ANHANG I

(Artikel 1)

LISTE DER REFERENZMETHODEN

Index Mind. = Mindestwert, Max. = Höchstwert, Anhang = Anhang der zitierten Verordnung, FFTM = Fettfreie Trockenmasse, PZ = Peroxidzahl, A = Aussehen, G = Geschmack, K = Konsistenz, TBC = Gesamtkolonienzahl, Therm = thermophile Keimzahl, MS = Mitgliedstaat, IDF = International Dairy Federation, ISO = International Standards Organisation, IUPAC = International Union of Pure and Applied Chemistry, ADPI = American Dairy Products Institute, LCS = gezuckerte Kondensmilch, LCC = eingedampfte Milch oder Sahne).

TEIL A

Verordnung der Kommission	Erzeugnis	Parameter	Grenzwert (1)	Referenzmethode	Anmerkung
Verordnung (EG) Nr. 2771/1999 — Öffentliche Lagerhaltung	Ungesalzene Butter	Fett	Mind. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Wasser	Bis zu 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FFTM	Bis zu 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Säuregrad	1,2 mmol/100 g Fett	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PZ (max.)	0,3 mEq. Sauerstoff/1 000 g Fett	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Anmerkung 1
		Coliforme Keime	Nicht nachweisbar in 1 g	Anhang X	Anmerkung 3
		Fremdfett	Nicht nachweisbar durch Triglyceridanalyse	Anhang XX
		Sterol-Kennzeichnungsmittel	Nicht nachweisbar, β-Sitosterin ≤40 mg/kg	Anhang VIII
		Sonstige Kennzeichnungsmittel
		— Vanillin	Nicht nachweisbar	Anhang VI
		— Carotinsäure-Ethylester	≤6 mg/kg	Anhang VII
		— Önanthsäure-Triglyceride	Nicht nachweisbar	Anhang V
		Sensorische Merkmale	Mindestens 4 von 5 Punkten für Aussehen, Geschmack und Konsistenz	Anhang IV
		Wasserdispersion	Mindestens 4 Punkte	ISO 7586:1985|IDF 112A:1989
Verordnung (EG) Nr. 2771/1999 — Private Lagerhaltung	Ungesalzene Butter	Fett	Mind. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Wasser	Bis zu 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FFTM	Bis zu 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Verordnung (EG) Nr. 2771/1999 — Private Lagerhaltung	Gesalzene Butter	Fett	Mind. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Wasser	Bis zu 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FFTM (ohne Salz)	Bis zu 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Salz	Bis zu 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Verordnung (EG) Nr. 1898/2005 Kapitel II	Ungesalzene Butter	Fett	Mind. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Fremdfett		Anhang XX
		Wasser	Bis zu 16 % m/m	ISO 3727-1 2001|IDF 80-1:2001
		FFTM	Bis zu 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Kennzeichnungsmittel
		— Sterole	Siehe Anhang VIII	Anhang VIII
		— Vanillin	Siehe Anhang VI	Anhang VI
		— Carotinsäure-Ethylester	Siehe Anhang VII	Anhang VII
		— Önanthsäure-Triglyceride	Siehe Anhang V	Anhang V
Verordnung (EG) Nr. 1898/2005 Kapitel II	Gesalzene Butter	Fett	Mind. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Fremdfett		Anhang XX
		Wasser	Bis zu 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FFTM (ohne Salz)	Bis zu 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Salz	Bis zu 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Kennzeichnungsmittel
		— Sterole	Siehe Anhang VIII	Anhang VIII
		— Vanillin	Siehe Anhang VI	Anhang VI
		— Carotinsäure-Ethylester	Siehe Anhang VII	Anhang VII
		— Önanthsäure-Triglyceride	Siehe Anhang V	Anhang V
Verordnung (EG) Nr. 1898/2005 Kapitel II	Butterfett	Fett	Mind. 99,8 % m/m	|IDF 24:1964
		Wasser und FFTM	Bis zu 0,2 % m/m	ISO 5536:2002|IDF 23:2002 (Feuchtigkeit) IDF 24:1964 (FFTM)
		Säuregrad	1,2 mmol/100 g Fett	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PZ (max.)	0,5 mEq Sauerstoff/1 000 g Fett	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Anmerkung 1
		Fremdfett	Ohne	Anhang XX
		Geschmack	Unverfälscht
		Geruch	Kein Fremdgeruch
		Sonst.	Keine Neutralisierungsmittel, Antioxidantien und Konservierungsmittel
		Kennzeichnungsmittel
		— Sterole	Siehe Anhang VIII	Anhang VIII
		— Vanillin	Siehe Anhang VI	Anhang VI
		— Carotinsäure-Ethylester	Siehe Anhang VII	Anhang VII
		— Önanthsäure-Triglyceride	Siehe Anhang V	Anhang V
Verordnung (EG) Nr. 1898/2005 Kapitel II	Rahm	Fett	Mind. 35 % m/m	ISO 2450:1999|IDF 16 C:1987
		Fremdfett		Anhang XX
		Kennzeichnungsmittel
		— Sterole	Siehe Anhang VIII		Anmerkung 2
		— Vanillin	Siehe Anhang VI	Anhang VI
		— Carotinsäure-Ethylester	Siehe Anhang VII		Anmerkung 2
		— Önanthsäure-Triglyceride	Siehe Anhang V	Anhang V
Verordnung (EG) Nr. 1898/2005 Kapitel III	Butterfett	Fett	Mind. 96 % m/m		Anmerkung 2
		Fremdfett		Anhang XX
		FFTM	Bis zu 2 % m/m		Anmerkung 2
		Kennzeichnungsmittel
		— Stigmasterin (95 % m/m)	15 g/100 kg Butterfett	Anhang VIII
		— Stigmasterin (85 % m/m)	17 g/100 kg Butterfett	Anhang VIII
		— Önanthsäure-Triglyceride	10,34 kg/t Butterfett	Anhang V
		— Ethylester der Buttersäure und Stigmasterin		— Ethylester der Buttersäure — Stigmasterin: Anhang VIII	Anmerkung 2
		— Ethylester der Buttersäure und Önanthsäure-Triglyceride		— Ethylester der Buttersäure — Önanthsäure-Triglyceride: Anhang V	Anmerkung 2
		Lecithin (E 322)	Bis zu 0,5 % m/m		Anmerkung 2
		NaCl	Bis zu 0,75 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Säuregrad	1,2 mmol/100 g Fett	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PZ (max.)	Bis zu 0,5 mEq. Sauerstoff/1 000 g Fett	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Anmerkung 1
		Geschmack	Unverfälscht
		Geruch	Ohne Fremdgeruch
		Sonstige	Ohne Neutralisierungsmittel, Antioxidantien und Konservierungsmittel
Verordnung (EG) Nr. 1898/2005 Kapitel IV	Ungesalzene Butter	Fett	Mind. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Wasser	Bis zu 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FFTM	Bis zu 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Verordnung (EG) Nr. 1898/2005 Kapitel IV	Gesalzene Butter	Fett	Mind. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Wasser	Bis zu 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FFTM (ohne Salz)	Bis zu 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Salz	Bis zu 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Artikel 9 und Titel II der Verordnung (EG) Nr. 1255/1999	Käse aus Schafsmilch und/oder Ziegenmilch	Kuhmilch	<1 % m/m	Anhang IX
Verordnung (EWG) Nr. 2921/90	Anhang I — Säurekasein	Wasser	Bis zu 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Fett	Bis zu 1,75 % m/m	ISO 5543:2004|IDF127:2004
		Freie Säure	Bis zu 0,30 ml 0,1 n NaOH-Lösung	ISO 5547:1978|IDF 91:1979
Verordnung (EWG) Nr. 2921/90	Anhang I — Labmolke	Wasser	Bis zu 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Fett	Bis zu 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Asche	Mind. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|IDF 90:1979
Verordnung (EWG) Nr. 2921/90	Anhang I — Kaseinate	Wasser	Bis zu 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Milcheiweiß	Mind. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Fett und Asche	Bis zu 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Gebundene Asche		ISO 5544:1978|IDF 89:1979
		Asche		ISO 5545:1978|IDF 90:1979
Verordnung (EWG) Nr. 2921/90	Anhang II — Säurekasein	Wasser	Bis zu 10,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Fett	Bis zu 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Freie Säure	Bis zu 0,20 ml 0,1 n NaOH-Lösung/g	ISO 5547:1978|IDF 91:1979
		TBC (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkung 3
		Coliforme Keime	Keine in 0,1 g	Anhang X	Anmerkung 3
		Therm. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkungen 3 und 4
Verordnung (EWG) Nr. 2921/90	Anhang II — Labkasein	Wasser	Bis zu 8,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Fett	Bis zu 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Asche	Mind. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TBC (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkung 3
		Coliforme Keime	Keine in 0,1 g	Anhang X	Anmerkung 3
		Therm. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkungen 3 und 4
Verordnung (EWG) Nr. 2921/90	Anhang II — Kaseinate	Wasser	Bis zu 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Milcheiweiß	Mind. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Fett und Asche	Bis zu 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004 ISO 5544:1978|IDF 89:1979 oder ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TBC (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkung 3
		Coliforme Keime	Keine in 0,1 g	Anhang X	Anmerkung 3
		Therm. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkungen 3 und 4
Verordnung (EWG) Nr. 2921/90	Anhang III — Kaseinate	Wasser	Bis zu 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Milcheiweiß	Mind. 85,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Fett	Bis zu 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Laktose	Bis zu 1,00 % m/m	ISO 5548:2004|IDF 106:2004
		Asche	Bis zu 6,50 % m/m	ISO 5544:1978|IDF 89:1979 oder ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TBC (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkung 3
		Coliforme Keime	Keine in 0,1 g	Anhang X	Anmerkung 3
		Therm. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkungen 3 und 4
Änderung der Verordnung (EG) Nr. 2799/1999	Mischfutter und Magermilchpulver (MMP) (Fütterung)	Wasser (saures Buttermilchpulver)	Bis zu 5 % m/m	Anhang XIX
		Eiweiß	31,4 % m/m (mind.) der fettfreien Trockenmasse	ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
		Wasser (MMP)	Bis zu 5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Fette (MMP)	Bis zu 11 % m/m	ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
		Labmolke (MMP)	Keine	Anhang XIII	Anmerkung 6
		Stärke (MMP)	Keine	Anhang XVII
		Wasser (Mischungen)	Bis zu 5 % m/m der fettfreien Trockenmasse	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Fett (Mischungen)		Kommissionsrichtlinie 84/4/EWG (ABl. L 15 vom 18.1.1984, S. 29)
		Labmolke (Mischungen)	Keine	Anhang XIII
		MMP-Gehalt (im Endprodukt)	Mind. 50 % m/m	Anhang XVI
		Fett (im Endprodukt)	Mind. 2,5 % m/m oder 5 % m/m	Kommissionsrichtlinie 84/4/EWG (ABl. L 15 vom 18.1.1984, S. 29)	Anmerkung 7
		Stärke (im Endprodukt)	Mind. 2 % m/m	Anhang XVII	Anmerkung 8
		Kupfer (im Endprodukt)	25 ppm	Kommissionsrichtlinie 78/633/EWG (ABl. L 206 vom 26.7.1987, S. 43)
Verordnung (EG) Nr. 214/2001	MMP (sprühgetrocknet)	Fett	Bis zu 1,0 % m/m	ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
		Eiweiß	31,4 % (2)m/m (mind.) der fettfreien Trockenmasse	ISO 8968-1/2:2001|IDF 20-1/2:2001
		Wasser	Bis zu 3,5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Säuregrad	Bis zu 19,5 ml, 0,1 n NaOH, 10 g fettfreie Trockenmasse	ISO 6091:1980|IDF 86:1981
		Laktate	Bis zu 150 mg/100 g fettfreie Trockenmasse	ISO 8069:2005|IDF 69:2005
		Phosphatase	Negativ	ISO 11816-1:2006|IDF 155-1:2006
		Löslichkeit	Bis zu 0,5 ml bei 24 °C	ISO 8156:2005|IDF 129:2005
		Verbrannte Teilchen	Filterscheiben A oder B (15,0 mg)	ADPI (1990)
		TBC	40 000/g	ISO 4833:2003	Anmerkung 3
		Coliforme Keime	Negativ/0,1 g	Anhang X	Anmerkung 3
		Buttermilch	Negativ	Anhang XIV
		Molke-Lab	Negativ	Anhang XII
		Molke-Säure	Negativ		Anmerkung 2
		Antibakterielle Stoffe		Anhang XV

TEIL B

Die in Teil B genannten Referenzmethoden können bei der Analyse sämtlicher Produkte verwendet werden, die mindestens einer der in Spalte 1 genannten Verordnungen unterliegen.

Verordnung der Kommission	Produkt	KN-Code	Parameter	Grenzwert	Referenzmethode	Anmerkung
Verordnung (EWG) Nr. 2658/87 Verordnung (EG) Nr. 2535/2001 Verordnung (EG) Nr. 1282/2006	Milch und Rahm, weder eingedickt noch mit Zusatz von Zucker oder anderen Süßmitteln	0401	Fett (≤6 % m/m)	Die Grenzwerte wurden der Beschreibung des KN-Codes des jeweiligen Produkts bzw. Teil 9 der in der Verordnung (EWG) Nr. 3846/87 der Kommission (ABl. L 366 vom 24.12.1987, S. 1) enthaltenen Nomenklatur für Ausfuhrerstattungen oder der Verordnung (EG) Nr. 2535/2001 (ABl. L 341 vom 22.12.2001, S. 29) entnommen.	ISO 1211:2001|IDF 1D:1996
			Fett (> 6 % m/m)		ISO 2450:1999|IDF 16C:1987
	Milch und Rahm, eingedickt oder mit Zusatz von Zucker oder anderen Süßmitteln	0402	Fett (flüssig)		ISO 1737:1999|IDF 13C:1987
			Fett (fest)		ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
			Eiweiß		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF20-1|2|3:2001
			Saccharose (normaler Gehalt)		ISO 2911:2004 |IDF 35:2004
			Saccharose (niedriger Gehalt)			Anmerkung 2
			Gesamtfeststoffe (LCS)		ISO 6734:1989|IDF 15B:1991
			Gesamtfeststoffe (LCC)		ISO 6731:1989|IDF 21B:1987
			Wasser (Milchpulver)		ISO 5537:2004|IDF 26:2004
			Wasser (Rahmpulver)		Anhang XVIII
	Buttermilch, fermentierte oder gesäuerte Milch (einschließlich Rahm) eingedickt oder nicht eingedickt unter Zusatz von Zucker oder anderen Süßmitteln	0403	Fett		ISO 1211:2001|IDF 1D:1996 ISO 1736:2000|IDF 9C:1987 ISO 2450:1999|IDF 16 C:1987 ISO 7208:1999|IDF 22B:1987 ISO 8262-3:2005|IDF 124-3:2005
			Eiweiß		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Saccharose (normaler Gehalt)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Saccharose (niedriger Gehalt)			Anmerkung 2
			Wasser (saures Buttermilchpulver)		Anhang XIX
			Wasser (süßes Buttermilchpulver)		ISO 5537:2004|IDF26:2004
			Gesamtfeststoffe (sonst. Produkte)		Von der zuständigen Behörde zugelassene Methoden
	Molke, auch eingedickt oder mit Zusatz von Zucker oder sonstigen Süßmitteln; Erzeugnisse, die aus natürlichen Milchbestandteilen bestehen	0404	Fett		ISO 1736:2000|IDF 9C:1987 ISO 2450:1999|IDF 16C:1987 ISO 7208:1999|IDF 22B:1987
			Eiweiß		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Saccharose (normaler Gehalt)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Saccharose (niedriger Gehalt)			Anmerkung 2
		0404 90	Eiweiß		ISO 8968 1/2 2001|IDF 20-1/2:2001
			Wasser		IDF 21B:1987
			Gesamtfeststoffe		ISO 6734:1989|IDF 15B:1991
			(Eingedickte Produkte)		ISO 6731:1989|IDF 21B:1987
	Butter und sonstige Fettstoffe aus Milch; Milchstreichfette	0405	Fett (wenn ≤ 85 % m/m)		ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Butter	Wasser		ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
			FFTM		ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
			NaCl		ISO 15648:2004|IDF 179:2004
			Fett (wenn > 99 % m/m)		IDF 24:1964
	Butterschmalz		Wasser (wenn Fett < 99 % m/m)		ISO 5536:2002|IDF 23:2002
	Käse und Quark/Topfen	0406	Fett		ISO 1735:2004|IDF 5:2004
			Trockenmasse		ISO 5534:2004|IDF 4:2004
			Trockenmasse (Ricotta)		ISO 2920:2004|IDF 58:2004
			NaCl		ISO 5943:2006|IDF 88:2006
			Laktose		ISO 5765-1/2:2002|IDF 79-1/2:2002
Verordnung (EWG) Nr. 2658/87	Mischfutter	2309	Laktose		Anhang XI

Anmerkungen zur Liste der EU-Referenzmethoden

Anmerkung 1: Milchfettisolierung siehe ISO 1740:1991 (Lichtschutz).

Anmerkung 2: Es wurde keine Referenzmethode festgelegt. Die Methoden wurden von der zuständigen Behörde zugelassen.

Anmerkung 3: Vorbereitung der Probe gemäß ISO 8261:2001|IDF 122:2001.

Anmerkung 4: Bebrütung 48 Stunden bei einer Temperatur von 55 °C; das Austrocknen des Nährmediums ist zu verhindern.

Anmerkung 5: % m/m FFTM = % m/m Trockenmasse — % m/m Fett.

Anmerkung 6: Richtlinie 84/4/EWG der Kommission.

Anmerkung 7: Verordnung (EG) Nr. 2799/1999 der Kommission (ABl. L 340 vom 31.12.1999, S. 3–27).

Anmerkung 8: Richtlinie 78/633/EWG der Kommission.

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(1)  Unbeschadet der Anforderungen der jeweiligen Verordnung.

(2)  Der Mindesteiweißgehalt müsste zum 1. September 2009 34 % betragen.

ANHANG II

(Artikel 3)

BEWERTUNG DER KONFORMITÄT EINER PARTIE MIT DEN GESETZLICHEN GRENZWERTEN

1.   KURZBESCHREIBUNG

Wenn die maßgeblichen Rechtsvorschriften ausführliche Verfahren für die Probenahme vorsehen, sind diese Verfahren einzuhalten. Ansonsten ist aus einer zur Kontrolle vorgelegten Partie grundsätzlich eine aus mindestens drei Probeneinheiten bestehende Stichprobe zu nehmen. Es kann eine Sammelprobe hergestellt werden. Das ermittelte Ergebnis wird mit den gesetzlichen Grenzwerten verglichen, indem ein Konfidenzintervall von 95 % (zweifache Standardabweichung) berechnet wird; die jeweilige Standardabweichung hängt davon ab, 1. ob die betreffende Methode im Wege einer internationalen Zusammenarbeit durch Werte für σr und σR validiert wurde bzw. 2. — bei interner Validierung — ob ein Wert für die interne Wiederholbarkeit berechnet wurde. Dieses Konfidenzintervall gibt dann Aufschluss über die Messunsicherheit des Ergebnisses.

2.   DIE METHODE WIRD IM WEGE INTERNATIONALER ZUSAMMENARBEIT VALIDIERT

In diesem Fall wurden die Wiederholstandardabweichung σr und die Vergleichsstandardabweichung σR ermittelt, und das Laboratorium kann die Konformität mit den Leistungsmerkmalen der validierten Methode nachweisen.

Das arithmetische Mittel der n wiederholten Messungen wird verglichen.

Die erweiterte Messunsicherheit (k = 2) von wird mit folgender Formel berechnet:

Wenn das Endergebnis x der Messung mit einer Gleichung der Form x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 oder x = y 1 / y 2 berechnet wird, sind die üblichen Verfahren zur Kombination von Standardabweichungen in diesen Fällen anzuwenden.

Die Partie wird als nicht konform mit dem oberen gesetzlichen Grenzwert UL eingestuft, wenn gilt:

;

Ansonsten ist die Konformität der Partie mit UL festzustellen.

Die Partie wird als nicht mit dem unteren gesetzlichen Grenzwert LL eingestuft, wenn

ist.

Ansonsten wird die Konformität mit LL festgestellt.

3.   INTERNE VALIDIERUNG UNTER BERECHNUNG DER INTERNEN VERGLEICHSSTANDARDABWEICHUNG

Wenn in dieser Verordnung nicht spezifizierte Methoden verwendet werden und keine Präzisionsmessungen durchgeführt wurden, ist eine interne Validierung vorzunehmen. Die interne Wiederholstandardabweichung sir und die interne Vergleichsstandardabweichung siR sind anstelle von σr bzw. σ R in der Formel zur Berechnung der erweiterten Messunsicherheit U zu verwenden.

Es gelten die in Absatz 1 genannten Entscheidungskriterien. Wenn die Partie allerdings als nicht mit den gesetzlichen Grenzwerten konform bewertet wird, müssen die Messungen mit der in dieser Verordnung genannten Methode wiederholt werden, und es ist eine Entscheidung gemäß Absatz 1 zu treffen.

ANHANG III

(Artikel 4)

BEWERTUNG DER PRÜFPERSONEN UND DER ZUVERLÄSSIGKEIT DER ERGEBNISSE BEI SENSORISCHEN PRÜFUNGEN

Von den Verfahren mit Skala (IDF-Norm 99C:1997) sind folgende Verfahren anwendbar:

A.   BESTIMMUNG DES „WIEDERHOLINDEXES“

Während eines Zeitraums von 12 Monaten werden mindestens zehn Proben als Blind-Doppelanalysen durch eine Prüfperson analysiert. Diese Analyse erfolgt gewöhnlich zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Ergebnisse für individuelle Produktmerkmale werden anhand folgender Formel bewertet:

Dabei sind:

w1	:	Wiederholindex
xi1	:	Punktzahl für die erste Bewertung der Probe xi
xi2	:	Punktzahl für die zweite Bewertung der Probe xi
n	:	Anzahl Proben

Die zu beurteilenden Proben müssen einen breiten Qualitätsbereich umfassen. w1 darf den Wert 1,5 (5-Punkte-Skala) nicht überschreiten.

B.   BESTIMMUNG DES „ABWEICHUNGSINDEXES“

Dieser Index ist zu verwenden um nachzuprüfen, ob eine Prüfperson die gleiche Skala für Qualitätsbewertung wie eine erfahrene Prüfpersonengruppe verwendet. Die von der Prüfperson erzielten Ergebnisse werden mit dem Durchschnitt der von der Prüfpersonengruppe erzielten Ergebnisse verglichen.

Folgende Formel wird für die Bewertung der Ergebnisse verwendet:

Dabei sind:

xi1; xi2	:	Siehe Abschnitt A)
;	:	Durchschnittspunktzahl der Prüfpersonengruppe für die erste bzw. zweite Bewertung von Probe xi
n	:	Anzahl Proben (mindestens zehn innerhalb von 12 Monaten)

Die zu bewertenden Proben müssen einen weiten Qualitätsbereich erfassen. D1 darf den Wert 1,5 (5-Punkte-Skala) nicht überschreiten.

Die Mitgliedstaaten teilen alle Schwierigkeiten bei der Anwendung dieses Verfahrens mit.

Wenn festgestellt wird, dass bei einzelnen Prüfpersonen der Grenzwert 1,5 für den Abweichungs- oder den Wiederholungsindex überschritten wurde, müssen Experten der zuständigen Behörden binnen der jeweils nächsten Wochen mindestens eine Stichprobe unter den von diesen Prüfpersonen bewerteten Proben einer „erneuten Prüfung“ unterziehen oder mindestens eine weitere „begleitete“ Prüfung gemeinsam mit diesen Prüfpersonen durchführen. Eine sorgfältige Überwachung ist die Voraussetzung für die Entscheidung, ob diese Prüfpersonen weiter in Anspruch genommen werden sollen. Die Ergebnisse sollten dokumentiert und für etwaige Folgemaßnahmen als Nachweis aufbewahrt werden.

C.   VERGLEICH DER IN VERSCHIEDENEN REGIONEN EINES MITGLIEDSTAATS UND IN VERSCHIEDENEN MITGLIEDSTAATEN ERZIELTEN ERGEBNISSE

Wenn durchführbar, wird mindestens einmal pro Jahr ein Versuch organisiert, um den Vergleich der Ergebnisse der Prüfpersonen verschiedener Regionen zu ermöglichen. Werden signifikante Unterschiede beobachtet, müssen die erforderlichen Maßnahmen getroffen werden, um die Gründe zu ermitteln und zu vergleichbaren Ergebnissen zu gelangen.

Die Mitgliedstaaten können Versuche organisieren, die den Vergleich der Ergebnisse ihrer eigenen Prüfpersonen mit den Ergebnissen von Prüfpersonen der benachbarten Mitgliedstaaten ermöglichen. Bei signifikanten Unterschieden muss eine gründliche Untersuchung erfolgen, um zu vergleichbaren Ergebnissen zu gelangen.

Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission die Ergebnisse dieser Vergleiche mit.

ANHANG IV

(Artikel 4)

SENSORISCHE PRÜFUNG VON BUTTER

1.   ANWENDUNGSBEREICH

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren für die sensorische Prüfung von Butter, das einheitlich in allen Mitgliedstaaten angewandt werden soll.

Nähere Informationen sind der geltenden Norm für Milch und Milcherzeugnisse IDF 99 — Teile 1, 2 und 3 über sensorische Prüfungen zu entnehmen.

2.   BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Sensorische Prüfung (Sinnenprüfung): Beurteilung der Merkmale eines Erzeugnisses durch menschliche Sinne.

Prüfergruppe: Gruppe von ausgewählten Prüfern, bei deren Arbeit es nicht zu einem Gedankenaustausch oder einer gegenseitigen Beeinflussung kommen darf.

Prüfperson: eine Person, die wegen ihrer Fähigkeit zur Durchführung einer sensorischen Prüfung ausgewählt wurde; dieser Typ von Prüfpersonen kann über eingeschränkte Erfahrung verfügen.

Fachkundige Prüfperson: eine Person mit hoch entwickelter sensorischer Empfindlichkeit und ausgeprägter Erfahrung mit Methoden zur sensorischen Prüfung, die konsistente und zuverlässige sensorische Bewertungen unterschiedlicher Produkte vornehmen kann; dieser Typ von Prüfpersonen verfügt über ein gutes sensorisches Langzeitgedächtnis.

Bewertende Prüfung: sensorische Prüfung durch eine Prüfergruppe anhand einer Punkteskala; eine Terminologie zur Bezeichnung von Fehlern ist zu verwenden.

Benotende Prüfung: Qualitätseinstufung aufgrund der bewertenden Prüfung.

Prüfformulare: Formulare zur Aufzeichnung der Einzelmesswerte für jedes Merkmal und der Gesamtnote des Erzeugnisses. (Dieses Formular kann auch zur Aufzeichnung der chemischen Zusammensetzung verwendet werden.)

3.   PRÜFRAUM

Siehe ISO 8589 und ISO/DIS 22935-2|IDF 99-2 Absatz 7.

Es ist dafür Sorge zu tragen, dass die Prüfer im Prüfraum nicht durch äußere Einflüsse gestört werden.

Der Prüfraum muss frei von Fremdgerüchen und einfach zu reinigen sein. Die Wände müssen hell sein und dürfen nicht reflektieren.

Der Prüfraum und seine Beleuchtung müssen so beschaffen sein, dass die zu prüfenden Produktmerkmale nicht beeinflusst werden.

Der Raum muss mit einer geeigneten Thermostatregelung ausgestattet sein, um eine gleich bleibende Temperatur der Butter sicherstellen zu können. Die Butter sollte bei der benotenden Prüfung eine Temperatur von 12 °C (±2 °C) haben.

4.   AUSWAHL DER PRÜFPERSONEN

Die Prüfperson muss mit Buttererzeugnissen vertraut und zur sensorischen Prüfung geeignet sein. Ihre Eignung ist von der zuständigen Behörde regelmäßig zu überprüfen (mindestens einmal jährlich).

4.1.   ISO/DIS 22935-1|IDF 99-1 Absatz 4 (Einstellung) und Absatz 5.1 sind bezüglich der allgemeinen Anforderungen sowie der Prüfungen zu beachten, die möglicherweise vor dem offiziellen Einsatz einer neuen Prüfperson durchzuführen sind.

Wesentlich ist, dass ständig Schulungsmaßnahmen durchgeführt werden, und regelmäßig sollten allgemeine Zusammenkünfte stattfinden. Bezüglich der Qualifizierung der Prüfergruppe ist ISO 8586-1 zu beachten.

4.2.   Eine erste Qualifizierungsmaßnahme sollte folgende Inhalte zum Gegenstand haben:

—	allgemeine Theorie und praktische Bedeutung der sensorischen Prüfung;

—	Methoden, Punkte-Skalen und Beschreibung sensorischer Eindrücke;

—	Erkennung und Nachweis sensorischer Merkmale und spezifische sensorische Begriffe;

—	allgemeine Unterweisung zur Herstellung von Butter;

—	validierte Referenzen und Proben, die der Prüfperson helfen können, spezifische Qualitäten und Intensitäten des Produktgeschmacks zu bestimmen.

5.   ANFORDERUNGEN AN DIE PRÜFERGRUPPE

Die Gruppe soll sich aus einer ungeraden Zahl von Prüfern zusammensetzen und mindestens drei Prüfer umfassen. Dabei muss es sich mehrheitlich um Bedienstete der zuständigen Behörde oder um eigens dazu befugte Personen handeln, die nicht für die Milchwirtschaft tätig sind.

Ein Prüfungsleiter ist für das gesamte Verfahren verantwortlich; er kann der Prüfergruppe angehören.

Vor der Prüfung müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden, damit die Prüfer bestmögliche Leistungen erbringen können:

—	Die Prüfer dürfen an keiner Krankheit leiden, die ihre Leistungen beeinträchtigen könnte. Ansonsten muss ein anderer Prüfer in die Gruppe aufgenommen werden;

—	die Prüfer müssen sich pünktlich zur Prüfung einfinden und dafür sorgen, dass sie genügend Zeit für ihre Prüfung haben;

—	die Prüfer sollten keine stark riechenden Erzeugnisse wie Parfüm, Rasierwasser, Deodorants usw. benutzen und keine stark gewürzten Speisen gegessen haben;

—	die Prüfer dürfen während der letzten halben Stunde vor der Prüfung nicht rauchen und nicht essen und ausschließlich Wasser trinken.

6.   LEISTUNGSFÄHIGKEIT

Alle Prüfpersonen sollten regelmäßig in Gruppen zur Durchführung sensorischer Prüfungen eingesetzt werden, damit sie ihre Kompetenz nicht verlieren. Die Häufigkeit wird von der Menge und dem Durchsatz der zu prüfenden Butter abhängen; nach Möglichkeit sollte pro Monat mindestens eine Prüfergruppe zusammenkommen.

Auch erfahrenere Prüfpersonen sollten jährlich an mehreren Prüfergruppen beteiligt werden (möglichst mindestens einmal pro Vierteljahr).

7.   PROBENAHME UND VORBEREITUNG DER PROBE

Entscheidend ist, dass keine störenden Rückschlüsse auf die Identität der Proben gezogen werden können; die Proben sollten codiert werden.

Die entsprechenden Vorkehrungen sollten vor der Prüfung getroffen werden. Die Butter muss während der Beförderung zum Prüfraum entsprechend temperiert sein (6 °C ± 2 °C).

Erfolgt die sensorische Bewertung in einem Kühlhaus, wird die Probe mit Hilfe eines Butterbohrers entnommen. Findet die sensorische Bewertung an einem anderen Ort statt, sollte mindestens eine 500-g-Probe entnommen werden. Während der Prüfung sollte die Butter eine Temperatur von 12 °C (±2 °C) haben; (in ISO/DIS 22935-2|IDF 99-2 wird die Prüftemperatur für Butter mit 14 °C ±2 °C angegeben.) Größere Abweichungen sind unter allen Umständen zu vermeiden.

8.   BEWERTUNG DER PRÜFMERKMALE

8.1.   Die sensorische Prüfung bezieht sich auf drei Merkmale: Aussehen, Konsistenz und Geschmack.

Das „Aussehen“ wird durch folgende Kriterien bestimmt: Farbe, augenscheinliche Reinheit, Fehlen physikalischer Verunreinigungen, Fehlen von Schimmelbildung und Einheitlichkeit der Wasserdispersion. Die Wasserdispersion wird gemäß der IDF-Norm 112A/1989 geprüft.

Die „Konsistenz“ ergibt sich aus folgenden Kriterien: Struktur, Textur undFestigkeit. Die Streichfähigkeit kann physisch geprüft werden, wenn ein einzelner Mitgliedstaat dies wünscht, um den Anforderungen der Kunden nachzukommen. Die Kommission kann beschließen, die Methodik künftig zu harmonisieren.

Der Begriff „Struktur“ bezieht sich auf die Stabilität des Produktes in der vom Verbraucher verwendeten Form. Im Allgemeinen besteht ein Zusammenhang zwischen Struktur, Festigkeit und Streichfähigkeit, und die Struktur sollte im Allgemeinen im gesamten Produkt einheitlich sein. Dieses Merkmal steht in engem Zusammenhang auch mit der Textur und beschreibt die Formstabilität des Produktes unter dem Eigengewicht. Die Struktur zeigt sich in der Schnittfestigkeit und kann mechanisch sowie mit dem Mund und den Fingern erfühlt werden.

Als „Geschmack“ wird die im Mund, vornehmlich durch die Geschmacksknospen der Zunge, wahrnehmbare Beschaffenheit bezeichnet.

Als „Aroma“ wird die mit der Nase und mit dem Geruchssinn wahrnehmbare Beschaffenheit bezeichnet.

Bei einer deutlichen Abweichung von der empfohlenen Temperatur ist eine zuverlässige Prüfung der Konsistenz und des Geschmacks nicht möglich. Die Temperatur ist von größter Bedeutung.

Die benotende Prüfung von Butter muss auf einen späteren Zeitpunkt verschoben werden, wenn die Temperatur außerhalb der empfohlenen Bandbreite liegt.

8.2.   Jedes Merkmal ist separat zu beurteilen. Die Bewertung der Merkmale erfolgt gemäß Tabelle 1.

8.3.   Vor dem Beginn der Prüfung sollten die Prüfer eine gemeinsame Beurteilung einer oder zweier Kontrollproben auf Aussehen, Konsistenz und Geschmack bzw. Aroma durchführen, um Übereinstimmung hinsichtlich der Kriterien zu erzielen.

8.4.   Für die Akzeptanz erforderliche Bewertung

Siehe Teil 7 — Terminologie und Beschreibung der jeweils maßgeblichen Bewertungskriterien.

	Höchstwert	Mindestanforderung
Aussehen	5	4
Konsistenz	5	4
Geschmack/Aroma	5	4

—	Wird die erforderliche Mindestpunktzahl nicht erreicht, ist der jeweilige Mangel zu beschreiben.

—	Die von den einzelnen Prüfern vergebenen Punktzahlen sind auf dem Prüfformular zu vermerken.

—	Das Erzeugnis wird aufgrund der Mehrheitsentscheidung akzeptiert oder verworfen.

—	Fälle, in denen zwischen den einzelnen bewertenden Prüfungen auf die jeweiligen Merkmale größere Unterschiede auftreten als zwischen benachbarten Punkten, sollten Ausnahmen darstellen (höchstens eine von 20 Proben). Anderenfalls ist die Eignung der Prüfergruppe vom Prüfungsleiter zu überprüfen.

9.   ÜBERWACHUNG

Der Prüfungsleiter, bei dem es sich um einen offiziellen Bediensteten der zuständigen Behörde handeln muss und der auch Mitglied der Prüfergruppe sein kann, muss generell für das gesamte Verfahren verantwortlich sein. Er muss alle für jedes Merkmal vergebenen und auf dem Prüfformular vermerkten Bewertungen erfassen und bescheinigen, dass das Erzeugnis akzeptiert oder zurückgewiesen wurde.

10.   TERMINOLOGIE

Siehe Anhang, Tabelle 2.

11.   LITERATUR

FIL-|IDF 99C:1997 Sensory evaluation of dairy products by scoring — Reference method.

ISO/DIS 22935|IDF 99 Milch und Milcherzeugnisse — Sensorische Analyse — Teile 1-3.

ISO 8586-1 Sensorische Analyse; Allgemeine Richtlinien für die Auswahl, Schulung und Überprüfung von Prüfpersonen, Teil 1.

ISO 8589 Sensorische Analyse; Allgemeine Richtlinien für die Gestaltung von Prüfräumen.

FIL-|IDF 112A:1989 Butter — Determination of Wasser dispersion value.

Tabelle 1

Bewertende Prüfung von Butter

Aussehen			Konsistenz			Geschmack + Aroma
Punktzahlen	Nr. (1)	Bewertung	Punktzahlen (Qualitätsklasse)	Nr. (1)	Bewertung	Punktzahl (Qualitätsklasse)	Nr. (1)	Bewertung
5		Sehr gut Idealtyp Höchste Qualität (uniform, seco)	5		Sehr gut Idealtyp Höchste Qualität (gut streichfähig)	5		Sehr gut Idealtyp Höchste Qualität (absolut rein, feinstes Aroma)
4		Gut  (2) Keine offensichtlichen Mängel	4	17 18	Gut  (2) hart weich	4		Gut  (2) keine offensichtlichen Mängel
3	1 2 3 4 5 6 7 8	Genügend (geringe Mängel) wasserlässig zweifarbig (bunt) streifig geflammt, marmoriert fleckig ausgeölt überfärbt locker, nicht kompakt	3	14 15 16 17 18	Genügend (geringe Mängel) kurz, spröde, krümelig salbig, teigig, schmierig klebrig hart weich	3	21 22 25 27 33 34 35	Genügend (geringe Mängel) unrein Fremdgeschmack sauer Kochgeschmack Futtergeschmack herb bitter versalzen
2	1 3 4 5 6 10 11 12	Mangelhaft (offensichtliche Mängel) wasserlässig streifig geflammt, marmoriert fleckig ausgeölt Fremdbestandteile schimmelig ungelöstes Salz	2	14 15 16 17 18	Mangelhaft (offensichtliche Mängel) kurz, spröde, krümelig salbig, schmierig, teigig klebrig hart weich	2	21 22 23 25 32 33 34 35 36 38	Ungenügend (wahrnehmbare Mängel) unrein Fremdgeschmack schal sauer Oxydationsgeschmack, Metallgeschmack Futtergeschmack herb, bitter versalzen dumpf, muffig, faulig Chemikaliengeschmack
1	1 3 4 5 6 7 9 10 11 12	Schlecht (ausgeprägte Mängel) wasserlässig streifig geflammt, marmoriert fleckig ausgeölt überfärbt körnig Fremdbestandteile schimmelig ungelöstes Salz	1	14 15 16 17 18	Sehr mangelhaft (ausgeprägte Mängel) kurz, bröckelig, krümelig salbig, schmierig, teigig klebrig hart weich	1	22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38	Sehr mangelhaft (ausgeprägte Mängel) Fremdgeschmack käsig, käsigsauer sauer hefeartig Schimmelgeschmack ranzig ölig, fischig talgig Oxidationsgeschmack, Metallgeschmack grob, bitter versalzen dumpf, muffig, faulig Malzig Chemikaliengeschmack

Tabelle 2

Mängelbezeichnungen bei Butter

I. Aussehen

1. Wasserlässig

2. Zweifarbig (bunt)

3. Streifig

4. Geflammt, marmoriert

5. Fleckig

6. Ausgeölt

7. Überfärbt

8. Locker (nicht kompakt) (mit Löchern und Spalten)

9. Körnig

10. Fremdbestandteile

11. Schimmelig

12. Ungelöstes Salz

II. Konsistenz

14. Kurz, spröde, krümelig, bröckelig

15. Salbig, teigig, schmierig

16. Klebrig

17. Hart

18. Weich

III. Geruch und Geschmack

20. Ohne Geschmack

21. Unrein (3)

22. Fremdgeschmack

23. Schal

24. Käsig, käsigsauer

25. Sauer

26. Hefeartig

27. a) Kochgeschmack

b) Anbrenngeschmack (brandig)

28. Schimmel-Geschmack

29. Ranzig

30. Ölig, fischig

31. Talgig

32. a) Oxydationsgeschmack

b) Metall-Geschmack

33. Futtermittel-Geschmack

34. Grob, bitter

35. Versalzen

36. Dumpf, muffig, faulig

37. Malzig

38. Chemikalien-Geschmack

---

(1)  Tabelle 2.

(2)  Die unter der Bewertung „gut“ genannten Mängel sind nur als sehr geringfügige Abweichungen vom Idealtyp zu betrachten.

(3)  Diese Mängelbezeichnung soll möglichst wenig verwendet und auf die Fälle beschränkt werden, in denen der Geschmacksmangel nicht genauer umschrieben werden kann.

ANHANG V

(Artikel 5)

BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ÖNANTHSÄURE-TRIGLYCERID IN BUTTER, BUTTERSCHMALZ UND RAHM DURCH GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE DER TRIGLYCERIDE

1.   ANWENDUNGSBEREICH

Im Folgenden wird eine Methode zur Bestimmung des Gehalts an Önanthsäure-Triglycerid in Butterschmalz, Butter und Rahm beschrieben.

2.   BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Önanthsäure-Gehalt: Der mit dem in dieser Methode beschriebenen Verfahren ermittelte Gehalt an Önanthsäure-Triglycerid.

Anmerkung: Der Önanthsäure-Gehalt wird bei Butterschmalz und Butter ausgedrückt in kg/t Produkt und bei Rahm in kg/t Milchfett.

3.   KURZBESCHREIBUNG

Milchfett wird aus den verschiedenen Produkten gemäß ISO 14156|IDF 172:2001 extrahiert. Die quantitative Bestimmung des Gehalts an Önanthsäure-Triglycerid im gewonnenen Fett erfolgt durch Kapillarsäulen-Gaschromatografie. Das für die Probe ermittelte Ergebnis wird unter Annahme des Capronsäure-Triglycerids als interne Standardprobe bewertet.

Anmerkung: Auch Tributyrin hat sich als ausreichende interne Standardprobe erwiesen.

4.   REAGENZIEN

Es sind ausschließlich anerkannt analysenreine Reagenzien zu verwenden.

4.1.   n-Hexan

4.2.   Standard-Capronsäure-Triglycerid, Reinheit mindestens 99 %

4.3.   Standard-Önanthsäure-Triglycerid, Reinheit mindestens 99 %

4.4.   Wasserfreies Natriumsulfat (Na2SO4)

5.   APPARATUR

Normale Laborausrüstung sowie insbesondere:

5.1.   eine Analysewaage, Genauigkeit 1 mg

5.2.   Messkolben, Füllmengen 10 ml und 20 ml

5.3.   Zentrifugenröhrchen, Füllmenge 30 ml

5.4.   ein Rotationsverdampfer

5.5.   ein Ofen, in dem eine gleich bleibende Temperatur von 50 °C ±5 °C aufrechterhalten werden kann

5.6.   Filterpapier, mittlere Porengröße, Durchmesser ca. 15 cm

Gaschromatografie-Ausrüstung:

5.7.1.   ein Gaschromatograf mit Injektor (split/splitless oder on-column) und Flammenionisations-Detektor (FID);

eine GC-Säule, mit einer stationären Phase, in der erfolgreich eine Triglycerid-Abtrennung durchgeführt wurde (100 % Dimethylpolysiloxan oder 5 % Phenyl — 95 % Methylpolysiloxan). Die stationäre Phase, die Säulenhöhe (4 bis 15 m), der Innendurchmesser (0,22 bis 0,50 mm) und die Filmstärke (mindestens 0,12 µm) sind aufgrund von Erfahrungen im Laboratorium sowie abhängig vom jeweiligen Injektionssystem zu wählen. In jedem Fall müssen mit der gewählten Säule der Lösungsmittel-Peak und der Capronsäure-Triglycerid-Peak klar getrennt dargestellt und eine Basislinien-Auflösung zwischen dem Capronsäure-Triglycerid- und dem Önanthsäure-Triglycerid-Peak ermöglicht wird. Im Folgenden werden exemplarisch einige mögliche Aufbauten beschrieben.

5.7.2.1.   Beispiele möglicher Aufbauten mit Split-Injektor:

—	Trägergas: Helium;

—	Kopfdruck Säule: 100 kPa;

—	Säule: 12 m Höhe, 0,5 mm Innendurchmesser, 0,1 µm Filmstärke Quarzglassäule;

—	stationäre Phase: 100 % Dimethylpolysiloxan oder 5 % Phenyl/95 % Dimethylpolysiloxan (z. B. HT5);

—	Säulentemperatur: Ausgangstemperatur 130 °C, Dauer 1 Minute, steigend um 20 °C/min bis auf 260 °C; anschließend weiterer Anstieg um 30 °C/min bis auf 360 °C; 10 min bei 360 °C;

—	Detektortemperatur: 370 °C;

—	Injektortemperatur: 350 °C;

—	Splitverhältnis: 1:30;

—	injiziertes Probenvolumen: 1 µl;

5.7.2.2.   Beispiel eines möglichen Aufbaus mit On-Column-Injektor:

—	Trägergas: Wasserstoff (Constant-Flow-System);

—	Kopfdruck Säule: 89 kPa;

—	Säule: 4 m Höhe, 0,32 mm Innendurchmesser, 0,25 µm Filmstärke, Quarzglassäule;

—	stationäre Phase: 5 % Phenyl/95 % Dimethylpolysiloxan;

—	Säulentemperatur: Ausgangstemperatur 60 °C, Dauer 2 min, ansteigend um 35 °C/min auf 340 °C, Beibehaltung dieser Temperatur 5 min;

—	Detektortemperatur: 350 °C;

—	injiziertes Probenvolumen: 1 µl;

5.8.   eine Injektionsspritze, Fassungsvermögen 5 µl.

6.   PROBENAHME

Wichtig ist, dass das Laboratorium eine Probe erhält, die tatsächlich repräsentativ ist und bei Transport oder Lagerung nicht beschädigt oder verändert wurde.

Die Probenahme ist nicht Bestandteil der in dieser internationalen Norm spezifizierten Methode. Eine empfohlene Methode zur Probenahme ist IDF-Norm 50C: 1995 bzw. ISO 707-1997 — „Milch und Milchprodukte — Leitfaden zur Probenahme“ zu entnehmen.

7.   VERFAHREN

7.1.   Herstellung der Testprobe und der Probeneinwaage

Verfahren gemäß ISO 14156|IDF 172:2001

7.1.1.   Butterschmalz, Butter

7.1.1.1.   50 bis 100 g der Testprobe werden im Ofen (5.5) geschmolzen.

7.1.1.2.   0,5 bis 1,0 g wasserfreies Natriumsulfat (5.4) werden auf ein Faltenfilterpapier gegeben.

7.1.1.3.   Das Fett wird durch das Filterpapier mit dem wasserfreien Natriumsulfat gefiltert, und das entstehende Filtrat in einem im Ofen (5.5) vorgehaltenen Becherglas aufgefangen. Beim Dekantieren der geschmolzenen Butter auf das Filterpapier ist darauf zu achten, dass kein Serum übertragen wird.

7.1.2.   Rahm

7.1.2.1.   Die Testprobe wird auf 20 °C ±2 °C erwärmt.

7.1.2.2.   Die Probe wird gründlich gemischt oder gerührt.

7.1.2.3.   Von der Testprobe wird eine geeignete Menge aufgelöst, so dass sich eine Probeneinwaage von 100 ml mit einem Fettmasseanteil von etwa 4 % ergibt.

7.1.2.4.   Anschließend ist das Fett wie bei Rohmilch und bei homogenisierter Milch (siehe ISO 14156|IDF 172:2001, Absatz 8.3) aus dem Rahm abzutrennen.

7.1.2.5.   In einen 10-ml-Messkolben (5.2) wird 1 g des gewonnenen Fetts gegeben (Toleranz 1 mg). 1 ml der in Absatz 7.2.2 genannten Lösung wird hinzugegeben. Anschließend ist der Messkolben unter Zugabe von n-Hexan (4.1) auf eine Füllmenge von 10 ml aufzufüllen und zu homogenisieren.

7.1.2.6.   1 ml der in Absatz 7.1.1.2 genannten Lösung wird in einen 10-ml-Messkolben (5.2) gegeben; anschließend wird mit n-Hexan (4.1) auf 10 ml aufgefüllt.

7.2.   Vorbereitung der Kalibrierungsstandards

7.2.1.   100 mg Önanthsäure-Triglycerid (4.3) werden in 10 ml n-Hexan (4.1) aufgelöst.

7.2.2.   100 mg Capronsäure-Triglycerid (4.2) werden in 10 ml n-Hexan (4.1) aufgelöst.

7.2.3.   1 ml der in Absatz 7.2.2 genannten Lösung wird in einen 10-ml-Messkolben (5.2) gegeben; anschließend wird mit n-Hexan (4.1) auf 10 ml aufgefüllt.

7.2.4.   Jeweils 1 ml der in Absatz 7.2.1 und der in Absatz 7.2.2 genannten Lösung wird in einen 10-ml-Messkolben (5.2) gegeben; anschließend wird mit n-Hexan (4.1) auf 10 ml aufgefüllt.

7.2.5.   1 ml der in Absatz 7.2.4 genannten Lösung wird in einen 10-ml-Messkolben (5.2) gegeben; anschließend wird mit n-Hexan (4.1) auf 10 ml aufgefüllt.

7.3.   Chromatografische Bestimmung

7.3.1.   Von der in Absatz 7.2.5 genannten Standardlösung wird zweimal 1 µl injiziert.

7.3.2.   Von jeder Probenlösung ist jeweils 1 µl zu injizieren.

Anmerkung: Wenn der On-Column-Injektor eingesetzt wird, sollten sowohl die Standardlösung als auch die Probenlösungen in einer erhöhten Verdünnung verwendet werden.

7.3.3.   Das in Absatz 7.3.1 genannte Verfahren ist bei jeder dritten Probe zu wiederholen, damit jeweils am Anfang und am Ende einer Probenreihe eine Standardinjektion erfolgen kann. Die Ergebnisse beruhen auf den mittleren durchschnittlichen Kalibrierfaktoren der Standardchromatogramme.

8.   BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

Bei jedem Chromatogramm sind die Peak-Flächen des Önanthsäure- und des Capronsäure-Triglycerids zu integrieren.

Diese Anweisungen sind für alle Probenfolgen zu wiederholen, bei denen jeweils vorher und nachher die Standardlösung injiziert wird. (Unmittelbar vor jeder Probenreihe wird zweimal die Standardlösung STD1 injiziert, und unmittelbar nach jeder Probenreihe wird zweimal die Standardlösung STD2 eingespritzt.)

8.1.   Kalibrierung

8.1.1.   Jeweils für die zweite Probe von STD1, Rf1(a) und Rf1(b) ist der Reaktionsfaktor zu berechnen.

Rf1 (a) oder (b) = (Peak-Fläche Capronsäure-Triglycerid/Peak-Fläche Önanthsäure-Triglycerid) × 100

Der mittlere durchschnittliche Reaktionsfaktor Rf1 wird berechnet:

Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(b)) / 2

8.1.2.   Ähnlich wird der mittlere durchschnittliche Reaktionsfaktor für STD2 und Rf2 berechnet.

8.1.3.   Der mittlere durchschnittliche Reaktionsfaktor Rf wird berechnet:

Rf = (Rf1 + Rf2) /2

8.2.   Testproben

Für jedes ermittelte Proben-Chromatogramm zwischen STD1 und STD2 wird der Önanthsäuregehalt (C (in kg/t)) berechnet:

C = (Peak-Fläche für Önanthsäure-Triglycerid × Rf × 100)/(Peak-Fläche Capronsäure-Triglycerid × Wt × 1 000)

Dabei sind:

—	Wt = Gewicht des gewonnenen Fetts (g),

—	100 = Verdünnungsvolumen der Probe,

—	1 000 = Umrechnungsfaktor (μg/g in kg/t).

Bei Butterproben wird der Fettgehalt der Butter berücksichtigt und ein bereinigter Konzentrationswert CButter (kg/t Butter) berechnet

CButter = CFett × F

Dabei ist: F = Fettgehalt der Butter.

9.   GENAUIGKEIT

Nähere Informationen zu einem Leistungstest mit Butter gemäß ISO 5725-1 und ISO 5725-2 (Genauigkeit der Methode) sind Ziffer 12 zu entnehmen.

Die Grenzwerte für die Wiederholbarkeit und die Vergleichbarkeit werden für das Konfidenzintervall 95 % ausgedrückt und sind auf andere als die genannten Konzentrationsbereiche und Matrizen möglicherweise nicht übertragbar.

9.1.   Wiederholbarkeit

Die absoluten Unterschiede zwischen zwei einzelnen Testergebnissen, die nach derselben Methode bei identischem Testmaterial im selben Laboratorium von demselben Analytiker und mit derselben Ausrüstung binnen eines kurzen Zeitraums ermittelt wurden, liegen in höchstens 5 % aller Fälle über 0,35 kg/t.

9.2.   Vergleichbarkeit

Die absoluten Unterschiede zwischen zwei einzelnen Testergebnissen, die nach derselben Methode bei identischem Testmaterial in verschiedenen Laboratorien von verschiedenen Analytikern und mit unterschiedlicher Ausrüstung ermittelt wurden, liegen in höchstens 5 % aller Fälle über 0,66 kg/t.

10.   TOLERANZGRENZEN: UNTERGRENZE (BEI UNZUREICHENDEN MENGEN)

10.1.   Zur Prüfung der richtigen Kennzeichnung des Erzeugnisses sind dem gekennzeichneten Erzeugnis drei Proben zu entnehmen.

10.2.   Butter und Butterfett

10.2.1.   Die Beimischungsquote beträgt 11 kg Önanthsäure-Triglycerid mit einer Reinheit von 95 % pro Tonne Butter (d. h. 10,45 kg/t).

10.2.2.   Die Ergebnisse von drei Proben, die aus der Analyse des Produkts ermittelt wurden, werden zur Prüfung der Quote und der Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels verwendet; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	9,51 kg/t (95 % der Mindestquote der Beimischung von Önanthsäure-Triglycerid mit einer Reinheit von 95 %, einfache Bestimmung);

—	6,89 kg/t (70 % der Mindestquote der Beimischung von Önanthsäure-Triglycerid mit einer Reinheit von 95 %, einfache Bestimmung);

—	es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 9,51 kg und 6,89 kg erhält.

10.3.   Rahm

10.3.1.   Die Beimischung beträgt 10 kg Önanthsäure-Triglycerid mit einer Reinheit von mindestens 95 % pro Tonne Milchfett (d. h. 9,50 kg/t gekennzeichnetes Milchfett).

10.3.2.   Aufgrund der Ergebnisse der drei in der Produktanalyse untersuchten Proben wird die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels geprüft; das niedrigste Ergebnis wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	8,60 kg/t (95 % der Mindestquote der Beimischung von Önanthsäure-Triglycerid mit einer Reinheit von 95 %, einfache Bestimmung);

—	6,23 kg/t (70 % der Mindestquote der Beimischung von Önanthsäure-Triglycerid mit einer Reinheit von 95 %, einfache Bestimmung);

—	es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 8,60 kg und 6,23 kg erhält.

11.   TOLERANZGRENZEN: OBERGRENZEN (BEI ÜBERSCHREITUNG DER MENGE UM MEHR ALS 20 %)

11.1.   Zur Prüfung der richtigen Kennzeichnung des Erzeugnisses sind dem gekennzeichneten Erzeugnis drei Proben zu entnehmen.

11.2.   Butter und Butterfett

11.2.1.   Die Ergebnisse von drei Proben, die aus der Analyse des Produkts ermittelt wurden, werden zur Prüfung der Quote und der Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels verwendet; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf den folgenden Grenzwert beurteilt:

—	oberer Grenzwert 12,96 kg/t.

11.3.   Rahm

11.3.1.   Die Ergebnisse von drei Proben, die aus der Analyse des Produkts ermittelt wurden, werden zur Prüfung der Quote und der Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels verwendet; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf den folgenden Grenzwert beurteilt:

—	oberer Grenzwert 11,82 kg/t.

12.   WEITERE INFORMATIONEN: STATISTISCHE ANALYSE VON ERGEBNISSEN BEI DER BESTIMMUNG VON ÖNANTHSÄURETRIGLYCERID IN BUTTERFETT DURCH TRIGLYCERIDANALYSE

Zur Bestimmung des Önanthsäuretriglycerid-Gehalts in gekennzeichneter Butter wurden vier gemeinsame Versuche durchgeführt.

Am ersten Ringtest haben sich neun Laboratorien beteiligt; es wurden keine Spezifikationen bezüglich der anzuwendenden Analysemethoden vorgegeben.

Am zweiten Ringtest nahmen zehn Laboratorien teil; es wurden vier unterschiedliche Methoden angewendet:

—	quantitative Methylheptanoat-Bestimmung mit n-Nonan oder Methylnonanoat als interner Standardprobe;

—	quantitative Önanthsäuretriglycerid-Bestimmung mit Tricaproat als interner Standardprobe;

—	quantitative Methylheptanoat-Bestimmung mit einer Kalibrierungsprobe/Gemisch;

—	quantitative Methylheptanoat-Bestimmung mit einem Kalibrierungsgemisch.

Wenn FAME analysiert würde, müssten zudem zwei verschiedene Verfahren zum Methylierungsnachweis (De Francesco und Christopherson & Glass) eingesetzt werden.

Wegen der ermittelten Ergebnisse wurden zwei Methoden zur Durchführung des dritten Ringtests gewählt:

—	quantitative Methylheptanoat-Bestimmung mit n-Nonan oder Methylnonanoat als interner Standardprobe;

—	quantitative Önanthsäuretriglycerid-Bestimmung mit Tricaproat als interner Standardprobe.

Die Ergebnisse von sieben Laboratorien zeigten, dass sich mit der FAME-Methode eine höhere Variabilität ergab, und entsprechend wurde entschieden, ausschließlich die Bestimmung mit Önanthsäuretriglycerid als Triglycerid gemäß dem Verfahren zum quantitativen Önanthsäuretriglycerid-Nachweis mit Tricaproat als interner Standardprobe zu verwenden. Zudem muss die Triglyceridanalyse mit einer Kapillarsäule durchgeführt werden.

Im vierten Ringtest wurden vier Proben (A, B, C und D) verteilt, und neun Laboratorien übermittelten Ergebnisse (Tabellen 1-2).

Zwei Laboratorien (DE und EU) analysierten die Proben nach der FAME-Methode.

Wegen der geringeren Anzahl der Laboratorien wurde die statistische Berechnung sowohl für die gesamte Datengruppe (Abbildungen 1-2) einschließlich der FAME-Ergebnisse als auch für die aus der TG-Analyse ermittelten Daten durchgeführt.

Tests auf Ausreißer

—	Probe A: In Dixon-, Cochran- und Grubbs-Tests mit 1 und 5 % wurde ein Ausreißer in einem Laboratorium festgestellt.

—	Probe B: Im Grubbs-Test mit 5 % wurde ein Ausreißer in einem Laboratorium festgestellt.

—	Probe C: In Dixon- und Grubbs-Tests mit 1 und 5 % wurde in einem Labor ein Ausreißer festgestellt.

—	Probe D: In Dixon- und Grubbs-Tests mit 1 und 5 % wurde in einem Laboratorium ein Ausreißer festgestellt.

Der Ausreißer wurde bei der Berechnung nicht berücksichtigt.

Die mit der FAME-Methode ermittelten Ergebnisse wurden mit den durchgeführten Tests nie als Ausreißer gewertet.

Parameter für die Genauigkeit

In den Tabellen 1 und 2 sind die Ergebnisse aller Laboratorien und die Parameter für die Genauigkeit genannt, die für eine annehmbare Anzahl (8) an Laboratorien berechnet wurden; die Ergebnisse beruhen leider aber nicht alle auf derselben Analysemethode.

In den Tabellen 3 und 4 sind ausschließlich mit der TG-Methode ermittelte Ergebnisse sowie die entsprechenden Genauigkeitsparameter zusammengestellt. Die Annahme dieser Parameter unterliegt dem Vorbehalt der Annahme der geringen Anzahl an Laboratorien (6).

Aus den Abbildungen 2 und 3 gehen die Trends der berechneten Werte für Sr und SR der vier Proben der beiden beschriebenen Datenreihen hervor.

In Tabelle 5 sind die Werte für Sr und SR mit den entsprechenden Pool-Werten und den Gesamtparametern r und R zusammengestellt.

Außerdem wurde die kritische Differenz bei einem Konfidenzintervall von 95 % berechnet.

Tabelle 1

Statistische Ergebnisse TG- und FAME*-Methode

Probe A		R1	R2	Mittelwert	Verbleibende Laboratorien nach Ausscheiden von Ausreißern	8
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Anz. Ausreißer	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Ausreißer	DК
ZPLA	DE*	11,6	11,8	11,7	Mittelwert	11,3
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Tatsächlicher Wert	11,0
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Wiederholstandardabweichung (Sr)	0,09
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Relative Wiederholbarkeit sd (RSDr %)	0,80
ËÈLA	FI	11,3	11,2	11,3	Wiederholbarkeit < r (95 %)	0,26
ISPRA	EU*	11,0	11,0	11,0	Relative Wiederholbarkeit r %	2,24
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Vergleichsstandardabweichung (SR)	0,23
					Relative Vergleichbarkeit sd (RSDR %)	2,04
					Vergleichbarkeit R (95 %)	0,84
					Relative Vergleichbarkeit R %	5,71
Probe B		R1	R2	Mittelwert	Verbleibende Laboratorien nach Ausschluss von Ausreißern	8
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Anz. Ausreißer	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Ausreißer	DK
ZPLA	DE*	14,0	13,8	13,9	Mittelwert	13,4
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Tatsächlicher Wert	13,5
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Wiederholstandardabweichung (Sr)	0,14
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Relative Wiederholbarkeit sd (RSDr %)	1,04
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Wiederholbarkeit r (95 %)	0,40
ISPRA	EU*	13,2	13,3	13,3	Relative Wiederholbarkeit r %	2,91
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Vergleichsstandardabweichung (SR)	0,35
					Relative Vergleichbarkeit sd (RSDR %)	2,61
					Vergleichbarkeit R (95 %)	0,99
					Relative Vergleichbarkeit R %	7,31

Tabelle 2

Statistische Ergebnisse TG- und FAME*-Methode

Probe C		R1	R2	Mittelwert	Verbleibende Laboratorien nach Ausschluss von Ausreißern	8
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Anz. Ausreißer	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Ausreißer	DK
ZPLA	DE*	9,2	9,4	9,3	Mittelwert	9,3
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Tatsächlicher Wert	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Wiederholstandardabweichung (Sr)	0,14
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Relative Wiederholbarkeit sd (RSDr %)	1,50
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Wiederholbarkeit r (95 %)	0,40
ISPRA	EU*	9,4	9,3	9,4	Relative Wiederholbarkeit r %	4,20
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Vergleichsstandardabweichung (SR)	0,17
					Relative Vergleichbarkeit sd (RSDR %)	1,82
					Vergleichbarkeit R (95 %)	0,47
					Relative Vergleichbarkeit R %	5,10
Probe D		R1	R2	Mittelwert	Verbleibende Laboratorien nach Ausschluss von Ausreißern	8
RENNES	R1	1,6	1,6	1,6	Anz. Ausreißer	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Ausreißer	DK
ZPLA	DE*	2,3	2,3	2,3	Mittelwert	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Tatsächlicher Wert	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Wiederholstandardabweichung (Sr)	0,08
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relative Wiederholbarkeit sd (RSDr %)	3,81
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Wiederholbarkeit r (95 %)	0,22
ISPRA	EU*	2,3	2,3	2,3	Relative Wiederholbarkeit r %	10,67
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Vergleichsstandardabweichung (SR)	0,24
					Relative Vergleichbarkeit sd (RSDR %)	11,43
					Vergleichbarkeit R (95 %)	0,67
					Relative Vergleichbarkeit R %	32,00

Tabelle 3

Statistische Ergebnisse TG- und FAME*-Methode

Probe A		R1	R2	Mittelwert	Verbleibende Laboratorien nach Ausschluss von Ausreißern	6
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Anz. Ausreißer	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Ausreißer	DК
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Mittelwert	11,2
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Tatsächlicher Wert	11,0
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Wiederholstandardabweichung (Sr)	0,09
ËÈLA	FI	11,3	11,2	11,3	Relative Wiederholbarkeit sd (RSDr %)	0,80
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Wiederholbarkeit r (95 %)	0,25
					Relative Wiederholbarkeit r %	2,24
					Vergleichsstandardabweichung (SR)	0,13
					Relative Vergleichbarkeit sd (RSDR %)	1,16
					Vergleichbarkeit R (95 %)	0,36
					Relative Vergleichbarkeit R %	3,25
Probe B		R1	R2	Mittelwert	Verbleibende Laboratorien nach Ausschluss von Ausreißern	6
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Anz. Ausreißer	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Ausreißer	DК
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Mittelwert	13,3
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Tatsächlicher Wert	13,5
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Wiederholstandardabweichung (Sr)	0,15
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Relative Wiederholbarkeit sd (RSDr %)	1,13
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Wiederholbarkeit r (95 %)	0,42
					Relative Wiederholbarkeit r %	3,16
					Vergleichsstandardabweichung (SR)	0,33
					Relative Vergleichbarkeit sd (RSDR %)	2,48
					Vergleichbarkeit R (95 %)	0,93
					Relative Vergleichbarkeit R %	6,94

Tabelle 4

Statistische Ergebnisse TG-Methode

Probe C		R1	R2	Mittelwert	Verbleibende Anzahl Laboratorien nach Ausschluss von Ausreißern	6
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Anz. Ausreißer	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Ausreißer	DК
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Mittelwert	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Tatsächlicher Wert	9,3
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Wiederholstandardabweichung (Sr)	0,15
ËÈLA	FI	9,4	9,6	9,5	Relative Wiederholbarkeit sd (RSDr %)	1,61
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Wiederholbarkeit r (95 %)	0,42
					Relative Wiederholbarkeit r %	4,51
					Vergleichsstandardabweichung (SR)	0,19
					Relative Vergleichbarkeit sd (RSDR %)	2,04
					Vergleichbarkeit R (95 %)	0,53
					Relative Vergleichbarkeit R %	5,71
Probe D		R1	R2	Mittelwert	Verbleibende Anzahl Laboratorien nach Ausschluss von Ausreißern	6
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Anz. Ausreißer	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Ausreißer Mittelwert	DK
					Mittelwert	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Tatsächlicher Wert	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Wiederholstandardabweichung (Sr)	0,09
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relative Wiederholbarkeit sd (RSDr %)	4,29
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Wiederholbarkeit r (95 %)	0,26
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Relative Wiederholbarkeit r%	12,01
					Vergleichsstandardabweichung (SR)	0,25
					Relative Vergleichbarkeit sd (RSDR %)	11,90
					Vergleichbarkeit R (95 %)	0,69
					Relative Vergleichbarkeit R %	33,32

Tabelle 5

Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit (mit FAME)

	Anz. Laboratorien	Ausreißer	Wiederholbarkeit Sr (95 %)	Vergleichbarkeit SR (95 %)
Probe A	8	1	0,09	0,23
Probe Β	8	1	0,14	0,35
Probe C	8	1	0,14	0,17
Probe D	8	1	0,08	0,24
Pool-Wert			0,116	0,256
			r	R
Pool-Wert * 2,8			0,324	0,716
CrD95 = 0,40 Erklärte Mindestreinheit für Önanthsäuretriglycerid = 95 % Erklärter unterer Grenzwert für Önanthsäuretriglycerid in Butterfett = 11 kg/t In Anbetracht der kritischen Differenz bei einem Konfidenzintervall von 95 % darf der Mittelwert dieser beiden Ergebnisse folgende Werte nicht unterschreiten:   bei Beimischung von Önanthsäuretriglycerid mit einer Reinheit von 95 % 10,05 kg/t.

Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit (ohne FAME)

	Anz. Laboratorien	Ausreißer	Wiederholbarkeit Sr (95 %)	Vergleichbarkeit SR (95 %)
Probe A	6	1	0,09	0,13
Probe B	6	1	0,15	0,33
Probe C	6	1	0,15	0,19
Probe D	6	1	0,09	0,25
Pool-Wert			0,124	0,237
			r	R
Pool-Wert * 2,8			0,347	0,663
CrD95 = 0,36 Erklärte Mindestreinheit für Önanthsäuretriglycerid = 95 % Erklärter unterer Grenzwert für Önanthsäuretriglycerid in Butterfett = 11 kg/t In Anbetracht der kritischen Differenz bei einem Konfidenzintervall von 95 % darf der Mittelwert dieser beiden Ergebnisse folgende Werte nicht unterschreiten:   bei Beimischung von Önanthsäuretriglycerid mit einer Reinheit von 95 % 10,09 kg/t.

Abbildung 1 (1)

Versuchsergebnisse Probe A

Versuchsergebnisse Probe B

Versuchsergebnisse Probe C

Versuchsergebnisse Probe D

Abbildung 2

Wiederholstandardabweichung und Vergleichsstandardabweichung bei verschiedenen Konzentrationen (TG und FAME)

Abbildung 3

Wiederholstandardabweichung und Vergleichsstandardabweichung bei verschiedenen Konzentrationen (TG)

Abbildung 4

Beispiel unter Verwendung eines On-Column-Injektors

---

(1)  = FAME-Methode.

ANHANG VI

(Artikel 5)

BESTIMMUNG DES VANILLIN-GEHALTS IN BUTTERFETT, BUTTER ODER RAHM DURCH HPLC

1.   GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Beschrieben wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Vanillin in Butter, Butterfett oder Rahm.

2.   KURZBESCHREIBUNG

Extraktion einer bekannten Probemenge mit Hilfe eines Isopropanol-Ethanol-Acetonitril-Gemisches (1:1:2); Abscheidung des Hauptteils des Fetts durch Kühlung bei –15 °C bis –20 °C und anschließendes Zentrifugieren.

Nach Verdünnung mit Wasser Bestimmung des Vanillingehalts durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC).

3.   APPARATUR

Normale Laborausstattung und insbesondere:

3.1.   Gefrierschrank zur Kühlung auf einen Temperaturbereich von –15 bis –20 °C;

3.2.   Einwegspritzen mit einem Fassungsvermögen von 2 ml;

3.3.   Membranmikrofilter (Porengröße 0,45 µm), beständig gegen eine Lösung mit 5 % Extraktionslösung (4.4);

3.4.   Flüssigkeitschromatografie-System, bestehend aus einer Pumpe (Durchfluss von 1,0 ml/min), einem Injektor (20 µl Injektionsvolumen, automatisch oder manuell), einem UV-Detektor (306 nm, 0,01 Å gesamter Bereich), einem Aufzeichnungsgerät oder Integrator und einem Säulenthermostat für eine Betriebstemperatur von 25 °C;

3.5.   Analysesäule (250 mm × 4,6 mm ID), gepackt mit LiChrospher RP 18 (Merck, 5 µm) oder gleichwertigem Material;

3.6.   Vorsäule (ca. 20 mm × 3 mm ID), trocken gepackt mit LiChrospher RP 18 (5 bis 10 µm) oder gleichwertigem Material;

3.7.   Zentrifuge (2 000 Umin-1).

4.   REAGENZIEN

Alle verwendeten Reagenzien müssen analysenrein sein.

4.1.   Isopropanol

4.2.   Ethanol 96 % (v/v)

4.3.   Acetonitril

4.4.   Extraktionslösung

Gemisch aus Isopropanol (4.1), Ethanol (4.2) und Acetonitril (4.3) im Verhältnis 1:1:2 (v/v)

Vanillin (4-Hydroxy-3-methoxy-benzaldehyd) ≥98 %

4.5.1.   Vanillin-Stammlösung (= 500 µg/ml)

Etwa 50 mg Vanillin (4.5) auf 0,1 mg (CM mg) werden genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen; anschließend werden 25 ml Extraktionslösung (4.4) hinzugefügt und mit Wasser aufgefüllt.

4.5.2.   Vanillin-Standardlösung (= 10 µg/ml)

5 ml der Vanillin-Stammlösung (4.5.1) werden in einen 250-ml-Messkolben pipettiert und mit Wasser aufgefüllt.

4.5.3.   Methanol, HPLC-Qualität

4.5.4.   Eisessigsäure

4.5.5.   Wasser, HPLC-Qualität

4.5.6.   HPLC, mobile Phase

300 ml Methanol (4.5.3) werden mit etwa 500 ml Wasser (4.5.5) und 20 ml Essigsäure (4.5.4) in einem 1 000-ml-Messkolben gemischt und mit Wasser (4.5.5) aufgefüllt. Dieses Gemisch wird durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm (3.3) gefiltert.

5.   VERFAHREN

5.1.   Vorbereitung der Probe

5.1.1.   Butter

Die Probe wird erhitzt, bis sie zu schmelzen beginnt. Eine Überhitzung auf etwa 30 °C ist zu vermeiden. Möglicherweise trennt sich die Butter nicht in zwei Phasen. Wenn die Probe ausreichend pastös ist, ist sie durch Schütteln zu homogenisieren. Nach 15-minütigem Rühren der Butter wird eine Probe genommen. Etwa 5 g (SM g) Butter werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen.

5.1.2.   Butterfett

Unmittelbar vor der Probenahme wird der Behälter mit dem Butterfett in einen Ofen mit einer Temperatur von 40 bis 50 °C gegeben und dort belassen, bis das Butterfett vollständig geschmolzen ist. Die Probe wird durch Schütteln oder Rühren vermischt; dabei ist die Bildung von Blasen durch zu starkes Rühren zu vermeiden. Etwa 4 g (SM g) Butterfett werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen.

5.1.3.   Rahm

Die Probe wird in einem Wasserbad oder einem Inkubator auf 35 bis 40 °C erwärmt. Anschließend wird das Fett durch Schütteln bzw. wenn nötig durch Rühren homogenisiert. Die Probe wird rasch auf 20 ±2 °C abgekühlt. Nun müsste die Probe homogen aussehen; ansonsten ist das Verfahren zu wiederholen. Etwa 10 g (SM g) Rahm werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen.

5.2.   Vorbereitung der Versuchslösung

Zur Probe (5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3) werden etwa 75 ml der Extraktionslösung (4.4) hinzugefügt; anschließend wird ca. 15 Minuten umgerührt oder stark geschüttelt und mit Extraktionslösung (4.4) aufgefüllt. Etwa 10 ml dieses Extrakts werden in ein Reagenzglas mit Stopfen gegeben. Das Reagenzglas wird in den Gefrierschrank (3.1) gesetzt und ca. 30 Minuten stehen gelassen. Der kalte Extrakt wird 5 Minuten bei etwa 2 000 min-1 zentrifugiert und sofort abgegossen. Die abgegossene Lösung muss auf Zimmertemperatur abkühlen. 5 ml der abgegossenen Lösung werden in einen 100-ml-Messkolben pipettiert; danach wird mit Wasser aufgefüllt. Ein Aliquot wird mit einer Spritze (3.2) durch einen Membran-Mikrofilter (3.3) gefiltert. Das Filtrat ist nun für die HPLC bereit.

5.3.   Kalibrierung

5 ml der Vanillin-Standardlösung (4.5.2) werden in einen 100-ml-Messkolben pipettiert. 5 ml Extraktionslösung (4.4) werden hinzugefügt; anschließend wird bis zur Markierung mit Wasser aufgefüllt. Diese Lösung enthält 0,5 µg/ml Vanillin.

5.4.   Bestimmung durch HPLC

Das Chromatografiesystem wird zur Stabilisierung etwa 30 Minuten stehen gelassen. Die Standardlösung (5.3) wird eingespritzt. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die Differenz der Peak-Flächen oder Peak-Höhen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Einspritzungen weniger als 2 % beträgt. Unter den beschriebenen Bedingungen beträgt die Retentionszeit von Vanillin etwa 9 Minuten. Die Kalibrierlösung (5.3) wird doppelt analysiert, indem 20 µl eingespritzt werden. 20 µl der Versuchslösungen (5.2) werden eingespritzt. Die Peak-Flächen oder -Höhen für Vanillin werden ermittelt. Nach 10 Einspritzungen der Testproben (5.2) wird erneut zweimal die Kalibrierlösung (5.3) eingespritzt.

6.   BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

Für jede Partie Versuchslösungen wird die durchschnittliche Peak-Fläche (oder -Höhe) (AC) der Vanillin-Peaks in Zusammenhang mit den Doppeleinspritzungen der Kalibrierlösung jeweils vor und nach einer Probenreihe berechnet (insgesamt 4 Flächen oder Höhen).

Der Kalibrierfaktor (R) wird wie folgt berechnet:

Dabei ist CM die Masse des Vanillins in mg (4.5.1).

Der Vanillin-Anteil (C) der Testprobe (in mg/kg) wird wie folgt berechnet:

Dabei sind:

AS	=	Peak-Fläche des Vanillin-Peaks der Testprobe
SM	=	Masse der Testprobe in g (5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3)

Anmerkung: Bei der Untersuchung von Rahm auf Vanillin wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration als mg Kennzeichnungsmittel/kg Milchfett ausgedrückt. Dazu wird C mit 100/f multipliziert. Mit f wird der Fettgehalt von Rahm in Prozent (m/m) bezeichnet.

20	=	Faktor zur Berücksichtigung der Verdünnung der Standard- und der Testprobe
0,96	=	Korrekturfaktor für den Fettgehalt in der ersten Verdünnung der Testprobe

Anmerkung: Anstelle von Peak-Flächen können auch Peak-Höhen verwendet werden (siehe 8.3).

7.   GENAUIGKEIT DER METHODE

7.1.   Wiederholbarkeit (r)

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 16 mg/kg voneinander abweichen.

7.2.   Vergleichbarkeit (R)

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 27 mg/kg voneinander abweichen.

8.   TOLERANZGRENZEN

8.1.   Dem gekennzeichneten Erzeugnis sind drei Proben zu entnehmen, um die Homogenität zu prüfen.

Das Kennzeichnungsmittel wird entweder aus Vanille oder aus synthetischem Vanillin gewonnen.

8.2.1.   Die Beimischungsquote für 4-Hydroxy-3-methoxy-benzaldehyd beträgt 250 g je Tonne Butterfett oder Butter. Bei der Kennzeichnung von Rahm beträgt die Beimischungsquote 250 g je Tonne Milchfett.

8.2.2.   Die Ergebnisse der drei in der Produktanalyse gewonnenen Proben werden verwendet, um die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels zu bestimmen; das niedrigste ermittelte Ergebnis wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	220,8 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote),

—	158,3 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 220,8 mg/kg und 158,3 mg/kg erhält.

Das Kennzeichnungsmittel wird ausschließlich aus Vanilleschoten oder deren vollständigen Auszügen gewonnen.

8.3.1.   Die Beimischungsquote für 4-Hydroxy-3-methoxy-benzaldehyd beträgt 100 g je Tonne Butterfett oder Butter. Bei der Kennzeichnung von Rahm beträgt die Beimischungsquote 100 g je Tonne Milchfett.

8.3.2.   Aufgrund der Ergebnisse der drei aus der Produktanalyse gewonnenen Proben werden die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels geprüft; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	78,3 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote),

—	53,3 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 78,3 mg/kg und 53,3 mg/kg erhält.

9.   ANMERKUNGEN

9.1.   Die Wiederfindung von Vanillinzusätzen liegt bei einer Menge von 250 mg/kg Butterschmalz zwischen 97 und 103,8 %. Durchschnittlich wurde ein Gehalt von 99,9 % mit einer Standardabweichung von 2,7 % ermittelt.

9.2.   Die Standardlösung enthält 5 % Extraktionslösung, um die Peak-Erweiterung durch die in den Proben vorhandenen 5 % Extraktionslösung zu kompensieren. Dadurch wird eine Quantifizierung über die Peak-Höhen möglich.

9.3.   Die Analyse basiert auf einer linearen Kalibrierungslinie mit Nullachsenabschnitt.

9.4.   Die Linearität sollte bei der ersten Analyse und später in regelmäßigen Abständen sowie nach Änderungen oder Reparaturen der HPLC-Geräte durch Verwendung geeigneter Verdünnungen der Standardlösung (4.5.2) geprüft werden. Vanillin kann durch in unpasteurisiertem Rahm oder in Erzeugnissen aus unpasteurisiertem Rahm enthaltene Enzyme zu Vanillinsäure, Divanillin und sonstigen Verbindungen abgebaut werden.

ANHANG VII

(Artikel 5)

BESTIMMUNG VON BETA-APO-8'-CAROTINSÄURE-ETHYLESTER IN BUTTERFETT UND IN BUTTER DURCH SPEKTROMETRIE

1.   GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Die Methode beschreibt ein Verfahren für die quantitative Bestimmung von Beta-Apo-8'-Carotinsäure-Ethylester (Apo-Carotin-Ester) in Butterfett und Butter. Apo-Carotin-Ester stellt die Summe aller Stoffe in einem Extrakt von Proben dar, die unter den in der Methode dargestellten Bedingungen gewonnen werden und Licht bei 440 nm absorbieren.

2.   KURZBESCHREIBUNG

Das Butterfett wird in Petrolether gelöst; anschließend wird die Absorption bei 440 nm gemessen. Der Apo-Carotinester-Gehalt wird bezogen auf eine externe Standardprobe bestimmt.

3.   APPARATUR

3.1.   Messpipetten mit Fassungsvermögen von 0,25, 0,50, 0,75 und 1,0 ml

3.2.   Spektrophotometer, geeignet für die Verwendung bei 440 nm (und 447-449 nm), ausgestattet mit Küvetten mit optischer Weglänge von 1 cm

3.3.   Messkolben, 20 ml und 100 ml

3.4.   Analysewaage, Empfindlichkeit 0,1 mg, Messgenauigkeit 1 mg, Skalenteilung 0,1 mg

3.5.   Ofen, 45 °C ±1 °C

3.6.   Aschefreie Schnellfilter

4.   REAGENZIEN

Alle Reagenzien müssen analysenrein sein.

Apo-Carotinester-Suspension (ungefähr 20 %)

4.1.1.   Der Gehalt der Suspension ist wie folgt zu bestimmen:

Die Suspension wird auf 45 bis 50 °C erwärmt und in der ungeöffneten Originalverpackung homogenisiert. Etwa 400 mg werden genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und in 20 ml Chloroform (4.4) aufgelöst; anschließend wird bis zur Marke mit Cyclohexan (4.5) aufgefüllt. 5 ml dieser Lösung werden mit Cyclohexan auf 100 ml aufgefüllt (Lösung A). 5 ml der Lösung A werden mit Cyclohexan auf 100 ml verdünnt. Die Absorption wird bei 447-449 nm gemessen. (Das Maximum im Vergleich zu Cyclohexan unter Verwendung von 1-cm-Küvetten wird als Blindprobe gemessen.)

P Apo-Carotin-Ester-Gehalt (%) = (Absmax × 40 000) / (Msusp × 2 550) bzw. (Absmax / 2 550) × (100 / 5) × (100 / 5) × (100 / Msusp)

Absmax	=	Höchstabsorption der Kalibrierlösung
Msusp	=	Masse der Suspension (g)
2 550	=	Referenzlaboratorien (1 %, 1 cm)
P	=	Reinheit (Gehalt) der Suspension (%)

Anmerkung: Apo-Carotin-Ester-Suspension ist empfindlich gegenüber Luft, Hitze und Licht. In der ungeöffneten Originalverpackung (unter Stickstoffsiegel) und an einem kühlen Platz kann sie etwa zwölf Monate aufbewahrt werden. Nach Öffnung ist der Inhalt innerhalb kurzer Zeit zu verwenden.

4.1.2.   Apo-Carotin-Ester-Standardlösung, ungefähr 0,2 mg/ml

0,100 g Apo-Carotin-Ester-Suspension (4.1.1) (W) werden auf 1 mg genau abgewogen, in Petroleumbenzin (4.2) aufgelöst und quantitativ in einen 100-ml-Messkolben gegeben; anschließend wird bis zur Marke mit Petroleumbenzin aufgefüllt.

Diese Lösung enthält (W × P) 10 mg/ml Apo-Carotin-Ester.

Anmerkung: Die Lösung muss kühl und dunkel aufbewahrt werden. Nicht verwendete Lösung ist nach einem Monat zu beseitigen.

4.2.   Petroleumbenzin (40-60 °C)

4.3.   Natriumsulfat, wasserfrei, granular, zuvor 2 Stunden lang bei 102 °C getrocknet.

4.4.   Chloroform

4.5.   Cyclohexan

5.   VERFAHREN

5.1.   Vorbereitung der Probe

5.1.1.   Butterfett

Die Probe wird in einem Ofen bei etwa 45 °C geschmolzen.

5.1.2.   Butter

Die Probe wird in einem Ofen bei etwa 45 °C geschmolzen und ein repräsentativer Teil durch einen Filter mit etwa 10 g wasserfreiem Natriumsulfat (4.3) gefiltert; diese Schritte werden unter Abschirmung von starkem natürlichem oder künstlichem Licht und bei einer gleich bleibenden Temperatur von 45 °C durchgeführt. Es wird eine geeignete Menge Butterfett entnommen.

5.2.   Bestimmung

Etwa 1 g Butterfett oder Milchfett (5.1.2) (M) werden auf 1 mg genau abgewogen. Das Fett wird unter Verwendung von Petroleumbenzin (4.2) quantitativ in einen 20-ml-(V)-Messkolben gegeben; anschließend wird bis zur Marke aufgefüllt und gründlich gemischt.

Ein Aliquot dieses Gemisches wird in eine 1-cm-Küvette gebracht; dann wird die Absorption bei 440 nm im Vergleich zur Blindprobe mit Petroleumbenzin gemessen. Die Konzentration des Apo-Carotin-Esters in der Lösung wird durch Vergleich mit der Kalibrierkurve C (μg/ml) ermittelt.

5.3.   Kalibrierung

0, 0,25, 0,5, 0,75 und 1,0 ml der Apo-Carotin-Ester-Standardlösung (4.1.2) werden in fünf 100-ml-Messkolben pipettiert. Anschließend wird mit Petroleumbenzin (4.2) aufgefüllt und gemischt.

Die ungefähren Konzentrationen der Lösungen liegen im Bereich 0 bis 2 µg/ml und werden im Vergleich mit der Konzentration der Standardlösung (4.1.2) (W × P) / 10 mg/ml genau berechnet. Die Absorptionswerte bei 440 nm werden bezogen auf die Petroleumbenzin-Blindprobe (4.2) gemessen.

Die Absorptionswerte auf der y-Achse und die jeweiligen Apo-Carotin-Ester-Konzentrationen werden auf der x-Achse eintragen. Die Formel der Kalibrierkurve wird berechnet.

6.   BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

6.1.   Der Apo-Carotin-Ester-Gehalt, ausgedrückt in mg/kg des Erzeugnisses, wird mit den folgenden Formeln berechnet:

Butterfett: Butterfett (C × V)/M

Butter: 0,82 (C × V)M

Dabei sind:

C	=	Apo-Carotin-Ester-Gehalt in µg/ml, von der Kalibrierkurve (5.3) abzulesen
V	=	Volumen (ml) der Versuchslösung (5.2)
M	=	Masse (g) der Testprobe (5.2)
0,82	=	Berichtigungsfaktor für den Milchfettgehalt der Butter

7.   GENAUIGKEIT DER METHODE

7.1.   Wiederholbarkeit

7.1.1.   Butteranalyse

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 1,4 mg/kg voneinander abweichen.

7.1.2.   Butterfettanalyse

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 1,6 mg/kg voneinander abweichen.

7.2.   Vergleichbarkeit

7.2.1.   Butteranalyse

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 4,7 mg/kg voneinander abweichen.

7.3.   Butterfettanalyse

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 5,3 mg/kg voneinander abweichen.

7.4.   Herkunft der Präzisionsdaten

Die Präzisionsdaten stammen aus einem 1995 unter Beteiligung von elf Laboratorien und zwölf gekennzeichneten Proben (sechs Blindduplikate) für Butter und zwölf gekennzeichneten Proben (sechs Blindduplikate) für Butterfett durchgeführten Versuch.

8.   TOLERANZGRENZEN

8.1.   Zur Prüfung der richtigen Kennzeichnung des Erzeugnisses sind dem gekennzeichneten Erzeugnis drei Proben zu entnehmen.

8.2.   Butter

8.2.1.   Der Beimischungsanteil für Butter beträgt unter Berücksichtigung der Hintergrundabsorption 22 mg/kg.

8.2.2.   Die Ergebnisse der drei aus der Produktanalyse erhaltenen Proben werden verwendet, um die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels zu prüfen; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	17,7 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote),

—	12,2 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das durch Interpolierung zwischen 17,7 mg/kg und 12,2 mg/kg ermittelt wurde.

8.3.   Butterfett

8.3.1.   Der Beimischungsanteil für Butterfett beträgt unter Berücksichtigung der Hintergrundabsorption 24 mg/kg.

Die Ergebnisse der drei aus der Produktanalyse erhaltenen Proben werden verwendet, um die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels zu prüfen; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	19,2 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote),

—	13,2 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das durch Interpolierung zwischen 13,2 mg/kg und 19,2 mg/kg ermittelt wurde.

ANHANG VIII

(Artikel 5)

BESTIMMUNG DES SITOSTERIN- ODER DES STIGMASTERIN-GEHALTS IN BUTTER ODER BUTTERFETT DURCH KAPILLARSÄULEN-GASCHROMATOGRAFIE

1.   GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Die Methode beschreibt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Sitosterin bzw. Stigmasterin in Butterfett und Butter. Sitosterin ist dabei die Summe von β-Sitosterin und 22-Dihydro-β-Sitosterin; die anderen Sitosterine werden als unbedeutend betrachtet.

2.   KURZBESCHREIBUNG

Das Butterfett bzw. die Butter wird mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift. Die unverseifbaren Bestandteile werden mit Ether extrahiert.

Die Sterine werden zu Trimethylsilylethern derivatisiert und durch Kapillarsäulen-Gaschromatografie mit Betulin als interner Standardprobe analysiert.

3.   APPARATUR

3.1.   150-ml-Verseifungskolben mit Rückflusskühler und Schliffverbindungen

3.2.   500-ml- Scheidetrichter

3.3.   250-ml-Kolben

3.4.   Druckausgleichtrichter (etwa 250 ml) zum Auffangen von überschüssigem Ether

3.5.   Glassäule, 350 mm × 20 mm, mit Sinterglasfritte

3.6.   Wasserbad oder Heizhaube

3.7.   Reaktionsglas, 2 ml

Zur Verwendung mit einer Kapillarsäule geeigneter Gaschromatograf, ausgerüstet mit einem „Split-System“ und folgenden Bestandteilen:

3.8.1.   Säulenofen, der die gewünschte Temperatur mit einer Genauigkeit von ±1 °C halten kann;

3.8.2.   Verdampfer mit einstellbarer Temperatur;

3.8.3.   Flammenionisationsdetektor und einem Signal-Verstärker;

3.8.4.   Aufzeichnungsgerät mit Integrator für den Signal-Verstärker (3.8.3).

3.9.   Quarzglas-Kapillarsäule, vollständig mit BP1 oder einem gleichwertigen Material beschichtet (oder eine sonstige Säule mit mindestens gleicher Auflösung) mit einheitlicher Stärke von 0,25 µm; die Säule muss die Trimethylsilylderivate von Lanosterin und Sitosterin trennen können. Geeignet ist eine mit BP 1 beschichtete Säule von 12 m Länge und 0,2 mm Innendurchmesser.

3.10.   1-μl-Gaschromatografie-Mikrospritze mit gehärteter Nadel.

4.   REAGENZIEN

Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Das verwendete Wasser muss destilliert sein oder einen mindestens gleichwertigen Reinheitsgrad aufweisen.

4.1.   Ethanol, Reinheitsgrad mindestens 95 %

4.2.   60 %ige Kaliumhydroxid-Lösung (600 g Kaliumhydroxid (mindestens 85 %) werden in Wasser gelöst; die Lösung wird anschließend mit Wasser bis auf einen Liter aufgefüllt

Betulin, Reinheitsgrad mindestens 99 %

Betulinlösungen in Diethylether (4.4)

4.3.1.1.   Die zur Bestimmung von Sitosterin verwendete Betulinlösung muss eine Konzentration von 1,0 mg/ml aufweisen.

4.3.1.2.   Die zur Bestimmung von Stigmasterin verwendete Betulinlösung muss eine Konzentration von 0,4 mg/ml aufweisen.

4.4.   Diethylether, analysenrein (frei von Peroxiden oder Rückständen)

4.5.   Natriumsulfat, wasserfrei, granular, zuvor 2 Stunden bei 102 °C getrocknet

4.6.   Silylierungsreagens, z. B. TRI-SIL (erhältlich von Pierce Chemical Co., Kat.-Nr. 49001) oder vergleichbares Reagenz. (Achtung: TRI-SIL ist entflammbar, giftig, ätzend und potenziell kanzerogen. Das Laborpersonal muss mit den Sicherheitsdaten zu TRI-SIL vertraut sein und die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen treffen.)

4.7.   Lanosterol

Sitosterin, bekannter Reinheitsgrad mindestens 90 % (P)

Anmerkung 1: Die Reinheit der Standardstoffe für die Kalibrierung ist durch Normalisierung zu bestimmen. Dazu wird angenommen, dass das Chromatogramm alle in der Probe vorhandenen Sterine wiedergibt, dass die Gesamtfläche der Peaks 100 % der Sterinbestandteile darstellt und dass alle Sterine ein gleich starkes Detektorsignal hervorrufen. Es ist sicherzustellen, dass das System in den maßgeblichen Konzentrationsbereichen linear verläuft.

4.8.1.   Sitosterin-Standardlösung: Sitosterin (4.8) wird in Diethylether (4.4) mit einer Konzentration von etwa 0,5 mg/ml (Genauigkeit 0,001 mg/ml) gelöst;

Stigmasterin, bekannter Reinheitsgrad mindestens 90 % (P);

4.9.1.   Stigmasterin-Standardlösung: Stigmasterin (4.9) wird in Diethylether (4.4) mit einer Konzentration von etwa 0,2 mg/ml (Genauigkeit 0,001 mg/ml) gelöst;

4.10.   Testlösung für die Prüfung der Auflösung: Lanosterin (4.7) (0,05 mg/ml) und Sitosterin (4.8) (0,5 mg/ml) werden in Diethylether (4.4) gelöst.

5.   METHODE

5.1.   Herstellung der Standardlösungen für die Chromatografie:

Die interne Standardlösung (4.3.1) muss der entsprechenden Sterin-Standardlösung und der verseiften Probe gleichzeitig zugesetzt werden (siehe 5.2.2).

5.1.1.   Sitosterin-Standardlösung für die Chromatografie: je 1 ml der Sitosterin-Standardlösung (4.8.1) werden in 2 Reaktionsgläser (3.7) gegeben; der Ether ist durch einen Stickstoffstrom zu entfernen. 1 ml der internen Standardlösung (4.3.1.1) werden hinzugegeben und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt.

5.1.2.   Stigmasterin-Standardlösung für die Chromatografie: je 1 ml der Stigmasterin-Standardlösung (4.9.1) wird in 2 Reaktionsgläser (3.7) gegeben und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt. 1 ml der internen Standardlösung (4.3.1.2) wird hinzugegeben und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt.

5.2.   Vorbereitung der unverseifbaren Bestandteile

5.2.1.   Die Butterprobe wird bei höchstens 35 °C geschmolzen und unter Rühren gründlich durchgemischt.

Ungefähr 1 g Butter (W2) oder Butterfett (W2) werden auf 1 mg genau in einen 150-ml-Kolben (3.1) eingewogen. 50 ml Ethanol (4.1) und 10 ml Kaliumhydroxid-Lösung (4.2) werden hinzugegeben. Der Rückflusskühler wird angebracht und 30 Minuten auf etwa 75 °C erhitzt. Der Kühler wird abgenommen; danach wird gewartet, bis sich der Kolben auf Raumtemperatur abgekühlt hat.

5.2.2.   1,0 ml der internen Standardlösung (4.3.1.1 bei der Bestimmung von Sitosterin bzw. 4.3.1.2 bei der Bestimmung von Stigmasterin) werden in den Kolben gegeben. Die Lösung wird gründlich gemischt. Der Inhalt des Kolbens wird quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter (3.2) gegeben, in dem der Kolben nacheinander mit 50 ml Wasser und 250 ml Diethylether (4.4) ausgespült wird. Der Scheidetrichter wird zwei Minuten kräftig geschüttelt; anschließend wird die Phasentrennung abgewartet. Die untere Wasserschicht wird abgelassen und die Etherschicht viermal mit je 100 ml Wasser ausgeschüttelt.

Anmerkung 2: Damit keine Emulsion entsteht, ist es wichtig, die ersten beiden Waschvorgänge mit Wasser vorsichtig auszuführen (10 Drehungen). Beim dritten Waschvorgang kann 30 Sekunden lang kräftig geschüttelt werden. Sollte sich eine Emulsion bilden, kann diese durch Zugabe von 5-10 ml Ethanol aufgelöst werden. Bei Zugabe von Ethanol muss unbedingt noch zweimal kräftig mit Wasser ausgeschüttelt werden.

5.2.3.   Die klare seifenfreie Etherschicht wird durch eine Glassäule (3.5) mit 30 g wasserfreiem Natriumsulfat (4.5) eluiert. Der Ether wird in einem 250-ml-Kolben (3.3) aufgefangen. Ein Siedesteinchen wird hinzugegeben; anschließend wird die Flüssigkeit auf einem Wasserbad oder einer Heizhaube fast bis zur völligen Trockenheit eingedampft; dabei wird das überschüssige Lösungsmittel aufgefangen.

Anmerkung 3: Werden die Probenextrakte bei zu hoher Temperatur vollständig getrocknet, können Sterinverluste auftreten.

5.3.   Vorbereitung der Trimethylsilylether

5.3.1.   Die im Kolben verbliebene Etherlösung mit 2 ml Ether wird in ein 2-ml-Reaktionsglas (3.7) gegeben und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt. Der Kolben wird mit 2 weiteren 2-ml-Aliquoten Ether ausgespült; dabei wird jeweils der Inhalt in das Reaktionsglas umgefüllt und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt.

5.3.2.   Die Probe wird durch Zugabe von 1 ml TRI-SIL (4.6) silyliert. Das Glas wird verschlossen und kräftig geschüttelt, damit sich die Probe auflöst. Wenn sich die Probe nicht vollständig auflöst, wird die Probe auf 65-70 °C erwärmt. Danach wird die Probe mindestens fünf Minuten stehen gelassen, bevor sie in den Gaschromatografen injiziert wird. Die Standardlösungen werden in gleicher Weise wie die Proben silyliert. Die Mischung zur Prüfung der Auflösung (4.10) wird ebenfalls in gleicher Weise wie die Proben silyliert.

Anmerkung 4: Die Silylierung ist in wasserfreier Umgebung vorzunehmen. Die unvollständige Silylierung von Betulin wird durch einen zweiten Peak dicht neben dem von Betulin angezeigt.

Ethanol-Rückstände in der Silylierungsphase können die Silylierung beeinträchtigen. Möglicherweise wurde in der Extraktionsphase nicht hinreichend gespült. In diesem Fall muss bei der Extraktion ein fünftes Mal gespült werden (30 Sekunden kräftiges Schütteln).

5.4.   Analyse durch Gaschromatografie

5.4.1.   Herstellung der Arbeitsbedingungen

Der Gaschromatograf wird gemäß der Herstelleranweisung vorbereitet.

Als Leitlinie gelten die folgenden Arbeitsbedingungen:

—	Säulentemperatur: 265 °C

—	Injektortemperatur: 265 °C

—	Detektortemperatur: 300 °C

—	Durchflussgeschwindigkeit des Trägergases: 0,6 ml/min

—	Wasserstoffdruck: 84 kPa

—	Luftdruck: 155 kPa

—

Splitverhältnis: 10:1 bis 50:1; das Splitverhältnis ist nach den Herstelleranweisungen zu optimieren; anschließend wird die Linearität des Detektorsignals im interessierenden Konzentrationsbereich überprüft. Anmerkung 5: Es ist unbedingt darauf zu achten, dass die Injektionsröhre regelmäßig gereinigt wird.

—	Menge der eingespritzten Substanz: 1 µl TMSE-Lösung.

Vor Beginn jeglicher Analysen muss gewartet werden, bis das System äquilibriert ist und ein hinreichend stabiles Response-Signal liefert.

Diese Bedingungen können je nach Beschaffenheit der Säule und des Gaschromatografen abgewandelt werden, damit Chromatogramme entstehen, die den folgenden Anforderungen genügen:

—	Der Sitosterin-Peak muss vom Lanosterin-Peak genügend abgesetzt sein. Abbildung 1 zeigt ein typisches Chromatogramm, das sich aus der silylierten Testlösung zur Prüfung der Auflösung ergeben sollte (4.10).

—	Die relativen Retentionszeiten der folgenden Sterine sollten ungefähr betragen: — Cholesterin: 1,0 — Stigmasterin: 1,3 — Sitosterin: 1,5 — Betulin: 2,5

—	Die Retentionszeit für Betulin sollte etwa 24 Minuten betragen.

5.4.2.   Analyseverfahren

1 µl der silylierten Standardlösung (Stigmasterin bzw. Sitosterin) wird eingespritzt; danach sind die Parameter für die Kalibrierung des Integrators einzustellen.

Darauf wird nochmals 1 µl der silylierten Standardlösung eingespritzt, um die Response-Faktoren in Bezug auf Betulin zu bestimmen.

1 µl der silylierten Probelösung wird eingespritzt; danach werden die Peak-Flächen gemessen. Am Anfang und am Ende einer jeden gaschromatografischen Analysenfolge muss die Standardlösung eingespritzt werden.

Als Leitlinie sollte nach je sechs Probelösungen die Standardlösung eingespritzt werden.

Anmerkung 6: Bei der Integration des Stigmasterin-Peaks ist auch das durch die Punkte 1, 2 und 3 in Abbildung 2b markierte Tailing mit zu erfassen.

Bei der Integration des Sitosterin-Peaks ist die Fläche des Peaks von 22-Dihydro-β-Sitosterin (Stigmastanin), das unmittelbar nach Sitosterin eluiert wird, mit zu erfassen, wenn das gesamte Sitosterin berechnet werden soll.

6.   BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

6.1.   Die Fläche der Sterin-Peaks und der Betulin-Peaks für die zu Beginn und am Ende eines Durchlaufs eingespritzten Standardlösungen bestimmen und R1 berechnen:

R1 = (durchschnittliche Fläche des Sterin-Peaks der Standardlösung)/(durchschnittliche Fläche des Betulin-Peaks der Standardlösung)

Die Fläche des Sterin-Peaks (Stigmasterin und Sitosterin) und des Betulin-Peaks der Probe werden bestimmt, und R2 wird berechnet:

R2 = (Fläche des Sterin-Peaks der Probe)/(Fläche des Betulin-Peaks der Probe)

W1	=	Steringehalt der Standardprobe (mg) in 1 ml Standardlösung (4.8.1 oder 4.9.1)
W2	=	Gewicht der Probe (g) (5.2.1)
P	=	Reinheitsgrad des Standardsterins (4.8 oder 4.9)

Steringehalt der Probe (mg/kg) = ((R 2) / (R 1)) × ((W 1) / (W 2)) × P × 10

7.   GENAUIGKEIT DER METHODE

7.1.   Butter

7.1.1.   Wiederholbarkeit

7.1.1.1.   Stigmasterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 19,3 mg/kg voneinander abweichen.

7.1.1.2.   Sitosterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 23,0 mg/kg voneinander abweichen.

7.1.2.   Vergleichbarkeit

7.1.2.1.   Stigmasterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 31,9 mg/kg voneinander abweichen.

7.1.2.2.   Sitosterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 8,7 % des Durchschnitts der Bestimmungen voneinander abweichen.

7.1.3.   Herkunft der Präzisionsdaten

Die Präzisionsdaten stammen aus einem 1992 durchgeführten Versuch, an dem 8 Laboratorien beteiligt waren und bei dem 6 Proben (3 Blindproben) auf Stigmasterin und 6 Proben (3 Blindproben) auf Sitosterin untersucht wurden.

7.2.   Butterfett

7.2.1.   Wiederholbarkeit

7.2.1.1.   Stigmasterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 10,2 mg/kg voneinander abweichen.

7.2.1.2.   Sitosterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 3,6 % des Durchschnitts der Bestimmungen voneinander abweichen.

7.2.2.   Vergleichbarkeit

7.2.2.1.   Stigmasterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 25,3 mg/kg voneinander abweichen.

7.2.2.2.   Sitosterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 8,9 % des Durchschnitts der Bestimmungen voneinander abweichen.

7.2.3.   Herkunft der Präzisionsdaten

Die Präzisionsdaten stammen aus einem 1991 durchgeführten Versuch, an dem neun Laboratorien beteiligt waren und bei dem 6 Proben (3 Blindproben) auf Stigmasterin und 6 Proben (3 Blindproben) auf Sitosterin untersucht wurden.

8.   TOLERANZBEREICH

8.1.   Zur Prüfung der richtigen Kennzeichnung des Erzeugnisses sind dem gekennzeichneten Erzeugnis drei Proben zu entnehmen.

8.2.   Butter

8.2.1.   Stigmasterin

8.2.1.1.   Der Beimischungsanteil für Stigmasterin beträgt 150 g bei mindestens 95 % reinem Stigmasterin je Tonne Butter, d. h. 142,5 mg/kg, bzw. 170 g bei mindestens 85 % reinem Stigmasterin je Tonne Butter, d. h. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2.   Die in der Produktanalyse für die drei Proben ermittelten Ergebnisse werden verwendet, um die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels zu prüfen; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	115,8 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem Sitosterin),

—	117,7 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem Stigmasterin).

—	80,1 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem Stigmasterin),

—	81,5 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem Stigmasterin).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das durch Interpolierung zwischen 115,8 mg/kg und 80,1 mg/kg bzw. 117,7 mg/kg und 81,5 mg/kg ermittelt wurde.

8.2.2.   Sitosterin

8.2.2.1.   Der Beimischungsanteil für Sitosterin beträgt 600 g bei mindestens 90 % reinem Sitosterin je Tonne Butter, d. h. 540 mg/kg.

8.2.2.2.   Die in der Produktanalyse für die drei Proben ermittelten Ergebnisse werden verwendet, um die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels zu prüfen; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	482,6 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem Sitosterin),

—	347,6 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem Sitosterin).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 482,6 mg/kg und 347,6 mg/kg erhält.

8.3.   Butterfett

8.3.1.   Stigmasterin

8.3.1.1.   Der Beimischungsanteil für Sitosterin beträgt 150 g bei mindestens 95 % reinem Sitosterin je Tonne Butterfett, d. h. 142,5 mg/kg oder 170 g bei mindestens 85 % reinem Stigmasterin je Tonne Butterfett, d. h. 144,5 mg/kg

8.3.1.2.   Aufgrund der Ergebnisse der drei in der Produktanalyse untersuchten Proben wird die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels geprüft; das niedrigste Ergebnis wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	118,5 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem Sitosterin),

—	120,4 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem Stigmasterin),

—	82,9 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem Stigmasterin),

—	84,3 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem Stigmasterin).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 118,5 mg/kg und 82,9 mg/kg bzw. 120,4 mg/kg und 84,3 mg/kg erhält.

8.3.2.   Sitosterin

8.3.2.1.   Der Beimischungsanteil für Sitosterin beträgt 600 g bei mindestens 90 % reinem Sitosterin je Tonne Butterfett, d. h. 540 mg/kg.

8.3.2.2.   Aufgrund der Ergebnisse der drei in der Produktanalyse untersuchten Proben wird die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels geprüft; das niedrigste Ergebnis wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—	480,9 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem Sitosterin),

—	345,9 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem Sitosterin).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 480,9 mg/kg und 345,9 mg/kg erhält.

Abbildung 1

Chromatogramm Auflösung Testgemisch

Wünschenswert ist eine vollständige Auflösung, d. h. der Peak-Verlauf muss zur Basislinie zurückführen, bevor der nächste Sitosterin-Peak beginnt; allerdings ist auch eine unvollständige Auflösung annehmbar.

Abbildung 2a	Abbildung 2b
Stigmasterol standard	Butter sample denatured with stigmasterol
Hinweis: Die Integration des Stigmasterin-Peaks muss etwaige Tailings gemäß den Ziffern 1, 2 und 3 beinhalten.

Abbildung 3a	Abbildung 3b
Sistosterol standard	Butter sample denatured with β-Sitosterol
Hinweis: β-Sitosterin enthält häufig eine Verunreinigung (als Stigmastanol), die unmittelbar nach dem β-Sitosterin eluiert. Die Flächen dieser beiden Peaks sind bei der Bewertung des Gesamtgehalts an β-Sitosterin zusammenzufassen.

ANHANG IX

(Artikel 6)

REFERENZMETHODE ZUM NACHWEIS VON KUHMILCH UND KASEIN IN KÄSE AUS SCHAF-, ZIEGEN- ODER BÜFFELMILCH ODER AUS GEMISCHEN VON SCHAF-, ZIEGEN- ODER BÜFFELMILCH

1.   ANWENDUNGSBEREICH

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Kuhmilch und Kasein in Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung der γ-Kaseine nach Plasminolyse.

2.   ANWENDBARKEIT

Dieses Verfahren dient dem empfindlichen und spezifischen Nachweis von Kuhmilch und Kasein (jeweils mit und ohne Wärmebehandlung) in frischem und gereiftem Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch. Es ist ungeeignet für den Nachweis von Milch- und Käsefälschung durch hitzebehandeltes Rindermolkekonzentrat.

3.   KURZBESCHREIBUNG

3.1.   Das Kasein wird aus Käse und Referenzproben isoliert.

3.2.   Das isolierte Kasein wird gelöst; anschließend wird eine Plasminspaltung vorgenommen (EC.3.4.21.7).

3.3.   Die plasminbehandelten Kaseine werden in Anwesenheit von Harnstoff und unter Anfärben der Proteine isoelektrisch fokussiert.

3.4.   Die Auswertung erfolgt durch Vergleich der gefärbten γ3- und γ2-Kaseinbanden (Kuhmilchnachweis) zwischen der zu bestimmenden Probe und der im selben Gel laufenden, 0 % und 1 % Kuhmilch enthaltenden Referenzproben.

4.   REAGENZIEN

Soweit nicht anders angegeben, sind analysenreine Reagenzien zu verwenden. Das Wasser muss zweimal destilliert oder von entsprechender Reinheit sein.

Anmerkung: Die folgenden Angaben gelten für im Labor hergestellte harnstoffhaltige Polyacrylamidgele im Format 265 × 125 × 0,25 mm. Bei Verwendung anderer Gelrezepturen und -formate müssen die Elektrophoresebedingungen gegebenenfalls angepasst werden.

Isoelektrische Fokussierung

4.1.   Reagenzien zur Herstellung der harnstoffhaltigen Polyacrylamidgele

4.1.1.   Gelstammlösung

4,85 g Acrylamid,

0,15 g N, N-Methylen-bis-acrylamid (BIS),

48,05 g Harnstoff und

15,00 g Glycerin (87 % w/w)

werden in Wasser aufgelöst; anschließend wird die Lösung auf 100 ml aufgefüllt, in Braunglasflaschen gegeben und im Kühlschrank aufbewahrt.

Anmerkung: Statt der angegebenen Festeinwaagen der neurotoxischen Acrylamide kann vorzugsweise eine der handelsüblichen Acrylamid-Fertiglösungen verwendet werden. Bei einer solchen Lösung mit 30 % (w/w) Acrylamid und 0,8 % (w/v) BIS müssen anstelle der Festeinwaagen 16,2 ml für die genannte Rezeptur eingesetzt werden. Die Haltbarkeit der Gelstammlösung beträgt maximal 10 Tage. Beträgt die Leitfähigkeit mehr als 5 µS, wird die Lösung mit 2 g Amberlite MB-3 versetzt, unter Rühren 30 Minuten lang entionisiert und dann membranfiltriert (0,45 µm).

4.1.2.   Gellösung

Aus der Gelstammlösung (siehe 4.1.1) wird durch Versetzen mit verschiedenen Ampholyten und Additiven eine Gellösung hergestellt:

9,0 ml Gelstammlösung,

24 mg β-Alanin,

500 µl Ampholyt pH 3,5-9,5 (1),

250 µl Ampholyt pH 5-7 (1),

250 µl Ampholyt pH 6-8 (1).

Die Gellösung wird durchmischt und 2 bis 3 Minuten im Ultraschallbad oder im Vakuum entgast.

Anmerkung: Die Gellösung darf erst unmittelbar vor dem Gießen (siehe 6.2) angesetzt werden.

4.1.3.   Katalysatorlösungen

4.1.3.1.   TEMED: N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin

4.1.3.2.   40 % (w/w) PER: Ammoniumpersulfat

800 mg PER werden mit Wasser versetzt und auf 2 ml aufgefüllt.

Anmerkung: Der PER-Lösung muss immer frisch angesetzt werden.

4.2.   Kontaktflüssigkeit

Kerosin oder n-Decan.

4.3.   Anodenlösung

5,77 g Phosphorsäure (85 % w/w) werden mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

4.4.   Kathodenlösung

2,00 g Natriumhydroxid werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

Probenvorbereitung

4.5.   Reagenzien zur Proteinisolierung

4.5.1.   Verdünnte Essigsäure (25,0 ml Eisessigsäure werden mit Wasser auf 100 aufgefüllt.)

4.5.2.   Dichlormethan

4.5.3.   Aceton

4.6.   Protein-Lösungspuffer

5,75 g Glycerin (87 % w/w),

24,03 g Harnstoff und

250 mg Dithiothreitol

werden in destilliertem Wasser aufgelöst und auf 50 ml aufgefüllt.

Anmerkung: Die Lösung ist im Kühlschrank aufzubewahren und höchstens 1 Woche haltbar.

4.7.   Reagenzien für die Plasminspaltung des Kaseins

4.7.1.   Ammoniumcarbonat-Pufferlösung

0,2 mol/l NH4HCO3-Lösung (1,58 g/100 ml Wasser), die mit 0,05 mol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA 1,46 g/100 ml) versetzt wurde, wird mit 0,2 mol/l (NH4)2CO3-Lösung (1,92 g/100 ml Wasser), die mit 0,05 mol/l EDTA versetzt wurde, auf pH 8 titriert.

4.7.2.   Bovines Plasmin (EC. 3.4.21.7), Aktivität mindestens 5 U/ml

4.7.3.   ε-Aminocapronsäure zur Enzyminaktivierung

2,624 g ε-Aminocapronsäure (6-Amino-n-Hexansäure) werden in 100 ml 40 %igem Ethanol (v/v) gelöst.

4.8.   Standardproben

4.8.1.   Zertifizierte Standardproben eines Gemisches von mit Lab versetztem Schaf- und Ziegen-Magermilchpulver, das jeweils 0 % und 1 % Kuhmilch enthält, sind erhältlich beim Kommissionsinstitut für Referenzmaterialien und Messwesen, B-2440 Geel, Belgien.

4.8.2.   Ansetzen der Interim-Standardproben von labversetzter Büffelmilch mit 0 % bzw. 1 % Kuhmilch

Zur Gewinnung von Magermilch wird eine rohe Büffel- bzw. Kuhsammelmilch bei einer Temperatur von 37 °C mit 2 500 g 20 Minuten lang zentrifugiert. Nach raschem Abkühlen des Zentrifugenbechers nebst Inhalt auf 6 bis 8 °C wird die Fettschwimmschicht restlos entfernt. Zum Ansetzen der 1 %igen Standardprobe werden 495 ml Büffelmagermilch in einem 1-l-Becherglas mit 5,00 ml Kuhmagermilch versetzt und durch Zusetzen verdünnter Milchsäure (10 % w/w) auf einen pH-Wert von 6,4 eingestellt. Die Temperatur wird auf 35 °C eingestellt; anschließend werden 100 µl Kälberlab (Labstärke 1: 10 000, ca. 3 000 U/ml) hinzugegeben. 1 Minute wird gerührt; danach wird das Becherglas mit einer Aluminiumfolie abgedeckt eine Stunde bei einer Temperatur von 35 °C stehen gelassen, damit sich der Quark/Topfen bilden kann. Anschließend wird die gesamte dickgelegte Milchprobe ohne vorheriges Homogenisieren oder Abscheiden der Molke gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wird das Produkt gleichmäßig und homogen vermahlen. Zum Ansetzen der 0 %igen Standardprobe wird das gleiche Verfahren mit reiner Büffelmagermilch durchgeführt. Die Standardproben sind bei –20 °C aufzubewahren.

Anmerkung: Es empfiehlt sich, die Reinheit der Büffelmilch durch isoelektrische Fokussierung der plasminbehandelten Kaseine vor dem Ansetzen der Standardproben zu prüfen.

Reagenzien zur Proteinfärbung

4.9.   Fixierlösung

150 g Trichloressigsäure werden in Wasser gelöst und auf 1 000 ml aufgefüllt.

4.10.   Entfärbelösung

500 ml Methanol und 200 ml Eisessig werden mit destilliertem Wasser auf 2 000 ml aufgefüllt.

Anmerkung: Die Entfärbelösung ist jeden Tag frisch anzusetzen; sie kann zweckmäßigerweise aus Vorratslösungen 50 % (v/v) Methanol und 20 % (v/v) Eisessig durch Mischen gleicher Volumina zubereitet werden.

4.11.   Färbelösungen

4.11.1.   Färbelösungen (Vorratslösung 1)

3,0 g Coomassie Brilliant Blau G-250 (C.I. 42655) werden in 1 000 ml 90 % (v/v) Methanol mit einem Magnetrührer (etwa 45 Minuten) verrührt und anschließend durch zwei mittelschnelle Faltenfilter gefiltert.

4.11.2.   Färbelösung (Vorratslösung 2)

5,0 g Kupfersulfatpentahydrat werden in 1 000 ml 20 %iger Essigsäure (v/v) gelöst.

4.11.3.   Färbelösung (gebrauchsfertig)

Unmittelbar vor dem Färben werden jeweils 125 ml der Vorratslösungen (4.11.1 und 4.11.2) miteinander vermischt.

Anmerkung: Die Färbelösung ist am Tag des Ansetzens aufzubrauchen.

5.   AUSRÜSTUNG

5.1.   Glasplatten (265 × 125 × 4 mm); Gummiroller mit Walzenbreite von 15 cm; Nivelliertisch

5.2.   Gelträgerfolie (265 × 125 mm)

5.3.   Gegenfolie (280 × 125 mm); beide Längsseiten werden mit je einem Klebestreifen (280 × 6 × 0,25 mm) abgeklebt (Abbildung 1).

5.4.   Elektrofokussierkammer mit Kühlplatte (z. B. 265 × 125 mm) mit geeignetem Spannungsgeber (≥ 2,5 kV) oder Elektrophoreseautomat

5.5.   Umlaufkryostat, thermostatregelbar auf 12 ± 0,5 °C

5.6.   Zentrifuge, einstellbar auf 3 000 g

5.7.   Elektrodenstreifen (≥265 mm lang)

5.8.   Tropfflaschen aus Kunststoff, für Anoden- und Kathodenlösung

5.9.   Probenapplikatoren 10 × 5 mm (Viskose oder Filterpapier mit geringer Proteinadsorption)

5.10.   Scheren, Skalpelle und Pinzetten aus Edelstahl

5.11.   Färbe- und Entfärbeschalen aus Edelstahl oder Glas (z. B. Instrumentenschalen 280 × 150 mm)

5.12.   Regelbarer Homogenisierstab (Schaftdurchmesser 10 mm), Drehzahlbereich 8 000-20 000 min-1

5.13.   Magnetrührer

5.14.   Ultraschallbad

5.15.   Folienschweißgerät

5.16.   25-μl-Mikropipetten

5.17.   Vakuumzentrifuge oder Gefriertrockner

5.18.   Thermostatregelbares Wasserbad, einstellbar auf 35 und 40 ± 1 °C, mit Schüttelvorrichtung

5.19.   Densitometerausrüstung, Registrierung bei λ = 634 nm

6.   VERFAHREN

6.1.   Probenvorbereitung

6.1.1.   Kaseinisolierung

Eine 5 g Trockenmasse entsprechende Menge Käse oder die Referenzstandardproben werden in ein 100-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben; 60 ml destilliertes Wasser werden hinzugegeben; anschließend wird die Probe mit einem Homogenisierstab (8 000 bis 10 000 Umin-1 homogenisiert. Mit verdünnter Essigsäure (4.5.1) wird der pH-Wert 4,6 eingestellt; dann wird die Probe zentrifugiert (5 Minuten, 3 000 g). Fette und Molke werden dekantiert und der Rückstand in 40 ml destilliertem Wasser, das mit verdünnter Essigsäure (4.5.1) auf einen pH-Wert von 4-5 eingestellt wurde, homogenisiert (20 000 Umin-1), mit 20 ml Dichlormethan (4.5.2) versetzt, nochmals homogenisiert und dann zentrifugiert (5 Minuten bei 3 000 g). Die zwischen wässriger und organischer Phase schwimmende Kaseinschicht (siehe Abbildung 2) wird mit einem Spatel angehoben, damit beide Phasen dekantiert werden können. Das Kasein wird nochmals in 40 ml destilliertem Wasser (siehe oben) und 20 ml Dichlormethan homogenisiert und zentrifugiert. Dieser Vorgang ist zu wiederholen, bis beide Extraktionsphasen farblos sind (zwei- bis dreimal). Der Proteinrückstand wird mit 50 ml Aceton (4.5.3) homogenisiert und über ein mittelschnelles Faltenpapierfilter abfiltriert. Das Filterretentat wird zweimal mit je 25 ml Aceton gewaschen, an der Luft oder im Stickstoffstrom getrocknet und in einer Reibschale fein zerrieben.

Anmerkung: Trockene Kaseinisolate sind bei –20 °C aufzubewahren.

6.1.2.   Plasminspaltung der β-Kaseine zur Anreicherung der γ-Kasein-Konzentration

25 mg Kaseinisolat (6.1.1) werden in 0,5 ml Ammoniumcarbonatpufferlösung (4.7.1) suspendiert und 20 Minuten z. B. im Ultraschallbad homogenisiert. Das Homogenisat wird auf 40 °C erwärmt, mit 10 µl Plasmin (4.7.2) versetzt, durchmischt und eine Stunde bei 40 °C unter ständigem Schütteln bebrütet. Zur Enzyminhibierung werden 20 µl ε-Aminocapronsäurelösung (4.7.3), danach 200 mg fester Harnstoff und schließlich 2 mg Dithiothreitol zugesetzt.

Anmerkung: Zur Verbesserung der Symmetrie der fokussierten Kaseinbanden empfiehlt es sich, die Lösung nach Zusatz von ε-Aminocapronsäure gefrierzutrocknen und den Probenrückstand in 0,5 ml Harnstoffpufferlösung (4.6) zu lösen.

6.2.   Herstellen der harnstoffhaltigen Polyacrylamidgele

Auf eine Glasplatte (5.1) wird die Gelträgerfolie (5.2) mit Hilfe einiger Tropfen Wasser aufgewalzt; ausgetretenes Wasser ist mit einem Papiertuch aufzunehmen. In gleicher Weise wird die mit Abstandshaltern (0,25 mm) versehene Gegenfolie (5.3) auf eine weitere Glasplatte aufgewalzt. Diese wird dann horizontal auf einem Nivelliertisch ausgerichtet.

Die frisch angesetzte, entgaste Gellösung (4.1.2) wird mit je 10 µl der Katalysatorlösungen TEMED und PER (4.1.3.1) versetzt, kurz durchmischt und gleichmäßig auf die Mitte der Gegenfolie ausgegossen. Die Gelträgerplatte wird (mit der Folie nach unten) mit einer Kante auf die nivellierte Gegenfolienplatte aufgesetzt und so langsam abgesenkt, dass sich zwischen den Folien ein Gelfilm bilden und sich gleichmäßig und blasenfrei ausbreiten kann (Abbildung 3). Die Gelträgerfolienplatte wird mit Hilfe eines dünnen Spatels vollständig aufgesetzt; drei weitere Glasplatten werden als Andruckgewichte aufgelegt. Nach vollständiger Polymerisierung (ca. 60 Minuten) wird das auf der Gelträgerfolie anpolymerisierte Gel mitsamt Gegenfolie durch Verkanten der Glasplatten herausgelöst. Die Rückseite der Trägerfolie wird sorgfältig von Gelresten und Harnstoff gesäubert. Das „Gel-Sandwich“ wird nun in einen Folienschlauch eingeschweißt und im Kühlschrank (maximal 6 Wochen) aufbewahrt.

Anmerkung: Die Gegenfolie mit den Abstandshaltern kann wiederverwendet werden. Das Polyacrylamidgel kann auf kleinere Formate zugeschnitten werden; dies ist bei kleinem Probenumfang oder bei Verwendung eines Elektrophoreseautomaten zu empfehlen (2 Gele im Format 4,5 × 5 cm).

6.3.   Isoelektrische Fokussierung

Der Kühlthermostat wird auf 12 °C eingestellt. Nach Abwischen der Gelträgerfolienrückseite mit Kerosin (4.2) werden einige Tropfen Kerosin auf die Mitte des Kühlblocks aufgebracht. Das „Gel-Sandwich“ wird mit der Trägerseite nach unten blasenfrei aufgewalzt. Ausgetretenes Kerosin wird abgewischt und die Gegenfolie abgezogen. Die Elektrodenstreifen werden mit den entsprechenden Elektrodenlösungen (4.3, 4.4) getränkt, auf die Gellänge zugeschnitten und auf die dafür vorgesehenen Stellen gelegt (Elektrodenabstand 9,5 cm).

Die Fokussierung ist unter folgenden Bedingungen durchzuführen:

6.3.1.   Gelformat 265 × 125 × 0,25 mm

Schritt	Dauer (min)	Spannung (V)	Stromstärke (mA)	Leistung (W)	Voltstunden (Vh)
1. Vorfokussierung	30	max. 2 500	max. 15	konstant 4	ca. 300
2. Probenfokussierung (2)	60	max. 2 500	max. 15	konstant 4	ca. 1 000
3. Endfokussierung	60	max. 2 500	max. 5	max. 20	ca. 3 000
	40	max. 2 500	max. 6	max. 20	ca. 3 000
	30	max. 2 500	max. 7	max. 25	ca. 3 000

Anmerkung: Bei Änderung der Stärke oder Breite der Gele sind Strom und Leistung entsprechend anzupassen (z. B. Verdopplung von Stromstärke und Leistung bei Verwendung eines 0,5 mm starken Gels im Format 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2.   Beispiel eines Spannungsprogramms für einen Elektrophoreseautomaten (2 Gele je 5,0 × 4,5 cm); direkte Aufbringung der Elektroden auf das Gel (ohne Elektrodenstreifen)

Schritt	Spannung	Stromstärke	Leistung	Temp.	Voltstunden
1. Vorfokussierung	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	85 Vh
2. Probenfokussierung	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 °C	30 Vh
3. Fokussierung	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	80 Vh
4. Fokussierung	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 °C	570 Vh

In Schritt 2 wird der Probenapplikator bei 0 Vh aufgesetzt.

In Schritt 2 wird der Probenapplikator bei 30 Vh abgenommen.

6.4.   Proteinanfärbung

6.4.1.   Fixieren der Proteine

Unmittelbar nach Abschalten des Stroms werden die Elektrodenstreifen entfernt. Das Gel wird sofort in eine mit 200 ml Fixierlösung (4.9) gefüllte Färbe- und Entfärbeschale gegeben und 15 Minuten geschüttelt.

6.4.2.   Waschen und Färben der Gelplatte

Die Fixierlösung wird restlos abgegossen und die Gelplatte zweimal je 30 Sekunden mit 100 ml Entfärbelösung (4.10) gespült. Die Entfärbelösung wird abgegossen und die Schale mit 250 ml Färbelösung (4.11.3) gefüllt; die Färbelösung wird 45 Minuten leicht geschwenkt, um die Lösung einwirken zu lassen.

6.4.3.   Entfärben der Gelplatte

Die Färbelösung wird abgegossen, die Gelplatte zweimal mit je 100 ml Entfärbelösung (4.10) gespült und anschließend mindestens 2 x 15 Minuten in 200 ml Entfärbelösung geschwenkt, bis der Hintergrund klar und farblos ist. Die Gelplatte wird dann mit destilliertem Wasser (zweimal 2 Minuten) gespült und an der Luft (2 bis 3 Stunden) oder mit dem Fön (ca. 10 bis 15 Minuten) getrocknet.

Anmerkung 1: Fixierung, Färben und Entfärben erfolgen bei einer Temperatur von 20 °C. Bei höheren Temperaturen dürfen diese Schritte nicht ausgeführt werden.

Anmerkung 2: Wird einer empfindlicheren Silberfärbelösung (z. B. Silberfärbelösungs-Kit, Protein Pharmacia Biotech, Code Nr. 17-1150-01) der Vorzug gegeben, sind die plasminbehandelten Kaseinproben auf 5 mg/ml zu verdünnen.

7.   BEWERTUNG

Die Bewertung erfolgt durch Vergleich der Proteinbandenmuster der unbekannten Probe mit den Referenzstandardproben auf demselben Gel. Der Nachweis von Kuhmilch in Käsen aus Schaf, Ziegen- oder Büffelmilch und in Gemischen aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch erfolgt aufgrund der γ3- und der γ2-Kaseine, bei denen die isoelektischen Punkte im pH-Wert-Bereich 6,5 bis 7,5 liegen (Abbildungen 4a und b und Abbildung 5). Die Nachweisgrenze des Verfahrens liegt unter 0,5 %.

7.1.   Visuelle Bestimmung

Zur visuellen Bestimmung des Kuhmilchanteils empfiehlt es sich, die Konzentration der Proben und der Standardproben auf die Stärke der Schaf-, Ziegen- und/oder Büffel-γ2 und -γ3-Kaseine einzustellen (siehe „γ2 E,G,B“ und „γ3 E,G,B“ in den Abbildungen 4a und 4b und Abbildung 5). Nur dann kann der Kuhmilchgehalt (kleiner, gleich oder größer als 1 %) in der zu beurteilenden Probe durch direkten Vergleich der Stärken der Rinder-γ2- und -γ3-Kaseinzonen (siehe „γ3 C“ und „γ2 C“ in den Abbildungen 4a, 4b und 5) mit denen der 0 %- und 1 %-Standardproben (Schaf, Ziege) oder laboreigenen Interims-Standardproben (Büffelmilch) bestimmt werden.

7.2.   Densitometrische Bestimmung

Nach Möglichkeit ist mit Hilfe eines Densitometers (5.19) das Peak-Flächen-Verhältnis der γ2- und γ3-Kaseine (siehe Abbildung 5) zwischen Rind und Schaf, Ziege und/oder Büffel zu ermitteln. Dieser Wert ist mit dem γ2- und γ3-Kasein-Peak-Flächen-Verhältnis der 1 %igen Standardprobe (Schaf, Ziege) oder der im selben Gel laufenden laboreigenen Interims-Standardprobe (Büffel) zu vergleichen.

Anmerkung: Reagiert die 1 % Kuhmilch enthaltende Standardprobe eindeutig positiv sowohl auf γ2- als auch auf γ3-Kaseine, die 0 %ige Standardprobe dagegen nicht, liefert die Methode zuverlässige Ergebnisse. Ansonsten ist das Verfahren unter genauer Beachtung der Verfahrensvorschrift zu optimieren.

Eine Stichprobe gilt als positiv, wenn die Kuhmilchkaseine γ2 und γ3 oder die entsprechenden Peak-Flächen-Verhältnisse zumindest den Zahlen für die 1 %ige Standardprobe entsprechen.

8.   LITERATUR

1.	Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2.	Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3.

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier; in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, Hrsg.) S. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4.	Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5.	Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 µm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Abbildung 1

Schematische Darstellung der Gegenfolie

Abbildung 2

Kaseinschwimmschicht zwischen wässriger und organischer Phase nach dem Zentrifugieren

Abbildung 3

Klapptechnik zur Herstellung ultradünner Polyacrylamidgele

a = Abstandshalter (0,25 mm); b = Gegenplatte (5.3); c, e = Glasplatten (5.1); d = Gellösung (4.1.2); f = Gelträgerplatte (5.2)

Abbildung 4a

Isoelektrische Fokussierung plasminbehandelter Kaseine von Schaf- und Ziegenmilchkäse mit unterschiedlichem Kuhmilchgehalt

% CM = Kuhmilchgehalt C = Kuh, E = Schaf, G = Ziege.

Abgebildet ist die obere Hälfte des IEF-Gels.

Abbildung 4b

Isoelektrische Fokussierung plasminbehandelter Kaseine von Käse, der aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- und Büffelmilch mit unterschiedlichem Kuhmilchgehalt hergestellt wurde

% CM = Prozentanteil Kuhmilch; 1 + = Probe mit 1 % Kuhmilch, versetzt mit reinem Kuhmilchkasein in der Mitte des Durchlaufs C = Kuh, E = Schaf, G = Ziege, B = Büffel.

Abgebildet ist der gesamte Trennungsabstand des IEF-Gels.

Abbildung 5

Densitogrammreihe der Standardproben (STD) und Käseproben aus Gemischen von Schaf- und Ziegenmilch nach isoelektrischer Fokussierung

a, b = Standardproben mit 0 und 1 % Kuhmilch; c-g = Käseproben mit 0, 1, 2, 3 und 7 % Kuhmilch; C = Kuh, E = Schaf, G = Ziege

Die obere Hälfte des IEF-Gels wurde bei λ = 634 nm analysiert.

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(1)  Die Produkte Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) und Resolyte® pH 5-7 und pH 6-8 (BDH, Merck) haben sich als besonders geeignet für die erforderliche Trennung der γ-Kaseine erwiesen.

(2)  Probenauftrag: Nach der Vorfokussierung (Schritt 1) werden 18 µl der Probe und der Standardlösungen auf die Probenapplikatoren (10 × 5 mm) pipettiert und in Abständen von 1 mm voneinander sowie von 5 mm in Längsrichtung von der Anode auf das Gel gebracht und leicht angedrückt. Die Fokussierung erfolgt unter den beschriebenen Bedingungen; nach der 60-minütigen Probenfokussierung sind die Probenapplikatoren vorsichtig abzunehmen.