1.3.2016   

EL

Επίσημη Εφημερίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης

L 54/1


ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΕ) 2016/266 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ

της 7ης Δεκεμβρίου 2015

για την τροποποίηση, με σκοπό την προσαρμογή του στην τεχνική πρόοδο, του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 440/2008 για καθορισμό των μεθόδων δοκιμής κατ' εφαρμογή του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών προϊόντων (REACH)

(Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)

Η ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ,

Έχοντας υπόψη τη Συνθήκη για τη λειτουργία της Ευρωπαϊκής Ένωσης,

Έχοντας υπόψη τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 18ης Δεκεμβρίου 2006, για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών προϊόντων (REACH) και για την ίδρυση του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Χημικών Προϊόντων καθώς και για την τροποποίηση της οδηγίας 1999/45/ΕΚ και για την κατάργηση του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 793/93 του Συμβουλίου και του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1488/94 της Επιτροπής καθώς και της οδηγίας 76/769/ΕΟΚ του Συμβουλίου και των οδηγιών της Επιτροπής 91/155/ΕΟΚ, 93/67/ΕΟΚ, 93/105/ΕΚ και 2000/21/ΕΚ (1), και ιδίως το άρθρο 13 παράγραφος 2,

Εκτιμώντας τα ακόλουθα:

(1)

Ο κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 440/2008 της Επιτροπής (2) περιλαμβάνει τις μεθόδους δοκιμών που πρέπει να εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό των φυσικοχημικών ιδιοτήτων, της τοξικότητας και της οικοτοξικότητας των χημικών προϊόντων στο πλαίσιο του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006.

(2)

Ο κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 440/2008 πρέπει να επικαιροποιηθεί για να συμπεριλάβει νέες και επικαιροποιημένες μεθόδους δοκιμών που εγκρίθηκαν πρόσφατα από τον ΟΟΣΑ, ούτως ώστε να ληφθεί υπόψη η τεχνική πρόοδος και να εξασφαλιστεί η μείωση του αριθμού των ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς σκοπούς, σύμφωνα με την οδηγία 2010/63/ΕΕ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου (3). Ζητήθηκε η γνώμη των ενδιαφερόμενων φορέων σχετικά με το παρόν σχέδιο.

(3)

Η προσαρμογή περιλαμβάνει είκοσι μεθόδους δοκιμών: μια νέα μέθοδο για τον προσδιορισμό μιας φυσικοχημικής ιδιότητας, έντεκα νέες μεθόδους δοκιμών και τρεις επικαιροποιημένες μεθόδους δοκιμών για την εκτίμηση της οικοτοξικότητας, καθώς και πέντε νέες μεθόδους δοκιμών για την εκτίμηση της πορείας και της συμπεριφοράς στο περιβάλλον.

(4)

Συνεπώς, ο κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 440/2008 θα πρέπει να τροποποιηθεί ανάλογα.

(5)

Τα μέτρα που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό είναι σύμφωνα με τη γνώμη της επιτροπής που έχει συσταθεί δυνάμει του άρθρου 133 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:

Άρθρο 1

Το παράρτημα του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 440/2008 τροποποιείται σύμφωνα με το παράρτημα του παρόντος κανονισμού.

Άρθρο 2

Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης.

Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.

Βρυξέλλες, 7 Δεκεμβρίου 2015.

Για την Επιτροπή

Ο Πρόεδρος

Jean-Claude JUNCKER


(1)  ΕΕ L 396 της 30.12.2006, σ. 1.

(2)  Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 440/2008 της Επιτροπής, της 30ής Μαΐου 2008, για τον καθορισμό των μεθόδων δοκιμής κατ' εφαρμογή του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών προϊόντων (REACH) (ΕΕ L 142 της 31.5.2008, σ. 1).

(3)  Οδηγία 2010/63/ΕΕ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 22ας Σεπτεμβρίου 2010, περί προστασίας των ζώων που χρησιμοποιούνται για επιστημονικούς σκοπούς (ΕΕ L 276 της 20.10.2010, σ. 33).


ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

Το παράρτημα του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 440/2008 τροποποιείται ως εξής:

1)

Στην αρχή του παραρτήματος, πριν από το μέρος Α, προστίθεται η εξής σημείωση:

«Σημείωση:

Προτού χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε από τις ακόλουθες μεθόδους δοκιμών για τη δοκιμασία μιας πολυσυστατικής ουσίας (MCS), μιας ουσίας άγνωστης ή ασταθούς σύνθεσης, ενός προϊόντος πολύπλοκης αντίδρασης ή βιολογικού υλικού (UVCB), ή μείγματος, και αν η εφαρμοσιμότητα της μεθόδου για τη δοκιμασία MCS, UVCB ή μειγμάτων δεν αναφέρεται στην αντίστοιχη μέθοδο δοκιμών, θα πρέπει να εξετάζεται κατά πόσον η μέθοδος ενδείκνυται για τον επιδιωκόμενο κανονιστικό σκοπό.

Αν η μέθοδος δοκιμών χρησιμοποιείται για τη δοκιμασία MCS, UVCB ή μείγματος, θα πρέπει να παρέχονται, στο μέτρο του δυνατού, επαρκείς πληροφορίες σχετικά με τη σύνθεσή του, π.χ. τη χημική ταυτότητα των συστατικών του, την ποσοτική τους εμφάνιση, καθώς και τις σχετικές ιδιότητες των συστατικών.»

2)

Προστίθεται το κεφάλαιο A.24:

«

A.24.   ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ (N-ΟΚΤΑΝΟΛΗ/ΝΕΡΟ), ΜΕΘΟΔΟΣ HPLC (ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ)

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 117 του ΟΟΣΑ (2004).

1.

Ως συντελεστής κατανομής (Ρ) ορίζεται ο λόγος των συγκεντρώσεων ισορροπίας μιας διαλυμένης ουσίας σε διφασικό σύστημα που αποτελείται από δύο σε μεγάλο βαθμό μη αναμείξιμους διαλύτες. Στην περίπτωση n-οκτανόλης και νερού,

Formula

Επειδή ο συντελεστής κατανομής είναι το πηλίκο δύο συγκεντρώσεων, είναι αδιάστατο μέγεθος και δίνεται συνήθως με τη μορφή του δεκαδικού λογαρίθμου του.

2.

Ο Pow συνιστά βασική παράμετρο στις μελέτες σχετικά με τη συμπεριφορά των χημικών ουσιών στο περιβάλλον. Έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει εξαιρετικά σημαντική σχέση μεταξύ του Pow ουσιών σε μη ιοντισμένη μορφή και της βιοσυσσώρευσής τους στα ψάρια. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι ο Pow συνιστά χρήσιμη παράμετρο για την πρόβλεψη της προσρόφησης στο έδαφος και τα ιζήματα, καθώς και για τον προσδιορισμό ποσοτικών σχέσεων δομής-δράσης για μεγάλο φάσμα βιολογικών επιδράσεων.

3.

Η αρχική πρόταση για τη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμών βασιζόταν σε άρθρο των C.V. Eadsforth και P. Moser (1). Η ανάπτυξη της μεθόδου δοκιμών και η διεργαστηριακή συγκριτική δοκιμή σε επίπεδο ΟΟΣΑ συντονίστηκαν από την Υπηρεσία Περιβάλλοντος (Umweltbundesamt) της Ομοσπονδιακής Δημοκρατίας της Γερμανίας κατά τη διάρκεια του 1986 (2).

ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ

4.

Οι τιμές του log Pow στην κλίμακα – 2 έως 4 (περιστασιακά έως 5 και άνω) (1) μπορούν να προσδιορίζονται πειραματικά με τη μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης (κεφάλαιο A.8 του παρόντος παραρτήματος, κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών 107 του ΟΟΣΑ). Η μέθοδος HPLC καλύπτει τις τιμές του log Pow στην κλίμακα από 0 έως 6 (1)(2)(3)(4)(5). Η συγκεκριμένη μέθοδος μπορεί να απαιτήσει εκτίμηση του Pow, ώστε να κατανεμηθούν οι κατάλληλες ουσίες αναφοράς και να υποστηριχθούν οποιαδήποτε συμπεράσματα αντλούνται από τα δεδομένα που προκύπτουν από τη δοκιμή. Οι μέθοδοι υπολογισμού εξετάζονται εν συντομία στο προσάρτημα της παρούσας μεθόδου δοκιμών. Ο τρόπος λειτουργίας της HPLC είναι ισοκρατικός.

5.

Οι τιμές του Pow εξαρτώνται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες, όπως τη θερμοκρασία, το pH, την ιοντική ισχύ κ.λπ., οι οποίες θα πρέπει να προσδιορίζονται στο πείραμα με σκοπό την ορθή ερμηνεία των δεδομένων Pow. Για τις ιοντιζόμενες ουσίες, μια άλλη μέθοδος [π.χ. σχέδιο κατευθυντήριας γραμμής του ΟΟΣΑ σχετικά με τη μέθοδο μέτρησης του pH για τις ιοντιζόμενες ουσίες (6)] θα μπορούσε να καταστεί διαθέσιμη και να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικά. Αν και το εν λόγω σχέδιο κατευθυντήριας γραμμής του ΟΟΣΑ μπορεί να ενδείκνυται για τον προσδιορισμό του Pow για τις συγκεκριμένες ιοντιζόμενες ουσίες, σε ορισμένες περιπτώσεις είναι καταλληλότερο να χρησιμοποιείται η μέθοδος HPLC σε περιβαλλοντικά σημαντικό pH (βλ. σημείο 9).

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

6.

Η HPLC αντίστροφης φάσης διεξάγεται σε αναλυτικές στήλες που φέρουν μια εμπορικά διαθέσιμη στερεά φάση με μακριές αλυσίδες υδρογονανθράκων (π.χ. C8, Cl8) χημικώς ενωμένες με διοξείδιο του πυριτίου.

7.

Η χημική ουσία που εγχέεται σε τέτοια στήλη διαχωρίζεται μεταξύ της κινητής φάσης του διαλύτη και της υδρογονανθρακικής στατικής φάσης, καθώς μετακινείται κατά μήκος της στήλης με τη βοήθεια της κινητής φάσης. Οι ουσίες συγκρατούνται ανάλογα με τον συντελεστή κατανομής τους σε υδρογονάνθρακα-νερό· οι υδρόφιλες ουσίες εκλούονται πρώτες και οι λιπόφιλες ουσίες τελευταίες. Ο χρόνος κατακράτησης βρίσκεται από τον παράγοντα χωρητικότητας k, που δίνεται από τον τύπο:

Formula

όπου tR είναι ο χρόνος κατακράτησης της υπό δοκιμή ουσίας, και t0 είναι ο νεκρός χρόνος, δηλ. ο μέσος χρόνος που χρειάζεται το μόριο ενός διαλύτη για να περάσει από τη στήλη. Δεν απαιτούνται ποσοτικές αναλυτικές μέθοδοι· μόνο ο προσδιορισμός των χρόνων κατακράτησης είναι αναγκαίος.

8.

Ο συντελεστής κατανομής της υπό δοκιμή ουσίας σε οκτανόλη/νερό μπορεί να υπολογιστεί εάν ο παράγοντας χωρητικότητάς της k προσδιοριστεί πειραματικά και, στη συνέχεια, προστεθεί στην ακόλουθη εξίσωση:

Formula

όπου

a, b

=

συντελεστές γραμμικής παλινδρόμησης.

Η ανωτέρω εξίσωση μπορεί να επιλυθεί με τη γραμμική παλινδρόμηση μεταξύ του λογαρίθμου των συντελεστών κατανομής των ουσιών αναφοράς σε οκτανόλη/νερό και του λογαρίθμου των παραγόντων χωρητικότητας των ουσιών αναφοράς.

9.

Η μέθοδος HPLC αντίστροφης φάσης καθιστά εφικτή την εκτίμηση των συντελεστών κατανομής των οποίων η τιμή του log Pow είναι στην περιοχή μεταξύ 0 και 6, αλλά, σε εξαιρετικές περιπτώσεις, μπορεί να επεκταθεί για να καλύπτει την τιμή του log Pow στην περιοχή μεταξύ 6 και 10. Αυτό μπορεί να απαιτήσει την τροποποίηση της κινητής φάσης (3). Η μέθοδος δεν έχει εφαρμογή σε ισχυρά οξέα και βάσεις, σε σύμπλοκα μετάλλων, σε ουσίες που αντιδρούν με το μέσο έκλουσης ή σε επιφανειοδραστικές ουσίες. Οι μετρήσεις μπορούν να διενεργούνται σε ιοντιζόμενες ουσίες στη μη ιοντισμένη μορφή τους (ελεύθερο οξύ ή ελεύθερη βάση) μόνο με τη χρησιμοποίηση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος με pH μικρότερο του pKa, για το ελεύθερο οξύ, ή μεγαλύτερο του pKa, για την ελεύθερη βάση. Εναλλακτικά, η πεχαμετρική μέθοδος για τη δοκιμή ιοντιζόμενων ουσιών (6) θα μπορούσε να καταστεί διαθέσιμη και να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτική μέθοδος (6). Εάν η τιμή του log Pow προσδιορίζεται με σκοπό τη χρήση στην ταξινόμηση ως προς την περιβαλλοντική επικινδυνότητα ή στην εκτίμηση των κινδύνων για το περιβάλλον, η δοκιμή θα πρέπει να διεξάγεται στην περιοχή pH που είναι σημαντική για το φυσικό περιβάλλον, δηλ. στην περιοχή pH 5,0 - 9.

10.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι προσμείξεις μπορεί να δυσχεράνουν την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, λόγω αβεβαιότητας ως προς την απόδοση των κορυφών. Στην περίπτωση μειγμάτων που έχουν ως αποτέλεσμα ανεπαρκώς διαχωρισμένες ζώνες, θα πρέπει να δηλώνονται το ανώτατο και το κατώτατο όριο του log Pow, καθώς και το επί τοις εκατό εμβαδόν κάθε κορυφής που αντιστοιχεί σε log Pow. Στην περίπτωση μειγμάτων που αποτελούνται από ομάδα ομόλογων ενώσεων, θα πρέπει επίσης να δηλώνεται η μεσοσταθμική τιμή του log Pow (7), η οποία πρέπει να υπολογίζεται με βάση τις μεμονωμένες τιμές Pow και τις τιμές του αντίστοιχου επί τοις εκατό εμβαδού (8). Όλες οι κορυφές που συμβάλλουν κατά 5 % ή περισσότερο στο ολικό εμβαδόν κορυφής θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά τον υπολογισμό (9):

Formula

Η μεσοσταθμική τιμή του log Pow είναι έγκυρη μόνο για ουσίες ή μείγματα (π.χ. ταλλέλαια) που αποτελούνται από ομόλογες ενώσεις (π.χ. σειρά αλκανίων). Είναι δυνατόν να πραγματοποιούνται μετρήσεις μειγμάτων με χρήσιμα αποτελέσματα, υπό την προϋπόθεση ότι ο αναλυτικός ανιχνευτής που θα χρησιμοποιείται θα έχει την ίδια ευαισθησία προς όλες τις ουσίες του μείγματος και θα μπορεί να τις διαχωρίζει επαρκώς.

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟ ΔΟΚΙΜΗ ΟΥΣΙΑ

11.

Η σταθερά διάστασης, ο συντακτικός τύπος και η διαλυτότητα στην κινητή φάση θα πρέπει να είναι γνωστά προτού χρησιμοποιηθεί η μέθοδος. Πληροφορίες σχετικά με την υδρόλυση θα ήταν επίσης χρήσιμες.

ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ

12.

Για να αυξηθεί η αξιοπιστία της μέτρησης, πρέπει να εκτελούνται επαναληπτικοί προσδιορισμοί.

Επαναληψιμότητα: Οι τιμές του log Pow που προκύπτουν από επαναλαμβανόμενες μετρήσεις οι οποίες διενεργήθηκαν υπό πανομοιότυπες συνθήκες και κατά τις οποίες χρησιμοποιήθηκε το ίδιο σύνολο ουσιών αναφοράς θα πρέπει να μη διαφέρουν περισσότερο από ± 0,1 λογαριθμικές μονάδες.

Αναπαραγωγιμότητα: Εάν οι μετρήσεις επαναλαμβάνονται με διαφορετικό σύνολο ουσιών αναφοράς, τα αποτελέσματα μπορεί να είναι διαφορετικά. Κατά κανόνα, ο συντελεστής συσχέτισης R όσον αφορά τη σχέση μεταξύ του log k και του log Pow για μια ομάδα εξεταζόμενων ουσιών είναι περίπου 0,9, τιμή που αντιστοιχεί σε συντελεστή κατανομής σε οκτανόλη/νερό του log Pow ± 0,5 λογαριθμικές μονάδες.

13.

Η διεργαστηριακή συγκριτική δοκιμή απέδειξε ότι, με τη μέθοδο HPLC, οι τιμές του log Pow μπορούν να ληφθούν με απόκλιση ± 0,5 μονάδων από τις τιμές της μεθόδου της ανακινούμενης φιάλης (2). Στη βιβλιογραφία βρίσκονται και άλλες συγκρίσεις (4)(5)(10)(11)(12). Τα γραφήματα συσχέτισης που βασίζονται σε δομικά συγγενείς ουσίες αναφοράς παρέχουν τα ακριβέστερα αποτελέσματα (13).

ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ

14.

Για να υπάρξει συσχέτιση του μετρούμενου παράγοντα χωρητικότητας k μιας ουσίας με τον Pow της εν λόγω ουσίας, πρέπει να καταρτιστεί καμπύλη βαθμονόμησης που να χρησιμοποιεί τουλάχιστον 6 σημεία (βλ. σημείο 24). Η επιλογή των κατάλληλων ουσιών αναφοράς εναπόκειται στον χρήστη. Κανονικά, οι ουσίες αναφοράς θα πρέπει να έχουν τιμές log Pow οι οποίες να περικλείουν τον log Pow της υπό δοκιμή ουσίας, δηλ. τουλάχιστον μία ουσία αναφοράς θα πρέπει να έχει Pow υψηλότερο από τον αντίστοιχο της υπό δοκιμή ουσίας, και μία άλλη ουσία θα πρέπει να έχει Pow χαμηλότερο από τον αντίστοιχο της υπό δοκιμή ουσίας. Η προεκβολή θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο σε εξαιρετικές περιπτώσεις. Είναι προτιμότερο αυτές οι ουσίες αναφοράς να είναι δομικά συγγενείς με την υπό δοκιμή ουσία. Οι τιμές του log Pow των ουσιών αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν για τη βαθμονόμηση θα πρέπει να βασίζονται σε αξιόπιστα πειραματικά δεδομένα. Ωστόσο, για ουσίες με υψηλό log Pow (κατά κανόνα, πάνω από 4) μπορούν να χρησιμοποιούνται οι υπολογισθείσες τιμές, εκτός εάν υπάρχουν διαθέσιμα αξιόπιστα πειραματικά δεδομένα. Εάν χρησιμοποιούνται τιμές προεκβολής, θα πρέπει να καθορίζεται οριακή τιμή.

15.

Για πολλές ομάδες χημικών ουσιών υπάρχουν εκτεταμένοι πίνακες τιμών του log Pow (14)(15). Εάν δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία για τους συντελεστές κατανομής δομικά συγγενικών ουσιών, μπορεί να χρησιμοποιηθεί γενικότερη βαθμονόμηση, η οποία να καθορίζεται με βάση άλλες ουσίες αναφοράς. Οι συνιστώμενες ουσίες αναφοράς και οι τιμές Pow τους παρατίθενται στον πίνακα 1. Για τις ιοντιζόμενες ουσίες, οι παρεχόμενες τιμές ισχύουν για τη μη ιοντισμένη μορφή. Η εφικτότητα και η ποιότητα των τιμών ελέγχθηκαν κατά τη διεργαστηριακή συγκριτική δοκιμή.

Πίνακας 1

Συνιστώμενες ουσίες αναφοράς

 

Aριθμός CAS

Ουσία αναφοράς

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-βουτανόνη

(Μεθυλαιθυλκετόνη)

0,3

 

2

1122-54-9

4-ακετυλοπυριδίνη

0,5

 

3

62-53-3

Ανιλίνη

0,9

 

4

103-84-4

Ακετανιλίδιο

1,0

 

5

100-51-6

Βενζυλική αλκοόλη

1,1

 

6

150-76-5

4-μεθοξυφαινόλη

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Φαινοξυοξικό οξύ

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Φαινόλη

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-δινιτροφαινόλη

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Βενζονιτρίλιο

1,6

 

11

140-29-4

Φαινυλακετονιτρίλιο

1,6

 

12

589-18-4

4-μεθυλοβενζυλική αλκοόλη

1,6

 

13

98-86-2

Ακετοφαινόνη

1,7

 

14

88-75-5

2-νιτροφαινόλη

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-νιτροβενζοϊκό οξύ

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-χλωρανιλίνη

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Νιτροβενζόλιο

1,9

 

18

104-54-1

Κινναμυλαλκοόλη

(Κινναμωμική αλκοόλη)

1,9

 

19

65-85-0

Βενζοϊκό οξύ

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

π-κρεσόλη

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Κινναμωμικό οξύ

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Ανισόλη

2,1

 

23

93-58-3

Βενζοϊκό μεθύλιο

2,1

 

24

71-43-2

Βενζόλιο

2,1

 

25

99-04-7

3-μεθυλοβενζοϊκό οξύ

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-χλωροφαινόλη

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Τριχλωροαιθυλένιο

2,4

 

28

1912-24-9

Ατραζίνη

2,6

 

29

93-89-0

Βενζοϊκό αιθύλιο

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-διχλωροβενζονιτρίλιο

2,6

 

31

535-80-8

3-χλωροβενζοϊκό οξύ

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Τολουόλιο

2,7

 

33

90-15-3

1-ναφθόλη

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-διχλωροανιλίνη

2,8

 

35

108-90-7

Χλωροβενζόλιο

2,8

 

36

1746-13-0

Αλλυλοφαινυλαιθέρας

2,9

 

37

108-86-1

Βρωμοβενζόλιο

3,0

 

38

100-41-4

Αιθυλοβενζόλιο

3,2

 

39

119-61-9

Βενζοφαινόνη

3,2

 

40

92-69-3

4-φαινυλοφαινόλη

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Θυμόλη

3,3

 

42

106-46-7

1,4-διχλωροβενζόλιο

3,4

 

43

122-39-4

Διφαινυλαμίνη

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Ναφθαλίνη

3,6

 

45

93-99-2

Βενζοϊκό φαινύλιο

3,6

 

46

98-82-8

Ισοπροπυλοβενζόλιο

3,7

 

47

88-06-2

2,4-6-τριχλωροφαινόλη

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Διφαινύλιο

4,0

 

49

120-51-4

Βενζοϊκό βενζύλιο

4,0

 

50

88-85-7

2,4-δινιτρο-6-sec-βουτυλοφαινόλη

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-τριχλωροβενζόλιο

4,2

 

52

143-07-7

Δωδεκανοϊκό οξύ

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Διφαινυλαιθέρας

4,2

 

54

85-01-8

Φαινανθρένιο

4,5

 

55

104-51-8

n-βουτυλοβενζόλιο

4,6

 

56

103-29-7

Διβενζύλιο

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-διφαινυλοπυριδίνη

4,9

 

58

206-44-0

Φλουορανθένιο

5,1

 

59

603-34-9

Τριφαινυλαμίνη

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής

16.

Εάν κρίνεται αναγκαίο, η εκτίμηση του συντελεστή κατανομής μπορεί να επιτυγχάνεται, κατά προτίμηση, με τη χρήση μεθόδου υπολογισμού (βλ. προσάρτημα) ή, όπου ενδείκνυται, με την εφαρμογή του λόγου της διαλυτότητας της υπό δοκιμή ουσίας στους καθαρούς διαλύτες.

Εργαστηριακός εξοπλισμός

17.

Απαιτείται υγροχρωματογράφος, ο οποίος να διαθέτει αντλία χαμηλών παλμών και κατάλληλο σύστημα ανίχνευσης. Σε ευρύ φάσμα χημικών ομάδων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ανιχνευτής UV, με μήκος κύματος 210 nm, ή ανιχνευτής RI. Η παρουσία πολικών ομάδων στη στατική φάση μπορεί να επηρεάσει σοβαρά την απόδοση της στήλης HPLC. Κατά συνέπεια, οι στατικές φάσεις θα πρέπει να έχουν το ελάχιστο δυνατό ποσοστό πολικών ομάδων (16). Μπορούν να χρησιμοποιούνται εμπορικά διαθέσιμα μικροσωματιδιακά υλικά πλήρωσης στηλών χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης ή έτοιμες γεμισμένες στήλες. Μεταξύ του συστήματος έγχυσης και της αναλυτικής στήλης μπορεί να τοποθετείται προστήλη.

Κινητή φάση

18.

Για την παρασκευή του διαλύτη έκλουσης ο οποίος απαεριώνεται πριν από τη χρήση, χρησιμοποιούνται μεθανόλη και απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό ποιότητας HPLC. Θα πρέπει να γίνεται χρήση ισοκρατικής έκλουσης. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται αναλογίες μεθανόλης/νερού με ελάχιστη περιεκτικότητα σε νερό 25 %. Κατά κανόνα, μείγμα 3:1 (v/v) μεθανόλης-νερού είναι ικανοποιητικό για την έκλουση ουσιών με log Ρ 6 εντός μίας ώρας, με ταχύτητα ροής 1 ml/λεπτό. Για ουσίες με log Ρ άνω του 6 μπορεί να είναι αναγκαίο να μειωθεί ο χρόνος έκλουσής τους (όπως και των ουσιών αναφοράς) με μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης ή του μήκους της στήλης.

19.

Η υπό δοκιμή ουσία και οι ουσίες αναφοράς πρέπει να είναι διαλυτές στην κινητή φάση, σε συγκέντρωση επαρκή ώστε να είναι εφικτή η ανίχνευσή τους. Με το μείγμα μεθανόλης-νερού μπορούν να χρησιμοποιηθούν πρόσθετα μόνο σε εξαιρετικές περιπτώσεις, αφού αυτά μεταβάλλουν τις ιδιότητες της στήλης. Σε αυτές τις περιπτώσεις πρέπει να επιβεβαιώνεται ότι ο χρόνος κατακράτησης της υπό δοκιμή ουσίας και των ουσιών αναφοράς δεν επηρεάζεται. Εάν το μείγμα μεθανόλης-νερού δεν είναι το ενδεδειγμένο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλα μείγματα οργανικών διαλυτών-νερού, π.χ. αιθανόλης-νερού, ακετονιτριλίου-νερού ή ισοπροπυλικής αλκοόλης (2-προπανόλης)-νερού.

20.

Το pH του μέσου έκλουσης είναι κρίσιμος παράγοντας για τις ιοντιζόμενες ουσίες. Θα πρέπει να είναι μέσα στην περιοχή του pH λειτουργίας της στήλης, συνήθως μεταξύ 2 και 8. Συνιστάται η χρήση ρυθμιστικού διαλύματος. Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η καθίζηση αλάτων και η φθορά της στήλης, κάτι που συμβαίνει με ορισμένα μείγματα οργανικής φάσης-ρυθμιστικού διαλύματος. Κατά κανόνα, δεν συνιστώνται οι μετρήσεις HPLC με στατικές φάσεις που έχουν ως βάση το οξείδιο του πυριτίου για pH πάνω από 8, δεδομένου ότι η χρήση αλκαλικής κινητής φάσης μπορεί να προκαλέσει ταχεία ελάττωση της απόδοσης της στήλης.

Διαλυμένες ουσίες

21.

Η υπό δοκιμή ουσία και οι ουσίες αναφοράς πρέπει να είναι επαρκώς καθαρές, ώστε να αποδίδονται οι κορυφές των χρωματογραφημάτων στις αντίστοιχες ουσίες. Εάν είναι δυνατόν, οι ουσίες που χρησιμοποιούνται για τους σκοπούς της δοκιμής ή της βαθμονόμησης διαλύονται στην κινητή φάση. Εάν για τη διάλυση της υπό δοκιμή ουσίας και της ουσίας αναφοράς χρησιμοποιείται διαλύτης άλλος από την κινητή φάση, η κινητή φάση θα πρέπει να χρησιμοποιείται για την τελική αραίωση πριν από την έγχυση.

Συνθήκες της δοκιμής

22.

Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια των μετρήσεων δεν θα πρέπει να διαφέρει περισσότερο από ± 1 °C.

Προσδιορισμός του νεκρού χρόνου to

23.

Ο νεκρός χρόνος t0 μπορεί να μετρηθεί με τη χρήση μη κατακρατούμενων οργανικών ουσιών (π.χ. θειουρίας ή φορμαμιδίου). Ακριβέστερος νεκρός χρόνος μπορεί να προσδιοριστεί από τους χρόνους κατακράτησης που μετρήθηκαν ή από ομάδα περίπου επτά μελών ομόλογης σειράς (π.χ. n-αλκυλο μεθυλο κετόνες) (17). Οι χρόνοι κατακράτησης tR (nC + 1) παριστώνται γραφικά σε συνάρτηση με τον tR (nC), όπου nC είναι ο αριθμός των ατόμων άνθρακα. Λαμβάνεται ευθεία γραμμή, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, όπου το A, που αντιπροσωπεύει τον λόγο k(nC + 1)/k(nC), είναι σταθερό. Ο νεκρός χρόνος t0 λαμβάνεται από το σημείο τομής (1 – A)t0 και την κλίση A.

Εξίσωση παλινδρόμησης

24.

Το επόμενο βήμα είναι να αποτυπωθεί η συσχέτιση του log k σε συνάρτηση με τον log Ρ για τις κατάλληλες ουσίες αναφοράς, όπου οι τιμές του log P προσεγγίζουν την τιμή που αναμένεται για την υπό δοκιμή ουσία. Στην πράξη, εγχέονται ταυτόχρονα 6 έως 10 ουσίες αναφοράς. Οι χρόνοι κατακράτησης προσδιορίζονται, κατά προτίμηση σε ολοκληρωτή καταγραφής συνδεδεμένο με το σύστημα ανίχνευσης. Οι αντίστοιχοι λογάριθμοι των παραγόντων χωρητικότητας, log k, σχεδιάζονται ως συνάρτηση του log P. Η εξίσωση παλινδρόμησης εκτελείται σε τακτά χρονικά διαστήματα, τουλάχιστον μία φορά την ημέρα, ώστε να λαμβάνονται υπόψη οι πιθανές μεταβολές στην απόδοση της στήλης.

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ POW ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗΣ ΟΥΣΙΑΣ

25.

Η υπό δοκιμή ουσία εγχέεται στις μικρότερες ανιχνεύσιμες ποσότητες. Ο χρόνος κατακράτησης προσδιορίζεται δύο φορές. Ο συντελεστής κατανομής της υπό δοκιμή ουσίας λαμβάνεται με παρεμβολή του υπολογιζόμενου παράγοντα χωρητικότητας στην καμπύλη βαθμονόμησης. Για πολύ χαμηλούς και πολύ υψηλούς συντελεστές κατανομής είναι αναγκαία η προεκβολή. Ειδικά σε αυτές τις περιπτώσεις, πρέπει να δίνεται προσοχή στα όρια εμπιστοσύνης της γραμμής παλινδρόμησης. Εάν ο χρόνος κατακράτησης του δείγματος βρίσκεται έξω από την περιοχή των χρόνων κατακράτησης που λαμβάνονται για τα πρότυπα, θα πρέπει να δηλώνεται οριακή τιμή.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ

Έκθεση δοκιμής

26.

Στην έκθεση πρέπει να περιλαμβάνονται τα ακόλουθα στοιχεία:

εάν καθορίζονται, η προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής, οι εκτιμώμενες τιμές και η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε· και εάν εφαρμόστηκε μέθοδος υπολογισμού, η πλήρης περιγραφή της, όπως αναγνώριση της βάσης δεδομένων και λεπτομερή στοιχεία σχετικά με την επιλογή τμημάτων·

υπό δοκιμή ουσίες και ουσίες αναφοράς: καθαρότητα, συντακτικός τύπος και αριθμός CAS·

περιγραφή του εξοπλισμού και των συνθηκών λειτουργίας: αναλυτική στήλη, προστήλη·

κινητή φάση, μέσα ανίχνευσης, περιοχή θερμοκρασιών, pH·

προφίλ έκλουσης (χρωματογραφήματα)·

νεκρός χρόνος και τρόπος μέτρησής του·

στοιχεία κατακράτησης και βιβλιογραφικές τιμές log Pow για τις ουσίες αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν στη βαθμονόμηση·

λεπτομερή στοιχεία για τη προσαρμοσμένη γραμμή παλινδρόμησης (log k σε συνάρτηση με τον log Pow) και τον συντελεστή συσχέτισης της γραμμής συμπεριλαμβανομένων των διαστημάτων εμπιστοσύνης·

δεδομένα μέσης κατακράτησης και παρεμβλημένη τιμή log Pow για την εξεταζόμενη ουσία·

στην περίπτωση μείγματος: χρωματογράφημα του προφίλ έκλουσης με επισήμανση των τιμών αποκοπής·

τιμές log Pow σχετικές με το επί τοις εκατό εμβαδόν της κορυφής του log Pow·

υπολογισμός με τη βοήθεια γραμμής παλινδρόμησης·

υπολογισθείσες μεσοσταθμικές τιμές log Pow, κατά περίπτωση.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals — Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, Νοέμβριος 2000.

(7)

OSPAR (1995). “Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995”, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Παράρτημα 10, Oviedo, 20–24 Φεβρουαρίου 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3 Αυγούστου.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, σ. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, Νέα Υόρκη.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Προσάρτημα

Μέθοδοί υπολογισμού του POW

Εισαγωγή

1.

Το παρόν προσάρτημα παρέχει σύντομη εισαγωγή στον υπολογισμό του Pow. Για περισσότερες πληροφορίες, συμβουλευθείτε τα εγχειρίδια (1)(2).

2.

Οι υπολογισθείσες τιμές του Pow χρησιμοποιούνται με σκοπό:

να αποφασιστεί η πειραματική μέθοδος που θα χρησιμοποιηθεί: η μέθοδος της ανακινούμενης φιάλης, για log Pow μεταξύ – 2 και 4, και η μέθοδος HPLC, για log Pow μεταξύ 0 και 6·

να επιλεγούν οι συνθήκες που θα εφαρμοστούν στη μέθοδο HPLC (ουσίες αναφοράς, αναλογία μεθανόλης-νερού)·

να ελεγχθεί η αξιοπιστία των τιμών που λαμβάνονται με τις πειραματικές μεθόδους·

να δοθεί εκτιμώμενη τιμή σε περίπτωση που δεν μπορούν να εφαρμοστούν πειραματικές μέθοδοι.

Αρχή των μεθόδων υπολογισμού

3.

Οι μέθοδοι υπολογισμού που προτείνονται στην παρούσα ενότητα βασίζονται στη θεωρητική κατάτμηση του μορίου σε κατάλληλα τμήματα για τα οποία υπάρχουν γνωστές αξιόπιστες αυξήσεις του log Pow · Ο log Pow προκύπτει από την άθροιση των τμηματικών τιμών και των διορθωτικών όρων για ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις. Υπάρχουν πίνακες σταθερών και διορθωτικών όρων για τα τμήματα (1)(2)(3)(4)(5)(6). Ορισμένοι ενημερώνονται τακτικά (3).

Αξιοπιστία των υπολογισθεισών τιμών

4.

Κατά κανόνα, η αξιοπιστία των μεθόδων υπολογισμού μειώνεται όσο αυξάνει η πολυπλοκότητα της υπό μελέτη ουσίας. Στην περίπτωση απλών μορίων με μικρό μοριακό βάρος και με μία ή δύο λειτουργικές ομάδες, μπορεί να αναμένεται απόκλιση 0,1 έως 0,3 μονάδων του log Pow μεταξύ των αποτελεσμάτων των διαφόρων μεθόδων κατάτμησης και των μετρούμενων τιμών. Το περιθώριο σφάλματος θα εξαρτηθεί από την αξιοπιστία των σταθερών των τμημάτων που χρησιμοποιούνται, την ικανότητα αναγνώρισης των ενδομοριακών αλληλεπιδράσεων (π..χ. των δεσμών υδρογόνου) και την ορθή χρήση των διορθωτικών όρων. Στην περίπτωση ιοντιζόμενων ουσιών, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη το φορτίο και ο βαθμός ιοντισμού (10).

Η μέθοδος π των Fujita και Hansch

5.

Η σταθερά υδρόφοβου υποκαταστάτη, π, η οποία εισήχθη αρχικά από τους Fujita et al. (7), ορίζεται ως εξής:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

όπου PhX είναι αρωματικό παράγωγο και PhH η μητρική ουσία.

π.χ.

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

Η μέθοδος π είναι πρωτίστως σημαντική για τις αρωματικές ουσίες. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν οι τιμές π για μεγάλο αριθμό υποκαταστατών (4)(5).

Μέθοδος Rekker

6.

Με τη μέθοδο Rekker (8), η τιμή log Pow υπολογίζεται ως εξής:

Formula

όπου το ai δηλώνει πόσες φορές ένα συγκεκριμένο τμήμα εμφανίζεται στο μόριο, και το fi δηλώνει την αύξηση του log Pow του τμήματος. Οι όροι αλληλεπίδρασης μπορούν να εκφραστούν ως ακέραιο πολλαπλάσιο μίας και μόνης σταθεράς Cm (που καλείται “μαγική σταθερά”). Οι σταθερές fi και Cm του τμήματος έχουν προσδιοριστεί από κατάλογο 1 054 πειραματικών τιμών Pow 825 ουσιών μέσω ανάλυσης πολλαπλής παλινδρόμησης (6)(8). Ο προσδιορισμός των όρων αλληλεπίδρασης διενεργείται σύμφωνα με ένα σύνολο κανόνων (6)(8)(9).

Μέθοδος Hansch και Leo

7.

Με τη μέθοδο Hansch και Leo (4), η τιμή log Pow υπολογίζεται ως εξής:

Formula

όπου fi είναι μια σταθερά τμήματος, Fj ένας διορθωτικός όρος (παράγοντας), ai και bj η αντίστοιχη συχνότητα εμφάνισης. Με βάση πειραματικές τιμές Pow προσδιορίστηκαν εμπειρικά ένας κατάλογος ατομικών και ομαδικών τιμών τμημάτων και ένας κατάλογος διορθωτικών όρων Fj. Οι διορθωτικοί όροι χωρίστηκαν σε πολλές διαφορετικές κατηγορίες (1)(4). Αναπτύχθηκαν πακέτα λογισμικού, ώστε να ληφθούν υπόψη όλοι οι κανόνες και οι διορθωτικοί όροι (3).

ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗ ΜΕΘΟΔΟΣ

8.

Ο υπολογισμός του log Pow πολύπλοκων μορίων μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά, εάν το μόριο χωριστεί σε μεγαλύτερα τμήματα για τα οποία υπάρχουν αξιόπιστες τιμές log Pow, είτε από πίνακες (3)(4) είτε από υφιστάμενες μετρήσεις. Τα τμήματα αυτά (π.χ. ετεροκυκλικοί δακτύλιοι, ανθρακινόνη, αζωβενζόλιο) μπορούν να συνδυαστούν στη συνέχεια με τις τιμές π της μεθόδου Hansch ή με τις σταθερές τμημάτων της μεθόδου Rekker ή της μεθόδου Leo.

Παρατηρήσεις

i)

Οι μέθοδοι υπολογισμού εφαρμόζονται μόνο σε μερικώς ή πλήρως ιοντιζόμενες ουσίες, όταν λαμβάνονται υπόψη οι αναγκαίοι διορθωτικοί παράγοντες.

ii)

Εάν μπορεί να υποτεθεί η ύπαρξη ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου, πρέπει να προστεθούν οι αντίστοιχοι διορθωτικοί όροι (περίπου +0,6 έως +1,0 μονάδες του log Pow). Ενδείξεις για την παρουσία τέτοιων δεσμών μπορούν να ληφθούν από στερεοχημικά μοντέλα ή φασματοσκοπικά δεδομένα.

iii)

Εάν υπάρχει πιθανότητα περισσότερων από μίας ταυτομερών μορφών, ως βάση του υπολογισμού θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί η πιο πιθανή μορφή.

iv)

Οι αναθεωρήσεις των καταλόγων με τις σταθερές τμημάτων θα πρέπει να ακολουθούνται προσεκτικά.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ

(1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, Νέα Υόρκη (1982).

(2)

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (Νέα Υόρκη) και Οξφόρδη (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, Νέα Υόρκη (1979).

(5)

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, Νέα Υόρκη (1977).

(9)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R.A. Scherrer. ACS — Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

»

3)

Το κεφάλαιο Γ.3 αντικαθίσταται από το εξής κείμενο:

«

Γ.3.   ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΕ ΦΥΚΗ (ΑΛΓΕΣ) ΚΑΙ ΚΥΑΝΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΑ ΤΩΝ ΓΛΥΚΩΝ ΥΔΑΤΩΝ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 201 του ΟΟΣΑ (2006· το παράρτημα διορθώθηκε το 2011). Διαπιστώθηκε ότι η μέθοδος δοκιμών έπρεπε να επεκταθεί, ώστε να συμπεριληφθούν πρόσθετα είδη οργανισμών, και να επικαιροποιηθεί, ώστε να καλυφθούν οι απαιτήσεις που αφορούν την εκτίμηση επικινδυνότητας και την ταξινόμηση των χημικών ουσιών. Η αναθεώρηση αυτή ολοκληρώθηκε με βάση τη μεγάλη πρακτική πείρα, την επιστημονική πρόοδο όσον αφορά τις μελέτες τοξικότητας σε φύκη και την ευρεία κανονιστική χρήση στο διάστημα που μεσολάβησε από την πρώτη έγκριση της μεθόδου.

2.

Οι ορισμοί που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στο προσάρτημα 1.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

3.

Σκοπός της παρούσας δοκιμής είναι να προσδιοριστούν οι επιδράσεις μιας χημικής ουσίας στην ανάπτυξη μικροφυκών (μικροαλγών) και/ή κυανοβακτηριδίων των γλυκών υδάτων. Οργανισμοί δοκιμής που βρίσκονται στην εκθετική φάση ανάπτυξης εκτίθενται στην υπό δοκιμή χημική ουσία σε ασυνεχείς καλλιέργειες κατά κανόνα για χρονικό διάστημα 72 ωρών. Παρά τη σχετικά μικρή διάρκεια της δοκιμής, είναι δυνατόν να εκτιμηθούν οι επιδράσεις σε πολλές γενεές.

4.

Η απόκριση του συστήματος είναι η μείωση της ανάπτυξης σε μια σειρά καλλιεργειών φυκών (μονάδες δοκιμής) που εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Η απόκριση αξιολογείται σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση έκθεσης, σε σύγκριση με τη μέση ανάπτυξη ταυτόσημων καλλιεργειών ελέγχου που δεν έχουν εκτεθεί στην ουσία. Για την πλήρη έκφραση της απόκρισης του συστήματος στις τοξικές επιδράσεις (βέλτιστη ευαισθησία), οι καλλιέργειες αφήνονται να αναπτυχθούν εκθετικά χωρίς περιορισμούς, σε συνθήκες επάρκειας θρεπτικών στοιχείων και συνεχούς φωτισμού, για επαρκές χρονικό διάστημα, ώστε να μετρηθεί η μείωση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης.

5.

Η ανάπτυξη και η αναστολή της ανάπτυξης προσδιορίζονται ποσοτικά με μετρήσεις της βιομάζας φυκών σε συνάρτηση με τον χρόνο. Η βιομάζα φυκών ορίζεται ως το ξηρό βάρος ανά μονάδα όγκου, π.χ. mg φυκών/λίτρο διαλύματος δοκιμής. Ωστόσο, είναι δύσκολο να μετρηθεί το ξηρό βάρος και, για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιούνται παράμετροι υποκατάστασης. Από αυτές τις παραμέτρους, χρησιμοποιείται συχνότερα ο αριθμός κυττάρων. Άλλες παράμετροι που χρησιμοποιούνται ως υποκατάστατα είναι ο κυτταρικός όγκος, ο φθορισμός, η οπτική πυκνότητα κ.λπ. Θα πρέπει να είναι γνωστός ο συντελεστής μετατροπής της μετρούμενης παραμέτρου υποκατάστασης σε βιομάζα.

6.

Το τελικό σημείο της δοκιμής είναι η αναστολή της ανάπτυξης, εκφραζόμενη ως η λογαριθμική αύξηση της βιομάζας (μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης) στη διάρκεια της περιόδου έκθεσης. Από τους μέσους ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης που καταγράφονται για μια σειρά διαλυμάτων δοκιμής, προσδιορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης κατά συγκεκριμένο ποσοστό x % (π.χ. 50 %) και εκφράζεται ως ErCx (π.χ. ErC50).

7.

Μία επιπλέον μεταβλητή απόκρισης που χρησιμοποιείται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών είναι η απόδοση, η οποία ενδέχεται να απαιτείται για τη συμμόρφωση με ειδικές κανονιστικές απαιτήσεις σε ορισμένες χώρες. Η απόδοση ορίζεται ως η βιομάζα στο τέλος της περιόδου έκθεσης μείον τη βιομάζα στην αρχή της περιόδου έκθεσης. Από την απόδοση που καταγράφεται για μια σειρά διαλυμάτων δοκιμής, προσδιορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί αναστολή της απόδοσης κατά συγκεκριμένο ποσοστό x % (π.χ. 50 %) και εκφράζεται ως EyCx (π.χ. EyC50).

8.

Επιπροσθέτως, μπορούν να προσδιοριστούν στατιστικά η κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης (LOEC) και η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC).

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟ ΔΟΚΙΜΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ

9.

Στις σχετικές με την υπό δοκιμή χημική ουσία πληροφορίες που μπορεί να είναι χρήσιμες για τον καθορισμό των συνθηκών δοκιμής περιλαμβάνονται ο συντακτικός τύπος, ο βαθμός καθαρότητας, η σταθερότητα στο φως, η σταθερότητα στις συνθήκες της δοκιμής, οι ιδιότητες απορρόφησης του φωτός, η σταθερά pKa και τα αποτελέσματα των μελετών μετατροπής, συμπεριλαμβανομένης της βιοαποικοδομησιμότητας στο νερό.

10.

Η υδατοδιαλυτότητα, ο συντελεστής κατανομής σε μείγμα οκτανόλης-νερού (Pow) και η τάση ατμών της υπό δοκιμή χημικής ουσίας θα πρέπει να είναι γνωστά και θα πρέπει να υπάρχει επικυρωμένη μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό της χημικής ουσίας στα διαλύματα δοκιμής, μέθοδος της οποίας η απόδοση ανάκτησης και το όριο ανίχνευσης θα πρέπει να αναφέρονται στην έκθεση.

ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

11.

Για να είναι έγκυρη η δοκιμή, πρέπει να πληρούνται τα ακόλουθα κριτήρια επιδόσεων:

Η βιομάζα στις καλλιέργειες ελέγχου θα πρέπει να έχει αυξηθεί εκθετικά με συντελεστή τουλάχιστον 16 εντός των 72 ωρών που διαρκεί η δοκιμή. Αυτό αντιστοιχεί σε ειδικό ρυθμό ανάπτυξης 0,92 ημέρα– 1. Ο ρυθμός ανάπτυξης των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων ειδών είναι συνήθως σημαντικά υψηλότερος (βλ. προσάρτημα 2). Το κριτήριο αυτό μπορεί να μην πληρούται όταν χρησιμοποιούνται είδη βραδύτερης ανάπτυξης από εκείνα που παρατίθενται στο προσάρτημα 2. Στην περίπτωση αυτή, η διάρκεια της δοκιμής πρέπει να παρατείνεται μέχρι να επιτευχθεί τουλάχιστον δεκαεξαπλάσια αύξηση στις καλλιέργειες ελέγχου, ενώ η ανάπτυξη πρέπει να είναι εκθετική σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Η διάρκεια της δοκιμής είναι δυνατόν να συντομευθεί σε τουλάχιστον 48 ώρες, ώστε να διατηρηθεί η απεριόριστη εκθετική ανάπτυξη κατά τη δοκιμή, προκειμένου να επιτευχθεί ο ελάχιστος πολλαπλασιαστής 16.

Ο μέσος συντελεστής μεταβολής για τους τμηματικούς ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης (ημέρες 0-1, 1-2 και 2-3, στην περίπτωση της δοκιμής 72 ωρών) των καλλιεργειών ελέγχου (βλ. προσάρτημα 1, σημείο “Συντελεστής μεταβολής”) δεν πρέπει να υπερβαίνει το 35 %. Ο υπολογισμός του τμηματικού ειδικού ρυθμού ανάπτυξης περιγράφεται στο σημείο 49. Το κριτήριο αυτό εφαρμόζεται στη μέση τιμή των συντελεστών μεταβολής που υπολογίζεται για τις ταυτόσημες καλλιέργειες ελέγχου.

Στις δοκιμές σε Pseudokirchneriella subcapitata και Desmodesmus subspicatus, ο συντελεστής μεταβολής των μέσων ειδικών ρυθμών ανάπτυξης ταυτόσημων καλλιεργειών ελέγχου σε όλη την περίοδο δοκιμής δεν πρέπει να υπερβαίνει το 7 %. Για άλλα είδη που χρησιμοποιούνται σπανιότερα στις δοκιμές, η αντίστοιχη τιμή δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10 %.

ΧΗΜΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ

12.

Είναι δυνατόν να υποβληθούν σε δοκιμή μία ή περισσότερες ουσίες αναφοράς, όπως η 3,5-διχλωροφαινόλη που χρησιμοποιήθηκε στη διεθνή δοκιμή δακτυλίου (ring test) (1), προκειμένου να ελεγχθεί η διαδικασία δοκιμής. Το διχρωμικό κάλιο μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως χημική ουσία αναφοράς για τα πράσινα φύκη. Είναι επιθυμητή η υποβολή της χημικής ουσίας αναφοράς σε δοκιμή τουλάχιστον ανά εξάμηνο.

ΕΦΑΡΜΟΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

13.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών εφαρμόζεται με τη μεγαλύτερη ευχέρεια σε υδατοδιαλυτές ουσίες, οι οποίες είναι πιθανόν να παραμείνουν στο νερό υπό τις συνθήκες της δοκιμής. Για τον έλεγχο πτητικών, ισχυρώς απορροφώμενων, έγχρωμων ή δυσδιάλυτων στο νερό χημικών ουσιών ή χημικών ουσιών που μπορεί να επηρεάσουν τη διαθεσιμότητα θρεπτικών ή ανόργανων στοιχείων στο θρεπτικό μέσο δοκιμής, ενδέχεται να απαιτηθούν ορισμένες τροποποιήσεις της περιγραφόμενης διαδικασίας (π.χ. κλειστό σύστημα, εγκλιματισμός των δοκιμαστικών δοχείων). Καθοδήγηση σχετικά με ορισμένες κατάλληλες τροποποιήσεις παρέχεται στις δημοσιεύσεις (2) (3) και (4).

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ

Εργαστηριακός εξοπλισμός

14.

Τα δοχεία δοκιμής και ο λοιπός εξοπλισμός που θα έρχονται σε επαφή με τα διαλύματα δοκιμής θα πρέπει να είναι εξ ολοκλήρου από γυαλί ή άλλο χημικώς αδρανές υλικό. Τα στοιχεία του εξοπλισμού πρέπει να εκπλύνονται σχολαστικά, ώστε να εξασφαλίζεται η απουσία παρεμβολής οργανικών ή ανόργανων ξένων προσμείξεων στην ανάπτυξη των φυκών ή στη σύσταση των διαλυμάτων δοκιμής.

15.

Κατά κανόνα, τα δοχεία δοκιμής είναι γυάλινες φιάλες, των οποίων οι διαστάσεις επιτρέπουν επαρκή όγκο καλλιέργειας για την εκτέλεση μετρήσεων στη διάρκεια της δοκιμής και επαρκή μεταφορά μάζας CO2 από την ατμόσφαιρα (βλ. σημείο 30). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ο όγκος του υγρού πρέπει να επαρκεί για τους αναλυτικούς προσδιορισμούς (βλ. σημείο 37).

16.

Επιπλέον, μπορεί να απαιτηθούν ορισμένα από τα ακόλουθα στοιχεία εξοπλισμού ή και όλα:

Συσκευή καλλιέργειας: Συνιστάται η χρήση ερμαρίου ή θαλάμου, στο εσωτερικό του οποίου η επιλεγμένη θερμοκρασία επώασης μπορεί να διατηρείται στους ± 2 °C.

Φωτόμετρα: Αξίζει να επισημανθεί ότι η μέθοδος μέτρησης της φωτεινής έντασης, και ιδίως ο τύπος δέκτη (συλλέκτη), μπορεί να επηρεάσει τη μετρούμενη τιμή. Οι μετρήσεις θα πρέπει να εκτελούνται κατά προτίμηση με σφαιρικό (4 π) δέκτη (ο οποίος αποκρίνεται στο άμεσο και στο ανακλώμενο φως από όλες τις γωνίες πάνω και κάτω από το επίπεδο μέτρησης) ή με δέκτη 2 π (ο οποίος αποκρίνεται στο φως το οποίο εκπέμπεται από όλες τις γωνίες πάνω από το επίπεδο μέτρησης).

Εξοπλισμός για τον προσδιορισμό της βιομάζας των φυκών: Ο αριθμός κυττάρων –η παράμετρος υποκατάστασης που χρησιμοποιείται συχνότερα για τη βιομάζα των φυκών– μπορεί να καταμετρηθεί με τη βοήθεια ηλεκτρονικού μετρητή σωματιδίων, μικροσκοπίου με θάλαμο καταμέτρησης ή κυτταρόμετρου ροής. Άλλες παράμετροι υποκατάστασης για τη βιομάζα μπορούν να μετρηθούν με κυτταρόμετρο, φθορισμόμετρο, φασματοφωτόμετρο ή χρωματόμετρο. Είναι χρήσιμο να υπολογίζεται ο συντελεστής μετατροπής που συνδέει τον αριθμό κυττάρων με το ξηρό βάρος. Όταν χρησιμοποιείται φασματοφωτόμετρο, ενδέχεται να απαιτούνται κυψελίδες οπτικής διαδρομής τουλάχιστον 4 cm, προκειμένου να λαμβάνονται χρήσιμες μετρήσεις σε χαμηλές συγκεντρώσεις βιομάζας.

Οργανισμοί δοκιμής

17.

Μπορούν να χρησιμοποιούνται διάφορα είδη μη ενωμένων μικροφυκών και κυανοβακτηριδίων. Τα στελέχη που παρατίθενται στο προσάρτημα 2 έχουν αποδειχθεί κατάλληλα για χρήση στη διαδικασία δοκιμής που περιγράφεται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών.

18.

Εάν χρησιμοποιούνται άλλα είδη, θα πρέπει να αναφέρεται το στέλεχος και/ή η προέλευση. Πρέπει να επιβεβαιώνεται η δυνατότητα διατήρησης της εκθετικής ανάπτυξης των επιλεγμένων φυκών δοκιμής σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής υπό τις επικρατούσες συνθήκες.

Θρεπτικό μέσο

19.

Συνιστάται η χρήση δύο εναλλακτικών θρεπτικών μέσων: του μέσου του ΟΟΣΑ και του μέσου AAP. Η σύσταση αυτών των μέσων παρατίθεται στο προσάρτημα 3. Αξίζει να σημειωθεί ότι η αρχική τιμή του pH και η ρυθμιστική χωρητικότητα (ικανότητα ρύθμισης της αύξησης του pH) των δύο θρεπτικών μέσων είναι διαφορετικές. Συνεπώς, τα αποτελέσματα των δοκιμών ενδέχεται να διαφέρουν ανάλογα με το χρησιμοποιούμενο θρεπτικό μέσο, ιδίως κατά τον έλεγχο ιοντιζόμενων ουσιών.

20.

Η τροποποίηση των θρεπτικών μέσων ενδέχεται να είναι αναγκαία για ορισμένους σκοπούς, π.χ. για τον έλεγχο μετάλλων και παραγόντων χηλικής συμπλοκοποίησης ή για τη διεξαγωγή δοκιμών σε διαφορετικές τιμές pH. Η χρήση τροποποιημένου θρεπτικού μέσου πρέπει να περιγράφεται λεπτομερώς και να αιτιολογείται (3)(4).

Αρχική συγκέντρωση βιομάζας

21.

Η αρχική βιομάζα πρέπει να είναι η ίδια σε όλες τις καλλιέργειες δοκιμής και αρκετά μικρή, ώστε να επιτρέπει την εκθετική ανάπτυξη σε όλη τη διάρκεια της περιόδου επώασης, χωρίς τον κίνδυνο να εξαντληθούν τα θρεπτικά στοιχεία. Η αρχική βιομάζα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,5 mg/l σε ξηρό βάρος. Συνιστώνται οι ακόλουθες αρχικές συγκεντρώσεις κυττάρων:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103 – 104 κύτταρα/ml

Desmodesmus subspicatus

2-5 × 103 κύτταρα/ml

Navicula pelliculosa

104 κύτταρα/ml

Anabaena flos-aquae

104 κύτταρα/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 κύτταρα/ml

Συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας

22.

Το εύρος συγκεντρώσεων στο οποίο είναι πιθανόν να σημειωθούν επιδράσεις μπορεί να προσδιοριστεί με βάση τα αποτελέσματα των δοκιμών προσδιορισμού του εύρους τιμών. Για την τελική και οριστική δοκιμή, θα πρέπει να επιλέγονται τουλάχιστον πέντε συγκεντρώσεις, διατεταγμένες σε γεωμετρική πρόοδο, με λόγο προόδου που να μην υπερβαίνει το 3,2. Στην περίπτωση των υπό δοκιμή χημικών ουσιών με επίπεδη καμπύλη απόκρισης ως προς τη συγκέντρωση, ενδέχεται να δικαιολογείται υψηλότερος λόγος προόδου. Η σειρά των συγκεντρώσεων θα πρέπει κατά προτίμηση να καλύπτει το εύρος που προκαλεί αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης των φυκών κατά 5-75 %.

Επαναλήψεις και μάρτυρες

23.

Ο σχεδιασμός της δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τρεις επαναλήψεις σε κάθε συγκέντρωση δοκιμής. Εάν δεν απαιτείται προσδιορισμός της NOEC, ο σχεδιασμός της δοκιμής μπορεί να τροποποιηθεί για να αυξηθεί ο αριθμός των συγκεντρώσεων και να μειωθεί ο αριθμός των επαναλήψεων ανά συγκέντρωση. Οι επαναλήψεις για τον μάρτυρα πρέπει να είναι τουλάχιστον τρεις και, ιδανικά, θα πρέπει να είναι διπλάσιες από τις επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση δοκιμής.

24.

Είναι δυνατόν να παρασκευαστεί χωριστή σειρά διαλυμάτων δοκιμής για τον αναλυτικό προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (βλ. σημεία 36 και 38).

25.

Όταν χρησιμοποιείται διαλύτης για τη διάλυση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, ο σχεδιασμός της δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει πρόσθετους μάρτυρες που να περιέχουν τον διαλύτη στην ίδια συγκέντρωση με εκείνη που χρησιμοποιείται στις καλλιέργειες δοκιμής.

Παρασκευή της ενοφθαλμισμένης καλλιέργειας

26.

Για να προσαρμοστούν τα φύκη δοκιμής στις συνθήκες της δοκιμής και για να εξασφαλιστεί ότι βρίσκονται στην εκθετική φάση ανάπτυξης όταν χρησιμοποιούνται για τον ενοφθαλμισμό των διαλυμάτων δοκιμής, παρασκευάζεται ενοφθαλμισμένη καλλιέργεια στο θρεπτικό μέσο δοκιμής 2-4 ημέρες πριν από την έναρξη της δοκιμής. Η βιομάζα των φυκών θα πρέπει να ρυθμίζεται κατά τρόπο ώστε η ενοφθαλμισμένη καλλιέργεια να παρουσιάζει εκθετική ανάπτυξη μέχρι την έναρξη της δοκιμής. Η ενοφθαλμισμένη καλλιέργεια επωάζεται υπό τις ίδιες συνθήκες με τις καλλιέργειες δοκιμής. Μετράται η αύξηση της βιομάζας στην ενοφθαλμισμένη καλλιέργεια για να εξασφαλιστεί ότι η ανάπτυξη βρίσκεται στο φυσιολογικό πεδίο τιμών για το στέλεχος δοκιμής υπό τις συνθήκες καλλιέργειας. Παράδειγμα της διαδικασίας για την καλλιέργεια των φυκών παρέχεται στο προσάρτημα 4. Για να αποτρέπεται η σύγχρονη κυτταρική διαίρεση κατά τη διάρκεια της δοκιμής, ενδέχεται να απαιτείται ένα δεύτερο στάδιο πολλαπλασιασμού στην ενοφθαλμισμένη καλλιέργεια.

Παρασκευή των διαλυμάτων δοκιμής

27.

Όλα τα διαλύματα δοκιμής πρέπει να περιέχουν τις ίδιες συγκεντρώσεις θρεπτικού μέσου και την ίδια αρχική βιομάζα φυκών δοκιμής. Τα διαλύματα δοκιμής με τις επιλεγμένες συγκεντρώσεις παρασκευάζονται συνήθως με την ανάμειξη ενός διαλύματος παρακαταθήκης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας με θρεπτικό μέσο και ενοφθαλμισμένη καλλιέργεια. Κατά κανόνα, τα διαλύματα παρακαταθήκης παρασκευάζονται με διάλυση της χημικής ουσίας στο θρεπτικό μέσο δοκιμής.

28.

Μπορούν να χρησιμοποιούνται διαλύτες –π.χ. ακετόνη, t-βουτυλική αλκοόλη και διμεθυλοφορμαμίδιο– ως φορείς για την προσθήκη, στο θρεπτικό μέσο δοκιμής, δυσδιάλυτων στο νερό χημικών ουσιών (2)(3). Η συγκέντρωση του διαλύτη δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 100 μl/l, ενώ θα πρέπει να προστίθεται διαλύτης στην ίδια συγκέντρωση σε όλες τις καλλιέργειες (συμπεριλαμβανομένων των καλλιεργειών ελέγχου) της σειράς δοκιμών.

Επώαση

29.

Τα δοχεία δοκιμής πωματίζονται με διαπερατά από τον αέρα πώματα. Τα δοχεία ανακινούνται και τοποθετούνται στη συσκευή καλλιέργειας. Κατά τη δοκιμή, είναι απαραίτητο να διατηρούνται τα φύκη σε εναιώρημα και να διευκολύνεται η μεταφορά CO2. Για τον σκοπό αυτό, απαιτείται συνεχής ανατάραξη ή ανάδευση. Οι καλλιέργειες θα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία μεταξύ 21 και 24 °C, με ανοχή ± 2 °C. Για είδη εκτός εκείνων που παρατίθενται στο προσάρτημα 2, π.χ. για τροπικά είδη, μπορεί να ενδείκνυνται υψηλότερες θερμοκρασίες, υπό τον όρο ότι πληρούνται τα κριτήρια εγκυρότητας. Συνιστάται τυχαιοποιημένη τοποθέτηση των φιαλών στον επωαστήρα και καθημερινή αλλαγή των θέσεών τους.

30.

Το pH του θρεπτικού μέσου ελέγχου δεν θα πρέπει να αυξάνεται κατά περισσότερο από 1,5 μονάδες στη διάρκεια της δοκιμής. Στην περίπτωση μετάλλων και χημικών ουσιών που ιοντίζονται εν μέρει σε τιμές pH γύρω από το pH της δοκιμής, ενδέχεται να είναι αναγκαίο να περιοριστεί η μεταβολή του pH, προκειμένου να ληφθούν αναπαραγώγιμα και σαφή αποτελέσματα. Μεταβολή του pH < 0,5 μονάδες είναι τεχνικά εφικτή και μπορεί να επιτευχθεί με την εξασφάλιση επαρκούς ταχύτητας μεταφοράς μάζας CO2 από τον αέρα του περιβάλλοντος στο διάλυμα δοκιμής, π.χ. με αύξηση της ταχύτητας ανατάραξης. Άλλη δυνατότητα είναι η μείωση του απαιτούμενου CO2 με μείωση της αρχικής βιομάζας ή της διάρκειας της δοκιμής.

31.

Η επιφάνεια στην οποία επωάζονται οι καλλιέργειες θα πρέπει να φωτίζεται με συνεχές, ομοιόμορφο φως φθορισμού, π.χ. τύπου “ψυχρό λευκό φως” ή “φως ημέρας”. Τα στελέχη των φυκών και των κυανοβακτηριδίων έχουν διαφορετικές απαιτήσεις φωτός. Θα πρέπει να επιλέγεται η φωτεινή ένταση που είναι κατάλληλη για τον χρησιμοποιούμενο οργανισμό δοκιμής. Για τα συνιστώμενα είδη πράσινων φυκών, η φωτεινή ένταση στο επίπεδο των διαλυμάτων δοκιμής πρέπει να επιλέγεται από το εύρος τιμών 60-120 μE · m– 2 s– 1, μετρούμενη στο αποτελεσματικό από πλευράς φωτοσύνθεσης μήκος κύματος 400-700 nm με κατάλληλο δέκτη. Ορισμένα είδη, ιδίως το Anabaena flos-aquae, αναπτύσσονται ικανοποιητικά σε χαμηλότερη φωτεινή ένταση και μπορεί να υποστούν βλάβες σε υψηλή φωτεινή ένταση. Για τα είδη αυτά, θα πρέπει να επιλέγεται μέση φωτεινή ένταση από το εύρος τιμών 40-60 μE · m– 2· s– 1. (Στην περίπτωση φωτομέτρων που είναι βαθμονομημένα σε lux, το πεδίο τιμών 4 440-8 880 lux, προκειμένου για ψυχρό λευκό φως, αντιστοιχεί περίπου στη συνιστώμενη φωτεινή ένταση των 60-120 μE · m– 2 · s– 1). Η φωτεινή ένταση πρέπει να διατηρείται εντός ± 15 % από τη μέση φωτεινή ένταση στην περιοχή επώασης.

Διάρκεια δοκιμής

32.

Κατά κανόνα, η δοκιμή διαρκεί 72 ώρες. Ωστόσο, είναι δυνατόν να επιλέγονται μικρότερα ή μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, υπό τον όρο ότι πληρούνται όλα τα κριτήρια εγκυρότητας που αναφέρονται στο σημείο 11.

Μετρήσεις και αναλυτικοί προσδιορισμοί

33.

Η βιομάζα των φυκών σε κάθε φιάλη προσδιορίζεται τουλάχιστον κάθε ημέρα κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Εάν οι μετρήσεις εκτελούνται σε μικρές ποσότητες που αφαιρούνται από το διάλυμα δοκιμής με σιφώνιο, οι τελευταίες δεν θα πρέπει να αναπληρώνονται.

34.

Η βιομάζα μετράται με χειρωνακτική καταμέτρηση κυττάρων σε μικροσκόπιο ή με ηλεκτρονικό μετρητή σωματιδίων (σε αριθμό κυττάρων και/ή βιοόγκο). Μπορούν να χρησιμοποιούνται εναλλακτικές τεχνικές, π.χ. κυτταρομετρία ροής, φθορισμός χλωροφύλλης in vitro ή in vivo (5)(6) ή οπτική πυκνότητα, εάν είναι δυνατόν να αποδειχθεί ικανοποιητική συσχέτιση με τη βιομάζα στο εύρος των τιμών βιομάζας που σημειώνεται στη δοκιμή.

35.

Το pH των διαλυμάτων μετράται στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής.

36.

Εάν υπάρχει αναλυτική διαδικασία που επιτρέπει τον προσδιορισμό της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο χρησιμοποιούμενο εύρος συγκεντρώσεων, τα διαλύματα δοκιμής θα πρέπει να υποβάλλονται σε ανάλυση ώστε να επαληθεύονται οι αρχικές συγκεντρώσεις και η διατήρηση των συγκεντρώσεων έκθεσης κατά τη διάρκεια της δοκιμής.

37.

Στις περιπτώσεις όπου οι συγκεντρώσεις έκθεσης είναι πιθανό να διαφέρουν από τις ονομαστικές συγκεντρώσεις κατά λιγότερο από 20 % στη διάρκεια της δοκιμής, ενδέχεται να αρκεί η ανάλυση της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής, στο χαμηλό και στο υψηλό επίπεδο συγκέντρωσης δοκιμής, καθώς και σε ένα επίπεδο κοντά στην αναμενόμενη EC50. Συνιστάται η ανάλυση όλων των συγκεντρώσεων δοκιμής στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής, όταν οι συγκεντρώσεις είναι απίθανο να παραμείνουν εντός των ορίων του 80-120 % της ονομαστικής συγκέντρωσης. Προκειμένου για πτητικές, ασταθείς ή ισχυρώς προσροφώμενες υπό δοκιμή χημικές ουσίες, συνιστάται πρόσθετη δειγματοληψία για ανάλυση ανά 24 ώρες κατά τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης, ώστε να προσδιορίζεται ακριβέστερα η απώλεια υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Για τις συγκεκριμένες χημικές ουσίες ενδέχεται να χρειάζονται επιπλέον επαναλήψεις. Σε κάθε περίπτωση, οι συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας αρκεί να προσδιορίζονται μόνο σε ένα δοχείο επανάληψης για κάθε συγκέντρωση δοκιμής (ή στο συνενωμένο περιεχόμενο των δοχείων ανά επανάληψη).

38.

Τα θρεπτικά μέσα δοκιμής που παρασκευάζονται ειδικά για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων έκθεσης κατά τη δοκιμή θα πρέπει να υποβάλλονται στην ίδια ακριβώς αγωγή όπως εκείνα που χρησιμοποιούνται για τη δοκιμή, δηλαδή να εμβολιάζονται με φύκη και να επωάζονται υπό πανομοιότυπες συνθήκες. Εάν απαιτείται ανάλυση της συγκέντρωσης της διαλυμένης υπό δοκιμή χημικής ουσίας, ενδέχεται να είναι αναγκαίος ο διαχωρισμός των φυκών από το θρεπτικό μέσο. Κατά προτίμηση, ο διαχωρισμός θα πρέπει να εκτελείται με φυγοκέντρηση σε χαμηλή ισχύ g, επαρκή για την καθίζηση των φυκών.

39.

Εάν υπάρχουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας διατηρήθηκε ικανοποιητικά εντός των ορίων της ονομαστικής ή μετρηθείσας αρχικής συγκέντρωσης ± 20 % σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής, η ανάλυση των αποτελεσμάτων μπορεί να βασίζεται στις ονομαστικές ή τις μετρηθείσες αρχικές τιμές. Εάν η απόκλιση από την ονομαστική ή τη μετρηθείσα αρχική συγκέντρωση δεν βρίσκεται εντός του ± 20 %, η ανάλυση των αποτελεσμάτων θα πρέπει να βασίζεται στον γεωμετρικό μέσο όρο των συγκεντρώσεων κατά την έκθεση ή σε μοντέλα που περιγράφουν τη μείωση της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (3)(7).

40.

Η δοκιμή αναστολής της ανάπτυξης φυκών είναι δυναμικότερο σύστημα δοκιμών από την πλειονότητα των υπόλοιπων δοκιμών βραχυπρόθεσμης τοξικότητας σε υδρόβιους οργανισμούς. Κατά συνέπεια, ενδέχεται να είναι δύσκολο να προσδιοριστούν οι πραγματικές συγκεντρώσεις έκθεσης, ιδίως όταν ελέγχονται προσροφώμενες χημικές ουσίες σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Στις περιπτώσεις αυτές, η εξαφάνιση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας από το διάλυμα λόγω προσρόφησης στην αυξανόμενη βιομάζα φυκών δεν συνεπάγεται την απώλειά της από το σύστημα της δοκιμής. Κατά την ανάλυση του αποτελέσματος της δοκιμής, θα πρέπει να εξακριβώνεται κατά πόσον η μείωση της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην πορεία της δοκιμής συνοδεύεται από μείωση της αναστολής της ανάπτυξης. Εάν συμβαίνει αυτό, μπορεί να εξεταστεί το ενδεχόμενο να εφαρμοστεί κατάλληλο μοντέλο που να περιγράφει τη μείωση της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημική ουσίας (7). Εάν δεν συμβαίνει αυτό, μπορεί να ενδείκνυται να βασίζεται η ανάλυση των αποτελεσμάτων στις αρχικές (ονομαστικές ή μετρηθείσες) συγκεντρώσεις.

Άλλες παρατηρήσεις

41.

Θα πρέπει να εκτελείται μικροσκοπική παρατήρηση ώστε να επαληθεύεται η φυσιολογική και υγιής εμφάνιση της ενοφθαλμισμένης καλλιέργειας και να εντοπίζονται τυχόν ανωμαλίες στην εμφάνιση των φυκών (οι οποίες έχουν ενδεχομένως προκληθεί από την έκθεση στην υπό δοκιμή χημική ουσία) στο τέλος της δοκιμής.

Οριακή δοκιμή

42.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, π.χ. όταν από προκαταρτική δοκιμή έχει προκύψει ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία δεν έχει τοξικές επιδράσεις σε συγκεντρώσεις έως 100 mg/l ή έως το όριο διαλυτότητάς της στο θρεπτικό μέσο δοκιμής (αναλόγως του ποια είναι μικρότερη), είναι δυνατόν να διεξάγεται οριακή δοκιμή, η οποία συνίσταται σε σύγκριση των αποκρίσεων μιας ομάδας ελέγχου και μιας ομάδας αγωγής (συγκέντρωση ίση με 100 mg/l ή με το όριο διαλυτότητας). Συνιστάται ένθερμα να τεκμηριώνεται αυτό με ανάλυση της συγκέντρωσης έκθεσης. Η οριακή δοκιμή υπόκειται σε όλες τις συνθήκες δοκιμής και όλα τα κριτήρια εγκυρότητας που περιγράφονται ανωτέρω, με εξαίρεση τον αριθμό των επαναλήψεων αγωγής, που θα πρέπει να είναι τουλάχιστον έξι. Οι μεταβλητές απόκρισης της ομάδας ελέγχου και της ομάδας αγωγής μπορούν να αναλυθούν με στατιστική δοκιμή σύγκρισης των μέσων όρων, π.χ. δοκιμασία t του Student. Εάν οι διασπορές στις δύο ομάδες είναι άνισες, θα πρέπει να διεξάγεται προσαρμοσμένη δοκιμασία t για άνισες διασπορές.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ

Χάραξη καμπυλών ανάπτυξης

43.

Η βιομάζα των δοχείων δοκιμής μπορεί να εκφράζεται σε μονάδες της παραμέτρου υποκατάστασης που έχει χρησιμοποιηθεί για τις μετρήσεις (π.χ. αριθμός κυττάρων, φθορισμός).

44.

Καταχωρίζονται σε πίνακα οι εκτιμώμενες συγκεντρώσεις βιομάζας στις καλλιέργειες δοκιμής και στους μάρτυρες, καθώς και οι συγκεντρώσεις του υλικού δοκιμής και οι χρόνοι μέτρησης, τουλάχιστον σε ακέραιες ώρες, για τη χάραξη των καμπυλών ανάπτυξης. Στο πρώτο αυτό στάδιο μπορεί να φανούν χρήσιμες τόσο η λογαριθμική όσο και η γραμμική κλίμακα, αλλά η λογαριθμική κλίμακα είναι υποχρεωτική και, γενικά, παρουσιάζει ακριβέστερα τις μεταβολές του τύπου ανάπτυξης κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Σημειωτέον ότι το λογαριθμικό διάγραμμα της εκθετικής ανάπτυξης έχει τη μορφή ευθείας γραμμής, της οποίας η κλίση παρέχει τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης.

45.

Με τη βοήθεια των διαγραμμάτων, εξετάζεται αν η ανάπτυξη στις καλλιέργειες ελέγχου είναι εκθετική με τον αναμενόμενο ρυθμό σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Εξετάζονται με κριτικό πνεύμα όλα τα σημεία δεδομένων, καθώς και η εμφάνιση των διαγραμμάτων και ελέγχεται η πιθανότητα σφάλματος στα ανεπεξέργαστα δεδομένα και στις διαδικασίες. Ειδικότερα, ελέγχονται τα σημεία δεδομένων που φαίνεται να αποκλίνουν λόγω συστηματικού σφάλματος. Εάν είναι προφανές ότι μπορούν να εντοπιστούν λάθη στη διαδικασία και/ή να θεωρηθούν εξαιρετικά πιθανά, τα αντίστοιχα σημεία δεδομένων σημειώνονται ως ακραίες τιμές και δεν λαμβάνονται υπόψη στη μετέπειτα στατιστική ανάλυση. (Η μηδενική συγκέντρωση φυκών σε ένα από τα δύο ή τρία δοχεία επανάληψης μπορεί να υποδηλώνει εσφαλμένο εμβολιασμό ή ελλιπή καθαρισμό του δοχείου). Στην έκθεση δοκιμής πρέπει να αναφέρονται επακριβώς οι λόγοι απόρριψης ενός σημείου δεδομένων ως ακραίας τιμής. Αποδεκτοί λόγοι είναι μόνο τα (σπάνια) λάθη στη διαδικασία και όχι απλώς ο χαμηλός βαθμός ακρίβειας. Οι στατιστικές διαδικασίες για τον εντοπισμό των ακραίων τιμών έχουν περιορισμένη χρησιμότητα στην επίλυση προβλημάτων αυτού του είδους και δεν μπορούν να υποκαταστήσουν την κρίση του ειδικού. Οι ακραίες τιμές (που σημειώνονται ως τέτοιες) θα πρέπει κατά προτίμηση να συμπεριλαμβάνονται στα σημεία δεδομένων που απεικονίζονται μεταγενέστερα σε γραφικές παραστάσεις ή πίνακες.

Μεταβλητές απόκρισης

46.

Σκοπός της δοκιμής είναι να προσδιοριστούν οι επιδράσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην ανάπτυξη φυκών. Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών περιγράφονται δύο μεταβλητές απόκρισης, ώστε να ανταποκρίνονται στις διαφορετικές προτιμήσεις και κανονιστικές ανάγκες των κρατών μελών. Για να είναι τα αποτελέσματα των δοκιμών αποδεκτά σε όλα τα κράτη μέλη, οι επιδράσεις θα πρέπει να αξιολογούνται με χρήση και των δύο μεταβλητών απόκρισης α) και β) που περιγράφονται κατωτέρω.

α)    Μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης : Αυτή η μεταβλητή απόκρισης υπολογίζεται με βάση τη λογαριθμική αύξηση της βιομάζας στη διάρκεια της δοκιμής, εκφραζόμενη ανά ημέρα.

β)    Απόδοση : Αυτή η μεταβλητή απόκρισης αντιστοιχεί στη βιομάζα στο τέλος της δοκιμής μείον την αρχική βιομάζα.

47.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι τιμές τοξικότητας που υπολογίζονται με τη χρήση των ανωτέρω δύο μεταβλητών απόκρισης δεν είναι συγκρίσιμες και η διαφορά αυτή πρέπει να αναγνωρίζεται, όταν χρησιμοποιούνται τα αποτελέσματα της δοκιμής. Εφόσον τηρούνται οι συνθήκες δοκιμής που καθορίζονται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών, οι τιμές ECx που προκύπτουν από τον μέσο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (ErCx) είναι γενικά υψηλότερες από τα βασιζόμενα στην απόδοση αποτελέσματα (EyCx), λόγω της μαθηματικής βάσης της αντίστοιχης προσέγγισης. Αυτό δεν θα πρέπει να ερμηνεύεται ως διαφορά ευαισθησίας μεταξύ των δύο μεταβλητών απόκρισης· πρόκειται απλώς για μαθηματική διαφορά των τιμών. Η έννοια του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης βασίζεται στον γενικό εκθετικό τύπο ανάπτυξης των φυκών σε απεριόριστες καλλιέργειες, όπου η τοξικότητα εκτιμάται με βάση τις επιδράσεις στον ρυθμό ανάπτυξης, χωρίς να εξαρτάται από την απόλυτη τιμή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης του μάρτυρα ή από την κλίση της καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης ή από τη διάρκεια της δοκιμής. Αντίθετα, τα αποτελέσματα που βασίζονται στην απόδοση ως μεταβλητή απόκρισης εξαρτώνται από όλες τις άλλες προαναφερόμενες μεταβλητές. Η EyCx εξαρτάται από τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης του είδους φυκών που χρησιμοποιείται σε κάθε δοκιμή, καθώς και από τον μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης, ο οποίος μπορεί να διαφέρει μεταξύ των ειδών ή ακόμη και μεταξύ διαφορετικών στελεχών φυκών. Η συγκεκριμένη μεταβλητή απόκρισης δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τη σύγκριση της ευαισθησίας σε τοξικούς παράγοντες μεταξύ ειδών φυκών ή ακόμα και μεταξύ διαφορετικών στελεχών. Μολονότι είναι προτιμότερο, από επιστημονική άποψη, να χρησιμοποιείται ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για την εκτίμηση της τοξικότητας, η παρούσα μέθοδος δοκιμών περιλαμβάνει και εκτιμήσεις της τοξικότητας με βάση την απόδοση, προκειμένου να καλυφθούν οι κανονιστικές απαιτήσεις που ισχύουν σήμερα σε ορισμένες χώρες.

Μέσος ρυθμός ανάπτυξης

48.

Ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για συγκεκριμένη χρονική περίοδο υπολογίζεται ως η λογαριθμική αύξηση της βιομάζας από την ακόλουθη εξίσωση, η οποία εφαρμόζεται σε κάθε ένα από τα δοχεία ελέγχου και τα δοχεία αγωγής:

Formula

[1],

όπου:

μi-j

=

ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης κατά το χρονικό διάστημα i έως j,

Xi

=

η βιομάζα σε χρόνο i, και

Xj

=

η βιομάζα σε χρόνο j.

Για κάθε ομάδα αγωγής και ομάδα ελέγχου υπολογίζεται η μέση τιμή του ρυθμού ανάπτυξης, συνοδευόμενη από εκτίμηση της διασποράς.

49.

Υπολογίζεται ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για τη συνολική διάρκεια της δοκιμής (κατά κανόνα, ημέρες 0-3), με χρήση της ονομαστικής ενοφθαλμισμένης βιομάζας ως αρχικής τιμής και όχι της μετρηθείσας αρχικής τιμής, επειδή με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται συνήθως μεγαλύτερη ακρίβεια. Εάν ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της βιομάζας επιτρέπει τον αρκούντως ακριβή προσδιορισμό της μικρής βιομάζας ενοφθαλμίσματος (π.χ. κυτταρόμετρο ροής), μπορεί να χρησιμοποιείται η μετρηθείσα αρχική συγκέντρωση βιομάζας. Υπολογίζεται επίσης ο τμηματικός ρυθμός ανάπτυξης, ως ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για κάθε ημέρα της περιόδου δοκιμής (ημέρες 0-1, 1-2 και 2-3) και εξετάζεται αν ο ρυθμός ανάπτυξης των μαρτύρων παραμένει σταθερός (βλ. κριτήρια εγκυρότητας στο σημείο 11). Εάν την πρώτη ημέρα διαπιστωθεί ειδικός ρυθμός ανάπτυξης σημαντικά χαμηλότερος από τον συνολικό μέσο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης, αυτό μπορεί να αποτελεί ένδειξη λανθάνουσας φάσης. Ενώ στις καλλιέργειες ελέγχου η λανθάνουσα φάση μπορεί να ελαχιστοποιείται και, πρακτικά, να εξαλείφεται με κατάλληλο πολλαπλασιασμό της προκαλλιέργειας, η λανθάνουσα φάση στις εκτιθέμενες καλλιέργειες μπορεί να υποδηλώνει ανάκαμψη μετά το πρώτο τοξικό στρες ή ελαττωμένη έκθεση λόγω απώλειας της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (όπου συμπεριλαμβάνεται η ρόφηση στη βιομάζα φυκών) μετά την αρχική έκθεση. Ως εκ τούτου, για την αξιολόγηση των επιδράσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας κατά τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης, μπορεί να υπολογιστεί ο τμηματικός ρυθμός ανάπτυξης. Οι ουσιώδεις διαφορές μεταξύ του τμηματικού και του μέσου ρυθμού ανάπτυξης υποδηλώνουν απόκλιση από τη σταθερή εκθετική ανάπτυξη και δικαιολογούν την ενδελεχή εξέταση των καμπυλών ανάπτυξης.

50.

Υπολογίζεται η εκατοστιαία αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης για κάθε επανάληψη αγωγής από την εξίσωση [2]:

Formula

[2],

όπου:

%Ir

=

η εκατοστιαία αναστολή του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης,

μC

=

η μέση τιμή του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης (μ) στην ομάδα ελέγχου,

μT

=

ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης στην επανάληψη αγωγής.

51.

Όταν χρησιμοποιούνται διαλύτες για την παρασκευή των διαλυμάτων δοκιμής, πρέπει να χρησιμοποιούνται στους υπολογισμούς της εκατοστιαίας αναστολής οι μάρτυρες με διαλύτη και όχι οι μάρτυρες χωρίς διαλύτη.

Απόδοση

52.

Η απόδοση υπολογίζεται ως η βιομάζα στο τέλος της δοκιμής μείον την αρχική βιομάζα για κάθε μεμονωμένο δοχείο ελέγχου και δοχείο αγωγής. Για κάθε συγκέντρωση δοκιμής και για κάθε μάρτυρα υπολογίζεται η μέση τιμή της απόδοσης, συνοδευόμενη από εκτίμηση της διασποράς. Η εκατοστιαία αναστολή της απόδοσης (% Iy) μπορεί να υπολογιστεί για κάθε επανάληψη αγωγής από τον ακόλουθο τύπο:

Formula

[3]

όπου:

% Iy

=

η εκατοστιαία αναστολή της απόδοσης,

YT

=

η μέση τιμή της απόδοσης στην ομάδα ελέγχου,

YT

=

η τιμή της απόδοσης στην επανάληψη αγωγής.

Χάραξη της καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης

53.

Σχεδιάζεται διάγραμμα της εκατοστιαίας αναστολής σε συνάρτηση με τον λογάριθμο της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Το διάγραμμα αυτό εξετάζεται ενδελεχώς και απορρίπτονται τα σημεία δεδομένων που ενδεχομένως σημειώθηκαν ως ακραίες τιμές κατά το πρώτο στάδιο. Συνδέονται τα σημεία δεδομένων με ομαλή γραμμή, με το μάτι ή με παρεμβολή με τη βοήθεια υπολογιστή, ώστε να ληφθεί μια πρώτη εικόνα της σχέσης μεταξύ συγκέντρωσης και απόκρισης. Στη συνέχεια, εφαρμόζεται λεπτομερέστερη μέθοδος, κατά προτίμηση στατιστική μέθοδος με τη χρήση υπολογιστή. Ανάλογα με τη σκοπούμενη χρήση, την ποιότητα (ακρίβεια) και τον όγκο των δεδομένων, καθώς και με τη διαθεσιμότητα εργαλείων ανάλυσης δεδομένων, είναι δυνατόν να αποφασιστεί (μερικές φορές, μάλιστα, δικαιολογείται απόλυτα) να τερματιστεί η ανάλυση των δεδομένων στο στάδιο αυτό και απλώς να ληφθούν οι βασικές τιμές EC50 και EC10 (και/ή EC20) από την προσαρμοσμένη με το μάτι καμπύλη (βλ. επίσης το σημείο κατωτέρω σχετικά με τις διεγερτικές επιδράσεις). Βάσιμοι λόγοι για τη μη εφαρμογή στατιστικής μεθόδου μπορούν να είναι, μεταξύ άλλων, οι εξής:

Τα δεδομένα δεν είναι κατάλληλα ώστε, εάν εφαρμόζονταν μέθοδοι με τη χρήση υπολογιστή, να παρήγαγαν πιο αξιόπιστα αποτελέσματα από εκείνα που δίνει η κρίση του ειδικού. Στις περιπτώσεις αυτές, μάλιστα, ορισμένα προγράμματα υπολογιστή ενδέχεται να μην προσφέρουν καν αξιόπιστη λύση (οι επαναληπτικές διαδικασίες μπορεί να μην συγκλίνουν κ.λπ.).

Οι αποκρίσεις ανάπτυξης που οφείλονται σε διέγερση δεν είναι δυνατόν να αντιμετωπιστούν επαρκώς με τη χρήση των διαθέσιμων προγραμμάτων υπολογιστή (βλ. κατωτέρω).

Στατιστικές διαδικασίες

54.

Το ζητούμενο είναι να ληφθεί ποσοτική σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης με ανάλυση παλινδρόμησης. Είναι δυνατόν να εφαρμοστεί σταθμισμένη γραμμική παλινδρόμηση, μετά από γραμμικό μετασχηματισμό των δεδομένων απόκρισης –π.χ. σε μονάδες probit ή logit ή Weibull (8)–, αλλά προτιμώνται οι τεχνικές μη γραμμικής παλινδρόμησης, με τις οποίες αντιμετωπίζονται καλύτερα οι αναπόφευκτες ανωμαλίες των δεδομένων και οι αποκλίσεις τους από τις ομαλές κατανομές. Κοντά στις περιοχές είτε της μηδενικής είτε της πλήρους αναστολής, οι ανωμαλίες αυτές ενδέχεται να μεγεθυνθούν από τον μετασχηματισμό και να αλλοιώσουν την ανάλυση (8). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι πρότυπες μέθοδοι ανάλυσης με τη χρήση αποτελεσμάτων μετασχηματισμού probit, logit ή Weibull προορίζονται για δεδομένα που δέχονται μόνο δύο τιμές (π.χ. θνησιμότητα ή επιβίωση) και πρέπει να τροποποιούνται ώστε να μπορούν να εφαρμόζονται σε δεδομένα ανάπτυξης ή βιομάζας. Ειδικές διαδικασίες για τον προσδιορισμό των τιμών ECx από συνεχή δεδομένα παρατίθενται στις δημοσιεύσεις (9), (10) και (11). Η χρήση της ανάλυσης μη γραμμικής παλινδρόμησης περιγράφεται λεπτομερέστερα στο προσάρτημα 5.

55.

Για κάθε μεταβλητή απόκρισης που πρόκειται να αναλυθεί, χρησιμοποιείται η σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης για να υπολογιστούν σημειακές εκτιμήσεις των τιμών ECx. Όπου είναι δυνατόν, θα πρέπει να προσδιορίζονται, για κάθε εκτίμηση, τα όρια εμπιστοσύνης 95 %. Η καλή προσαρμογή των δεδομένων απόκρισης στο μοντέλο παλινδρόμησης θα πρέπει να αξιολογείται με γραφική ή στατιστική μέθοδο. Η ανάλυση παλινδρόμησης θα πρέπει να εκτελείται με τη χρήση των αποκρίσεων της κάθε επανάληψης και όχι των μέσων όρων των ομάδων αγωγής. Ωστόσο, εάν η μη γραμμική προσαρμογή καμπύλης είναι δύσκολη ή ανέφικτη, λόγω υπερβολικής σκεδαστικότητας των δεδομένων, το πρόβλημα μπορεί να παρακαμφθεί με την εφαρμογή της παλινδρόμησης στους μέσους όρους των ομάδων ως πρακτικό μέσο περιορισμού της επιρροής των ύποπτων ακραίων τιμών. Η χρήση αυτής της εναλλακτικής επιλογής θα πρέπει να αναφέρεται στην έκθεση δοκιμής ως παρέκκλιση από την κανονική διαδικασία, οφειλόμενη στο γεγονός ότι η προσαρμογή της καμπύλης με τις τιμές των επιμέρους επαναλήψεων δεν απέδωσε ικανοποιητικό αποτέλεσμα.

56.

Εάν τα διαθέσιμα μοντέλα/μέθοδοι παλινδρόμησης είναι ακατάλληλα για τα δεδομένα, μπορούν επίσης να ληφθούν εκτιμήσεις και όρια εμπιστοσύνης για την EC50 με γραμμική παρεμβολή με τη μέθοδο bootstrap (13).

57.

Για την εκτίμηση της LOEC και, κατ' επέκταση της NOEC, όσον αφορά τις επιδράσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στον ρυθμό ανάπτυξης, είναι αναγκαία η σύγκριση των μέσων όρων των ομάδων αγωγής με τεχνικές ανάλυσης της διασποράς (ANOVA). Στη συνέχεια, ο μέσος όρος για κάθε συγκέντρωση πρέπει να συγκρίνεται με τον μέσο όρο του μάρτυρα με κατάλληλη μέθοδο πολλαπλής σύγκρισης ή δοκιμής τάσης. Χρήσιμη για τον σκοπό αυτό μπορεί να είναι η δοκιμασία Dunnett ή η δοκιμασία Williams (12)(14)(15)(16)(17). Είναι απαραίτητο να κρίνεται αν ευσταθεί η παραδοχή της ANOVA για ομοιογενή διασπορά. Η εκτίμηση αυτή μπορεί να διενεργηθεί γραφικά ή με επίσημη δοκιμή (17). Κατάλληλες δοκιμασίες είναι η δοκιμασία Levene και η δοκιμασία Bartlett. Εάν δεν ισχύει η παραδοχή της ομοιογένειας της διασποράς, αυτό είναι μερικές φορές δυνατόν να διορθωθεί με λογαριθμικό μετασχηματισμό των δεδομένων. Στις περιπτώσεις ακραίας ετερογένειας της διασποράς η οποία δεν είναι δυνατόν να διορθωθεί με μετασχηματισμό, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο ανάλυσης με μεθόδους όπως ο έλεγχος φθίνουσας τάσης κατά Jonckheere. Πρόσθετη καθοδήγηση σχετικά με τον προσδιορισμό της NOEC παρέχεται στη δημοσίευση (11).

58.

Οι πρόσφατες επιστημονικές εξελίξεις υπαγόρευσαν τη σύσταση να εγκαταλειφθεί η έννοια της NOEC και να αντικατασταθεί από σημειακές εκτιμήσεις των τιμών ECx βάσει παλινδρόμησης. Δεν έχει καθοριστεί κατάλληλη τιμή του x για την παρούσα δοκιμή σε φύκη. Φαίνεται να ενδείκνυται ένα εύρος 10 έως 20 % (ανάλογα με την επιλεγμένη μεταβλητή απόκρισης) και, κατά προτίμηση, θα πρέπει να αναφέρονται τόσο η EC10 όσο και η EC20.

Διέγερση της ανάπτυξης

59.

Μερικές φορές παρατηρείται διέγερση της ανάπτυξης (αρνητική αναστολή) σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε σε όρμηση (“τοξική διέγερση”) είτε στην προσθήκη διεγερτικών αυξητικών παραγόντων, μέσω του υλικού δοκιμής, στο ελάχιστο θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιείται. Σημειωτέον ότι η προσθήκη ανόργανων θρεπτικών στοιχείων δεν προβλέπεται να έχει άμεση επίδραση, επειδή το θρεπτικό μέσο δοκιμής διατηρεί περίσσεια θρεπτικών στοιχείων σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Εάν η διέγερση σε χαμηλή δόση δεν είναι ακραία, συνήθως μπορεί να αγνοηθεί στους υπολογισμούς της EC50. Ωστόσο, εάν είναι ακραία ή εάν πρόκειται να υπολογιστεί τιμή ECx για χαμηλή τιμή του x, ενδέχεται να χρειαστούν ειδικές διαδικασίες. Η απαλοιφή των αποκρίσεων διέγερσης από την ανάλυση δεδομένων πρέπει, κατά το δυνατόν, να αποφεύγεται και, εάν το διαθέσιμο λογισμικό προσαρμογής καμπυλών δεν μπορεί να δεχθεί ελάσσονα διέγερση, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί η γραμμική παρεμβολή με τη μέθοδο bootstrap. Σε περίπτωση ακραίας διέγερσης, μπορεί να εξεταστεί το ενδεχόμενο χρήσης μοντέλου όρμησης (18).

Μη τοξική αναστολή της ανάπτυξης

60.

Τα υλικά δοκιμής που απορροφούν το φως μπορούν να προκαλέσουν μείωση του ρυθμού ανάπτυξης, επειδή η σκίαση περιορίζει τη διαθέσιμη ποσότητα φωτός. Αυτά τα είδη επιδράσεων, που οφείλονται σε φυσικά αίτια, θα πρέπει να διαχωρίζονται από τις τοξικές επιδράσεις με τροποποίηση των συνθηκών δοκιμής και να αναφέρονται χωριστά. Σχετική καθοδήγηση παρέχεται στις δημοσιεύσεις (2) και (3).

ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ

61.

Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:

 

Υπό δοκιμή χημική ουσία:

φυσική υπόσταση και σημαντικές φυσικοχημικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένου του ορίου υδατοδιαλυτότητας·

δεδομένα χημικής ταυτοποίησης (π.χ. αριθ. CAS), συμπεριλαμβανομένης της καθαρότητας (προσμείξεις).

 

Υπό δοκιμή είδος:

στέλεχος, προμηθευτής ή πηγή και χρησιμοποιηθείσες συνθήκες καλλιέργειας.

 

Συνθήκες δοκιμής:

ημερομηνία έναρξης της δοκιμής και διάρκεια της δοκιμής·

περιγραφή του σχεδιασμού της δοκιμής: δοχεία δοκιμής, όγκοι καλλιεργειών, πυκνότητα βιομάζας στην αρχή της δοκιμής·

σύνθεση του θρεπτικού μέσου·

συγκεντρώσεις δοκιμής και επαναλήψεις (π.χ. αριθμός επαναλήψεων, αριθμός συγκεντρώσεων δοκιμής και χρησιμοποιηθείσα γεωμετρική πρόοδος)·

περιγραφή της παρασκευής των διαλυμάτων δοκιμής, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης διαλυτών κ.λπ.·

συσκευή καλλιέργειας·

φωτεινή ένταση και ποιότητα του φωτός (πηγή, ομοιογένεια)·

θερμοκρασία·

ελεγχθείσες συγκεντρώσεις: ονομαστικές συγκεντρώσεις δοκιμής και τυχόν αποτελέσματα των αναλύσεων για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στα δοχεία δοκιμής. Θα πρέπει επίσης να αναφέρονται η απόδοση ανάκτησης της μεθόδου και το όριο ποσοτικού προσδιορισμού στη μήτρα δοκιμής·

όλες οι παρεκκλίσεις από την παρούσα μέθοδο δοκιμών·

μέθοδος προσδιορισμού της βιομάζας και απόδειξη συσχέτισης της μετρούμενης παραμέτρου με το ξηρό βάρος.

 

Αποτελέσματα:

τιμές pH στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής σε κάθε αγωγή·

βιομάζα κάθε φιάλης σε κάθε σημείο μέτρησης και μέθοδος μέτρησης της βιομάζας·

καμπύλες ανάπτυξης (διάγραμμα της βιομάζας συναρτήσει του χρόνου)·

υπολογισθείσες μεταβλητές απόκρισης για κάθε επανάληψη αγωγής, συνοδευόμενες από τους μέσους όρους και τον συντελεστή μεταβολής για τις επαναλήψεις·

γραφική παράσταση της σχέσης συγκέντρωσης-επίδρασης·

εκτιμήσεις της τοξικότητας για τις μεταβλητές απόκρισης, π.χ. EC50, EC10, EC20 και τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης. Τιμές LOEC και NOEC, εφόσον έχουν υπολογιστεί, και στατιστικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό αυτό·

εάν έχει χρησιμοποιηθεί τεχνική ANOVA, το ανιχνεύσιμο μέγεθος της επίδρασης (π.χ. η ελάχιστη σημαντική διαφορά)·

διέγερση της ανάπτυξης που ενδεχομένως διαπιστώθηκε σε οποιοδήποτε δοχείο αγωγής·

τυχόν άλλες παρατηρηθείσες επιδράσεις, π.χ. μορφολογικές μεταβολές στα φύκη·

συζήτηση των αποτελεσμάτων, συμπεριλαμβανομένης τυχόν επιρροής ως προς την έκβαση της δοκιμής λόγω παρακκλίσεων από την παρούσα μέθοδο δοκιμών.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality — Algal growth inhibition test (Πρότυπο ΕΛΟΤ EN ISO 8692: Ποιότητα νερού — Δοκιμή παρεμπόδισης ανάπτυξης αλγών γλυκού νερού με μονοκυτταρικές πράσινες άλγες).

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Παρίσι.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on Biotesting of Samples (ΕΛΟΤ ISO 5667-16 Ποιότητα νερού — Δειγματοληψία — Μέρος 16: Καθοδήγηση για βιοδοκιμασίες δειγμάτων).

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Παρίσι.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, Νέα Υόρκη.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Προσάρτημα 1

Ορισμοι

Για τους σκοπούς της παρούσας μεθόδου δοκιμών χρησιμοποιούνται οι ακόλουθοι ορισμοί και συντμήσεις:

Βιομάζα : το ξηρό βάρος της ζώσας ύλης την οποία περιέχει ένας πληθυσμός, εκφραζόμενο ως προς δεδομένο όγκο, π.χ. mg φυκών/λίτρο διαλύματος δοκιμής. Η βιομάζα ορίζεται συνήθως ως μάζα, αλλά στην παρούσα μέθοδο δοκιμών η λέξη αυτή χρησιμοποιείται για να δηλώσει μάζα ανά όγκο. Επίσης, στην παρούσα δοκιμή μετρώνται συνήθως υποκατάστατα της βιομάζας, όπως ο αριθμός κυττάρων, ο φθορισμός κ.λπ. Ως εκ τούτου, ο όρος “βιομάζα” αναφέρεται και σε αυτά τα μέτρα υποκατάστασης.

Χημική ουσία : μια ουσία ή ένα μείγμα.

Συντελεστής μεταβολής : αδιάστατο μέτρο της μεταβλητότητας μιας παραμέτρου, το οποίο ορίζεται ως ο λόγος της τυπικής απόκλισης προς τον μέσο όρο. Μπορεί επίσης να εκφραστεί σε ποσοστό επί τοις εκατό. Η μέση τιμή του συντελεστή μεταβολής του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης σε ταυτόσημες καλλιέργειες ελέγχου θα πρέπει να υπολογίζεται ως εξής:

1.

Υπολογίζεται ο επί τοις εκατό συντελεστής μεταβολής του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης από τους ημερήσιους/τμηματικούς ρυθμούς ανάπτυξης για καθεμία από τις ταυτόσημες καλλιέργειες.

2.

Εξάγεται ο μέσος όρος όλων των τιμών που υπολογίστηκαν στο σημείο 1, ώστε να προκύψει η μέση τιμή του συντελεστή μεταβολής του ημερήσιου/τμηματικού ειδικού ρυθμού ανάπτυξης στις ταυτόσημες καλλιέργειες ελέγχου.

ECx : η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, διαλυμένης στο θρεπτικό μέσο δοκιμής, η οποία προκαλεί μείωση της ανάπτυξης του οργανισμού δοκιμής κατά x % (π.χ. 50 %) εντός της δηλούμενης περιόδου έκθεσης (πρέπει να αναφέρεται επακριβώς, εάν διαφέρει από την πλήρη ή κανονική διάρκεια της δοκιμής). Για να δηλώνεται σαφώς αν η τιμή EC έχει προκύψει από τον ρυθμό ανάπτυξης ή από την απόδοση, χρησιμοποιείται το σύμβολο “ErC” για τον ρυθμό ανάπτυξης και το σύμβολο “EyC” για την απόδοση.

Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης : το πλήρες συνθετικό μέσο καλλιέργειας στο οποίο αναπτύσσονται τα φύκη δοκιμής, όταν εκτίθενται στην υπό δοκιμή χημική ουσία. Η υπό δοκιμή χημική ουσία διαλύεται, κατά κανόνα, στο θρεπτικό μέσο δοκιμής.

Ρυθμός ανάπτυξης (μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης): η λογαριθμική αύξηση της βιομάζας κατά την περίοδο έκθεσης.

Κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης (LOEC) : η χαμηλότερη ελεγχθείσα συγκέντρωση στην οποία παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης (με p < 0,05) υπό την επίδραση της χημικής ουσίας, σε σύγκριση με τον μάρτυρα, εντός δεδομένου χρόνου έκθεσης. Ωστόσο, όλες οι συγκεντρώσεις δοκιμής που υπερβαίνουν τη LOEC πρέπει να έχουν βλαβερή επίδραση ίση ή μεγαλύτερη από εκείνη που παρατηρείται στη LOEC. Σε περίπτωση που δεν είναι δυνατόν να πληρούνται οι δύο αυτοί όροι, πρέπει να εξηγείται πλήρως ο τρόπος επιλογής της LOEC (και, κατ' επέκταση, της NOEC).

Συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC) : η συγκέντρωση δοκιμής που είναι αμέσως μικρότερη από τη LOEC.

Μεταβλητή απόκρισης : μεταβλητή για την εκτίμηση της τοξικότητας, η οποία προκύπτει, με διάφορες μεθόδους υπολογισμού, από κάθε μετρούμενη παράμετρο που περιγράφει τη βιομάζα. Για την παρούσα μέθοδο δοκιμών, οι ρυθμοί ανάπτυξης και η απόδοση είναι μεταβλητές απόκρισης που προκύπτουν από τη μέτρηση της βιομάζας απευθείας ή μέσω οποιασδήποτε από τις αναφερόμενες παραμέτρους υποκατάστασης.

Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης : μεταβλητή απόκρισης η οποία ορίζεται ως το πηλίκο της διαφοράς των φυσικών λογαρίθμων μιας παρατηρούμενης παραμέτρου (στην παρούσα μέθοδο δοκιμών, της βιομάζας) προς το αντίστοιχο χρονικό διάστημα.

Υπό δοκιμή χημική ουσία : κάθε ουσία ή μείγμα που υποβάλλεται σε δοκιμή με τη χρήση της παρούσας μεθόδου δοκιμών.

Απόδοση : η τιμή μετρούμενης μεταβλητής στο τέλος της περιόδου έκθεσης μείον την τιμή της ίδιας μεταβλητής στην αρχή της περιόδου έκθεσης, διαφορά που εκφράζει την αύξηση της βιομάζας κατά τη διάρκεια της δοκιμής.

Προσάρτημα 2

ΣΤΕΛΕΧΗ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΑΠΟΔΕΙΧΘΕΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΓΙΑ ΤΗ ΔΟΚΙΜΗ

Πράσινα φύκη

 

Pseudokirchneriella subcapitata (παλαιότερα γνωστό ως Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (παλαιότερα γνωστό ως Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG

Διάτομα

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Κυανοβακτηρίδια

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Πηγές στελεχών

Τα συνιστώμενα στελέχη διατίθενται ως μονοκαλλιέργειες φυκών από τις ακόλουθες συλλογές (με αλφαβητική σειρά):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

ΗΠΑ

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

ΗΝΩΜΕΝΟ ΒΑΣΙΛΕΙΟ

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

University of Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

ΓΕΡΜΑΝΙΑ

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

ΗΠΑ.

Εμφάνιση και χαρακτηριστικά των συνιστώμενων ειδών

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Εμφάνιση

Καμπύλα, συστραμμένα μεμονωμένα κύτταρα

Ωοειδή, ως επί το πλείστον μεμονωμένα κύτταρα

Ράβδοι ή βέργες

Αλυσίδες ωοειδών κυττάρων

Ράβδοι ή βέργες

Διαστάσεις (μήκος × πλάτος) μm

8-14 × 2-3

7-15 × 3-12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Κυτταρικός όγκος (μm3/κύτταρο)

40-60 (2)

60-80 (2)

40-50 (2)

30-40 (2)

2,5 (3)

Κυτταρικό ξηρό βάρος (mg/κύτταρο)

2-3 × 10– 8

3-4 × 10– 8

3-4 × 10– 8

1-2 × 10– 8

2-3 × 10– 9

Ρυθμός ανάπτυξης (4) (ημέρα– 1)

1,5-1,7

1,2-1,5

1,4

1,1-1,4

2,0 – 2,4

Ειδικές συστάσεις για την καλλιέργεια και τον χειρισμό των συνιστώμενων για τη δοκιμή ειδών

Pseudokirchneriella subcapitata και Desmodesmus subspicatus

Τα συγκεκριμένα πράσινα φύκη είναι γενικά εύκολο να διατηρηθούν σε διάφορα μέσα καλλιέργειας. Πληροφορίες σχετικά με τα κατάλληλα θρεπτικά μέσα διατίθενται από τις συλλογές καλλιεργειών. Τα κύτταρα είναι κατά κανόνα μεμονωμένα, ενώ η κυτταρική πυκνότητα μπορεί να μετρηθεί εύκολα με ηλεκτρονικό μετρητή σωματιδίων ή μικροσκόπιο.

Anabaena flos-aquae

Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν διάφορα θρεπτικά μέσα για τη διατήρηση μητρικών καλλιεργειών. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό να μην αφήνεται η ασυνεχής καλλιέργεια να αναπτυχθεί πέραν της λογαριθμικής φάσης κατά την ανανέωση, επειδή η ανάκτηση είναι δύσκολη στο σημείο αυτό.

Το Anabaena flos-aquae σχηματίζει συσσωματώματα από επικαλυπτόμενες αλυσίδες κυττάρων. Το μέγεθος των συσσωματωμάτων αυτών μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με τις συνθήκες καλλιέργειας. Όταν χρησιμοποιείται μικροσκοπική καταμέτρηση ή ηλεκτρονικός μετρητής σωματιδίων για τον προσδιορισμό της βιομάζας, ενδέχεται να απαιτείται θραύση των εν λόγω συσσωματωμάτων.

Για τη θραύση των αλυσίδων, προκειμένου να μειωθεί η μεταβλητότητα του αριθμού κυττάρων, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί η επίδραση ηχητικών κυμάτων. Η εφαρμογή ηχητικών κυμάτων για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα από το απαιτούμενο για τη θραύση των αλυσίδων σε μικρότερα τεμάχια είναι δυνατόν να καταστρέψει τα κύτταρα. Η ένταση των ηχητικών κυμάτων και η διάρκεια της επίδρασής τους πρέπει να είναι πανομοιότυπες σε κάθε αγωγή.

Καταμετρώνται στο αιμοκυτταρόμετρο αρκετά πεδία (τουλάχιστον 400 κύτταρα) για να διευκολυνθεί η αντιστάθμιση της μεταβλητότητας. Με τον τρόπο αυτό, βελτιώνεται η αξιοπιστία των μικροσκοπικών προσδιορισμών της πυκνότητας.

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ηλεκτρονικός μετρητής σωματιδίων για τον προσδιορισμό του συνολικού κυτταρικού όγκου των φυκών Anabaena μετά τη θραύση των αλυσίδων κυττάρων με επιμελή εφαρμογή ηχητικών κυμάτων. Η ενέργεια των ηχητικών κυμάτων πρέπει να ρυθμίζεται, ώστε να αποτρέπεται η διάρρηξη των κυττάρων.

Χρησιμοποιείται μαγνητικός αναδευτήρας (vortex) ή ανάλογη κατάλληλη μέθοδος για να εξασφαλιστούν η καλή ανάμειξη και η ομοιογένεια του εναιωρήματος φυκών με το οποίο εμβολιάζονται τα δοχεία δοκιμής.

Τα δοχεία δοκιμής θα πρέπει να τοποθετούνται σε περιστροφικές ή παλινδρομικές τράπεζες ανακίνησης, ρυθμισμένες σε ταχύτητα περίπου 150 στροφών ανά λεπτό. Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η περιοδική ανακίνηση, προκειμένου να περιορίζεται η τάση του Anabaena να σχηματίζει συστάδες. Εάν σχηματιστούν συστάδες, πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε τα δείγματα για τις μετρήσεις της βιομάζας να είναι αντιπροσωπευτικά. Για τη διάσπαση των συστάδων των φυκών, μπορεί να χρειαστεί ζωηρή ανακίνηση πριν από τη δειγματοληψία.

Synechococcus leopoliensis

Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν διάφορα θρεπτικά μέσα για τη διατήρηση μητρικών καλλιεργειών. Πληροφορίες σχετικά με τα κατάλληλα θρεπτικά μέσα παρέχονται από τις συλλογές καλλιεργειών.

Το Synechococcus leopoliensis αναπτύσσεται σε μεμονωμένα ραβδοειδή κύτταρα. Τα κύτταρα είναι πολύ μικρά, γεγονός που περιπλέκει τη χρήση μικροσκοπικής καταμέτρησης για τον προσδιορισμό της βιομάζας. Οι ηλεκτρονικοί μετρητές σωματιδίων που είναι κατάλληλα εξοπλισμένοι για την καταμέτρηση σωματιδίων μεγέθους περίπου 1 μm είναι χρήσιμοι. Μπορούν επίσης να εφαρμοστούν μετρήσεις φθορισμού in vitro.

Navicula pelliculosa

Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν διάφορα θρεπτικά μέσα για τη διατήρηση μητρικών καλλιεργειών. Πληροφορίες σχετικά με τα κατάλληλα θρεπτικά μέσα παρέχονται από τις συλλογές καλλιεργειών. Σημειωτέον ότι το θρεπτικό μέσο απαιτείται να περιέχει πυριτικό άλας.

Το Navicula pelliculosa ενδέχεται να σχηματίσει συσσωματώματα υπό ορισμένες συνθήκες καλλιέργειας. Λόγω της παραγωγής λιπιδίων, τα κύτταρα των φυκών τείνουν μερικές φορές να συσσωρεύονται στο επιφανειακό υμένιο. Στις περιπτώσεις αυτές, πρέπει να εφαρμόζονται ειδικά μέτρα κατά τη λήψη των επιμέρους δειγμάτων για τον προσδιορισμό της βιομάζας, ώστε τα δείγματα που λαμβάνονται να είναι αντιπροσωπευτικά. Ενδέχεται να απαιτείται ζωηρή ανατάραξη, π.χ. με τη χρήση μαγνητικού αναδευτήρα.

Προσάρτημα 3

Θρεπτικά μέσα

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα από τα ακόλουθα δύο θρεπτικά μέσα:

Το θρεπτικό μέσο του ΟΟΣΑ: το πρωτότυπο θρεπτικό μέσο της κατευθυντήριας γραμμής TG 201 του ΟΟΣΑ, σύμφωνο επίσης με το πρότυπο ISO 8692·

Το θρεπτικό μέσο AAP της EPA (Υπηρεσία Προστασίας Περιβάλλοντος των ΗΠΑ), σύμφωνο επίσης με την ASTM.

Κατά την παρασκευή των ανωτέρω θρεπτικών μέσων πρέπει να χρησιμοποιούνται χημικές ουσίες καθαρότητας αντιδραστηρίου ή αναλυτικής καθαρότητας και απιονισμένο νερό.

Σύνθεση του θρεπτικού μέσου AAP (US EPA) και του θρεπτικού μέσου της TG 201 του ΟΟΣΑ

Συστατικό

AAP

ΟΟΣΑ

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0.000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 · 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

Η μοριακή αναλογία του EDTA προς τον σίδηρο υπερβαίνει ελαφρά τη μονάδα. Με τον τρόπο αυτό, αποτρέπεται η καθίζηση σιδήρου και, ταυτόχρονα, ελαχιστοποιείται ο σχηματισμός χηλικών συμπλόκων των ιόντων βαρέων μετάλλων.

Στη δοκιμή με το διάτομο Navicula pelliculosa πρέπει να προστίθεται Na2SiO3 · 9H20 και στα δύο θρεπτικά μέσα, ώστε να επιτυγχάνεται συγκέντρωση 1,4 mg Si/l.

Το pH του θρεπτικού μέσου επιτυγχάνεται στην κατάσταση ισορροπίας μεταξύ του ανθρακικού συστήματος του μέσου και της μερικής πίεσης του CO2 στον ατμοσφαιρικό αέρα. Το pH στους 25 °C συνδέεται, κατά προσέγγιση, με τη μοριακή συγκέντρωση όξινων ανθρακικών ιόντων με τη σχέση:

pHeq = 11,30 + log[HCO3]

Με 15 mg NaHCO3/l επιτυγχάνεται pHeq = 7,5 (θρεπτικό μέσο US EPA) και με 50 mg NaHCO3/l επιτυγχάνεται pHeq = 8,1 (θρεπτικό μέσο ΟΟΣΑ).

Στοιχειακή σύνθεση των θρεπτικών μέσων δοκιμής

Στοιχείο

AAP

ΟΟΣΑ

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Παρασκευή του θρεπτικού μέσου του ΟΟΣΑ

Θρεπτικό στοιχείο

Συγκέντρωση στο διάλυμα παρακαταθήκης

Διάλυμα παρακαταθήκης 1:

μακροθρεπτικά συστατικά

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Διάλυμα παρακαταθήκης 2:

σίδηρος

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Διάλυμα παρακαταθήκης 3:

ιχνοστοιχεία

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Διάλυμα παρακαταθήκης 4:

όξινο ανθρακικό άλας

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Τα διαλύματα παρακαταθήκης αποστειρώνονται με διήθηση μέσω μεμβράνης (μέση διάμετρος πόρων 0,2 μm) ή σε αυτόκαυστο (120 °C, 15 λεπτά). Τα διαλύματα φυλάσσονται στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία 4 °C.

Τα διαλύματα παρακαταθήκης 2 και 4 πρέπει να μην αποστειρώνονται σε αυτόκαυστο αλλά με διήθηση μέσω μεμβράνης.

Παρασκευάζεται θρεπτικό μέσο με την προσθήκη κατάλληλου όγκου των διαλυμάτων παρακαταθήκης 1-4 σε νερό:

 

Σε 500 ml αποστειρωμένου νερού προστίθενται:

 

10 ml διαλύματος παρακαταθήκης 1

 

1 ml διαλύματος παρακαταθήκης 2

 

1 ml διαλύματος παρακαταθήκης 3

 

1 ml διαλύματος παρακαταθήκης 4

 

Συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 1 000 ml με αποστειρωμένο νερό.

Το θρεπτικό μέσο αφήνεται να φθάσει σε κατάσταση ισορροπίας με το ατμοσφαιρικό CO2 για επαρκή χρόνο — εάν είναι απαραίτητο, με τη διοχέτευση φυσαλίδων στείρου φιλτραρισμένου αέρα για μερικές ώρες.

Παρασκευή του θρεπτικού μέσου US EPA

1.

Σε περίπου 900 ml απιονισμένου ή απεσταγμένου νερού προστίθεται 1 ml από κάθε διάλυμα παρακαταθήκης 2.1–2.7 και το σύνολο αραιώνεται μέχρι το 1 λίτρο.

2.

Τα διαλύματα παρακαταθήκης μακροθρεπτικών συστατικών παρασκευάζονται με διάλυση των ακόλουθων ουσιών σε 500 ml απιονισμένου ή απεσταγμένου νερού. Τα αντιδραστήρια 2.1, 2.2, 2.3 και 2.4 είναι δυνατόν να συνδυαστούν σε ένα ενιαίο διάλυμα παρακαταθήκης.

2.1

NaNO3

12,750 g.

2.2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g.

2.3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g.

2.4

Διάλυμα παρακαταθήκης μακροθρεπτικών συστατικών (βλ. 3).

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g.

2.6

K2HPO4

0,522 g.

2.7

NaHCO3

7,500 g.

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

Βλ. σημείωση 1.

Σημειωση 1: Χρησιμοποιείται μόνο για τα είδη διατόμων. Μπορεί να προστίθεται κατευθείαν (202,4 mg) ή μέσω διαλύματος παρακαταθήκης, κατά τρόπο ώστε η τελική συγκέντρωση Si στο θρεπτικό μέσο να είναι 20 mg/l.

3.

Το διάλυμα παρακαταθήκης μικροθρεπτικών συστατικών παρασκευάζεται με διάλυση των ακόλουθων ουσιών σε 500 ml απιονισμένου ή απεσταγμένου νερού:

3.1

H3BO3

92,760 mg.

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg.

3.3

ZnCl2

1,635 mg.

3.4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg.

3.5

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg.

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg.

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg.

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg. [(αιθυλενοδινιτριλο)τετραοξικό νάτριο].

3.9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg Βλ. σημείωση 2.

Σημειωση 2: Χρησιμοποιείται μόνο στο θρεπτικό μέσο για μητρικές καλλιέργειες ειδών διατόμων.

4.

Ρυθμίζεται το pH στην τιμή 7,5 ± 0,1 με διάλυμα NaOH ή HCl 0,1 N ή 1,0 N.

5.

Το θρεπτικό μέσο διηθείται σε στείρο υποδοχέα μέσω είτε διηθητικής μεμβράνης των 0,22μm, εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί μετρητής σωματιδίων, είτε ηθμού των 0,45μm, εάν δεν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί μετρητής σωματιδίων.

6.

Το θρεπτικό μέσο φυλάσσεται στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία περίπου 4 °C, μέχρι να χρησιμοποιηθεί.

Προσάρτημα 4

Παράδειγμά διαδικασίας για την καλλιέργειά φυκών

Γενικές παρατηρήσεις

Σκοπός της καλλιέργειας με την ακόλουθη διαδικασία είναι να ληφθούν καλλιέργειες φυκών για δοκιμές τοξικότητας.

Πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλες μέθοδοι, ώστε να εξασφαλίζεται ότι οι καλλιέργειες φυκών δεν θα μολυνθούν από βακτηρίδια. Μπορεί να είναι επιθυμητές οι αξενικές (χωρίς παρουσία ξένων οργανισμών) καλλιέργειες, αλλά πρέπει να παρασκευάζονται και να χρησιμοποιούνται μονοκαλλιέργειες φυκών.

Όλες οι εργασίες πρέπει να εκτελούνται υπό στείρες συνθήκες, ώστε να αποφεύγεται η μόλυνση με βακτηρίδια και άλλα φύκη.

Εξοπλισμός και υλικά

Βλ. μέθοδο δοκιμών: σημείο “Εργαστηριακός εξοπλισμός”.

Διαδικασίες για τη λήψη καλλιεργειών φυκών

Παρασκευή θρεπτικών διαλυμάτων (θρεπτικών μέσων):

Όλα τα θρεπτικά άλατα του θρεπτικού μέσου παρασκευάζονται ως συμπυκνωμένα διαλύματα παρακαταθήκης και αποθηκεύονται στο σκοτάδι και υπό ψύξη. Τα διαλύματα αυτά αποστειρώνονται με διήθηση ή σε αυτόκαυστο.

Το θρεπτικό μέσο παρασκευάζεται με την προσθήκη της ενδεδειγμένης ποσότητας διαλύματος παρακαταθήκης σε στείρο απεσταγμένο νερό, με μέριμνα για την αποφυγή μολύνσεων. Όταν πρόκειται για στερεό μέσο, προστίθεται άγαρ σε αναλογία 0,8 τοις εκατό.

Μητρική καλλιέργεια:

Οι μητρικές καλλιέργειες είναι μικρές καλλιέργειες φυκών που μεταφέρονται τακτικά σε πρόσφατα παρασκευασμένο θρεπτικό μέσο για να δράσουν ως αρχικό υλικό δοκιμής. Εάν οι καλλιέργειες δεν χρησιμοποιούνται τακτικά, φέρονται σε σωλήνες με άγαρ υπό κλίση. Μεταφέρονται σε πρόσφατα παρασκευασμένο θρεπτικό μέσο τουλάχιστον ανά δίμηνο.

Οι μητρικές καλλιέργειες αναπτύσσονται σε κωνικές φιάλες που περιέχουν το κατάλληλο θρεπτικό μέσο (όγκος περίπου 100 ml). Όταν τα φύκη επωάζονται στους 20 °C με συνεχή φωτισμό, απαιτείται μεταφορά μία φορά την εβδομάδα.

Κατά τη μεταφορά, ποσότητα “παλαιάς” καλλιέργειας μεταφέρεται με αποστειρωμένα σιφώνια σε φιάλη με πρόσφατα παρασκευασμένο θρεπτικό μέσο, έτσι ώστε με τα είδη ταχείας ανάπτυξης η αρχική συγκέντρωση να είναι περίπου 100 φορές μικρότερη από ό,τι στην παλαιά καλλιέργεια.

Ο ρυθμός ανάπτυξης ενός είδους μπορεί να προσδιοριστεί από την καμπύλη ανάπτυξης. Εάν αυτή είναι γνωστή, μπορεί να εκτιμηθεί η πυκνότητα στην οποία η καλλιέργεια θα πρέπει να μεταφερθεί σε νέο θρεπτικό μέσο. Ο σχετικός υπολογισμός πρέπει να γίνεται προτού η καλλιέργεια φθάσει στη φάση θανάτου.

Προκαλλιέργεια:

Η προκαλλιέργεια προορίζεται να προσφέρει την κατάλληλη ποσότητα φυκών για τον εμβολιασμό των καλλιεργειών δοκιμής. Η προκαλλιέργεια επωάζεται υπό τις συνθήκες δοκιμής και χρησιμοποιείται ενώ βρίσκεται ακόμη στην εκθετική φάση ανάπτυξης, κατά κανόνα έπειτα από περίοδο επώασης 2-4 ημερών. Όταν οι καλλιέργειες φυκών περιέχουν παραμορφωμένα ή ανώμαλα κύτταρα, πρέπει να απορρίπτονται.

Προσάρτημα 5

Ανάλυσή δεδομένων με μη γραμμική παλινδρόμησή

Γενικές παρατηρήσεις

Η απόκριση κατά τις δοκιμές σε φύκη και τις λοιπές δοκιμές μικροβιακής ανάπτυξης — αύξηση της βιομάζας — είναι εκ φύσεως συνεχής ή μετρική μεταβλητή: συνίσταται σε ταχύτητα διεργασίας, εάν χρησιμοποιείται ο ρυθμός ανάπτυξης, και στο ολοκλήρωμά της ως προς τον χρόνο, εάν έχει επιλεγεί η βιομάζα. Και τα δύο συσχετίζονται με την αντίστοιχη μέση απόκριση ταυτόσημων καλλιεργειών ελέγχου που δεν έχουν εκτεθεί στην ουσία και παρουσιάζουν μέγιστη απόκριση στις επιβαλλόμενες συνθήκες — κατά τη δοκιμή σε φύκη, το φως και η θερμοκρασία αποτελούν τους πρωταρχικούς καθοριστικούς παράγοντες. Το σύστημα είναι κατανεμημένο ή ομοιογενές και η βιομάζα μπορεί να θεωρηθεί ως ένα συνεχές, χωρίς να λαμβάνονται υπόψη τα επιμέρους κύτταρα. Για το σύστημα αυτό, η κατανομή της διασποράς του τύπου απόκρισης συνδέεται μόνο με τους πειραματικούς παράγοντες (περιγράφεται τυπικά από τη λογαριθμοκανονική ή την κανονική κατανομή του σφάλματος). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τις τυπικές αποκρίσεις των βιοδοκιμασιών με δεδομένα που δέχονται μόνο δύο τιμές, όπου η ανοχή (με τυπική διωνυμική κατανομή) των επιμέρους οργανισμών υποτίθεται συχνά ότι είναι η κυρίαρχη συνιστώσα της διασποράς. Οι αποκρίσεις του μάρτυρα, εν προκειμένω, είναι μηδέν ή στο επίπεδο υποβάθρου.

Στην απλή περίπτωση, η κανονικοποιημένη ή σχετική απόκριση, r, μειώνεται με μονοτονία από το 1 (μηδενική αναστολή) έως το 0 (100 % αναστολή). Σημειωτέον ότι όλες οι αποκρίσεις ενέχουν σφάλμα και ότι φαινόμενη αρνητική αναστολή είναι δυνατόν να υπολογιστεί μόνο ως επακόλουθο τυχαίου σφάλματος.

Ανάλυση παλινδρόμησης

Μοντέλα

Σκοπός της ανάλυσης παλινδρόμησης είναι να περιγραφεί ποσοτικά η καμπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης με τη μορφή μαθηματικής συνάρτησης παλινδρόμησης Y = f(C) ή, συνηθέστερα, F (Z), όπου Z = log C. Η εφαρμογή της αντίστροφης συνάρτησης, C = f– 1 (Y), επιτρέπει τον υπολογισμό των τιμών της ECx, όπως των EC50, EC10 και EC20, καθώς και των οικείων ορίων εμπιστοσύνης 95 %. Έχει αποδειχθεί ότι οι σχέσεις συγκέντρωσης-απόκρισης που προκύπτουν από τις δοκιμές αναστολής της ανάπτυξης φυκών περιγράφονται επιτυχώς από διάφορες απλές μαθηματικές συναρτήσεις. Στις συναρτήσεις αυτές περιλαμβάνονται, π.χ., η λογιστική εξίσωση, η ασύμμετρη εξίσωση του Weibull και η συνάρτηση της λογαριθμοκανονικής κατανομής — όλες σιγμοειδείς καμπύλες που τείνουν ασυμπτωτικά προς το μηδέν, όταν C → 0, και προς το ένα, όταν C → άπειρο.

Τελευταία, προτείνεται η χρήση μοντέλων συνεχούς συνάρτησης ορίου (π.χ. μοντέλο Kooijman για την αναστολή της ανάπτυξης πληθυσμού, Kooijman et al. 1996) αντί των ασυμπτωτικών μοντέλων. Τα μοντέλα αυτά βασίζονται στην υπόθεση ότι δεν υπάρχουν επιδράσεις σε συγκεντρώσεις κάτω από ένα όριο, EC0 +, το οποίο υπολογίζεται με προεκβολή της καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης μέχρι να τέμνει τον άξονα των συγκεντρώσεων, με την εφαρμογή απλής συνεχούς συνάρτησης που δεν είναι διαφορίσιμη στο αρχικό σημείο.

Σημειωτέον ότι η ανάλυση μπορεί να συνίσταται σε απλή ελαχιστοποίηση των αθροισμάτων των τετραγώνων των καταλοίπων (με την παραδοχή σταθερής διασποράς) ή των σταθμισμένων τετραγώνων, εάν αντισταθμίζεται η ετερογένεια της διασποράς.

Διαδικασία

Η διαδικασία μπορεί να συνοψιστεί ως εξής: Επιλέγεται η κατάλληλη συναρτησιακή εξίσωση, Y = f(C), και προσαρμόζεται στα δεδομένα με μη γραμμική παλινδρόμηση. Χρησιμοποιούνται, κατά προτίμηση, οι μετρήσεις από κάθε επιμέρους φιάλη αντί των μέσων τιμών των επαναλήψεων, ώστε να αντληθούν όσο το δυνατόν περισσότερες πληροφορίες από τα δεδομένα. Από την άλλη πλευρά, σε περίπτωση μεγάλης διασποράς, η πρακτική εμπειρία έχει δείξει ότι οι μέσες τιμές των επαναλήψεων είναι δυνατόν να οδηγήσουν σε ακριβέστερη μαθηματική εκτίμηση, επηρεαζόμενη σε μικρότερο βαθμό από τα συστηματικά σφάλματα των δεδομένων, απ' ό,τι η εκτίμηση με κάθε επιμέρους σημείο δεδομένων που έγινε δεκτό.

Σχεδιάζεται το διάγραμμα της προσαρμοσμένης καμπύλης και των δεδομένων των μετρήσεων και εξετάζεται κατά πόσον η προσαρμογή της καμπύλης είναι η ενδεδειγμένη. Ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο για τον σκοπό αυτό μπορεί να είναι η ανάλυση των καταλοίπων. Εάν η συναρτησιακή σχέση που επιλέχθηκε για την προσαρμογή της καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης δεν περιγράφει ικανοποιητικά το σύνολο της εν λόγω καμπύλης ή κάποιο ουσιώδες τμήμα της, όπως την απόκριση σε χαμηλές συγκεντρώσεις, επιλέγεται άλλη δυνατότητα προσαρμογής της καμπύλης — π.χ. ασύμμετρη καμπύλη, όπως η συνάρτηση Weibull, αντί της συμμετρικής. Η αρνητική αναστολή ενδέχεται να αποτελέσει πρόβλημα, π.χ. με τη συνάρτηση της λογαριθμοκανονικής κατανομής, το οποίο απαιτεί ομοίως εναλλακτική συνάρτηση παλινδρόμησης. Δεν συνιστάται να δίνεται στις αρνητικές αυτές τιμές η τιμή μηδέν ή μικρή θετική τιμή, γιατί αυτό στρεβλώνει την κατανομή του σφάλματος. Για τον υπολογισμό των τιμών ECχαμηλόx μπορεί να ενδείκνυνται χωριστές προσαρμογές σε τμήματα της καμπύλης, όπως εκείνο που αντιστοιχεί στο χαμηλό επίπεδο αναστολής. Από την προσαρμοσμένη εξίσωση υπολογίζονται [με “αντίστροφη επίλυση”, C = f– 1(Y)] χαρακτηριστικές σημειακές τιμές της ECx και αναφέρονται τουλάχιστον η EC50 και μία ή δύο εκτιμήσεις ECχαμηλόx. Η πρακτική εμπειρία από τη διενέργεια δοκιμών έχει δείξει ότι, κατά κανόνα, η ακρίβεια της μεθόδου δοκιμών σε φύκη επιτρέπει εύλογα ακριβείς εκτιμήσεις στο επίπεδο αναστολής 10 %, εάν επαρκούν τα σημεία δεδομένων — εκτός εάν εμφανιστεί διέγερση στις χαμηλές συγκεντρώσεις ως παράγοντας σύγχυσης. Συχνά, η ακρίβεια εκτίμησης της EC20 είναι σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη της EC10, επειδή η EC20 βρίσκεται συνήθως στο σχεδόν ευθύγραμμο τμήμα της κεντρικής καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η ερμηνεία της EC10 είναι δυνατόν να παρουσιάζει δυσκολίες, λόγω της διέγερσης της ανάπτυξης. Για τον λόγο αυτό, μολονότι η EC10 προκύπτει κατά κανόνα με επαρκή ακρίβεια, συνιστάται να αναφέρεται πάντα και η EC20.

Συντελεστές στάθμισης

Επειδή η πειραματική διασπορά δεν είναι γενικά σταθερή και, συνήθως, περιλαμβάνει μια αναλογική συνιστώσα, αποτελεί πλεονέκτημα η συστηματική διενέργεια σταθμισμένης παλινδρόμησης. Κατά κανόνα, για την ανάλυση αυτή υποτίθεται ότι οι συντελεστές στάθμισης είναι αντιστρόφως ανάλογοι της διασποράς:

Wi = 1/Var(ri)

Πολλά προγράμματα παλινδρόμησης παρέχουν τη δυνατότητα ανάλυσης της σταθμισμένης παλινδρόμησης, περιλαμβάνοντας πίνακα με τους συντελεστές στάθμισης. Για λόγους διευκόλυνσης, οι συντελεστές στάθμισης θα πρέπει να κανονικοποιούνται πολλαπλασιαζόμενοι επί n/Σ wi (όπου n είναι ο αριθμός των σημείων δεδομένων), ώστε το άθροισμά τους να ισούται με τη μονάδα.

Κανονικοποίηση των αποκρίσεων

Η κανονικοποίηση με βάση τη μέση τιμή απόκρισης των μαρτύρων δημιουργεί ορισμένα προβλήματα αρχής και οδηγεί σε σχετικά περίπλοκη δομή της διασποράς. Η διαίρεση των αποκρίσεων διά του μέσου όρου των αποκρίσεων των μαρτύρων, ώστε να ληφθεί η εκατοστιαία αναστολή, εισάγει ένα πρόσθετο σφάλμα, οφειλόμενο στο σφάλμα του μέσου όρου των μαρτύρων. Εάν το σφάλμα αυτό δεν είναι αμελητέο, οι συντελεστές στάθμισης και τα όρια εμπιστοσύνης της παλινδρόμησης πρέπει να διορθωθούν, ώστε να ληφθεί υπόψη η συνδιασπορά με τον μάρτυρα (Draper και Smith, 1981). Σημειωτέον ότι η μεγάλη ακρίβεια στην εκτίμηση της μέσης τιμής της απόκρισης των μαρτύρων έχει σημασία για την ελαχιστοποίηση της συνολικής διασποράς της σχετικής απόκρισης. Η διασπορά αυτή υπολογίζεται ως εξής:

(Ο δείκτης i αναφέρεται στο επίπεδο συγκέντρωσης i και ο δείκτης 0 στους μάρτυρες.)

Yi = σχετική απόκριση = ri/r0 = 1 –I = f(Ci)

με διασπορά Var(Y i) = Var ( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

και αφού (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 και (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2

με κανονική κατανομή των δεδομένων και με επαναλήψεις mi και m0: Var(ri ) = σ2/mi

η συνολική διασπορά της σχετικής απόκρισης Yi λαμβάνει λοιπόν τη μορφή:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

Το σφάλμα στον μέσο όρο των μαρτύρων είναι αντιστρόφως ανάλογο προς την τετραγωνική ρίζα του αριθμού των επαναλήψεων μαρτύρων από τον οποίο εξήχθη ο μέσος όρος. Ως εκ τούτου, μερικές φορές δικαιολογείται η προσθήκη ιστορικών δεδομένων, με την οποία περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό το σφάλμα. Μια εναλλακτική διαδικασία συνίσταται στη μη κανονικοποίηση των δεδομένων και στην προσαρμογή των απόλυτων τιμών απόκρισης, συμπεριλαμβανομένης της τιμής της απόκρισης του μάρτυρα, η οποία όμως εισάγεται ως πρόσθετη παράμετρος για προσαρμογή με μη γραμμική παλινδρόμηση. Με τη συνήθη διπαραμετρική εξίσωση παλινδρόμησης, η μέθοδος αυτή απαιτεί την προσαρμογή τριών παραμέτρων και, συνεπώς, περισσότερα σημεία δεδομένων από τη μη γραμμική παλινδρόμηση σε δεδομένα που έχουν κανονικοποιηθεί με τη χρήση προκαθορισμένης απόκρισης μάρτυρα.

Αντίστροφα διαστήματα εμπιστοσύνης

Ο υπολογισμός διαστημάτων εμπιστοσύνης στη μη γραμμική παλινδρόμηση με αντίστροφη επίλυση είναι σχετικά πολύπλοκος και δεν διατίθεται ως βασική επιλογή στα συνήθη στατιστικά προγράμματα υπολογιστών. Κατά προσέγγιση όρια εμπιστοσύνης είναι δυνατόν να ληφθούν από τα τυποποιημένα προγράμματα μη γραμμικής παλινδρόμησης με αναπαραμετροποίηση (Bruce και Versteeg, 1992), η οποία περιλαμβάνει νέα γραφή της μαθηματικής εξίσωσης, με τις επιθυμητές εκτιμήσεις σημείων, π.χ. EC10 και EC50, ως παραμέτρους προς υπολογισμό. [Έστω η εξίσωση I = f (α, β, συγκέντρωση) στην οποία το f (α, β, συγκέντρωση) αντικαθίσταται με την ισοδύναμη συνάρτηση g (EC10, EC50, συγκέντρωση) με χρήση των σχέσεων ορισμού f (α, β, EC10) = 0,1 και f (α, β, EC50) = 0,5.

Πιο άμεσος υπολογισμός (Andersen et al, 1998) εκτελείται με τη διατήρηση της αρχικής εξίσωσης και τη χρήση αναπτύγματος Taylor γύρω από τις μέσες τιμές των ri και r0.

Πρόσφατα, άρχισαν να χρησιμοποιούνται ευρέως οι μέθοδοι bootstrap. Στις μεθόδους αυτές χρησιμοποιούνται τα δεδομένα από τις μετρήσεις και η συχνή νέα δειγματοληψία, η οποία κατευθύνεται από γεννήτρια τυχαίων αριθμών, για την εκτίμηση εμπειρικής κατανομής της διασποράς.

ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, Νέα Υόρκη.

Bruce, R..D. and Versteeg,, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

»

4)

Το κεφάλαιο Γ.11 αντικαθίσταται από το εξής κείμενο:

«

Γ.11.   ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΙΛΥΣ, ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΑΝΑΠΝΟΗΣ (ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΑΝΘΡΑΚΑ ΚΑΙ ΑΜΜΩΝΙΟΥ)

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 209 του ΟΟΣΑ (2010). Με τη μέθοδο που περιγράφεται προσδιορίζεται η επίδραση μιας χημικής ουσίας στους μικροοργανισμούς ενεργοποιημένης ιλύος (κυρίως, βακτήρια) με μέτρηση του ρυθμού αναπνοής τους (οξείδωση άνθρακα και/ή αμμωνίου) υπό καθορισμένες συνθήκες, με την παρουσία διάφορων συγκεντρώσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Η μέθοδος δοκιμών βασίζεται στη δοκιμή της ETAD (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing industry) (1)(2), στην προηγούμενη κατευθυντήρια γραμμή (TG) 209 του ΟΟΣΑ (3) και στο αναθεωρημένο πρότυπο ISO 8192 (4). Σκοπός της μεθόδου αυτής είναι να προσφέρει ταχεία μέθοδο εξέτασης με την οποία να είναι δυνατόν να εκτιμηθούν οι επιδράσεις των χημικών ουσιών στους μικροοργανισμούς της ενεργοποιημένης ιλύος κατά το βιολογικό (αερόβιο) στάδιο καθαρισμού στις εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων. Τα αποτελέσματα της δοκιμής μπορούν επίσης να λειτουργήσουν ως δείκτης των κατάλληλων μη ανασταλτικών συγκεντρώσεων των υπό δοκιμή χημικών ουσιών που πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε δοκιμές βιοαποικοδομησιμότητας (π.χ. κεφάλαια Γ.4 A-ΣΤ, Γ.9, Γ.10, Γ.12 και Γ.29 του παρόντος παραρτήματος, TG 302C του ΟΟΣΑ). Στην περίπτωση αυτή, η δοκιμή μπορεί να εκτελεστεί ως δοκιμή διαλογής, παρόμοια με τη δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών ή με την οριακή δοκιμή (βλ. σημείο 39), λαμβανομένης υπόψη μόνο της συνολικής αναπνοής. Ωστόσο, τα στοιχεία αυτά θα πρέπει να αντιμετωπίζονται με προσοχή όταν πρόκειται για δοκιμές άμεσης βιοαποικοδομησιμότητας (κεφάλαια Γ.4 A-ΣΤ και Γ.29 του παρόντος παραρτήματος), για τις οποίες η συγκέντρωση του ενοφθαλμίσματος είναι σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη που χρησιμοποιείται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών. Πράγματι, η απουσία αναστολής στη συγκεκριμένη δοκιμή αναπνοής δεν συνεπάγεται αυτομάτως μη ανασταλτικές συνθήκες στη δοκιμή άμεσης βιοαποικοδομησιμότητας των κεφαλαίων Γ.4 A-ΣΤ ή Γ.29 του παρόντος παραρτήματος.

2.

Γενικά, η δοκιμή αναστολής της αναπνοής φαίνεται ότι έχει εφαρμοστεί με επιτυχία από τότε που δημοσιεύτηκε για πρώτη φορά αλλά, σε ορισμένες περιπτώσεις, αναφέρθηκαν εσφαλμένα αποτελέσματα, π.χ. (2) (4) (5). Οι καμπύλες αναπνοής σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση είναι ενίοτε διφασικές, οι καμπύλες δόσης-απόκρισης έχουν παραμορφωθεί και οι τιμές EC50 κυμαίνονται σε μη αναμενόμενα χαμηλά επίπεδα (5). Έρευνες έχουν δείξει ότι αυτά τα αποτελέσματα λαμβάνονται όταν η ενεργοποιημένη ιλύς που χρησιμοποιείται στη δοκιμή νιτροποιείται σημαντικά και η υπό δοκιμή χημική ουσία έχει μεγαλύτερη επίδραση στην οξείδωση του αμμωνίου απ' ό,τι στη γενική ετεροτροφική οξείδωση. Κατά συνέπεια, τα εσφαλμένα αποτελέσματα μπορεί να διορθωθούν με τη διενέργεια επιπλέον δοκιμών στις οποίες θα χρησιμοποιείται ειδικός αναστολέας νιτροποίησης. Εάν προσδιοριστεί ο ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου με και χωρίς τον εν λόγω αναστολέα, π.χ. την N-αλλυλοθειουρία (ATU), μπορούν να υπολογιστούν οι αντίστοιχοι ρυθμοί πρόσληψης οξυγόνου κατά τη συνολική, ετεροτροφική οξείδωση και τη νιτροποίηση (4) (7) (8). Με τον τρόπο αυτό, μπορούν να προσδιοριστούν οι ανασταλτικές επιδράσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στις δύο διεργασίες και μπορούν να υπολογιστούν, με τον συνήθη τρόπο, οι τιμές EC50 τόσο για την οξείδωση οργανικού άνθρακα (ετεροτροφική οξείδωση) όσο και για την οξείδωση αμμωνίου (νιτροποίηση). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, σε σπάνιες περιπτώσεις, η ανασταλτική επίδραση της N-αλλυλοθειουρίας μπορεί να εξουδετερωθεί εν μέρει ή πλήρως εάν δημιουργηθούν σύμπλοκα με υπό δοκιμή χημικές ουσίες ή συμπληρώματα του θρεπτικού μέσου, π.χ. ιόντα Cu++ (6). Τα ιόντα Cu++ είναι ιδιαίτερα σημαντικά για το βακτήριο Nitrosomonas, αλλά είναι τοξικά σε υψηλότερη συγκέντρωση.

3.

Η νιτροποίηση κατά την αερόβια επεξεργασία λυμάτων συνιστά απαραίτητο στάδιο για την απομάκρυνση αζωτούχων ενώσεων από λύματα μέσω απονίτρωσης αέριων προϊόντων. Η ανάγκη αυτής της διεργασίας έχει καταστεί πιεστική ιδιαίτερα στις ευρωπαϊκές χώρες. Η ΕΕ έχει πλέον θεσπίσει χαμηλότερα όρια όσον αφορά τη συγκέντρωση αζώτου στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα που απορρίπτονται στους υδάτινους αποδέκτες (5).

4.

Στις περισσότερες περιπτώσεις, η μέθοδος που εκτιμά μόνο την επίδραση στις διεργασίες οξείδωσης οργανικού άνθρακα είναι κατάλληλη. Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, απαιτείται εξέταση της επίδρασης μόνο στη νιτροποίηση, ή στη νιτροποίηση και την οξείδωση οργανικού άνθρακα χωριστά, προκειμένου να ερμηνευθούν τα αποτελέσματα και να κατανοηθούν οι επιδράσεις.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ

5.

Οι ρυθμοί αναπνοής των δειγμάτων ενεργοποιημένης ιλύος που τροφοδοτούνται με συνθετικά απόβλητα μετρώνται σε ερμητικά κλειστή κυψελίδα που περιέχει ηλεκτρόδιο οξυγόνου έπειτα από χρόνο επαφής 3 ωρών. Με βάση ένα ρεαλιστικό σενάριο έκθεσης, θα μπορούσαν να ενδείκνυνται μεγαλύτεροι χρόνοι επαφής. Εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία βιοαποικοδομείται γρήγορα –π.χ. αβιοτικά μέσω υδρόλυσης– ή είναι πτητική και η συγκέντρωση δεν είναι δυνατόν να διατηρηθεί σταθερή, μπορεί να χρησιμοποιείται επιπλέον μια συντομότερη περίοδος έκθεσης, π.χ. 30 λεπτών. Η ευαισθησία κάθε παρτίδας ενεργοποιημένης ιλύος θα πρέπει να ελέγχεται με τη βοήθεια κατάλληλης χημικής ουσίας αναφοράς την ημέρα της έκθεσης. Κατά κανόνα, η δοκιμή χρησιμοποιείται για να προσδιοριστεί η ECx (π.χ. η EC50) της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και/ή η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίπτωσης (NOEC).

6.

Η αναστολή πρόσληψης οξυγόνου από μικροοργανισμούς που οξειδώνουν τον οργανικό άνθρακα μπορεί να εκφράζεται χωριστά από την αναστολή πρόσληψης οξυγόνου από μικροοργανισμούς που οξειδώνουν το αμμώνιο, εάν μετρηθούν οι ρυθμοί πρόσληψης οξυγόνου με και χωρίς την N-αλλυλοθειουρία, έναν ειδικό αναστολέα της οξείδωσης του αμμωνίου σε νιτρώδη από τα νιτροποιητικά βακτήρια πρώτου σταδίου. Στην περίπτωση αυτή, η εκατοστιαία αναστολή του ρυθμού πρόσληψης οξυγόνου υπολογίζεται με τη σύγκριση του ρυθμού πρόσληψης οξυγόνου παρουσία της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και του μέσου ρυθμού πρόσληψης οξυγόνου των αντίστοιχων μαρτύρων που δεν περιέχουν την υπό δοκιμή χημική ουσία, τόσο με όσο και χωρίς τον ειδικό αναστολέα, την N-αλλυλοθειουρία.

7.

Τυχόν πρόσληψη οξυγόνου που προκύπτει από αβιοτικές διεργασίες μπορεί να ανιχνευθεί με τον προσδιορισμό του ρυθμού της σε μείγματα που περιλαμβάνουν την υπό δοκιμή χημική ουσία, θρεπτικό μέσο συνθετικών αποβλήτων και νερό, και δεν περιλαμβάνουν ενεργοποιημένη ιλύ.

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟ ΔΟΚΙΜΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ

8.

Για να είναι δυνατή η ορθή ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να είναι γνωστά η ταυτοποίηση (κατά προτίμηση, ο αριθμός CAS), η ονομασία (IUPAC), τα χαρακτηριστικά καθαρότητας, υδατοδιαλυτότητας, τάσης ατμών, πτητικότητας και προσρόφησης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Κατά κανόνα, οι πτητικές χημικές ουσίες μπορούν να ελεγχθούν επαρκώς μόνο εάν λαμβάνονται ειδικές προφυλάξεις (βλ. σημείο 21).

ΕΦΑΡΜΟΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ

9.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών εφαρμόζεται σε υδατοδιαλυτές, δυσδιάλυτες και πτητικές χημικές ουσίες. Ωστόσο, ενδέχεται να μην είναι πάντα δυνατόν να ληφθούν οι τιμές EC50 με χημικές ουσίες περιορισμένης διαλυτότητας, ενώ έγκυρα αποτελέσματα με πτητικές χημικές ουσίες μπορούν να ληφθούν μόνο υπό τον όρο ότι το μεγαλύτερο μέρος (π.χ. > 80 %) της υπό δοκιμή χημικής ουσίας παραμένει στο μείγμα της αντίδρασης στο τέλος της(των) περιόδου(-ων) έκθεσης. Όταν υπάρχει αμφιβολία ως προς τη σταθερότητα ή την πτητικότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, θα πρέπει να υποβάλλονται επιπλέον αναλυτικά στοιχεία, ώστε να προσδιορίζεται ακριβέστερα η συγκέντρωση ECx.

ΧΗΜΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ

10.

Οι χημικές ουσίες αναφοράς θα πρέπει να ελέγχονται περιοδικά, ώστε να διασφαλίζεται η αξιοπιστία της μεθόδου δοκιμών και των συνθηκών δοκιμής, και να ελέγχεται η ευαισθησία κάθε παρτίδας ενεργοποιημένης ιλύος που χρησιμοποιείται ως μικροβιακό ενοφθάλμισμα την ημέρα της έκθεσης. Ως αναστολέας αναφοράς συνιστάται η χημική ουσία 3,5-διχλωροφαινόλη (3,5-DCP), αφού είναι γνωστός αναστολέας της αναπνοής και χρησιμοποιείται σε πολλούς τύπους δοκιμών αναστολής/τοξικότητας (4). Επίσης, ως χημική ουσία αναφοράς μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο πενταένυδρος θειικός χαλκός (II), για την αναστολή της ολικής αναπνοής (9). Η N-μεθυλανιλίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ειδική χημική ουσία αναφοράς για την αναστολή νιτροποίησης (4).

ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΜΟΤΗΤΑ

11.

Ο ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου των τυφλών μαρτύρων (που δεν περιέχουν την υπό δοκιμή χημική ουσία ή χημική ουσία αναφοράς) δεν θα πρέπει να είναι μικρότερος από 20 mg οξυγόνου ανά γραμμάριο ενεργοποιημένης ιλύος (ξηρό βάρος των αιωρούμενων στερεών) ανά ώρα. Εάν ο ρυθμός είναι χαμηλότερος, η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται με πλυμένη ενεργοποιημένη ιλύ ή με ιλύ από άλλη πηγή. Ο συντελεστής μεταβολής του ρυθμού πρόσληψης οξυγόνου στις επαναλήψεις ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 30 % στο τέλος της οριστικής δοκιμής.

12.

Στο πλαίσιο διεθνούς δοκιμής δακτυλίου (ring test) που διοργανώθηκε το 2004 από τον ISO (4) και κατά την οποία χρησιμοποιήθηκε ενεργοποιημένη ιλύς προερχόμενη από οικιακά λύματα, διαπιστώθηκε ότι η EC50 της 3,5-DCP κυμαινόταν μεταξύ 2 mg/l και 25 mg/l για τη ολική αναπνοή, μεταξύ 5 mg/l και 40 mg/l για την ετεροτροφική αναπνοή και μεταξύ 0,1 mg/l και 10 mg/l για την αναπνοή κατά τη νιτροποίηση. Εάν η EC50 της 3,5-DCP δεν βρίσκεται εντός του αναμενόμενου εύρους τιμών, η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται με ενεργοποιημένη ιλύ από άλλη πηγή. Η EC50 του πενταένυδρου θειικού χαλκού (II) θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 53 και 155 mg/l για την ολική αναπνοή (9).

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ

Δοχεία και συσκευές δοκιμής

13.

Θα πρέπει να χρησιμοποιείται ο συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός, καθώς και τα εξής:

α)

δοχεία δοκιμής — π.χ. ποτήρια ζέσεως 1 000 ml που θα περιέχουν 500 ml μείγματος της αντίδρασης (βλ. 5 στο σχήμα 1)·

β)

κυψελίδες και συνδετήρες για τη μέτρηση της συγκέντρωσης του διαλυμένου οξυγόνου· κατάλληλο ηλεκτρόδιο οξυγόνου· ερμητικά κλειστή κυψελίδα η οποία θα περιέχει το δείγμα χωρίς υπερκείμενο χώρο και θα διαθέτει καταγραφέα (π.χ. 7, 8, 9 στο σχήμα 1 του προσαρτήματος 2)· εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιείται φιάλη BOD με κατάλληλο προσαρμοστικό κολάρο ώστε το ηλεκτρόδιο οξυγόνου να συγκρατείται στον λαιμό της φιάλης (βλ. σχήμα 2 του προσαρτήματος 3). Για να αποφευχθεί η απώλεια υγρού λόγω υπερχείλισης κατά την εισαγωγή του ηλεκτροδίου οξυγόνου, συνιστάται να εισάγεται στην αρχή χοάνη ή γυάλινος σωλήνας μέσω του κολάρου, ή να χρησιμοποιούνται δοχεία με διευρυμένο περιστόμιο. Και στις δύο περιπτώσεις, θα πρέπει να χρησιμοποιείται μαγνητικός αναδευτήρας ή εναλλακτική μέθοδος ανάδευσης, π.χ. αυτοκινούμενος ανιχνευτήρας ανάδευσης·

γ)

μαγνητικοί αναδευτήρες και μαγνητικές ράβδοι (καλυμμένες με αδρανές υλικό), που χρησιμοποιούνται στον θάλαμο μέτρησης και/ή στα δοχεία δοκιμής·

δ)

διάταξη αερισμού: εάν είναι αναγκαίο, ο συμπιεσμένος αέρας θα πρέπει να διέλθει μέσα από κατάλληλο φίλτρο, ώστε να απομακρυνθούν σκόνες και έλαια, και μέσα από φιάλες έκπλυσης που περιέχουν νερό, ώστε να υγροποιηθεί. Το περιεχόμενο των δοχείων θα πρέπει να αεριστεί με σιφώνια Pasteur, ή άλλες διατάξεις αερισμού, που δεν απορροφούν χημικές ουσίες. Μπορεί να χρησιμοποιείται ανακινητήρας ελλειψοειδούς κίνησης ο οποίος να λειτουργεί με ταχύτητες μεταξύ 150 και 250 rpm με φιάλες χωρητικότητας, π.χ. 2 000 ml, ώστε να καλύπτεται το απαιτούμενο οξυγόνο για την ιλύ και να παρακάμπτονται οι δυσκολίες που οφείλονται σε χημικές ουσίες που προκαλούν υπερβολικό αφρισμό, είναι πτητικές και, ως εκ τούτου, χάνονται, ή είναι δύσκολο να διασπαρούν με διαβίβαση αέρα. Κατά κανόνα, το σύστημα δοκιμής αποτελείται από μια σειρά ποτηριών ζέσεως που αερίζονται συνεχώς και τοποθετούνται διαδοχικά (π.χ. ανά διαστήματα των περίπου 10 - 15 λεπτών) και στη συνέχεια αναλύονται διαδοχικά. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιείται επικυρωμένος εξοπλισμός που επιτρέπει τον ταυτόχρονο αερισμό και τη μέτρηση του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου στα μείγματα·

ε)

πεχάμετρο·

στ)

φυγόκεντρος, απλή επιτραπέζια φυγόκεντρος για ιλύ, με μέγιστη ταχύτητα 10 000 m/s2.

Αντιδραστήρια

14.

Αντιδραστήρια αναλυτικής καθαρότητας θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής.

Νερό

15.

Θα πρέπει να χρησιμοποιείται απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό, το οποίο να περιέχει λιγότερο από 1 mg/l DOC, εκτός εάν ορίζεται ρητά η χρήση νερού βρύσης χωρίς χλώριο.

Συνθετικά απόβλητα

16.

Το θρεπτικό μέσο θα πρέπει να παρασκευάζεται ώστε να περιέχει τα ακόλουθα συστατικά στις αναφερόμενες ποσότητες:

πεπτόνη

16 g

εκχύλισμα κρέατος (ή συγκρίσιμο φυτικό εκχύλισμα)

11 g

ουρία

3 g

χλωριούχο νάτριο (NaCl)

0,7 g

διένυδρο χλωριούχο ασβέστιο (CaC12 · 2H2O)

0,4 g

επταένυδρο θειικό μαγνήσιο (MgSO4 · 7H2O)

0,2 g

άνυδρο όξινο φωσφορικό κάλιο (K2HPO4)

2,8 g

απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό έως 1 λίτρο

 

17.

Το pH αυτού του διαλύματος θα πρέπει να είναι 7,5 ± 0,5. Εάν το παρασκευαζόμενο θρεπτικό μέσο δεν χρησιμοποιείται αμέσως, θα πρέπει να φυλάσσεται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία 0 °C έως 4 °C, για μέγιστο διάστημα 1 εβδομάδας ή υπό συνθήκες που δεν αλλοιώνουν τη σύνθεσή του. Θα πρέπει να επισημανθεί ότι τα συγκεκριμένα συνθετικά απόβλητα είναι 100 φορές πυκνότερα από αυτά που περιγράφονται στην τεχνική έκθεση του ΟΟΣΑ “Προτεινόμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό της βιοαποικοδομησιμότητας των επιφανειοδραστικών ουσιών που χρησιμοποιούνται στα συνθετικά απορρυπαντικά” (11 Ιουνίου 1976), με την προσθήκη επιπλέον μονόξινου φωσφορικού καλίου.

18.

Εναλλακτικά, τα συστατικά του θρεπτικού μέσου μπορούν να αποστειρώνονται χωριστά πριν από τη φύλαξή τους, ή μπορεί να προστίθενται η πεπτόνη και το εκχύλισμα κρέατος λίγο πριν από την εκτέλεση της δοκιμής. Το θρεπτικό μέσο, προτού χρησιμοποιηθεί, θα πρέπει να αναμειγνύεται πλήρως και, αν κρίνεται αναγκαίο, να προσαρμόζεται η τιμή του pH στο 7,5 ± 0,5.

Υπό δοκιμή χημική ουσία

19.

Σε περίπτωση εύκολα υδατοδιαλυτών υπό δοκιμή χημικών ουσιών, θα πρέπει να παρασκευάζεται διάλυμα παρακαταθήκης μόνο μέχρι το μέγιστο όριο υδατοδιαλυτότητας (οι καθιζήσεις δεν είναι αποδεκτές). Σε περίπτωση δυσδιάλυτων στο νερό ουσιών, τα μείγματα ουσιών με διαφορετική υδατοδιαλυτότητα και οι προσροφητικές ουσίες θα πρέπει να ζυγίζονται απευθείας στα δοχεία δοκιμής. Σ' αυτές τις περιπτώσεις, η χρήση διαλυμάτων παρακαταθήκης μπορεί να αποτελεί εναλλακτική, εάν διαλυμένες συγκεντρώσεις των υπό δοκιμή χημικών ουσιών προσδιορίζονται αναλυτικά στα δοχεία δοκιμής (πριν από την προσθήκη της ενεργοποιημένης ιλύος). Εάν παρασκευάζονται κλάσματα περιεχόμενα στο νερό (WAF), ο αναλυτικός προσδιορισμός των διαλυμένων συγκεντρώσεων των υπό δοκιμή χημικών ουσιών στα δοχεία δοκιμής είναι επίσης ουσιώδης. Θα πρέπει να αποφεύγεται η χρήση οργανικών διαλυτών, μέσων διασποράς ή γαλακτωματοποιητών για να βελτιωθεί η διαλυτότητα. Όταν υπάρχουν αρκετά στοιχεία σχετικά με τη σταθερότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας υπό αυτές τις συνθήκες, είναι δυνατόν να γίνεται υπερήχηση στα διαλύματα παρακαταθήκης και προηγούμενη ανάδευση στα εναιωρήματα, π.χ. ολονυκτίως.

20.

Η υπό δοκιμή χημική ουσία μπορεί να επηρεάσει αρνητικά το pH στο σύστημα δοκιμής. Πριν από την εκτέλεση της δοκιμής, θα πρέπει να προσδιορίζεται το pH των μειγμάτων που υφίστανται αγωγή με την υπό δοκιμή χημική ουσία, στο πλαίσιο προκαταρκτικής δοκιμασίας, για να βεβαιωθεί κατά πόσον είναι αναγκαίο να προσαρμοστεί το pH πριν από την κυρίως δοκιμή και, ξανά, κατά την ημέρα της κυρίως δοκιμής. Τα διαλύματα/εναιωρήματα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο νερό θα πρέπει να εξουδετερώνονται πριν από την προσθήκη ενοφθαλμίσματος, αν κρίνεται αναγκαίο. Ωστόσο, επειδή η εξουδετέρωση μπορεί να μεταβάλει τις χημικές ιδιότητες της υπό δοκιμή ουσίας, θα μπορούσε να διενεργούνται περαιτέρω δοκιμές, ανάλογα με τους σκοπούς της μελέτης, ώστε να εκτιμάται η επίδραση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην ιλύ χωρίς προσαρμογή του pH.

21.

Οι τοξικές επιδράσεις των πτητικών χημικών ουσιών, ιδίως σε δοκιμές κατά τις οποίες διοχετεύεται στο σύστημα αέριο με τη μορφή φυσαλίδων, μπορούν να ποικίλλουν σε ένταση λόγω απωλειών της ουσίας κατά την περίοδο έκθεσης. Θα πρέπει να δίνεται προσοχή όταν πρόκειται για τις ουσίες αυτές, δηλ. να διενεργείται ειδική ανάλυση των εν λόγω ουσιών στα μείγματα ελέγχου που τις περιέχουν και να τροποποιείται το σύστημα αερισμού.

Χημική ουσία αναφοράς

22.

Εάν χρησιμοποιείται ως χημική ουσία αναφοράς η 3,5-διχλωροφαινόλη, θα πρέπει να παρασκευάζεται διάλυμα 1,00 g 3,5-διχλωροφαινόλης σε 1 000 ml νερού (15). Θα πρέπει να χρησιμοποιείται θερμό νερό και/ή υπερήχηση για να επιταχυνθεί η διάλυση· το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι χαραγής, αφού θα έχει ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ωστόσο, θα πρέπει να βεβαιώνεται ότι δεν έχει μεταβληθεί η δομή της χημικής ουσίας αναφοράς. Το pH του διαλύματος θα πρέπει να ελέγχεται και, αν είναι αναγκαίο, να προσαρμόζεται σε pH 7 - 8 με NaOH ή H2SO4.

23.

Εάν χρησιμοποιείται ως χημική ουσία αναφοράς πενταένυδρος θειικός χαλκός (II), χρησιμοποιούνται συγκεντρώσεις 58 mg/l, 100 mg/l και 180 mg/l (συντελεστής 1,8). Η ουσία ζυγίζεται απευθείας στα δοχεία δοκιμής (29 - 50 - 90 mg για συνολικό όγκο 500 ml). Στη συνέχεια, διαλύεται σε 234 ml νερού βρύσης αποστειρωμένου σε αυτόκαυστο. Ο πενταένυδρος θειικός χαλκός (II) είναι ευδιάλυτη ουσία. Κατά την έναρξη της δοκιμής, προστίθενται 16 ml συνθετικών αποβλήτων και 250 ml ενεργοποιημένης ιλύος.

Ειδικός αναστολέας της νιτροποίησης

24.

Θα πρέπει να παρασκευάζεται διάλυμα παρακαταθήκης N-αλλυλοθειουρίας (ATU) 2,32 g/l. Με την προσθήκη 2,5 ml αυτού του διαλύματος παρακαταθήκης σε μείγμα επώασης τελικού όγκου 500 ml προκύπτει τελική συγκέντρωση 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), η οποία είναι γνωστό ότι επαρκεί (4) για να προκαλέσει 100 % αναστολή της νιτροποίησης σε νιτροποιητική ενεργοποιημένη ιλύ που περιέχει 1,5 g/l αιωρούμενα στερεά.

Αβιοτικοί μάρτυρες

25.

Σε σπάνιες περιπτώσεις, μια υπό δοκιμή χημική ουσία με ισχυρές αναγωγικές ιδιότητες ενδέχεται να προκαλέσει μετρήσιμη αβιοτική κατανάλωση οξυγόνου. Σ' αυτές τις περιπτώσεις, οι αβιοτικοί μάρτυρες είναι αναγκαίοι για να γίνεται διάκριση μεταξύ της αβιοτικής πρόσληψης οξυγόνου από την υπό δοκιμή χημική ουσία και της μικροβιακής αναπνοής. Οι αβιοτικοί μάρτυρες μπορούν να παρασκευάζονται με αφαίρεση του ενοφθαλμίσματος από τα μείγματα δοκιμής. Ομοίως, μπορούν να συμπεριλαμβάνονται αβιοτικοί μάρτυρες χωρίς ενοφθάλμισμα, όταν διενεργούνται υποστηρικτικές αναλυτικές μετρήσεις για να προσδιοριστεί η επιτευχθείσα συγκέντρωση κατά τη φάση έκθεσης της δοκιμής, π.χ. όταν χρησιμοποιούνται διαλύματα παρακαταθήκης δυσδιάλυτων στο νερό χημικών ουσιών των οποίων τα συστατικά παρουσιάζουν διαφορετική υδατοδιαλυτότητα. Σε συγκεκριμένες περιπτώσεις, μπορεί να είναι αναγκαίο να παρασκευαστεί αβιοτικός μάρτυρας με αποστειρωμένο ενοφθάλμισμα (π.χ. με αυτόκαυστο ή με την προσθήκη αποστειρωτικών τοξικών ουσιών). Ορισμένες χημικές ουσίες μπορούν να παράγουν ή να καταναλώνουν οξυγόνο μόνο εάν η αντιδρώσα επιφάνεια είναι αρκετά μεγάλη, ακόμα και αν συνήθως απαιτούν πολύ υψηλότερη θερμοκρασία ή πίεση για να γίνει η αντίδραση. Ως προς αυτό, θα πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στα υπεροξέα. Το αποστειρωμένο ενοφθάλμισμα παρέχει μεγάλη επιφάνεια.

Ενοφθάλμισμα

26.

Για γενική χρήση, η ενεργοποιημένη ιλύς θα πρέπει να συλλέγεται από την έξοδο της δεξαμενής αερισμού, ή κοντά στην έξοδο της δεξαμενής, σε έναν σταθμό επεξεργασίας λυμάτων σε καλή κατάσταση λειτουργίας ο οποίος επεξεργάζεται, κατά κύριο λόγο, οικιακά λύματα. Με βάση τον σκοπό της δοκιμής, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλοι κατάλληλοι τύποι ή πηγές ενεργοποιημένης ιλύος, όπως π.χ. η ιλύς που έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριο, σε ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις αιωρούμενων στερεών 2 g/l έως 4 g/l. Ωστόσο, οι τύποι ιλύος που προέρχονται από διαφορετικές εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων είναι πιθανό να εμφανίζουν διαφορετικά χαρακτηριστικά και διαφορετικό βαθμό ευαισθησίας.

27.

Η ιλύς μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη μορφή με την οποία συλλέγεται, αλλά θα πρέπει να απομακρύνονται τα χονδρόκοκκα σωματίδια με καθίζηση για σύντομο χρονικό διάστημα, π.χ. 5 έως 15 λεπτά, και απόχυση της υπερκείμενης στιβάδας που αποτελείται από λεπτότερα σωματίδια ή με κοσκίνισμα (π.χ. με μέγεθος οπής 1 mm2). Εναλλακτικά, η ιλύς μπορεί να ομογενοποιείται σε αναμείκτη για περίπου 15 δευτερόλεπτα ή περισσότερο, αλλά απαιτείται προσοχή όσον αφορά τις δυνάμεις διάτμησης και τη μεταβολή της θερμοκρασίας που μπορεί να επέλθει σε περίπτωση ανάμειξης για μεγάλο χρονικό διάστημα.

28.

Η έκπλυση της ιλύος είναι συχνά αναγκαία, π.χ. αν ο ρυθμός της ενδογενούς αναπνοής είναι βραδύς. Η ιλύς θα πρέπει, στην αρχή, να φυγοκεντρείται έως ότου παραχθούν καθαρό υπερκείμενο υγρό και συσσωματώματα στερεών σωματιδίων αποβλήτων, π.χ. 10 λεπτά σε περίπου 10 000 m/s2. Το υπερκείμενο υγρό θα πρέπει να απορρίπτεται και η ιλύς θα πρέπει να επανεναιωρείται με ανατάραξη σε νερό βρύσης που δεν περιέχει χλώριο και, στη συνέχεια, το νερό έκπλυσης θα πρέπει να απομακρύνεται με επαναφυγοκέντρηση και εκ νέου απόρριψη. Η διαδικασία έκπλυσης και φυγοκέντρησης θα πρέπει να επαναλαμβάνεται, αν κρίνεται αναγκαίο. Θα πρέπει να προσδιορίζεται η ξηρή μάζα γνωστού όγκου της ιλύος που έχει επανεναιωρηθεί, η οποία συμπυκνώνεται με την αφαίρεση υγρού ή διαλύεται περαιτέρω σε νερό βρύσης που δεν περιέχει χλώριο για να επιτευχθεί η απαιτούμενη συγκέντρωση στερών σωματιδίων της ιλύος, δηλ. 3 g/l. Η ενεργοποιημένη ιλύς θα πρέπει να αερίζεται συνεχώς (π.χ. 2 l/λεπτό) στη θερμοκρασία της δοκιμής και, όταν είναι δυνατό, να χρησιμοποιείται την ημέρα της συλλογής. Εάν αυτό δεν είναι δυνατόν, η ιλύς θα πρέπει να τροφοδοτείται καθημερινά με θρεπτικό υλικό από συνθετικά απόβλητα (50 ml θρεπτικό υλικό από συνθετικά απόβλητα ανά λίτρο ενεργοποιημένης ιλύος) για δύο επιπλέον ημέρες. Ακολούθως, η ιλύς χρησιμοποιείται για τη δοκιμή και τα αποτελέσματα θεωρούνται έγκυρα, υπό τον όρο ότι δεν έχει επέλθει καμία σημαντική μεταβολή στη δραστηριότητά της, με βάση τον ρυθμό της ενδογενούς ετεροτροφικής αναπνοής της και της αναπνοής της κατά τη νιτροποίηση.

29.

Μπορεί να ανακύψουν δυσκολίες κατά την επώαση, σε περίπτωση αφρισμού σε τέτοιον βαθμό ώστε ο αφρός και τα στερεά σωματίδια της ιλύος που αυτός μεταφέρει να υπερχειλίζουν τα δοχεία αερισμού. Ενίοτε, ο αφρισμός μπορεί απλώς να προκαλείται από την παρουσία των συνθετικών αποβλήτων, αλλά αφρισμός θα πρέπει να αναμένεται σε περίπτωση που η υπό δοκιμή χημική ουσία είναι, ή περιέχει, επιφανειοδραστική ουσία. Η απώλεια στερεών σωματιδίων της ιλύος στα μείγματα δοκιμής θα έχει ως αποτέλεσμα τεχνητά μειωμένους ρυθμούς αναπνοής, οι οποίοι θα μπορούσαν εσφαλμένα να εκληφθούν ως αποτέλεσμα αναστολής. Επιπλέον, ο αερισμός διαλύματος επιφανειοδραστικών ουσιών συγκεντρώνει την επιφανειοδραστική ουσία στο στρώμα του αφρού· η απώλεια αφρού από το σύστημα της δοκιμής θα ελαττώσει τις συγκεντρώσεις έκθεσης. Ο αφρισμός μπορεί να ελέγχεται με απλές μηχανικές μεθόδους (π.χ. περιστασιακή ανάδευση με το χέρι με τη χρήση γυάλινης ράβδου) ή με την προσθήκη αντιαφριστικού παράγοντα σε μορφή σιλικονούχου γαλακτώματος που δεν περιέχει επιφανειοδραστική ουσία και/ή με την εφαρμογή της μεθόδου αερισμού με ανακίνηση των φιαλών. Εάν το πρόβλημα συνδέεται με την παρουσία των συνθετικών αποβλήτων, η σύνθεση των αποβλήτων θα πρέπει να τροποποιείται με την προσθήκη αντιαφριστικού παράγοντα σε αναλογία, π.χ., 50 μl/l. Εάν ο αφρισμός οφείλεται στην υπό δοκιμή χημική ουσία, η ποσότητα που απαιτείται για την ελάττωση του αφρού θα πρέπει να προσδιορίζεται στη μέγιστη συγκέντρωση δοκιμής και, στη συνέχεια, κάθε μεμονωμένο δοχείο αερισμού θα πρέπει να υποβάλλεται σε πανομοιότυπη αγωγή (συμπεριλαμβανομένων εκείνων που δεν περιέχουν αφρό, όπως οι τυφλοί μάρτυρες και τα δοχεία αναφοράς). Εάν χρησιμοποιούνται αντιαφριστικοί παράγοντες, δεν θα πρέπει να υπάρχει αλληλεπίδραση με το ενοφθάλμισμα και/ή την υπό δοκιμή χημική ουσία.

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ

30.

Η αναστολή μπορεί να προσδιοριστεί για τρεις διαφορετικούς τύπους πρόσληψης οξυγόνου: την ολική, την αμιγώς ετεροτροφική και την οφειλόμενη στη νιτροποίηση. Κατά κανόνα, η μέτρηση της αναστολής της ολικής πρόσληψης οξυγόνου θα πρέπει να επαρκεί. Οι επιδράσεις που έχουν η οξείδωση οργανικού άνθρακα και η οξείδωση αμμωνίου στην ετεροτροφική πρόσληψη οξυγόνου πρέπει να προσδιορίζονται όταν υπάρχει ειδική απαίτηση για τα δύο αυτά χωριστά τελικά σημεία σε σχέση με συγκεκριμένη χημική ουσία ή (κατά περίπτωση) για να ερμηνευθούν άτυπες καμπύλες δόσης-απόκρισης όσον αφορά την αναστολή της ολικής πρόσληψης οξυγόνου.

Συνθήκες δοκιμής

31.

Η δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία 20 ± 2 °C.

Μείγματα δοκιμής

32.

Τα μείγματα δοκιμής (εμφανίζονται ως FT στον πίνακα 1) που περιέχουν νερό, θρεπτικό υλικό από συνθετικά απόβλητα και την υπό δοκιμή χημική ουσία θα πρέπει να παρασκευάζονται ώστε να λαμβάνονται διαφορετικές ονομαστικές συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (βλ. πίνακα 1 για ενδεικτικές τιμές όγκου των συστατικών). Το pH θα πρέπει να προσαρμόζεται στο 7,5 ± 0,5, αν είναι αναγκαίο. Τα μείγματα θα πρέπει να διαλύονται με νερό και το ενοφθάλμισμα θα πρέπει να προστίθεται για να ληφθούν ίσοι τελικοί όγκοι στα δοχεία και να ξεκινήσει ο αερισμός.

Μείγματα αναφοράς

33.

Τα μείγματα (FR) θα πρέπει να παρασκευάζονται με τη χημική ουσία αναφοράς, π.χ. 3,5-διχλωροφαινόλη, αντί της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, κατά τον ίδιο τρόπο με τα μείγματα δοκιμής.

Τυφλοί μάρτυρες

34.

Οι τυφλοί μάρτυρες (FB) θα πρέπει να παρασκευάζονται στην αρχή και στο τέλος της περιόδου έκθεσης, όταν πρόκειται για δοκιμές στις οποίες τα ποτήρια ζέσεως τοποθετούνται διαδοχικά ανά διαστήματα. Όταν εκτελούνται δοκιμές που χρησιμοποιούν εξοπλισμό ο οποίος επιτρέπει την ταυτόχρονη μέτρηση της κατανάλωσης οξυγόνου, θα πρέπει να συμπεριλαμβάνονται τουλάχιστον δύο τυφλοί μάρτυρες σε κάθε παρτίδα ταυτόχρονης ανάλυσης. Οι τυφλοί μάρτυρες περιέχουν ίσο όγκο ενεργοποιημένης ιλύος και συνθετικού θρεπτικού μέσου, αλλά δεν περιέχουν την υπό δοκιμή χημική ουσία ή τη χημική ουσία αναφοράς. Θα πρέπει να διαλύονται με νερό στον ίδιο όγκο με τα μείγματα δοκιμής και αναφοράς.

Αβιοτικοί μάρτυρες

35.

Εάν είναι απαραίτητο, για παράδειγμα εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία είναι γνωστό ή πιθανολογείται ότι έχει ισχυρές αναγωγικές ιδιότητες, θα πρέπει να παρασκευάζεται μείγμα FA, για να μετράται η αβιοτική κατανάλωση οξυγόνου. Το μείγμα θα πρέπει να περιέχει τις ίδιες ποσότητες υπό δοκιμή χημικής ουσίας και θρεπτικού υλικού από συνθετικά απόβλητα και τον ίδιο όγκο με τα μείγματα δοκιμής, αλλά να μην περιέχει ενεργοποιημένη ιλύ.

Γενική διαδικασία και μετρήσεις

36.

Τα μείγματα δοκιμής, τα μείγματα αναφοράς και οι τυφλοί και οι αβιοτικοί μάρτυρες επωάζονται στη θερμοκρασία δοκιμής υπό συνθήκες αναγκαστικού αερισμού (0,5 - 1 l/min), ώστε να διατηρείται η συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου πάνω από το 60 - 70 % του κορεσμού και να διατηρούνται οι κροκίδες ιλύος σε εναιώρημα. Η ανάδευση των καλλιεργειών είναι επίσης απαραίτητη για να διατηρούνται οι κροκίδες ιλύος σε εναιώρημα. Η επώαση θεωρείται ότι ξεκινά όταν το ενοφθάλμισμα της ενεργοποιημένης ιλύος έρχεται για πρώτη φορά σε επαφή με τα άλλα συστατικά του τελικού μείγματος. Στο τέλος της επώασης, μετά τους καθορισμένους χρόνους έκθεσης, οι οποίοι διαρκούν συνήθως 3 ώρες, τα δείγματα λαμβάνονται για να μετρηθεί ο ρυθμός με τον οποίο μειώνεται η συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου στην κυψελίδα που προορίζεται για τον συγκεκριμένο σκοπό (σχήμα 2 του προσαρτήματος 3) ή σε πλήρως γεμάτη φιάλη BOD. Ο τρόπος με τον οποίο ξεκινά η επώαση εξαρτάται επίσης από τη χωρητικότητα του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται για να μετρηθούν οι ρυθμοί κατανάλωσης οξυγόνου. Για παράδειγμα, εάν περιλαμβάνει έναν μόνο αισθητήρα οξυγόνου, οι μετρήσεις πραγματοποιούνται μεμονωμένα. Στην περίπτωση αυτή, θα πρέπει να παρασκευάζονται τα διάφορα μείγματα που είναι αναγκαία για τη δοκιμή με συνθετικά απόβλητα, χωρίς να προστίθεται το ενοφθάλμισμα, και οι απαιτούμενες ποσότητες ιλύος θα πρέπει να προστίθενται σε κάθε δοχείο της σειράς. Κάθε επώαση θα πρέπει να ξεκινά με τη σειρά, ανά κατάλληλα χρονικά διαστήματα, π.χ. 10 έως 15 λεπτών. Εναλλακτικά, το σύστημα μέτρησης μπορεί να περιλαμβάνει περισσότερους από έναν αισθητήρες οι οποίοι διευκολύνουν τις πολλαπλές ταυτόχρονες μετρήσεις· σ' αυτή την περίπτωση, το εμβόλιο μπορεί να προστίθεται την ίδια στιγμή στις κατάλληλες ομάδες δοχείων.

37.

Η ονομαστική συγκέντρωση ενεργοποιημένης ιλύος σε όλα τα δείγματα δοκιμής και αναφοράς και στους τυφλούς (αλλά όχι αβιοτικούς) μάρτυρες είναι 1,5 g/l των αιωρούμενων στερεών. Η κατανάλωση οξυγόνου θα πρέπει να μετράται έπειτα από έκθεση 3 ωρών. Κατά περίπτωση, θα πρέπει να διενεργούνται μετρήσεις έπειτα από επιπλέον έκθεση διάρκειας 30 λεπτών, όπως περιγράφεται προηγουμένως στο σημείο 5.

Νιτροποιητική ικανότητα της ιλύος

38.

Για να αποφασιστεί κατά πόσον η ιλύς έχει την ικανότητα να νιτροποιεί και, εάν ναι, με ποιο ρυθμό, θα πρέπει να παρασκευαστούν μείγματα (FB), όπως τα μείγματα τυφλών μαρτύρων και τα άλλα μείγματα “ελέγχου” (FN), τα οποία όμως περιέχουν επίσης N-αλλυλοθειουρία σε αναλογία 11,6 mg/l. Τα μείγματα θα πρέπει να αερίζονται και να επωάζονται σε θερμοκρασία 20 °C ± 2 °C επί 3 ώρες. Ακολούθως, θα πρέπει να μετρώνται οι ρυθμοί πρόσληψης οξυγόνου και να υπολογίζεται ο ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου λόγω νιτροποίησης.

Μοντέλα δοκιμών

Δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών

39.

Εκτελείται προκαταρκτική δοκιμή, κατά περίπτωση, για να εκτιμηθεί το εύρος συγκεντρώσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που είναι απαραίτητες στην οριστική δοκιμή για τον προσδιορισμό της αναστολής της κατανάλωσης οξυγόνου. Εναλλακτικά, η απουσία αναστολής της κατανάλωσης οξυγόνου από την υπό δοκιμή χημική ουσία στο πλαίσιο προκαταρκτικής δοκιμής μπορεί να αποδεικνύει ότι η οριστική δοκιμή είναι περιττή. Ωστόσο, θα πρέπει να διενεργούνται δοκιμές εις τριπλούν με την υψηλότερη συγκέντρωση δοκιμής της προκαταρκτικής δοκιμής (κατά κανόνα 1 000 mg/l· τιμή η οποία εξαρτάται από τις απαιτήσεις δεδομένων).

Πίνακας 1

Παραδείγματα μειγμάτων για την προκαταρκτική δοκιμή

Αντιδραστήριο

Αρχική συγκέντρωση

Διάλυμα παρακαταθήκης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας

10 g/l

Διάλυμα παρακαταθήκης συνθετικού θρεπτικού μέσου

Βλ. σημείο 16

Εναιώρημα παρακαταθήκης ενεργοποιημένης ιλύος

3 g/l αιωρούμενα στερεά

Συστατικά των μειγμάτων

Χορήγηση δόσεων στα δοχεία δοκιμής (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Διάλυμα παρακαταθήκης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (ml)

(σημεία 19 έως 21)

0,5

5

50

0

50

Διάλυμα παρακαταθήκης θρεπτικού υλικού από συνθετικά απόβλητα (ml)

(σημείο 16)

16

16

16

16

16

Εναιώρημα ενεργοποιημένης ιλύος (ml)

(σημεία 26 έως 29)

250

250

250

250

250

Νερό

(σημείο 15)

233,5

229

184

234

434

Συνολικός όγκος των μειγμάτων (ml)

500

500

500

500

500

Συγκεντρώσεις στο μείγμα

 

 

 

 

 

Εναιώρημα δοκιμής (mg/l)

Ενεργοποιημένη ιλύς

10

10

1 000

0

1 000

(αιωρούμενα στερεά) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Στη δοκιμή θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τρεις συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, π.χ. 10 mg/l, 100 mg/l και 1 000 mg/l με έναν τυφλό μάρτυρα και, αν είναι απαραίτητο, τουλάχιστον τρεις αβιοτικοί μάρτυρες με τις υψηλότερες συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (βλ. ενδεικτικά τον πίνακα 1). Στην ιδανική περίπτωση, η χαμηλότερη συγκέντρωση δεν θα πρέπει να έχει καμία επίδραση στην κατανάλωση οξυγόνου. Εάν κρίνεται σκόπιμο, θα πρέπει να υπολογίζονται οι ρυθμοί πρόσληψης οξυγόνου και ο ρυθμός νιτροποίησης· στη συνέχεια, θα πρέπει να υπολογίζεται το ποσοστό αναστολής. Ανάλογα με τον σκοπό της δοκιμής, είναι επίσης πιθανό να προσδιορίζεται απλώς η τοξικότητα μιας οριακής συγκέντρωσης, π.χ. 1 000 mg/l. Εάν δεν παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές τοξικές επιδράσεις σε αυτή τη συγκέντρωση, δεν είναι αναγκαίο να διεξαχθούν περαιτέρω δοκιμές σε υψηλότερες ή χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Θα πρέπει να επισημανθεί ότι οι δυσδιάλυτες στο νερό ουσίες, τα μείγματα των οποίων τα συστατικά παρουσιάζουν διαφορετικό βαθμό υδατοδιαλυτότητας και οι προσροφητικές ουσίες θα πρέπει να ζυγίζονται απευθείας στα δοχεία δοκιμής. Στην περίπτωση αυτή, ο όγκος που προορίζεται για το διάλυμα παρακαταθήκης της υπό δοκιμή ουσίας θα πρέπει να αντικαθίσταται με νερό αραίωσης.

Οριστική δοκιμή

Αναστολή της συνολικής πρόσληψης οξυγόνου

41.

Στη δοκιμή θα πρέπει να χρησιμοποιείται ένα εύρος συγκεντρώσεων που να προκύπτει από την προκαταρκτική δοκιμή. Για τον υπολογισμό της NOEC και της ECx (π.χ. EC50) συνιστάται, στις περισσότερες περιπτώσεις, να χρησιμοποιούνται έξι μάρτυρες και πέντε συγκεντρώσεις αγωγής σε γεωμετρική σειρά με πέντε επαναλήψεις. Η δοκιμή με τον αβιοτικό μάρτυρα δεν χρειάζεται να επαναληφθεί, εάν δεν υπήρξε πρόσληψη οξυγόνου κατά την προκαταρκτική δοκιμή, αλλά, εάν συντελείται σημαντική πρόσληψη, τότε θα πρέπει να περιλαμβάνονται αβιοτικοί μάρτυρες για κάθε συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Η ευαισθησία της ιλύος θα πρέπει να ελέγχεται με τη βοήθεια της ουσίας αναφοράς 3,5-διχλωροφαινόλη. Η ευαισθησία της ιλύος θα πρέπει να ελέγχεται για κάθε σειρά δοκιμών, αφού είναι γνωστό ότι η ευαισθησία παρουσιάζει διακυμάνσεις. Σε κάθε περίπτωση, τα δείγματα λαμβάνονται από τα δοχεία δοκιμής έπειτα από 3 ώρες, και μετά την πάροδο επιπλέον 30 λεπτών, αν κρίνεται αναγκαίο, για να μετρηθεί ο ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου στην κυψελίδα που περιέχει ηλεκτρόδιο οξυγόνου. Οι συγκεκριμένοι ρυθμοί αναπνοής του μάρτυρα και των μειγμάτων δοκιμής υπολογίζονται με βάση τα στοιχεία που συλλέγονται· στη συνέχεια, υπολογίζεται το ποσοστό αναστολής με βάση την εξίσωση 7 κατωτέρω.

Διαφοροποίηση μεταξύ της αναστολής της ετεροτροφικής αναπνοής και της νιτροποίησης

42.

Η χρήση του ειδικού αναστολέα της νιτροποίησης, ATU, επιτρέπει την άμεση εκτίμηση των ανασταλτικών επιδράσεων που έχουν οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες στην ετεροτροφική οξείδωση και, εάν αφαιρεθεί ο ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου παρουσία της ATU από τον συνολικό ρυθμό πρόσληψης (χωρίς την παρουσία ATU), μπορούν να υπολογιστούν οι επιδράσεις στον ρυθμό νιτροποίησης. Θα πρέπει να παρασκευάζονται δύο σειρές μειγμάτων αντίδρασης σύμφωνα με τα μοντέλα δοκιμών για την ECx ή την NOEC τα οποία περιγράφονται στο σημείο 41, αλλά, συμπληρωματικά, η ATU θα πρέπει να προστίθεται σε κάθε μείγμα της μίας από τις δύο σειρές σε τελική συγκέντρωση 11,6 mg/l, που έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει πλήρως τη νιτροποίηση σε ιλύ που περιλαμβάνει αιωρούμενα στερεά σε συγκεντρώσεις έως 3 000 mg/l (4). Οι ρυθμοί πρόσληψης οξυγόνου θα πρέπει να μετρώνται μετά την περίοδο έκθεσης· αυτές οι άμεσες τιμές εκφράζουν μόνο την ετεροτροφική αναπνοή, οι δε διαφορές μεταξύ αυτών των τιμών και των αντίστοιχων ρυθμών ολικής αναπνοής εκφράζουν τη νιτροποίηση. Στη συνέχεια, υπολογίζονται οι διάφοροι βαθμοί αναστολής.

Μετρήσεις

43.

Μετά την(τις) περίοδο(-όδους) έκθεσης, θα πρέπει να μεταφερθεί ένα δείγμα από το πρώτο δοχείο αερισμού στην κυψελίδα που περιέχει ηλεκτρόδιο οξυγόνου (σχήμα 1 του προσαρτήματος 2) και η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου θα πρέπει να μετριέται αμέσως. Σε περίπτωση συστήματος με περισσότερα από ένα ηλεκτρόδια, οι μετρήσεις μπορούν να γίνονται ταυτόχρονα. Είναι σημαντικό η ανάδευση (με τη βοήθεια καλυμμένου μαγνήτη) να γίνεται με την ίδια ταχύτητα με εκείνη που χρησιμοποιείται όταν το ηλεκτρόδιο βαθμονομείται, ώστε να εξασφαλιστεί ότι ο καθετήρας ανταποκρίνεται με την ελάχιστη δυνατή καθυστέρηση στη μεταβολή των συγκεντρώσεων οξυγόνου, και να μπορέσουν να πραγματοποιηθούν τακτικές και αναπαραγώγιμες μετρήσεις οξυγόνου στα δοχεία μέτρησης. Συνήθως, το σύστημα αυτοκινούμενου ανιχνευτήρα ανάδευσης που περιέχει ορισμένα ηλεκτρόδια οξυγόνου θεωρείται κατάλληλο. Η κυψελίδα θα πρέπει να εκπλένεται με νερό έπειτα από κάθε μέτρηση. Εναλλακτικά, το δείγμα μπορεί να χρησιμοποιείται για την πλήρωση μιας φιάλης BOD (σχήμα 2 του προσαρτήματος 3) η οποία να διαθέτει μαγνητικό αναδευτήρα. Στη συνέχεια, θα πρέπει να εισάγεται στον λαιμό της φιάλης ένας αισθητήρας οξυγόνου με προσαρμοστικό κολάρο και να τίθεται σε λειτουργία ο μαγνητικός αναδευτήρας. Και στις δύο περιπτώσεις, η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου θα πρέπει να μετριέται συνεχώς και να καταγράφεται για περίοδο διάρκειας 5 έως 10 λεπτών, συνήθως, ή έως ότου η συγκέντρωση οξυγόνου μειωθεί σε επίπεδα κάτω των 2 mg/l. Το ηλεκτρόδιο θα πρέπει να αφαιρείται, το μείγμα θα πρέπει να μεταφέρεται εκ νέου στο δοχείο αερισμού και η διαδικασία αερισμού και ανάδευσης θα πρέπει να συνεχίζεται, εάν κριθεί αναγκαία η μέτρηση έπειτα από μεγαλύτερες περιόδους έκθεσης.

Επαλήθευση της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας

44.

Για ορισμένους σκοπούς, ενδέχεται να είναι απαραίτητο να μετρηθεί η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στα δοχεία δοκιμής. Θα πρέπει να επισημανθεί ότι, εάν χρησιμοποιούνται διαλύματα παρακαταθήκης που περιέχουν:

δυσδιάλυτες στο νερό ουσίες,

μείγματα με συστατικά τα οποία παρουσιάζουν διαφορετικό βαθμό υδατοδιαλυτότητας, ή

ευδιάλυτες στο νερό ουσίες, στις οποίες όμως η συγκέντρωση του διαλύματος παρακαταθήκης προσεγγίζει το μέγιστο όριο υδατοδιαλυτότητας,

το διαλυμένο κλάσμα είναι άγνωστο, και η πραγματική συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που μεταφέρεται στα δοχεία δοκιμής δεν είναι γνωστή. Για τον χαρακτηρισμό της έκθεσης, είναι απαραίτητη η αναλυτική εκτίμηση των συγκεντρώσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στα δοχεία δοκιμής. Για λόγους διευκόλυνσης, η αναλυτική εκτίμηση θα πρέπει να πραγματοποιείται πριν από την προσθήκη του ενοφθαλμίσματος. Επειδή στα δοχεία δοκιμής θα μεταφέρονται μόνο διαλυμένα κλάσματα, οι συγκεντρώσεις που θα μετρώνται ενδέχεται να είναι ιδιαίτερα χαμηλές.

45.

Για να αποφευχθούν χρονοβόρες και δαπανηρές αναλύσεις, συνιστάται να ζυγίζεται απλώς η υπό δοκιμή χημική ουσία απευθείας μέσα στα δοχεία δοκιμής και, για μεταγενέστερους υπολογισμούς, να λαμβάνεται ως βάση η αρχική ονομαστική συγκέντρωση που ζυγίστηκε. Δεν είναι απαραίτητο να γίνεται διαφοροποίηση μεταξύ διαλυμένων, αδιάλυτων ή προσροφημένων κλασμάτων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, γιατί όλα αυτά τα κλάσματα εμφανίζονται υπό πραγματικές συνθήκες και στους σταθμούς επεξεργασίας λυμάτων και ενδέχεται να ποικίλλουν ανάλογα με τη σύνθεση των λυμάτων. Ο σκοπός της μεθόδου δοκιμής είναι να εκτιμηθεί ρεαλιστικά η μη ανασταλτική συγκέντρωση και δεν ενδείκνυται να εξετάζεται λεπτομερώς ποια κλάσματα συμβάλλουν στην αναστολή των οργανισμών της ενεργοποιημένης ιλύος. Τέλος, οι προσροφητικές ουσίες θα πρέπει επίσης να ζυγίζονται απευθείας μέσα στα δοχεία δοκιμής, για τα οποία θα πρέπει να χρησιμοποιείται σιλανιωμένο γυαλί, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι απώλειες μέσω της προσρόφησης.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΕΚΘΕΣΕΙΣ

Υπολογισμός των ρυθμών πρόσληψης οξυγόνου

46.

Οι ρυθμοί πρόσληψης οξυγόνου θα πρέπει να υπολογίζονται με βάση τον μέσο όρο των μετρούμενων τιμών, π.χ. με βάση το γραμμικό τμήμα των γραφημάτων της συγκέντρωσης οξυγόνου συναρτήσει του χρόνου, ενώ οι υπολογισμοί θα πρέπει να περιορίζονται στις συγκεντρώσεις οξυγόνου μεταξύ 2,0 mg/l και 7,0 mg/l, αφού οι υψηλότερες και οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις μπορεί, με τη σειρά τους, να επηρεάσουν τους ρυθμούς κατανάλωσης. Μερικές φορές είναι αναπόφευκτο και αναγκαίο να χρησιμοποιούνται ζώνες συγκεντρώσεων που βρίσκονται πάνω ή κάτω από αυτές τις τιμές, π.χ. όταν η αναπνοή καταστέλλεται έντονα και, κατά συνέπεια, γίνεται πολύ αργή ή εάν μια συγκεκριμένη ενεργοποιημένη ιλύς αναπνέει πολύ γρήγορα. Αυτό είναι αποδεκτό, υπό τον όρο ότι τα διευρυμένα τμήματα της καμπύλης πρόσληψης είναι ευθύγραμμα και η κλίση τους δεν μεταβάλλεται όταν περνά από τα όρια των 2,0 mg/l ή 7,0 mg/l O2. Τα τυχόν μη ευθύγραμμα τμήματα της καμπύλης δηλώνουν ότι το σύστημα μέτρησης σταθεροποιείται ή ότι ο ρυθμός πρόσληψης μεταβάλλεται, και δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των ρυθμών αναπνοής. Ο ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου θα πρέπει να εκφράζεται σε χιλιοστογραμμάρια ανά λίτρο ανά ώρα (mg/lh) ή σε χιλιοστογραμμάρια ανά γραμμάριο ξηρής ιλύος ανά ώρα (mg/gh). Ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου, R, σε mg/lh, μπορεί να υπολογίζεται ή να παρεμβάλλεται με βάση το ευθύγραμμο τμήμα της καμπύλης της καταγεγραμμένης μείωσης του οξυγόνου σύμφωνα με την εξίσωση 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

όπου:

Q1

είναι η συγκέντρωση οξυγόνου στην αρχή του επιλεγμένου ευθύγραμμου τμήματος της καμπύλης (mg/l)·

Q2

είναι η συγκέντρωση οξυγόνου στο τέλος του επιλεγμένου ευθύγραμμου τμήματος της καμπύλης (mg/l)·

Δt

είναι το χρονικό διάστημα μεταξύ των δύο μετρήσεων (min).

47.

Ο ειδικός ρυθμός αναπνοής (Rs) εκφράζεται ως η ποσότητα του οξυγόνου που καταναλώνεται ανά γραμμάριο ξηρού βάρους της ιλύος ανά ώρα (mg/gh), σύμφωνα με την εξίσωση 2:

Rs = R/SS

(2)

όπου SS είναι η συγκέντρωση αιωρούμενων στερών στο μείγμα δοκιμής (g/l).

48.

Οι διάφοροι δείκτες του R που μπορούν να συνδυαστούν μεταξύ τους είναι οι εξής:

S

ειδικός ρυθμός

T

συνολικός ρυθμός αναπνοής

N

ρυθμός αναπνοής λόγω νιτροποίησης

H

ρυθμός ετεροτροφικής αναπνοής

A

ρυθμός αναπνοής λόγω αβιοτικών διεργασιών

B

ρυθμός αναπνοής με βάση τυφλές δοκιμασίες (μέσος όρος)

Υπολογισμός του ρυθμού πρόσληψης οξυγόνου λόγω νιτροποίησης

49.

Η σχέση μεταξύ ολικής αναπνοής (RT), αναπνοής λόγω νιτροποίησης (RN) και ετεροτροφικής αναπνοής (RH) δίνεται από την εξίσωση 3:

RN = RT – RH

(3)

όπου:

RN

είναι ο ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου λόγω νιτροποίησης (mg/lh)·

RT

είναι ο μετρηθείς ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου από τον τυφλό μάρτυρα (χωρίς ATU· FB) (mg/lh)·

RH

είναι ο μετρηθείς ρυθμός πρόσληψης οξυγόνου από τον τυφλό μάρτυρα με την προσθήκη ATU (FN) (mg/lh).

50.

Η σχέση αυτή ισχύει για τις τιμές των τυφλών μαρτύρων (RNB, RTB, RHB), των αβιοτικών μαρτύρων (RNA, RTA, RHA) και των δοκιμασιών με υπό δοκιμή χημικές ουσίες (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Οι ειδικοί ρυθμοί αναπνοής υπολογίζονται ως εξής:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Εάν η τιμή του RN είναι αμελητέα (π.χ. < 5 % του RT στους τυφλούς μάρτυρες) κατά την προκαταρκτική δοκιμή, μπορεί να υποτεθεί ότι η ετεροτροφική πρόσληψη οξυγόνου ισούται με την ολική πρόσληψη και ότι δεν συντελείται νιτροποίηση. Εάν οι δοκιμές εξετάζουν τις επιδράσεις στους ετεροτροφικούς και τους νιτροποιητικούς μικροοργανισμούς, θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί εναλλακτική πηγή ενεργοποιημένης ιλύος. Διενεργείται οριστική δοκιμή εάν υπάρχουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι οι ρυθμοί πρόσληψης οξυγόνου καταστέλλονται σε συνάρτηση με τις συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας.

Υπολογισμός του ποσοστού αναστολής

52.

Το ποσοστό αναστολής, IT, της συνολικής κατανάλωσης οξυγόνου σε κάθε συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας δίνεται από την εξίσωση 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Ομοίως, το ποσοστό αναστολής της ετεροτροφικής πρόσληψης οξυγόνου, IH, σε κάθε συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, δίνεται από την εξίσωση 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

Τέλος, η αναστολή της πρόσληψης οξυγόνου λόγω νιτροποίησης, IN, σε κάθε συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, δίνεται από την εξίσωση 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Το ποσοστό αναστολής της πρόσληψης οξυγόνου θα πρέπει να σχεδιάζεται ως συνάρτηση του λογαρίθμου της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (καμπύλη αναστολής, βλ. σχήμα 3 του προσαρτήματος 4). Καμπύλες αναστολής σχεδιάζονται για κάθε περίοδο αερισμού διάρκειας 3 ωρών ή έπειτα από την πάροδο επιπλέον 30 λεπτών. Η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που αναστέλλει την πρόσληψη οξυγόνου κατά 50 % (EC50) θα πρέπει να υπολογίζεται ή να παρεμβάλλεται με βάση τη συγκεκριμένη καμπύλη. Εάν είναι διαθέσιμα τα κατάλληλα στοιχεία, μπορούν να υπολογιστούν ή να παρεμβληθούν τα όρια εμπιστοσύνης 95 % της EC50, η κλίση της καμπύλης και οι κατάλληλες τιμές που σηματοδοτούν την αρχή της αναστολής (π.χ. EC10 ή EC20) και το τέλος της αναστολής (π.χ. EC80 ή EC90).

56.

Θα πρέπει να επισημανθεί ότι, δεδομένης της συχνά παρατηρούμενης μεταβλητότητας των αποτελεσμάτων, μπορεί σε πολλές περιπτώσεις να αρκεί να εκφραστούν τα αποτελέσματα και κατά τάξεις μεγέθους, π.χ.:

EC50

< 1 mg/l

EC50

1 mg/l έως 10 mg/l

EC50

10 mg/l έως 100 mg/l

EC50

> 100 mg/l

Ερμηνεία των αποτελεσμάτων

ECx

57.

Οι τιμές της ECx, συμπεριλαμβανομένων των αντίστοιχων κατώτατων και ανώτατων ορίων εμπιστοσύνης 95 % για την παράμετρο, υπολογίζονται με κατάλληλες στατιστικές μεθόδους [π.χ. ανάλυση Probit, λογιστική συνάρτηση ή συνάρτηση Weibull, απλοποιημένη μέθοδος Spearman-Karber ή απλή παρεμβολή (11)]. Η ECx λαμβάνεται εάν εισαχθεί στην εξίσωση τιμή που να αντιστοιχεί στο x % του μέσου όρου του μάρτυρα. Για τον υπολογισμό της EC50 ή οποιασδήποτε άλλης ECx, οι μέσοι όροι ανά αγωγή (x) θα πρέπει να υποβάλλονται σε ανάλυση παλινδρόμησης.

Εκτίμηση NOEC

58.

Εάν εφαρμόζεται στατιστική ανάλυση για τον προσδιορισμό της NOEC, είναι απαραίτητο να υπάρχουν στατιστικά στοιχεία ανά δοχείο (κάθε μεμονωμένο δοχείο θεωρείται πανομοιότυπο). Θα πρέπει να ακολουθούνται κατάλληλες στατιστικές μέθοδοι σύμφωνα με το έγγραφο του ΟΟΣΑ με τίτλο Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). Γενικώς, οι δυσμενείς επιδράσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε σύγκριση με τον μάρτυρα διερευνώνται μέσω μονόπλευρου (μικρότερου) ελέγχου στατιστικής υπόθεσης με p ≤ 0,05.

Έκθεση δοκιμής

59.

Στην έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνονται τα ακόλουθα στοιχεία:

 

Υπό δοκιμή χημική ουσία

κοινή ονομασία, χημική ονομασία, αριθμός CAS, καθαρότητα·

φυσικοχημικές ιδιότητες της υπό δοκιμή χημικής ουσίας [π.χ. log Kow, υδατοδιαλυτότητα, τάση ατμών, σταθερά του Henry (H) και πιθανά στοιχεία σχετικά με την πορεία της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, π.χ. προσρόφηση σε ενεργοποιημένη ιλύ]·

 

Σύστημα δοκιμής

πηγή, συνθήκες λειτουργίας του σταθμού επεξεργασίας λυμάτων και φύση των εισροών που λαμβάνει, συγκέντρωση, προεπεξεργασία και διατήρηση της ενεργοποιημένης ιλύος·

 

Συνθήκες δοκιμής

θερμοκρασία δοκιμής, pH κατά τη δοκιμή και διάρκεια της(των) περιόδου(-ων) έκθεσης·

 

Αποτελέσματα

ειδική κατανάλωση οξυγόνου των μαρτύρων (mg O2/(g ιλύος × h)·

όλα τα δεδομένα που έχουν μετρηθεί, καμπύλη(-ες) αναστολής και μέθοδος υπολογισμού της EC50·

EC50 και, εάν είναι δυνατόν, όρια εμπιστοσύνης 95 %, κατά περίπτωση EC20, EC80· ενδεχομένως η NOEC και οι εφαρμοσθείσες στατιστικές μέθοδοι, εάν δεν μπορεί να προσδιοριστεί η EC50·

αποτελέσματα για την ολική αναπνοή και, κατά περίπτωση, για την ετεροτροφική αναπνοή και την αναπνοή λόγω νιτροποίησης·

αβιοτική πρόσληψη οξυγόνου στον φυσικοχημικό μάρτυρα (που τυχόν χρησιμοποιείται)·

ονομασία της χημικής ουσίας αναφοράς και αποτελέσματα με τη συγκεκριμένη χημική ουσία·

κάθε παρατήρηση και παρέκκλιση από την τυποποιημένη διαδικασία που θα μπορούσε να έχει επηρεάσει τα αποτελέσματα.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

ΟΟΣΑ (1984), Ενεργοποιημένη ιλύς, δοκιμή αναστολής της αναπνοής, κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών 209, Κατευθυντήριες γραμμές για τις δοκιμές χημικών ουσιών, ΟΟΣΑ, Παρίσι.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization (ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 8192 Ποιότητα νερού — Δοκιμή αναστολής της κατανάλωσης οξυγόνου από την ενεργό ιλύ για την οξείδωση του άνθρακα και του αμμωνίου).

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — συνοδεύει την κατευθυντήρια γραμμή 209 του ΟΟΣΑ. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization (ΕΛΟΤ EN ISO 10634 Κατευθυντήριες οδηγίες για την παρασκευή και την επεξεργασία των ελάχιστα υδατοδιαλυτών οργανικών ενώσεων με προοπτική την αξιολόγηση της βιοδιασπασιμότητάς τους σε υδατικό περιβάλλον).

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, ΟΟΣΑ, Παρίσι.

Προσάρτημα 1

Ορισμοί

Για την παρούσα μέθοδο δοκιμών ισχύουν οι ακόλουθοι ορισμοί:

Χημική ουσία : μια ουσία ή ένα μείγμα.

ECx (αποτελεσματική συγκέντρωση για επίδραση x %) : η συγκέντρωση που προκαλεί επίδραση x % σε οργανισμούς δοκιμής εντός συγκεκριμένης περιόδου έκθεσης σε σύγκριση με μάρτυρα. Για παράδειγμα, η EC50 είναι η συγκέντρωση που εκτιμάται ότι προκαλεί επίδραση στο τελικό σημείο δοκιμής σε ποσοστό 50 % του εκτιθέμενου πληθυσμού επί καθορισμένη περίοδο έκθεσης.

NOEC (συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης) : η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην οποία δεν παρατηρείται καμία επίδραση. Στην παρούσα δοκιμή, η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στη NOEC δεν έχει στατιστικώς σημαντική επίδραση (p < 0,05) εντός δεδομένης περιόδου έκθεσης σε σύγκριση με τον μάρτυρα.

Υπό δοκιμή χημική ουσία : κάθε ουσία ή μείγμα που υποβάλλεται σε δοκιμή με τη χρήση της παρούσας μεθόδου δοκιμών.

Προσάρτημα 2

Σχήμα 1:   Παραδείγματα συσκευών μέτρησης

Image

Επεξήγηση

1

ενεργοποιημένη ιλύς

2

συνθετικό θρεπτικό μέσο

3

υπό δοκιμή χημική ουσία

4

αέρας

5

δοχείο ανάμειξης

6

μαγνητικός αναδευτήρας

7

κυψελίδα μέτρησης οξυγόνου

8

ηλεκτρόδιο οξυγόνου

9

συσκευή μέτρησης οξυγόνου

10

καταγραφέας

Προσάρτημα 3

Σχήμα 2:   Παράδειγμα συσκευής μέτρησης με φιάλη BOD

Image

Επεξήγηση

1

δοχείο δοκιμής

2

ηλεκτρόδιο οξυγόνου

3

συσκευή μέτρησης οξυγόνου

Προσάρτημα 4

Σχήμα 3:   Παράδειγμα καμπυλών αναστολής

Image

Επεξήγηση

X

συγκέντρωση 3,5-διχλωροφαινόλης (mg/l)

Y

αναστολή ( %)

Image

αναστολή ετεροτροφικής αναπνοής με τη χρήση νιτροποιητικής ιλύος

Image

αναστολή νιτροποίησης με τη χρήση νιτροποιητικής ιλύος

»

5)

Το κεφάλαιο Γ.26 αντικαθίσταται από το εξής κείμενο:

«

Γ.26   ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ LEMNA

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 221 του ΟΟΣΑ (2006). Έχει σχεδιαστεί με σκοπό την εκτίμηση της τοξικότητας χημικών ουσιών στα υδρόβια φυτά των γλυκών υδάτων του γένους Lemna (κοινώς, λέμνα ή φακή του νερού). Βασίζεται σε υφιστάμενες μεθόδους (1)(2)(3)(4)(5)(6), αλλά περιλαμβάνει τροποποιήσεις αυτών των μεθόδων, οι οποίες αποτυπώνουν τα αποτελέσματα πρόσφατων ερευνητικών εργασιών και διαβουλεύσεων για ορισμένα ζητήματα καίριας σημασίας. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών επικυρώθηκε με διεθνή δοκιμή δακτυλίου (ring test) (7).

2.

Στην παρούσα μέθοδο περιγράφεται η διεξαγωγή δοκιμών τοξικότητας με χρήση των ειδών Lemna gibba και Lemna minor, που έχουν αμφότερα μελετηθεί εκτενώς και αποτελούν το αντικείμενο των προαναφερόμενων προτύπων. Η συστηματική κατάταξη του Lemna spp. είναι δύσκολη, γιατί περιπλέκεται από την ύπαρξη πληθώρας φαινοτύπων. Παρόλο που μπορεί να παρουσιαστεί γενετική μεταβλητότητα στην απόκριση της λέμνας σε τοξικούς παράγοντες, τα σχετικά με αυτό το αίτιο μεταβλητότητας δεδομένα δεν επαρκούν, προς το παρόν, ώστε να υποδειχθεί η χρήση συγκεκριμένου κλώνου κατά την εφαρμογή της παρούσας μεθόδου δοκιμών. Σημειωτέον ότι η δοκιμή δεν διεξάγεται με αξενικές καλλιέργειες, λαμβάνονται όμως μέτρα σε διάφορα στάδια της διαδικασίας δοκιμής ώστε να ελαχιστοποιείται η μόλυνση από άλλους οργανισμούς.

3.

Περιγράφεται λεπτομερώς η διεξαγωγή δοκιμών με ανανέωση (ημιστατικό και συνεχούς ροής σύστημα) και χωρίς ανανέωση (στατικό σύστημα) του διαλύματος δοκιμής. Ανάλογα με τους στόχους της δοκιμής και τις απαιτήσεις των κανονιστικών ρυθμίσεων, συνιστάται να εξετάζεται το ενδεχόμενο εφαρμογής των ημιστατικών και των συνεχών τεχνικών, π.χ. στην περίπτωση των χημικών ουσιών που χάνονται ταχέως από το διάλυμα, λόγω εξάτμισης, φωτοαποικοδόμησης, καθίζησης ή βιοαποικοδόμησης. Περαιτέρω καθοδήγηση παρέχεται στη δημοσίευση (8).

4.

Οι ορισμοί που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στο προσάρτημα 1.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

5.

Εκθετικές καλλιέργειες φυτών του γένους Lemna αφήνονται να αναπτυχθούν ως μονοκαλλιέργειες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας για περίοδο επτά ημερών. Σκοπός της δοκιμής είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιδράσεων της χημικής ουσίας στη βλαστητική αύξηση κατά την ανωτέρω περίοδο, με βάση εκτιμήσεις των επιλεγμένων μετρούμενων μεταβλητών. Ο αριθμός θαλλών είναι η πρωταρχική μετρούμενη μεταβλητή. Μετράται επίσης τουλάχιστον μία ακόμη μεταβλητή (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος), επειδή ορισμένες χημικές ουσίες είναι δυνατόν να έχουν πολύ μεγαλύτερη επίδραση σε άλλες μετρούμενες μεταβλητές απ' όση στον αριθμό θαλλών. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιδράσεων της χημικής ουσίας, συγκρίνεται η ανάπτυξη στα διαλύματα δοκιμής με εκείνη των μαρτύρων και προσδιορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης κατά συγκεκριμένο ποσοστό x % (π.χ. 50 %), η οποία εκφράζεται ως ECx (π.χ. EC50).

6.

Το τελικό σημείο της δοκιμής είναι η αναστολή της ανάπτυξης, εκφραζόμενη ως λογαριθμική αύξηση της μετρούμενης μεταβλητής (μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης) κατά τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης. Από τους μέσους ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης που καταγράφονται για μια σειρά διαλυμάτων δοκιμής, προσδιορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης κατά συγκεκριμένο ποσοστό x % (π.χ. 50 %) και εκφράζεται ως ErCx (π.χ. ErC50).

7.

Μία επιπλέον μεταβλητή απόκρισης που χρησιμοποιείται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών είναι η απόδοση, η οποία ενδέχεται να απαιτείται για τη συμμόρφωση με ειδικές κανονιστικές απαιτήσεις σε ορισμένες χώρες. Η απόδοση ορίζεται ως η διαφορά των μετρούμενων μεταβλητών στο τέλος της περιόδου έκθεσης μείον τις μετρούμενες μεταβλητές στην αρχή της περιόδου έκθεσης. Από την απόδοση που καταγράφεται για μια σειρά διαλυμάτων δοκιμής, προσδιορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί αναστολή της απόδοσης κατά συγκεκριμένο ποσοστό x % (π.χ. 50 %) και εκφράζεται ως EyCx (π.χ. EyC50).

8.

Επιπροσθέτως, μπορούν να προσδιοριστούν στατιστικά η κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης (LOEC) και η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC).

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟ ΔΟΚΙΜΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ

9.

Θα πρέπει να υπάρχει αναλυτική μέθοδος επαρκούς ευαισθησίας για τον ποσοτικό προσδιορισμό της χημικής ουσίας στο θρεπτικό μέσο δοκιμής.

10.

Στις σχετικές με την υπό δοκιμή χημική ουσία πληροφορίες που μπορεί να είναι χρήσιμες για τον καθορισμό των συνθηκών δοκιμής περιλαμβάνονται ο συντακτικός τύπος, η καθαρότητα, η υδατοδιαλυτότητα, η σταθερότητα στο νερό και στο φως, οι σταθερές pKa και Kow, η τάση ατμών και η βιοαποικοδομησιμότητα. Η υδατοδιαλυτότητα και η τάση ατμών μπορούν να χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της σταθεράς του νόμου του Henry, η οποία δείχνει αν είναι πιθανόν να σημειωθούν σημαντικές απώλειες της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στη διάρκεια της δοκιμής. Με τον τρόπο αυτό κρίνεται ευκολότερα αν πρέπει να ληφθούν ιδιαίτερα μέτρα για τον έλεγχο των εν λόγω απωλειών. Σε περίπτωση που τα στοιχεία για τη διαλυτότητα και τη σταθερότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας είναι αβέβαια, συνιστάται να εκτιμώνται οι ιδιότητες αυτές υπό τις συνθήκες της δοκιμής, δηλαδή με το θρεπτικό μέσο και σε συνθήκες θερμοκρασίας και φωτισμού που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν στη δοκιμή.

11.

Όταν ο έλεγχος του pH του θρεπτικού μέσου δοκιμής έχει ιδιαίτερη σημασία, π.χ. στις δοκιμές μετάλλων ή ασταθών στην υδρόλυση χημικών ουσιών, συνιστάται η προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος στο θρεπτικό μέσο (βλ. σημείο 21). Περαιτέρω καθοδήγηση για τον έλεγχο χημικών ουσιών που οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες δυσχεραίνουν τη δοκιμή τους παρέχονται στη δημοσίευση (8).

ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

12.

Για να είναι έγκυρη η δοκιμή, ο χρόνος διπλασιασμού του αριθμού θαλλών στον μάρτυρα πρέπει να είναι μικρότερος από 2,5 ημέρες (60 ώρες), τιμή που αντιστοιχεί περίπου σε επταπλασιασμό εντός επτά ημερών και σε μέσο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης 0,275 ημέρα– 1. Με τα θρεπτικά μέσα και τις συνθήκες δοκιμής που περιγράφονται στη παρούσα μέθοδο, το κριτήριο αυτό είναι δυνατόν να πληρούται σε στατικό σύστημα δοκιμής (5). Προβλέπεται επίσης ότι αυτό το κριτήριο θα πληρούται υπό συνθήκες ημιστατικής και συνεχούς δοκιμής. Ο υπολογισμός του χρόνου διπλασιασμού παρατίθεται στο σημείο 49.

ΧΗΜΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ

13.

Είναι δυνατόν να υποβληθούν σε δοκιμή μία ή περισσότερες ουσίες αναφοράς, όπως η 3,5-διχλωροφαινόλη που χρησιμοποιήθηκε στη διεθνή δοκιμή δακτυλίου (ring test) (7), προκειμένου να ελεγχθεί η διαδικασία δοκιμής. Είναι σκόπιμο η ουσία αναφοράς να υποβάλλεται σε δοκιμές τουλάχιστον δύο φορές ετησίως ή, σε περίπτωση δοκιμών που διεξάγονται με μικρότερη συχνότητα, παράλληλα με τον προσδιορισμό της τοξικότητας της υπό δοκιμή χημικής ουσίας.

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Εργαστηριακός εξοπλισμός

14.

Όλα τα τεμάχια εξοπλισμού που έρχονται σε επαφή με τα θρεπτικά μέσα δοκιμής πρέπει να είναι κατασκευασμένα από γυαλί ή άλλο χημικώς αδρανές υλικό. Τα γυάλινα σκεύη που χρησιμοποιούνται για καλλιέργεια και δοκιμές θα πρέπει να καθαρίζονται, ώστε να απομακρύνονται οι ξένες χημικές ουσίες που θα μπορούσαν να διεισδύσουν στο θρεπτικό μέσο δοκιμής, και να είναι αποστειρωμένα. Τα δοχεία δοκιμής θα πρέπει να έχουν ικανό πλάτος, ώστε οι θαλλοί των διαφόρων αποικιών στα δοχεία ελέγχου να μπορούν να αναπτυχθούν χωρίς να αλληλεπικαλύπτονται στο τέλος της δοκιμής. Δεν έχει σημασία αν οι ρίζες αγγίζουν τον πυθμένα των δοχείων δοκιμής· συνιστάται όμως κάθε δοχείο δοκιμής να έχει ελάχιστο βάθος 20 mm και ελάχιστο όγκο 100 ml. Η επιλογή του τύπου του δοχείου δοκιμής δεν έχει κρίσιμη σημασία, εφόσον πληρούνται οι απαιτήσεις αυτές. Τα γυάλινα ποτήρια ζέσεως, τα δοχεία κρυστάλλωσης ή τα γυάλινα τρυβλία Petri ενδεδειγμένων διαστάσεων έχουν αποδειχθεί όλα κατάλληλα. Τα δοχεία δοκιμής πρέπει να καλύπτονται, ώστε να ελαχιστοποιούνται η εξάτμιση και η τυχαία επιμόλυνση, και, παράλληλα, να είναι δυνατή η αναγκαία ανταλλαγή αέρα. Τα κατάλληλα δοχεία δοκιμής, και ιδίως τα καλύμματα, πρέπει να αποτρέπουν τη σκίαση και τις αλλαγές στα φασματικά χαρακτηριστικά του φωτός.

15.

Οι καλλιέργειες και τα δοχεία δοκιμής δεν θα πρέπει να φυλάσσονται μαζί. Ο καλύτερος τρόπος για να επιτευχθεί αυτό είναι η χρήση χωριστών θαλάμων, επωαστήρων ή δωματίων ανάπτυξης σε συνθήκες περιβάλλοντος. Ο φωτισμός και η θερμοκρασία πρέπει να μπορούν να ρυθμίζονται και να διατηρούνται σταθερά (βλ. σημεία 35-36).

Οργανισμός δοκιμής

16.

Ο οργανισμός που χρησιμοποιείται στην παρούσα δοκιμή είναι είτε ο Lemna gibba είτε ο Lemna minor. Σύντομες περιγραφές των ειδών λέμνας που έχουν χρησιμοποιηθεί σε δοκιμές τοξικότητας παρατίθενται στο προσάρτημα 2. Το φυτικό υλικό μπορεί να λαμβάνεται από συλλογή καλλιεργειών, από άλλο εργαστήριο ή από τον αγρό. Εάν τα φυτά συλλέγονται στον αγρό, θα πρέπει να διατηρούνται σε καλλιέργεια στο ίδιο θρεπτικό μέσο με εκείνο που χρησιμοποιείται στη δοκιμή, τουλάχιστον για οκτώ εβδομάδες πριν από τη χρήση τους. Οι αγροί από τους οποίους συλλέγονται τα φυτά των αρχικών καλιεργειών πρέπει να είναι απαλλαγμένοι από εμφανείς πηγές μόλυνσης. Εάν τα φυτά λαμβάνονται από άλλο εργαστήριο ή από συλλογή καλλιεργειών, θα πρέπει να διατηρούνται υπό ανάλογες συνθήκες για χρονικό διάστημα τουλάχιστον τριών εβδομάδων. Θα πρέπει πάντα να αναφέρονται η πηγή του φυτικού υλικού, καθώς και το είδος και ο κλώνος (εφόσον είναι γνωστός) που χρησιμοποιήθηκαν στη δοκιμή.

17.

Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μονοκαλλιέργειες εμφανώς απαλλαγμένες από επιμόλυνση από άλλους οργανισμούς, όπως φύκη και πρωτόζωα. Τα υγιή φυτά του είδους L. minor συνίστανται σε αποικίες που περιλαμβάνουν δύο έως πέντε θαλλούς, ενώ οι υγιείς αποικίες του L. gibba είναι δυνατόν να περιλαμβάνουν έως επτά θαλλούς.

18.

Η ποιότητα και η ομοιομορφία των φυτών που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή επηρεάζουν σημαντικά την έκβασή της και, συνεπώς, πρέπει να επιλέγονται επιμελώς. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται νεαρά, ταχέως αναπτυσσόμενα φυτά, χωρίς ορατές αλλοιώσεις ή αποχρωματισμό (χλώρωση). Οι καλλιέργειες καλής ποιότητας χαρακτηρίζονται από υψηλή συχνότητα εμφάνισης αποικιών με δύο τουλάχιστον θαλλούς. Ο μεγάλος αριθμός μεμονωμένων θαλλών αποτελεί ένδειξη περιβαλλοντικής καταπόνησης, π.χ. περιορισμός θρεπτικών στοιχείων, και δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται στη δοκιμή φυτικό υλικό από τέτοιες καλλιέργειες.

Καλλιέργεια

19.

Για να μειωθεί η συχνότητα διατήρησης της καλλιέργειας (π.χ. όταν δεν έχουν προγραμματιστεί δοκιμές σε λέμνα για κάποιο διάστημα), οι καλλιέργειες μπορούν να διατηρούνται σε συνθήκες ελαττωμένου φωτισμού και ελαττωμένης θερμοκρασίας (4-10 °C). Λεπτομέρειες σχετικά με την καλλιέργεια παρέχονται στο προσάρτημα 3. Τα εμφανή σημεία επιμόλυνσης από φύκη ή άλλους οργανισμούς μπορεί να επιβάλλουν την επιφανειακή αποστείρωση ενός επιμέρους δείγματος θαλλών λέμνας, ακολουθούμενη από μεταφορά σε πρόσφατα παρασκευασμένο θρεπτικό μέσο (βλ. προσάρτημα 3). Στην περίπτωση αυτή, η υπόλοιπη επιμολυσμένη καλλιέργεια θα πρέπει να απορρίπτεται.

20.

Τουλάχιστον επτά ημέρες πριν από τη διεξαγωγή της δοκιμής, επαρκής αριθμός αποικιών μεταφέρεται ασηπτικά σε στείρο θρεπτικό μέσο πρόσφατης παρασκευής και καλλιεργείται για 7-10 ημέρες υπό τις συνθήκες της δοκιμής.

Θρεπτικό μέσο δοκιμής

21.

Συνιστώνται διαφορετικά θρεπτικά μέσα για το Lemna minor και το Lemna gibba, τα οποία περιγράφονται κατωτέρω. Θα πρέπει να μελετάται με προσοχή η προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος στο θρεπτικό μέσο δοκιμής [4-μορφολινοπροπανοσουλφονικό οξύ (MOPS, αριθ. CAS: 1132-61-2) στο θρεπτικό μέσο για το L. minor και NaHCO3 στο θρεπτικό μέσο για το L. gibba], εάν υπάρχουν υπόνοιες ότι ενδέχεται να αντιδράσει με την υπό δοκιμή χημική ουσία και να επηρεάσει την έκφραση της τοξικότητάς της. Αποδεκτό είναι επίσης το θρεπτικό μέσο Steinberg (9), εφόσον πληρούνται τα κριτήρια εγκυρότητας.

22.

Για την καλλιέργεια και τις δοκιμές σε L. minor συνιστάται τροποποιημένη έκδοση του θρεπτικού μέσου για τη λέμνα του Σουηδικού Ινστιτούτου Προτύπων (SIS). Η σύνθεση αυτού του θρεπτικού μέσου παρατίθεται στο προσάρτημα 4.

23.

Για την καλλιέργεια και τις δοκιμές σε L. gibba συνιστάται το θρεπτικό μέσο 20X — AAP, που περιγράφεται στο προσάρτημα 4.

24.

Κατάλληλο για το είδος L. minor είναι και το περιγραφόμενο στο προσάρτημα 4 θρεπτικό μέσο Steinberg, το οποίο, ωστόσο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για το L. gibba, εφόσον πληρούνται τα κριτήρια εγκυρότητας.

Διαλύματα δοκιμής

25.

Τα διαλύματα δοκιμής παρασκευάζονται συνήθως με αραίωση διαλυμάτων παρακαταθήκης. Τα διαλύματα παρακαταθήκης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας παρασκευάζονται, κατά κανόνα, με διάλυση της χημικής ουσίας στο θρεπτικό μέσο.

26.

Η υψηλότερη συγκέντρωση δοκιμής της υπό δοκιμή χημικής ουσίας θα πρέπει κανονικά να μην υπερβαίνει την υδατοδιαλυτότητα της χημικής ουσίας υπό τις συνθήκες της δοκιμής. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα φυτά Lemna spp. επιπλέουν στην επιφάνεια και είναι δυνατόν να εκτεθούν σε χημικές ουσίες που συσσωρεύονται στη μεσεπιφάνεια νερού-αέρα (π.χ. δυσδιάλυτες στο νερό ή υδρόφοβες ή επιφανειοδραστικές χημικές ουσίες). Στις περιπτώσεις αυτές, η έκθεση θα οφείλεται σε υλικό που δεν είναι διαλυμένο, οι δε συγκεντρώσεις δοκιμής μπορεί να υπερβαίνουν την υδατοδιαλυτότητα, ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Σε περίπτωση υπό δοκιμή χημικών ουσιών χαμηλής υδατοδιαλυτότητας, ενδέχεται να είναι απαραίτητο να παρασκευάζεται πυκνό διάλυμα παρακαταθήκης ή διασπορά της χημικής ουσίας με τη βοήθεια οργανικού διαλύτη ή μέσου διασποράς, ώστε να διευκολύνεται η προσθήκη ακριβών ποσοτήτων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο θρεπτικό μέσο δοκιμής και να υποβοηθούνται η διασπορά και η διάλυσή της. Θα πρέπει να καταβάλλεται κάθε δυνατή προσπάθεια για την αποφυγή της χρήσης τέτοιων υλικών. Η χρήση βοηθητικών διαλυτών ή μέσων διασποράς δεν θα πρέπει να προκαλεί φυτοτοξικότητα. Για παράδειγμα, μεταξύ των διαλυτών ευρείας χρήσης που δεν προκαλούν φυτοτοξικότητα σε συγκεντρώσεις έως 100 μLl/l περιλαμβάνονται η ακετόνη και το διμεθυλοφορμαμίδιο. Εάν χρησιμοποιείται διαλύτης ή μέσο διασποράς, η τελική του συγκέντρωση θα πρέπει να αναφέρεται, να διατηρείται στο ελάχιστο επίπεδο (≤ 100 μl/l) και να είναι η ίδια σε κάθε αγωγή και μάρτυρα. Περαιτέρω καθοδήγηση για τη χρήση μέσων διασποράς παρέχεται στη δημοσίευση (8).

Ομάδες δοκιμής και ελέγχου

27.

Η προηγούμενη γνώση της τοξικότητας της υπό δοκιμή χημικής ουσίας για τη λέμνα, π.χ. μέσω δοκιμής προσδιορισμού του εύρους τιμών, διευκολύνει την επιλογή των κατάλληλων συγκεντρώσεων δοκιμής. Στην οριστική δοκιμή τοξικότητας θα πρέπει κανονικά να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον πέντε συγκεντρώσεις δοκιμής, διατεταγμένες σε γεωμετρική πρόοδο. Κατά προτίμηση, ο λόγος προόδου θα πρέπει να μην υπερβαίνει το 3,2, αλλά επιτρέπεται να χρησιμοποιείται υψηλότερη τιμή, εάν η καμπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης είναι επίπεδη. Εάν χρησιμοποιούνται λιγότερες από πέντε συγκεντρώσεις, η επιλογή αυτή θα πρέπει να αιτιολογείται. Σε κάθε συγκέντρωση δοκιμής θα πρέπει να διενεργούνται τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις.

28.

Για τον καθορισμό του εύρους των συγκεντρώσεων δοκιμής (για τη δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών και/ή για την οριστική δοκιμή τοξικότητας), θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη τα εξής:

Για τον προσδιορισμό της ECx, η τιμή της θα πρέπει να περικλείεται από τις συγκεντρώσεις δοκιμής, ώστε να εξασφαλίζεται το ενδεδειγμένο επίπεδο εμπιστοσύνης. Για παράδειγμα, εάν πρόκειται να εκτιμηθεί η EC50, η υψηλότερη συγκέντρωση δοκιμής θα πρέπει να υπερβαίνει την τιμή EC50. Εάν η τιμή EC50 βρίσκεται εκτός του εύρους των συγκεντρώσεων δοκιμής, τα σχετικά διαστήματα εμπιστοσύνης θα είναι μεγάλα, με αποτέλεσμα να καθίσταται ενδεχομένως αδύνατη η ορθή αξιολόγηση της στατιστικής προσαρμογής του μοντέλου.

Εάν το ζητούμενο είναι η εκτίμηση των LOEC/NOEC, η χαμηλότερη συγκέντρωση δοκιμής θα πρέπει να είναι αρκούντως χαμηλή, ώστε η ανάπτυξη να μην είναι σημαντικά μικρότερη από την ανάπτυξη του μάρτυρα. Επιπλέον, η υψηλότερη συγκέντρωση δοκιμής θα πρέπει να είναι αρκούντως υψηλή, ώστε η ανάπτυξη να είναι σημαντικά μικρότερη από την ανάπτυξη του μάρτυρα. Σε αντίθετη περίπτωση, η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται με διαφορετικό εύρος συγκεντρώσεων (εκτός εάν η υψηλότερη συγκέντρωση βρίσκεται στο όριο διαλυτότητας ή το μέγιστο απαιτούμενο όριο συγκέντρωσης, π.χ. 100 mg/l).

29.

Κάθε δοκιμή θα πρέπει να περιλαμβάνει μάρτυρες που συνίστανται σε θρεπτικό μέσο, αριθμό θαλλών και αποικιών, συνθήκες περιβάλλοντος και διαδικασίες ίδια με εκείνα των δοχείων δοκιμής, αλλά χωρίς την υπό δοκιμή χημική ουσία. Εάν χρησιμοποιείται βοηθητικός διαλύτης ή μέσο διασποράς, θα πρέπει να συμπεριλαμβάνεται πρόσθετη αγωγή ελέγχου με τον διαλύτη/μέσο διασποράς στην ίδια συγκέντρωση με τη χρησιμοποιούμενη στα δοχεία που περιέχουν την υπό δοκιμή χημική ουσία. Ο αριθμός των πανομοιότυπων δοχείων ελέγχου (και, κατά περίπτωση, των δοχείων με τον διαλύτη) θα πρέπει να είναι τουλάχιστον ίσος και, στην ιδανική περίπτωση, διπλάσιος από τον αριθμό των δοχείων που χρησιμοποιούνται για κάθε συγκέντρωση δοκιμής.

30.

Εάν δεν απαιτείται προσδιορισμός της NOEC, ο σχεδιασμός της δοκιμής είναι δυνατόν να τροποποιηθεί, ώστε να αυξηθεί ο αριθμός των συγκεντρώσεων και να μειωθεί ο αριθμός των δοχείων ανά συγκέντρωση. Ωστόσο, τα δοχεία ελέγχου πρέπει να είναι τουλάχιστον τρία.

Έκθεση

31.

Αποικίες αποτελούμενες από 2 έως 4 ορατούς θαλλούς μεταφέρονται από την καλλιέργεια του ενοφθαλμίσματος ασηπτικά και με τυχαιοποιημένη κατανομή μεταξύ των δοχείων δοκιμής. Κάθε δοχείο δοκιμής θα πρέπει να περιέχει συνολικά 9 έως 12 θαλλούς. Ο αριθμός των θαλλών και των αποικιών θα πρέπει να είναι ο ίδιος σε κάθε δοχείο δοκιμής. Η εμπειρία από την παρούσα μέθοδο και τα δεδομένα της δοκιμής δακτυλίου δείχνουν ότι η διεξαγωγή τριών επαναλήψεων ανά αγωγή, κατά την οποία κάθε δοχείο περιέχει αρχικά 9 έως 12 θαλλούς, αρκεί για την ανίχνευση διαφορών στην ανάπτυξη περίπου της τάξης του 4 έως 7 %, όταν η αναστολή υπολογίζεται με βάση τον ρυθμό ανάπτυξης (10 έως 15 %, όταν υπολογίζεται με βάση την απόδοση) μεταξύ των ομάδων αγωγής (7).

32.

Απαιτείται τυχαιοποιημένος σχεδιασμός για τη θέση των δοχείων δοκιμής στον επωαστήρα, ώστε να ελαχιστοποιείται η επιρροή των χωρικών διαφορών ως προς τη φωτεινή ένταση ή τη θερμοκρασία. Απαιτείται επίσης σχεδιασμός κατά συστάδες ή τυχαιοποιημένη επανατοποθέτηση των δοχείων μετά τις παρατηρήσεις (ή συχνότερη αλλαγή θέσης).

33.

Εάν από προκαταρτική δοκιμή σταθερότητας προκύπτει ότι δεν είναι δυνατόν να διατηρηθεί η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (δηλ. η μετρούμενη συγκέντρωση μειώνεται κάτω του 80 % της μετρηθείσας αρχικής συγκέντρωσης) σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής (7 ημέρες), συνιστάται ημιστατικό σύστημα δοκιμής. Στην περίπτωση αυτή, οι αποικίες θα πρέπει να εκτίθενται σε πρόσφατα παρασκευασμένα διαλύματα δοκιμής και ελέγχου τουλάχιστον δύο φορές κατά τη δοκιμή (π.χ. την 3η και την 5η ημέρα). Η συχνότητα έκθεσης στο πρόσφατα παρασκευασμένο θρεπτικό μέσο θα εξαρτάται από τη σταθερότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας· ενδέχεται να χρειαστεί μεγαλύτερη συχνότητα για τη διατήρηση σχεδόν σταθερών συγκεντρώσεων εξαιρετικά ασταθών ή πτητικών χημικών ουσιών. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ενδέχεται να απαιτείται συνεχής διαδικασία (8)(10).

34.

Το σενάριο έκθεσης μέσω εφαρμογής στο φύλλωμα (ψεκασμός) δεν καλύπτεται από την παρούσα μέθοδο δοκιμών· βλ. αντ' αυτής δημοσίευση (11).

Συνθήκες επώασης

35.

Θα πρέπει να χρησιμοποιείται συνεχής φωτισμός με θερμό ή ψυχρό λευκό φως φθορισμού, ώστε να εξασφαλίζεται φωτεινή ένταση η οποία επιλέγεται από το πεδίο τιμών 85-135 μE · m– 2s– 1 (ισοδύναμο με 6 500-10 000 lux), μετρούμενη σε φωτοσυνθετικά ενεργό μήκος κύματος της ακτινοβολίας (400-700 nm), σε σημεία που βρίσκονται στην ίδια απόσταση από τη φωτεινή πηγή όπως οι θαλλοί της λέμνας. Οι τυχόν διαφορές από την επιλεγμένη φωτεινή ένταση στην επιφάνεια όπου διεξάγεται η δοκιμή δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν το ± 15 %. Η μέθοδος ανίχνευσης και μέτρησης του φωτός, ιδίως δε ο τύπος του αισθητήρα, επηρεάζουν τη μετρούμενη τιμή. Οι σφαιρικοί αισθητήρες (που αποκρίνονται στο φως το οποίο εκπέμπεται από όλες τις γωνίες επάνω και κάτω από το επίπεδο μέτρησης) και οι αισθητήρες συνημιτόνου (που αποκρίνονται στο φως το οποίο εκπέμπεται από όλες τις γωνίες επάνω από το επίπεδο μέτρησης) προτιμώνται έναντι των αισθητήρων μονής κατεύθυνσης και παρέχουν μεγαλύτερες ενδείξεις για τις πολυσημειακές φωτεινές πηγές του είδους που περιγράφεται στην παρούσα μέθοδο.

36.

Η θερμοκρασία στα δοχεία δοκιμής θα πρέπει να είναι 24 ± 2 °C. Το pH του θρεπτικού μέσου ελέγχου δεν θα πρέπει να αυξάνεται κατά περισσότερο από 1,5 μονάδες στη διάρκεια της δοκιμής. Ωστόσο, οι αποκλίσεις πέραν της 1,5 μονάδας δεν ακυρώνουν τη δοκιμή, εάν είναι δυνατόν να αποδειχθεί ότι πληρούνται τα κριτήρια εγκυρότητας. Πρέπει να αποδίδεται μεγαλύτερη προσοχή στη μεταβολή του pH σε ειδικές περιπτώσεις, όπως κατά τη δοκιμή ασταθών χημικών ουσιών ή μετάλλων. Περαιτέρω καθοδήγηση παρέχεται στη δημοσίευση (8).

Διάρκεια

37.

Η δοκιμή τερματίζεται 7 ημέρες μετά τη μεταφορά των φυτών στα δοχεία δοκιμής.

Μετρήσεις και αναλυτικοί προσδιορισμοί

38.

Στην αρχή της δοκιμής μετράται και καταγράφεται ο αριθμός θαλλών στα δοχεία δοκιμής, με μέριμνα ώστε να καταμετρώνται οι προεξέχοντες ευδιάκριτοι θαλλοί. Οι αριθμοί θαλλών που φαίνονται φυσιολογικοί ή αφύσικοι πρέπει να προσδιορίζονται στην αρχή της δοκιμής, τουλάχιστον μία φορά ανά 3 ημέρες κατά την περίοδο έκθεσης (δηλ. τουλάχιστον 2 φορές στη διάρκεια της επταήμερης περιόδου) και στο τέλος της δοκιμής. Θα πρέπει να σημειώνονται οι αλλαγές στην ανάπτυξη των φυτών (π.χ. μεταβολή του μεγέθους και της εμφάνισης των θαλλών, ενδείξεις νέκρωσης, χλώρωσης ή κυφότητας, θραύση ή απώλεια πλευστότητας των αποικιών), καθώς και στο μήκος και στην όψη των ριζών. Θα πρέπει επίσης να σημειώνονται τα σημαντικά χαρακτηριστικά του θρεπτικού μέσου δοκιμής (π.χ. παρουσία αδιάλυτων υλικών, ανάπτυξη φυκών στο δοχείο δοκιμής).

39.

Εκτός από την καταμέτρηση των θαλλών κατά τη δοκιμή, εκτιμώνται και οι επιδράσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και σε μία (ή περισσότερες) από τις ακόλουθες μετρούμενες μεταβλητές:

i)

συνολική θαλλική επιφάνεια·

ii)

ξηρό βάρος·

iii)

υγρό βάρος.

40.

Η συνολική θαλλική επιφάνεια παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι μπορεί να προσδιορίζεται σε κάθε δοχείο δοκιμής και ελέγχου στην αρχή, στη διάρκεια και στο τέλος της δοκιμής. Το ξηρό ή το υγρό βάρος θα πρέπει να προσδιορίζεται στην αρχή της δοκιμής, σε δείγμα της καλλιέργειας του ενοφθαλμίσματος το οποίο είναι αντιπροσωπευτικό του υλικού που χρησιμοποιήθηκε για την εκκίνηση της δοκιμής, καθώς και στο τέλος της δοκιμής στο φυτικό υλικό κάθε δοχείου δοκιμής και ελέγχου. Εάν δεν μετράται η θαλλική επιφάνεια, προτιμάται το ξηρό βάρος έναντι του υγρού βάρους.

41.

Η συνολική θαλλική επιφάνεια, το ξηρό βάρος και το υγρό βάρος μπορούν να προσδιορίζονται ως εξής:

i)

Συνολική θαλλική επιφάνεια: Η συνολική θαλλική επιφάνεια όλων των αποικιών μπορεί να προσδιορίζεται με ανάλυση εικόνων. Είναι δυνατόν να αποτυπώνεται το περίγραμμα του δοχείου δοκιμής και των φυτών με βιντεοκάμερα (δηλ. με τοποθέτηση του δοχείου σε φωτοτράπεζα) και να ψηφιοποιείται η προκύπτουσα εικόνα. Στη συνέχεια, μπορεί να προσδιορίζεται η συνολική θαλλική επιφάνεια σε δοχείο δοκιμής με βαθμονόμηση με επίπεδα σχήματα γνωστού εμβαδού. Θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για τον αποκλεισμό παρεμβολών που οφείλονται στο χείλος του δοχείου. Εναλλακτική αλλά πιο επίπονη προσέγγιση είναι η λήψη φωτοτυπιών των δοχείων δοκιμής και των φυτών, η αποκοπή του προκύπτοντος περιγράμματος των αποικιών και ο προσδιορισμός της επιφάνειάς τους με αναλυτή φυλλικής επιφάνειας ή χαρτί γραφημάτων. Κατάλληλες μπορεί να είναι και άλλες τεχνικές (π.χ. αναλογία βάρους χαρτιού μεταξύ της επιφάνειας του περιγράμματος των αποικιών και της μοναδιαίας επιφάνειας).

ii)

Ξηρό βάρος: Από κάθε δοχείο δοκιμής συλλέγονται όλες οι αποικίες και εκπλύνονται με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Στυπώνονται για την απομάκρυνση της περίσσειας νερού και, κατόπιν, ξηραίνονται στους 60 °C μέχρι σταθερού βάρους. Τα ενδεχόμενα θραύσματα ριζών θα πρέπει να συμπεριλαμβάνονται. Το ξηρό βάρος θα πρέπει να εκφράζεται με ακρίβεια τουλάχιστον 0,1 mg.

iii)

Υγρό βάρος: Όλες οι αποικίες μεταφέρονται σε προζυγισμένους σωλήνες κατασκευασμένους από πολυστυρόλιο (ή άλλο αδρανές υλικό), με στρογγυλό πυθμένα που φέρει μικρές οπές (1 mm). Στη συνέχεια, οι σωλήνες φυγοκεντρούνται στις 3 000 rpm για 10 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι σωλήνες, που περιέχουν τις στεγνές πλέον αποικίες, επαναζυγίζονται και υπολογίζεται το υγρό βάρος με αφαίρεση του βάρους του κενού σωλήνα.

Συχνότητα των μετρήσεων και των αναλυτικών προσδιορισμών

42.

Εάν εφαρμόζεται σχεδιασμός στατικής δοκιμής, θα πρέπει να μετράται το pH κάθε αγωγής στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής. Εάν εφαρμόζεται σχεδιασμός ημιστατικής δοκιμής, το pH θα πρέπει να μετράται σε κάθε παρτίδα “πρόσφατου” διαλύματος δοκιμής, πριν από κάθε ανανέωση, καθώς και στα αντίστοιχα “εξαντλημένα” διαλύματα.

43.

Η φωτεινή ένταση θα πρέπει να μετράται στον θάλαμο ανάπτυξης, τον επωαστήρα ή το δωμάτιο, σε σημεία που βρίσκονται στην ίδια απόσταση από τη φωτεινή πηγή όπως οι θαλλοί της λέμνας. Οι μετρήσεις θα πρέπει να εκτελούνται τουλάχιστον μία φορά στη διάρκεια της δοκιμής. Θα πρέπει να καταγράφεται, τουλάχιστον ημερησίως, η θερμοκρασία του θρεπτικού μέσου σε υποκατάστατο δοχείο, το οποίο διατηρείται υπό τις ίδιες συνθήκες στον θάλαμο ανάπτυξης, τον επωαστήρα ή το δωμάτιο.

44.

Στη διάρκεια της δοκιμής, οι συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας προσδιορίζονται σε κατάλληλα διαστήματα. Η ελάχιστη απαίτηση για τις στατικές δοκιμές είναι ο προσδιορισμός των συγκεντρώσεων στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής.

45.

Στις ημιστατικές δοκιμές, κατά τις οποίες η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας αναμένεται ότι δεν θα παραμείνει εντός των ορίων της ονομαστικής συγκέντρωσης ± 20 %, είναι απαραίτητο να υποβάλλονται σε ανάλυση όλα τα πρόσφατα παρασκευασμένα διαλύματα δοκιμής, καθώς και τα ίδια διαλύματα σε κάθε ανανέωση (βλ. σημείο 33). Ωστόσο, στην περίπτωση των δοκιμών κατά τις οποίες η μετρηθείσα αρχική συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας διαφέρει περισσότερο από ± 20 % από την ονομαστική συγκέντρωση, αλλά μπορούν να προσκομιστούν επαρκή στοιχεία από τα οποία να προκύπτει ότι οι αρχικές συγκεντρώσεις είναι επαναλήψιμες και σταθερές (δηλ. κυμαίνονται μεταξύ 80 και 120 % της αρχικής συγκέντρωσης), είναι δυνατόν να εκτελείται χημικός προσδιορισμός μόνο για την υψηλότερη και τη χαμηλότερη συγκέντρωση δοκιμής. Σε κάθε περίπτωση, οι συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας πριν από την ανανέωση είναι αναγκαίο να προσδιορίζονται μόνο σε ένα από τα δοχεία επανάληψης για κάθε συγκέντρωση δοκιμής (ή στο συνενωμένο περιεχόμενο των δοχείων ανά επανάληψη).

46.

Εάν χρησιμοποιείται συνεχής δοκιμή, ενδείκνυται σύστημα δειγματοληψίας ανάλογο με το περιγραφόμενο για τις ημιστατικές δοκιμές, το οποίο περιλαμβάνει ανάλυση στην αρχή, στη μέση και στο τέλος της δοκιμής, χωρίς όμως μετρήσεις στα “εξαντλημένα” διαλύματα, που δεν ενδείκνυνται στην προκειμένη περίπτωση. Στον συγκεκριμένο τύπο δοκιμής, θα πρέπει να ελέγχεται ημερησίως η ταχύτητα ροής του μέσου αραίωσης και της υπό δοκιμή χημικής ουσίας ή του διαλύματος παρακαταθήκης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας.

47.

Εάν υπάρχουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας διατηρήθηκε ικανοποιητικά εντός των ορίων της ονομαστικής ή μετρηθείσας αρχικής συγκέντρωσης ± 20 % σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής, η ανάλυση των αποτελεσμάτων μπορεί να βασιστεί στις ονομαστικές ή μετρηθείσες αρχικές τιμές. Εάν η απόκλιση από την ονομαστική ή τη μετρηθείσα αρχική συγκέντρωση δεν βρίσκεται εντός του ± 20 %, η ανάλυση των αποτελεσμάτων θα πρέπει να βασίζεται στον γεωμετρικό μέσο όρο των συγκεντρώσεων κατά την έκθεση ή σε μοντέλα που περιγράφουν τη μείωση της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (8).

Οριακή δοκιμή

48.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, π.χ. όταν από προκαταρκτική δοκιμή προκύπτει ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία δεν έχει τοξικές επιδράσεις σε συγκεντρώσεις έως 100 mg/l ή έως το όριο διαλυτότητάς της στο θρεπτικό μέσο δοκιμής (αναλόγως του ποια είναι μικρότερη), είναι δυνατόν να διεξάγεται οριακή δοκιμή, η οποία να συνίσταται σε σύγκριση των αποκρίσεων μιας ομάδας ελέγχου και μιας ομάδας αγωγής (συγκέντρωση ίση με 100 mg/l ή με το όριο διαλυτότητας). Συνιστάται ένθερμα να τεκμηριώνεται αυτό με ανάλυση της συγκέντρωσης έκθεσης. Η οριακή δοκιμή υπόκειται σε όλες τις συνθήκες δοκιμής και όλα τα κριτήρια εγκυρότητας που περιγράφονται ανωτέρω, με εξαίρεση τον αριθμό των επαναλήψεων αγωγής, ο οποίος θα πρέπει να είναι διπλάσιος. Η ανάπτυξη στην ομάδα ελέγχου και στην ομάδα αγωγής είναι δυνατόν να υποβληθεί σε στατιστική ανάλυση με δοκιμή σύγκρισης μέσων όρων, π.χ. δοκιμασία t του Student.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΕΚΘΕΣΕΙΣ

Χρόνος διπλασιασμού

49.

Για τον προσδιορισμό του χρόνου διπλασιασμού (Td ) του αριθμού θαλλών και την τήρηση αυτού του κριτηρίου εγκυρότητας στη μελέτη (σημείο 12), εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος στα δεδομένα που προκύπτουν από τα δοχεία ελέγχου:

Td = ln 2/μ

όπου μ είναι ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, ο οποίος προσδιορίζεται όπως περιγράφεται στα σημεία 54-55.

Μεταβλητές απόκρισης

50.

Η δοκιμή αποσκοπεί στον προσδιορισμό των επιδράσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στη βλαστητική ανάπτυξη της λέμνας. Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών περιγράφονται δύο μεταβλητές απόκρισης, δεδομένου ότι διαφορετικές δικαιοδοσίες έχουν διαφορετικές προτιμήσεις και κανονιστικές ανάγκες. Για να είναι τα αποτελέσματα των δοκιμών αποδεκτά σε όλα τα κράτη μέλη, οι επιδράσεις θα πρέπει να αξιολογούνται με τη χρήση και των δύο μεταβλητών απόκρισης α) και β) που περιγράφονται κατωτέρω.

α)

Μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης: Αυτή η μεταβλητή απόκρισης υπολογίζεται με βάση τις μεταβολές του λογαρίθμου του αριθμού θαλλών και, επιπλέον, τις μεταβολές του λογαρίθμου μιας άλλης μετρούμενης παραμέτρου (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος) με την πάροδο του χρόνου (εκφραζόμενες ανά ημέρα) στους μάρτυρες και σε κάθε ομάδα αγωγής. Η εν λόγω μεταβλητή αναφέρεται μερικές φορές ως σχετικός ρυθμός ανάπτυξης (12).

β)

Απόδοση: Αυτή η μεταβλητή απόκρισης υπολογίζεται με βάση τις μεταβολές του αριθμού θαλλών και, επιπλέον, τις μεταβολές μίας άλλης μετρούμενης παραμέτρου (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος) στους μάρτυρες και σε κάθε ομάδα αγωγής μέχρι το τέλος της δοκιμής.

51.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι τιμές τοξικότητας που υπολογίζονται με χρήση των ανωτέρω δύο μεταβλητών απόκρισης δεν είναι συγκρίσιμες και η διαφορά αυτή πρέπει να αναγνωρίζεται, όταν χρησιμοποιούνται τα αποτελέσματα της δοκιμής. Εάν τηρούνται οι συνθήκες δοκιμής που καθορίζονται στην παρούσα μέθοδο, οι τιμές ECx που προκύπτουν από τον μέσο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (ErCx) είναι γενικά υψηλότερες από τα βασιζόμενα στην απόδοση αποτελέσματα (EyCx), λόγω της μαθηματικής βάσης της αντίστοιχης προσέγγισης. Αυτό δεν θα πρέπει να ερμηνεύεται ως διαφορά ευαισθησίας μεταξύ των δύο μεταβλητών απόκρισης· πρόκειται απλώς για μαθηματική διαφορά τιμών. Η έννοια του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης βασίζεται στον γενικό εκθετικό τύπο ανάπτυξης των ειδών λέμνας σε απεριόριστες καλλιέργειες, όπου η τοξικότητα εκτιμάται με βάση τις επιδράσεις στον ρυθμό ανάπτυξης, χωρίς να εξαρτάται από την απόλυτη τιμή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης του μάρτυρα ούτε από την κλίση της καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης ούτε από τη διάρκεια της δοκιμής. Αντίθετα, τα αποτελέσματα που βασίζονται στην απόδοση ως μεταβλητή απόκρισης εξαρτώνται από όλες τις άλλες προαναφερόμενες μεταβλητές. Η EyCx εξαρτάται από τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης του είδους λέμνας που χρησιμοποιείται σε κάθε δοκιμή, καθώς και από τον μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης, ο οποίος μπορεί να διαφέρει μεταξύ των ειδών ή ακόμη και μεταξύ διαφορετικών κλώνων. Η συγκεκριμένη μεταβλητή απόκρισης δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τη σύγκριση της ευαισθησίας σε τοξικούς παράγοντες μεταξύ ειδών λέμνας ή ακόμα και διαφορετικών κλώνων. Μολονότι είναι προτιμότερο, από επιστημονική άποψη, να χρησιμοποιείται ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για την εκτίμηση της τοξικότητας, η παρούσα μέθοδος δοκιμών περιλαμβάνει και εκτιμήσεις της τοξικότητας με βάση την απόδοση, προκειμένου να καλυφθούν οι κανονιστικές απαιτήσεις που ισχύουν σήμερα σε ορισμένες χώρες.

52.

Οι εκτιμήσεις της τοξικότητας θα πρέπει να βασίζονται στον αριθμό θαλλών και σε μία πρόσθετη μετρούμενη παράμετρο (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος), επειδή ορισμένες χημικές ουσίες ενδέχεται να έχουν πολύ μεγαλύτερη επίδραση σε άλλες μετρούμενες μεταβλητές απ' ό,τι στον αριθμό θαλλών. Η επίδραση αυτή δεν ανιχνεύεται με τον υπολογισμό μόνο του αριθμού θαλλών.

53.

Ο αριθμός θαλλών και κάθε άλλη μετρούμενη μεταβλητή που έχει καταγραφεί, δηλ. η συνολική θαλλική επιφάνεια, το ξηρό βάρος ή το υγρό βάρος, καταχωρίζονται σε πίνακα μαζί με τις συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας για κάθε χρόνο μέτρησης. Η μετέπειτα ανάλυση δεδομένων, π.χ. για την εκτίμηση της LOEC, της NOEC ή της ECx, θα πρέπει να βασίζεται στις τιμές κάθε επανάληψης και όχι στις μέσες τιμές που έχουν υπολογιστεί για κάθε ομάδα αγωγής.

Μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης

54.

Ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για συγκεκριμένη χρονική περίοδο υπολογίζεται ως η λογαριθμική αύξηση των μεταβλητών ανάπτυξης — αριθμός θαλλών και μία ακόμη μετρούμενη μεταβλητή (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος) — από τον ακόλουθο τύπο, ο οποίος εφαρμόζεται για κάθε επανάληψη ελέγχου και αγωγής:

Formula

όπου:

:

μi-j

:

ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης κατά το χρονικό διάστημα i έως j,

:

Ni

:

η μετρούμενη μεταβλητή στο δοχείο δοκιμής ή ελέγχου κατά τη χρονική στιγμή i,

:

Nj

:

η μετρούμενη μεταβλητή στο δοχείο δοκιμής ή ελέγχου κατά τη χρονική στιγμή j,

:

t

:

το χρονικό διάστημα i έως j.

Για κάθε ομάδα αγωγής και ομάδα ελέγχου υπολογίζεται η μέση τιμή του ρυθμού ανάπτυξης, συνοδευόμενη από εκτίμηση της διασποράς.

55.

Θα πρέπει να υπολογίζεται ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για τη συνολική διάρκεια της δοκιμής (η χρονική στιγμή “i” στον ανωτέρω τύπο είναι η αρχή της δοκιμής και η χρονική στιγμή “j” το τέλος της). Για κάθε συγκέντρωση δοκιμής και για κάθε μάρτυρα, υπολογίζεται η μέση τιμή του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης, συνοδευόμενη από εκτίμηση της διακύμανσης. Επιπλέον, θα πρέπει να υπολογίζεται ο τμηματικός ρυθμός ανάπτυξης με σκοπό την αξιολόγηση των επιδράσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στη διάρκεια της περιόδου έκθεσης (π.χ. με εξέταση των λογαριθμικά μετασχηματισμένων καμπυλών ανάπτυξης). Οι ουσιώδεις διαφορές μεταξύ του τμηματικού και του μέσου ρυθμού ανάπτυξης υποδηλώνουν απόκλιση από τη σταθερή εκθετική ανάπτυξη και δικαιολογούν την ενδελεχή εξέταση των καμπυλών ανάπτυξης. Μια συντηρητική προσέγγιση στην περίπτωση αυτή θα ήταν η σύγκριση των ειδικών ρυθμών ανάπτυξης κατά το χρονικό διάστημα μέγιστης αναστολής μεταξύ των καλλιεργειών που έχουν υποβληθεί σε αγωγή και των καλλιεργειών ελέγχου.

56.

Στη συνέχεια, είναι δυνατόν να υπολογιστεί η εκατοστιαία αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης (Ir) για κάθε συγκέντρωση δοκιμής (ομάδα αγωγής) από τον ακόλουθο τύπο:

Formula

όπου:

:

% Ir

:

η εκατοστιαία αναστολή του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης,

:

μC

:

η μέση τιμή του μ στον μάρτυρα,

:

μT

:

η μέση τιμή του μ στην ομάδα αγωγής.

Απόδοση

57.

Οι επιδράσεις στην απόδοση προσδιορίζονται με βάση δύο μετρούμενες μεταβλητές –τον αριθμό θαλλών και μία ακόμη μετρούμενη μεταβλητή (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος)– των οποίων η παρουσία διαπιστώνεται σε κάθε δοχείο δοκιμής στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής. Στην περίπτωση του ξηρού ή του υγρού βάρους, η αρχική βιομάζα προσδιορίζεται σε δείγμα θαλλών που λαμβάνεται από την ίδια παρτίδα που χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό των δοκιμαστικών δοχείων (βλ. σημείο 20). Για κάθε συγκέντρωση δοκιμής και για κάθε μάρτυρα υπολογίζεται η μέση τιμή της απόδοσης, συνοδευόμενη από εκτίμηση της διασποράς. Η μέση εκατοστιαία αναστολή της απόδοσης (%Iy) μπορεί να υπολογιστεί για κάθε ομάδα αγωγής με τον ακόλουθο τύπο:

Formula

όπου:

:

% Iy

:

: η εκατοστιαία μείωση της απόδοσης,

:

bC

:

: η τελική βιομάζα μείον την αρχική βιομάζα στην ομάδα ελέγχου,

:

bΤ

:

: η τελική βιομάζα μείον την αρχική βιομάζα στην ομάδα αγωγής.

Χάραξη των καμπυλών συγκέντρωσης-απόκρισης

58.

Θα πρέπει να χαράσσονται καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης που να συνδέουν τη μέση τιμή της εκατοστιαίας αναστολής της μεταβλητής απόκρισης (Ir ή Iy, υπολογιζόμενη όπως υποδεικνύεται στο σημείο 56 ή 57) με τον λογάριθμο της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας.

Εκτίμηση της ECx

59.

Οι εκτιμήσεις της ECx (π.χ. της EC50) θα πρέπει να βασίζονται τόσο στον μέσο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (ErCx), όσο και στην απόδοση (EyCx). Καθεμία από τις μεταβλητές αυτές θα πρέπει να βασίζεται στον αριθμό θαλλών και σε μία πρόσθετη μετρούμενη μεταβλητή (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος), επειδή υπάρχουν υπό δοκιμή χημικές ουσίες που επιδρούν διαφορετικά στον αριθμό θαλλών απ' ό,τι σε άλλες μετρούμενες μεταβλητές. Επομένως, οι επιθυμητές παράμετροι τοξικότητας είναι τέσσερις τιμές ECx για κάθε βαθμό αναστολής x που έχει υπολογιστεί: ErCx (αριθμός θαλλών)· ErCx (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος)· EyCx (αριθμός θαλλών)· και EyCx (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος).

Στατιστικές διαδικασίες

60.

Το ζητούμενο είναι να ληφθεί ποσοτική σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης με ανάλυση παλινδρόμησης. Είναι δυνατόν να εφαρμοστεί σταθμισμένη γραμμική παλινδρόμηση, έπειτα από γραμμικό μετασχηματισμό των δεδομένων απόκρισης –π.χ. σε μονάδες probit ή logit ή Weibull (13)–, αλλά προτιμώνται οι τεχνικές μη γραμμικής παλινδρόμησης, με τις οποίες αντιμετωπίζονται καλύτερα οι αναπόφευκτες ανωμαλίες των δεδομένων και οι αποκλίσεις τους από τις ομαλές κατανομές. Κοντά στις περιοχές είτε της μηδενικής είτε της πλήρους αναστολής, οι ανωμαλίες αυτές ενδέχεται να μεγεθυνθούν από τον μετασχηματισμό και να αλλοιώσουν την ανάλυση (13). Σημειωτέον ότι οι συνήθεις μέθοδοι ανάλυσης με χρήση αποτελεσμάτων μετασχηματισμού probit, logit ή Weibull προορίζονται για δεδομένα που δέχονται μόνο δύο τιμές (π.χ. θνησιμότητα ή επιβίωση) και πρέπει να τροποποιούνται για να καλύψουν δεδομένα ανάπτυξης ή απόδοσης. Ειδικές διαδικασίες για τον προσδιορισμό των τιμών ECx από συνεχή δεδομένα παρατίθενται στις δημοσιεύσεις (14), (15) και (16).

61.

Για κάθε μεταβλητή απόκρισης που πρόκειται να αναλυθεί, χρησιμοποιείται η σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης για να υπολογιστούν σημειακές εκτιμήσεις των τιμών ECx. Όπου είναι δυνατόν, θα πρέπει να προσδιορίζονται, για κάθε εκτίμηση, τα όρια εμπιστοσύνης 95 %. Η καλή προσαρμογή των δεδομένων απόκρισης στο μοντέλο παλινδρόμησης θα πρέπει να αξιολογείται με γραφική ή στατιστική μέθοδο. Η ανάλυση παλινδρόμησης θα πρέπει να εκτελείται με τη χρήση των αποκρίσεων της κάθε επανάληψης και όχι των μέσων όρων των ομάδων αγωγής.

62.

Εάν τα διαθέσιμα μοντέλα/μέθοδοι παλινδρόμησης είναι ακατάλληλα για τα δεδομένα, μπορούν επίσης να λαμβάνονται εκτιμήσεις και όρια εμπιστοσύνης για την EC50 με γραμμική παρεμβολή με τη μέθοδο bootstrap (17).

63.

Για την εκτίμηση της LOEC και, κατ' επέκταση, της NOEC, είναι αναγκαία η σύγκριση των μέσων όρων των ομάδων αγωγής με την εφαρμογή τεχνικών ανάλυσης της διακύμανσης (ANOVA). Στη συνέχεια, ο μέσος όρος για κάθε συγκέντρωση πρέπει να συγκρίνεται με τον μέσο όρο του μάρτυρα με κατάλληλη μέθοδο πολλαπλής σύγκρισης ή δοκιμής τάσης. Χρήσιμη για τον σκοπό αυτό μπορεί να είναι η δοκιμασία Dunnett ή η δοκιμασία Williams (18)(19)(20)(21). Είναι απαραίτητο να κρίνεται αν ευσταθεί η παραδοχή της ANOVA για ομοιογενή διασπορά. Η εκτίμηση αυτή μπορεί να διενεργηθεί γραφικά ή με επίσημη δοκιμή (22). Κατάλληλες δοκιμασίες είναι η δοκιμασία Levene και η δοκιμασία Bartlett. Εάν δεν ισχύει η παραδοχή της ομοιογένειας της διασποράς, αυτό είναι μερικές φορές δυνατόν να διορθωθεί με λογαριθμικό μετασχηματισμό των δεδομένων. Στις περιπτώσεις ακραίας ετερογένειας της διασποράς η οποία δεν είναι δυνατόν να διορθωθεί με μετασχηματισμό, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο ανάλυσης με μεθόδους όπως ο έλεγχος φθίνουσας τάσης κατά Jonckheere. Πρόσθετη καθοδήγηση σχετικά με τον προσδιορισμό της NOEC παρέχεται στη δημοσίευση (16).

64.

Οι πρόσφατες επιστημονικές εξελίξεις υπαγόρευσαν τη σύσταση να εγκαταλειφθεί η έννοια της NOEC και να αντικατασταθεί από σημειακές εκτιμήσεις των τιμών ECx βάσει παλινδρόμησης. Δεν έχει καθοριστεί κατάλληλη τιμή του x για την παρούσα δοκιμή σε λέμνα. Ωστόσο, φαίνεται να ενδείκνυται ένα εύρος 10 έως 20 % (ανάλογα με την επιλεγμένη μεταβλητή απόκρισης) και, κατά προτίμηση, θα πρέπει να αναφέρονται τόσο η EC10 όσο και η EC20.

Υποβολή εκθέσεων

65.

Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:

 

Υπό δοκιμή χημική ουσία:

φυσική κατάσταση και φυσικοχημικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένου του ορίου υδατοδιαλυτότητας·

δεδομένα χημικής ταυτοποίησης (π.χ. αριθ. CAS), συμπεριλαμβανομένης της καθαρότητας (προσμείξεις).

 

Υπό δοκιμή είδος:

επιστημονική ονομασία, κλώνος (εάν είναι γνωστός) και πηγή.

 

Συνθήκες δοκιμής:

εφαρμοζόμενη διαδικασία δοκιμής (στατική, ημιστατική ή συνεχής)·

ημερομηνία έναρξης της δοκιμής και διάρκεια της δοκιμής·

θρεπτικό μέσο δοκιμής·

περιγραφή του πειραματικού σχεδιασμού: δοχεία δοκιμής και καλύμματα, όγκοι διαλυμάτων, αριθμός αποικιών και θαλλών ανά δοχείο δοκιμής στην αρχή της δοκιμής·

συγκεντρώσεις δοκιμής (ονομαστικές και μετρηθείσες, κατά περίπτωση) και αριθμός επαναλήψεων ανά συγκέντρωση·

μέθοδοι παρασκευής των διαλυμάτων παρακαταθήκης και των διαλυμάτων δοκιμής, συμπεριλαμβανομένης της ενδεχόμενης χρήσης διαλυτών ή μέσων διασποράς·

θερμοκρασία κατά τη δοκιμή·

φωτεινή πηγή, ένταση και ομοιογένεια·

τιμές pH των θρεπτικών μέσων δοκιμής και ελέγχου·

συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και μέθοδος ανάλυσης, με τα κατάλληλα δεδομένα αξιολόγησης της ποιότητας (μελέτες επικύρωσης, τυπικές αποκλίσεις ή όρια εμπιστοσύνης των αναλύσεων)·

μέθοδοι προσδιορισμού του αριθμού θαλλών και των τιμών άλλων μετρούμενων μεταβλητών, π.χ. ξηρό βάρος, υγρό βάρος ή θαλλική επιφάνεια·

όλες οι παρεκκλίσεις από την παρούσα μέθοδο δοκιμών.

 

Αποτελέσματα:

ανεπεξέργαστα δεδομένα: αριθμός θαλλών και τιμές άλλων μετρούμενων μεταβλητών για κάθε δοχείο δοκιμής και ελέγχου σε κάθε παρατήρηση και χρόνο ανάλυσης·

μέσοι όροι και τυπικές αποκλίσεις για κάθε μετρούμενη μεταβλητή·

καμπύλες ανάπτυξης για κάθε συγκέντρωση (συνιστάται να χαράσσονται με λογαριθμικό μετασχηματισμό των μετρούμενων μεταβλητών, βλ. σημείο 55)·

χρόνος διπλασιασμού / ρυθμός ανάπτυξης στον μάρτυρα, με βάση τον αριθμό θαλλών·

υπολογισθείσες μεταβλητές απόκρισης για κάθε επανάληψη αγωγής, συνοδευόμενες από τους μέσους όρους και τον συντελεστή μεταβολής για τις επαναλήψεις·

γραφική παράσταση της σχέσης συγκέντρωσης-επίδρασης·

εκτιμήσεις των τοξικών τελικών σημείων για τις μεταβλητές απόκρισης, π.χ. EC50, EC10, EC20 και τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης. Τιμές LOEC και/ή NOEC, εάν έχουν υπολογιστεί, και στατιστικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό τους·

εάν έχει χρησιμοποιηθεί τεχνική ANOVA, το ανιχνεύσιμο μέγεθος της επίδρασης (π.χ. η ελάχιστη σημαντική διαφορά)·

διέγερση της ανάπτυξης που ενδεχομένως διαπιστώθηκε σε οποιοδήποτε δοχείο αγωγής·

τυχόν ορατά σημεία φυτοτοξικότητας, καθώς και παρατηρήσεις των διαλυμάτων δοκιμής·

συζήτηση των αποτελεσμάτων, συμπεριλαμβανομένης της επίδρασης τυχόν αποκλίσεων από την παρούσα μέθοδο στην έκβαση της δοκιμής.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). σ. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA — United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 σελίδες.

(3)

AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 σελίδες.

(4)

SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 σελίδες (στα σουηδικά).

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 — 120 σελίδες.

(6)

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Παρίσι.

(9)

International Organisation for Standardisation. ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test.

(10)

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

(11)

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 — 359.

(12)

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

(13)

Christensen, E.R.,, Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.

(14)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

(15)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

(16)

ΟΟΣΑ. (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Οργανισμός Οικονομικής Συνεργασίας και Ανάπτυξης, Παρίσι.

(17)

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(19)

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

(20)

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

(21)

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.

(22)

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Προσάρτημα 1

Ορισμοί

Για τους σκοπούς της παρούσας μεθόδου δοκιμών, χρησιμοποιούνται οι ακόλουθοι ορισμοί και συντμήσεις:

Βιομάζα : το ξηρό βάρος της ζώσας ύλης την οποία περιέχει ένας πληθυσμός. Στην παρούσα δοκιμή, μετρώνται συνήθως υποκατάστατα της βιομάζας, όπως ο αριθμός θαλλών ή η θαλλική επιφάνεια. Ως εκ τούτου, ο όρος βιομάζα αναφέρεται και σε αυτά τα υποκατάστατα μέτρα.

Χημική ουσία : μια ουσία ή ένα μείγμα.

Χλώρωση : ο κίτρινος χρωματισμός του θαλλικού ιστού.

Κλώνος : οργανισμός ή κύτταρο που δημιουργείται με αγενή αναπαραγωγή από ένα μόνο άτομο. Συνεπώς, τα μέλη του ίδιου κλώνου είναι γενετικώς πανομοιότυπα.

Αποικία : συσσωμάτωμα μητρικών και θυγατρικών θαλλών (συνήθως 2 έως 4), συνδεδεμένων μεταξύ τους. Μερικές φορές, αναφέρεται ως φυτό.

ECx : η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, διαλυμένης στο θρεπτικό μέσο δοκιμής, η οποία προκαλεί μείωση της ανάπτυξης της λέμνας κατά x % (π.χ. 50 %) εντός της δηλούμενης περιόδου έκθεσης (πρέπει να αναφέρεται επακριβώς, εάν διαφέρει από την πλήρη ή κανονική διάρκεια της δοκιμής). Για να δηλώνεται σαφώς αν η τιμή EC έχει προκύψει από τον ρυθμό ανάπτυξης ή από την απόδοση, χρησιμοποιούνται, αντίστοιχα, τα σύμβολα “ErC” και “EyC”, ακολουθούμενα από τη μεταβλητή που μετρήθηκε, π.χ. ErC (αριθμός θαλλών).

Συνεχής δοκιμή : η δοκιμή στην οποία τα διαλύματα δοκιμής αντικαθίστανται συνεχώς.

Θαλλός : ατομική/μεμονωμένη “φυλλοειδής” δομή του φυτού λέμνα. Πρόκειται για τη μικρότερη μονάδα, δηλ. άτομο, με ικανότητα αναπαραγωγής.

Κυφότητα : οι θαλλοί που εμφανίζουν εξόγκωμα ή διόγκωση.

Ανάπτυξη : η αύξηση της μετρούμενης μεταβλητής –π.χ. αριθμός θαλλών, ξηρό βάρος, υγρό βάρος ή θαλλική επιφάνεια– στη διάρκεια της δοκιμής.

Ρυθμός ανάπτυξης (μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης): η λογαριθμική αύξηση της βιομάζας κατά την περίοδο έκθεσης.

Κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης (LOEC) : η χαμηλότερη ελεγχθείσα συγκέντρωση στην οποία παρατηρείται στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης (με p < 0,05) υπό την επίδραση της χημικής ουσίας, σε σύγκριση με τον μάρτυρα, εντός δεδομένου χρόνου έκθεσης. Ωστόσο, όλες οι συγκεντρώσεις δοκιμής που υπερβαίνουν τη LOEC πρέπει να έχουν βλαβερή επίδραση ίση ή μεγαλύτερη από εκείνη που παρατηρείται στη LOEC. Σε περίπτωση που δεν είναι δυνατόν να πληρούνται οι δύο αυτοί όροι, πρέπει να εξηγείται πλήρως ο τρόπος επιλογής της LOEC (και, κατ' επέκταση, της NOEC).

Μετρούμενες μεταβλητές : κάθε είδους μεταβλητή που μετράται, προκειμένου να εκφραστεί το τελικό σημείο της δοκιμής με χρήση μίας ή περισσότερων διαφορετικών μεταβλητών απόκρισης. Στην παρούσα μέθοδο, μετρούμενες μεταβλητές είναι ο αριθμός θαλλών, η θαλλική επιφάνεια, το υγρό βάρος και το ξηρό βάρος.

Μονοκαλλιέργεια : καλλιέργεια με ένα μόνο είδος φυτού.

Νέκρωση : νεκρός (δηλ. λευκός ή διαποτισμένος με νερό) θαλλικός ιστός.

Συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC) : η συγκέντρωση δοκιμής που είναι αμέσως μικρότερη από τη LOEC.

Φαινότυπος : τα αντιληπτά χαρακτηριστικά ενός οργανισμού τα οποία καθορίζονται από την αλληλεπίδραση των γονιδίων του με το περιβάλλον του.

Μεταβλητές απόκρισης : μεταβλητές για την εκτίμηση της τοξικότητας, οι οποίες προκύπτουν, με διάφορες μεθόδους υπολογισμού, από τις μετρούμενες μεταβλητές που περιγράφουν τη βιομάζα. Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών, ο ρυθμός ανάπτυξης και η απόδοση είναι μεταβλητές απόκρισης που προκύπτουν από μετρούμενες μεταβλητές, όπως ο αριθμός θαλλών, η θαλλική επιφάνεια, το υγρό βάρος ή το ξηρό βάρος.

Ημιστατική δοκιμή (ανανέωσης) : η δοκιμή στη διάρκεια της οποίας το διάλυμα δοκιμής αντικαθίσταται ανά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα.

Στατική δοκιμή : η δοκιμή στη διάρκεια της οποίας δεν ανανεώνεται το διάλυμα δοκιμής.

Υπό δοκιμή χημική ουσία : κάθε ουσία ή μείγμα που υποβάλλεται σε δοκιμή με τη χρήση της παρούσας μεθόδου δοκιμών.

Τελικό σημείο της δοκιμής : περιγράφει, ως στόχο της δοκιμής, τον γενικό παράγοντα που θα μεταβληθεί υπό την επίδραση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε σχέση με τον μάρτυρα. Στην παρούσα μέθοδο, το τελικό σημείο της δοκιμής είναι η αναστολή της ανάπτυξης, η οποία μπορεί να εκφραστεί με διάφορες μεταβλητές απόκρισης, οι οποίες βασίζονται σε μία ή περισσότερες μετρούμενες μεταβλητές.

Θρεπτικό μέσο δοκιμής : το πλήρες συνθετικό θρεπτικό υλικό, στο οποίο αναπτύσσονται τα φυτά της δοκιμής, όταν εκτίθενται στην υπό δοκιμή χημική ουσία. Η υπό δοκιμή χημική ουσία διαλύεται, κατά κανόνα, στο θρεπτικό μέσο δοκιμής.

Απόδοση : ισούται με την τιμή της μετρούμενης μεταβλητής που εκφράζει τη βιομάζα στο τέλος της περιόδου έκθεσης μείον την τιμή της ίδιας μεταβλητής στην αρχή της περιόδου έκθεσης.

Προσάρτημα 2

Περιγραφή του φυτού Lemna spp.

Το υδρόβιο φυτό Lemna spp., κοινώς λέμνα ή φακή του νερού, ανήκει στην οικογένεια των λεμνιδών (Lemnaceae), που περιλαμβάνει ορισμένα κοσμοπολίτικα είδη, ταξινομημένα σε τέσσερα γένη. Οι διαφορές τους ως προς την εμφάνιση και τη συστηματική κατάταξη έχουν περιγραφεί εκτενώς (1)(2). Τα είδη Lemna gibba και Lemna minor είναι αντιπροσωπευτικά των εύκρατων περιοχών και χρησιμοποιούνται ευρέως σε δοκιμές τοξικότητας. Και τα δύο αυτά είδη έχουν έναν επιπλέοντα ή βυθισμένο δισκοειδή βλαστό (θαλλό), ενώ από το κέντρο της κάτω επιφάνειας κάθε θαλλού εξέρχεται μια λεπτότατη ρίζα. Η Lemna spp. σπάνια παράγει άνθη και τα φυτά πολλαπλασιάζονται με βλαστητική αναπαραγωγή, παράγοντας νέους θαλλούς (3). Σε σύγκριση με τα φυτά μεγαλύτερης ηλικίας, τα νεαρότερα έχουν ασθενέστερο χρώμα και βραχύτερες ρίζες και αποτελούνται από δύο έως τρεις θαλλούς διαφορετικών μεγεθών. Το μικρό μέγεθος της λέμνας, η απλή δομή της, η αγενής αναπαραγωγή της και ο μικρός χρόνος γενεάς καθιστούν τα φυτά του γένους αυτού ιδιαίτερα κατάλληλα για εργαστηριακές δοκιμές (4)(5).

Λόγω πιθανών διειδικών διαφορών ως προς την ευαισθησία, μόνο οι συγκρίσεις ευαισθησίας εντός του ίδιου είδους είναι έγκυρες.

Παραδείγματα ειδών λέμνας που έχουν χρησιμοποιηθεί σε δοκιμές: αναφορά των ειδών στη βιβλιογραφία

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 σελίδες.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 σελίδες.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 σελίδες (στα σουηδικά).

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). σ. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 σελίδες.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Πηγές ειδών λέμνας

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Τορόντο, Οντάριο, Καναδάς, M5S 3 B2

Τηλ.: +1-416-978-3641

Φαξ: +1-416-978-5878

Ηλ. ταχ.: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

ΗΠΑ

Τηλ.: 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

Στοκχόλμη

ΣΟΥΗΔΙΑ

Τηλ.: +46 8 674 7240

Φαξ: +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Βερολίνο

ΓΕΡΜΑΝΙΑ

Ηλ. ταχ.: lemna@uba.de

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Ελβετία.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

Προσάρτημα 3

Διατήρηση της μητρικής καλλιέργειας

Οι μητρικές καλλιέργειες μπορούν να διατηρούνται σε χαμηλότερη θερμοκρασία (4-10 °C) για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, χωρίς να χρειάζεται να παρασκευαστούν εκ νέου. Το θρεπτικό μέσο για τη λέμνα μπορεί να είναι ίδιο με το θρεπτικό μέσο της δοκιμής, αλλά για τις μητρικές καλλιέργειες μπορούν να χρησιμοποιούνται άλλα πλούσια σε θρεπτικά στοιχεία μέσα.

Κατά διαστήματα, μερικά νεαρά φυτά χρώματος ανοικτού πράσινου μεταφέρονται με τεχνική ασηψίας σε νέα δοχεία καλλιέργειας τα οποία περιέχουν πρόσφατα παρασκευασμένο θρεπτικό μέσο. Στις συνθήκες χαμηλότερης θερμοκρασίας που υποδεικνύονται στη παρούσα μέθοδο, η υποκαλλιέργεια μπορεί να πραγματοποιείται ανά τρίμηνο κατ' ανώτατο όριο.

Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται χημικώς καθαρά (εκπλυμένα με οξέα) και στείρα γυάλινα δοχεία καλλιέργειας και να εφαρμόζονται τεχνικές εργασίας σε συνθήκες ασηψίας. Εάν μολυνθεί η μητρική καλλιέργεια, π.χ. από φύκη ή μύκητες, απαιτούνται μέτρα για την εξάλειψη των επιμολυντικών οργανισμών. Στην περίπτωση των φυκών και των περισσότερων άλλων επιμολυντικών οργανισμών, αυτό μπορεί να επιτευχθεί με επιφανειακή αποστείρωση. Λαμβάνεται δείγμα του μολυσμένου φυτικού υλικού και κόβονται οι ρίζες. Στη συνέχεια, το υλικό αυτό αναταράσσεται ζωηρά μέσα σε καθαρό νερό και εμβαπτίζεται σε διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5 % (v/v) για χρονικό διάστημα μεταξύ 30 δευτερολέπτων και 5 λεπτών. Κατόπιν, το φυτικό υλικό εκπλύνεται με στείρο νερό και κατανέμεται σε έναν ορισμένο αριθμό δοχείων καλλιέργειας που περιέχουν πρόσφατα παρασκευασμένο θρεπτικό μέσο (παρτίδες). Η κατεργασία αυτή έχει ως επακόλουθο τον θάνατο πολλών θαλλών, ιδίως όταν η έκθεση διαρκεί περισσότερο χρόνο, αλλά ορισμένοι από τους επιζώντες είναι συνήθως απαλλαγμένοι από μόλυνση. Οι τελευταίοι μπορούν έπειτα να χρησιμοποιηθούν για τον επανεμβολιασμό νέων καλλιεργειών.

Προσάρτημα 4

Θρεπτικά μέσα

Συνιστώνται διαφορετικά θρεπτικά μέσα για τα είδη L. minor και L. gibba. Για το L. minor συνιστάται τροποποιημένη έκδοση του θρεπτικού μέσου του Σουηδικού Ινστιτούτου Τυποποίησης (SIS), ενώ για το L. gibba, συνιστάται το θρεπτικό μέσο 20X AAP. Η σύνθεση των δύο μέσων παρατίθεται κατωτέρω. Κατά την παρασκευή των ανωτέρω θρεπτικών μέσων πρέπει να χρησιμοποιούνται χημικές ουσίες καθαρότητας αντιδραστηρίου ή αναλυτικής καθαρότητας και απιονισμένο νερό.

Θρεπτικό μέσο του Σουηδικού Ινστιτούτου Τυποποίησης (SIS) για τη λέμνα

Τα διαλύματα παρακαταθήκης I — V αποστειρώνονται σε αυτόκαυστο (120 °C, 15 λεπτά) ή με διήθηση μέσω μεμβράνης (διάμετρος πόρων 0,2 μm περίπου).

Τα διαλύματα παρακαταθήκης VI και (προαιρετικά) VII αποστειρώνονται μόνο με διήθηση μέσω μεμβράνης και δεν πρέπει να θερμαίνονται σε αυτόκαυστο.

Τα στείρα διαλύματα παρακαταθήκης θα πρέπει να φυλάσσονται σε συνθήκες ψύχους και σκότους. Τα διαλύματα παρακαταθήκης I - V θα πρέπει να απορρίπτονται έπειτα από έξι μήνες, ενώ η διάρκεια αποθήκευσης των διαλυμάτων παρακαταθήκης VI και (προαιρετικά) VII είναι ένας μήνας.

Αριθ. διαλύματος παρακαταθήκης

Ουσία

Συγκέντρωση στο διάλυμα παρακαταθήκης

(g/l)

Συγκέντρωση στο παρασκευαζόμενο θρεπτικό μέσο

(mg/ߦl)

Παρασκευαζόμενο θρεπτικό μέσο

 

 

 

 

Στοιχείο

Συγκέντρωση

(mg/ߦl)

Ι

NaNO3

8,50

85

Na· N

32· 14

KH2PO4

1,34

13,4

K· P

6,0· 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg· S

7,4· 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca· Cl

9,8· 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (ρυθμιστικό διάλυμα)

490

490

Για την παρασκευή 1 λίτρου θρεπτικού μέσου SIS προστίθενται σε 900 ml απιονισμένου νερού τα ακόλουθα:

10 ml διαλύματος παρακαταθήκης I

5 ml διαλύματος παρακαταθήκης II

5 ml διαλύματος παρακαταθήκης III

5 ml διαλύματος παρακαταθήκης IV

1 ml διαλύματος παρακαταθήκης V

5 ml διαλύματος παρακαταθήκης VI

1 ml διαλύματος παρακαταθήκης VII (προαιρετικά)

Σημείωση: Για ορισμένες υπό δοκιμή χημικές ουσίες ενδέχεται να χρειάζεται ένα επιπλέον διάλυμα παρακαταθήκης VII [ρυθμιστικό διάλυμα MOPS (μορφολινοπροπανοσουλφονικό οξύ) — βλ. σημείο 11].

Ρυθμίζεται το pH στην τιμή 6,5 ± 0,2 με 0,1 ή 1 mol HCl ή NaOH, και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι το 1 λίτρο με απιονισμένο νερό.

Θρεπτικό μέσο 20X AAP

Τα διαλύματα παρακαταθήκης παρασκευάζονται με στείρο απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό.

Τα στείρα διαλύματα παρακαταθήκης θα πρέπει να φυλάσσονται σε συνθήκες ψύχους και σκότους. Στις συνθήκες αυτές, η διάρκεια αποθήκευσης των διαλυμάτων παρακαταθήκης είναι τουλάχιστον 6-8 εβδομάδες.

Για το θρεπτικό μέσο 20X AAP παρασκευάζονται πέντε διαλύματα παρακαταθήκης θρεπτικών στοιχείων (A1, A2, A3, B και Γ), με χρήση χημικών ουσιών καθαρότητας αντιδραστηρίου. Λαμβάνονται 20 ml από κάθε διάλυμα παρακαταθήκης θρεπτικών στοιχείων και προστίθενται σε περίπου 850 ml απιονισμένου νερού για να προκύψει το θρεπτικό μέσο. Ρυθμίζεται το pH στην τιμή 7,5 ± 0,1 με 0,1 ή 1 mol HCl ή NaOH, και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι το 1 λίτρο με απιονισμένο νερό. Στη συνέχεια, το θρεπτικό μέσο διηθείται μέσω διηθητικής μεμβράνης των 0,2 μm (περίπου) σε στείρο υποδοχέα.

Το θρεπτικό μέσο που προορίζεται για τη διεξαγωγή δοκιμών θα πρέπει να παρασκευάζεται 1-2 ημέρες πριν χρησιμοποιηθεί, ώστε να είναι δυνατόν να σταθεροποιηθεί το pH. Το pH του θρεπτικού μέσου θα πρέπει να ελέγχεται πριν από τη χρήση του και, εάν είναι απαραίτητο, να ρυθμίζεται εκ νέου με την προσθήκη διαλύματος NaOH ή HCl 0,1 ή 1 M, όπως περιγράφεται ανωτέρω.

Αριθ. διαλύματος παρακαταθήκης

Ουσία

Συγκέντρωση στο διάλυμα παρακαταθήκης

(g/ߦl) (7)

Συγκέντρωση στο παρασκευαζόμενο θρεπτικό μέσο

(mg/ߦl) (7)

Παρασκευαζόμενο θρεπτικό μέσο

 

 

 

 

Στοιχείο

Συγκέντρωση

(mg/ߦl) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na· N

190· 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2 · O

1,4

30

K· P

9,4· 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na· C

220· 43

Θρεπτικό μέσο Steinberg (κατά το πρότυπο ISO 20079)

Συγκεντρώσεις και διαλύματα παρακαταθήκης

Κατά το πρότυπο ISO 20079, το τροποποιημένο θρεπτικό μέσο Steinberg χρησιμοποιείται μόνο για το είδος Lemna minor (δεδομένου ότι μόνο το Lemna minor επιτρέπεται)· ωστόσο, δοκιμές έχουν αποδείξει ότι είναι δυνατόν να επιτευχθούν ικανοποιητικά αποτελέσματα με τη χρήση του και για το είδος Lemna gibba.

Κατά την παρασκευή του εν λόγω μέσου, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται χημικές ουσίες καθαρότητας αντιδραστηρίου ή αναλυτικής καθαρότητας και απιονισμένο νερό.

Παρασκευάζεται το θρεπτικό μέσο από διαλύματα παρακαταθήκης ή από το πυκνό υλικό δεκαπλάσιας συγκέντρωσης, το οποίο παρέχει τη δυνατότητα επίτευξης μέγιστης συγκέντρωσης χωρίς καθίζηση.

Πίνακας 1

Θρεπτικό μέσο Steinberg σταθερού pH (τροποποιημένο κατά Altenburger)

Συστατικό

Θρεπτικό μέσο

Μακροθρεπτικά στοιχεία

Μοριακό βάρος

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Μικροθρεπτικά στοιχεία

Μοριακό βάρος

0,1 μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA, διένυδρο άλας με νάτριο

372,24

1 500,00

4,03


Πίνακας 2

Διαλύματα παρακαταθήκης (Μακροθρεπτικά στοιχεία)

1.

Μακροθρεπτικά στοιχεία (σε 50πλάσια συγκέντρωση)

g/l

Διάλυμα παρακαταθήκης 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Διάλυμα παρακαταθήκης 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Διάλυμα παρακαταθήκης 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Πίνακας 3

Διαλύματα παρακαταθήκης (Μικροθρεπτικά στοιχεία)

2.

Μικροθρεπτικά στοιχεία (σε 1 000πλάσια συγκέντρωση)

mg/l

Διάλυμα παρακαταθήκης 4:

H3BO3

120,0

Διάλυμα παρακαταθήκης 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Διάλυμα παρακαταθήκης 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Διάλυμα παρακαταθήκης 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Διάλυμα παρακαταθήκης 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA, διένυδρο άλας με νάτριο

1 500,00

Τα διαλύματα παρακαταθήκης 2 και 3, και χωριστά διαλύματα παρακαταθήκης 4 έως 7 είναι δυνατόν να ενωθούν (λαμβανομένων υπόψη των απαιτούμενων συγκεντρώσεων).

Για να παραταθεί η διάρκεια αποθήκευσης, τα διαλύματα παρακαταθήκης θερμαίνονται σε αυτόκαυστο στους 121 °C για 20 λεπτά ή, εναλλακτικά, υποβάλλονται σε αποστειρωτική διήθηση (ηθμός των 0,2 μm). Στην περίπτωση του διαλύματος παρακαταθήκης 8, συνιστάται ένθερμα η αποστειρωτική διήθηση (ηθμός των 0,2 μm).

Παρασκευή του (τροποποιημένου) θρεπτικού μέσου Steinberg με την τελική συγκέντρωση

Σε περίπου 900 ml απιονισμένου νερού προστίθενται 20 ml από τα διαλύματα παρακαταθήκης 1, 2 και 3 (βλ. πίνακα 2), ώστε να αποφεύγεται η καθίζηση.

Προστίθεται 1,0 ml από τα διαλύματα παρακαταθήκης 4, 5, 6, 7 και 8 (βλ. πίνακα 3).

Το pH θα πρέπει να είναι 5,5 +/- 0,2 (ρυθμίζεται με την προσθήκη του ελάχιστου δυνατού όγκου διαλύματος NaOH ή HCl).

Συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 1 000 ml με νερό.

Εάν τα διαλύματα παρακαταθήκης είναι αποστειρωμένα και χρησιμοποιείται το ενδεδειγμένο νερό, δεν απαιτείται περαιτέρω αποστείρωση. Εάν αποστειρώνεται το τελικό θρεπτικό μέσο, το διάλυμα παρακαταθήκης 8 θα πρέπει να προστίθεται μετά τη θέρμανση σε αυτόκαυστο (στους 121 °C για 20 λεπτά).

Παρασκευή του πυκνού (τροποποιημένου) θρεπτικού μέσου Steinberg με δεκαπλάσια συγκέντρωση για ενδιάμεση αποθήκευση

Σε περίπου 30 ml απιονισμένου νερού προστίθενται 20 ml από τα διαλύματα παρακαταθήκης 1, 2 και 3 (βλ. πίνακα 2), ώστε να αποφεύγεται η καθίζηση.

Προστίθεται 1,0 ml από τα διαλύματα παρακαταθήκης 4, 5, 6, 7 και 8 (βλ. πίνακα 3). Συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 100 ml με νερό.

Εάν τα διαλύματα παρακαταθήκης είναι αποστειρωμένα και χρησιμοποιείται το ενδεδειγμένο νερό, δεν απαιτείται περαιτέρω αποστείρωση. Εάν αποστειρώνεται το τελικό θρεπτικό μέσο, το διάλυμα παρακαταθήκης 8 θα πρέπει να προστίθεται μετά τη θέρμανση σε αυτόκαυστο (στους 121 °C για 20 λεπτά).

Το pH του θρεπτικού μέσου (τελική συγκέντρωση) θα πρέπει να είναι 5,5 ± 0,2.

»

6)

Προστίθενται τα ακόλουθα κεφάλαια Γ.31 έως Γ.46:

«

Γ.31.   ΔΟΚΙΜΗ ΣΕ ΧΕΡΣΑΙΑ ΦΥΤΑ: ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΔΥΣΗΣ ΣΠΟΡΟΦΥΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΠΟΡΟΦΥΤΩΝ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμής είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 208 του ΟΟΣΑ (2006). Οι μέθοδοι δοκιμών επανεξετάζονται περιοδικά με βάση την επιστημονική πρόοδο και την εφαρμοσιμότητά τους στην κανονιστική χρήση. Η παρούσα επικαιροποιημένη μέθοδος δοκιμών έχει σχεδιαστεί με σκοπό να εκτιμηθούν οι δυνητικές επιδράσεις των χημικών ουσιών στην ανάδυση και την ανάπτυξη σποροφύτων. Ως τέτοια, δεν καλύπτει τις χρόνιες επιδράσεις ή τις επιδράσεις στην αναπαραγωγή (δηλ. σπορόδεση, σχηματισμός ανθέων, ωρίμανση καρπών). Πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι συνθήκες έκθεσης και οι ιδιότητες της χημικής ουσίας που πρόκειται να υποβληθεί σε δοκιμή, ώστε να εξασφαλίζεται ότι χρησιμοποιούνται οι ενδεικνυόμενες μέθοδοι δοκιμών (π.χ. κατά τη δοκιμή μετάλλων / μεταλλικών ενώσεων θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι επιδράσεις του pH και των αντίστοιχων αντισταθμιστικών ιόντων) (1). Η παρούσα μέθοδος δοκιμών δεν αφορά τα φυτά που εκτίθενται σε ατμούς χημικών ουσιών. Η μέθοδος εφαρμόζεται στις δοκιμές χημικών ουσιών εν γένει, βιοκτόνων και προϊόντων προστασίας των καλλιεργειών (γνωστών και ως φυτοπροστατευτικών προϊόντων ή παρασιτοκτόνων). Έχει αναπτυχθεί με βάση υφιστάμενες μεθόδους (2) (3) (4) (5) (6) (7). Ελήφθησαν επίσης υπόψη άλλες παραπομπές που αφορούν τις δοκιμές σε φυτά (8) (9) (10). Οι ορισμοί που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στο προσάρτημα 1.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

2.

Η δοκιμή εκτιμά τις επιδράσεις στην ανάδυση σποροφύτων και την αρχική ανάπτυξη ανώτερων φυτών έπειτα από έκθεση στην υπό δοκιμή χημική ουσία στο έδαφος (ή σε άλλη κατάλληλη μήτρα εδάφους). Οι σπόροι τοποθετούνται σε έδαφος που έχει υποστεί αγωγή με την υπό δοκιμή χημική ουσία, και εκτιμώνται οι επιδράσεις μετά την πάροδο συνήθως 14 έως 21 ημερών έπειτα από ανάδυση του 50 % των σποροφύτων στην ομάδα ελέγχου. Τα μετρούμενα τελικά σημεία είναι η οπτική εκτίμηση της ανάδυσης σποροφύτων, το ξηρό βάρος των βλαστών (εναλλακτικά, το υγρό βάρος των βλαστών) και, σε ορισμένες περιπτώσεις, το ύψος των βλαστών, καθώς και η εκτίμηση των εμφανών βλαβερών επιδράσεων σε διάφορα μέρη του φυτού. Αυτές οι μετρήσεις και οι παρατηρήσεις συγκρίνονται με τις αντίστοιχες για τα φυτά ελέγχου που δεν έχουν υποβληθεί σε αγωγή.

3.

Ανάλογα με την αναμενόμενη οδό έκθεσης, η υπό δοκιμή χημική ουσία είτε ενσωματώνεται στο έδαφος (ή, ενδεχομένως, σε τεχνητή μήτρα εδάφους) είτε εφαρμόζεται στην επιφάνεια του εδάφους, κάτι που αντιπροσωπεύει ακριβώς την πιθανή οδό έκθεσης στη χημική ουσία. Η ενσωμάτωση στο έδαφος πραγματοποιείται με αγωγή του χύδην εδάφους. Μετά την εφαρμογή, το έδαφος μεταφέρεται σε δοχεία και, στη συνέχεια, οι σπόροι του συγκεκριμένου είδους φυτού φυτεύονται στο έδαφος. Οι επιφανειακές εφαρμογές πραγματοποιούνται σε έδαφος μέσα σε δοχείο στο οποίο έχουν ήδη φυτευθεί οι σπόροι. Στη συνέχεια, οι μονάδες δοκιμής (μάρτυρες και εδάφη που έχουν υποστεί αγωγή συν σπόροι) τοποθετούνται σε κατάλληλες συνθήκες που ευνοούν την εκβλάστηση/ανάπτυξη των φυτών.

4.

Ανάλογα με τον επιδιωκόμενο σκοπό, η δοκιμή μπορεί να διεξάγεται για τον προσδιορισμό της καμπύλης δόσης-απόκρισης, ή σε μία συγκέντρωση/ποσότητα ως οριακή δοκιμή. Εάν τα αποτελέσματα από τη δοκιμή σε μία συγκέντρωση/ποσότητα υπερβαίνουν ένα συγκεκριμένο όριο τοξικότητας (π.χ. εάν διαπιστώνονται επιδράσεις που υπερβαίνουν το x %), διενεργείται δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών με σκοπό να προσδιοριστεί το ανώτερο και το κατώτερο όριο τοξικότητας και, στη συνέχεια, δοκιμή σε πολλαπλές συγκεντρώσεις/ποσότητες, με σκοπό τη χάραξη καμπύλης δόσης-απόκρισης. Εφαρμόζεται κατάλληλη στατιστική ανάλυση, για να ληφθεί η αποτελεσματική συγκέντρωση ECx ή η αποτελεσματική ποσότητα εφαρμογής ERx (π.χ. EC25, ER25, EC50, ER50) για την(τις) πιο ευαίσθητη(-ες) ενδεικνυόμενη(-ες) παράμετρο(-τρους). Με αυτή τη δοκιμή μπορούν επίσης να υπολογιστούν η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC) και η κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης (LOEC).

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟ ΔΟΚΙΜΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ