«ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ

1.   ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Τα δείγματα που προορίζονται για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών λαμβάνονται σύμφωνα με τις μεθόδους οι οποίες περιγράφονται κατωτέρω. Τα δείγματα που λαμβάνονται με τον τρόπο αυτόν θεωρούνται αντιπροσωπευτικά των δειγματιζόμενων τμημάτων.

Σκοπός της αντιπροσωπευτικής δειγματοληψίας είναι η λήψη μικρού κλάσματος παρτίδας, έτσι ώστε ο προσδιορισμός οποιουδήποτε ιδιαίτερου χαρακτηριστικού αυτού του κλάσματος να αντιστοιχεί στη μέση τιμή του χαρακτηριστικού της παρτίδας. Η παρτίδα δειγματίζεται με την επαναληπτική λήψη μερικών ποσοτήτων δείγματος σε διάφορες μεμονωμένες θέσεις της. Οι εν λόγω μερικές ποσότητες δείγματος συνδυάζονται με ανάμειξη για να σχηματιστεί ένα συνολικό δείγμα, από το οποίο παρασκευάζονται αντιπροσωπευτικά τελικά δείγματα με αντιπροσωπευτική διαίρεση.

Εάν διαπιστωθεί με οπτική εξέταση ή με βάση άλλες συναφείς πληροφορίες. ότι τα προς δειγματοληψία τμήματα της ζωοτροφής διαφέρουν ως προς την ποιότητα από την υπόλοιπη ζωοτροφή της ίδιας παρτίδας, τα εν λόγω τμήματα διαχωρίζονται από την υπόλοιπη ζωοτροφή και αντιμετωπίζονται ως χωριστή υποπαρτίδα. Εάν η διαίρεση της ζωοτροφής σε χωριστές υποπαρτίδες είναι αδύνατη, η ζωοτροφή δειγματίζεται ως μία παρτίδα. Το γεγονός αυτό αναφέρεται στο πρωτόκολλο δειγματοληψίας.

Όταν διαπιστώνεται ότι ζωοτροφή, από την οποία ελήφθησαν δείγματα σύμφωνα με τις διατάξεις του παρόντος κανονισμού, δεν πληροί τις ενωσιακές απαιτήσεις και η εν λόγω ζωοτροφή αποτελεί μέρος παρτίδας ζωοτροφών της ίδιας κατηγορίας ή περιγραφής, θεωρείται ότι η διαπίστωση αφορά το σύνολο των ζωοτροφών της συγκεκριμένης παρτίδας, εκτός εάν από διεξοδική εξέταση δεν προκύψουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη παρτίδα δεν πληροί τις απαιτήσεις της ΕΕ.

Η δειγματοληψία μπορεί επίσης να περιλαμβάνει ζωοτροφές που παρέχονται προς πώληση από επιχειρήσεις ζωοτροφών με εξ αποστάσεως πώληση σύμφωνα με το άρθρο 11 παράγραφος 3 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 767/2009 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου (1). Η δειγματοληψία των ζωοτροφών που παρέχονται προς πώληση με εξ αποστάσεως πώληση υπόκειται καταρχήν στα σημεία που καθορίζονται στο παρόν παράρτημα. Ειδικές πτυχές της δειγματοληψίας των δειγμάτων από εξ αποστάσεως πώληση περιγράφονται στο σημείο 11.

2.   ΟΡΙΣΜΟΙ

—

Παρτίδα: προσδιορισμένη ποσότητα ζωοτροφών που έχουν κοινά χαρακτηριστικά, όπως καταγωγή, ποικιλία, είδος συσκευασίας, συσκευαστή, αποστολέα ή επισήμανση και, όταν πρόκειται για διεργασία παραγωγής, μια μονάδα παραγωγής προερχόμενη από μία μόνο εγκατάσταση παραγωγής, στην οποία χρησιμοποιούνται ενιαίες παράμετροι παραγωγής, ή ένας ορισμένος αριθμός τέτοιων μονάδων, όταν παράγονται σε συνεχή σειρά και αποθηκεύονται μαζί.

—	Δειγματιζόμενο τμήμα: παρτίδα ή προσδιορισμένο μέρος της παρτίδας ή υποπαρτίδα.

—	Σφραγισμένο δείγμα: δείγμα το οποίο σφραγίζεται κατά τρόπο που εμποδίζει την πρόσβαση στο δείγμα χωρίς θραύση ή αφαίρεση της σφραγίδας.

—	Μερική ποσότητα (δόση) δείγματος: ποσότητα λαμβανόμενη από ένα σημείο του δειγματιζόμενου τμήματος.

—	Συνολικό δείγμα: άθροισμα των μερικών ποσοτήτων δείγματος που έχουν ληφθεί από το ίδιο δειγματιζόμενο τμήμα.

—	Μειωμένο δείγμα: μέρος του συνολικού δείγματος, το οποίο προκύπτει από αυτό με διαδικασία αντιπροσωπευτικής μείωσης.

—	Τελικό δείγμα: μέρος του συνολικού δείγματος (αναμεμειγμένο), του μειωμένου δείγματος ή του ομογενοποιημένου συνολικού δείγματος, ανάλογα με τον τύπο του ελέγχου (βλέπε σημείο 9.4).

—	Εργαστηριακό δείγμα: δείγμα που προορίζεται για το εργαστήριο (όπως παραλαμβάνεται από το εργαστήριο) και μπορεί να είναι τελικό, μειωμένο ή συνολικό δείγμα.

—	Δείγμα πώλησης εξ αποστάσεως: δείγμα παρτίδας ζωοτροφών που παρέχεται προς πώληση εξ αποστάσεως.

3.   ΓΕΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ

—	τα δείγματα λαμβάνονται από πρόσωπα εξουσιοδοτημένα για τον σκοπό αυτόν από την αρμόδια αρχή.

—	Για δείγμα πώλησης εξ αποστάσεως, η αρμόδια αρχή ζητεί μια ποσότητα ζωοτροφών από την επιχείρηση ζωοτροφών μέσω επικοινωνίας εξ αποστάσεως.

—	Τα δείγματα πρέπει να σφραγίζονται κατά τρόπο που εμποδίζει την πρόσβαση στο δείγμα χωρίς θραύση ή αφαίρεση της σφραγίδας.

Το σήμα της σφραγίδας θα πρέπει να είναι αναγνωρίσιμο με βεβαιότητα και ευδιάκριτο.

—	Ταυτοποίηση του δείγματος: το δείγμα πρέπει να φέρει ανεξίτηλη σήμανση και να ταυτοποιείται κατά τρόπο που να το συνδέει σαφώς με το πρωτόκολλο δειγματοληψίας.

—

Από κάθε συνολικό ή μειωμένο δείγμα λαμβάνονται τα ακόλουθα τελικά δείγματα:πρέπει να λαμβάνεται ένα για τον έλεγχο (επιβολή της νομοθεσίας) και ένα για την επιχείρηση ζωοτροφών (δείγμα ως μέσο άμυνας). Είναι δυνατόν να ληφθεί και ένα άλλο τελικό δείγμα ως δείγμα αναφοράς. Σε περίπτωση ομογενοποίησης του πλήρους συνολικού δείγματος, τα τελικά δείγματα λαμβάνονται από το ομογενοποιημένο συνολικό δείγμα, εκτός εάν η διαδικασία αυτή αντίκειται στους κανόνες των κρατών μελών για τα δικαιώματα των επιχειρήσεων ζωοτροφών.

—

Σύμφωνα με το άρθρο 15 παράγραφοι 1 και 2 του κανονισμού (ΕΕ) 2017/625, όταν είναι αναγκαίο για τη διενέργεια επίσημης δειγματοληψίας, οι υπεύθυνοι επιχειρήσεων ζωοτροφών, όταν τους ζητείται από τις αρμόδιες αρχές: — παρέχουν στο προσωπικό των αρμόδιων αρχών πρόσβαση στον εξοπλισμό που βρίσκεται υπό τον έλεγχό τους, συμπεριλαμβανομένης, εφόσον απαιτείται, της διάθεσης κατάλληλου εξοπλισμού δειγματοληψίας και εξοπλισμού ατομικής προστασίας· — επικουρούν και συνεργάζονται με το προσωπικό των αρμόδιων αρχών προκειμένου να καταστεί δυνατή η δειγματοληψία, μεταξύ άλλων παρέχοντας στο προσωπικό των αρμόδιων αρχών πρόσβαση στις ζωοτροφές.

4.   ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ

4.1.   Ο εξοπλισμός δειγματοληψίας πρέπει να είναι κατασκευασμένος από υλικά που δεν είναι δυνατόν να μολύνουν τα προς δειγματοληψία προϊόντα. Ο εξοπλισμός πολλαπλών χρήσεων πρέπει να μπορεί να καθαρίζεται εύκολα ώστε να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση.

4.2.   Συνιστώμενος εξοπλισμός για τη δειγματοληψία στερεών ζωοτροφών.

4.2.1.   Μη μηχανική δειγματοληψία

4.2.1.1.

Φτυάρι με επίπεδο πυθμένα και κατακόρυφες πλευρές.

4.2.1.2.

Δειγματολήπτης τύπου λόγχης με επιμήκη σχισμή ή με διαμερίσματα. Οι διαστάσεις του δειγματολήπτη τύπου λόγχης πρέπει να είναι κατάλληλες για τα χαρακτηριστικά του δειγματιζόμενου τμήματος (βάθος περιέκτη, διαστάσεις σάκου κ.λπ.) και το μέγεθος σωματιδίων της ζωοτροφής. Εάν ο δειγματολήπτης τύπου λόγχης διαθέτει πολλά ανοίγματα, αυτά θα πρέπει να χωρίζονται μεταξύ τους με διαμερίσματα ή να είναι διαγωνίως στοιχισμένα (ζιγκ ζαγκ), ώστε να εξασφαλίζεται η λήψη των δειγμάτων στις διάφορες θέσεις κατά μήκος του δειγματολήπτη.

4.2.2.   Μηχανική δειγματοληψία

Για τη δειγματοληψία ρεουσών ζωοτροφών επιτρέπεται να χρησιμοποιείται κατάλληλος μηχανικός εξοπλισμός. Ο μηχανικός εξοπλισμός θεωρείται κατάλληλος όταν λαμβάνονται δείγματα τουλάχιστον από ολόκληρη τη διατομή που καταλαμβάνει η ροή.

Η δειγματοληψία ρεουσών ζωοτροφών (με υψηλές ταχύτητες ροής) μπορεί να διενεργηθεί με αυτόματους δειγματολήπτες.

4.2.3.   Διαιρέτης

Για την παρασκευή μειωμένων δειγμάτων με αντιπροσωπευτικό τρόπο θα πρέπει να χρησιμοποιούνται, κατά το δυνατόν και εφόσον κρίνεται σκόπιμο, συσκευές που προορίζονται για τη διαίρεση του δείγματος σε ίσα περίπου μέρη.

5.   ΠΟΣΟΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟΝ ΑΡΙΘΜΟ ΤΩΝ ΜΕΡΙΚΩΝ ΠΟΣΟΤΗΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

—

Οι ποσοτικές απαιτήσεις των σημείων 5.1 και 5.2, όσον αφορά τον αριθμό των μερικών ποσοτήτων δείγματος, ισχύουν για δειγματιζόμενα τμήματα που δεν υπερβαίνουν τους 500 τόνους και από τα οποία μπορούν να ληφθούν δείγματα με αντιπροσωπευτικό τρόπο. Η περιγραφόμενη διαδικασία δειγματοληψίας ισχύει και για ποσότητες μεγαλύτερες από το καθοριζόμενο μέγιστο μέγεθος δειγματιζόμενου τμήματος, υπό τον όρο ότι αγνοείται ο μέγιστος αριθμός μερικών ποσοτήτων δείγματος που παρατίθεται στους κατωτέρω πίνακες στα σημεία 5.1.1, 5.1.3 και 5.1.5, και ότι ο αριθμός των μερικών ποσοτήτων δείγματος προσδιορίζεται από τον τύπο εξαγωγής τετραγωνικής ρίζας που περιλαμβάνεται στο αντίστοιχο τμήμα της διαδικασίας (βλέπε σημείο 5.3), ενώ αυξάνεται αναλόγως το ελάχιστο μέγεθος συνολικού δείγματος. Αυτό δεν αποκλείει τη διαίρεση μεγάλων παρτίδων σε μικρότερες υποπαρτίδες και τη δειγματοληψία από κάθε υποπαρτίδα με τη διαδικασία που περιγράφεται στα σημεία 5.1 και 5.2.

—	Το μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος πρέπει να καθιστά εφικτή τη δειγματοληψία από όλα τα μέρη που το αποτελούν.

—

Για πολύ μεγάλες παρτίδες ή υποπαρτίδες (άνω των 500 τόνων) και για παρτίδες οι οποίες μεταφέρονται ή αποθηκεύονται με τρόπο που δεν επιτρέπει τη δειγματοληψία με τη διαδικασία δειγματοληψίας που προβλέπεται στα σημεία 5.1 και 5.2 του παρόντος κεφαλαίου, πρέπει να εφαρμόζεται η διαδικασία που περιγράφεται στο σημείο 5.3.

—

Για τα δείγματα πώλησης εξ αποστάσεως, το μέγεθος της παρτίδας από την οποία ζητείται η ποσότητα συνήθως δεν είναι γνωστό στην αρμόδια αρχή. Ως εκ τούτου, η διαδικασία που αναφέρεται στα σημεία 5.1 και 5.2 δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί. Στην περίπτωση αυτή, εφαρμόζεται η διαδικασία που περιγράφεται στο σημείο 11.

—

Εάν η νομοθεσία επιβάλλει στη επιχείρηση ζωοτροφών υποχρέωση συμμόρφωσης με τον παρόντα κανονισμό στο πλαίσιο υποχρεωτικού συστήματος παρακολούθησης, η επιχείρηση ζωοτροφών μπορεί να αποκλίνει από τις ποσοτικές απαιτήσεις του παρόντος σημείου, προκειμένου να λάβει υπόψη επιχειρησιακά χαρακτηριστικά, υπό τον όρο ότι έχει αποδείξει κατά τρόπο που ικανοποιεί την αρμόδια αρχή την ισοδυναμία της διαδικασίας δειγματοληψίας από πλευράς αντιπροσωπευτικότητας και έχει λάβει σχετική άδεια από την αρμόδια αρχή.

—

Σε έκτακτες περιπτώσεις, εάν δεν είναι δυνατή η εφαρμογή της καθοριζόμενης μεθόδου δειγματοληψίας ως προς τις ποσοτικές απαιτήσεις, επειδή προκαλείται εμπορικά απαράδεκτη ζημία στην παρτίδα (λόγω της μορφής της συσκευασίας, του μέσου μεταφοράς, του τρόπου αποθήκευσης κ.λπ.), επιτρέπεται η εφαρμογή εναλλακτικής μεθόδου δειγματοληψίας, υπό τον όρο ότι είναι όσο το δυνατόν αντιπροσωπευτικότερη και ότι περιγράφεται και τεκμηριώνεται πλήρως.

5.1.   Ποσοτικές απαιτήσεις σχετικά με τις μερικές ποσότητες δείγματος για τον έλεγχο ουσιών ή προϊόντων που είναι ομοιογενώς κατανεμημένα σε ολόκληρη τη ζωοτροφή

5.1.1.   Ασυσκεύαστες (χύμα) στερεές ζωοτροφές

Μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος	Ελάχιστος αριθμός μερικών ποσοτήτων δείγματος (δόσεων)
≤ 2,5  τόνοι	7
> 2,5  τόνοι	√ γινόμενο του αριθμού των τόνων που αποτελούν το δειγματιζόμενο τμήμα επί 20  (*1), με ανώτατο όριο τις 40 μερικές ποσότητες δείγματος

5.1.2.   Ασυσκεύαστες υγρές ζωοτροφές

Μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος	Ελάχιστος αριθμός μερικών ποσοτήτων δείγματος (δόσεων)
≤ 2,5  τόνοι ή ≤ 2 500  λίτρα	4  (*2)
> 2,5  τόνοι ή > 2 500  λίτρα	7  (*2)

5.1.3.   Συσκευασμένες ζωοτροφές

Οι ζωοτροφές (στερεές και υγρές) μπορούν να συσκευαστούν σε σάκους, μεταλλικά κουτιά, βαρέλια κ.λπ., που αναφέρονται στον ακόλουθο πίνακα ως μονάδες. Η δειγματοληψία από μεγάλες μονάδες (≥ 500 kg ή λίτρα) πρέπει να διενεργείται σύμφωνα με τις διατάξεις που αφορούν τις ασυσκεύαστες ζωοτροφές (βλέπε σημεία 5.1.1 και 5.1.2).

Μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος	Ελάχιστος αριθμός μονάδων από τις οποίες πρέπει να λαμβάνεται μία (τουλάχιστον) μερική ποσότητα δείγματος (*3)
1 έως 20 μονάδες	1 μονάδα (*4)
21 έως 150 μονάδες	3 μονάδες (*4)
151 έως 400 μονάδες	5 μονάδες (*4)
> 400 μονάδες	¼ της √ (αριθμός των μονάδων που αποτελούν το δειγματιζόμενο τμήμα) (*5), με ανώτατο όριο τις 40 μονάδες

5.1.4.   Κτηνοτροφικές πλάκες και πλάκες λείξης ανόργανων αλάτων

Τουλάχιστον μία κτηνοτροφική πλάκα ή πλάκα λείξης ανά δειγματιζόμενο τμήμα 25 μονάδων, με ανώτατο όριο τις 4 πλάκες.

Στην περίπτωση των κτηνοτροφικών πλακών ή πλακών λείξης των οποίων το βάρος δεν υπερβαίνει το 1 kg, μερική ποσότητα δείγματος είναι το περιεχόμενο μιας πλάκας.

5.1.5.   Χορτονομή

Μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος	Ελάχιστος αριθμός μερικών ποσοτήτων δείγματος (δόσεων) (*6)
≤ 5 τόνοι	5
> 5 τόνοι	√(γινόμενο του αριθμού των τόνων που αποτελούν το δειγματιζόμενο τμήμα επί 5 ) (*7), με ανώτατο όριο τις 40 μερικές ποσότητες δείγματος

5.2.   Ποσοτικές απαιτήσεις σχετικά με τις μερικές ποσότητες δείγματος για τον έλεγχο συστατικών ή ουσιών που ενδέχεται να είναι ανομοιογενώς κατανεμημένα στη ζωοτροφή

Αυτές οι ποσοτικές απαιτήσεις, όσον αφορά τις μερικές ποσότητες δείγματος, πρέπει να τηρούνται στις ακόλουθες περιπτώσεις:

—	έλεγχος αφλατοξινών, εργοτίου της σίκαλης, άλλων μυκοτοξινών και επιβλαβών βοτανικών προσμείξεων των πρώτων υλών ζωοτροφών·

—	έλεγχος της διασταυρούμενης μόλυνσης από συστατικό, συμπεριλαμβανομένων των γενετικώς τροποποιημένων υλικών, ή ουσία που αναμένεται να είναι ανομοιογενώς κατανεμημένη στις ζωοτροφές.

Εάν η ελεγκτική αρχή έχει βάσιμες υπόνοιες για ανομοιογενή κατανομή και στην περίπτωση διασταυρούμενης μόλυνσης από συστατικό ή ουσία σε σύνθετη ζωοτροφή, μπορούν να εφαρμοστούν οι ποσοτικές απαιτήσεις του ακόλουθου πίνακα.

Μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος	Ελάχιστος αριθμός μερικών ποσοτήτων δείγματος (δόσεων)
< 80 τόνοι	Βλέπε ποσοτικές απαιτήσεις στο σημείο 5.1. Ο αριθμός των προς λήψη μερικών ποσοτήτων δείγματος πρέπει να πολλαπλασιάζεται επί 2,5.
≥ 80 τόνοι	100

5.3.   Ποσοτικές απαιτήσεις για τις μερικές ποσότητες δείγματος στην περίπτωση των πολύ μεγάλων παρτίδων

Στην περίπτωση των πολύ μεγάλων δειγματιζόμενων τμημάτων (άνω των 500 τόνων), αριθμός των προς λήψη μερικών ποσοτήτων δείγματος = 40 μερικές ποσότητες δείγματος + √ τόνοι, για τον έλεγχο ουσιών ή προϊόντων που είναι ομοιογενώς κατανεμημένα σε ολόκληρη τη ζωοτροφή, ή = 100 μερικές ποσότητες δείγματος + √ τόνοι, για τον έλεγχο συστατικών ή ουσιών που ενδέχεται να είναι ανομοιογενώς κατανεμημένα στις ζωοτροφές.

6.   ΠΟΣΟΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟ ΣΥΝΟΛΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ

Απαιτείται μόνο ένα συνολικό δείγμα ανά δειγματιζόμενο τμήμα.

	Είδος ζωοτροφών	Ελάχιστο μέγεθος συνολικού δείγματος (*8)  (*9)
6.1.	Ασυσκεύαστες ζωοτροφές	4  kg
6.2.	Συσκευασμένες ζωοτροφές:	4  kg (*10)
6.3.	Υγρές ή ημίρρευστες ζωοτροφές:	4  λίτρα
6.4.	Κτηνοτροφικές πλάκες ή πλάκες λείξης ανόργανων αλάτων:
6.4.1.	βάρους άνω του 1 kg η καθεμία	4  kg
6.4.2.	βάρους έως 1 kg η καθεμία	το βάρος 4 αρχικών κτηνοτροφικών πλακών ή πλακών λείξης
6.5.	Χορτονομή	4 kg (*11)

7.   ΠΟΣΟΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΑ ΤΕΛΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ

Τελικά δείγματα

Απαιτείται η ανάλυση ενός τουλάχιστον τελικού δείγματος. Η ποσότητα του προς ανάλυση τελικού δείγματος δεν μπορεί να είναι μικρότερη από τις ακόλουθες ποσότητες:

Στερεές ζωοτροφές	500  g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)
Υγρές ή ημίρρευστες ζωοτροφές:	500  ml (*12)

8.   ΜΕΘΟΔΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΓΙΑ ΠΟΛΥ ΜΕΓΑΛΕΣ ΠΑΡΤΙΔΕΣ Ή ΠΑΡΤΙΔΕΣ ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΟΝΤΑΙ Ή ΜΕΤΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΡΟΠΟ ΠΟΥ ΚΑΘΙΣΤΑ ΑΝΕΦΙΚΤΗ ΤΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ ΑΠΟ ΤΟ ΣΥΝΟΛΟ ΤΗΣ ΠΑΡΤΙΔΑΣ

8.1.   Γενικές αρχές

Εάν ο τρόπος μεταφοράς ή αποθήκευσης μιας παρτίδας δεν επιτρέπει τη λήψη μερικών ποσοτήτων δείγματος από το σύνολό της, η δειγματοληψία θα πρέπει κατά προτίμηση να διενεργείται στη διάρκεια της εκροής της παρτίδας.

Στην περίπτωση των μεγάλων αποθηκών ζωοτροφών, θα πρέπει να παροτρύνονται οι επιχειρήσεις να εγκαταστήσουν στις αποθήκες αυτές εξοπλισμό που καθιστά δυνατή την (αυτόματη) δειγματοληψία από το σύνολο κάθε αποθηκευμένης παρτίδας.

Σε περίπτωση εφαρμογής των διαδικασιών δειγματοληψίας που προβλέπονται στο παρόν σημείο, ενημερώνεται σχετικά η επιχείρηση ζωοτροφών ή ο αντιπρόσωπός της. Εάν η επιχείρηση ζωοτροφών ή ο αντιπρόσωπός της αμφισβητήσει τη διαδικασία δειγματοληψίας, οφείλει να δώσει τη δυνατότητα στην αρμόδια αρχή να λάβει δείγματα από το σύνολο της παρτίδας, με έξοδα της επιχείρησης.

8.2.   Μεγάλες παρτίδες μεταφερόμενες με πλοία

8.2.1.   Δυναμική δειγματοληψία μεγάλων παρτίδων που μεταφέρονται με πλοία

Η δειγματοληψία μεγάλων παρτίδων που βρίσκονται σε πλοία διενεργείται κατά προτίμηση στη διάρκεια της εκροής του προϊόντος (δυναμική δειγματοληψία).

Η δειγματοληψία πρέπει να εκτελείται ανά κύτος (ενότητα που μπορεί να διαχωριστεί με φυσικό μέσο). Ωστόσο τα κύτη εκκενώνονται διαδοχικά εν μέρει, με αποτέλεσμα να εκλείπει ο αρχικός φυσικός διαχωρισμός μετά τη μεταφορά στις εγκαταστάσεις αποθήκευσης. Συνεπώς, η δειγματοληψία μπορεί να πραγματοποιηθεί σε συνάρτηση με τον αρχικό φυσικό διαχωρισμό ή με τον διαχωρισμό μετά τη μεταφορά στις εγκαταστάσεις αποθήκευσης.

Η εκφόρτωση ενός πλοίου μπορεί να διαρκέσει πολλές ημέρες. Κατά κανόνα, η δειγματοληψία πρέπει να εκτελείται κατά τακτά διαστήματα σε όλη τη διάρκεια της εκφόρτωσης. Δεν είναι, όμως, πάντα εφικτή ή σκόπιμη η παρουσία επίσημου επιθεωρητή σε όλη τη διάρκεια της εκφόρτωσης. Για τον λόγο αυτό, επιτρέπεται η δειγματοληψία μέρους της συνολικής παρτίδας (δειγματιζόμενο τμήμα). Για τον προσδιορισμό του αριθμού των μερικών ποσοτήτων δείγματος λαμβάνεται υπόψη το μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος.

Σε περίπτωση δειγματοληψίας μέρους μιας παρτίδας ζωοτροφών της ίδιας κατηγορίας ή περιγραφής και εάν το εν λόγω μέρος της παρτίδας διαπιστωθεί ότι δεν πληροί τις ενωσιακές απαιτήσεις, θεωρείται ότι θίγεται το σύνολο των ζωοτροφών της συγκεκριμένης παρτίδας, εκτός εάν από διεξοδική εξέταση δεν προκύψουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη παρτίδα δεν πληροί τις απαιτήσεις της ΕΕ.

Η παρουσία επιθεωρητή είναι απαραίτητη έστω και αν το επίσημο δείγμα λαμβάνεται αυτόματα. Ωστόσο, σε περίπτωση αυτόματης δειγματοληψίας με προκαθορισμένες παραμέτρους, οι οποίες δεν είναι δυνατόν να μεταβληθούν κατά τη δειγματοληψία, και συλλογής των μερικών ποσοτήτων δείγματος σε σφραγισμένα δοχεία που αποκλείουν κάθε πιθανότητα απάτης, η παρουσία επιθεωρητή απαιτείται μόνο κατά την έναρξη και τη λήξη της δειγματοληψίας, καθώς και σε κάθε αναγκαία αλλαγή του δοχείου συλλογής των δειγμάτων.

8.2.2.   Στατική δειγματοληψία παρτίδων που μεταφέρονται με πλοία

Για τη δειγματοληψία με στατική μέθοδο πρέπει να εφαρμόζεται η διαδικασία που προβλέπεται για τις εγκαταστάσεις αποθήκευσης (σιλό) οι οποίες είναι προσπελάσιμες από την κορυφή (βλέπε σημείο 8.4.1).

Η δειγματοληψία πρέπει να εκτελείται στο προσπελάσιμο τμήμα (από την κορυφή) της παρτίδας/του κύτους. Για τον προσδιορισμό του αριθμού των μερικών ποσοτήτων δείγματος λαμβάνεται υπόψη το μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος. Σε περίπτωση δειγματοληψίας μέρους μιας παρτίδας ζωοτροφών της ίδιας κατηγορίας ή περιγραφής και εάν το εν λόγω μέρος της παρτίδας διαπιστωθεί ότι δεν πληροί τις ενωσιακές απαιτήσεις, θεωρείται ότι θίγεται το σύνολο των ζωοτροφών της συγκεκριμένης παρτίδας, εκτός εάν από διεξοδική εξέταση δεν προκύψουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη παρτίδα δεν πληροί τις απαιτήσεις της ΕΕ.

8.3.   Δειγματοληψία μεγάλων παρτίδων σε αποθήκες

Η δειγματοληψία πρέπει να εκτελείται στο προσπελάσιμο τμήμα της παρτίδας. Για τον προσδιορισμό του αριθμού των μερικών ποσοτήτων δείγματος λαμβάνεται υπόψη το μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος. Σε περίπτωση δειγματοληψίας μέρους μιας παρτίδας ζωοτροφών της ίδιας κατηγορίας ή περιγραφής και εάν το εν λόγω μέρος της παρτίδας διαπιστωθεί ότι δεν πληροί τις ενωσιακές απαιτήσεις, θεωρείται ότι θίγεται το σύνολο των ζωοτροφών της συγκεκριμένης παρτίδας, εκτός εάν από διεξοδική εξέταση δεν προκύψουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη παρτίδα δεν πληροί τις απαιτήσεις της ΕΕ.

8.4.   Δειγματοληψία σε εγκαταστάσεις αποθήκευσης (σιλό)

8.4.1.   Δειγματοληψία σε (εύκολα) προσπελάσιμα από την κορυφή σιλό

Η δειγματοληψία πρέπει να εκτελείται στο προσπελάσιμο τμήμα της παρτίδας. Για τον προσδιορισμό του αριθμού των μερικών ποσοτήτων δείγματος λαμβάνεται υπόψη το μέγεθος του δειγματιζόμενου τμήματος. Σε περίπτωση δειγματοληψίας μέρους μιας παρτίδας ζωοτροφών της ίδιας κατηγορίας ή περιγραφής και εάν το εν λόγω μέρος της παρτίδας διαπιστωθεί ότι δεν πληροί τις ενωσιακές απαιτήσεις, θεωρείται ότι θίγεται το σύνολο των ζωοτροφών της συγκεκριμένης παρτίδας, εκτός εάν από διεξοδική εξέταση δεν προκύψουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη παρτίδα δεν πληροί τις απαιτήσεις της ΕΕ.

8.4.2.   Δειγματοληψία σε απροσπέλαστα από την κορυφή σιλό (κλειστά σιλό)

8.4.2.1.   Απροσπέλαστα από την κορυφή σιλό (κλειστά σιλό), χωρητικότητας 100 τόνων και άνω

Δεν είναι δυνατή η στατική δειγματοληψία των ζωοτροφών που αποθηκεύονται στις εγκαταστάσεις αυτές. Για τον λόγο αυτόν, εάν πρέπει να διενεργηθεί δειγματοληψία στο σιλό και δεν υπάρχει δυνατότητα μετακίνησης του φορτίου, πρέπει να γίνει συνεννόηση με τον επιχειρηματία ώστε αυτός να ειδοποιήσει τον επιθεωρητή για τον χρόνο εκφόρτωσης του σιλό και να είναι δυνατή η δειγματοληψία κατά την εκροή της ζωοτροφής.

8.4.2.2.   Απροσπέλαστα από την κορυφή σιλό (κλειστά σιλό), χωρητικότητας κάτω των 100 τόνων

Η διαδικασία δειγματοληψίας περιλαμβάνει τη μεταφορά ποσότητας 50 έως 100 kg σε δοχείο και τη λήψη του δείγματος από αυτή. Το μέγεθος του συνολικού δείγματος αντιστοιχεί στο σύνολο της παρτίδας, ενώ ο αριθμός των μερικών ποσοτήτων δείγματος συνδέεται με την ποσότητα που μεταφέρεται από το σιλό στο δοχείο για τη δειγματοληψία. Σε περίπτωση δειγματοληψίας μέρους μιας παρτίδας ζωοτροφών της ίδιας κατηγορίας ή περιγραφής και εάν το εν λόγω μέρος της παρτίδας διαπιστωθεί ότι δεν πληροί τις ενωσιακές απαιτήσεις, θεωρείται ότι θίγεται το σύνολο των ζωοτροφών της συγκεκριμένης παρτίδας, εκτός εάν από διεξοδική εξέταση δεν προκύψουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη παρτίδα δεν πληροί τις απαιτήσεις της ΕΕ.

8.5.   Δειγματοληψία ασυσκεύαστων ζωοτροφών σε μεγάλα κλειστά εμπορευματοκιβώτια

Συχνά, η δειγματοληψία των παρτίδων αυτών είναι δυνατή μόνο κατά την εκφόρτωσή τους. Σε ορισμένες περιπτώσεις η εκφόρτωση στο σημείο εισαγωγής ή ελέγχου είναι αδύνατη και, ως εκ τούτου, η δειγματοληψία θα πρέπει να διενεργείται κατά την εκφόρτωση των εν λόγω εμπορευματοκιβωτίων.

9.   ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΛΗΨΗ, ΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΤΗ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ

9.1.   Γενικά

Τα δείγματα πρέπει να λαμβάνονται και να παρασκευάζονται χωρίς αδικαιολόγητη καθυστέρηση, λαμβανομένων υπόψη των απαραίτητων προφυλάξεων για την αποφυγή αλλοίωσης ή μόλυνσης του προϊόντος. Τα όργανα, οι επιφάνειες και τα δοχεία στα οποία θα τοποθετηθούν τα δείγματα πρέπει να είναι καθαρά και ξηρά.

9.2.   Μερικές ποσότητες δείγματος

Οι μερικές ποσότητες δείγματος πρέπει να λαμβάνονται τυχαία από το σύνολο του δειγματιζόμενου τμήματος, να είναι περίπου ισομεγέθεις και ομοιόμορφα κατανεμημένες.

Οι μερικές ποσότητες δείγματος έχουν μέγεθος τουλάχιστον 100 γραμμαρίων ή, στην περίπτωση των χορτονομών με χαμηλό ειδικό βάρος, 25 γραμμαρίων.

Εάν πρέπει να ληφθούν λιγότερες από 40 μερικές ποσότητες δείγματος, σύμφωνα με τους κανόνες της διαδικασίας δειγματοληψίας που καθορίζεται στο σημείο 8, το μέγεθος των μερικών ποσοτήτων δείγματος προσδιορίζεται σε συνάρτηση με το απαιτούμενο μέγεθος του συνολικού δείγματος που πρέπει να επιτευχθεί (βλέπε σημείο 6).

Σε περίπτωση δειγματοληψίας μικρών παρτίδων συσκευασμένων ζωοτροφών, όπου οι ποσοτικές απαιτήσεις επιβάλλουν να λαμβάνεται περιορισμένος αριθμός μερικών ποσοτήτων δείγματος, μερική ποσότητα δείγματος είναι το περιεχόμενο μιας αρχικής μονάδας που δεν υπερβαίνει το 1 kg ή 1 λίτρο.

Σε περίπτωση δειγματοληψίας συσκευασμένων ζωοτροφών που αποτελούνται από μικρές μονάδες (π.χ. κάτω των 250 g), το μέγεθος της μερικής ποσότητας δείγματος εξαρτάται από το μέγεθος της μονάδας.

Στην περίπτωση των δειγμάτων πώλησης εξ αποστάσεως, το μέγεθος της μερικής ποσότητας δείγματος εξαρτάται από το μέγεθος της μονάδας και μπορεί επίσης να περιέχει λιγότερο από 100 g ή 100 ml σε μεμονωμένες περιπτώσεις.

9.2.1.   Ασυσκεύαστες ζωοτροφές

Εφόσον κρίνεται σκόπιμο, η δειγματοληψία εκτελείται κατά τη μετακίνηση του δειγματιζόμενου τμήματος (φόρτωση ή εκφόρτωση).

9.2.2.   Συσκευασμένες ζωοτροφές

Αφού επιλεγεί ο απαιτούμενος αριθμός μονάδων για τη δειγματοληψία, όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5, αφαιρείται μέρος του περιεχόμενου κάθε μονάδας με δειγματολήπτη τύπου λόγχης ή φτυάρι. Εάν είναι απαραίτητο, τα δείγματα λαμβάνονται μετά τη χωριστή εκκένωση των μονάδων.

9.2.3.   Ομοιογενείς ή ομογενοποιήσιμες υγρές ή ημίρρευστες ζωοτροφές

Αφού επιλεγεί ο απαιτούμενος αριθμός μονάδων για τη δειγματοληψία, όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5, ομογενοποιείται το περιεχόμενο, εάν χρειάζεται, και λαμβάνεται μία ποσότητα από κάθε μονάδα.

Οι μερικές ποσότητες δείγματος μπορούν να ληφθούν κατά τη μετάγγιση του περιεχομένου.

9.2.4.   Μη ομογενοποιήσιμες υγρές ή ημίρρευστες ζωοτροφές

Αφού επιλεγεί ο απαιτούμενος αριθμός μονάδων για τη δειγματοληψία, όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5, λαμβάνονται δείγματα από διάφορα επίπεδα.

Τα δείγματα μπορούν επίσης να ληφθούν κατά τη μετάγγιση του περιεχομένου. Στην περίπτωση αυτή, όμως, πρέπει να απορρίπτονται τα πρώτα κλάσματα.

Σε κάθε περίπτωση, ο λαμβανόμενος συνολικός όγκος δεν πρέπει να είναι μικρότερος από 10 λίτρα.

9.2.5.   Κτηνοτροφικές πλάκες και πλάκες λείξης ανόργανων αλάτων

Αφού επιλεγεί ο απαιτούμενος αριθμός πλακών για τη δειγματοληψία, όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5, μπορεί να ληφθεί ένα μέρος από κάθε πλάκα. Εάν υπάρχουν υπόνοιες ότι η πλάκα δεν είναι ομοιογενής, μπορεί να ληφθεί ολόκληρη ως δείγμα.

Στην περίπτωση των κτηνοτροφικών πλακών ή πλακών λείξης των οποίων το βάρος δεν υπερβαίνει το 1 kg, μερική ποσότητα δείγματος είναι το περιεχόμενο μιας πλάκας.

9.3.   Παρασκευή των συνολικών δειγμάτων

Οι μερικές ποσότητες δείγματος αναμειγνύονται για να σχηματιστεί ένα και μόνο συνολικό δείγμα.

9.4.   Παρασκευή των τελικών δειγμάτων

Το υλικό του συνολικού δείγματος αναμειγνύεται επιμελώς (2).

Κάθε δείγμα τοποθετείται σε κατάλληλο περιέκτη/δοχείο. Λαμβάνονται όλες οι απαραίτητες προφυλάξεις για να αποφεύγεται κάθε μεταβολή της σύνθεσης του δείγματος, μόλυνση ή αλλοίωση που θα μπορούσε να επέλθει κατά τη μεταφορά ή τη φύλαξη.

9.4.1.   Ομοιογενώς κατανεμημένες ουσίες

Για τον έλεγχο συστατικών ή ουσιών που είναι ομοιογενώς κατανεμημένα σε ολόκληρη τη ζωοτροφή, το συνολικό δείγμα μπορεί να μειωθεί με αντιπροσωπευτικό τρόπο σε 2 kg ή 2 λίτρα τουλάχιστον (μειωμένο δείγμα) (3), κατά προτίμηση με μηχανικό ή αυτόματο διαιρέτη. Για τον έλεγχο της παρουσίας υπολειμμάτων φυτοφαρμάκων σε όσπρια, σπόρους σιτηρών και καρπούς με κέλυφος, το ελάχιστο μέγεθος του μειωμένου δείγματος είναι 3 kg. Εάν το είδος της ζωοτροφής δεν επιτρέπει τη χρήση διαιρέτη ή εάν δεν υπάρχει διαιρέτης, το δείγμα μπορεί να μειωθεί με τη μέθοδο της διαίρεσης σε τέταρτα (να τεταρτιαστεί).

Στη συνέχεια, από το συνολικό δείγμα ή τα μειωμένα δείγματα λαμβάνονται τα τελικά δείγματα (για τον έλεγχο, ως μέσο άμυνας και ως δείγματα αναφοράς), των οποίων η ποσότητα είναι περίπου ίδια και τα οποία ανταποκρίνονται στις ποσοτικές απαιτήσεις του σημείου 7.

9.4.2.   Ανομοιογενώς κατανεμημένες ουσίες

Για τον έλεγχο συστατικών, συμπεριλαμβανομένων των γενετικώς τροποποιημένων υλικών, ή ουσιών που ενδέχεται να είναι ανομοιογενώς κατανεμημένα στις ζωοτροφές, το συνολικό δείγμα:

(i)	ομογενοποιείται πλήρως. Στη συνέχεια, από το ομογενοποιημένο συνολικό δείγμα λαμβάνονται τα τελικά δείγματα (για τον έλεγχο, ως μέσο άμυνας και ως δείγματα αναφοράς), των οποίων η ποσότητα είναι περίπου ίδια και τα οποία ανταποκρίνονται στις ποσοτικές απαιτήσεις του σημείου 7· ή

(ii)

μειώνεται σε 2 kg ή 2 λίτρα (4), τουλάχιστον, με μηχανικό ή αυτόματο διαιρέτη. Μόνον εφόσον το είδος της ζωοτροφής δεν επιτρέπει τη χρήση διαιρέτη, μπορεί το δείγμα να μειωθεί, εάν είναι απαραίτητο, με τη μέθοδο της διαίρεσης σε τέταρτα. Για τον έλεγχο της παρουσίας γενετικώς τροποποιημένου υλικού στο πλαίσιο του κανονισμού (ΕΕ) αριθ. 619/2011, το μειωμένο δείγμα πρέπει να περιέχει τουλάχιστον 35 000 σπέρματα/σπόρους ώστε να είναι δυνατόν να ληφθούν τελικά δείγματα για την επιβολή της νομοθεσίας, ως μέσο άμυνας και ως δείγματα αναφοράς που να περιέχουν τουλάχιστον 10 000 σπέρματα/σπόρους [βλέπε υποσημείωση (**) στο σημείο 6 και υποσημείωση (*) στο σημείο 7].

Στη συνέχεια, από το μειωμένο δείγμα παρασκευάζονται τα τελικά δείγματα, των οποίων η ποσότητα είναι περίπου ίδια και τα οποία ανταποκρίνονται στις ποσοτικές απαιτήσεις του σημείου 7.

9.5.   Συσκευασία των δειγμάτων

Οι περιέκτες ή οι συσκευασίες σφραγίζονται και επισημαίνονται κατά τρόπο ώστε να είναι αδύνατον να ανοιχθούν χωρίς να καταστραφεί η σφραγίδα. Η ετικέτα πρέπει να είναι εξολοκλήρου ενσωματωμένη στη σφραγίδα. Εναλλακτικά, επιτρέπεται η τοποθέτηση του δείγματος σε περιέκτη που να μπορεί να πωματιστεί κατά τρόπο ώστε να μην είναι δυνατόν να ανοιχθεί χωρίς ανεπανόρθωτη βλάβη του περιέκτη, ο οποίος δεν πρέπει να επαναχρησιμοποιείται.

9.6.   Αποστολή των δειγμάτων στο εργαστήριο

Τα δείγματα αποστέλλονται χωρίς καθυστέρηση στο αναλυτικό εργαστήριο που έχει οριστεί, συνοδευόμενα από τις απαραίτητες για την ανάλυση πληροφορίες.

10.   ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ

Για κάθε δείγμα συντάσσεται πρωτόκολλο το οποίο επιτρέπει την αδιαμφισβήτητη ταυτοποίηση του δειγματιζόμενου τμήματος και του μεγέθους του.

Στο πρωτόκολλο αναφέρεται επίσης κάθε απόκλιση από τη διαδικασία δειγματοληψίας που προβλέπεται στον παρόντα κανονισμό.

Το πρωτόκολλο τίθεται στη διάθεση του εργαστηρίου επισήμου ελέγχου και, επιπλέον, στη διάθεση της επιχείρησης ζωοτροφών και/ή του εργαστηρίου που ορίζει η επιχείρηση ζωοτροφών.

11.   ΔΕΙΓΜΑ ΠΩΛΗΣΗΣ ΕΞ ΑΠΟΣΤΑΣΕΩΣ

—

Για δείγμα πώλησης εξ αποστάσεως, η αρμόδια αρχή ζητά τις ζωοτροφές από την επιχείρηση ζωοτροφών μέσω τεχνικών εξ αποστάσεως επικοινωνίας. Στην περίπτωση αυτή, όταν ζητά τη ζωοτροφές, η αρμόδια αρχή δεν χρειάζεται να ταυτοποιείται με επίσημη ταυτότητα του υπευθύνου επιχείρησης ζωοτροφών και μπορεί να χρησιμοποιεί καλυμμένη ταυτότητα.

—

Το συνολικό δείγμα και τα τελικά δείγματα του δείγματος πώλησης εξ αποστάσεως πρέπει να λαμβάνονται αμέσως μετά την παραλαβή του φορτίου από πρόσωπα εξουσιοδοτημένα για τον σκοπό αυτόν. Για την παραγωγή του συνολικού δείγματος, πρέπει να λαμβάνεται κατάλληλος αριθμός στοιχειωδών δειγμάτων τυχαία και ομοιόμορφα κατανεμημένα από τη συνολική ποσότητα που λαμβάνεται και να αναμειγνύονται/ομογενοποιούνται επιμελώς, σύμφωνα, στο μέτρο του δυνατού, με τις αρχές που ορίζονται στα σημεία 5, 9.2 και 9.3. Εάν η ζωοτροφή είναι συσκευασμένη σε μεμονωμένες μονάδες, πρέπει να λαμβάνονται τουλάχιστον 4 μονάδες από τις οποίες πρέπει να λαμβάνεται τουλάχιστον ένα στοιχειώδες δείγμα. Εάν αποδειχθεί κατά περίπτωση ότι οι λαμβανόμενες μονάδες προέρχονται από διαφορετικές παρτίδες, ο αριθμός των μονάδων που πρέπει να αποτελέσουν αντικείμενο δειγματοληψίας πρέπει να μειωθεί και να περιοριστεί στις μονάδες που προέρχονται από την ίδια παρτίδα. Σε περίπτωση ανάλυσης του εξ αποστάσεως πωλούμενου δείγματος για συστατικά ή ουσίες που δεν είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα στις ζωοτροφές, ο αριθμός των στοιχειωδών δειγμάτων πρέπει να είναι τουλάχιστον 2,5 φορές μεγαλύτερος από τον αριθμό των δειγμάτων που αναλύονται σε ουσίες ομοιόμορφα κατανεμημένες σε όλη τη ζωοτροφή. Στη συνέχεια, από το συνολικό δείγμα λαμβάνονται τα αντίστοιχα τελικά δείγματα (για έλεγχο, ως μέσο άμυνας και, ενδεχομένως, αναφοράς) σύμφωνα, στο μέτρο του δυνατού, με τις αρχές που ορίζονται στο σημείο 9.4 και το αρχείο δειγματοληψίας δείχνει ότι πρόκειται για δείγμα εξ αποστάσεως πώλησης. Στη συνέχεια, η αρμόδια αρχή ενημερώνει αμέσως τον υπεύθυνο της επιχείρησης ζωοτροφών για τη δειγματοληψία. Ο υπεύθυνος επιχείρησης ζωοτροφών ενημερώνεται επίσης ότι ένα δείγμα (για λόγους άμυνας) διατηρείται, όταν είναι δυνατόν, στη διάθεσή του από την αρμόδια αρχή, σε συγκεκριμένη τοποθεσία, για αμυντικούς σκοπούς ή αποστέλλεται στον υπεύθυνο επιχείρησης ζωοτροφών ή αποστέλλεται στο εργαστήριο που έχει οριστεί από τον υπεύθυνο επιχείρησης ζωοτροφών σύμφωνα με τους ισχύοντες εθνικούς κανόνες. Εάν το δείγμα αποστέλλεται απευθείας στο επίσημο εργαστήριο, το τελικό δείγμα πρέπει να παρασκευάζεται και να σφραγίζεται στο εργαστήριο από εξουσιοδοτημένα για το σκοπό αυτό πρόσωπα ή παρουσία εξουσιοδοτημένων για τον σκοπό αυτόν προσώπων. Το αρχείο δειγματοληψίας του δείγματος εξ αποστάσεως πώλησης πρέπει να αποστέλλεται αμέσως μετά τον σχηματισμό των τελικών δειγμάτων στην αρμόδια αρχή, η οποία ενημερώνει τον υπεύθυνο της επιχείρησης ζωοτροφών για τη δειγματοληψία. Θεωρείται ότι η ποσότητα που προμηθεύει ο υπεύθυνος της επιχείρησης ζωοτροφών στην αρμόδια αρχή αντιπροσωπεύει μέρος παρτίδας ζωοτροφών της ίδιας κατηγορίας ή περιγραφής. Σύμφωνα με το άρθρο 15 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 178/2002 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου (5), σε περίπτωση δειγματοληψίας μέρους μιας παρτίδας ζωοτροφών της ίδιας κατηγορίας ή περιγραφής και εάν το εν λόγω μέρος της παρτίδας διαπιστωθεί ότι δεν πληροί τις ενωσιακές απαιτήσεις, θεωρείται ότι θίγεται το σύνολο των ζωοτροφών της συγκεκριμένης παρτίδας, εκτός εάν από διεξοδική εξέταση δεν προκύψουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη παρτίδα δεν πληροί τις απαιτήσεις της ΕΕ.

«ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II

ΓΕΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΙΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΖΩΟΤΡΟΦΩΝ

A.   ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ

1.   Σκοπός

Οι διαδικασίες που περιγράφονται στο παρόν παράρτημα αφορούν την προετοιμασία προς ανάλυση των δειγμάτων που αποστέλλονται στα εργαστήρια ελέγχου, μετά τη δειγματοληψία σύμφωνα με τις διατάξεις του παραρτήματος I.

Τα εργαστηριακά δείγματα πρέπει να παρασκευάζονται κατά τρόπο ώστε οι ζυγιζόμενες ποσότητες, που προβλέπονται στις αναλυτικές μεθόδους, να είναι ομοιογενείς και αντιπροσωπευτικές των τελικών δειγμάτων.

Εκτός από τις διαδικασίες που περιγράφονται στο παρόν παράρτημα, ακολουθούνται οι κατευθυντήριες γραμμές για την προετοιμασία των δειγμάτων που προβλέπονται στο πρότυπο EN ISO 6498.

2.   Απαραίτητες προφυλάξεις

Η εφαρμοστέα διαδικασία παρασκευής δειγμάτων εξαρτάται από τις αναλυτικές μεθόδους που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν και από τα συστατικά ή ουσίες που πρόκειται να ελεγχθούν. Για τον λόγο αυτόν, είναι πολύ σημαντικό η ακολουθούμενη διαδικασία παρασκευής δειγμάτων να είναι η κατάλληλη για τη χρησιμοποιούμενη αναλυτική μέθοδο και τα ελεγχόμενα συστατικά ή ουσίες.

Όλες οι απαραίτητες εργασίες πρέπει να διεξάγονται κατά τρόπο ώστε να αποφεύγονται, κατά το δυνατόν, η μόλυνση του δείγματος και οι μεταβολές της σύνθεσής του.

Η κονιοποίηση, η ανάμειξη και η κοσκίνιση εκτελούνται χωρίς καθυστέρηση και με ελαχιστοποίηση της έκθεσης του δείγματος στον αέρα και στο φως. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται μύλοι και κονιοποιητές που ενδέχεται να προκαλέσουν σημαντική θέρμανση του δείγματος.

Συνιστάται η χειροκίνητη κονιοποίηση των ζωοτροφών που είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες στη θερμότητα. Πρέπει επίσης να εξασφαλίζεται ότι οι ίδιες οι συσκευές δεν αποτελούν πηγή μόλυνσης.

Η ομογενοποίηση του δείγματος με την παρασκευή μείγματος με ανάμειξη μεγάλης διάτμησης με νερό έχει αποδειχθεί ότι παρέχει σε ορισμένες περιπτώσεις πιο ομοιογενή επιμέρους δείγματα από ό,τι η ξηρή ομογενοποίηση/άλεση, ιδίως στην περίπτωση χημικών ουσιών ανομοιογενούς κατανομής. Ωστόσο, και η ομογενοποίηση με επαρκή ξηρή άλεση μπορεί να παρέχει ομοιογενή επιμέρους δείγματα.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως για τον προσδιορισμό των εργοτίων της σίκαλης, των επιβλαβών βοτανικών προσμείξεων κ.λπ., η ομογενοποίηση του δείγματος δεν μπορεί να γίνει με άλεση, παρά με επαρκή ανάμειξη του δείγματος.

Εάν δεν είναι δυνατόν να παρασκευαστεί το δείγμα χωρίς σημαντική μεταβολή του ποσοστού υγρασίας σε αυτό, προσδιορίζεται η υγρασία του πριν και μετά την παρασκευή, με τη μέθοδο που καθορίζεται στο παράρτημα III μέρος Α.

3.   Διαδικασία

3.1.   Γενική διαδικασία

Από το τελικό δείγμα λαμβάνεται το γνωστό κλάσμα δοκιμασίας. Δεν συνιστάται κωνικοποίηση και διαίρεση σε τέταρτα (coning and quartering), επειδή μπορεί να προκύψουν γνωστά κλάσματα δοκιμασίας με μεγάλο σφάλμα διαμερισμού.

3.1.1.   Ζωοτροφές που μπορούν να κονιοποιηθούν ως έχουν

—	Το τελικό δείγμα αναμειγνύεται και συλλέγεται σε κατάλληλο καθαρό και ξηρό περιέκτη, εφοδιασμένο με αεροστεγές πώμα. Η ανάμειξη επαναλαμβάνεται αμέσως πριν από τη ζύγιση της προς ανάλυση ποσότητας (γνωστό κλάσμα δοκιμασίας), για να εξασφαλιστεί πλήρης ομογενοποίηση.

3.1.2.   Ζωοτροφές που μπορούν να κονιοποιηθούν μετά από ξήρανση

—

Εκτός αντίθετης διάταξης των αναλυτικών μεθόδων, το τελικό δείγμα ξηραίνεται έως ότου το ποσοστό υγρασίας του κατέλθει στο 8-12 %, με την εφαρμογή της διαδικασίας προκαταρτικής ξήρανσης που περιγράφεται στο παράρτημα III, μέρος A «Προσδιορισμός υγρασίας», σημείο 4.3. Στη συνέχεια εκτελούνται οι εργασίες που υποδεικνύονται στο σημείο 3.1.1.

3.1.3.   Υγρές ή ημίρρευστες ζωοτροφές

—	Το τελικό δείγμα συλλέγεται σε κατάλληλο καθαρό και ξηρό περιέκτη, εφοδιασμένο με αεροστεγές πώμα. Αναμειγνύεται πλήρως, αμέσως πριν από τη ζύγιση της προς ανάλυση ποσότητας (γνωστό κλάσμα δοκιμασίας), για να εξασφαλιστεί πλήρης ομογενοποίηση.

3.1.4.   Λοιπές ζωοτροφές

—	Εάν δεν είναι δυνατόν να παρασκευαστούν τα τελικά δείγματα σύμφωνα με μια από τις ανωτέρω διαδικασίες, εφαρμόζεται άλλη διαδικασία που εξασφαλίζει ότι οι ζυγιζόμενες για την ανάλυση ποσότητες (γνωστά κλάσματα δοκιμασίας) είναι ομοιογενείς και αντιπροσωπευτικές των τελικών δειγμάτων.

3.2.   Ειδική διαδικασία για τις περιπτώσεις της οπτικής ή μικροσκοπικής εξέτασης και της ομογενοποίησης ολόκληρου του συνολικού δείγματος

—	Σε περίπτωση οπτικής εξέτασης (χωρίς τη χρήση μικροσκοπίου), χρησιμοποιείται για την εξέταση ολόκληρο το συνολικό ή τελικό δείγμα.

—

Σε περίπτωση μικροσκοπικής εξέτασης, το εργαστήριο μπορεί να μειώνει το συνολικό δείγμα ή να μειώνει περαιτέρω το μειωμένο δείγμα. Τα τελικά δείγματα ως μέσο άμυνας και πιθανώς ως δείγματα αναφοράς λαμβάνονται με διαδικασία ισοδύναμη με εκείνη που ακολουθείται όσον αφορά το τελικό δείγμα για την επιβολή της νομοθεσίας.

—	Σε περίπτωση ομογενοποίησης ολόκληρου του συνολικού δείγματος, τα τελικά δείγματα λαμβάνονται από το ομογενοποιημένο συνολικό δείγμα.

—

Για τον προσδιορισμό των εργοτίων της σίκαλης και των επιβλαβών βοτανικών προσμείξεων, το τελικό δείγμα πρέπει να διαιρεθεί σε 2 επιμέρους δείγματα ίσου βάρους περίπου 500 γραμμαρίων. Εξετάζεται ένα μερικό δείγμα. Αν το αποτέλεσμα των μερικών δειγμάτων είναι ίσο ή μικρότερο του 50 % (κατώφλιο αναλυτικού προσδιορισμού) του ανώτατου επιπέδου, το δείγμα συμμορφώνεται με το ανώτατο επίπεδο. Αν το αποτέλεσμα είναι μεγαλύτερο από το 50 % του ανώτατου επιπέδου, πρέπει να εξεταστεί και άλλο μερικό δείγμα και να χρησιμοποιηθεί ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων των 2 μερικών δειγμάτων για τον έλεγχο της συμμόρφωσης με το ανώτατο επίπεδο.

4.   Φύλαξη των δειγμάτων

Τα δείγματα πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία που δεν μεταβάλλει τη σύνθεσή τους. Τα δείγματα που προορίζονται για την ανάλυση βιταμινών ή ιδιαίτερα φωτοευαίσθητων ουσιών φυλάσσονται σε συνθήκες που αποτρέπουν τη δυσμενή επίδραση του φωτός σε αυτά.

B.   ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΤΙΣ ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΙΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ

1.

Εκτός αντίθετης διάταξης των αναλυτικών μεθόδων, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικής καθαρότητας (pro analysis/p.a.). Για την ανάλυση των ιχνοστοιχείων, η καθαρότητα των αντιδραστηρίων πρέπει να ελέγχεται με τυφλό πείραμα. Ανάλογα με το λαμβανόμενο αποτέλεσμα, ενδέχεται να απαιτείται επιπλέον καθαρισμός των αντιδραστηρίων.

2.

Όταν στις αναλυτικές μεθόδους αναφέρονται εργασίες παρασκευής διαλυμάτων, αραίωσης, έκπλυσης ή πλύσης, χωρίς ένδειξη για το είδος του διαλύτη ή αραιωτικού μέσου, εννοείται ότι πρέπει να χρησιμοποιείται νερό. Κατά κανόνα, το νερό πρέπει να είναι απιονισμένο ή απεσταγμένο. Σε ειδικές περιπτώσεις, που επισημαίνονται στις μεθόδους ανάλυσης, το νερό πρέπει να υποβάλλεται σε ειδικές μεθόδους καθαρισμού.

3.

Λαμβανομένου υπόψη του συνήθους εξοπλισμού των εργαστηρίων ελέγχου, στις μεθόδους ανάλυσης αναφέρονται μόνο τα ειδικά όργανα και συσκευές ή εκείνα που απαιτούν συγκεκριμένο τρόπο χρήσης. Ο εξοπλισμός αυτός πρέπει να είναι καθαρός, ιδίως σε περίπτωση προσδιορισμού πολύ μικρών ποσοτήτων ουσιών.

Γ.   ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΚΑΙ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

1.   Διαδικασία εκχύλισης

Σε πολλές μεθόδους καθορίζεται συγκεκριμένη διαδικασία εκχύλισης. Κατά κανόνα, μπορούν να εφαρμοστούν και άλλες διαδικασίες εκχύλισης πέραν της αναφερόμενης στη μέθοδο, υπό τον όρο ότι έχει αποδειχθεί ότι η απόδοση εκχύλισης της χρησιμοποιούμενης διαδικασίας εκχύλισης είναι ισοδύναμη, για την υπό ανάλυση μήτρα, με εκείνη της διαδικασίας που αναφέρεται στη μέθοδο.

2.   Διαδικασία καθαρισμού

Σε πολλές μεθόδους καθορίζεται συγκεκριμένη διαδικασία καθαρισμού. Κατά κανόνα, μπορούν να εφαρμοστούν και άλλες διαδικασίες καθαρισμού πέραν της αναφερόμενης στη μέθοδο, υπό τον όρο ότι έχει αποδειχθεί ότι τα αναλυτικά αποτελέσματα που προκύπτουν από τη χρησιμοποιούμενη διαδικασία καθαρισμού είναι ισοδύναμα, για την υπό ανάλυση μήτρα, με εκείνα της διαδικασίας που αναφέρεται στη μέθοδο.

3.   Αριθμός προσδιορισμών

Στην περίπτωση της ανάλυσης ανεπιθύμητων ουσιών, εάν το αποτέλεσμα του πρώτου προσδιορισμού είναι σημαντικά μικρότερο (> 50 %) από την προς έλεγχο προδιαγραφή, δεν απαιτούνται πρόσθετοι προσδιορισμοί, υπό τον όρο ότι εφαρμόζονται οι κατάλληλες διαδικασίες ποιότητας. Σε άλλες περιπτώσεις είναι απαραίτητη η ανάλυση εις διπλούν (δεύτερος προσδιορισμός) για να αποκλειστεί η πιθανότητα εσωτερικής διασταυρούμενης μόλυνσης ή συμπτωματικής ανάμειξης δειγμάτων. Ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων των δύο προσδιορισμών χρησιμοποιείται για περαιτέρω αξιολόγηση.

Στην περίπτωση ελέγχου ελάχιστων ή μέγιστων επιπέδων πρόσθετων υλών ζωοτροφών, εάν το αποτέλεσμα του πρώτου προσδιορισμού είναι υψηλότερα από το ελάχιστο επίπεδο ή κάτω από το μέγιστο επίπεδο, δεν απαιτούνται πρόσθετοι προσδιορισμοί, υπό τον όρο ότι εφαρμόζονται οι κατάλληλες διαδικασίες ποιότητας. Σε άλλες περιπτώσεις είναι απαραίτητη η ανάλυση εις διπλούν (δεύτερος προσδιορισμός) για να αποκλειστεί η πιθανότητα εσωτερικής διασταυρούμενης μόλυνσης ή συμπτωματικής ανάμειξης δειγμάτων. Ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων των δύο προσδιορισμών χρησιμοποιείται για περαιτέρω αξιολόγηση.

Στην περίπτωση του ελέγχου της δηλούμενης περιεκτικότητας σε ουσία ή συστατικό, εάν το αποτέλεσμα του πρώτου προσδιορισμού επιβεβαιώνει τη δηλούμενη περιεκτικότητα, δηλαδή το αναλυτικό αποτέλεσμα περικλείεται στο αποδεκτό εύρος μεταβλητότητας της δηλούμενης περιεκτικότητας, δεν απαιτούνται πρόσθετοι προσδιορισμοί, υπό τον όρο ότι εφαρμόζονται οι κατάλληλες διαδικασίες ποιότητας. Σε άλλες περιπτώσεις είναι απαραίτητη η ανάλυση εις διπλούν (δεύτερος προσδιορισμός) για να αποκλειστεί η πιθανότητα εσωτερικής διασταυρούμενης μόλυνσης ή συμπτωματικής ανάμειξης δειγμάτων. Ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων των δύο προσδιορισμών χρησιμοποιείται για περαιτέρω αξιολόγηση (το μέσο αποτέλεσμα της ανάλυσης εμπίπτει ή όχι στο αποδεκτό εύρος διακύμανσης της δηλούμενης περιεκτικότητας).

Σε ορισμένες περιπτώσεις, αυτό το αποδεκτό εύρος διακύμανσης ορίζεται στη νομοθεσία, όπως στον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 767/2009 και στον κανονισμό (ΕΕ) 2019/4 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου (1).

4.   Αναφορά της χρησιμοποιούμενης αναλυτικής μεθόδου

Στη έκθεση ανάλυσης αναφέρεται η χρησιμοποιούμενη αναλυτική μέθοδος.

5.   Αναφορά των αναλυτικών αποτελεσμάτων

Τα αναλυτικά αποτελέσματα εκφράζονται όπως προβλέπεται στην αναλυτική μέθοδο, με κατάλληλο αριθμό σημαντικών ψηφίων, και διορθώνονται, εάν είναι απαραίτητο, για να ληφθεί υπόψη το ποσοστό υγρασίας του τελικού δείγματος πριν από την παρασκευή.

Τα περισσότερα κανονιστικά επίπεδα (π.χ. μέγιστο επίπεδο, ελάχιστο επίπεδο) στη νομοθεσία της ΕΕ για τις ζωοτροφές καθορίζονται σε σχέση με ζωοτροφές με περιεκτικότητα σε υγρασία 12 %. Ως εκ τούτου, στις περιπτώσεις αυτές, προκειμένου να εκτιμηθεί το αναλυτικό αποτέλεσμα που μετρήθηκε στο δείγμα σε σχέση με το κανονιστικό επίπεδο, το αναλυτικό αποτέλεσμα πρέπει πρώτα να διαιρεθεί με την περιεκτικότητα του δείγματος σε ξηρά ουσία (σε %) και να πολλαπλασιαστεί επί 88, όπως αναφέρεται στον ακόλουθο τύπο:

όπου:

Mc	:	ποσοστό υγρασίας του δείγματος (%). 100 – Mc επομένως, αντιπροσωπεύει την περιεκτικότητα του δείγματος σε ξηρά ουσία (%).
Rana	:	αναλυτικό αποτέλεσμα όπως μετρήθηκε στο δείγμα
R12 %	:	αποτέλεσμα για ζωοτροφή με ποσοστό υγρασίας 12 %·να αξιολογηθεί σε σχέση με το κανονιστικό επίπεδο.

Επιπλέον, εφόσον πληρούνται οι ακόλουθες προϋποθέσεις:

—	το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι σημαντικά (> 50 %) χαμηλότερο ή υψηλότερο από τις πληροφορίες/προδιαγραφές επισήμανσης προς έλεγχο (ανάλογα με το αν οι πληροφορίες/προδιαγραφές επισήμανσης αποτελούν το μέγιστο ή ελάχιστο επίπεδο)·

—

η περιεκτικότητα σε υγρασία της δειγματιζόμενης ζωοτροφής είναι γνωστή και μπορεί να προσδιοριστεί ότι η διόρθωση της περιεκτικότητας σε υγρασία δεν θα μεταβάλει την εκτίμηση, τότε, υπό την προϋπόθεση ότι εφαρμόζονται οι κατάλληλες διαδικασίες ποιότητας και ότι η ανάλυση εξυπηρετεί μόνο τον σκοπό του ελέγχου της συμμόρφωσης με τις νομικές διατάξεις, η διόρθωση της περιεκτικότητας σε υγρασία μπορεί να παραλείπεται (π.χ. σε περιπτώσεις όπου δεν υπάρχει προδιαγραφή ή κανονιστικό επίπεδο), εκτός εάν αυτό απαιτείται για λόγους ερμηνείας.

Εάν το αποτέλεσμα της ανάλυσης διορθωθεί ως προς την περιεκτικότητα σε υγρασία, η αντίστοιχη αβεβαιότητα μέτρησης πρέπει επίσης να διορθωθεί με την ίδια διαδικασία.

Σε περίπτωση προσδιορισμού των εργοτίων της σίκαλης ή επιβλαβών βοτανικών προσμείξεων με οπτική/μικροσκοπική εξέταση, δεν είναι απαραίτητη η διόρθωση της περιεκτικότητας σε υγρασία.

6.   Αβεβαιότητα αναλυτικής μέτρησης και ποσοστό ανάκτησης στην περίπτωση της ανάλυσης ανεπιθύμητων ουσιών

Όσον αφορά τις ανεπιθύμητες ουσίες, κατά την έννοια της οδηγίας 2002/32/ΕΚ, ένα προϊόν που προορίζεται για ζωοτροφή θεωρείται ότι δεν συμμορφώνεται με την καθορισμένη μέγιστη περιεκτικότητα, εάν κριθεί ότι το αναλυτικό αποτέλεσμα, ως μέσος όρος δύο ανεξάρτητων προσδιορισμών, σε σχέση με ζωοτροφή με ποσοστό υγρασίας 12 %, υπερβαίνει τη μέγιστη περιεκτικότητα, λαμβανομένων υπόψη της διευρυμένης αβεβαιότητας μέτρησης που υπολογίζεται με τη χρήση συντελεστή κάλυψης ίσου με 2, ο οποίος παρέχει διάστημα εμπιστοσύνης περίπου 95 %, και της διόρθωσης ως προς την ανάκτηση. Αυτό σημαίνει, ότι για την εκτίμηση της συμμόρφωσης χρησιμοποιείται η συγκέντρωση που προκύπτει από την ανάλυση, μετά από διόρθωση ως προς την ανάκτηση και αφαίρεση της διευρυμένης αβεβαιότητας μέτρησης. Η διαδικασία αυτή εφαρμόζεται μόνο σε περιπτώσεις όπου η μέθοδος ανάλυσης επιτρέπει την εκτίμηση της διευρυμένης αβεβαιότητας της αναλυτικής μέτρησης και της διόρθωσης για ανάκτηση. (π.χ. δεν απαιτείται σε περίπτωση οπτικής/μικροσκοπικής εξέτασης).

Εάν το αναλυτικό αποτέλεσμα του δείγματος που ελήφθη ως μέσο άμυνας υπερβαίνει τη μέγιστη περιεκτικότητα (χωρίς να λαμβάνεται υπόψη η διευρυμένη αβεβαιότητα της αναλυτικής μέτρησης), αυτό επιβεβαιώνει τη μη συμμόρφωση που διαπιστώθηκε με το δείγμα ελέγχου, ελλείψει ειδικών εθνικών κανόνων για το θέμα αυτό.

Το αναλυτικό αποτέλεσμα αναφέρεται ως εξής (στον βαθμό που η χρησιμοποιούμενη αναλυτική μέθοδος επιτρέπει την εκτίμηση της διευρυμένης αβεβαιότητας αναλυτικής μέτρησης):

α)

διορθωμένο ως προς την ανάκτηση, κατά περίπτωση, και όταν διορθώνεται αυτό πρέπει να δηλώνεται με αυτόν τον τρόπο. Αναφέρεται το ποσοστό ανάκτησης, εκτός εάν η εγγενής διόρθωση για τη μεροληψία αποτελεί μέρος της διαδικασίας, όπου μεροληψία είναι η διαφορά μεταξύ της μετρούμενης τιμής και της συγκέντρωσης αναφοράς. Η διόρθωση για ανάκτηση δεν είναι απαραίτητη εάν το ποσοστό ανάκτησης κυμαίνεται μεταξύ 90 και 110 %.

β)	ως «x +/– U», όπου x είναι το αποτέλεσμα της ανάλυσης και U είναι η διευρυμένη αβεβαιότητα αναλυτικής μέτρησης, με τη χρήση παράγοντα κάλυψης 2 (2) που παρέχει επίπεδο εμπιστοσύνης περίπου 95 %.

Ωστόσο, εάν το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι σημαντικά μικρότερο (> 50 %) από την προς έλεγχο προδιαγραφή, και υπό τον όρο ότι εφαρμόζονται οι κατάλληλες διαδικασίες ποιότητας και η ανάλυση χρησιμοποιείται με αποκλειστικό σκοπό τον έλεγχο της συμμόρφωσης προς τις νομοθετικές διατάξεις, η αναφορά του ποσοστού ανάκτησης και η διευρυμένη αβεβαιότητα της αναλυτικής μέτρησης μπορεί να παραλείπονται (π.χ. σε περιπτώσεις που δεν υπάρχει προδιαγραφές ή κανονιστικό επίπεδο), εκτός εάν η αβεβαιότητα μέτρησης είναι απαραίτητη για την ερμηνεία.

7.   Αβεβαιότητα αναλυτικής μέτρησης και ποσοστό ανάκτησης στην περίπτωση της ανάλυσης περιεκτικότητας σε πρόσθετες ύλες ζωοτροφών

Για να ελεγχθεί η συμμόρφωση με την επιτρεπόμενη ελάχιστη και μέγιστη περιεκτικότητα σε πρόσθετες ύλες ζωοτροφών, η παρουσία μιας πρόσθετης ύλης ζωοτροφών θεωρείται ότι δεν συμμορφώνεται με την καθορισμένη ελάχιστη και μέγιστη περιεκτικότητα, εάν το αναλυτικό αποτέλεσμα ως μέσος όρος δύο ανεξάρτητων προσδιορισμών, σε σχέση με ζωοτροφή με περιεκτικότητα σε υγρασία 12 %, θεωρείται ότι:

—

υπερβαίνει τη μέγιστη περιεκτικότητα, λαμβανομένης υπόψη της διευρυμένης αβεβαιότητας της αναλυτικής μέτρησης και της διόρθωσης για ανάκτηση. Αυτό σημαίνει, ότι για την εκτίμηση της συμμόρφωσης χρησιμοποιείται η συγκέντρωση που προκύπτει από την ανάλυση (δηλαδή ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών), μετά από διόρθωση ως προς την ανάκτηση και αφαίρεση της διευρυμένης αβεβαιότητας μέτρησης.

—

υπολείπεται της ελάχιστης περιεκτικότητας, λαμβανομένης υπόψη της διευρυμένης αβεβαιότητας της αναλυτικής μέτρησης και της διόρθωσης για ανάκτηση. Αυτό σημαίνει, ότι για την εκτίμηση της συμμόρφωσης χρησιμοποιείται η συγκέντρωση που προκύπτει από την ανάλυση (δηλαδή ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών), μετά από διόρθωση ως προς την ανάκτηση και πρόσθεση της διευρυμένης αβεβαιότητας μέτρησης.

Εάν το αναλυτικό αποτέλεσμα του δείγματος που ελήφθη ως μέσο άμυνας υπερβαίνει τη μέγιστη περιεκτικότητα (χωρίς να λαμβάνεται υπόψη η διευρυμένη αβεβαιότητα της αναλυτικής μέτρησης), αυτό επιβεβαιώνει τη μη συμμόρφωση που διαπιστώθηκε με το δείγμα ελέγχου, ελλείψει ειδικών εθνικών κανόνων για το θέμα αυτό.

Το αναλυτικό αποτέλεσμα αναφέρεται ως εξής (στον βαθμό που η χρησιμοποιούμενη αναλυτική μέθοδος επιτρέπει την εκτίμηση της αβεβαιότητας μέτρησης και του ποσοστού ανάκτησης):

α)

διορθωμένο ως προς την ανάκτηση, κατά περίπτωση, και όταν διορθώνεται αυτό πρέπει να δηλώνεται με αυτόν τον τρόπο. Αναφέρεται το ποσοστό ανάκτησης, εκτός εάν η εγγενής διόρθωση για τη μεροληψία αποτελεί μέρος της διαδικασίας, όπου μεροληψία είναι η διαφορά μεταξύ της μετρούμενης τιμής και της συγκέντρωσης αναφοράς. Η διόρθωση για ανάκτηση δεν είναι απαραίτητη εάν το ποσοστό ανάκτησης κυμαίνεται μεταξύ 90 και 110 %.

β)	ως «x +/– U», όπου x είναι το αποτέλεσμα της ανάλυσης (μέσος όρος των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών) και U είναι η διευρυμένη αβεβαιότητα αναλυτικής μέτρησης, με τη χρήση παράγοντα κάλυψης 2 (3) που παρέχει επίπεδο εμπιστοσύνης περίπου 95 %.

«ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III

ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΩΝ ΥΛΩΝ ΖΩΟΤΡΟΦΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΣΥΝΘΕΤΩΝ ΖΩΟΤΡΟΦΩΝ

Α.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΥΓΡΑΣΙΑΣ

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των ζωοτροφών σε υγρασία. Στην περίπτωση ζωοτροφών που περιέχουν πτητικές ουσίες, όπως οργανικά οξέα, πρέπει να σημειωθεί ότι μαζί με την περιεκτικότητα της υγρασίας προσδιορίζεται και ένας σημαντικός αριθμός πτητικών ουσιών.

Η μέθοδος δεν αφορά την ανάλυση των γαλακτοκομικών προϊόντων ως πρώτων υλών ζωοτροφών και σύνθετων ζωοτροφών, που αποτελούνται κυρίως από γαλακτοκομικών προϊόντα, την ανάλυση ζωικών και φυτικών λιπών και ελαίων, καθώς και την ανάλυση των ελαιούχων σπόρων και καρπών.

Ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας των ελαιούχων σπόρων σε υγρασία καθορίζεται με τη μέθοδο που προβλέπεται στο πρότυπο EN ISO 665 Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε υγρασία και πτητικές ουσίες, με την προϋπόθεση ότι οι σπόροι σόγιας πρέπει να αλεστούν πριν από τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε υγρασία.

2.   Αρχή

Το δείγμα ξηραίνεται υπό καθορισμένες συνθήκες οι οποίες διαφέρουν αναλόγως της φύσης της ζωοτροφής. Η απώλεια βάρους προσδιορίζεται με ζύγιση. Είναι απαραίτητο να διενεργείται προκαταρκτική ξήρανση, όταν πρόκειται για στερεά ζωοτροφή η οποία έχει υψηλή περιεκτικότητα σε υγρασία.

3.   Όργανα

3.1.

Τριβείο αποτελούμενο από υλικό το οποίο δεν απορροφά υγρασία, είναι εύκολο στον καθαρισμό του, επιτρέπει ταχεία και ομοιόμορφη τριβή χωρίς να προκαλεί την παραγωγή αξιόλογης θερμότητας, δεν επιτρέπει κατά το δυνατόν την επαφή με τον εξωτερικό αέρα και ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις οι οποίες επισημαίνονται στις παραγράφους 4.1.1 και 4.1.2 (π.χ. σφυριά ή μικροτριβεία ψυχόμενα με νερό, κωνικοί λυόμενοι μύλοι, τριβεία βραδείας κίνησης ή οδοντωτών δίσκων).

3.2.

Αναλυτικός ζυγός ακριβείας 1 mg.

3.3.

Στεγνά μεταλλικά δοχεία από ανοξείδωτο μέταλλο ή από γυαλί, εφοδιασμένα με κάλυμμα το οποίο εξασφαλίζει αεροστεγές κλείσιμο. Ωφέλιμη επιφάνεια που επιτρέπει την κατανομή της ποσότητας του δείγματος σε αναλογία 0,3 g ανά cm2 περίπου.

3.4.

Ισοθερμικός κλίβανος αποξήρανσης (± 2 °C) ηλεκτρικής θέρμανσης που εξασφαλίζει ταχεία ρύθμιση της θερμοκρασίας και επαρκώς αεριζόμενος (1).

3.5.

Ρυθμιζόμενος ηλεκτρικός κλίβανος κενού με ελαιοαντλία και με μηχανισμό εισαγωγής ξηρού και θερμού αέρα ή αφυδατικού μέσου (π.χ. οξειδίου του ασβεστίου).

3.6.

Αποξηραντήρας με παχειά διάτρητη μεταλλική πλάκα ή πλάκα από πορσελάνη που περιέχει δραστικό αφυδατικό μέσο.

4.   Διαδικασία

Σημείωση:

Οι εργασίες που περιγράφονται στο παρόν μέρος πρέπει να διενεργούνται αμέσως μετά το άνοιγμα των συσκευασιών τα οποία περιέχουν τα δείγματα. Οι αναλύσεις πρέπει να διενεργούνται τουλάχιστον εις διπλούν.

4.1.   Προετοιμασία

4.1.1.   Ζωοτροφές εκτός από εκείνες που εμπίπτουν στις παραγράφους 4.1.2 και 4.1.3

Λαμβάνεται ποσότητα δείγματος τουλάχιστον 50 g. Αν είναι απαραίτητο κονιοποιείται ή συνθλίβεται κατά τον ενδεδειγμένο τρόπο προς αποφυγή κάθε μεταβολής της περιεκτικότητας σε υγρασία (βλέπε σημείο 6).

4.1.2.   Σιτηρά και χονδράλευρα

Λαμβάνεται ποσότητα δείγματος τουλάχιστον 50 g. Αλέθεται κατά τρόπο ώστε τα μόρια αυτού να διέρχονται τουλάχιστον κατά 50 % διαμέσου κοσκίνου των 0,5 mm και να μη συγκρατείται σε κόσκινο με στρογγυλά ανοίγματα 1 mm περισσότερο του 10 % του απορρίμματος.

4.1.3.   Ρευστές ζωοτροφές ή πάστες, ζωοτροφές αποτελούμενες κυρίως από λιπαρές ύλες

Λαμβάνεται και ζυγίζεται ποσότητα δείγματος 25 g περίπου με προσέγγιση 10 mg, προστίθεται η ενδεδειγμένη ποσότητα άνυδρου άμμου η οποία έχει ζυγισθεί με προσέγγιση 10 mg και αναμειγνύεται μέχρι την επίτευξη ενός ομοιογενούς προϊόντος.

4.2.   Αποξήρανση

Ξηραίνεται ένας περιέκτης (σημείο 3.3) με το κάλυμμά του στον κλίβανο ο οποίος είναι ρυθμισμένος στους 103 °C για 30 λεπτά ± 1 λεπτά. Εξάγεται από τον κλίβανο και αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος εντός του αποξηραντήρα (σημείο 3.6).

4.2.1.   Ζωοτροφές εκτός από εκείνες που εμπίπτουν στα σημεία 4.2.2 και 4.2.3

Λαμβάνεται το απόβαρο του δοχείου με το κάλυμμά του, με προσέγγιση 1 mg. Ζυγίζεται ποσότητα 5 g περίπου δείγματος, με προσέγγιση 1 mg μέσα στο δοχείο του οποίου το απόβαρο έχει ληφθεί και κατανέμεται ομοιόμορφα. Τοποθετείται το δοχείο χωρίς το κάλυμμά του μέσα στον κλίβανο αποξήρανσης ο οποίος έχει προηγουμένως θερμανθεί σε 103 °C. Προς αποφυγή μεγάλης πτώσης της θερμοκρασίας του κλιβάνου το δοχείο εισάγεται το ταχύτερο δυνατόν. Αφήνεται να ξηρανθεί επί τέσσερις ώρες από τη στιγμή κατά την οποία η θερμοκρασία του κλιβάνου αποξήρανσης έχει επανέλθει στους 103 °C. Ο κλίβανος ανοίγεται, επανατοποθετείται αμέσως το κάλυμμα στο δοχείο, εξάγεται το δοχείο από τον κλίβανο, αφήνεται να ψυχθεί επί 30 έως 45 λεπτά εντός του αποξηραντήρα (σημείο 3.6) και ζυγίζεται με προσέγγιση 1 mg περίπου.

Στην περίπτωση κατά την οποία οι ζωοτροφές συνίστανται ουσιωδώς (> 50 %) σε έλαια και λίπη ζωικής και φυτικής προέλευσης διενεργείται συμπληρωματική ξήρανση 30 λεπτών μέσα στον κλίβανο αποξήρανσης στους 103 °C. Η διαφορά μεταξύ των δύο ζυγίσεων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,1 % της υγρασίας.

4.2.2.   Σιτηρά, άλευρα, χονδράλευρα και σιμιγδάλια

Λαμβάνεται το απόβαρο του δοχείου με το κάλυμμά του, με προσέγγιση 0,5 mg. Ζυγίζεται ποσότητα 5 g περίπου κονιοποιημένου δείγματος, με προσέγγιση 1 mg, μέσα στο δοχείο του οποίου το απόβαρο έχει ληφθεί και κατανέμεται ομοιόμορφα. Το δοχείο τοποθετείται χωρίς το κάλυμμά του μέσα στον κλίβανο αποξήρανσης ο οποίος έχει προηγουμένως θερμανθεί στους 130 °C. Προς αποφυγή μεγάλης πτώσης της θερμοκρασίας του κλιβάνου το δοχείο εισάγεται το ταχύτερο δυνατόν. Αφήνεται να ξηρανθεί επί δύο ώρες από τη στιγμή κατά την οποία η θερμοκρασία του κλιβάνου αποξήρανσης έχει επανέλθει στους 130 °C. Ο κλίβανος ανοίγεται, επανατοποθετείται αμέσως το κάλυμμα στο δοχείο, εξάγεται το δοχείο από τον κλίβανο, αφήνεται να ψυχθεί επί 30 έως 45 λεπτά εντός του αποξηραντήρα (σημείο 3.6) και ζυγίζεται με προσέγγιση 1 mg.

4.2.3.   Σύνθετες ζωοτροφές που περιέχουν περισσότερο του 4 % σακχαρόζη ή λακτόζη:πρώτες ύλες ζωοτροφών όπως χαρούπια, αφυδατωμένα προϊόντα σιτηρών, φύτρα βύνης, λοβοί τεύτλων, διαλυτοί ιχθείς και ζάχαρη

Λαμβάνεται το απόβαρο του δοχείου με το κάλυμμά του, με προσέγγιση 0,5 mg. Ζυγίζεται ποσότητα 5 g περίπου δείγματος, με προσέγγιση 1 mg μέσα στο δοχείο του οποίου το απόβαρο έχει ληφθεί και κατανέμεται ομοιόμορφα. Το δοχείο τοποθετείται χωρίς το κάλυμμά του μέσα στον κλίβανο (σημείο 3.5), ο οποίος έχει προηγουμένως θερμανθεί σε θερμοκρασία από 80 °C μέχρι 85 °C. Προς αποφυγή μεγάλης πτώσης της θερμοκρασίας του κλιβάνου το δοχείο εισάγεται το ταχύτερο δυνατόν.

Επιφέρεται πίεση 100 Torr και αφήνεται να ξηρανθεί στην πίεση αυτή επί τέσσερις ώρες, είτε σε ξηρό και θερμό ρεύμα αέρος, είτε με τη χρήση αφυδατικού μέσου (300 g περίπου για 20 δείγματα). Στην τελευταία περίπτωση διακόπτεται η σύνδεση με την αντλία κενού όταν επιτευχθεί η ως άνω πίεση. Η διάρκεια ξήρανσης μετράται από τη στιγμή κατά την οποία η θερμοκρασία του κλιβάνου έχει επανέλθει στους 80 °C έως 85 °C. Ο κλίβανος επαναφέρεται στη συνέχεια με προσοχή σε ατμοσφαιρική πίεση. Ο κλίβανος ανοίγεται, επανατοποθετείται αμέσως το κάλυμμα στο δοχείο, εξάγεται το δοχείο από τον κλίβανο, αφήνεται να ψυχθεί επί 30 έως 45 λεπτά εντός του αποξηραντήρα (σημείο 3.6) και ζυγίζεται με προσέγγιση 1 mg. Διενεργείται συμπληρωματική ξήρανση 30 λεπτών μέσα στον κλίβανο κενού σε θερμοκρασία 80 °C έως 85 °C και ζυγίζεται εκ νέου. Η διαφορά μεταξύ των δύο ζυγίσεων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,1 % της υγρασίας.

4.3.   Προκαταρκτική (μερική) ξήρανση

Είναι αναγκαίο να ξηραίνονται μερικώς ζωοτροφές «που έχουν διαβραχεί» με κλάσμα μάζας μικρότερο από 85 % ξηράς ουσίας [π.χ. χορτονομές, ολικά αναμεμειγμένα σιτηρέσια, (μη) υγρές ζωοτροφές] πριν από τη λεπτή άλεση, προκειμένου να αναλυθούν οι σταθερές ουσίες τους για ασταθείς ουσίες, δεν είναι δυνατή η μερική ξήρανση.

Η μερική ξήρανση μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε με τη χρήση κλιβάνου με εξαναγκασμένη κυκλοφορία αέρα ή με φούρνο μικροκυμάτων είτε με λυοφιλίωση. Με εξαίρεση τη μερική ξήρανση με λυοφιλίωση, στόχος είναι η ξήρανση της ζωοτροφής με διατήρηση της θερμοκρασίας του δείγματος κάτω από τους 60 °C, έτσι ώστε η χημική σύνθεση να επηρεάζεται ελάχιστα. Η ξήρανση σε θερμοκρασίες υψηλότερες από 60 °C προκαλεί χημικές αλλαγές στη ζωοτροφή (π.χ. αποδόμηση πρωτεϊνών). Η αποξηραμένη ζωοτροφή πρέπει να διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 15 λεπτά πριν από τη μέτρηση της μερικώς ξηράς ουσίας, ώστε να ελαχιστοποιείται η πιθανή μεταβολή της υγρασίας που μπορεί να προκύψει κατά τη διάρκεια της άλεσης και της αποθήκευσης. Η ξήρανση σε θερμοκρασίες κάτω των 60 °C δεν αφαιρεί όλο το νερό από τη ζωοτροφή· ως εκ τούτου, η (αρχική) μερική ξήρανση δεν αντιπροσωπεύει την ολική ξηρά ουσία της ζωοτροφής. Μετά την ξήρανση, το μερικό δείγμα αλέθεται και αναλύεται η (τελική) ξηρά ουσία του μερικώς ξηρού δείγματος (η απομένουσα περιεκτικότητα σε υγρασία είναι μεταξύ 3 % και 15 %) εφόσον έχουν προσδιοριστεί τα άλλα χημικά συστατικά.

Ως εκ τούτου, συνιστάται μια διαδικασία δύο σταδίων για τον προσδιορισμό της ξηράς ουσίας. Αρχικά προσδιορίζεται η μερική περιεκτικότητα σε ξηρά ουσία (εάν είναι κατώτερη του 85 % επί ξηράς ουσίας), στη συνέχεια προσδιορίζεται η εναπομένουσα περιεκτικότητα σε ξηρά ουσία σε αλεσμένο δείγμα δοκιμής και πολλαπλασιάζεται η μερικώς ξηρά ουσία επί το εναπομένον ξηρό υπόλειμμα για τον προσδιορισμό της συνολικής ξηράς ουσίας.

5.   Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Η περιεκτικότητα σε υγρασία (X) ως ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος υπολογίζεται με τους ακόλουθους τύπους:

5.1.   Αποξήρανση χωρίς προκαταρκτική ξήρανση

όπου:

m	=	αρχικό βάρος σε γραμμάρια της ποσότητας του δείγματος,
m0	=	βάρος σε γραμμάρια της ξηρανθείσας ποσότητας του δείγματος.

5.2.   Αποξήρανση με προκαταρτική ξήρανση (2)

όπου:

m	=	αρχικό βάρος σε γραμμάρια της ποσότητας του δείγματος,
m1	=	βάρος σε γραμμάρια της ποσότητας του δείγματος κατόπιν προκαταρκτικής ξήρανσης,
m2	=	βάρος σε γραμμάρια της ποσότητας του δείγματος κατόπιν κονιοποίησης ή άλεσης,
m0	=	βάρος σε γραμμάρια της ξηρανθείσας ποσότητας του δείγματος.

5.3.   Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλα διενεργούμενων προσδιορισμών στο ίδιο δείγμα δεν υπερβαίνει το 0,2 % της απόλυτης τιμής υγρασίας, με εξαίρεση τις υγρές τροφές για ζώα συντροφιάς και τα τεχνητά κόκαλα για σκύλους, όπου η διαφορά δεν υπερβαίνει το 0,5 % της απόλυτης τιμής υγρασίας.

6.   Παρατήρηση

Αν η κονιοποίηση αποδεικνύεται απαραίτητη και αν προκύπτει ότι αυτό εξασκεί κάποια μεταβολή της περιεκτικότητας σε υγρασία του προϊόντος, τα αποτελέσματα της ανάλυσης, τα οποία αναφέρονται στα συστατικά της ζωοτροφής, πρέπει να προσαρμόζονται ανάλογα με την περιεκτικότητα σε υγρασία του αρχικού δείγματος.

B.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΥΓΡΑΣΙΑ ΤΩΝ ΖΩΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΤΙΚΩΝ ΛΙΠΩΝ ΚΑΙ ΕΛΑΙΩΝ

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε υγρασία (νερό και άλλες πτητικές ουσίες) των ζωικών και φυτικών λιπών και ελαίων.

2.   Αρχή

Το δείγμα ξηραίνεται σε 103 °C μέχρι σταθερού βάρους (η απώλεια του βάρους μεταξύ δύο διαδοχικών ζυγισμάτων πρέπει να είναι ίση ή κατώτερη του 1 mg). Η απώλεια βάρους προσδιορίζεται με ζύγιση.

3.   Όργανα

3.1.

Υποδοχέας (κάψα) επίπεδου πυθμένα από ανοξείδωτο υλικό, διαμέτρου 8 έως 9 cm και ύψους περίπου 3 cm.

3.2.

Θερμόμετρο με ενισχυμένο βολβό και θάλαμο διαστολής στο άνω άκρο, διαβαθμισμένο μεταξύ 80 °C περίπου έως 110 °C τουλάχιστον και μήκους 10 cm περίπου.

3.3.

Αμμόλουτρο ή θερμαινόμενη ηλεκτρική πλάκα.

3.4.

Ξηραντήρας που περιέχει δραστικό αφυδατικό μέσο.

3.5.

Αναλυτικός ζυγός.

4.   Διαδικασία

Ζυγίζεται ποσότητα 20 g περίπου, με προσέγγιση 1 mg, του ομογενοποιημένου δείγματος εντός του ξηρού υποδοχέα (σημείο 3.1), του οποίου έχει ληφθεί το απόβαρο και ο οποίος περιέχει το θερμόμετρο (σημείο 3.2). Θερμαίνεται επί του αμμόλουτρου ή επί της θερμαινόμενης πλάκας (σημείο 3.3), ανακινώντας σταθερά με το θερμόμετρο έτσι ώστε η θερμοκρασία να ανέλθει στους 90 °C εντός 7 περίπου λεπτών.

Μειώνεται η θερμότητα, ανάλογα με τη συχνότητα ανόδου των φυσαλίδων από τον πυθμένα του υποδοχέα. Η θερμοκρασία δεν πρέπει να υπερβεί τους 105 °C. Συνεχίζεται η ανακίνηση αποξύνοντας τον πυθμένα του υποδοχέα μέχρι να παύσουν να δημιουργούνται φυσαλίδες.

Για να εξασφαλισθεί η πλήρης απομάκρυνση της υγρασίας, επαναλαμβάνεται πολλές φορές η θέρμανση στους 103 °C ± 2 °C, με ψύξη στους 93 °C μεταξύ των διαδοχικών θερμάνσεων. Ακολούθως αφήνεται να ψυχθεί εντός του ξηραντήρα (σημείο 3.4) μέχρι θερμοκρασίας δωματίου και ζυγίζεται. Επαναλαμβάνεται η εργασία αυτή μέχρις ότου η απώλεια βάρους μεταξύ δύο διαδοχικών ζυγίσεων να μην υπερβαίνει τα 2 mg.

Σημείωση:

Αύξηση του βάρους του δείγματος κατόπιν επανειλημμένων θερμάνσεων δείχνει οξείδωση του λίπους. Στην περίπτωση αυτή το αποτέλεσμα υπολογίζεται από τη ζύγιση η οποία διενεργείται αμέσως πριν αρχίσει να αυξάνεται το βάρος.

5.   Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Η επί τοις εκατό περιεκτικότητα σε υγρασία του δείγματος (X) δίδεται από τον τύπο:

όπου:

m	=	βάρος, σε γραμμάρια, της ποσότητος του δείγματος,
m1	=	βάρος, σε γραμμάρια, του υποδοχέα και του περιεχομένου του πριν από τη θέρμανση,
m2	=	βάρος, σε γραμμάρια, του υποδοχέα και του περιεχομένου μετά τη θέρμανση.

Αποτελέσματα μικρότερα του 0,05 % πρέπει να καταχωρούνται με την ένδειξη «μικρότερα του 0,05 %».

Επαναληψιμότητα

Η διαφορά της υγρασίας μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλων προσδιορισμών που έγιναν στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,1 % σε απόλυτη τιμή.

Γ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΑΖΩΤΟ ΚΑΙ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΟΛΙΚΕΣ ΑΖΩΤΟΥΧΕΣ ΟΥΣΙΕΣ

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των ζωοτροφών σε ολικές αζωτούχες ουσίες βάσει της περιεκτικότητας σε άζωτο, όπως αυτή προσδιορίζεται με τη μέθοδο Kjeldahl (3).

2.   Αρχή

Το δείγμα ανοργανοποιείται με θειικό οξύ παρουσία καταλύτη. Το όξινο διάλυμα καθίσταται αλκαλικό με διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου. Η αμμωνία αποστάζεται και συλλέγεται μέσα σε καθορισμένη ποσότητα θειικού οξέος, η περίσσεια του οποίου ογκομετρείται με διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου.

Εναλλακτικά, η αμμωνία που εκλύεται αποστάζεται σε περίσσεια διαλύματος βορικού οξέος και, στη συνέχεια, ογκομετρείται με διάλυμα υδροχλωρικού οξέος ή θειικού οξέος.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Θειικό κάλιο.

3.2.

Καταλύτης: οξείδιο του (δισθενούς) χαλκού (CuO) ή θειικός χαλκός πεντάκις (δισθενής) ένυδρος CuSO4 5H2O.

3.3.

Ψευδάργυρος υπό μορφή κόκκων.

3.4.

Θειικό οξύ, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Θειικό οξύ, πρότυπο ογκομετρικό διάλυμα, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Θειικό οξύ, πρότυπο ογκομετρικό διάλυμα, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Θειικό οξύ, πρότυπο ογκομετρικό διάλυμα, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Δείκτης ερυθρό του μεθυλίου· διαλύονται 300 mg ερυθρού του μεθυλίου σε 100 ml αιθανόλης, σ = 95-96 % (v/v).

3.9.

Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (μπορεί να χρησιμοποιηθεί διάλυμα του εμπορίου για τεχνικές χρήσεις) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Υδροξείδιο του νατρίου, πρότυπο ογκομετρικό διάλυμα c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Υδροξείδιο του νατρίου, πρότυπο ογκομετρικό διάλυμα c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Ελαφρόπετρα υπό μορφή κόκκων, η οποία έχει πλυθεί σε υδροχλωρικό οξύ και υποβληθεί σε ανάφλεξη.

3.13.

Ακετανιλίδιο (σ.τ. = 114 °C, περιεκτικότητα αζώτου = 10,36 %).

3.14.

Σακχαρόζη (ελεύθερη αζώτου).

3.15.

Βορικό οξύ (H3BO3).

3.16.

Δείκτης ερυθρό του μεθυλίου· διαλύονται 100 mg ερυθρού του μεθυλίου σε 100 ml αιθανόλης ή μεθανόλης.

3.17.

Διάλυμα πράσινου της βρωμοκρεζόλης: διαλύονται 100 mg πράσινου της βρωμοκρεζόλης σε 100 ml αιθανόλης ή μεθανόλης.

3.18.

Διάλυμα βορικού οξέος (συγκέντρωσης 10 g/l έως 40 g/l ανάλογα με τα όργανα που χρησιμοποιούνται) Όταν εφαρμόζεται η χρωματομετρική μέθοδος ανίχνευσης μέχρι το τέλος της αντίδρασης, οι δείκτες ερυθρό του μεθυλίου και πράσινο της βρωμοκρεζόλης πρέπει να προστίθενται στα διαλύματα βορικού οξέος. Αν παρασκευάζεται 1 λίτρο διαλύματος βορικού οξέος, πριν ρυθμιστεί ο όγκος του, πρέπει να προστεθούν 7 ml διαλύματος ερυθρού του μεθυλίου (σημείο 3.16) και 10 ml διαλύματος πράσινου της βρωμοκρεζόλης (σημείο 3.17). Ανάλογα με την ποσότητα του νερού που χρησιμοποιείται, το pH του διαλύματος βορικού οξέος μπορεί να διαφέρει από παρτίδα σε παρτίδα. Το pH του διαλύματος βορικού οξέος πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 4,3 και 4,7. Συχνά απαιτείται μια ρύθμιση με την προσθήκη μικρής ποσότητας αλκάλεως για να προκύψει ένα θετικό τυφλό δείγμα. Σημείωση: Με την προσθήκη περίπου 3 ml έως 4 ml NaOH (σημείο 3.11) σε 1 λίτρο διαλύματος βορικού οξέος συγκέντρωσης 10 g/l επιτυγχάνεται συνήθως επαρκής ρύθμιση. Το διάλυμα αποθηκεύεται σε θερμοκρασία δωματίου και προστατεύεται από το φως και τις πηγές έκλυσης ατμών αμμωνίας κατά την αποθήκευση.

3.19.

Υδροχλωρικό οξύ, πρότυπο διάλυμα, c(HCl) = 0,10 mol/l. Σημείωση: Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ογκομετρικά διαλύματα (σημεία 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 και 3.19) διαφορετικών συγκεντρώσεων, αν η συγκέντρωση διορθωθεί για τους υπολογισμούς. Οι συγκεντρώσεις πρέπει πάντοτε να εκφράζονται με ακρίβεια τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων.

4.   Όργανα

Συσκευή κατάλληλη για ανοργανοποίηση, απόσταξη και ογκομέτρηση σύμφωνα με τη μέθοδο Kjeldahl.

5.   Διαδικασία

5.1.   Ανοργανοποίηση

Ζυγίζουμε 1 g του δείγματος με ακρίβεια 0,001 g και το εισάγουμε στη φιάλη της συσκευής ανοργανοποίησης. Προσθέτουμε 15 g θειικού καλίου (σημείο 3.1), την ενδεδειγμένη ποσότητα καταλύτου (σημείο 3.2) (0,3 έως 0,4 g CuO ή 0,9 έως 1,2 g CuSO4-5H2O), 25 ml θειικού οξέος (σημείο 3.4) και, αν χρειάζεται, μερικούς κόκκους ελαφρόπετρας (σημείο 3.12) και αναμειγνύουμε.

Θερμαίνουμε τη φιάλη μετρίως στην αρχή, ανακινώντας από καιρού σε καιρό εάν είναι απαραίτητο, μέχρις ότου απανθρακωθεί η μάζα και εξαφανισθεί ο αφρός· εν συνεχεία θερμαίνουμε περισσότερο μέχρις ότου το υγρό αρχίσει να βράζει σταθερά. Η θέρμανση είναι επαρκής όταν οι ατμοί του ζέοντος οξέος υγροποιούνται πάνω στα τοιχώματα της φιάλης. Πρέπει να αποφεύγεται η υπερθέρμανση των πλευρικών τοιχωμάτων καθώς και η προσκόλληση οργανικών σωματιδίων επ’ αυτών.

Όταν το διάλυμα καταστεί διαυγές και αποκτήσει ανοικτό πράσινο χρώμα, αφήνεται να βράσει επί δύο ακόμη ώρες και εν συνεχεία αφήνεται να ψυχθεί.

5.2.   Απόσταξη

Προσθέτουμε με προσοχή ικανή ποσότητα νερού ώστε τα θειικά άλατα να διαλυθούν πλήρως. Αφήνουμε το διάλυμα να ψυχθεί και προσθέτουμε εν συνεχεία μερικούς κόκκους ψευδαργύρου (σημείο 3.3), αν απαιτείται. Συνεχίζουμε σύμφωνα με το σημείο 5.2.1 ή 5.2.2.

5.2.1.   Απόσταξη σε θειικό οξύ

Εισάγουμε στη φιάλη συλλογής της αποστακτικής συσκευής 25 ml (με ακρίβεια μετρημένα) θειικού οξέος (σημείο 3.5) ή (σημείο 3.7) ανάλογα με την κατ’ εκτίμηση αναμενόμενη περιεκτικότητα σε άζωτο. Προσθέτουμε μερικές σταγόνες ερυθρού του μεθυλίου (σημείο 3.8).

Συνδέουμε τη φιάλη ανοργανοποίησης με τον συμπυκνωτή της αποστακτικής συσκευής και βυθίζουμε το άκρο του συμπυκνωτή στο υγρό της φιάλης συλλογής μέχρι βάθους 1 cm τουλάχιστον (βλέπε παρατήρηση στο σημείο 8.3). Προσθέτουμε βραδέως 100 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.9) στη φιάλη ανοργανοποίησης προσέχοντας ώστε να μη σημειωθεί απώλεια αμμωνίας (βλέπε παρατήρηση στο σημείο 8.1). Θερμαίνουμε τη φιάλη μέχρι την απόσταξη όλης της αμμωνίας.

5.2.2.   Απόσταξη σε βορικό οξύ

Στις περιπτώσεις όπου η ογκομέτρηση της περιεκτικότητας του αποστάγματος σε αμμωνία εκτελείται χειρωνακτικά, εφαρμόζεται η διαδικασία που αναφέρεται παρακάτω. Στις περιπτώσεις όπου η μονάδα απόσταξης είναι πλήρως αυτοματοποιημένη έτσι ώστε να συμπεριλαμβάνει την ογκομέτρηση της περιεκτικότητας του αποστάγματος σε αμμωνία, ακολουθούμε τις οδηγίες του κατασκευαστή σχετικά με τη λειτουργία της μονάδας απόσταξης.

Τοποθετούμε μια φιάλη συλλογής που περιέχει 25 ml έως 30 ml διαλύματος βορικού οξέος (σημείο 3.18) κάτω από το στόμιο εκροής του συμπυκνωτή με τέτοιο τρόπο ώστε ο σωλήνας διανομής να βρίσκεται κάτω από την επιφάνεια της περίσσειας του διαλύματος βορικού οξέος. Ρυθμίζουμε τη μονάδα απόσταξης έτσι ώστε να παρέχει 50 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.9). Χρησιμοποιούμε τη μονάδα απόσταξης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αποστάζουμε την αμμωνία που εκλύεται με την προσθήκη του διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου. Συλλέγουμε το απόσταγμα από το διάλυμα βορικού οξέος. Η ποσότητα του αποστάγματος (χρόνος απόσταξης με ατμό) εξαρτάται από την ποσότητα του αζώτου που περιέχεται στο δείγμα. Ακολουθούμε τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ΣΗΜΕΙΩΣΗ:

Σε μια ημιαυτόματη μονάδα απόσταξης, η προσθήκη περίσσειας υδροξειδίου του νατρίου και η απόσταξη με ατμό εκτελούνται αυτόματα.

5.3.   Ογκομέτρηση

Συνεχίζουμε σύμφωνα με τα σημεία 5.3.1 ή 5.3.2.

5.3.1.   Θειικό οξύ

Ογκομετρείται η περίσσεια θειικού οξέος στη φιάλη συλλογής με διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.10 ή 3.11) αναλόγως της συγκέντρωσης του χρησιμοποιηθέντος θειικού οξέος μέχρι το τέλος της αντίδρασης.

5.3.2.   Βορικό οξύ

Ογκομετρείται το περιεχόμενο της φιάλης συλλογής με το πρότυπο ογκομετρικό διάλυμα υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.19) ή με το πρότυπο ογκομετρικό διάλυμα θειικού οξέος (σημείο 3.6), χρησιμοποιώντας προχοΐδα και διαβάζοντας την ένδειξη για την ποσότητα του ογκομετρικού διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε.

Όταν εφαρμόζεται η χρωματομετρική μέθοδος ανίχνευσης μέχρι το τέλος της αντίδρασης, ως τέλος της αντίδρασης θεωρείται το πρώτο ίχνος ρόδινου χρώματος στο περιεχόμενο. Η ένδειξη της προχοΐδας εκτιμάται με προσέγγιση 0,05 ml. Ένας μαγνητικός δίσκος ανάδευσης με φωτεινή ένδειξη ή φωτομετρικός ανιχνευτής μπορεί να βοηθήσει στην ανίχνευση του τέλους της αντίδρασης.

Αυτή η διαδικασία μπορεί να γίνει αυτόματα χρησιμοποιώντας μια αποστακτική συσκευή ατμού με αυτόματη ογκομέτρηση.

Ακολουθούνται οι οδηγίες του κατασκευαστή σχετικά με τη λειτουργία της ειδικής αποστακτικής συσκευής ή αποστακτικής συσκευής/τιτλοδότη.

Σημείωση:

Όταν χρησιμοποιείται αυτόματο σύστημα ογκομέτρησης, η ογκομέτρηση ξεκινά αμέσως μετά την έναρξη της απόσταξης και χρησιμοποιείται διάλυμα βορικού οξέος συγκέντρωσης 1 % (σημείο 3.18).

Στις περιπτώσεις όπου χρησιμοποιείται πλήρως αυτοματοποιημένη μονάδα απόσταξης, η αυτόματη ογκομέτρηση της αμμωνίας μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί με ανίχνευση του τέλους της αντίδρασης, χρησιμοποιώντας ένα ποτενσιομετρικό σύστημα πεχαμέτρησης.

Σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιείται ένας αυτόματος τιτλοδότης, με πεχάμετρο. Το πεχάμετρο πρέπει να βαθμονομηθεί σωστά, στο εύρος pH 4 έως 7, ακολουθώντας τις συνήθεις εργαστηριακές διαδικασίες βαθμονόμησης πεχάμετρου.

Το τέλος της αντίδρασης ογκομέτρησης με βάση το pH είναι η τιμή pH 4,6 δηλαδή η κορυφή στην καμπύλη ογκομέτρησης (σημείο καμπής)

5.4.   Τυφλό πείραμα

Για να επιβεβαιωθεί ότι τα αντιδραστήρια είναι ελεύθερα αζώτου, πραγματοποιούμε τυφλό πείραμα (ανοργανοποίηση, απόσταξη και ογκομέτρηση) χρησιμοποιώντας 1 g σακχαρόζης (σημείο 3.14) αντί του δείγματος.

6.   Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Οι υπολογισμοί εκτελούνται σύμφωνα με το σημείο 6.1. ή 6.2.

6.1.   Υπολογισμός για την ογκομέτρηση σύμφωνα με το σημείο 5.3.1

Η περιεκτικότητα σε ολικές αζωτούχες ουσίες, ως κλάσμα βάρους, υπολογίζεται βάσει του τύπου:

όπου:

V0	=	είναι ο όγκος (σε ml) του NaOH (σημείο 3.10 ή 3.11) που χρησιμοποιήθηκε κατά το τυφλό πείραμα,
V1	=	είναι ο όγκος (σε ml) του NaOH (σημείο 3.10 ή 3.11) που χρησιμοποιήθηκε για την ογκομέτρηση του δείγματος,
c	=	είναι η συγκέντρωση (σε mol/l) του NaOH (σημείο 3.10 ή 3.11),
m	=	είναι το βάρος του δείγματος (σε g).

6.2.   Υπολογισμός για την ογκομέτρηση σύμφωνα με το σημείο 5.3.2

6.2.1.   Ογκομέτρηση με υδροχλωρικό οξύ

Η περιεκτικότητα σε ολικές αζωτούχες ουσίες, ως κλάσμα βάρους, υπολογίζεται βάσει του τύπου:

όπου:

m	=	είναι το βάρος της παρτίδας δοκιμής (σε g),
c	=	είναι η συγκέντρωση (σε mol/l) του πρότυπου ογκομετρικού διαλύματος υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.19),
V0	=	είναι ο όγκος (σε ml) του υδροχλωρικού οξέος που χρησιμοποιήθηκε κατά το τυφλό πείραμα,
V1	=	είναι ο όγκος (σε ml) του υδροχλωρικού οξέος που χρησιμοποιήθηκε για την παρτίδα δοκιμής.

6.2.2.   Ογκομέτρηση με θειικό οξύ

Η περιεκτικότητα σε ολικές αζωτούχες ουσίες, ως κλάσμα βάρους, υπολογίζεται βάσει του τύπου:

όπου:

m	=	είναι το βάρος της παρτίδας δοκιμής (σε g),
c	=	είναι η συγκέντρωση (σε mol/l) του πρότυπο διαλύματος θειικού οξέος (σημείο 3.6),
V0	=	είναι ο όγκος (σε ml) του θειικού οξέος (σημείο 3.6) που χρησιμοποιήθηκε κατά το τυφλό πείραμα,
V1	=	είναι ο όγκος (σε ml) του θειικού οξέος (σημείο 3.6) που χρησιμοποιήθηκε για την παρτίδα δοκιμής.

7.   Επαλήθευση της μεθόδου

7.1.   Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλων προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει

—	το 0,4 % σε απόλυτη τιμή, για επίπεδα αζωτούχων ουσιών μικρότερα από 20 %,

—	το 2,0 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για επίπεδα από 20 % έως 40 %,

—	το 0,8 % σε απόλυτη τιμή, για επίπεδα μεγαλύτερα από 40 %.

7.2.   Αναπαραγωγιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα σε διαφορετικά εργαστήρια δεν πρέπει να υπερβαίνει:

—	το 1,8 % σε απόλυτη τιμή, για επίπεδα αζωτούχων ουσιών μικρότερα από 20 %,

—	το 9,0 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για επίπεδα από 20 % έως 40 %,

—	το 3,6 % σε απόλυτη τιμή, για επίπεδα μεγαλύτερα από 40 %.

7.3.   Ακρίβεια της μεθόδου

Η ανάλυση (ανοργανοποίηση, απόσταξη και ογκομέτρηση) διεξάγεται σε κατάλληλη ποσότητα ακετανιλιδίου (σημείο 3.13) (π.χ. 0,2 έως 0,3 g) παρουσία 1 g σακχαρόζης (σημείο 3.14)·για 1 g ακετανιλιδίου απαιτούνται 14,80 ml θειικού οξέος (σημείο 3.5). Η ανάκτηση πρέπει να είναι τουλάχιστον 99 %.

8.   Παρατηρήσεις

8.1.

Η συσκευή μπορεί να είναι χειροκίνητη, ημιαυτόματη ή αυτόματη. Αν η συσκευή είναι τέτοια ώστε μεταξύ ανοργανοποίησης και απόσταξης να χρειαστεί να γίνει μεταφορά, χρειάζεται προσοχή ώστε κατά τη μεταφορά αυτή να μη σημειωθούν απώλειες. Αν η φιάλη της αποστακτικής συσκευής δεν διαθέτει σταγονομετρικό χωνί, προσθέτουμε το υδροξείδιο του νατρίου αμέσως πριν από τη σύνδεση της φιάλης στο συμπυκνωτή, ρίχνοντας το υγρό σιγά-σιγά.

8.2.

Εάν το προκύπτον από την ανοργανοποίηση υγρό πήγνυται, προβαίνουμε σε νέο προσδιορισμό χρησιμοποιώντας μεγαλύτερη ποσότητα θειικού οξέος (σημείο 3.4) από την οριζόμενη στο σημείο 5.1.

8.3.

Για προϊόντα χαμηλής περιεκτικότητας σε άζωτο, ο όγκος του θειικού οξέος (σημείο 3.7) που εισάγεται στη φιάλη συλλογής μπορεί να μειωθεί, αν χρειαστεί, σε 10 ή 15 ml και να συμπληρωθεί με νερό μέχρι τα 25 ml.

8.4.

Για συνήθεις αναλύσεις, μπορούν να εφαρμοστούν εναλλακτικές μέθοδοι αναλύσης για τον προσδιορισμό των ολικών αζωτούχων ουσιών, αλλά η μέθοδος Kjeldahl που περιγράφεται στο παρόν μέρος Γ είναι η μέθοδος αναφοράς Η ισοδυναμία των αποτελεσμάτων που προκύπτουν με την εναλλακτική μέθοδο (π.χ. DUMAS) σε σύγκριση με τη μέθοδο αναφοράς πρέπει να αποδεικνύεται για κάθε επιμέρους μήτρα. Καθώς τα αποτελέσματα που προκύπτουν με μια εναλλακτική μέθοδο, ακόμα και μετά την επαλήθευση της ισοδυναμίας της μεθόδου, μπορεί να αποκλίνουν ελαφρώς από τα αποτελέσματα που προκύπτουν με τη μέθοδο αναφοράς, είναι απαραίτητο να αναφέρεται στην αναλυτική έκθεση η μέθοδος ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των ολικών αζωτούχων ουσιών.

Δ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΟΥΡΙΑΣ

1.   Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των ζωοτροφών για μηρυκαστικά σε ουρία που χρησιμοποιείται ως πρόσθετη ύλη ζωοτροφών.

2.   Αρχή

Το δείγμα φέρεται εν αιωρήσει σε νερό παρουσία ενός βοηθητικού της στράγγισης παράγοντα. Το αιώρημα διηθείται. Η περιεκτικότητα σε ουρία του διηθήματος προσδιορίζεται μετά από προσθήκη 4-διμεθυλαμινοβενζαλδεΰδης (4-DMAB) και μέτρηση της οπτικής πυκνότητας σε μήκος κύματος 420 nm.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Διάλυμα 4-διμεθυλαμινοβενζαλδεΰδης: διαλύονται 1,6 g 4-DMAB σε 100 ml αιθανόλης 96 % και προστίθενται 10 ml υδροχλωρικού οξέος (ρ20 1,19 g/ml). Αυτό το αντιδραστήριο διατηρείται κατ’ ανώτατο όριο δύο εβδομάδες.

3.2.

Διάλυμα Carrez Ι: Διαλύονται σε νερό 21,9 g οξεικού ψευδαργύρου Zn(CH3COO)2 2H2O και 3 g κρυσταλλικού οξεικού οξέος. Φέρεται στα 100 ml με νερό.

3.3.

Διάλυμα Carrez ΙΙ: διαλύονται σε νερό 10,6 g σιδηροκυανιούχου καλίου, K4Fe(CN)6 3H2O. Φέρεται στα 100 ml με νερό.

3.4.

Ενεργός άνθρακας, μη προσροφών την ουρία (ελέγξιμο).

3.5.

Διάλυμα 0,1 % (βάρος/όγκο) ουρίας.

4.   Όργανα

4.1.

Αναμείκτης (παλινδρομητής): περίπου 35 έως 40 στροφές ανά λεπτό.

4.2.

Δοκιμαστικοί σωλήνες: 160 × 16 mm με εσμυρισμένα πώματα.

4.3.

Φασματοφωτόμετρο

5.   Διαδικασία

5.1.   Ανάλυση του δείγματος

Ζυγίστε, με ακρίβεια 1 mg, 2 g δείγματος και τοποθετήστε τα μαζί με 1 g ενεργού άνθρακα (σημείο 3.4) σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml. Προσθέστε 400 ml νερό και 5 ml από το διάλυμα Carrez I (σημείο 3.2), αναμείξτε επί περίπου 30 δευτερόλεπτα και προσθέστε 5 ml από το διάλυμα Carrez II (σημείο 3.3). Αναμείξτε επί 30 λεπτά στον παλινδρομητή. Συμπληρώστε μέχρι της χαραγής με νερό, ανακινήστε και διηθήστε.

Λάβετε 5 ml από το διαυγές και άχρουν διήθημα, φέρτε τα εντός των δοκιμαστικών σωλήνων με εσμυρισμένα πώματα, προσθέστε 5 ml διαλύματος 4-DMAB (σημείο 3.1) και αναμείξτε. Τοποθετήστε τους σωλήνες μέσα σε υδατόλουτρο σε 20 °C (+/– 4 °C). Έπειτα από 15 λεπτά, μετρήστε την οπτική πυκνότητα του διαλύματος του δείγματος στο φασματοφωτόμετρο στα 420 nm σε σύγκριση με τυφλό πείραμα.

5.2.   Πρότυπη καμπύλη

Λάβετε όγκους 1, 2, 4, 5 και 10 ml από το διάλυμα ουρίας (σημείο 3.5), φέρτε τους σε ογκομετρικές φιάλες των 100 ml και συμπληρώστε μέχρι τη χαραγή με νερό. Λάβετε 5 ml από κάθε διάλυμα, προσθέστε από 5 ml διαλύματος 4-DMAB (σημείο 3.1), ομογενοποιήστε και μετρήστε την οπτική πυκνότητα όπως υποδεικνύεται ανωτέρω σε σύγκριση με διάλυμα μάρτυρα που περιέχει 5 ml 4-DMAB και 5 ml νερό, απαλλαγμένο ουρίας. Χαράξτε την πρότυπη καμπύλη.

6.   Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Με την πρότυπη καμπύλη υπολογίστε την ποσότητα της ουρίας δείγματος που χρησιμοποιήθηκε.

Εκφράστε το αποτέλεσμα σε mg ουρίας ανά kg δείγματος.

7.   Αξιολόγηση της μεθόδου

7.1.   Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα στο ίδιο εργαστήριο και από τον ίδιο χειριστή δεν πρέπει να υπερβαίνει:

—

Στα 420 nm — 50 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για περιεκτικότητα σε ουρία από 3 000 mg/kg έως χαμηλότερη από 5 000 mg/kg· — 25 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για περιεκτικότητα σε ουρία από 5 000 mg/kg έως χαμηλότερη από 7 000 mg/kg· — 20 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή για περιεκτικότητα σε ουρία άνω των 7 000 mg/kg.

—

Στα 435 nm — 40 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για περιεκτικότητα σε ουρία από 3 000 mg/kg έως χαμηλότερη από 5 000 mg/kg· — 25 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για περιεκτικότητα σε ουρία από 5 000 mg/kg έως χαμηλότερη από 9 000 mg/kg· — 5 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή για περιεκτικότητα σε ουρία άνω των 9 000 mg/kg.

7.2.   Αναπαραγωγιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα σε διαφορετικά εργαστήρια και/ή από διαφορετικούς χειριστές δεν πρέπει να υπερβαίνει:

—	Στα 420 nm — τα 3 000 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητα σε ουρία από 3 000 mg/kg έως χαμηλότερη από 12 000 mg/kg· — τα 4 500 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες σε ουρία ίσες ή μεγαλύτερες των 12 000 mg/kg.

—	Στα 435 nm — 50 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για περιεκτικότητα σε ουρία από 3 000 mg/kg έως χαμηλότερη από 8 000 mg/kg· — 25 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή για περιεκτικότητες σε ουρία ίσες ή μεγαλύτερες των 8 000 mg/kg.

8.   Αποτελέσματα διεργαστηριακής μελέτης

Διοργανώθηκε διεργαστηριακή διαδικασία σύγκρισης της ΕΕ στην οποία συμμετείχαν 18 εργαστήρια. Αναλύθηκαν πέντε θετικά δείγματα σύνθετων ζωοτροφών για μηρυκαστικά (στους πίνακες 1 και 2, όπου αναφέρονται ως MAT) (ανάλυση 1) σε διπλά τυφλά δείγματα, ενώ αναλύθηκε μία φορά και ένα τυφλό σύνθετης ζωοτροφής για μηρυκαστικά.

Οι υπολογισμοί για τα όρια επαναληψιμότητας (r) και αναπαραγωγιμότητας (R), όπως ορίζονται από τις διεθνείς κατευθυντήριες γραμμές, πραγματοποιήθηκαν μετά την αφαίρεση των ακραίων τιμών με τη χρήση ανάλυσης μεταβλητότητας των έγκυρων τιμών.

Οι υπολογισθείσες τιμές επιδόσεων της μεθόδου (επαναληψιμότητα, αναπαραγωγιμότητα) παρουσιάζονται στους ακόλουθους πίνακες. Σε όλα τα δείγματα που υποβλήθηκαν σε δοκιμή, συμπεριλαμβανομένου του τυφλού υλικού, δεν βρέθηκαν ψευδώς θετικά ή ψευδώς αρνητικά.

Πίνακας 1

Χαρακτηριστικά επιδόσεων της μεθόδου για την ουρία, μετρούμενα σε λ = 420 nm σε όλα τα υλικά

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Πρόβατα	Βοοειδή	Πρόβατα	Πρόβατα	Βοοειδή
Στόχος κλάσματος μάζας (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Μέσο κλάσμα μάζας. (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας, sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας, sr (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Σχετική τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας, RSDR (%)	27	19	13	10	14
Σχετική τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας, RSDr (%)	17	9	7	7	6
Όριο αναπαραγωγιμότητας, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Όριο επαναληψιμότητας, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Πίνακας 2

Χαρακτηριστικά επιδόσεων της μεθόδου για την ουρία, μετρούμενα σε λ = 435 nm σε όλα τα υλικά

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Πρόβατα	Βοοειδή	Πρόβατα	Πρόβατα	Βοοειδή
Στόχος κλάσματος μάζας (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Μέσο κλάσμα μάζας. (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας, sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας, sr (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Σχετική τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας, RSDR (%)	17	18	9	7	12
Σχετική τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας, RSDr (%)	14	10	8	2	1
Όριο αναπαραγωγιμότητας, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Όριο επαναληψιμότητας, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9.   Παρατηρήσεις

9.1.

Για περιεκτικότητες σε ουρία ανώτερες από 3 % μειώστε την ποσότητα δοκιμής σε 1 g ή αραιώστε το αρχικό διάλυμα για να μην έχετε περισσότερο από 50 mg ουρίας στα 500 ml.

9.2.

Για χαμηλές περιεκτικότητες σε ουρία, αυξήστε την ποσότητα δοκιμής, αρκεί το διήθημα να παραμείνει διαυγές και άχρουν.

9.3.

Τα ανωτέρω αποτελέσματα από τις διεργαστηριακές δοκιμές δεν δείχνουν σημαντική διαφορά ως προς την ακρίβεια μεταξύ της ουρίας που μετράται στα 420 nm και της ουρίας που μετράται στα 435 nm.

E.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ (ΕΚΤΟΣ ΤΗΣ ΘΡΥΠΤΟΦΑΝΗΣ)

Οι μέθοδοι ανάλυσης που πρέπει να χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των αμινοξέων (εκτός της θρυπτοφάνης) είναι:

—	EN ISO 13903 Ζωοτροφές — Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε αμινοξέα

—	EN ISO 17180 Ζωοτροφές — Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε λυσίνη, μεθειονίνη και θρεονίνη σε εμπορικά προϊόντα αμινοξέων και προμείγματα (4)

—	η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στα σημεία 1 έως 10 κατωτέρω,

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό των ελεύθερων (συνθετικών και φυσικών) και ολικών (ενωμένων σε πεπτίδια και ελεύθερων) αμινοξέων σε πρώτες ύλες ζωοτροφών, σύνθετες ζωοτροφές και προμείγματα που περιέχουν λιγότερο από 10 % (5) από κάθε αμινοξύ, με χρήση αναλυτή αμινοξέων. Μπορεί να εφαρμοστεί στα ακόλουθα αμινοξέα: κυστ(ε)ίνη, μεθειονίνη, λυσίνη, θρεονίνη, αλανίνη, αργινίνη, ασπαραγινικό οξύ, γλουταμινικό οξύ, γλυκίνη, ιστιδίνη, ισολευκίνη, λευκίνη, φαινυλαλανίνη, προλίνη, σερίνη, τυροσίνη και βαλίνη.

Η μέθοδος δεν κάνει διάκριση μεταξύ των διαφόρων αλάτων των αμινοξέων ούτε και μπορεί να επιτύχει διαφοροποίηση μεταξύ των μορφών D και L των αμινοξέων. Δεν είναι κατάλληλη για τον προσδιορισμό της θρυπτοφάνης και των υδροξυλιωμένων παραγώγων των αμινοξέων.

2.   Αρχή

2.1.   Ελεύθερα αμινοξέα

Τα προστιθέμενα ελεύθερα αμινοξέα εκχυλίζονται με τη βοήθεια αραιού υδροχλωρικού οξέος. Τα συνεκχυλιζόμενα αζωτούχα μακρομόρια καθιζάνουν με σουλφοσαλικυλικό οξύ και απομακρύνονται με διήθηση. Το pH του διηθήματος ρυθμίζεται στο 2,20. Τα αμινοξέα διαχωρίζονται με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και προσδιορίζονται με αντίδραση με νινυδρίνη και φωτομετρική ανίχνευση στα 570 nm.

2.2.   Ολικά αμινοξέα

Ο τρόπος εργασίας εξαρτάται από τα εξεταζόμενα αμινοξέα. Η κυστ(ε)ίνη και η μεθειονίνη πρέπει να οξειδώνονται προς κυστεϊνικό οξύ και σουλφόνη μεθειονίνης πριν από την υδρόλυση. Η τυροσίνη πρέπει να προσδιορίζεται σε υδρόλυμα μη οξειδωμένων δειγμάτων. Όλα τα υπόλοιπα αμινοξέα που αναφέρονται στο σημείο 1 (Σκοπός και πεδίο εφαρμογής) μπορούν να προσδιορίζονται είτε σε οξειδωμένο είτε σε μη οξειδωμένο δείγμα.

Η οξείδωση πραγματοποιείται στους 0 °C με μείγμα υπερμυρμηκικού οξέος και φαινόλης. Η περίσσεια του οξειδωτικού αντιδραστηρίου αποσυντίθεται με διθειώδες νάτριο. Το δείγμα, οξειδωμένο ή μη, υδρολύεται με υδροχλωρικό οξύ (σημείο 3.20) επί 23 ώρες. Το pH του υδρολύματος ρυθμίζεται στο 2,20. Τα αμινοξέα διαχωρίζονται με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και προσδιορίζονται με αντίδραση με νινυδρίνη και φωτομετρική ανίχνευση στα 570 nm (440 nm στην περίπτωση της προλίνης).

3.   Αντιδραστήρια

Πρέπει να χρησιμοποιείται δισαπεσταγμένο νερό ή νερό ισοδύναμης καθαρότητας (αγωγιμότητα < 10 μS).

3.1.

Υπεροξείδιο του υδρογόνου, w (w/w) = 30 %.

3.2.

Μυρμηκικό οξύ, w (w/w) = 98-100 %.

3.3.

Φαινόλη.

3.4.

Διθειώδες νάτριο.

3.5.

Υδροξείδιο του νατρίου.

3.6.

Διένυδρο 5-σουλφοσαλικυλικό οξύ.

3.7.

Υδροχλωρικό οξύ, πυκνότητας περίπου 1,18 g/ml.

3.8.

Διένυδρο κιτρικό νάτριο.

3.9.

2,2’-θειοδιαιθανόλη (θειοδιγλυκόλη).

3.10.

Χλωριούχο νάτριο

3.11.

Νινυδρίνη.

3.12.

Πετρελαϊκός αιθέρας, περιοχή ζέσεως 40-60 °C.

3.13.

Νορλευκίνη, ή άλλη ένωση κατάλληλη για χρήση ως εσωτερικό πρότυπο.

3.14.

Αέριο άζωτο (< 10 ppm οξυγόνο).

3.15.

1-οκτανόλη.

3.16.

Αμινοξέα.

3.16.1.

Τυπικές ουσίες των αμινοξέων που παρατίθενται στο σημείο 1 (Σκοπός και πεδίο εφαρμογής). Καθαρές ενώσεις που δεν περιέχουν νερό κρυσταλλοποίησης. Ξηραίνονται υπό κενό υπεράνω P2O5 or H2SO4 για 1 εβδομάδα πριν από τη χρήση.

3.16.2.

Κυστεϊνικό οξύ.

3.16.3.

Σουλφόνη μεθειονίνης.

3.17.

Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου, c = 7,5 mol/l: διαλύονται 300 g NaOH (σημείο 3.5) σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.18.

Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου, c = 1 mol/l: διαλύονται 40 g NaOH (σημείο 3.5) σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.19.

Διάλυμα μυρμηκικού οξέος-φαινόλης: Αναμειγνύονται 889 g μυρμηκικού οξέος (σημείο 3.2) με 111 g νερού και προστίθενται 4,73 g φαινόλης (σημείο 3.3).

3.20.

Μείγμα υδρόλυσης, c = 6 mol HCl/l που περιέχει 1 g φαινόλης/l: Προστίθεται 1 g φαινόλης (σημείο 3.3) σε 492 ml HCl (σημείο 3.7) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.21.

Μείγμα εκχύλισης, c = 0,1 mol HCl/l που περιέχει 2 % θειοδιγλυκόλη: λαμβάνονται 8,2 ml HCl (σημείο 3.7), αραιώνονται με περίπου 900 ml νερού, προστίθενται 20 ml θειοδιγλυκόλης (σημείο 3.9) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό, (τα σημεία 3.7 και 3.9 δεν πρέπει να αναμειγνύονται απευθείας).

3.22.

5-σουλφοσαλικυλικό οξύ ß = 6 %: διαλύονται 60 g 5-σουλφοσαλικυλικού οξέος (σημείο 3.6) σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.23.

Μείγμα οξείδωσης (υπερμυρμηκικό οξύ-φαινόλη): Αναμειγνύονται 0,5 ml υπεροξειδίου του υδρογόνου (σημείο 3.1) με 4,5 ml διαλύματος μυρμηκικού οξέος-φαινόλης (σημείο 3.19) σε ένα μικρό γυάλινο ποτήρι ζέσεως. Αφήνεται προς επώαση στους 20-30 °C για 1 ώρα για να σχηματιστεί το υπερμυρμηκικό οξύ, και στη συνέχεια ψύχεται σε λουτρό νερού/πάγου (15 λεπτά) πριν προστεθεί στο δείγμα. Προσοχή: αποφύγετε την επαφή με το δέρμα και φοράτε προστατευτικά ρούχα.

3.24.

Διάλυμα κιτρικού άλατος, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Διαλύονται 19,61 g κιτρικού νατρίου (σημείο 3.8), 5 ml θειογλυκόλης (σημείο 3.9), 1 g φαινόλης (σημείο 3.3) και 16,0 ml HCl (σημείο 3.7) σε περίπου 800 ml νερό. Το pH ρυθμίζεται στο 2,20. Το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.25.

Ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης, το οποίο παρασκευάζεται ανάλογα με τις συνθήκες του αναλυτή που χρησιμοποιείται (σημείο 4.9).

3.26.

Αντιδραστήριο νινυδρίνης, το οποίο παρασκευάζεται ανάλογα με τις συνθήκες του αναλυτή που χρησιμοποιείται (σημείο 4.9).

3.27.

Πρότυπα διαλύματα αμινοξέων. Τα εν λόγω διαλύματα πρέπει να αποθηκεύονται σε θερμοκρασία κάτω των 5 oC.

3.27.1.

Αρχικό πρότυπο διάλυμα αμινοξέων (σημείο 3.16.1). c = 2,5 μmol/ml για κάθε αμινοξύ. Διατίθεται στο εμπόριο.

3.27.2.

Αρχικό πρότυπο διάλυμα κυστεϊνικού οξέως και σουλφόνης μεθειονίνης, c = 1,25 μmol/ml. Διαλύονται 0,2115 g κυστεϊνικού οξέως (σημείο 3.16.2) και 0,2265 g σουλφόνης μεθειονίνης (σημείο 3.16.3) σε διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24) σε μια ογκομετρική φιάλη 1 l και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με διάλυμα κιτρικού οξέος. Αποθηκεύεται σε θερμοκρασία κάτω των 5 °C για 12 μήνες το πολύ. Το εν λόγω διάλυμα δεν χρησιμοποιείται αν το αρχικό πρότυπο διάλυμα (σημείο 3.27.1) περιέχει κυστεϊνικό οξύ και σουλφόνη μεθειονίνης.

3.27.3.

Αρχικό πρότυπο διάλυμα του εσωτερικού προτύπου π.χ. νορλευκίνη, c = 20 μmol/l. Διαλύονται 0,6560 g νορλευκίνης (σημείο 3.13) σε διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24) σε μια ογκομετρική φιάλη και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 250 ml με ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού οξέος. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία κάτω των 5 °C για 6 μήνες το πολύ.

3.27.4.

Διάλυμα βαθμονόμησης πρότυπων αμινοξέων για χρήση με υδρολύματα, c = 5 nmol/50 μl κυστεϊνικού οξέος και σουλφόνης μεθειονίνης και c = 10 nmol/50 μl για τα υπόλοιπα αμινοξέα. Διαλύονται 2,2 g χλωριούχου νατρίου (σημείο 3.10) σε γυάλινο ποτήρι ζέσεως 100 ml με 30 ml διαλύματος κιτρικού οξέως (σημείο 3.24). Προστίθενται 4,00 ml αρχικού πρότυπου διαλύματος αμινοξέων (σημείο 3.27.1), 4,00 ml αρχικού πρότυπου διαλύματος κυστεϊνικού οξέως και σουλφόνης μεθειονίνης (σημείο 3.27.2) και 0,50 ml αρχικού πρότυπου διαλύματος εσωτερικού προτύπου (σημείο 3.27.3), αν χρησιμοποιούνται. Το pH ρυθμίζεται στο 2,20 με υδροξείδιο του νατρίου (σημείο 3.18). Μεταγγίζεται ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη 50 ml. Το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή της φιάλης με διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24) και αναμειγνύεται. Αποθηκεύεται σε θερμοκρασία κάτω των 5 °C για 3 μήνες το πολύ. Βλέπε επίσης παρατηρήσεις στο σημείο 9.1.

3.27.5.

Διάλυμα βαθμονόμησης πρότυπων αμινοξέων για χρήση με υδρολύματα το οποίο παρασκευάζεται σύμφωνα με το σημείο 5.3.3.1 και για χρήση με εκχυλίσματα (σημείο 5.2). Το διάλυμα βαθμονόμησης παρασκευάζεται σύμφωνα με το σημείο 3.27.4 αλλά παραλείποντας το χλωριούχο νάτριο. Αποθηκεύεται σε θερμοκρασία κάτω των 5 °C για 3 μήνες το πολύ.

4.   Όργανα

4.1.

Σφαιρική φιάλη των 100 ή 250 ml, που φέρει κάθετο ψυκτήρα.

4.2.

Φιάλη από βοροπυριτικό γυαλί 100 ml με βιδωτό πώμα με επένδυση από καουτσούκ/τεφλόν (π.χ. Duran, Schott) για χρήση σε ξηραντήρα.

4.3.

Ξηραντήρας με δυναμικό αερισμό και ρυθμιστή θερμοκρασίας ακρίβειας υψηλότερης από ± 2 oC.

4.4.

pH-μετρο (με ακρίβεια τριών δεκαδικών ψηφίων).

4.5.

Φίλτρο μεμβράνης (0,22 μm).

4.6.

Μηχανή φυγοκέντρησης.

4.7.

Περιστροφικός εξατμιστής κενού.

4.8.

Μηχανικό τάρακτρο (σέικερ) ή μαγνητικός αναδευτήρας

4.9.

Αναλυτής αμινοξέων ή εξοπλισμός HPLC με ιοντοανταλλακτική στήλη, συσκευή για νινυδρίνη, παραγώγιση μετά τη στήλη και φωτομετρικό ανιχνευτή. Πραγματοποιείται πλήρωση της στήλης με θειούχες ρητίνες πολυστυρένιου, κατάλληλες για τον διαχωρισμό των αμινοξέων μεταξύ τους και για τον διαχωρισμό από άλλα υλικά θετικά στη νινυδρίνη. Η ροή μέσα στους κλάδους με το ρυθμιστικό διάλυμα και τη νινυδρίνη εξασφαλίζεται με αντλίες σταθερότητας ροής ± 0,5 % κατά την περίοδο που καλύπτει τόσο την εκτέλεση της πρότυπης βαθμονόμησης όσο και την ανάλυση του δείγματος. Με ορισμένους αναλυτές αμινοξέων είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν διαδικασίες υδρόλυσης όπου το υδρόλυμα έχει συγκέντρωση νατρίου c = 0,8 mol/l και περιέχει όλο το μυρμηκικό οξύ που απομένει μετά το στάδιο της οξείδωσης. Άλλοι πάλι δεν εξασφαλίζουν τον ικανοποιητικό διαχωρισμό ορισμένων αμινοξέων αν το υδρόλυμα περιέχει περίσσεια μυρμηκικού οξέος και/ή έχει υψηλές συγκεντρώσεις ιόντων νατρίου. Σε αυτή την περίπτωση, μειώνεται ο όγκος των οξέων με εξάτμιση σε περίπου 5 ml μετά την υδρόλυση και πριν από τη ρύθμιση του pH. Η εξάτμιση πρέπει να εκτελείται υπό κενό και σε ανώτατη θερμοκρασία 40 °C.

5.   Διαδικασία

5.1.   Παρασκευή δειγμάτων

Το δείγμα αλέθεται ώστε να διέρχεται από κόσκινο με διάμετρο οπών 0,5 mm. Δείγματα με υψηλή υγρασία πρέπει είτε να ξηραίνονται με αέρα σε θερμοκρασία μη υπερβαίνουσα τους 50 C ή να ξηραίνονται με ψύξη πριν από την άλεση. Δείγματα με υψηλή περιεκτικότητα σε λίπος πρέπει να εκχυλίζονται με πετρελαϊκό αιθέρα (σημείο 3.12) πριν από την άλεση.

5.2.   Προσδιορισμός ελεύθερων αμινοξέων

Σε κωνική φιάλη ζυγίζεται με προσέγγιση 0,2 mg κατάλληλη ποσότητα (1-5 g) του παρασκευασθέντος δείγματος (σημείο 5.1). Προστίθενται 100,0 ml μείγματος εκχύλισης (σημείο 3.21). Το σύνολο ανακινείται ή αναμειγνύεται επί 60 λεπτά χρησιμοποιώντας μηχανικό τάρακτρο ή μαγνητικό αναδευτήρα (σημείο 4.8). Το ίζημα αφήνεται να κατακαθίσει και 10,0 ml του υπερκείμενου διαλύματος μεταφέρονται με σιφώνιο σε ποτήρι ζέσεως 100 ml.

Προστίθενται 5,0 ml διαλύματος σουλφοσαλικυλικού οξέος (σημείο 3.22), αναδεύοντας με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο διάλυμα υποβάλλεται σε διήθηση ή φυγοκέντρηση για την απομάκρυνση τυχόν ιζήματος. Τοποθετούνται 10,0 ml του διαλύματος που προκύπτει σε ποτήρι ζέσεως 100 ml και ρυθμίζεται το pH στο 2,20 χρησιμοποιώντας διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.18). Το διάλυμα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη κατάλληλου όγκου χρησιμοποιώντας διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24), και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή της φιάλης με διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24).

Αν χρησιμοποιείται εσωτερικό πρότυπο, προστίθεται 1,00 ml εσωτερικού προτύπου (σημείο 3.27.3) ανά 100 ml τελικού διαλύματος και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24).

Ακολουθεί χρωματογράφηση σύμφωνα με το σημείο 5.4.

Εάν τα εκχυλίσματα δεν εξεταστούν την ίδια ημέρα, πρέπει να φυλαχθούν σε θερμοκρασία κάτω των 5 °C.

5.3.   Προσδιορισμός των συνολικών αμινοξέων

5.3.1.   Οξείδωση

Ζυγίζονται με προσέγγιση 0,2 mg από 0,1 έως 1 g του παρασκευασθέντος δείγματος (σημείο 5.1) σε:

—	σφαιρική φιάλη 100 ml (σημείο 4.1) για ανοικτή υδρόλυση (σημείο 5.3.2.3), ή

—	σφαιρική φιάλη 250 ml (σημείο 4.1) αν απαιτείται χαμηλή συγκέντρωση νατρίου (σημείο 5.3.3.1), ή

—	φιάλη 100 ml με βιδωτό πώμα (σημείο 4.2), για κλειστή υδρόλυση (σημείο 5.3.2.4).

Η ζυγισθείσα ποσότητα δείγματος πρέπει να έχει περιεκτικότητα σε άζωτο περίπου 10 mg και περιεκτικότητα σε υγρασία όχι μεγαλύτερη των 100 mg.

Η φιάλη ψύχεται μέσα σε λουτρό νερού-πάγου στους 0 °C, προστίθενται 5 ml μείγματος οξείδωσης (σημείο 3.23) και αναμειγνύεται χρησιμοποιώντας γυάλινη σπαθίδα με κυρτή άκρη. Η φιάλη μαζί με τη σπαθίδα σφραγίζεται με αεροστεγή μεμβράνη. Το λουτρό νερού/πάγου που περιέχει τη σφραγισμένη φιάλη τοποθετείται σε ψυγείο στους 0 °C και αφήνεται για 16 ώρες. Μετά τις 16 ώρες, η φιάλη εξάγεται από το ψυγείο και η περίσσεια του οξειδωτικού αντιδραστηρίου αποσυντίθεται προσθέτοντας 0,84 g διθειώδους νατρίου (σημείο 3.4).

Ακολουθείται η διαδικασία του σημείου 5.3.2.1.

5.3.2.   Υδρόλυση

5.3.2.1.

Υδρόλυση οξειδωμένων δειγμάτων Στο οξειδωμένο δείγμα που παρασκευάστηκε σύμφωνα με το σημείο 5.3.1 προστίθενται 25 ml μείγματος υδρόλυσης (σημείο 3.20), φροντίζοντας να εκπλυθούν τυχόν κατάλοιπα δείγματος που παραμένουν στα τοιχώματα του δοχείου και στη σπαθίδα. Ανάλογα με τη διαδικασία υδρόλυσης που χρησιμοποιείται, ακολουθείται η διαδικασία του σημείου 5.3.2.3 ή 5.3.2.4.

5.3.2.2.

Υδρόλυση μη οξειδωμένων δειγμάτων Ζυγίζονται, είτε σε μια σφαιρική φιάλη 100 ml ή 250 ml (σημείο 4.1) είτε σε μια φιάλη 100 ml με βιδωτό πώμα (σημείο 4.2), με προσέγγιση 0,2 mg, από 0,1 έως 1 g του δείγματος που παρασκευάστηκε (σημείο 5.1). Η ζυγισθείσα ποσότητα δείγματος πρέπει να έχει περιεκτικότητα σε άζωτο περίπου 10 mg. Προστίθενται προσεκτικά 25 ml μείγματος υδρόλυσης (σημείο 3.20) και αναμειγνύονται με το δείγμα. Ακολουθείται η διαδικασία του σημείου 5.3.2.3 ή 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Ανοικτή υδρόλυση Προστίθενται 3 γυάλινες σφαίρες στο μείγμα της φιάλης (το οποίο παρασκευάστηκε σύμφωνα με το σημείο 5.3.2.1 ή 5.3.2.2) και θερμαίνεται στο σημείο βρασμού με συνεχή παραγωγή φυσαλίδων υπό αναρροή για 23 ώρες. Όταν ολοκληρωθεί η υδρόλυση, ο ψυκτήρας εκπλύνεται με 5 ml διαλύματος κιτρικού οξέος (σημείο 3.24). Η φιάλη αποσυνδέεται και ψύχεται σε λουτρό πάγου. Ακολουθείται η διαδικασία του σημείου 5.3.3.

5.3.2.4.

Κλειστή υδρόλυση Η φιάλη με το μείγμα που παρασκευάστηκε σύμφωνα με το σημείο 5.3.2.1 ή 5.3.2.2 τοποθετείται σε ξηραντήρα (σημείο 4.3) στους 110 °C. Κατά την πρώτη ώρα της ξήρανσης, για να αποφευχθεί η υπερβολική αύξηση της πίεσης (λόγω της έκλυσης αέριων ουσιών) και τυχόν έκρηξη, το βιδωτό πώμα τοποθετείται πάνω στο στόμιο του δοχείου. Η φιάλη δεν πρέπει να σφραγιστεί με το βιδωτό πώμα. Μετά από μία ώρα, η φιάλη σφραγίζεται με το πώμα και αφήνεται στον ξηραντήρα (σημείο 4.3) για 23 ώρες. Όταν ολοκληρωθεί η υδρόλυση, η φιάλη εξάγεται από τον ξηραντήρα, ξεβιδώνεται προσεκτικά το πώμα και η φιάλη τοποθετείται σε λουτρό νερού/πάγου. Αφήνεται να ψυχθεί. Ανάλογα με τη διαδικασία που χρησιμοποιείται για τη ρύθμιση του pH (σημείο 5.3.3), το περιεχόμενο της φιάλης μεταγγίζεται ποσοτικά σε ένα ποτήρι ζέσεως 250 ml ή μια σφαιρική φιάλη 250 ml, χρησιμοποιώντας διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24). Ακολουθείται η διαδικασία του σημείου 5.3.3.

5.3.3.   Ρύθμιση του pH

Ανάλογα με την ανοχή του αναλυτή αμινοξέων στο νάτριο (σημείο 4.9), για τη ρύθμιση του pH ακολουθείται η διαδικασία του σημείου 5.3.3.1 ή 5.3.3.2.

5.3.3.1.

Για τα χρωματογραφικά συστήματα (σημείο 4.9) που απαιτούν χαμηλή συγκέντρωση νατρίου. Κρίνεται σκόπιμο να χρησιμοποιηθεί αρχικό πρότυπο διάλυμα του εσωτερικού προτύπου (σημείο 3.27.3), όταν χρησιμοποιούνται αναλυτές αμινοξέων που απαιτούν χαμηλή συγκέντρωση νατρίου (εφόσον πρέπει να μειωθεί ο όγκος του όξινου διαλύματος). Σε αυτή την περίπτωση προστίθενται 2,00 ml αρχικού πρότυπου διαλύματος του εσωτερικού προτύπου (σημείο 3.27.3) στο υδρόλυμα πριν από την εξάτμιση. Προστίθενται 2 σταγόνες 1-οκτανόλης (σημείο 3.15) στο υδρόλυμα το οποίο παρασκευάστηκε σύμφωνα με το σημείο 5.3.2.3 ή 5.3.2.4. Χρησιμοποιώντας έναν περιστροφικό εξατμιστή κενού (σημείο 4.7), ο όγκος μειώνεται σε 5-10 ml, υπό κενό, στους 40 °C Αν ο όγκος μειωθεί κατά λάθος κάτω των 5 ml, το υδρόλυμα πρέπει να απορριφθεί και η ανάλυση να γίνει από την αρχή. Το pH ρυθμίζεται στο 2,20 με διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.18) και ακολουθείται η διαδικασία του σημείου 5.3.4.

5.3.3.2.

Για όλους τους υπόλοιπους αναλυτές αμινοξέων (σημείο 4.9) Λαμβάνονται τα υδρολύματα που παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το σημείο 5.3.2.3 ή 5.3.2.4 και υποβάλλονται σε μερική εξουδετέρωση, προσθέτοντας προσεκτικά και με ταυτόχρονη ανάδευση 17 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.17), διατηρώντας τη θερμοκρασία κάτω από τους 40 °C. Το pH ρυθμίζεται στο 2,20 σε θερμοκρασία δωματίου, χρησιμοποιώντας διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.17) και, τέλος, διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.18). Ακολουθείται η διαδικασία του σημείου 5.3.4.

5.3.4.   Διάλυμα δείγματος για χρωματογράφηση

Το υδρόλυμα με το ρυθμισμένο pH (σημείο 5.3.3.1 ή 5.3.3.2) μεταγγίζεται ποσοτικά με διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24) σε ογκομετρική φιάλη 200 ml και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24).

Αν δεν έχει χρησιμοποιηθεί ήδη εσωτερικό πρότυπο, προστίθενται 2,00 ml εσωτερικού προτύπου (σημείο 3.27.3) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24). Το διάλυμα αναμειγνύεται πολύ καλά.

Ακολουθεί χρωματογράφηση σύμφωνα με το σημείο 5.4.

Εάν τα δείγματα δεν εξεταστούν την ίδια ημέρα, πρέπει να φυλαχθούν σε θερμοκρασία κάτω των 5 °C.

5.4.   Χρωματογράφηση

Πριν από τη χρωματογράφηση, το εκχύλισμα (σημείο 5.2) ή το υδρόλυμα (σημείο 5.3.4) ρυθμίζεται σε θερμοκρασία δωματίου. Το μείγμα αναμειγνύεται καλά και διηθείται κατάλληλη ποσότητα με φίλτρο μεμβράνης 0,22 μm (σημείο 4.5). Το διαυγές διάλυμα που προκύπτει υποβάλλεται σε χρωματογράφηση ιοντοανταλλαγής, χρησιμοποιώντας αναλυτή αμινοξέων (σημείο 4.9).

Η έγχυση μπορεί να εκτελεστεί διά χειρός ή αυτόματα. Είναι σημαντικό να προστεθεί η ίδια ποσότητα διαλύματος ± 0,5 % στη στήλη για την ανάλυση των προτύπων και των δειγμάτων, εκτός αν χρησιμοποιείται εσωτερικό πρότυπο, και οι αναλογίες νατρίου/αμινοξέα στα πρότυπα διαλύματα και στα διαλύματα δείγματος να είναι παρόμοιες, όσο αυτό είναι πρακτικά δυνατόν.

Σε γενικές γραμμές, η συχνότητα των κύκλων βαθμονόμησης εξαρτάται από τη σταθερότητα του αντιδραστηρίου νινυδρίνης και από το αναλυτικό σύστημα. Το πρότυπο ή το δείγμα αραιώνεται με διάλυμα κιτρικού οξέος (σημείο 3.24), προκειμένου η περιοχή μεγίστων του προτύπου να αντιστοιχεί σε 30-200 % της περιοχής μεγίστων των αμινοξέων του δείγματος.

Η χρωματογράφηση αμινοξέων διαφοροποιείται ελαφρώς ανάλογα με τον τύπο του αναλυτή και τη ρητίνη που χρησιμοποιείται. Το επιλεγμένο σύστημα πρέπει να είναι σε θέση να διαχωρίζει τα αμινοξέα μεταξύ τους, καθώς και από άλλα υλικά θετικά στη νινυδρίνη Εντός του εύρους λειτουργίας του χρωματογραφικού συστήματος πρέπει να εμφανιστεί μια γραμμική απόκριση στις μεταβολές των ποσοτήτων των αμινοξέων που προστίθενται στη στήλη.

Κατά τη χρωματογράφηση, η αναλογία ύψους ελαχίστων/μεγίστων που αναφέρεται παρακάτω ισχύει όταν αναλύεται ένα ισομοριακό διάλυμα (των υπό προσδιορισμό αμινοξέων). Το εν λόγω ισομοριακό διάλυμα πρέπει να περιέχει τουλάχιστον 30 % της μέγιστης ποσότητας κάθε αμινοξέος που μπορεί να μετρηθεί με ακρίβεια με το σύστημα του αναλυτή αμινοξέων (σημείο 4.9).

Για τον διαχωρισμό θρεονίνης-σερίνης, η αναλογία ύψους ελαχίστων/μεγίστων του κατώτερου από τα δύο αλληλεπικαλυπτόμενα αμινοξέα στο χρωματογράφημα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 2:10 (αν προσδιορίζονται μόνο κυστ(ε)ίνη, μεθειονίνη, θρεονίνη και λυσίνη, ο ανεπαρκής διαχωρισμός από τα γειτονικά μέγιστα θα επηρεάσει αρνητικά τον προσδιορισμό). Για όλα τα υπόλοιπα αμινοξέα, ο διαχωρισμός πρέπει να είναι καλύτερος από 1:10.

Το σύστημα πρέπει να εξασφαλίζει τον διαχωρισμό της λυσίνης από «τεχνητά σφάλματα λυσίνης» και από την ορνιθίνη.

6.   Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Το εμβαδόν των κορυφών του δείγματος και του προτύπου μετράται για κάθε επιμέρους αμινοξύ και η ποσότητα (X), σε g αμινοξέος ανά kg δείγματος, υπολογίζεται με τον τύπο:

Αν χρησιμοποιείται εσωτερικό πρότυπο, ο τύπος πολλαπλασιάζεται επί:

A	=	εμβαδόν κορυφής, υδρόλυμα ή εκχύλισμα
B	=	εμβαδόν κορυφής, διάλυμα βαθμονόμησης
C	=	εμβαδόν κορυφής, εσωτερικό πρότυπο στο υδρόλυμα ή εκχύλισμα
D	=	εμβαδόν κορυφής, εσωτερικό πρότυπο, διάλυμα βαθμονόμησης
M	=	μοριακό βάρος του υπό προσδιορισμό αμινοξέος
c	=	συγκέντρωση προτύπου σε μmol/ml
m	=	βάρος δείγματος (g) (διορθωμένο στο αρχικό βάρος αν είναι αποξηραμένο ή απολιπωμένο)
V	=	ml συνολικού υδρολύματος (σημείο 5.3.4) ή ml του υπολογιζόμενου συνολικού όγκου αραίωσης του εκχυλίσματος (σημείο 6.1).

Η κυστίνη και η κυστεΐνη προσδιορίζονται και οι δύο ως κυστεϊνικό οξύ σε υδρολύματα οξειδωμένου δείγματος, υπολογίζονται όμως ως κυστίνη (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) χρησιμοποιώντας την τιμή M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol)

Η μεθειονίνη προσδιορίζεται ως σουλφόνη μεθειονίνης σε υδρολύματα οξειδωμένου δείγματος, υπολογίζεται όμως ως μεθειονίνη χρησιμοποιώντας την τιμή M: 149,21 g/mol.

Η προστιθέμενη ελεύθερη μεθειονίνη προσδιορίζεται έπειτα από εκχύλιση ως μεθειονίνη. Για τον υπολογισμό, χρησιμοποιείται η ίδια τιμή M.

6.1.

Ο ολικός μετά την αραίωση όγκος των εκχυλισμάτων (F) για τον προσδιορισμό των ελεύθερων αμινοξέων (σημείο 5.2) υπολογίζεται ως εξής: V = όγκος του τελικού εκχυλίσματος

7.   Αξιολόγηση της μεθόδου

Η μέθοδος δοκιμάστηκε σε διεθνή διεργαστηριακή σύγκριση που έγινε το 1990 χρησιμοποιώντας τέσσερις διαφορετικές ζωοτροφές (αναμεμειγμένη ζωοτροφή χοίρων, φύραμα πουλερικών, συμπύκνωμα πρωτεΐνης, προμείγματα).

Σημείωση:

Η μέθοδος δοκιμάστηκε κατά τη διάρκεια δεύτερης διεθνούς μελέτης διεργαστηριακής σύγκρισης το 2003 με τη χρήση διπλών τυφλών ζευγών δειγμάτων ζωοτροφών για την ολοκλήρωση της πάχυνσης για κοτόπουλα κρεατοπαραγωγής, ζωοτροφών εκκίνησης για κοτόπουλα κρεατοπαραγωγής, αραβοσίτου, ιχθυαλεύρου και αλεύρου πουλερικών. Για λεπτομέρειες, βλέπε EN ISO 13903.

Τα αποτελέσματα της διεργαστηριακής σύγκρισης του 1990, μετά την αφαίρεση των εκτός κλίμακας αποκλίσεων, της μέσης και της σταθερής απόκλισης δίδονται στους πίνακες που ακολουθούν:

Μέσοι όροι σε g/kg

Υλικό αναφοράς	Αμινοξύ
	Θρεονίνη	Κυστ(ε)ίνη	Μεθειονίνη	Λυσίνη
Αναμεμειγμένη ζωοτροφή χοίρων	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Σύνθετο φύραμα πουλερικών	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Συμπύκνωμα πρωτεΐνης	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Πρόμειγμα	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = Αριθμός συμμετασχόντων εργαστηρίων.

7.1.   Επαναληψιμότητα

Η επαναληψιμότητα εκφραζόμενη ως «τυπική απόκλιση εντός εργαστηρίου» της διεργαστηριακής σύγκρισης του προηγούμενου πίνακα εμφαίνεται στον ακόλουθο πίνακα:

Συντελεστής μεταβλητότητας (%) για την επαναληψιμότητα (CVr)

Υλικό αναφοράς	Αμινοξύ
	Θρεονίνη	Κυστ(ε)ίνη	Μεθειονίνη	Λυσίνη
Αναμεμειγμένη ζωοτροφή χοίρων	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Σύνθετο φύραμα πουλερικών	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Συμπύκνωμα πρωτεΐνης	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Πρόμειγμα	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = Αριθμός συμμετασχόντων εργαστηρίων.

7.2.   Αναπαραγωγιμότητα

Τα σχετικά αποτελέσματα για την τυπική απόκλιση μεταξύ εργαστηρίων για τη διεργαστηριακή σύγκριση που αναφέρθηκε παραπάνω εμφαίνονται στον ακόλουθο πίνακα:

Συντελεστής μεταβλητότητας (%) για την αναπαραγωγιμότητα (CVR)

Υλικό αναφοράς	Αμινοξύ
	Θρεονίνη	Κυστ(ε)ίνη	Μεθειονίνη	Λυσίνη
Αναμεμειγμένη ζωοτροφή χοίρων	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Σύνθετο φύραμα πουλερικών	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Συμπύκνωμα πρωτεΐνης	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Πρόμειγμα	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = Αριθμός συμμετασχόντων εργαστηρίων.

8.   Χρήση υλικών αναφοράς

Η σωστή εφαρμογή της μεθόδου ελέγχεται πραγματοποιώντας επανειλημμένες μετρήσεις των πιστοποιημένων υλικών αναφοράς που είναι διαθέσιμα. Συνιστάται η διακρίβωση με πιστοποιημένο διάλυμα διακριβώσεων αμινοξέων.

9.   Παρατηρήσεις

9.1.

Λόγω διαφορών μεταξύ αναλυτών αμινοξέων, ως κατευθυντήρια οδός πρέπει να χρησιμοποιούνται οι τελικές συγκεντρώσεις των διαλυμάτων διακρίβωσης των αμινοξέων (βλέπε σημεία 3.27.4 και 3.27.5) και του υδρολύματος (βλέπε σημείο 5.3.4). Το πεδίο της γραμμικής ανταπόκρισης της συσκευής, πρέπει να ελεγχθεί για όλα τα αμινοξέα. Το πρότυπο διάλυμα διαλύεται με ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού άλατος προκειμένου να παρουσιασθούν οι περιοχές αιχμής στο μέσο του πεδίου.

9.2.

Όταν για την ανάλυση των προϊόντων υδρόλυσης χρησιμοποιείται εξοπλισμός υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, οι πειραματικές συνθήκες πρέπει να βελτιστοποιούνται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

9.3.

Με την εφαρμογή της μεθόδου σε σύνθετες ζωοτροφές ή προμείγματα που περιέχουν περισσότερο από 1 % χλωρίδιο (συμπυκνώματα, ανόργανες ζωοτροφές, συμπληρωματικές ζωοτροφές) θα μπορούσε να υπάρξει εκτίμηση κατώτερη της κανονικής όσον αφορά τη μεθειονίνη και θα πρέπει να προβλέπεται ειδική αγωγή.

10.   Κριτήρια απόδοσης

Η συλλογή των αποτελεσμάτων (εκτός από την τυροσίνη) που προέρχονται από τις 2 συνεργατικές μελέτες (του 1990, της οποίας τα αποτελέσματα αναφέρονται στο σημείο 7 ανωτέρω, και του 2005, όπως αυτά περιγράφονται στο πρότυπο EN/ISO 13903) παρέχει τα ακόλουθα κριτήρια επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας. Οι τιμές που προέκυψαν από τις εν λόγω διεργαστηριακές δοκιμές ενδέχεται να μην ισχύουν για πεδία τιμών συγκέντρωσης και υλικά διαφορετικά από τα αναφερόμενα.

10.1.   Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα στο ίδιο εργαστήριο και από τον ίδιο χειριστή δεν πρέπει να υπερβαίνει:

—	το 6 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της γλυκίνης, αλανίνης, λυσίνης, προλίνης, γλουταμινικού οξέος, ισολευκίνης και ιστιδίνης·

—	το 8 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της θρεονίνης, φαινυλαλανίνης, μεθειονίνης, του ασπαραγινικού οξέος και της λευκίνης·

—	το 10 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της αργινίνης και της βαλίνης·

—	το 12 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της σερίνης·

—	το 15 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της κυστ(ε)ίνης.

10.2.   Αναπαραγωγιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα σε διαφορετικά εργαστήρια και/ή από διαφορετικούς χειριστές δεν πρέπει να υπερβαίνει:

—	το 15 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της γλυκίνης, της αλανίνης και της θρεονίνης·

—	το 20 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της λυσίνης, της προλίνης, της φαινυλαλανίνης, της μεθειονίνης και του ασπαραγινικού οξέος·

—	το 22 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση του γλουταμινικού οξέος και της λευκίνης·

—	το 27 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της αργινίνης·

—	το 32 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της αργινίνης·

—	το 35 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της βαλίνης και της σερίνης·

—	το 40 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της ιστιδίνης·

—	το 50 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή, για τα ολικά αμινοξέα στην περίπτωση της κυστ(ε)ίνης.

ΣΤ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΘΡΥΠΤΟΦΑΝΗΣ

Οι μέθοδοι ανάλυσης που πρέπει να χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της θρυπτοφάνης είναι:

—	EN ISO 13904 Ζωοτροφές — Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε τρυπτοφάνη·

—	η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στα σημεία 1 έως 9 κατωτέρω.

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της συνολικής και της ελεύθερης θρυπτοφάνης σε ζωοτροφές. Δεν γίνεται διάκριση μεταξύ D- και L-μορφών.

2.   Αρχή

Για τον προσδιορισμό της συνολικής θρυπτοφάνης, το δείγμα υδρολύεται υπό αλκαλικές συνθήκες με κορεσμένο διάλυμα υδροξειδίου του βαρίου και θερμαίνεται στους 110 °C για 20 ώρες. Μετά την υδρόλυση, προστίθεται εσωτερικό πρότυπο.

Για τον προσδιορισμό της ελεύθερης θρυπτοφάνης, το δείγμα εκχυλίζεται υπό ήπιες όξινες συνθήκες παρουσία εσωτερικού προτύπου.

Η θρυπτοφάνη και το εσωτερικό πρότυπο στο υδρόλυμα ή στο εκχύλισμα προσδιορίζονται μέσω HPLC με ανίχνευση φθορισμού.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Πρέπει να χρησιμοποιείται δισαπεσταγμένο νερό ή νερό ισοδύναμης καθαρότητας (αγωγιμότητα < 10 μS/cm).

3.2.

Πρότυπη ουσία: θρυπτοφάνη (καθαρότητα/περιεκτικότητα ≥ 99 %) ξηρανθείσα υπό κενό υπεράνω πεντοξειδίου του φωσφόρου.

3.3.

Ουσία εσωτερικού προτύπου: α-μεθυλο-θρυπτοφάνη (καθαρότητα/περιεκτικότητα ≥ 99 %), ξηρανθείσα υπό κενό υπεράνω πεντοξειδίου του φωσφόρου

3.4.

Οκταένυδρο υδροξείδιο του βαρίου [πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια ώστε το Ba(OH)2.8 H2O να μην εκτίθεται υπερβολικά στον αέρα για την αποφυγή σχηματισμού BaCO3, πράγμα το οποίο μπορεί να προκαλέσει προβλήματα στον προσδιορισμό] (βλέπε σημείο 9.3).

3.5.

Υδροξείδιο του νατρίου.

3.6.

Ορθοφωσφορικό οξύ, w (w/w) = 85 %.

3.7.

Υδροχλωρικό οξύ, ρ20 1,19 g/ml.

3.8.

Μεθανόλη, καθαρότητας ισοδύναμης HPLC

3.9.

Πετρελαϊκός αιθέρας, περιοχή ζέσεως 40-60 °C.

3.10.

Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου, c = 1 mol/l 40,0 g NaOH (σημείο 3.5) διαλύονται σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό (σημείο 3.1).

3.11.

Υδροχλωρικό οξύ, c = 6 mol/l: Λαμβάνονται 492 ml HCl (σημείο 3.7) και συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.12.

Υδροχλωρικό οξύ, c = 1 mol/l: Λαμβάνονται 82 ml HCl (σημείο 3.7) και συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.13.

Υδροχλωρικό οξύ, c = 0,1 mol/l: Λαμβάνονται 8,2 ml HCl (σημείο 3.7) και συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.14.

Ορθοφωσφορικό οξύ, c = 0,5 mol/l: Λαμβάνονται 34 ml ορθοφωσφορικού οξέος (σημείο 3.6) και συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό (σημείο 3.1).

3.15.

Πυκνό διάλυμα θρυπτοφάνης (σημείο 3.2), c = 2,50 μmol/ml: Σε ογκομετρική φιάλη 500 ml διαλύονται 0,2553 g θρυπτοφάνης (σημείο 3.2) σε υδροχλωρικό οξύ (σημείο 3.13) και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με υδροχλωρικό οξύ (σημείο 3.13). Το διάλυμα αποθηκεύεται στους –18 °C για τέσσερις εβδομάδες το πολύ.

3.16.

Πυκνό διάλυμα εσωτερικού προτύπου, c = 2,50 μmol/ml: Σε ογκομετρική φιάλη 500 ml διαλύονται 0,2728 g α-μεθυλο-θρυπτοφάνης (σημείο 3.3) σε υδροχλωρικό οξύ (σημείο 3.13) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με υδροχλωρικό οξύ (σημείο 3.13). Το διάλυμα αποθηκεύεται στους –18 °C για τέσσερις εβδομάδες το πολύ.

3.17.

Πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης θρυπτοφάνης και εσωτερικού προτύπου: Λαμβάνονται 2,00 ml πυκνού διαλύματος θρυπτοφάνης (σημείο 3.15), και 2,00 ml πυκνού διαλύματος εσωτερικού προτύπου (α-μεθυλο-θρυπτοφάνη) (σημείο 3.16). Αραιώνονται με νερό (σημείο 3.1) και μεθανόλη (σημείο 3.8) μέχρι περίπου τον ίδιο όγκο και την ίδια περίπου συγκέντρωση μεθανόλης (10-30 %) όπως και το τελικό υδρόλυμα. Το διάλυμα αυτό πρέπει να παρασκευάζεται λίγο πριν από τη χρήση του. Κατά τη διάρκεια της παρασκευής, προστατεύεται από το άμεσο ηλιακό φως.

3.18.

Οξικό οξύ.

3.19.

1,1,1-τριχλωρο-2-μεθυλο-2-προπανόλη.

3.20.

Αιθανολαμίνη w (w/w) > 98 %.

3.21.

Διάλυμα 1 g 1,1,1-τριχλωρο-2-μεθυλο-2-προπανόλης (σημείο 3.19) σε 100 ml μεθανόλης (σημείο 3.8).

3.22.

Κινητή φάση για HPLC: 3,00 g οξικό οξύ (σημείο 3.18) + 900 ml νερό (σημείο 3.1) + 50,0 ml διάλυμα (σημείο 3.21) 1,1,1-τριχλωρο-2-μεθυλο-2-προπανόλης (σημείο 3.19) σε μεθανόλη (σημείο 3.8) (1 g/10 ml). Το pH ρυθμίζεται στο 5,00 με αιθανολαμίνη (σημείο 3.20). Συμπληρώνεται μέχρι τα 1 000 ml με νερό (σημείο 3.1).

4.   Όργανα

4.1.

Εξοπλισμός HPLC με φασματοφθορισμομετρικό ανιχνευτή.

4.2.

Υγρή χρωματογραφική στήλη, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm πλήρωση, ή ισοδύναμη.

4.3.

pH-μετρο.

4.4.

Φιάλη πολυπροπυλενίου, χωρητικότητας 125 ml, ευρύλαιμη και με βιδωτό πώμα.

4.5.

Φίλτρο μεμβράνης, 0,45 μm.

4.6.

Αυτόκλειστο, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7.

Μηχανικό τάρακτρο (σέικερ) ή μαγνητικός αναδευτήρας.

4.8.

Αναμείκτης vortex.

5.   Διαδικασία

5.1.   Παρασκευή δειγμάτων

Το δείγμα αλέθεται ώστε να διέρχεται από κόσκινο με διάμετρο οπών 0,5 mm. Δείγματα με υψηλή υγρασία πρέπει είτε να ξηραίνονται με αέρα σε θερμοκρασία μη υπερβαίνουσα τους 50 °C ή να ξηραίνονται με ψύξη πριν από την άλεση. Δείγματα με υψηλή περιεκτικότητα σε λίπος πρέπει να εκχυλίζονται με πετρελαϊκό αιθέρα (σημείο 3.9) πριν από την άλεση.

5.2.   Προσδιορισμός ελεύθερης θρυπτοφάνης (εκχύλισμα)

Σε κωνική φιάλη, ζυγίζεται με προσέγγιση 1 mg κατάλληλη ποσότητα (1-5 g) του παρασκευασθέντος δείγματος (σημείο 5.1). Προστίθενται 100,0 ml υδροχλωρικό οξύ, (σημείο 3.13) και 5,00 ml πυκνό διάλυμα εσωτερικού προτύπου (σημείο 3.16). Το σύνολο ανακινείται ή αναμειγνύεται επί 60 min χρησιμοποιώντας μηχανικό τάρακτρο ή μαγνητικό αναδευτήρα (σημείο 4.7). Το ίζημα αφήνεται να κατακαθίσει και 10,0 ml του υπερκείμενου διαλύματος μεταφέρονται με σιφώνιο σε ποτήρι ζέσεως. Προστίθενται 5 ml ορθο-φωσφορικού οξέος (σημείο 3.14). Το pH ρυθμίζεται στο 3 χρησιμοποιώντας υδροξείδιο του νατρίου (σημείο 3.10). Προστίθεται ικανή ποσότητα μεθανόλης (σημείο 3.8) ώστε να ληφθεί συγκέντρωση μεταξύ 10 και 30 % μεθανόλης στον τελικό όγκο. Το διάλυμα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη καταλλήλου όγκου και αραιώνεται με νερό στον όγκο που απαιτείται για τη χρωματογραφία [περίπου ο ίδιος όγκος με το πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης (σημείο 3.17)].

Μερικά ml του διαλύματος διηθούνται μέσω φίλτρου μεμβράνης 0,45 μm (σημείο 4.5) πριν εγχυθούν στη στήλη HPLC. Ακολουθεί χρωματογράφηση σύμφωνα με το σημείο 5.4.

Το πρότυπο διάλυμα και τα εκχυλίσματα προστατεύονται από το άμεσο ηλιακό φως. Εάν δεν είναι δυνατή η ανάλυση των εκχυλισμάτων την ίδια ημέρα, τα εκχυλίσματα μπορούν να φυλαχθούν στους 5 °C για τρεις ημέρες το πολύ.

5.3.   Προσδιορισμός της συνολικής θρυπτοφάνης (υδρόλυμα)

Στην πολυπροπυλενική φιάλη (σημείο 4.4) ζυγίζονται με προσέγγιση 0,2 mg από 0,1 έως 1 g του παρασκευασθέντος δείγματος (σημείο 5.1). Η ζυγισθείσα ποσότητα δείγματος πρέπει να έχει περιεκτικότητα σε άζωτο περίπου 10 mg. Προστίθενται 8,4 g οκταένυδρο υδροξείδιο του βαρίου (σημείο 3.4) και 10 ml νερό. Το σύνολο αναμειγνύεται σε αναμείκτη vortex (σημείο 4.8) ή μαγνητικό αναδευτήρα (σημείο 4.7). Ο επικαλυμμένος με τεφλόν μαγνήτης αφήνεται στο μείγμα. Τα τοιχώματα του δοχείου εκπλύνονται προς τα κάτω με 4 ml νερό. Τοποθετείται το βιδωτό πώμα και η φιάλη κλείνεται χαλαρά. Μεταφέρεται σε αυτόκλειστο (σημείο 4.6) με βραστό νερό και ατμό για 30-60 λεπτά. Το αυτόκλειστο κλείνεται και ακολουθεί θέρμανση στους 110 (± 2) °C για 20 ώρες.

Πριν ανοιχθεί το αυτόκλειστο, η θερμοκρασία μειώνεται λίγο κάτω από τους 100 °C. Για την αποφυγή κρυστάλλωσης του Ba(OH)2.8 H2O, προστίθενται στο θερμό μείγμα 30 ml νερού σε θερμοκρασία δωματίου. Το σύνολο ανακινείται ή αναδεύεται ήπια. Προστίθενται 2,00 ml πυκνό διάλυμα εσωτερικού προτύπου (α-μεθυλο-θρυπτοφάνης) (σημείο 3.16). Τα δοχεία ψύχονται σε λουτρό νερού/πάγου για 15 λεπτά.

Στη συνέχεια προστίθενται 5 ml ορθοφωσφορικού οξέος (σημείο 3.14). Το δοχείο διατηρείται στο λουτρό ψύξης και εξουδετερώνεται με HCl (σημείο 3.11) με ταυτόχρονη ανάδευση και το pH ρυθμίζεται στο 3,0 με HCl (σημείο 3.12). Προστίθεται ικανή ποσότητα μεθανόλης ώστε να ληφθεί συγκέντρωση μεταξύ 10 και 30 % μεθανόλης στον τελικό όγκο. Κατάλληλη ποσότητα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη και αραιώνεται με νερό στον καθορισμένο όγκο που απαιτείται για τη χρωματογραφία (π.χ. 100 ml). Η προσθήκη μεθανόλης δεν πρέπει να προκαλεί καθίζηση.

Μερικά ml του διαλύματος διηθούνται μέσω φίλτρου μεμβράνης 0,45 μm (σημείο 4.5) πριν εγχυθούν στη στήλη HPLC. Ακολουθεί χρωματογράφηση σύμφωνα με το σημείο 5.4.

Το πρότυπο διάλυμα και τα υδρολύματα προστατεύονται από το άμεσο ηλιακό φως. Εάν δεν είναι εφικτή η ανάλυση των υδρολυμάτων την ίδια ημέρα, τότε αυτά μπορούν να φυλαχθούν στους 5 °C για τρεις ημέρες το πολύ.

5.4.   Προσδιορισμός με HPLC

Για ισοκρατική έκλουση κατάλληλες είναι οι ακόλουθες συνθήκες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες συνθήκες, υπό την προϋπόθεση ότι παρέχουν ισοδύναμα αποτελέσματα (βλέπε επίσης τις παρατηρήσεις στα σημεία 9.1 και 9.2):

Υγρή χρωματογραφική στήλη	125 mm × 4 mm, C18, 3 μm πλήρωση, ή στήλη (σημείο 4.2):ισοδύναμη
Θερμοκρασία στήλης:	θερμοκρασία δωματίου
Κινητή φάση (σημείο 3.22):	3,00 g οξικό οξύ (σημείο 3.18) + 900 ml νερό (σημείο 3.1) +50,0 ml διάλυμα (σημείο 3.21) 1,1,1-τριχλωρο-2- μεθυλο-2-προπανόλης (σημείο 3.19) σε μεθανόλη (σημείο 3.8) (1 g/100 ml). Το pH ρυθμίζεται στο 5,00 με αιθανολαμίνη (σημείο 3.20). Συμπληρώνεται μέχρι τα 1 000  ml με νερό (σημείο 3.1)
Ρυθμός ροής:	1 ml/min
Συνολικός χρόνος ροής:	περίπου 34 min
Μήκος κύματος ανίχνευσης:	διέγερση: 280 nm, εκπομπή: 356 nm.
όγκος έγχυσης	20 μl

6.   Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Υπολογίζεται η ποσότητα της θρυπτοφάνης (X), σε g ανά 100 g δείγματος.

A	=	εμβαδόν κορυφής εσωτερικού προτύπου, πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης (σημείο 3.17)
B	=	εμβαδόν κορυφής θρυπτοφάνης, εκχύλισμα (σημείο 5.2) ή υδρόλυμα (σημείο 5.3)
V1	=	όγκος σε ml (2 ml) πυκνού διαλύματος θρυπτοφάνης (σημείο 3.15) που προστίθεται στο διάλυμα βαθμονόμησης (σημείο 3.17)
C	=	συγκέντρωση σε μmol/ml = 2,50 πυκνού διαλύματος θρυπτοφάνης (σημείο 3.15) που προστίθεται στο διάλυμα βαθμονόμησης (σημείο 3.17)
V2	=	όγκος σε ml του πυκνού διαλύματος εσωτερικού προτύπου (σημείο 3.16) που προστίθεται στην εκχύλιση (σημείο 5.2) = 5,00 ml ή στο υδρόλυμα (σημείο 5.3) = 2,00 ml
C	=	εμβαδόν κορυφής εσωτερικού προτύπου, εκχύλισμα (σημείο 5.2) ή υδρόλυμα (σημείο 5.3)
D	=	εμβαδόν κορυφής θρυπτοφάνης, πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης (σημείο 3.17)
V3	=	όγκος σε ml (= 2,00 ml) πυκνού διαλύματος εσωτερικού προτύπου (σημείο 3.16) που προστίθεται στο πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης (σημείο 3.17)
m	=	βάρος δείγματος σε g (διορθωμένο στο αρχικό βάρος εφόσον έχει ξηρανθεί ή/και απολιπανθεί)
M	=	μοριακό βάρος θρυπτοφάνης (= 204,23 g/mol)

7.   Επαναληψιμότητα

Η διαφορά των αποτελεσμάτων των δύο παράλληλα διενεργουμένων προσδιορισμών του ίδιου δείγματος δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή.

8.   Αποτελέσματα διεργαστηριακής μελέτης

Πραγματοποιήθηκε διεργαστηριακή ενωσιακή μελέτη (4η διασύγκριση) στην οποία τρία δείγματα αναλύθηκαν από μέχρι δώδεκα εργαστήρια για την πιστοποίηση της μεθόδου υδρόλυσης. Σε κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν πέντε επαναληπτικές αναλύσεις. Τα αποτελέσματα δίδονται στον ακόλουθο πίνακα:

	Δείγμα 1 Ζωοτροφή χοίρων	Δείγμα 2 Ζωοτροφή χοίρων με συμπλήρωμα L-θρυπτοφάνης	Δείγμα 3 Συμπύκνωμα ζωοτροφής για χοίρους
L	12	12	12
n Μέσος όρος [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVr [%]	6,3	6,0	2,2
L = αριθμός υποβληθέντων εργαστηριακών αποτελεσμάτων n = αριθμός μεμονωμένων αποτελεσμάτων που διατηρούνται απαλείφοντας τις ακραίες τιμές (προσδιορίζονται με τη δοκιμή ακραίων τιμών Cochran, Dixon) sr = τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας SR = τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας r = επαναληψιμότητα R = αναπαραγωγιμότητα CVr = συντελεστής μεταβλητότητας της επαναληψιμότητας, % CVR = συντελεστής μεταβλητότητας της αναπαραγωγιμότητας, %.

Πραγματοποιήθηκε μια άλλη ενωσιακή μελέτη (3η διασύγκριση) στην οποία δύο δείγματα αναλύθηκαν από μέχρι δεκατρία εργαστήρια για την πιστοποίηση της μεθόδου υδρόλυσης. Σε κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν πέντε επαναληπτικές αναλύσεις. Τα αποτελέσματα δίδονται στον ακόλουθο πίνακα:

	Δείγμα 4 Μείγμα σίτου και σόγιας	Δείγμα 5 Μείγμα σίτου και σόγιας (= δείγμα 4) με προσθήκη θρυπτοφάνης (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Μέσος όρος [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = αριθμός υποβληθέντων εργαστηριακών αποτελεσμάτων n = αριθμός μεμονωμένων αποτελεσμάτων που διατηρούνται απαλείφοντας τις ακραίες τιμές (προσδιορίζονται με τη δοκιμή ακραίων τιμών Cochran, Dixon) sr = τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας SR = τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας r = επαναληψιμότητα R = αναπαραγωγιμότητα CVr = συντελεστής μεταβλητότητας της επαναληψιμότητας, % CVR = συντελεστής μεταβλητότητας της αναπαραγωγιμότητας, %.

Πραγματοποιήθηκε μια άλλη ενωσιακή μελέτη διασύγκρισης στην οποία αναλύθηκαν τέσσερα δείγματα από μέχρι επτά εργαστήρια με σκοπό την πιστοποίηση θρυπτοφάνης για υδρόλυση. Τα αποτελέσματα δίνονται κατωτέρω. Σε κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν πέντε επαναληπτικές αναλύσεις.

	Δείγμα 1 Αναμεμειγμένη ζωοτροφή χοίρων (CRM 117)	Δείγμα 2 Ιχθυάλευρο με χαμηλά λιπαρά (CRM 118)	Δείγμα 3 Σογιάλευρο (CRM 119)	Δείγμα 4 Αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Μέσος όρος [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = αριθμός υποβληθέντων εργαστηριακών αποτελεσμάτων n = αριθμός μεμονωμένων αποτελεσμάτων που διατηρούνται απαλείφοντας τις ακραίες τιμές (προσδιορίζονται με τη δοκιμή ακραίων τιμών Cochran, Dixon) sr = τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας SR = τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας r = επαναληψιμότητα R = αναπαραγωγιμότητα CVr = συντελεστής μεταβλητότητας της επαναληψιμότητας, % CVR = συντελεστής μεταβλητότητας της αναπαραγωγιμότητας, %.

9.   Παρατηρήσεις

9.1.

Με ειδικές χρωματογραφικές συνθήκες μπορεί να επιτευχθεί καλύτερος διαχωρισμός μεταξύ θρυπτοφάνης και α-μεθυλο-θρυπτοφάνης. Ισοκρατική έκλουση που ακολουθείται από καθαρισμό της διαβαθμισμένης στήλης: Υγρή χρωματογραφική στήλη: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm πλήρωση, ή ισοδύναμη Θερμοκρασία στήλης: 32 °C Κινητή φάση: A: 0,01 mol/l KH2PO4/μεθανόλη, 95 + 5 (V+V). B: Μεθανόλη Πρόγραμμα βαθμίδων: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Ρυθμός ροής: 1,2 ml/min Συνολικός χρόνος ροής: περίπου 33 min

9.2.

Η χρωματογραφία διαφοροποιείται ανάλογα με τον τύπο HPLC και το χρησιμοποιούμενο υλικό πλήρωσης στήλης. Το επιλεγόμενο σύστημα πρέπει να μπορεί να επιτυγχάνει διαχωρισμό βασικής γραμμής μεταξύ θρυπτοφάνης και εσωτερικού προτύπου. Περαιτέρω, παίζει σημαντικό ρόλο τα προϊόντα αποδόμησης να διαχωρίζονται σωστά από τη θρυπτοφάνη και το εσωτερικό πρότυπο. Πρέπει να χρησιμοποιούνται υδρολύματα χωρίς εσωτερικό πρότυπο για να ελέγχεται η βασική γραμμή υπό το εσωτερικό πρότυπο για προσμείξεις. Παίζει σημαντικό ρόλο ο χρόνος λειτουργίας να είναι αρκετά μεγάλος για την έκλουση όλων των προϊόντων αποδόμησης, διαφορετικά στις επόμενες χρωματογραφικές δοκιμές μπορεί να παρεισφρύσουν όψιμες κορυφές έκλουσης. Στην περιοχή εργασίας, το χρωματογραφικό σύστημα πρέπει να παρέχει γραμμική απόκριση. Η γραμμική απόκριση πρέπει να μετριέται με σταθερή (την κανονική) συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου και ποικίλες συγκεντρώσεις θρυπτοφάνης. Έχει σημασία το μέγεθος των κορυφών και της θρυπτοφάνης και του εσωτερικού προτύπου να είναι στα πλαίσια της γραμμικής περιοχής του συστήματος HPLC/φθορισμού. Εάν η/οι κορυφή/-ές ή της θρυπτοφάνης και/ή του εσωτερικού προτύπου είναι πολύ μικρή ή πολύ υψηλή, η ανάλυση πρέπει να επαναλαμβάνεται με άλλο μέγεθος δείγματος και/ή τελικό όγκο.

9.3.   Υδροξείδιο του βαρίου

Με τον χρόνο, το υδροξείδιο του βαρίου είναι πολύ δύσκολο να διαλυθεί. Το γεγονός αυτό συνεπάγεται μη διαυγές διάλυμα για τον προσδιορισμό HPLC, πράγμα το οποίο μπορεί να δώσει χαμηλές τιμές για τη θρυπτοφάνη.

Ζ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΚΑΙ ΛΙΠΩΝ

1.   Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η παρούσα μέθοδος αποσκοπεί στον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε ακατέργαστα έλαια και λίπη των ζωοτροφών.

Η εφαρμογή μίας εκ των δύο κατωτέρω περιγραφόμενων διαδικασιών εξαρτάται από τη φύση και τη σύνθεση της ζωοτροφής και το σκοπό για τον οποίο πραγματοποιείται η ανάλυση.

Για τον προσδιορισμό των ακατέργαστων ελαίων και λιπών σε ελαιούχους σπόρους και καρπούς καθώς και σε ζωοτροφές στις οποίες η περιεκτικότητα σε ακατέργαστα έλαια/λίπη υπερβαίνει το 15 %, η εκχύλιση θα πρέπει να πραγματοποιείται με τη διαδικασία Α και η εκ νέου εκχύλιση με τη διαδικασία Β (σημείο 5.3).

1.1.   Διαδικασία Α — Μέσες εκχυλιζόμενες ακατέργαστες λιπαρές ουσίες

Εφαρμόζεται σε απλά υλικά φυτικής προέλευσης, με εξαίρεση εκείνα που εντάσσονται στο πεδίο εφαρμογής της διαδικασίας B.

1.2.   Διαδικασία B — Ολικά ακατέργαστα έλαια και λίπη

Εφαρμόζεται σε απλά υλικά ζωικής προέλευσης, και σε όλες τις σύνθετες τροφές. Εφαρμόζεται σε όλα εκείνα τα υλικά από τα οποία δεν είναι δυνατόν να εκχυλίζονται πλήρως έλαια και λιπαρές ουσίες χωρίς προκαταρκτική υδρόλυση, π.χ. γλουτένη, ζύμη, πρωτεΐνες γεωμήλων, και προϊόντα που υποβάλλονται σε εξώθηση, νιφαδοποίηση και εν θερμώ κατεργασία.

1.3.   Ερμηνεία των αποτελεσμάτων

Σε κάθε περίπτωση κατά την οποία επιτυγχάνονται υψηλότερα αποτελέσματα με την εφαρμογή της διαδικασίας Β έναντι αυτών της διαδικασίας Α, ως ορθή τιμή γίνεται δεκτή η επιτυγχανόμενη διά της διαδικασίας Β.

2.   Αρχή

2.1.   Διαδικασία Α

Το δείγμα υδρολύεται με αιθέρα. Το διαλυτικό μέσο απομακρύνεται με απόσταξη και το υπόλειμμα ξηραίνεται και ζυγίζεται.

2.2.   Διαδικασία Β

Γίνεται επεξεργασία του δείγματος με υδροχλωρικό οξύ υπό θέρμανση. Το μείγμα ψύχεται και φιλτράρεται. Το υπόλειμμα ξεπλένεται και ξηραίνεται και προσδιορίζεται σύμφωνα με τη μέθοδο A.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Πετρελαϊκός αιθέρας, διάστημα αναβράσεως: 40 μέχρι 60 °C. Ο δείκτης του βρωμίου πρέπει να είναι κατώτερος από 1 και το υπόλειμμα της εξατμίσεως κατώτερο από 2 mg/100 ml.

3.2.

Άνυδρο θειικό νάτριο.

3.3.

Υδροχλωρικό οξύ, c = 3 mol/l.

3.4.

Επιβοηθητικό διήθησης, π.χ. γη διατόμων, Hyflo-supercel.

4.   Όργανα

4.1.

Συσκευή εκχύλισης. Εάν η συσκευή είναι εφοδιασμένη με σιφώνιο (συσκευή Soxhlet), η παροχή αναρροής ρυθμίζεται προς επίτευξη 10 στροφών τουλάχιστον ανά ώρα. Εφόσον χρησιμοποιείται συσκευή άνευ σιφωνίων, η παροχή του αναρρεούμενου υγρού πρέπει να είναι 10 ml περίπου ανά λεπτό.

4.2.

Φυσίγγια εκχύλισης, ελεύθερα διαλυτών στον αιθέρα ουσιών των οποίων το πορώδες ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις του σημείου 4.1.

4.3.

Ξηραντήρας, είτε κενού σε 75 °C ± 3 °C, είτε με ατμοσφαιρική πίεση σε 100 °C ± 3 °C.

5.   Διαδικασία

5.1.   Διαδικασία A (βλέπε σημείο 8.1)

Ζυγίζονται 5 g δείγματος, με προσέγγιση 1 mg, εισάγονται εντός φυσιγγίου εκχύλισης (σημείο 4.2) και καλύπτονται με βαμβακερό πώμα απαλλαγμένου λιπαρών ουσιών.

Τοποθετείται το φυσίγγιο εντός συσκευής εκχύλισης (σημείο 4.1) και εκχυλίζεται επί 6 ώρες με αιθέρα (σημείο 3.1). Συλλέγεται το εκχύλισμα εντός ξηράς φιάλης, εφοδιασμένης με μερικά τεμάχια κίσσηρης, της οποίας έχει ληφθεί το απόβαρο (6).

Απομακρύνεται το διαλυτικό μέσο με απόσταξη. Ξηραίνεται το υπόλειμμα επί μιάμιση ώρα τοποθετώντας τη φιάλη εντός ξηραντήρα (σημείο 4.3). Ψύχεται εντός αποξηραντήρα και ζυγίζεται. Διενεργείται εκ νέου ξήρανση για 30 λεπτά προς επιβεβαίωση ότι το βάρος της λιπαράς ύλης παραμένει σταθερό (η απώλεια του βάρους μεταξύ δύο διαδοχικών ζυγισμάτων πρέπει να είναι κατώτερη του 1 mg).

5.2.   Διαδικασία Β

Ζυγίζονται 2,5 g δείγματος με προσέγγιση 1 ml (βλέπε σημείο 8.2) και εισάγονται εντός γυάλινου ποτηριού ζέσεως των 400 ml ή εντός κωνικής φιάλης των 300 ml και προστίθενται 100 ml υδροχλωρικού οξέος 3M (σημείο 3.3) και μερικά τεμάχια κίσσηρης. Καλύπτεται το γυάλινο ποτήρι ζέσεως με γυαλί ωρολογίου ή εφοδιάζεται η κωνική φιάλη με κάθετο ψυκτήρα. Το μείγμα φέρεται σε ήπιο βρασμό με τη χρήση χαμηλής φλόγας ή θερμαντικής πλάκας και διατηρείται εκεί για μία ώρα. Αποφεύγεται η προσκόλληση του προϊόντος επί των πλευρών του δοχείου.

Ψύχεται και προστίθεται ποσότητα επιβοηθητικού διηθήσεως (σημείο 3.4), επαρκής προς αποφυγή κάθε απωλείας λιπαρής ύλης κατά τη διάρκεια της διηθήσεως. Διηθείται διά διπλού υγρανθέντος διηθητικού χάρτου ελεύθερου λιπαρών υλών. Διηθείται με διπλό υγρό διηθητικό χάρτη ελεύθερου λιπαρών υλών. Εκπλύνεται το υπόλειμμα με ψυχρό νερό μέχρι την ουδετεροποίηση του διηθήματος. Η παρουσία αυτών υποδεικνύει ότι το δείγμα πρέπει να εκχυλιστεί με αιθέρα, κατά τη διαδικασία Α, πριν από την υδρόλυση.

Τοποθετείται ο διπλός διηθητικός χάρτης ο οποίος περιέχει το υπόλειμμα σε γυαλί ωρολογίου και ξηραίνεται επί μιάμιση ώρα εντός κλιβάνου αποξήρανσης (σημείο 4.3) σε θερμοκρασία 100 ± 3 °C.

Εισάγεται ο διπλός διηθητικός χάρτης και το ξηρό υπόλειμμα εντός φυσιγγίου εκχύλισης (σημείο 4.2) και καλύπτεται με βαμβακερό πώμα απαλλαγμένου λιπαρών ουσιών (σημείο 4.1). Τοποθετείται το φυσίγγιο εντός συσκευής εκχύλισης και ακολουθείται ο τρόπος εργασίας όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1, δεύτερη και τρίτη παράγραφος.

5.3.   Διαδικασία Α και εκ νέου εκχύλιση από τη διαδικασία Β.

Για τον προσδιορισμό των ακατέργαστων ελαίων και λιπών σε ελαιούχους σπόρους και καρπούς καθώς και σε ζωοτροφές στις οποίες η περιεκτικότητα σε ακατέργαστα έλαια/λίπη υπερβαίνει το 15 %, η εκχύλιση θα πρέπει να πραγματοποιείται με τη διαδικασία Α και η εκ νέου εκχύλιση με τη διαδικασία Β.

Αυτό σημαίνει ότι μετά την εκχύλιση με πετρελαϊκό αιθέρα (διαδικασία Α), το υπόλειμμα ή τμήμα του υπολείμματος επανεκχυλίζεται με υδροχλωρικό οξύ (διαδικασία Β). Η περιεκτικότητα σε ακατέργαστα έλαιο και λίπος είναι το άθροισμα του αποτελέσματος των διαδικασιών Α και Β.

6.   Διατύπωση των αποτελεσμάτων

Το αποτέλεσμα του ζυγίσματος εκφράζεται σε ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος.

7.   Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλα διενεργούμενων προσδιορισμών, στο ίδιο δείγμα, από τον ίδιο αναλυτή, δεν πρέπει να υπερβαίνει:

—	το 0,2 %, σε απόλυτη τιμή για περιεκτικότητες σε ακατέργαστα έλαια και λίπη μικρότερες του 5 %,

—	το 4,0 %, του μεγαλύτερου αποτελέσματος για περιεκτικότητα από 5 έως 10 %,

—	το 0,4 %, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες μεγαλύτερες του 10 %.

8.   Παρατηρήσεις

8.1.

Για τα προϊόντα με υψηλή περιεκτικότητα λιπαρών ουσιών, δύσκολα κονιοποιούμενα ή μη κατάλληλα για λήψη μειωμένης και ομοιογενούς ποσότητας. Ζυγίζονται 20 g δείγματος με προσέγγιση 1 mg και αναμειγνύονται με ποσότητα 10 g ή περισσότερων άνυδρου θειικού νατρίου (σημείο 3.2). Διενεργείται εκχύλιση με αιθέρα (σημείο 3.1) όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1. Το επιτευχθέν εκχύλισμα συμπληρώνεται έως 500 ml με αιθέρα (σημείο 3.1) και αναμειγνύεται. Εισάγονται 50 ml του διαλύματος σε μικρή ξηρή φιάλη εφοδιασμένη με μερικά τεμάχια κίσσηρης της οποίας έχει ληφθεί το απόβαρο. Απομακρύνεται το διαλυτικό μέσο με απόσταξη, ξηραίνεται και ακολουθείται ο τρόπος εργασίας όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1 τελευταία παράγραφος. Απομακρύνεται το διαλυτικό μέσο του υπολείμματος της εκχύλισης, το οποίο βρίσκεται εντός του φυσιγγίου, κονιοποιείται το υπόλοιπο σε κόκκους 1 mm, τοποθετείται εκ νέου εντός φυσιγγίου (άνευ προσθήκης θειικού νατρίου) και ακολουθείται ο τρόπος εργασίας όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1 δεύτερη και τρίτη παράγραφος. Η περιεκτικότητα σε ακατέργαστες λιπαρές ύλες σε ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος εκφράζεται με τον τύπο: όπου: m1 = βάρος σε γραμμάρια του υπολείμματος της πρώτης εκχύλισης (χρησιμοποιηθέν μέρος του εκχυλίσματος), m2 = βάρος σε γραμμάρια του υπολείμματος του δευτέρου εκχυλίσματος.

8.2.

Η ποσότητα του δείγματος ορισμένων προϊόντων (π.χ. χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρές ύλες) μπορεί να αυξηθεί.

8.3.

Τροφές ζώων συντροφιάς υψηλής περιεκτικότητας σε νερό πρέπει να αναμειγνύονται με άνυδρο θειικό νάτριο πριν από την υδρόλυση και την εκχύλιση σύμφωνα με τη διαδικασία B.

8.4.

Στο σημείο 5.2, ενδέχεται να είναι αποτελεσματικότερη η χρήση θερμού νερού, αντί του ψυχρού, για την έκπλυση του υπολείμματος μετά τη διήθηση.

8.5.

Ο χρόνος ξήρανσης της μιάμισης ώρας είναι πιθανόν να πρέπει να παραταθεί για ορισμένες ζωοτροφές. Πρέπει να αποφεύγεται η υπερβολική ξήρανση, καθώς οδηγεί σε χαμηλές τιμές αποτελεσμάτων. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί φούρνος μικροκυμάτων.

Η.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΝΩΔΩΝ ΟΥΣΙΩΝ

1.   Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό των εντός των ζωοτροφών οργανικών υλών, των ελεύθερων λιπών και αδιάλυτων σε όξινα ή αλκαλικά μέσα, που συμβατικά ονομάζονται ινώδεις ουσίες.

Η μέθοδος δεν εφαρμόζεται στην περίπτωση της λιγνοκυτταρίνης και του φυτικού άνθρακα (πολύ λεπτά σωματίδια).

2.   Αρχή

Το δείγμα, ενδεχομένως απολιπανθέν, υποβάλλεται σε κατεργασία διαδοχικά με ζέοντα διαλύματα θειικού οξέος και υδροξειδίου του νατρίου καθορισμένης συγκέντρωσης. Το υπόλειμμα διαχωρίζεται με διήθηση σε ηθμό από συντετηγμένο γυαλί αμιάντου, εκπλύνεται, ξηραίνεται, ζυγίζεται και αποτεφρώνεται σε θερμοκρασιακό εύρος 475 έως 500 °C. Η απώλεια βάρους που προκύπτει από την αποτέφρωση αντιστοιχεί στις ινώδεις ουσίες του δείγματος.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Θειικό οξύ, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Αντιαφριτικό γαλάκτωμα (π.χ. n-οκτανόλη).

3.3.

Διηθητικό μέσο (Celite 545 ή ισοδύναμο), θερμαινόμενο στους 500 °C για τέσσερις ώρες (σημείο 8.6).

3.4.

Καθαρή ακετόνη.

3.5.

Πετρελαϊκός αιθέρας, περιοχή ζέσεως 40 έως 60 °C.

3.6.

Υδροχλωρικό οξύ, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Διάλυμα υδροξειδίου του καλίου, c = 0,23 mol/l.

4.   Όργανα

4.1.

Θερμαντική μονάδα για την ανοργανοποίηση με θειικό οξύ και διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου, η οποία διαθέτει στήριγμα για το γυάλινο χωνευτήριο (σημείο 4.2) και σωλήνα εκροής με στρόφιγγα στην έξοδο των υγρών και κενού, ενδεχομένως με συμπιεσμένο αέρα. Κάθε μέρα, πριν από τη χρήση, η μονάδα προθερμαίνεται με βραστό νερό για πέντε λεπτά.

4.2.

Γυάλινο χωνευτήριο με διηθητική πλάκα από συντηγμένο γυαλί με πόρους μεγέθους 40-90 μm. Πριν από την πρώτη χρήση, θερμαίνεται στους 500 °C για λίγα λεπτά και αφήνεται να ψυχθεί (σημείο 8.6).

4.3.

Κύλινδρος χωρητικότητας τουλάχιστον 270 ml με κάθετο ψυκτήρα, κατάλληλος για βρασμό.

4.4.

Κλίβανος αποξήρανσης με θερμοστάτη.

4.5.

Ηλεκτρικός κλίβανος με θερμοστάτη.

4.6.

Μονάδα εκχύλισης που αποτελείται από πλάκα στήριξης για το γυάλινο χωνευτήριο (σημείο 4.2) και από σωλήνα εκροής με στρόφιγγα στην έξοδο κενού και υγρών.

4.7.

Συνδετικοί δακτύλιοι για τη συναρμολόγηση της θερμαντικής μονάδας (σημείο 4.1), του χωνευτηρίου (σημείο 4.2) και του κυλίνδρου (σημείο 4.3), καθώς και για τη σύνδεση της μονάδας εκχύλισης εν ψυχρώ (σημείο 4.6) και του χωνευτηρίου.

5.   Διαδικασία

Ζυγίζεται 1 g του παρασκευασθέντος δείγματος με προσέγγιση 1 mg και τοποθετείται μέσα στο χωνευτήριο (σημείο 4.2), (βλέπε σημεία 9.1, 9.2 και 9.3).

Συναρμολογείται η θερμαντική μονάδα (σημείο 4.1) και το γυάλινο χωνευτήριο (σημείο 4.2), στη συνέχεια ο κύλινδρος (σημείο 4.3) συνδέεται με το χωνευτήριο. Προστίθενται 150 ml του ζέοντος θειικού οξέος (σημείο 3.1) στο συναρμολογημένο κύλινδρο και χωνευτήριο και, αν χρειάζεται, προστίθενται λίγες σταγόνες αντιαφριτικού γαλακτώματος (σημείο 3.2).

Το υγρό θερμαίνεται μέχρι του σημείου βρασμού εντός 5 ± 2 λεπτών και υποβάλλεται σε έντονο βρασμό για ακριβώς 30 λεπτά.

Ανοίγεται η στρόφιγγα του σωλήνα εκροής (σημείο 4.1) και, υπό κενό, διηθείται το θειικό οξύ μέσω του γυάλινου χωνευτηρίου. Τα κατάλοιπα εκπλένονται τρεις φορές με 30 ml ζέοντος νερού κάθε φορά, φροντίζοντας για την ξηρή διήθηση των καταλοίπων μετά από κάθε έκπλυση.

Κλείνεται η στρόφιγγα εκροής και μεταγγίζονται 150 ml ζέοντος διαλύματος υδροξειδίου του καλίου (σημείο 3.7) στο συναρμολογημένο κύλινδρο και χωνευτήριο. Προστίθενται λίγες σταγόνες αντιαφριτικού γαλακτώματος (σημείο 3.2). Το υγρό θερμαίνεται μέχρι του σημείου βρασμού εντός 5 ± 2 λεπτών και υποβάλλεται σε έντονο βρασμό για ακριβώς 30 λεπτά. Ακολουθεί διήθηση και επαναλαμβάνεται η διαδικασία έκπλυσης που χρησιμοποιείται στη διαδικασία του θειικού οξέος.

Μετά την τελική έκπλυση και ξήρανση, αποσυνδέεται το χωνευτήριο και το περιεχόμενό του και επανασυνδέεται στη μονάδα εκχύλισης εν ψυχρώ (σημείο 4.6). Τα κατάλοιπα εκπλένονται, υπό κενό, μέσα στο χωνευτήριο τρεις φορές με 25 ml ακετόνης κάθε φορά (σημείο 3.4), φροντίζοντας για την ξηρή διήθηση των καταλοίπων μετά από κάθε έκπλυση.

Το χωνευτήριο ξηραίνεται στον κλίβανο αποξήρανσης στους 130 °C μέχρι να σταθεροποιηθεί το βάρος του. Μετά από κάθε ξήρανση, αφήνεται να ψυχθεί μέσα στον ξηραντήρα και ζυγίζεται ταχέως. Το χωνευτήριο τοποθετείται μέσα στον ηλεκτρικό κλίβανο και αποτεφρώνεται μέχρι να σταθεροποιηθεί το βάρος του (η απώλεια βάρους μεταξύ δύο διαδοχικών μετρήσεων πρέπει να είναι μικρότερη ή ίση των 2 mg) στους 475 °C έως 500 °C για τουλάχιστον 30 λεπτά.

Μετά από κάθε θέρμανση, αφήνεται να ψυχθεί πρώτα μέσα στον κλίβανο και μετά μέσα στον ξηραντήρα πριν από το ζύγισμα.

Διενεργείται ένα τυφλό πείραμα χωρίς το δείγμα. Η απώλεια βάρους κατά την αποτέφρωση δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 4 mg.

6.   Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Η περιεκτικότητα σε ινώδεις ουσίες σε ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος δίδεται από τον τύπο:

όπου:

m	=	βάρος δείγματος σε g,
m0	=	απώλεια βάρους κατά την αποτέφρωση, κατά τη διάρκεια του προσδιορισμού, σε g,
m1	=	απώλεια βάρους κατά την αποτέφρωση, κατά τη διάρκεια του τυφλού πειράματος, σε g.

7.   Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ δύο παράλληλα διενεργούμενων προσδιορισμών που έγιναν στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το:

—	0,6 % σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητα σε ινώδεις ουσίες μικρότερη του 10 %,

—	6 % σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητα σε ινώδεις ουσίες ίση ή υψηλότερη του 10 %.

8.   Αναπαραγωγιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα σε διαφορετικά εργαστήρια δεν πρέπει να υπερβαίνει:

—	1,0 % σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητα σε ινώδεις ουσίες μικρότερη του 10 %,

—	10 % σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητα σε ινώδεις ουσίες ίση ή υψηλότερη του 10 %.

9.   Παρατηρήσεις

9.1.

Οι ζωοτροφές που περιέχουν περισσότερο του 10 % λιπαρές ουσίες πρέπει να απολιπαίνονται πριν από την ανάλυση με πετρελαϊκό αιθέρα (σημείο 3.5). Το χωνευτήριο (σημείο 4.2) με το περιεχόμενό του συνδέεται με τη μονάδα εκχύλισης εν ψυχρώ (σημείο 4.6). Υπό κενό, τα κατάλοιπα εκπλένονται τρεις φορές με 30 ml πετρελαϊκού αιθέρα κάθε φορά, φροντίζοντας για την ξήρανση των καταλοίπων. Το χωνευτήριο και το περιεχόμενό του συνδέεται με τη θερμαντική μονάδα (σημείο 4.1) και ακολουθείται η διαδικασία που περιγράφεται στο σημείο 5.

9.2.

Οι ζωοτροφές που περιέχουν λίπη τα οποία δεν μπορούν να προκύψουν με απευθείας εκχύλιση με πετρελαϊκό αιθέρα (σημείο 3.5) πρέπει να απολιπαίνονται όπως υποδεικνύεται στο σημείο 8.1 και να απολιπαίνονται εκ νέου μετά το βρασμό με οξύ. Μετά το βρασμό με οξύ και την έκπλυση, το χωνευτήριο και το περιεχόμενό του συνδέεται με τη μονάδα εκχύλισης εν ψυχρώ (σημείο 4.6) και εκπλένεται τρεις φορές με 30 ml ακετόνης κάθε φορά, και στη συνέχεια τρεις φορές με 30 ml πετρελαϊκού αιθέρα κάθε φορά. Το προϊόν διηθείται υπό κενό μέχρις ότου αποξηρανθεί και η ανάλυση συνεχίζεται όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5, ξεκινώντας με την κατεργασία με υδροξείδιο του καλίου.

9.3.

Αν η ζωοτροφή περιέχει πάνω από 5 % ανθρακικά άλατα καλίου, το χωνευτήριο (σημείο 4.2) με το ζυγισμένο δείγμα συνδέεται με τη θερμαντική μονάδα (σημείο 4.1). Το δείγμα επλένεται τρεις φορές με 30 ml υδροχλωρικού οξέος κάθε φορά (σημείο 3.6). Μετά από κάθε προσθήκη οξέος, το δείγμα αφήνεται για ένα λεπτό περίπου πριν από τη διήθηση. Το δείγμα εκπλένεται μία φορά με 30 ml νερού και η διαδικασία συνεχίζεται όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.

9.4.

Αν χρησιμοποιείται συσκευή με τη μορφή βάσης (περισσότερα από ένα χωνευτήρια προσαρτημένα στην ίδια θερμαντική μονάδα), δεν επιτρέπεται η διενέργεια δύο μεμονωμένων προσδιορισμών στο ίδιο δείγμα ανάλυσης στην ίδια σειρά.

9.5.

Αν, μετά το βρασμό, η διήθηση των όξινων και βασικών διαλυμάτων είναι δυσχερής, διοχετεύεται συμπιεσμένος αέρας μέσω του σωλήνα εκροής της θερμαντικής μονάδας και στη συνέχεια συνεχίζεται η διήθηση.

9.6.

Η θερμοκρασία αποτέφρωσης δεν πρέπει να υπερβαίνει τους 500 °C, προκειμένου να παρατείνεται η διάρκεια ζωής του γυάλινου χωνευτηρίου. Χρειάζεται προσοχή ώστε να αποφεύγεται η υπερβολική θερμική καταπόνηση στη διάρκεια των κύκλων θέρμανσης και ψύξης.

Θ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΑΚΧΑΡΩΝ

1.   Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό των αναγόντων σακχάρων και των ολικών σακχάρων έπειτα από ιμβερτοποίηση, εκφρασμένων σε γλυκόζη ή, κατά περίπτωση, σε σακχαρόζη, με συντελεστή μετατροπής 0,95. Εφαρμόζεται στις σύνθετες ζωοτροφές. Ιδιαίτερες διαδικασίες προβλέπονται για άλλες ζωοτροφές. Σε μερικές περιπτώσεις χρειάζεται να προσδιορισθεί ξεχωριστά η λακτόζη και να λαμβάνεται υπόψη στον υπολογισμό των αποτελεσμάτων.

Η μέθοδος αυτή πρέπει να χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε σάκχαρα προς χρήση στον υπολογισμό της ενεργειακής αξίας της ζωοτροφής.

Σε περίπτωση που η περιεκτικότητα σε σάκχαρα πρέπει να προσδιοριστεί για άλλους σκοπούς, μπορούν να εφαρμοστούν και άλλες μέθοδοι ανάλυσης.

2.   Αρχή

Τα σάκχαρα διαλύονται σε αραιή αιθανόλη- το διάλυμα αποστραγγίζεται με τη βοήθεια των αντιδραστηρίων Carrez I και II. Έπειτα από απομάκρυνση της αιθανόλης, οι προσδιορισμοί πραγματοποιούνται πριν και μετά από ιμβερτοποίηση, κατά τη μέθοδο Luff-Schoorl.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Αιθανόλη 40 % (κατ’ όγκο) πυκνότητας: 0,948 g/ml σε θερμοκρασία 20 °C, και στο σημείο αλλαγής της φαινολοφθαλεΐνης.

3.2.

Διάλυμα Carrez Ι: Διαλύονται σε νερό 21,9 g οξεικού ψευδαργύρου Zn(CH3COO)2 2H2O και 3 g κρυσταλλικού οξεικού οξέος. Φέρεται στα 100 ml με νερό.

3.3.

Διάλυμα Carrez ΙΙ: διαλύονται σε νερό 10,6 g σιδηροκυανιούχου καλίου K4Fe(CN)6 3H2O. Συμπληρώστε στα 100 ml με νερό.

3.4.

Διάλυμα 0,1 % (βάρος/όγκο) πορτοκαλόχρου του μεθυλίου.

3.5.

Υδροχλωρικό οξύ 4 mol/l.

3.6.

Υδροχλωρικό οξύ 0,1 mol/l.

3.7.

Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 0,1 mol/l.

3.8.

Αντιδραστήριο κατά Luff-Schoorl: Ανακινώντας προσεκτικά, μεταγγίστε το διάλυμα του κιτρικού οξέος (σημείο 3.8.2) στο διάλυμα ανθρακικού νατρίου (σημείο 3.8.3). Κατόπιν προσθέστε το διάλυμα του θειικού χαλκού (σημείο 3.8.1) και συμπληρώστε στο 1 l με νερό. Αφήστε σε ηρεμία μια νύκτα και διηθήστε. Ελέγξτε τη συγκέντρωση του ληφθέντος αντιδραστηρίου (Cu 0,05 mol/l, Na2 CO3 1 mol/l), βλέπε σημείο 5.4 τελευταία παράγραφο. Το pH του διαλύματος πρέπει να είναι 9,4 περίπου.

3.8.1.

Διάλυμα θειικού χαλκού: Διαλύστε 25 g θειικού χαλκού Cu SO4 5H2O, ελεύθερου σιδήρου, σε 100 ml νερό.

3.8.2.

Διάλυμα κιτρικού οξέος: διαλύστε 50 g κιτρικού οξέος, C6H8O7•H2O σε 50 ml νερό.

3.8.3.

Διάλυμα ανθρακικού νατρίου: Διαλύστε 143,8 g άνυδρου ανθρακικού νατρίου σε 300 ml περίπου θερμού νερού. Αφήστε να ψυχθεί.

3.9.

Διάλυμα θειοθειικού νατρίου 0,1 mol/l.

3.10.

Διάλυμα αμύλου: Προσθέστε ένα μείγμα από 5 g διαλυτού αμύλου και 30 ml νερού σε 1 l ζέοντος νερού. Ζέει επί 3 λεπτά, αφήνεται να ψυχθεί και, ενδεχομένως, προστίθενται 10 mg ιωδιούχου υδραργύρου ως συντηρητικού.

3.11.

Θειικό οξύ 3 mol/l.

3.12.

Διάλυμα 30 % (κ.ο.) ιωδιούχου καλίου.

3.13.

Τεμάχια ελαφρόπετρας κατεργασμένα με βρασμό μέσα σε υδροχλωρικό οξύ, πλυμένα με νερό και στεγνωμένα.

3.14.

3-μεθυλοβουταν-1-όλη

4.   Όργανα

Αναμείκτης (παλινδρομητής): περίπου 35 έως 40 στροφές ανά λεπτό.

5.   Διαδικασία

5.1.   Εκχύλιση δείγματος

Ζυγίστε 2,5 g δείγματος, με προσέγγιση 1 mg, και τοποθετήστε τα μέσα σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml. Προσθέστε 200 ml αιθανόλης (σημείο 3.1) και αναμείξτε επί μία ώρα στον παλινδρομητή. Προσθέστε 5 ml διαλύματος Carrez I (σημείο 3.2) και ανακινήστε επί περίπου 30 δευτερόλεπτα. Προσθέστε κατόπιν 5 ml διαλύματος Carrez II (σημείο 3.3) και ανακινήστε πάλι επί ένα λεπτό. Συμπληρώστε μέχρι τη χαραγή με αιθανόλη (σημείο 3.1), ομογενοποιήστε και διηθήστε. Αφαιρέστε 200 ml από το διήθημα και εξατμίστε περίπου στο μισό όγκο, προκειμένου να απομακρυνθεί το μεγαλύτερο μέρος της αιθανόλης. Μεταφέρτε ποσοτικά το υπόλειμμα της εξάτμισης με τη βοήθεια θερμού νερού, σε ογκομετρική φιάλη των 200 ml, ψύξτε, γεμίστε με νερό μέχρι τη χαραγή, ομογενοποιήστε και διηθήστε αν χρειάζεται. Το διάλυμα αυτό θα χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των αναγόντων σακχάρων και, έπειτα από ιμβερτοποίηση, τον προσδιορισμό των ολικών σακχάρων.

5.2.   Προσδιορισμός των αναγόντων σακχάρων

Αφαιρέστε με σιφώνιο μία ποσότητα από το διάλυμα που δεν υπερβαίνει τα 25 ml και περιέχει λιγότερο από 60 mg ανάγοντα σάκχαρα, εκφρασμένα σε γλυκόζη. Αν χρειάζεται, συμπληρώστε στα 25 ml με νερό απεσταγμένο και προσδιορίστε την περιεκτικότητα σε ανάγοντα σάκχαρα κατά Luff-Schoorl. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε γλυκόζη επί τοις εκατό.

5.3.   Προσδιορισμός των ολικών σακχάρων μετά από ιμβερτοποίηση

Αφαιρέστε με σιφώνιο 50 ml διαλύματος και τοποθετήστε τα σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml. Προσθέστε μερικές σταγόνες διαλύματος πορτοκαλόχρου του μεθυλίου (σημείο 3.4) κατόπιν, προσεκτικά και ανακινώντας, υδροχλωρικό οξύ (σημείο 3.5) μέχρι σαφούς αλλαγής στο κόκκινο. Προσθέστε 15 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.6), βυθίστε τη φιάλη σε εντόνως ζέον υδατόλουτρο και αφήστε την εκεί επί 30 λεπτά. Ψύξτε ταχέως στους 20 °C περίπου και προσθέστε 15 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (σημείο 3.7). Συμπληρώστε στα 100 ml με νερό και ομογενοποιήστε. Αφαιρέστε μια ποσότητα που δεν υπερβαίνει τα 25 ml και περιέχει λιγότερο από 60 mg ανάγοντα σάκχαρα, εκφρασμένα σε γλυκόζη. Αν χρειάζεται, συμπληρώστε στα 25 ml με νερό απεσταγμένο και προσδιορίστε την περιεκτικότητα σε ανάγοντα σάκχαρα κατά Luff-Schoorl. Το αποτέλεσμα εκφράζεται ως ποσοστό γλυκόζης ή, όπου χρειάζεται, σε σακχαρόζη κατόπιν πολλαπλασιασμού με τον συντελεστή 0,95.

5.4.   Ὀγκομέτρηση κατά Luff-Schoorl

Αφαιρέστε με σιφώνιο 25 ml αντιδραστηρίου κατά Luff-Schoorl (σημείο 3.8) και τοποθετήστε τα σε κωνική φιάλη των 300 ml. Προσθέστε 25 ml, επακριβώς μετρηθέντα, του στραγγισμένου διαλύματος των σακχάρων. Προσθέστε δύο τεμάχια ελαφρόπετρας (σημείο 3.13), θερμάνατε, ανακινώντας με το χέρι, επάνω από ελεύθερη φλόγα μέσου ύψους και φέρτε το υγρό σε βρασμό σε δύο λεπτά περίπου. Τοποθετήστε αμέσως την κωνική φιάλη πάνω σε μεταλλικό πλέγμα εφοδιασμένο με οθόνη αμιάντου και οπή διαμέτρου περίπου 6 cm, κάτω από την οποία έχει αναφθεί φλόγα. Η φλόγα είναι ρυθμισμένη κατά τρόπο ώστε μόνο ο πυθμένας της φιάλης να θερμαίνεται. Προσαρμόστε κατόπιν έναν ψυκτήρα επαναφοράς στην κωνική φιάλη. Από τη στιγμή αυτή ζέει επί 10 λεπτά ακριβώς. Ψύξτε αμέσως σε ψυχρό νερό και μετά από 5 λεπτά περίπου, ογκομετρήστε ως ακολούθως:

Προσθέστε 10 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (σημείο 3.12) και, αμέσως μετά και με προσοχή (λόγω κινδύνου σχηματισμού μεγάλης ποσότητας αφρού), 25 ml θειικού οξέος (σημείο 3.11). Ογκομετρήστε κατόπιν με το διάλυμα θειοκυανιούχου νατρίου (σημείο 3.9) μέχρι να εμφανισθεί ελαφρώς κιτρίνη χροιά, προσθέστε τον δείκτη αμύλου (σημείο 3.10) και ολοκληρώστε την ογκομέτρηση.

Πραγματοποιήστε την ίδια ογκομέτρηση σε ένα μείγμα επακριβώς μετρηθέν από 25 ml αντιδραστηρίου κατά Luff-Schoorl (σημείο 3.8) και 25 ml νερού, αφού προσθέσετε 10 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (σημείο 3.12) και 25 ml θειικού οξέος (σημείο 3.11), χωρίς να φέρετε σε βρασμό.

6.   Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Υπολογίσατε με τη βοήθεια του πίνακα την ποσότητα της γλυκόζης σε mg που αντιστοιχεί στη διαφορά μεταξύ των τιμών των δύο ογκομετρήσεων, εκφρασμένων σε ml θειοθειικού νατρίου 0,1 mol/l. Εκφράστε το αποτέλεσμα ως ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος.

7.   Ιδιαίτεροι τρόποι εργασίας

7.1.

Για ζωοτροφές πολύ πλούσιες σε μελάσσα και άλλες μη ιδιαίτερης ομοιογένειας, ζυγίστε 20 g και τοποθετήστε τα σε ογκομετρική φιάλη του 1 l με 500 ml νερό. Αναμείξτε επί μία ώρα στον παλινδρομητή. Αποστραγγίστε με τη βοήθεια των διαλυμάτων Carrez I (σημείο 3.2) και II (σημείο 3.3) όπως περιγράφεται στο σημείο 5.1 χρησιμοποιώντας όμως μια ποσότητα 4 φορές υψηλότερη για κάθε αντιδραστήριο. Συμπληρώστε μέχρι τη χαραγή με 80 % αιθανόλη (κατ’ όγκο). Ομογενοποιήστε και διηθήστε. Απομακρύντε την αιθανόλη όπως περιγράφεται στο σημείο 5.1. Επί απουσίας δεξτρινοποιημένου αμύλου, συμπληρώστε μέχρι τη χαραγή με απεσταγμένο νερό.

7.2.

Για τις μελάσσες και τις πρώτες ύλες ζωοτροφών οι οποίες είναι πλούσιες σε σάκχαρα και πρακτικά απαλλαγμένες αμύλου (χαρούπια, ξηρά υπολείμματα τεύτλων κ.ά.) ζυγίστε 5 g, τοποθετήστε τα σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml, προσθέστε 200 ml νερού απεσταγμένου και αναμείξτε επί μία ώρα ή περισσότερο, αν χρειάζεται, στον παλινδρομητή. Αποστραγγίστε κατόπιν με τη βοήθεια των διαλυμάτων Carrez I (σημείο 3.2) και II (σημείο 3.3) όπως περιγράφεται στο σημείο 5.1. Συμπληρώστε μέχρι τη χαραγή με ψυχρό νερό, ομογενοποιήστε και διηθήστε. Για τον προσδιορισμό των ολικών σακχάρων ακολουθήστε τη διαδικασία που περιγράφεται στο σημείο 5.3.

8.   Παρατηρήσεις

8.1.

Συνιστάται να προστεθεί περίπου 1 ml 3-μεθυλοβουταν-1-όλης (σημείο 3.14) (χωρίς να ληφθεί υπόψη ο όγκος), πριν το βρασμό με το αντιδραστήριο Luff-Schoorl, προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός αφρού.

8.2.

Η διαφορά μεταξύ της περιεκτικότητας σε ολικά σάκχαρα μετά την ιμβερτοποίηση, εκφρασμένα σε γλυκόζη, και της περιεκτικότητας σε ανάγοντα σάκχαρα, εκφρασμένα σε γλυκόζη, πολλαπλασιασμένη επί 0,95, δίνει την περιεκτικότητα σε σακχαρόζη επί τοις εκατό.

8.3.

Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε ανάγοντα σάκχαρα, με εξαίρεση τη λακτόζη, δύο μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν:

8.3.1.

Για έναν κατά προσέγγιση υπολογισμό, πολλαπλασιάζουμε επί 0,675 την περιεκτικότητα σε λακτόζη προσδιορισμένη με ξεχωριστό προσδιορισμό και αφαιρούμε το αποτέλεσμα από την περιεκτικότητα σε ανάγοντα σάκχαρα.

8.3.2.

Για έναν ακριβή υπολογισμό των αναγόντων σακχάρων, με εξαίρεση τη λακτόζη, είναι απαραίτητο να ξεκινήσουμε από την ίδια ποσότητα δοκιμής για τους δύο τελικούς προσδιορισμούς. Η μία από τις αναλύσεις πραγματοποιείται επί ενός τμήματος του διαλύματος που λαμβάνεται σύμφωνα με το σημείο 5.1, η άλλη επί ενός τμήματος του διαλύματος που λαμβάνεται κατά τον προσδιορισμό της λακτόζης σύμφωνα με τη μέθοδο που προβλέπεται για το σκοπό αυτό (έπειτα από ζύμωση των άλλων ειδών σακχάρων και αποστράγγιση). Και στις δύο περιπτώσεις, η ποσότητα του υπάρχοντος σακχάρου προσδιορίζεται σύμφωνα με τη μέθοδο Luff-Schoorl και υπολογίζεται σε mg γλυκόζης. Οι δύο τιμές αφαιρούνται η μία από την άλλη και η διαφορά εκφράζεται σε ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος. Παράδειγμα Οι δύο ληφθέντες όγκοι αντιστοιχούν για κάθε προσδιορισμό, σε ποσότητα δοκιμής 250 mg. Στην πρώτη περίπτωση, καταναλώνονται 17 ml διαλύματος θειοθειικού νατρίου 0,1 mol/litre πράγμα που αντιστοιχεί σε 44,2 mg γλυκόζης, στη δεύτερη περίπτωση 11 ml, πράγμα που αντιστοιχεί σε 27,6 mg γλυκόζης. Η διαφορά συνίσταται σε 16,6 mg γλυκόζης. Η περιεκτικότητα σε ανάγοντα σάκχαρα (με εξαίρεση τη λακτόζη), υπολογισμένη σε γλυκόζη, είναι επομένως: Πίνακας τιμών για 25 ml αντιδραστηρίου κατά Luff-Schoorl ml Na2 S2 O3 0,1 mol/litre, δύο λεπτά θέρμανση, δέκα λεπτά βρασμός Na2 S2 O3 0,1 mol/l Γλυκόζη, φρουκτόζη ιμβερτοποιημένα σάκχαρα C6 H12 O6 Λακτόζη C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/litre ml mg διαφορά mg διαφορά ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Ι.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΛΑΚΤΟΖΗΣ

1.   Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε λακτόζη ζωοτροφών που περιέχουν περισσότερο από 0,5 % λακτόζης.

2.   Αρχή

Τα σάκχαρα διαλύονται σε νερό. Το διάλυμα υποβάλλεται σε ζύμωση με τον ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae που αφήνει τη λακτόζη ανέπαφη. Έπειτα από αποστράγγιση και διήθηση, η περιεκτικότητα σε λακτόζη του διηθήματος προσδιορίζεται με τη μέθοδο Luff-Schoorl.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Αιώρημα μυκήτων Saccharomyces cerevisiae: δημιουργήστε εναιώρημα 25 g νωπής μαγιάς σε 100 ml νερού. Το εναιώρημα διατηρείται το πολύ μία εβδομάδα σε ψυγείο.

3.2.

Διάλυμα Carrez Ι: Διαλύονται σε νερό 21,9 g οξεικού ψευδαργύρου Zn(CH3COO)2 2H2O και 3 g κρυσταλλικού οξεικού οξέος. Φέρεται στα 100 ml με νερό.

3.3.

Διάλυμα Carrez ΙΙ: διαλύονται σε νερό 10,6 g σιδηροκυανιούχου καλίου K4Fe(CN)6 3H2O. Συμπληρώστε στα 100 ml με νερό.

3.4.

Αντιδραστήριο κατά Luff-Schoorl: Ανακινώντας προσεκτικά, μεταγγίστε το διάλυμα του κιτρικού οξέος (σημείο 3.4.2) στο διάλυμα του ανθρακικού νατρίου (σημείο 3.4.3). Προσθέστε στη συνέχεια το διάλυμα του θειικού χαλκού (σημείο 3.4.1) και συμπληρώστε στο 1 l με νερό. Αφήστε σε ηρεμία μια νύκτα και διηθήστε. Ελέγξτε την καυστικότητα του ληφθέντος διαλύματος (Cu 0,05 mol/litre· Na2 CO3 1 mol/litre). Το pH του διαλύματος πρέπει να είναι 9,4 περίπου.

3.4.1.

Διάλυμα θειικού χαλκού: Διαλύστε 25 g θειικού χαλκού Cu SO4 5H2O, ελεύθερου σιδήρου, σε 100 ml νερό.

3.4.2.

Διάλυμα κιτρικού οξέος: διαλύστε 50 g κιτρικού οξέος, C6H8O7•H2O σε 50 ml νερό.

3.4.3.

Διάλυμα ανθρακικού νατρίου: Διαλύστε 143,8 g άνυδρου ανθρακικού νατρίου σε 300 ml περίπου θερμού νερού. Αφήστε να ψυχθεί.

3.5.

Κόκκοι ελαφρόπετρας κατεργασμένοι με βρασμό σε υδροχλωρικό οξύ, πλυμένοι και ξηραμένοι.

3.6.

Διάλυμα 30 % (βάρος/όγκο) ιωδιούχου καλίου.

3.7.

Θειικό οξύ 3 mol/litre.

3.8.

Διάλυμα θειοθειικού νατρίου 0,1 mol/litre.

3.9.

Διάλυμα αμύλου: Προσθέστε ένα μείγμα από 5 g διαλυτού αμύλου και 30 ml νερού σε 1 l ζέοντος νερού. Ζέει επί 3 λεπτά, αφήνεται να ψυχθεί και, ενδεχομένως, προστίθενται 10 mg ιωδιούχου υδραργύρου ως συντηρητικού.

4.   Όργανα

Υδατόλουτρο εφοδιασμένο με θερμοστάτη ρυθμισμένο στους 38 έως 40 °C.

5.   Διαδικασία

Ζυγίστε 1 g δείγματος με προσέγγιση 1 mg και τοποθετήστε αυτή την ποσότητα δείγματος σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml, προσθέστε 25 έως 30 ml νερού. Τοποθετήσατε τη φιάλη επί τριάντα λεπτά σε ζέον υδρόλουτρο και ψύξτε κατόπιν στους 35 °C περίπου. Προσθέστε 5 ml εναιωρήματος μαγιάς (σημείο 3.1) και ομογενοποιήστε. Αφήστε τη φιάλη σε ηρεμία επί δύο ώρες μέσα σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 38 έως 40 °C. Ψύξτε κατόπιν μέχρι 20 °C περίπου.

Προσθέστε 2,5 ml διαλύματος Carrez I (σημείο 3.2) και ανακινήστε επί τριάντα δευτερόλεπτα, προσθέστε κατόπιν 2,5 ml διαλύματος Carrez II (σημείο 3.3) και ανακινήστε εκ νέου, επί τριάντα δευτερόλεπτα. Συμπληρώστε στα 100 ml με νερό, αναμείξτε και διηθήστε. Αφαιρέστε με σιφώνιο μία ποσότητα διηθήματος όχι μεγαλύτερη από 25 ml η οποία περιέχει κατά προτίμηση 40 έως 80 mg λακτόζης και τοποθετήστε τη σε κωνική φιάλη των 300 ml. Αν χρειάζεται, συμπληρώστε στα 25 ml με νερό.

Προβείτε κατά τον ίδιο τρόπο σε τυφλό πείραμα με 5 ml εναιωρήματος μαγιάς (σημείο 3.1). Προσδιορίστε την περιεκτικότητα σε λακτόζη κατά Luff-Schoorl ως ακολούθως: Προσθέστε 25 ml ακριβώς αντιδραστηρίου κατά Luff-Schoorl (σημείο 3.4) και δύο τεμάχια ελαφρόπετρας (σημείο 3.5). Θερμάνατε ανακινώντας με το χέρι, πάνω από ελεύθερη φλόγα μέσου ύψους και φέρτε το υγρό σε βρασμό εντός δύο λεπτών περίπου. Τοποθετήστε αμέσως την κωνική φιάλη πάνω σε μεταλλικό πλέγμα εφοδιασμένο με οθόνη αμιάντου και οπή διαμέτρου περίπου 6 cm, κάτω από την οποία έχει αναφθεί φλόγα. Η φλόγα είναι ρυθμισμένη κατά τρόπο ώστε μόνο ο πυθμένας της φιάλης να θερμαίνεται. Προσαρμόστε κατόπιν έναν ψυκτήρα επαναφοράς στην κωνική φιάλη. Από τη στιγμή αυτή ζέει επί 10 λεπτά ακριβώς. Ψύξτε αμέσως σε ψυχρό νερό και μετά από 5 λεπτά περίπου, ογκομετρήστε ως ακολούθως:

Προσθέστε 10 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (σημείο 3.6) και, αμέσως μετά και με προσοχή (λόγω κινδύνου σχηματισμού μεγάλης ποσότητας αφρού), 25 ml θειικού οξέος (σημείο 3.7). Τιτλοδοτήστε κατόπιν με το διάλυμα του θειοθειικού νατρίου (σημείο 3.8) μέχρι να εμφανιστεί ελαφρώς κίτρινος χρωματισμός, προσθέστε τον δείκτη αμύλου (σημείο 3.9) και ολοκληρώστε την τιτλοδότηση.

Πραγματοποιήστε την ίδια τιτλοδότηση σε επακριβώς μετρηθέν μείγμα από 25 ml αντιδραστηρίου κατά Luff-Schoorl (σημείο 3.4) και 25 ml νερού, αφού έχετε προσθέσει 10 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (σημείο 3.6) και 25 ml θειικού οξέος (σημείο 3.7), χωρίς να φέρετε σε βρασμό.

6.   Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Υπολογίστε με τη βοήθεια του πίνακα την ποσότητα της λακτόζης σε mg που αντιστοιχεί στη διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο τιτλοδοτήσεων, εκφράστε σε ml θειοθειικού νατρίου 0,1 mol/litre.

Εκφράστε το αποτέλεσμα της άνυδρης λακτόζης σε ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος.

7.   Παρατήρηση

1.

Για τα προϊόντα που περιέχουν περισσότερο από 40 % ζυμώσιμα σάκχαρα χρησιμοποιήστε περισσότερο από 5 ml εναιωρήματος μαγιάς (σημείο 3.1).

2.

Στις ζωοτροφές «με μειωμένη λακτόζη» (π.χ. γάλα για γάτες), η λακτόζη μετατρέπεται σε φρουκτόζη, η οποία δεν έχει υποστεί πλήρη ζύμωση εντός 2 ωρών με αποτέλεσμα υψηλότερα ή ψευδώς θετικά αποτελέσματα (καθώς παραμένουν υπολείμματα φρουκτόζης στο εκχύλισμα). Πίνακας τιμών για 25 ml αντιδραστηρίου κατά Luff-Schoorl ml Na2 S2 O3 0,1 mol/litre, δύο λεπτά θέρμανση, δέκα λεπτά βρασμός Na2 S2 O3 0,1 mol/litre Γλυκόζη, φρουκτόζη ιμβερτοποιημένα σάκχαρα C6 H12 O6 Λακτόζη C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg διαφορά mg διαφορά ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

ΙΑ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΜΥΛΟΥ

ΠΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ

1.   Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η παρούσα μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε άμυλο και σε προϊόντα διάσπασης των υψηλών μοριακών βαρών αμύλου των ζωοτροφών με στόχο τον έλεγχο συμμόρφωσης προς τη δηλούμενη ενεργειακή αξία (βλέπε διατάξεις του παραρτήματος VII) και προς τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 767/2009.

Η μέθοδος αυτή πρέπει να χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε άμυλο προς χρήση στον υπολογισμό της ενεργειακής αξίας της ζωοτροφής.

Σε περίπτωση που η περιεκτικότητα σε άμυλο πρέπει να προσδιοριστεί για άλλους σκοπούς, μπορούν να εφαρμοστούν και άλλες μέθοδοι ανάλυσης.

2.   Αρχή

Η μέθοδος περιλαμβάνει δύο προσδιορισμούς. Κατά τον πρώτο, το δείγμα υφίσταται επεξεργασία με αραιωμένο υδροχλωρικό οξύ. Ύστερα από διαύγαση και διήθηση, μετριέται η οπτική στροφική ικανότητα του διαλύματος με πολωσιμετρία.

Κατά τον δεύτερο, το δείγμα εκχυλίζεται με αιθανόλη 40 %. Κατόπιν οξύνισης του διηθήματος με τη χρήση υδροχλωρικού οξέος, διαύγασης και διήθησης, μετράται η οπτική στροφική ικανότητα υπό τις ίδιες συνθήκες όπως και στον πρώτο προσδιορισμό.

Η διαφορά μεταξύ των δύο μετρήσεων πολλαπλασιαζόμενη επί έναν γνωστό συντελεστή δίδει την περιεκτικότητα του δείγματος σε άμυλο.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Υδροχλωρικό οξύ, διάλυμα 25 % (κ.β.) πυκνότητα: 1,126 g/ml.

3.2.

Υδροχλωρικό οξύ, διάλυμα 1,13 % (κ.ό.) Η συμπύκνωση πρέπει να ελέγχεται με ογκομετρική τιτλοδότηση, με τη χρήση διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 0,1 Ν παρουσία ερυθρού του μεθυλίου 0,1 % (κ.ό.) σε αιθανόλη 94 % (κατ’ όγκο). Για την εξουδετέρωση των 10 ml, απαιτούνται 30,94 ml NaOH συγκέντρωσης 0,1 mol/litre.

3.3.

Διάλυμα Carrez Ι: Διαλύονται σε νερό 21,9 g οξεικού ψευδαργύρου Zn(CH3COO)2 2H2O και 3 g κρυσταλλικού οξεικού οξέος. Συμπληρώνεται με νερό έως 100 ml.

3.4.

Διάλυμα Carrez ΙΙ: διαλύονται σε νερό 10,6 g σιδηροκυανιούχου καλίου, K4 Fe(CN)6 3H2O. Συμπληρώνεται με νερό έως 100 ml.

3.5.

Αιθανόλη 40 % (κατ’ όγκο), πυκνότητα: 0,948 g/ml στους 20 °C.

4.   Όργανα

4.1.

Κωνική φιάλη (Erlenmeyer) 250 ml με σύνηθες εσμυρισμένο πώμα συνδεδεμένη με κάθετο ψυκτήρα.

4.2.

Πολωσίμετρο ή σακχαρόμετρο.

5.   Διαδικασία

5.1.   Προετοιμασία του δείγματος

Κονιοποιείται το δείγμα έτσι ώστε να διέρχεται όλη η ποσότητα αυτού διαμέσου κοσκίνου στρογγυλών οπών διαμέτρου 0,5 mm.

5.2.   Προσδιορισμός της συνολικής οπτικής στροφικής ικανότητος (Ρ ή S) (βλέπε παρατήρηση στο σημείο 7.1)

Ζυγίζονται 2,5 g κονιοποιημένου δείγματος με προσέγγιση 1 mg και εισάγονται εντός ογκομετρικής φιάλης των 100 ml. Προστίθενται 25 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.2), ανακινούνται προς επίτευξη καλής κατανομής της ποσότητας του δείγματος και προστίθενται εκ νέου άλλα 25 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.2). Η φιάλη εμβαπτίζεται εντός ζέοντος υδρόλουτρου και κατά τη διάρκεια των πρώτων επομένων 3 λεπτών ανακινείται έντονα και σταθερά προς αποφυγή σχηματισμού συσσωματώσεων. Η ποσότητα του νερού στο υδρόλουτρο πρέπει να είναι επαρκής για να επιτρέπει τη διατήρηση του λουτρού στο σημείο βρασμού κατά το χρονικό διάστημα της παραμονής της φιάλης εντός αυτού. Η φιάλη δεν πρέπει να εξέρχεται του λουτρού κατά τη διάρκεια της ανακίνησης. Μετά πάροδο 15 λεπτών ακριβώς εξάγεται η φιάλη από το λουτρό, προστίθενται 30 ml ψυχρού νερού και ψύχεται αμέσως σε 20 °C.

Προστίθενται 5 ml διαλύματος Carrez Ι (σημείο 3.3) και ανακινείται επί 30 δευτερόλεπτα περίπου. Προστίθενται ακολούθως 5 ml διαλύματος Carrez ΙΙ (σημείο 3.4) και ανακινείται εκ νέου επί 30 δευτερόλεπτα περίπου. Συμπληρώνεται ο όγκος της φιάλης με νερό, ομοιογενοποιείται και διηθείται. Εάν το διήθημα δεν είναι πλήρως διαυγές (σπάνια περίπτωση), ο προσδιορισμός επαναλαμβάνεται με τη χρησιμοποίηση μεγαλυτέρων ποσοτήτων διαλυμάτων Carrez Ι και ΙΙ, επί παραδείγματι 10 ml.

Μετράται ακολούθως η οπτική στροφική ικανότητα του διαλύματος εντός σωλήνα 200 mm με πολωσίμετρο ή σακχαρόμετρο.

5.3.   Προσδιορισμός της οπτικής στροφικής ικανότητος (Ρ ή S) των διαλυτών προσμίξεων σε αιθανόλη 40 %

Ζυγίζονται 5 g δείγματος με προσέγγιση 1 mg, εισάγονται εντός ογκομετρικής φιάλης των 100 ml και προστίθενται 80 ml περίπου αιθανόλης (σημείο 3.5) (βλέπε παρατήρηση στο σημείο 7.2). Αφήνεται η φιάλη σε ηρεμία επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια του χρονικού αυτού διαστήματος ανακινείται έντονα έξι φορές κατά τέτοιο τρόπο ώστε η ποσότητα του δείγματος να αναμιχθεί καλά με την αιθανόλη. Συμπληρώνεται ακολούθως ο όγκος με αιθανόλη (σημείο 3.5), ομοιογενοποιείται και διηθείται.

Εισάγονται με σιφώνιο 50 ml του διηθήματος (αντιστοιχούν σε 2,5 g δείγματος) εντός της κωνικής φιάλης των 250 ml, προστίθενται 2,1 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.1) και ανακινείται έντονα. Προσαρμόζεται κάθετος ψυκτήρας στην κωνική φιάλη και βυθίζεται αύτη εντός ζέοντος υδρολούτρου. Μετά 15 λεπτά ακριβώς εξάγεται η κωνική φιάλη από το υδρόλουτρο, μεταγγίζεται το περιεχόμενο αυτής εντός ογκομετρικής φιάλης των 100 ml εκπλύνοντας με ελαφρώς ψυχρό νερό και ψύχεται μέχρι 20 °C.

Διαυγάζεται ακολούθως με τη χρήση των διαλυμάτων Carrez Ι (σημείο 3.3) και ΙΙ (σημείο 3.4), συμπληρώνεται ο όγκος με νερό, ομοιογενοποιείται, διηθείται και μετριέται η οπτική στροφική ικανότητα όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.2, δεύτερη και τρίτη παράγραφος.

6.   Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Η επί τοις εκατό περιεκτικότητα του δείγματος σε άμυλο υπολογίζεται ως ακολούθως:

6.1.   Μετρήσεις διενεργούμενες με πολωσίμετρο

P	=	συνολική στροφική ικανότητα σε μοίρες
P’	=	οπτική στροφική ικανότητα σε μοίρες των ουσιών που διαλύονται σε αιθανόλη 40 % (κατ’ όγκο)
	=	η ειδική οπτική στροφική ικανότητα καθαρού αμύλου. Οι συμβατικώς αποδεκτές τιμές του συντελεστή αυτού είναι οι κάτωθι:

+ 185,9°	:	άμυλο ορύζης
+ 185,7°	:	άμυλο γεωμήλων
+ 184,6°	:	άμυλο αραβοσίτου
+ 182,7	:	άμυλο σίτου
+ 181,5°	:	άμυλο κριθής
+ 181,3°	:	άμυλο βρώμης
+ 184,0	:	άλλοι τύποι και μείγματα αμύλου των σύνθετων ζωοτροφών

6.2.   Μετρήσεις διενεργούμενες με σακχαρόμετρο

S	=	συνολική οπτική στροφική ικανότητα σε σακχαρομετρικούς βαθμούς
S’	=	οπτική στροφική ικανότητα σε σακχαρομετρικούς βαθμούς των ουσιών που διαλύονται, σε αιθανόλη 40 % (ο/ο)
N	=	βάρος σε g σακχαρόζης εντός 100 ml νερού που παρέχουν οπτική στροφική ικανότητα 100 σακχαρομετρικών βαθμών εντός σωλήνος 200 mm 16,29 g για γαλλικά σακχαρόμετρα 26,00 g για γερμανικά σακχαρόμετρα 20,00 g για μεικτά σακχαρόμετρα
	=	ειδική οπτική στροφική ικανότητα καθαρού αμύλου (βλέπε σημείο 6.1)

6.3.   Επαναληψιμότητα

Η διαφορά των αποτελεσμάτων των δύο παράλληλα διενεργουμένων προσδιορισμών του ίδιου δείγματος δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,4 σε απόλυτη τιμή για περιεκτικότητα αμύλου μικρότερη του 40 % και 1 % σε σχετική τιμή για περιεκτικότητα αμύλου ίση ή μεγαλύτερη του 40 %.

7.   Παρατηρήσεις

7.1.

Εάν το δείγμα περιέχει ανθρακικά άλατα πλέον του 6 % εκφρασμένα σε ανθρακικά άλατα ασβεστίου, πρέπει αυτά να εξουδετερωθούν με τη χρήση της απαιτουμένης ακριβούς ποσότητας αραιωμένου θειικού οξέος, πριν από τον προσδιορισμό της συνολικής οπτικής στροφικής ικανότητας.

7.2.

Στην περίπτωση προϊόντων με υψηλή περιεκτικότητα σε λακτόζη, όπως η σκόνη ορού γάλακτος ή το αποβουτυρωμένο γάλα, διενεργούνται τα ακόλουθα, κατόπιν προσθήκης 80 ml αιθανόλης (σημείο 3.5). Προσαρμόζεται κάθετος ψυκτήρας στη φιάλη, εμβαπτίζεται η φιάλη σε υδατόλουτρο 50 C επί 30 λεπτά. Αφήνεται ακολούθως να ψυχθεί και συνεχίζεται η ανάλυση όπως υποδεικνύεται ανωτέρω στο σημείο 5.3.

7.3.

Οι ακόλουθες πρώτες ύλες ζωοτροφών, σε περίπτωση παρουσίας τους σε σημαντική ποσότητα στις ζωοτροφές, είναι γνωστό ότι προκαλούν παράσιτα κατά τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε άμυλο με την πολωσιμετρική μέθοδο και, ως εκ τούτου, ενδέχεται να προκύψουν εσφαλμένα αποτελέσματα: — προϊόντα ζαχαροτεύτλων όπως πούλπα ζαχαροτεύτλων, μελάσα ζαχαροτεύτλων, μελασωμένη πούλπα ζαχαροτεύτλων, βινάσα ζαχαροτεύτλων, ζάχαρη ζαχαροτεύτλων· — πούλπα εσπεριδοειδών· — λιναρόσπορος· πλακούντες έκθλιψης λιναρόσπορου· πλακούντες εκχυλισμένου λιναρόσπορου, — σπόροι κράμβης· πλακούντες έκθλιψης κραμβόσπορων πλακούντες εκχυλισμένων κραμβόσπορων· φλοιοί κραμβόσπορων, — ηλιανθόσπορος· πλακούντες εκχυλισμένου ηλιανθόσπορου· πλακούντες εκχυλισμένου μερικώς αποφλοιωμένου ηλιανθόσπορου, — πλακούντες έκθλιψης φοινικοκαρυάς, πλακούντες εκχυλισμένης φοινικοκαρυάς, — πούλπα γεωμήλων, — αφυδατωμένη μαγιά, — προϊόντα πλούσια σε ινουλίνη (π.χ. κατάλοιπα επεξεργασίας και άλευρα κολοκασίου), — υπολείμματα ζωικού λίπους. — προϊόντα σόγιας Στις περιπτώσεις αυτές μπορεί να εφαρμοστεί η μέθοδος ανάλυσης που προβλέπεται στον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 121/2008 της Επιτροπής (7). Η μέθοδος αυτή μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για ζωοτροφές που περιέχουν λιγότερο από 1 % άμυλο.

ΙΒ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΗΣ ΤΕΦΡΑΣ

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των ζωοτροφών σε ακατέργαστη τέφρα.

2.   Αρχή

Το δείγμα αποτεφρώνεται στους 550 °C. Το υπόλειμμα ζυγίζεται.

3.   Αντιδραστήρια

Διάλυμα 20 % (κ.β.) νιτρικού αμμωνίου.

4.   Όργανα

4.1.

Θερμαντική πλάκα.

4.2.

Ηλεκτρική κάμινος με θερμοστάτη.

4.3.

Κάψες αποτέφρωσης από πυρίτιο, πορσελάνη ή πλατίνα, παραλληλεπίπεδες (περίπου 60 × 40 × 25 mm) ή στρογγυλές (διαμέτρου: 60 έως 75 mm, ύψους: 20 έως 40 mm).

5.   Διαδικασία

Ζυγίζονται 5 g περίπου δείγματος με προσέγγιση 1 mg (2,5 g για προϊόντα που έχουν τάση διόγκωσης) εντός κάψας αποτέφρωσης πριν από τη θέρμανση στους 550 C, την ψύξη και προζύγισμά της. Τοποθετείται η κάψα επί θερμαντικής πλάκας και θερμαίνεται προοδευτικά μέχρι την ανθρακοποίηση της ύλης. Ακολουθεί αποτέφρωση σύμφωνα με το σημείο 5.1. ή 5.2.

5.1.

Εισάγεται η κάψα εντός της ηλεκτρικής καμίνου ρυθμισμένης στους 550 °C. Διατηρείται στη θερμοκρασία αυτή μέχρι τη λήψη λευκής, ανοικτού γκρίζου ή ροδόχρου τέφρας, καταφανώς απαλλαγμένης από ανθρακώδη σωματίδια. Η κάψα φέρεται εντός ξηραντήρα, αφήνεται να ψυχθεί και ζυγίζεται αμέσως.

5.2.

Εισάγεται η κάψα εντός της ηλεκτρικής καμίνου ρυθμισμένης στους 550 °C. Αποτεφρώνεται για 3 ώρες. Η κάψα φέρεται εντός ξηραντήρα, αφήνεται να ψυχθεί και ζυγίζεται αμέσως. Αποτεφρώνεται εκ νέου για 30 λεπτά ώστε να εξασφαλιστεί ότι το βάρος της τέφρας παραμένει σταθερό (η απώλεια βάρους μεταξύ δύο διαδοχικών ζυγισμάτων πρέπει να είναι μικρότερη ή ίση από 1 mg).

6.   Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Υπολογίστε το βάρος του υπολείμματος με αφαίρεση του απόβαρου.

Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος.

7.   Παρατηρήσεις

7.1.

Η τέφρα των υλών που αποτεφρώνονται δύσκολα πρέπει να υπόκειται σε πρώτη αποτέφρωση επί τρεις ώρες τουλάχιστον, να ψύχεται και να προστίθενται σε αυτήν μερικές σταγόνες διαλύματος 20 % νιτρικού αμμωνίου ή νερού (προσεκτικά, προς αποφυγή διασποράς ή συγκόλλησης των σωματιδίων της τέφρας) Συνεχίζεται η αποτέφρωση κατόπιν ξήρανσης σε κλίβανο. Επαναλαμβάνεται ενδεχομένως η εργασία μέχρι την πλήρη αποτέφρωση.

7.2.

Για ύλες ανθεκτικές στην κατεργασία η οποία υποδεικνύεται στο σημείο 7.1, διενεργούνται τα κάτωθι: κατόπιν αποτέφρωσης επί τρεις ώρες παραλαμβάνεται η τέφρα με θερμό νερό και διηθείται με μικρό ηθμό ελεύθερου τέφρας. Αποτεφρώνεται ο ηθμός και το περιεχόμενο αυτού εντός της αρχικής κάψας. Το διήθημα φέρεται εντός της ψυχθείσας κάψας, εξατμίζεται μέχρι ξηρού, αποτεφρώνεται και ζυγίζεται.

7.3.

Στην περίπτωση των ελαίων και των λιπών, ζυγίζεται με ακρίβεια ποσότητα δείγματος 25 g εντός κάψας ενδεδειγμένης χωρητικότητας. Ανθρακοποιείται με ανάφλεξη της ύλης μέσω ταινίας διηθητικού χάρτου ελεύθερου τέφρας. Μετά από την καύση, υγραίνεται με τη μικρότερη απαραίτητη ποσότητα νερού. Ξηραίνεται και αποτεφρώνεται όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.

ΙΓ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΕΦΡΑΣ ΑΔΙΑΛΥΤΗΣ ΣΤΟ ΥΔΡΟΧΛΩΡΙΚΟ ΟΞΥ

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό σε ανόργανες ύλες, αδιάλυτες στο υδροχλωρικό οξύ, των ζωοτροφών. Δύο μέθοδοι προβλέπονται ανάλογα με τη φύση του δείγματος.

1.1.

Μέθοδος Α: εφαρμόσιμη στις απλές οργανικές ζωοτροφές και στις περισσότερες από τις σύνθετες ζωοτροφές.

1.2.

Μέθοδος Β: εφαρμόσιμη στις ανόργανες ενώσεις και μείγματα καθώς και στις σύνθετες ζωοτροφές των οποίων η περιεκτικότητα σε αδιάλυτα στο υδροχλωρικό οξύ, προσδιοριζόμενη κατά τη μέθοδο Α, είναι ανώτερη από 1 %.

2.   Αρχή

2.1.

Μέθοδος A: το δείγμα απανθρακώνεται, γίνεται κατεργασία της τέφρας, εν βρασμώ με υδροχλωρικό οξύ και το αδιάλυτο υπόλειμμα διηθείται και ζυγίζεται.

2.2.

Μέθοδος B: γίνεται κατεργασία του δείγματος με υδροχλωρικό οξύ. Το διάλυμα διηθείται, το υπόλειμμα απανθρακώνεται και γίνεται κατεργασία της λαμβανομένης τέφρας όπως στη μέθοδο Α.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Υδροχλωρικό οξύ 3 mol/litre.

3.2.

Διάλυμα 20 % (κατ’ όγκο) τριχλωροξικού οξέος.

3.3.

Διάλυμα 1 % (κατ’ όγκο) τριχλωροξικού οξέος.

4.   Όργανα

4.1.

Θερμαινόμενη πλάκα.

4.2.

Ηλεκτρική κάμινος με θερμοστάτη.

4.3.

Κάψες αποτέφρωσης από πυρίτιο, πορσελάνη ή πλατίνα παραλληλεπίπεδες (περίπου 60 × 40 × 25 mm) ή κυκλικές (διαμέτρου: 60 έως 75 mm, ύψους: 20 έως 40 mm).

4.4.

Φίλτρα ελεύθερα τέφρας

5.   Διαδικασία

5.1.   Μέθοδος A:

Αποτεφρώστε την ποσότητα δοκιμής σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται για τον προσδιορισμό της ακατέργαστης τέφρας. Επίσης μπορείτε να χρησιμοποιήσετε την τέφρα που πήρατε από αυτόν τον προσδιορισμό.

Τοποθετήστε την τέφρα μέσα σε ποτήρι των 250 έως 400 ml με τη βοήθεια 75 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.1). Φέρτε προσεκτικά το υγρό σε ήπιο βρασμό και διατηρήστε τον επί 15 λεπτά. Διηθήστε το θερμό διάλυμα πάνω σε διηθητικό χαρτί απαλλαγμένο από τέφρα και πλύντε το υπόλειμμα με θερμό νερό μέχρι την εξαφάνιση της όξινης αντίδρασης. Ξηράνατε τον ηθμό που περιέχει το υπόλειμμα και αποτεφρώστε σε προζυγισμένη κάψα σε θερμοκρασία 550 °C τουλάχιστον και 700 °C κατ’ ανώτατο όριο. Αφήστε προς ψύξη σε ξηραντήρα και ζυγίστε.

5.2.   Μέθοδος Β

Ζυγίστε, με προσέγγιση 1 mg, 5 g δείγματος και τοποθετήστε τα σε ποτήρι των 250 έως 400 ml. Προσθέστε διαδοχικά 25 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.1), αναμείξτε και περιμένετε να τελειώσει ο αναβρασμός. Προσθέστε ακόμη 50 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.1). Περιμένετε το τέλος μιας ενδεχόμενης έκλυσης αερίου, τοποθετήστε εν συνεχεία το ποτήρι μέσα σε ζέον υδατόλουτρο και διατηρήστε το εκεί επί 30 λεπτά ή περισσότερο, αν χρειάζεται, προκειμένου να υδρολυθεί πλήρως το άμυλο που ενδεχομένως υπάρχει. Διηθήστε εν θερμώ επί ηθμού απαλλαγμένου τέφρας και πλύντε τον ηθμό με τη βοήθεια 50 ml θερμού νερού (βλέπε παρατήρηση στο σημείο 7). Τοποθετήστε τον ηθμό που περιέχει το υπόλειμμα μέσα σε κάψα αποτέφρωσης, ξηράνατε και αποτεφρώστε σε θερμοκρασία 550 °C τουλάχιστον και 700 °C κατ’ ανώτατο όριο.Τοποθετήστε την τέφρα μέσα σε ποτήρι των 250 έως 400 ml με τη βοήθεια 75 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.1)·ακολουθήστε τα υποδεικνυόμενα στο σημείο 5.1, δεύτερο εδάφιο.

6.   Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Υπολογίστε το βάρος του υπολείμματος αφαιρώντας το απόβαρο. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε ποσοστό επί τοις εκατό του δείγματος.

7.   Παρατήρηση

Εάν η διήθηση αποδεικνύεται δύσκολη, επαναλάβετε τον προσδιορισμό αντικαθιστώντας τα 50 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.1) με 50 ml τριχλωροξικού οξέος 20 % (σημείο 3.2) και εκπλένοντας τον ηθμό με τη βοήθεια θερμού διαλύματος τριχλωροξικού οξέος 1 % (σημείο 3.3).

ΙΔ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΟΥ ΦΩΣΦΟΡΙΚΟΥ

Η περιεκτικότητα σε ολικού φωσφόρου προσδιορίζεται με

—	τη μέθοδο ανάλυσης που προβλέπεται στο πρότυπο EN 15510 Ζωοτροφές: Μέθοδοι δειγματοληψίας και ανάλυσης — Προσδιορισμός του ασβεστίου, νατρίου, φωσφόρου, μαγνησίου, καλίου, σιδήρου, ψευδαργύρου, χαλκού, μαγγανίου, κοβαλτίου, μολυβδαινίου, αρσενικού και μολύβδου με ICP-AES, ή

—	τη μέθοδο ανάλυσης που προβλέπεται στο πρότυπο EN 15621 Ζωοτροφές: Μέθοδοι δειγματοληψίας και ανάλυσης — Προσδιορισμός του ασβεστίου, νατρίου, φωσφόρου, μαγνησίου, καλίου, θείου, σιδήρου, ψευδαργύρου, χαλκού, μαγγανίου, και κοβαλτίου μετά από χώνευση υπό πίεση με ICP-AES, ή

—	τη φωτομετρική μέθοδος όπως περιγράφεται κατωτέρω.

ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των ζωοτροφών σε ολικό φωσφόρο. Ενδείκνυται ιδιαιτέρως για την ανάλυση προϊόντων πτωχών σε φωσφόρο. Σε ορισμένες περιπτώσεις (προϊόντα πλούσια σε φωσφόρο) μπορεί να εφαρμοσθεί μέθοδος σταθμικής ανάλυσης.

2.   Αρχή

Το δείγμα μεταλλοποιείται, είτε διά της ξηράς οδού (ξηρής καύσης) (στην περίπτωση των οργανικών τροφών), είτε διά της υγράς οδού (στην περίπτωση των μεταλλικών ενώσεων και των ρευστών τροφών) και φέρεται σε όξινο διάλυμα. Το διάλυμα υποβάλλεται σε κατεργασία με μολυβδοβαναδικό αντιδραστήριο. Η οπτική πυκνότητα του κίτρινου διαλύματος που σχηματίζεται μετράται με φασματοφωτόμετρο σε 430 nm.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Ανθρακικό ασβέστιο.

3.2.

Υδροχλωρικό οξύ, ρ20 = 1,10 g/ml (περίπου 6 mol/litre).

3.3.

Νιτρικό οξύ, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.

Νιτρικό οξύ, ρ20 = 1,38 έως 1,42 g/ml.

3.5.

Θειικό οξύ, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.

Μολυβδοβαναδικό αντιδραστήριο: Αναμειγνύονται 200 ml διαλύματος επταμολυβδαινικού αμμωνίου (σημείο 3.6.1), 200 ml διαλύματος μονοβαναδικού αμμωνίου (σημείο 3.6.2) και 134 ml νιτρικού οξέος (σημείο 3.4) εντός ογκομετρικής φιάλης ενός λίτρου. Ο όγκος συμπληρώνεται με νερό.

3.6.1.

Διάλυμα επταμολυβδαινικού αμμωνίου: Σε θερμό νερό διαλύονται 100 g επταμολυβδαινικού αμμωνίου (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Προστίθενται 10 ml αμμωνίας (πυκνότητας 0,91 g/ml) και ο όγκος συμπληρώνεται με νερό μέχρι ενός λίτρου.

3.6.2.

Διάλυμα μονοβαναδικού αμμωνίου: Διαλύονται εντός 400 ml θερμού νερού 2,35 g μονοβαναδικού αμμωνίου NH4VO3. Προστίθενται βραδέως και με ανακίνηση 20 ml αραιού νιτρικού οξέος [7 ml HNO3 (σημείο 3.4) + 13 ml HO] και ο όγκος συμπληρώνεται με H2O μέχρι ενός λίτρου.

3.7.

Πρότυπο διάλυμα ενός (1) mg φωσφόρου ανά ml: Διαλύεται εντός νερού ποσότητα 4,387 g δισοξίνου φωσφορικού καλίου KH2PO4. Ο όγκος συμπληρώνεται με νερό μέχρι ενός λίτρου.

4.   Όργανα

4.1.

Χωνευτήρια αποτέφρωσης από πυρίτιο, πορσελάνη ή πλατίνα.

4.2.

Ηλεκτρική κάμινος με διαμερίσματα εφοδιασμένη με θερμοστάτη ρυθμισμένο στους 550 °C.

4.3.

Φιάλη Kjeldahl των 250 ml.

4.4.

Ογκομετρικές φιάλες και σιφώνια ακριβείας.

4.5.

Φασματοφωτόμετρο.

4.6.

Δοκιμαστικοί σωλήνες διαμέτρου 16 mm περίπου με σμυριδωμένα στόμια διαμέτρου 14,5 mm·χωρητικότητα: 25 έως 30 ml.

5.   Διαδικασία

5.1.   Παρασκευή του διαλύματος

Ανάλογα με τη φύση του δείγματος, παρασκευάζεται διάλυμα όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1.1 ή 5.1.2.

5.1.1.   Συνήθης διαδικασία

Ζυγίζεται ένα 1 g ή περισσότερο δείγματος με προσέγγιση 1 mg. Η ποσότητα του δείγματος εισάγεται εντός φιάλης Kjeldahl, προστίθεται ποσότητα 20 ml θειικού οξέος (σημείο 3.5), ανακινείται προς πλήρη διαποτισμό των υλών με το οξύ και προς αποφυγή επικάθισης αυτών των υλών επί των πλευρών της φιάλης, θερμαίνεται και διατηρείται επί 10 λεπτά σε κατάσταση βρασμού. Αφήνεται να ψυχθεί ελαφρώς, προστίθενται 2 ml νιτρικού οξέος (σημείο 3.4), θερμαίνεται ηπίως, αφήνεται να ψυχθεί ελαφρώς, προστίθεται εκ νέου λίγο νιτρικό οξύ (σημείο 3.4) και θερμαίνεται μέχρι βρασμού. Επαναλαμβάνονται οι ίδιες ενέργειες μέχρι την επίτευξη αχρώμου διαλύματος. Ψύχεται, προστίθεται λίγο νερό, μεταγγίζεται το υγρό εντός ογκομετρικής φιάλης των 500 ml, εκπλύνοντας τη φιάλη Kjeldahl με θερμό νερό. Αφήνεται να ψυχθεί, ο όγκος συμπληρώνεται με νερό, ομοιογενοποιείται και διηθείται.

5.1.2.   Δείγματα που περιέχουν οργανικές ύλες και ελεύθερα δισόξινου φωσφορικού ασβεστίου και μαγνησίου

Ζυγίζονται 2,5 g περίπου δείγματος, με προσέγγιση 1 mg, εντός χωνευτηρίου αποτέφρωσης. Η ποσότητα του δείγματος αναμειγνύεται μέχρι την πλήρη ανάμειξη ενός 1 g ανθρακικού ασβεστίου (σημείο 3.1). Ασβεστοποιείται εντός της καμίνου στους 550 C μέχρι την επίτευξη λευκής ή φαιάς τέφρας (μικρή ποσότητα άνθρακος δεν εμπνέει ανησυχία). Μεταγγίζεται η τέφρα εντός γυάλινου ποτηριού ζέσεως των 250 ml. Προστίθενται 20 ml νερού και υδροχλωρικό οξύ (σημείο 3.2) μέχρι την παύση του αφρισμού. Προστίθενται ακολούθως άλλα 10 ml υδροχλωρικού οξέος (σημείο 3.2). Φέρεται το γυάλινο ποτήρι ζέσεως σε αμμόλουτρο και εξατμίζεται μέχρι ξήρανσης προς αδιαλυτοποίηση του χαλαζία. Επαναδιαλύεται το υπόλειμμα με 10 ml νιτρικού οξέος (σημείο 3.3) και βράζεται επί του αμμόλουτρου ή της θερμαινόμενης πλάκας επί 5 λεπτά, χωρίς εξάτμιση μέχρι την ξήρανση. Μεταγγίζεται το υγρό εντός ογκομετρικής φιάλης των 500 ml, εκπλύνοντας το γυάλινο ποτήρι ζέσεως πολλές φορές με θερμό νερό. Αφήνεται να ψυχθεί, ο όγκος συμπληρώνεται με νερό, ομοιογενοποιείται και διηθείται.

5.2.   Ανάπτυξη του χρωματισμού και μέτρηση της οπτικής πυκνότητας

Μέρος της ποσότητας του διηθήματος που προέκυψε βάσει του σημείου 5.1.1 ή 5.1.2 αραιώνεται προς επίτευξη συγκέντρωσης φωσφόρου μέχρι 40 mg/ml κατ’ ανώτατο όριο. Εισάγονται 10 ml του διαλύματος εντός δοκιμαστικού σωλήνα (σημείο 4.6) και προστίθενται 10 ml του μολυβδοβαναδικού αντιδραστηρίου (σημείο 3.6). Ομοιογενοποιείται και αφήνεται σε ηρεμία επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία τουλάχιστον 20 °C. Η οπτική πυκνότητα μετράται με το φασματοφωτόμετρο σε 430 mm μέσω σύγκρισης με το διάλυμα που προκύπτει διά της προσθήκης 10 ml μολυβδοβαναδικού αντιδραστηρίου (σημείο 3.6) σε 10 ml νερού.

5.3.   Καμπύλη βαθμονόμησης

Βάσει του πρότυπου διαλύματος (σημείο 3.7) παρασκευάζονται διαλύματα που περιέχουν αντιστοίχως 5, 10, 20, 30 και 40 μg φωσφόρου ανά ml. Λαμβάνονται 10 ml από κάθε ένα εκ των διαλυμάτων αυτών στα οποία προστίθενται 10 ml μολυβδοβαναδικού αντιδραστηρίου (σημείο 3.6). Ομοιογενοποιούνται και αφήνονται σε ηρεμία επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία τουλάχιστον 20 °C. Μετράται η οπτική πυκνότητα υπό τις συνθήκες που καθορίζονται στο σημείο 5.2. Η καμπύλη βαθμονόμησης διαμορφώνεται χαράσσοντας τη γραμμή των σημείων τομής των τιμών οπτικής πυκνότητας και των αντίστοιχων ποσοτήτων φωσφόρου. Για συγκεντρώσεις που κυμαίνονται μεταξύ 0 και 40 μg/ml η καμπύλη είναι γραμμική.

6.   Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Προσδιορίζεται η ποσότητα φωσφόρου εντός της ποσότητας δείγματος μέσω αναφοράς στην καμπύλη βαθμονόμησης.

Το αποτέλεσμα εκφράζεται επί τοις εκατό του δείγματος.

Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο παράλληλα πραγματοποιούμενων προσδιορισμών επί του ίδιου δείγματος δεν πρέπει να υπερβαίνει:

—	το 3 % σε σχετική τιμή για περιεκτικότητες σε φωσφόρο μικρότερες του 5 %,

—	το 0,15 % σε απόλυτη τιμή για περιεκτικότητες σε φώσφορο ίσες ή μεγαλύτερες του 5 %.

ΙΕ.   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΧΛΩΡΙΟΥ ΤΩΝ ΧΛΩΡΙΟΥΧΩΝ

1.   Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό του χλωρίου των χλωριούχων των διαλυτών στο νερό, συμβατικά εκπεφρασμένου σε χλωριούχο νάτριο. Είναι εφαρμόσιμη σε όλες τις ζωοτροφές.

2.   Αρχή

Τα χλωριούχα διαλύονται στο νερό. Εάν το προϊόν περιέχει οργανικές ουσίες προβείτε σε αποστράγγιση. Το διάλυμα οξυνίζεται ελαφρά με νιτρικό οξύ και τα χλωριούχα καταβυθίζονται ως χλωριούχος άργυρος με τη βοήθεια διαλύματος νιτρικού αργύρου. Η περίσσεια νιτρικού αργύρου ογκομετρείται με ένα διάλυμα θειοκυανιούχου αμμωνίου, κατά τη μέθοδο Volhard.

3.   Αντιδραστήρια

3.1.

Διάλυμα θειοκυανιούχου αμμωνίου 0,1 mol/litre.

3.2.

Διάλυμα νιτρικού αργύρου 0,1 mol/litre.

3.3.

Κεκορεσμένο διάλυμα θειικού σιδηροαμμωνίου (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.

Νιτρικό οξύ, πυκνότητα: 1,38 g/ml.

3.5.

Διαιθυλικός αιθέρας.

3.6.

Ακετόνη.

3.7.

Διάλυμα Carrez Ι: Διαλύονται σε νερό 21,9 g οξεικού ψευδαργύρου Zn(CH3COO)2 2H2O και 3 g κρυσταλλικού οξεικού οξέος. Φέρεται στα 100 ml με νερό.

3.8.

Διάλυμα Carrez ΙΙ: διαλύονται σε νερό 10,6 g σιδηροκυανιούχου καλίου K4Fe(CN)6 3H2O. Συμπληρώστε στα 100 ml με νερό.

3.9.

Ενεργός άνθρακας, απαλλαγμένος χλωριούχων και μη επιδεκτικός προσρόφησης χλωριούχων.

4.   Όργανα

Αναμείκτης (παλινδρομητής): περίπου 35 έως 40 στροφές ανά λεπτό.

5.   Διαδικασία

5.1.   Παρασκευή του διαλύματος

Ανάλογα με τη φύση του δείγματος, ετοιμάστε ένα διάλυμα όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1.1, 5.1.2 ή 5.1.3.

Πραγματοποιήστε παράλληλα απαλλαγμένο από το προς ανάλυση δείγμα.

5.1.1.   Δείγματα απαλλαγμένα οργανικής ύλης

Ζυγίστε, με ακρίβεια 1 mg, μια ποσότητα δοκιμής (όχι μεγαλύτερη των 10 g), που να μην περιέχει περισσότερο από 3 g χλωρίου σε μορφή χλωριούχων. Τοποθετήστε τη σε μια ογκομετρική φιάλη των 500 ml με 400 ml νερού θερμοκρασίας 20 °C περίπου.Αναμείξτε επί 30 λεπτά στον παλινδρομητή, συμπληρώστε μέχρι τη χαραγή, ομογενοποιήστε και διηθήστε.

5.1.2.   Δείγματα που περιέχουν οργανικές ύλες, εκτός των προϊόντων που αναφέρονται στο σημείο 5.1.3.

Ζυγίστε, με ακρίβεια 1 mg, 5 g περίπου δείγματος και τοποθετήστε τα μαζί με 1 g ενεργού άνθρακα σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml. Προσθέστε 400 ml νερού θερμοκρασίας 20 C περίπου και 5 ml διαλύματος Carrez I (σημείο 3.7), ανακινήστε για 30 δευτερόλεπτα και προσθέστε κατόπιν 5 ml διαλύματος Carrez II (σημείο 3.8). Αναμείξτε επί 30 λεπτά στον παλινδρομητή, συμπληρώστε μέχρι τη χαραγή, ομογενοποιήστε και διηθήστε.

5.1.3.   Ζωοτροφές ψημένες, πίττες και άλευρο λιναριού, προϊόντα πλούσια σε άλευρο λιναριού και άλλα προϊόντα πλούσια σε μυκυλιώματα ή σε κολλοειδείς ουσίες (π.χ. άμυλο σε μορφή δεξτρίνης)

Ετοιμάστε το διάλυμα όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1.2 αλλά μην διηθείτε. Αφήστε προς καταστάλαξη (εάν είναι απαραίτητο, φυγοκεντρήστε), παραλάβατε 100 ml από το υγρό που επιπλέει και εισαγάγετέ τα σε ογκομετρική φιάλη των 200 ml. Αναμείξτε με ακετόνη (σημείο 3.6) και συμπληρώστε μέχρι τη χαραγή με τον διαλύτη αυτόν, ομογενοποιήστε και διηθήστε.

5.2.   Ογκομέτρηση

Εισαγάγετε με προχοΐδα μέσα σε κωνική φιάλη 25 έως 100 ml από το διήθημα (ανάλογα με την αναμενόμενη περιεκτικότητα σε χλώριο) που πάρθηκε κατά τα σημεία 5.1.1, 5.1.2 ή 5.1.3. Η ποσότητα αυτή δεν πρέπει να περιέχει περισσότερο από 150 mg χλωρίου (Cl). Αραιώστε, αν είναι απαραίτητο, στα 50 ml τουλάχιστον με νερό, προσθέστε 5 ml νιτρικού οξέος (σημείο 3.4), 20 ml κεκορεσμένου διαλύματος θειϊκού σιδηροαμμωνίου (σημείο 3.3) και 2 σταγόνες διαλύματος θειοκυανιούχου αμμωνίου (σημείο 3.1), με προχοΐδα γεμάτη μέχρι τη χαραγή μηδέν. Μεταφέρτε εν συνεχεία με προχοΐδα το διάλυμα νιτρικού αργύρου (σημείο 3.2) έτσι ώστε να δημιουργηθεί περίσσεια των 5 ml. Προσθέστε 5 ml διαιθυλικού αιθέρα (σημείο 3.5) και ανακινήστε δυνατά ώστε το ίζημα να συσσωματωθεί. Ογκομετρήστε την περίσσεια του νιτρικού αργύρου με το διάλυμα του θειοκυανιούχου αμμωνίου (σημείο 3.1) μέχρις ότου η αλλαγή του χρώματος στο ερυθροκαστανό επιμένει επί ένα λεπτό.

6.   Υπολογισμός αποτελεσμάτων

Η ποσότητα του χλωρίου (X), εκφρασμένη σε χλωριούχο νάτριο επί τοις εκατό, δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:

όπου:

V1	=	ml διαλύματος νιτρικού αργύρου 0,1 mol/l που προστέθηκαν
V2	=	ml διαλύματος θειοκυανιούχου αμμωνίου 0,1 mol/l που χρησιμοποιήθηκαν κατά την ογκομέτρηση
m	=	g βάρους του δείγματος.

Εάν το τυφλό πείραμα υποδεικνύει κατανάλωση διαλύματος νιτρικού αργύρου 0,1 mol/l, αφαιρέστε αυτόν τον όγκο από τον όγκο (V1 – V2).

7.   Παρατηρήσεις

7.1.

Η ογκομέτρηση μπορεί επίσης να γίνει ποτενσιομετρικώς.

7.2.

Για προϊόντα πολύ πλούσια σε λιπαρές ύλες, προχωρήστε σε προηγούμενη απολίπανση με διαιθυλικό αιθέρα ή πετρελαϊκό αιθέρα.

7.3.

Για ιχθυάλευρα, η ογκομέτρηση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη μέθοδο Mohr.