σχετικά με τους όρους υγειονομικού ελέγχου που διέπουν τη διακίνηση των ιπποειδών και τις εισαγωγές ιπποειδών προέλευσης τρίτων χωρών

(Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας, και ιδίως το άρθρο 37,

Η παρούσα οδηγία καθορίζει τους όρους υγειονομικού ελέγχου που διέπουν τη διακίνηση ιπποειδών μεταξύ των κρατών μελών και τις εισαγωγές ιπποειδών από τρίτες χώρες.

Για τους σκοπούς της παρούσας οδηγίας, νοούνται ως:

ΚΑΝΟΝΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΚΙΝΗΣΗ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΚΡΑΤΩΝ ΜΕΛΩΝ

Τα κράτη μέλη επιτρέπουν τη διακίνηση εγγεγραμμένων ιπποειδών στο έδαφός τους και αποστέλλουν στο έδαφος άλλων κρατών μελών μόνο τα ιπποειδή που πληρούν τις προϋποθέσεις των άρθρων 4 και 5.

Ωστόσο, οι αρμόδιες αρχές των κρατών μελών προορισμού μπορούν να χορηγούν γενικές ή περιορισμένες παρεκκλίσεις για τις διακινήσεις ιπποειδών:

Τα κράτη μέλη που κάνουν χρήση της ευχέρειας αυτής ενημερώνουν την Επιτροπή σχετικά με το περιεχόμενο των χορηγούμενων παρεκκλίσεων.

1. Τα ιπποειδή δεν πρέπει να παρουσιάζουν κανένα κλινικό σύμπτωμα ασθένειας κατά την επιθεώρηση. Η επιθεώρηση πρέπει να πραγματοποιείται εντός των 48 ωρών που προηγούνται της επιβιβάσεως ή της φορτώσεως των ιπποειδών. Ωστόσο, όσον αφορά τα εγγεγραμμένα ιπποειδή, η επιθεώρηση αυτή απαιτείται – με την επιφύλαξη του άρθρου 6 – μόνο για τις ενδοκοινοτικές συναλλαγές.

2. Με την επιφύλαξη των απαιτήσεων που προβλέπονται στην παράγραφο 5 για τις ασθένειες που πρέπει να δηλώνονται υποχρεωτικά, ο επίσημος κτηνίατρος πρέπει, κατά την επιθεώρηση, να βεβαιώνεται ότι δεν υπάρχει κανένα στοιχείο –ιδίως βάσει των δηλώσεων του ιδιοκτήτη ή του εκτροφέα– που να οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα ιπποειδή έχουν έλθει σε επαφή με άλλα ιπποειδή προσβεβλημένα από μόλυνση ή μεταδοτική ασθένεια κατά τη διάρκεια των τελευταίων ημερών πριν από την επιθεώρηση.

3. Τα ιπποειδή δεν πρέπει να προορίζονται για θανάτωση στα πλαίσια προγράμματος εξάλειψης μολυσματικής ή μεταδοτικής ασθένειας το οποίο εφαρμόζεται σε ένα κράτος μέλος.

4. Τα ιπποειδή πρέπει να αποτελούν αντικείμενο αναγνώρισης η οποία πρέπει να γίνεται:

5. Επιπλέον της απαιτήσεως που προβλέπεται στο άρθρο 5, τα ιπποειδή δεν πρέπει να προέρχονται από εκμετάλλευση στην οποία έχει επιβληθεί κάποιο από τα ακόλουθα απαγορευτικά μέτρα:

6. Στην περίπτωση που κράτος μέλος θεσπίζει ή έχει θεσπίσει προαιρετικό ή υποχρεωτικό πρόγραμμα καταπολέμησης ασθένειας στην οποία είναι εκτεθειμένα τα ιπποειδή, μπορεί να υποβάλει στην Επιτροπή το πρόγραμμα αυτό, εντός έξι μηνών από τις 4 Ιουλίου 1990 για το Βέλγιο, τη Δανία, τη Γερμανία, την Ιρλανδία, την Ελλάδα, την Ισπανία, τη Γαλλία, την Ιταλία, το Λουξεμβούργο, τις Κάτω Χώρες, την Πορτογαλία και το Ηνωμένο Βασίλειο, από την 1η Ιανουαρίου 1995 για την Αυστρία, τη Φινλανδία και τη Σουηδία, από την 1η Μαΐου 2004, για την Τσεχική Δημοκρατία, την Εσθονία, την Κύπρο, τη Λετονία, τη Λιθουανία, την Ουγγαρία, τη Μάλτα, την Πολωνία, τη Σλοβενία και τη Σλοβακία και από την 1η Ιανουαρίου 2007 για τη Βουλγαρία και τη Ρουμανία, αναφέροντας ιδίως:

Η Επιτροπή εξετάζει τα προγράμματα που της κοινοποιούν τα κράτη μέλη. Τα εγκρίνει, ενδεχομένως, τηρώντας τα κριτήρια που προβλέπονται στο πρώτο εδάφιο σύμφωνα με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2. Με την ίδια διαδικασία μπορούν να προσδιορισθούν οι γενικές ή περιορισμένες συμπληρωματικές εγγυήσεις που είναι δυνατό να απαιτηθούν στις ενδοκοινοτικές συναλλαγές. Οι εγγυήσεις αυτές δεν επιτρέπεται να υπερβαίνουν τις εγγυήσεις που απαιτεί το κράτος μέλος σε εθνικά πλαίσια.

Τα προγράμματα που υποβάλλονται από τα κράτη μέλη μπορούν να τροποποιηθούν ή να συμπληρωθούν με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 3. Με την ίδια διαδικασία μπορεί να εγκριθεί τροποποίηση ή συμπλήρωση ήδη εγκριθέντων προγραμμάτων ή εγγυήσεων που έχουν προσδιορισθεί σύμφωνα με το δεύτερο εδάφιο.

1. Τα κράτη μέλη που δεν είναι απαλλαγμένα από την πανώλη των ίππων μπορούν να αποστέλλουν ιπποειδή από το τμήμα του εδάφους τους το οποίο θεωρείται μολυσμένο κατά την έννοια της παραγράφου 2 του παρόντος άρθρου μόνον υπό τους όρους που ορίζονται στην παράγραφο 5.

2. Ένα τμήμα του εδάφους κράτους μέλους θεωρείται μολυσμένο από την πανώλη των ίππων εάν:

Το τμήμα του εδάφους το οποίο θεωρείται μολυσμένο από την πανώλη των ίππων αποτελείται τουλάχιστον:

3. Οι κανόνες ελέγχου και τα μέτρα καταπολέμησης της πανώλης των ίππων στα εδάφη και ζώνες που αναφέρονται στην παράγραφο 2 καθώς και οι σχετικές παρεκκλίσεις, ορίζονται στην οδηγία 92/35/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 29ης Απριλίου 1992, για τη θέσπιση των κανόνων ελέγχου και των μέτρων καταπολέμησης της πανώλης των ίππων (8).

4. Κάθε εμβολιασμένο ιπποειδές που βρίσκεται στη ζώνη προστασίας πρέπει να εγγράφεται και να επισημαίνεται, σύμφωνα με το άρθρο 6 παράγραφος 1 στοιχείο δ) της οδηγίας 92/35/ΕΟΚ.

Στο έγγραφο αναγνώρισης ή/και το υγειονομικό πιστοποιητικό πρέπει να γίνεται σαφής μνεία του εν λόγω εμβολιασμού.

5. Ένα κράτος μέλος μπορεί να αποστέλλει από το έδαφος που αναφέρεται στο δεύτερο εδάφιο της παραγράφου 2 μόνο τα ιπποειδή που πληρούν τις ακόλουθες απαιτήσεις:

Τα κράτη μέλη που εφαρμόζουν εναλλακτικό καθεστώς ελέγχου το οποίο προσφέρει εναλλακτικές εγγυήσεις ισοδύναμες προς τις προβλεπόμενες στο άρθρο 4 σημείο 5 για τη διακίνηση ιπποειδών στο έδαφός τους, μπορούν να χορηγούν, υπό τον όρο της αμοιβαιότητας, παρέκκλιση από το άρθρο 4 παράγραφος 1 δεύτερη φράση και από το άρθρο 8 παράγραφος 1 στοιχείο β).

1. Τα ιπποειδή πρέπει να οδηγούνται, το συντομότερο δυνατόν, από την εκμετάλλευση προελεύσεως, είτε απευθείας είτε μέσω εγκεκριμένου κέντρου συγκέντρωσης, όπως αυτό ορίζεται στο άρθρο 2 παράγραφος 2 στοιχείο ιε) της οδηγίας 64/432/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 26ης Ιουνίου 1964, περί προβλημάτων υγειονομικού ελέγχου στον τομέα των ενδοκοινοτικών συναλλαγών βοοειδών και χοιροειδών (9), στον τόπο προορισμού, με μέσα μεταφοράς και προσδέσεως τα οποία καθαρίζονται και απολυμαίνονται τακτικά με απολυμαντικό και με συχνότητα που καθορίζεται από το κράτος μέλος αποστολής. Τα μεταφορικά οχήματα πρέπει να είναι διαρρυθμισμένα κατά τρόπο ώστε η κόπρος, η στρωμνή ή η χορτονομή των ιπποειδών να μην είναι δυνατόν να χυθεί ή να πέσει εκτός του οχήματος κατά τη μεταφορά. Τηρουμένου του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1/2005, η μεταφορά πρέπει να πραγματοποιείται κατά τρόπον ώστε να εξασφαλίζεται αποτελεσματικά η υγειονομική προστασία και η ευζωία των ιπποειδών.

2. Το κράτος μέλος προορισμού μπορεί, κατά γενικό ή περιορισμένο τρόπο, να χορηγεί παρέκκλιση από ορισμένες απαιτήσεις του άρθρου 4 παράγραφος 5, μόνον εφόσον το ζώο είναι εφοδιασμένο με ειδικό σήμα με το οποίο να διευκρινίζεται ότι προορίζεται για σφαγή και εφόσον το υγειονομικό πιστοποιητικό σύμφωνα με το παράρτημα ΙΙΙ περιέχει μνεία της παρέκκλισης αυτής.

Στις περιπτώσεις χορήγησης τέτοιας παρέκκλισης, τα ιπποειδή σφαγής πρέπει να οδηγούνται απευθείας στο οριζόμενο σφαγείο προκειμένου να σφαγούν εντός χρονικού διαστήματος που δεν υπερβαίνει τις πέντε ημέρες από την άφιξη στο σφαγείο.

3. Ο επίσημος κτηνίατρος οφείλει να καταχωρίσει σε μητρώο τον αριθμό ταυτότητας ή τον αριθμό του εγγράφου αναγνώρισης του σφαζόμενου ιπποειδούς και να διαβιβάσει στην αρμόδια αρχή του τόπου αποστολής, εφόσον αυτή το ζητήσει, βεβαίωση με την οποία πιστοποιείται η σφαγή του συγκεκριμένου ιπποειδούς.

2. Το υγειονομικό πιστοποιητικό ή, στην περίπτωση εγγεγραμμένων ιπποειδών, η υγειονομική βεβαίωση πρέπει με την επιφύλαξη του άρθρου 6 να έχουν συνταχθεί 48 ώρες ή, το αργότερο, την τελευταία εργάσιμη ημέρα πριν από τη φόρτωση, στην ή στις επίσημες γλώσσες του κράτους μέλους αποστολής και προορισμού. Η διάρκεια ισχύος του υγειονομικού πιστοποιητικού ή της υγειονομικής βεβαίωσης είναι δέκα ημέρες. Η υγειονομική βεβαίωση και το υγειονομικό πιστοποιητικό πρέπει να αποτελούνται από ένα μόνο φύλλο.

3. Αντί του ατομικού υγειονομικού πιστοποιητικού που αναφέρεται στην παράγραφο 1 στοιχείο β), οι μετακινήσεις των ιπποειδών, πλην των εγγεγραμμένων μεταξύ των κρατών μελών, μπορούν να πραγματοποιούνται υπό την κάλυψη ενός μόνον υγειονομικού πιστοποιητικού ανά παρτίδα.

Οι προβλεπόμενοι από την οδηγία 90/425/ΕΟΚ κανόνες εφαρμόζονται ειδικότερα στους ελέγχους στον τόπο καταγωγής, στη διοργάνωση και στην παρακολούθηση των ελέγχων που οφείλει να διενεργεί η χώρα προορισμού καθώς και στα ληπτέα μέτρα διασφάλισης.

Οι πραγματογνώμονες κτηνίατροι της Επιτροπής μπορούν, εφόσον αυτό είναι απαραίτητο για την ενιαία εφαρμογή της παρούσας οδηγίας και σε συνεργασία με τις αρμόδιες εθνικές αρχές, να πραγματοποιούν ελέγχους επιτόπου. Η Επιτροπή πληροφορεί τα κράτη μέλη για τα αποτελέσματα των ελέγχων που πραγματοποιούνται.

Το κράτος μέλος στο έδαφος του οποίου πραγματοποιείται έλεγχος προσφέρει κάθε δυνατή βοήθεια στους πραγματογνώμονες για την εκπλήρωση της αποστολής τους.

Οι λεπτομέρειες εφαρμογής του παρόντος άρθρου καθορίζονται με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2.

ΚΑΝΟΝΕΣ ΓΙΑ ΤΙΣ ΕΙΣΑΓΩΓΕΣ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ ΑΠΟ ΤΡΙΤΕΣ ΧΩΡΕΣ

Τα ιπποειδή που εισάγονται στην Κοινότητα πρέπει να πληρούν τους όρους που θεσπίζονται στα άρθρα 12 έως 16.

1. Η εισαγωγή ιπποειδών στην Κοινότητα επιτρέπεται μόνον από τρίτες χώρες που περιλαμβάνονται σε κατάλογο που καταρτίζεται ή τροποποιείται σύμφωνα με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2.

Λαμβανομένης υπόψη της υγειονομικής κατάστασης και των εγγυήσεων που παρέχονται από την τρίτη χώρα για τα ιπποειδή, είναι δυνατόν να αποφασίζεται, σύμφωνα με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2, ότι η έγκριση που προβλέπεται στο πρώτο εδάφιο της παρούσας παραγράφου ισχύει για ολόκληρο το έδαφος της εγκεκριμένης τρίτης χώρας ή μόνο για μέρος του εδάφους της.

Για τον λόγο αυτόν, λαμβάνεται υπόψη ο τρόπος με τον οποίο η εγκεκριμένη τρίτη χώρα θεσπίζει και εφαρμόζει, εντός του εδάφους της, τα σχετικά διεθνή πρότυπα, ιδίως την αρχή της περιφερειοποίησης, σε σχέση με τις υγειονομικές της απαιτήσεις για την εισαγωγή από άλλες τρίτες χώρες και από την Κοινότητα.

2. Κατά την εκπόνηση ή την τροποποίηση του καταλόγου που προβλέπεται στην παράγραφο 1, λαμβάνονται υπόψη ειδικότερα τα ακόλουθα:

3. Η Επιτροπή θεσπίζει τις αναγκαίες διατάξεις ώστε να διατίθενται στο κοινό ενημερωμένες εκδόσεις του καταλόγου που καταρτίζεται ή τροποποιείται σύμφωνα με την παράγραφο 1.

Ο κατάλογος μπορεί να συνδυάζεται με άλλους καταλόγους που καταρτίζονται για την προστασία της υγείας των ζώων και της δημόσιας υγείας και μπορεί επίσης να περιλαμβάνει υποδείγματα υγειονομικών πιστοποιητικών.

4. Ειδικοί όροι σχετικά με τις εισαγωγές για κάθε τρίτη χώρα ή ομάδα τρίτων χωρών, όσον αφορά την κατάσταση υγείας των ιπποειδών στη συγκεκριμένη τρίτη χώρα ή ομάδα τρίτων χωρών, θεσπίζονται σύμφωνα με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2.

5. Οι λεπτομερείς κανόνες για την εφαρμογή των παραγράφων 1 έως 4 και τα κριτήρια για την εγγραφή τρίτων χωρών ή τμημάτων τρίτων χωρών στον κατάλογο που προβλέπεται στην παράγραφο 1 μπορούν να θεσπίζονται σύμφωνα με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2.

1. Τα ιπποειδή πρέπει να προέρχονται από τρίτη χώρα η οποία είναι:

2. Με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2 μπορεί να αποφασιστεί ότι:

Πριν από την ημέρα της φόρτωσής τους, ενόψει της αποστολής τους προς το κράτος μέλος προορισμού, τα ιπποειδή πρέπει να έχουν παραμείνει χωρίς διακοπή στο έδαφος ή τμήμα του εδάφους τρίτης χώρας ή, σε περίπτωση διαφοροποίησης των απαιτήσεων ανά περιοχή, στο τμήμα του εδάφους που ορίζεται κατ’ εφαρμογή του άρθρου 13 παράγραφος 2 στοιχείο α), επί χρονικό διάστημα που θα καθορισθεί κατά την έγκριση των αποφάσεων που θα θεσπισθούν κατ’ εφαρμογή του άρθρου 15.

Πρέπει να προέρχονται από περιοχή που έχει υπαχθεί σε υγειονομικό έλεγχο.

Η εισαγωγή ιπποειδών από το έδαφος τρίτης χώρας ή από τμήμα εδάφους τρίτης χώρας, οριζόμενο κατ’ εφαρμογή του άρθρου 13 παράγραφος 2 στοιχείο α) που περιλαμβάνεται στον κατάλογο ο οποίος καταρτίζεται σύμφωνα με το άρθρο 12 παράγραφος 1, επιτρέπεται μόνον εφόσον τα ιπποειδή, πέραν των απαιτήσεων που προβλέπονται στο άρθρο 13:

1. Τα ιπποειδή πρέπει να αναγνωρίζονται σύμφωνα με το άρθρο 4 παράγραφος 4 και να συνοδεύονται από υγειονομικό πιστοποιητικό που έχει συνταχθεί από επίσημο κτηνίατρο της τρίτης χώρας εξαγωγής. Το υγειονομικό πιστοποιητικό πρέπει:

2. Το υγειονομικό πιστοποιητικό συντάσσεται επί εντύπου συμφώνου προς υπόδειγμα που καταρτίζεται με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2.

1. Αμέσως μετά την άφιξή τους στο κράτος μέλος προορισμού, τα ιπποειδή σφαγής πρέπει να οδηγούνται σε σφαγείο, είτε απευθείας είτε μέσω εγκεκριμένου κέντρου συγκέντρωσης κατά το άρθρο 7, και, σύμφωνα με τις απαιτήσεις του υγειονομικού ελέγχου, να σφάζονται εντός προθεσμίας που θα καθορισθεί κατά την έγκριση των αποφάσεων που θα θεσπισθούν κατ’ εφαρμογή του άρθρου 15.

2. Με την επιφύλαξη των ειδικών όρων που ενδεχομένως καθορίζονται με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2, η αρμόδια αρχή του κράτους μέλους προορισμού δύναται, λόγω των απαιτήσεων του υγειονομικού ελέγχου, να ορίζει το σφαγείο στο οποίο πρέπει να μεταφέρονται τα ιπποειδή αυτά.

Έλεγχοι διενεργούνται επιτόπου από πραγματογνώμονες κτηνιάτρους των κρατών μελών και της Επιτροπής, για να εξακριβωθεί αν οι διατάξεις της οδηγίας αυτής, και ιδίως εκείνες του άρθρου 12 παράγραφος 2, εφαρμόζονται αποτελεσματικά.

Εάν κατά τη διενέργεια ελέγχου δυνάμει του παρόντος άρθρου, αποκαλυφθούν σοβαρά στοιχεία σε βάρος μιας εκμετάλλευσης, η Επιτροπή ενημερώνει αμέσως τα κράτη μέλη σχετικά και εκδίδει αμέσως απόφαση για την προσωρινή αναστολή της έγκρισης. Τελική απόφαση λαμβάνεται σύμφωνα με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 3.

Οι πραγματογνώμονες των κρατών μελών που επιφορτίζονται με τους ελέγχους αυτούς ορίζονται από την Επιτροπή έπειτα από πρόταση των κρατών μελών.

Οι έλεγχοι αυτοί διενεργούνται για λογαριασμό της Κοινότητας, η οποία αναλαμβάνει τα αντίστοιχα έξοδα.

Η περιοδικότητα και οι λεπτομέρειες των ελέγχων αυτών καθορίζονται σύμφωνα με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 2.

Τα παραρτήματα I έως IV τροποποιούνται με τη διαδικασία του άρθρου 21 παράγραφος 3.

1. Η Επιτροπή επικουρείται από τη μόνιμη επιτροπή για την τροφική αλυσίδα και την υγεία των ζώων που ιδρύθηκε από το άρθρο 58 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 178/2002 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 28ης Ιανουαρίου 2002, για τον καθορισμό των γενικών αρχών και απαιτήσεων της νομοθεσίας για τα τρόφιμα, για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Αρχής για την Ασφάλεια των Τροφίμων και τον καθορισμό διαδικασιών σε θέματα ασφαλείας των τροφίμων (10).

2. Στις περιπτώσεις που γίνεται μνεία της παρούσας παραγράφου, εφαρμόζονται τα άρθρα 5 και 7 της απόφασης 1999/468/ΕΚ.

Η προθεσμία που προβλέπεται στο άρθρο 5 παράγραφος 6 της απόφασης 1999/468/ΕΚ ορίζεται τρίμηνη.

3. Στις περιπτώσεις που γίνεται μνεία της παρούσας παραγράφου, εφαρμόζονται τα άρθρα 5 και 7 της απόφασης 1999/468/ΕΚ.

Η προθεσμία που προβλέπεται στο άρθρο 5 παράγραφος 6 της απόφασης 1999/468/ΕΚ ορίζεται σε 15 μέρες.

Η οδηγία 90/426/ΕΚ, όπως τροποποιήθηκε με τις πράξεις που παρατίθενται στο παράρτημα V μέρος Α, καταργείται, με την επιφύλαξη των υποχρεώσεων των κρατών μελών όσον αφορά τις προθεσμίες ενσωμάτωσης στο εθνικό δίκαιο των οδηγιών που εμφαίνονται στο παράρτημα V, μέρος Β.

Οι αναφορές στην καταργούμενη οδηγία νοούνται ως αναφορές στην παρούσα οδηγία και διαβάζονται σύμφωνα με τον πίνακα αντιστοιχίας του παραρτήματος VI.

Η παρούσα οδηγία αρχίζει να ισχύει την εικοστή ημέρα από τη δημοσίευσή της στην Επίσημη Εφημερίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης.

Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα κράτη μέλη.

(1) Γνώμη της 22ας Απριλίου 2009 (δεν έχει ακόμα δημοσιευθεί στην Επίσημη Εφημερίδα).

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ

ΥΠΟΔΕΙΓΜΑ

ΥΓΕΙΟΝΟΜΙΚΗ ΒΕΒΑΙΩΣΗ (1)

Διαβατήριο αριθ. …

Πιστοποιείται (2) ότι τα ιπποειδή που αναφέρονται ανωτέρω πληρούν τους ακόλουθους όρους:

α)	εξετάσθηκαν σήμερα και δεν παρουσιάζουν κανένα κλινικό σύμπτωμα ασθένειας·

β)	δεν πρόκειται για ζώα προοριζόμενα να θανατωθούν στα πλαίσια προγράμματος εξάλειψης μεταδοτικής ασθένειας το οποίο εφαρμόζεται στο κράτος μέλος·

γ)

—

δεν προέρχονται από το έδαφος ή τμήμα του εδάφους κράτους μέλους για το οποίο ισχύουν μέτρα απαγόρευσης λόγω της πανώλης των ίππων, ή

προέρχονται από το έδαφος ή τμήμα του εδάφους κράτους μέλους το οποίο αποτελεί αντικείμενο περιοριστικών μέτρων λόγω της πανώλης των ίππων και υποβλήθηκαν με ικανοποιητικά αποτελέσματα στις εξετάσεις που προβλέπονται στο άρθρο 5 παράγραφος 5 της οδηγίας 2009/156/ΕΚ στον σταθμό σαρανταήμερης απομόνωσης …, από τις … έως τις … (3)·

—	δεν έχουν εμβολιασθεί κατά της πανώλης των ίππων, ή έχουν εμβολιασθεί κατά της πανώλης των ίππων στις … (3) (4)·

δ)

δεν προέρχονται από εκμετάλλευση που αποτελεί αντικείμενο μέτρων απαγόρευσης για υγειονομικούς λόγους και δεν έχουν έλθει σε επαφή με τα ιπποειδή εκμετάλλευσης που αποτελεί αντικείμενο απαγόρευσης για υγειονομικούς λόγους:

—	στην περίπτωση ιπποειδών που πιθανολογείται ότι έχουν προσβληθεί από trypanosoma equiperdum, επί έξι μήνες από την ημερομηνία της τελευταίας επαφής ή ενδεχόμενης επαφής με άρρωστο ιπποειδές. Ωστόσο, εάν πρόκειται για επιβήτορα ίππο, η απαγόρευση ισχύει έως τον ευνουχισμό του,

—	σε περίπτωση μάλεως και εγκεφαλομυελίτιδος των ιπποειδών, επί έξι μήνες από την ημερομηνία κατά την οποία θανατώθηκαν τα προσβληθέντα από την ασθένεια αυτή ιπποειδή,

—

στην περίπτωση λοιμώδους αναιμίας, κατά τη διάρκεια της περιόδου που απαιτείται ώστε, με βάση την ημερομηνία κατά την οποία θανατώθηκαν τα προσβληθέντα από την ασθένεια αυτή ιπποειδή, να αντιδράσουν τα υπόλοιπα ζώα αρνητικά σε δύο εξετάσεις Coggins οι οποίες γίνονται σε διάστημα τριών μηνών η μία από την άλλη,

—	στην περίπτωση αφθώδους στοματίτιδας, επί έξι μήνες από την τελευταία περίπτωση,

—	στην περίπτωση λύσσας, επί ένα μήνα από την τελευταία περίπτωση,

—	στην περίπτωση βακτηριακού άνθρακα, επί 15 ημέρες από την τελευταία περίπτωση,

—

σε περίπτωση κατά την οποία όλα τα ζώα των ευαίσθητων ειδών που βρίσκονται στην εκμετάλλευση εσφάγησαν ή θανατώθηκαν και απολυμάνθηκαν οι εγκαταστάσεις επί 30 ημέρες από την ημερομηνία κατά την οποία εσφάγησαν ή θανατώθηκαν τα ζώα και απολυμάνθηκαν οι εγκαταστάσεις, εκτός από την περίπτωση του βακτηριακού άνθρακα για τον οποίο η διάρκεια της απαγόρευσης είναι 15 ημέρες·

ε)	δεν έχουν έλθει, εξ όσων γνωρίζω, σε επαφή με ιπποειδή που έχουν προσβληθεί από μεταδοτική ασθένεια ή μόλυνση στη διάρκεια των 15 τελευταίων ημερών·

στ)

κατά τον χρόνο της επιθεώρησης, ήταν σε φυσική κατάσταση κατάλληλη για την προβλεπόμενη μετακίνηση σύμφωνα με τις διατάξεις του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1/2005 (5).

Ημερομηνία	Τόπος	Σφραγίδα και υπογραφή του επίσημου κτηνιάτρου (6)

(1) Η παρούσα βεβαίωση δεν απαιτείται σε περίπτωση διμερούς συμφωνίας σύμφωνα με το άρθρο 6 της οδηγίας 2009/156/ΕΚ.

(2) Η βεβαίωση ισχύει για δέκα ημέρες.

(3) Να διαγραφεί η λανθασμένη μνεία.

(4) Πρέπει να γίνει μνεία του εμβολιασμού στο διαβατήριο.

(5) Η παρούσα δήλωση δεν απαλλάσσει τους μεταφορείς από τις υποχρεώσεις τους σύμφωνα με τις ισχύουσες κοινοτικές διατάξεις, ιδίως όσον αφορά τη φυσική κατάσταση ζώων προς μεταφορά.

(6) Όνομα με κεφαλαία και ιδιότητα

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV

ΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗ ΠΑΝΩΛΗ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ

ΔΙΑΓΝΩΣΗ

Τα αντιδραστήρια για τις ενζυμικές δοκιμές ανοσοπροσρόφησης (ELISA), που περιγράφονται κατωτέρω, μπορούν να ληφθούν από το εργαστήριο αναφοράς της Ευρωπαϊκής Κοινότητας ή από τα εργαστήρια αναφοράς για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών, του Διεθνούς Γραφείου Επιζωοτιών (ΟΙΕ).

1. ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ ELISA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗΣ ΠΑΝΩΛΗΣ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ (AHSV) (ΥΠΟΧΡΕΩΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ)

Η ανταγωνιστική δοκιμή ELISA χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων κατά του AHSV, σε ορούς κάθε είδους ιπποειδών. Ο ευρέος φάσματος, πολυκλωνικός ορός ανοσοποιημένου έναντι του AHSV ινδικού χοιριδίου (αποκαλούμενος στη συνέχεια «αντιορός ινδικού χοιριδίου») είναι εξειδικευμένος κατά οροομάδα και ικανός να ανιχνεύει όλους τους γνωστούς οροτύπους του ιού της αφρικανικής πανώλης των ιπποειδών.

Η αρχή αυτής της μεθόδου δοκιμής συνίσταται στη διακοπή, από το δείγμα ορού δοκιμής, της αντίδρασης μεταξύ του αντιγόνου του AHSV και ενός αντιορού ινδικού χοιριδίου. Τα αντισώματα AHSV που περιέχονται στο δείγμα ορού δοκιμής ανταγωνίζονται εκείνα του αντιορού ινδικού χοιριδίου, με αποτέλεσμα την εξασθένηση του αναμενόμενου χρώματος (μετά την προσθήκη σημασμένων με ένζυμο αντισωμάτων αντιορού ινδικού χοιριδίου και υποστρώματος). Οι οροί μπορούν να υποβληθούν σε δοκιμή μετά από μία μόνον αραίωση 1 προς 5 (μέθοδος δοκιμής της κηλίδας) ή να τιτλοδοτηθούν (μέθοδος της τιτλοδότησης του ορού), ώστε να ληφθούν τελικά σημεία αραίωσης. Οι τιμές αναστολής που είναι υψηλότερες από 50 % μπορούν να θεωρηθούν θετικές.

Το πρωτόκολλο δοκιμής που περιγράφεται κατωτέρω χρησιμοποιείται στο Περιφερειακό Εργαστήριο Αναφοράς για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών, στο Pirbright του Ηνωμένου Βασιλείου.

1.1. Διαδικασία δοκιμής

1.1.1. Παρασκευή των πλακών

1.1.1.1.

Επιστρώνονται οι πλάκες ELISA με αντιγόνο AHSV που έχει εξαχθεί από μολυσμένες κυτταροκαλλιέργειες με AHSV, αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών-διτανθρακικών ιόντων, pH 9,6. Οι πλάκες επωάζονται επί μία νύκτα στους 4 °C.

1.1.1.2.

Οι πλάκες εκπλύνονται τρεις φορές με υπερχείλιση και εκκένωση των κοιλοτήτων με τη βοήθεια φυσιολογικού ορού στον οποίο έχει προστεθεί ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS), pH 7,2 έως 7,4, και ακολουθεί ξήρανση με στράγγιση σε απορροφητικό χαρτί.

1.1.2. Κοιλότητες μάρτυρες

1.1.2.1.

Στη στήλη 1 τιτλοδοτούνται οι θετικοί οροί μάρτυρες σε σειρά αραιώσεων στο διπλάσιο, από 1 προς 5 έως 1 προς 640, σε παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα [PBS που περιέχει Tween-20 σε αναλογία 0,05 % (v/v), αποκορυφωμένο γάλα σε αναλογία 5 % (Cadbury’s Marvel TM) (w/v) και ορό ενήλικου βοοειδούς σε αναλογία 1 % (v/v)] ώστε να ληφθεί τελικός όγκος 50 μl ανά κοιλότητα.

1.1.2.2.

Στις κοιλότητες A και B της στήλης 2 προστίθενται 50 μl αρνητικού ορού μάρτυρα, αραιωμένου 1 προς 5 (10 μl ορού + 40 μl παρεμποδιστικού ρυθμιστικού διαλύματος).

1.1.2.3.

Στις κοιλότητες C και D της στήλης 2, προστίθενται 100 μl παρεμποδιστικού ρυθμιστικού διαλύματος (ΤΥΦΛΟ).

1.1.2.4.

Στις κοιλότητες E, F, G και H της στήλης 2 προστίθενται 50 μl παρεμποδιστικού ρυθμιστικού διαλύματος (μάρτυρας ινδικού χοιριδίου).

1.1.3. Μέθοδος της δοκιμής κηλίδας

1.1.3.1.

Σε διπλή σειρά κοιλοτήτων των στηλών 3 έως 12 προστίθενται 50 μl από κάθε ορό δοκιμής αραιωμένο 1 προς 5 με παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα (10 μl ορού + 40 μl παρεμποδιστικού ρυθμιστικού διαλύματος).

1.1.4. Μέθοδος της τιτλοδότησης ορού

1.1.4.1.

Από κάθε δείγμα δοκιμής παρασκευάζεται σειρά αραιώσεων στο διπλάσιο (1 προς 5 έως 1 προς 640) με παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα, μέσα σε οκτώ κοιλότητες χωριστών στηλών (3 έως 12).

και στη συνέχεια

1.1.5. Σε όλες τις κοιλότητες της πλάκας ELISA, πλην εκείνων που περιέχουν το ΤΥΦΛΟ διάλυμα, προστίθενται 50 μl αντιορού ινδικού χοιριδίου που έχει προηγουμένως αραιωθεί σε παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα (κάθε κοιλότητα περιέχει πλέον τελικό όγκο 100 μl).

1.1.5.1.

Οι πλάκες επωάζονται επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C σε περιστρεφόμενο αναδευτήρα.

1.1.5.2.

Οι πλάκες εκπλύνονται 3 φορές και ακολουθεί ξήρανση όπως στο σημείο 1.1.1.

1.1.5.3.

Σε κάθε κοιλότητα προστίθενται 50 μl αντιορού κουνελιού έναντι του ορού του ινδικού χοιριδίου συζευγμένου με υπεροξειδάση (HRP), αφού προηγουμένως αραιωθεί σε παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα.

1.1.5.4.

Οι πλάκες επωάζονται επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C σε περιστρεφόμενο αναδευτήρα.

1.1.5.5.

Οι πλάκες εκπλύνονται 3 φορές και ακολουθεί ξήρανση όπως προηγουμένως.

1.1.6. Χρωμογόνο

Παρασκευάζεται το διάλυμα χρωμογόνου OPD (OPD = ορθο-φαινυλοδιαμίνη) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (0,4 mg/ml σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό) αμέσως πριν χρησιμοποιηθεί. Προστίθεται υπόστρωμα (υπεροξείδιο του υδρογόνου = Η2Ο2) μέχρι να ληφθεί τελική συγκέντρωση 0,05 % (v/v) (1 μέρος προς 2000 μέρη διαλύματος 30 % H2O2). Κατόπιν προστίθενται σε κάθε κοιλότητα 50 μl του διαλύματος OPD και οι πλάκες αφήνονται στον πάγκο επί δέκα λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Διακόπτεται η αντίδραση με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 50 μl θειικού οξέος (Η2SO4) 1M.

1.1.7. Ανάγνωση των αποτελεσμάτων

Φασματοφωτομετρική ανάγνωση σε μήκος κύματος 492 nm.

1.2. Έκφραση των αποτελεσμάτων

1.2.1.

Με τη βοήθεια κάποιου λογισμικού, εκτυπώνονται οι τιμές οπτικής πυκνότητας (OD), καθώς και το επί τοις εκατό ποσοστό αναστολής (PI) για τους ορούς δοκιμής και τους ορούς μάρτυρες, με βάση τη μέση τιμή που έχει καταγραφεί για τις τέσσερις κοιλότητες που αντιστοιχούν στους μάρτυρες ινδικού χοιριδίου. Τα εκφραζόμενα σε τιμές OD και PI δεδομένα χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστεί αν τα αποτελέσματα της δοκιμής περικλείονται εντός αποδεκτών ορίων. Τα ανώτατα όρια ελέγχου (UCL) και τα κατώτατα όρια μάρτυρα (LCL) για τον μάρτυρα ινδικού χοιριδίου βρίσκονται μεταξύ των τιμών OD 1,4 και 0,4 αντίστοιχα. Το τελικό σημείο της τιτλοδότησης του θετικού ορού μάρτυρα, με βάση PI 50 %, θα πρέπει να είναι 1 προς 240 (εντός πεδίου τιμών 1 προς 120 έως 1 προς 480). Οποιαδήποτε πλάκα δεν πληροί τα κριτήρια αυτά πρέπει να απορρίπτεται. Ωστόσο, εάν ο τίτλος του θετικού ορού μάρτυρα υπερβαίνει το 1 προς 480, αλλά τα δείγματα δοκιμής είναι αρνητικά, τα τελευταία μπορούν να γίνουν δεκτά.

Οι δύο κοιλότητες που περιέχουν αρνητικό ορό μάρτυρα και οι δύο κοιλότητες που περιέχουν το τυφλό διάλυμα θα πρέπει να δίδουν τιμές PI μεταξύ + 25 % και –25 % και μεταξύ + 95 και + 105 %, αντίστοιχα. Η λήψη τιμών εκτός αυτών των ορίων δεν ακυρώνει την πλάκα, αλλά αποτελεί ένδειξη ανάπτυξης προϋπάρχοντος χρώματος.

1.2.2.

Το όριο διάγνωσης (διαχωριστικές τιμές) για τους ορούς δοκιμής είναι 50 % (PI 50 %). Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμές PI άνω του 50 % καταγράφονται ως θετικά. Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμές PI κάτω του 50 % καταγράφονται ως αρνητικά.

Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμές PI μεγαλύτερες ή μικρότερες από το όριο για τις διπλές κοιλότητες, θεωρούνται αμφίβολα. Τα εν λόγω δείγματα μπορούν να υποβάλλονται σε νέα δοκιμή κηλίδας και δοκιμή τιτλοδότησης. Τα θετικά δείγματα μπορούν επίσης να τιτλοδοτηθούν, για να παράσχουν μια ένδειξη του βαθμού θετικότητας.

Διάταξη της δοκιμής κηλίδας

+ μάρτ.

Όροι δοκιμής

1:5

– μάρτ.

1:10

– μάρτ.

1:20

ΤΥΦΛΟ

1:40

ΤΥΦΛΟ

1:80

ΙΧ μάρτ.

1:160

ΙΧ μάρτ.

1:320

ΙΧ μάρτ.

1:640

ΙΧ μάρτ.

– μάρτ.	=	αρνητικός ορός μάρτυρας.
+ μάρτ.	=	θετικός ορός μάρτυρας
ΙΧ μάρτ.	=	μάρτυρας ινδικού χοιριδίου.

Διάταξη της τιτλοδότησης ορού

+ μάρτ.

Όροι δοκιμής

1:5

– μάρτ.

1:5

1:10

– μάρτ.

1:10

1:20

ΤΥΦΛΟ

1:20

1:40

ΤΥΦΛΟ

1:40

1:80

ΙΧ μάρτ.

1:80

1:160

ΙΧ μάρτ.

1:160

1:320

ΙΧ μάρτ.

1:320

1:640

ΙΧ μάρτ.

1:640

– μάρτ.	=	αρνητικός ορός μάρτυρας.
+ μάρτ.	=	θετικός ορός μάρτυρας.
ΙΧ μάρτ.	=	μάρτυρας ινδικού χοιριδίου.

2. ΕΜΜΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗ ELISA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗΣ ΠΑΝΩΛΗΣ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ (AHSV) (ΥΠΟΧΡΕΩΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ)

Η δοκιμή που περιγράφεται κατωτέρω συμφωνεί με την περιγραφή δοκιμής που περιλαμβάνεται στο κεφάλαιο 2.1.11 του εγχειριδίου προτύπων για διαγνωστικές δοκιμές και εμβόλια του OIE (Διεθνούς Γραφείου Επιζωοτιών), τέταρτη έκδοση, 2000.

Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VP7 έχει χρησιμοποιηθεί ως αντιγόνο για τον προσδιορισμό αντισωμάτων κατά του ιού AHS, με υψηλό δείκτη ευαισθησίας και εξειδίκευσης. Άλλα πλεονεκτήματα είναι ότι είναι σταθερή και δεν είναι λοιμογόνος.

2.1. Διαδικασία δοκιμής

2.1.1. Στερεά φάση

2.1.1.1.

Επιστρώνονται οι πλάκες ELISA με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VP7 από AHSV-4, αραιωμένη με ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών-διτανθρακικών ιόντων, pH 9,6. Οι πλάκες επωάζονται επί μία νύκτα σε θερμοκρασία 4 °C.

2.1.1.2.

Οι πλάκες εκπλύνονται πέντε φορές με αποσταγμένο νερό που περιέχει Tween 20 σε αναλογία 0,01 % (v/v) (διάλυμα έκπλυσης) και κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα του διαλύματος έκπλυσης.

2.1.1.3.

Οι πλάκες παρεμποδίζονται (μπλοκάρονται), με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 200 μl φυσιολογικού ορού με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS) + αποκορυφωμένο γάλα (ξηράς μορφής αποκορυφωμένο γάλα NestléTM) σε αναλογία 5 % (w/v), επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

2.1.1.4.

Απομακρύνεται το παρεμποδιστικό διάλυμα και οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό.

2.1.2. Δείγματα δοκιμής

2.1.2.1.

Τα δείγματα ορού που πρόκειται να ελεγχθούν, καθώς και οι θετικοί και αρνητικοί οροί μάρτυρες, αραιώνονται σε 1 προς 25 με PBS + αποκορυφωμένο γάλα σε αναλογία 5 % (w/v) + Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (v/v), 100 μl ανά κοιλότητα. Επωάζονται επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

Για την τιτλοδότηση, δημιουργούνται σειρές αραιώσεων στο διπλάσιο, αρχίζοντας από 1 προς 25 (100 μl/κοιλότητα), ένας ορός ανά στήλη πλάκας, και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία με τους θετικούς και τους αρνητικούς μάρτυρες. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

2.1.2.2.

Οι πλάκες εκπλύνονται όπως περιγράφεται στο σημείο 2.1.1.2.

2.1.3. Προϊόν σύζευξης

2.1.3.1.

Διανέμονται 100 μl/κοιλότητα γ-σφαιρίνης αντιορού αλόγου, συζευγμένης με υπεροξειδάση (HPR), αφού προηγουμένως αραιωθεί με PBS + γάλα σε αναλογία 5 % + Tween 20 σε αναλογία 0,05 %, pH 7,2. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

2.1.3.2.

Οι πλάκες εκπλύνονται όπως περιγράφεται στο σημείο 2.1.1.2.

2.1.4. Χρωμογόνο/υπόστρωμα

2.1.4.1.

Προστίθενται 200 μl/κοιλότητα διαλύματος χρωμογόνου/υποστρώματος [10 ml από 80,6 mM DMAB (διμεθυλοαμινοβενζαλδεΰδη) + 10 ml από 1,56 mM MBTH (3-μεθυλο-2 βενζο-θειαζολινοϋδραζονοϋδροχλωρίδιο) + 5 μl H2O2].

Ύστερα από 5-10 λεπτά περίπου (πριν αρχίσει να χρωματίζεται ο αρνητικός μάρτυρας), διακόπτεται η ανάπτυξη του χρώματος με την προσθήκη 50 μl H2SO4 3N.

Επίσης είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και άλλα χρωμογόνα, όπως ABTS (2,2′-αζινο-δισ-[3-εθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ]), TMB (τετραμεθυλοβενζυδίνη) ή OPD (ορθο-φαινυλοδιαμίνη).

2.1.4.2.

Ανάγνωση των αποτελεσμάτων σε μήκος κύματος 600 nm (ή 620 nm).

2.2. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων

2.2.1.

Υπολογίζεται η διαχωριστική τιμή, προσθέτοντας τον αριθμό 0,6 στην τιμή που αντιστοιχεί στον αρνητικό μάρτυρα (0,6 είναι η τυπική απόκλιση που προκύπτει από ομάδα 30 αρνητικών ορών).

2.2.2.

Τα δείγματα δοκιμής που δίνουν τιμές απορρόφησης χαμηλότερες από τη διαχωριστική τιμή θεωρούνται αρνητικά.

2.2.3.

Τα δείγματα της δοκιμής που δίνουν τιμές απορρόφησης υψηλότερες από τη διαχωριστική τιμή + 0,15 θεωρούνται θετικά.

2.2.4.

Τα δείγματα δοκιμής που δίνουν ενδιάμεσες τιμές απορρόφησης θεωρούνται αμφίβολα και πρέπει να χρησιμοποιείται δεύτερη μέθοδος για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων.

3. ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ ELISA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗΣ ΠΑΝΩΛΗΣ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ (AHSV) (ΥΠΟΧΡΕΩΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ)

Η παρεμποδιστική δοκιμή ELISA έχει σχεδιασθεί για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων κατά του AHSV σε ορούς από οποιαδήποτε ευπαθή είδη. Η VP7 είναι η κύρια αντιγονική πρωτεΐνη ιού που περιέχει ο AHSV και διατηρείται στους εννέα ορότυπους. Δεδομένου ότι και το μονοκλωνικό αντίσωμα (Mab) κατευθύνεται προς τη VP7, η δοκιμασία χαρακτηρίζεται από υψηλό βαθμό ευαισθησίας και εξειδίκευσης. Επιπλέον, το ανασυνδυασμένο αντιγόνο VP7 είναι τελείως αβλαβές, με αποτέλεσμα να παρέχει μεγάλη ασφάλεια.

Η αρχή αυτής της μεθόδου δοκιμής συνίσταται στη διακοπή της αντίδρασης μεταξύ της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης VP7 —το αντιγόνο που συνδέεται στην πλάκα ELISA— και του ειδικού για την εν λόγω πρωτεΐνη συζευγμένου μονοκλωνικού αντισώματος (Mab). Το αντίσωμα που περιέχει ο ορός δοκιμής θα παρεμποδίσει την αντίδραση αντιγόνου-Mab, προκαλώντας εξασθένηση του χρώματος.

Η δοκιμή που περιγράφεται κατωτέρω, διεξάγεται στο Εργαστήριο Αναφοράς της Ευρωπαϊκής Κοινότητας για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών στο Algete της Ισπανίας.

3.1. Διαδικασία δοκιμής

3.1.1. Πλάκες ELISA

3.1.1.1.

Επιστρώνονται οι πλάκες με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VP7 από AHSV-4, αραιωμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών-διτανθρακικών ιόντων, pH 9,6. Επωάζονται επί μία νύκτα σε θερμοκρασία 4 °C.

3.1.1.2.

Οι πλάκες εκπλύνονται πέντε φορές με φυσιολογικό ορό με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS) που περιέχει Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (v/v) (PBST).

3.1.1.3.

Οι πλάκες σταθεροποιούνται με κατεργασία με σταθεροποιητικό διάλυμα (ώστε να μπορούν να αποθηκευθούν επί μεγάλο χρονικό διάστημα σε θερμοκρασία 4 °C χωρίς μείωση της δραστικότητάς τους), και ξηραίνονται σε απορροφητικό υλικό.

3.1.2. Δείγματα δοκιμής και μάρτυρες

3.1.2.1.	:	Για μαζικό διαγνωστικό έλεγχο	:	Οι οροί δοκιμής και οι μάρτυρες αραιώνονται κατευθείαν στην πλάκα σε αναλογία 1 προς 10 με PBST, έτσι ώστε να ληφθεί τελικός όγκος 100 μl/κοιλότητα. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.
3.1.2.2.	:	Για τιτλοδότηση	:	Σε οκτώ κοιλότητες παρασκευάζονται σειρές αραιώσεων στο διπλάσιο από τους ορούς δοκιμής και τους θετικούς ορούς μάρτυρες (100 μl/κοιλότητα) από 1 προς 10 έως 1 προς 1 280. Ο αρνητικός μάρτυρας ελέγχεται σε αραίωση 1 προς 10.

3.1.3. Προϊόν σύζευξης

Σε κάθε κοιλότητα προστίθενται 50 μl υπεροξειδάσης (HRP), συζευγμένης με Mab (μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για την πρωτεΐνη VP7) που έχουν προηγουμένως αραιωθεί και το σύνολο αναμειγνύεται ήπια για να ομοιογενοποιηθεί. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 37 °C.

3.1.4. Οι πλάκες εκπλύνονται πέντε φορές με PBST και στεγνώνονται όπως παραπάνω.

3.1.5. Χρωμογόνο/υπόστρωμα

Προστίθενται 100 μl/κοιλότητα διαλύματος χρωμογόνου/υποστρώματος [1 ml ABTS (2,2′-αζινο-δισ-[3-εθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ]) συγκεντρώσεως 5 mg/ml + 9 ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών-κιτρικών ιόντων 0,1M με pH 4 που περιέχει H2O2 σε αναλογία 0,03 %)] και ακολουθεί επώαση επί δέκα λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η ανάπτυξη του χρώματος διακόπτεται με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 100 μl SDS (θειικό νάτριο-δωδεκύλιο) συγκεντρώσεως 2 % (w/v).

3.1.6. Ανάγνωση των αποτελεσμάτων

Ανάγνωση των αποτελεσμάτων σε μήκος κύματος 405 nm με συσκευή ανάγνωσης ELISA.

3.2. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων

3.2.1. Έλεγχος καταλληλότητας της δοκιμασίας

Η δοκιμή είναι κατάλληλη, εφόσον η οπτική πυκνότητα (OD) του αρνητικού μάρτυρα (NC) είναι μεγαλύτερη από 1,0 και η OD του θετικού μάρτυρα (PC) μικρότερη από 0,2.

3.2.2. Υπολογισμός των διαχωριστικών τιμών

Θετική διαχωριστική τιμή	=	NC - [(NC -PC) × 0,3]
Αρνητική διαχωριστική τιμή	=	NC - [(NC -PC) × 0,2]

όπου NC είναι η OD του αρνητικού μάρτυρα και PC η OD του θετικού.

3.2.3. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων

Τα δείγματα των οποίων η OD είναι μικρότερη από τη θετική διαχωριστική τιμή θεωρούνται θετικά ως προς τα αντισώματα κατά του AHSV.

Τα δείγματα των οποίων η OD είναι μεγαλύτερη από την αρνητική διαχωριστική τιμή θεωρούνται αρνητικά ως προς τα αντισώματα κατά του AHSV.

Τα δείγματα των οποίων η OD κυμαίνεται μεταξύ των ανωτέρω δύο τιμών θεωρούνται αμφίβολα και τα ζώα από τα οποία προέρχονται θα πρέπει να υποβάλλονται σε νέα δειγματοληψία μετά από δύο έως τρεις εβδομάδες.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VI

Πίνακας αντιστοιχίας

Οδηγία 90/426/ΕΟΚ	Παρούσα οδηγία
Άρθρο 1	Άρθρο 1
Άρθρο 2 στοιχεία α) και β)	Άρθρο 2 στοιχεία α) και β)
Άρθρο 2 στοιχείο γ)	Άρθρο 2 στοιχείο γ) σημεία i) και ii)
Άρθρο 2 στοιχεία δ) έως θ)	Άρθρο 2 στοιχεία δ) έως θ)
Άρθρο 3	Άρθρο 3
Άρθρο 4 παράγραφοι 1, 2 και 3	Άρθρο 4 παράγραφοι 1, 2 και 3
Άρθρο 4 παράγραφος 4 σημεία i) και ii)	Άρθρο 4 παράγραφος 4 στοιχεία α) και β)
Άρθρο 4 παράγραφος 5 στοιχείο α) πρώτη έως έκτη περίπτωση	Άρθρο 4 παράγραφος 5 στοιχείο α) σημεία i) έως vi)
Άρθρο 4 παράγραφος 5 στοιχείο β)	Άρθρο 4 παράγραφος 5 στοιχείο β)
Άρθρο 4 παράγραφος 6 πρώτο εδάφιο πρώτη έως όγδοη περίπτωση	Άρθρο 4 παράγραφος 6 πρώτο εδάφιο στοιχεία α) έως η)
Άρθρο 4 παράγραφος 6 δεύτερο και τρίτο εδάφιο	Άρθρο 4 παράγραφος 6 δεύτερο και τρίτο εδάφιο
Άρθρο 5 παράγραφος 1	Άρθρο 5 παράγραφος 1
Άρθρο 5 παράγραφος 2 στοιχείο α)	Άρθρο 5 παράγραφος 2 πρώτο εδάφιο στοιχεία α) και β)
Άρθρο 5 παράγραφος 2 στοιχείο β)	Άρθρο 5 παράγραφος 2 δεύτερο εδάφιο στοιχεία α) και β)
Άρθρο 5 παράγραφος 2 στοιχείο γ)	Άρθρο 5 παράγραφος 3
Άρθρο 5 παράγραφος 2 στοιχείο δ)	Άρθρο 5 παράγραφος 4
Άρθρο 5 παράγραφος 3 στοιχεία α) και β)	Άρθρο 5 παράγραφος 5 στοιχεία α) και β)
Άρθρο 5 παράγραφος 3 στοιχείο γ) πρώτη και δεύτερη περίπτωση	Άρθρο 5 παράγραφος 5 στοιχείο γ) πρώτο εδάφιο σημεία i) και ii)
Άρθρο 5 παράγραφος 3 στοιχείο γ) πρώτη περίπτωση, τελευταία πρόταση	Άρθρο 5 παράγραφος 5 στοιχείο γ) δεύτερο εδάφιο
Άρθρο 5 παράγραφος στοιχεία δ) και ε)	Άρθρο 5 παράγραφος στοιχεία δ) και ε)
Άρθρο 6	Άρθρο 6
Άρθρο 7	Άρθρο 7
Άρθρο 8 παράγραφος 1 πρώτο εδάφιο, πρώτη και δεύτερη περίπτωση	Άρθρο 8 παράγραφος 1 στοιχεία α) και β)
Άρθρο 8 παράγραφος 1 δεύτερο εδάφιο	Άρθρο 8 παράγραφος 2
Άρθρο 8 παράγραφος 2	Άρθρο 8 παράγραφος 3
Άρθρο 9	Άρθρο 9
Άρθρο 10	Άρθρο 10
Άρθρο 11 παράγραφος 1	Άρθρο 11
Άρθρο 11 παράγραφος 2	—
Άρθρο 12	Άρθρο 12
Άρθρο 13	Άρθρο 13
Άρθρο 14	Άρθρο 14
Άρθρο 15	Άρθρο 15
Άρθρο 16 παράγραφος 1 στοιχεία α) έως στ)	Άρθρο 16 παράγραφος 1 στοιχεία α) έως στ)
Άρθρο 16 παράγραφος 1 τελευταία πρόταση	—
Άρθρο 16 παράγραφος 2	Άρθρο 16 παράγραφος 2
Άρθρο 17	Άρθρο 18
Άρθρο 18	Άρθρο 17
Άρθρο 19 σημεία i) έως iv)	Άρθρο 19 στοιχεία α) έως δ)
Άρθρο 22	—
Άρθρο 23	Άρθρο 20
Άρθρο 24 παράγραφοι 1 και 2	Άρθρο 21 παράγραφοι 1 και 2
Άρθρο 24 παράγραφος 3	—
Άρθρο 25 παράγραφοι 1 και 2	Άρθρο 21 παράγραφοι 1 και 3
Άρθρο 26	—
Άρθρο 27	—
—	Άρθρο 22
—	Άρθρο 23
Άρθρο 28	Άρθρο 24
Παράρτημα A	Παράρτημα I
Παράρτημα Β	Παράρτημα II
Παράρτημα Γ	Παράρτημα III
Παράρτημα Δ	Παράρτημα IV
—	Παράρτημα V
—	Παράρτημα VI

Οδηγία 90/426/ΕΟΚ του Συμβουλίου (ΕΕ L 224 της 18.8.1990, σ. 42).
Οδηγία 90/425/ΕΟΚ του Συμβουλίου (ΕΕ L 224 της 18.8.1990, σ. 29).	Μόνον το άρθρο 15 παράγραφος 3
Οδηγία 91/496/ΕΟΚ του Συμβουλίου (ΕΕ L 268 της 24.9.1991, σ. 56).	Μόνον όσον αφορά την παραπομπή στην οδηγία 90/426/ΕΟΚ, που περιέχεται στο άρθρο 26 παράγραφος 2
Απόφαση 92/130/ΕΟΚ της Επιτροπής (ΕΕ L 47 της 22.2.1992, σ. 26).
Οδηγία 92/36/ΕΟΚ του Συμβουλίου (ΕΕ L 157 της 10.6.1992, σ. 28).	Μόνον το άρθρο 1
πράξη προσχώρησης του 1994, παράρτημα Ι, σημείο V.E.I.A.3 (ΕΕ C 241 της 29.8.1994, σ. 132).
Απόφαση της Επιτροπής 2001/298/ΕΚ της Επιτροπής (ΕΕ L 102 της 12.4.2001, σ. 63).	Μόνον όσον αφορά την παραπομπή στην οδηγία 90/426ΕΟΚ, που περιέχεται στο άρθρο 1 παράγραφος 1 και στο παράρτημα Ι σημείο 2
Απόφαση της Επιτροπής 2002/160/ΕΚ της Επιτροπής (ΕΕ L 53 της 23.2.2002, σ. 37).
Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 806/2003 του Συμβουλίου (ΕΕ L 122 της 16.5.2003, σ. 1).	Μόνον το παράρτημα ΙΙΙ σημείο 10
Πράξη προσχώρησης του 2003, παράρτημα ΙΙ, σημείο 6.B.I.16 (ΕΕ L 236 της 23.9.2003, σ. 381).
Οδηγία 2004/68/ΕΚ του Συμβουλίου (ΕΕ L 139 της 30.4.2004, σ. 322).	Μόνον το άρθρο 15
Οδηγία 2006/104/ΕΚ του Συμβουλίου (ΕΕ L 363 της 20.12.2006, σ. 352).	Μόνον το σημείο Ι.2 του παραρτήματος.
Οδηγία 2008/73/ΕΚ του Συμβουλίου (ΕΕ L 219 της 14.8.2008, σ. 40).	Μόνον το άρθρο 7

Οδηγία	Προθεσμία ενσωμάτωσης
90/426/ΕΟΚ	1η Ιανουαρίου 1992
90/425/ΕΟΚ	1η Ιουλίου 1992
91/496/ΕΟΚ	1η Ιουλίου 1992
92/36/ΕΟΚ	31η Δεκεμβρίου 1992
2004/68/ΕΚ	19η Νοεμβρίου 2005
2006/104/ΕΚ	1η Ιανουαρίου 2007
2008/73/ΕΚ	1η Ιανουαρίου 2010