„ANHANG C

BRUCELLOSE

1.   IDENTIFIZIERUNG DES KRANKHEITSERREGERS

Die Diagnose gilt als gesichert, wenn durch modifizierte Färbung zum Nachweis der Säurefestigkeit oder durch immunspezifische Färbung Organismen der Brucella-Gattung in Abortmaterial, Vaginalsekret oder Milch nachgewiesen werden, besonders, wenn dieser Befund durch serologische Untersuchungen untermauert wird. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bietet zusätzliche Nachweismethoden.

Soweit möglich sollte Brucella spp. isoliert werden, indem mit Material aus Uterussekret, abortierten Föten, Eutersekret oder bestimmten Geweben (z. B. von Lymphknoten sowie männlichen und weiblichen Fortpflanzungsorganen) Kulturen auf herkömmlichen Nährböden oder Auswahlnährböden angelegt werden.

Nach der Isolierung werden Spezies und Biovar durch Phagenlysis und/oder oxidative Stoffwechseluntersuchungen sowie nach kulturellen, biochemischen und serologischen Kriterien identifiziert. Die PCR kann sowohl als ergänzende Methode als auch zur Biotypisierung anhand bestimmter Gensequenzen dienen.

Die eingesetzten Methoden und Medien, ihre Standardisierung und die Auswertung der Testbefunde müssen den Vorgaben der Kapitel 2.4.3 (Rinderbrucellose), 2.7.2 (Schaf- und Ziegenbrucellose) und 2.8.5 (Schweinebrucellose) des OIE-Handbuchs zu Untersuchungsmethoden und Vakzinen für Landtiere, sechste Ausgabe (2008), entsprechen.

2.   IMMUNOLOGISCHE TESTMETHODEN

2.1.   Standards

2.1.1.   Zur Herstellung der Antigene für den Rose-Bengal-Test (RBT), den Serumagglutinationstest (SAT), die Komplementbindungsreaktion (KBR) und den Milch-Ring-Test (MRT) sind der Weybridge-Stamm Nr. 99 oder der USDA-Stamm 1119-3 von Brucella abortus Biovar 1 zu verwenden.

2.1.2.   Standardreferenzserum für die genannten Tests ist das Internationale Referenz-Standardserum des OIE (International Reference Standard Serum — OIEISS), früher bekannt als Zweites Internationales Anti-Brucella-abortus-Serum der WHO (ISAbS).

2.1.3.   Standardreferenzseren für Enzym-Immuntests (ELISA-Tests) sind:

—	das OIEISS,

—	das schwachpositive OIE-ELISA-Standardserum (weak-positive OIE ELISA Standard Serum — OIEELISAWPSS),

—	das starkpositive OIE-ELISA-Standardserum (strong-positive OIE ELISA Standard Serum — OIEELISASPSS),

—	das negative OIE-ELISA-Standardserum (negative OIE ELISA Standard Serum — OIEELISANSS).

2.1.4.   Standardreferenzseren für Fluoreszenz-Polarisations-Assays (FPA) sind:

—	das schwachpositive OIE-ELISA-Standardserum (weak-positive OIE ELISA Standard Serum — OIEELISAWPSS),

—	das starkpositive OIE-ELISA-Standardserum (strong-positive OIE ELISA Standard Serum — OIEELISASPSS),

—	das negative OIE-ELISA-Standardserum (negative OIE ELISA Standard Serum — OIEELISANSS).

2.1.5.   Die unter den Nummern 2.1.3 und 2.1.4 genannten Standardseren sind beim Gemeinschaftsreferenzlabor für Brucellose und bei der Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Vereinigtes Königreich, erhältlich.

2.1.6.   Das OIEISS, das OIEELISAWPSS, das OIEELISASPSS und das OIEELISANSS sind internationale Primärstandards, aus denen in jedem Mitgliedstaat für jeden der unter Nummer 2.1.1 genannten Tests sekundäre nationale Referenzstandards („Arbeitsstandards“) herzustellen sind.

2.2.   Enzym-Immuntests (ELISA-Tests) oder andere Bindungstests zum indirekten Nachweis des Erregers der Rinderbrucellose in Serum oder Milch

2.2.1.   Material und Reagenzien

Die angewendete Testmethode und die Auswertung der Testbefunde müssen entsprechend den Prinzipien des Kapitels 1.1.4 des OIE-Handbuchs zu Untersuchungsmethoden und Vakzinen für Landtiere, sechste Ausgabe (2008), validiert worden sein und zumindest Labor- und diagnostische Untersuchungen umfassen.

2.2.2.   Teststandardisierung

2.2.2.1.   Standardisierung der Testmethode für einzelne Serumproben:

a)	Eine 1:150-Vorverdünnung (1) des OIEISS oder eine 1:2-Vorverdünnung des OIEELISAWPSS oder eine 1:16-Vorverdünnung des OIEELISASPSS in einem negativen Serum (oder in einer Sammelprobe negativer Seren) muss eine positive Reaktion ergeben;

b)	eine 1:600-Vorverdünnung des OIEISS oder eine 1:8-Vorverdünnung des OIEELISAWPSS oder eine 1:64-Vorverdünnung des OIEELISASPSS in einem negativen Serum (oder in einer Sammelprobe negativer Seren) muss eine negative Reaktion ergeben;

c)	das OIEELISANSS muss stets eine negative Reaktion ergeben.

2.2.2.2.   Standardisierung der Testmethode für Serumsammelproben:

a)

Eine 1:150-Vorverdünnung des OIEISS oder eine 1:2-Vorverdünnung des OIEELISAWPSS oder eine 1:16-Vorverdünnung des OIEELISASPSS in einem negativen Serum (oder in einer Sammelprobe negativer Seren), erneut verdünnt in negativen Seren um die Zahl der die Sammelprobe ausmachenden Proben, muss eine positive Reaktion ergeben;

b)	das OIEELISANSS muss stets eine negative Reaktion ergeben;

c)	der Test muss dazu geeignet sein, bei einem einzelnen Tier einer Gruppe von Tieren, von denen Serumproben in einer Sammelprobe zusammengefasst wurden, eine Brucella-Infektion nachzuweisen.

2.2.2.3.   Standardisierung der Testmethode für Milch- oder Molkensammelproben:

a)	Eine 1:1 000-Vorverdünnung des OIEISS oder eine 1:16-Vorverdünnung des OIEELISAWPSS oder eine 1:125-Vorverdünnung des OIEELISASPSS in einem negativen Serum (oder in einer Sammelprobe negativer Seren), in negativer Milch erneut 1:10 verdünnt, muss eine positive Reaktion ergeben;

b)	das OIEELISANSS, in negativer Milch 1:10 verdünnt, muss stets eine negative Reaktion ergeben;

c)	der Test muss dazu geeignet sein, bei einem einzelnen Tier einer Gruppe von Tieren, von denen Milch- oder Molkenproben in einer Sammelprobe zusammengefasst wurden, eine Brucella-Infektion nachzuweisen.

2.2.3.   Bedingungen für die Anwendung der ELISA-Testmethoden zum Nachweis der Rinderbrucellose

2.2.3.1.   Bei Anwendung der unter den Nummern 2.2.2.1 und 2.2.2.2 vorgegebenen Kalibrierungen auf Untersuchungen von Serumproben nach ELISA-Testmethoden und unter Berücksichtigung der vorherrschenden Seuchenlage muss der ELISA diagnostisch zumindest ebenso empfindlich sein wie der RBT oder die KBR.

2.2.3.2.   Bei Anwendung der unter der Nummer 2.2.2.3 vorgegebenen Kalibrierungen auf die Untersuchung von Milchsammelproben nach ELISA-Testmethoden und unter Berücksichtigung nicht nur der Seuchenlage, sondern auch der durchschnittlichen und erwarteten extremen Haltungsformen muss der ELISA diagnostisch zumindest ebenso empfindlich sein wie der MRT.

2.2.3.3.   Werden ELISA-Testmethoden zur Bescheinigung im Sinne des Artikels 6 Absatz 1 oder zur Feststellung und Erhaltung des Bestandsstatus gemäß Anhang A Teil II Nummer 10 angewendet, so sind die Serumproben so zur Sammelprobe zusammenzufassen, dass die Testbefunde zweifelsfrei den unter die Sammelprobe fallenden einzelnen Tieren zugeordnet werden können. Etwaige Bestätigungstests sind an Serumproben einzelner Tiere durchzuführen.

2.2.3.4.   ELISA-Testmethoden eignen sich zur Untersuchung von Milchproben aus Milch, die in einem Betrieb mit mindestens 30 % laktierenden Milchkühen gesammelt wurde. Wird diese Methode angewendet, so sind alle erforderlichen Vorkehrungen zu treffen, um sicherzustellen, dass die zur Untersuchung entnommenen Proben zweifelsfrei den einzelnen Tieren zugeordnet werden können, von denen die Milch gewonnen wurde. Etwaige Bestätigungstests sind an Serumproben einzelner Tiere durchzuführen.

2.3.   Komplementbindungsreaktion (KBR)

2.3.1.   Das Antigen entspricht einer Bakteriensuspension in Phenol-Kochsalzlösung (NaCl mit einer Massenkonzentration von 0,85 %, Phenol mit einer Volumenkonzentration von 0,5 %) oder in Veronalpuffer. Antigene können in konzentrierter Form abgegeben werden, vorausgesetzt, der anzuwendende Verdünnungsfaktor ist auf dem Flaschenetikett angegeben. Das Antigen ist bei 4 °C zu lagern und darf nicht eingefroren werden.

2.3.2.   Seren sind wie folgt zu inaktivieren:

—	Rinderserum: bei 56 bis 60 °C für 30 bis 50 Minuten;

—	Schweinserum: bei 60 °C für 30 bis 50 Minuten.

2.3.3.   Im Interesse einer aussagekräftigen Testreaktion wird eine Komplementdosis verwendet, die höher ist als die für die komplette Hämolyse erforderliche Mindestdosis.

2.3.4.   Bei jedem Reaktionstest sind folgende Funktionskontrollen durchzuführen:

a)	Kontrolle der antikomplementären Wirkung des Serums;

b)	Antigenkontrolle;

c)	Kontrolle des hämolysierenden Systems;

d)	Komplementkontrolle;

e)	Empfindlichkeitskontrolle zu Beginn der Reaktion anhand eines positiven Serums;

f)	Kontrolle der Spezifität der Reaktion anhand eines negativen Serums.

2.3.5.   Ergebnisberechnung

Das OIEISS enthält 1 000 internationale KBR-Einheiten (IKBRE) je ml. Wird das OIEISS nach einer gegebenen Methode getestet, so wird das Testergebnis als Titerwert (TOIEISS; höchste direkte Verdünnung, die eine 50 %ige Hämolyse herbeiführt) ausgedrückt. Das als Titerwert vorliegende Testergebnis für das Testserum (TTESTSERUM) ist als IKBRE je ml auszudrücken. Um einen Titer eines nach dieser Methode getesteten unbekannten Testserums (TTESTSERUM) in den IKBRE-Wert umzurechnen (Faktor F), ist nach folgender Formel zu verfahren:

F = 1 000 × 1/TOIEISS

Der Gehalt an internationalen KBR-Einheiten je ml Testserum (IKBRETESTSERUM) ist nach folgender Formel zu berechnen:

ICFTUTESTSERUM = F × TTESTSERUM

2.3.6.   Ergebnisauswertung

Ein Serum mit 20 oder mehr IKBRE je ml gilt als positiv.

2.4.   Milch-Ring-Test (MRT)

2.4.1.   Das Antigen entspricht einer mit Hämatoxylin angefärbten Bakteriensuspension in Phenol-Kochsalzlösung (NaCl mit einer Massenkonzentration von 0,85 %, Phenol mit einer Volumenkonzentration von 0,5 %). Das Antigen ist bei 4 °C zu lagern und darf nicht eingefroren werden.

2.4.2.   Die Antigenempfindlichkeit ist im Verhältnis zum OIEISS so zu standardisieren, dass das Antigen bei einer 1:500-Verdünnung des OIEISS in negativer Milch positiv und bei einer 1:1 000-Verdünnung negativ reagiert.

2.4.3.   Der MRT ist an Proben durchzuführen, die für den Inhalt jeder Milchkanne bzw. jedes Sammeltanks des betreffenden Betriebs repräsentativ sind.

2.4.4.   Die Milchproben dürfen weder eingefroren noch erhitzt noch heftig geschüttelt worden sein.

2.4.5.   Der Test ist nach einer der folgenden Methoden durchzuführen:

—	an einer mindestens 25 mm hohen Milchsäule mit einem Milchvolumen von 1 ml, dem entweder 0,03 ml oder 0,05 ml eines der standardisierten angefärbten Antigene zugegeben wurde;

—	an einer mindestens 25 mm hohen Milchsäule mit einem Milchvolumen von 2 ml, dem 0,05 ml eines der standardisierten angefärbten Antigene zugegeben wurde;

—	an einem Milchvolumen von 8 ml, dem 0,08 ml eines der standardisierten angefärbten Antigene zugegeben wurde.

2.4.6.   Das Milch-Antigen-Gemisch ist zusammen mit positiven und negativen Arbeitsstandards für 60 Minuten bei 37 °C zu inkubieren. Eine anschließende Inkubation während 16 bis 24 Stunden bei 4 °C erhöht die Testempfindlichkeit.

2.4.7.   Ergebnisauswertung

a)	negative Reaktion: gefärbte Milch, farbloser Rahm;

b)	positive Reaktion: — Milch und Rahm gleichermaßen gefärbt oder — farblose Milch und gefärbter Rahm.

2.5.   Gepufferter Brucella-Antigen-Test (Rose-Bengal-Test (RBT))

2.5.1.   Das Brucella-Antigen entspricht einer mit Bengalrosa angefärbten Bakteriensuspension in Verdünnungspuffer mit einem pH-Wert von 3,65 ± 0,05. Das Antigen wird gebrauchsfertig geliefert. Es ist bei 4 °C zu lagern und darf nicht eingefroren werden.

2.5.2.   Das Antigen wird ohne Bezug zur Zellkonzentration hergestellt. Seine Empfindlichkeit muss jedoch im Verhältnis zum OIEISS so standardisiert werden, dass es bei einer Serumverdünnung von 1:45 positiv und bei einer Serumverdünnung von 1:55 negativ reagiert.

2.5.3.   Der RBT ist wie folgt durchzuführen:

a)

20-30 μl Serum mit einer gleichen Menge Antigen auf einer weißen oder emaillierten Platte über eine Fläche von ungefähr 2 cm Durchmesser verteilt mischen. Die Mischung über einen Zeitraum von vier Minuten bei Umgebungstemperatur leicht schwenken und anschließend bei guter Beleuchtung auf Agglutinationsreaktion beobachten.

b)	Testautomaten können verwendet werden, jedoch nur, wenn sie ebenso empfindlich und exakt sind wie die manuelle Methode.

2.5.4.   Ergebnisauswertung

Jede sichtbare Reaktion gilt als positiv, es sei denn, die Ränder sind stark angetrocknet.

Positive und negative Arbeitsstandards sind in jede Testreihe einzubeziehen.

2.6.   Serumagglutinationstest (SAT)

2.6.1.   Das Antigen entspricht einer Bakteriensuspension in Phenol-Kochsalzlösung (NaCl mit einer Massenkonzentration von 0,85 %, Phenol mit einer Volumenkonzentration von 0,5 %).

Formaldehyd darf nicht verwendet werden.

Antigene können in konzentrierter Form abgegeben werden, vorausgesetzt, der anzuwendende Verdünnungsfaktor ist auf dem Flaschenetikett angegeben.

Damit die Zahl falschpositiver Testergebnisse reduziert wird, kann der Antigensuspension in der Endverdünnung bis zu 5 mM EDTA zugesetzt werden. Der pH-Wert von 7,2 ist anschließend in der Antigensuspension neu anzupassen.

2.6.2.   Das OIEISS enthält 1 000 internationale Agglutinationseinheiten.

2.6.3.   Das Antigen wird ohne Bezug auf die Zellkonzentration aufbereitet; seine Empfindlichkeit ist jedoch im Verhältnis zum OIEISS so zu standardisieren, dass entweder 50 % Agglutination mit einer Serum-Endverdünnung zwischen 1:600 und 1:1 000 oder 75 % Agglutination mit einer Serum-Endverdünnung zwischen 1:500 und 1:750 gewährleistet ist.

Es kann sich auch als sinnvoll erweisen, anhand einer Gruppe definierter Seren die Reaktivität neuer Antigenchargen mit bereits standardisierten Chargen zu vergleichen.

2.6.4.   Der Test wird entweder in Reagenzgläsern oder auf Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Mischung aus Antigen und Serumverdünnungen wird bei 37 °C für 16 bis 24 Stunden inkubiert.

Für jedes Serum sind mindestens drei Verdünnungen anzulegen. Verdächtiges Serum ist so zu verdünnen, dass die im positiven Limit liegende Reaktion am mittleren Glas (beziehungsweise an der mittleren Vertiefung im Falle von Mikrotiterplatten) abgelesen wird.

2.6.5.   Ergebnisauswertung

Die Stärke der Brucella-Agglutination im Serum ist als IE je ml auszudrücken.

Ein Serum mit mehr als 30 IE je ml gilt als positiv.

2.7.   Fluoreszenz-Polarisations-Assay (FPA)

2.7.1.   Der FPA kann in Reagenzgläsern oder auf Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt werden. Die angewendete Methode, ihre Standardisierung und die Auswertung der Testbefunde müssen den Vorgaben von Kapitel 2.4.3 (Rinderbrucellose) des OIE-Handbuchs zu Untersuchungsmethoden und Vakzinen für Landtiere, sechste Ausgabe (2008), entsprechen.

2.7.2.   Teststandardisierung

Standardisierung des FPA:

a)	das OIEELISASPSS und das OIEELISAWPSS ergeben stets eine positive Reaktion;

b)	eine 1:8-Vorverdünnung des OIEELISAWPSS oder eine 1:64-Vorverdünnung des OIEELISASPSS in einem negativen Serum (oder in einer Sammelprobe negativer Seren) ergeben stets eine negative Reaktion;

c)	das OIEELISANSS ergibt stets eine negative Reaktion.

Jede Testserie hat Folgendes zu beinhalten: ein starkpositives, ein schwachpositives und ein negatives Standardserum (kalibriert anhand der OIE-ELISA-Standardseren).

3.   ERGÄNZENDE TESTMETHODEN

3.1.   Intrakutantest (Brucellintest)

3.1.1.   Bedingungen für die Durchführung des Intrakutantests:

a)	Zur Bescheinigung der Brucellosefreiheit für den innergemeinschaftlichen Handel darf der Intrakutantest nicht verwendet werden;

b)	Der Intrakutantest ist eine der spezifischsten Testmethoden zum Nachweis einer Brucellose-Infektion bei nicht geimpften Tieren; die Diagnose darf jedoch nicht nur auf Grundlage des Intrakutantests erfolgen;

c)	Rinder, die auf eine der serologischen Untersuchungen gemäß diesem Anhang negativ, auf den Intrakutantest jedoch positiv reagiert haben, sind als infiziert bzw. unter Infektionsverdacht zu betrachten;

d)

Rinder, die auf eine der serologischen Untersuchungen gemäß diesem Anhang positiv reagiert haben, können einem Intrakutantest unterzogen werden, damit die serologischen Testbefunde untermauert werden, insbesondere wenn in brucellosefreien oder amtlich anerkannt brucellosefreien Rinderbeständen eine Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen andere Bakterien nicht ausgeschlossen werden kann.

3.1.2.   Der Test ist mit einem standardisierten und definierten Brucellin-Präparat durchzuführen, das kein Lipopolysaccharid-Antigen (LPS-Antigen)) der S-Form enthält, welches unspezifische Entzündungsreaktionen hervorrufen oder spätere serologische Untersuchungen beeinträchtigen kann.

Die Methode zur Herstellung von Brucellin muss den Vorgaben des Kapitels 2.4.3 Abschnitt C1 des OIE-Handbuchs zu Untersuchungsmethoden und Vakzinen für Landtiere, sechste Ausgabe (2008), entsprechen.

3.1.3.   Testmethode

3.1.3.1.   0,1 ml Brucellin wird intrakutan in die Schwanzfalte, die Flankenhaut oder die Halsseite injiziert.

3.1.3.2.   Das Testergebnis ist nach 48 bis 72 Stunden abzulesen.

3.1.3.3.   Die Hautdicke an der Injektionsstelle vor der Injektion und bei der Nachuntersuchung wird mit Hilfe eines Mess-Schiebers mit Feineinstellung gemessen.

3.1.3.4.   Ergebnisauswertung

Heftige Reaktionen manifestieren sich durch lokale Schwellung und Induration und sind leicht erkennbar.

Eine Hautverdickung von 1,5 bis 2 mm gilt als positiver Testbefund.

3.2.   Kompetitiver Enzymimmunoassay (cELISA)

3.2.1.   Bedingungen für die Anwendung des cELISA

Zur Bescheinigung der Brucellosefreiheit für den innergemeinschaftlichen Handel darf der cELISA nicht verwendet werden.

Rinder, die auf eine der anderen in diesem Anhang genannten serologischen Untersuchungen positiv reagiert haben, können einem cELISA unterzogen werden, damit die anderen serologischen Testbefunde untermauert werden, insbesondere wenn in brucellosefreien oder amtlich anerkannt brucellosefreien Rinderbeständen eine Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen andere Bakterien nicht ausgeschlossen werden kann, oder damit Reaktionen aufgrund von Restantikörpern ausgeschlossen werden, die sich wegen einer Impfung mit S19 gebildet haben.

3.2.2.   Testmethode

Der Test ist in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Kapitels 2.4.3 Abschnitt B Nummer 2 des OIE-Handbuchs zu Untersuchungsmethoden und Vakzinen für Landtiere, sechste Ausgabe (2008), durchzuführen.“