ANHANG II
ANHANG XX
Verfahren für die Bestimmung des Gehalts an Wachsen, Fettsäuremethylestern und Fettsäureethylestern durch Kapillargaschromatographie
1. ZWECK
Dieses Verfahren dient der Bestimmung des Gehalts an Wachsen, Fettsäuremethylestern und Fettsäureethylestern in Olivenölen. Die einzelnen Wachse und Alkylester werden nach der Zahl der Kohlenstoffatome getrennt. Das Verfahren wird empfohlen als Instrument für die Unterscheidung zwischen Olivenöl und Oliventresteröl sowie als Qualitätsparameter für native Olivenöle extra, indem es die Feststellung von betrügerischen Mischungen aus nativen Olivenölen extra und Ölen minderwertiger Qualität ermöglicht, unabhängig davon, ob es sich dabei um native Öle, Lampantöle oder desodorierte Öle handelt.
2. PRINZIP
Das Öl wird mit einem geeigneten internen Standard versetzt und chromatographisch über eine Kieselgelsäule fraktioniert. Die unter Versuchsbedingungen eluierte Fraktion (mit schwächerer Polarität als Triacylglycerine) wird rückgeführt und sofort kapillargaschromatographisch analysiert.
3. GERÄTE
3.1. Erlenmeyerkolben, 25 ml
3.2. Glassäule für Flüssigchromatographie, Innendurchmesser 15 mm, Länge 30-40 cm, mit geeignetem Absperrhahn.
3.3. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen, mit Direkteinspritzung, bestehend aus:
3.3.1. Thermostatregelbarer Ofen mit Temperaturprogrammierung
3.3.2. Kalteinspritzsystem zur Direktaufgabe der Probe auf die Säule
3.3.3. Flammenionisations-Detektor mit Verstärker
3.3.4. Integrator mit Schreiber (Anmerkung 1) zur Verwendung mit dem Verstärker (3.3.3), Ansprechzeit max. 1 Sekunde, variabler Papiervorschub
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Anmerkung 1: |
Es können auch Informatiksysteme verwendet werden, bei denen die GC-Daten mittels PC erfasst werden. |
3.3.5. Kapillarsäure, Quarzglas (für die Analyse der Wachse sowie der Methyl- und Ethylester), Länge 8-12 m, Innendurchmesser 0,25-0,32 mm, Innenwand belegt mit Trennflüssigkeit Anmerkung 2), gleichmäßige Schichtdicke zwischen 0,10 und 0,30 μm.
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Anmerkung 2: |
Geeignete Trennflüssigkeiten vom Typ SE52, SE54 usw. sind im Handel erhältlich. |
3.4. Mikroliterspritze, 10 μl, zur Direkteinspritzung in die Säule, mit gehärteter Nadel
3.5. Elektrorührwerk
3.6. Rotationsverdampfer
3.7. Muffelofen
3.8. Analysenwaage mit einer Messgenauigkeit von ± 0,1 mg
3.9. Übliche Laborgeräte
4. REAGENZIEN
4.1. Kieselgel, 60-200 μm mesh. Das Kieselgel im Muffelofen mindestens vier Stunden lang auf eine Temperatur von 500 °C erhitzen und nach dem Abkühlen mit 2 % Wasser, bezogen auf die verwendete Menge Kieselgel, versetzen. Durch gründliches Schütteln homogenisieren. Vor Gebrauch mindestens 12 Stunden im Exsikkator aufbewahren.
4.2. n-Hexan, für die Chromatographie oder Rückstandsanalyse (die Reinheit muss überprüft werden).
ACHTUNG - Die Dämpfe können sich entzünden. Von Wärmequellen, Funken oder offenem Feuer fernhalten. Die Flaschen müssen immer fest verschlossen sein. Bei der Verwendung ist für ausreichende Belüftung zu sorgen. Entstehung von Dämpfen verhindern und alle möglichen Geräte, von denen ein Brandrisiko ausgehen kann, z. B. nicht aus nicht entflammbaren Werkstoffen hergestellte Heizgeräte oder elektrische Geräte, entfernen. Schädlich beim Einatmen, da Nervenzellen geschädigt werden können. Dämpfe nicht einatmen. Erforderlichenfalls ein geeignetes Atemschutzgerät benutzen. Berührung mit den Augen und der Haut vermeiden.
4.3. Ethylether, für die Chromatographie
ACHTUNG - Leichtentzündlich und mäßig toxisch. Reizt die Haut. Schädlich beim Einatmen. Kann die Augen schädigen. Die Wirkungen können mit Verzögerung eintreten. Der Stoff kann explosionsfähige Peroxide bilden. Die Dämpfe können sich entzünden. Von Wärmequellen, Funken oder offenem Feuer fernhalten. Die Flaschen müssen immer fest verschlossen sein. Bei der Verwendung ist für ausreichende Belüftung zu sorgen. Entstehung von Dämpfen verhindern und alle möglichen Geräte, von denen ein Brandrisiko ausgehen kann, z. B. nicht aus nicht entflammbaren Werkstoffen hergestellte Heizgeräte oder elektrische Geräte, entfernen. Nicht bis zur Trockne oder fast bis zur Trockne eindampfen. Die Peroxidbildung kann durch Zugabe von Wasser oder eines geeigneten Reduktionsmittels verringert werden. Nicht trinken. Dämpfe nicht einatmen. Längere oder wiederholte Berührung mit der Haut vermeiden.
4.4. n-Heptan, für die Chromatographie, oder Iso-Octan
ACHTUNG - Entzündlich. Schädlich beim Einatmen. Von Wärmequellen, Funken oder offenem Feuer fernhalten. Die Flaschen müssen immer fest verschlossen sein. Bei der Verwendung ist für ausreichende Belüftung zu sorgen. Dämpfe nicht einatmen. Längere oder wiederholte Berührung mit der Haut vermeiden.
4.5. Standardlösung aus Laurylarachidat (Anmerkung 3) 0,05 % (m/v) in Heptan (interner Standard für Wachse)
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Anmerkung 3: |
Es kann auch Palmitylpalmitat, Myristylstearat oder Arachidyllaureat verwendet werden. |
4.6. Standardlösung aus Methylheptadecanoat, 0,02 % (m/v) in Heptan (interner Standard für Methyl- und Ethylester)
4.7. Sudan 1 (1-Phenylazo-2-naphthol)
4.8. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, für die Gaschromatographie
ACHTUNG
Wasserstoff: Leichtentzündlich, unter Druck. Von Wärmequellen, Funken, offenem Feuer oder elektrischen Geräten, die nicht aus nicht entflammbaren Werkstoffen hergestellt sind, fernhalten. Flaschenventil immer geschlossen halten, wenn das Gas nicht verwendet wird. Immer mit einem Druckregler verwenden. Vor dem Öffnen des Flaschenventils die Einstellfeder lockern. Beim Öffnen des Ventils nicht vor der Austrittsöffnung der Flasche stehen. Bei der Verwendung ist für ausreichende Belüftung zu sorgen. Wasserstoff nicht von einer Flasche in eine andere umfüllen. Gas nicht in der Flasche mischen. Die Flaschen gegen Umfallen sichern. Von Sonneneinstrahlung und Wärmequellen fernhalten. In korrosionsfreier Umgebung lagern. Keine beschädigten oder unetikettierten Flaschen verwenden.
Helium: Verdichtetes Gas unter hohem Druck. Es verringert die zum Atmen zur Verfügung stehende Menge Sauerstoff. Flasche geschlossen halten. Bei der Verwendung ist für ausreichende Belüftung zu sorgen. Lagerbereiche nur betreten, wenn sie ordnungsgemäß belüftet werden. Immer mit einem Druckregler verwenden. Vor dem Öffnen des Flaschenventils die Einstellfeder lockern. Gas nicht von einer Flasche in eine andere umfüllen. Die Flaschen gegen Umfallen sichern. Beim Öffnen des Ventils nicht vor der Austrittsöffnung der Flasche stehen. Von Sonneneinstrahlung und Wärmequellen fernhalten. In korrosionsfreier Umgebung lagern. Keine beschädigten oder unetikettierten Flaschen verwenden. Nicht einatmen. Nur für technische Zwecke verwenden.
4.9. Hilfsgase:
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Wasserstoff, rein, für die Gaschromatographie |
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— |
Luft, rein, für die Gaschromatographie |
ACHTUNG
Luft: Verdichtetes Gas unter hohem Druck. In Gegenwart von brennbaren Stoffen vorsichtig verwenden, da bei den meisten organischen Verbindungen die Selbstentzündungstemperatur an der Luft unter hohem Druck erheblich niedriger ist. Flaschenventil immer geschlossen halten, wenn das Gas nicht verwendet wird. Immer einen Druckregler verwenden. Vor dem Öffnen des Flaschenventils die Einstellfeder lockern. Beim Öffnen des Ventils nicht vor der Austrittsöffnung der Flasche stehen. Gas nicht von einer Flasche in eine andere umfüllen. Gas nicht in der Flasche mischen. Die Flaschen gegen Umfallen sichern. Von Sonneneinstrahlung und Wärmequellen fernhalten. In korrosionsfreier Umgebung lagern. Keine beschädigten oder unetikettierten Flaschen verwenden. Für technische Zwecke bestimmte Luft darf nicht eingeatmet oder für Atemschutzgeräte verwendet werden.
5. VERFAHREN
5.1. Vorbereiten der Chromatographiesäule
15 g Kieselgel (4.1) in n-Hexan (4.2) suspendieren und in die Säule (3.2) aufgeben. Nach der Spontansedimentation mit einem Elektrorührwerk nachbehandeln, um eine möglichst homogene Chromatographieschicht zu erzielen, und zur Entfernung etwa enthaltener Verunreinigungen mit 30 ml n-Hexan spülen. Mit Hilfe der Analysenwaage (3.8) genau 500 g der Probe in den 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) einwiegen und entsprechend dem vermuteten Wachsgehalt mit der geeigneten Menge interner Standardlösung (4.5) versetzen. So werden bei Olivenöl 0,1 mg Laurylarachidat, bei Oliventresteröl 0,25 bis 0,50 mg und für Olivenöle 0,05 mg Methylheptadecanoat (4.6) zugesetzt.
Die derart gewonnene Probe unter Verwendung von je zwei Teilen 2 ml n-Hexan (4.2) in die gemäß Chromatographiesäule überführen.
Das Lösungsmittel bis zu einem Stand von 1 mm über der oberen Absorbensgrenzfläche ablaufen lassen. Weiter mit n-Hexan/Ethylether (99:1) spülen und 220 ml bei einem Durchsatz von etwa 15 Tropfen/10 Sekunden auffangen. (Diese Fraktion enthält die Methyl- und Ethylester sowie die Wachse). (Anmerkung 4) (Anmerkung 5).
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Anmerkung 4: |
Das n-Hexan/Ethylethergemisch (99:1) sollte jeden Tag frisch zubereitet werden. |
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Anmerkung 5: |
Für eine visuelle Kontrolle der Elution der Wachse können der gelösten Probe 100 μl Sudan I (1 % im Elutionsmittel) zugesetzt werden. Die Retentionszeit des Farbstoffs liegt zwischen der der Wachse und der der Triacylglycerine. Wenn der Farbstoff das Ende der Säule erreicht, sind daher alle Wachse eluiert und die Elution kann beendet werden. |
Die derart gewonnenen Fraktionen im Rotationsverdampfer so lange trocknen, bis das Lösungsmittel nahezu restlos verdampft ist, wobei die letzten 2 ml im schwachen Stickstoffstrom abgeblasen werden. Die Fraktion, die die Methyl- und Ethylester enthält, wird mithilfe von 2-4 ml n-Heptan oder Iso-Octan als Verdünnungslösungsmittel aufgefangen.
5.2. Gaschromatographische Analyse
5.2.1. Vorarbeiten
Die Säule in den Gaschromatographen (3.3) einsetzen, wobei der Säulenanfang an das On-column-System und das Säulenende an den Detektor angeschlossen wird. Den Gaschromatographen auf Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors und des Schreibers usw. überprüfen.
Wird die Säule zum ersten Mal verwendet, wird empfohlen, sie einzufahren. Einen schwachen Gasstrom durch die Säule leiten, den Gaschromatographen einschalten und allmählich über einen Zeitraum von etwa 4 Stunden auf eine Temperatur von 350 °C aufheizen.
Die Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten; dann die Analysebedingungen einstellen (Gasstrom, Zünden der Flamme, Anschluss an den elektronischen Schreiber (3.3.4), Säulenofentemperatur, Detektor usw.). Das Signal mit einer Empfindlichkeit aufzeichnen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muss linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.
Eine negative geradlinige Drift ist ein Indiz für einen fehlerhaften Anschluss der Säule, eine positive Drift deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule hin.
5.2.2. Wahl der Arbeitsbedingungen für Wachse sowie Methyl- und Ethylester (Anmerkung 6)
Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:
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80 °C Ausgangstemperatur (1′) 
140 °C 
335 °C (20)
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—
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—
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Anmerkung 6: |
Wegen der hohen Endtemperatur ist eine positive Drift von höchstens 10 % der Skala zulässig. |
Diese Bedingungen können je nach Beschaffenheit der Säule und des Gaschromatographen abgewandelt werden, damit eine Trennung aller Wachse und Fettsäuremethylester und -ethylester sowie eine ausreichende Auflösung der Peaks (siehe Abbildungen 2, 3 und 4) erzielt werden. Die Retentionszeit des internen Standards Laurylarachidat muss 18 ± 3 Minuten betragen, der größte Wachspeak muss mindestens 60 % des Vollausschlags erreichen und der interne Standard Methylheptadecanoat für die Methyl- und Ethylester muss den Vollausschlag erreichen.
Die Parameter für die Peakintegration sind so zu wählen, dass die in Betracht kommenden Peakflächen korrekt bewertet werden.
5.3. Durchführung der Analyse
Mit der 10-μl-Mikroliterspritze 10 μl Probelösung aufziehen und dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, bis die Nadel leer ist. Die Nadel in das Einspritzsystem einführen, nach 1-2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen.
Das Chromatogramm aufzeichnen, bis je nach analysierter Fraktion alle Wachse oder Stigmastadiene eluiert sind.
Die Grundlinie muss stets den vorgeschriebenen Anforderungen genügen.
5.4. Identifizierung der Peaks
Die Peakflächen anhand der Retentionszeiten durch Vergleich mit Wachsgemischen identifizieren, deren Retentionszeiten bekannt sind und die unter denselben Bedingungen analysiert wurden. Die Alkylester werden anhand von Mischungen von Methyl- und Ethylestern der wichtigsten Fettsäuren in Olivenölen (Palmitinsäure und Ölsäure) identifiziert.
Abbildung 1 zeigt ein Chromatogramm der Wachse in einem nativen Olivenöl. Die Abbildungen 2 und 3 zeigen Chromatogramme von zwei nativen Olivenölen extra aus dem Einzelhandel, eines mit Methyl- und Ethylestern, das andere ohne. Abbildung 4 zeigt die Chromatogramme eines nativen Olivenöls extra höchster Qualität und des gleichen Öls, das mit 20 % desodoriertem Öl versetzt ist.
5.5. Quantitative Analyse der Wachse
Die Peakflächen des internen Standards Laurylarachidat und der aliphatischen C40- bis C46-Ester werden mit Hilfe eines Integrators ermittelt.
Der Gesamtwachsgehalt wird durch Addition jedes einzelnen Wachses, in mg/kg Fett, wie folgt bestimmt:
Dabei ist:
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Ax |
= |
Peakfläche jedes einzelnen Esters in Computer Counts |
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As |
= |
Peakfläche des internen Standards Laurylarachidat in Computer Counts |
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ms |
= |
Masse des zugegebenen internen Standards Laurylarachidat in mg; |
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m |
= |
Masse der für die Bestimmung entnommenen Probe in g. |
5.5.1. Quantitative Analyse der Methyl- und Ethylester
Die Peakflächen des internen Standards Methylheptadecanoat, der Methylester der C16- und C18-Fettsäuren und der Ethylester der C16- und C18-Fettsäuren werden mithilfe eines Integrators bestimmt.
Der Gehalt jedes Alkylesters in mg/kg Fett wird wie folgt bestimmt:
Dabei ist:
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Ax |
= |
Peakfläche der einzelnen C16- und C18-Ester in Computer Counts |
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As |
= |
Peakfläche des internen Standards Methylheptadecanoat in Computer Counts |
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ms |
= |
Masse des zugegebenen internen Standards Methylheptadecanoat in mg; |
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m |
= |
Masse der für die Bestimmung entnommenen Probe in g. |
6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE
Die Summe der Gehalte an den einzelnen Wachsen von C40 bis C46 (Anmerkung 7) wird in mg/kg Fett angegeben.
Die Summe der Gehalte der Methyl- und der Ethylester von C16 bis C18 sowie die Summe der beiden angeben.
Die Ergebnisse sind auf das nächste mg/kg zu runden.
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Anmerkung 7: |
Die mengenmäßig zu bestimmenden Bestandteile sind an den Peaks der Ester mit gerader Kohlenstoffzahl von C40 bis C46 abzulesen, wie als Beispiel im nachstehenden Chromatogramm der Wachse von Olivenöl dargestellt. Wenn der C46-Ester doppelt erscheint, ist zur Identifizierung die Wachsfraktion eines Oliventresteröls zu analysieren, bei dem der C46-Peak deutlich überwiegt und daher leicht zu erkennen ist. |
Das Verhältnis zwischen Ethylestern und Methylestern angeben.
Abbildung 1
Beispiel eines Gaschromatogramms der Wachsfraktion eines Olivenöls (1)
Abbildung 2
Methylester, Ethylester und Wachse in einem nativen Olivenöl
Abbildung 3
Methylester, Ethylester und Wachse in einem nativen Olivenöl extra
Abbildung 4
Teil eines Chromatogramms eines nativen Olivenöls extra und des gleichen Öls, das mit desodoriertem Öl versetzt ist
Anlage A
Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit des Gases
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen 1-3 μl Methan (oder Propan) einspritzen und die Säulendurchlaufzeit des Gases vom Zeitpunkt des Einspritzens bis zum Peak-Austritt (tM) messen.
Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tM definiert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tM die gemessene Zeit in Sekunden.
(1) Nach der Elution der Sterolester darf das Chromatogramm keine signifikanten Peaks aufweisen (Triacylglycerine).