„B.   BESTIMMUNG DES GEHALTS AN DIOXINEN (PCDD/PCDF) UND PCB

KAPITEL I

Probenahmeverfahren und Auswertung von Analyseergebnissen

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Proben für die amtliche Untersuchung des Gehalts an polychlorierten Dibenzo-p-dioxinen (PCDD), polychlorierte Dibenzofurane (PCDF) sowie dioxinähnlichen polychlorierten Biphenylen (PCB) (1) und nicht dioxinähnlichen PCB in Futtermitteln werden nach den in Anhang I beschriebenen Verfahren genommen. Hinsichtlich der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die in Futtermitteln gleichmäßig verteilt sind, gelten die quantitativen Anforderungen gemäß Anhang I Nummer 5.A. Die mit diesem Verfahren gewonnenen Sammelproben sind als repräsentativ für die betreffenden Partien oder Teilpartien anzusehen. Anhand der bei den Laborproben bestimmten Gehalte wird festgestellt, ob die in der Richtlinie 2002/32/EG festgesetzten Höchstgehalte eingehalten wurden.

Für die Zwecke dieses Teils des Anhangs V gelten die Begriffsbestimmungen in Anhang I der Entscheidung 2002/657/EG der Kommission vom 14. August 2002 zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen (2).

2.   Übereinstimmung der Partie bzw. Teilpartie mit den Höchstgehalten

2.1.   Für nicht dioxinähnliche PCB

Die Partie entspricht den Vorgaben, wenn das Ergebnis der Untersuchung den in der Richtlinie 2002/32/EG für nicht dioxinähnliche PCB festgelegten Höchstgehalt unter Berücksichtigung der Messunsicherheit nicht überschreitet.

Die Partie entspricht den Vorgaben nicht, wenn die durch eine zweite Untersuchung (3) bestätigte Obergrenze (4) des Untersuchungsergebnisses den in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalt unter Berücksichtigung der Messunsicherheit überschreitet.

Die Messunsicherheit wird auf eine der beiden folgenden Arten berücksichtigt:

—	durch Berechnung der erweiterten Unsicherheit unter Verwendung eines Erweiterungsfaktors von 2, was ein Vertrauensniveau von etwa 95 % ergibt. Eine Partie oder Teilpartie ist nicht konform, wenn der gemessene Wert minus U über dem Höchstgehalt liegt;

—	durch Bestimmung der Entscheidungsgrenze (CCα) gemäß Anhang I Nummer 3.1.2.5 der Richtlinie 2002/657/EG. Eine Partie oder eine Teilpartie ist nicht konform, wenn der gemessene Wert gleich CCα ist oder diesen Wert übersteigt.

Diese Auslegungsbestimmungen gelten für das Untersuchungsergebnis der für die amtliche Kontrolle entnommenen Probe. Im Falle einer Analyse für Rechtfertigungs- oder Referenzwecke gelten die einzelstaatlichen Bestimmungen.

2.2.   Für PCDD/F und dioxinähnliche PCB

Die Partie entspricht den Vorgaben, wenn das Ergebnis einer einzelnen Untersuchung,

—	durchgeführt mit einem Screening-Verfahren, dessen Falsch-negativ-Rate unter 5 % liegt, ergibt, dass der Wert den in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalt für PCDD/PCDF und für die Summe von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB nicht überschreitet;

—	durchgeführt mit einem Bestätigungsverfahren, den in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalt für PCDD/PCDF und für die Summe von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB unter Berücksichtigung der Messunsicherheit nicht überschreitet.

Für Screening-Assays ist ein Cut-off-Wert festzulegen, anhand dessen entschieden wird, ob die Probe den jeweils relevanten Gehalten für PCDD/PCDF bzw. die Summe von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB entspricht.

Die Partie entspricht den Vorgaben nicht, wenn die mittels eines Bestätigungsverfahrens ermittelte und durch eine zweite Untersuchung bestätigte Obergrenze (5) des Untersuchungsergebnisses den in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalt unter Berücksichtigung der Messunsicherheit überschreitet (6).

Die Messunsicherheit wird auf eine der beiden folgenden Arten berücksichtigt:

—

durch Berechnung der erweiterten Unsicherheit unter Verwendung eines Erweiterungsfaktors von 2, was ein Vertrauensniveau von etwa 95 % ergibt. Eine Partie oder Teilpartie ist nicht konform, wenn der gemessene Wert minus U über dem Höchstgehalt liegt. Bei einer getrennten Bestimmung des Gehalts an PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB ist die Summe der geschätzten erweiterten Messunsicherheit der getrennten Analyseergebnisse der PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB für die Berechnung der Summe der PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB zu verwenden;

—	durch Bestimmung der Entscheidungsgrenze (CCα) gemäß Anhang I Nummer 3.1.2.5 der Entscheidung 2002/657/EG. Eine Partie oder eine Teilpartie ist nicht konform, wenn der gemessene Wert gleich CCα ist oder diesen Wert übersteigt.

Diese Auslegungsbestimmungen gelten für das Untersuchungsergebnis der für die amtliche Kontrolle entnommenen Probe. Im Falle einer Analyse für Rechtfertigungs- oder Referenzwecke gelten die einzelstaatlichen Bestimmungen.

3.   Ergebnisse, die die Aktionsgrenzwerte gemäß Anhang II der Richtlinie 2002/32/EG überschreiten

Aktionsgrenzwerte dienen als Instrument zur Auswahl der Proben in Fällen, in denen eine Kontaminationsquelle gefunden werden muss und Maßnahmen zu deren Eindämmung oder Beseitigung getroffen werden müssen. Durch Screening-Verfahren sind geeignete Cut-off-Werte für die Auswahl dieser Proben festzulegen. Die zur Bestimmung einer Kontaminationsquelle, deren Eindämmung oder Beseitigung notwendigen Maßnahmen werden nur dann getroffen, wenn die Überschreitung der Aktionsgrenzwerte durch eine im Bestätigungsverfahren erfolgte Zweitanalyse unter Berücksichtigung der Messunsicherheit bestätigt wird (7).

KAPITEL II

Probenvorbereitung und Anforderungen an Untersuchungsverfahren zur amtlichen Kontrolle des Gehalts an Dioxinen (PCDD/PCDF) und dioxinähnlichen PCB in Futtermitteln

1.   Anwendungsbereich

Die in diesem Anhang beschriebenen Anforderungen gelten, wenn Futtermittel zur amtlichen Kontrolle des Gehalts an 2,3,7,8-substituierten polychlorierten Dibenzo-p-dioxinen und polychlorierten Dibenzofuranen (PCDD/F) und dioxinähnlichen polychlorierten Biphenylen (dioxinähnliche PCB) oder zu anderen regulatorischen Zwecken untersucht werden.

Die Überwachung des Vorhandenseins von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB in Futtermitteln kann zwei verschiedenen Zwecken dienen:

a)

Auswahl derjenigen Proben, deren Gehalt an PCCD/F und dioxinähnlichen PCB die Höchstgehalte oder die Aktionsgrenzwerte überschreitet. Bei diesem Ansatz können die aufgrund ihres hohen Probendurchsatzes kostengünstigen Screening-Verfahren zum Einsatz kommen, wodurch größere Chancen bestehen, neue Vorfälle mit hoher Exposition und Gesundheitsgefahren für die Verbraucher aufzudecken. Screening-Verfahren können bioanalytische Methoden und GC/MS-Verfahren umfassen. Ihre Anwendung hat insbesondere die Vermeidung falsch-negativer Ergebnisse zum Ziel. Die Konzentration von PCDD/F und der Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB in diesen Proben mit signifikanten Gehalten muss dann durch ein Bestätigungsverfahren ermittelt/bestätigt werden.

b)

Bestimmung der Gehalte an PCDD/F und dioxinähnlichen PCB in Futtermittelproben im Bereich der niedrigen Hintergrundbelastung. Dies ist wichtig für die Verfolgung der zeitlichen Entwicklung, die Bewertung der Exposition der Bevölkerung und für den Aufbau einer Datenbank im Hinblick auf eine mögliche Neubewertung der Auslösewerte und Höchstgehalte. Erreicht wird dies durch die Bestätigungsverfahren, die es ermöglichen, PCDD/F und dioxinähnliche PCB in der interessierenden Konzentration eindeutig zu identifizieren und zu quantifizieren. Diese Verfahren können zur Bestätigung der im Screening-Verfahren erhaltenen Ergebnisse und zur Bestimmung der Belastung im niedrigen Hintergrundbereich bei der Futtermittelüberwachung genutzt werden. Sie sind außerdem bei der Feststellung von Kongeneren-Mustern zur Bestimmung der Quelle einer möglichen Kontamination von Bedeutung. Derzeit werden diese Verfahren mittels hochauflösender Gaschromatografie/hochauflösender Massenspektrometrie (HRGC/HRMS) durchgeführt.

2.   Klassifikation der Verfahren nach dem Quantifizierungs-Grad  (8)

2.1.   Qualitative Methoden zeigen an, ob die interessierenden Analyten vorliegen oder nicht, ohne dabei Hinweise auf die Konzentration des vermuteten Analyten zu geben. Potenziell könnten mit qualitativen Methoden auch semiquantitative Ergebnisse erzielt werden, sie werden jedoch ausschließlich dazu verwendet, die Frage, ob Gehalte über oder unter bestimmten Werten (beispielsweise Nachweisgrenze, Bestimmungsgrenze oder Cut-off-Werte) vorliegen oder nicht, mit ja oder nein zu beantworten.

Zur Kontrolle der Höchstgehalte und Aktionsgrenzwerte für PCDD/PCDF und dioxinähnliche PCB in Futtermitteln können Screening-Verfahren verwendet werden, die auf einem Vergleich der Untersuchungsergebnisse mit einem Cut-off-Wert basieren und angeben, ob die interessierende Konzentration möglicherweise überschritten wird oder nicht.

2.2.   Semiquantitative Methoden sind Verfahren, mit denen die ungefähre Konzentration eines vermuteten Analyten angegeben werden kann, bei denen aber das numerische Ergebnis den Anforderungen an quantitative Methoden nicht genügt. Sie können dazu benutzt werden, Hinweise auf den Konzentrationsbereich des Analyten zu erlangen, die es dem Analytiker erleichtern, den Kalibrierbereich für die nachfolgend durchzuführende Bestätigungsuntersuchung festzulegen, sowie zur Qualitätssicherung. Folgende Verfahren gelten beispielsweise als semiquantitativ:

a)

Verfahren, die auf der Anwendung biologischer Grundsätze beruhen, beispielsweise zellbasierte Assays, Rezeptor-Assays oder Immunoassays, nachfolgend ‚bioanalytische Methoden‘ genannt, mit denen ein Vorliegen der interessierenden Analyten erkannt werden kann, die eine Kalibrierkurve enthalten, mit denen die Frage, ob die interessierende Konzentration möglicherweise überschritten wird, mit ja oder nein beantwortet werden kann und die eine Angabe des Ergebnisses in bioanalytischen Äquivalenten (BEQ) erlauben, was wiederum einen Hinweis auf den TEQ-Wert in der Probe gibt;

b)	physikalisch-chemisches Prüfverfahren (z. B. Gaschromatografie-Massenspektrometrie/Massenspektrometrie (GC-MS/MS) oder Gaschromatografie/niedrig auflösende Massenspektrometrie (GC/LRMS)), bei dem die gemessenen Präzisionskriterien nicht den Anforderungen für quantitative Untersuchungen genügen.

2.3.   Quantitative Methoden entsprechen den gleichen Anforderungen hinsichtlich Genauigkeit, Messbereich und Präzision wie die Bestätigungsverfahren. Ist eine Quantifizierung erforderlich, müssen die quantitativen Methoden genauso validiert werden wie die Bestätigungsverfahren.

3.   Hintergrund

Zur Berechnung der Toxizitätsäquivalente (TEQ) werden die Konzentrationen der einzelnen Substanzen in einer bestimmten Probe mit den jeweiligen Toxizitätsäquivalenzfaktoren (TEF) der Weltgesundheitsorganisation, die in der Anlage zu diesem Anhang aufgeführt sind, multipliziert und dann addiert, woraus sich die Gesamtkonzentration an dioxinähnlichen Verbindungen, ausgedrückt in TEQ, ergibt.

Für die Zwecke von Anhang V Teil B gilt als akzeptierte spezifische Bestimmungsgrenze eines einzelnen Kongeners die Konzentration eines Analyts in einem Probenextrakt, die ein Signal des Messgeräts bei zwei verschiedenen Ionen (Fragmentionen) hervorruft, die mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 bei dem weniger empfindlichen Signal verbunden sind; weiterhin müssen die Identifizierungskriterien, wie sie beispielsweise in der Norm prEN 16215 (Futtermittel — Bestimmung von Dioxinen und dioxinähnlichen PCB mittels Gaschromatografie/hochauflösende Massenspektrometrie (GC/HRMS) und von Indikator-PCB mittels GC/HRMS) und/oder in der EPA-Methode 1613 Revision B beschrieben sind, erfüllt sein.

Mit bioanalytischen Methoden erhält man kein Ergebnis auf Ebene der Kongeneren, sondern lediglich einen Hinweis (9) auf den TEQ-Gehalt, der in bioanalytischen Äquivalenten (BEQ) ausgedrückt wird, wodurch der Tatsache Rechnung getragen wird, dass möglicherweise nicht alle Verbindungen, die in einem Probenextrakt vorliegen, der ein Signal erzeugt, allen Voraussetzungen des TEQ-Prinzips genügen.

Screening- und Bestätigungsverfahren können nur dann zur Kontrolle einer bestimmten Matrix verwendet werden, wenn sie empfindlich genug sind, Gehalte im interessierenden Bereich (Aktionsgrenzwerte oder Höchstgehalte) zuverlässig zu bestimmen.

4.   Anforderungen an die Qualitätssicherung

4.1.   Auf jeder Stufe des Probenahme- und Analyseverfahrens sind Maßnahmen zur Vermeidung von Kreuzkontamination zu treffen.

4.2.   Die Proben sind in hierfür geeigneten Glas-, Aluminium-, Polypropylen- oder Polyethylen-Behältern zu lagern und zu transportieren, so dass der Gehalt der Proben an PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB nicht verfälscht wird. Spuren von Papierstaub sind vom Probenbehälter zu entfernen.

4.3.   Lagerung und Transport der Proben haben so zu erfolgen, dass die Futtermittelprobe unversehrt erhalten bleibt.

4.4.   Sofern zutreffend, sind die einzelnen Laborproben mithilfe eines Verfahrens fein zu mahlen und gründlich zu mischen, mit dem nachweislich eine vollständige Homogenisierung erreicht wird (z. B. so fein gemahlen, dass die Probe durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm passt). Falls die Proben einen zu hohen Feuchtigkeitsgehalt aufweisen, sind sie vor dem Mahlen zu trocknen.

4.5.   Die Reagenzien, Glasgeräte und die weitere Ausrüstung sind auf Faktoren, die möglicherweise die TEQ- und BEQ-basierten Ergebnisse verfälschen könnten, zu kontrollieren.

4.6.   Es ist eine Methodenleerwert-Untersuchung durchzuführen, bei der das gesamte Analyseverfahren durchgeführt und nur die Probe weggelassen wird.

4.7.   Bei Anwendung bioanalytischer Methoden ist zu überprüfen, dass sämtliche Glasgeräte und Lösungsmittel, die bei der Analyse verwendet werden, frei von Verbindungen sind, die die Erkennung der Zielverbindungen im Arbeitsbereich beeinträchtigen könnten. Glasgeräte sind mit Lösungsmitteln zu spülen oder auf Temperaturen zu erhitzen, die geeignet sind, alle Spuren von PCDD/PCDF, dioxinähnlicher Verbindungen und interferierender Verbindungen von der Oberfläche der Geräte zu entfernen.

4.8.   Die Menge der für die Extraktion verwendeten Probe muss ausreichend groß sein, um die Anforderungen hinsichtlich eines ausreichend niedrigen Arbeitsbereichs, der den Bereich der interessierenden Konzentrationen beinhaltet, zu erfüllen.

4.9.   Zur spezifischen Vorbereitung der Proben der zu untersuchenden Erzeugnisse sind Verfahren gemäß international anerkannten Leitlinien zu verwenden.

5.   Anforderungen an Laboratorien

5.1.   Gemäß den Bestimmungen der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 müssen die Laboratorien von einer anerkannten Stelle akkreditiert sein, die nach ISO Guide 58 arbeitet, damit sichergestellt ist, dass die Laboratorien bei der Untersuchung Qualitätssicherungsverfahren anwenden. Die Laboratorien müssen gemäß der Norm EN ISO/IEC 17025 akkreditiert sein.

5.2.   Die Laborleistung ist durch die kontinuierliche erfolgreiche Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen zur Ermittlung des Gehalts an PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB in den entsprechenden Futtermittelmatrices und Konzentrationsbereichen unter Beweis zu stellen.

5.3.   Laboratorien, die zur Routinekontrolle von Proben Screening-Verfahren verwenden, müssen eng mit Laboratorien zusammenarbeiten, die Bestätigungsverfahren anwenden, sowohl zur Qualitätssicherung als auch zur Bestätigung der Ergebnisse verdächtiger Proben.

6.   Grundlegende Anforderungen an Verfahren zur Untersuchung auf Dioxine (PCDD/PCDF) und dioxinähnliche PCB

6.1.   Niedriger Arbeitsbereich und niedrige Bestimmungsgrenzen

Bei PCDD/PCDF müssen die nachweisbaren Mengen wegen der extrem hohen Toxizität einiger dieser Verbindungen im oberen Femtogramm-Bereich (10–15 g) liegen. Bei den meisten PCB-Kongeneren ist eine Bestimmungsgrenze im Nanogramm-Bereich (10–9 g) bereits ausreichend. Zur Messung der toxischeren dioxinähnlichen PCB-Kongenere (insbesondere der non-orthosubstituierten Kongenere) muss das untere Ende des Arbeitsbereichs bis in den unteren Pikogramm-Bereich (10–12 g) reichen. Bei allen anderen PCB-Kongeneren ist eine Bestimmungsgrenze im Nanogramm-Bereich (10–9 g) ausreichend.

6.2.   Hohe Selektivität (Spezifizität)

6.2.1.   PCDD/PCDF und dioxinähnliche PCB müssen von einer Vielzahl anderer, gemeinsam extrahierter und möglicherweise interferierender Verbindungen unterschieden werden, die in Konzentrationen von bis zu mehreren Größenordnungen höher als diejenigen der interessierenden Analyten vorhanden sind. Bei GC/MS-Verfahren ist eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Kongeneren erforderlich, beispielsweise zwischen toxischen (z. B. die siebzehn 2,3,7,8-substituierten PCDD/PCDF sowie die zwölf dioxinähnlichen PCB) und anderen Kongeneren.

6.2.2.   Bioanalytische Methoden müssen einen Nachweis der Zielverbindungen als Summe der PCDD/PCDF und/oder dioxinähnlichen PCB ermöglichen. Ziel der Probenaufreinigung muss sein, Verbindungen, die falsch-negative Ergebnisse verursachen könnten oder Verbindungen, die das Signal schwächen und dadurch falsch-negative Ergebnisse verursachen könnten, zu entfernen.

6.3.   Hohe Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision, beobachtete Bioassay-Wiederfindung)

6.3.1.   Bei Anwendung von GC/MS-Verfahren muss die Bestimmung eine valide Schätzung der tatsächlichen Konzentration in einer Probe ermöglichen. Hohe Genauigkeit ist notwendig, damit die Zurückweisung eines Ergebnisses einer Probenuntersuchung aufgrund der geringen Zuverlässigkeit des bestimmten TEQ-Gehalts vermieden wird. Die Genauigkeit des Analyseverfahrens wird angegeben durch die Richtigkeit (Differenz zwischen dem gemessenen Mittelwert eines Analyten in einem zertifizierten Material und seinem zertifizierten Wert, ausgedrückt als Prozentsatz dieses Wertes) und die Präzision (RSDR, Relative Standardabweichung, berechnet aus unter Reproduzierbarkeitsbedingungen ermittelten Ergebnissen).

6.3.2.   Für bioanalytische Methoden ist die beobachtete Bioassay-Wiederfindung zu bestimmen. Die beobachtete Bioassay-Wiederfindung ist der BEQ-Gehalt, berechnet anhand einer TCDD-Kalibrierkurve oder einer PCB-126-Kalibrierkurve nach Korrektur um den Blindwert, geteilt durch den mittels GC/HRMS-Verfahren bestimmten TEQ-Wert. Dadurch sollen Faktoren wie der Verlust von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen Verbindungen während der einzelnen Extraktions- bzw. Reinigungsschritte, die Verstärkung oder Abschwächung des Signals durch mitextrahierte Verbindungen (agonistische bzw. antagonistische Wirkung), die Qualität der Kurvenanpassung oder Unterschiede zwischen den Werten der Toxizitätsäquivalenzfaktoren (TEF) und der relativen Wirksamkeit (REP) möglichst korrigiert werden. Die beobachtete Bioassay-Wiederfindung wird anhand geeigneter Referenzproben berechnet, die im Bereich der interessierenden Konzentration liegen und repräsentative Kongeneren-Muster aufweisen.

6.4.   Validierung im interessierenden Bereich und allgemeine Qualitätssicherungsmaßnahmen

6.4.1.   Die Laboratorien haben im Rahmen der Validierung und während der Routineanalytik den Nachweis der Leistungsfähigkeit eines Verfahrens im interessierenden Bereich, z. B. 0,5 ×, 1 × und 2 × die interessierende Konzentration mit einem akzeptablen Variationskoeffizienten für wiederholte Untersuchung, zu führen.

6.4.2.   Als interne Qualitätssicherungsmaßnahmen müssen regelmäßige Methodenleerwert-Kontrollen und Experimente mit dotierten Proben oder Analysen von Kontrollproben (sofern erhältlich, vorzugsweise zertifiziertes Referenzmaterial) durchgeführt werden. Für Methodenleerwert-Kontrollen, Experimente mit dotierten Proben und Analysen von Kontrollproben sind Qualitätskontroll-Charts anzufertigen und zu prüfen, damit sichergestellt ist, dass die Analyseleistungsfähigkeit den Anforderungen genügt.

6.5.   Bestimmungsgrenze

6.5.1.   Bei einem bioanalytischen Screening-Verfahren ist eine Ermittlung der Bestimmungsgrenze (LOQ) nicht unbedingt erforderlich; es muss jedoch nachgewiesen sein, dass mit dem Verfahren eine Unterscheidung zwischen dem Methodenleerwert und dem Cut-off-Wert möglich ist. Wird ein BEQ-Gehalt angegeben, ist eine Konzentration festzulegen, ab der Ergebnisse mitgeteilt werden (Meldewert), um Proben, die ein Ergebnis unterhalb davon aufweisen, entsprechend einstufen zu können. Der Meldewert muss sich mindestens um den Faktor drei von Methodenleerwert-Proben mit einem Signal unterhalb des Arbeitsbereiches unterscheiden. Er ist daher auf der Grundlage von Proben zu berechnen, die ungefähr den erforderlichen Mindestgehalt an Zielverbindungen enthalten und nicht aus dem Signal/Rausch-Verhältnis oder einem Assay-Leerwert.

6.5.2.   Die LOQ liegt beim Bestätigungsverfahren bei etwa einem Fünftel der interessierenden Konzentration.

6.6.   Analysekriterien

Damit die Ergebnisse der Bestätigungs- oder Screening-Verfahren zuverlässig sind, müssen folgende Kriterien für den TEQ-Wert bzw. den BEQ-Wert erfüllt sein, entweder bestimmt als Gesamt-TEQ (Summe der PDCC/PCDF und dioxinähnlichen PCB) oder separat für PCDD/PCDF und dioxinähnliche PCB.

	Screening mit bioanalytischen oder physikalisch-chemischen Verfahren	Bestätigungsverfahren
Falsch-negativ-Rate (10)	< 5 %
Richtigkeit		– 20 bis +20 %
Wiederholbarkeit (RSDr)	< 20 %
Laborinterne Reproduzierbarkeit (RSDR)	< 25 %	< 15 %

6.7.   Besondere Anforderungen an Screening-Verfahren

6.7.1.   Sowohl GC/MS-Verfahren als auch bioanalytische Methoden dürfen zum Screening verwendet werden. Bei GC/MS-Verfahren sind die unter Nummer 7 festgelegten Anforderungen zu erfüllen. Für zellbasierte bioanalytische Methoden sind unter Nummer 8 spezifische Anforderungen festgelegt.

6.7.2.   Laboratorien, die zur Routinekontrolle von Proben Screening-Verfahren verwenden, müssen eng mit Laboratorien zusammenarbeiten, die das Bestätigungsverfahren anwenden.

6.7.3.   Der Nachweis der Leistungsfähigkeit des Screening-Verfahrens ist während der Routineanalyse durch Qualitätssicherung und permanente Validierung zu erbringen. Es muss ein kontinuierliches Programm zur Kontrolle der als konform beurteilten Analysenergebnisse geben.

6.7.4.   Prüfung auf eine mögliche Unterdrückung der Zellantwort und auf Zytotoxizität:

20 % der Probenextrakte sind während des Routine-Screenings sowohl ohne als auch mit Zusatz einer der interessierenden Konzentration entsprechenden Menge von 2,3,7,8-TCDD zu analysieren, damit überprüft werden kann, ob das Signal möglicherweise durch interferierende Stoffe im Probenextrakt unterdrückt wird. Die gemessene Konzentration der dotierten Probe ist mit der Summe aus der Konzentration der nicht dotierten Probe und der Konzentration der Dotierung zu vergleichen. Liegt die gemessene Konzentration mehr als 25 % unter der berechneten (Summen-)Konzentration, ist dies ein Hinweis auf eine mögliche Signalunterdrückung und die entsprechende Probe ist einem GC/HRMS-Bestätigungsverfahren zu unterziehen. Die Ergebnisse sind anhand von Qualitätskontroll-Charts zu überwachen.

6.7.5.   Qualitätssicherung bei als konform beurteilten Proben

Etwa 2–10 % der konformen Proben sind, je nach Probenmatrix und Laborerfahrung, mittels GC/HRMS zu bestätigen.

6.7.6.   Bestimmung der Falsch-negativ-Raten auf Grundlage der Qualitätssicherungsdaten:

Die Rate falsch-negativer Ergebnisse beim Screening von Proben unter- und oberhalb der Höchstgehalte oder Aktionsgrenzwerte ist zu bestimmen. Der tatsächliche Anteil der falsch-negativen Ergebnisse muss unter 5 % liegen. Wenn im Rahmen der Qualitätssicherung je Matrix/Matrixgruppe mindestens 20 Proben bestätigt wurden, ist aus dieser Datenbasis die Falsch-negativ-Rate zu ermitteln. Die zur Ermittlung der Falsch-negativ-Rate mindestens erforderlichen 20 Ergebnisse können auch die Ergebnisse von in Ringversuchen oder im Rahmen eines Kontaminationsereignisses untersuchten Proben miteinschließen, die einen Konzentrationsbereich von beispielsweise bis zum doppelten Höchstgehalt abdecken. Die Proben müssen die häufigsten Kongeneren-Muster abdecken, die verschiedene Kontaminationsquellen repräsentieren.

Obwohl Screening-Verfahren hauptsächlich auf die Ermittlung derjenigen Proben abzielen, in denen der Aktionsgrenzwert überschritten wird, ist das ausschlaggebende Kriterium zur Bestimmung der Falsch-negativ-Rate der Höchstgehalt, unter Berücksichtigung der Messunsicherheit des Bestätigungsverfahrens.

6.7.7.   Alle Proben, die im Screening-Verfahren als möglicherweise nicht konform beurteilt werden, müssen durch ein Bestätigungsverfahren (GC/HRMS) überprüft werden. Diese Proben dürfen ebenfalls zur Bewertung der Rate der falsch-negativen Ergebnisse herangezogen werden. Im Rahmen von Screening-Verfahren entspricht die Falsch-positiv-Rate dem Anteil derjenigen Ergebnisse, von denen sich im Bestätigungsverfahren durch GC/HRMS herausstellt, dass sie konform sind, nachdem sie zunächst als vermutlich nicht konform eingestuft worden waren. Die Vorteilhaftigkeit des Screening-Verfahrens ist auf Grundlage eines Vergleichs zwischen der Zahl der falsch-positiven Proben und der Gesamtzahl der untersuchten Proben zu bewerten. Dabei muss der Anteil der falsch-positiven Proben so gering sein, dass ein Screening vorteilhaft ist.

6.7.8.   Zumindest unter Validierungsbedingungen müssen bioanalytische Methoden einen stichhaltigen Hinweis auf den TEQ-Gehalt ergeben, berechnet und ausgedrückt als BEQ.

Bei unter Wiederholbarkeitsbedingungen angewandten bioanalytischen Methoden wäre in der Regel die laborinterne Wiederholbarkeit RSDr geringer als die Reproduzierbarkeit RSDR.

7.   Besondere Anforderungen an GC/MS-Verfahren für Screening- oder Bestätigungszwecke

7.1.   Allgemeine Anforderungen

Bei Futtermitteln mit einer Kontamination von etwa 1 ng WHO-TEQ/kg Erzeugnis mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 12 % darf die Differenz zwischen Ober- und Untergrenze nicht mehr als 20 % (gestützt auf die Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB) betragen. Bei einer geringeren Kontamination, wie z. B. 0,5 ng WHO-TEQ/kg Erzeugnis, kann die Differenz zwischen Ober- und Untergrenze im Bereich zwischen 25 und 40 % liegen.

7.2.   Kontrolle der Wiederfindungsrate

7.2.1.   Die Zugabe von 13C-markierten 2,3,7,8-chlorsubstituierten internen PCDD/PCDF-Standards und 13C-markierten internen dioxinähnlichen PCB-Standards ist ganz zu Anfang des Analyseverfahrens, z. B. vor der Extraktion, durchzuführen, damit das Analyseverfahren validiert werden kann. Bei jeder der tetra- bis octachlorierten homologen Gruppen von PCDD/PCDF und bei jeder der homologen Gruppen von dioxinähnlichen PCB muss mindestens ein Kongener zugegeben werden (alternativ dazu mindestens ein Kongener je massenspektrometrisch ausgewählter Ionenaufzeichnungsfunktion zur Überwachung von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB). Im Fall der Bestätigungsverfahren sind alle 17 13C-markierten 2,3,7,8-substituierten internen PCDD/PCDF-Standards und alle 12 13C-markierten internen dioxinähnlichen PCB-Standards zu verwenden.

7.2.2.   Die relativen Responsefaktoren sind mittels geeigneter Kalibrierlösungen auch für diejenigen Kongenere zu bestimmen, bei denen kein 13C-markiertes Analogon zugegeben ist.

7.2.3.   Bei Futtermitteln pflanzlichen Ursprungs und Futtermitteln tierischen Ursprungs, die weniger als 10 % Fett enthalten, ist die Zugabe der internen Standards vor der Extraktion obligatorisch. Bei Futtermitteln tierischen Ursprungs, die mehr als 10 % Fett enthalten, können die internen Standards entweder vor oder nach der Fettextraktion zugegeben werden. Die Extraktionseffizienz ist auf geeignete Weise zu validieren, abhängig davon, auf welcher Stufe die internen Standards zugegeben und ob die Ergebnisse auf Erzeugnis- oder Fettbasis angegeben werden.

7.2.4.   Vor der GC/MS-Analyse sind 1 oder 2 Wiederfindungs-(Surrogat-)Standard(s) zuzugeben.

7.2.5.   Es ist eine Kontrolle der Wiederfindungsrate erforderlich. Bei Bestätigungsverfahren müssen die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards zwischen 60 und 120 % liegen. Geringere oder höhere Wiederfindungsraten für einzelne Kongenere, insbesondere für einige hepta- und octachlorierte Dibenzo-p-dioxine und Dibenzofurane, werden unter der Bedingung akzeptiert, dass ihr Beitrag zum TEQ-Wert 10 % des gesamten TEQ-Werts (basierend auf der Summe von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB) nicht übersteigt. Bei GC/MS-Screening-Verfahren müssen die Wiederfindungen zwischen 30 und 140 % liegen.

7.3.   Entfernung interferierender Stoffe

—	Die PCDD/PCDF sind von interferierenden chlorierten Verbindungen, wie z. B. nicht dioxinähnlichen PCB und chlorierten Diphenylethern, mittels geeigneter chromatografischer Verfahren abzutrennen (vorzugsweise mit Florisil-, Aluminiumoxid- und/oder Aktivkohlensäule).

—	Die gaschromatografische Auftrennung der Isomere ist < 25 % von Peak zu Peak zwischen 1,2,3,4,7,8-HxCDF und 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

7.4.   Kalibrierung mittels Standardkurve

Die Kalibrierkurve muss alle jeweils relevanten Bereiche der interessierenden Konzentrationen abdecken.

8.   Besondere Anforderungen an bioanalytische Methoden

Bioanalytische Methoden sind Verfahren, die auf der Anwendung biologischer Grundsätze beruhen, beispielsweise zellbasierte Assays, Rezeptor-Assays oder Immunoassays. In Nummer 8 werden allgemeine Anforderungen an bioanalytische Methoden festgelegt.

Mit einem Screening-Verfahren wird eine Probe prinzipiell entweder als konform oder als vermutlich nicht konform eingestuft. Dazu wird der berechnete BEQ-Wert mit dem Cut-off-Wert verglichen (siehe Nummer 8.3). Proben, die unter dem Cut-off-Wert liegen, gelten als konform, Proben die dem Cut-off-Wert entsprechen oder diesen überschreiten, gelten als vermutlich nicht konform und müssen mit einem Bestätigungsverfahren untersucht werden. In der Praxis kann ein BEQ-Gehalt, der 2/3 des Höchstgehalts entspricht, als geeignetester Cut-off-Wert dienen, mit dem eine Falsch-negativ-Rate von unter 5 % sowie eine annehmbare Rate von falsch-positiven Ergebnissen gewährleistet wird. Da für PCDD/F und für die Summe von PCDD/F und dioxinähnliche PCB unterschiedliche Höchstgehalte gelten, ist zur Prüfung der Konformität der Proben ohne Fraktionierung ein geeigneter Bioassay-Cut-off-Wert für PCDD/F erforderlich. Zur Überprüfung von Proben, in denen die Aktionsgrenzwerte überschritten werden, würde sich ein entsprechender Prozentsatz der interessierenden Konzentration als Cut-off-Wert eignen.

Außerdem kann bei bestimmten bioanalytischen Methoden ein ungefährer Gehalt, ausgedrückt in BEQ, für solche Proben angegeben werden, die im Arbeitsbereich liegen und den Meldewert überschreiten (siehe Nummern 8.1.1 und 8.1.6).

8.1.   Signalauswertung

8.1.1.   Allgemeine Anforderungen

—

Berechnet man die Konzentrationen anhand einer TCDD-Kalibrierkurve, so weisen die Werte am unteren und am oberen Ende der Kurve eine große Variabilität (hoher Variationskoeffizient (VK)) auf. Der Arbeitsbereich ist der Bereich, in dem der VK weniger als 15 % beträgt. Das untere Ende des Arbeitsbereichs (Meldegrenze) muss mindestens um den Faktor drei über den Methodenleerwerten liegen. Der EC70-Wert (70 % der maximalen effektiven Konzentration) stellt normalerweise das obere Ende des Arbeitbereichs dar; es liegt aber niedriger, wenn der VK in diesem Bereich über 15 % liegt. Der Arbeitsbereich wird im Rahmen der Validierung festgelegt. Die Cut-off-Werte (siehe Nummer 8.3) müssen vollständig innerhalb des Arbeitsbereichs liegen.

—

Standardlösungen und Probenextrakte sind mindestens zweifach zu messen. Werden Zweifachmessungen durchgeführt, müssen eine Standardlösung oder ein Kontrollextrakt in 4 bis 6 über die Platte verteilten Vertiefungen getestet werden und ein Signal oder eine Konzentration (nur im Arbeitsbereich möglich) auf Grundlage eines VK < 15 % hervorbringen.

8.1.2.   Kalibrierung

8.1.2.1.    Kalibrierung mittels Standardkurve

—

Die Gehalte in Proben werden durch Vergleich der im Assay gemessenen Zellantwort mit einer TCDD-Kalibrierkurve (oder einer PCB-126-Kalibrierkurve oder einer Kalibrierkurve aus einer Standardmischung aus PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB) geschätzt, um den BEQ-Gehalt im Extrakt und somit in der Probe zu berechnen.

—

Eine Kalibrierkurve muss aus 8 bis 12 Konzentrationen bestehen (jeweils mindestens zweifach) und über eine ausreichende Zahl von Konzentrationen am unteren Ende der Kurve (Arbeitsbereich) verfügen. Besondere Aufmerksamkeit ist der Qualität der Kurvenanpassung im Arbeitsbereich zu widmen. Der R2-Wert als solcher hilft wenig oder gar nicht bei der Einschätzung der Qualität der Anpassung bei nichtlinearer Regression. Eine bessere Anpassung erhält man durch die Minimierung des Unterschieds zwischen dem berechneten und dem beobachteten Gehalt im Arbeitsbereich der Kurve, z. B. durch Minimierung der Summe der Abweichungsquadrate.

—

Der geschätzte BEQ-Gehalt in der Probe wird anschließend um den für eine Matrix-/Reagenzienleerwert-Probe (zur Berücksichtigung von Verunreinigungen durch die verwendeten Lösungsmittel und Chemikalien) errechneten BEQ-Wert und um die beobachtete Wiederfindung (errechnet aus dem BEQ-Gehalt geeigneter Referenzproben mit repräsentativen Kongeneren-Mustern im Bereich der interessierenden Konzentration) korrigiert. Bei der Wiederfindungskorrektur muss die beobachtete Wiederfindung sich im geforderten Bereich befinden (siehe Nummer 8.1.4). Die für die Wiederfindungskorrektur verwendeten Referenzproben müssen den unter Nummer 8.2 aufgeführten Anforderungen entsprechen.

8.1.2.2.    Kalibrierung anhand von Referenzproben

Alternativ kann eine Kalibrierkurve auf Grundlage von mindestens 4 Referenzproben im Bereich der interessierenden Konzentration verwendet werden (siehe Nummer 8.2.4: eine Matrixleerwert-Probe sowie drei Referenzproben, die jeweils 0,5 ×, 1,0 × und 2,0 × die interessierende Konzentration enthalten), wodurch keine Notwendigkeit zur Korrektur um Blindwerte und Wiederfindung besteht. In diesem Fall kann das Signal, das 2/3 des Höchstgehalts entspricht (siehe Nummer 8.3), direkt auf Grundlage dieser Proben berechnet und als Cut-off-Wert verwendet werden. Zur Überprüfung von Proben, in denen die Aktionsgrenzwerte überschritten werden, würde sich ein entsprechender Prozentsatz dieser Aktionsgrenzwerte als Cut-off-Wert eignen.

8.1.3.   Separate Bestimmung von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB

Extrakte können in Fraktionen, welche PCDD/PCDF und dioxinähnliche PCB enthalten, aufgetrennt werden, so dass PCDD/PCDF-TEQ und TEQ der dioxinähnlichen Verbindungen (jeweils als BEQ) getrennt angegeben werden können. Zur Bewertung der Ergebnisse für die Fraktion, die dioxinähnliche PCB enthält, ist vorzugsweise eine PCB-126-Kalibrierkurve zu verwenden.

8.1.4.   Beobachtete Bioassay-Wiederfindung

Die ‚beobachtete Bioassay-Wiederfindung‘ ist auf Grundlage geeigneter Referenzproben mit repräsentativen Kongeneren-Mustern im Bereich der interessierenden Konzentration zu berechnen und wird als Prozentsatz des BEQ-Gehalts im Vergleich zum TEQ-Gehalt ausgedrückt. Je nachdem, welche Art von Assay oder TEF (11) verwendet wird, können die Unterschiede zwischen TEF- und REP-Faktoren in dioxinähnlichen PCB zu niedrigeren Wiederfindungswerten für dioxinähnliche PCB im Vergleich zu PCDD/PCDF führen. Daher muss die beobachtete Bioassay-Wiederfindung bei einer getrennten Bestimmung von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB für dioxinähnliche PCB 25 bis 60 % und für PCDD/PCDF 50 bis 130 % betragen (bei Verwendung einer TCDD-Kalibrierkurve). Der Beitrag der dioxinähnlichen PCB zur Summe der PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB kann je nach Matrices und Proben unterschiedlich sein; dies spiegelt sich in der beobachteten Bioassay-Wiederfindung für die Summe der PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB wider, die zwischen 30 und 130 % liegen muss. Jede wesentliche Änderung der TEF-Werte für PCDD/PCDF und dioxinähnliche PCB in den EU-Rechtsvorschriften erfordert eine Überarbeitung dieser Bereiche.

8.1.5.   Kontrolle der Wiederfindung nach Reinigung der Probenextrakte

Der Verlust von Verbindungen während der Reinigung ist im Rahmen der Validierung zu überprüfen. Eine Matrixleerprobe, dotiert mit einem Gemisch verschiedener Kongenere, ist dem Reinigungsverfahren zu unterziehen (mindestens n = 3) und Wiederfindung und Streuung sind mittels einer GC/HRMS-Analyse zu untersuchen. Die Wiederfindung muss zwischen 60 und 120 % betragen, insbesondere für Kongenere, die in verschiedenen Gemischen jeweils mehr als 10 % des TEQ-Gehalts ausmachen.

8.1.6.   Meldegrenze

Werden BEQ-Gehalte angegeben, ist auf der Grundlage relevanter Matrix-Proben, die typische Kongeneren-Muster aufweisen, eine Meldegrenze zu ermitteln; dabei ist die Kalibrierkurve der Standards aufgrund ihrer geringen Präzision im unteren Bereich nicht heranzuziehen. Die Einflüsse aus Extraktion und Reinigung müssen berücksichtigt werden. Die Meldegrenze muss mindestens um den Faktor drei über den Methodenleerwerten liegen.

8.2.   Verwendung von Referenzproben

8.2.1.   Referenzproben müssen repräsentativ für Probenmatrix, Kongeneren-Muster und Konzentrationen für PCDD/PCDF und dioxinähnliche PCB im interessierenden Bereich sein.

8.2.2.   Bei jeder Test-Reihe ist eine Matrixleerprobe, oder, sofern dies nicht möglich ist, eine Methodenleerwert-Probe, sowie eine Referenzprobe im interessierenden Bereich einzubeziehen. Diese Proben müssen zur gleichen Zeit und unter identischen Bedingungen extrahiert und analysiert werden. Die Referenzprobe muss im Vergleich zu der Matrixleerprobe ein deutlich höheres Signal aufweisen, wodurch die Eignung des Analyseverfahrens gewährleistet ist. Diese Proben können zur Korrektur um Leerwert und Wiederfindung verwendet werden.

8.2.3.   Referenzproben, die zur Korrektur um die Wiederfindung herangezogen werden, müssen repräsentativ für die untersuchten Proben sein, d. h. die Kongeneren-Muster dürfen nicht zu einer Unterschätzung der Gehalte führen.

8.2.4.   Zusätzliche Referenzproben, deren Konzentration z. B. das 0,5- und 2-fache der interessierenden Konzentration beträgt, können einbezogen werden, damit die ordnungsgemäße Durchführung der Untersuchungen in dem für die Kontrolle der interessierenden Konzentration relevanten Bereich nachgewiesen werden kann. In Kombination können diese Proben zur Berechnung der BEQ-Gehalte in den untersuchten Proben verwendet werden (siehe Nummer 8.1.2.2).

8.3.   Bestimmung der Cut-off-Werte

Die Beziehung zwischen den in BEQ ausgedrückten Ergebnissen der bioanalytischen Methode und den in TEQ ausgedrückten Ergebnissen des GC/HRMS-Verfahrens ist zu ermitteln, z. B. durch Matrix-bezogene Kalibrierexperimente unter Verwendung von Referenzproben, die mit 0, 0,5 ×, 1 × und 2 × dem Höchstgehalt dotiert sind und auf jeder Konzentrationsstufe jeweils 6-mal untersucht werden (n = 24). Korrekturfaktoren (Leerwert und Wiederfindung) können auf der Grundlage dieses Verhältnisses geschätzt werden, sind jedoch gemäß Nummer 8.2.2 zu überprüfen.

Für die Entscheidung, ob eine Probe den Höchstgehalten entspricht, oder gegebenenfalls zur Überprüfung der Aktionsgrenzwerte sind Cut-off-Werte zu ermitteln, wobei die interessierenden Konzentrationen entweder einzeln für PCDD/PCDF und dioxinähnliche PCB, oder aber für die Summe von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB festgelegt sein können. Sie stellen den unteren Endpunkt der Verteilung bioanalytischer Ergebnisse (korrigiert um Leerwert und Wiederfindung) von Proben dar, die Gehalte an der Entscheidungsgrenze des GC/HRMS-Verfahrens aufweisen, berechnet auf Grundlage eines Vertrauensniveaus von 95 %, was eine Falsch-negativ-Rate von < 5 % impliziert, und auf Basis einer RSDR unter 25 %. Die GC/HRMS-Entscheidungsgrenze entspricht dem Höchstgehalt zuzüglich der Messunsicherheit.

Der Cut-off-Wert (in BEQ) kann gemäß einem der unter den Nummern 8.3.1, 8.3.2 oder 8.3.3 beschriebenen Ansätze berechnet werden (siehe Abbildung 1):

8.3.1.

Verwendung des unteren Bands des Prognoseintervalls von 95 % an der GC/HRMS-Entscheidungsgrenze: Dabei ist BEQDL der BEQ-Wert, der der GC/HRMS-Entscheidungsgrenze entspricht, die wiederum dem Höchstgehalt zuzüglich der Messunsicherheit entspricht. sy,x die Reststandardabweichung t α,f = m–2 der Student-t-Faktor (α = 5 %, f = Freiheitsgrade, einseitig) m die Gesamtzahl der Kalibrierpunkte (Laufzahl j) n die Anzahl der Wiederholungen auf jeder Ebene xi die GC/HRMS-Probenkonzentration (in TEQ) des Kalibrierpunktes i der Mittelwert der Konzentrationen (in TEQ) aller Kalibrierproben Quadratsummenparameter, i = Laufzahl des Kalibrierpunktes i

8.3.2.

Berechnung aus bioanalytischen Ergebnissen (korrigiert um Leerwert und Wiederfindung) aus der Mehrfachuntersuchung (n ≥ 6) von Proben, die Gehalte an der GC/HRMS-Entscheidungsgrenze aufweisen, als unterer Endpunkt der Datenverteilung am entsprechenden BEQ-Mittelwert: Cut-off-Wert = BEQDL – 1,64 × SDR Dabei ist SDR die Standardabweichung der Bioassay-Ergebnisse am BEQDL, gemessen unter laborinternen Reproduzierbarkeitsbedingungen

8.3.3.

Berechnung als Mittelwert der bioanalytischen Ergebnisse (in BEQ, korrigiert um Leerwert und Wiederfindung) auf der Grundlage mehrfacher Untersuchungen (n ≥ 6) von Proben, die mit 2/3 der interessierenden Konzentration kontaminiert sind, auf Grundlage der Beobachtung, dass dieser Wert in der Nähe des gemäß Nummer 8.3.1 oder 8.3.2 bestimmten Cut-off-Wertes liegt. Abbildung 1

8.3.4.

Beschränkungen der Cut-off-Werte: Auf BEQ basierende Cut-off Werte, die anhand der im Rahmen der Validierung und unter Verwendung einer begrenzten Anzahl von Proben mit unterschiedlichen Matrix-/Kongeneren-Mustern erzielten RSDR berechnet wurden, können höher sein als die auf TEQ basierenden interessierenden Konzentrationen, da hier die Präzision höher ist, als es in einer Routine möglich ist, in der ein unbekanntes Spektrum möglicher Kongeneren-Muster überprüft werden muss. In solchen Fällen ist der Berechnung der Cut-off-Werte eine RSDR = 25 % zugrunde zu legen, oder aber es sind zwei Drittel der interessierenden Konzentration als Cut-off-Wert zu verwenden.

8.4.   Leistungsmerkmale

8.4.1.   Es sind Tests zur Wiederholbarkeit bioanalytischer Methoden auszuführen, um Informationen über die Standardabweichung innerhalb einer Testreihe bzw. zwischen Testreihen zu erhalten. Die Wiederholbarkeit muss unter 20 % liegen, die laborinterne Reproduzierbarkeit unter 25 %. Grundlage dafür müssen die nach Korrektur um Blindwert und Wiederfindung als BEQ berechneten Konzentrationen sein.

8.4.2.   Während der Validierung muss nachgewiesen werden, dass mit dem Testverfahren zwischen einer Leerprobe und einem Gehalt am Cut-off-Wert unterschieden werden kann, so dass Proben, deren Gehalt über dem entsprechenden Cut-off-Wert liegt, identifiziert werden können (siehe Nummer 8.1.2).

8.4.3.   Die zu bestimmenden Verbindungen, mögliche auftretende Störungen und der maximal akzeptable Leerwert müssen festgelegt werden.

8.4.4.   Die Standardabweichung in Prozent, mit der die Signalwerte oder die aus den Signalwerten berechneten Konzentrationen (nur möglich im Arbeitsbereich) behaftet sind, darf bei einer dreifachen Bestimmung eines Probenextrakts nicht mehr als 15 % betragen.

8.4.5.   Zur Bewertung der Leistungsfähigkeit einer bioanalytischen Methode über einen konstanten Zeitraum hinweg sind die unkorrigierten Ergebnisse der Referenzprobe(n), ausgedrückt in BEQ (Leerwert und interessierende Konzentration), heranzuziehen.

8.4.6.   Für Leerwert-Proben und für jede Art von Referenzproben sind Qualitätskontroll-Charts anzufertigen und zu prüfen, damit sichergestellt ist, dass die analytische Leistungsfähigkeit den Anforderungen genügt, insbesondere bei Leerwert-Proben im Hinblick auf den erforderlichen Mindestabstand zum unteren Ende des Arbeitsbereichs und für Referenzproben hinsichtlich der laborinternen Reproduzierbarkeit. Leerwert-Proben sind so zu prüfen, dass falsch-negative Ergebnisse bei Abzug der Werte vermieden werden.

8.4.7.   Die Ergebnisse aus GC/HRMS-Analysen verdächtiger Proben und 2 bis 10 % der konformen Proben (mindestens 20 Proben je Matrix) sind zu sammeln und zur Bewertung der Leistungsfähigkeit des Screening-Verfahrens und der Beziehung zwischen BEQ und TEQ zu verwenden. Diese Datenbank kann zur Neubewertung der Cut-off-Werte für Routineproben der validierten Matrices genutzt werden.

8.4.8.   Die Leistungsfähigkeit eines Verfahrens kann auch durch Teilnahme an Ringversuchen nachgewiesen werden. Die Ergebnisse von in Ringversuchen analysierten Proben, die einen Konzentrationsbereich bis zum zweifachen Höchstgehalt abdecken, können zur Bewertung der Falsch-negativ-Rate herangezogen werden, wenn ein Laboratorium seine Leistungsfähigkeit unter Beweis gestellt hat. Die Proben müssen die häufigsten Kongeneren-Muster abdecken, die verschiedene Kontaminationsquellen repräsentieren.

8.4.9.   Bei Kontaminationsfällen können die Cut-off-Werte neu ermittelt werden, um den Besonderheiten von Matrix und Kongeneren-Muster des jeweiligen Zwischenfalls Rechnung zu tragen.

9.   Bericht über die Ergebnisse

9.1.   Bestätigungsverfahren

9.1.1.   Sofern das Untersuchungsverfahren dies zulässt, müssen die Untersuchungsergebnisse die Werte der einzelnen Kongenere von PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB enthalten und als Untergrenze (‚lowerbound‘), Obergrenze (‚upperbound‘) und Mittelwert (‚mediumbound‘) vorgelegt werden, damit möglichst viele Informationen in den Untersuchungsberichten enthalten sind und die Ergebnisse somit entsprechend den speziellen Anforderungen interpretiert werden können.

9.1.2.   In dem Bericht muss das zur Extraktion der PCDD/PCDF, dioxinähnlichen PCB und Lipide verwendete Verfahren genannt werden.

9.1.3.   Die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards sind zur Verfügung zu stellen, falls die Wiederfindungen außerhalb des unter Nummer 7.2.5 genannten Bereichs liegen, falls die Gehalte in den Proben den Höchstgehalt überschreiten sowie in anderen Fällen auf Nachfrage.

9.1.4.   Da bei der Entscheidung über die Konformität einer Probe die Messunsicherheit zu berücksichtigen ist, ist dieser Parameter vorzulegen. Das Analyseergebnis ist als x +/– U anzugeben, wobei x das Analyseergebnis darstellt und U die erweiterte Messunsicherheit unter Verwendung eines Faktors von 2, was einem Vertrauensniveau von ca. 95 % entspricht. Bei einer getrennten Bestimmung des Gehalts an PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB ist die Summe der geschätzten erweiterten Messunsicherheit der getrennten Analyseergebnisse der PCDD/PCDF und dioxinähnlichen PCB für die Berechnung der Summe der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB zu verwenden.

9.1.5.   Wird die Messunsicherheit durch Anwendung des CCα (vgl. Nummer 2.2) berücksichtigt, so ist dieser Parameter anzugeben.

9.1.6.   Die Ergebnisse sind in denselben Einheiten und mit mindestens derselben Anzahl signifikanter Stellen anzugeben wie die in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalte.

9.2.   Bioanalytische Screening-Verfahren

9.2.1.   Das Ergebnis des Screenings ist anzugeben als ‚konform‘ oder ‚vermutlich nicht konform‘.

9.2.2.   Außerdem können Ergebniswerte für PCDD/PCDF und/oder dioxinähnliche PCB in BEQ, nicht TEQ, angegeben werden.

9.2.3.   Wird eine Messunsicherheit hinsichtlich des BEQ-Gehalts angegeben, z. B. als Standardabweichung, muss sie auf einer mindestens dreifachen Analyse der Probe beruhen, einschließlich Extraktion, Reinigung und Ermittlung des Testsignals.

9.2.4.   Proben, deren Gehalt unterhalb der Meldegrenze liegt, sind als solche zu bezeichnen.

9.2.5.   In dem Bericht muss für jede Art von Probenmatrix die interessierende Konzentration genannt werden, auf der die Bewertung beruht.

9.2.6.   Aus dem Bericht müssen die Art des verwendeten Tests, die grundlegenden Testprinzipien und die Art der Kalibrierung hervorgehen.

9.2.7.   In dem Bericht muss das zur Extraktion der PCDD/PCDF, dioxinähnlichen PCB und Lipide verwendete Verfahren genannt werden.

KAPITEL III

Probenvorbereitung und Anforderungen an Untersuchungsverfahren zur amtlichen Kontrolle des Gehalts an nicht dioxinähnlichen PCB (PCB-Nrn. 28, 52, 101, 138, 153, 180)

1.   Anzuwendende Nachweisverfahren

Gaschromatografie/Elektroneneinfangdetektor (GC/ECD), GC/LRMS, GC/MS-MS, GC/HRMS oder gleichwertige Verfahren.

2.   Bestimmung und Bestätigung der interessierenden Analyten

2.1.   Relative Retentionszeit im Verhältnis zu internen Standards oder Referenzstandards (akzeptable Abweichung +/– 0,25 %).

2.2.   Gaschromatografische Trennung aller sechs Indikator-PCB (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 und PCB 180) von interferierenden Stoffen, insbesondere von koeluierenden PCB und insbesondere dann, wenn die Gehalte der Proben an der gesetzlichen Grenze liegen und bestätigt werden muss, dass sie nicht konform sind.

Hinweis:

Kongenere, die oft koeluieren, sind beispielsweise PCB 28/31, PCB 52/69 und PCB 138/163/164. Bei GC/MS-Verfahren muss auch die Möglichkeit von Störungen durch Fragmente höher chlorierter Kongenere berücksichtigt werden.

2.3.   Anforderungen an GC/MS-Techniken

Prüfung von mindestens

a)	zwei spezifischen Ionen bei HRMS;

b)	zwei spezifischen Ionen mit m/z > 200 oder drei spezifischen Ionen mit m/z > 100 bei LRMS,

c)	1 Vorläufer-Ion und 2 Produkt-Ionen bei MS-MS.

Zulässige Höchsttoleranzen für das Isotopenhäufigkeitsverhältnis für ausgewählte Massenfragmente:

Relative Abweichung des Isotopenhäufigkeitsverhältnisses ausgewählter Massenfragmente von der theoretischen Häufigkeit oder dem Kalibrierstandard für das Zielion (das am häufigsten vorkommende Ion) und das/die Qualifizier-Ion/en.

Relative Intensität des/der Qualifizier-Ions/-Ionen im Vergleich zum Zielion	GC-EI-MS (relative Abweichung)	GC-CI-MS, GC-MSn (relative Abweichung)
> 50 %	± 10 %	± 20 %
> 20 bis 50 %	± 15 %	± 25 %
> 10 bis 20 %	± 20 %	± 30 %
≤ 10 %	± 50 % (12)	± 50 % (12)

2.4.   Anforderungen an GC/ECD-Techniken

Ergebnisse, die die Toleranzgrenze überschreiten, sind anhand von zwei GC-Säulen mit stationären Phasen unterschiedlicher Polarität zu bestätigen.

3.   Nachweis der Leistungsfähigkeit des Verfahrens

Die Leistungsfähigkeit der Methode im interessierenden Bereich (0,5 bis 2 Mal interessierende Konzentration) mit einem akzeptablen Variationskoeffizienten für wiederholte Analysen (siehe Anforderungen an die Laborpräzision unter Nummer 8) ist zu validieren.

4.   Bestimmungsgrenze

Die Methodenleerwerte dürfen nicht höher sein als 30 % des Kontaminationswerts, der dem Höchstgehalt entspricht (13).

5.   Qualitätssicherung

Regelmäßige Blindkontrollen, Analysen dotierter Proben, Qualitätssicherungsproben, Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen zu relevanten Matrices.

6.   Kontrolle der Wiederfindungsrate

6.1.   Es sind geeignete interne Standards mit physikalisch-chemikalischen Eigenschaften, die denen der interessierenden Analyten vergleichbar sind, zu verwenden.

6.2.   Zugabe interner Standards:

Zugabe zu Erzeugnissen (vor Extraktion und Clean-up).

6.3.   Anforderungen an Verfahren, in denen alle sechs isotopenmarkierten Indikator-PCB-Kongenere verwendet werden:

a)	Die Ergebnisse sind um die Wiederfindung interner Standards zu korrigieren;

b)	Die Wiederfindung isotopenmarkierter interner Standards muss zwischen 50 und 120 % betragen;

c)	höhere oder geringere Wiederfindungsraten für einzelne Kongenere, die weniger als 10 % der Summe der sechs Indikator-PCB ausmachen, sind akzeptabel.

6.4.   Anforderungen an Verfahren, in denen nicht alle sechs isotopenmarkierten internen Standards oder andere interne Standards verwendet werden:

a)	die Wiederfindung des/der internen Standards ist in jeder Probe zu überprüfen;

b)	die Wiederfindungen des/der internen Standard(s) muss zwischen 60 und 120 % betragen;

c)	die Ergebnisse sind um die Wiederfindungen interner Standards zu korrigieren.

6.5.   Die Wiederfindungen nicht markierter Kongenere sind mittels dotierter Proben oder Qualitätskontrollproben mit Konzentrationen im interessierenden Bereich zu prüfen. Für diese Kongenere sind Wiederfindungsraten zwischen 70 und 120 % akzeptabel.

7.   Anforderungen an Laboratorien

Gemäß den Bestimmungen der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 müssen die Laboratorien von einer anerkannten Stelle akkreditiert sein, die nach ISO Guide 58 arbeitet, damit sichergestellt ist, dass die Laboratorien bei der Untersuchung Qualitätssicherungsverfahren anwenden. Die Laboratorien müssen gemäß der Norm ISO/IEC/17025 akkreditiert sein.

8.   Leistungsmerkmale: Kriterien für die Summe der sechs Indikator-PCB im interessierenden Bereich

Richtigkeit	– 30 bis + 30 %
Laborpräzision (RSD%)	≤ 20 %
Differenz zwischen berechneter Obergrenze (‚upperbound‘) und Untergrenze (‚lowerbound‘)	≤ 20 %

9.   Bericht über die Ergebnisse

9.1.   Sofern das Untersuchungsverfahren dies zulässt, müssen die Untersuchungsergebnisse die Werte der einzelnen PCB-Kongenere enthalten und als Untergrenze, Obergrenze und Mittelwert vorgelegt werden, damit möglichst viele Informationen in den Untersuchungsberichten enthalten sind und die Ergebnisse somit entsprechend den speziellen Anforderungen interpretiert werden können.

9.2.   In dem Bericht muss das zur Extraktion der PCB und Lipide verwendete Verfahren genannt werden.

9.3.   Die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards sind zur Verfügung zu stellen, falls die Wiederfindungen außerhalb des unter Nummer 6 genannten Bereichs liegen, falls die Gehalte in den Proben den Höchstgehalt überschreiten sowie in anderen Fällen auf Nachfrage.

9.4.   Da bei der Entscheidung über die Konformität einer Probe die Messunsicherheit zu berücksichtigen ist, ist dieser Parameter ebenfalls vorzulegen. Das Analyseergebnis ist als x +/– U anzugeben, wobei x das Analyseergebnis darstellt und U die erweiterte Messunsicherheit unter Verwendung eines Faktors von 2, was einem Vertrauensniveau von ca. 95 % entspricht.

9.5.   Wird die Messunsicherheit durch Anwendung des CCα (vgl. Kapitel I Nummer 2.1.) berücksichtigt, so ist dieser Parameter anzugeben.

9.6.   Die Ergebnisse sind in denselben Einheiten und mit mindestens derselben Anzahl signifikanter Stellen anzugeben wie die in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalte.“