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411. | (6) | Chapter B.45 of this Annex, Skin Absorption: In Vitro Method. | (7) | IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-Based Pharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Chapter B.44 of this Annex, Skin Absorption: In Vivo Method. | (10) | Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (11) | Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York. | Appendix | DEFINITIONS | Absorption : Process(es) of uptake of chemicals into or across tissues. Absorption refers to parent compound and all its metabolites. Not to be confused with “bioavailability”. | Accumulation (Bioaccumulation): Increase of the amount of a test chemical over time within tissues (usually fatty tissues, following repeated exposure); if the input of a test chemical into the body is greater than the rate at which it is eliminated, the organism accumulates the test chemical and toxic concentrations of a test chemical might be achieved. | ADME : Acronym for “Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion”. | AUC : (Area under the plasma concentration-time curve): Area under the curve in a plot of concentration of test chemical in plasma over time. It represents the total amount of test chemical absorbed by the body within a predetermined period of time. Under linear conditions, the AUC (from time zero to infinity) is proportional to the total amount of a test chemical absorbed by the body, irrespective of the rate of absorption. | Autoradiography : (Whole-body autoradiography): Used to determine qualitatively and/or quantitatively the tissue localisation of a radioactive test chemical, this technique uses X-ray film or more recently digital phosphorimaging to visualize radioactively labelled molecules or fragments of molecules by recording the radiation emitted within the object under study. Quantitative whole-body autoradiography, compared to organ dissection, may have some advantages for the evaluation of test chemical distribution and the assessment of overall recovery and resolution of radioactive material in tissues. One significant advantage, for example, is it can be used in a pigmented animal model to assess possible association of the test chemical with melanin, which can bind certain molecules. However, while it may provide convenient whole body overviews of the high-capacity-low-affinity binding sites, this technique might be limited in recognising specific target sites such as receptor-binding sites where relatively high-resolution and high-sensitivity are needed for detection. When autoradiography is used, experiments intended to determine mass balance of administered compound should be conducted as a separate group or in a separate study from the tissue distribution experiment, where all excreta (which may also include expired air) and whole carcasses are homogenised and assayed by liquid scintillation counting. | Biliary excretion : Excretion via the bile ducts. | Bioaccumulation : See “Accumulation”. | Bioavailability : Fraction of an administered dose that reaches the systemic circulation or is made available at the site of physiological activity. Usually, bioavailability of a test chemical refers to the parent compound, but it could refer to its metabolite. It considers only one chemical form. Nota Bene: bioavailability and absorption are not the same. The difference between e.g. oral absorption (i.e. presence in gut wall and portal circulation) and bioavailability (i.e. presence in systemic blood and in tissues) can arise from chemical degradation due to gut wall metabolism or efflux transport back to the intestinal lumen or presystemic metabolism in the liver, among other factors (10). Bioavailability of the toxic component (parent compound or a metabolite) is a critical parameter in human risk assessment (high-to-low dose extrapolation, route-to-route extrapolation) for derivation of an internal value from the external NOAEL or BMD (applied dose). For liver effects upon oral administration, it is the oral absorption that suffices. However, for every effect other than at the portal of entry, it is the bioavailability that is in general a more reliable parameter for further use in risk assessment, not the absorption. | Biopersistence : See “Persistence”. | Biotransformation : (Usually enzymatic) chemical conversion of a test chemical of interest into a different chemical within the body. Synonymous with “metabolism”. | Cmax : Either maximal (peak) concentration in blood (plasma/serum) after administration or maximal (peak) excretion (in urine or faeces) after administration. | Clearance rate : Quantitative measure of the rate at which a test chemical is removed from the blood, plasma or a certain tissue per unit time. | Compartment : Structural or biochemical portion (or unit) of a body, tissue or cell, that is separate from the rest. | Detoxification pathways : Series of steps leading to the elimination of toxic chemicals from the body, either by metabolic change or excretion. | Distribution : Dispersal of a test chemical and its derivatives throughout an organism. | Enzymes/Isozymes : Proteins that catalyse chemical reactions. Isozymes are enzymes that catalyse similar chemical reactions but differ in their amino acid sequence. | Enzymatic Parameters : Km: Michaelis constant and Vmax: maximum velocity. | Excretion : Process(es) by which an administered test chemical and/or its metabolites are removed from the body. | Exogenously : Introduced from or produced outside the organism or system. | Extrapolation : Inference of one or more unknown values on the basis of that which is known or has been observed. | Half-life (t1/2) : The time taken for the concentration of the test chemical to decrease by one-half in a compartment. It typically refers to plasma concentration or the amount of the test chemical in the whole body. | Induction/Enzyme induction : Enzyme synthesis in response to an environmental stimulus or inducer molecule. | Linearity/linear kinetics : A process is linear in terms of kinetics when all transfer rates between compartments are proportional to the amounts or concentrations present, i.e. first order. Consequently, clearance and distribution volumes are constant, as well as half-lives. The concentrations achieved are proportional to the dosing rate (exposure), and accumulation is more easily predictable. Linearity/Non-linearity can be assessed by comparing the relevant parameters, e.g. AUC, after different doses or after single and repeated exposure. Lack of dose dependency may be indicative of saturation of enzymes involved in the metabolism of the compound, an increase of AUC after repeated exposure as compared to single exposure may be an indication for inhibition of metabolism and a decrease in AUC may be an indication for induction of metabolism [see also (11)]. | Mass balance : Accounting of test chemical entering and leaving the system. | Material balance : See “mass balance”. | Mechanism (Mode) of toxicity/Mechanism (Mode) of action : Mechanism of action refers to specific biochemical interactions through which a test chemical produces its effect. Mode of action refers to more general pathways leading to the toxicity of a test chemical. | Metabolism : Synonymous with “biotransformation”. | Metabolites : Products of metabolism or metabolic processes. | Oral Absorption : The percentage of the dose of test chemical absorbed from the site of administration (i.e. GI tract). This critical parameter can be used to understand the fraction of the administered test chemical that reaches the portal vein, and subsequently the liver. | Partition coefficient : Also known as the distribution coefficient, it is a measure of the differential solubility of a chemical in two solvents. | Peak blood (plasma/serum) levels : Maximal (peak) blood (plasma/serum) concentration after administration (see also “Cmax”). | Persistence (biopersistence) : Long-term presence of a chemical (in a biological system) due to resistance to degradation/elimination. | Read-across : The endpoint information for one or more chemicals is used to make a prediction of the endpoint for the target chemical. | Receptor Microscopic Autoradiography (or Receptor Microautoradiography): This technique may be used to probe xenobiotic interaction with specific tissue sites or cell populations as for instance in receptor binding or specific mode of action studies that may require high-resolution and high sensitivity which may not be feasible with other techniques such as whole-body autoradiography. | Route of administration (oral, IV, dermal, inhalation, etc.): Refers to the means by which chemicals are administered to the body (e.g. orally by gavage, orally by diet, dermal, by inhalation, intravenously, etc.). | Saturation : State whereby one or more of the kinetic (e.g. absorption, metabolism or clearance) process(es) are at a maximum (read “saturated”). | Sensitivity : Capability of a method or instrument to discriminate between measurement responses representing different levels of a variable of interest. | Steady-state blood (plasma) levels : Non-equilibrium state of an open system in which all forces acting on the system are exactly counter-balanced by opposing forces, in such a manner that all its components are stationary in concentration although matter is flowing through the system. | Systems Modelling (Physiologically-based Toxicokinetic, Pharmacokinetic-based, Physiologically-based Pharmacokinetic, Biologically-based, etc.): Abstract model that uses mathematical language to describe the behaviour of a system. | Target tissue : Tissue in which a principal adverse effect of a toxicant is manifested. | Test chemical : Any chemical or mixture tested using this Test Method. | Tissue distribution : Reversible movement of a test chemical from one location in the body to another. Tissue distribution can be studied by organ dissection, homogenisation, combustion and liquid scintillation counting or by qualitative and/or quantitative whole body autoradiography. The former is useful to obtain concentration and percent of recovery from tissues and remaining carcass of the same animals, but may lack resolution for all tissues and may have less than ideal overall recovery (< 90 %). See definition for the latter above. | Tmax : Time to reach Cmax. | Toxicokinetics (Pharmacokinetics): Study of the absorption, distribution, metabolism, and excretion of chemicals over time. | Validation of models : Process of assessing the adequacy of a model to consistently describe the available toxicokinetic data. Models may be evaluated via statistical and visual comparison of model predictions with experimental values against a common independent variable (e.g. time). The extent of evaluation should be justified in relation to the intended use of the model. | ’ | 7) | Se sustituye el capítulo B.36 por el texto siguiente: | «B.36. TOXICOCINÉTICA | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 417 de la OCDE (2010). Se realizan estudios para investigar la toxicocinética de una sustancia problema a fin de obtener la debida información sobre su absorción, distribución, biotransformación (metabolismo) y excreción, relacionar la concentración o la dosis con la toxicidad observada y llegar a comprender los mecanismos toxicológicos. La toxicocinética puede ayudar a entender mejor los estudios toxicológicos demostrando que los animales de experimentación están expuestos de manera sistémica a la sustancia problema y revelando cuáles son las fracciones circulantes (la sustancia original o sus metabolitos). Los parámetros toxicocinéticos básicos que se determinan en estos estudios indican además la capacidad de acumulación de la sustancia problema en los tejidos y órganos, así como el potencial de inducción metabólica tras la exposición a dicha sustancia. | 2. | Los datos toxicocinéticos pueden ayudar a determinar la idoneidad y relevancia de extrapolar los datos de toxicidad animal a la evaluación del riesgo y/o del peligro para la especie humana. Por otro lado, los estudios toxicocinéticos pueden aportar información muy útil para determinar los niveles posológicos en los estudios de toxicidad (cinética lineal y no lineal), los efectos de la vía de administración, la biodisponibilidad y otras cuestiones relacionadas con el diseño experimental. Algunos de estos datos pueden servir de ayuda en el desarrollo de un modelo toxicocinético basado en la fisiología (PBTK). | 3. | Los datos toxicocinéticos y de los metabolitos tienen aplicaciones importantes en la medida en que indican posibles toxicidades y modos de acción, así como su relación con el nivel de dosis y la vía de exposición. Además, los datos sobre el metabolismo resultan útiles para evaluar la importancia toxicológica de la exposición a metabolitos de la sustancia problema que son de origen exógeno. | 4. | Una información toxicocinética adecuada será de ayuda para respaldar la mayor aceptabilidad y aplicabilidad de los modelos de relación estructura-actividad cuantitativa o de extrapolación o agrupación estructural cuando se pretende evaluar la seguridad de la sustancias. Finalmente, los datos cinéticos pueden servir para evaluar la importancia toxicológica de otras investigaciones (in vivo/in vitro). | 5. | Mientras no se mencione otra vía de administración (véanse en particular los puntos 74 a 78), el presente método de ensayo es aplicable a la administración oral de la sustancia problema. | CONSIDERACIONES INICIALES | 6. | Los sistemas normativos imponen diferentes requisitos y necesidades en torno a los criterios de valoración y parámetros que se usan para evaluar la toxicocinética de las diferentes clases de productos químicos (plaguicidas, biocidas, productos químicos industriales, etc.). Contra la que es habitual, este método de ensayo describe el estudio de la toxicocinética, que abarca múltiples determinaciones y criterios de valoración. En el futuro se podrán desarrollar distintos métodos de ensayo y/o documentos de orientación para describir cada criterio de valoración detenidamente y por separado. En la aplicación del presente método de ensayo, los análisis y evaluaciones que se lleven a cabo quedarán especificados por los requisitos y las necesidades de cada sistema normativo en particular. | 7. | Son numerosos los estudios que se podrían realizar para evaluar el comportamiento toxicocinético de una sustancia problema dentro de un marco regulador. Dependiendo de las situaciones o necesidades normativas concretas, sin embargo, no tiene por qué ser obligatorio efectuar todos los estudios posibles para la evaluación de una sustancia. En el diseño de los estudios toxicocinéticos es importante la flexibilidad para tomar en consideración las características de la sustancia química que se pretende estudiar. En algunos casos solo habrá que investigar algunos aspectos determinados para hacer una valoración del riesgo y del peligro asociados a la sustancia problema. En algunas situaciones, se pueden recopilar los datos toxicocinéticos como parte de la evaluación de otros estudios toxicológicos. En otros casos serán necesarios estudios toxicocinéticos complementarios y más exhaustivos, en función de las necesidades normativas o de que surjan nuevos interrogantes al evaluar la sustancia problema. | 8. | Antes de comenzar el estudio y con el fin de mejorar su calidad y minimizar el sufrimiento animal, el laboratorio de ensayo tendrá en cuenta toda la información disponible acerca de la sustancia problema y de sus principales metabolitos y análogos, en la que pueden incluirse datos de otros métodos de ensayo pertinentes (estudios in vivo e in vitro, o evaluaciones in silico). En la planificación del estudio y la interpretación de sus resultados pueden ser de ayuda las propiedades fisicoquímicas, como el coeficiente de partición octanol-agua (expresado como log POW), el pKa, la hidrosolubilidad, la presión de vapor, y el peso molecular de la sustancia química. Estas propiedades se pueden determinar con los procedimientos adecuados que se describen en los correspondientes métodos de ensayo. | LIMITACIONES | 9. | El presente método de ensayo no ha sido diseñado para contemplar circunstancias especiales, como es el caso de las hembras grávidas o lactantes y de su progenie, ni para evaluar los residuos potenciales en los animales productores de alimentos que han estado expuestos. Sin embargo, los datos obtenidos de un estudio B.36 pueden aportar una valiosa información de base para el diseño de investigaciones específicas en este sentido. El presente método de ensayo no está destinado a la investigación de nanomateriales. El informe de una revisión preliminar de las directrices de ensayo (TG) de la OCDE para determinar su aplicabilidad a los nanomateriales indica que la TG 417 (equivalente a este método de ensayo B.36) no siempre es aplicable a los nanomateriales (1). | DEFINICIONES | 10. | Las definiciones de términos relacionados con este método de ensayo se pueden consultar en el apéndice. | CONSIDERACIONES SOBRE EL BIENESTAR ANIMAL | 11. | Se ofrecen indicaciones sobre el trato compasivo de los animales en el documento de orientación (GD) no 19 de la OCDE (2). Se recomienda consultar dicho GD en relación con todos los estudios in vivo e in vitro descritos en este método de ensayo. | DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS | Estudios piloto | 12. | Se recomienda y se insta a realizar estudios piloto para la selección de los parámetros experimentales de los estudios toxicocinéticos (metabolismo, balance de masas, procedimientos analíticos, determinación del intervalo de dosis, exhalación de CO2, etc.). La caracterización de algunos de estos parámetros puede no necesitar el uso de sustancias marcadas radiactivamente. | Selección de los animales | Especie | 13. | La especie animal (y cepa) empleada en la investigación toxicocinética será, preferiblemente, la misma que en otros estudios toxicológicos efectuados con la sustancia química de interés. Normalmente se prefiere la rata, por cuanto se utiliza ampliamente en los estudios toxicológicos. El uso complementario de otras especies puede estar justificado si los estudios críticos de toxicología aportan pruebas de toxicidad importante en estas especies, o si la toxicidad/toxicocinética en estas resulta más relevante para la especie humana. Se justificará la elección de la especie animal y de la cepa. | 14. | Mientras no se indique lo contrario, el presente método de ensayo se refiere a la rata como especie experimental. Si se usan otras especies experimentales es posible que deban modificarse determinados aspectos metodológicos. | Edad y cepa | 15. | Se escogerán animales adultos jóvenes y sanos (normalmente de 6-12 semanas en el momento de la administración; véanse también los puntos 13 y 14). Se justificará el uso de animales que no sean adultos jóvenes. Todos los animales deben tener edades parecidas al principio del estudio. El peso de los animales no debe diferir en un porcentaje superior a ± 20 % del valor medio del grupo experimental. Idealmente, la cepa empleada debe ser la misma que se haya usado para obtener la base de datos toxicológicos de la sustancia problema. | Número y sexo de los animales | 16. | Por cada nivel de dosis investigado se emplearán como mínimo cuatro animales de un sexo. Se justificará la elección del sexo de los animales empleados. Se planteará usar animales de ambos sexos (4 machos y 4 hembras) si hay indicios para sospechar variaciones importantes de la toxicidad en función del sexo. | Alojamiento y alimentación | 17. | Como norma, los animales deben ser enjaulados de manera individual durante el período de estudio. El enjaulamiento en grupo puede estar justificado en circunstancias especiales. Se aplicará iluminación artificial en una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La sala de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C) y a una humedad relativa del 30-70 %. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. | Sustancia problema | 18. | Se utilizará una sustancia química marcada radiactivamente con 14C para investigar todos los aspectos del estudio relacionados con el balance de masas y la identificación de los metabolitos; ahora bien, si se puede demostrar que: | — | es posible evaluar adecuadamente el balance de masas y la identificación de los metabolitos empleando la sustancia problema sin marcar, | — | la especificidad y sensibilidad analíticas del método usado con la sustancia problema no radiactiva son iguales o superiores a las que se obtendrían con la sustancia química radiomarcada, | entonces no será necesario marcar radiactivamente la sustancia problema. Por lo demás, se pueden usar otros isótopos radiactivos y estables, particularmente si son responsables o forman parte de la fracción tóxica de la sustancia problema. Cuando sea posible, el marcador radiactivo se ubicará en una fracción nuclear de la molécula metabólicamente estable (no intercambiable, no eliminada metabólicamente en forma de CO2 y que no pase a formar parte de la reserva de moléculas de un solo átomo de carbono del organismo). Puede ser necesario el radiomarcado de distintos sitios o regiones específicas de la molécula para seguir el destino metabólico de la sustancia problema. | 19. | Las sustancias problema, radiomarcadas o no, se analizarán con los métodos adecuados para establecer su pureza y su identidad. La pureza radiactiva de la sustancia problema radiomarcada debe ser la máxima posible para esa sustancia en particular (lo ideal es que supere el 95 %) y se procurará por todos los medios identificar los niveles de impurezas del 2 % o superiores. Se documentarán la pureza, la identidad y los porcentajes de impurezas que se hayan detectado. Cada marco regulador podrá proporcionar más indicaciones que orienten en la definición y las especificaciones de las sustancias que son mezclas, así como en la elección de métodos para la determinación de la pureza. | Selección de la dosis | Estudio piloto | 20. | Generalmente es suficiente una dosis oral única para realizar el estudio piloto. La dosis debe ser atóxica, pero lo bastante elevada para permitir la identificación de los metabolitos en las excretas (y, si procede, en el plasma) y el cumplimiento de la finalidad enunciada del estudio piloto, según se expone en el punto 12 del presente método de ensayo. | Estudios principales | 21. | En los estudios principales se prefiere usar como mínimo dos dosis, por cuanto la información derivada de al menos dos grupos posológicos permite establecer los niveles de dosis en otros estudios de toxicidad y contribuye a evaluar la relación dosis-respuesta observada en los estudios de toxicidad previos. | 22. | Cuando se administran dos dosis, ambas deben ser lo bastante elevadas para permitir la identificación de los metabolitos en las excretas (y, si procede, en el plasma). En la selección de las dosis se tendrá en cuenta la información de los estudios de toxicidad previos. Cuando no se disponga de tal información (de estudios de toxicidad oral aguda que hayan documentado los signos clínicos de toxicidad, o de estudios de administración continuada), se podrá considerar para la dosis más elevada un valor por debajo de la DL50 (por las vías oral y cutánea) o la CL50 (por inhalación) estimadas, o bien por debajo del límite inferior del intervalo de toxicidad aguda estimado. La dosis más baja será una fracción de la más elevada. | 23. | Cuando solo se investiga una dosis, lo ideal es que sea lo bastante elevada para permitir la identificación de los metabolitos en las excretas (y, si procede, en el plasma) sin provocar toxicidad aparente. Se justificarán los motivos de no incluir un segundo nivel posológico. | 24. | Cuando sea necesario establecer el efecto de la posología sobre los procesos cinéticos, puede ser que no basten dos dosis, y al menos una de ellas será lo bastante elevada para saturar dichos procesos. Si el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo (AUC) no es lineal entre dos niveles de dosis empleados en el estudio principal, ello indica con bastante certeza que se está produciendo la saturación de uno o más procesos cinéticos en algún punto entre los dos niveles de dosificación. | 25. | Cuando la sustancia problema posea escasa toxicidad, se empleará una dosis máxima de 1 000 mg/kg peso corporal por las vías oral y cutánea (si la vía es inhalatoria, consúltese el capítulo B.2 del presente anexo; típicamente, esta dosis no debe superar los 2 mg/l). En función de las necesidades normativas y de las características específicas de la sustancia, puede hacer falta una dosis más elevada. Se justificará siempre la selección de la dosis. | 26. | La toxicocinética de dosis única y los datos de distribución en los tejidos pueden ser suficientes para determinar el potencial de acumulación y de persistencia. Sin embargo, en algunas circunstancias se requiere la administración de dosis repetidas: 1) para investigar mejor el potencial de acumulación y de persistencia o los cambios de toxicocinética (caso de la inducción o inhibición enzimáticas), o 2) cuando así lo exige el marco regulador de aplicación. En los estudios de administración continuada, si bien suele bastar con la administración continuada de dosis bajas, determinadas circunstancias imponen además la administración continuada de dosis elevadas (véase también el punto 57). | Administración de la sustancia problema | 27. | La sustancia problema se debe disolver o suspender de manera homogénea en el mismo vehículo que se haya empleado en los estudios de toxicidad oral con administración por sonda gástrica, si se dispone de esa información. Se justificará la elección del vehículo. En el diseño del estudio se tendrán en cuenta la elección del vehículo y el volumen de administración. El método habitual de administración es por sonda gástrica; no obstante, en determinadas situaciones puede resultar ventajosa la administración del producto en una cápsula de gelatina o mezclado con el alimento (se justificará en ambos casos). Se documentará la verificación de la dosis real que se administra a cada animal. | 28. | El volumen máximo de líquido que se puede administrar de una vez por sonda gástrica depende del tamaño de los animales experimentales, del tipo de vehículo y de si se priva a los animales de alimento antes de administrarles la sustancia problema. Se justificarán los motivos de alimentar a los animales o de restringir la comida antes de administrar la dosis. Normalmente, el volumen será lo más bajo posible, se trate de vehículos acuosos o no. En el caso de los roedores, el volumen de administración no debe exceder generalmente de 10 ml/kg peso corporal. Cuando se trata de sustancias químicas más lipófilas, el volumen de vehículo puede ser en principio de 4 ml/kg peso corporal. Si la administración es continuada, de modo que esté contraindicado el ayuno diario, se contemplará un volumen menor de administración (2-4 ml/kg peso corporal). Siempre que sea posible se procurará utilizar un volumen de dosis coherente con el administrado en otros estudios realizados con la misma sustancia introducida por sonda gástrica. | 29. | Con el fin de establecer la biodisponibilidad o la absorción oral relativa, se puede recurrir a la administración intravenosa (i.v.) de la sustancia problema y a la determinación de sus concentraciones en la sangre o las excretas. En el estudio i.v. se administra, en un vehículo adecuado, una dosis única (que suele ser equivalente pero no superior a la dosis oral más baja; véase la selección de la dosis) de la sustancia problema. El producto se administrará en un volumen adecuado (por ejemplo, 1 ml/kg peso corporal), en el lugar de aplicación establecido, como mínimo a 4 animales del sexo seleccionado para la investigación (pueden ser ambos sexos, siempre que se justifique; véase el punto 16). Para la administración i.v. de la sustancia problema se requiere la suspensión o disolución completa de la dosis preparada. El vehículo de la administración i.v. no debe afectar a la circulación ni a la integridad de la sangre. Si la sustancia problema se administra en infusión, se documentará la velocidad de la misma y se normalizará en todos los animales siempre y cuando se emplee una bomba. Se empleará anestesia cuando se vaya a canular (ya sea para la administración de la sustancia química o para tomar muestras de sangre) la vena yugular o la arteria femoral. Se considerará detenidamente el tipo de anestesia usado, ya que puede influir en la toxicocinética. Se permitirá a los animales recuperarse debidamente antes de administrarles la sustancia problema y el vehículo. | 30. | Con determinadas sustancias se pueden emplear otras vías de administración, como la cutánea o la inhalatoria (véanse los puntos 74-78), dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas y del uso o del grado de exposición humana previsibles. | Mediciones | Balance de masas | 31. | El balance de masas viene determinado por la suma del porcentaje de la dosis (radiactiva) administrada que se excreta en la orina, las heces y el aire espirado y el porcentaje que está presente en los tejidos, el resto del cuerpo y los líquidos de lavado de la jaula (véase el punto 46). En general se considera aceptable una recuperación total de la dosis (radiactiva) administrada > 90 %. | Absorción | 32. | Es posible hacer una estimación inicial de la absorción excluyendo del balance de masas el porcentaje de la dosis presente en el aparato digestivo y/o en las heces. En el punto 33 se puede consultar el cálculo del porcentaje de absorción. En los puntos 44-49 se describe la investigación de las excretas. Cuando el estudio del balance de masas no permita establecer la magnitud exacta de la absorción que sigue a la administración oral (por ejemplo, cuando se detecte en las heces más del 20 % de la dosis administrada), pueden ser necesarias otras investigaciones. Estas pueden ser de dos tipos: 1) administración oral de la sustancia problema y medición de su contenido en la bilis, o 2) administración oral o i.v. de la sustancia problema y medición, por cada una de las dos vías, de su contenido neto en orina + aire espirado + cuerpo. En los dos tipos de diseño, la medida de la radiactividad se efectúa como un método subsidiario del análisis químico específico de la sustancia problema y sus metabolitos. | 33. | En los estudios de excreción biliar la vía de administración tradicional es la oral. En este tipo de estudios, se canulan los conductos biliares de al menos 4 animales del sexo seleccionado (o de ambos sexos, siempre que se justifique) y se les administra una dosis única de la sustancia problema. Después de la administración se supervisa la excreción de la radiactividad/sustancia problema en la bilis durante el tiempo necesario para calcular el porcentaje de la dosis administrada que se excreta por esta vía, el cual se aplica directamente al cálculo de la absorción oral según la fórmula siguiente: | 34. | Con determinadas sustancias se produce la secreción directa por la mucosa intestinal de la dosis absorbida. En tales casos, la medición del porcentaje de dosis en heces después de la administración oral en ratas sometidas a canulación del conducto biliar no se considera representativa de la dosis no absorbida. Se recomienda que, cuando sea previsible la secreción intestinal, el cálculo del porcentaje de dosis absorbida se base en una comparación de la dosis excretada después de las administraciones oral e i.v. (ratas con el conducto biliar intacto o canulado; véase el punto 35). Se recomienda también que, cuando se juzgue necesario cuantificar la secreción intestinal, se mida la excreción que sigue a la administración de una dosis i.v. en ratas con el conducto biliar canulado. | Biodisponibilidad | 35. | La biodisponibilidad se puede determinar por la cinética plasmática/sanguínea medida en los grupos de administración oral e i.v., según se describe en los puntos 50-52, mediante análisis químico específico de la sustancia problema y de sus metabolitos principales, de modo que no se requiere el marcado radiactivo. El cálculo de la biodisponibilidad (F) de la sustancia problema o de sus metabolitos principales se puede hacer según la fórmula siguiente: | donde AUC es el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo, y exp es la vía de administración experimental (oral, cutánea o inhalatoria). | 36. | En la evaluación del riesgo de efectos sistémicos, en general se prefiere calcular la biodisponibilidad del componente tóxico antes que el porcentaje de absorción cuando se comparan las concentraciones sistémicas observadas en animales experimentales con los datos análogos de biovigilancia obtenidos en estudios de exposición ocupacional. La situación puede hacerse más compleja si las dosis se sitúan en el intervalo de no linealidad, por lo que conviene que el cribado toxicocinético determine las dosis del intervalo lineal. | Distribución en los tejidos | 37. | El conocimiento de la distribución en los tejidos de una sustancia y de sus metabolitos es importante para la identificación de los tejidos diana, la comprensión de los mecanismos que subyacen a la toxicidad, y la calibración del potencial de acumulación y persistencia que tienen la sustancia y sus metabolitos. El porcentaje de la dosis (radiactiva) total presente en los tejidos y en el resto del cuerpo se medirá como mínimo al concluir el ensayo de excreción (habitualmente, hasta 7 días después de administrar la dosis, o menos dependiendo del comportamiento de la sustancia concreta). Cuando no se detecte la sustancia problema en los tejidos al concluir el estudio (por ejemplo, porque tenga una semivida corta y se haya eliminado antes), conviene ser precavido para no malinterpretar los datos. En estas situaciones, se investigará la distribución en los tejidos en un momento que coincida con el pico de concentración plasmática/sanguínea (Tmáx) de la sustancia (y/o de sus metabolitos) o con la tasa máxima de excreción urinaria, según convenga (véase el punto 38). Puede ser necesario, además, tomar muestras de tejido en otros momentos para determinar la distribución de la sustancia problema y/o sus metabolitos, para evaluar (cuando proceda) la dependencia del tiempo, para ayudar a establecer el balance de masas o porque así lo estipule la autoridad competente. Se tomarán muestras de los tejidos siguientes: adiposo, hígado, aparato digestivo, riñón, bazo, sangre completa, resto del cuerpo, órganos diana y otros tejidos (tiroides, eritrocitos, órganos reproductores, piel y ojos, especialmente en animales pigmentados) que puedan revestir importancia para la evaluación toxicológica de la sustancia problema. Se contemplará el análisis de otros tejidos en los mismos tiempos de medición con el fin de maximizar el uso de los animales, pero también en el caso de que se observe toxicidad en un órgano diana en los estudios de toxicidad crónica o subcrónica. Se documentará además la concentración (radiactiva) residual y la relación de concentraciones en tejidos/plasma (sangre). | 38. | Puede ser también necesario, o requerido por la autoridad competente, el estudio de la distribución en los tejidos en un momento que coincida con el pico de concentración plasmática/sanguínea (Tmáx) o con la tasa máxima de excreción urinaria, determinada en los correspondientes ensayos de cinética plasmática/sanguínea o de excreción. Tal información puede ser útil para esclarecer la toxicidad y el potencial de acumulación y persistencia de la sustancia problema y sus metabolitos. Se justificará la selección de las muestras de tejido; en general, las muestras para análisis deben ser idénticas a las ya mencionadas (véase el punto 37). | 39. | En los estudios de distribución en los tejidos, la cuantificación de la radiactividad se puede hacer mediante disección de órganos, homogeneización, combustión y/o solubilización, seguidas de recuento de centelleo líquido (LSC) de los residuos retenidos. Algunas técnicas que se encuentran en distintas fases de desarrollo, como la autorradiografía cuantitativa del cuerpo entero y la autorradiografía microscópica de receptores, pueden ser útiles para medir la distribución de una sustancia problema en los órganos y los tejidos (3) (4). | 40. | Cuando la vía de exposición es distinta de la oral, se deben tomar y analizar muestras de tejidos específicos, como son los pulmones en los estudios de inhalación y la piel en los estudios dermatológicos. Véanse los puntos 74 a 78. | Metabolismo | 41. | Se tomarán muestras de excretas (y de plasma, según proceda) para la identificación y la cuantificación de la sustancia problema intacta y de sus metabolitos, tal como se describe en los puntos 44-49. Se acepta la agrupación de las excretas para facilitar la identificación metabólica en un grupo posológico dado. Se recomienda hacer un perfil de los metabolitos a intervalos de tiempo determinados. Si la carencia de muestras o de radiactividad lo impide, se admite la agrupación de la orina y las heces recogidas en distintos momentos, pero nunca es aceptable la agrupación entre distintos sexos o grupos de dosis. Se emplearán los oportunos métodos cualitativos y cuantitativos para valorar la radiactividad en orina, en heces y espirada, y si procede en la bilis de los animales tratados. | 42. | Se procurará por todos los medios identificar todos los metabolitos con un contenido igual o superior al 5 % de la dosis administrada y proporcionar un esquema metabólico de la sustancia problema. Deberán identificarse las sustancias problema que se hayan detectado en las excretas con un contenido igual o superior al 5 % de la dosis administrada. Por identificación se entiende la determinación estructural exacta de sus componentes. Habitualmente, la identificación se acomete mediante co-cromatografía del metabolito y de sustancias patrón conocidas aplicando dos sistemas no afines, o mediante técnicas que permiten una identificación estructural positiva como son la espectrometría de masas, la resonancia magnética nuclear (RMN), etc. En el caso de la co-cromatografía, las técnicas cromatográficas que emplean la misma fase estacionaria con dos sistemas de solvente distintos no se consideran un método adecuado de doble verificación de la identidad del metabolito, puesto que no son independientes. La identificación mediante co-cromatografía debe hacerse con dos sistemas no afines, analíticamente independientes, como son la cromatografía en capa fina (TLC) de fase normal e inversa y la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). La confirmación por medios espectroscópicos no será necesaria, siempre que la separación cromatográfica sea de calidad aceptable. Se puede llegar también a una identificación inequívoca con métodos que proporcionan información estructural, tales como: cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC-MS) o cromatografía de líquidos con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC-MS) y espectroscopia de RMN. | 43. | Cuando no sea posible la identificación de los metabolitos con un contenido igual o superior al 5 % de la dosis administrada, se agregará una justificación o explicación en el informe final. Para llegar a una comprensión mejor de la vía metabólica que permita evaluar el riesgo o factor de riesgo que supone la sustancia problema, puede ser conveniente identificar los metabolitos con un contenido inferior al 5 % de la dosis administrada. Siempre que sea posible se aportará la confirmación estructural. Puede incluirse el perfil en plasma, sangre u otros tejidos. | Excreción | 44. | La tasa y la velocidad de excreción de la dosis administrada se determinará midiendo el porcentaje recuperado de la dosis (radiactiva) en orina, heces y aire espirado. Estos datos ayudarán, entre otras cosas, a establecer el balance de masas. A intervalos adecuados se determinarán las cantidades de sustancia problema (radiactividad) eliminada en orina, heces y aire espirado (véanse los puntos 47-49). Los ensayos de administración continuada deben diseñarse correctamente con el fin de recopilar datos de excreción que cumplan los objetivos descritos en el punto 26. Así será posible la comparación con los ensayos de dosis única. | 45. | Si un estudio piloto ha demostrado (de conformidad con el punto 49) que no se excreta en el aire espirado una cantidad importante de la sustancia problema (radiactividad), no será necesario tomar muestras de aire espirado en el estudio definitivo. | 46. | Cada animal se ubicará en una unidad metabólica aparte para la recogida de las excretas (orina, heces y aire espirado). Al concluir cada período de recogida (véanse los puntos 47-49), las unidades metabólicas se lavan con el disolvente adecuado (lo que se llama "lavado de la jaula") para garantizar la máxima recuperación de la sustancia problema (radiactividad). La recogida de las excretas concluirá al cabo de 7 días o cuando se haya recuperado al menos el 90 % de la dosis administrada, lo que ocurra antes. | 47. | La cantidad total de sustancia problema (radiactividad) en la orina se determinará como mínimo en dos momentos del día 1 de recogida, uno de ellos a las 24 horas de la administración, y en lo sucesivo diariamente hasta la conclusión del estudio. Se recomienda establecer más de dos momentos de muestreo en el día 1 (por ejemplo, a las 6, 12 y 24 horas). Se analizarán los resultados de los estudios piloto para obtener información sobre otros momentos, complementarios o alternativos, de recogida. Se justificarán debidamente los programas de recogida de muestras. | 48. | La cantidad total de sustancia problema (radiactividad) en las heces se determinará diariamente, comenzando a las 24 horas de la administración y hasta la conclusión del estudio, salvo que los estudios piloto indiquen otros momentos, complementarios o alternativos, de recogida. Se justificará debidamente cualquier otro programa de recogida de muestras. | 49. | En un experimento concreto se podrá interrumpir la recogida del CO2 y de otras sustancias volátiles en el aire espirado cuando en el mismo se detecte menos del 1 % de la dosis administrada durante un período de recogida de 24 horas. | Estudios cinéticos | Cinética plasmática/sanguínea | 50. | La finalidad de estos estudios es hacer estimaciones de los principales parámetros toxicocinéticos [Cmáx, Tmáx, semivida (t1/2), AUC] de la sustancia problema. Estos estudios se pueden realizar con una sola dosis o, más frecuentemente, con dos o más dosis. La posología dependerá de la naturaleza y del objeto de la investigación. Los datos cinéticos son a veces necesarios para resolver cuestiones como la biodisponibilidad de la sustancia problema o evaluar el efecto de la dosis sobre el aclaramiento (por ejemplo, evaluar si el aclaramiento se satura de manera dependiente de la dosis). | 51. | En este tipo de estudios deben emplearse como mínimo 4 animales de un mismo sexo por cada grupo de dosis. Se justificará la elección del sexo de los animales empleados. Se planteará usar animales de ambos sexos (4 machos y 4 hembras) si hay indicios para sospechar variaciones importantes de la toxicidad en función del sexo. | 52. | Tras la administración de la sustancia problema (radiomarcada), se tomarán muestras de sangre de cada animal en los momentos indicados y con una metodología de muestreo apropiada. El volumen y el número de las muestras de sangre que se pueden tomar de cada animal pueden estar limitados por los posibles efectos del muestreo reiterado sobre la salud y fisiología de los animales o sobre la sensibilidad del método analítico. Se analizarán las muestras de cada animal por separado. En algunas circunstancias (por ejemplo, caracterización de los metabolitos), puede estar indicado agrupar las muestras de varios animales. Las muestras agrupadas se identificarán claramente y se justificará el motivo de agruparlas. Cuando se usan sustancias químicas radiomarcadas, puede estar indicado el análisis de la radiactividad total presente. En tal caso se analizará la radiactividad total en la sangre completa y en el plasma, o bien en el plasma y los eritrocitos, para poder calcular el cociente de distribución sangre/plasma. En otras situaciones se precisan estudios más específicos, que exigen la identificación del compuesto parental y/o de sus metabolitos o del grado de afinidad por las proteínas. | Cinética en otros tejidos | 53. | La finalidad de estos estudios es conocer cómo evolucionan con el tiempo las concentraciones de la sustancia problema en los diversos tejidos, para dar respuesta a interrogantes como el mecanismo de la acción tóxica, la bioacumulación y la biopersistencia. La selección de los tejidos y de la frecuencia de medición dependerá del aspecto concreto que se pretenda investigar y de la base de datos toxicológicos de la sustancia estudiada. Para el diseño de estos estudios cinéticos complementarios se tendrá en cuenta la información acumulada, tal como se describe en los puntos 37-40. En estos estudios la administración puede ser única o continuada. Se justificará detalladamente el método elegido. | 54. | Los motivos para efectuar estudios cinéticos en otros tejidos pueden ser los siguientes: | — | que haya indicios de una semivida prolongada en sangre, con posible acumulación de la sustancia problema en varios tejidos, o | — | que interese comprobar si se ha alcanzado un estado estacionario en tejidos concretos (por ejemplo, en los estudios de administración continuada, aunque se haya alcanzado un estado estacionario aparente en sangre, puede ser interesante determinar si se ha alcanzado ese mismo estado estacionario en los tejidos diana). | 55. | En este tipo de investigación cinética, se administra una dosis oral apropiada de la sustancia problema como mínimo a 4 animales por cada dosis y tiempo de medición, y se supervisa la distribución en los tejidos seleccionados a lo largo del tiempo. Se puede usar un solo sexo de animales, salvo que haya indicios de toxicidad asociada al sexo. Se analizará la radiactividad total o bien el compuesto parental y/o sus metabolitos, dependiendo del aspecto que se pretenda investigar. La distribución en los tejidos se evaluará con las técnicas apropiadas. | Inducción e inhibición enzimáticas | 56. | El estudio de los posibles efectos de inducción o inhibición enzimáticas o de la biotransformación de la sustancia problema puede ser necesario en alguna de las siguientes situaciones: | 1) | hay indicios de una relación entre la biotransformación de la sustancia problema y el aumento de la toxicidad; | 2) | los datos de toxicidad disponibles indican una relación no lineal entre la dosis y el metabolismo; | 3) | los resultados de los estudios de identificación de metabolitos apuntan a la formación de un metabolito potencialmente tóxico por una vía metabólica inducida por la sustancia problema; | 4) | para hallar explicación a efectos hipotéticamente vinculados a fenómenos de inducción enzimática; | 5) | si se observan alteraciones toxicológicamente significativas en el perfil metabólico de la sustancia problema, ya sea en ensayos in vitro o in vivo realizados con diferentes especies o condiciones experimentales, puede estar indicada la caracterización de las enzimas que intervienen (por ejemplo, enzimas de fase I como las isoenzimas del sistema de la monooxigenasa dependiente del citocromo P450, enzimas de fase II como el sistema enzimático de la sulfotransferasa o de la uridina-difosfato-glucuronosiltransferasa, u otras). Tal información podría ser de ayuda para evaluar la pertinencia de las extrapolaciones entre especies. | 57. | Deben emplearse protocolos experimentales adecuados para evaluar las alteraciones toxicocinéticas relacionadas con la sustancia problema, debidamente validados y justificados. Ejemplos de tales protocolos serían la administración continuada de una sustancia problema sin marcar, seguida de una dosis radiomarcada el día 14, o la administración continuada de una sustancia radiomarcada con muestreos los días 1, 7 y 14 para determinar los perfiles metabólicos. La administración continuada de una sustancia radiomarcada también puede aportar datos sobre su bioacumulación (véase el punto 26). | OTROS PLANTEAMIENTOS | 58. | Otros planteamientos complementarios de los estudios in vivo que se describen en el presente método de ensayo pueden proporcionar informaciones útiles sobre la absorción, distribución, metabolismo o eliminación de una sustancia problema en ciertas especies. | Uso de la información in vitro | 59. | Algunos aspectos del metabolismo de la sustancia problema se pueden investigar en ensayos in vitro con la metodología adecuada. Para el estudio de los posibles metabolitos se pueden emplear aislados o cultivos recientes de hepatocitos y fracciones subcelulares (por ejemplo, microsomas y citosol o fracción S9) de hígado. El metabolismo local del órgano diana, como el pulmón, puede ser de interés para la evaluación del riesgo. A este efecto resultan útiles las fracciones microsomales de los tejidos diana. Las investigaciones con microsomas pueden ayudar a entender las posibles diferencias en función del sexo y de la edad y a caracterizar los parámetros enzimáticos (Km y Vmáx) de interés para evaluar la dependencia del metabolismo en función de la dosis o los niveles de exposición. Además, las investigaciones con microsomas pueden ayudar a identificar las enzimas microsomales específicas que intervienen en el metabolismo de la sustancia problema, lo que tendría relevancia de cara a la extrapolación entre especies (véase también el punto 56). La capacidad de inducir biotransformación se puede investigar también en fracciones subcelulares de hígado (por ejemplo, microsomas y citosol) de animales previamente tratados con la sustancia de interés, in vitro en estudios de inducción de hepatocitos o a partir de líneas celulares específicas que expresen las enzimas relevantes. En circunstancias especiales y en las condiciones adecuadas, se podría contemplar el uso de fracciones subcelulares de tejidos humanos para investigar las posibles diferencias de biotransformación entre distintas especies. Los resultados de las investigaciones in vitro pueden ser útiles para el desarrollo de modelos toxicocinéticos basados en la fisiología (PBTK) (5). | 60. | Los estudios de absorción dérmica in vitro pueden proporcionar una información suplementaria para caracterizar la absorción (6). | 61. | Es posible usar cultivos celulares primarios de hepatocitos y extensiones de tejido fresco para hacer investigaciones similares a las realizadas con microsomas hepáticos. En ciertos casos es posible resolver cuestiones concretas empleando líneas celulares con una expresión definida de la enzima relevante o producidas mediante ingeniería genética. En otros casos resultará útil el estudio in vitro de la inhibición y la inducción de las isoenzimas del citocromo P450 (CYP1A1, 2E1, 1A2, y otras) y/o de las enzimas de fase II provocada por el compuesto parental. La información obtenida puede ser aplicable a otros compuestos estructuralmente afines. | Uso de los datos toxicocinéticos de los estudios de toxicidad como información complementaria | 62. | El análisis de las muestras de sangre, tejidos o excretas obtenidas en el transcurso de cualesquiera otros estudios de toxicidad pueden proporcionar datos sobre la biodisponibilidad, la variación de las concentraciones plasmáticas con el tiempo (AUC, Cmáx), la capacidad de bioacumulación, la velocidad de eliminación y los cambios metabólicos y cinéticos dependientes de la edad y del sexo. | 63. | Se puede enfocar el diseño del estudio para intentar dar respuesta a cuestiones relacionadas con los niveles de dosis más elevadas, como son: la saturación de las vías de absorción, biotransformación o excreción; la intervención de nuevas vías metabólicas, y la limitación de los metabolitos tóxicos. | 64. | La evaluación de los factores de riesgo puede hacerse extensiva a cuestiones como: | — | el cambio de la sensibilidad con la edad, debido a variaciones en el estado de la barrera hematoencefálica, la función renal o la capacidad destoxificadora del hígado, | — | el cambio de la sensibilidad con las subpoblaciones, debido a diferencias en la capacidad de biotransformación o a otras variaciones toxicocinéticas, | — | el grado de exposición del feto, por el paso de las sustancias a través de la placenta, o del recién nacido por transmisión con la leche materna. | Aplicación de los modelos toxicocinéticos | 65. | Los modelos toxicocinéticos son aplicables a diversos aspectos de la evaluación del riesgo y de los factores de riesgo, como cuando se trata de prever la exposición sistémica y la concentración alcanzada en los tejidos internos. Permiten valorar también aspectos concretos del modo de acción y constituyen una base para la extrapolación entre especies y el esclarecimiento de las vías de exposición, las pautas de administración y la evaluación del riesgo humano. En el desarrollo de modelos PBTK para una sustancia problema y una especie determinadas son de ayuda los siguientes datos: 1) coeficientes de reparto; 2) constantes bioquímicas y parámetros fisiológicos; 3) parámetros específicos de la vía de absorción, y 4) datos cinéticos in vivo para la evaluación del modelo [por ejemplo, valores de aclaramiento en las vías de excreción principales (> 10 %), Km y Vmáx para valorar el metabolismo]. Los datos experimentales que se tomen para el desarrollo del modelo han de basarse en métodos científicamente reconocidos, y los resultados del modelo deben ser validados. A menudo se determinan los parámetros específicos de la sustancia problema y de la especie, como la velocidad de absorción, el coeficiente de reparto entre sangre y tejidos y las constantes metabólicas, para facilitar el desarrollo de modelos no compartimentales o basados en la fisiología (7). | DATOS E INFORME | 66. | Es recomendable que el informe del estudio vaya acompañado de un índice. | Cuerpo principal del informe | 67. | El cuerpo principal del informe debe contener la información que se recoge en este método de ensayo, organizada en secciones y puntos de la manera siguiente: | Resumen | 68. | Esta sección del informe debe contener un resumen del diseño del estudio y una descripción de los métodos empleados. Debe destacar así mismo los principales resultados referentes al balance de masas, la naturaleza y magnitud de los metabolitos, los residuos en tejidos, la velocidad de eliminación, la capacidad de bioacumulación, las diferencias en función del sexo, etc. El resumen se presentará con el detalle suficiente para permitir la evaluación de los resultados. | Introducción | 69. | Esta sección del informe debe contener los objetivos del estudio, su justificación y diseño, así como cualquier información histórica o de referencia pertinente. | Material y métodos | 70. | En esta sección se hará una descripción pormenorizada de toda la información pertinente. | a) | Sustancia problema | Esta subsección debe facilitar la identificación de la sustancia problema: denominación química, estructura molecular, determinación cualitativa y cuantitativa de la composición química, pureza y, siempre que sea posible, tipo de impurezas y sus cantidades. Debe contener además información sobre propiedades fisicoquímicas tales como el estado físico, color, solubilidad macroscópica o coeficiente de partición, estabilidad y, en su caso, corrosividad. Cuando proceda, se facilitará información acerca de los isómeros. Si se trata de una sustancia radiomarcada, esta subsección debe contener además los siguientes datos: tipo de radionucleido, posición del marcador, actividad específica y pureza radioquímica. | Se indicará el tipo o la descripción de cualesquiera vehículo, diluyentes, agentes de suspensión, emulsionantes y demás productos empleados para la administración de la sustancia problema. | b) | Animales de ensayo | Esta subsección debe contener la información referente a los animales de ensayo, como la selección y justificación de la especie, cepa y edad al principio del estudio, el sexo y el peso corporal, el estado de salud y la zootecnia. | c) | Métodos | Esta subsección debe contener los pormenores del diseño del estudio y la metodología empleada. Debe incluir una descripción de: | 1) | la justificación de cualquier cambio de la vía o de las condiciones de exposición, cuando proceda; | 2) | la justificación para seleccionar los niveles o concentraciones de las dosis; | 3) | una descripción de los estudios piloto utilizados en el diseño experimental de los estudios de seguimiento, cuando proceda; se presentarán los datos que respalden el estudio piloto; | 4) | se describirá la forma de preparar la disolución de la dosis y, en su caso, el tipo de disolvente o vehículo; | 5) | el número de lotes o grupos de tratamiento y el número de animales por grupo; | 6) | las concentraciones y el volumen de las dosis (y la actividad específica de la dosis cuando sea radiactiva); | 7) | la(s) vía(s) y los métodos de administración; | 8) | la frecuencia de administración; | 9) | el período de ayuno (en su caso); | 10) | la radiactividad total por animal; | 11) | la manipulación de los animales; | 12) | la recogida y el tratamiento de las muestras; | 13) | los métodos analíticos aplicados a la separación, cuantificación e identificación de los metabolitos; | 14) | el límite de detección de los métodos empleados; | 15) | otros procedimientos y medidas experimentales empleados (entre ellos, la validación de los métodos de análisis de los metabolitos). | d) | Análisis estadístico | Si se hace un análisis estadístico de los resultados, el informe debe recoger información suficiente sobre el método y el programa informático empleados, de manera que un revisor o estadístico independiente pueda reevaluar y reconstruir el análisis. | En el caso de estudios de modelización de sistemas como el PBTK, la presentación de los modelos debe comprender una descripción de los mismos que permita su reconstrucción y validación independientes (véanse el punto 65 y la definiciones del apéndice): | Resultados | 71. | En esta sección se deben presentar todos los datos de manera descriptiva en el texto, así como resumidos y tabulados con la pertinente evaluación estadística. Los datos de recuento radiactivo deben resumirse y expresarse de forma adecuada a la naturaleza del estudio, habitualmente en microgramos o miligramos equivalentes por masa de muestra, aunque pueden usarse otras unidades. Esta sección debe contener ilustraciones gráficas de los resultados, una reproducción de los datos cromatográficos y espectrométricos representativos, la identificación y cuantificación de los metabolitos y las rutas metabólicas propuestas, acompañadas de la estructura molecular de los metabolitos. Debe contener además, cuando proceda, la siguiente información: | 1) | Recuperación absoluta y relativa de la radiactividad en orina, heces, aire espirado y líquidos de lavado (de orina y heces) de la jaula. | — | En los estudios dermatológicos, se incluirán también los datos de recuperación de la sustancia problema en la piel tratada y los lavados epidérmicos; y radiactividad residual en el dispositivo de cobertura de la piel y en la unidad metabólica, así como en los líquidos analizados del lavado epidérmico. Se ofrecen más observaciones en los puntos 74 a 77. | — | En los estudios de inhalación se incluirán también los datos de recuperación de la sustancia problema en los pulmones y tejidos nasales (8). Se ofrecen más observaciones en el punto 78. | 2) | Distribución en los tejidos, expresada en porcentaje de la dosis administrada y en concentración (microgramos equivalentes por gramo de tejido), y coeficiente de reparto tejidos-sangre o tejidos-plasma. | 3) | Se calculará el balance de masas en todos los estudios en que se valoren los tejidos corporales y las excretas. | 4) | Concentraciones plasmáticas y parámetros toxicocinéticos (biodisponibilidad, AUC, Cmáx, Tmáx, eliminación, semivida) medidos después de la administración por la vía o vías de exposición principales. | 5) | Velocidad y porcentaje de absorción de la sustancia problema después de su administración por la vía o vías de exposición principales. | 6) | Cantidades de la sustancia problema y de sus metabolitos (expresadas en porcentaje de la dosis administrada) que se recuperan en las excretas. | 7) | Referencias a los datos del apéndice que reflejan los resultados individuales de cada animal en todos los parámetros (dosis administrada, porcentaje de recuperación, concentraciones, parámetros toxicocinéticos, etc.). | 8) | representación gráfica de las rutas metabólicas propuestas y las estructuras moleculares de los metabolitos. | Discusión y conclusiones | 72. | En esta sección el autor o autores deben: | 1) | proponer una ruta metabólica hipotética basada en los resultados de metabolismo y eliminación de la sustancia problema; | 2) | comentar cualquier posible diferencia de eliminación y/o biotransformación de la sustancia problema en función de la especie y del sexo; | 3) | tabular y comentar la identificación y la cuantificación de los metabolitos, velocidades de eliminación, capacidad de bioacumulación y nivel residual en los tejidos del compuesto parental o de sus metabolitos y, en su caso, las posibles variaciones toxicocinéticas dependientes de la dosis; | 4) | incorporar a esta sección cualesquiera datos toxicocinéticos de interés que se hayan obtenido en el transcurso de los estudios de toxicidad; | 5) | presentar una conclusión concisa que esté respaldada por los resultados del estudio; | 6) | añadir las secciones que se juzguen necesarias o pertinentes. | 73. | Se pueden añadir secciones para adjuntar referencias bibliográficas, tablas, figuras, apéndices, etc. | VÍAS DE EXPOSICIÓN ALTERNATIVAS | Cutánea | Tratamiento cutáneo | 74. | En esta sección se recoge información específicamente relacionada con la investigación toxicocinética de la sustancia problema por vía cutánea. La absorción cutánea se describe en el capítulo B.44 de este anexo [Absorción cutánea: método in vivo (9)]. Para otros parámetros como los relacionados con la distribución y el metabolismo puede aplicarse este método de ensayo B.36. En el tratamiento cutáneo se aplican una o más concentraciones de la sustancia problema. La sustancia problema (material puro, diluido o formulado que contiene la sustancia problema y que se aplica a la piel) debe ser la misma (o un análogo realista) que aquella a la que pudiera verse expuesto el hombre u otra posible especie diana. Las dosis deben seleccionarse de conformidad con los puntos 20-26 de este método de ensayo. En la selección de la dosis cutánea se tendrán en cuenta factores como la exposición humana previsible y las concentraciones a las que se haya observado toxicidad en otros estudios de toxicidad cutánea. La dosis cutánea se disolverá, si es preciso, en un vehículo adecuado y se aplicará en el volumen necesario para liberar la dosis prevista. Antes de proceder a la aplicación, se recorta el pelo de la región dorsal del tronco de los animales. Se puede recurrir al rasurado, pero, en este caso, debe efectuarse unas 24 horas antes del ensayo. En ambos casos hay que cuidar de no lesionar la piel, lo que podría alterar su permeabilidad. Deberá dejarse despejada, para la aplicación de la sustancia problema, una superficie equivalente aproximadamente al 10 % de la corporal. Cuando se trata de sustancias muy tóxicas, la superficie despejada puede ser inferior al 10 %, pero deberá cubrirse en todo lo posible con una capa delgada y uniforme del producto. En todos los grupos de tratamiento cutáneo se tratará una superficie de piel de la misma extensión. Las zonas tratadas se protegerán con un apósito bien sujeto. Los animales se enjaularán por separado. | 75. | Debe hacerse un estudio de lavado epidérmico para evaluar la fracción de la dosis de sustancia química aplicada que se puede eliminar de la piel lavando la zona tratada con agua y un jabón suave. Este estudio puede servir también para establecer el balance de masas cuando la sustancia problema se administra por vía cutánea. En el estudio de lavado epidérmico se aplica una dosis única de la sustancia problema a dos animales. La selección de la dosis se hará de conformidad con el punto 23 de este método de ensayo (véase también el tiempo de contacto epidérmico en el punto 76). Se determinan las cantidades de la sustancia problema que se recuperan en los líquidos de lavado, a fin de evaluar la eficacia con que dicho lavado elimina la sustancia de la piel. | 76. | Salvo que sea corrosiva, la sustancia problema se aplica y mantiene sobre la piel durante un tiempo mínimo de 6 horas. En el momento de retirar el apósito, la zona tratada se lava siguiendo el procedimiento descrito en el estudio de lavado epidérmico (véase el punto 75). Se analizará el contenido de sustancia residual en el apósito y en los líquidos de lavado. Al concluir la investigación, se sacrificará cada animal de manera compasiva, de conformidad con (2), y se le retirará la piel tratada. Se prepara debidamente un corte de piel tratada para analizarlo y valorar la sustancia (radiactividad) residual. | 77. | En la evaluación toxicocinética de los productos farmacéuticos puede ser necesario aplicar diversos procedimientos, de conformidad con el marco regulador apropiado. | Inhalación | 78. | Se emplea una concentración única (o más, si es necesario) de la sustancia problema. Las concentraciones deben seleccionarse de conformidad con los puntos 20-26 de este método de ensayo. Los tratamientos de inhalación deben hacerse con un equipo inhalador de "cono nasal" o de "solo la cabeza" para evitar la absorción por otras vías (8). Si las condiciones de exposición son otras, habrá que justificar y documentar los cambios. Se definirá el tiempo de inhalación; es habitual una exposición de 4-6 horas. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris. | (2) | OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris. | (3) | Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81. | (4) | Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40. | (5) | Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411. | (6) | Capítulo B.45 del presente anexo. Absorción cutánea: método in vitro. | (7) | IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Capítulo B.44 del presente anexo. Absorción cutánea: método in vivo. | (10) | Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (11) | Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York. | Apéndice | DEFINICIONES | Absorción : conjunto de procesos por los que una sustancia pasa a los tejidos orgánicos. El término se refiere a la absorción del compuesto parental y de todos sus metabolitos. No debe confundirse con la "biodisponibilidad". | Absorción oral : porcentaje de la dosis de sustancia que es absorbido en el lugar de administración (es decir, el aparato digestivo). Este importante parámetro sirve para conocer la fracción de la sustancia química administrada que llega a la vena porta y, posteriormente, al hígado. | Acumulación : (bioacumulación)aumento del contenido de una sustancia en los tejidos a lo largo del tiempo (generalmente en el tejido adiposo y por administración continuada); si la velocidad a la que penetra una sustancia en el organismo es superior a la velocidad con que se elimina, la sustancia se acumula en el organismo y puede alcanzar concentraciones tóxicas. | ADME : siglas de "Absorción, Distribución, Metabolismo y Excreción". | AUC : (área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo): área bajo la curva que resulta de representar la concentración plasmática de una sustancia problema en función del tiempo. Representa la cantidad total de la sustancia problema que ha absorbido el organismo en un período establecido. En condiciones de linealidad, el AUC (desde el tiempo cero al infinito) es proporcional a la cantidad total de la sustancia problema que absorbe el organismo, independientemente de cuál sea la velocidad de absorción. | Autorradiografía : (autorradiografía de cuerpo entero): empleada para determinar cualitativa o cuantitativamente la localización de una sustancia química radiactiva en los tejidos, esta técnica se vale de las imágenes de rayos X o, más recientemente, de la fluoroscopia digital para visualizar moléculas (o fragmentos de moléculas) marcadas radiactivamente registrando la radiación emitida en la víscera o tejido que se desea estudiar. Comparada con la disección de órganos, la autorradiografía cuantitativa de cuerpo entero puede aportar ciertas ventajas para valorar la distribución de la sustancia problema, la recuperación total y la resolución del material radiactivo en los tejidos. Otra ventaja importante es que se puede aplicar a un modelo animal pigmentado para valorar la posible asociación de la sustancia problema con la melanina, capaz de unirse a ciertas moléculas. No obstante, y aunque puede facilitar una interesante visión global de los sitios de unión de alta capacidad y baja afinidad, esta técnica tendría limitaciones para reconocer regiones diana específicas, como los sitios de unión a receptores, para cuya detección se precisa una resolución relativamente alta y una elevada sensibilidad. Cuando se usa la autorradiografía deben realizarse, en un grupo aparte o en un estudio separado del ensayo de distribución en los tejidos, investigaciones para determinar el balance de masas del compuesto administrado, en las que todas las excretas (con la posible inclusión del aire espirado) y los restos del cuerpo de los animales sean homogeneizados y analizados con contador de centelleo líquido. | Autorradiografía microscópica de receptores : (o microautorradiografía): técnica que puede servir para comprobar la interacción de una sustancia xenobiótica con poblaciones celulares o sitios específicos de los tejidos, como en el caso de las investigaciones de la unión a los receptores o de los mecanismos de acción específicos, donde se precisan una resolución y una sensibilidad elevadas que no se consiguen con otras técnicas como la autorradiografía de cuerpo entero. | Balance de masas : expresa la cantidad de sustancia que entra y sale del sistema. | Balance de materia : véase "balance de masas". | Bioacumulación : véase "Acumulación". | Biodisponibilidad : fracción de la dosis administrada que pasa a la circulación sistémica o está disponible en los tejidos para ejercer su actividad fisiológica. Frecuentemente, la biodisponibilidad de una sustancia se refiere al compuesto parental, pero también puede referirse a su metabolito. Tiene en cuenta solamente una forma química. Nota bene: no confundir biodisponibilidad con absorción. Así, la diferencia entre la absorción oral (contenido de la sustancia en la mucosa intestinal y en la circulación portal) y la biodisponibilidad (contenido en la sangre circulante y en los tejidos) puede deberse, entre otros factores, a: 1) la degradación química efectuada por digestión en la mucosa intestinal, 2) la circulación enterohepática que devuelve parte de la sustancia a la luz intestinal, o 3) el metabolismo hepático de primer paso (10). La biodisponibilidad del componente tóxico (compuesto parental o metabolito) es un parámetro esencial en la evaluación del riesgo humano (extrapolación entre dosis altas y bajas, o entre distintas vías), ya que permite obtener un valor interno partiendo de los valores de NOAEL o BMD (dosis administrada), que son externos. Para evaluar los efectos hepáticos que siguen a una administración oral, basta con conocer la absorción oral. En cambio, cuando se estudian los efectos en lugares distintos de la vía de entrada, la biodisponibilidad es en general un parámetro más fiable que la absorción para evaluar el riesgo. | Biopersistencia : véase "persistencia". | Biotransformación : conversión química (generalmente enzimática) de la sustancia de interés en un producto diferente, que tiene lugar en el organismo. Es sinónimo de "metabolismo". | Cmáx : concentración máxima (pico) en sangre (plasma o suero), o bien excreción máxima (pico) en orina y heces, que se produce después de la administración. | Coeficiente de reparto : también llamado coeficiente de distribución, es una medida de la solubilidad diferencial de una sustancia en dos solventes. | Compartimento : parte (o unidad) estructural o bioquímica de un organismo, tejido o célula que puede diferenciarse del resto. | Concentración máxima (pico) en sangre (plasma o suero) : máxima concentración (o pico) que se alcanza en la sangre (plasma o suero) después de administrar una sustancia (véase también "Cmáx"). | Concentraciones sanguíneas (plasmáticas) en estado estacionario : estado de no equilibrio de un sistema abierto, en el que todas las fuerzas que actúan sobre él están exactamente contrarrestadas por fuerzas opuestas de manera tal que todos sus componentes se hallan en concentración estacionaria pese a que fluye materia a través del sistema. | Correlación o "read across" : método por el cual se toman los datos conocidos de una variable en respuesta a una o varias sustancias para predecir el comportamiento de esa variable en respuesta a la sustancia problema. | Distribución : dispersión de una sustancia problema y de sus metabolitos por todo el organismo. | Distribución en los tejidos : movimiento reversible de una sustancia problema por los distintos tejidos orgánicos. La distribución en los tejidos se puede estudiar mediante disección de órganos, homogeneización, combustión y recuento de centelleo líquido, o mediante autorradiografía cualitativa y cuantitativa del cuerpo entero. El primer método resulta válido para obtener la concentración y el porcentaje de recuperación en los tejidos y en el resto del cuerpo de un mismo animal, pero puede no alcanzar resolución adecuada en todos los tejidos y puede arrojar una recuperación total inferior a de lo deseable (< 90 %). Consúltense más arriba las definiciones del segundo método. | Enzimas/isoenzimas : proteínas que catalizan las reacciones bioquímicas. Las isoenzimas son enzimas que catalizan reacciones bioquímicas semejantes, pero que presentan secuencias de aminoácidos diferentes. | Excreción biliar : excreción que tiene lugar a través de los conductos biliares. | Excreción : conjunto de procesos por los que una sustancia administrada y/o sus metabolitos son eliminados del organismo. | Exógeno : generado o introducido desde fuera del organismo o sistema orgánico. | Extrapolación : método por el que se infiere uno o más valores desconocidos a partir de otros conocidos u observados. | Inducción enzimática : síntesis enzimática que se produce como respuesta a un estímulo ambiental o una molécula inductora. | Linealidad/cinética lineal : un proceso tiene una cinética lineal cuando todos los intercambios entre compartimentos se producen a una velocidad proporcional a la concentración o cantidad presente; es una cinética de primer orden. En consecuencia, los volúmenes de eliminación y distribución son constantes, al igual que la semivida. Las concentraciones alcanzadas son proporcionales al nivel de dosis (exposición) y la acumulación es más facil de predecir. La existencia o no de linealidad se puede determinar comparando los parámetros oportunos, como el AUC, después de administrar dosis diferentes o después de exposiciones únicas y repetidas. La falta de dependencia de la dosis puede indicar saturación de las enzimas que intervienen en el metabolismo del compuesto; un aumento del AUC después de la exposición continuada en comparación con la exposición única puede indicar inhibición del metabolismo; y una disminución del AUC puede indicar, a su vez, inducción del metabolismo [véase también (11)]. | Mecanismo (modo) de toxicidad/mecanismo (modo) de acción : por mecanismo de acción se entienden las interacciones bioquímicas específicas por las que una sustancia química produce su efecto. Por modo de acción se entienden las principales rutas o vías más generales por las que una sustancia llega a producir su efecto (o toxicidad). | Metabolismo : es sinónimo de "biotransformación". | Metabolitos : productos del metabolismo o de los procesos metabólicos. | Modelización de sistemas (toxicocinética basado en la fisiología, basada en la farmacocinética, farmacocinética basada en la fisiología, basada en la biología, etc.): modelo abstracto que aplica el lenguaje matemático para describir el comportamiento de un sistema. | Parámetros enzimáticos : Km (constante de Michaelis) y Vmáx (velocidad máxima). | Persistencia (biopersistencia) : presencia prolongada de una sustancia en un sistema biológico debido a que resiste la degradación/eliminación. | Saturación : estado en virtud del cual uno o varios procesos cinéticos (absorción, metabolismo o eliminación) se encuentran en su límite máximo, es decir, saturados. | Semivida (t1/2) : tiempo necesario para que la concentración de una sustancia se reduzca a la mitad en un compartimento dado. Normalmente se refiere a la concentración plasmática o a la cantidad de sustancia en todo el organismo. | Sensibilidad : capacidad de un método o instrumento para reflejar pequeñas diferencias en el grado de respuesta de una variable de interés. | Sustancia problema : cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este método de ensayo. | Tejido diana : tejido en el que se manifiesta el efecto adverso principal de un agente tóxico. | Tmáx : tiempo que se tarda en alcanzar la Cmáx. | Toxicocinética (farmacocinética): estudio de los procesos de absorción, distribución, metabolismo y excreción de las sustancias a lo largo del tiempo. | Validación de los modelos : proceso por el cual se evalúa la adecuación de un modelo para describir de manera coherente los datos toxicocinéticos disponibles. Los modelos se pueden evaluar mediante comparación visual y estadística de las predicciones del modelo con los valores experimentales obtenidos para una variable independiente común (por ejemplo, el tiempo). Se ha de justificar la magnitud de la evaluación en relación con el uso que se pretende dar al modelo. | Velocidad (o tasa) de aclaramiento : es una medida cuantitativa de la cantidad de una sustancia problema que se elimina de la sangre, el plasma o un determinado tejido por unidad de tiempo. | Vía de administración (oral, i.v., cutánea, inhalatoria, etc.): medio por el cual se administran las sustancias químicas al organismo (por ejemplo, por vía oral con los alimentos o mediante sonda gástrica, por inyección intravenosa, por vía cutánea a través de la piel, por inhalación con el aire aspirado, etc.). | Vías de destoxificación : conjunto de procesos que llevan a la eliminación de las sustancias tóxicas del organismo, ya sea por degradación metabólica o por excreción. | » |
| (8) | Chapter B.52 is added: | ‘B.52. ACUTE INHALATION TOXICITY — ACUTE TOXIC CLASS METHOD | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 436 (2009). The first acute inhalation TG 403 was adopted in 1981, and has since been revised (see chapter B.2 of this Annex (1)). Development of an Inhalation Acute Toxic Class (ATC) method (2) (3) (4) was considered appropriate following the adoption of the revised oral ATC method (chapter B.1 tris of this Annex) (5). A retrospective performance assessment of the ATC test method for acute inhalation toxicity showed that the method is suitable for being used for Classification and Labelling purposes (6). The inhalation ATC Test Method will allow the use of serial steps of fixed target concentrations to provide a ranking of test chemical toxicity. Lethality is used as key endpoint, however, animals in severe pain or distress, suffering or impending death should be humanely killed to minimise suffering. Guidance on humane endpoints is available in the OECD Guidance Document No 19 (7). | 2. | Guidance on the conduct and interpretation of this Test Method can be found in the Guidance Document No 39 on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39) (8). | 3. | Definitions used in the context of this Test Method are provided in Appendix 1 and in GD 39 (8). | 4. | The Test Method provides information on the hazardous properties and allows the test chemical to be ranked and classified according to the Regulation (EC) No 1272/2008 for the classification of chemicals that cause acute toxicity (9). In case point estimates of LC50-values or concentration-response analyses are required, chapter B.2 of this Annex (1) is the appropriate Test Method to use. Further guidance on Test Method selection can be found in GD 39 (8). This Test Method is not specially intended for the testing of specialized materials, such as poorly soluble isometric or fibrous materials or manufactured nanomaterials. | INITIAL CONSIDERATIONS | 5. | Before considering testing in accordance with this Test Method, all available information on the test chemical, including existing studies whose data would support not doing additional testing should be considered by the testing laboratory in order to minimize animal usage. Information that may assist in the selection of the most appropriate species, strain, sex, mode of exposure and appropriate test concentrations include the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally related chemicals. Concentrations that are expected to cause severe pain and distress, due to corrosive (4) or severely irritant actions, should not be tested with this Test Method [see GD 39 (8)]. | PRINCIPLE OF THE TEST | 6. | It is the principle of the test that based on a stepwise procedure, sufficient information is obtained on the acute inhalation toxicity of the test chemical during an exposure period of 4 hours to enable its classification. Other durations of exposure may apply to serve specific regulatory purposes. At any of the defined concentration steps, 3 animals of each sex are tested. Depending on the mortality and/or the moribund status of the animals, 2 steps may be sufficient to allow judgement on the acute toxicity of the test chemical. If evidence is provided that one sex is more susceptible than the other, then the test may be continued with the more susceptible sex only. The outcome of the previous step will determine the following step such that: | a) | No further testing is needed, | b) | Testing of three animals per sex, or | c) | Testing with 6 animals of the more susceptible sex only i.e. the lower boundary estimates of the toxic class should be based on 6 animals per test concentration group, regardless of sex. | 7. | Moribund animals or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress should be humanely killed, and are considered in the interpretation of the test results in the same way as animals that died on test. Criteria for making the decision to kill moribund or severely suffering animals, and guidance on the recognition of predictable or impending death, are the subject of Guidance Document No 19 on Humane Endpoints (7). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 8. | Healthy young adult animals of commonly used laboratory strains should be used. The preferred species is the rat and justifications should be provided if other species are used. | Preparation of animals | 9. | Females should be nulliparous and non-pregnant. On the exposure day, animals should be young adults 8 to 12 weeks of age, and body weights should be within ± 20 % of the mean weight for each sex of any previously exposed animals at the same age. The animals are randomly selected, marked for individual identification. The animals are kept in their cages for at least 5 days prior to the start of the test to allow for acclimatisation to laboratory conditions. Animals should also be acclimatised to the test apparatus for a short period prior to testing, as this will lessen the stress caused by introduction to the new environment. | Animal husbandry | 10. | The temperature of the experimental animal maintenance room should be 22 ± 3 °C. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, though this may not be possible when using water as a vehicle. Before and after exposures, animals generally should be caged in groups by sex and concentration, but the number of animals per cage should not interfere with clear observation of each animal and should minimise losses due to cannibalism and fighting. When animals are to be exposed nose-only, it may be necessary for them to be acclimated to the restraining tubes. The restraining tubes should not impose undue physical, thermal, or immobilisation stress on the animals. Restraint may affect physiological endpoints such as body temperature (hyperthermia) and/or respiratory minute volume. If generic data are available to show that no such changes occur to any appreciable extent, then pre-adaptation to the restraining tubes is not necessary. Animals exposed whole-body to an aerosol should be housed individually during exposure to prevent them from filtering the test aerosol through the fur of their cage mates. Conventional and certified laboratory diets may be used, except during exposure, accompanied with an unlimited supply of municipal drinking water. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light/12 hours dark. | Inhalation chambers | 11. | The nature of the test chemical and the objective of the test should be considered when selecting an inhalation chamber. The preferred mode of exposure is nose-only (which term includes head-only, nose-only or snout-only). Nose-only exposure is generally preferred for studies of liquid or solid aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. Special objectives of the study may be better achieved by using a whole-body mode of exposure, but this should be justified in the study report. To ensure atmosphere stability when using a whole-body chamber, the total volume of the test animals should not exceed 5 % of the chamber volume. Principles of the nose-only and whole body exposure techniques and their particular advantages and disadvantages are described in GD 39 (8). | EXPOSURE CONDITIONS | Administrations of concentrations | 12. | A fixed duration of exposure for four hours, excluding equilibration time, is recommended. Other durations may be needed to meet specific requirements, however, justification should be provided in the study report [see GD 39 (8)]. Animals exposed in whole-body chambers should be housed individually to prevent ingestion of test chemical due to grooming of cage mates. Feed should be withheld during the exposure period. Water may be provided throughout a whole-body exposure. | 13. | Animals are exposed to the test chemical as a gas, vapour, aerosol, or a mixture thereof. The physical state to be tested depends on the physico-chemical properties of the test chemical, the selected concentration, and/or the physical form most likely present during the handling and use of the test chemical. Hygroscopic and chemically reactive test chemicals should be tested under dry air conditions. Care should be taken to avoid generating explosive concentrations. | Particle-size distribution | 14. | Particle sizing should be performed for all aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. To allow for exposure of all relevant regions of the respiratory tract, aerosols with mass median aerodynamic diameters (MMAD) ranging from 1 to 4 μm with a geometric standard deviation (σg) in the range of 1,5 to 3,0 are recommended (8) (13) (14). Although a reasonable effort should be made to meet this standard, expert judgment should be provided if it cannot be achieved. For example, metal fumes may be smaller than this standard, and charged particles, fibres, and hygroscopic materials (which increase in size in the moist environment of the respiratory tract) may exceed this standard. | Test chemical preparation in a vehicle | 15. | A vehicle may be used to generate an appropriate concentration and particle size of the test chemical in the atmosphere. As a rule, water should be given preference. Particulate material may be subjected to mechanical processes to achieve the required particle size distribution, however, care should be taken not to decompose or alter the test chemical. In cases where mechanical processes are believed to have altered test chemical composition (e.g. extreme temperature from excessive milling due to friction), the composition of the test chemical should be verified analytically. Adequate care should be taken to not contaminate the test chemical. It is not necessary to test non-friable granular materials which are purposefully formulated to be un-inhalable. An attrition test should be used to demonstrate that respirable particles are not produced when the granular material is handled. If an attrition test produces respirable particles, an inhalation toxicity test should be performed. | Control animals | 16. | A concurrent negative (air) control group is not necessary. When a vehicle other than water is used to assist in generating the test atmosphere, a vehicle control group should only be used when historical inhalation toxicity data are not available. If a toxicity study of a test chemical formulated in a vehicle reveals no toxicity, it follows that the vehicle is non-toxic at the concentration tested; thus, there is no need for a vehicle control. | MONITORING OF EXPOSURE CONDITIONS | Chamber airflow | 17. | The flow of air through the chamber should be carefully controlled, continuously monitored, and recorded at least hourly during each exposure. The monitoring of test atmosphere concentration (or stability) is an integral measurement of all dynamic parameters and provides an indirect means to control all relevant dynamic atmosphere generation parameters. Special consideration should be given to avoiding re-breathing in nose-only chambers in cases where airflow through the exposure system are inadequate to provide dynamic flow of test chemical atmosphere. There are prescribed methodologies that can be used to demonstrate that re-breathing does not occur under the selected operation conditions (8) (15). Oxygen concentration should be at least 19 % and carbon dioxide concentration should not exceed 1 %. If there is reason to believe that these standards cannot be met, oxygen and carbon dioxide concentrations should be measured. | Chamber temperature and relative humidity | 18. | Chamber temperature should be maintained at 22 ± 3 °C. Relative humidity in the animals’ breathing zone, for both nose-only and whole-body exposures, should be monitored and recorded at least three times for durations up to 4 hrs, and hourly for shorter durations. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, but this may either be unattainable (e.g. when testing water based mixtures) or not measurable due to test chemical interference with the test method. | Test chemical: nominal concentration | 19. | Whenever feasible, the nominal exposure chamber concentration should be calculated and recorded. The nominal concentration is the mass of generated test chemical divided by the total volume of air passed through the chamber system. The nominal concentration is not used to characterise the animals’ exposure, but a comparison of the nominal and the actual concentration gives an indication of the generation efficiency of the test system, and thus may be used to discover generation problems. | Test chemical: actual concentration | 20. | The actual concentration is the test chemical concentration at the animals’ breathing zone in an inhalation chamber. Actual concentrations can be obtained either by specific methods (e.g. direct sampling, adsorptive or chemical reactive methods, and subsequent analytical characterisation) or by non-specific methods such as gravimetric filter analysis. The use of gravimetric analysis is acceptable only for single component powder aerosols or aerosols of low volatility liquids and should be supported by appropriate pre-study test chemical-specific characterisations. Multi-component powder aerosol concentration may also be determined by gravimetric analysis. However, this requires analytical data which demonstrate that the composition of airborne material is similar to the starting material. If this information is not available, a reanalysis of the test chemical (ideally in its airborne state) at regular intervals during the course of the study may be necessary. For aerosolised agents that may evaporate or sublimate, it should be shown that all phases were collected by the method chosen. The target, nominal, and actual concentrations should be provided in the study report, but only actual concentrations are used in statistical analyses to calculate lethal concentration values. | 21. | One lot of the test chemical should be used, if possible, and the test sample should be stored under conditions that maintain its purity, homogeneity, and stability. Prior to the start of the study, there should be a characterisation of the test chemical, including its purity and, if technically feasible, the identity, and quantities of identified contaminants and impurities. This can be demonstrated by, but is not limited to, the following data: retention time and relative peak area, molecular weight from mass spectroscopy or gas chromatography analyses, or other estimates. Although the test sample’s identity is not the responsibility of the test laboratory, it may be prudent for the test laboratory to confirm the sponsor’s characterisation at least in a limited way (e.g. colour, physical nature, etc.). | 22. | The exposure atmosphere shall be held as constant as practicable and monitored continuously and/or intermittently depending on the method of analysis. When intermittent sampling is used, chamber atmosphere samples should be taken at least twice in a four hour study. If not feasible due to limited air flow rates or low concentrations, one sample may be collected over the entire exposure period. If marked sample-to-sample fluctuations occur, the next concentrations tested should use four samples per exposure. Individual chamber concentration samples should not deviate from the mean chamber concentration by more than ± 10 % for gases and vapours, and by no more than ± 20 % for liquid or solid aerosols. Time to chamber equilibration (t95) should be calculated and recorded. The duration of an exposure spans the time that the test chemical is generated and this takes into account the times required to attain t95. Guidance for estimating t95 can be found in GD 39 (8). | 23. | For very complex mixtures consisting of vapours/gases, and aerosols (e.g. combustion atmospheres and test chemicals propelled from purpose-driven end-use products/devices), each phase may behave differently in an inhalation chamber so at least one indicator substance (analyte), normally the principal active substance in the mixture, of each phase (vapour/gas and aerosol) should be selected. When the test chemical is a mixture, the analytical concentration should be reported for the total mixture and not just for the active ingredient or the component (analyte). Additional information regarding actual concentrations can be found in GD 39 (8). | Test chemical: particle size distribution | 24. | The particle size distribution of aerosols should be determined at least twice during each 4 hour exposure by using a cascade impactor or an alternative instrument such as an aerodynamic particle sizer. If equivalence of the results obtained by a cascade impactor or an alternative instrument can be shown, then the alternative instrument may be used throughout the study. A second device, such as a gravimetric filter or an impinger/gas bubbler, should be used in parallel to the primary instrument to confirm the collection efficiency of the primary instrument. The mass concentration obtained by particle size analysis should be within reasonable limits of the mass concentration obtained by filter analysis [see GD 39 (8)]. If equivalence can be demonstrated in the early phase of the study, then further confirmatory measurements may be omitted. For animal welfare reasons, measures should be taken to minimize inconclusive data which may lead to a need to repeat an exposure. Particle sizing should be performed for vapours if there is any possibility that vapour condensation may result in the formation of an aerosol, or if particles are detected in a vapour atmosphere with potential for mixed phases (see paragraph 14). | PROCEDURE | Main test | 25. | Three animals per sex, or six animals of the more susceptible sex, are used for each step. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. The concentration level to be used as the starting dose is selected from one of four fixed levels and the starting concentration level should be that which is most likely to produce toxicity in some of the dosed animals. The testing schemes for gases, vapours and aerosols (included in Appendixes2-4) represent the testing with the cut-off values of the CLP categories 1-4 (9) for gases (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (Appendix 2), for vapours (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (Appendix 3) and for aerosols (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (Appendix 4). Category 5, which is not implemented in Regulation (EC) No 1272/2008 (9) relates to concentrations above the respective limit concentrations. For each starting concentration, the respective testing scheme applies. Depending on the number of humanely killed or dead animals, the test procedure follows the indicated arrows until a categorisation can be made. | 26. | The time interval between exposure groups is determined by the onset, duration, and severity of toxic signs. Exposure of animals at the next concentration level should be delayed until there is reasonable confidence in the survival of the previously tested animals. A period of three or four days between the exposures at each concentration level is recommended to allow for the observation of delayed toxicity. The time interval may be adjusted as appropriate, e.g. in case of inconclusive responses. | Limit test | 27. | The limit test is used when the test chemical is known or expected to be virtually non-toxic, i.e. eliciting a toxic response only above the regulatory limit concentration. Information about the toxicity of the test chemical can be gained from knowledge about similar tested substances or similar mixtures, taking into consideration the identity and percentage of components known to be of toxicological significance. In those situations where there is little or no information about its toxicity, or the test chemical is expected to be toxic, the main test should be performed [further guidance can be found in GD 39 (8)]. | 28. | Using the normal procedure, three animals per sex, or six animals of the more susceptible sex, are exposed at concentrations of 20 000 ppm for gases, 20 mg/l for vapours and 5 mg/l for dusts/mists, respectively (if achievable), which serves as the limit test for this Test Method. When testing aerosols, the primary goal should be to achieve a respirable particle size (i.e. an MMAD of 1-4 μm). This is possible with most test chemicals at a concentration of 2 mg/l Aerosol testing at greater than 2 mg/l should only be attempted if a respirable particle size can be achieved [see GD 39 (8)]. In accordance with GHS (16), testing in excess of a limit concentration is discouraged for animal welfare reasons. Testing in GHS Category 5 (16), which is not implemented in Regulation (EC) No 1272/2008 (9), should only be considered when there is a strong likelihood that results of such a test would have direct relevance for protecting human health, and justification provided in the study report. In the case of potentially explosive test chemicals, care should be taken to avoid conditions favourable for an explosion. To avoid an unnecessary use of animals, a test run without animals should be conducted prior to the limit test to ensure that the chamber conditions for a limit test can be achieved. | OBSERVATIONS | 29. | The animals should be clinically observed frequently during the exposure period. Following exposure, clinical observations should be made at least twice on the day of exposure, or more frequently when indicated by the response of the animals to treatment, and at least once daily thereafter for a total of 14 days. The length of the observation period is not fixed, but should be determined by the nature and time of onset of clinical signs and length of the recovery period. The times at which signs of toxicity appear and disappear are important, especially if there is a tendency for signs of toxicity to be delayed. All observations are systematically recorded with individual records being maintained for each animal. Animals found in a moribund condition and animals showing severe pain and/or enduring signs of severe distress should be humanely killed for animal welfare reasons. Care should be taken when conducting examinations for clinical signs of toxicity that initial poor appearance and transient respiratory changes, resulting from the exposure procedure, are not mistaken for treatment-related effects. The principles and criteria summarised in the Humane Endpoints Guidance Document should be taken into consideration (7). When animals are killed for humane reasons or found dead, the time of death should be recorded as precisely as possible. | 30. | Cage-side observations should include changes in the skin and fur, eyes and mucous membranes, and also respiratory, circulatory, autonomic and central nervous systems, and somato-motor activity and behaviour patterns. When possible, any differentiation between local and systemic effects should be noted. Attention should be directed to observations of tremors, convulsions, salivation, diarrhoea, lethargy, sleep and coma. The measurement of rectal temperatures may provide supportive evidence of reflex bradypnea or hypo/hyperthermia related to treatment or confinement. | Body weights | 31. | Individual animal weights should be recorded once during the acclimatisation period, on the day of exposure prior to exposure (day 0) and at least on days 1, 3 and 7 (and weekly thereafter), and at the time of death or euthanasia if exceeding day 1. Body weight is recognised as a critical indicator of toxicity and animals exhibiting a sustained decrement of ≥ 20 %, compared to pre-study values, should be closely monitored. Surviving animals are weighed and humanely killed at the end of the post-exposure period. | Pathology | 32. | All test animals, including those which die during the test or are euthanised and removed from the study for animal welfare reasons, should be subjected to gross necropsy. If necropsy cannot be performed immediately after a dead animal is discovered, the animal should be refrigerated (not frozen) at temperatures low enough to minimize autolysis. Necropsies should be performed as soon as possible, normally within a day or two. All gross pathological changes should be recorded for each animal with particular attention to any changes in the respiratory tract. | 33. | Additional examinations included a priori by design may be considered to extend the interpretive value of the study, such as measuring lung weight of surviving rats and/or providing evidence of irritation by microscope examination of the respiratory tract. Examined organs may include those showing evidence of gross pathology in animals surviving 24 or more hours, and organs known or expected to be affected. Microscopic examination of the entire respiratory tract may provide useful information for test chemicals that are reactive with water, such as acids and hygroscopic test chemicals. | DATA AND REPORTING | Data | 34. | Individual animal data on body weights and necropsy findings should be provided. Clinical observation data should be summarised in tabular form, showing for each test group the number of animals used, the number of animals displaying specific signs of toxicity, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons, time of death of individual animals, a description and time course of toxic effects and reversibility, and necropsy findings. | Test report | 35. | The test report should include the following information, as appropriate: | | Test animals and husbandry | — | Description of caging conditions, including: number (or change in number) of animals per cage, bedding material, ambient temperature and relative humidity, photoperiod, and identification of diet; | — | Species/strain used and justification for using a species other than the rat; | — | Number, age, and sex of animals; | — | Method of randomisation; | — | Details of food and water quality (including diet type/source, water source); | — | Description of any pre-test conditioning including diet, quarantine, and treatment for disease; | | Test chemical | — | Physical nature, purity, and, where relevant, physico-chemical properties (including isomerisation); | — | Identification data and Chemical Abstract Services (CAS) Registry Number, if known; | | Vehicle | — | Justification for use of vehicle and justification for choice of vehicle (if other than water); | — | Historical or concurrent data demonstrating that the vehicle does not interfere with the outcome of the study; | | Inhalation chamber | — | Description of the inhalation chamber including dimensions and volume; | — | Source and description of equipment used for the exposure of animals as well as generation of atmosphere; | — | Equipment for measuring temperature, humidity, particle-size, and actual concentration; | — | Source of air, treatment of air supplied/extracted and system used for conditioning; | — | Methods used for calibration of equipment to ensure a homogeneous test atmosphere; | — | Pressure difference (positive or negative); | — | Exposure ports per chamber (nose-only); location of animals in the system (whole-body); | — | Temporal homogeneity/stability of test atmosphere; | — | Location of temperature and humidity sensors and sampling of test atmosphere in the chamber; | — | Air flow rates, air flow rate/exposure port (nose-only), or animal load/chamber (whole-body); | — | Information about the equipment used to measure oxygen and carbon dioxide, if applicable; | — | Time required to reach inhalation chamber equilibrium (t95); | — | Number of volume changes per hour; | — | Metering devices (if applicable); | | Exposure data | — | Rationale for target concentration selection in the main study; | — | Nominal concentrations (total mass of test chemical generated into the inhalation chamber divided by the volume of air passed through the chamber); | — | Actual test chemical concentrations collected from the animals’ breathing zone; for test mixtures that produce heterogeneous physical forms (gases, vapours, aerosols), each may be analysed separately; | — | All air concentrations should be reported in units of mass (e.g. mg/l, mg/m3, etc.), units of volume (e.g. ppm, ppb) may also be reported parenthetically; | — | Particle size distribution, mass median aerodynamic diameter (MMAD), and geometric standard deviation (σg), including their methods of calculation. Individual particle size analyses should be reported; | | Test conditions | — | Details of test chemical preparation, including details of any procedures used to reduce the particle size of solid substances or to prepare solutions of the test chemical. In cases where mechanical processes may have altered test chemical composition, include the results of analyses to verify the composition of the test chemical; | — | A description (preferably including a diagram) of the equipment used to generate the test atmosphere and to expose the animals to the test atmosphere; | — | Details of the chemical analytical method used and method validation (including efficiency of recovery of test chemical from the sampling medium); | — | The rationale for the selection of test concentrations; | | Results | — | Tabulation of chamber temperature, humidity, and airflow; | — | Tabulation of chamber nominal and actual concentration data; | — | Tabulation of particle size data including analytical sample collection data, particle size distribution, and calculations of the MMAD and σg; | — | Tabulation of response data and concentration level for each animal (i.e. animals showing signs of toxicity including mortality, nature, severity, and duration of effects); | — | Individual body weights of animals collected on study days, date and time of death if prior to scheduled euthanasia; time course of onset of signs of toxicity, and whether these were reversible for each animal; | — | Necropsy findings and histopathological findings for each animal, if available; | — | The CLP category classification and the LC50 cut-off value; | | Discussion and interpretation of results | — | Particular emphasis should be made to the description of methods used to meet this Test Method’s criteria, e.g. the limit concentration or the particle size; | — | The respirability of particles in light of the overall findings should be addressed, especially if the particle-size criteria could not be met; | — | The consistency of methods used to determine nominal and actual concentrations, and the relation of actual concentration to nominal concentration should be included in the overall assessment of the study; | — | The likely cause of death and predominant mode of action (systemic versus local) should be addressed; | — | An explanation should be provided if there was a need to humanely sacrifice animals in pain or showing signs of severe and enduring distress, based on the criteria in the OECD Guidance Document on Humane Endpoints (7). | LITERATURE: | (1) | Chapter B.2 of this Annex, Acute Toxicity (Inhalation). | (2) | Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254. | (3) | Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549. | (4) | Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134. | (5) | Chapter B.1 tris of this Annex, Acute Oral Toxicity — Acute Toxic Class Method. | (6) | OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (7) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (9) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006 (OJ L 353, 31.12.2008, p. 1). | (10) | Chapter B.40 of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER). | (11) | Chapter B.40 bis of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test. | (12) | OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (13) | Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. | (14) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. | (15) | Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167 | (16) | UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html] | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Procedure to be followed by each of the starting concentrations for gases (ppm/4h) | General remarks (5) | For each starting concentration, the respective testing schemes as included in this Appendix outline the procedure to be followed. | Appendix 2a: Starting concentration is 100 ppm | Appendix 2b: Starting concentration is 500 ppm | Appendix 2c: Starting concentration is 2 500 ppm | Appendix 2d: Starting concentration is 20 000 ppm | Depending on the number of humanely killed or dead animals, the test procedure follows the indicated arrows. | Appendix 2a | Acute Inhalation Toxicity: | Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4h for gases | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at ≥ 20000 ppm/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 2b | Acute Inhalation Toxicity: | Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at ≥ 20000 ppm/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 2c | Acute Inhalation Toxicity: | Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at ≥ 20000 ppm/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 2d | Acute Inhalation Toxicity: | Test Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at ≥ 20000 ppm/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 3 | Procedure to be followed by each of the starting concentrations for vapour (mg/l/4h) | General remarks (6) | For each starting concentration, the respective testing schemes as included in this Appendix outline the procedure to be followed. | Appendix 3a: Starting concentration is 0,5 mg/l | Appendix 3b: Starting concentration is 2,0 mg/l | Appendix 3c: Starting concentration is 10 mg/l | Appendix 3d: Starting concentration is 20 mg/l | Depending on the number of humanely killed or dead animals, the test procedure follows the indicated arrows. | Appendix 3a | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for vapours | - 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | - 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | - GHS: Globally Harmonized Classification System | - ∞: unclassified | - Testing at 50 mg/L/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 3b | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 50 mg/L4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 3c | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used pers step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 50 mg/L/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 3d | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 50 mg/L/4h: see Guidance Document 39(8) | Appendix 4 | Procedure to be followed by each of the starting concentrations for aerosols (mg/l/4h) | General remarks (7) | For each starting concentration, the respective testing schemes as included in this Appendix outline the procedure to be followed. | Appendix 4a: Starting concentration is 0,05 mg/l | Appendix 4b: Starting concentration is 0,5 mg/l | Appendix 4c: Starting concentration is 1 mg/l | Appendix 4d: Starting concentration is 5 mg/l | Depending on the number of humanely killed or dead animals, the test procedure follows the indicated arrows. | Appendix 4a | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 0,05 mg/L/4h for aerosols | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 12.5 mg/L4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 4b | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for aerosols | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 12.5 mg/L4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 4c | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 12.5 mg/L4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 4d | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 5 mg/L/4h for_aerosols | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6 : Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 12.5 mg/L/4h: see Guidance Document 39 (8) | ’ | 8) | Se añade el capítulo B.52: | «B.52. TOXICIDAD AGUDA POR INHALACIÓN. MÉTODO DE LAS CLASES DE TOXICIDAD AGUDA | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 436 de la OCDE (2009). Las primeras TG 403 de toxicidad aguda por inhalación se adoptaron en 1981 y desde entonces han sido revisadas [véase el capítulo B.2 de este anexo (1)]. Se consideró apropiado desarrollar un método de clases de toxicidad aguda por inhalación [Acute Toxic Class o ATC, (2) (3) (4)] después de adoptar el método de las clases de toxicidad aguda por vía oral (capítulo B.1 ter de este anexo) (5). Una evaluación retrospectiva de los resultados del método de las clases de toxicidad aguda por inhalación reveló que es adecuado para los fines de clasificación y etiquetado (6). El método de las clases de toxicidad aguda por inhalación permite aplicar una progresión serial de concentraciones previamente definidas para obtener una escala de toxicidad de la sustancia problema. El criterio de valoración principal es la letalidad, pero los animales moribundos o que presenten signos de dolor, angustia o sufrimiento intenso y duradero deben sacrificarse de forma compasiva para minimizar su sufrimiento. Se recomienda consultar el documento de orientación no 19 de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo (7). | 2. | Se ofrece una guía para la realización e interpretación de estudios según este método de ensayo en el documento de orientación no 39 sobre los ensayos de toxicidad por inhalación aguda (GD 39) (8). | 3. | Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan en el apéndice 1 y en el documento GD 39 (8). | 4. | El método de ensayo proporciona información acerca de los factores de riesgo y facilita la ordenación y clasificación de la sustancia problema de conformidad con el Reglamento (CE) no 1272/2008 en relación con la clasificación de las sustancias químicas que provocan toxicidad aguda (9). Cuando sea preciso calcular valores puntuales de CL50 o analizar la relación concentración-respuesta, el método de ensayo recomendable es el que se describe en el capítulo B.2 del presente anexo (1). Se ofrecen más orientaciones sobre la selección del método de ensayo en el documento de orientación (GD) no 39 (8). El presente método de ensayo no ha sido concebido específicamente para el análisis de productos especializados, como materiales fibrosos o isométricos escasamente solubles o nanoproductos manufacturados. | CONSIDERACIONES INICIALES | 5. | Antes de considerar la aplicación de este método de ensayo y con el fin de minimizar el sufrimiento animal, el laboratorio de análisis deberá tener en cuenta toda la información disponible sobre la sustancia problema, sin olvidar los estudios existentes cuyos datos pudieran desaconsejar la realización de nuevas investigaciones. En la selección de la especie, cepa, sexo y modo de exposición más apropiados resulta útil toda información referente a: identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema; resultados de anteriores ensayos de toxicidad in vivo o in vitro; uso(s) previsto(s) y posible exposición humana; datos de (Q)SAR previos y datos toxicológicos acerca de sustancias estructuralmente afines. No deberán investigarse con este método de ensayo concentraciones que previsiblemente provoquen un dolor o sufrimiento intensos debido a efectos corrosivos (4) o irritantes graves [véase el documento GD 39 (8)]. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 6. | El ensayo se basa en un procedimiento secuencial, en el que se obtiene suficiente información sobre la toxicidad aguda por inhalación de la sustancia problema durante un período de exposición de 4 horas, para permitir su clasificación. Pueden aplicarse otros tiempos de exposición con fines normativos específicos. Cada una de las fases de concentración definidas se investiga en 3 animales de cada sexo. Dependiendo del número de animales que se encuentren muertos o moribundos, pueden bastar 2 fases de concentración para evaluar la toxicidad aguda de la sustancia problema. Si hay indicios de que uno de los sexos es más sensible que el otro, la investigación debe proseguir únicamente con el sexo más sensible. El resultado de la fase preliminar determina cuál será la fase siguiente, de manera que: | a) | no se requieran más ensayos, | b) | se investiguen tres animales de cada sexo, o | c) | se investiguen solo 6 animales del sexo más sensible; es decir, el cálculo del límite inferior de la clase tóxica debe basarse en 6 animales por grupo de concentración experimental, independientemente del sexo. | 7. | Los animales moribundos o que den muestras claras de dolor o muestren signos de sufrimiento intenso y continuo deben ser sacrificados de forma compasiva y en la interpretación de los resultados serán considerados de la misma manera que los que hayan muerto durante el ensayo. En el documento de orientación no 19 de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (7) se dan criterios para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a sufrimiento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte es previsible o inminente. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Selección de la especie animal | 8. | Hay que usar animales adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio corriente. La especie recomendada es la rata y, en caso de usar otra especie, se justificará debidamente. | Preparación de los animales | 9. | Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. El día de la exposición, los animales serán adultos jóvenes de 8 a 12 meses de edad y su peso corporal no se desviará en más del ± 20 % del peso medio de su sexo calculado en animales previamente expuestos de la misma edad. Los animales se seleccionan al azar y se marcan para permitir su identificación individual. Se mantiene a los animales en las jaulas al menos cinco días antes de empezar el estudio para que se acostumbren a las condiciones de laboratorio. Deberán también aclimatarse al equipo del ensayo durante un breve período preliminar, para así reducir el estrés provocado por la introducción en un entorno nuevo. | Zootecnia | 10. | La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. La humedad relativa se mantendrá idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, si bien esto no siempre es posible cuando se usa el agua como vehículo. Antes y después de las exposiciones, los animales deberán enjaularse en principio por grupos de sexo y nivel de exposición, pero el número de animales por jaula será tal que permita la observación sin trabas de cada animal y minimice las pérdidas por agresiones y canibalismo. Cuando la exposición es solo por la nariz, puede ser necesario aclimatar a los animales a los tubos de sujeción. Estos no deberán ejercer sobre los animales tensiones físicas, térmicas o de inmovilización. La sujeción puede influir en parámetros fisiológicos como la temperatura corporal (hipertermia) o el volumen respiratorio por minuto. Si se dispone de datos generales en el sentido de que no se producen estos cambios en medida apreciable, se podrá prescindir de la adaptación previa a los tubos de sujeción. Los animales expuestos de cuerpo entero a un aerosol se enjaularán de manera individual durante la exposición para evitar que el aerosol en estudio se filtre por el pelo de sus compañeros de jaula. Salvo durante la exposición, se podrán administrar las dietas habituales de laboratorio certificadas, acompañadas de un suministro ilimitado de agua potable de la traída municipal. Se aplicará iluminación artificial en una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. | Cámaras de inhalación | 11. | Para seleccionar una cámara de inhalación se tendrán en cuenta la naturaleza de la sustancia problema y la finalidad del ensayo. El modo de exposición preferible es de solo por la nariz (término que abarca los modos de exposición solo por la cabeza, solo por la nariz y solo por el hocico). Este modo de exposición es el recomendado generalmente para los estudios de aerosoles líquidos o sólidos y de vapores que pueden condensarse formando aerosoles. Determinados objetivos de la investigación se podrían alcanzar mejor utilizando el modo de exposición de cuerpo entero, pero esto debe justificarse en el informe del estudio. Para asegurar la estabilidad atmosférica cuando se emplea una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los animales experimentales no debe exceder del 5 % del volumen de la cámara. En el documento GD 39 (8) se describen los principios de las técnicas de exposición de cuerpo entero y de solo por la nariz y sus ventajas e inconvenientes respectivos. | CONDICIONES DE EXPOSICIÓN | Administración de las concentraciones | 12. | Se recomienda un período de exposición prefijado de cuatro horas, sin contar el tiempo de equilibrado. El período puede variar dependiendo de las necesidades concretas, pero se justificarán los motivos en el informe del estudio [véase el documento GD 39 (8)]. Los animales expuestos en cámaras de cuerpo entero se enjaularán de manera individual para evitar la ingestión de la sustancia problema debido a las conductas de limpieza de los compañeros de jaula. Se suprimirá la alimentación durante el período de exposición. Se puede suministrar agua durante todo el período de exposición de cuerpo entero. | 13. | Los animales se exponen a la sustancia problema en forma de gas, vapor, aerosol o una mezcla de estos. Las condiciones físicas de la investigación dependerán de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, de la concentración seleccionada y/o de la forma física más probable que adoptará dicha sustancia durante su manipulación y administración. Las sustancias higroscópicas y químicamente reactivas deberán estudiarse en condiciones de aire seco. Se procurará evitar la acumulación de concentraciones explosivas. | Distribución granulométrica | 14. | Se controlará el tamaño de partícula en todos los aerosoles y vapores que puedan condensarse formando aerosoles. Para facilitar la exposición de todas las zonas de interés de las vías respiratorias, se recomiendan aerosoles que tengan un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) de 1 a 4 μm, con una desviación típica geométrica (σg) en el intervalo de 1,5 a 3,0 (8) (13) (14). Se procurará dentro de lo razonable ajustarse a este marco de referencia, pero si ello no es posible se consultará la opinión de expertos. Por ejemplo, los humos metálicos pueden tener un diámetro de partícula menor, mientras que las partículas con carga, las fibras y las sustancias higroscópicas (que aumentan de tamaño en el medio húmedo de las vías respiratorias) pueden sobrepasar este límite de referencia. | Preparación de la sustancia problema en un vehículo | 15. | Se puede recurrir a un vehículo para crear una concentración y un tamaño de partícula adecuados de la sustancia problema en la atmosfera. Por regla general se dará preferencia al agua. El material particulado se puede someter a tratamientos mecánicos para obtener la distribución granulométrica deseada, pero procurando no descomponer ni alterar la sustancia problema. Cuando se considere que los procesos mecánicos pueden haber alterado la composición de la sustancia problema (por ejemplo, las temperaturas extremas de una fricción excesiva), esta se verificará analíticamente. Se pondrá especial atención para no contaminar la sustancia problema. No es necesario analizar compuestos granulados no friables que han sido intencionadamente formulados como no inhalables. Se recurrirá a una prueba de desgaste para demostrar que no se generan partículas respirables durante la manipulación del material granulado. Si en la prueba de desgaste se generan partículas respirables, habrá que efectuar un ensayo de toxicidad por inhalación. | Animales de control | 16. | No es necesario emplear un grupo de control negativo (con aire) en paralelo. Si se usa un vehículo distinto del agua para generar la atmósfera experimental, solo será necesario recurrir a un grupo de control del vehículo cuando no se disponga de datos anteriores de toxicidad por inhalación. Si un ensayo de toxicidad de una sustancia problema formulada en un vehículo revela que no hay toxicidad, se deduce que el vehículo es atóxico a la concentración analizada; por lo tanto, no se precisa un control del vehículo. | SUPERVISIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN | Caudal de aire de la cámara | 17. | El caudal de aire de la cámara se controlará minuciosamente, se supervisará de manera continuada y se registrará como mínimo cada hora durante cada exposición. La supervisión de la concentración (o estabilidad) atmosférica del ensayo constituye una medida integral de todos los parámetros dinámicos y proporciona un medio indirecto de controlar todos los parámetros dinámicos de interés en la generación de un escenario atmosférico. Se pondrá especial atención para evitar la reinspiración en las cámaras de solo por la nariz en aquellos casos en los que el caudal de aire a través del sistema de exposición sea insuficiente para crear un flujo continuo del medio atmosférico de ensayo. Se han descrito metodologías capaces de demostrar que no tiene lugar la reinspiración en las condiciones operativas establecidas (8) (15). La concentración de oxígeno debe ser como mínimo del 19 %, y la de dióxido de carbono no debe superar el 1 %. Si existen razones para suponer que no están consiguiendo estos valores de referencia, habrá que determinar las concentraciones de ambos gases. | Temperatura y humedad relativa de la cámara | 18. | La temperatura de la cámara se mantendrá en 22 ± 3 °C. La humedad relativa en la zona de respiración de los animales, cuando se trata de exposiciones de solo por la nariz y de cuerpo entero, se supervisará y registrará al menos tres veces en operaciones de hasta 4 horas, y cada hora en operaciones más cortas. La humedad relativa debe mantenerse idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, pero este valor de referencia puede ser inalcanzable (por ejemplo, cuando se analizan mezclas acuosas) o imposible de medir (cuando hay interferencias de la sustancia con el método de ensayo). | Sustancia problema: concentración nominal | 19. | Siempre que sea factible, se calculará y registrará la concentración nominal en la cámara de exposición. La concentración nominal es la masa de sustancia problema generada dividida por el volumen total de aire que recorre el sistema de la cámara. La concentración nominal no se usa para caracterizar la exposición de los animales, pero la comparación entre la concentración nominal y la real nos da un índice de la eficiencia generadora del sistema experimental, de modo que puede servir para detectar problemas en la generación de la atmósfera. | Sustancia problema: concentración real | 20. | La concentración real es la concentración de sustancia problema presente en la zona de respiración de los animales en una cámara de inhalación. Las concentraciones reales se pueden calcular con métodos específicos (por ejemplo, muestreo directo, métodos de adsorción o uso de reactivos químicos y posterior valoración analítica) o bien con métodos inespecíficos como la gravimetría por filtración. El análisis gravimétrico es aceptable exclusivamente para aerosoles de un único componente en polvo o de líquidos de baja volatilidad, y deberá sustentarse en caracterizaciones preliminares específicas de la sustancia de ensayo. La concentración de los aerosoles de polvos multicomponentes se puede determinar también por gravimetría. Sin embargo, hacen falta datos analíticos que demuestren que la composición del material aerotransportado es afín a la del material de partida. Si no se dispone de tal información, puede ser necesario repetir el análisis de la sustancia problema (idealmente, en estado aerotransportado) a intervalos regulares a lo largo del ensayo. Cuando se trate de productos en forma de aerosol capaces de evaporar o sublimar, habrá que demostrar que el método elegido es capaz de recoger todas las fases. En el informe del estudio se harán constar las concentraciones diana, nominales y reales, pero en los análisis estadísticos destinados a calcular los valores de concentración letal se emplean solo las concentraciones reales. | 21. | Se usará, a ser posible, un solo lote de sustancia problema, que se conservará en condiciones que preserven su pureza, homogeneidad y estabilidad. Antes de iniciar el estudio deberá hacerse una caracterización de la sustancia problema consistente en un análisis de pureza y, si es técnicamente factible, de identidad y de cuantificación de contaminantes e impurezas. Con este fin se pueden aportar, entre otros, los siguientes datos: tiempo de retención y área relativa del pico, peso molecular determinado mediante espectroscopia de masas o cromatografía de gases y otras determinaciones. Si bien la identidad de la muestra de ensayo no es responsabilidad del laboratorio de análisis, la prudencia aconseja que este confirme, aunque sea dentro de ciertos límites, la caracterización facilitada por el promotor (por ejemplo, color, naturaleza física, etc.). | 22. | La atmósfera de exposición se mantendrá constante en la medida de lo posible y bajo supervisión continua y/o intermitente, dependiendo del método analítico. Si la técnica de muestreo es intermitente, habrá que tomar muestras atmosféricas de la cámara por lo menos dos veces en un ensayo de cuatro horas. De no ser esto posible por darse concentraciones bajas o un caudal de aire limitado, se podrá tomar una muestra en todo el período de exposición. Si se producen fluctuaciones importantes de una muestra a otra, para analizar las siguientes concentraciones se tomarán cuatro muestras por exposición. Las concentraciones individuales medidas en la cámara no deben desviarse de la concentración media en ± 10 % cuando se trata de gases y vapores, y en ± 20 % en el caso de aerosoles de líquidos o sólidos. Se calculará y registrará el tiempo de equilibrado de la cámara (t95). La duración de cualquier exposición abarca el tiempo que tarda en generarse la sustancia problema, lo que incluye el tiempo necesario para alcanzar t95. Se ofrecen indicaciones para el cálculo de t95 en el documento de orientación no 39 (8). | 23. | Cuando se manejan mezclas muy complejas de gases/vapores y aerosoles (por ejemplo, atmósferas de combustión y sustancias problema propulsadas con dispositivos/productos fabricados con fines determinados), cada fase puede comportarse de manera diferente en una cámara de inhalación, de modo que se seleccionará como mínimo una sustancia indicadora (analito), normalmente la sustancia activa principal de la mezcla, para cada fase (gas/vapor y aerosol). Si el producto analizado es una mezcla, habrá que documentar la concentración analítica de la mezcla total y no solo de la sustancia indicadora o del componente activo (analito). Se ofrece más información sobre las concentraciones reales en el documento de orientación no 39 (8). | Sustancia problema: distribución granulométrica | 24. | La distribución granulométrica en los aerosoles se determinará al menos dos veces por cada período de exposición de 4 horas, empleando un impactador de cascada o un aparato alternativo como un medidor del tamaño aeorodinámico de partícula. Si se puede demostrar la equivalencia de los resultados obtenidos con el impactador de cascada y con el aparato alternativo, entonces se podrá emplear este último durante todo el estudio. Se empleará un segundo dispositivo, como un filtro gravimétrico o un sistema de burbujeo o de purga, en paralelo con el equipo principal para confirmar la eficiencia de recogida de este último. La concentración en masa obtenida mediante análisis granulométrico tendrá unos límites de desviación razonables con respecto a la concentración en masa obtenida mediante gravimetría por filtración [véase el documento GD 39 (8)]. Si es posible demostrar su equivalencia en la fase inicial del estudio, podrán omitirse en lo sucesivo las pruebas confirmatorias. Por razones de bienestar animal, se tomarán medidas para minimizar la obtención de datos no concluyentes que obligarían a repetir la exposición. Se controlará el tamaño de partícula en los vapores cuando exista la posibilidad de que la condensación del vapor provoque la formación de un aerosol, o cuando se detecten partículas en una atmósfera de vapor que puedan inducir la mezcla de fases (véase el punto 14). | PROCEDIMIENTO | Ensayo principal | 25. | En cada fase se estudian tres animales de cada sexo, o bien seis animales del sexo más sensible. Cuando se exponen con la técnica de solo la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. La concentración que se usará en la fase inicial se selecciona de entre una a cuatro concentraciones predefinidas, y debe ser aquella que provoque más probablemente toxicidad en algunos de los animales tratados. Los esquemas de ensayo de gases, vapores y aerosoles (apéndices 2 a 4) se articulan en torno a los valores de corte de las categorías 1-4 del Reglamento CLP (9) para gases (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 horas; apéndice 2), para vapores (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 horas; apéndice 3) y para aerosoles (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 horas; apéndice 4). La categoría 5, que no se contempla en el Reglamento (CE) no 1272/2008 (9), corresponde a concentraciones por encima de las respectivas concentraciones límite. A cada concentración inicial se le aplica el correspondiente esquema de ensayo. En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, el procedimiento de ensayo seguirá las flechas indicadas hasta establecer una categoría. | 26. | El intervalo de tiempo entre los grupos de exposición se determina según la aparición, duración y gravedad de los signos tóxicos. La exposición de los animales al siguiente nivel de concentración se retrasará hasta tener una seguridad razonable de la supervivencia de los animales previamente estudiados. Se recomienda un período de tres o cuatro días entre la administración de cada nivel de dosis para poder observar la toxicidad retardada. Este intervalo puede ajustarse según convenga, por ejemplo en caso de respuestas no concluyentes. | Ensayo límite | 27. | El ensayo límite se practica cuando se sabe o supone que la sustancia problema es prácticamente atóxica, es decir, que induce una respuesta tóxica solo cuando supera la concentración límite normativa. Puede obtenerse información acerca de la toxicidad de la sustancia estudiada a partir de los conocimientos disponibles sobre sustancias o mezclas afines, teniendo en cuenta cuáles son los componentes que se sabe que son importantes desde el punto de vista toxicológico y en qué porcentaje aparecen. En situaciones en que se disponga de poca o ninguna información sobre la toxicidad de la sustancia o en las que se prevea que esta será tóxica, se llevará a cabo el ensayo principal [se ofrecen más indicaciones en el documento de orientación (GD) no 39 (8)]. | 28. | Según el procedimiento habitual se exponen tres animales de cada sexo, o seis animales del sexo más sensible, a concentraciones de 20 000 ppm de gases, 20 mg/l de vapores o 5 mg/l de polvos/nieblas, respectivamente y siempre que se puedan alcanzar, lo que constituye el ensayo límite de este método. Cuando se analicen aerosoles, el objetivo principal será obtener un tamaño de partícula respirable (es decir, un MMAD de 1-4 μm). El estudio de aerosoles a concentraciones mayores de 2 mg/l solo se emprenderá si se puede obtener un tamaño de partícula respirable [véase el documento GD 39 (8)]. De conformidad con el SGA (16), por razones de bienestar animal se desaconseja investigar más allá de las concentraciones límite. La realización de pruebas en la categoría 5 (16) del SGA, que no está recogida en el Reglamento (CE) no 1272/2008 (9), solo se contemplará cuando haya muchas probabilidades de que sus resultados vayan a incidir directamente en la protección de la salud humana, lo cual deberá justificarse en el informe del estudio. Cuando se trate de sustancias problema potencialmente explosivas, se procurará evitar las condiciones favorables a una explosión. A fin de evitar el uso innecesario de animales, se hará una operación de prueba sin animales antes del ensayo límite, para confirmar que se crean en la cámara las condiciones adecuadas para dicho ensayo límite. | CONTEXTO | 29. | Los animales se someterán a observación clínica frecuente durante el período de exposición. Las observaciones clínicas se repetirán al menos dos veces el día de la exposición, o más frecuentemente si lo indica la respuesta de los animales al tratamiento, y en lo sucesivo al menos una vez al día durante un período total de 14 días. La duración del período de observación no es fija, antes bien deberá determinarse en función de la naturaleza y el tiempo de aparición de los signos clínicos y de la longitud del período de recuperación. Es importante conocer el momento en el que aparecen y desaparecen los signos de toxicidad, especialmente si hay tendencia a una aparición retardada de los signos tóxicos. Todas las observaciones se registrarán sistemáticamente en fichas individuales de cada animal. Por razones de bienestar animal, los animales moribundos o que den muestras de dolor o signos de sufrimiento intenso y continuo deben ser sacrificados de forma compasiva. En el momento de explorar los signos clínicos de toxicidad, se procurará que el mal aspecto inicial y los trastornos respiratorios transitorios, derivados del procedimiento de exposición, no se confundan con efectos relacionados con el tratamiento. Se tendrán en cuenta los principios y criterios resumidos en el documento de orientación sobre criterios de tratamiento compasivo [Humane Endpoints Guidance Document (7)]. Cuando se encuentre algún animal muerto o se sacrifique por razones compasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la muerte. | 30. | Las observaciones en de la jaula deberían incluir los cambios en la piel, pelo, ojos y membranas mucosas, y también los sistemas respiratorio, circulatorio, nervioso central y autónomo, así como la actividad somatomotriz y las pautas de comportamiento. Cuando sea posible se diferenciarán los efectos locales de los sistémicos. Debe prestarse atención especial a la observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. El registro de la temperatura rectal puede ayudar a detectar una bradipnea refleja o una hipo/hipertermia relacionadas con el tratamiento o con el confinamiento. | Peso corporal | 31. | Los pesos corporales individuales se registrarán una vez durante el período de aclimatación, en el día previo a la exposición (día 0), y al menos en los días 1, 3 y 7 (y, en lo sucesivo, semanalmente) y en el momento de la muerte o la eutanasia si se produce después del día 1. Se acepta que el peso corporal es un indicador crítico de la toxicidad, por lo que deberán vigilarse estrechamente los animales que muestren una reducción progresiva de peso ≥ 20 % en comparación con los valores preliminares. Los animales supervivientes se pesan y se sacrifican de forma compasiva al final del período de post-exposición. | Anatomía patológica | 32. | Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran durante su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar animal, se someterán a autopsia macroscópica. Si la autopsia no se puede practicar inmediatamente después de comprobar la muerte del animal, este será refrigerado (no congelado) a temperaturas suficientemente bajas para minimizar la autólisis. Las autopsias se practicarán lo antes posible, normalmente en el plazo de uno o dos días. Se documentarán todas las modificaciones anatomopatológicas macroscópicas observadas en cada animal, poniendo especial atención en las alteraciones de las vías respiratorias. | 33. | Se podrán contemplar otras exploraciones incluidas de antemano en el diseño para ampliar el valor interpretativo del estudio, como la medida del peso pulmonar de las ratas que sobrevivan o el examen microscópico de las vías respiratorias para aportar pruebas de irritación. La exploración de órganos puede extenderse a aquellos que muestran signos de anatomapatología macroscópica en los animales que sobreviven 24 o más horas y a los órganos que se saben o suponen afectados. El examen microscópico de la totalidad de las vías respiratorias puede proporcionar información útil en el caso de sustancias problema que son reactivas con el agua, como las de naturaleza ácida o higroscópica. | DATOS E INFORME | Datos | 34. | Se documentarán por separado los datos de peso corporal y los resultados de la autopsia de cada animal. Los resultados de la observación clínica se reunirán en un cuadro que presente, por cada grupo de ensayo, el número de animales utilizados, el número de animales que presenten signos específicos de toxicidad, el número de animales hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte de los distintos animales, la descripción y la evolución temporal de los efectos tóxicos y sin reversibilidad, y los resultados de la autopsia. | Informes de los ensayos | 35. | El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información siguiente: | | Animales de experimentación y zootecnia | — | Descripción de las condiciones de enjaulado, tales como: número (o variación del número) de animales por jaula, materiales de cama, temperatura ambiente y humedad relativa, fotoperíodo e identificación de la dieta. | — | Especie o variedad empleada y justificación del uso de una especie distinta de la rata. | — | Número, edad y sexo de los animales. | — | Método de asignación al azar. | — | Pormenores de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo/origen de la alimentación y el origen del agua). | — | Descripción de cualquier acondicionamiento previo al estudio, incluidos alimentación, cuarentena y tratamiento de enfermedades. | | Sustancia problema: | — | Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (incluida la isomerización). | — | Identificación química y número de registro del Chemical Abstracts Service (CAS), si se conoce. | | Vehículo: | — | Justificación del uso de un vehículo y justificación de la elección del mismo (si es distinto del agua). | — | Datos históricos o paralelos que demuestren que el vehículo no interfiere en los resultados del estudio. | | Cámara de inhalación: | — | Descripción de la cámara de inhalación, incluidos las dimensiones y el volumen. | — | Procedencia y descripción del equipo empleado para la exposición de los animales y la generación de la atmósfera. | — | Equipo empleado para medir la temperatura, la humedad, el tamaño de partícula y la concentración real. | — | Fuente de aire, tratamiento del aire suministrado/extraído y sistema de acondicionamiento. | — | Métodos de calibración del equipo para garantizar una atmósfera experimental homogénea. | — | Diferencia de presión (positiva o negativa). | — | Puertos de exposición por cámara (de solo por la nariz); ubicación de los animales en el sistema (de cuerpo entero). | — | Homogeneidad/estabilidad temporal de la atmósfera experimental. | — | Localización de los sensores de temperatura y humedad, y muestreo de la atmósfera experimental en la cámara. | — | Caudales de aire, caudal del aire por puerto de exposición (solo por la nariz) o carga de animales por cámara (de cuerpo entero). | — | Descripción del equipo empleado para medir el oxígeno y el dióxido de carbono, si procede. | — | Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio (t95) en la cámara de inhalación. | — | Número de variaciones de volumen por hora. | — | Dispositivos de dosificación (si procede). | | Datos relativos a la exposición: | — | Justificación de la concentración diana seleccionada en el estudio principal. | — | Concentraciones nominales (masa total de sustancia problema generada en la cámara de inhalación dividida por el volumen de aire que recorre la cámara). | — | Concentraciones reales de la sustancia problema recuperadas en la zona de respiración de los animales; en el caso de mezclas que dan lugar a formas físicas heterogéneas (gases, vapores, aerosoles), se podrá analizar cada una de ellas por separado. | — | Todas las concentraciones atmosféricas se registrarán en unidades de masa (mg/l, mg/m3, etc.); se podrán indicar además las unidades de volumen (ppm, ppmm) entre paréntesis. | — | Distribución del tamaño de partícula, diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) y desviación típica geométrica (σg), incluidos los correspondientes métodos de cálculo; se documentarán los análisis granulométricos individuales. | | Condiciones del ensayo: | — | Descripción pormenorizada de la preparación de la sustancia problema y de cualquier método empleado para reducir el tamaño de partícula de las materias sólidas o preparar soluciones de la sustancia problema; cuando exista la posibilidad de que los procesos mecánicos hayan alterado la composición de la sustancia problema, se incluirán los resultados de los análisis realizados para verificar dicha composición. | — | Descripción (preferiblemente acompañada de un diagrama) del equipo empleado para generar la atmósfera experimental y para exponer los animales a la misma. | — | Descripción pormenorizada del método de análisis químico empleado y de la validación del método (incluida la eficiencia de recuperación de la sustancia problema en el medio ambiente experimental). | — | Justificación de las concentraciones experimentales seleccionadas. | | Resultados: | — | Tabulación de los valores de temperatura de la cámara, humedad y caudal de aire. | — | Tabulación de las concentraciones nominales y reales de la cámara. | — | Tabulación de los datos de tamaño de partícula, incluidos los de recogida de muestras para el análisis, distribución granulométrica y cálculos de MMAD y σg. | — | Tabulación de las respuestas y niveles de concentración de cada animal (es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la mortalidad y la naturaleza, gravedad y duración de los efectos), | — | Pesos corporales de cada animal registrados en el estudio; fecha y hora de la muerte si se produce antes de la eutanasia programada; cronología de la aparición de los signos de toxicidad e indicación de si estos son reversibles en cada animal. | — | Resultados de la autopsia y observaciones histopatológicas de cada animal, si se dispone de ellas. | — | Categoría de la clasificación CLP y valor de corte de la CL50. | | Evaluación e interpretación de los resultados: | — | Se hará especial hincapié en la descripción de los procedimientos empleados para cumplir los criterios del presente método de ensayo, esto es, la concentración límite o el tamaño de partícula. | — | Se tomará en consideración la respirabilidad de las partículas a la luz de los resultados globales, de manera especial si no se cumplen los criterios relativos al tamaño de partícula. | — | En la evaluación global del estudio se expondrá la coherencia de los métodos empleados para determinar las concentraciones nominales y reales y la relación entre ellas. | — | Se explicará la causa probable de muerte y el mecanismo de acción (sistémico o local) predominante. | — | Se facilitará una explicación de por qué ha sido preciso sacrificar de forma compasiva los animales con signos evidentes de dolor o de sufrimiento intenso y duradero, atendiendo a los criterios del documento de orientación de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (7). | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Capítulo B.2 del presente anexo. Toxicidad aguda por inhalación. | (2) | Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254. | (3) | Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549. | (4) | Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134. | (5) | Capítulo B.1 ter del presente anexo. Toxicidad oral aguda. Método de las clases de toxicidad aguda. | (6) | OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (7) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (9) | Reglamento (CE) no 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE, y se modifica el reglamento (CE) no 1907/2006 (DO L 353 de 31.12.2008, p. 1). | (10) | Capítulo B.40 del presente anexo. Corrosión cutánea in vitro: ensayo de resistencia eléctrica transcutánea (RET). | (11) | Capítulo B.40 bis del presente anexo. Corrosión cutánea in vitro: ensayo con modelo de piel humana. | (12) | OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (13) | Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. | (14) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. | (15) | Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167 | (16) | Naciones Unidas (2007), Sistema globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (SGA), ST/SG/AC.10/30, Naciones Unidas, Nueva York y Ginebra. Disponible en la dirección: [http://www.unece.org.es/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_s.html] | Apéndice 1 | DEFINICIÓN | Sustancia problema: cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este método de ensayo. | Apéndice 2 | Procedimiento de ensayo según la concentración inicial en caso de gases (ppm/4 horas) | Observaciones generales (5) | Por cada concentración inicial, el procedimiento que debe seguirse se indica en los respectivos esquemas de ensayo que figuran en el presente anexo. | Apéndice 2a: concentración inicial de 100 ppm | Apéndice 2b: concentración inicial de 500 ppm | Apéndice 2c: concentración inicial de 2 500 ppm | Apéndice 2d: concentración inicial de 20 000 ppm | En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, el procedimiento de ensayo seguirá las flechas indicadas. | Apéndice 2a | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicialde 100 ppm/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con = 20 000 ppm/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 2b | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicialde 500 ppm/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con ≥ 20 000 ppm/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 2c | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicialde 2 500 ppm/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0–6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con = 20 000 ppm/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 2d | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicialde 20 000 ppm/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con ≥ 20 000 ppm/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 3 | Procedimiento de ensayo según la concentración inicial en caso de vapores (mg/l/4 horas) | Observaciones generales (6) | Por cada concentración inicial, el procedimiento que debe seguirse se indica en los respectivos esquemas de ensayo que figuran en el presente anexo. | Apéndice 3a: concentración inicial de 0,5 mg/l | Apéndice 3b: concentración inicial de 2,0 mg/l | Apéndice 3c: concentración inicial de 10 mg/l | Apéndice 3d: concentración inicial de 20 mg/l | En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, el procedimiento de ensayo seguirá las flechas indicadas. | Apéndice 3a | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de vapores con una concentración inicial de 0,5 mg/l/4 horas | - En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | - 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | - SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | - ∞: Sin dasificar | - Estudios con 50 mg/l4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 3b | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicial de 2 mg/l/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0–6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con 50 mg/l4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 3c | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de vapores con una concentración inicial de 10 mg/l/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0–6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con 50 mg/l4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 3d | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de vapores con una concentración inicial de 20 mg/l/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: sin dasificar | Estudios con 50 mg/l/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 4 | Procedimiento de ensayo según la concentración inicial en caso de aerosoles (mg/l/4 horas) | Observaciones generales (7) | Por cada concentración inicial, el procedimiento que debe seguirse se indica en los respectivos esquemas de ensayo que figuran en el presente anexo. | Apéndice 4a: concentración inicial de 0,05 mg/l | Apéndice 4b: concentración inicial de 0,5 mg/l | Apéndice 4c: concentración inicial de 1 mg/l | Apéndice 4d: concentración inicial de 5 mg/l | En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, el procedimiento de ensayo seguirá las flechas indicadas. | Apéndice 4a | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de vapores con una concentración inicial de 0,05 mg/l/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin clasificar | Estudios con 12,5 mg/l/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 4b | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de aerosoles con una concentración inicial de 0,5 mg/l/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con 12,5 mg/l/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 4c | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de aerosoles con una concentración inicial de 1 mg/l/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con 12,5 mg/l/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | Apéndice 4d | Toxicidad aguda por inhalación: | Procedimiento de ensayo de aerosoles con una concentración inicial de 5 mg/l/4 horas | En cada fase se estudian 3 ♂ + 3 ♀, o bien 6 animales del sexo más sensible | 0-6: número de animales muertos o moribundos por concentración estudiada | SGA: sistema globalmente armonizado de dasificación y etiquetado de productos químicos | ∞: Sin dasificar | Estudios con 12,5 mg/l/4 horas: véase el documento de orienatación no 39(8) | » |
| (9) | Chapter C.10 is replaced by the following: | ‘C.10. SIMULATION TESTAEROBIC SEWAGE TREATMENT: C.10-A: ACTIVATED SLUDGE UNITS — C.10-B: BIOFILMS | C.10-A: Activated Sludge Units | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 303 (2001). In the 1950s it was realised that the newly introduced surfactants caused excessive foaming in waste water treatment plants and in rivers. They were not fully removed in the aerobic treatment and in some cases limited the removal of other organic matter. This instigated many investigations into how surfactants could be removed from waste waters and whether new chemicals produced by industry were amenable to waste water treatment. In order to do this, model units were used representing the two main types of aerobic biological waste water treatment (activated sludge and percolating, or trickling, filtration). It would have been impractical and very costly to distribute each new chemical and to monitor large-scale treatment plants, even on a local basis. | INITIAL CONSIDERATIONS | Activated sludge units | 2. | Model activated sludge units have been described ranging in size from 300 ml up to about 2 000 ml. Some closely mimicked full-scale plants, having sludge settlement tanks with settled sludge being pumped back to the aeration tank, while others provided no settlement facilities e.g. Swisher (1). The size of the apparatus is a compromise; on the one hand, it must be large enough for successful mechanical operation and for the provision of sufficient volume of samples without affecting the operation, while on the other hand it should not be so large that it demands excessive space and materials. | 3. | Two forms of apparatus which have been extensively and satisfactorily used are the Husmann units (2) and Porous Pot units (3)(4), first used in the study of surfactants; these are described in this Test Method. Others have also been used satisfactorily, e.g. Eckenfelder (5). Because of the relatively high cost and effort of applying this simulation test, simpler and cheaper screening tests, now embodied in chapter C.4 A-F of this Annex (6) were investigated in parallel. Experience with many surfactants and other chemicals has shown that those which passed the screening tests (readily biodegradable) also degraded in the simulation test. Some of those failing the screening tests passed the inherent biodegradability tests (chapters C.12 (7) and C.19 (8) of this Annex) but only some of this latter group were degraded in the simulation test, while those chemicals which failed tests for inherent biodegradability did not degrade in the simulation tests (9)(10)(11). | 4. | For some purposes simulation tests carried out under a single set of operating conditions are sufficient; the results are expressed as a percentage removal of the test chemical or of dissolved organic carbon (DOC). A description of such a test is given in this test method. However, unlike the previous version of this chapter, which described only one type of apparatus treating synthetic sewage in the coupled mode using a relatively crude method of sludge wastage, this text offers a number of variations. Alternatives to the type of apparatus, mode of operation, sewage and sludge wastage removal are described. This text closely follows that of ISO 11733 (12), which was carefully scrutinised during its preparation, though the method has not been subject to a ring test. | 5. | For other purposes the concentration of the test chemical in the effluent is required to be known more accurately and for this a more extensive method is needed. For example, the sludge wastage rate must be more precisely controlled throughout each day and throughout the period of the test, and units have to be run at a number of wastage rates. For a fully comprehensive method, tests should also be run at two or three different temperatures: such a method is described by Birch (13)(14) and summarised in Appendix 6. However, present knowledge is insufficient to decide which of the kinetic models are applicable to the biodegradation of chemicals in waste water treatment and in the aquatic environment generally. The application of Monod kinetics, given in Appendic 6 as an example, is limited to chemicals present at 1 mg/l and above, but in the opinion of some even this remains to be substantiated. Tests at concentrations more truly reflecting those found in waste waters are indicated, in Appendix 7, but such tests, and those in Appendix 6, are included in Appendices instead of being issued as separate Test Methods. | Filters | 6. | Much less attention has been given to model percolating filters, perhaps because they are more cumbersome and less compact than activated sludge plant models. Gerike et al developed trickling filter units and operated them in the coupled mode ((15). These filters were relatively large (height 2 m; volume 60 l) and each required as much as 2 l/h of sewage. Baumann et al (16), simulated trickling filters by inserting polyester “fleece” strips into 1 m tubes (14 mm int. diameter) after the strips had been immersed in concentrated activated sludge for 30 min. The test chemical as sole C source in a mineral salts solution was fed down the vertical tube and biodegradation was assessed from measurements of DOC in the effluent and CO2 in the issuing gas. | 7. | Biofilters have been simulated in another way (15); the inner surfaces of rotating tubes, inclined at a small angle to the horizontal, were fed with sewage (about 250 ml/h) with and without the test chemical, and the collected effluents analysed for DOC and/or the specific test chemical. | PRINCIPLE OF THE TEST | 8. | This method is designed to determine the elimination and the primary and/or ultimate biodegradation of water-soluble organic chemicals by aerobic micro-organisms in a continuously operated test system simulating the activated sludge process. An easily biodegradable organic medium and the organic test chemical are the sources of carbon and energy for the micro-organisms. | 9. | Two continuously operated test units (activated sludge plants or porous pots) are run in parallel under identical conditions which are chosen to suit the purpose of the test. Normally the mean hydraulic retention time is 6 h and the mean sludge age (sludge retention time) is 6 to 10 days. Sludge is wasted by one of two methods, the test chemical is normally added at a concentration of between 10 mg/l dissolved organic carbon (DOC) and 20 mg/l DOC, to the influent (organic medium) of only one of the units. The second unit is used as a control unit to determine the biodegradation of the organic medium. | 10. | In frequently taken samples of the effluents, the DOC, preferably, or chemical oxygen demand (COD) is determined, together with the concentration of the test chemical (if required) by specific analysis, in the effluent from the unit receiving the test chemical. The difference between the effluent concentrations of DOC or COD in the test and control units is assumed to be due to the test chemical or its organic metabolites. This difference is compared with the influent concentration of DOC or COD due to the added test chemical in order to determine the elimination of the test chemical. | 11. | Biodegradation may normally be distinguished from bioadsorption by careful examination of the elimination-time curve and may usually be confirmed by applying a test for ready biodegradation using an acclimatised inoculum from the unit receiving the test chemical. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 12. | The purity, water solubility, volatility and adsorption characteristics of the test chemical should be known to enable correct interpretation of results to be made. Normally volatile and insoluble chemicals cannot be tested unless special precautions are taken (see Appendix 5). The chemical structure, or at least the empirical formula, should also be known in order to calculate theoretical values and/or to check measured values of parameters, e.g. theoretical oxygen demand (ThOD), dissolved organic carbon (DOC) and chemical oxygen demand (COD). | 13. | Information on the toxicity of the test chemical to micro-organisms (see Appendix 4) may be useful for selecting appropriate test concentrations and may be essential for the correct interpretation of low biodegradation values. | PASS LEVELS | 14. | In the original application of this simulation (confirmatory) test to the primary biodegradation of surfactants, a removal of more than 80 % of the specific chemical is required before the surfactant may be marketed. If the value of 80 % is not attained, this simulation (confirmatory) test may be applied and the surfactant may be marketed only if more than 90 % of the specific chemical is removed. With chemicals in general there is no question of pass/fail and the value of percentage removal obtained can be used in proximate calculations of the probable environmental concentration to be used in hazard assessments posed by chemicals. Results tend to follow an all or nothing pattern. In a number of studies of pure chemicals the percentage removal of DOC was found to be > 90 % in more than three quarters and > 80 % in over 90 % of chemicals which showed any significant degree of biodegradability. | 15. | Relatively few chemicals (e.g. surfactants) are present in sewage at the concentrations (about 10 mg C/l) used in this test. Some chemicals may be inhibitory at these concentrations, while the kinetics of removal of others may be different at low concentrations. A more accurate assessment of the degradation could be made by using modified methods, using realistically low concentrations of the test chemical, and the data collected could be used to calculate kinetic constants. However, the necessary experimental techniques have not yet been fully validated and neither have the kinetic models, which describe the biodegradation reactions, been established (see Appendix 7). | REFERENCE CHEMICALS | 16. | To ensure that the experimental procedure is being carried out correctly, it is useful occasionally to test chemicals whose behaviour is known simultaneously when test chemicals are investigated. Such chemicals include adipic acid, 2-phenyl phenol, 1-naphthol, diphenic acid, 1-naphthoic acid, etc. (9)(10)(11). | REPRODUCIBILITY OF TEST RESULTS | 17. | There have been far fewer reports of studies of simulation tests than of tests for ready biodegradability. Reproducibility between (simultaneous) replicates is good (within 10-15 %) for test chemicals degraded by 80 % or more but for less well degraded chemicals variability is greater. Also, with some borderline chemicals widely disparate results (e.g. 10 %, 90 %) have been recorded on different occasions within the 9 weeks allowed in the test. | 18. | Little difference has been found in results obtained with the two types of apparatus, but some chemicals have been more extensively and consistently degraded in the presence of domestic sewage than with OECD synthetic sewage. | DESCRIPTION OF THE TEST METHOD | Apparatus | Test system | 19. | The test system for one test chemical consists of a test unit and a control unit; but when only specific analyses are performed (primary biodegradation) only a test unit is required. One control unit can be used for several test units receiving either the same or different test chemicals. In the case of coupling (Appendix 3) each test unit must have its own control unit. The test system may be either an activated sludge plant model, Husmann unit (Appendx 1, Figure 1) or a porous pot (Appendix 1, Figure 2). In both cases storage vessels of sufficient size for the influents and effluents are needed, as well as pumps to dose the influent, either mixed with solution of the test chemical or separately. | 20. | Each activated sludge plant unit consists of an aeration vessel with a known capacity of about 3 litres of activated sludge and a separator (secondary clarifier) which holds about 1,5 litres; the volumes can, to some extent, be changed by adjusting the height of the separator. Vessels of different sizes are permissible if they are operated with comparable hydraulic loads. If it is not possible to keep the temperature in the test room in the desired range, the use of water-jacketed vessels with temperature controlled water is recommended. An airlift pump or a dosing pump is used to recycle the activated sludge from the separator to the aeration vessel, either continuously or intermittently at regular intervals. | 21. | The porous pot system consists of an inner, porous cylinder with a conical bottom held in a slightly larger vessel of the same shape, but made of an impervious plastic material. A suitable material for the porous vessel is porous polyethylene of maximum pore size 90 μm and 2 mm thickness. Separation of the sludge from the treated organic medium is effected by differential passage through the porous wall. Effluents collect in the annular space from where it overflows into the collecting vessel. No settlement occurs and hence there is no sludge return. The whole system may be mounted in a thermostatically controlled water-bath. Porous pots become blocked and could overflow in the initial stages. In such a case, replace the porous liner with a clean one by first siphoning the sludge from the pot into a clean bucket and removing the blocked liner. After wiping out the impervious outer cylinder insert a clean liner and return the sludge to the pot. Any sludge adhering to the sides of the blocked liner is also carefully scraped off and transferred. Clean blocked pots first by using a fine jet of water to remove remaining sludge and by soaking in dilute sodium hypochlorite solution, then in water, followed by thoroughly rinsing with water. | 22. | For aeration of the sludge in the aeration vessels of both systems, suitable techniques are required, for example sintered cubes (diffuser stones) and compressed air. The air shall be cleaned, if necessary, by passing through a suitable filter and washed. Sufficient air must pass through the system to maintain aerobic conditions and to keep sludge flocs in suspension at all times during the test. | Filtration apparatus or centrifuge | 23. | Device for filtration of samples with membrane filters of suitable porosity (nominal aperture diameter 0,45 μm) which adsorb soluble organic chemicals and release organic carbon to a minimum degree. If filters are used which release organic carbon, wash the filters carefully with hot water to remove leachable organic carbon. Alternatively, a centrifuge capable of producing 40 000 m/s2 may be used. | Analytical equipment | 24. | Apparatus required to determine: | — | DOC(dissolved organic carbon) and TOC (total organic carbon), or COD (chemical oxygen demand); | — | specific chemical, if required; | — | suspended solids, pH, oxygen concentration in water; | — | temperature, acidity and alkalinity; | — | ammonium, nitrite and nitrate, if the test is performed under nitrifying conditions. | Water | 25. | Tap water, containing less than 3 mg/l DOC. Determine the alkalinity if not already known. | 26. | Deionised water, containing less than 2 mg/l DOC. | Organic medium | 27. | Synthetic sewage, domestic sewage or a mixture of both is permissible as the organic medium. It has been shown (11)(14) that the use of domestic sewage alone often gives increased percentage DOC removal and even allows the removal and biodegradation of some chemicals which are not biodegraded when OECD synthetic sewage is used. Also, the constant or intermittent addition of domestic sewage often stabilises the activated sludge, including the crucial ability to settle well. Thus, the use of domestic sewage is recommended. Measure the DOC or COD concentration in each new batch of organic medium. The acidity or alkalinity of the organic medium should be known. The organic medium may require the addition of a suitable buffer (sodium hydrogen carbonate or potassium dihydrogen phosphate) if it is of low acidity or alkalinity, to maintain a pH of about 7,5 ± 0,5 in the aeration vessel during the test. The amount of buffer to be added, and when to add it, has to be decided in each individual case. When mixtures are used either continuously or intermittently, the DOC (or COD) of the mixture must be kept at an approximately constant value, e.g. by dilution with water. | Synthetic sewage | 28. | Dissolve in each litre of tap water: peptone, 160 mg; meat extract, 110 mg; urea, 30 mg; anhydrous dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4), 28 mg; sodium chloride (NaCl), 7 mg; calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O), 4 mg; magnesium sulphate heptahydrate (Mg2SO4.7H20), 2 mg. This OECD synthetic sewage is an example and gives a mean DOC concentration in the influent of about 100 mg/l. Alternatively, use other compositions, with about the same DOC concentration, which are closer to real sewage. If a less concentrated influent is required, dilute the synthetic sewage, for example 1:1, with tap water to obtain a concentration of about 50 mg/l. Such a weaker influent will allow better growth of nitrifying organisms and this modification should be used if the simulation of nitrifying waste water plants is to be investigated. This synthetic sewage may be made up in distilled water in a concentrated form and stored at about 1 °C for up to one week. When needed, dilute with tap water. (This medium is unsatisfactory e.g. nitrogen concentration is very high, relatively low carbon content, but nothing better has been suggested, except to add more phosphate as buffer and extra peptone). | Domestic sewage | 29. | Use fresh settled sewage collected daily from a treatment works receiving predominantly domestic sewage. It should be collected, prior to primary sedimentation, from the overflow channel of the primary sedimentation tank, or from the feed to the activated sludge plant, and be largely free from coarse particles. The sewage can be used after storage for several days (but generally should not exceed seven days) at about 4 °C, if it is proved that the DOC (or COD) has not significantly decreased (i.e. by less than 20 %) during storage. In order to limit disturbances to the system, the DOC (or COD) of each new batch should be adjusted before use to an appropriate constant value, e.g. by dilution with tap water. | Activated sludge | 30. | Collect activated sludge for inoculation from the aeration tank of a well operated waste water treatment plant or from a laboratory — scale activated sludge unit, treating predominantly domestic sewage. | Stock solutions of test chemical | 31. | For chemicals of adequate solubility, prepare stock solutions at appropriate concentrations (e.g. 1 to 5 g/l) in deionised water, or in the mineral portion of the synthetic sewage. (for insoluble and volatile chemicals, see Appendix 5). Determine the DOC and total organic carbon (TOC) of the stock solution and repeat the measurements for each new batch. If the difference between the DOC and TOC is greater than 20 %, check the water-solubility of the test chemical. Compare the DOC or the concentration of the test chemical measured by specific analysis of the stock solution with the nominal value, to ascertain whether recovery is good enough (normally > 90 % can be expected). Ascertain, especially for dispersions, whether or not DOC can be used as an analytical parameter or if only an analytical technique specific for the test chemical can be used. Centrifugation of the samples is required for dispersions. For each new batch, measure the DOC, COD or the test chemical with specific analysis. | 32. | Determine the pH of the stock solution. Extreme values indicate that the addition of the chemical may have an influence on the pH of the activated sludge in the test system. In this case neutralise the stock solution to obtain a pH of 7 ± 0,5 with small amounts of inorganic acid or base, but avoid precipitation of the test chemical. | PROCEDURE | 33. | The procedure is described for the activated sludge plant units; it has to be slightly adapted for the porous pot system. | Preparation of the inoculum | 34. | Inoculate the test system at the beginning of the test with either activated sludge or an inoculum containing a low concentration of micro-organisms. Keep the inoculum aerated at room temperature until it is used and use it within 24 h. In the first case, take a sample of activated sludge from the aeration tank of an efficiently operated biological waste water treatment plant, or a laboratory treatment plant, which receives predominantly domestic sewage. If nitrifying conditions are to be simulated, take sludge from a nitrifying waste water treatment plant. Determine the concentration of suspended solids and, if necessary, concentrate the sludge by settling so that the volume added to the test system is minimal. Ensure that the starting concentration of dry matter is about 2,5 g/l. | 35. | In the second case, use 2 ml/l to 10 ml/l of an effluent from a domestic biological waste water treatment plant as an inoculum. To get as many different species of bacteria as possible, it may be helpful to add inocula from various other sources, for example surface water. In this case, the activated sludge will develop and grow in the test system. | Dosage of organic medium | 36. | Ensure that influent and effluent containers and tubing from influent vessels and to effluent vessels are thoroughly cleaned to remove microbial growths initially and throughout the test. Assemble the test systems in a room where the temperature is controlled (normally in the range 20-25 °C) or use water-jacketed test units. Prepare a sufficient volume of the required organic medium (paragraphs 27-29). Initially fill the aeration vessel and the separator with the organic medium and add the inoculum (paragraphs 34, 35). Start the aeration such that the sludge is kept in suspension and in an aerobic state and begin dosing the influent and recycling the settled sludge. Dose organic medium out of storage vessels into the aeration vessels (paragraphs 20, 21) of the test and control units and collect the respective effluents in similar storage vessels. To get the normal hydraulic retention time of 6 h, the organic medium is pumped at 0,5 l/h. To confirm this rate, measure the daily amount of organic medium dosed by noting the reduction in volumes of the medium in the storage vessels. Other modes of dosing would be necessary for determining the effects of intermittent release and “shock” loading of chemicals. | 37. | If the organic medium is prepared for use for a period longer than 1 day, cooling at about 4 °C, or other appropriate methods of conservation are necessary to prevent microbial growth and biodegradation outside the test units (paragraph 29). If synthetic sewage is used, it is possible to prepare, and store at about 4 °C, a concentrated stock solution (e.g. 10-fold the normal concentration, paragraph 28). This stock solution can be well mixed with the appropriate volume of tap water before use; alternatively, it can be pumped directly while the appropriate amount of tap water is pumped separately. | Dosage of test chemical | 38. | Add an appropriate volume of the stock solution of the test chemical (paragraph 31) to the storage vessel of the influent or dose it directly with a separate pump into the aeration vessel. The normal mean test concentration in the influent should be between 10 mg/l and 20 mg/l DOC, with an upper concentration of no more than 50 mg/l. If the water-solubility of the test chemical is low or if toxic effects are likely to occur, reduce the concentration to 5 mg/l DOC or even less, but only if a suitable specific analytical method is available and performed (dispersed test chemicals which are poorly soluble in water may be added using special dosing techniques, see Appendix 5). | 39. | Start adding the test chemical after a period in which the system has stabilised and is removing DOC of the organic medium efficiently (about 80 %). It is important to check that all units are working equally efficiently before the addition of test chemical; if they are not, it usually helps to mix the individual sludges and to re-dispense equal volumes to individual units. When an inoculum of (about) 2,5 g/l (dry weight) activated sludge is used, the test chemical may be added from the start of the test since directly adding increasing amounts from the beginning has the advantage that the activated sludge may be better able to adapt to the test chemical. In whatever manner the test chemical is added, it is recommended that the relevant flow rate and/or the volumes in the storage vessel(s) are measured at regular intervals. | Handling of activated sludge | 40. | The concentration of activated sludge solids normally stabilises between limits during the test, independent of the inoculum used, in the range 1 to 3 g/l (dry weight) depending on the quality and concentration of the organic medium, operating conditions, the nature of the micro-organisms present and the influence of the test chemical. | 41. | Either determine the suspended solids in the aeration vessels at least weekly and discard surplus sludge to maintain the concentration at 1 g/l to 3 g/l (dry weight), or control the mean sludge age at a constant value usually in the range 6 days to 10 days. If, for example, a sludge retention time of 8 days is chosen, remove daily 1/8 of the volume of the activated sludge in the aeration vessel and discard it. Carry this out on a daily basis or, preferably, by means of an automatic intermittently operating pump. Maintaining the concentration of suspended solids constant, or within narrow limits, does not maintain a constant sludge retention time (SRT), which is the operating variable that determines the value of the concentration of test chemical in the effluent. | 42. | Throughout the test, remove, at least daily, any sludge adhering to the walls of the aeration vessel and the separator so that it is resuspended. Check and clean regularly all tubes and tubing to prevent growth of biofilm. Recycle the settled sludge from the separator to the aeration vessel, preferably by intermittent pumping. No recycling takes place in the porous pot system but ensure that clean inner pots are inserted before the volume in the vessel rises significantly (paragraph 21). | 43. | Poor settlement and loss of sludge may occur in the Husmann plant units. These may be rectified by employing one or more of the actions, listed below, in parallel in test and control units: | — | fresh sludge or flocculant (for example 2 ml/vessel of 50 g/l FeCl3) could be added at regular intervals, e.g. weekly, but ascertain that no reaction or precipitation of the test chemical occurs with FeCl3; | — | the air-lift pump could be replaced by a peristaltic pump, thus enabling a sludge recirculation flow which about equals the influent flow to be used and allowing development of an anaerobic zone in the settled sludge (the geometry of the air-lift pump limits the minimum flow rate of returned sludge to be about 12-fold that of the influent); | — | sludge could be pumped intermittently from the separator to the aeration vessel (e.g. 5 min. every 2,5 h to recycle 1 l/h to 1,5 l/h; | — | a non-toxic, anti-foaming agent at minimal concentration could be used to prevent loss by foaming (e.g. silicone oil); | — | air could be passed through the sludge in the separator in short, shock bursts (e.g. 10 sec. every hour); | — | the organic medium may be dosed at intervals into the aeration vessel (e.g. 3 min. to 10 min. every hour). | Sampling and analysis | 44. | At regular intervals measure the dissolved oxygen concentration, the temperature and the pH value of the activated sludge in the aeration vessels. Ensure that sufficient oxygen is always available (> 2 mg/l) and that the temperature is kept in the required range (normally 20 °C to 25 °C). Keep the pH at 7,5 ± 0,5 by dosing small amounts of inorganic base or acid into the aeration vessel or into the influent, or by increasing the buffering capacity of the organic medium (see paragraph 27). When nitrification occurs acid is produced, the oxidation of 1 mg N producing the equivalent of about 7 mg CO3 –. The frequency of measuring depends on the parameter to be measured and the stability of the system, and may vary between daily and weekly measurements. | 45. | Measure the DOC or COD in the influents to the control and test vessels. Measure the test chemical concentration in the test influent by specific analysis or estimate it from the concentration in the stock solution (paragraph 31), the volume used and the amount of sewage dosed into the test unit. It is recommended that the concentration of the test chemical be calculated in order to reduce the variability of the concentration data. | 46. | Take suitable samples from the collected effluent (e.g. 24 h composites) and filter through a membrane of pore size 0,45 μm or centrifuge them at about 40,000 m/s2 for about 15 min. Centrifuging should be used if filtering is difficult. Determine DOC or COD at least in duplicate to measure ultimate biodegradation and, if required, primary biodegradation by an analysis specific for the test chemical. | 47. | The use of COD may give rise to analytical problems at low concentrations and is therefore recommended only if a sufficiently high test concentration (about 30 mg/l) is used. Also, for strongly adsorbing chemicals, it is recommended that the amount of adsorbed chemical in the sludge be measured using an analytical technique specific for the test chemical. | 48. | The frequency of sampling depends on the expected duration of the test. A recommended frequency is three times per week. Once the units are operating efficiently, allow from 1 week to a maximum of 6 weeks after the test chemical has been introduced, for adaptation to reach a steady state. Preferably obtain at least 15 valid values in the plateau phase (paragraph 59), normally lasting 3 weeks, for the evaluation of the test result. The test may be completed if a sufficient degree of elimination is reached (e.g. > 90 %) and these 15 values, which represent analyses carried out each weekday over 3 weeks, are available. Normally, do not exceed a test duration of more than 12 weeks after addition of the test chemical. | 49. | If the sludge nitrifies and if the effects of the test chemical on nitrification are to be studied, analyse samples from the effluent of the test and control units at least once per week for ammonium and/or nitrite plus nitrate. | 50. | All analyses should be performed as soon as possible, especially the nitrogen determinations. If analyses have to be postponed, store the samples at about 4 °C in the dark in full, tightly stopped bottles. If samples have to be stored for more than 48 h, preserve them by deep-freezing, acidification (e.g. 10 ml/l of a 400 g/l solution of sulphuric acid) or by addition of a suitable toxic substance (e.g. 20 ml/l of a 10 g/l solution of mercury (II) chloride). Ensure that the preservation technique does not influence results of analysis. | Coupling of test units | 51. | If coupling is to be used (Appendix 3), daily exchange the same amount of activated sludge (150 ml to 1 500 ml for aeration vessels containing 3 litres of liquor) between the aeration vessels of the test unit and its control unit. If the test chemical adsorbs strongly onto the sludge, change only the supernatant of the separators. In both cases use a correction factor to calculate the test results (paragraph 55). | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 52. | Calculate the percentage of DOC or COD elimination of the test chemical for each timed assessment, using the equation: | where | Dt | = | % elimination of DOC or COD at time t | Cs | = | DOC or COD in the influent due to the test chemical, preferably estimated from the stock solution (mg/l) | E | = | measured DOC or COD value in the test effluent at time t (mg/l) | Eo | = | measured DOC or COD value in the control effluent at time t (mg/l) | 53. | The degree of DOC or COD elimination of the organic medium in the control unit is helpful information in assessing the biodegradative activity of the activated sludge during the test. Calculate the percentage elimination from the equation: | where | DB | = | % elimination of DOC or COD of the organic medium in the control unit at time t | CM | = | DOC or COD of the organic medium in the control influent (mg/l) | Optionally, calculate the percentage elimination DOC or COD due to the organic medium plus test chemical in the test unit from the equation: | where | DT | = | % elimination of total test influent DOC or COD | CT | = | DOC or COD of total test influent or calculated from stock solutions (mg/l) | 54. | Calculate the removal of the test chemical if measured with a specific analytical method at each time assessment from equation: | where | DST | = | % primary elimination of test chemical at time t | Si | = | measured or estimated test chemical concentration in the test influent (mg/l) | Se | = | measured test chemical concentration in test effluent at time t (mg/l) | 55. | If the coupling mode has been used, compensate the dilution of the test chemical in the aeration vessel by the sludge exchange using a correction factor (see Appendix 3). If a mean hydraulic retention time of 6 h and an exchange of half of the volume of the activated sludge in the aeration vessel have been used, the determined daily elimination values (Dt, paragraph 52) have to be corrected to obtain the true degree of elimination, Dtc, of the test chemical from the equation: | Expression of test results | 56. | Plot the percentage elimination Dt (or Dtc) and Dst, if available, versus time (see Appendic 2). From the shape of the elimination curve of the test chemical (per se or as DOC) some conclusions may be drawn about the removal process. | Adsorption | 57. | If a high DOC elimination of the test chemical is observed from the beginning of the test, the test chemical is probably eliminated by adsorption onto the activated sludge solids. It is possible to prove this by determining the adsorbed test chemical by specific analysis. It is not usual for the elimination of DOC of adsorbable chemicals to remain high throughout the test; normally, there is a high degree removal initially which gradually falls to an equilibrium value. If, however, the adsorbable test chemical was able to cause acclimation of the microbial population in some way or other, the DOC elimination of the test chemical would subsequently increase and reach a high plateau value. | Lag phase | 58. | As in static, screening tests, many test chemicals require a lag phase before full biodegradation occurs. In the lag phase, acclimation or adaptation of the degrading bacteria takes place with almost no removal of the test chemical; then the initial growth of these bacteria occurs. This phase ends and the degradation phase is taken to begin when about 10 % of the initial amount of test chemical is removed (after allowing for adsorption, if it occurs). The lag phase is often highly variable and poorly reproducible. | Plateau phase | 59. | The plateau phase of an elimination curve in a continuous test is defined as that phase in which the maximum degradation takes place. The plateau phase should be at least 3 weeks and have about 15 measured valid values. | Mean degree of elimination of test chemical | 60. | Calculate the mean value from the elimination values (Dt) of the test chemical at the plateau phase. Rounded to the nearest whole number (1 %), it is the degree of elimination of the test chemical. It is also recommended to calculate the 95 % confidence interval of the mean value. | Elimination of organic medium | 61. | Plot the percentage of elimination of the DOC or COD of the organic medium in the control unit (DB) versus time. Indicate the mean degree of elimination in the same way as for the test chemical (paragraph 60). | Indication of biodegradation | 62. | If the test chemical does not adsorb significantly on to activated sludge and the elimination curve has a typical shape of a biodegradation curve with lag, degradation and plateau phases (paragraphs 58, 59), the measured elimination can safely be attributed to biodegradation. If a high initial removal has taken place, the simulation test cannot differentiate between biological and abiotic elimination processes. In such cases, and in other cases where there is any doubt about biodegradation (e.g. if stripping takes place), analyse adsorbed test chemicals or perform additional static biodegradation tests based on parameters clearly indicating biological processes. Such tests are the oxygen uptake methods (chapter C.4 D, E and F of this Annex (6)) or a test with measurement of carbon dioxide production (chapter C.4 C of this Annex (6)) or the ISO Headspace method (18), using a pre-exposed inoculum from the simulation test. If both the DOC removal and specific chemical removal have been measured, significant differences (the former being lower than the latter) between the percentages removed indicate the presence in the effluents of intermediate organic products which may be more difficult to degrade than the parent chemical. | Validity of test results | 63. | Information on the normal biodegradation behaviour of the inoculum is achieved if the degree of elimination of the organic medium (paragraph 53) in the control unit is determined. Consider the test to be valid if the degree of DOC or COD elimination in the control unit(s) is > 80 % after two weeks and no unusual observations have been made. | 64. | If a readily biodegradable (reference) chemical has been used, the degree of biodegradation (Dt, paragraph 52) should be > 90 %. | 65. | If the test is performed under nitrifying conditions, the mean concentration in the effluents should be < 1 mg/l ammonia-N and < 2 mg/l nitrite-N. | 66. | If these criteria (paragraphs 63-65) are not met, repeat the test using an inoculum from a different source, test a reference chemical, and review all experimental procedures. | Test Report | 67. | The test report must include the following: | | Test chemical: | — | identification data; | — | physical nature and, where relevant, physical-chemical properties. | | Test conditions: | — | type of test system; any modifications for testing insoluble and volatile chemicals; | — | type of organic medium; | — | proportion and nature of industrial waste waters in sewage, if known; | — | inoculum, nature and sampling site(s), concentration and any pre-treatment; | — | test chemical stock solution: DOC and TOC content; how prepared, if suspension; test concentration used; reasons if outside range of 10-20 mg/l DOC; method of addition; date first added; any changes; | — | mean sludge age and mean hydraulic retention time; method of sludge wastage; methods of overcoming bulking, loss of sludge, etc.; | — | analytical techniques employed; | — | test temperature; | — | qualities of the sludge-bulking, sludge volume index (SVI), mixed liquor suspended solids (MLSS); | — | any deviations from standard procedures and any circumstances which may have affected results. | | Test results: | — | all measured data (DOC, COD, specific analyses, pH, temperature, oxygen concentration, suspended solids, N chemicals, if relevant; | — | all calculated values of Dt (or Dtc), DB, DSt obtained in tabular form and the elimination curves; | — | information on lag and plateau phases, test duration, the degree of elimination of the test chemical and that of the organic medium in the control unit, together with statistical information and statements of biodegradability and validity of the test; | — | discussion of results. | LITERATURE: | (1) | Swisher RD (1987). “Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp. | (2) | German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No 49: 698-706. | (3) | Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No 70, Water Research Centre, Medmenham, UK. | (4) | Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915. | (5) | Eckenfelder, W.W (19) US EPA. | (6) | Chapter C.4 of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability. | (7) | Chapter C.12 of this Annex, Biodegradation — Modified SCAS Test. | (8) | Chapter C.19 of this Annex, Estimation of the Adsorption Coefficient (K OC ) on Soil and on Sewage Sludge Using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). | (9) | Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173. | (10) | Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55. | (11) | Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp. 113-138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. | (12) | ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biodegradability of organic substances in an aqueous medium — activated sludge simulation test. | (13) | Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48. | (14) | Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340-343. | (15) | Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758. | (16) | Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. | (17) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91-98 ISBN 0117516619. | (18) | ISO 14593 (1998). Water Quality — Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels. | Appendix 1 | Figure 1 | Equipment used for assessment of biodegradability | Husmann unit | Figure 2 | Equipment used for assessment of biodegradability | Porous pot | Figure 3 | Details of 3 litre porous pot aeration vessel | Appendix 2 | Example of an elimination curve | Polyethylene glycol 400 Test Concentration 20 mg/l DOC | Appendix 3 | [INFORMATIVE] | COUPLING OF THE TEST UNITS | In order to try to equalise the microbial populations in sludges in a test unit, receiving sewage plus a test chemical, and in a control unit, receiving only sewage, a daily interchange of sludge was introduced (1). The procedure was called coupling and the method is known as coupled units. Coupling was initially performed using Husmann activated sludge units but it has also been done with Porous Pot units (2)(3). No significant differences in results were found as between non-coupled and coupled units, whether Husmann or Porous Pot so there is no advantage in expending the time and energy needed in coupling the units. | Sludge exchanges can give the appearance of quite a considerable removal, since some of the test chemical in transferred and the concentrations of test chemical in the test and control effluents become more nearly equal. Thus, correcting factors have to be used, which depend on the fraction exchanged and the mean hydraulic retention time. More details of the calculation have been published (1). | Calculate the corrected DOC or COD elimination degree using the general formula: | where | Dtc | = | corrected % DOC or COD elimination | Dt | = | determined % DOC or COD elimination | a | = | interchange fraction of the volume of the activated sludge units | r | = | mean hydraulic retention time (h) | If, for example, half of the volume of the aeration tank is exchanged (a = 0,5) and the mean hydraulic retention time is 6 h, the correction formula is: | LITERATURE: | (1) | Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135. | (2) | Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. | (3) | Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK. | Appendix 4 | EVALUATION OF INHIBITION OF THE ACTIVATED SLUDGE | Process by test chemicals | 1. | A chemical (or a waste water) may not be degraded or removed in the simulation test and may even have an inhibitory effect on the sludge micro-organisms. Other chemicals are biodegraded at low concentrations but are inhibitory at higher concentration (hormesis). Inhibitory effects may have been revealed at an earlier stage or may be determined by applying a toxicity test, using an inoculum similar to or identical with that used in the simulation test (1). Such methods are inhibition of oxygen uptake (chapter C.11 of this Annex (2) and ISO 8192(3)) or inhibition of growth of sludge organisms (ISO 15522 (4)). | 2. | In the simulation test any inhibition will be manifest by the difference in dissolved organic carbon (DOC) or chemical oxygen demand COD between the effluent from the test vessel and that from the control being greater than the DOC added as test chemical. Expressed in another way, the percentage removal of DOC (and biochemical oxygen demand BOD, chemical oxygen demand COD, and/or NH+ 4) of the organic medium on treatment will be decreased by the presence of the test chemical. If this occurs, the test should be repeated reducing the concentration of the test chemical until a level is reached at which no inhibition occurs and perhaps further reducing the concentration until the test chemical is biodegraded. However, if the test chemical (or waste water) has adverse effects on the process at all concentrations tested, the indications are that the chemical is difficult, if not impossible, to treat biologically, but it may be worth repeating the test with activated sludge from a different source and/or subjecting the sludge to a more gradual acclimation. | 3. | Conversely, if the test chemical is bioeliminated at the first attempt in the simulation test, its concentration should be increased if it is required to be known whether the chemical could be inhibitory. | 4. | It should be remembered in trying to determine degrees of inhibition that the activated sludge population can change, so that with time the micro-organisms may develop a tolerance towards an inhibitory chemical. | 5. | Calculation of degree of inhibition: | The overall percentage removals Ro, of BOD, DOC, COD etc., for the test and control units can be calculated from: | where: | I | = | influent concentration of BOD, DOC, COD etc., for test or control vessels (mg/l) | E | = | respective effluent concentrations (mg/l). | I and E must be corrected for the DOC due to the test chemical in the test units, otherwise the calculations of percentage inhibition will be incorrect. | The degree of inhibition caused by the presence of the test chemical can be calculated from: | where: | Rc | = | percentage removal in the control vessels | Rt | = | percentage removal in the test vessels | LITERATURE: | (1) | Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259. | (2) | Chapter C.11 of this Annex, Biodegradation — Activated Sludge Respiration Inhibition Test. | (3) | ISO 8192 (2007) Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation. | (4) | ISO 15522 (1999) Water Quality — Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms. | Appendix 5 | Poorly water-soluble test chemicals — volatile chemicals | Poorly water-soluble chemicals | Few reports seem to have been published on subjecting poorly water-soluble and insoluble chemicals to tests simulating waste water treatment (1)(2)(3). | There is no single method of dispersal of the test chemical which is applicable to all insoluble chemicals. Two of the four types of method described in ISO 10634 (4) would seem to be suitable for attempting to disperse test chemicals for simulation testing; they are the use of emulsifying agents and/or of ultrasonic energy. The stability over at least 24h periods of the resulting dispersion should be established. Suitably stabilised dispersions, contained in a constantly stirred reservoir (paragraph 38), would then be dosed to the aeration tank separately from the domestic (or synthetic) sewage. | If the dispersions are stable, investigate how the test chemical can be determined in the dispersed form. It is unlikely that DOC will be suitable, so that a specific analytical method for the test chemical would have to be established which could be applied to effluents, effluent solids and activated sludge. The fate of the test chemical in the simulation of the activated sludge process would then be determined in liquid and solid phases. Thus, a “mass balance” would be established to decide whether the test chemical had been biodegraded. However, this would indicate only primary biodegradation. Demonstration of ultimate biodegradation should be attempted by applying a respirometric test for ready biodegradability (chapter C.4 of this Annex (5) C, F or D) using as inoculum sludge exposed to the test chemical in the simulation test. | Volatile chemicals | The application of waste water treatment simulations to volatile chemicals is both debatable and problematic. As with poorly water-soluble test chemicals, very few reports seem to have been published describing simulation tests using volatile chemicals. A conventional type of complete-mixing apparatus is adapted by sealing the aeration and settling tanks, measuring and controlling the air flow using flow-meters and passing the exit gas through traps to collect volatile organic matter. In some cases, a vacuum pump is used to draw the exit gas through a “cold” trap or a purge-trap containing Tenax and silica gel for gas-chromatographic analyses. The test chemical present in the trap can be determined analytically. | The test is carried out in two parts. The units are first operated without sludge but with the synthetic waste water plus test chemical being pumped into the aeration tank. Influent, effluent and exit gas samples are collected and analysed for the test chemical for a few days. From the data collected, the percentage (Rvs) of the test chemical stripped from the system may be calculated. | Then the normal biological test (with sludge) is performed under operating conditions identical to those in the stripping study. DOC or COD measurements are also made to check that the units are performing efficiently. Occasional analyses are made to determine the test chemical in the influent, effluent and exit gas in the first part of the test; after acclimation more frequent analyses are made. Again, from the data in the steady state, the percentage of removal of the test chemical from the liquid phase by all processes (RT) (physical and biological) may be calculated, as well as the proportion (RV) stripped from the system. | Calculation: | (a) | In the non-biological test, the percentage (RVP) of the test material stripped from the system may be calculated from: | where | RVP | = | removal of test chemical by volatilisation (%), | SVP | = | test chemical collected in trap expressed as equivalent concentration in liquid phase (mg/l), | SIP | = | test chemical concentration in influent (mg/l). | (b) | In the biological test, the percentage (RV) of the test material stripped from the system may be calculated from: | where | RV | = | removal of test chemical by volatilisation in biological test (%), | SV | = | test chemical collected in trap in biological test, expressed as equivalent concentration in liquid influent (mg/l), | SI | = | test chemical concentration in influent (mg/l). | (c) | In the biological test, the percentage (RT) of the test chemical removed by all processes is given by: | where | SE = concentration of test chemical in the (liquid) effluent (mg/l). | (d) | Thus, the percentage (RBA) removed by biodegradation plus adsorption can be calculated from: | Separate tests should be carried out to determine whether the test chemical is adsorbed; if it is, then a further correction may be made. | (e) | A comparison between the proportion of test chemical stripped from the biological (Rv) and non-biological test (Rvp) systems indicates the overall effect that biological treatment has had on the emission of the test chemical into the atmosphere. | Example: | Benzene | Sludge retention time = 4 days | A synthetic sewage; retention time = 8 h. | SIP | = | SI = 150 mg/l | SVP | = | 150 mg/l (SEP = 0) | SV | = | 22,5 mg/l | SE | = | 50 μg/l | Thus, | RVP | = | 100, RV = 15 | RT | = | 100 and RBA = 85. | Benzene was assumed not to be adsorbed onto sludge. | LITERATURE: | (1) | Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854. | (2) | Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA. | (3) | Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97. | (4) | ISO 10634 (1995) Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. | (5) | Chapter C.4 of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability. | Appendix 6 | Effects of sludge retention time (SRT) on treatability of chemicals | INTRODUCTION | 1. | The method described in the main text was designed to ascertain whether the chemicals tested (usually those known to be inherently, but not readily, biodegradable) can be biodegraded within the limits imposed in waste water treatment plants. The results are expressed in terms of percentage removal and percentage biodegradation. The conditions of operation of the activated sludge units and choice of influent allow rather wide variations in concentration of the test chemical in the effluent. Tests are carried out at only one nominal concentration of sludge solids or one nominal sludge retention time (SRT) and the sludge wastage regimes described can cause the value of SRT to vary considerably during the test, both from day to day and during a day. | 2. | In this variant (1)(2) the SRT is controlled within much narrower limits throughout each 24h period (just as happens on the large-scale) which results in a more constant concentration in effluents. Domestic sewage is recommended since it gives more consistent and higher percentage removals. Also, the effects of a number of SRT values are investigated and in a more detailed study the effects of a range of temperatures on effluent concentration may be determined. | 3. | There is no general agreement yet on which kinetic models operate when chemicals bio-degrade under conditions in waste water treatment. The Monod model of bacterial growth and substrate utilisation was chosen (1)(2) to be applied to the data collected, since the method was intended to be applied only to chemicals produced in high tonnages, resulting in concentrations in sewage of above 1 mg/l. The validity of the simplified model and the assumptions made was established using a series of alcohol ethoxylates having varying degrees of primary biodegradability (2)(3). | Note: | This variant method follows closely much of the text of this test method C.10-A and only those details which differ are given hereafter. | PRINCIPLE OF THE TEST | 4. | Activated sludge porous-pot units, designed to facilitate the (almost) continuous wastage of mixed liquor allowing very precise control of the sludge retention time (SRT, or θs), are operated in the non-coupled mode over a range of SRTs and, optionally, over a range of temperatures. The retention time is usually 2 to 10 days and the temperature between 5 and 20 °C. Sewage, preferably domestic, and a solution of the test chemical are dosed separately to the units at rates to give the required sewage retention time (3 to 6 hours) and the required concentration of test chemical in the influent. Control units receiving no test chemical are operated in parallel for comparative purposes. | 5. | Other types of apparatus can be used but great care should be exercised to ensure that good control of SRT is achieved. For example, when using plants, which incorporate a settler, allowance for loss of solids via the plant effluent may be necessary. Further, special precautions to avoid errors due to variation in the quantity of sludge in the settler should also be taken. | 6. | The units are operated at each selected set of conditions and, after equilibrium has been reached, the average steady state concentrations in the effluents of test chemical and, optionally, DOC are obtained over a period of about three weeks. Besides assessing the percentage removal of test chemical and, optionally, DOC, the relationship between plant-operating conditions and the concentration in the effluent is expressed in graphical form. From this tentative kinetic constants may be calculated and the conditions under which the test chemical can be treated may be predicted. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 7. | Chapter C.10 A, paragraphs 12 and 13 apply. | PASS LEVELS | 8. | Chapter C.10 A, paragraphs 14 and 15 apply. | REFERENCE TEST CHEMICAL | 9. | Chapter C.10 A, paragraph 16 applies. | REPRODUCIBILITY OF TEST RESULTS | 10. | Chapter C.10 A, paragraphs 17 and 18 apply. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | 11. | A suitable unit is the modified porous pot system (Appendix 6.1). It consists of an inner vessel (or liner) constructed from porous polypropylene of 3,2 mm thickness and pore size of approximately 90 μm, the joint being butt-welded. (This makes a more robust unit than that described in paragraph 21 of this chapter, C.10 A). The liner is fitted into an impervious polyethylene outer vessel, which consists of two parts: a circular base in which holes are bored to accommodate two air lines and a sludge-wastage line, and an upper cylinder which screws on to the base and which has an outlet placed so as to give a known volume (3 l) in the porous pot vessel. One of the air lines is fitted with a diffuser stone and the other is open-ended and set at right-angles to the stone in the pot. This system produces the necessary turbulence to ensure that the contents of the pot are completely mixed, as well as providing concentrations of dissolved oxygen greater than 2 mg/l. | 12. | The appropriate number of units are maintained at controlled temperatures in the range of 5 to 20 °C (± 1 °C), either in water baths or in constant temperature rooms. Pumps are required to dose to the aeration vessels the solution of the test chemical and settled sewage at the required rates (0-1,0 ml/min and 0-25 ml/min, respectively) and a third pump to remove waste sludge from the aeration vessels. The necessary very low flow-rate of waste sludge is achieved by using a pump set at a higher rate and operated intermittently by the use of a timer-switch, e.g. operating for 10 seconds per min, pump delivery rate of 3ml/min yielding a wastage rate of 0,5 ml/min. | Filtration apparatus or centrifuge | 13. | Chapter C10 A, paragraph 23 applies. | Analytical equipment | 14. | Chapter C.10 A, paragraph 24 applies. | Water | 15. | Chapter C.10 A, paragraphs 25 and 26 apply. | Organic medium | 16. | Chapter C.10 A, paragraph 27 applies. | Synthetic sewage | 17. | Chapter C.10 A, paragraph 28 applies. | Domestic sewage | 18. | Chapter C.10 A, paragraph 29 applies. | Activated sludge | 19. | Chapter C10 A, paragraph 30 applies. | Stock solutions of test chemical | 20. | Chapter C.10 A, paragraphs 31 and 32 apply. | PROCEDURE | Preparation of the inoculum | 21. | Chapter C.10 A, paragraph 34 applies only — use activated sludge (about 2,5 g/l). | Number of test units | 22. | For a simple test, ie. to measure percentage removal, only a single SRT is required, but in order to acquire data necessary to calculate tentative kinetic constants 4 or 5 SRT values are required. Values between 2 and 10 days are usually chosen. Practically, it is convenient to perform a test at 4 or 5 SRTs simultaneously at one temperature; in extended studies the same SRT values, or perhaps a different range of values, are used at other temperatures within the range 5 to 20 °C. For primary biodegradation (the main use), only one unit per set of conditions is normally required. However, for ultimate biodegradability a control unit is required, for each set of conditions, which receives sewage but not test chemical. If the test chemical is thought to be present in the sewage used, it would be necessary to use control units when assessing primary biodegradation, and making the necessary correction in the calculations. | Dosage of organic medium and test chemical | 23. | Chapter C.10 A, paragraphs 36 to 39 apply, but note that the test chemical solution is dosed separately and that various sludge wastage rates are used. Also monitor and adjust, if necessary, to within ± 10 %, the flow-rates of influents, effluents and sludge wastage frequently, e.g. twice per day. If difficulties are encountered in the analytical methods when domestic sewage is used, carry out the test with synthetic sewage, but it must be assured that different media give comparable kinetic data. | Handling of activated sludge units | 24. | Chapter C.10 A, paragraphs 40 to 43 apply, but control SRT only by “constant” wastage of sludge. | Sampling and analysis | 25. | Chapter C.10 A, paragraphs 44 to 50 apply, except that the concentration of the test chemical is to be determined and DOC determined optionally; COD should not be used. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 26. | Chapter C.10 A, paragraphs 52 to 54 apply. | Expression of test results | 27. | Chapter C.10 A, paragraphs 56 to 62 apply. | Calculation of kinetic constants | 28. | It is more realistic to quote the mean steady — state concentration of the test chemical in the effluent and to describe how this varies with plant-operating conditions than to quote percentage primary biodegradation. This can be done by consideration of equation (6) in Appendix 6.2, which can yield values for KS, μm and θSC, the critical sludge retention time. | (Alternatively, approximate values of KS and μm may be obtained using a simple computer program to fit the theoretical curve calculated from equation 2 (Appendix 6.2) to the experimental values obtained. Although any given solution will not be unique, a reasonable approximation of KS and μm can be obtained.) | Variability of results | 29. | It is common experience that variable values of kinetic parameters for individual chemicals are obtained. It is thought that the conditions under which the sludge has been grown, as well as the conditions prevailing in the test used (as in paragraph 5 and in other tests), have a large effect on the resulting values. One aspect of this variability has been discussed by Grady et al (4), who have suggested that the terms “extant” and “intrinsic” should be applied to two extreme conditions representing the limits of physiological state a culture may attain during a kinetic experiment. If the state is not allowed to change during the test, the kinetic parameter values reflect the conditions in the environment from which the micro-organisms were taken; these values are called “extant” or currently existing. At the other extreme, if conditions in the test are such as to permit the full development of the protein-synthesizing system allowing maximum possible growth rate, the kinetic parameters obtained are said to be “intrinsic”, and are dependent only on the nature of the substrate and the types of bacteria in the culture. As a guide, extant values will be obtained by keeping the ratio of concentration of substrate to competent micro-organisms (So/Xo) low, e.g. 0,025, and intrinsic values arise when the ratio is high e.g. at least 20. In both cases, So should equal or exceed the relevant value of Ks, the half-saturation constant. | 30. | Variability and other facets of biodegradation kinetics were discussed at a recent SETAC workshop (5). From such studies, reported and projected, a clearer view of kinetics operating in waste water treatment plants should be forth-coming to enable a better interpretation of existing data to be made, as well as to suggest more relevant designs for future Test Methods. | LITERATURE: | (1) | Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33-48. | (2) | Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340-343. | (3) | Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422. | (4) | Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742-748. | (5) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels. | Appendix 6.1 | Porous Pot with SRT Control | Appendix 6.2 | Calculation of Kinetic Constants | 1. | By assuming Monod kinetics apply and considering a mass balance of active solids and substrate across the activated sludge system (1), the following steady state expressions can be obtained: | [1] | or | [2] | where: | S1 | = | concentration of substrate in effluent, (mg/l) | KS | = | half-saturation constant, the concentration at which μ = μm/2 (mg/l) | μ | = | specific growth rate (d–1) | μm | = | maximum value of μm(d–1) | Kd | = | specific decay rate of active solids (d–1) | θS | = | sludge mean retention time, SRT (d) | Examination of this equation leads to the following conclusions: | (i) | The effluent concentration is independent of that in the influent (S0); hence, the percentage biodegradation varies with the influent concentration, S0. | (ii) | The only plant-control parameter affecting S1 is the sludge retention time, θS. | (iii) | For a given concentration in the influent, S0, there will be a critical sludge retention time, such that: | [3] | where: | θSC = critical sludge retention time, below which the competent micro-organisms will be washed out of the plant. | (iv) | Since the other parameters in equation (2) are associated with growth kinetics, temperature is likely to affect the effluent substrate level and the critical sludge age, ie. the sludge retention time needed to obtain a certain degree of treatment would increase with decreasing temperature. | 2. | From a mass balance of solids in the porous pot system, and assuming that the solids concentration in the plant effluent, X2 is low compared with that in the aeration vessel, X1, the sludge retention time | [4] | and | where: | V | = | volume of the aeration vessel (l) | X1 | = | concentration of solids in aeration vessel (mg/l) | X2 | = | concentration of solids in effluent (mg/l) | Q0 | = | flow rate of influent (l/d) | Q1 | = | flow rate of waste sludge (l/d) | Thus, it is possible to control the sludge retention time at any pre-selected value by the control of the waste sludge flow rate, Q1. | Conclusions: | 3. | The main purpose of the test is thus to allow the effluent concentration, and hence the levels of test chemical in the receiving waters, to be predicted. | 4. | By plotting S1, vs. θS, the critical sludge retention time, θSC, can sometimes be readily evaluated, eg. curve 3 in Figure 1. When this is not possible, θSC may be calculated, together with approximate values of μm and KS, by plotting S1, vs. S1•θS. | Rearrangement of equation (1) gives | [5] | If Kd is small, then 1 + θs · Kd ~ 1 and [5] becomes: | [6] | Thus, the plot should be a straight line (see Figure 2) of slope 1/μm and intercept KS/μm; also θS ~1/μm. | Figure 1 | Three temperatures; five SRTs | Figure 2 | Regression Line SRT · S1 vs S1 at T = 5 °C | Glossary: | Effluent concentration: | Curve: | Appendix 7 | TEST AT LOW (μg/l) CONCENTRATION RANGE | 1. | Many chemicals are normally present in the aquatic environment, even in waste waters, at very low concentrations (μg/l). At such concentrations, they probably do not serve as primary substrates resulting in growth, but are more likely to degrade as non-growth, secondary substrates, concurrent with a variety of naturally occurring carbon chemicals. Consequently the degradations of such chemicals will not fit the model described in Appendic 6. There are many models which could be applied and, under the conditions prevailing in waste water treatment systems, more than one may be simultaneously operative. Far more research will be necessary to elucidate this problem. | 2. | Meanwhile the procedure given in the main text (chapter C.10 A) can be followed, but only for primary biodegradability, using suitably low concentrations (< 100 μg/l) and a validated analytical procedure. The percentage biodegradation may be calculated (see para. 54 of the Test Method) provided that abiotic processes (adsorption, volatility, etc.) are taken into account. An example is the study by Nyholm and his associates (1)(2) using a 4 h cycle in a fill and draw system. They reported pseudo first-order constants for 5 chemicals added in a synthetic sewage at 5 to 100 μg/l. (For ultimate biodegradability 14C-labelled test chemicals may be used. A description of this is beyond the scope of this Test Method since there are as yet no agreed procedures, though a proposed method for ISO 14592 (3) contains guidance on the use of 14C-labelled chemicals. | SCAS test | 3. | Later, a simpler two-stage test was proposed (4)(5)(6); the semi-continuous activated sludge (SCAS) method is followed by short-term kinetic tests on samples withdrawn from the SCAS units. The SCAS system is operated with known sludge wastage rates (unlike the original C.12 test method) and is fed a modified OECD synthetic sewage or domestic sewage. The synthetic sewage was modified (because of changing pH value and poor sludge settleability) by addition of phosphate as buffer, yeast extract, iron (III) chloride and trace element salts, and its COD was increased to about 750 mg/l by increasing the concentration of peptone and meat extract. The units were operated on a 24 h cycle: aeration for 23 h, wastage of sludge, settlement, withdrawal of supernatant (effluent) followed by addition of synthetic sewage plus test chemical, up to 100 μg/l, (i.e. at about the same concentration used in the short term test). Once per week 10 % of the total sludge was replaced by fresh sludge in order to maintain a balanced microbial population. | 4. | The concentrations of test chemical initially and at the end of aeration are measured and the test is continued until a constant removal of test chemical is attained; this takes from one week to several months. | Short-term test | 5. | A short test (e.g. 8 hours) is applied to determine the (pseudo) first order kinetic rate constant for the decay of the test chemical in activated sludge of known but different origins and histories. In particular, sludge samples are taken from the SCAS reactors — at the end of an aeration period when the concentration of organic substrate is low — during the course of an acclimatisation experiment (paragraphs 3, 4). Sludge may also be taken from a parallel SCAS unit not exposed to the test chemical, for comparison. Mixtures of sludge and the test chemical added at two or more concentrations in the range 1-50 μg/l are aerated, without the addition of synthetic sewage or other organic substrate. The test chemical remaining in solution is determined at regular intervals e.g. hourly depending on the degradability of the chemical, for a period not longer than 24h. Samples are centrifuged before appropriate analysis. | Calculations | 6. | Data from the SCAS units are used to calculate the percentage removal of test chemical (paragraph 54). Also, an average rate constant, K1, (normalised for concentration of suspended solids) can be calculated from: | where: | t | = | aeration time (23h) | Ce | = | concentration at end of aeration period (μg/l) | Ci | = | concentration at beginning of aeration (μg/l) | SS | = | concentration of activated sludge solids (g/l) | 7. | In the short term test the log % concentration remaining is plotted against time and the slope of the initial part (10-50 % degradation) of the plot is equivalent to K1, the (pseudo) first order constant. The constant is normalised with respect to the concentration of sludge solids by dividing the slope by the concentration of sludge solids. The reported result must also include details of initial concentrations of the test chemical and suspended solids, sludge retention time, sludge loading and source, and details of pre-exposure (if any) to the test chemical. | Variability of results | 8. | Variability and other facets of biodegradation kinetics were discussed at a recent SETAC workshop (7). From such studies, reported and projected, a clearer view of kinetics operating in waste water treatment plants should be forth-coming to enable a better interpretation of existing data to be made, as well as to suggest more relevant designs for future Test Methods. | LITERATURE: | (1) | Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353. | (2) | Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510. | (3) | ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality — Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water. | (4) | Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864. | (5) | Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735. | (6) | Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen. | (7) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels. | C.10-B: Biofilms | INTRODUCTION | 1. | Simulation tests are normally applied to chemicals which have failed a screening test for ready biodegradability (Chapter C.4 A to F of this Annex (9)), but have passed a test for inherent biodegradability. Exceptionally simulation tests are also applied to any chemical about which more information is required, especially high-tonnage chemicals, and normally the activated sludge test is applied (C.10 A). In some circumstances, however, specific information is required relating the behaviour of a chemical to methods of waste water treatment involving biofilms, namely, percolating or trickling filters, rotating biological contactors, fluidised beds. To meet this need various devices have been developed. | 2. | Gerike et al. (1) used large, pilot-scale trickling filters which they used in the coupled mode. These filters took up much space and required relatively large volumes of sewage or synthetic sewage. Truesdale et al. (2) described smaller filters (6 ft × 6 in. diameter) which were fed surfactant-free natural sewage but still required rather large volumes. As many as 14 weeks were required for the development of a “mature” biofilm and an additional 4-8 weeks were needed after first introduction of the test surfactant before acclimatisation took place. | 3. | Baumann et al. (3) developed a much smaller filter which used polyester “fleece” previously steeped in activated sludge as the inert medium supporting the biofilm. The test chemical was used as the sole source of carbon and biodegradability was assessed from measurements of dissolved organic carbon (DOC) in the influent and effluent, and from the amount of CO2 in the exit gas. | 4. | A quite different approach was made by Gloyna et al. (4) who invented the rotating tubular reactor. On the internal surface of the rotating tube a biofilm was grown on the known surface area by passage of influent introduced at the top end of the tube, inclined at a small angle to the horizontal. The reactor has been used to study the biodegradability of surfactants (5), as well as to investigate the optimal thickness of biofilm and diffusion through the film (6). These latter authors further developed the reactor, including modifying it to be able to determine CO2 in the exit gas. | 5. | The rotating tubular reactor has been adopted by the Standing Committee of Analysts (UK) as a standard method for assessing both the biodegradability of chemicals (7) and the treatability and toxicity of waste waters (8). The method described here has the advantages of simplicity, compactness, reproducibility and the need for relatively small volumes of organic medium. | PRINCIPLE OF THE TEST | 6. | Synthetic or domestic sewage, and the test chemical, in admixture or alone, are applied to the internal surface of a slowly rotating inclined tube. A layer of microorganisms, similar to those present on bio-filter media, is built up on the internal surface. The conditions of operation of the reactor are chosen to give adequate elimination of organic matter and, if required, oxidation of ammonium. | 7. | Effluent from the tube is collected and either settled and/or filtered before analysis for dissolved organic carbon (DOC) and/or the test chemical by a specific method. Control units receiving no test chemical are operated in parallel under the same conditions for comparative purposes. The difference between the concentrations of DOC in the effluent from the test and control units is assumed to be due to the test chemical and its organic metabolites. This difference is compared with the concentration of the added test chemical (as DOC) to calculate the elimination of the test chemical. | 8. | Biodegradation may normally be distinguished from bio-adsorption by careful examination of the elimination-time curve. Confirmation may usually be obtained by applying a test for ready biodegradation (oxygen uptake or carbon dioxide production) using an acclimated inoculum taken at the end of the test from the reactors receiving the test chemical. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 9. | The purity, water solubility, volatile and adsorption characteristics of the test chemical should be known to enable correct interpretation of results to be made. | 10. | Normally, volatile and poorly soluble chemicals cannot be tested unless special precautions are taken (see Appendix 5 to chapter C.10 A). The chemical structure, or at least the empirical formula, should also be known in order to calculate theoretical values and/or to check measured values of parameters, e.g. theoretical oxygen demand (ThOD), DOC. | 11. | Information on the toxicity of the test chemical to micro-organisms (see Appendix 4 to chapter C.10 A) may be useful for selecting appropriate test concentrations and may be essential for the correct interpretation of low biodegradation values. | PASS LEVELS | 12. | Originally, the primary biodegradation of surfactants was required to reach 80 % or more before the chemical could be marketed. If the value of 80 % is not attained, this simulation (confirmatory) test may be applied and the surfactant may be marketed only if more than 90 % of the specific chemical is removed. With chemicals in general there is no question of a pass/fail level and the value of percentage removed can be used in proximate calculations of the probable environmental concentration to be used in hazard assessments posed by chemicals. In a number of studies of pure chemicals the percentage removal of DOC was found to be > 90 % in more than three-quarters, and > 80 % in over 90 %, of chemicals which showed any significant degree of biodegradability. | REFERENCE CHEMICALS | 13. | To ensure that the experimental procedure is being carried out correctly, it is useful occasionally to test reference chemicals whose behaviour is known. Such chemicals include adipic acid, 2-phenyl phenol, 1-naphthol, diphenic acid and 1-naphthoic acid. | REPRODUCIBILITY OF TEST RESULTS | 14. | The relative standard deviation within tests was found by a laboratory in the UK to be 3,5 % and between tests to be 5 % (7). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | Rotating tubular reactors | 15. | The apparatus (see figures 1 and 2 in the Appendix 8 consists of a bank of acrylic tubes each 30,5 cm long and 5 cm internal diameter, supported on rubber-rimmed wheels contained within a metal supporting frame. Each tube has an outside lip, approximately 0,5 cm deep, to retain it on the wheels, the internal surface is roughened with coarse wire wool and there is a 0,5 cm deep internal lip at the upper (feed) end to retain the liquid. The tubes are inclined at an angle of approximately one degree to the horizontal to achieve the required contact time when the test medium is applied to a clean tube. The rubber-tyred wheels are rotated using a slow, variable-speed motor. The temperature of the tubes is controlled by installation in a constant temperature room. | 16. | By enclosing each tube reactor inside a slightly larger, capped tube and ensuring that connections were gas-tight, exit CO2 gas could be collected in an alkaline solution for subsequent measurement (6). | 17. | A 24h supply, for each tube, of organic medium with added test chemical if applicable, is contained in a 20 l storage vessel (A)(see Figure 2). If required, the test chemical solution may be dosed separately. Near the bottom of each storage vessel there is an outlet which is connected by suitable tubing, e.g. silicone rubber, via a peristaltic pump (B) to a glass or acrylic delivery tube which enters 2-4 cm into the higher (feed) end of the inclined tube (C). Effluent is allowed to drip from the lower end of the inclined tube to be collected in another storage vessel (D). The effluent is settled or filtered before analysis. | Filtration apparatus-centrifuge | 18. | Device for filtration of samples with membranes filter of suitable porosity (nominal aperture diameter 0,45 μm) which adsorb organic chemicals or release organic carbon to a minimum degree. If filters are used which release organic carbon, wash them carefully with hot water to remove leachable organic carbon. Alternatively a centrifuge capable of achieving 40 000 m/sec2 may be used. | 19. | Analytical equipment for determining: | — | DOC/total organic carbon (TOC), or chemical oxygen demand (COD); | — | specific chemical (HPLC, GC etc.) if required; | — | pH, temperature, acidity, alkalinity; | — | ammonium, nitrite, nitrate, if the tests are performed under nitrifying conditions. | Water | 20. | Tap water, containing less than 3 mg/l DOC. | 21. | Distilled or deionised water, containing less than 2 mg/l DOC. | Organic medium | 22. | Synthetic sewage, domestic sewage or a mixture of both may be used as the organic medium. It has been shown that the use of domestic sewage alone often gives increased percentage removed of DOC (in activated sludge units) and even allows the biodegradation of some chemicals, which are not biodegraded when OECD synthetic sewage is used. Thus, the use of domestic sewage is recommended. Measure the DOC (or COD) concentration in each new batch of organic medium. The acidity or alkalinity of the organic medium should be known. The medium may require the addition of a suitable buffer (sodium hydrogen carbonate or potassium hydrogen phosphate), if it is of low acidity or alkalinity, to maintain a pH of about 7,5 ± 0,5 in the reactor during the test. The amount of buffer, and when to add it, has to be decided in each individual case. | Synthetic sewage | 23. | Dissolve in each 1 litre of tap water: peptone, 160 mg; meat extract, 110 mg; urea, 30 mg; anhydrous dipotassium hydrogen phosphate, (K2HPO4), 28 mg; sodium chloride, (NaCl), 7 mg; calcium chloride dihydrate, (CaCl2.2H2O), 4 mg; magnesium sulphate heptahydrate, (MgSO4.7H2O), 2 mg. This OECD synthetic sewage is an example and gives a mean DOC concentration in the influent of about 100 mg/l. Alternatively, use other compositions, with about the same DOC concentrations, which are closer to real sewage. This synthetic sewage may be made up in distilled water in a concentrated form and stored at about 1 °C for up to one week. When needed, dilute with tap water. (This medium is unsatisfactory e.g. nitrogen concentration is very high, relatively low carbon content, but nothing better has been suggested, except to add more phosphate, as buffer, and extra peptone). | Domestic sewage | 24. | Use fresh settled sewage collected daily from a treatment works receiving predominantly domestic sewage. It should be collected from the overflow channel of the primary sedimentation tank, or from the feed to activated sludge plant, and be largely free from coarse particles. The sewage can be used after storage for several days at about 4 °C, if it is proved that the DOC (or COD) has not significantly decreased (i.e. by less than 20 %) during storage. In order to limit disturbances to the system, the DOC (or COD) of each new batch should be adjusted before use to an appropriate constant value, e.g. by dilution with tap water. | Lubricant | 25. | Glycerol or olive oil may be used for lubricating the peristaltic pump rollers: both are suitable for use on silicone-rubber tubing. | Stocks solutions of test chemical | 26. | For chemicals of adequate solubility prepare stock solutions at appropriate concentrations (e.g. 1 to 5 g/l) in deionised water or in the mineral portion of the synthetic sewage. For insoluble chemicals, see Appendix 5 in chapter C.10-A. This method is not suitable for volatile chemicals without modifications to the tubular reactors (paragraph 16). Determine the DOC and TOC of the stock solution and repeat the measurements for each new batch. If the difference between the DOC and TOC is greater than 20 %, check the water-solubility of the test chemical. Compare the DOC or the concentration of the test chemical measured by specific analysis of the stock solution with the nominal value to ascertain whether recovery is good enough (normally > 90 % can be expected). Ascertain, especially for dispersions, whether or not DOC can be used as an analytical parameter or if only an analytical technique specific for the test chemical can be used. Centrifugation of the samples is required for dispersions. For each new batch, measure the DOC, COD or the test chemical with specific analysis. | 27. | Determine the pH of the stock solution. Extreme values indicate that the addition of the chemical may have an influence on the pH of the activated sludge in the test system. In this case neutralise the stock solution to obtain a pH of 7 ± 0,5 with small amounts of inorganic acid or base, but avoid precipitation of the test chemical. | PROCEDURE | Preparation of organic medium for dosing | 28. | Ensure that all influent and effluent containers and tubing from influent vessels and to effluent vessels are thoroughly cleaned to remove microbial growths, initially and throughout the test. | 29. | Prepare the synthetic sewage (paragraph 23) freshly each day either from the solids or from the concentrated stock solution by appropriate dilution with tap water. Measure the required amount in a cylinder and add to a clean influent vessel. Also, where necessary, add the required amount of the stock solution of the test chemical or reference chemical to the synthetic sewage before dilution. If it is more convenient or necessary to avoid loss of the test chemical, prepare a separate diluted solution of the test chemical in a separate reservoir and deliver this to the inclined tubes via a different dosing pump. | 30. | Alternatively (and preferably), use settled domestic sewage (paragraph 24) collected freshly each day if possible. | Operation of rotating tubular reactors | 31. | Two identical tubular reactors are required for the assessment of one test chemical, and they are assembled in a constant temperature room normally at 22 ± 2 °C. | 32. | Adjust the peristaltic pumps to deliver 250 ± 25 ml/h of the organic medium (without test chemical) into the inclined tubes, which are rotated at 18 ± 2 rpm. Apply the lubricant (paragraph 25) to the pump tubes initially and periodically through the test to ensure proper functioning and to prolong the life of the tubing. | 33. | Adjust the angle of inclination of the tubes to the horizontal to produce a residence time of 125 ± 12,5 sec. for the feed in a clean tube. Estimate the retention time by adding a non-biological marker (e.g. NaCl, inert dye) to the feed: the time taken to reach peak concentration in the effluent is taken to be the mean retention time (when maximum film is present, the retention time can increase up to about 30 min.). | 34. | These rates, speeds and times have been found to give adequate removals (> 80 %) of DOC (or COD) and to produce nitrified effluents. The rate of flow should be changed if removal is insufficient or if the performance of a particular treatment plant is to be simulated. In the latter case, adjust the rate of dosing the organic medium until the performance of the reactor matches that of the treatment plant. | Inoculation | 35. | Airborne inoculation may be sufficient to start the growth of micro-organisms when synthetic sewage is used, but otherwise add 1 ml/l of settled sewage to the feed for 3 days. | Measurements | 36. | At regular intervals check that the dose-rates and rotating speeds are within the required limits. Also, measure the pH of the effluent, especially if nitrification is expected. | Sampling and analysis | 37. | The method, pattern and frequency of sampling are chosen to suit the purpose of the test. For example, take snap (or grab) samples of influent and effluent, or collect samples over a longer period e.g. 3-6 h. In the first period, without test chemical, take samples twice per week. Filter the samples through membranes or centrifuge at about 40 000 m/sec2 for about 15 min (paragraph 18). It may be necessary to settle and/or coarse-filter the samples before membrane filtration. Determine DOC (or COD) at least in duplicate and if required BOD, ammonium and nitrite/nitrate. | 38. | All analyses should be performed as soon as possible after collection and preparation of the samples. If analyses have to be postponed, store the samples at about 4 °C in the dark in full, tightly stoppered bottles. If samples have to be stored for more than 48h, preserve them by deep-freezing, acidification or by addition of a suitable toxic chemical (e.g. 20 ml/l of a 10 g/l solution of mercury (II) chloride). Ensure that the preservation technique does not influence the results of analysis. | Running-in period | 39. | In this period, the surface biofilm grows to reach an optimal thickness, usually taking about 2 weeks and should not exceed 6 weeks. The removal (paragraph 44) of DOC (or COD) increases and reaches a plateau value. When the plateau has been reached at a similar value in both tubes, one is selected to be a control in the remainder of the test, during which their performance should remain consistent. | Introduction of test chemical | 40. | At this stage add the test chemical to the other reactor at the required concentration, usually 10-20 mg C/l. The control continues to receive the organic medium alone. | Acclimation period | 41. | Continue the twice weekly analyses for DOC (or COD) and, if primary biodegradability is to be assessed, also measure the concentration of the test chemical by specific analysis. Allow from one to six weeks (or longer under special conditions) after the test chemical has first been introduced for acclimation to occur. When the percentage removal (paragraphs 43-45) reaches a maximum value, obtain 12-15 valid values in the plateau phase over about 3 weeks for evaluation of the mean percentage removal. The test is considered completed if a sufficiently high degree of elimination is reached. Normally, do not exceed a test duration of more than 12 weeks after the first addition of the test chemical. | Sloughing of the film | 42. | The sudden removal of large quantities of excess film from the tubes, or sloughing, takes place at relatively regular intervals. To ensure that the comparability of results is unaffected, allow tests to cover at least two full cycles of growing and sloughing. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 43. | Calculate the percentage DOC (or COD) elimination of the test chemical for each timed assessment using the equation: | where: | Dt | = | percentage elimination of DOC (or COD) at time t; | Cs | = | concentration of DOC (or COD) in the influent due to the test chemical, preferably estimated from the concentration in, and volume added, of the stock solution (mg/l); | E | = | measured DOC (or COD) in the test effluent at time t (mg/l); | Eo | = | measured DOC (or COD) in the control effluent at time t (mg/l). | Repeat the calculation for the reference chemical, if tested. | Performance of the control reactor | 44. | The degree of DOC (or COD) elimination (DB) of the organic medium in the control reactors is helpful information in assessing the biodegradative activity of the biofilm during the test. Calculate the percentage elimination from the equation: | where: | Cm= DOC (or COD) of the organic medium in the control influent (mg/l). | 45. | Calculate the removal (DST) of the test chemical, if measured, by a specific analytical method at each time assessment from the equation: | where: | Si | = | measured or, preferably, estimated concentration of test chemical in the test influent (mg/l) | Se | = | measured test chemical concentration in the test effluent at time t (mg/l) | If the analytical method gives a positive value in unamended sewage equivalent to S c mg/l, calculate the percentage removal (DSC) from: | Expression of test results | 46. | Plot the percentage elimination D t and DST (or DSC), if available, versus time (see Appendix 2 in chapter C.10- A). Take the mean (expressed to the nearest whole number) and standard deviation of the 12-15 values for DT (and for DST, if available) obtained in the plateau phase as the percentage removal of the test chemical. From the shape of the elimination curve, some conclusions may be drawn about the removal processes. | Adsorption | 47. | If a high DOC elimination of the test chemical is observed at the beginning of the test, the test chemical is probably eliminated by adsorption on to the biofilm. It may be possible to prove this by determining the adsorbed test chemical on solids sloughed from the film. It is not usual for the elimination of the DOC of adsorbable chemicals to remain high throughout the test; normally, there is an initial high degree of removal which gradually falls to an equilibrium value. If, however, the adsorbed test chemical was able to cause acclimation of the microbial population, the elimination of the test chemical DOC would subsequently increase and reach a high, plateau level. | Lag phase | 48. | As in static, screening tests many test chemicals require a lag phase before full biodegradation occurs. In the lag phase, acclimation (or adaptation) of the competent bacteria takes place with almost no removal of the test chemical; then the initial growth of these bacteria occurs. This phase ends and the degradation phase is arbitrarily taken to begin when about 10 % of the initial amount of test chemical is removed (after allowing for adsorption, if it occurs). The lag phase is often highly variable and poorly reproducible. | Plateau phase | 49. | The plateau phase of an elimination curve in a continuous test is defined as that phase in which the maximum degradation takes place. This phase should last at least 3 weeks and have about 12-15 measured valid values. | Mean degree of elimination of the test chemical | 50. | Calculate the mean value from the elimination values Dt (and Dst, if available) of the test chemical at the plateau phase. Rounded to the nearest whole number (1 %), it is the degree of elimination of the test chemical. It is also recommended to calculate the 95 % confidence interval of the mean value. In a similar way calculate the mean degree (DB) of elimination of the organic medium in the control vessel. | Indication of biodegradation | 51. | If the test chemical does not adsorb significantly on to the biofilm and the elimination curve has a typical shape of a biodegradation curve with lag, degradation and plateau phases (paragraphs 48, 49), the measured elimination can safely be attributed to biodegradation. If a high initial removal has taken place, the simulation test cannot differentiate between biological and abiotic elimination processes. In such cases, and in other cases where there is any doubt about biodegradation (e.g. if stripping takes place), analyse adsorbed test chemical on samples of the film or perform additional static (screening) tests for biodegradability based on parameters clearly indicating biological processes. Such tests are the oxygen uptake methods (Chapter C.4 of this Annex D, E and F) (9) or a test which measures CO2 production (Chapter C.4-C of this Annex or the Headspace method) (10); use as inoculum pre-exposed biofilm from the appropriate reactor. | 52. | If both the DOC removal and specific chemical removal have been measured, significant differences (the former being lower than the latter) between the percentages removed indicate the presence in the effluents of intermediate organic products, which may be more difficult to degrade; these should be investigated. | Validity of test results | 53. | Consider the test to be valid if the degree of DOC (or COD) elimination (DB) in the control units is > 80 % after 2 weeks operation and no unusual observations have been made. | 54. | If a readily biodegradable (reference) chemical has been tested, the degree of biodegradation should be > 90 % and the difference between duplicate values should not be greater than 5 %. If these two criteria are not met, review the experimental procedures and/or obtain domestic sewage from another source. | 55. | Similarly, differences between biodegradation values from duplicate units (if used) treating a test chemical should not differ by more than 5 %. If this criterion is not met but the removals are high, continue analysis for a further three weeks. If removal is low, investigate the inhibitory effects of the test chemical if not known and repeat the test at a lower concentration of test chemical, if that is feasible. | Test Report | 56. | The test report must include the following: | | Test chemical: | — | identification data; | — | physical nature and, where relevant, physico-chemical properties. | | Test conditions: | — | any modifications to test system, especially if insolubles or volatiles tested; | — | type of organic medium; | — | proportion and nature of industrial wastes in sewage, if used and if known; | — | method of inoculation; | — | test chemical stock solution — DOC (dissolved organic carbon) and TOC (total organic carbon) content; how prepared, if suspension; test concentration(s) used, reasons if outside range 10-20 mg/l DOC; method of addition; date first added; any changes in concentration; | — | mean hydraulic retention time (with no growth); rotational speed of tube; approximate angle of inclination, if possible; | — | details of sloughing; time and intensity; | — | test temperature and range; | — | analytical techniques employed. | | Test results: | — | all measured data DOC, COD, specific analyses, pH, temperature, N chemicals, if relevant; | — | all calculated date of Dt (or Dtc), DB, Ds obtained in tabular form and elimination curves; | — | information on lag and plateau phases, test duration, the degree of elimination of the test chemical, of the reference chemical (if tested) and of the organic medium (in the control unit), together with statistical data and statements of biodegradability and validity of the test; | — | discussion of results. | LITERATURE: | (1) | Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758. | (2) | Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444. | (3) | Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. | (4) | Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357. | (5) | Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94. | (6) | Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881. | (7) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London. | (8) | Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London. | (9) | Chapter C.4 of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability A-F. | (10) | ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels. | Appendix 8 | Figure 1 | Rotating tubes | Figure 2 | Flow diagram | DEFINITIONS: | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Chemicals: “It should be noted that the term ‘chemical’ is used broadly in the UNCED agreements and subsequent documents to include substances, products, mixtures, preparations, or any other terms that may be used in existing systems to denote coverage”. | ’ | 9) | El capítulo C.10 se sustituye por el texto siguiente: | «C.10. PRUEBA DE SIMULACIÓN DE TRATAMIENTO AERÓBICO DE AGUAS RESIDUALES: C.10-A: UNIDADES DE LODO ACTIVADO — C.10-B: BIOPELÍCULAS | C.10-A: Unidades de lodo activado | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo de la OCDE TG 303 (2001). En la década de 1950 se observó que los agentes tensioactivos de reciente introducción provocaban la formación excesiva de espuma en las depuradoras de aguas residuales y en los ríos. El tratamiento aeróbico no era suficiente para eliminarlos totalmente y en algunos casos limitaban la eliminación de otros tipos de materia orgánica. Esta situación dio pie a que se pusieran en marcha muchas investigaciones sobre cómo eliminar los agentes tensioactivos de las aguas residuales y sobre si las nuevas sustancias producidas por la industria podían someterse al tratamiento de las aguas residuales. Con este objetivo, se utilizaron unidades modelo que representaban a los dos tipos principales de tratamiento biológico aeróbico de las aguas residuales (lodo activado y filtración por percolación o por goteo). Habría sido poco práctico y muy caro distribuir cada sustancia nueva y controlar las grandes depuradoras, incluso de forma local. | CONSIDERACIONES INICIALES | Unidades de lodo activado | 2. | Se han descrito unidades modelo de lodo activado en una gama de 300 a unos 2 000 ml. Algunas simulaban muy bien las condiciones de las instalaciones de escala real, y disponían de tanques de sedimento de lodo en los que el lodo sedimentado se bombeaba de nuevo al tanque de aireación, mientras que otras no tenían dispositivos de sedimentación como, por ejemplo, Swisher (1). El tamaño del aparato representa un compromiso: por una parte, debe ser suficientemente grande para un funcionamiento mecánico adecuado y para permitir la toma de un volumen suficiente de muestras sin que el funcionamiento se vea afectado, pero, por otra parte, no debe ser tan grande que sus necesidades de espacio y de materiales sean excesivas. | 3. | Dos formas de aparatos que se han utilizado ampliamente y dando satisfacción son las unidades Husmann (2) y las unidades de depósito poroso (3) (4), que son las utilizadas en primer lugar en el estudio de tensioactivos; estas se describen en el presente método de ensayo. Hay otros tipos que también se han utilizado con éxito, como el de Eckenfelder (5). Debido a que son relativamente elevados el coste y el esfuerzo necesarios para aplicar esta prueba de simulación, se han investigado en paralelo otros ensayos exploratorios más simples y baratos, recogidos ahora en el capítulo C.4-A a F del presente anexo (6). La experiencia con muchos tensioactivos y otras sustancias ha puesto de manifiesto que los que pasaban los ensayos exploratorios (fácilmente biodegradables) también se degradaban en el ensayo de simulación. Algunos de los que no pasaban los ensayos exploratorios sí conseguían pasar los ensayos de biodegradabilidad intrínseca [capítulos C.12 (7) y C.19 (8) del presente anexo], pero solo algunos de este último grupo eran degradados en el ensayo de simulación, mientras que las sustancias que no pasaban los ensayos de biodegradabilidad intrínseca tampoco se degradaban en los ensayos de simulación (9) (10) (11). | 4. | Para algunos fines son suficientes los ensayos de simulación efectuados con un solo conjunto de condiciones de funcionamiento; los resultados se expresan en porcentaje de la eliminación de la sustancia problema o del carbono orgánico disuelto (COD). En el presente método de ensayo se describe un método de este tipo. Sin embargo, a diferencia de la versión anterior del presente capítulo, que describía un solo tipo de aparato para depurar agua residual sintética en el método de unidades acopladas utilizando un método relativamente sencillo de retirada de lodo, el presente texto ofrece una serie de variaciones. Se describen alternativas del tipo de aparato, del modo de funcionamiento y de eliminación de las aguas residuales y de retirada del lodo. El texto sigue de cerca el de la norma ISO 11733 (12), que fue objeto de mucha atención durante su preparación, aunque el método no se ha sometido a estudio interlaboratorios. | 5. | Para otros fines, es necesario determinar con mayor precisión la concentración de la sustancia problema en el efluente, para lo cual hace falta un método de mayor envergadura. Por ejemplo, la proporción de lodo retirado debe regularse de forma más precisa a lo largo de cada día y de cada fase del ensayo, y las unidades deben funcionar a diversas proporciones de retirada. Para que el método sea totalmente exhaustivo, es necesario hacer ensayos a dos o tres temperaturas diferentes. Un método de este tipo es descrito por Birch (13) (14) y se resume en el apéndice 6. Sin embargo, los conocimientos actuales son insuficientes para decider cuál de los modelos cinéticos es aplicable a la biodegradación de las sustancias en la depuración de aguas residuales y en el medio acuático en general. La aplicación de una cinética de Monod, señalada en el apéndice 6 como ejemplo, se limita a las sustancias presentes a una concentración de 1 mg/l o más pero, en opinión de algunos autores, incluso este extremo está aún por confirmar. En el apéndice 7 se indican ensayos a concentraciones que reflejan con mayor fidelidad las que se encuentran en las aguas residuales, pero estos ensayos, así como los del apéndice 6, se incluyen como apéndices en lugar de publicarse como métodos de ensayo aparte. | Filtros | 6. | Se ha prestado mucha menos atención a los modelos de filtros percoladores, quizá debido a que son más engorrosos y menos compactos que los modelos de instalaciones de lodo activado. Gerike et al. desarrollaron unas unidades de filtros por goteo y las utilizaron con el método de unidades acopladas (15). Estos filtros son relativamente grandes (2 m de altura y 60 l de volumen) y cada uno requiere hasta 2 l/h de aguas residuales. Baumann et al. (16) simularon filtros de goteo insertando tiras de "lana" de poliéster en tubos de 1 m (14 mm de diámetro interior) después de haberlas sumergido en lodo activado concentrado durante 30 min. Se introdujo desde arriba en el tubo vertical la sustancia problema como única fuente de C en una solución de sales minerales, y se evaluó la biodegradación midiendo el COD en el efluente y el CO2 en el gas emitido. | 7. | Se han simulado biofiltros de otra manera (15): se ponían en contacto las superficies internas de tubos giratorios, inclinados levemente respecto a la horizontal, con aguas residuales (con un flujo de unos 250 ml/h), tanto con la sustancia problema como sin ella, y en los efluentes recogidos se examinaba la concentración de COD o la de la sustancia problema. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 8. | El presente método está concebido para determinar la eliminación y la biodegradación primaria o la final de sustancias orgánicas hidrosolubles por microorganismos aerobios en un sistema de ensayo de funcionamiento continuo que simula el proceso del lodo activado. Las fuentes de carbono y energía para los microorganismos son un medio orgánico fácilmente biodegradable y la sustancia problema orgánica. | 9. | Se disponen dos unidades de prueba en funcionamiento continuo (instalaciones de lodo activado o depósitos porosos), en paralelo y en las mismas condiciones, elegidas como idóneas para el objetivo del ensayo. Normalmente, el tiempo medio de retención hidráulica es de 6 h y la edad media del lodo (tiempo de retención del lodo) está entre 6 y 10 días. El lodo se retira por uno de los dos métodos, la sustancia problema se añade normalmente al afluente (medio orgánico) de una sola de las unidades, a una concentración de entre 10 y 20 mg/l de carbono orgánico disuelto (COD). La segunda unidad sirve de control para determinar la biodegradación del medio orgánico. | 10. | Se toman muestras frecuentes de los efluentes y en ellas se determina preferentemente el COD, o bien la demanda química de oxígeno (DQO), junto con la concentración de la sustancia problema (en caso necesario) mediante análisis específico, en el efluente de la unidad a la que se añade dicha sustancia. Se acepta que la diferencia entre las concentraciones de COD o de DQO en los efluentes de las unidades de ensayo y de control se debe a la sustancia problema o a sus metabolitos orgánicos. Esta diferencia se compara con la concentración en los afluentes de COD o de DQO debida a la sustancia problema, a fin de determinar la eliminación de dicha sustancia. | 11. | Normalmente es posible distinguir la biodegradación de la bioadsorción mediante un examen atento de la curva de eliminación respecto al tiempo, y se puede confirmar mediante un ensayo de biodegradación fácil utilizando un inóculo aclimatado procedente de la unidad que recibe la sustancia problema. | INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA | 12. | Es necesario conocer las características de pureza, hidrosolubilidad, volatilidad y adsorción de la sustancia problema para poder interpretar correctamente los resultados. Normalmente no es posible hacer el ensayo con sustancias volátiles e insolubles, salvo que se adopten precauciones especiales (véase el apéndice 5). También debe conocerse la estructura química, o al menos la fórmula empírica, para poder calcular los valores teóricos o comprobar los valores medidos de ciertos parámetros, como la demanda teórica de oxígeno (DTO), el carbono orgánico disuelto (COD) y la demanda química de oxígeno (DQO). | 13. | El disponer de datos sobre la toxicidad de la sustancia problema para los micororganismos (véase el apéndice 4) puede ser útil para seleccionar las concentraciones adecuadas para el ensayo y puede ser fundamental para interpretar correctamente los valores bajos de la biodegradación. | UMBRALES | 14. | En la aplicación original de este ensayo (confirmatorio) de simulación a la biodegradación primaria de tensioactivos, se exige una eliminación del 80 % de la sustancia específica para poder comercializar el tensioactivo. Si no se alcanza el valor del 80 %, puede aplicarse este ensayo (confirmatorio) de simulación y el tensioactivo puede comercializarse solamente si se elimina más del 90 % de la sustancia específica. Con las sustancias en general, no se trata de pasar un umbral sino de que el valor obtenido del porcentaje de la eliminación pueda utilizarse para calcular aproximadamente la concentración probable en el medio ambiente que deba utilizarse en la evaluación del peligro planteado por las sustancias. Los resultados tienden a seguir un modelo de todo o nada. En una serie de estudios de sustancias puras, se observó que el porcentaje de la eliminación de COD era > 90 % en más de tres cuartos y > 80 % en más del 90 % de las sustancias que mostraban un grado significativo de biodegradabilidad. | 15. | Son relativamente pocas las sustancias (por ejemplo, tensioactivos) que están presentes en las aguas residuales a las concentraciones utilizadas en el presente ensayo (alrededor de 10 mg C/l). Algunas sustancias pueden resultar inhibidoras a estas concentraciones, mientras que la cinética de eliminación de otras puede ser diferente a concentraciones bajas. Podría conseguirse una evaluación más exacta de la degradación utilizando métodos modificados, con concentraciones de la sustancia problema a un nivel más bajo próximo a las situaciones reales, y los datos recogidos podrían utilizarse para calcular las constantes cinéticas. Sin embargo, aún no se han validado las técnicas experimentales necesarias, y tampoco se han establecido los modelos cinéticos que describen las reacciones de biodegradación (véase el apéndice 7). | SUSTANCIAS DE REFERENCIA | 16. | Para asegurarse de la correcta ejecución del procedimiento experimental, es conveniente someter a ensayo ocasionalmente sustancias cuyo comportamiento se conozca, a la vez que se investigan sustancias problema. Entre esas sustancias se cuentan el ácido adípico, el 2-fenil-fenol, el 1-naftol, el ácido difénico, el ácido 1-naftoico, etc. (9) (10) (11). | REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO | 17. | Ha habido muchos menos informes de estudios de ensayos de simulación que de ensayos de la biodegradabilidad fácil. La reproducibilidad obtenida con muestras en paralelo es buena (dentro del 10-15 %) en el caso de las sustancias problema degradadas en un 80 % o más, pero la variabilidad es mayor cuando se trata de sustancias que se degradan menos bien. Asimismo, con algunas sustancias límite se han encontrado resultados muy dispares (por ejemplo, 10 %, 90 %) en distintas ocasiones dentro del plazo de 9 semanas permitido en el ensayo. | 18. | Se ha observado poca diferencia en los resultados obtenidos con los dos tipos de equipo, pero algunas sustancias se han degradado de forma más amplia y sistemática en presencia de agua residual doméstica que con el agua residual sintética de la OCDE. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO | Equipo | Sistema de ensayo | 19. | El sistema de ensayo para una sola sustancia problema consiste en una unidad de ensayo y una unidad de control, pero cuando solo se efectúan análisis específicos (biodegradación primaria) únicamente hace falta la unidad de ensayo. Una misma unidad de control puede utilizarse con varias unidades de ensayo que reciban la misma o diferentes sustancias problema. En caso de acoplamiento (apéndice 3), cada unidad de ensayo debe disponer de su propia unidad de control. El sistema de ensayo puede ser bien un modelo de instalación de lodo activado, unidad Husmann (apéndice 1, figura 1), o bien un depósito poroso (apéndice 1, figura 2). En ambos casos es necesario disponer de recipientes de almacenamiento de tamaño suficiente para los afluentes y efluentes, así como bombas para dosificar el afluente, bien mezclado con una disolución de la sustancia problema o bien aparte. | 20. | Cada instalación de lodo activado consiste en un recipiente de aireación con una capacidad conocida de unos 3 litros de lodo activado y en un separador (depósito de decantación secundario) de una capacidad de unos 1,5 litros; los volúmenes pueden modificarse en cierta medida ajustando la altura del depósito de decantación. Pueden utilizarse recipientes de tamaños diferentes si funcionan con presiones hidráulicas comparables. Si no es posible mantener la temperatura de la sala de ensayo en la banda deseada, se recomienda utilizar recipientes con camisa de agua a temperatura regulada. Se utiliza una bomba de elevación por aire comprimido o una bomba dosificadora para reciclar el lodo activado, pasándolo desde el depósito de decantación al recipiente de aireación, bien de forma continua o bien de forma intermitente, a intervalos periódicos. | 21. | El sistema de depósito poroso consiste en un cilindro interior, poroso, de fondo cónico, incluido en un recipiente algo más grande, de la misma forma, pero hecho de material plástico impermeable. El recipiente poroso puede estar hecho, por ejemplo, de polietileno poroso con un diámetro máximo de poro de 90 μm y 2 mm de espesor. La separación del lodo respecto al medio orgánico tratado se efectúa mediante el paso diferencial a través de la pared porosa. Los efluentes se recogen en el espacio anular a partir del cual rebosan al recipiente de recogida. No se produce sedimentación y, por tanto, no hay retorno del lodo. El sistema en conjunto puede estar montado en un baño de agua de temperatura regulada. Los depósitos porosos se pueden bloquear y rebosar en las fases iniciales. En tal caso, se debe sustituir el forro poroso por uno limpio, pasando previamente con sifón el lodo del depósito a un cubo limpio y extrayendo el forro bloqueado. Tras limpiar el cilindro exterior impermeable, se inserta un forro limpio y se devuelve el lodo al depósito. El lodo que pueda quedar adherido a los lados del forro bloqueado se raspa cuidadosamente y se transfiere también. Los depósitos bloqueados se limpian primero con un chorro fino de agua para eliminar el lodo restante; luego se sumergen en solución diluida de hipoclorito sódico y después en agua; finalmente, se enjuagan a fondo con agua. | 22. | Para la aireación del lodo en los recipientes de aireación de ambos sistemas, es necesario aplicar técnicas adecuadas como, por ejemplo, cubos sinterizados (piedras difusoras) y aire comprimido. El aire se limpiará, en caso necesario, pasándolo por un filtro adecuado y lavándolo. Debe pasar suficiente aire a través del sistema para mantener las condiciones aeróbicas y mantener en suspensión los flóculos de lodo todo el tiempo que dure el ensayo. | Equipo de filtración o centrífuga | 23. | Dispositivo de filtración de muestras con filtros de membrana de porosidad adecuada (diámetro de abertura nominal de 0,45 μm) que adsorban sustancias orgánicas solubles y liberen carbono orgánico en un grado mínimo. Si se utilizan filtros que liberan carbono orgánico, lavar cuidadosamente los filtros con agua caliente para eliminar el carbono orgánico lixiviable. Otra posibilidad es utilizar una centrífuga que pueda alcanzar una aceleración de 40 000 m/s2. | Equipo analítico | 24. | Equipo necesario para determinar: | — | el COD (carbono orgánico disuelto) y el COT (carbono orgánico total), o la DQO (demanda química de oxígeno), | — | la sustancia específica, en su caso, | — | los sólidos en suspensión, el pH, la concentración de oxígeno en el agua, | — | la temperatura, la acidez y la alcalinidad, | — | el amonio, el nitrito y el nitrato, si el ensayo se efectúa en condiciones de nitrificación. | Agua | 25. | Agua del grifo, con menos de 3 mg/l de COD. Debe determinarse la alcalinidad, en caso de que no se conozca previamente. | 26. | Agua desionizada, con menos de 2 mg/l de COD. | Medio orgánico | 27. | Como medio orgánico puede aceptarse agua residual sintética, agua residual doméstica o una mezcla de ambos tipos. Se ha observado (11) (14) que el uso de agua residual doméstica sola suele llevar a un mayor porcentaje de eliminación del COD y que incluso permite la eliminación y la biodegradación de algunas sustancias no biodegradadas cuando se utiliza el agua residual sintética de la OCDE. Asimismo, la adición constante o intermitente de agua residual doméstica suele estabilizar el lodo activado, incluida la capacidad crucial de sedimentar bien. Así pues, se recomienda el uso de agua residual doméstica. Debe medirse la concentración de COD o de DQO en cada nuevo lote de medio orgánico. Es necesario conocer la acidez o la alcalinidad del medio orgánico. Es posible que el medio orgánico requiera la adición de un amortiguador adecuado (carbonato de hidrógeno y sodio, o fosfato de dihidrógeno y potasio) si es baja su acidez o su alcalinidad, para mantener durante el ensayo un pH de alrededor de 7,5 ± 0,5 en el recipiente de aireación. Debe decidirse en cada caso la cantidad de amortiguador que ha de añadirse, y en qué momento hacerlo. Cuando se hagan mezclas tanto de forma continua como de forma intermitente, es necesario mantener aproximadamente constante el valor del COD (o de la DQO) de la mezcla, por ejemplo mediante dilución con agua. | Agua residual sintética | 28. | Disuélvase en cada litro de agua del grifo: peptona, 160 mg; extracto de carne, 110 mg; urea, 30 mg; fosfato de hidrógeno y dipotasio anhidro (K2HPO4), 28 mg; cloruro de sodio (NaCl), 7 mg; cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O), 4 mg; sulfato de magnesio heptahidratado (Mg2SO4.7H2O), 2 mg. El agua residual sintética de la OCDE es un ejemplo y da una concentración media de COD en el afluente de unos 100 mg/l. También es posible utilizar otras composiciones, con la misma concentración aproximada de COD, que se acerquen más al agua residual real. Si hace falta un afluente menos concentrado, puede diluirse el agua residual sintética, por ejemplo en la proporción 1:1, con agua del grifo para obtener una concentración de unos 50 mg/l. Este afluente más débil permitirá un mejor crecimiento de los organismos nitrificantes, y esta modificación debe utilizarse si se tiene que investigar la simulación de las instalaciones de aguas residuales nitrificantes. El agua residual sintética puede elaborarse con agua destilada en forma concentrada y conservarse a alrededor de 1 °C durante una semana como máximo. En el momento en que se necesite, se diluye con agua del grifo. (Este medio no es satisfactorio ya que, por ejemplo, la concentración de nitrógeno es muy elevada y el contenido de carbono es relativamente bajo, pero no se ha sugerido nada mejor, salvo añadir más fosfato como amortiguador y peptona adicional.) | Agua residual doméstica | 29. | Debe utilizarse agua residual recién decantada, recogida cada día en una depuradora que reciba predominantemente agua residual doméstica. Debe recogerse, antes de la sedimentación primaria, del canal del rebosadero del tanque de sedimentación primaria o de la alimentación a la instalación de lodo activado y encontrarse exenta en gran medida de partículas gruesas. El agua residual puede seguir utilizándose tras guardarse varios días (pero en general no más de siete días) a una temperatura de unos 4 °C, si se demuestra que el COD (o la DQO) no ha descendido de forma significativa (es decir, en menos del 20 %) durante el almacenamiento. A fin de limitar las perturbaciones del sistema, el COD (o la DQO) de cada lote nuevo debe ajustarse a un nivel constante adecuado, antes de utilizarlo, por ejemplo, mediante dilución con agua del grifo. | Lodo activado | 30. | Debe recogerse lodo activado para la inoculación, a partir del tanque de aireación de una depuradora de aguas residuales que funcione bien o de una unidad de lodo activado de laboratorio que trate predominantemente aguas residuales domésticas. | Soluciones madre de sustancia problema | 31. | Con sustancias de solubilidad adecuada, deben prepararse soluciones madre a concentraciones apropiadas (por ejemplo, de 1 a 5 g/l) en agua desionizada, o en la porción mineral del agua residual sintética (respecto a las sustancias insolubles y volátiles, véase el apéndice 5). Hay que determinar el COD y el carbono orgánico total (COT) de la solución madre y repetir las mediciones con cada lote nuevo. Si la diferencia entre el COD y el COT es superior al 20 %, ha de comprobarse la hidrosolubilidad de la sustancia problema. Hay que comparar los valores nominales con los valores de COD o la concentración de la sustancia problema medidos por análisis específico de la solución madre, para considerar si la recuperación es suficientemente buena (normalmente puede esperarse > 90 %). Ha de comprobarse, especialmente en el caso de dispersiones, si el COD puede utilizarse como parámetro analítico o si solo es posible utilizar una técnica analítica específica para la sustancia problema. En el caso de dispersiones es necesario centrifugar las muestras. Con cada lote nuevo hay que medir el COD, la DQO o la sustancia mediante análisis específico. | 32. | Determínese el pH de la solución madre. La presencia de valores extremos indica que la adición de la sustancia puede influir en el pH de lodo activado en el sistema de ensayo. En este caso, haya que neutralizar la solución madre para obtener un pH de 7 ± 0,5, utilizando pequeñas cantidades de ácidos o bases inorgánicos, pero evitando la precipitación de la sustancia problema. | PROCEDIMIENTO | 33. | Se describe el procedimiento para las unidades de instalaciones de lodo activado; para el sistema de depósito poroso ha de adaptarse ligeramente. | Preparación del inóculo | 34. | Inocúlese el sistema de ensayo al inicio del ensayo con lodo activado o bien con un inóculo que contenga una pequeña concentración de microorganismos. Manténgase el inóculo aireado a temperatura ambiente hasta que se vaya a utilizar, en el plazo máximo de 24 h. En el primer caso, tómese una muestra de lodo activado del tanque de aireación de una depuradora biológica de aguas residuales que funcione con eficiencia o bien de una depuradora de laboratorio, que reciba predominantemente aguas residuales domésticas. Si se van a simular condiciones de nitrificación, tómese lodo de una depuradora de aguas residuales de nitrificación. Determínese la concentración de sólidos en suspensión y, en caso necesario, concéntrese el lodo por sedimentación, de forma que el volumen añadido al sistema de ensayo sea mínimo. Ha de asegurarse que la concentración inicial de materia seca es de alrededor de 2,5 g/l. | 35. | En el segundo caso, utilícense como inóculo entre 2 ml/l y 10 ml/l de un efluente procedente de una depuradora biológica de aguas residuales domésticas. Para conseguir tantas especies diferentes de bacterias como sea posible, puede ser conveniente añadir inóculos procedentes de otras fuentes diversas como, por ejemplo, aguas superficiales. En este caso, el lodo activado se va a desarrollar y crecer en el sistema de ensayo. | Dosificación del medio orgánico | 36. | Hay que asegurarse de que los recipientes del afluente y del efluente, así como los tubos que los unen, se limpian a fondo para eliminar la eventual proliferación microbiana, tanto al principio como durante todo el ensayo. Móntense los sistemas de ensayo en salas donde la temperatura esté regulada (normalmente en la banda de 20-25 °C) o utilícense unidades de ensayo provistas de camisas de agua. Prepárese un volumen suficiente del medio orgánico requerido (puntos 27-29). Llénese inicialmente el recipiente de aireación y el depósito de decantación con el medio orgánico y añádase el inóculo (puntos 34 y 35). Iníciese la aireación de forma que el lodo se mantenga en suspensión y en condiciones aeróbicas, y empiécese a introducir el afluente y a reciclar el lodo sedimentado. Pásese medio orgánico de los recipientes de almacenamiento a los de aireación (puntos 20 y 21) de las unidades de ensayo y de control, y recójanse los efluentes respectivos en recipientes de almacenamiento similares. Para conseguir el tiempo normal de retención hidráulica de 6 h, el medio orgánico se bombea con un caudal de 0,5 l/h. A fin de confirmar este extremo, mídase la cantidad diaria de medio orgánico introducido anotando la reducción de volumen del medio presente en los recipientes de almacenamiento. Serían necesarios otros modos de dosificación para determinar los efectos de una liberación intermitente y de una aportación de sustancias de "choque". | 37. | Si el medio orgánico se prepara para utilizarlo durante un plazo superior a 1 día, es necesario enfriarlo a unos 4 °C o aplicar otros métodos adecuados de conservación para impedir el crecimiento microbiano y la biodegradación fuera de las unidades de ensayo (punto 29). Si se utiliza agua residual sintética, es posible preparar y conservar a unos 4 °C una solución madre concentrada (por ejemplo, a una concentración 10 veces superior a la normal, punto 28) Esta solución madre puede mezclarse bien con el volumen adecuado de agua del grifo antes de utilizarla; otra posibilidad consiste en bombearla directamente a la vez que se bombea aparte la cantidad adecuada de agua del grifo. | Dosificación de la sustancia problema | 38. | Añádase un volumen adecuado de la solución madre de sustancia problema (punto 31) al recipiente de almacenamiento del afluente o introdúzcase directamente con una bomba aparte en el recipiente de aireación. La concentración de ensayo media normal en el afluente debe situarse entre 10 y 20 mg/l de COD, con una concentración máxima no superior a 50 mg/l. Si la hidrosolubilidad de la sustancia problema es baja o resulta probable que aparezcan efectos tóxicos, puede reducirse la concentración a 5 mg/l de COD, o incluso menos, pero solo si existe y se utiliza un método analítico específico adecuado (las sustancias problema dispersadas que son poco hidrosolubles pueden añadirse mediante técnicas de dosificación especiales, véase el apéndice 5). | 39. | Se empieza a añadir la sustancia problema cuando el sistema se haya estabilizado y ya esté reduciendo eficientemente el COD del medio orgánico (alrededor del 80 %). Es importante comprobar que todas las unidades funcionan con la misma eficiencia antes de la adición de la sustancia problema; en caso contrario, suele ser útil mezclar los distintos lodos y volver a repartirlos en cantidades iguales a cada unidad. Cuando se utilice un inóculo de unos 2,5 g/l (en peso seco), es posible añadir la sustancia problema desde el inicio del ensayo ya que la adición directa de cantidades crecientes desde el principio ofrece la ventaja de que el lodo activado puede adaptarse mejor a la sustancia problema. Independientemente de la manera de añadir la sustancia problema, se recomienda que se midan a intervalos regulares el caudal pertinente y/o los volúmenes de los recipientes de almacenamiento. | Manipulación del lodo activado | 40. | La concentración de sólidos del lodo activado suele estabilizarse entre unos límites durante el ensayo, independientemente del inóculo utilizado, en la banda de 1 a 3 g/l (en peso seco), en función de la calidad y de la concentración del medio orgánico, las condiciones de funcionamiento, la naturaleza de los microorganismos presentes y la influencia de la sustancia problema. | 41. | Procédase bien a determinar los sólidos en suspensión de los recipientes de aireación al menos una vez por semana y desechar el exceso de lodo para mantener la concentración entre 1 y 3 g/l (en peso seco), o bien a controlar la edad media del lodo para conseguir un valor constante, normalmente en la banda de 6 a 10 días. Si, por ejemplo, se elige un tiempo de retención del lodo de 8 días, hay que eliminar cada día 1/8 del volumen del lodo activado presente en el recipiente de aireación y desecharlo. Esta operación debe realizarse cada día o, preferentemente, mediante una bomba que funcione de forma automática e intermitente. El mantener constante (o dentro de unos límites estrechos) la concentración de sólidos en suspensión no mantiene constante el tiempo de retención del lodo (TRL), que es la variable operativa que determina el valor de la concentración de la sustancia problema en el efluente. | 42. | A lo largo de todo el ensayo debe retirarse, con una fecuencia al menos diaria, todo el lodo que se adhiera a las paredes del recipiente de aireación y del depósito de decantación, de forma que se vuelva a suspender. Obsérvense y límpiense periódicamente todos los tubos para evitar el crecimiento de biopelículas. El lodo sedimentado del depósito de decantación se recicla introduciéndolo de nuevo en el recipiente de aireación, de preferencia mediante bombeo intermitente. En el sistema de depósito poroso no se efectúa ningún reciclado, pero ha de asegurarse la introducción de cilindros internos limpios antes de que el volumen del recipiente aumente significativamente (punto 21). | 43. | En las unidades Husmann puede darse escasa sedimentación y pérdida de lodo. Estas unidades pueden rectificarse aplicando una o varias de las medidas que figuran a continuación, en paralelo en las unidades de ensayo y de control: | — | puede añadirse a intervalos periódicos (por ejemplo, cada semana) lodo nuevo o floculante (por ejemplo, 2 ml/recipiente de solución de FeCl3 de 50 g/l), pero asegurándose de que no se produce ninguna precipitación ni reacción de la sustancia problema con el FeCl3, | — | puede sustituirse la bomba de elevación por aire comprimido mediante una bomba peristáltica, permitiendo así un flujo de recirculación de lodo que compensa aproximadamente el flujo de afluente que debe utilizarse y permitiendo el desarrollo de una zona anaerobia en el lodo sedimentado (la geometría de la bomba de aire comprimido limita el caudal mínimo del lodo retornado a unas 12 veces el del afluente), | — | puede bombearse intermitentemente lodo desde el depósito de decantación al recipiente de aireación (por ejemplo, 5 min. cada 2,5 h para reciclar entre 1 l/h y 1,5 l/h), | — | puede utilizarse un agente antiespumante no tóxico a una concentración mínima, para evitar pérdidas por formación de espuma (por ejemplo, aceite de silicona), | — | puede pasarse aire a través del lodo en el depósito de decantación en forma de fuertes impulsos breves (por ejemplo, de 10 sec cada hora), | — | es posible añadir el medio orgánico al recipiente de aireación a intervalos (por ejemplo, de 3 a 10 min cada hora). | Muestreo y análisis | 44. | A intervalos periódicos debe medirse la concentración de oxígeno disuelto, la temperatura y el valor del pH del lodo activado presente en los recipientes de aireación. Hay que velar por que siempre se disponga de oxígeno suficiente (> 2 mg/l) y que la temperatura se mantenga en la banda necesaria (normalmente, de 20 a 25 °C). Manténgase el pH a 7,5 ± 0,5 añadiendo al recipiente de aireación o al afluente pequeñas cantidades de base o ácido inorgánico, o aumentando la capacidad de amortiguación del medio orgánico (véase el punto 27). Cuando se efectúa la nitrificación se produce ácido: la oxidación de 1 mg de N produce el equivalente de unos 7 mg de CO3 –. La frecuencia de las mediciones depende del parámetro que se mida y de la estabilidad del sistema, y puede variar entre diaria y semanal. | 45. | Mídanse el COD o la DQO en los afluentes que entran en los recipientes de control y de ensayo. Mídase la concentración de la sustancia problema en el afluente de la unidad de ensayo mediante análisis específico o estímese a partir de la concentración en la solución madre (punto 31), el volumen utilizado y la cantidad de agua residual introducida en la unidad de ensayo. Se recomienda calcular la concentración de la sustancia problema para reducir la variabilidad de los datos de concentración. | 46. | Tómense muestras adecuadas del afluente recogido (por ejemplo, muestras compuestas de 24 h) y fíltrense por una membrana de 0,45 μm de diámetro de poro, o centrifúguense a unos 40 000 m/s2 durante 15 min aproximadamente. La centrifugación debe utilizarse si resulta difícil realizar la filtración. Determínese el COD o la DQO al menos por duplicado para medir la biodegradación final y, en caso necessario, la biodegradación primaria mediante un análisis específico de la sustancia problema. | 47. | El uso del COD puede ocasionar problemas analíticos a concentraciones bajas, por lo que se recomienda solo si se utiliza una concentración suficientemente alta de la sustancia problema (unos 30 mg/l). Asimismo, en caso de sustancias muy adsorbentes, se recomienda medir la cantidad de sustancia adsorbida en el lodo mediante una técnica analítica específica de la sustancia problema. | 48. | La frecuencia del muestreo depende de la duración prevista del ensayo. Es recomendable una frecuencia de tres veces por semana. Una vez que las unidades estén funcionando con eficiencia, debe dejarse pasar entre 1 semana y un máximo de 6 semanas después de la introducción de la sustancia problema, para permitir que se alcance el estado de equilibrio. Es preferible obtener al menos 15 valores válidos en la fase de meseta (punto 59), que dura normalmente 3 semanas, para la evaluación del resultado del ensayo. El ensayo puede completarse si se alcanza un grado suficiente de eliminación (por ejemplo, > 90 %) y se dispone de estos 15 valores, que representan análisis efectuados cada día laborable durante 3 semanas. Normalmente, no debe llegarse a una duración del ensayo superior a 12 semanas tras la adición de la sustancia problema. | 49. | Si se produce nitrificación en el lodo, y si se quiere estudiar los efectos de la sustancia problema sobre la nitrificación, debe analizarse el contenido de amonio y/o de nitrito más nitrato en muestras tomadas del afluente de las unidades de ensayo y de control, al menos una vez por semana. | 50. | Todos los análisis deben llevarse a cabo lo antes posible, especialmente las determinaciones de nitrógeno. Si resulta necesario retrasar un análisis, las muestras deben conservarse a unos 4 °C a oscuras, en frascos llenos y bien cerrados. Si resulta necesario almacenar las muestras durante más de 48 h, hay que conservarlas por ultracongelación, por acidificación (por ejemplo, 10 ml/l de una solución de ácido sulfúrico de 400 g/l) o por adición de una sustancia tóxica adecuada [por ejemplo, 20 ml/l de una solución de cloruro de mercurio (II) de 10 g/l]. Hay que verificar que la técnica de conservación no altera los resultados de los análisis. | Acoplamiento de unidades de ensayo | 51. | Si se utiliza el acoplamiento (apéndice 3), hay que intercambiar cada día la misma cantidad de lodo activado (entre 150 y 1 500 ml en el caso de recipientes de aireación que contienen 3 litros de líquido) entre los recipientes de aireación de la unidad de ensayo y de su unidad de control. Si la sustancia problema se adsorbe fuertemente al lodo, debe cambiarse solo el sobrenadante de los depósitos de decantación. En ambos casos hay que aplicar un factor de corrección para calcular los resultados del ensayo (punto 55). | DATOS E INFORME | Tratamiento de los resultados | 52. | Calcúlese el porcentaje de eliminación de la sustancia problema en términos de COD o de DQO respecto a cada evaluación programada en el tiempo, con ayuda de la ecuación siguiente: | donde: | Dt | = | % de eliminación del COD o de la DQO al tiempo t | Cs | = | valores de COD o DQO en el afluente debidos a la sustancia problema, de preferencia estimados a partir de la solución madre (mg/l) | E | = | valores de COD o DQO medidos en el efluente de ensayo al tiempo t (mg/l) | Eo | = | valores de COD o DQO medidos en el afluente de control al tiempo t (mg/l) | 53. | El grado de eliminación del COD o de la DQO del medio orgánico en la unidad de control es un dato útil para evaluar la actividad de biodegradación del lodo activado durante el ensayo. Calcúlese el porcentaje de eliminación con ayuda de la ecuación siguiente: | donde: | DB | = | % de eliminación del COD o de la DQO del medio orgánico de la unidad de control al tiempo t | CM | = | valores de COD o de DQO del medio orgánico en el afluente de control (mg/l) | También es posible calcular el porcentaje de eliminación del COD o de la DQO debidos al medio orgánico más la sustancia problema en la unidad de ensayo, con ayuda de la ecuación siguiente: | donde: | DT | = | % de eliminación del COD o de la DQO en la totalidad del afluente de ensayo | CT | = | valores de COD o de DQO de la totalidad del afluente de ensayo o calculados a partir de las soluciones madre (mg/l) | 54. | Calcúlese la eliminación de la sustancia problema si se mide con un método analítico específico en cada evaluación programada en el tiempo, con ayuda de la ecuación siguiente: | donde: | DST | = | % de eliminación primaria de la sustancia problema al tiempo t | Si | = | concentración medida o estimada de la sustancia problema en el afluente de ensayo (mg/l) | Se | = | concentración medida de la sustancia problema en el efluente de ensayo al tiempo t (mg/l) | 55. | Si se ha utilizado el modo de acoplamiento, compénsese la dilución de la sustancia problema en el recipiente de aireación debida al intercambio de lodo utilizando un factor de corrección (véase el apéndice 3). Si se ha aplicado un tiempo medio de retención hidráulica de 6 h y el intercambio de la mitad del volumen del lodo activado en el recipiente de aireación, es necesario corregir los valores de eliminación determinados diariamente (Dt, punto 52) para obtener el grado real de eliminación, Dtc, de la sustancia problema con ayuda de la ecuación siguiente: | Expresión de los resultados del ensayo | 56. | Represéntese el porcentaje de eliminación Dt (o Dtc) y Dst, si está disponible, frente al tiempo (véase el apéndice 2). Es posible extraer conclusiones sobre el proceso de eliminación a partir de la forma de la curva de eliminación de la sustancia problema (en sí misma o como COD). | Adsorción | 57. | Si desde el inicio del ensayo se observa una elevada eliminación del COD de la sustancia problema, es probable que esta se elimine por adsorción a los sólidos del lodo activado. Es posible comprobar este extremo determinando la sustancia problema adsorbida mediante análisis específico. No es normal que la eliminación del COD de sustancias adsorbidas se mantenga elevada durante todo el ensayo; normalmente la eliminación es intensa al principio y después va cayendo gradualmente hasta alcanzar un valor de equilibrio. Si, no obstante, la sustancia problema adsorbida pudiera causar de alguna forma la aclimatación de la población microbiana, la eliminación del COD de la sustancia problema aumentaría posteriormente y alcanzaría un elevado nivel de meseta. | Tiempo de latencia | 58. | Como en los ensayos estáticos exploratorios, muchas sustancias problema requieren una fase de latencia antes de que se produzca la biodegradación plena. En esta fase de latencia tiene lugar la aclimatación o adaptación de las bacterias de degradación, sin que haya apenas eliminación de la sustancia problema; después empieza el crecimiento de estas bacterias. Esta fase termina y se supone que comienza la fase de degradación cuando se ha eliminado alrededor del 10 % de la cantidad inicial de sustancia problema (después de tener en cuenta la adsorción, en su caso). La fase de latencia suele ser muy variable y poco reproducible. | Fase de meseta | 59. | La fase de meseta de una curva de eliminación en un ensayo continuo se define como la fase en que se produce el máximo de degradación. La fase de meseta debe durar al menos 3 semanas y permitir la medición de unos 15 valores válidos. | Grado medio de eliminación de la sustancia problema | 60. | Calcular la media de los valores de eliminación (Dt) de la sustancia problema en la fase de meseta. Redondeado al entero más próximo (1 %), es el grado de eliminación de la sustancia problema. Se recomienda calcular asimismo el intervalo de confianza del 95 % para la media. | Eliminación del medio orgánico | 61. | Represéntese frente al tiempo el porcentaje de eliminación del COD o de la DQO del medio orgánico en la unidad de control (DB). Indíquese el grado medio de eliminación de la misma forma que con la sustancia problema (punto 60). | Indicación de la biodegradación | 62. | Si la sustancia problema no se adsorbe significativamente al lodo activado y la curva de eliminación tiene la forma típica de una curva de biodegradación con fases de latencia, de degradación y de meseta (puntos 58 y 59), la eliminación medida puede atribuirse con seguridad a la biodegradación. Si ha tenido lugar una eliminación inicial importante, el ensayo de simulación no puede diferenciar entre el proceso de eliminación biológico y el abiótico. En tales casos, y en otros en que haya alguna duda sobre la biodegradación (por ejemplo, si se produce eliminación), se deben analizar las sustancias problema adsorbidas o efectuar ensayos adicionales de biodegradación estática, con parámetros que indiquen claramente si se trata de procesos biológicos. Tales ensayos son los métodos de consumo de oxígeno [capítulo C.4-D, E y F del presente anexo (6)] o un ensayo con medición de la producción de dióxido de carbono [capítulo C.4-C del presente anexo (6)], o el método del espacio de cabeza de la ISO (18), utilizando un inóculo preexpuesto del ensayo de simulación. Si se han medido tanto la eliminación del COD como la eliminación específica de la sustancia, una diferencia significativa (siendo la primera más baja que la segunda) entre los porcentajes de eliminación indica la presencia en los efluentes de productos orgánicos intermedios que pueden ser más difíciles de degradar que la sustancia original. | Validez de los resultados del ensayo | 63. | Mediante la determinación del grado de eliminación del medio orgánico (punto 53) en la unidad de control se consigue información sobre el comportamiento normal de biodegradación del inóculo. Se considera que el ensayo es válido si el grado de eliminación del COD o de la DQO en la unidad o unidades de control es > 80 % tras dos semanas y no se han observado fenómenos inusuales. | 64. | Si se ha utilizado una sustancia (de referencia) fácilmente biodegradable, el grado de biodegradación (Dt, punto 52) debe ser > 90 %. | 65. | Si el ensayo se realiza en condiciones de nitrificación, la concentración media en los efluentes debe ser < 1 mg/l de N amoniacal y < 2 mg/l de N nitroso. | 66. | Si no se cumplen estos criterios (puntos 63-65), repítase el ensayo utilizando un inóculo de una fuente diferente, sométase a ensayo una sustancia de referencia y revísense todos los procedimientos experimentales. | Informe del ensayo | 67. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Datos de identificación. | — | Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas. | | Condiciones de ensayo: | — | Tipo de sistema de ensayo, eventuales modificaciones para el ensayo de sustancias insolubles y volátiles. | — | Tipo de medio orgánico. | — | Proporción y naturaleza de los residuos industriales presentes en las aguas residuales, si se conocen. | — | Inóculo, naturaleza y lugar o lugares de recogida, concentración y posible tratamiento previo. | — | Solución madre de sustancia problema: contenido de COD y COT, forma de preparación si se trata de una suspensión, concentración utilizada en el ensayo, justificación del eventual recurso a concentraciones fuera de la banda de 10 a 20 mg/l de COD, método de adición, fecha de la primera adición, cambios eventuales. | — | Edad media del lodo y tiempo medio de retención hidráulica, método de retirada del lodo, métodos para solucionar la aglomeración, la pérdida de lodo, etc. | — | Técnicas analíticas empleadas. | — | Temperatura del ensayo. | — | Cualidades de la aglomeración del lodo, índice volumétrico de lodo (IVL), sólidos en suspensión en el licor mixto (SSLM). | — | Eventuales desviaciones respecto a los procedimientos normalizados y circunstancias que puedan afectar a los resultados. | | Resultados del ensayo: | — | Todos los datos medidos (COD, DQO, análisis específicos, pH, temperatura, concentración de oxígeno, sólidos en suspensión, sustancias nitrogenadas (cuando sea pertinente). | — | Todos los valores calculados de Dt (o Dtc), DB, DSt obtenidos en formato tabular y las curvas de eliminación. | — | Información de las fases de latencia y de meseta, duración del ensayo, grado de eliminación de la sustancia problema y del medio orgánico en la unidad de control, junto con información estadística y declaraciones sobre la biodegradabilidad y la validez del ensayo. | — | Discusión de los resultados. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Swisher RD (1987). "Surfactant Biodegradation", 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp. | (2) | German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706. | (3) | Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, UK. | (4) | Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915. | (5) | Eckenfelder, W.W (19) US EPA. | (6) | Capítulo C.4 del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad "fácil". | (7) | Capítulo C.12 del presente anexo. Biodegradación — Prueba LASC modificada. | (8) | Capítulo C.19 del presente anexo. Cálculo del coeficiente de adsorción (KOC) en suelos y en lodos de aguas residuales mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). | (9) | Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173. | (10) | Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55. | (11) | Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp. 113-138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. | (12) | ISO 11733 (1995; revisada de 2004). Evaluación de la eliminación y de la biodegradabilidad de los compuestos orgánicos en medio acuoso-ensayo de simulación de lodos activados. | (13) | Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornadas Com. Español. Deterg.: 33-48. | (14) | Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340-343. | (15) | Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat. Res. 14: 753-758. | (16) | Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF-Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. | (17) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91-98 ISBN 011 751661 9. | (18) | ISO 14593 (1998). Calidad del agua-Evaluación de la biodegradabilidad final de los compuestos orgánicos en medio acuoso. Método de análisis del carbono inorgánico en recipientes cerrados. | Apéndice 1 | Figura 1 | Equipo utilizado para evaluar la biodegradabilidad | Unidad de Husmann | Figura 2 | Equipo utilizado para evaluar la biodegradabilidad | Depósito poroso | Figura 3 | Detalles del recipiente de aireación con depósito poroso de tres litros | Apéndice 2 | Ejemplo de curva de eliminación | Polietilenglicol 400 Concentración de ensayo del COD: 20 mg/l | Apéndice 3 | [CON CARÁCTER INFORMATIVO] | ACOPLAMIENTO DE LAS UNIDADES DE ENSAYO | A fin de equilibrar las poblaciones microbianas de los lodos presentes en la unidad de ensayo, que recibe el agua residual más la sustancia problema, y en la unidad de control, que solo recibe el agua residual, se introdujo el intercambio diario de lodos (1). El procedimiento se denominó acoplamiento y el método se conoce como el de unidades acopladas. El acoplamiento se llevó a cabo inicialmente utilizando las unidades de lodo activado de Husmann, pero también se ha aplicado a unidades de depósito poroso (2) (3). No se han encontrado diferencias significativas entre los resultados obtenidos utilizando unidades acopladas y los obtenidos utilizando unidades no aclopadas, ni con unidades Husmann ni con depósitos porosos, por lo que no ofrece ninguna ventaja dedicar tiempo y energía a acoplar las unidades. | Los intercambios de lodos pueden dar la apariencia de una eliminación considerable, ya que parte de la sustancia problema se transfiere y las concentraciones de esta sustancia problema en los efluentes de ensayo y de control llegan a equilibrarse más. Así pues, es necesario utilizar factores de corrección, que dependen de la fracción intercambiada y del tiempo medio de retención hidráulica. Se han publicado más detalles del cálculo (1). | Calcúlese el grado corregido de eliminación de COD o de DQO utilizando la fórmula general siguiente: | donde: | Dtc | = | porcentaje corregido de eliminación de COD o de DQO | Dt | = | porcentaje determinado de eliminación de COD o de DQO | a | = | fracción intercambiada del volumen de las unidades de lodo activado | r | = | tiempo medio de retención hidráulica (h) | Si, por ejemplo, se intercambia la mitad del volumen del tanque de aireación (a = 0,5) y el tiempo medio de retención hidráulica es de 6 h, la fórmula de corrección es la siguiente: | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135. | (2) | Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. | (3) | Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK. | Apéndice 4 | EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DEL LODO ACTIVADO | Procedimiento con sustancias problema | 1. | Es posible que una sustancia (o un agua residual) no se degrade ni se elimine en el ensayo de simulación, e incluso que tenga un efecto inhibidor sobre los microorganismos del lodo. Otras sustancias se biodegradan a pequeñas concentraciones pero son inhibidoras a concentraciones más elevadas (hormesis). Los efectos inhibidores pueden haberse puesto de manifiesto en una fase anterior o haberse determinado en un ensayo de toxicidad, utilizando un inóculo similar o idéntico al utilizado en el ensayo de simulación (1). Tales métodos son la inhibición del consumo de oxígeno [capítulo C.11 del presente anexo (2) y norma ISO 8192(3)] o la inhibición del crecimiento de los organismos del lodo [ISO 15522 (4)]. | 2. | En el ensayo de simulación, la eventual inhibición se manifiesta en que la diferencia en carbono orgánico disuelto (COD) o en demanda química de oxígeno (DQO) entre el efluente del recipiente de ensayo y el del recipiente de control es mayor que el COD añadido como sustancia problema. Dicho de otra manera, el porcentaje de eliminación de COD [(y de demanda bioquímica de oxígeno (DBO), de demanda química de oxígeno (DQO) y/o de NH+ 4)] del medio orgánico en tratamiento se ve reducido por la presencia de la sustancia problema. Si ocurre esto, es necesario repetir el ensayo reduciendo la concentración de la sustancia problema hasta que se alcance un nivel al que no se produzca inhibición, y quizás reduciendo aún más la concentración hasta que la sustancia problema sea biodegradada. Sin embargo, si la sustancia problema (o el agua residual) tiene efectos negativos sobre el proceso a todas las concentraciones ensayadas, se puede deducir que la sustancia es difícil, o incluso imposible, de tratar biológicamente, pero puede merecer la pena repetir el ensayo con lodo activado procedente de otra fuente o someter el lodo a una aclimatación más gradual. | 3. | Inversamente, si la sustancia problema se bioelimina al primer intento en el ensayo de simulación, debe aumentarse su concentración cuando se necesite saber si esta sustancia puede ser inhibidora. | 4. | Al tratar de determinar el grado de inhibición, ha de tenerse presente que puede cambiar la población del lodo activado, de forma que con el tiempo los microorganismos pueden desarrollar tolerancia frente a una sustancia inhibidora. | 5. | Cálculo del grado de inhibición: | Los porcentajes generales de eliminación Ro, de DBO, COD, DQO, etc., de las unidades de ensayo y de control pueden calcularse con ayuda de la fórmula siguiente: | donde: | I | = | concentración de DBO, COD, DQO, etc., en los afluentes de los recipientes de ensayo o de control (mg/l) | E | = | concentraciones en los efluentes respectivos (mg/l) | Es necesario corregir I y E para tener en cuenta el COD debido a la sustancia problema en las unidades de ensayo; en caso contario, serán incorrectos los cálculos del porcentaje de inhibición. | El grado de inhibición debido a la presencia de la sustancia problema puede calcularse con ayuda de la fórmula siguiente: | donde: | Rc | = | porcentaje de eliminación en los recipientes de control | Rt | = | porcentaje de eliminación en los recipientes de ensayo | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259. | (2) | Capítulo C.11 del presente anexo. Biodegradación — Lodo activado: Prueba de inhibición de la respiración. | (3) | ISO 8192 (2007): Calidad del agua — Ensayo de inhibición del consumo de oxígeno por lodos activados por oxidación del carbono y del amonio. | (4) | ISO 15522 (1999) Calidad del agua — Determinación del efecto inhibidor de los componentes del agua sobre los microoganismos de los lodos activados. | Apéndice 5 | Sustancias problema poco hidrosolubles — sustancias volátiles | Sustancias poco hidrosolubles | Parece que se han publicado pocos informes sobre la posibilidad de someter las sustancias poco hidrosolubles e insolubles a ensayos de simulación del tratamiento de las aguas residuales (1) (2) (3). | No hay un solo método de dispersión de la sustancia problema que pueda aplicarse a todas las sustancias insolubles. Parece que dos de los cuatros tipos de métodos descritos en la norma ISO 10634 (4) pueden ser adecuados para intentar dispersar las sustancias problema para el ensayo de simulación; consisten en el uso de emulgentes y de energía de ultrasonidos. Hay que determinar la estabilidad de la dispersión resultante a lo largo de períodos de al menos 24 h. La dispersión estabilizada de forma adecuada en un depósito con agitación constante (punto 38) se pasa al tanque de aireación aparte del agua residual doméstica (o sintética). | Si las dispersiones son estables, investíguese cómo puede determinarse la sustancia problema en la forma dispersa. Resulta poco probable que el COD sea adecuado, por lo que debería establecerse un método analítico específico para la sustancia problema que pueda aplicarse a los efluentes, a los sólidos del efluente y al lodo activado. Entonces se determinaría el destino de la sustancia problema en la simulación del proceso del lodo activado, tanto en la fase líquida como en la sólida. Por tanto, se establecería un "balance de masas" para decidir si la sustancia problema se ha degradado. Sin embargo, de esta forma se indicaría solo la biodegradación primaria. Debe intentarse demostrar la biodegradación final mediante un ensayo de respirometría (capítulo C.4-C, F o D del presente anexo) (5) utilizando como inóculo lodo expuesto a la sustancia problema en el ensayo de simulación. | Sustancias volátiles | La aplicación de simulaciones de la depuración de agua residual a las sustancias volátiles es controvertida y problemática. Igual que en el caso de las sustancias poco hidrosolubles, se encuentran muy pocos informes publicados sobre ensayos de simulación de sustancias volátiles. Se adapta un tipo convencional de aparato de mezcla completa sellando los tanques de aireación y de sedimentación, midiendo y controlando el flujo de aire con caudalímetros y pasando el gas de salida por trampas para recoger la materia orgánica volátil. En ciertos casos se utiliza una bomba de vacío para extraer el gas de salida a través de una trampa "fría" o una trampa de purga que contenga Tenax y gel de sílice para efectuar después análisis cromatográficos de gases. La sustancia problema presente en la trampa puede determinarse analíticamente. | El ensayo se lleva a cabo en dos partes. En primer lugar se hacen funcionar las unidades sin lodo pero bombeando al tanque de aireación el agua residual sintética más la sustancia problema. Se toman muestras del afluente, del efluente y del gas de salida, y se analizan para determinar su contenido en sustancia problema durante varios días. A partir de los datos obtenidos, es posible calcular el porcentaje (Rvs) de sustancia problema eliminado del sistema. | A continuación se efectúa el ensayo biológico normal (con lodo), en condiciones de funcionamiento idénticas a las del estudio de eliminación. También se toman mediciones del COD o de la DQO para comprobar que las unidades funcionan de forma eficiente. Se efectúan análisis ocasionales para determinar la presencia de sustancia problema en el afluente, en el efluente y en el gas de salida de la primera parte del ensayo; tras la aclimatación se efectúan análisis con más frecuencia. También aquí es posible calcular, a partir de los datos del estado de equilibrio, el porcentaje de eliminación de la sustancia problema a partir de la fase líquida mediante todos los procesos (RT) (físicos y biológicos), así como la proporción (RV) eliminada del sistema. | Cálculo | a) | En el ensayo no biológico, es posible calcular el porcentaje (RVP) de sustancia problema eliminado del sistema con ayuda de la fórmula siguiente: | donde: | RVP | = | eliminación de la sustancia problema por volatilización (%), | SVP | = | sustancia problema recogida en la trampa, expresada en concentración equivalente de la fase líquida (mg/l), | SIP | = | concentración de la sustancia problema en el afluente (mg/l). | b) | En el ensayo biológico, es posible calcular el porcentaje (RV) de sustancia problema eliminado del sistema con ayuda de la fórmula siguiente: | donde: | RV | = | eliminación de la sustancia problema por volatilización en el ensayo biológico (%), | SV | = | sustancia problema recogida en la trampa en el ensayo biológico, expresada en concentración equivalente del afluente líquido (mg/l), | SI | = | concentración de la sustancia problema en el afluente (mg/l). | c) | En el ensayo biológico, el porcentaje de sustancia problema eliminado por todos los procesos viene dado por la fórmula siguiente: | donde: | SE = concentración de la sustancia problema en el efluente (líquido) (mg/l). | d) | Así pues, el porcentaje (RBA) eliminado por biodegradación más adsorción puede calcularse con ayuda de la fórmula siguiente: | Deben llevarse a cabo ensayos separados para determinar si la sustancia problema se adsorbe; en caso afirmativo, es posible aplicar otra corrección más. | e) | La comparación entre la proporción de sustancia problema eliminada de los sistemas de ensayo biológico (Rv) y no biológico (Rvp) indica el efecto general que ha tenido el tratamiento biológico sobre la emisión de la sustancia problema a la atmósfera. | Ejemplo: | Benceno | Tiempo de retención del lodo = 4 días | Agua residual sintética; tiempo de retención = 8 h | SIP | = | SI = 150 mg/l | SVP | = | 150 mg/l (SEP = 0) | SV | = | 22,5 mg/l | SE | = | 50 μg/l | Así pues, | RVP | = | 100 %, RV = 15 % | RT | = | 100 % y RBA = 85 %. | Se deduce que el benceno no es adsorbido por el lodo. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854. | (2) | Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA. | (3) | Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97. | (4) | ISO 10634 (1995) Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación y tratamiento de los compuestos orgánicos poco solubles en agua para la subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso. | (5) | Capítulo C.4 del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad "fácil". | Apéndice 6 | Efectos del tiempo de retención del lodo (TRL) para el tratamiento de las sustancias | INTRODUCCIÓN | 1. | El método descrito en el texto principal se ideó para determinar si las sustancias objeto del ensayo (generalmente, aquellas de las que se sabe que son intrísecamente biodegradables, pero no fácilmente biodegradables) pueden biodegradarse dentro de los límites impuestos en las depuradoras de aguas residuales. Los resultados se expresan en términos de porcentaje de eliminación y de porcentaje de biodegradación. Las condiciones de funcionamiento de las unidades de lodo activado y la elección del afluente permiten variaciones bastante amplias en la concentración de la sustancia problema en el efluente. Los ensayos se efectúan a una sola concentración nominal o a un solo tiempo nominal de retención del lodo (TRL) y los regímenes de retirada de lodo descritos pueden hacer que el valor del TRL varíe considerablemente tanto de un día a otro como a lo largo de un mismo día. | 2. | En esta variante (1) (2), el TRL se controla dentro de unos límites mucho más estrechos durante la totalidad de cada período de 24 h (igual que sucede a gran escala), lo que hace que la concentración en los efluentes sea más constante. Se recomienda utilizar agua residual doméstica porque da unos porcentajes de eliminación más constantes y elevados. Asimismo, se investigan los efectos de una serie de valores del TRL y es posible determinar en un estudio más detallado los efectos de una serie de temperaturas sobre la concentración en el efluente. | 3. | No hay acuerdo general sobre qué modelos cinéticos son aplicables cuando se biodegradan sustancias en las condiciones de la depuración de aguas residuales. Se eligió el modelo de Monod de crecimiento bacteriano y de utilización del sustrato (1) (2) para aplicarlo a los datos recogidos, ya que el método estaba destinado a aplicarse solo a las sustancias producidas en grandes cantidades, lo que lleva a concentraciones superiores a 1 mg/l en las aguas residuales. La validez del modelo simplificado y de las suposiciones aceptadas se estableció utilizando una serie de etoxilatos de alcohol con diversos grados de biodegradabilidad primaria (2) (3). | Nota: | Esta variante del método sigue muy de cerca el grueso del texto del método de ensayo C.10-A, y a continuación se indican solo los detalles en que difiere. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 4. | Se utilizan depósitos porosos de lodo activado, diseñados para facilitar la retirada (casi) continua de mezcla líquida para permitir un control muy preciso del tiempo de retención del lodo (TRL, o θs), en modo sin acoplamiento con una serie de TRL y, de forma optativa, con una serie de temperaturas. El tiempo de retención suele ser de 2 a 10 días y la temperatura varía entre 5 y 20 °C. Se introducen en las unidades, por separado, el agua residual, preferentemente de tipo doméstico, y la solución de la sustancia problema, a un caudal que permita alcanzar el tiempo deseado de retención del agua residual (de 3 a 6 horas) y la concentración deseada de sustancia problema en el afluente. Con fines comparativos, se hacen funcionar en paralelo unidades de control sin sustancia problema. | 5. | Pueden utilizarse otros tipos de aparatos, pero debe ponerse mucha atención para velar por que se consiga un buen control del TRL. Por ejemplo, cuando se utilicen instalaciones que incorporen un sedimentador, puede ser necesario tener en cuenta la pérdida de sólidos a través del efluente de la depuradora. Por otra parte, deben tomarse precauciones especiales para evitar errores debidos a la variación en la cantidad de lodo presente en el sedimentador. | 6. | Las unidades se hacen funcionar bajo cada conjunto seleccionado de condiciones y, una vez alcanzado el equilibrio, se obtienen a lo largo de unas tres semanas las concentraciones medias de la sustancia problema en el estado de equilibrio en los efluentes y, de forma optativa, los valores de COD. Además de evaluar el porcentaje de eliminación de la sustancia problema y, opcionalmente, del COD, debe expresarse de forma gráfica la relación entre las condiciones de funcionamiento de la instalación y la concentración en el efluente. A partir de aquí pueden calcularse constantes cinéticas orientativas y es posible predecir bajo qué condiciones podrá depurarse la sustancia problema. | INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA | 7. | Son aplicables los puntos 12 y 13 del capítulo C.10-A. | UMBRALES | 8. | Son aplicables los puntos 14 y 15 del capítulo C.10-A. | SUSTANCIA DE REFERENCIA | 9. | Es aplicable el punto 16 del capítulo C.10-A. | REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO | 10. | Son aplicables los puntos 17 y 18 del capítulo C.10-A. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Equipo | 11. | Una unidad adecuada es la consituida por el sistema del depósito poroso modificado (apéndice 6.1). Consiste en un recipiente interior (o revestimiento) hecho de polipropileno poroso de 3,2 mm de espesor y un diámetro de poro de unos 90 μm, con la junta soldada a tope (de esta manera, la unidad es más sólida que la descrita en el punto 21 del presente capítulo, C.10 A). El revestimiento se introduce en un recipiente exterior de polietileno impermeable, que consiste en dos partes: una base circular en la que se perforan agujeros para alojar dos tubos de aire y un tubo de retirada de lodo, y un cilindro superior que se atornilla a la base y que tiene una salida situada de forma que pase un volumen conocido (3 l) al recipiente del depósito poroso. Uno de los tubos de aire está provisto de una piedra difusora y el otro tiene el extremo abierto y está colocado en ángulo recto respecto a la piedra del depósito. Este sistema produce la turbulencia necesaria para garantizar que el contenido del depósito se mezcla completamente, y que la concentración de oxígeno disuelto es > 2 mg/l. | 12. | Se mantiene el número adecuado de unidades a una temperatura controlada en el rango de 5 a 20 °C (± 1 °C), bien en baño de agua o bien en salas de temperatura constante. Se requieren bombas que introduzcan en los recipientes de aireación la solución de la sustancia problema y el lodo sedimentado, al caudal necesario (0-1,0 ml/min y 0-25 ml/min, respectivamente), y una tercera bomba que elimine el lodo residual de los recipientes de aireación. El caudal necesario, que debe ser muy bajo, de lodo residual se consigue con una bomba regulada a un caudal superior y que funcione de forma intermitente por medio de un temporizador que la active, por ejemplo, durante 10 s cada minuto, si el caudal de la bomba es de 3 ml/min, lo que da un caudal de retirada de lodo de 0,5 ml/min. | Equipo de filtración o centrífuga | 13. | Es aplicable el punto 23 del capítulo C10-A. | Equipo analítico | 14. | Es aplicable el punto 24 del capítulo C.10-A. | Agua | 15. | Son aplicables los puntos 25 y 26 del capítulo C.10-A. | Medio orgánico | 16. | Es aplicable el punto 27 del capítulo C.10-A. | Agua residual sintética | 17. | Es aplicable el punto 28 del capítulo C.10-A. | Agua residual doméstica | 18. | Es aplicable el punto 29 del capítulo C.10-A. | Lodo activado | 19. | Es aplicable el punto 30 del capítulo C10-A. | Soluciones madre de sustancia problema | 20. | Son aplicables los puntos 31 y 32 del capítulo C.10-A. | PROCEDIMIENTO | Preparación del inóculo | 21. | Es aplicable solamente el punto 34 del capítulo C.10-A. Utilícese lodo activado (con una concentración en torno a 2,5 g/l). | Número de unidades de ensayo | 22. | Para un ensayo sencillo, es decir, para medir el porcentaje de eliminación, solo se necesita un único TRL, pero para conseguir los datos necesarios para calcular las constantes cinéticas orientativas hacen falta 4 o 5 valores de TRL. Generalmente se eligen valores de entre 2 y 10 días. En la práctica, es conveniente efectuar el ensayo con 4 o 5 TRL simultáneamente a una única temperatura; en estudios ampliados se utilizan los mismos valores de TRL, o quizá una gama diferente de valores, pero a otras temperaturas en el rango de 5 a 20 °C. Para la degradación primaria (uso principal), normalmente solo es necesaria una unidad por conjunto de condiciones. Sin embargo, para estudiar la biodegradabilidad final hay que disponer de una unidad de control, con cada conjunto de condiciones, que reciba el agua residual pero no la sustancia problema. Si se piensa que la sustancia problema se encuentra en el agua residual utilizada, será necesario utilizar unidades de control cuando se haga la evaluación de la biodegradación primaria, y aplicar las correcciones pertinentes en los cálculos. | Introducción del medio orgánico y de la sustancia problema | 23. | Aplíquense los puntos 36 a 39 del capítulo C.10-A, pero obsérvese que la solución de sustancia problema se introduce aparte y que se utilizan diversas proporciones de retirada de lodo. Debe procederse a medir y ajustar, en caso necesario, en una banda de ± 10 %, los caudales de los afluentes, efluentes y lodo retirado, con frecuencia, por ejemplo, dos veces al día. Si se encuentran dificultades en los métodos analíticos cuando se utiliza agua residual doméstica, efectúese el ensayo con agua residual sintética, pero asegurándose de que los medios diferentes proporcionan datos cinéticos comparables. | Manipulación de las unidades de lodo activado | 24. | Son aplicables los puntos 40 a 43 del capítulo C.10-A, pero hay que controlar el TRL solamente por medio de la retirada "constante" de lodo. | Muestreo y análisis | 25. | Son aplicables los puntos 44 a 50 del capítulo C.10-A, salvo que aquí debe determinarse la concentración de la sustancia problema y es opcional la determinación del COD; no debe utilizarse la DQO. | DATOS E INFORME | Tratamiento de los resultados | 26. | Son aplicables los puntos 52 a 54 del capítulo C.10-A. | Expresión de los resultados del ensayo | 27. | Son aplicables los puntos 56 a 62 del capítulo C.10-A. | Cálculo de las constantes cinéticas | 28. | Es más realista indicar la concentración media de la sustancia problema en el estado de equilibrio en el efluente y describir cómo varía en función de las condiciones de funcionamiento de la instalación, en lugar de indicar el porcentaje de biodegradación primaria. Puede hacerse atendiendo a la ecuación (6) del apéndice 6.2, con la que se pueden obtener valores de KS, μm y θSC, que es el tiempo crítico de retención de lodo. | [Otra posibilidad consiste en obtener valores aproximados de KS y μm utilizando un sencillo programa informático para ajustar a los valores experimentales obtenidos la curva teórica calculada a partir de la ecuación 2 (apéndice 6.2). Aunque las eventuales soluciones dadas no serán únicas, puede obtenerse una aproximación razonable de KS y μm]. | Variabilidad de los resultados | 29. | Es una experiencia común obtener valores variables de los parámetros cinéticos para las distintas sustancias. Se piensa que en los valores resultantes influyen mucho las condiciones en las que se ha formado el lodo, así como las condiciones reinantes durante el ensayo efectuado (como en el punto 5 y en otros ensayos). Grady et al. (4) han discutido un aspecto de esta variabilidad y han sugerido que los términos "existente" e "intrínseca" deben aplicarse a dos situaciones extremas que representan los límites del estado fisiológico que un cultivo puede alcanzar durante un experimento cinético. Si no se permite que cambie el estado durante el ensayo, los valores de los parámetros cinéticos reflejan las condiciones del ambiente del que se han tomado los microorganismos; estos valores se denominan "existentes" o presentes en el momento. Al otro extremo, si las condiciones del ensayo son tales que permiten el pleno desarrollo del sistema de síntesis de proteínas y así alcanzar la tasa de crecimiento más elevada posible, los parámetros cinéticos obtenidos se denominan "intrínsecos", y solo dependen de la naturaleza del sustrato y de los tipos de bacterias del cultivo. Como referencia, se obtendrán valores existentes manteniendo baja la proporción de concentración del sustrato respecto a los microorganismos competentes (So/Xo), por ejemplo 0,025, y los valores intrínsecos aparecen cuando la proporción es elevada, es decir, de al menos 20. En ambos casos, So debe igualar o superar al valor pertinente de Ks, la constante de semisaturación. | 30. | En un reciente taller de la SETAC (5) se discutieron la variabilidad y otras facetas de la cinética de la biodegradación. De tales estudios, tanto de los ya publicados como de los que aún están en fase de proyecto, debe obtenerse una visión más clara de la cinética de las depuradoras, a fin de permitir una mejor interpretación de los datos disponibles, y para sugerir mejoras de los futuros métodos de ensayo. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornadas Com. Español. Deterg.: 33-48. | (2) | Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340-343. | (3) | Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422. | (4) | Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742-748. | (5) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels. | Apéndice 6.1 | Depósito poroso con control del TRL | Texto de la imagen | Sustancia problema | Afluente | Recipiente exterior de plástico | Revestimiento de polipropileno poroso | Sello | Piedra difusora | Rosca | Base de plástico macizo | Lodo residual | Entrada de aire | Efluente | Apéndice 6.2 | Cálculo de las constantes cinéticas | 1. | Aceptando que se aplica la cinética de Monod y considerando un balance de masas de sólidos activos y de sustrato en todo el sistema de lodo activado (1), pueden obtenerse las siguientes expresiones del estado de equilibrio: | [1] | o | [2] | donde: | S1 | = | concentración de sustrato en el efluente (mg/l) | KS | = | constante de semisaturación, concentración a la que μ = μm/2 (mg/l) | μ | = | tasa de crecimiento específico (d–1) | μm | = | valor máximo de μm (d–1) | Kd | = | tasa de degradación específica de los sólidos activos (d–1) | θS | = | tiempo medio de retención del lodo, TRL (d) | Del examen de esta ecuación se deducen las conclusiones siguientes: | i) | la concentración del efluente es independiente de la del afluente (S0); por tanto, el porcentaje de biodegradación varía con la concentración del afluente, S0, | ii) | el único parámetro de control de la instalación que afecta a S1 es el tiempo de retención del lodo, θS, | iii) | para una concentración dada en el afluente, S0, habrá un tiempo crítico de retención del lodo tal que: | [3] | donde: | θSC = tiempo crítico de retención del lodo, por debajo del cual los microorganismos competentes serán arrastrados fuera de la instalación, | iv) | dado que los demás parámetros de la ecuación (2) están asociados con la cinética de crecimiento, es probable que la temperatura afecte al nivel del sustrato del efluente y a la edad crítica del lodo, es decir, el tiempo de retención del lodo necesario para obtener cierto grado de depuración aumentará según descienda la temperatura. | 2. | A partir del balance de masas de sólidos en el sistema del depósito poroso, y aceptando que la concentración de sólidos en el efluente de la instalación, X2, es baja respecto a la del recipiente de aireación, X1, el tiempo de retención del lodo es: | [4] | y | donde: | V | = | volumen del recipiente de aireación (l) | X1 | = | concentración de sólidos en el recipiente de aireación (mg/l) | X2 | = | concentración de sólidos en el efluente (mg/l) | Q0 | = | caudal del afluente (l/d) | Q1 | = | caudal del lodo residual (l/d). | Así pues, es posible fijar el tiempo de retención del lodo a cualquier valor preseleccionado mediante el control del caudal del lodo residual, Q1. | Conclusiones: | 3. | En consecuencia, el objetivo principal del ensayo consiste en poder prever la concentración del efluente y, por tanto, los niveles de sustancia problema en las aguas receptoras. | 4. | Mediante la representación gráfica de S1 frente a θS, a veces puede evaluarse fácilmente el tiempo crítico de retención del lodo, θSC; véase por ejemplo la curva 3 de la figura 1. Cuando esto no es posible, se puede calcular θSC, junto con los valores aproximados de μm y KS, representando S1 frente a S1•θS. | Una reordenación de la ecuación (1) da el resultado siguiente: | [5] | Si Kd es pequeña, entonces 1 + θs · Kd ~ 1 y [5] se convierte en lo siguiente: | [6] | Así pues, la gráfica deberá ser una línea recta (véase la figura 2) de pendiente 1/μm y ordenada en el origen KS/μm; también θS ~1/μm. | Figura 1 | Tres temperaturas; cinco TRL | Figura 2 | Recta de regresión TRL · S1 frente a S1 a T = 5 °C | Glosario: | TRL | Concentración del efluente | Apéndice 7 | ENSAYO CON UN RANGO DE CONCENTRACIONES BAJAS (μg/l) | 1. | En el medio acuático suele haber muchas sustancias presentes, incluso en las aguas residuales, a concentraciones muy bajas (μg/l). A tales concentraciones, no es probable que sirvan de sustratos primarios que permitan el crecimiento, pero es más probable que se degraden como sustratos secundarios, no responsables del crecimiento, en paralelo con otras diversas sustancias carbonadas presentes de forma natural. Por tanto, la degradación de tales sustancias no se ajustará al modelo descrito en el apéndice 6. Hay muchos modelos que podrían aplicarse y, bajo las condiciones reinantes en los sistemas de depuración de aguas residuales, podrían estar operativos simultáneamente más de uno. Es mucha la investigación que ha de hacerse todavía para poder resolver este problema. | 2. | Mientras tanto, puede seguirse el procedimiento indicado en el texto principal (capítulo C.10-A), pero solo en relación con la biodegradabilidad primaria, utilizando concentraciones suficientemente bajas (< 100 μg/l) y un procedimiento analítico validado. Puede calcularse el porcentaje de biodegradación (véase el punto 54 del método de ensayo) siempre que se tengan en cuenta los eventuales procesos abióticos (adsorción, volatilidad, etc.). Puede citarse como ejemplo el estudio de Nyholm y sus asociados (1) (2), con un ciclo de 4 h en un sistema de llenado y recogida. Calcularon constantes de pseudoprimer orden respecto a 5 sustancias añadidas a un agua residual a concentraciones entre 5 y 100 μg/l. Para la biodegradabilidad final, pueden utilizarse sustancias marcadas con 14C. Queda fuera del ámbito del presente método de ensayo recoger una descripción de esta posibilidad, ya que por ahora no se dispone de procedimientos aprobados, aunque un método propuesto para la norma ISO 14592 (3) contiene orientaciones sobre el uso de sustancias marcadas con 14C. | Prueba LASC | 3. | Después se propuso un ensayo más simple en dos etapas (4) (5) (6); el método del lodo activado semicontinuo (LASC) va seguido por ensayos cinéticos a corto plazo con muestras tomadas de las unidades de LASC. El sistema LASC funciona con tasas conocidas de retirada de lodo (a diferencia del método de ensayo C.12 original) y se alimenta con agua residual sintética de la OCDE modificada o con agua residual doméstica. El agua residual sintética se modificó (debido a que el valor de pH variaba y a que la capacidad de sedimentación del lodo era baja) por la adición de fosfato como amortiguador, extracto de levadura, cloruro de hierro (III) y sales de oligoelementos, y se aumentó su DQO hasta alrededor de 750 mg/l por la elevación de la concentración de peptona y extracto de carne. Las unidades funcionaban en ciclos de 24 h: aireación durante 23 h, retirada del lodo, sedimentación, retirada del sobrenadante (efluente) seguida de la adición del agua residual sintética más la sustancia problema, hasta 100 μg/l, (es decir, a la misma concentración aproximadamente que en el ensayo a corto plazo). Una vez por semana, el 10 % del lodo total se sustituye con lodo nuevo a fin de mantener la población microbiana en equilibrio. | 4. | Se miden las concentraciones de la sustancia problema al inicio y al final de la aireación, y el ensayo prosigue hasta que se estabilice la eliminación de la sustancia problema; esto puede necesitar desde una semana hasta varios meses. | Ensayo a corto plazo | 5. | Se lleva a cabo un ensayo a corto plazo (por ejemplo, 8 horas) para determinar la constante cinética de velocidad de (pseudo) primer orden de la degradación de la sustancia problema en lodo activado de orígenes e historiales conocidos pero diferentes. En particular, se toman muestras de lodo de los reactores LASC —al final de un período de aireación cuando la concentración de sustrato orgánico es baja— durante la realización de un experimento de aclimatación (puntos 3, 4). También puede tomarse lodo de una unidad paralela de LASC no expuesta a la sustancia problema, con fines comparativos. Se airean las mezclas de lodo y de sustancia problema añadida a dos o más concentraciones en el rango de 1-50 μg/l, sin adición de agua residual sintética ni otro sustrato orgánico. Se determina el contenido de sustancia problema que queda en disolución a intervalos periódicos como, por ejemplo, cada hora, en función de la degradabilidad de la sustancia, durante no más de 24 h. Se centrifugan las muestras antes de someterlas a un análisis adecuado. | Cálculos | 6. | Los datos de las unidades LASC se utilizan para calcular el porcentaje de eliminación de la sustancia problema (punto 54). Asimismo es posible calcular la constante media de velocidad, K1, (normalizada para tener en cuenta la concentración de sólidos en suspensión) con ayuda de la ecuación siguiente: | donde: | t | = | tiempo de aireación (23 h) | Ce | = | concentración al final del período de aireación (μg/l) | Ci | = | concentración al inicio de la aireación (μg/l) | SS | = | concentración de sólidos en el lodo activado (mg/l) | 7. | En el ensayo a corto plazo, se representa frente al tiempo el log del porcentaje de la concentración restante, y la pendiente de la parte inicial (degradación del 10-50 %) de la gráfica es equivalente a K1, la constante de (pseudo) primer orden. La constante se normaliza respecto a la concentración de sólidos en el lodo dividiendo la pendiente por la concentración de sólidos en el lodo. El resultado comunicado debe incluir asimismo datos de las concentraciones iniciales de la sustancia problema y de los sólidos en suspensión, tiempo de retención del lodo, carga y origen del lodo, así como datos de la eventual exposición previa a la sustancia problema. | Variabilidad de los resultados | 8. | En un reciente taller de la SETAC (7) se discutieron la variabilidad y otras facetas de la cinética de la biodegradación. De tales estudios, tanto de los ya publicados como de los que aún están en fase de proyecto, debe obtenerse una visión más clara de la cinética de las depuradoras, a fin de permitir una mejor interpretación de los datos disponibles, y para sugerir mejoras de los futuros métodos de ensayo. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353. | (2) | Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510. | (3) | ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Calidad del agua. Evaluación de la biodegradabilidad aerobia de compuestos orgánicos a baja concentración en el agua. | (4) | Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864. | (5) | Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and estándar (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735. | (6) | Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen. | (7) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels. | C.10-B: Biopelículas | INTRODUCCIÓN | 1. | Los ensayos de simulación se aplican normalmente a sustancias que no han superado un ensayo exploratorio de la biodegradabilidad fácil [(capítulo C.4-A a F del presente anexo (9)], pero sí han pasado un ensayo de biodegradabilidad intrínseca. Con carácter excepcional, también se aplican los ensayos de simulación a cualquier sustancia de la que se requiera más información, especialmente sustancias comercializadas en grandes cantidades, y normalmente se aplica el ensayo del lodo activado (C.10-A). Sin embargo, en ciertas circunstancias, es necesario conseguir información específica relativa al comportamiento de una sustancia ante métodos de depuración de aguas residuales con participación de biopelículas: filtros percoladores o por goteo, biodiscos giratorios, lechos fluidizados. Se han diseñado diversos dispositivos para satisfacer esta necesidad. | 2. | Gerike et al. (1) han utilizado grandes filtros por goteo de laboratorio, en modo de acoplamiento. Estos filtros ocupaban mucho espacio y necsitaban volúmenes relativamente grandes de agua residual natural o sintética. Truesdale et al. (2) han descrito filtros más pequeños (6 pies × 6 pulgadas de diámetro) que aceptaban aguas residuales naturales exentas de agentes tensioactivos, pero seguían necesitando volúmenes bastante grandes. Para que se formara una biopelícula "madura" hacían falta hasta 14 semanas, y se necesitaba un plazo adicional de 4-8 semanas tras la primera introducción del agente tensioactivo antes de que se realizara la aclimatación. | 3. | Baumann et al. (3) han desarrollado un filtro mucho más pequeño utilizando "lana" de poliéster previamente remojada en lodo activado como medio inerte de soporte de la biopelícula. Se utilizaba como única fuente de carbono la sustancia problema, y se evaluaba la biodegradabilidad a partir de mediciones del carbono orgánico disuelto (COD) en el afluente y en el efluente, y de la cantidad de CO2 en el gas de salida. | 4. | Gloyna et al. (4), aplicando un enfoque bastante diferente, inventaron el reactor tubular giratorio. Sobre la superficie interna del tubo giratorio se cultivaba una biopelícula sobre un área conocida pasando el afluente introducido por la parte superior del tubo, que se encontraba inclinado ligeramente respecto a la horizontal. Este reactor se ha utilizado para estudiar la biodegradabilidad de los tensioactivos (5), y también para investigar el espesor óptimo de la biopelícula y la difusión a través de la película (6). Estos últimos autores han seguido desarrollando el reactor, incluso modificándolo para que pueda determinarse el CO2 en el gas de salida. | 5. | El Standing Committee of Analysts (Comité Permanente de Analistas del Reino Unido) ha adoptado el reactor tubular giratorio como método normal para evaluar tanto la biodegradabilidad de las sustancias (7) como la posibilidad de tratar las aguas residuales y su toxicidad (8). El método aquí descrito reúne las ventajas de ser simple, compacto y reproducible y de necesitar un volumen relativamente reducido de medio orgánico. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 6. | A la superficie interna de un tubo inclinado que gira lentamente se aplica agua residual sintética o doméstica, y la sustancia problema, mezclada o sola. En esa superficie interna se forma una capa de microorganismos, similar a las presentes en los medios de los biofiltros. Las condiciones de trabajo del reactor se eligen de manera que permitan la eliminación adecuada de la materia orgánica y, cuando sea necesario, la oxidación del amonio. | 7. | Se recoge el efluente del tubo y se sedimenta y/o se filtra antes de analizarlo para determinar la concentración de carbono orgánico disuelto (COD) y/o la de la sustancia problema mediante un método específico. Con fines comparativos, se hacen funcionar en paralelo y bajo las mismas condiciones unidades de control sin sustancia problema. Se acepta que la diferencia entre las concentraciones de COD en los efluentes de las unidades de ensayo y de control se debe a la sustancia problema y a sus metabolitos orgánicos. Para calcular la eliminación de la sustancia problema, se compara esta diferencia con la concentración de la sustancia problema añadida (como COD). | 8. | Normalmente puede distinguirse la biodegradación de la bioadsorción examinando atentamente la curva de la eliminación frente al tiempo. Generalmente puede confirmarse aplicando el ensayo de biodegradación fácil (consumo de oxígeno o producción de dióxido de carbono) con un inóculo aclimatado, tomado al final del ensayo de los reactores que reciben la sustancia problema. | INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA | 9. | Es necesario conocer las características de pureza, hidrosolubilidad, volatilidad y adsorción de la sustancia problema para poder interpretar correctamente los resultados. | 10. | Normalmente no es posible hacer el ensayo con sustancias volátiles y poco solubles, salvo que se adopten precauciones especiales (véase el apéndice 5 del capítulo C.10-A). También debe conocerse la estructura química, o al menos la fórmula empírica, para poder calcular los valores teóricos o comprobar los valores medidos de ciertos parámetros, como la demanda teórica de oxígeno (DTO) o el COD. | 11. | El disponer de datos sobre la toxicidad de la sustancia problema para los microorganismos (véase el apéndice 4 del capítulo C.10-A) puede ser útil para seleccionar las concentraciones adecuadas para el ensayo y puede ser fundamental para interpretar correctamente los valores bajos de biodegradación. | UMBRALES | 12. | Originalmente se exigía que la biodegradación primaria de tensioactivos llegara como mínimo al 80 % para poder comercializar la sustancia. Si no se alcanza el valor del 80 %, puede aplicarse este ensayo (confirmatorio) de simulación y el tensioactivo puede comercializarse solamente si se elimina más del 90 % de la sustancia específica. Con las sustancias en general, no se trata de pasar un umbral sino de que el valor de eliminación porcentual pueda utilizarse para calcular aproximadamente la concentración probable en el medio ambiente que deba utilizarse en la evaluación del peligro planteado por las sustancias. En una serie de estudios de sustancias puras, se observó que el porcentaje de eliminación del COD era > 90 % en más de las tres cuartas partes, y > 80 % en más del 90 %, de las sustancias que mostraban un grado significativo de biodegradabilidad. | SUSTANCIAS DE REFERENCIA | 13. | Para asegurarse de la correcta ejecución del procedimiento experimental, es conveniente someter ocasionalmente a ensayo sustancias de referencia cuyo comportamiento se conozca. Entre esas sustancias se cuentan el ácido adípico, el 2-fenil-fenol, el 1-naftol, el ácido difénico y el ácido 1-naftoico. | REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO | 14. | Un laboratorio del Reino Unido dedujo que la desviación típica relativa era del 3,5 % dentro de un ensayo y del 5 % entre ensayos (7). | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Equipo | Reactores tubulares giratorios | 15. | El dispositivo (véanse las figuras 1 y 2 del apéndice 8) consiste en un banco de tubos acrílicos, cada uno de los cuales mide 30,5 cm de longitud y 5 cm de diámetro interior, apoyado en ruedas con borde de caucho, con un marco metálico de soporte. Cada tubo tiene una pestaña exterior, de unos 0,5 cm de profundidad, para mantenerlo sobre las ruedas, la superficie interior se ha hecho rugosa con lana de acero basta, y hay una pestaña interior de 0,5 cm de profundidad en el extremo superior (de alimentación) para retener el líquido. Los tubos presentan una inclinación de un grado aproximadamente respecto a la horizontal para conseguir el tiempo de contacto necesario cuando se aplica el medio de ensayo a un tubo limpio. Las ruedas con borde de caucho se hacen girar mediante un motor de velocidad lenta y variable. La temperatura de los tubos está controlada por su instalación en una zona de temperatura constante. | 16. | Si se encierra cada reactor de tubos dentro de un tubo taponado, ligeramente mayor, y se vela por que las conexiones sean estancas, es posible recoger el CO2 de salida en una solución alcalina para su medición posterior (6). | 17. | En un recipiente de almacenamiento de 20 l se pone el suministro de 24 h, para cada tubo, de medio orgánico con la sustancia problema añadida, en su caso (A) (véase la figura 2). Cuando sea necesario, se podrá añadir aparte la solución de la sustancia problema. Cerca del fondo de cada recipiente de almacenamiento hay una salida conectada mediante los tubos adecuados (por ejemplo, de caucho de silicona) a través de una bomba peristáltica a un tubo de alimentación acrílico o de vidrio que se introduce 2-4 cm en el extremo superior (alimentación) del tubo inclinado (C). Se deja que el efluente gotee desde el extremo inferior del tubo inclinado para recogerse en otro recipiente de almacenamiento (D). El efluente se somete a sedimentación o filtración antes de proceder a su análisis. | Equipo de filtración y centrífuga | 18. | Dispositivo de filtración de muestras con filtros de membrana de porosidad adecuada (diámetro de abertura nominal de 0,45 μm) que adsorban sustancias orgánicas solubles o liberen carbono orgánico en un grado mínimo. Si se utilizan filtros que liberan carbono orgánico, lavarlos cuidadosamente con agua caliente para eliminar el carbono orgánico lixiviable. Otra posibilidad es utilizar una centrífuga que pueda alcanzar una aceleración de 40 000 m/s2. | 19. | Equipo analítico para determinar: | — | el COD, el carbono orgánico total (COT), o la demanda química de oxígeno (DQO), | — | la sustancia específica (por HPLC, CG, etc.), cuando sea necesario, | — | pH, temperatura, acidez, alcalinidad, | — | amonio, nitrito y nitrato, si los ensayos se efectúan en condiciones de nitrificación. | Agua | 20. | Agua del grifo, con menos de 3 mg/l de COD. | 21. | Agua destilada o desionizada, con menos de 2 mg/l de COD. | Medio orgánico | 22. | Como medio orgánico puede utilizarse agua residual sintética, agua residual doméstica o una mezcla de ambos tipos. Se ha observado que el uso de agua residual doméstica sola suele llevar a un mayor porcentaje de eliminación del COD (en las unidades de lodo activado) y que incluso permite la biodegradación de algunas sustancias que no se biodegradan cuando se utiliza el agua residual sintética de la OCDE. Así pues, se recomienda el uso de agua residual doméstica. Debe medirse la concentración de COD (o de DQO) en cada nuevo lote de medio orgánico. Es necesario conocer la acidez o la alcalinidad del medio orgánico. Es posible que el medio orgánico requiera la adición de un amortiguador adecuado (carbonato de hidrógeno y sodio, o fosfato de hidrógeno y potasio) si es baja su acidez o su alcalinidad, para mantener durante el ensayo un pH de alrededor de 7,5 ± 0,5 en el reactor. Debe decidirse en cada caso la cantidad de amortiguador que ha de añadirse, y en qué momento hacerlo. | Agua residual sintética | 23. | Disuélvase en cada litro de agua del grifo: peptona, 160 mg; extracto de carne, 110 mg; urea, 30 mg; fosfato de hidrógeno y dipotasio anhidro (K2HPO4), 28 mg; cloruro de sodio (NaCl), 7 mg; cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O), 4 mg; sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O), 2 mg. El agua residual sintética de la OCDE es un ejemplo y da una concentración media de COD en el afluente de unos 100 mg/l. También es posible utilizar otras composiciones, con la misma concentración aproximada de COD, que se acerquen más al agua residual real. El agua residual sintética puede elaborarse con agua destilada en forma concentrada y conservarse a alrededor de 1 °C durante una semana como máximo. En el momento en que se necesite, se diluye con agua del grifo. (Este medio no es satisfactorio: la concentración de nitrógeno es muy elevada y el contenido de carbono es relativamente bajo, por ejemplo, pero no se ha sugerido nada mejor, salvo añadir más fosfato como amortiguador y peptona adicional.) | Agua residual doméstica | 24. | Debe utilizarse agua residual recién decantada, recogida cada día en una depuradora que reciba predominantemente agua residual doméstica. Debe recogerse del canal del rebosadero del tanque de sedimentación primaria, o de la alimentación a la instalación de lodo activado, y encontrarse exenta en gran medida de partículas gruesas. El agua residual puede seguir utilizándose tras guardarse varios días a unos 4 °C, si se demuestra que el COD (o la DQO) no ha descendido de forma significativa (es decir, en menos del 20 %) en ese plazo. A fin de limitar las perturbaciones del sistema, el COD (o la DQO) de cada lote nuevo debe ajustarse a un nivel constante adecuado, antes de utilizarlo, por ejemplo, mediante dilución con agua del grifo. | Lubricante | 25. | Puede aplicarse glicerol o aceite de oliva para lubricar los rodillos de la bomba peristáltica: ambos productos son adecuados para utilizarse con tubos de caucho de silicona. | Soluciones madre de sustancia problema | 26. | Con sustancias de solubilidad adecuada, preparar soluciones madre a concentraciones apropiadas (por ejemplo, de 1 a 5 g/l) en agua desionizada, o en la porción mineral del agua residual sintética. Respecto a las sustancias insolubles, véase el apéndice 5 del capítulo C.10-A. Este método no es adecuado para las sustancias volátiles si no se modifican los reactores tubulares (punto 16). Hay que determinar el COD y el COT de la solución madre y repetir las mediciones con cada lote nuevo. Si la diferencia entre el COD y el COT es superior al 20 %, ha de comprobarse la hidrosolubilidad de la sustancia problema. Comparar con los valores nominales el COD o la concentración de la sustancia problema medida por análisis específico de la solución madre, para considerar si la recuperación es suficientemente buena (normalmente puede esperarse > 90 %). Ha de evaluarse, especialmente en el caso de las dispersiones, si el COD puede utilizarse como parámetro analítico o si solo es posible utilizar una técnica analítica específica de la sustancia problema. En el caso de las dispersiones es necesario centrifugar las muestras. Con cada lote nuevo hay que medir el COD, la DQO o la sustancia mediante análisis específico. | 27. | Determínese el pH de la solución madre. La presencia de valores extremos indica que la adición de la sustancia puede influir en el pH de lodo activado en el sistema de ensayo. En este caso, haya que neutralizar la solución madre para obtener un pH de 7 ± 0,5, utilizando pequeñas cantidades de ácidos o bases inorgánicos, pero evitando la precipitación de la sustancia problema. | PROCEDIMIENTO | Preparación del medio orgánico para su introducción | 28. | Hay que asegurarse de que todos los recipientes del afluente y del efluente, así como los tubos que los unen, se limpian a fondo para eliminar la eventual proliferación microbiana, tanto al principio como a lo largo del ensayo. | 29. | Prepárese el agua residual sintética (punto 23) cada día de nuevo, bien a partir de los sólidos o bien a partir de la solución madre concentrada mediante la dilución adecuada con agua del grifo. Mídase la cantidad necesaria con una probeta y añádase a un recipiente de afluente limpio. También, cuando sea necesario, añádase al agua residual sintética, antes de la dilución, la cantidad necesaria de solución madre de la sustancia problema o de la sustancia de referencia. Si es más conveniente o necesario para evitar pérdidas de la sustancia problema, prepárese una solución diluida aparte de la sustancia problema en un depósito aparte y añádase a los tubos inclinados mediante una bomba dosificadora diferente. | 30. | Otra posibilidad, preferible, es utilizar agua residual doméstica decantada (punto 24), recogida de nuevo cada día, cuando sea posible. | Funcionamiento de los reactores tubulares giratorios | 31. | Para la evaluación de una sola sustancia problema, hacen falta dos reactores tubulares idénticos montados en una sala de temperatura constante, normalmente a 22 ± 2 °C. | 32. | Ajústense las bombas peristálticas para que lleven un caudal de 250 ± 25 ml/h de medio orgánico (sin la sustancia problema) a los tubos inclinados, que giran a 18 ± 2 rpm. Aplíquese el lubricante (punto 25) a los tubos de la bomba al inicio y periódicamente a lo largo del ensayo, para conseguir un funcionamiento adecuado y prolongar la vida de los tubos. | 33. | Ajústese el ángulo de inclinación de los tubos respecto a la horizontal para conseguir un tiempo de residencia de 125 ± 12,5 s de la alimentación en un tubo limpio. Estímese el tiempo de retención añadiendo a la alimentación un marcador no biológico (por ejemplo, NaCl, un colorante inerte): se acepta que el tiempo necesario para alcanzar la concentración máxima en el efluente es el tiempo medio de retención (cuando la película es máxima, el tiempo de retención puede aumentar hasta unos 30 min). | 34. | Se ha comprobado que estas tasas, velocidades y tiempos proporcionan retiradas adecuadas (> 80 %) del COD (o de la DQO) y producen efluentes nitrificados. La velocidad de flujo debe modificarse si la eliminación es insuficiente o si ha de simularse el comportamiento de una depuradora particular. En este último caso, ajústese la proporción de medio orgánico introducido hasta que el comportamiento del reactor se alinee con el de la depuradora. | Inoculación | 35. | La inoculación aérea puede ser suficiente para iniciar el crecimiento de los microorganismos cuando se utiliza agua residual sintética; en caso contrario, añádase a la alimentación durante 3 días 1 ml/l de agua residual decantada. | Mediciones | 36. | A intervalos periódicos, compruébese que las dosis de introducción de material y velocidades de giro se ajustan a los límites requeridos. Asimismo, mídase el pH del efluente, especialmente si se espera que haya nitrificación. | Muestreo y análisis | 37. | El método, la pauta y la frecuencia del muestreo deben elegirse de manera que se ajusten al propósito del ensayo. Por ejemplo, tómense muestras instantáneas de afluente y de efluente, o bien recójanse muestras a lo largo de un período más largo (por ejemplo, de 3 a 6 h). En el primer período, sin sustancia problema, tómense muestras dos veces por semana. Fíltrense las muestras por membrana o centrifúguense a alrededor de 40 000 m/s2 durante unos 15 min (punto 18). Puede ser necesario sedimentar las muestras y/o pasarlas por un filtro grueso antes de proceder a la filtración por membrana. Determínese el COD (o la DQO) al menos por duplicado y, en caso necesario, la DBO y el contenido de amonio y de nitrito/nitrato. | 38. | Todos los análisis deben efectuarse lo antes posible tras la recogida y preparación de las muestras. Si resulta necesario retrasar un análisis, las muestras deben conservarse a unos 4 °C a oscuras, en frascos llenos y bien cerrados. Si es necesario almacenar las muestras durante más de 48 h, hay que conservarlas por congelación, por acidificación o por adición de una sustancia tóxica adecuada [por ejemplo, 20 ml/l de una solución de cloruro de mercurio (II) de 10 g/l]. Hay que verificar que la técnica de conservación no altera los resultados de los análisis. | Período de rodaje | 39. | En este período, la biopelícula superficial crece hasta alcanzar un espesor óptimo, lo que generalmente necesita unas 2 semanas y no debe superar las 6 semanas. La eliminación de COD (o de DQO) (punto 44) va aumentando hasta alcanzar un valor de meseta. Una vez alcanzada la meseta con un valor similar en ambos tubos, se selecciona uno de ellos como control para el resto del ensayo, durante el cual su comportamiento debe mantenerse constante. | Introducción de la sustancia problema | 40. | Añádase en este momento la sustancia problema al otro reactor, a la concentración requerida, generalmente de 10 a 20 mg C/l. El control sigue recibiendo solamente el medio orgánico. | Período de aclimatación | 41. | Continúese haciendo los análisis del COD (o de la DQO) dos veces por semana y, si hay que evaluar la biodegradabilidad primaria, mídase también la concentración de la sustancia problema mediante un análisis específico. Déjese de 1 a 6 semanas (o incluso más en condiciones especiales) una vez añadida por primera vez la sustancia problema, para permitir que se dé la aclimatación. Cuando el porcentaje de eliminación (puntos 43 a 45) alcance el valor máximo, obténganse de 12 a 15 valores válidos en la fase de meseta a lo largo de unas 3 semanas, para evaluar el porcentaje medio de eliminación. Se considera que el ensayo está completado si se alcanza un nivel suficientemente elevado de eliminación. Normalmente, no debe llegarse a una duración del ensayo superior a 12 semanas tras la primera adición de la sustancia problema. | Arranque de la película | 42. | A intervalos relativamente periódicos, se produce la brusca eliminación de grandes cantidades del excedente de película de los tubos, o "arranque". Para garantizar que esto no afecta a la comparabilidad de los resultados, permítase que los ensayos abarquen al menos dos ciclos completos de crecimiento y de arranque. | DATOS E INFORME | Tratamiento de los resultados | 43. | Calcúlese el porcentaje de eliminación de la sustancia problema en términos de COD (o de DQO) respecto a cada evaluación programada en el tiempo, con ayuda de la ecuación siguiente: | donde: | Dt | = | porcentaje de eliminación del COD (o de la DQO) al tiempo t, | Cs | = | concentración de COD (o DQO) en el afluente debida a la sustancia problema, de preferencia estimada a partir de la concentración en la solución madre y del volumen añadido de esta (mg/l), | E | = | valores de COD (o DQO) medidos en el efluente de ensayo al tiempo t (mg/l), | Eo | = | valores de COD (o DQO) medidos en el efluente de control al tiempo t (mg/l). | Repítase el cálculo con la eventual sustancia de referencia utilizada. | Comportamiento del reactor de control | 44. | El grado de eliminación del COD (o de la DQO) (DB) del medio orgánico en los reactores de control es un dato útil para evaluar la actividad de biodegradación de la biopelícula durante el ensayo. Calcúlese el porcentaje de eliminación con ayuda de la ecuación siguiente: | donde: | Cm= valores de COD (o de DQO) del medio orgánico en el afluente de control (mg/l). | 45. | Calcúlese la eliminación (DST) de la sustancia problema si se mide con un método analítico específico en cada evaluación programada en el tiempo, con ayuda de la ecuación siguiente: | donde: | Si | = | concentración medida o, de preferencia, estimada de la sustancia problema en el afluente de ensayo (mg/l), | Se | = | concentración medida de la sustancia problema en el efluente de ensayo al tiempo t (mg/l). | Si el método analítico da un valor positivo en el agua residual no modificada equivalente a S c mg/l, calcúlese el porcentaje de eliminación (DSC) con ayuda de la fórmula siguiente: | Expresión de los resultados del ensayo | 46. | Represéntese el porcentaje de eliminación Dt y DST (o DSC), si está disponible, frente al tiempo (véase el apéndice 2 del capítulo C.10 A). Tómese la media (redondeada al número entero más próximo) y la desviación típica de los 12-15 valores de DT (y de DST, si se dispone de ellos) obtenidos en la fase de meseta como porcentaje de eliminación de la sustancia problema. De la forma de la curva de eliminación pueden deducirse ciertas conclusiones sobre los procesos de eliminación. | Adsorción | 47. | Si al inicio del ensayo se observa una elevada eliminación del COD de la sustancia problema, es probable que esta se elimine por adsorción a la biopelícula. Quizá sea posible comprobar este extremo determinando la sustancia problema adsorbida a los sólidos arrancados de la película. No es normal que la eliminación del COD de sustancias adsorbibles se mantenga elevada durante todo el ensayo; normalmente la eliminación es intensa al principio y después va cayendo gradualmente hasta alcanzar un valor de equilibrio. Si, no obstante, la sustancia problema adsorbida pudiera causar de alguna forma la aclimatación de la población microbiana, la eliminación del COD de la sustancia problema aumentaría posteriormente y alcanzaría un elevado nivel de meseta. | Tiempo de latencia | 48. | Como en los ensayos exploratorios estáticos, muchas sustancias problema requieren una fase de latencia antes de que se produzca la biodegradación plena. En esta fase de latencia, tiene lugar la aclimatación o adaptación de las bacterias competentes, sin que haya apenas eliminación de la sustancia problema; después empieza el crecimiento de estas bacterias. Esta fase termina y se acepta arbitrariamente que comienza la fase de degradación cuando se ha eliminado alrededor del 10 % de la cantidad inicial de sustancia problema (después de tener en cuenta la adsorción, en su caso). La fase de latencia suele ser muy variable y poco reproducible. | Fase de meseta | 49. | La fase de meseta de una curva de eliminación en un ensayo continuo se define como la fase en que se produce el máximo de degradación. Esta fase debe durar al menos 3 semanas y permitir la medición de unos 12-15 valores válidos. | Grado medio de eliminación de la sustancia problema | 50. | Calcúlese la media de los valores de eliminación Dt (y Dst, cuando se disponga de ellos) de la sustancia problema en la fase de meseta. Redondeado al entero más próximo (1 %), es el grado de eliminación de la sustancia problema. Se recomienda calcular asimismo el intervalo de confianza del 95 % para la media. De forma análoga, calcúlese el grado medio (DB) de eliminación del medio orgánico en el recipiente de control. | Indicación de la biodegradación | 51. | Si la sustancia problema no se adsorbe significativamente a la biopelícula y la curva de eliminación tiene la forma típica de una curva de biodegradación con fases de latencia, de degradación y de meseta (puntos 48 y 49), la eliminación medida puede atribuirse con seguridad a la biodegradación. Si ha tenido lugar una eliminación inicial importante, el ensayo de simulación no puede diferenciar entre el proceso de eliminación biológico y el abiótico. En tales casos, y en otros en que haya alguna duda sobre la biodegradación (por ejemplo, si se produce eliminación), se deben analizar en muestras de la película las sustancias problema adsorbidas o efectuar ensayos adicionales estáticos (exploratorios) de la biodegradación, en relación con parámetros que indiquen claramente si se trata de procesos biológicos. Tales ensayos son los métodos de consumo de oxígeno (capítulo C.4-D, E y F del presente anexo) (9) o un ensayo con medición de la producción de CO2 (capítulo C.4-C del presente anexo) o el método del espacio de cabeza (10); debe utilizarse como inóculo biopelícula preexpuesta del reactor adecuado. | 52. | Si se han medido tanto la eliminación del COD como la eliminación específica de la sustancia, una diferencia significativa (siendo la primera más baja que la segunda) entre los porcentajes de eliminación indica la presencia en los efluentes de productos orgánicos intermedios que pueden ser más difíciles de degradar; habrá que investigar tales productos. | Validez de los resultados del ensayo | 53. | Se considera que el ensayo es válido si el grado de eliminación (DB) del COD (o de la DQO) en las unidades de control es > 80 % tras dos semanas y no se han observado fenómenos inusuales. | 54. | Si se ha sometido a ensayo una sustancia (de referencia) fácilmente biodegradable, el grado de biodegradación debe ser > 90 % y la diferencia entre los valores de los duplicados no debe superar el 5 %. Si no se cumplen estos dos criterios, revísense los procedimientos experimentales u obténgase agua residual doméstica de otra fuente. | 55. | Análogamente, las diferencias entre los valores de la biodegradación de unidades duplicadas (en su caso) en que se trate una sustancia problema no deben superar el 5 %. Si no se cumple este criterio pero las eliminaciones son altas, continúese el análisis durante otras tres semanas. Si la eliminación es baja, investíguense los efectos inhibidores de la sustancia problema si no se conocen, y repítase el ensayo con una concentración menor de la sustancia problema, cuando sea posible. | Informe del ensayo | 56. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Datos de identificación. | — | Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas. | | Condiciones de ensayo: | — | Eventuales modificaciones del sistema de ensayo, especialmente si se han estudiado sustancias insolubles o volátiles. | — | Tipo de medio orgánico. | — | Proporción y naturaleza de los residuos industriales presentes en las aguas residuales, si se utilizan y conocen. | — | Método de inoculación. | — | Solución madre de sustancia problema: contenido en COD (carbono orgánico disuelto) y COT (carbono orgánico total), forma de preparación si se trata de una suspensión, concentración o concentraciones usadas y justificación si están fuera de la banda de 10 a 20 mg/l de COD, método de adición, fecha de la primera adición, cambios eventuales en la concentración. | — | Tiempo medio de retención hidráulica (sin crecimiento), velocidad de giro del tubo, ángulo aproximado de inclinación, si es posible. | — | Detalles del arranque, tiempo e intensidad. | — | Temperatura del ensayo y banda. | — | Técnicas analíticas empleadas. | | Resultados del ensayo: | — | Todos los datos medidos: COD, DQO, análisis específicos, pH, temperatura, sustancias nitrogenadas (cuando sea pertinente). | — | Todos los valores calculados de Dt (o Dtc), DB, DS obtenidos en formato tabular y las curvas de eliminación. | — | Información sobre las fases de latencia y de meseta, duración del ensayo, grado de eliminación de la sustancia problema, de la sustancia de referencia (si se utiliza) y del medio orgánico (en la unidad de control), junto con información estadística y declaraciones sobre la biodegradabilidad y la validez del ensayo. | — | Discusión de los resultados. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758. | (2) | Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444. | (3) | Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF-Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. | (4) | Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357. | (5) | Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94. | (6) | Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881. | (7) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London. | (8) | Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London. | (9) | Capítulo C.4 del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad "fácil" A-F. | (10) | ISO 14593 (1998). Calidad del agua-Evaluación de la biodegradabilidad final de las sustancias orgánicas en medio acuoso. Método de análisis del carbono inorgánico liberado en recipientes cerrados. | Apéndice 8 | Figura 1 | Tubos giratorios | Figura 2 | Diagrama de flujo | DEFINICIONES: | a. Sustancia problema: Toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este método de ensayo. | b. Sustancias: Ha de señalarse que en los acuerdos de la CNUMAD y en los documentos subsiguientes se usa el término "producto químico" para referirse a sustancias, productos, mezclas, preparados, o cualesquiera otras denominaciones utilizadas en los sistemas actuales para describir los productos químicos en cuestión. En el presente documento se utiliza el término "sustancia" en este mismo sentido amplio. | » |
| (10) | Chapters C.27, C.28, C.29 and C.30 are added: | ‘C.27 SEDIMENT-WATER CHIRONOMID TOXICITY TEST USING SPIKED SEDIMENT | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 218 (2004). This Test Method is designed to assess the effects of prolonged exposure of chemicals to the sediment-dwelling larvae of the freshwater dipteran Chironomus sp. It is based on existing toxicity test protocols for Chironomus riparius and Chironomus tentans which have been developed in Europe (1)(2)(3) and North America (4)(5)(6)(7)(8) and ring-tested (1)(6)(9). Other well documented chironomid species may also be used, e.g. Chironomus yoshimatsui (10)(11). | 2. | The exposure scenario used in this Test Method is spiking of sediment with the test substance. The selection of the appropriate exposure scenario depends on the intended application of the test. The scenario of spiking sediment is intended to simulate accumulated levels of chemicals persisting in the sediment. This exposure system involves spiking sediment of a sediment-water test system. | 3. | Substances that need to be tested towards sediment-dwelling organisms usually persist in this compartment over long time periods. The sediment-dwelling organisms may be exposed via a number of routes. The relative importance of each exposure route, and the time taken for each to contribute to the overall toxic effects, is dependent on the physical-chemical properties of the chemical concerned. For strongly adsorbing substances (e.g. with log Kow > 5) or for substances covalently binding to sediment, ingestion of contaminated food may be a significant exposure route. In order not to underestimate the toxicity of highly lipophilic substances, the use of food added to the sediment before application of the test substance may be considered. In order to take all potential routes of exposure into account the focus of this Test Method is on long-term exposure. The test duration is in the range of 20-28 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and 28-65 days for C. tentans. If short-term data are required for a specific purpose, for example to investigate the effects of an unstable chemical, additional replicates may be removed after a 10-day period. | 4. | The measured endpoints are the total number of adults emerged and the time to emergence. It is recommended that measurements of larval survival and growth should only be made after a 10-day period if additional short-term data are required, using additional replicates as appropriate. | 5. | The use of formulated sediment is recommended. Formulated sediment has several advantages over natural sediments: | — | the experimental variability is reduced because it forms a reproducible “standardised matrix” and the need to find uncontaminated and clean sediment sources is eliminated; | — | the tests can be initiated at any time without encountering seasonal variability in the test sediment and there is no need to pre-treat the sediment to remove indigenous fauna; the use of formulated sediment also reduces the cost associated with the field collection of sufficient amounts of sediment for routine testing; | — | the use of formulated sediment allows for comparisons of toxicity and ranking substances accordingly. | 6. | Definitions used are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 7. | First instar chironomid larvae are exposed to a concentration range of the test chemical in sediment — water systems. The test substance is spiked into the sediment and first instar larvae are subsequently introduced into test beakers in which the sediment and water concentrations have been stabilised. Chironomid emergence and development rate is measured at the end of the test. Larval survival and weight may also be measured after 10 days if required (using additional replicates as appropriate). These data are analysed either by using a regression model in order to estimate the concentration that would cause × % reduction in emergence or larval survival or growth (e.g. EC15, EC50 etc.), or by using statistical hypothesis testing to determine a NOEC/LOEC. The latter requires comparison of effect values with control values using statistical tests. | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 8. | The water solubility of the test substance, its vapour pressure, measured or calculated partitioning into sediment and stability in water and sediment should be known. A reliable analytical method for the quantification of the test substance in overlying water, pore water and sediment with known and reported accuracy and limit of detection should be available. Useful information includes the structural formula and purity of the test substance. Chemical fate of the test substance (e.g. dissipation, abiotic and biotic degradation, etc.) also is useful information. Further guidance for testing substances with physical-chemical properties that make them difficult to perform the test is provided in (12) | REFERENCE CHEMICALS | 9. | Reference chemicals may be tested periodically as a means of assuring that the test protocol and test conditions are reliable. Examples of reference toxicants used successfully in ring-tests and validation studies are: lindane, trifluralin, pentachlorophenol, cadmium chloride and potassium chloride (1)(2)(5)(6)(13). | VALIDITY OF THE TEST | 10. | For the test to be valid the following conditions apply: | — | the emergence in the controls must be at least 70 % at the end of the test. (1)(6); | — | C. riparius and C. yoshimatsui emergence to adults from control vessels should occur between 12 and 23 days after their insertion into the vessels; for C. tentans, a period of 20 to 65 days is necessary. | — | at the end of the test, pH and the dissolved oxygen concentration should be measured in each vessel. The oxygen concentration should be at least 60 per cent of the air saturation value (ASV) at the temperature used, and the pH of overlying water should be in the 6-9 range in all test vessels; | — | the water temperature should not differ by more than ± 1,0 °C. The water temperature could be controlled by isothermal room and in that case the room temperature should be confirmed in an appropriate time interval. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test vessels | 11. | The study is conducted in glass 600 ml beakers measuring 8 cm in diameter. Other vessels are suitable, but they should guarantee a suitable depth of overlying water and sediment. The sediment surface should be sufficient to provide 2 to 3 cm2 per larvae. The ratio of the depth of the sediment layer to the depth of the overlying water should be 1:4. Test vessels and other apparatus that will come into contact with the test system should be made entirely of glass or other chemically inert material (e.g. Teflon). | Selection of species | 12. | The species to be used in the test is preferably Chironomus riparius. Chironomus tentans is also suitable but more difficult to handle and requires a longer test period. Chironomus yohimatsui may also be used. Details of culture methods are given in Appendix 2 for Chironomus riparius. Information on culture conditions is also available for other species, i.e. Chironomus tentans (4) and Chironomus yoshimatsui (11). Identification of species must be confirmed before testing but is not required prior to every test if organisms come from an in-house culture. | Sediment | 13. | Formulated sediment (also called reconstituted, artificial or synthetic sediment) should preferably be used. However, if natural sediment is used, it should be characterised (at least pH, organic carbon content, determination of other parameters such as C/N ratio and granulometry are also recommended), and it should be free from any contamination and other organisms that might compete with, or consume the chironomids. It is also recommended that, before it is used in a chironomid toxicity test, the natural sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. The following formulated sediment, based on the artificial soil used in Test Method C.8 (14), is recommended for use in this test (1)(15)(16): | (a) | 4-5 % (dry weight) peat: as close to pH 5,5 to 6,0 as possible; it is important to use peat in powder form, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and only air dried. | (b) | 20 % (dry weight) kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %). | (c) | 75-76 % (dry weight) quartz sand (fine sand should predominate with more than 50 per cent of the particles between 50 and 200 μm). | (d) | Deionised water is added to obtain moisture content of the final mixture in a range of 30-50 %. | (e) | Calcium carbonate of chemically pure quality (CaCO3) is added to adjust the pH of the final mixture of the sediment to 7,0 ± 0,5. Organic carbon content of the final mixture should be 2 % (± 0,5 %) and is to be adjusted by the use of appropriate amounts of peat and sand, according to (a) and (c). | 14. | The source of peat, kaolin clay and sand should be known. The sediment components should be checked for the absence of chemical contamination (e.g. heavy metals, organochlorine compounds, organophosphorous compounds, etc.). An example for the preparation of the formulated sediment is described in Appendix 3. Mixing of dry constituents is also acceptable if it is demonstrated that after addition of overlying water a separation of sediment constituents (e.g. floating of peat particles) does not occur, and that the peat or the sediment is sufficiently conditioned. | Water | 15. | Any water which conforms to the chemical characteristics of acceptable dilution water as listed in Appendices 2 and 4 is suitable as test water. Any suitable water, natural water (surface or ground water), reconstituted water (see Appendix 2) or dechlorinated tap water are acceptable as culturing water and test water if chironomids will survive in it for the duration of the culturing and testing without showing signs of stress. At the start of the test, the pH of the test water should be between 6 and 9 and the total hardness not higher than 400 mg/l as CaCO3. However, if there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 must not be used in this situation). The same type of water should be used throughout the whole study. The water quality characteristics listed in Appendix 4 should be measured at least twice a year or when it is suspected that these characteristics may have changed significantly. | Stock solutions — Spiked sediments | 16. | Spiked sediments of the chosen concentration are usually prepared by addition of a solution of the test substance directly to the sediment. A stock solution of the test substance dissolved in deionised water is mixed with the formulated sediment by rolling mill, feed mixer or hand mixing. If poorly soluble in water, the test substance can be dissolved in as small a volume as possible of a suitable organic solvent (e.g. hexane, acetone or chloroform). This solution is then mixed with 10 g of fine quartz sand for one test vessel. The solvent is allowed to evaporate and it has to be totally removed from sand; the sand is then mixed with the suitable amount of sediment per test beaker. Only agents which volatilise readily can be used to solubilise, disperse or emulsify the test substance. It should be born in mind that the sand provided by the test substance and sand mixture, has to be taken into account when preparing the sediment (i.e. the sediment should thus be prepared with less sand). Care should be taken to ensure that the test substance added to sediment is thoroughly and evenly distributed within the sediment. If necessary, subsamples can be analysed to determine degree of homogeneity. | TEST DESIGN | 17. | The test design relates to the selection of the number and spacing of the test concentrations, the number of vessels at each concentration and the number of larvae per vessel. Designs for EC point estimation, for estimation of NOEC, and for conducting a limit test are described. | Design for analysis by regression | 18. | The effect concentration (e.g. EC15, EC50) and the concentration range, over which the effect of the test substance is of interest, should be spanned by the concentrations included in the test. Generally, the accuracy and especially validity, with which estimates of effect concentrations (ECx) can be made, is improved when the effect concentration is within the range of concentrations tested. Extrapolating much below the lowest positive concentration or above the highest concentration should be avoided. A preliminary range-finding test is helpful for selecting the range of concentrations to be used (see paragraph 27). | 19. | If the ECx is to be estimated, at least five concentrations and three replicates for each concentration should be tested. In any case, it is advisable that sufficient test concentrations are used to allow good model estimation. The factor between concentrations should not be greater than two (an exception could be made in cases when the dose response curve has a shallow slope). The number of replicates at each treatment can be reduced if the number of test concentrations with different responses is increased. Increasing the number of replicates or reducing the size of the test concentration intervals tends to lead to narrower confidence intervals for the test. Additional replicates are required if 10-day larval survival and growth are to be estimated. | Design for estimation of a NOEC/LOEC | 20. | If the LOEC or NOEC are to be estimated, five test concentrations with at least four replicates should be used and the factor between concentrations should not be greater than two. The number of replicates should be sufficient to ensure adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (p = 0,05). With the development rate, an Analysis of Variance (ANOVA) is usually appropriate, such as Dunnett-test and Williams-test (17)(18)(19)(20). In the emergence ratio the Cochran-Armitage, Fisher’s exact (with Bonferroni correction), or Mantel-Haenszel tests may be used. | Limit test | 21. | A limit test may be performed (one test concentration and control) if no effects were seen in the preliminary range-finding test. The purpose of the limit test is to perform a test at a concentration sufficiently high to enable decision makers to exclude possible toxic effects of the test substance, and the limit is set at a concentration which is not expected to appear in any situation. 1 000 mg/kg (dry weight) is recommended. Usually, at least six replicates for both the treatment and control are necessary. Adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (p = 0,05) should be demonstrated. With metric response (development rate and weight), the t-test is a suitable statistical method if data meet the requirements of this test (normality, homogeneous variances). The unequal-variance t-test or a non parametric test, such as the Wilcoxon-Mann-Whithey test may be used, if these requirements are not fulfilled. With the emergence ratio, the Fisher exact test is appropriate. | PROCEDURE | Conditions of exposure | Preparation of spiked sediment — water system | 22. | The spiking procedure described in Test Method C.8: Toxicity for Earthworms is recommended for application of the test substance (14). The spiked sediments are placed in the vessels and overlying water is added to produce a sediment-water volume ratio of 1:4 (see paragraphs 11 and 15). The depth of the sediment layer should be in the range of 1,5-3 cm. To avoid separation of sediment ingredients and re-suspension of fine material during addition of test water in the water column, the sediment can be covered with a plastic disc while water is poured onto it, and the disc removed immediately afterwards. Other devices may also be appropriate. | 23. | The test vessels should be covered (e.g. by glass plates). If necessary, during the study the water levels will be topped to the original volume in order to compensate for water evaporation. This should be performed using distilled or deionised water to prevent build-up of salts. | Stabilisation | 24. | Once the spiked sediment with overlying water has been prepared, it is desirable to allow partitioning of the test substance from the aqueous phase to the sediment (3)(4)(6)(13). This should preferably be done under the conditions of temperature and aeration used in the test. Appropriate equilibration time is sediment and chemical specific, and can be in the order of hours to days and in rare cases up to several weeks (4-5 weeks). As this would leave time for degradation of many chemicals, equilibrium is not awaited but an equilibration period of 48 hours is recommended. At the end of this further equilibration period, the concentration of the test substance should be measured in the overlying water, the pore water and the sediment, at least at the highest concentration and a lower one (see paragraph 38). These analytical determinations of the test substance allow for calculation of mass balance and expression of results based on measured concentrations. | Addition of test organisms | 25. | Four to five days before adding the test organisms to the test vessels, egg masses should be taken from the cultures and placed in small vessels in culture medium. Aged medium from the stock culture or freshly prepared medium may be used. If the latter is used, a small amount of food e.g. green algae and/or a few droplets of filtrate from a finely ground suspension of flaked fish food should be added to the culture medium (see Appendix 2). Only freshly laid egg masses should be used. Normally, the larvae begin to hatch a couple of days after the eggs are laid (2 to 3 days for Chironomus riparius at 20 °C and 1 to 4 days for Chironomus tentans at 23 °C and Chironomus yoshimatui at 25 °C) and larval growth occurs in four instars, each of 4-8 days duration. First instar larvae (2-3 or 1-4 days post hatching) should be used in the test. The instar of midges can possibly be checked using head capsule width (6). | 26. | Twenty first instar larvae are allocated randomly to each test vessel containing the spiked sediment and water, using a blunt pipette. Aeration of the water has to be stopped while adding the larvae to test vessels and remain so for another 24 hours after addition of larvae (see paragraphs 25 and 32). According to the test design used (see paragraphs 19 and 20), the number of larvae used per concentration is at least 60 for the EC point estimation and 80 for determination of NOEC. | Test concentrations | 27. | A range-finding test may be helpful to determine the range of concentrations for the definitive test. For this purpose a series of widely spaced concentrations of the test substance are used. In order to provide the same density of surface per chironomids, which is to be used for the definitive test, chironomids are exposed to each concentration of the test substance for a period which allows estimation of appropriate test concentrations, and no replicates are required. | 28. | The test concentrations for the definitive test are decided based on the result of the range-finding test. At least five concentrations should be used and selected as described in paragraphs 18 to 20. | Controls | 29. | Control vessels without any test substance but including sediment should be included in the test with the appropriate number of replicates (see paragraphs 19-20). If a solvent has been used for application of test substance (see paragraph 16), a sediment solvent control should be added. | Test system | 30. | Static systems are used. Semi-static or flow-through systems with intermittent or continuous renewal of overlying water might be used in exceptional cases as for instance if water quality specifications become inappropriate for the test organism or affect chemical equilibrium (e.g. dissolved oxygen levels fall too low, the concentration of excretory products rises too high or minerals leach from sediment and affect pH and/or water hardness). However, other methods for ameliorating the quality of overlying water, such as aeration, will normally suffice and be preferable. | Food | 31. | It is necessary to feed the larvae, preferably daily or at least three times per week. Fish-food (a suspension in water or finely ground food, e.g. TetraMin or TetraPhyll; see details in Appendix 2) in the amount of 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg for C. yoshimatui) per larvae per day seems adequate for young larvae for the first 10 days. Slightly more food may be necessary for older larvae: 0,5-1 mg per larvae per day should be sufficient for the rest of the test. The food ration should be reduced in all treatments and control if fungal growth is seen or if mortality is observed in controls. If fungal development cannot be stopped the test is to be repeated. When testing strongly adsorbing substances (e.g. with log Kow > 5), or substances covalently binding to sediment, the amount of food necessary to ensure survival and natural growth of the organisms may be added to the formulated sediment before the stabilisation period. For this, plant material must be used instead of fish food, e.g. addition of 0,5 % (dry weight) finely ground leaves of e.g. stinging nettle (Urtica dioica), mulberry (Morus alba), white clover (Trifolium repens), spinach (Spinacia oleracea) or of other plant material (Cerophyl or alpha-cellulose) may be used. | Incubation conditions | 32. | Gentle aeration of the overlying water in test vessels is supplied preferably 24 hours after addition of the larvae and is pursued throughout the test (care should be taken that dissolved oxygen concentration does not fall below 60 per cent of ASV). Aeration is provided through a glass Pasteur pipette fixed 2-3 cm above the sediment layer (i.e. one or few bubbles/sec). When testing volatile chemicals, consideration may be given not to aerate the sediment-water system. | 33. | The test is conducted at a constant temperature of 20 °C (± 2 °C). For C. tentans and C. yoshimatui recommended temperatures are 23 °C and 25 °C (± 2 °C), respectively. A 16 hours photoperiod is used and the light intensity should be 500 to 1 000 lux. | Exposure duration | 34. | The exposure commences with the addition of larvae to the spiked and control vessels. The maximum exposure duration is 28 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and 65 days for C. tentans. If midges emerge earlier, the test can be terminated after a minimum of five days after emergence of the last adult in the control. | Observations | Emergence | 35. | The development time and the total number of fully emerged male and female midges are determined. Males are easily identified by their plumose antennae. | 36. | The test vessels should be observed at least three times per week to make visual assessment of any abnormal behaviour (e.g. leaving sediment, unusual swimming), compared with the control. During the period of expected emergence a daily count of emerged midges is necessary. The sex and number of fully emerged midges are recorded daily. After identification the midges are removed from the vessels. Any egg masses deposited prior to the termination of the test should be recorded and then removed to prevent re-introduction of larvae into the sediment. The number of visible pupae that have failed to emerge is also recorded. Guidance on measurement of emergence is provided in Appendix 5. | Growth and survival | 37. | If data on 10-day larval survival and growth are to be provided, additional test vessels should be included at the start, so that they may be used subsequently. The sediment from these additional vessels is sieved using a 250 μm sieve to retain the larvae. Criteria for death are immobility or lack of reaction to a mechanical stimulus. Larvae not recovered should also be counted as dead (larvae which have died at beginning of the test may have been degraded by microbes). The (ash free) dry weight of the surviving larvae per test vessel is determined and the mean individual dry weight per vessel calculated. It is useful to determine which instar the surviving larvae belong to; for that measurement of the width of the head capsule of each individual can be used. | Analytical measurements | Concentration of the test substance | 38. | Prior to test commencement (i.e. addition of larvae), samples of bulk sediment are removed from at least one vessel per treatment for the analytical determination of the test substance concentration in the sediment. It is recommended that, as a minimum, samples of the overlying water, the pore water and the sediment be analysed at the start (see paragraph 24) and at the end of the test, at the highest concentration and a lower one. These determinations of test substance concentration inform about the behaviour/partitioning of the test substance in the water-sediment system. | 39. | When intermediate measurements are made (e.g. at day 7) and if the analysis needs large samples which cannot be taken from test vessels without influencing the test system, analytical determinations should be performed on samples from additional test vessels treated in the same way (including the presence of test organisms) but not used for biological observations. | 40. | Centrifugation at e.g. 10 000 g and 4 °C for 30 min. is the recommended procedure to isolate interstitial water. However, if the test substance is demonstrated not to adsorb to filters, filtration may also be acceptable. In some cases it might not be possible to analyse concentrations in the pore water as the sample size is too small. | Physical-chemical parameters | 41. | pH and temperature of the test vessels should be measured in an appropriate manner (see paragraph 10). Hardness and ammonia should be measured in the controls and one test vessel at the highest concentration at the start and the end of the test. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 42. | The purpose of this test is to determine the effect of the test substance on the development rate and the total number of fully emerged male and female midges, or in the case of the 10-day test effects on survival and weight of the larvae. If there are no indications of statistically different sensitivities of sexes, male and female results may be pooled for statistical analyses. The sensitivity differences between sexes can be statistically judged by e.g. a χ2-r × 2 table test. Larval survival and mean individual dry weight per vessel must be determined after 10 days where required. | 43. | Effect concentrations expressed and based on dry weight, are calculated preferably based on measured sediment concentrations at the beginning of the test (see paragraph 38). | 44. | To compute a point estimate for the EC50 or any other ECx, the per-vessel statistics may be used as true replicates. In calculating a confidence interval for any ECx the variability among vessels should be taken into account, or it should be shown that this variability is so small that it can be ignored. When the model is fitted by Least Squares, a transformation should be applied to the per-vessel statistics in order to improve the homogeneity of variance. However, ECx values should be calculated after the response is transformed back to the original value. | 45. | When the statistical analysis aims at determining the NOEC/LOEC by hypothesis testing, the variability among vessels needs to be taken into account, e.g. by a nested ANOVA. Alternatively, more robust tests (21) can be appropriate in situations where there are violations of the usual ANOVA assumptions. | Emergence ratio | 46. | Emergence ratios are quantal data, and can be analyzed by the Cochran-Armitage test applied in step-down manner where a monotonic dose-response is expected and these data are consistent with this expectation. If not, a Fisher’s exact or Mantel-Haenszel test with Bonferroni-Holm adjusted p-values can be used. If there is evidence of greater variability between replicates within the same concentration than a binomial distribution would indicate (often referenced as “extra-binomial” variation), then a robust Cochran-Armitage or Fisher exact test such as proposed in (21), should be used. | The sum of midges emerged per vessel, ne, is determined and divided by the number of larvae introduced, na: | where: | ER | = | emergence ratio | ne | = | number of midges emerged per vessel | na | = | number of larvae introduced per vessel | 47. | An alternative that is most appropriate for large sample sizes, when there is extra binomial variance, is to treat the emergence ratio as a continuous response and use procedures such as William’s test when a monotonic dose-response is expected and is consistent with these ER data. Dunnett’s test would be appropriate where monotonicity does not hold. A large sample size is defined here as the number emerged and the number not emerging both exceeding five, on a per replicate (vessel) basis. | 48. | To apply ANOVA methods values of ER should first be transformed by the arcsin-sqrt-transformation or Freeman-Tukey transformation to obtain an approximate normal distribution and to equalise variances. The Cochran-Armitage, Fisher’s exact (Bonferroni), or Mantel-Haenszel tests can be applied when using the absolute frequencies. The arcsin-sqrt transformation is applied by taking the inverse sine (sin-1) of the square root of ER. | 49. | For emergence ratios, ECx-values are calculated using regression analysis (or e.g. probit (22), logit, Weibull, appropriate commercial software etc.). If regression analysis fails (e.g. when there are less than two partial responses), other non-parametric methods such as moving average or simple interpolation are used. | Development rate | 50. | The mean development time represents the mean time span between the introduction of larvae (day 0 of the test) and the emergence of the experimental cohort of midges. (For the calculation of the true development time, the age of larvae at the time of introduction should be considered). The development rate is the reciprocal of the development time (unit: 1/day) and represents that portion of larval development which takes place per day. The development rate is preferred for the evaluation of these sediment toxicity studies as its variance is lower, and it is more homogeneous and closer to normal distribution as compared to development time. Hence, powerful parametric test procedures may be used with development rate rather than with development time. For development rate as a continuous response, ECx-values can be estimated by using regression analysis (e.g. (23), (24)). | 51. | For the following statistical tests, the number of midges observed on inspection day × are assumed to be emerged at the mean of the time interval between day x and day x – l (l = length of the inspection interval, usually 1 day). The mean development rate per vessel (x) is calculated according to: | where: | : | mean development rate per vessel | i | : | index of inspection interval | m | : | maximum number of inspection intervals | : | number of midges emerged in the inspection interval i | ne | : | total number of midges emerged at the end of experiment (= | ) | xi | : | development rate of the midges emerged in interval i | where: | dayi | : | inspection day (days since application) | li | : | length of inspection interval i (days, usually 1 day) | Test report | 52. | The test report must at least provide the following information: | | Test substance: | — | physical nature and, where relevant, physical-chemical properties (water solubility, vapour pressure, partition coefficient in soil (or in sediment if available), stability in water, etc.); | — | chemical identification data (common name, chemical name, structural formula, CAS number, etc.) including purity and analytical method for quantification of test substance. | | Test species: | — | test animals used: species, scientific name, source of organisms and breeding conditions; | — | information on handling of egg masses and larvae; | — | age of test animals when inserted into test vessels. | | Test conditions: | — | sediment used, i.e. natural or formulated sediment; | — | for natural sediment, location and description of sediment sampling site, including, if possible, contamination history; characteristics: pH, organic carbon content, C/N ratio and granulometry (if appropriate). | — | preparation of the formulated sediment: ingredients and characteristics (organic carbon content, pH, moisture, etc. at the start of the test); | — | preparation of the test water (if reconstituted water is used) and characteristics (oxygen concentration, pH, conductivity, hardness, etc. at the start of the test); | — | depth of sediment and overlying water; | — | volume of overlying and pore water; weight of wet sediment with and without pore water; | — | test vessels (material and size); | — | method of spiking sediment: test concentrations used, number of replicates and use of solvent if any; | — | stabilisation equilibrium phase of the spiked sediment-water system: duration and conditions; | — | incubation conditions: temperature, light cycle and intensity, aeration (frequency and intensity); | — | detailed information on feeding including type of food, preparation, amount and feeding regime. | | Results: | — | the nominal test concentrations, the measured test concentrations and the results of all analyses to determine the concentration of the test substance in the test vessel; | — | water quality within the test vessels, i.e. pH, temperature, dissolved oxygen, hardness and ammonia; | — | replacement of evaporated test water, if any; | — | number of emerged male and female midges per vessel and per day; | — | number of larvae which failed to emerge as midges per vessel; | — | mean individual dry weight of larvae per vessel, and per instar, if appropriate; | — | percent emergence per replicate and test concentration (male and female midges pooled); | — | mean development rate of fully emerged midges per replicate and treatment rate (male and female midges pooled); | — | estimates of toxic endpoints e.g. ECx (and associated confidence intervals), NOEC and/or LOEC,, and the statistical methods used for their determination; | — | discussion of the results, including any influence on the outcome of the test resulting from deviations from this Test Method. | LITERATURE: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. | (10) | Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. | (11) | Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. | (12) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Test Method C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms. | (15) | Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. | (16) | Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. | (17) | Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. | (18) | Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. | (19) | Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. | (20) | Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. | (21) | Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. | (22) | Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. | (23) | Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. | (24) | Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. | Appendix 1 | DEFINITIONS | For the purpose of this Test Method the following definitions are used: | Formulated sediment or reconstituted, artificial or synthetic sediment, is a mixture of materials used to mimic the physical components of a natural sediment. | Overlying water is the water placed over sediment in the test vessel. | Interstitial water or pore water is the water occupying space between sediment and soil particles. | Spiked sediment is sediment to which test substance has been added. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Recommendations for culture of Chironomus riparius | 1. | Chironomus larvae may be reared in crystallising dishes or larger containers. Fine quartz sand is spread in a thin layer of about 5 to 10 mm deep over the bottom of the container. Kieselguhr (e.g. Merck, Art 8117) has also been shown to be a suitable substrate (a thinner layer of up to a very few mm is sufficient). Suitable water is then added to a depth of several cm. Water levels should be topped up as necessary to replace evaporative loss, and prevent desiccation. Water can be replaced if necessary. Gentle aeration should be provided. The larval rearing vessels should be held in a suitable cage which will prevent escape of the emerging adults. The cage should be sufficiently large to allow swarming of emerged adults, otherwise copulation may not occur (minimum is ca. 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Cages should be held at room temperature or in a constant environment room at 20 ± 2 °C with a photo period of 16 hour light (intensity ca. 1 000 lux), 8 hours dark. It has been reported that air humidity of less than 60 % RH can impede reproduction. | Dilution water | 3. | Any suitable natural or synthetic water may be used. Well water, dechlorinated tap water and artificial media (e.g. Elendt “M4” or “M7” medium, see below) are commonly used. The water has to be aerated before use. If necessary, the culture water may be renewed by pouring or siphoning the used water from culture vessels carefully without destroying the tubes of larvae. | Feeding larvae | 4. | Chironomus larvae should be fed with a fish flake food (TetraMin® TetraPhyll® or other similar brand of proprietary fish food), at approximately 250 mg per vessel per day. This can be given as a dry ground powder or as a suspension in water: 1,0 g of flake food is added to 20 ml of dilution water and blended to give a homogenous mix. This preparation may be fed at a rate of about 5 ml per vessel per day (shake before use). Older larvae may receive more. | 5. | Feeding is adjusted according to the water quality. If the culture medium becomes “cloudy”, the feeding should be reduced. Food additions must be carefully monitored. Too little food will cause emigration of the larvae towards the water column, and too much food will cause increased microbial activity and reduced oxygen concentrations. Both conditions can result in reduced growth rates. | 6. | Some green algae (e.g. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) cells may also be added when new culture vessels are set up. | Feeding emerged adults | 7. | Some experimenters have suggested that a cotton wool pad soaked in a saturated sucrose solution may serve as a food for emerged adults. | Emergence | 8. | At 20 ± 2 °C adults will begin to emerge from the larval rearing vessels after approximately 13-15 days. Males are easily distinguished by having plumose antennae. | Egg masses | 9. | Once adults are present within the breeding cage, all larval rearing vessels should be checked three times weekly for deposition of the gelatinous egg masses. If present, the egg masses should be carefully removed. They should be transferred to a small dish containing a sample of the breeding water. Egg masses are used to start a new culture vessel (e.g. 2-4 egg masses/vessel) or are used for toxicity tests. | 10. | First instar larvae should hatch after 2-3 days. | Set-up of new culture vessels | 11. | Once cultures are established it should be possible to set up a fresh larval culture vessel weekly or less frequently depending on testing requirements, removing the older vessels after adult midges have emerged. Using this system a regular supply of adults will be produced with a minimum of management. | Preparation of test solutions “M4” and “M7” | 12. | Elendt (1990) has described the “M4” medium. The “M7” medium is prepared as the “M4” medium except for the substances indicated in Table 1, for which concentrations are four times lower in “M7” than in “M4”. A publication on the “M7” medium is in preparation (Elendt, personal communication). The test solution should not be prepared according to Elendt and Bias (1990) for the concentrations of NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 and K2HPO4 given for the preparation of the stock solutions are not adequate. | Preparation of the “M7”-medium | 13. | Each stock solution (I) is prepared individually and a combined stock solution (II) is prepared from these stock solutions (I) (see Table 1). Fifty ml from the combined stock Solution (II) and the amounts of each macro nutrient stock solution which are given in Table 2 are made up to 1 litre of deionised water to prepare the “M7” medium. A vitamin stock solution is prepared by adding three vitamins to deionised water as indicated in Table 3, and 0,1 ml of the combined vitamin stock solution are added to the final “M7” medium shortly before use. (The vitamin stock solution is stored frozen in small aliquots). The medium is aerated and stabilised. | LITERATURE: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. | Table 1 | Stock solutions of trace elements for medium M4 and M7 | Stock solutions (I) | Amount (mg) made up to 1 litre of deionised water | To prepare the combined stock solution (II): mix the following amounts (ml) of stock solutions (I) and make up to 1 litre of deionised water | Final concentrations in test solutions (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (8) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (8) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (8) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (8) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (8) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (8) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (8) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (8) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (8) (9) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (8) (9) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Table 2 | Macro nutrient stock solutions for medium M4 and M7 | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of macro nutrient stock solutions added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Table 3 | Vitamin stock solution for medium M4 and M7. All three vitamin solutions are combined to make a single vitamin stock solution | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of vitamin stock solution added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | Thiamine hydrochloride | 750 | 0,1 | 0,075 | Cyanocobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotine | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | LITERATURE: | Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. | Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. | Appendix 3 | PREPARATION OF FORMULATED SEDIMENT | Sediment composition | The composition of the formulated sediment should be as follows: | Constituent | Characteristics | % of sediment | dry weight | Peat | Sphagnum moss peat, as close to pH 5,5-6,0 as possible, no visible plant remains, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and air dried | 4-5 | Quartz sand | Grain size: > 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm | 75-76 | Kaolinite clay | Kaolinite content ≥ 30 % | 20 | Organic carbon | Adjusted by addition of peat and sand | 2 (± 0,5) | Calcium carbonate | CaCO3, pulverised, chemically pure | 0,05-0,1 | Water | Conductivity ≤ 10 μS/cm | 30-50 | Preparation | The peat is air dried and ground to a fine powder. A suspension of the required amount of peat powder in deionised water is prepared using a high-performance homogenising device. The pH of this suspension is adjusted to 5,5 ± 0,5 with CaCO3. The suspension is conditioned for at least two days with gentle stirring at 20 ± 2 °C, to stabilise pH and establish a stable microbial component. pH is measured again and should be 6,0 ± 0,5. Then the peat suspension is mixed with the other constituents (sand and kaolin clay) and deionised water to obtain a homogeneous sediment with a water content in a range of 30-50 per cent of dry weight of the sediment. The pH of the final mixture is measured once again and is adjusted to 6,5 to 7,5 with CaCO3 if necessary. Samples of the sediment are taken to determine the dry weight and the organic carbon content. Then, before it is used in the chironomid toxicity test, it is recommended that the formulated sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. | Storage | The dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored in a dry and cool place at room temperature. The formulated (wet) sediment should not be stored prior to its use in the test. It should be used immediately after the 7 days conditioning period that ends its preparation. | LITERATURE: | Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms. | Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. | Appendix 4 | Chemical Characteristics of an Acceptable Dilution Water | Substance | Concentrations | Particulate matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2 mg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Hardness as CaCO3 | < 400 mg/l (*3) | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorus pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | Appendix 5 | Guidance for monitoring emergence of chironomid larvae | Emergence traps are placed on the test beakers. These traps are needed from day 20 to the end of the test. Example of trap used is drawn below: | C. 28. SEDIMENT-WATER CHIRONOMID TOXICITY TEST USING SPIKED WATER | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD TG 219 (2004). This Test Method is designed to assess the effects of prolonged exposure of chemicals to the sediment-dwelling larvae of the freshwater dipteran Chironomus sp. It is mainly based on the BBA guideline using a sediment-water test system with artificial soil, and water column exposure scenario (1). It also takes into account existing toxicity test protocols for Chironomus riparius and Chironomus tentans which have been developed in Europe and North America (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) and ring-tested (1)(6)(9). Other well documented chironomid species may also be used, e.g. Chironomus yoshimatsui (10)(11). | 2. | The exposure scenario used in this Test Method is water spiking. The selection of the appropriate exposure scenario depends on the intended application of the test. The water exposure scenario, involving spiking of the water column, is intended to simulate a pesticide spray drift event and covers the initial peak of concentrations in pore water. It is also useful for other types of exposure (including chemical spills) except accumulation processes lasting longer than the test period. | 3. | Substances that need to be tested towards sediment-dwelling organisms usually persist in this compartment over long time periods. The sediment-dwelling organisms may be exposed via a number of routes. The relative importance of each exposure route, and the time taken for each to contribute to the overall toxic effects, is dependent on the physical-chemical properties of the chemical concerned. For strongly adsorbing substances (e.g. with log Kow > 5) or for substances covalently binding to sediment, ingestion of contaminated food may be a significant exposure route. In order not to underestimate the toxicity of highly lipophilic substances, the use of food added to the sediment before application of the test substance may be considered. In order to take all potential routes of exposure into account the focus of this Test Method is on long-term exposure. The test duration is in the range of 20-28 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and 28-65 days for C. tentans. If short-term data are required for a specific purpose, for example to investigate the effects of unstable chemicals, additional replicates may be removed after a 10-day period. | 4. | The measured endpoints are the total number of adults emerged and the time to emergence. It is recommended that measurements of larval survival and growth should only be made after a 10-day period if additional short-term data are required, using additional replicates as appropriate. | 5. | The use of formulated sediment is recommended. Formulated sediment has several advantages over natural sediments: | — | the experimental variability is reduced because it forms a reproducible “standardised matrix” and the need to find uncontaminated and clean sediment sources is eliminated; | — | the tests can be initiated at any time without encountering seasonal variability in the test sediment and there is no need to pre-treat the sediment to remove indigenous fauna; the use of formulated sediment also reduces the cost associated with the field collection of sufficient amounts of sediment for routine testing; | — | the use of formulated sediment allows for comparisons of toxicity and ranking substances accordingly: toxicity data from tests with natural and artificial sediments were comparable for several chemicals (2). | 6. | Definitions used are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 7. | First instar chironomid larvae are exposed to a concentration range of the test substance in sediment-water systems. The test starts by placing first instar larvae into the test beakers containing the sediment-water system and subsequently spiking the test substance into the water. Chironomid emergence and development rate is measured at the end of the test. Larval survival and weight may also be measured after 10 days if required (using additional replicates as appropriate). These data are analysed either by using a regression model in order to estimate the concentration that would cause x % reduction in emergence, larvae survival or growth (e.g. EC15, EC50, etc.), or by using statistical hypothesis testing to determine a NOEC/LOEC. The latter requires comparison of effect values with control values using statistical tests. | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 8. | The water solubility of the test substance, its vapour pressure, measured or calculated partitioning into sediment and stability in water and sediment should be known. A reliable analytical method for the quantification of the test substance in overlying water, pore water and sediment with known and reported accuracy and limit of detection should be available. Useful information includes the structural formula and purity of the test substance. Chemical fate of the test substance (e.g. dissipation, abiotic and biotic degradation, etc.) also is useful information. Further guidance for testing substances with physical-chemical properties that make them difficult to perform the test is provided in (12). | REFERENCE CHEMICALS | 9. | Reference chemicals may be tested periodically as a means of assuring that the test protocol and test conditions are reliable. Examples of reference toxicants used successfully in ring-tests and validation studies are: lindane, trifluralin, pentachlorophenol, cadmium chloride and potassium chloride. (1)(2)(5)(6)(13). | VALIDITY OF THE TEST | 10. | For the test to be valid the following conditions apply: | — | the emergence in the controls must be at least 70 % at the end of the test. (1)(6); | — | C. riparius and C. yoshimatsui emergence to adults from control vessels should occur between 12 and 23 days after their insertion into the vessels; for C. tentans, a period of 20 to 65 days is necessary. | — | at the end of the test, pH and the dissolved oxygen concentration should be measured in each vessel. The oxygen concentration should be at least 60 % of the air saturation value (ASV) at the temperature used, and the pH of overlying water should be in the 6-9 range in all test vessels; | — | the water temperature should not differ by more than ± 1,0 °C. The water temperature could be controlled by isothermal room and in that case the room temperature should be confirmed in an appropriate time intervals. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test vessels | 11. | The study is conducted in glass 600 ml beakers measuring 8 cm in diameter. Other vessels are suitable, but they should guarantee a suitable depth of overlying water and sediment. The sediment surface should be sufficient to provide 2 to 3 cm2 per larvae. The ratio of the depth of the sediment layer to the depth of the overlying water should be 1:4. Test vessels and other apparatus that will come into contact with the test system should be made entirely of glass or other chemically inert material (e.g. Teflon). | Selection of species | 12. | The species to be used in the test is preferably Chironomus riparius. Chironomus tentans is also suitable but more difficult to handle and requires a longer test period. Chironomus yohimatsui may also be used. Details of culture methods are given in Appendix 2 for Chironomus riparius. Information on culture conditions is also available for other species, i.e. Chironomus tentans (4) and Chironomus yoshimatsui (11). Identification of species must be confirmed before testing but is not required prior to every test if organisms come from an in-house culture. | Sediment | 13. | Formulated sediment (also called reconstituted, artificial or synthetic sediment) should preferably be used. However, if natural sediment is used, it should be characterised (at least pH, organic carbon content, determination of other parameters such as C/N ratio and granulometry are also recommended), and it should be free from any contamination and other organisms that might compete with, or consume the chironomids. It is also recommended that, before it is used in a chironomid toxicity test, the natural sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. The following formulated sediment, based on the artificial soil used in Test Method C.8 (14), is recommended for use in this test (1)(15)(16): | a) | 4-5 % (dry weight) peat: as close to pH 5,5 to 6,0 as possible; it is important to use peat in powder form, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and only air dried. | b) | 20 % (dry weight) kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %). | c) | 75-76 % (dry weight) quartz sand (fine sand should predominate with more than 50 % of the particles between 50 and 200 μm). | d) | Deionised water is added to obtain moisture of the final mixture in a range of 30-50 %. | e) | Calcium carbonate of chemically pure quality (CaCO3) is added adjust the pH of the final mixture of the sediment to 7,0 ± 0,5. | f) | Organic carbon content of the final mixture should be 2 % (± 0,5 %) and is to be adjusted by the use of appropriate amounts of peat and sand, according to (a) and (c). | 14. | The source of peat, kaolin clay and sand should be known. The sediment components should be checked for the absence of chemical contamination (e.g. heavy metals, organochlorine compounds, organophosphorous compounds, etc.). An example for the preparation of the formulated sediment is described in Appendix 3. Mixing of dry constituents is also acceptable if it is demonstrated that after addition of overlying water a separation of sediment constituents (e.g. floating of peat particles) does not occur, and that the peat or the sediment is sufficiently conditioned. | Water | 15. | Any water which conforms to the chemical characteristics of acceptable dilution water as listed in Appendices 2 and 4 is suitable as test water. Any suitable water, natural water (surface or ground water), reconstituted water (see Appendix 2) or dechlorinated tap water are acceptable as culturing water and test water if chironomids will survive in it for the duration of the culturing and testing without showing signs of stress. At the start of the test, the pH of the test water should be between 6 and 9 and the total hardness not higher than 400 mg/l as CaCO3. However, if there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 must not be used in this situation). The same type of water should be used throughout the whole study. The water quality characteristics listed in Appendix 4 should be measured at least twice a year or when it is suspected that these characteristics may have changed significantly. | Stock solutions — Spiked water | 16. | Test concentrations are calculated on the basis of water column concentrations, i.e. the water overlying the sediment. Test solutions of the chosen concentrations are usually prepared by dilution of a stock solution. Stock solutions should preferably be prepared by dissolving the test substance in test medium. The use of solvents or dispersants may be required in some cases in order to produce a suitably concentrated stock solution. Examples of suitable solvents are acetone, ethanol, methanol, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol dimethyl ether, dimethylformamide and triethylene glycol. Dispersants which may be used are Cremophor RH40, Tween 80, methylcellulose 0,01 % and HCO-40. The solubilising agent concentration in the final test medium should be minimal (i.e. ≤ 0,1 ml/l) and should be the same in all treatments. When a solubilising agent is used, it must have no significant effects on survival or no visible adverse effect on the chironomid larvae as revealed by a solvent-only control. However, every effort should be made to avoid the use of such materials. | TEST DESIGN | 17. | The test design relates to the selection of the number and spacing of the test concentrations, the number of vessels at each concentration and the number of larvae per vessel. Designs for EC point estimation, for estimation of NOEC, and for conducting a limit test are described. The analysis by regression is preferred to the hypothesis testing approach. | Design for analysis by regression | 18. | The effect concentration (e.g. EC15, EC50) and the concentration range, over which the effect of the test substance is of interest, should be spanned by the concentrations included in the test. Generally, the accuracy and especially validity, with which estimates of effect concentrations (ECx) can be made, is improved when the effect concentration is within the range of concentrations tested. Extrapolation much below the lowest positive concentration or above the highest concentration should be avoided. A preliminary range-finding test is helpful for selecting the range of concentrations to be used (see paragraph 27). | 19. | If the ECx is to be estimated, at least five concentrations and three replicates for each concentration should be tested. In any case, it is advisable that sufficient test concentrations are used to allow a good model estimation. The factor between concentrations should not be greater than two (an exception could be made in cases when the dose response curve has a shallow slope). The number of replicates at each treatment can be reduced if the number of test concentrations with different responses is increased. Increasing the number of replicates or reducing the size of the test concentration intervals tends to lead to narrower confidence intervals for the test. Additional replicates are required if 10-day larval survival and growth are to be estimated. | Design for estimation of a NOEC/LOEC | 20. | If the LOEC/NOEC are to be estimated, five test concentrations with at least four replicates should be used and the factor between concentrations should not be greater than two. The number of replicates should be sufficient to ensure adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (p = 0,05). With the development rate, an Analysis of Variance (ANOVA) is usually appropriate, such as Dunnett-test and Williams-test (17)(18)(19)(20). In the emergence ratio the Cochran-Armitage, Fisher’s exact (with Bonferroni correction), or Mantel-Haenszel tests may be used. | Limit test | 21. | A limit test may be performed (one test concentration and control) if no effects were seen in the preliminary range-finding test. The purpose of the limit test is to indicate that the toxic value of the test substance is greater than the limit concentration tested. No suggestion for a recommended concentration can be made in this Test Method; this is left to the regulators’ judgement. Usually, at least six replicates for both the treatment and control are necessary. Adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (p = 0,05) should be demonstrated. With metric response (development rate and weight), the t-test is a suitable statistical method if data meet the requirements of this test (normality, homogeneous variances). The unequal-variance t-test or a non parametric test, such as the Wilcoxon-Mann-Whithey test may be used, if these requirements are not fulfilled. With the emergence ratio, the Fisher exact test is appropriate. | PROCEDURE | Conditions of exposure | Preparation of spiked water-sediment system | 22. | Appropriate amounts of formulated sediment (see paragraphs 13-14 and Appendix 3) are added in the test vessels to form a layer of at least 1,5 cm. Water is added to a depth of 6 cm (see paragraph 15). The ratio of the depth of the sediment layer and the depth of the water should not exceed 1:4 and the sediment layer should not be deeper than 3 cm. The sediment-water system should be left under gentle aeration for seven days prior to addition of test organisms (see paragraph 14 and Appendix 3). To avoid separation of sediment ingredients and re-suspension of fine material during addition of test water in the water column, the sediment can be covered with a plastic disc while water is poured onto it, and the disc is removed immediately afterwards. Other devices may also be appropriate. | 23. | The test vessels should be covered (e.g. by glass plates). If necessary, during the study the water levels will be topped to the original volume in order to compensate for water evaporation. This should be performed using distilled or deionised water to prevent build-up of salts. | Addition of test organisms | 24. | Four to five days before adding the test organisms to the test vessels, egg masses should be taken from the cultures and placed in small vessels in culture medium. Aged medium from the stock culture or freshly prepared medium may be used. If the latter is used, a small amount of food e.g. green algae and/or a few droplets of filtrate from a finely ground suspension of flaked fish food should be added to the culture medium (see Appendix 2). Only freshly laid egg masses should be used. Normally, the larvae begin to hatch a couple of days after the eggs are laid (2 to 3 days for Chironomus riparius at 20 °C and 1 to 4 days for Chironomus tentans at 23 °C and Chironomus yoshimatui at 25 °C) and larval growth occurs in four instars, each of 4-8 days duration. First instar larvae (2-3 or 1-4 days post hatching) should be used in the test. The instar of midges can possibly be checked using head capsule width (6). | 25. | Twenty first instar larvae are allocated randomly to each test vessel containing the spiked sediment and water, using a blunt pipette. Aeration of the water has to be stopped while adding the larvae to test vessels and remain so for another 24 hours after addition of larvae (see paragraphs 24 and 32). According to the test design used (see paragraphs 19 and 20), the number of larvae used per concentration is at least 60 for the EC point estimation and 80 for determination of NOEC. | 26. | Twenty-four hours after adding the larvae, the test substance is spiked into the overlying water column, and slight aeration is again supplied. Small volumes of test substance solutions are applied below the surface of the water using a pipette. The overlying water should then be mixed with care not to disturb the sediment. | Test concentrations | 27. | A range-finding test may be helpful to determine the range of concentrations for the definitive test. For this purpose a series of widely spaced concentrations of the test substance are used. In order to provide the same density of surface per chironomids, which is to be used for the definitive test, chironomids are exposed to each concentration of the test substance for a period which allows estimation of appropriate test concentrations, and no replicates are required. | 28. | The test concentrations for the definitive test are decided based on the result of the range-finding test. At least five concentrations should be used and selected as described in paragraphs 18 to 20. | Controls | 29. | Control vessels without any test substance but including sediment should be included in the test with the appropriate number of replicates (see paragraphs 19-20). If a solvent has been used for application of test substance (see paragraph 16), a sediment solvent control should be added. | Test system | 30. | Static systems are used. Semi-static or flow-through systems with intermittent or continuous renewal of overlying water might be used in exceptional cases as for instance if water quality specifications become inappropriate for the test organism or affect chemical equilibrium (e.g. dissolved oxygen levels fall too low, the concentration of excretory products rises too high or minerals leach from sediment and affect pH and/or water hardness). However, other methods for ameliorating the quality of overlying water, such as aeration, will normally suffice and be preferable. | Food | 31. | It is necessary to feed the larvae, preferably daily or at least three times per week. Fish-food (a suspension in water or finely ground food, e.g. TetraMin or TetraPhyll; see details in Appendix 2) in the amount of 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg for C. yoshimatui) per larvae per day seems adequate for young larvae for the first 10 days. Slightly more food may be necessary for older larvae: 0,5-1 mg per larvae per day should be sufficient for the rest of the test. The food ration should be reduced in all treatments and control if fungal growth is seen or if mortality is observed in controls. If fungal development cannot be stopped the test is to be repeated. When testing strongly adsorbing substances (e.g. with log Kow > 5), or substances covalently binding to sediment, the amount of food necessary to ensure survival and natural growth of the organisms may be added to the formulated sediment before the stabilisation period. For this, plant material must be used instead of fish food, e.g. addition of 0,5 % (dry weight) finely ground leaves of e.g. stinging nettle (Urtica dioica), mulberry (Morus alba), white clover (Trifolium repens), spinach (Spinacia oleracea) or of other plant material (Cerophyl or alpha-cellulose) may be used. | Incubation conditions | 32. | Gentle aeration of the overlying water in test vessels is supplied preferably 24 hours after addition of the larvae and is pursued throughout the test (care should be taken that dissolved oxygen concentration does not fall below 60 %of ASV). Aeration is provided through a glass Pasteur pipette fixed 2-3 cm above the sediment layer (i.e. one or few bubbles/sec). When testing volatile chemicals, consideration may be given not to aerate the sediment-water system. | 33. | The test is conducted at a constant temperature of 20 °C (± 2 °C). For C. tentans and C. yoshimatui, recommended temperatures are of 23 °C and 25 °C (± 2 °C), respectively. A 16 hours photoperiod is used and the light intensity should be 500 to 1 000 lux. | Exposure duration | 34. | The exposure commences with the addition of larvae to the spiked and control vessels. The maximum exposure duration is 28 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and 65 days for C. tentans. If midges emerge earlier, the test can be terminated after a minimum of five days after emergence of the last adult in the control. | OBSERVATIONS | Emergence | 35. | The development time and the total number of fully emerged male and female midges are determined. Males are easily identified by their plumose antennae. | 36. | The test vessels should be observed at least three times per week to make visual assessment of any abnormal behaviour (e.g. leaving sediment, unusual swimming), compared with the control. During the period of expected emergence a daily count of emerged midges is necessary. The sex and number of fully emerged midges are recorded daily. After identification the midges are removed from the vessels. Any egg masses deposited prior to the termination of the test should be recorded and then removed to prevent re-introduction of larvae into the sediment. The number of visible pupae that have failed to emerge is also recorded. Guidance on measurement of emergence is provided in Appendix 5. | Growth and survival | 37. | If data on 10-day larval survival and growth are to be provided, additional test vessels should be included at the start, so that they may be used subsequently. The sediment from these additional vessels is sieved using a 250 μm sieve to retain the larvae. Criteria for death are immobility or lack of reaction to a mechanical stimulus. Larvae not recovered should also be counted as dead (larvae which have died at beginning of the test may have been degraded by microbes). The (ash free) dry weight of the surviving larvae per test vessel is determined and the mean individual dry weight per vessel calculated. It is useful to determine which instar the surviving larvae belong to; for that measurement of the width of the head capsule of each individual can be used. | Analytical measurements | Concentration of the test substance | 38. | As a minimum, samples of the overlying water, the pore water and the sediment must be analysed at the start (preferably one hour after application of test substance) and at the end of the test, at the highest concentration and a lower one. These determinations of test substance concentration inform on the behaviour/partitioning of the test substance in the water-sediment system. Sampling of sediment at the start of the test may influence the test system (e.g. removing test larvae), thus additional test vessels should be used to perform analytical determinations at the start and during the test if appropriate (see paragraph 39). Measurements in sediment might not be necessary if the partitioning of the test substance between water and sediment has been clearly determined in a water/sediment study under comparable conditions (e.g. sediment to water ratio, type of application, organic carbon content of sediment). | 39. | When intermediate measurements are made (e.g. at day 7) and if the analysis needs large samples which cannot be taken from test vessels without influencing the test system, analytical determinations should be performed on samples from additional test vessels treated in the same way (including the presence of test organisms) but not used for biological observations. | 40. | Centrifugation at e.g. 10 000 g and 4 °C for 30 min. is the recommended procedure to isolate interstitial water. However, if the test substance is demonstrated not to adsorb to filters, filtration may also be acceptable. In some cases it might not be possible to analyse concentrations in the pore water as the sample size is too small. | Physical-chemical parameters | 41. | The pH, dissolved oxygen in the test water and temperature of the test vessels should be measured in an appropriate manner (see paragraph 10). Hardness and ammonia should be measured in the controls and one test vessel at the highest concentration at the start and the end of the test. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 42. | The purpose of this test is to determine the effect of the test substance on the development rate and the total number of fully emerged male and female midges, or in the case of the 10-day test effects on survival and weight of the larvae. If there are no indications of statistically different sensitivities of sexes, male and female results may be pooled for statistical analyses. The sensitivity differences between sexes can be statistically judged by e.g. a χ2-r × 2 table test. Larval survival and mean individual dry weight per vessel must be determined after 10 days where required. | 43. | Effect concentrations expressed as concentrations in the overlaying water, are calculated preferably based on measured concentrations at the beginning of the test (see paragraph 38). | 44. | To compute a point estimate for the EC50 or any other ECx, the per-vessel statistics may be used as true replicates. In calculating a confidence interval for any ECx the variability among vessels should be taken into account, or it should be shown that this variability is so small that it can be ignored. When the model is fitted by Least Squares, a transformation should be applied to the per-vessel statistics in order to improve the homogeneity of variance. However, ECx values should be calculated after the response is transformed back to the original value. | 45. | When the statistical analysis aims at determining the NOEC/LOEC by hypothesis testing, the variability among vessels needs to be taken into account, e.g. by a nested ANOVA. Alternatively, more robust tests (21) can be appropriate in situations where there are violations of the usual ANOVA assumptions. | Emergence ratio | 46. | Emergence ratios are quantal data, and can be analyzed by the Cochran-Armitage test applied in step-down manner where a monotonic dose-response is expected and these data are consistent with this expectation. If not, a Fisher’s exact or Mantel-Haenszal test with Bonferroni-Holm adjusted p-values can be used. If there is evidence of greater variability between replicates within the same concentration than a binomial distribution would indicate (often referenced as “extra-binomial” variation), then a robust Cochran-Armitage or Fisher exact test such as proposed in (21), should be used. | 47. | The sum of midges emerged per vessel, ne, is determined and divided by the number of larvae introduced, na: | where: | ER | = | emergence ratio | ne | = | number of midges emerged per vessel | na | = | number of larvae introduced per vessel | 48. | An alternative that is most appropriate for large sample sizes, when there is extra binomial variance, is to treat the emergence ratio as a continuous response and use procedures such as William’s test when a monotonic dose-response is expected and is consistent with these ER data. Dunnett’s test would be appropriate where monotonicity does not hold. A large sample size is defined here as the number emerged and the number not emerging both exceeding five, on a per replicate (vessel) basis. | 49. | To apply ANOVA methods values of ER should first be transformed by the arcsin square roottransformation or Freeman-Tukey transformation to obtain an approximate normal distribution and to equalise variances. The Cochran-Armitage, Fisher’s exact (Bonferroni), or Mantel-Haenszel tests can be applied when using the absolute frequencies. The arcsin square root transformation is applied by taking the inverse sine (sine–1) of the square root of ER. | 50. | For emergence ratios, ECx-values are calculated using regression analysis (or e.g. probit (22), logit, Weibull, appropriate commercial software etc.). If regression analysis fails (e.g. when there are less than two partial responses), other non-parametric methods such as moving average or simple interpolation are used. | Development rate | 51. | The mean development time represents the mean time span between the introduction of larvae (day 0 of the test) and the emergence of the experimental cohort of midges. (For the calculation of the true development time, the age of larvae at the time of introduction should be considered). The development rate is the reciprocal of the development time (unit: 1/day) and represents that portion of larval development which takes place per day. The development rate is preferred for the evaluation of these sediment toxicity studies as its variance is lower, and it is more homogeneous and closer to normal distribution as compared to development time. Hence, powerful parametric test procedures may be used with development rate rather than with development time. For development rate as a continuous response, ECx-values can be estimated by using regression analysis (e.g. (23)(24)). | 52. | For the following statistical tests, the number of midges observed on inspection day x are assumed to be emerged at the mean of the time interval between day x and day x – l (l = length of the inspection interval, usually 1 day). The mean development rate per vessel (x) is calculated according to: | where: | : | mean development rate per vessel | i | : | index of inspection interval | m | : | maximum number of inspection intervals | : | number of midges emerged in the inspection interval i | ne | : | total number of midges emerged at the end of experiment (= | ) | xi | : | development rate of the midges emerged in interval i | where: | dayi | : | inspection day (days since application) | li | : | length of inspection interval i (days, usually 1 day) | Test report | 53. | The test report must at least provide the following information: | | Test substance: | — | physical nature and, where relevant, physical-chemical properties (water solubility, vapour pressure, partition coefficient in soil (or in sediment if available), stability in water, etc.); | — | chemical identification data (common name, chemical name, structural formula, CAS number, etc.) including purity and analytical method for quantification of test substance. | | Test species: | — | test animals used: species, scientific name, source of organisms and breeding conditions; | — | information on handling of egg masses and larvae; | — | age of test animals when inserted into test vessels. | | Test conditions: | — | sediment used, i.e. natural or formulated sediment; | — | for natural sediment, location and description of sediment sampling site, including, if possible, contamination history; characteristics: pH, organic carbon content, C/N ratio and granulometry (if appropriate). | — | preparation of the formulated sediment: ingredients and characteristics (organic carbon content, pH, moisture, etc. at the start of the test); | — | preparation of the test water (if reconstituted water is used) and characteristics (oxygen concentration, pH, conductivity, hardness, etc. at the start of the test); | — | depth of sediment and overlying water; | — | volume of overlying and pore water; weight of wet sediment with and without pore water; | — | test vessels (material and size); | — | method of preparation of stock solutions and test concentrations; | — | application of test substance: test concentrations used, number of replicates and use of solvent if any; | — | incubation conditions: temperature, light cycle and intensity, aeration (frequency and intensity); | — | detailed information on feeding including type of food, preparation, amount and feeding regime. | | Results: | — | the nominal test concentrations, the measured test concentrations and the results of all analyses to determine the concentration of the test substance in the test vessel; | — | water quality within the test vessels, i.e. pH, temperature, dissolved oxygen, hardness and ammonia; | — | replacement of evaporated test water, if any; | — | number of emerged male and female midges per vessel and per day; | — | number of larvae which failed to emerge as midges per vessel; | — | mean individual dry weight of larvae per vessel, and per instar, if appropriate; | — | percent emergence per replicate and test concentration (male and female midges pooled); | — | mean development rate of fully emerged midges per replicate and treatment rate (male and female midges pooled); | — | estimates of toxic endpoints e.g. ECx (and associated confidence intervals), NOEC and/or LOEC, and the statistical methods used for their determination; | — | discussion of the results, including any influence on the outcome of the test resulting from deviations from this Test Method. | LITERATURE: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. | (10) | Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. | (11) | Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. | (12) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms, | (15) | Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. | (16) | Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. | (17) | Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. | (18) | Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. | (19) | Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. | (20) | Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. | (21) | Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. | (22) | Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. | (23) | Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. | (24) | Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. | Appendix 1 | DEFINITIONS | For the purpose of this method the following definitions are used: | Formulated sediment or reconstituted, artificial or synthetic sediment, is a mixture of materials used to mimic the physical components of a natural sediment. | Overlying water is the water placed over sediment in the test vessel. | Interstitial water or pore water is the water occupying space between sediment and soil particles. | Spiked water is the test water to which test substance has been added. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Recommendations for culture of Chironomus riparius | 1. | Chironomus larvae may be reared in crystallising dishes or larger containers. Fine quartz sand is spread in a thin layer of about 5 to 10 mm deep over the bottom of the container. Kieselguhr (e.g. Merck, Art 8117) has also been shown to be a suitable substrate (a thinner layer of up to a very few mm is sufficient). Suitable water is then added to a depth of several cm. Water levels should be topped up as necessary to replace evaporative loss, and prevent desiccation. Water can be replaced if necessary. Gentle aeration should be provided. The larval rearing vessels should be held in a suitable cage which will prevent escape of the emerging adults. The cage should be sufficiently large to allow swarming of emerged adults, otherwise copulation may not occur (minimum is ca. 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Cages should be held at room temperature or in a constant environment room at 20 ± 2 °C with a photo period of 16 hour light (intensity ca. 1 000 lux), 8 hours dark. It has been reported that air humidity of less than 60 % RH can impede reproduction. | Dilution water | 3. | Any suitable natural or synthetic water may be used. Well water, dechlorinated tap water and artificial media (e.g. Elendt “M4” or “M7” medium, see below) are commonly used. The water has to be aerated before use. If necessary, the culture water may be renewed by pouring or siphoning the used water from culture vessels carefully without destroying the tubes of larvae. | Feeding larvae | 4. | Chironomus larvae should be fed with a fish flake food (TetraMin®, TetraPhyll® or other similar brand of proprietary fish food), at approximately 250 mg per vessel per day. This can be given as a dry ground powder or as a suspension in water: 1,0 g of flake food is added to 20 ml of dilution water and blended to give a homogenous mix. This preparation may be fed at a rate of about 5 ml per vessel per day (shake before use.) Older larvae may receive more. | 5. | Feeding is adjusted according to the water quality. If the culture medium becomes “cloudy”, the feeding should be reduced. Food additions must be carefully monitored. Too little food will cause emigration of the larvae towards the water column, and too much food will cause increased microbial activity and reduced oxygen concentrations. Both conditions can result in reduced growth rates. | 6. | Some green algae (e.g. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) cells may also be added when new culture vessels are set up. | Feeding emerged adults | 7. | Some experimenters have suggested that a cotton wool pad soaked in a saturated sucrose solution may serve as a food for emerged adults. | Emergence | 8. | At 20 ± 2 °C adults will begin to emerge from the larval rearing vessels after approximately 13-15 days. Males are easily distinguished by having plumose antennae. | Egg masses | 9. | Once adults are present within the breeding cage, all larval rearing vessels should be checked three times weekly for deposition of the gelatinous egg masses. If present, the egg masses should be carefully removed. They should be transferred to a small dish containing a sample of the breeding water. Egg masses are used to start a new culture vessel (e.g. 2-4 egg masses/vessel) or are used for toxicity tests. | 10. | First instar larvae should hatch after 2-3 days. | Set-up of new culture vessels | 11. | Once cultures are established it should be possible to set up a fresh larval culture vessel weekly or less frequently depending on testing requirements, removing the older vessels after adult midges have emerged. Using this system a regular supply of adults will be produced with a minimum of management. | Preparation of test solutions “M4” and “M7” | 12. | Elendt (1990) has described the “M4” medium. The “M7” medium is prepared as the “M4” medium except for the substances indicated in Table 1, for which concentrations are four times lower in “M7” than in “M4”. A publication on the “M7” medium is in preparation (Elendt, personal communication). The test solution should not be prepared according to Elendt and Bias (1990) for the concentrations of NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 and K2HPO4 given for the preparation of the stock solutions are not adequate. | Preparation of the “M7”-medium | 13. | Each stock solution (I) is prepared individually and a combined stock solution (II) is prepared from these stock solutions (I) (see Table 1). 50 ml from the combined stock Solution (II) and the amounts of each macro nutrient stock solution which are given in Table 2 are made up to 1 l of deionised water to prepare the “M7” medium. A vitamin stock solution is prepared by adding three vitamins to deionised water as indicated in Table 3, and 0,1 ml of the combined vitamin stock solution are added to the final “M7” medium shortly before use. (The vitamin stock solution is stored frozen in small aliquots). The medium is aerated and stabilised. | Table 1 | Stock solutions of trace elements for medium M4 and M7 | Stock solutions (I) | Amount (mg) made up to 1 litre of deionised water | To prepare the combined stock solution (II): mix the following amounts (ml) of stock solutions (I) and make up to 1 litre of deionised water | Final concentrations in test solutions (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (10) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (10) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (10) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (10) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (10) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (10) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (10) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (10) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (10) (11) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (10) (11) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Table 2 | Macro nutrient stock solutions for medium M4 and M7 | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of macro nutrient stock solutions added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Table 3 | Vitamin stock solution for medium M4 and M7 | All three vitamin solutions are combined to make a single vitamin stock solution. | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of vitamin stock solution added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | Thiamine hydrochloride | 750 | 0,1 | 0,075 | Cyanocobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotine | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | LITERATURE: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. | Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. | Appendix 3 | PREPARATION OF FORMULATED SEDIMENT | Sediment composition | The composition of the formulated sediment should be as follows: | Constituent | Characteristics | % of sediment | dry weight | Peat | Sphagnum moss peat, as close to pH 5,5-6,0 as possible, no visible plant remains, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and air dried | 4-5 | Quartz sand | Grain size: > 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm | 75-76 | Kaolinite clay | Kaolinite content ≥ 30 % | 20 | Organic carbon | Adjusted by addition of peat and sand | 2 (± 0,5) | Calcium carbonate | CaCO3, pulverised, chemically pure | 0,05-0,1 | Water | Conductivity ≤ 10 μS/cm | 30-50 | Preparation | The peat is air dried and ground to a fine powder. A suspension of the required amount of peat powder in deionised water is prepared using a high-performance homogenising device. The pH of this suspension is adjusted to 5,5 ± 0,5 with CaCO3. The suspension is conditioned for at least two days with gentle stirring at 20 ± 2 °C, to stabilise pH and establish a stable microbial component. pH is measured again and should be 6,0 ± 0,5. Then the peat suspension is mixed with the other constituents (sand and kaolin clay) and deionised water to obtain a homogeneous sediment with a water content in a range of 30-50 per cent of dry weight of the sediment. The pH of the final mixture is measured once again and is adjusted to 6,5 to 7,5 with CaCO3 if necessary. Samples of the sediment are taken to determine the dry weight and the organic carbon content. Then, before it is used in the chironomid toxicity test, it is recommended that the formulated sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. | Storage | The dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored in a dry and cool place at room temperature. The formulated (wet) sediment should not be stored prior to its use in the test. It should be used immediately after the 7 days conditioning period that ends its preparation. | LITERATURE: | Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms | Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R and Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. | Appendix 4 | Chemical Characteristics of Acceptable Dilution Water | Substance | Concentrations | Particulate matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2 mg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Hardness as CaCO3 | < 400 mg/l (*4) | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorus pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | Appendix 5 | Guidance for monitoring emergence of chironomid larvae | Emergence traps are placed on the test beakers. These traps are needed from day 20 to the end of the test. Example of trap used is drawn below: | C.29. READY BIODEGRADABILITY — CO2 IN SEALED VESSELS (HEADSPACE TEST) | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 310 (2006). This Test Method is a screening method for the evaluation of ready biodegradability of chemicals and provides similar information to the six test methods described in chapter C.4 of this Annex A to F. Therefore, a chemical that shows positive results in this Test Method can be considered readily biodegradable and consequently rapidly degradable in the environment. | 2. | The well established carbon dioxide (CO2) method (1), based on Sturm’s original test (2) for assessing biodegradability of organic chemicals, by the measurement of the carbon dioxide produced by microbial action, has normally been the first choice for testing poorly soluble chemicals and those which strongly adsorb. It is also chosen for soluble (but not volatile) chemicals, since the evolution of carbon dioxide is considered by many to be the only unequivocal proof of microbial activity. Removal of dissolved organic carbon can be effected by physico-chemical processes — adsorption, volatilisation, precipitation, hydrolysis — as well as by microbial action and many non-biological reactions consume oxygen; rarely is CO2 produced from organic chemicals abiotically. In the original and modified Sturm test (1)(2) CO2 is removed from the liquid phase to the absorbing vessels by sparging (i.e. bubbling air treated to remove CO2 through the liquid medium), while in the version of Larson (3)(4) CO2 is transferred from the reaction vessel to the absorbers by passing CO2-free air through the headspace and, additionally, by shaking the test vessel continuously. Only in the Larson modification is the reaction vessel shaken; stirring is specified only for insoluble substances in ISO 9439 (5) and in the original US version (6), both of which specify sparging rather than headspace replacement. In another official US EPA method (7) based on Gledhill’s method (8), the shaken reaction vessel is closed to the atmosphere and CO2 produced is collected in an internal alkaline trap directly from the gaseous phase, as in classical Warburg/Barcroft respirometer flasks. | 3. | However, inorganic carbon (IC) has been shown to accumulate in the medium during the application of the standard, modified Sturm test to a number of chemicals (9). A concentration of IC as high as 8 mg/l was found during the degradation of 20 mg C/l of aniline. Thus, the collection of CO2 in the alkaline traps did not give a true reflection of the amount of CO2 produced microbiologically at intermediate times during the degradation. As a result, the specification that > 60 % theoretical maximum CO2 production (ThCO2) must be collected within a “10-d window” (the 10 days immediately following the attainment of 10 % biodegradation) for a test chemical to be classified as readily biodegraded will not be met for some chemicals which would be so classified using dissolved organic carbon (DOC) removal. | 4. | When the percentage degradation is a lower value than expected, IC is possibly accumulated in the test solution. Then, the degradability may be assessed with the other ready biodegradability tests. | 5. | Other drawbacks of the Sturm methodology (cumbersome, time-consuming, more prone to experimental error and not applicable to volatile chemicals) had earlier prompted a search for a sealed vessel technique, other than Gledhill’s, rather than gas flow-through (10)(11). Boatman et al (12) reviewed the earlier methods and adopted an enclosed headspace system in which the CO2 was released into the headspace at the end of incubation by acidifying the medium. CO2 was measured by gas chromatography (GC)/IC analysis in automatically taken samples of the headspace but dissolved inorganic carbon (DIC) in the liquid phase was not taken into account. Also, the vessels used were very small (20 ml) containing only 10 ml of medium, which caused problems e.g. when adding the necessarily very small amounts of insoluble test chemicals, and/or there may be insufficient or no microorganisms present in the inoculated medium that are competent to degrade the test chemicals. | 6. | These difficulties have been overcome by the independent studies of Struijs and Stoltenkamp (13) and of Birch and Fletcher (14), the latter being inspired by their experience with apparatus used in the anaerobic biodegradation test (15). In the former method (13) CO2 is measured in the headspace after acidification and equilibration, while in the latter (14) DIC in both the gaseous and liquid phases was measured, without treatment; over 90 % of the IC formed was present in the liquid phase. Both methods had advantages over the Sturm test in that the test system was more compact and manageable, volatile chemicals can be tested and the possibility of delay in measuring CO2 produced is avoided. | 7. | The two approaches were combined in the ISO Headspace CO2 Standard (16), which was ring-tested (17) and it is this Standard which forms the basis of the present Test Method. Similarly, the two approaches have been used in the US EPA method (18). Two methods of measuring CO2 have been recommended, namely CO2 in headspace after acidification (13) and IC in the liquid phase after the addition of excess alkali. The latter method was introduced by Peterson during the CONCAWE ring test (19) of this headspace method modified to measure inherent biodegradability. The changes made in the 1992 (20) revision of the methods in chapter C.4 of this Annex for Ready Biodegradability have been incorporated into this Test Method, so that the conditions (medium, duration etc.) are otherwise the same as those in the revised Sturm test (20). Birch and Fletcher (14) have shown that very similar results were obtained with this headspace test as were obtained with the same chemicals in the OECD Ring Test (21) of the revised Test Methods. | PRINCIPLE OF THE TEST | 8. | The test chemical, normally at 20 mg C/l, as the sole source of carbon and energy, is incubated in a buffer-mineral salts medium which has been inoculated with a mixed population of micro-organisms. The test is performed in sealed bottles with a headspace of air, which provides a reservoir of oxygen for aerobic biodegradation. The CO2 evolution resulting from the ultimate aerobic biodegradation of the test chemical is determined by measuring the IC produced in the test bottles in excess of that produced in blank vessels containing inoculated medium only. The extent of biodegradation is expressed as a percentage of the theoretical maximum IC production (ThIC), based on the quantity of test chemical (as organic carbon) added initially. | 9. | The DOC removal and/or the extent of primary biodegradation of the test chemical can also be measured (20). | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 10. | The organic carbon content (% w/w) of the test chemical needs to be known, either from its chemical structure or by measurement, so that the percentage degradation may be calculated. For volatile test chemicals, a measured or calculated Henry’s law constant is helpful for determining a suitable headspace to liquid volume ratio. Information on the toxicity of the test chemical to micro-organisms is useful in selecting an appropriate test concentration and for interpreting results showing poor biodegradability: it is recommended to include the inhibition control unless it is known that the test chemical is not inhibitory to microbial activities (see paragraph 24). | APPLICABILITY OF THE METHOD | 11. | The test is applicable to water-soluble and insoluble test chemicals, though good dispersion of the test chemical should be ensured. Using the recommended headspace to liquid volume ratio of 1:2, volatile chemicals with a Henry’s law constant of up to 50 Pa.m3.mol–1 can be tested as the proportion of test chemical in the headspace will not exceed 1 % (13). A smaller headspace volume may be used when testing chemicals, which are more volatile, but their bioavailability may be limiting especially if they are poorly soluble in water. However, users must ensure that the headspace to liquid volume ratio and the test chemical concentration are such that sufficient oxygen is available to allow complete aerobic biodegradation to occur (e.g. avoid using a high substrate concentration and a small headspace volume). Guidance on this matter can be found in (13)(23). | REFERENCE CHEMICALS | 12. | In order to check the test procedure, a reference chemical of known biodegradability should be tested in parallel. For this purpose, aniline, sodium benzoate or ethylene glycol may be used when testing water-soluble test chemicals and 1-octanol for poorly soluble test chemicals (13). Biodegradation of these chemicals must reach > 60 % ThIC within 14 days. | REPRODUCIBILITY | 13. | In the ISO ring test of the method (17), the following results were obtained using the recommended conditions, including 20 mg C test chemical/l. | Test Chemical | Mean Percentage Biodegradation | (28d) | Coefficient of variation | (%) | Number of Laboratories | Aniline | 90 | 16 | 17 | 1-Octanol | 85 | 12 | 14 | Within-test variability (replicability), using aniline, was low with coefficients of variability not greater than 5 % in nearly all test runs. In the two cases in which the replicability was worse, the greater variability was probably due to high IC production in the blanks. Replicability was worse with 1-octanol but was still less than 10 % for 79 % of test runs. This greater within-test variability may have been due to dosing errors, as a small volume (3 to 4 μl) of 1-octanol had to be injected into sealed test bottles. Higher coefficients of variation would result when lower concentrations of test chemical are used, especially at concentrations lower than 10 mg C/l. This could be partially overcome by reducing the concentration of total inorganic carbon (TIC) in the inoculum. | 14. | In an EU ring-test (24) of five surfactants added at 10 mg C/l, the following results were obtained: | Test Chemical | Mean Percentage biodegradation | (28d) | Coefficient of variation | (%) | Number of laboratories | Tetrapropylene | Benzene sulphonate | 17 | 45 | 10 | Di-iso-octylsulpho-Succinate | (anionic) | 72 | 22 | 9 | Hexadecyl-trimethyl (*5) | Ammonium chloride | (cationic) | 75 | 13 | 10 | Iso-Nonylphenol - (ethoxylate)9 | (non-ionic) | 41 | 32 | 10 | Coco-amide-propyl | Dimethylhydroxy | Sulphobetaine | (amphoteric) | 60 | 23 | 11 | The results show that generally, the variability was higher for the less well-degraded surfactants. Within-test variability was less than 15 % for over 90 % of cases, the highest reaching 30-40 %. | NOTE: | Most surfactants are not single molecular species but are mixtures of isomers, homologues, etc. which degrade after different characteristic lag periods and at different kinetic rates resulting in “blurred”, extenuated curves, so that the 60 % pass value may not be reached within “the 10-d window”, even though each individual molecular species would reach > 60 % within 10 days if tested alone. This may be observed with other complex mixtures as well. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | 15. | Normal laboratory apparatus and: | (a) | Glass serum bottles, sealed with butyl rubber stoppers and crimp-on aluminium seals. The recommended size is “125 ml” which have a total volume of around 160 ml (in this case the volume of each bottle should be known to be 160 ± 1 ml). A smaller size of vessel may be used when the results fulfil the conditions described in paragraph 66 and 67; | (b) | Carbon analyser or other instrument (e.g. gas chromatograph) for measuring inorganic carbon; | (c) | Syringes of high precision for gaseous and liquid samples; | (d) | Orbital shaker in a temperature-controlled environment; | (e) | A supply of CO2 free air — this can be prepared by passing air through soda lime granules or by using an 80 % N2/20 % 02 gas mixture (optional) (see paragraph 28); | (f) | Membrane-filtration device of 0,20–0,45 μm porosity (optional); | (g) | Organic carbon analyser (optional). | Reagents | 16. | Use analytical grade reagents throughout. | Water | 17. | Distilled or de-ionised water should be used containing ≤ 1 mg/l as total organic carbon. This represents ≤ 5 % of the initial organic carbon content introduced by the recommended dose of the test chemical. | Stock solutions for the mineral salts medium | 18. | The stock solutions and the mineral salts medium are similar to those in ISO 14593 (16) and C.4 “ready biodegradability” tests (20). The use of a higher concentration of ammonium chloride (2,0 g/l instead of 0,5 g/l) should only be necessary in very exceptional cases, e.g. when the test chemical concentration is > 40 mg C/l. Stock solutions should be stored under refrigeration and disposed of after six months, or earlier if there is evidence of precipitation or microbial growth. Prepare the following stock solutions: | (a) | Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 8,50 g | Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 21,75 g | Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g | Ammonium chloride (NH4Cl) 0,50 g | Dissolve in water and make up to 1 litre. The pH of this solution should be 7,4 (± 0,2). If this is not the case, then prepare a new solution. | (b) | Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) 36,40 g | Dissolve in water and make up to 1 litre. | (c) | Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H2O) 22,50 g | Dissolve in water and make up to 1 litre. | (d) | Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3.6H20) 0,25 g | Dissolve in water and make up to 1 litre and add one drop of concentrated HCl. | Preparation of mineral medium | 19. | Mix 10 ml of solution (a) with approximately 800 ml water (paragraph 17), then add 1 ml of solutions (b), (c) and (d) and make up to 1 litre with water (paragraph 17). | Other reagents | 20. | Concentrated ortho-phosphoric acid (H3PO4) (> 85 % mass per volume). | Sodium hydroxide solution 7M | 21. | Dissolve 280 g of sodium hydroxide (NaOH) in 1 litre of water (paragraph 17). Determine the concentration of DIC of this solution and consider this value when calculating the test result (see paragraphs 55 and 61), especially in the light of the validity criterion in paragraph 66 (b). Prepare a fresh solution if the concentration of DIC is too high. | Test chemical | 22. | Prepare a stock solution of a sufficiently water-soluble test chemical in water (paragraph 17) or in the test medium (paragraph 19) at a concentration preferably 100-fold greater than the final concentration to be used in the test; it may be necessary to adjust the pH of the stock solution. The stock solution should be added to the mineral medium to give a final organic carbon concentration of between 2 and 40 mg C/l, preferably 20 mg C/l. If concentrations lower than these are used, the precision obtained may be impaired. Soluble and insoluble liquid chemicals may be added to the vessels directly using high precision syringes. Poorly soluble and insoluble test chemicals may require special treatment (25). The choices are: | (a) | direct addition of known weighed amounts; | (b) | ultrasonic dispersion before addition; | (c) | dispersion with the aid of emulsifying agents to be required to establish whether they have any inhibitory or stimulatory effects on microbial activity before addition; | (d) | adsorption of liquid test chemicals, or a solution in a suitable volatile solvent, on to an inert medium or support (e.g. glass fibre filter), followed by evaporation of the solvent, if used, and direct addition of known amounts; | (e) | addition of known volume of a solution of the test chemical in an easily volatile solvent to an empty test vessel, followed by evaporation of the solvent. | Agents or solvents used in (c), (d) and (e) have to be tested for any stimulatory or inhibitory effect on microbial activity (see paragraph 42(b).) | Reference chemical | 23. | Prepare a stock solution of the (soluble) reference chemical in water (paragraph 17) at a concentration preferably 100-fold greater than the final concentration to be used (20 mg C/l) in the test. | Inhibition check | 24. | Test chemicals frequently show no significant degradation under the conditions used in ready biodegradation assessments. One possible cause is that the test chemical is inhibitory to the inoculum at the concentration at which it is applied in the test. An inhibition check may be included in the test design to facilitate identification (in retrospect) of inhibition as a possible cause or contributory factor. Alternatively, the inhibition check may rule out such interferences and show that zero or slight degradation is attributable solely to non-amenability to microbial attack under the conditions of the test. In order to obtain information on the toxicity of the test chemical to (aerobic) micro-organisms, prepare a solution in the test medium containing the test chemical and the reference chemical (paragraph 19), each at the same concentrations as added, respectively (see paragraph 22 and 23). | Inoculum | 25. | The inoculum may be derived from a variety of sources: activated sludge; sewage effluent (non-chlorinated); surface waters and soils; or from a mixture of these (20). The biodegradative activity of the source should be checked by using a reference chemical. Whatever the source, micro-organisms previously exposed to the test chemical should not be used if the procedure is to be used as a test for ready biodegradability. | Warning: | Activated sludge, sewage and sewage effluent contain pathogenic organisms and must be handled with caution. | 26. | Based on experience, the optimal volume for the inoculum is that which: | — | is sufficient to give adequate biodegradative activity; | — | degrades the reference chemical by the stipulated percentage (see paragraph 66); | — | gives 102 to 105 colony-forming units per millilitre in the final mixture; | — | normally gives a concentration of 4 mg/l suspended solids in the final mixture when activated sludge is used, concentrations up to 30 mg/l may be used but may significantly increase CO2 production of the blanks (26); | — | contributes less than 10 % of the initial concentration of organic carbon introduced by the test chemical; | — | is generally 1-10 ml of inoculum for 1 litre of test solution. | Activated sludge | 27. | Activated sludge is freshly collected from the aeration tank of a sewage treatment plant or laboratory-scale unit treating predominantly domestic sewage. If necessary, coarse particles should be removed by sieving (e.g. using a 1 mm2 mesh sieve) and the sludge should be kept aerobic until used. | 28. | Alternatively, after removal of any coarse particles, settle or centrifuge (e.g. 1 100 × g for 10 minutes). Discard the supernatant liquid. The sludge may be washed in the mineral solution. Suspend the concentrated sludge in mineral medium to yield a concentration of 3-5 g suspended solids/l. Thereafter aerate until required. | 29. | Sludge should be taken from a properly working conventional treatment plant. If sludge has to be taken from a high rate treatment plant, or is thought to contain inhibitors, it should be washed. Settle or centrifuge the re-suspended sludge after thorough mixing, discard the supernatant liquid and again suspend the washed sludge in a further volume of mineral medium. Repeat this procedure until the sludge is considered to be free from excess substrate or inhibitor. | 30. | After complete re-suspension is achieved, or with untreated sludge, withdraw a sample just before use for the determination of the dry weight of the suspended solids. | 31. | A further alternative is to homogenise activated sludge (3-5 g suspended solids/l). Treat the sludge in a Waring blender for 2 minutes at medium speed. Settle the blended sludge for 30 minutes or longer if required and decant liquid for use as inoculum at the rate of about 10 mg/l of mineral medium. | 32. | Still further reduction of the blank CO2 evolution can be achieved by aerating the sludge overnight with CO2-free air. Use 4 mg/l activated sludge solids as the concentration of the inoculum in this test (13). | Secondary sewage effluent | 33. | Alternatively, the inoculum can be derived from the secondary effluent of a treatment plant or laboratory-scale unit receiving predominantly domestic sewage. Maintain the sample under aerobic conditions and use on the day of collection, or pre-condition if necessary. The effluent should be filtered through a coarse filter to remove gross particulate matter and the pH value is measured. | 34. | To reduce its IC content, the filtrate is sparged with CO2-free air (paragraph 15-e) for 1 h while maintaining the pH at 6,5 using orthophosphoric acid (paragraph 20). The pH value is restored to its original value with sodium hydroxide (paragraph 21) and after settling for about 1 h a suitable volume of the supernatant is taken for inoculation. This sparging procedure reduces the IC content of the inoculum. For example, when the maximum recommended volume of filtered sparged effluent (100 ml) per litre was used as inoculum, the amount of IC present in blank control vessels was in the range 0,4 to 1,3 mg/l (14), representing 2-6,5 % of test chemical C at 20 mg C/l and 4-13 % at 10 mg C/l. | Surface waters | 35. | A sample is taken of an appropriate surface water. It should be kept under aerobic conditions and used on the day of collection. The sample should be concentrated, if necessary, by filtration or centrifugation. The volume of inoculum to be used in each test vessel should meet the criteria given in paragraph 26. | Soils | 36. | A sample is taken of an appropriate soil, collected to a depth of up to 20 cm below the soil surface. Stones, plant remains and invertebrates should be removed from the sample of soil before it is sieved through a 2 mm mesh (if the sample is too wet to sieve immediately, then partially air dry to facilitate sieving). It should be kept under aerobic conditions and used on the day of collection (If the sample is transported in a loosely-tied black polythene bag, it can be stored at 2 to 4 °C in the bag for up to one month). | Preconditioning of inoculum | 37. | Inoculum may be pre-conditioned to the experimental conditions, but not pre-adapted to the test chemical. Pre-conditioning can reduce the blank CO2 evolution. Pre-conditioning consists of aerating activated sludge after diluting in test medium to 30 mg/l with moist CO2-free air for up to 5-7 days at the test temperature. | TEST PROCEDURE | Number of bottles | 38. | The number of bottles (paragraph 15-a) needed for a test will depend on the frequency of analysis and the test duration. | 39. | It is recommended that triplicate bottles be analysed after a sufficient number of time intervals such that the 10-d window may be identified. Also at least five test bottles (paragraph 15-a) from sets (a), (b) and (c) (see paragraph 42) are analysed at the end of the test, to enable 95 % confidence intervals to be calculated for the mean percentage biodegradation value. | Inoculated medium | 40. | The inoculum is used at a concentration of 4 mg/l activated sludge dry solids. Prepare immediately before use sufficient inoculated medium by adding, for example, 2 ml suitably treated activated sludge (paragraphs 27 to 32) at 2 000 mg/l to 1 litre of mineral salts medium (paragraph 19). When secondary sewage effluent is to be used add up to 100 ml effluent (paragraph 33) to 900 ml mineral salts medium (paragraph 19) and dilute to 1 litre with medium. | Preparation of bottles | 41. | Aliquots of inoculated medium are dispensed into replicate bottles to give a headspace to liquid ratio of 1:2 (e.g. add 107 ml to 160 ml-capacity bottles). Other ratios may be used, but see the warning given in paragraph 11. When using either type of inoculum, care must be taken to ensure that the inoculated medium is adequately mixed to ensure that it is uniformly distributed to the test bottles. | 42. | Sets of bottles (paragraph 15a) are prepared to contain the following: | (a) | Test vessels (denoted FT) containing the test chemical; | (b) | Blank controls (denoted FB) containing only the test medium plus inoculum; any chemicals, solvents, agents or glass fibre filters used to introduce the test chemical into the test vessels must also be added; | (c) | Vessels (denoted FC) for checking the procedure containing the reference chemical; | (d) | If needed, vessels (denoted FI) for checking a possible inhibitory effect of the test chemical containing both the test chemical and reference chemical at the same concentrations (paragraph 24) as in bottles FT and FC, respectively; | (e) | Vessels (denoted FS) for checking a possible abiotic degradation as (a) plus 50 mg/l HgCl2 or sterilised by some other means (e.g. by autoclaving). | 43. | Water-soluble test chemicals and reference chemicals are added as aqueous stock solutions (paragraphs 22, 23 and 24) to give a concentration of 10 to 20 mg C/l. | 44. | Insoluble test chemicals and insoluble reference chemicals are added to bottles in a variety of ways (see paragraph 22a-e) according to the nature of the test chemical, either before or after addition of the inoculated medium, depending on the method of treatment of the test chemical. If one of the procedures given in paragraph 22a-e is used, then the blank bottles FB (paragraph 42b) should be treated in a similar fashion but excluding the test chemical or reference chemical. | 45. | Volatile test chemicals should be injected into sealed bottles (paragraph 47) using a micro syringe. The dose is calculated from the volume injected and the density of the test chemical. | 46. | Water should be added to vessels, where necessary, to give the same liquid volume in each vessel. It must be ensured that the headspace to liquid ratio (usually 1:2) and concentration of the test chemical are such that sufficient oxygen is available in the headspace to allow for complete biodegradation. | 47. | All bottles are then sealed for example, with butyl rubber septa and aluminium caps. Volatile tests chemicals should be added at this stage (paragraph 45). If the decrease in DOC concentration of the test solution is to be monitored and for time zero analyses to be performed for initial IC concentration (sterile controls, paragraph 42e) or other determinands, remove an appropriate sample from the test vessel. The test vessel and its contents are then discarded. | 48. | The sealed bottles are placed on a rotary shaker (paragraph 15d), with a shaking rate sufficient to keep the bottle contents well mixed and in suspension (e.g. 150 to 200 rpm), and incubated in the dark at 20 °C, to be kept within ± 1 °C. | Sampling | 49. | The pattern of sampling will depend on the lag period and kinetic rate of biodegradation of the test chemical. Bottles are sacrificed for analysis on the day of sampling, which should be at least weekly or more frequently (e.g. twice per week) if a complete degradation curve is required. The requisite number of replicate bottles is taken from the shaker, representing FT, FB and FC and, if used FI and FS (see paragraph 42). The test normally runs for 28d. If the biodegradation curve indicates that a plateau has been attained before 28d, the test may be concluded earlier than 28d. Take samples from the five bottles reserved for the 28th day of the test for analysis and use the results to calculate the confidence limits or coefficient of variation of percentage biodegradation. Bottles representing the checks for inhibition and for abiotic degradation need not be sampled as frequently as the other bottles; day 1 and day 28 would be sufficient. | Inorganic carbon (IC) analysis | 50. | CO2 production in the bottles is determined by measuring the increase in the concentration of inorganic carbon (IC) during incubation. There are two recommended methods available for measuring the amount of IC produced in the test, and these are described immediately below. Since the methods can give slightly different results only one should be used in a test run. | 51. | Method (a) is recommended if the medium is likely to contain remnants of, for example, a glass-filter paper and/or insoluble test chemical. This analysis can be performed using a gas chromatograph if a carbon analyser is not available. It is important that the bottles should be at or close to the test temperature when the headspace gas is analysed. Method (b) can be easier for laboratories using carbon analysers to measure IC. It is important that the sodium hydroxide solution (paragraph 21) used to convert CO2 to carbonate is either freshly prepared or its IC content is known, so that this can be taken into account when calculating the test results (see paragraph 66-b.) | Method (a): acidification to pH < 3 | 52. | Before each batch of analyses, the IC analyser is calibrated using an appropriate IC standard (e.g. 1 % w/w CO2 in N2). Concentrated orthophosphoric acid (paragraph 20) is injected through the septum of each bottle sampled to lower the pH of the medium to < 3 (e.g. add 1 ml to 107 ml test medium). The bottles are placed back on the shaker. After shaking for one hour at the test temperature the bottles are removed from the shaker, aliquots (e.g. 1 ml) of gas are withdrawn from the headspace of each bottle and injected into the IC analyser. The measured IC concentrations are recorded as mg C/l. | 53. | The principle of this method is that after acidification to pH < 3 and equilibration at 20 °C, the equilibrium constant for the distribution of CO2 between the liquid and gaseous phases in the test bottles is 1,0 when measured as a concentration (13). This should be demonstrated for the test system at least once as follows: | Set up bottles containing 5 and 10 mg/l as IC using a solution of anhydrous sodium carbonate (Na2 CO3) in CO2-free water prepared by acidifying water to pH 6,5 with concentrated ortho-phosphoric acid (paragraph 20), sparging overnight with CO2-free air and raising the pH to neutrality with alkali. Ensure that the ratio of the headspace volume to the liquid volume is the same as in the tests (e.g. 1:2). Acidify and equilibrate as described in paragraph 52, and measure the IC concentrations of both the headspace and liquid phases. Check that the two concentrations are the same within experimental error. If they are not, the operator should review the procedures. This check on the distribution of IC between liquid and gaseous phases need not be made every time the test is performed; it could presumably be made while performing the calibration. | 54. | If DOC removal is to be measured (water-soluble test chemicals only), samples should be taken of the liquid phase from separate (non-acidified) bottles, membrane-filtered and injected into the DOC analyser. These bottles can be used for other analyses as necessary, to measure primary biodegradation. | Method (b): conversion of CO2 to carbonate | 55. | Before each batch of analyses, the IC analyser is calibrated using an appropriate standard — for example, a solution of sodium bicarbonate (NaHCO3) in CO2 free water (see paragraph 53) in the range 0 to 20 mg/l as IC. Sodium hydroxide solution (7M, paragraph 21) (e.g. 1 ml to 107 ml medium) is injected through the septum of each bottle sampled and the bottles are shaken for 1 h at the test temperature. Use the same NaOH solution on all bottles sacrificed on a particular day, but not necessarily on all sampling occasions throughout a test. If absolute blank IC values are required at all sampling occasions, IC determinations of the NaOH solution will be required each time it is used. The bottles are removed from the shaker and allowed to settle. Suitable volumes (e.g. 50 to 1 000 μl) of the liquid phase in each vessel are withdrawn by syringe. The samples are injected into the IC analyser and the concentrations of IC are recorded. It should be ensured that the analyser used is equipped properly to deal with the alkaline samples produced in this method. | 56. | The principle of this method is that after the addition of alkali and shaking, the concentration of IC in the headspace is negligible. This should be checked for the test system at least once by using IC standards, adding alkali and equilibrating, and measuring the concentration of IC in both the headspace and liquid phases (see paragraph 53). The concentration in the headspace should approach zero. This check on the virtually complete absorption of CO2 need not be made every time the test is performed. | 57. | If DOC removal is to be measured (water-soluble test chemicals only), samples should be taken of the liquid phase from separate bottles (containing no added alkali), membrane filtered and injected into the DOC analyser. These bottles can be used for other analyses, as necessary, to measure primary biodegradability. | DATA AND REPORTING | Calculating of results | 58. | Assuming 100 % mineralisation of the test chemical to CO2, the ThIC in excess of that produced in the blank controls equals the TOC added to each test bottle at the start of the test, that is: | The total mass (mg) of inorganic carbon (TIC) in each bottle is: | Equation [1] | where: | VL | = | volume of liquid in the bottle (litre); | CL | = | concentration of IC in the liquid (mg/l as carbon); | VH | = | volume of the headspace (litre); | CH | = | concentration of IC in the headspace (mg/l as carbon). | The calculations of TIC for the two analytical methods used for measuring IC in this test are described below in paragraphs 60 and 61. Percentage biodegradation (% D) in each case is given by: | Equation [2] | where: | TICt | = | mg TIC in test bottle at time t; | TICb | = | mean mg TIC in blank bottles at time t; | TOC | = | mg TOC added initially to the test vessel. | The percentage biodegradation % D is calculated for the test (FT), reference (FC) and, if included inhibition monitoring control (FI) bottles from the respective amounts of TIC produced up to each sampling time. | 59. | If there has been a significant increase in the TIC content of the sterile controls (FS) over the test period, then it may be concluded that abiotic degradation of the test chemical has occurred and this must be taken into account in the calculation of D in Equation [2]. | Acidification to pH < 3 | 60. | Since acidification to pH < 3 and equilibration results in the equalisation of the concentration of TIC in the liquid and gaseous phases, only the concentration of IC in the gas phase needs to be measured. Thus, from Equation [1] , where VB = volume of the serum bottle. | Conversion of CO2 to carbonate | 61. | In this method calculations are performed as in Equation [1], but the negligible amount of IC in the gaseous phase is ignored, that is , and. | Expression of Results | 62. | A biodegradation curve is obtained by plotting percentage biodegradation, D, against time of incubation and if possible, the lag phase, biodegradation phase, 10-d window and plateau phase, that is the phase in which the maximal degradation has been reached and the biodegradation curve has levelled out, are indicated. If comparable results are obtained for parallel test vessels FT (< 20 % difference), a mean curve is plotted (see Appendix 2, Fig.1); if not, curves are plotted for each vessel. The mean value of the percentage biodegradation in the plateau phase is determined or the highest value is assessed (e.g. when the curve decreases in the plateau phase), but it is important to assess that in the latter case the value is not an outlier. Indicate this maximum level of biodegradation as “degree of biodegradation of the test chemical” in the test report. If the number of test vessels was insufficient to indicate a plateau phase, the measured data of the last day of the test are used to calculate a mean value. This last value, the mean of five replicates, serves to indicate the precision with which the percentage biodegradation was determined. Also report the value obtained at the end of the 10-d window. | 63. | In the same way, a curve for the reference chemical, FC, is plotted and, if included, for the abiotic elimination check, FS and the inhibition control, FI. | 64. | The amounts of TIC present in the blank controls (FB) are recorded as are those in flasks FS (abiotic check), if these vessels were included in the test. | 65. | Calculate D for the FI vessels, based on the theoretical IC yield anticipated from only the reference component of the mixture. If, at day 28, [(DFC (12) – DFI (13)/DFC] × 100 > 25 %, it may be assumed that the test chemical inhibited the activity of the inoculum, and this may account for low values of DFT obtained under the conditions of the test. In this case the test could be repeated using a lower test concentration and preferably reducing the DIC in the inoculum and TIC formed in the blank controls, since the lower concentration will otherwise reduce the precision of the method. Alternatively, another inoculum may be used. If in flask FS (abiotic) a significant increase (> 10 %) in the amount of TIC is observed, abiotic degradation processes may have occurred. | Validity of results | 66. | A test is considered valid if: | (a) | the mean percentage degradation in vessels FC containing the reference chemical is > 60 % by the 14th day of incubation; and | (b) | the mean amount of TIC present in the blank controls FB at the end of the test is > 3 mg C/l. | If these limits are not met, the test should be repeated with an inoculum from another source and/or the procedures used should be reviewed. For example, if high blank IC production is a problem the procedure given in paragraphs 27 to 32 should be followed. | 67. | If the test chemical does not reach 60 % ThIC and was shown not to be inhibitory (paragraph 65), the test could be repeated with increased concentration of inoculum (up to 30 mg/l activated sludge and 100 ml effluent/l) or inocula from other sources, especially if degradation had been in the range 20 to 60 %. | Interpretation of results | 68. | Biodegradation > 60 % ThIC within the 10-d window in this test demonstrates that the test chemical is readily biodegradable under aerobic conditions. | 69. | If the pass value of 60 % ThIC is not attained, determine the pH value in media in bottles which have not been made acid or alkaline; a value of less than 6,5 could indicate that nitrification had occurred. In such a case repeat the test with a buffer solution of higher concentration. | Test Report | 70. | Compile a table of % D for each test (FT), reference (FC) and, if included, inhibition control bottle (FI) for each day sampled. If comparable results are obtained for replicate bottles, plot a curve of mean % D against time. Record the amount of TIC in the blanks (FB) and in the sterile controls (FS) DOC and/or other determinands, and their percentage removal. | 71. | Determine the mean value of % D in the plateau phase, or use the highest value if the biodegradation curve decreases in the plateau phase, and report this as the “degree of biodegradation of the test chemical”. It is important to ensure that in the latter case the highest value is not an outlier. | 72. | The test report must include the following information: | | Test chemical: | — | common name, chemical name, CAS number, structural formula and relevant physical-chemical properties; | — | purity (impurities) of test chemical. | | Test conditions: | — | reference to this Test Method; | — | description of the test system used (e.g. volume of the vessel, head space to liquid ratio, method of stirring, etc.); | — | application of test chemical and reference chemical to test system: test concentration used and amount of carbon dosed into each test bottle, any use of solvents; | — | details of the inoculum used, any pre-treatment and pre-conditioning; | — | incubation temperature; | — | validation of the principle of IC analysis; | — | main characteristics of the IC analyser employed (and any other analytical methods used); | — | number of replicates. | | Results: | — | raw data and calculated values of biodegradability in tabular form; | — | the graph of percentage degradation against time for the test and reference chemicals, the lag phase, degradation phase, 10-d window and slope; | — | percentage removal at plateau, at end of test, and after 10-d window; | — | reasons for any rejection of the test results; | — | any other facts that are relevant to the procedure followed; | — | discussion of results. | LITERATURE: | (1) | Chapter C.4 of this Annex Determination of “Ready” Biodegradability — CO2 Evolution Test (Method C.4-C). | (2) | Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167. | (3) | Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161. | (4) | Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210. | (5) | ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution Test (Sturm). | (6) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835.3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (7) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (8) | Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929. | (9) | Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812. | (10) | Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185. | (11) | Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53. | (12) | Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243. | (13) | Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211. | (14) | Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524. | (15) | Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550. | (16) | ISO 14593, (1999) Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (CO2 headspace test). | (17) | Battersby NS (1997). The ISO headspace CO2 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822. | (18) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC. | (19) | Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An “inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235. | (20) | Chapter C.4 of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability. | (21) | OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris. | (22) | Chapter C.11 of this Annex, Activated sludge respiration inhibition test. | (23) | Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327. | (24) | EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK. | (25) | ISO 10634 (1996) Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. | Appendix 1 | ABBREVIATIONS AND DEFINITIONS | IC: Inorganic carbon | ThCO2 : Theoretical carbon dioxide (mg) is the quantity of carbon dioxide calculated to be produced from the known or measured carbon content of the test chemical when fully mineralised; also expressed as mg carbon dioxide evolved per mg test chemical. | DOC: Dissolved organic carbon is the organic carbon present in solution or that which passes through a 0,45 micrometre filter or remains in the supernatant after centrifuging at approx. 4 000 g (about 40 000 m sec-2) for 15 min. | DIC: Dissolved inorganic carbon | ThIC: Theoretical inorganic carbon | TIC: Total inorganic carbon | Readily biodegradable: An arbitrary classification of chemicals which have passed certain specified screening tests for ultimate biodegradability; these tests are so stringent that it is assumed that such chemicals will rapidly and completely biodegrade in aquatic environments under aerobic conditions. | 10-d window: The 10 days immediately following the attainment of 10 % biodegradation. | Inherent biodegradability: A classification of chemicals for which there is unequivocal evidence of biodegradation (primary or ultimate) in any test of biodegradability. | Ultimate aerobic biodegradation: The level of degradation achieved when the test chemical is totally utilised by micro-organisms resulting in the production of carbon dioxide, water, mineral salts and new microbial cellular constituents (biomass). | Mineralisation: Mineralisation is the complete degradation of an organic chemical to CO2 and H2O under aerobic conditions, and CH4, CO2 and H2O under anaerobic conditions. | Lag phase: The time from the start of a test until acclimatization and/or adaptation of the degrading microorganisms is achieved and the biodegradation degree of a test chemical or organic matter has increased to a detectable level (e.g. 10 % of the maximum theoretical biodegradation, or lower, dependent on the accuracy of the measuring technique). | Degradation phase: The time from the end of the lag period to the time when 90 % of the maximum level of degradation has been reached. | Plateau phase: Plateau phase is the phase in which the maximal degradation has been reached and the biodegradation curve has levelled out. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Example of a biodegradation curve | Figure 1 | Biodegradation of 1-octanol in the CO2 headspace test | Glossary | Biodegradation: | Degradation phase: | Maximum level of biodegradation: | Plateau phase: | 10-d(ay) window: | Test time (days): | C. 30. BIOACCUMULATION IN TERRESTRIAL OLIGOCHAETES | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 317 (2010). Among the Test Methods relating to environmental fate, the Bioconcentration: Flow-through Fish Test (chapter C.13 of this Annex (49)) and the Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochaetes (53) were published in 1996 and 2008 respectively. The extrapolation of aquatic bioaccumulation data to terrestrial organisms like earthworms is difficult, if possible at all. Model calculations based on a test chemical’s lipophilicity, e.g. (14) (37), are currently used for the assessment of bioaccumulation of chemicals in soil, as e.g. in the EU Technical Guidance Document (19). The need for a compartment-specific test method has already been addressed, e.g. (55). Such a method is especially important for the evaluation of secondary poisoning in terrestrial food chains (4). Several national test methods address the issue of bioaccumulation in organisms other than fish e.g. (2) and (72). A method on the measurement of bioaccumulation from contaminated soils in earthworms (Eisenia fetida, Savigny) and potworms has been developed by the American Society for Testing and Materials (3). An internationally accepted method for the determination of bioaccumulation in spiked soil will improve the risk assessment of chemicals in terrestrial ecosystems e.g. (25) (29). | 2. | Soil-ingesting invertebrates are exposed to soil bound chemicals. Among these animals, terrestrial oligochaetes play an important role in the structure and function of soils (15) (20). Terrestrial oligochaetes live in soil and partly at the soil surface (especially the litter layer); they frequently represent the most abundant species in terms of biomass (54). By bioturbation of the soil and by serving as prey these animals can have a strong influence on the bioavailability of chemicals to other organisms like invertebrates (e.g. predatory mites and beetles; e.g. (64)) or vertebrate (e.g. foxes and gulls) predators (18) (62). Some species of terrestrial oligochaetes currently used in ecotoxicological testing are described in Appendix 5. | 3. | The ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus (3) provides many essential and useful details for the performance of the present soil bioaccumulation Test Method. Further documents that are referred to in this Test Method are chapter C.13 of this Annex, Bioconcentration: Flow-through Fish Test (49) and OECD TG 315: Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates (53). Practical experience with soil bioaccumulation studies and publications from LITERATURE e.g. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79) are also major sources of information for this Test Method. | 4. | This Test Method is mostly applicable to stable, neutral organic chemicals, which tend to adsorb to soils. Testing for bioaccumulation of soil-associating, stable metallo-organic compounds may be possible with this Test Method. It is also applicable to metals and other trace elements. | PRE-REQUISITE | 5. | Tests for measuring the bioaccumulation of a chemical in terrestrial oligochaetes have been performed with heavy metals (see e.g. (63)) and persistent, organic chemicals having log Kow values between 3,0 and 6,0, e.g. (40). Such tests also apply to: | — | Chemicals that show a log Kow of more than 6,0 (super-hydrophobic chemicals); | — | Chemicals which belong to a class of organic chemicals known to have the potential to bioaccumulate in living organisms, e.g. surface active or highly adsorptive chemicals; | — | Chemicals that indicate the potential for bioaccumulation from structural features, e.g. analogues of chemicals with known bioaccumulation potential; and | — | Metals. | 6. | Information on the test chemical such as common name, chemical name (preferably IUPAC name), structural formula, CAS registry number, purity, safety precautions, proper storage conditions and analytical methods should be obtained before beginning the study. In addition, the following information should be known: | (a) | solubility in water; | (b) | octanol-water partition coefficient, Kow; | (c) | soil-water partition coefficient, expressed as Koc; | (d) | vapour pressure; | (e) | degradability (e.g. in soil, water); | (f) | known metabolites. | 7. | Radiolabelled or non-radiolabelled test chemicals can be used. However, to facilitate analysis it is recommended to use a radiolabelled test chemical. The decision will be made based on the detection limits or a requirement to measure parent test chemical and metabolites. If a radiolabelled test chemical is used and total radioactive residues are measured, it is important that the radiolabelled residues in both the soil and the test organisms are characterised for percentages of parent test chemical and labelled non-parent, e.g. in samples taken at steady state or at the end of the uptake phase, to allow a bioaccumulation factor (BAF) calculation for the parent test chemical and for the soil metabolites of concern (see paragraph 50). The method described here may have to be modified, e.g. to provide sufficient biomass, for measuring non-radiolabelled organic test chemical or metals. When total radioactive residues are measured (by liquid scintillation counting following extraction, combustion or tissue solubilisation), the bioaccumulation factor is based on the parent test chemical and metabolites. The BAF calculation should preferably be based on the concentration of the parent test chemical in the organisms and total radioactive residues. Subsequently, the biota-soil accumulation factor (BSAF), normalized to the lipid content of worm and organic carbon content (OC) of soil should be calculated from the BAF for reasons of comparability between results from different bioaccumulation tests. | 8. | Toxicity of the test chemical to the species used in the test should be known, e.g. an effect concentration (ECx) or lethal concentration (LCx) for the time of the uptake phase (e.g. (19)). The selected concentration of the test chemical should preferably be about 1 % of its acute asymptotic LC50, and at least 10-fold higher than its detection limit in soil by the analytical method used. If available, preference should be given to toxicity values derived from long-term studies on sublethal endpoints (51) (52). If such data are not available, an acute toxicity test will provide useful information (see e.g. (23)). | 9. | An appropriate analytical method of known accuracy, precision, and sensitivity for the quantification of the chemical in the test solutions, in the soil, and in the biological material should be available, together with details of sample preparation and storage as well as material safety data sheets. Analytical detection limits of the test item in soil and worm tissue should also be known. If a 14C-labelled test chemical is used, the specific radioactivity (i.e. Bq mol-1) and the percentage of radioactivity associated with impurities should be known. The specific radioactivity of the test chemical should be high enough to facilitate analysis, and the test concentrations used should not elicit toxic effects. | 10. | The test can be performed with an artificial soil or with natural soils. Information on characteristics of the natural soil used, e.g. origin of soil or its constituents, pH, organic carbon content, particle size distribution (percent sand, silt, and clay), and water holding capacity (WHC), should be known before the start of the test (3) (48). | PRINCIPLE OF THE TEST | 11. | The parameters which characterise the bioaccumulation of a test chemical include the bioaccumulation factor (BAF), the uptake rate constant (ks) and the elimination rate constant (ke). Definitions are provided in Appendix 1. | 12. | The test consists of two phases: the uptake (exposure) phase and the elimination (post-exposure) phase. During the uptake phase, replicated groups of worms are exposed to soil, which has been spiked with the test chemical. In addition to the test animals, groups of control worms are held under identical conditions without the test chemical. The dry weight and lipid content of the test organisms are measured. This can be done using worms of the control group. Analytical background values (blank) can be obtained by analysing samples of the control worms and soil. For the elimination phase, the worms are transferred to a soil free of the test chemical. An elimination phase is always required unless uptake of the test chemical during the exposure phase has been insignificant. An elimination phase provides information on the rate at which the test chemical is excreted by the test organisms (e.g. (27)). If a steady state has not been reached during the uptake phase, the determination of the kinetic parameters – kinetic bioaccumulation factor BAFk, uptake and elimination rate constant(s) – should preferably be based on simultaneous fitting of the results of the uptake and elimination phases. The concentration of the test chemical in/on the worms is monitored throughout both phases of the test. | 13. | During the uptake phase, measurements are made at sampling times up to 14 days (enchytraeids) or 21 days (earthworms) until the steady state is reached (11) (12) (67). The steady state occurs when a plot of the concentration in worms against time is parallel to the time axis, and three successive concentration analyses made on samples taken at intervals of at least two days do not vary more than ± 20 % of each other based on statistical comparisons (e.g. analysis of variance, regression analysis). | 14. | The elimination phase consists of transferring the test organisms to vessels containing the same substrate without the test chemical. During the elimination phase, measurements are made at sampling times during 14 days (enchytraeids) or 21 days (earthworms) unless earlier analytical determination showed 90 % reduction of the test chemical residues in worms. The concentration of the test chemical in the worms at the end of the elimination phase is reported as non-eliminated residues. The steady state bioaccumulation factor (BAFss) is calculated preferably both as the ratio of the concentration in worms (Ca) and in the soil (Cs) at apparent steady state, and as a kinetic bioaccumulation factor, BAFK, as the ratio of the rate constant of uptake from soil (ks) and the elimination rate constant (ke) (see Appendix 1 for definitions) assuming first-order kinetics (see Appendix 2 for calculations). If first-order kinetics is obviously not applicable, other models should be employed. | 15. | The uptake rate constant, the elimination rate constant (or constants, where other models are involved), the kinetic bioaccumulation factor (BAFK), and where possible, the confidence limits of each of these parameters are calculated from computerised model equations (see Appendix 2 for guidance). The goodness of fit of any model can be determined from e.g. the correlation coefficient or the coefficient of determination (coefficients close to one indicate a good fit) or chi-squared. Also the size of the standard error or confidence limit around the estimated parameters may be indicative of the goodness of fit of the model. | 16. | To reduce variability in test results for test chemicals with high lipophilicity, bioaccumulation factors should be expressed in relation to lipid content and organic carbon content (kg soil organic carbon (OC) kg-1 worm lipid content). This approach is based on the fact that for some chemical classes, there is a clear relationship between the potential for bioaccumulation and lipophilicity; this has been well established for fish (47). There is a relationship between the lipid content of fish and the bioaccumulation of such chemicals. For benthic organisms, similar correlations have been found e.g. (30) (44). Likewise for terrestrial oligochaetes this correlation has been demonstrated e.g. (5) (6) (7) (14). If sufficient worm tissue is available, the lipid content of the test animals can be determined on the same biological material as the one used to determine the concentration of the test chemical. Alternatively, control animals can be used to measure the lipid content. | VALIDITY OF THE TEST | 17. | For a test to be valid the following criteria should be fulfilled for both controls and treatments: | — | At the end of the test, the overall mortality during uptake and elimination phase should not exceed 10 % (earthworms) or 20 % (enchytraeids) of the total number of the introduced worms. | — | For Eisenia fetida and Eisenia andrei, the mean mass loss as measured at the end of the uptake and at the end of the elimination phase should not exceed 20 % compared to the initial fresh weight (f.w.) at start of each phase. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test species | 18. | Several species of terrestrial oligochaetes are recommended for bioaccumulation testing. The most commonly used species Eisenia fetida or Eisenia andrei (Lumbricidae), or Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, or Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae)) are described in Appendix 5. | Apparatus | 19. | Care should be taken to avoid the use of materials, for all parts of the equipment, which can dissolve, adsorb the test chemical or leach other chemicals, and have an adverse effect on the test animals. Standard rectangular or cylindrical vessels, made of chemically inert material and of suitable capacity can be used in compliance with the loading rate, i.e. the number of test worms. Stainless steel, plastic or glass may be used for any equipment having contact with the test media. The test vessels should be appropriately covered to prevent escaping of the worms, while allowing sufficient air supply. For chemicals with high adsorption coefficients, such as synthetic pyrethroids, silanised glass may be required. In these situations the equipment will have to be discarded after use (49). Radiolabelled test items and volatile chemicals should be prevented from escaping. Traps (e.g. glass gas washing bottles) should be employed containing suitable absorbents to retain any residues evaporating from the test vessels. | Soil | 20. | The test soil should be of a quality that will allow the survival and preferably the reproduction of the test organisms for the duration of the acclimation and test periods without them showing any abnormal appearance or behaviour. The worms should burrow in the soil. | 21. | The artificial soil described in the chapter C.8 of this Annex (48) is recommended for use as the substrate in the tests. Preparation of the artificial soil for use in the bioaccumulation tests and recommendations for the storage of artificial soil are given in Appendix 4. Air-dried artificial soil may be stored at room temperature until use. | 22. | However, natural soils from unpolluted sites may serve as test and/or culture soil. Natural soils should be characterised at least by origin (collection site), pH, organic carbon content, particle size distribution (percent sand, silt, and clay), maximum water holding capacity (WHCmax), and percent water content (3). Analysis of the soil or its constituents for micro-pollutants prior to use should provide useful information. If field soil from agricultural land is used, it should not have been treated with crop protection products or with manure from treated animals as fertilizers for at least one year and with organic fertilizers for at least six months prior to sampling (50). Manipulation procedures for natural soils prior to use in ecotoxicological tests with oligochaetes in the laboratory are described in (3). For natural soils the storage time in the laboratory should be kept as short as possible. | Application of the test chemical | 23. | The test chemical is incorporated into the soil. The physicochemical properties of the test chemical should be taken into consideration. A water-soluble test chemical should be completely dissolved in water before it be mixed with the soil. The recommended spiking procedure for poorly water-soluble test chemical involves coating of one or more of the (artificial) soil constituents with the test chemical. For example, the quartz sand, or a portion thereof, can be soaked with a solution of the test chemical in a suitable organic solvent, which is then slowly evaporated to dryness. The coated fraction can then be mixed into the wet soil. The major advantage of this procedure is that no solvent is introduced into the soil. When a natural soil is used, the test chemical may be added by spiking an air-dried portion of the soil as described above for the artificial soil, or by stirring the test chemical into the wet soil, with subsequent evaporating step if a solubilising agent is used. In general, the contact of wet soil with solvents should be avoided as far as possible. The following should be considered (3): | — | If a solvent other than water is used, it should be one that is water-miscible and/or can be driven off (for example, evaporated), leaving only the test chemical on the soil. | — | If a solvent control is used, there is no need for negative control. The solvent control should contain the highest concentration of solvent added to the soil and should use solvent from the same batch used to make the stock solution. Toxicity and volatility of the solvent, and solubility of the test chemical in the chosen solvent should be the main criteria used for the selection of a suitable solubilising agent. | 24. | For chemicals that are poorly soluble in water and in organic solvents, 2,0-2,5 g of finely ground quartz sand per test vessel can be mixed with the quantity of test chemical, e.g. using mortar and pestle, to obtain the desired test concentration. This mixture of quartz sand and test chemical is added to the pre-moistened soil and thoroughly mixed with an appropriate amount of de-ionised water to obtain the required moisture content. The final mixture is distributed to the test vessels. The procedure is repeated for each test concentration, and an appropriate control with 2,0-2,5 g of finely ground quartz sand per test vessel is also prepared. | 25. | The concentration of the test chemical in the soil should be determined after spiking. The homogenous distribution of the test chemical into the soil should be verified before introducing the test organisms. The method used for spiking, and the reasons for choosing a specific spiking procedure should be reported (24). | 26. | Equilibrium between the soil and the pore-water phase should ideally be established before adding the organisms; a time period of four days at 20 °C is recommended. For many poorly water-soluble organic chemicals the time required to reach a true equilibrium between adsorbed and dissolved fractions can be counted in days or months. Depending on the purpose of the study, for example when the environmental conditions are to be mimicked, the spiked soil may be “aged” for a longer period, e.g. for metals three weeks at 20 °C (22). | Culturing of the test organisms | 27. | Worms should be preferably kept in permanent laboratory culture. Guidance on laboratory culture methods for Eisenia fetida and Eisenia andrei, and Enchytraeid species, is provided in Appendix 5 (see also (48) (51) (52)). | 28. | The worms used in the tests should be free from observable diseases, abnormalities and parasites. | PERFORMANCE OF THE TEST | 29. | The test organisms are exposed to the test chemical during the uptake phase. The uptake phase should be of 14 days (enchytraeids) or 21 days (earthworms) unless it is demonstrated that steady state has been reached. | 30. | For the elimination phase, the worms are transferred to a soil free of test chemical. The first sample should be taken at 4-24 h after the start of elimination phase. Examples of sampling schedules for a 21-day uptake phase and a 21-day elimination phase are given in Appendix 3. | Test organisms | 31. | For many species of terrestrial enchytraeids the individual weight is very low (e.g. 5-10 mg wet weight per individual for Enchytraeus albidus and less for Enchytraeus crypticus or Enchytraeus luxuriosus); in order to perform the weight measurements and chemical analysis, it may be necessary to pool the worms of the replicate test vessels (i.e. all the worms of a replicate vessel will be used for obtaining one analytical tissue result). 20 individual enchytraeids are added to each replicate, and at least three replicates should be used. If the analytical detection limit of the test chemical is high, more worms may be necessary. For test species with higher individual weight (Eisenia fetida and Eisenia andrei), replicate vessels containing one individual can be used. | 32. | The earthworms used in a test should be of similar weight (e.g. Eisenia fetida and Eisenia andrei should have an individual weight of 250-600 mg). Enchytraeids (e.g. Enchytraeus albidus) should have a length of approximately 1 cm. All worms used in a particular test should come from the same source, and should be adult animals with clitellum (see Appendix 5). Since the weight and age of an animal might have an effect on the BAF-values (e.g. due to varying lipid content and/or presence of eggs), these parameters should be recorded accurately and taken into account in the interpretation of results. In addition, cocoons can be deposited during the exposure period, which will also have an impact on the BAF values. It is recommended that a sub-sample of the test worms be weighed before the test in order to estimate the mean wet and dry weights. | 33. | A high soil-to-worm ratio should be used in order to minimise the decrease of the test chemical concentration in the soil during the uptake phase. For Eisenia fetida and Eisenia andrei a minimum amount of 50 g dry weight (d.w.) of soil per worm, and for enchytraeids, a minimum of 10-20 g d.w. of soil per test vessel are recommended. The vessels should contain a soil layer of 2-3 cm (enchytraeids) or 4-5 cm (earthworms). | 34. | The worms used in a test are removed from the culture (e.g. enchytraeids by using jeweller’s tweezers). Adult animals are transferred to non-treated test soil for acclimation, and fed (see paragraph 36). If the test conditions differ from the culture conditions, an acclimation phase of 24-72 h should be sufficient to adapt the worms to the test conditions. After acclimation, earthworms are rinsed by transfer to glass dishes (e.g. petri dishes) containing clean water, and subsequently weighed before they are added to the test soil. Prior to weighing, excess water should be removed from the worms by gently touching them against the edge of the dish or by blotting them cautiously dry by using a slightly moistened paper towel. | 35. | Burrowing behaviour of the test organisms should be observed and recorded. In tests with earthworms, the animals (control and treatments) normally burrow in the soil within a period of a few hours; this should be checked no later than 24 h after addition of the worms to the test vessels. If the earthworms fail to burrow in the soil (e.g. more than 10 % over more than half of the uptake phase), this indicates that either the test conditions are not appropriate or the test organisms are not healthy. In such a case the test should be stopped and repeated. Enchytraeids mainly live in the interstitial pores of the soil, and frequently their integument may be only partly in contact with the surrounding substrate; exposure of burrowing and non-burrowing enchytraeids is assumed to be equivalent and non-burrowing of the enchytraeids does not necessarily require the repetition of the test. | Feeding | 36. | Feeding should be envisaged when a soil with low total organic carbon content is used. When an artificial soil is used, a weekly feeding rate (i.e. the worms should be fed once a week) of 7 mg of dried dung per g soil dry weight is recommended for earthworms, and a weekly rate of 2-2,5 mg of ground oat flakes per g soil dry weight is recommended for enchytraeids (11). The first food ration should be mixed with the soil immediately before the test organisms are added. Preferably the same type of food like in the cultures should be used (see Appendix 5). | Light and temperature | 37. | The tests should be carried out under a controlled 16/8 hours light/dark cycle, preferably 400 to 800 lx in the area of the test vessels (3). The test temperature should be 20 ± 2 °C throughout the test. | Test concentrations | 38. | A single concentration is used. Situations where additional concentration(s) is(are) required should be justified. If toxicity (ECx) of the test chemical is close to the analytical detection limit, the use of radiolabelled test chemical with high specific radioactivity is recommended. For metals, the concentration should be above the background level in tissue and soil. | Replicates | 39. | For the kinetic measurements (uptake and elimination phase), the minimum number of treated replicate vessels should be three per sampling point. The total number of replicates prepared should be sufficient to cover all sampling times during the uptake and the elimination phase. | 40. | For the biological observations and measurements (e.g. dry-to-wet weight ratio, lipid content) and for the analysis of background concentrations in worms and soil, at least 12 replicate vessels of a negative control (four sampled at start, four at end of uptake, and four at end of elimination) should be provided if no solvent other than water is used. If any solubilising agent is used for application of the test chemical, a solvent control (four replicate vessels should be sampled at start, four at the end of the uptake phase, and four at the end of the elimination phase) containing all constituents except for test item should be run in addition to the treated replicates. In this case, four additional replicate vessels of a negative control (no solvent) may also be provided for optional sampling at the end of the uptake phase. These replicates can be compared biologically with the solvent control in order to gain information on a possible influence of the solvent on the test organisms. It is recommended establishing a sufficient number of additional reserve replicate vessels (e.g. eight) for treatment and control(s). | Frequency of soil quality measurements | 41. | Soil pH, soil moisture content and the temperature (continuously) in the test room should be measured at the start and end of the uptake and elimination phases. Once per week the soil moisture content should be controlled by weighing the test vessels and comparing actual weights with initial weights at test start. Water losses should be compensated by adding deionised water. | Sampling and analysis of worms and soil | 42. | An example of schedule for the uptake and elimination phases in earthworm and enchytraeid bioaccumulation tests is given in Appendix 3. | 43. | The soil is sampled from the test vessels for the determination of test chemical concentration before inserting the worms, and during the uptake and elimination phases. During the test the concentrations of test chemical are determined in the worms and the soil. In general, total soil concentrations are measured. As an option, concentrations in pore water may be measured; in such case, rationale and appropriate methods should be provided prior to initiation of a study, and included in the report. | 44. | The worms and soil are sampled at least at six occasions during the uptake and the elimination phases. If the stability of a test chemical is demonstrated, the number of soil analyses can be reduced. It is recommended analysing at least three replicates at the beginning and at the end of the uptake phase. If the concentration in soil measured at the end of the uptake phase deviates from the initial concentration by more than 30 %, the soil samples taken at other dates should also be analysed. | 45. | Remove the worms of a given replicate from the soil at each sampling time (e.g. after spreading the soil of the replicate on a shallow tray and picking the worms using soft jewellers’ tweezers), rinse them quickly with water in a shallow glass or steel tray. Remove excess water (see paragraph 34). Transfer the worms carefully to a pre-weighed vessel, weigh them instantly, including gut content. | 46. | The earthworms (Eisenia sp.) should then be allowed to purge their gut overnight e.g. on a moist filter paper in a covered petri dish (see paragraph 34). After purging, the weight of the worms should be determined in order to assess a possible decrease in biomass during the test (see validity criteria in paragraph 17). Weighing and tissue analysis of Enchytraeids is carried out without purging, as this is technically difficult due to the small size of these worms. After final weight determination, the worms should be killed immediately, using the most appropriate method (e.g. using liquid nitrogen, or freezing at temperatures below – 18 °C). | 47. | During the elimination phase, the worms replace contaminated gut contents with clean soil. This means, measurements in un-purged worms (enchytraeids in this context) sampled immediately before the elimination phase include contaminated gut soil. For aquatic oligochaetes it is assumed that after the initial 4-24 h of the elimination phase, most of the contaminated gut content has been replaced by clean sediment e.g. (46). Similar findings have been reported for earthworms in studies on the accumulation of radiolabelled cadmium and zinc (78). In the non-purged enchytraeids, the concentration of this first sample of the elimination phase may be considered as the tissue concentration after gut purge. To account for dilution of the test item concentration by uncontaminated soil during the elimination phase, the weight of the gut content may be estimated from worm wet weight/worm ash weight or worm dry weight/worm ash weight ratios. | 48. | The soil and worm samples should be preferably analysed immediately after removal (i.e. within 1-2 days) in order to prevent degradation or other losses, and it is recommended calculating the approximate uptake and elimination rates as the test proceeds. If the analysis is delayed, the samples should be stored by an appropriate method, e.g. by deep-freezing (≤ – 18 °C). | 49. | It should be checked that the precision and reproducibility of the chemical analysis, as well as the recovery of the test chemical from soil and worm samples are satisfactory for the given method; the extraction efficiency, the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) should be reported. Likewise it should be checked that the test chemical is not detectable in the control vessels in concentrations higher than background. When the concentration of the test chemical in the test organism Ca is > 0 in the control worms, this should be included in the calculation of the kinetic parameters (see Appendix 2). All samples should be handled throughout the test to minimise contamination and loss (e.g. resulting from adsorption of the test chemical on the sampling device). | 50. | When working with radiolabelled test chemicals, it is possible to analyse parent and metabolites. Quantification of parent test chemical and metabolites at steady state or at the end of the uptake phase provides important information. The samples should then be “cleaned up” so that the parent test chemical can be quantified separately. If single metabolites exceed 10 % of total radioactivity in the analysed sample(s), the identification of these metabolites is recommended. | 51. | The overall recovery, and the recovery of test chemical in worms, soil, and if used, in traps containing absorbents to retain evaporated test chemical, should be recorded and reported. | 52. | Pooling of the individuals sampled from a given test vessel is acceptable for enchytraeid worms which are smaller than earthworms. If pooling involves the reduction of the number of replicates, this limits the statistical procedures which can be applied to the data. If a specific statistical procedure and power are required, then an adequate number of replicate test vessels should be included in the test to accommodate the desired pooling, procedure and power. | 53. | It is recommended that the BAF be expressed both as a function of total dry weight and, when required (i.e. for highly hydrophobic chemicals), as a function of the lipid content. Suitable methods should be used for determination of lipid content (some existing methods – e.g. (31) (58) – should be adapted for this purpose). These methods use a chloroform/methanol extraction technique. However, to avoid the use of chlorinated solvents, a modification of the Bligh and Dyer method (9) as described in (17) should be used. Since the various methods may not give identical values, it is important to give details of the method used. When possible, i.e. if sufficient worm tissue is available, the lipid analysis should ideally be made on the same sample or extract as the one used for analysis of the test chemical, since the lipids often have to be removed from the extract before it can be analysed chromatographically (49). Alternatively, control animals may be used to measure the lipid content, which can then be used to normalise BAF values. This latter approach reduces the contamination of equipment with the test chemical. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 54. | The uptake curve of the test chemical is obtained by plotting its concentration in/on the worms during the uptake phase against time on arithmetic scales. When the curve has reached a plateau, or steady state (see definitions in Appendix 1), the steady state bioaccumulation factor BAFss is calculated from: | Ca is the concentration of test chemical in the test organism | Cs is the concentration of test chemical in the soil | 55. | When no steady state is reached, the BAFK, based on the rate constants, should be determined instead of BAFss, as described below: | — | Determine the accumulation factor (BAFK) as the ratio ks/ke. | — | Uptake and elimination rates are preferably calculated simultaneously (see Equation 11 in Appendix 2) | — | The elimination rate constant (ke) is usually determined from the elimination curve (i.e. a plot of the concentration of the test item in the worms during the elimination phase). The uptake rate constant ks is then calculated given ke and a value of Ca which is derived from the uptake curve – See Appendix 2 for a description of these methods. The preferred method for obtaining BAFK and the rate constants, ks, and ke, is to use non-linear parameter estimation methods on a computer. If the elimination is obviously not first-order, then more complex models should be employed. | Test report | 56. | The test report should include the following information: | | Test chemical: | — | Any available information on acute or long term toxicity (e.g. ECx, LCx„ NOEC) of the test chemical towards soil-dwelling oligochaetes; | — | purity, physical nature and, physicochemical properties e.g. log Kow, water solubility; | — | chemical identification data; source of the test item, identity and concentration of any solvent used; | — | if radiolabelled test chemical is used, the precise position of the labelled atoms, the specific radioactivity, and the radiochemical purity. | | Test species: | — | scientific name, strain, source, any pre-treatment, acclimation, age, size-range, etc.. | | Test conditions: | — | test procedure used; | — | type and characteristics of illumination used and photoperiod(s); | — | test design (e.g. number and size of test vessels, soil mass and height of soil layer, number of replicates, number of worms per replicate, number of test concentrations, duration of uptake and elimination phases, sampling frequency); | — | rationale for the choice of test vessel material; | — | method of test item preparation and application as well as reasons for choosing a specific method; | — | the nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test vessels, and the method by which these values were obtained; | — | source of the constituents of the artificial soil or – if natural media are used – origin of the soil, description of any pre-treatment, results of the controls (survival, biomass development, reproduction), soil characteristics (pH, total organic carbon content, particle size distribution (percent sand, silt, and clay), WHCmax, percent water content at start and at end of the test, and any other measurements made); | — | detailed information on the treatment of soil and worm samples, including details of preparation, storage, spiking procedures, extraction, and analytical procedures (and precision) for the test item in worms and soil, and lipid content (if measured), and recoveries of the test item. | | Results: | — | mortality of the control worms and the worms in each test vessel and any observed abnormal behaviour (e.g. soil avoidance, lack of reproduction in a bioaccumulation test with enchytraeids); | — | the dry weight to wet weight ratio of the soil and the test organisms (useful for normalisation); | — | the wet weights of the worms at each sampling time; for earthworms, the wet weights at start of the test, and at each sampling time before and after gut purging; | — | the lipid content of the test organisms (if determined); | — | curves, showing the uptake and elimination kinetics of the test chemical in the worms, and the time to steady state; | — | Ca and Cs (with standard deviation and range, if appropriate) for all sampling times (Ca expressed in g kg–1 wet and dry weight of whole body, Cs expressed in g kg–1 wet and dry weight of soil). If a biota-soil accumulation factor (BSAF) is required (e.g. for comparison of results from two or more tests performed with animals of differing lipid content), Ca may additionally be expressed as g kg–1 lipid content of the organism, and Cs may be expressed as g kg–1 organic carbon (OC) of the soil; | — | BAF (expressed in kg soil·kg–1 worm), soil uptake rate constant ks (expressed in g soil kg–1 of worm day–1), and elimination rate constant ke (expressed in day–1); BSAF (expressed in kg soil OC kg–1 worm lipid content) may be reported additionally; | — | if measured: percentages of parent chemical, metabolites, and bound residues (i.e. the percentage of test chemical that cannot be extracted with common extraction methods) detected in soil and test animals; | — | methods used for the statistical analyses of data. | | Evaluation of results: | — | compliance of the results with the validity criteria as listed in paragraph 17; | — | unexpected or unusual results, e.g. incomplete elimination of the test chemical from the test animals. | LITERATURE: | (1) | Amorim M (2000). 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Bioaccumulation results from both bioconcentration and biomagnification processes (see below). | Bioconcentration is the increase in concentration of the test chemical in or on an organism, resulting from the uptake of the chemical exclusively from the surrounding medium (i.e. via the body surface and ingested soil), relative to the concentration of the test chemical in the surrounding medium. | Biomagnification is the increase in concentration of the test chemical in or on an organism, resulting mainly from uptake from contaminated food or prey, relative to the concentration of the test chemical in the food or prey. Biomagnification can lead to a transfer or accumulation of the test item within food webs. | The elimination of a test chemical is the loss of this chemical from the test organism tissue by active or passive processes that occurs independently of presence or absence of the test item in the surrounding medium. | The bioaccumulation factor (BAF) at any time during the uptake phase of this bioaccumulation test is the concentration of test chemical in/on the test organism (Ca in g·kg-1 dry weight of worm) divided by the concentration of the chemical in the surrounding medium (Cs as g·kg-1 of dry weight of soil); the BAF has the units of kg soil·kg-1 worm. | The steady state bioaccumulation factor (BAFss) is the BAF at steady state and does not change significantly over a prolonged period of time, the concentration of the test chemical in the surrounding medium (Cs as g.kg-1 of dry weight of soil) being constant during this period of time. | Bioaccumulation factors calculated directly from the ratio of the soil uptake rate constant and the elimination rate constant (ks and ke, see below) are termed kinetic bioaccumulation factor (BAFK). | The biota-soil accumulation factor (BSAF) is the lipid-normalised concentration of the test chemical in/on the test organism divided by the organic carbon-normalised concentration of the test chemical in the soil at steady state. Ca is then expressed as g·kg-1 lipid content of the organism, and Cs as g·kg-1 organic content of the soil; the BSAF has the units of kg OC·kg-1 lipid. | A plateau or steady state is defined as the equilibrium between the uptake and elimination processes that occur simultaneously during the exposure phase. The steady state is reached in the plot of BAF against time when the curve becomes parallel to the time axis and three successive analyses of BAF made on samples taken at intervals of at least two days are within 20 % of each other, and there are no statistically significant differences among the three sampling periods. For test chemicals which are taken up slowly, more appropriate intervals would be seven days (49). | The organic carbon-water partitioning coefficient (Koc) is the ratio of a chemical’s concentration in/on the organic carbon fraction of a soil and the chemical's concentration in water at equilibrium. | The octanol-water partitioning coefficient (Kow) is the ratio of a chemical’s solubility in n-octanol and water at equilibrium, also sometimes expressed as Pow. The logarithm of Kow (log Kow) is used as an indication of a chemical's potential for bioaccumulation by aquatic organisms. | The uptake or exposure phase is the time during which the test organisms are exposed to the test chemical. | The soil uptake rate constant (ks) is the numerical value defining the rate of increase in the concentration of the test item in/on the test organism resulting from uptake from the soil phase. ks is expressed in g soil kg-1 of worm d-1. | The elimination phase is the time, following the transfer of the test organisms from a contaminated medium to a medium free of the test item, during which the elimination (or the net loss) of the chemical from the test organisms is studied. | The elimination rate constant (ke) is the numerical value defining the rate of reduction in the concentration of the test item in/on the test organism, following the transfer of the test organisms from a medium containing the test item to a chemical-free medium; ke is expressed in d-1. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Calculation of uptake and elimination parameters | The main endpoint of a bioaccumulation test is the bioaccumulation factor, BAF. The measured BAF can be calculated by dividing the concentration in the test organism, Ca, by the concentration in the soil, Cs, at steady state. If the steady state is not reached during the uptake phase, the BAFK is calculated from the rate constants instead of BAFss. However, it should be noted if the BAF is based on steady state concentrations or not. | The usual means for obtaining the kinetic bioaccumulation factor (BAFK), the soil uptake rate constant (ks) and the elimination rate constant (ke) is to use non-linear parameter estimation methods on a computer, e.g. based on the models described in (68). Given a set of sequential time concentration data and the model equations: | 0 < t < tc | [equation 1] | or | t > tc | [equation 2] | where: | Ca | = | concentration of chemical in worms [g kg-1 wet or dry weight] | ks | = | uptake rate constant in tissue [g soil kg-1 of worm d-1] | Cs | = | concentration of chemical in soil [g kg-1 of wet or dry weight] | ke | = | elimination rate constant [d-1] | tc | = | time at the end of the uptake phase, | these computer programs calculate values for BAFK, ks and ke. | When the background concentration in the non-exposed worms e.g. on day 0 differs significantly from zero (this may e.g. be the case for metals), this background concentration (Ca,0) should be included in these equations, to make them read: | 0 < t < tc | [equation 3] | and | t > tc | [equation 4] | In cases where a significant decrease of the test chemical concentration in the soil is observed over time during the uptake phase, the following models can be used e.g. (67) (79): | [equation 5] | where: | Cs | = | concentration of chemical in the soil [g kg-1 wet or dry weight] | k0 | = | degradation rate constant in soil [d-1] | C0 | = | initial concentration of chemical in soil [g kg-1 of wet or dry weight] | 0 < t < tc | [equation 6] | t > tc | [equation 7] | where: | Ca | = | concentration of chemical in worms [g kg-1 wet or dry weight] | ks | = | uptake rate constant in tissue [g soil kg-1 of worm d-1] | k0 | = | degradation rate constant in soil [d-1] | ke | = | elimination rate constant [d-1] | tc | = | time at the end of the uptake phase. | When steady state is reached during the uptake phase (i.e. t = ∞), equation 1 | 0 < t < tc | [equation 1] | may be reduced to: | or | [equation 8] | Then ks/ke x Cs is an approach to the concentration of the test item in the worm tissue at steady state (Ca,ss). | The biota-soil accumulation factor (BSAF) can be calculated as follows: | [equation 9] | where foc is the fraction of soil organic carbon, and flip is the fraction of worm lipid, both preferably determined on samples taken from the test, and based either on dry weight or on wet weight, respectively. | The elimination kinetics can be modelled using the data from the elimination phase and applying the following model equation and a computer-based non-linear parameter estimation method. If the data points plotted against time indicate a constant exponential decline of the test item concentration in the animals, a one-compartment model (equation 9) can be used to describe the time course of elimination. | [equation 10] | Elimination processes sometimes appear to be biphasic, showing a rapid decline of Ca during the early phases, that changes to a slower loss of test items in the later phases of the elimination, e.g. (27) (68). The two phases can be interpreted by the assumption, that there are two different compartments in the organism, from which the test item is lost with different velocities. In these cases, specific LITERATURE should be studied e.g. (38) (39) (40) (78). | Using the model equations above, the kinetic parameters (ks and ke) may also be calculated in one run by applying the first order kinetics model to all data from both the uptake and elimination phase simultaneously. For a description of a method that may allow for such a combined calculation of uptake and elimination rate constants, references (41), (73) and (70) may be consulted. | [equation 11] | Note: | When uptake and elimination parameters are estimated simultaneously from the combined uptake and the elimination data, “m” as shown in equation 11 is a descriptor that allows the computer program to assign the equation’s sub-terms to the data sets of the respective phase and to perform the evaluation correctly (m = 1 for uptake phase; m = 2 for elimination phase). | Nevertheless, these model equations should be used with caution, especially when changes in the test chemical's bioavailability, or (bio)degradation occur during the test (see e.g. (79)). | Appendix 3 | EXAMPLES OF SCHEDULES FOR SOIL BIOACCUMULATION TESTS | Earthworm test | (a) | Uptake phase with 8 sampling dates used for calculation of kinetics | Day | Activity | – 6 | Conditioning of the prepared soil for 48 h; | – 4 | Spiking of the soil fraction with the test chemical solution; evaporating of any solvent; mixing of the soil constituents; distributing the soil to the test vessels; equilibration at test conditions for 4 days (3 weeks for metal-spiked soil); | – 3 to – 1 | Separation of the test organisms from the culture for acclimation; preparation and moisturising of the soil constituents; | 0 | Measuring temperature, and soil pH; removing soil samples from treated vessels and solvent controls for determination of test chemical concentration; addition of food ration; weighing and randomised distribution of the worms to the test vessels; retaining of sufficient subsamples of worms for determination of analytical background values, wet and dry weight, and lipid content; weighing of all test vessels to control soil moisture; controlling air supply, if closed test system is used; | 1 | Controlling air supply, recording worm behaviour and temperature; taking soil and worm samples for determination of test item concentration; | 2 | Same as day 1; | 3 | Controlling air supply, worm behaviour and temperature; | 4 | Same as day 1; | 5-6 | Same as day 3; | 7 | Same as day 1; addition of food ration; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 8-9 | Same as day 3; | 10 | Same as day 1; | 11-13 | Same as day 3; | 14 | Same as day 1; addition of food ration; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 15-16 | Same as day 3; | 17 | Same as day 1; | 18-20 | Same as day 3; | 21 | Same as day 1; measuring temperature and soil pH; control soil moisture by re-weighing the test vessels; end of uptake phase; transfer worms from remaining exposed replicates to vessels containing clean soil for elimination phase (no gut-purging); sampling of soil and worms from solvent controls. | | Pre-exposure activities (equilibration phase) should be scheduled taking into account the properties of the test chemical. | | Activities described for day 3 should be performed daily (at least on workdays). | (b) | Elimination phase | Day | Activity | – 6 | Preparation and moisturising of the soil constituents; conditioning of the prepared soil for 48 h; | – 4 | Mixing of the soil constituents; distributing the soil to the test vessels; incubation at test conditions for 4 days; | 0 (end of uptake phase) | Measuring temperature and soil pH; weighing and randomised distribution of the worms to the test vessels; addition of food ration; transfer worms from remaining exposed replicates to vessels containing clean soil; taking soil and worm samples after 4-6 h for determination of test chemical concentration; | 1 | Controlling air supply, recording worm behaviour and temperature; taking soil and worm samples for determination of test chemical concentration; | 2 | Same as day 1; | 3 | Controlling air supply, worm behaviour and temperature; | 4 | Same as day 1; | 5-6 | Same as day 3; | 7 | Same as day 1; addition of food ration; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 8-9 | Same as day 3; | 10 | Same as day 1; | 11-13 | Same as day 3; | 14 | Same as day 1; addition of food ration; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 15-16 | Same as day 3; | 17 | Same as day 1; | 18-20 | Same as day 3; | 21 | Same as day 1; measuring temperature and soil pH; control soil moisture by re-weighing the test vessels; sampling of soil and worms from solvent controls. | | Preparation of the soil prior to start of elimination phase should be done in the same manner as before the uptake phase. | | Activities described for day 3 should be performed daily (at least on workdays). | Enchytraeid test | (a) | Uptake phase with 8 sampling dates used for calculation of kinetics | Day | Activity | – 6 | Conditioning of the prepared soil for 48 h; | – 4 | Spiking of the soil fraction with the test chemical solution; evaporating of any solvent; mixing of the soil constituents; distributing the soil to the test vessels; equilibration at test conditions for 4 days (3 weeks for metal-spiked soil); | – 3 to – 1 | Separation of the test organisms from the culture for acclimation; preparation and moisturising of the soil constituents; | 0 | Measuring temperature, and soil pH; removing soil samples from treated vessels and solvent controls for determination of test chemical concentration; addition of food ration to soil; weighing and randomised distribution of the worms to the test vessels; retaining of sufficient subsamples of worms for determination of analytical background values, wet and dry weight, and lipid content; weighing of all test vessels to control soil moisture; controlling air supply, if closed test system is used; | 1 | Controlling air supply, recording worm behaviour and temperature; taking soil and worm samples for determination of test item concentration; | 2 | Same as day 1; | 3 | Controlling air supply, worm behaviour and temperature; | 4 | Same as day 1; | 5-6 | Same as day 3; | 7 | Same as day 1; addition of food ration to soil; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 9 | Same as day 1; | 10 | Same as day 3; | 11 | Same as day 1; | 12-13 | Same as day 3; | 14 | Same as day 1; addition of food ration to soil; measuring temperature and soil pH; control soil moisture by re-weighing the test vessels; end of uptake phase; transfer worms from remaining exposed replicates to vessels containing clean soil for elimination phase (no gut-purging); sampling of soil and worms from solvent controls. | | Pre-exposure activities (equilibration phase) should be scheduled taking into account the properties of the test chemical. | | Activities described for day 3 should be performed daily (at least on workdays). | Appendix 4 | Artificial soil – preparation and storage recommendations | Since natural soils from a particular source may not be available throughout the year, and indigenous organisms as well as the presence of micro-pollutants can influence the test, an artificial substrate, the artificial soil according to Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms (48), is recommended for use in this test. Several test species can survive, grow, and reproduce in this soil, and maximum standardisation as well as intra- and interlaboratory comparability of test and culture conditions are provided. | Soil constituents: | Peat: | 10 % | Sphagnum-peat, in accordance with the OECD Guideline 207 (48); | Quartz sand: | 70 % | Industrial quartz sand (air dried); grain size: more than 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm, but all particles should be ≤ 2 mm; | Kaolinite clay: | 20 % | Kaolinite content ≥ 30 %; | Calcium carbonate: | ≤ 1 % | CaCO3, pulverised, chemically pure. | As an option, the organic carbon content of the artificial soil may be reduced, e.g. by lowering the peat content to 4-5 % of dry soil and increasing the sand content accordingly. By such a reduction in organic carbon content, the possibilities of adsorption of test chemical to the soil (organic carbon) may be decreased, and the availability of the test chemical to the worms may increase (74). It has been demonstrated that Enchytraeus albidus and Eisenia fetida can comply with the validity criteria on reproduction when tested in field soils with lower organic carbon content, e.g. 2,7 % (33), (61), and there is experience that this can also be achieved in artificial soil with 5 % peat. | Preparation | The dry constituents of the soil are mixed thoroughly (e.g. in a large-scale laboratory mixer). This should be done about one week before starting the test. The mixed dry soil constituents should be moistened with deionised water at least 48 h before application of the test item in order to equilibrate/stabilise the acidity. For the determination of pH a mixture of soil and 1 M KCl solution in a 1:5 ratio is used. If the pH value is not within the required range (6,0 ± 0,5), a sufficient amount of CaCO3 is added to the soil, or a new batch of soil is prepared. | The maximum water holding capacity (WHC) of the artificial soil is determined according to ISO 11268-2 (35). At least two days before starting the test, the dry artificial soil is moistened by adding enough deionised or reconstituted water to obtain approximately half of the final water content. The final water content should be 40 % to 60 % of the maximum WHC. At the start of the test, the pre-moistened soil is divided into as many batches as the number of test concentrations and controls used for the test, and the moisture content is adjusted to 40-60 % of WHCmax by using the solution of the test item and/or by adding deionised or reconstituted water. The moisture content is determined at the beginning and at the end of the test (at 105 °C). It should be optimal for the species’ requirements (the moisture content can also be checked as follows: when the soil is gently squeezed in the hand, small drops of water should appear between the fingers). | Storage | The dry constituents of the artificial soil may be stored at room temperature until use. The prepared, pre-moistened soil may be stored in a cool place for up to three days prior to spiking; care should be taken to minimise evaporation of water. Soil spiked with the test item should be used immediately unless there is information indicating that the particular soil can be stored without affecting the toxicity and bioavailability of the test item. Samples of spiked soil may then be stored under the conditions recommended for the particular test item until analysis. | Appendix 5 | Species of terrestrial oligochaetes recommended for testing bioaccumulation from soil | Earthworms | The recommended test species is Eisenia fetida (Savigny 1826), belonging to the family Lumbricidae. Since 1972 it is divided into two subspecies (Eisenia fetida and Eisenia andrei (10)). According to Jaenike (36), they are true, separate species. Eisenia fetida is easily recognised by its bright intersegmental yellow stripes whereas Eisenia andrei has a uniform, dark red colour. Originating probably from the region of the Black Sea, they are distributed worldwide today, especially in anthropogenically modified habitats like compost heaps. Both can be used for ecotoxicological as well as bioaccumulation tests. | Eisenia fetida and Eisenia andrei are commercially available, e.g. as fish bait. In comparison to other lumbricid earthworms, they have a short life-cycle, reaching maturity within ca. 2-3 months (at room temperature). Their optimum temperature is approximately at 20-24 °C. They prefer relatively moist substrates with a nearly neutral pH and a high content of organic material. Since these species have been widely used in standardised ecotoxicological tests for about 25 years, their culturing is well established (48) (77). | Both species can be bred in a wide range of animal wastes. The breeding medium recommended by ISO (35) is a 50:50 mixture of horse or cattle manure and peat. The medium should have a pH value of about 6 to 7 (regulated with calcium carbonate), a low ionic conductivity (less than 6 mS/cm or less than 0,5 % salt concentration) and should not be contaminated excessively with ammonia or animal urine. Also, a commercial gardening soil free of additives, or artificial soil according to OECD (48), or a 50:50 mixture of both can be used. The substrate should be moist but not too wet. Breeding boxes of 10 litre to 50 litre volume are suitable. | To obtain worms of standard age and mass, it is best to start the culture with cocoons. Therefore, adult worms are added to a breeding box containing fresh substrate to produce cocoons. Practical experience has shown that a population density of approximately 100 adult worms per kg substrate (wet weight) leads to good reproduction rates. After 28 days, the adult worms are removed. The earthworms hatched from the cocoons are used for testing when mature after at least 2 months but less than 12 months. | Worms of the species described above can be considered healthy if they move through the substrate, do not try to leave the substrate, and reproduce continuously. Very slow motioning or a yellow posterior end (in the case of Eisenia fetida) indicates substrate exhaustion. In this case, fresh substrate and/or a lower number of animals per box is recommended. | Additional selected references | Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58. | Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81. | Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S. | Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55. | Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201. | Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171. | Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology — from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp. | Enchytraeids | The recommended test species is Enchytraeus albidus Henle 1837 (white potworm). Enchytraeus albidus is one of the biggest (up to 15 mm) species of the annelid oligochaete family Enchytraeidae and it is worldwide distributed e.g. (8). Enchytraeus albidus is found in marine, limnic and terrestrial habitats, mainly in decaying organic matter (seaweed, compost) and rarely in meadows (42). This broad ecological tolerance and some morphological variations indicate that there might be different races for this species. | Enchytraeus albidus is commercially available, sold as food for fish. It should be checked whether the culture is contaminated by other, usually smaller species (60). If contamination occurs, all worms should be washed with water in a Petri dish. Large adult specimens of Enchytraeus albidus are then selected (by using a stereomicroscope) to start a new culture. All other worms are discarded. Its life cycle is short as maturity is reached between 33 days (at 18 °C) and 74 days (at 12 °C). Only cultures which have been kept in the laboratory for at least 5 weeks (one generation) without problems should be used for a test. | Other species of the Enchytraeus genus are also suitable, especially Enchytraeus luxuriosus. This species is a true soil inhabitant, which has been newly described in (65). If other species of Enchytraeus are used, they should be clearly identified and the rationale for the selection of the species should be reported. | Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) is a species belonging to the same group as Enchytraeus luxuriosus. It has not been found to exist with certainty in the field, having only been described from earthworm cultures and compost heaps (Römbke 2003). Its original ecological requirements are therefore not known. However, recent laboratory studies in various field soils have confirmed that this species has a broad tolerance towards soil properties like pH and texture (Jänsch et al. 2005). In recent years, this species has often been used in ecotoxicological studies because of the simplicity of its breeding and testing, e.g. Kuperman et al. 2003). However, it is small (3-12 mm; 7 mm on average (Westheide & Müller 1996), and this makes handling more difficult compared with Enchytraeus albidus. When using this species instead of Enchytraeus albidus, the size of the test vessel can but needs not to be smaller. In addition, it should be considered that this species reproduces very rapidly having a generation time of less than 20 days at 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) and even quicker at higher temperatures. | Enchytraeids of the species Enchytraeus albidus (as well as other Enchytraeus species) can be bred in large plastic boxes (e.g. 30 × 60 × 10 cm or 20 × 12 × 8 cm which is suitable for culture of worms of small size) filled with a mixture of artificial soil and commercially available, uncontaminated garden soil free of additives. Compost material should be avoided since it could contain toxic chemicals like heavy metals. Fauna should be removed from the breeding soil before use by three times deep-freezing. Pure artificial soil can also be used but the reproduction rate could be slower compared to that obtained with mixed substrates. The substrate should have a pH of 6,0 ± 0,5. The culture is kept in an incubator at a temperature of 15 ± 2 °C without light. In any case, a temperature higher than 23 °C should be avoided. The artificial/natural soil moisture should be moist but not wet. When the soil is gently pressed by hand, only small drops of water should appear. In any case, anoxic conditions should be avoided (e.g. if a lid is used, the number of lid holes should be high enough to provide sufficient exchange of air). The breeding soil should be aerated by carefully mixing it once per week. | The worms should be fed at least once per week ad libitum with rolled oats which are placed into a cavity on the soil surface and covered with soil. If food from the last feeding date remains in the container, the amount of food given should be adjusted accordingly. If fungi grow on the remaining food, it should be replaced by a new quantity of rolled oats. In order to stimulate reproduction, the rolled oats may be supplemented with commercially available, vitamin amended protein powder every two weeks. After three months, the animals are transferred to a freshly prepared culture or breeding substrate. The rolled oats, which have to be stored in sealed vessels, should be autoclaved or heated before use in order to avoid infections by flour mites (e.g. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) or predacious mites (e.g. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). After disinfecting, the food is ground up so that it can easily be strewn on the soil surface. Another possible food source is baker’s yeast or the fish food TetraMin®. | In general, the culturing conditions are sufficient if worms do not try to leave the substrate, move quickly through the soil, exhibit a shiny outer surface without soil particles clinging to it, are more or less whitish coloured, and if worms of different ages are visible. Actually, worms can be considered healthy if they reproduce continuously. | Additional selected references | Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126. | Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83. | Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656. | Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616. | Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479-488. | Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267. | ’ | 10) | Se añaden los capítulos C.27, C.28, C.29 y C.30 siguientes: | «C.27. ENSAYO DE TOXICIDAD PARA QUIRONÓMIDOS EN SISTEMAS SEDIMENTO-AGUA CON SEDIMENTO ENRIQUECIDO | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo de la OCDE TG 218 (2004). Está diseñado para evaluar los efectos de la exposición prolongada de sustancias sobre las larvas del díptero de agua dulce Chironomus sp., que viven en los sedimentos. Se basa en los actuales protocolos de ensayo de toxicidad para Chironomus riparius y Chironomus tentans que se han elaborado en Europa (1) (2) (3) y en América del Norte (4) (5) (6) (7) (8) y se han sometido a ensayos interlaboratorios (1) (6) (9). Pueden utilizarse asimismo otras especies de quironómidos bien documentadas como, por ejemplo, Chironomus yoshimatsui (10) (11). | 2. | La situación de exposición aplicada en el presente método de ensayo es el enriquecimiento del sedimento con la sustancia problema. La selección de la situación de exposición adecuada depende de la aplicación que se prevea para el ensayo. La situación de enriquecimiento del sedimento tiene el objetivo de simular niveles acumulados de sustancias que permanecen en el sedimento. Este sistema de exposición implica el enriquecimiento del sedimento de un sistema de ensayo sedimento-agua. | 3. | Las sustancias que tienen que someterse a ensayo respecto a organismos que viven en los sedimentos suelen permanecer en este compartimento durante largos períodos. Los organismos que viven en los sedimentos pueden estar expuestos a través de varias vías de exposición. La importancia relativa de cada vía de exposición, y el tiempo que tarda cada una de ellas en contribuir a los efectos tóxicos generales, dependen de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia correspondiente. En el caso de las sustancias que se adsorben fuertemente (por ejemplo, con log Kow > 5) o en el de las sustancias que se unen covalentemente con el sedimento, la ingestión de alimentos contaminados puede constituir una vía de exposición significativa. A fin de no subestimar la toxicidad de sustancias muy lipofílicas, puede considerarse la adición de alimentos al sedimento antes de aplicar la sustancia problema. Para tener en cuenta todas las vías potenciales de exposición, el presente método de ensayo insiste en la exposición a largo plazo. La duración del ensayo está en la banda de 20 a 28 días en el caso de C. riparius y C. yoshimatsui, y de 28 a 65 días en el de C. tentans. Si se necesitan datos a un plazo más corto con algún fin específico como, por ejemplo, investigar los efectos de una sustancia inestable, es posible retirar réplicas adicionales tras un plazo de diez días. | 4. | Los parámetros medidos son el número total de adultos que aparecen y el tiempo transcurrido hasta su aparición. Se recomienda que las mediciones de supervivencia y crecimiento de las larvas no se hagan hasta que hayan pasado diez días si se necesitan datos adicionales a corto plazo, utilizando réplicas adicionales cuando convenga. | 5. | Se recomienda el uso de sedimentos artificiales, que presentan diversas ventajas sobre los sedimentos naturales: | — | se reduce la variabilidad experimental porque se constituye una "matriz normalizada" reproducible y desaparece la necesidad de conseguir fuentes de sedimentos limpios y no contaminados, | — | pueden iniciarse los ensayos en cualquier momento sin problemas de variabilidad estacional del sedimento en cuestión, y no es necesario aplicar ningún tratamiento previo al sedimento para eliminar la fauna endógena; el uso de un sedimento artificial reduce también el coste asociado con la recogida de campo de cantidades suficientes de sedimentos para los ensayos sistemáticos, | — | el uso de sedimento artificial permite comparar la toxicidad de las sustancias y clasificarlas en consecuencia. | 6. | En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 7. | Se exponen quironómidos de primer estadio larvario a una serie de concentraciones de la sustancia problema en sistemas sedimento-agua. La sustancia problema se introduce en el sedimento y a continuación se toman larvas del primer estadio y se ponen en vasos donde se han estabilizado diferentes concentraciones de sedimento y agua. Al final del ensayo se mide la tasa de aparición de adultos y de desarrollo de quironómidos. También es posible medir la supervivencia y el peso de las larvas a los 10 días en caso necesario, utilizando réplicas adicionales cuando proceda. Estos datos se analizan o bien usando un modelo de regresión para estimar la concentración que provocaría una reducción del x % en la aparición de adultos o en la supervivencia o el crecimiento de las larvas (por ejemplo, EC15, EC50, etc.), o bien realizando contrastes estadísticos de hipótesis para determinar la NOEC/LOEC. Esta última posibilidad exige la comparación de valores de efectos con valores que tienen control, utilizando pruebas estadísticas. | INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA | 8. | Deben conocerse la hidrosolubilidad de la sustancia problema, su presión de vapor, su reparto medido o calculado en el sedimento y su estabilidad en el agua y en el sedimento. Para cuantificar la sustancia problema presente en el agua sobrenadante, en el agua intersticial y en el sedimento, debe disponerse de un método analítico fiable, cuya precisión y límite de detección sean conocidos y se indiquen. Entre la información útil se incluyen la fórmula estructural y la pureza de la sustancia problema. También es útil la información sobre el destino químico de la sustancia problema (por ejemplo, disipación, degradación abiótica y biótica, etc.). En la referencia 12 se ofrece más orientación sobre los ensayos de sustancias con propiedades fisicoquímicas que dificultan la realización del ensayo. | SUSTANCIAS DE REFERENCIA | 9. | Puede realizarse periódicamente un ensayo con sustancias de referencia, para asegurarse de la fiabilidad del protocolo y de las condiciones del ensayo. Las siguientes sustancias son ejemplos de tóxicos de referencia utilizados con éxito en estudios interlaboratorios y de validación: lindano, trifluralina, pentaclorofenol, cloruro de cadmio y cloruro de potasio (1) (2) (5) (6) (13). | VALIDEZ DEL ENSAYO | 10. | Para que el ensayo sea válido deben darse las condiciones siguientes: | — | la aparición de adultos en los controles no ha de ser inferior al 70 % al final del ensayo (1) (6), | — | la aparición de adultos de C. riparius y C. yoshimatsui en los recipientes de control debe producirse cuando hayan transcurrido entre 12 y 23 días desde su introducción en los recipientes; en el caso de C. tentans es necesario un plazo de entre 20 y 65 días, | — | al final del ensayo deben medirse en cada recipiente el pH y la concentración de oxígeno disuelto; la concentración de oxígeno debe ser al menos el 60 % del valor de saturación en el aire a la temperatura aplicada, y el pH del agua sobrenadante debe estar en el rango de 6 a 9 en todos los recipientes de ensayo, | — | la temperatura del agua no debe variar en más de ± 1,0 °C; la temperatura del agua podría controlarse mediante un espacio isotérmico y, en tal caso, debería confirmarse la temperatura ambiente de ese espacio a intervalos apropiados. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Recipientes de ensayo | 11. | El estudio se lleva a cabo en vasos de vidrio de 600 ml de capacidad y 8 cm de diámetro. Pueden utilizarse otros recipientes que garanticen una altura adecuada de sedimento y de agua sobrenadante. La superficie del sedimento debe ser suficiente para que correspondan de 2 a 3 cm2 por larva. La proporción de la altura de la capa de sedimento respecto a la altura del agua sobrenadante debe ser de 1:4. Los recipientes de ensayo y demás instrumentos que hayan de entrar en contacto con el sistema de ensayo serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte como, por ejemplo, teflón. | Selección de la especie | 12. | La especie que debe usarse preferentemente en el ensayo es Chironomus riparius. También es adecuada la especie Chironomus tentans, pero resulta más difícil de manejar y requiere un período de ensayo más largo. Asimismo es posible utilizar Chironomus yoshimatsui. En el apéndice 2 se da información sobre los métodos de cultivo de Chironomus riparius. También se dispone de información sobre las condiciones de cultivo de otras especies, como Chironomus tentans (4) y Chironomus yoshimatsui (11). Hay que confirmar la identificación de la especie antes de realizar los ensayos, pero no es necesario hacerlo antes de cada ensayo si los organismos proceden de un cultivo del propio laboratorio. | Sedimento | 13. | Es preferible utilizar un sedimento artificial (también denominado formulado, reconstituido o sintético). Sin embargo, si se utiliza sedimento natural, deben determinarse sus características (al menos, el pH y el contenido de carbono, pero es recomendable incluir otros parámetros, como la relación C/N y la granulometría), y debe estar exento de toda contaminación y de otros organismos que pudieran competir con los quironómidos o consumirlos. También se recomienda que el sedimento natural, antes de emplearse en un ensayo de toxicidad para quironómidos, se someta durante siete días a las mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo. Se recomienda utilizar en este ensayo (1) (15) (16) el siguiente sedimento artificial, basado en el suelo artificial empleado en el método de ensayo C.8 (14): | a) | 4-5 % de turba (peso seco), de pH lo más próximo posible a la banda 5,5-6,0; es importante utilizar turba en forma de polvo, finamente molida (tamaño de partícula ≤ 1 mm) y secada solo al aire; | b) | 20 % de caolín (peso seco), con un contenido de caolinita preferentemente superior al 30 %; | c) | 75-76 % de arena de cuarzo (peso seco); debe predominar la arena fina, con más del 50 % de las partículas de un tamaño entre 50 y 200 μm; | d) | agua desionizada añadida para obtener un contenido de humedad en la mezcla final el rango de 30 a 50 %; | e) | carbonato de calcio de calidad químicamente pura (CaCO3) añadido para ajustar el pH de la mezcla final del sedimento a 7,0 ± 0,5; el contenido de carbono orgánico de la mezcla final debe ser del 2 % (± 0,5 %), ajustado mediante el empleo de cantidades adecuadas de turba y arena, según las letras a) y c). | 14. | Debe conocerse el origen de la turba, del caolín y de la arena. Hay que comprobar que los componentes del sedimento no presentan contaminación química (por ejemplo, con metales pesados, compuestos organoclorados, compuestos organofosforados, etc.). En el apéndice 3 se describe un ejemplo de preparación del sedimento artificial. Puede aceptarse también la mezcla de componentes secos si se demuestra que, tras la adición de agua sobrenadante, no se produce separación de los componentes del sedimento (por ejemplo, flotación de partículas de turba), y que la turba o el sedimento están suficientemente acondicionados. | Agua | 15. | Es adecuada como agua de ensayo cualquier agua que se ajuste a las características químicas de un agua de dilución aceptable según se indica en los apéndices 2 y 4. Puede utilizarse como agua de cultivo y agua de ensayo cualquier agua adecuada, agua natural (superficial o subterránea), agua reconstituida (véase el apéndice 2) o agua del grifo desclorada, siempre que los quironómidos sobrevivan en ella durante las fases de cultivo y ensayo sin mostrar signos de presión. Al inicio del ensayo, el pH del agua de ensayo debe estar entre 6 y 9 y la dureza total no debe superar el valor de 400 mg/l en CaCO3. Sin embargo, si se sospecha interacción entre los iones responsables de la dureza y la sustancia problema, debe utilizarse agua menos dura (por tanto, en esta situación no debe emplearse el medio M4 de Elendt). Debe usarse el mismo tipo de agua a lo largo de todo el estudio. Las características de calidad del agua recogidas en el apéndice 4 deben medirse al menos dos veces al año o cuando se sospeche que pueden haber cambiado de forma significativa. | Soluciones madre — sedimentos enriquecidos | 16. | Los sedimentos enriquecidos a la concentración elegida se preparan por lo general añadiendo una solución de la sustancia problema directamente al sedimento. La solución madre de la sustancia problema preparada con agua desionizada se mezcla con el sedimento artificial mediante molino de rodillos, mezcladora de piensos o a mano. Si la sustancia problema es poco soluble en agua, puede disolverse en el mínimo volumen posible de un disolvente orgánico apropiado (por ejemplo, hexano, acetona o cloroformo). Esta solución se mezcla a continuación con 10 g de arena de cuarzo fina para un solo recipiente de ensayo. Se deja que se evapore el disolvente, que tiene que desaparecer totalmente de la arena; después se mezcla la arena con la cantidad adecuada de sedimento para un vaso de ensayo. Para solubilizar, dispersar o emulsionar la sustancia problema solo pueden utilizarse agentes que se volatilicen rápidamente. No ha de olvidarse que la arena aportada por la mezcla de sustancia problema y arena tiene que tenerse en cuenta a la hora de preparar el sedimento (es decir, el sedimento debe prepararse entonces con menos arena). Debe velarse por que la sustancia problema añadida al sedimento se distribuya de forma total y homogénea por el sedimento. En caso necesario, deben analizarse submuestras para determinar el grado de homogeneidad. | DISEÑO DEL ENSAYO | 17. | El diseño del ensayo se refiere a la selección del número de concentraciones de ensayo y al intervalo entre las mismas, al número de recipientes por concentración y al número de larvas por recipiente. Se describen los diseños para la estimación puntual de la EC y de la NOEC, así como para realizar un ensayo límite. | Diseño para análisis de regresión | 18. | La concentración con efecto (por ejemplo, EC15, EC50) y el rango de concentraciones en la que resulta interesante el efecto de la sustancia problema, tienen que estar abarcadas entre las concentraciones incluidas en el ensayo. En general, la exactitud y, sobre todo, la validez con la que pueden hacerse las estimaciones de las concentraciones con efecto (ECx) mejoran cuando la concentración con efecto se encuentra dentro del rango de concentraciones ensayadas. Debe evitarse extrapolar muy por debajo de la menor concentración positiva o por encima de la concentración máxima. Es conveniente efectuar previamente un ensayo para seleccionar el rango de concentraciones que se deba utilizar (véase el punto 27). | 19. | Si ha de estimarse la ECx, deben someterse a ensayo al menos cinco concentraciones y tres réplicas por cada concentración. En cualquier caso, es recomendable utilizar suficientes concentraciones de ensayo para poder hacer una buena estimación del modelo. El factor entre concentraciones no sebe ser mayor que dos (puede permitirse una excepción en los casos en que la pendiente de la curva dosis-respuesta sea poco pronunciada). El número de réplicas de cada tratamiento puede reducirse si aumenta el número de concentraciones de ensayo con diferentes respuestas. El aumento del número de réplicas o la reducción del tamaño del intervalo entre concentraciones de ensayo tiende a estrechar los intervalos de confianza del ensayo. Si se han de estimar la supervivencia y el crecimiento de las larvas a los 10 días, es necesario emplear réplicas adicionales. | Diseño para estimar una NOEC/LOEC | 20. | Si hay que estimar la LOEC y/o la NOEC, se deben emplear cinco concentraciones de ensayo con un mínimo de cuatro réplicas y el factor entre concentraciones no debe exceder de dos. El número de réplicas debe ser suficiente para garantizar una potencia estadística adecuada que permita detectar una diferencia del 20 % respecto al control con un nivel de significación del 5 % (p = 0,05). Respecto a la tasa de desarrollo, suele ser adecuado un análisis de la varianza (ANOVA), como el ensayo de Dunnett o el de Williams (17) (18) (19) (20). Para la tasa de aparición, pueden emplearse el método de Cochran-Armitage, la prueba exacta de Fisher (con la corrección de Bonferroni), o el método de Mantel-Haenszel. | Ensayo límite | 21. | Puede llevarse a cabo un ensayo límite (una sola concentración de ensayo y un control) si no se han observado efectos en el ensayo previamente efectuado para seleccionar el rango de concentraciones. La finalidad del ensayo límite es someter a ensayo una concentración suficientemente elevada como para permitir a los responsables excluir cualquier efecto tóxico de la sustancia problema, y el límite se establece a una concentración que no se espera encontrar en la realidad en ninguna situación. Se recomienda la concentración de 1 000 mg/kg (peso seco). Generalmente hacen falta al menos seis réplicas tanto de las unidades de tratamiento como de las de control. Debe demostrarse una potencia estadística adecuada que permita detectar una diferencia del 20 % respecto al control con un nivel de significación del 5 % (p = 0,05). Con una respuesta métrica (tasa de desarrollo y peso), la prueba t es un método estadístico adecuado si los datos cumplen los requisitos de esta prueba (normalidad, varianzas homogéneas). Si estos requisitos no se satisfacen, puede utilizarse la prueba t de varianzas desiguales o una prueba no paramétrica, tal como la de Wilcoxon-Mann-Whithey. En relación con la tasa de aparición de adultos es adecuada la prueba exacta de Fisher. | PROCEDIMIENTO | Condiciones de exposición | Preparación del sistema sedimento enriquecido-agua | 22. | El procedimiento de enriquecimiento descrito en el método de ensayo C.8. Toxicidad para gusanos de tierra es el recomendado para su aplicación a la sustancia problema (14). Los sedimentos enriquecidos se colocan en los recipientes y se añade agua sobrenadante para conseguir una relación de volumen sedimento-agua de 1:4 (véanse los puntos 11 y 15). La altura de la capa de sedimento debe estar entre 1,5 y 3 cm. Para evitar que se separen los ingredientes del sedimento y se resuspendan las partículas finas durante la adición del agua de ensayo a la columna de agua, puede cubrirse el sedimento con un disco de plástico mientras se vierte el agua encima, y retirar el disco inmediatamente a continuación. Puede ser adecuado también utilizar otros dispositivos. | 23. | Los recipientes de ensayo tienen que estar cubiertos (por ejemplo, con placas de vidrio). Cuando sea necesario, manténgase durante el estudio el volumen de agua inicial añadiendo agua para compensar la evaporación de esta. Para esta operación debe utilizarse agua destilada o desionizada a fin de evitar la formación de sales. | Estabilización | 24. | Una vez preparado el sedimento enriquecido con el agua sobrenadante, es conveniente dejar que la sustancia problema se reparta pasando de la fase acuosa al sedimento (3) (4) (6) (13). Esto debe efectuarse de preferencia en las mismas condiciones de temperatura y aireación que el ensayo. El tiempo adecuado para el equilibrado depende de la sustancia y del sedimento, y puede ser del orden de horas o de días, aunque en ciertos casos raros puede llegar a ser de varias semanas (4 o 5 semanas). Como esto daría ocasión para la degradación de muchas sustancias, no se espera hasta alcanzar el equilibrio completo, sino que se recomienda un período de equilibrado de 48 h. Al final de este período de equilibrado, debe medirse la concentración de la sustancia problema en el agua sobrenadante, en el agua intersticial y en el sedimento, al menos a la concentración más elevada y a una inferior (véase el punto 38). Estas determinaciones analíticas de la sustancia problema permiten el cálculo del balance de masas y la expresión de los resultados sobre la base de las concentraciones medidas. | Adición de los organismos de ensayo | 25. | Cuatro o cinco días antes de añadir los organismos de ensayo a los recipientes de ensayo, deben tomarse de los cultivos masas de huevos y ponerlas en recipientes pequeños con medio de cultivo. Puede utilizarse medio viejo del cultivo madre o medio recién preparado. Si se utiliza este último, debe añadírsele una pequeña cantidad de alimento como, por ejemplo, algas verdes o unas gotitas de filtrado de una suspensión finamente molida de alimento para peces en copos (véase el apéndice 2). Solo deben utilizarse masas de huevos recién puestas. Normalmente, las larvas empiezan a salir de los huevos un par de días después de la puesta (de 2 a 3 días en el caso de Chironomus riparius a 20 °C y de 1 a 4 días en el de Chironomus tentans a 23 °C y en el de Chironomus yoshimatsui a 25 °C) y el crecimiento de las larvas tiene lugar en cuatro fases, cada una de entre 4 y 8 días de duración. En el ensayo deben utilizarse larvas de primera fase (2-3 o 1-4 días tras la eclosión). La fase de los animales puede comprobarse midiendo la anchura de la cápsula cefálica (6). | 26. | Se asignan aleatoriamente veinte larvas de primera fase a cada recipiente de ensayo que contenga el sedimento enriquecido y el agua, utilizando una pipeta de punta roma. Es necesario detener la aireación del agua mientras se ponen las larvas en los recipientes de ensayo y mantener la situación durante otras 24 horas tras la adición de las larvas (véanse los puntos 25 y 32). Según el diseño de ensayo empleado (véanse los puntos 19 y 20), el número de larvas utilizadas por concentración es de al menos 60 para la estimación puntual de la ECx y de 80 para la determinación de la NOEC. | Concentraciones de ensayo | 27. | Puede ser útil efectuar un ensayo preliminar para determinar el rango de concentraciones adecuadas para el ensayo definitivo. Con este fin se utiliza una serie de concentraciones de la sustancia problema, muy diferentes entre sí. A fin de proporcionar la misma densidad superficial por quironómido que se vaya a emplear para el ensayo definitivo, se exponen los quironómidos a cada concentración de la sustancia problema durante un plazo que permita la estimación de las concentraciones de ensayo adecuadas, y no hace falta utilizar réplicas. | 28. | Las concentraciones de ensayo para el ensayo definitivo se deciden sobre la base del resultado del ensayo de determinación del rango de concentraciones. Deben utilizarse al menos cinco concentraciones y seleccionarse como se describe en los puntos 18 a 20. | Controles | 29. | Deben incluirse en el ensayo, con el número adecuado de réplicas, recipientes de control sin sustancia problema pero con sedimento (véanse los puntos 19-20). Si se ha utilizado algún disolvente para aplicar la sustancia problema (véase el punto 16), debe añadirse un control del disolvente en el sedimento. | Sistema de ensayo | 30. | Se emplean sistemas estáticos. Pueden utilizarse en casos excepcionales sistemas semiestáticos o dinámicos con renovación intermitente o continua del agua sobrenadante, como, por ejemplo, si las especificaciones de calidad del agua se hacen inadecuadas para el organismo de ensayo o afectan al equilibrio químico (por ejemplo, cuando los niveles de oxígeno disuelto caen demasiado, la concentración de excrementos se eleva demasiado, o se lixivian minerales del sedimento con modificación del pH y/o de la dureza del agua). Sin embargo, normalmente será suficiente y preferible emplear otros métodos de mejora de la calidad del agua sobrenadante, como la aireación. | Alimentación | 31. | Es necesario alimentar a las larvas, de preferencia una vez al día o, al menos, tres veces por semana. Parece adecuada una ración diaria de comida para peces (suspensión en agua o comida finamente molida como, por ejemplo, Tetra-Min o Tetra-Phyll; véanse detalles en el apéndice 2), de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg para C. yoshimatsui) por larva durante los 10 primeros días. Las larvas de más edad pueden necesitar algo más de comida: entre 0,5 y 1 mg por larva al día debería ser suficiente durante el resto del ensayo. La ración alimentaria debe reducirse en todos los tratamientos y controles si se observa crecimiento de hongos o si se aprecia mortalidad en los controles. Si no puede detenerse el desarrollo fúngico, hay que repetir el ensayo. Cuando se someten a ensayo sustancias muy adsorbentes (por ejemplo, con log Kow > 5), o hay sustancias que se unen covalentemente al sedimento, es posible añadir al sedimento artificial, antes del período de estabilización, la cantidad de comida necesaria para garantizar la supervivencia y el crecimiento natural de los organismos. Con este objetivo, debe utilizarse material vegetal en lugar de la comida para peces, por ejemplo, adición de 0,5 % (peso seco) de hojas finamente molidas de ortiga mayor (Urtica dioica), morera (Morus alba), trébol blanco (Trifolium repens), espinaca (Spinacia oleracea) u otro material vegetal (Cerophyl o alfa-celulosa). | Condiciones de incubación | 32. | Se aporta aireación suave al agua sobrenadante de los recipientes de ensayo, preferentemente a las 24 h de la adición de las larvas, y se continúa a lo largo de todo el ensayo (debe tenerse cuidado para que la concentración de oxígeno disuelto no caiga por debajo del 60 % del valor de saturación en el aire). La aireación se aporta mediante una pipeta Pasteur de vidrio fijada a 2-3 cm por encima del nivel del sedimento, con el ritmo de una o unas pocas burbujas por segundo. Cuando se sometan a ensayo sustancias volátiles, debe considerarse el no airear el sistema sedimento-agua. | 33. | El ensayo se efectúa a la temperatura constante de 20 °C (± 2 °C). En el caso de C. tentans y de C. yoshimastsui, las temperaturas recomendadas son de 23 °C y 25 °C (± 2 °C), respectivamente. Se usa un fotoperíodo de 16 h, con una intensidad luminosa de 500 a 1 000 lux. | Duración de la exposición | 34. | La exposición comienza con la adición de larvas a los recipientes con sedimento enriquecido y a los de control. La duración máxima del ensayo es de 28 días en el caso de C. riparius y C. yoshimatsui, y de 65 días en el de C. tentans. Si los dípteros aparecen antes, es posible terminar el ensayo tras un mínimo de cinco días desde la aparición del último adulto en los recipientes de control. | Observaciones | Aparición de adultos | 35. | Se determinan el tiempo de desarrollo y el número total de dípteros machos y hembras que aparecen completamente. Los machos se identifican fácilmente por sus antenas plumosas. | 36. | Hay que observar los recipientes de ensayo al menos tres veces por semana para hacer una evaluación visual de los eventuales comportamientos anormales (por ejemplo, dejar el sedimento, nadar de forma inusual) respecto al control. Durante el tiempo en que se prevea que ha de ocurrir la aparición es necesario efectuar un recuento diario de los dípteros aparecidos. Se registran cada día el sexo y el número de los dípteros aparecidos completamente. Tras su identificación, se sacan los dípteros de los recipientes. Las eventuales masas de huevos puestas antes de la terminación del ensayo deben anotarse y después retirarse para evitar la reintroducción de larvas en el sedimento. También debe registrarse el número de pupas visibles de las que no han llegado a aparecer adultos. En el apéndice 5 se dan orientaciones sobre la medición de la aparición de los dípteros. | Crecimiento y supervivencia | 37. | Si han de proporcionarse datos sobre la supervivencia y el crecimiento de larvas a los 10 días, deben incluirse desde el principio recipientes de ensayo adicionales, de forma que puedan utilizarse después. El sedimento de estos recipientes adicionales se filtra a través de un tamiz de 250 μm para retener las larvas. Los criterios para determinar la muerte son la inmovilidad o la ausencia de reacción ante un estímulo mecánico. Las larvas no recuperadas deben contarse asimismo como muertas (las larvas que hayan muerto al inicio del ensayo pueden haber sido degradadas por los microbios). Se determina el peso seco (libre de cenizas) de las larvas supervivientes por recipiente de ensayo y se calcula el peso seco individual medio por recipiente. Es útil determinar a qué fase pertenecen las larvas supervivientes; para obtener este dato puede utilizarse la medición de la anchura de la cápsula cefálica de cada individuo. | Mediciones analíticas | Concentración de la sustancia problema | 38. | Antes de iniciar el ensayo (es decir, la adición de las larvas), se toman muestras de sedimento de al menos un recipiente por tratamiento para la determinación analítica de la concentración de la sustancia problema en el sedimento. Se recomienda que, como mínimo, se analicen muestras del agua sobrenadante, del agua intersticial y del sedimento al inicio (véase el punto 24) y al final del ensayo, a la concentración máxima y a una inferior. Estas determinaciones de la concentración de la sustancia problema informan sobre el comportamiento y el reparto de la sustancia problema en el sistema agua-sedimento. | 39. | Cuando se hagan mediciones intermedias (por ejemplo, el día no 7) y si los análisis necesitan grandes muestras que no puedan tomarse de los recipientes de ensayo sin influir en el sistema de ensayo, las determinaciones analíticas deben llevarse a cabo con muestras de recipientes de ensayo adicionales tratados de la misma manera (incluida la presencia de los organismos de ensayo) pero que no se utilizan para las observaciones biológicas. | 40. | El procedimiento recomendado para aislar el agua intersticial es la centrifugación, por ejemplo a 10 000 g y 4 °C durante 30 min. Sin embargo, si se demuestra que la sustancia problema no se adsorbe a los filtros, también puede aceptarse la filtración. En algunos casos puede resultar imposible analizar las concentraciones en el agua intersticial debido a que el tamaño de la muestra es demasiado pequeño. | Parámetros fisicoquímicos | 41. | Deben medirse de la manera adecuada el pH y la temperatura de los recipientes de ensayo (véase el punto 10). Hay que medir la dureza y el amoníaco en los controles y en un recipiente de ensayo a la concentración máxima, al inicio y al final del ensayo. | DATOS E INFORME | Tratamiento de los resultados | 42. | El objetivo de este ensayo es determinar el efecto de la sustancia completamente sobre la tasa de desarrollo y el número total de dípteros machos y hembras totalmente aparecidos o, en el caso de los efectos del ensayo de 10 días, sobre la supervivencia y el peso de las larvas. Si no hay ninguna señal de sensibilidades estadísticamente diferentes según los sexos, a efectos de análisis estadísticos pueden agruparse los resultados de machos y de hembras. Las diferencias de sensibilidad entre los sexos pueden evaluarse estadísticamente mediante, por ejemplo, una prueba de tabla de contingencia de χ2-r × 2. Cuando así se requiera, habrá que determinar la supervivencia de las larvas y su peso seco individual medio por recipiente al cabo de 10 días. | 43. | Las concentraciones que tienen efecto, expresadas en peso seco y sobre la base de este, se calculan preferentemente a partir de las concentraciones medidas en el sedimento al inicio del ensayo (véase el punto 38). | 44. | A efectos de computar una estimación puntual para la EC50 o cualquier otra ECx, las estadísticas por recipiente pueden utilizarse como réplicas verdaderas. Al calcular el intervalo de confianza para cualquier ECx, debe tenerse en cuenta la variabilidad entre recipientes, o bien hay que mostrar que esta variabilidad es tan pequeña que puede despreciarse. Cuando el modelo sigue el método de los mínimos cuadrados, debe aplicarse una transformación estadística por cada recipiente a fin de mejorar la homogeneidad de la varianza. Sin embargo, los valores de ECx deben calcularse después de haber vuelto a transformar la respuesta al valor original. | 45. | Cuando el análisis estadístico se dirige a determinar la NOEC/LOEC mediante contrastes de hipótesis, es necesario tener en cuenta la variabilidad entre recipientes, por ejemplo mediante un análisis de varianza anidado. También puede ser adecuado realizar ensayos más robustos (21) en situaciones en que no se cumplen las hipótesis de los análisis de varianza usuales. | Tasa de aparición | 46. | Las tasas de aparición son datos cuantales y pueden ser analizados por el método de Cochran-Armitage aplicado con ajuste secuencial de residuos cuando se prevé una relación dosis-respuesta monótona y estos datos son coherentes con dicha previsión. En caso contrario, puede utilizarse una prueba exacta de Fisher o el método de Mantel-Haenszel con los valores p ajustados según Bonferroni-Holm. Si hay pruebas de que la variabilidad entre réplicas dentro de la misma concentración es mayor de lo que indicaría una distribución binomial (lo que se señala generalmente como variación "extrabinomial"), hay que utilizar un método de Cochran-Armitage o una prueba exacta de Fisher robustos (como se propone en el punto 21). | Se determina la suma de dípteros aparecidos por recipiente, ne, y se divide por el número de larvas introducidas, na: | donde: | ER | = | tasa de aparición | ne | = | número de dípteros aparecidos por recipiente | na | = | número de larvas introducidas por recipiente | 47. | Otra posibilidad más adecuada para las muestras de gran tamaño, cuando hay variación extrabinomial, consiste en tratar la tasa de aparición como una respuesta continua y emplear procedimientos tales como la prueba de Williams cuando se prevé una relación dosis-respuesta monótona y es coherente con estos datos de tasa de aparición. La prueba de Dunnett sería apropiada si no se mantuviera la monotonía. Se define aquí como muestra de gran tamaño la que corresponde a la situación en que tanto el número de dípteros emergidos como el número de no emergidos es superior a cinco, por réplica (recipiente). | 48. | Para aplicar los métodos de análisis de la varianza, hay que transformar primero los valores de tasa de aparición mediante la transformación arcoseno de la raíz cuadrada o la transformación de Freeman-Tukey para obtener una distribución normal aproximada y uniformizar las varianzas. Cuando se usan las frecuencias absolutas es posible aplicar el método de Cochran-Armitage, la prueba exacta de Fisher (Bonferroni), o el método de Mantel-Haenszel. La transformación arcoseno de la raíz cuadrada se aplica tomando el arcoseno (sen-1) de la raíz cuadrada de la tasa de aparición. | 49. | Respecto a las tasas de aparición, los valores de ECx se calculan mediante análisis de regresión [o, por ejemplo, probit (22), logit, Weibull, programas comerciales apropiados, etc.]. Si no sirve el análisis de regresión (por ejemplo, cuando hay menos de dos respuestas parciales), se utilizan otros métodos no paramétricos, tales como la media móvil o la interpolación simple). | Tasa de desarrollo | 50. | El tiempo de desarrollo medio corresponde al intervalo medio de tiempo entre la introducción de las larvas (día 0 del ensayo) y la aparición de la cohorte experimental de dípteros (para el cálculo del tiempo de desarrollo verdadero debe tenerse en cuenta la edad de las larvas en el momento de su introducción). La tasa de desarrollo es la inversa del tiempo de desarrollo (unidades: 1/día) y corresponde a la porción de desarrollo larvario que se produce en un día. Es preferible utilizar la tasa de desarrollo para evaluar estos estudios de toxicidad en los sedimentos, ya que su varianza es menor y es más homogénea y próxima a la distribución normal que el tiempo de desarrollo. Por tanto, pueden usarse procedimientos de ensayos paramétricos más potentes con la tasa de desarrollo que con el tiempo de desarrollo. Considerando a la tasa de desarrollo como respuesta continua, es possible estimar valores de ECx mediante análisis de regresión [por ejemplo, (23), (24)]. | 51. | En relación con las siguientes pruebas estadísticas, se supone que el número de dípteros observados en el día de inspección x ha aparecido a la media del intervalo de tiempo entre el día x y el día x - l (l = longitud del intervalo de inspección, que es normalmente de 1 día). La tasa de desarrollo media por recipiente (x) se calcula con ayuda de la siguiente fórmula: | donde: | : | tasa de desarrollo media por recipiente, | i | : | índice del intervalo de inspección, | m | : | número máximo de intervalos de inspección, | : | número de dípteros aparecidos en el intervalo de inspección i, | ne | : | número total de dípteros aparecidos al final del experimento (= | ), | xi | : | tasa de desarrollo de los dípteros aparecidos en el intervalo i, | donde: | dayi | : | día de inspección (días desde la aplicación), | li | : | longitud del intervalo de inspección i (en días, generalmente 1 día). | Informe del ensayo | 52. | El informe del ensayo debe dar, como mínimo, la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (hidrosolubilidad, presión de vapor, coeficiente de reparto en el suelo (o en el sedimento, si se conoce), estabilidad en el agua, etc.). | — | Datos de identificación química (nombre común, nombre químico, fórmula estructural, número CAS, etc.), incluida la pureza y el método de análisis cuantitativo de la sustancia problema. | | Especie de ensayo: | — | Animales utilizados en el ensayo: especie, nombre científico, origen de los organismos y condiciones de cría. | — | Información sobre la manipulación de las masas de huevos y de las larvas. | — | Edad de los animales de ensayo cuando se introducen en los recipientes de ensayo. | | Condiciones de ensayo: | — | Sedimento utilizado, es decir, si es natural o artificial. | — | En el caso del sedimento natural, ubicación y descripción del lugar de muestreo del sedimento, incluyendo, si se puede, un historial de la contaminación; características: pH, contenido de carbono orgánico, relación C/N y granulometría (cuando sea apropiado). | — | Preparación del sedimento artificial: ingredientes y características (contenido de carbono orgánico, pH, humedad, etc., al inicio del ensayo). | — | Preparación del agua de ensayo (si se utiliza agua reconstituida) y características (concentración de oxígeno, pH, conductividad, dureza, etc., al inicio del ensayo). | — | Altura del sedimento y del agua sobrenadante. | — | Volumen del agua sobrenadante y del agua intersticial, peso del sedimento húmedo con y sin agua intersticial. | — | Recipientes de ensayo (material y tamaño). | — | Método para enriquecer el sedimento: concentraciones de ensayo utilizadas, número de réplicas y empleo eventual de disolvente. | — | Fase de estabilización (equilibrado) del sistema sedimento enriquecido – agua: duración y condiciones. | — | Condiciones de incubación: temperatura, intensidad y ciclo de luz, aireación (frecuencia e intensidad). | — | Información detallada sobre la alimentación de los animales, incluidos el tipo de alimento, la preparación, la cantidad y el régimen alimentario. | | Resultados: | — | Concentraciones de ensayo nominales, concentraciones de ensayo medidas y resultados de todos los análisis efectuados para determinar la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo. | — | Calidad del agua de los recipientes de ensayo, es decir, pH, temperatura, oxígeno disuelto, dureza y amoníaco. | — | Sustitución del agua de ensayo evaporada, en su caso. | — | Número de dípteros machos y hembras aparecidos por recipiente y por día. | — | Número de larvas que no han aparecido como dípteros por recipiente. | — | Peso seco individual medio de las larvas por recipiente, y por fase, en caso apropiado. | — | Porcentaje de apariciones por réplica y concentración de ensayo (sin distinguir entre dípteros machos y hembras). | — | Tasa de desarrollo media de los dípteros aparecidos completamente por réplica y tasa de tratamiento (sin distinguir entre dípteros machos y hembras). | — | Estimación de los parámetros de toxicidad como, por ejemplo, ECx (con intervalos de confianza asociados), NOEC y/o LOEC, y métodos estadísticos empleados para su determinación. | — | Discusión de los resultados del ensayo, incluida la eventual influencia que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp. 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). 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Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. | Apéndice 1 | DEFINICIONES | A efectos del presente método de ensayo, aplicarán las siguientes definiciones: | Sedimento artificial (o sedimento reconstituido, formulado o sintético): una mezcla de materiales empleada para imitar los componentes físicos de un sedimento natural. | Agua sobrenadante: el agua situada sobre el sedimento en el recipiente de ensayo. | Agua intersticial: el agua que ocupa el espacio entre el sedimento y las partículas del suelo. | Sedimento enriquecido: el sedimento al que se ha añadido sustancia problema. | Sustancia problema: toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este método de ensayo. | Apéndice 2 | Recomendaciones para el cultivo de Chironomus riparius | 1. | Las larvas de Chironomus pueden criarse en cristalizadores o en recipientes más grandes. Sobre el fondo del recipiente se extiende arena de cuarzo fina, en una capa delgada de unos 5 a 10 mm de espesor. Se ha comprobado que la tierra de diatomeas (por ejemplo, Merck, Art 8117) también constituye un sustrato adecuado (es suficiente una capa más fina, de muy pocos milímetros). A continuación se añade agua adecuada hasta una altura de varios centímetros. Los niveles deben mantenerse rellenando con agua en la medida necesaria para compensar las pérdidas por evaporación y evitar la desecación. En caso necesario, es posible sustituir el agua. Debe aportarse una aireación suave. Los recipientes de cría de las larvas deben mantenerse en una jaula adecuada para evitar que se escapen los adultos que aparezcan. La jaula debe ser lo suficientemente grande como para permitir el enjambrado de los adultos aparecidos, ya que en caso contrario puede que no haya copulación (las dimensiones mínimas son de unos 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Las jaulas deben mantenerse a temperatura ambiente o en una zona de ambiente constante a 20 ± 2 °C con un fotoperíodo de 16 horas de luz (de intensidad alrededor de 1 000 lux) y 8 horas de oscuridad. Se ha comunicado que una humedad relativa del aire de menos del 60 % puede impedir la reproducción. | Agua de dilución | 3. | Puede emplearse cualquier agua natural o sintética que sea adecuada. Se suelen utilizar agua de pozo, agua del grifo desclorada y medios artificiales (como, por ejemplo, medio M4 o M7 de Elendt, véase más abajo). Es necesario airear el agua antes de emplearla. En caso necesario, el agua de cultivo puede renovarse sacando cuidadosamente, por vertido o con sifón, el agua usada de los recipientes de cultivo, sin destruir los tubos de las larvas. | Alimentación de las larvas | 4. | Las larvas de Chironomus deben alimentarse con comida para peces en copos (Tetra Min®, Tetra Phyll® u otra marca similar de comida comercial para peces), al ritmo de aproximadamente 250 mg por recipiente al día. Puede administrarse como polvo molido seco o como suspensión en agua: se añade 1,0 g de comida en copos a 20 ml de agua de dilución y se mezcla para obtener un resultado homogéneo. Esta preparación puede administrarse al ritmo de unos 5 ml por recipiente al día y ha de agitarse antes de usarse. Las larvas más viejas pueden recibir más cantidad. | 5. | La alimentación se ajusta según la calidad del agua. Si el medio de cultivo se pone turbio, hay que reducir la alimentación. Es necesario supervisar cuidadosamente la adición de comida. Si la comida es demasiado escasa, se provocará la emigración de las larvas hacia la columna de agua, mientras que si es excesiva aumentará la actividad microbiana y se reducirá la concentración de oxígeno. Ambas situaciones pueden producir un descenso de la tasa de crecimiento. | 6. | Es posible añadir también algunas células de algas verdes (como, por ejemplo, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) cuando se establecen recipientes de cultivo nuevos. | Alimentación de los adultos aparecidos | 7. | Algunos experimentadores han sugerido que un disco de algodón empapado en una solución saturada de sacarosa puede servir de alimento para los adultos aparecidos. | Aparición de adultos | 8. | A 20 ± 2 °C, los adultos empiezan a aparecer en los recipientes de cría de larvas a los 13-15 días aproximadamente. Los machos se distinguen fácilmente porque tienen antenas plumosas. | Masas de huevos | 9. | Una vez haya adultos en la jaula de cría, deben supervisarse todos los recipientes de cría de larvas tres veces por semana para observar la puesta de masas gelatinosas de huevos. Cuando se encuentren, las masas de huevos deben retirarse cuidadosamente y transferirse a una pequeña placa que contenga una muestra del agua de cría. Las masas de huevos se emplean para iniciar un nuevo recipiente de cultivo (por ejemplo, 2-4 masas de huevos por recipiente) o para los ensayos de toxicidad. | 10. | Las larvas en primer estadio deben salir de los huevos al cabo de 2 – 3 días. | Establecimiento de nuevos recipientes de cultivo | 11. | Cuando se hayan establecido los cultivos, debe ser posible establecer un nuevo recipiente de cultivo de larvas cada semana o con menos frecuencia, según los requisitos de cultivo, eliminando los recipientes más viejos una vez han aparecido los dípteros adultos. Con este sistema, se obtendrá un suministro regular de adultos, con una gestión mínima. | Preparación de las soluciones de ensayo M4 y M7 | 12. | Elendt (1990) describió el medio M4. El M7 se prepara como el medio M4, salvo en lo relativo a las sustancias indicadas en el cuadro 1, cuyas concentraciones son cuatro veces más bajas en el medio M7 que en el M4. Se está preparando una publicación sobre el medio M7 (Elendt, comunicación personal). La solución de ensayo no debe prepararse siguiendo a Elendt y Bias (1990), ya que no son adecuadas las concentraciones de NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 y K2HPO4 dadas para la preparación de las soluciones madre. | Preparación del medio M7 | 13. | Las soluciones madre (I) se preparan por separado cada una y a partir de ellas se prepara una solución madre combinada (II) (véase el cuadro 1). Se toman 50 ml de la solución madre combinada (II) junto con las cantidades de solución madre de cada macronutriente que se dan en el cuadro 2 y se llevan a 1 litro con agua desionizada para preparar el medio M7. Se prepara una solución madre de vitaminas añadiendo tres vitaminas a agua desionizada como se indica en el cuadro 3, y se añaden al medio M7 final 0,1 ml de la solución madre de vitaminas combinadas, poco antes de su empleo (la solución madre de vitaminas se conserva congelada en pequeñas partes alícuotas). El medio se airea y se estabiliza. | BIBLIOGRAFÍA: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | Cuadro 1 | Soluciones madre de oligoelementos para los medios M4 y M7 | Soluciones madre (I) | Cantidad (mg) enrasada a 1 litro con agua desionizada | Para preparar la solución madre combinada (II): mezclar las siguientes cantidades (ml) de soluciones madre (I) y enrasar a 1 litro con agua desionizada | Concentraciones finales en las soluciones de ensayo (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (8) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (8) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (8) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (8) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (8) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (8) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (8) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (8) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (8) (9) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (8) (9) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Cuadro 2 | Soluciones madre de macronutrientes para los medios M4 y M7 | | Cantidad enrasada a 1 litro con agua desionizada | (mg) | Cantidad de soluciones madre de macronutrientes añadida para preparar los medios M4 y M7 | (ml/l) | Concentraciones finales en las soluciones de ensayo de M4 y M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Cuadro 3 | Solución madre de vitaminas para los medios M4 y M7. Las tres soluciones de vitaminas se combinan para formar una única solución madre de vitaminas | | Cantidad enrasada a 1 litro con agua desionizada | (mg) | Cantidad de solución madre de vitaminas añadida para preparar los medios M4 y M7 | (ml/l) | Concentraciones finales en las soluciones de ensayo de M4 y M7 | (mg/l) | Clorhidrato de tiamina | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianocobalamina (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotina | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | BIBLIOGRAFÍA: | Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. | Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. | Apéndice 3 | PREPARACIÓN DEL SEDIMENTO ARTIFICIAL | Composición del sedimento | La composición del sedimento artificial debe ser la siguiente: | Componente | Características | % de sedimento | en peso seco | Turba | Turba esfágnea, de pH lo más próximo posible a 5,5-6,0, sin restos vegetales visibles, finamente molida (tamaño de partícula ≤ 1 mm) y secada al aire | 4 - 5 | Arena de cuarzo | Granulometría: > 50 % de las partículas deben encontrarse en la banda de 50-200 μm | 75 - 76 | Caolín | Contenido en caolinita ≥ 30 % | 20 | Carbono orgánico | Ajustado mediante adición de turba y arena | 2 (± 0,5) | Carbonato de calcio | CaCO3, pulverizado, químicamente puro | 0,05 - 0,1 | Agua | Conductividad ≤ 10 μS/cm | 30 - 50 | Preparación | La turba se seca al aire y se tritura hasta convertirse en un polvo fino. Se prepara en agua desionizada una suspensión de la cantidad necesaria de polvo de turba, utilizando un dispositivo de homogeneización de prestaciones elevadas. El pH de esta suspensión se ajusta a 5,5 ± 0,5 con CaCO3. La suspensión se deja durante al menos dos días con agitación suave a 20 ± 2 °C, para estabilizar el pH e implantar un componente microbiano estable. Se vuelve a medir el pH, que debe quedar a 6,0 ± 0,5. A continuación se mezcla la suspensión de turba con los demás componentes (arena y caolín) y con agua desionizada para obtener un sedimento homogéneo con un contenido de agua del 30-50 % del peso seco del sedimento. Se vuelve a medir el pH de la mezcla final y se ajusta a 6,5-7,5 con CaCO3 en caso necesario. Se toman muestras del sedimento para determinar el peso seco y el contenido en carbono orgánico. Se recomienda a continuación que el sedimento artificial, antes de emplearse en el ensayo de toxicidad para quironómidos, se someta durante siete días a las mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo. | Almacenamiento | Los componentes secos utilizados para preparar el sedimento artificial pueden almacenarse en un lugar fresco y seco, a temperatura ambiente. El sedimento (húmedo) ya preparado no debe almacenarse antes de su empleo en el ensayo. Debe utilizarse inmediatamente tras el tiempo de acondicionamiento de 7 días con que termina su preparación. | BIBLIOGRAFÍA: | Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra. | Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. | Apéndice 4 | Características químicas aceptables del agua de dilución | Sustancia | Concentraciones | Materia en partículas | < 20 mg/l | Carbono orgánico total | < 2 mg/l | Amoníaco no ionizado | < 1 μg/l | Dureza expresada en CaCO3 | < 400 mg/l (*3) | Cloro residual | < 10 μg/l | Plaguicidas organofosforados totales | < 50 ng/l | Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlorados | < 50 ng/l | Cloro orgánico total | < 25 ng/l | Apéndice 5 | Orientaciones para el seguimiento de la aparición de las larvas de quironómidos | Se ponen trampas de aparición en los vasos del ensayo. Estas trampas tienen que mantenerse desde el día 20 hasta el final del ensayo. A continuación figura el esquema de un ejemplo de trampa: | C. 28. ENSAYO DE TOXICIDAD PARA QUIRONÓMIDOS EN SISTEMAS SEDIMENTOS-AGUA CON AGUA ENRIQUECIDA | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 219 (2004). El presente método de ensayo está diseñado para evaluar los efectos de la exposición prolongada de sustancias sobre las larvas del díptero de agua dulce Chironomus sp., que viven en los sedimentos. Se basa principalmente en las directrices del BBA, que utiliza un sistema de ensayo sedimento-agua con suelo artificial, y una situación de exposición en la columna de agua (1). También tiene en cuenta los actuales protocolos de ensayo de toxicidad para Chironomus riparius y Chironomus tentans que se han elaborado en Europa y en América del Norte (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) y se han sometido a ensayos interlaboratorios (1) (6) (9). Pueden utilizarse asimismo otras especies de quironómidos bien decumentadas como, por ejemplo, Chironomus yoshimatsui (10) (11). | 2. | La situación de exposición empleada en el presente método de ensayo es el enriquecimiento del agua. La selección de la situación de exposición adecuada depende de la aplicación que se prevea para el ensayo. La situación de exposición en agua, que implica el enriquecimiento de la columna de agua, pretende simular un caso de aerosol errático de un plaguicida y comprende el pico inicial de concentraciones en el agua intersticial. También es útil para otros tipos de exposición (incluidos los vertidos de sustancias), salvo los procesos de acumulación que duren más que el período de ensayo. | 3. | Las sustancias que tienen que someterse a ensayo respecto a organismos que viven en los sedimentos suelen permanecer en este compartimento durante largos plazos. Los organismos que viven en los sedimentos pueden estar expuestos a través de varias vías de exposición. La importancia relativa de cada vía de exposición, y el tiempo que tarda cada una de ellas en contribuir a los efectos tóxicos generales, dependen de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia correspondiente. En el caso de las sustancias que se adsorben fuertemente (por ejemplo, con log Kow > 5) o en el de las sustancias que se unen covalentemente con el sedimento, la ingestión de alimentos contaminados puede constituir una vía de exposición significativa. A fin de no subestimar la toxicidad de sustancias muy lipofílicas, puede considerarse la adición de alimentos al sedimento antes de aplicar la sustancia problema. Para tener en cuenta todas las vías potenciales de exposición, el presente método de ensayo insiste en la exposición a largo plazo. La duración del ensayo está en la banda de 20 a 28 días en el caso de C. riparius y C. yoshimatsui, y de 28 a 65 días en el de C. tentans. Si se necesitan datos a un plazo más corto con algún fin específico como, por ejemplo, para investigar los efectos de sustancias inestables, es posible retirar réplicas paralelas adicionales tras un plazo de diez días. | 4. | Los parámetros medidos son el número total de adultos que aparecen y el tiempo transcurrido hasta la aparición. Se recomienda que las mediciones de supervivencia y crecimiento de las larvas no se hagan hasta que hayan pasado diez días si se necesitan datos adicionales a corto plazo, utilizando réplicas adicionales cuando convenga. | 5. | Se recomienda el uso de sedimentos artificiales, que presentan diversas ventajas sobre los sedimentos naturales: | — | se reduce la variabilidad experimental porque se constituye una "matriz normalizada" reproducible y desaparece la necesidad de conseguir fuentes de sedimentos limpios y no contaminados, | — | pueden iniciarse los ensayos en cualquier momento sin problemas de variabilidad estacional del sedimento en cuestión, y no es necesario aplicar ningún tratamiento previo al sedimento para eliminar la fauna endógena; el uso de un sedimento artificial reduce también el coste asociado con la recogida de campo de cantidades suficientes de sedimentos para los ensayos sistemáticos, | — | el uso de sedimento artificial permite comparar la toxicidad de las sustancias y clasificarlas en consecuencia: son comparables los datos de toxicidad obtenidos de ensayos realizados con sedimentos naturales y artificiales en relación con diversas sustancias (2). | 6. | En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 7. | Se exponen quironómidos de la primera fase del estado larvario a una serie de concentraciones de la sustancia problema en sistemas sedimento-agua. El ensayo se inicia poniendo larvas de primer estadio en vasos de ensayo que contienen el sistema sedimento-agua y a continuación se añade al agua la sustancia problema. Al final del ensayo se mide la tasa de aparición y de desarrollo de quironómidos. También es posible medir la supervivencia y el peso de las larvas a los 10 días en caso necesario, utilizando réplicas adicionales cuando proceda. Estos datos se analizan o bien usando un modelo de regresión para estimar la concentración que provocaría una reducción del x % en la aparición o en la supervivencia o el crecimiento de las larvas (por ejemplo, EC15, EC50, etc.), o bien realizando contrastes estadísticos de hipótesis para determinar la NOEC/LOEC. Esta última posibilidad exige la comparación de valores que tienen efectos con valores de control, utilizando pruebas estadísticas. | INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA | 8. | Deben conocerse la hidrosolubilidad de la sustancia problema, su presión de vapor, su reparto medido o calculado en el sedimento y su estabilidad en el agua y en el sedimento. Para cuantificar la sustancia problema presente en el agua sobrenadante, en el agua intersticial y en el sedimento, debe disponerse de un método analítico fiable, cuya precisión y límite de detección sean conocidos y se indiquen. Entre la información útil se incluyen la fórmula estructural y la pureza de la sustancia problema. También es útil la información sobre el destino químico de la sustancia problema (por ejemplo, disipación, degradación abiótica y biótica, etc.). En la referencia 12 se ofrece más orientación sobre los ensayos de sustancias con propiedades fisicoquímicas que dificultan la realización del ensayo. | SUSTANCIAS DE REFERENCIA | 9. | Puede realizarse periódicamente un ensayo con sustancias de referencia, para asegurarse de la fiabilidad del protocolo y de las condiciones del ensayo. Las siguientes sustancias son ejemplos de tóxicos de referencia utilizados con éxito en estudios interlaboratorios y de validación: lindano, trifluralina, pentaclorofenol, cloruro de cadmio y cloruro de potasio (1) (2) (5) (6) (13). | VALIDEZ DEL ENSAYO | 10. | Para que el ensayo sea válido deben darse las condiciones siguientes: | — | la aparición de adultos en los controles no ha de ser inferior al 70 % al final del ensayo (1) (6), | — | la aparición de adultos de C. riparius y C. yoshimatsui en los recipientes de control debe producirse cuando hayan transcurrido entre 12 y 23 días desde su introducción en los recipientes; en el caso de C. tentans es necesario un plazo de entre 20 y 65 días, | — | al final del ensayo deben medirse en cada recipiente el pH y la concentración de oxígeno disuelto; la concentración de oxígeno debe ser al menos el 60 % del valor de saturación en el aire a la temperatura aplicada, y el pH del agua sobrenadante debe estar en el rango de 6 a 9 en todos los recipientes de ensayo, | — | la temperatura del agua no debe variar en más de ± 1,0 °C; la temperatura del agua podría controlarse mediante un espacio isotérmico y, en tal caso, debería confirmarse la temperatura ambiente de ese espacio a intervalos apropiados. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Recipientes de ensayo | 11. | El estudio se lleva a cabo en vasos de vidrio de 600 ml de capacidad y 8 cm de diámetro. Pueden utilizarse otros recipientes que garanticen una altura adecuada de sedimento y de agua sobrenadante. La superficie del sedimento debe ser suficiente para que correspondan de 2 a 3 cm2 por larva. La proporción de la altura de la capa de sedimento respecto a la altura del agua sobrenadante debe ser de 1:4. Los recipientes de ensayo y demás instrumentos que hayan de entrar en contacto con el sistema de ensayo serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte como, por ejemplo, teflón. | Selección de las especies | 12. | La especie que debe usarse preferentemente en el ensayo es Chironomus riparius. También es adecuada la especie Chironomus tentans, pero resulta más difícil de manejar y requiere un período de ensayo más largo. Asimismo es posible utilizar Chironomus yohimatsui. En el apéndice 2 se da información sobre los métodos de cultivo de Chironomus riparius. También se dispone de información sobre las condiciones de cultivo de otras especies, como Chironomus tentans (4) y Chironomus yoshimatsui (11). Hay que confirmar la identificación de la especie antes de realizar los ensayos, pero no es necesario hacerlo antes de cada ensayo si los organismos proceden de un cultivo del propio laboratorio. | Sedimento | 13. | Es preferible utilizar un sedimento artificial (también denominado formulado, reconstituido o sintético). Sin embargo, si se utiliza sedimento natural, deben determinarse sus características (al menos, el pH y el contenido de carbono, pero es recomendable incluir otros parámetros, como la relación C/N y la granulometría), y debe estar exento de toda contaminación y de otros organismos que pudieran competir con los quironómidos o consumirlos. También se recomienda que el sedimento natural, antes de emplearse en un ensayo de toxicidad para quironómidos, se someta durante siete días a las mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo. Se recomienda utilizar en este ensayo (1) (15) (16) el siguiente sedimento artificial, basado en el suelo artificial empleado en el método de ensayo C.8 (14): | a) | 4-5 % de turba (peso seco): de pH lo más próximo posible a la banda 5,5-6,0; es importante utilizar turba en forma de polvo, finamente molida (tamaño de partícula ≤ 1 mm) y secada solo al aire; | b) | 20 % de caolín (peso seco), con un contenido de caolinita preferentemente superior al 30 %; | c) | 75-76 % de arena de cuarzo (peso seco); debe predominar la arena fina, con más del 50 % de las partículas de un tamaño entre 50 y 200 μm; | d) | agua desionizada para obtener un contenido de humedad en la mezcla final en el rango de 30 a 50 %; | e) | carbonato de calcio de calidad químicamente pura (CaCO3) añadido para ajustar el pH de la mezcla final del sedimento a 7,0 ± 0,5; | f) | el contenido de carbono orgánico de la mezcla final debe ser del 2 % (± 0,5 %), ajustado mediante el empleo de cantidades adecuadas de turba y arena, según las letras a) y c). | 14. | Debe conocerse el origen de la turba, del caolín y de la arena. Hay que comprobar que los componentes del sedimento no presentan contaminación química (por ejemplo, con metales pesados, compuestos organoclorados, compuestos organofosforados, etc.). En el apéndice 3 se describe un ejemplo de preparación del sedimento artificial. Puede aceptarse también la mezcla de componentes secos si se demuestra que, tras la adición de agua sobrenadante, no se produce separación de los componentes del sedimento (por ejemplo, flotación de partículas de turba), y que la turba o el sedimento están suficientemente acondicionados. | Agua | 15. | Es adecuada como agua para el ensayo cualquier agua que se ajuste a las características químicas de un agua de dilución aceptable según se indica en los apéndices 2 y 4. Puede utilizarse como agua de cultivo y agua de ensayo cualquier agua adecuada, agua natural (superficial o subterránea), agua reconstituida (véase el apéndice 2) o agua del grifo desclorada, siempre que los quironómidos sobrevivan en ella durante las fases de cultivo y ensayo sin mostrar signos de presión. Al inicio del ensayo, el pH del agua de ensayo debe estar entre 6 y 9 y la dureza total no debe superar el valor de 400 mg/l en CaCO3. Sin embargo, si se sospecha interacción entre los iones responsables de la dureza y la sustancia problema, debe utilizarse agua menos dura (por tanto, en esta situación no debe emplearse el medio M4 de Elendt). Debe usarse el mismo tipo de agua a lo largo de todo el estudio. Las características de calidad del agua recogidas en el apéndice 4 deben medirse al menos dos veces al año o cuando se sospeche que pueden haber cambiado de forma significativa. | Soluciones madre — agua enriquecida | 16. | Las concentraciones de ensayo se calculan a partir de las concentraciones en la columna de agua, es decir, en el agua sobrenadante, que recubre al sedimento. Las soluciones de ensayo de las concentraciones elegidas se preparan por dilución de una solución madre. A ser posible, estas soluciones madre deben prepararse disolviendo la sustancia en medio de ensayo. En algunos casos puede ser necesario utilizar disolventes o dispersantes para obtener una solución madre a la concentración deseada. Como ejemplos de disolventes adecuados pueden darse los siguientes: etanol, metanol, éter monometílico de etilenglicol, éter dimetílico de etilenglicol, dimetilformamida y trietilenglicol. Los dispersantes utilizables son Cremaphor RH40, Tween 80, metilcelulosa al 0,01 % y HCO-40. La concentración del agente solubilizante en el medio de ensayo final debe ser mínima (es decir, ≤ 0,1 ml/l) y la misma en todos los tratamientos. Si se emplea un agente solubilizante, no debe actuar de forma significativa sobre la supervivencia ni producir efectos nocivos visibles sobre las larvas de quironómidos, lo cual ha de demostrarse en un lote de control que solo lleve disolvente. No obstante, debe hacerse todo lo posible por evitar el uso de dichas sustancias. | DISEÑO DEL ENSAYO | 17. | El diseño del ensayo se refiere a la selección del número de concentraciones de ensayo y al intervalo entre las mismas, al número de recipientes por concentración y al número de larvas por recipiente. Se describen los diseños para la estimación puntual de la EC y de la NOEC, así como para realizar un ensayo límite. Es preferible el análisis de regresión antes que el planteamiento de contrastes de hipótesis. | Diseño para análisis de regresión | 18. | La concentración con efecto (por ejemplo, EC15, EC50) y el rango de concentraciones en la que resulta interesante el efecto de la sustancia problema, tienen que estar abarcadas entre las concentraciones incluidas en el ensayo. En general, la exactitud y, sobre todo, la validez con la que pueden hacerse las estimaciones de las concentraciones con efecto (ECx) mejoran cuando la concentración con efecto se encuentra dentro del rango de concentraciones ensayadas. Debe evitarse extrapolar muy por debajo de la menor concentración positiva o por encima de la concentración máxima. Es conveniente efectuar previamente un ensayo para seleccionar el rango de concentraciones que se deba utilizar (véase el punto 27). | 19. | Si ha de estimarse la ECx, deben someterse a ensayo al menos cinco concentraciones y tres réplicas por cada concentración. En cualquier caso, es recomendable utilizar suficientes concentraciones de ensayo para poder hacer una buena estimación del modelo. El factor entre concentraciones no sebe ser mayor que dos (puede permitirse una excepción en los casos en que la pendiente de la curva dosis-respuesta sea poco pronunciada). El número de réplicas de cada tratamiento puede reducirse si aumenta el número de concentraciones de ensayo con diferentes respuestas. El aumento del número de réplicas o la reducción del tamaño del intervalo entre concentraciones de ensayo tiende a estrechar los intervalos de confianza del ensayo. Si se han de estimar la supervivencia y el crecimiento de las larvas a los 10 días, es necesario emplear réplicas adicionales. | Diseño para estimar una NOEC/LOEC | 20. | Si hay que estimar la LOEC y/o la NOEC, se deben emplear cinco concentraciones de ensayo con un mínimo de cuatro réplicas y el factor entre concentraciones no debe exceder de dos. El número de réplicas debe ser suficiente para garantizar una potencia estadística adecuada que permita detectar una diferencia del 20 % respecto al control con un nivel de significación del 5 % (p = 0,05). Respecto a la tasa de desarrollo, suele ser adecuado un análisis de la varianza (ANOVA), como el ensayo de Dunnett o el de Williams (17) (18) (19) (20). Para la tasa de aparición, pueden emplearse el método de Cochran-Armitage, la prueba exacta de Fisher (con la corrección de Bonferroni), o el método de Mantel-Haenszel. | Ensayo límite | 21. | Puede llevarse a cabo un ensayo límite (una sola concentración de ensayo y un control) si no se han observado efectos en el ensayo previamente efectuado para seleccionar la banda de concentraciones. El objetivo del ensayo límite es indicar que el valor tóxico de la sustancia problema es superior a la concentración límite estudiada. No es posible formular en el presente método de ensayo ninguna sugerencia de concentración recomendada; queda al criterio de las autoridades reguladoras. Generalmente hacen falta al menos seis réplicas tanto de las unidades de tratamiento como de las de control. Debe demostrarse una potencia estadística adecuada que permita detectar una diferencia del 20 % respecto al control con un nivel de significación del 5 % (p = 0,05). Con una respuesta métrica (tasa de desarrollo y peso), la prueba t es un método estadístico adecuado si los datos cumplen los requisitos de esta prueba (normalidad, varianzas homogéneas). Si estos requisitos no se satisfacen, puede utilizarse la prueba t de varianzas desiguales o una prueba no paramétrica, tal como la de Wilcoxon-Mann-Whithey. En relación con la tasa de aparición de adultos es adecuada la prueba exacta de Fisher. | PROCEDIMIENTO | Condiciones de exposición | Preparación del sistema agua enriquecida-sedimento | 22. | Se añaden a los recipientes de ensayo cantidades adecuadas del sedimento artificial (véanse los puntos 13-14 y el apéndice 3) para formar una capa de al menos 1,5 cm. Se añade agua hasta una altura de 6 cm (véase el punto 15). La proporción de la altura de la capa de sedimento respecto a la altura del agua no debe ser mayor que 1:4, y la capa de sedimento no debe tener una altura mayor que 3 cm. El sistema sedimento-agua debe dejarse con aireación suave durante siete días antes de que se añadan los organismos de ensayo (véanse el punto 14 y el apéndice 3). Para evitar que se separen los ingredientes del sedimento y se resuspendan las partículas finas durante la adición del agua de ensayo a la columna de agua, puede cubrirse el sedimento con un disco de plástico mientras se vierte el agua encima, y retirar el disco inmediatamente a continuación. Puede ser adecuado también utilizar otros dispositivos. | 23. | Los recipientes de ensayo tienen que estar cubiertos (por ejemplo, con placas de vidrio). Cuando sea necesario, manténgase durante el estudio el volumen de agua inicial añadiendo agua para compensar la evaporación de esta. Para esta operación debe utilizarse agua destilada o desionizada para evitar la formación de sales. | Adición de los organismos de ensayo | 24. | Cuatro o cinco días antes de añadir los organismos de ensayo a los recipientes de ensayo, deben tomarse de los cultivos masas de huevos y ponerlas en recipientes pequeños con medio de cultivo. Puede utilizarse medio viejo del cultivo madre o medio recién preparado. Si se utiliza este último, debe añadírsele una pequeña cantidad de alimento como, por ejemplo, algas verdes o unas gotitas de filtrado de una suspensión finamente molida de alimento para peces en copos (véase el apéndice 2). Solo deben utilizarse masas de huevos recién puestas. Normalmente, las larvas empiezan a salir de los huevos un par de días después de la puesta (de 2 a 3 días en el caso de Chironomus riparius a 20 °C y de 1 a 4 días en el de Chironomus tentans a 23 °C y en el de Chironomus yoshimatsui a 25 °C) y el crecimiento de las larvas tiene lugar en cuatro fases, cada una de entre 4 y 8 días de duración. En el ensayo deben utilizarse larvas de la primera fase (2-3 o 1-4 días tras la eclosión). La fase de los animales puede comprobarse midiendo la anchura de la cápsula cefálica (6). | 25. | Se asignan aleatoriamente veinte larvas de primera fase a cada recipiente de ensayo que contenga el sedimento enriquecido y el agua, utilizando una pipeta de punta roma. Es necesario detener la aireación del agua mientras se ponen las larvas en los recipientes de ensayo y mantener la situación durante otras 24 horas tras la adición de las larvas (véanse los puntos 24 y 32). Según el diseño de ensayo empleado (véanse los puntos 19 y 20), el número de larvas utilizadas por concentración es de al menos 60 para la estimación puntual de la EC y de 80 para la determinación de la NOEC. | 26. | A las veinticuatro horas de haber añadido las larvas, se pone la sustancia problema en la columna de agua sobrenadante, y se vuelve a aportar aireación leve. Utilizando una pipeta, se aplican pequeños volúmenes de las soluciones de la sustancia problema por debajo de la superficie del agua. A continuación debe mezclarse el agua sobrenadante, con cuidado de no alterar el sedimento. | Concentraciones de ensayo | 27. | Puede ser útil efectuar un ensayo preliminar para determinar el rango de concentraciones adecuadas para el ensayo definitivo. Con este fin se utiliza una serie de concentraciones de la sustancia problema, muy diferentes entre sí. A fin de proporcionar la misma densidad superficial por quironómido que se vaya a emplear para el ensayo definitivo, se exponen los quironómidos a cada concentración de la sustancia problema durante un plazo que permita la estimación de las concentraciones de ensayo adecuadas, y no hace falta utilizar réplicas. | 28. | Las concentraciones de ensayo para el ensayo definitivo se deciden sobre la base del resultado del ensayo de determinación del rango de concentraciones. Deben utilizarse al menos cinco concentraciones y seleccionarse como se describe en los puntos 18 a 20. | Controles | 29. | Deben incluirse en el ensayo, con el número adecuado de réplicas, recipientes de control sin sustancia problema pero con sedimento (véanse los puntos 19-20). Si se ha utilizado algún disolvente para aplicar la sustancia problema (véase el punto 16), debe añadirse un control del disolvente en el sedimento. | Sistema de ensayo | 30. | Se emplean sistemas estáticos. Pueden utilizarse en casos excepcionales sistemas semiestáticos o dinámicos con renovación intermitente o continua del agua sobrenadante, como, por ejemplo, si las especificaciones de calidad del agua se hacen inadecuadas para el organismo de ensayo o afectan al equilibrio químico (por ejemplo, cuando los niveles de oxígeno disuelto caen demasiado, la concentración de excrementos se eleva demasiado, o se lixivian minerales del sedimento con modificación del pH y/o de la dureza del agua). Sin embargo, normalmente será suficiente y preferible emplear otros métodos de mejora de la calidad del agua sobrenadante, como la aireación. | Alimentación | 31. | Es necesario alimentar a las larvas, de preferencia una vez al día o, al menos, tres veces por semana. Parece adecuada una ración diaria de comida para peces (suspensión en agua o comida finamente molida como, por ejemplo, Tetra-Min o Tetra-Phyll; véanse detalles en el apéndice 2), de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg para C. yoshimatsui) por larva durante los 10 primeros días. Las larvas de más edad pueden necesitar algo más de comida: entre 0,5 y 1 mg por larva al día debería ser suficiente durante el resto del ensayo. La ración alimentaria debe reducirse en todos los tratamientos y controlarse si se observa crecimiento de hongos o si se aprecia mortalidad en los controles. Si no puede detenerse el desarrollo fúngico, hay que repetir el ensayo. Cuando se someten a ensayo sustancias muy adsorbentes (por ejemplo, con log Kow > 5), o hay sustancias que se unen covalentemente al sedimento, es posible añadir al sedimento artificial, antes del período de estabilización, la cantidad de comida necesaria para garantizar la supervivencia y el crecimiento natural de los organismos. Con este objetivo, debe utilizarse material vegetal en lugar de la comida para peces, por ejemplo, adición de 0,5 % (peso seco) de hojas finamente molidas de ortiga mayor (Urtica dioica), morera (Morus alba), trébol blanco (Trifolium repens), espinaca (Spinacia oleracea) u otro material vegetal (Cerophyl o alfa-celulosa). | Condiciones de incubación | 32. | Se aporta aireación suave al agua sobrenadante de los recipientes de ensayo, preferentemente a las 24 h de la adición de las larvas, y se continúa a lo largo de todo el ensayo (debe tenerse cuidado para que la concentración de oxígeno disuelto no caiga por debajo del 60 % del valor de saturación en el aire). La aireación se aporta mediante una pipeta Pasteur de vidrio fijada a 2-3 cm por encima del nivel del sedimento, con el ritmo de una o unas pocas burbujas por segundo. Cuando se sometan a ensayo sustancias volátiles, debe considerarse el no airear el sistema sedimento-agua. | 33. | El ensayo se efectúa a la temperatura constante de 20 °C (± 2 °C). En el caso de C. tentans y de C. yoshimatsui, las temperaturas recomendadas son de 23 °C y 25 °C (± 2 °C), respectivamente. Se usa un fotoperíodo de 16 h, con una intensidad luminosa de 500 a 1 000 lux. | Duración de la exposición | 34. | La exposición comienza con la adición de larvas a los recipientes enriquecidos y a los de control. La duración máxima del ensayo es de 28 días en el caso de C. riparius y C. yoshimatsui, y de 65 días en el de C. tentans. Si los dípteros aparecen antes, es posible terminar el ensayo tras un mínimo de cinco días desde la aparición del último adulto en los recipientes de control. | OBSERVACIONES | Aparición de adultos | 35. | Se determinan el tiempo de desarrollo y el número total de dípteros machos y hembras que aparecen completamente. Los machos se identifican fácilmente por sus antenas plumosas. | 36. | Hay que observar los recipientes de ensayo al menos tres veces por semana para hacer una evaluación visual de los eventuales comportamientos anormales (por ejemplo, dejar el sedimento, nadar de forma inusual) respecto al control. Durante el tiempo en que se prevea que ha de ocurrir la aparición es necesario efectuar un recuento diario de los dípteros aparecidos. Se registran cada día el sexo y el número de los dípteros aparecidos completamente. Tras su identificación, se sacan los dípteros de los recipientes. Las eventuales masas de huevos puestas antes de la terminación del ensayo deben anotarse y después retirarse para evitar la reintroducción de larvas en el sedimento. También debe registrarse el número de pupas visibles de las que no han llegado a aparecer adultos. En el apéndice 5 se dan orientaciones sobre la medición de la aparición de los dípteros. | Crecimiento y supervivencia | 37. | Si han de proporcionarse datos sobre la supervivencia y el crecimiento de larvas a los 10 días, deben incluirse desde el principio recipientes de ensayo adicionales, de forma que puedan utilizarse después. El sedimento de estos recipientes adicionales se filtra a través de un tamiz de 250 μm para retener las larvas. Los criterios para determinar la muerte son la inmovilidad o la ausencia de reacción ante un estímulo mecánico. Las larvas no recuperadas deben contarse asimismo como muertas (las larvas que hayan muerto al inicio del ensayo pueden haber sido degradadas por los microbios). Se determina el peso seco (libre de cenizas) de las larvas supervivientes por recipiente de ensayo y se calcula el peso seco individual medio por recipiente. Es útil determinar a qué fase pertenecen las larvas supervivientes; para obtener este dato puede utilizarse la medición de la anchura de la cápsula cefálica de cada individuo. | Mediciones analíticas | Concentración de la sustancia problema | 38. | Como mínimo, deben analizarse muestras del agua sobrenadante, del agua intersticial y del sedimento al inicio (preferentemente una hora tras la aplicación de la sustancia problema) y al final del ensayo, a la concentración máxima y a una inferior. Estas determinaciones de la concentración de la sustancia problema informan sobre el comportamiento y el reparto de la sustancia problema en el sistema agua-sedimento. La toma de muestras del sedimento al inicio del ensayo puede influir en el sistema de ensayo (por ejemplo, eliminando larvas del ensayo), por lo que deberían emplearse recipientes de ensayo adicionales para realizar las determinaciones analíticas al inicio y durante el ensayo cuando sea apropiado (véase el punto 39). Puede no ser necesario efectuar mediciones en el sedimento si se ha determinado claramente el reparto de la sustancia problema entre el agua y el sedimento en un estudio agua/sedimento en condiciones comparables (por ejemplo, proporción entre sedimento y agua, tipo de aplicación, contenido en carbono orgánico del sedimento). | 39. | Cuando se hagan mediciones intermedias (por ejemplo, el día no 7) y si los análisis necesitan grandes muestras que no puedan tomarse de los recipientes de ensayo sin influir en el sistema de ensayo, las determinaciones analíticas deben llevarse a cabo con muestras de recipientes de ensayo adicionales tratados de la misma manera (incluida la presencia de los organismos de ensayo) pero que no se utilizan para las observaciones biológicas. | 40. | El procedimiento recomendado para aislar el agua intersticial es la centrifugación, por ejemplo a 10 000 g y 4 °C durante 30 min. Sin embargo, si se demuestra que la sustancia problema no se adsorbe a los filtros, también puede aceptarse la filtración. En algunos casos puede resultar imposible analizar las concentraciones en el agua intersticial debido a que el tamaño de la muestra es demasiado pequeño. | Parámetros fisicoquímicos | 41. | Deben medirse de la manera adecuada el pH, el oxígeno disuelto en el agua de ensayo y la temperatura de los recipientes de ensayo (véase el punto 10). Hay que medir la dureza y el amoníaco en los controles y en un recipiente de ensayo a la concentración máxima, al inicio y al final del ensayo. | DATOS E INFORME | Tratamiento de los resultados | 42. | El objetivo de este ensayo es determinar el efecto de la sustancia problema sobre la tasa de desarrollo y el número total de dípteros machos y hembras completamente aparecidos o, en el caso de los efectos del ensayo de 10 días, sobre la supervivencia y el peso de las larvas. Si no hay ninguna señal de sensibilidades estadísticamente diferentes según los sexos, pueden agruparse los resultados de machos y de hembras a efectos de análisis estadísticos. Las diferencias de sensibilidad entre los sexos pueden evaluarse estadísticamente mediante, por ejemplo, una prueba de tabla de contingencia de χ2-r × 2 cuadro. Cuando así se requiera, habrá que determinar la supervivencia de las larvas y su peso seco individual medio por recipiente al cabo de 10 días. | 43. | Las concentraciones que tienen efecto, expresadas como concentraciones en el agua sobrenadante, se calculan preferentemente a partir de las concentraciones medidas al inicio del ensayo (véase el punto 38). | 44. | A efectos de computar una estimación puntual para la EC50 o cualquier otra ECx, las estadísticas por recipiente pueden utilizarse como réplicas verdaderas. Al calcular el intervalo de confianza para cualquier ECx, debe tenerse en cuenta la variabilidad entre recipientes, o bien hay que mostrar que esta variabilidad es tan pequeña que puede despreciarse. Cuando el modelo sigue el método de los mínimos cuadrados, debe aplicarse una transformación estádistica por cada recipiente a fin de mejorar la homogeneidad de la varianza. Sin embargo, los valores de ECx deben calcularse después de haber vuelto a transformar la respuesta al valor original. | 45. | Cuando el análisis estadístico se dirige a determinar la NOEC/LOEC mediante contrastes de hipótesis, es necesario tener en cuenta la variabilidad entre recipientes, por ejemplo mediante un análisis de varianza anidado. También puede ser adecuado realizar ensayos más robustos (21) en situaciones en que no se cumplen las hipótesis de los análisis de varianza usuales. | Tasa de aparición | 46. | Las tasas de aparición son datos cuantales y pueden ser analizados por el método de Cochran-Armitage aplicado con ajuste secuencial de residuos cuando se prevé una relación dosis-respuesta monótona y estos datos son coherentes con dicha previsión. En caso contrario, puede utilizarse una prueba exacta de Fisher o el método de Mantel-Haenszel con los valores p ajustados según Bonferroni-Holm. Si hay pruebas de que la variabilidad entre réplicas dentro de la misma concentración es mayor de lo que indicaría una distribución binomial (lo que se señala generalmente como variación "extrabinomial"), hay que utilizar un método de Cochran-Armitage o una prueba exacta de Fisher robustos (como se propone en el punto 21). | 47. | Se determina la suma de dípteros aparecidos por recipiente, ne, y se divide por el número de larvas introducidas, na: | donde: | ER | = | tasa de aparición | ne | = | número de dípteros aparecidos por recipiente | na | = | número de larvas introducidas por recipiente | 48. | Otra posibilidad más adecuada para las muestras de gran tamaño, cuando hay variación extrabinomial, consiste en tratar la tasa de aparición como una respuesta continua y emplear procedimientos tales como la prueba de Williams cuando se prevé una relación dosis-respuesta monótona y es coherente con estos datos de tasa de aparición. La prueba de Dunnett sería apropiada si no se mantuviera la monotonía. Se define aquí como muestra de gran tamaño la que corresponde a la situación en que tanto el número de dípteros emergidos como el número de no emergidos es superior a cinco, por réplica (recipiente). | 49. | Para aplicar los métodos de análisis de la varianza, hay que transformar primero los valores de la tasa de aparición mediante la transformación arcoseno de la raíz cuadrada o la transformación de Freeman-Tukey para obtener una distribución normal aproximada y uniformizar las varianzas. Cuando se usan las frecuencias absolutas es posible aplicar el método de Cochran-Armitage, la prueba exacta de Fisher (Bonferroni) o el método de Mantel-Haenszel. La transformación arcoseno de la raíz cuadrada se aplica tomando el arcoseno (sen–1) de la raíz cuadrada de la tasa de aparición. | 50. | Respecto a las tasas de aparición, los valores de ECx se calculan mediante análisis de regresión (o, por ejemplo, probit (22), logit, Weibull, programas comerciales apropiados, etc.). Si no sirve el análisis de regresión (por ejemplo, cuando hay menos de dos respuestas parciales), se utilizan otros métodos no paramétricos, tales como la media móvil o la interpolación simple). | Tasa de desarrollo | 51. | El tiempo medio de desarrollo corresponde al intervalo medio de tiempo entre la introducción de las larvas (día 0 del ensayo) y la aparición de la cohorte experimental de dípteros (para el cálculo del tiempo de desarrollo verdadero debe tenerse en cuenta la edad de las larvas en el momento de su introducción). La tasa de desarrollo es la inversa del tiempo de desarrollo (unidades: 1/día) y corresponde a la porción de desarrollo larvario que se produce en un día. Es preferible utilizar la tasa de desarrollo para evaluar estos estudios de toxicidad en los sedimentos, ya que su varianza es menor y es más homogénea y próxima a la distribución normal que el tiempo de desarrollo. Por tanto, pueden usarse procedimientos de ensayos paramétricos potentes más con la tasa de desarrollo que con el tiempo de desarrollo. Considerando la tasa de desarrollo como respuesta continua, es posible estimar valores de ECx mediante análisis de regresión [por ejemplo, (23) (24)]. | 52. | En relación con las siguientes pruebas estadísticas, se supone que el número de dipteros observados en el día de inspección x ha aparecido a la media del intervalo de tiempo entre el día x y el día x - l (l = longitud del intervalo de inspección, que es normalmente de 1 día). La tasa de desarrollo media por recipiente (x) se calcula con ayuda de la siguiente fórmula: | donde: | : | tasa de desarrollo media por recipiente, | i | : | índice del intervalo de inspección, | m | : | número máximo de intervalos de inspección, | : | número de dípteros aparecidos en el intervalo de inspección i, | ne | : | número total de dípteros aparecidos al final del experimento (= | ), | xi | : | tasa de desarrollo de los dípteros aparecidos en el intervalo i, | donde: | dayi | : | día de inspección (días desde la aplicación), | li | : | longitud del intervalo de inspección i (en días, generalmente 1 día). | Informe del ensayo | 53. | El informe del ensayo debe dar, como mínimo, la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (hidrosolubilidad, presión de vapor, coeficiente de reparto en el suelo (o en el sedimento, si se conoce), estabilidad en el agua, etc.). | — | Datos de identificación química (nombre común, nombre químico, fórmula estructural, número CAS, etc.), incluida la pureza y el método de análisis cuantitativo de la sustancia problema. | | Especie de ensayo: | — | Animales utilizados en el ensayo: especie, nombre científico, origen de los organismos y condiciones de cría. | — | Información sobre la manipulación de las masas de huevos y de las larvas. | — | Edad de los animales de ensayo cuando se introducen en los recipientes de ensayo. | | Condiciones de ensayo: | — | Sedimento utilizado, es decir, si es natural o artificial. | — | En el caso del sedimento natural, ubicación y descripción del lugar de muestreo del sedimento, incluyendo, si se puede, un historial de la contaminación; características: pH, contenido de carbono orgánico, relación C/N y granulometría (cuando sea apropiado). | — | Preparación del sedimento artificial: ingredientes y características (contenido de carbono orgánico, pH, humedad, etc., al inicio del ensayo. | — | Preparación del agua de ensayo (si se utiliza agua reconstituida) y características (concentración de oxígeno, pH, conductividad, dureza, etc., al inicio del ensayo). | — | Altura del sedimento y del agua sobrenadante. | — | Volumen del agua sobrenadante y del agua intersticial, peso del sedimento húmedo con y sin agua intersticial. | — | Recipientes de ensayo (material y tamaño). | — | Método de preparación de soluciones madre y concentraciones de ensayo. | — | Aplicación de la sustancia problema: concentraciones de ensayo utilizadas, número de réplicas y empleo eventual de disolvente. | — | Condiciones de incubación: temperatura, intensidad y ciclo de luz, aireación (frecuencia e intensidad). | — | Información detallada sobre la alimentación de los animales, incluidos el tipo de alimento, la preparación, la cantidad y el régimen alimentario. | | Resultados: | — | Concentraciones de ensayo nominales, concentraciones de ensayo medidas y resultados de todos los análisis efectuados para determinar la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo. | — | Calidad del agua de los recipientes de ensayo, es decir, pH, temperatura, oxígeno disuelto, dureza y amoníaco. | — | Sustitución del agua de ensayo evaporada, en su caso. | — | Número de dípteros machos y hembras aparecidos por recipiente y por día. | — | Número de larvas que no han aparecido como dípteros por recipiente. | — | Peso seco individual medio de las larvas por recipiente, y por fase, en caso apropiado. | — | Porcentaje de apariciones por réplica y concentración de ensayo (sin distinguir entre dípteros machos y hembras). | — | Tasa de desarrollo media de los dípteros aparecidos completamente por réplica y tasa de tratamiento (sin distinguir entre dípteros machos y hembras). | — | Estimación de los parámetros de toxicidad como, por ejemplo, ECx (con intervalos de confianza asociados), NOEC y/o LOEC, y métodos estadísticos empleados para su determinación. | — | Discusión de los resultados del ensayo, incluida la eventual influencia que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp. 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. | (10) | Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. | (11) | Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. | (12) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra. | (15) | Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. | (16) | Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. | (17) | Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. | (18) | Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. | (19) | Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. | (20) | Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. | (21) | Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585. | (22) | Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. | (23) | Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. | (24) | Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. | Apéndice 1 | DEFINICIONES | A efectos del presente método, se aplicarán las siguientes definiciones por: | Sedimento artificial (o sedimento reconstituido, formulado o sintético): mezcla de materiales empleada para imitar los componentes físicos de un sedimento natural. | Agua sobrenadante: el agua situada sobre el sedimento en el recipiente de ensayo. | Agua intersticial: el agua que ocupa el espacio entre el sedimento y las partículas del suelo. | Agua enriquecida: el agua a la que se ha añadido sustancia problema. | Sustancia problema: toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este método de ensayo. | Apéndice 2 | Recomendaciones para el cultivo de Chironomus riparius | 1. | Las larvas de Chironomus pueden criarse en cristalizadores o en recipientes más grandes. Sobre el fondo del recipiente se extiende arena de cuarzo fina, en una capa delgada de unos 5 a 10 mm de espesor. Se ha comprobado que la tierra de diatomeas (por ejemplo, Merck, Art 8117) también constituye un sustrato adecuado (es suficiente una capa más fina, de muy pocos milímetros). A continuación se añade agua adecuada hasta una altura de varios centímetros. Los niveles deben mantenerse rellenando con agua en la medida necesaria para compensar las pérdidas por evaporación y evitar la desecación. En caso necesario, es posible sustituir el agua. Debe aportarse una aireación suave. Los recipientes de cría de las larvas deben mantenerse en una jaula adecuada para evitar que se escapen los adultos. La jaula debe ser lo suficientemente grande como para permitir el enjambrado de los adultos aparecidos, ya que en caso contrario puede que no haya copulación (las dimensiones mínimas son de unos 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Las jaulas deben mantenerse a temperatura ambiente o en una zona de ambiente constante a 20 ± 2 °C con un fotoperíodo de 16 horas de luz (de intensidad alrededor de 1 000 lux) y 8 horas de oscuridad. Se ha comunicado que una humedad relativa del aire de menos del 60 % puede impedir la reproducción. | Agua de dilución | 3. | Puede emplearse cualquier agua natural o sintética que sea adecuada. Se suelen utilizar agua de pozo, agua del grifo desclorada y medios artificiales (como, por ejemplo, medio M4 o M7 de Elendt, véase más abajo). Es necesario airear el agua antes de emplearla. En caso necesario, el agua de cultivo puede renovarse sacando cuidadosamente, por vertido o con sifón, el agua usada de los recipientes de cultivo, sin destruir los tubos de las larvas. | Alimentación de las larvas | 4. | Las larvas de Chironomus deben alimentarse con comida para peces en copos (Tetra Min®, Tetra Phyll® u otra marca similar de comida comercial para peces), al ritmo de aproximadamente 250 mg por recipiente al día. Puede administrarse como polvo molido seco o como suspensión en agua: se añade 1,0 g de comida en copos a 20 ml de agua de dilución y se mezcla para obtener un resultado homogéneo. Esta preparación puede administrarse al ritmo de unos 5 ml por recipiente al día y ha de agitarse antes de usarse. Las larvas más viejas pueden recibir más cantidad. | 5. | La alimentación se ajusta según la calidad del agua. Si el medio de cultivo se pone turbio, hay que reducir la alimentación. Es necesario supervisar cuidadosamente la adición de comida. Si la comida es demasiado escasa, se provocará la emigración de las larvas hacia la columna de agua, mientras que si es excesiva aumentará la actividad microbiana y se reducirá la concentración de oxígeno. Ambas situaciones pueden producir un descenso de la tasa de crecimiento. | 6. | Es posible añadir también algunas células de algas verdes (como, por ejemplo, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) cuando se establecen recipientes de cultivo nuevos. | Alimentación de los adultos aparecidos | 7. | Algunos experimentadores han sugerido que un disco de algodón empapado en una solución saturada de sacarosa puede servir de alimento para los adultos aparecidos. | Aparición de adultos | 8. | A 20 ± 2 °C, los adultos empiezan a aparecer en los recipientes de cría de larvas a los 13-15 días aproximadamente. Los machos se distinguen fácilmente porque tienen antenas plumosas. | Masas de huevos | 9. | Una vez haya adultos en la jaula de cría, deben supervisarse todos los recipientes de cría de larvas tres veces por semana para observar la puesta de masas gelatinosas de huevos. Cuando se encuentren, las masas de huevos deben retirarse cuidadosamente y transferirse a una pequeña placa que contenga una muestra del agua de cría. Las masas de huevos se emplean para iniciar un nuevo recipiente de cultivo (por ejemplo, 2-4 masas de huevos por recipiente) o para los ensayos de toxicidad. | 10. | Las larvas en primer estadio deben salir de los huevos al cabo de 2 – 3 días. | Establecimiento de nuevos recipientes de cultivo | 11. | Cuando se hayan establecido los cultivos, debe ser posible establecer un nuevo recipiente de cultivo de larvas cada semana o con menos frecuencia, según los requisitos de cultivo, eliminando los recipientes más viejos una vez han aparecido los dípteros adultos. Con este sistema, se obtendrá un suministro regular de adultos, con una gestión mínima. | Preparación de las soluciones de ensayo M4 y M7 | 12. | Elendt (1990) describió el medio M4. El M7 se prepara como el medio M4, salvo en lo relativo a las sustancias indicadas en el cuadro 1, cuyas concentraciones son cuatro veces más bajas en el medio M7 que en el M4. Se está preparando una publicación sobre el medio M7 (Elendt, comunicación personal). La solución de ensayo no debe prepararse siguiendo a Elendt y Bias (1990), ya que no son adecuadas las concentraciones de NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 y K2HPO4 dadas para la preparación de las soluciones madre. | Preparación del medio M7 | 13. | Las soluciones madre (I) se preparan por separado cada una y a partir de ellas se prepara una solución madre combinada (II) (véase el cuadro 1). Se toman 50 ml de la solución madre combinada (II) junto con las cantidades de solución madre de cada macronutriente que se dan en el cuadro 2 y se enrasa a 1 litro con agua desionizada para preparar el medio M7. Se prepara una solución madre de vitaminas añadiendo tres vitaminas a agua desionizada como se indica en el cuadro 3, y se añaden al medio M7 final 0,1 ml de la solución madre de vitaminas combinadas, poco antes de su empleo (la solución madre de vitaminas se conserva congelada en pequeñas partes alícuotas). El medio se airea y se estabiliza. | Cuadro 1 | Soluciones madre de oligoelementos para los medios M4 y M7 | Soluciones madre (I) | Cantidad (mg) enrasada a 1 litro con agua desionizada | Para preparar la solución madre combinada (II): mezclar las siguientes cantidades (ml) de soluciones madre (I) y enrasar a 1 litro con agua desionizada | Concentraciones finales en las soluciones de ensayo (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (10) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (10) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (10) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (10) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (10) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (10) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (10) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (10) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (10) (11) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (10) (11) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Cuadro 2 | Soluciones madre de macronutrientes para los medios M4 y M7 | | Cantidad enrasada a 1 litro con agua desionizada | (mg) | Cantidad de soluciones madre de macronutrientes añadida para preparar los medios M4 y M7 | (ml/l) | Concentraciones finales en las soluciones de ensayo de M4 y M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Cuadro 3 | Solución madre de vitaminas para los medios M4 y M7 | Las tres soluciones de vitaminas se combinan para formar una única solución madre de vitaminas. | | Cantidad enrasada a 1 litro con agua desionizada | (mg) | Cantidad de solución madre de vitaminas añadida para preparar los medios M4 y M7 | (ml/l) | Concentraciones finales en las soluciones de ensayo de M4 y M7 | (mg/l) | Clorhidrato de tiamina | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianocobalamina (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotina | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | BIBLIOGRAFÍA: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. | Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. | Apéndice 3 | PREPARACIÓN DEL SEDIMENTO ARTIFICIAL | Composición del sedimento | La composición del sedimento artificial debe ser la siguiente: | Componente | Características | % de sedimento | en peso seco | Turba | Turba esfágnea, de pH lo más próximo posible a 5,5-6,0, sin restos vegetales visibles, finamente molida (tamaño de partícula ≤ 1 mm) y secada al aire | 4-5 | Arena de cuarzo | Granulometría: > 50 % de las partículas deben encontrarse en la banda de 50-200 μm | 75-76 | Caolín | Contenido en caolinita ≥ 30 % | 20 | Carbono orgánico | Ajustado mediante adición de turba y arena | 2 (± 0,5) | Carbonato de calcio | CaCO3, pulverizado, químicamente puro | 0,05 - 0,1 | Agua | Conductividad ≤ 10 μS/cm | 30 - 50 | Preparación | La turba se seca al aire y se tritura hasta convertirse en un polvo fino. Se prepara en agua desionizada una suspensión de la cantidad necesaria de polvo de turba, utilizando un dispositivo de homogeneización de prestaciones elevadas. El pH de esta suspensión se ajusta a 5,5 ± 0,5 con CaCO3. La suspensión se deja durante al menos dos días con agitación suave a 20 ± 2 °C, para estabilizar el pH e implantar un componente microbiano estable. Se vuelve a medir el pH, que debe quedar a 6,0 ± 0,5. A continuación se mezcla la suspensión de turba con los demás componentes (arena y caolín) y con agua desionizada para obtener un sedimento homogéneo con un contenido de agua del 30-50 % del peso seco del sedimento. Se vuelve a medir el pH de la mezcla final y se ajusta a 6,5-7,5 con CaCO3 en caso necesario. Se toman muestras del sedimento para determinar el peso seco y el contenido en carbono orgánico. Se recomienda a continuación que el sedimento artificial, antes de emplearse en el ensayo de toxicidad para quironómidos, se someta durante siete días a las mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo. | Almacenamiento | Los componentes secos utilizados para preparar el sedimento artificial pueden almacenarse en un lugar fresco y seco, a temperatura ambiente. El sedimento (húmedo) ya preparado no debe almacenarse antes de su empleo en el ensayo. Debe utilizarse inmediatamente tras el tiempo de acondicionamiento de 7 días con que termina su preparación. | BIBLIOGRAFÍA: | Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra. | Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. | Apéndice 4 | Características químicas aceptables del agua de dilución | Sustancia | Concentraciones | Materia en partículas | < 20 mg/l | Carbono orgánico total | < 2 mg/l | Amoníaco no ionizado | < 1 μg/l | Dureza expresada en CaCO3 | < 400 mg/l (*4) | Cloro residual | < 10 μg/l | Plaguicidas organofosforados totales | < 50 ng/l | Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlorados | < 50 ng/l | Cloro orgánico total | < 25 ng/l | Apéndice 5 | Orientaciones para el seguimiento de la aparición de las larvas de quironómidos | Se ponen trampas de aparición en los vasos del ensayo. Estas trampas tienen que mantenerse desde el día 20 hasta el final del ensayo. A continuación figura el esquema de un ejemplo de trampa: | C.29. BIODEGRADABILIDAD FÁCIL—CO2 EN RECIPIENTES SELLADOS (ENSAYO DEL ESPACIO DE CABEZA) | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo de la OCDE TG 310 (2006). El presente método de ensayo es un método exploratorio para la evaluación de la biodegradabilidad fácil de las sustancias y aporta información similar a los seis métodos de ensayo descritos en el capítulo C.4-A a F del presente anexo. Por tanto, una sustancia que tenga resultados positivos con el presente método de ensayo puede considerarse fácilmente biodegradable y, en consecuencia, rápidamente degradable en el medio ambiente. | 2. | Normalmente, la primera opción para someter a ensayo las sustancias poco solubles y las que se adsorben mucho ha sido el reconocido método del dióxido de carbono (CO2) (1), basado en el ensayo original de Sturm (2) para evaluar la biodegradabilidad de las sustancias orgánicas, mediante la medición del dióxido de carbono producido por la acción microbiana. También se ha elegido para sustancias solubles (pero no volátiles), ya que el desprendimiento de dióxido de carbono es ampliamente considerado como la única prueba inequívoca de actividad microbiana. La eliminación del carbono orgánico disuelto puede verse afectada por procesos fisicoquímicos, como la adsorción, la volatilización, la precipitación o la hidrólisis, así como por la actividad microbiana, y son muchas las reacciones no biológicas que consumen oxígeno, mientras que es raro que se produzca CO2 a partir de sustancias orgánicas de forma abiótica. En el ensayo de Sturm, tanto original como modificado (1) (2), el CO2 pasa de la fase líquida a los recipientes absorbentes por arrastre (es decir, burbujeando aire tratado a través del medio líquido para eliminar el CO2), mientras que en la versión de Larson (3) (4) el CO2 se transfiere desde el recipiente de reacción a los absorbentes pasando aire exento de CO2 a través del espacio de cabeza y, de forma adicional, sacudiendo continuamente el recipiente de ensayo. El recipiente de reacción se sacude solo en la modificación de Larson; la agitación se especifica solo para sustancias insolubles en la norma ISO 9439 (5) y en la versión original de EE. UU. (6), y en estas dos normas se especifica el arrastre en lugar de la sustitución del espacio de cabeza. En otro método oficial de la EPA norteamericana (7), basado en el método de Gledhill (8), el recipiente de reacción sacudido está cerrado a la atmósfera y el CO2 producido se recoge en una trampa alcalina interna directamente desde la fase gaseosa, como en los frascos del respirómetro clásico de Warburg/Barcroft. | 3. | Sin embargo, se ha demostrado que se acumula carbono inorgánico (CI) en el medio durante la aplicación del ensayo de Sturm normal y modificado a una serie de sustancias (9). Durante la degradación de 20 mg C/l de anilina se encontró una concentración de CI de hasta 8 mg/l. Así pues, la recogida de CO2 en las trampas alcalinas no refleja fielmente la cantidad de CO2 producida por los microorganismos en fases intermedias de la degradación. Como resultado, la especificación de que > 60 % de la producción maxima teórica de CO2 (CO2T) debe recogerse dentro de un período de observación de 10 días (los 10 días inmediatamente siguientes a la consecución del 10 % de la biodegradación) para que una sustancia problema se clasifique como fácilmente biodegradable, no se cumplirá en el caso de ciertas sustancias que sí se clasificarían en esa categoría si se utilizara el método de la eliminación del carbono orgánico disuelto (COD). | 4. | Cuando el porcentaje de degradación es menor que el valor previsto, es posible que se acumule CI en la solución de ensayo. En tales casos, la degradabilidad puede evaluarse con los otros ensayos de biodegrabilidad fácil. | 5. | Otros inconvenientes de la metodología de Sturm (que es engorrosa, exige mucho tiempo, se presta más al error experimental y no es aplicable a las sustancias volátiles) ya antes habían incitado a buscar una técnica de recipiente cerrado, distinta de la Geldhill, en lugar del burbujeo de gas (10) (11). Boatman et al (12) revisaron los métodos anteriores y adoptaron un sistema de espacio de cabeza cerrado en el que se desprendía el CO2 a ese espacio al final de la incubación, al acidificar el medio. El CO2 se midió analizando el carbono inorgánico mediante cromatografía de gases (GC) en muestras tomadas de forma automática en el espacio de cabeza, pero sin tener en cuenta el carbono inorgánico disuelto (CID) en la fase líquida. Además, los recipientes empleados eran muy pequeños (20 ml), con tan solo 10 ml de medio, lo que provocaba problemas, por ejemplo cuando se añadían las cantidades necesariamente muy pequeñas de sustancias problema insolubles, o en el medio inoculado podía no haber microorganismos competentes (o no haberlos en número suficiente) para degradar las sustancias problema. | 6. | Estas dificultades se han vencido mediante los estudios independientes de Struijs y Stoltenkamp (13) y de Birch y Fletcher (14), el último de los cuales se inspiró en su experiencia con los aparatos utilizados en el ensayo de degradación anaeróbica (15). En el primer método (13) se mide el CO2 en el espacio de cabeza tras acidificación y equilibrado, mientras que en el segundo (14) el CID se mide tanto en la fase gaseosa como en la líquida, sin tratamiento; más del 90 % del CI formado se encontraba en la fase líquida. Ambos métodos aventajan al ensayo de Sturm en el sentido de que su sistema de ensayo es más compacto y manejable, es posible utilizarlos con sustancias químicas y evitan la posibilidad de retrasos en la medición del CO2 producido. | 7. | Los dos enfoques se combinaron en la norma ISO sobre el CO2 en el espacio de cabeza (16), que se sometió a un estudio interlaboratorios (17), y es esta norma la que forma la base del presente método de ensayo. De forma similar, los dos enfoques se han utilizado en el método de la EPA de EE. UU. (18). Se han recomendado dos métodos de medición del CO2, a saber, el CO2 en el espacio de cabeza previa acidificación (13) y el CI en la fase líquida tras la adición de un exceso de álcali. Este último método fue introducido por Peterson durante el ensayo interlaboratorios CONCAWE (19) de este método de espacio de cabeza modificado para medir la biodegradabilidad intrínseca. Los cambios efectuados en la revisión de 1992 (20) de los métodos del capítulo C.4 del presente anexo para estudiar la biodegradabilidad fácil se han incorporado al presente método de ensayo, de forma que, por lo demás, las condiciones (medio, duración, etc.) son las mismas que en el ensayo revisado de Sturm (20). Birch y Fletcher (14) han señalado que con este ensayo de espacio de cabeza se obtenían resultados muy similares a los obtenidos con las mismas sustancias en el ensayo interlaboratorios de la OCDE (21) de los métodos de ensayo revisados. | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 8. | La sustancia problema, normalmente a la concentración de 20 mg C/l, como única fuente presente de carbono y de energía, se incuba en un medio amortiguador de sales minerales que se ha inoculado con una población mixta de microorganismos. El ensayo se lleva a cabo en frascos cerrados con un espacio de cabeza lleno de aire, que aporta una reserva de oxígeno para la biodegradación aerobia. El desprendimiento de CO2 derivado de la degradación aerobia final de la sustancia problema se determina midiendo el CI producido en los frascos de ensayo en exceso respecto al producido en los recipientes en blanco que contienen solamente medio inoculado. El grado de biodegradación se expresa en porcentaje de la producción máxima teórica de CI (CITe), sobre la base de la cantidad de sustancia problema (en carbono orgánico) añadida inicialmente. | 9. | También puede medirse la eliminación del COD y/o el grado de biodegradación primaria de la sustancia problema (20). | INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA | 10. | Es preciso conocer el contenido de carbono orgánico (% p/p) de la sustancia problema, bien por su estructura química o bien por medición, de forma que sea posible calcular el porcentaje de degradación. En el caso de las sustancias problema volátiles, es útil disponer de la constante de la ley de Henry, medida o calculada, para determinar una relación adecuada entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido. También es conveniente disponer de información sobre la toxicidad de la sustancia problema para los microorganismos a la hora de seleccionar una concentración de ensayo adecuada y para interpretar los resultados que indiquen escasa biodegradabilidad: se recomienda incluir un control de la inhibición salvo que se sepa que la sustancia problema no es inhibidora de la actividad microbiana (véase el punto 24). | APLICABILIDAD DEL MÉTODO | 11. | El ensayo es aplicable a las sustancias problema hidrosolubles e insolubles, aunque debe velarse por conseguir una buena dispersión de la sustancia problema. Utilizando la relación recomendada entre volumen del espacio de cabeza y volumen del líquido de 1:2, las sustancias volátiles con una constante de la ley de Henry de hasta 50 Pa.m3.mol–1 pueden someterse a ensayo, ya que la proporción de la sustancia problema en el espacio de cabeza no superará el valor del 1 % (13). Puede utilizarse un volumen menor del espacio de cabeza cuando se estudien sustancias que sean más volátiles pero cuya biodisponibilidad pueda ser limitante, en particular si son poco solubles en agua. Sin embargo, los usuarios deben velar por que la relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido y la concentración de la sustancia problema sean tales que se disponga de suficiente oxígeno para que pueda darse una biodegradación aerobia completa (es decir, evitar el uso de una concentración elevada de sustrato y un pequeño volumen del espacio de cabeza). Pueden encontrarse orientaciones sobre esta cuestión en las referencias 13 y 23. | SUSTANCIAS DE REFERENCIA | 12. | Para comprobar el procedimiento del ensayo, debe someterse al mismo, en paralelo, una sustancia de referencia de biodegradabilidad conocida. A estos efectos, pueden utilizarse anilina, benzoato de sodio o etilenglicol para el ensayo de sustancias problema hidrosolubles, y 1-octanol para el de sustancias problema poco solubles (13). La biodegradación de estas sustancias debe llegar a > 60 % del CITe en el plazo de 14 días. | REPRODUCIBILIDAD | 13. | En el ensayo interlaboratorios del método (17), se obtuvieron los siguientes resultados aplicando las condiciones recomendadas, incluida la concentración de 20 mg C de sustancia problema por litro. | Sustancia problema | Porcentaje medio de biodegradación | (28 d) | Coeficiente de variación | (%) | Número de laboratorios | Anilina | 90 | 16 | 17 | 1-Octanol | 85 | 12 | 14 | La variabilidad dentro del ensayo (reproducibilidad), utilizando anilina, era baja, con coeficientes de variabilidad no superiores al 5 % en casi todas las tandas de ensayos. En los dos casos en que la reproducibilidad era peor, la mayor variabilidad se debía probablemente a la alta producción de CI en las pruebas en blanco. La reproducibilidad era peor con el 1-octanol, pero aún así era menor del 10 % en el 79 % de las tandas de ensayos. Esta mayor variabilidad dentro del ensayo puede haberse debido a errores en la dosificación, ya que es necesario inyectar pequeños volúmenes (de 3 a 4 μl) de 1-octanol en frascos de ensayo sellados. Se encuentran mayores coeficientes de variación cuando se emplean concentraciones menores de sustancia problema, especialmente concentraciones inferiores a 10 mg C/l. Esto puede superarse parcialmente reduciendo la concentración de carbono inorgánico total (CIT) en el inóculo. | 14. | En un ensayo interlaboratorios de la UE (24) de cinco agentes tensioactivos a la concentración de 10 mg de C/l se obtuvieron los siguientes resultados: | Sustancia problema | Porcentaje medio de biodegradación | (28 d) | Coeficiente de variación | (%) | Número de laboratorios | Tetrapropileno- | benceno-sulfonato | 17 | 45 | 10 | Di-iso-octilsulfo-succinato | (aniónico) | 72 | 22 | 9 | Cloruro de hexadecil-trimetilamonio (*5) | (catiónico) | 75 | 13 | 10 | Iso-nonilfenol -(etoxilato)9 | (no iónico) | 41 | 32 | 10 | Coco-amida-propil | dimetilhidroxi | sulfobetaína | (anfótera) | 60 | 23 | 11 | Los resultados indican que, en general, la variabilidad era mayor con los agentes tensioactivos menos degradados. La variabilidad dentro del ensayo era inferior al 15 % en más del 90 % de los casos, y los valores máximos llegaban al 30-40 %. | NOTA: | La mayoría de los agentes tensioactivos no son especies moleculares únicas sino mezclas de isómeros, homólogos, etc., que se degradan tras períodos de latencia característicos diferentes y con tasas cinéticas diferentes, lo que se plasma en curvas atenuadas, "borrosas", de forma que el valor de corte del 60 % puede no ser alcanzado dentro del período de observación de 10 días, incluso aunque cada especie molecular individual superara ese valor en el plazo de 10 días si se ensayara sola. Esto puede observarse también con otras mezclas complejas. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Equipo | 15. | Equipo normal de laboratorio, además de lo siguiente: | a) | Frascos de suero de vidrio, cerrados con tapones de caucho butílico y cápsulas de aluminio. El tamaño recomendado es de "125 ml", con un volumentotal de unos 160 ml (en este caso, es necesario saber que el volumen de cada frasco es de 160 ± 1 ml). Puede emplearse un tamaño menor de recipiente cuando los resultados cumplen las condiciones descritas en los puntos 66 y 67. | b) | Analizador de carbono u otro instrumento (por ejemplo, cromatógrafo de gases) para medir el carbono inorgánico. | c) | Jeringas de alta precisión para tomar muestras gaseosas y líquidas. | d) | Agitador orbital en un ambiente de temperatura controlada. | e) | Aporte de aire exento de CO2; puede prepararse haciendo pasar aire a través de gránulos de cal sodada o utilizando una mezcla gaseosa con 80 % N2/20 % O2 (opcional) (véase el punto 28). | f) | Dispositivo de filtración por membrana de 0,20-0,45 μm de porosidad (opcional). | g) | Analizador de carbono orgánico (opcional). | Reactivos | 16. | Deben utilizarse siempre reactivos de pureza analítica. | Agua | 17. | Debe utilizarse agua destilada o desionizada, con ≤ 1 mg/l de carbono orgánico total. Esto corresponde a ≤ 5 % del contenido de carbono orgánico inicial introducido por la dosis recomendada de la sustancia problema. | Soluciones madre para el medio de sales minerales | 18. | Las soluciones madre y el medio de sales minerales son similares a los de los ensayos de la norma ISO 14593 (16) y del capítulo C.4 "biodegradabilidad fácil" (20). El uso de una concentración superior de cloruro de amonio (2,0 g/l en lugar de 0,5 g/l) debe ser necesario solo en casos muy excepcionales como, por ejemplo, cuando la concentración de la sustancia problema es > 40 mg C/l. Las soluciones madre deben conservarse refrigeradas y se eliminarán al cabo de seis meses, o antes si aparecen signos de precipitación o de crecimiento microbiano. Deben prepararse los seis frascos siguientes: | a) | Fosfato de dihidrógeno y potasio (KH2PO4) 8,50 g | Fosfato de hidrógeno y dipotasio (K2HPO4) 21,75 g | Fosfato de hidrógeno y disodio dihidratado (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g | Cloruro de amonio (NH4Cl) 0,50 g | Disolver en agua y enrasar a 1 litro. El pH de esta solución debe ser 7,4 (± 0,2). Si no es así, debe prepararse una solución nueva. | b) | Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O) 36,40 g | Disolver en agua y enrasar a 1 litro. | c) | Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 22,50 g | Disolver en agua y enrasar a 1 litro. | d) | Cloruro de hierro (III) hexahidratado (FeCl3.6H20) 0,25 g | Disolver en agua y enrasar a 1 litro; añadir una gota de HCl concentrado. | Preparación del medio mineral | 19. | Se mezclan 10 ml de la solución a) con unos 800 ml de agua (véase el punto 17), se añade a continuación 1 ml de las soluciones b), c) y d) y se enrasa a 1 litro con agua (punto 17). | Otros reactivos | 20. | Ácido ortofosfórico concentrado (H3PO4) (> 85 %, peso en volumen). | Solución de hidróxido de sodio 7M | 21. | Se disuelven 280 g de hidróxido de sodio (NaOH) en 1 litro de agua (punto 17). Se determina la concentración de CID de esta solución y se tiene en cuenta este valor cuando se calcule el resultado del ensayo (véanse los puntos 55 y 61), especialmente en función del criterio de validez del punto 66 b). Si la concentración de CID es demasiado elevada, debe prepararse una solución nueva. | Sustancia problema | 22. | Preparar una solución madre de una sustancia problema suficientemente hidrosoluble, en agua (punto 17) o en el medio de ensayo (punto 19), a una concentración preferiblemente 100 veces mayor que la concentración final que se vaya a emplear en el ensayo; puede ser necesario ajustar el pH de la solución madre. La solución madre debe añadirse al medio mineral para conseguir una concentración final de carbono orgánico entre 2 y 40 mg C/l, preferiblemente 20 mg C/l. Si se utilizan concentraciones menores que estas, la precisión obtenida puede verse afectada. Las sustancias líquidas solubles e insolubles pueden añadirse a los recipientes directamente mediante jeringas de precisión. Puede ser necesario aplicar un tratamiento especial a las sustancias problema poco solubles o insolubles (25). Las opciones son las siguientes: | a) | adición directa de cantidades pesadas conocidas; | b) | dispersión con ultrasonidos antes de la adición; | c) | dispersión con ayuda de agentes emulgentes, de los que se determinará si tienen algún efecto inhibidor o estimulante de la actividad microbiana antes de añadir la sustancia problema; | d) | adsorción de sustancias problema líquidas, o de una solución en un disolvente volátil adecuado, a un medio o soporte inerte (por ejemplo, filtro de fibras de vidrio), seguida de evaporación del disolvente eventualmente empleado, y adición directa de cantidades conocidas; | e) | adición de un volumen conocido de una solución de la sustancia problema en un disolvente muy volátil a un recipiente de ensayo vacío, seguido de evaporación del disolvente. | Hay que someter a ensayo los agentes o disolventes utilizados en las letras c), d) y e) para comprobar si tienen efecto estimulante o inhibidor sobre la actividad microbiana [véase el punto 42 b)]. | Sustancia de referencia | 23. | Preparar una solución madre de la sustancia de referencia (soluble) en agua (punto 17), a una concentración de preferencia 100 veces mayor que la concentración final que se vaya a emplear en el ensayo (20 mg C/l). | Comprobación de la inhibición | 24. | Es frecuente que las sustancias problema no muestren degradación significativa en las condiciones aplicadas en las evaluaciones de la biodegradación fácil. Una de las posibles causas es que la sustancia problema sea inhibidora para el inóculo a la concentración a la que se aplica en el ensayo. Puede incluirse en el diseño del ensayo una comprobación de la inhibición para facilitar la identificación (a posteriori) de la inhibición como posible causa o factor contribuyente. Por el contrario, la comprobación de la inhibición puede excluir tales interferencias y mostrar que la degradación nula o escasa debe atribuirse solo a que los microorganismos no son capaces de atacar la sustancia en la condiciones del ensayo. A fin de obtener información sobre la toxicidad de la sustancia problema para los microorganismos (aerobios), preparar una solución del medio de ensayo con la sustancia problema y la sustancia de referencia (punto 19), cada una a las mismas concentraciones que se añaden en el ensayo en sí (véanse los puntos 22 y 23). | Inóculo | 25. | El inóculo puede obtenerse de diversas fuentes: lodo activado, efluente de aguas residuales (no cloradas), aguas superficiales y suelos, o de una mezcla de estas (20). La actividad biodegradante de la fuente debe comprobarse utilizando una sustancia de referencia. Independientemente de la fuente, no deben utilizarse microorganismos que se hayan expuesto anteriormente a la sustancia problema, si se quiere emplear el procedimiento como ensayo de la biodegradabilidad fácil. | Advertencia: | Hay que manejar con cuidado el lodo activado, las aguas residuales y los efluentes de aguas residuales, debido a su contenido en organismos patógenos. | 26. | Según la experiencia, el volumen óptimo del inóculo es aquel que: | — | resulta suficiente para dar una actividad de biodegradación adecuada, | — | degrada la sustancia de referencia en el porcentaje estipulado (véase el punto 66), | — | da entre 102 y 105 unidades formadoras de colonias por mililitro en la mezcla final, | — | da normalmente una concentración de 4 mg/l de sólidos en suspensión en la mezcla final cuando se utiliza lodo activado; es posible emplear concentraciones de hasta 30 mg/l, pero pueden aumentar significativamente la producción de CO2 de los blancos (26), | — | contribuye con menos del 10 % de la concentración inicial de carbono orgánico introducido por la sustancia problema, | — | se encuentra generalmente en la banda de 1 a 10 ml de inóculo por litro de solución de ensayo. | Lodo activado | 27. | Se recoge, justo antes del proceso, lodo activado del depósito de aireación de una depuradora de aguas residuales o de una instalación de laboratorio que trate predominantemente aguas residuales domésticas. En caso necesario, deben retirarse las partículas gruesas por tamizado (por ejemplo, con un tamiz de 1 mm2 de malla) y el lodo ha de mantenerse en condiciones aerobias hasta el momento de su utilización. | 28. | También, después de eliminar las eventuales partículas gruesas, puede dejarse sedimentar o centrifugarse (por ejemplo, 1 100 × g durante 10 min). Se desecha el sobrenadante. El lodo puede lavarse en la solución de minerales. Se suspende el lodo concentrado en medio mineral para obtener una concentración de 3 a 5 g de sólidos en suspensión/1 y después se somete a aireación hasta que se utilice. | 29. | El lodo debería obtenerse de una depuradora convencional que trabaje adecuadamente. Si el lodo tiene que obtenerse de una depuradora de elevado rendimiento o se piensa que contiene inhibidores, debería lavarse. El lodo resuspendido se mezcla bien y a continuación se deja sedimentar o se centrifuga, se desecha el sobrenadante y se vuelve a suspender el lodo lavado en otro volumen de medio mineral. Este procedimiento se repite hasta que se considere que el lodo queda exento de un exceso de sustrato o de inhibidor. | 30. | Después de conseguir la resuspensión completa, o con el lodo sin tratar, se toma una muestra justo antes de su utilización para determinar el peso seco de los sólidos en suspensión. | 31. | Otra posibilidad diferente es homogeneizar lodo activado (de 3 a 5 g de sólidos suspendidos/1). Se trata el lodo en un mezclador Waring durante 2 minutos a velocidad media. El lodo mezclado se deja sedimentar durante 30 minutos, o más en caso necesario, y se decanta el líquido para utilizarlo como inóculo en la proporción de unos 10 mg/l de medio mineral. | 32. | Puede conseguirse una reducción aún mayor del desprendimiento de CO2 en el blanco aireando el lodo hasta el día siguiente con aire exento de CO2. Utilizar como concentración del inóculo en este ensayo 4 mg/l de sólidos del lodo activado (13). | Efluente secundario de aguas residuales | 33. | El inóculo puede obtenerse también a partir del efluente secundario de una depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba predominantemente aguas residuales domésticas. Mantener la muestra en condiciones aerobias y utilizarla el día de la toma, o acondicionarla previamente en caso necesario. El efluente debe filtrarse por un filtro grueso para eliminar las partículas gruesas y se mide el valor del pH. | 34. | Para reducir su contenido de CI, se hace pasar por el filtrado aire exento de CO2 (punto 15, letra e) durante 1 h, manteniendo el pH a 6,5 mediante el uso de ácido ortofosfórico (punto 20). El valor del pH se restaura a su valor original con hidróxio de sodio (punto 21) y, después de dejar sedimentar durante 1 h aproximadamente, se toma un volumen adecuado del sobrenadante para la inoculación. Este procedimiento de arrastre reduce el contenido de CI del inóculo. Por ejemplo, cuando se utilizaba como inóculo el volumen recomendado máximo de efluente sometido al arrastre y filtrado (100 ml) por litro, la cantidad de CI presente en los recipientes de control en blanco estaba en la banda de 0,4-1,3 mg/l (14), lo que correspondía a entre el 2 y el 6,5 % del C de la sustancia problema a 20 mg C/l y entre el 4 y el 13 % a 10 mg C/l. | Aguas superficiales | 35. | Se toma una muestra de un agua superficial adecuada. Debe mantenerse en condiciones aerobias y utilizarse el mismo día de la toma. En caso necesario, la muestra debe concentrarse por filtración o centrifugación. El volumen de inóculo que se vaya a utilizar en cada recipiente de ensayo debe cumplir los criterios del punto 26. | Suelos | 36. | Se toma una muestra de un suelo adecuado, recogida a una profundidad de hasta 20 cm por debajo de la superficie del suelo. Hay que retirar las piedras, restos vegetales e invertebrados de la muestra de suelo antes de pasarla por un tamiz de 2 mm de malla (si la muestra está demasiado húmeda para tamizarla inmediatamente, se deja secar parcialmente al aire para facilitar el tamizado). Debe mantenerse en condiciones aerobias y utilizarse el mismo día de la toma; si la muestra se transporta en una bolsa de polietileno negra sin cerrar completamente, puede conservarse en la bolsa hasta un mes a una temperatura de entre 2 y 4 °C. | Preacondicionamiento del inóculo | 37. | Los inóculos pueden estar preacondicionados a las condiciones experimentales, pero no preadaptados a la sustancia problema. El preacondicionamiento puede reducir el desprendimiento de CO2 del blanco. El preacondicionamiento consiste en airear el lodo activado, tras diluirlo en el medio de ensayo hasta una concentración de 30 mg/l, con aire húmedo exento de CO2 durante un máximo de 5 o 7 días a la temperatura del ensayo. | PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO | Número de frascos | 38. | El número de frascos [punto 15, letra a)] necesarios para un ensayo dependerá de la frecuencia de los análisis y de la duración del ensayo. | 39. | Se recomienda analizar frascos por triplicado tras un número suficiente de intervalos de tiempo, de forma que pueda señalarse el período de observación de 10 días. También se analizan al final del ensayo al menos cinco frascos de ensayo [punto 15, letra a)] de los conjuntos a), b) y c) (véase el punto 42), para permitir el cálculo de los intervalos de confianza del 95 % del valor medio del porcentaje de biodegradación. | Medio inoculado | 40. | El inóculo se emplea a la concentración de 4 mg/l de sólidos secos del lodo activado. Preparar inmediatamente antes del uso una cantidad suficiente de medio inoculado añadiendo, por ejemplo, 2 ml de lodo activado tratado de forma adecuada (puntos 27 a 32) a la concentración de 2 000 mg/l a 1 litro de medio de sales minerales (punto 19). Cuando deba utilizarse efluente secundario de aguas residuales, añadir hasta 100 ml de efluente (punto 33) a 900 ml de medio de sales minerales (punto 19) y enrasar a 1 litro con medio. | Preparación de los frascos | 41. | Se ponen en frascos replicados alícuotas de medio inoculado para obtener una relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido de 1:2 (por ejemplo, añadir 107 ml a frascos de 160 ml de capacidad). Es posible utilizar otras proporciones, pero téngase en cuenta la advertencia del punto 11. Independientemente del tipo de inóculo utilizado, ha de ponerse atención para que el medio inoculado se mezcle adecuadamente a fin de garantizar que se distribuye de manera uniforme en los frascos de ensayo. | 42. | Se preparan conjuntos de frascos [punto 15, letra a)] que contengan lo siguiente: | a) | recipientes de ensayo (denominados FT) que contengan la sustancia problema; | b) | controles en blanco (denominados FB) que contengan el medio de ensayo más el inóculo; deben añadirse también las eventuales sustancias, disolventes, agentes o filtros de fibra de vidrio que se utilicen para introducir la sustancia problema en los recipientes de ensayo; | c) | recipientes (denominados FC) para comprobar el procedimiento que contengan la sustancia de referencia; | d) | en caso necesario, recipientes (denominados FI) para comprobar un posible efecto inhibidor de la sustancia problema que contengan tanto la sustancia problema como la sustancia de referencia a las mismas concentraciones (punto 24) que se encuentran en los frascos FT y FC, respectivamente; | e) | recipientes (denominados FS) para comprobar una possible degradación abiótica como en la letra a) más 50 mg/l HgCl2 o esterilizados de alguna otra manera (por ejemplo, mediante autoclavado). | 43. | Las sustancias problema y sustancias de referencia hidrosolubles se añaden como soluciones madre acuosas (puntos 22, 23 y 24) para dar una concentración de entre 10 y 20 mg C/l. | 44. | Las sustancias problema y sustancias de referencia insolubles se añaden a los frascos de diversas formas [véase el punto 22, letras a) a e)] según la naturaleza de la sustancia problema, bien antes o bien después de la adición del medio inoculado, en función del método de tratamiento de la sustancia problema. Si se aplica uno de los procedimientos indicados en el punto 22, letras a) a e), los frascos en blanco FB [punto 42, letra b)] deben tratarse de forma similar, pero excluyendo la sustancia problema o la sustancia de referencia. | 45. | Las sustancias problema volátiles deben inyectarse en frascos sellados (punto 47) mediante una microjeringa. La dosis se calcula a partir del volumen inyectado y de la densidad de la sustancia problema. | 46. | En caso necesario, se añade agua a los recipientes para obtener el mismo volumen de líquido en cada uno de ellos. Ha de velarse por que la relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido (normalmente, 1:2) y la concentración de la sustancia problema sean tales que se disponga de suficiente oxígeno en el espacio de cabeza para permitir una biodegradación completa. | 47. | A continuación se sellan todos los frascos, por ejemplo con diafragmas de caucho butílico y cápsulas de aluminio. Las sustancias problema volátiles deben añadirse en esta fase (punto 45). Si ha de seguirse el descenso de la concentración de COD de la solución de ensayo y han de realizarse análisis a tiempo cero para determinar la concentración de CI inicial [controles estériles, punto 42, letra e)] u otros parámetros, tomar una muestra apropiada del recipiente de ensayo. Este recipiente y su contenido se desechan a continuación. | 48. | Los frascos sellados se colocan en un agitador rotatorio [punto 15, letra d)], con una velocidad de agitación suficiente para mantener el contenido de los frascos bien mezclado y en suspensión (por ejemplo, de 150 a 200 rpm), y se incuban a oscuras y a 20 °C, con una precisión de ± 1 °C. | Muestreo | 49. | El patrón de muestreo dependerá del período de latencia y de la tasa cinética de biodegradación de la sustancia problema. Se toman frascos para analizarlos el mismo día del muestreo, que debe hacerse al menos una vez por semana o con más frecuencia (por ejemplo, dos veces por semana) si hace falta obtener la curva de degradación completa. Se toma del agitador el número necesario de frascos replicados, que correspondan a FT, FB y FC y, cuando se utilicen, FI y FS (véase el punto 42). El ensayo dura normalmente 28 días. Si la curva de biodegradación indica que se alcanza una meseta antes del día 28, el ensayo puede darse por concluido sin llegar al día 28. Tomar muestras de los cinco frascos reservados para el día 28 del ensayo a fin de analizarlas y utilizar los resultados para calcular los límites de confianza o el coeficiente de variación del porcentaje de degradación. No es necesario tomar con tanta frecuencia como de los demás frascos muestras de los que correspondan a las comprobaciones de la inhibición y de la degradación abiótica; es suficiente con los días 1 y 28. | Análisis de carbono inorgánico (CI) | 50. | La producción de CO2 en los frascos se determina midiendo el aumento de la concentración de carbono inorgánico (CI) durante la incubación. Se dispone de dos métodos recomendados para medir la cantidad de CI producida en el ensayo, y se describen inmediatamente a continuación. Dado que los métodos pueden dar resultados ligeramente diferentes, en cada tanda de ensayos hay que utilizar uno solo. | 51. | Se recomienda el método a) si resulta probable que el medio contenga restos de, por ejemplo, un papel de filtro de vidrio o sustancia problema insoluble. Este análisis puede realizarse utilizando un cromatógrafo de gases si no se dispone de analizador de carbono. Es importante que los frascos estén a la temperatura del ensayo (o cerca de esta) cuando se analice el gas del espacio de cabeza. El método b) puede ser más fácil para los laboratorios que utilicen analizadores de carbono para medir el CI. Es importante que la solución de hidróxido de sodio (punto 21) utilizada para convertir el CO2 en carbonato sea recién preparada o bien que se conozca su contenido en CI, de forma que este pueda tenerse en cuenta a la hora de calcular los resultados del ensayo [véase el punto 66, letra b)]. | Método a): acidificación a pH < 3 | 52. | Antes de cada lote de análisis, se calibra el analizador de CI utilizando un patrón adecuado de CI (por ejemplo, CO2 al 1 % p/p en N2). Se inyecta ácido ortofosfórico concentrado (punto 20) a través del diafragma de cada frasco de la muestra para reducir el pH del medio a<3 (por ejemplo, añadir 1 ml a 107 ml de medio de ensayo). Los frascos se vuelven a colocar en el agitador. Tras agitar durante una hora a la temperatura de ensayo, se sacan los frascos del agitador, se retiran alícuotas (por ejemplo, de 1 ml) de gas del espacio de cabeza de cada frasco y se inyectan en el analizador de CI. Las concentraciones medidas de CI se registran en mg C/l. | 53. | El principio del presente método consiste en que, tras la acidificación hasta un pH<3 y la estabilización a 20 °C, la constante de equilibrio para la distribución del CO2 entre las fases líquida y gaseosa de los frascos de ensayo es de 1,0 cuando se mide en concentraciones (13). Es necesario demostrar al menos una vez que esto es así con el sistema de ensayo, de la manera siguiente: | Preparar frascos con 5 y 10 mg/l de CI utilizando una solución de carbonato de sodio anhidro (Na2CO3) en agua exenta de CO2, obtenida acidificando agua hasta llegar a un pH de 6,5 con ácido ortofosfórico concentrado (punto 20), burbujeando hasta el día siguiente aire exento de CO2 y elevando el pH con álcali hasta llegar a la neutralidad. Asegurarse de que la relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido es la misma que en los ensayos (por ejemplo, de 1:2). Acidificar y equilibrar como se describe en el punto 52, y medir las concentraciones de CI tanto en la fase del espacio de cabeza como en la del líquido. Comprobar que las dos concentraciones son la misma, teniendo en cuenta el error experimental. En caso contrario, el operario debe revisar los procedimientos. No es necesario efectuar esta verificación de la distribución del CI entre las fases líquida y gaseosa cada vez que se realiza el ensayo; en principio puede hacerse durante la calibración. | 54. | Si se quiere medir la eliminación del COD (solo con sustancias problema hidrosolubles), hay que tomar muestras de la fase líquida de distintos frascos (no acidificados), filtrarlas por membrana e inyectarlas en el analizador de COD. Estos frascos pueden utilizarse en otros análisis en caso necesario, para medir la biodegradación primaria. | Método b): conversión del CO2 en carbonato | 55. | Antes de cada lote de análisis, calibrar el analizador de CI utilizando un patrón adecuado como, por ejemplo, una solución de bicarbonato sódico (NaHCO3) en agua exenta de CO2 (véase el punto 53) en la banda de 0 a 20 mg/l de CI. Inyectar solución de hidróxido de sodio (7 M, punto 21) (por ejemplo, 1 ml en 107 ml de medio) a través del diafragma de cada frasco muestreado; agitar los frascos durante 1 h a la temperatura de ensayo. Usar la misma solución de NaOH en todos los frascos apartados un día determinado, pero no necesariamente en todos los muestreos efectuados a lo largo de un ensayo. Si se necesita conocer los valores absolutos de CI de los blancos en todos los muestreos, será necesario determinar el CI de la solución de NaOH cada vez que se utilice. Sacar los frascos del agitador y dejar reposar. Se retiran con jeringa volúmenes adecuados (por ejemplo, de 50 a 1 000 μl) de la fase líquida de cada recipiente. Las muestras se inyectan en el analizador de CI y se registran las concentraciones de CI. Hay que velar por que el analizador empleado esté equipado de forma adecuada para tratar las muestras alcalinas preparadas según este método. | 56. | El principio del presente método consiste en que, tras la adición de álcali y la agitación, se hace despreciable la concentración de CI en el espacio de cabeza. Es necesario demostrar al menos una vez que esto es así con el sistema de ensayo, utilizando patrones de CI, añadiendo álcali y dejando equilibrar, para medir a continuación la concentración de CI tanto en la fase del espacio de cabeza como en la líquida (véase el punto 53). La concentración en el espacio de cabeza debe aproximarse a cero. Esta comprobación de que la absorción de CO2 es prácticamente total no resulta necesario hacerla cada vez que se realiza el ensayo. | 57. | Si se quiere medir la eliminación del COD (solo con sustancias problema hidrosolubles), hay que tomar muestras de la fase líquida de distintos frascos (a los que no se ha añadido álcali), filtrarlas por membrana e inyectarlas en el analizador de COD. Estos frascos pueden utilizarse en otros análisis en caso necesario, para medir la biodegradabilidad primaria. | DATOS E INFORME | Cálculo de los resultados | 58. | Suponiendo una mineralización del 100 % de la sustancia problema en CO2, el CITe que supere el producido en los controles en blanco equivale al COT añadido a cada frasco de ensayo al inicio del ensayo; es decir: | La masa total (mg) del carbono inorgánico (CIT) de cada frasco es: | Ecuación [1] | donde: | VL | = | volumen de líquido en el frasco (litros); | CL | = | concentración de CI en el líquido (mg/l en carbono); | VH | = | volumen del espacio de cabeza (litros); | CH | = | concentración de CI en el espacio de cabeza (mg/l en carbono). | Los cálculos del CIT de los dos métodos analíticos utilizados para medir el CI en este ensayo se describen más adelante, en los puntos 60 y 61. El porcentaje de biodegradación (% D) en cada caso viene dado por la fórmula siguiente: | Ecuación [2] | donde: | CITt | = | mg CIT en el frasco de ensayo en el tiempo t; | CITb | = | mg CIT medio en los frascos en blanco en el tiempo t; | COT | = | mg COT añadidos inicialmente al recipiente de ensayo. | El porcentaje de biodegradación (% D) se calcula para los frascos de ensayo (FT), de referencia (FC) y, cuando se incluyan, de control del seguimiento de la inhibición (FI) a partir de las respectivas cantidades de CIT producidas hasta cada tiempo de muestreo. | 59. | Si se observa un aumento significativo del contenido de CIT de los controles estériles (FS) a lo largo del período de ensayo, puede concluirse que ha habido degradación abiótica de la sustancia problema, y hay que tener esto en cuenta al calcular el valor de D en la ecuación [2]. | Acidificación a pH < 3 | 60. | Dado que la acidificación a pH < 3 y el equilibrado resulta en la igualación de la concentración de CIT en las fases líquida y gaseosa, solo debe medirse la concentración de CI en la fase gaseosa. Así pues, de la ecuación [1] se desprende que , donde VB = volumen del frasco de suero. | Conversión del CO2 en carbonato | 61. | En este método se realizan los cálculos como en la ecuación [1], pero se ignora la cantidad despreciable de CI presente en la fase gaseosa, es decir, , y. | Expresión de los resultados | 62. | Se obtiene una curva de biodegradación representando el porcentaje de biodegradación, D, frente al tiempo de incubación y, si es posible, se indican las fases de latencia y de biodegradación y el período de observación de 10 días, así como la fase de meseta, es decir, la fase en que se ha alcanzado la degradación máxima y se ha aplanado la curva de biodegradación. Si se obtienen resultados comparables con los recipientes de ensayo paralelos FT (< 20 % de diferencia), se representa una curva media (véase el apéndice 2, fig.1); en caso contrario, se representan las curvas de cada recipiente. Se determina el valor medio del porcentaje de biodegradación en la fase de meseta o se evalúa el valor máximo (por ejemplo, cuando la curva decrece en la fase de meseta), pero es importante evaluar que en este último caso el valor no es anómalo. Hay que indicar este nivel máximo de biodegradación en el informe de ensayo como "grado de biodegradación de la sustancia problema". Si el número de recipientes de ensayo es insuficiente para indicar la fase de meseta, se utilizan los valores medidos el último día del ensayo para calcular el valor medio. Este último valor, la media de cinco réplicas, sirve para indicar la precisión con que se ha determinado el porcentaje de biodegradación. Indíquese también el valor obtenido al final del período de observación de 10 días. | 63. | De la misma manera, se representa la curva para la sustancia de referencia, FC, y, si están incluidos, para la comprobación de la eliminación abiótica, FS y el control de la inhibición, FI. | 64. | Se registran las cantidades de CIT presentes en los controles en blanco (FB), así como las de los frascos FS (comprobación abiótica), si se han incuido en el ensayo los recipientes correspondientes. | 65. | Calcular el valor de D correspondiente a los recipientes FI, sobre la base del rendimiento de CI teórico previsto a partir de únicamente el componente de referencia de la mezcla. Si, al día 28, [(DFC (12)– DFI (13))/DFC] × 100 > 25 %, puede aceptarse que la sustancia problema ha inhibido la actividad del inóculo, y esto puede explicar la obtención de bajos valores de DFT en las condiciones del ensayo. En este caso, el ensayo puede repetirse utilizando una concentración de ensayo menor y, de preferencia, reduciendo el CID en el inóculo y el CIT formado en los controles en blanco, ya que, si no, la menor concentración reduciría la precisión del método. También puede utilizarse otro inóculo. Si en el frasco FS (abiótico) se observa un aumento significativo (> 10 %) en la cantidad de CIT, es posible que se hayan dado procesos de degradación abiótica. | Validez de los resultados | 66. | Se considera que un ensayo es válido si: | a) | el valor medio del porcentaje de degradación en los recipientes FC que contienen la sustancia de referencia es > 60 % para el 14o día de incubación, y | b) | el valor medio del CIT presente en los controles en blanco FB al final del ensayo es > 3 mg C/l. | Si no se respetan estos límites, hay que repetir el ensayo con un inóculo procedente de otra fuente o revisar los procedimientos aplicados. Por ejemplo, si la obtención de un contenido elevado de CI en los blancos es un problema, debe seguirse el procedimiento contemplado en los puntos 27 a 32. | 67. | Si la sustancia problema no alcanza el 60 % del CITe y se ha visto que no es inhibidora (punto 65), podría repetirse el ensayo con una concentración superior del inóculo (hasta 30 mg/l de lodo activado y 100 ml de efluente/l) o inóculo de otras fuentes, sobre todo si la degradación estaba en la banda del 20 al 60 %. | Interpretación de los resultados | 68. | Una biodegradación > 60 % del CITe en el plazo de observación de 10 días en este ensayo demuestra que la sustancia problema es fácilmente biodegradable en condiciones aerobias. | 69. | Si no se alcanza el umbral del 60 % del CITe, determinar el valor de pH en los medios de los frascos que no se han acidificado ni alcalinizado; un valor inferior a 6,5 podría indicar que se ha producido nitrificación. En tal caso, repítase el ensayo con una solución amortiguadora de mayor concentración. | Informe del ensayo | 70. | Elaborar una tabla con los valores del % D de cada uno de los frascos de ensayo (FT), de referencia (FC) y, si se han incluido, de control de la inhibición (FI) correspondientes a cada día muestreado. Si se obtienen resultados comparables con los frascos replicados, trazar la curva del valor medio del % D frente al tiempo. Registrar la cantidad de CIT en los blancos (FB) y en los controles estériles (FS), así como el COD y otros parámetros, y su porcentaje de eliminación. | 71. | Determinar el valor medio del % D en la fase de meseta, o utilizar el valor máximo si la curva de biodegradación decrece en la fase de meseta, y comunicarlo como "grado de biodegradación de la sustancia problema". Es importante asegurarse de que en este último caso el valor máximo no es anómalo. | 72. | El informe del ensayo deberá incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Nombre común, nombre químico, número CAS, fórmula estructural, y propiedades fisicoquímicas pertinentes. | — | Pureza (impurezas) de la sustancia problema. | | Condiciones de ensayo: | — | Referencia al presente método de ensayo. | — | Descripción del sistema de ensayo utilizado (por ejemplo, volumen del recipiente, relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido, método de agitación, etc.). | — | Aplicación de la sustancia problema y de la sustancia de referencia al sistema de ensayo: concentración de ensayo utilizada y cantidad de carbono añadida a cada frasco de ensayo, eventual uso de disolventes. | — | Datos del inóculo empleado, eventual tratamiento y acondicionamiento previos. | — | Temperatura de incubación. | — | Validación del principio del análisis del CI. | — | Características principales del analizador de IC empleado (y de otros eventuales métodos analíticos aplicados). | — | Número de réplicas. | | Resultados: | — | Datos en bruto y valores calculados de biodegradabilidad en forma tabular. | — | Gráficas del porcentaje de degradación frente al tiempo correspondientes a la sustancia problema y a la sustancia de referencia, fase de latencia, fase de degradación, período de observación de 10 días y pendiente. | — | Porcentaje de eliminación en la meseta, al final del ensayo y tras el período de observación de 10 días. | — | Motivos del eventual rechazo de los resultados del ensayo. | — | Cualquier otro dato que pueda ser pertinente sobre el procedimiento seguido. | — | Discusión de los resultados. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Capítulo C.4 del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad "fácil". Ensayo de desprendimiento de CO2 (método C.4-C) | (2) | Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167. | (3) | Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161. | (4) | Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210. | (5) | ISO 9439 (1990; revisada en 1999). Calidad del agua. Evaluación de la biodegradabilidad aerobia final de los compuestos orgánicos en medio acuoso. Método por valoración del dióxido de carbono producido (Sturm). | (6) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (7) | US EPA (1996). 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Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC. | (19) | Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An "inherent" biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235. | (20) | Capítulo C.4 del presente anexo: Determinación de la biodegradabilidad "fácil". | (21) | OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris. | (22) | Capítulo C.11 del presente anexo. Lodo activado: Prueba de inhibición de la respiración. | (23) | Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327. | (24) | EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK. | (25) | ISO 10634 (1996) Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación y tratamiento de los compuestos orgánicos poco solubles en agua para la subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso. | Apéndice 1 | ABREVIATURAS Y DEFINICIONES | CI: Carbono inorgánico. | CO2Te: Dióxido de carbono teórico (mg); es la cantidad de dióxido de carbono que se calcula que va a producirse a partir del contenido en carbono, conocido o medido, de la sustancia problema cuando se mineraliza completamente; se expresa también como mg de dióxido de carbono producido por mg de sustancia problema. | COD: Carbono orgánico disuelto; es el carbono orgánico presente en solución o el que pasa a través de un filtro de 0,45 micrómetros o permanece en el sobrenadante tras centrifugación a aproximadamente 4 000 g (± 40 000 m sec-2) durante 15 minutos. | CID: Carbono inorgánico disuelto. | CITe: Carbono inorgánico teórico. | CIT: Carbono inorgánico total. | Fácilmente biodegradable: Categoría arbitraria de sustancias químicas que han pasado determinados ensayos exploratorios específicos en cuanto a la biodegradabilidad última; estos ensayos son tan estrictos que se acepta que estos compuestos se degradan rápida y completamente en los medios ambientes acuáticos en condiciones aerobias. | Período de observación de 10 días: Son los 10 días que siguen inmediatamente al momento en que se alcanza el 10 % de degradación. | Biodegradabilidad intrínseca: Categoría de sustancias químicas que presentan signos inequívocos de biodegradación (primaria o final) en algún ensayo de biodegradabilidad. | Biodegradación aerobia final: Es el nivel de degradación al que llega la sustancia problema cuando es totalmente utilizada por microorganismos dando lugar a la producción de dióxido de carbono, agua, sales minerales y nuevos constituyentes celulares microbianos (biomasa). | Mineralización: Degradación completa de una sustancia orgánica a CO2 y H2O en condiciones aerobias y a CH4, CO2 y H2O en condiciones anaerobias. | Fase de latencia: Tiempo comprendido desde el inicio de un ensayo hasta que se consigue la aclimatación o adaptación de los microorganismos de degradación y llega a un nivel detectable el grado de biodegradación de una sustancia o materia orgánica problema (por ejemplo, hasta el 10 % de la biodegradación teórica máxima, o menos, en función de la exactitud de la técnica de medición). | Fase de degradación: Tiempo transcurrido desde el final de la fase de latencia hasta el momento en que se alcanza el 90 % del nivel máximo de degradación. | Fase de meseta: Fase en la que se ha alcanzado la degradación máxima y se ha aplanado la curva de biodegradación. | Sustancia problema: Toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este método de ensayo. | Apéndice 2 | Ejemplo de curva de biodegradación | Figura 1 | Biodegradación del 1-octanol en el ensayo del espacio de cabeza de CO2 | Glosario: | Biodegradación | Fase de degradación | Nivel máximo de biodegradación | Fase de meseta | Período de observación de 10 días | Tiempo de ensayo (días) | C.30. BIOACUMULACIÓN EN OLIGOQUETOS TERRESTRES | INTRODUCCIÓN | 1. | El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo de la OCDE TG 317 (2010). Entre los métodos de ensayo relativos al destino en el medio ambiente, los denominados Bioconcentración — Ensayo dinámico con peces [capítulo C.13 del presente anexo (49)] y Bioacumulación en oligoquetos bentónicos que viven en los sedimentos (53) se publicaron respectivamente en 1996 y 2008, respectivamente. Extrapolar datos de bioacumulación acuática a los organismos terrestres, como los gusanos de tierra, resulta difícil, si no imposible. Actualmente se utilizan modelos de cálculo basados en la lipofilia de la sustancia problema [por ejemplo, (14) (37)] para la evaluación de la bioacumulación de sustancias en el suelo como, por ejemplo, en el documento de orientación técnica de la UE (19). Ya se ha establecido la necesidad de disponer de un método específico del compartimento [por ejemplo, (55)]. Esto es especialmente importante para la evaluación del envenenamiento secundario en cadenas alimentarias terrestres (4). Varios métodos de ensayo nacionales se refieren a la cuestión de la bioacumulación en organismos diferentes de los peces, como, por ejemplo, (2) y (72). La American Society for Testing and Materials ha elaborado un método para medir la bioacumulación en gusanos de tierra (Eisenia fetida, Savigny) y gusanos terrestres del género Enchytraeus (3). Un método reconocido internacionalmente para la determinación de la bioacumulación en suelo enriquecido mejorará la evaluación del riesgo que plantean las sustancias para los ecosistemas terrestres [por ejemplo, (25) (29)]. | 2. | Los invertebrados que ingieren suelo están expuestos a las sustancias unidas a este. Entre dichos animales, los oligoquetos terrestres desempeñan una papel importante para la estructura y la función de los suelos (15) (20). Los oligoquetos terrestres viven en el interior del suelo y parcialmente en su superficie (especialmente en la capa de materia orgánica en descomposición); suelen representar las especies más abundantes en términos de biomasa (54). Al remover la tierra y servir de presa estos animales pueden influir mucho en la biodisponibilidad de las sustancias para otros organismos, como predadores invertebrados [por ejemplo, ácaros y escarabajos predadores (64)] o vertebrados [por ejemplo, zorros y gaviotas (18) (62)]. En el apéndice 5 se describen algunas especies de oligoquetos terrestres que se utilizan actualmente en ensayos ecotoxicológicos. | 3. | La guía ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus (3) proporciona muchos datos fundamentales y útiles para la realización del presente método de ensayo sobre bioacumulación en el suelo. También se hace referencia en el presente método de ensayo al capítulo C.13 del presente anexo (Bioconcentración — Ensayo dinámico con peces) (49) y a las directrices TG 315 de la OCDE (Bioacumulación en oligoquetos bentónicos que viven en los sedimentos) (53). Asimismo, constituyen fuentes principales de información para el presente método de ensayo la experiencia práctica con estudios de bioacumulación en el suelo y las publicaciones de la bibliografía, como, por ejemplo, (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79). | 4. | El método de ensayo es sobre todo aplicable a las sustancias orgánicas neutras y estables, que tienden a adsorberse al suelo. Es posible que este método de ensayo pueda aplicarse en los ensayos de bioacumulación de compuestos organometálicos estables que se asocian al suelo. También es aplicable a los metales y otros oligoelementos. | REQUISITO PREVIO | 5. | Se han realizado ensayos para medir la bioacumulación en los oligoquetos terrestres en relación con metales pesados [véase por ejemplo (63)] y de sustancias orgánicas persistentes con un valor de log Kow entre 3,0 y 6,0 [véase por ejemplo (40)]. Estos ensayos también son aplicables a: | — | las sustancias con un valor de log Kow superior a 6,0 (sustancias superhidrofóbicas), | — | las sustancias que pertenecen a una clase de sustancias orgánicas de las que se sepa que tienen potencial para bioacumularse en organismos vivos como, por ejemplo, las sustancias tensioactivas o muy adsorbentes, | — | las sustancias cuyas características estructurales indican potencial de bioacumulación como, por ejemplo, los análogos de sustancias con potencial de bioacumulación conocido, y | — | los metales. | 6. | Antes de empezar el estudio ha de obtenerse información sobre la sustancia problema, como el nombre común, el nombre químico (de preferencia la denominación IUPAC), la fórmula estructural, el número de registro CAS, la pureza, las precauciones de seguridad, las condiciones adecuadas de conservación y los métodos analíticos. Además, deben conocerse los datos siguientes: | a) | hidrosolubilidad; | b) | coeficiente de reparto octanol/agua Kow; | c) | coeficiente de reparto suelo/agua Koc; | d) | presión de vapor; | e) | degradabilidad (por ejemplo, en el suelo, en agua); | f) | metabolitos conocidos. | 7. | Pueden utilizarse sustancias problema tanto con marcado radiactivo como sin él. Sin embargo, para facilitar el análisis se recomienda emplear sustancias problema con marcado radiactivo. La decisión dependerá de los límites de detección o de la necesidad de medir la sustancia problema inicial y sus metabolitos Si se utiliza una sustancia problema con marcado radiactivo y se miden los residuos radiactivos totales, es importante caracterizar estos residuos tanto en el suelo como en los organismos de ensayo en cuanto a los porcentajes de sustancia problema inicial y de otras sustancias marcadas, por ejemplo en muestras tomadas en el estado de equilibrio o al final de la fase de absorción, para poder calcular un factor de bioacumulación (BAF) de la sustancia problema inicial y de sus metabolitos importantes presentes en el suelo (véase el punto 50). Es posible que se tenga que modificar el método aquí descrito como, por ejemplo, para conseguir biomasa suficiente o para medir sustancias problema orgánicas no marcadas radiactivamente o metales. Cuando se miden los residuos radiactivos totales (por recuento de centelleo líquido tras la extracción, combustión o disolución de los tejidos), el factor de bioacumulación se basará en la sustancia problema inicial y en sus metabolitos. El cálculo del BAF se basará preferentemente en la concentración de la sustancia problema inicial en los organismos y en los residuos radiactivos totales. Posteriormente, debe calcularse el factor de acumulación biota-suelo (BSAF), normalizado teniendo en cuenta el contenido de lípidos de los gusanos y el contenido de carbono orgánico (CO) del suelo, a partir del BAF, para permitir comparar los resultados obtenidos con diferentes ensayos de bioacumulación. | 8. | Debe conocerse la toxicidad de la sustancia problema para la especie utilizada en el ensayo, por ejemplo en forma de concentración con efecto (ECx) o de concentración letal (LCx) por la fase de absorción [por ejemplo, (19)]. Normalmente, la concentración seleccionada de la sustancia problema será aproximadamente del 1 % de su LC50 aguda asintótica, y al menos diez veces superior a su límite de detección en el suelo por el método de análisis elegido. Cuando sea posible, se dará prioridad a los valores de toxicidad derivados de estudios a largo plazo con parámetros subletales (51) (52). Si no se dispone de tales datos, un ensayo de toxicidad aguda aportará información útil [véase, por ejemplo, (23)]. | 9. | Debe disponerse de un método analítico adecuado, de exactitud, precisión y sensibilidad conocidas para la cuantificación de la sustancia en las soluciones de ensayo, en el suelo y en el material biológico, así como de datos sobre la preparación y la conservación de las muestras, junto con las fichas de datos de seguridad de los materiales. Es necesario también conocer el límite de detección analítica de la sustancia problema tanto en el suelo como en los tejidos de los gusanos. Si se utiliza una sustancia problema con marcado radiactivo, debe conocerse la radiactividad específica (es decir, en Bq mol-1) y el porcentaje de radiactividad asociada con las impurezas. La radiactividad específica de la sustancia problema debe ser suficentemente elevada para facilitar el análisis, y las concentraciones de ensayo utilizadas no deben provocar efectos tóxicos. | 10. | El ensayo puede efectuarse con suelo artificial o con suelos naturales. Antes del inicio del ensayo debe disponerse de información sobre las características del suelo natural empleado como, por ejemplo, origen del suelo o sus componentes, pH, contenido de carbono orgánico, granulometría (porcentaje de arena, limo y arcilla), y capacidad de retención de agua (WHC) (3) (48). | PRINCIPIO DEL ENSAYO | 11. | Entre los parámetros que caracterizan la bioacumulación de una sustancia problema se cuentan el factor de bioacumulación (BAF), la constante de la velocidad de absorción (ks) y la constante de la velocidad de eliminación (ke). En el apéndice 1 se dan las definiciones pertinentes. | 12. | El ensayo se divide en dos fases: la de absorción (exposición) y la de eliminación (post-exposición). Durante la fase de absorción, se exponen al suelo, que se ha enriquecido con la sustancia problema, grupos de gusanos en paralelo (réplicas). Además de los animales de ensayo, se someten a las mismas condiciones pero sin la sustancia problema grupos de gusanos de control. Se miden el peso seco y el contenido de lípidos de los organismos de ensayo. Esto puede hacerse con gusanos del grupo de control. Pueden obtenerse valores analíticos de referencia (blanco) analizando muestras del suelo y de los gusanos de control. Para la fase de eliminación, los gusanos se pasan a un suelo libre de la sustancia problema. Siempre hay que hacer una fase de eliminación, salvo que la absorción de la sustancia problema durante la fase de exposición haya sido insignificante. La fase de eliminación aporta información sobre la velocidad a la que los organismos de ensayo excretan la sustancia problema [por ejemplo, (27)]. Si durante la fase de absorción no se ha llegado a un estado de equilibrio, es preferible que la determinación de los parámetros cinéticos (factor de bioacumulación cinético, BAFk) y las constantes de velocidad de absorción y de eliminación se base en el ajuste simultáneo de los resultados de las fases de absorción y de eliminación. La concentración de la sustancia problema en el interior o en la superficie de los gusanos es objeto de seguimiento a lo largo de ambas fases del ensayo. | 13. | Durante la fase de absorción, se efectúan mediciones a los tiempos de muestreo hasta 14 días (enquitreidos) o 21 días (gusanos de tierra) hasta que se alcance el estado de equilibrio (11) (12) (67). El estado de equilibrio se alcanza cuando una representación de la concentración en los gusanos frente al tiempo es paralela al eje del tiempo, y tres análisis sucesivos de la concentración efectuados con muestras tomadas a intervalos de al menos dos días no muestran una diferencias entre sí superiores al ± 20 % sobre la base de comparaciones estadísticas (por ejemplo, análisis de varianza, análisis de regresión). | 14. | La fase de eliminación consiste en transferir los organismos de ensayo a recipientes que contienen el mismo sustrato pero sin la sustancia problema. Durante la fase de eliminación, se llevan a cabo mediciones a los tiempos de muestreo durante 14 días (enquitreidos) o 21 días (gusanos de tierra) salvo que en alguna determinación analítica se ponga antes de manifiesto que se ha llegado a una reducción del 90 % de los residuos de la sustancia problema en los gusanos. La concentración de la sustancia problema en los gusanos al final de la fase de eliminación se registra como residuos no eliminados. El factor de bioacumulación en el estado de equilibrio (BAFss) se calcula de preferencia como la proporción de la concentración en gusanos (Ca) y en el suelo (Cs) en el estado de equilibrio aparente, y también como factor de bioacumulación cinético (BAFk) que es la proporción entre la constante de la velocidad de absorción desde el suelo (ks) y la constante de la velocidad de eliminación (ke) (véanse las definiciones en el apéndice 1), aceptando que la cinética es de orden 1 (véanse los cálculos en el apéndice 2). En caso de que claramente no pueda aplicarse la cinética de primer orden, será necesario emplear otros modelos. | 15. | La constante de la velocidad de absorción, la constante de la velocidad de eliminación (o constantes, cuando participen otros modelos), el factor de bioacumulación cinético (BAFk) y, cuando sea posible, los límites de confianza de cada uno de estos parámetros, se calculan a partir de ecuaciones modelo con ayuda de ordenador (véanse orientaciones en el apéndice 2). La adecuación del ajuste de cualquier modelo puede determinarse a partir de, por ejemplo, el coeficiente de correlación o del coeficiente de determinación (si los coeficientes están próximos a la unidad, es que la adecuación es buena) o con la prueba de ji cuadrado. También puede ser indicativo de la calidad del ajuste del modelo el orden del error típico o el límite de confianza alrededor de los parámetros estimados. | 16. | Para reducir la variabilidad de los resultados de los ensayos de sustancias problema con elevada lipofilia, los factores de bioacumulación deben expresarse en relación con el contenido de lípidos y el contenido de carbono orgánico (kg de carbono orgánico en el suelo/kg de contenido de lípidos en los gusanos). Este enfoque se basa en el hecho de que, con algunos tipos de sustancias químicas, hay una clara relación entre el potencial de bioacumulación y la lipofilia; esto está bien demostrado en peces (47). Hay una relación entre el contenido en lípidos de los peces y la bioacumulación de tales sustancias. Se han encontrado correlaciones similares en los organismos bentónicos [véanse, por ejemplo, (30) (44)]. Análogamente se ha demostrado esta correlación en el caso de los oligoquetos terrestres [véanse por ejemplo (5) (6) (7) (14)]. Si se dispone de suficiente tejido de gusanos, puede determinarse el contenido en lípidos de los animales de ensayo con el mismo material biológico que se utilice para determinar la concentración de la sustancia problema. Otra posibilidad es utilizar los animales de control para medir el contenido en lípidos. | VALIDEZ DEL ENSAYO | 17. | Para que un ensayo sea válido, deben cumplir los siguientes criterios tanto los grupos de control como los de tratamiento: | — | Al final del ensayo, la mortalidad general durante las fases de absorción y de eliminación no debe superar el 10 % (gusanos de tierra) o el 20 % (enquitreidos) del número total de gusanos introducidos. | — | Respecto a Eisenia fetida y Eisenia andrei, la pérdida media de masa medida al final de la fase de absorción y al final de la fase de eliminación no debe superar el 20 % respecto al peso fresco (pf) al inicio de cada fase. | DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO | Especies de ensayo | 18. | Para el ensayo de bioacumulación se recomienda emplear varias especies de oligoquetos terrestres. Las especies Eisenia fetida o Eisenia andrei (Lumbricidae), o Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, o Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae), que son las más frecuentemente utilizadas, se describen en el apéndice 5. | Equipo | 19. | Se tendrá cuidado de no utilizar, con ninguna parte del equipo, materiales que puedan disolver o adsorber la sustancia problema o lixiviar otras sustancias, o tener algún efecto adverso sobre los animales de ensayo. Pueden utilizarse recipientes normales rectangulares o cilíndricos, de materiales químicamente inertes y de una capacidad adecuada para la tasa de carga, es decir, para el número de gusanos de ensayo. Para los equipos que estén en contacto con los medios de ensayo pueden utilizarse acero inoxidable, plástico o vidrio. Los recipientes de ensayo deben estar cubiertos de forma adecuada para evitar que se escapen los gusanos, pero permitiendo que entre suficiente aire. En el caso de sustancias con elevados coeficientes de adsorción, como los piretroides sintéticos, puede ser necesario emplear vidrio silanizado. Será necesario, en estos casos, deshacerse de los equipos una vez usados (49). Debe evitarse que se escapen las sustancias problema con marcado radiactivo y también las sustancias volátiles. Deben emplearse trampas (por ejemplo, frascos lavadores de gas, de vidrio) con absorbentes adecuados para retener los eventuales residuos que se evaporen de los recipientes de ensayo. | Suelo | 20. | El suelo de ensayo debe ser tal que permita la supervivencia y, preferentemente, la reproducción de los organismos de ensayo durante los períodos de aclimatación y de ensayo, sin que aparezcan comportamientos ni aspectos anormales en los animales. Los gusanos deben enterrarse en el suelo. | 21. | Se recomienda para usarlo como sustrato de los ensayos el suelo artificial descrito en el capítulo C.8 del presente anexo (48). En el apéndice 4 se explica la preparación del suelo artificial para emplearlo en los ensayos de acumulación, y se dan recomendaciones para su almacenamiento. El suelo artificial secado al aire puede conservarse a temperatura ambiente hasta el momento de su utilización. | 22. | Sin embargo, como suelo para el ensayo o para el cultivo de los gusanos pueden emplearse suelos naturales procedentes de lugares exentos de contaminación. Los suelos naturales deben caracterizarse al menos por su origen (lugar de recogida), pH, contenido de carbono orgánico, granulometría (porcentaje de arena, limo y arcilla), capacidad de retención de agua máxima del suelo (WHCmax), y contenido porcentual de agua (3). El análisis del suelo o de sus componentes para detectar microcontaminantes antes de la utilización debe aportar información útil. Si se utiliza suelo de campo de tierras agrícolas, no debe haberse tratado con productos fitosanitarios ni haberse fertilizado con estiércol de animales tratados durante al menos un año ni con fertilizantes orgánicos durante al menos seis meses antes del muestreo (50). En la referencia 3 se describen los procedimientos de manipulación de los suelos naturales antes de su empleo en los ensayo de ecotoxicología con oligoquetos en laboratorio. El período de almacenamiento de los suelos naturales en el laboratorio debe ser lo más breve posible. | Aplicación de la sustancia problema | 23. | La sustancia problema se incorpora al suelo. Hay que tener en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema. Las sustancias problema hidrosolubles deben disolverse completamente en agua antes de mezclarse con el suelo. El procedimiento de enriquecimiento del suelo con sustancias problema poco hidrosolubles implica el recubrimiento de uno o varios de los componentes del suelo (artificial) con la sustancia problema. Por ejemplo, la arena de cuarzo, o una porción de la misma, puede sumergirse en una solución de la sustancia problema en un disolvente orgánico adecuado, que se evapora lentamente después hasta sequedad. La fracción recubierta puede mezclarse a continuación con el suelo húmedo. La ventaja principal de este procedimiento es que no se introduce ningún disolvente en el suelo. Cuando se utiliza suelo natural, la sustancia problema puede añadirse introduciéndola en una porción de suelo secada al aire como se describe más arriba respecto al suelo artificial, o agitando la sustancia problema en el suelo húmedo, con una fase posterior de evaporación si se utiliza agente solubilizante. En general, debe evitarse el contacto del suelo húmedo con los disolventes, en la medida de lo posible. Deben considerarse los elementos siguientes (3): | — | Si se utiliza un disolvente distinto del agua, debe ser uno miscible con esta y/o que pueda extraerse (por ejemplo, mediante evaporación), para dejar en el suelo solamente la sustancia problema. | — | Si se utiliza un control del disolvente, no es necesario emplear un control negativo. El control del disolvente debe contener la máxima concentración de disolvente que se haya añadido al suelo y hay que utilizar disolvente del mismo lote empleado para hacer la solución madre. Los principales criterios para la selección de un agente solubilizante adecuado deben ser la toxicidad y la volatilidad del disolvente, y la solubilidad de la sustancia problema en el disolvente elegido. | 24. | En el caso de sustancias poco solubles en agua y en disolventes orgánicos, es posible mezclar (por ejemplo, utilizando un mortero) entre 2,0 y 2,5 g de arena de cuarzo finamente molida por recipiente de ensayo con la cantidad de sustancia problema necesaria para obtener la concentración de ensayo deseada. Esta mezcla de arena de cuarzo y sustancia problema se añade al suelo previamente humedecido y se mezcla completamente con la cantidad adecuada de agua desionizada para obtener el contenido necesario de humedad. La mezcla final se reparte en los recipientes de ensayo. Se repite el procedimiento con cada concentración de ensayo, y se prepara asimismo un control adecuado con 2,0 – 2,5 g de arena de cuarzo finamente molida por recipiente de ensayo. | 25. | Debe determinarse la concentración de la sustancia problema en el suelo tras su adición a este. Ha de verificarse que la sustancia problema está distribuida de forma homogénea en el suelo antes de introducir los organismos de ensayo. Hay que indicar el método utilizado para añadir la sustancia problema y los motivos de la elección del procedimiento concreto (24). | 26. | Lo ideal es que se establezca el equilibrio entre el suelo y la fase de agua intersticial antes de añadir los organismos; se recomienda dejar un tiempo de cuatro días a 20 °C. Con muchas sustancias orgánicas poco hidrosolubles, el plazo necesario para alcanzar un equilibrio verdadero entre las fracciones adsorbidas y las disueltas puede ser del orden de días o de meses. En función del objeto del estudio, por ejemplo cuando se pretende simular las condiciones ambientales, el suelo al que se ha añadido la sustancia puede "envejecerse" durante un plazo mayor como por ejemplo, en el caso de los metales, de tres semanas a 20 °C (22). | Cultivo de los organismos de ensayo | 27. | Es preferible mantener los gusanos en cultivos de laboratorio permanentes. En el apéndice 5 se dan orientaciones sobre los métodos de cultivo en laboratorio de Eisenia fetida y Eisenia andrei, así como de especies de enquitreidos [véanse también (48) (51) (52)]. | 28. | Los gusanos utilizados en los ensayos deben estar libres de enfermedades, anomalías y parásitos observables. | REALIZACIÓN DEL ENSAYO | 29. | Los organismos de ensayo se exponen a la sustancia problema durante la fase de absorción, la cual debe durar 14 días (con los enquitreidos) o 21 días (con los gusanos de tierra), salvo que se demuestre que se ha alcanzado el estado de equilibrio. | 30. | Para la fase de eliminación, los gusanos se pasan a un suelo libre de la sustancia problema. La primera muestra debe tomarse a las 4 – 24 h tras el inicio de la fase de eliminación. En el apéndice 3 se dan ejemplos de planes de muestreo con una fase de absorción de 21 días y una fase de eliminación también de 21 días. | Organismos de ensayo | 31. | En muchas especies de enquitreidos terrestres, el peso de cada individuo es muy bajo (por ejemplo, de 5-10 mg de peso húmedo por individuo de Enchytraeus albidus y aún menos en el caso de Enchytraeus crypticus o de Enchytraeus luxuriosus); a fin de efectuar las mediciones del peso y el análisis químico, puede ser necesario agrupar los gusanos de los recipientes de ensayo replicados (es decir, todos los gusanos de un recipiente replicado se utilizarán para obtener un solo resultado de los tejidos analizados). A cada recipiente replicado se añaden 20 individuos de enquitreidos, y se utilizan al menos tres réplicas. Si el límite de detección analítica de la sustancia problema es elevado, puede ser necesario emplear más gusanos. Cuando se trate de especies de ensayo con mayor peso individual (Eisenia fetida y Eisenia andrei), pueden emplearse recipientes replicados con un solo individuo. | 32. | Los gusanos de tierra empleados en un ensayo deben tener pesos similares (por ejemplo, los individuos de Eisenia fetida y de Eisenia andrei deben tener un peso de 250 – 600 mg). Los enquitreidos (por ejemplo, Enchytraeus albidus) deben tener una longitud aproximada de 1 cm. Todos los gusanos utilizados en un ensayo concreto deben proceder de la misma fuente, y ser adultos con clitelo (véase el apéndice 5). Ya que el peso y la edad de un animal pueden afectar a los valores del BAF (por ejemplo, debido a las variaciones en el contenido de lípidos o a la presencia de huevos), estos parámetros deben registrarse con exactitud y tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. Además, pueden depositarse capullos durante el período de exposición, lo que también afecta a los valores del BAF. Se recomienda pesar una submuestra de la población de gusanos de ensayo antes del ensayo, para calcular el peso medio, tanto seco como húmedo. | 33. | Debe ser elevada la proporción de suelo respecto a los gusanos, para minimizar la disminución de la concentración de la sustancia problema en el suelo durante la fase de absorción. Con Eisenia fetida y Eisenia andrei se recomienda una cantidad mínima de 50 g de peso seco (p.s.) de suelo por gusano; con enquitreidos, la recomendación es de un mínimo de 10-20 g p.s. de suelo por recipiente de ensayo. Los recipientes deben contener una capa de suelo de 2-3 cm (enquitreidos) o 4-5 cm (gusanos de tierra). | 34. | Los gusanos empleados en un ensayo se toman del cultivo (por ejemplo, en el caso de los entriqueidos utilizando unas pinzas de joyero). Se transfieren animales adultos a un suelo de ensayo no tratado para su aclimatación, y se les da comida (véase el punto 36). Si las condiciones de ensayo son diferentes de las condiciones de cultivo, debe ser suficiente una fase de aclimatación de 24 – 72 h para que los gusanos se adapten a las condiciones de ensayo. Tras su aclimatación, los gusanos de tierra se lavan transfiriéndolos a placas de vidrio (por ejemplo, placas Petri) que contengan agua limpia, y después se pesan antes de añadirlos al suelo de ensayo. Antes de hacer la pesada, debe retirarse el exceso de agua de los gusanos, poniéndolos suavemente contra el borde de la placa o secándolos con precaución con una servilleta de papel humedecida ligeramente. | 35. | Debe observarse y registrarse la conducta de enterramiento de los organismos de ensayo. En los ensayos con gusanos de tierra, los animales (de control y de tratamiento) se entierran normalmente en el suelo en el plazo de unas pocas horas; ha de comprobarse que esto es así en el plazo máximo de 24 h tras la adición de los gusanos a los recipientes de ensayo. Si los gusanos no se entierran en el suelo (por ejemplo, hay más del 10 % de gusanos que no se entierran a lo largo de más de la mitad de la fase de absorción), puede ser que las condiciones de ensayo no sean adecuadas o bien que los organismos de ensayo no estén sanos. En tal caso, es necesario parar el ensayo y repetirlo. Los enquitreidos viven principalmente en los poros intersticiales del suelo, y con frecuencia su tegumento puede estar en contacto tan solo parcial con el sustrato que lo rodea; se acepta que la exposición de los enquitreidos enterrados y no enterrados es equivalente, y el que estos animales no se entierren no implica necesariamente que deba repetirse el ensayo. | Alimentación | 36. | Debe preverse dar alimento a los animales cuando se utilice un suelo con bajo contenido de carbono orgánico total. Si se utiliza suelo artificial, se recomienda una tasa de alimentación semanal (es decir, los gusanos se alimentan una vez por semana) de 7 mg de estiércol seco por gramo de suelo en peso seco para los gusanos de tierra, y una tasa semanal de 2 – 2,5 mg de copos de avena molidos por gramo de suelo en peso seco para los enquitreidos (11). La primera ración de alimento debe mezclarse con el suelo justo antes de que se añadan los organismos de ensayo. Es preferible utilizar el mismo de tipo de alimento que en los cultivos (véase el apéndice 5). | Luz y temperatura | 37. | Los ensayos deben efectuarse con un ciclo controlado de 16/8 horas de luz/oscuridad, con un nivel de iluminación preferentemente de 400 a 800 lx en la zona de los recipientes de ensayo (3). La temperatura de ensayo debe ser de 20 ± 2 °C en toda la duración. | Concentraciones de ensayo | 38. | Se utiliza una única concentración. Deben justificarse las situaciones en que sea necesario añadir una o varias concentraciones más. Si la toxicidad (ECx) de la sustancia problema está próxima al límite de detección analítica, se recomienda utilizar sustancias problema con marcado radiactivo de elevada radiactividad específica. En el caso de los metales, la concentración debe ser superior al nivel de fondo de los tejidos y del suelo. | Réplicas | 39. | Para las mediciones cinéticas (fases de absorción y de eliminación), el número mínimo de réplicas de recipientes tratados debe ser de tres por punto de muestreo. El número total de réplicas preparadas debe ser suficiente para todos los puntos de muestreo previstos de las fases de absorción y de eliminación. | 40. | Para las observaciones y mediciones biológicas (por ejemplo, relación entre peso seco y peso húmedo, contenido de lípidos) y para el análisis de las concentraciones de fondo en los gusanos y el suelo, deben preverse al menos 12 recipientes replicados de un control negativo (cuatro muestreados al inicio, cuatro al final de la fase de absorción y cuatro al final de la fase de eliminación) si no se utiliza ningún disolvente distinto del agua. Si se emplea algún agente solubilizante para la aplicación de la sustancia problema, debe utilizarse, además de las réplicas tratadas, un control del disolvente (cuatro recipientes de ensayo muestreados al inicio, cuatro al final de la fase de absorción y cuatro al final de la fase de eliminación) con todos los componentes salvo la sustancia problema. En este caso, pueden prepararse otros cuatro recipientes adicionales de un control negativo (sin disolvente) para permitir un muestreo opcional al final de la fase de absorción. Estas réplicas pueden compararse biológicamente con el control de disolvente para obtener información en cuanto a la posible influencia del disolvente sobre los organismos de ensayo. Se recomienda preparar un número suficiente de recipientes adicionales de reserva (por ejemplo, ocho) añadidos a los de tratamiento y de control. | Frecuencia de las mediciones de la calidad del suelo | 41. | Al inicio y al final de las fases de absorción y de eliminación deben medirse el pH del suelo, el contenido de humedad del suelo y (continuamente) la temperatura de la sala del ensayo. Una vez por semana debe controlarse el contenido de humedad del suelo pesando los recipientes de ensayo y comparando los pesos medidos en cada momento con los pesos iniciales del comienzo del ensayo. Las pérdidas de agua deben compensarse añadiendo agua desionizada. | Muestreo y análisis de los gusanos y del suelo | 42. | En el apéndice 3 se encuentra un ejemplo de plan para las fases de absorción y de eliminación de los ensayos de bioacumulación en gusanos de tierra y en enquitreidos. | 43. | Se toman muestras del suelo de los recipientes de ensayo para la determinación de la concentración de la sustancia problema antes de introducir los gusanos, y durante las fases de absorción y de eliminación. Durante el ensayo se determinan las concentraciones de la sustancia problema en los gusanos y en el suelo. En general, se miden las concentraciones totales en el suelo. Como opción pueden medirse las concentraciones en el agua intersticial; en tal caso, hay que aportar la justificación e indicar los métodos adecuados, antes del inicio del estudio, e incluir estos datos en el informe. | 44. | Se toman muestras de los gusanos y del suelo al menos en seis ocasiones durante las fases de absorción y de eliminación. Si se demuestra la estabilidad de la sustancia problema, puede reducirse el número de análisis del suelo. Se recomienda analizar al menos tres réplicas al inicio y al final de la fase de absorción. Si la concentración en el suelo medida al final de la fase de absorción se desvía de la concentración inicial en más del 30 %, será necesario analizar también las muestras de suelo en otras fechas. | 45. | En cada punto de muestreo se extraen los gusanos del suelo de una réplica dada (por ejemplo, después de extender el suelo de la réplica en una bandeja poco profunda, utilizando pinzas de joyero blandas) y se lavan rápidamente con agua en una bandeja poco profunda de vidrio o de acero. Se retira el exceso de agua (véase el punto 34). Se transfieren los gusanos con cuidado a un recipiente tarado y se pesan inmediatamente, incluido el contenido intestinal. | 46. | A continuación hay que dejar que los gusanos de tierra (Eisenia sp.) se purguen del contenido intestinal durante una noche, por ejemplo, en un papel de filtro húmedo puesto en una placa Petri cerrada (véase el punto 34). Tras la purga, debe determinarse el peso de los gusanos para evaluar una posible disminución de la biomasa durante el ensayo (véanse los criterios de validez en el punto 17). La pesada y el análisis tisular de los enquitreidos se efectúan sin purgar, ya que tales operaciones resultan difíciles técnicamente debido al pequeño tamaño de estos gusanos. Tras la determinación final del peso, los gusanos se matan inmediatamente, utilizando el método más adecuado (por ejemplo, con nitrógeno líquido, o congelando por debajo de – 18 °C). | 47. | Durante la fase de eliminación, los gusanos van sustituyendo por suelo limpio el contenido intestinal contaminado. Esto significa que las mediciones de gusanos sin purgar (enquitreidos en este contexto) muestreados justo antes de la fase de eliminación incluyen el suelo contaminado presente en el intestino. Respecto a los oligoquetos acuáticos se acepta que, tras las primeras 4-24 h de la fase de eliminación, la mayor parte del contenido intestinal contaminado ha sido sustituido por sedimento limpio [véase, por ejemplo, (46)]. Se han comunicado observaciones similares en relación con los gusanos de tierra en estudios sobre la acumulación de cadmio y zinc radiomarcados (78). En los enquitreidos no purgados, la concentración de esta primera muestra de la fase de eliminación puede considerarse como la concentración tisular tras la purga intestinal. Para tener en cuenta la dilución de la concentración de la sustancia problema por el suelo no contaminado durante la fase de eliminación, es posible estimar el peso del contenido intestinal a partir de la relación entre el peso húmedo de los gusanos y el peso de las cenizas de los gusanos, o de la relación entre el peso seco de los gusanos y el peso de las cenizas de los gusanos. | 48. | Es preferible analizar las muestras de suelo y de gusanos inmediatamente después de haberlas tomado (es decir, en el plazo de 1 o 2 días) para evitar la degradación y otras pérdidas, y se recomienda calcular las velocidades aproximadas de absorción y de eliminación según se va llevando a cabo el ensayo. Si se retrasa el análisis, las muestras deben conservarse siguiendo un método adecuado como, por ejemplo, mediante congelación (≤ –18 °C). | 49. | Hay que comprobar que la precisión y la reproducibilidad del análisis químico, así como la recuperación de la sustancia problema de las muestras de suelo y de gusanos, son satisfactorias para el método considerado; deben indicarse la eficiencia de la extracción, el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ). Análogamente hay que comprobar que la sustancia problema no es detectable en los recipientes de control a concentraciones superiores a la de fondo. Cuando la concentración de la sustancia problema en el organismo de ensayo Ca es > 0 en los gusanos de control, debe incluirse en el cálculo de los parámetros cinéticos (véase el apéndice 2). Todas las muestras deben manipularse a lo largo de todo el ensayo de manera que se minimicen la contaminación y las pérdidas (por ejemplo, derivadas de la adsorción de la sustancia problema al dispositivo de muestreo). | 50. | Cuando se trabaja con sustancias problema radiomarcadas, es posible analizar la sustancia original y sus metabolitos. La cuantificación de la sustancia problema original y de sus metabolitos en el estado de equilibrio o al final de la fase de absorción proporciona importante información. Las muestras deben "limpiarse" después, de manera que pueda cuantificarse aparte la sustancia problema original. Si alguno de los distintos metabolitos supera el 10 % de la radiactividad total de la muestra o muestras analizadas, se recomienda identificarlo. | 51. | Hay que registrar y comunicar la recuperación total y la recuperación de la sustancia problema en gusanos, suelo y, si se utilizan, trampas que contengan absorbentes para retener la sustancia problema evaporada. | 52. | Es aceptable mezclar los individuos muestreados de un recipiente de ensayo dado en el caso de los enquitreidos, que son más pequeños que los gusanos de tierra. Si esa mezcla implica reducir el número de réplicas, quedan limitados los procedimientos estadísticos que pueden aplicarse a los datos. Si se necesitan un procedimiento y una potencia estadística específica, convendrá entonces utilizar en el ensayo un número adecuado de recipientes de ensayo replicados, para conciliar la mezcla con el procedimiento y la potencia deseados. | 53. | Se recomienda expresar el BAF tanto en función del peso seco total como, cuando se requiera (es decir, en el caso de las sustancias muy hidrofóbicas), en función del contenido lipídico. Deben aplicarse métodos adecuados para la determinación del contenido lipídico; a este propósito deben adaptarse algunos métodos existentes, véase por ejemplo (31) (58). Estos métodos aplican una técnica de extracción con cloroformo/metanol. Sin embargo, para evitar el uso de disolventes clorados debe utilizarse una modificación del método de Bligh y Dyer (9), como se describe en (17). Los diversos métodos pueden no dar valores idénticos, por lo que es importante precisar bien el método utilizado. Lo ideal es hacer el análisis de los lípidos, cuando sea posible (es decir, si se dispone de suficiente tejido de gusanos), con la misma muestra o extracto que se haya utilizado para el análisis de la sustancia problema, puesto que los lípidos deben a menudo retirarse del extracto antes de que este se pueda analizar por cromatografía (49). Otra posibilidad es utilizar animales del control para medir el contenido lipídico, el cual puede servir para normalizar los valores del BAF. Este último planteamiento reduce la contaminación del equipo con la sustancia problema. | DATOS E INFORME | Tratamiento de los resultados | 54. | La curva de absorción de la sustancia problema se obtiene representando gráficamente su concentración en la superficie o el interior de los gusanos durante la fase de absorción en función del tiempo, con una escala aritmética. Cuando la curva ha alcanzado la fase de meseta, o un estado de equilibrio (véanse las definiciones en el apéndice 1), el factor de bioacumulación en el estado de equilibrio (BAFss) se calcula con ayuda de la fórmula siguiente; | Ca es la concentración de la sustancia problema en el organismo de ensayo | Cs es la concentración de la sustancia problema en el suelo | 55. | Si no se alcanza el estado de equilibrio, debe determinarse el BAFk, a partir de las constantes de velocidad, en lugar del BAFss, como se describe a continuación: | — | Determinar el factor de acumulación (BAFK) como la relación ks/ke. | — | Es preferible calcular simultáneamente las constantes de absorción y de eliminación (véase la ecuación 11 del apéndice 2). | — | La constante de la velocidad de eliminación (ke) se calcula normalmente a partir de la curva de eliminación (es decir, la gráfica de la concentración de la sustancia problema en los gusanos durante la fase de eliminación). A continuación se calcula la constante de la velocidad de absorción ks a partir de ke y del valor de Ca derivado de la curva de absorción; véase en el apéndice 2 una descripción de estos métodos. Para obtener el factor de bioconcentración BAFK y las constantes de velocidad ks y ke se utilizarán preferiblemente métodos informáticos de estimación de parámetros no lineales. En caso de que la eliminación claramente no siga una cinética de primer orden, será necesario emplear otros modelos más complejos. | Informe del ensayo | 56. | El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: | | Sustancia problema: | — | Toda la información disponible sobre la toxicidad aguda o a largo plazo (por ejemplo ECx, LCx, NOEC) de la sustancia problema respecto a los oligoquetos que viven en el suelo. | — | Pureza, naturaleza física y propiedades fisicoquímicas como, por ejemplo, log Kow, hidrosolubilidad. | — | Datos de identificación química, fuente de la sustancia problema, identidad y concentración de los eventuales disolventes utilizados. | — | Si se utilizan sustancias problema radiomarcadas, la posición precisa de los átomos marcados, la radiactividad específica y la pureza radioquímica. | | Especie de ensayo: | — | Denominación científica, cepa, fuente, eventuales tratamientos previos, aclimatación, edad, rango de tamaños, etc. | | Condiciones de ensayo: | — | Procedimiento de ensayo seguido. | — | Tipo y características del alumbrado y del fotoperíodo o fotoperíodos utilizados. | — | Diseño del ensayo (por ejemplo, número y tamaño de los recipientes de ensayo, masa de suelo y altura de la capa de suelo, número de réplicas, número de gusanos por réplica, número de concentraciones de ensayo, duración de las fases de absorción y eliminación, frecuencia del muestreo). | — | Justificación de la elección del material de los recipientes de ensayo. | — | Método de preparación y aplicación de la sustancia problema, así como motivos para elegir un método específico. | — | Concentraciones de ensayo nominales, medias de los valores medidos y sus desviaciones típicas en los recipientes de ensayo, y método de obtención de estos valores. | — | Fuente de los componentes del suelo artificial o, si se utilizan medios naturales, origen del suelo, descripción de los eventuales tratamientos previos, resultados de los controles (supervivencia, desarrollo de la biomasa, reproducción), características del suelo (pH, contenido de carbono orgánico total, granulometría (porcentaje de arena, limo y arcilla), WHCmax, contenido porcentual de agua al inicio y al final del ensayo, y otras mediciones realizadas eventualmente). | — | Información pormenorizada sobre el tratamiento de las muestras de suelo y de gusanos, incluidos datos de preparación, almacenamiento, adición de la sustancia problema, extracción y procedimientos (y precisión) del análisis de la sustancia problema en los gusanos y en el suelo y del contenido lipídico (si se mide), y recuperaciones de la sustancia problema. | | Resultados: | — | Mortalidad de los gusanos de control y de los gusanos de cada recipiente de ensayo, y eventuales comportamientos anormales observados (por ejemplo, evitación del suelo, ausencia de reproducción en un ensayo de bioacumulación con enquitreidos). | — | Relación de peso seco a peso húmedo del suelo y de los organismos del ensayo (útil a efectos de normalización). | — | Pesos húmedos de los gusanos a cada punto temporal de muestreo; en el caso de los gusanos de tierra, los pesos húmedos al inicio del ensayo y a cada punto temporal de muestreo antes y después de la purga intestinal. | — | El contenido lipídico de los organismos de ensayo (si se determina). | — | Curvas que indiquen las cinéticas de absorción y de eliminación de la sustancia problema en los gusanos y el tiempo hasta alcanzar el estado de equilibrio. | — | Ca y Cs (con desviación típica y bandas, en caso adecuado) a todos los puntos temporales de muestreo (Ca expresada g kg-1 de peso húmedo y seco de cuerpo completo, Cs expresada en g kg-1 de peso húmedo y seco de suelo); si se necesita conocer el factor de acumulación biota-suelo (BSAF) (por ejemplo, a efectos de comparación de los resultados de dos o más ensayos realizados con animales de diferente contenido lipídico), Ca puede expresarse además en g kg-1 de contenido lipídico del organismo, y Cs puede expresarse en g kg-1 de carbono orgánico del suelo. | — | BAF (expresado en kg de suelo·kg-1 de gusanos), constante de la velocidad de absorción del suelo ks (expresada en g de suelo kg-1 de gusanos día-1), y constante de la velocidad de eliminación ke (expresada en día-1); también puede indicarse adicionalmente el BSAF (expresado en kg de CO del suelo kg-1 de contenido lipídico de los gusanos). | — | Los siguientes parámetros, si se miden: porcentajes de sustancia original, metabolitos, y residuos ligados (es decir, porcentaje de sustancia problema que no puede extraerse con métodos comunes de extracción) detectados en el suelo y en los animales de ensayo. | — | Métodos utilizados para los análisis estadísticos de los datos. | | Evaluación de los resultados: | — | Cumplimiento de los resultados con los criterios de validez recogidos en el punto 17, | — | resultados imprevistos o poco usuales como, por ejemplo, eliminación incompleta de la sustancia problema de los animales de ensayo. | BIBLIOGRAFÍA: | (1) | Amorim M (2000). 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Chem. 15: 402–406. | Apéndice 1 | DEFINICIONES | Bioacumulación es el aumento de la concentración de la sustancia problema en el interior o en la superficie de un organismo respecto a la concentración de esta sustancia en el medio ambiente. La bioacumulación es el resultado de procesos tanto de bioconcentración como de biomagnificación (véase más abajo). | Bioconcentración es el aumento de la concentración de la sustancia problema en el interior o en la superficie de un organismo derivado de la absorción de la sustancia solo a partir del medio circundante (es decir, a través de la superficie corporal y del suelo ingerido), respecto a la concentración de esta sustancia en el medio circundante. | Biomagnificación es el aumento de la concentración de la sustancia problema en el interior o en la superficie de un organismo derivado de la absorción a través de comida o presas contaminadas, respecto a la concentración de esta sustancia en la comida o en la presa. La biomagnificación puede provocar la transferencia o la acumulación de la sustancia dentro de redes alimentarias. | La eliminación de una sustancia problema es la pérdida de esta sustancia por parte del tejido del organismo de ensayo por procesos activos o pasivos que se producen independientemente de la presencia o ausencia de la sustancia en el medio circundante. | El factor de bioacumulación (BAF) en cualquier momento de la fase de absorción de este ensayo de bioacumulación es la concentración de la sustancia problema en la superficie o en el interior del organismo de ensayo (Ca en g·kg-1 de peso seco de gusanos) dividida por la concentración de la sustancia en el medio circundante (Cs en g·kg-1 de peso seco de suelo); la unidad del BAF es el kg de suelo·kg-1 de gusanos. | El factor de bioacumulación en el estado de equilibrio (BAFss) es el BAF en dicho estado y no cambia significativamente a lo largo de un período prolongado de tiempo, durante el cual se mantiene constante la concentración de la sustancia problema en el medio circundante (Cs en g.kg-1 de peso seco de suelo). | Los factores de bioacumulación calculados directamente a partir de la relación entre la constante de la velocidad de absorción del suelo y la constante de la velocidad de eliminación (ks y ke, véase más adelante) se denominan factores de bioacumulación cinéticos (BAFK). | El factor de acumulación biota-suelo (BSAF) es la concentración (normalizada teniendo en cuenta el contenido lipídico) de la sustancia problema en la superficie o en el interior del organismo de ensayo, dividida entre la concentración (normalizada teniendo en cuenta el contenido de carbono orgánico) de la sustancia problema en el suelo en el estado de equilibrio. Ca se expresa entonces en g·kg-1 de contenido lipídico del organismo, y Cs en g·kg-1 de carbono orgánico del suelo; la unidad del BSAF es el kg de carbono orgánico·kg-1 de lípidos. | La meseta o el estado de equilibrio se define como el equilibrio entre los procesos de absorción y de eliminación que se dan simultáneamente durante la fase de exposición. La fase de equilibrio se alcanza en la representación gráfica del BAF frente al tiempo cuando la curva se hace paralela al eje del tiempo y tres análisis sucesivos del BAF realizados con muestras tomadas a intervalos de, al menos, dos días presentan una diferencia máxima del ± 20 % entre sí, y no hay diferencias estadísticamente significativas entre los tres puntos temporales de muestreo. Si las sustancias problema se absorben con lentitud, es más apropiado que los intervalos sean semanales (49). | El coeficiente de reparto carbono orgánico-agua (Koc) es la relación de la concentración de una sustancia en la fracción de carbono orgánico de un suelo respecto a su concentración en el agua, en equilibrio. | El coeficiente de reparto octanol-agua (Kow) es la relación entre la solubilidad de una sustancia en n-octanol y en agua, en equilibrio; también se denomina Pow. El logaritmo de Kow (log Kow) se utiliza como indicación del potencial de bioacumulación de una sustancia por los organismos acuáticos. | La fase de absorción o de exposición es el tiempo durante el cual los organismos de ensayo se exponen a la sustancia problema. | La constante de la velocidad de absorción del suelo (ks) es el valor numérico que define la velocidad del aumento de la concentración de la sustancia problema en el organismo de ensayo debido a la absorción desde la fase del suelo. ks se expresa en g de suelo kg-1 de gusanos d-1. | La fase de eliminación es el tiempo, tras la transferencia de los organismos de ensayo desde un medio contaminado a un medio exento de la sustancia problema, durante el cual se estudia la eliminación (o la pérdida neta) de la sustancia por los organismos de ensayo. | La constante de la velocidad de eliminación (ke) es el valor numérico que define la velocidad de reducción de la concentración de la sustancia problema en el organismo de ensayo, tras la transferencia de los organismos de ensayo desde un medio que contiene la sustancia problema hacia un medio exento de ella; ke se expresa en d-1. | Sustancia problema: Toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este método de ensayo. | Apéndice 2 | Cálculo de los parámetros de absorción y de eliminación | El parámetro principal del ensayo de bioacumulación es el factor de bioacumulación, el BAF. El BAF medido puede calcularse dividiendo la concentración en el organismo de ensayo, Ca, por la concentración en el suelo, Cs, en el estado de equilibrio. Si no se alcanza el estado de equilibrio durante la fase de absorción, en lugar del BAFss se calcula el BAFK a partir de las constantes de velocidad. Sin embargo, ha de señalarse si el BAF se refiere o no a las concentraciones en el estado de equilibrio. | El medio usual de obtener el factor de bioacumulación cinético (BAFK), la constante de la velocidad de absorción del suelo (ks) y la constante de la velocidad de eliminación (ke) es emplear métodos informáticos de estimación de parámetros no lineales, por ejemplo siguiendo los modelos descritos en (68). Dado un conjunto de datos secuenciales de concentración en el tiempo y las ecuaciones del modelo: | 0 < t < tc | [ecuación 1] | o | t > tc | [ecuación 2] | donde: | Ca | = | concentración de sustancia en los gusanos [g kg-1 de peso húmedo o seco] | ks | = | constante de la velocidad de absorción en los tejidos [g de suelo kg-1 de gusanos d-1] | Ca | = | concentración de sustancia en el suelo [g kg-1 de peso húmedo o seco] | ke | = | constante de la velocidad de eliminación [d-1] | tc | = | tiempo al final de la fase de absorción; | estos programas informáticos calculan los valores de BAFK, ks y ke. | Cuando la concentración de fondo en los gusanos no expuestos, por ejemplo en el día 0, se aparta significativamente de cero (como puede suceder, por ejemplo, con los metales), es necesario incluir la concentración de fondo (Ca,0) en estas ecuaciones, que así se convierten en las siguientes: | 0 < t < tc | [ecuación 3] | y | t > tc | [ecuación 4] | En los casos en que se observe un descenso significativo de la concentración de la sustancia problema en el suelo a lo largo del tiempo durante la fase de absorción, pueden utilizarse los modelos siguientes, por ejemplo (67) (79): | [ecuación 5] | donde: | Cs | = | concentración de sustancia en el suelo [g kg-1 de peso húmedo o seco] | k0 | = | constante de la velocidad de degradación en el suelo [d-1] | C0 | = | concentración inicial de sustancia en el suelo [g kg-1 de peso húmedo o seco] | 0 < t < tc | [ecuación 6] | t > tc | [ecuación 7] | donde: | Ca | = | concentración de sustancia en los gusanos [g kg-1 de peso húmedo o seco] | ks | = | constante de la velocidad de absorción en los tejidos [g de suelo kg-1 de gusanos d-1] | k0 | = | constante de la velocidad de degradación en el suelo [d-1] | ke | = | constante de la velocidad de eliminación [d-1] | tc | = | tiempo al final de la fase de absorción. | Cuando se alcanza el estado de equilibrio durante la fase de absorción (es decir, t = ∞), la ecuación 1 | 0 < t < tc | [ecuación 1] | puede reducirse a: | o | [ecuación 8] | Entonces, ks/ke x Cs es una aproximación de la concentración de la sustancia problema en el tejido de los gusanos en el estado de equilibrio (Ca,ss). | El factor de acumulación biota-suelo (BSAF) puede calcularse de la forma siguiente: | [ecuación 9] | donde foc es la fracción de carbono orgánico del suelo, y flip es la fracción de lípidos de los gusanos, habiéndose determinado ambos valores preferentemente en muestras tomadas del ensayo, y referidos al peso seco o al peso húmedo. | La cinética de eliminación puede modelizarse utilizando los datos de la fase de eliminación y aplicando la siguiente ecuación modelo y un método informático de estimación de parámetros no lineales. Si la representación de los datos frente al tiempo indica un declive exponencial constante de la concentración de la sustancia problema en los animales, puede utilizarse un modelo monocompartimental (ecuación 9) para describir la evolución temporal de la eliminación. | [ecuación 10] | Los procesos de eliminación a veces resultan bifásicos, con un rápido declive de Ca durante las primeras etapas, que luego se convierte en una pérdida más lenta de sustancia problema en las fases posteriores de la eliminación [véanse, por ejemplo, (27) (68)]. Las dos fases pueden interpretarse aceptando que hay dos compartimentos diferentes en el organismo, y la sustancia problema sale de cada uno de ellos a diferentes velocidades. En estos casos hay que consultar la bibliografía específica, como (38) (39) (40) (78). | Utilizando las ecuaciones modelo anteriores, es posible calcular también los parámetros cinéticos (ks y ke) de una sola vez aplicando el modelo de cinética de primer orden a todos los datos de las fases tanto de absorción como de eliminación, simultáneamente. Para encontrar una descripción de un método que permita este cálculo combinado de las constantes de velocidad de absorción y de eliminación, pueden consultarse las referencias (41) (73) y (70). | [ecuación 11] | Nota: | Cuando los parámetros de absorción y de eliminación se estiman simultáneamente a partir de los datos combinados de absorción y de eliminación, el símbolo "m" de la ecuación 11 es un descriptor que permite al programa informático asignar los subtérminos de la ecuación a los conjuntos de datos de la fase respectiva y llevar a cabo la evaluación correctamente (m = 1 para la fase de absorción; m = 2 para la fase de eliminación). | No obstante, estas ecuaciones modelo deben emplearse con precaución, especialmente cuando durante el ensayo se producen cambios en la (bio)degradación o en la biodisponibilidad de la sustancia problema [véase, por ejemplo, (79)]. | Apéndice 3 | EJEMPLOS DE CALENDARIOS DE ENSAYOS DE BIOACUMULACIÓN EN EL SUELO | Ensayo con gusanos de tierra | a) | Fase de absorción con ocho fechas de muestreo para el cálculo de la cinética | Día | Actividad | – 6 | Acondicionamiento durante 48 h del suelo preparado. | – 4 | Adición de la solución de la sustancia problema a la fracción del suelo; evaporación de los eventuales disolventes; mezcla de los componentes del suelo; distribución del suelo en los recipientes de ensayo; equilibrado a las condiciones de ensayo durante 4 días (3 semanas en caso de adición de metales al suelo). | – 3 a – 1 | Separación de los organismos de ensayo del cultivo de aclimatación; preparación y humidificación de los componentes del suelo. | 0 | Medición de la temperatura y del pH del suelo; toma de muestras del suelo de los recipientes de tratamiento y de los controles de disolvente para determinar la concentración de la sustancia problema; adición de la ración alimentaria; pesada y distribución aleatorizada de los gusanos en los recipientes de ensayo; conservación de suficientes submuestras de gusanos para la determinación de los valores analíticos de fondo, peso húmedo y seco, y contenido lipídico; pesada de todos los recipientes de ensayo para controlar la humedad del suelo; control del aporte de aire, si se utiliza un sistema de ensayo cerrado. | 1 | Control del aporte de aire, registro del comportamiento de los gusanos y de la temperatura; toma de muestras de suelo y de gusanos para determinar la concentración de la sustancia problema. | 2 | Como el día 1. | 3 | Control del aporte de aire, del comportamiento de los gusanos y de la temperatura. | 4 | Como el día 1. | 5-6 | Como el día 3. | 7 | Como el día 1; adición de la ración alimentaria; control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y compensación del agua evaporada. | 8-9 | Como el día 3. | 10 | Como el día 1. | 11-13 | Como el día 3. | 14 | Como el día 1; adición de la ración alimentaria; control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y compensación del agua evaporada. | 15-16 | Como el día 3. | 17 | Como el día 1. | 18-20 | Como el día 3. | 21 | Como el día 1; medición de la temperatura y del pH del suelo; control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo; final de la fase de absorción; transferencia de los gusanos de las réplicas expuestas restantes a recipientes que contienen suelo limpio, para la fase de eliminación (sin purga intestinal); toma de muestras de suelo y de gusanos para los controles de los disolventes. | | Las actividades previas a la exposición (fase de equilibrado) deben programarse teniendo en cuenta las propiedades de la sustancia problema. | | Las actividades descritas para el día 3 deben realizarse diariamente (al menos en los días laborables). | b) | Fase de eliminación | Día | Actividad | – 6 | Preparación y humidificación de los componentes del suelo; acondicionamiento durante 48 h del suelo preparado. | – 4 | Mezcla de los componentes del suelo; distribución del suelo en los recipientes de ensayo; incubación a las condiciones de ensayo durante 4 días. | 0 (final de la fase de absorción) | Medición de la temperatura y del pH del suelo; pesada y distribución aleatorizada de los gusanos en los recipientes de ensayo; adición de la ración alimentaria; transferencia de los gusanos de las réplicas expuestas restantes a recipientes que contienen suelo limpio; toma de muestras de suelo y de gusanos al cabo de 4 – 6 horas para determinar la concentración de la sustancia problema. | 1 | Control del aporte de aire, registro del comportamiento de los gusanos y de la temperatura; toma de muestras de suelo y de gusanos para determinar la concentración de la sustancia problema. | 2 | Como el día 1. | 3 | Control del aporte de aire, del comportamiento de los gusanos y de la temperatura. | 4 | Como el día 1. | 5-6 | Como el día 3. | 7 | Como el día 1; adición de la ración alimentaria; control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y compensación del agua evaporada. | 8-9 | Como el día 3. | 10 | Como el día 1. | 11-13 | Como el día 3. | 14 | Como el día 1; adición de la ración alimentaria; control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y compensación del agua evaporada. | 15-16 | Como el día 3. | 17 | Como el día 1. | 18-20 | Como el día 3. | 21 | Como el día 1; medición de la temperatura y del pH del suelo; control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo; toma de muestras de suelo y de gusanos para los controles de los disolventes. | | La preparación del suelo antes del inicio de la fase de eliminación debe hacerse de la misma forma que antes de la fase de absorción. | | Las actividades descritas para el día 3 deben realizarse diariamente (al menos en los días laborables). | Ensayo con enquitreidos | a) | Fase de absorción con ocho fechas de muestreo para el cálculo de la cinética | Día | Actividad | – 6 | Acondicionamiento durante 48 h del suelo preparado. | – 4 | Adición de la solución de la sustancia problema a la fracción del suelo; evaporación de los eventuales disolventes; mezcla de los componentes del suelo; distribución del suelo en los recipientes de ensayo; equilibrado a las condiciones de ensayo durante 4 días (3 semanas en caso de adición de metales al suelo). | -3 a -1 | Separación de los organismos de ensayo del cultivo de aclimatación; preparación y humidificación de los componentes del suelo. | 0 | Medición de la temperatura y del pH del suelo; toma de muestras del suelo de los recipientes de tratamiento y de los controles de disolvente para determinar la concentración de la sustancia problema; adición de la ración alimentaria al suelo; pesada y distribución aleatorizada de los gusanos en los recipientes de ensayo; conservación de suficientes submuestras de gusanos para la determinación de los valores analíticos de fondo, peso húmedo y seco, y contenido lipídico; pesada de todos los recipientes de ensayo para controlar la humedad del suelo; control del aporte de aire, si se utiliza un sistema de ensayo cerrado. | 1 | Control del aporte de aire, registro del comportamiento de los gusanos y de la temperatura; toma de muestras de suelo y de gusanos para determinar la concentración de la sustancia problema. | 2 | Como el día 1. | 3 | Control del aporte de aire, del comportamiento de los gusanos y de la temperatura. | 4 | Como el día 1. | 5-6 | Como el día 3. | 7 | Como el día 1; adición de la ración alimentaria al suelo; control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y compensación del agua evaporada. | 9 | Como el día 1. | 10 | Como el día 3. | 11 | Como el día 1. | 12-13 | Como el día 3. | 14 | Como el día 1; adición de la ración alimentaria al suelo; medición de la temperatura y del pH del suelo; control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo; final de la fase de absorción; transferencia de los gusanos de las réplicas expuestas restantes a recipientes que contienen suelo limpio, para la fase de eliminación (sin purga intestinal); toma de muestras de suelo y de gusanos para los controles de los disolventes. | | Las actividades previas a la exposición (fase de equilibrado) deben programarse teniendo en cuenta las propiedades de la sustancia problema. | | Las actividades descritas para el día 3 deben realizarse diariamente (al menos en los días laborables). | Apéndice 4 | Suelo artificial — recomendaciones de preparación y conservación | Dado que es posible que no se disponga durante todo el año de suelos naturales de una fuente particular, y que la presencia de organismos endógenos y de microcontaminantes puede influir en el ensayo, se recomienda emplear en este ensayo el suelo artificial indicado en el capítulo C.8 del presente anexo, Toxicidad para gusanos de tierra (48). Son varias las especies de ensayo que pueden sobrevivir, crecer y reproducirse en este suelo, y se facilita con él una normalización máxima, así como la comparabilidad intra e interlaboratorios de las condiciones de ensayo y de cultivo. | Componentes del suelo: | Turba: | 10 % | Turba esfágnea, de acuerdo con las directrices 207 de la OCDE (48), | Arena de cuarzo: | 70 % | Arena de cuarzo industrial (secada al aire); granulometría: más del 50 % de las partículas debe estar en la banda de 50-200 μm, pero todas las partículas deben tener ≤ 2 mm, | Caolín: | 20 % | Contenido en caolinita ≥ 30 %, | Carbonato de calcio: | ≤ 1 % | CaCO3, pulverizado, químicamente puro. | Como opción, puede reducirse el contenido de carbono orgánico del suelo artificial como, por ejemplo, rebajando el contenido de turba al 4-5 % de suelo seco y aumentando análogamente el contenido de arena. Con esta reducción del contenido de carbono orgánico, es posible que disminuyan las posibilidades de adsorción de la sustancia problema al suelo (carbono orgánico) y que aumente la disponibilidad de la sustancia problema para los gusanos (74). Se ha demostrado que Enchytraeus albidus y Eisenia fetida pueden ajustarse a los criterios de validez sobre la reproducción cuando se someten a ensayo en suelos de campo con un contenido menor de carbono orgánico como, por ejemplo, del 2,7 % (33) (61), y la experiencia demuestra que esto también puede conseguirse en suelo artificial con un 5 % de turba. | Preparación | Los componentes secos del suelo se mezclan a fondo (por ejemplo, en un mezclador de laboratorio de gran escala). Esta operación debe efectuarse alrededor de una semana antes de que se inicie el ensayo. La mezcla de componentes secos del suelo debe humedecerse con agua desionizada, al menos 48 h antes de que se añada la sustancia problema a fin de equilibrar o estabilizar la acidez. Para la determinación del pH se utiliza una mezcla de suelo y solución 1 M de KCl en la proporción de 1:5. Si el pH no se encuentra en la banda necesaria (6,0 ± 0,5), se añade al suelo una cantidad suficiente de CaCO3 o se prepara un nuevo lote de suelo. | Se determina de acuerdo con la norma ISO 11268-2 (35) la capacidad de retención de agua (WHC) máxima del suelo artificial. Al menos dos días antes del inicio del ensayo, el suelo artificial seco se humedece añadiéndole una cantidad suficiente de agua desionizada o reconstituida para obtener aproximadamente la mitad del contenido final de agua. El contenido final de agua debe estar entre el 40 y el 60 % del WHC máximo. Al inicio del ensayo, el suelo previamente humedecido se divide en tantos lotes como concentraciones de ensayo y controles se vayan a emplear en el ensayo, y el contenido de humedad se ajusta al 40 – 60 % del WHCmax utilizando la solución de la sustancia problema o añadiendo agua desionizada o reconstituida. Se determina el contenido de humedad al inicio y al final del ensayo (a 105 °C). El resultado debe ser óptimo para los requisitos de la especie utilizada (también es posible comprobar el contenido de humedad de la manera siguiente: cuando el suelo se aprieta suavemente con la mano, deben aparecer gotitas de agua entre los dedos). | Almacenamiento | Los componentes secos del suelo artificial pueden conservarse a temperatura ambiente hasta el momento de su utilización. El suelo preparado, humedecido previamente, puede conservarse en un lugar fresco hasta tres días antes de que se le añada la sustancia problema; debe velarse por reducir al mínimo la evaporación de agua. Una vez se le haya añadido la sustancia problema, el suelo debe utilizarse inmediatamente, salvo que se disponga de información en el sentido de que ese suelo concreto puede conservarse sin que se vea afectada la toxicidad ni la biodisponibilidad de la sustancia problema. En tal caso, es posible conservar, en las condiciones recomendadas para el ensayo concreto, las muestras de suelo con la sustancia problema añadida hasta el momento de su análisis. | Apéndice 5 | Especies de oligoquetos recomendadas para el ensayo de bioacumulación a partir del suelo | Gusanos de tierra | La especie recomendada para el ensayo es Eisenia fetida (Savigny 1826), que pertenece a la familia Lumbricidae. Desde 1972 está dividida en dos subespecies [Eisenia fetida y Eisenia andrei (10)]. Según Jaenike (36), se trata de verdaderas especies aparte. Eisenia fetida se reconoce fácilmente por sus rayas intersegmentales de color amarillo claro, mientras que Eisenia andrei tiene color rojo oscuro uniforme. Proceden probablemente de la region del mar Negro, y actualmente tienen una distribución universal, especialmente en hábitats modificados antropogénicamente, como las pilas de compost. Las dos especies pueden utilizarse en ensayos tanto ecotoxicológicos como de bioacumulación. | Eisenia fetida y Eisenia andrei están disponibles en el comercio, por ejemplo como cebos de pesca. En comparación con otros gusanos de tierra lumbrícidos, tienen un ciclo de vida breve y alcanzan la madurez en el plazo de unos 2 o 3 meses (a temperatura ambiente). Su temperatura óptima es de unos 20 – 24 °C; prefieren sustratos relativamente húmedos, con un pH casi neutro y un elevado contenido de materia orgánica. Como estas especies llevan unos 25 años utilizándose ampliamente en ensayos ecotoxicológicos normalizados, su cultivo se conoce muy bien (48) (77). | Ambas especies pueden cultivarse en una amplia gama de residuos animales. El medio de cría recomendado por la ISO (35) es una mezcla al 50 % de estiércol de caballo o de vaca y de turba. Este medio debe tener un valor aproximado de pH entre 6 y 7 (regulado con carbonato de calcio) y una conductividad iónica baja (menos de 6 mS/cm o menos del 0,5 % de concentración salina), y no debe presentar una contaminación excesiva de amoníaco ni de orina animal. También puede utilizarse un suelo comercial de jardinería exento de aditivos, o un suelo artificial de acuerdo con la OCDE (48), o una mezcla de ambos al 50 %. El sustrato debe estar húmedo, pero no demasiado mojado. Son adecuados los incubadores de un volumen entre 10 y 50 litros. | Para obtener gusanos de edad y masa normalizadas, lo mejor es iniciar el cultivo con capullos. Por tanto, se añaden gusanos adultos a un incubador que contenga sustrato fresco para producir capullos. La experiencia práctica indica que se obtienen buenas tasas de reproducción con una densidad de población de unos 100 gusanos adultos por kg de sustrato (peso húmedo). Tras 28 días se extraen los gusanos adultos. Los gusanos de tierra que salen de los capullos se utilizan para los ensayos una vez hayan madurado, al cabo de un mínimo de 2 meses y un máximo de 12 meses. | Los gusanos de las especies antes descritas pueden considerarse sanos si se mueven a través del sustrato, no intentan abandonarlo y se reproducen continuamente. Un movimiento muy lento o un color amarillo en el extremo posterior (en el caso de Eisenia fetida) son indicativos de agotamiento del sustrato. En este caso, se recomienda añadir sustrato fresco o rebajar el número de animales por incubador. | Bibliografía adicional seleccionada | Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58. | Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81. | Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S. | Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55. | Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201. | Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171. | Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology-from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp. | Enquitreidos | La especie recomendada es Enchytraeus albidus, Henle 1837 (gusano blanco). Esta especie es una de las más grandes (hasta 15 mm) de la familia Enchytraeidae de los anélidos oligoquetos y presenta una distribución universal [véase, por ejemplo, (8)]. Enchytraeus albidus se encuentra en hábitats marinos, lacustres y terrestres, sobre todo en materia orgánica en descomposición (algas, compost) y raramente en praderas (42). Esta amplia tolerancia ecológica y algunas variaciones morfológicas indican que la especie podría tener diferentes razas. | Enchytraeus albidus se encuentra en el comercio, vendida como alimento para peces. Ha de comprobarse si el cultivo está contaminado con otras especies, generalmente más pequeñas (60). Si se da la contaminación, hay que lavar todos los gusanos con agua en una placa Petri. Después se seleccionan ejemplares adultos grandes de Enchytraeus albidus (empleando un microscopio estereoscópico) para iniciar un nuevo cultivo. Se desechan todos los demás gusanos. Tienen un breve ciclo de vida, ya que alcanzan la madurez entre los 33 días (a 18 °C) y los 74 días (a 12 °C). Solo deben utilizarse para los ensayos los cultivos que hayan estado en el laboratorio al menos 5 semanas (una generación) sin problemas. | También son adecuadas otras especies del género Enchytraeus, en particular Enchytraeus luxuriosus. Esta especie es un verdadero habitante del suelo, que se ha descrito recientemente en (65). Si se utilizan otras especies de Enchytraeus, deben identificarse claramente y hay que indicar los motivos por los que se han seleccionado. | Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) es una especie que pertenece al mismo grupo que Enchytraeus luxuriosus. No se ha determinado con certeza si existe en el campo, ya que solo se ha descrito a partir de cultivos de gusanos de tierra y de pilas de compost (Römbke 2003). Por tanto, no se conocen sus requisitos ecológicos originales. Sin embargo, en estudios de laboratorio recientes en varios suelos de campo se ha confirmado que esta especie muestra una amplia tolerancia respecto a propiedades del suelo como el pH y la textura (Jänsch et al. 2005). En los últimos años se está utilizando esta especie con frecuencia en estudios ecotoxicológicos debido a la simplicidad de su cultivo y de sus ensayos, por ejemplo según Kuperman et al. 2003). Sin embargo, es pequeña (3 – 12 mm; 7 mm de media (Westheide & Müller 1996), lo que hace que sea más difícil de manejar que Enchytraeus albidus. Cuando se utiliza esta especie en lugar de Enchytraeus albidus, es posible reducir el tamaño del recipiente de ensayo, aunque no es necesario. Por otra parte, ha de tenerse en cuenta que esta especie se reproduce muy rápidamente, con un tiempo de generación inferior a 20 días a 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) e incluso más deprisa a temperaturas más altas. | Los enquitreidos de la especie Enchytraeus albidus (así como otras especies del género Enchytraeus) pueden criarse en grandes cajas de plástico (por ejemplo, de 30 × 60 × 10 cm o 20 × 12 × 8 cm, que es adecuado para el cultivo de gusanos de pequeño tamaño) llenas de una mezcla de suelo artificial y de suelo de jardín comercial, sin contaminar y exento de aditivos. Debe evitarse material de compost, ya que podría contener sustancias tóxicas, como metales pesados. Antes de utilizar el suelo de cultivo hay que eliminar la fauna, congelándolo tres veces. También puede utilizarse suelo artificial puro, pero la tasa de reproducción podría ser menor que la obtenida con sustratos mixtos. El sustrato debe tener un pH de 6,0 ± 0,5. El cultivo se mantiene en un incubador a la temperatura de 15 ± 2 °C a oscuras. En cualquier caso, ha de evitarse una temperatura superior a 23 °C. El suelo artificial/natural debe estar húmedo, pero no demasiado mojado. Cuando se aprieta el suelo suavemente con la mano, solo deben aparecer gotitas de agua. En todo caso hay que evitar las condiciones anóxicas (es decir, si se utiliza tapa, el número de agujeros de esta debe bastar para que sea suficiente la renovación del aire). El suelo del cultivo debe airearse removiéndolo cuidadosamente una vez por semana. | Debe darse alimento a los gusanos ad libitum al menos una vez por semana con granos aplastados de avena que se introducen en una cavidad de la superficie del suelo y se recubren con suelo. Si queda comida en el recipiente desde la última vez que se les haya dado, será necesario ajustar en consecuencia la cantidad de alimento dado. Si se aprecia crecimiento fúngico en la comida restante, será necesario sustituir esta por una nueva cantidad de granos aplastados de avena. Para estimular la reproducción, es posible complementar cada dos semanas los granos aplastados de avena utilizando proteínas en polvo con vitaminas añadidas, disponibles en el comercio. Al cabo de tres meses, los animales se transfieren a un sustrato de cría o cultivo recién preparado. Los granos aplastados de avena, que deben conservarse en recipientes herméticamente cerrados, tienen que pasarse por el autoclave o calentarse antes de su utilización para evitar infecciones por ácaros de la harina (por ejemplo, Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) o ácaros depredadores [por ejemplo, Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina]. Tras su desinfección, el alimento se muele de forma que sea fácil de espolvorear sobre la superficie del suelo. Otra posible fuente de alimento es la levadura de panadería o la comida para peces TetraMin®. | En general, las condiciones de cultivo son suficientes si los gusanos no intentan abandonar el sustrato, se mueven rápidamente por el suelo, presentan una superficie externa brillante sin que se les adhieran partículas del suelo, presentan un color más o menos blanquecino, y se observan gusanos de diferentes edades. En realidad, puede considerarse que los gusanos están sanos si se reproducen continuamente. | Bibliografía adicional seleccionada | Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126. | Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83. | Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656. | Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616. | Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488. | Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267. | » |
| (1) This information is only given for the convenience of users. Other equivalent computer programmes may be used if they can be shown to produce the same results. | (1) Esta información se facilita exclusivamente para mayor comodidad del usuario. Se pueden utilizar otros programas informáticos siempre que se demuestre que dan lugar a los mismos resultados. |
| (1) If no sex susceptibility information is available, rats of both sexes will be used, i.e. 1 animal/sex per concentration. Based on existing information, or if it becomes apparent during this exposure session that one sex is more susceptible, 10 animals of the susceptible sex will be used (2 animals per concentration/time point) at each concentration level during subsequent testing. | (1) Si no se dispone de datos de sensibilidad en función del sexo, se usarán ratas de ambos sexos, es decir, 1 animal por sexo y por concentración. De existir información previa, o si se pone de manifiesto en esta sesión de exposición que uno de los sexos es más sensible, en los siguientes ensayos se someterán 10 animales del sexo sensible (2 por cada valor de concentración/tiempo) a cada nivel de concentración. |
| (2) When Regulation (EC) No 1272/2008 is used, the limit concentrations for gases, vapours, and aerosols are 20 000 ppm, 20 mg/l, and 5 mg/l, respectively. In case of expected toxicity or based on the results of the sighting study, lower starting concentrations should be chosen. In case of regulatory or scientific needs, higher concentrations may be used. | (2) En virtud del Reglamento (CE) no 1272/2008, las concentraciones límite de los gases, vapores y aerosoles son de 20 000 ppm, 20 mg/l y 5 mg/l, respectivamente. Si cabe esperar toxicidad o así lo indican los resultados del estudio preliminar, se seleccionarán concentraciones iniciales más bajas. Por necesidades científicas o normativas se podrán aplicar concentraciones más elevadas. |
| (3) Ideally, exposure of animals at the next concentration level should be delayed until there is reasonable confidence of survival for previously treated animals. This allows the study director to adjust the target concentration and durations for the next exposure session. | (3) Idealmente, la exposición de los animales al siguiente nivel de concentración se retrasará hasta tener una seguridad razonable de la supervivencia de los animales previamente tratados. Ello permitirá al director del estudio ajustar la concentración diana y los tiempos de la siguiente sesión de exposición. |
| (4) The minimum dose (concentration x time) which resulted in mortality during testing at initial concentration (first exposure session) will be taken as a guide to establish the next combination of concentration and exposure durations. Typically, the concentration will be decreased two-fold (1/2L) and animals will be exposed over a new time range with a finer grid using a geometric division of exposure periods with a factor 1,4 (√2; see reference 11) around the time according to the minimum lethal dose level (time x concentration) observed during the first exposure. In this figure (Figure 1), mortality in Exposure session I was first observed at 15 min; the durations during session II are therefore centred around 30 min, and are 15, 21 30, 42 and 60 min. After the first two exposures, it is strongly advised to plot the data in a similar figure as indicated above, and to check whether the relationship between concentration and time has an angle of 45 degrees (n = 1) or if the concentration-time-response relationship is less steep (e.g. n = 2) or steeper (e.g. n = 0,8). In the latter cases it is strongly advised to adapt the next concentrations and durations accordingly. | (4) La dosis mínima (concentración × tiempo) capaz de inducir mortalidad en el estudio de la concentración inicial (primera sesión de exposición) se tomará como base para establecer la siguiente combinación de concentración y períodos de exposición. Habitualmente, la concentración se reduce a la mitad (1/2L) y los animales se exponen a un cuadriculado temporal más denso, aplicando una división geométrica de los períodos de exposición según un factor de 1,4 (√2; véase la referencia 11) en torno al tiempo que corresponde a la dosis letal mínima (tiempo × concentración) observada en la primera sesión de exposición. Según la figura 1, en la sesión de exposición I se observó mortalidad por primera vez a los 15 minutos; los tiempos aplicados durante la sesión II, por tanto, se centrarán en torno a los 30 minutos, y serán de 15, 21, 30, 42 y 60 min. Después de las dos primeras exposiciones, resulta muy aconsejable proyectar los resultados en una gráfica semejante a la indicada más arriba, y comprobar si la relación entre concentración y tiempo presenta un ángulo de 45 grados (n = 1), o si la relación concentración-tiempo-respuesta es de pendiente menos pronunciada (por ejemplo, n = 2) o más pronunciada (por ejemplo, n = 0,8). En los dos últimos casos se recomienda encarecidamente adaptar en consecuencia los siguientes valores de concentración y tiempo aplicados. |
| (5) In certain cases it may be necessary to increase the concentration (2L) over a new time range with a still finer grid using a geometric division of exposure periods with a factor 1,4 (√2) around the time according to the minimum lethal concentration level observed during the first exposure. The minimum exposure duration should preferably exceed 5 minutes; the maximum exposure duration should not exceed 8 hours. | (5) En determinados casos puede ser necesario aumentar la concentración (2L) y aplicar un cuadriculado temporal aún más denso, haciendo una división geométrica de los períodos de exposición por un factor de 1,4 (√2) en torno al tiempo que corresponde a la concentración letal mínima observada en la primera exposición. El período mínimo de exposición rebasará preferiblemente los 5 minutos; el período máximo de exposición no debe superar las 8 horas. |
| (2) For a number of measurements in serum and plasma, most notably for glucose, overnight fasting would be preferable. The major reason for this preference is that the increased variability which would inevitably result from non-fasting, would tend to mask more subtle effects and make interpretation difficult. On the other hand, however, overnight fasting may interfere with the general metabolism of the animals and, particularly in feeding studies, may disturb the daily exposure to the test chemical. If overnight fasting is adopted, clinical biochemical determinations should be performed after the conduct of functional observations in week 4 of the study. | (2) El ayuno desde la víspera es preferible para realizar ciertos análisis en el suero y el plasma, sobre todo para la determinación de glucosa. La razón principal es que el aumento de la variabilidad que provocaría necesariamente la toma de alimentos podría enmascarar efectos más sutiles y dificultar la interpretación. Por otra parte, el ayuno desde la víspera puede influir en el metabolismo general de los animales y, especialmente en los estudios en que la sustancia problema se administra con los alimentos, puede alterar la exposición diaria a dicha sustancia. Si se adopta el ayuno desde la víspera, deben realizarse análisis de bioquímica clínica después de la realización de las observaciones funcionales en la cuarta semana del estudio. |
| (*1) Because a lengthy fasting period can introduce bias in glucose measurements for the treated versus control animals, the study director should determine whether it is appropriate to fast the animals. If a fasting period is used, it should be appropriate to the species used; for the rat this may be 16 h (overnight fasting). Determination of fasting glucose may be carried out after overnight fasting during the last exposure week, or after overnight fasting prior to necropsy (in the latter case together with all other clinical pathology parameters). | (*1) Puesto que un período de ayuno prolongado puede introducir un sesgo en las determinaciones de glucosa entre los animales de control y los tratados, el director del estudio decidirá si es apropiado o no imponer dicho ayuno a los animales. Si se impone un período de ayuno, será acorde a la especie empleada; para las ratas puede ser de 16 horas (ayuno desde la víspera). La determinación de la glucosa en ayunas puede hacerse con ayuno desde la víspera durante la última semana de exposición, o bien con ayuno desde la víspera antes de proceder a la autopsia (en este último caso, con la determinación de todos los restantes parámetros de patología clínica). |
| (*2) Because a lengthy fasting period can introduce bias in glucose measurements for the treated versus control animals, the study director should determine whether it is appropriate to fast the animals. If a fasting period is used, it should be appropriate to the species used; for the rat this may be 16 h (overnight fasting). Determination of fasting glucose may be carried out after overnight fasting during the last exposure week, or after overnight fasting prior to necropsy (in the latter case together with all other clinical pathology parameters). | (*2) Puesto que un período de ayuno prolongado puede introducir un sesgo en las determinaciones de glucosa entre los animales testigo y los tratados, el director del estudio decidirá si es apropiado o no imponer dicho ayuno a los animales. Si se impone un período de ayuno, será acorde a la especie empleada; para las ratas puede ser de 16 horas (ayuno desde la víspera). La determinación de la glucosa en ayunas puede hacerse previo ayuno desde la víspera durante la última semana de exposición, o bien previo ayuno desde la víspera antes de proceder a la autopsia (en este último caso, con la determinación de los restantes parámetros de patología clínica). |
| (3) For a number of measurements in serum and plasma, most notably for glucose, overnight fasting is preferable. The major reason for this preference is that the increased variability which would inevitably result from non-fasting, would tend to mask more subtle effects and make interpretation difficult. However it should be noted that overnight fasting may interfere with the general metabolism of the animals and, particularly in feeding studies, may disrupt the daily exposure to the test chemical. All animals should be assessed in the same physiological condition and preferably detailed or neurological assessments should therefore be scheduled for a different day than clinical biochemistry sampling. | (3) El ayuno desde la víspera es preferible para realizar ciertos análisis en el suero y el plasma, sobre todo para la determinación de glucosa. La razón principal es que el aumento de la variabilidad que provocaría necesariamente la toma de alimentos podría enmascarar efectos más sutiles y dificultar la interpretación. Por otra parte, el ayuno desde la víspera puede influir en el metabolismo general de los animales y, especialmente en los estudios en que la sustancia problema se administra con los alimentos, puede alterar la exposición diaria a dicha sustancia. Todos los animales se deben examinar en las mismas condiciones fisiológicas, por lo que se aconseja programar las evaluaciones neurológicas y detalladas en un día distinto del destinado a la toma de muestras para bioquímica clínica. |
| (4) The corrosivity evaluation could be based on expert judgment using such evidence as: human and animal experience, existing (in vitro) data, e.g. chapter B.40 (10), B.40 bis (11) of this annex or OECD TG 435 (12), pH values, information from similar chemicals or any other pertinent data. | (4) La evaluación de la corrosividad puede basarse en la opinión de expertos con información sobre: experiencia en animales y humanos, datos (in vitro) disponibles [capítulos B.40 (10) y B.40 bis (11) de este anexo y TG 435 de la OCDE (12)], valores de pH, información acerca de sustancias afines o cualesquiera otros datos pertinentes. |
| (5) In the following tables reference is made to GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). The EU equivalent is Regulation (EC) No 1272/2008. In the case of Acute Inhalation Toxicity, the Regulation (EC) No 1272/2008 (9) does not implement Category 5. | (5) En los cuadros siguientes se hace referencia al SGA (sistema globalmente armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos). El equivalente de la UE es el Reglamento (CE) no 1272/2008. En el caso de la toxicidad aguda por inhalación, el Reglamento (CE) no 1272/2008 (9) no contempla la categoría 5. |
| (6) In the following tables reference is made to GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). The EU equivalent is Regulation (EC) No 1272/2008. In the case of Acute Inhalation Toxicity, the Regulation (EC) No 1272/2008 (9) does not implement Category 5. | (6) En los cuadros siguientes se hace referencia al SGA (sistema globalmente armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos). El equivalente de la UE es el Reglamento (CE) no 1272/2008. En el caso de la toxicidad aguda por inhalación, el Reglamento (CE) no 1272/2008 (9) no contempla la categoría 5. |
| (7) In the following tables reference is made to GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). The EU equivalent is Regulation (EC) No 1272/2008. In the case of Acute Inhalation Toxicity the Regulation (EC) No 1272/2008 (9) does not implement Category 5. | (7) En los cuadros siguientes se hace referencia al SGA (sistema globalmente armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos). El equivalente de la UE es el Reglamento (CE) no 1272/2008. En el caso de la toxicidad aguda por inhalación, el Reglamento (CE) no 1272/2008 (9) no contempla la categoría 5. |
| (8) These substances differ in M4 and M7, as indicated above. | (8) Estas sustancias difieren en M4 y M7, como se indica más arriba. |
| (9) These solutions are prepared individually, then poured together and autoclaved immediately. | (9) Estas soluciones se preparan por separado y después se juntan y se pasan por el autoclave inmediatamente. |
| (*3) However, it should be noted that if there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 must not be used in this situation). | (*3) Sin embargo, si se sospecha interacción entre los iones responsables de la dureza y la sustancia problema, debe utilizarse agua menos dura (por tanto, en esta situación no debe emplearse el medio M4 de Elendt). |
| (10) These substances differ in M4 and M7, as indicated above. | (10) Estas sustancias difieren en M4 y M7, como se indica más arriba. |
| (11) These solutions are prepared individually, then poured together and autoclaved immediately. | (11) Estas soluciones se preparan por separado y después se juntan y se pasan por el autoclave inmediatamente. |
| (*4) However, it should be noted that if there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 must not be used in this situation). | (*4) Sin embargo, si se sospecha interacción entre los iones responsables de la dureza y la sustancia problema, debe utilizarse agua menos dura (por tanto, en esta situación no debe emplearse el medio M4 de Elendt). |
| (*5) SiO2 was added to neutralize toxicity. | (*5) Se añade SiO2 para neutralizar la toxicidad. |
| (12) The percentage degradation in Vessels FC containing the reference substance. | (12) Porcentaje de degradación en los recipientes FC que contienen la sustancia de referencia. |
| (13) The percentage degradation in Vessels FI. | (13) Porcentaje de degradación en los recipientes FI. |
