EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 01991R2568-20151016

Consolidated text: Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91 της Επιτροπής της 11ης Ιουλίου 1991 σχετικά με τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων καθώς και με τις μεθόδους προσδιορισμού

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/1991/2568/2015-10-16

1991R2568 — EL — 16.10.2015 — 028.001


Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθημα τεκμηρίωσης και δεν δεσμεύει τα κοινοτικά όργανα

►B

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ

της 11ης Ιουλίου 1991

σχετικά με τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων καθώς και με τις μεθόδους προσδιορισμού

(ΕΕ L 248 της 5.9.1991, σ. 1)

Τροποποιείται από:

 

 

Επίσημη Εφημερίδα

  αριθ.

σελίδα

ημερομηνία

►M1

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 3682/91 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 17ης Δεκεμβρίου 1991

  L 349

36

18.12.1991

 M2

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 1429/92 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 26ης Μαΐου 1992

  L 150

17

2.6.1992

 M3

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 1683/92 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 29ης Ιουνίου 1992

  L 176

27

30.6.1992

 M4

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 1996/92 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 15ης Ιουλίου 1992

  L 199

18

18.7.1992

►M5

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 3288/92 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 12ης Νοεμβρίου 1992

  L 327

28

13.11.1992

►M6

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 183/93 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 29ης Ιανουαρίου 1993

  L 22

58

30.1.1993

 M8

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 620/93 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 17ης Μαρτίου 1993

  L 66

29

18.3.1993

 M9

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 177/94 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 28ης Ιανουαρίου 1994

  L 24

33

29.1.1994

 M10

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 2632/94 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 28ης Οκτωβρίου 1994

  L 280

43

29.10.1994

►M11

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 656/95 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 28ης Μαρτίου 1995

  L 69

1

29.3.1995

 M12

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 2527/95 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 27ης Οκτωβρίου 1995

  L 258

49

28.10.1995

 M13

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 2472/97 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 11ης Δεκεμβρίου 1997

  L 341

25

12.12.1997

 M14

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 282/98 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 3ης Φεβρουαρίου 1998

  L 28

5

4.2.1998

 M15

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 2248/98 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 19ης Οκτωβρίου 1998

  L 282

55

20.10.1998

 M16

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 379/1999 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 19ης Φεβρουαρίου 1999

  L 46

15

20.2.1999

 M17

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 455/2001 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 6ης Μαρτίου 2001

  L 65

9

7.3.2001

 M18

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 2042/2001 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 18ης Οκτωβρίου 2001

  L 276

8

19.10.2001

►M19

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 796/2002 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 6ης Μαΐου 2002

  L 128

8

15.5.2002

►M20

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 1989/2003 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 6ης Νοεμβρίου 2003

  L 295

57

13.11.2003

►M21

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 702/2007 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 21ης Ιουνίου 2007

  L 161

11

22.6.2007

 M22

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 640/2008 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 4ης Ιουλίου 2008

  L 178

11

5.7.2008

►M23

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΕ) αριθ. 61/2011 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 24ης Ιανουαρίου 2011

  L 23

1

27.1.2011

 M24

ΕΚΤΕΛΕΣΤΙΚΌΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΕ) αριθ. 661/2012 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 19ης Ιουλίου 2012

  L 192

3

20.7.2012

►M25

ΕΚΤΕΛΕΣΤΙΚΌΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΕ) αριθ. 299/2013 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 26ης Μαρτίου 2013

  L 90

52

28.3.2013

►M26

ΕΚΤΕΛΕΣΤΙΚΌΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΕ) αριθ. 1348/2013 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 16ης Δεκεμβρίου 2013

  L 338

31

17.12.2013

►M27

ΚΑΤ' ΕΞΟΥΣΙΟΔΌΤΗΣΗ ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΕ) 2015/1830 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 8ης Ιουλίου 2015

  L 266

9

13.10.2015

►M28

ΕΚΤΕΛΕΣΤΙΚΌΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΕ) 2015/1833 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ της 12ης Οκτωβρίου 2015

  L 266

29

13.10.2015


Διορθώνεται από:

►C1

Διορθωτικό, ΕΕ L 108, 25.4.1992, σ.  57  (2568/1991)

 C2

Διορθωτικό, ΕΕ L 176, 20.7.1993, σ.  26  (183/1993)




▼B

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ

της 11ης Ιουλίου 1991

σχετικά με τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων καθώς και με τις μεθόδους προσδιορισμού



Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας,

τον κανονισμό αριθ. 136/66/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 22ας Σεπτεμβρίου 1966 περί δημουργίας κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα των λιπαρών ουσιών ( 1 ), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 3577/90 ( 2 ), και ιδίως το άρθρο 35α,

Εκτιμώντας:

ότι στο παράρτημα του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ προβλέπονται η περιγραφή και ο ορισμός των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων που διατίθενται στο εμπόριο στο εσωτερικό κάθε κράτους μέλους, καθώς και όσον αφορά τις ενδοκοινοτικές συναλλαγές και τις συναλλαγές με τις τρίτες χώρες·

ότι, για να καταστεί δυνατός ο διαχωρισμός μεταξύ των διαφόρων τύπων ελαίου, θα πρέπει να καθοριστούν τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά κάθε ελαίου, καθώς και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των παρθένων ελαίων, κατά τρόπο που να διασφολίζεται η γνησιότητα και η ποιότητα των εν λόγω προϊόντων, με την επιφύλαξη των υπολοίπων διατάξεων, οι οποίες αφορούν αυτό το θέμα·

ότι θα πρέπει να προσδιοριστούν κατά ενιαίο τρόπο σε ολόκληρη την Κοινότητα τα χαρακτηριστικά των διαφόρων τύπων ελαίου· ότι, προς το σκοπό αυτό, θα πρέπει να καθοριστούν οι μέθοδοι, χημικής ανάλυσης και οργανοληπτικής αξιολόγησης στην Κοινότητα· ότι θα πρέπει, εντούτοις, να επιτραπεί κατά τη διάρκεια μεταβατικής περιόδου η χρησιμοποίηση άλλων μεθόδων ανάλυσης που εφαρμόζονται στα κράτη μέλη, προβλέποντας παράλληλα ότι, σε περίπτωση που τα αποτελέσματα παρουσιάζουν διαφορές, θα είναι καθοριστικά τα αποτελέσματα που έχουν ληφθεί με βάση την ενιαία μέθοδο·

ότι ο προσδιορισμός των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του ελαιολάδου και των μεθόδων ανάλυσης οδηγεί στην προσαρμογή των συμπληρωματικών επεξηγήσεων του κεφαλαίου 15 της συνδυασμένης ονοματολογίας·

ότι στην μέθοδο αξιολόγησης των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρθένων ελαίων περιλαμβάνεται η συγκρότηση ομάδος δοκιμαστών που έχουν επιλεγεί και εξασκηθεί ειδικά γι' αυτό· ότι είναι, επομένως, σκόπιμο να προβλεφθεί η προθεσμία η αναγκαία για την δημιουργία μιας τέτοιας υποδομής· ότι, λαμβανομένων υπόψη των δυσκολιών που θα συναντήσουν ορισμένα κράτη μέλη για την συγκρότηση ομάδων δοκιμαστών, είναι σκόπιμο να δοθεί άδεια να καταφεύγουν στις υπάρχουσες ομάδες άλλων κρατών μελλών·

ότι, για να εξασφαλιστεί η ορθή λειτουργία του συστήματος των εισφορών που εφαρμόζονται κατά την εισαγωγή των ελαιοπυρήνων είναι σκόπιμο να προβλεφθεί μια ενιαία μέθοδος για τον καθορισμό της περιεκτικότητας σε έλαιο των εν λόγω προϊόντων·

ότι, για να μην προκληθεί ζημιά στο εμπόριο, είναι σκόπιμο να προβλεφθεί μια περιορισμένη περίοδος για την διάθεση του τυποποιημένου ελαιολάδου πρό της ενάρξεως του παρόντος κανονισμού·

ότι είναι σκόπιμο να καταργηθεί ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1058/77 της Επιτροπής ( 3 ), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 1858/88 ( 4

ότι η Επιτροπή Διαχείρισης Λιπαρών Ουσιών δεν διατύπωσε γνώμη εντός της ταχθείσας προδεσμίας,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:



▼M20

Άρθρο 1

1.  Θεωρούνται παρθένα ελαιόλαδα, κατά την έννοια του σημείου 1 α) και β) του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, τα ελαιόλαδα των οποίων τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημεία 1 και 2 του παρόντος κανονισμού.

2.  Θεωρείται ελαιόλαδο λαμπάντε, κατά την έννοια του σημείου 1 γ) του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 3 του παρόντος κανονισμού.

3.  Θεωρείται εξευγενισμένο ελαιόλαδο, κατά την έννοια του σημείου 2 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 4 του παρόντος κανονισμού.

4.  Θεωρείται ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισμένο ελαιόλαδο και παρθένα ελαιόλαδα, κατά την έννοια του σημείου 3 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 5 του παρόντος κανονισμού.

5.  Θεωρείται ακατέργαστο πυρηνέλαιο κατά την έννοια του σημείου 4 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το έλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 6 του παρόντος κανονισμού.

6.  Θεωρείται εξευγενισμένο πυρηνέλαιο, κατά την έννοια του σημείου 5 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το έλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 7 του παρόντος κανονισμού.

7.  Θεωρείται πυρηνέλαιο κατά την έννοια του σημείου 6 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το έλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 8 του παρόντος κανονισμού.

▼M26

Άρθρο 2

1.  Τα προβλεπόμενα στο παράρτημα I του παρόντος κανονισμού χαρακτηριστικά των ελαίων προσδιορίζονται σύμφωνα με τις ακόλουθες μεθόδους ανάλυσης:

α) για τον προσδιορισμό των ελευθέρων λιπαρών οξέων, εκφραζόμενων σε εκατοστιαία αναλογία ελαϊκού οξέος, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα II·

β) για τον προσδιορισμό του αριθμού υπεροξειδίων, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα III·

γ) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε κηρούς, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα IV·

δ) για τον προσδιορισμό της σύστασης και της περιεκτικότητας σε στερόλες και τριτερπενικές διαλκοόλες με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα V·

ε) για τον προσδιορισμό της εκατοστιαίας αναλογίας μονοπαλμιτικού 2-γλυκερυλίου, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα VII·

στ) για τη φασματοφωτομετρική ανάλυση, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα IX·

▼M28

ζ) για τον προσδιορισμό της συστάσεως σε λιπαρά οξέα, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα X·

▼M26

η) για τον προσδιορισμό των αλογονούχων πτητικών διαλυτών, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XI·

θ) για την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρθένων ελαιολάδων, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XII·

ι) για τον προσδιορισμό των στιγμασταδιενίων, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XVII·

ια) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε τριγλυκερίδια με ECN42, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XVIII·

▼M28

ιβ) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XIX·

▼M26

ιγ) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε κηρούς, καθώς και σε μεθυλεστέρες και αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα ΧΧ.

▼M28 —————

▼M26

2.  Ο έλεγχος των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρθένων ελαιολάδων από τις εθνικές αρχές ή τους αντιπροσώπους τους διενεργείται από ομάδες δοκιμαστών αναγνωρισμένες από τα κράτη μέλη.

Τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά ελαιολάδου που αναφέρονται στο πρώτο εδάφιο θεωρούνται σύμφωνα με τη δηλούμενη κατηγορία του ελαιολάδου, εάν η αναγνωρισμένη από το κράτος μέλος ομάδα επιβεβαιώσει τη συγκεκριμένη κατάταξη.

Σε περίπτωση που η αναγνωρισμένη ομάδα δεν επιβεβαιώσει τη δηλούμενη κατηγορία ως προς τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, οι εθνικές αρχές ή οι αντιπρόσωποί τους αναθέτουν χωρίς καθυστέρηση, ύστερα από αίτηση του ενδιαφερομένου, τη διενέργεια δύο κατ’ έφεση εξετάσεων από άλλες αναγνωρισμένες ομάδες, από τις οποίες η μία τουλάχιστον διενεργείται από ομάδα αναγνωρισμένη από το κράτος μέλος παραγωγής του ελαιολάδου. Τα υπόψη χαρακτηριστικά θεωρούνται σύμφωνα με τα δηλωθέντα, εάν οι δύο κατ’ έφεση εξετάσεις επιβεβαιώσουν τη συγκεκριμένη κατάταξη. Σε αντίθετη περίπτωση, τα έξοδα των κατ’ έφεση εξετάσεων βαρύνουν τον ενδιαφερόμενο.

3.  Κατά τον έλεγχο των χαρακτηριστικών των ελαίων από τις εθνικές αρχές ή τους αντιπροσώπους τους, όπως προβλέπεται στην παράγραφο 1, η δειγματοληψία διενεργείται σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα EN ISO 661 για την προετοιμασία δείγματος δοκιμής και EN ISO 5555 για τη δειγματοληψία. Ωστόσο, κατά παρέκκλιση από το σημείο 6.8 του προτύπου EN ISO 5555, για τις παρτίδες που αποτελούνται από τα εν λόγω έλαια σε άμεσες συσκευασίες, η δειγματοληψία διενεργείται σύμφωνα με το παράρτημα Ια του παρόντος κανονισμού. Στην περίπτωση των χύδην ελαιολάδων για τα οποία δεν μπορεί να εφαρμοστεί το πρότυπο EN ISO 5555, η δειγματοληψία διενεργείται σύμφωνα με τις υποδείξεις της αρμόδιας αρχής του κράτους μέλους.

Με την επιφύλαξη των διατάξεων του προτύπου EN ISO 5555 και του κεφαλαίου 6 του προτύπου EN ISO 661, τα δείγματα προφυλάσσονται από το φως και από υψηλές θερμοκρασίες το ταχύτερο δυνατό και αποστέλλονται στο εργαστήριο για ανάλυση το αργότερο την πέμπτη εργάσιμη ημέρα από τη λήψη τους. Σε αντίθετη περίπτωση, τα δείγματα φυλάσσονται κατά τρόπο ώστε να μην υποστούν υποβάθμιση ή φθορά κατά τη διάρκεια της μεταφοράς ή της αποθήκευσής τους προτού αποσταλούν στο εργαστήριο.

4.  Για τους ελέγχους που προβλέπονται στην παράγραφο 3, οι αναλύσεις που αναφέρονται στα παραρτήματα II, III, IX, XII και XX, καθώς και, κατά περίπτωση, οι κατ’ έφεση αναλύσεις που απαιτούνται βάσει της εθνικής νομοθεσίας, διεξάγονται πριν από την ημερομηνία ελάχιστης διατηρησιμότητας στην περίπτωση των συσκευασμένων προϊόντων. Σε περίπτωση δειγματοληψίας χύδην ελαίων, οι αναλύσεις αυτές διεξάγονται το αργότερο τον έκτο μήνα ύστερα από τον μήνα κατά τον οποίο ελήφθη το δείγμα.

Δεν ισχύει καμία προθεσμία για τις άλλες αναλύσεις που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό.

Εάν τα αποτελέσματα των αναλύσεων δεν αντιστοιχούν στα χαρακτηριστικά της κατηγορίας ελαιολάδου ή πυρηνελαίου που δηλώθηκε, ο ενδιαφερόμενος ενημερώνεται σχετικά, το αργότερο έναν μήνα πριν από τη λήξη της προθεσμίας που ορίζεται στο πρώτο εδάφιο, εκτός εάν η δειγματοληψία διενεργήθηκε λιγότερο από δύο μήνες πριν από την ημερομηνία ελάχιστης διατηρησιμότητας.

5.  Για τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων με τις μεθόδους που προβλέπονται στο πρώτο εδάφιο της παραγράφου 1, τα αποτελέσματα των αναλύσεων συγκρίνονται απευθείας με τα όρια που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό.

▼M25

Άρθρο 2a

1.  Για τους σκοπούς του παρόντος άρθρου, ως «ελαιόλαδο που διατίθεται στο εμπόριο» νοείται η συνολική ποσότητα ελαιολάδου και πυρηνελαίου ενός δεδομένου κράτους μέλους, η οποία καταναλώνεται στο εν λόγω κράτος μέλος ή εξάγεται από το εν λόγω κράτος μέλος.

2.  Τα κράτη μέλη εξασφαλίζουν ότι οι έλεγχοι συμμόρφωσης πραγματοποιούνται επιλεκτικά, βάσει ανάλυσης κινδύνου, με την απαραίτητη συχνότητα, έτσι ώστε να διασφαλίζεται η συμφωνία του ελαιολάδου που διατίθεται στο εμπόριο με τη δηλωθείσα κατηγορία.

3.  Τα κριτήρια αξιολόγησης του κινδύνου μπορεί να περιλαμβάνουν:

α) την κατηγορία του ελαίου, την περίοδο παραγωγής, την τιμή των ελαίων σε σχέση με άλλα φυτικά έλαια, τις εργασίες ανάμειξης και συσκευασίας, τις εγκαταστάσεις και τις συνθήκες αποθήκευσης, τη χώρα καταγωγής, τη χώρα προορισμού, τα μέσα μεταφοράς ή την ποσότητα της παρτίδας·

β) τη θέση των επιχειρήσεων στην αλυσίδα εμπορίας, την ποσότητα και/ή την αξία των προϊόντων που διαθέτουν στο εμπόριο, το φάσμα των κατηγοριών ελαίων που διαθέτουν στο εμπόριο, τον τύπο των δραστηριοτήτων που ασκούν, όπως η έκθλιψη, η αποθήκευση, το ραφινάρισμα, η ανάμειξη, η συσκευασία ή η λιανική πώληση·

γ) τα πορίσματα από προηγούμενους ελέγχους, συμπεριλαμβανομένων του αριθμού και του τύπου των ελαττωμάτων που διαπιστώθηκαν, τη συνήθη ποιότητα των ελαίων που διατίθενται στο εμπόριο, τις επιδόσεις του χρησιμοποιούμενου τεχνικού εξοπλισμού·

δ) την αξιοπιστία των συστημάτων διασφάλισης της ποιότητας των επιχειρήσεων ή των συστημάτων αυτοελέγχου σε σχέση με τη συμμόρφωση προς τις προδιαγραφές εμπορίας·

ε) τον τόπο διενέργειας του ελέγχου, ιδίως εάν αυτός είναι το σημείο πρώτης εισόδου στην Ένωση, το σημείο τελευταίας εξόδου από την Ένωση ή ο τόπος παραγωγής, συσκευασίας, φόρτωσης ή πώλησης των ελαίων στον τελικό καταναλωτή·

στ) κάθε άλλη πληροφορία που θα μπορούσε να δηλώνει κίνδυνο μη συμμόρφωσης.

4.  Τα κράτη μέλη θεσπίζουν εκ των προτέρων:

α) τα κριτήρια αξιολόγησης του κινδύνου μη συμμόρφωσης παρτίδων·

β) βάσει ανάλυσης κινδύνου για κάθε κατηγορία κινδύνου, τον ελάχιστο αριθμό επιχειρήσεων ή παρτίδων και/ή ποσοτήτων που θα αποτελέσουν αντικείμενο ελέγχου συμμόρφωσης.

Διενεργείται τουλάχιστον ένας ετήσιος έλεγχος συμμόρφωσης ανά χίλιους τόνους ελαιολάδου που διατίθεται στο εμπόριο στο κράτος μέλος.

5.  Τα κράτη μέλη επαληθεύουν τη συμμόρφωση:

α) με τη διεξαγωγή των αναλύσεων που προβλέπονται στο παράρτημα I, ανεξαρτήτως σειράς· ή

β) σύμφωνα με τη σειρά που προβλέπεται στο παράρτημα Ιβ σχετικά με το διάγραμμα αποφάσεων, μέχρι να υπάρξει κατάληξη σε μία από τις αποφάσεις που αναφέρονται από το εν λόγω διάγραμμα.

▼M19 —————

▼M25

Άρθρο 3

Στην περίπτωση που διαπιστώνεται ότι ένα ελαιόλαδο διαφέρει από την περιγραφή της κατηγορίας του, το ενδιαφερόμενο κράτος μέλος επιβάλλει, με την επιφύλαξη άλλων ενδεχομένων κυρώσεων, αποτελεσματικές, αναλογικές και αποτρεπτικές κυρώσεις οι οποίες καθορίζονται ανάλογα με τη σοβαρότητα της διαπιστωθείσας παρατυπίας.

Όταν από τους ελέγχους προκύπτουν σημαντικές παρατυπίες, τα κράτη μέλη αυξάνουν τη συχνότητα των ελέγχων σε σχέση με το στάδιο εμπορίας, την κατηγορία ελαιολάδου, την καταγωγή ή άλλα κριτήρια.

▼M5

Άρθρο 4

▼M19

1.  Για την εκτίμηση και τον έλεγχο από τις αρμόδιες αρχές ή τον εκπρόσωπό τους των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, τα κράτη μέλη δύνανται να αναγνωρίζουν ομάδες δοκιμαστών.

Οι όροι αναγνώρισης καθορίζονται από τα κράτη μέλη έτσι, κυρίως, ώστε:

 να ανταποκρίνονται στους όρους του παραρτήματος XII σημείο 4,

 να διασφαλίζεται ότι η κατάρτιση του επικεφαλής της ομάδας πραγματοποιείται από ίδρυμα και υπό προϋποθέσεις αναγνωρισμένες για το σκοπό αυτό από το κράτος μέλος,

 η εγκυρότητα των λαμβανόμενων αποτελεσμάτων των εξετάσεων να υπόκειται σε σύστημα ετήσιου ελέγχου διαμορφωμένο από το κράτος μέλος.

Κάθε κράτος μέλος κοινοποιεί στην Επιτροπή κατάλογο των αναγνωρισμένων ομάδων καθώς και τα μέτρα που ελήφθησαν σύμφωνα με την παρούσα παράγραφο.

▼M5

2.  Στην περίπτωση που ένα κράτος αντιμετωπίζει δυσκολίες για να συγκροτήσει επιτροπή δοκιμαστών στην επικράτειά του, μπορεί να προσφύγει σε αναγνωρισμένη επιτροπή δοκιμαστών σε ένα άλλο κράτος μέλος.

3.  Κάθε κράτος μέλος καθορίζει τον κατάλογο των επιτροπών δοκιμαστών που συγκροτούνται από τις επαγγελματικές ή διεπαγγελματικές οργανώσεις σύμφωνα με τους όρους που περιγράφονται στην παράγραφο 1 και μεριμνά για την τήρηση των όρων αυτών.

▼M19 —————

▼B

Άρθρο 6

1.  Η περιεκτικότητα σε έλαιο των ελαιοπυρήνων και των άλλων υπολειμμάτων εκχύλισης του ελαιολάδου (κωδικός ΣΟ 2306 90 11 και 2306 90 19 ) προσδιορίζεται σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται στο παράρτημα XV.

2.  Η περιεκτικότητα σε έλαιο που αναφέρεται στην παράγραφο 1 είναι εκπεφρασμένη επί του 3 % κατά βάρος επί ξηράς ουσίας.

▼M20

Άρθρο 7

Εφαρμόζονται οι κοινοτικές διατάξεις όσον αφορά την παρουσία επιμολυντών.

Όσον αφορά την περιεκτικότητα σε αλογονωμένους διαλύτες τα όρια για όλες τις κατηγορίες ελαιολάδου είναι τα ακόλουθα:

 ανώτατη περιεκτικότητα κάθε αλογονωμένου διαλύτη που έχει ανιχνευθεί 0,1 mg/kg,

 ανώτατη συνολική περιεκτικότητα των αλογονωμένων διαλυτών που έχουν ανιχνευθεί 0,2 mg/kg.

▼M25

Άρθρο 7a

Τα φυσικά ή νομικά πρόσωπα και οι ομάδες προσώπων που έχουν στην κατοχή τους, για την άσκηση του επαγγέλματός τους ή για εμπορικούς σκοπούς, ελαιόλαδο και πυρηνέλαιο από το στάδιο της έκθλιψης στο ελαιοτριβείο μέχρι και την εμφιάλωση, υποχρεούνται να τηρούν μητρώα στα οποία καταγράφονται η είσοδος και η έξοδος κάθε κατηγορίας των ελαίων αυτών.

Τα κράτη μέλη μεριμνούν για την εκπλήρωση της υποχρέωσης που προβλέπεται στο πρώτο εδάφιο.

▼M25

Άρθρο 8

1.  Τα κράτη μέλη κοινοποιούν στην Επιτροπή τα μέτρα εφαρμογής του παρόντος κανονισμού. Γνωστοποιούν στην Επιτροπή οποιεσδήποτε μεταγενέστερες τροποποιήσεις.

2.  Το αργότερο μέχρι τις 31 Μαΐου κάθε έτους, τα κράτη μέλη διαβιβάζουν στην Επιτροπή έκθεση σχετικά με την εφαρμογή του παρόντος κανονισμού κατά το προηγούμενο ημερολογιακό έτος. Η έκθεση περιλαμβάνει τουλάχιστον τα αποτελέσματα των ελέγχων συμμόρφωσης που διενεργήθηκαν στα ελαιόλαδα σύμφωνα με τα υποδείγματα που παρατίθενται στο παράρτημα XXI.

3.  Οι κοινοποιήσεις που αναφέρονται στον παρόντα κανονισμό υποβάλλονται σύμφωνα με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 792/2009 της Επιτροπής ( 5 ).

▼B

Άρθρο 9

Ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1058/77 καταργείται.

Άρθρο 10

1.  Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.

Η εφαρμογή της μεθόδου του παραρτήματος XII αρχίζει από την ►M1  1η Νοεμβρίου 1992 ◄ , εξαιρουμένων των διαδικασιών των σχετικών με την παρέμβαση.

▼M5

Η μέθοδος αυτή δεν εφαρμόζεται στα παρθένα ελαιόλαδα που συσκευάζονται πριν από την 1η Νοεμβρίου 1992.

▼B

2.  Ο παρών κανονισμός δεν ισχύει για τα ελαιόλαδα και τα πυρηνέλαια που συσκευάστηκαν έως την ημερομηνία έναρξης ισχύος του παρόντος κανονισμού και τέθηκαν στο εμπόριο έως τις 31 Οκτωβρίου 1992.

Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ

Σύνοψη



Παράρτημα I:

Χαρακτηριστικά του ελαιόλαδου

Παράρτημα Ια:

Δειγματοληψια ελαιολαδου ή πυρηνελαιου που παραδιδονται σε αμεσεσ συσκευασιεσ

Παράρτημα Ιβ:

Διαγραμμα αποφασεων για την εξακριβωση τησ συμφωνιασ ενοσ δειγματοσ ελαιολαδου με τη δηλωθεισα κατηγορια

Παράρτημα II:

►M21  Προσδιορισμός των ελευθέρων λιπαρών οξέων, εν ψυχρώ μέθοδος ◄

Παράρτημα III:

Προσδιορισμός του αριθμού υπεροξειδίων

Παράρτημα IV:

►M6  Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε κηρούς διά χρωματογραφίας αερίου φάσεως με τριχοειδή στήλη ◄

Παράρτημα V:

Προσδιορισμοσ τησ συνθεσησ και τησ περιεκτικοτητασ σε στερολεσ και τριτερπενικεσ διαλκοολεσ με αεριοχρωματογραφια τριχοειδουσ στηλησ

Παράρτημα VII:

►M21  Προσδιορισμός της εκατοστιαίας αναλογίας 2-μονοπαλμιτίνης ◄

▼M20 —————

▼B

Παράρτημα IX:

Φασματοφωτομετρικη εξεταση υπεριωδουσ

▼M28

Παράρτημα Χ:

Προσδιορισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με αεριοχρωματογραφία

▼B

Παράρτημα XI:

Προσδιορισμός της περιεκτικότητας του ελαιολάδου σε αλογονούχους πτητικούς διαλύτες

Παράρτημα XII:

Μεθοδοσ του διεθνουσ συμβουλιου ελαιοκομιασ για την οργανοληπτικη εξεταση παρθενου ελαιολαδου

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

Παράρτημα XV:

Περιεκτικότητα σε έλαιο των ελαιοπυρήνων

Παράρτημα XVI:

Προσδιορισμός του αριθμού ιωδίου

Παράρτημα XVII:

Μέθοδος προσδιορισμού των στιγμασταδιενίων στα φυτικά έλαια

Παράρτημα XVIII:

Προσδιορισμοσ τησ διαφορασ μεταξυ πραγματικησ και θεωρητικησ περιεκτικοτητασ σε τριακυλογλυκερολεσ με ECN 42

Παράρτημα XIX:

►M28  Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης ◄

▼M23

Παράρτημα ΧΧ:

Μέθοδος προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε κηρούς, καθώς και σε μεθυλεστέρες και αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων, με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης

▼M28 —————

▼M25

Παράρτημα XXI:

Αποτελέσματα των αναφερόμενων στο άρθρο 8 παράγραφος 2 ελέγχων συμμόρφωσης για τα ελαιόλαδα

▼M27




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ



Κατηγορία

Αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων (FAEE) (*)

Οξύτητα

(%) (*)

Αριθμός υπεροξειδίων

mEq O2/kg (*)

Κηροί

mg/kg (**)

2-μονοπαλμιτικό γλυκερύλιο

(%)

Στιγμασταδιένια

mg/kg (1)

Διαφορά μεταξύ ECN42 (HPLC) και ECN42

(θεωρητικός υπολογισμός)

K232 (*)

K268 ή K270 (*)

ΔΚ (*)

Οργανοληπτική εξέταση

Διάμεσος του ελαττώματος (Md) (*)

Οργανοληπτική εξέταση

Διάμεση τιμή του φρουτώδους (Mf) (*)

1.  Εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο

FAEE ≤ 40 mg/kg (ελαιοκομική περίοδος 2013-2014) (2)

FAEE ≤ 35 mg/kg (ελαιοκομική περίοδος 2014-2016)

FAEE ≤ 30 mg/kg (ελαιοκομική περίοδος μετά το 2016)

≤ 0,8

≤ 20

C42 + C44 + C46 ≤ 150

≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Md = 0

Mf > 0

≤ 1,0 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 %

2.  Παρθένο ελαιόλαδο

≤ 2,0

≤ 20

C42 + C44 + C46 ≤ 150

≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Md ≤ 3,5

Mf > 0

≤ 1,0 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 %

3.  Μειονεκτικό ελαιόλαδο (λαμπάντε)

> 2,0

C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3)

≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ |0,3|

Md > 3,5 (4)

≤ 1,1 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 %

4.  Εξευγενισμένο ελαιόλαδο

≤ 0,3

≤ 5

C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350

≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 %

≤ |0,3|

≤ 1,10

≤ 0,16

≤ 1,1 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 %

5.  Σύνθετο ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισμένα και παρθένα ελαιόλαδα

≤ 1,0

≤ 15

C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350

≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 %

≤ |0,3|

≤ 0,90

≤ 0,15

≤ 1,0 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 %

6.  Ακατέργαστο πυρηνέλαιο

C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5)

≤ 1,4

≤ |0,6|

7.  Εξευγενισμένο πυρηνέλαιο

≤ 0,3

≤ 5

C40 + C42 + C44 + C46 > 350

≤ 1,4

≤ |0,5|

≤ 2,00

≤ 0,20

8.  Πυρηνέλαιο

≤ 1,0

≤ 15

C40 + C42 + C44 + C46 > 350

≤ 1,2

≤ |0,5|

≤ 1,70

≤ 0,18

(1)   Άθροισμα των ισομερών που θα μπορούσαν να διαχωριστούν (ή όχι) με τριχοειδή στήλη.

(2)   Το όριο ισχύει για τα ελαιόλαδα που έχουν παραχθεί από την 1η Μαρτίου 2014 και έπειτα.

(3)   Τα έλαια με περιεκτικότητα σε κηρούς μεταξύ 300 και 350 mg/kg θεωρούνται μειονεκτικά ελαιόλαδα, εάν η περιεκτικότητα σε ολικές αλειφατικές αλκοόλες είναι μικρότερη ή ίση με 350 mg/kg ή εάν η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης είναι μικρότερη ή ίση με 3,5 %.

(4)   Η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων μπορεί να είναι μικρότερη ή ίση με 3,5 και η διάμεσος του φρουτώδους να ισούται με 0.

(5)   Τα έλαια με περιεκτικότητα σε κηρούς μεταξύ 300 και 350 mg/kg θεωρούνται ακατέργαστα πυρηνέλαια, εάν η περιεκτικότητα σε ολικές αλειφατικές αλκοόλες υπερβαίνει τα 350 mg/kg και η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης υπερβαίνει το 3,5 %.



Κατηγορία

Σύσταση σε λιπαρά οξέα (1)

Ολικά ισομερή του transελαϊκού οξέος

(%)

Ολικά ισομερή του trans-λινελαϊκού + trans- λινολενικού οξέος

(%)

Σύσταση σε στερόλες

Ολικές στερόλες

(mg/kg)

Ερυθροδιόλη και ουβαόλη

(%) (**)

Μυριστικό

(%)

Λινολενικό

(%)

Αραχιδικό

(%)

Εικοσενικό

(%)

Βεχενικό

(%)

Λιγνοκηρικό

(%)

Χοληστερόλη

(%)

Βρασικαστερόλη

(%)

Καμπεστερόλη (2)

(%)

Στιγμαστερόλη

(%)

Φαινόμενη βσιτοστερόλη (3)

(%) (**)

δ-7 Στιγμαστενόλη (2)

(%)

1.  Εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Καμπ.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2.  Παρθένο ελαιόλαδο

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Καμπ.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3.  Μειονεκτικό ελαιόλαδο (λαμπάντε)

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (4)

4.  Εξευγενισμένο ελαιόλαδο

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Καμπ.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5.  Σύνθετο ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισμένα και παρθένα ελαιόλαδα

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Καμπ.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6.  Ακατέργαστο πυρηνέλαιο

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (5)

7.  Εξευγενισμένο πυρηνέλαιο

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Καμπ.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8.  Πυρηνέλαιο

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Καμπ.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

(1)   Περιεκτικότητα σε άλλα λιπαρά οξέα (%): παλμιτικό: 7,50-20,00· παλμιτελαϊκό: 0,30-3,50· δεκαεπτανικό: ≤ 0,30· δεκαεπτενικό: ≤ 0,30· στεατικό: 0,50-5,00· ελαϊκό: 55,00-83,00· λινελαϊκό: 2,50-21,00.

(2)   Βλέπε προσάρτημα του παρόντος παραρτήματος.

(3)   Φαινόμενη β-σιτοστερόλη: δ-5,23-στιγμασταδιενόλη + κλεροστερόλη + β-σιτοστερόλη + σιτοστανόλη + δ-5-αβεναστερόλη + δ-5,24-στιγμασταδιενόλη.

(4)   Τα έλαια με περιεκτικότητα σε κηρούς μεταξύ 300 και 350 mg/kg θεωρούνται μειονεκτικά ελαιόλαδα, εάν η περιεκτικότητα σε ολικές αλειφατικές αλκοόλες είναι μικρότερη ή ίση με 350 mg/kg ή εάν η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης είναι μικρότερη ή ίση με 3,5 %.

(5)   Τα έλαια με περιεκτικότητα σε κηρούς μεταξύ 300 και 350 mg/kg θεωρούνται ακατέργαστα πυρηνέλαια, εάν η περιεκτικότητα σε ολικές αλειφατικές αλκοόλες υπερβαίνει τα 350 mg/kg ή εάν η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης υπερβαίνει το 3,5 %.

Σημειώσεις:

α) Τα αποτελέσματα των αναλύσεων πρέπει να εκφράζονται με τον αριθμό δεκαδικών ψηφίων που προβλέπεται για κάθε χαρακτηριστικό. Το τελευταίο αριθμητικό ψηφίο πρέπει να αυξάνεται κατά μία μονάδα, εάν το επόμενο ψηφίο είναι μεγαλύτερο από 4.

β) Αρκεί έστω και ένα χαρακτηριστικό να μην ανταποκρίνεται στις αναγραφόμενες τιμές για να καταταχθεί το ελαιόλαδο σε άλλη κατηγορία ή να δηλωθεί ότι δεν είναι καθαρό για τους σκοπούς του παρόντος κανονισμού.

γ) Τα αναφερόμενα στην ποιότητα του ελαιολάδου χαρακτηριστικά που σημειώνονται με αστερίσκο (*) υποδηλώνουν ότι: — προκειμένου για μειονεκτικό ελαιόλαδο, τα δύο σχετικά όρια μπορούν να διαφέρουν συγχρόνως από τις αναγραφόμενες τιμές, — προκειμένου για παρθένο ελαιόλαδο, η διαφορά ενός τουλάχιστον από τα όρια αυτά από τις αναγραφόμενες τιμές συνεπάγεται αλλαγή κατηγορίας, το ελαιόλαδο όμως εξακολουθεί να κατατάσσεται σε μία από τις κατηγορίες παρθένου ελαιολάδου.

δ) Τα χαρακτηριστικά που σημειώνονται με διπλό αστερίσκο (**) υποδηλώνουν ότι, για όλα τα είδη πυρηνελαίων, τα δύο σχετικά όρια μπορούν να διαφέρουν συγχρόνως από τις αναγραφόμενες τιμές.




Προσάρτημα

ΔΕΝΔΡΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΑΠΟΦΑΣΕΩΝ

Δενδροδιάγραμμα αποφάσεων σχετικά με την καμπεστερόλη για παρθένα και εξαιρετικά παρθένα ελαιόλαδα:

image

Οι άλλες παράμετροι συμμορφώνονται με τα όρια του παρόντος κανονισμού.

Δενδροδιάγραμμα αποφάσεων σχετικά με τη δ-7 στιγμαστενόλη για:

 Εξαιρετικά παρθένα και παρθένα ελαιόλαδα

  image

Οι άλλες παράμετροι συμμορφώνονται με τα όρια του παρόντος κανονισμού.

 Πυρηνέλαια (ακατέργαστα και εξευγενισμένα)

  image

▼M26




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ια

ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ Ή ΠΥΡΗΝΕΛΑΙΟΥ ΠΟΥ ΠΑΡΑΔΙΔΟΝΤΑΙ ΣΕ ΑΜΕΣΕΣ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΕΣ

Η παρούσα μέθοδος δειγματοληψίας εφαρμόζεται σε παρτίδες ελαιολάδου ή πυρηνελαίου σε άμεσες συσκευασίες. Ισχύουν διαφορετικές μέθοδοι δειγματοληψίας ανάλογα με το αν η περιεκτικότητα της άμεσης συσκευασίας υπερβαίνει τα 5 λίτρα ή όχι.

Ως «παρτίδα» νοείται ένα σύνολο μονάδων πώλησης που παράγονται, μεταποιούνται και συσκευάζονται σε τέτοιες συνθήκες ώστε το έλαιο που περιέχει καθεμία από αυτές τις μονάδες πώλησης να θεωρείται ομοιογενές ως προς όλα τα αναλυτικά χαρακτηριστικά. Οι παρτίδες πρέπει να ταυτοποιούνται σύμφωνα με την οδηγία 2011/91/ΕΕ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου ( 6 ).

Ως «στοιχειώδες δείγμα» νοείται η ποσότητα ελαίου που περιέχεται σε μια άμεση συσκευασία και λαμβάνεται από τυχαίο σημείο της παρτίδας.

1.   ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΟΥ ΒΑΣΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

1.1.    Άμεση συσκευασία με χωρητικότητα που δεν υπερβαίνει τα 5 λίτρα

Ως «βασικό δείγμα», προκειμένου για άμεση συσκευασία με χωρητικότητα που δεν υπερβαίνει τα 5 λίτρα, νοείται ο αριθμός των στοιχειωδών δειγμάτων που λαμβάνονται από μια παρτίδα και σύμφωνα με τον πίνακα 1.



Πίνακας 1

Το ελάχιστο μέγεθος βασικού δείγματος πρέπει να είναι το εξής

Όταν η χωρητικότητα της άμεσης συσκευασίας είναι

Το βασικό δείγμα πρέπει να είναι το έλαιο που περιέχεται

α)  1 λίτρο ή μεγαλύτερη

α)  σε 1 άμεση συσκευασία

β)  μικρότερη από 1 λίτρο

β)  στον ελάχιστο αριθμό συσκευασιών με συνολική χωρητικότητα τουλάχιστον 1,0 λίτρου

Κάθε κράτος μέλος δύναται να αυξάνει τον αριθμό των συσκευασιών που αναφέρονται στον πίνακα 1 και συνιστούν ένα βασικό δείγμα, ανάλογα με τις ανάγκες του (για παράδειγμα, οργανοληπτική εξέταση από διαφορετικό εργαστήριο από αυτό που διενήργησε τις χημικές αναλύσεις, κατ’ έφεση ανάλυση κ.λπ.).

1.2.    Άμεση συσκευασία με χωρητικότητα που υπερβαίνει τα 5 λίτρα

Ως «βασικό δείγμα», προκειμένου για άμεση συσκευασία με χωρητικότητα που υπερβαίνει τα 5 λίτρα, νοείται ένα αντιπροσωπευτικό μέρος του συνόλου των στοιχειωδών δειγμάτων, λαμβανόμενο με διαδικασία μείωσης και σύμφωνα με τον πίνακα 2. Το βασικό δείγμα πρέπει να αποτελείται από διάφορα αντιπροσωπευτικά δείγματα.

Ως «αντιπροσωπευτικό δείγμα» βασικού δείγματος νοείται καθεμία από τις συσκευασίες που απαρτίζουν το βασικό δείγμα.



Πίνακας 2

Ελάχιστος αριθμός στοιχειωδών δειγμάτων που πρέπει να επιλέγονται

Αριθμός συσκευασιών στην παρτίδα

Ελάχιστος αριθμός στοιχειωδών δειγμάτων που πρέπει να επιλέγονται

Έως 10

1

Από … 11 έως 150

2

Από … 151 έως 500

3

Από … 501 έως 1 500

4

Από … 1 501 έως 2 500

5

> 2 500 ανά 1 000 συσκευασίες

1 επιπλέον στοιχειώδες δείγμα

Προκειμένου να μειωθεί ο όγκος των δειγματιζόμενων άμεσων συσκευασιών, το περιεχόμενο των στοιχειωδών δειγμάτων ομοιογενοποιείται για την παρασκευή του βασικού δείγματος. Τα τμήματα περιεχομένου των διαφορετικών στοιχειωδών δειγμάτων τοποθετούνται σε κοινό δοχείο για ομοιογενοποίηση με ανάδευση, ώστε να προστατεύονται όσο το δυνατόν καλύτερα από τον αέρα.

Το περιεχόμενο του βασικού δείγματος πρέπει να τοποθετείται σε σειρά συσκευασιών με την ελάχιστη χωρητικότητα του 1,0 λίτρου, καθεμία από τις οποίες αποτελεί αντιπροσωπευτικό δείγμα βασικού δείγματος.

Κάθε κράτος μέλος δύναται να αυξάνει τον αριθμό των βασικών δειγμάτων, ανάλογα με τις ανάγκες του (για παράδειγμα, οργανοληπτική εξέταση από διαφορετικό εργαστήριο από αυτό που διενήργησε τις χημικές αναλύσεις, κατ’ έφεση ανάλυση κ.λπ.).

Κάθε συσκευασία πρέπει να πληρούται κατά τρόπο που ελαχιστοποιεί το στρώμα αέρα στο πάνω μέρος της και, στη συνέχεια, να κλείνεται κατάλληλα και να σφραγίζεται ώστε να διασφαλίζεται ο αλύμαντο του προϊόντος.

Αυτά τα αντιπροσωπευτικά δείγματα πρέπει να επισημαίνονται προκειμένου να εξασφαλίζεται η ορθή ταυτοποίησή τους.

2.   ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

2.1. Κάθε βασικό δείγμα πρέπει να χωρίζεται σε εργαστηριακά δείγματα, σύμφωνα με το σημείο 2.5 του προτύπου EN ISO 5555, και να υποβάλλεται σε ανάλυση με τη σειρά που εμφαίνεται στο δενδροδιάγραμμα αποφάσεων του παραρτήματος Ιβ ή με οποιαδήποτε άλλη τυχαία σειρά.

2.2. Εάν όλα τα αποτελέσματα των αναλύσεων συμφωνούν με τα χαρακτηριστικά της δηλωθείσας κατηγορίας ελαίου, ολόκληρη η παρτίδα θεωρείται σύμφωνη.

Εάν έστω και ένα αποτέλεσμα των αναλύσεων δεν συμφωνεί με τα χαρακτηριστικά της δηλωθείσας κατηγορίας ελαίου, ολόκληρη η παρτίδα θεωρείται μη σύμφωνη.

3.   ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑΣ ΤΗΣ ΠΑΡΤΙΔΑΣ

3.1. Προκειμένου να επαληθευθεί η κατηγορία της παρτίδας, η αρμόδια αρχή μπορεί να αυξήσει τον αριθμό των βασικών δειγμάτων που λαμβάνονται από διάφορα σημεία της παρτίδας σύμφωνα με τον επόμενο πίνακα:



Πίνακας 3

Αριθμός βασικών δειγμάτων καθοριζόμενος από το μέγεθος της παρτίδας

Μέγεθος της παρτίδας (λίτρα)

Αριθμός βασικών δειγμάτων

Λιγότερα από 7 500

2

7 500 έως λιγότερα από 25 000

3

25 000 έως λιγότερα από 75 000

4

75 000 έως λιγότερα από 125 000

5

125 000 ή περισσότερα

6 + 1 για κάθε επιπλέον 50 000 λίτρα

Κάθε στοιχειώδες δείγμα που αποτελεί μέρος του βασικού δείγματος πρέπει να λαμβάνεται από μη διακριτή θέση της παρτίδας· είναι απαραίτητο να σημειώνεται η θέση κάθε βασικού δείγματος και να ταυτοποιείται με σαφήνεια.

Κάθε βασικό δείγμα πρέπει να σχηματίζεται σύμφωνα με τις διαδικασίες που αναφέρονται στα σημεία 1.1 και 1.2.

Στη συνέχεια, κάθε βασικό δείγμα υποβάλλεται στις αναλύσεις που αναφέρονται στο άρθρο 2 παράγραφος 1.

3.2. Όταν ένα από τα αποτελέσματα των αναφερόμενων στο άρθρο 2 παράγραφος 1 αναλύσεων ενός τουλάχιστον βασικού δείγματος δεν συμφωνεί με τα χαρακτηριστικά της δηλωθείσας κατηγορίας ελαίου, ολόκληρη η παρτίδα δειγματοληψίας θεωρείται μη σύμφωνη.




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ιβ

ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΑΠΟΦΑΣΕΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΞΑΚΡΙΒΩΣΗ ΤΗΣ ΣΥΜΦΩΝΙΑΣ ΕΝΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΜΕ ΤΗ ΔΗΛΩΘΕΙΣΑ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ

Πίνακας 1

image

Πίνακας 2

image

Πίνακας 3

image




Προσάρτημα 1



Πίνακας αντιστοιχίας μεταξύ των παραρτημάτων του παρόντος κανονισμού και των αναλύσεων που αναφέρονται στο δενδροδιάγραμμα αποφάσεων

—  Οξύτητα

Παράρτημα II

Προσδιορισμός των ελεύθερων λιπαρών οξέων, ψυχρή μέθοδος

—  Αριθμός υπεροξειδίων

Παράρτημα III

Προσδιορισμός του αριθμού υπεροξειδίων

—  Φασματομετρία υπεριώδους

Παράρτημα IX

Φασματοφωτομετρική ανάλυση

—  Οργανοληπτική εξέταση

Παράρτημα XII

Οργανοληπτική εξέταση παρθένου ελαιολάδου

—  Αιθυλεστέρες

Παράρτημα ΧΧ

Μέθοδος προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε κηρούς, καθώς και σε μεθυλεστέρες και αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων, με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης

—  3,5-στιγμασταδιένια

Παράρτημα XVII

Μέθοδος προσδιορισμού των στιγμασταδιενίων στα φυτικά έλαια

▼M28

—  Trans ισομερή των λιπαρών οξέων

Παράρτημα X

Προσδιορισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με αεριοχρωματογραφία

—  Περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα

Παράρτημα X

Προσδιορισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με αεριοχρωματογραφία

▼M26

—  ΔΕCN42

Παράρτημα XVIII

Προσδιορισμός της σύνθεσης σε τριγλυκερίδια με ECN42 (διαφορά μεταξύ των δεδομένων HPLC και της θεωρητικής περιεκτικότητας)

— Σύνθεση σε στερόλες και ολικές στερόλες

— Ερυθροδιόλη και ουβαόλη

Παράρτημα V

Προσδιορισμός της σύστασης και της περιεκτικότητας σε στερόλες και τριτερπενικές διαλκοόλες μέσω αέριας χρωματογραφίας τριχοειδούς στήλης

—  Κηροί

Παράρτημα IV

Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε κηρούς με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης

▼M28

—  Αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες

Παράρτημα XIX

Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης

▼M26

—  Κορεσμένα λιπαρά οξέα στη θέση 2

Παράρτημα VII

Προσδιορισμός της εκατοστιαίας αναλογίας 2-μονοπαλμιτίνης

▼B




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II

▼M21

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ, ΕΝ ΨΥΧΡΩ ΜΕΘΟΔΟΣ

▼B

1.   ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Ο προσδιορισμός ελεύθερων λιπαρών οξέων σε ελαιόλαδα. Η περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα εκφράζεται ως οξύτητα υπολογισθείσα με συμβατικό τρόπο.

1.1.   Αρχή

Διαλύεται το δείγμα σε μείγμα διαλυτών και τα περιεχόμενα ελεύθερα λιπαρά οξέα ογκομετρούνται χρησιμοποιώντας διάλυμα υδροξείδιου του καλίου σε αιθανόλη.

1.2.   Αντιδραστήρια

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναγνωρισμένης αναλυτικής καθαρότητας και το χρησιμοποιούμενο νερό να είναι απεσταγμένο ή ισοδύναμης καθαρότητας.

1.2.1.   Μείγμα διαιθυλαιθέρος αιθανόλης 95 % [με αναλογία 1:1 (V/V)].

Προσοχή:

Ο διαιθυλαιθέρας είναι εξαιρετικά εύφλεκτος και μπορεί να σχηματίσει εκρηκτικά υπεροξείδια. Πρέπει να λαμβάνεται ειδική μέριμνα κατά τη χρήση του.

Εξουδετερώνεται ακριβώς τη στιγμή χρησιμοποίησής του με το διάλυμα υδροξείδιου του καλίου (1.2.2), με την προσθήκη 0,3 ml διαλύματος φαινολοφθαλεϊνης (1.2.3) ανά 100 ml μείγματος.

Σημείωση:

Εάν δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί διαιθυλαιθέρας, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μείγμα διαλυτών που περιέχει αιθανόλη και τολουόλιο. Εάν χρειαστεί, η αιθανόλη μπορεί να αντικατασταθεί από 2-προπανόλη.

1.2.2.

Πρότυπο διάλυμα υδροξειδίου του καλίου σε αιθανόλη, κανονικότητας περίπου 0,1 mol/l ή, εάν χρειαστεί, περίπου 0,5 mol/l.

Η ακριβής συγκέντρωση του αιθανολικού διαλύματος υδροξείδιου του καλίου πρέπει να είναι γνωστή και να έχει ελεγχθεί ακριβώς πριν χρησιμοποιηθεί. Χρησιμοποιείται διάλυμα παρασκευασμένο τουλάχιστον πέντε ημέρες πριν από τη χρήση και αποθηκευμένο σε σκούρα (καστανή) γυάλινη φιάλη με ελαστικό πώμα. Το διάλυμα πρέπει να είναι άχρωμο ή χρώματος αμυδρώς κίτρινου.

Σημείωση:

Ένα σταθερό άχρωμο διάλυμα υδροξείδιου του καλίου μπορεί να παρασκευαστεί ως εξής: Φέρονται σε βρασμό 1 000 ml αιθανόλης με 8 g υδροξείδιου του καλίου και 0,5 g ρινισμάτων αργιλίου και συνεχίζεται επί μία ώρα ο βρασμός με κάθετο ψυκτήρα. Εκτελείται αμέσως διήθηση. Διαλύεται μέσα στο διήθημα η απαιτούμενη ποσότητα υδροξείδιου του καλίου. Αφήνονται επί αρκετές ημέρες και το διαυγές υπερκείμενο υγρό διαχωρίζεται με έκχυση από το ίζημα ανθρακικού καλίου.

Το διάλυμα μπορεί επίσης να παρασκευαστεί χωρίς διήθηση ως εξής: Σε 1 000 ml αιθανόλης προστίθενται 4 ml βουτυλικού αργιλίου και το μείγμα αφήνεται επί αρκετές ημέρες. Το υπερκείμενο υγρό εκχύεται και διαλύεται η απαιτούμενη ποσότητα υδροξείδιου του καλίου. Το διάλυμα είναι έτοιμο προς χρήση.

1.2.3.

Φαινολοφθαλεΐνη, διάλυμα 10 g/l σε αιθανόλη 95-96 (V/V) ή κυανούν της βρωμοφαινόλης (στην περίπτωση λιπών με έντονο χρώμα), διάλυμα 20 g/l σε αιθανόλη 95-96 (V/V).

1.3.   Όργανα

Συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός, περιλαμβάνοντας:

1.3.1.

Αναλυτικό ζυγό.

1.3.2.

Κωνική φιάλη των 250 ml.

1.3.3.

Προχοΐδα των 10 ml, βαθμονομημένη ανά 0,05 ml.

1.4.   Διαδικασία

1.4.1.

Παρασκευή δείγματος προς ανάλυση

Ο προσδιορισμός πραγματοποιείπαι επί του διηθημένου δείγματος, εάν η συνολική περιεκτικότητα σε υγρασία και ξένες προσμείξεις είναι μικρότερη από 1 %, ο προσδιορισμός πραγματοποιείται επί που δείγματος όπως έχει.

1.4.2.

Ποσότης του δείγματος δοκιμής

Η ποσότης του δείγματος δοκιμής είναι ανάλογη με την αναμενόμενη οξύτητα, σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα.



Αναμενόμενος δείκτης οξύτητας

Μάζα δείγματος δοκιμής

Ακρίβεια ζύγισης δείγματος δοκιμής

< 1

20

0,05

1 μέχρι 4

10

0,02

4 μέχρι 15

2,5

0,01

15 μέχρι 75

0,5

0,001

> 75

0,1

0,0002

Το δείγμα δοκιμής ζυγίζεται στην κωνική φιάλη (4.3.2).

1.4.3.

Προσδιορισμός

Το δείγμα δοκιμής (1.4.2) διαλύεται σε 50 ως 150 ml του προηγούμενα εξουδετερωμένου μείγματος διαιθυλαιθέρος και αιθανόλης (1.2.1).

Ογκομετρείται με ταυτόχρονη ανάδευση με το διάλυμα 0,1 mol υδροξείδιου του καλίου (1.2.2) (βλέπε σημείωση 2) έως ότου αλλάξει χρώμα ο δείκτης (το ρόδινο χρώμα της φαινολοφθαλεΐνης επικρατεί επί τουλάχιστον 10 δευτερόλεπτα).

Σημειώσεις:

1. Το τιτλοδοτημένο αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου (1.2.2) δύναται να αντικατασταθεί από ένα υδατικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου ή του νατρίου, εφόσον ο όγκος του εισαχθέντος ύδατος δεν επιφέρει διαχωρισμό των φάσεων.

2. Εάν η απαραίτητη ποσότητα διαλύματος του υδροξειδίου του καλίου 0,1 mol/l υπερβαίνει τα 10 ml, χρησιμοποιείται ένα διάλυμα 0,5 mol/l.

3. Εάν το διάλυμα θολώνει κατά την ογκομέτρηση, προστίθεται μια ικανοποιητική ποσότητα μείγματος διαλυτών προκειμένου να επιτευχθεί ένα διαυγές διάλυμα.

1.5.   Έκφραση της οξύτητας επί τοις % συγκέντρωσης ελαϊκού οξέος

Η οξύτητα, εκφρασμένη σε κατά βάρος εκατοστιαία αναλογία, ισούται με:

image

όπου:

V είναι ο όγκος σε χιλιοστόλιτρα, του τιτλοδοτημένου διαλύματος υδροξειδίου του καλίου που έχει χρησιμοποιηθεί,

c είναι η ακριβής συγκέντρωση, σε moles ανά λίτρο, του τιτλοδοτημένου διαλύματος υδροξειδίου του καλίου που έχει χρησιμοποιηθεί,

M είναι το γραμμομοριακό βάρος, σε γραμμάρια ανά mole, του οξέος που χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση του αποτελέσματος (= 282),

m είναι το βάρος, σε γραμμάρια, του δείγματος δοκιμής.

Ως αποτέλεσμα λαμβάνεται ο αριθμητικός μέσος όρος ►M6  δύο προσδιορισμών ◄ .




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΩΝ

1.   ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Η προδιαγραφή αυτη περιγράφει μια μέθοδο προσδιορισμού του αριθμού των υπεροξειδίων ελαίων και λιπών.

2.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

►C1  Η μέθοδος ◄ αυτή είναι εφαρμόσιμη σε ζωικά και φυτικά έλαια και λίπη.

3.   ΟΡΙΣΜΟΣ

Ο αριθμός υπεροξειδίων εκφράζει την ποσότητα αυτών των συστατικών του δείγματος (εκφρασμένη σε χιλιοστοϊσοδύναμα ενεργού οξυγόνου ανά kg) που οξειδώνουν το ιωδιούχο κάλιο κάτω από τις περιγραφόμενες συνθήκες αναλύσεις.

4.   ΑΡΧΗ

Το ληφθέν δείγμα διαλύεται σε μείγμα οξεικού οξέος και χλωροφόρμιου και προστίθεται διάλυμα ιωδιούχου καλίου. Ογκομέτρηση του απελευθερούμενου ιωδίου με πρότυπο διάλυμα θειοθειικού νατρίου.

5.   ΟΡΓΑΝΑ

Όλος ο χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός πρέπει να είναι απαλλαγμένος αναγωγικών ή οξειδωτικών ουσιών.

Σημείωση:

Να μην λιπαίνονται οι εσμυρισμένες επιφάνειες.

5.1.

Γυάλινο κουτάλι των 3 ml.

5.2.

Εσμυρισμένες φιάλες με πώματα, χωρητικότητας περίπου 250 ml, οι οποίες προηγουμένως έχουν ξηρανθεί και στις οποίες έχει διαβιβάσθει αδρανές αέριο (άζωτο ή, προτιμότερα, διοξείδιο του άνθρακα).

5.3.

Προχοΐδα των 25 ή 50 ml, βαθμολογημένη ανά 0,1 ml.

6.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

6.1.

Χλωροφόρμιο, αναλυτικής καθαρότητος, απαλλαγμένο οξυγόνου με διοχέτευση υπό πίεση, μέσα από αυτό, ρεύματος καθαρού, ξηρού αδρανούς αερίου.

6.2.

Κρυσταλλικό οξεικό οξύ, αναλυτικής καθαρότητος, απαλλαγμένο οξυγόνου με διοχέτευση, υπό πίεση, μέσα από αυτό, καθαρού, ξηρού αερίου.

6.3.

Κεκορεσμένο υδατικό διάλυμα ΚΙ προσφάτως παρασκευασθέν, απαλλαγμένο από ιώδιο και ιωδικά.

6.4.

Πρότυπο διάλυμα ►C1  θειθειικού ◄ νατρίου 0,01 ή 0,002 N, τιτλοδοτημένο μόλις πριν χρησιμοποιηθεί.

6.5.

Υδατικό διάλυμα αμύλου 10 g/l, πρόσφατα παρασκευασμένο από φυσικό διαλυτό άμυλο.

7.   ΔΕΙΓΜΑ

Να ληφθεί μέριμνα για την παραλαβή και διατήρηση του δείγματος μακριά από φώς, θερμότητα και σε εντελώς γεμάτα γυάλινα δοχεία, ερμητικά σφραγισμένα με πώματα, από αδιαφανές γυαλί ή φελλό.

8.   ΠΟΡΕΙΑ ΑΝΑΛΥΣΕΩΣ

Η ανάλυση πρέπει να γίνεται με διάχυτο φυσικό ή με τεχνητό φωτισμό. Ζυγίζεται σε γυάλινο κουτάλι (5.1) ή εάν αυτό δεν υπάρχει, σε φιάλη (5.2) με ακρίβεια 0,001 g, ποσότης του δείγματος σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα, ανάλογα με τον αναμενόμενο αριθμό υπεροξειδίων.



Αναμενόμενος αριθμός υπεροξειδίων

(mEq)

Βάρος δείγματος σε gr

(g)

0-12

5,0-2,0

12-20

2,0-1,2

20-30

1,2-0,8

30-50

0,8-0,5

50-90

0,5-0,3

Αποπωματίζεται μία φιάλη (5.2) και εισάγεται το γυάλινο κουτάλι που περιέχει τη ζυγισθείσα ποσότητα του δείγματος. Προστίθενται 10 ml χλωροφόρμιου (6.1). Διαλύεται το δείγμα γρήγορα με ανάδευση. Προστίθενται 15 ml οξικού οξέος (6.2), κατόπιν 1 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (6.3). Πωματίζεται γρήγορα, γίνεται ανάδευση επί ένα λεπτό, και αφήνεται για 5 λεπτά ακριβώς, μακριά από το φώς σε θερμοκρασία 15 έως 25 °C.

Προστίθενται περίπου 75 ml απεσταγμένου νερού. Το απελευθερούμενο ιώδιο ογκομετρείται με το διάλυμα του θειοθειικού νατρίου (6.4) (διάλυμα 0,002 N για αναμενόμενες τιμές μικρότερες από 12, και διάλυμα 0,01 N για αναμενόμενες τιμές πάνω από 12) με ζωηρή ανάδευση, χρησιμοποιώντας διάλυμα αμύλου (6.5) σαν δείκτη.

Εκτελούνται δύο ποσδιορισμοί στο ίδιο δοκιμαστικό δείγμα.

Εκτελείται ταυτόχρονα λευκός προσδιορισμός (τυφλός). Εάν το αποτέλεσμα του τυφλού ξεπερνά τα 0,05 ml διαλύματος 0,01 N θειοθειικού νατρίου (6.4), αντικαθίστανται τα αντιδραστήρια.

9.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Ο αριθμός υπεροξειδίων (AY), εκπεφρασμένος σε χιλιοστοϊσοδύναμα ενεργού οξυγόνου ανά kg, δίνεται από τη σχέση:

image



όπου

V  είναι ο αριθμός των ml του προτύπου διαλύματος θειοθειικού νατρίου (6.4) χρησιμοποιούμενου για την ογκομέτρηση, μετά την αφαίρεση του λευκού,

T  είναι η ακριβής κανονικότητα του διαλύματος θειοθειικού νατρίου (6.4) που χρησιμοποιείται,

m  είναι το βάρος του δείγματος σε g.

Σαν αποτέλεσμα λαμβάνεται ο αριθμητικός μέσος των δύο εκτελεσθέντων προσδιορισμών.

▼M21




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΚΗΡΟΥΣ ΜΕ ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΤΡΙΧΟΕΙΔΟΥΣ ΣΤΗΛΗΣ

1.   ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Στην παρούσα μέθοδο περιγράφεται διαδικασία προσδιορισμού της περιεκτικότητας των ελαιολάδων σε κηρούς. Οι κηροί διαχωρίζονται ανάλογα με τον αριθμό των ατόμων άνθρακα. Η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί κυρίως για τη διάκριση μεταξύ του ελαιολάδου που λαμβάνεται με έκθλιψη και εκείνου που λαμβάνεται με εκχύλιση (πυρηνέλαιο).

2.   ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Προστίθεται στη λιπαρή ουσία κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο και ακολουθεί διαχωρισμός με χρωματογραφία σε στήλη ένυδρου διοξειδίου του πυριτίου (silica gel). Παραλαμβάνεται το πρώτο κλάσμα που εκλούεται στις συνθήκες της δοκιμής (με πολικότητα μικρότερη εκείνης των τριγλυκεριδίων) και υποβάλλεται σε άμεση ανάλυση με αέρια χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

3.   ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

3.1.

Κωνική φιάλη (Erlenmeyer) των 25 ml.

3.2.

Γυάλινη στήλη για αέρια χρωματογραφία, εσωτερικής διαμέτρου 15,0 mm και ύψους 30-40 cm, εφοδιασμένη με στρόφιγγα.

3.3.

Αεριοχρωματογράφος δυνάμενος να λειτουργεί με τριχοειδή στήλη, εφοδιασμένος με σύστημα απευθείας εισαγωγής του δείγματος στη στήλη και αποτελούμενος από:

3.3.1.

Θερμοστατούμενο θάλαμο στηλών, εξοπλισμένο με προγραμματιστή θερμοκρασίας.

3.3.2.

Σύστημα έγχυσης εν ψυχρώ για απευθείας εισαγωγή στη στήλη.

3.3.3.

Ανιχνευτή ιονισμού φλόγας και μετατροπέα-ενισχυτή.

3.3.4.

Καταγραφέα-ολοκληρωτή δυνάμενο να λειτουργεί με τον μετατροπέα-ενισχυτή (3.3.3), με χρόνο απόκρισης που δεν υπερβαίνει το 1 δευτερόλεπτο και με μεταβλητή ταχύτητα χαρτιού. (Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν πληροφορικά συστήματα, στα οποία τα αεριοχρωματογραφικά δεδομένα λαμβάνονται με τη βοήθεια υπολογιστή.)

3.3.5.

Τριχοειδή στήλη από γυαλί ή τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους 8 έως 12 m, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επικαλυμμένη εσωτερικά με υγρή φάση, ομοιόμορφου πάχους 0,10 έως 0,30 μm (Κατάλληλη υγρή φάση του εμπορίου, τύπου SE 52 ή SE 54.)

3.4.

Μικροσύριγγα των 10 μl για την απευθείας εισαγωγή στη στήλη, με συγκολλημένη στο σώμα της βελόνα.

3.5.

Ηλεκτρικός δονητής.

3.6.

Περιστροφικός εξατμιστήρας.

3.7.

Ηλεκτρικός κλίβανος.

3.8.

Αναλυτικός ζυγός με ακρίβεια ζύγισης ± 0,1 mg.

3.9.

Συνήθη εργαστηριακά γυάλινα σκεύη.

4.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

4.1.

Διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) κοκκομετρικού βαθμού 60 έως 200 μm

H silica gel πρέπει να τοποθετείται στον κλίβανο σε θερμοκρασία 500 °C επί 4 ώρες τουλάχιστον. Αφού ψυχθεί, προστίθεται νερό σε αναλογία 2 % της ληφθείσας ποσότητας silica gel. Το μείγμα αναδεύεται κατάλληλα, ώστε να ομοιογενοποιηθεί και φυλάσσεται στο σκοτάδι επί 12 τουλάχιστον ώρες πριν χρησιμοποιηθεί.

4.2.

n-εξάνιο για χρωματογραφία.

4.3.

Αιθυλαιθέρας για χρωματογραφία.

4.4.

n-επτάνιο για χρωματογραφία.

4.5.

Πρότυπο διάλυμα λαυρικού αραχιδεστέρα 0,1 % (m/V) σε εξάνιο (εσωτερικό πρότυπο) (Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί παλμιτικός παλμιτεστέρας ή μυριστικός στεατεστέρας.)

4.5.1.

Χρωστική Soudan 1 (1-φαινυλ-αζω-2-ναφθόλη)

4.6.

Φέρον αέριο: καθαρό υδρογόνο ή ήλιο, για αέρια χρωματογραφία

4.7.

Βοηθητικά αέρια:

 καθαρό υδρογόνο για αέρια χρωματογραφία,

 καθαρός αέρας, για αέρια χρωματογραφία.

5.   ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

5.1.   Ετοιμασία της χρωματογραφικής στήλης

Σχηματίζεται εναιώρημα 15 g silica gel (4.1) σε n-εξάνιο (4.2) και εισάγεται στη στήλη (3.2). Αφήνεται να κατακαθίσει. Η αυτόματη καθίζηση συμπληρώνεται με τη βοήθεια ηλεκτρικού αναδευτήρα (3.5), ώστε η χρωματογραφική στιβάδα να γίνει πιο ομοιογενής. Διηθούνται μέσω της στήλης 30 ml n-εξανίου για να απομακρυνθούν οι ενδεχόμενες ξένες προσμείξεις. Ζυγίζονται με ακρίβεια στον αναλυτικό ζυγό (3.8) 500 mg δείγματος μέσα στη φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1) και προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα εσωτερικού προτύπου (4.5), ανάλογα με την εκτιμώμενη περιεκτικότητα σε κηρούς. Για παράδειγμα, προστίθεται 0,1 mg λαυρικού αραχιδεστέρα στην περίπτωση του ελαιολάδου και 0,25 έως 0,50 mg στην περίπτωση του πυρηνελαίου. Το παρασκευαζόμενο με τον τρόπο αυτό δείγμα φέρεται στη χρωματογραφική στήλη με τη βοήθεια δύο ποσοτήτων n-εξανίου (4.2) των 2 ml.

Αφήνεται ο διαλύτης να εκρεύσει μέχρι ύψους 1 mm πάνω από το προσροφητικό και, κατόπιν, διηθούνται μέσω της στήλης 70 ml n-εξανίου ακόμη, για να απομακρυνθούν τα φυσιολογικώς ενυπάρχοντα n-αλκάνια. Αρχίζει τότε η χρωματογραφική έκλουση με συλλογή 180 ml μείγματος n-εξανίου και αιθυλαιθέρα 99:1, ενώ η ταχύτητα ροής διατηρείται σε 15 σταγόνες περίπου ανά 10 δευτερόλεπτα. Το δείγμα πρέπει να εκλούεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 22 ± 4 °C.

Σημειώσεις:

 Το μείγμα n-εξανίου και αιθυλαιθέρα (99:1) πρέπει να παρασκευάζεται καθημερινά.

 Για τον οπτικό έλεγχο της ορθής έκλουσης των κηρών, είναι δυνατόν να προστεθούν στο διάλυμα του δείγματος 100 μl διαλύματος Soudan 1 % σε μείγμα έκλουσης. Επειδή ο χρόνος κατακράτησης της χρωστικής αυτής έχει τιμή μεταξύ εκείνης των κηρών και των τριγλυκεριδίων, όταν το χρώμα φθάσει στον πυθμένα της χρωματογραφικής στήλης, η έκλουση πρέπει να διακοπεί, καθώς έχουν διέλθει όλοι οι κηροί.

Το λαμβανόμενο με τον τρόπο αυτό κλάσμα ξηραίνεται στον περιστροφικό εξατμιστήρα (3.6) μέχρι να απομακρυνθεί σχεδόν τελείως ο διαλύτης. Τα τελευταία 2 ml διαλύτη απομακρύνονται με τη διαβίβαση ελαφρού ρεύματος αζώτου και, στη συνέχεια, προστίθενται 2-4 ml n-επτανίου.

5.2.   Ανάλυση με αέρια χρωματογραφία

5.2.1.   Προκαταρκτικές εργασίες

Τοποθετείται η στήλη μέσα στον αεριοχρωματογράφο (3.3) με σύνδεση του άκρου εισόδου με το σύστημα απευθείας εισαγωγής (on-column) και του άκρου εξόδου με τον ανιχνευτή. Εκτελούνται οι γενικοί έλεγχοι της συσκευής αέριας χρωματογραφίας (συμπεριφορά των κυκλωμάτων των αερίων, απόδοση του ανιχνευτή και του συστήματος καταγραφής κ.λπ.).

Εάν η στήλη χρησιμοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται η ρύθμιση των συνθηκών της. Διαβιβάζεται ελαφρό ρεύμα αερίου μέσω της στήλης και, στη συνέχεια, τίθεται σε λειτουργία η συσκευή αέριας χρωματογραφίας. Θερμαίνεται σταδιακά μέχρι να επιτευχθεί θερμοκρασία 350 °C εντός 4 ωρών περίπου. Η θερμοκρασία αυτή διατηρείται επί 2 τουλάχιστον ώρες και, κατόπιν, ρυθμίζεται η συσκευή στις συνθήκες λειτουργίας (ρύθμιση της παροχής των αερίων, αφή της φλόγας, σύνδεση με τον ηλεκτρονικό καταγραφέα (3.3.4), ρύθμιση της θερμοκρασίας του θαλάμου στηλών και του ανιχνευτή κ.λπ.) και καταγράφεται το σήμα με ευαισθησία τουλάχιστον διπλάσια της προβλεπόμενης για την εκτέλεση της ανάλυσης. Η βασική γραμμή (baseline) πρέπει να είναι ευθεία, χωρίς κορυφές και απόκλιση.

Ευθύγραμμη αρνητική απόκλιση υποδηλώνει ατελείς συνδέσεις της στήλης, ενώ θετική απόκλιση υποδηλώνει ανεπαρκή ρύθμιση των συνθηκών της στήλης.

5.2.2.   Επιλογή των συνθηκών εργασίας

Κατά κανόνα, πρέπει να τηρούνται οι ακόλουθες συνθήκες εργασίας:

 θερμοκρασία της στήλης:

 



 

20 °C/λεπτό

 

5 °C/λεπτό

 

20 °C/λεπτό

 

Κατά την έναρξη 80 °C

(1′)

240 °C

325 °C

(6′)

340 °C

(10′)

 θερμοκρασία του ανιχνευτή: 350 °C,

 εγχεόμενη ποσότητα υλικού: 1 μl του n-επτανικού διαλύματος (2-4 ml),

 φέρον αέριο: ήλιο ή υδρογόνο με τη βέλτιστη γραμμική ταχύτητα για το επιλεγμένο αέριο (βλέπε προσάρτημα),

 ευαισθησία των οργάνων: κατάλληλη ώστε να πληρούνται οι κατωτέρω όροι.

Οι συνθήκες αυτές μπορούν να τροποποιούνται ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της στήλης και του αεριοχρωματογράφου, ώστε να επιτυγχάνονται διαχωρισμός όλων των κηρών, ικανοποιητική διαχωριστική (διακριτική) ικανότητα για όλες τις κορυφές (βλέπε σχήμα) και χρόνος κατακράτησης 18 ± 3 λεπτών για το εσωτερικό πρότυπο με 32 άτομα άνθρακα (C32). Η αντιπροσωπευτικότερη κορυφή των κηρών πρέπει να ισούται τουλάχιστον με το 60 % της κατώτερης τιμής της κλίμακας.

Οι παράμετροι ολοκλήρωσης των κορυφών πρέπει να καθορίζονται κατά τρόπο ώστε να υπολογίζονται σωστά τα εμβαδά των κορυφών που λαμβάνονται υπόψη.

Σημείωση:Λόγω της υψηλής τελικής θερμοκρασίας, γίνεται δεκτή θετική μετατόπιση, η οποία δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10 % της κατώτερης τιμής της κλίμακας.

5.3.   Εκτέλεση της ανάλυσης

Λαμβάνεται 1 μl διαλύματος με τη μικροσύριγγα των 10 μl και αποσύρεται το έμβολο της σύριγγας, ώστε να αδειάσει η βελόνα. Εισάγεται η βελόνα στο σύστημα έγχυσης και μετά από 1 έως 2 δευτερόλεπτα εγχέεται το διάλυμα γρήγορα. Μετά από 5 δευτερόλεπτα περίπου, η βελόνα εξάγεται αργά.

Καταγράφονται οι ενδείξεις του οργάνου μέχρι την πλήρη έκλουση των κηρών.

Η βασική γραμμή πρέπει πάντοτε να ανταποκρίνεται στους απαιτούμενους όρους.

5.4.   Ταυτοποίηση των κορυφών

Οι διάφορες κορυφές πρέπει να ταυτοποιούνται βάσει των χρόνων κατακράτησης και με σύγκριση με μείγματα κηρών γνωστών χρόνων κατακράτησης, που αναλύθηκαν στις ίδιες συνθήκες.

Το κατωτέρω σχήμα απεικονίζει χρωματογράφημα των κηρών παρθένου ελαιολάδου.

5.5.   Ποσοτικός προσδιορισμός

Με τη βοήθεια του ολοκληρωτή υπολογίζονται τα εμβαδά των κορυφών που αντιστοιχούν στο εσωτερικό πρότυπο και στους αλειφατικούς εστέρες με 40 έως 46 άτομα άνθρακα (C40 έως C46).

Υπολογίζεται η περιεκτικότητα κάθε εστέρα σε κηρούς, σε mg/kg λιπαρής ουσίας, σύμφωνα με τον τύπο:

image

όπου:

Ax

=

το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί σε κάθε εστέρα, σε τετραγωνικά χιλιοστόμετρα,

As

=

το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στο εσωτερικό πρότυπο, σε τετραγωνικά χιλιοστόμετρα,

ms

=

η προστιθέμενη μάζα εσωτερικού προτύπου, σε χιλιοστόγραμμα,

m

=

η μάζα του λαμβανόμενου για τον προσδιορισμό δείγματος, σε γραμμάρια.

6.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Αναφέρεται το άθροισμα των τιμών περιεκτικότητας σε κηρούς C40 έως C46, σε mg/kg λιπαρής ουσίας (ppm).

Σημείωση:Τα συστατικά που πρέπει να προσδιορίζονται ποσοτικά αναφέρονται στις κορυφές που αντιστοιχούν σε εστέρες με άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα μεταξύ C40 και C46, κατά το παράδειγμα του χρωματογραφήματος κηρών ελαιολάδου που εμφαίνεται στο κατωτέρω σχήμα. Σε περίπτωση διπλής εμφάνισης του εστέρα C46, συνιστάται η ταυτοποίησή του με ανάλυση του κλάσματος των κηρών πυρηνελαίου, όπου η κορυφή C46 αναγνωρίζεται εύκολα, καθώς υπερισχύει σαφώς.

Τα αποτελέσματα εκφράζονται με ένα δεκαδικό ψηφίο.

Σχήμα

Χρωματογράφημα κηρών παρθένου ελαιολάδου ( 7 )

image

Υπόμνημα:

I.S.

=

λαυρικός αραχιδεστέρας

1

=

Διτερπενικοί εστέρες

2 + 2′

=

Εστέρες C40

3 + 3′

=

Εστέρες C42

4 + 4′

=

Εστέρες C44

5

=

Εστέρες C46

6

=

Τριτερπενικοί εστέρες στερολών και αλκοόλης.




Προσάρτημα

Προσδιορισμός της γραμμικής ταχύτητας του αερίου

Εγχέονται 1 έως 3 μl μεθανίου (ή προπανίου) στον αεριοχρωματογράφο, ο οποίος έχει προηγουμένως ρυθμιστεί στις κανονικές συνθήκες λειτουργίας. Χρονομετρείται η διαδρομή του αερίου μέσω της στήλης από την έγχυσή του μέχρι την εμφάνιση της κορυφής (tM).

Η γραμμική ταχύτητα, σε cm/s, παρέχεται από τον τύπο L/tM, όπου L το μήκος της στήλης, σε εκατοστόμετρα, και tM ο χρόνος, σε δευτερόλεπτα.

▼M26




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ V

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΣΤΕΡΟΛΕΣ ΚΑΙ ΤΡΙΤΕΡΠΕΝΙΚΕΣ ΔΙΑΛΚΟΟΛΕΣ ΜΕ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΤΡΙΧΟΕΙΔΟΥΣ ΣΤΗΛΗΣ

1.   ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Η μέθοδος περιγράφει τη διαδικασία προσδιορισμού της περιεκτικότητας ελαιολάδων και πυρηνελαίων σε στερόλες και σε τριτερπενικές διαλκοόλες, μεμονωμένες και ολικές.

2.   ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Το έλαιο, στο οποίο έχει προστεθεί α-χολεστανόλη ως εσωτερικό πρότυπο, σαπωνοποιείται με αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου· στη συνέχεια, οι ασαπωνοποίητες ύλες εκχυλίζονται με αιθυλαιθέρα.

Το κλάσμα στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών διαχωρίζεται από τις ασαπωνοποίητες ύλες με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας σε βασική πλάκα πυριτικής πηκτής (silica gel). Τα ανακτώμενα από την πλάκα κλάσματα μετατρέπονται σε τριμεθυλοσιλυλαιθέρες και, στη συνέχεια, υποβάλλονται σε ανάλυση με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

3.   ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

Συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός και, ειδικότερα, τα εξής:

3.1. Σφαιρική φιάλη των 250 ml, εφοδιασμένη με κάθετο ψυκτήρα με εσμυρισμένους κωνικούς συνδέσμους.

3.2. Διαχωριστική χοάνη των 500 ml.

3.3. Σφαιρικές φιάλες των 250 ml.

3.4. Πλήρης εξοπλισμός για ανάλυση με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, με γυάλινες πλάκες διαστάσεων 20 × 20 cm.

3.5. Λυχνία υπεριώδους φωτός, με μήκος κύματος 254 ή 366 nm.

3.6. Μικροσύριγγες των 100 και 500 μl.

3.7. Κυλινδρική διηθητική χοάνη με πορώδες διάφραγμα G3 (πορώδους 15-40 μm), διαμέτρου 2 cm περίπου και ύψους 5 cm, κατάλληλη για διήθηση υπό κενό, και με εσμυρισμένο κωνικό σύνδεσμο (αρσενικό).

3.8. Κωνική φιάλη κενού των 50 ml, με εσμυρισμένο κωνικό σύνδεσμο (θηλυκό), η οποία μπορεί να συνδεθεί με τη διηθητική χοάνη (σημείο 3.7).

3.9. Δοκιμαστικός σωλήνας με κωνικό πυθμένα, των 10 ml, με γυάλινο πώμα ασφαλείας.

3.10. Αεριοχρωματογράφος, κατάλληλος για λειτουργία με τριχοειδή στήλη, εφοδιασμένος με σύστημα έγχυσης με διαμοιρασμό (split injector), αποτελούμενος από:

3.10.1. θερμοστατούμενο θάλαμο για στήλες, που επιτρέπει να διατηρείται η επιθυμητή θερμοκρασία με ακρίβεια ± 1°C·

3.10.2. μονάδα έγχυσης με ρυθμιζόμενη θερμοκρασία, ψεκαστικό στοιχείο από υπερσιλανιωμένο γυαλί και σύστημα διαμοιρασμού·

3.10.3. ανιχνευτή ιονισμού φλόγας (FID)·

3.10.4. σύστημα απόκτησης δεδομένων κατάλληλο για χρήση με τον ανιχνευτή FID (σημείο 3.10.3.), με δυνατότητα μη αυτόματης ολοκλήρωσης.

3.11. Τριχοειδής στήλη από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους 20 έως 30 m, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επιστρωμένη με διφαινύλιο 5% - διμεθυλοπολυσιλοξάνιο 95% (στατική φάση SE-52 ή SE-54 ή ανάλογη), ομοιόμορφου πάχους 0,10 έως 0,30 μm.

3.12. Μικροσύριγγα των 10 μl για αέρια χρωματογραφία, με μη αποσπώμενη βελόνα, κατάλληλη για έγχυση με διαμοιρασμό.

3.13 Ξηραντήρας με χλωριούχο ασβέστιο

4.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

4.1. Υδροξείδιο του καλίου τίτλου τουλάχιστον 85 %.

4.2. Αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου, περίπου 2 N.

Διαλύονται υπό ψύξη 130 g υδροξειδίου του καλίου (σημείο 4.1) σε 200 ml απεσταγμένου νερού και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι το ένα λίτρο με αιθανόλη (σημείο 4.10). Το διάλυμα φυλάσσεται σε καλά πωματισμένες σκοτεινόχρωμες γυάλινες φιάλες, για δύο ημέρες κατά μέγιστο όριο.

4.3. Αιθυλαιθέρας, αναλυτικής καθαρότητας.

4.4. Αιθανολικό διάλυμα υδροξείδιου του καλίου, περίπου 0,2 Ν.

Διαλύονται 13 g υδροξειδίου του καλίου (σημείο 4.1) σε 20 ml απεσταγμένου νερού και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι το ένα λίτρο με αιθανόλη (σημείο 4.10).

4.5. Άνυδρο θειικό νάτριο, αναλυτικής καθαρότητας.

4.6. Γυάλινες πλάκες (20x20 cm), επιστρωμένες με πυριτική πηκτή χωρίς δείκτη φθορισμού, πάχους 0,25 mm (διατίθενται στο εμπόριο έτοιμες για χρήση).

4.7. Τολουόλιο, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.8. Ακετόνη, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.9. n-εξάνιο, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.10. Αιθυλαιθέρας, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.11. Αιθανόλη, αναλυτικής καθαρότητας.

4.12. Οξικός αιθυλεστέρας, αναλυτικής καθαρότητας.

4.13. Διάλυμα αναφοράς για χρωματογραφία λεπτής στιβάδας: χοληστερόλη ή φυτοστερόλη, και διάλυμα ερυθροδιόλης 5 % σε οξικό αιθυλεστέρα (σημείο 4.11).

4.14. Αιθανολικό διάλυμα 2-7-διχλωροφλουορεσκεΐνης 0,2 %. Το διάλυμα καθίσταται ελαφρώς αλκαλικό με την προσθήκη μερικών σταγόνων αλκοολικού διαλύματος υδροξειδίου του καλίου 2 N (σημείο 4.2).

4.15. Άνυδρη πυριδίνη, χρωματογραφικής καθαρότητας (βλ. σημείωση 5).

4.16. Εξαμεθυλοδισιλαζάνιο, αναλυτικής καθαρότητας.

4.17. Τριμεθυλοχλωροσιλάνιο, αναλυτικής καθαρότητας.

4.18. Διαλύματα δείγματος τριμεθυλοσιλυλαιθέρων των στερολών.

Παρασκευάζονται κατά τον χρόνο της χρήσης από στερόλες και ερυθροδιόλη, προερχόμενες από τα έλαια που τις περιέχουν.

4.19. α-χολεστανόλη, καθαρότητας άνω του 99% (η καθαρότητα πρέπει να ελέγχεται με αεριοχρωματογραφική ανάλυση).

4.20. Διάλυμα εσωτερικού προτύπου α-χολεστανόλης 0,2% (m/V) σε οξικό αιθυλεστέρα (σημείο 4.11).

4.21. Διάλυμα φαινολοφθαλεΐνης 10 g/L σε αιθανόλη (σημείο 4.10).

4.22. Φέρον αέριο: υδρογόνο ή ήλιο, αεριοχρωματογραφικής καθαρότητας.

4.23. Βοηθητικά αέρια: υδρογόνο, ήλιο, άζωτο και αέρας, αεριοχρωματογραφικής καθαρότητας.

4.24. Μείγμα n-εξανίου (σημείο 4.9)/αιθυλαιθέρα (σημείο 4.10) 65:35 (V/V).

4.25. Αντιδραστήριο σιλυλίωσης, το οποίο είναι μείγμα πυριδίνης-εξαμεθυλοδισιλαζανίου-τριμεθυλοχλωροσιλανίου 9:3:1 (V/V/V).

5.   ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

5.1.

Παρασκευή των ασαπωνοποίητων υλών.

5.1.1.

Με τη βοήθεια μικροσύριγγας των 500 μl (σημείο 3.6), εισάγεται στη σφαιρική φιάλη των 250 ml (σημείο 3.1) όγκος διαλύματος εσωτερικού προτύπου α-χολεστανόλης (σημείο 4.20) ο οποίος περιέχει ποσότητα χολεστανόλης που αντιστοιχεί σε 10 % περίπου της περιεκτικότητας του δείγματος σε στερόλες. Για παράδειγμα, για 5 g δείγματος ελαιολάδου πρέπει να προστεθούν 500 μl του διαλύματος α-χολεστανόλης (σημείο 4.20), ενώ για 5 g δείγματος πυρηνελαίου πρέπει να προστεθούν 1 500 μl. Το διάλυμα εξατμίζεται σε θερμό υδατόλουτρο, σε ελαφρύ ρεύμα αζώτου, μέχρι ξηρού. Μετά την ψύξη της σφαιρικής φιάλης ζυγίζονται 5±0,01 g ξηρού διηθημένου δείγματος στην ίδια σφαιρική φιάλη.

Σημείωση 1: Στην περίπτωση των ζωικών ή φυτικών λιπών και ελαίων τα οποία περιέχουν σημαντικές ποσότητες χοληστερόλης, μπορεί να εμφανιστεί κορυφή η οποία έχει παρόμοιο χρόνο κατακράτησης με αυτόν της χολεστανόλης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, πρέπει να αναλύεται το στερολικό κλάσμα εις διπλούν, με και χωρίς εσωτερικό πρότυπο.

5.1.2.

Προστίθενται 50 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξείδιου του καλίου 2 Ν (σημείο 4.2) και τεμαχίδια ελαφρόπετρας, συνδέεται ο κάθετος ψυκτήρας και το σύνολο θερμαίνεται, διατηρούμενο σε ήπιο βρασμό, μέχρι να πραγματοποιηθεί η σαπωνοποίηση (το διάλυμα γίνεται διαυγές). Συνεχίζεται η θέρμανση για 20 λεπτά, έπειτα προστίθενται 50 ml απεσταγμένου νερού από το επάνω μέρος του ψυκτήρα, αποσυνδέεται ο ψυκτήρας και ψύχεται η σφαιρική φιάλη μέχρι τους 30 °C περίπου.

5.1.3.

Μεταγγίζεται ποσοτικώς το περιεχόμενο της σφαιρικής φιάλης σε διαχωριστική χοάνη των 500 ml (σημείο 3.2), με τη βοήθεια διαδοχικών ποσοτήτων απεσταγμένου νερού (50 ml). Προστίθενται περίπου 80 ml αιθυλαιθέρα (σημείο 4.10) και ανακινείται ζωηρά η διαχωριστική χοάνη για περίπου 60 δευτερόλεπτα, ενώ κατά διαστήματα εκτονώνεται η πίεση με αναστροφή της χοάνης και άνοιγμα της στρόφιγγας. Αφήνεται σε ηρεμία μέχρι να ολοκληρωθεί ο διαχωρισμός των δύο φάσεων (σημείωση 2).

Στη συνέχεια, αφαιρείται όσο το δυνατόν πληρέστερα το διάλυμα σάπωνα και φέρεται σε δεύτερη διαχωριστική χοάνη. Εκτελούνται δύο ακόμη εκχυλίσεις της υδατικής-αλκοολικής φάσης, με τον ίδιο τρόπο και με 60 έως 70 ml αιθυλαιθέρα (σημείο 4.10).

Σημείωση 2: Τα πιθανά γαλακτώματα μπορούν να καταστραφούν με την προσθήκη μικρών ποσοτήτων αιθανόλης (σημείο 4.11).

5.1.4.

Ενώνονται τα τρία αιθερικά εκχυλίσματα σε μία διαχωριστική χοάνη η οποία περιέχει 50 ml νερού. Συνεχίζεται η έκπλυση με νερό (50 ml) μέχρις ότου το νερό έκπλυσης δεν χρωματίζεται πλέον ρόδινο με την προσθήκη μιας σταγόνας διαλύματος φαινολοφθαλεΐνης (σημείο 4.21).

Μετά την απομάκρυνση του νερού έκπλυσης, ακολουθεί διήθηση σε άνυδρο θειικό νάτριο (σημείο 4.5) σε προζυγισμένη σφαιρική φιάλη των 250 ml, ενώ η χοάνη και ο ηθμός εκπλύνονται με μικρές ποσότητες αιθυλαιθέρα (σημείο 4.10).

5.1.5.

Εξατμίζεται ο διαλύτης με απόσταξη σε περιστροφικό εξατμιστήρα στους 30 °C υπό κενό. Προστίθενται 5 ml ακετόνης και απομακρύνεται πλήρως ο πτητικός διαλύτης με ελαφρύ ρεύμα αέρα. Το υπόλειμμα ξηραίνεται σε κλίβανο στους 103 ± 2 °C επί 15 λεπτά. Ψύχεται σε ξηραντήρες και ζυγίζεται με ακρίβεια 0,1 mg.

5.2.

Διαχωρισμός του κλάσματος στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών (ερυθροδιόλη + ουβαόλη)

5.2.1.

Ετοιμασία των βασικών πλακών χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας. Οι πλάκες πυριτικής πηκτής (σημείο 4.6) βυθίζονται σε βάθος περίπου 4 cm στο αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου 0,2 N (σημείο 4.5) επί 10 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια αφήνονται να στεγνώσουν σε απαγωγό επί δύο ώρες και, τέλος, τοποθετούνται σε κλίβανο στους 100 °C επί μία ώρα.

Απομακρύνονται από τον κλίβανο και φυλάσσονται σε ξηραντήρα με χλωριούχο ασβέστιο (σημείο 3.13) μέχρι να χρησιμοποιηθούν (οι πλάκες που έχουν υποστεί αυτή την κατεργασία πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 15 ημερών).

Σημείωση 3: Η χρήση βασικών πλακών πυριτικής πηκτής για τον διαχωρισμό του στερολικού κλάσματος εξαλείφει την ανάγκη κατεργασίας του ασαπωνοποίητου κλάσματος με αλουμίνα. Με τον τρόπο αυτό, όλες οι ενώσεις όξινου χαρακτήρα (λιπαρά οξέα και άλλες) συγκρατούνται στη γραμμή τοποθέτησης των κηλίδων δείγματος και η ζώνη των αλειφατικών και τριτερπενικών αλκοολών εμφανίζεται σαφώς διαχωρισμένη από τη ζώνη των στερολών.

5.2.2.

Στον θάλαμο ανάπτυξης εισάγεται μείγμα εξανίου-αιθυλαιθέρα (σημείο 4.24) (σημείωση 4) μέχρι ύψους περίπου 1 cm. Ο θάλαμος κλείνεται με κατάλληλο κάλυμμα και αφήνεται σε ηρεμία επί μισή ώρα τουλάχιστον, σε ψυχρό χώρο, ώστε να αποκατασταθεί ισορροπία υγρού-ατμών. Στις εσωτερικές επιφάνειες του θαλάμου είναι δυνατόν να στερεωθούν λωρίδες διηθητικού χαρτιού που βυθίζονται στο υγρό έκλουσης. Με τον τρόπο αυτό μειώνεται κατά το ένα τρίτο περίπου ο χρόνος ανάπτυξης του χρωματογραφήματος και επιτυγχάνεται πιο ομοιόμορφη και ομαλή έκλουση των συστατικών.

Σημείωση 4: Για να επιτυγχάνονται απολύτως αναπαραγώγιμες συνθήκες έκλουσης, πρέπει να χρησιμοποιείται νέο μείγμα ανάπτυξης σε κάθε δοκιμή. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτικός διαλύτης μείγμα n-εξανίου–αιθυλεθέρα 50:50 (V/V).

5.2.3.

Παρασκευάζεται διάλυμα ασαπωνοποίητων υλών (σημείο 5.1.5) 5 % περίπου σε οξικό αιθυλεστέρα (σημείο 4.12). Με μικροσύριγγες των 100 ml τοποθετούνται στο κάτω χείλος (2 cm) της χρωματογραφικής πλάκας (σημείο 5.2.1) 0,3 ml του προαναφερθέντος διαλύματος σε μια λεπτή και ομοιόμορφη γραμμή. Στην ευθεία της γραμμής τοποθέτησης, φέρονται 2 έως 3 μl του διαλύματος αναφοράς του υλικού (σημείο 4.13), για την ταυτοποίηση της ζώνης των στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών μετά την ανάπτυξη.

5.2.4.

Η πλάκα τοποθετείται στον θάλαμο ανάπτυξης, ο οποίος έχει προετοιμαστεί όπως περιγράφεται στο σημείο 5.2.2. Η θερμοκρασία του περιβάλλοντος πρέπει να διατηρείται μεταξύ 15 και 20 °C (σημείωση 5). Ο θάλαμος κλείνεται αμέσως με το κάλυμμα και αφήνεται προς έκλουση μέχρι το μέτωπο του διαλύτη να φθάσει σε ύψος περίπου 1 cm από το πάνω χείλος της πλάκας. Απομακρύνεται η πλάκα από τον θάλαμο ανάπτυξης και ο διαλύτης εξατμίζεται σε ρεύμα θερμού αέρα ή αφήνοντας την πλάκα να στεγνώσει σε απαγωγό.

Σημείωση 5: Τυχόν υψηλότερη θερμοκρασία θα μπορούσε να δυσχεράνει τον διαχωρισμό.

5.2.5.

Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και ομοιόμορφα με το διάλυμα 2,7-διχλωροφλουορεσκεΐνης (σημείο 4.14) και, στη συνέχεια, αφήνεται να στεγνώσει. Όταν η πλάκα παρατηρείται κάτω από υπεριώδες φως, οι ζώνες των στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών μπορούν να αναγνωριστούν από την ευθυγράμμισή τους με τις κηλίδες του διαλύματος αναφοράς (σημείο 4.13). Σημειώνεται με μαύρο μολύβι το περίγραμμα των ζωνών κατά μήκος των άκρων του φθορισμού (βλ. εικόνα πλάκας χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας στο σχήμα 3).

5.2.6.

Αφαιρείται η πυριτική πηκτή από τη σημειωμένη επιφάνεια με απόξεση με τη βοήθεια μεταλλικής σπάτουλας. Το αφαιρούμενο θρυμματισμένο υλικό φέρεται σε διηθητική χοάνη (σημείο 3.7). Προστίθενται 10 ml οξικού αιθυλεστέρα (σημείο 4.12) και το σύνολο αναμιγνύεται προσεκτικά με τη μεταλλική σπάτουλα και διηθείται υπό κενό. Το διήθημα συλλέγεται στην κωνική φιάλη (σημείο 3.8) που είναι συνδεδεμένη με τη διηθητική χοάνη.

Εκπλύνεται το υπόλειμμα στη χοάνη τρεις φορές με αιθυλαιθέρα (σημείο 4.3) (περίπου 10 ml κάθε φορά) και το διήθημα συλλέγεται ομοίως στη φιάλη που είναι συνδεδεμένη με τη διηθητική χοάνη. Εξατμίζεται το διήθημα μέχρι όγκου περίπου 4-5 ml, μεταγγίζεται το υπολειπόμενο διάλυμα μέσα στον προζυγισμένο σωλήνα των 10 ml (σημείο 3.9) και εξατμίζεται μέχρι ξηρού με ήπια θέρμανση σε ελαφρύ ρεύμα αζώτου. Προστίθενται μερικές σταγόνες ακετόνης (σημείο 4.8) και εξατμίζεται εκ νέου μέχρι ξηρού.

Το υπόλειμμα που περιέχει ο δοκιμαστικός σωλήνας αποτελείται από τα κλάσματα των στερολών και των τριτερπενικών διαλκοολών.

5.3.

Παρασκευή των τριμεθυλοσιλυλαιθέρων.

5.3.1.

Στον δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει το κλάσμα στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών προστίθεται το αντιδραστήριο σιλυλίωσης (σημείο 4.25) (σημείωση 6), σε αναλογία 50 μl ανά χιλιοστόγραμμο στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών, αποφεύγοντας κάθε απορρόφηση υγρασίας (σημείωση 7).

Σημείωση 6: Υπάρχουν στο εμπόριο διαλύματα έτοιμα προς χρήση. Διατίθενται στο εμπόριο και άλλα σιλυλιωτικά αντιδραστήρια, όπως π.χ. το δις(τριμεθυλοσιλυλο)τριφθορακεταμίδιο + 1 % τριμεθυλοχλωροσιλάνιο, το οποίο πρέπει να αραιώνεται με ίσο όγκο άνυδρης πυριδίνης.

Η πυριδίνη μπορεί να αντικατασταθεί από την ίδια ποσότητα ακετονιτριλίου.

5.3.2.

Ο δοκιμαστικός σωλήνας πωματίζεται, ανακινείται προσεκτικά (χωρίς αναστροφή) έως την πλήρη διαλυτοποίηση των ενώσεων. Αφήνεται σε ηρεμία για 15 τουλάχιστον λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και κατόπιν φυγοκεντρείται για μερικά λεπτά: το διαυγές διάλυμα είναι έτοιμο για αεριοχρωματογραφική ανάλυση.

Σημείωση 7: Η ενδεχόμενη εμφάνιση ελαφρού γαλακτώδους ιριδισμού είναι φυσιολογική και δεν προκαλεί κανένα πρόβλημα. Ένδειξη παρουσίας υγρασίας ή αλλοίωσης του αντιδραστηρίου αποτελεί ο σχηματισμός λευκών νιφάδων ή η εμφάνιση ρόδινου χρώματος. Στην περίπτωση αυτή, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί (μόνο εάν χρησιμοποιείται μείγμα εξαμεθυλοδισιλαζανίου-τριμεθυλοχλωροσιλανίου).

5.4.

Ανάλυση με αεριοχρωματογραφία.

5.4.1.

Προκαταρκτικές εργασίες, σταθεροποίηση της τριχοειδούς στήλης.

5.4.1.1. Τοποθετείται η στήλη (σημείο 3.11) στον αεριοχρωματογράφο, συνδέοντας το άκρο εισόδου με το σύστημα έγχυσης με διαμοιρασμό και το άκρο εξόδου με τον ανιχνευτή.

Διενεργούνται οι συνήθεις έλεγχοι της αεριοχρωματογραφικής μονάδας (διαρροές από τα κυκλώματα των αερίων, απόδοση του ανιχνευτή, του συστήματος διαμοιρασμού και του συστήματος καταγραφής κ.λπ.).

5.4.1.2. Εάν η στήλη χρησιμοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται να προηγείται σταθεροποίηση: Διοχετεύεται ελαφρύ ρεύμα αερίου διαμέσου της στήλης, τίθεται σε λειτουργία η αεριοχρωματογραφική μονάδα και αρχίζει βαθμιαία θέρμανση μέχρις ότου η θερμοκρασία υπερβεί κατά τουλάχιστον 20 °C εκείνη της κανονικής λειτουργίας (σημείωση 8). Η θερμοκρασία αυτή διατηρείται για δύο ώρες τουλάχιστον, κατόπιν ολόκληρη η μονάδα τίθεται σε κατάσταση λειτουργίας (ρύθμιση της ροής των αερίων και του διαμοιρασμού, έναυση της φλόγας, σύνδεση με το υπολογιστικό σύστημα, ρύθμιση της θερμοκρασίας της στήλης, του ανιχνευτή και του συστήματος έγχυσης κ.λπ.) και, στη συνέχεια, καταγράφεται το σήμα με ευαισθησία τουλάχιστον διπλάσια της σκοπούμενης για την ανάλυση. Η γραμμή βάσης πρέπει να είναι ευθεία, χωρίς κανενός είδους κορυφή, και να μην παρουσιάζει ολίσθηση.

Τυχόν αρνητική ευθύγραμμη ολίσθηση υποδηλώνει ατελή στεγανότητα των συνδέσεων της στήλης, ενώ η θετική ολίσθηση υποδηλώνει ανεπαρκή σταθεροποίηση της στήλης.

Σημείωση 8: Η θερμοκρασία σταθεροποίησης πρέπει να είναι πάντοτε χαμηλότερη κατά 20 °C τουλάχιστον από τη μέγιστη θερμοκρασία που προβλέπεται στις προδιαγραφές της χρησιμοποιούμενης στατικής φάσης.

5.4.2.

Επιλογή συνθηκών λειτουργίας

5.4.2.1. Οι συνθήκες λειτουργίας είναι οι ακόλουθες:

 θερμοκρασία της στήλης: 260 ± 5 °C·

 θερμοκρασία του συστήματος έγχυσης: 280-300 °C·

 θερμοκρασία του ανιχνευτή: 280-300 °C·

 γραμμική ταχύτητα του φέροντος αερίου: ήλιο 20 έως 35 cm/s, υδρογόνο 30 έως 50 cm/s·

 αναλογία διαμοιρασμού: από 1:50 έως 1:100·

 ευαισθησία του οργάνου: τετραπλάσια έως 16πλάσια της ελάχιστης εξασθένησης·

 ευαισθησία καταγραφής: 1 έως 2 mV στην πλήρη κλίμακα,

 ποσότητα εγχεόμενης ουσίας: 0,5 έως 1 μl διαλύματος τριμεθυλοσιλυλαιθέρων (TMSE).

Οι συνθήκες αυτές μπορούν να μεταβάλλονται ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της στήλης και του αεριοχρωματογράφου, ώστε να λαμβάνονται χρωματογραφήματα που να πληρούν τις ακόλουθες απαιτήσεις:

 ο χρόνος κατακράτησης για την κορυφή της β-σιτοστερόλης θα πρέπει να είναι 20 ± 5 min·

 η κορυφή της καμπεστερόλης θα πρέπει να είναι: για το ελαιόλαδο (μέση περιεκτικότητα 3%) 20 ± 5 % της πλήρους κλίμακας, για το σογιέλαιο (μέση περιεκτικότητα 20 %) 80 ± 10 % της πλήρους κλίμακας·

 πρέπει να διαχωρίζονται όλες οι περιεχόμενες στερόλες. Οι κορυφές, εκτός του διαχωρισμού τους, πρέπει να είναι και τελείως διακριτές, δηλαδή το ίχνος κάθε κορυφής θα πρέπει να επιστρέφει στη γραμμή βάσης, πριν αρχίσει να διαγράφεται η επόμενη κορυφή. Η ανεπαρκής διαχωριστική ικανότητα είναι, παρ’ όλα αυτά, ανεκτή, υπό την προϋπόθεση ότι η κορυφή που αντιστοιχεί στον χρόνο κατακράτησης 1,02 (σιτοστανόλη) είναι ποσοτικά μετρήσιμη με τη χρήση της καθέτου.

5.4.3.

Εκτέλεση της ανάλυσης

5.4.3.1. Με τη μικροσύριγγα των 10 μl λαμβάνεται 1 μl εξανίου, αναρροφώνται 0,5 μl αέρα και στη συνέχεια 0,5 έως 1 μl του διαλύματος του δείγματος. Ανυψώνεται λίγο ακόμη το έμβολο της σύριγγας ώστε να κενωθεί η βελόνα. Εισάγεται η βελόνα στη μεμβράνη του συστήματος έγχυσης και μετά από ένα έως δύο δευτερόλεπτα εγχέεται ταχύτατα το περιεχόμενό της. Στη συνέχεια, έπειτα από πέντε δευτερόλεπτα περίπου, η βελόνα αποσύρεται αργά.

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί επίσης αυτόματο σύστημα έγχυσης.

5.4.3.2. Εκτελείται καταγραφή μέχρι πλήρους έκλουσης των TMSE των περιεχόμενων τριτερπενικών διαλκοολών. Η γραμμή βάσης πρέπει να εξακολουθεί να πληροί τις απαιτήσεις (σημείο 5.4.1.2).

5.4.4.

Ταυτοποίηση των κορυφών

Οι κορυφές ταυτοποιούνται βάσει των χρόνων κατακράτησης και μέσω σύγκρισης με το μείγμα TMSE των στερολών και των τριτερπενικών διαλκοολών που έχει υποβληθεί σε ανάλυση υπό τις ίδιες συνθήκες (βλ. προσάρτημα).

Οι στερόλες και οι τριτερπενικές διαλκοόλες εκλούονται με την ακόλουθη σειρά: χοληστερόλη, βρασικαστερόλη, εργοστερόλη, 24-μεθυλενο-χοληστερόλη, καμπεστερόλη, καμπεστανόλη, στιγμαστερόλη, δ-7-καμπεστερόλη, δ-5,23-στιγμασταδιενόλη, κλεροστερόλη, β-σιτοστερόλη, σιτοστανόλη, δ-5-αβεναστερόλη, δ-5,24-στιγμασταδιενόλη, δ-7-στιγμαστενόλη, δ-7-αβεναστερόλη, ερυθροδιόλη και ουβαόλη.

Στον πίνακα 1 αναφέρονται οι χρόνοι κατακράτησης της β-σιτοστερόλης για τις στήλες SE-52 και SE-54.

Στα σχήματα 1 και 2 απεικονίζονται τυπικά χρωματογραφήματα για ορισμένα έλαια.

5.4.5.

Ποσοτική αξιολόγηση.

5.4.5.1. Με τη βοήθεια του υπολογιστικού συστήματος υπολογίζονται τα εμβαδά των κορυφών που αντιστοιχούν στην α-χολεστανόλη και στις στερόλες και τριτερπενικές διαλκοόλες. Δεν λαμβάνονται υπόψη οι κορυφές ενώσεων που δεν περιλαμβάνονται στις ενώσεις του πίνακα 1 (δεν πρέπει υπολογίζεται η εργοστερόλη). Ο συντελεστής απόκρισης για την α-χολεστανόλη θα πρέπει να θεωρείται ότι ισούται με 1.

5.4.5.2. Υπολογίζεται η συγκέντρωση κάθε στερόλης χωριστά, σε mg/100 g λιπαρής ουσίας, ως ακολούθως:

image

όπου:

Ax

=

εμβαδόν της κορυφής της στερόλης x, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος·

As

=

εμβαδόν της κορυφής της α-χολεστανόλης, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος·

ms

=

μάζα της α-χολεστανόλης που προστέθηκε, σε χιλιοστόγραμμα·

m

=

μάζα του δείγματος που ελήφθη για τον προσδιορισμό, σε γραμμάρια.

6.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

6.1. Αναφέρονται οι συγκεντρώσεις των επιμέρους στερολών, σε mg/kg λιπαρής ουσίας, καθώς και το άθροισμά τους ως «ολικές στερόλες».

Η σύνθεση σε επιμέρους στερόλες και σε ερυθροδιόλη και ουβαόλη θα πρέπει να εκφράζεται με ένα δεκαδικό ψηφίο.

Η σύνθεση σε ολικές στερόλες πρέπει να εκφράζεται χωρίς δεκαδικά ψηφία.

▼M28

6.2. Υπολογίζεται η εκατοστιαία αναλογία κάθε στερόλης από τον λόγο του εμβαδού της αντίστοιχης κορυφής προς το άθροισμα των εμβαδών των κορυφών των στερολών:

image

όπου:

Ax

=

εμβαδόν της κορυφής της στερόλης x·

ΣΑ

=

άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυφών.

▼M26

6.3. Φαινόμενη β- σιτοστερόλη: δ-5,23-στιγμασταδιενόλη + χολεστερόλη + β-σιτοστερόλη + σιτοστανόλη + δ-5-αβεναστερόλη + δ-5,24-στιγμασταδιενόλη.

6.4. Υπολογίζεται η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης:

image

όπου

ΣΑ

=

αθροιστικό εμβαδόν των κορυφών των στερολών, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος·

Er

=

εμβαδόν της κορυφής της ερυθροδιόλης, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος·

Uv

=

εμβαδόν της κορυφής της ουβαόλης, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος·




Προσαρτημα

Προσδιορισμός της γραμμικής ταχύτητας του αερίου

Εγχέονται 1 έως 3 μl μεθανίου (ή προπανίου) στον αεριοχρωματογράφο, ο οποίος έχει προηγουμένως ρυθμιστεί στις κανονικές συνθήκες λειτουργίας. Χρονομετράται η διαδρομή του αερίου μέσω της στήλης από την έγχυσή του μέχρι την εμφάνιση της κορυφής (tM).

Η γραμμική ταχύτητα, σε cm/s, παρέχεται από τον τύπο L/tM, όπου L το μήκος της στήλης, σε εκατοστόμετρα, και tM ο μετρούμενος χρόνος, σε δευτερόλεπτα.



Πίνακας 1

Σχετικοί χρόνοι κατακράτησης των στερολών

Κορυφή

Ταυτοποίηση

Σχετικός χρόνος κατακράτησης

Στήλη SE 54

Στήλη SE 52

1

Χοληστερόλη

δ-5-χοληστεν-3β-όλη

0,67

0,63

2

Χολεστανόλη

5α-χολησταν-3β-όλη

0,68

0,64

3

Βρασικαστερόλη

[24S]-24-μεθυλο-δ-5,22-χολησταδιεν-3β-όλη

0,73

0,71

*

Εργοστερόλη

[24S]-24-μεθυλο-Δ-5,7,22-χοληστατριεν-3ß-όλη

0,78

0,76

4

24-μεθυλενο-χοληστερόλη

24-μεθυλενο-Δ-5,24-χολησταδιεν-3ß-όλη

0,82

0,80

5

Καμπεστερόλη

(24R)-24-μεθυλο-Δ-5-χοληστεν-3ß-όλη

0,83

0,81

6

Καμπεστανόλη

(24 R)- 24-μεθυλο-χολησταν-3ß-όλη

0,85

0,82

7

Στιγμαστερόλη

(24S)-24-αιθυλο-Δ-5,22-χολησταδιεν-3ß-όλη

0,88

0,87

8

Δ-7-καμπεστερόλη

(24R)-24-μεθυλο-Δ-7-χοληστεν-3ß-όλη

0,93

0,92

9

Δ-Δ5,23-στιγμασταδιενόλη

(24R,S)-24-αιθυλο-Δ-5,23-χολησταδιεν-3ß-όλη

0,95

0,95

10

Κλεροστερόλη

(24S)-24-αιθυλο-Δ-5,25-χολεσταδιεν-3ß-όλη

0,96

0,96

11

ß-σιτοστερόλη

(24R)-24-αιθυλ-Δ5-χοληστεν-3ß-όλη

1,00

1,00

12

Σιτοστανόλη

24-αιθυλο-χολησταν-3ß-όλη

1,02

1,02

13

Δ-5-αβεναστερόλη

(24Z)-24-αιθυλιδενο-Δ-5-χοληστεν-3ß-όλη

1,03

1,03

14

Δ-5,24-στιγμασταδιενόλη

(24R,S)-24-αιθυλο-Δ-5,24-χολησταδιεν-3ß-όλη

1,08

1,08

15

Δ-7-στιγμαστενόλη

(24R,S)-24-αιθυλο-Δ-7-χοληστεν-3ß-όλη

1,12

1,12

16

Δ-7-αβεναστερόλη

(24Z)-24-αιθυλιδενο-Δ-7-χοληστεν-3ß-όλη

1,16

1,16

17

Ερυθροδιόλη

5α-ελαιαν-12-εν-3ß,28-διόλη

1,41

1,41

18

Ουβαόλη

Δ-12-ουρσεν-3ß,28-διόλη

1,52

1,52

Σχήμα 1

Αεριοχρωματογράφημα του κλάσματος στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών ελαιολάδου λαμπάντε (δείγμα εμβολιασμένο με εσωτερικό πρότυπο)

image

Σχήμα 2

Αεριοχρωματογράφημα του κλάσματος στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών εξευγενισμένου ελαιολάδου (δείγμα εμβολιασμένο με εσωτερικό πρότυπο)

image

Σχήμα 3

Πλάκα χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας ελαιολάδου-πυρηνελαίου με τη ζώνη που πρέπει να αποξεστεί για τον προσδιορισμό των στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών

image

1 – Σκουαλένιο

2 – Τριτερπενικές και αλειφατικές αλκοόλες

3 – Στερόλες και τριτερπενικές διαλκοόλες

4 – Εκκίνηση και ελεύθερα λιπαρά οξέα

▼M26 —————

▼M21




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VII

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΚΑΤΟΣΤΙΑΙΑΣ ΑΝΑΛΟΓΙΑΣ 2-ΜΟΝΟΠΑΛΜΙΤΙΝΗΣ

1.   ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Στην παρούσα μέθοδο περιγράφεται η αναλυτική διαδικασία για τον προσδιορισμό της εκατοστιαίας αναλογίας παλμιτικού οξέος στη θέση 2 των τριγλυκεριδίων μέσω της εκτίμησης της 2-μονοπαλμιτίνης.

Η παρούσα μέθοδος έχει εφαρμογή στα φυτικά έλαια που είναι υγρά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 °C).

2.   ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Μετά την παρασκευή του, το δείγμα ελαιολάδου υφίσταται την επίδραση παγκρεατικής λιπάσης: λόγω μερικής και εξειδικευμένης υδρόλυσης στις θέσεις 1 και 3 του μορίου του τριγλυκεριδίου, σχηματίζονται μονογλυκερίδια στη θέση 2. Μετά από σιλυλίωση (σιλανοποίηση), προσδιορίζεται η εκατοστιαία αναλογία 2-μονοπαλμιτίνης στο κλάσμα των μονογλυκεριδίων με αέρια χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

3.   ΣΥΝΗΘΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

3.1.

Κωνική φιάλη (Erlenmeyer) των 25 ml

3.2.

Ποτήρια ζέσεως των 100, 250 και 300 ml

3.3.

Γυάλινη χρωματογραφική στήλη, εσωτερικής διαμέτρου 21-23 mm και μήκους 400 mm, εφοδιασμένη με πλάκα από συντετηγμένο γυαλί και στρόφιγγα

3.4.

Ογκομετρικοί κύλινδροι των 10, 50, 100 και 200 ml

3.5.

Σφαιρικές φιάλες των 100 και 250 ml

3.6.

Περιστροφικός εξατμιστήρας

3.7.

Σωλήνες φυγοκέντρου των 10 ml, με κωνικό πυθμένα και εσμυρισμένο πώμα

3.8.

Φυγόκεντρος για σωλήνες των 10 και 100 ml

3.9.

Θερμοστάτης ικανός να διατηρεί τη θερμοκρασία στους 40 ± 0,5 °C

3.10.

Βαθμολογημένα σιφώνια του 1 και των 2 ml

3.11.

Υποδερμική σύριγγα του 1 ml

3.12.

Μικροσύριγγα των 100 μl

3.13.

Διαχωριστική χοάνη των 1 000 ml

3.14.

Αεριοχρωματογράφος για τριχοειδείς στήλες, εφοδιασμένος με σύστημα έγχυσης εν ψυχρώ «on column» για απευθείας εισαγωγή του δείγματος στη στήλη και με κλίβανο ικανό να διατηρεί την επιλεγόμενη θερμοκρασία με ακρίβεια 1 °C

3.15.

Σύστημα έγχυσης εν ψυχρώ «on column» για απευθείας εισαγωγή του δείγματος στη στήλη

3.16.

Ανιχνευτής ιονισμού φλόγας και ηλεκτρόμετρο

3.17.

Καταγραφέας-ολοκληρωτής κατάλληλος για το ηλεκτρόμετρο, με χρόνο απόκρισης που δεν υπερβαίνει το 1 δευτερόλεπτο και με μεταβλητή ταχύτητα χαρτιού

3.18.

Τριχοειδής στήλη από γυαλί ή τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους 8 έως 12 μέτρων, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επικαλυμμένη με μεθυλοπολυσιλοξάνιο ή φαινυλοπολυσιλοξάνιο 5 %, πάχους 0,10 έως 0,30 μm, με δυνατότητα χρήσης στους 370 °C

3.19.

Μικροσύριγγα των 10 μl για την απευθείας εισαγωγή στη στήλη, μήκους τουλάχιστον 7,5 cm, με συγκολλημένη στο σώμα της βελόνα

4.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

4.1.

Διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) κοκκομετρικού βαθμού μεταξύ 0,063 και 0,200 mm (70/280 mesh), που παρασκευάζεται ως εξής: τοποθετείται η silica gel σε κάψα από πορσελάνη, ξηραίνεται στο πυριατήριο στους 160 °C επί 4 ώρες και, κατόπιν, αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μέσα σε ξηραντήρα. Προστίθεται ποσότητα νερού ίση με 5 % του βάρους του silica gel ως εξής: σε φιάλη Erlenmeyer των 500 ml ζυγίζονται 152 g silica gel και προστίθενται 8 g απεσταγμένου νερού. Η φιάλη πωματίζεται και το σύνολο ανακινείται ήπια, ώστε να επιτευχθεί ομοιογενής κατανομή του νερού, και αφήνεται σε ηρεμία τουλάχιστον επί 12 ώρες πριν χρησιμοποιηθεί.

4.2.

n-εξάνιο (χρωματογραφικής καθαρότητας)

4.3.

Ισοπροπανόλη

4.4.

Υδατικό διάλυμα ισοπροπανόλης 1:1 (κ.ό.)

4.5.

Παγκρεατική λιπάση. Η δραστικότητα της χρησιμοποιούμενης λιπάσης πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 2,0 και 10 μονάδων λιπάσης ανά mg. (Στο εμπόριο κυκλοφορούν παγκρεατικές λιπάσες με δραστικότητα 2,0 έως 10 μονάδων ανά mg ενζύμου.)

4.6.

Ρυθμιστικό διάλυμα τρις-υδροξυ-μεθυλαμινομεθανίου: υδατικό διάλυμα 1 Μ, του οποίου το pH ρυθμίζεται στην τιμή 8 (ποτενσιομετρικός έλεγχος) με πυκνό HCI (1:1 κ.ό.)

4.7.

Χολικό νάτριο ενζυματικής καθαρότητας, υδατικό διάλυμα 0,1 % (το διάλυμα αυτό πρέπει να χρησιμοποιείται εντός 15 ημερών από την παρασκευή του)

4.8.

Χλωριούχο ασβέστιο, υδατικό διάλυμα 22 %

4.9.

Διαιθυλαιθέρας για χρωματογραφία

4.10.

Διαλύτης ανάπτυξης: μείγμα η-εξανίου και διαιθυλαιθέρα 87:13 (κ.ό.)

4.11.

Υδροξείδιο του νατρίου, διάλυμα 12 % κ.β.

4.12.

Φαινολοφθαλεΐνη, διάλυμα 1 % σε αιθανόλη

4.13.

Φέρον αέριο: υδρογόνο ή ήλιο για αέρια χρωματογραφία

4.14.

Βοηθητικά αέρια: – υδρογόνο, καθαρότητας τουλάχιστον 99 %, απαλλαγμένο υγρασίας και οργανικών ουσιών – και αέρας της ίδιας καθαρότητας, για αέρια χρωματογραφία

4.15.

Αντιδραστήριο σιλυλίωσης: μείγμα πυριδίνης-εξαμεθυλοδισιλαζανίου-τριμεθυλοχλωροσιλανίου 9:3:1 (κ.ό.) (Στο εμπόριο κυκλοφορούν έτοιμα διαλύματα. Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και άλλα αντιδραστήρια σιλυλίωσης, όπως π.χ. δις-τριμεθυλοσιλυλοτριφθορακεταμίδιο + 1 % τριμεθυλοχλωροσιλάνιο, αραιωμένα με ίσο όγκο άνυδρης πυριδίνης.)

4.16.

Ουσίες αναφοράς: καθαρά μονογλυκερίδια ή μείγματα μονογλυκεριδίων γνωστής εκατοστιαίας σύστασης, ανάλογης με τη σύσταση του δείγματος.

5.   ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

5.1.   Προετοιμασία του δείγματος

5.1.1.

Τα έλαια με περιεκτικότητα σε ελεύθερα οξέα κάτω του 3 % δεν χρειάζεται να εξουδετερώνονται πριν από τη χρωματογραφία σε στήλη silica gel. Τα έλαια των οποίων η περιεκτικότητα σε ελεύθερα οξέα υπερβαίνει το 3 % πρέπει να εξουδετερώνονται σύμφωνα με το σημείο 5.1.1.1.

5.1.1.1.

Στη διαχωριστική χοάνη των 1 000 ml (3.13) φέρονται 50 g ελαίου και 200 ml n-εξανίου. Προστίθενται 100 ml ισοπροπανόλης και ποσότητα διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 12 % (4.11) η οποία αντιστοιχεί στην περιεκτικότητα του ελαίου σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, προσαυξημένη κατά 5 %. Το σύνολο αναδεύεται ζωηρά επί ένα λεπτό, προστίθενται 100 ml απεσταγμένου νερού, αναδεύεται πάλι και αφήνεται σε ηρεμία.

Μετά το διαχωρισμό, απορρίπτεται η κατώτερη στιβάδα που περιέχει τους σάπωνες και απομακρύνονται οι πιθανές ενδιάμεσες στιβάδες (βλέννες και αδιάλυτες ουσίες). Το εξανικό διάλυμα του εξουδετερωμένου ελαίου εκπλύνεται με διαδοχικές δόσεις 50-60 ml διαλύματος ισοπροπανόλης σε νερό 1:1 (κ.ό.) (4.4) μέχρι να εξαφανιστεί το ρόδινο χρώμα της φαινολοφθαλεΐνης.

Απομακρύνεται το μεγαλύτερο μέρος του εξανίου με απόσταξη υπό κενό (χρησιμοποιείται π.χ. περιστροφικός εξατμιστήρας) και το έλαιο μεταγγίζεται σε σφαιρική φιάλη των 100 ml (3.5) και ξηραίνεται υπό κενό μέχρι να απομακρυνθεί τελείως ο διαλύτης.

Μετά το τέλος της εργασίας αυτής, η οξύτητα του ελαίου πρέπει να είναι μικρότερη από 0,5 %.

5.1.2.

Σε φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1) φέρεται 1,0 g του ανωτέρω παρασκευάσματος ελαίου και διαλύεται σε 10 ml μείγματος ανάπτυξης (4.10). Το διάλυμα αφήνεται σε ηρεμία τουλάχιστον επί 15 λεπτά πριν από τη χρωματογραφία σε στήλη silica gel.

Εάν το διάλυμα είναι θολό, φυγοκεντρείται ώστε να εξασφαλιστούν άριστες συνθήκες για τη χρωματογραφία. (Μπορούν να χρησιμοποιηθούν έτοιμες φύσιγγες silica gel SPE των 500 mg).

5.1.3.

Ετοιμασία της χρωματογραφικής στήλης

Προστίθενται στη στήλη (3.3) περίπου 30 ml διαλύτη ανάπτυξης (4.10). Με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου εισάγεται στο κατώτερο τμήμα της ένα τεμάχιο βάμβακα και πιέζεται για να αφαιρεθεί ο αέρας.

Σε ποτήρι ζέσεως παρασκευάζεται εναιώρημα 25 g silica gel (4.1) σε περίπου 80 ml διαλύτη ανάπτυξης και προστίθεται στη στήλη με τη βοήθεια διαχωριστικής χοάνης.

Εξακριβώνεται ότι έχει εισέλθει στη στήλη το σύνολο του silica gel. Μετά από έκπλυση με τον διαλύτη ανάπτυξης (4.10), ανοίγεται η στρόφιγγα της στήλης και το υγρό αφήνεται να εκρεύσει έως ότου η στάθμη του να βρίσκεται περίπου 2 mm πάνω από το silica gel.

5.1.4.

Χρωματογραφία στήλης

Σε φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1), ζυγίζεται ακριβώς 1,0 g δείγματος που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με το σημείο 5.1.

Το δείγμα διαλύεται σε 10 ml διαλύτη ανάπτυξης (4.10). Το διάλυμα προστίθεται στη χρωματογραφική στήλη που έχει ετοιμαστεί σύμφωνα με το σημείο 5.1.3, ενώ λαμβάνεται μέριμνα ώστε να μην ανακινηθεί η επιφάνεια της στήλης.

Ανοίγεται η στρόφιγγα και το διάλυμα του δείγματος αφήνεται να εκρεύσει έως ότου η στάθμη του εξισωθεί με τη στάθμη του silica gel. Ακολουθεί ανάπτυξη με 150 ml διαλύματος ανάπτυξης. Η ταχύτητα ροής ρυθμίζεται σε 2 ml/min (έτσι ώστε τα 150 ml να εκρεύσουν από τη στήλη εντός 60-70 λεπτών περίπου).

Το έκλουσμα συλλέγεται σε προζυγισμένη σφαιρική φιάλη των 250 ml. Εξατμίζεται ο διαλύτης υπό κενό και απομακρύνονται τα τελευταία ίχνη του με διαβίβαση ρεύματος αζώτου.

Ζυγίζεται η σφαιρική φιάλη και υπολογίζεται το εκχύλισμα που συλλέχθηκε.

[Σε περίπτωση χρήσης έτοιμων φυσίγγων silica gel SPE, ακολουθείται η εξής διαδικασία:

Μετά την ετοιμασία των φυσίγγων με 3 ml n-εξανίου, προστίθεται σε αυτές 1 ml διαλύματος (5.1.2).

Μετά τη διήθηση του διαλύματος, ακολουθεί ανάπτυξη με 4 ml μείγματος η-εξανίου και διαιθυλαιθέρα 9:1 (κ.ό.).

Το έκλουσμα συλλέγεται σε σωλήνα των 10 ml και συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού με διαβίβαση ρεύματος αζώτου.

Το ξηρό υπόλειμμα υφίσταται την επίδραση παγκρεατικής λιπάσης (5.2). Είναι θεμελιώδους σημασίας η εξακρίβωση της σύστασης σε λιπαρά οξέα πριν και μετά τη διέλευση από τη φύσιγγα SPE].

5.2.   Υδρόλυση με παγκρεατική λιπάση

5.2.1.

Στον σωλήνα φυγοκέντρου ζυγίζεται 0,1 g ελαίου που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με το σημείο 5.1. Προστίθενται 2 ml ρυθμιστικού διαλύματος (4.6), 0,5 ml διαλύματος χολικού νατρίου (4.7) και 0,2 ml διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου με καλή ανάδευση μετά από κάθε προσθήκη. Κλείνεται ο σωλήνας με το εσμυρισμένο πώμα και τοποθετείται στον θερμοστάτη στους 40 ± 0,5 °C.

5.2.2.

Προστίθενται 20 mg λιπάσης, το σύνολο αναδεύεται επιμελώς (χωρίς να διαβραχεί το πώμα) και τοποθετείται στον θερμοστάτη επί 2 λεπτά ακριβώς. Στη συνέχεια ο σωλήνας αποσύρεται, ανακινείται ζωηρά επί 1 λεπτό ακριβώς και αφήνεται να ψυχθεί.

5.2.3.

Προστίθεται 1 ml διαιθυλαιθέρα, ο σωλήνας πωματίζεται και το αιθερικό διάλυμα ανακινείται ζωηρά, φυγοκεντρείται και μεταφέρεται με μικροσύριγγα σε καθαρό και στεγνό σωλήνα.

5.3.   Παρασκευή των σιλυλοπαραγώγων και προετοιμασία της αέριας χρωματογραφίας

5.3.1.

Σε σωλήνα με κωνικό πυθμένα των 10 ml φέρονται με μικροσύριγγα 100 μl διαλύματος (5.2.3).

5.3.2.

Απομακρύνεται ο διαλύτης με τη διαβίβαση ελαφρού ρεύματος, αζώτου, προστίθενται 200 μl αντιδραστηρίου σιλυλίωσης (4.15) και ο σωλήνας πωματίζεται και αφήνεται σε ηρεμία επί 20 λεπτά.

5.3.3.

Μετά από 20 λεπτά, προστίθενται 1 έως 5 ml n-εξανίου (ανάλογα με τις συνθήκες χρωματογραφίας): το διάλυμα που προκύπτει είναι έτοιμο για αέρια χρωματογραφία.

5.4.   Αέρια χρωματογραφία

Οι συνθήκες εργασίας είναι οι ακόλουθες:

 θερμοκρασία του συστήματος έγχυσης («on column») μικρότερη από το σημείο ζέσεως του διαλύτη (68 °C),

 θερμοκρασία του ανιχνευτή: 350 °C,

 θερμοκρασία της στήλης: προγραμματισμός της θερμοκρασίας του κλιβάνου: 60 °C επί 1 λεπτό, αύξηση 15 °C ανά λεπτό μέχρι τους 180 °C και έπειτα 5 °C ανά λεπτό μέχρι τους 340 °C, κατόπιν 340 °C επί 13 λεπτά,

 φέρον αέριο: υδρογόνο ή ήλιο, ρυθμισμένο στην κατάλληλη γραμμική ταχύτητα, ώστε να επιτευχθεί η διαχωριστική ικανότητα που αποτυπώνεται στο σχήμα 1. Ο χρόνος κατακράτησης του τριγλυκεριδίου C54 πρέπει να είναι 40 ± 5 λεπτά (βλέπε σχήμα 2). (Οι ανωτέρω συνθήκες εργασίας προτείνονται ενδεικτικά. Κάθε τεχνικός οφείλει να τις βελτιστοποιεί για να επιτύχει την επιθυμητή διαχωριστική ικανότητα. Η κορυφή που αντιστοιχεί στην 2-μονοπαλμιτίνη πρέπει να έχει ελάχιστο ύψος 10 % της κλίμακας του καταγραφέα.),

 εγχεόμενη ποσότητα ουσίας: 0,5-1 μl του n-εξανικού διαλύματος (5 ml) (5.3.3).

5.4.1.   Ταυτοποίηση των κορυφών

Τα επιμέρους μονογλυκερίδια ταυτοποιούνται βάσει των λαμβανόμενων χρόνων κατακράτησης και με σύγκριση με τους χρόνους κατακράτησης προτύπων μειγμάτων μονογλυκεριδίων, που αναλύθηκαν στις ίδιες συνθήκες.

5.4.2.   Ποσοτικός προσδιορισμός

Το εμβαδόν κάθε κορυφής υπολογίζεται με ηλεκτρονικό ολοκληρωτή.

6.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Η εκατοστιαία αναλογία 2-μονοπαλμιτίνης υπολογίζεται από τον λόγο του εμβαδού της αντίστοιχης κορυφής προς το άθροισμα των εμβαδών των κορυφών όλων των μονογλυκεριδίων (βλέπε σχήμα 2), σύμφωνα με τον τύπο:

glyceryl monopalmitate (%):

image

όπου:

Ax

=

το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στη 2-μονοπαλμιτίνη,

ΣΑ

=

το άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυφών που αντιστοιχούν σε μονογλυκερίδια.

Το αποτέλεσμα πρέπει να εκφράζεται με ένα δεκαδικό ψηφίο.

7.   ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ

Στην έκθεση της ανάλυσης θα πρέπει να αναφέρονται τα εξής:

 παραπομπή στη παρούσα μέθοδο,

 κάθε στοιχείο απαραίτητο για την πλήρη ταυτοποίηση του δείγματος,

 το αποτέλεσμα της ανάλυσης,

 κάθε παρέκκλιση από την παρούσα μέθοδο, ανεξαρτήτως του εάν έχει αποφασιστεί από τα ενδιαφερόμενα μέρη ή οφείλεται σε άλλους λόγους,

 στοιχεία ταυτότητας του εργαστηρίου, ημερομηνία της ανάλυσης και υπογραφή των υπευθύνων γι’ αυτή.

Σχήμα 1

Χρωματογράφημα των προϊόντων της αντίδρασης σιλυλίωσης που προέκυψαν από την επίδραση λιπάσης σε εξευγενισμένο ελαιόλαδο, στο οποίο είχε προστεθεί 20 % εστεροποιημένο έλαιο (100 %)

image

Key: «acides gras libres» = free fatty acids; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = refined olive oil + 20 % esterified oil; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitolein; «1-2 mono C18 insat.» = unsaturated 1-2 mono C18

Σχήμα 2

Χρωματογράφημα:

A)

μη εστεροποιημένου ελαιόλαδου, μετά από την επίδραση λιπάσης και από σιλυλίωση· στις συνθήκες αυτές (τριχοειδής στήλη 8-12 m), το κλάσμα των κηρών εκλούεται ταυτόχρονα με το κλάσμα των διγλυκεριδίων ή λίγο αργότερα.

Μετά την επίδραση της λιπάσης, η περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 15 %

image

Υπόμνημα:

1

=

Ελεύθερα λιπαρά οξέα

2

=

Μονογλυκερίδια

3

=

Διγλυκερίδια

4

=

Τριγλυκερίδια

*

=

2-μονοπαλμιτίνη

**

=

Τριγλυκερίδιο C54

Χρωματογράφημα:

B)

εστεροποιημένου ελαίου, μετά από την επίδραση λιπάσης και από σιλυλίωση· στις συνθήκες αυτές (τριχοειδής στήλη 8-12 m), το κλάσμα των κηρών εκλούεται ταυτόχρονα με το κλάσμα των διγλυκεριδίων ή λίγο αργότερα.

Μετά την επίδραση της λιπάσης, η περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 15 %.

image

Υπόμνημα:

1

=

Ελεύθερα λιπαρά οξέα

2

=

Μονογλυκερίδια

3

=

Διγλυκερίδια

4

=

Τριγλυκερίδια

*

=

2-μονοπαλμιτίνη

**

=

Τριγλυκερίδιο C54

8.   ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ

ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ

Στο εμπόριο κυκλοφορούν λιπάσες ικανοποιητικής δραστικότητας. Είναι επίσης δυνατή η εργαστηριακή παρασκευή τους ως εξής:

Ψύχονται 5 kg νωπού παγκρέατος χοίρου στους 0 °C. Το πάγκρεας απαλλάσσεται από το στερεό λίπος και τον συνδετικό ιστό που το περιβάλλουν και αλέθεται σε μικροτεμαχιστή με λεπίδες μέχρι να ληφθεί ρευστός πολτός. Ο πολτός αυτός αναδεύεται επί 4-6 ώρες με 2,5 λίτρα άνυδρης ακετόνης και κατόπιν φυγοκεντρείται. Το υπόλειμμα εκχυλίζεται τρεις φορές ακόμα με τον ίδιο όγκο άνυδρης ακετόνης και, έπειτα, δύο φορές με μείγμα ακετόνης και διαιθυλαιθέρα 1:1 (κ.ό.) και δύο φορές με διαιθυλαιθέρα.

Το υπόλειμμα ξηραίνεται υπό κενό επί 48 ώρες για να ληφθεί σταθερή σκόνη, η οποία διατηρείται για μεγάλο χρονικό διάστημα στο ψυγείο, προφυλαγμένη από την υγρασία.

ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ

Παρασκευάζεται γαλάκτωμα ελαιολάδου ως εξής:

Αναδεύεται σε αναμικτήρα επί 10 λεπτά μείγμα 165 ml διαλύματος αραβικού κόμμεως 100 g/l, 15 g θρυμματισμένου πάγου και 20 ml εξουδετερωμένου ελαιολάδου.

Σε ποτήρι ζέσεως των 50 ml εισάγονται διαδοχικά 10 ml του εν λόγω γαλακτώματος, 0,3 ml διαλύματος χολικού νατρίου 0,2 g/ml και 20 ml απεσταγμένου νερού.

Το ποτήρι τοποθετείται σε θερμοστάτη, ρυθμισμένο στους 37 °C, και εισάγονται τα ηλεκτρόδια του πεχάμετρου και ο ελικοειδής αναδευτήρας.

Προστίθεται στάγδην, με προχοΐδα, διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 0,1 N μέχρι να επιτευχθεί pH 8,3.

Προστίθεται μια ποσότητα αιωρήματος σκόνης λιπάσης σε νερό (0,1 g/ml λιπάσης). Όταν η ένδειξη του πεχάμετρου είναι 8,3, τίθεται σε λειτουργία το χρονόμετρο και προστίθεται στάγδην διάλυμα υδροξειδίου νατρίου με το ρυθμό που απαιτείται για να διατηρηθεί το pH στην τιμή 8,3. Σημειώνεται ανά λεπτό ο όγκος διαλύματος που καταναλώνεται.

Σχεδιάζεται γραφική παράσταση των δεδομένων σε ορθογώνιο σύστημα αξόνων, με τετμημένη τους χρόνους και τεταγμένη τα ml αλκαλικού διαλύματος 0,1 N που καταναλώθηκαν για να διατηρηθεί το pH σταθερό. Πρέπει να προκύπτει γραμμική καμπύλη.

Η δραστικότητα της λιπάσης, μετρούμενη σε μονάδες λιπάσης ανά mg, παρέχεται από τον ακόλουθο τύπο:

image

όπου:

A

=

η δραστικότητα σε μονάδες λιπάσης/mg,

V

=

τα χιλιοστόλιτρα διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 0,1 N που καταναλώνονται ανά λεπτό (υπολογιζόμενα από την καμπύλη),

N

=

η κανονικότητα του διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου,

m

=

η μάζα της ελεγχόμενης λιπάσης, σε mg.

Ως μονάδα λιπάσης ορίζεται η ποσότητα του ενζύμου που ελευθερώνει 10 μικρογραμμοϊσοδύναμα οξέος ανά λεπτό.

▼M20 —————

▼M28




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IX

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ

ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Με τη φασματοφωτομετρική εξέταση υπεριώδους είναι δυνατόν να ληφθούν πληροφορίες σχετικά με την ποιότητα μιας λιπαρής ύλης, την κατάσταση διατήρησής της και τις μεταβολές που προκλήθηκαν με τεχνολογικές διεργασίες. Η απορρόφηση στα μήκη κύματος που καθορίζονται στη μέθοδο οφείλεται στην παρουσία συζυγιακών διενίων και τριενίων που προέρχονται από διαδικασίες οξείδωσης και/ή πρακτικές εξευγενισμού. Η εν λόγω απορρόφηση εκφράζεται ως ειδική απόσβεση

image

(η απόσβεση διαλύματος 1 % της λιπαρής ύλης στον καθοριζόμενο διαλύτη, με κυψελίδα των 10 mm), η οποία δηλώνεται κατά σύμβαση με το σύμβολο Κ (αναφέρεται επίσης ως «συντελεστής απόσβεσης»).

1.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Στο παρόν παράρτημα περιγράφεται η διαδικασία φασματοφωτομετρικής εξέτασης του ελαιολάδου στο υπεριώδες τμήμα του φάσματος.

2.   ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Ένα δείγμα διαλύεται στον απαιτούμενο διαλύτη και, στη συνέχεια, μετράται η απορρόφηση του διαλύματος στα καθορισμένα μήκη κύματος έναντι του καθαρού διαλύτη.

Υπολογίζονται οι ειδικές αποσβέσεις σε μήκη κύματος 232 nm και 268 nm σε ισοοκτάνιο ή 232 nm και 270 nm σε κυκλοεξάνιο, για συγκέντρωση 1 % w/v και με κυψελίδα των 10 mm.

3.   ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

3.1.

Φασματοφωτόμετρο κατάλληλο για μετρήσεις σε μήκη κύματος υπεριώδους (220 nm έως 360 nm), με δυνατότητα ένδειξης ανά νανομετρική μονάδα. Συνιστάται ο τακτικός έλεγχος για την ακρίβεια και την αναπαραγωγιμότητα των κλιμάκων μήκους κύματος και απορρόφησης, καθώς και για παράσιτο φως.

3.1.1.

Κλίμακα μήκους κύματος: Η κλίμακα αυτή είναι δυνατόν να ελεγχθεί με τη χρήση υλικού αναφοράς, το οποίο συνίσταται σε γυάλινο οπτικό φίλτρο που περιέχει οξείδιο του ολμίου ή διάλυμα οξειδίου του ολμίου (σφραγισμένο ή όχι) που έχει διακριτές φασματικές ζώνες απορρόφησης. Τα υλικά αναφοράς είναι σχεδιασμένα για τον έλεγχο και τη βαθμονόμηση των κλιμάκων μήκους κύματος των φασματοφωτομέτρων ορατού και υπεριώδους με μέγιστο ονομαστικό εύρος φασματικής ζώνης 5 nm. Οι μετρήσεις πραγματοποιούνται έναντι αέρα ως τυφλού στην περιοχή μηκών κύματος 640 έως 240 nm, σύμφωνα με τις οδηγίες που επισυνάπτονται στα υλικά αναφοράς. Διορθώνεται η γραμμή βάσης με κενή διαδρομή της δέσμης σε κάθε μεταβολή του πλάτους της σχισμής. Τα μήκη κύματος του προτύπου παρατίθενται στο πιστοποιητικό του υλικού αναφοράς.

3.1.2.

Κλίμακα απορρόφησης: Η κλίμακα αυτή είναι δυνατόν να ελεγχθεί με τη χρήση υλικών αναφοράς που είναι διαθέσιμα στο εμπόριο, τα οποία συνίστανται σε όξινα διαλύματα διχρωμικού καλίου, σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις και σε πιστοποιημένες τιμές απορρόφησης στο λmax (σε τέσσερα διαλύματα διχρωμικού καλίου σε υπερχλωρικό οξύ, τοποθετημένα σε τέσσερις ερμητικά σφραγισμένες κυψελίδες υπεριώδους από χαλαζία, για τη μέτρηση της γραμμικότητας και της φωτομετρικής ακρίβειας στο υπεριώδες τμήμα του φάσματος). Τα διαλύματα διχρωμικού καλίου μετρώνται έναντι τυφλού του χρησιμοποιούμενου οξέος, μετά από διόρθωση της γραμμής βάσεως, σύμφωνα με τις οδηγίες που επισυνάπτονται στο υλικό αναφοράς. Οι τιμές απορρόφησης παρατίθενται στο πιστοποιητικό του υλικού αναφοράς.

Μια άλλη δυνατότητα για να ελεγχθεί η απόκριση του φωτοκυττάρου και του φωτοπολλαπλασιαστή προσφέρει η ακόλουθη διαδικασία: ζυγίζονται 0,2000 g καθαρού χρωμικού καλίου για φασματοφωτομετρία, διαλύονται σε διάλυμα 0,05 N υδροξείδιου του καλίου σε ογκομετρική φιάλη των 1 000  ml και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τη χαραγή. Λαμβάνονται ακριβώς 25 ml από το διάλυμα, μεταφέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τη χαραγή, με τη χρήση ίδιου διαλύματος υδροξειδίου του καλίου.

Μετράται η απόσβεση του διαλύματος που λαμβάνεται κατ' αυτόν τον τρόπο στα 275 nm, με τη χρήση του διαλύματος υδροξειδίου του καλίου ως αναφοράς. Η απόσβεση που με μετρήθηκε με τη χρήση κυψελίδας 1 cm θα πρέπει να είναι 0,200 ± 0,005.

3.2.

Ορθογώνιες κυψελίδες από χαλαζία με καλύμματα, κατάλληλες για μετρήσεις σε μήκη κύματος στην υπεριώδη ακτινοβολία (220 έως 360 nm) οπτικής path-length 10 mm. Όταν πληρούνται με νερό ή άλλον κατάλληλο διαλύτη, οι κυψελίδες δεν πρέπει να εμφανίζουν διαφορά μεταξύ τους μεγαλύτερη από 0,01 μονάδες απόσβεσης.

3.3.

Ογκομετρικές φιάλες μιας χαραγής χωρητικότητας 25 ml, κλάσης A.

3.4.

Αναλυτικός ζυγός με ακρίβεια ενδείξεων 0,0001 g.

4.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, χρησιμοποιούνται μόνον αντιδραστήρια αναγνωρισμένης αναλυτικής καθαρότητας και νερό αποσταγμένο ή απιονισμένο ή ισοδύναμης καθαρότητας.

Διαλύτης: Ισοοκτάνιο (2,2,4 τριμεθυλοπεντάνιο) για τις μετρήσεις στα 232 nm και 268 nm, ή κυκλοεξάνιο για τις μετρήσεις στα 232 nm και 270 nm, με απορρόφηση μικρότερη από 0,12 στα 232 nm και μικρότερη από 0,05 στα 270 nm έναντι αποσταγμένου νερού, μετρούμενη με κυψελίδα των 10 mm.

5.   ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

5.1.

Το δείγμα πρέπει να είναι απόλυτα ομοιογενές και απαλλαγμένο από αιωρούμενες προσμείξεις. Σε αντίθετη περίπτωση, πρέπει να διηθείται με χάρτινο ηθμό σε θερμοκρασία 30 °C περίπου.

5.2.

Σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml ζυγίζονται επακριβώς (με ακρίβεια 1 mg) περίπου 0,25 g του προετοιμασμένου με τον τρόπο αυτό δείγματος, συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τη χαραγή με τον καθορισμένο διαλύτη και το μείγμα ομοιογενοποιείται. Το διάλυμα που προκύπτει πρέπει να είναι τελείως διαυγές. Εάν παρατηρηθεί γαλακτώδης ιριδισμός ή θολερότητα, το διάλυμα διηθείται γρήγορα με χάρτινο ηθμό.

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Γενικά, μάζα 0,25 έως 0,30 g αρκεί για μετρήσεις απορρόφησης των παρθένων και των εξαιρετικά παρθένων ελαιολάδων στα 268 nm και 270 nm. Για μετρήσεις σε μήκος κύματος 232 nm, απαιτούνται συνήθως 0,05 g δείγματος, και για τον λόγο αυτό παρασκευάζονται κατά κανόνα δύο διαφορετικά διαλύματα. Για μετρήσεις απορρόφησης των πυρηνελαίων, των εξευγενισμένων ελαιολάδων και των νοθευμένων ελαιολάδων, απαιτείται συνήθως μικρότερη ποσότητα δείγματος, π.χ. 0,1 g, λόγω της υψηλότερης απορρόφησής τους.

5.3.

Εφόσον χρειάζεται, διορθώνεται η γραμμή βάσεως (220-290 nm) με διαλύτη και στις δύο κυψελίδες από χαλαζία (δείγμα και αναφοράς), κατόπιν πληρούται με το διάλυμα δοκιμής μια κυψελίδα από χαλαζία και μετρώνται οι αποσβέσεις σε 232, 268 και 270 nm έναντι του διαλύτη που χρησιμοποιήθηκε.

Οι καταγραφόμενες τιμές απόσβεσης πρέπει να βρίσκονται εντός του εύρους από 0,1 έως 0,8 ή εντός του εύρους γραμμικότητας του φασματοφωτομέτρου που θα πρέπει να επαληθευθεί. Σε αντίθετη περίπτωση, πρέπει να επαναλαμβάνονται οι μετρήσεις με τη χρήση πυκνότερου ή αραιότερου διαλύματος, αναλόγως.

5.4.

Μετά τη μέτρηση της απορρόφησης σε 268 ή 270 nm και μετράται η απορρόφηση σε λmax, λmax + 4 and λmax – 4. Οι εν λόγω τιμές απορρόφησης χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστεί η μεταβολή της ειδικής απόσβεσης (ΔΚ).

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το λmax θεωρείται ότι είναι 268 nm για το ισοοκτάνιο που χρησιμοποιείται ως διαλύτης και 270 nm για το κυκλοεξάνιο.

6.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

6.1.

Καταγράφονται οι τιμές ειδικής απόσβεσης (συντελεστές απόσβεσης) στα διάφορα μήκη κύματος, οι οποίες υπολογίζονται ως εξής:

image

όπου:

Κλ

=

ειδική απόσβεση σε μήκος κύματος λ,

Ελ

=

μετρούμενη απόσβεση σε μήκος κύματος λ,

c

=

συγκέντρωση του διαλύματος, σε g/100 ml,

S

=

μήκος διαδρομής της κυψελίδας από χαλαζία, σε cm,

εκφραζόμενο με ακρίβεια δύο δεκαδικών ψηφίων.

6.2.

Μεταβλητότητα της ειδικής απόσβεσης (ΔΚ)

Η μεταβλητότητα της απόλυτης τιμής απόσβεσης (ΔΚ) υπολογίζεται με τον τύπο:

image

όπου Km είναι η ειδική απόσβεση σε μήκος κύματος που αντιστοιχεί στη μέγιστη απορρόφηση στα 270 nm και 268 nm, ανάλογα με το χρησιμοποιούμενο διαλυτικό μέσο.

Τα αποτελέσματα εκφράζονται με ακρίβεια δύο δεκαδικών ψηφίων.




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Χ

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΜΕ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ

1.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Το παρόν παράρτημα παρέχει καθοδήγηση για τον χρωματογραφικό προσδιορισμό των ελεύθερων και των δεσμευμένων λιπαρών οξέων σε φυτικά λίπη και έλαια μετά τη μετατροπή τους σε μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων (FAME).

Τα δεσμευμένα λιπαρά οξέα στων τριακυλογλυκερολών (TAG) και, ανάλογα με τη μέθοδο εστεροποίησης, τα ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA), μετατρέπονται σε μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων (FAME), που προσδιορίζονται με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

Η μέθοδος που περιγράφεται στο παρόν παράρτημα επιτρέπει τον προσδιορισμό των FAME από C12 έως C24, περιλαμβανομένων των κορεσμένων, cis- και trans-μονοακόρεστων και cis- και trans-πολυακόρεστων μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων.

2.   ΑΡΧΗ

Η αεριοχρωματογραφία (GC) χρησιμοποιείται για την ποσοτική ανάλυση των FAME (μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων). Οι FAME παρασκευάζονται σύμφωνα με το μέρος Α. Εν συνεχεία, εγχέονται στο σύστημα έγχυσης και εξατμίζονται εντός αυτού. Ο διαχωρισμός των FAME διεξάγεται σε αναλυτικές στήλες συγκεκριμένης πολικότητας και μήκους. Για την ανίχνευση των FAME χρησιμοποιείται ανιχνευτής ιονισμού φλόγας (FID). Οι συνθήκες ανάλυσης παρατίθενται στο μέρος Β.

Ως φέρον αέριο (κινητή φάση) στην αεριοχρωματογραφία των FAME με FID μπορεί να χρησιμοποιείται υδρογόνο ή ήλιο. Το υδρογόνο επιταχύνει τον διαχωρισμό και παρέχει πιο ευδιάκριτες κορυφές. Η στατική φάση είναι μικροσκοπική στιβάδα λεπτού υγρού υμενίου επί αδρανούς στερεάς επιφάνειας που έχει κατασκευαστεί από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου.

Κατά τη διέλευσή τους μέσω της τριχοειδούς στήλης, οι υπό ανάλυση εξατμισθείσες ενώσεις αλληλεπιδρούν με τη στατική φάση που επιστρώνει την εσωτερική επιφάνεια της στήλης. Λόγω της διαφορετικής αλληλεπίδρασης των διαφόρων ενώσεων, εκλούονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Πρόκειται για τον λεγόμενο «χρόνο κατακράτησης» της ένωσης για ένα δεδομένο σύνολο παραμέτρων της ανάλυσης. Η σύγκριση των χρόνων κατακράτησης χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση των διαφόρων ενώσεων.

ΜΕΡΟΣ Α

ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΚΑΙ ΠΥΡΗΝΕΛΑΙΟΥ

1.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Το μέρος αυτό καθορίζει την παρασκευή των μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων. Περιλαμβάνει διαδικασίες για την παρασκευή μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων ελαιολάδου και πυρηνελαίου.

2.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Η παρασκευή των μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων ελαιολάδου και πυρηνελαίων εκτελείται με μετεστεροποίηση σε μεθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου σε θερμοκρασία δωματίου. Η αναγκαιότητα του καθαρισμού του δείγματος πριν από τη μετεστεροποίηση εξαρτάται από την περιεκτικότητα του δείγματος σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και την προς προσδιορισμό αναλυτική παράμετρο, μπορεί δε να επιλεγεί σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα:



Κατηγορία ελαίου

Μέθοδος

Παρθένο ελαιόλαδο με οξύτητα ≤ 2,0 %

1.  Λιπαρά οξέα

2.  Trans-λιπαρά οξέα

3.  ΔΕCN 42 (μετά τον καθαρισμό με πυριτική πηκτή για SPE)

Εξευγενισμένο ελαιόλαδο

Ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισμένα ελαιόλαδα και παρθένα ελαιόλαδα

Εξευγενισμένο πυρηνέλαιο

Πυρηνέλαιο

Παρθένο ελαιόλαδο με οξύτητα > 2,0 %

Ακατέργαστο πυρηνέλαιο

1.  Λιπαρά οξέα (μετά τον καθαρισμό με πυριτική πηκτή για SPE)

2.  Τrans-λιπαρά οξέα (μετά τον καθαρισμό με πυριτική πηκτή για SPE)

3.  ΔΕCN 42 (μετά τον καθαρισμό με πυριτική πηκτή για SPE)

3.   ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ

3.1.    Μετεστεροποίηση σε μεθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου σε θερμοκρασία δωματίου

3.1.1.    Βασική αρχή

Οι μεθυλεστέρες σχηματίζονται με μετεστεροποίηση σε μεθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου ως ενδιάμεση φάση πριν από τη σαπωνοποίηση.

3.1.2.    Αντιδραστήρια

3.1.2.1.

Μεθανόλη με περιεκτικότητα σε νερό όχι άνω του 0,5 % (m/m).

3.1.2.2.

Εξάνιο χρωματογραφικής καθαρότητας.

3.1.2.3.

Επτάνιο χρωματογραφικής καθαρότητας.

3.1.2.4.

Διαιθυλικός αιθέρας (οξείδιο διαιθυλίου), σταθεροποιημένος για ανάλυση.

3.1.2.5.

Ακετόνη, χρωματογραφικής καθαρότητας.

3.1.2.6.

Διαλύτης έκλουσης για τον καθαρισμό του ελαίου με χρωματογραφία στήλης/εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE), μείγμα εξανίου-διαιθυλαιθέρα 87/13 (v/v).

3.1.2.7.

Υδροξείδιο του καλίου, μεθανολικό διάλυμα περίπου 2Μ: διαλύουμε 11,2 g υδροξειδίου του καλίου σε 100 ml μεθανόλης.

3.1.2.8.

Φύσιγγες πυριτικής πηκτής του 1 g (6 ml), για εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE).

3.1.3.    Εξοπλισμός

3.1.3.1.

Δοκιμαστικοί σωλήνες με βιδωτό πώμα (χωρητικότητας 5 ml) εφοδιασμένο με παρέμβυσμα από PTFE.

3.1.3.2.

Βαθμονομημένα ή αυτόματα σιφώνια των 2 και 0,2 ml.

3.1.4.    Καθαρισμός δειγμάτων ελαίου

Εφόσον είναι αναγκαίο, τα δείγματα καθαρίζονται με διοχέτευση του ελαίου από φύσιγγα εκχύλισης στερεάς φάσης από διοξείδιο του πυριτίου. Φύσιγγα διοξειδίου του πυριτίου (3.1.2.8) τοποθετείται σε συσκευή εκλούσεως υπό κενό και πλένεται με 6 ml εξανίου (3.1.2.2). Η πλύση πραγματοποιείται σε ατμοσφαιρική πίεση. Στη συνέχεια, εισάγεται στη στήλη διάλυμα ελαίου (περίπου 0,12 g) σε 0,5 ml εξανίου (3.1.2.2) για εισαγωγή του διαλύματος στο διοξείδιο του πυριτίου και στη συνέχει γίνεται έκλουση με 10 ml εξανίου/διαιθυλαιθέρα (87:13 v/v) (3.1.2.6). Το σύνολο των εκλουσμάτων ομοιογενοποιείται και χωρίζεται σε δύο ίσα μέρη. Το ένα εκ των δύο μερών εξατμίζεται μέχρι ξηράνσεως σε περιστροφικό εξατμιστήρα υπό ελαττωμένη πίεση και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το υπόλειμμα διαλύεται σε 1 ml επτανίου. Το λαμβανόμενο διάλυμα είναι έτοιμο για την ανάλυση των λιπαρών οξέων με αεριοχρωματογράφο. Το δεύτερο μέρος εξατμίζεται και το υπόλειμμα διαλύεται σε 1 ml ακετόνης για ανάλυση των τριγλυκεριδίων, με HPLC εφόσον χρειάζεται.

3.1.5.    Διαδικασία

Σε δοκιμαστικό σωλήνα με βιδωτό πώμα των 5 ml (3.1.3.1), ζυγίζονται περίπου 0,1 g δείγματος ελαίου. Προστίθενται 2 ml (3.1.2.2) επτανίου και αναδεύονται. Προστίθενται 0,2 ml μεθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του καλίου (3.1.2.7), ο σωλήνας πωματίζεται με το εφοδιασμένο με παρέμβυσμα από PTFE πώμα και το όλον αναδεύεται ισχυρά επί 30 δευτερόλεπτα. Ο σωλήνας αφήνεται σε ηρεμία μέχρις ότου το πάνω μέρος του διαλύματος καταστεί διαυγές. Η άνω στιβάδα, η οποία και περιέχει τους μεθυλεστέρες, μεταγγίζεται. Το διάλυμα επτανίου είναι έτοιμο για έγχυση στον αεριοχρωματογράφο. Είναι σκόπιμο να διατηρείται το διάλυμα στο ψυγείο μέχρι την αεριοχρωματογραφική ανάλυση. Δεν συνιστάται η αποθήκευση του διαλύματος για περισσότερες από 12 ώρες.

ΜΕΡΟΣ Β

ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΜΕ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ

1.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Το παρόν μέρος παρέχει γενικές οδηγίες για την εφαρμογή της αεριοχρωματογραφίας τριχοειδούς στήλης για τον προσδιορισμό της ποιοτικής και ποσοτικής σύστασης μείγματος μεθυλεστέρων, οι οποίοι λαμβάνονται από λιπαρά οξέα με τη μέθοδο που καθορίζεται στο μέρος Α.

Το παρόν μέρος δεν έχει εφαρμογή στα πολυμερισμένα λιπαρά οξέα.

2.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

2.1.    Φέρον αέριο

Αδρανές αέριο (ήλιο ή υδρογόνο) που έχει πλήρως ξηρανθεί και περιέχει λιγότερο από 10 mg/kg οξυγόνου.

Σημείωση 1:  Το υδρογόνο μπορεί να διπλασιάσει την ταχύτητα της ανάλυσης, αλλά είναι επικίνδυνο. Υπάρχουν διαθέσιμα συστήματα ασφαλείας.

2.2.    Βοηθητικά αέρια

2.2.1.

Υδρογόνο (καθαρότητας ≥ 99,9 %) απαλλαγμένο από οργανικές προσμείξεις.

2.2.2.

Αέρας ή οξυγόνο απαλλαγμένα από οργανικές προσμείξεις.

2.2.3.

Άζωτο (καθαρότητα > 99 %).

2.3.    Πρότυπο αναφοράς

Μείγμα μεθυλεστέρων καθαρών λιπαρών οξέων ή μεθυλεστέρες λιπών γνωστής σύστασης, κατά προτίμηση ανάλογης με τη σύσταση της προς ανάλυση λιπαρής ύλης. Τα cis και trans ισομερή δεκαοκτενοϊκών, δεκαοκταδιενικών και δεκαοκτατριενικών μεθυλεστέρων είναι χρήσιμα για τον προσδιορισμό των trans ισομερών των ακόρεστων οξέων.

Θα πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια ώστε να παρεμποδιστεί η οξείδωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων.

3.   ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

Οι παρεχόμενες υποδείξεις αφορούν τον συνήθη εργαστηριακό εξοπλισμό αέριας χρωματογραφίας, με χρήση τριχοειδών στηλών και ανιχνευτή ιονισμού φλόγας.

3.1.    Αεριοχρωματογράφος

Ο αεριοχρωματογράφος αποτελείται από τα ακόλουθα στοιχεία:

3.1.1.    Σύστημα έγχυσης

Χρησιμοποιείται σύστημα έγχυσης με τριχοειδείς στήλες, οπότε το σύστημα έγχυσης θα πρέπει να είναι ειδικά σχεδιασμένο για χρήση με στήλες του είδους αυτού. Μπορεί να είναι σύστημα με διαμοιραστή ροής (split) ή σύστημα έγχυσης στη στήλη (on-column) χωρίς διαμοιραστή ροής (splitless).

3.1.2.    Κλίβανος

Ο κλίβανος πρέπει να θερμαίνει την τριχοειδή στήλη σε θερμοκρασία τουλάχιστον 260 °C και να διατηρεί την επιθυμητή θερμοκρασία με ακρίβεια ± 0,1 °C. Η δεύτερη απαίτηση έχει ιδιαίτερη σημασία όταν χρησιμοποιείται στήλη από συντετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου.

Η χρήση προγραμματισμού θερμοκρασίας για τη θέρμανση συνιστάται σε όλες τις περιπτώσεις, αλλά ιδίως προκειμένου για λιπαρά οξέα με λιγότερα από 16 άτομα άνθρακα.

3.1.3.    Τριχοειδής στήλη

3.1.3.1.

Στήλη κατασκευασμένη από υλικό αδρανές σε σχέση με τις προς ανάλυση ουσίες (συνήθως γυαλί ή συντετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου). Η εσωτερική διάμετρος κυμαίνεται μεταξύ 0,20 mm και 0,32 mm. Η εσωτερική επιφάνεια υποβάλλεται σε κατάλληλη κατεργασία (επιφανειακή προετοιμασία, αδρανοποίηση), πριν επιστρωθεί με τη στατική φάση. Μήκος 60 m αρκεί για τα λιπαρά οξέα και τα cis και trans ισομερή των λιπαρών οξέων.

3.1.3.2.

Στατική φάση, κατάλληλες είναι οι στήλες με σταυροδεσμούς πολικού πολυσιλοξανίου (κυανοπροπυλοσιλικόνη).

Σημείωση 2:  Τα πολικά πολυσιλοξάνια υπάρχει κίνδυνος να προκαλέσουν δυσχέρειες στην ταυτοποίηση και τον διαχωρισμό του λινολενικού οξέος και των οξέων C20.

Οι επιστρώσεις πρέπει να είναι λεπτές, δηλαδή πάχους 0,1 έως 0,2 μm.

3.1.3.3.

Συναρμολόγηση και προετοιμασία («κοντισιονάρισμα») της στήλης.

Κατά τη συναρμολόγηση των τριχοειδών στηλών τηρούνται οι συνήθεις προφυλάξεις, δηλαδή διάταξη της στήλης στον κλίβανο (στήριγμα), επιλογή και συναρμολόγηση των συνδέσμων (στεγανότητα), σύνδεση των άκρων της στήλης με το σύστημα έγχυσης και τον ανιχνευτή (μείωση των μη ωφέλιμων χώρων). Η στήλη τοποθετείται κάτω από ρεύμα φέροντος αερίου [παραδείγματος χάρη 0,3 bar (30 kPa), προκειμένου για στήλη μήκους 25 m και εσωτερικής διαμέτρου 0,3 mm].

Το κοντισιονάρισμα της στήλης γίνεται με προγραμματισμό της θερμοκρασίας του κλιβάνου ώστε να ανέρχεται 3 °C/min από τη θερμοκρασία περιβάλλοντος μέχρι μια θερμοκρασία 10 °C χαμηλότερη από το σημείο αντοχής της στατικής φάσης. Η θερμοκρασία του κλιβάνου διατηρείται στη θερμοκρασία αυτή επί μία ώρα, μέχρι να σταθεροποιηθεί η γραμμή βάσεως. Έπειτα επαναφέρεται στους 180 °C για λειτουργία σε ισόθερμες συνθήκες.

Σημείωση 3:  Στο εμπόριο κυκλοφορούν κατάλληλα προετοιμασμένες στήλες.

3.1.4.    Ανιχνευτής ιονισμού φλόγας και μετατροπέας-ενισχυτής

3.2.    Σύριγγα

Η σύριγγα πρέπει να έχει ανώτατη χωρητικότητα 10 μl και να είναι αριθμημένη ανά 0,1 μl.

3.3.    Σύστημα απόκτησης δεδομένων

Σύστημα απόκτησης δεδομένων που συνδέεται επιγραμμικά με τους ανιχνευτές και χρησιμοποιείται με λογισμικό κατάλληλο για ολοκλήρωση και κανονικοποίηση των κορυφών.

4.   ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Οι εργασίες που περιγράφονται στα σημεία 4.1 έως 4.3 αφορούν τη χρήση ανιχνευτή ιονισμού φλόγας.

4.1.    Συνθήκες δοκιμής

4.1.1.    Επιλογή βέλτιστων συνθηκών λειτουργίας για τριχοειδείς στήλες

Λόγω των χαρακτηριστικών αποδοτικότητας και δυνατότητας των τριχοειδών στηλών, ο διαχωρισμός των συστατικών και η διάρκεια της ανάλυσης εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου στη στήλη. Θα χρειαστεί επομένως να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες λειτουργίας με προσαρμογή αυτής της παραμέτρου (ή απλώς με απώλεια πίεσης στην κορυφή της στήλης), ανάλογα με το εάν στόχος είναι η βελτίωση του διαχωρισμού ή η επιτάχυνση της ανάλυσης.

Οι ακόλουθες συνθήκες έχουν αποδειχθεί κατάλληλες για τον διαχωρισμό των FAME (C4 έως C26). Παραδείγματα χρωματογραφημάτων παρουσιάζονται στο προσάρτημα Β:



θερμοκρασία του συστήματος έγχυσης:

250 °C

θερμοκρασία του ανιχνευτή:

250 °C

θερμοκρασία του κλιβάνου:

165 °C (8 min) έως 210 °C σε 2 °C/min

υδρογόνο ως φέρον αέριο:

πίεση στην κορυφή της στήλης: 179 kPa

συνολική ροή:

154,0 ml/min

αναλογία διαμοιρασμού:

1:100

όγκος έγχυσης:

1 μl

4.1.2.    Προσδιορισμός της διακριτικής ικανότητας (βλ. προσάρτημα Α)

Υπολογίζεται η διακριτική ικανότητα, R, δύο γειτονικών κορυφών Ι και ΙΙ, με χρήση του τύπου:

R = 2 × ((dr(II) d r(I))/(ω(I) + ω(II))) ή R = 2 × ((tr ( II )t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (Φαρμακοποιία ΗΠΑ)

ή

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) [JP (Ιαπωνική Φαρμακοποιία), EP (Ευρωπαϊκή Φαρμακοποιία), BP (Βρετανική Φαρμακοποιία)]

όπου:

d r(Ι) είναι η απόσταση κατακράτησης της κορυφής I·

d r(ΙΙ) είναι η απόσταση κατακράτησης της κορυφής ΙΙ·

t r(Ι) είναι o χρόνος κατακράτησης της κορυφής I·

t r(ΙΙ) είναι o χρόνος κατακράτησης της κορυφής ΙΙ·

ω(Ι) είναι το πλάτος της βάσης της κορυφής I·

ω(ΙΙ) είναι το πλάτος της βάσης της κορυφής ΙΙ·

ω0,5 είναι το πλάτος της κορυφής της συγκεκριμένης ένωσης στο μέσον του ύψους της κορυφής.

Εάν ω(Ι) ≈ ω(ΙΙ), η διακριτική ικανότητα R υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους τύπους:

R = (dr ( II )d r(I))/ω = (dr ( II )d r(I))/4σ

όπου:

σ είναι η τυπική απόκλιση (βλέπε προσάρτημα Α, σχήμα 1).

Εάν η απόσταση dr μεταξύ των δύο κορυφών d r(II)d r(I) είναι ίση με 4σ, ο παράγων διακριτικής ικανότητας R = 1.

Εάν δύο κορυφές δεν διαχωρίζονται πλήρως, οι εφαπτόμενες στα σημεία καμπής των δύο κορυφών τέμνονται στο σημείο C. Για να διαχωριστούν πλήρως οι δύο κορυφές, η μεταξύ τους απόσταση πρέπει να είναι ίση με:

d r(II)d r(I) = 6 σ εξού R = 1,5 (βλέπε προσάρτημα Α, σχήμα 3).

5.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

5.1.    Ποιοτική ανάλυση

Οι κορυφές που αντιστοιχούν στους μεθυλεστέρες του δείγματος του χρωματογραφήματος στο προσάρτημα Β σχήμα 1 ταυτοποιούνται, αν είναι απαραίτητο με παρεμβολή ή με σύγκριση με εκείνες των μειγμάτων μεθυλεστέρων αναφοράς (όπως αναφέρεται στο σημείο 2.3).

5.2.    Ποσοτική ανάλυση

5.2.1.    Προσδιορισμός της σύστασης

Υπολογίζεται το κλάσμα της κατά μάζα περιεκτικότητας w i των επιμέρους μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων, εκφραζόμενο ως κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία μεθυλεστέρων, ως εξής:

5.2.2.    Μέθοδος υπολογισμού

5.2.2.1.   Γενική περίπτωση

Η περιεκτικότητα σε δεδομένο συστατικό i, εκφραζόμενη σε κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία μεθυλεστέρων, υπολογίζεται με τον προσδιορισμό του επί τοις εκατό ποσοστού που αντιπροσωπεύει το εμβαδόν της αντίστοιχης κορυφής ως προς το άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυφών, εφαρμόζοντας τον ακόλουθο τύπο:

wi = (Αi/ΣΑ) × 100

όπου:

Αi είναι το εμβαδόν κάτω από την κορυφή του επιμέρους μεθυλεστέρα λιπαρού οξέος i·

ΣΑ είναι το άθροισμα των εμβαδών που περικλείονται από όλες τις κορυφές όλων των μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων.

Τα αποτελέσματα εκφράζονται με δύο δεκαδικά ψηφία.

Σημείωση 4:  Για τα λίπη και τα έλαια, το κλάσμα της κατά μάζα περιεκτικότητας των μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων ισούται με το κλάσμα της κατά μάζα περιεκτικότητας των τριακυλογλυκερολών σε γραμμάρια ανά 100 g. Για τις περιπτώσεις στις οποίες η παραδοχή αυτή δεν επιτρέπεται, βλ. 5.2.2.2.

5.2.2.2.   Χρήση συντελεστών διορθώσεως

Σε ορισμένες περιπτώσεις, για παράδειγμα παρουσία λιπαρών οξέων με λιγότερα από 8 άτομα άνθρακα ή οξέων με δευτερεύουσες ομάδες, τα εμβαδά διορθώνονται με ειδικούς συντελεστές διόρθωσης. Οι συντελεστές αυτοί καθορίζονται για κάθε επιμέρους όργανο. Προς τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιούνται κατάλληλα υλικά αναφοράς με πιστοποιημένη σύσταση σε λιπαρά οξέα στο αντίστοιχο πεδίο τιμών.

Σημείωση 5:  Οι εν λόγω συντελεστές διορθώσεως δεν είναι ταυτόσημοι με τους θεωρητικούς συντελεστές διορθώσεως του FID, οι οποίοι παρατίθενται στο προσάρτημα Α, δεδομένου ότι περιλαμβάνουν επίσης τις επιδόσεις του συστήματος έγχυσης κ.λπ. Ωστόσο, σε περίπτωση μεγαλύτερων διαφορών, πρέπει να ελέγχεται ολόκληρο το σύστημα ως προς τις επιδόσεις.

Για το εν λόγω μείγμα αναφοράς, η κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία του FAME i παρέχεται από τον τύπο:

wi = (mi m) × 100

όπου:

mi είναι το εμβαδόν του FFAME i στο μείγμα αναφοράς·

Σm είναι η συνολική μάζα των διαφόρων συστατικών ως FAME του μείγματος αναφοράς.

Από το χρωματογράφημα του μείγματος αναφοράς υπολογίζεται το επί τοις εκατό ποσοστό ανά εμβαδόν για το FAME i ως εξής:

wi = (Ai/ΣΑ) × 100

όπου:

Αi είναι το εμβαδόν του FAME i στο μείγμα αναφοράς·

ΣΑ είναι το άθροισμα όλων των εμβαδών όλων των FAME του μείγματος αναφοράς.

Οπότε ο συντελεστής διορθώσεως Fc είναι

Fc = (mi × ΣΑ)/(Ai/Σm)

Για το δείγμα, η κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία κάθε FAME i είναι:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Τα αποτελέσματα εκφράζονται με δύο δεκαδικά ψηφία.

Σημείωση 6:  Η υπολογιζόμενη τιμή αντιστοιχεί στην κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία του επιμέρους λιπαρού οξέος υπολογιζόμενη ως τριακυλογλυκερόλες λιπαρού οξέος ανά 100 g λίπους.

5.2.2.3.   Χρήση εσωτερικού προτύπου

Σε ορισμένες αναλύσεις (παραδείγματος χάρη όταν ο ποσοτικός προσδιορισμός δεν αφορά όλα τα λιπαρά οξέα, όπως στην περίπτωση ταυτόχρονης παρουσίας οξέων με 4 και 6 άτομα άνθρακα και οξέων με 16 και 18 άτομα άνθρακα, ή όταν είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί η απόλυτη ποσότητα ενός λιπαρού οξέος σε ένα δείγμα), απαιτείται η χρήση εσωτερικού προτύπου. Χρησιμοποιούνται συνήθως λιπαρά οξέα με 5, 15 ή 17 άτομα άνθρακα. Ο συντελεστής διόρθωσης (αν έχει εφαρμογή) θα πρέπει να προσδιορίζεται και για το εσωτερικό πρότυπο.

Η κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία του συστατικού i, εκφραζόμενη σε μεθυλεστέρες, παρέχεται από τον τύπο:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

όπου:

Α i είναι το εμβαδόν του FAME i·

A IS είναι το εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου·

F i είναι ο συντελεστής διορθώσεως του λιπαρού οξέος i, εκφραζόμενος ως FAME·

F IS είναι ο συντελεστής διορθώσεως του εσωτερικού προτύπου·

m είναι η μάζα του δείγματος δοκιμής, σε χιλιοστόγραμμα·

m IS είναι η μάζα του εσωτερικού προτύπου, σε χιλιοστόγραμμα.

Τα αποτελέσματα εκφράζονται με δύο δεκαδικά ψηφία.

6.   ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΩΝ

Στην έκθεση ανάλυσης περιγράφονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των μεθυλεστέρων και για την αεριοχρωματογραφική τους ανάλυση. Αναφέρονται επίσης όλες οι λεπτομέρειες της εκτέλεσης που δεν καθορίζεται στην παρούσα πρότυπη μέθοδο, ή θεωρείται προαιρετική, καθώς και οι λεπτομέρειες τυχόν συμβάντων που ενδέχεται να έχουν επηρεάσει τα αποτελέσματα.

Η έκθεση ελέγχου περιλαμβάνει όλα τα στοιχεία που είναι απαραίτητα για την πλήρη ταυτοποίηση του δείγματος.

7.   ΑΚΡΙΒΕΙΑ

7.1.    Αποτελέσματα διεργαστηριακής δοκιμής

Λεπτομέρειες σχετικά με διεργαστηριακή δοκιμή για την ακρίβεια της μεθόδου παρατίθενται στο παράρτημα Γ του προτύπου IOC/T.20/Doc. αριθ. 33. Οι τιμές που προέκυψαν από αυτή τη διεργαστηριακή δοκιμή ενδέχεται να μην ισχύουν για πεδία τιμών συγκέντρωσης και υλικά διαφορετικά από τα αναφερόμενα.

7.2.    Επαναληψιμότητα

Η διαφορά σε απόλυτες τιμές μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο ανεξάρτητων μεμονωμένων δοκιμών που εκτελέστηκαν με μικρή χρονική διαφορά με την ίδια μέθοδο σε πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό στο ίδιο εργαστήριο από τον ίδιο τεχνικό, ο οποίος χρησιμοποίησε τον ίδιο εξοπλισμό, δεν πρέπει να υπερβαίνει σε περισσότερες από το 5 % των περιπτώσεων την τιμή R που αναφέρεται στους πίνακες 1 έως 14 του παραρτήματος Γ του προτύπου IOC/T.20/Doc. αριθ. 33.

7.3.    Αναπαραγωγιμότητα

Η διαφορά σε απόλυτες τιμές μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων δοκιμών που εκτελέστηκαν με την ίδια μέθοδο σε πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό σε διαφορετικά εργαστήρια από διαφορετικούς τεχνικούς που χρησιμοποίησαν διαφορετικό εξοπλισμό, δεν πρέπει να υπερβαίνει σε περισσότερες από το 5 % των περιπτώσεων την τιμή R που αναφέρεται στους πίνακες 1 έως 14 του παραρτήματος Γ του προτύπου IOC/T.20/Doc. αριθ. 33.




Προσάρτημα Α

Σχήμα 1

image

με ω0,5 πλάτος γραμμής στο ήμισυ του ύψους του τριγώνου (ABC) και b πλάτος του τριγώνου στο ήμισυ του ύψους (NPM).



Σχήμα 2

Σχήμα 3

image

image




Προσάρτημα Β

Σχήμα 1

Χρωματογραφικό προφίλ πυρηνελαίου, ληφθέν με τη μέθοδο της μεθυλίωσης εν ψυχρώ

image

Οι χρωματογραφικές κορυφές αντιστοιχούν στους μεθυλεστέρες, εκτός αν υποδεικνύεται διαφορετικά.

▼B




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XI

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ►C1  ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ◄ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΣΕ ΑΛΟΓΟΝΟΥΧΟΥΣ ΠΤΗΤΙΚΟΥΣ ΔΙΑΛΥΤΕΣ

1.   ΑΡΧΗ

Αεριοχρωματογραφική ανάλυση σύμφωνα με την τεχνική «head space».

2.   ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ

2.1.

Συσκευή αερίου χρωματογραφίας, με ανιχνευτή σύλληψης ηλεκτρονίων (ECD).

2.2.

Συσκευή «head space».

2.3.

Στήλη αερίου χρωματογραφίας από γυαλί μήκους 2 μέτρων και διαμέτρου 2 mm, ►C1  με στατική φάση ◄ . OV101 ως 10 % ή ισοδύναμο, που εμποτίζει γη διατόμων, η οποία έχει αποτεφρωθεί, εκπλυθεί με οξέα και μετατραπεί σε σιλάνιο, κοκκομετρικού βαθμού 80 ως 100 Mesh.

2.4.

Φέρον αέριο και βοηθητικό αέριο: άζωτο για αέριο χρωματογραφία, ►C1  κατάλληλο για ανιχνευτή σύλληψης ηλεκτρονίων ◄ .

2.5.

Γυάλινα φιαλίδια 10 ώς 15 ml, με επένδυση από τεφλόν και ένα πώμα από αλουμίνιο εφοδιασμένο με στόμιο, για δειγματοληψία με σύριγγα.

2.6.

Λαβίδες ερμητικού κλεισίματος.

2.7.

Σύριγγα για αέριο 0,5 ως 2 ml.

3.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

3.1.

Πρότυπα: αλογονούχοι πτητικοί διαλύτες ►C1  χρωματογραφικής καθαρότητας ◄ .

4.   ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ

4.1.

Ζυγίζουμε ακριβώς 3 g ελαιολάδου περίπου σε ένα γυάλινο φιαλίδιο (μιας χρήσεως), κλείνουμε το φιαλίδιο ερμητικά. Εισάγουμε το φιαλίδιο σε θερμοστάτη σε 70 °C για μία ώρα. Λαμβάνουμε με ακρίβεια, με τη βοήθεια σύριγγας, όγκο 0,2 ώς 0,5 ml από το «head space».Το εγχέουμε στη στήλη της συσκευής αερίου χρωματογραφίας που ρυθμίζεται ως εξής:

 θερμοκρασία έγχυσης: 150 °C,

 θερμοκρασία στήλης: 70 ώς 80 °C,

 θερμοκρασία ανίχνευσης: 200 ως 250 °C.

Είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν άλλες θερμοκρασίες στο βαθμό που τα αποτελέσματα είναι ισοδύναμα.

4.2.

Διαλύματα αναφοράς. Προετοιμάζουμε πρότυπα διαλύματα, χρησιμοποιώντας εξευγενισμένο ελαιόλαδο χωρίς ίχνη διαλυτών, σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται μεταξύ 0,05 και 1 mg/kg και ανάλογες με την υπολογιζόμενη περιεκτικότητα του δείγματος. Η ενδεχόμενη διάλυση πρέπει να γίνεται με πεντάνιο.

4.3.

►C1  Ποσοτικός προσδιορισμός ◄ . Συγκρίνουμε τα εμβαδά ή τα ύψη των κορυφών του φάσματος που αντιστοιχούν στο δείγμα και στο πρότυπο διάλυμα με την υπολογιζόμενη πλησιέστερη συγκέντρωση. Αν η σχετική απόκλιση είναι μεγαλύτερη από 10 %, η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί, συγκρίνοντας με ένα νέο πρότυπο διάλυμα, μέχρι η σχετική συγκέντρωση να ανταποκρίνεται στη σχετική απόκλιση που προαναφέρεται. Η περιεκτικότητα υπολογίζεται με βάση ένα μέσο όρο των στοιχειωδών εγχύσεων.

4.4.

Διατύπωση αποτελεσμάτων. Τα αποτελέσματα ►C1  εκφράζονται ◄ σε mg/kg (ppm). Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου είναι 0,01 mg/kg.

▼M26




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XII

ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΟΥ ΔΙΕΘΝΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟΥ ΕΛΑΙΟΚΟΜΙΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΠΑΡΘΕΝΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ

▼M28

1.   ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Η διεθνής μέθοδος που περιγράφεται στο παρόν παράρτημα αποβλέπει στον καθορισμό, αφενός της διαδικασίας αξιολόγησης των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του παρθένου ελαιολάδου, κατά την έννοια του σημείου 1 του μέρους VΙΙΙ του παραρτήματος VΙΙ του κανονισμού (ΕΕ) αριθ. 1308/2013 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου ( 8 ), και, αφετέρου, της διαδικασίας ταξινόμησης των παρθένων ελαιολάδων βάσει των εν λόγω χαρακτηριστικών. Η μέθοδος περιλαμβάνει επίσης ενδείξεις για προαιρετική επισήμανση.

Η περιγραφόμενη μέθοδος ισχύει μόνο για τα παρθένα ελαιόλαδα και για την ταξινόμηση και επισήμανσή τους με βάση την ένταση των αντιληπτών ελαττωμάτων και του φρουτώδους, που προσδιορίζονται από ομάδα δοκιμαστών οι οποίοι επιλέγονται, εκπαιδεύονται και ελέγχονται ως ομάδα.

Τα πρότυπα IOC (Διεθνές Συμβούλιο Ελαιοκομίας) που αναφέρονται στο παρόν παράρτημα χρησιμοποιούνται στην τελευταία διαθέσιμη έκδοση τους.

▼M26

2.   ΓΕΝΙΚΟ ΒΑΣΙΚΟ ΛΕΞΙΛΟΓΙΟ ΤΗΣ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ

Βλ. πρότυπο IOC/T.20/Doc. Νo 4 «Sensory Analysis: General Basic Vocabulary » (Οργανοληπτική ανάλυση: Γενικό βασικό λεξιλόγιο)

3.   ΕΙΔΙΚΟ ΛΕΞΙΛΟΓΙΟ

3.1.    Αρνητικές ιδιότητες

Ατροχάδο/Μούργα: Χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδου που προέρχεται από ελιές στοιβαγμένες σε σωρούς ή αποθηκευμένες υπό συνθήκες τέτοιες ώστε να βρίσκονται σε προχωρημένο στάδιο αναερόβιας ζύμωσης, ή ελαιολάδου που έχει παραμείνει σε επαφή με το ίζημα το οποίο καθιζάνει σε δεξαμενές και βαρέλια σε υπόγειες αποθήκες και έχει επίσης υποστεί αναερόβια ζύμωση.

Μουχλιασμένο- νοτισμένο-χωματίλα: Χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδου που προέρχεται από καρπούς προσβεβλημένους σε μεγάλη έκταση από μύκητες και ζυμομύκητες, λόγω της αποθήκευσής τους επί πολλές ημέρες σε υγρό περιβάλλον, ή ελαιολάδου που προέρχεται από ελιές οι οποίες συλλέχθηκαν μαζί με χώμα ή λάσπη και δεν πλύθηκαν.

Κρασώδες-ξυδάτο- ξινό-ξινισμένο: Χαρακτηριστική οσμή-γεύση ορισμένων ελαιολάδων που θυμίζει κρασί ή ξύδι. Οφείλεται κυρίως σε διεργασία αερόβιας ζύμωσης των ελιών ή υπολειμμάτων ελαιοζύμης σε σάκους (τάπητες) ελαιοπιεστηρίου που δεν καθαρίστηκαν σωστά, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό οξικού οξέος, οξικού αιθυλεστέρα και αιθανόλης.

Ταγγό: Οσμή-γεύση των ελαιολάδων που έχουν υποστεί έντονη οξείδωση.

Παγωμένης ελιάς (υγρό ξύλο): Χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδων που έχουν παραχθεί από ελιές οι οποίες επλήγησαν από παγετό πάνω στο δένδρο.

▼M28

3.1.1.    Άλλες αρνητικές ιδιότητες



Ψημένο ή καμένο

Χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδων προερχόμενη από υπερβολική και/ή παρατεταμένη θέρμανση κατά την επεξεργασία και, ιδιαίτερα, κατά τη θερμομάλαξη της ελαιοζύμης, όταν αυτή πραγματοποιείται σε ακατάλληλες θερμικές συνθήκες.

Άχυρο-ξύλο

Χαρακτηριστική οσμή-γεύση ορισμένων ελαιολάδων που προέρχονται από ελιές οι οποίες έχουν αφυδατωθεί.

Τραχύ

Πηχτή και ζυμώδης αίσθηση που παράγεται στο στόμα από ορισμένα παλαιά έλαια.

Γράσο

Οσμή-γεύση ελαιολάδου που θυμίζει πετρέλαιο, λιπαντικά ή ορυκτέλαια.

Φυτικά υγρά

Οσμή-γεύση που αποκτάται από το ελαιόλαδο ύστερα από παρατεταμένη επαφή του με με φυτικά υγρά του ελαιοτριβείου τα οποία έχουν υποστεί ζύμωση.

Άλμη

Οσμή-γεύση ελαιολάδου που προέρχεται από ελιές διατηρημένες σε άλμη.

Μεταλλικό

Οσμή-γεύση που θυμίζει μέταλλο. Είναι χαρακτηριστική ιδιότητα ελαιολάδου που έχει παραμείνει επί μακρόν σε επαφή με μεταλλικές επιφάνειες, κατά τη θραύση του ελαιοκάρπου, τη μάλαξη, την έκθλιψη ή την αποθήκευση.

Σπάρτο

Χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδου που προέρχεται από ελιές οι οποίες έχουν υποστεί έκθλιψη σε καινούριους σάκους ελαιοπιεστηρίου από σπάρτο. Μπορεί να διαφέρει ανάλογα με το αν πρόκειται για σάκους κατασκευασμένους από χλωρό ή από αποξηραμένο σπάρτο.

Σκουληκιασμένο

Οσμή-γεύση ελαιολάδου που προέρχεται από ελιές οι οποίες έχουν προσβληθεί σοβαρά από νύμφες δάκου (Bactrocera oleae).

Αγγουρώδες

Οσμή-γεύση ελαιολάδου η οποία οφείλεται σε υπερβολικά μακρόχρονη ερμητική συσκευασία, και ειδικότερα σε λευκοσιδηρά δοχεία, και αποδίδεται στον σχηματισμό 2,6-εννεαδιενάλης.

3.2.    Θετικές ιδιότητες



Φρουτώδες

Σύνολο οσφραντικών αισθήσεων χαρακτηριστικών των ελαιολάδων, το οποίο εξαρτάται από την ποικιλία της ελιάς και προέρχεται από υγιείς και φρέσκες ελιές, ώριμες ή άγουρες. Γίνεται αντιληπτό απευθείας με την όσφρηση και/ή από την οπισθορινική οδό.

Πικρό

Χαρακτηριστική πρωταρχική γεύση ελαιολάδου που έχει ληφθεί από πράσινες ελιές ή από ελιές των οποίων το χρώμα αρχίζει να αλλάζει. Γίνεται αντιληπτή μέσω των περιχαρακωμένων γευστικών θηλών που σχηματίζουν το γευστικό λάμδα της γλώσσας.

Πικάντικο

Καυστική απτική αίσθηση, χαρακτηριστική των ελαιολάδων που παράγονται στην αρχή της ελαιοκομικής περιόδου, κυρίως από ελιές που είναι ακόμη άγουρες. Μπορεί να γίνει αντιληπτή σε όλη τη στοματική κοιλότητα, ιδίως στον φάρυγγα.

3.3.    Προαιρετική ορολογία για την επισήμανση

Κατόπιν αιτήματος, ο επικεφαλής της ομάδας των δοκιμαστών μπορεί να πιστοποιήσει ότι τα αξιολογηθέντα ελαιόλαδα ανταποκρίνονται στους ορισμούς και στα πεδία τιμών που αντιστοιχούν στους ακόλουθους επιθετικούς προσδιορισμούς, ανάλογα με την ένταση και την αντίληψη των ιδιοτήτων:

Θετικές ιδιότητες (φρουτώδες, πικρό και πικάντικο): Ανάλογα με την ένταση της αντίληψης:

  έντονο, όταν η διάμεση τιμή της ιδιότητας υπερβαίνει το 6,

  μεσαίο, όταν η διάμεση τιμή της ιδιότητας κυμαίνεται μεταξύ 3 και 6,

  ελαφρό, όταν η διάμεση τιμή της ιδιότητας είναι μικρότερη του 3.



Φρουτώδες

Σύνολο οσφραντικών αισθήσεων χαρακτηριστικών των ελαιολάδων, το οποίο εξαρτάται από την ποικιλία της ελιάς και προέρχεται από υγιείς και φρέσκες ελιές, όπου δεν κυριαρχεί ούτε το άγουρο ούτε το ώριμο φρουτώδες. Γίνεται αντιληπτό απευθείας με την όσφρηση και/ή από την οπισθορινική οδό.

Άγουρο φρουτώδες

Σύνολο οσφραντικών αισθήσεων χαρακτηριστικών των ελαιολάδων, το οποίο θυμίζει άγουρο φρούτο, εξαρτάται από την ποικιλία της ελιάς και προέρχεται από πράσινες, υγιείς και φρέσκες ελιές. Γίνεται αντιληπτό απευθείας με την όσφρηση και/ή από την οπισθορινική οδό.

Ώριμο φρουτώδες

Σύνολο οσφραντικών αισθήσεων χαρακτηριστικών των ελαιολάδων, το οποίο θυμίζει ώριμο φρούτο, εξαρτάται από την ποικιλία της ελιάς και προέρχεται από υγιείς και φρέσκες ελιές. Γίνεται αντιληπτό απευθείας με την όσφρηση και/ή από την οπισθορινική οδό.

Ισορροπημένο

Ελαιόλαδο που δεν εμφανίζει έλλειψη ισορροπίας. Ως έλλειψη ισορροπίας νοείται η γευστικο-οσφραντική και απτική αίσθηση όπου η διάμεση τιμή της ιδιότητας του πικρού και/ή της ιδιότητας του πικάντικου υπερβαίνει κατά δύο μονάδες τη διάμεση τιμή της ιδιότητας του φρουτώδους.

Γλυκό ελαιόλαδο

Ελαιόλαδο στο οποίο η διάμεση τιμή της ιδιότητας του πικρού και εκείνη της ιδιότητας του πικάντικου είναι μικρότερες ή ίσες με 2.

▼M26

4.   ΠΟΤΗΡΙ ΓΙΑ ΤΗ ΓΕΥΣΙΓΝΩΣΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΕΛΑΙΩΝ

Βλ. πρότυπο IOC/T.20/Doc. No 5 «Glass for Oil Tasting» (Ποτήρι για τη γευσιγνωστική δοκιμασία ελαίων).

5.   ΑΙΘΟΥΣΑ ΓΕΥΣΙΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ

Βλ. πρότυπο IOC/T.20/Doc. No 6 «Guide for the Installation of a Test Room» (Οδηγός για την εγκατάσταση αίθουσας γευσιγνωστικής δοκιμασίας).

6.   ΥΛΙΚΟ

Κάθε θάλαμος πρέπει να είναι εφοδιασμένος με το ακόλουθο υλικό, το οποίο απαιτείται για την ορθή εκτέλεση των καθηκόντων των δοκιμαστών και πρέπει να είναι εύκολα προσιτό:

 ποτήρια (τυποποιημένα) που περιέχουν τα δείγματα, φέρουν κωδικό αριθμό, καλύπτονται με υάλους ωρολογίου και διατηρούνται σε θερμοκρασία 28 °C ± 2 °C·

 φύλλο χαρακτηρισμού (βλ. σχήμα 1), σε έντυπη ή ηλεκτρονική μορφή, υπό την προϋπόθεση ότι πληρούνται οι προϋποθέσεις του φύλλου χαρακτηρισμού, μαζί με τις οδηγίες χρήσης του, εάν είναι απαραίτητο·

 στυλό διαρκείας ή με ανεξίτηλο μελάνι·

 δίσκοι με φέτες μήλου και/ή νερό, ανθρακούχο ή μη, και/ή φρυγανιές·

 ένα ποτήρι νερό σε θερμοκρασία δωματίου·

 φύλλο στο οποίο υπενθυμίζονται οι γενικοί κανόνες που παρατίθενται στις ενότητες 8.4 και 9.1.1·

 πτυελοδοχείο.

7.   ΕΠΙΚΕΦΑΛΗΣ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ ΔΟΚΙΜΑΣΤΩΝ ΚΑΙ ΔΟΚΙΜΑΣΤΕΣ

7.1.    Επικεφαλής της ομάδας

Ο επικεφαλής της ομάδας δοκιμαστών πρέπει να είναι κατάλληλα εκπαιδευμένο πρόσωπο με άρτια γνώση των ειδών ελαιολάδου που πρόκειται να εξετάσει στο πλαίσιο της εργασίας του. Αποτελεί το βασικό πρόσωπο της ομάδας και είναι υπεύθυνος για την οργάνωση και τη λειτουργία της.

Η εργασία του επικεφαλής της ομάδας απαιτεί βασική κατάρτιση στα εργαλεία οργανοληπτικής ανάλυσης, οξύτητα των αισθήσεων, σχολαστική προετοιμασία, οργάνωση και διεξαγωγή των δοκιμασιών, καθώς και δεξιότητες και υπομονή για τον σχεδιασμό και την εκτέλεση των δοκιμασιών με επιστημονικό τρόπο.

Είναι ο μόνος υπεύθυνος για την επιλογή, την κατάρτιση και την παρακολούθηση των δοκιμαστών προκειμένου να διαπιστώνει το επίπεδο των δεξιοτήτων τους. Ως εκ τούτου, είναι υπεύθυνος για τις εκτιμήσεις των δοκιμαστών, που πρέπει να είναι πάντα αντικειμενικές. Για τον σκοπό αυτό, πρέπει να εκπονεί ειδικές διαδικασίες βασιζόμενες σε δοκιμασίες και σαφή κριτήρια αποδοχής και απόρριψης. Βλ. πρότυπο IOC/T.20/Doc. No 14 «Guide for the selection, training and monitoring of skilled virgin olive oil tasters» (Οδηγός για την επιλογή, την κατάρτιση και την παρακολούθηση ειδικευμένων δοκιμαστών ελαιολάδου).

Ο επικεφαλής της ομάδας είναι υπεύθυνος για τις επιδόσεις της και, συνεπώς, για την αξιολόγησή της, για την οποία πρέπει να παρέχει αξιόπιστα και αντικειμενικά αποδεικτικά στοιχεία. Σε κάθε περίπτωση, θα πρέπει να μπορεί να αποδεικνύει ανά πάσα στιγμή ότι η χρησιμοποιούμενη μέθοδος και οι δοκιμαστές ελέγχονται. Συνιστάται η περιοδική βαθμονόμηση της ομάδας (πρότυπο IOC/T.20/Doc. No 14, παράγραφος 5).

Φέρει την τελική ευθύνη για την τήρηση των αρχείων της ομάδας. Τα αρχεία αυτά πρέπει να είναι πάντα ανιχνεύσιμα. Πρέπει να πληρούν τις απαιτήσεις διασφάλισης και ποιότητας που καθορίζονται στα διεθνή πρότυπα οργανοληπτικής ανάλυσης και να εξασφαλίζουν σε κάθε περίπτωση την ανωνυμία των δειγμάτων.

Ο επικεφαλής της ομάδας είναι υπεύθυνος για την καταγραφή των εργαλείων και του εξοπλισμού που είναι απαραίτητα για τη συμμόρφωση με τις προδιαγραφές της παρούσας μεθόδου, καθώς και για τη διασφάλιση του ότι αυτά καθαρίζονται και συντηρούνται δεόντως. Ο επικεφαλής φυλάσσει γραπτές αποδείξεις των ανωτέρω, καθώς και της τήρησης των συνθηκών δοκιμασίας.

Είναι αρμόδιος για την παραλαβή και τη φύλαξη των δειγμάτων μετά την άφιξή τους στο εργαστήριο, καθώς και για την αποθήκευσή τους μετά τη δοκιμασία. Κατά την εκτέλεση των ανωτέρω καθηκόντων, διασφαλίζει σε κάθε περίπτωση ότι όλα τα δείγματα παραμένουν ανώνυμα και ότι αποθηκεύονται με τον ενδεδειγμένο τρόπο. Για τον σκοπό αυτόν, οφείλει να εκπονεί γραπτές διαδικασίες προκειμένου να διασφαλίζεται ότι η όλη διαδικασία είναι ανιχνεύσιμη και παρέχει εγγυήσεις.

Επιπλέον, ο επικεφαλής της ομάδας είναι υπεύθυνος για την προετοιμασία, την κωδικοποίηση και την παρουσίαση των δειγμάτων στους δοκιμαστές, σύμφωνα με τον ενδεδειγμένο πειραματικό σχεδιασμό βάσει προκαθορισμένων πρωτοκόλλων, καθώς και για τη συγκέντρωση και τη στατιστική επεξεργασία των δεδομένων που παρέχουν οι δοκιμαστές.

Είναι αρμόδιος για την εκπόνηση και την κατάρτιση τυχόν άλλων διαδικασιών που ενδεχομένως είναι απαραίτητες για τη συμπλήρωση του παρόντος προτύπου και τη διασφάλιση της εύρυθμης λειτουργίας της ομάδας.

Πρέπει να αναζητεί τρόπους σύγκρισης των αποτελεσμάτων της ομάδας του με τα αποτελέσματα άλλων ομάδων που αναλαμβάνουν την ανάλυση παρθένων ελαιολάδων, προκειμένου να βεβαιώνεται για την εύρυθμη λειτουργία της ομάδας του.

Είναι καθήκον του επικεφαλής της ομάδας να εμψυχώνει τα μέλη της, κεντρίζοντας το ενδιαφέρον και την περιέργειά τους και καλλιεργώντας ανταγωνιστικό πνεύμα μεταξύ τους. Για να το επιτύχει αυτό ο επικεφαλής, συνιστάται ένθερμα να εξασφαλίζει ομαλή αμφίδρομη ροή πληροφοριών με τα μέλη της ομάδας, ενημερώνοντάς τα για όλα τα καθήκοντα που εκτελεί και τα αποτελέσματα που επιτυγχάνονται. Επιπρόσθετα, διασφαλίζει ότι η γνώμη του δεν γίνεται γνωστή και εμποδίζει τους δοκιμαστές με πιθανές αρχηγικές τάσεις να επιβάλλουν τα κριτήριά τους στους υπόλοιπους δοκιμαστές.

Ο επικεφαλής της ομάδας συγκαλεί τους δοκιμαστές αρκετά πριν από τη διενέργεια των δοκιμασιών και απαντά σε τυχόν ερωτήσεις τους σχετικά με την εκτέλεση των δοκιμασιών, χωρίς όμως να εκφράζει γνώμη σχετικά με το δείγμα.

▼M28

7.1.1.    Αναπληρωτής επικεφαλής της ομάδας

Ο επικεφαλής της ομάδας μπορεί, για βάσιμους λόγους, να αντικατασταθεί από αναπληρωτή επικεφαλής της ομάδας, ο οποίος μπορεί να τον αντικαθιστά σε καθήκοντα που αφορούν την εκτέλεση των δοκιμών. Ο αναπληρωτής αυτός πρέπει να διαθέτει όλα τα απαραίτητα προσόντα που απαιτούνται από έναν επικεφαλής της ομάδας.

▼M28

7.2.    Δοκιμαστές

Τα άτομα που μετέχουν ως δοκιμαστές στις οργανοληπτικές δοκιμασίες ελαιολάδων πρέπει να ενεργούν εθελοντικά. Ως εκ τούτου, είναι σκόπιμο να υποβάλλουν οι υποψήφιοι γραπτή αίτηση. Οι υποψήφιοι επιλέγονται, εκπαιδεύονται και παρακολουθούνται από τον επικεφαλής της ομάδας με βάση την ικανότητά τους να διακρίνουν μεταξύ ομοειδών δειγμάτων. Υπενθυμίζεται ότι η ακρίβεια των εκτιμήσεών τους βελτιώνεται με την κατάρτιση.

Οι δοκιμαστές πρέπει να ενεργούν ως πραγματικοί αισθητηριακοί παρατηρητές, παραβλέποντας τις προσωπικές γευστικές προτιμήσεις τους και αναφέροντας αποκλειστικά τις αισθήσεις που αντιλαμβάνονται. Για να το επιτύχουν αυτό, πρέπει να εργάζονται πάντα σιωπηλά, ήρεμα και χωρίς βιασύνη, εστιάζοντας στον μέγιστο δυνατό βαθμό τις αισθήσεις τους στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του δείγματος που δοκιμάζουν.

Για κάθε δοκιμασία απαιτούνται 8 έως 12 δοκιμαστές. Ωστόσο, συνιστάται να προβλέπονται ορισμένοι επιπλέον δοκιμαστές προκειμένου να καλύψουν τυχόν απουσίες.

▼M26

8.   ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ

8.1.    Παρουσίαση του δείγματος

Το δείγμα ελαίου προς ανάλυση παρουσιάζεται σε τυποποιημένα ποτήρια γευσιγνωστικής δοκιμασίας που συμμορφώνονται με το πρότυπο IOC/T.20/Doc. No 5 «Glass for Oil Tasting».

Το ποτήρι περιέχει 14–16 ml ελαίου, ή 12,8 έως 14,6 g ελαίου εάν πρόκειται να ζυγιστούν τα δείγματα, και καλύπτεται με ύαλο ωρολογίου.

Κάθε ποτήρι σημειώνεται με κωδικό ο οποίος αποτελείται είτε από αριθμούς είτε από συνδυασμό γραμμάτων και αριθμών που επιλέγονται τυχαία. Ο κωδικός σημειώνεται με άοσμο σύστημα σήμανσης.

8.2.    Θερμοκρασία δοκιμασίας και δείγματος

Τα προς γευσιγνωστική δοκιμασία δείγματα ελαίου διατηρούνται στα ποτήρια σε θερμοκρασία 28 ° C ± 2 ° C καθόλη τη διάρκεια της δοκιμασίας. Η συγκεκριμένη θερμοκρασία έχει επιλεγεί επειδή διευκολύνει την παρατήρηση οργανοληπτικών διαφορών σε σύγκριση με τη θερμοκρασία δωματίου και επειδή σε χαμηλότερες θερμοκρασίες οι αρωματικές ενώσεις που χαρακτηρίζουν τα εν λόγω έλαια εξατμίζονται ασθενώς, ενώ οι υψηλότερες θερμοκρασίες οδηγούν στον σχηματισμό των πτητικών ενώσεων που αποτελούν ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των θερμών ελαίων. Σχετικά με τη μέθοδο που πρέπει να χρησιμοποιείται για τη θέρμανση των δειγμάτων όταν έχουν τοποθετηθεί στα ποτήρια, βλ. πρότυπο IOC/T.20/Doc. No 5 «Glass for Oil Tasting».

Η θερμοκρασία της αίθουσας γευσιγνωστικής δοκιμασίας πρέπει να είναι 20° έως 25° C (βλ. πρότυπο IOC/T.20/Doc. No 6).

8.3.    Ώρες διεξαγωγής των δοκιμασιών

Οι βέλτιστες ώρες εργασίας για τη δοκιμασία ελαίων είναι οι πρωινές. Έχει αποδειχθεί ότι υπάρχουν διαστήματα κατά τη διάρκεια της ημέρας όπου η αντίληψη της γεύσης και της οσμής είναι καλύτερη. Για ένα διάστημα πριν από τα γεύματα οι αισθήσεις της όσφρησης και της γεύσης είναι οξύτερες, ενώ μετά τα γεύματα εξασθενίζουν.

Εντούτοις, αυτό το κριτήριο δεν πρέπει θα εφαρμόζεται σε βαθμό τέτοιο ώστε η πείνα να αποσπά την προσοχή των δοκιμαστών, με αποτέλεσμα να ελαττώνεται η διακριτική τους ικανότητα. Συνεπώς, συνιστάται να πραγματοποιούνται οι συνεδρίες γευσιγνωστικής δοκιμασίας το πρωί, μεταξύ των ωρών 10.00 και 12.00.

8.4.    Δοκιμαστές: γενικοί κανόνες δεοντολογίας

Οι κατωτέρω συστάσεις αφορούν τη συμπεριφορά των δοκιμαστών κατά τη διάρκεια της εργασίας τους.

Οι δοκιμαστές που καλούνται από τον επικεφαλής της ομάδας να συμμετάσχουν σε οργανοληπτική δοκιμασία θα πρέπει να μπορούν να παραστούν τις καθορισμένες ώρες και οφείλουν να τηρούν τους ακόλουθους κανόνες:

 Να μην καπνίζουν ούτε να πίνουν καφέ τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την καθορισμένη ώρα της δοκιμασίας.

 Να μη χρησιμοποιούν άρωμα, καλλυντικό ή σαπούνι του οποίου η οσμή θα μπορούσε να παραμείνει έως τον χρόνο διεξαγωγής της δοκιμασίας. Να χρησιμοποιούν σαπούνι χωρίς άρωμα για να πλένουν τα χέρια τους, τα οποία θα πρέπει στη συνέχεια να ξεπλένουν καλά και να στεγνώνουν όσες φορές είναι απαραίτητο για να εξαλειφθεί κάθε ίχνος οσμής.

 Να μην τρώνε τίποτα τουλάχιστον μία ώρα πριν από τη διεξαγωγή της γευσιγνωστικής δοκιμασίας.

 Εάν οι δοκιμαστές δεν αισθάνονται καλά σωματικά και, συγκεκριμένα, εάν επηρεάζεται η αίσθηση της όσφρησης και της γεύσης τους, ή εάν βρίσκονται υπό ψυχολογική πίεση που τους εμποδίζει να συγκεντρωθούν στην εργασία τους, πρέπει να μην συμμετέχουν στη γευσιγνωστική δοκιμασία και να ειδοποιούν σχετικά τον επικεφαλής της ομάδας.

 Εφόσον οι δοκιμαστές τηρούν τους ανωτέρω κανόνες, καταλαμβάνουν τη θέση τους στον καθορισμένο θάλαμο με τάξη και ησυχία.

 Διαβάζουν προσεκτικά τις οδηγίες που παρέχονται στο φύλλο χαρακτηρισμού και αρχίζουν να εξετάζουν το δείγμα μόνον αφού προηγουμένως έχουν προετοιμαστεί πλήρως για την εργασία που καλούνται να εκτελέσουν (ήρεμα και χωρίς βιασύνη). Σε περίπτωση αμφιβολίας, θα πρέπει να συμβουλεύονται κατ’ ιδίαν τον επικεφαλής της ομάδας.

 Πρέπει να παραμένουν σιωπηλοί κατά την εκτέλεση των καθηκόντων τους.

 Πρέπει να έχουν απενεργοποιημένο το κινητό τους τηλέφωνο καθόλη τη διάρκεια της δοκιμασίας ώστε να μην αποσπούν την προσοχή των συναδέλφων τους και να μην τους ενοχλούν.

9.   ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ ΤΩΝ ΠΑΡΘΕΝΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΩΝ

9.1.    Τεχνική γευσιγνωστικής δοκιμασίας

9.1.1. Οι δοκιμαστές σηκώνουν το ποτήρι, κρατώντας το καλυμμένο με την ύαλο ωρολογίου, το γέρνουν ελαφρά και σε αυτή τη θέση το περιστρέφουν πλήρως, ώστε να διαβραχεί όσο το δυνατόν περισσότερο η εσωτερική επιφάνεια. Μόλις ολοκληρωθεί αυτό το στάδιο, αφαιρούν την ύαλο ωρολογίου και οσφραίνονται το δείγμα με αργές, βαθιές εισπνοές για να αξιολογήσουν το ελαιόλαδο. Η διάρκεια της όσφρησης δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 30 δευτερόλεπτα. Εάν κατά τη διάρκεια αυτού του διαστήματος οι δοκιμαστές δεν καταλήξουν σε κανένα συμπέρασμα, πρέπει να κάνουν ένα σύντομο διάλειμμα και μετά να επαναλάβουν την προσπάθεια.

Αφού πραγματοποιηθεί η οσφρητική δοκιμασία, οι δοκιμαστές αξιολογούν τις αισθήσεις που δημιουργεί το έλαιο στο στόμα (σύνολο των αισθήσεων όσφρησης-γεύσης-αφής από την οπισθορινική οδό). Για τον σκοπό αυτό, βάζουν στο στόμα τους μια μικρή ποσότητα ελαίου, 3 ml περίπου. Είναι πολύ σημαντικό να κατανέμεται το έλαιο σε όλη τη στοματική κοιλότητα, από το πρόσθιο τμήμα του στόματος και της γλώσσας, στα πλάγια και στο οπίσθιο τμήμα τους έως την υπερώα και τον φάρυγγα, καθώς είναι γνωστό ότι η ένταση με την οποία γίνονται αντιληπτές οι γεύσεις και οι απτικές αισθήσεις διαφέρει ανάλογα με τη ζώνη της γλώσσας, της υπερώας και του φάρυγγα.

Θα πρέπει να τονιστεί ότι είναι αναγκαίο να διασκορπίζεται το έλαιο, σε επαρκή ποσότητα και πολύ αργά, πάνω από το οπίσθιο τμήμα της γλώσσας μέχρι την υπερώα και τον φάρυγγα, ενώ οι δοκιμαστές επικεντρώνουν την προσοχή τους στη σειρά εμφάνισης των ερεθισμάτων «πικρό» και «πικάντικο». Σε αντίθετη περίπτωση, σε ορισμένα έλαια και τα δύο αυτά ερεθίσματα μπορεί να περάσουν απαρατήρητα, ενώ σε άλλα, το ερέθισμα «πικρό» μπορεί να συγκαλύπτεται από το ερέθισμα «πικάντικο».

Οι μικρές και διαδοχικές εισπνοές αέρα από το στόμα επιτρέπουν στον δοκιμαστή όχι μόνο να διασκορπίσει το δείγμα σε όλη τη στοματική κοιλότητα, αλλά και να αντιληφθεί τις πτητικές αρωματικές ενώσεις με το πίσω μέρος της ρινικής κοιλότητας, επιβάλλοντας τη χρήση αυτής της οδού.

Θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η απτική αίσθηση του πικάντικου. Για τον σκοπό αυτόν, συνιστάται η κατάποση του ελαίου.

9.1.2. Κατά την οργανοληπτική εξέταση παρθένου ελαιολάδου, συνιστάται να αξιολογούνται το πολύ ΤΕΣΣΕΡΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ σε κάθε συνεδρία, με ανώτατο όριο τις τρεις συνεδρίες ημερησίως, προκειμένου να αποφεύγεται η αντίθεση που θα μπορούσε να προκληθεί από τη γευσιγνωστική δοκιμασία άλλων δειγμάτων αμέσως.

Καθώς στις διαδοχικές γευσιγνωστικές δοκιμασίες προκαλείται κόπωση ή απώλεια της ευαισθησίας από τα δείγματα που έχουν προηγηθεί, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιείται ένα προϊόν ικανό να εξαλείψει από το στόμα τα υπολείμματα του ελαιολάδου της προηγούμενης γευσιγνωστικής δοκιμασίας.

Συνιστάται να χρησιμοποιείται μια λεπτή φέτα μήλου, την οποία αφού μασήσει ο δοκιμαστής μπορεί να την πετάξει στο πτυελοδοχείο. Στη συνέχεια, ο δοκιμαστής ξεπλένει το στόμα του με λίγο νερό σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Πρέπει να μεσολαβούν τουλάχιστον 15 λεπτά από τη λήξη μιας συνεδρίας έως την έναρξη της επόμενης.

9.2.    Χρήση του φύλλου χαρακτηρισμού από τους δοκιμαστές

Το φύλλο χαρακτηρισμού που προορίζεται για χρήση από τους δοκιμαστές περιγράφεται λεπτομερώς στο σχήμα 1 του παρόντος παραρτήματος.

Κάθε δοκιμαστής της ομάδας οσφραίνεται και έπειτα γεύεται το εξεταζόμενο ελαιόλαδο ( 9 ). Στη συνέχεια, καταγράφει στην κλίμακα των 10 cm που υπάρχει στο φύλλο χαρακτηρισμού που έχει στη διάθεσή του την ένταση με την οποία αντιλαμβάνεται καθεμία από τις αρνητικές και θετικές ιδιότητες.

Εάν οι δοκιμαστές αντιληφθούν αρνητικές ιδιότητες που δεν αναφέρονται στο τμήμα 4, τις καταγράφουν κάτω από την επικεφαλίδα «Άλλες», χρησιμοποιώντας τον όρο ή τους όρους που τις περιγράφουν με τη μεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια.

▼M28

9.3.    Χρήση των δεδομένων από τον επικεφαλής της ομάδας

Ο επικεφαλής της ομάδας συλλέγει τα φύλλα χαρακτηρισμού που έχουν συμπληρώσει οι δοκιμαστές και εξετάζει τις εντάσεις που έχουν αποδοθεί στις διάφορες ιδιότητες. Σε περίπτωση που εντοπίσει κάποια ανωμαλία, καλεί τον δοκιμαστή να αναθεωρήσει το φύλλο χαρακτηρισμού και, αν κρίνεται αναγκαίο, να επαναλάβει τη δοκιμασία.

Ο επικεφαλής της ομάδας εισάγει τα δεδομένα κάθε μέλους της ομάδας σε πρόγραμμα υπολογιστή παρόμοιο με αυτό που προβλέπεται στο πρότυπο IOC/T.20/Doc. αριθ. 15, με σκοπό τον στατιστικό υπολογισμό των αποτελεσμάτων της ανάλυσης, βάσει υπολογισμού της διάμεσης τιμής τους. Βλ. σημείο 9.4 και το προσάρτημα του παρόντος παραρτήματος. Τα δεδομένα για συγκεκριμένο δείγμα εισάγονται με τη βοήθεια πίνακα αποτελούμενου από εννέα στήλες, οι οποίες αντιστοιχούν στις εννέα αισθητηριακές ιδιότητες, και από n σειρές, οι οποίες αντιστοιχούν στα n μέλη της ομάδας που μετείχαν στη δοκιμασία.

Όταν τουλάχιστον το 50 % των μελών της ομάδας έχει αντιληφθεί ένα ελάττωμα και το έχει καταγράψει κάτω από την επικεφαλίδα «Άλλες», ο επικεφαλής της ομάδας υπολογίζει τη διάμεση τιμή του εν λόγω ελαττώματος και συνάγει την αντίστοιχη ταξινόμηση.

Η τιμή του ανθεκτικού συντελεστή μεταβλητότητας που καθορίζει την ταξινόμηση (ελάττωμα με τη μεγαλύτερη ένταση και ιδιότητα του φρουτώδους) δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20 %.

Σε αντίθετη περίπτωση, ο επικεφαλής της ομάδας οφείλει να επαναλάβει την αξιολόγηση του συγκεκριμένου δείγματος σε άλλη συνεδρία γευσιγνωστικής δοκιμασίας.

Εάν αυτή η κατάσταση προκύπτει συχνά, συνιστάται να παρέχει ο επικεφαλής της ομάδας ειδική πρόσθετη κατάρτιση στους δοκιμαστές (πρότυπο IOC/T.20/Doc. αριθ. 14, παράγραφος 5) και να χρησιμοποιεί τον δείκτη επαναληψιμότητας και τον δείκτη απόκλισης για τον έλεγχο των επιδόσεων (πρότυπο IOC/T.20/Doc. αριθ. 14, παράγραφος 6).

9.4.    Ταξινόμηση του ελαίου

Το έλαιο κατατάσσεται στις κατωτέρω κατηγορίες, ανάλογα με τη διάμεση τιμή των ελαττωμάτων και τη διάμεση τιμή της ιδιότητας του φρουτώδους. Η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων ορίζεται ως η διάμεση τιμή του ελαττώματος που γίνεται αντιληπτό με τη μεγαλύτερη ένταση. Η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων και η διάμεση τιμή του φρουτώδους εκφράζονται με ένα δεκαδικό ψηφίο.

Το έλαιο κατατάσσεται μέσω σύγκρισης της διάμεσης τιμής των ελαττωμάτων και της διάμεσης τιμής του φρουτώδους με τα πεδία τιμών αναφοράς που παρέχονται κατωτέρω. Τα όρια των εν λόγω πεδίων τιμών έχουν καθοριστεί λαμβανομένου υπόψη του σφάλματος της μεθόδου και, ως εκ τούτου, θεωρούνται απόλυτα. Τα πακέτα λογισμικού δίνουν τη δυνατότητα απεικόνισης της κατάταξης σε πίνακα στατιστικών δεδομένων ή σε γράφημα.

α) Εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο: η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι ίση με 0 και η διάμεση τιμή για το φρουτώδες είναι μεγαλύτερη του 0.

β) Παρθένο ελαιόλαδο: η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι μεγαλύτερη του 0, χωρίς όμως να υπερβαίνει το 3,5 και η διάμεση τιμή του φρουτώδους είναι μεγαλύτερη του 0.

γ) Ελαιόλαδο λαμπάντε: η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων υπερβαίνει το 3,5 ή η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι μικρότερη ή ίση με 3,5 και η διάμεση τιμή του φρουτώδους είναι ίση με 0.

Σημείωση 1:  Όταν η διάμεση τιμή της ιδιότητας του πικρού και/ή του πικάντικου είναι μεγαλύτερη του 5,0, ο επικεφαλής της ομάδας το σημειώνει στο πιστοποιητικό δοκιμασίας.

Στην περίπτωση αναλύσεων που πραγματοποιούνται στο πλαίσιο των ελέγχων συμμόρφωσης, πραγματοποιείται μία δοκιμή. Στην περίπτωση αναλύσεων επανελέγχου, ο επικεφαλής της ομάδας πρέπει να πραγματοποιεί διπλή ανάλυση σε χωριστές συνεδριάσεις. Η διάμεση τιμή των ιδιοτήτων υπολογίζεται βάσει του συνόλου των δεδομένων που αναφέρονται στο φύλλο χαρακτηρισμού και για τις δύο δοκιμές.



Σχήμα 1

ΦΥΛΛΟ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΥ ΠΑΡΘΕΝΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ

Ένταση αντίληψης των ελαττωμάτων

Ατροχάδο/Μούργα

 

 

Μουχλιασμένο/νοτισμένο/χωματίλα

 

 

Κρασώδες/ξιδάτο

Ξινό/ξινισμένο

 

 

Παγωμένης ελιάς

(υγρό ξύλο)

 

 

Ταγκό

 

 

Άλλες αρνητικές ιδιότητες:

 

 

Περιγραφή:

Μεταλλικό Άχυρο Σκουληκιασμένο Τραχύ

Άλμη Ψημένο ή καμένο Φυτικά υγρά

Σπάρτο Αγγουρώδες Γράσο

Ένταση αντίληψης των θετικών ιδιοτήτων

Φρουτώδες

 

 

 

Άγουρο

Ώριμο

Πικρό

 

 

Πικάντικο

 

 

 

 

 

Όνομα του δοκιμαστή:

 

Κωδικός δοκιμαστή:

Κωδικός δείγματος:

Υπογραφή:

Ημερομηνία:

Παρατηρήσεις:

▼M26




Προσάρτημα

Μεθοδοσ υπολογισμου τησ διαμεσησ τιμησ και των διαστηματων εμπιστοσυνησ

Διάμεση τιμή

image

Η διάμεση τιμή ορίζεται ως ο πραγματικός αριθμός Xm που χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι η πιθανότητα (p) να είναι οι τιμές (X) της κατανομής μικρότερες από τον αριθμό αυτόν (Xm) είναι μικρότερη ή ίση με 0,5 και ότι, ταυτόχρονα, η πιθανότητα (p) να είναι οι τιμές (X) της κατανομής μικρότερες ή ίσες με Xm είναι μεγαλύτερη ή ίση με 0,5. Σύμφωνα με έναν πιο πρακτικό ορισμό, η διάμεση τιμή είναι το 50ό εκατοστημόριο μιας κατανομής αριθμών διατεταγμένων κατ’ αύξουσα σειρά. Με πιο απλά λόγια, είναι ο κεντρικός αριθμός ενός συνόλου διατεταγμένων αριθμών των οποίων το πλήθος είναι περιττός αριθμός ή ο μέσος όρος των δύο κεντρικών αριθμών ενός συνόλου διατεταγμένων αριθμών των οποίων το πλήθος είναι άρτιος αριθμός.

Ανθεκτική τυπική απόκλιση

Προκειμένου να εκτιμηθεί αξιόπιστα η μεταβλητότητα γύρω από τη μέση τιμή, είναι απαραίτητη η αναφορά στην ανθεκτική τυπική απόκλιση κατά Stuart και Kendall (4). Ο τύπος εκφράζει την ασυμπτωτική ανθεκτική τυπική απόκλιση, δηλ. την ανθεκτική εκτίμηση της μεταβλητότητας των εξεταζόμενων δεδομένων, όπου N είναι ο αριθμός των παρατηρήσεων και IQR το ενδοτεταρτημοριακό διάστημα, το οποίο περιλαμβάνει ακριβώς το 50 % των περιπτώσεων μιας δεδομένης κατανομής πιθανότητας:

image

Το ενδοτεταρτημοριακό εύρος υπολογίζεται με υπολογισμό του μεγέθους της διαφοράς μεταξύ του 75ου και του 25ου εκατοστημορίου.

image

όπου εκατοστημόριο είναι η τιμή Xpc που χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι η πιθανότητα (p) να είναι οι τιμές της κατανομής μικρότερες της Xpc είναι μικρότερη ή ίση με ένα συγκεκριμένο εκατοστό και ότι, ταυτόχρονα, η πιθανότητα (p) να είναι οι τιμές της κατανομής μικρότερες ή ίσες με τη Xpc είναι μεγαλύτερη ή ίση με το εν λόγω εκατοστό. Εκατοστό είναι το επιλεγόμενο κλάσμα της λαμβανόμενης κατανομής. Στην περίπτωση της διάμεσης τιμής, ισούται με το 50/100.

image

Πρακτικά, εκατοστημόριο είναι η τιμή κατανομής που αντιστοιχεί σε καθορισμένο εμβαδόν, το οποίο οριοθετείται από την καμπύλη κατανομής ή πυκνότητας. Για παράδειγμα, το 25ο εκατοστημόριο αντιπροσωπεύει την τιμή κατανομής που αντιστοιχεί σε εμβαδόν ίσο με 0,25 ή 25/100.

Στο πλαίσιο της παρούσας μεθόδου, τα εκατοστημόρια υπολογίζονται βάσει των πραγματικών τιμών που εμφανίζονται στον πίνακα δεδομένων (διαδικασία υπολογισμού εκατοστημορίων).

Ανθεκτικός συντελεστής μεταβλητότητας (%)

Ο CVr% αποτελεί καθαρό αριθμό που δείχνει το επί τοις εκατό ποσοστό μεταβλητότητας του αναλυόμενου συνόλου αριθμών. Για τον λόγο αυτόν, ο εν λόγω συντελεστής είναι πολύ χρήσιμος για τον έλεγχο της αξιοπιστίας των δοκιμαστών της ομάδας.

image

Διαστήματα εμπιστοσύνης 95 % για τη διάμεση τιμή

Τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95 % (τιμή του σφάλματος πρώτης τάξης ίση με 0,05 ή 5 %) αντιπροσωπεύουν το εύρος εντός του οποίου θα μπορούσε να κυμαίνεται η διάμεση τιμή εάν ήταν δυνατή η επανάληψη του πειράματος άπειρες φορές. Στην πράξη, δείχνουν το εύρος διακύμανσης της δοκιμής υπό τις συνθήκες λειτουργίας που έχουν επιλεγεί, με την παραδοχή ότι είναι δυνατή η επανάληψη της δοκιμασίας πολλές φορές. Όπως και ο CVr%, το διάστημα βοηθά στην εκτίμηση της αξιοπιστίας της δοκιμής.

image

image

όπου C = 1,96 στην περίπτωση του διαστήματος εμπιστοσύνης 95%.

Παράδειγμα του φύλλου υπολογισμού παρατίθεται στο παράρτημα Ι του προτύπου IOC/T 20/Doc. Νο 15.

Βιβλιογραφια

(1) Wilkinson, L. 1990. Systat: The system for statistics. Evanston, IL.SYSTAT Α.Ε.

(2) Cicchitelli, G. 1984. Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.

(3) Massart, D.L.; Vandeginste, B.G.M.; Deming, Y.; Michotte, L. 1988. Chemometrics. A textbook. Elsevier. Amsterdam.

(4) Kendall, M.G.; Stuart, A. 1967. The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co.

(5) McGill, R.; Tukey, J.W.; Larsen, W.A. 1978. Variation of Box Plots. The American Statistician, 32, (2), 12-16.

(6) IOC/T.28/Doc. No 1 September 2007, Guidelines for the accreditation of sensory testing laboratories with particular reference to virgin olive oil according to standard ISO/IEC 17025:2005.

(7) IOC/T.20/Doc. No 14.

(8) IOC/T.20/Doc. No 15.

(9) ISO/IEC 17025:05.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XV

1.   ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΕ ΕΛΑΙΟ ΤΩΝ ΕΛΑΙΟΠΥΡΗΝΩΝ

1.1.   Εξοπλισμός

 κατάλληλη συσκευή εκχυλίσεως εφοδιασμένη με σφαιρική φιάλη των 200 έως 250 ml,

 λουτρό ηλεκτρικής θερμάνσεως (αμμόλουτρο, υδρόλουτρο κ.λπ.) θερμαινόμενη πλάκα,

 αναλυτικός ζυγός,

 φούρνος ρυθμισμένος στους 80 °C το μέγιστο,

 φούρνος ηλεκτρικής θερμάνσεως εφοδιασμένος με θερμοστατικό μηχάνημα, ρυθμισμένος στους 103 ± 2 °C με μηχανισμό εμφυσήσεως αέρος η μειώσεως της πιέσεως,

 μηχανικός μύλος εύκολα καθαριζόμενος, που να επιτρέπει τη σύνθλιψη, χωρίς να επιφέρει ανύψωση της θερμοκρασίας ή αισθητή μεταβολή της περιεκτικότητος σε υγρασία και έλαιο,

  ►C1  φύσιγγα εκχυλίσεως και υδρόφιλος βάμβαξ ◄ ή διηθητικός χάρτης, απαλλαγμένα συστατικών εκχυλιζομένων με το εξάνιο,

 ξηραντήρας,

 κόσκινο διαμέτρου οπών 1 mm,

 μικρά τεμαχίδια ξηρανθείσης ελαφρόπετρας.

1.2.   Αντιδραστήρια

Κανονικό εξάνιο (technical grade), το οποίο μετά από πλήρη εξάτμιση να αφήνει υπόλειμμα το πολύ 0,002 g ανά 100 ml.

2.   ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

2.1.   Παρασκευή του δείγματος δοκιμής

Αλέθουμε το εργαστηριακό δείγμα εάν παρίσταται ανάγκη, με μηχανικό μύλο, καλά καθαρισμένο, ώστε νά λάβουμε τεμάχια που να δύνανται να διέλθουν από το κόσκινο.

Χρησιμοποιούμε το εικοστό περίπου του δείγματος για τον πλήρη καθαρισμό του μύλου, απορρίπτουμε το άλεσμα αυτό, αλέθουμε την υπόλοιπη ποσότητα, τη συλλέγουμε, την αναμειγνύουμε προσεκτικά και την αναλύουμε αμέσως.

2.2.   Ποσότης δοκιμής

Μόλις ολοκληρωθεί η εργασία λειοτριβήσεως, ζυγίζουμε 10 g του δείγματος δοκιμής με ακρίβεια 0,01 g.

2.3.   Προετοιμασία των εκχυλιστικών δακτυλίων (cartouche)

Τοποθετούμε το δείγμα δοκιμής εντός του δακτύλιου και πωματίζουμε με ►C1  υδρόφιλο βάμβακα ◄ . Αν χρησιμοποιείται διηθητικός χάρτης, το άλεσμα τυλίγεται μέσα σ' αυτόν.

2.4.   Προκαταρκτική ξήρανση

Αν ο ελαιοπυρήνας είναι πολύ υγρός (παραδείγματος χάρη περιεκτικότητα σε υγρασία και πτητικές ύλες άνω του 10 %), ξηραίνουμε αυτόν προκαταρκτικώς διά τοποθετήσεως του ετοίμου δακτυλίου (ή του διηθητικού χάρτου) επί τι χρονικό διάστημα μέσα σε φούρνο θερμανθέντα σε θερμοκρασία όχι ανώτερη των 80 °C γιά να ελαττώσουμε την περιεκτικότητα σε υγρασία και πτητικές ύλες κάτω του 10 %.

2.5.   Προετοιμασία της σφαιρικής φιάλης

Ζυγίζουμε, με ακρίβεια 1 mg, φιάλη περιέχουσα ένα ή δύο τεμαχίδια ελαφρόπετρας, προηγουμένως ξηρανθείσα μέσα σε φούρνο στούς 103 ± 2 °C και εν συνεχεία ψυχθείσα μέσα σε ξηραντήρα γιά διάστημα τουλάχιστον μίας ώρας.

2.6.   Πρώτη εκχύλιση

Μέσα στη συσκευή εκχυλίσεως εισάγουμε ►C1  τη φύσιγγα ◄ (ή το διηθητικό χάρτη) που περιέχει την ποσότητα δοκιμής. Χύνουμε εντός της σφαιρικής φιάλης την απαραίτητη ποσότητα εξανίου. Συνδέουμε τη φιάλη με τή συσκευή εκχυλίσεως και το σύνολο τοποθετείται στο ηλεκτρικά θερμαινόμενο λουτρό. Ρυθμίζουμε τη θέρμανση κατά τέτοιο τρόπο ώστε η ταχύτης επαναρροής να είναι τουλάχιστον 3 σταγόνες το δευτερόλεπτο (βρασμός μέτριος, όχι ισχυρός).

Μετά τέσσερις ώρες εκχυλίσεως ψύχουμε. Απομακρύνουμε ►C1  τη φύσιγγα ◄ από τη συσκευή εκχυλίσεως και το θέτουμε σε ρεύμα αέρος για να απομακρύνουμε τον εμποτισθέντα διαλύτη.

2.7.   Δεύτερη εκχύλιση

Αδειάζουμε ►C1  τη φύσιγγα ◄ εντός μικρο-αλεστήρος και αλέθουμε σε όσο το δυνατό λεπτότερα τεμάχια Επαναφέρουμε το μείγμα πάλι μέσα ►C1  στη φύσιγγα ◄ ποσοτικά και τοποθετούμέ το δακτύλιο μέσα στη συσκευή εκχυλίσεως.

Συνεχίζουμε την εκχύλιση για δύο επιπλέον ώρες, χρησιμοποιώντας την ίδια σφαιρικη φιάλη που περιέχει το πρώτο εκχύλισμα.

Το λαμβανόμενο στη φιάλη εκχυλίσεως διάλυμα πρέπει να είναι διαυγές. Αν δεν είναι, το διηθούμε με διηθητικό χάρτη και ξεπλένουμε την αρχική φιάλη και το διηθητικό χάρτη αρκετές φορές με εξάνιο. Συλλέγουμε το διήθημα και το διαλύτη της πλύσεως εντός δευτέρας σφαιρικής φιάλης, η οποία έχει προηγουμένως ξηρανθεί και ζυγισθεί με ακρίβεια 1 mg.

2.8.   Απομάκρυνση του διαλύτου και ζύγιση του εκχυλίσματος

Απομακρύνουμε το μεγαλύτερο μέρος του διαλύτου δι' αποστάξεως επί ηλεκτρικώς θερμαινομένου λουτρού. Απομακρύνουμε τα τελευταία ίχνη του διαλύτου θερμαίνοντας τη φιάλη μέσα σε φούρνο στους 103 ° ± 2 °C για 20 λεπτά. Διευκολύνουμε την απομάκρυνση αυτή είτε δι' εμφυσήσεως, κατά διαλείμματα αέρος, ή προτιμότερο αδρανούς αερίου, είτε διά μειώσεως της πιέσεως.

Αφήνουμε τη φιάλη να ψυχθεί μέσα σε ξηραντήρα επί μια τουλάχιστον ώρα και ζυγίζουμε με ακρίβεια 1 mg.

Θερμαίνουμε εκ νέου για 10 λεπτά με τις ίδιες συνθήκες, ψύχουμε μέσα στον ξηραντήρα και ζυγίζουμε.

Η διαφορά μεταξύ των δύο ζυγίσεων δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 10 mg. Αν όχι, θερμαίνουμε εκ νέου για διάστημα 10 λεπτών, ψύχουμε και ζυγίζουμε, επαναλαμβάνοντας την εργασία μέχρις ότου η διαφορά βάρους μεταξύ δύο ζυγίσεων να μην είναι μεγαλύτερη από 10 mg. Λαμβάνουμε υπόψη την τελευταία ζύγιση της φιάλης.

Εκτελούμε δύο προσδιορισμούς επί του αυτού δείγματος δοκιμής.

3.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

3.1.   Τρόπος υπολογισμού και τύπος

α) Το εκχύλισμα εκπεφρασμένο επί τοις εκατό κατά μάζα του προϊόντος ως έχει, ισούται με:

image

όπου:

S = είναι το ποσοστό επί τοις % κατά μάζα του εκχυλίσματος του προϊόντος ως έχει,

m0 = είναι η μάζα, σε γραμμάρια, της ποσότητος δοκιμής,

m1 = είναι η μάζα, σε γραμμάρια, του εκχυλίσματος μετά την ξήρανση.

Λαμβάνουμε ως αποτέλεσμα τον αριθμητικό μέσο όρο των δύο προσδιορισμών εφόσον πληρούνται οι προϋποθέσεις επαναληπτικότητος.

Εκφράζουμε το αποτέλεσμα με ένα δεκαδικό ψηφίο.

β) Το εκχύλισμα ανάγεται επί ξηράς ουσίας με τον ακόλουθο τύπο:



image

= εκχύλισμα επί τοις εκατό λιπαρό ξηρό.

όπου:

S = είναι το ποσοστό κατά μάζα του εκχυλίσματος του προϊόντος ως έχει [βλέπε στοιχείο α)],

U = είναι η περιεκτικότης σε υγρασία και πτητικές ύλες.

3.2.   Επαναληπτικότης

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο προσδιορισμών, οι οποίοι πραγματοποιούνται συγχρόνως ή ταχέως ο ένας μετά τον άλλο από τον ίδιο αναλύτη, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,2 g εκχυλίσματος εξανίου ανά 100 g δείγματος.

Σε αντίθετη περίπτωση, επαναλαμβάνουμε την ανάλυση με δύο άλλες ποσότητες δοκιμής. Αν και πάλι η διαφορά υπερβαίνει τα 0,2 g, λαμβάνουμε ως αποτέλεσμα τον αριθμητικό μέσο όρο των τεσσάρων πραγματοποιηθέντων προσδιορισμών.




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVI

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΙΩΔΙΟΥ

1.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

►C1  Η διεθνής αυτή προδιαγραφή περιγράφει ◄ μέθοδο προσδιορισμού του αριθμού ιωδίου στα ζωικά και φυτικά λίπη και έλαια το οποία αναφέρονται στο εξής ως λιπαρές ουσίες.

2.   ΟΡΙΣΜΟΣ

►C1  Για τους σκοπούς της παρούσης διεθνούς προδιαγραφής ◄ εφαρμόζεται ο ακόλουθος ορισμός:

2.1.

Αριθμός ιωδίου· η μάζα του ιωδίου που απορροφάται από το δείγμα υπό τις συνθήκες εργασίας που καθορίζονται στο παρόν διεθνές πρότυπο.

Ο αριθμός ιωδίου εκφράζεται σε γραμμάρια ιωδίου ανά 100 g δείγματος.

3.   ΑΡΧΗ

Διάλυση του δείγματος στο διαλύτη και προσθήκη αντιδραστήριου Wijs. Προσθήκη μετά την πάροδο καθορισμένου χρόνου διαλύματος ιωδιούχου καλίου και νερού και τιτλοδότηση του ιωδίου που ελευθερώθηκε με διάλυμα θειοθειικού νατρίου.

4.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι ανεγνωρισμένης αναλυτική καθαρότητας.

4.1.

Ιωδιούχο κάλιο, διάλυμα 100 g/l, απαλλαγμένο ιωδικών ιόντων ή ελευθέρου ιωδίου.

4.2.

Διάλυμα αμύλου

Αναμειγνύονται 5 g διαλυτού αμύλου με 30 ml ύδατος, το μείγμα διαλύεται με 1 000 ml ζέοντος ύδατος, ζέεται επί 3 λεπτά και αφήνεται να ψυχθεί.

4.3.

Θειοθειικό νάτριο, πρότυπο διάλυμα C (Na2S2O3 · 5H2O) = 0,1 mol/l, το οποίο έχει τιτλοδοτηθεί το πολύ 7 ημέρες πριν από τη χρήση.

4.4.

Διαλύτης, για την παρασκευή του οποίου αναμείχθηκαν ίσοι όγκοι κυκλοεξανίου και οξικού οξέος.

4.5.

Αντιδραστήριο Wijs, ήτοι διάλυμα μονοχλωριούχου ιωδίου σε οξικό οξύ. Χρησιμοποιείται αντιδραστήριο Wijs του εμπορίου.

Σημείωση:

Το αντιδραστήριο περιέχει 9 g ICL3 + 9 g I σε οξικό οξύ.

5.   ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΚΕΥΗ

Συνήθη εργαστηριακά όργανα και σκεύη και ιδίως τα κατωτέρω:

5.1.

Γυάλινα κοχλιάρια ζυγίσεως κατάλληλα για την ελεγχόμενη ποσότητα και για την εισαγωγή της στις φιάλες (5.2).

5.2.

Κωνικές φιάλες χωριτικότητας 500 ml με εσμυρισμένα πώματα και τελείως ξηρές.

6.   ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ

Το ομογενοποιημένο δείγμα ξηραίνεται με θειικό νάτριο και διηθείται.

7.   ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

7.1.

Βάρος δείγματος

Το βάρος του δείγματος ποικίλλει ανάλογα με τον αναμενόμενο αριθμό ιωδίου όπως προκύπτει από τον πίνακα 1.



Πίνακας Ι

Αναμενόμενος αριθμός ιωδίου

Βάρος δείγματος (g)

μικρότερος από 5

3,00

5 έως 20

1,00

21 έως 50

0,40

51 έως 100

0,20

101 έως 150

0,13

151 έως 200

0,10

Το δείγμα ζυγίζεται με προσέγγιση 0,1 mg στο γυάλινο κοχλιάριο ζυγίσεως (5.1).

7.2.

Ποσοτικός προσδιορισμός

Το ζυγισθέν δείγμα φέρεται σε κωνική φιάλη των 500 ml (5.2). Προστίθενται 20 ml διαλύτη (4.4) για τη διάλυση της λιπαράς ουσίας. Ακολούθως προστίθενται επακριβώς 25 ml αντιδραστηρίου Wijs (4.5), τοποθετείται το πώμα, η φιάλη ανακινείται και τοποθετείται σε σκοτεινό μέρος. Για τη λήψη του αντιδραστηρίου Wijs δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί σιφώνιο που απαιτεί αναρρόφηση με το στόμα.

Κατά τον ίδιο τρόπο παρασκευάζεται το τυφλό διάλυμα με διαλύτη και αντιδραστήριο αλλά χωρίς δείγμα.

Για τα δείγματα των οποίων η τιμή ιωδίου είναι μικρότερη από 150, οι φιάλες αφήνονται σε σκοτεινό μέρος επί 1 ώρα. Όταν πρόκειται για δείγματα με αριθμό ιωδίου μεγαλύτερο από 150 και για πολυμερισμένα προϊόντα ή προϊόντα με σημαντικό βαθμό οξείδωσης, οι φιάλες αφήνονται σε σκοτεινό μέρος επί 2 ώρες.

Μετά την πάροδο του απαιτούμενου χρόνου προστίθενται σε καθεμία από τις φιάλες 20 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (4.1) και 150 ml νερού.

Ακολουθεί ογκομέτρηση με το πρότυπο διάλυμα θειοθειικού νατρίου (4.3) έως ότου εξαφανισθεί σχεδόν τελείως το κίτρινο χρώμα που οφείλεται στο ιώδιο. Προστίθενται λίγες σταγόνες διαλύματος αμύλου (4.2) και η ογκομέτρηση συνεχίζεται μέχρι την πρώτη εξαφάνιση του κυανού χρώματος μετά από ισχυρή ανάδευση.

Σημείωση:

Ο ποτενσιομετρικός προσδιορισμός του τέλους της αντιδράσεως επιτρέπεται.

7.3.

Αριθμός προσδιορισμών

Για κάθε δείγμα πραγματοποιούνται δύο ποσοτικοί προσδιορισμοί.

8.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Ο αριθμός ιωδίου δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:

image

όπου:

c = η αριθμητική τιμή της ακριβούς συγκεντρώσεως, σε mol ανά λίτρο, του προτύπου διαλύματος θειοθειικού νατρίου (4.3) που χρησιμοποιήθηκε,

V1 = η αριθμητική τιμή του όγκου, σε ml, του προτύπου διαλύματος θειοθειικού νατρίου (4.3) που χρησιμοποιήθηκε για την τυφλή δοκιμασία,

V2 = η αριθμητική τιμή του όγκου, σε ml, του προτύπου διαλύματος θειοθειικού νατρίου (4.3) που χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό,

m = η αριθμητική τιμή της μάζας, σε g, του δείγματος (7.1).

Λαμβάνεται ως αποτέλεσμα ο αριθμητικός μέσος όρος των δύο προσδιορισμών, υπό την προϋπόθεση ότι τηρούνται οι απαιτήσεις όσον αφορά την επαναληψιμότητα.

▼M11




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVII

ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΣΤΑΔΙΕΝΙΩΝ ΣΕ ΦΥΤΙΚΑ ΕΛΑΙΑ

1.   ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Προσδιορισμός των στιγματαδιενίων σε φυτικά έλαια χαμηλής περιεκτικότητας στους εν λόγω υδρογονάνθρακες, κυρίως σε παρθένα ελαιόλαδα και σε ακατέργαστα πυρηνέλαια.

2.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Η μέθοδος είναι εφαρμόσιμη για όλα τα φυτικά έλαια, οι μετρήσεις όμως είναι αξιόπιστες μόνον όταν η περιεκτικότητα του ελαίου στους εν λόγω υδρογονάνθρακες περιλαμβάνεται μεταξύ των τιμών 0,01 και 4,0 mg/kg. Η μέθοδος προσφέρεται κυρίως για την ανίχνευση της παρουσίας εξευγενισμένων (ραφιναρισμένων) φυτικών ελαίων (ελαιολάδων, πυρηνελαίων, ηλιανθελαίων, φοινικελαίων, κ.λπ.) στο παρθένο ελαιόλαδο, αφού τα εξευγενισμένα έλαια περιέχουν στιγμασταδιένια ενώ τα παρθένα όχι.

3.   ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Απομόνωση των ασαπωνοποίητων υλών, διαχωρισμός του κλάσματος στεροειδών υδρογονανθράκων με χρωματογραφία στήλης επί πηκτής διοξειδίου του πυριτίου (silica gel) και ανάλυση με αέριο χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

4.   ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

4.1.

Φιάλες των 250 ml με επίπεδο πυθμένα κατάλληλες για χρήση με ψυκτήρα αναρροής.

4.2.

Διαχωριστικές χοάνες των 500 ml.

4.3.

Σφαιρικές φιάλες των 100 ml.

4.4.

Περιστροφικός εξατμιστήρας.

4.5.

Υάλινη στήλη χρωματογραφίας εσωτερικής διαμέτρου 1,5-2,0 cm και μήκους 50 cm, με στρόφιγγα Teflon και βύσμα από υαλοβάμβακα ή δίσκο από συντετηγμένο γυαλί στον πυθμένα. Για να ετοιμαστεί η στήλη silica gel, εισάγεται μέσα στην υάλινη στήλη εξάνιο μέχρι ύψους 5 cm περίπου και εν συνεχεία η στήλη πληρούται με υδαρές μείγμα silica gel και εξανίου (15 g σε 40 ml) το οποίο προστίθεται τμηματικά. Το περιεχόμενο της στήλης αφήνεται σε ηρεμία και η καθίζηση ολοκληρώνεται με ελαφρά ανατάραξη. Προστίθεται άνυδρο θειικό νάτριο μέχρι ύψους 0,5 cm περίπου και τέλος εκλούεται η περίσσεια εξανίου.

4.6.

Χρωματογράφος αερίου με ανιχνευτή ιονισμού δια φλογός, split ή διάταξη έγχυσης εν ψυχρώ, ενσωματωμένη στη στήλη και κλίβανος προγραμματιζόμενης θερμοκρασίας με ακρίβεια ± 1 °C.

4.7.

Τριχοειδής στήλη από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου για αέριο χρωματογραφία (εσωτερικής διαμέτρου 0,25 ή 0,30 mm και μήκους 25 m), με επίστρωση από 5 % - φαινυλομεθυλοσιλικόνη πάχους 0,25 mm.

Σημείωση 1.

Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες στήλες ανάλογης ή μικρότερης πολικότητας.

4.8.

Καταγραφέας-ολοκληρωτής με δυνατότητα ολοκλήρωσης κοιλάδα προς κοιλάδα.

4.9.

Μικροσύριγγα των 5-10 ml για αέριο χρωματογραφία με σκληρυμμένη βελόνη.

4.10.

Ηλεκτρικό θερμαντήρα ή εστία.

5.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικής καθαρότητος, εκτός εάν διευκρινίζεται διαφορετικά. Το χρησιμοποιούμενο νερό πρέπει να είναι απεσταγμένο ή τουλάχιστον ισοδύναμης καθαρότητας.

5.1.

Εξάνιο ή μείγμα αλκανίων σημείου ζέσεως 65-70 °C, αποσταζόμενο σε αποστακτική ύλη.

Σημείωση 2.

Ο διαλύτης πρέπει να αποστάζεται ώστε να απομακρύνονται οι ξένες προσμείξεις.

5.2.

Αιθανόλη 96 κ.ό.

5.3.

Άνυδρο θειικό νάτριο.

5.4.

Αλκοολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου 10 %. Προστίθενται 10 ml ύδατος σε 50 g υδροξειδίου του καλίου, το διάλυμα αναδεύεται και εν συνεχεία αραιώνεται με αιθανόλη μέχρις όγκου 500 ml.

Σημείωση 3.

Το αλκοολικό διάλυμα ποτάσας γίνεται φαιόχρουν όσο παραμένει· γι' αυτό πρέπει να παρασκευάζεται σε ημερήσια βάση και να φυλάσσεται σε καλώς πωματισμένες σκούρες υάλινες φιάλες.

5.5.

Silica gel 60 για χρωματογραφία στήλης, άνοιγμα βροχίδων 70-230 (αριθ. αναφ. Merck 7734 ή ανάλογος).

Σημείωση 4.

Η silica gel μπορεί συνήθως να χρησιμοποιείται απευθείας από το δοχείο χωρίς προηγούμενη επεξεργασία. Ωστόσο, μερικές παρτίδες ενδέχεται να παρουσιάσουν χαμηλού βαθμού δραστηριότητα με αποτέλεσμα κακής ποιότητας χρωματογραφικό διαχωρισμό. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η επεξεργασία της silica gel πρέπει να γίνεται με τον ακόλουθο τρόπο: αποενεργοποιείται η silica gel με θέρμανση επί τέσσερις τουλάχιστον ώρες σε θερμοκρασία 550 °C. Μετά τη θέρμανση, τοποθετείται σε ξηραντήρα ενόσω ψύχεται, και εν συνεχεία μεταφέρεται σε πωματισμένη φιάλη. Προστίθεται 2 % ύδατος και η φιάλη αναταράσσεται μέχρις ότου δεν υπάρχουν πλέον σβώλοι, αλλά σκόνη που αιωρείται ελεύθερα.

Εάν από διάφορες παρτίδες silica gel ληφθούν χρωματογραφήματα με αλληλεπικαλυπτόμενες κορυφές, η επεξεργασία της πρέπει να γίνει κατά τον ανωτέρω περιγραφόμενο τρόπο. Μια άλλη λύση θα ήταν να χρησιμοποιηθεί silica gel 60 εξαιρετικής καθαρότητας (αριθ. αναφ. Merck 7754).

5.6.

Μητρικό διάλυμα (200 ppm) χολησταδιενί-3,5-ου (Sigma, καθαρότητας 99 %) σε εξάνιο (10 mg σε 50 ml).

5.7.

Πρότυπο διάλυμα (συγκεντρώσεως 20 ppm) χολησταδιενί-3,5-ου σε εξάνιο, λαμβανόμενο με αραίωση του ανωτέρω διαλύματος.

Σημείωση 5.

Διατηρούμενα σε θερμοκρασία κατώτερη των 4 °C, τα διαλύματα των σημείων 5.6 και 5.7 μπορούν να παραμείνουν αναλλοίωτα επί τέσσερις τουλάχιστον μήνες.

5.8.

Διάλυμα n-εικοσιεννεανενίου σε εξάνιο συγκεντρώσεως περίπου 100 ppm.

5.9.

Φέρον αέριο για χρωματογραφία: ήλιο ή υδρογόνο καθαρότητας 99,9990 %.

5.10.

Βοηθητικά αέρια για ανιχνευτή ιονισμού διά φλογός: υδρογόνο καθαρότητα 99,9990 % και καθαρισμένος αέρας.

6.   ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

6.1.   Προετοιμασία των ασαπωνοποίητων υλών:

6.1.1.

Ζυγίζονται 20 ± 0,1 g ελαίου μέσα σε φιάλη των 250 ml (σημείο 4.1), προστίθεται 1 ml πρότυπου διαλύματος χολησταδιενί-3,5-ου (20mg) και 75 ml αλκοολικού διαλύματος ποτάσας 10 %, συναρμολογείται ο ψυκτήρας αναρροής και ακολουθεί θέρμανση μέχρι ελαφρού βρασμού επί 30 λεπτά. Απομακρύνεται η φιάλη που περιέχει το δείγμα από τη θερμότητα και το διάλυμα αφήνεται να ψυχθεί ελαφρά (το διάλυμα δεν αφήνεται να ψυχθεί εντελώς γιατί τότε το δείγμα θα στερεοποιηθεί). Προστίθενται 100 ml ύδατος και το διάλυμα μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη (σημείο 4.2) με τη βοήθεια 100 ml εξανίου. Το μείγμα ανακινείται ζωηρώς επί 30 δευτερόλεπτα και αφήνεται να ηρεμήσει μέχρι να σχηματισθούν οι στιβάδες.

Σημείωση 6.

Εάν σχηματισθεί γαλάκτωμα το οποίο διατηρείται, προστίθενται μικρές ποσότητες αιθανόλης.

6.1.2.

Η υποκείμενη υδατική φάση μεταφέρεται σε δεύτερη διαχωριστική χοάνη και εκχυλίζεται εκ νέου με 100 ml εξανίου. Αφήνεται να εκρεύσει για μια ακόμη φορά η κατώτερη φάση και εκπλύνονται τα εκχυλίσματα εξανίου (συνδυαζόμενα σε μια άλλη διαχωριστική χοάνη) τρεις φορές με 100 ml μείγματος αιθανόλης-ύδατος (1: 1) κάθε φορά, μέχρις ότου επιτευχθεί ουδέτερο pH.

6.1.3.

Το διάλυμα εξανίου διαβιβάζεται μέσω άνυδρου θειικού νατρίου (50 g), εκπλύνεται με 20 ml εξανίου και εξατμίζεται μέχρι ξηράνσεως μέσα σε περιστροφικό εξατμιστήρα σε θερμοκρασία 30 °C και υπό χαμηλή πίεση.

6.2.   Διαχωρισμός του κλάσματος στεροειδών υδρογονανθράκων:

6.2.1.

Το υπόλειμμα φέρεται στην κλασματική στήλη με τη βοήθεια δύο δόσεων εξανίου του 1 ml η καθεμία, αφήνεται το δείγμα να εκρεύσει επί της στήλης με ταπείνωση της στάθμης του διαλύματος μέχρι της ανωτάτης στάθμης του θειικού νατρίου και αρχίζει η χρωματογραφική έκλουση με εξάνιο με ταχύτητα ροής ίση προς 1 ml/min περίπου. Απορρίπτονται τα πρώτα 25-30 ml του εκλούσματος και συλλέγονται τα επόμενα 40 ml. Το κλάσμα αυτό μεταγγίζεται σε σφαιρική φιάλη των 100 ml.

Σημείωση 7.

Το πρώτο κλάσμα περιέχει κορεσμένους υδρογονάνθρακες (σχήμα 1α) και το δεύτερο κλάσμα περιέχει τους στεροειδείς. Με περαιτέρω έκλουση λαμβάνεται ο υδρογονάνθρακας squalene και συνεχείς ενώσεις. Για να επιτευχθεί ικανοποιητικός διαχωρισμός μεταξύ κορεσμένων και στεροειδών υδρογονανθράκων, οι όγκοι των κλασμάτων πρέπει να είναι οι καταλληλότεροι δυνατοί. Προς τούτο, ο όγκος του πρώτου κλάσματος πρέπει να προσαρμόζεται κατά τρόπον ώστε, κατά την ανάλυση του δεύτερου κλάσματος, οι κορυφές που αντιστοιχούν στους κορεσμένους υδρογονάνθρακες να είναι χαμηλές (βλέπε σχήμα 1γ)· αν δεν εμφανισθούν, αλλά η ένταση της κορυφής του πρότυπου διαλύματος είναι χαμηλή, τότε ο όγκος πρέπει να ελαττώνεται. Πάντως, δεν χρειάζεται να γίνεται πλήρης διαχωρισμός μεταξύ των συστατικών του πρώτου και του δεύτερου κλάσματος, αφού κατά την ανάλυση με αέριο χρωματογραφία δεν γίνεται αλληλεπικάλυψη κορυφών, εφόσον έχουν τηρηθεί οι συνθήκες αερίου χρωματογραφίας που αναφέρονται στο σημείο 6.3.1. Ούτε χρειάζεται κατά κανόνα να επιτυγχάνεται ο κατλληλότερος όγκος του δεύτερου κλάσματος, αφού με τα περαιτέρω συστατικά γίνεται ικανοποιητικός διαχωρισμός. Παρ' όλα αυτά, μια υψηλή κορυφή που σημειώνεται σε χρόνο κατακράτησης χαμηλότερο κατά 1,5 min περίπου από τον αντίστοιχο του πρότυπου διαλύματος οφείλεται στον υδρογονάνθρακα squalene και είναι ενδεικτική μη ικανοποιητικού διαχωρισμού.

6.2.2.

Το δεύτερο κλάσμα εξατμίζεται μέχρι ξηράνσεως μέσα σε εξατμιστήρα σε θερμοκρασία 30 °C και υπό χαμηλή πίεση, και αμέσως, μετά διαλύεται το υπόλειμμα σε 0,2 ml εξανίου. Το διάλυμα φυλάσσεται στο ψυγείο μέχρις ότου αναλυθεί.

Σημείωση 8.

Τα υπολείμματα των σημείων 6.1.3 και 6.2.2 δεν πρέπει να παραμένουν ξηρά και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Μόλις ληφθούν, πρέπει να προστίθεται ο διαλύτης και εν συνεχεία να φυλάσσονται στο ψυγείο.

6.3.   Αέριος χρωματογραφία:

6.3.1.

Συνθήκες εργασίας για διάταξη έγχυσης split:

 Θερμοκρασία στη διάταξη έγχυσης: 300 °C.

 Θερμοκρασία ανιχνευτή: 320 °C.

 Καταγραφέας-ολοκληρωτής: οι παράμετροι ολοκλήρωσης πρέπει να καθορίζονται κατά τρόπον ώστε ο υπολογισμός των εμβαδών να είναι ακριβής. Συνιστάται η ολοκλήρωση κοιλάδα προς κοιλάδα.

 Ευαισθησία: το δεκαεξαπλάσιο περίπου της ελάχιστης εξασθένησης.

 όγκος εγχεόμενου διαλύματος: 1ml.

 Θερμοκρασίες προγραμματισμού του κλιβάνου: αρχικά 235 °C επί 6 min και εν συνεχεία αύξηση κατά 2 °C/min μέχρι θερμοκρασίας 285 °C.

 Έγχυση με μερισμό ροής: 1: 15.

 Φέρον αέριο: ήλιο ή υδρογόνο υπό πίεση 120 kPa περίπου.

Οι συνθήκες αυτές μπορούν να προσαρμόζονται ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του χρωματογράφου και της στήλης, κατά τρόπον ώστε τα λαμβανόμενα χρωματογραφήματα να πληρούν τους ακόλουθους όρους: ο χρόνος κατακράτησης του διαλύματος εσωτερικού προτύπου θα αντιστοιχεί προς τους χρόνους που εμφαίνονται στο σημείο 6.3.2 με ακρίβεια ± 5 min· η κορυφή του διαλύματος εσωτερικού προτύπου θα αντιστοιχεί προς το 80 % τουλάχιστον της πλήρους κλίμακας.

Το σύστημα αέριας χρωματογραφίας πρέπει να ελέγχεται με έγχυση μείγματος από το μητρικό διάλυμα χολησταδιενίου (σημείο 5.6) και το διάλυμα n-εικοσιεννεανίου (σημείο 5.8). Η κορυφή που αντιστοιχεί στο χολησταδιέν-3,5-ιο πρέπει να εμφανίζεται πριν από την κορυφή που αντιστοιχεί στο n-εικοσιεννεάνιο (σχήμα 1γ)· εάν αυτό δεν συμβεί, υπάρχουν δύο λύσεις: να μειωθεί η αρχική θερμοκρασία του κλιβάνου ή/και να χρησιμοποιηθεί στήλη αερίου χρωματογραφίας μικρότερης πολικότητας.

6.3.2.

Ταυτοποίηση των κορυφών του φάσματος.

Η κορυφή του διαλύματος εσωτερικού προτύπου εμφανίζεται στα 19 min περίπου και το στιγμασταδιέν-3,5-ιο σε σχετικό χρόνο κατακράτησης ίσο προς 1,29 (βλέπε σχήμα 1β). Το στιγμασταδιέν-3,5-ιο συνοδεύεται από μικρές ποσότητες ισομερούς και, συνήθως, εμφανίζονται και τα δύο ως μία κορυφή χρωματογραφήματος. Παρόλα αυτά, εάν η στήλη είναι πολύ πολική ή έχει μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, το ισομερές μπορεί να εμφανίζεται ως μικρή κορυφή πριν και πολύ κοντά στην κορυφή του στιγμασταδιεν-3,5-ίου (σχήμα 2). Για να εξασφαλιστεί η έκλουση των στιγμασταδιενίων σε μία κορυφή συνιστάται η αντικατάσταση της στήλης με άλλη μικρότερης πολικότητας ή μεγαλύτερης εσωτερικής διαμέτρου.

Σημείωση 9.

Στιγμασταδιένια αναφοράς μπορούν να ληφθούν από την ανάλυση ενός εξευγενισμένου φυτικού ελαίου με τη χρησιμοποίηση μικρότερης ποσότητας δείγματος (1-2 g). Τα στιγμασταδιένια εμφανίζονται ως ευμεγέθης κορυφή που ταυτοποιείται εύκολα.

6.3.3.

Ποσοτικός προσδιορισμός

Η περιεκτιότητα σε στιγμασταδένιο προσδιορίζεται βάσει του τύπου:

στιγμασταδένια (mg/kg):

image



όπου:

Ab = εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στο στιγμασταδένιο (εάν η κορυφή αυτή χωρίζεται σε δύο, άθροισμα των εμβαδών που αντιστοιχούν στα δύο ισομερή)

Ac = εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου (χολησταδένιο)

Mc = μάζα (σε mg) του προστιθέμενου προτύπου

Mo = μάζα (σε g) του δείγματος ελαίου.

Το όριο ανίχνευσης κυμαίνεται γύρω από την τιμή 0,01 mg/kg.

image

image

Σχήμα 1

Χρωματογραφήματα αερίου ληφθέντα από δείγματα ελαιολάδου που αναλύθηκαν σε τριχοειδή στήλη (εσωτερικής διαμέτρου 0,25 mm και μήκους 25 m) από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, επιχρισμένη με 5 %- φαινυλομεθυλοσιλικόνη πάχους 0,25 mm.

α) Πρώτο κλάσμα (30 ml) από παρθένο ελαιόλαδο, ενισχυμένο με το πρότυπο διάλυμα.

β) Δεύτερο κλάσμα (40 ml) από ελαιόλαδο που περιέχει στιγμασταδιένια σε αναλογία 0,10 mg/kg.

γ) Δεύτερο κλάσμα (40 ml) που περιέχει μικρό ποσοστό του πρώτου κλάσματος.

image

Σχήμα 2

Χρωματογράφημα αερίου από δείγμα εξευγενισμένου ελαιολάδου που αναλύεται στη στήλη DB-5, το οποίο δείχνει το ισομερές του στιγμασταδιεν-3,5-ίου.

▼M25




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVIII

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΑΣ ΜΕΤΑΞΥ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΘΕΩΡΗΤΙΚΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΤΡΙΑΚΥΛΟΓΛΥΚΕΡΟΛΕΣ ΜΕ ECN 42

1.   ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Προσδιορισμός της απόλυτης διαφοράς μεταξύ των πειραματικών τιμών περιεκτικότητας σε τριακυλογλυκερόλες (TAG) με ισοδύναμο αριθμό ατόμων άνθρακα ίσο με 42 (ECN42HPLC), οι οποίες προσδιορίζονται στο έλαιο με υγροχρωματογραφία υψηλής επίδοσης (HPLC), και της θεωρητικής τιμής TAG με ισοδύναμο αριθμό ατόμων άνθρακα ίσο με 42 (ECN 42θεωρητικό), η οποία υπολογίζεται βάσει της σύστασης σε λιπαρά οξέα.

2.   ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Το πρότυπο ισχύει για το ελαιόλαδο. Η μέθοδος εφαρμόζεται για την ανίχνευση της παρουσίας μικρών ποσοτήτων σπορελαίων (πλούσιων σε λινελαϊκό οξύ) σε οποιαδήποτε κατηγορία ελαιολάδου.

3.   ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Στα γνήσια ελαιόλαδα η περιεκτικότητα σε τριακυλογλυκερόλες με ECN 42, προσδιοριζόμενη με ανάλυση HPLC, και η θεωρητική περιεκτικότητα σε τριακυλογλυκερόλες με ECN 42 (υπολογιζόμενη βάσει της σύστασης σε λιπαρά οξέα, η οποία προσδιορίζεται με χρωματογραφία αερίου-υγρού) συμπίπτουν εντός ενός ορίου. Διαφορές μεγαλύτερες από τις τιμές που έχουν υιοθετηθεί για κάθε τύπο ελαιολάδου υποδηλώνουν ότι το ελαιόλαδο περιέχει σπορέλαια.

4.   ΜΕΘΟΔΟΣ

Η μέθοδος υπολογισμού της θεωρητικής περιεκτικότητας σε τριακυλογλυκερόλες με ECN 42, καθώς και της διαφοράς σε σχέση με τα δεδομένα που προκύπτουν από την HPLC, συνίσταται ουσιαστικά στον συντονισμό αναλυτικών δεδομένων που έχουν ληφθεί με άλλες μεθόδους. Διακρίνονται τρεις φάσεις: προσδιορισμός της σύστασης σε λιπαρά οξέα με χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης, υπολογισμός της θεωρητικής σύστασης σε τριακυλογλυκερόλες με ECN 42, προσδιορισμός των τριακυλογλυκερολών με ECN 42.

4.1.    Εργαστηριακά σκεύη και όργανα

4.1.1.

Σφαιρικές φιάλες των 250 και 500 ml.

4.1.2.

Ποτήρια ζέσεως των 100 ml.

4.1.3.

Γυάλινη χρωματογραφική στήλη, εσωτερικής διαμέτρου 21 mm και μήκους 450 mm, με στρόφιγγα και τυποποιημένο κωνικό άκρο (θηλυκό) στην κορυφή.

4.1.4.

Διαχωριστικές χοάνες των 250 ml, με τυποποιημένο κωνικό άκρο (αρσενικό) στον πυθμένα, κατάλληλο για σύνδεση με την κορυφή της στήλης.

4.1.5.

Γυάλινη ράβδος μήκους 600 mm.

4.1.6.

Γυάλινο χωνί διαμέτρου 80 mm.

4.1.7.

Ογκομετρικές φιάλες των 50 ml.

4.1.8.

Ογκομετρικές φιάλες των 20 ml.

4.1.9.

Περιστροφικός εξατμιστήρας

4.1.10.

Υγροχρωμαογράφος υψηλής επίδοσης, με δυνατότητα θερμοστατικού ελέγχου της θερμοκρασίας της στήλης.

4.1.11.

Διατάξεις εισαγωγής δείγματος για παροχή 10 μl.

4.1.12.

Ανιχνευτής: διαφορικό διαθλασίμετρο. Η ευαισθησία πλήρους κλίμακας θα πρέπει να ισούται τουλάχιστον με 10–4 μονάδες δείκτη διάθλασης.

4.1.13.

Στήλη: σωλήνας από ανοξείδωτο χάλυβα, διαστάσεων 250 mm (μήκος) x 4,5 mm (εσωτερική διάμετρος), πληρωμένος με διοξείδιο του πυριτίου που περιέχει 22 έως 23 % άνθρακα σε μορφή δεκαοκτυλοσιλανίου, διαμέτρου σωματιδίων 5 μm.

4.1.14.

Λογισμικό επεξεργασίας δεδομένων.

4.1.15.

Φιαλίδια των 2 ml περίπου, με διάφραγμα (septum) επιστρωμένο με Teflon και βιδωτό πώμα.

4.2.    Αντιδραστήρια

Τα αντιδραστήρια θα πρέπει να είναι αναλυτικής καθαρότητας. Οι διαλύτες έκλουσης θα πρέπει να έχουν απαεριωθεί και είναι δυνατόν να ανακυκλώνονται επανειλημμένα, χωρίς αυτό να έχει επίδραση στους διαχωρισμούς.

4.2.1.

Πετρελαϊκός αιθέρας, κλάσμα 40-60 °C, χρωματογραφικής καθαρότητας, ή εξάνιο.

4.2.2.

Αιθυλαιθέρας, χωρίς υπεροξείδια, πρόσφατα αποσταγμένος.

4.2.3.

Διαλύτης έκλουσης για τον καθαρισμό του ελαίου με χρωματογραφία στήλης: μείγμα πετρελαϊκού αιθέρα-αιθυλαιθέρα 87:13 (v/v).

4.2.4.

Πυριτική πηκτή (silica gel) με κόκκους μεγέθους 70-230 mesh, τύπου Merck 7734, με τυποποιημένο ποσοστό υγρασίας 5 % (w/w).

4.2.5.

Υαλοβάμβακας.

4.2.6.

Ακετόνη για HPLC.

4.2.7.

Ακετονιτρίλιο ή προπιονιτρίλιο για HPLC.

4.2.8.

Διαλύτης έκλουσης HPLC: μείγμα ακετονιτριλίου-ακετόνης (οι αναλογίες ρυθμίζονται κατά τρόπο ώστε να επιτευχθεί ο επιθυμητός διαχωρισμός· εκκίνηση με μείγμα 50:50) ή προπιονιτρίλιο.

4.2.9.

Διαλύτης διαλυτοποίησης: ακετόνη

4.2.10.

Τριγλυκερίδια αναφοράς: είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν τριγλυκερίδια του εμπορίου (τριπαλμιτίνη, τριελαΐνη κ.λπ.) και στη συνέχεια να χαραχθεί καμπύλη των χρόνων κατακράτησης συναρτήσει του ισοδύναμου αριθμού ατόμων άνθρακα ή, εναλλακτικά, να χρησιμοποιηθούν χρωματογραφήματα αναφοράς που έχουν ληφθεί με σογιέλαιο, μείγμα σογιελαίου-ελαιολάδου σε αναλογία 30:70 και καθαρό ελαιόλαδο (βλέπε σημειώσεις 1 και 2 και σχήματα 1 έως 4).

4.2.11.

Στήλη εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) των 6 ml, με 1 g διοξειδίου του πυριτίου ως στερεά φάση.

4.3.    Προετοιμασία του δείγματος

Δεδομένου ότι είναι δυνατόν να ληφθούν ψευδοθετικά αποτελέσματα λόγω της παρουσίας ορισμένων παρεμποδιζουσών ουσιών, το δείγμα πρέπει να υποβάλλεται πάντα σε καθαρισμό σύμφωνα με τη μέθοδο 2.507 της IUPAC, η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των πολικών ενώσεων στις λιπαρές ύλες για τηγάνισμα.

4.3.1.    Ετοιμασία της χρωματογραφικής στήλης

Πληρούται η στήλη (4.1.3.) με περίπου 30 ml διαλύτη έκλουσης (4.2.3.) και έπειτα εισάγεται σε αυτή υαλοβάμβακας (4.2.5.), ωθούμενος προς τον πυθμένα της με τη βοήθεια της γυάλινης ράβδου (4.1.5.).

Σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml παρασκευάζεται εναιώρημα 25 g πυριτικής πηκτής (4.2.4.) σε 80 ml μείγματος έκλουσης (4.2.3.), το οποίο μεταγγίζεται κατόπιν στη στήλη με γυάλινο χωνί (4.1.6.).

Για να εξασφαλιστεί η πλήρης μετάγγιση της πυριτικής πηκτής στη στήλη, εκπλύνεται το ποτήρι ζέσεως με το μείγμα έκλουσης και τα εκπλύματα μεταγγίζονται επίσης στη στήλη.

Ανοίγεται η στρόφιγγα και αφήνεται ο διαλύτης να εκρεύσει από τη στήλη έως ότου η στάθμη του φθάσει σε ύψος περίπου 1 cm πάνω από την πυριτική πηκτή.

4.3.2.    Χρωματογραφία στήλης

Σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml (4.1.7.) ζυγίζονται, με ακρίβεια 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g ελαίου, το οποίο έχει προηγουμένως διηθηθεί, ομοιογενοποιηθεί και, εάν είναι απαραίτητο, αφυδατωθεί.

Το έλαιο διαλύεται σε περίπου 20 ml διαλύτη έκλουσης (4.2.3.), ενδεχομένως με ελαφρά θέρμανση για να διευκολυνθεί η διάλυση. Το διάλυμα ψύχεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και ο όγκος του συμπληρώνεται με διαλύτη έκλουσης.

Με τη βοήθεια ογκομετρικού σιφωνίου εισάγονται 20 ml του διαλύματος στη στήλη που έχει ετοιμαστεί σύμφωνα με το σημείο 4.3.1. Ανοίγεται η στρόφιγγα και αφήνεται ο διαλύτης να εκρεύσει έως ότου η στάθμη του φθάσει στο ύψος της στιβάδας πυριτικής πηκτής.

Ακολουθεί έκλουση με 150 ml διαλύτη έκλουσης (4.2.3.), του οποίου η παροχή ρυθμίζεται σε περίπου 2 ml/min (για τη διέλευση των 150 ml μέσω της στήλης απαιτούνται περίπου 60-70 λεπτά).

Το έκλουσμα συλλέγεται σε σφαιρική φιάλη των 250 ml (4.1.1.), προζυγισμένη σε κλίβανο, και ζυγίζεται με ακρίβεια. Απομακρύνεται ο διαλύτης υπό ελαττωμένη πίεση σε περιστροφικό εξατμιστήρα (4.1.9) και ζυγίζεται το υπόλειμμα, το οποίο χρησιμοποιείται για την παρασκευή του διαλύματος προς ανάλυση με HPLC και προς παρασκευή των μεθυλεστέρων.

Το ποσοστό ανάκτησης του δείγματος από τη στήλη πρέπει να είναι τουλάχιστον 90 % για τις κατηγορίες εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο, παρθένο ελαιόλαδο, εξευγενισμένο ελαιόλαδο και ελαιόλαδο και τουλάχιστον 80 % για το ελαιόλαδο λαμπάντε και το πυρηνέλαιο.

4.3.3.    Καθαρισμός με SPE

Ενεργοποιείται η στήλη διοξειδίου του πυριτίου SPE με τη διέλευση 6 ml εξανίου (4.2.3) υπό κενό, με μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η ξηρότητα.

Σε φιαλίδιο των 2 ml (4.1.15) ζυγίζονται 0,12 g, με ακρίβεια 0,001 g, και διαλύονται με 0,5 ml εξανίου (4.2.3).

Εισάγεται το διάλυμα στη στήλη SPE και ακολουθεί έκλουση με 10 ml μείγματος εξανίου-διαιθυλαιθέρα (87:13, v/v) (4.2.3).

Το συλλεγόμενο κλάσμα εξατμίζεται μέχρι ξηρού, σε περιστροφικό εξατμιστήρα (4.1.9), υπό ελαττωμένη πίεση και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το υπόλειμμα διαλύεται σε 2 ml ακετόνης (4.2.6) για ανάλυση τριακυλογλυκερολών (TAG).

4.4.    Ανάλυση με HPLC

4.4.1.    Προετοιμασία των δειγμάτων για χρωματογραφική ανάλυση

Παρασκευάζεται διάλυμα 5 % του προς ανάλυση δείγματος με ζύγιση 0,5 ± 0,001 g δείγματος σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml και συμπλήρωση του όγκου με 10 ml διαλύτη διαλυτοποίησης (4.2.9).

4.4.2.    Διαδικασία

Συναρμολογείται το χρωματογραφικό σύστημα. Διοχετεύεται διαλύτης έκλουσης (4.2.8) με παροχή 1,5 ml/min για τον καθαρισμό ολόκληρου του συστήματος και ακολουθεί αναμονή έως ότου σταθεροποιηθεί η γραμμή βάσης,

Εισάγονται 10 μl του δείγματος που έχει προετοιμαστεί σύμφωνα με το σημείο 4.3.

4.4.3.    Υπολογισμός και έκφραση των αποτελεσμάτων

Χρησιμοποιείται η μέθοδος κανονικοποίησης των εμβαδών, δηλαδή η παραδοχή ότι το άθροισμα των εμβαδών των κορυφών που αντιστοιχούν στις TAG με ECN 42 έως ECN 52 ισούται με 100 %.

Η σχετική εκατοστιαία αναλογία κάθε τριγλυκεριδίου υπολογίζεται από τον τύπο:

image

Τα αποτελέσματα θα πρέπει να εκφράζονται με δύο τουλάχιστον δεκαδικά ψηφία.

Βλέπε σημειώσεις 1 έως 4.

4.5.    Υπολογισμός της σύστασης σε τριακυλογλυκερόλες (γραμμομόρια %) από δεδομένα για τη σύσταση σε λιπαρά οξέα (εμβαδόν %)

4.5.1.    Προσδιορισμός της σύστασης σε λιπαρά οξέα

Η σύσταση σε λιπαρά οξέα προσδιορίζεται σύμφωνα με το πρότυπο ISO 5508, με τη χρήση τριχοειδούς στήλης. Οι μεθυλεστέρες παρασκευάζονται σύμφωνα με το έγγραφο COI/T.20/Doc. No 24.

4.5.2.    Λιπαρά οξέα για τους υπολογισμούς

Τα γλυκερίδια χωρίζονται σε ομάδες ανάλογα με τον ισοδύναμο αριθμό ατόμων άνθρακα (ECN), λαμβανομένων υπόψη των κατωτέρω ισοδυναμιών μεταξύ ECN και λιπαρών οξέων. Έχουν ληφθεί υπόψη μόνο λιπαρά οξέα με 16 και 18 άτομα άνθρακα, επειδή είναι τα μόνα που έχουν σημασία για το ελαιόλαδο. Τα λιπαρά οξέα θα πρέπει να κανονικοποιούνται στο 100 %.



Λιπαρό οξύ

Συντομογραφία

Μοριακό βάρος

(MW)

ECN

Παλμιτικό οξύ

P

256,4

16

Παλμιτελαϊκό οξύ

Po

254,4

14

Στεατικό οξύ

S

284,5

18

Ελαϊκό οξύ

O

282,5

16

Λινελαϊκό οξύ

L

280,4

14

Λινολενικό οξύ

Ln

278,4

12

4.5.3.    Μετατροπή του εμβαδού % σε γραμμομόρια για όλα τα λιπαρά οξέα (1)



image

image

image

image

image

image

4.5.4.    Κανονικοποίηση των γραμμομορίων λιπαρών οξέων στο 100 % (2)

image

image

image

image

image

image

Το αποτέλεσμα παρέχει την εκατοστιαία αναλογία κάθε λιπαρού οξέος, σε γραμμομόρια %, αδιακρίτως θέσης (1, 2 και 3) στις TAG.

Στη συνέχεια υπολογίζεται το άθροισμα των κορεσμένων λιπαρών οξέων (SFA) P και S και το άθροισμα των ακόρεστων λιπαρών οξέων (UFA) Po, O, L και Ln (3):

image

image

4.5.5.    Υπολογισμός της σύστασης σε λιπαρά οξέα στη θέση 2 και στις θέσεις 1 και 3 των TAG

Τα λιπαρά οξέα κατανέμονται σε τρεις ομάδες ως εξής: μια ομάδα για τη θέση 2 και δύο ίδιες μεταξύ τους ομάδες για τις θέσεις 1 και 3, με διαφορετικούς συντελεστές για τα κορεσμένα λιπαρά οξέα (P και S) και τα ακόρεστα (Po, O, L και Ln).

4.5.5.1.   Κορεσμένα λιπαρά οξέα στη θέση 2 [P(2) και S(2)] (4)

image

image

4.5.5.2.   Ακόρεστα λιπαρά οξέα στη θέση 2 [Po(2), O(2), L(2) και Ln(2)] (5):

image

image

image

image

4.5.5.3.   Λιπαρά οξέα στις θέσεις 1 και 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) και Ln(1,3)] (6):

image

image

image

image

image

image

4.5.6.    Υπολογισμός των τριακυλογλυκερολών

4.5.6.1.   TAG με ένα μόνο λιπαρό οξύ (AAA, εν προκειμένω LLL, PoPoPo) (7)

image

4.5.6.2.   TAG με δύο λιπαρά οξέα (AAB, εν προκειμένω PoPoL, PoLL) (8)

image

image

4.5.6.3.   TAG με τρία διαφορετικά λιπαρά οξέα (ABC, εν προκειμένω OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

image

image

image

4.5.6.4.   Τριακυλογλυκερόλες με ECN42

Οι τριακυλογλυκερόλες με ECN42 υπολογίζονται από τις εξισώσεις 7, 8 και 9 και στη συνέχεια αναφέρονται κατά τη σειρά της αναμενόμενης έκλουσης στην HPLC (κατά κανόνα, μόνο τρεις κορυφές).

LLL

PoLL και το ισομερές θέσης LPoL

OLLn και τα ισομερή θέσης OLnL και LnOL

PoPoL και το ισομερές θέσης PoLPo

PoOLn και τα ισομερή θέσης OPoLn και OLnPo

PLLn και τα ισομερή θέσης LLnP και LnPL

PoPoPo

SLnLn και το ισομερές θέσης LnSLn

PPoLn και τα ισομερή θέσης PLnPo και PoPLn

Οι τριακυλογλυκερόλες με ECN42 προκύπτουν ως το άθροισμα των εννέα τριακυλογλυκερολών, συμπεριλαμβανομένων των ισομερών θέσης. Τα αποτελέσματα θα πρέπει να εκφράζονται με δύο τουλάχιστον δεκαδικά ψηφία.

5.   ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Η υπολογιζόμενη θεωρητική περιεκτικότητα συγκρίνεται με την περιεκτικότητα που προσδιορίζεται με ανάλυση HPLC. Εάν η διαφορά μεταξύ των απολύτων τιμών των δεδομένων που έχουν προκύψει από την HPLC και των θεωρητικών δεδομένων υπερβαίνει τις τιμές που προβλέπονται στο πρότυπο, για την αντίστοιχη κατηγορία ελαιολάδου, το δείγμα περιέχει σπορέλαιο.

Τα αποτελέσματα εκφράζονται με δύο δεκαδικά ψηφία.

6.   ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ (ΟΙ ΑΡΙΘΜΟΙ ΠΑΡΑΠΕΜΠΟΥΝ ΣΕ ΕΝΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥ ΚΕΙΜΕΝΟΥ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ)

— 4.5.1.    Υπολογισμός των % γραμμομορίων λιπαρών οξέων από δεδομένα χρωματογραφίας αερίου-υγρού (κανονικοποιημένο εμβαδόν %)

Ελήφθησαν τα ακόλουθα δεδομένα για τη σύσταση σε λιπαρά οξέα, με χρωματογραφία υγρού-αερίου



Λιπαρό οξύ

P

S

Po

O

L

Ln

MW

256,4

284,5

254,4

282,5

280,4

278,4

Εμβαδόν %

10,0

3,0

1,0

75,0

10,0

1,0

— 4.5.3    Μετατροπή του εμβαδού % σε γραμμομόρια για όλα τα λιπαρά οξέα [βλέπε τύπο (1)]

γραμμομόρια P

=

image

γραμμομόρια S

=

image

γραμμομόρια Po

=

image

γραμμομόρια O

=

image

γραμμομόρια L

=

image

γραμμομόρια Ln

=

image

Σύνολο

=

0,35821 γραμμομόρια TAG

— 4.5.4    Κανονικοποίηση των γραμμομορίων λιπαρών οξέων στο 100 % [βλέπε τύπο (2)]

γραμμομόρια % P(1,2,3)

=

image

γραμμομόρια % S(1,2,3)

=

image

γραμμομόρια % Po(1,2,3)

=

image

γραμμομόρια % O(1,2,3)

=

image

γραμμομόρια % L(1,2,3)

=

image

γραμμομόρια % Ln(1,2,3)

=

image

Σύνολο γραμμομορίων %

=

100 %

Άθροισμα των κορεσμένων και άθροισμα των ακόρεστων λιπαρών οξέων στις θέσεις 1,2 και 3 των TAG [βλέπε τύπο (3)]

image

image

— 4.5.5    Υπολογισμός της σύστασης σε λιπαρά οξέα στη θέση 2 και στις θέσεις 1 και 3 των TAG

— 4.5.5.1   Κορεσμένα λιπαρά οξέα στη θέση 2 [P(2) and S(2)] [βλέπε τύπο (4)]

image

image

— 4.5.5.2   Ακόρεστα λιπαρά οξέα στη θέση 2 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) και Ln(1,3)] [βλέπε τύπο (5)]

image

image

image

image

— 4.5.5.3   Λιπαρά οξέα στις θέσεις 1 και 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) και Ln(1,3)] [βλέπε τύπο (6)]

image

image

image

image

image

image

— 4.5.6.    Υπολογισμός των τριακυλογλυκερολών

Από την υπολογισθείσα σύσταση σε λιπαρά οξέα στις θέσεις στερεοειδικής αρίθμησης 1 και 3



Λιπαρό οξύ

στις θέσεις 1 και 3

στη θέση 2

P

16,004 %

0,653 %

S

4,325 %

0,177 %

Po

1,015 %

1,262 %

O

68,526 %

85,296 %

L

9,204 %

11,457 %

Ln

0,927 %

1,153 %

Άθροισμα

100,0 %

100,0 %

υπολογίζονται οι ακόλουθες τριακυλογλυκερόλες:

LLL

PoPoPo

PoLL με 1 ισομερές θέσης

SLnLn με 1 ισομερές θέσης

PoPoL με 1 ισομερές θέσης

PPoLn με 2 ισομερή θέσης

OLLn με 2 ισομερή θέσης

PLLn με 2 ισομερή θέσης

PoOLn με 2 ισομερή θέσης

— 4.5.6.1.   TAG με ένα μόνο λιπαρό οξύ (LLL, PoPoPo) [βλέπε τύπο (7)]

image = 0,09706 mol LLL

image

— 4.5.6.2   TAG με δύο λιπαρά οξέα (PoLL, SLnLn, PoPoL) [βλέπε τύπο (8)]

image

image

0,03210 mol PoLL

image

image

0,00094 mol SLnLn

image

image

0,00354 mol PoPoL

— 4.5.6.3   TAG με τρία διαφορετικά λιπαρά οξέα (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) [βλέπε τύπο (9)]

image

image

image

0,00761 mol PPoLn

image

image

image

0,43655 mol OLLn

image

image

image

0,06907 mol PLLn

image

image

image

0,04812 mol PoOLn

ECN42 = 0,69512 mol TAG

Σημείωση 1: Η σειρά έκλουσης μπορεί να προσδιοριστεί με υπολογισμό των ισοδύναμων αριθμών ατόμων άνθρακα, οι οποίοι συχνά ορίζονται από τη σχέση image , όπου CN είναι ο αριθμός ατόμων άνθρακα και n ο αριθμός διπλών δεσμών. Η εν λόγω σειρά μπορεί να υπολογιστεί ακριβέστερα αν ληφθεί υπόψη η προέλευση των διπλών δεσμών. Αν no, nl και nln είναι οι αριθμοί των διπλών δεσμών του ελαϊκού, του λινελαϊκού και του λινολενικού οξέος, αντίστοιχα, ο ισοδύναμος αριθμός ατόμων άνθρακα μπορεί να υπολογιστεί από τη σχέση που παριστά ο ακόλουθος τύπος:

image

όπου οι συντελεστές do, dl και dln υπολογίζονται από τα τριγλυκερίδια αναφοράς. Στις συνθήκες που καθορίζονται στην παρούσα μέθοδο, η σχέση που προκύπτει είναι κατά προσέγγιση:

image

Σημείωση 2: Για αρκετά τριγλυκερίδια αναφοράς είναι επίσης δυνατόν να υπολογιστεί η διαχωριστική ικανότητα ως προς την τριελαΐνη

image

τριελαΐνηςμε τη χρήση του ανηγμένου χρόνου κατακράτησης

image

Η γραφική παράσταση του λογάριθμου log α συναρτήσει του αριθμού των διπλών δεσμών επιτρέπει τον προσδιορισμό των τιμών χρόνου κατακράτησης για όλα τα τριγλυκερίδια λιπαρών οξέων που περιέχουν τα τριγλυκερίδια αναφοράς – βλέπε σχήμα 1.

Σημείωση 3: Η αποδοτικότητα της στήλης θα πρέπει να επιτρέπει τον πλήρη διαχωρισμό της κορυφής που αντιστοιχεί στην τριλινελαΐνη από τις κορυφές που αντιστοιχούν στα τριγλυκερίδια με γειτονικούς χρόνους κατακράτησης. Η έκλουση εκτελείται μέχρι την κορυφή που αντιστοιχεί στον ECN 52.

Σημείωση 4: Εξασφαλίζεται ορθή μέτρηση του εμβαδού όλων των κορυφών που ενδιαφέρουν στο πλαίσιο του παρόντος προσδιορισμού, αν η δεύτερη κορυφή που αντιστοιχεί στον ECN 50 καλύπτει το 50 % της πλήρους κλίμακας του καταγραφέα.

Σχήμα 1

Γραφική παράσταση του λογάριθμου log α συναρτήσει του αριθμού των διπλών δεσμών

image

Αριθμός διπλών δεσμών

La: λαυρικό οξύ, My: μυριστικό οξύ, P: παλμιτικό οξύ, S: στεατικό οξύ, O: ελαϊκό οξύ, L: λινελαϊκό οξύ, Ln: λινολενικό οξύ

Σχήμα 2

Ελαιόλαδο χαμηλής περιεκτικότητας σε λινελαϊκό οξύ

α)

image

Με διαλύτη: μείγμα ακετόνης-ακετονιτριλίου

ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ α: Κύρια συστατικά των χρωματογραφικών κορυφών: ECN42: (1) LLL + PoLL, (2) OLLn + PoOLn, (3) PLLn· ECN44: (4) OLL + PoOL, (5) OOLn + PLL, (6) POLn + PPoPo, (7) OOL + PoΟΟ· ECN46: (8) OOL + LnPP, (9) PoOO, (10) SLL + PLO, (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo, (12) PLΡ· ECN48: (13) OOO + PoPP, (14 + 15) SOL + POO, (16) ΡΟΡ· ECN50: (17) SOO, (18) POS + SLS.

β)

image

Με διαλύτη: προπιονιτρίλιο

ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ β: Κύρια συστατικά των χρωματογραφικών κορυφών: ECN42: (1) LLL, (2) OLLn + PoLL, (3) PLLn· ECN44: (4) OLL, (5) OOLn + PoOL, (6) PLL + PoPoO, (7) POLn + PPoPo + PPoL· ECN46: (8) OOL + LnPP, (9) PoOO, (10) SLL + PLO, (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo, (12) PLΡ· ECN48: (13) OOO + PoPP, (14) SOL, (15) POO, (16) ΡΟΡ· ECN50: (17) SOO, (18) POS + SLS

Σχήμα 3

Ελαιόλαδο υψηλής περιεκτικότητας σε λινελαϊκό οξύ

α)

image

Με διαλύτη: μείγμα ακετόνης-ακετονιτριλίου (50:50)

Διάγραμμα α: Κύρια συστατικά των χρωματογραφικών κορυφών: ECN42: (1’) LLL + PoLL, (2’) OLLn + PoOLn, (3’) PLLn· ECN44: (4’) OLL + PoOL, (5’) OOLn + PLL, (6’) POLn + PPoPo· ECN46: (7’) OOL + PoOO, (8’) PLO + SLL + PoOP, (9’) PLP + PoΡΡ· ECN48: (10’) OOO, (11’) POO + SLL + PPoO, (12’) POP + PLS· ECN50: (13’) SOO, (14’) POS + SLS

β)

image

Με διαλύτη: προπιονιτρίλιο

Διάγραμμα β: Κύρια συστατικά των χρωματογραφικών κορυφών: ECN42: (1) LLL, (2 + 2’) OLLn + PoLL, (3) PLLn· ECN44: (4) OLL, (5) OOLn + PoOL, (6) PLL + PoPoO, (7) POLn + PPoPo + PPoL· ECN46: (8) OOL + LnPP, (9) PoOO, (10) SLL + PLO, (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo· ECN48: (12) PLP, (13) OOO + PoPP, (14) SOL, (15) POO, (16) ΡΟΡ· ECN50: (17) SOO, (18) POS + SLS· ECN52: (19) AOO.

▼M19




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XIX

▼M28

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΤΡΙΤΕΡΠΕΝΙΚΕΣ ΑΛΚΟΟΛΕΣ ΜΕ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΤΡΙΧΟΕΙΔΟΥΣ ΣΤΗΛΗΣ

1.   ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Το παρόν παράρτημα περιγράφει διαδικασία προσδιορισμού της περιεκτικότητας λιπαρών υλών σε αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες.

▼M19

2.   ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Η λιπαρή ύλη, μετά από προσθήκη 1-εικοσανόλης ως εσωτερικό πρότυπο, σαπωνοποιείται με αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου και στη συνέχεια τα ασαπωνοποίητα συστατικά εκχυλίζονται με αιθυλαιθέρα. Το κλάσμα των αλκοολών διαχωρίζεται από το εκχύλισμα των ασαπωνοποιήτων με χρωματογραφία σε βασική πλάκα βασικού διοξειδίου του πυριτίου· οι ανακτώμενες από το διοξείδιο του πυριτίου αλκοόλες μετατρέπονται σε τριμεθυλοσιλυλαιθέρες και αναλύονται με χρωματογραφία αέριας φάσης τριχοειδούς στήλης.

3.   ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ

3.1. Σφαιρική φιάλη 250 ml που φέρει κάθετο ψυκτήρα με εσμυρισμένα άκρα.

3.2. Διαχωριστική χοάνη 500 ml.

3.3. Σφαιρικές φιάλες 250 ml.

3.4. Πλήρης εξοπλισμός για χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, με γυάλινες πλάκες 20 × 20 cm.

3.5. Λυχνία υπεριώδους, μήκους κύματος 366 ή 254 nm.

3.6. Μικροσύριγγες 100 και 500 μl.

3.7. Κυλινδρική διηθητική χοάνη με πορώδη ηθμό G3 (πορώδες 15 έως 40 μm) διαμέτρου περίπου 2 cm και ύψους 5 cm, με κατάλληλο άκρο για διήθηση υπό κενό και αρσενικό εσμυρισμένο άκρο 12/21.

3.8. Φιάλη κενού των 50 ml με θηλυκό εσμυρισμένο άκρο 12/21 κατάλληλο για τη διηθητική χοάνη (3.7).

3.9. Σωλήνας με κωνικό πυθμένα, των 10 ml, με πώμα ασφαλείας.

3.10. Χρωματογράφος αέριας φάσης κατάλληλος για λειτουργία με τριχοειδή στήλη, εφοδιασμένος με σύστημα κλασμάτωσης, αποτελούμενος από:

3.10.1. Θερμοστατούμενο θάλαμο για τη στήλη, που επιτρέπει τη διατήρηση της επιθυμητής θερμοκρασίας με ακρίβεια περίπου 1 °C.

3.10.2. Σύστημα έγχυσης με ρυθμιζόμενη θερμοκρασία και είσοδο από υπερσιλανισμένο γυαλί.

3.10.3. Ανιχνευτής ιονισμού φλόγας και μετατροπέας-ενισχυτής.

3.10.4. Καταγραφέας-ολοκληρωτής κατάλληλος για λειτουργία με μετατροπέα-ενισχυτή με χρόνο απόκρισης το πολύ ένα δευτερόλεπτο και με μεταβλητή ταχύτητα χαρτιού.

3.11. Τριχοειδής στήλη από γυαλί ή από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους 20 έως 30 μέτρων, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, καλυμμένη εσωτερικά από υγρό SE-52 ή SE-54 ή ισοδύναμο, με πάχος μεταξύ 0,10 και 0,30 μm.

3.12. Μικροσύριγγα για χρωματογραφία αέριας φάσης των 10 μl με εσκληρυμένη βελόνη.

3.13. Ζυγός ακριβείας με ευαισθησία 1 mg (με ένδειξη 0,1 mg).

4.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

4.1. Υδροξείδιο του καλίου, αιθανολικό διάλυμα περίπου 2 Ν: 130 g υδροξειδίου του καλίου (ελάχιστου τίτλου 85 %) διαλύονται υπό ψύξη σε 200 ml απεσταγμένου νερού και κατόπιν το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου ενός λίτρου με αιθανόλη. Το διάλυμα φυλάσσεται σε γυάλινες καλά πωματισμένες αδιαφανείς φιάλες.

4.2. Αιθυλαιθέρας, αναλυτικής καθαρότητας.

4.3. Άνυδρο θειικό νάτριο, αναλυτικής καθαρότητας.

4.4. Γυάλινες πλάκες καλυμμένες με διοξείδιο του πυριτίου χωρίς δείκτη φθορισμού, πάχους 0,25 mm (διατίθενται στο εμπόριο έτοιμες για χρήση).

4.5. Υδροξείδιο του καλίου, αιθανολικό διάλυμα 0,2 N: 13 g υδροξειδίου του καλίου διαλύονται σε 20 ml απεσταγμένο νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου ενός λίτρου με αιθανόλη.

4.6. Βενζόλιο, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).

4.7. Ακετόνη, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).

4.8. Εξάνιο χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).

4.9. Αιθυλαιθέρας, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).

4.10. Χλωροφόρμιο, αναλυτικής καθαρότητας.

▼M28

4.11. Διάλυμα αναφοράς για χρωματογραφία λεπτής στιβάδας: Αλκοόλες C20-C28, 0,5 % σε χλωροφόρμιο, ή κλάσμα αλκοολών που λαμβάνονται όπως αναφέρεται στο σημείο 5.2 από τις ασαπωνοποίητες ύλες πυρηνελαίου.

▼M19

4.12. Διχλωρο-2′-7′-φλουορεσκεΐνη, αιθανολικό διάλυμα 0,2 %. Καθίσταται ελαφρώς βασικό με προσθήκη μερικών σταγονών αλκοολικού διαλύματος υδροξειδίου του καλίου 2 N.

4.13. Άνυδρη πυριδίνη, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.14. Εξαμεθυλοδισιλαζάνιο.

4.15. Τριμεθυλοχλωροσιλάνιο.

4.16. Πρότυπα διαλύματα τριμεθυλοσιλυλαιθέρων των αλειφατικών αλκοολών από C20 έως C28. Πρέπει να παρασκευάζονται τη στιγμή της χρήσης από μείγματα καθαρών αλκοολών.

4.17. 1-εικοσανόλη, διάλυμα 0,1 % (m/v) σε χλωροφόρμιο (εσωτερικό πρότυπο).

4.18. Φέρον αέριο: καθαρό υδρογόνο ή ήλιο, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.19. Βοηθητικό αέριο: καθαρό άζωτο, για αέρια χρωματογραφία.

5.   ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

5.1.   Παρασκευή των ασαπωνοποιήτων

5.1.1.

Με τη βοήθεια της μικροσύριγγας 500 μl, εισάγεται στη σφαιρική φιάλη 250 ml διάλυμα 1-εικοσανόλης 0,1 % σε χλωροφόρμιο (4.17) που περιέχει ποσότητα 1-εικοσανόλης που αντιστοιχεί στο 10 % περίπου του περιεχομένου σε αλειφατικές αλκοόλες στην ποσότητα του προς δοκιμή δείγματος. Για παράδειγμα, για 5 g δείγματος, πρέπει να προστίθενται 250 μl του διαλύματος 1-εικοσανόλης 0,1 % εάν πρόκειται για δείγμα ελαιολάδου ή σπορελαίου και 1 500 μl εάν πρόκειται για πυρηνέλαιο.

Ακολουθεί εξάτμιση σε ρεύμα αζώτου μέχρι ξηράνσεως και κατόπιν ζυγίζονται 5 g ακριβώς ξηρού δείγματος και προστίθενται υπό διήθηση στην ίδια σφαιρική φιάλη.

5.1.2.

Προστίθενται 50 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του καλίου 2 N, τοποθετείται ο κάθετος ψυκτήρας και θερμαίνουμε σε ατμόλουτρο μέχρις ελαφρού βρασμού υπό ταυτόχρονη ζωηρή ανάδευση μέχρις ότου πραγματοποιηθεί σαπωνοποίηση (το διάλυμα γίνεται διαυγές). Η θέρμανση συνεχίζεται επί είκοσι λεπτά και κατόπιν προστίθενται 50 ml απεσταγμένο νερό από την κορυφή του ψυκτήρα, ο ψυκτήρας αποσυνδέεται και η σφαιρική φιάλη ψύχεται στους 30 °C περίπου.

5.1.3.

Το περιεχόμενο της σφαιρικής φιάλης μεταγγίζεται ποσοτικώς σε διαχωριστική χοάνη 500 ml, υποβοηθώντας τη μετάγγιση με την προσθήκη ποσοτήτων απεσταγμένου ύδατος, χρησιμοποιώντας συνολικά 50 ml. Προστίθενται περίπου 80 ml αιθυλαιθέρα, η χοάνη ανακινείται ζωηρά για 30 περίπου δευτερόλεπτα και αφήνεται σε ηρεμία μέχρι να επέλθει διαχωρισμός (σημείωση 1).

Η υποκείμενη υδατική φάση διαχωρίζεται συλλέγοντάς την σε άλλη διαχωριστική χοάνη. Πραγματοποιούνται ακόμη δύο εκχυλίσεις της υδατικής φάσεως, με τον ίδιο τρόπο, χρησιμοποιώντας κάθε φορά 60 έως 70 ml αιθυλαιθέρα.

Σημείωση 1:

Τυχόν γαλακτώματα μπορούν να εξαλειφθούν προσθέτοντας με υδροβολέα μικρή ποσότητα αιθυλικής ή μεθυλικής αλκοόλης.

5.1.4.

Τα αιθερικά εκχυλίσματα συγκεντρώνονται σε μία μόνη διαχωριστική χοάνη και πλένονται με απεσταγμένο νερό (50 ml κάθε φορά) μέχρις ουδετέρας αντιδράσεως του νερού πλύσεως.

Το νερό πλύσεως απομακρύνεται, το διάλυμα ξηραίνεται με άνυδρο θειικό νάτριο και διηθείται μέσω ανύδρου θειικού νατρίου σε προζυγισμένη σφαιρική φιάλη 250 ml, εκπλένοντας τη χοάνη και το φίλτρο με μικρές ποσότητες αιθυλαιθέρα.

5.1.5.

Ο αιθέρας αποστάζεται μέχρις ότου να παραμείνει μόνον μια μικρή ποσότητα και κατόπιν ξηραίνεται υπό ελαφρό κενό ή σε ρεύμα αζώτου, η ξήρανση ολοκληρώνεται σε ξηραντήριο στους 100 °C επί ένα τέταρτο της ώρας περίπου, ακολουθεί ζύγιση και έπειτα ψύξη σε ξηραντήρα.

5.2.   Διαχωρισμός του αλκοολικού κλάσματος

5.2.1.

Ετοιμασία των βασικών πλακών: οι πλάκες διοξειδίου του πυριτίου (4.4) βυθίζονται πλήρως στο αιθανολικό διάλυμα 0,2 N υδροξειδίου του καλίου (4.5) επί δέκα δευτερόλεπτα και αφήνονται στη συνέχεια να στεγνώσουν καλά σε απαγωγό επί δύο ώρες και τοποθετούνται τελικά σε κλίβανο στους 100 °C επί μία ώρα.

Απομακρύνονται από τον κλίβανο και φυλάσσονται σε ξηραντήρα με χλωριούχο ασβέστιο μέχρι να χρησιμοποιηθούν (οι πλάκες που έχουν προετοιμαστεί με αυτό τον τρόπο πρέπει να χρησιμοποιούνται μέσα σε δεκαπέντε ημέρες).

Σημείωση 2:

Η χρήση των βασικών πλακών διοξειδίου του πυριτίου για το διαχωρισμό του αλκοολικού κλάσματος εξαλείφει την ανάγκη κατεργασίας των ασαπωνοποιήτων με αλουμίνα. Με τον τρόπο αυτό, όλες οι ενώσεις όξινου χαρακτήρα (λιπαρά οξέα και άλλες) συγκρατούνται στη γραμμή εναπόθεσης. Έτσι, η λωρίδα των αλειφατικών και τερπενικών αλκοολών λαμβάνεται σαφώς διαχωρισμένη από την ταινία των στερολών.

5.2.2.

Στο θάλαμο ανάπτυξης εισάγεται μείγμα εξανίου-αιθυλαιθέρα 65/35 (V/V) μέχρις ύψους περίπου 1 cm ( 10 ).

Ο θάλαμος κλείνεται με κατάλληλο καπάκι και αφήνεται έτσι επί μισή ώρα τουλάχιστον έτσι ώστε να αποκατασταθεί ισορροπία υγρού/ατμού. Στις εσωτερικές επιφάνειες του θαλάμου είναι δυνατόν να στερεωθούν λωρίδες διηθητικού χαρτιού που βυθίζονται στο υγρό έκλουσης: με τον τρόπο αυτό μπορεί να μειωθεί κατά το ένα τρίτο περίπου ο χρόνος μετατόπισης του μετώπου του υγρού και να επιτευχθεί πλέον ομοιόμορφη έκλουση των συστατικών.

Σημείωση 3:

Για να έχουμε απολύτως αναπαραγώγιμες συνθήκες έκλουσης, το μείγμα πρέπει να αλλάζει σε κάθε δοκιμή.

5.2.3.

Παρασκευάζεται διάλυμα 5 % περίπου ασαπωνοποιήτων (5.1.5) σε χλωροφόρμιο και, με τη μικροσύριγγα των 100 μl, αποτίθενται στη χρωματογραφική πλάκα (5.2.1) σε απόσταση 2 cm περίπου από το ένα χείλος, 0,3 ml του προαναφερθέντος διαλύματος σε μια συνεχή γραμμή, όσο το δυνατό λεπτότερη και πιο ομοιόμορφη. Στην ευθεία της γραμμής απόθεσης, σε μια από τις άκρες της πλάκας, φέρονται 2 έως 3 μl του διαλύματος αναφοράς των αλειφατικών αλκοολών (4.11), για την ταυτοποίηση της λωρίδας των αλειφατικών αλκοολών κατά την τελευταία ανάπτυξη.

5.2.4.

Η πλάκα τοποθετείται στο θάλαμο ανάπτυξης, ο οποίος έχει προετοιμαστεί όπως περιγράφεται στο σημείο 5.2.2. Η θερμοκρασία του περιβάλλοντος πρέπει να διατηρείται μεταξύ 15 και 20 °C. Ο θάλαμος κλείνεται αμέσως με το καπάκι και αφήνεται να επέλθει έκλουση μέχρις ότου το μέτωπο του διαλύτη να φθάσει περίπου 1 cm από το πάνω χείλος της πλάκας.

Η πλάκα στη συνέχεια απομακρύνεται από το θάλαμο ανάπτυξης και ο διαλύτης εξατμίζεται σε ρεύμα θερμού αέρα ή καλύτερα αφήνοντας την πλάκα να στεγνώσει σε απαγωγό.

▼M28

5.2.5.

Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και ομοιόμορφα με το διάλυμα της διχλωρο-2′-7′-φλουορεσκεΐνης. Ως λωρίδα των αλειφατικών αλκοολών αναγνωρίζεται εκείνη που είναι στην ίδια ευθεία με την κηλίδα που λαμβάνεται με το διάλυμα αναφοράς: με ένα μαύρο μολύβι σημειώνεται το σύνολο της λωρίδας των αλειφατικών αλκοολών και της αμέσως παραπάνω λωρίδας που αντιστοιχεί στις τερπενικές αλκοόλες (σημείωση 4).

Σημείωση 4:

Η υπόδειξη για ομαδοποίηση της λωρίδας των αλειφατικών αλκοολών και της λωρίδας των τερπενικών αλκοολών οφείλεται στο ότι ορισμένες αλειφατικές αλκοόλες μπορεί να εγκλωβιστούν στη λωρίδα των τριτερπενικών αλκοολών. Παράδειγμα διαχωρισμού χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC) περιλαμβάνεται στο σχήμα 1 του προσαρτήματος.

5.2.6.

Με μια μεταλλική σπάτουλα ξύνεται το διοξείδιο του πυριτίου που περιλαμβάνεται στην οριοθετημένη ζώνη. Το ξύσμα εισάγεται στη χοάνη διηθήσεως (3.7), προστίθενται 10 ml θερμού χλωροφορμίου, αναμειγνύουμε επισταμένως με τη μεταλλική σπάτουλα και διηθούμε με τη βοήθεια κενού. Στη συνέχεια το διήθημα συλλέγεται στη φιάλη (3.8), η οποία είναι συνδεδεμένη με τη χοάνη διηθήσεως.

Το διοξείδιο του πυριτίου στη χοάνη πλένεται τρεις φορές με αιθυλαιθέρα (περίπου 10 ml κάθε φορά) και συλλέγεται όπως και το διήθημα στη συνδεδεμένη με τη χοάνη διηθήσεως φιάλη. Το διήθημα εξατμίζεται μέχρις όγκου περίπου 4 έως 5 ml, το υπολειπόμενο διάλυμα μεταγγίζεται σε προζυγισμένο σωλήνα 10 ml (3.9), ξηραίνεται με θέρμανση σε ελαφρύ ρεύμα αζώτου, προστίθενται μερικές σταγόνες ακετόνης, ξηραίνεται εκ νέου, τοποθετείται για δέκα λεπτά περίπου στον κλίβανο στους 105 °C, αφήνεται να ψυχθεί σε ξηραντήρα και ζυγίζεται.

Το υπόλειμμα στον σωλήνα αποτελείται από το κλάσμα των αλειφατικών αλκοολών.

▼M19

5.3.   Παρασκευή των τριμεθυλοσιλυλαιθέρων

5.3.1.

Στο σωλήνα που περιέχει το κλάσμα των αλειφατικών αλκοολών, προστίθεται το αντιδραστήριο σιλυλιώσεως, το οποίο είναι μείγμα πυριδίνης-εξαμεθυλοδισιλαζάνιου-τριμεθυλοχλωροσιλανίου 9/3/1 (V/V/V) (σημείωση 5) σε αναλογία 50 μl ανά χιλιοστόγραμμο αλειφατικών αλκοολών, αποφεύγοντας κάθε απορρόφηση υγρασίας (σημείωση 6).

Σημείωση 5:

Στο εμπόριο υπάρχουν έτοιμα προς χρήση διαλύματα. Υπάρχουν και άλλα σιλυλιωτικά αντιδραστήρια όπως π.χ. το δις-τριμεθυλοσιλυλοτριφθορακεταμίδιο + 1 % τριμεθυλοχλωροσιλάνιο που αραιώνεται με ίσο όγκο άνυδρης πυριδίνης.

Σημείωση 6:

Η ενδεχόμενη εμφάνιση μιας ελαφράς θολότητας είναι φυσιολογική και δεν εμπνέει καμία ανησυχία. Ένδειξη παρουσίας υγρασίας ή αλλοίωσης του αντιδραστηρίου αποτελεί ο σχηματισμός λευκών νιφάδων ή η εμφάνιση ροζ χρωματισμού. Στην περίπτωση αυτή, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί.

5.3.2.

Ο σωλήνας πωματίζεται, ανακινείται προσεκτικά (χωρίς να αναποδογυριστεί) έως την πλήρη διαλυτοποίηση των αλειφατικών αλκοολών. Αφήνεται σε ηρεμία για δεκαπέντε τουλάχιστον λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και κατόπιν φυγοκεντρείται για μερικά λεπτά: το διαυγές διάλυμα είναι έτοιμο για ανάλυση με αεριοχρωματογραφική ανάλυση.

5.4.   Ανάλυση με χρωματογραφία αέριας φάσης

5.4.1.   Προκαταρκτικές εργασίες, σταθεροποίηση της στήλης

5.4.1.1.

Τοποθετείται η στήλη στο χρωματογράφο αέριας φάσης, συνδέοντας το άκρο εισόδου με τον εισαγωγέα που είναι συνδεδεμένος με το σύστημα κλασμάτωσης και το άκρο εξόδου με τον ανιχνευτή. Πραγματοποιούνται οι εν γένει έλεγχοι που απαιτούνται για μια διάταξη χρωματογραφίας αέριας φάσης (στεγανότητα του κυκλώματος των αερίων, αποτελεσματικότητα του ανιχνευτή, αποτελεσματικότητα του συστήματος κλασμάτωσης και του συστήματος καταγραφής κ.λπ.).

5.4.1.2.

Εάν η στήλη χρησιμοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται να προηγείται σταθεροποίηση. Διοχετεύεται ένα ελαφρό ρεύμα φέροντος αερίου διαμέσου της στήλης αυτής, τίθεται σε λειτουργία ο αέριος χρωματογράφος και αρχίζει μια βαθμιαία θέρμανση μέχρις ότου να φθάσουμε σε μια θερμοκρασία τουλάχιστον 20 °C πάνω από εκείνη της συνήθους λειτουργίας (σημείωση 7). Η θερμοκρασία αυτή διατηρείται για δύο ώρες τουλάχιστον και κατόπιν η διάταξη φέρεται σε συνθήκες λειτουργίας (ρύθμιση της ροής του αερίου και του διαχωρισμού, άναμμα της φλόγας, σύνδεση με τον ηλεκτρονικό καταγραφέα, ρύθμιση της θερμοκρασίας του θαλάμου για τη στήλη, του ανιχνευτή και του εκκινητήρα κ.λπ.) και καταγράφεται το σήμα με ευαισθησία τουλάχιστον δύο φορές πάνω από εκείνη που προβλέπεται για την εκτέλεση της ανάλυσης. Το ίχνος της λαμβανόμενης γραμμής βάσεως πρέπει να είναι γραμμικό, χωρίς οποιαδήποτε φύσεως κορυφή και δεν πρέπει να παρουσιάζει μετατόπιση. Τυχόν αρνητική ευθύγραμμη μετατόπιση δείχνει ατελή στεγανότητα των συνδέσεων της στήλης, τυχόν θετική μετατόπιση δείχνει ανεπαρκή σταθεροποίηση της στήλης.

Σημείωση 7:

Η θερμοκρασία σταθεροποίησης πρέπει να είναι πάντοτε κατώτερη κατά 20 °C τουλάχιστον από τη μέγιστη θερμοκρασία που προβλέπεται για το χρησιμοποιούμενο υγρό κατανομής.

5.4.2.   Επιλογή συνθηκών εργασίας

5.4.2.1. Οι ενδεικτικές συνθήκες εργασίας είναι οι ακόλουθες:

 θερμοκρασία της στήλης: ισοθερμική έναρξη οκτώ λεπτών στους 180 °C, κατόπιν πρόγραμμα 5 °C ανά λεπτό μέχρι τους 260 °C και κατόπιν ακόμη δεκαπέντε λεπτά στους 260 °C,

 θερμοκρασία του εξατμιστή: 280 °C,

 θερμοκρασία του ανιχνευτή: 290 °C,

 γραμμική ταχύτητα του φέροντος αερίου: ήλιο, 20 έως 35 cm ανά δευτερόλεπτο, υδρογόνο, 30 έως 50 cm ανά δευτερόλεπτο,

 λόγος της διαίρεσης διαχωρισμού: από 1/50 έως 1/100,

 ευαισθησία οργάνου: τετραπλάσια έως 16πλάσια της ελάχιστης εξασθένησης,

 ευαισθησία καταγραφής: 1 έως 2 millivolts στη βασική κλίμακα,

 ταχύτητα του χαρτιού: 30 έως 60 cm ανά ώρα,

 ποσότητα εγχυόμενης ουσίας: 0,5 έως 1 μl διαλύματος TMSE.

Οι συνθήκες αυτές μπορούν να τροποποιούνται ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της στήλης και του χρωματογράφου έτσι ώστε να λαμβάνονται χρωματογραφήματα που να ικανοποιούν τις ακόλουθες συνθήκες:

 ο χρόνος κατακράτησης της αλκοόλης C26 πρέπει να είναι 18 ± πέντε λεπτά,

 η κορυφή της αλκοόλης C22 πρέπει να είναι 80 ± 20 % της βασικής κλίμακας για το ελαιόλαδο και για τα σπορέλαια 40 ± 20 % της βασικής κλίμακας.

5.4.2.2. Για τον έλεγχο των απαιτούμενων ανωτέρω συνθηκών, πραγματοποιούνται επανειλημμένες εγχύσεις με τα δείγματα μειγμάτων των TMSE των αλκοολών και οι λειτουργικές συνθήκες προσαρμόζονται μέχρις ότου ληφθούν τα καλύτερα αποτελέσματα.

5.4.2.3. Οι παράμετροι ολοκλήρωσης των κορυφών πρέπει να τίθενται κατά τρόπον ώστε να λαμβάνονται σωστές τιμές για τις εξεταζόμενες κορυφές.

5.4.3.   Εκτέλεση της ανάλυσης

5.4.3.1. Λαμβάνεται με τη μικροσύριγγα των 10 μl, 1 μl εξανίου, αναρροφώνται 0,5 μl αέρα και διαδοχικώς 0,5 έως 1 μl του διαλύματος του δείγματος. Τραβάμε λίγο ακόμη το έμβολο της σύριγγας έτσι ώστε η βελόνα να κενωθεί. Εισάγουμε τη βελόνα στη μεμβράνη της διάταξης εγχύσεως και μετά ένα έως δύο δευτερόλεπτα εγχύουμε ταχύτατα, εξάγοντας στη συνέχεια αργά τη βελόνα, μετά πέντε δευτερόλεπτα περίπου.

5.4.3.2. Εκτελείται καταγραφή μέχρι πλήρους εκλούσεως των TMSE των υπαρχουσών αλειφατικών αλκοολών. Η γραμμή βάσης πρέπει να πληροί πάντοτε τις απαιτούμενες συνθήκες (5.4.1.2).

▼M28

5.4.4.    Ταυτοποίηση των κορυφών.

Η ταυτοποίηση των μεμονωμένων κορυφών πραγματοποιείται βάσει των χρόνων κατακράτησης και διά συγκρίσεως με το μείγμα των TMSE των αλειφατικών αλκοολών, με ανάλυση υπό τις ίδιες συνθήκες.

Παραδείγματα χρωματογραφήματος του αλκοολικού κλάσματος ενός εξευγενισμένου ελαιολάδου περιλαμβάνονται στα σχήματα 2 και 3 του προσαρτήματος.

▼M19

5.4.5.   Ποσοτικός προσδιορισμός

5.4.5.1. Προβαίνουμε με τον ολοκληρωτή στον υπολογισμό του εμβαδού των κορυφών της 1-εικοσανόλης και των αλειφατικών αλκοολών C22, C24, C26 και C28.

5.4.5.2. Η περιεκτικότητα σε κάθε μεμονωμένη αλειφατική αλκοόλη υπολογίζεται σε χιλιοστόγραμμα για

1 000

γραμμάρια λιπαρής ύλης, ως εξής:

image

όπου:

Ax = εμβαδόν της κορυφής της αλκοόλης x

As = εμβαδόν της κορυφής της 1-εικοσανόλης

ms = βάρος προστιθέμενης 1-εικοσανόλης, σε χιλιοστόγραμμα

m = βάρος ληφθέντος δείγματος για τον προσδιορισμό, σε γραμμάρια.

6.   ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Οι περιεκτικότητες των μεμονωμένων αλειφατικών αλκοολών αναφέρονται σε χιλιοστόγραμμα για 1 000 γραμμάρια λιπαρής ύλης και το άθροισμά τους ως «συνολικές αλειφατικές αλκοόλες».

▼M28




Προσάρτημα

Παράδειγμα διαχωρισμού TLC και παραδείγματα χρωματογραφημάτων

Σχήμα 1

Πλάκα χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας του ασαπωνοποίητου κλάσματος από ελαιόλαδο στο οποίο γίνεται έκλουση με εξάνιο/διαιθυλαιθέρα (65/35)

image



1

Αλκοόλη C26

A

Στερόλες

2

Αλκοόλη C30

B

Αλειφατικές αλκοόλες

3

Αλκοόλη C20

Γ

Τριτερπενικές αλκοόλες

4

Μείγμα αλκοολών C20-22-26-30

Δ

Σκουαλένιο

5

Εξαιρετικό παρθένο ασαπωνοποίητο.

 

 

Σχήμα 2

Χρωματογράφημα του αλκοολικού κλάσματος ενός εξευγενισμένου ελαιολάδου

image



1 = φυτόλη

5 = αλκοόλη C24

9 = 24-μεθυλενο-κυκλοαρτενόλη

2 = γερανυλ γερανιόλη

6 = αλκοόλη C26

10 = κιτροσταδιενόλη

3 = αλκοόλη C20 (IS)

7 = αλκοόλη C28

11 = κυκλοβρανόλη

4 = αλκοόλη C22

8 = κυκλοαρτενόλη

 

Σχήμα 3

Αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες εξευγενισμένου ελαιολάδου και ελαιολάδου δεύτερης φυγοκέντρισης

image



1 = φυτόλη

5 = αλκοόλη C24

9 = 24-μεθυλενο-κυκλοαρτενόλη (24MeCA)

2 = γερανυλ γερανιόλη (CX)

6 = αλκοόλη C26

10 = κιτροσταδιενόλη

3 = αλκοόλη C20

7 = αλκοόλη C28

11 = κυκλοβρανόλη

4 = αλκοόλη C22

8 = κυκλοαρτενόλη (CA)

 

▼M23




ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΧΧ

Μέθοδος προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε κήρους,καθώς και σε μεθυλεστέρες ακι αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων,με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης

1.   ΣΚΟΠΟΣ

Σκοπός της παρούσας μεθόδου είναι ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας των ελαιολάδων σε κηρούς, καθώς και σε μεθυλεστέρες και αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων. Οι επιμέρους κηροί και αλκυλεστέρες διαχωρίζονται ανάλογα με τον αριθμό των ατόμων άνθρακα. Η μέθοδος συνιστάται ως μέσο διάκρισης μεταξύ ελαιολάδου και πυρηνελαίου και ως παράμετρος ποιότητας των εξαιρετικών παρθένων ελαιολάδων, βάσει της οποίας είναι δυνατόν να εντοπιστεί η παράνομη ανάμιξη εξαιρετικών παρθένων ελαιολάδων με έλαια κατώτερης ποιότητας, ανεξαρτήτως του εάν αυτά είναι παρθένα ελαιόλαδα, μειονεκτικά ελαιόλαδα (λαμπάντε) ή ορισμένα αποσμημένα έλαια.

2.   ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Προσθήκη κατάλληλων εσωτερικών προτύπων στο έλαιο και κλασματικός διαχωρισμός με χρωματογραφία σε στήλη ένυδρου διοξειδίου του πυριτίου (silica gel). Παραλαβή του κλάσματος που εκλούεται στις συνθήκες της δοκιμής (με πολικότητα μικρότερη εκείνης των τριακυλογλυκερολών) και απευθείας ανάλυση με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

3.   ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

3.1.

Κωνική φιάλη (Erlenmeyer) των 25 ml

3.2.

Γυάλινη στήλη για υγροχρωματογραφία, εσωτερικής διαμέτρου 15 mm και μήκους 30-40 cm, εφοδιασμένη με κατάλληλη στρόφιγγα

3.3.

Αεριοχρωματογράφος κατάλληλος για χρήση με τριχοειδή στήλη, εφοδιασμένος με σύστημα απευθείας εισαγωγής του δείγματος στη στήλη (on-column) και αποτελούμενος από:

3.3.1.

Θερμοστατούμενο κλίβανο με προγραμματισμό της θερμοκρασίας

3.3.2.

Ψυχρό εγχυτήρα για την απευθείας εισαγωγή του δείγματος στη στήλη

3.3.3.

Ανιχνευτή ιονισμού φλόγας και μετατροπέα-ενισχυτή

3.3.4.

Καταγραφέα-ολοκληρωτή (σημείωση 1) για χρήση με τον μετατροπέα-ενισχυτή (σημείο 3.3.3), με χρόνο απόκρισης που δεν υπερβαίνει το 1 δευτερόλεπτο και με μεταβλητή ταχύτητα χαρτιού

Σημείωση 1:  Μπορούν επίσης να χρησιμοποιούνται ηλεκτρονικά συστήματα, στα οποία τα αεριοχρωματογραφικά δεδομένα εισάγονται μέσω προσωπικού υπολογιστή.

3.3.5.

Τριχοειδή στήλη από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου (για ανάλυση κηρών, μεθυλεστέρων και αιθυλεστέρων), μήκους 8 έως 12 μέτρων και εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επιστρωμένη εσωτερικά με υγρή φάση (σημείωση 2) ομοιόμορφου πάχους 0,10 έως 0,30 μm

Σημείωση 2:  Στο εμπόριο κυκλοφορούν κατάλληλες για τον σκοπό αυτό υγρές φάσεις, όπως οι SE 52, SE 54 κ.λπ.

3.4.

Μικροσύριγγα των 10 μl, με συγκολλημένη στο σώμα της βελόνα, για την απευθείας εισαγωγή του δείγματος στη στήλη

3.5.

Ηλεκτρικό τάρακτρο

3.6.

Περιστροφικός εξατμιστήρας

3.7.

Θερμομονωμένος κλίβανος

3.8.

Αναλυτικός ζυγός για ζυγίσεις με ακρίβεια ± 0,1 mg

3.9.

Συνήθη εργαστηριακά γυάλινα σκεύη

4.   ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

4.1.

Διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) κοκκομετρικού βαθμού 60-200 μm. Τοποθετείται το silica gel στον θερμομονωμένο κλίβανο όπου παραμένει σε θερμοκρασία 500 °C επί 4 ώρες τουλάχιστον. Αφήνεται να ψυχθεί και, έπειτα, προστίθεται νερό σε αναλογία 2 % της χρησιμοποιηθείσας ποσότητας silica gel. Το υδαρές μείγμα ανακινείται έντονα ώστε να ομοιογενοποιηθεί και φυλάσσεται στον ξηραντήρα τουλάχιστον επί 12 ώρες πριν χρησιμοποιηθεί.

4.2.

κ-εξάνιο, χρωματογραφικής καθαρότητας ή καθαρότητας για ανάλυση υπολειμμάτων (η καθαρότητα πρέπει να ελέγχεται)

ΠΡΟΣΟΧΗ – Υπάρχει πιθανότητα ανάφλεξης ατμών. Να διατηρείται μακριά από πηγές θερμότητας, σπινθήρες ή γυμνή φλόγα. Να εξακριβώνεται ότι οι φιάλες είναι πάντα πωματισμένες σωστά. Να εξασφαλίζεται ο κατάλληλος εξαερισμός κατά τη χρήση. Να αποφεύγεται η συγκέντρωση ατμών και να απομακρύνεται κάθε πιθανός κίνδυνος πυρκαγιάς, όπως θερμαντικές ή ηλεκτρικές συσκευές που δεν είναι κατασκευασμένες από άφλεκτο υλικό. Εξαιρετικά επιβλαβές μέσω της εισπνοής, διότι μπορεί να βλάψει τα νευρικά κύτταρα. Να αποφεύγεται η εισπνοή των ατμών. Εάν χρειάζεται, να χρησιμοποιείται κατάλληλη αναπνευστική συσκευή. Να αποφεύγεται η επαφή με τους οφθαλμούς και το δέρμα.

4.3.

Αιθυλαιθέρας, χρωματογραφικής καθαρότητας

ΠΡΟΣΟΧΗ – Εξαιρετικά εύφλεκτο και μετρίως τοξικό. Ερεθίζει το δέρμα. Εξαιρετικά επιβλαβές μέσω της εισπνοής. Μπορεί να βλάψει τους οφθαλμούς. Οι επιδράσεις ενδέχεται να εμφανιστούν αργότερα. Μπορεί να σχηματίσει εκρηκτικά υπεροξείδια. Υπάρχει πιθανότητα ανάφλεξης ατμών. Να διατηρείται μακριά από πηγές θερμότητας, σπινθήρες ή γυμνή φλόγα. Να εξακριβώνεται ότι οι φιάλες είναι πάντα πωματισμένες σωστά. Να εξασφαλίζεται ο κατάλληλος εξαερισμός κατά τη χρήση. Να αποφεύγεται η συγκέντρωση ατμών και να απομακρύνεται κάθε πιθανός κίνδυνος πυρκαγιάς, όπως θερμαντικές ή ηλεκτρικές συσκευές που δεν είναι κατασκευασμένες από άφλεκτο υλικό. Να μην εξατμίζεται μέχρι ή σχεδόν μέχρι ξηρού. Ο σχηματισμός υπεροξειδίων είναι δυνατόν να περιοριστεί με την προσθήκη νερού ή κατάλληλου αναγωγικού μέσου. Να μην πίνεται. Να αποφεύγεται η εισπνοή των ατμών. Να αποφεύγεται η παρατεταμένη ή επανειλημμένη επαφή με το δέρμα.

4.4.

κ-επτάνιο, χρωματογραφικής καθαρότητας, ή ισοοκτάνιο

ΠΡΟΣΟΧΗ – Εύφλεκτο. Εξαιρετικά επιβλαβές μέσω της εισπνοής. Να διατηρείται μακριά από πηγές θερμότητας, σπινθήρες ή γυμνή φλόγα. Να εξακριβώνεται ότι οι φιάλες είναι πάντα πωματισμένες σωστά. Να εξασφαλίζεται ο κατάλληλος εξαερισμός κατά τη χρήση. Να αποφεύγεται η εισπνοή των ατμών. Να αποφεύγεται η παρατεταμένη ή επανειλημμένη επαφή με το δέρμα.