1.

Η μέθοδος δοκιμών αδιαφάνειας (θολερότητας) και διαπερατότητας του κερατοειδούς βοοειδών (Bovine Corneal Opacity and Permeability/BCOP) αποτελεί μέθοδο δοκιμών in vitro που μπορεί να χρησιμοποιείται, υπό συγκεκριμένες περιστάσεις και περιορισμούς, για την ταξινόμηση ουσιών και μειγμάτων ως “διαβρωτικών και ισχυρών ερεθιστικών των οφθαλμών” (1) (2) (3). Για τους σκοπούς της παρούσας μεθόδου δοκιμών, ως ισχυρά ερεθιστικά ορίζονται οι ουσίες οι οποίες προκαλούν οφθαλμικές αλλοιώσεις που εμμένουν στο κουνέλι για τουλάχιστον 21 ημέρες μετά τη χορήγηση. Αν και δεν θεωρείται έγκυρη για την πλήρη αντικατάσταση της οφθαλμικής δοκιμής in vivo σε κουνέλια, η μέθοδος BCOP συνιστάται για χρήση στο πλαίσιο μιας στρατηγικής κλιμακωτών δοκιμών για τη κανονιστική ταξινόμηση και επισήμανση εντός συγκεκριμένου πεδίου εφαρμογής (4) (5). Οι ουσίες και τα μείγματα ελέγχου (6) μπορούν να ταξινομούνται ως διαβρωτικά ή ισχυρά ερεθιστικά για τους οφθαλμούς χωρίς περαιτέρω δοκιμές σε κουνέλια. Μια ουσία που εμφανίζει αρνητικά αποτελέσματα πρέπει να υποβάλλεται σε δοκιμή σε κουνέλια στο πλαίσιο στρατηγικής διαδοχικών ελέγχων, όπως περιγράφεται στην κατευθυντήρια γραμμή 405 (7) του ΟΟΣΑ για τη διεξαγωγή δοκιμών (κεφάλαιο B. 5 του παρόντος παραρτήματος).

2.

Σκοπός της παρούσας μεθόδου δοκιμών είναι η περιγραφή των διαδικασιών που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της πιθανής διαβρωτικότητας ή ισχυρής ερεθιστικότητας μιας ελεγχόμενης ουσίας για τους οφθαλμούς, όπως μετράται από την ικανότητά της να προκαλεί αδιαφάνεια και αυξημένη διαπερατότητα σε απομονωμένο βόειο κερατοειδή. Οι τοξικές επιδράσεις στον κερατοειδή μετρώνται μέσω: (i) της μειωμένης μετάδοσης του φωτός (αδιαφάνεια) και (ii) της αυξημένης διέλευσης χρωστικής νατριούχου φλουορεσκεΐνης (διαπερατότητα). Οι αξιολογήσεις της αδιαφάνειας και της διαπερατότητας του κερατοειδούς κατόπιν έκθεσης σε ελεγχόμενη ουσία συνδυάζονται για να εξαχθεί βαθμολογία ερεθιστικότητας in vitro (In Vitro Irritancy Score/IVIS), η οποία χρησιμοποιείται για την ταξινόμηση του βαθμού ερεθιστικότητας της ελεγχόμενης ουσίας.

3.

Σε δοκιμές με τη μέθοδο BCOP έχουν υποβληθεί και ερεθιστικά των οφθαλμών που προκαλούν αλλοιώσεις οι οποίες υποχωρούν εντός διαστήματος μικρότερου των 21 ημερών, καθώς και μη ερεθιστικά. Πάντως, δεν έχει αξιολογηθεί επισήμως η ορθότητα και η αξιοπιστία της μεθόδου δοκιμής BCOP για ουσίες που εμπίπτουν σε αυτές τις κατηγορίες.

4.

Στο προσάρτημα 1 παρέχονται ορισμοί.

5.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών βασίζεται στο πρωτόκολλο της μεθόδου δοκιμών BCOP της Διυπηρεσιακής Συντονιστικής Επιτροπής για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ICCVAM)(8), το οποίο καταρτίστηκε σύμφωνα με διεθνή μελέτη επικύρωσης (4)(5)(9), με τη συνεισφορά του Ευρωπαϊκού Κέντρου για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ECVAM) και του Ιαπωνικού Κέντρου για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων(JaCVAM). Το πρωτόκολλο βασίζεται σε στοιχεία που ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Επιστημών In Vitro (IIVS) και το πρωτόκολλο INVITTOX 124 (10), το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη προεπικύρωσης της δοκιμασίας BCOP που διενεργήθηκε κατά την περίοδο 1997-1998 με κοινοτική χρηματοδότηση. Αμφότερα αυτά τα πρωτόκολλα βασίζονται στη μεθοδολογία της δοκιμασίας BCOP που περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Gautheron et al. (11).

6.

Οι περιορισμοί που προσδιορίστηκαν για την παρούσα μέθοδο δοκιμών βασίζονται στα υψηλά ψευδοθετικά ποσοστά για τις αλκοόλες και τις κετόνες και στο υψηλό ψευδοαρνητικό ποσοστό για τα στερεά, που προέκυψαν από τη βάση δεδομένων επικύρωσης (βλ. παράγραφο 44) (5). Όταν οι ουσίες που εμπίπτουν σε αυτές τις χημικές και φυσικές κατηγορίες αποκλείονται από τη βάση δεδομένων, αυξάνεται σημαντικά η ορθότητα της δοκιμής BCOP στα συστήματα ταξινόμησης της ΕΕ, της EPA (Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ) και του GHS (Παγκόσμιο Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης και Επισήμανσης των Χημικών Προϊόντων) (5). Για τον σκοπό της παρούσας δοκιμασίας (δηλ. τη ταυτοποίηση μόνο των διαβρωτικών/ισχυρών ερεθιστικών των οφθαλμών), τα ψευδοαρνητικά ποσοστά δεν είναι κρίσιμης σημασίας, διότι οι ουσίες αυτές θα υποβληθούν ακολούθως σε δοκιμή σε κουνέλια ή σε άλλες επαρκώς επικυρωμένες δοκιμές in vitro, ανάλογα με τις ρυθμιστικές απαιτήσεις, στο πλαίσιο στρατηγικής διαδοχικών ελέγχων με μέθοδο προσέγγισης βασιζόμενη στο βάρος της απόδειξης. Επιπλέον, η υφιστάμενη βάση δεδομένων επικύρωσης δεν καθιστά εφικτή τη δέουσα αξιολόγηση ορισμένων κατηγοριών χημικών ουσιών ή προϊόντων (π.χ. των μειγμάτων). Παρόλα αυτά, οι ερευνητές θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν την παρούσα μέθοδο δοκιμών για κάθε τύπο υλικού δοκιμής (συμπεριλαμβανομένων των μειγμάτων), με τα θετικά αποτελέσματα να θεωρούνται ενδεικτικά απόκρισης οφθαλμικής διαβρωτικότητας ή ισχυρής ερεθιστικότητας. Πάντως, τα θετικά αποτελέσματα που λαμβάνονται με αλκοόλες ή κετόνες πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή λόγω του κινδύνου υπερεκτιμημένης πρόβλεψης.

7.

Όλες οι διαδικασίες με τους οφθαλμούς και τους κερατοειδείς βοοειδών πρέπει να συμμορφώνονται προς τους κανονισμούς και τις διαδικασίες που εφαρμόζονται στην εγκατάσταση δοκιμής για τον χειρισμό υλικών ζωικής προέλευσης, περιλαμβανομένων, μεταξύ άλλων, ιστών και ιστικών υγρών. Συνιστάται η τήρηση των γενικών εργαστηριακών προφυλάξεων (12).

8.

Ένας περιορισμός της μεθόδου δοκιμών είναι ότι, αν και λαμβάνει υπόψη ορισμένες από τις επιδράσεις στους οφθαλμούς οι οποίες αξιολογήθηκαν στη μέθοδο δοκιμών οφθαλμικής ερεθιστικότητας σε κουνέλια και, εν μέρει, τη σοβαρότητά τους, δεν λαμβάνει υπόψη τους τραυματισμούς του επιπεφυκότος και της ίριδας. Επίσης, μολονότι δεν είναι εφικτή η αξιολόγηση αυτής καθαυτής της αναστρεψιμότητας των αλλοιώσεων του κερατοειδούς στο πλαίσιο της δοκιμασίας BCOP, έχει προταθεί, βάσει των οφθαλμικών μελετών σε κουνέλια, η αξιολόγηση του αρχικού βάθους του τραύματος του κερατοειδούς για τη διάκριση μεταξύ μη αναστρέψιμων και αναστρέψιμων επιδράσεων (13). Τέλος, η BCOP δεν καθιστά εφικτή την αξιολόγηση του δυναμικού συστημικής τοξικότητας που συνδέεται με την έκθεση των οφθαλμών.

9.

Συνεχίζονται οι προσπάθειες για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό της χρησιμότητας και των περιορισμών της δοκιμασίας BCOP ως προς τον προσδιορισμό των μη ισχυρών ερεθιστικών και των μη ερεθιστικών ουσιών (βλ. επίσης παράγραφο 45). Οι χρήστες ενθαρρύνονται επίσης να παρέχουν δείγματα ή/και δεδομένα σε φορείς επικύρωσης, για μια επίσημη αξιολόγηση των πιθανών μελλοντικών χρήσεων της μεθόδου δοκιμών BCOP, καθώς και για την ταυτοποίηση των μη ισχυρών ερεθιστικών και των μη ερεθιστικών.

10.

Τα εργαστήρια που εκτελούν για πρώτη φορά τη συγκεκριμένη δοκιμασία πρέπει να χρησιμοποιούν τις χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας που προβλέπονται στο προσάρτημα 2. Τα εργαστήρια μπορούν να χρησιμοποιούν αυτές τις χημικές ουσίες για να αποδείξουν την τεχνική ικανότητά τους όσον αφορά την εφαρμογή της μεθόδου δοκιμών BCOP πριν από την υποβολή δεδομένων από τη δοκιμασία BCOP, για τη κανονιστική ταξινόμηση των κινδύνων.

11.

Η μέθοδος δοκιμών BCOP είναι ένα οργανοτυπικό μοντέλο που εξασφαλίζει βραχυπρόθεσμη διατήρηση της κανονικής φυσιολογικής και βιοχημικής λειτουργίας του βόειου κερατοειδούς in vitro. Στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμών, η βλάβη που προκαλείται από την ελεγχόμενη ουσία αξιολογείται μέσω ποσοτικών μετρήσεων των μεταβολών στην αδιαφάνεια (θολερότητα) και στη διαπερατότητα του κερατοειδούς, με τη χρήση αδιαφανομέτρου και φασματοφωτομέτρου ορατού φωτός, αντιστοίχως. Αμφότερες οι μετρήσεις χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό βαθμολογίας ερεθιστικότητας in vitro (IVIS), η οποία χρησιμοποιείται για την κατάταξη σε κατηγορία ταξινόμησης κινδύνου ερεθιστικότητας in vitro, με σκοπό την πρόβλεψη του δυναμικού οφθαλμικού ερεθισμού in vivo για την ελεγχόμενη ουσία (βλ. κριτήρια απόφασης).

12.

Στη μέθοδο δοκιμής BCOP χρησιμοποιούνται κερατοειδείς που απομονώνονται από τους οφθαλμούς προσφάτως σφαχθέντων βοοειδών. Η κερατοειδική αδιαφάνεια μετράται ποσοτικά ως η ποσότητα φωτός που μεταδίδεται μέσω του κερατοειδούς. Η διαπερατότητα μετράται ποσοτικά ως η ποσότητα χρωστικής νατριούχου φλουορεσκεΐνης που διέρχεται από το πλήρες πάχος του κερατοειδούς, όπως ανιχνεύεται στο θρεπτικό υλικό του οπίσθιου θαλάμου. Οι ελεγχόμενες ουσίες εφαρμόζονται στην επιθηλιακή επιφάνεια του κερατοειδούς με προσθήκη στον εμπρόσθιο θάλαμο της διάταξης συγκράτησης του κερατοειδούς. Στο προσάρτημα 3 παρατίθεται περιγραφή και διάγραμμα διάταξης συγκράτησης κερατοειδούς που χρησιμοποιείται στη μέθοδο δοκιμής BCOP. Οι διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς κυκλοφορούν στο εμπόριο ή κατασκευάζονται κατά παραγγελία.

13.

Τα βοοειδή που αποστέλλονται στα σφαγεία θανατώνονται συνήθως για κατανάλωση από τον άνθρωπο ή για άλλες εμπορικές χρήσεις. Οι κερατοειδείς που χρησιμοποιούνται στη μέθοδο δοκιμής BCOP προέρχονται μόνο από υγιή ζώα που θεωρούνται κατάλληλα για είσοδο στην ανθρώπινη τροφική αλυσίδα. Δεδομένου ότι το βάρος των βοοειδών ποικίλλει ανάλογα με τη φυλή, την ηλικία και το φύλο, δεν υπάρχει συνιστώμενο βάρος του ζώου κατά τη σφαγή.

14.

Όταν χρησιμοποιούνται οφθαλμοί ζώων διαφορετικών ηλικιών ενδέχεται να προκύψουν διακυμάνσεις των διαστάσεων του κερατοειδούς. Οι κερατοειδείς με οριζόντια διάμετρο > 30,5 mm και κεντρικό πάχος (CCT) ≥ 1 100 μm προέρχονται γενικά από βοοειδή ηλικίας άνω των οκτώ ετών, ενώ οι κερατοειδείς με οριζόντια διάμετρο < 28,5 mm και CCT < 900 μm προέρχονται συνήθως από βοοειδή ηλικίας κάτω των πέντε ετών (14). Για τον λόγο αυτό, συνήθως δεν χρησιμοποιούνται οφθαλμοί βοοειδών ηλικίας άνω των 60 μηνών. Κατά κανόνα δεν χρησιμοποιούνται ούτε οφθαλμοί βοοειδών ηλικίας κάτω των 12 μηνών, διότι οι οφθαλμοί αυτοί δεν έχουν αναπτυχθεί πλήρως και το πάχος και η διάμετρος του κερατοειδούς υπολείπονται σημαντικά των τιμών που αναφέρονται σε οφθαλμούς ενήλικων βοοειδών. Εντούτοις, επιτρέπεται η χρήση κερατοειδών νεαρών ζώων (6 έως 12 μηνών) επειδή παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα, όπως η αυξημένη διαθεσιμότητα, το περιορισμένο ηλικιακό εύρος και οι μειωμένοι κίνδυνοι πιθανής έκθεσης των εργαζομένων στη σπογγώδη εγκεφαλοπάθεια των βοοειδών (15). Δεδομένου ότι κρίνεται σκόπιμη η περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης του μεγέθους ή του πάχους του κερατοειδούς στον βαθμό απόκρισης στις διαβρωτικές και ερεθιστικές ουσίες, συνιστάται στους χρήστες να αναφέρουν την εκτιμώμενη ηλικία ή/και το βάρος των ζώων από τα οποία προέρχονται οι κερατοειδείς που χρησιμοποιούνται στις μελέτες.

15.

Οι οφθαλμοί συλλέγονται από υπαλλήλους των σφαγείων. Για την ελαχιστοποίηση μηχανικών και άλλων φθορών των οφθαλμών, οι οφθαλμοί πρέπει να εξορύσσονται το συντομότερο μετά τη θανάτωση. Για την αποφυγή έκθεσης των οφθαλμών σε πιθανώς ερεθιστικές ουσίες, οι υπάλληλοι των σφαγείων δεν πρέπει να χρησιμοποιούν απορρυπαντικά κατά την έκπλυση της κεφαλής των ζώων.

16.

Οι οφθαλμοί πρέπει να εμβαπτίζονται πλήρως σε διάλυμα αλάτων Hank (Hanks’ Balanced Salt Solution/HBSS) εντός δοχείου κατάλληλου μεγέθους και να μεταφέρονται στο εργαστήριο κατά τρόπο ώστε να ελαχιστοποιείται η υποβάθμιση ή/και η βακτηριδιακή μόλυνση. Επειδή οι οφθαλμοί συλλέγονται κατά τη διαδικασία σφαγής, ενδέχεται να εκτεθούν σε αίμα και σε άλλες βιολογικές ουσίες, συμπεριλαμβανομένων των βακτηριδίων και άλλων μικροοργανισμών. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να διασφαλίζεται η ελαχιστοποίηση του κινδύνου μόλυνσης (π.χ. με τη φύλαξη του δοχείου που περιέχει τους οφθαλμούς σε υγρό πάγο, την προσθήκη αντιβιοτικών στο διάλυμα HBSS που χρησιμοποιείται για τη φύλαξη των οφθαλμών κατά τη μεταφορά [π.χ. 100 IU πενικιλίνης/mL και 100 μg στρεπτομυκίνης/mL]).

17.

Το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ της συλλογής των οφθαλμών και της χρήσης των κερατοειδών στη μέθοδο δοκιμής BCOP πρέπει να είναι το μικρότερο δυνατόν (κατά κανόνα η συλλογή και η χρήση πρέπει να γίνονται την ίδια ημέρα) και να αποδεικνύεται ότι δεν υπονομεύει τα αποτελέσματα της δοκιμασίας. Τα αποτελέσματα αυτά βασίζονται στα κριτήρια επιλογής των οφθαλμών, καθώς και στις αποκρίσεις των θετικών και των αρνητικών μαρτύρων. Όλοι οι οφθαλμοί που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία πρέπει να προέρχονται από την ίδια ομάδα οφθαλμών που συλλέχθηκαν συγκεκριμένη ημέρα.

18.

Μόλις οι οφθαλμοί φτάσουν στο εργαστήριο, εξετάζονται προσεκτικά για ελαττώματα όπως αυξημένη αδιαφάνεια, αμυχές και νεοαγγείωση. Πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο κερατοειδείς χωρίς ελαττώματα αυτού του είδους.

19.

Η ποιότητα κάθε κερατοειδούς αξιολογείται και σε μεταγενέστερα στάδια της δοκιμασίας. Οι κερατοειδείς με αδιαφάνεια μεγαλύτερη των επτά μονάδων (ΣΗΜΕΙΩΣΗ: το αδιαφανόμετρο πρέπει να διακριβώνεται βάσει των προτύπων αδιαφάνειας που χρησιμοποιούνται για τον καθορισμό των μονάδων αδιαφάνειας, βλ. προσάρτημα 3) μετά από αρχική εξισορρόπηση διάρκειας μίας ώρας, πρέπει να απορρίπτονται.

20.

Κάθε ομάδα οφθαλμών που υποβάλλεται σε αγωγή (ελεγχόμενη ουσία, παράλληλοι αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες) αποτελείται από τουλάχιστον τρεις οφθαλμούς. Στη δοκιμασία BCOP, για τους αρνητικούς μάρτυρες πρέπει να χρησιμοποιούνται τρεις κερατοειδείς. Δεδομένου ότι όλοι οι κερατοειδείς εκτέμνονται από τον πλήρη βολβό και στερεώνονται στους θαλάμους της διάταξης συγκράτησης κερατοειδούς, υπάρχει το ενδεχόμενο να εμφανιστούν τεχνητά σφάλματα (artefact) στις επιμέρους τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας του κερατοειδούς (συμπεριλαμβανομένου του αρνητικού μάρτυρα) λόγω του χειρισμού. Επιπλέον, οι τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας που λαμβάνονται από τους κερατοειδείς-αρνητικούς μάρτυρες χρησιμοποιούνται για τη διόρθωση των τιμών αδιαφάνειας και διαπερατότητας του κερατοειδούς του δοκιμίου και των θετικών μαρτύρων στους υπολογισμούς της IVIS.

21.

Κερατοειδείς χιτώνες χωρίς ελαττώματα ανατέμνονται κατά τρόπο ώστε να παραμένει δακτύλιος σκληρού χιτώνα 2 έως 3 mm με σκοπό τη διευκόλυνση του επακόλουθου χειρισμού, λαμβανομένης μέριμνας για την αποφυγή φθορών στο κερατοειδικό επιθήλιο και ενδοθήλιο. Οι απομονωθέντες κερατοειδείς στερεώνονται σε ειδικές διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς που αποτελούνται από εμπρόσθιο και οπίσθιο διαμέρισμα, τα οποία εφάπτονται με το επιθήλιο και το ενδοθήλιο του κερατοειδούς, αντιστοίχως. Αμφότεροι οι θάλαμοι πληρώνονται μέχρι υπερχείλισης με προθερμασμένο θρεπτικό υλικό ελάχιστων τροφικών απαιτήσεων Eagle (Eagle's Minimum Essential Medium/EMEM) (πρώτα ο οπίσθιος θάλαμος), κατά τρόπο ώστε να μη σχηματίζονται φυσαλίδες. Η διάταξη αφήνεται εν συνεχεία να σταθεροποιηθεί στους 32 ± 1 °C για τουλάχιστον μία ώρα ούτως ώστε να εξισορροπηθεί η θερμοκρασία των κερατοειδών με τη θερμοκρασία του θρεπτικού υλικού και να επιτευχθεί, στο μέτρο του δυνατού, φυσιολογική μεταβολική δραστηριότητα (η θερμοκρασία της επιφάνειας του κερατοειδούς in vivo είναι κατά προσέγγιση 32 °C).

22.

Μετά την παρέλευση του διαστήματος εξισορρόπησης, προστίθεται φρέσκο προθερμασμένο EMEM σε αμφότερους τους θαλάμους και για κάθε κερατοειδή σημειώνονται οι αρχικές ενδείξεις αδιαφάνειας. Οι κερατοειδείς που εμφανίζουν μακροσκοπικές βλάβες ιστού (π.χ. αμυχές, χρώση, νεοαγγείωση) ή αδιαφάνεια > 7 μονάδων απορρίπτονται. Υπολογίζεται η μέση αδιαφάνεια όλων των εξισορροπημένων κερατοειδών. Τουλάχιστον τρεις κερατοειδείς με τιμές αδιαφάνειας που προσεγγίζουν τη διάμεση τιμή για όλους τους κερατοειδείς επιλέγονται ως αρνητικοί μάρτυρες (ή ως μάρτυρες με διαλύτη). Οι εναπομένοντες κερατοειδείς κατανέμονται στη συνέχεια σε ομάδες αγωγής ή θετικών μαρτύρων.

23.

Επειδή η θερμοχωρητικότητα του νερού είναι υψηλότερη από του αέρα, το νερό παρέχει πιο σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας για επώαση. Κατά συνέπεια, για τη διατήρηση της διάταξης συγκράτησης κερατοειδούς και του περιεχομένου της σε θερμοκρασία 32 ± 1 °C συνιστάται η χρήση υδατόλουτρου. Εντούτοις, μπορούν να χρησιμοποιούνται και επωαστήρες αέρα, με προφυλάξεις για τη διατήρηση σταθερής θερμοκρασίας (π.χ. με προθέρμανση των διατάξεων συγκράτησης και των θρεπτικών υλικών).

24.

Χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πρωτόκολλα αγωγής, ένα για υγρά και επιφανειοδραστικά (στερεά ή υγρά) και ένα για μη επιφανειοδραστικά στερεά.

25.

Τα υγρά υποβάλλονται σε δοκιμή χωρίς αραίωση, ενώ τα επιφανειοδραστικά υποβάλλονται σε δοκιμή σε συγκέντρωση 10 % w/v σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9 %, σε αποσταγμένο νερό ή σε άλλο διαλύτη για τον οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεν έχει δυσμενείς επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής. Τα ημιστερεά, οι κρέμες και οι κηροί υποβάλλονται κατά κανόνα σε δοκιμή ως υγρά. Για διαφορετικές αραιώσεις πρέπει να παρέχεται κατάλληλη αιτιολόγηση. Οι κερατοειδείς εκτίθενται στα υγρά και στα επιφανειοδραστικά επί 10 λεπτά. Σε περίπτωση διαφορετικής διάρκειας έκθεσης, πρέπει να παρέχεται κατάλληλη επιστημονική αιτιολόγηση.

26.

Τα μη επιφανειοδραστικά στερεά υποβάλλονται κατά κανόνα σε δοκιμή ως διαλύματα ή εναιωρήματα σε συγκέντρωση 20 % σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9 %, σε αποσταγμένο νερό ή σε άλλο διαλύτη για τον οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεν έχει δυσμενείς επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής. Υπό ορισμένες συνθήκες και με την κατάλληλη επιστημονική αιτιολόγηση, τα στερεά μπορούν επίσης να υποβάλλονται σε δοκιμή ως έχουν, μέσω άμεσης εφαρμογής στην επιφάνεια του κερατοειδούς με τη μέθοδο του ανοικτού θαλάμου (βλ. παράγραφο 29). Οι κερατοειδείς εκτίθενται στα στερεά επί τέσσερις ώρες, αλλά, όπως και στην περίπτωση των υγρών και των επιφανειοδραστικών, μπορούν να χρησιμοποιούνται διαφορετικά διαστήματα έκθεσης κατόπιν κατάλληλης επιστημονικής αιτιολόγησης.

27.

Μπορούν να χρησιμοποιούνται διαφορετικές μέθοδοι αγωγής, ανάλογα με τη φύση και τα χημικά χαρακτηριστικά της ελεγχόμενης ουσίας (π.χ. στερεά, υγρά, παχύρευστα έναντι μη παχύρευστων υγρών). Παράγοντας κρίσιμης σημασίας είναι να εξασφαλίζεται ότι η ελεγχόμενη ουσία καλύπτει επαρκώς την επιφάνεια του επιθηλίου και ότι απομακρύνεται κατά την έκπλυση. Η μέθοδος κλειστού θαλάμου χρησιμοποιείται κατά κανόνα για ελεγχόμενες ουσίες μη παχύρευστες έως ελαφρώς παχύρευστες, ενώ για τις ημι-παχύρευστες και παχύρευστες, καθώς και για τα στερεά ως έχουν χρησιμοποιείται κατά κανόνα μέθοδος ανοικτού θαλάμου.

28.

Στη μέθοδο κλειστού θαλάμου, ποσότητα ελεγχόμενης ουσίας (750 μL) που επαρκεί ώστε να καλύπτεται το επιθήλιο του κερατοειδούς, εισάγεται στον εμπρόσθιο θάλαμο μέσω των δοσιμετρικών οπών στην επάνω επιφάνειά του και, εν συνεχεία, οι οπές σφραγίζονται κατά την έκθεση με τα πώματα του θαλάμου. Είναι σημαντικό να διασφαλίζεται η έκθεση κάθε κερατοειδούς στην ελεγχόμενη ουσία για το ενδεδειγμένο χρονικό διάστημα.

29.

Στη μέθοδο ανοικτού θαλάμου, πριν από την αγωγή αφαιρούνται από τον εμπρόσθιο θάλαμο ο δακτύλιος ασφάλισης της θυρίδας και η γυάλινη θυρίδα. Ο μάρτυρας ή η ελεγχόμενη ουσία (750 μL ή ποσότητα που επαρκεί για την πλήρη κάλυψη του κερατοειδούς) εφαρμόζεται απευθείας στην επιφάνεια του επιθηλίου του κερατοειδούς με τη βοήθεια μικροσιφωνίου. Εάν είναι δύσκολη η αναρρόφηση μιας ελεγχόμενης ουσίας, η ουσία μπορεί να φέρεται υπό πίεση σε σιφώνιο θετικής μετατόπισης για τη διευκόλυνση της δοσιμέτρησης. Το ρύγχος του σιφωνίου θετικής μετατόπισης εισάγεται στο άκρο έκχυσης της σύριγγας κατά τρόπο ώστε το υλικό να φέρεται υπό πίεση στο ρύγχος μετατόπισης. Ταυτοχρόνως, πιέζεται το έμβολο της σύριγγας ενόσω το έμβολο του σιφωνίου έλκεται προς τα επάνω. Εάν εμφανιστούν φυσαλίδες αέρα στο ρύγχος του σιφωνίου, το δοκίμιο απομακρύνεται (εξωθείται) και η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου το ρύγχος πληρωθεί χωρίς να σχηματίζονται φυσαλίδες αέρα. Εάν χρειαστεί, μπορεί να χρησιμοποιηθεί κανονική σύριγγα (χωρίς βελόνα), η οποία επιτρέπει τη μέτρηση επακριβούς όγκου ελεγχόμενης ουσίας και την ευκολότερη εφαρμογή στο επιθήλιο του κερατοειδούς. Μετά τη δοσιμέτρηση, η γυάλινη θυρίδα επανατοποθετείται στον εμπρόσθιο θάλαμο για να δημιουργηθεί εκ νέου κλειστό σύστημα.

30.

Μετά την παρέλευση του διαστήματος έκθεσης, η ελεγχόμενη ουσία, ο αρνητικός μάρτυρας ή ο θετικός μάρτυρας απομακρύνεται από τον εμπρόσθιο θάλαμο και το επιθήλιο υποβάλλεται σε έκπλυση τουλάχιστον τρεις φορές (ή έως ότου δεν παρατηρούνται οπτικές ενδείξεις της ελεγχόμενης ουσίας) με EMEM (που περιέχει ερυθρό της φαινόλης). Για την έκπλυση χρησιμοποιείται θρεπτικό υλικό που περιέχει ερυθρό της φαινόλης διότι με την παρακολούθηση της αλλαγής του χρώματος του ερυθρού της φαινόλης είναι εφικτός ο προσδιορισμός της αποτελεσματικότητας της έκπλυσης όξινων ή αλκαλικών υλικών. Οι κερατοειδείς υποβάλλονται σε έκπλυση περισσότερες από τρεις φορές, εάν το ερυθρό της φαινόλης εξακολουθεί να αποχρωματίζεται (κίτρινο ή μοβ) ή εάν παραμένει ορατή η ελεγχόμενη ουσία. Όταν η ελεγχόμενη ουσία απομακρυνθεί πλήρως από το μέσο, οι κερατοειδείς υποβάλλονται σε τελική έκπλυση με EMEM (χωρίς ερυθρό της φαινόλης). Το EMEM (χωρίς ερυθρό της φαινόλης) χρησιμοποιείται ως διάλυμα τελικής έκπλυσης ούτως ώστε να διασφαλίζεται η απομάκρυνση του ερυθρού της φαινόλης από τον εμπρόσθιο θάλαμο πριν από τη μέτρηση της αδιαφάνειας. Στη συνέχεια, ο εμπρόσθιος θάλαμος πληρώνεται εκ νέου με φρέσκο EMEM που δεν περιέχει ερυθρό της φαινόλης.

31.

Όσον αφορά τα υγρά ή τα επιφανειοδραστικά, μετά την έκπλυσή τους οι κερατοειδείς υποβάλλονται σε επώαση για δύο επιπλέον ώρες στους 32 ± 1 °C. Σε ορισμένες περιπτώσεις ενδέχεται να είναι σκόπιμη η παράταση της διάρκειας επώασης μετά την έκθεση, κάτι το οποίο κρίνεται κατά περίπτωση. Οι κερατοειδείς που υποβάλλονται σε αγωγή με στερεά εκπλύνονται σχολαστικά στο τέλος του τετράωρου διαστήματος έκθεσης, αλλά δεν απαιτείται περαιτέρω επώαση.

32.

Στο τέλος του διαστήματος επώασης μετά την έκθεση σε υγρά και επιφανειοδραστικά και στο τέλος του τετράωρου διαστήματος έκθεσης σε μη επιφανειοδραστικά στερεά, καταγράφεται η αδιαφάνεια και η διαπερατότητα κάθε κερατοειδούς. Επίσης, κάθε κερατοειδής επιθεωρείται οπτικά και καταγράφονται οι σχετικές παρατηρήσεις (π.χ. αποφλοίωση ιστού, κατάλοιπα ελεγχόμενης ουσίας, ανομοιογενής αδιαφάνεια). Οι παρατηρήσεις αυτές είναι πιθανότατα σημαντικές καθώς ενδέχεται να αντικατοπτρίζονται στις διακυμάνσεις των ενδείξεων του αδιαφανομέτρου.

33.

Σε κάθε πείραμα περιλαμβάνονται παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες ή μάρτυρες με διαλύτη/φορέα και θετικοί μάρτυρες.

34.

Κατά τη δοκιμή υγρής ουσίας χωρίς αραίωση, στη μέθοδο δοκιμών BCOP περιλαμβάνεται παράλληλος αρνητικός μάρτυρας (π.χ. χλωριούχο νάτριο 0,9 % ή αποσταγμένο νερό), ούτως ώστε να ανιχνεύονται μη ειδικές αλλαγές στο σύστημα δοκιμής και να παρέχεται μια αρχική τιμή για τα τελικά σημεία της δοκιμής. Κατά τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται επίσης ότι οι συνθήκες της δοκιμής δεν προκαλούν πλασματική απόκριση ερεθισμού.

35.

Κατά τη δοκιμή αραιωμένου υγρού, επιφανειοδραστικού ή στερεού, στη μέθοδο δοκιμών BCOP περιλαμβάνεται ομάδα παράλληλου μάρτυρα με διαλύτη/φορέα, ούτως ώστε να ανιχνεύονται μη ειδικές αλλαγές στο σύστημα δοκιμής και να παρέχεται μια αρχική τιμή για τα τελικά σημεία της δοκιμασίας. Μπορεί να χρησιμοποιείται μόνο διαλύτης/φορέας για τον οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεν έχει δυσμενείς επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής.

36.

Σε κάθε πείραμα περιλαμβάνεται γνωστό ερεθιστικό οφθαλμών ως παράλληλος θετικός μάρτυρας, ούτως ώστε να εξακριβώνεται η πρόκληση της κατάλληλης απόκρισης. Δεδομένου ότι στην παρούσα μέθοδο δοκιμών η δοκιμασία BCOP χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό διαβρωτικών ή ισχυρών ερεθιστικών, ο θετικός μάρτυρας πρέπει υπό ιδανικές συνθήκες να είναι ουσία αναφοράς που προκαλεί ισχυρή απόκριση στο πλαίσιο της συγκεκριμένης μεθόδου δοκιμών. Προκειμένου, ωστόσο, να διασφαλισθεί η δυνατότητα αξιολόγησης της μεταβλητότητας της απόκρισης στον θετικό μάρτυρα σε συνάρτηση με τον χρόνο, το μέγεθος της απόκρισης ερεθισμού δεν πρέπει να είναι υπερβολικό.

37.

Παραδείγματα θετικών μαρτύρων για τις υγρές ελεγχόμενες ουσίες είναι το διμεθυλοφορμαμίδιο ή το υδροξείδιο του νατρίου 1 %. Παράδειγμα θετικού μάρτυρα για τις στερεές ελεγχόμενες ουσίες είναι το ιμιδαζόλιο 20 % (κατά βάρος προς όγκο) σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9 %.

38.

Οι ουσίες που χρησιμοποιούνται σαν σημείο αναφοράς είναι χρήσιμες για την αξιολόγηση του δυναμικού οφθαλμικού ερεθισμού άγνωστων χημικών ουσιών συγκεκριμένης χημικής κατηγορίας ή κατηγορίας προϊόντων ή για την αξιολόγηση του σχετικού ερεθιστικού δυναμικού ενός ερεθιστικού των οφθαλμών εντός συγκεκριμένου εύρους αποκρίσεων ερεθισμού.

39.

Η αδιαφάνεια προσδιορίζεται από την ποσότητα φωτός που μεταδίδεται μέσω του κερατοειδούς. Η αδιαφάνεια του κερατοειδούς μετράται ποσοτικά με τη χρήση αδιαφανομέτρου, με το οποίο λαμβάνονται τιμές αδιαφάνειας μετρούμενες σε συνεχή κλίμακα.

40.

Η διαπερατότητα προσδιορίζεται από την ποσότητα χρωστικής νατριούχου φλουορεσκεΐνης που διαπερνά όλες τις κυτταρικές στιβάδες του κερατοειδούς (δηλ. το επιθήλιο στην εξωτερική επιφάνεια του κερατοειδούς έως το ενδοθήλιο στην εσωτερική επιφάνειά του). Στον εμπρόσθιο θάλαμο της διάταξης συγκράτησης κερατοειδούς, ο οποίος βρίσκεται σε επαφή με το επιθήλιο του κερατοειδούς, προστίθεται 1 mL διαλύματος νατριούχου φλουορεσκεΐνης (4 ή 5 mg/mL κατά τη δοκιμή υγρών και επιφανειοδραστικών ή μη επιφανειοδραστικών στερεών, αντιστοίχως), ενώ ο οπίσθιος θάλαμος, που βρίσκεται σε επαφή με το ενδοθήλιο του κερατοειδούς, πληρώνεται με φρέσκο EMEM. Η διάταξη συγκράτησης επωάζεται εν συνεχεία σε οριζόντια θέση επί 90 ± 5 min σε θερμοκρασία 32 ± 1 °C. Η ποσότητα νατριούχου φλουορεσκεΐνης που εισέρχεται στον οπίσθιο θάλαμο μετράται ποσοτικά με φασματοφωτομετρία ορατού/υπεριώδους. Οι φασματοφωτομετρικές μετρήσεις που λαμβάνονται στα 490 nm καταγράφονται ως τιμές οπτικής πυκνότητας (OD490) ή απορρόφησης, μετρούμενες σε συνεχή κλίμακα. Οι τιμές διαπερατότητας για τη φλουορεσκεΐνη προσδιορίζονται βάσει των τιμών OD490 που λαμβάνονται με φασματοφωτόμετρο ορατού φωτός με πρότυπο μήκος διαδρομής 1 cm.

41.

Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί συσκευή ανάγνωσης πλακών μικροτιτλοδότησης 96 κοιλοτήτων εφόσον (i) μπορεί να καθοριστεί το γραμμικό εύρος της συσκευής ανάγνωσης πλακών για τον προσδιορισμό των τιμών OD490 για τη φλουορεσκεΐνη και (ii) χρησιμοποιείται ο ορθός όγκος δειγμάτων φλουορεσκεΐνης στην πλάκα 96 κοιλοτήτων για την επίτευξη τιμών OD490 ισοδύναμων με το πρότυπο μήκος διαδρομής 1 cm (αυτό απαιτεί ενδεχομένως εντελώς πλήρεις κοιλότητες [συνήθως 360L]).

42.

Μετά τη διόρθωση των τιμών αδιαφάνειας και μέσης διαπερατότητας (OD490) για να ληφθούν υπόψη η αδιαφάνεια υποβάθρου και οι τιμές διαπερατότητας OD490 που αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα, οι μέσες τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας OD490 για κάθε ομάδα αγωγής πρέπει να συνδυάζονται σε εμπειρικό τύπο για τον υπολογισμό της βαθμολογίας ερεθιστικότητας in vitro (IVIS) για κάθε ομάδα αγωγής, ως εξής:

IVIS = μέση τιμή αδιαφάνειας + (15 × μέση τιμή διαπερατότητας OD490)

Οι Sina et al. (16) αναφέρουν ότι ο συγκεκριμένος τύπος προέκυψε στο πλαίσιο ενδοεργαστηριακών και διεργαστηριακών μελετών. Τα δεδομένα που προέκυψαν για μια σειρά 36 ενώσεων στο πλαίσιο πολυεργαστηριακής μελέτης υποβλήθηκαν σε πολυμεταβλητή ανάλυση για τον καθορισμό της εξίσωσης βέλτιστης προσαρμογής δεδομένων in vivo και in vitro. Η ανάλυση αυτή διεξήχθη από επιστήμονες σε δύο διαφορετικές εταιρείες, οι οποίοι κατέληξαν σε σχεδόν πανομοιότυπες εξισώσεις.

43.

Οι τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας πρέπει επίσης να αξιολογούνται χωριστά, ούτως ώστε να διαπιστώνεται αν μια ελεγχόμενη ουσία προκαλεί διαβρωτικότητα ή σοβαρό ερεθισμό μέσω ενός μόνο από τα δύο τελικά σημεία (βλ. κριτήρια απόφασης).

44.

Μια ουσία που συνεπάγεται IVIS ≥ 55,1 ορίζεται ως διαβρωτική ή ισχυρά ερεθιστική. Όπως αναφέρεται στην παράγραφο 1, εάν η ελεγχόμενη ουσία δεν χαρακτηρίζεται ως διαβρωτική ή ισχυρά ερεθιστική για τους οφθαλμούς, πρέπει να διεξάγονται επιπρόσθετες δοκιμές για ταξινόμηση και επισήμανση. Η μέθοδος δοκιμών BCOP έχει συνολική ακρίβεια 79 % (113/143) έως 81 % (119/147), ψευδοθετικό ποσοστό 19 % (20/103) έως 21 % (22/103) και ψευδοαρνητικό ποσοστό 16 % (7/43) έως 25 % (10/40), σε σύγκριση με τα δεδομένα που προκύπτουν από τη μέθοδο οφθαλμικής δοκιμής in vivo σε κουνέλια, τα οποία ταξινομήθηκαν σύμφωνα με τα συστήματα ταξινόμησης της EPA (1), της ΕΕ (2) ή GHS (3). Όταν αποκλείονται από τη βάση δεδομένων οι ουσίες ορισμένων κατηγοριών, χημικών (αλκοόλες, κετόνες) και φυσικών (στερεά), , η ακρίβεια της μεθόδου δοκιμής BCOP στα συστήματα ταξινόμησης της ΕΕ, της EPA και GHS κυμαίνεται από 87 % (72/83) έως 92 % (78/85), ενώ τα ψευδοθετικά ποσοστά κυμαίνονται από 12 % (7/58) έως 16 % (9/56) και τα ψευδοαρνητικά από 0 % (0/27) έως 12 % (3/26).

45.

Ακόμη και εάν μια ελεγχόμενη ουσία δεν ταξινομηθεί ως διαβρωτική ή ισχυρά ερεθιστική για τους οφθαλμούς, τα δεδομένα της μεθόδου δοκιμής BCOP μπορούν να χρησιμεύσουν, σε συνδυασμό με δεδομένα από την οφθαλμική δοκιμή in vivo σε κουνέλια ή από επαρκώς επικυρωμένη δοκιμή in vitro, για την περαιτέρω αξιολόγηση της σκοπιμότητας και των περιορισμών της μεθόδου δοκιμών BCOP ως προς τον χαρακτηρισμό μη ισχυρών ερεθιστικών και μη ερεθιστικών (καταρτίζεται έγγραφο καθοδήγησης σχετικά με τη χρήση μεθόδων δοκιμών οφθαλμικής τοξικότητας in vitro).

46.

Μια δοκιμή θεωρείται αποδεκτή εάν για τον θετικό μάρτυρα προκύπτει IVIS που εμπίπτει εντός δύο τυπικών αποκλίσεων της ισχύουσας ιστορικής μέσης τιμής, η οποία πρέπει να επικαιροποιείται τουλάχιστον ανά τρίμηνο ή κάθε φορά που εκτελείται αποδεκτή δοκιμή σε εργαστήρια όπου δεν διεξάγονται συχνά δοκιμές (λιγότερο από μία φορά το μήνα). Οι αποκρίσεις στον αρνητικό μάρτυρα ή στον μάρτυρα με διαλύτη/φορέα πρέπει να έχουν ως αποτέλεσμα τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας μικρότερες από τα καθορισμένα ανώτερα όρια των τιμών αδιαφάνειας και διαπερατότητας υποβάθρου για κερατοειδείς βοοειδών που υποβάλλονται σε αγωγή με τον αντίστοιχο αρνητικό μάρτυρα ή μάρτυρα με διαλύτη/φορέα.

47.

Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία, εφόσον αυτά έχουν σημασία για τη διενέργεια της μελέτης:

Ελεγχόμενες ουσίες και μάρτυρες

Πληροφορίες σχετικά με τον χορηγό και την εγκατάσταση δοκιμών

Αιτιολόγηση της μεθόδου και του πρωτοκόλλου δοκιμής που χρησιμοποιούνται

Ακεραιότητα της μεθόδου δοκιμών

διαδικασία που χρησιμοποιείται για τη διασφάλιση της ακεραιότητας (ορθότητα και αξιοπιστία) της μεθόδου δοκιμών με την πάροδο του χρόνου (π.χ. περιοδικές δοκιμές των ουσιών ελέγχου ικανότητας, χρήση ιστορικών δεδομένων για τους αρνητικούς και τους θετικούς μάρτυρες).

Κριτήρια αποδοχής της δοκιμής

Συνθήκες δοκιμής

Αποτελέσματα

Συζήτηση των αποτελεσμάτων

Συμπέρασμα

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1272/2008 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 16ης Δεκεμβρίου 2008, για την ταξινόμηση, την επισήμανση και τη συσκευασία των ουσιών και των μειγμάτων, την τροποποίηση και την κατάργηση των οδηγιών 67/548/ΕΟΚ και 1999/45/ΕΚ και την τροποποίηση του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006. ΕΕ L 353 της 31.12.2008, σ. 1.

(3)

UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007.Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(5)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Αρ. δημοσίευσης NIH: 07-4517. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(6)

ΕΚ (2006). Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 18ης Δεκεμβρίου 2006, για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών προϊόντων (REACH) και για την ίδρυση του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Χημικών Προϊόντων καθώς και για την τροποποίηση της οδηγίας 1999/45/ΕΚ και για την κατάργηση του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 793/93 του Συμβουλίου και του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1488/94 της Επιτροπής καθώς και της οδηγίας 76/769/ΕΟΚ του Συμβουλίου και των οδηγιών της Επιτροπής 91/155/ΕΟΚ, 93/67/ΕΟΚ, 93/105/ΕΚ και 2000/21/ΕΚ. ΕΕ L 396 της 30.12.2006, σ. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Αρ. δημοσίευσης NIH: 07-4517. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(11)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(12)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(13)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

(17)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

1.

Η μέθοδος δοκιμών σε απομονωμένους οφθαλμούς ορνιθίων (Isolated Chicken Eye/ICE) αποτελεί μέθοδο δοκιμών in vitro που μπορεί να χρησιμοποιείται, υπό συγκεκριμένες περιστάσεις και περιορισμούς, για την ταξινόμηση ουσιών και μειγμάτων ως διαβρωτικών και ισχυρών ερεθιστικών των οφθαλμών (1) (2) (3). Για τους σκοπούς της παρούσας κατευθυντήριας γραμμής δοκιμής, ως ισχυρά ερεθιστικά ορίζονται εκείνα που προκαλούν οφθαλμικές αλλοιώσεις που εμμένουν στο κουνέλι για τουλάχιστον 21 ημέρες μετά τη χορήγηση. Αν και δεν θεωρείται έγκυρη για την πλήρη αντικατάσταση της οφθαλμικής δοκιμής in vivo σε κουνέλια, η μέθοδος ICE συνιστάται για χρήση στο πλαίσιο στρατηγικής κλιμακωτών δοκιμών για ρυθμιστική ταξινόμηση και επισήμανση εντός συγκεκριμένου πεδίου εφαρμογής (4) (5). Οι ελεγχόμενες ουσίες και μείγματα (6) που εμφανίζουν θετικά αποτελέσματα στην παρούσα δοκιμασία μπορούν να ταξινομηθούν ως διαβρωτικά ή ισχυρά ερεθιστικά των οφθαλμών χωρίς περαιτέρω δοκιμές σε κουνέλια. Ουσίες που εμφανίζουν αρνητικά αποτελέσματα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή σε κουνέλια στο πλαίσιο στρατηγικής διαδοχικών ελέγχων, όπως περιγράφεται στην κατευθυντήρια γραμμή 405 (7) του ΟΟΣΑ για τη διεξαγωγή δοκιμών (κεφάλαιο B. 5 του παρόντος παραρτήματος).

2.

Σκοπός της παρούσας μεθόδου δοκιμών είναι η περιγραφή των διαδικασιών που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της πιθανής διαβρωτικότητας ή ισχυρής ερεθιστικότητας μιας ελεγχόμενης ουσίας για τους οφθαλμούς, όπως μετράται από την ικανότητά της να προκαλεί τοξικότητα σε εξορυγμένο οφθαλμό ορνιθίου. Οι τοξικές επιδράσεις στον κερατοειδή μετρώνται με: (i) ποιοτική αξιολόγηση της αδιαφάνειας, (ii) ποιοτική αξιολόγηση της βλάβης στο επιθήλιο βάσει της εφαρμογής φλουορεσκεΐνης στον οφθαλμό (κατακράτηση φλουορεσκεΐνης), (iii) ποσοτική μέτρηση της αύξησης του πάχους (οίδημα) και (iv) ποιοτική αξιολόγηση της μακροσκοπικής μορφολογικής βλάβης στην επιφάνεια. Οι αξιολογήσεις της αδιαφάνειας, του οιδήματος και της βλάβης του κερατοειδούς κατόπιν έκθεσης στην ελεγχόμενη ουσία πραγματοποιούνται χωριστά και εν συνεχεία συνδυάζονται για την ταξινόμηση της οφθαλμικής ερεθιστικότητας.

3.

Σε δοκιμές με τη μέθοδο ICE έχουν υποβληθεί και ερεθιστικά των οφθαλμών που προκαλούν αλλοιώσεις οι οποίες υποχωρούν εντός διαστήματος μικρότερου των 21 ημερών, καθώς και μη ερεθιστικά. Εντούτοις, δεν έχουν αξιολογηθεί επισήμως η ορθότητα και η αξιοπιστία της μεθόδου δοκιμών ICE για ουσίες που εμπίπτουν σε αυτές τις κατηγορίες.

4.

Στο προσάρτημα 1 παρέχονται ορισμοί.

5.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών βασίζεται στο πρωτόκολλο της μεθόδου δοκιμών ICE της Διυπηρεσιακής Συντονιστικής Επιτροπής για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ICCVAM) (8), το οποίο καταρτίστηκε βάσει διεθνούς μελέτης επικύρωσης (4) (5) (9), με τη συνεισφορά του Ευρωπαϊκού Κέντρου για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ECVAM), του Ιαπωνικού Κέντρου για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (JaCVAM) και του Τμήματος Τοξικολογίας και Εφαρμοσμένης Φαρμακολογίας του θεματικού τομέα “Ποιότητα ζωής” (Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology) του ερευνητικού οργανισμού ΤΝΟ (Κάτω Χώρες). Το πρωτόκολλο βασίζεται σε στοιχεία που ελήφθησαν από δημοσιευμένα πρωτόκολλα, καθώς και στο πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται επί του παρόντος από τον οργανισμό TNO (10) (11) (12) (13) (14).

6.

Οι περιορισμοί που προσδιορίστηκαν για την παρούσα μέθοδο βασίζονται στο ψευδοθετικό ποσοστό για τις αλκοόλες και στα ψευδοαρνητικά ποσοστά για τα στερεά και τα επιφανειοδραστικά (βλ. παράγραφο 47) (4). Όταν αποκλείονται από τη βάση δεδομένων οι ουσίες που εμπίπτουν σε αυτές τις χημικές και φυσικές κατηγορίες, αυξάνεται σημαντικά η ορθότητα της ICE στα συστήματα ταξινόμησης της ΕΕ, της EPA (Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ) και GHS (Παγκόσμιο Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης και Επισήμανσης των Χημικών Προϊόντων) (4). Για τον σκοπό της παρούσας δοκιμασίας (δηλ. την ταυτοποίηση μόνο των διαβρωτικών/ισχυρών ερεθιστικών των οφθαλμών), τα ψευδοαρνητικά ποσοστά δεν είναι κρίσιμης σημασίας, διότι οι ουσίες αυτές θα υποβληθούν ακολούθως σε δοκιμή σε κουνέλια ή σε άλλες επαρκώς επικυρωμένες δοκιμές in vitro, ανάλογα με τις κανονιστικές απαιτήσεις, στο πλαίσιο στρατηγικής διαδοχικών ελέγχων με μέθοδο προσέγγισης βασιζόμενη στο βάρος της απόδειξης. Επιπλέον, η υφιστάμενη βάση δεδομένων επικύρωσης δεν καθιστά εφικτή τη δέουσα αξιολόγηση ορισμένων χημικών κατηγοριών ή κατηγοριών προϊόντων (π.χ. των μειγμάτων). Παρόλα αυτά, οι ερευνητές θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν την παρούσα μέθοδο δοκιμών για όλους τους τύπους ελεγχόμενων υλικών (συμπεριλαμβανομένων των μειγμάτων), με τα θετικά αποτελέσματα να θεωρούνται ενδεικτικά απόκρισης των οφθαλμών για διαβρωτικό ή ισχυρό ερεθιστικό. Πάντως, τα θετικά αποτελέσματα που λαμβάνονται με τις αλκοόλες πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή λόγω κινδύνου υπερεκτιμημένης πρόβλεψης.

7.

Όλες οι διαδικασίες με τους οφθαλμούς ορνιθίων πρέπει να συμμορφώνονται προς τους κανονισμούς και τις διαδικασίες που εφαρμόζονται στην εγκατάσταση δοκιμών για τον χειρισμό υλικών ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων, μεταξύ άλλων, των ιστών και ιστικών υγρών. Συνιστάται η τήρηση των γενικών εργαστηριακών προφυλάξεων (15).

8.

Ένας περιορισμός της μεθόδου δοκιμής συνίσταται στο ότι, αν και λαμβάνει υπόψη ορισμένες από τις επιδράσεις στους οφθαλμούς οι οποίες αξιολογήθηκαν στη μέθοδο δοκιμών οφθαλμικής ερεθιστικότητας σε κουνέλια και, εν μέρει, τη σοβαρότητά τους, δεν λαμβάνει υπόψη τους τραυματισμούς του επιπεφυκότος και της ίριδας. Επίσης, μολονότι δεν είναι εφικτή η αξιολόγηση αυτής καθαυτής της αναστρεψιμότητας των βλαβών του κερατοειδούς στο πλαίσιο της μεθόδου δοκιμών ICE, έχει προταθεί, βάσει των οφθαλμικών μελετών σε κουνέλια, η αξιολόγηση του αρχικού βάθους του τραύματος του κερατοειδούς για τη διάκριση μεταξύ μη αναστρέψιμων και αναστρέψιμων επιδράσεων (16). Τέλος, η μέθοδος δοκιμών ICE δεν καθιστά εφικτή την αξιολόγηση του δυναμικού συστημικής τοξικότητας που συνδέεται με την έκθεση των οφθαλμών.

9.

Συνεχίζονται οι προσπάθειες για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό της σκοπιμότητας και των περιορισμών της μεθόδου δοκιμών ICE ως προς τον χαρακτηρισμό των μη ισχυρών ερεθιστικών και των μη ερεθιστικών (βλ. επίσης παράγραφο 48). Συνιστάται επίσης στους χρήστες να παρέχουν δείγματα ή/και δεδομένα σε φορείς επικύρωσης για μια επίσημη αξιολόγηση των πιθανών μελλοντικών χρήσεων της μεθόδου δοκιμών ICE, καθώς και για τον χαρακτηρισμό των μη ισχυρών ερεθιστικών και των μη ερεθιστικών.

10.

Τα εργαστήρια που διεξάγουν για πρώτη φορά την παρούσα δοκιμή πρέπει να χρησιμοποιούν τις χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας που προβλέπονται στο προσάρτημα 2. Ένα εργαστήριο μπορεί να χρησιμοποιεί αυτές τις χημικές ουσίες για να αποδείξει την τεχνική ικανότητά του όσον αφορά την εφαρμογή της μεθόδου δοκιμών ICE, πριν από την υποβολή δεδομένων από τη δοκιμή ICE, για κανονιστική ταξινόμηση κινδύνων.

11.

Η μέθοδος δοκιμών ICE είναι ένα οργανοτυπικό μοντέλο που εξασφαλίζει βραχυπρόθεσμη διατήρηση των οφθαλμών ορνιθίων in vitro. Στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμών, η βλάβη που προκαλείται από την ελεγχόμενη ουσία αξιολογείται μέσω προσδιορισμού του οιδήματος και της αδιαφάνειας του κερατοειδούς και της κατακράτησης φλουορεσκεΐνης. Με τις δύο τελευταίες παραμέτρους επιτυγχάνεται ποιοτική αξιολόγηση, ενώ η ανάλυση του οιδήματος του κερατοειδούς παρέχει ποσοτική αξιολόγηση. Κάθε μέτρηση είτε μετατρέπεται σε ποσοτική βαθμολογία για τον υπολογισμό ενός συνολικού δείκτη ερεθισμού είτε κατατάσσεται σε ποιοτική κατηγορία, η οποία χρησιμοποιείται για ταξινόμηση ως προς την οφθαλμική διαβρωτικότητα και την ισχυρή ερεθιστικότητα in vitro. Το καθένα από αυτά τα αποτελέσματα μπορεί εν συνεχεία να χρησιμοποιείται για την πρόγνωση του δυναμικού οφθαλμικής διαβρωτικότητας και ισχυρής ερεθιστικότητας in vivo μιας ελεγχόμενης ουσίας (βλ. κριτήρια απόφασης).

12.

Έχει παγιωθεί ιστορικά η χρήση, για τη δοκιμή, οφθαλμών που συλλέγονται από ορνίθια που θανατώνονται σε σφαγείο για κατανάλωση από τον άνθρωπο, γεγονός που συνεπάγεται ότι δεν απαιτείται η χρήση πειραματόζωων. Χρησιμοποιούνται μόνο οφθαλμοί υγιών ζώων που θεωρούνται κατάλληλα για είσοδο στην ανθρώπινη τροφική αλυσίδα.

13.

Αν και δεν έχει διενεργηθεί ελεγχόμενη μελέτη για την αξιολόγηση της βέλτιστης ηλικίας των ορνιθίων, στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμής χρησιμοποιούνται κατά παράδοση τα νεαρά ορνίθια που οδηγούνται συνήθως σε σφαγείο πουλερικών (ηλικίας περίπου 7 εβδομάδων και βάρους 1,5 – 2,5 kg).

14.

Τα κεφάλια πρέπει να αφαιρούνται αμέσως μετά την αναισθητοποίηση των ορνιθίων, συνήθως με ηλεκτροπληξία, και την τομή στον τράχηλο για αφαίμαξη. Η εγκατάσταση από την οποία προέρχονται τα ορνίθια πρέπει να βρίσκεται κοντά στο εργαστήριο ούτως ώστε τα κεφάλια να μεταφέρονται ταχέως από το σφαγείο στο εργαστήριο προκειμένου να ελαχιστοποιείται η υποβάθμιση ή/και η βακτηριδιακή μόλυνση. Το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ της συλλογής των κεφαλών των ορνιθίων και της χρήσης των οφθαλμών στη μέθοδο δοκιμών ICE πρέπει να είναι το μικρότερο δυνατόν (κατά κανόνα εντός δύο ωρών) και να αποδεικνύεται ότι δεν υπονομεύει τα αποτέλεσμα της δοκιμασίας. Τα αποτελέσματα αυτά βασίζονται στα κριτήρια επιλογής των οφθαλμών, καθώς και στις αποκρίσεις των θετικών και των αρνητικών μαρτύρων. Όλοι οι οφθαλμοί που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία πρέπει να προέρχονται από την ίδια ομάδα οφθαλμών που συλλέχθηκαν συγκεκριμένη ημέρα.

15.

Επειδή οι οφθαλμοί ανατέμνονται στο εργαστήριο, οι κεφαλές μεταφέρονται από το σφαγείο ολόκληρες, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, εντός πλαστικών δοχείων που διατηρούνται υγρά με πετσέτες εμποτισμένες με ισότονο αλατούχο διάλυμα (φυσιολογικό ορό).

16.

Οφθαλμοί με υψηλή αρχική χρώση φλουορεσκεΐνης (> 0,5) ή βαθμολογία αδιαφάνειας κερατοειδούς > 0,5 μετά την εξόρυξή τους, απορρίπτονται.

17.

Κάθε ομάδα αγωγής και κάθε ομάδα παράλληλων θετικών μαρτύρων αποτελείται από τρεις τουλάχιστον οφθαλμούς. Η ομάδα αρνητικών μαρτύρων ή μαρτύρων με διαλύτη (εάν δεν χρησιμοποιείται φυσιολογικός ορός ως διαλύτης) αποτελείται από τουλάχιστον έναν οφθαλμό.

18.

Τα βλέφαρα εκτέμνονται προσεκτικά κατά τρόπο ώστε να μην προκαλείται βλάβη στον κερατοειδή. Η ακεραιότητα του κερατοειδούς αξιολογείται ταχέως με την ενστάλαξη σταγόνας νατριούχου φλουορεσκεΐνης 2 % w/v στην επιφάνεια του κερατοειδούς για λίγα δευτερόλεπτα. Ακολουθεί έκπλυση του κερατοειδούς με ισότονο φυσιολογικό ορό. Οι οφθαλμοί που έχουν υποβληθεί σε αγωγή με φλουορεσκεΐνη εξετάζονται με σχισμοειδή λυχνία για να διαπιστώνεται αν είναι άθικτος ο κερατοειδής (κατακράτηση φλουορεσκεΐνης και αδιαφάνεια κερατοειδούς ≤ 0,5).

19.

Εάν ο κερατοειδής είναι άθικτος, ο οφθαλμός εκτέμνεται περαιτέρω από το κρανίο με προσοχή, κατά τρόπο ώστε να μην προκαλείται βλάβη στον κερατοειδή. Ο βολβός αποσπάται από τον οφθαλμικό κόγχο με χειρουργικές λαβίδες, με τις οποίες συγκρατείται σταθερά η σκαρδαμυκτική μεμβράνη, ενώ αποκόπτονται οι οφθαλμικοί μυς με κυρτό αμβλύ ψαλίδι. Είναι σημαντικό να αποφεύγεται η άσκηση υπερβολικής πίεσης ώστε να μην προκαλείται βλάβη στον κερατοειδή (τεχνητά σφάλματα λόγω συμπίεσης).

20.

Κατά την απόσπαση του οφθαλμού από τον οφθαλμικό κόγχο πρέπει να παραμένει συνδεδεμένο ένα ορατό τμήμα του οπτικού νεύρου. Μετά την αφαίρεσή του από τον οφθαλμικό κόγχο, ο οφθαλμός τοποθετείται σε απορροφητικό τολύπιο και αφαιρούνται η σκαρδαμυκτική μεμβράνη και ο λοιπός συνδετικός ιστός.

21.

Ο εξορυγμένος οφθαλμός στερεώνεται σε σφιγκτήρα από ανοξείδωτο χάλυβα με τον κερατοειδή σε κατακόρυφη θέση. Ο σφιγκτήρας μεταφέρεται εν συνεχεία σε θάλαμο της συσκευής υπέρτηξης (16). Οι σφιγκτήρες πρέπει να τοποθετούνται στη συσκευή υπέρτηξης κατά τρόπο ώστε ολόκληρος ο κερατοειδής να καλύπτεται με τον ισότονο φυσιολογικό ορό. Η θερμοκρασία των θαλάμων της συσκευής υπέρτηξης πρέπει να είναι ελεγχόμενη στους 32 ± 1,5 °C. Στο προσάρτημα 3 παρατίθεται διάγραμμα τυπικής συσκευής υπέρτηξης και των σφιγκτήρων οφθαλμών, που κυκλοφορούν στο εμπόριο ή κατασκευάζονται κατά παραγγελία. Η συσκευή μπορεί να τροποποιείται ούτως ώστε να προσαρμόζεται στις ανάγκες του εκάστοτε εργαστηρίου (π.χ. να χωράει διαφορετικό αριθμό οφθαλμών).

22.

Μετά την τοποθέτησή τους στη συσκευή υπέρτηξης, οι οφθαλμοί επανεξετάζονται με μικροσκόπιο με σχισμοειδή λυχνία ούτως ώστε να διαπιστωθεί ότι δεν υπέστησαν βλάβη κατά τη διαδικασία ανατομής. Παράλληλα, πρέπει να μετράται το πάχος του κερατοειδούς στην κορυφή του με το παχύμετρο της σχισμοειδούς λυχνίας. Οι οφθαλμοί με (i) κατακράτηση φλουορεσκεΐνης > 0,5, (ii) αδιαφάνεια κερατοειδούς > 0,5 ή (iii) περαιτέρω ενδείξεις βλάβης πρέπει να αντικαθίστανται. Από τους οφθαλμούς που δεν απορρίπτονται βάσει οποιουδήποτε από τα προαναφερθέντα κριτήρια, οι μεμονωμένοι οφθαλμοί με πάχος κερατοειδούς που αποκλίνει κατά περισσότερο από 10 % από τη μέση τιμή για το σύνολο των οφθαλμών, πρέπει να απορρίπτονται. Οι χρήστες πρέπει να γνωρίζουν ότι από μικροσκόπια με σχισμοειδείς λυχνίες ενδέχεται να προκύψουν διαφορετικές μετρήσεις του πάχους του κερατοειδούς ανάλογα με το πλάτος της σχισμής. Το πλάτος της σχισμής πρέπει να ρυθμίζεται στα 0,095 mm.

23.

Όταν όλοι οι οφθαλμοί έχουν εξετασθεί και εγκριθεί, επωάζονται επί περίπου 45 έως 60 λεπτά για την εξισορρόπησή τους με το σύστημα δοκιμής πριν από τη δοσιμέτρηση. Μετά την παρέλευση του διαστήματος εξισορρόπησης, καταγράφεται η μηδενική μέτρηση αναφοράς ως αρχική τιμή του πάχους και της αδιαφάνειας του κερατοειδούς (χρόνος = 0). Η βαθμολογία κατακράτησης φλουορεσκεΐνης κατά την ανατομή χρησιμοποιείται ως η αρχική μέτρηση για το συγκεκριμένο τελικό σημείο.

24.

Αμέσως μετά τις μηδενικές μετρήσεις αναφοράς, ο οφθαλμός (στον σφιγκτήρα του) απομακρύνεται από τη συσκευή υπέρτηξης, τοποθετείται σε οριζόντια θέση και στον κερατοειδή εφαρμόζεται η ελεγχόμενη ουσία.

25.

Οι υγρές ελεγχόμενες ουσίες υποβάλλονται κατά κανόνα σε δοκιμή χωρίς να αραιώνονται, αλλά μπορούν να αραιώνονται εάν κριθεί απαραίτητο (π.χ. στο πλαίσιο του σχεδιασμού της μελέτης). Ο προτιμώμενος διαλύτης για την αραίωση των ουσιών είναι ο φυσιολογικός ορός. Μπορούν όμως να χρησιμοποιούνται και εναλλακτικοί διαλύτες υπό ελεγχόμενες συνθήκες, αλλά πρέπει να αποδεικνύεται η καταλληλότητά τους.

26.

Οι υγρές ελεγχόμενες ουσίες εφαρμόζονται στον κερατοειδή κατά τρόπο ώστε ολόκληρη η επιφάνειά του να καλύπτεται ομοιογενώς με την ελεγχόμενη ουσία. Ο τυπικός όγκος είναι 0,03 mL.

27.

Εάν είναι εφικτό, οι στερεές ουσίες πρέπει να κονιοποιούνται σε όσο το δυνατόν λεπτότερους κόκκους σε ιγδίο με ύπερο, ή με συγκρίσιμο εργαλείο λειοτρίβησης. Η σκόνη εφαρμόζεται στον κερατοειδή κατά τρόπο ώστε η επιφάνειά του να καλύπτεται ομοιόμορφα με την ελεγχόμενη ουσία. Η τυπική ποσότητα είναι 0,03 g.

28.

Η ελεγχόμενη ουσία (υγρή ή στερεά) εφαρμόζεται επί 10 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια εκπλύνεται από τον οφθαλμό με ισότονο φυσιολογικό ορό (περίπου 20 mL) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολούθως, ο οφθαλμός (στον σφιγκτήρα του) επαναφέρεται στη συσκευή υπέρτηξης στην αρχική κατακόρυφη θέση.

29.

Κάθε πείραμα πρέπει να περιλαμβάνει παράλληλους αρνητικούς μάρτυρες ή μάρτυρες με διαλύτη/φορέα και θετικούς μάρτυρες.

30.

Κατά τη δοκιμή υγρών χωρίς αραίωση ή στερεών, ως παράλληλος αρνητικός μάρτυρας στη μέθοδο δοκιμών ICE χρησιμοποιείται φυσιολογικός ορός για την ανίχνευση μη ειδικών αλλαγών στο σύστημα δοκιμής και για να εξασφαλίζεται ότι οι συνθήκες δοκιμασίας δεν προκαλούν πλασματική απόκριση ερεθισμού.

31.

Κατά τη δοκιμή αραιωμένων υγρών, στη μέθοδο δοκιμών περιλαμβάνεται ομάδα παράλληλων μαρτύρων με διαλύτη/φορέα για την ανίχνευση μη ειδικών αλλαγών στο σύστημα δοκιμής και για να εξασφαλίζεται ότι οι συνθήκες δοκιμής δεν προκαλούν πλασματική απόκριση ερεθισμού. Όπως αναφέρεται στην παράγραφο 25, μπορεί να χρησιμοποιείται μόνο διαλύτης/φορέας για τον οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεν έχει δυσμενείς επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής.

32.

Σε κάθε πείραμα περιλαμβάνεται γνωστό ερεθιστικό των οφθαλμών ως παράλληλος θετικός μάρτυρας ούτως ώστε να επιβεβαιώνεται η πρόκληση της κατάλληλης απόκρισης. Δεδομένου ότι στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμών η δοκιμασία ICE χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό διαβρωτικών ή ισχυρών ερεθιστικών, ο θετικός μάρτυρας πρέπει να είναι ουσία αναφοράς που προκαλεί σοβαρή απόκριση στο πλαίσιο της συγκεκριμένης μεθόδου. Ωστόσο, για να διασφαλισθεί η δυνατότητα αξιολόγησης της μεταβλητότητας της απόκρισης στον θετικό μάρτυρα σε συνάρτηση με τον χρόνο, το μέγεθος της σοβαρής απόκρισης δεν πρέπει να είναι υπερβολικό. Πρέπει να παράγονται επαρκή δεδομένα in vitro για τον θετικό μάρτυρα ούτως ώστε να είναι εφικτός ο υπολογισμός ενός στατιστικώς καθορισμένου αποδεκτού εύρους του θετικού μάρτυρα. Εάν για έναν συγκεκριμένο θετικό μάρτυρα δεν διατίθενται επαρκή ιστορικά δεδομένα από τη μέθοδο δοκιμών ICE, ενδέχεται να απαιτείται η διεξαγωγή μελετών για την απόκτηση αυτών των πληροφοριών.

33.

Παραδείγματα θετικών μαρτύρων για υγρές ελεγχόμενες ουσίες είναι το οξικό οξύ 10 % ή το χλωριούχο βενζαλκόνιο 5 %, ενώ παραδείγματα θετικών μαρτύρων για στερεές ελεγχόμενες ουσίες είναι το υδροξείδιο του νατρίου ή το ιμιδαζόλιο.

34.

Οι ουσίες που χρησιμοποιούνται σαν σημείο αναφοράς είναι χρήσιμες για την αξιολόγηση του δυναμικού οφθαλμικού ερεθισμού άγνωστων χημικών ουσιών συγκεκριμένης χημικής κατηγορίας ή κατηγορίας προϊόντων ή για την αξιολόγηση του σχετικού ερεθιστικού δυναμικού ενός ερεθιστικού των οφθαλμών εντός συγκεκριμένου εύρους αποκρίσεων ερεθισμού.

35.

Οι κερατοειδείς που έχουν υποβληθεί σε αγωγή αξιολογούνται προ της αγωγής και στα 30, 75, 120, 180 και 240 λεπτά (± 5 λεπτά) από την έκπλυση που ακολουθεί την αγωγή. Τα χρονικά αυτά σημεία εξασφαλίζουν επαρκή αριθμό μετρήσεων κατά τη διάρκεια του τετράωρου διαστήματος αγωγής, παρέχοντας παράλληλα επαρκή χρόνο μεταξύ των μετρήσεων για τις απαιτούμενες παρατηρήσεις επί όλων των οφθαλμών.

36.

Τα αξιολογούμενα τελικά σημεία είναι η αδιαφάνεια, το οίδημα του κερατοειδούς, η κατακράτηση φλουορεσκεΐνης και οι επιδράσεις στη μορφολογία (π.χ. εντύπωμα ή χαλάρωση του επιθηλίου). Όλα τα τελικά σημεία, με εξαίρεση την κατακράτηση φλουορεσκεΐνης (η οποία προσδιορίζεται μόνο προ της αγωγής και 30 λεπτά μετά την έκθεση στην ελεγχόμενη ουσίας) προσδιορίζονται σε καθένα από τα ανωτέρω τελικά σημεία.

37.

Συνιστάται η λήψη φωτογραφιών για την τεκμηρίωση της αδιαφάνειας του κερατοειδούς, της κατακράτησης φλουορεσκεΐνης, των μορφολογικών επιδράσεων και, εάν διενεργείται, της παθολογοανατομικής εξέτασης.

38.

Μετά την τελική εξέταση στις τέσσερις ώρες, συνιστάται στους χρήστες να διατηρούν τους οφθαλμούς σε κατάλληλο συντηρητικό (π.χ. ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλδεΰδης [φορμόλη]) για πιθανή παθολογοανατομική εξέταση.

39.

Το οίδημα του κερατοειδούς προσδιορίζεται βάσει μετρήσεων του πάχους του κερατοειδούς με οπτικό παχύμετρο σε σχισμοειδή λυχνία, εκφράζεται ως ποσοστό επί τοις εκατό και υπολογίζεται βάσει του ακόλουθου τύπου:

40.

Υπολογίζεται το μέσο ποσοστό οιδήματος του κερατοειδούς για όλους τους οφθαλμούς της δοκιμής και για όλα τα χρονικά σημεία παρατήρησης. Βάσει της υψηλότερης μέσης βαθμολογίας για το οίδημα του κερατοειδούς, όπως παρατηρείται ανεξαρτήτως χρονικού σημείου, προκύπτει για κάθε ελεγχόμενη ουσία συνολική βαθμολογία κατηγορίας.

41.

Η αδιαφάνεια του κερατοειδούς υπολογίζεται βάσει της επιφάνειας του κερατοειδούς με την πυκνότερη αδιαφάνεια. Υπολογίζεται η μέση αδιαφάνεια κερατοειδούς για όλους τους οφθαλμούς της δοκιμής και για όλα τα χρονικά σημεία παρατήρησης. Βάσει της υψηλότερης μέσης βαθμολογίας για την αδιαφάνεια του κερατοειδούς, όπως παρατηρείται ανεξαρτήτως χρονικού σημείου, προκύπτει για κάθε ελεγχόμενη ουσία συνολική βαθμολογία κατηγορίας (πίνακας 1).

Πίνακας 1

Βαθμολογία αδιαφάνειας κερατοειδούς

42.

Υπολογίζεται η μέση τιμή κατακράτησης φλουορεσκεΐνης για όλους τους οφθαλμούς της δοκιμής μόνο στο χρονικό σημείο παρατήρησης των 30 λεπτών, το οποίο χρησιμοποιείται για τη συνολική βαθμολογία κατηγορίας που προκύπτει για κάθε ελεγχόμενη ουσία (πίνακας 2).

Πίνακας 2

Βαθμολογία κατακράτησης φλουορεσκεΐνης

43.

Στις μορφολογικές επιδράσεις περιλαμβάνεται το “εντύπωμα” των επιθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς, η “χαλάρωση” του επιθηλίου, η “τράχυνση” της επιφάνειας του κερατοειδούς και η “πρόσφυση” της ελεγχόμενης ουσίας στον κερατοειδή. Τα ευρήματα αυτά ποικίλλουν σε σοβαρότητα και ενδέχεται να παρατηρούνται ταυτόχρονα. Η ταξινόμησή τους είναι υποκειμενική ανάλογα με την ερμηνεία του ερευνητή.

44.

Τα αποτελέσματα σχετικά με την αδιαφάνεια και το οίδημα του κερατοειδούς και με την κατακράτηση φλουορεσκεΐνης πρέπει να αξιολογούνται χωριστά ώστε να προκύπτει κατηγορία ICE για κάθε τελικό σημείο. Ακολούθως, οι κατηγορίες ICE για κάθε τελικό σημείο συνδυάζονται για την ταξινόμηση της ερεθιστικότητας κάθε ελεγχόμενης ουσίας.

45.

Μετά την αξιολόγηση κάθε τελικού σημείου, είναι εφικτή η κατάταξη σε κατηγορίες ICE βάσει προκαθορισμένου εύρους. Η ερμηνεία του πάχους του κερατοειδούς (πίνακας 3), της αδιαφάνειάς του (πίνακας 4) και της κατακράτησης φλουορεσκεΐνης (πίνακας 5) βάσει τεσσάρων κατηγοριών ICE πραγματοποιείται σύμφωνα με τις ακόλουθες κλίμακες:

Πίνακας 3

Κριτήρια ταξινόμησης ICE για το πάχος του κερατοειδούς

Πίνακας 4

Κριτήρια ταξινόμησης ICE για την αδιαφάνεια

Πίνακας 5

Κριτήρια ταξινόμησης ICE για τη μέση κατακράτηση φλουορεσκεΐνης

46.

Η συνολική ταξινόμηση ερεθιστικότητας in vitro για μια ελεγχόμενη ουσία αξιολογείται βάσει της ταξινόμησης ερεθιστικότητας που αντιστοιχεί στον συνδυασμό των κατηγοριών οιδήματος του κερατοειδούς, αδιαφάνειας του κερατοειδούς και κατακράτησης φλουορεσκεΐνης, όπως εμφαίνεται στον πίνακα 6.

Πίνακας 6

Συνολικές ταξινομήσεις ερεθιστικότητας in vitro

47.

Όπως αναφέρεται στην παράγραφο 1, εάν η ελεγχόμενη ουσία δεν χαρακτηρίζεται ως διαβρωτικό ή ισχυρό ερεθιστικό των οφθαλμών, πρέπει να διεξάγονται επιπρόσθετες δοκιμές για ταξινόμηση και επισήμανση. Η μέθοδος δοκιμών ICE έχει συνολική ορθότητα 83 % (120/144) έως 87 % (134/154), ψευδοθετικό ποσοστό 6 % (7/122) έως 8 % (9/116) και ψευδοαρνητικό ποσοστό 41 % (13/32) έως 50 % (15/30) για τον χαρακτηρισμό διαβρωτικών και ισχυρών ερεθιστικών των οφθαλμών, σε σύγκριση με τα δεδομένα από τη μέθοδο οφθαλμικών δοκιμών in vivo σε κουνέλια, τα οποία ταξινομήθηκαν σύμφωνα με τα συστήματα ταξινόμησης της EPA (1), της ΕΕ (2) ή GHS (3). Όταν αποκλείονται από τη βάση δεδομένων οι ουσίες ορισμένων κατηγοριών, χημικών (αλκοόλες και επιφανειοδραστικά) και φυσικών (στερεά), η ορθότητα της ICE στα συστήματα ταξινόμησης της ΕΕ, της EPA και GHS κυμαίνεται από 91 % (75/82) έως 92 % (69/75), ενώ τα ψευδοθετικά ποσοστά κυμαίνονται από 5 % (4/73) έως 6 % (4/70) και τα ψευδοαρνητικά από 29 % (2/7) έως 33 % (3/9) (4).

48.

Ακόμη και εάν μια ελεγχόμενη ουσία δεν ταξινομηθεί ως διαβρωτικό ή ισχυρό ερεθιστικό των οφθαλμών, τα δεδομένα από την ICE μπορούν να χρησιμεύσουν, σε συνδυασμό με δεδομένα από την οφθαλμική δοκιμή in vivo σε κουνέλια ή από επαρκώς επικυρωμένη δοκιμή in vitro, στην περαιτέρω αξιολόγηση της σκοπιμότητας και των περιορισμών της μεθόδου δοκιμών ICE για τον χαρακτηρισμό μη ισχυρών ερεθιστικών και μη ερεθιστικών (καταρτίζεται έγγραφο καθοδήγησης σχετικά με τη χρήση μεθόδων δοκιμών οφθαλμικής τοξικότητας in vitro).

49.

Μια δοκιμή θεωρείται αποδεκτή εάν για τους παράλληλους αρνητικούς μάρτυρες ή μάρτυρες με φορέα/διαλύτη και τους παράλληλους θετικούς μάρτυρες προκύπτει ταξινόμηση ερεθιστικότητας που εμπίπτει στις κατηγορίες των μη ερεθιστικών και των ισχυρών ερεθιστικών/διαβρωτικών, αντιστοίχως.

50.

Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία, εφόσον αυτά έχουν σημασία για τη διενέργεια της μελέτης:

Ελεγχόμενες ουσίες και μάρτυρες

Πληροφορίες σχετικά με τον χορηγό και την εγκατάσταση δοκιμών

Αιτιολόγηση της μεθόδου και του πρωτοκόλλου δοκιμής που χρησιμοποιούνται

Ακεραιότητα της μεθόδου δοκιμής

διαδικασία που χρησιμοποιείται για τη διασφάλιση της ακεραιότητας (ορθότητα και αξιοπιστία) της μεθόδου δοκιμής με την πάροδο του χρόνου (π.χ. περιοδικές δοκιμές των ουσιών ελέγχου ικανότητας, χρήση ιστορικών δεδομένων για τους αρνητικούς και θετικούς μάρτυρες).

Κριτήρια αποδοχής της δοκιμής

εάν υπάρχει, το αποδεκτό εύρος τιμών για τους παράλληλους μάρτυρες συγκριτικής αξιολόγησης βάσει ιστορικών δεδομένων.

Συνθήκες δοκιμής

Αποτελέσματα

Συζήτηση των αποτελεσμάτων

Συμπέρασμα

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1272/2008 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 16ης Δεκεμβρίου 2008, για την ταξινόμηση, την επισήμανση και τη συσκευασία των ουσιών και των μειγμάτων, την τροποποίηση και την κατάργηση των οδηγιών 67/548/ΕΟΚ και 1999/45/ΕΚ και την τροποποίηση του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006. ΕΕ L 353 της 31.12.2008, σ. 1.

(3)

United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(6)

ΕΚ (2006). Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 18ης Δεκεμβρίου 2006 , για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών προϊόντων (REACH) και για την ίδρυση του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Χημικών Προϊόντων καθώς και για την τροποποίηση της οδηγίας 1999/45/ΕΚ και για την κατάργηση του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 793/93 του Συμβουλίου και του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1488/94 της Επιτροπής καθώς και της οδηγίας 76/769/ΕΟΚ του Συμβουλίου και των οδηγιών της Επιτροπής 91/155/ΕΟΚ, 93/67/ΕΟΚ, 93/105/ΕΚ και 2000/21/ΕΚ. ΕΕ L 396 της 30.12.2006, σ. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(17)

Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(19)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Διατίθεται στον δικτυακό τόπο:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]